Ο ρόλος του νευρογενετικού μορίου ΒΜ88/Cend 1 στον καθορισμό της μοίρας των Νευρικών Βλαστικών Κυττάρων σε φυσιολογικές συνθήκες και έπειτα από τραυματισμό του ΚΝΣ
Authors: Αραβαντινού-Φατώρου Αικατερίνη 
Published: August 2021

Η εγκεφαλική βλάβη αποτελεί ένα εξαιρετικά σημαντικό πρόβλημα της δημόσιας υγείας, ενώ στις περισσότερες περιπτώσεις εγκεφαλικού τραυματισμού, η αποκατάσταση δεν είναι εφικτή. Σε όλες τις περιπτώσεις εγκεφαλικής βλάβης πραγματοποιείται ενεργοποίηση του κυτταρικού πληθυσμού των αστρογλοιακών κυττάρων του ΚΝΣ, τα οποία, μεταξύ άλλων, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απάντηση του εγκεφάλου. Μετά από τραυματισμό του εγκεφάλου τα αστροκύτταρα αντιδρούν μέσω πολλαπλών και πολύπλοκων αλλαγών στην μορφολογία τους, στη έκφραση γονιδίων και στην ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, που τελικά καταλήγουν στην δημιουργία του αστρογλοιακού φραγμού. Τελευταίες ερευνητικές μελέτες υποδεικνύουν ότι παράλληλα με την ενεργοποίηση για τη δημιουργία του αστρογλοιακού φραγμού, τα αστροκύτταρα διαθέτουν δυναμικό επαναπρογραμματισμού τους προς διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους του ΚΝΣ έπειτα από εγκεφαλική βλάβη. Προς αυτή την κατεύθυνση, νεώτερα πειραματικά δεδομένα in vitro επαναπρογραμματισμού αστρογλοιακών κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού προς νευρογένεση και σχηματισμό λειτουργικών νευρώνων ικανών να δημιουργούν συνάψεις, έχει ανοίξει ένα νέο πεδίο έρευνας στο χώρο της αναγεννητικής ιατρικής. Οι μελέτες αυτές υποδηλώνουν ότι ενεργοποιημένα αστρογλοιακά κύτταρα απομονωμένα ακόμη και από μη-νευρογενετικές περιοχές του ενήλικου εγκεφάλου μετά από τοπικό τραυματισμό έχουν το δυναμικό να επανα-προγραμματιστούν in vitro δίνοντας νευρώνες ικανούς να δημιουργούν συνάψεις μετά από υπερέκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων γνωστών στην προώθηση της νευρογένεσης κατά την εμβρυική ανάπτυξη.Ένας καλά μελετημένος μεταγραφικός παράγοντας που επάγει τη νευρογένεση σε μελέτες υπερέκφρασης του σε ενεργοποιημένα αστροκύτταρα είναι η bHLH προ-νευρική πρωτεΐνη Neurogenin2, η οποία επάγει τον σχηματισμό γλουταματεργικών και ντοπαμινεργικών νευρώνων in vitro. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηριού μας έχουν δείξει ότι η νευρογενετική πρωτεΐνη Cend1 συμμετέχει στο μονοπάτι της νευρωνικής διαφοροποίησης, μέσω ενεργοποίησής της από τα bHLH προ-νευρικά γονίδια Neurogenin 1 και 2. Επιπλέον, υπερέκφραση του Cend1 σε νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα οδηγεί σε έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίησή τους ειδικά προς το νευρωνικό φαινότυπο. Τέλος, πειράματα μεταμόσχευσης νευρικών βλαστικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη Cend1 σε ένα ζωικό μοντέλο τραυματισμού του εγκεφαλικού φλοιού ποντικού, έχουν δείξει ότι υψηλή έκφραση της Cend1 στα μεταμοσχευμένα κύτταρα οδηγεί παράλληλα με την επαγωγή της νευρωνικής διαφοροποίησης τους σε μείωση της αστρογλοίωσης του γειτονικού νευροεκφυλισμένου εγκεφαλικού ιστού. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα παραπάνω δεδομένα, βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του δυναμικού νευρωνικού επαναπρογραμματισμού του μορίου Cend1 σε συνδυασμό με την Neurogenin 2 (Neurog2) και η αξιολόγηση της συνεργιστικής δράσης των δυο μορίων στον κατευθείαν επανα-προγραμματισμό των αστροκυττάρων, αλλά και γενεαλογικά πιο απομακρυσμένων από το νευρικό σύστημα κυτταρικών τύπων, προς τους βασικούς υπότυπους νευρώνων που είναι παρόντες στο φλοιό. Προς αυτή την κατεύθυνση η μελέτη του δυναμικού επανα-προγραμματισμού των δύο νευρογενετικών μορίων πραγματοποιήθηκε in vitro σε δύο κυτταρικά συστήματα: α) σε καθαρές καλλιέργειες αστροκυττάρων προερχόμενων από εγκεφαλικό φλοιό ποντικών ηλικίας 5 ημερών και β) σε καλλιέργειες εμβρυικών ινοβλαστών ποντικού, που αποτελούν ένα κυτταρικό τύπο γενεαλογικά απομακρυσμένο από το νευρικό σύστημα.Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι υπερέκφραση του Cend1, της Neurog2 ή ταυτόχρονα και των δύο μαζί σε πρωτογενείς καλλιέργειες αστροκυττάρων οδηγεί στη δημιουργία διαφοροποιημένων Gaba-εργικών νευρώνων μετά από υπερέκφραση της Cend1 και ντοπαμινεργικών ή γλουταματεργικών νευρώνων έπειτα από υπερέκφραση της Neurog2. Επίσης πειράματα μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων για διάστημα 1 βδομάδας έδειξαν ότι μετά από υπερέκταση της Cend1, τα αστροκύτταρα υφίστανται 2-3 διαιρέσεις πριν δια-διαφοροποιηθούν προς νευρώνες, σε αντίθεση με αυτά που υπερεκφράζουν την Neurog2, τα οποία διαφοροποιούνται κατευθείαν προς νευρώνες, χωρίς να παρεμβληθεί πολλαπλασιασμός. Προς έκπληξή μας, στις διπλά μετασχηματισμένες καλλιέργειες με Cend1 και Neurog2 εμφανίζονται τρισδιάστατες σφαίρες με υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναμικό. Τα κύτταρα αυτά, όταν καλλιεργούνται παρουσία υλικού νευρικών βλαστικών κυττάρων (ΝΒΚ), αναπτύσσονται ως αιρούμενες νευρόσφαιρες, ενώ απουσία των αυξητικών παραγόντων, διαφοροποιούνται προς τους τρεις κύριους τύπους της νευρωνικής γενεαλογίας, δηλαδή νευρώνες, αστροκύτταρα και ολιγοδενδροκύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι διαθέτουν δυναμικό νευρικών βλαστικών κυττάρων. Θέλοντας να διερευνήσουμε εάν το δυναμικό επαναπρογραμματισμού των Cend1 και Neurog2 νευρογενετικών πρωτεϊνών είναι ικανό να οδηγήσει σε ευρύτερη δια-διαφοροποίηση και συγκεκριμένα δια-διαφοροποίηση εμβρυικών ινοβλαστών προς νευρώνες, προχωρήσαμε σε πειράματα επαναπρογραμματισμού τους με τους ιικούς φορείς που υπερεκφράζουν τις Cend1 και Neurog2 πρωτεΐνες. Στις μετασχηματισμένες καλλιέργειες διαπιστώσαμε την παρουσία διαφοροποιημένων ηλεκτροφυσιολογικά ενεργών νευρώνων, οι οποίοι εκφράζουν και μάρτυρες υποτύπων νευρώνων (GABA, TH), σε ποσοστό που προσεγγίζει το 60% του συνολικού αριθμού των κυττάρων στις διπλά επιμολυσμένες καλλιέργειες.Για τη διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού δράσης των δύο μορίων στον επαναπρογραμματισμό των αστροκυττάρων αρχικά προσδιορίσαμε τα επίπεδα έκφρασης των μορίων Cend1 και Neurog2 είτε σε επίπεδο πρωτεΐνης ανοσοϊστοχημικά είτε σε επίπεδο mRNA με RT-PCR. Η ανάλυση που ακολούθησε αποκάλυψε μία θετικά ανατροφοδοτούμενη λούπα μεταξύ των δύο αυτών μορίων, ενώ η ενδογενής αποσιώπηση του Cend1 αποκάλυψε ότι η Cend1 είναι απαραίτητη για την ολοκλήρωση της νευρογενετικής δράσης της Neurog2. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων από τα PCR-arrays υποδηλώνει την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt-β-catenin ειδικά στις διπλά επιμολυσμένες καλλιέργειες, γεγονός το οποίο εξηγεί την εμφάνιση του φαινοτύπου των αιωρούμενων νευροσφαιρών, καθώς υποδηλώνει ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση των 2 μορίων σηματοδοτεί την επαγωγή του νευρικού βλαστικού χαρακτήρα τους και της πολλαπλασιαστικής τους ικανότητας. Εν κατακλείδι τα δεδομένα μας προτείνουν την ύπαρξη κοινών μηχανισμών νευρογενετικού επαναπρογραμματισμού μεταξύ των μορίων CEND1 και NEUROG2 αναδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο του CEND1 στο μονοπάτι της NEUROG2 κατά τον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων προς νευρώνες.