Ο ρόλος των ανταγωνιστών της ιντεγκρίνης αvβ3 στην επαγωγή της απόπτωσης στον καρκίνο του μαστού
Authors: Μαρίνου Ιφιγένεια 
Published: September 2021

Σε παγκόσμια κλίμακα ο καρκίνος του μαστού είναι τρίτος σε συχνότητα και το ποσοστό των θανάτων από αυτή την αιτία ανέρχεται σε ποσοστό 60% επί του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου. Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τη συχνότερη κακοήθεια του γυναικείου πληθυσμού παγκοσμίως. Το κύριο αίτιο θανάτου είναι η δημιουργία μεταστάσεων σε διάφορες θέσεις όπως τα οστά, οι πνεύμονες, το ήπαρ και ο εγκέφαλος. Η μετάσταση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, κατά την οποία τα καρκινικά κύτταρα διηθούν τον περιβάλλοντα συνδετικό ιστό, εισέρχονται στη κυκλοφορία και κατόπιν εξαγγειώνονται και πολλαπλασιάζονται στη νέα θέση.Σε πολλά από τα βήματα της διαδικασίας της μετάστασης παίζουν αποφασιστικό ρόλο οι ιντεγκρίνες, μια οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων προσκόλλησης που συνδέουν τον κυτταροσκελετό με την ΕΘΟ ή/και γειτονικά κύτταρα μεταξύ τους. H αλληλεπίδραση των ιντεγκρινών με τα υποστρώματα-συνδέτες τους ρυθμίζουν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες, οι οποίες συσχετίζονται με την ανάπτυξη ενός όγκου και την πολυσταδιακή διαδικασία της μετάστασης, όπως είναι η κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, η διήθηση, ο πολλαπλασιασμός, η επιβίωση των κυττάρων στη νέα τους εστία και η αγγειογένεση. Η υπεροικογένεια των ιντεγκρινών αποτελείται από 18α και 8β έως σήμερα γνωστές υπομονάδες που σχηματίζουν 24 ετεροδιμερή για το σχηματισμό μιας μεγάλης ποικιλίας ιντεγκρινών που λειτουργούν ως υποδοχείς για διάφορους κυτταρικούς συνδέτες και πρωτεΐνες της ΕΘΟ. Κάθε ετεροδιμερές ιντεγκρινών παρουσιάζει εξειδίκευση για τους συνδέτες του, σύμφωνα με την οποία οι ιντεγκρίνες ταξινομούνται σε 4 μεγάλες κατηγορίες: εκείνες που συνδέονται με το κολλαγόνο, τις ιντεγκρίνες που αναγνωρίζουν το τριπεπτίδιο RGD (-Arg-Gly-Asp-) στα συστατικά της ΕΘΟ, τις ιντεγκρίνες που συνδέονται με τη λαμινίνη και τέλος τις ιντεγκρίνες που εκφράζονται ειδικά στα λευκοκύτταρα. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι ιντεγκρίνες, μέσω της προσκόλλησης του κυττάρου στην ΕΘΟ ή σε άλλα γειτονικά κύτταρα, επάγουν μονοπάτια μεταγωγής σήματος που υποστηρίζουν την κυτταρική επιβίωση, ενώ ταυτόχρονα αναστέλλουν μονοπάτια ενεργοποίησης της απόπτωσης. Όταν η κυτταρική προσκόλληση διακοπεί ή γίνει υπό λανθασμένες ή ανεπαρκείς συνθήκες, οι ίδιες ιντεγκρίνες επάγουν μονοπάτια ενεργοποίησης της απόπτωσης, γνωστή ως ανοίκια (anoikis), προκειμένου να αποφευχθεί η λανθασμένη επαναπροσκόλληση των κυττάρων σε νέα υποστρώματα. Έτσι, στις διάφορες μορφογενετικές αναπτυξιακές διεργασίες, συμμετέχουν στη ρύθμιση της κυτταρικής κίνησης και μετανάστευσης, ενώ συμμετέχουν ως υποδοχείς στη φλεγμονή, στην επούλωση πληγών και στη συνάθροιση αιμοπεταλίων για την ανάπτυξη θρόμβου.Οι περιοχές της πλασματικής μεμβράνης που οι ιντεγκρίνες συνδέουν τον κυτταροσκελετό της ακτίνης με την ΕΘΟ λέγονται θέσεις εστιακής προσκόλλησης. Η κυτταρική μετανάστευση πραγματοποιείται μέσω του συνεχούς πολυμερισμού των ινιδίων ακτίνης στο πρόσθιο άκρο και της ελεγχόμενης αποδιοργάνωσης των θέσεων προσκόλλησης στο οπίσθιο άκρο των καρκινικών κυττάρων. Ένας συνδυασμός στοχευόμενης ενδοκυττάρωσης/ανακύκλωσης και πλευρικής διάχυσης στη πλασματική μεμβράνη οδηγούν τις ιντεγκρίνες στις νεοσχηματιζόμενες θέσεις εστιακής προσκόλλησης στο πρόσθιο άκρο των μεταναστευτικών κυττάρων. Πρόσφατες εργασίες απέδειξαν ότι η ενδοκυττάρωση των ιντεγκρινών από τη πλασματική μεμβράνη στα πρώιμα ενδοσώματα και η επακόλουθη ανακύκλωσή τους στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση και διήθηση.Στον καρκίνο του μαστού, η παρουσία της ιντεγκρίνης αvβ3 σηματοδοτεί την εκτεταμένη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, τόσο στο λοβιακό, όσο και στο πορογενές καρκίνωμα. Σε όλα τα είδη του καρκίνου του μαστού όπου είχε γίνει μετάσταση στα οστά, υπήρχε έντονη έκφραση της ιντεγκρίνης αvβ3 στα καρκινικά κύτταρα. Η ιντεγκρίνη αvβ3 είναι μία από τις ιντεγκρίνες που αναγνωρίζουν το τριπεπτίδιο RGD ως θέση πρόσδεσης με συστατικά της ΕΘΟ, όπως είναι η βιτρονεκτίνη, η φιμπρονεκτίνη, η οστεοποντίνη. Η ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης αvβ3 και η συμβολή της στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων είναι ειδική ως προς το υπόστρωμα με το οποίο συνδέεται. Από τα υποστρώματα της ιντεγκρίνης αvβ3, η βιτρονεκτίνη αποτελεί σημαντικό μοντέλο μελέτης πρόσδεσης και ενεργοποίησης αυτής της ιντεγκρίνης, γιατί, αν και αποτελεί κοινό συνδέτη για όλες τις αv-υπομονάδες που εκφράζονται στις καρκινικές κυτταρικές σειρές του μαστού, δεν εντοπίζεται μόνο στο πλάσμα, αλλά και σε πολλές εξωκυττάριες ουσίες, όπως είναι αυτή των λεμφαδένων, που αποτελούν την πρώτη θέση μετάστασης στον καρκίνο του μαστού.Τα τελευταία χρόνια, στην προσπάθεια των ερευνητών να αναπτύξουν αντικαρκινικές θεραπείες, έχουν χρησιμοποιηθεί αντισώματα εναντίον υπομονάδων των ιντεγκρινών, συνθετικά RGD πεπτίδια, καθώς και οι δισιντεγκρίνες με στόχο την ανταγωνιστική δράση τους ως προς αυτή των ιντεγκρινών, έτσι ώστε να σταματήσει η ανάπτυξη του όγκου και να ανασταλεί η μεταστατική δυναμικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων. Οι δισιντεγκρίνες αποτελούν μία οικογένεια χαμηλού μοριακού βάρους RGD πετπιδίων που έχουν απομονωθεί από δηλητήριο φιδιών. Λόγω του RGD πεπτιδίου που περιέχουν, προσδένονται ειδικά στις ιντεγκρίνες αΙΙbβ3, α5β1 και αvβ3 που εκφράζονται στα αιμοπετάλια, στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και σε καρκινικά κύτταρα, όπως αυτά του μαστού. Αποτέλεσμα της πρόσδεσής τους είναι η αναστολή της κυτταρικής προσκόλλησης και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων διαταράσσοντας την ειδική πρόσδεση των ιντεγκρινών στα συστατικά της ΕΘΟ, επάγοντας την -εξαρτώμενη από τις κασπάσες- διεργασία της απόπτωσης, λόγω μη προσκόλλησης σε υπόστρωμα. Μεταξύ των δισιντεγκρινών που προσδένονται και αναστέλλουν τη δράση της ιντεγκρίνης αvβ3, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η κοντορτροστατίνη, η οποία έχει ανασταλτική δράση στον καρκίνο του μαστού. Είναι ομοδιμερές και έχει στην κάθε υπομονάδα μία RGD αλληλουχία, γεγονός που της προσδίδει μοναδικές ιδιότητες σε σχέση με τις υπόλοιπες μονομερείς δισιντεγκρίνες. Έτσι, η κοντορτροστατίνη έχει τη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης με την ιντεγκρίνη αvβ3, σε σχέση με τις άλλες δισιντεγκρίνες που προσδένονται σε αυτήν την ιντεγκρίνη. Με βάση τα παραπάνω στην παρούσα μελέτη έγινε μελέτη της έκφρασης της ιντεγκρίνης αvβ3 σε πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων μαστού, οι οποίες αναπτύχθηκαν από βιοψίες διασφόρων βαθμών κακοήθειας, αλλά και απο πρωτογενείς καλλιέργειες ινοαδενωμάτων, για συγκριτικούς λόγους. Το πλεονέκτημα των πρωτογενών καλλιεργειών είναι ότι προσεγγίζουν την in vivo κατάσταση του πρωτογενούς όγκου, αλλά σε ελεγχόμενο περιβάλλον κυτταροκαλλιέργειας. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες αναπτύσονται σε τεχνητό υπόστρωμα βιτρονεκτίνης, και σε αυτές μελετήθηκε υπό την επίδραση της δισιντεγκρίνης κοντορτροστατίνης, η έκφραση της ιντεγκρίνης αvβ3 και ο ρόλος της στην προσκολλητική και στη μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού, καθώς και στην επαγωγή του μηχανισμού της απόπτωσης, με στόχο την ανάπτυξη πειραματικού μοντέλου μελέτης αυτής της δισιντεγκρίνης ως θεραπευτικού εργαλείου στον καρκίνο του μαστού.Πρωτογενείς καλλιέργειες από βιοψίες καρκινωμάτων μαστού και ινοαδενωμάτων αναπτύχτηκαν σε τεχνητό υπόστρωμα βιτρονεκτίνης χρησιμοποιώντας τη μη ενζυμική μέθοδο. Η βιτρονεκτίνη αποτελεί το κύριο μόριο πρόσδεσης και ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης ανβ3 μέσω της RGD αλληλουχίας. Επίσης, εντοπίζεται στην ΕΘΟ των λεμφαδένων που αποτελεί την αρχική θέση μετάστασης στο καρκίνο του μαστού και έχει βρεθεί ότι συσσωρεύεται τοπικά στην ΕΘΟ καρκινωμάτων μαστού. Οι συνθήκες των καλλιεργειών που εφαρμόστηκαν ευνοούν την ανάπτυξη καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων (~80%) και ενός ελεγχόμενου ποσοστού ινοβλαστών (~20%). Η παρουσία ινοβλαστών στις αναπτυσσόμενες πρωτογενείς καλλιέργειες θεωρείται απαραίτητη, καθώς προσομοιάζει καλύτερα το in vivo μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκεκριμένα, οι ινοβλάστες έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν με τα καρκινικά κύτταρα σε όλα τα στάδια εξέλιξης του όγκου και ενισχύουν τη μεταστατική διαδικασία. Στη παρούσα εργασία, για πρώτη φορά μελετήθηκε η επίδραση της δισιντεγκρίνης Mokason σε πλήρως ανεπτυγμένα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν με την τεχνική του ιστοτεμαχίου, με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο ρόλος αυτού του δηλητηρίου στην επαγωγή της απόπτωσης μέσω της έκφρασης της ιντεγκρίνης ανβ3 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επώαση των καλά ανεπτυγμένων καρκινικών κυττάρων μαστού με τη δισιντεγκρίνη για 2h προκάλεσε το στρογγύλεμα και τη συρρίκνωση των κυττάρων, η οποία συνοδεύτηκε από αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Συγκεκριμένα, σε κάποια κύτταρα, η επώαση με το mokason προκάλεσε την αποκόλληση του κεντρικού κυτταρικού σώματος από το υπόστρωμα, αποδιοργανώνοντας τις θέσεις εστιακής προσκόλλησης στις θέσεις αυτές, ενώ τα κύτταρα παρέμειναν προσκολλημένα μέσω των λαμελιποδίων και των φιλοποδίων στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα αυτά, το πρότυπο κατανομής της ανβ3 μετατοπίστηκε στη περιφέρεια υπό τη μορφή γραμμικών συναθροίσεων στις θέσεις που τα κύτταρα παραμένουν προσκολλημένα ενώ αντίστοιχα ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε στο κεντρικό κυτταρικό σώμα και διατήρησε την ινώδη εμφάνισή του στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα που η επώαση με το δηλητήριο προκάλεσε πλήρη αποστρογγυλοποίηση, η ιντεγκρίνη ανβ3 παρουσίασε ένα διάχυτο πρότυπο κατανομής σε όλη τη κυτταρική επιφάνεια ενώ ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε πλήρως. Επιπλέον, στα καρκινικά κύτταρα διηθητικού πορογενουύς καρκινώματος βαθμού κακοήθειας ΙΙ, το δηλητήριο προκάλεσε εντονότερες μορφολογικές επιδράσεις σε σχέση με τα καρκινικά κύτταρα βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ. Αντίθετα, η επώαση με το δηλητήριο των κυττάρων ινοαδενώματος, στα οποία τα επίπεδα έκφρασης της ανβ3 είναι πολύ χαμηλά, δεν προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία τους και στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης.Ο διπλός ανοσοφθορισμός της αννεξίνης V και κασπάσης 8 έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα όλων των βαθμών κακοήθειας, μετά την επίδραση της δισιντεγκρίνης εισέρχονται σε αποπτωτική φάση. Ακόμη, έγινε διπλός ανοσοφθορισμός της ιντεγκρίνης ανβ3 με κασπάση 8 προκειμένου να προσδιοριστεί η κατανομή της ιντεγκρίνης σε αυτά τα κύτταρα που βρίσκονται σε φάση προαποπτωτική μετά την επίδραση της δισιντεγκρίνης. Από τα αποτελέσματα παρατηρήθηκε αυξημένος ρυθμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 στις κυτταρικές προσεκβολές, ο οποίος πιθανόν να εξυπηρετεί στη μεταφορά της στις περιοχές των κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένες στο υπόστρωμα μετά την επίδραση της δισιντεγκρίνης. Ακόμη με τη μεθοδολογία ανοσοφθορισμού μελετήθηκε η επίδραση της δισιντεγκρίνης mokason όχι μόνον στην ιντεγκρίνη ανβ3 αλλά και στις πρωτεΐνες που συνδέονται με την κυτταροπλασματική ουρά των ιντεγκρινών και προσδένονται άμεσα ή έμμεσα με την ακτίνη, όπως η ταλίνη. Η ταλίνη προσδένεται στην ιντεγκρίνη και ρυθμίζει την πρόσδεση της με συσσωματώσεις ινιδίων ακτίνης και ιντεγκρίνης. Ακόμη, η ταλίνη μεσω ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης προωθεί την καρκινογένεση και τη μετάσταση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ταλίνη εντοπίζεται διάχυτη στο κυτταρόπλασμα και με τη μορφή γραμμικών συναθροίσεων που βρίσκονται συγκεντρωμένες περισσότερο στην περιφέρεια του κυτταρικού σώματος και των κυτταροπλασματικών προσεκβολώνΤέλος, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ανοσοστυπώματος κατά Western, η επώαση των καρκινικών κυττάρων μαστού με τη δισιντεγκρίνη mokason δεν επηρεάζει την έκφραση της ιντεγκρίνης ανβ3 και συνεπώς η αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 είναι αποτέλεσμα της πλευρικής διάχυσης στην πλασματική μεμβράνη και της διακίνησης της ιντεγκρίνης αυτής. Ακόμη με τεχνική ανοσοστυπώματος κατά Western διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα εισέρχονται σε φάση προαπόπτωσης 2 ώρες μετά την επίδραση του δηλητηρίου επειδή στις καλλιέργειες διαπιστώνετα η παρουσία δεικτών προαπόπτωσης όπως είναι η κασπάση 8 και η αννεξίνη V. Τέλος, φαίνεται ελάττωση στην ταλίνη στα καρκινικά κύτταρα μετά την επώαση με το δηλητήριο, στοιχείο αναμενόμενο εφόσον η ταλίνη αποτελεί δείκτη κακοήθειας και μεταστατικότητας. Συμπερασματικά, το μοντέλο των πρωτογενών καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων μαστού που αναπτύχθηκε με τη τεχνική του ιστοτεμαχίου, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σαν ένα πειραματικό μοντέλο για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμεταστατικών θεραπειών στον καρκίνο του μαστού μέσω της αναστολής της ιντεγκρίνης αvβ3.