Μελέτη της επίδρασης της οικογένειας του EGFR στον καρκίνο του μαστού
Authors: Ζώη Ηλιάννα 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Ο human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) υπερεκφράζεται στο 20-30% των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού (ΚΜ) και σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Σηματοδοτικά μονοπάτια καθοδικά του υποδοχέα receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) παίζουν κεντρικό ρόλο στον ΚΜ. Το σηματοδοτικό μονοπάτι RANKL/RANK εμπλέκεται στον HER-2(+) ΚΜ. Ο μοριακός μηχανισμός της συμμετοχής του στην καρκινογένεση παραμένει αδιερεύνητος. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της εμπλοκής του RANK υποδοχέα, και του σηματοδοτικού μονοπατιού του NF-κB στην ογκογένεση των HER-2(+) καρκινωμάτων μαστού (ΚΜ). Επιπλέον στόχος είναι η αποσαφήνιση του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης της RANKL/RANK σηματοδότησης από μέλη της οικογένειας EGFR μέσω πιθανής φυσικής αλληλεπίδρασης, επηρεάζοντας βασικές κυτταρικές ιδιότητες. Τελικός στόχο της μελέτης αποτελεί η in vitro αξιολόγηση της συνδυαστικής αναστολής των RANK και EGFR υποδοχέων στην εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων γεγονός που συμβάλει σε νέες πιθανές θεραπευτικές προτάσεις. Υλικά και Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ΚΜ, SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-453. Μελετήθηκε η έκφραση των RANK και RANKL, μέσω RT-PCR, Western-Blot και τεχνικές ανοσοφθορισμού. Η αλληλεπίδραση του RANK με τον HER-2 ανιχνεύθηκε μέσω της μεθόδου Proximity Ligation Assay (PLA), η οποία επιτρέπει την οπτικοποίηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Η ενεργοποίηση του NF-κB μονοπατιού μελετήθηκε μέσω Western-Blot. Χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς trastuzumab (T), pertuzumab (P), denosumab (D) των δύο μελετώμενων μονοπατιών. Εφαρμόστηκαν λειτουργικές δοκιμασίες μετανάστευσης, απόπτωσης και πολλαπλασιασμού. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μελετήθηκε εκτιμώντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων με τη δοκιμασία ΧTT και του clonogenic assay, το μεταναστευτικό δυναμικό με τη βιοδοκιμή προσομοίωσης τραύματος δι’ αμυχής (Scratch-Wound Healing Assay), ενώ η απόπτωση μέσω FACS έπειτα από χρώση των κυττάρων με ανεξίνη V. Αποτελέσματα: Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχεα RANK και του συνδέτη του RANKL εντοπίστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ο υποδοχέας RANK βρέθηκε ότι διμερίζεται με τα μέλη της οικογένειας EGFR. Ο αριθμός των διμερών RANK/ HER-2 ανά κύτταρο φαίνεται να εξαρτάται από την έκφραση του HER-2 (SKBR3:5.4,BT474:8.2,MCF7:0.7,MDA-MB-453:0.3). Τα διμερή RANK/ HER-2 μειώνονται παρουσία των αναστολέων Denosumab (D), Trastuzumab (T) και Pertuzumab (P), ενώ αυξάνονται παρουσία του RANKL (R) στα κύτταρα SKBR3 (m:5.4, D:1.2, T:1.9, DT:0.6, TP:1, DTP:0.4, R:11.8) και BT474 (m:8.2, D:3.1, T:4.3, DT:0.7, TP:3.4, DTP:3.2, R:11.6). Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με τους αναστολείς μειώνει περαιτέρω την ενεργοποίηση του μονοπατιού NF-κB σε σχέση με τη μονή στόχευση. Η αναστολή των RANKL και HER-2 στη κυτταρική σειρά SKBR3 έχει ως αποτέλεσμα τον μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αυξημένη απόπτωση και χαμηλότερο μεταναστευτικό δυναμικό συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου (m) ενώ αντίθετες τιμές παρατηρήθηκαν παρουσία RANKL. Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με D, T και P πλεονεκτεί έναντι της μονής στόχευσης στις λειτουργικές δοκιμασίες. Το denosumab κατέστειλε την NF-κΒ σηματοδότηση και ελάττωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού στα καρκινικά κύτταρα MDA-MB-453. Η κυτταρική σειρά MCF7 δεν ανταποκρίθηκε στους αναστολείς. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν μια νέα φυσική και μοριακή συσχέτιση μεταξύ των HER-2 και RANK μονοπατιών, η οποία επηρεάζει την εξέλιξη των HER-2(+) ΚΜ. Επιπλέον, παρουσιάζονται ενδείξεις που καθιστούν τη συνδυαστική στόχευση των RANKL, HER-2 ως ωφέλιμη θεραπευτική στρατηγική, η οποία θα πρέπει να ελεγχθεί περαιτέρω σε συγκεκριμένους ασθενείς με ΚΜ.