Μηχανισμοί δράσης προβιοτικών μικροοργανισμών σε in vitro και in vivo συστήματα
Authors: Χονδρού Πελαγία 
Published: May 2021

Ο όρος προβιοτικός χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να περιγράψει ουσίες που παράγονται από κάποιο μικροοργανισμό και οι οποίες επηρεάζουν ευεργετικά τον ξενιστή, βελτιώνοντας την εντερική μικροβιακή ισορροπία του (Fuller, 1989). Ακολούθησαν διάφορες μελέτες και προτάθηκαν αρκετοί ορισμοί για να καταλήξουμε στον επίσημο ορισμό από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization - WHO) και τον Διεθνή Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας (Food and Agriculture Organization - FAO), ο οποίος ορίζει τα προβιοτικά ως «ζωντανούς μικροοργανισμούς οι οποίοι, όταν χορηγούνται σε κατάλληλη ποσότητα, προσφέρουν θετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή» (FAO/WHO, 2002). Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται πιο συχνά ως προβιοτικοί είναι κυρίως οξυγαλακτικά βακτήρια, του γένους Lactobacillus, και Bifidobacterium, καθώς επίσης και στελέχη του γένους Enterococcus. Κάθε νέο στέλεχος που απομονώνεται, θα πρέπει να διαθέτει ορισμένα χαρακτηριστικά. Αρχικά, λόγω του ότι ενσωματώνεται στα τρόφιμα, θα πρέπει να μπορεί να επιβιώσει κατά το πέρασμα του από το γαστρεντερικό σωλήνα, και ειδικότερα να ανταπεξέλθει στις όξινες συνθήκες του στομάχου και στη δράση πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως είναι οι πεψίνες και οι παγκρεατίνες. Η ικανότητα προσκόλλησης είναι επίσης, μια ιδιότητα μέσω της οποίας παρατείνεται η παρουσία και η δράση των προβιοτικών στο γαστρεντερικό σωλήνα, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερο χρόνο αλληλεπίδρασης τους με τον ξενιστή. Ωστόσο, δεν αποτελεί προαπαιτούμενο της δράσης τους. Επίσης, κάθε νέο εν δυνάμει προβιοτικό στέλεχος που απομονώνεται, είναι απαραίτητο να μην είναι παθογόνο και να διαθέτει αντι-μικροβιακή δράση έναντι παθογόνων μικροοργανισμών (Mercenier et al., 2008). Υπάρχουν πολλές μελέτες που καταδεικνύουν τα οφέλη των προβιοτικών σε παθολογικές καταστάσεις του γαστρεντερικού συστήματος, όπως για παράδειγμα στην ιδιοπαθή φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και το σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου (irritable bowel syndrome – IBS). Επίσης, αυξάνονται τα τελευταία χρόνια οι μελέτες που αποδεικνύουν την ευεργετική δράση των προβιοτικών και σε διαταραχές άλλων συστημάτων, όπως είναι διαταραχές του μεταβολισμού, ανοσολογικές διαταραχές ή διαταραχές του ψυχισμού του ατόμου. Παράλληλα, μετά από in vitro και in vivo έρευνες έχει παρατηρηθεί μείωση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μετά από επίδραση με προβιοτικούς μικροοργανισμούς (Tiptiri-Kourpeti et al., 2016), καθώς επίσης και άλλων μορφών καρκινικών κυττάρων όπως για παράδειγμα καρκινικά κύτταρα μαστού (Marschalek et al., 2017). Οι μηχανισμοί με τους οποίους δρουν οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι ειδικοί για το κάθε στέλεχος και καθορίζουν την αποτελεσματικότητα τους και τις ευεργετικές τους επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι η ενίσχυση του επιθηλιακού φραγμού, η προσκόλληση στον εντερικό βλεννογόνο, ο ανταγωνιστικός αποκλεισμός παθογόνων μικροβίων, η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και η τροποποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή (Bermudez-Brito et al., 2012).Τα τελευταία χρόνια υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για την απομόνωση νέων προβιοτικών μικροοργανισμών και την εφαρμογή τους στην ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων. Στο πλαίσιο αυτό, η ερευνητική μας ομάδα, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υγιεινής, του Τμήματος Αγροτικής Ανάπτυξης του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης, αρχικά απομόνωσε νέα οξυγαλακτικά βακτήρια από γαλακτοκομικό προϊόν τύπου φέτα, και μελέτησε το προβιοτικό τους δυναμικό μέσω καθιερωμένων in vitro δοκιμασιών, συμπεριλαμβανομένων της αντίστασης στο χαμηλό pH, της αντίστασης σε πεψίνη και παγκρεατίνη, καθώς και της αντοχής στη δράση χολικών αλάτων. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε έλεγχος ασφάλειας μέσω της μελέτης ανθεκτικότητας έναντι κοινά χρησιμοποιούμενων αντιβιοτικών. Το στέλεχος Lactobacillus Κ5, το οποίο εμφάνισε τις καλύτερες προβιοτικές ιδιότητες, επιλέχθηκε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής να ταυτοποιηθεί μοριακά, να μελετηθεί περαιτέρω ως προς το προβιοτικό του δυναμικό και να χαρακτηριστούν οι μηχανισμοί δράσης του, εφαρμόζοντας τόσο in vitro όσο και in vivo πειραματικά μοντέλα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μοριακή ταυτοποίηση και αποδείχθηκε ότι το εν λόγω στέλεχος ανήκει στο είδος paracasei. Παράλληλα αναπτύχθηκε μια αντίδραση PCR για την ανίχνευση του στελέχους σε τρόφιμα, με τη χρήση στελεχο-ειδικών εκκινητών οι οποίοι σχεδιάστηκαν με την τεχνική ανάλυσης τυχαία ενισχυμένου πολυμορφικού DNA (RAPD - Random amplified polymorphic DNA). Ακολούθησε στη συνέχεια, μελέτη των μηχανισμών δράσης του συγκεκριμένου στελέχους in vitro. Πιο συγκεκριμένα, μέσω ποσοτικής ανάλυσης και συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού, μελετήθηκε η προσκολλητική ικανότητα του L. paracasei K5 στην καρκινική σειρά εντερικών επιθηλιακών κυττάρων Caco-2. Το στέλεχος L. paracasei K5 εμφάνισε σημαντική ικανότητα προσκόλλησης στα καρκινικά κύτταρα, η οποία ήταν παρόμοια με τα στελέχη αναφοράς L. casei ATCC 393 και L. rhamnosus GG, δύο εμπορικά διαθέσιμα προβιοτικά στελέχη. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η πιθανή αντι-πολλαπλασιαστική του δράση και αποδείχθηκε ότι μετά από επίδραση με το συγκεκριμένο στέλεχος παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων με δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενο τρόπο. Η παρατηρούμενη ανασταλτική επίδραση του L. paracasei K5 έναντι των καρκινικών κυττάρων, αποδείχθηκε ότι επάγεται με τη διαδικασία της απόπτωσης μέσω τροποποίησης της γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένων μορίων της οικογένειας Bcl-2 σε επίπεδο mRNA, η οποία επιβεβαιώθηκε και σε επίπεδο πρωτεΐνης. Παράλληλα, αποδείχθηκε η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης του στελέχους έναντι των καρκινικών κυττάρων Caco-2. Στη συνέχεια, θέλοντας να μελετήσουμε τη δράση του συγκεκριμένου στελέχους in vivo, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα. Πιο συγκεκριμένα, με το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα ποντικών, που αποτελεί ένα καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο φλεγμονής, διερευνήθηκε η ανοσορρυθμιστική ικανότητα του L. paracasei K5. Στα ποντίκια τα οποία δέχθηκαν επίδραση με το προβιοτικό στέλεχος παρατηρήθηκε αυξημένη στρατολόγηση κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, η οποία ήταν 8 φορές μεγαλύτερη συγκριτικά με τα ποντίκια αναφοράς. Η ανάλυση του εξιδρώματος των ραχιαίων αεροθυλάκων αποκάλυψε μια σημαντική τροποποίηση της έκφρασης διαφόρων προ-φλεγμονωδών παραγόντων στην περιοχή. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης συγκεκριμένων κυτοκινών και χημειοκινών (IL-1α, ΙL-1β, IL-6, TNF-α – tumor necrosis factor-alpha, C-X-C motif ligand 2 – CXCL2), καθώς επίσης και διαλυτών μεσολαβητών φλεγμονής (intercellular adhesion molecule – sICAM και metallopeptidase inhibitor-1 –TIMP-1). Παράλληλα, μελετήθηκαν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υποδοχέων TLRs – Toll-like receptors, με την τεχνική της PCR πραγματικού χρόνου μετά από επίδραση με το στέλεχος L. paracasei K5 στα κύτταρα Caco-2. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε παροδική επαγωγή της έκφρασης των TLR2, 4, 6, και 9. Συνοψίζοντας, στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας μελετήθηκε εκτενώς ένα νέο οξυγαλακτικό βακτηρίο ως προς το προβιοτικό του δυναμικό, τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo πειραματικά μοντέλα. Αποδείχθηκε ότι το στέλεχος Lactobacillus paracasei Κ5 παρουσιάζει σημαντικές προβιοτικές ιδιότητες και μπορεί μελλοντικά να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων.