Επιγενετικοί μηχανισμοί στην εκφυλιστική νόσο των αρθρώσεων
Authors: Παπαγεωργίου Αλίκη-Αλεξάνδρα 
Published: April 2024

Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) ορίζεται ως μια χρόνια, πολυφαινοτυπική, εκφυλιστική ασθένεια των αρθρώσεων. Η προχωρημένη ηλικία αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα κινδύνου στην εξέλιξη της ΟΑ, συνοδευόμενη από παθολογικές τροποποιήσεις σε όλους τους ιστούς των αρθρώσεων που αφορούν κυρίως τη γήρανση των κυττάρων, την προοδευτική αποικοδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, τη φλεγμονή του αρθρικού υγρού και την απορρύθμιση της μεταβολικής ομοιόστασης των αρθρικών χονδροκυττάρων. Πέραν του παράγοντα της γήρανσης, η ΟΑ αποτελεί ένα νόσημα με ισχυρή γενετική συνιστώσα, καθώς σε ποσοστό της τάξης του 50% αποδίδεται στην κληρονομικότητα, παράγοντας που, ωστόσο, δεν φαίνεται να εξηγεί επαρκώς την αιτιοαποθέγεια της νόσου. Στην προσπάθεια κατανόησης των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών και της γονιδιακής ρύθμισης που λαμβάνει χώρα κατά την εξέλιξη της ΟΑ, τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό ενδιαφέρον στρέφεται στην επιγενετική, η οποία περιγράφει κληρονομήσιμες φαινοτυπικές τροποποιήσεις που δεν προκύπτουν από αλλαγές στην αλληλουχία των βάσεων του DNA. Ένα μόριο-κλειδί στην αιτοπαθογένεια της ΟΑ αποτελεί η σιρτουίνη 1 (SIRT1), μια εξαιρετικά συντηρημένη NAD+ αποακετυλάση ιστονικών και μη πρωτεϊνών, η οποία ρυθμίζει τις μεταβολικές λειτουργίες των χονδροκυττάρων, τη φλεγμονώδη απόκριση, τη μιτοχονδριακή βιογένεση, τη γήρανση και την απόπτωση μέσω αποακετυλίωσης των υποστρωμάτων της, όπως μεταγραφικών παραγόντων και ακετυλιωμένων ιστονών. Έχει δειχθεί ότι σε χρόνιες φλεγμονώδεις και ηλικιοσχετιζόμενες νοσηρότητες, συμπεριλαμβανομένης της ΟΑ, όπου το οξειδωτικό στρες είναι αυξημένο, η SIRT1 εμφανίζει μειωμένη έκφραση, επιφέροντας διαταραχή της μεταβολικής ισορροπίας και αυξημένη φλεγμονώδη και καταβολική δραστηριότητα στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών που συμμετέχουν στη ρύθμιση της έκφρασης και της δράσης της αποακετυλάσης SIRT1 σε ανθρώπινα ΟΑ χονδροκύτταρα. Το πειραματικό κομμάτι της διατριβής περιελάμβανε δύο σκέλη. Στο πρώτο σκέλος διερευνήθηκε ο ρόλος της μεθυλίωσης του DNA στη ρύθμιση της SIRT1. Το πρότυπο μεθυλίωσης του υποκινητή της SIRT1 αναλύθηκε σε φυσιολογικά και ΟΑ χονδροκύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση αλληλούχισης κατόπιν κατεργασίας του DNA με διθειώδες άλας. Ακολούθως, η ικανότητα σύνδεσης του μεταγραφικού παράγοντα C/EBPα στον υποκινητή της SIRT1 αξιολογήθηκε με δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (Chromatin immunoprecipitation, ChIP). Στη συνέχεια, η αλληλεπίδραση του C/EBPα με τον υποκινητή της SIRT1 καθώς και τα επίπεδα έκφρασης της SIRT1 αξιολογήθηκαν μετά από χορήγηση του αναστολέα της μεθυλίωσης 5-Aza-2-Deoxycytidine (5-AzadC) στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Τα επίπεδα ακετυλίωσης και πυρηνικού εντοπισμού της υπομονάδας p65 του μεταγραφικού παράγοντα Nuclear factor kappa-Β (NF-κΒp65), και τα επίπεδα έκφρασης των φλεγμονωδών μεσολαβητών ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) και IL-6 και TNFa και των καταβολικών γονιδίων (μεταλλοπρωτεϊνάση-1 (MMP-1) και MMP-9) και αγγρεκανάση ADAMTS-5 που σχετίζονται με την ΟΑ, αξιολογήθηκαν σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-AzadC, με ή χωρίς μετέπειτα επίδραση με siRNA έναντι της SIRT1. Στο δεύτερο πειραματικό σκέλος της διατριβής διερευνήθηκε η συμμετοχή ενός μικρού μη-κωδικού RNA, του miR-217-5p, στη ρύθμιση της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική αναζήτηση και πρόβλεψη των γονιδίων-στόχων του miR-217-5p και ανάλυση της οντολογίας αυτών στις βάσεις δεδομένων Gene Ontology (GO) και Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways, ενώ τα επίπεδα έκφρασης mir-217-5p αξιολογήθηκαν σε φυσιολογικά και ΟΑ χονδροκύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA και πρωτεΐνης της SIRT1, τα επίπεδα ακετυλίωσης των NF-κΒp65 και p53, και τα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων φλεγμονωδών μεσολαβητών [IL-1β, IL-6, TNFa], ρυθμιστικών γονιδίων του αρθρικού χόνδρου [MMP-1, MMP-9, MMP-13, COL2A1, ACAN] και προ-αποπτωτικών δεικτών [Bax, pro-caspase-3, cleaved caspase-3] που σχετίζονται με την ΟΑ, αξιολογήθηκαν σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επίδραση με μιμητικό miR-217 (miR-217-mimic), καθώς και σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επίδραση με αναστολέα του miR-217 (miR-217-inhibitor) με ή χωρίς επακόλουθη διαμόλυνση με siRNA έναντι της SIRT1. Τα αποτελέσματα του πρώτου ερευνητικού σκέλους έδειξαν υπερμεθυλίωση ειδικών δινουκλεοτιδίων CpG στον υποκινητή της SIRT1, που συσχετίστηκε με μείωση της έκφρασης της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μειωμένη ικανότητα δέσμευσης του C/EBPa στις υπερμεθυλιωμένες περιοχές του υποκινητή της SIRT1. Η χορήγηση 5-AzadC αποκατέστησε τη μεταγραφική δραστηριότητα του C/EBPα, επάγοντας την έκφραση της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Η αποακετυλίωση του NF-κΒp65 σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-AzadC αποτράπηκε με χορήγηση siSIRT1. Ομοίως, τα ΟΑ χονδροκύτταρα που έλαβαν 5-AzadC εμφάνισαν μειωμένη έκφραση των IL-1β, IL-6, MMP-1 και MMP-9 που αντιστράφηκε μετά από διπλή επίδραση με 5-AzadC/siSIRT1. Παράλληλα, από την εκτέλεση των βιοπληροφορικών αναλύσεων πρόβλεψης και οντολογίας των γονιδίων-στόχων του miR-217, φάνηκε ότι η SIRT1 αποτελεί ένα γονίδιο με εμπλοκή στην ΟΑ, που στοχεύεται άμεσα από το miR-217-5p, ενώ φάνηκε ότι το miR-217-5p υπερεκφράζεται στα ΟΑ χονδροκύτταρα, γεγονός που εξηγεί ως ένα βαθμό τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης της SIRT1 στην ΟΑ. Τα αποτελέσματα της επίδρασης με miR-217-mimic ήταν αντίθετα των ευρημάτων από την επίδραση με miR-217 inhibitor. Η αποακετυλίωση των NF-κΒp65 και p53 σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με miR-217 inhibitor αναστράφηκε κατόπιν επίδρασης με siSIRT1. Ομοίως, τα ΟΑ χονδροκύτταρα που έλαβαν αγωγή με miR-217 inhibitor εμφάνισαν αυξημένη έκφραση COL2A1, ACAN και μειωμένη έκφραση IL-1β, IL-6, TNFa, MMP-1, MMP-9, MMP-13, Bax και cleaved caspase-3, η οποία αντιστράφηκε μετά τη χορήγηση διπλής επίδρασης με miR-217 inhibitor/siSIRT1. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν την επίδραση της μεθυλίωσης του DNA και του miR-217-5p στην καταστολή της αποακετυλάσης SIRT1, η οποία διαταράσσει την προστατευτική αντικαταβολική, αντιφλεγμονώδη και αντιαποπτωτική δράση της στα ΟΑ χονδροκύτταρα, και συμβάλλει περαιτέρω στη παθογένεση της ΟΑ.