Αρσενολιπίδια, φωσφολιπίδια, καροτενοειδή και μέταλλα της Penaeus Kerathurus
Authors: Κόρα Λιντίτα 
Published: August 2021

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η γενική χημική σύσταση (λίπος, υγρασία, τέφρα, και πρωτεΐνες), η σύσταση των ολικών, πολικών και ουδετέρων λιπιδίων (χοληστερόλη και τριγλυκερίδια), η σύσταση των λιπαρών οξέων των ολικών, πολικών, καθώς και των επί μέρους τάξεων των κυριοτέρων πολικών λιπιδίων (PC και ΡΕ), στους μύες και κεφαλοθώρακες της γαρίδας Peneaus kerathurus. Η εργασία εστιάσθηκε κυρίως στον προσδιορισμό και τη μελέτη της μοριακής δομής των φωσφολιπιδίων (PC, PE, Sph και LPC) και αρσενολιπιδίων, καθώς και τον προσδιορισμό των καροτενοειδών, τα οποία αποτελούν ενώσεις με σημαντικές βιολογικές δράσεις. Επίσης προσδιορίσθηκαν μέταλλα και μεταλλοειδή όπως Fe, Cu, Zn, Mn, Se, Mg, Ni, Cr, Cd, As, Pb, Hg. Για αυτό το λόγο εφαρμόστηκε συνδυασμένη μεθοδολογία η οποία περιελάμβανε τεχνικές HPLC, LC-ESIMS/MS, NMR, φασματομετρικές κ.α. Για την παραπάνω μελέτη επιλέχθηκαν γαρίδες του είδους Ρ. kerathurus οι οποίες αποτελούν σημαντικό μέρος της μεσογειακής διατροφής και καταναλώνονται σε μεγαλύτερη κλίμακα από τα υπόλοιπα καρκινοειδή (αστακοί, καραβίδες, καβούρια), ενώ αποτελεί και αντικείμενο ιχθυοκαλλιέργειας . Το λίπος, η υγρασία, η τέφρα και οι πρωτεΐνες των μυών της Ρ. kerathurus βρέθηκαν 0.6±0.02% επί του νωπού ιστού, 77.41±0.27%, 1.93±0.34% και 19.20±0.49% αντίστοιχα και των κεφαλοθωράκων 1.43±0.04% επί του νωπού ιστού, 39.00±0.18%, και 12.02±0.15% αντίστοιχα (δεν έγινε προσδιορισμός πρωτεϊνών). Τα πολικά λιπίδια βρέθηκαν ότι αποτελούσαν το 68.02±0.51% των ολικών λιπιδίων των μυών της Ρ. kerathurus ενώ μόνο το 46.5±0.7% των κεφαλοθωράκων. Επίσης βρέθηκε ότι τα πολικά λιπίδια των μυών και των κεφαλοθωράκων αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια (> 94% των πολικών λιπιδίων). Η μελέτη της σύστασης των επιμέρους τάξεων των πολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων έδειξε ότι η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) αποτελεί το κύριο φωσφολιπίδιο (55.6% και 46.4% αντίστοιχα) ενώ ακολουθεί η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ) (29.3% και 25.7% αντίστοιχα). Η σφιγγομυελίνη (Sph), η καρδιολιπίνη (CL), η λυσο-φωσφατιδυλοχολίνη (LPC), η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙ) προσδιορίσθηκαν σε μικρότερα ποσοστά. Στα ουδέτερα λιπίδια των μυών βρέθηκε ότι οι στερόλες αποτελούσαν το κύριο συστατικό (84.9% των ολικών ουδετέρων λιπιδίων) ενώ στα ουδέτερα λιπίδια των κεφαλοθωράκων, το κύριο συστατικό ήταν τα τριγλυκερίδια (67.2% των ολικών ουδετέρων λιπιδίων). Από την μελέτη της σύστασης των λιπαρών οξέων των ολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων βρέθηκε ότι τα κυριότερα κορεσμένα λιπαρά οξέα στους μύες και κεφαλοθώρακες ήταν το C16:0 (παλμιτικό) σε ποσότητες 127.24±2.77 και 343.78±12.71mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα, και το C18:0 (στεατικό) σε ποσότητες 62.99±1.52 και 128.85±8.20 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα, τα κύρια μονοακόρεστα το C16:1 ω-9 cis (παλμιτελαϊκό) σε ποσότητες 54.05±0.33 και 103.29±4.06 mg /100g νωπού ιστού αντίστοιχα και το C18:1 ω-9 cis (ελαϊκό) σε ποσότητες 106.97±2.47 και 188.7±17.83 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα. Στα κύρια πολυακόρεστα λιπαρά οξέα βρέθηκε το C20:5 ω-3 cis (EPA) σε ποσότητες 166.87±2.57 και 214.49±20.36 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα όπως και το C22:6 ω-3 cis (DHA) σε ποσότητες 125.31±1.67 και 208.62±30.27 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα. Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται ότι οι μύες και οι κεφαλοθώρακες ήταν πλουσιότεροι σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και ιδιαιτέρως σε ω-3 (EPA και DELA) έναντι των μονοακόρεστων. Όσο αφορά τον προσδιορισμό των περιεχομένων λιπαρών οξέων στα πολικά λιπίδια και σε επιμέρους τάξεις φωσφολιπιδίων, το ποσοστό των κορεσμένων λιπαρών οξέων των πολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων της P. kerathurus ήταν παρόμοιο, ενώ το ποσοστό των κορεσμένων λιπαρών οξέων των επιμέρους τάξεων των φωσφολιπιδίων PC και ΡΕ των μυών της γαρίδας ήταν μεγαλύτερο από αυτό των κεφαλοθωράκων. Το ποσοστό των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων των πολικών λιπιδίων των μυών καθώς και των επιμέρους τάξεων των φωσφολιπιδίων PC και ΡΕ βρέθηκε μεγαλύτερο συγκριτικά με αυτό στα αντίστοιχα κλάσματα των κεφαλοθωράκων. Η αναλογία ω-3/ω6 βρέθηκε ότι ήταν μεγαλύτερη στα πολικά λιπίδια, στην φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και την φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ) των μυών (2.49±0.005, 1.66±0.02 και 1.76±0.05) συγκριτικά με την ίδια αναλογία στους κεφαλοθώρακες. Ο λόγος EPA/DHA βρέθηκε μεγαλύτερος της μονάδας στην φωσφατιδυλοχολίνη (3.52±0.002) και φωφατιδυλοαιθανολαμίνη (2.74±0.01) τόσο των μυών όσο και των κεφαλοθωράκων. Για την ταυτοποίηση της μοριακής δομής των φωσφολιπιδίων και αρσενολιπιδίων, στα ολικά λιπίδια (χλωροφορμική φάση από Bligh-Dyer) των μυών και κεφαλοθωράκων της μελετούμενης γαρίδας τα πολικά λιπίδια (φωσφολιπίδια) απομονώθηκαν από τα ολικά λιπίδια των μυών και κεφαλοθωράκων (χωριστά) της γαρίδας P. kerathurus με την τεχνική Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE), προσδιορίστηκε η αναλογία πολικών και ουδετέρων, ακολούθησε ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των επιμέρους λιπιδικών τάξεων και στη συνέχεια απομονώθηκαν τα μοριακά είδη φωσφολιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων της γαρίδας με παρασκευαστική TLC, αναλύθηκαν πρώτα: • Ως αμιγή μοριακά είδη με ηλεκτροψεκασμό θετικών ιόντων σε σειρά με φασματομετρία μαζών (ESI-MS/MS) όπου ταυτοποιήθηκαν αλκυλο-ακυλο-, αλκενυλο-ακυλο- και διακυλο-παράγωγα. Ανιχνεύθηκαν ως κύριο πρόδρομο ιόν το θετικό ψευδο-μοριακό ιόν [Μ+ΗΓ] και ως παραγόμενο ιόν του, το βασικό ιόν της κεφαλής-ομάδας (π.χ φωσφοχολίνη σε τιμή m/z 184) καθώς και κορυφές με τιμές m/z που αντιστοιχούν σε ιόντα λιπαρών οξέων [RCOO⁻]. • Ως υδρολυμένα μόρια (μετά από ήπια αλκαλική και μερική όξινη υδρόλυση), με την εφαρμογή της τεχνικής LC-MS/MS με παρακολούθηση επιλεγμένων αντιδράσεων (SRM) για τον προσδιορισμό ενώσεων του αρσενικού όπως: DMA, AC (αρσενοχολίνη), οξο- και θειο-αρσενοσάκχαρα. Επίσης για την ποιοτική ανάλυση καθώς και για τον προσδιορισμό της μοριακής δομής των πολικών λιπιδίων (φωσφολιπιδίων), των κυριότερων ενώσεων τους, φωσφατιδυλοχολίνης (PC) και φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (ΡΕ), καθώς και της σφιγγομυελίνης (SPH) και λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC) εφαρμόσθηκε και φασματοσκοπία NMR. Με την τεχνική αυτή μελετήθηκαν τα φάσματα ¹Η και 3iΡ για την κάθε ένωση χωριστά. Η ταυτοποίηση των κορυφών στα φάσματα πρωτονίου των δειγμάτων (PC και ΡΕ) έγινε σε σύγκριση με τα φάσματα πρωτονίου προτύπων ουσιών της PC, ΡΕ, SPH, LPC, καθώς και τα δισδιάστατα πειράματα gCOSY (ομοπυρηνικό πείραμα συσχέτισης πυρήνων υδρογόνου μέσω δεσμού) και HSQC (ετεροπυρηνικό πείραμα συσχέτισης πυρήνων υδρογόνου με τους πυρήνες των ανθράκων που είναι άμεσα συνδεδεμένοι). Επίσης, με χρήση τεχνικών δισδιάστατης φασματοσκοπίας NMR (COSY, HSQC, HMBC) επιβεβαιώθηκε η παρουσία πλασμαλογόνων (αλκυλο-1-ενυλο ether) στο κλάσμα των πολικών λιπιδίων, ταυτοποιώντας τα χαρακτηριστικά πρωτόνια του διπλού δεσμού (0-CH=CH-). Από τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των καροτενοειδών βρέθηκε ότι η περιεκτικότητα των ολικών καροτενοειδών στους μύες της Ρ. kerathurus (3.33±0.07 mg/g ολικών λιπιδίων) ήταν μικρότερη από την περιεκτικότητά τους στους κεφαλοθώρακες (9.30±0.10 mg/g ολικών λιπιδίων). Όσο αφορά την σύσταση των καροτενοειδών που προσδιορίστηκαν στο λίπος των μυών και των κεφαλοθωράκων της γαρίδας P. kerathurus (Πίνακας 10.1.2) φαίνεται ότι η κανθαξανθίνη είναι το κύριο συστατικό τόσο στους μύες (0.73±0.03 mg/100g νωπού ιστού) όσο και στους κεφαλοθώρακες (4.12±0.07 mg/100g νωπού ιστού). Ακολουθούν η ζεαξανθίνη (0.52±0.03 mg/100 g νωπού ιστού), η ελεύθερη ασταξανθίνη (0.42±0.02 mg/100g νωπού ιστού) και η all-trans-komeivr\(0.32±0.02 mg/100g νωπού ιστού) στους μύες καθώς και η ελεύθερη ασταξανθίνη (2.70±0.05 mg/100g νωπού ιστού), η all-trans-Xovxeivr\(2.65±0.05 mg/g νωπού ιστού) και η ζεαξανθίνη (2.29±0.06 mg/100g νωπού ιστού) στους κεφαλοθώρακες (Σχήμα 10.1.1). Σε μικρότερες ποσότητες προσδιορίσθηκαν μονοεστέρες και διεστέρες της ασταξανθίνης στους μύες και κεφαλοθώρακες, ενώ η κρυπτοξανθίνη ανιχνεύθηκε μόνο στους κεφαλοθώρακες. Τέλος, σε λυοφυλιωμένα δείγματα των μυών και κεφαλοθωράκων της γαρίδας προσδιορίσθηκαν μέταλλα σε μg/g ξηρού ιστού (Fe 33,2±0,2 και 98,33±0,1 μg/g ξηρού ιστού, Cu 13,08±0,02 και 120,68±0,02 μg/g ξηρού ιστού, Zn 110,38±0,09 και 142,15±0,09 μg/g ξηρού ιστού, Μn 0,21±0,1 και 1,18±0,1 μg/g ξηρού ιστού, Mg 1795±3,1 και 3157±3,1 μg/g ξηρού ιστού, Ni 0,03±0,02 και 0,17±0,02, Cd 0,025±0,01 και 0,46±0,01, Pb 1,57±0,1 και 1,65±0,1 μg/g ξηρού ιστού αντίστοιχα, και μεταλλοειδή (Se 0,27±0,4 και 0,068±0,4 μg/g ξηρού ιστού, As 35,05±0,2 και 27,4±0,2 μg/g ξηρού ιστού), με φασματομετρία ατομικής απορρόφησης. Σε κανέναν από τους δυο ιστούς δεν προσδιορίσθηκε Cr. Hg (0,068±3,1μg/g ξηρού ιστού) προσδιορίσθηκε μόνο στους κεφαλοθώρακες. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τις γαρίδες ως τρόφιμο με σύσταση ανερχόμενου ενδιαφέροντος, δεδομένης της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε φωσφολιπίδια, ξανθοφύλλες και πολυακόρεστα ω-3 λιπαρά οξέα, όπως και ως σημαντική πηγή αρσενολιπιδίων και αρσενοσακχάρων, τα οποία αποτελούν ενώσεις με σημαντικές βιολογικές δράσεις.