Ο ρόλος των μικρών πλούσιων σε λευκίνη πρωτεογλυκανών (SLRPs) στη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου οστεοσαρκώματος
Authors: Αγγελιδάκης Ιωάννης 
Published: September 2021

Τα σαρκώματα συνιστούν το 1% περίπου του συνόλου των κακοήθων νεοπλασιών κάθε χρόνο, είναι μεσεγχυματικής προέλευσης και κατατάσσονται με βάση τον τύπο του ιστού προέλευσης τους. Το οστεοσάρκωμα είναι ένας όγκος υψηλής κακοήθειας, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία νεοπλασματικών κυττάρων που παράγουν οστεοειδές. Αποτελεί τον δεύτερο σε συχνότητα πρωτοπαθή όγκο των οστών μετά το μυέλωμα και το 20% όλων των σαρκωμάτων των οστών. Το οστεοσάρκωμα εμφανίζεται πιο συχνά στην δεύτερη δεκαετία της ζωής και με μικρότερη συχνότητα στην έκτη δεκαετία. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) του οστεοσαρκώματος είναι πλούσια σε κολλαγόνο, γλυκοπρωτεϊνες και πρωτεογλυκάνες (Benayahuetal., 2001; Piepkornetal., 1988; Roughley, 2006).Οι πλούσιες σε λευκίνη πρτωτεογλυκάνες (SLRPs) αποτελούν κύρια μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας του συνδετικού ιστού και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης (Nikitovic et.al., 2012). Επίσης, οι SLRPs αποτελούν τις πιο άφθονες πρωτεογλυκάνες του οστεοειδούς (Waddington &L angley 1998; Young etal., 2005). Αλλαγές στην έκφραση των SLRPs έχουν παρατηρηθεί σε ποικιλία τύπων καρκινικών κυττάρων, όπως του οστεοσαρκώματος, του ινοσαρκώματος και του χονδροσαρκώματος. Τα μέλη της οικογένειας των SLRPs εμφανίζουν δομική ομοιομορφία και κατατάσσονται σε πέντε κατηγορίες (SchaeferandIozzo2008). Η κατηγορία Ι περιλαμβάνει την διακοσμιτίνη (decorin) και την διγλυκάνη (biglycan), η κατηγορία ΙΙ τις ινομοδουλίνη (fibromodulin), λουμικάνη (lumican), PRELP, κερατοκάνη (keratocan) και οστεοκατχερίνη (osteocadherin) καιηκατηγορία ΙΙ την επιφυκάνη (epiphycan) και οστεογλυκίνη/μιμεκάνη (asteoglycin/mimecan) (Hockingetal., 1998; Fisheretal., 1989; Oldbergetal., 1989; Blochbergeretal., 1992; Bengtssonetal., 1995; Sommarinetal., 1998; Friedman eta l., 2000). Επίσης, τελευταίες έχουν ανακαλυφτεί η οπτικίνη (opticin) και η ασπορίνη (asporin) (Reardon et al., 2000; Lorenzoetal., 2001). Οι κατηγορίες IVκαι V έχουν χαρακτηριστεί ως μη-κανονικές (SchaeferandIozzo 2008). Ο πρωτεϊνικός κορμός των SLRPs έχει μέγεθος 40-50 kDa με μοτίβα πλούσια σε λευκίνη, τα οποία επαναλαμβάνονται 9-10 φορές στο C-τελικό άκρο τους. Στην N-τελική περιοχή τους οι SLRPs φέρουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με διαφορετική χημική σύσταση (Nikitovic et al., 2008; McEwanetal., 2006). Ο βαθμός το είδος γλυκοζυλίωσης φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην οστεογένεση και τη χονδρογένεση (Radaetal., 2000). Το χαρακτηριστικό σε σχήμα πετάλου αλόγου του πρωτεϊνικού τους κορμού, τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με συστατικά της ECM, όπως οι αυξητικοί παράγοντες, επηρεάζοντας ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες (Nikitovic et al., 2008; Nikitovic et al., 2012).Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο ρυθμιστικός ρόλος δύο σημαντικών SLRP, της λουμικάνης και της διγλυκάνης, στις κυτταρικές λειτουργίες του οστεοσαρκώματος. Οι κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος έχει δειχθεί ότι εκφράζουν και εκκρίνουν την μικρή πλούσια σε λευκίνη πρωτεογλυκάνη (SLRP), λουμικάνη (Nikitovic et.al., 2008). Η λουμικάνη έχει προηγουμένως αποδειχτεί ότι ρυθμίζει την ανάπτυξη και την κινητικότητα των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Στην έρευνα της παρούσας διατριβής, κύτταρα οστεοσαρκώματος της κυτταρικής σειράς Saos 2 ελλειπή σε έκφραση λουμικάνης παρουσίασαν αυξημένη κυτταρική προσκόλληση σε υπόστρωμα ινονεκτίνης (FN) (p≤0.01). Μελετήθηκε επίσης η δράση του αυξητικού παράγοντα transforming growth factor β2 (TGF- β2). Η εξωγενής προσθήκη του TGF- β2 αύξησε στατιστικά σημαντικά την προσκόλληση των κυττάρων στην FN (p≤0.01). Αντιθέτως, η μείωση της δράσης του παράγοντα αυτού δεν άλλαξε την ικανότητα των Saos 2 κυττάρων με (siRNA-transfected) ή δίχως λουμικάνη (scramblesiRNA-transfected) να προσκολληθούν στην FN (p=NS). Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ της έκφρασης της λουμικάνης και της ικανότητας προσκόλλησης των κυττάρων Saos 2 η οποία ρυθμίζεται από την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGF- β2. Στην συνέχεια, παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση του Smad 2 σηματοδοτικού μορίου στα κύτταρα με ελειπή έκφραση λουμικάνης (p≤0.01) η οποία αναστάλθηκε με την παρουσία αντισωμάτων έναντι του TGF- β2. Το τελευταίο, αποδεικνύει ότι η λουμικάνη αποτελεί ρυθμιστή του σηματοδοτικού άξονα TGF- β2/Smad 2. Επιπρόσθετα, στην διατριβή παρουσιάζονται αποτελέσματα για την έκφραση της β1-ιντεγκρίνης και την ενεργοποίηση της pFAK (εστιακή κινάση προσκόλλησης), που είναι σημαντικά μόρια για την πρόσδεση των κύτταρων στην FN. Συμπερασματικά, η μελέτη περιγράφει ένα καινούριο μηχανισμό σηματοδότησης στα ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος: η έκκριση της λουμικάνης στον εξωκυττάριο χώρο αποτελεί έναν ενδογενή αναστολέα της δράσης του αυξητικού παράγοντα TGF-β2 και έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή των μορίων pSmad 2, β1 ιντεγκρίνης και pFAK και την ρύθμιση της προσκολλητικής ικανότητας των κυττάρων του οστεοσάρκωματος (Nikitovic et al., 2011).Στην συνέχεια, μελετήθηκε η επίσης λειτουργικά σημαντική SLRP, διγλυκάνη στα κύτταρα του οστεοσαρκώματος. Η διγλυκάνη συμμετέχει στην ομοιόσταση και στην ανάπτυξη των οστών καθώς και στην παθολογία τους. Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν η MG63. Τα αποτελέσματα αρχικά έδειξαν ότι η διγλυκάνη αυξάνει τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του οστεοσαρκώματος (p≤ 0.001). Στην συνέχεια, ο IGF-I αποδείχτηκε ότι αυξάνει στατιστικά σημαντικά την έκφραση της διγλυκάνης (p≤ 0.01) και αντιθέτως η έλλειψη έκφρασης της διγλυκάνης από τα κύτταρα μείωσε στατιστικά σημαντικά το βασικό αλλά και τον επαγόμενο από τον IGF-I πολλαπλασιασμό των MG63 κυττάρων (p≤ 0.001; p≤ 0.01). Η παραπάνω ρύθμιση του πολλαπλασιασμού ήταν αποτέλεσμα της σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα IGF-IR, του οποίου η ενεργοποίηση αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά (p≤ 0.01) στα MG63 κύτταρα με ελλιπή έκφραση διγλυκάνης. Η διγλυκάνη έχει δειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι μπορεί να ρυθμίσει το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-κατενίνης. Στην παρούσα μελέτη αποδείχτηκε ότι η διγλυκάνη αυξάνει στατιστικά σημαντικά την έκφραση της β-κατενίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο καθώς και τον εντοπισμό της στο κυτταρόπλασμα (p≤ 0.01), την μεμβράνη (p≤ 0.01) και τον πυρήνα των κυττάρων MG63 οστεοσαρκώματος (p≤ 0.05). Μελέτες ανοσοφθορισμού μας έδειξαν ότι η αύξηση της β-κατενίνης οφείλεται στον συν-εντοπισμό της διγλυκάνης και τουWnt συν-υποδοχέα LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 6) που έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της αποδόμησης της β-κατενίνης, καθώς και συν-εντοπισμό της β-κατενίνης και του ενεργοποιημένου υποδοχέα pIGF-IR στο κυτταρόπλασμα και στην μεμβράνη των MG-63 κυττάρων. Ο συν-εντοπισμός αυτός ήταν ακόμα πιο έντονος μετά την εξωγενή προσθήκη διγλυκάνης. Παράλληλα, η ελλιπή έκφραση της διγλυκάνης μείωσε στατιστικά σημαντικά την βασική αλλά και την επαγόμενη από τον IGF-I ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μορίου ERK1/2, (p≤ 0.001). Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή παρουσιάζει δύο καινούριους μηχανισμούς μέσω των οποίων οι SLRPs επηρεάζουν τις κυτταρικές λειτουργίες του οστεοσαρκώματος. Ο πρώτος μηχανισμός αναδεικνύει ότι η διγλυκάνη μέσω του LRP6/β-κάτενινη/IGF-IR σηματοδοτικού άξονα ενισχύει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων του οστεοσαρκώματος (Aggelidakisetal., 2018). Ο δεύτερος μηχανισμός δείχνει ότι η λουμικάνη επηρεάζει την κατάντι σηματοδότηση του TGF β2, συμπεριλαμβανόμενων Smad2/β ιντεγκρίνη/pFAK, στη ρύθμιση της προσκόλλησης των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Οι δύο αυτές SLRPs αποδεικνύεται ότι μπορούν να αποτελούν μόρια στόχους για την ρύθμιση της εξέλιξης των καρκινικών κυττάρων του οστεοσαρκώματος και δημιουργούν τις προϋποθέσεις για μια πιο αποτελεσματική θεραπευτική αντιμετώπιση των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης.