Νέες προσεγγίσεις στη φυτοχημική ανάλυση
Authors: Πετράκης Ελευθέριος 
Published: September 2021

Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής αρχικά αναπτύχθηκαν νέες μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό επιλεγμένων δευτερογενών μεταβολιτών με βιολογικό ενδιαφέρον, όπως το μονοτερπένιο πουλεγόνη, που απαντά κυρίως στο αιθέριο έλαιο του φυτού Mentha pulegium L. (κοινώς φλισκούνι), και οι οργανοθειούχες ενώσεις αλλιίνη και μεθιίνη, οι οποίες αποτελούν τα σημαντικότερα σουλφοξείδια της S-αλκ(εν)υλo-L-κυστεΐνης που εντοπίζονται στους βολβούς του φυτού Allium sativum L. (κοινώς σκόρδο). Πιο αναλυτικά, η πουλεγόνη αποτελεί αμφιλεγόμενο συστατικό τροφίμων, ποτών και καλλυντικών, εξαιτίας της τοξικότητας που μπορεί να προκαλέσει στον άνθρωπο σε υψηλές συγκεντρώσεις. Για το λόγο αυτό, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή έχει καθορίσει ανώτατα επιτρεπτά όρια περιεκτικότητας σε πουλεγόνη για επιμέρους κατηγορίες τροφίμων και ποτών. Προκειμένου να καταστεί εφικτή η άμεση και γρήγορη ποσοτικοποίηση της πουλεγόνης στο φυσικό προϊόν που αποτελεί βασική της πηγή, το έλαιο από φλισκούνι, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος με τη χρήση της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR) σε συνδυασμό με την παλινδρόμηση μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS). Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της μεθόδου ήταν, κατά κύριο λόγο, αιθέρια έλαια που παραλήφθηκαν από ξηρή δρόγη φυτικών δειγμάτων διαφορετικών πληθυσμών της Ελλάδας με τη μέθοδο της υδροαπόσταξης σε συσκευή Clevenger. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η προτεινόμενη μέθοδος που βασίστηκε στα φασματοσκοπικά δεδομένα της περιοχής 1650-1260 cm-1 αποδείχθηκε ισοδύναμη, βάσει των στατιστικών ελέγχων F και t, με την αεριοχρωματογραφική μέθοδο αναφοράς (GC-FID) για εύρος συγκεντρώσεων πουλεγόνης από 157 έως 860 mg/mL. Η αλλιίνη και η μεθιίνη αποτελούν πρόδρομες ενώσεις πλήθους βιοδραστικών μορίων του σκόρδου. Για τον ποσοτικό τους προσδιορισμό αναπτύχθηκαν, σε πρώτη φάση, νέες μέθοδοι με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων (HILIC) συζευγμένης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (PDA) ή φασματομετρίας μαζών - ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS). Η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης (RSM), μέσω του κεντρικού σύνθετου σχεδιασμού (CCD), χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών των δύο μεθόδων, με παράγοντες την τιμή pH και την αναλογία (%) ακετονιτριλίου/νερού στην κινητή φάση. Η ανάλυση σε δείγματα σκόρδου διαφορετικής προέλευσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα μεθανολικά εκχυλίσματα που παραλήφθηκαν. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας FT-IR με την τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (DRIFTS) και της πολυμεταβλητής ανάλυσης φασματοσκοπικών δεδομένων αναπτύχθηκε μια εναλλακτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της αλλιίνης και της μεθιίνης στα μεθανολικά εκχυλίσματα από δείγματα σκόρδου. Για την ανάπτυξη των στατιστικών μοντέλων παλινδρόμησης με τη μέθοδο PLS, χρησιμοποιήθηκαν ως τιμές αναφοράς οι συγκεντρώσεις που προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία.Στη συνέχεια της διατριβής πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος αυθεντικότητας στα στίγματα του κρόκου (Crocus sativus L.), που συνιστούν το ακριβότερο άρτυμα στην παγκόσμια αγορά και επομένως έναν από τους επικρατέστερους στόχους για νοθεία. Η πρώτη μελέτη βασίστηκε στη χημειομετρική ανάλυση του αποτυπώματος των μεταβολιτών που καταγράφηκε με τη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (1H NMR), με σκοπό την ανίχνευση νοθείας του κρόκου με χαρακτηριστικά φυτικά υλικά, όπως οι στήμονες του φυτού C. sativus, τα πέταλα κάρθαμου (Carthamus tinctorius L.), ο κουρκουμάς (Curcuma longa L.) και το εκχύλισμα των καρπών γαρδένιας (Gardenia jasminoides Ellis). Για τη λήψη των φασμάτων 1H NMR χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα αυθεντικών και νοθευμένων δειγμάτων κρόκου σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO-d6). Τα μοντέλα επιβλεπόμενης ταξινόμησης που αναπτύχθηκαν μέσω διαχωριστικής ανάλυσης με ορθογώνια προβολή σε λανθάνουσες δομές (OPLS-DA, O2PLS-DA) υποδεικνύουν ότι μπορεί να γίνει αξιόπιστη εκτίμηση της ύπαρξης και του είδους νοθείας κατ’ ελάχιστο στο επίπεδο του 20% (w/w), μέσω της μη στοχευόμενης διερεύνησης του συνολικού αποτυπώματος μεταβολιτών που προκύπτει με 1H NMR. Με τη δεύτερη μελέτη, όπου χρησιμοποιήθηκαν η φασματοσκοπική τεχνική DRIFTS και χημειομετρικές τεχνικές ταξινόμησης και ποσοτικοποίησης, επιτεύχθηκε μια ολοκληρωμένη αναλυτική προσέγγιση της νοθείας του κρόκου με φυτικά υλικά. Εκτός των προαναφερθέντων υλικών νοθείας ελέγχθηκαν, επίσης, τα πέταλα καλέντουλας (Calendula officinalis L.) και το εκχύλισμα από άνθη του φυτού Buddleja officinalis Maxim. Στο πρώτο στάδιο αναπτύχθηκε ένα μοντέλο ανίχνευσης νοθείας με τα έξι επιμέρους φυτικά υλικά, κάνοντας χρήση ολόκληρου του φασματοσκοπικού αποτυπώματος (4000-600 cm-1). Για το δεύτερο μοντέλο ταξινόμησης αξιοποιήθηκαν τα δεδομένα της περιοχής 2000-600 cm-1, όπου εντοπίστηκαν οι σημαντικότερες διαφοροποιήσεις λόγω των απορροφήσεων χαρακτηριστικών δευτερογενών μεταβολιτών των υλικών. Η αναγνώριση του υλικού νοθείας στα νοθευμένα δείγματα υλοποιήθηκε με μεγάλη ευαισθησία, σε ελάχιστο ποσοστό 5% (w/w). Και στις δύο περιπτώσεις έγινε επιβλεπόμενη αναγνώριση προτύπων με διαχωριστική ανάλυση μέσω παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιμέρους υλικών στα νοθευμένα δείγματα, τα βέλτιστα μοντέλα PLS που προέκυψαν, για εύρος νοθείας 0-20% (w/w), βασίστηκαν στην επιλογή μεταβλητών από τα φασματικά διαστήματα που εμφάνισαν μέγιστη συνέργεια (siPLS). Η συνολική επίδοση των μοντέλων PLS/siPLS καθώς και τα όρια ανίχνευσης, τα οποία κυμάνθηκαν από 1.0 έως 3.1% (w/w), αναδεικνύουν το ιδιαίτερο πρακτικό ενδιαφέρον της μεθοδολογίας για την αντιμετώπιση περιπτώσεων νοθείας με υλικά φυτικής προέλευσης.Επιπλέον, μελετήθηκε η νοθεία του κρόκου με τις συνθετικές χρωστικές Sudan I-IV, οι οποίες είναι αζωχρώματα απαγορευμένα στις περισσότερες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ευρωπαϊκής Ένωσης, για χρήση σε τρόφιμα λόγω πιθανής καρκινογένεσης. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε μια νέα προσέγγιση με τη χρήση της φασματοσκοπίας 1H NMR υψηλής διαχωριστικής ικανότητας. Όπως αποδείχθηκε, διαφορετικά σήματα πρωτονίων (1Η) αρωματικών δακτυλίων μπορούν να ληφθούν υπόψη για τον εντοπισμό καθεμίας από τις χρωστικές Sudan I-IV σε ενδεχόμενη νοθεία αυτού του τύπου στον κρόκο, τα οποία ακολούθως μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον ποσοτικό προσδιορισμό των χρωστικών με 1Η NMR (qHNMR). Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα αποτέλεσε η ποσοτικοποίηση του Sudan III που πραγματοποιήθηκε σε διάφορα επίπεδα νοθείας (0.14-7.1 g/kg), εξετάζοντας τη φασματική ταινία που εμφανίζεται σε χημική μετατόπιση 8.064 ppm. Η υψηλή γραμμικότητα, ακρίβεια και ταχύτητα των αναλύσεων έδειξαν πως η μέθοδος με φασματοσκοπία 1Η NMR είναι ικανή για τον έλεγχο της νοθείας του κρόκου με χρωστικές ουσίες της οικογένειας Sudan.Από τα ευρήματα της διατριβής προέκυψε, τέλος, ότι η φασματοσκοπία FT-IR μπορεί να αποτελέσει μια σημαντική, μη καταστρεπτική τεχνική για τη διερεύνηση της βιοδραστικότητας τερπενοειδών ενώσεων σε προνύμφες κουνουπιών του είδους Culex pipiens L. Σύμφωνα με τα φάσματα FT-IR που καταγράφηκαν, συγκεκριμένες ταινίες απορρόφησης χαρακτηριστικής έντασης οφείλονται στην ύπαρξη χαρακτηριστικών ομάδων που μπορούν να καθορίζουν τη δραστικότητα μορίων με ανάλογη δομή. Έπειτα από τον έλεγχο της τοξικής δράσης τερπενοειδών, προσδιορίστηκαν οι τιμές των θανάσιμων συγκεντρώσεων LC50 και LC90 που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μοντέλων πρόβλεψης της εν λόγω δραστικότητας με τα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-IR και τη μέθοδο PLS.