Bioactive ion-releasing platforms for regenerative medicine applications
Authors:   , Ximenes Carballo Celia 
Published: March 2024

(English) One of the most exploited tissue-engineering-based strategies nowadays is to use scaffolds that allow local stimulation of the targeted tissues, increasing therapy effectiveness while reducing toxicity. Therefore, scaffolds mus! be designed to mimic and stimulate the natural processes that occur in tissues to allow in situ regeneration. For that purpose, researchers often rely on the use of bioactive molecules, or even cells, to stimulate and trigger the regenerative pathways. Although the use of molecules or cells may be efficient, there is a concern regarding their safety, as well as their costs, and scalability.
Macro and microminerals are essential components of human tissues. Most of them, such as calcium and zinc, act as secondary messengers, enabling tissue functionality. Specifically, calcium and zinc modulate the wound healing process through ECM deposition, cell proliferation, and chemotaxis. Calcium and phosphate also affect bone signaling through remodeling and mineralization. On !he other hand, calcium has been reported to enhance angiogenesis, which is highly needed to favor regeneration and tissue integration.
Therefore, sorne researchers have used these ions to develop strategies for tissue engineering. Several ion-loaded hydrogels, metal particles, or metal-organic frameworks had been widely used for treating skin and bone conditions. However, !hose materials may have limited application owing to their fas! release. Bioglasses had also been widely used in biomedical applications, especially bone-healing applications. However, their processability and tuneability may be limited, hampering their suitability for specific applications.
In this thesis, we explored the fabrication of different ion-releasing platforms for wound and bone healing applications. First, we explored the incorporation of ions in polymeric platforms. Although ions could be entrapped within the polymeric particles, the release was fas!, which did not fil our objectives.
Then, we explored the fabrication of a dual-ion releasing system based on calcium and zinc for soft tissue engineering. This system avoided using phosphates, which may induce tissue calcifications in the long term, as well as borates and silicates, which metabolism may be unknown. We obtained a wide range of particles, fully characterized.
lnterestingly, these particles showed increased cell chemotaxis, collagen deposition, increased VEGF production, and modulated differentiation as well as wound contraction when tested in vitro using primary human dermal cells.
Then, a brief study of particle incorporation into chitosan-collagen-based 3D-printed hydrogels was performed to fabricate functional platforms for the local release of ions in chronic wounds. Our results showed that chitosan concentrations needed for proper printability were toxic for dermal cells, hampering their application. Hence, further refinement of the strategies used to fabricate the 3D hydrogels need refinement.
Finally, calcium-phosphate-based particles were incorporated into polylactic acid solutions to produce 3D-printed scaffolds for bone-healing applications. The incorporation of the particles enhanced the angiogenic properties of our scaffolds. In vitro, scaffolds promoted VEGF release by hMSCs. In vivo, they allowed blood vessel infiltration and maturation, enhancing the scaffold-tissue integration.
In conclusion, this thesis has contributed to developing new materials that can successfully be employed as cost-effective alternatives for wound and bone healing in situ advanced therapies where bioactive ions are the main actors in the healing process.

(Español) Una de las estrategias más explotadas actualmente en el campo de la bioingeniería de tejidos se basa en usar materiales que estimulan el tejido localmente, incrementando la efectividad de la terapia y disminuyendo la toxicidad de esta. Para ese propósito, normalmente se usan moléculas bioactivas, o incluso células, para estimular los mecanismos de regeneración. Aunque estas estrategias pueden ser efectivas, hay una preocupación generalizada sobre su seguridad, así como sus elevados costes y su aplicabilidad a gran escala.
Los macro y micronutrientes son componentes esenciales en el organismo humano. Muchos de ellos, como el calcio o el zinc, actúan como moléculas señalizadoras secundarias, permitiendo el funcionamiento del tejido. Específicamente, el calcio y el zinc modulan el proceso de curación de heridas mediante deposición de matriz extracelular, así como migración y proliferación celular. Por otro lado, el calcio y el fosfato afectan la señalización en el hueso mediante su remodelado y mineralización. Además, el calcio ha sido reconocido como un estimulante del proceso angiogénico, altamente necesario para favorecer la regeneración de tejidos.
Teniendo esto en cuenta, los investigadores han usado estos iones en el campo de regeneración de tejidos, a través de hidrogeles, partículas metálicas o MOFs. La principal desventaja de esos materiales es su aplicabilidad limitada debido a su rápida liberación iónica. Los materiales cerámicos como el Bioglass también se han usado para aplicaciones biomédicas, especialmente para regeneración de hueso. Aun así, muchas veces su procesabilidad y modificación puede ser difícil, limitando su aplicación.
En esta tesis, hemos explorado la fabricación de diferentes plataformas liberadoras de iones para su aplicación en la regeneración de hueso y piel. Primeramente, se exploró la incorporación de iones en plataformas poliméricas. Aunque los iones fueron encapsulados con éxito, su liberación era muy rápida.
De esta forma, se exploró la fabricación de un sistema de liberación dual basado en calcio y zinc para su aplicación en regeneración de tejidos blandos. Este sistema evita el uso de fosfatos, el cual puede inducir calcificación de tejido a largo plazo,
así como el uso de silicatos, cuya metabolización no es del todo conocida. Se obtuvieron diferentes tipos de partículas, que se caracterizaron exhaustivamente.
Cuando se testearon in vitro con células primarias de la piel, estas partículas demostraron favorecer la quimiotaxis celular, la producción de colágeno y VEGF, e influenciaron la diferenciación celular y contracción.
Posteriormente, se realizó un estudio preliminar sobre la incorporación de las partículas en un hidrogel impreso en 3D basado en quitosano y colágeno. Nuestros resultados demostraron que las concentraciones de quitosano ideales para realizar una buena impresión de los materiales eran toxicas para las células. Se necesita profundizar en los ensayos y estrategias a seguir para poder fabricar estos materiales.
Finalmente, se usaron partículas basadas en calcio y fosfato incorporadas en disoluciones de ácido poli láctico para producir materiales impresos en 3D. La incorporación de las partículas mejoró las propiedades angiogénicas de los materiales. In vitro, los materiales promovieron la liberación de VEGF producido por células mesenquimales. In vivo, estos permitieron la infiltración de vasos sanguíneos y promovieron su maduración, mejorando la integración material-tejido.
En conclusión, esta tesis ha contribuido en el desarrollo de nuevos materiales donde los iones son los principales efectores en la estimulación del tejido, y que pueden ser empleados como alternativas con buenos niveles de efectividad / coste para su aplicación local en regeneración de hueso y piel.