Αξιολόγηση εξονικών πολυμορφισμών σε CpG αλληλουχίες και ενισχυτές ματίσματος σε γονίδια που συνδέονται με διαβήτη τύπου ΙΙ
Authors: Καραμπατάκη Μαρία 
Published: August 2021

Σύγχρονες μελέτες ευρείας κλίμακας διενεργούνται παγκοσμίως για τον προσδιορισμό των γενετικών χαρακτηριστικών (πολυμορφισμών) που αποτελούν προδιαθεσικούς παράγοντες για την εμφάνιση νοσημάτων πολυπαραγοντικών, συχνών ή και σπάνιων. Οι έρευνες που διενεργούνται στο πλαίσιο των ευρείας γονιδιωματικής συσχέτισης μελετών (GWAS, genome-wide association studies), στοχεύουν στη διερεύνηση σε ιδιαίτερα μεγάλο δείγμα του πληθυσμού όλων των πολυμορφισμών που έχουν καταγραφεί, ανεξάρτητα από την τυχόν συσχέτισή τους με συγκεκριμένες μεταβολές στις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τις αλληλουχίες στις οποίες εντοπίζονται, το πώς εκφράζονται οι πρωτεΐνες αυτές και από τυχόν άλλες παθολογικές καταστάσεις με τις οποίες μπορεί να συνδέονται. Ωστόσο, οι σύγχρονες γνώσεις στο πεδίο της λειτουργικής γονιδιωματικής επιτρέπουν πλέον, την πληρέστερη αξιολόγηση με τη χρήση της βιοπληροφορικής των γενετικών μεταβολών που μπορεί να επηρεάζουν την έκφραση, και συγκεκριμένα το μάτισμα των πρωτεϊνών. Είναι πλέον βέβαιο, ότι τέτοιες πληροφορίες μπορούν να βοηθήσουν σημαντικά στην επιλογή ενός μικρού αριθμού SNPs από μια πληθώρα πολυμορφισμών, που πιθανόν να οδηγούν σε αληθινά συνώνυμες μεταβολές, τουλάχιστον όσον αφορά στην κωδική περιοχή των γονιδίων. Μια από τις σημαντικότερες διαδικασίες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί η παραγωγή ποικίλων προϊόντων ματίσματος με ελεγχόμενο τρόπο, που επιτρέπει τη χωροθέτηση και τη ρύθμιση των εμπλεκόμενων διαδικασιών. H διατριβή αυτή είχε ως στόχο να αναδείξει τη σημασία της επιλογής των θέσεων που έχουν λειτουργική σημασία για την έκφραση του γονιδίου, όχι στο επίπεδο της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης αλλά συγκεκριμένα στη ρύθμιση του ματίσματός του. Επιλέγοντας ως πρότυπο νόσημα τον «πολυπαραγοντικό» σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, αρχικά εντοπίσαμε τα «σημαντικά» για τη νόσο γονίδια και προσδιορίσαμε με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, που αναφέρονται σε παραμέτρους της λειτουργικής γονιδιωματικής ένα μικρό αριθμό πολυμορφισμών, που βρίσκονται σε ρυθμιστικές για το μάτισμα θέσεις και θα μπορούσαν να έχουν σημαντικό ρόλο, να επηρεάζουν την λειτουργία των γονιδίων και τελικά να σχετίζονται με προδιάθεση για τη νόσο. Ως προϋπόθεση τέθηκε οι πολυμορφισμοί αυτοί να επιφέρουν σημαντικές μεταβολές σε εξονικές αλληλουχίες ματίσματος, και/ή να μεταβάλλουν το δυνητικό επιγενετικό προφίλ του DNA (να απαλείφουν ή να δημιουργούν αλληλουχίες CpG). Τόσο o έλεγχος της σχετικής βιβλιογραφίας, όσο και τα δικά μας πειραματικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι η ύπαρξη πολυμορφισμών στις θέσεις αυτές δεν είναι ιδιαίτερα συχνή, αλλά συνοδεύεται από σημαντικά αυξημένη προδιάθεση για εμφάνιση διαβήτη τύπου 2, επιβεβαιώνοντας έτσι, την επιλογή αυτών των συγκεκριμένων πολυμορφισμών.Η πολυμορφικότητα των γονιδίων που σχετίζονται με το διαβήτη τύπου 2 ήταν αρκετά μεγάλη και οι πολυμορφισμοί που επιλέξαμε να μελετήσουμε ήταν συνώνυμοι πολυμορφισμοί, διότι είναι αυτοί που κατ’εξοχήν διαφεύγουν τον έλεγχο και θεωρούνται εκ των προτέρων ουδέτεροι. Από το σύνολο των 670 εξονικών μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών των γονιδίων που σχετίζονται με τη νόσο, περίπου το 35% ήταν οι συνώνυμοι. Αντίθετα, η πολυμορφικότητα ήταν περιορισμένη στις σημαντικές για το μάτισμα θέσεις (κανονικές θέσεις ματίσματος και εξονικοί ενισχυτές ματίσματος) και στα εναλλακτικά ματιζόμενα εξόνια. Έτσι, στα γονίδια που συνδέονται με διαβήτη τύπου 2 δεν βρέθηκαν συνώνυμοι πολυμορφισμοί σε περιοχές ματίσματος στα όρια εξονιών-ιντρονίων (κανονικές θέσεις ματίσματος) και μόνο 10% των συνώνυμων εξονικών πολυμορφισμών βρίσκονταν σε εξονικούς ενισχυτές ματίσματος και εναλλακτικά ματιζόμενα εξόνια. Το γεγονός αυτό, πιθανότατα σημαίνει την ύπαρξη αυστηρών κανόνων επιτήρησης του ματίσματος σε γονίδια που σχετίζονται με τη διαδικασία διακίνησης της γλυκόζης. Εντούτοις, ιδιαίτερα υψηλή εμφανίζεται η πολυμορφικότητα των θέσεων μεθυλίωσης - θέσεις CpG στις ρυθμιστικές για το μάτισμα ακολουθίες. Έτσι, στα γονίδια που συνδέονται με διαβήτη τύπου 2 πάνω από τους μισούς (56%) συνώνυμους πολυμορφισμούς που επηρεάζουν σημαντικά το μάτισμα βρίσκονται σε θέσεις CpG. Αυτό, σε συνδυασμό με τα πρόσφατα ευρήματα που αποδεικνύουν τη λειτουργική συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και του εναλλακτικού ματίσματος, διαμέσου της πρωτεΐνης CTCF, υποδηλώνει την ιδιαίτερη βαρύτητα που μπορεί να έχουν οι πολυμορφισμοί σε θέσεις CpG στη διαδικασία του ματίσματος.Από την αξιολόγηση των συνώνυμων εξονικών πολυμορφισμών που βρίσκονται σε ρυθμιστικές για το μάτισμα θέσεις, οδηγηθήκαμε σε δύο συνώνυμους πολυμορφισμούς στα γονίδια του διαβήτη τύπου 2 για τους οποίους διερευνήθηκε επίσης, πειραματικά η συσχέτισή τους με τη νόσο σε δείγμα του ελληνικού πληθυσμού: rs3749166, στο γονίδιο CAPN10 (καλπαΐνη 10) που κωδικοποιεί έναν αναδιαμορφωτή του μεταφορέα 2 της γλυκόζης και rs5404, στο γονίδιο SLC2A2 που κωδικοποιεί το μεταφορέα 2 της γλυκόζης.Και οι δύο συνώνυμοι πολυμορφισμοί που διερευνήθηκαν πειραματικά σχετίζονται με αυξημένη προδιάθεση για το διαβήτη τύπου 2. Συγκεκριμένα, ο πολυμορφισμός rs3749166(G>A) εμφανίζοται με το πολυμορφικό αλληλόμορφο A και τον ετερόζυγο γονότυπο AG να είναι επιβαρυντικοί για τη νόσο, ενώ ο μη πολυμορφικός γονότυπος GG εμφανίζεται ως προστατευτικός για τη νόσο. Ο πολυμορφισμός rs5404 (C>T) εμφανίζεται με το πολυμορφικό αλληλόμορφο Τ να είναι το προστατευτικό και εφόσον δεν απαντάται σε ομόζυγη κατάσταση στα δείγματά μας, λόγω της εξαιρετικά χαμηλής πληθυσμιακής συχνότητας του συγκεκριμένου γονότυπου TT, 0-1,7%, ο πολυμορφικός CT είναι ο προφυλακτικός και ο μη πολυμορφικός γονότυπος CC ο επιβαρυντικός για τη νόσο. Ο rs5404 στον ελληνικό πληθυσμό συνδέεται με την πολυμορφική θέση C/T και αποτελεί υποκατηγορία του πολυμορφισμού rs5404 με τα αλληλόμορφα G/A, που θεωρούνται κυρίαρχα στους διάφορους πληθυσμούς.Η σύγκριση των δύο πολυμορφισμών έδειξε ότι ο πολυμορφισμός rs3749166(G>A) και ιδιαίτερα το πολυμορφικό του αλληλόμορφο Α είναι το επιβαρυντικό σε σχέση με τον πολυμορφισμό rs5404 (C>T), όσον αφορά στην προδιάθεση για το διαβήτη τύπου 2 και στην ετερόζυγη μορφή του AG συνδέεται με νεότερη ηλικία διάγνωσης και εκδήλωσης της νόσου. Ωστόσο, η ρύθμιση του διαβήτη τύπου 2 εκφραζόμενη με τη γλυκόζη νηστείας δε φαίνεται να σχετίζεται με τους γονότυπους των δύο πολυμορφισμών, ενώ όσον αφoρά στη γλυκοσυλιωμένη αιμοσφαιρίνη ο επιβαρυντικός γονότυπος AGCC σχετίζεται με αυξημένες τιμές γλυκοσυλιωμένης αιμοσφαιρίνης σε σχέση με τους υπόλοιπους γονότυπους. Από τη μελέτη μας η απώλεια της θέσης επιγενετικής τροποποίησης-θέση CpG εμφανίζεται να συσχετίζεται είτε θετικά (rs5404) είτε αρνητικά (rs3749166) με τη νόσο, και συγκεκριμένα, η παρουσία της θέσης CpG έχει προφυλακτική επίδραση στην περίπτωση του πολυμορφισμού rs3749166 (αλληλόμορφο G προστατευτικό) και επιβαρυντική στην περίπτωση του πολυμορφισμού rs5404 (αλληλόμορφο C επιβαρυντικό). Αυτό υποδηλώνει ότι η εξελικτική απώλεια των θέσεων CpG μπορεί να είναι είτε προφυλακτική, είτε επιβαρυντική και δεν υπάρχει εκ των προτέρων επιλογή προς τη μια ή την άλλη κατεύθυνση, τουλάχιστον όσον αφορά πολυμορφισμούς που σχετίζονται με εκφυλιστικά νοσήματα, όπως ο διαβήτης τύπου 2.Η μελέτη μας οδήγησε στην επιβεβαίωση δύο συνώνυμων πολυμορφισμών στον ελληνικό πληθυσμό που σχετίζονται με το διαβήτη τύπου 2. Επίσης, η προσέγγιση αυτή ανέδειξε τη σημασία της επιλογής των θέσεων που έχουν λειτουργική σημασία για την έκφραση του γονιδίου και συγκεκριμένα τη ρύθμιση του ματίσματος και θα μπορούσε σε επόμενο στάδιο να παρέχει τη δυνατότητα πρόβλεψης του κινδύνου ανάπτυξης της νόσου για κάθε άτομο με βάση αυτή τη γενετική πληροφορία με τη χρήση αξιόπιστων μοντέλων πρόβλεψης. Τέλος, η γνώση μας αναφορικά με τους επιγενετικούς SNPs θα μπορούσε να αναδείξει την σημασία της εφαρμογής προληπτικών μέτρων με προφυλακτικό στόχο, για τους φορείς πολυμορφισμών που συνδέονται με αυξημένη προδιάθεση για τη νόσο.