Ανάπτυξη συστήματος τεχνητής παραγωγής βιογενών ελευθέρων ριζών για την προσομοιωμένη μελέτη των οξειδωτικών τροποποιήσεων σε κρίσιμα βιομόρια σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική κατάσταση των διαφόρων βιολογικών συστημάτων
Authors: Σκιπητάρη Μαριάννα 
Published: November 2023

Οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου (•OH) και σουπεροξειδίου (O2•−) είναι βασικές παράμετροι της πρόκλησης οξειδωτικού stress (ΟΣ) σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς. Συνεπώς, οι μελέτες για τη διερεύνηση in vitro των οξειδωτικών τους επιδράσεων σε βιολογικά συστήματα παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον στη ΒιολογίαΙατρική και Φαρμακευτική, αλλά και σε πολλές άλλες γνωστικές περιοχές όπως η Χημεία, η Φυσική και η Αστροβιολογία. Ωστόσο, η προσομοιωμένη μελέτη των in vitro επιδράσεων των •OH και O2•−, μέσω της εξειδικευμένης και ανεξάρτητα ελεγχόμενης in vitro παραγωγής τους δεν είναι εφικτή με τις υφιστάμενες μεθόδους (π.χ., της •OH με το σύστημα Fenton και της O2•− με το σύστημα οξειδάσης της ξανθίνης), διότι όχι μόνο δεν ελέγχουν τους ρυθμούς παραγωγής των •OH και O2•−, αλλά παράγουν/χρησιμοποιούν και άλλες παραμέτρους ΟΣ (π.χ. H2O2 από το σύστημα Fenton). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αναπτύχθηκε ένα σύστημα φωτοδιεγειρόμενων νανοσωματιδίων TiO2 (TiO2-NP) για την απολύτως ελεγχόμενη και εξειδικευμένη παραγωγή •OH και O2•−, σε μοριακή αναλογία 1:1, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για in vitro βιολογικές προσομοιώσεις πρόκλησης υψηλού ΟΣ από αυτές τις ελεύθερες ρίζες. Ειδικότερα, το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ώστε να παράγει •OH και O2•−, ταυτόχρονα ή μεμονωμένα, καθώς αυτές οι επιλογές προσομοιώνουν όλους τους in vivo συνδυασμούς παραγωγής τους. Επιπλέον, οι γνωστές μη ειδικές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις του TiO2-NP με το H2O και διάφορα βιολογικά συστήματα (π.χ., κύτταρα, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες) προσομοιώνουν τις εστιακές/απομακρυσμένες αλληλεπιδράσεις οποιασδήποτε in vivo εστιακής πηγής •OH και O2•− με τους εξω/ενδοκυτταρικούς βιολογικούς τους στόχους, οι οποίες λαμβάνουν χώρα στο πυκνό κυτταρικό περιβάλλον. Για το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο με σκοπό να είναι εφαρμόσιμο στα περισσότερα βιολογικά συστήματα. Οι ταχύτητες παραγωγής των •OH και O2•− από το σύστημα TiO2-NP ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση των εξειδικευμένων μορίων-ανιχνευτών τους τερεφθαλικό οξύ (TPA) και διυδροαιθίδιο (HE), αντίστοιχα, και συγκρίθηκαν με τον ρυθμό παραγωγής •OH από το σύστημα Fenton. Διαπιστώθηκε ότι η κινητική των αντιδράσεων •OH και O2•− με τα TPA και HE υπόκειται σε συναγωνισμό αλληλεπιδράσεων με την πηγή παραγωγής τους, το σύστημα TiO2-NP. Παρόμοια φαινόμενα συναγωνισμού πηγών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species/ROS) με βιολογικούς στόχους είναι πολύ συνηθισμένα στα βιολογικά συστήματα, και ως εκ τούτου το σύστημα TiO2-NP παράλληλα αποτελεί προσομοιωτή τους με τα TPA/HE, κάτι που δεν διαπιστώθηκε κινητικά με το σύστημα Fenton. Το σύστημα TiO2-NP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την προσομοιωμένη μελέτη δοσο-εξαρτώμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων στα επιμέρους βιολογικά συστήματα όλων των βιολογικών συστημάτων από τις •OH και O2•−. Αυτό συμπεραίνεται από το γεγονός ότι οι αναλογικοί γραμμικοί ρυθμοί παραγωγής •OH και O2•− (60 min και έως 8 min, αντίστοιχα) μπορούν να ελεγχθούν μεταβάλλοντας (α) τη συγκέντρωση TiO2, (β) την ενέργεια εκπομπής εκάστου των φωτονίων της φωτεινής πηγής και (γ) την ένταση του φωτός. Αντίθετα, η παραγωγή •OH από το σύστημα Fenton μεγιστοποιήθηκε σε ~5 sec ανεξάρτητα από τη μεταβολή της συγκέντρωσης Fe-II. Το σύστημα TiO2-NP, παράγοντας •OH και O2•−, δοκιμάστηκε ενδεικτικά σε αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA, πρότυπη υδρόφιλη πρωτεΐνη) και τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL, δομική ομοιότητα με τα περισσότερα βιολογικά συστήματα, π.χ., κύτταρα, μεμβράνες, οργανίδια). Το σύστημα TiO2-NP προκάλεσε γραμμική αύξηση όλων των εξεταζόμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων τόσο στην BSA όσο και στην LDL για έκθεση από 20 έως 40 min, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι κυρίως δοσο-εξαρτώμενες από την •OH. Αντίθετα, το σύστημα Fenton δεν εμφάνισε, δοσο-εξαρτώμενες από την •OH , τροποποιήσεις στη BSA. Επίσης, το σύστημα TiO2-NP χρησιμοποιήθηκε για την in vitro διερεύνηση της επίδρασης των •OH ή/και O2•−, στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης (HI) (η οποία αξιολογήθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ), προσδιορίζοντας στη HI τον κατακερματισμό της και το σχηματισμό cross-links διτυροσίνης (Tyr-Tyr). Η έκθεση στην •OH, αλλά όχι στην O2•−, επηρέασε προοδευτικά τη δυνατότητα κρυστάλλωσης της HI, ενώ συσχετίστηκε αναλογικά με το σχηματισμό Tyr-Tyr και τη συσσωμάτωση της HI (με τον κατακερματισμό της σε πολύ μικρότερη έκταση). Εστιάζοντας στη δομής της HI, σε σχέση με την έκθεση στην •OH, δεν εντοπίστηκαν δομικές τροποποιήσεις των μορίων ή μεταβολές σε επιρρεπή στην οξείδωση αμινοξέα, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι οι κρύσταλλοι που μελετήθηκαν σχηματίστηκαν από μόρια που δεν έχουν υποστεί οξειδωτικές τροποποιήσεις.