Μελέτες επί της δομής και λειτουργίας πρωτεϊνικών υπομονάδων του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της ριβονουκλεάσης P από το Dictyostelium discoideum
Authors: Σταματοπούλου Βασιλική 
Published: August 2021

Η ριβονουκλεάση P (RNase Ρ) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο θραύει ενδονουκλεολυτικά τα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα 5' άκρα τους. Πρόσφατα, βρέθηκε πως η RNase Ρ συμμετέχει στην μεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν tRNA, rRNA και άλλα μικρά μη κωδικοποιούντα RNA. Η RNase Ρ έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών περιοχών της ζωής (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans. Σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, η RNase Ρ είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Υπάρχουν μόνο δύο, πρόσφατα, αναφερόμενες εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase Ρ είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase Ρ από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν πολλούς ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η πυρηνική RNase Ρ από το Dictyostelium discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση, ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase Ρ που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την κλωνοποίηση και τις ιδιότητες αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης DRpp29 με την RNA υπομονάδα της RNase Ρ του D. discoideum. Πειράματα ηλεκτροφορητικής κινητικότητας έδειξαν, πως η DRpp29 δεσμεύεται ειδικά με την RNA υπομονάδα, ένα χαρακτηριστικό που επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τον σχεδιασμό του μοντέλου της δομής της DRpp29. Επιπλέον, κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα απολοιφής της DRpp29, για να μελετηθούν οι περιοχές της DRpp29 που συνεισφέρουν ή/και είναι υπεύθυνες για την άμεση αλληλεπίδρασή της με την RNA υπομονάδα. Εντοπίστηκε μια περιοχή, μεταξύ των ευκαρυωτικών ομολόγων, πλούσια σε λυσίνες και αργινίνες, η οποία φαίνεται να διευκολύνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών υπομονάδων. Προσδιορίσαμε, επίσης, με τη διεξαγωγή ανάλυσης αποτυπώματος και τη χρήση δεδομένων βιοπληροφορικής, τη δευτεροταγή δομή της RNA υπομονάδας της RNase Ρ του D. discoideum. Με ανάλυση αποτυπώματος αποκαλύφθηκε, πως η DRpp29 αλληλεπιδρά με την περιοχή εξειδίκευσης (“S-domain”) της RNA υπομονάδας, δείχνοντας, ότι η DRpp29 επηρεάζει την ικανότητα δέσμευσης του υποστρώματος από το ένζυμο. Στη συνέχεια, ελέγχθη η ικανότητα της DRpp29 και των μεταλλαγμάτων της να σχηματίζουν, μαζί με την RNA υπομονάδα του Ε. coli, ενεργά ενζυμικά σύμπλοκα με δραστικότητα RNase Ρ. Τέλος, ελέγχθη ο σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase Ρ του D. discoideum, με την πραγματοποίηση πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την DRpp29, τον πρωτεϊνικό της συνεργάτη DRpp21 και την RNA υπομονάδα.