Διερεύνηση μεθόδων φαινοτυπικού ελέγχου για την ανίχνευση εκτεταμένου φάσματος β-λακταμασών στα gram- αρνητικά βακτήρια
Authors: Γριβάκου Ευγενία 
Published: September 2021

Η αντοχή των gram-αρνητικών βακτηρίων στις κεφαλοποσπορίνες τρίτης γενεάς αποτελεί μείζον θέμα δημόσιας υγείας παγκόσμια, οφειλόμενο ως επί το πλείστον στην παραγωγή εκτεταμένου φάσματος β-λακταμασών (ESBLs) . Το φαινόμενο αυτό πρωτοεμφανίστηκε τη δεκαετία του 1980 και σήμερα έχει διαστάσεις ενδημίας σε αρκετές περιοχές του κόσμου. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος εισήχθησαν ευρέως στη θεραπευτική οι καρβαπενέμες, με συνέπεια να αναδυθούν στελέχη που παράγουν ταυτόχρονα ESBLs και καρβαπενεμάσες . Επίσης , υπάρχουν στελέχη που παράγουν ταυτόχρονα ESBLs και AmpC-β-λακταμάσες. Παρουσία αυτών των ενζύμων, η παραγωγή των ESBLs δεν αποκαλύπτεται με τις τρέχουσες φαινοτυπικές μεθόδους. Οι ESBLs παραμένουν «κρυμμένες» και η συχνότητά τους υποεκτιμάται. Το CLSI προτείνει για τη φαινοτυπική ανίχνευση των ESBLs μια δοκιμασία συνδυασμένων δίσκων, το CLSI ESBL Confirmatory Test. Στο τεστ αυτό χρησιμοποιούνται 2 κεφαλοσπορίνες ( κεφοταξίμη και κεφταζιδίμη). Το CLSI ESBL Test δεν εφαρμόζεται σε στελέχη που παράγουν καρβαπενεμάσες ή AmpCs .Με την παρούσα διατριβή, προσπαθήσαμε να τροποποιήσουμε το κλασικό τεστ ωστε να βελτιωθεί η απόδοσή του, ιδιαίτερα σε μια εποχή με αυξανόμενη συχνότητα συμπαραγωγής ESBLs και καρβαπενεμασών ή AmpCs, φαινόμενο ιδιαίτερα διαδεδομένο στα εντεροβακτηριακά . Στη συνέχεια , θελήσαμε να δοκιμάσουμε αν οι τροποποιήσεις αυτές μπορούν να ανιχνεύσουν αποτελεσματικά τις ESBLs και εκτός των εντεροβακτηριακών , οπότε επιπλέον μελετήσαμε στελέχη P.aeruginosa που ταυτόχρονα παράγουν MBLs. Η φαινοτυπική ανίχνευση των ESBLs στην P.aeruginosa αποτελεί πρόκληση για τον κλινικό μικροβιολόγο, καθώς η υπερπαραγωγή της ενδογενούς AmpC ή/και η ταυτόχρονη παραγωγή καρβαπενεμασών μπορεί να καλύψει την παραγωγή των ESBLs. Η τροποποίηση που προτείνουμε συνίσταται στην προσθήκη 400μg βορονικού και 292μg EDTA στους δίσκους της κεφταζιδίμης και κεφοταξίμης χωρίς και με παρουσία κλαβουλανικού. Το βορονικό οξύ είναι αναστρέψιμος αναστολέας των KPC- καρβαπενεμασών και των AmpCs.To EDTA είναι αναστολέας των MBL. Θεωρήσαμε , επομένως, ότι με την προσθήκη αυτών των αναστολέων στους δίσκους των αντιβιοτικών θα αποκαλυπτόταν με τη συνέργεια του κλαβουλανικού η παραγωγή των ESBLs.Στη μελέτη συμπεριλήφθησαν 368 στελέχη αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, που απομονώθηκαν από λοιμώξεις ισάριθμων ασθενών που νοσηλεύτηκαν σε επτά ελληνικά νοσοκομεία κατά το διάστημα 2007-2014. Ο αρχικός έλεγχος των στελεχών συμπεριέλαβε τον καθορισμό των MICs των κυριότερων αντιβιοτικών με τη μέθοδο διαδοχικών αραιώσεων σε άγαρ, φαινοτυπικές δοκιμασίες για την παραγωγή καρβαπενεμασών και κεφαλοσπορινασών και μοριακές μεθόδους τυποποίησης (single- end και real -time PCRs). Οι PCRs και η αλληλούχιση των τελικών προϊόντων χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των γονιδίων που έφεραν ESBLs, KPCs, MBLs, AmpCs και ΟΧΑ-48. Συγκεκριμένα, συμπεριελήφθησαν 189 θετικά για την παραγωγή ESBLs στελέχη και 179 στελέχη που δεν παρήγαγαν ESBLs. Από τα 189 θετικά για την παραγωγή ESBLs στελέχη, τα 118 ήταν στελέχη που ταυτόχρονα παρήγαγαν καρβαπενεμάσες ή AmpCs. Από αυτά τα στελέχη,τα 301 ήταν εντεροβακτηριακά και τα υπόλοιπα 67 ήταν στελέχη P.aeruginosa.Σε όλα τα στελέχη εφαρμόστηκαν το CLSI ESBL Confirmatory Test και η τροποποιημένη με την προσθήκη βορονικού και EDTA μέθοδος (modified CLSI ESBL test). Από τη συγκριτική αξιολόγηση και την ανάλυση των αποτελεσμάτων, διαπιστώθηκε ότι το τροποποιημένο τεστ (modified CLSI ESBL test) ανίχνευσε την παραγωγή ESBLs σε 158 από τα 162 στελέχη εντεροβακτηριακών (ευαισθησία 97,5% ) και δεν έδωσε κανένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα (ειδικότητα 100%). Αντιθέτως, η ευαισθησία του CLSI ESBL Confirmatory Test ήταν 65,4% , ενώ η ειδικότητά του ήταν 97.1% , καθώς έδωσε 4 ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Ειδικότερα, το τροποποιημένο τεστ (modified CLSI ESBL test) ανίχνευσε την παραγωγή ESBLs σχεδόν σε όλα τα στελέχη που ταυτόχρονα παρήγαγαν καρβαπενεμάσες ή AmpCs (106 από τα 108, ευαισθησία 98,1%) ,ενώ το CLSI ESBL Confirmatory Test δεν αποκάλυψε την παραγωγή ESBLs σε 55 από τα 108 στελέχη (ευαισθησία 49,1%) . Όσον αφορά στην ανίχνευση των ESBLs σε P.aeruginosa, το τροποποιημένο τεστ (modified CLSI test) έχει ευαισθησία 100% και ειδικότητα 100%, σε αντίθεση με το CLSI ESBL Confirmatory Test , που εντόπισε την παραγωγή ESBLs σε 4 από τα 10 στελέχη που ταυτόχρονα παράγουν MBL και σε 15 από τα 17 στελέχη που ειναι αποκλειστικά ESBL-producers. Η ευαισθησία του CLSI Test είναι 70,3% και η ειδικότητα είναι 92,5%.Το τροποποιημένο τεστ (modified CLSI ESBL test) εκτιμήθηκε ως εύκολης εφαρμογής και χαμηλού κόστους μέθοδος με μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα , που μπορεί να διακρίνει με ακρίβεια την παραγωγή ESBLs , χωρίς την προϋπόθεση της γνώσης της ταυτόχρονης παρουσίας καρβαπενεμασών ή AmpCs,ενώ μπορεί να εφαρμοστεί και σε στελέχη P.aeruginosa. Το τροποποιημένο τεστ (modified CLSI ESBL test) αποτελεί χρήσιμο εργαλειο για επιδημιολογικούς σκοπούς και για την εφαρμογή μέτρων ελέγχου λοιμώξεων, ενώ μπορεί να συμβάλλει στην αποκλιμάκωση της θεραπείας.