Το σύστημα των ενδογενών κανναβινοειδών ως θεραπευτικός στόχος για την αντιμετώπιση αμφιβληστροειδοπαθειών
Authors: Σπυριδάκος Δημήτριος 
Published: September 2023

Εισαγωγή: Η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ), αποτελεί μία από τις κυριότερες επιπλοκές του διαβήτη και χαρακτηρίζεται από εκτεταμένες βλάβες στα αγγεία του αμφιβληστροειδούς, την παρουσία φλεγμονής και την προοδευτική εκφύλιση διαφόρων κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, που οδηγεί σε μείωση της οπτικής οξύτητας και τύφλωση. Το βασικό γεγονός που οδηγεί στην εκδήλωση της ΔΑς, είναι η διαταραχή στην ομοιόσταση της «νευροαγγειακής μονάδας» (neurovascular unit) στον αμφιβληστροειδή, ένας όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει την στενή λειτουργική σύνδεση και αλληλεξάρτηση μεταξύ των νευρώνων, των γλοιακών κυττάρων και των αγγείων του αμφιβληστροειδούς. Η χρόνια υπεργλυκαιμία στον διαβήτη, μειώνει την έκφραση προστατευτικών νευροτροφικών παραγόντων και αυξάνει την έκφραση προφλεγμονωδών παραγόντων, όπως οι κυτοκίνες και ο αυξητικός παράγοντας των ενδοθηλιακών κυττάρων (VEGF). Αυτή η ανισορροπία συμβάλει στην προοδευτική καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων, που απαρτίζουν τα τοιχώματα των αγγείων και συνθέτουν τον εσωτερικό αιματο-αμφιβληστροειδικό φραγμό (ΑΑΦ), με αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων και την είσοδο στοναμφιβληστροειδή κυτταροτοξικών παραγόντων, που οδηγούν στην εκδήλωση φλεγμονής, ισχαιμίας και οξειδωτικού στρες. Παράλληλα παρατηρείται προοδευτική εκφύλιση των νευρικών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, μέσω αποπτωτικών μηχανισμών. Εξαιτίας των εκτεταμένων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τα πρώιμα στάδια της ΔΑς, παρατηρείται και το φαινόμενο της αντιδραστικής γλοίωσης, κατά το οποίο τα μικρογλοιακά κύτταρα, τα αστροκύτταρα και τα κύτταρα του Muller ενεργοποιούνται και ενδέχεται να διαμεσολαβήσουν προφλεγμονώδεις αποκρίσεις, ενισχύοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο την νευρο-φλεγμονή. Η παλαιότερη άποψη που θεωρούσε την διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια απλά μία μικρο-αγγειακή διαταραχή, έχει αναθεωρηθεί, καθ’ ότι πλέον οι μελέτες, λαμβάνουν σοβαρά υπόψη τους και την συνεισφορά της νευροεκφύλισης στην παθοφυσιολογία της νόσου. Ολοένα και περισσότερες ενδείξεις, υποδεικνύουν ότι το οξειδωτικό στρες, η νευροεκφύλιση και η φλεγμονή εκδηλώνονται κατά τα πρώιμα στάδια της νόσου και σε συγκεκριμένες περιπτώσεις προηγούνται των διαταραχών στα αγγεία. Οι υπάρχουσες θεραπείες για την ΔΑ (λέιζερ, ενδοφθάλμια έγχυση παραγόντων που αναστέλλουν τον VEGF και τα κορτικοστεροειδή), εφαρμόζονται σε μεταγενέστερα στάδια της νόσου, όπου η όραση του ασθενούς έχει πλέον υποστεί μεγάλη βλάβη, ενώ στοχεύουν κυρίως την αγγειακή συνιστώσα της νόσου και δευτερευόντως την φλεγμονή. Κατά τα αρχικά στάδια της νόσου, οι όποιες παρεμβάσεις περιορίζονται απλά στον έλεγχο των παραγόντων κινδύνου για την νόσο, όπως τα επίπεδα γλυκόζης και η υπέρταση. Η ανάγκη για την εύρεση φαρμακευτικών παραγόντων με νευροπροστατευτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις και η εφαρμογή τους κατά τα αρχικά στάδια γένεσης της ΔΑς είναι επιτακτική, καθ’ ότι θα μπορούσε να αποτελέσει μια καλή θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση της εξέλιξης της νόσου. To ΕΚΣ διαθέτει το ρόλο του νευρορρυθμιστή στο κεντρικό νευρικό σύστημα, καθώς είναι σε θέση να ελέγχει τασεοελεγχόμενους διαύλους ιόντων, την προσυναπτική απελευθέρωση του γλουταμινικού οξέος και την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, που συμμετέχουν σε σημαντικές κυτταρικές αποκρίσεις, όπως η επιβίωση ή η διαφοροποίηση του κυττάρου. Στον αμφιβληστροειδή, οι CB1 υποδοχείς εκφράζονται σε διάφορους τύπους νευρικών κυττάρων, όπως οι φωτοϋποδοχείς, τα βραχύινα και τα γαγγλιακά κύτταρα. Oι CB2 υποδοχείς εκφράζονται κατά κύριο λόγο σε κύτταρα της γλοίας, όπως τα κύτταρα του Muller και η μικρογλοία, όπου διαδραματίζουν κομβικό ρόλο στην ρύθμιση των [11]φλεγμονωδών αποκρίσεων. Οι προστατευτικές επιδράσεις που επιδεικνύει το ΕΚΣ σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στο νευρικό σύστημα, έχουν μελετηθεί εκτενώς. Στον αμφιβληστροειδή μελέτες αναφέρουν τις νευροπροστατευτικές ιδιότητες των κανναβινοειδών, μέσω της ενεργοποίησης των CB1 υποδοχέων, σε αρκετά μοντέλα αμφιβληστροειδοπαθειών. Ωστόσο, ευρήματα από μελέτες σε μοντέλα επιπλοκών του διαβήτη, υποδεικνύουν, ότι η ενεργοποίηση του CB1 υποδοχέα ενισχύει το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή, ενώ η χρήση ανταγωνιστών για τον CB1 υποδοχέα, μειώνει τον κυτταρικό θάνατο, το οξειδωτικό στρες, την φλεγμονή και παρουσιάζει αγγειοπροστατευτικές δράσεις, σε παθήσεις που σχετίζονται με το διαβήτη. Τα ευρήματα για τις προστατευτικές δράσεις που πρoκύπτουν από την αναστολή της ενεργοποίησης των CB1 υποδοχέων, αναφέρονται και σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στο οπτικό σύστημα. Εν αντιθέσει με τον CB1 υποδοχέα, η ενεργοποίηση του CB2 υποδοχέα των κανναβινοειδών, διαμεσολαβεί κατά κύριο λόγο προστατευτικές επιδράσεις, αφού είναι σε θέση να μειώνει την φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και τον κυτταρικό θάνατο. Οι προστατευτικές δράσεις των CB2 αγωνιστών έχουν επαληθευθεί σε μοντέλα επιπλοκών του διαβήτη, όπως η διαβητική νεφροπάθεια, καθώς και σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή. Στον αντίποδα, πλήθος μελετών αναφέρουν τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις αγωνιστών για τους κανναβινοειδικούς υποδοχείς (CB1/CB2) σε αρκετές αμφιβληστροειδοπάθειες και ειδικότερα σε μοντέλα διεγερσιτοξικότητας στον αμφιβληστροειδή. Πέραν των άμεσων αγωνιστών, η χορήγηση αναστολέων των μεταβολικών ενζύμων των ενδοκανναβινοειδών αποτελεί έναν έμμεσο τρόπο χειρισμού της σηματοδότησης τους μέσω των κανναβινοειδικών υποδοχέων. Παρά την πληθώρα ευρημάτων στον εγκέφαλο, στον αμφιβληστροειδή, τα ευρήματα για τις δράσεις των αναστολέων των ενζύμων μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών είναι ελάχιστα. Στόχος: Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, στόχος της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη των προστατευτικών ιδιοτήτων των κανναβινοειδών σε δύο μοντέλα αμφιβληστροειδοπαθειών και για τον σκοπό αυτό χωρίστηκε σε δύο μέρη: Α. Στο πρώτο μέρος χρησιμοποιήθηκε ένα in vivo μοντέλο δύο εβδομάδων, επαγόμενης από στρεπτοζoτοκίνη ΔΑς σε επίμυες, το οποίο προσομοιάζει στα πρώιμα στάδια της νόσου και εξετάστηκαν οι νευροπροστατευτικές, οι αντιφλεγμονώδεις και οι αγγειοπροστατευτικές δράσεις, της χορήγησης τοπικά μέσω σταγόνων: α) SR141716, ανταγωνιστή του CB1 υποδοχέα, β) ΑΜ1710, αγωνιστή του CB2 υποδοχέα και γ) συνδυασμού των παραπάνω, SR141716+AM1710. Β. Στο δεύτερο μέρος χρησιμοποιήθηκε ένα in vivo μοντέλοδιεγερσιτοξικότητας επαγόμενης από AMPA στον αμφιβληστροειδή επίμυων. Εξετάστηκαν οι νευροπροστατευτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης των ακόλουθων αναστολέων των μεταβολικών ενζύμων του ενδοκανναβινοειδούς 2-AG: α) AM12100 [αναστολέας της alpha/beta-Hydrolase domain containing 6 (ABHD6)] and b) AM11920 [διπλός αναστολέας της alpha/beta-Hydrolase domain containing 6/ monoacylglycerol lipase (ABHD6/MAGL)]. Μεθοδολογία: Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί και θηλυκοι SpragueDawley επίμυες (250-300 g). Για τα πειράματα της ΔΑ, η επαγωγή του διαβήτη πραγματοποιήθηκε με μία ενδοπεριτοναϊκή (i.p) χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης (STZ) (70mg/kg). Τα πειραματόζωα των οποίων η γλυκόζη ήταν >250 mg/dL θεωρούνταν διαβητικά. Τα προς μελέτη κανναβινοειδή χορηγήθηκαν καθημερινά για 14 ημέρες με την μορφή οφθαλμικών σταγόνων σε δοσολογία 10 mg/ml, ξεκινώντας δύο ημέρες μετά την χορήγηση του STZ. Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό που εφαρμόστηκε προέκυψαν [12]οι ακόλουθες ομάδες: 1. Ομάδα ελέγχου+ έκδοχο, 2.Διαβητικά+ έκδοχο, 3. Διαβητικά+ AM1710, 4. Διαβητικά+ SR141716, 5. Διαβητικά+ AM1710+SR141716. Μία ημέρα μετά την τελευταία χορήγηση των κανναβινοειδών τα πειραματόζωα θανατώθηκαν, οι οφθαλμοί τους αφαιρέθηκαν και απομονώθηκε ο αμφιβληστροειδής. Για την εκτίμηση της νευροπροστασίας πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές μελέτες έναντι του NFL(neurofilament, δείκτης αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων), της cleaved caspase 3 (δείκτης αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου), της bNOS (brain nitric oxide synthase, δείκτης βραχύινων κυττάρων) και του NT (nitrotyrosine, δείκτης οξειδωτικής βλάβης). Επιπλέον εκτιμήθηκε το πάχος του αμφιβληστροειδούς με την χρήση της ιστολογικής χρώσης Ηωσίνης/ Αιματοξυλίνης. Οι αντιφλεγμονώδεις δράσεις των κανναβινοειδών αξιολογήθηκαν με την χρήση αντισωμάτων έναντι της GFAP (Glial fibrillary acidic protein, δείκτης αστροκυττάρων και κυττάρων του Muller), της Iba1 (Ionized calcium-binding adaptor molecule 1, δείκτης μικρογλοίας) και την πραγματοποίηση ELISA για την προφλεγμονώδη κυτοκίνη TNFα (Tumor necrosis factor alpha). Για την αξιολόγηση των αγειοπροστατευτικών δράσεων των κανναβινοειδών πραγματοποιήθηκε μελέτη συνεντοπισμού του NT με τον αγγειακό δείκτη CD-31 (cluster of differentiation 31, δείκτης ενδοθηλιακών κυττάρων), καθώς και ELISA για τον VEGF (Vascular endothelial growth factor A). Επιπροσθέτως για την εκτίμηση της αγγειακής διαπερατότητας χρησιμοποιήθηκε η τεχνική Evans Blue. Για τα πειράματα της AMPA διεγερσιτοξικότητας τα ζώα έλαβαν ενδοϋαλοειδικές εγχύσεις του AMPA (42 nmol/οφθαλμό) είτε μόνου του, είτε σε συνδυασμό με το AM12100 (10-5-10-3 M) ή το AM11920 (10-6-10-4 M). Μία ημέρα μετά την πραγματοποίηση των εγχύσεων τα πειραματόζωα θανατώθηκαν και αφαιρέθηκαν οι ιστοί τους. Η νευροπροστασία αξιολογήθηκε με την χρήση αντισώματος έναντι της bNOS, ενώ για τις αντιφλεγμονώδεις δράσεις, χρησιμοποιήθηκαν οι δείκτες των γλοιακών κυττάρων GFAP και Iba1. Αποτελέσματα: Στο μοντέλο της διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας η θεραπεία με τα κανναβινοειδικά ανάλογα επέδειξε ποικίλες νευροπροστατευτικές αποκρίσεις. Αναλυτικότερα η επαγόμενη από τον διαβήτη μείωση του πάχους και της ανοσοδραστικότητας του NFL, αποκαταστάθηκε από την χορήγηση του AM1710, του SR141716 και του συνδυασμού τους. Επιπλέον τόσο το AM1710, όσο και το SR141716 αποκατέστησαν το μειωμένο πάχος του αμφιβληστροειδούς και ειδικότερα της INL. Ωστόσο, μόνο ο CB2 αγωνιστής, AM1710, ανέστειλε αποτελεσματικά τον αυξημένο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στην εσωτερική πυρηνική στιβάδα (INL). Το AM1710 και η συνδυαστική θεραπεία (AM1710+SR141716) προστάτευσαν επαρκώς τα βραχύινα κύτταρα που εκφράζουν b NOS, στην INL, χωρίς να παρατηρηθεί κάποια σημαντική επίδραση από τηνμεμονωμένη χορήγηση του SR141716. Ακόμη, oι τρεις κανναβινοειδικές θεραπείες ανέστειλαν τα αυξημένα επίπεδα της νιτροτυροσίνης (NT) στους διαβητικούς αμφιβληστροειδείς, με την μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα να επιτυγχάνεται από την συνδυαστική θεραπεία AM1710+SR141716. Σε επίπεδο φλεγμονής μόνο o CB2 αγωνιστής, AM1710, ήταν αποτελεσματικός. Ειδικότερα, το AM1710 μείωσε την αντιδραστικήμακρογλοία, τον αριθμό των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων, καθώς και τα επίπεδα της προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNFα στον αμφιβληστροειδή. Τα κανναβινοειδικά ανάλογα διαμεσολάβησαν επίσης και αγγειοπροστατευτικές δράσεις. Τόσο το AM1710 όσο και το SR141716, μείωσαν τα επίπεδα του VEGF και την αυξημένη αγγειακή διαρροή στον αμφιβληστροειδή των διαβητικών ζώων. Στο μοντέλο της AMPA διεγερσιτοξικότητας Το χειρισμός των ενδογενών επιπέδων της 2-AG εξυπηρετεί νευροπροστατευτικές δράσεις. Πιο συγκεκριμένα ο αναστολέας της ABHD6 (AM12100) και ο διπλός αναστολέας της ABHD6/MAGL (AM11920), προστάτευσαν τα bNOS κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, [13]με την μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα να παρατηρείται κατά την χορήγηση του διπλού αναστολέα, ΑΜ11920. Τέλος κατά την χορήγηση των αναστολέων προέκυψαν και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Ο διπλός αναστολέας της ABHD6/MAGL (AM11920), μείωσε τον αυξημένο αριθμό των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων στον αμφιβληστροειδή, ενώ και οι δύο αναστολείς (AM12100 & AM11920) παρουσίασανδοσοεξαρτώμενη επίδραση στην μείωση της ενεργοποίησης της μακρογλοίας, χωρίς να διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητά τους. Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, γίνεται κατανοητό ότι η ενεργοποίηση του CB2 υποδοχέακατά τα πρώιμα στάδια της ΔΑς, θα μπορούσε να αποτελέσει μια καλή στρατηγική για την αναχαίτιση της ανεξέλεγκτης εξέλιξης της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιπλέον, πέρα από τους άμεσους αγωνιστές, ο χειρισμός των ενδογενών κανναβινοειδών με την χορήγηση αναστολέων του μεταβολισμού των ενδογενών κανναβινοειδών, αποτελεί μια καλή επιλογή για τον περιορισμό της επαγόμενης από την διεγερσιτοξικότητα, νευροεκφύλισης και φλεγμονής, σε συνθήκες ισχαιμίας. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω στοιχεία, γίνεται κατανοητό ότι τα κανναβινοειδή αποτελούν τον ιδανικό υποψήφιο, στη βάση του οποίου θα μπορούσαν να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις για την αντιμετώπιση των αμφιβληστροειδοπαθειών. Προτού όμως γίνει αυτό, περαιτέρω μελέτες χρειάζονται προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου το ΕΚΣ ασκεί τις προστατευτικές του δράσεις και παράλληλα να ξεπεραστούν τυχόν περιορισμοί που προκύπτουν από την θεραπευτική χορήγηση των κανναβινοειδών.