Φυτοχημικά συστατικά των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των στύλων του Crocus sativus για την αντιμετώπιση του καταρράκτη και άλλων σελήνιο-επαγομένων οξειδωτικών βλαβών
Authors: Φερλέμη Αναστασία-Βαρβάρα 
Published: August 2021

Το σεληνιώδες νάτριο (Na2SeO3), μια ανόργανη ένωση του σεληνίου, όταν λαμβάνεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις λειτουργεί ευεργετικά, αφού το σελήνιο είναι συστατικό αρκετών ενζύμων. Η χορήγησή του, όμως, σε μεγάλες συγκεντρώσεις επάγει σημαντικές οξειδωτικές βλάβες – όταν χορηγηθεί σε αναπτυσσόμενους επίμυες επάγει το σχηματισμό οφθαλμικού καταρράκτη. Σχεδόν τα τελευταία 40 χρόνια έχει αναπτυχθεί ένα in vivo πειραματικό μοντέλο, βάσει αυτής της παρατήρησης, το οποίο έχει χρησιμεύσει τόσο στην κατανόηση των μηχανισμών της καταρρακτογένεσης όσο και στη διερεύνηση δυνητικών αντικαταρρακτογόνων παραγόντων, μεταξύ των οποίων πολλά φυσικά προϊόντα. Ωστόσο, όταν οι ίδιες δόσεις χορηγούνται σε ενήλικα πειραματόζωα είναι θανατηφόρες. Η ανθεκτικότητα των νεογνών επίμυων δεν έχει μέχρι σήμερα εξηγηθεί. Στην παραδοσιακή θεραπευτική το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus και των φύλλων διαφόρων taxa του γένους Vaccinium χρησιμοποιούνταν για την αντιμετώπιση οφθαλμικών νόσων. Σε προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας εδείχθη ότι η χορήγηση του εκχυλίσματος κρόκου στους επίμυες εμποδίζει την εμφάνιση καταρράκτη. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να διερευνηθεί η αντικαταρρακτογόνος δυνατότητα του εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων και να μελετηθεί η δραστικότητα και ο μηχανισμός δράσης των κυριότερων συστατικών των φύλλων του Vaccinum corymbosum και των στύλων του Crocus sativus με απώτερο στόχο την ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων. Αρχικά, προσδιορίσαμε τη σύσταση και τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες των δυο εκχυλισμάτων. Η HPLC-DAD χρωματογραφική ανάλυση και ο αδρός ποσοτικός προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών έδειξαν ότι τόσο το ολικό έγχυμα του Vaccinium corymbosum (BLD) όσο και τα κλάσματά του (AcΟEt, BuOH, Aqueous), που προέκυψαν από διαδοχικές εκχυλίσεις με οξικό αιθυλεστέρα και βουτανόλη, είναι πλούσια πηγή υδροξικινναμωμικών οξέων, όπως το χλωρογενικό οξύ και φλαβονολών όπως ο υπεροζίτης, η ρουτίνη, η ισοκερσετίνη και η κερσετίνη. Αξιοσημείωτη παρατήρηση είναι ότι αν και με πλούσιο φαινολικό περιεχόμενο, το BLD και τα κλάσματά του δεν περιέχουν ανθοκυανίνες. Η αντιοξειδωτική ικανότητα του BLD και των κλασμάτων του ελέγχθηκε με τρεις διαφορετικές μεθόδους. Η διαφορετική φαινολική σύσταση των κλασμάτων φαίνεται ότι επηρεάζει την αντιοξειδωτική τους ικανότητα όμως συνολικά διαπιστώσαμε ότι το έγχυμα είναι ένας πολύ ισχυρός αντιοξειδωτικός παράγοντας in vitro∙ σαρώνει αποτελεσματικά τη ρίζα του DPPH∙, ανάγει το κατιόν σιδήρου και δημιoυργεί χηλικά σύμπλοκα με το σίδηρο. Το μεθανολικό εκχύλισμα των στύλων του κρόκου είναι γνωστό από παλαιότερες μελέτες ότι περιλαμβάνει κυρίως trans- και cis-κροκίνες, επομένως στην παρούσα φάση ποσοτικοποιήσαμε αδρά μόνο το σύνολο των κροκινών. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας του εκχυλίσματος κρόκου έδειξε ότι, παρά την ισχυρή ικανότητα σάρωσης ριζών από την κροκετίνη, το εκχύλισμα είναι μέτριος αντιοξειδωτικός παράγοντας πιθανόν λόγω της παρουσίας φαινολικών ενώσεων σε μικρές συγκεντρώσεις, δρα ωστόσο ως ισχυρός χηλικός παράγοντας, ισχυρότερος και από το BLD. Με σκοπο να μελετηθεί in vivo η αντικαταρρακτογόνος δράση του εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων, αναπτυσσόμενοι επίμυες Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες: ομάδα «Se» που έλαβε ενδοπεριτοναϊκά σεληνιώδες νάτριο (20μmol/kg σωματικού βάρους) τη 10η ημέρα της ζωής, ομάδα «SeBLD» που έλαβε ενδοπεριτοναϊκά 20μmol Na2SeO3/kg σωματικού βάρους τη 10η ημέρα της ζωής και υποδόρια 100mg ξηρού εκχυλίσματος BLD/kg σωματικού βάρους την 11η και τη 12η ημέρα της ζωής και ομάδα «C» που έλαβε φυσιολογικό ορό τις αντίστοιχες ημέρες. Η σταδιοποίηση του καταρράκτη, που πραγματοποιήθηκε στους απομονωμένους κρυσταλλικούς φακούς των πειραματόζωων την 21η ημέρα της ζωής, απέδειξε ότι το BLD είχε αναστείλει επιτυχώς την εμφάνιση θολερότητας (ομάδα Se: καταρράκτης σταδίου 4 και ομάδα SeBLD: καταρράκτης σταδίου 1). Ο προσδιορισμός της ενεργότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων SOD, CAT και GPx, των επιπέδων της γλουταθειόνης, της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της οξείδωσης των –SH ομάδων των πρωτεϊνών στο φακό και η ανάλυση του πρωτεϊνικού περιεχομένου έδειξαν ότι το BLD είχε ισχυρή αντικαταρρακτογόνο δράση καθώς διατήρησε την οξειδοαναγωγική ισορροπία στους κρυσταλλικούς φακούς στα επίπεδα της ομάδας C και περιόρισε την πρωτεόλυση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών χαμηλού μοριακού μεγέθους που επάγονται από το Na2SeO3 και προκαλούν τη χαρακτηριστική θολερότητα του καταρρακτικού φακού. Με τη χρήση του ανωτέρω μοντέλου μας δόθηκε, επίσης, η ευκαιρία να διερευνήσουμε τις επιπτώσεις της τοξικής δοσολογίας του Na2SeO3 καθώς και την επίδραση του εγχύματος των φύλλων στην οξειδοαναγωγική κατάσταση και την πρωτεολυτική ικανότητα του ήπατος και των εγκεφαλικών περιοχών φλοιός, μεσεγκέφαλος και παρεγκεφαλίδα των αναπτυσσόμενων επίμυων. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της ενεργότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων και μικρών μορίων καθώς της έκτασης της λιπιδικής υπεροξείδωσης έδειξαν ότι αν και η ένωση είναι ισχυρά τοξική προκαλεί ιστο-ειδικές και μέτριας έκτασης οξειδωτικές βλάβες στο ήπαρ και τον εγκεφαλικό φλοιό, ο μεσεγκέφαλος παραμένει σχεδόν ανεπηρέαστος και η παρεγκεφαλίδα δεν επηρεάζεται καθόλου. Φαίνεται ότι η ενδογενής αντιοξειδωτική άμυνα που είναι ενισχυμένη τις πρώτες ημέρες της ζωής κάθε οργανισμού, προστατεύει επιτυχώς από την τοξικότητα του σεληνίου δίνοντας μια εξήγηση της ανθεκτικότητας των αναπτυσσόμενων οργανισμών. Από την άλλη μεριά το έγχυμα έδρασε ως ισχυρός εξωγενής αντιοξειδωτικός παράγοντας, επαναφέροντας την ισορροπία στους διαταραγμένους ιστούς και ενισχύοντας την αντιοξειδωτική άμυνα όσων δε διαταράχθηκαν. Στην in-vitro μελέτη των κύριων μηχανισμών δράσης των επικρατέστερων συστατικών του BLD μέσω των οποίων προστατεύεται η ακεραιότητα των πρωτεϊνών του φακού, των οποίων η αποικοδόμηση επάγεται άμεσα ή έμμεσα από το σεληνιώδες νάτριο και οδηγεί στην καταρρακτογένεση, βρήκαμε ότι οι γλυκοζίτες ρουτίνη, υπεροζίτης και ισοκερσετίνη αναστέλουν σε επίπεδο μΜ την μ-καλπαϊνη. Από τις μεταβολές στο φάσμα της κερσετίνης κατά τη φωτομετρική τιτλοδότηση φαίνεται ότι αυτή οξειδώνεται πλήρως από τα ιόντα σεληνιώδους και αλληλεπιδρά ασθενώς με τα ιόντα ασβεστίου. Τα παραπάνω αντικατοπτρίστηκαν στην επιτυχημένη αναστολή της σεληνιο- και ασβεστιο-επαγόμενης θολερότητας στα ομογενοποιήματα των φακών χοίρων ενός in vitro πειραματικού μοντέλου. Η κερσετίνη ήταν ο ισχυρότερος αναστολέας, ενώ οι γλυκοζίτες της και το χλωρογενικό οξύ ήταν λιγότερο αποτελεσματικοί. Η in vitro διερεύνηση της δραστικότητας της κροκετίνης, κύριου μεταβολίτη των κροκινών που εμπεριέχονται στο εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, απέδειξε ότι είναι εξίσου αποτελεσματικό φυσικό προϊόν από οσα μελετήθηκαν ερμηνεύοντας τα προηγούμενα θετικά in vivo αποτελέσματα. Είναι ισχυρότατος αναστολέας της μ-καλπαΐνης (IC50 145 nM), αναπτύσσει ασθενείς ηλεκτροστατικές έλξεις, πιθανότατα ομοιοπολικής φύσης, με τα ιόντα σεληνιώδους μέσω του ακόρεστου σκελετού, αλληλεπιδρά ασθενώς με τα ιόντα ασβεστίου και αναστέλλει σε ικανοποιητικό βαθμό τη σεληνιο- και ασβεστιο-επαγόμενη θολερότητα των πρωτεϊνών στο in vitro μοντέλο των κρυσταλλικών φακών χοίρων. Εν κατακλείδι, η κερσετίνη σε σημαντικότερο βαθμό και η κροκετίνη σε μικρότερο, παρεμβάλλονται σε τρια μοριακά μονοπάτια που οδηγούν σε καταρρακτογένεση: περιορίζουν την οξείδωση των πρωτεϊνών από το σεληνιώδες νάτριο, περιορίζουν την έμμεση ενεργοποίηση των καλπαϊνών με συμπλοκοποίηση των ιόντων ασβεστίου και αναστέλλουν άμεσα την μ-καλπαΐνη προλαμβάνοντας την πρωτεόλυση των κρυσταλλινών. Επομένως, στην παρούσα διατριβή αναδεικνύεται η πιθανή προληπτική/θεραπευτική αξία των πολυφαινολών των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των αποκαροτενοειδών του κρόκου Κοζάνης έναντι του καταρράκτη και οξειδωτικών βλαβών.