Διερεύνηση και ανάπτυξη μηχανισμών γενετικής και μεβρανικής τροποποίησης κυττάρων για χρήση σε βιοαισθητήρες
Authors: Μαυρίκου Σοφία 
Published: September 2021

Η σύγχρονη βιομηχανία φυτοπροστατευτικών προϊόντων για να καταπολεμήσει ταπροβλήματα που έχουν δημιουργηθεί από την αύξηση της ανθεκτικότητας τωνεντόμων στα φυτοπροστατευτικά προϊόντα καταβάλλει τεράστιες προσπάθειες γιατην έρευνα νέων εντομοκτόνων που στοχεύουν σε διαφορετικά βιοχημικά καιφυσιολογικά ενεργά κέντρα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν 2 σχετικά νέεςκατηγορίες εντομοκτόνων, τα νεονικοτινοειδή και τα αμίδια του τετρονικού οξέος μεαπώτερο σκοπό την ανάπτυξη κυτταρικού βιο-αισθητήρα που θα ανιχνεύει τηνύπαρξη υπολειμμάτων τους σε λαχανικά. Η παρούσα μελέτη απαρτίζεται από 3 μέρη.Στο 1ο μέρος της μελετώνται οι τοξικολογικές επιδράσεις 8 εντομοκτόνων μεδιαφορετικές χημικές δομές, 3 αμιδίων του τετρονικού οξέος (spiromesifen,spirodiclofen, spirotetramat) και 5 νεονικοτινοειδών (imidacloprid, clothianidin,thiacloprid, acetamiprid, thiamethoxam) σε διαφοροποιημένα και σε μηδιαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος (N2a) που θα αποτελέσουν στησυνέχεια το βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα. Τα κύτταρα κατά τηδιάρκεια της καλλιέργειας εκτέθηκαν σε τέσσερεις διαφορετικές συγκεντρώσεις τουκάθε εντομοκτόνου (3, 10, 30 και 100μΜ) για 24 και 48 ώρες σε συνθήκες πουευνοούσαν και που δεν ευνοούσαν τη διαφοροποίηση τους. Κατόπιν, για τηνεκτίμηση της κυτταροτοξικότητας/βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκανοι βιοχημικές δοκιμές πρόσληψης των χρωστικών ΜΤΤ, ουδέτερου ερυθρού (NR) καιιωδιούχου προπιδίου (PI) όπου τα αμίδια του τετρονικού οξέος προκάλεσαναυξημένη μείωση της βιωσιμότητας στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ. Παράλληλαμελετήθηκε μικροσκοπικά η παρεμπόδιση της προέκτασης των νευρικών αξόνων μεχρώση των κυττάρων με Coomassie Brilliant Blue. Ο προσδιορισμός τουμεμβρανικού δυναμικού και της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου ([Ca2+]) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των χρώσεων DiSC3(5) και Fluo-3αντίστοιχα σε φωτόμετρο φθορισμού. Τα εντομοκτόνα προκάλεσαν αποπόλωση τηςκυτταρικής μεμβράνης καθώς και αύξηση της πρόσληψης του ενδοκυτταρικού [Ca2+]κυρίως στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ και στις δυο κατηγορίες κυττάρων.Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές μελέτες για την επίδραση τωνεντομοκτόνων στους ενζυμικούς και βιολογικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς τωνκυττάρων. Συγκεκριμένα μετρήθηκαν η δραστικότητα των ενζύμων S-τρανσφεράσητης γλουταθειόνης (GST), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) με τη μέθοδο τουνιτρο-μπλε τετραζολίου (ΝΒΤ), η υπεροξέιδωση των λιπιδίων με τη μέθοδο τουθειοβαρβιτουρικού οξέος (ΤΒΑ) καθώς και η μεταβολή της συγκέντρωσης τηςανηγμένης και της οξειδωμένης γλουταθειόνης με τη μέθοδο Ellman. Παρατηρήθηκεότι τα εντομοκτόνα αύξησαν την ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων και τηςMDA μειώνοντας ταυτόχρονα τα επίπεδα της γλουταθειόνης, κυρίως στις υψηλέςσυγκεντρώσεις. Με την ίδια μέθοδο πραγματοποιήθηκε και προσδιορισμός τηςδραστικότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE) η οποία φάνηκε νααυξάνεται τόσο από την επίδραση των νεονικοτινοειδών όσο και από την επίδρασητων αμιδίων του τετρονικού οξέος. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης τωνολικών πρωτεϊνών των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford. Επιπλέον,πραγματοποιήθηκε μεμβρανική τροποποίηση κυττάρων Vero με το ένζυμο AChE γιαμελλοντική χρήση τους ως βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα, μέσωτων μεθόδων της ηλεκτροπόρωσης και της οσμωτικής ένθεσης και εκτιμήθηκεκατόπιν η βιωσιμότητα των κυττάρων καθώς και η ενεργότητα του ενζύμου στακύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι κύτταρα που τροποποιήθηκαν με τη μέθοδο της οσμωτικής ένθεσης παρουσίασαν αυξημένη βιωσιμότητα ενώ αυξήθηκε και ηδραστικότητα του ενζύμου AChE. Στο 2ο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης μία μέθοδος ανίχνευσης υπολειμμάτων νεονικοτινοειδών και αμιδίων του τετρονικούοξέος σε υποστρώματα αγγουριού και τομάτας μετά από εξεργασία των δειγμάτων μετη μέθοδο QuEChERS. Τα αποτελέσματα της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν στησυνέχεια για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του κυτταρικού βιοαισθητήρα πουαναπτύχθηκε στη συνέχεια. Τέλος κατά το 3ο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκεμέθοδος προσδιορισμού των εντομοκτόνων σε ποτενσιοστάτη σε εκτυπωμέναηλεκτρόδια άνθρακα με τη χρήση κυττάρων N2a (κυτταρικός βιοαισθητήρας) καιχωρίς τη χρήση κυττάρων N2a με τη μέθοδο της διαφορικής παλμικής βολταμετρίας.Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα διαφοροποιημένα κύτταρα αποτελούνένα εξαιρετικό εργαλείο μελέτης της νευροβιολογίας και της νευροτοξικότητας αφούπαρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα ευαισθησίας τους σεφυτοπροστατευτικά προϊόντα και ξενοβιοτικά και μελλοντικά αναμένεται να έχουνβασικό ρόλο στην ανάπτυξη κυτταρικών βιοαισθητήρων πολύ υψηλήςεκλεκτικότητας και ευαισθησίας.