Physiological and molecular aspects of sublethally injured Listeria monocytogenes cells
Authors: Σιδεράκου Δανάη-Ουρανία 
Published: March 2022

Οι αντιμικροβιακές πρακτικές που εφαρμόζονται στη βιομηχανία τροφίμων με στόχο τον περιορισμό των παθογόνων βακτηρίων μπορούν να προκαλέσουν υποθανατiο τραυματισμό. Η παρουσία τραυματισμένων κυττάρων που επιβιώνουν μετά από μία αντιμικροβιακή πρακτική είναι ζωτικής σημασίας για την ασφάλεια και την ποιότητα των τροφίμων. Τα υποθανάτια τραυματισμένα κύτταρα μπορεί να διατηρήσουν ένα μέρος της λειτουργικότητάς τους ή μπορεί να ανακτήσουν βελτιωμένη ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις αφού ανακάμψουν από τον τραυματισμό. Ο μικροοργανισμός L. monocytogenes είναι ένα παθογόνο βακτήριο που μπορεί να προσαρμοστεί σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών που συναντώνται στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων και ως εκ τούτου αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για την ασφάλεια των τροφίμων. Αυτό το βακτήριο επιβιώνει ως σαπρόφυτο και ως ενδοκυτταρικό παθογόνο. Κατά τη διάρκεια του σαπροφυτικού κύκλου ζωής του, μπορεί να προσκολληθεί σε επιφάνειες και να σχηματίσει βιο-υμένιο, κάτι που το βοηθά να παραμένει στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων για μεγάλο χρονικό διάστημα και να αποτελέσει πηγή επιμόλυνσης. Ως ενδοκυτταρικό παθογόνο, το βακτήριο L. monocytogenes μπορεί να επιβιώσει από τα εμπόδια που απαντώνται στο περιβάλλον του ξενιστή, να εισβάλει και να πολλαπλασιαστεί στα κύτταρά του και ως εκ τούτου να προκαλέσει ασθένεια (λιστερίωση). Ο υποθανάτιος τραυματισμός μπορεί να είναι δομικός ή μεταβολικός, επηρεάζοντας δυνητικά τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις, την προσκόλληση σε επιφάνειες και την μολυσματικότητά του. Πληροφορίες για τη εμφάνιση υποθανάτιου τραυματισμού σε συνθήκες επεξεργασίας τροφίμων αλλά και για τη φυσιολογία του τραυματισμένου L. monocytogenes μπορεί να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα των αποφάσεων που λαμβάνονται σχετικά με την ασφάλεια των τροφίμων.Ο στόχος αυτής της διατριβής ήταν η κατανόηση της εμφάνισης υποθανάτιου τραυματισμού στο βακτήριο L. monocytogenes υπό διαφορετικές συνθήκες που σχετίζονται με το περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων όπως και η μελέτη των φαινοτυπικών και μοριακών χαρακτηριστικών των υποθανάτια τραυματισμένων κυττάρων. Για την επίτευξη αυτών των στόχων, η προσέγγιση που ακολουθήθηκε, σε πρώτο στάδιο, ήταν να ποσοτικοποιηθεί ο υποθανάτιος τραυματισμός υπο διάφορετικές συνθήκες καταπόνησης που απαντώνται στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων. Οι φαινότυποι που διερευνήθηκαν στα τραυματισμένα κύτταρα L. monocytogenes ήταν η μολυσματικότητα in vitro και η ικανότητα προσκόλλησης σε επιφάνειες. Αξιολογήθηκαν επίσης η μεταγραφή γονιδίων σχετικών με την μολυσματικότητα και την απόκριση σε καταπονήσεις. Τέλος, μελετήθηκε η επίδρασή της θερμοκρασίας προκαλλιέργειας των κυττάρων στην επιβίωση και τον τραυματισμό του L. monocytogenes σε συνθήκες καταπόνησης καθώς και το δυναμικό ανάπτυξης των κυττάρων μετά από καταπόνηση.Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 2, έδειξαν ότι οι αντιμικροβιακοί παράγοντες, που στοχεύουν στην εξάλειψη του παθογόνου, μπορούν να προκαλέσουν υποθανάτιο τραυματισμό, καθώς και ότι κάθε είδος καταπόνησης (υπεροξυκό οξύ, χλωριούχο βενζαλκόνιο, γαλακτικό οξύ, θέρμανση, καταπόνηση απο έλλειψη θρεπτικών συστατικών, ωσμωτική καταπόνηση) είχε διαφορετικό αντίκτυπο στην επιβίωση και την κινητική τραυματισμού των L. monocytogenes ScottA και EGDe. Τα υψηλότερα επίπεδα τραυματισμού σημειώθηκαν από το απολυμαντικό υπεροξικό οξύ (Peracetic acid, PAA). Έπειτα ακολουθήσε το γαλακτικό οξύ και η θέρμανση. Η θερμοκρασία έκθεσης (4oC και 20oC) επηρέασε την κινητική θανάτωσης αλλά και τραυματισμού του L. monocytogenes. Επιπλέον, η προσαρμογή των κυττάρων σε μέσο υψηλής αλατότητας χωρίς θρεπτικά συστατικά επηρέασε την αποτελεσματικότητα των απολυμαντικών υπεροξικό οξύ και χλωριούχο βενζαλκόνιο στην ικανότητα τους να προκαλούν θανάτωση αλλά και τραυματισμό. Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 3, έδειξαν ότι τα κύτταρα L. monocytogenes που έχουν τραυματιστεί από PAA διατηρούν σημαντικές ιδιότητες της φυσιολογίας τους. Τα τραυματισμένα κύτταρα παραμένουν ικανά να προσκολλώνται (μετά από 2 και 24 ώρες) σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα στους 4oC και 20oC. In vitro πειράματα παθογένειας χρησιμοποιώντας κύτταρα Caco-2 του ανθρώπινου εντερικού επιθηλίου έδειξαν ότι τα τραυματισμένα κύτταρα L. monocytogenes μπόρεσαν να εισβάλουν στα κύτταρα ξενιστές αλλά δεν μπόρεσαν να πολλαπλασιαστούν ενδοκυτταρικά. Η επώαση των τραυματισμένων κυττάρων L. monocytogenes ScottA σε υγρό θρεπτικό μέσο στους 4oC, είχε ως αποτέλεσμα τη θετική ρύθμιση των γονιδίων παθογένειας flaA, inlA και plcA. Επιπλέον, διαστελεχιακές διαφορές παρατηρήθηκαν στο δυναμικό παθογένειας των τραυματισμένων κυττάρων.Στο κεφάλαιο 4, διερευνήθηκαν το δυναμικό ανάπτυξης μεμονωμένων κυττάρων μετά από καταπόνηση και τραυματισμό, καθώς και η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης των κυττάρων στον τραυματισμό. H προκαλλιέργεια κυττάρων στους 20oC και στους 4οC (συγκριτικά με τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν στη βέλτιστη θερμοκρασία των 30oC) συνδέθηκε με μεγαλύτερα επίπεδα τραυματισμού κατά την έκθεση σε PAA-20oC και PAA-4oC αντίστοιχα. Η καταπόνηση και ο τραυματισμός από την έκθεση σε PAA επηρέασαν το δυναμικό ανάπτυξης του L. monocytogenes σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων. Συγκεκριμένα, οι χρόνοι ανάπτυξης, σε υγρό θρεπτικό μέσο ήταν μεγαλύτεροι και έδειξαν υψηλή παραλλακτικότητα. Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή έχει στόχο να αναδείξει τη σημασία του υποθανάτιου τραυματισμού στον L. monocytogenes αλλά και τις συνέπειες που έχει για την ασφάλεια των τροφίμων. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν ότι ο παθογόνος μικροοργανισμός, μετά από μια αντιμικροβιακή καταπόνηση μπορεί να επιβιώσει σε κατάσταση υποθανάτιου τραυματισμού, διατηρώντας παράλληλα σημαντικά λειτουργικά χαρακτηριστικά που του επιτρέπουν να επιβιώσει στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων και δυνητικά να προκαλέσει ασθένεια. Η παραλλακτικότητα στο δυναμικό ανάπτυξης των τραυματισμένων κυττάρων μπορεί να επηρεάσει την αποτελεματικότητα των μεθόδων ανίχνευσής τους. Τα ποσοτικά δεδομένα αυτής της μελέτης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη μοντέλων πρόβλεψης υποθανάτιου τραυματισμού του παθογόνου. Τα αποτελέσματα σχετικά με τη φαινοτυπική και μεταγραφική απόκριση μπορούν να συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την απόκριση του τραυματισμένου L. monocytogenes εντός του ξενιστή αλλά και στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων.