Επιδημιολογικός, κλινικός και μοριακός έλεγχος ανοσοκατεσταλμένων γυναικών που μολύνθηκαν από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων
Authors: Τραϊανού Αθηνά 
Published: August 2021

Η λοίμωξη από τους ιούς των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papilloma Viruses – HPV) αποτελεί σήμερα τη συχνότερη σεξουαλικά μεταδιδόμενη νόσο στις γυναίκες. Παράλληλα, έχει βρεθεί από βιβλιογραφικά δεδομένα ότι ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papilloma Virus- HPV) είναι αυτός που κυρίως ενοχοποιείται για την ανάπτυξη καρκίνου στον τράχηλο της μήτρας. Χρησιμοποιώντας την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR-Polymerase Chain Reaction) το HPV-DNA ανιχνεύεται σε ποσοστό σχεδόν 100% στον διηθητικό καρκίνο του τραχήλου.Ωστόσο, η εξέλιξη της λοίμωξης από τον ιό HPV εξαρτάται από τον τύπο του ιού (ογκογόνο ή μη), από περιβαλλοντικούς παράγοντες (κάπνισμα, σεξουαλικές συνήθειες) και κυρίως από την κατάσταση του ανοσιακού συστήματος του ξενιστή (που θα επιτρέψει ή όχι να εμφανισθεί η αλλοίωση και να εξελιχθεί). Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη διαδικασία καρκινογένεσης και δρουν είτε συμβάλλοντας στην επιμονή της λοίμωξης, είτε διεγείροντας την εξέλιξή της προς διηθητικό καρκίνο. Η γνώση της δράσης και της σημασίας αυτών των παραγόντων, αν και ατελής, είναι απαραίτητη για να κατανοήσουμε τη φυσική πορεία από την λοίμωξη μέχρι την εμφάνιση των αλλοιώσεων του επιθηλίου. Η ανάπτυξη διηθητικής νόσου προϋποθέτει τη συσσώρευση γενετικών αλλαγών, οι οποίες θα οδηγήσουν σε επιγενετικές αλλαγές που θα ενεργοποιήσουν την έκφραση των γονιδίων του ιού στο επιθηλιακό κύτταρο. Όσον αφορά όμως τον επιπολασμό του ιού σε ανοσοκατεσταλμένες γυναίκες, τα δεδομένα είναι λίγο διαφορετικά. Λόγω επηρεασμένης ανοσιακής απάντησης οι γυναίκες αυτές θεωρείται ότι είναι πιο επιρρεπείς στην εμφάνιση καρκίνου στο γεννητικό σύστημα μετά από μόλυνση από τον ιό HPV. Γι'αυτό για τις γυναίκες αυτές είναι μεγίστης σημασίας η διερεύνηση του τρόπου δράσης του ιού σε αυτές, η τακτική παρακολούθησή τους μέσω των διαγνωστικών τεχνικών αλλά και η ανάπτυξη βιολογικών δεικτών που θα επέτρεπαν τη διάγνωση της νόσου σε πρώιμα στάδια.Επιγενετικά φαινόμενα, όπως η μεθυλίωση του DNA, πιστεύεται πως συνδέονται άμεσα με την παθογένεια του καρκίνου, καθώς διαταράσσουν τη φυσιολογική έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, τη διαφοροποίηση και τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Μη φυσιολογική έκφραση των DNA μεθυλοτρανσφερασών έχει συσχετισθεί με την καρκινογένεση προκαλώντας, είτε εκτενή υπομεθυλίωση των φυσιολογικά μεθυλιωμένων περιοχών του επαναλαμβανόμενου DNA, είτε τοπική υπερμεθυλίωση των φυσιολογικά μη μεθυλιωμένων CpG νησίδων. Επομένως είναι σημαντική η διερεύνηση αυτών των πρωτεϊνών, ώστε να αξιολογηθεί και η πιθανή χρήση τους ως καρκινικών δεικτών.Η παρούσα συγκριτική μελέτη ασθενών-μαρτύρων (cases-controls) αφορά σε δύο ομάδες Ελληνίδων γυναικών, ανοσοκατεσταλμένων (λόγω μεταμόσχευσης νεφρού) και μη, σχετικά με την διερεύνηση της συσχέτισης τόσο των επιδημιολογικών τους χαρακτηριστικών, όσο και των παραγόντων της ανοσοκαταστολής τους, με την μόλυνση της γεννητικής περιοχής τους από τον ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων και με την έκφραση των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B. Συγκεκριμένα, ως υλικό της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 50 τραχηλικά και 50 επιχρίσματα αιδοίου μεταμοσχευμένων γυναικών, και 100 τραχηλικά και 100 επιχρίσματα αιδοίου υγιών εθελοντριών γυναικών. Η λήψη έγινε με ειδική ψήκτρα, το κυτταρικό υλικό τοποθετήθηκε σε ειδικά αποστειρωμένα πλαστικά φιαλίδια Εppendorf (διατηρημένα σε συνθήκες κατάψυξης, για να μην αλλοιωθεί το γενετικό υλικό), και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στο εργαστήριο με σκοπό την απομόνωση τόσο DNA, όσο και RNA απ' όλα τα δείγματα. Στο πρώτο σκέλος της μελέτης το DNA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση με PCR του HPV και την τυποποίηση του πιθανόν ανιχνευόμενου HPV τύπου. Παράλληλα, από όλες τις ασθενείς έγινε και λήψη τεστ Παπανικολάου.'Οσον αφορά στο RNA των δειγμάτων, αυτό χρησιμοποιήθηκε στο δεύτερο σκέλος της μελέτης για τον έλεγχο με PCR της έκφρασης των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B. Στη συνέχεια, στις 14 μεταμοσχευμένες και στις 20 υγιείς με παθολογικά κυτταρολογικά ευρήματα, ή/και εύρεση μολύνσεων από τύπους HPV, οι γυναίκες εκλήθησαν για περαιτέρω έλεγχο με κολποσκόπηση και βιοψία από τον τράχηλο της μήτρας.Σχετικά με τα HPV DNA test, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά σχετικά με την προέλευση των δειγμάτων (τράχηλος ή αιδοίο), όπως επίσης στη συνέχεια όπου αναλύονται οι τύποι του HPV, φαίνεται ότι σχεδόν πάντα οι ίδιοι τύποι του ιού προσβάλλουν ταυτόχρονα τον τράχηλο και το αιδοίο της ίδιας γυναίκας.Ανάλυση των δειγμάτων ανέδειξε ότι στις μεταμοσχευμένες θετικό HPV DNA test έχει το 28% ενώ αντίστοιχα στις φυσιολογικές το 20% και επομένως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο γκρουπ (p=0,35). Μάλιστα, ακόμα και στην τυποποίηση του ιού δεν υπάρχει διαφορά, καθώς ο συχνότερος τύπος του ιού είναι ο HPV53 και στις δύο ομάδες γυναικών. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ούτε η ηλικία των γυναικών αλλά ούτε και οι συνήθειες καπνίσματος ή η ηλικία έναρξης σεξουαλικών επαφών, σε καμία από τις δύο ομάδες, δεν συσχετίζεται με την μόλυνσή τους από τον ιό. Αντίθετα, οι ιοί HPV προσβάλουν συχνότερα μεταμοσχευμένες γυναίκες που έχουν περισσότερους από 8 σεξουαλικούς συντρόφους κατά τη διάρκεια της ζωής τους ή που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή για περισσότερο από 21 χρόνια. Στα τραχηλικά επιχρίσματα της μελέτης μας ήταν έκδηλη η υπεροχή του HPV DNA test σε σχέση με το τεστ Παπανικολάου (p=0,001) σε ότι αναφορά την ανίχνευση λοίμωξης από τον ιό και στις δύο ομάδες γυναικών. Στη συνέχεια, από τη μελέτη των βιοψιών στις γυναίκες με τα θετικά HPV DNA test δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά, ανάμεσα στις δύο ομάδες γυναικών, σε καμία από τις υποομάδες CIN (CIN1 p=0,41, CIN2 p=0,62, CIN3 p=0,39). Όμως, λόγω του περιορισμένου αριθμού ασθενών με CIN, δεν υπήρξε δυνατότητα για συσχέτιση του CIN με συγκεκριμένο τύπο HPV.Όπως ήδη αναφέρθηκε, η έκφραση των DNMT3A και DNMT3B παίζει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της καρκινογένεσης σε πολλά όργανα και ιστούς, όπως επίσης και στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης μας προσπαθήσαμε να ελέγξουμε την έκφραση των μεθυλοτρανσφερασών DNMT3A και DNMT3B στο κυτταρικό υλικό από τον τράχηλο της μήτρας των δύο ομάδων γυναικών και να συσχετίσουμε αυτά τα ευρήματα με την μόλυνση από δεδομένους τύπους του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV), καθώς πολύ λίγα δεδομένα έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία για μεταμοσχευμένες ασθενείς.Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, μόνο η έκφραση της DNMT3B στην ομάδα ελέγχου είναι αυξημένη με στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με την DNMT3Α στην ίδια ομάδα (p=0,001), καθώς και με την DNMT3Β στις μεταμοσχευμένες γυναίκες. Είναι τα πρώτα αποτελέσματα που υποστηρίζουν ότι, υπάρχει περίπτωση η αυξημένη έκφραση της DNMT3Β στις υγιείς γυναίκες ή αν το δούμε από την άλλη πλευρά, η απενεργοποίηση της έκφρασης της DNMT3B στις μεταμοσχευμένες γυναίκες να σχετίζεται με την φαρμακευτική ανοσοκαταστολή των μεταμοσχευμένων και την διαφορετική λειτουργία του ανοσιακού τους συστήματος, αλλά παρόμοια αναφορά στην βιβλιογραφία δεν υπάρχει. Ενδεχομένως, η μελέτη της ποσοτικοποίησης της έκφρασης της DNMT3Β, σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων και με περαιτέρω ανάλυση του ανοσιακού συστήματος των μεταμοσχευμένων, να έδινε μια πιο σαφή εικόνα για τον τρόπο λειτουργίας της DNMT3Β σε αυτές τις ασθενείς και για τη συσχέτισή της με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Στην προσπάθεια μας να ελέγξουμε την έκφραση των DNA μεθυλοτρανσφερασών στα δείγματα με θετικό HPV DNA test, βρήκαμε ότι η DNMT3A εκφράζεται στο 62% των γυναικών με θετικό HPV DNA test και στις δύο ομάδες γυναικών, ενώ η DNMT3B εκφράζεται μόνο στο 12%. Ωστόσο δεν βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στις DNA μεθυλοτρανσφεράσες και σε συγκεκριμένο τύπο HPV. Και πάλι εάν ο αριθμός των δειγμάτων προς εξέταση ήταν μεγαλύτερος ίσως θα μπορούσαμε να βρούμε συσχέτιση ανάμεσα στις DNMT3A και DNMT3B και σε συγκεκριμένο τύπο HPV. Έπειτα έχοντας υπ'όψιν μας τη διεθνή βιβλιογραφία και την θετική επίδραση των HPV16 και 18 στα επίπεδα έκφρασης των μεθυλοτρανσφερασών, διερευνήσαμε την συσχέτιση της έντασης της έκφρασης των DNMT3A και DNMT3B με την λοίμωξη με HPV. Σύμφωνα όμως με τα αποτελέσματά μας, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική σχέση ανάμεσα στην υπερέκφραση των μεθυλοτρανσφερασών και στην HPV λοίμωξη και στις δύο ομάδες γυναικών.Τέλος στατιστική συσχέτιση δεν βρέθηκε ούτε ανάμεσα στην υπερέκφραση των DNMT3A και DNMT3B και στις γυναίκες με κάποιο βαθμό CIN.Συμπερασματικά, τα δεδομένα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν ότι στις μεταμοσχευμένες γυναίκες ο αριθμός των σεξουαλικών τους συντρόφων και τα χρόνια της ανοσοκαταστολής είναι οι επικίνδυνοι παράγοντες για λοίμωξή τους από τους ιούς HPV, με τον HPV53 να είναι ο συχνότερος τύπος του ιού που τις προσβάλλει. Επιπλέον τα αποτελέσματά μας τονίζουν την τάση οι μεταμοσχευμένες γυναίκες να μην αποτελούν πια ιδιαίτερη ομάδα υψηλού κινδύνου για λοίμωξη της γεννητικής περιοχής από τους ιούς HPV και ανάπτυξη CIN. Αυτή η διαπίστωση οδηγεί κλινικά τις μεταμοσχευμένες γυναίκες να συμμετέχουν στον προληπτικό έλεγχο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, σύμφωνα με την ηλικία τους και τις σεξουαλικές τους συνήθειες και όχι σύμφωνα με τις συνθήκες μεταμόσχευσής τους. Είναι φανερό ότι απαιτούνται εκτεταμένες μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων σε μεταμοσχευμένες γυναίκες, τόσο για να καθοριστούν οι προδιαγραφές για τον προληπτικό τους έλεγχο σε ότι αφορά τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όσο και για να υπάρξει μια πιο σαφή εικόνα της συσχέτισης των DNΑ μεθυλοτρανσφερασών με την ανοσοκαταστολή, με τον HPV και το CIN στην ιδιαίτερη αυτή ομάδα ασθενών, έτσι ώστε να αξιολογηθεί αν είναι δυνατή η χρήση τους ως καρκινικών δεικτών.