Επιδημιολογική μελέτη των πλασμιδιακών μηχανισμών αντοχής στις κινολόνες σε εντεροβακτηριακά που απομονώνονται από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ΑΤΤΙΚΟΝ
Authors: Μαργαρίτης Αθανάσιος 
Published: September 2021

ΠΕΡΙΛΗΨΗΑπό το 1998, πέραν των ήδη γνωστών χρωμοσωμιακών μηχανισμών, έχουν ανακαλυφθεί τρεις μηχανισμοί για την πλασμιδιακά κωδικοποιούμενη αντοχή στις κινολόνες (PMQR). Ο πρώτος αφορά τα πλασμιδιακά γονίδια qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, και qnrVC που κωδικοποιούν πρωτεΐνες της οικογένειας επαναλλαμβανόμενων πενταπεπτιδίων που προστατεύουν την DNA γυράση και την τοποϊσομεράση IV από την δράση των κινολονών. Ο δεύτερος μηχανισμός πλασμιδιακής αντοχής, περιλαμβάνει ακετυλίωση των κινολονών από μια παραλλαγή της κοινής ακετυλοτρανσφεράσης AAC (6 ') – Ιb που τροποποιεί τις αμινογλυκοσίδες. Ο τρίτος μηχανισμός είναι μια αντλία ενεργητικής εκροής που παράγεται από τα πλασμιδιακά γονίδια QepAB και OqxAB. Η PMQR έχει βρεθεί σε κλινικά αλλά και περιβαλλοντικά στελέχη σε όλο τον κόσμο και φαίνεται να εξαπλώνεται με τη πάροδο του χρόνου. Η ύπαρξη των γονιδίων αυτών (PMQR), δεν φαίνεται να προσφέρει ανιχνεύσιμη αντοχή στις κινολόνες σύμφωνα με τα κριτήρια της EUCAST (>2mgL για την σιπροφλοξασίνη). Όταν όμως, συνδυαστούν με χρωμοσωμικές μεταλλαγές αυξάνουν σε αξιοσημείωτα επίπεδα την αντοχή στις κινολόνες, ενώ η συνύπαρξη τους με γονίδια αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών, όπως οι β-λακταμάσες και οι καρβαπενεμάσες, στα ίδια συζευκτικά πλασμίδια, υποδηλώνει τη δυνατότητα επιλογής και διασποράς πολυαντοχής με την άσκοπη χρήση των κινολονών.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της συχνότητας εμφάνισης πλασμιδιακά κωδικοποιούμενης αντοχής στις κινολόνες μέσω της ομάδας γονιδίων qnr, του γονιδίου aac(6’)Ib-cr και των γονιδίων αντλίας qepA και oqxAB, σε Gram-αρνητικά στελέχη τα οποία απομονώνονται από καλλιέργειες ασθενών που νοσηλεύονται σε μεγάλο Πανεπιστημιακό νοσοκομείο της Αθήνας. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η συνύπαρξη τους με γόνους αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών όπως οι β-λακταμάσες και οι καρβαπενεμάσες, στα ίδια συζευκτικά πλασμίδια. Τέλος εκτιμήθηκε η κλινική επίδραση των πλασμιδιακά κωδικοποιούμενων γονιδίων αντοχής στις κινολόνες, μέσω της επίπτωσης στη βακτηριοκτόνο δράση και στο παράθυρο επιλογής μεταλλαγών (mutant selection window) MSW, της σιπροφλοξασίνης και της λεβοφλοξασίνης.Μελετήθηκαν 96 στελέχη Gram-αρνητικά στελέχη που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες, και 340 στελέχη E.coli (n=185) και K.pneumoniae (n=155) που απομονώθηκαν από ουρoλοιμώξεις, πύα ή βρογχικές εκκρίσεις στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων και Αντιμικροβιακής Θεραπείας της Δ΄ Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ‘Αττικόν’, το διάστημα Οκτώβριος 2008 έως Μάρτιος 2010. Τα στελέχη αυτά, παρουσιάζαν αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ και ευαισθησία ή αντοχή στις νεώτερες κινολόνες. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε αυστηρά ένα στέλεχος ανά ασθενή. Διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα ανίχνευσης των PMQR γονιδίων ήταν 17,2% μεταξύ όλων των ανθεκτικών στο ναλιδιξικό οξύ στελεχών που ελέγχθηκαν και 7,3% μεταξύ αυτών που είχαν απομονωθεί από καλλιέργειες αίματος. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η πλασμιδιακά κωδικοποιούμενη αντοχή στις κινολόνες μπορεί να είναι πιο συχνή από ότι έχει αναφερθεί μέχρι τώρα στη χώρα μας. Επίσης, με βάση αυτά που γνωρίζουμε, για πρώτη φορά ανιχνεύτηκαν στο ίδιο πλασμίδιο τα γονίδια qnrS1 και aac(6')- Ιb-cr.Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτής της μελέτης με μετασυζευγμένα/μετασχηματισμένα στελέχη στα οποία είχε μεταφερθεί πλασμίδιο με ένα ή περισσότερα γονίδια PMQR, συμφωνούν με την τρέχουσα βιβλιογραφία που δείχνει ότι ένα PMQR γονίδιο δρώντας μόνο, παρέχει μόνο χαμηλού επιπέδου αντοχή στις κινολόνες, συγκρίσιμη με εκείνη που παρέχει ή πρώτη μετάλλαξη στη DNA γυράση. Επίσης, είδαμε ότι το qnrS1 είναι υπεύθυνο για χαμηλότερου επιπέδου αντοχή σε σύγκριση με τα qnrA1 και qnrB2 όταν εκφράζεται σε εργαστηριακά στελέχη. Πρόσθετα γονίδια PMQR ή / και μεταλλάξεις στην QRDR μπορεί να αυξήσουν συνεργικά την MIC πάνω από τα καθορισμένα επίπεδα ευαισθησίας. Εντούτοις, η πιο σημαντική συνέπεια των γονιδίων PMQR, είναι ο ρόλος τους στην επιλογή στελεχών με υψηλότερου επιπέδου αντοχή στις κινολόνες, καθώς και την συν-επιλογή άλλων γονιδίων αντοχής που εδράζονται στο ίδιο πλασμίδιο, ειδικά γονίδια που κωδικοποιούν β-λακταμάσες, συμπεριλαμβανομένων των ESBLs και των καρβαπενεμασών. Στην παρούσα μελέτη, ο προσδιορισμός της MPC χρησιμοποιώντας κλινικά και εργαστηριακά στελέχη, επιβεβαίωσε τη συμβολή των γονιδίων PMQR στη διεύρυνση του MSW τόσο της σιπροφλοξασίνης όσο και της λεβοφλοξασίνης (για τα περισσότερα από τα στελέχη που εξετάστηκαν), σε επίπεδα πάνω από αυτά που επιτυγχάνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας με το αντίστοιχο φάρμακο,, καθιστώντας την επίτευξη του κριτηρίου AUC/MPC, αδύνατον να καλυφθεί με συμβατικές δόσεις. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μονοθεραπεία με κινολόνη θα έχει σαν απότοκο την επιλογή υψηλού επιπέδου αντοχής στις κινολόνες και πιθανόν την κλινική αποτυχία κατά τη διάρκεια της θεραπείας.Οι δοκιμασίες του χρόνου θανάτωσης που πραγματοποιήθηκαν με χρήση ευαίσθητων στις κινολόνες κλινικών και εργαστηριακών στελεχών επιβεβαίωσαν ότι η παρουσία των γονιδίων PMQR μπορεί ενίοτε να θέσει σε κίνδυνο τη βακτηριοκτόνο δράση της σιπροφλοξασίνης και της λεβοφλοξασίνης, ειδικά όταν εκφράζονται σε στέλεχη E.cloacae, S.maltophilia ή K.pneumoniae και, όταν συνυπάρχουν περισσότερα του ενός γονίδια PMQR.Τέλος, η αξιολόγηση της επίδρασης του ενοφθαλμίσματος στην ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα, στην παρούσα μελέτη, αποκάλυψε ότι η MIC όλων των κλινικών στελεχών αυξήθηκε πάνω από το όριο ευαισθησίας και για τις δύο κινολόνες που μελετήθηκαν, με την παρουσία ενός υψηλότερου ενοφθαλμίσματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι, στο πλαίσιο μιας κλινικής λοίμωξης με υψηλό μικροβιακό φορτίο, τα παθογόνα που φέρουν PMQR, μπορούν να οδηγήσουν σε αποτυχία την θεραπεία με κινολόνες. Συμπερασματικά, διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα ανίχνευσης γονιδίων PMQR σε πληθυσμό Gram-αρνητικών μικροβίων είναι υψηλότερη από οτι είχε μέχρι σήμερα αναφερθεί στη χώρα μας. Τα γονίδια PMQR μπορούν να θέσουν σε κίνδυνο την in vitro αποτελεσματικότητα των κινολονών, εάν εκφραστούν σε ένα ευνοϊκό γενετικό υπόβαθρο, μπορούν να διευρύνουν το MSW των κινολονών διευκολύνοντας την επιλογή ανθεκτικών στελεχών και τέλος, να συμβάλλουν στην κλινική αποτυχία σε λοιμώξεις με υψηλό μικροβιακό φορτίο. Η εμπειρική χρήση κινολονών πρέπει να γίνεται με σκεπτικισμό και να αποφεύγεται η χορήγηση τους για λοιμώξεις από στελέχη με αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ ή με MIC≥0.25mg/L στη λεβοφλοξασίνη ή τη σιπροφλοξασίνη. Τα γονίδια PMQR αποτελούν μια πραγματική απειλή που εντούτοις, μπορεί να διαλάθει της προσοχής. Η παρουσία τους συχνά είναι δύσκολο να προσδιοριστεί ελλείψει κατάλληλων φαινοτυπικών δεικτών και η στρατηγική μακροπρόθεσμης προοπτικής επιτήρησης των γονιδίων PMQR φαίνεται οτι είναι απαραίτητη. Περισσότερες μελέτες απαιτούνται στο μέλλον, με επίκεντρο την ανάλυση των πλασμιδίων και των γενετικών δομών πάνω στις οποίες εδράζονται τα PMQR για την καλύτερη κατανόηση της επιτυχούς διάδοσης τους.