Μελέτη της αλκοολικής ζύμωσης με χρήση ζυμών non-Saccharomyces
Authors: Δρόσου Φωτεινή 
Published: September 2022

Η μπίρα είναι ένα μοναδικό προϊόν με ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, η οποία αποτελείται από τέσσερα βασικά συστατικά: το νερό, τη βύνη, το λυκίσκο και τη ζύμη. Η απαίτηση για μαζική παραγωγή της, οδήγησε στην επιλογή και τη χρήση συγκεκριμένων στελεχών Saccharomyces, τα οποία εμφανίζουν υψηλή αποδοτικότητα, χωρίς ωστόσο να προσφέρουν πολυπλοκότητα αρώματος και γεύσης στο τελικό προϊόν. Με τη ραγδαία ανάπτυξη των μικροζυθοποιείων σε παγκόσμια κλίμακα, οι ζυθοποιοί προσπάθησαν να διαφοροποιήσουν τα προϊόντα τους επιλέγοντας εναλλακτικές βύνες και λυκίσκους, με απώτερο σκοπό τον εμπλουτισμό των προϊόντων τους σε αρώματα και γεύση. Ένας από τους τρόπους είναι και η επιλογή διαφορετικών ζυμομυκήτων, δεδομένου ότι ο μεταβολισμός τους, είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που καθορίζουν το οργανοληπτικό προφίλ του ζύθου. Γνωστοί αρχικά από τον κλάδο της Οινολογίας ως μικροοργανισμοί αλλοίωσης, οι non-Saccharomyces ή «άγριες» ζύμες, αποτελούν κύρια επιλογή πλέον λόγω της αρωματικής και γευστικής πολυπλοκότητας που προσδίδουν στους οίνους. Αντίστοιχες απόψεις, όσον αφορά στην αλλοίωση του τελικού προϊόντος, επικρατούσαν και στον κλάδο της Ζυθοποιίας, αν και σε ορισμένα στυλ μπίρας, όπως τις Lambic, η χρήση τους είναι επιτακτική ακόμη και σε μικτές ζυμώσεις με διαφορετικά γένη. Σήμερα, μεγάλο ενδιαφέρον παρατηρείται για τη χρήση των non-Saccharomyces στον κλάδο της ζυθοποίησης, οι οποίοι μέσα από διάφορα μεταβολικά μονοπάτια που ακολουθούν για τον μεταβολισμό των σακχάρων του ζυθογλεύκους, μπορούν να παράξουν ένα πλήθος ουσιών που επιδρούν και συνεισφέρουν στο αρωματικό προφίλ του ζύθου. Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η παραγωγή καινοτόμου ζύθου με τη χρήση στελεχών non-Saccharomyces, ο οποίος θα διαφοροποιούνταν από τα αντίστοιχα συμβατικά προϊόντα λόγω της αρωματικής του πολυπλοκότητας. Εκτός του διαφοροποιημένου αρωματικού προφίλ, είναι αναγκαίο το χρησιμοποιούμενο στέλεχος να έχει τη δυνατότητα να μεταβολίζει τα βασικά σάκχαρα του ζυθογλεύκους (γλυκόζη, φρουκτόζη και μαλτόζη) προκειμένου να παραχθεί αιθανόλη. Για αυτό το σκοπό, έπειτα από βιβλιογραφική ανασκόπηση σε μελέτες που διεξήχθησαν σε οινογλεύκη, επιλέχθηκαν δύο non-Saccharomyces ζύμες, η Torulaspora delbrueckii (T.d.) και η Metschnikowia pulcherrima (M.p.) ως εναλλακτικές ζύμες έναντι των συμβατικών στελεχών του S. cerevisiae (S.c.). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο εμπορικά στελέχη T.d. 291 (Lallemand) και T.d. Prelude (Hansen) κι ένα εμπορικό στέλεχος M. pulcherrima (Flavia MP 346, Lallemand), σε σύγκριση με ένα στέλεχος S. cerevisiae (US-05, Fermentis by Lesaffre). Η έρευνα επικεντρώθηκε στη μελέτη της ικανότητας των συγκεκριμένων στελεχών να ζυμώσουν τα κύρια σακχάρα του βυνογλεύκους, στη μέτρηση της παραγόμενης αιθανόλης, στην κατανάλωση του ελεύθερου αζώτου αμινοξέων καθώς και στη διερεύνηση της επίδρασης της θερμοκρασίας ζύμωσης στην κινητική των ζυμώσεων. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκαν δύο διαφορετικές θερμοκρασίες ζύμωσης, 13 και 20 °C. Επίσης, με τη χρήση του αέριου χρωματογράφου μελετήθηκαν οι πτητικές ενώσεις που παρήχθησαν σε κάθε σάκχαρο ξεχωριστά. Με βάση τα άνωθεν, παρασκευάστηκαν συνθετικά υποστρώματα γλυκόζης, φρουκτόζης, μαλτόζης και ένα μίγμα των προαναφερθέντων σακχάρων σε αναλογίες που αντιστοιχούν με αυτές ενός τυπικού ζυθογλεύκους (86% μαλτόζη, 9% γλυκόζη και 5% φρουκτόζη) και ζυμώθηκαν στους 13 και 20 °C, με σκοπό τη μελέτη της κινητικής της ζύμωσης. Από τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης της ζύμωσης προέκυψε ότι όλα τα μελετώμενα στελέχη είναι ικανά να μεταβολίζουν όλα τα σάκχαρα, να παράγουν ικανοποιητική ποσότητα αιθανόλης και να αναπτύσσονται και στις δύο θερμοκρασίες, αλλά με βραδύτερο ρυθμό στους 13 °C. Η κατανάλωση της γλυκόζης ήταν ταχύτερη έναντι της φρουκτόζης, για την T. delbrueckii 291 στους 20 °C, ενώ για την T. delbrueckii Prelude στους 13 °C. Η μαλτόζη παρουσίασε χαμηλότερο ρυθμό κατανάλωσης συγκριτικά με τους μονοσακχαρίτες, και ειδικά στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, χωρίς να επιδρά στη συγκέντρωση των υπολειμματικών σακχάρων. Στη ζύμωση με T. delbrueckii 291 παρατηρείται φάση υστέρησης κατά τον μεταβολισμό της μαλτόζης αλλά και κατά την ανάπτυξή του, η οποία οφείλεται στη δυσκολία του συγκεκριμένου στελέχους να ενεργοποιήσει το ένζυμο μαλτάση. Στη ζύμωση με M. pulcherrima η κατανάλωση της μαλτόζης πραγματοποιείται βραδύτερα σε σχέση με τους δύο μονοσακχαρίτες (γλυκόζη και φρουκτόζη), παρουσιάζοντας χαμηλότερο ρυθμό μεταβολισμού καθώς και μικρή υστέρηση στην έναρξη της ζύμωσης.Το λογιστικό μοντέλο Monod χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη λόγω της απλότητας και της καλής του προσαρμογής. Το μοντέλο αυτό είναι σε θέση να προβλέψει τον ρυθμό ανάπτυξης βιομάζας για τη συμβατική ζύμη και το στέλεχος της T. delbrueckii Prelude, καθώς τα πειραματικά αποτελέσματα ανάπτυξης των κυττάρων παρουσίασαν καλή προσαρμογή, ωστόσο δεν εμφανίζει ικανοποιητική προσαρμογή για τα δεδομένα της T. delbrueckii 291, ειδικά στους 13 °C. Γενικότερα, η T. delbrueckii 291 παρουσίασε το μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης στους δύο μονοσακχαρίτες και ειδικότερα στη θερμοκρασία των 20 °C, ακολουθούμενη από το στέλεχος της M. pulcherrima Aντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης με τις τιμές k των non-Sacharromyces ζυμών να μη διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Η μέγιστη κυτταρική συγκέντρωση όλων των μη συμβατικών ζυμών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (p<0,05) από την αντίστοιχη του S.c US-05 σε όλα τα ζυμώσιμα σάκχαρα και θερμοκρασίες ζύμωσης. Η κυτταρική απόδοση βρέθηκε υψηλότερη στο στέλεχος της T. delbrueckii 291 στους δύο μονοσακχαρίτες. Ως προς τις ζύμώσεις των μικτών σακχάρων, η μέγιστη κυτταρική ανάπτυξη παρατηρείται στους 20 °C στις ζυμώσεις των Τ. delbrueckii 291 και M. pulcherrima, ενώ και στους 13 °C, οι non-Saccharomyces παρουσιάζουν υψηλότερο πληθυσμό από τον S. cerevisiae US-05. Η θερμοκρασία είχε σημαντική (p<0,05) επίδραση στην απόδοση της αιθανόλης. Οι άγριες ζύμες παρήγαγαν ποσότητες αιθανόλης ίσες ή και υψηλότερες από τον συμβατικό σακχαρομύκητα. Ειδικότερα, στους 13 °C, σημαντικά υψηλότερη ήταν η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης (40 g/L) από την Μ. pulcherrima (p<0,05) στη ζύμωση της μαλτόζης, ξεπερνώντας τις υπόλοιπες ζύμες. Αντίθετα, στους 20 °C, υψηλότερη συγκέντρωση παρήγαγε η συμβατική ζύμη (43 g/L). Επιπλέον, η τελική συγκέντρωση του ελεύθερου αζώτου των αμινοξέων διέφερε σημαντικά (p<0,05) μεταξύ των μελετώμενων στελεχών και των θερμοκρασιών ζύμωσης. Από τις άγριες ζύμες, εκείνη που παρουσίασε μεγαλύτερη ανάγκη σε άζωτο ήταν η Μ. pulcherrima σε όλα τα μελετώμενα σάκχαρα και στις δύο θερμοκρασίες ζύμωσης, ενώ μεταξύ των T. delbrueckii στελεχών μεγαλύτερη κατανάλωση παρουσίασε το στέλεχος 291. Οι πτητικές ενώσεις επηρεάστηκαν σημαντικά (p<0,05) από τη θερμοκρασία ζύμωσης και από το εξεταζόμενο σάκχαρο που χρησιμοποιήθηκε, ενώ όλα τα στελέχη παρήγαγαν ανώτερες αλκοόλες, λιπαρά οξέα μεσαίας αλυσίδας και τους εστέρες τους στη ζύμωση της μαλτόζης και των μικτών σακχάρων. Πιο συγκεκριμένα, τα δύο στελέχη T. delbrueckii παρουσίασαν υψηλές τιμές στην φαινυλαιθυλική αλκόολη, σε διαφορετικά σάκχαρα το κάθε ένα, με το 291 να παρουσιάζει τις υψηλότερες τιμές στη μαλτόζη, ενώ το Τ. delbrueckii Prelude στο μίγμα σακχάρων, στους 20 °C. Αντίστοιχα αποτελέσματα παρουσιάζονται στις ζυμώσεις της M. pulcherrima, με την τελευταία να παρουσιάζει τις μέγιστες τιμές στη φρουκτόζη και στο μίγμα. Στους 13 °C, τα εξεταζόμενα στελέχη παρουσίασαν υψηλότερες συγκεντρώσεις στους εστέρες των λιπαρών οξέων από τον S. cerevisiae US-05, και ταυτοχρόνως, ανιχνεύθηκαν περισσότεροι εστέρες σε σύγκριση με τους 20 °C. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης των πτητικών ενώσεων, το στέλεχος 291 παράγει τις μέγιστες συγκεντρώσεις στους 20 °C, ενώ το Τ. delbrueckii Prelude στους 13 °C. Ως προς τη ζύμωση με την M. pulcherrima, μεγαλύτερη παραγωγή των εστέρων των λιπαρών οξέων μεσαίας αλυσίδας παρατηρείται για τις ζυμώσεις στους 13 °C. Ως προς τα εξεταζόμενα σάκχαρα, οι περισσότεροι εστέρες ανιχνεύθηκαν στο μίγμα σακχάρων για τα δύο στελέχη T. delbrueckii, ενώ για την M. pulcherrima στη φρουκτόζη. Αφού διαπιστώθηκε η δυνατότητα ζύμωσης των κύριων σακχάρων, μελετήθηκε η παραγωγή ζύθου τύπου American Pale Ale, με αρχικές τιμές πυκνότητας 12,2±0,1 °P και pH 5,1±0,1. Στα πειράματα αυτά παρασκευάστηκαν διαφορετικές μπίρες οι οποίες ζυμώθηκαν με μονοκαλλιέργειες των μελετώμενων ζυμών S. cerevisiae US-05, T. delbrueckii 291, T. delbrueckii Prelude και M. pulcherrima, καθώς και με μικτές καλλιέργειες της συμβατικής ζύμης με κάθε στέλεχος Τ.d. σε αναλογία 1:10 και με M. pulcherrima σε αναλογίες 1:1 και 1:10 στους 13 και 20 °C. Ειδικότερα, για τη μικτή καλλιέργεια του S. cerevisiae US-05 με τα στελέχη της T. delbrueckii επιλέχθηκε η αναλογία 1:10, με βάση τη βιβλιογραφία, καθώς έχει βρεθεί ότι οι δύο μικροοργανισμοί στη συγκεκριμένη αναλογία αναπτύσσονται παράλληλα χωρίς ανταγωνισμό, παράγοντας ένα προϊόν με πολύ ενδιαφέρον αρωματικό προφίλ και υψηλά ποσοστά αιθανόλης. Όσον αφορά στο στέλεχος της M. pulcherrima δεν έχει δοκιμαστεί ξανά σε παραγωγή ζύθου, επομένως θεωρήθηκε χρήσιμο να εξεταστεί σε διαφορετικές αναλογίες, ούτως ώστε να μελετηθεί διεξοδικά η κινητική της ζύμωσης, ο ανταγωνισμός μεταξύ των δύο μικροοργανισμών καθώς και τα χαρακτηριστικά των παραγόμενων ζύθων. Αν και παρουσίασαν χαμηλότερους ρυθμούς ζύμωσης από τον S. cerevisiae US-05, οι μελετώμενες non-Saccharomyces ζύμες ήταν ικανές να παράγουν μπίρα τύπου American Pale Ale, τόσο σε μονοκαλλιέργειες όσο και σε ζυμώσεις μικτής καλλιέργειας και στις δύο εξεταζόμενες θερμοκρασίες (13 και 20 °C). Η μονοκαλλιέργεια T. delbrueckii 291 είχε το βραδύτερο μεταβολικό ρυθμό και στις δύο θερμοκρασίες, παρουσιάζοντας παρόμοια φάση υστέρησης με τις ζυμώσεις των συνθετικών υποστρωμάτων. Η κατανάλωση του FAN ήταν ταχύτατη στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης για όλες τις non-Saccharomyces ζύμες, προκειμένου να επιβιώσουν στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης καθώς και από το στρες της διάσπασης του δισακχαρίτη. Όσον αφορά στις ζυμώσεις με M. pulcherrima, στους 20 °C, η μεικτή ζύμωση με αναλoγία 1:1, παρουσίασε παρόμοιο μεταβολικό ρυθμό με τη συμβατική ζύμη, υποδεικνύοντας ότι στη μεικτή αυτή ζύμωση επικράτησε ο S. cerevisiae US-05. Oι μικτές ζυμώσεις των μη συμβατικών ζυμών παρουσίασαν περιεκτικότητα σε αιθανόλη στο τελικό προϊόν αντίστοιχη με αυτή του S. cerevisiae US-05, ειδικά στους 20 °C. Εξαίρεση αποτέλεσε η μεικτή ζύμωση του Τ.delbrueckii Prelude, του οποίου η παραγόμενη αιθανόλη (5,40±0,10% ABV) ξεπέρασε σημαντικά (p<0,05) τον S. cerevisiae US-05. Και στις δύο θερμοκρασίες οι μονοκαλλιέργειες παρήγαγαν χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Επιπλέον, στο τέλος της ζύμωσης, μετρήθηκε το χρώμα και η πικράδα των παραγόμενων ζύθων καθώς και μετά από διάστημα 30 ημερών προκειμένου να παρατηρηθεί η μεταβολή τους. Μετά από χρονικό διάστημα 30 ημερών παρατηρήθηκε ότι στις μικτές ζυμώσεις η κροκίδωση ήταν μεγαλύτερη από τις μονοκαλλιέργειες λόγω της παρουσίας του S. cerevisiae US-05. Μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών, οι μονοκαλλιέργειες των στελεχών της T. delbrueckii παρουσίασαν υψηλότερες τιμές χρώματος, σε σχέση με την M. pulcherrima, ενώ οι τιμές στην πικράδα δεν διαφοροποιήθηκαν σημαντικά στις περισσότερες ζυμώσεις. Όσον αφορά στη γεύση και το άρωμα των παραγόμενων ζύθων, η μεικτή ζύμωση του T. delbrueckii 291 παρουσίασε το πιο αρωματικό προφίλ στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, με περισσότερες φρουτώδεις νότες και ανθικά αρώματα, ενώ το στέλεχος T. delbrueckii Prelude στους 20 °C. Ως προς το στέλεχος Μ. pulcherrima, η μονοκαλλιέργεια είναι αυτή που διαφοροποιήθηκε σημαντικά (p<0,05) από τον S. cerevisiae US-05 και ειδικότερα στην υψηλή θερμοκρασία ζύμωσης, παρουσιάζοντας πλουσιότερο οργανοληπτικό προφιλ, καθώς μπορεί να ενισχύσει τη μπίρα με περισσότερες φρουτώδεις, αλλά και φαινολικές νότες, αφού στην περίπτωση του συγκεκριμένου στελέχους καταγράφηκε η υψηλότερη συγκέντρωση της 2-μεθοξυ-4-βινυλ-γουαιακόλης, η οποία είναι υπεύθυνη για πικάντικες νότες.Τέλος, οι παραπάνω ζύθοι, αφιλτράριστοι κι απαστερίωτοι, ωρίμασαν σε ψυκτικό θάλαμο στους 13 °C, για δύο χρόνια. Σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (1 μήνας, 6 μήνες, 1 και 2 χρόνια) συλλέχθηκαν δείγματα για τη μελέτη της εξέλιξης των αρωματικών ενώσεων κατά τη διάρκεια της παλαίωσης,. Γενικά, δεν ανιχνεύθηκαν off-flavors ενώσεις, όπως η χαρακτηριστική ένωση trans-2-nonenal (γεύση χαρτονιού), αλλά οι ζύθοι μεταβλήθηκαν αρωματικά. Οι πτητικές ενώσεις που παρήχθησαν στη ζύμωση των 13 °C, δεν αυξήθηκαν παρά μόνο κατά τη φάση της αυτόλυσης, χωρίς να ανιχνεύονται ενώσεις παλαίωσης. Αντίθετα, στις ζυμώσεις των 20 °C οι μεταβολές είναι σημαντικές (p<0,05), ιδίως για τη μονο- και τη μικτή ζύμωση του Τ. delbrueckii 291, επηρεάζοντας τη διαμόρφωση του οργανοληπτικού προφίλ των ζύθων. Στις ζυμώσεις της M. pulcherrima, οι σημαντικότερες μεταβολές καταγράφηκαν στη μονοκαλλιέργεια, ενώ και οι δύο εξεταζόμενες αναλογίες στις μικτές ζυμώσεις δεν διαφοροποιήθηκαν σημαντικά μεταξύ τους. Οι μεταβολές των πτητικών ενώσεων στον S. cerevisiae US-05 παρατηρήθηκαν στη ζύμωση των 20 °C, με σημαντική αύξηση των ανώτερων αλκοολών αλλά και των εστέρων των λιπαρών οξέων μεσαίας αλυσίδας κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Στη χαμηλή θερμοκρασία ζύμωσης, παρατηρήθηκε υδρόλυση των εστέρων σε όλες τις ζυμώσεις, γεγονός που μπορεί να είναι η κύρια αιτία για την απώλεια του φρουτώδη χαρακτήρα της μπίρας κατά την αποθήκευση και ωρίμανση. Γενικότερα στις non-Saccharomyces ζυμώσεις, τα φρουτώδη αρώματα, καθώς και τα αρώματα ανθέων μετατράπηκαν σε αρώματα πυρηνόκαρπων φρούτων, όπως του βερύκοκου και του ροδάκινου αλλά και καραμέλας, γεγονός που αποδίδεται στην αύξηση των αιθυλεστέρων και την ανίχνευση νέων πτητικών ενώσεων, όπως διαφόρων λακτονών που συνέβαλαν στο άρωμα και στη γεύση.Εν κατακλείδι, από τη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή βρέθηκε ότι οι μελετώμενες άγριες ζύμες είναι ικανές να παράγουν καινοτόμα προϊόντα μπίρας με ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, και επομένως αποτελούν μία βιώσιμη λύση για την διαφοροποίηση των μικροζυθοποιείων.