Μελέτη του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 καθώς και της υπεροικογένειας της Geminin στην πρόκληση γονιδιωματικής αστάθειας και στον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας
Authors: Πετρόπουλος Μιχαήλ 
Published: September 2021

Η ομαλή πρόοδος του κυτταρικού κύκλου και η χωρο-χρονική ρύθμιση της αντιγραφής εξασφαλίζουν την διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Από το τέλος της μίτωσης και σε όλη την διάρκεια της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου, πραγματοποιείται η συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων τα οποία καθορίζουν τις θέσεις έναρξης της αντιγραφής, οι οποίες θα πυροδοτηθούν στην S φάση. Η συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων πραγματοποιείται μέσω στρατολόγησης μορίων MCM2-7 στη χρωματίνη μέσω της συνεργασίας των παραγόντων ORC1-6, CDT1 και CDC6. Απορρύθμιση της έκφρασης των CDT1 και CDC6 έχει δειχθεί ότι επάγει επαναντιγραφή, αντιγραφικό στρες και βλάβες στο DNA, διαδικασία που έχει συσχετιστεί με την καρκινική εξαλλαγή των κυττάρων. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί ένα τύπο γονιδιωματικής αστάθειας που εμφανίζεται συχνά σε διαφορετικούς καρκίνους και συμβάλλει στην ενεργοποίηση ογκογονιδίων και απόκτηση ανθεκτικότητας σε αντικαρκινικές θεραπείες. Στην συγκεκριμένη διατριβή, μελετήσαμε την πιθανή συμμετοχή της επαναντιγραφής του DNA στην πρόκληση γονιδιακής ενίσχυσης. Υπερέκφραση των παραγόντων CDT1 και CDC6 οδήγησε σε διπλασιασμούς του γονιδίου DHFR σε καρκινικά κύτταρα καθώς και στην απόκτηση ανθεκτικότητας στο αντικαρκινικό φάρμακο μεθοτρεξάτη. Παράλληλα, δείχθηκε ότι η διαδικασία αυτή απαιτεί την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου μέσω των κινασών ATR/ATM, το οποίο είναι απαραίτητο για την καθοδική σηματοδότηση μονοπατιών επιδιόρθωσης. Οι βλάβες που προκλήθηκαν έπειτα από επαναντιγραφή του DNA οδήγησαν σε ενεργοποίηση διαφορετικών μονοπατιών επιδιόρθωσης, από τα οποία τα εξαρτώμενα από τον παράγοντα RAD52 φάνηκαν να συμμετέχουν σε μεγαλύτερο βαθμό. Ο παράγοντας RAD52 δείχθηκε ότι είναι απαραίτητος για τον διπλασιασμό του γονιδίου DHFR έπειτα από υπερέκφραση των CDT1 και CDC6, με τον παράγοντα 53BP1 να δρα ανασταλτικά. Παράλληλα, κύτταρα που έφεραν υπερέκφραση των CDT1 και CDC6 και απουσία του RAD52, εμφάνισαν εκτεταμένες βλάβες στο γενετικό υλικό, ανωμαλίες κατά τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και κυτταρικό θάνατο. Επομένως, δείχθηκε ότι η επαναντιγραφή του DNA αποτελεί ένα μηχανισμό πρόκλησης γονιδιωματικής αστάθειας ο οποίος μπορεί να συμβάλλει στην επιλογή κυτταρικών κλώνων με εξελικτικό πλεονέκτημα. Υπερέκφραση του CDT1 είτε αποσιώπηση της Geminin οδηγεί σε επαναδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA, πρόκληση διπλών θραύσεων και κυτταρικό θάνατο. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, ελέγξαμε την πιθανή αντικαρκινική δράση μικρών συνθετικών χημικών ενώσεων οι οποίες αναστέλλουν/παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση των CDT1/Geminin. Πειράματα ελέγχου της αλληλεπίδρασης των CDT1/Geminin σε καρκινικά κύτταρα παρουσία των συνθετικών χημικών ενώσεων έδειξαν αποτελεσματική αναστολή της αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών. Παράλληλα, επώαση διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών σειρών με τη συνθετική χημική ένωση #1 οδήγησε σε πρόκληση διπλών θραύσεων, παύση της αντιγραφής και του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις S/G2, φαινότυπος που προσομοιάζει την υπερέκφραση του CDT1 ή την αναστολή της Geminin. Παράλληλα, η συνθετική χημική ένωση #1 προκάλεσε αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικές σειρές σε αντίθεση με φυσιολογικές κυτταρικές σειρές αναδεικνύοντας την πιθανή αντικαρκινική της δράση. Η απορρύθμιση της έκφρασης των πρωτεϊνών CDT1 και Geminin έχει συσχετιστεί με την καρκινική εξαλλαγή των κυττάρων. Παράλληλα, οι πρωτεΐνες CDT1 και Geminin έχουν προταθεί ως δείκτες πολλαπλασιασμού σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Παρόλα αυτά, ο ρόλος των CDT1 και Geminin δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin ενισχύει την καρκινογένεση του παχέος εντέρου παρουσία χημικών μεταλλαξιγόνων. Παράλληλα, οι καρκινικοί όγκοι που έφεραν υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin παρουσίασαν αυξημένες βλάβες στο γενετικό υλικό. Επιπλέον, τόσο στους όγκους του παχέος εντέρου όσο και σε κρύπτες από το παρακείμενο φυσιολογικό επιθήλιο παρατηρήθηκε αυξημένη στρατολόγηση μορίων Mcm2 στους διαγονιδιακούς μύες που έφεραν υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin. Επομένως, η απορρύθμιση της έκφρασης των Cdt1 και Geminin συμβάλλει στην εξέλιξη της καρκινογένεσης πιθανότατα μέσω αύξησης της αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διατριβής δείχθηκε ότι η επαναντιγραφή του DNA συμβάλλει στην πρόκληση γονιδιακών διπλασιασμών, διαδικασία που προωθεί την απόκτηση εξελικτικού πλεονεκτήματος στα κύτταρα. Στο δεύτερο μέρος, μελετήθηκε η ειδικότητα συνθετικών χημικών ενώσεων ως προς την αναστολή/παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης των CDT1/Geminin σε ευκαρυωτικά κύτταρα, ο μηχανισμός δράσης τους καθώς και η πιθανή αντικαρκινική τους δράση. Τέλος, στο τρίτο μέρος της διατριβής, δείχθηκε ότι η υπερέκφραση του Cdt1 και η απαλοιφή της Geminin προάγουν την καρκινογένεση του παχέος εντέρου μέσω απορρύθμισης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA.