Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγρο-οικοσυστήματα
Authors: Κάμου Ναταλί-Νεφέλη 
Published: September 2021

Η πίεση των καταναλωτών για παραγωγή ποιοτικών προϊόντων, καθαρών από υπολείμματα αγροχημικών, οδήγησαν στην ανάγκη υιοθέτησης μεθόδων που στοχεύουν στην παραγωγή προϊόντων µε το ελάχιστο δυνατό κόστος και τη μικρότερη επιβάρυνση του περιβάλλοντος. Στο πλαίσιο μιας τέτοιας στρατηγικής εντάσσεται και η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών που πετυχαίνουν βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών και ονομάζονται παράγοντες βιολογικού ελέγχου ή παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης (biological control agents, BCAs). Οι βακτηριακοί παράγοντες βιολογικού ελέγχου σε πολλές περιπτώσεις προάγουν την αύξηση των φυτών και για αυτό καλούνται Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Η παρούσα εργασία στοχεύει στη διερεύνηση του τρόπου δράσης τεσσάρων στελεχών ριζοβακτηρίων με αποδεδειγμένη ικανότητα βιοελέγχου. Συγκεκριμένα, τα στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76 επιλέχθηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν, σε πειράματα in vitro και in planta, τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis – lycopersici (Forl). Στο πλαίσιο του παραπάνω στόχου, απομονώθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και αξιολογήθηκαν in vitro, δύο σημαντικές αντιβιοτικές ενώσεις, το καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) και η προδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6-methoxy prodigiosin), από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, αντίστοιχα. Η αναστολή της ανάπτυξης του παθογόνου μύκητα Forl αλλά και του μύκητα Clonostachys rosea IK726 μετά την εφαρμογή και των δύο μερικά καθαρισμένων αντιβιοτικών ουσιών, ήταν έντονη. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση ακατέργαστων εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βακτηρίων επί των δύο προαναφερθέντων μυκήτων σε in vitro πειράματα, υπολογίζοντας τις τιμές EC50 (Half maximal Effective Concentration). Τα παραπάνω πειράματα συνεισφέρουν στην κατανόηση της σημασίας των αντιβιοτικών ουσιών για τη δράση των συγκεκριμένων βακτηριακών στελεχών κατά των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών αλλά και πώς αυτά μπορεί στο πεδίο δράσης τους να αναστέλλουν και ωφέλιμους μικροοργανισμούς. Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητα των βιοπαραγόντων να παράγουν άλλες αντιμικροβιακές ουσίες, πλην των αντιβιοτικών, αλλά και ρυθμιστές ανάπτυξης. Επιβεβαιώθηκε η ικανότητα παραγωγής σιδηροφόρων και πρωτεασών από όλα τα στελέχη ενώ το P. chlororaphis ToZa7 αποδείχτηκε ικανό να παράγει επιπλέον και υδροκυάνιο. Η παραγωγή αυτών των ενώσεων μπορεί να εξηγήσει την ικανότητά τους να περιορίζουν σημαντικά την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας που αυτός προκαλεί. Όσον αφορά στην παραγωγή και έκκριση φυτορμονών, όλα τα στελέχη αποδείχτηκαν ικανά να παράγουν ινδολοξικό οξύ με κορυφαίο στέλεχος το S. marcescens PiHa5II το οποίο προκάλεσε και την εντονότερη προαγωγή της αύξησης που παρατηρήθηκε σε διάφορα φυτά. Σε αυτό το πλαίσιο προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα των μακροστοιχείων N, C, S, Κ, Ca, Mg και Ρ σε φυτά ρεπανιού που είχαν δεχτεί επεμβάσεις με τα ριζοβακτήρια. Όσον αφορα το υπέργειο τμήμα, το βακτήριο S. marcescens PiHa5ΙΙ αύξησε σημαντικά την απορρόφηση του καλίου στα φύλλα, ενώ η επέμβαση με το P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά την απορρόφησή του μαγνησίου. Όσον αφορά το υπόγειο τμήμα, παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο στις μετρήσεις απορρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, τα οποία αυξήθηκαν μετά από τον εμβολιασμό με τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76 αντίστοιχα. Όσον αφορά στα βασικά θρεπτικά στοιχεία, άζωτο, άνθρακα και θείο (N, C, S), στο υπέργειο τμήμα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει στατιστικά σημαντικά την απορρόφηση και συσσώρευση του αζώτου, ενώ η απορρόφηση του άνθρακα επηρεάζεται από την παρουσία του B. cereus S76, το οποίο και αυξάνει σημαντικά την συγκέντρωση του στοιχείου στα φύλλα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Στο υπόγειο τμήμα, το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση του αζώτου και του άνθρακα, ενώ η επέμβαση με το S. marcescens PiHa5II μειώνει τη συγκέντρωση του θείου σε σύγκριση με τα φυτά του μάρτυρα που δεν έχουν υποστεί βακτηριακή μεταχείριση.Στη συνέχεια μελετήθηκε η προοπτική συνδυασμού των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 με τον C. rosea IK726. Η διερεύνηση έγινε αρχικά μέσω της μελέτης της έκφρασης 14 γονιδίων μεταφορέων ABC στον C. rosea IK726, με τη χρήση της ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης έδειξε σημαντική επαγωγή στην έκφραση των γονιδίων abcB1, abcB26, abcG8 και abcG25 στο μυκήλιο που αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών, του S. rubidaea S55. Ωστόσο, καμία σημαντική επαγωγή δεν παρατηρήθηκε στο αντίστοιχο υπερκείμενο του P. chlororaphis ToZa7. Επιπλέον, όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 και 72 ωρών του S. rubidaea S55, 5 γονίδια (abcC14, abcC12, abcB20, abcB1, και abcB26) εκφράστηκαν σημαντικά περισσότερο, ενώ η αντίστοιχη ανάπτυξη σε υπερκείμενο 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε την επαγωγή 3 μόνο γονιδίων (abcC14, abcB1, και abcB26). Η σημασία των γονιδίων που κωδικοποιούν τους μεταφορείς ABC έγκειται στο ότι προσδίδουν στον μύκητα την ικανότητα αποτοξίνωσης του κυττάρου από δευτερογενείς μεταβολίτες. Η θετική επίδραση του συνδυασμού των βιοπαραγόντων διαπιστώθηκε σε in planta πειράματα σε τομάτα, σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπου και παρουσίασαν ικανοποιητική φυτοπροστατευτική δράση έναντι του Forl. Προκειμένου να συνδεθεί η αρνητική επίδραση των βιοπαραγόντων S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 και C. rosea IK726 στη σήψη ριζών και λαιμού, διερευνήθηκε η επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με μηχανισμούς άμυνας σε φυτά τομάτας, μετά από προσβολή από τον μύκητα Forl και εμβολιασμό των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 σε συνδυασμό με τον C. rosea IK726 και μεμονωμένα. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε ρίζες φυτών τομάτας που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες και τα γονίδια που μελετήθηκαν ήταν τα PR-1a, GLUA και CHI3 τα οποία κωδικοποιούν αντιμικροβιακές πρωτεΐνες τύπου PR-1, PR-2, PR-3, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου PR-1a ήταν υψηλότερα στην τομάτα μετά από μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο 48 ώρες από τον εμβολιασμό επαγωγής με τον C. rosea IK726. Το ίδιο παρατηρήθηκε και ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με συνδυασμό του C. rosea IK726 με το P. chlororaphis ToZa7. Το γονίδιο αυτό έδειξε να εκφράζεται εντονότερα και όταν επέδρασε στο φυτό το S. rubidaea S55 και 72 ώρες αργότερα ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Το γονίδιο CHI3 εκφράστηκε περισσότερο όταν η μόλυση πρόκλησης με το παθογόνο έγινα 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με C. rosea. Όσον αφορά στο γονίδιο GLUA, τα επίπεδα έκφρασής του στην τομάτα αυξήθηκαν ελάχιστα μετά από μόλυνση πρόκλησης που έγινε 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με S. rubidaea S55 και με C. rosea ΙΚ726 καιμε C. rosea ΙΚ726 S. rubidaea S55. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR-1a και GLUA αυξήθηκαν σημαντικά στην τομάτα, μετά από έκθεση στο στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, για 120 ώρες, χωρίς να ακολουθήσει μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Τέλος, στο πλαίσιο της μελέτης των αλληλεπιδράσεων του C. rosea IK726 και του Forl στη ριζόσφαιρα, οι δύο μύκητες μετασχηματίστηκαν με τα γονίδια της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (DsRed), αντίστοιχα. Οι παρατηρήσεις σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser φανέρωσαν την ικανότητα αποικισμού του ριζικού συστήματος της τομάτας από τον ωφέλιμο μύκητα C. rosea IK726. Παράλληλες παρατηρήσεις in vitro ενίσχυσαν την υπόθεση ότι ο βασικός τρόπος δράσης του C. rosea IK726 είναι ο υπερπαρασιτισμός των υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα. Τέλος, μελετήθηκε ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το στέλεχος P. chlororaphis Τοζα7. Το στέλεχος ΤοΖα7 μετασχηματίστηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης μέσω βακτηριακής σύζευξης. Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε ότι το ριζοβακτήριο αποίκισε τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας, ενώ επιβεβαιώθηκε η ενδοφυτική του ικανότητα με απομόνωση από το εσωτερικό των επιδερμικών κυττάρων.