Διερεύνηση μηχανισμών συνδυαστικής δράσης φωτός, φωτοευαίσθητων ουσιών και φυσικών αντιοξειδωτικών σε μοντέλα νεοπλασιών με ανάπτυξη οπτικών μεθόδων
Authors: Πετρή Ασπασία 
Published: September 2021

Οι αλληλεπιδράσεις του φωτός με βιολογικούς ιστούς, η κατανόηση των μηχανισμών που τις διέπουν και η δυνατότητα αξιοποίησης αυτών για διαγνωστικούς ή και θεραπευτικούς σκοπούς απασχολεί την ανθρωπότητα σχεδόν από την απαρχή της ιστορίας. Τα τελευταία χρόνια συστηματική έρευνα διεξάγεται στην κατεύθυνση τόσον της διάγνωσης, αναπτύσσοντας τεχνολογίες «οπτικής βιοψίας», όσον και στην κατεύθυνση της θεραπείας νεοπλασιών και μη καρκινικών αλλοιώσεων. Κυρίαρχο ρόλο στις μεθοδολογίες θεραπείας, μέσω της αξιοποίησης των δυνατοτήτων του φωτός, κατέχει η φωτοδυναμική θεραπεία. Σκοπό της παρούσας διατριβής απετέλεσε η διερεύνηση των μηχανισμών δράσης φωτός και φωτοευαίσθητων ουσιών με μοντέλα νεοπλασιών, όπως αυτοί τροποποιούνται με την εισαγωγή μεθόδων νανοτεχνολογίας και αξιοποίηση της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Εφαρμογή της έρευνας απετέλεσε η βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής δράσης σε καρκινικούς όγκους τριών διαστάσεων εν τω βάθει, με παράλληλη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας, της σοβαρότερης παρενέργειας της φωτοδυναμικής θεραπείας. Αξιοποιήθηκε η πλέον πρόσφατη τεχνολογική εξέλιξη, στην τομή νανοτεχνολογίας - φωτοδυναμικής, ο εγκλεισμός φωτοευαισθητοποιητών σε νανοσωματίδια. Διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί τροποποίησης της συγκέντρωσης των ενδοκυττάριων ελευθέρων ριζών και δραστικών οξυγονούχων ειδών, σε μοντέλα νεοπλασιών, τόσο σε επίπεδο κυττάρου όσον και σε πειραματόζωα, με σκοπό την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης των ελευθέρων ριζών και δραστικών οξυγονούχων ειδών και την καταστολή της ενδοκυττάριας αντιοξειδωτικής άμυνας ώστε να καμφθεί ο ανταγωνισμός που δέχεται η φωτοδυναμική και να ενισχυθεί η δράση της. Διερευνήθηκε η δυνατότητα άρσης της παραμένουσας φωτοευαισθησίας. Προκειμένου να επεκταθεί η εφαρμογή της φωτοδυναμικής θεραπείας σε μη επιφανειακούς καρκινικούς όγκους σε εσωτερικά όργανα του σώματος τέθηκε ως στόχος η ανάπτυξη συστήματος ενδοϊστικής φωτοδυναμικής ακτινοβόλησης. Η παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε σε τέσσερις άξονες:Αρχικά ανεπτύχθησαν μοντέλα καρκίνου του προστάτη τόσο σε επίπεδο κυττάρου (in vitro) όσο και σε επίπεδο μυός (in vivo). Τα μοντέλα αυτά είναι απαραίτητα για τη μελέτη των μηχανισμών δράσης αλλά και για την ανάπτυξη μεθοδολογιών θεραπείας της νόσου. Τα μοντέλα σε επίπεδο κυττάρου επιτρέπουν τη μελέτη των επιδράσεων διαφόρων ερεθισμάτων, ακόμα και σε μοριακό επίπεδο, διευκολύνοντας την εις βάθος κατανόηση των μηχανισμών δράσης διαφόρων παραγόντων. Τα μοντέλα πειραματοζώων είναι ιδιαιτέρως σημαντικά καθώς εξασφαλίζουν την ανάπτυξη καρκινικών όγκων οι οποίοι φαινοτυπικά παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες με τους καρκινικούς όγκους που απαντώνται στον άνθρωπο και επιτρέπουν την ανάπτυξη θεραπευτικών σχημάτων. Ακολούθως ανεπτύχθησαν μεθοδολογίες και μελετήθηκαν οι φωτοφυσικές ιδιότητες και η φωτοδυναμική δράση της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC οι οποίες συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες της ελεύθερης m-THPC. Ο εγκλεισμός φωτοευαισθητοποιητών σε νανοσωματίδια είναι πρόσφατη εξέλιξη στην κατεύθυνση της βελτιστοποίησης των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων των μορίων αυτών. Διαπιστώθηκε η υπεροχή της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC έναντι της ελεύθερης τόσο ως προς τις φωτοφυσικές ιδιότητες όσο και ως προς τη φωτοδυναμική δράση, γεγονός που επιτρέπει τη χορήγηση μικρότερων ποσοτήτων φωτοευαισθητοποιητή για την πρόκληση κυτταρικού θανάτου. Για την ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη αναπτύχθηκε σύστημα ενδοϊστικής ακτινοβόλησης. Μέσω του συστήματος αυτού γινόταν η μεταφορά του φωτός διέγερσης μέσα στον καρκινικό όγκο με τρόπο τέτοιο ώστε να καλύπτεται όλη η έκταση του καρκινικού όγκου, χωρίς να εκτείνεται εκτός των ορίων αυτού. Το σύστημα αποτελείτο από διοδικό laser στα 652 nm με ισχύ εξόδου έως 2 W στο οποίο συνδεόταν οπτική ίνα με γυμνό ακροδέκτη για τη μεταφορά του φωτός μέσα στον καρκινικό όγκο. Παράλληλα, μέσω απεικονιστικού συστήματος αποτελούμενου από CCD κάμερα με κατάλληλη διάταξη φωτισμού προσαρτημένων σε στερεοτακτική διάταξη καταγραφόταν η απόκριση των καρκινικών όγκων στη θεραπεία. Διαπιστώθηκε πως ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία με την εγκλεισμένη σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC μπορεί να θεραπεύσει πλήρως τον καρκινικό όγκο στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη. Η παρατήρηση αυτή, σε συνδυασμό με την υπεροχή της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC και σε επίπεδο κυττάρου, συνηγορούν στην επέκταση των μελετών ενδοϊστικής φωτοδυναμικής θεραπείας με την εγκλεισμένη λιποσωμιακή m-THPC σε κλινικό επίπεδο για τη θεραπεία καρκίνου του προστάτη.Εν συνεχεία διερευνήθηκε η βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων της φωτοδυναμικής δράσης και η ταυτόχρονη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας, η οποία αποτελεί το σοβαρότερο πρόβλημα της φωτοδυναμικής θεραπείας. Ανεπτύχθησαν δυο προσεγγίσεις με στόχο κοινό, τη μεταβολή της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Η πρώτη προσέγγιση αφορούσε τη ρήξη της ενδοκυττάριας αντιοξειδωτικής άμυνας μέσω χορήγησης του αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης, L-buthionine sulfoximine (BSO). Μολονότι ο παράγοντας BSO χρησιμοποιείται για να κάψει την αντίσταση του οργανισμού στις αντικαρκινικές θεραπείες (π.χ. χημειοθεραπεία) και υπάρχουν δεδομένα τα οποία υποστηρίζουν ότι πράγματι ενισχύει την αποτελεσματικότητα των θεραπειών, η δράση του σε συνδυασμό με τη φωτοδυναμική δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά. Απουσιάζουν δε από τη βιβλιογραφία μελέτες της συνδυασμένης δράσης της φωτοδυναμικής με τον αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης στην περίπτωση καρκίνου του προστάτη. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε η πιθανότητα συνέργειας του αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης (BSO) με τη φωτοδυναμική θεραπεία σε επίπεδο μοντέλου κυττάρου καρκίνου του προστάτη. Ο παράγοντας BSO, ανάλογα με τη συγκέντρωση χορήγησης, έδρασε σε ορισμένες περιπτώσεις ανταγωνιστικά ως προς τη φωτοδυναμική, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις ενίσχυσε τη φωτοδυναμική δράση. Η δεύτερη προσέγγιση, στην κατεύθυνση τροποποίησης της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας, αφορούσε στη χορήγηση φυσικού μείγματος δευτερογενών μεταβολιτών με πλούσιες αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Τα μείγματα αυτά σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις δρουν αντιοξειδωτικά, δεσμεύοντας ελεύθερες ρίζες και δραστικά οξυγονούχα είδη. Σε μεγαλύτερες ωστόσο συγκεντρώσεις η δράση τους είναι προ-οξειδωτική. Ισχυρή αντιοξειδωτική / προ-οξειδωτική δράση παρουσιάζουν φυσικά μείγματα πολυφαινολών προερχόμενα από συστατικά φυτών. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε και καθορίστηκε ότι μείγμα πολυφαινολών προερχόμενο από φλοιό πεύκου P.halepepsis παρουσίαζε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και στη συνέχεια ήταν αυτό το οποίο ελέγχθηκε σε συνδυασμό με τη φωτοδυναμική. Στο μοντέλο κυττάρου καρκίνου του προστάτη το φυσικό μείγμα πολυφαινολών έδρασε σε συνέργεια με τη φωτοδυναμική, σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις, ενισχύοντας τη δράση της. Σε συνδυασμό με την ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη κατόρθωσε να διατηρήσει τη θεραπευτική δράση της ενδοϊστικής φωτοδυναμικής αίροντας πλήρως την παραμένουσα φωτοευαισθησία. Το ζήτημα της βελτίωσης των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων των φωτοευαισθητοποιητών μέσω του εγκλεισμού τους σε νανοσωματίδια και η διερεύνηση του αν όντως ενισχύουν τη φωτοδυναμική δράση είναι από αυτά που προβληματίζουν εντονότερα την επιστημονική κοινότητα. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ανεδείχθη η υπεροχή της φωτοδυναμικής δράσης της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC σε σύγκριση με την ελεύθερη m-THPC. Τα αποτελέσματα της έρευνας επεξεργάστηκαν τόσο θεωρητικά όσον και στατιστικά και έγινε συγκριτική αντιπαράθεση με αντίστοιχα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Η παρούσα διατριβή συνεισφέρει στη βελτιστοποίηση της ενδοϊστικής φωτοδυναμικής θεραπείας καρκίνου του προστάτη εισάγοντας την τεχνολογία εγκλεισμένων σε νανοσωματίδια φωτοευαισθητοποιητών.Από τα σοβαρότερα προβλήματα τα οποία η φωτοδυναμική θεραπεία καλείται να αντιπαλέψει επιτυχώς για να γίνει ευρύτερα αποδεκτή είναι η παραμένουσα φωτοευαισθησία. Έως τώρα δεν έχει διατυπωθεί επιτυχής μεθοδολογία αντιμετώπισης του προβλήματος. Οι μελέτες στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ανέδειξαν πως φυσικό μείγμα πολυφαινολών διατήρησε τη δράση της φωτοδυναμικής αίροντας πλήρως την παραμένουσα φωτοευαισθησία. Επομένως, η παρούσα διατριβή συνεισφέρει στη βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής δράσης και στην άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας μέσω της χορήγησης φυσικού μείγματος πολυφαινολών. Το αποτέλεσμα είναι διεθνώς πρωτότυπο καθώς δεν υπάρχει αναφορά άλλη στην οποία να παρουσιάζεται θεραπεία του καρκινικού όγκου με παράλληλη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας. Η άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας μέσω της χορήγησης του φυσικού μείγματος πολυφαινολών θα συμβάλλει σημαντικά στην ευρύτερη αποδοχή της φωτοδυναμικής θεραπείας. Παρέχει, τέλος, νέα δεδομένα στην κατανόηση των μηχανισμών δράσης παραγόντων που τροποποιούν την ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική ισορροπία. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής είναι διεθνώς πρωτότυπα ενώ πέρα από τη βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής μπορούν να αξιοποιηθούν και σε άλλες αντικαρκινικές θεραπείες που δρουν μέσω οξειδωτικού στρες.