Ταυτοποίηση νέων μη κωδικών RNAs (ncRNAs), μέσω αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS), και μελέτη της έκφρασής τους σε καρκινικά κύτταρα και στερεούς όγκους
Authors: Διαμαντόπουλος Ιωάννης-Μάριος 
Published: April 2022

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου και ο καρκίνος του προστάτη αποτελούν κύριες κατηγορίες στερεών κακοήθων όγκων, ενώ η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία αποτελεί έναν τύπο αιματολογικής κακοήθειας. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ο τρίτος κατά σειρά συνηθέστερος καρκίνος που διαγιγνώσκεται σε άνδρες και γυναίκες, αριθμώντας εκατοντάδες χιλιάδες νέα περιστατικά παγκοσμίως, σε ετήσια βάση. Ο καρκίνος αυτός αποτελεί μια από τις κυρίαρχες (3η στις γυναίκες και 2η στους άνδρες) αιτίες θανάτου από καρκίνο. Παράλληλα, ο καρκίνος του προστάτη (PCa) είναι ο τέταρτος σε συχνότητα εμφάνισης καρκίνος στην Ευρώπη και είναι ο πιο συχνός μη δερματικός καρκίνος μεταξύ των ανδρών. Οι αιματολογικές κακοήθειες είναι ετερογενής ομάδα νοσημάτων του αιμοποιητικού ιστού και συνολικά, αντιπροσωπεύουν περίπου το 10% του συνόλου των καρκίνων. Μεγάλο ζητούμενο αποτελεί η ανακάλυψη νέων ευαίσθητων μοριακών βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και πρόβλεψη της θεραπευτικής αγωγής του καρκίνου. Στην αλληλούχηση επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing, NGS) συγκαταλέγονται σύγχρονες μεθοδολογίες για ευρείας κλίμακας μελέτες του γονιδιώματος και του μεταγραφώματος, που επιτρέπουν την παράλληλη αλληλούχηση ενός εξαιρετικά μεγάλου αριθμού μορίων νουκλεϊκών οξέων χωρίς να απαιτείται ο σχεδιασμός ενός εξίσου μεγάλου αριθμού εκκινητών. Για τους λόγους αυτούς, το NGS αποτελεί «επανάσταση» στα πεδία της Μοριακής Βιολογίας. Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της τεχνολογίας NGS είναι η αλληλούχηση RNA (RNA-seq), μια μέθοδος για τη λεπτομερή ανάλυση του μεταγραφώματος. Η εφαρμογή του RNA-seq και τα σύγχρονα εργαλεία βιοπληροφορικής φανέρωσαν την ύπαρξη μιας πληθώρας μη κωδικών μορίων RNA (non coding RNAs, ncRNAs) που μεταγράφονται από το γονιδίωμα. Τα ncRNA χωρίζονται βάσει μεγέθους σε δυο ευρείς κατηγορίες, τα μικρού μήκους ncRNA (sncRNA) και τα μεγάλα ncRNA (lncRNA) μόρια.Τα δεδομένα που έχουν προκύψει μέσα από τις έρευνες οι οποίες σχετίζονται με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος υποδηλώνουν ότι ποσοστό μεγαλύτερο από το 80% του ανθρώπινου DNA είναι μεταγραφικά ενεργό. Ωστόσο, λιγότερο από το 3% κωδικοποιεί πρωτεΐνες. Τα μη κωδικά μόρια RNA διακρίνονται σε ρυθμιστικά ncRNAs καθώς και σε "housekeeping" ncRNAs. Τα τελευταία περιλαμβάνουν τα ριβοσωμικά RNAs (rRNAs) και τα μεταφορικά RNAs (tRNAs). Τα ρυθμιστικά ncRNAs ανάλογα με το μέγεθος τους μπορούν να διαχωριστούν σε δύο ομάδες: τα μικρά ncRNAs (<200 νουκλεοτίδια) και τα μεγάλα (long non coding RNAs, lncRNAs, >200 νουκλεοτίδια). Τα μικρά μη κωδικά μόρια RNA (sncRNA) περιλαμβάνουν τα microRNAs (miRNAs), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs), τα μικρά πυρηνισκικά RNAs (snoRNAs), τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs), τα RNAs που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη PIWI, (piRNAs) κ.ά. Αξίζει να σημειωθεί πως το μεγαλύτερο ποσοστό του ανθρώπινου κυτταρικού RNA αποτελείται από ριβωσιμικό rRNA. Άλλα είδη, όπως τα mRNA, snoRNA και snRNA εκφράζονται σε μικρότερα επίπεδα από τα rRNA και tRNA. Τα microRNAs μπορεί να εμφανίζουν και αυτά υψηλά επίπεδα έκφρασης, αλλά αυτό εξαρτάται από τον τύπο και την λειτουργία του κάθε κυττάρου (π.χ microRNA-92a-3p). Πολλές φορές στα καρκινικά δείγματα βρίσκονται να έχουν παρεκκλίνουσα έκφραση από τα φυσιολογικά δείγματα. Η αλλαγή της έκφρασης των microRNAs επηρεάζει με τη σειρά της την έκφραση μερικών δεκάδων–εκατοντάδων γονιδίων. Η έκφραση των microRNAs επηρεάζεται και αυτή από την υπερμεθυλίωση και την υπομεθυλίωση των CpG νησίδων. Όσον αφορά στα lncRNAs, συνολικά, παρουσιάζουν σχετικά χαμηλή έκφραση. Τέλος, αξίζει να αναφερθεί πως ανακαλύπτονται ολοένα και περισσότερα είδη μη κωδικών RNA, όπως τα enhancer RNAs (eRNAs), τα οποία θεωρείται πως δρουν ρυθμίζοντας την τρισδιάστατη δομή των χρωμοσωμάτων κοντά στις θέσεις της μεταγραφής. Ένα άλλο παράδειγμα είναι, επίσης, τα κυκλικά RNAs που λειτουργούν πολλές φορές σαν «σφουγγάρι» των microRNAs, καθώς εμφανίζουν ομολογία με αυτά και εμποδίζουν με αυτόν τον τρόπο την αλληλεπίδρασή τους με άλλα μόρια.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στη μοριακή ταυτοποίηση, μελέτη και αξιολόγηση νέων βιομορίων τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί βιοδείκτες, κυρίως στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του προστάτη αλλά και στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, εφαρμόσθηκαν μοριακές μεθοδολογίες αιχμής – όπως η αλληλούχηση επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing, NGS) – για την ταυτοποίηση, ανάπτυξη πρωτοκόλλων προσδιορισμού και τη μελέτη έκφρασης νέων μικρών μη κωδικών μορίων RNA (sncRNA). Με τη συγκεκριμένη προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση 10 νέων μικρών μη κωδικών μορίων RNA τα οποία και καταχωρήθηκαν στην αντίστοιχη τράπεζα δεδομένων (GeneBank® of NCBI). Ακολούθησε η ανάπτυξη και η επικύρωση μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού τους σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφρασή τους σε πλήθος καρκινικών σειρών αλλά και σε καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου και προστάτη. Παράλληλα, μελετήθηκε η δράση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου ενώ πραγματοποιήθηκε in vitro μελέτη της βιωσιμότητας και του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς και μελέτη της κυτταροτοξικότητας των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι α)Στα κύτταρα της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς παχέος εντέρου Caco-2, που επωάστηκαν με το αντικαρκινικό φάρμακο Irinotecan παρατηρείται αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του MT815884 μετά από 24 ώρες η οποία ελαττώνεται στις 48 και 72 ώρες επώαση. Όσον αφορά στην επίδραση του Elotaxin, παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση σχετιζόμενη με το χρόνο επώασης, φαινόμενα που δεν παρατηρήθηκαν με το φάρμακο μεθοτρεξάτη. β) Η έκφραση του μη κωδικού μορίου RNA 28S rRF (MT815881) σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη βρέθηκε να αποτελεί ένα νέο, υποψήφιο μοριακό βιοδείκτη δυσμενούς πρόγνωσης της νόσου. γ) Η έκφραση του μικρού μη κωδικού μορίου miR-16-5p βρέθηκε να αποτελεί ένα νέο, υποψήφιο μοριακό βιοδείκτη δυσμενούς πρόγνωσης στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. δ) Η έκφραση του miR-92a-3p σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος βρέθηκε επίσης να αποτελεί ένα νέο, ανεξάρτητο μοριακό βιοδείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία.Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε η δημιουργία ενός προγνωστικού συστήματος μοριακής ταξινόμησης των ασθενών σε χαμηλού και υψηλού κινδύνου, αναφορικά με τον κίνδυνο εμφάνισης υποτροπής σχετικά με τα μελετώμενα μόρια μη κωδικών μορίων RNA.