Η κυτταρική διαφοροποίηση και η γονιδιακή μεθυλίωση στις αιματολογικές κακοήθειες
Authors: Μπενετάτος Λεωνίδας 
Published: January 2014

Εισαγωγή: Η κυτταρική διαφοροποίηση αποτελεί ένα φυσικό φαινόμενο το οποίο παρατηρείται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Όταν ένα κύτταρο αποκτήσει ταυτότητα μέσω της διαφοροποίησης είναι απίθανο να αλλάξει η «μοίρα» του έστω και αν το κύτταρο αυτό τοποθετηθεί σε διαφορετικό κυτταρικό περιβάλλον. Η διαδικασία της κυτταρικής διαφοροποίησης απαιτεί μη μεταβολές στη αλληλουχία του DNA και φαίνεται ότι υπόκειται σε επιγενετικό έλεγχο ο οποίος αποτελεί μέγιστο ρυθμιστικό μηχανισμό της κυτταρικής διαφοροποίησης και της μετάδοσης αυτής από το μητρικό στο θυγατρικό κύτταρο. Για την επίτευξη της κυτταρικής διαφοροποίησης απαιτείται σίγαση της έκφρασης ορισμένων γονιδίων ειδικών για ειδικό τύπο κυττάρων, μέσω της μεθυλίωσης των CpG νησίδων, και ενεργοποίηση ορισμένων άλλων. Ο καλύτερα μελετημένος επιγενετικός μηχανισμός είναι η μεθυλίωση του DNA η οποία σχετίζεται με την μεταγραφική αποσιώπηση των γονιδίων και λαμβάνει χώρα στη βάση κυτοσίνη η οποία προηγείται της βάσης γουανίνης στην ακολουθία του γονιδιώματος και η αντίδραση καταλύεται από τις μεθυλτρανφεράσες οι οποίες προσκολλούν ισοσθενώς μία μεθυλομάδα στη θέση C5 του δακτυλίου της κυτοσίνης. Το εναρκτήριο λάκτισμα για την έναρξη και διατήρηση της διαδικασίας της κυτταρικής διαφοροποίησης δίδεται από τους επιγενετικούς μηχανισμούς. Παρόλο που αυτοί οι επιγενετικοί μηχανισμοί εδραιώνονται πρώιμα κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των οργανισμών, συμβαίνουν συνεχείς προσαρμογές κατά τη διάρκεια της ζωής των κυττάρων ως απάντηση σε εσωτερικά και περιβαλλοντικά ερεθίσματα που μπορεί να οδηγήσουν, αργότερα στη ζωή, στην ανάπτυξη νοσημάτων και καρκίνου. Η κυτταρική διαφοροποίηση βασίζεται στις επιγενετικές αλλαγές οι οποίες σχετίζονται με την επιλεκτική χρονικά ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων και την ελεγχόμενη αποσιώπηση πολυδύναμων γονιδίων. Σκοπός: Να μελετηθεί το μοτίβο της μεθυλίωσης των υποκινητών των αποτυπομένων γονιδίων MEG3 και SNRPN σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ), μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) και πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ) και να συσχετισθούν οι τυχών διαταραχές της μεθυλίωσης με την συνολική επιβίωση των ασθενών, το στάδιο της νόσου, τους υπότυπους της νόσου, τις διάφορες χρωμοσωμιακές ανωμαλίες και τις αιματολογικές παραμέτρους. Ασθενείς και μέθοδοι: Μελετήθηκαν 85 ασθενείς με μυελοειδείς κακοήθειες (42 ασθενείς με ΟΜΛ και 43 ασθενείς με ΜΔΣ) καθώς και 21 ασθενείς με ΠΜ οι οποίοι διαγνώσθηκαν και αντιμετωπίσθηκαν στην Αιματολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Από τους ασθενείς με μυελοειδείς κακοήθειες οι 57 (67,1%) ήταν άνδρες και οι 28 (32,9%) ήταν γυναίκες με συνολική μέση ηλικία 71,8±13,3 έτη (εύρος 16-92 έτη). Από τους 21 ασθενείς με ΠΜ οι 11 (52,4%) ήταν άνδρες ενώ οι 10 (47,6%) ήταν γυναίκες και η συνολική μέση ηλικία ήταν 66,5 έτη (εύρος 48-85 έτη). Η διάγνωση της νόσου του ΠΜ έγινε βάσει προκαθορισμένων κριτηρίων τα οποία διατυπώθηκαν από την Διεθνή Ομάδα Εργασίας του Πολλαπλού Μυελώματος. Οι ασθενείς με ΟΜΛ και ΜΔΣ ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας-ΠΟΥ και επιπλέον οι ασθενείς με ΜΔΣ επανεξετάσθηκαν ώστε να πληρούν τα πλέον πρόσφατα διαγνωστικά κριτήρια όπως αυτά διατυπώθηκαν στην συνάντηση της Διεθνούς Ομάδας ΜΔΣ το 2007. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση γονιδιωματικού DNA από δείγματα μυελού των οστών χρησιμοποιώντας το QIAmp® DNA Mini Kit (Qiagen, Bioanalytica, Athens, Greece) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συνεχεία, το DNA σε χημική κατεργασία με διθειώδες νάτριο με τη χρήση του EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, CA, USA) βάσει του πρωτοκόλλου του κατασκευαστή. Η μελέτη της μεθυλίωσης των δύο γονιδίων έγινε με τη μέθοδο MSP, χρησιμοποιώντας το HotStar Taq Master Mix kit της Qiagen. Αποτελέσματα: Στο φυσιολογικό μοτίβο μεθυλίωσης του γονιδίου MEG3 παρατηρούνται 2 μπάντες, εκ των οποίων μία αντιστοιχεί στο μεθυλιωμένο πατρικό αλλήλιο και έχει προϊόν 160 bp και μία αντιστοιχεί στο μη-μεθυλιωμένο μητρικό αλλήλιο με προϊόν 160 bp. Στην περίπτωση της μη-φυσιολογικής μεθυλίωσης παρατηρείται η ύπαρξη μόνο του πατρικού αλληλίου ενώ δεν παρατηρείται το μητρικό αλλήλιο. ........................................................