Identification and functional characterization of RNA silencing key-genes in the model pennate diatom species Phaeodactylum tricornutum
Authors: Γρυπιώτη Αιμιλία 
Published: September 2021

Ο μηχανισμός της RNA Σίγησης, γνωστός και ως μονοπάτι RNA παρεμβολής (RNA interference, RNAi), αποτελεί ένα συντηρημένο μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης με τη διαμεσολάβηση μικρών RNA μορίων (sRNA), (Fire et al., 1998). Στα διάτομα, και στο διάτομο οργανισμό μοντέλο Phaeodactylum tricornutum, έχει παρατηρηθεί η σίγηση εξωγενών και ενδογενών γονιδίων μετά την εισαγωγή ανάστροφων επαναλήψεων, συμπληρωματικών μεταγράφων και τεχνητών miRNAs (De Riso et al., 2009; Kaur and Spillane, 2015). Στο P. tricornutum έχει προταθεί η παρουσία ενός ενδογενούς RNAi μονοπατιού μετά από μελέτες των sRNAs, της γονιδιακής έκφρασης και της μεθυλίωσης DNA του (Veluchamy et al., 2013; Rogato et al., 2014). Αυτό το RNAi μονοπάτι μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και μεταθετά στοιχεία (Transposable Elements,TEs) και πιθανώς να επηρεάζει την απόκριση προσαρμογής σε συνθήκες περιορισμένων θρεπτικών (Maumus et al., 2009). Ομόλογα των βασικών RNAi γονιδίων DICER (DCR), ARGONAUTE (AGO) και RNA-Dependent RNA polymerase (RDR) έχουν αναγνωριστεί με ανάλυση in silico (De Riso et al., 2009). Ωστόσο, η εξακρίβωση του γονιδιακού μοντέλου τους, ο χαρακτηρισμός της λειτουργίας τους και ο ρόλος τους σε επίπεδο φυσιολογίας παραμένουν άγνωστα. Στην παρούσα διατριβή, επιβεβαιώνεται η ύπαρξη ενός μοναδικού γονιδίου PtDCR, PtAGO και PtRDR στο P. tricornutum μετά από εκτεταμένη ανάλυση in silico των διαθέσιμων γονιδιωματικών και μεταγραφικών δεδομένων του. Η ανεύρεση και φυλογενετική ανάλυση των DCR, AGO και RDR ομόλογων γονιδίων στα διάτομα από όλες τις διαθέσιμες βάσεις δεδομένων παρουσιάζουν μια μη αναμενόμενη διαφοροποίηση του RNAi μονοπατιού σε αυτούς τους οργανισμούς. Το cDNA των PtDCR/AGO/RDR κλωνοποιήθηκε και αναγνωρίστηκαν μετάγραφα εναλλακτικού ματίσματος των PtDCR και PtAGO. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των PtDCR-/AGO-/RDR-YFP διερευνήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία. Για τον χαρακτηρισμό της λειτουργίας των PtDCR και PtAGO γονιδίων δοκιμάστηκε αρχικά η έκφρασή τους στα ετερόλογα συστήματα της ζύμης Saccharomyces cerevisiae και του φυτού Nicotiana bethamiana. Στη συνέχεια, με την εφαρμογή της CRISPR/Cas9-καθοδηγούμενης μεταλλαξιγένεσης, πρόσφατα προσαρμοσμένη στο P. tricornutum, δημιουργήθηκαν επιτυχώς οι μεταλλαγμένες σειρές με εκτοπισμό PtDCR-KO και PtAGO-KO (KnockOut). Η μελέτη του φαινοτύπου στην ανάπτυξη των PtDCR-KO σειρών έγινε σε καλλιέργειες υπό φυσιολογικές συνθήκες, υπό συνθήκες περιορισμένων νιτρικών και μετά από UV-επαγόμενο στρες. Παράλληλα, διεξήχθη αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) και ανάλυση των ολικών μεταγράφων mRNA και small RNAs. Τα πειράματα των καλλιεργειών υποδεικνύουν ότι η PtDCR ίσως παίζει ρόλο στην απόκριση υπό την έλλειψη νιτρικών. Η μεταγραφική ανάλυση αποκάλυψε ότι και τα sRNA και τα mRNA μετάγραφα επηρεάστηκαν στη DCR-KO σειρά. Συνολικά, η κατανομή του μεγέθους των sRNA μετατοπίστηκε προς μεγαλύτερου μεγέθους μόρια στην PtDCR-KO σειρά. Επίσης, ο αριθμός των sRNA που εντοπίζονται σε TEs ήταν δραματικά μειωμένος στη PtDCR-KO σειρά και παρατηρήθηκε μία συνακόλουθη αύξηση του αριθμού των mRNA κάποιων TEs. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι στα PtDCR-KO sRNA μετάγραφα παρατηρούνται επίσης αλλαγές στους tRNA-παραγόμενους sRNA πληθυσμούς υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο της DCR στην επεξεργασία αυτών των μορίων στα διάτομα. Έχει προταθεί ότι η κινητοποίηση των TE παίζει σημαντικό ρόλο στη εξελικτική διαφοροποίηση των διατόμων και στην ικανότητά τους για γρήγορη απόκριση και προσαρμογή σε ποικίλα περιβάλλοντα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής δείχνουν ότι το μοναδικό γονίδιο DCR στο P. tricornutum παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή των TE-παραγόμενων sRNAs και πιθανά στην κινητοποίηση των TEs, επηρεάζοντας σημαντικά την απόκριση προσαρμογής των διατόμων και την εξέλιξή τους.