Συσχέτιση της ρετρομετάθεσης με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική διαδικασία
Authors: Θρασυβούλου Σωτηρούλα 
Published: September 2021

Τα ρετροτρανσποζόνια είναι αλληλουχίες DNA, ικανές να μετατίθενται σε νέες θέσεις στο γένωμα. Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση (ΕΜΤ) εμφανίζεται κυρίως κατά την εμβρυογένεση, ενώ η επαγωγή της στην ενήλικη ζωή συμβάλλει στην καρκινογένεση.Έχει προταθεί η συσχέτιση μεταξύ επαγωγής ΕΜΤ και καρκινικών βλαστικών κυττάρων.Σκοπός της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση εάν: 1. γεγονότα ρετρομετάθεσης συμβαίνουν σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού και κυρίως, 2. οι επιπτώσεις της ρετρομετάθεσης συσχετίζονται με ΕΜΤ. Τα κύρια ευρήματα της παρούσας διατριβής είναι τα ακόλουθα:1. Κυτταρομετρία ροής, έδειξε ότι η διαμόλυνση του μη-αυτόνομου ρετροτρανσποζονίου VL30 σε προγονικά κύτταρα μαστού ποντικού HC11 οδήγησε στην παραγωγή υψηλότερης συχνότητας ρετρομετάθεσης, συγκριτικά με τα διαφοροποιημένα κύτταρα μαστού C127 και EPH4. Επίσης, η διαμόλυνση του ρετροτρανσποζονίου L1 και του ρετροϊού MoMLV ως ρετροτρανσποζόνιο σε κύτταρα HC11 παρήγαγε γεγονότα ρετρομετάθεσης υψηλής συχνότητας. 2. Σε αντίθεση με τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα C127 και EPH4, τα οποία διατήρησαν τον επιθηλιακό τους φαινότυπο, κυτταρικοί κλώνοι HC11-VL30 απόκτησαν ένα μεσεγχυματικό φαινότυπο. Παρομοίως, μεσεγχυματική μορφολογία παρουσίασαν και οι θετικοί ρετρομετάθεσης κλώνοι HC11-L1, σε αντίθεση με τους κλώνους HC11-DO.MT στους οποίους δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερες μορφολογικές διαφορές.3. Επίσης σε κλώνους HC11-VL30, ανοσοαποτύπωση κατά western και ανοσοφθορισμός έδειξε πλήρη απώλεια έκφρασης της Ε-καντερίνης, ενός διάχυτου πρότυπου εντοπισμού της β-κατενίνης και επαγωγή της έκφρασης Ν-καντερίνης και φιμπρονεκτίνης καθώς ανάλυση Real Time PCR απεκάλυψε επαγωγή RNA έκφρασης των παραγόντων Snail,Twist, Slug και της κυτοκίνης TGF-β1. Παράλληλα, κύτταρα HC11-L1 παρουσίασαν παρόμοιο προφίλ έκφρασης των παραπάνω δεικτών EMT, με εξαίρεση τη TGF-β1 όπου δεν παρατηρήθηκε ιδιαίτερη μεταβολή RNA έκφρασή της.4. Τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα HC11-VL30 και HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν από αυξημένο μεταστατικό δυναμικό συγκριτικά με τα κύτταρα HC11,ικανότητα διήθησης σε γέλη matrigel και σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ. 5. Κύτταρα κλώνων HC11-VL30 και HC11-L1 με επαγμένη ΕΜΤ ήταν ικανά ανάπτυξης υπό συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης ορού και σχημάτιζαν μαμμόσφαιρες σε μέσα μειωμένης προσκόλλησης.6. Κύτταρα προερχόμενα από μαμμόσφαιρες κλώνων HC11-VL30 και HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν θετικά ως προς: α. τον αντιγονικό φαινότυπο των καρκινικών βλαστικών κυττάρων CD44+/CD24-/low, β. επαγωγή έκφρασης RNA του γονιδίου Oct4 και γ. ικανότητες αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης. Επιπλέον, παρουσιάστηκαν δύο χαρακτηριστικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων μαμμοσφαιρών HC11-L1 και HC11-VL30: δ. μόνο οι μαμμόσφαιρες HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν από αυξημένη έκφραση RNA του γονιδίου Nanogκαι ε. ενώ τα κύτταρα μαμμοσφαιρών HC11-VL30 διαφοροποιήθηκαν σε δομές που ομοιάζαν με αυτές του γαλακτοφόρου αδένα, τα κύτταρα μαμμοσφαιρών HC11-L1 διαφοροποιήθηκαν σε κυτταρικές δομές αποτελούμενες κυρίως από μεσεγχυματικά κύτταρα και σε μικρότερο ποσοστό από επιθηλιακά.7. Ένεση κυττάρων HC11-VL30 και HC11-L1 στα συγγενικά ποντίκια Balb/cοδήγησε στη παραγωγή όγκων. Στην περίπτωση νεοπλάσματος από κύτταρα HC11-VL30,αθροίσεις νεοπλασματικών κυττάρων χαρακτηρίσθηκαν, κατά θέσεις, από θετικότητα ως προς την πανκερατίνη υποδηλώνοντας εστιακή επιθηλιακή διαφοροποίηση. 8. Απομονωμένα καρκινικά κύτταρα από νεοπλάσματα HC11-L1 παρουσίασαν μεσεγχυματική μορφολογία, ικανότητα σχηματισμού μαμμοσφαιρών, υπό συνθήκες μειωμένης προσκόλλησης και θετικότητα ως προς τα γεγονότα ρετρομετάθεσης έπειτα από ανάλυση PCR.