Ενζυμική μηχανική και ανάπτυξη βιοτεχνολογικών εφαρμογών σε διαγνωστικά και θεραπευτικά ένζυμα
Authors: Ιωάννου Ελισάβετ 
Published: December 2022

Τα ένζυμα αξιοποιούνται σε ευρύ φάσμα βιοτεχνολογικών, βιομηχανικών, βιοϊατρικών και φαρμακευτικών εφαρμογών. Η ταχύρυθμη πρόοδος της μοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας κατά τις τελευταίες δεκαετίες έχει καταστήσει εφικτή τη τροποποίηση και τη βελτιστοποίηση υφιστάμενων ενζύμων μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής, αλλά και τον ορθολογικό σχεδιασμό νεοσύστατων βιοκαταλυτών με εξειδικευμένες λειτουργίες. Στόχος της διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη καινοτόμων βιοκαταλυτών με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, οι οποίοι δύναται να χρησιμοποιηθούν σε εύρος βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Οι τροποποιημένοι βιοκαταλύτες αναπτύχθηκαν αξιοποιώντας πολύπλευρες διεπιστημονικές προσεγγίσεις με εργαλεία της ενζυμικής μηχανικής, της αναλυτικής χημείας, της δομικής βιολογίας/βιοϋπολογιστικής και της βιονανοτεχνολογίας. Ο πρώτος και κύριος πυλώνας της διατριβής εστίασε στην τροποποίηση των πολυλειτουργικών ενζύμων αποτοξίνωσης, τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs), οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί σε διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές. Οι GSTs αποτελούν ένζυμα της Φάσης ΙΙ της κυτταρικής αποτοξίνωσης και καταλύουν τη σύζευξη του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης με ενδογενείς ή εξωγενείς ηλεκτρονιόφιλες υδρόφοβες ενώσεις, για τον σχηματισμό πιο υδατοδιαλυτών συμπλόκων που απομακρύνονται ευκολότερα από το κύτταρο. Εντοπίζονται στους περισσότερους οργανισμούς και έχουν συνδεθεί με την εμφάνιση φαινομένων μειωμένης αποτελεσματικότητας φαρμάκων στον άνθρωπο αλλά και αντοχής σε ζιζανιοκτόνα σε φυτικούς οργανισμούς. Η εκτεταμένη εφαρμογή ζιζανιοκτόνων για το μεταφυτρωτικό έλεγχο καλλιεργειών έχει συνδράμει στην εμφάνιση πληθυσμών ζιζανίων που εμφανίζουν αντοχή σε ζιζανιοκτόνα με διαφορετικούς τρόπους δράσης και περιορισμένες ομοιότητες στη χημική δομή (Μultiple Ηerbicide Resistance: MHR). Το φαινόμενο MHR σχετίζεται με τον ενισχυμένο μεταβολισμό και την ικανότητα αποτοξίνωσης των ενδογενών ενζύμων των ζιζανίων, όπως και οι GSTs της phi κλάσης (GSTFs) στα Alopecurus myosuroides και Lolium rigidum. Τα ένζυμα αυτά αποτρέπουν το ζιζανιοκτόνο να φθάσει στη θέση-στόχο, χωρίς να δρουν απευθείας σε αυτή. Στην παρούσα εργασία τροποποιήθηκαν επιλεγμένες GSTFs μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής, με σκοπό την μελέτη της εξέλιξης των μηχανισμών του MHR, αλλά και την βελτίωση των καταλυτικών και δομικών τους ιδιοτήτων. Μέσω in vitro κατευθυνόμενης εξέλιξης (DNA shuffling), αναπτύχθηκε μια βιβλιοθήκη GSTF μορφών μέσω ανασυνδυασμού τμημάτων επιλεγμένων gstf γονιδίων με υψηλή ομολογία, τα οποία προέρχονταν από τα MHR ζιζάνια Alopecurus myosuroides και Lolium rigidum και τα καλλιεργούμενα σιτηρά Triticum durum και Hordeum vulgare. Οι GSTFs των σιτηρών εμφάνιζαν σημαντικά υψηλότερες καταλυτικές σταθερές συγκριτικά με εκείνες των ζιζανίων, συνεπώς οι επιλεγμένες ενζυμικές μορφές αποτέλεσαν ιδανικό μοντέλο για τη συσχέτιση της δομής και λειτουργίας μέσω μεθόδων κατευθυνόμενης εξέλιξης. Κατά το DNA shuffling, τα gstf γονίδια άγριου τύπου υποβλήθηκαν σε πέψη με DNAse και τα τμήματα που προέκυψαν επανενώθηκαν μέσω PCR χωρίς προσθήκη εξωγενών εκκινητών, σχηματίζοντας τελικά χιμαιρικές ενζυμικές μορφές. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σάρωση αποικιών ως προς την ενζυμική δραστικότητα για τη σύσταση βιβλιοθήκης χιμαιρικών ενζύμων. Οι ενζυμικές παραλλαγές με την υψηλότερη ειδική δραστικότητα καθαρίστηκαν με μεταλλοχηλική χρωματογραφία και χαρακτηρίστηκαν ως προς τα κινητικά τους χαρακτηριστικά, τη θερμοσταθερότητα και την δυνατότητα αναστολής της δράσης τους με παρουσία χλωρακεταμιδικών ζιζανιοκτόνων, για τα οποία εμφάνιζαν εκλεκτικότητα τα ένζυμα αγρίου τύπου. Η μελέτη ανέδειξε την ενζυμική μορφή sh101 με επταπλάσια βελτίωση στην καταλυτική σταθερά και βελτιωμένη θερμική σταθερότητα κατά 8,3 ℃, και την sh155 με τρεις φορές υψηλότερη ευαισθησία αναστολής προς το ζιζανιοκτόνο butachlor. Επιπροσθέτως, η επίλυση των κρυσταλλικών δομών μέσω ακτίνων Χ των παραλλαγών sh101 και sh155 του DNA shuffling επέτρεψε τον εντοπισμό δομικών στοιχείων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της kcat, στη θερμική σταθερότητα και την ανασταλτική ισχύ. Η αυτοσυναρμολόγηση πρωτεϊνών (protein self-assembly) έχει χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη δομικά σταθερών, βιοσυμβατών και βιοαποδομήσιμων νανοϋλικών, εμπνευσμένων από φυσικές πρωτεϊνικές δομές οι οποίες ενέχουν δομικό, καταλυτικό ή σηματοδοτικό ρόλο. Με στόχο την αυτοσυναρμολόγηση λειτουργικών και σταθερών ενζυμικών νανοσυμπλόκων, επιλέχθηκε προς τροποποίηση η ενζυμική παραλλαγή sh101 με τα βέλτιστα κινητικά χαρακτηριστικά, και η sh155 η οποία, εκτός από βελτιωμένες κινητικές παραμέτρους, παρουσίαζε υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία για το ζιζανιοκτόνο butachlor. Το sh155, λόγω της σταθερότητας που αναμένεται να αποκτήσει κατά την αυτοσυναρμολόγηση, αποτελεί ιδιαίτερα υποσχόμενο μέσο για την ανάπτυξη ενός ενζυμικού βιοαισθητήρα προσδιορισμού του butachlor σε δείγματα νερού. Στο εγχείρημα της αυτοσυναρμολόγησης GSTF νανοσυμπλεγμάτων χρησιμοποιήθηκε μια μακροκυκλική ένωση (ξενιστής) ως εκλεκτική “κόλλα” μεταξύ των ενζυμικών μορίων μετά από προσθήκη κατάλληλου αμινοξικού επιτόπου στο Ν-τελικό τους άκρο. Ο επίτοπος που επιλέχθηκε παρουσιάζει εκλεκτικότητα και υψηλή συγγένεια δέσμευσης με το μόριο-ξενιστή. Συνεπώς, μέσω αλληλεπιδράσεων ξενιστή-ξενιζομένου (host-guest) υλοποιήθηκε η σύνθεση GSTF νανοσυμπλόκων. Αρχικά, οι επισημασμένες με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη GSTFs εμφάνισαν μείωση στην ένταση φθορισμού τους, μετά την προσθήκη του ξενιστή σε διαφορετικές στοιχειομετρικές αναλογίες, η οποία συνδέθηκε με την καθίζηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων και τον ολιγομερισμό των GSTF μορίων. Η παρατήρηση των επισημασμένων GSTFs, μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας (CLSM), ανέδειξε το σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στη μικροκλίμακα. Επιπλέον, η μορφολογία των δειγμάτων μελετήθηκε περαιτέρω στην νανοκλίμακα με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Η ανάλυση των δειγμάτων με HPLC μοριακού ηθμού, σε συνδυασμό με την επίλυση μιας κρυσταλλικής δομής των πρωτεϊνικών νανοσυμπλόκων, αποκάλυψαν ότι ευνοείται ο σχηματισμός καθορισμένων ολιγομερών συμπλεγμάτων στις υπό μελέτη συνθήκες. Τα ενζυμικά νανοσυμπλέγματα που χαρακτηρίστηκαν διατηρούσαν τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Η παραπάνω μελέτη συνέβαλε στην ανάπτυξη μεθόδων ορθολογικού σχεδιασμού μέσω αλληλεπιδράσεων ξενιστή-ξενιζομένου για την αυτοσυναρμολόγηση καινοτόμων GSTF νανοδομών με βελτιωμένες ιδιότητες για βιοτεχνολογικές και βιοϊατρικές εφαρμογές.Το πεδίο των ενζυμικών βιοαισθητήρων έχει αναπτυχθεί εκτενώς τις τελευταίες δεκαετίες, αποδίδοντας οικονομικές και εύχρηστες μεθόδους για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση μεγάλου εύρους ενώσεων-στόχων, με εφαρμογή στη βιοϊατρική, στην ανίχνευση περιβαλλοντικών ρύπων, στην ασφάλεια τροφίμων και στον έλεγχο βιομηχανικών διεργασιών. Η εντατικοποίηση χρήσης φυτοφαρμάκων στις γεωργικές πρακτικές οδηγεί στη μόλυνση των υδάτινων πεδίων από γεωργικά υπολείμματα. Ένα εγχείρημα της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός ενζυμικού βιοαισθητήρα για τον προσδιορισμό του χλωρακεταμιδικού ζιζανιοκτόνου butachlor σε δείγματα νερού. Στη μέθοδο αξιοποιήθηκε το εξαιρετικά σταθερό νανοσύμπλεγμα της ενζυμικής μορφής sh155, η οποία εμφάνιζε εκλεκτικότητα και ευαισθησία για το butachlor. Η ακινητοποίηση του GSTF νανοσυμπλέγματος πραγματοποιήθηκε μέσω ομοιοπολικής σύνδεσης σε κατάλληλο φορέα μετά από αντίδραση με γλουταραλδεΰδη. Ο συνδυασμός της τεχνολογίας ακινητοποίησης σε κατάλληλο πολυμερές υλικό με την υπερμοριακή GSTF δομή απέδωσε στο σύστημα εξαιρετική σταθερότητα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό του butachlor σε δείγματα νερού βασίστηκε στην αναστολή της δράσης των GSTFs και αποτελεί μια χαμηλού κόστους επιλογή για σάρωση μεγάλου όγκου δειγμάτων έναντι των συμβατικών αναλυτικών χρωματογραφικών τεχνικών, με επαρκή ευαισθησία για την ανίχνευση συγκεντρώσεων butachlor έως 0,18 μg/mL.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η πρωτεολυτική ικανότητα του Arthrospira platensis (κοινή σπιρουλίνα), με σκοπό την ανάπτυξη ενός ενζυμικού σκευάσματος με πρωτεολυτική δράση και πιθανή δερματική χρήση. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα αποτελούν τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα ένζυμα βιομηχανικής κλίμακας, ενώ διαθέτουν ποικίλες εφαρμογές στην ιατρική και στη κοσμητολογία. Η μελέτη επικεντρώθηκε στην επίδραση του pH και της παρουσίας δισθενών ιόντων μέταλλων στην πρωτεολυτική δράση σε διαφορετικά υποστρώματα. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα του εκχυλίσματος αξιολογήθηκαν μέσω ζυμογραφίας, η οποία υπέδειξε την ύπαρξή τουλάχιστον δυο διαφορετικών πρωτεολυτικών ενζύμων. Ακόμα, αναπτύχθηκε ήπια μέθοδος διαχωρισμού των συστατικών του εκχυλίσματος, με ικανοποιητική καθαρότητα και απόδοση, μέσω υδατικού διφασικού συστήματος (ATPS). Τελικά, το εκχύλισμα του A. platensis χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ενός σκευάσματος υδρογέλης, όπου η πρωτεολυτική του δράση μπορεί να συμβάλει στην τοπική βελτίωση της επιδερμικής επιφάνειας ως απολεπιστικός παράγοντας. Οι θαλάσσιοι πόροι θεωρούνται ασφαλείς, με αμελητέα κυτταροτοξικότητα για τον άνθρωπο, ενώ είναι πλούσιοι σε βιοδραστικές ουσίες με οφέλη για το δέρμα. Το σκεύασμα υδρογέλης που κατασκευάστηκε έδρασε ως μέσο εγκλωβισμού των πρωτεολυτικών ενζύμων του κυανοβακτηρίου, βελτιώνοντας σημαντικά την σταθερότητά τους στο χρόνο, γεγονός που αποτελεί πλεονέκτημα στην ανάπτυξη προϊόντων με ενζυμική δράση.