Μελέτη του συστήματος μεταφοράς σήματος δύο συστατικών AtoS-AtoC και η συμβολή του στη ρύθμιση κυτταρικών λειτουργιών μικροοργανισμών
Authors: Φιλίππου Παναγιώτα 
Published: January 2014

Η διατριβή αυτή είχε ως πρωταρχικό στόχο την μελέτη της λειτουργικότητας σε μοριακό επίπεδο της κινάσης του συστήματος μετάδοσης σήματος δύο συστατικών AtoS-AtoC στο βακτήριο E. coli. Η κινάση AtoS αποτελεί τον πυρήνα του συστήματος που έπειτα από επαγωγή από ακετοξικό, διαμέσου φωσφομεταφοράς, ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων του atoDAEB οπερονίου για τον καταβολισμό λιπαρών οξέων μικρής αλυσίδας. Η μελέτη του μηχανισμού αυτοφωσφορυλίωσης της AtoS ξεκίνησε με την πειραματική απόδειξη πως καθαρισμένες ανασυνδυασμένες μορφές της AtoS (μεταλλαγμένες και αγρίου τύπου) δρουν ως πραγματικές κινάσες. Το υποψήφιο προς φωσφορυλίωση αμινοξύ ταυτοποιήθηκε ως η ιστιδίνη Η-398 που εντοπίζεται στο συντηρημένο «Η-κουτί», έπειτα από την αδυναμία αυτοφωσφορυλίωσης του μεταλλάγματος Η398L καθώς και την αδυναμία της μεταλλαγμένης AtoS(H398L) στην επαγωγή από το ακετοξικό του atoDAEB οπερονίου. Η ανικανότητα αυτοφωσφορυλίωσης δεν οφειλόταν σε μεγάλες δομικές αλλαγές στη διαμόρφωση της AtoS εφόσον το Η398L μετάλλαγμα επανάκτησε την ικανότητα δέσμευσης του ATP. Επιπρόσθετα, το Η398L μετάλλαγμα της AtoS συναγωνίζεται στο να καταλύσει την trans-φωσφορυλίωση σε μια μεταλλαγμένη στο «G2-κουτί» AtoS (G565A) που διαφορετικά αποτυγχάνει να αυτοφωσφορυλιωθεί εξαιτίας της ανικανότητάς της στη δέσμευση του ATP. O σχηματισμός ομοδιμερών ως απαραίτητη προϋπόθεση για τον μηχανισμό trans-αυτοφωσφορυλίωσης της AtoS αποδείχθηκε με πειράματα χημικής σταυροσύνδεσης τόσο in vitro όσο και in vivo για όλες τις ανασυνδυασμένες μορφές της AtoS. Ο διμερισμός της AtoS δεν επάγεται από το μοριακό σήμα, εφόσον η παρουσία του ακετοξικού δεν επηρέασε την ενδοκυττάρια συμπεριφορά της AtoS ως διμερούς. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε επίσης ο μηχανισμός επαγωγής του AtoC από τις πολυαμίνες στην E. coli, εξαιτίας της διπλής του λειτουργίας ως θετικός μεταγραφικός ρυθμιστής του atoDAEB οπερονίου και ως μη συναγωνιστικός αναστολέας της ODC στη ρύθμιση της βιοσύνθεσης των πολυαμινών. Εξετάστηκε ο ρόλος των πολυαμινών στην μεταγραφή του atoC και παράλληλα ξεκαθαρίστηκαν οι επιδράσεις τους στη μεταγραφή άλλων γονιδίων που μοιράζονται τοπολογική και/ή λειτουργική συγγένεια με το atoDAEB οπερόνιο. Οι πολυαμίνες δρουν στο μεταγραφικό επίπεδο, όπως αποδείχθηκε από την εξειδικευμένη μεταγραφική ενεργοποίηση του atoC σε τρία διαφορετικά κυτταρικά στελέχη. Επιπρόσθετα, μια ομάδα από ανάλογα πολυαμινών συντέθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως εργαλεία για την διευκρίνιση του τρόπου δράσης των φυσικών πολυαμινών. Οι επιδράσεις αυτών των ενώσεων ελέγχθηκαν σε διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως η επαγωγή της έκφρασης του atoC καθώς και του atoDAEB οπερονίου, η ρύθμιση της δραστικότητας της ODC και της δράσης κινάσης AtoS, καθώς επίσης και η ανάπτυξη του πολυαμινο-εξαρτώμενου E. coli στελέχους. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν πως τα ανάλογα πουτρεσκίνης και διαμινοπροπανίου ενεργοποίησαν τη μεταγραφή του atoC, ενδεικτικό των δομικών απαιτήσεων των διαμινών για την επαγωγή του. Ορισμένα ανάλογα ενεργοποίησαν και το atoDAEB ενώ το πιο δραστικό ανάλογο ενίσχυσε την δράση κινάσης της κυτταροπλασματικής μορφής της AtoS. Επιπρόσθετα, η επαγωγή του atoC προκάλεσε την αντίστοιχη συσσώρευση των ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών επιπέδων του και την επακόλουθη αναστολή της δραστικότητας της ODC. Αυτή η αναστολή πιθανότατα να οφείλεται στη δημιουργία ανενεργών συμπλόκων ODC-AtoC, εφόσον τα ανάλογα πολυαμινών δεν επηρέασαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα της ODC.