Γονιδιωματική και μεταβολομική ανάλυση θαλάσσιων μικροφυκών
Authors: Πατέλου Μαρία 
Published: September 2021

Τις τελευταίες δεκαετίες, τα μικροφύκη έχουν προσελκύσει το επιστημονικό ενδιαφέρον λόγω των πολυάριθμων πλεονεκτημάτων και εφαρμογών τους. Είναι πρωτογενείς παραγωγοί οξυγόνου για πολλούς οργανισμούς και καταλαμβάνουν τη βάση της τροφικής αλυσίδας. Η βελτιστοποίηση των παραμέτρων που ρυθμίζουν τη λειτουργία των κυττάρων αποτελεί κρίσιμο βήμα στην εκμετάλλευση τους. Πολλές νέες και προηγμένες τεχνολογίες βιοτεχνολογίας έχουν υιοθετηθεί ως εργαλεία για τον προσδιορισμό της προέλευσης, της φυσιολογίας, της κυτταρικής λειτουργίας και του μεταβολισμού τους. Στο πλαίσιο αυτό, διεξήχθησαν δύο πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις, η μέθοδος αλληλούχησης γονιδιώματος και η συνδυαστική ανάλυση ομικών τεχνολογιών, προκειμένου να εμπλουτιστούν οι υπάρχουσες γνώσεις για το θαλάσσιο φυτοπλαγκτόν. Το μεταβολικό πρότυπο των μικροφυκών, που παρουσιάζει ιδιαίτερο επιστημονικό ή/και εμπορικό ενδιαφέρον, θα μπορούσε να συμβάλει στην κατανόηση των κυτταρικών μηχανισμών τους που είναι το πρώτο βήμα της μεταβολικής μηχανικής. Οι ομικές τεχνολογίες αποτελούν σημαντική πηγή πληροφόρησης για την κατανόηση των κυτταρικών διεργασιών, ενώ η χρήση τους ως εργαλείο στη μελέτη της παραγόμενης βιομάζας και της κυτταρικής παραγωγικότητας των μικροφυκών αυξάνεται ραγδαία. Η έλλειψη αλληλουχιών γονιδιωμάτων μικροφυκών αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο για τη μελέτη της γονιδιακής ρύθμισης και της μεταβολικής απόκρισης. Με τη λογική αυτή, διεξήχθη η μέθοδος αλληλούχησης επόμενης γενιάς Illumina 2000 HiSeq για τον προσδιορισμό του πυρηνικού, πλαστιδιακού και μιτοχονδριακού γονιδιώματος του μικροφύκους Chlorella minutissima UTEX 2341. Πραγματοποιήθηκε de novo συναρμολόγηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τους συναρμολογητές Velvet και Genious. Η πρόβλεψη των χλωροπλαστικών γονιδίων εκτελέστηκε ab initio με το λογισμικό Glimmer 3. Η ταυτοποίηση των γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή RAST (Rapid Annotation Subsystem Technology) και το κατατεθειμένο γονιδίωμα του Auxenochlorella protothecoides ως γονιδίωμα αναφοράς. Παραδόξως, η αλληλούχηση του γονιδιώματος και η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψαν ότι το στέλεχος UTEX 2341 χαρακτηρίζεται ουσιαστικά λανθασμένα ως Chlorella αφού φέρει εντυπωσιακή ομοιότητα με το Α. protothecoides. Η συναρμολόγηση είχε ως αποτέλεσμα το τελικό «πρόχειρο» γονιδίωμα με μέγεθος 32.7 Mb και κάλυψη γονιδιώματος 200x. Επιπλέον προσδιορίστηκαν τα γονιδιακά χαρακτηριστικά του μικροφύκους και πραγματοποιήθηκε χαρτογράφηση των γονιδίων με βάση τα υπάρχοντα αλληλουχημένα γονιδιώματα. Οι περιβαλλοντικές συνθήκες επηρεάζουν έντονα τόσο το μεταβολομικό όσο και το μεταγραφομικό πρότυπο των μικροφυκών, επηρεάζοντας τη σύνθεση πολυάριθμων χημικών ενώσεων με εφαρμογή στην φαρμακευτική, στην κοσμετολογία, στη διατροφή αλλά και στον τομέα των βιοκαυσίμων. Οι ιδιότητες του φωτός αποτελούν θεμελιώδεις παραμέτρους που επηρεάζουν όλους τους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς. Σε μια προσπάθεια ανίχνευσης των μεταβολών που σημειώνονται κατά τη διάρκεια της περιβαλλοντικής μεταβολής του φωτός, χρησιμοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη ομική προσέγγιση, ενώ τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές στατιστικές προσεγγίσεις. Στο πλαίσιο αυτό μελετήθηκε το μεταβολικό πρότυπο του μικροφύκους Α. protothecoides UTEX 2341 (πρώην C. minutissima) υπό διαφορετικές εντάσεις φωτός αλλά και υπό ερυθρή και κυανή μονοχρωματική ακτινοβολία για να προσδιοριστεί η μεταβολική απόκριση του στην ποσότητα και ποιότητα του παρεχόμενου φωτισμού. Σύμφωνα με την παρούσα μελέτη, ο μεταβολισμός του Α. protothecoides επηρεάζεται σημαντικά αυξάνοντας τα επίπεδα πολλών μεταβολιτών ως απόκριση στην ερυθρή μονοχρωματική ακτινοβολία αλλά και το παρατεταμένο σκότος. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μεταβολομική ανάλυση των οικονομικά σημαντικών στελεχών, Nannochloropsis gaditana, Tetraselmis chuii και Phaeodactylum tricornutum ανεπτυγμένων υπό ερυθρή, κυανή και πράσινη φιλτραρισμένη πηγή φωτός, με βάση την τεχνολογία GC-MS. Η φιλτραρισμένη ακτινοβολία χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ως εναλλακτική μέθοδος μεταβολής της ποιότητας ακτινοβολίας σε μικροφύκη αντί της μονοχρωματικής πηγής φωτός. Το λιπιδικό τους περιεχόμενο προσδιορίστηκε με ανάλυση GC-FID, ενώ αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα βασισμένη στην qPCR πραγματικού χρόνου για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων του N. gaditana που εμπλέκονται στον πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολισμό και τα αποτελέσματα συνδυάστηκαν με τη μεταβολομική ανάλυση. Ο φωτοσυνθετικός περιορισμός προκάλεσε μειωμένη κυτταρική πυκνότητα όλων των στελεχών υπό την φιλτραρισμένη ακτινοβολία σε σύγκριση με το πλήρες φάσμα. Κάθε στέλεχος αποκρίθηκε διαφορετικά αλλάζοντας τη χημική του σύνθεση ώστε να προσαρμοστεί στις νέες συνθήκες φωτός. Η σύγκριση των μεταγραφικών και μεταβολομικών αποτελεσμάτων αποκάλυψαν εκτεταμένες μεταβολικές προσαρμογές που προκλήθηκαν από την ποιότητα του φωτός στο N. gaditana. Στo Ν. gaditana, παρατηρήθηκε συνολική επαγωγή μεταγραφής γονιδίων και επιπέδων μεταβολιτών, που αφορούσαν κυρίως τo μεταβολισμό αμινοξέων. Η κυανή φιλτραρισμένη πηγή φωτός προκάλεσε μειωμένη συγκέντρωση υδατανθράκων, αλλά αυξημένη περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Η πράσινη φιλτραρισμένη ακτινοβολία προκάλεσε τις χαμηλότερες αποκρίσεις μεταβολιτών και γονιδίων στο N. gaditana, γεγονός που υπο-δεικνύει ότι απορροφάται ανεπαρκώς από το συγκεκριμένο στέλεχος. Πέραν ορισμένων εξαιρέσεων, η συγκέντρωση των μεταβολιτών του μικροφύκους T. chuii είτε παρέμεινε στα ίδια επίπεδα είτε μειώθηκε με την μεταβολή της ποιότητας του φωτός. Ισχυρότερη επίδραση είχε το ερυθρό φιλτραρισμένο φως, το οποίο προκάλεσε σημαντικά χαμηλή απόκριση αρκετών μεταβολιτών και ιδιαίτερα αμινοξέων. Λιγότερο επηρεασμένο στέλεχος αποδείχθηκε το P. tricornutum, το οποίο παρουσίασε ελάχιστες σημαντικές μεταβολές των αναγνωρισμένων μεταβολιτών. Εντούτοις, ήταν το μοναδικό μικροφύκος με τροποποιημένη περιεκτικότητα πολλών λιπαρών οξέων υπό τη μονοχρωματική ακτινοβολία. Χρησιμοποιώντας μόνο ηλιακή ακτινοβολία, το φιλτράρισμα φωτός θα μπορούσε να αποδειχθεί μια οικονομικά αποδοτική και τεχνικά εφαρμόσιμη μέθοδος σε εμπορικής κλίμακας καλλιέργειες όπως είναι οι μεγάλου όγκου βιοαντιδραστήρες μικροφυκών και μπορεί να οδηγήσει σε κύτταρα με το επιθυμητό βιοχημικό και μεταβολικό περιεχόμενο, χωρίς την ανάγκη εγκατάστασης απαιτητικού εξοπλισμού παροχής φωτός. Μελλοντικοί στόχοι της παρούσας έρευνας θα αποσκοπούν στη βελτιστοποίηση των ιδιοτήτων φωτισμού προς την κατεύθυνση της βιομάζας και της μεταβολικής παραγωγικότητας.