Επίδραση της χημειοθεραπείας με ή χωρίς τον αντι-αγγειογενετικό παράγοντα Bevacizumab στα ανοσοκατασταλτικά κύτταρα σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα
Authors: Κοΐνης Φίλιππος 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις συχνότερες νεοπλασίες, αντιπροσωπεύοντας το 13% των νέων διαγνώσεων καρκίνου παγκοσμίως κατά το έτος 2012. Ο ΜΜΚΠ είναι ο πιο συχνός τύπος καρκίνου του πνεύμονα (~85% των περιπτώσεων) και διακρίνεται περαιτέρω σε διάφορους υπότυπους (αδενοκαρκίνωμα, πλακώδες καρκίνωμα, κτλ) με βάση μοριακά και ιστολογικά χαρακτηριστικά. Ο κεντρικός ρόλος της φλεγμονώδους διαδικασίας και των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την καρκινογένεση έχει σε σημαντικό βαθμό ήδη αποδειχθεί. Το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή αλληλεπιδρά με τα καρκινικά κύτταρα μέσω μίας παράδοξης διαδικασίας που μπορεί να διακριθεί σε τρία στάδια: 1) το στάδιο της εξάλλειψης (elimination), 2) το στάδιο της ισορροπίας/ανοσοελέγχου (equilibrium) και 3) το στάδιο της ανοσοδιαφυγής (escape), όπου τα νεοπλασματικά κύτταρα εγκαθιστώντας ένα ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον διαφεύγουν της ανοσολογικής επιτήρησης και πολλαπλασιάζονται πλέον ανεξέλεγκτα. Μεταξύ των ισχυρότερων αναστολέων της αντινεοπλασματικής ανοσολογικής απάντησης είναι τα Τ-ρυθμιστικά κύτταρα (Treg) και τα άωρα μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs). Ωστόσο, τα δεδομένα που υπάρχουν για το ρόλο των MDSCs και των Treg σε ασθενείς με ΜΜΚΠ είναι περιορισμένα.Ο VEGF είναι ο ισχυρότερος ρυθμιστής της νέο-αγγειογένεσης. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν μία πολύπλευρη και ισχυρή κατασταλτική επίδραση του VEGF στην αντινεοπλασματική ανοσολογική απάντηση. Μεταξύ των προτεινόμενων μηχανισμών περιλαμβάνονται η αναστολή της ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων, η προσέλκυση MDSCs στην περιοχή του όγκου και η προαγωγή του πολλαπλασιασμού των Treg. Λαμβάνοντας υπόψη την προτεινόμενη σχέση ανάμεσα στο VEGF και την ανοσοκαταστολή , το bevacizumab (μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF) μπορεί να έχει έναν ισχυρό ρόλο στην αναστροφή του «μικροπεριβάλλοντος ανοσολογικής ανοχής» που δημιουργεί ο καρκίνος.Με βάση τα προαναφερθέντα, γίνεται αντιληπτό ότι ένα ευρύ δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ καρκινικών και ανοσοκατασταλτικών κυττάρων συμμετέχει και, πιθανώς, συνεισφέρει στην εξέλιξη της νεοπλασματικής νόσου. Τον ρόλο του διαμεσολαβητή σε αυτή την αλληλεπίδραση έχουν ποικίλες ουσίες, συμπεριλαμβανομένου και του VEGF, με τελικό στόχο την εγκατάσταση ενός συστήματος ανοσοδιαφυγής στον περιβάλλον του όγκου, που επιτρέπει τον απρόσκοπτο πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Η μελέτη του μηχανισμού επέκτασης, μετανάστευσης και τελικά εγκατάστασης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιοχή του όγκου, η αναγνώριση και ο καθορισμός συγκεκριμένων υποπληθυσμών τους με σημαντική συμμετοχή στην ανοσολογική απάντηση και ο ενδελεχής προσδιορισμός της λειτουργικότητάς τους θα αποκαλύψει δυνητικά κομβικούς θεραπευτικούς στόχους έναντι της ογκο-επαγόμενης ανοσοκαταστολής. Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική εργασία σχεδιάστηκε με στόχο την ανίχνευση και το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό υποπληθυσμών ανοσοκατασταλτικών κυττάρων (Treg/MDSCs) στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ, τον προσδιορισμό της συχνότητάς τους κατά τη διάγνωση και την αξιολόγηση της προγνωστικής τους αξίας. Κατόπιν, η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε επέτρεψε τη μελέτη της επίδρασης της χημειοθεραπείας, με ή χωρίς την προσθήκη του bevacizumab, στη λειτουργικότητα και τα επίπεδα των κυκλοφορούντων ανοσοκατασταλτικών κυττάρων (Treg/MDSCs) και τη συσχέτιση των μεταβολών τους με την κλινική έκβαση. Ασθενείς και μέθοδοι: Στη μελέτη εντάχθηκαν νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ΜΜΚΠ σταδίου IIIB/IV. Περιφερικό αίμα συλλέχθηκε από τους ασθενείς πριν από την έναρξη της θεραπείας, μετά το 3ο κύκλο της θεραπείας, καθώς και τη στιγμή που διαπιστώθηκε πρόοδος νόσου. Παρόμοιας ηλικίας και φύλου, υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες. Διάφοροι υποπληθυσμοί MDSCs και Treg μελετήθηκαν μετά από σήμανσή τους με τα κατάλληλα αντισώματα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η ανοσοκατασταλτική τους δράση εκτιμήθηκε μέσω της ανασταλτικής τους επίδρασης στην παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα. Αποτελέσματα: Φαινοτυπικός προσδιορισμός υποτύπων MDSCs με κλινική σημασία στο ΜΜΚΠ και ο προγνωστικός τους ρόλος: Στη μελέτη εντάχθηκαν 110 ασθενείς. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 68 έτη. Στην πλειοψηφία τους ήταν άρρενες (84.5%). Το 51.8% είχαν αδενοκαρκίνωμα και το 74.5 % είχαν νόσο σταδίου IV. Δείγματα αίματος από 19 υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (controls).Για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των MDSCs χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 11 δείκτες. Συνοπτικά, τρεις νέοι υποπληθυσμοί MDSCs ταυτοποιήθηκαν στους ασθενείς με ΜΜΚΠ, δυο μονοκυτταρικής [CD14+CD15−CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15−M-MDSCs) και ο CD14+CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15+ M-MDSCs)] και ένας κοκκιοκυτταρικής προέλευσης [CD14−CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (G-MDSCs)]. Αυτοί οι πληθυσμοί ήταν αυξημένοι στο περιφερικό αίμα των ασθενών συγκριτικά με τους φυσιολογικούς αιμοδότες [(CD15+ M-MDSCs, 3.5 ± 0.5% έναντι 0.5 ± 0.2%, p≤0.0001), (CD15− M-MDSCs, 5.2 ± 0.5% έναντι 3 ± 0.8%, p=0.04) και (G-MDSCs, 2 ± 0.5% έναντι 0.1 ± 0.02%, p≤0.0001)]. Εντούτοις, η διαφορά στη συχνότητα των MDSCs μεταξύ των ασθενών με νόσο σταδίου ΙΙΙ και εκείνων με νόσο σταδίου IV δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Με βάση την καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία, οι ασθενείς που εμφάνισαν πρόοδο νόσου (PD) είχαν υψηλότερα επίπεδα Μ-MDSCs προ της έναρξης της θεραπείας (CD14+CD15+HLA-DR−Lin−: 1.1 ± 0.3%, CD14+CD15−HLA-DR−Lin−: 5.5 ± 1.1%) συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν (CR, PR και SD) στην θεραπεία (0.6 ± 0.07%, p=0.02 και 2.9 ± 0.3%, p=0.02 αντίστοιχα). «Φυσιολογικά» επίπεδα των CD15+ Μ-MDSCs (εντός του 90% των επίπεδων των φυσιολογικών αιμοδοτών) προ της έναρξης της θεραπείας συσχετίσθηκαν με μεγαλύτερο διάστημα επιβίωσης χωρίς πρόοδο νόσου (PFS) και μεγαλύτερη συνολική επιβίωση (OS), συγκριτικά με τα αυξημένα επίπεδα (10.87 έναντι 5.3 μήνες, p=0.005 και 12.9 έναντι 7.1 μήνες, p=0.008, αντίστοιχα). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης της επιβίωσης, τα υψηλά επίπεδα CD15+ Μ-MDSCs προ της έναρξης της θεραπείας ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πτωχής επιβίωσης (για το PFS: HR = 2.41, 95% CI: 1.37–4.24, p=0.002 και για το OS: HR = 2.35, 95% CI: 1.25–4.41, p=0.008). Τέλος, επιβεβαιώθηκε ότι αυτοί οι υποπληθυσμοί MDSCs είναι λειτουργικοί και καταστέλλουν την παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα CD3+ T κύτταρα. Επίδραση της θεραπείας στα επίπεδα των MDSCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΜΚΠ: Στην ανάλυση αυτή εντάχθηκαν συνολικά 46 ασθενείς, 33 στο σκέλος της χημειοθεραπείας και 13 στο σκέλος της χημειοθεραπείας με bevacizumab. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 68 έτη. Στην πλειοψηφία τους ήταν άνδρες (85%). Μετά από 3 κύκλους χημειοθεραπείας το 24% των ασθενών εμφάνισε PR, το 67% SD και τέλος το 9% PD. Συνολικά, η χημειοθεραπεία δεν είχε κάποια ομοιόμορφη, καθολική επίδραση στον αριθμό των διαφόρων μονοκυτταρικών (M-) και κοκκιοκυτταρικών (G-) υποπληθυσμών MDSCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΜΚΠ. Εντούτοις, τρεις κύκλοι χημειοθεραπείας σε συνδυασμό με bevacizumab οδήγησαν σε στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των G-MDSCs συγκριτικά με τα σχήματα που δεν περιελάμβαναν bevacizumab (μέση μεταβολή στη συχνότητα των G-MDSCs, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: -0.68±0.34% έναντι 0.69±0.38%, αντίστοιχα, p=0.0086). Επίσης, μετά από τρεις κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που εμφάνισαν PD είχαν αυξημένα επίπεδα όλων των υποπληθυσμών των MDSCs συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία. Μία άλλη ενδιαφέρουσα παρατήρηση από τη μελέτη αυτή ήταν ότι, μετά από 3 κύκλους θεραπείας, οι ασθενείς που παρουσίασαν PD είχαν στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων των CD15+ M-MDSCs, σε σχέση με τα επίπεδα προ της έναρξης της θεραπείας (p=0.03). Τέλος, η θεραπεία δεν επηρέασε την ανοσοκατασταλτική λειτουργία των κυττάρων. Φαινοτυπικός προσδιορισμός Treg με κλινική σημασία στο ΜΜΚΠ και ο προγνωστικός τους ρόλος: Στη μελέτη αυτή αναλύθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος από 156 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 62 έτη και στην πλειοψηφία τους ήταν άρρενες (82.1%). Το 57.6% είχαν αδενοκαρκίνωμα και το 82.1% είχαν νόσο σταδίου IV. Δείγματα αίματος από 31 υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (controls).Για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των Treg χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 9 δείκτες. Τα επίπεδα των CD4+CD25+ Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών ήταν αυξημένα συγκριτικά με τους φυσιολογικούς δότες (24.81 ± 1% έναντι 14.67 ± 1.5%, αντίστοιχα, p=0.0002). Ανάλογα με το στάδιο ενεργοποίησης και διαφοροποίησής τους, τρεις υπότυποι των CD4+ Treg (naive, effector και terminal effectors) μελετήθηκαν. Ασθενείς με PD, ως καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία πρώτης γραμμής, είχαν στατιστικά σημαντικά αυξημένη συχνότητα naive Treg (CD25highCD127–/lowCD152–FoxP3lowCD45RO–) συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν (CR, PR και SD) στη θεραπεία (3.17 ± 0.58% έναντι 0.81 ± 0.33%, αντίστοιχα, p=0.003). Επιπλέον, τα αυξημένα (άνω του 90% των επίπεδων στους φυσιολογικούς αιμοδότες) επίπεδα των naive CD4+Treg προς της έναρξης της θεραπείας συσχετίστηκαν με πτωχότερη OS συγκριτικά με τους ασθενείς στους οποίους τα επίπεδα των κυττάρων ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων (OS: 18.37 έναντι 40.47 μήνες, αντίστοιχα, p=0.039). Oι ασθενείς με υψηλά επίπεδα των effector CD4+ Treg (CD25highCD127lowCD152+FoxP3+CD45RO+) προ της έναρξης της θεραπείας είχαν μικρότερο PFS (6.8 έναντι 8.53 μήνες, p=0.046) και OS (5 έναντι 15.37 μήνες, p=0.037). Αντιθέτως, ασθενείς με PD, ως καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία, είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά terminal effector Treg (CD25highCD127–CD152+FoxP3+CD45RO+) (PD έναντι CR+PR+SD: 7.48 ± 1.27% έναντι 14.08 ± 2.74%, αντίστοιχα, p=0.04). Μάλιστα, υψηλά επίπεδα των terminal effector Treg, προ της έναρξης της θεραπείας, συσχετίσθηκαν με αυξημένο PFS (16.2 έναντι 7.5 μήνες αντίστοιχα, p=0.03) και OS (μη προσδιορισμένη έναντι 12.63 μήνες, αντίστοιχα, p=0.049). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης της επιβίωσης η υψηλή συχνότητα των naïve Tregs στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πτωχής OS (HR= 8.632, 95% CI: 2.226-33.468, p=0.002). Τέλος, διαπιστώθηκε ότι οι συγκεκριμένοι υποπληθυσμοί Treg, ανεξάρτητα από το στάδιο ενεργοποίησης τους και διαφοροποίησης τους, είναι λειτουργικοί και καταστέλλουν την παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα CD4+ T κύτταρα. Επίδραση της θεραπείας στα επίπεδα των Treg υποτύπων στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ: Συνολικά αναλύθηκαν 46 ασθενείς με ΜΜΚΠ, οι ίδιοι ασθενείς που αναλύθηκαν για την επίδραση της θεραπείας στα MDSCs. Από αυτούς ελήφθη αίμα προ της χορήγησης και μετά από 3 κύκλους θεραπείας.Συνολικά, η θεραπεία δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μεταβολή των επιπέδων των CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών. Ωστόσο, μετά από 3 κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που έλαβαν bevacizumab είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 14.81 ± 4.615% έναντι 36.44 ± 4.506%, p=0.0058). Ειδικότερα για τα naive Treg, μετά από 3 κύκλους θεραπείας, οι ασθενείς που είχαν λάβει bevacizumab είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα κυττάρων συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά naive Treg μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 0.6273 ± 0.345% έναντι 3.44 ± 1.076%, p=0.019). Μάλιστα, η χημειοθεραπεία χωρίς την προσθήκη bevacizumab συσχετίσθηκε με στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων των naive Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών (ποσοστά naive Treg προ και μετά από 3 κύκλους θεραπείας χωρίς bevacizumab: 1.456 ± 0.353% έναντι 3.44 ± 1.076% αντίστοιχα, p=0.045). Για τα effector Treg δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ασθενών που έλαβαν ή δεν έλαβαν bevacizumab (μέση μεταβολή στα ποσοστά των effector Treg, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 0.3818 ± 1.54% έναντι -1.59 ± 3.2%, p=0.49). Τέλος, μετά από 3 κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που έλαβαν bevacizumab είχαν χαμηλότερα επίπεδα terminal effector Treg συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά terminal effector Treg μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 7.3 ± 2.958% έναντι 15.72 ± 3.128%, p=0.059). Συμπέρασμα: Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφει σαφώς, φαινοτυπικά και λειτουργικά, διακριτούς υποπληθυσμούς MDSCs και Treg με προγνωστική αξία, στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ. Η ποσοτικοποίηση της συχνότητάς τους στο περιφερικό αίμα αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας επιβίωσης των ασθενών, ενισχύοντας τις προοπτικές της κλινικής χρησιμότητας του συγκεκριμένου βιοδείκτη. Η επιλεκτική στόχευση συγκεκριμένων υποπληθυσμών MDSCs και Treg μέσω της θεραπείας με bevacizumab παρέχει ενδείξεις αφενός για την ανοσοτροποιητική δράση της αντι-αγγειογενετικής θεραπείας και αφετέρου για την κλινική χρησιμότητά της ως ένα εργαλείο που θα περιορίσει το ανοσοκατασταλτικό δυναμικό σε ασθενείς με ΜΜΚΠ. Θα πρέπει να τονιστεί ωστόσο, ότι τα παραπάνω δεδομένα παραμένει να επιβεβαιωθούν προοπτικά σε τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες όπου θα ενταχθούν περισσότεροι ασθενείς, με μεγαλύτερη ομοιογένεια στον ιστολογικό τύπο και τη θεραπεία που λαμβάνουν και τα επίπεδα των κυκλοφορούντων MDSCs/Treg θα συσχετισθούν με την συχνότητά τους στη περιοχή του όγκου, όπου ασκούν την ανοσοκατασταλτική τους δράση. Είναι κοινός τόπος, ότι η αναβάθμιση της γνώσης μας για τα MDSCs και τα Treg κρίνεται θεμελιώδους σημασίας για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων στρατηγικών με στόχο την αποτελεσματική ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του «ανοσοκατασταλτικού δυναμικού» στο μικροπεριβάλλον του όγκου και την επιλογή ασθενών με ΜΜΚΠ που πιθανώς θα επωφελούνταν από την εφαρμογή μιας ανοσοθεραπευτικής προσέγγισης.