Ανάπτυξη και μελέτη λιπιδικών νανοσυστημάτων για την βελτίωση της κλινικής εικόνας δερματικών παθήσεων
Authors: Λιακοπούλου Αγγελική 
Published: October 2022

Η χρήση των νανοφορέων στην μεταφορά φαρμάκων έχει προσφέρει νέες δυνατότητες στην τοπική θεραπεία δερματικών ασθενειών βελτιώνοντας τη διέλευση και τη συσσώρευση φαρμάκων στις διάφορες στοιβάδες του δέρματος, μειώνοντας τις συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργειες και ενισχύοντας τη διαλυτότητα υδρόφοβων φαρμάκων. Η παρούσα εργασία αποσκοπούσε στην ανάπτυξη και διερεύνηση νανοσωματιδίων για τη βελτίωση της τοπικής χορήγησης του βιομορίου της κουρκουμίνης. Η κουρκουμίνη (CUR) έχει μακρά ιστορία χρήσης ως αντιμικροβιακός, αντιφλεγμονώδης, αντιοξειδωτικός, αντικαρκινικός και επουλωτικός παράγοντας, μεταξύ άλλων, για τη θεραπεία πολλών δερματικών παθήσεων. Η ενκαψακίωση σε νανοφορείς μπορεί να ξεπεράσει τους περιορισμούς χορήγησης της CUR, όπως η λιποφιλικότητα και η φωτοαποικοδόμηση. Λιπιδικοί νανοφορείς με διαφορετική ρευστότητα μήτρας (Solid Lipid Nanoparticles; SLN, Nanostructured Lipid Carriers; NLC, and Nanoemulsion; NE) παρασκευάστηκαν για την τοπική χορήγηση της CUR σε περίπτωση ακμής και/ή σμηγματορροϊκής δερματίτιδας (Seborrheic Dermatitis, S.D.). Επίσης, μια ομάδα κενών νανοφορέων, χωρίς CUR, αναπτύχθηκε για σύγκριση. Για την επίτευξη ευκολότερης τοπικής εφαρμογής, όλοι οι νανοφορείς που παρασκευάστηκαν ενσωματώθηκαν σε πηκτώματα με βάση το Carbopol Ultrez 10 (CRB). Η προετοιμασία των νανοφορέων βασίστηκε στην διαδικασία της θερμής ομογενοποίησης σε συνδυασμό με υπερήχους, ενώ η μορφοποίηση τους σε πηκτώματα επιτεύχθηκε με εξουδετέρωση ύστερα από την προσθήκη τριαιθανολαμίνης μέχρι το pΗ να ρυθμιστεί περίπου στο 5.5. Έπειτα, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στο ψυγείο (4οC) για περαιτέρω φυσικοχημικό χαρακτηρισμό. Το μέγεθος των σωματιδίων, ο δείκτης πολυδιασποράς (Polydispersity Index, PdI) και το ζ-δυναμικό όλων των δειγμάτων μετρήθηκαν με την τεχνική της Δυναμικής & Ηλεκτροφορητικής Σκέδασης Φωτός (Dynamic & Electrophoretic Light Scattering, DLS & ELS). Η επιφανειακή μορφολογία των νανοσωματιδίων μελετήθηκε με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Τransmission Εlectron Μicroscopy, TEM). Η φόρτωση και η αποτελεσματικότητα της ενκαψακίωσης της CUR στα νανοσωματίδια προσδιορίστηκε με την χρήση της χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού (Size exclusion Chromatography, SEC) σε συνδυασμό με τη Φασματοφωτομετρία υπεριώδους-ορατού (Spectroscopy Ultraviolet-Visible, UV-Vis). Η περιεκτικότητα της CUR στα πηκτώματα προσδιορίστηκε, αντίστοιχα. Παράμετροι όπως το pΗ και το ιξώδες των πηκτωμάτων ελέγχθηκαν επίσης. Επιπλέον, η σταθερότητα όλων των σκευασμάτων αξιολογήθηκε μετά από φυγοκέντρηση (5000rpm, 30min). Σε επόμενο στάδιο, τα δείγματα υποβλήθηκαν και σε επιταχυνόμενη γήρανση (τρεις κύκλοι θέρμανσης στους 45oC και ψύξης στους 25oC). Περαιτέρω μελέτες σταθερότητας διεξήχθησαν μετά την αποθήκευση των δειγμάτων απουσία φωτός, στους 4oC κατά τις οποίες μετρήθηκαν οι προηγούμενες φυσικοχημικές παράμετροι σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα (1, 8, 15, 30, 60 και 90 ημέρες (d)). Η δερματική απόφραξη και η ικανότητα σχηματισμού λιπιδικού υμενίου των σκευασμάτων, καθώς και τα χαρακτηριστικά της απελευθέρωσης του ενσωματωμένου βιομορίου της CUR, η προστασία του από τη φωτοαποικοδόμηση, η επίδραση των νανοφορέων στις αντιοξειδωτικές και επουλωτικές του ιδιότητες , αλλά και στη βιωσιμότητα των κυττάρων και τη γονιδιακή έκφραση μελετήθηκαν in vitro, χρησιμοποιώντας κενούς νανοφορείς ή ελεύθερη CUR ως μάρτυρες. Επιπλέον, τα πηκτώματα αξιολογήθηκαν ως προς την επαλειψιμότητά τους αλλά και την αντιμικροβιακή τους αποτελεσματικότητα, για την οποία εφαρμόστηκε η δοκιμή αποτελεσματικότητας συντήρησης, (Perservative Efficacy Test, ΡΕΤ). Στη συνέχεια, μία in vivo μελέτη διεξήχθη για τον έλεγχο της διαπερατότητας του δέρματος από την ενσωματωμένη CUR με τη χρήση της τεχνικής αποκόλλησης αυτοκόλλητης ταινία ή / και κελίων στατικής διάχυσης (Franz cells), ενώ παράμετροι όπως η διαδερμική απώλεια νερού (Transepidermal Water Loss, TEWL) και η ενυδάτωση του δέρματος αξιολογήθηκαν μετά την εφαρμογή των δειγμάτων σε υγιές ανθρώπινο δέρμα. Τέλος, αξιολογήθηκε in vivo σε ασθενείς με ήπια συμπτώματα, η αποτελεσματικότητα του πηκτώματος NLC.CUR GEL στην ανακούφιση συμπτωμάτων ακμή και/ή S.D., ενώ πηκτώματα όπως αυτό της ελεύθερης CUR (CUR GEL) ή το κενό πήκτωμα (CRB GEL) χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση. Όλοι οι κενοί και φορτωμένοι νανοφορείς καθώς και τα αντίστοιχα πηκτώματα αναπτύχθηκαν επιτυχώς. Όλα τα νανοσωματίδια έδειξαν αποτελεσματικότητα ενκαψακίωσης και φόρτωσης της CUR στην περιοχή 88-94% και 1.40-1.49%, αντίστοιχα. Η περιεκτικότητα της CUR στα πηκτώματα κυμάνθηκε περίπου στο 75%, ελαφρώς χαμηλότερη από αυτή των αρχικών διασπορών νανοσωματιδίων. Το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμάνθηκε μεταξύ 122.60 nm ± 8.39 nm (NE, p < 0.05) και 131.43 nm ± 9.94 nm (SLN, p < 0.05), ενώ ο PdI και το ζ-δυναμικό όλων των νανοφορέων βρέθηκαν κοντά στο 0.2 και -60.00 mV, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, τα πηκτώματα επέδειξαν αυξημένο μέγεθος και PdI στην περιοχή 40-45%, ενώ το ζ-δυναμικό δεν διέφερε από των αρχικών διασπορών. Οι εικόνες TEM έδειξαν σφαιρικά και λεία επιφανειακά σωματίδια. Το pH όλων των νανοσωματιδίων ήταν ελαφρώς όξινο (~4.50), ενώ το pΗ των πηκτωμάτων ρυθμίστηκε κοντά στο 5.70 με τριαιθανολαμίνη. Επιπλέον, τα πηκτώματα με τις ενσωματωμένες διασπορές των SLNs, NLCs και ΝΕs παρουσίασαν έναν μη νευτώνειο, ψευδοπλαστικό χαρακτήρα με θιξοτροπική συμπεριφορά. Τα παρασκευασμένα νανο-μορφοποιημένα πηκτώματα είχαν βέλτιστο ιξώδες και επάλειψη που απαιτείται για τοπική χορήγηση. Η ενκαψακίωση της CUR στα νανοσωματίδια ή τα πηκτώματα δεν επηρέασε τα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά. Όλοι οι νανοφορείς και τα αντίστοιχα πηκτώματα παρέμειναν σταθεροί μετά τις δοκιμασίες της φυγοκέντρησης, ενώ κατά τη δοκιμασία της επιταχυνόμενης γήρανσης προκλήθηκε πολύ μικρή μείωση στο μέγεθος και το pH των ΝΕ.CUR GEL και NLC.CUR GEL, αντίστοιχα. Κατά την περίοδο αποθήκευσης των δειγμάτων στους 4oC, μόνο ο νανοφορέας NLC.CUR παρουσίασε μείωση του μέσου μεγέθους κατά 6.23% την τελευταία ημέρα της δοκιμής σταθερότητας (90d). Η περιεκτικότητα της CUR στους νανοφορείς ήταν σταθερή, ενώ σημειώθηκε μικρή μείωση για το SLN.CUR και NE.CUR μετά από 15 και 60 ημέρες, αντίστοιχα. Στην περίπτωση των πηκτωμάτων, η περιεκτικότητα σε CUR δεν επηρεάστηκε για 15 ημέρες, ενώ παρατηρήθηκε μείωση κατά 24% μετά από 30 ημέρες. Επίσης, δεν σημειώθηκαν αλλαγές στις τιμές pH και ιξώδους των πηκτωμάτων για 90 ημέρες. Η απελευθέρωση της CUR από τους νανοφορείς ή τα πηκτώματα εξελίχθηκε με διφασικό τρόπο συμπεριλαμβανομένης μιας αρχικής φάσης «έκρηξης», ακολουθούμενη από μια τάση παρατεταμένης απελευθέρωσης. Ωστόσο, τα πηκτώματα προκάλεσαν την αρχική φάση «έκρηξης» νωρίτερα, και η συγκράτηση της ενκαψακιωμένης CUR ήταν παρόμοια για όλα τα πηκτώματα, μεταξύ 20-30%, ανεξάρτητα από τη φυσική λιπιδική κατάσταση των ενσωματωμένων νανοφορέων. Η ενκαψακιωμένη CUR απελευθερώθηκε από τα SLNs μέσω διάβρωσης ενώ από τα NLCs και NEs μέσω διάχυσης. Αντίθετα, η απελευθέρωση της CUR από τα πηκτώματα βασίστηκε αποκλειστικά στη διάχυση. Σύμφωνα με τη δοκιμασία DPPH, η ενκαψακίωση της CUR βρέθηκε ότι μειώνει τη δραστικότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας κατά το ήμισυ, σε χαμηλή συγκέντρωση (0.04-0.05 mg/mL), ενώ η δοκιμασία FRAP έδωσε αντίστροφα αποτελέσματα ως προς τη δραστικότητα αναγωγής του σιδήρου. Η ενσωμάτωση των φορτωμένων νανοφορέων στα πηκτώματα δεν προκάλεσε ανασταλτικό αποτέλεσμα στους εξεταζόμενους Gram (-) και Gram (+) μικροοργανισμούς ούτε παρήγαγε αντιμυκητιασικό αποτέλεσμα. Ωστόσο, έχει μεγάλη σημασία η αντιβακτηριακή δράση που παράγεται από τους άδειους νανοφορείς έναντι όλων των Gram (-) και Gram (+) βακτηρίων της δοκιμασίας. Η δραστηριότητά τους, η οποία ακολούθησε τη σειρά SLN < NLC < NE, είναι πιθανό να σχετίζεται με το υγρό τριγλυκερίδιο (TG) και την εκάστοτε περιεκτικότητά του. Τα νανοσωματίδια χαμηλής ρευστότητας και τα πηκτώματά τους παρείχαν καλύτερη απόφραξη της επιφάνειας του δέρματος, ικανότητα σχηματισμού συμπαγούς / πυκνού λιπιδικού υμενίου και μεγαλύτερη συγκράτηση του ενσωματωμένου βιομορίου μετά την έκθεση σε ηλιακό φως. Όλοι οι νανοφορείς αλλά ειδικά το NLC, πέτυχαν ταχύτερη μείωση της επιφάνειας των αμυχών με την χαμηλότερη συγκέντρωση ενσωματωμένης CUR. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε περίπου 80%, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα δείγματα ήταν μη τοξικά για τα κύτταρα και ασφαλή για εξωτερική χρήση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η ελεύθερη και νανο-ενκαψακιωμένη CUR ρυθμίζει μεταγραφικά τα γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική αντιοξειδωτική οδό. Είναι ενδιαφέρον ότι όλα τα δείγματα παρουσίασαν ατομική αντιοξειδωτική προστασία υπό ή χωρίς συνθήκες οξειδωτικού στρες. Η in vivo μελέτη του βάθους διέλευσης της SC έδειξε αυξημένη διείσδυση της CUR από τους νανοφορείς, ενώ στα πηκτώματα ο ρυθμός διεύσδυσης χαρακτηρίστηκε πιο αργός. Η in vivo μελέτη σε υγιείς εθελοντές έδειξε σημαντικά αποτελέσματα, πιο συγκεκριμένα όσον αφορά την TEWL και την ενυδάτωση του δέρματος. Ο δερματικός φραγμός δεν επηρεάστηκε καθόλου ή βελτιώθηκε, ενώ παράλληλα παρατηρήθηκε μικρή μείωση της ενυδάτωσης του δέρματος μετά την εφαρμογή νανοσωματιδίων, ειδικά από το κενό NE ή το SLN.CUR. Αντίθετα, το NΕ GEL ήταν το μόνο που διατάραξε το δερματικό φραγμό μετά από 120min, προκαλώντας αύξηση κατά 19% στην τιμή της TEWL. Αύξηση στα επίπεδα ενυδάτωσης, περίπου στο 17%, παρατηρήθηκε για όλα τα πηκτώματα, ωστόσο η προσθήκη της CUR φάνηκε να ρυθμίζει τη χρονική εκδήλωση αυτού του αποτελέσματος. Η ενσωμάτωση της διασποράς NLC.CUR σε πήκτωμα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη in vivo δραστικότητα κατά των συμπτωμάτων της ακμής ή της S.D. σε σύγκριση με το (ελεύθερο) CUR GEL ή το (κενό) CRB GEL. Συνολικά, αυτή η Διατριβή υποστηρίζει ότι η νανοτεχνολογία μπορεί να ενισχύσει τη δράση της CUR στην αντιμετώπιση δερματικών παθήσεων. Σημαντικά χαρακτηριστικά των νανοφορέων, όπως η ρευστότητα της μήτρας, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασμό των CUR - νανοσυστημάτων βέλτιστης απόδοσης. Η ενσωμάτωση του νανοφορέα NLC.CUR σε πήκτωμα φαίνεται ότι επάγει την χρήση του ως σύστημα τοπικής χορήγησης φαρμάκων για την ανακούφιση των ασθενών από συμπτώματα ακμής ή / και S.D.. Εντούτοις, περαιτέρω έρευνα ή επικύρωση του φαρμακολογικού δυναμικού του συγκεκριμένου σκευάσματος θεωρείται αναγκαία.