Μελέτη των αναπτυξιακών μηχανισμών που ενέχονται στην οργάνωση του χιτωνίου και του υποχιτωνίου του εμβρυϊκού εγκεφάλου του Felis catus
Authors: Σίσκος Νικήστρατος 
Published: February 2022

Η προσέγγιση της ανάπτυξης του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) σε σχέση με την εξέλιξη των ειδών, οδήγησε τους νευροεπιστήμονες στην ανάπτυξη προτύπων όπου τα πειραματικά δεδομένα συστηματοποιούνται και αξιολογούνται. Η χρήση μεθόδων μοριακής βιολογίας για τη μελέτη της χωροχρονικής έκφρασης των γονιδίων, γνωστή και ως γονιδιοαρχιτεκτονική προσέγγιση, οδήγησε στη χαρτογράφηση μοριακά διακριτών επικρατειών με σαφή όρια, τα οποία δεν ήταν δυνατόν να ταυτοποιηθούν με άλλο τρόπο. Η γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη της ανάπτυξης του ΚΝΣ, σε διάφορα είδη σπονδυλωτών, επαναπροσδιόρισε αρκετές ομολογίες και οδήγησε στην αναθεώρηση των προτύπων για την ανάπτυξη του ΚΝΣ, οδηγώντας, τελικά, στην πρόταση του προσωμερικού προτύπου, το οποίο επιχειρεί να περιγράψει το αρχέτυπο οργάνωσης (Bauplan) του ΚΝΣ σε όλα τα σπονδυλωτά. Σε αντίθεση με παλαιότερα πρότυπα, το προσωμερικό πρότυπο προϋποθέτει ότι το ΚΝΣ των σπονδυλωτών αποτελείται από μία σειρά μεταμερικά οργανωμένων τμημάτων που ονομάζονται, γενικώς, νευρομερίδια και ειδικά στον πρόσθιο εγκέφαλο προσωμερίδια. Το προσωμερικό πρότυπο οδήγησε σε επαναξιολόγηση των συσχετίσεων μεταξύ των επιμέρους περιοχών του ΚΝΣ των θηλαστικών, γεγονός που οδήγησε στην ανάπτυξη μιας νέα οντολογίας για το ΚΝΣ. Σύμφωνα με το προσωμερικό πρότυπο, ο πρόσθιος εγκέφαλος διακρίνεται στον διεγκέφαλο, ο οποίος αποτελεί την καταβολή του προθαλάμου, του θαλάμου και της προτετραδυμικής περιοχής (προσωμερίδια p3, p2 και p1 αντίστοιχα), και στον δευτεροταγή πρόσθιο εγκέφαλο (προσωμερίδια hp1 και hp2), από τον οποίο προέρχονται ο υποθάλαμος και ο τελεγκέφαλος. Ενώ ο υποθάλαμος αποτελείται τόσο από το βασικό, όσο και από το πτερυγοειδές πέταλο, ο τελεγκέφαλος αποτελείται μόνο από το πτερυγοειδές. Αναλυτικότερα, από το εγκολπωμένο τμήμα του πτερυγοειδούς πετάλου του προσωμεριδίου hp1 προέρχονται το χιτώνιο και το μεγαλύτερο τμήμα του υποχιτωνίου. Αντίθετα, η προοπτική περιοχή αναπτύσσεται από το τελεγκεφαλικό τμήμα του πτερυγοειδούς πετάλου του προσωμεριδίου hp2, το οποίο δεν εγκολπώνεται.Το υποχιτώνιο διαφέρει από το χιτώνιο με βάση τη γονιδιακή έκφραση. Αναλυτικότερα, το χιτώνιο χαρακτηρίζεται από την έκφραση γονιδίων όπως τα Tbr1/2, Pax6, Emx1/2, Lef1 και Ngn1/2, ενώ το υποχιτώνιο από τα Dlx1/2/5/6, Gsx1/2, Mash1, Nkx2-1 και Lhx6/7, μεταξύ άλλων. Περαιτέρω, η γονιδιακή έκφραση επιτρέπει τη διαίρεση τόσο του υποχιτωνίου, όσο και του χιτωνίου σε διακριτές επικράτειες οι οποίες σχετίζονται με διαφορετικές μεταγεννητικές ανατομικές δομές και διακριτούς φαινοτύπους νευρώνων. Ειδικότερα, το χιτώνιο διακρίνεται σε κοιλιακό, πλάγιο, ραχιαίο και μέσο τομέα, οι οποίοι συσχετίζονται με τις καταβολές του οσφρητικού εγκεφάλου (οσφρητικός βολβός και οσφρητικός αλλοφλοιός), του προτειχίσματος, του ισοφλοιού και του ιπποκάμπειου σχηματισμού αντίστοιχα. Το υποχιτώνιο διακρίνεται με βάση τη γονιδιακή έκφραση σε τέσσερεις επικράτειες, οι οποίες ονομάζονται ραβδωτή, ωχρή, διαγώνια και προοπτική επικράτεια και αποτελούν τις καταβολές του συμπλέγματος κερκοφόρου πυρήνα/καλύπτρας, της ωχρής σφαίρας, της διαγώνιας ταινίας και των προοπτικών πυρήνων αντίστοιχα.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να προσεγγίσει και να ερμηνεύσει την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου στην κατοικίδια γάτα (Felis catus), χρησιμοποιώντας την γονιδιοαρχιτεκτονική μεθοδολογία, σύμφωνα με το προσωμερικό πρότυπο και την απορρέουσα αναπτυξιακή οντολογία. Το συγκεκριμένο ζωικό είδος παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τις νευροεπιστήμες, δεδομένων των μορφολογικών χαρακτηριστικών αλλά και της πολυπλοκότητας του εγκεφάλου του, που το τοποθετούν ενδιάμεσα των λειεγκέφαλων και των γυρεγκέφαλων θηλαστικών. Επιπλέον, η γάτα αποτέλεσε δημοφιλές ζωικό πρότυπο κατά τη διάρκεια του 20ου αιώνα, ενώ μετά την αλληλούχιση του γονιδιώματός της και δεδομένης της εκτεταμένης κτηνιατρικής επιτήρησης που απολαμβάνει, επανακάμπτει τόσο στις νευροεπιστήμες όσο και στη μεταφραστική έρευνα. Για την γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη του εμβρυικού τελεγκεφάλου στη γάτα χρησιμοποιήθηκαν γονίδια-δείκτες των επιμέρους περιοχών τόσο του χιτωνίου όσο και του υποχιτωνίου, τα οποία επιλέχθηκαν μετά από συστηματική μελέτη αντίστοιχων εργασιών στον ποντικό και σε άλλα σπονδυλόζωα. Ακολούθως, τμήματα των γονιδίων-δεικτών κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα ώστε να χρησιμοποιηθούν ως ιχνηθέτες σε έμβρυα γάτας. Ο κύριος όγκος της ανάλυσης πραγματοποιήθηκε σε έμβρυα μεταξύ της 26ης και 27ης ημέρας (Ε26/27), ενώ χρησιμοποιήθηκαν έμβρυα πρωιμότερων (Ε22/23 και Ε24/25) ή πιο ανεπτυγμένων (Ε28/29 και Ε34/35) σταδίων για τη χρονολόγηση των επιμέρους διαδικασιών.Αναλυτικότερα, η έκταση του χιτωνίου και του υποχιτωνίου, καθώς και το μεταξύ τους όριο, προσδιορίστηκαν με βάση τις επικράτειες έκφρασης των γονιδίων Tbr2 και Dlx2 αντίστοιχα, τα οποία εμφανίζουν στις πολλαπλασιαστικές ζώνες των ανωτέρω συμπληρωματικά πρότυπα. Η θέση και η έκταση του κοιλιακού χιτωνίου μελετήθηκε με τη βοήθεια πρωτίστως της απουσίας έκφρασης Emx1, η οποία αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου τομέα, και δευτερευόντως με βάση την ισχυρή έκφραση των Pax6 και Tbr2, αλλά και την ισχνή έκφραση του Lhx2. Αντίστοιχα, το ραχιαίο χιτώνιο χαρακτηρίστηκε από έκφραση των γονιδίων Pax6, Lhx2 και Emx1, ενώ στο μέσο χιτώνιο εκτός από τα ανωτέρω ανιχνεύθηκαν μετάγραφα του Lef1. Ακόμη, το πλάγιο χιτώνιο προσδιορίστηκε με τη βοήθεια του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Nr4a2. Με τον ίδιο τρόπο, η ραβδωτή επικράτεια του υποχιτωνίου χαρακτηρίστηκε από έκφραση των γονιδίων Dlx2, Mash1, αλλά απουσία του Nkx2-1, το πρότυπο έκφρασης του οποίου περιορίστηκε στην ωχρή, τη διαγώνια και την προοπτική επικράτεια. Η διαγώνια και η προοπτική επικράτεια διαφοροποιήθηκαν, σε σχέση με την ωχρή, μέσω της ισχνής έκφρασης Lhx2 στις πρώτες, ενώ, ακολούθως, το όριο της διαγώνιας επικράτειας με την προοπτική υποδείχθηκε με βάση την έκφραση του Er81.Η παραπάνω ανάλυση υπέδειξε ότι τα πρότυπα έκφρασης των ανωτέρω γονιδίων και κατά συνέπεια τα κύρια διαμερίσματα του χιτωνίου και του υποχιτωνίου, είναι συντηρημένα μεταξύ της γάτας και του ποντικού. Επιπλέον, η μελέτη της δυναμικής της γονιδιακής έκφρασης, σε έμβρυα διαφορετικών σταδίων, χρησιμοποιήθηκε για τη χρονολόγηση της ανάπτυξης διαφορετικών δομών στον τελεγκέφαλο, ενώ τα κυριότερα ευρήματα είναι τα εξής:1.Η δυναμική έκφραση του Tbr1 στη φλοιική πλάκα και η εξίσου δυναμική έκφραση του Tbr2 στην κοιλιακή ζώνη, των διαφόρων τομέων του χιτωνίου, αποκαλύπτουν ότι η νευρογένεση σε αυτό ακολουθεί συγκεκριμένο χωροχρονικό πρότυπο: προηγείται η ανάπτυξη της φλοιικής πλάκας του κοιλιακού χιτωνίου, ενώ η αντίστοιχη στο μέσο χιτώνιο αναπτύσσεται τελευταία.2.Στον οσφρητικό βολβό, τα πρώτα Tbr2-θετικά μιτροειδή κύτταρα εντοπίζονται στη διάμεση ζώνη ήδη κατά το στάδιο Ε22/23, ενώ οι πρώτοι Gad2/Er81-θετικοί διάμεσοι νευρώνες εντοπίζονται μεταξύ της κοιλιακής και της διάμεσης ζώνης στο στάδιο Ε24/25.3.Η εστιακή έκφραση του γονιδίου Nr4a2 στην καταβολή του προτειχίσματος εντοπίστηκε από το στάδιο Ε28/29 κι έπειτα.4.Η αμυγδαλή παρουσίασε εστιακή έκφραση των Emx1, Pax6 και Tbr2 από το στάδιο Ε24/25 και μετά, παραπέμποντας στην εμφάνιση των πρώτων πυρηνόμορφων δομών.5.Η παρουσία Tbr2-θετικών κυττάρων Cajal-Retzius στη μηνιγγική επιφάνεια του μέσου χιτωνίου, στο όριο με το φλοιικό χείλος εμβρύων σταδίου Ε26/27, σηματοδότησε την έναρξη του σχηματισμού της δευτεροταγούς μήτρας του ιπποκάμπου.Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ένα περίπλοκο πρότυπο ετεροχρονισμών μεταξύ του ποντικού και της γάτας, όπως φαίνεται από διαφορές στο χρονισμό των αναπτυξιακών γεγονότων: ορισμένα συμβαίνουν νωρίτερα στη γάτα σε σχέση με στον ποντικό και αντιστρόφως. Για παράδειγμα, το στάδιο E22/23 στη γάτα ισοδυναμεί σε γενικές γραμμές με το στάδιο E11,5 του ποντικού: η εγκόλπωση ωστόσο του οσφρητικού βολβού, στη γάτα έχει ήδη ξεκινήσει από την E22/23, ενώ στον ποντικό αυτό λαμβάνει χώρα μετά την E12. Αντίστοιχα, η έκφραση Nr4a2 στο πλάγιο χιτώνιο του ποντικού ανιχνεύεται ήδη από την Ε12,5, ενώ στη γάτα από την Ε28/29 κι έπειτα. Επιπλέον, φαίνεται ότι στη γάτα απαιτείται, εν γένει, μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για την ολοκλήρωση των αναπτυξιακών διεργασιών· αυτό το χαρακτηριστικό δύναται να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη της ανάπτυξης και συγκεκριμένα στον ακριβή προσδιορισμό των διακριτών σταδίων μιας πολύπλοκης διαδικασίας, όπως η οντογένεση του τελεγκεφάλου.Συνοψίζοντας, η παρούσα, γονιδιοαρχιτεκτονική μελέτη έδειξε ότι ο τελεγκέφαλος της γάτας διαιρείται σε περιοχές τοπολογικά ισοδύναμες με εκείνες που έχουν περιγραφεί σε άλλα είδη σπονδυλωτών, και ειδικά στον ποντικό, σε συμφωνία με το προσωμερικό πρότυπο και την απορρέουσα οντολογία. Επιπλέον, αναδεικνύεται η ετερόχρονη φύση των αναπτυξιακών γεγονότων, όταν αυτά μελετώνται υπό το εξελικτικό πρίσμα μεταξύ διαφορετικών ειδών, έστω και αν η μεταξύ τους (εξελικτική) απόσταση είναι μικρή. Τα παραπάνω αποτελέσματα, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η γάτα ανήκει στα γυρεγκέφαλα θηλαστικά, αναδεικνύουν το συγκεκριμένο είδος υπογραμμίζοντας τη σημασία του ως ζωικού προτύπου στη μελέτη της οντογένεσης και της εξέλιξης του ΚΝΣ. Καθώς αυτή είναι η πρώτη συστηματική ανάλυση της γονιδιοαρχιτεκτονικής του τελεγκεφάλου της γάτας, προσδοκούμε ότι θα αποτελέσει έρεισμα, δεδομένης της επανεμφάνισης του εν λόγω είδους στη νευροεπιστημονική έρευνα.