Λεπτομερής ενζυμικός χαρακτηρισμός μιας νέας ανθρώπινης ριβονουκλεάσης
Authors: Κυρίτση Μαριάννα 
Published: September 2021

Ο μεταβολισμός του RNA αποτελεί ένα θεμελιώδες και αναπόσπαστο κομμάτι τηςσωστής κυτταρικής λειτουργίας. Είναι γεγονός ότι μια πλειάδα μηχανισμών καικυτταρικών παραγόντων εξυπηρετούν την επιτήρηση και άμεση απομάκρυνση τωνελαττωματικών RNA μορίων, ενώ ταυτόχρονα ελέγχουν τον ρυθμό αποικοδόμησηςτων mRNAs συμβάλλοντας έτσι καθοριστικά στη συνολική ρύθμιση της γονιδιακήςέκφρασης. Πέρα όμως από την αποικοδόμηση, εξίσου σημαντικές είναι και οιαντιδράσεις ωρίμανσης-τροποποίησης που υφίστανται όλα ανεξαιρέτως τα RNAμόρια προκειμένου να αποκτήσουν την in vivo λειτουργικότητα τους, καθώς και οιμηχανισμοί βιογένεσης της πλειάδας των τάξεων μικρών RNAs. Για την κατανόησηαυτού του ιδιαίτερα σημαντικού αλλά και πολύπλοκου κομματιού του κυτταρικούμεταβολισμού καθίσταται απαραίτητη η ενδελεχής μελέτη των ενζύμων πουκαταλύουν τις αντιδράσεις διάσπασης του RNA, δηλαδή των ριβονουκλεασών. Οιριβονουκλεάσες αποτελούν μια από τις αρχαιότερες και πιο ετερογενείς ομάδεςενζύμων, που εξαπλώνεται σήμερα σε όλους ανεξαρτήτως τους οργανισμούς.Από το εργαστήριο μας έχει πρόσφατα εγκαθιδρυθεί και μελετάται συστηματικά η οικογένεια των ριβονουκλεασών κ. Πρόκειται για μια ορθόλογη οικογένειαπρωτεϊνών που αντιπροσωπεύεται σε ένα πολύ μεγάλο εύρος μεταζώων καιεξαπλώνεται από το φύλο των Κνιδοζώων έως την τάξη των θηλαστικών. Οιπρωτεϊνικοί αντιπρόσωποι της οικογένειας παρουσιάζουν ιδιαίτερα αυξημένησυντηρητικότητα, ενώ έχουν μικρό μέγεθος, της τάξης των 85-105 αμινοξικώνκαταλοίπων. Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες του εργαστηρίου μας εστιάζονται στονανθρώπινο αντιπρόσωπο. Το γονίδιο της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ εντοπίζεταιστο χρωμόσωμα 17, διατηρεί το χαρακτηριστικό πρότυπο οργάνωσης των γονιδίωντης οικογένειας, αποτελούμενο από τρία εξώνια που διακόπτονται από δύο εσώνια,ενώ εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ιστούς και τα αναπτυξιακά στάδια. Η πρωτεΐνηπου κωδικοποιείται αποτελείται από 98 αμινοξέα και εμφανίζειενδοριβονουκλεολυτική ενεργότητα.Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει κινηθεί σε δύο κατευθύνσεις. Η πρώτηπεριλαμβάνει την πληρέστερη ενζυμική μελέτη της human RNase κ, ενώ η δεύτερητον προσδιορισμό αμινοξικών καταλοίπων που συμβάλλουν στη λειτουργικότητα του ενζύμου.Στα πλαίσια του πρώτου στόχου, η τροποποίηση του πρωτοκόλλου παραγωγής τηςRNase κ στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris αλλά και του χρωματογραφικού καθαρισμού της, οδήγησε στην ανάκτηση μεγαλύτερωνποσοτήτων ανασυνδυασμένου ενζύμου σε πλήρως ομογενή μορφή.Το ένζυμο που προέκυψε από το νέο πρωτόκολλο έκφρασης-καθαρισμούχρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της υποστρωματικής εξειδίκευσης τηςανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, έναντι μιας σειράς συνθετικών RNA και RNA-DNAυποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων προσδιορισμού της ενζυμικήςενεργότητας έναντι ενός μονόκλωνου 30μερούς RNA υποστρώματος, το οποίοπεριλαμβάνει όλους τους διαφορετικούς φωσφοδιεστερικούς δεσμούς, έδειξαν ότι ηhuman RNase κ υδρολύει επιλεκτικά και κατά σειρά προτίμησης τους ApG > ApU >UpA > UpU δεσμούς. Το παραπάνω πρότυπο υποστρωματικής εξειδίκευσηςσυμφωνεί με τα αποτελέσματα προηγούμενων πειραμάτων του εργαστηρίου μας, σταοποία χρησιμοποιήθηκε ανασυνδυασμένο ένζυμο μικρότερου βαθμού καθαρότητας,που παράγεται από την εφαρμογή διαφορετικού πρωτοκόλλου έκφρασης-καθαρισμού.Σε συνέχεια των πειραμάτων αυτών, ακολούθησε η χρήση μιας σειράςδιαφορετικών οκτανουκλεοτιδίων του τύπου 5΄-dΤdΤdΤrAdNdΤdΤdΤ-3΄ και 5΄-dΝdΝdΝrAdGdNdNdN-3΄, που περιέχουν μια μοναδική θέση υδρόλυσης από τηνανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Η σύγκριση της εξειδίκευσης του ανθρώπινου ενζύμουως προς τα διαφορετικά υποστρώματα αποκάλυψε ότι: Η ενεργότητα της RNase κ επηρεάζεται από το νουκλεοτίδιο που ακολουθείτην αδενίνη στον προς διάσπαση ApN δεσμό, αφού το ένζυμο διασπά κατάσειρά προτίμησης τους δεσμούς ApG> ApT> ApC-ApA. Επιπλέον, η ενεργότητα της RNase κ επηρεάζεται από την αλληλουχία τωνβάσεων εκατέρωθεν του δεσμού υδρόλυσης. Συγκεκριμένα, το ανθρώπινοένζυμο εμφανίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα που φέρεινουκλεοτίδια θυμίνης εκατέρωθεν του ApG δεσμού, υδρολύει σε αρκετάμικρότερο βαθμό τα υποστρώματα με νουκλεοτίδια γουανίνης και κυτοσίνηςστις αντίστοιχες θέσεις, ενώ δεν μπορεί να διασπάσει τον φωσφοδιεστερικόδεσμό όταν εκατέρωθεν αυτού υπάρχουν κατάλοιπα αδενίνης.Οι ριβονουκλεάσες της οικογένειας κ περιλαμβάνουν 3-5 κατάλουπα κυστεϊνών,εκ των οποίων οι κυστεΐνες 6, 14 και 69 (αρίθμηση με βάση τον ανθρώπινο αντιπρόσωπο) είναι απόλυτα συντηρημένες. Στα πλαίσια της προσπάθειαςεντοπισμού των αμινοξικών καταλοίπων που συμβάλλουν στη λειτουργικότητα του ενζύμου, αρχικά διερευνήθηκε λεπτομερώς ο ρόλος των 5 καταλοίπων κυστεΐνης τηςανθρώπινης RNase κ. Η μελέτη της επίδρασης αλκυλιωτικών και αναγωγικώνπαραγόντων στην ενεργότητα του ενζύμου, σε συνδυασμό με την μελέτη τηςηλεκτροφορητικής κινητικότητας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης υπό αναγωγικέςκαι μη συνθήκες, αποκάλυψαν ότι η ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ δεν σχηματίζειομοδιμερή μέσω δισουλφιδικών γεφυρών, ενώ τα κατάλοιπα κυστεΐνης δενεμπλέκονται στην καταλυτική της ενεργότητα, αλλά συμμετέχουν στον σχηματισμόενός τουλάχιστον ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού.Ο ρόλος του κάθε καταλοίπου κυστεΐνης στη στερεοδιαμόρφωση-ενεργότητα τουενζύμου διερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες μορφές τηςανθρώπινης RNάσης κ, που προέκυψαν από την αντικατάσταση του κάθε καταλοίπουκυστεΐνης με σερίνη. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που προέκυψαν μέσω τηςέκφρασης στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris, καθαρίστηκανσε ομογενή μορφή και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα προσδιορισμού τηςριβονουκλεολυτικής ενεργότητας καθώς και σε πειράματα ανάλυσης σε πηκτώματαSDS-PAGE υπό αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών αποκάλυψαν ότι τα κατάλοιπα Cys7, Cys14 και Cys85 δενσυμμετέχουν στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών και δεν επηρεάζουν τηνενζυμική ενεργότητα της ανθρώπινης RNάσης κ. Αντίθετα, η αντικατάσταση τωνκαταλοίπων Cys6 ή Cys69 με σερίνη επηρεάζει την ηλεκτροφορητική συμπεριφοράτης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης απουσία και παρουσία β-μερκαπτοαιθανόλης καιοδηγεί σε ολοκληρωτική απώλεια της ενζυμικής ενεργότητας, υποδεικνύοντας ότι τακατάλοιπα αυτά συμμετέχουν στο σχηματισμό ενός ενδομοριακού δισουλφιδικούδεσμού, απαραίτητου για την αναδίπλωση του μορίου στη λειτουργική του μορφή. Ηαπόλυτη συντηρητικότητα των καταλοίπων Cys6 και Cys69 υπαινίσσεται ότι ο δεσμόςαυτός είναι πιθανότατα συντηρημένος σε όλους τους αντιπροσώπους της οικογένειας.Με σκοπό τώρα τον εντοπισμό αμινοξέων της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ πουσυμμετέχουν στον καταλυτικό μηχανισμό ή στην αναγνώριση-δέσμευση του RNAυποστρώματος, προχωρήσαμε σε ένα πρώτο βήμα στη στόχευση των περισσότεροσυντηρημένων βασικών αμινοξικών καταλοίπων Lys10, His36 και Αrg92 μεκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Οι αντίστοιχες μεταλλαγμένες μορφές του ενζύμου del10Lys, His36Ala και Arg92Ala παρήχθησαν στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris και καθαρίστηκαν σε ομογενή μορφή, σύμφωνα με τοπρωτόκολλο που ακολουθήσαμε και για το φυσικού τύπου ένζυμο.Η μελέτη της επίδρασης των μεταλλαγών αυτών στη λειτουργικότητα της RNase κέγινε: α) με σύγκριση του ρυθμού υδρόλυσης του υποστρώματος 5΄-dTdTdTdTrAdGdTdTdTdT-3΄ από το φυσικού τύπου και τα μεταλλαγμένα ένζυμα,β) με προσδιορισμό του Κm των ενζύμων έναντι του υποστρώματος 5΄-FAMdTdTdTdTdTrAdGdTdTdTdTdT-BHQ1-3΄ (subΒ) και γ) με σύγκριση του προτύπουεξειδίκευσης που εμφανίζουν τα μεταλλαγμένα ένζυμα έναντι μιας σειράςσυνθετικών υποστρωμάτων του τύπου 5΄-dΝdΝdΝrAdΝdNdNdN-3΄σε σχέση με τηφυσικού τύπου RNase κ. Ο προσδιορισμός του Km της RNase κ και τωνμεταλλαγμένων μορφών της επετεύχθη βάσει ενός πρωτοκόλλου συνεχούς ενζυμικήςδοκιμασίας με χρήση φθορίζοντος υποστρώματος, το οποίο αναπτύχθηκε στα πλαίσιατης παρούσας διατριβής. Από τα πειράματα αυτά προέκυψε ότι: Η απαλοιφή της Lys στη θέση 10 δεν επηρέασε ούτε τη ριβονουκλεολυτικήενεργότητα αλλά ούτε και την υποστρωματική εξειδίκευση του ενζύμου, κάτι που υποδεικνύει ότι, παρά την απόλυτη συντηρητικότητα του, το εν λόγωαμινοξύ δε συμμετέχει άμεσα στον καταλυτικό μηχανισμό ή στη δέσμευσητου RNA υποστρώματος. Η μεταλλαγμένη μορφή His36Ala εμφανίζει το ίδιο πρότυπο εξειδίκευσης,αλλά μειωμένη ενεργότητα σε σύγκριση με το φυσικού τύπου ένζυμο, κάτιπου βρέθηκε ότι οφείλεται πιθανότατα στην ελαττωμένη συγγένεια του για τουπόστρωμα. Η διατήρηση ενός ποσοστού της ενζυμικής ενεργότητας από τομεταλλαγμένο ένζυμο αποκλείει τη συμμετοχή της His36 της RNase κ σεμηχανισμό όξινης-βασικής κατάλυσης, αντίστοιχο με αυτούς που έχουν ωςσήμερα περιγραφεί. Θεωρούμε πολύ πιθανόν ότι η μικρότερη συγγένεια πουεμφανίζει η μεταλλαγμένη μορφή έναντι του υποστρώματος subΒ, οφείλεταιστη διαταραχή της στερεοδιαμόρφωσης του ενζύμου εξαιτίας τηςαντικατάστασης του καταλοίπου ιστιδίνης με κατάλοιπο αλανίνης. Η αντικατάσταση του καταλοίπου Arg92 με Ala οδήγησε επίσης σεσημαντική μείωση της ενζυμικής ενεργότητας και αύξηση της τιμής Km έναντι του υποστρώματος subΒ, χωρίς παράλληλη τροποποίηση του προτύπουυποστρωματικής εξειδίκευσης. Το αποτέλεσμα αυτό αποτελεί ισχυρή ένδειξηότι το συγκεκριμένο αμινοξύ διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση του RNA υποστρώματος, καθώς τα κατάλοιπα Arg συμμετέχουνσυχνά στη μη ειδική δέσμευση του RNA μέσω της αλληλεπίδρασης τους μετις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των νουκλεοτιδίων.Ως μελλοντική προσέγγιση, καθοριστικής σημασίας κρίνεται η κρυσταλλογραφικήμελέτη της δομής της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, η οποία αφενός θα υποστηρίξειπεραιτέρω τα παραπάνω ευρήματα και αφετέρου θα βοηθήσει στη διαλεύκανση τουκαταλυτικού μηχανισμού του συγκεκριμένου ενζύμου, ο οποίος με τη σειρά του θααποτελέσει πολύτιμο εργαλείο στην προσπάθεια προσδιορισμού του βιολογικούρόλου της πρωτεΐνης αυτής.