Characterization of insecticide resistance mechanisms of the olive fly (Bactrocera oleae) and its interactions with symbiotic bacteria of the species Candidatus Erwinia dacicola
Authors: Κοΐδου Βενετία 
Published: July 2022

O δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae (B. oleae) αποτελεί τον πιο σημαντικό εχθρό της ελαιοκαλλιέργειας, προκαλώντας έντονη υποβάθμιση τόσο στην ποιότητα όσο και στην ποσότητα της ελαιοπαραγωγής παγκοσμίως. Ωστόσο, οι διαφορετικές στρατηγικές διαχείρισης του εντόμου έχουν αποδειχθεί δύσκολες και αναποτελεσματικές για διάφορους λόγους, γεγονός το οποίο έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ανάπτυξη εναλλακτικών εργαλείων και προσεγγίσεων. Στόχος αυτής της διατριβής είναι να παράσχει νέες γνώσεις και να χαρακτηρίσει μηχανισμούς οι οποίοι πιθανώς να εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του δάκου στα εντομοκτόνα, έναν από τους βασικότερους περιοριστικούς παράγοντες όσον αφορά την αποτελεσματική διαχείριση των εντόμων, καθώς και στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δάκου και των συμβιωτικών βακτηρίων του είδους Candidatus Erwinia dacicola (Ca. E. dacicola), αποβλέποντας στην ανάπτυξη μιας νέας γενιά καινοτόμων στρατηγικών ελέγχου του εντόμου, οι οποίες θα στοχεύουν στη διατάραξη της συμβιωτικής του σχέσης με τα βακτήρια (dysbiosis).Η παρούσα μελέτη χωρίζεται σε 3 ενότητες. Στην πρώτη ενότητα, ο στόχος ήταν να αναπτυχθεί και να εφαρμοστεί ένα ακριβές εργαλείο τροποποίησης του γονιδιώματος στο δάκο, και συγκεκριμένα μια προσέγγιση βασισμένη στην τεχνολογία CRISPR/Cas9. Επιλέξαμε να στοχεύσουμε το γονίδιο scarlet, το οποίο προσφέρει έναν εύκολα ανιχνεύσιμο φαινότυπο στο χρώμα των ματιών του εντόμου, προκειμένου να αποδείξουμε ότι αυτή η τεχνολογία είναι εφαρμόσιμη σε αυτόν τον οργανισμό. Δύο sgRNA μόρια-οδηγοί μαζί με την ενδονουκλεάση Cas9 ενέθηκαν σε έμβρυα δάκου αρχικού σταδίου. Οι γονιδιακές τροποποιήσεις στο γονίδιο scarlet, οι οποίες δημιούργησαν έναν εντυπωσιακό φαινότυπο κίτρινων ματιών, επιβεβαιώθηκαν με PCR και αλληλούχηση. Η δημιουργία ενός αποτελεσματικού εργαλείου τροποποίησης γονιδίων, με χρήση της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 για το δάκο της ελιάς, θα διευκολύνει τη μελέτη κρίσιμων μοριακών μονοπατιών στη βιολογία και τη φυσιολογία του εντόμου. Η διαθεσιμότητα ενός τέτοιου μοριακού εργαλείου θα επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση των ρόλων διαφόρων γονιδίων και μηχανισμών (ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, αλληλεπιδράσεις με συμβιωτικά βακτήρια κ.α.), με σκοπό τη μελλοντική ανάπτυξη και εφαρμογή νέων στρατηγικών διαχείρισης του δάκου.Στη δεύτερη ενότητα αυτής της μελέτης, διερευνήσαμε μηχανισμούς που πιθανώς εμπλέκονται στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας του δάκου σε διαφορετικά εντομοκτόνα. Η διαχείριση του δάκου της ελιάς στην Ελλάδα έχει βασιστεί κυρίως στη χρήση χημικών (μικρομοριακών) εντομοκτόνων. Η μακροχρόνια υπερβολική χρήση οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων (OP) έχει δημιουργήσει σοβαρά προβλήματα ανάπτυξης ανθεκτικότητας σε αυτές τις χημικές ενώσεις. Τα OP στοχεύουν το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση (AChE) του εντόμου και καταστέλλουν τη λειτουργία του, η οποία είναι η υδρόλυση του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh), με αποτέλεσμα να προκαλείται νευροτοξικότητα και επακόλουθος θάνατος του εντόμου. Στο πρώτο μέρος της δεύτερης ενότητας, επιχειρήσαμε το λειτουργικό χαρακτηρισμό μιας μεταλλαγής στόχου στην AChE του δάκου (απαλοιφή τριών γλουταμινών, Δ3Q), η οποία έχει συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα του δάκου στα OP από το 2008, μέσα από πειράματα πεδίου και in vitro δοκιμές. Έχει προταθεί ότι η απαλοιφή αυτών των τριών αμινοξέων στο τελευταίο εξόνιο του γονιδίου, παρέχει καλύτερη αγκυροβόληση της πρόδρομης μορφής του ενζύμου στην κυτταρική μεμβράνη.Το αποτέλεσμα είναι να αυξάνονται τα διαθέσιμα μόρια που υδρολύουν την ACh και αλληλεπιδρούν με το εντομοκτόνο. Με αυτόν τον τρόπο, ο δάκος επιβιώνει σε υψηλότερες δόσεις του εντομοκτόνου, αναπτύσσοντας ανθεκτικότητα σε αυτές τις ενώσεις. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση δεν έχει υποστηριχθεί ακόμη με in vivo δεδομένα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση in vivo, και πιο συγκεκριμένα με την εισαγωγή της μετάλλαξης Δ3Q, με το εργαλείο γονιδιακής τροποποίησης CRISPR/Cas9 το οποίο αναπτύχθηκε στην προηγούμενη ενότητα, σε ένα ευαίσθητο γενετικό υπόβαθρο ενός εργαστηριακού στελέχους δάκου, με στόχο την μελέτη του φαινοτύπου κατά την εφαρμογή OP εντομοκτόνου.Εφαρμόστηκε λοιπόν μια στρατηγική κατά την οποία η καθαρισμένη και εμπορικά διαθέσιμη πρωτεΐνη Cas9 μαζί με sgRNA μόρια οδηγούς και ένα συνθετικό DNA δότη ssODN ενέθηκαν σε έμβρυα δάκου, σύμφωνα με τη μεθοδολογία η οποία αναπτύχθηκε στην προηγούμενη ενότητα, με σκοπό την ενσωμάτωση της μεταλλαγής Δ3Q, με ομόλογο ανασυνδυασμό (μηχανισμός HDR). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και in vitro, πέντε από τα συνολικά επτά sgRNAs κατευθύνουν την Cas9 στις επιθυμητές θέσεις κοπής, προκειμένου να κατατμηθεί το DNA και δυνητικά να ενσωματωθεί το πρότυπο κομμάτι DNA (το οποίο περιλαμβάνει τη μεταλλαγή Δ3Q στο τέλος της AChE), το αντίστοιχο αποτέλεσμα δεν επιτεύχθηκε in vivo. 2,174 έμβρυα δάκου ενέθηκαν και αλληλουχήθηκαν σε ομάδες. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν κάποια κατάτμηση του DNA, υποδηλώνοντας την πιθανώς ανεπαρκή πρόσληψη του συμπλόκου Cas9/RNP από τα πολικά ή τα ωοθυλακικά κύτταρα του εμβρύου, γεγονός που υποδεικνύει τη χαμηλή απόδοση αυτής της μεθοδολογίας μικρο-ενέσεων σε αυτό το έντομο. Συμπερασματικά, η knock-in μέθοδος με χρήση του εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης CRISPR/Cas9 χρήζει περαιτέρω βελτίωσης, προκειμένου να εισάγονται επιτυχώς μεταλλάξεις για το λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων και μηχανισμών.Στο δεύτερο μέρος της δεύτερης ενότητας της διατριβής, ψάξαμε για υποψήφια γονίδια στο δάκο, τα οποία συμμετέχουν σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε πυρεθροειδή εντομοκτόνα, μέσω RNA αλληλούχησης, ειδικά στα μαλπιγγιανα σωληνάρια (malpighian tubules, MTs) του εντόμου. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ταυτοποιηθούν γονίδια τα οποία έχουν ιστο-ειδική έκφραση και ως εκ τούτου δεν θα ήταν εύκολο να ανιχνευτούν σε δεδομένα RNA αλληλούχησης ολόκληρου του οργανισμού. Η μελέτη αυτή επιτεύχθηκε μέσω σύγκρισης της γονιδιακής έκφρασης στα MTs, έναν από τους προτεινόμενους ιστούς αποτοξικοποίησης στα έντομα, σε έναν ανθεκτικό και έναν ευαίσθητο σε πυρεθροειδή πληθυσμό. Η αλληλούχηση του RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina, σε τρεις βιολογικές επαναλήψεις για κάθε έναν από τους δύο πληθυσμούς. Στη συνέχεια, οι αλληλουχίες RNA στοιχήθηκαν με τη διαθέσιμη αλληλουχία αναφοράς του γονιδιώματος του δάκου της ελιάς, υπολογίστηκαν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και ταυτοποιήθηκαν γονίδια τα οποία σημείωσαν υπερ-έκφραση ή υπο- έκφραση, τόσο στον ανθεκτικό όσο και στον ευαίσθητο πληθυσμό. Όπως ήταν αναμενόμενο, εντοπίστηκαν πολλά γονίδια τα οποία είναι ευρέως γνωστό ότι εμπλέκονται σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, όπως οι P450 μονοοξυγενάσες (cytochrome P450s), οι S- τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) και οι UDP-γλυκουρονοσυλο-τρανσφεράσες (UGTs). Επιπλέον, εντοπίστηκαν πολλά άλλα γονίδια, των οποίων ο πιθανός ρόλος τους σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα μένει να αποσαφηνιστεί μέσω περαιτέρω έρευνας.Η υπερ-έκφραση δύο γονιδίων μονοοξυγενασών P450 (CYP4P6 και CYP6G28) η οποία επισημάνθηκε στα δεδομένα RNA, επικυρώθηκε ποσοτικά με ανάλυση RT-qPCR και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός ενός από αυτά, μέσω γονιδιακής σίγασης (με τη χρήση της τεχνολογίας παρεμβολής RNA, RNAi), απέδωσε έναν πολλά υποσχόμενο φαινότυπο, μετά από εφαρμογή βιοδοκιμής τοξικότητας με alpha-cypermethrin (πυρεθροειδές εντομοκτόνο). Συγκεκριμένα, η μειωμένη κατά 30% έκφραση του γονιδίου CYP4P6 (σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου στα δείγματα μάρτυρες) επέφερε αύξηση στα επίπεδα θνησιμότητας (21%) στα ενεμένα άτομα, κατά την εφαρμογή του εντομοκτόνου, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (4% θνησιμότητα). Ο συγκεκριμένος φαινότυπος συνηγορεί υπέρ μιας πιθανής συμμετοχής της CYP4P6 στο μηχανισμό ανθεκτικότητας του δάκου στα πυρεθροειδή. Ωστόσο, η περιορισμένη διαθεσιμότητα δάκων δεν επέτρεψε την εξαγωγή ενός στατιστικά σημαντικού συμπεράσματος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής.Συμπερασματικά, αρκετά γονίδια αποτοξικοποίησης καταγράφηκαν ως υπερ-εκφραζόμενα βάσει των δεδομένων RNAseq, μετά την αλληλούχηση των MTs από ανθεκτικά και ευαίσθητα σε alpha- cypermethrin άτομα δάκου, παρέχοντας νέες πληροφορίες σχετικά με την αποτοξικοποίση των εντομοκτόνων σε αυτό το είδος. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες λειτουργικού χαρακτηρισμού των γονιδίων κρίνονται απαραίτητες. Μετά τα ενθαρρυντικά πρώτα αποτελέσματα που αναφέρονται στην παρούσα διερεύνηση (σχετικά με τον πιθανό ρόλο του γονιδίου CYP4P6), τα οποία ωστόσο χρήζουν περαιτέρω επιβεβαίωσης, οι ενδιαφέρουσες περιπτώσεις γονιδίων μπορούν να διερευνηθούν με in vitro πειράματα μεταβολισμού εντομοκτόνων, προκειμένου να διαλευκανθεί η πιθανή συμμετοχή τους στους μηχανισμούς αποτοξικοποίσης των εντομοκτόνων στο δάκο. Η απόκτηση αυτής της γνώσης μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών για την καταπολέμηση αυτού του επιβλαβούς εντόμου και την προστασία των ελαιόδεντρων, η καλλιέργεια των οποίων έχει μεγάλη οικονομική σημασία.Στην τρίτη ενότητα αυτής της διατριβής, προσεγγίστηκε η μοναδική ικανότητα του δάκου της ελιάς να χρησιμοποιεί άγουρες ελιές για την ανάπτυξή του, η οποία έχει συσχετιστεί με αλληλεπιδράσεις με συμβιωτικά βακτήρια. Στόχος αποτέλεσε να αναδειχθούν και να διερευνηθούν κρίσιμες πτυχές της μοναδικής αυτής συμβιωτικής σχέσης, μεταξύ του ξενιστή και του κυρίαρχου συμβιωτικού βακτηρίου Ca. E. dacicola, μέσω πειραμάτων μικροσκοπίας και ιστοειδικής μεταγραφικής ανάλυσης. Αρχικά, επιχειρήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός του Ca. E. dacicola, κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής του δάκου, από το στάδιο της προνύμφης μέχρι το ενήλικο στάδιο, συγκρίνοντας μύγες που αναπτύσσονται σε άγουρες αλλά και σε ώριμες ελιές. Η μελέτη αυτή έγινε με χρήση ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR) και έδειξε έντονη διακύμανση μεταξύ των διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων. Επιπλέον, μέσω τεχνικών συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης (confocal scanning imaging analysis), απεικονίστηκε το τμήμα του μεσεντέρου του δάκου, οι επονομαζόμενες τυφλές γαστρικές απολήξεις (gastric caeca), το οποίο φιλοξενεί τα συμβιωτικά βακτήρια κατά τα προνυμφικά στάδια του εντόμου και το οποίο διαπιστώσαμε ότι υπόκειται σε μορφολογικό μετασχηματισμό, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο της προνύμφης. Στη συνέχεια, αναλύθηκαν τα αποτελέσματα δύο συγκρίσεων, προκειμένου να μελετηθούν γονίδια τα οποία σχετίζονται αφενός με τον μετασχηματισμό και την ανάπτυξη του γαστρικού τυφλού και αφετέρου με τη ρύθμιση της συμβιωτικής σχέσης του δάκου με το Ca. E. dacicola. Πραγματοποιήθηκε λεπτομερής ανάλυση των δεδομένων, εστιάζοντας σε ορισμένες ομάδες γονιδίων που δυνητικά συμμετέχουν σε μηχανισμούς αυτής της συμβίωσης, καθώς και στον αναπτυξιακά ρυθμιζόμενο μετασχηματισμό του γαστρικού τυφλού.Οι νέες πτυχές οι οποίες παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη, σχετικά με τις αναπτυξιακές μεταβολές του δάκου της ελιάς και την αλληλεπίδρασή του με τον μητρικά κληρονομούμενο και απαραίτητο συμβιώτη, Ca. E. dacicola, μπορούν να αξιοποιηθούν στη μελλοντική ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών διαχείρισης του εντόμου, οι οποίες θα στοχεύουν αυτήν την ιδιόμορφη συμβιωτική σχέση. Πιο ειδικά, η κατανόηση αυτής της συμβίωσης θα αποτελέσει τη βάση για την εγκαθίδρυση νέων προσεγγίσεων διαχείρισης του δάκου, μέσω του Ca. E. dacicola ή άλλων συμβιωτικών βακτηρίων, με χρήση μοριακών και κλασικών εργαλείων σε έξυπνες εφαρμογές.Συνολικά, τα δεδομένα που παρέχονται στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, δηλαδή η ανάπτυξη ενός ακριβούς εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης για εφαρμογή στο δάκο (βασιζόμενο στο σύστημα CRISPR/Cas9) καθώς και τα δεδομένα αλληλούχησης RNA, τα οποία αναφέρονται στην ανάπτυξη ανθεκτικότητάς του σε εντομοκτόνα αλλά και στη συμβιωτικές του αλληλεπιδράσεις, παρέχουν πλέον τη δυνατότητα να μελετηθεί η μοριακή βάση διαφόρων μηχανισμών (ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, συμβιωτικές σχέσεις με μικροοργανισμούς) με συστηματικό τρόπο. Η γνώση αυτή θα συμβάλλει στην ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών καταπολέμησης του δάκου, οι οποίες θα διαφοροποιούνται από τις παραδοσιακές προσεγγίσεις και θα παρέχουν μια αποτελεσματική διαχείριση αυτού του καταστροφικού για την ελαιοπαραγωγή εντόμου.