Χρήση βλαστοκυττάρων στην ανάπτυξη εμβιομηχανικών μοντέλων για την μελέτη φαρμακευτικών παραγόντων στην θεραπεία της εντερικής φλεγμονής
Authors: Κανδηλογιαννάκης Λεωνίδας 
Published: June 2022

ΕισαγωγήΗ Αναγεννητική Ιατρική, ένα διαρκώς αναπτυσσόμενο επιστημονικό πεδίο, διαθέτει ως βασικό της εργαλείο τα ολοδύναμα (pluripotent) βλαστοκύτταρα, με τα εμβρυικά να είναι εν δυνάμει τα πιο κατάλληλα λόγω της ισχυρής ικανότητας αυτό-ανανέωσης και του δυναμικού διαφοροποίησης τους, αλλά να συνοδεύονται επίσης από περιορισμούς, όπως η ανεπαρκής διαθεσιμότητά τους και τα ηθικά διλήμματα που προκύπτουν στην απομόνωση και στη χρήση τους. Σημαντική εφαρμογή των εμβρυικών βλαστοκυττάρων αποτελούν τα οργανίδια, τρισδιάστατες (3D) κυτταρικές δομές που προσομοιάζουν διαφορετικά όργανα, όπως για παράδειγμα το έντερο, την καρδιά ή τον πνεύμονα. Τα Ανθρώπεια Εντερικά Οργανίδια (ΑΕΟ), τα οποία αναπτύσσονται από ολοδύναμα βλαστοκύτταρα με διαδικασίες που αντιγράφουν την οργανογένεση, αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο in vitro πειραματικό μοντέλο με ποικίλες χρήσεις. Η αρχιτεκτονική και η κυτταρική τους σύσταση προσομοιάζει τον εντερικό βλεννογόνο, καθώς διαθέτουν μεσέγχυμα και όλα τα είδη των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και σχηματίζουν τρισδιάστατες (3D) δομές που απαρτίζονται από κρύπτες και λάχνες. Η σύνθετη κυτταρική τους σύσταση προσφέρει πλεονεκτήματα στις in vitro μελέτες σε σχέση με τις κλασσικές κυτταροκαλλιέργειες και η ανθρώπεια προέλευσή τους πλεονεκτήματα σε σχέση με τα ζωικά μοντέλα, γεγονός που τα καθιστά πολύτιμο εργαλείο σε μελέτες εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. Παρόλα αυτά, κυρίως λόγω της πολυπλοκότητας τους, παράγοντες, που σχετίζονται με την χρήση τους σε in vitro μελέτες, δεν έχουν διερευνηθεί επαρκώς. Η δυνατότητα χρήσης εναλλακτικών πηγών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων αποτελεί κυρίαρχο στόχο της αναγεννητικής ιατρικής. Η ανακάλυψη των πολύ μικρών εμβρυϊκού τύπου βλαστοκυττάρων (Very Small Embryonic-like - VSELs), κύτταρα που εκφράζουν εμβρυϊκούς ολοδύναμους δείκτες και μπορούν να βρεθούν σε ιστούς ενηλίκων, προσπάθησε να αντιμετωπίσει τους περιορισμούς που φέρει η χρήση των εμβρυικών βλαστοκυττάρων. Ωστόσο, η τεχνική απομόνωσής τους αποτέλεσε πρόκληση για πολλές ερευνητικές ομάδες, λόγω του μικρού μεγέθους τους και του φαινομενικά μικρού αριθμού τους, με αποτέλεσμα την περιορισμένη αξιοποίησή τους. Τα VSELs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε μία πληθώρα εφαρμογών της Εμβιομηχανικής, όπως για την ανάπτυξη αυτόλογων σύνθετων τρισδιάστατων εντερικών δομών με σκοπό τη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η χρήση βλαστοκυττάρων για την δημιουργία ανθρώπειων εντερικών οργανιδίων (Human Intestinal Organoids - HIOs), με στόχο την εφαρμογή τους στην μελέτη φαρμακευτικών ουσιών για την αντιμετώπιση της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης και στην ανάπτυξη βασικών δομών για την πιθανή δημιουργία τεχνητών μοσχευμάτων. Συγκεκριμένα, κατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στόχος ήταν η ανάπτυξη Ανθρώπειων Εντερικών Οργανιδίων (ΑΕΟ) από την κυτταρική σειρά εμβρυικών βλαστοκυττάρων Η1 και η ταυτοποίηση των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξής τους. Επιπλέον, στόχος ήταν η μελέτη της έκφρασης ινωτικών και μεσεγχυματικών δεικτών κατά τη διαδικασία ωρίμανσής τους και της επίδρασης των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών, IL-1α και TNF-α, στην έκφραση ινωτικών και φλεγμονωδών μεσολαβητών στα ΑΕΟ σε διαφορετικά στάδια καλλιέργειάς τους. Κατά το δεύτερο σκέλος, στόχος ήταν η απομόνωση βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα, η ταυτοποίηση τους με ποικίλους δείκτες εμβρυικών, αιμοποιητικών και μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων και η μελέτη της πολυδυναμικότητάς τους, ελέγχοντας την ικανότητά τους να διαφοροποιηθούν προς άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς.Υλικά και ΜέθοδοιΚατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε καλλιέργεια της εμβρυικής κυτταροσειράς βλαστοκυττάρων Η1 και διαφοροποίηση αυτής προς ΑΕΟ με την χρήση εμπορικά διαθέσιμου κιτ. Τα ΑΕΟ χαρακτηρίστηκαν με ανοσοφθορισμό σε όλα τα στάδια διαφοροποίησης. Προκειμένου να εξεταστεί η εξέλιξή τους, συγκρίναμε την mRNA έκφραση ινωτικών και μεσεγχυματικών δεικτών στις γενεές 1-10. Προκειμένου να εξεταστεί η λειτουργικότητά τους, ΑΕΟ από διαφορετικές γενεές διεγέρθηκαν με 5ng/ml IL-1α και 50ng/ml TNF-α για 12 ή 48 ώρες: στο τέλος της 12ωρης επώασης, συλλέχθηκε το ολικό RNA και εξετάστηκε η ινωτική mRNA έκφραση των κολλαγόνου τύπου Ι, III, φιμπρονεκτίνης, Tissue Factor (TF) και α-SMA, η φλεγμονώδης mRNA έκφραση των χημειοκινών CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 και CCL20, καθώς και η mRNA έκφραση των tight junction πρωτεϊνών OCLN, CLDN1, ZO1 και JAMA με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου [reverse transcription quantitative (rtq-PCR)]. Στο τέλος της 48ωρης επώασης, συλλέχθηκαν τα καλλιεργητικά υπερκείμενα και εξετάστηκε η φλεγμονώδης πρωτεϊνική έκφραση των χημειοκινών CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 και CCL20 με Ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA). Κατά το δεύτερο σκέλος, έγινε απομόνωση μικρών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα (ΜΒΑ), τα οποία αρχικά μετρήθηκαν και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν με δείκτες εμβρυϊκής, μεσεγχυματικής ή αιμοποιητικής προέλευσης χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό. Επιπλέον, έγινε διαφοροποίηση των μικρών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων προς κύτταρα της γενεαλογίας του μεσοδέρματος, και συγκεκριμένα προς κύτταρα του λιπώδους ιστού, των οστών και του χόνδρου, με την χρήση εμπορικά διαθέσιμων αντιδραστηρίων.ΑποτελέσματαΚατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε καλλιέργεια των εμβρυικών βλαστοκυττάρων Η1 και δημιουργία βιοτράπεζας αυτών. Στη συνέχεια, με την χρήση εξειδικευμένων αυξητικών παραγόντων έγινε διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων Η1, που οδήγησε σε επιτυχή ανάπτυξη οργανιδίων. Ταυτοποίηση των οργανιδίων αυτών έδειξε ότι επρόκειτο για εντερικά οργανίδια (ΑΕΟ), που περιείχαν επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κυτταρικά στοιχεία. Η αξιολόγηση της έκφρασης μεσεγχυματικών δεικτών, καθώς και δεικτών της εξωκυττάριας μήτρας (Extracellular Matrix - ECM), έδειξε ότι τα ΑΕΟ έχουν ένα επαρκώς ανεπτυγμένο μεσεγχυματικό στοιχείο, το οποίο σταδιακά μειώνεται μέσω των γενεών καλλιέργειας, ενώ το επιθηλιακό στοιχείο παρέμενε σταθερό. Συγκεκριμένα, υπήρχε υψηλή mRNA έκφραση του CD90, του κολλαγόνου τύπου Ι, τύπου III και της φιμπρονεκτίνης στις πρώιμες γενεές, που αντανακλά την ύπαρξη μεσεγχυματικών κυττάρων, η οποία όμως σταδιακά μειώθηκε στις όψιμες γενεές. Οι προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α και TNF-α επήγαγαν την mRNA έκφραση της φιμπρονεκτίνης, του κολλαγόνου τύπου Ι και III, του TF και της α-SMA κυρίως σε πρώιμες γενεές. Ομοίως, παρατηρήθηκαν ισχυρές χημειοκινικές αποκρίσεις (CXCL10, CXCL1, CCL2, CXCL8 και CCL20) σε mRNA και πρωτεϊνικό επίπεδο σε πρώιμες αλλά όχι όψιμες γενεές. Αντίθετα, οι tight junction πρωτεΐνες, CLDN1 και JAMA, ανταποκρίθηκαν στη φλεγμονώδη διέγερση ανεξάρτητα από τη γενεά των ΑΕΟ. Οι μελέτες αυτές επιβεβαίωσαν την λειτουργικότητα των ΑΕΟ, που τα καθιστά εργαλείο στη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης.Κατά το δεύτερο σκέλος, έγινε επιτυχής απομόνωση μικρών βλαστοκυττάρων αίματος (ΜΒΑ), με την χρήση μηχανικών τεχνικών, που είχαν σαν αποτέλεσμα υψηλότερη απόδοση σε σχέση με τις αναφερόμενες στην τρέχουσα βιβλιογραφία. Τα ΜΒΑ εξέφραζαν ολοδύναμους εμβρυονικούς δείκτες, όπως Nanog, SSEA-3 και τους παράγοντες Yamanaka (SOX-2, Oct-4, cMyc και KLF4). Επιπλέον, ένα κλάσμα τους εξέφραζε αιμοποιητικούς δείκτες, όπως το CD45 και το CD90, και/ή μεσεγχυματικούς, όπως το CD29, το CD105 και το PTH1R, υποδηλώνοντας ότι τα ΜΒΑ είναι ένας μεικτός πολυδύναμος πληθυσμός βλαστοκυττάρων. Πιλοτικές δοκιμασίες λειτουργικότητας, που ακολούθησαν, έδειξαν ότι τα ΜΒΑ μπορούν να διαφοροποιηθούν προς τη γενεαλογία του μεσοδέρματος, όπως δημιουργία κυττάρων του λιπώδους ιστού, των οστών και του χόνδρου.ΣυμπεράσματαΣυμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει την επιτυχή ανάπτυξη ΑΕΟ από εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, με τα ΑΕΟ να περιέχουν λειτουργικά επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα, τα δεύτερα κυρίως κατά τη διάρκεια πρώιμων γενεών, καθιστώντας τα καινοτόμο εργαλείο στη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. Επιπλέον, το μοντέλο των ΑΕΟ προτείνεται για τη μελέτη επιθηλιακών-μεσεγχυματικών αλληλεπιδράσεων σε πρώιμες γενεές όταν υπάρχει έντονη έκφραση του μεσεγχυματικού στοιχείου. Τέλος, ανέδειξε μια νέα και εύκολη διαδικασία απομόνωσης μικρών βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα, που αποδίδει έναν άφθονο πληθυσμό με χαρακτηριστικά πολυδυναμίας, ο οποίος δύναται να διαφοροποιηθεί προς άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς και πιθανώς να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο για την ανάπτυξη αυτόλογων οργανιδίων.