Συγκριτική γονιδιωματική και λειτουργική μελέτη ενζύμων του ξενοβιοτικού μεταβολισμού
Authors: Τσίρκα Θεοδώρα 
Published: September 2021

Οι Ν-ακετυλοτρανσφεράσες των αρυλαμινών (ΝΑΤ) είναι ένζυμα του ξενοβιοτικού μεταβολισμού που καταλύουν τη μεταφορά της ακετυλομάδας από το ακετυλοσυνένζυμο-Α σε αρυλαμίνες. Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο λειτουργικά γονίδια, τα ΝΑΤ1 και ΝΑΤ2 που είναι πολυμορφικά. Πολλά από τα αλληλόμορφά τους κωδικοποιούν αλλοένζυμα με μειωμένη ενεργότητα και αυτό είναι δυνατό να επηρεάζει την εξατομικευμένη απόκριση σε φάρμακα ή την ευαισθησία σε καρκινογόνα. Λειτουργικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΝΑΤ του ανθρώπου αποτελούν δύσχρηστο πειραματικό υλικό. Στην παρούσα διατριβή επιχειρείται συγκριτική γονιδιωματική και λειτουργική μελέτη, προκειμένου να ταυτοποιηθούν πρωτεΐνες ΝΑΤ πρωτευόντων οι οποίες να είναι υψηλά ομόλογες προς του ανθρώπου και να υπερτερούν ως πειραματικό υλικό in vitro. Για το σκοπό αυτό, κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια ΝΑΤ 11 πρωτευόντων. Οι ανασυνδυασμένες ΝΑΤ πρωτεΐνες μελετήθηκαν με τεχνικές μέτρησης ενζυμικής ενεργότητας και διαφορικής σάρωσης φθορομετρίας (DSF). Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά ΝΑΤ1- και ΝΑΤ2-επιλεκτικά υποστρώματα, και οι πρωτεΐνες μελετήθηκαν περαιτέρω με μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής τους. Λαμβάνοντας υπ’ όψη την ποσότητα της εκφρασμένης πρωτεΐνης, τη θερμική σταθερότητα και την ενζυμική ενεργότητα, οι πρωτεΐνες ΝΑΤ1 των M. mulatta/M. sylvanus, ΝΑΤ1 του N. gabriellae και ΝΑΤ2 του E. patas προτείνονται ως οι καταλληλότερες για χρήση ως μοντέλων μελέτης των ανθρώπινων ΝΑΤ. Επιπλέον, τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να αξιοποιηθούν και στο πλαίσιο μελετών της εξελικτικής ιστορίας των ΝΑΤ στα πρωτεύοντα.Η αλληλούχηση των γονιδίων ΝΑΤ1 και ΝΑΤ2 ενός πληθυσμού του είδους M. mulatta προσδιόρισε την ύπαρξη 14 μη συνώνυμων πολυμορφισμών, οι οποίοι μελετήθηκαν ως προς τις λειτουργικές επιπτώσεις τους στην ανασυνδυασμένη έκφραση, την ενεργότητα, τη θερμική σταθερότητα και τη δομή των αντίστοιχων αλλοενζύμων ΝΑΤ. Η πλειοψηφία των πολυμορφισμών οδήγησε σε μείωση της ενζυμικής ενεργότητας. Αξιοσημείωτη ήταν η λειτουργική επίπτωση του πολυμορφισμού p.Asp142Tyr, ο οποίος προκάλεσε αύξηση στη θερμική σταθερότητα και ενεργότητα της πρωτεΐνης ΝΑΤ2. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε ο πολυμορφισμός p.Val231Ile, όπου παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας παρουσία ΝΑΤ2-επιλεκτικών υποστρωμάτων, ενώ αντίθετα παρατηρήθηκε αύξηση έναντι των ΝΑΤ1-επιλεκτικών, γεγονός που δεν έχει παρατηρηθεί προηγουμένως για κανένα ισοένζυμο ΝΑΤ και γι’αυτό μελετήθηκε περαιτέρω. Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις της ενζυμικής ενεργότητας, πειράματα ενζυμικής κινητικής και πειράματα ανοσοαπoτύπωσης και DSF, καθώς και υπολογιστική μελέτη της δομής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πολυμορφισμός p.Val231Ile επιδρά κυρίως αλλάζοντας τη συγγένεια του ενζύμου έναντι διαφορετικών υποστρωμάτων και η επιλεκτικότητα του ισοενζύμου ΝΑΤ2 μεταβάλλεται ώστε να προσομοιάζει αυτήν του ισοενζύμου ΝΑΤ1.Η διατριβή αυτή συμπληρώνεται με την εφαρμογή της κρυσταλλογραφίας και της τεχνολογίας του συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων. Η διεξαγωγή συγκριτικών μελετών των ΝΑΤ σε διαφορετικά πρωτεύοντα επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση του ρόλου τους στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό και διευκολύνει τον προσδιορισμό λειτουργικών στοιχείων πάνω στα οποία πιθανόν έχει δράσει η φυσική επιλογή. Η παρούσα μελέτη παρείχε πρωτότυπη επιστημονική γνώση που αναμένεται να διευκολύνει τις μελλοντικές μελέτες.