Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην Α-Συνουκλεϊνη και το λυσόσωμα σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις
Authors: Brekk Oeystein Roed 
Published: September 2021

Η διδακτορική μου διατριβή εστιάστηκε κυρίως στο πρωτεολυτικό μονοπάτι της αυτοφαγίας διαμεσολαβούμενης από σαπερόνες (chaperone mediated autophagy, CMA), και στο ρόλο αυτής στις νευροεκφυλιστικές νόσους. Πιο συγκεκριμένα, εστιαστήκαμε στην αλληλεπίδραση μεταξύ του CMA και μιας μικρής νευρωνικής πρωτεΐνης, της α-συνουκλεΐνης (SNCA), η οποία εμπλέκεται στην παθολογία της νόσου του Πάρκινσον, μιας προοδευτικής νευροεκφυλιστικής διαταραχής που επηρεάζει κυρίως τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας του μεσεγκεφάλου (substantia nigra pars compacta, SNpc). Η CMA, αποτελεί ένα εξειδικευμένο λυσοσωμικό πρωτεολυτικό μονοπάτι, το οποίο περιλαμβάνει την απευθείας μετατόπιση πρωτεϊνών-υποστρωμάτων του μονοπατιού στο λυσοσωμικό αυλό, μετά από την αναγνώρισή τους από ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών-συνοδών του κυτταροπλάσματος. Παρά την πληθώρα των μορίων που εμπλέκονται στη διαδικασία, το πρωταρχικό ρυθμοκαθοριστικό στάδιο του CMA μονοπατιού θεωρείται ότι είναι τα επίπεδα του υποδοχέα LAMP2A στη λυσοσωμική μεμβράνη. Έτσι, είναι λογικό να θεωρηθεί ότι μεταβάλλοντας τα επίπεδα του LAMP2A μπορούμε να ελέγξουμε και τη δραστηριότητα αυτού του πρωτεολυτικού μονοπατιού.Η α-συνουκλεΐνη, είναι μικρή νευρωνική πρωτεΐνη 14 kDa που εντοπίζεται κυρίως στις προσυναπτικές νευρικές απολήξεις, και μολονότι η ακριβής λειτουργία της είναι εν πολλοίς άγνωστη, ο γενετικός τόπος που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη αυτή αποτελεί μια σημαντική θέση για γενετικές μεταβολές τόσο σε οικογενείς όσο και σε σποραδικές μορφές της νόσου Πάρκινσον. Συγκεκριμένα, τόσο παρανοηματικές μεταλλαγές όσο και πολλαπλασιασμοί του γενετικού τόπου της α-συνουκλεΐνης έχουν αναγνωρισθεί σε οικογενείς μορφές της νόσου, ενώ πολυμορφισμοί μέσα στο γονίδιο SNCA έχουν αναγνωρισθεί σε σποραδικές μορφές τη νόσου, μέσω μεγάλης κλίμακας μελετών γενετικής συσχέτισης (genome-wide associated studies, GWAS). Επιπρόσθετα, η α-συνουκλεΐνη αποτελεί και το κύριο συστατικό των σωματίων Lewy (Lewy Bodies, LBs) και των νευριτών Lewy (Lewy Neurites, LNs), τα οποία αποτελούν πρωτεινικά έγκλειστα που συσσωρεύονται στα σώματα των νευρώνων ή στους νευρίτες αντίστοιχα, στις εγκεφαλικές περιοχές που πάσχουν στη νόσο του Πάρκινσον, και τα οποία αποτελούν το κύριο διαγνωστικό σημάδι της παθολογίας της νόσου. Εκτός από τη νόσο Πάρκινσον, και άλλες ασθένειες, κυρίως η Ατροφία Πολλαπλών Συστημάτων και Άνοια με Σωμάτια Lewy, χαρακτηρίζονται επίσης από συσσώρευση εγκλείστων τα οποία είναι θετικά για α-συνουκλεΐνη. Αυτές οι ασθένειες ονομάζονται συλλογικά «συνουκλεϊνοπάθειες», καθώς θεωρείται ότι η διαδικασία της συσσώρευσης της α-συνουκλεΐνης αποτελεί ένα κομβικό σημείο όχι μόνο για τη μεταθανάτια διάγνωση των νόσων, αλλά και για την εμφάνιση και μετάδοση αυτών των ασθενειών. Αυτή η γνώση, και ειδικά οι περιπτώσεις πολλαπλασιασμού της αγρίου τύπου α-συνουκλεΐνης, έχει οδηγήσει στη θεώρηση ότι το πρωτεϊνικό φορτίο της α-συνουκλεΐνης μέσα σε νευρωνικά κύτταρα ή κύτταρα γλοίας διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αιτιοπαθογένεια των συνουκλεϊνοπαθειών. Έτσι, είναι πολύ σημαντικό να αναγνωριστούν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η α-συνουκλεΐνη αποικοδομείται μέσα σε αυτά κύτταρα.Μελέτες από το δικό μας εργαστήριο και από άλλα, έχουν δείξει ότι η α-συνουκλεΐνη αποικοδομείται κατά κύριο λόγο μέσω CMA σε νευρωνικά κύτταρα, ενώ οι σχετιζόμενες με τη νόσο Πάρκινσον μεταλλάξεις, αναστέλλουν αυτό το μονοπάτι. Έτσι, η αλληλεπίδραση της α-συνουκλεΐνης με τα λυσοσωμικά μονοπάτια στο πλαίσιο των νευροεκφυλιστικών νόσων, αποτελεί αντικείμενο έντονης μελέτης, και η αλληλοεξάρτηση της α-συνουκλεΐνης με το CMA μονοπάτι ειδικότερα, αποτελεί το κύριο θέμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Αρχικά, σκοπός μας ήταν να διερευνήσουμε κατά πόσον η ενίσχυση του CMA μονοπατιού in vivo, θα μπορούσε να δράσει θεραπευτικά σε νευροεκφυλισμό που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον. Για το σκοπό αυτό, υπερεκφράσαμε τον υποδοχέα LAMP2A στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της συμπαγούς μοίρας μέλαινας ουσίας (SNpc), οι οποίοι είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στη νόσο Πάρκινσον, μέσω στερεοτακτικής μεταφοράς αδενο- σχετιζόμενων ιών (adeno-associated viruses, rAAVs), σε μια προσπάθεια να προστατεύσουμε αυτούς τους νευρώνες από την τοξικότητα που προκαλεί η υπερέκφραση της αγρίου τύπου α- συνουκλεΐνης, πάλι μέσω rAAVs. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του LAMP2A, κύριου υποδοχέα του CMA μονοπατιού, ήταν ικανή να προστατεύσει πλήρως τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της SNpc, ενώ παράλληλα απέτρεψε σε μεγάλο βαθμό το σχηματισμό τοξικών μορφών και την επακόλουθη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης. Έτσι, συμπεράναμε ότι η υπερέκφραση του LAMP2A μπορεί να αποτελέσει μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατιγική για την αντιμετώπιση της τοξικότητας που προκαλεί η υπερέκφραση της α-συνουκλεΐνης, σε ένα καλά καθιερωμένο ζωικό μοντέλο της νόσου Πάρκινσον. Η συγκεκριμένη εργασία που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Brain τον Ιούνιο του 2013, ήταν από τις πρώτες που έδειξαν μια αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση έναντι της τοξικότητας της α-συνουκλεΐνης σε ζωικό μοντέλο. Βασιζόμενοι στα παραπάνω ευρήματα, θελήσαμε να ελέγξουμε την αλληλένδετη ερώτηση που προκύπτει από τις ευεργετικές επιδράσεις της ενίσχυσης της λειτουργίας του CMA μονοπατιού: μπορεί η δυσλειτουργία του CMA να έχει εξίσου καταστροφικές επιδράσεις in vivo, στον εγκέφαλο επίμυος; Μολονότι η λειτουργία του CMA μονοπατιού έχει εμπλακεί στην παθογένεια της νόσου, με αρκετές μελέτες να περιγράφουν τις βλαβερές επιπτώσεις πρωτεϊνών-υποστρωμάτων του μονοπατιού στη νευρωνική λειτουργία, με την α-συνουκλεΐνη να αποτελεί τον κύριο ύποπτο, λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με τη φυσιολογική σημασία του CMA στο φυσιολογικό εγκέφαλο καθώς και τις επιπτώσεις τις δυσλειτουργίας του εν λόγω μονοπατιού στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει μειωμένα επίπεδα πρωτεϊνών-δεικτών του CMA κατά τη γήρανση στο ήπαρ και στον Παρκινσονικό εγκέφαλο, αλλά αυτό είναι το αίτιο ή το αποτέλεσμα;Προκειμένου να απαντήσουμε αυτό το σημαντικό ερώτημα, αξιοποιήσαμε την καλά καθιερωμένη μέθοδο για in vivo διαμόλυνση των ντοπαμινεργικών νευρώνων μέσω rAAVs και κατασκευάσαμε δυο ιικούς φορείς που εξέφραζαν αλληλουχίες shRNA που θα προκαλούσαν επιλεκτική σίγαση του υποδοχέα LAMP2A επίμυος στη SNpc, καθώς και ιούς που εξέφραζαν shRNA-μάρτυρα, και τους μεταφέραμε στερεοτακτικά στη μέλαινα ουσία ενήλικων επίμυων.Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι μείωση των επιπέδων του ενδογενούς LAMP2A ≈ 50% οδηγεί σε σοβαρό νευροεκφυλισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων της SNpc στις 8 εβδομάδες μετά την έγχυση, ο οποίος ακολουθεί την εκφύλιση των ντοπαμινεργικών απολήξεων και τη μείωση των επιπέδων της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα, ευρήματα που είναι εμφανή 4 εβδομάδες μετά την έγχυση. Επιπρόσθετα, βρήκαμε ότι στα κυτταρικά σώματα των ντοπαμινεργικών νευρώνων οι οποίοι έχουν διαμολυνθεί με τους ιούς που προκαλούν σίγαση του LAMP2A, παρατηρείται συσσώρευση ενδογενούς α-συνουκλεΐνης, ενώ ταυτόχρονα παρατηρείται αυξημένη αντισταθμιστική ενεργοποίηση άλλων πρωτεολυτικών μονοπατιών και έντονη φλεγμονή στην παρακείμενη περιοχή. Αυτή η απώλεια της ντοπαμινεργικής νεύρωσης οδήγησε επίσης σε σημαντικά κινητικά προβλήματα, ιδιαίτερα εμφανή στις 8 και 12 εβδομάδες μετά την έγχυση. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα αυτής της μελέτης αποκαλύπτουν –για πρώτη φορά- τις επιπτώσεις της δυσλειτουργίας του CMA μονοπατιού στο ενήλικο ντοπαμινεργικό σύστημα και η εργασία αυτή έχει γίνει δεκτή προς δημοσίευση στο περιοδικό Autophagy. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν τη σημασία της καλής λειτουργίας του CMA μονοπατιού στη διατήρηση της νευρωνικής ομοιόστασης, ειδικά σε ότι αφορά την αποικοδόμηση τόσο της υπερεκφρασμένης όσο και της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης, λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με άλλα πιθανά μονοπάτια τα οποία μπορεί να επηρεάζονται από τη μεταβολή της λειτουργίας του CMA. Έτσι, υποθέσαμε ότι θα υπάρχουν άγνωστα - μέχρι σήμερα- υποστρώματα με σημαντικές δράσεις στη λειτουργία των νευρικών κυττάρων τα οποία θα εξαρτώνταν από τη σωστή λειτουργία του CMA μονοπατιού.Σε μια προσπάθεια να διαλευκάνουμε κατά πόσον υπάρχει κάποιο τμήμα του νευρωνικού πρωτεώματος το οποίο να επηρεάζεται σημαντικά με τη μεταβολή της λειτουργίας του CMA μονοπατιού, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα πρωτογενών καλλιεργειών φλοιικών νευρώνων επίμυος σε συνδυασμό με ιικούς φορείς, προκειμένου να επιτύχουμε υπερέκφραση (αδενοϊοί) ή σίγαση (αργοϊοί) του υποδοχέα LAMP2A, χρησιμοποιώντας στη δεύτερη περίπτωση τις ίδιες αλληλουχίες shRNA με παραπάνω, τις οποίες εκφράσαμε σε αργοϊούς αυτή τη φορά. Για να φέρουμε εις πέρας αυτήν την πρωτεωμική μελέτη, συνεργαστήκαμε με το εργαστήριο της Δρ. Αντωνία Βλάχου στο ΙΙΒΕΑΑ, και πραγματοποιήσαμε MS/MS-συζευγμένη 2D- PAGE ανάλυση κυτταρικών εκχυλισμάτων, στα οποία είχε προηγηθεί είτε υπερέκφραση είτε σίγαση του LAMP2A, καταλήγοντας τελικά στην αναγνώριση 56 νέων πεπτιδίων, των οποίων τα επίπεδα άλλαζαν σημαντικά όταν μεταβαλλόταν η ενεργότητα του CMA μονοπατιού. Δυο από αυτά τα πεπτίδια, οι πρωτεΐνες DJ-1, που είναι μια αντιοξειδωτική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην οικογενή μορφή της νόσου Πάρκινσον, και CRMP-2, που είναι ένας προ-νευρωνικός παράγοντας που εμπλέκεται στη σχιζοφρένεια, επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση, καθώς εμφάνισαν παρόμοιο πρότυπο μεταβολής λόγω αλλαγής των επιπέδων του LAMP2A. Αναγνωρίσαμε ξεχωριστές φαινοτυπικές αλλαγές στις φλοιικές καλλιέργειες λόγω μείωσης των επιπέδων τόσο του DJ1 όσο και του CRMP2, που προέκυψαν από τη μείωση της ενεργότητας του CMA μονοπατιού, αλλαγές οι οποίες επανέρχονταν στα επίπεδα του μάρτυρα μετά από υπερέκφραση εξωγενώς του DJ1 ή του CRMP2, αντίστοιχα. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το γεγονός ότι, η υπερέκφραση είτε του DJ1 είτε του CRMP2 απουσία κάποιας αλλαγής στο CMA, δεν οδήγησε σε ανιχνεύσιμες φαινοτυπικές αλλαγές, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι επιδράσεις οφείλονταν στη λειτουργία του CMA μονοπατιού στο κύτταρο. Καθώς η πλήρης λίστα με τα πεπτίδια που βγήκαν από αυτήν την ανάλυση αφορά αρκετές κυτταρικές λειτουργίες, απομένουν να αναγνωριστούν και άλλα μονοπάτια τα οποία επηρεάζονται από τη δυσλειτουργία του CMA μονοπατιού. Στο διάστημα συγγραφής αυτής της διατριβής, τα ευρήματα της παραπάνω μελέτης προετοιμάζονται για κατάθεση. Φυσικά, πραγματοποιήσαμε αρκετά πειράματα τα οποία δεν ταιριάζουν στις κύριες θεματικές ενότητες των προαναφερθέντων δημοσιεύσεων, και έτσι δεν έχουν ακόμα δημοσιευθεί ή ενσωματωθεί σε κάποια εργασία προς δημοσίευση, τουλάχιστον μέχρι στιγμής. Για παράδειγμα, κάναμε αρκετές προσπάθειες να εξακριβώσουμε τον τρόπο αποικοδόμησης της πρωτεΐνης LRRK2 – μιας κινάσης που εμπλέκεται στη νόσο του Πάρκινσον- σε πρωτογενείς φλοιικές καλλιέργειες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι και αυτή, όπως και οι πρωτεΐνες DJ-1 και CRMP-2, μειώνεται σημαντικά μετά από μείωση των επιπέδων του LAMP2A, και κατ’ επέκταση μετά από μείωση της ενεργότητας του CMA μονοπατιού. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε και με τη χρήση ειδικών αναστολέων της ολικής λειτουργίας του λυσοσώματος, ενώ, η επιλεκτική αναστολή της μακροαυτοφαγίας, ένα άλλο κύριο μονοπάτι του λυσοσώματος, δεν είχε κάποιο ιδιαίτερο αποτέλεσμα. Έτσι, υποθέσαμε ότι η δυσλειτουργία του CMA μονοπατιού ειδικά προκαλούσε αυτό το αποτέλεσμα στα επίπεδα της πρωτεΐνης LRRK2, πιθανόν λόγω επαγωγής της αποικοδόμησης μέσω προτεασώματος. Ενώ η προεπώαση με ένα γενικό αναστολέα του λυσοσώματος δε φάνηκε να μειώνει την απόκριση των κυττάρων στην αναστολή της λειτουργίας του πρωτεασώματος, τέτοιοι φαρμακολογικοί αναστολείς σε συνδυασμό με τη σίγαση του LAMP2A με αργοϊούς ήταν ιδιαίτερα τοξικοί στα χέρια μας, και έτσι δεν μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε ότι αυτό το αποτέλεσμα ήταν πράγματι ειδικό για το CMA. Στην παρούσα φάση, αναζητούμε λιγότερο τοξικές μεθόδους για την αναστολή του πρωτεασώματος, προκειμένουν να εξακριβώσουμε τη λειτουργική συσχέτιση μεταξύ του πρωτεασώματος και του CMA.Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε σε κάποια ιδιαίτερα σημαντικά αποτελέσματα. Πρωτίστως, η υπερέκφραση του υποδοχέα LAMP2A αποτελεί μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση των συνουκλεϊνοπαθειών, καθώς η επαγωγή του CMA, αποτρέπει τη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης και την επακόλουθη νευροτοξικότητα. Κατά δεύτερον, η δυσλειτουργία του CMA μονοπατιού λόγω σίγασης ή απαλοιφής της έκφρασης του υποδοχέα LAMP2A μπορεί να αποτελέσει το πρώτο βήμα που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο σε πολλές παθήσεις που χαρακτηρίζονται από αυξημένη συσσώρευση πρωτεϊνών και υπερβολική ενεργοποίηση πρωτεολυτικών μονοπατιών, η οποία σε μεγάλο βαθμό μπορεί να έρχεται δευτερογενώς σε αυτό το αρχικό ερέθισμα. Και τέλος, μέσω επαγωγής των προαναφερθέντων μονοπατιών –ή μέσω άλλων μηχανισμών συνολικά- η δυσλειτουργία του CMA μονοπατιού μπορεί έμμεσα να οδηγεί σε απορύθμιση αρκετών σημαντικών πρωτεϊνών με βλαβερές επιπτώσεις για το κύτταρο.Καθώς αρκετές μελέτες στο πεδίο έχουν αρχίσει να εστιάζουν σε μη-επεμβατικές μεθόδους για την ενίσχυση του CMA μονοπατιού σε ανθρώπους –μέσω φαρμακολογικών σκευασμάτων ή άλλων κατασκευών ικανών να διαπεράσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό- αυτοί οι μηχανισμοί θα μπορούσαν να διερευνηθούν περαιτέρω για την ικανότητα τους να αποτρέπουν τη νευροεκφύλιση που παρατηρείται σε μια πληθώρα ασθενειών, στις οποίες η συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης ή η δυσλειτουργία του CMA, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο.