Time-resolved FTIR και ηλεκτροχημικές μελέτες των cbb3, aa3-600 και ba3 οξειδασών
Authors: Σταυράκης Σταύρος 
Published: August 2021

Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο χαρακτηρισμός της δομής και της δυναμικής του διπυρηνικού κέντρου καθώς και ο προσδιορισμός των δυναμικών αναγωγής των κυτοχρωμικών και κινολικών οξειδασών. Σε αυτή την εργασία περιγράφεται η κινητική μελέτη του συμπλόκου cbb3-CO με την τεχνική της step-scan FTIR φασματοσκοπίας. Το κυτόχρωμα cbb3 είναι η μοναδική αιμοχαλκοξειδάση στην οποία η διάσπαση του CuB-CO συμπλόκου συνοδεύεται από το σχηματισμό του Fe-CO συμπλόκου. Τα time-resolved FT-IR φάσματα της φωτοδιάσπασης του CO στη cbb3 κυτοχρωμική οξειδάση δείχνουν ότι η ν(CO) δόνηση τάσης του CuB στους 2064 cm-1 είναι ίδια με εκείνη του κυτοχρώματος αα3 παρόλο που το κυτόχρωμα cbb3 δεν περιέχει το cross-link Ηis-Tyr244 και τη φαρνεσυλική αλυσίδα. Οι ταχύτητες που υπολογίσαμε για τη διάσπαση του CO από το CuB (t1/2 = 120 μs) και την επαναδέσμευση του στην αίμη b3 (t1/2 = 150 μs) δείχνουν ότι το καθοριστικό στάδιο για την επαναδέσμευση του CO στην αίμη b3 είναι ο αποσχηματισμός του CuB-CO συμπλόκου. Σαν ένα πρώτο βήμα για την κατανόηση της αντίδρασης του κυτοχρώματος cbb3 με το NO είναι ο χαρακτηρισμός του διπυρηνικού κέντρου κατά τη δέσμευση του ΝΟ. Γι αυτό το λόγο μελετήσαμε με φασματοσκοπία UV-Vis και FTIR τη δομή του υποκατεστημένου με ΝΟ κυτοχρώματος cbb3 και τη συγκρίνουμε με αυτή των ΝΟ-συμπλόκων της αναγωγάσης του ΝΟ (ΝΟR) και της μυοσφαιρίνης. Τα δεδομένα δείχνουν ότι το ΝΟ δεσμεύεται αποκλειστικά στην αίμη b3 και όχι στο CuB. Αυτή είναι η πρώτη δονητική μελέτη της δέσμευσης του ΝΟ σε αιμοχαλκοξειδάση που βρίσκεται στην οξειδωμένη κατάσταση. Η απελευθέρωση του ΝΟ από την αίμη b3 του cbb3 δείχνει ότι το περιβάλλον της αίμης b3 στο cbb3 είναι λιγότερο πολικό από αυτό της NOR και ότι η ανοιχτή δομή του διπυρηνικού κέντρου b3/CuB, συγκρινόμενη με τη κλειστή δομή του διπυρηνικού κέντρου b3/μη-αιμικός Fe του NOR, διευκολύνει τη θερμική απελευθέρωσή του. Στην εργασία αυτή αποδεικνύουμε για πρώτη φορά την ύπαρξη μιας μικτού σθένους αίμη Fe3+/Cu1+-CO δομή. Σε αντίθεση με όλες τις γνωστές αιμοχαλκοξειδάσες, παρουσιάζουμε εδώ άμεση απόδειξη ότι προσθήκη του Ο2 στο πλήρως ανηγμένο αίμη-Fe2+-CO σύμπλοκο αντικαθιστά το CΟ από την αίμη b Fe2+ παράγοντας ένα σταθερό αίμη Fe3+/Cu1+-CO διπυρηνικό σύμπλοκο. Αυτή η ανίχνευση του σε ισορροπία Cu1+-CO συμπλόκου, δεν έχει παρατηρηθεί προηγουμένως σε οποιαδήποτε δομικά γνωστά αιμοχαλκοξειδάση και μοντέλα αίμης- Cu. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήσαμε την φασματοσκοπία time-resolved step-scan FTIR για τη διερεύνηση της δομής και της δυναμικής του διπυρηνικού κέντρου του κυτοχρώματος αα3-600 του Bacillus subtilis. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μεταβολές που συμβαίνουν στο εγγύς περιβάλλον της αίμης α3 δεν επηρεάζουν την αποδέσμευση του CO από το CuB. Επιπλέον δείχνουν ότι υπάρχει ένα ενεργειακό φράγμα το οποίο εμποδίζει την επαναδέσμευση του CO στην αίμη α3 και ότι η απόσπαση του CO από το CuB συμβαίνει μέσω της απελευθέρωσης του στο διαλύτη πριν επαναδεσμευθεί στην αίμη α3. Για την ερμηνεία των δεδομένων μας, προτείνουμε ένα μοντέλο για τη δυναμική του διπυρηνικού κέντρου a32+ /CuB1+ μετά τη φωτόλυση του CO Με τη φασματοηλεκτροχημική τεχνική προσδιορίσαμε τα δυναμικά αναγωγής των οξειδοαναγωγικών κέντρων του κυτοχρώματος cbb3. Στη συνέχεια γίνεται μια σύγκριση του δυναμικού αναγωγής της αίμης b3 ανάμεσα στο κυτόχρωμα cbb3 σχετικά με το περιβάλλον της αίμης πριν την αντίδραση με το ΝΟ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πλήρης αναγωγή του διπυρηνικού κέντρου στο ένζυμο αυτό είναι θερμοδυναμικά ευνοούμενη. Αυτό σημαίνει ότι ο μηχανισμός ενεργοποίησης του ΝΟ πραγματοποιείται με ένα πλήρως ανηγμένο διπυρηνικό κέντρο αίμης b3/CuB. Αντίθετα η τιμή του δυναμικού αναγωγής της αίμης b3 της NOR δηλώνει ότι η αναγωγή της αίμης του διπυρηνικού κέντρου είναι μη ευνοϊκή από τους φυσιολογικούς δότες ηλεκτρονίων. Ο μηχανισμός της αναγωγής του ΝΟ σε Ν2Ο που καταλύεται από το κυτόχρωμα bα3 δεν έχει και τη νιτρική αναγωγάση έτσι ώστε να εξάγουμε συμπεράσματα ακόμη διευκρινιστεί Σαν ένα πρώτο βήμα ως προς τη διερεύνηση αυτού του μηχανισμού χρησιμοποιήσαμε τη φασματοηλεκτροχημική τεχνική για να μελετήσαμε το σύμπλοκο του ανηγμένου κυτοχρώματος bα3 με το ΝΟ. Γνωρίζοντας τον αριθμό των ηλεκτρόνιων που δίνουμε ή αποσπούμε ηλεκτροχημικά, είμαστε σε θέση να εκτιμήσουμε τις πιθανές καταστάσεις δέσμευσης του υποκαταστάτη και την οξειδωτική τους κατάσταση, κατά την ηλεκτροχημική οξείδωση του πλήρως ανηγμένου συμπλόκου bα32+-ΝΟ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το κυτόχρωμα bα3 επιτελεί την καταλυτική ανάγωγη δύο ηλεκτρονίων του ΝΟ σε Ν2Ο και η οξείδωση της αίμης b αποτελεί το καθοριστικό στάδιο για την αναγωγή του ΝΟ.