Συγκριτική μελέτη της παρουσίας οργανικών και ανόργανων στοιχείων στον εγκέφαλο της γάτας και των παθολογοανατομικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία
Authors: Αποστολοπούλου Εμμανουέλα 
Published: November 2023

Η διαδικασία της γήρανσης προκαλεί τόσο λειτουργικές διαταραχές όσο και ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στο ΚΝΣ του ανθρώπου και των ζώων. Σκοπός μας στην παρούσα διατριβή ήταν να διερευνήσουμε την παρουσία 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων, καθώς και των αντιοξειδωτικών ενζύμων MT-I/II και SOD-1 και την πιθανή σύνδεσή τους, στον βαθμό που ήταν δυνατό, με την πάροδο της ηλικίας και με τις παθολογοανατομικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με αυτήν, συμπεριλαμβανομένων των εναποθέσεων Αβ στον εγκέφαλο της γάτας. Για την υλοποίηση των παραπάνω στόχων, μελετήθηκαν 30 γάτες, 27 ηλικιωμένες, και 3 νεαρές-μάρτυρες, οι οποίες επιλέχθηκαν μεταξύ των ζώων που προσκομίζονταν νεκρά στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Τμήματος Κτηνιατρικής του ΑΠΘ. Στη συνέχεια οι γάτες, με κριτήριο την ηλικία τους, χωρίστηκαν στις εξής ομάδες: ομάδα Α (νεαρές-Μάρτυρες), ομάδα Β (Ώριμες), ομάδα Γ (Παρήλικες) και ομάδα Δ (Υπερήλικες). Αμέσως μετά την ευθανασία ή έως και 3 ώρες μετά το θάνατο, διενεργούνταν νεκροτομή και λήψη του εγκεφάλου και τεμαχισμός του σε δύο ημιμόρια. Ακολουθούσε μονιμοποίησή του και λήψη ιστοτεμαχίων για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση. Αυτά προέρχονταν από το δεξιό ημιμόριο του εγκεφάλου και αφορούσαν τον μετωπιαίο και τον κροταφικό λοβό, τον ιππόκαμπο, τον θάλαμο, το ραβδωτό σώμα και την παρεγκεφαλίδα. Τέλος, ακολουθούσε έγκλεισή τους σε παραφίνη. Σε διαδοχικές ιστολογικές τομές εφαρμόστηκαν οι εξής ιστοχημικές χρώσεις: Η-Ε, για τη διαπίστωση της παρουσίας των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία, η χρώση του υπεριωδικού οξέος (PAS), για την αξιολόγηση της παρουσίας κοκκίων λιποφουσκίνης και σωματίων πολυγλυκοζάνης και η Klüver Barrera, για την εκτίμηση του βαθμού εκφύλισης των νευρικών ινών της λευκής ουσίας. Τέλος, εφαρμόστηκαν οι ιστοχημικές χρώσεις Perl’s/DAB και Ροδανίνης για την ανίχνευση του σιδήρου (Fe) και του χαλκού (Cu), αντίστοιχα. Επιπλέον, εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος (Σύστημα Ανίχνευσης Πολυμερούς Υπεροξειδάσης του Χρένου) με τη χρήση αντισωμάτων κατά του πεπτιδίου Αβ42, της GFAP, της MT-I/II και της SOD-1. Τα δυο τελευταία, αποτελούν αντιοξειδωτικά ένζυμα. Ειδικότερα, οι μεταλλοθειονίνες συμμετέχουν στην ομοιοστασία και τη μεταφορά ενδογενών μετάλλων, όπως του Cu και του ψευδαργύρου (Zn). Επισημαίνουμε ότι η υπερέκφραση των παραπάνω ουσιών έχει προστατευτική δράση έναντι της γήρανσης και των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, επειδή έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν τα ενδογενή μέταλλα και, συνεπώς, να αναστέλλουν την τοξική τους δράση. Επίσης, η παρουσία του ενζύμου SOD-1, το οποίο δεσμεύει τον Cu και τον Zn, προστατεύει το κεντρικό νευρικό σύστημα από την οξειδωτική καταπόνηση. Όλες οι ιστολογικές τομές εξετάστηκαν με το φωτονικό μικροσκόπιο και βαθμονομήθηκαν οι αλλοιώσεις που σχετίζονται με τη γήρανση, η παρουσία του Fe και του Cu, και τέλος η παρουσία του Αβ42, της GFAP, της MT-I/II και της SOD-1. Στα αποτελέσματα αυτά εφαρμόστηκε στατιστική ανάλυση με τους ελέγχους X2 και Kruskal Wallis. Τέλος, σε ιστοτεμάχια που λήφθηκαν από το αριστερό ημιμόριο του εγκεφάλου, αξιολογήθηκε ποσοτικά η παρουσία 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων με την εφαρμογή της φασματοφωτομετρικής μεθόδου ICP-MS (φασματοφωτομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος). Για τη στατιστική ανάλυση και την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των ποσοτικών αναλύσεων εφαρμόστηκαν οι έλεγχοι one-way ANOVA και Duncan. Μετά τη μελέτη των ιστολογικών τομών, διενεργήθηκε καταγραφή και βαθμονόμηση αφενός των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που συνδέονται με την ηλικία, αφετέρου της παρουσίας του Αβ42 και της GFAP, όπως έχει περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες. Σχετικά με την παρουσία του Αβ42, επισημαίνουμε ότι επιπλέον των εναποθέσεων που έχουν αναφερθεί ως τώρα για τη γάτα, αυτό διαπιστώθηκε και στο κυτταρόπλασμα ολιγάριθμων αστροκυττάρων, σε 6 ηλικιωμένα ζώα που εμφάνιζαν ταυτόχρονα έντονου βαθμού αστρογλοίωση. Για τη μελέτη της GFAP στα αστροκύτταρα διενεργήθηκε συνδυαστικά ημιποσοτική και μορφολογική αξιολόγηση και τελική βαθμονόμηση. Επιπλέον, σε τομές που εφαρμόστηκε η χρώση Perl’s/DAB παρατηρήθηκαν εξωκυτταρικές εναποθέσεις Fe με τη μορφή πλακών (IPs) δύο τύπων, τις συμπαγείς και τις διάχυτες, καθώς και ενδοκυτταρική εναπόθεση σε νευρώνες και νευρογλοιακά κύτταρα. Τέλος, παρατηρήθηκαν και εναποθέσεις Fe που συνδεόταν με τη μυελίνη, οι οποίες παρατηρούνταν με τη μορφή «ζωνών». Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι ο πυρηνίσκος των νευρώνων αποτελεί την κύρια περιοχή εντόπισης του Fe ενδοκυτταρικά. Επίσης, με την πάροδο της ηλικίας στη ΦΟ και τη ΛΟ του μετωπιαίου λοβού και στον θάλαμο διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της παρουσίας Fe με τη μορφή IPs (p≤0,05). Όμοια, στην παρεγκεφαλίδα παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του Fe που συνδέεται με τη μυελίνη (p≤0,05). Επίσης, με τη χρώση της Ροδανίνης παρατηρήθηκε η παρουσία Cu στο περικάρυο των νευρώνων, καθώς και στο κυτταρόπλασμα νευρογλοιακών κυττάρων. Η έκφραση της ΜΤ-Ι/ΙΙ ανοσοϊστοχημικά αφορούσε τα αστροκύτταρα, τους νευρώνες, τα επιθηλιοειδή κύτταρα της λεπτομήνιγγας, τα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος, τα επενδυματικά κύτταρα καθώς και το τοίχωμα των αγγείων του εγκεφάλου, των μηνίγγων και του χοριοειδούς πλέγματος. Η έκφραση του παραπάνω ενζύμου στην πλειονότητα των περιοχών που εξετάστηκαν εμφάνιζε αύξηση με την πάροδο της ηλικίας (p≤0,05), γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι θα μπορούσε να αποτελεί δείκτη γήρανσης του εγκεφάλου στη γάτα. Τέλος, το ένζυμο SOD-1 ανιχνεύθηκε, κυρίως, στους νευρώνες, και σε μικρότερο βαθμό στα αστροκύτταρα, τον μέσο χιτώνα των αγγείων, τα επιθηλιοειδή κύτταρα των μηνίγγων, τα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος και τα επενδυματικά κύτταρα. Αναφορικά με τη συγκέντρωση των μετάλλων στους εγκεφάλους που μελετήσαμε, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη μέθοδο ICP-MS ανιχνεύθηκαν όλα τα μέταλλα που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων των τοξικών. Ωστόσο, για κανένα από αυτά δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ηλικιακών ομάδων. Πρωτότυπα στοιχεία της έρευνάς μας αποτελούν: α) Η ανίχνευση της παρουσίας 28 ενδογενών και τοξικών μετάλλων σε μίγμα που προερχόταν από 5 διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου της γάτας με την εφαρμογή φασματοφωτομετρίας. β) Η διερεύνηση της παρουσίας και της κατανομής του Fe και του Cu με την εφαρμογή ειδικών ιστοχημικών χρώσεων στον εγκέφαλο ηλικιωμένων γατών. γ) Η ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των αντιοξειδωτικών ενζύμων ΜΤ-Ι/ΙΙ και SOD-1. Τα αποτελέσματά μας πιστεύουμε πως ενισχύουν την άποψη ότι η γάτα αποτελεί κατάλληλο φυσικό ζώο-πρότυπο για τη μελέτη της παθογένειας της γήρανσης ή/και των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων στα ζώα και τον άνθρωπο.