Μελέτη του φυσιολογικού ρόλου της 4-υδροξυλάσης της προλίνης κατά την ωρίμανση του καρπού της τομάτας
Authors: Περράκης Ανδρέας 
Published: September 2021

Οι P4Hs ανήκουν στην οικογένεια των 2-οξογλουταρικό-εξαρτώμενων διοξυγενασών και για το σχηματισμό υδροξυπρολίνης απαιτούνται 2-οξογλουταρικό οξύ και Ο2 ως συνυποστρώματα, Fe²+ ως συμπαράγοντας και ασκορβικό οξύ για μέγιστη ενεργότητα (Kivirikko και Myllyharju, 1998). Στα φυτά, ο ρόλος των P4Hs έχει διερευνηθεί κυρίως με την κατασκευή και το χαρακτηρισμό μεταλλάξεων στο γένομα της αραβίδοψης (Hieta και Myllyharju, 2002) στο γαρύφαλλο (Vlad et.al., 2010) στην πράσινη άλγη Chlamydomonas reinhardtii (Keskiaho et al., 2007) και την τομάτα (Fragkostefanakis et al., 2014). Παρά την μεγάλη τους σημασία στην δομή και λειτουργία του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών, λίγα έχουν γίνει για τον προσδιορισμό της φυσιολογικής τους σημασίας στα φυτά και πιο συγκεκριμένα στον καρπό της τομάτας. Προς αυτήν την κατεύθυνση, δημιουργήθηκαν σταθερές γενετικά τροποποιημένες σειρές φυτών μέσο της επιμόλυνσης κοτυληδόνων με Agrobacteriun t., χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ιστοκαλλιέργειας. Ειδικότερα χρησιμοποιήθηκε ο φορέας 35S::P4H3-RNAi όπου μέσω του μηχανισμού της RNAi γονιδιακής σίγησης προκάλεσε την μείωση της έκφρασης ενός γονιδίου P4H στην ποικιλία τομάτας c.v. Ailsa Craig,. Από την άλλη χρησιμοποιήθηκε η κασέτα 35S:: P4H3 cDNA όπου με την καθοδήγηση του ίδιου προωθητή (35S) προκάλεσε την υπερ-έκφραση ενός γονιδίου P4H. Πιο συγκεκριμένα η μείωση της έκφρασης του Ρ4H3 mRNA σε 9 ανεξάρτητες σειρές φυτών προκάλεσε: I) καρπούς μικρότερης διαμέτρου κατά ~30%, II) μείωση κατά 80% στον αριθμό των σπόρων ανά καρπό, III) σπόροι διαφορετικής μορφολογίας με έμβρυα μικρότερου μήκους και διαφορές στην φυτρωτική τους ικανότητα, ΙV) μεταβολή στα επίπεδα έκκρισης του κλιμακτηρικού αιθυλενίου, V) αύξηση στη συγκέντρωση των καροτενοειδών αλλά και VI) στην συνοχή της σάρκας. Για τον προσδιορισμό της έκκρισης του κλιμακτηρικού αιθυλενίου έγιναν μετρήσεις στους καρπούς με τη χρήση αέριου χρωματογράφου στήλης (GC) καθόλη την πορεία ωρίμανσής τους ξεκινώντας από το στάδιο του μεταχρωματισμού έως το στάδιο του ώριμου κόκκινου. Ο προσδιορισμός των καροτενοειδών έγινε κυρίως από καρπούς που ήταν στο στάδιο του ώριμου κόκκινου (RR) χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού και συνοχή της σάρκας προσδιορίστηκε με τη χρήση μηχανικού αναλυτή μεγάλων παραμορφώσεων (Texture Analyze- TA-XT2i) Από τις αναλύσεις αυτές βρέθηκε ότι από το βιοσυνθετικό μονοπάτι του αιθυλενίου η σημαντικότερη μεταβολή εντοπίζεται σε μία συνθάση του αιθυλενίου κατά τα στάδια του TU, PK και RR. Από το βιοσυνθετικό μονοπάτι των καροτενοειδών βρέθηκε ότι η ισομεράση carotene isomerase (ΖΙCO) παρουσιάζει σημαντική αύξηση κυρίως κατά το στάδιο της αλλαγής χρώματος (TU), ενώ από τις αναλύσεις των γονιδίων που εμπλέκονται στη συνοχή της σάρκας βρέθηκε ότι η πολυγαρακτουρονάση (PG) αυξάνεται κατακόρυφα στο στάδιο του μεταχρωματισμού (BR). Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης τριών AGPs γονιδίων έδειξε ότι η έκφραση τους είχε μειωθεί στατιστικά σημαντικά και στα τρία εξεταζόμενα γονίδια κυρίως στο στάδιο του TU και PK, επαληθεύοντας έτσι τη θεωρία περί εμπλοκής των PH4s στην λειτουργία των AGPs (Fragkstefanakis et al, 2014; Vlad et al., 2007; Kivirikko et al, 1998).Εκτός από τις δομικές και φυσιολογικές αλλαγές που προκλήθηκαν, παρατηρήθηκαν και σημαντικές μεταβολές στο πρόγραμμα αποκοπής του καρπού και άνθους όπου παρατηρήθηκε ότι και στις 9 RNAi-P4H3 ανεξάρτητες σειρές, υπήρξε μία καθυστέρηση της διαδικασίας αποκοπής σε υπερώριμους καρπούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς καρπούς (WT). Οι συγκεκριμένες αλλαγές στο πρόγραμμα αποκοπής προφανώς συνδέονται με την δύναμη εφελκυσμού της ζώνης αποκοπής σε καρπούς στο στάδιο του ώριμου καρπού (RR) όπου σύμφωνα με τις μελέτες αποκοπής, απαιτήθηκε μεγαλύτερη δύναμη (Newton) και περισσότερος χρόνος λόγω της μεγαλύτερης ελαστικότητας (Elongation percentage %) για την σχίση της ζώνης αποκοπής του καρπού. Τέλος, Από την ανάλυση των μικροσυστοιχιών ταυτοποιήθηκαν δύο μεταγραφικοί παράγοντες (ERF24 και bHLH54) οι οποίοι παρουσίασαν σημαντική διαφορά έκφρασης (fold change) μεταξύ της σειράς RNAi-P4H3 και του μάρτυρα στο χρονικό διάστημα ωρίμανσης μεταξύ Br+10, Br+30 και Br+90. Ο κύριος σκοπός της εργασίας που ήταν η αλλαγή της έκφρασης μίας P4H στην τομάτα ολοκληρώθηκε επιτυχώς, ενώ δημιουργήθηκε μία σειρά από γενετικά τροποποιημένους καρπούς με αρκετά διαφορετικά μορφολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά.