Λειτουργική ανάλυση των φωσφατασών διπλής εξειδίκευσης (DUSPs) στη drosophila melanogaster
Authors: Καρκαλή Αικατερίνη 
Published: August 2021

Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των ενεργοποιούµενων από µιτογόνα ερεθίσµατα πρωτεΐνικών κινασών [ Mitogen Activated Protein Kinases, (MAPKs)] είναι εκτενώς µελετηµένα και ρυθµίζουν πληθώρα βιολογικών διαδικασιών, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση και η ωσµορύθµιση. Μέχρι στιγµής, έχουν χαρακτηριστεί τρεις υποοικογένειες των MAPKs, αυτή των ελεγχόµενων από εξωκυττάρια ερεθίσµατα κινασών [ Extracellular signal Regulated Kinases, (ERK)], η υποοικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών του αµινοτελικού άκρου του µεταγραφικού παράγοντα c -Jun [c-Jun N-terminal Kinases, (JNK)] και τέλος η υποοικογένεια των p38 κινασών. Οι κινάσες JNK και p38, συνιστούν τις ενεργοποιούµενες από στρες πρωτεϊνικές κινάσες [Stress Activated Protein Kinases, (SAPKs)] καθώς η ενεργοποίηση τους επάγεται κατά ειδικό τρόπο σε συνθήκες παρειβαλλοντικού στρες. Η ένταση και η διάρκεια της ενεργοποίησης των MAPKs έχουν δειχθεί να επηρεάζουν την τελική απόκριση του κυττάρου σε δεδοµένο ερέθισµα. Οι φωσφατάσες διπλής εξειδίκευσης [Dual Specificity Phosphatases, (DUSPs)] αποτελούν κύριους ρυθµιστές της ενεργότητας των MAPΚs κατά την διάρκεια της ανάπτυξης, της καρκινικής εξαλλαγής, καθώς επίσης και υπό συνθήκες περιβαλλοντικού στρες. Οι DUSPs ανήκουν στην υπέρ-οικογένεια των πρωτεϊνικών φωσφατασών τυροσίνης [Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs)]. Η ενζυµική τους ενεργότητα βασίζεται στην κυστεΐνη του ενεργού τους κέντρου, ενώ δύνανται να αποφωσφορυλιώσουν τόσο κατάλοιπα φώσφο-τυροσίνης όσο κατάλοιπα φώσφο-θρεονίνης. Στα θηλαστικά, αρκετά µέλη της οικογένειας των DUSPs εµφανίζουν εξειδίκευση έναντι των MAPKs. Η ανάλυση του γονιδιώµατος της Drosophila σε συνδυασµό µε γενετικές µελέτες έδειξε ότι τα βασικά χαρακτηριστικά της σηµατοδότησης µέσω MAPKs είναι συντηρηµένα µεταξύ της Drosophila και των θηλαστικών, καθιστώντας τη Drosophila κατάλληλο οργανισµό – πρότυπο για την µελέτη τους. Αντίστοιχα, έξι DUSPs έχουν εντοπιστεί στο γονιδίωµα της Drosophila, εκ των οποίων η φωσφατάση Puckered είναι το πιο καλά χαρακτηρισµένο µέλος τους. Η Puckered αρχικά ταυτοποιήθηκε ως η JNK-ειδική φωσφατάση υπεύθυνη για την καταστολή της σηµατοδότησης µέσω JNK, κατά τα αρχικά στάδια του «ραχιαίου κλεισίµατος» (dorsal closure), ενός µορφογενετικού γεγονότος της εµβρυϊκής ζωής της Drosοphila melanogaster. Μετέπειτα µελέτες επιβεβαίωσαν την συµµετοχή της φωσφατάσης Puckered και σε άλλες αναπτυξιακές διαδικασίες. Στην ενήλικη Drosophila, η δράση της φωσφατάσης Puckered έχει δειχτεί να επηρεάζει την ανοσολογική απόκριση, την επούλωση τραυµάτων, την ανοχή του στρες καθώς επίσης την επιµήκυνση της βιωσιµότητας του οργανισµού. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η λειτουργική ανάλυση των DUSPs στη Drosophila melanogaster. Συγκεκριµένα, το ενδιαφέρον µας εστιάστηκε στην φωσφατάση Puckered και στην ανάλυση των µηχανισµών µετα-µεταφραστικής ρύθµισης της δράσης της. Παράλληλα επιχειρήσαµε να διαλευκάνουµε τον λειτουργικό ρόλο της Puckered in vivo, κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του νευρικού συστήµατος του εντόµου. In silico ανάλυση της αµινοξικής ακολουθίας της Puckered έδειξε εννέα πιθανές θέσεις MAPK-εξαρτώµενης φωσφορυλίωσης, γεγονός που µας ώθησε να εξετάσουµε κατά πόσο η Puckered φωσφορυλιώνεται από αυτή την κατηγορία κινασών. Για τον σκοπό αυτό εκφράσαµε την Puckered στο ετερόλογο σύστηµα της κυτταρικής σειράς HEK293 και επιδράσαµε στα κύτταρα µε αρσενικό νάτριο προκειµένου να επάγουµε την ενεργότητα των ΜAPKs. Το αρσενικό νάτριο είναι ισχυρός επαγωγέας συνθηκών οξειδωτικού στρες στο κύτταρο και ενεργοποιεί κατά κύριο λόγο τις SAPKs, ενώ, σε µικρότερο βαθµό, ενεργοποιούνται και οι κινάσες ERK1/2. Η επίδραση µε αρσενικό νάτριο σε κύτταρα, που είχαν υποστεί διαµόλυνση ώστε να εκφράζουν την Puckered, είχε ως αποτέλεσµα την επιβράδυνση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας της Puckered σε αποδιατακτικά πηκτώµατα ακρυλαµιδίου. Η εν λόγω αλλαγή στην ηλεκτροφορητική συµπεριφορά της Puckered οφείλονταν σε φωσφορυλίωση του µορίου της, όπως διαπιστώσαµε µετά από επίδραση µε το ένζυµο λφωσφατάση σε ανοσο-κατακρηµνίσµατα της πρωτεΐνης, τα οποία είχαν προκύψει από εκχυλίσµατα κυττάρων που συν-έκφραζαν την Puckered µε την ενεργό µορφή της κινάσης JNK. Η συν-έκφραση της Puckered µε τις συνεχώς ενεργές µορφές των κινασών JNK και p38, στα κύτταρα ΗΕΚ293, οδηγεί σε φωσφορυλίωση του µορίου της, ενώ αντίθετα, η επαγωγή της ενεργότητας των ERK, µετά από διέγερση των κυττάρων µε τον επιδερµικό αυξητικό παράγοντα, δεν είχε καµία επίδραση στο µόριο της Puckered. Επιπροσθέτως, η ταυτόχρονη αναστολή των κινασών JNK και p38, µε χρήση των χηµικών αναστολέων SP600125 και SB203580, µείωσε σηµαντικά τα επίπεδα της επαγόµενης από αρσενικό νάτριο φωσφορυλίωσης της Puckered, ενώ η παρεµπόδιση της ενεργοποίησης των ERK1/2 µέσω του αναστολέα PD98059 δεν επέφερε καµία αλλαγή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του µορίου της. Συνεπώς από τα αποτελέσµατα αυτών των πειραµάτων οδηγηθήκαµε στο συµπέρασµα ότι η Puckered φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες JNK και p38 σε συνθήκες οξειδωτικού στρες επαγόµενου από αρσενικό νάτριο. Η ανάλυση ανοσο-κατακρηµνισµάτων της Puckered µέσω φασµατογραφίας µαζών οδήγησε στην ανίχνευση φωσφορυλίωσης του καταλοίπου σερίνης της θέσης 413, η οποία ωστόσο ανιχνεύθηκε τόσο παρουσία όσο και απουσία συνθηκών οξειδωτικού στρες. Βάση της παρατηρούµενης επιβράδυνση της Puckered σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, εικάζουµε ότι η θέση φωσφορυλίωσης στο κατάλοιπο σερίνης 413, δεν είναι µοναδική και ότι πιθανώς υπάρχουν και άλλες θέσεις, οι οποίες διέφυγαν ανίχνευσης στο σύστηµα µας. Στη συνέχεια, προκειµένου να εξετάσουµε την επίδραση της φωσφορυλίωσης στη δράση της Puckered εξετάσαµε τόσο την αλληλεπίδραση της µε τις SAPKs όσο και την ενεργότητα της έναντι της JNK. H αλληλεπίδραση της Puckered µε την κινάση p38 ανιχνεύθηκε τόσο υπό φυσιολογικές όσο και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες, αν και σε συνθήκες στρες ήταν ενισχυµένη. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση της Puckered µε την κινάση JNK ήταν ανιχνεύσιµη µόνο σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Συνεπώς η Puckered αλληλεπιδρά µε τις SAPKs ενώ η αλληλεπίδραση ενισχύεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τέλος, σε πειράµατα όπου η επίδραση µε αρσενικό νάτριο στα κύτταρα πραγµατοποιήθηκε για διαφορετικούς χρόνους επώασης, παρατηρήσαµε ότι η φωσφορυλίωση της Puckered γίνεται σταδιακά φτάνοντας στο µέγιστο σηµείο της στα 60 λεπτά επώασης. Η σύγκριση των επιπέδων ενεργοποίησης της κινάσης JNK παρουσία και απουσία τις Puckered, στους ίδιους χρόνους επώασης, έδειξε ότι η παρουσία της Puckered επιφέρει στατιστικά σηµαντική µείωση των επιπέδων ενεργοποίησης της JNK, η οποία όµως είναι ορατή µέχρι τα 60 λεπτά επώασης, δηλαδή µέχρι τη χρονική στιγµή όπου παρατηρείται το µέγιστο της φωσφορυλίωσης του µορίου της. Συνεπώς, η φσωφορυλίωση της Puckered πιθανώς να επηρεάζει αρνητικά την δράση της ως φωσφατάση. Με στόχο την in vivo µελέτη της Puckered κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του νευρικού συστήµατος της Drosophila melanogaster, προχωρήσαµε στην ανάπτυξη των κατάλληλων εργαλείων. Αρχικά δηµιουργήσαµε διαγονιδιακές σειρές σιώπησης, οι οποίες θα µας επέτρεπαν την χωροχρονικά κατευθυνόµενη σιώπηση του γονιδίου puckered στη Drosophila, ενώ τη συνέχεια, αναπτύξαµε πολυκλωνικό ορό έναντι του καρβοξυ-τελικού τµήµατος της πρωτεΐνης µε στόχο την ανίχνευση του ενδογενούς µορίου στους ιστούς του εντόµου. Η σιώπηση του γονιδίου puckered σε όλους τους µετα-µιτωτικούς νευρώνες του εντόµου, τόσο κατά τη διάρκεια της εµβρυϊκής ανάπτυξης όσο και κατά τα αναπτυξιακά στάδια της προνύµφης 1ου και 2ου σταδίου, είχε ως αποτέλεσµα την κατά 100% θνησιµότητα του οργανισµού. Ο χαρακτηρισµός του φαινοτύπου σε έµβρυα στα οποία είχε προηγηθεί σιώπηση του γονιδίου puckered σε όλους του µετα-µιτωτικούς νευρώνες έδειξε αλλοιώσεις στην µορφολογία τόσο του αξονικού ικριώµατος στο Κεντρικό Νευρικό Σύστηµα (ΚΝΣ), όσο και στην δοµή των περιφερικών νεύρων. Αντίστοιχος ήταν ο φαινότυπος της σιώπησης του γονιδίου puckered στα κύτταρα της µέσης γραµµής του ΚΝΣ. Η γενετική ανατοµή της εν λόγω κυτταρικής οµάδας έδειξε ότι το puckered κατέχει ρόλο στους νευρώνες και όχι στα γλοιακά κύτταρα της µέσης γραµµής. Τα αποτελέσµατα αυτά ενισχύονται και από την µελέτη του προτύπου έκφρασης του puckered στο εµβρυϊκό νευρικό σύστηµα, όπου δεν εντοπίστηκε έκφραση του γονιδίου σε γλοιακά κύτταρα. Αντίθετα, η ανάλυση εµβρύων σειρών αναφοράς του puckered έδειξε ότι το εν λόγω γονίδιο εκφράζεται σε συγκεκριµένους πληθυσµούς νευρώνων, τόσο στην κοιλιακή νευρική χορδή όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστηµα. Συγκεκριµένα, η έκφραση του puckered ανιχνεύθηκε στου κινητικούς νευρώνες aCC/RP2 και U, καθώς και τους ενδιάµεσους νευρώνες pCC και EL. Ο ανοσο-εντοπισµός της ενδογενούς Ρuckered µε τον πολυκλωνικό ορό που αναπτύξαµε απέδωσε σήµα στις διαµήκεις και εγκάρσιες συνδετικές οδούς του αξονικού ικριώµατος, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο της Ρuckered στους άξονες. Αξίζει να σηµειωθεί, ότι το πρότυπο έκφρασης του puckered είναι δυναµικό και αυξάνει σε πολυπλοκότητα κατά τη εξέλιξη της εµβρυϊκής ανάπτυξης. Τέλος, διαπιστώσαµε ότι το puckered εκφράζεται και στο ΚΝΣ του ενηλίκου της Drosophila, όπου εντοπίζεται τόσο σε νευρικά όσο και σε γλοιακά κύτταρα. Η διακοπή της νευροδιαβίβασης στο κύκλωµα των νευρώνων που εκφράζουν το puckered οδηγεί σε παράλυση του εντόµου.