Σύγχρονες μέθοδοι ολοκληρωμένης διαχείρισης αφλατοξινών στην καλλιέργεια του κελυφωτού φυστικιού
Authors: Καμινιάρης Μιχαήλ 
Published: October 2021

Οι αφλατοξίνες (Β1, B2, G1, G2) είναι μία κατηγορία μυκοτοξινών οι οποίες παράγονται κυρίως ως προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των μυκήτων Aspergillus section Flavi. Οι μύκητες αυτοί εντοπίζονται στη φύση ως σαπροφυτικοί αλλά και ως παρασιτικοί, ως εκ τούτου ανιχνεύονται σε μεγάλο εύρος φυτικών και ζωικών προϊόντων, τόσο προσυλλεκτικά όσο και μετασυλλεκτικά. Έχουν τη δυνατότητα να αναπτύσσονται σε πληθώρα υποστρωμάτων και η διαχείρισή τους δεν αποτελεί απλό διακύβευμα λόγω της σταθερότητάς τους. Παρουσιάζουν έντονη καρκινογόνο, μεταλλαξιογόνο, γονοτοξική, και τερατογόνο δράση προκαλώντας χρόνια ή οξεία τοξικότητα στον άνθρωπο και τα θηλαστικά. Τα κελυφωτά φιστίκια, που θεωρούνται ένας από τους πιο εύγευστους και διατροφικά άριστους ξηρούς καρπούς, μολύνονται συχνά από τοξικογόνα στελέχη Aspergillus section Flavi τα οποία παράγουν αφλατοξίνες. Η μόλυνση από αφλατοξίνες αποτελεί μία από τις σημαντικότερες αιτίες ποιοτικής και ποσοτικής υποβάθμισης των κελυφωτών φιστικιών παγκοσμίως. Κατά συνέπεια, στην Ευρώπη η ισχύουσα νομοθεσία έχει ορίσει ως ανώτατο επιτρεπτό όριο τα 12 μg/kg αφλατοξίνης Β1 και τα 15 μg/kg για το σύνολο των αφλατοξινών στα κελυφωτά φιστίκια που υφίστανται φυσική επεξεργασία και προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση.Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε αρχικά, διερεύνηση για την εύρεση κατάλληλων μη τοξικογόνων απομονώσεων A. flavus, ενδημικών επιφυτικών ζυμών και βακτηρίων, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως βιολογικοί παράγοντες διαχείρισης των αφλατοξινών στην καλλιέργεια των κελυφωτών φιστικιών. Απομονώθηκαν 1010 στελέχη μυκήτων Aspergillus section Flavi από καρπούς φιστικιών από 40 φιστικεώνες στην Αίγινα και στην Φθιώτιδα κατά το διάστημα 2014-2017. Μελετήθηκε η τοξικογόνος ικανότητά τους και η πληθυσμιακή διακύμανση των τοξικογόνων απομονώσεων, η οποία κυμάνθηκε από 42% ως 89% αναλόγως του έτους και της περιοχής. Επιπρόσθετα, 204 απομονώσεις κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες βλαστικής συμβατότητας (VCGs) με σκοπό την εύρεση κατάλληλων, γενετικά σταθερών, μη τοξικογόνων απομονώσεων για τη βιολογική διαχείριση των αφλατοξινών. Εντοπίστηκαν συνολικά 56 διακριτές ομάδες στην Ελλάδα, και η επικρατέστερη μη τοξικογόνος ομάδα μεταξύ αυτών, είναι ενδημική και στην Ιταλία και σε αυτήν ανήκει και ο μύκητας που περιέχεται στο AF-X1®, ένα ήδη εγκεκριμένο βιολογικό σκεύασμα στην Ιταλία για τη διαχείριση των αφλατοξινών στην καλλιέργεια του αραβοσίτου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro και in situ πειράματα για την εύρεση μη τοξικογόνων απομονώσεων με ικανότητα να παρεμποδίζουν την ικανότητα παραγωγής αφλατοξινών τοξικογόνων στελεχών, από όπου προέκυψαν απομονώσεις με ικανότητα 100% παρεμπόδισης. Τέλος, έγινε επιλογή δύο κατάλληλων απομονώσεων οι οποίες εφαρμόστηκαν σε πειράματα μικρής κλίμακας αγρού σε φιστικεώνες στην Αίγινα κατά τη διετία 2017-2018. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η παρεμπόδιση στη παραγωγή αφλατοξινών κυμάνθηκε από 76,7% έως 99,9%. Επιπλέον, απομονώθηκαν 292 ενδημικές επιφυτικές απομονώσεις ζυμών και 629 βακτηριακές απομονώσεις (με τις 161 να αξιολογούνται περαιτέρω), από καρπούς κελυφωτού φιστικιού από αγρούς στην Αίγινα (2014-2015) και αξιολογήθηκε η ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την ανάπτυξη και την in vitro παραγωγή αφλατοξινών. Οι πιο αποτελεσματικότερες απομονώσεις αξιολογήθηκαν σε in situ πειράματα και βρέθηκε ότι 7 απομονώσεις ζυμών και 1 βακτηριακή απομόνωση μπορούσαν να παρεμποδίσουν πλήρως την παραγωγή αφλατοξινών. Ακολούθησε μελέτη της επίδρασης των 7 αποτελεσματικών απομονώσεων ζυμών στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα AflR, που αποτελεί θετικό ρυθμιστή στη βιοσύνθεση των αφλατοξινών του A. flavus και παρατηρήθηκε πιθανή θετική συσχέτιση της εφαρμογής των ζυμών με την έκφραση του AflR. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ευαισθησία των αποτελεσματικών ζυμών σε χημικά μυκητοκτόνα σκευάσματα (Octave®, Geoxe®, Chorus®, Scala®, Fungazil®, Opera Νew®). Σχεδόν όλες οι ζύμες έδειξαν να είναι πολύ ευαίσθητες στα χημικά σκευάσματα που ελέγχθηκαν. Tέλος, επιλέχθηκαν δύο απομονώσεις ζυμών και μία βακτηριακή απομόνωση και αξιολογήθηκαν σε πειράματα μικρής κλίμακας αγρού σε 3 φιστικεώνες στην Αίγινα το 2017 και το 2018, ως προς την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την παραγωγή αφλατοξινών, με τα αποτελέσματα να υποδεικνύουν μείωση των παραγόμενων αφλατοξινών ως και 100%.Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η in vitro επίδραση 20 μυκητοκτόνων δραστικών ουσιών διαφόρων χημικών ομάδων (SDHIs, QoIs, ανιλοπυριμιδινών, DMIs, τριαζολών, ιμιδαζολών, φαινυλοπυρρολικών, γουανιδινών, δικαρβοξιμιδικών, χλωρονιτρικών, βενζιμιδαζολικών, διθειοκαρβαμικών και δίνιτρο-ανιλινών) ως προς την ικανότητα παρεμπόδισης την μυκηλιακής ανάπτυξης 10 ισχυρά τοξικογόνων ενδημικών στελεχών A. flavus. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δραστικές ουσίες pyrimethanil, cyprodinil, fludioxonil, prochloraz και imazalil ήταν αποτελεσματικές. Ακολούθησε αξιολόγηση 23 εμπορικών χημικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων ως προς την in situ ικανότητα μείωσης των παραγόμενων αφλατοξινών. Η παρεμπόδιση στην παραγωγή από ορισμένα σκευάσματα αφλατοξινών έφτασε το 100%. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση 3 εμπορικών σκευασμάτων εκ των πιο αποτελεσματικών (Switch®, Octave® και Scala®), σε 3 φιστικεώνες στην Αίγινα, κατά των παραγόμενων αφλατοξινών του μύκητα Aspergillus flavus σε σειρά δύο ετών (2017 και 2018), όπου ξανά η παρεμπόδιση έφθασε το 100%.Ακολούθως, αναπτύχθηκε ένα μηχανιστικό μοντέλο (AFLA-pistachio) με βάση τα μετεωρολογικά δεδομένα και τις προγενέστερες μολύνσεις από αφλατοξίνες σε φιστικεώνες, προκειμένου να προβλεφθεί η ανάπτυξη του Aspergillus flavus και η μόλυνση των φιστικιών με αφλατοξίνη Β1 σε προσυλλεκτικό επίπεδο. Το μοντέλο βασίστηκε στο μοντέλο AFLA-maize, που έχει δημιουργηθεί αντίστοιχα για την καλλιέργεια του αραβοσίτου, και η εσωτερική βαθμονόμηση έδειξε ότι το 72,1% των προβλέψεων ήταν σωστές. Στην εξωτερική βαθμονόμηση, το 95,6% των δειγμάτων προβλέφθηκαν σωστά από το μοντέλο.Τέλος, αναπτύχθηκε ένας ηλεκτροχημικός ανοσοαισθητήρας για τον προσδιορισμό της αφλατοξίνης Β1 σε κελυφωτά φιστίκια, με ακινητοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων αφλατοξίνης Β1 σε εκτυπωμένα ηλεκτρόδια χρυσού με χρήση τεχνολογίας σύνθετης εμπέδησης. Το όριο ανίχνευσης αφλατοξίνης Β1 για πρότυπα διαλύματα και τα δείγματα φιστικιού ήταν 0,5 ng/mL και 1 ng/mL, αντίστοιχα. Ο ανοσοαισθητήρας μπόρεσε να προσδιορίσει επιτυχώς τις συγκεντρώσεις αφλατοξίνης Β1 στο εύρος 4,56-50,86 ng/mL σε δείγματα φιστικιών. Η χρωματογραφική ανάλυση που ακολούθησε, αποκάλυψε ότι τα ανώτατα όρια ανίχνευσης του ανοσοαισθητήρα ήταν σε συγκεντρώσεις αφλατοξίνης Β1 χαμηλότερες από 345 ng/mL. Μελέτες εκλεκτικότητας έναντι της ωχρατοξίνης Α και της αφλατοξίνης Μ1 έδειξαν ότι ο προτεινόμενος ανοσοαισθητήρας για την ανίχνευση της αφλατοξίνης Β1, μπόρεσε να κάνει διάκριση μεταξύ των διαφόρων μυκοτοξινών που παράγονται από μύκητες του γένους Aspergillus. Συμπερασματικά, οι προαναφερθείσες ερευνητικές ενότητες αποτελούν μία υποσχόμενη πρόταση ενός σύγχρονου ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης αφλατοξινών στη καλλιέργεια του κελυφωτού φιστικιού.