Μελέτη του επιπέδου μεθυλίωσης και γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος
Authors: Αργυράκη Μαρία 
Published: September 2021

Το γονιδιακό εντύπωμα παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπου και είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του πλακούντα και τη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα γονίδια που υπόκεινται σε γονιδιακή εντύπωση εκφράζονται μονο-αλληλικά, αναλόγως του γονέα από τον οποίο κληρονομούνται και επηρεάζουν την εμβρυϊκή ανάπτυξη μέσω επιδράσεων στη λειτουργία του πλακούντα και του μεταβολισμού των θρεπτικών συστατικών. Η λανθασμένη μεθυλίωση των εντυπωμένων γονιδίων έχει επανειλημμένως προταθεί ως ο βασικός μοριακός μηχανισμός που συνδέει τις αρνητικές επιδράσεις περιβαλλοντικών παραγόντων με την εμφάνιση προβλημάτων υγείας στη διάρκεια της ζωής. Τα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών έχουν αποσαφηνίσει το ρόλο πολλών εντυπωμένων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των IGF2, MEST και PEG10, στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και τονίζουν τη σημασία του γονιδιακού εντυπώματος στη σωστή λειτουργία και ανάπτυξη του οργανισμού. Τα IGF2, MEST and PEG10 εντυπωμένα γονίδια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου και στον καθορισμό του βάρους γέννησης. Λανθασμένη έκφραση και μεθυλίωση αυτών των γονιδίων σχετίζεται με ανωμαλίες στην ανάπτυξη, πρόωρο τοκετό, χαμηλό βάρος γέννησης, εμφάνιση μεταβολικών συνδρόμων και νοητική υστέρηση. Η επίδραση πολλών περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως είναι το στρες κατά τον τοκετό και η σύλληψη μέσω εφαρμογής τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART), μπορούν να επηρεάσουν το επιγενετικό πρότυπο των ανωτέρω γονιδίων και να οδηγήσουν σε αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης/έκφρασης με αποτέλεσμα την εμφάνιση ασθενειών. Κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού τοκετού το έμβρυο εκτίθεται σε παράγοντες που εκλείπουν κατά την καισαρική τομή, όπως είναι το υψηλό κύμα ορμονών του στρες, το οποίο πυροδοτεί την παραγωγή κυτοκινών και άλλων ορμονών, προετοιμάζοντας το νεογνό για τη ζωή έξω από τη μήτρα. Σε κυτταρικό επίπεδο, η ισομορφή Oct4B1 του Oct4 μεταγραφικού παράγοντα φαίνεται να αποτελεί δείκτη απόκρισης του κυττάρου στο στρες, παρουσιάζοντας αυξημένα επίπεδα έκφρασης κάτω από στρεσσογόνες συνθήκες. Οι χειρισμοί και οι διαδικασίες κατά την εξωσωματική γονιμοποίηση, συμπεριλαμβανομένων του χειρισμού των γαμετών, της ωοθηκικής διέγερσης και της in vitro καλλιέργειας, αποτελούν τεχνητές παρεμβάσεις, που συμπίπτουν χρονικά με κρίσιμα στάδια επιγενετικής ρύθμισης και εκθέτουν το αναπτυσσόμενο επιγονιδίωμα σε στρεσσογόνους περιβαλλοντικούς παράγοντες που μπορεί να οδηγήσουν σε λανθασμένη δημιουργία και διατήρηση του γενωμικού εντυπώματος. Δεδομένου ότι οι επιγενετικές διεργασίες είναι ευαίσθητες στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων, η αύξηση της συχνότητας των καισαρικών τομών και της εφαρμογής τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής έχει δημιουργήσει πολλές ανησυχίες για τις μελλοντικές συνέπειές τους στην υγεία των ατόμων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της Oct4B1 ισομορφής και του μεταθετού στοιχείου HERV-W1, καθώς και των επιπέδων έκφρασης και μεθυλίωσης των IGF2, MEST και PEG10 εντυπωμένων γονιδίων σε δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος (UCB) νεογνών που γεννήθηκαν ύστερα από διαφορετικό τρόπο σύλληψης και τοκετού. Η μελέτη περιελάμβανε 4 διαφορετικές ομάδες μελέτης με 10 UCB δείγματα ανά ομάδα. Οι ομάδες μελέτης αποτελούνταν από νεογνά φυσιολογικού τοκετού (control group), καισαρικής τομής κεφαλικής προβολής και καισαρικής τομής ισχιακής προβολής. Η τέταρτη ομάδα αποτελούνταν από νεογνά που γεννήθηκαν ύστερα από την εφαρμογή ART μεθόδων. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά που προσπαθεί να συσχετίσει την έκφραση και μεθυλίωση των ανωτέρω γονιδίων με την προβολή το εμβρύου κατά την καισαρική τομή, καθώς και την πρώτη μελέτη που προσπαθεί να αξιολογήσει την έκφραση της Oct4B1 σε UCB δείγματα.Τα αποτελέσματα της διατριβής υποδεικνύουν ότι ο διαφορετικός τρόπος σύλληψης και τοκετού δεν προκαλεί στατιστικώς σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των Oct4B1 (p=0,58), IGF2 (p=0,96), MEST (p=0,75) και PEG10 (p=0,37) γονιδίων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Υπήρξε μια τάση για αυξημένη έκφραση του PEG10 γονιδίου στην ομάδα καισαρικής τομής με κεφαλική προβολή του εμβρύου, αλλά το αποτέλεσμα αυτό πρέπει να αξιολογηθεί σε μελέτες με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος. Τα αρνητικά αυτά αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στο μικρό μέγεθος δείγματος, αλλά και στα αυστηρά κριτήρια επιλογής που εφαρμόστηκαν ώστε τα αποτελέσματα να είναι πιο αξιόπιστα. Για το γονίδιο HERV-W1 δεν παρατηρήθηκε έκφραση στα δείγματα της μελέτης μας. Η ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA ανέδειξε την παρουσία τόσο των μη μεθυλιωμένων όσο και των μεθυλιωμένων αλληλομόρφων των IGF2, MEST και PEG10 εντυπωμένων γονιδίων, χωρίς να παρουσιάζονται διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ομάδων μελέτης. Η ανάλυση της μεθυλίωσης της Oct4B1 δεν ήταν δυνατή, καθώς η συγκεκριμένη ισομορφή μεταγράφεται από διαφορετικούς υποκινητές, οι οποίοι είναι άγνωστοι μέχρι στιγμής. Τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης όλων των γονιδίων βρίσκονται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα αποτελέσματα έκφρασης. Τα ανωτέρω αποτελέσματα είναι τα πρώτα που αναφέρονται σε περιστατικά καισαρικής τομής κεφαλικής και ισχιακής προβολής και αφορούν τα συγκεκριμένα γονίδια. Όσον αφορά την ομάδα των νεογνών που γεννήθηκαν ύστερα από την εφαρμογή τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενες βιβλιογραφικές αναφορές. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και μελέτες που αναφέρουν αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης DNA και έκφρασης αυτών των γονιδίων ύστερα από εφαρμογή ART τεχνικών. Κρίνεται απαραίτητο να κατανοήσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς δράσης των ART τεχνικών, προκειμένου να αυξηθεί η ασφάλεια αυτών των τεχνικών και να προληφθούν πιθανές επιπτώσεις στην υγεία. Γι αυτόν το λόγο, πρέπει να αποσαφηνιστούν τα αντικρουόμενα αποτελέσματα που υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία μέσω μεγαλύτερων και καλύτερα οριοθετημένων μελετών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο να τονίσει τη σημασία της αξιολόγησης των περιβαλλοντικών επιδράσεων στο επιγονιδίωμα. Θα μπορούσε να αποτελέσει ένα πρώτο βήμα για περισσότερο διεξοδικές αναλύσεις όσον αφορά το ρόλο των εντυπωμένων γονιδίων και της Oct4B1 ισομορφής στη ρύθμιση της ανθρώπινης αναπαραγωγής.