An integrated metabolomics approach using HR-LC-MS, NMR and chemometrics for the profiling of the red alga Laurencia
Authors: Κόκκοτου Αικατερίνη 
Published: January 2023

Το θαλάσσιο περιβάλλον, καλύπτοντας περίπου το 70% της επιφάνειας της Γης, φιλοξενεί μια σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη βιοποικιλομορφία, προσφέροντας έτσι μια τεράστια προοπτική για την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων, με στόχο τη θεραπεία ανίατων ασθενειών ή την αντιμετώπιση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Προκειμένου να επιβιώσουν σε ένα διαρκώς ανταγωνιστικό οικοσύστημα, οι θαλάσσιοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει μοναδικούς αμυντικούς μηχανισμούς, συνθέτοντας βιοδραστικές ενώσεις, οι οποίες σε ορισμένες περιπτώσεις παρουσιάζουν ασύγκριτη πολυπλοκότητα σε σχέση με τις ενώσεις που συντίθενται από τους χερσαίους οργανισμούς.Τα ροδοφύκη του γένους Laurencia θεωρούνται από τις πιο πλούσιες πηγές θαλάσσιας προέλευσης νέων δευτερογενών μεταβολιτών. Το γένος Laurencia περιλαμβάνει έως σήμερα 146 ταξινομικά αποδεκτά είδη, τα οποία συναντώνται κυρίως σε τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες παράκτιες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης και της Μεσογείου Θάλασσας. Παρόλο που έχει μελετηθεί εκτεταμένα τα τελευταία 50 χρόνια - οι σχετικές καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων MarinLit υπερβαίνουν τις 1.200 - νέοι μεταβολίτες εξακολουθούν να απομονώνονται από τα είδη του γένους. Τα είδη του γένους Laurencia βιοσυνθέτουν ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών μεταβολιτών, περιλαμβάνοντας σεσκιτερπένια, διτερπένια, τριτερπένια και C15 ακετογενίνες, οι οποίοι συχνά χαρακτηρίζονται από την παρουσία αλογόνων. Ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων μεταβολιτών εμφανίζει σημαντική βιολογική δράση, όπως αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, εντομοκτόνο και κυτταροτοξική, όπως παρουσιάζεται από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας στο Κεφάλαιο 1. Πρόσφατες αναφορές εστιάζουν στην πολυπλοκότητα της ταξινόμησης των ροδοφυκών του γένους Laurencia, η οποία σχετίζεται με την εκτεταμένη μορφολογική πλαστικότητα, σε συνδυασμό με τη χημική διακύμανση, αντανακλώντας σε σημαντικό βαθμό την επίδραση περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Η μεταβολομική αποτελεί μια αναδυόμενη τεχνολογία με εφαρμογές που εκτείνονται σε διάφορους τομείς, όπως η υγεία, τα φυσικά προϊόντα, οι βιοτεχνολογικές εφαρμογές και η διατροφή, ενώ ο αριθμός των μεταβολομικών μελετών σε θαλάσσιους οργανισμούς είναι περιορισμένος. Για μια μεταβολομική μελέτη απαιτείται η εφαρμογή αναλυτικών τεχνικών υψηλής απόδοσης, όπως η φασματοσκοπία NMR και η φασματομετρία μάζας (MS), σε συνδυασμό με εξειδικευμένα λογισμικά και βάσεις δεδομένων. Όσον αφορά στους θαλάσσιους οργανισμούς, ο μεγάλος αριθμός ενώσεων με άγνωστες δομές, καθώς και ο περιορισμένος αριθμός δεδομένων που μπορεί να ανακτηθεί από βάσεις δεδομένων, εξειδικευμένων στα φυσικά προϊόντα θαλάσσιας προέλευσης, αντανακλούν την αυξημένη δυσκολία στην αποτίμηση του πολύπλοκου μεταβολικού αποτυπώματος τους. Εφαρμογές της μεταβολομικής στους θαλάσσιους οργανισμούς και οι ερευνητικές προκλήσεις που σχετίζονται με αυτές εξετάζονται στο Κεφάλαιο 2. Η παρούσα μελέτη στόχευσε στο συνολικό δευτερογενές μεταβολικό αποτύπωμα εκχυλισμάτων της Laurencia εφαρμόζοντας σύγχρονες ολιστικές τεχνικές, όπως φασματοσκοπία UHPLC-PDA-HRMS και ΗR NMR, και εξειδικευμένα λογισμικά επεξεργασίας των πειραματικών δεδομένων, βάσεις δεδομένων εμπορικά διαθέσιμες (MarinLit), καθώς και in-house βιβλιοθήκες δεδομένων που αναπτύχθηκαν και εργαλεία πολυμεταβλητής ανάλυσης. Η μεθοδολογία, η οποία αναπτύχθηκε και περιγράφεται στο Κεφάλαιο 4, εφαρμόστηκε για τη σάρωση εκχυλισμάτων του γένους Laurencia ώστε να αναγνωριστούν ήδη γνωστοί βιβλιογραφικά μεταβολίτες (dereplication) και παράλληλα να εντοπιστεί η παρουσία νέων μεταβολιτών από τα πρώτα στάδια της χημικής ανάλυσης, ιεραρχώντας με αυτό τον τρόπο ποια δείγματα θα υποβάλλονταν περαιτέρω στη μακρά και επίπονη διαδικασία της φυτοχημικής ανάλυσης. Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση οδήγησε: α) Στην υλοποίηση μιας ‘in-house’ βάσης δεδομένων NMR που εστιάζει στα ροδοφύκη του γένους Laurencia και περιλαμβάνει πειραματικά ή/και βιβλιογραφικά δεδομένα NMR για δευτερογενείς μεταβολίτες προερχόμενους από είδη Laurencia και Aplysia, γνωστού και ως «λαγού της θάλασσας» που παρουσιάζει στενή οικολογική σχέση με τη Laurencia καθώς αυτή αποτελεί μέρος της διατροφής του. Η βάση δεδομένων υλοποιήθηκε στο περιβάλλον του λογισμικού ACD/Labs και διευκολύνει την αποτίμηση των δεδομένων 2D HSQC NMR με τη χρήση αλγορίθμων προσομοίωσης, οδηγώντας στην ασφαλή ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών που υπάρχουν στο δείγμα. Η βάση δεδομένων περιλαμβάνει περίπου 300 εγγραφές που αντιστοιχούν σε δομικά διαφορετικές ενώσεις από τις κατηγορίες των C15 ακετογενινών, σεσκιτερπενίων και διτερπενίων. β) Στην ανάπτυξη μιας βιβλιοθήκης LC-MS που περιλαμβάνει μεταβολίτες της Laurencia που έχουν απομονωθεί στο παρελθόν στο εργαστήριό μας γ) Στον ταχύτατο εντοπισμό δύο νέων C15 ακετογενινών της ομάδας των βρωμοαλλενίων (μαριλζαλλένιο B και χονδριοαλλένιο) σε ένα εκχύλισμα του είδους Laurencia chondrioides που συλλέχθηκε στην Κεφαλονιά. Τα αποτελέσματα της μελέτης έχουν ήδη δημοσιευθεί (Kokkotou et al., Phytochemistry, 2014, 108, 208-219). Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 5, εκπονήθηκε μια μελέτη που περιλάμβανε 103 δείγματα από είδη Laurencia από τις Ελληνικές ακτές, η οποία διερεύνησε τη δυνατότητα της ανάλυσης του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος με την εφαρμογή LC-MS/PCA και 1H NMR/PCA με στόχο τη διάκριση μοτίβων μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών του φύκους. Τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης συνοψίζονται στα ακόλουθα: α) Δείγματα Laurencia, τα οποία αναδείχθηκαν ως έκτροπα (outliers) υπέδειξαν την παρουσία νέων φυσικών προϊόντων β) Aναδείχθηκαν δύο κύριοι μεταβολικοί τύποι (metabotypes) στα δείγματα Laurencia που μελετήθηκαν, ο μεταβολικός τύπος Α που περιλαμβάνει ένα φάσμα C15 ακετογενινών και ο μεταβολικός τύπος Β, που χαρακτηρίζεται κυρίως από την παρουσία σεσκιτερπενίων. γ) Επιπλέον, η μελέτη αποκάλυψε την επίδραση τη θαλάσσιας οικολογικής περιοχής (Ιόνιο και Αιγαίο Πέλαγος) σε σχέση με την έκφραση των δύο μεταβολικών τύπων στα δείγματα του είδους Laurencia obtusa. Αυτή είναι η πρώτη μεταβολομική μελέτη του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος, η οποία πραγματοποιείται σε μεγάλο αριθμό πληθυσμών του γένους Laurencia. Στο Κεφάλαιο 6 εφαρμόστηκε στοχευμένη LC-HRMS σάρωση σε συλλογή πληθυσμών του γένους Laurencia για τον εντοπισμό βιοδραστικών διτερπενίων και συγκεκριμένα του διτερπενίου νεοροτζιολτριόλη (NRG) με ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση, το οποίο είχε απομονωθεί αρχικά από έναν πληθυσμό Laurencia glandulifera από την Κεφαλονιά, ενός δομικού αναλόγου της, της νεοροτζιολδιόλης, καθώς και των συγγενών δομών νεοροτζιολδιόλη Β και πρεβεζόλες Α-Ε, που είχαν απομονωθεί από ένα δείγμα L. obtusa από τις ακτές της Πρέβεζας. Αυτές οι ενώσεις πιθανόν να ανήκουν στo ίδιo βιοσυνθετικό μονοπάτι και έτσι αυτή η μελέτη σάρωσης με LC-HRMS στόχευσε στην ανίχνευση αυτών των διτερπενίων ή ακόμη και συναφών αναλόγων. Η παρουσία των ενώσεων-στόχων εντοπίστηκε σε πληθυσμό Laurencia sp. που συλλέχθηκε από τον κόλπο της Βάτσας στη Κεφαλονιά. Στη συνέχεια, η συλλογή από την ίδια περιοχή μεμονωμένων στελεχών του συγκεκριμένου πληθυσμού επέτρεψε τη διεξαγωγή μιας ενδο-πληθυσμιακής μελέτης. Η ανάλυση LC-HRMS/PCA κατέδειξε σαφώς την ενδο-πληθυσμιακή διακύμανση στο περιεχόμενο, αλλά ακόμα και την παρουσία/απουσία των ενώσεων-στόχων και περαιτέρω ξεχώρισε δύο ομάδες δειγμάτων συγκριτικά με τον μέσο πληθυσμό, μία ομάδα που χαρακτηρίζεται από ένα φάσμα διτερπενίων και μία άλλη ομάδα που περιλαμβάνει κυρίως σεσκιτερπένια. Στο χάρτη της PCA, η κατανομή των δειγμάτων σε σχήμα αντεστραμμένου "V", καθώς και η διευθέτηση των προαναφερθέντων ομάδων δειγμάτων υποδηλώνουν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της αφθονίας των διτερπενίων και των σεσκιτερπενίων, αναδεικνύοντας έτσι μία «αλληλεπίδραση» (cross-talk) μεταξύ των δύο οδών που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση των τερπενίων, δηλαδή το μονοπάτι της μεθυλερυθριτόλης (MEP) και το μονοπάτι του μεβαλονικού οξέος (MVA). Αυτή η διασύνδεση ίσως αποτελεί μια ερμηνεία για την προτιμώμενη βιοσύνθεση των βιοδραστικών διτερπενίων εις βάρος των σεσκιτερπενίων.Η μελέτη ανέδειξε επίσης την εποχιακή διακύμανση του δευτερογενούς μεταβολικού προφίλ του συγκεκριμένου πληθυσμού του ροδοφύκους, η οποία πιθανώς να εξαρτάται από τη μεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών ή από την έκθεση σε παθογόνους παράγοντες, επιφυτικούς ή φυτοφάγους οργανισμούς με συνέπεια την παραγωγή βιοδραστικών διτερπενίων ή σεσκιτερπενίων.