Φυτοχημική ανάλυση ιθαγενών ειδών Crepis spp.
Authors: Μπάρδα Χριστίνα 
Published: December 2022

Το γένος Crepis L. ανήκει στην οικογένεια Asteraceae (Compositae) και περιλαμβάνει περίπου 250 είδη, τα οποία ενδημούν στις εύκρατες περιοχές του βόρειου ημισφαιρίου και στην τροπική Αφρική, με μεγαλύτερη ποικιλομορφία ειδών στην περιοχή της Μεσογείου. Σήμερα, λιγότερο από το 10% των ειδών έχουν ερευνηθεί είτε από φυτοχημική είτε από άποψη βιοδραστικότητας. Επιπλέον, στο γένος Crepis, εμφανίζονται εδώδιμοι εκπρόσωποι, όπως τα είδη C. capillaris, C. commutata, C. foetida, C. setosa και C. vesicaria. Το γένος έχει αναφερθεί πλούσιο σε σεσκιτερπενικές λακτόνες και ιδιαίτερα σε γουαϊανολίδια, ενώ έχουν εντοπιστεί και άλλα τερπένια, όπως τριτερπένια και στερόλες. Μια άλλη ευρέως διαδεδομένη ομάδα φυσικών προϊόντων είναι τα φαινολικά και τα φλαβονοειδή, με κυρίαρχες ενώσεις τα παράγωγα του καφεϊκού οξέος και της λουτεολίνης, αντίστοιχα.Παρόλο που τα φυτοχημικά συστατικά του γένους Crepis έχουν αξιολογηθεί και βιβλιογραφικά έχει καταδειχθεί η αξία τους ως πολλά υποσχόμενες πηγές σεσκιτερπενικών λακτονών, το φαρμακολογικό δυναμικό του γένους δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως. Εκχυλίσματα που έχουν ληφθεί από τα διάφορα είδη Crepis και τα απομονωμένα συστατικά τους έχουν υποβληθεί σε περιορισμένη φαρμακολογική αξιολόγηση ως αντιικά, αντιμικροβιακά, αντιελκωτικά, αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και κυτταροτοξικά μέσα.Οι εξειδικευμένοι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι πολλά υποσχόμενοι φαρμακευτικοί παράγοντες για την πρόληψη ή τη διαχείριση πολλών διαταραχών. Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες σε παθολογικές καταστάσεις και η εμπλοκή του σε οξείες και χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων της αθηροσκλήρωσης, του διαβήτη και του καρκίνου, είναι καλά τεκμηριωμένος. Έτσι, σε συσχέτιση με το χημικό προφίλ του γένους, στοχεύσαμε να εντοπίσουμε παράγοντες κυτταροτοξικότητας και παράγοντες για την αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες, της φλεγμονής και της δυσλιπιδαιμίας μέσα από δυνητικά δραστικά φυσικά προϊόντα, όπως εκχυλίσματα ή ενώσεις, που θα μπορούσαν ενδεχομένως να χρησιμεύσουν σε σχετικές διαταραχές.Στο πλαίσιο αυτό, συλλέχθηκαν από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας και μελετήθηκαν εννέα είδη: Crepis auriculifolia Spreng, C. commutata (Spreng.) Greuter, C. dioscoridis L., C. foetida L., C. heldreichiana (Kuntze) Greuter, C. incana Sm., C. rubra L., C. sibthorpiana Boiss. & Heldr. και Phitosia crocifolia Kamari & Greuter (πρώην γνωστό ως Crepis crocifolia). Αυτά τα δείγματα εκχυλίστηκαν και διερευνήθηκαν περαιτέρω για το χημικό τους προφίλ και τις βιολογικές τους δράσεις. Αξίζει να αναφερθεί ότι από τα επιλεγμένα φυτά, τα C. auriculifolia, C. heldreichiana, C. incana, C. sibthorpiana και Phitosia crocifolia αντιπροσωπεύουν στενά ενδημικούς τύπους με περιορισμένη εξάπλωση.Διεξήχθη φυτοχημική ανάλυση, ήτοι απομόνωση, ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών και ποιοτική ανάλυση των εκχυλισμάτων τους με στόχο τον χαρακτηρισμό του χημικού φορτίου των φυτών. Επιλεγμένα εκχυλίσματα, κλάσματα και ουσίες μελετήθηκαν σε βιολογικούς ελέγχους για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικής, αντιοξειδωτικής, αντι- φλεγμονώδους και αντιυπερλιπιδαιμικής δράση τους. Για τον προσδιορισμό των συστατικών των προαναφερθέντων φυτών πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις χρησιμοποιώντας χρω- ματογραφικές τεχνικές (CC, VLC, HPLC κ.λπ.), φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζης (LC-MS) και αέρια χρωματογραφία με φασματομετρία μάζης (GC-MS).Φυτοχημική ανάλυση - Βιολογικές δοκιμασίεςΣχετικά με την φυτοχημική ανάλυση, συνολικά απομονώθηκαν σαράντα εφτά φυσικά προϊόντα από τα εκχυλίσματα Cy-hex:Et2O:MeΟH 1:1:1 και MeOH:H2O 5:1, εκ των οποίων είκοσι οκτώ συστατικά ανήκουν στην ομάδα των σεσκιτερπενικών λακτονών (1-28) με δέκα νέα φυσικά προϊόντα, δέκα έξι ανήκουν στα φαινολικά παράγωγα, από τα οποία εφτά είναι απλά φαινολικά (32-35,37-39), ένα καφεοϋλοκινικό (40) και ένα παράγωγο σαλικίνης (36), πέντε φλαβονοειδή (41-45), μία κουμαρίνη (46) και ένα λιγνάνιο (47). Επίσης απομονώθηκαν δύο τριτερπένια (29-30) και ένα νορ-ισοπρενοειδές (31). Επιπλέον, μελετήθηκαν τα πολικά εκχυλίσματα (MeOH:H2O 5:1) όλων των ειδών μέσω LC-MS και ταυτοποιήθηκαν συνολικά πενήντα δύο συστατικά, ενώ μέσω GC-MS μελετήθηκαν τα πτητικά συστατικά των ευρείας εξάπλωσης ειδών, C. foetida και C. rubra, και ταυτοποιήθηκαν τριάντα εννέα συστατικά.Cy-hex:Et2O:MeΟH 1:1:1, πτητικά εκχυλίσματα και ουσίες:•Από τα πτητικά εκχυλίσματα ερευνήσαμε το πλούσιο σε σαλικυλική αλδεΰδη εκχύλισμα CFA (υδραπόσταξη ανθέων της C. foetida) για την αντιφλεγμονώδη δράση του μέσω της αναστολής της έκφρασης του ICAM-1, που επάγεται από τον TNF-α. Το CFA έδειξε μια ισχυρή μείωση της έκφρασης του ICAM-1 κατά 65-70%, σε όλο το εύρος των ελεγχόμενων συγκεντρώσεων, χωρίς να παρουσιάζει καμία κυτταροτοξική δράση.•Με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας MTT ερευνήσαμε τα κλάσματα, που προέκυψαν από τα άπολα και τα μέσης πολικότητας εκχυλίσματα των ειδών Crepis auriculifolia, C. commutata, C. foetida, C. incana, C. rubra, C. sibthorpiana και Phitosia crocifolia σε ανθρώπινα αδενοκαρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa). Επελέγησαν τα κλάσματα, που περιέχουν σεσκιτερπενικές λακτόνες. Τα πιο δραστικά κλάσματα εμφάνισαν ΙC50 από 9.4 έως 23.7 µg/mL. Ένα φυτικό εκχύλισμα θεωρείται ότι έχει αποδεκτή ισχυρή in vitro κυτταροτοξική δράση, εάν η τιμή IC50 είναι μικρότερη από 20 μg/mL μετά από επώαση για 48 και 72 ώρες. Κατά συνέπεια, τα υπό μελέτη κλάσματα έχουν ισχυρή κυτταροτοξική δράση έναντι των κυττάρων HeLa και θα μπορούσαν να είναι μια πιθανή πηγή κυτταροτοξικών εξειδικευμένων φυσικών προϊόντων. Αυτό επιβεβαιώθηκε στο 2ο μέρος του πειράματος, όπου έγινε η μελέτη των καθαρών ουσιών γροσεϊμίνη (1), 8 επι-γροσεϊμίνη (2), ταραξινικό οξύ (26), φοιτοσίνη A (13), ταναπραιτενολίδιο (21), 2-οξο-11α-υδροξυ-13-διυδροσανταμαρίνη (24), 2β-υδροξυσανταμαρίνη (17), 8-επι-ισο- αμπερμποΐνη (3) 8-επι-ισολιπιδιόλη (11), ιντεγκριφολίνη (4) και 11β,13-διυδρο-ιντεγκριφολίνη (12). Εξ αυτών, οι ουσίες 4, 26, 1 και 21 εμφάνισαν ισχυρή δράση με τιμές IC50 6.5, 9.5 και 10.4 μΜ, αντίστοιχα.•Αναλύθηκε ο in vitro μεταβολισμός δύο σεσκιτερπενικών λακτονών (παρθενολίδιο και γροσεϊμίνη) χρησιμοποιώντας ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα. Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά το παρθενολίδιο, βρέθηκαν πέντε μεταβολίτες στη φάση Ι και ένα γλυκουρονίδιο στο συνδυασμένο μεταβολισμό των φάσεων Ι και ΙΙ. Για την γροσεϊμίνη, ανιχνεύθηκαν τέσσερις μεταβολίτες στη φάση Ι και δύο γλυκουρονίδια στη φάση II.MeOH:H2O 5:1 εκχυλίσματα:Επιπλέον, εξετάστηκαν τα πολικά εκχυλίσματα (MeOH:H2O 5:1), τα οποία ήταν πιο πιθανό να περιέχουν υδρόφιλες ενώσεις πιο σχετικές με την χρήση τους ως βρώσιμα χόρτα και επίσης δυνητικά ισχυρούς αντιοξειδωτικούς παράγοντες. Έτσι, με μια βιο-κατευθυνόμενη προσέγγιση πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ελέγχου για την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και υπολιπιδαιμική δράση των εκχυλισμάτων, μέσω πειραματικών διαδικασιών in vitro (Radical Scavenging of DPPH και Total Phenolic Con-tent-Folin Ciocalteu) και in vivo (μείωση οιδήματος ποδιού και υπολιπιδαιμική δράση σε μύες).Αρχικά, η αντιοξειδωτική δράση και ο προσδιορισμός του ολικού φαινολικού φορτίου αξιολογήθηκαν σε εννέα δείγματα, από τα οποία επιλέχθηκε το πιο δραστικό για περαιτέρω κλασμάτωση (C. incana). Τα κλάσματα, που προέκυψαν αξιολογήθηκαν εκ νέου με τις ίδιες μεθόδους, ώστε στο επόμενο βήμα να γίνει in vivo αξιολόγηση των εκχυλισμάτων και των κλασμάτων, σε μοντέλα φλεγμονής και υπερλιπιδαιμίας σε μύες. Μεταξύ των εκχυλισμάτων που δοκιμάστηκαν, η C. incana παρουσίασε in vitro τα υψηλότερα ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) (0.0834 mg/mL) και την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση (IC50 = 0.07 mg/mL), καθώς και την υψηλότερη αντιφλεγμονώδη δράση in vivo με 32% μείωση του οιδήματος. Επιπλέον, στο υπολιπιδαιμικό πρωτόκολλο, το ίδιο εκχύλισμα αύξησε την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) στο πλάσμα κατά 48.7% και μείωσε τη χοληστερόλη (41.3%), καθώς και τα τριγλυκερίδια (37.2%).