Μελέτη της επιβιωτικής λειτουργίας της Απολιποπρωτεΐνης J (CLU) στην κυτταρική γήρανση καθώς και κατόπιν επίδρασης εξωγενών κυτταροτοξικών περιβαλλοντικών ερεθισμάτων
Authors: Μπαλαντίνου Ειρήνη 
Published: January 2014

Η CLU αποτελεί έναν επιβιωτικό παράγοντα, ο οποίος εμπλέκεται σε μια πληθώρα φυσιολογικών διεργασιών και υπερ-εκφράζεται τόσο στην κυτταρική γήρανση όσο και κατόπιν επίδρασης εξωγενών κυτταροτοξικών περιβαλλοντικών ερεθισμάτων, όπως θερμικό σοκ, οξειδωτικό στρες, επίδραση με υπέρυθρη ή ιονίζουσα ακτινοβολία και με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Έτσι θεωρήθηκε σκόπιμο στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής να μελετηθεί η επίδραση του πρωτεασωμικού και λυσοσωμικού στρες στην έκφραση της CLU, αλλά και ο καθορισμός αν η CLU αποτελεί πρωτεολυτικό υπόστρωμα του πρωτεασώματος ή του λυσοσώματος. Ολική καθώς και μερική αναστολή του πρωτεασώματος είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επίπεδων mRNA και πρωτεΐνης της CLU σε πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειες νεαρών και γερασμένων ινοβλαστών WI38, αλλά και κύτταρα οστεοσαρκώματος U-2 OS. Επιδρώντας στη συνέχεια με δυο ειδικούς αναστολείς των μεταγραφικών παραγόντων HSF-1 και AP-1, οι οποίοι έχουν στοιχεία πρόσδεσης στον υποκινητή της CLU, παρατηρήθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας HSF-1 είναι υπεύθυνος για την επαγωγή του mRNA της CLU όταν ανασταλεί το πρωτεάσωμα. Όσο αφορά την πιθανή αποικοδόμηση της CLU από το πρωτεάσωμα, πειράματα επώασης με ραδιενεργή μεθειονίνη και ώσης για μερικές ώρες παρουσία ή μη αναστολέα του πρωτεασώματος σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU, οι psCLU και sCLU, συσσωρεύονται όταν ανασταλεί το πρωτεάσωμα, ενώ η έκκριση δεν επηρεάζεται, πράγμα που σημαίνει ότι και οι δυο αυτές ισομορφές αποικοδομούνται από το πρωτεάσωμα. Επίσης, πειράματα μελέτης της κινητικής της CLU για μερικές ώρες μετά την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης με κυκλοεξιμίδιο και παρουσία ή μη ενός ειδικού αναστολέα της Ε1 λιγάσης σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU συσσωρεύονται όταν ανασταλεί η Ε1 λιγάση, δηλαδή ουμπικουϊτυλιώνονται. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της CLU ή ουμπικουΐτίνης, καθώς και πειράματα διαδοχικής ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι της CLU και στη συνέχεια έναντι της ουμπικουΐτίνης, ανίχνευσαν μορφές υψηλότερου μοριακού βάρους από αυτό της CLU, οι οποίες ενδέχεται να απεικονίζουν ουμπικουϊτιλιωμένες μορφές της CLU. Τέλος, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της λιγάσης του ενδοπλασματικού δικτύου Hrd1/Synoviolin, έδειξαν ότι η CLU ουμπικουϊτυλιώνεται από την λιγάση αυτή τόσο υπό κανονικές συνθήκες όσο και κατόπιν στρες. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η έκφραση της CLU όταν ανασταλεί το δεύτερο ενδοκυτταρικό μονοπάτι αποικοδόμησης, εξωκυττάριων κυρίως πρωτεϊνών, το λυσόσωμα. Αναστολή του λυσοσώματος σε U-2 OS και WI38 κύτταρα, οδήγησε σε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων της CLU, αφήνοντας αναλλοίωτα τα επίπεδα mRNA, πιθανώς εξαιτίας της μειωμένης αποικοδόμησής της από το λυσόσωμα. Για να διερευνηθεί περεταίρω η πιθανή αποικοδόμηση της CLU από το λυσόσωμα, πειράματα μελέτης της κινητικής της CLU για μερικές ώρες μετά την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης με κυκλοεξιμίδιο και παρουσία ή μη αναστολέα του λυσοσώματος σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU συσσωρεύονται έπειτα από αναστολή του λυσοσώματος, άρα αποικοδομούνται από το λυσόσωμα.