Ανακάλυψη αναστολέων για την πρωτεΐνη TNF-α σαν ενώσεις οδηγούς για φάρμακα έναντι της ρευματοειδoύς αρθρίτιδας
Authors: Μέττου Ανθούλα 
Published: September 2021

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η ανακάλυψη νέων μικρομοριακών αναστολέων για τον Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (Tumour Necrosis Factor, TNF). Ο TNF έχει συσχετισθεί με αυτοάνοσες διαταραχές όπως ψωρίαση, νόσος του Crohn, νόσος του Alzheimer και παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Η αντι-TNF θεραπεία χρησιμοποιείται για ασθένειες όπως η αγκυλοποιητική σπονδυλαρθρίτιδα, η ρευματοειδής και ψωριασική αρθρίτιδα, η ψωρίαση, η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου κ.ά. Το SPD304 είναι ένα μικρό μόριο που αναστέλλει τη δράση του TNF καθώς αλληλεπιδρά με το τριμερές της πρωτεΐνης, προωθεί τον αποτριμερισμό της και έτσι προκύπτει ένα ανενεργό διμερές. Το SPD304 είναι τοξικό και για τον λόγο αυτό δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί σαν φαρμακευτική ουσία στην αντι-TNF θεραπεία αλλά σαν βάση για την ανακάλυψη νέων μικρομοριακών αναστολέων που εμποδίζουν τον τριμερισμό της πρωτεΐνης. Επομένως, η ανάπτυξη μικρομοριακών αναστολέων του TNF χαμηλής τοξικότητας παραμένει ένας διακαής στόχος.Το αντικείμενο του προγράμματος RAlead ήταν η ανακάλυψη μικρομοριακών αναστολέων του TNF και σε αυτό το πλαίσιο σχεδιάστηκε και συντέθηκε μια σειρά αναλόγων του SPD304 με σκοπό τη μείωση της τοξικότητας και την ενίσχυση της βιοδραστικότητας. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις που προέκυψαν από in silico μελέτες ελλιμενισμού (docking studies) αλλά και ενώσεις που σχεδιάστηκαν βάσει των ενδιάμεσων αποτελεσμάτων των μελετών πρόσδεσης. Για την αξιολόγηση των πιθανών προσδετών μετρήθηκε η σταθερά διάσπασης (dissociation constant, Kd) με φασματοσκοπία φθορισμού. Παράλληλα, μελετήθηκε ο μηχανισμός πρόσδεσης με την τεχνική της Ισόθερμης Θερμιδομετρίας Τιτλοδότησης (ITC). Επίσης μελετήθηκε κρυσταλλογραφικά ο τρόπος πρόσδεσης του SPD304 στην πρωτεΐνη TNF που χρησιμοποιήθηκε και στις μελέτες πρόσδεσης. Για όλες τις παραπάνω μελέτες προηγήθηκε έκφραση του TNF σε κύτταρα E-coli και καθαρισμός βάσει ενός πρωτόκολλου που αναπτύχθηκε.Ένα σοβαρό πρόβλημα που εμφανίστηκε και αντιμετωπίστηκε με επιτυχία κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, ήταν η χαμηλή υδατική διαλυτότητα των υπό μελέτη ουσιών. Μελετήθηκαν συγκεκριμένες τεχνικές για την ενίσχυση της διαλυτότητας και δημιουργήθηκε ένα πρωτόκολλο διάλυσης μικρών μορίων. Το πρωτόκολλο αυτό διαμορφώθηκε έτσι ώστε να είναι συμβατό με τις βιοχημικές δοκιμές πρόσδεσης όπως και με την πρωτεΐνη. Εκτός από τις in vitro βιοχημικές δοκιμές οι τεχνικές αυτές μπορούν να αποτελέσουν ένα δυνατό εργαλείο και στην κρυστάλλωση πρωτεϊνικών συμπλόκων με μικρά φαρμακευτικά μόρια. Μελετήθηκε μια σειρά 86 αναλόγων του SPD304 καθώς και μία σειρά 60 πιθανών αναστολέων που προέκυψαν από μελέτες ελλιμενισμού. Η πλειοψηφία των μορίων αυτών δεν ήταν αρκετά υδατοδιαλυτή έτσι ώστε να μετρηθεί η σταθερά διάσπασης. Με τις μελέτες διαλυτότητας κατέστη δυνατό οι περισσότερες από αυτές να διαλυθούν αρκετά έτσι ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της σταθεράς διάσπασης. Στο πλαίσιο των μελετών διαλυτότητας αξιολογήθηκε η επίδραση της προσθήκης συνδιαλυτών (DMSO, PEG3350) και άλλων προσθέτων (β-κυκλοδεξτρίνης) όπου φάνηκε ότι η PEG3350 είναι πιο αποτελεσματική από το DMSO για μετρίως αδιάλυτα μόρια και ότι η β-κυκλοδεξτρίνη είναι καταλληλότερη σε περιπτώσεις εξαιρετικά αδιάλυτων μορίων. Επίσης μελετήθηκε η επιρροή του χρόνου διάλυσης, της αρχικής φάσης των χημικών ενώσεων (στερεή/ υγρή) και του φιλτραρίσματος των δειγμάτων πριν από τη μέτρηση της διαλυτότητας. Οι μελέτες δραστικότητας ανέδειξαν περίπου 30 ενώσεις με δραστικότητα καλύτερη εκείνης του SPD304 (<5μM) και 20 ενώσεις με εφάμιλλη του SPD304 δραστικότητα (~5μM). Μερικές από αυτές είχαν σαφώς μειωμένη τοξικότητα. Το ποσοστό των ενώσεων που ήταν αδιάλυτες σε καθαρά υδατικά διαλύματα το οποίο είχε υπολογιστεί σε 76%, βάσει των μελετών διαλυτότητας, με τη χρήση συνδιαλυτών και άλλων τεχνικών ενίσχυσης της διαλυτότητας μειώθηκε σε 20%. Αυτό σημαίνει ότι έγινε εφικτή η ικανοποιητική διάλυση του 80% των ενώσεων έτσι ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της σταθεράς διάσπασής τους. Με βάση τα διαθέσιμα δεδομένα διαλυτότητας δημιουργήθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης διαλυτοτήτων (Novamechanics) το οποίο στηρίζεται στην ταξινόμηση διαχωρίζοντας τις αδιάλυτες από τις διαλυτές ενώσεις. Το μοντέλο Ποσοτικής Συσχέτισης Δομής Ιδιότητας (predictive Quantitative Structure Property Relationship model) στοχεύει στην πρόβλεψη της διαλυτότητας πιθανών μικρομοριακών αναστολέων του TNF σε υδατικά διαλύματα παρουσία 5% DMSO. Η απλότητα της προτεινόμενης μεθόδου την καθιστά ευρέως εφαρμόσιμη σε υπολογιστική διαλογή (virtual screening) και εξαγωγή δεδομένων (data mining) για την ταυτοποίηση διαλυτών μορίων.