Επιζωοτιολογική διερεύνηση διασποράς ιών που ανήκουν στα γένη Astrovirus, Norovirus και Sapovirus σε σκύλους και χοίρους της Ελλάδας, και πιθανοί συσχετισμοί τους για την εμφάνιση νόσου
Authors: Σταμέλου Ευθυμία 
Published: July 2022

Η ιογενής γαστρεντερίτιδα αποτελεί σημαντικό επιδημιολογικό πρόβλημα παγκοσμίως τόσο για τον άνθρωπο όσο και για τα ζώα. Οι ιοί Astrovirus, Norovirus και Sapovirus παρουσιάζουν παγκόσμια εξάπλωση και έχουν ανιχνευθεί συχνά σε ανθρώπους και ζώα, κυρίως με συμπτώματα γαστρεντερίτιδας. Ωστόσο, η σχέση τους με την πρόκληση νόσου στα ζώα παραμένει ασαφής. Οι ιοί αυτοί έχουν γενετικό υλικό RNA θετικής πολικότητας και παρουσιάζουν πολύ μεγάλη γενετική ποικιλομορφία. Το γένος Norovirus περιέχει τουλάχιστον 10 γονιδιακές ομάδες, οι οποίες περιέχουν περισσότερους από 40 γονότυπους και οι Sapoviruses περιέχουν 14 γονιδιακές ομάδες. Αντίστοιχα, η οικογένεια Astroviridae χωρίζεται σε 2 γένη, το γένος Avastrovirus και το γένος Mamastrovirus, τα οποία μολύνουν πτηνά και θηλαστικά, αντίστοιχα. Το γένος Mamastrovirus αποτελείται από 6 ιούς που εμφανίζουν ειδικότητα ξενιστή στα θηλαστικά και το γένος Avastrovirus αποτελείται από 3 ιούς με ειδικότητα ξενιστή στα πτηνά.Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε επιδημιολογική διερεύνηση της διασποράς των ιών Astrovirus, Norovirus και Sapovirus σε χοίρους και σκύλους της Ελλάδας και έγινε προσπάθεια συσχετισμού των ιών αυτών με νόσο στα δύο είδη ζώων. Στους χοίρους έγινε λήψη δειγμάτων κοπράνων από 28 εκτροφές, από διάφορες περιοχές της Ελλάδας. Συνολικά λήφθηκαν 1400 δείγματα κοπράνων χοίρων, τα οποία εξετάσθηκαν ανά ομάδες (pools) των 5 δειγμάτων (συνολικά 280 pools). Σε κάθε εκτροφή λαμβάνονταν δείγματα από 5 ηλικιακές ομάδες (θηλάζοντα χοιρίδια, απογαλακτισμένα, χοίρους στην προπάχυνση, χοίρους στην τελική πάχυνση και χοιρομητέρες). Όλα τα δείγματα προέρχονταν από φαινομενικά υγιή ζώα. Παράλληλα, σε όποιες εκτροφές υπήρχαν σκύλοι, λαμβάνονταν δείγματα και από αυτούς με στόχο να διερευνηθεί αν υπάρχει ταυτόχρονη παρουσία των ιών αυτών στα δύο είδη ζώων. Στους χοίρους, στόχος ήταν η εξέταση ανά εκτροφή, διερευνώντας την παρουσία των ιών αυτών ανά ηλικιακή ομάδα και την πιθανή συσχέτισή τους με συνήθεις πρακτικές εξωτερικής και εσωτερικής βιοασφάλειας που ακολουθούνται στις εκτροφές.Στους σκύλους, ακολουθήθηκε ατομική προσέγγιση. Πραγματοποιήθηκε λήψη δειγμάτων σιέλου και κοπράνων από 201 σκύλους, νεαρούς (<1έτους) και ενήλικες, προερχόμενους από 33 κτηνιατρεία από διάφορες περιοχές της Ελλάδας. Η λήψη δειγμάτων έγινε από υγιή ζώα και ζώα με συμπτώματα νόσου, κυρίως από το γαστρεντερικό σύστημα. Στόχος ήταν η εξέταση για τους ιούς Astrovirus Norovirus και Sapovirus και η διερεύνηση συσχετισμού των ιών αυτών με νόσο στον σκύλο αλλά και με το επίπεδο υγείας των ζώων αυτών και το άμεσο περιβάλλον τους.Τόσο στον χοίρο όσο και στον σκύλο, όλα τα δείγματα εξετάσθηκαν με δύο διαφορετικές μοριακές μεθόδους, αφού πρώτα απομονώθηκε το RNA από αυτά. Οι μοριακές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν είναι η απλή RT-PCR και η Sybr-Green Real-time RT-PCR, με στόχο την σύγκρισή τους σε επίπεδο ευαισθησίας. Μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων που προέκυψαν θετικά με τη μέθοδο της απλής RT-PCR, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση για την επιβεβαίωση των στελεχών των ιών που ανιχνεύθηκαν. Οι αλληλουχίες που αποκτήθηκαν στοιχήθηκαν μεταξύ τους και δημιουργήθηκαν φυλογενετικά δέντρα. Στους χοίρους, ο Astrovirus ανιχνεύθηκε σε όλες τις εκτροφές που εξετάσθηκαν. Ο επιπολασμός του ήταν 95,4%, αφού ανιχνεύθηκε σε 267/280 pools δειγμάτων. Επίσης, ανιχνεύθηκε σε παρόμοια ποσοστά σε όλες τις ηλικιακές ομάδες χοίρων. Ο επιπολασμός των Caliciviruses ήταν 12,9% (36/280) και 20,4%(57/280) με τη μέθοδο της απλής και Sybr-Green RT-PCR αντίστοιχα, και το μεγαλύτερο ποσοστό ανίχνευσης παρατηρήθηκε στους χοίρους τελικής πάχυνσης. Η αλληλούχιση και η φυλογενετική ανάλυση των θετικών δειγμάτων αποκάλυψαν ότι οι αλληλουχίες Astrovirus που ανιχνεύθηκαν ανήκουν στα στελέχη PAstV1, 3 and 4, με τον PAstV3 να είναι ο επικρατέστερος απλότυπος (91,2%). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η αλληλούχιση των θετικών δειγμάτων στους Caliciviruses ανέδειξε την παρουσία ιών που δεν αποτελούσαν στόχο της διατριβής και συγκεκριμένα των αλληλουχιών Kobuvirus and Sapelovirus και μιας αλληλουχίας με μεγάλη γενετική ομοιότητα με έναν Astrovirus νυχτερίδας. Καμία αλληλουχία Norovirus δεν ανιχνεύθηκε. Στους σκύλους, ο Astrovirus ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 7,5% (15/201) και 15% (29/201) με τη μέθοδο της απλής και Sybr-Green RT-PCR, αντίστοιχα. Ο επιπολασμός του ιού ήταν μεγαλύτερος στα υγιή ζώα, με μια μικρή ασυμφωνία των δύο μεθόδων σε ό,τι αφορά τα ποσοστά ανίχνευσης ανά ηλικία (67% σε νεαρούς σκύλους με τη μέθοδο της απλής RT-PCR, έναντι 52% σε ενήλικες σκύλους με τη μέθοδο της SYBR-Green Real-time RT-PCR). Ο Sapovirus του σκύλου ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 23% (κυρίως νεαρά και ασυμπτωματικά), μόνο με τη μέθοδο της SYBR-Green Real-time RT-PCR, ενώ ο Norovirus δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγματα, με καμία από τις δύο μοριακές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν. Από την αλληλούχιση των θετικών δειγμάτων για τον Astrovirus του σκύλου, προέκυψε μία αλληλουχία Astrovirus του σκύλου, η οποία με βάση τη φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε εμφανίζει μεγάλη γενετική ομοιότητα με αλληλουχίες Astrovirus του σκύλου από άλλες χώρες. Στο δεύτερο μέρος της έρευνας έγινε ειδική επιδημιολογική διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων των ιών που ανιχνεύθηκαν με παραμέτρους βιοασφάλειας των εκτροφών από τις οποίες λήφθηκαν τα δείγματα των χοίρων και παραμέτρους που σχετίζονταν με την υγεία και τις συνθήκες διαβίωσης στην περίπτωση των σκύλων. Για την εξέταση του συσχετισμού των παραμέτρων αυτών με τους ιούς που ανιχνεύθηκαν, πραγματοποιήθηκε ειδική στατιστική επεξεργασία με τις προηγμένες και καινοτόμες στατιστικές μεθόδους της Παραγοντικής Ανάλυσης των Αντιστοιχιών (AFC) και της Ανιούσας ιεραρχικής Ταξινόμησης (CAH), για τα δύο είδη ζώων ξεχωριστά. Οι μέθοδοι αυτές διερευνούν τις αλληλεξαρτήσεις και αλληλεπιδράσεις όλων ταυτοχρόνως των στοιχείων του φαινομένου, και αναδεικνύουν τις επικρατέστερες και ουσιαστικότερες τάσεις της δομής του. Με τη βοήθεια των παραπάνω μεθόδων και την παρουσία ή απουσία των ιών, οι εκτροφές χοίρων ομαδοποιήθηκαν σε δύο βασικές κατηγορίες, σε εκτροφές ανεπαρκούς βιοασφάλειας και σε εκτροφές, επαρκούς βιοασφάλειας με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά για την κάθε μια κατηγορία. Αντίστοιχα, οι σκύλοι ομαδοποιήθηκαν επίσης σε δύο βασικές κατηγορίες, σε σκύλους καλής κατάστασης υγείας και σε σκύλους κακής κατάστασης υγείας. Τα κυριότερα συμπεράσματα που προέκυψαν είναι τα εξής:•ο Sapovirus ανιχνεύεται στις εκτροφές επαρκούς βιοασφάλειας, με χαμηλή ωστόσο συσχέτιση, δηλαδή η παρουσία του δεν φαίνεται να σχετίζεται ιδιαίτερα με τις συνθήκες βιοασφάλειας των εκτροφών•Οι Astrovirus και Sapovirus ανιχνεύονται κυρίως σε νεαρούς, αρσενικούς, μέτριας προς κακής θρεπτικής κατάστασης σκύλους που ζουν εκτός των μεγάλων αστικών κέντρων (Αθήνα-Θεσσαλονίκη) και οι οποίοι έχουν κακή κατάσταση υγείας και παρουσιάζουν συμπτώματα εμέτου και διάρροιας. Παράλληλα, βρέθηκε συσχέτιση της παρουσίας των ιών αυτών με νόσο και σε άτομα της οικογένειας με την οποία ζουν.