Παρασκευή, μελέτη σταθερότητας και αποτελεσματικότητας (in vitro και in vivo) νανολιποσωμάτων για χορήγηση φαρμάκων στον εγκέφαλο
Authors: Παπαδιά Κωνσταντίνα 
Published: September 2021

Η ανάπτυξη φαρμάκων για το ΚΝΣ παρεμποδίζεται σοβαρά από την έλλειψη αποτελεσματικών μεθόδων για την διαπέραση φαρμάκων, διαμέσου του ΑΕΦ και εντός του εγκεφάλου. Για το λόγο αυτό η έρευνα στρέφεται στη χρήση νανοσωματιδίων για τη διαπέραση του ΑΕΦ. Η χρήση των στοχευμένων νανοφορέων έχει πρόσφατα αναβαθμιστεί και γίνεται προσπάθεια να επιλυθούν τα θέματα διαμόρφωσης αλλά και μεταφοράς κατά μήκος του ΑΕΦ ώστε να αναπτυχθούν εμπορικώς διαθέσιμα προϊόντα. Διάφοροι τύποι νανοσωματιδίων είναι υπό μελέτη για τη μεταφορά φαρμάκων διαμέσου του ΑΕΦ, ενώ οι μελέτες ανάπτυξης τέτοιων νανοσωματιδίων υποβοηθούνται με την ανάπτυξη κυτταρικών μοντέλων του ΑΕΦ. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά hCMEC/D3 ως in vitro μοντέλο του ΑΕΦ, για να διερευνηθεί η επίδραση του μεγέθους και του επιφανειακού φορτίου των νανολιποσωμάτων στην αλληλεπίδρασή τους με αυτά τα κύτταρα και να αποκλεισθεί η πιθανότητα εσφαλμένης ερμηνείας της ικανότητας στόχευσης διακοσμημένων λιποσωμάτων με μεγαλύτερο μέγεθος κατά τις in vitro δοκιμές. Αξιολογήθηκαν λιποσώματα με διαφορετικές μέσες διαμέτρους, θεωρητικά μεταξύ 50 και 400 nm και με διαφορετικό αρνητικό ζ-δυναμικό, ως προς την πρόσληψή τους από τα κύτταρα hCMEC/D3, καθώς και ως προς τη διαπερατότητα τους διαμέσου μονοστοιβάδων των hCMEC/D3 κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μέγεθος των λιποσωμάτων έχει σημαντική επίδραση τόσο στην πρόσληψή τους από τα κύτταρα, όσο και στη διαπερατότητα τους κατά μήκος των κυτταρικών μονοστοιβάδων. Αυτό έχει επαληθευτεί για τα μη φορτισμένα λιποσώματα που αποτελούνται από DSPC καθώς και για τα λιποσώματα με αρνητικό φορτίο επιφάνειας (στα οποία έχει γίνει αντικατάσταση του 10mol% [από τα συνολικά mol λιπιδίου] με DSPG). Από την άλλη πλευρά, η επίδραση του επιφανειακού φορτίου των λιποσωμάτων στην αλληλεπίδρασή τους με τα κύτταρα hCMEC/D3 είναι λιγότερο έντονη (στην περιοχή των διαφορετικών τιμών επιφανειακού φορτίου που αξιολογήθηκε που ήταν από -2 έως -16mV). Η αντικατάσταση ενός μέρους του DSPC με DSPG, σε ένα τόσο χαμηλό ποσό όσο το 5mol% (των συνολικών λιπιδίων), προκαλεί μία σημαντική αύξηση στην πρόσληψη λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Ωστόσο καμιά περαιτέρω αύξηση της πρόσληψης των λιποσωμάτων δεν παρατηρήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν ακόμα υψηλότερες συγκεντρώσεις του DSPG (μέχρι 15mol%). Επιπλέον, η αύξηση του αρνητικού φορτίου της επιφάνειας των λιποσωμάτων δεν επηρεάζει σημαντικά την μεταφορά τους διαμέσου της μονοστοιβάδας στην περιοχή μεταξύ -2 και -12.9mV, αλλά παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση στην διαπερατότητα κατά μήκος των κυτταρικών μονοστοιβάδων για τα λιποσώματα με τη μεγαλύτερη τιμή αρνητικού ζ-δυναμικό (-16mV) μεταξύ εκείνων που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον, υπολογίστηκε η διαπερατότητα των διαφόρων λιποσωμικών τύπων κατά μήκος της κυτταρικής μονοστοιβάδας, με την οποία επιβεβαιώθηκαν οι επιπτώσεις του μεγέθους και του φορτίου των λιποσωμάτων στο ρυθμό μεταφοράς τους από τη μονοστοιβάδα.Στη συνέχεια, με σκοπό την ανάπτυξη στοχευμένων λιποσωμάτων για την απελευθέρωση παραγόντων απεικόνισης ή/και θεραπευτικών παραγόντων κατά της νόσου Alzheimer και άλλων σχετικών παθολογιών του ΚΝΣ, παρασκευάστηκαν λιποσώματα στόχευσης και λιποσώματα διπλής στόχευσης χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (OX-26) για τον υποδοχέα τρανσφερίνης (γνωστό για τη στόχευση του υποδοχέα τρανσφερίνης) και ένα παράγωγο πεπτιδίου της απολιποπρωτεΐνης Ε3 (ΑροΕ) που στοχεύει στον υποδοχέα που σχετίζεται με τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LPR), για πρώτη φορά μαζί στο ίδιο λιπόσωμα. Προκειμένου να διερευνηθεί αν τα λιποσώματα διπλής στόχευσης έχουν αυξημένη ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λιποσώματα στόχευσης, διεξήχθησαν in vitro και in vivo μελέτες, στις οποίες συγκρίθηκε η ικανότητα στόχευσης των διαφόρων τύπων λιποσωμάτων με μη-στοχευμένα PEG λιποσώματα. Μετά την εφαρμογή διαφορετικών μεθοδολογιών προσκόλλησης των προσδετών, προκειμένου να επιτευχθεί η βέλτιστη απόδοση ακινητοποίησης του προσδέτη και λιπιδικής ανάκτησης, αξιολογήθηκαν τα στοχευμένα λιποσώματα για την ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ στα hCMEC/D3 κύτταρα και στη συνέχεια in vivo, προκειμένου να διερευνηθεί αν το in vitro μοντέλο του ΑΕΦ μπορεί να προβλέψει την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Μετά την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών των λιποσωμάτων (κατανομή μεγέθους, κ.λπ.) και εφόσον κρίθηκαν ικανά για in vivo χορήγηση, τα λιποσώματα διπλής στόχευσης υποβλήθηκαν σε in vitro δοκιμές ώστε να διερευνηθούν: (i) Η πιθανή κυτταροτοξικότητά τους και (ii) Η πρόσληψη τους από τα κύτταρα του εγκεφάλου και η ικανότητά μεταφοράς τους διαμέσου του in vitro μοντέλου του ΑΕΦ. Σε όλες τις in vitro μελέτες, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική βελτίωση της ικανότητας στόχευσης του εγκεφάλου με τα λιποσώματα διπλής στόχευσης, (υψηλότερη πρόσληψη από τα κύτταρα και υψηλότερη διαπερατότητα διαμέσου των μονοστοιβάδων των hCMEC/D3) συγκριτικά με τα λιποσώματα χωρίς προσδέτες (απλά PEG-λιποσώματα) ή με τα λιποσώματα που έχουν μόνον έναν προσδέτη, που έδειξαν ικανοποιητικά αποτελέσματα (υψηλότερη πρόσληψη και διαπέραση) σε σχέση με τα PEG-λιποσώματα. Επιπλέον, καμία λιποσωμική μορφή δεν προκάλεσε κυτταροτοξικότητα. Δύο in vivo μελέτες απεικόνισης ζώντων μυών, (με χρήση της χρωστικής DiR για παρακολούθηση των μορφών) επιβεβαίωσε την ικανότητα στόχευσης του εγκέφαλου που έχουν τα λιποσώματα διπλής στόχευσης. Ωστόσο, στην πορεία διενεργήθηκαν επιπρόσθετες in vitro μελέτες αλληλεπιδράσεων αυτών των λιποσωμάτων με τα κύτταρα παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων πρωτεϊνών ορού, για να διερευνηθεί εάν πιθανώς μπορεί να υπάρχει καλύτερη συσχέτιση των in vitro τιμών με τα in vivo αποτελέσματα, σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες.Οι ίδιες in vitro και in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν και για λιποσώματα που αποτελούνται από διαφορετικές λιπιδικές συστάσεις με μείγματα σφιγγομυελίνης με PA και είναι διακοσμημένα με το πεπτίδιο ApoE σε διαφορετικές πυκνότητες του προσδέτη στην επιφάνεια των λιποσωμάτων (εφόσον κρίθηκαν ικανά για in vivo χορήγηση) καθώς έχει αποδειχθεί στο παρελθόν η ικανότητά τους να δεσμεύονται με υψηλή συγγένεια στα πεπτίδια Αβ1-42. Η κυτταρική πρόσληψη των νανολιποσωμάτων σφιγγομυελίνης με 2.5mol% ApoE ήταν αυξημένη σε σύγκριση με εκείνα με 0.05mol% παρουσία πρωτεϊνών ορού σε ποσοστό 5%, ωστόσο με την αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών ορού στο τροποποιημένο κυτταρικό μοντέλο, η κυτταρική πρόσληψη αυτών μειώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις (παρουσία PA ή/και PEG), κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε στα λιποσώματα σφιγγομυελίνης με ποσοστό ApoE 0.05mol%, ακόμα και παρουσία 50% πρωτεϊνών ορου. Στην in vivo μελέτη στόχευσης του ΑΕΦ, μελετήθηκαν μόνο τα λιποσώματα σφιγγομυελίνης με 0.05mol% πυκνότητα του πεπτιδίου και χωρίς την παρουσία του PA, εφόσον είχαν καλύτερη συμπεριφορά στις in vitro δοκιμές, έχοντας ως δείγματα ελέγχου τα ApoE-λιποσώματα που αποτελούνται από λιπίδιο DSPC. Δεν παρουσιάστηκε αυξημένη ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ, κάτι που όμως πιθανώς να εξαρτάται από την πυκνότητα προσδετών στην επιφάνεια αλλά και από τη λιπιδική δόση που χορηγήθηκε ενδοφλεβίως.Τέλος, αναπτύχθηκαν πολυλειτουργικά λιποσώματα τα οποία εκτός των δύο προσδετών για στόχευση του ΑΕΦ είναι επίσης διακοσμημένα με λιπιδικό παράγωγο κουρκουμίνης το οποίο αναφέρεται ως Treg (το παράγωγο αυτό έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζει πολύ υψηλή συγγένεια για τα πεπτίδια Αβ, όταν είναι ακινητοποιημένο σε λιποσωμικές επιφάνειες), ως πιθανό σύστημα διάγνωσης/θεραπείας για τη νόσο Alzheimer. Βελτιστοποιήθηκε η ακινητοποίηση των προσδετών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, με την αξιολόγηση διαφορετικών μεθοδολογιών και επιλέχθηκε η τεχνική που έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς το μέγεθος των λιποσωμάτων, την απόδοση ακινητοποίησης των προσδετών και την απόδοση παραγωγής (ανάκτηση λιπιδίων). Αφού πρώτα αποδείχθηκε ότι τα πολυλειτουργικά λιποσώματα έχουν επαρκή σταθερότητα και ακεραιότητα και δεν παρουσίασαν καμία τοξικότητα, στη συνέχεια ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ (σε σύγκριση με τα λιποσώματα διπλής στόχευσης). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα πολυλειτουργικά λιποσώματα φαίνεται να έχουν παρόμοια ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ με εκείνη των λιποσωμάτων διπλής στόχευσης. Οι in vivo μελέτες επιβεβαίωσαν την παρόμοια συμπεριφορά των πολυλειτουργικών λιποσωμάτων και των λιποσωμάτων διπλής στόχευσης σε σχέση με την ικανότητά τους να φτάνουν στον εγκέφαλο, σε καλή συσχέτιση με τις in vitro μελέτες στο κυτταρικό μοντέλο του ΑΕΦ. Τα πολυλειτουργικά λιποσώματα με απλή πυκνότητα προσδετών του ΑΕΦ στην επιφάνειά τους έχουν ελαφρώς υψηλότερα κλάσματα σημάτων DiR στον εγκέφαλο/σώμα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα διπλής πυκνότητας. Με την αύξηση της πυκνότητας των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ στα πολυλειτουργικά λιποσώματα, η ικανότητά τους να στοχεύουν τον ΑΕΦ και να παραμείνουν στον εγκέφαλο μειώνεται, γεγονός το οποίο πιθανώς να οφείλεται στη μερική αλληλεπίδραση μεταξύ του Treg και των αμυλοειδών του εγκεφάλου, ή στην αλληλεπίδραση μεταξύ των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ και των μορίων του Treg (που προκαλεί μείωση της ικανότητας των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ να αλληλεπιδρούν με τους κυτταρικούς υποδοχείς στα κύτταρα του ΑΕΦ).