H απόκριση σε βλάβες του DNA σε ανθρώπινα ωοκύτταρα
Authors: Αγαπητού Κρυστάλλω 
Published: May 2023

Εισαγωγή: Τα κύτταρα του οργανισμού υφίσταται συνεχώς την επίδραση ενδογενών και εξωγενών γενοτοξικών παραγόντων, οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στο DNA και γονιδιωματική αστάθεια. Όταν οι βλάβες στο DNA αφορούν τα κύτταρα της γαμετικής σειράς, τότε αυτό μπορεί να οδηγήσει σε υπογονιμότητα, μη φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς και να επηρεάσει αρνητικά τα μαιευτικά και περιγεννητικά αποτελέσματα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η απόκριση των ωοκυττάρων σε βλάβες του DNA, δεδομένου πως τα κύτταρα αυτά σχηματίζονται κατά την εμβρυϊκή ζωή και παραμένουν στο στάδιο της πρόφασης της 1ης μειωτικής διαίρεσης έως και την εφηβεία. Κατά τη διάρκεια αυτής της μεγάλης περιόδου τα ωοκύτταρα εκτίθενται σε βλάβες του DNA, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα και το δυναμικό τους. Για τον λόγο αυτό η μελέτη της απόκρισης των ωοκυττάρων σε βλάβες του DNA είναι σημαντική. Αν και το θέμα αυτό απασχολεί την επιστημονική κοινότητα εδώ και τουλάχιστον τρεις δεκαετίες, τα υπάρχοντα δεδομένα προέρχονται κυρίως από μελέτες σε ζωικά μοντέλα, καθιστώντας τις μελέτες σε ανθρώπινα ωοκύτταρα αναγκαίες. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της απόκρισης ανθρώπινων ωοκυττάρων που βρίσκονται στο στάδιο του βλαστικού κυστιδίου (germinal vesicle, GV) σε βλάβες του DNA και συγκεκριμένα σε βλάβες της κατηγορίας των δίκλωνων θραυσμάτων του DNA (double strand breaks, DSBs). Απώτερος σκοπός ήταν η διερεύνηση της ευαισθησίας των σημείων ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τα διάφορα στάδια της μείωσης, η διερεύνηση του εάν και τα πόσον τα ωοκύτταρα που φέρουν βλάβες στο DNA μπορούν να ολοκληρώσουν την μείωση έχοντας βλάβες, η διερεύνηση του δυναμικού επιδιόρθωσης της βλάβης κατά τη μείωση και η διερεύνηση της πιθανής επίδρασης της βλάβης στα μορφοκινητικά χαρακτηριστικά των ωοκυττάρων στο πλαίσιο της in vitro ωρίμανσής τους.Υλικά & Μέθοδοι: Η παρούσα προοπτική μελέτη παρέμβασης πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Κυτταρικής και Αναπτυξιακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, σε συνεργασία με τη Μονάδα Ιατρικώς Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής ‘’Institute of Life’’ που εδρεύει στο Μαιευτήριο ‘’ΙΑΣΩ’’. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Εθνική Αρχή Ιατρικώς Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής (Αρ. Απόφασης 443/31.7.2018). Στη μελέτη συμμετείχαν 24 δότριες ωαρίων ηλικίας έως 35 ετών, οι οποίες υποβλήθηκαν σε κύκλο δωρεάς ωαρίων και για τους σκοπούς της έρευνας δώρισαν 158 GV ωοκύτταρα μετά από προφορική και έγγραφη συναίνεσή τους. Πιο αναλυτικά, όλες οι συμμετέχουσες στη μελέτη έλαβαν ως πρωτόκολλο διέγερσης το συμβατικό βραχύ πρωτόκολλο του ανταγωνιστή της GnRH (short GnRH antagonist protocol). Μετά την ωοληψία πραγματοποιήθηκε μηχανική και ενζυμική (hyaluronidase, FertiPro) απογύμνωση του συμπλέγματος των κοκκιωδών κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (COCs) και τα ωοκύτταρα ελέγχθηκαν για το βαθμό της πυρηνικής τους ωριμότητας. Τα ωοκύτταρα σταδίου GV χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, στην πειραματική ομάδα και στην ομάδα ελέγχου. Στην πειραματική ομάδα τα GV ωοκύτταρα επωάστηκαν για μία ώρα σε καλλιεργητικό υλικό εμπλουτισμένο με ετοποσίδη (Etop) με σκοπό την πρόκληση DSBs. Τα GV ωοκύτταρα της ομάδας ελέγχου (Control) δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη. Στη συνέχεια, μερικά από τα GV ωοκύτταρα και των δύο ομάδων μονιμοποιήθηκαν με τη χρήση παραφολμαδεΰδης (Etop PF και Control PF, αντίστοιχα) για να αξιολογηθεί η επίδραση της ετοποσίδης στην πρόκληση DSBs. Τα υπόλοιπα GV ωοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο επιτραπέζιο κλίβανο (benchtop) Astec Pengium (Astec) σε συνθήκες καλλιέργειας 6.5% CO2, 5% O2 και θερμοκρασία 37.5 οC για 24 ώρες. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της ετοποσίδης στην in vitro ωρίμανση των GV ωοκυττάρων πραγματοποιήθηκε ανάλυση των μορφοκινητικών δεδομένων με τη χρήση του ψηφιακού ανεστραμμένου μικροσκοπίου τεχνολογίας time-lapse (TL) ‘’Primo Vision’’ (TK Biotech, Vitrolife) (Etop TL). Εφαρμόζοντας τα ίδια πρωτόκολλα ανάλυσης αξιολογήθηκαν τα μορφοκινητικά δεδομένα της in vitro ωρίμανσης των GV ωοκυττάρων της ομάδας ελέγχου τα οποία δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη (Control TL). Μετά το πέρας της καλλιέργειας τα ωοκύτταρα μονιμοποιήθηκαν προκειμένου να διερευνηθεί η δυναμική επιδιόρθωσης βλαβών στο DNA. Τα πειράματα ανάλυσης των DSBs πραγματοποιήθηκαν μέσω της μελέτης του ανοσοφθορισμού της ιστόνης γ-H2AX, η οποία αποτελεί ειδικό βιοδείκτη της παρουσίας DSBs, με τη χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου (Leica TCS SP5). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος GraphPad Prism (έκδοση 8.4.3) και της Γλώσσας Προγραμματισμού R για Στατιστικούς Σκοπούς.Αποτελέσματα: Προκειμένου να μελετηθεί η ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τη πρόφαση της 1ης μειωτικής διαίρεσης και κατά τη φάση ΜΙ, 31 GV ωοκύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ετοποσίδης (Etop) που προκαλούν διαφορετικά επίπεδα γενοτοξικής βλάβης και στη συνέχεια αφέθηκαν να ωριμάσουν για 24 ώρες σε κλίβανο με ενσωματωμένο σύστημα time-lapse (TL). Πιο αναλυτικά, οκτώ (8) GV ωοκύτταρα εκτέθηκαν σε συγκέντρωση ετοποσίδης 100 μg/ml (Etop 100 TL), επτά (7) σε συγκέντρωση ετοποσίδης 20 μg/ml (Etop 20 TL), επτά (7) σε συγκέντρωση ετοποσίδης 10 μg/ml (Etop 10 TL), που προκαλούν εκτεταμένα, μέτρια και ήπια επίπεδα βλάβης, αντίστοιχα, ενώ εννέα (9) δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη και λειτούργησαν ως ομάδα ελέγχου (Control TL). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δεδομένων από το σύστημα time-lapse κατέδειξαν πως η ωρίμανση των ωοκυττάρων της ομάδας Etop 100 TL διακόπηκε στο στάδιο GV στο σύνολο (100%) των ωοκυττάρων της ομάδας αυτής. Σε αντίθεση με τα ωοκύτταρα της ομάδας Etop 100 TL, στα ωοκύτταρα των ομάδων Etop 20 TL και Etop 10 TL παρατηρήθηκε διάσπαση βλαστικού κυστιδίου (germinal vesicle breakdown, GVBD) σε ποσοστό 71.43% και σχηματισμός και αποβολή 1ου πολικού σωματίου (polar body extrusion, PBE) σε ποσοστά 71.43% και 57.14%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά αυτά ήταν παρόμοια με τα αντίστοιχα ποσοστά που καταγράφηκαν στην ομάδα ελέγχου (Control TL), όπου το ποσοστό διάσπασης βλαστικού κυστιδίου (GVBD rate) ήταν 88.89% και το ποσοστό σχηματισμού και αποβολής 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion rate) ήταν επίσης 88.89%. Τα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν πως τα ανθρώπινα ωοκύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς ελέγχου για βλάβες του DNA, οι οποίοι είναι ευαίσθητοι και ενεργοποιούνται εμποδίζοντας την περαιτέρω ωρίμανση των ωοκυττάρων σε εκτεταμένα επίπεδα βλάβης, χωρίς όμως να είναι ευαίσθητοι σε επίπεδα μέτριας ή/και ήπιας βλάβης, επιτρέποντας έτσι την ωρίμανση ωοκυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Με σκοπό την επιβεβαίωση της έλλειψης ευαισθησίας των μηχανισμών ελέγχου σε μέτρια επίπεδα βλάβης του DNA, επαναλήφθηκε η παραπάνω πειραματική διαδικασία σε 102 GV ωοκύτταρα, 45 εκ των οποίων εκτέθηκαν σε 20 μg/ml ετοποσίδης (Etop TL) και στη συνέχεια αφέθηκαν να ωριμάσουν για 24 ώρες σε κλίβανο με ενσωματωμένο σύστημα time-lapse (TL) και σε 57 GV ωοκύτταρα τα οποία δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη και λειτούργησαν ως ομάδα ελέγχου (Control TL). Της ανάλυσης είχαν προηγηθεί πειράματα ανοσοφθορισμού της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γ-Η2ΑΧ και συνεστιακής μικροσκοπίας για την επιβεβαίωση της γενοτοξικής επίδρασης της ετοποσίδης σε συγκέντρωση 20 μg/ml. Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ της πειραματικής ομάδας (Etop TL) και της ομάδας ελέγχου (Control TL) αναφορικά με τα ποσοστά διάσπασης βλαστικού κυστιδίου (GVBD rate 62.22% vs 63.16%, p-value = 0.543) και σχηματισμού και αποβολής 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion rate 85.71% vs 88.89%, p-value = 0.495). Επιπρόσθετα, και οι χρόνοι επίτευξης της διάσπασης του βλαστικού κυστιδίου (GVBD time 5.86 ± 3.19 ώρες vs 5.89 ± 3.71 ώρες, p-value = 0.792) και του σχηματισμού και αποβολής του 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion 18.32 ± 2.70 ώρες vs 17.96 ± 3.66 ώρες, p-value = 0.914), οι οποίοι αντικατοπτρίζουν τον χρόνο μετάβασης από το στάδιο GV στο στάδιο MII, δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώνουν την παραπάνω υπόθεση περί έλλειψης ευαισθησίας των μηχανισμών ελέγχου σε μέτρια επίπεδα γενοτοξικής βλάβης. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η πιθανή επίδραση της ετοποσίδης και της γενοτοξικής βλάβης που αυτή προκαλεί στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ωοκυττάρων. Στην πειραματική ομάδα (Etop TL) παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ωοκυττάρων που είχαν μη φυσιολογική μορφολογία και πιο ειδικά κοκκιώδες κυτταρόπλασμα (55.56%, 25/45) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Control TL) (29.82%, 17/57) (p-value = 0.015), καταδεικνύοντας πως ίσως οι βλάβες στο DNA σχετίζονται με μη φυσιολογικά μορφολογικά πρότυπα. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση υποομάδων με βάση την ηλικία των δοτριών, προκειμένου να διερευνηθεί το εάν και τα πόσον η ηλικία μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου βλαβών του DNA κατά την ωρίμανση των ωοκυττάρων. Στην μία υποομάδα συμπεριελήφθησαν GV ωοκύτταρα που συλλέχθηκαν από δότριες ηλικίας ≤ 30 ετών και στην άλλη υποομάδα συμπεριελήφθησαν GV ωοκύτταρα που συλλέχθηκαν από δότριες ηλικίας > 30 ετών. Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των υποομάδων αναφορικά με τα δεδομένα της μορφοκινητικής ωρίμανσης των ωοκυττάρων. Τέλος διερευνήθηκε η ικανότητα επιδιόρθωσης των DSBs που παρουσιάζουν τα ανθρώπινα GV ωοκύτταρα. Τα δεδομένα της στατιστικής ανάλυσης έδειξαν πως τα ωοκύτταρα σταδίου GV που εκτέθηκαν σε ετοποσίδη διαθέτουν μερική επιδιορθωτική ικανότητα των DSBs, καθώς ο εκπεμπόμενος ανοσοφθορισμός της γ-Η2ΑΧ παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερος μετά την καλλιέργεια σε σύγκριση με τον ανοσοφθορισμό αμέσως μετά την έκθεση σε ετοποσίδη και στατιστικά σημαντικά υψηλότερος σε σύγκριση με τον εκπεμπόμενο ανοσοφθορισμό από τα GV ωοκύτταρα της ομάδας ελέγχου. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συμφωνούν με την πλειονότητα των βιβλιογραφικών δεδομένων που αφορούν κυρίως μελέτες σε ζωικά μοντέλα και δείχνουν πως τα ανθρώπινα ωοκύτταρα σταδίου GV που φέρουν βλάβες στο DNA τους μπορούν να ολοκληρώσουν επιτυχώς την ωρίμανσή τους έως και το στάδιο MII. Αυτό οφείλεται στην χαμηλή ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τη μείωση, οι οποίοι προκαλούν αναστολή της ωρίμανσης των ωοκυττάρων όταν οι βλάβες είναι εκτεταμένες, χωρίς να ισχύει το ίδιο για βλάβες περιορισμένης έκτασης, οι οποίες όμως εν δυνάμει μπορούν να προκαλέσουν γονιδιωματική αστάθεια, επηρεάζοντας δυσμενώς το δυναμικό ανάπτυξης των ωοκυττάρων, καθώς και την μετέπειτα εμβρυϊκή ανάπτυξη. Αναφορικά με την επιδιορθωτική ικανότητα των ωοκυττάρων, αυτή είναι περιορισμένη και συντελείται κυρίως μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (homologous recombination, HR). H επιδιόρθωση της βλάβης δεν είναι συνθήκη ούτε αναγκαία, ούτε ικανή για την συνέχιση της ωρίμανσης των ωοκυττάρων, κάτι που σημαίνει πως πλήρως ώριμα ωάρια σταδίου MII μπορούν να φέρουν σημαντικές βλάβες στο DNA. Επίσης, φαίνεται πως τα ωοκύτταρα που φέρουν βλάβες στο DNA είναι πιο πιθανό να παρουσιάζουν μη φυσιολογικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, ακόμα και εάν επιτύχουν ωρίμανση έως το στάδιο MII. Ωστόσο η παρατήρηση αυτή πρέπει να διερευνηθεί προκειμένου να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα. Μελλοντικές μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνηθεί σε βάθος η απόκριση των ωοκυττάρων του ανθρώπου σε βλάβες στο DNA, τόσο σε μοριακό, όσο και σε κυτταρικό επίπεδο.