Μελέτη της καρκινογένεσης σε θυλακιοκυτταρικά καρκινώματα θυρεοειδούς
Authors: Φανουράκης Γαληνός 
Published: September 2021

ΕισαγωγήΗ ρύθμιση της απόπτωσης αποτελεί εξαιρετικής σημασίας διαδικασία για τηνανάπτυξη και διατήρηση πολυκύτταρων οργανισμών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρονπαρουσιάζει η μελέτη της απόπτωσης σε κακοήθεις νεοπλασίες.Το γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 έχει βρεθεί να επάγει τηναπόπτωση σε περίπτωση κυτταρικής βλάβης, ενεργοποιώντας μονοπάτιαπου προκαλούν το θάνατο του κυττάρου. Ανάμεσα στα μονοπάτια αυτάπεριλαμβάνεται και εκείνο του διαμεμβρανικού υποδοχέα Fas. Το γονίδιο fasφαίνεται λοιπόν να αποτελεί έναν από τους στόχους της δράσης τηςπρωτεΐνης p53.Ο υποδοχέας Fas, μέλος της οικογένειας των υποδοχέων Tumor NecrosisFactor Receptor (TNFR), αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα υποδοχέα πουπροκαλεί απόπτωση, όταν ενεργοποιηθεί από κατάλληλα ερεθίσματα. Τοαποπτωτικό αποτέλεσμα είναι η κατάληξη μιας αλληλουχίας συμβάντων,ενεργοποιήσεων μορίων και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών που επισυμβαίνουνστο εσωτερικό του κυττάρου. Με την ενεργοποίηση του υποδοχέα Fas,σχηματίζεται ένα σύμπλοκο (σύμπλοκο DISC) με τη συμμετοχή τουκυτταροπλασματικού άκρου του υποδοχέα και των πρωτεϊνών FADD, FLIPκαι του προ-ενζύμου προ-κασπάση 8. Η ενσωμάτωση μορίων προ-κασπάσης-8 στο σύμπλοκο DISC ουσιαστικά ενεργοποιεί την κασπάση 8, ηοποία με τη σειρά της ενεργοποιεί άλλες πρωτεάσες. Δημιουργείται έτσι ένας«καταρράκτης» αλλεπάλληλων γεγονότων ενεργοποίησης κασπασών πουτελικά προκαλούν τον κυτταρικό θάνατο, όπως άλλωστε είναι και τοζητούμενο της απόπτωσης. ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των γονιδίωνp53 και fas σε επίπεδο DNA, η διερεύνηση έκφρασης του υποδοχέα Fas σεμεταγραφικό επίπεδο ως προς την παρουσία της υδρόφοβης διαμεμβρανικήςυπομονάδας, η μελέτη των συστατικών στοιχείων του αποπτωτικούμονοπατιού του υποδοχέα Fas σε επίπεδο πρωτεϊνών και η αναζήτηση πιθανής εξήγησης της ανθεκτικότητας των θυρεοειδικών θυλακιοκυτταρικώνκαρκινικών κυττάρων προς αυτό το μονοπάτι, μέσω ενδεχόμενης απουσίαςέκφρασης ενός συστατικού στοιχείου.Υλικό και μέθοδοιΤο υλικό που συγκεντρώθηκε και μελετήθηκε στην παρούσα διδακτορικήδιατριβή, προέκυψε μετά από αναζήτηση στα αρχεία του Α’ ΕργαστηρίουΠαθολογικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και ΚαποδιστριακούΠανεπιστημίου Αθηνών. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε υλικό από συνολικά80 θυρεοειδικά ιστολογικά παρασκευάσματα (71 θηλώδη Ca, 2 θυλακιώδηCa, 2 αναπλαστικά Ca, 2 οξύφιλα (Hürthle) Ca, 2 μικτά Ca και έναςυπερπλαστικός όζος) που είχαν εξαιρεθεί χειρουργικά, μονιμοποιηθεί σεφορμόλη και εγκλειστεί σε κύβους παραφίνης.Τα θυρεοειδικά παρασκευάσματα που συλλέχθηκαν, μελετήθηκαν σε τρίαδιαφορετικά επίπεδα: σε επίπεδο DNA, RNA και πρωτεϊνών.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση DNA και έπειτα από κατάλληλες πειραματικές διεργασίες (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - PCR,καθαρισμός προϊόντων PCR), αναζητήθηκε διεξοδικά η πιθανή παρουσίαμεταλλαγών στα εξώνια 5, 6, 7 και 8 του γονιδίου p53 και του εξωνίου 9 τουγονιδίου fas, με τις τεχνικές ανάλυσης πολυμορφισμών διαμόρφωσηςπρωτοταγούς αλυσίδας (SSCP) και ανάλυσης πρωτοταγούς δομής DNA(sequencing).Παράλληλα, σε επιλεγμένα θυρεοειδικά δείγματα πραγματοποιήθηκεαπομόνωση RNA και παρασκευή cDNA, με σκοπό τη μελέτη έκφρασηςmRNA του υποδοχέα Fas, με την τεχνική της αντίστροφης μεταγραφής –αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR).Τέλος, η ιστική εντόπιση και η ημιποσοτική αξιολόγηση της έκφρασης τωνπρωτεϊνών p53, Fas, FADD, FLIP, προ-κασπάση 8 και κασπάση 8πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ανοσοϊστοχημείας. Αποτελέσματα Από τις συνολικά 40 περιπτώσεις θυρεοειδικών καρκινωμάτων πουμελετήθηκαν σε επίπεδο DNA, ανιχνεύθηκε μια μεταλλαγή στο εξώνιο 6του γονιδίου p53 σε ένα αναπλαστικό καρκίνωμα. Όλα τα υπόλοιπα δείγματα ήταν φυσιολογικά τόσο στο γονίδιο p53 όσο και στο γονίδιοfas. Από τ η ν α ν ά λ υ σ η μ ε τ η ν τ ε χ νι κ ή RT-PCR σ ε δ ε ί γ μ α τ α ο λ ι κ ο ύRNA θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κών κ α ρ κ ι νωμ ά των πρ ο έ κ υψε πως ηεπι κ ρ α τ ο ύ σ α μ ο ρφ ή mRNA τ ο υ γ ο νι δ ί ο υ Fas ε ί να ι ε κ ε ί νηπο υ πε ρ ι λ α μ β ά νε ι τ η ν υ δ ρ ό φο β η δ ι α μ ε μ β ρ α νι κ ή μ ο νά δ α κ α ιπα ρ ά λ λ η λ α ε ί να ι πα ρ ο ύ σ α σ ε ό λ α τ α δ ε ί γ μ α τ α πο υμ ε λ ε τ ή θ η κ α ν. Α ντ ί θ ε τ α , η ε να λ λ α κ τ ι κ ή μ ο ρφή τ ο υ δ ι α λ υ το ύFas, ε ί τ ε δ ε ν α νι χ ν ε ύ ε τ α ι κ α θ ό λ ο υ , ε ί τ ε ε ί να ι πα ρ ο ύ σ α α λ λ άσ ε ι δ ι α ί τ ε ρ α χα μ η λ ά επί πε δ α . Η α νο σ ο ϊ σ τ ο χη μ ι κ ή α νά λ υ σ η των θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κώνκ α ρ κ ι νωμ ά τ ων απ ο κ ά λ υψε ι σ χυ ρ ή α υ ξ η μ έ νη έ κφρ α σ η τ ο υυπο δ ο χέ α Fas σ χε δ ό ν σ τ ο σ ύ ν ο λ ο των δ ε ι γ μ ά τωνε ξ ε τ ά σ τ η κ α ν. Α ντ ί θ ε τ α , πυ ρ η νι κ ή χρώσ η γ ι α τ η ν πρωτ ε ΐ νηp53 ε ντ οπί σ τ η κ ε μ ο νά χα σ ε έ να α ν α πλ α σ τ ι κ ό κ α ρ κ ί νωμ α ,πο υ φ έ ρ ε ι τ η μ ε τ α λ λ α γ ή σ τ ο ε ξώνι ο 6 . Η πρωτ ε ΐ νη FADD μ ε λ ε τ ή θ η κ ε σ ε 1 9 θ η λώδ η κ α ι 2θ υ λ α κ ιώδ η κ α ρ κ ι νώμ α τ α κ α ι α πο κ ά λ υψε τ η ν πα ρ ο υ σ ί α τ η ςσ ε ό λ α τ α δ ε ί γ μ α τ α . Οι πρωτ ε ΐ νε ς FLIP, πρ ο -κ α σπά σ η 8 κ α ι κ α σπά σ η 8μ ε λ ε τ ή θ η κ α ν σ ε 5 0 θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ ά κ α ρ κ ι νώμ α τ α . Θε τ ι κ ήα νο σ ο α ντ ί δ ρ α σ η γ ι α τ η ν FLIP έ δ ε ι ξ α ν 3 5 σ υ νο λ ι κ ά δ ε ί γ μ α τ α ,γ ι α τ η ν π ρ ο - κ α σπ ά σ η 8 έ δ ε ι ξ α ν 3 9 δ ε ί γ μ α τ α , ε νώ τ έ λ ο ς ηκ α σπά σ η 8 ε μ φ ά νι σ ε α νο σ ο θ ε τ ι κ ό τ η τ α σ ε 2 0 κ α ρ κ ι νώμ α τ α .Σ υμπερ άσμ ατ αΈχε ι δ ε ι χθ ε ί ή δ η πε ι ρ α μ α τ ι κ ά πως τ α θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ άθ υ λ α κ ι ο κ υ τ τ α ρ ι κ ά κ α ρ κ ι νι κ ά κ ύ τ τ α ρ α έ χο υ ν α να πτ ύ ξ ε ι μ ι αα νθ ε κ τ ι κ ό τ η τ α σ τ η ν απόπτωσ η μ έ σω τ ο υ υπο δ ο χέ α Fas. Η μ ε λ έ τ ηπο υ πρ α γ μ α τ ο πο ι ή σ α μ ε απο κ ά λ υ ψε τ η δ ο μ ι κ ή α κ ε ρ α ι ό τ η τ α τ η ςπρωτ ε ΐ νη ς p53 πο υ ε νε ρ γ οπο ι ε ί , μ ε τ α ξ ύ ά λ λων , τ η ν έ κ φρ α σ η τ ο υυπο δ ο χέ α Fas, κ α θώς κ α ι τ η ν υ π ε ρ έ κφρ α σ η τ ο υ ί δ ι ο υ τ ο υυπο δ ο χέ α σ τ α θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ ά κ α ρ κ ι νι κ ά κ ύ τ τ α ρ α . Επι πλ έ ο ν,δ ι απι σ τώθ η κ ε η π α ρ ο υ σ ί α ό λων των β α σ ι κών πρωτ ε ϊ νών πο υ σ υ μ μ ε τ έ χο υ ν σ τ ο μ ο νο πά τ ι (FADD, FLIP, πρ ο -κ α σπ ά σ η 8 κ α ικ α σπά σ η 8 ). Τ ο πα ρ απά νω γ ε γ ο νό ς υπο δ ε ι κ νύ ε ι πως ηπα ρ α τ η ρ ο ύ μ ε νη α νθ ε κ τ ι κ ό τ η τ α , δ ε ν μπο ρ ε ί να ο φε ί λ ε τ α ι σ εδ ι α τ α ρ α χή τ η ς φυ σ ι ο λ ο γ ι κ ή ς έ κφ ρ α σ η ς των σ υ σ τ α τ ι κών σ τ ο ι χε ίωντ ο υ αποπτωτ ι κ ο ύ μ ο νο πα τ ι ο ύ τ ο υ υπο δ ο χέ α Fas.