Παραλαβή, ανάλυση με χρωματογραφικές - φασματοσκοπικές μεθόδους και βιολογική δράση αιθερίων ελαίων αρωματικών φυτών
Authors: Δαφερέρα Δήμητρα 
Published: August 2021

Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελούν τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών. Τρεις στόχους είχε η μελέτη αυτή. Ο πρώτος, είχε ως αντικείμενο την παραλαβή των αιθέριων ελαίων από τους φυτικούς ιστούς, την ανάλυσή τους με αέριο χρωματογραφία - φασματομετρία μαζών (Gas Chromatography - Mass Spectrometry, GC-MS) για τον προσδιορισμό της χημικής τους σύστασης και την αξιολόγηση της βιολογικής τους δράσης σε φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς. Ο δεύτερος στόχος, είχε ως αντικείμενο την εφαρμογή της φασματοσκοπίας Raman μετασχηματισμού Fourier (Fourier Transform Raman, FT- Raman) για τη μελέτη των αιθέριων ελαίων, σε δείγματα που παραλήφθηκαν από τους φυτικούς ιστούς, αλλά και δείγματα εμπορίου. Αντικείμενο του τρίτου στόχου αποτέλεσαν οι υπέρηχοι ως βάση μεθόδου εκχύλισης για την παραλαβή αιθέριων ελαίων από το αποξηραμένο φυτικό υλικό.Επιλέχθηκαν αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae, όπως η ρίγανη, το θυμάρι, ο δίκταμος, η μαντζουράνα, η λεβάντα, το φασκόμηλο, το δενδρολίβανο κοα. το φλησκούνι, διότι αποτελούν κοινά είδη στην Ελλάδα και σχετικά άφθονα, είτε σαν αυτοφυή είτε σαν καλλιεργούμενα φυτά και γιατί έχουν (στην πλειονότητά τους τουλάχιστο) καλές αποδόσεις σε αιθέριο έλαιο. Επίσης, στη φασματοσκοπική FT- Raman μελέτη συμπεριλήφθηκε το αιθέριο έλαιο της μαστίχας (Οικ. Anacardiaceae), διότι αποτελεί παραδοσιακό προϊόν της Χίου, με σκοπό την εύρεση μιας ταχείας και απλής μεθόδου για την τυποποίηση του μαστιχελαίου.Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων μελετήθηκε έναντι των μικροοργανισμών Pénicillium digitatum, Botrytis cinerea, Fusarium sp. (Fusarium solani var. coerulum) και Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis mv προσβάλλουν φυτικά είδη και προϊόντα. Ως μέθοδοι μελέτης χρησιμοποιήθηκαν πειράματα μέτρησης της γραμμικής αύξησης του μυκηλίου όλων των μυκήτων και πειράματα βλάστησης και παραγωγής των κονιδίων του μύκητα Pénicillium digitatum σε θρεπτικό υλικό Potato Dextrose Agar (PDA) ενώ στην περίπτωση του βακτηρίου Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis η βιολογική δράση των αιθέριων ελαίων αξιολογήθηκε μετρώντας την ανάπτυξη αυτού σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό Nutrient Agar (ΝΑ). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως όλα τα εξεταζόμενα αιθέρια έλαια παρουσίασαν αντιμικροβιακή δράση και στα τέσσερα φυτοπαθογόνα που δοκιμάστηκαν. Τα αιθέρια έλαια που περιέχουν θυμόλη και καρβακρόλη έχουν ισχυρή και ευρέους φάσματος αντιμικροβιακή δράση σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ τα αιθέρια έλαια που περιέχουν λιναλοόλη και πουλεγόνη επιδεικνύουν παρεμποδιστική ιδιότητα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, που εξαρτάται από τη φυσιολογική λειτουργία του μύκητα, αλλά και το είδος του μικροοργανισμού. Τα λιγότερο δραστικά έλαια είναι αυτά που περιέχουν ευκαλυπτόλη. Η δράση τους εξαρτάται από το είδος του μικροοργανισμού και την παρουσία άλλων ουσιών στο μίγμα. Εξετάστηκαν FT-Raman φάσματα συστατικών που περιέχονται σε αιθέρια έλαια, καθώς και τα φάσματα των αιθέριων ελαίων της οικογένειας Lamiaceae. Συσχετίζοντας τα FT-Raman φάσματα των καθαρών τερπενίων με αυτά των αιθέριων ελαίων, προκύπτει πως στο φάσμα του αιθέριου ελαίου εμφανίζονται χαρακτηριστικές κορυφές που αποδίδονται στην κύρια ή κύριες ουσίες του ελαίου. Οι προβλέψεις των κύριων συστατικών των αιθέριων ελαίων από τα φάσματα FT-Raman επιβεβαιώνονται από τα αποτελέσματα GC-MS. Το φάσμα FT-Raman ενός αιθέριου ελαίου αποτελεί «δακτυλικό αποτύπωμα» για το ίδιο και χαρακτηρίζεται από την επικρατέστερη ουσία στο μίγμα, με αποτέλεσμα να είναι εφικτή η διαφοροποίηση των αιθέριων ελαίων μεταξύ τους, ανάλογα με τα συστατικά που επικρατούν σ’αυτά. Επιπλέον, είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ των διαφορετικών χημειότυπων ενός αιθέριου ελαίου, όπως είναι της καρβακρόλης και της θυμόλης, ενώ σε συνδυασμό με την τεχνική GC-MS επιβεβαιώνει την ταυτοποίηση ουσιών των οποίων τα φάσματα μάζας τους είναι όμοια και εκλούονται σε πολύ κοντινούς χρόνους. Επιπλέον, αναπτύσσεται μέθοδος προσδιορισμού της εκατοστιαίας περιεκτικότητας του μαστιχελαίου σε α-πινένιο και β-μυρκένιο με τη φασματοσκοπία FT-Raman. Για το λόγο αυτό, ελήφθησαν καμπύλες αναφοράς για τα δύο αυτά κύρια συστατικά του, από τις οποίες υπολογίζονται τα % ποσοστά του α-πινενίου και β-μυρκενίου σε άγνωστα δείγματα μαστιχελαίων. Τα αποτελέσματα της μεθόδου FT-Raman συγκρίνονται με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τη μέθοδο GC-MS. Η μέθοδος παραλαβής των αιθέριων ελαίων από τα αποξηραμένα φυτά που βασίζεται στους υπερήχους, διαρκεί μόλις λίγα λεπτά. Η μέθοδος πραγματοποιήθηκε σε λουτρό υπερήχων που λειτουργεί σε συχνότητα 35 KHz. Ως εκχυλιστικό υγρό χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα νερού/οργανικού διαλύτη (1:1, ν/ν). Οι οργανικοί διαλύτες ήταν το πεντάνιο και ο διαιθυλαιθέρας. Η μικροαπόσταξη - εκχύλιση σε οργανικό διαλύτη αποτέλεσε τη μέθοδο αναφοράς. Η χημική σύσταση των παραλαμβανόμενων αιθέριων ελαίων προσδιορίστηκε με GC-MS. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως η ποιότητα του λαμβανόμενου αιθέριου ελαίου, στην περίπτωση της μεθόδου που βασίζεται στους υπερήχους, εξαρτάται από το σύστημα διαλυτών που χρησιμοποιείται για εκχύλιση. Όταν χρησιμοποιηθεί το σύστημα νερού/διαιθυλαιθέρα το αιθέριο έλαιο που παραλαμβάνεται είναι παρόμοιας χημικής σύστασης με αυτό της μεθόδου αναφοράς (με εξαίρεση το αιθέριο έλαιο του φλησκουνιού). Όταν χρησιμοποιηθεί το σύστημα νερό/πεντάνιο οι ποιοτικές διαφορές μεταξύ των εκχυλισμάτων είναι σημαντικές και διακρίνονται διάφορες περιπτώσεις ανάλογα με τη φύση του αιθέριου ελαίου. Γενικά, με το σύστημα αυτό παραλαμβάνονται εκχυλίσματα εμπλουτισμένα, ως προς την εκατοστιαία περιεκτικότητά τους, σε βιολογικά δραστικές ουσίες, όπως είναι η θυμόλη και η καρβακρόλη, ακόμα και σε αρωματικά φυτά στα οποία το ποσοστό τους είναι σχετικά χαμηλό.Από τη μελέτη αυτή προκύπτουν τα ακόλουθα συμπεράσματα: ί) Τα αιθέρια έλαια επιδεικνύουν διάφορα επίπεδα αντιμικροβιακής δράσης που εξαρτάται από το είδος του αρωματικού φυτού και του φυτοπαθογόνου. Η βιοδραστικότητα των αιθέριων ελαίων του δίκταμου και της μαντζουράνας συγκρίνεται άμεσα με αυτή της ρίγανης και του θυμαριού, ϋ) Με τη φασματοσκοπία FT-Raman είναι εφικτή η διαφοροποίηση των αιθέριων ελαίων ανάλογα με την επικρατέστερη ουσία μεταξύ ειδών και υποειδών, επιτυγχάνοντας ακόμη τη διάκριση διαφορετικών χημειοτύπων. Όπως προκύπτει και από τα αποτελέσματα του μαστιχελαίου η φασματοσκοπία FT- Raman μπορεί να εφαρμοστεί σε ποσοτικούς προσδιορισμούς και ιδιαίτερα στην τυποποίηση των αιθέριων ελαίων, iii) Οι υπέρηχοι, ως βάση μεθόδου εκχύλισης των αιθέριων ελαίων, παραλαμβάνουν μέσα σε λίγα λεπτά το αντιπροσωπευτικό αιθέριο έλαιο του φυτού, αν χησιμοποιηθεί ως σύστημα το νερό/διαιθυλαιθέρας, ή συντελούν στην παραλαβή εκχυλίσματος με αυξημένα ποσοστά σε βιολογικά δραστικές ουσίες, αν χρησιμοποιηθεί ως σύστημα το νερό/πεντάνιο.