Εφαρμογή υπολογιστικών μεθόδων στην στόχευση πρωτεϊνών για την καταστολή διεργασιών αναγνώρισης και μεταβολισμού φυσιολογικού και καρκινικού κυττάρου
Authors: Παπακωνσταντίνου Ελένη 
Published: April 2024

Ο καρκίνος χαρακτηρίζει μια ομάδα ασθενειών στις οποίες κοινό χαρακτηριστικό είναι ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, τα οποία αυξάνονται, διαιρούνται και πεθαίνουν με αυστηρά ελεγχόμενο τρόπο, τα καρκινικά κύτταρα διαφοροποιούν τις φυσιολογικές διεργασίες του κυτταρικού κύκλου. Πολλές απαντήσεις στην αντιμετώπιση των ασθενειών μπορούν να δοθούν από στοχευμένη καταστολή πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε σημαντικά κυτταρικά μονοπάτια, εφόσον οι πρωτεΐνες είναι τα πιο πολυδύναμα μακρομόρια στους οργανισμούς κι επιτελούν όλες τις σημαντικές διεργασίες στα κύτταρα. Ένα από τα πιο σημαντικά ζητήματα στη θεραπεία του καρκίνου είναι η κατανόηση των διαφορών μεταξύ φυσιολογικών και μη φυσιολογικών κυττάρων για τον αποτελεσματικό σχεδιασμό και την ανάπτυξη φαρμάκων με επιλεκτική δράση. Η μεταβολική οδός αποτελεί μία από τις βασικότερες αλλαγές μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Στα μεν φυσιολογικά κύτταρα, περιλαμβάνει την αερόβια γλυκόλυση, και την οξειδωτική φωσφορυλίωση, μέσω των οποίων αποδίδεται στο κύτταρο ενεργειακό κέρδος με την παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤΡ). Αντίθετα, τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από αυξημένη αερόβια γλυκόλυση και χρησιμοποιούν κυρίαρχα αυτή τη μεταβολική οδό για την παραγωγή του ATP ως κύρια πηγή ενέργειας, ένα φαινόμενο γνωστό και ως φαινόμενο Warburg (Warburg effect). Συνέπεια αυτού, τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μειωμένη οξειδωτική φωσφορυλίωση και αυξημένη παραγωγή των δομικών μονάδων που απαιτούνται για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Η στρατηγική μελέτη της γλυκολυτικής οδού του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων εμπλέκει τη δράση σημαντικών πρωτεϊνικών μορίων και η συνεισφορά της πρωτεϊνικής ομοιόστασης μπορεί να αποσαφηνίσει τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την καρκινογένεση. Τα τελευταία χρόνια δίνεται έμφαση στον μονοκαρβοξυλικό μεταφορέα 4 (monocarboxylate transporter 4 - MCT4), μια πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε γλυκολυτικούς ιστούς. Πολλές μελέτες επιβεβαιώνουν το ρόλο του MCT4 ως μεταφορέα του γαλακτικού οξέος σε καρκινικά κύτταρα με γλυκολυτικό φαινότυπο και η παρεμπόδιση του ρόλου του MCT4 ως μεταφορέα γαλακτικού οξέος προβλέπεται να δημιουργήσει συνθήκες γαλακτικής οξέωσης, διακοπή της γλυκόλυσης και θάνατο του καρκινικού κυττάρου. Εξ όσων γνωρίζουμε μέχρι σήμερα, ενώ η βιβλιογραφία και πειραματικές μελέτες δείχνουν ότι η απορρύθμιση του βιολογικού μονοπατιού στο οποίο δρα ο MCT4 έχει θετική επίδραση στην εξέλιξη του καρκίνου, ενισχύοντας την προσέγγιση της θεραπευτική δυναμικής που μπορεί να επιτευχθεί με την αναστολή της δράσης του, δεν έχει ανακαλυφθεί αναστολέας που να δρα επιλεκτικά στον MCT4 και να παρεμποδίζει την εκροή του γαλακτικού από το καρκινικό κύτταρο. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρείται η αποσαφήνιση των δομικών χαρακτηριστικών του MCT4 για τον αντικαρκινικό σχεδιασμό φαρμάκων, μέσω της εφαρμογής υπολογιστικών μεθόδων μοριακής μοντελοποίησης, προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής, και δημιουργίας ενός τρισδιάστατου φαρμακοφορικού μοντέλου ως θεραπευτική προσέγγιση για την ανακάλυψη εξειδικευμένων αναστολέων έναντι του MCT4. Ο MCT4 είναι ένας διαμεμβρανικός μεταφορέας που αποτελείται από 12 διαμεμβρανικές έλικες με χαρακτηριστική συμμετρία μεταξύ των δύο δομικών περιοχών του Ν-τελικού και C-τελικού μέρους της πρωτεΐνης αποτελούμενες από 6 έλικες, ΤΜ1-6 και ΤΜ7-12 αντίστοιχα, συνδεόμενοι μέσω ενός ευέλικτου ενδοπλασματικού βρόχου. Η χαρακτηριστική αυτή δομή προσδίδει στο μεταφορέα μία ευέλικτη στερεοδιάταξη αποκτώντας διαφορετικό προσανατολισμό ως προς τη μεμβράνη, επιτρέποντας τη δημιουργία ενός καναλιού μεταφοράς υποστρώματος που μεταφέρει το γαλακτικό μέσω του μηχανισμού ‘rocker switch’, και εναλλάσσοντας την πρόσβαση του υποστρώματος διαμέσου της μεμβράνης. Για τον MCT4 δεν υπάρχει έως και σήμερα κρυσταλλογραφικά λυμένη δομή και η διαθεσιμότητα ομόλογων μεταφορέων είναι περιορισμένη λόγω των περιορισμών στις μεθόδους επίλυσης δομών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Με σκοπό τη δημιουργία ενός αντιπροσωπευτικού μοντέλου του MCT4, πραγματοποιήθηκε αρχικά μία ολιστική φυλογενετική ανάλυση για τα τη διερεύνηση της εξελικτικής σχέσης του MCT4 μεταξύ των ειδών αλλά και μεταξύ των διαφορετικών μελών της οικογένειας SLC16 στα θηλαστικά. Η φυλογένεια μεταξύ των διαφορετικών μεταφορέων της οικογένειας δείχνει την στενότερη εξελικτική σχέση μεταξύ των MCT1-4, ενώ τα υπόλοιπα μέλη δείχνουν μακρινή συγγένεια, με τους MCT8 και MCT10 που είναι υπεύθυνοι για τη μεταφορά θυρεοειδικών ορμονών και αρωματικών αμινοξέων αντίστοιχα, να έχουν την πιο μακρινή εξελικτική σχέση. Μεταξύ των ειδών ο MCT4 εντοπίζεται στο βασίλειο των ζώων και μυκήτων, και η Ν-τελική δομική περιοχή της πρωτεΐνης (ΤΜ1-ΤΜ6) δείχνει υψηλότερο επίπεδο διατήρησης καθώς εμπλέκεται κυρίως στη δέσμευση πρωτονίων και στην εισαγωγή του μονοκαρβοξυλικού μεταφορέα στη μεμβράνη, ενώ η C-τελική δομική περιοχή (ΤΜ7-ΤΜ12) που συμμετέχει στη δέσμευση υποστρώματος δείχνει χαμηλότερο ποσοστό διατηρημένων αμινοξικών καταλοίπων. Μέσω της φυλογενετικής αυτής ανάλυσης, ακολουθήθηκε μία υβριδική προσέγγιση επιλογής προτύπου και ύφανσης, για την κατασκευή του μοντέλου της τρισδιάστατης δομής του MCT4 στον άνθρωπο (hMCT4), βασιζόμενοι στην συντήρηση της δομής των μεταφορέων της υπεροικογένειας κύριων διευκολυντών MFS (Major Facilitator Superfamily), και επιλέγοντας ανά δομικές ομάδες ομοιότητας αλληλουχίας τα κατάλληλα πρότυπα. Το τελικό μοντέλο βασίστηκε στην κρυσταλλογραφικά λυμένη δομή του μεταφορέα γλυκόζης hGLUT1, που διευκολύνει τη μετατόπιση της γλυκόζης κατά μήκος της μεμβράνης και έχει επίσης εξέχοντα ρόλο στον μεταβολισμό του καρκίνου, και ένα βακτηριακό ομόλογο του MCT4, το Syntrophobacter fumaroxidans MPOB (SfMOB) που επιδεικνύει την υψηλότερη ομολογία μεταξύ των κρυσταλλικών δομών που εντοπίστηκαν. Το προκύπτον τρισδιάστατο μοντέλο του hMCT4, αφού ελαχιστοποιήθηκε ενεργειακά, αξιολογήθηκε ως προς τα συνολικά δομικά και ενεργειακά του χαρακτηριστικά και τον προσανατολισμό του στη μεβράνη, και βρέθηκε να διατηρεί όλα τα χαρακτηριστικά που είναι γνωστά για τη στερεοδιαμόρφωση του MCT4, όπως προσανατολισμός και θέση διαμεμβρανικών ελίκων στην μεμβράνη και προβολή και προσανατολισμός των κύριων αμινοξικών καταλοίπων που εμπλέκονται στην δομή και τη λειτουργία μεταφοράς και κίνησης του υποδοχέα. Στη συνέχεια, το μοντέλο υποβλήθηκε σε πρωτόκολλα μοριακής δυναμικής για την προσομοίωση του μεταφορέα στη μεμβράνη και βρέθηκε να διατηρεί μια συνολικά σταθερή ενεργειακή κατάσταση μεταξύ των εναλλασσόμενων διαμορφώσεων που αποκτά. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός ενός φαρμακοφορικού μοντέλου ως μία δυναμική προσέγγιση που βασίζεται στη δομή της πρωτεΐνης και στις προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Έπειτα από μία αρχική ‘τυφλή’ αναζήτηση φαρμακοφορικών στοιχείων έναντι της δομής της πρωτεΐνης και μέσα από μία μαθηματική χωροχρονική ανάλυση φυσικοχημικών χαρακτηριστικών που αποδόθηκαν στις προβλεπόμενες από τη μοριακή δυναμική στερεοδιαμορφώσεις, εντοπίστηκαν οι πλέον σημαντικές φαρμακοφορικές ιδιότητες που διατηρούνται κατά την πάροδο του χρόνου προσομοίωσης και υπερισχύουν της δραστικότητας των υπολοίπων. Το τελικό συναινετικό τρισδιάστατο φαρμακοφορικό μοντέλο αποτελούνταν από επτά σημαντικά φαρμακοφορικά χαρακτηριστικά στον πυρήνα του καναλιού μεταφοράς, μία ομάδα προβαλλόμενου αρωματικού δακτυλίου, πέντε προβαλλόμενες θέσεις αποδέκτη δεσμού υδρογόνου και μία ομάδα που αντιπροσωπεύει τόσο αποδέκτη όσο και δότη υδρογονικού δεσμού. Τα χαρακτηριστικά αυτά συσχετίζονται με σημαντικά αμινοξικά κατάλοιπα του hMCT4 που εμπλέκονται στην μετατόπιση του υποστρώματος όσο και στις εναλλακτικές στερεοδιαμορφώσεις που αποκτά ο μεταφορέας. Τέλος, για την αξιολόγηση του φαρμακοφορικού μοντέλου και την εκτίμηση της δυναμικής του για πρόβλεψη νέων πιθανών υποστρωμάτων με δυνατότητα εξειδικευμένης αναστολής έναντι του MCT4, πραγματοποιήθηκε μία υπολογιστική σύγκριση του μοντέλου έναντι πειραματικά προσδιορισμένων ενώσεων που επιδεικνύουν ανασταλτική δράση, επαληθεύοντας την αναλογία των φαρμακοφορικών ιδιοτήτων του παρόντος μοντέλου με τα πειραματικά δεδομένα. Η ολιστική προσέγγιση και μεθοδολογία που ακολουθήθηκε για την κατασκευή του τρισδιάστατου μοντέλου της δομής του διαμεμβρανικού μεταφορέα MCT4 και ενός φαρμακοφορικού μοντέλου για τη συστηματική εφαρμογή αναζήτησης υποκαταστατών με δυνατότητα αναστολής της λειτουργίας του MCT4, αποτελεί μία καινοτόμα διαδρομή στον ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων και στην προσπάθεια ανάπτυξης νέων αντικαρκινικών στρατηγικών.