Η διελεύκανση των μοριακών μηχανισμών μάθησης και μνήμης με την χρήση μοντέλων γνωσιακών δυσλειτουργιών στην drosophila melanogaster
Authors: Κανελλόπουλος Αλέξανδρος 
Published: July 2014

Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει τίτλο «Η διελεύκανση των μοριακών μηχανισμών μάθησης και μνήμης με την χρήση μοντέλων γνωσιακών δυσλειτουργιών στην Drosophila melanogaster”. Ο λόγος που επιλέχθηκε η Drosophila σαν οργανισμός μοντέλο δεν είναι μόνο ένας. Η Drosophila, παρότι ανήκει στην κατηγορία των εντόμων παρουσιάζει μεγάλα πλεονεκτήματα έναντι άλλων οργανισμών. Τόσο η γενετική ανάλυση που προσφέρει, όσο και η ευκολία στον χειρισμό αποτελούν βασικά πλεονεκτήματα. Επίσης η δυναμική της μύγας για την μελέτη της συμπεριφοράς είναι πολύ μεγάλη και μπορούν να αναλυθούν συμπεριφορές παρόμοιες με αυτές των θηλαστικών. Έτσι η μάθηση και η μνήμη μελετώνται στην Drosophila με τις κατάλληλες αντιπροσωπευτικές μεθόδους, καθώς επίσης στις διαδικασίες αυτές εμπλέκονται μόρια και σηματοδοτικά μονοπάτια παρόμοια με αυτά των θηλαστικών.Η μάθηση και η μνήμη αποτελούν πολύ σημαντικές διαδικασίες για τον άνθρωπο και την επιβίωσή του. Προβλήματα στις διαδικασίες αυτές οδηγούν σε ασθένειες, η μοριακή βάση των οποίων είναι αδύνατο να διαλευκανθεί στον άνθρωπο. Ωστόσο για να βελτιωθεί η ποιότητα ζωής του ανθρώπου και να καταπολεμηθούν οι ασθένειες αυτές, είναι απαραίτητη η ταυτοποίηση και η μελέτη της λειτουργίας των μορίων εκείνων που παίζουν ρόλο στο σχηματισμό μάθησης και μνήμης, στο επίπεδο του νευρώνα. Ασθένειες όπως η Πνευματική Καθυστέρηση, ο Αυτισμός, η νόσος Αλτσχάιμερ, η νόσος Πάρκινσον, διάφορες άνοιες, η Σχιζοφρένεια, οι ημικρανίες, η διάσπαση προσοχής, διάφορα σύνδρομα και άλλες πολλές, παρουσιάζουν στα κύρια συμπτώματά τους μη φυσιολογική ικανότητα μάθησης και μνήμης. Γίνεται, επομένως κατανοητό, πόσο σημαντική και αναγκαία είναι η διαλεύκανση αυτών των μηχανισμών και η ανάδειξη της μοριακής βάσης που διέπει τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Η χρήση οργανισμών μοντέλων είναι απαραίτητη γιατί μόνο έτσι μπορούμε να οδηγηθούμε στα μόρια-πυρήνες που θεμελιώνουν το σχηματισμό μάθησης και μνήμης. Η προσομοίωση κάποιων ανθρώπινων ασθενειών σε οργανισμούς μοντέλα, όπως η Drosophila, μας επιτρέπει να μελετήσουμε τις ελλειμματικές συμπεριφορές που συνδέονται με μία ασθένεια αλλά και να εντρυφήσουμε σε βάθος ανακαλύπτοντας τα πραγματικά αίτια που οδηγούν στα ελλείμματα αυτά. Επιπροσθέτως, μέσω της μελέτης ασθενειών που επηρεάζουν τη μάθηση και τη μνήμη είναι δυνατός ο εντοπισμός συγκεκριμένων μορίων-κλειδιών που παίζουν ρόλο στις διαδικασίες αυτές. Επιτυγχάνεται έτσι η κατανόηση βασικών διαδικασιών μέσω της μελέτης των μονοπατιών που διαταράσσονται και οδηγούν σε προβλήματα στις συμπεριφορές αυτές. Επίσης με την κατανόηση των διαδικασιών αυτών και τον εντοπισμό των μοριακών στόχων μας δίνεται η δυνατότητα εύρεσης νέων φαρμακευτικών στόχων με σκοπό την βελτίωση της ποιότητας ζωής των ανθρώπων που υποφέρουν. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήσαμε το FXS για τη μελέτη της μάθησης και της μνήμης, δύο διαδικασιών που εμφανίζονται προβληματικές στους ασθενείς με το σύνδρομο. Το σύνδρομο του FXS παρουσιάζει πληθώρα γνωσιακών προβλημάτων, που είμαστε σε θέση να μελετήσουμε στην Drosophila καθώς επίσης εμπλέκει στην παθοφυσιολογία του και πλήθος μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών, βασικών στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης.Έτσι μελετήσαμε το ρόλο της dFMRP στις διαδικασίες αυτές και τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Βρήκαμε βασικά μόρια που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μάθηση και τη μνήμη. Εντοπίσαμε μονοπάτια που επηρεάζονται από την έλλειψη της πρωτεΐνης και ταυτοποιήσαμε το ρόλο τους στη μάθηση και τη μνήμη.Αναλυτικότερα, δείξαμε ότι η μείωση 50% της πρωτεΐνης στο κεντρικό νευρικό σύστημα αλλά και σε συγκεκριμένα νευρωνικά υποσύνολα, όπως αυτά των Μανιταροειδών σωματίων (της ανάλογης περιοχής του ιπποκάμπου) προκαλεί ελλειμματική μάθηση και μνήμη, όπως συμβαίνει και στα θηλαστικά. Επίσης δείξαμε ότι τα άτομα αυτά, παρουσιάζουν υπερκινητικότητα και ελαττωματική μη συνειρμική μάθηση. Ωστόσο με την μείωση της πρωτεΐνης 50%, μπορέσαμε να ξεπεράσουμε τα αναπτυξιακά προβλήματα που προκαλούνται από την έλλειψη της dFMRP και να μελετήσουμε τους συμπεριφορικούς φαινοτύπους που οφείλονται στα μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης και μόνο. Συμπεριφορικές μελέτες σε ανθρώπους και ποντίκια έχουν δείξει παρομοίως, ότι η μείωση της dFMRP οδηγεί σε ελλειμματική μάθηση και μνήμη καθώς και σε υπερκινητικότητα. Επομένως η μύγα αποτελεί ένα ευαίσθητο μοντέλο για μελέτη φαινοτύπων που παρατηρούνται σε ασθενείς και ποντίκι. Προβλήματα μάθησης, μνήμης , υπερκινητικότητας και αυτιστικές συμπεριφορές.Μέσω γενετικών και φαρμακολογικών εργαλείων καταδεικνύουμε ότι για το FXS ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο παίζουν τα επίπεδα του mGluR αλλά και τα επίπεδα του cAMP, δύο μόρια που μπορεί να ανήκουν στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι, το οποίο ρυθμίζεται από την dFMRP. Επίσης αναδείξαμε την θετική μεταγραφική ρύθμιση του dfmr1 από τα επίπεδα του cAMP μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης Α και αναδείξαμε τον μεταγραφικό παράγοντα CREB σαν το μόριο που μεταβιβάζει την πληροφορία στο γονιδίωμα. Επίσης η πρωτεΐνη παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στις συνάψεις ρυθμίζοντας τα επίπεδα του mGluR, και μάλιστα έχοντας ρόλο καταστολέα. Επιπροσθέτως για περαιτέρω επιβεβαίωση μελετήσαμε ότι πέρα από την μείωση, τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης οδηγούν σε μεταβολές της συμπεριφοράς. Είδαμε λοιπόν ότι ο συμπεριφορικός φαινότυπος οφείλεται στο cAMP, αλλά τελικά όχι μόνο, καθώς βρήκαμε ένα ακόμα μονοπάτι που επηρεάζεται από την έλλειψη της dFMRP, αυτό του ΜΑΡΚ. Η μείωση της dFMRP οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα της ενεργοποιημένης μορφής της ΜΑΡΚ και αυτό φαίνεται να οφείλεται στην αρνητική ρύθμιση της φωσφατάσης ΡΡ2Α από την dFMRP. Έτσι φαίνεται ότι η FMRP αποτελεί κύριο ρυθμιστή της πρωτεϊνικής σύνθεσης τοπικά στις συνάψεις ενώ οι αλλαγές στη μορφολογία και τη λειτουργία της σύναψης οδηγούν σε συμπεριφορικά ελλείμματα. Μέσα από τα πειράματά μας γίνεται κατανοητό ότι η απώλεια της dFMRP έχει σαν αποτέλεσμα να επηρεάζονται πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια, που επικοινωνούν μεταξύ τους με τελική κατάληξη τα συμπεριφορικά ελλείμματα. Η μελέτη της υπερ-κινητικότητας των ατόμων αυτών και η φαρμακολογική σάρωση που πραγματοποιήσαμε, κατέδειξε την πολυπλοκότητα του συνδρόμου και την απορύθμιση πολλών σηματοδοτικών μονοπατιών με την απώλεια της dFMRP. Είναι ωστόσο αναγκαία η περαιτέρω μελέτη για την ανάδειξη σημαντικών νευρωνικών υποσύνολων στα οποία η έλλειψη της πρωτεΐνης προκαλεί το φαινότυπο π.χ. ντοπαμινεργικοί νευρώνες.Επίσης είναι αναγκαία η επιπλέον μελέτη των μοριών-στόχων της FMRP και οι γενετικές αλληλεπιδράσεις της με σκοπό την κατανόηση και τον σχεδιασμό νέων φαρμακευτικών στόχων, αποτελεσματικότερων για το ευρύ φάσμα φαινοτύπων του συνδρόμου.Στην παρούσα διατριβή, ένα μεγάλο μέρος της αφιερώθηκε στην μελέτη της εξοικείωσης. Η σημασία της είναι αναγκαία μιας και η ελλειμματική εξοικείωση πιθανώς να εμπλέκεται και να επηρεάζει την μάθηση και εμπλέκεται σε ασθένειες όπως η σχιζοφρένεια, ο αυτισμός, μαθησιακά προβλήματα κ.α.Σε μια πρώτη προσέγγιση, καταφέραμε να δείξουμε τα απαραίτητα νευρωνικά υποσύνολα που η λειτουργία τους είναι σημαντική για την φυσιολογική εξοικείωση στην μύγα. Έτσι ανακαλύψαμε ότι οι α και β λοβοί των ΜΣ είναι απαραίτητοι για την φυσιολογική εξοικείωση. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο του FXS, είδαμε ότι η μείωση της dFMRP προκαλεί ελλειμματική εξοικείωση (αποτελέσματα δεν δείχνονται) και είναι πιθανό η μη φυσιολογική συνειρμική μάθηση και μνήμη, που παρουσιάζουν τα άτομα αυτά, να οφείλεται σε προβλήματα εξοικείωσης (μελέτη σε πρόοδο).Συνοψίζοντας, η συγκεκριμένη εργασία προσέφερε πολλά νέα στοιχεία για τον ρόλο και την λειτουργία της FMRP στο νευρικό σύστημα και τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Αναδείξαμε πολλά νέα μόρια - στόχους που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον σχεδιασμό νέων φαρμάκων καθώς επίσης μελετήσαμε και κάποια σηματοδοτικά μονοπάτια που επηρεάζονται από την έλλειψη της FMRP και εμπλέκονται στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Επίσης, ανακαλύψαμε τα απαραίτητα νευρωνικά υποσύνολα όπου η πρωτεΐνη χρειάζεται για φυσιολογική μάθηση και μνήμη. Τέλος, επιβεβαιώσαμε για μια ακόμη φορά την συνεισφορά και την αναγκαιότητα της μύγας στο ερευνητικό χώρο και αναδείξαμε νέα ερευνητικά θέματα που χρήζουν περαιτέρω μελέτης.