Development and creation of a biosensor to detect microorganisms through innovative electrochemical and molecular methods in water
Authors: Κοτσίρη Ζωή 
Published: November 2023

Το κύριο αντικείμενο της διδακτορικής μου έρευνας είχε ως στόχο την ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα για την ανίχνευση παθογόνων στο θαλασσινό νερό. Κατά την εφαρμογή του, αποφασίστηκε ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για να αποτυπωθεί η τρέχουσα κατάσταση στη βιβλιογραφία. Ως απάντηση στο αυξημένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων, πραγματοποιήθηκε μια συστηματική ανασκόπηση σύμφωνα με τα κριτήρια PRISMA, που εκτείνεται από τον Ιανουάριο 2010 έως τον Δεκέμβριο του 2019. Η μελέτη επικεντρώθηκε σε εφαρμογές βιοαισθητήρων για την ανίχνευση τροφιμογενών και υδατογενών βακτηρίων και ιών και ήταν βασίστηκε σε δημοσιεύσεις που αντλήθηκαν μέσω αναζητήσεων στις βάσεις δεδομένων Pubmed, ScienceDirect και Scopus. Οι περισσότερο ευρέως χρησιμοποιούμενες τεχνολογίες είναι οι μέθοδοι οπτικής και ηλεκτροχημικής ανίχνευσης σε βιοαισθητήρες λόγω της ικανότητάς τους να επιτυγχάνουν υψηλότερη ευαισθησία από άλλες μεθόδους ανίχνευσης. Ε. coli και Salmonella spp. είναι οι πιο μελετημένοι οργανισμοί, καθώς αυτά τα παθογόνα βακτήρια σχετίζονται με τροφιμογενείς νόσους. Εφαρμόστηκαν διαφορετικές μεθοδολογίες για τον καθορισμό της κατάλληλης μεθόδου για το τελικό σύστημα του βιοαισθητήρα. Αρχικά, εξετάστηκε η ανάπτυξη των κυττάρων E. coli σε διαλύματα με υψηλές συγκεντρώσεις NaCl. Σε σύγκριση με τα κλασσικά θρεπτικά μέσα, διαλύματα στα οποία είχε αντικατασταθεί το γλυκό νερό με 60% τεχνητό θαλασσινό νερό, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μορφολογική αλλοίωση των κυττάρων E. coli. Επομένως, φαίνεται ότι τα υγρά υψηλών συγκεντρώσεων σε NaCl δεν είχαν καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων E. coli. Τα μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα Ε1 απταμερή συνδέονται στη λιποσακχαριτική μεμβράνη των βακτηρίων χρησιμοποιώντας έναν μαγνήτη. Χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια E. coli και το αρχικό δείγμα συγκεντρώθηκε σε μικρότερο όγκο, συμπυκνώθηκε και στη συνέχεια επαναδιαλύθηκε σε μικρότερο όγκο. Το δείγμα υπόκειται σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction-PCR) και η κυτταρική λύση επιτυγχάνεται στον θερμικό κυκλοποιητή. Εφαρμόστηκε μέθοδος απομόνωσης γενετικού υλικού (DNA) χωρίς την απαίτηση για το στάδιο εμπλουτισμό ή εκχύλισης/καθαρισμού DNA, η μέθοδος αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) ανιχνεύει τα βακτήρια γρήγορα. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 103 CFU/mL. Οι εμπορικές προσεγγίσεις με βάση το DNA επικεντρώνονται στην ενζυματική, χημική ή θερμική λύση, μηχανική διάρρηξη του κυτταρικού τοιχώματος με σφαιρίδια ή υπερήχους ή σε συνδυασμό των παραπάνω και απαιτούν εξειδικευμένο εξοπλισμό. Έτσι, προτάθηκε μια εναλλακτική μέθοδος εκχύλισης, o βρασμός. Για την αξιολόγηση της μεθόδου βρασμού σε E. coli και E. faecalis, συγκρίθηκαν δύο εμπορικά διαθέσιμοι τρόποι απομόνωσης γενετικού υλικού και δοκιμάστηκαν με την κλασική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Quantitative polymerase chain reaction, qPCR) και τη χρωματο χρωματομετρική ισόθερμη ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου (Loop-mediated isothermal amplification, colorimetric LAMP). Η σύγκριση έδειξε ότι ο βρασμός που εφαρμόστηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν εξίσου αποτελεσματικός με τον εμπορικό με όριο ανίχνευσης περίπου 103 CFU/100 mL. Οι διάφοροι τύποι φίλτρων που διατίθενται στο εμπόριο εφαρμόστηκαν για το στάδιο της προ-συγκέντρωσης και τη δέσμευση των βακτηρίων στην επιφάνεια της μεμβράνης τους για να εκτιμηθεί η ανάκτησή τους. Η ανάκτηση μετρήθηκε με την εφαρμογή της τεχνικής επίστρωσης. Οι μικροΐνες υάλου/ίνα υάλου (GD/X) και φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) έδειξαν μέτρια αποτελέσματα όσον αφορά στον διαχωρισμό των βακτηρίων από την επιφάνεια της μεμβράνης, σημειώνοντας 67,5 και 48,33% αντίστοιχα. Το φίλτρο οξικής κυτταρίνης (CA) επιλέχθηκε με ποσοστό ανάκτησης 98,5% για το Ε. coli. Η ίδια μεθοδολογία εφαρμόστηκε με σειριακές αραιώσεις για E. coli και E. faecalis για την εύρεση του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου τεχνική πολυεπιλεκτικής χρωματομετρικής ισόθερμης ενίσχυσης με μεσολάβηση βρόχου (multiplex colorimetric LAMP) με όριο ανίχνευσης 104 CFU/1000 mL.Η επόμενη μέθοδος βασίστηκε στη σύζευξη ειδικών αντισωμάτων σε αντιγονικά στοιχεία του βακτηρίου E. coli και στη συνέχεια στη σύνδεση ενός δευτεροταγούς φθορίζοντος αντισώματος, καθιστώντας έτσι, το πρώτο ως αντιγόνο. Τρία είδη αντιγόνων - το σωματικό ή Ο αντιγόνο, το οποίο αντιστοιχεί σε τελικά σάκχαρα στην κυτταρική επιφάνεια του λιποπολυσακχαρίτη, τα καψικά ή Κ αντιγόνα και τα μαστιγιακά ή Η αντιγόνα - επιτρέπουν την ορολογική τυποποίηση μεταξύ των στελεχών του βακτηρίου E. coli. Το πρωτογενές αντίσωμα προσαρτήθηκε ειδικά σε αυτούς τους προαναφερθέντες στόχους. Τα πρωτοταγή και δευτεροταγή επισημασμένα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνδεση του βακτηρίου E. coli σε περιβαλλοντικά δείγματα. Η ανάλυση έδωσε ψευδώς θετικά αποτελέσματα και φάνηκε ανεπαρκής για να συμπεριληφθεί σε μια πλήρη ανάλυση βιοαισθητήρα. Η σύνθεση ενός ολοκληρωμένου συστήματος ανίχνευσης μικροοργανισμών βασίστηκε στην προ-συγκέντρωση μέσω φίλτρων και στην ανάκτηση βακτηρίων με αντίστροφη πλύση. Κατασκευάστηκε μια συσκευή που περιελάβανε το στάδιο της άντλησης νερού από τη θάλασσα, φίλτρο για τα μεγάλα σωματίδια (για δέσμευση ιζημάτων, βακτηρίων και οποιουδήποτε άλλου οργανισμού) που συλλέγονται σε δεξαμενή 1 L, φιλτράρισμα όγκου 1 L, πλύσιμο του φίλτρου με 100 ml dH2O, θέρμανση για τη λύση των κυττάρων, ανάμιξη των αντιδραστηρίων με το δείγμα για ενίσχυση του γονιδίου και, τέλος, οπτικοποίηση του αποτελέσματος μέσω αλλαγής χρώματος. Ένα μικροτσίπ από πολυδιμεθυλσιλοξάνιο (polydimethylsiloxane - PDMS) κατασκευάστηκε κατά παραγγελία σύμφωνα με τις απαιτήσεις. Η συσκευή περιέχει μια ηλεκτρική πιπέτα για την αυτοματοποιημένη μεταφορά των αντιδραστηρίων και του δείγματος στο μικροτσίπ. Η συσκευή δοκιμάστηκε στο πεδίο με πραγματικά δείγματα θαλασσινού νερού και η δοκιμή chi square έδειξε πανομοιότυπα αποτελέσματα μεταξύ του βιοαισθητήρα και της κλασικής μεθόδου μέτρησης μικροοργανισμών με τη μέθοδο διήθησης. Ο βιοαοσθητήρας είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την τακτική περιβαλλοντική παρακολούθηση της παραλίας και των ακτών κολύμβησης. Χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση νερού για δείκτες κοπρανώδους μόλυνσης και για την ανάπτυξη μιας συσκευής σήμανσης παρακολουθώντας δείγματα νερού. Κάθε στάδιο του βιοαισθητήρα εξετάστηκε και αξιολογήθηκε ξεχωριστά για την αποτελεσματικότητα του. Το συγκριτικό πλεονέκτημα της τεχνολογίας είναι η ταυτόχρονη ταυτοποίηση μικροοργανισμών στο θαλασσινό νερό και η άμεση απόκρισή του. Εάν κάποιο από τα μικρόβια υπάρχει σε μεγαλύτερες από τις επιτρεπόμενες ποσότητες, οι λουόμενοι δεν επιτρέπεται να χρησιμοποιούν την περιοχή.