Τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας κυττάρων σε κολλαγόνο τύπου Ι (3-Dinensional collagen system) και ανάλυση της αντίδρασης των κυττάρων του περριριζίου στα οστεοενσωματούμενα εμφυτεύματα στην οδοντιατρική επιστήμη
Authors: Μάμαλης Αναστάσιος 
Published: January 2014

Αντικείμενο πληθώρας ερευνητικών μελετών κυρίως σε επίπεδο in vitro έχουν επιχειρήσει να διελευκάνουν την ακριβή επίδραση των επιφανειακών χαρακτηριστικών των οστεοενσωματούμενων εμφυτευμάτων τιτανίου στα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των κυτταρικών στοιχείων που καθορίζουν τη βιολογική διαδικασία της οστεοενσωμάτωσης. Κύριος σκοπός της παρούσας, in vitro, έρευνας ήταν η μελέτη της διαφοροποίησης των κυττάρων του περιρριζίου σε μονοδιάστατα και σε τρισδιάστατα συστήματα καλλιέργειας κολλαγόνου και η αξιολόγηση της επίδρασης της μηχανικής επεξεργασίας (επιφάνεια SMOOTH), της χημικής επεξεργασίας με οξύ (επιφάνεια OSSEOTITE), της επεξεργασίας με επίστρωση υδροξυαπατίτη (επιφάνεια HA), της ταυτόχρονης επεξεργασίας με αμμοβολή και οξύ (επιφάνεια SLA) και της προσθήκης αερίου αζώτου (N₂) και ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (NaCl) σε αμμοβολημένες και χημικά επεξεργασμένες επιφάνειες τιτανίου(επιφάνεια SLACTIVE), στην αρχική προσκόλληση, στον πολλαπλασιασμό και στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση κυττάρων του ανθρώπινου περριριζίου. Υλικά για την παρούσα μελέτη αποτέλεσαν: ανθρώπινα περιρριζικά κύτταρα από 3 διαφορετικές κυτταρικές σειρές που προήλθαν από 3 προγομφίους άνω γνάθου, υγιών και νεαρών ατόμων, ελεύθερων τερηδόνας και περιοδοντικής νόσου, οι οποίοι εξήχθησαν για ορθοδοντικούς λόγους, εμφυτεύματα Τιτανίου στα οποία η εξωτερική επιφάνεια τους έχει υποστεί μηχανική (αμμοβολή), χημική επεξεργασία (οξύ), επίστρωση με υδροξυαπατίτη και προσθήκη ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (NaCl)/αερίου (N₂). Η μελέτη της διαφοροποίησης των κυττάρων στο μονοδιάστατο και τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, Η µέτρηση των κυττάρων έγινε µε τη µέθοδο του αποκλεισµού της χρωστικής κυανούν του τροπανίου (trypan blue dye exclusion assay) από τα ζωντανά κύτταρα. Η αξιολόγηση της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης έγινε με φωτομετρική μέθοδο ενώ η αξιολόγηση της έκφρασης οστεοκαλσίνης πραγματοποιήθηκε μέσω μιας ανοσολογικής δοκιμής χημειοφωταύγειας. Ενώ η έκφραση του παράγοντα μεταγραφής cbfa-1 έλαβε χώρα με την μέθοδο της σχετικής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης.Κατά την καλλιέργεια των κυττάρων του περιρριζίου παρατηρείται έκφραση βιμεντίνης (φαινοτυπικός δείκτης που αποδεικνύει μεσεγχυματική προέλευση των κυττάρων) στο μονόστιβο σύστημα καλλιέργειας και διατήρηση της έκφρασης στο τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας από ίνες κολλαγόνου. Ενώ παρατηρείται έκφραση α-Ακτίνης του Λείου Μυός (φαινοτυπικός δείκτης που αποδεικνύει ινοβλαστικό χαρακτήρα των κυττάρων) στο μονόστιβο σύστημα καλλιέργειας και απουσία διατήρησης της έκφρασης στο τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας από ίνες κολλαγόνου. Όσον αφορά την αρχική προσκόλληση των κυττάρων δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιφανειών. Αντίθετα, την 3η, την 12η και την 30η ημέρα της επώασης, η επιφάνεια SLActive υπερτερούσε σε βαθμό στατιστικά σημαντικό έναντι της SLA, HA, OSS, SMOOTH στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η έκφραση της Αλκαλικής Φωσφατάσης ως δείκτη οστεοβλαστικής διαφοροποίησης βρέθηκε να είναι μεγαλύτερη σε βαθμό στατιστικά σημαντικό για τις ημέρες 1, 7 και 30 του πειράματος με την επιφάνεια SLActive να υπερτερεί, αντίθετα δεν υπήρξε διαφορά για τις ημέρες 3 και 12. Η έκφραση Οστεοκαλσίνης ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη και μη στατιστικά επεξεργάσιμη. Η σχετική έκφραση του mRNA του παράγοντα cbfa-1 παρουσία του εμφυτεύματος SLACTIVE αυξήθηκε σημαντικά (>50%) σε σύγκριση με την αντίστοιχη σχετική έκφραση του mRNA του παράγοντα cbfa-1 παρουσία του εμφυτεύματος SLA. Συμπερασματικά, θα μπορούσε να λεχθεί ότι τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής καθιστούν σαφή την υπεροχή της SLActive επιφάνειας όσον αφορά την κυτταρική συμβατότητα της και την ικανότητα να επάγει τον οστεοβλαστικό φαινότυπο των κύτταρών του περιρριζίου.