Έλεγχος απόδοσης συστημάτων μεταφοράς αντιγόνων
Authors: Αθανασίου Ευανθία-Βαρβάρα 
Published: August 2021

Η σπλαγχνική λεϊσμανίαση οφείλεται στα στελέχη Leishmania (L.) donovani και L. infantum, προκαλεί ανοσοκαταστολή και είναι θανατηφόρος, αν δε χορηγηθεί θεραπεία. Λόγω των μειονεκτημάτων της χρήσης χημειοθεραπευτικών παραγόντων, η παρασκευή ενός ασφαλούς και αποτελεσματικού εμβολίου θεωρείται ως ο καταλληλότερος τρόπος ελέγχου του νοσήματος. Σκοπός της μελέτης ήταν η αναζήτηση νέων αντιγονικών πρωτεϊνών με ανοσοπρωτεομική και ο σχεδιασμός χιμαιρικών πεπτιδίων ανοσογονικών πρωτεϊνών του στελέχους L. infantum, προκειμένου να εγκλεισθούν σε νανοσωματίδια PLGA και να μελετηθεί in vitro η επίδρασή τους στην ωρίμανση και τη λειτουργική διαφοροποίηση δενδριτικών κυττάρων (ΔΚ), για την ανάπτυξη ενός πειραματικού εμβολίου που στοχεύει σε CD8(+) T κυτταρικές αποκρίσεις. Οι πρωτεΐνες του παρασίτου διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και μελετήθηκε το πρότυπο αναγνώρισής τους από αντισώματα ασυμπτωματικών και συμπτωματικών μολυσμένων με L. infantum σκύλων, μετά από ανάλυση Western. Προσδιορίστηκαν 21 πρωτεΐνες (οι περισσότερες συμμετέχουν στο μεταβολισμό, την πρωτεϊνοσύνθεση και την απόκριση του παρασίτου στην κυτταρική καταπόνηση) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως υποψήφια αντιγόνα στο σχεδιασμό εμβολίων, καθώς αναγνωρίστηκαν αποκλειστικά από αντισώματα ασυμπτωματικών σκύλων, οι οποίοι αναπτύσσουν ανοσία. Ακολούθως, τρεις πρωτεΐνες (CPA, ιστόνη H1, KMP-11) με αποδεδειγμένο προστατευτικό ρόλο έναντι του νοσήματος αναλύθηκαν αλγοριθμικά και προσδιορίστηκαν Τ κυτταρικοί επίτοποι που συνδέονται με μόρια HLA τάξης Ι και ΙΙ. Σχεδιάστηκαν πεπτίδια που περιλαμβάνουν ένα τουλάχιστον Τ κυτταρικό επίτοπο με υψηλή συγγένεια σύνδεσης με μόρια HLA τάξης Ι και γειτονικούς ή επικαλυπτόμενους Τ κυτταρικούς επιτόπους με συγγένεια σύνδεσης με μόρια HLA τάξης ΙΙ. Ύστερα από πειραματική επιβεβαίωση της ανοσογονικότητάς τους σε BALB/c ποντικούς, χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό μεγαλύτερων σε μήκος πεπτιδίων, με τη βοήθεια αμινοξικών αλληλουχιών σύνδεσης. Για κάθε πρωτεΐνη, σχεδιάστηκε ένα χιμαιρικό πεπτίδιο και ενσωματώθηκε σε νανοσωματίδια PLGA σε συνδυασμό ή όχι με MPLA ή επιφανειακή τροποποίηση με ένα οκταπεπτίδιο, που προσομοιάζει στην περιοχή σύνδεσης του TNFα με τον υποδοχέα TNFRII. Η in vitro αξιολόγηση των συνθέσεων πραγματοποιήθηκε σε ΔΚ διαγονιδιακών ποντικών, που εκθέτουν στα κύτταρα τους ένα υβριδικό μόριο MHC τάξης Ι με α1 και α2 επικράτειες όμοιες του ανθρώπινου μορίου HLA-A2.1. Ο εγκλεισμός των χιμαιρικών πεπτιδίων σε νανοσωματίδια PLGA ενίσχυσε την ωρίμανση των ΔΚ [αύξηση του ποσοστού των CD40(+), CD80(+), CD86(+), MHC τάξης Ι(+) και ΙΙ(+)] συγκριτικά με τα επίπεδα ωρίμανσης ύστερα από διέγερση με τα πεπτίδια σε διαλυτή μορφή. Η συνδυαστική χρήση του MPLA και η επιφανειακή τροποποίηση ενίσχυσε περαιτέρω την ωρίμανση, με ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στο ποσοστό των HLA τάξης Ι(+) ΔΚ που επιβεβαίωσε τον ορθό σχεδιασμό των χιμαιρικών πεπτιδίων. ΔΚ ευαισθητοποιημένα με μείγμα των πολυλειτουργικών νανοφορέων PLGA που έφεραν MPLA ή μείγμα των επιφανειακά τροποποιημένων πολυλειτουργικών νανοφορέων PLGA διαφοροποιήθηκαν λειτουργικά και αποδείχθηκαν ικανά να παρουσιάζουν αντιγόνα σε φυσιολογικά T κύτταρα, οδηγώντας σε ενεργοποίηση CD4(+) ΤΗ1 και CD8(+) Τc κυτταρικών κλώνων. Συμπερασματικά, επιβεβαιώθηκε η καταλληλότητα χρήσης των συγκεκριμένων πολυλειτουργικών νανοφορέων σε πειραματικά πρωτόκολλα εμβολιασμού έναντι της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης, ενώ το in vitro κυτταρικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε αποδείχθηκε κατάλληλο για τη διαλογή συστατικών εμβολίων συμβάλλοντας στη μείωση της χρήσης ζώων εργαστηρίου στον προκλινικό έλεγχο.