Παραλλακτικότητα του γονιδίου DRB1 σε ελληνικές φυλές προβάτων και συσχετισμός των αλληλομορφών του με παρασιτολογικές και παραγωγικές παραμέτρους
Authors: Σπετσαρίας Σταύρος 
Published: August 2021

Το Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (MHC) είναι ένα σύμπλοκο γονιδίωνμε λειτουργικό ρόλο που, κυρίως, αφορά ανοσολογικές ιδιότητες. Το γονίδιο DRB1,το πιο πολυμορφικό γονίδιο του MHC, κωδικοποιεί τη β πολυπεπτιδική αλυσίδα τουμορίου MHC της τάξεως ΙΙ και εδράζεται στην επιφάνεια τωναντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Τα APC παρουσιάζουν στα CD4+ T-λεμφοκύτταρα πεπτιδικά τμήματα αντιγόνων, προερχόμενα από εξωκυτταρικέςπρωτεΐνες και παράσιτα, μέσω των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ που διαθέτουν. Οέντονος πολυμορφισμός του γονιδίου DRB1 εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο εξόνιο2, το οποίο κωδικοποιεί τμήμα της περιοχής δέσμευσης του αντιγονικού πεπτιδίου(PBR) των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ και ως εκ τούτου η παραλλακτικότητα τουεξονίου 2 σχετίζεται άμεσα με την ανοσολογική απόκριση του οργανισμού.Έως τώρα δεν έχει μελετηθεί η παραλλακτικότητα του γονιδίου του προβάτουDRB1 (Ovar-DRB1) σε ελληνικές φυλές. Στη διεθνή Βάση ΔεδομένωνΑνοσοπολυμορφισμού για το Ovar-MHC (IPD-MHC Database EMBL-EBI),βρίσκονται καταχωρημένες 88 διαφορετικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του εξονίου2 του γονιδίου Ovar-DRB1 προβάτων από ξένες φυλές, κυρίως, εριοπαραγωγικής καικρεοπαραγωγικής κατεύθυνσης. Επιπλέον, στη βιβλιογραφία υπάρχουνδημοσιευμένες εργασίες στις οποίες αλληλόμορφα του γονιδίου Ovar-DRB1σχετίζονται με την ανθεκτικότητα, κυρίως, σε νημάτωδα, καθώς και με διάφορεςάλλες ιδιότητες που αφορούν σε παραγωγικά χαρακτηριστικά του προβάτου. Σκοπόςτης παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της παρουσίας αλληλομόρφων Ovar-DRB1 σεδύο ελληνικές φυλές προβάτων και ο συσχετισμός τους με την ανθεκτικότητα σεγαστρεντερικές παρασιτώσεις, καθώς και με χαρακτηριστικά της γαλακτοπαραγωγήςτους.Συλλέχτηκαν δείγματα αίματος και κοπράνων από δύο ποίμνια αποτελούμενααπό 232 πρόβατα Φριζάρτας και 203 Καλαρρύτικα, αντίστοιχα, ενώ λήφθηκαν καιστοιχεία από τον έλεγχο των αποδόσεων των δύο ποιμνίων. Από κάθε δείγμα αίματοςαπομονώθηκε το γονιδιωματικό DNA για την ενίσχυση του εξονίου 2 του γονιδίουOvar-DRB1, η οποία διεξήχθη με Touchdown PCR, ώστε να αποφευχθεί οσχηματισμός μη ειδικών προϊόντων. Ακολούθησε η απευθείας αλληλούχηση τωνενισχυμένων προϊόντων για την ταυτοποίηση των αλληλομόρφων. Η αλληλουχία τουεξονίου 2 των νέων αλληλομόρφων επαληθεύτηκε με δεύτερη PCR, στην οποίαχρησιμοποιήθηκε διαφορετικό ζεύγος εκκινητών και εν συνεχεία διενεργήθηκεκλωνοποίηση των προϊόντων της πριν την αλληλούχηση. Τα προϊόντα της δεύτερηςPCR ενσωματώθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pBlueScript SK, ο οποίοςχρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό των επιδεκτικών βακτηρίων E. coli του στελέχους JM109, σε καλλιέργεια. Tα νέα αλληλόμορφα εντοπίστηκαν στιςμετασχηματισμένες βακτηριακές αποικίες με τη βοήθεια της διεξαγωγής της ColonyPCR, τα προϊόντα της οποίας υπέστησαν πέψη με το ένζυμο περιορισμού RsaI. Απότις αποικίες αυτές απομονώθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς στους οποίους διεξήχθη ηαλληλούχηση του ενθέματός τους, επιβεβαιώνοντας την αλληλουχία του εξονίου 2των νέων αλληλομόρφων.Ο έλεγχος των παρασιτολογικών παραμέτρων διενεργήθηκε με τηνκοπρανολογική καταμέτρηση των αναπαραγωγικών στοιχείων των γαστρεντερικώνπαρασίτων (Faecal Egg Counting, FEC) και με τον προσδιορισμό των επιπέδων τουπεψινογόνου με την τροποποιημένη μέθοδο Hirschowitz στο πλάσμα του αίματος.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 39 αλληλόμορφαOvar-DRB1, εκ των οποίων 10 αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ενώκαταμετρήθηκαν 134 διαφορετικοί γονότυποι. Καταγράφηκε υψηλό ποσοστόετεροζυγωτίας, 84,49%, γεγονός το οποίο θεωρείται φυσιολογικό για το γονίδιοOvar-DRB1. Μόνον 15 στους 134 γονότυπους ήταν κοινοί και στις δύο φυλές, ενώστο 54% των γονότυπων των Καλαρρύτικων και στο 23% των γονότυπων τωνπροβάτων Φριζάρτας ταυτοποιήθηκαν νέα αλληλόμορφα. Στην Καλαρρύτικη φυλήπαρατηρήθηκε σημαντικό έλλειμμα ετεροζυγωτών γονότυπων.Το μεγαλύτερο ποσοστό ζώων με υψηλό παρασιτικό φορτίο και με υψηλάεπίπεδα πεψινογόνου στο πλάσμα εντοπίστηκε στην Καλαρρύτικη φυλή. Αν και στιςδύο φυλές βρέθηκαν ωοκύστες κοκκιδίων (Eimeria spp) και στρογγυλοειδή αυγάνηματωδών (strongyles), αυγά του κεστώδους Moniezia expansa και του νηματώδουςNematodirus filicollis ανιχνεύθηκαν μόνο στα Καλαρρύτικα, ενώ μόνο στα πρόβαταΦριζάρτας βρέθηκαν αυγά του νηματώδους Capillaria spp. Επίσης, στο 22,6% τωνΚαλαρρύτικων προβάτων βρέθηκαν περισσότερα του ενός είδους αναπαραγωγικάστοιχεία στο ίδιο ζώο, σε αντίθεση με το 1,6% των προβάτων Φριζάρτας.Στην Καλαρρύτικη φυλή, τα αλληλόμορφα της ομάδας G σχετίζοντανσημαντικά με χαμηλές τιμές FEC, ενώ της ομάδας Κ εμφάνισαν ασθενή συσχέτιση μευψηλές τιμές FEC. Επίσης, παρατηρήθηκε ασθενή συσχέτιση των αλληλομόρφων τηςομάδας Ι με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Στη φυλή Φριζάρτας, τα αλληλόμορφατης ομάδας Κ σχετίζονταν σημαντικά με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Επίσης, τααλληλόμορφα της ομάδας Κ είχαν σημαντική επίδραση στην ποσοστιαίασυγκέντρωση των ολικών στερεών, στην πρωτεϊνοπεριεκτικότητα, στηλιποπεριεκτικότητα και στη συγκέντρωση λακτόζης, ενώ τα αλληλόμορφα τηςομάδας Ε επιδρούσαν σημαντικά στη συγκέντρωση της λακτόζης. Η επίδραση τωναλληλομόρφων της ομάδας Κ ήταν σημαντική. Στην Καλαρρύτικη φυλή επιδρούσανστις τιμές FEC, ενώ στη φυλή Φριζάρτας στις τιμές mI.U. τυροσίνης και σεσυστατικά του γάλακτος.Η προσβολή από γαστρεντερικά παράσιτα δεν επέδρασε σημαντικά σταγαλακτοπαραγωγικά χαρακτηριστικά των προβατίνων της φυλής Φριζάρτας, ενώ στιςπροβατίνες της Καλαρρύτικης φυλής σχετιζόταν σημαντικά με χαμηλήπρωτεϊνοπεριεκτικότητα και με χαμηλά επίπεδα στερεού υπολείμματος άνευ λίπους,αλλά και με αυξημένη γαλακτοπαραγωγή (υπεραντιστάθμιση), υποδηλώνοντας τηνεξαιρετικά μεγάλη ανθεκτικότητα και προσαρμοστικότητα της φυλής.