PHARMACOKINETICS OF 7-O-GENTIOBIOZID FORMONONETIN DETERMINES ITS HEMOSTATIC ACTIVITY IN RATS
Authors: Зверев Я.Ф. , Федореев С.А. , Кудинов А.В. , Тарбеева Д.В. , Кулеш Н.И. , Григорчук В.П. , Замятина С.В. 
Published: February 2021

Цели исследования: 1) изучить сравнительное влияние 7-О-гентиобиозида формононетина (ГБФ) из корней M. amurensis на показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в условиях длительного энтерального и внутрибрюшинного введения крысам; 2) определить продукты метаболизма ГБФ в крови и моче крыс в условиях энтерального и внутрибрюшинного введения.
Материалы и методы. Исследование выполнено на самцах крыс Wistar массой 220–280 г. В первой серии экспериментов животные на протяжении 10 дней получали ГБФ энтерально и внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. По окончании периода введения определяли АДФ-стимулируемую агрегацию тромбоцитов, значения активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, тромбинового времени, содержание фибриногена, растворимых фибрин-мономерных комплексов, активность антитромбина III. Для интегрального анализа системы гемостаза применяли тромбоэластометрию. Во второй серии экспериментов ГБФ вводили внутрь 6 животным (1 группа) в дозе 150 мг/кг. Отбирали кровь через 2 и 4 часа после введения ГБФ, собирали мочу за 8 часов после введения ГБФ. У 6 животных (2 группа) производили те же манипуляции после внутрибрюшинного введения ГБФ в такой же дозе. Осуществляли специальную подготовку взятых проб для хромато-массспектрометрического анализа; полученные фракции анализировали на хромато-масс-спектрометре Shimadzu HPLC–PDA–MS. Масс-спектры регистрировали с использованием метода электрораспылительной ионизации в режиме положительных и отрицательных ионов (1,50 кВ) в диапазоне m/z 100–800. Полученные результаты обрабатывали статистическим методом вариационных рядов с использованием критерия Манна-Уитни.
Результаты. Изофлавоноид ГБФ оказывал существенное влияние на процессы тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза у крыс при его энтеральном введении, т. е. в условиях попадания ГБФ в желудочно-кишечный тракт, ингибируя процессы агрегации тромбоцитов и свертывания крови. Было зафиксировано почти 10-кратное снижение
АДФ-агрегации по сравнению с показателями контрольных животных. При исследовании коагуляционного гемостаза энтеральное применение ГБФ сопровождалось отчетливым и глубоким сдвигом основных учитываемых хронометрических показателей. Принципиально иная картина наблюдалась при внутрибрюшинном введении ГБФ: его угнетающего влияния на гемостаз обнаружено не было. Определены основные этапы метаболизма ГБФ у крыс в условиях энтерального применения. Установлены продукты биотрансформации изученного изофлавоноида, происходящей в кишечнике крыс.
Заключение. 1. В экспериментах на крысах впервые выявлена способность изофлавоноида ГБФ, выделенного из корей M. amurensis, ингибировать ряд показателей тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в условиях энтерального, но не внутрибрюшинного введения. Этот факт имеет важное практическое значение, поскольку открывает перспективу создания нового перорального лекарственного средства, способного уменьшить вероятность возникновения тромбозов при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. 2. Определены основные этапы метаболизма ГБФ у крыс, влияющие на его биодоступность в условиях энтерального применения. 3. Биологическая активность изученного изофлавоноида у крыс обусловлена его биотрансформацией в формононетин, даидзеин и другие продукты метаболизма, образующиеся под воздействием кишечной микробиоты животных.

Aims: 1. to study the comparative eff ect of 7-O-gentiobioside formononetin (GBF) from the roots of M. amurensis on platelet and coagulative hemostasis under prolonged enteral and intraperitoneal administration to rats; 2. to determine the metabolic products of GBF in blood and urine of rats under enteral and intraperitoneal administration.
Materials and methods. The study was performed on male Wistar rats weighing 220–280 grams. In the fi rst series of experiments animals received GBF enterally and intraperitoneally at a dose of 25 mg/kg for 10 days. At the end of the administration period we determined ADP-stimulated platelets aggregation, values of activated partial thromboplastin time, prothrombin time, thrombin time, fi brinogen level, content of soluble fi brin-monomer complexes, antithrombin III activity. Thromboelastometry was used for integral hemostasis analysis. In the second series of experiments GBF was administered enterally to 6 animals (group 1) in a dose of 150 mg/kg. Blood was collected 2 and 4 hours after GBF administration, urine was collected 8 hours after GBF administration. In 6 animals (group 2) the same manipulations were performed after intraperitoneal GBF administration in the same dose. Special samples were prepared for chromatographic-mass spectrometric analysis; the obtained fractions were analyzed on Shimadzu HPLC-PDA-MS chromatomass spectrometer. The mass spectra were recorded using the electrospray ionization method in the positive and negative ion mode (1.50 kV) in the m/z range 100–800. The obtained results were processed by a statistical method of variational series using the Mann-Whitney test.
Results. Enteral administration of isofl avonoid GBF had a signifi cant eff ect on platelet and coagulative hemostasis in rats; so getting the gastrointestinal tract GBF inhibited platelet aggregation and blood coagulation. Almost 10-fold decreasing in ADP-aggregation was registered in comparison with control animals. Enteral GBF administration was followed by a distinct and deep shift of the main chronometric recording parameters; under intraperitoneal GBF administration its suppressive action on hemostasis was not observed. The main stages of GBF metabolism under its enteral administration in rats were determined. The products of GBF biotransformation in rat’s intestine were revealed.
Conclusions. 1. For the fi rst time in experiments on rats the ability of isofl avonoid GBF isolated from the roots of M. amurensis was found to inhibit some parameters of platelet and coagulative hemostasis under enteral but not intraperitoneal administration. This fact is of great practical importance because it opens the prospect for creating of new oral drugs that can reduce the risk of thrombosis in various cardiovascular diseases. 2. We determined the main stages of GBF metabolism in rats that aff ected its bioavailability under enteral administration. 3. The biological activity of the studied isofl avonoid in rats is due to its biotransformation into formononetin, daidzein, and other metabolic products formed under the infl uence of the intestinal microbiota of animals.