Biochemical characterization of the CxxC- and PHD- fingers of the novel oncogene KDM2B
Authors: Δεικτάκης Ελευθέριος 
Published: September 2021

Η λεπτή γραμμή μεταξύ φυσιολογικής και παθολογικής κατάστασης του κυττάρου δεν εξαρτάται μόνο από την αλληλουχία του DNA αλλά και από πολύπλοκους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που προκύπτουν από χημικές τροποποιήσεις στις ιστόνες του DNA ή ακόμη και στο ίδιο. Παράγοντες αλληλεπίδρασης με το DNA ή/και τις ιστόνες, περιλαμβάνουν ειδικές πρωτεϊνικές επικράτειες που μεσολαβούν στην δημιουργία, αναγνώριση ή διαγραφή μιας ρυθμιστικής πληροφορίας. Η αποκρυπτογράφηση της πληροφορίας που βρίσκεται εγγεγραμμένη στην χρωματίνη, η διευκρίνηση του δυνητικού τους ρόλου των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων σε καταστάσεις παθογένειας, η αναγνώριση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις τροποποιήσεις αυτές καθώς και η κατανόηση του τρόπου λειτουργίας αυτών των πρωτεϊνών, αποτελούν πεδία έρευνας που συνεχώς εξελίσσονται. Επιτυχημένες προσπάθειες στην αναγνώριση επικρατειών που σχετίζονται με την μεθυλίωση και απομεθυλίωση των ιστονικών άκρων εισήγαγαν ένα ευρύ φάσμα μεθυλοτρανσερασών και απομεθυλασών που συντονίζονται χωρικά και χρονικά, οδηγώντας σε μια δυναμική κατάσταση του επιγενώματος, το οποίο επηρεάζει όχι μόνο τη δομή της χρωματίνης αλλά και τις φυσιολογικές λειτουργίες όπως την κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ενώ είναι επίσης συνδεδεμένο με αρκετές ανθρώπινες ασθένειες αλλά και με καρκίνο. Έως τώρα, πάνω από 20 πρωτεΐνες εχουν ανακαλυφθεί να είναι υπεύθυνες για την αφαίρεση μεθυλομάδων από κατάλοιπα λυσίνης στα άκρα ιστονών και ταξινομούνται σε δύο υπεροικογένειες. Η οικογένεια της αμινοξειδάσης περιλαμβάνει απομεθυλάσες που απαιτούν FAD ως συμπαράγοντα και η οικογένεια των οξυγονασών που περιλαμβάνει πρωτεΐνες όπου η απομεθυλίωση, που εξαρτάται από α-κετογλουταρικό οξύ και δισθενή ιόντα σιδήρου (Fe2+) και γίνεται από την Jumonji C επικράτεια. Στον ανθρώπινο οργανισμό, οι ειδικές για λυσίνης απομεθυλάσες χωρίζονται σε επτά οικογένειες (KMD1-7) και οι περισσότερες από αυτές παίζουν ρόλο κλειδί ως επιγενετικοί ρυθμιστές. Μερικές από αυτές απαρτίζουν στοιχεία περίπλοκων συμπλεγμάτων (π.χ. PRCs, NuRD, CoREST, MMLs) και συμμετέχουν στην πληθώρα φυσιολογικών κυτταρικών διαδικασιών (π.χ. μεταγραφή, αντιγραφή, επιδιόρθωση του DNA) μέσω διαφόρων μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης (π.χ. Notch, TGF-β, FGF, NF-κB). Η απορύθμιση της έκφραση αυτών των πρωτεϊνών στον άνθρωπο είναι άμεσα συνδεδεμένη με μια πληθώρα περιπτώσεων κακοήθειας, λευχαιμιών, ανθρώπινης ογκογένεσης, αναδεικνύοντας ένα διττό ρόλο και ως ογκογονίδια και ως ογκοκατασταλτικά γονίδια. Μια τέτοια περίπτωση είναι η ειδική για λυσίνης απομεθυλάση (KDM2B), η οποία σχετίζεται με το PRC1 σύμπλεγμα και στοχεύει τις τροποποιήσεις H3K36me2, H3K4me3 και H3K79me2/3. Η KDM2B συμμετέχει στην καταστολή της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική γήρανση μέσω του PRC2 συμπλέγματος. Η απομεθυλάση αυτή συνδέει διάφορες τροποποιήσεις της χρωματίνης όπως την απομεθυλίωση της H3K36me2 με την τριμεθυλίωση της H3K27 και την ουβικουιτινιλίωση της H2AK119. Έρευνες έχουν δείξει ότι έχει κεντρικό ρόλο στην εμφάνιση καρκίνου στο παχύ έντερο, στον προστάτη και στο πάγκρεας, καθώς και σε διάφορες λευχαιμίες. Επιπλέον, η KDM2B λειτουργεί ως κεντρικός ρυθμιστής μιας ομάδας microRNAs τα οποία στοχεύουν μέλη των PRC1 και PRC2 συμπλόκων, έχοντας μεγάλη επίπτωση σε εκείνα τα γονίδια τόσο σε υγιή όσο και σε καρκινικά κύτταρα. Η KDM2B έχει συσχετιστεί με την αναστολή της NF-κB/p65-εξαρτώμενης κυτταρικής απόπτωσης μέσω ενός μηχανισμού όπου ο παράγοντας NF-κB προάγει την έκφραση της KDM2B, η οποία καταστέλλει τον παράγοντα c-FOS σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Τέλος, η KDM2B έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει γονίδια στο γλυκολυτικό μονοπάτι και στο μονοπάτι σύνθεσης πρωτεογλυκανών καθώς επίσης και μεταβολικά, αντιοξειδωτικά γονίδια και γονίδια που σχετίζονται με την πολυδύναμικότητα των κυττάρων κατά την μορφογένεση και την ανάπτυξη. Η πρωτεϊνική δομή της KDM2B περιλαμβάνει στο αμινοτελικό άκρο την JmjC επικράτεια που είναι υπεύθυνη για την απομεθυλίωση και στο καρβοξυτελικό άκρο περιοχές πλούσιες σε λευκίνη και μια F-Box επικράτεια που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις της με άλλες πρωτεΐνες. Επιπλέον, η KDM2B διαθέτει δύο επικράτειες, τις CxxC και PHD, που προσδένουν δισθενή ιόντα ψευδαργύρου και οι οποίες βρίσκονται στο κέντρο της αμινοξικής αλληλουχίας. Έχει δειχθεί ότι υπάρχει ισχυρή δομική αλληλεξάρτηση μεταξύ αυτών των δύο επικρατειών η οποία αποτρέπει την απομόνωση έκαστης ανεξάρτητα σε σταθερή μορφή. Η CxxC επικράτεια έχει συσχετιστεί με την ικανότητα πρόσδεσης DNA και πιο συγκεκριμένα με την αναγνώριση μη μεθυλιωμένων αλληλουχιών που περιέχουν δινουκλεοτίδια κυτοσινης-γουανινης (CpG), ωστόσο, τα δομικά χαρακτηριστικά που είναι υπεύθυνα για αυτήν την αλληλεπίδραση παραμένουν αδιευκρίνιστα. Όσον αφορά, την PHD επικράτεια θεωρείται υπεύθυνη για τις αλληλεπιδράσεις της KDM2B με την χρωματίνη ωστόσο οι απόψεις διίστανται για το πια είναι η εξειδίκευσή της σε υποστρώματα και ποιος είναι ο ακριβής της ρόλος. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύσαμε να διαλευκάνουμε τον ρόλο αυτών των CxxC και PHD επικρατειών με στόχο να βελτιώσουμε την κατανόηση σε μοριακό επίπεδο της ανάμειξής τους στην λειτουργία της KDM2B το οποίο θα μας επέτρεπε να αναπτύξουμε ένα σύστημα εντοπισμού αναστολέων ειδικών για αυτές τις επικράτειες. Για την μελέτη επικρατειών, κλωνοποιήσαμε σε βακτηριακούς φορείς έκφρασης την αλληλουχία που κωδικοποιούσε τις επικράτειες CxxC-PHD της KDM2B του ποντικού και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε σε μια σειρά από βιοχημικά και βιοφυσικά πειράματα. Μια σειρά από μεταλλαξογενέσεις δημιούργησε μεταλλάγματα αυτών των επικρατειών τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση των βασικών αμινοξέων που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις αυτών των επικρατειών. Επιβεβαιώσαμε την Mg2+-ανεξάρτητη ικανότητα πρόσδεσης της KDM2B σε μη-μεθυλιωμένες DNA αλληλουχίες που περιείχαν CpG δινουκλεοτίδια και αναγνωρίσαμε τα κατάλοιπα R585, K608 και K616 ως βασικούς παίχτες αυτής της αλληλεπίδρασης. Οι πρωτεΐνες που περιείχαν μεταλλάξεις αυτών των αμινοξέων εμφάνιζαν μέχρι και 24 φορές μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης DNA. Η αναγνώριση των δομικών στοιχείων της CxxC επικράτειας τα οποία συμμετέχουν στον μηχανισμό πρόσδεσης DNA, μας επέτρεψε να συσχετίσουμε την λειτουργία της με τον βιολογικό ρόλο στην διαδικασίας παράκαμψης της γήρανσης σε εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικών. Επιπροσθέτως, εξετάσαμε τον ρόλο αυτής της επικράτειας αυτής στην διαδικασία της μετανάστευσης καρκινικών κυττάρων προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση της KDM2B η οποία έφερε την K616A μετάλλαξη απέτυχε να προκαλέσει την αυξημένη κινητικότητα που εμφάνιζαν τα κύτταρα που υπερέκφραζαν την αγρίου τύπου πρωτεΐνη υποδεικνύοντας πως η αναγνώριση του DNA να είναι σημαντική για την μετανάστευση και προσκόλληση καρκινικών κυττάρων. Με βάση αυτά τα δεδομένα σχεδιάσαμε ένα σύστημα εντοπισμού αναστολέων βασισμένο στο φθορισμό το οποίο θα μας παρείχε έναν γρήγορο και εύκολο τρόπο αξιολόγησης της αναγνώρισης DNA από την CxxC επικράτεια. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη συντήχθηκε με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη και σχεδιάστηκε μια σειρά από πειράματα στηριζόμενα στην τεχνική της μεταφοράς ενέργειας μέσω συντονισμού (FRET). Καταφέραμε να παρατηρήσουμε το φαινόμενο FRET κατά την πρόσδεση της ανασυνδυασμένη πρωτεΐνης με DNA αλληλουχίες που έφεραν το κατάλληλο φθοροφόρο, ωστόσο παρόλες τις προσπάθειές μας, η δημιουργία ενός επιτυχούς συστήματος εντοπισμού αναστολέων αποδείχθηκε αδύνατη λόγω περιορισμών από τον τεχνικό εξοπλισμό. Όσον αφορά την KDM2B PHD επικράτεια χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία MODified® Histone Peptide Array, η οποία μας επέτρεπε να εξετάσουμε 384 μοναδικούς συνδυασμούς από τροποποιήσεις ιστονών ως πιθανούς προσδέτες της. Επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση της PHD επικράτειας με την H3K4me3 τροποποίηση και αποκαλύψαμε μια πρωτοφανή αλληλεπίδραση με την H4K20me3 καθώς και μια πιο αδύναμη αλληλεπίδραση με την ουρά της H2B που περιλάμβανε τα αμινοξέα 1-19. Η ικανότητα της PHD επικράτειας να αναγνωρίζει μια τροποποίηση όπως τη H3K4me3, η οποία σχετίζεται με ευχρωματίνη και την H4K20me3, η οποία είναι σηματοδότης γονιδιακής σίγασης σε κάποιες περιπτώσεις και καρκίνου σε άλλες, στηρίζει επαρκώς την ιδέα ότι αυτή η απομεθυλάση έχει ποικιλότροπες λειτουργίες οι οποίες εξαρτώνται από το χωρικό και χρονικό ενδοκυτταρικό πλαίσιο. Ακόμα, η σχετικά υψηλή σταθερά διάσπασης που μετρήθηκε στα ITC πειράματα υποδεικνύει ότι η συνολική πρόσδεση της KDM2B με την χρωματίνη διεκπεραιώνεται από περισσότερες αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον, ερεύνα πάνω στα δομικά στοιχεία τα οποία συμμετέχουν πάνω στην αναγνώριση των ιστονών παρουσίασε πως το κατάλοιπο της φαινυλαλανίνης (F654), το οποίο βρίσκεται στο ενεργό κέντρο της PHD επικράτειας σύμφωνα με την in silico ανάλυση, δεν σχετίζεται με αυτήν την λειτουργία καθώς η πρωτεΐνη που έφερε μεταλλαγή στο συγκεκριμένο κατάλοιπο αναγνώρισε τις δύο προαναφερθείσες τροποποιήσεις παρόμοια με την αγρίου τύπου πρωτεΐνη. Τέλος, εξετάσαμε εάν η εξειδίκευση σε υποστρώματα που έχει KDM2B PHD επικράτεια είναι η ίδια με εκείνη της αδελφής της, της KDM2A. Συγκριτική ανάλυση των αποτελεσμάτων για τις δύο PHD επικράτειες έδειξε ότι αναγνωρίζουν διαφορετικά υποστρώματα και το οποίο συνάδει με προηγούμενες μελέτες που υποστηρίζουν ξεχωριστούς ρόλους για αυτές τις δύο απομεθυλάσες. Εν κατακλείδι, ο χαρακτηρισμός των μοριακών αλληλεπιδράσεων των CxxC και PHD επικρατειών της KDM2B, ο οποίος παρατίθεται σε αυτήν την διδακτορική διατριβή παρέχει μια πιο ευκρινή εικόνα του ρόλου τους και της συνεισφοράς τους στην λειτουργία αυτού του σημαντικού επιγενετικού παράγοντα και δημιουργεί νέα μονοπάτια για περαιτέρω έρευνα.