Μελέτη της βιοτεχνολογικής παραγωγής της 1,3-προπανοδιόλης κατά την αύξηση του μικροοργανισμού Clostridium butyricum σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη
Authors: Χατζηφράγκου Αφροδίτη 
Published: August 2021

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της φυσιολογικής συμπεριφοράς του βακτηρίου C. butyricum VPI 1718 κατά την καλλιέργεια του σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Η γλυκερόλη είναι μια ανανεώσιμη πηγή άνθρακα η οποία παράγεται σε διεθνές επίπεδο ως το κύριο υποπροϊόν των βιομηχανιών παραγωγής σαπώνων και οινοπνευματωδών ποτών. Η αλματώδης ανάπτυξη που σημειώνει τα τελευταία χρόνια η βιομηχανία παραγωγής εναλλακτικού τύπου καυσίμων, όπως το βιολογικό πετρέλαιο (βιοντήζελ) και η βιολογική αιθανόλη, έχει ως απόρροια την σημαντική αύξηση των αποθεμάτων της γλυκερόλης, ως ενός υποπροϊόντος (ή/και αποβλήτου) χρήζοντος ανάγκης για περαιτέρω επεξεργασία. Υπό αυτό το πρίσμα, προκειμένου να διαπιστωθεί η καταλληλότητα της βιομηχανικής γλυκερόλης ως υπόστρωμα για την αύξηση του εν λόγω μικροοργανισμού, εξετάστηκε αρχικά η επίδραση που ασκούν οι διάφορες προσμίξεις που δύνανται να βρεθούν στην σύσταση της βιομηχανικής γλυκερόλης. Οι προσμίξεις που εξετάστηκαν αφορούσαν στα φωσφορικά άλατα του καλίου και του νατρίου (Na2HPO4, K2HPO4), στο χλωριούχο νάτριο (NaCl), στη μεθανόλη, καθώς επίσης και στο ελαϊκό οξύ. Κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε στατικές αναερόβιες φιάλες, διαπιστώθηκε ότι, σε αντίθεση με τα φωσφορικά άλατα, η παρουσία του χλωριούχου νατρίου σε συγκέντρωση ίση με 4.5% (κ.β. επί της γλυκερόλης) στο θρεπτικό μέσο άσκησε προφανή παρεμποδιστική επίδραση τόσο επί της αύξησης του βακτηρίου C. butyricum, όσο και της παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης. Ωστόσο, κατά την τέλεση της βιοδιεργασίας σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου και την προσθήκη αυξημένων ποσοτήτων χλωριούχου νατρίου (έως 30% κ.β.), δεν παρατηρηθήκαν φαινόμενα επίσχεσης της μικροβιακής αύξησης. Επίσης, ο εν λόγω μικροοργανισμός εμφάνισε ανεκτικότητα στην παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων μεθανόλης κατά την καλλιέργεια του σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, αλλά και σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας, όπου τελέστηκε προσθήκη μεθανόλης, στην κατάσταση δυναμικής ισορροπίας. Ωστόσο, η ύπαρξη του ελαϊκού οξέος στο θρεπτικό μέσο επέδρασε εμφανώς παρεμποδιστικά στην βιοχημική απόκριση του μικροοργανισμού, ενώ το όριο ανεκτικότητας του ως προς το εν λόγω λιπαρό οξύ προσδιορίστηκε στο 1% (κ.β.). Επιπρόσθετα, η απουσία αρνητικής επίδρασης της ύπαρξης στεαρίνης (μια λιπαρή ύλη με περιεκτικότητα 80% κ.β. σε στεατικό οξύ) στο μέσο της καλλιέργειας, υποδηλώνει ότι η ύπαρξη του διπλού δεσμού στο μόριο του ελαϊκού οξέος εμπλέκεται στον μηχανισμό παρεμπόδισης που ασκεί η παρουσία του μονοακόρεστου λιπαρού οξέος στο βακτήριο C. butyricum. Το δεύτερο στάδιο του πειραματικού σχεδιασμού περιλάμβανε την διερεύνηση της στρατηγικής αναεροβίωσης και της γεωμετρίας του βιοαντιδραστήρα, στην αύξηση του βακτηρίου C. butyricum και την δυνατότητα παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης, σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος και ημι-διαλείποντος έργου, συνολικού όγκου 1-, 3- και 4.5-L. Εν προκειμένω, κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, με συνεχή εμφύσηση αερίου αζώτου, διαπιστώθηκε η ικανότητα της επιτυχούς τέλεσης της προπανοδιολικής ζύμωσης, ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση της ακάθαρτης γλυκερόλης και την γεωμετρία του βιοαντιδραστήρα. Αντιθέτως, κατά την απουσία εμφύσησης αερίου αζώτου (ήτοι υπό συνθήκες «αυτό-παραγόμενης» αναεροβίωσης μέσω των αερίων που παράγονται κατά το μεταβολισμό), σημειώθηκαν αξιόλογες διαφοροποιήσεις στην βιοχημική απόκριση του βακτηρίου. Συγκεκριμένα, σε βιοαντιδραστήρα 1-L, η απουσία της εμφύσησης αερίου αζώτου ευνόησε την σύνθεση γαλακτικού οξέος, μέσω του ενζύμου της γαλακτικής αφυδρογονάσης. Το φαινόμενο αυτό εντοπίστηκε μόνο κατά την τέλεση της βιοδιεργασίας σε βιοαντιδραστήρα μικρού όγκου, οφειλόμενο πιθανότατα στην μερική παρεμπόδιση της φωσφοροκλαστικής αντίδρασης, εξαιτίας της επίτευξης ανεπαρκούς αναερόβιου περιβάλλοντος εντός του βιοαντιδραστήρα. Έτσι, κατά την ημι-συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου C. butyricum υπό συνεχή εμφύσηση αζώτου επετεύχθη μέγιστη παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης ίση με 70.8 g/L, ενώ υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης, παρήχθησαν μόνο 30.5 g/L της εν λόγω διόλης. Ως εκ τούτου, από τα ανωτέρω αποτελέσματα τεκμαίρεται ότι ο συνδυασμός της στρατηγικής αναεροβίωσης και της γεωμετρίας του βιοαντιδραστήρα, δύναται να μεταβάλλει την βιοχημική συμπεριφορά του εν λόγω στελέχους.Ιδιαίτερη μνεία δόθηκε στην εύρεση του μέγιστου σημείου ανεκτικότητας του μικροοργανισμού στην παρουσία της 1,3-προπανοδιόλης (παραγόμενης και εξωγενώς προστιθέμενης), αλλά και της επίδρασης που αυτή ασκεί στο προφίλ των κυριότερων λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, κατά τα οποία προστίθεντο διάφορες συγκεντρώσεις 1,3-προπανοδιόλης στην εκθετική φάση της αύξησης του βακτηρίου C. butyricum. Διαπιστώθηκε η ικανότητα του μικροοργανισμού να ανθίσταται στην ύπαρξη 70 g/L και πλέον βιολογικώς παραχθείσης και εξωγενώς προστιθέμενης 1,3-προπανοδιόλης. Η δυναμική προσαρμογής του μικροοργανισμού σε περιβάλλον με υψηλές συγκεντρώσεις 1,3-προπανοδιόλης αξιολογήθηκε και κατά την αύξηση του σε συνεχή συστήματα καλλιέργειας. Όσον αφορά στην σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου, διαπιστώθηκε ότι η προσθήκη της εν λόγω διόλης κατά την ασυνεχή καλλιέργεια του μικροοργανισμού ευνόησε την σύνθεση ακόρεστων λιπιδίων. Αντιθέτως, κατά την συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου, η προστιθέμενη 1,3-προπανοδιόλη κατά την κατάσταση δυναμικής ισορροπίας, ευνόησε την βιοσύνθεση κορεσμένων λιπαρών οξέων. Ωστόσο, η επαγόμενη αύξηση του ποσοστού των κορεσμένων λιπαρών οξέων από την προσθήκη της 1,3-προπανοδιόλης, βρέθηκε να αίρεται κατά το μεταβατικό στάδιο της καλλιέργειας και μέχρι την επίτευξη στάσιμου σταδίου, ως αποτέλεσμα της βαθμιαίας απομάκρυνσης της διόλης από τον χημειοστάτη.Εν συνεχεία, ακολούθησε η μελέτη της βιοχημικής απόκρισης του βακτηρίου C. butyricum κατά την συνεχή καλλιέργεια του, υπό διαφορετικούς ρυθμούς αραίωσης και συγκεντρώσεως γλυκερόλης, τόσο σε συνάρτηση με την παραγόμενη 1,3-προπανοδιόλη, όσο και με την μεταβολή της σύστασης των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού. Αρχικά, ο πειραματικός σχεδιασμός προέβλεπε την εφαρμογή διαφορετικών ρυθμών αραίωσης (D) με σταθερή συγκέντρωση της ακάθαρτης γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο εισόδου της συνεχούς καλλιέργειας, υπό συνθήκες συνεχούς εμφύσησης αζώτου αλλά και αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Διαπιστώθηκε ότι η απόδοση του μικροοργανισμού ήταν σαφώς καλύτερη κατά την επίτευξη αναερόβιου περιβάλλοντος με συνεχή παροχή αερίου αζώτου, ενώ κατά την αυτό-παραγόμενη αναεροβίωση σημειώθηκαν αξιοσημείωτες βιοχημικές μεταβολές, οφειλόμενες ως επί το πλείστον στην αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτικού οξέος. Μάλιστα, στις εν λόγω συνθήκες καλλιέργειας, η παραγωγή του γαλακτικού οξέος βρέθηκε να ευνοείται κατά την εφαρμογή χαμηλών ρυθμών αραίωσης. Επιπρόσθετα, κατά εφαρμογή αυξανόμενων συγκεντρώσεων της ακάθαρτης γλυκερόλης στον χημειοστάτη με ταυτόχρονη διατήρηση σταθερού ρυθμού αραίωσης, ο μικροοργανισμός εμφάνισε ικανοποιητική επίδοση κατά την καλλιέργεια του με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο εισόδου ίση με 80 g/L. Συγκεκριμένα, κατά την επίτευξη κατάστασης δυναμικής ισορροπίας, εντός του χημειοστάτη βρίσκονταν 31.1 g/L 1,3-προπανοδιόλης, με τον αντίστοιχο συντελεστή απόδοσης να λαμβάνει την τιμή των 0.54 g ανά g καταναλωθέντος υποστρώματος. Επιπροσθέτως, μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών καλλιέργειας (ρυθμός αραίωσης, αρχική συγκέντρωση ακάθαρτης γλυκερόλης και στρατηγική της εφαρμογής αναερόβιου περιβάλλοντος στον βιοαντιδραστήρα) στην σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού. Ως εκ τούτου, παρουσιάστηκαν διαφοροποιήσεις, σχετιζόμενες με την συνεχή εμφύσηση ή μη αερίου αζώτου κατά την διάρκεια της συνεχούς καλλιέργειας του. Ειδικότερα, η ύπαρξη αερίου αζώτου στο περιβάλλον της καλλιέργειας κατέστησε το κλάσμα των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού πιο κορεσμένο, εν συγκρίσει με την αντίστοιχη κατανομή της σύστασης των λιπιδίων κατά την επίτευξη στάσιμου σταδίου υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Ακόμη, διαπιστώθηκε ότι κατά την συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου, η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα είχε ως αποτέλεσμα να καταστεί η σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου σαφώς πιο κορεσμένη.Τέλος, στη παρούσα διατριβή διερευνήθηκε και προτάθηκε η δυνατότητα της διεξαγωγής της προπανοδιολικής ζύμωσης υπό μη στείρες συνθήκες καλλιέργειας, ως μια αξιοποιήσιμη μέθοδος στο εγχείρημα της βιομηχανικής εφαρμογής της εν λόγω βιοδιεργασίας. Για τον σκοπό αυτό αξιολογήθηκε η επίδοση του βακτηρίου C. butyricum σε διάφορα συστήματα καλλιέργειας. Συγκεκριμένα, κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, διαπιστώθηκε η επιτυχής ολοκλήρωση της βιοδιεργασίας, τόσο κατά την χρήση διαφόρων ακάθαρτων γλυκερολών ποικίλης σύστασης και προελεύσεως, όσο και κατά την τέλεση της προπανοδιολικής ζύμωσης με αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος. Ιδιαίτερα ικανοποιητική κρίθηκε η επίδοση του μικροοργανισμού κατά την ημι-συνεχή καλλιέργεια του, όπου παρήχθησαν τελικώς 67.9 g/L 1,3-προπανοδιόλης, με τον συντελεστή απόδοσης ΥPDO/S να λαμβάνει την τιμή 0.55 g/g. Τέλος, η δυνατότητα εφαρμογής της προπανοδιολικής ζύμωσης υπό μη στείρες συνθήκες αξιολογήθηκε κατά την συνεχή καλλιέργεια του μικροοργανισμού, όπου και διαπιστώθηκε η σταθερότητα της βιοδιεργασίας ενώ καθαρότητα της καλλιέργειας επικυρώθηκε με την εφαρμογή της ανάλυσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και της ηλεκτροφόρησης σε διαβαθμισμένο αποδιατακτικό πήκτωμα (PCR-DGGE).