Δομική και λειτουργική ανάλυση των πρωτεϊνών BRCA1 και RAD51 σε βιοχημικό, βιοφυσικό και κυτταρικό επίπεδο στο σύστημα καρκίνου του μαστού - ωοθηκών
Authors: Δρίκος Ιωάννης 
Published: January 2014

H ogkokatastaltikή πρωτεΐνη BRCA1 συμμετέχει στις διαδικασίες επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού καθώς και στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, αλληλεπιδρώντας με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών όπως οι BACH1, CtIP, p53 kai Rad51. Metallάξεις του καρβοξυτελικού άκρου της BRCA1, οι οποίες εντοπίζονται σε ασθενείς, επηρεάζουν την ικανότητα αλληλεπίδρασης της BRCA1 με τις πρωτεΐνες BACH1 και CtIP. Stόχος της παρούσας εργασίας είναι ο προσδιορισμός της επίδρασης σημειακών μεταλλάξεων στη δομή και την λειτουργία του BRCA1-BRCT. Για το λόγο αυτό, το καρβοξυτελικό άκρο φυσικού τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε προκαρυωτικούς φορείς έκφρασης. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παράχθηκαν σε σταθερή και καθαρή μορφή. Βιοφυσική ανάλυση της δευτεροταγούς δομής και η θερμική σταθερότητα των τμημάτων BRCT, τόσο φυσικού τύπου όσο και των μεταλλαγμένων, πραγματοποιήθηκε με χρήση φασματογράφου κυκλικού διχρωϊσμού (CD) και μικροθερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (DSC). Η ικανότητα αλληλεπίδρασης των BRCA1-BRCTs με συνθετικά φωσφοπεπτίδια,, μελετήθηκε με μικροθερμιδομετρία μοριακής τιτλοδότησης (ITC). Τα αποτελέσματα βιοφυσικής ανάλυσης των μεταλλαγμένων καρβοξυτελικών τμημάτων BRCA1-BRCT (V1696L, M1652I, M1775K, M1783T, V1809F, P1812A) fanerώνουν την αλλαγή στην σταθερότητα του μορίου και την ικανότητα αλληλεπίδρασης με τα συνθετικά φωσφοπεπτίδια (pBACH1, pCtIP). Aπό την θερμοδυναμική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων του φυσικού τύπου και των μεταλλαγμένων BRCA1-BRCT sumπeraίνουμε: (a) thn sύνδεση του BRCT-wt me ta πeπtίδια pBACH1 kai pCtIP, (b) thn aπώλεια αλληλεπίδρασης των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών, (γ) οι μεταλλάξεις M1783T, P1812A sundέονται και με τα δύο πεπτίδια, (δ) η μετάλλαξη V1696L sundέεται μόνο με το pBACH1, (e) oi metallάξεις M1652I, M1775K, V1809F emfanίζουν απώλεια της αλληλεπίδρασης με τα δύο πεπτίδια, στ) το φυσικού τύπου καρβοξυτελικό άκρο συνδέεται ισχυρότερα με το pBACH1 se sύγκριση με το pCtIP. Η δευτεροταγής δομή όλων των μεταλλαγμένων τμημάτων, όπως προσδιορίστηκε με την χρήση της τεχνικής κυκλικού διχρωϊσμού, δεν εμφανίζει διαφοροποίηση σε σύγκριση με αυτή του φυσικού τύπου. Sthn πrosπάθεια μας να προσδιορίσουμε την επίδραση των συγκεκριμένων παθογόνων μεταλλάξεων του καρβοξυτελικού άκρου στην ενδοκυτταρική τοπολογία της BRCA1, dhmiourgήθηκαν συζευγμένα μεταλλάγματα του καρβοξυτελικού άκρου της πρωτεΐνης BRCA1 me GFP kai eisacqήκαν σε κύτταρα MCF7. H anάλυση της ενδοκυτταρικής τοπολογίας των GFP-BRCA1-BRCT’s kaqώς και των p53 kai Rad51, πragmatoπoiήθηκε με μικροσκοπία ανάστροφου φθορισμού. Σε in vivo πeirάματα σε κυτταρική σειρά MCF7, πarathrήθηκε shmantikή αλλαγή στην ενδοκυτταρική τοπολογία της ΒRCA1 kai ston endokuttarikό συνεντοπισμό σε σύγκριση με τις πρωτεΐνες p53, Rad51. Ta exacqέντα αποτελέσματα υποδεικνύουν την επίδραση των παθογόνων μεταλλάξεων στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό των μεταλλαγμένων μορίων και δύναται να προσδιορίζουν την αποσταθεροποιητική επίδραση παθογόνων σημειακών μεταλλάξεων του karboxutelikoύ άκρου στην δομή και την λειτουργία thV πrwteΐνης BRCA1.