Εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ειδικών για τον HIV CD4 και CD8 λεμφοκυττάρων στη διάρκεια της λοίμωξης προ και κατά τη διάρκεια της θεραπείας (HAART)
Authors: Χατζοπούλου Δήμητρα 
Published: September 2021

Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ποσοτική και ποιοτική εκτίμηση της ειδικής ανοσολογικής απάντησης σε HIV+ ασθενείς. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής (τετραμερή, ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών) με σκοπό την εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στη διάρκεια της HIV λοίμωξης και σε σχέση με τη θεραπεία.Ασθενείς: Μελετήθηκαν 94 δείγματα HIV(+) ασθενών που παρακολουθούνται στη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων του ΓΝΑ «Ευαγγελισμός» (61 ασθενείς ήταν θετικοί για το HLA-A2). Επιπλέον, μελετήθηκαν 32 μάρτυρες (Οι 10 ήταν θετικοί για το HLA-A2).Μέθοδοι: Για τον προσδιορισμό των ειδικών κυτταροτοξικών CD8+ Tλεμφοκυττάρων και των υποπληθυσμών τους ακολουθήθηκε η εξής μεθοδολογία:Έγινε χρώση πλήρους αίματος (σε EDTA) με τετραμερή, δηλ. διαλυτά συμπλέγματα από τέσσερα MHC μόρια συνδεδεμένα με αντιγονικό πεπτίδιο και φθορίζουσα ουσία που επιτρέπει την άμεση μέτρηση των ειδικών CD8+ T λεμφοκυττάρων.Χρησιμοποιήθηκαν τετραμερή σύμπλοκα MHC-Ι με πεπτίδια του HIV( HLA-A 0201HIV pol, HLA-A 0201 HIV gag) και του CMV (HLA-A 0201 CMV pp65). Τατετραμερή του CMV χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της διατήρησης ανοσιακής απάντησης σε αναμνηστικά αντιγόνα και τα τετραμερή του HIV χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ανοσιακής απάντησης στον HIV. Παράλληλα μελετήθηκαν οι υποπληθυσμοί των ειδικών για τον HIV και τον CMV CD8+ T λεμφοκυττάρων και του συνόλου τους και συγκεκριμένα τα CD8+/CD27+T-λεμφοκύτταρα καθώς και οι υποομάδες αυτών όσον αφορά τα CD45RA+ (παρθένα) και CD45RO+( μνημονικά)Τ-λεμφοκύτταρα. Για την ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ T λεμφοκυττάρων με ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών έγινε διέγερση πλήρους αίματος (σε ηπαρίνη)με πεπτίδια HIV, CMV και το υπεραντιγόνο σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB)ως θετικός μάρτυρας. Για συνδιέγερση χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα CD28 καιCD49d. Μετά επώαση έξι ωρών ακολούθησε η τεχνική χρώσης των ενδοκυττάριων κυτταροκινών και η μέτρηση στον κυτταρομετρητή ροής των CD4+CD69+IL-2+ και των CD4+CD69+IFN-γ+ κυττάρων, όπως και των CD4-CD69+IL-2+ και των CD4-CD69+IFN-γ+ κυττάρων, στο σύνολο των CD3+ T κυττάρων. Το CD69 χρησιμοποιήθηκε ως πρώιμος δείκτης ενεργοποίησης. Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε ότι τα ποσοστά των ασθενών με CMV-ειδικάCD8+ T λεμφοκύτταρα, που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο διατήρησης της ανοσιακής απάντησης σε αναμνηστικά αντιγόνα, ήταν σχεδόν διπλάσια (79,6%) από τα αντίστοιχα ποσοστά των ασθενών με HIV ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα (pol39,3% και gag 37,5%). Τα HIV- ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα, θετικά για τα πεπτίδια pol και gag, αποτελούνταν από ποικιλία υποπληθυσμών με υπεροχή τωνCD27+ κυττάρων όσον αφορά στο πεπτίδιο gag, ανεξάρτητα από την έκφραση τωνCD45RA ή CD45RO. Αντίθετα, στα CMV-ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα, υπερείχαν σαφώς τα CD27(-) κύτταρα, ανεξάρτητα από την έκφραση των CD45RA ή CD45RO.Επιπρόσθετα, η διατήρηση του πληθυσμού των CD27+ κυττάρων συσχετιζόταν με επιδείνωση των δεικτών παρακολούθησης της HIV λοίμωξης.Στους HIV+ ασθενείς η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 καιIFNγ, διατηρείτο μετά από διέγερση με το υπεραντιγόνο SEB που αφορούσε τοσύνολο των CD4+ T λεμφοκυττάρων (94,3%) και των CD8+ T λεμφοκυττάρων(91,4%). Όμως η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 και IFNγ έναντι τουCMV διατηρείτο σε μικρότερο συγκριτικά αριθμό HIV+ ασθενών (CD4+ T:72,2%και CD8+ T:68,6%) και σε ακόμη μικρότερο αριθμό ασθενών διατηρείτο η απάντηση έναντι του HIV(CD4+ T:58,8% και CD8+ T: 57,6%). Η ανίχνευση του συνδιασμούτων κυτταροκινών IL-2 και IFNγ που παράγονται από τα CD8+CD69+Tλεμφοκύτταρα, μετά από διέγερση με σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB) στους ασθενείς που βρίσκονταν υπό θεραπεία ήταν συχνότερη σε σχέση με εκείνους τους ασθενείς που δεν βρίσκονταν υπό αγωγή. Επιπλέον, η συνδιασμένη παραγωγή IL-2 και IFNγ από τα CD8+CD69+T λεμφοκύτταρα μετά από διέγερση με πεπτίδια HIVήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς υπό θεραπεία σε σχέση με τους ασθενείς που δεν είχαν λάβει θεραπεία Διαπιστώθηκε, δηλ. ότι η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 και IFNγ στο σύνολο των CD8+ T λεμφοκυττάρων μετά διέγερση με SEB, αλλά και με πεπτίδια HIV, ήταν μεγαλύτερη στους ασθενείς υπό αγωγή.Συμπεράσματα: Η ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD8+ T λεμφοκυττάρων με χρήση τετραμερών και η ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ Tλεμφοκυττάρων με ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών, με κυτταρομετρία ροής,είναι μέθοδοι που παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για την εκτίμηση της ειδικής ανοσιακής απάντησης έναντι του HIV. Η υπεροχή των CD27+HIV-ειδικών CD8+ Tλεμφοκυττάρων, μπορεί να σημαίνει ότι δεν ωριμάζουν επαρκώς και δεν είναι ικανά να αναστείλουν τον ιικό πολλαπλασιασμό, διότι αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν σε πλήρως ώριμα δραστικά κύτταρα. Επειδή οι δείκτες επιφανείας είναι ενδεικτικοί και δεν μπορούν να προβλέψουν με ακρίβεια το βαθμό διαφοροποίησης και τη λειτουργική ικανότητα των κυττάρων, περαιτέρω μελέτες θα προσδιορίσουν τον ακριβή ρόλο τους. Τέλος, βρέθηκε ότι η αντιρετροϊκή θεραπεία βελτιώνει τη λειτουργικότητα των HIV-ειδικών CD8+ T λεμφοκυττάρων, όσον αφορά την ικανότητα παραγωγής κυτταροκινών από αυτά, δηλ. διαπιστώθηκε η τάση ανάκαμψης του ανοσιακού συστήματος των ασθενών υπό θεραπεία.