Comparative study of the regulatoty role of probiotic microoganisms in homeostasis and cell function
Authors: Κιούση Δέσποινα-Ευγενία 
Published: December 2024

Ως προβιοτικοί ορίζονται οι μικροοργανισμοί οι οποίοι όταν καταναλωθούν σε επαρκείς ποσότητες επιφέρουν θετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή (FAO/WHO, 2001; Hill et al., 2014). Ο ορισμός αυτός διατυπώθηκε το 2001 από τον Οργανισμό Υγείας των Ηνωμένων Εθνών και τη Διεθνή Οργάνωση Τροφίμων και Υγείας, και επαναδιατυπώθηκε το 2014 από τη Διεθνή Επιστημονική Ένωση για τα Προβιοτικά και τα Πρεβιοτικά (Hill, et al., 2014). Αν και αυτός ο ορισμός είναι πρόσφατος, στην πραγματικότητα οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί χρησιμοποιούνται εδώ και χιλιετίες. Πράγματι, αναφορές σε προϊόντα ζύμωσης, ένα βασικό μέσο στο οποίο αναπτύσσονται αυτοί οι μικροοργανισμοί, υπάρχουν ήδη από το 4000 πΧ (Tamang et al., 2020). Τα προϊόντα ζύμωσης είναι πιο ανθεκτικά στην αλλοίωση σε θερμοκρασία δωματίου και έχουν διακριτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Έτσι οι αρχαίοι πολιτισμοί μπορούσαν να επεκτείνουν τη διάρκεια ζωής των άφθονων πρώτων υλών, και να παρασκευάσουν ασφαλή προς κατανάλωση ποτά και τρόφιμα. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι προϊόντα όπως το κρασί χρησιμοποιούνταν εμπειρικά για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών διαταραχών. Με την ανάπτυξη της μικροσκοπίας και του πεδίου της μικροβιολογίας, ανακαλύφθηκαν και απομονώθηκαν οι μικροοργανισμοί οι οποίοι συντελούν τη ζύμωση των πρώτων υλών. Παράλληλα, οι ευεργετικές για την υγεία επιδράσεις αυτών των προϊόντων καταγράφηκαν συστηματικά για πρώτη φορά από τον Ellie Metchnikoff. Ο ίδιος, δημοσίευσε το 1907 το βιβλίο με τίτλο «The Prolongation of Life» στο οποίο διατύπωσε ότι η κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε «ευεργετικούς μικροοργανισμούς» έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση αυτοτοξινών στο έντερο που προέρχονται από την Δυτικού τύπου διατροφή (Mackowiak, 2013). Ενώ οι αντιλήψεις αυτές είχαν εγκαταλειφθεί για πολλά χρόνια κατά τα οποία η ανθρωπότητα πλήχθηκε από επιδημίες και λοιμώξεις στο πεδίο της μάχης, την τελευταία δεκαετία οι ιδιότητες των ευεργετικών μικροοργανισμών μελετώνται, πλέον, συστηματικά. Παράλληλα, η αγορά των προβιοτικών μικροοργανισμών είναι ιδιαίτερα επικερδής, με την αξία της να αναμένεται να ξεπεράσει τα 100 δις δολάρια μέχρι το 2029. Με την ανάπτυξη του πεδίου των προβιοτικών μικροοργανισμών έχουν καθιερωθεί οδηγίες και κανονιστικά πλαίσια για την προστασία του καταναλωτή. Συγκεκριμένα, για να θεωρηθεί ένας νέος μικροοργανισμός ως προβιοτικός θα πρέπει να πληροί συγκεκριμένα κριτήρια ασφάλειας και λειτουργικότητας. Πιο συγκεκριμένοι, οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί πρέπει να είναι ευαίσθητοι σε κοινά αντιβιοτικά και να μην έχουν την ικανότητα σύνθεσης λοιμογόνων παραγόντων και μεταφοράς γονιδίων ανθεκτικότητας σε μικρόβια της μικροχλωρίδας του ξενιστή. Παράλληλα, τα προβιοτικά στελέχη θα πρέπει να είναι ανθεκτικά στις συνθήκες του γαστρεντερικού συστήματος, και να έχουν την ικανότητα παροδικού αποικισμού του (Hill et al., 2014). Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι προορίζονται για χρήση στη βιομηχανία τροφίμων θα πρέπει να είναι επιπλέον ανθεκτικοί στο ωσμωτικό σοκ, σε αερόβιες συνθήκες και ακραίες θερμοκρασίες έτσι ώστε να διασφαλιστεί η βιωσιμότητα τους κατά την παρασκευή, αποθήκευση και διακίνηση των τελικών προϊόντων. Σχετικά με τις λειτουργικές τους ικανότητες, οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να παρουσιάζουν αντιμικροβιακή, ανοσορρυθμιστική ή/και αντιοξειδωτική δράση (Binda et al., 2020). Τα πιο κοινά γένη στα οποία ανήκουν προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι τα Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., και Saccharomyces spp. Οι προβιοτικοί λακτοβάκιλλοι συναντώνται ελεύθεροι στη φύση ή σε συσχέτιση με κάποιον ξενιστή, ενώ είναι βασικά συστατικά της μικροχλωρίδας προϊόντων ζύμωσης (Duar et al., 2017). Ως μέλη της εντερικής και κολπικής μικροχλωρίδας συμμετέχουν σε βασικές διεργασίες εξασφαλίζοντας την ομοιοστατική τους λειτουργία. Πράγματι, σύγχρονες μελέτες καταδεικνύουν ότι η μείωση στον πληθυσμό τους συσχετίζεται με εντερικές και εξωεντερικές διαταραχές, όπως φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου, τοπικές και συστημικές λοιμώξεις, τον καρκίνο, ακόμη και νευροεκφυλιστικές νόσους (Olejniczak-Staruch et al., 2021). Έτσι, τα τελευταία χρόνια διερευνάται σε εντατικούς ρυθμούς η συνεισφορά της εξωγενούς χορήγησης προβιοτικών λακτοβακίλλων στην πρόληψη και αντιμετώπιση αυτών των ασθενειών. Τα υπάρχοντα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η προβιοτική δράση των λακτοβακίλλων είναι στελεχοειδική και επηρεάζεται από παράγοντες ειδικούς για κάθε ξενιστή (π.χ. ηλικία, φύλο, γενετική σύσταση, συνυπάρχουσες ασθένειες). Η μοριακή βάση αυτών των αλληλεπιδράσεων δεν είναι απόλυτα κατανοητή. Σήμερα, η εξέλιξη των ομικών τεχνολογιών και σύνθετων in vitro μοντέλων έχουν συντελέσει στην κατανόηση της εξελικτικής ιστορίας των προβιοτικών λακτοβακίλλων, καθώς και στην περιγραφή των αλληλεπιδράσεων με άλλα βακτήρια και τον ξενιστή σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο (Kiousi et al., 2021). Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο τη συγκριτική μελέτη των μοριακών και κυτταρικών αλληλεπιδράσεων τριών στελεχών αγρίου τύπου απομονωμένων από παραδοσιακά προϊόντα ζύμωσης. Πιο συγκεκριμένα τα στελέχη Lactiplantibacillus pentosus L33 (L33), Lp. plantarum L125 (L125) και Lc. paracasei SP5 (SP5) προέρχονται από προϊόντα κρέατος και κεφίρ, αντίστοιχα (Pavli et al., 2016; Mantzourani et al., 2019). Τα στελέχη αυτά εμφανίζουν προβιοτικά χαρακτηριστικά in vitro: αντοχή στα οξέα και τα χολικά άλατα, ευαισθησία σε κοινά αντιβιοτικά και έλλειψη αιμολυτικής δράσης. Το στέλεχος SP5 παρουσιάζει επιπλέον ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον, καθώς έχει ενσωματωθεί σε πληθώρα γαλακτοκομικών και μη- προϊόντων (Mantzoiurani et al., 2023; Bontsidis et al., 2022; Plessas et al., 2021; Kazakos et al., 2022). Πρόσφατα η ερευνητική μας ομάδα έχει δημοσιεύσει τη γονιδιωματική αλληλουχία των στελεχών L33 (Stergiou et al., 2021) και L125 (Tegopoulos et al., 2021). Στην παρούσα διατριβή έχουν επίσης μελετηθεί και οι ιδιότητες των εμπορικών προβιοτικών στελεχών Lc. rhamnosus GG (LGG) και Lc. casei ATCC 393 (Lc393). Αρχικά, το γονιδίωμα του στελέχους SP5 αλληλουχήθηκε για τον εντοπισμό γονιδίων που εμπλέκονται στο προβιοτικό και βιοτεχνολογικό δυναμικό του. Το στέλεχος αυτό έχει γονιδίωμα μήκους 2,958,982 bp και περιεκτικότητας σε βάσεις GC 46.3%. Κατά τη γονιδιωματική ανάλυση δεν βρέθηκαν πλασμίδια ή άλλα μεταθετά στοιχεία, καθώς και γονίδια επίκτητης αντοχής στα αντιβιοτικά. Ο νομαδικός χαρακτήρας του στελέχους αντικατοπτρίζεται στις πολλαπλές κασέτες για την ενδοκυττάρωση και τον μεταβολισμό ετερογενών πολυσακχαριτών, καθώς και στην περιορισμένη παρουσία βιοσυνθετικών μονοπατιών για αμινοξέα. Παρόλαυτα, το στέλεχος SP5 διαθέτει πολλαπλά πρωτεολυτικά ένζυμα για την παραλαβή αμινοξέων από εξωγενείς πηγές. Προκειμένου να μελετηθεί η προτίμηση των λακτοβακίλλων για συγκεκριμένα περιβάλλοντα, διενεργήθηκε συγκριτική πανγονιδιωματική ανάλυση. Πιο συγκεκριμένα υπολογίστηκε το πανγονιδίωμα στελεχών που ζουν ελεύθερα στο περιβάλλον, στελεχών τα οποία αποικίζουν ξενιστές, καθώς και νομαδικών στελεχών, και έγιναν συσχετίσεις μεταξύ των γονιδίων και της πηγής απομόνωσης τους. Έτσι ανιχνεύθηκαν δύο υποθετικές πρωτεΐνες οι οποίες συσχετίζονται με την προτίμηση στελεχών του είδους Lp. plantarum για διαβίωση στο εντερικό επιθήλιο εντόμων. Μία από τις πιο διαδεδομένες ιδιότητες προβιοτικών λακτοβακίλλων είναι να εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό και την εγκαθίδρυση ανταγωνιστικών μικροοργανισμών στο περιβάλλον τους. Για να το πετύχουν αυτό παράγουν πληθώρα αντιμικροβιακών μεταβολιτών, όπως γαλακτικό οξύ και οργανικά οξέα βραχέας αλύσου, καθώς και μικρών πεπτιδίων ή βακτηριοσινών (Arques et al., 2015). Παράλληλα, πολλά προβιοτικά στελέχη μπορούν να εμποδίζουν τον αποικισμό του επιθηλίου του ξενιστή από παθογόνα ή να ρυθμίζουν τις ανοσοαποκρίσεις προωθώντας την εκκαθάριση της λοίμωξης (Llewellyn and Foey, 2017). Σε αυτό το πλαίσιο, η αντιμικροβιακή δράση των τριών στελεχών αγρίου τύπου και των δύο εμπορικά διαθέσιμων προβιοτικών ελέγχθηκε έναντι των παθογόνων Staphylococcus aureus, Salmonella enterica και Escherichia coli. Αρχικά, μελετήθηκε η παρουσία γονιδίων για την παραγωγή βακτηριοσινών και άλλων πρωτεϊνών με αντιμικροβιακή δράση στο γονιδίωμα των πέντε στελεχών. Έτσι, στο γονιδίωμα των τριών στελεχών αγρίου τύπου εντοπίστηκαν οπερόνια βακτηριοσινών με υψηλή ομοιότητα σε επίπεδο αλληλουχίας και δομής με χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες από συγγενικά στελέχη. Πιο συγκεκριμένα, στο γονιδίωμα του στελέχους L33 βρέθηκε πλήρες οπερόνιο για την παραγωγή της πλανταρισίνης NC8, στο γονιδίωμα του στελέχους L125 για την πλανταρισίνη EF, ενώ στο γονιδίωμα του SP5 βρέθηκαν πολλαπλές αντιμικροβιακές πρωτεΐνες, όπως τα πεπτίδια LSEI-2392/2393 και αμιδάσες με ικανότητα διάσπασης του κυτταρικού τοιχώματος. Η έκφραση αυτών των πεπτιδίων αυξήθηκε σε συνεπώαση με τα παθογόνα-στόχους. Πρέπει να αναφερθεί ότι δεν βρέθηκαν αντίστοιχα πεπτίδια στο γονιδίωμα του LGG σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορες (De Keersmaecker et al., 2006; Kang et al., 2020), ενώ στο γονιδίωμα του Lc393 βρέθηκε ένα πεπτίδιο το οποίο παρουσίασε μικρή γενετική και δομική ομοιότητα με χαρακτηρισμένες βακτηριοσίνες. Η αντιμικροβιακή ικανότητα των λακτοβακίλλων και των μεταβολιτών (cell-free culture superantants, CFCS) τους ελέγχθηκε in vitro με κλασικές μικροβιολογικές τεχνικές και συνεστιακή μικροσκοπία. Πιο συγκεκριμένα, επίδραση με το CFCS μείωσε τη βιωσιμότητα και την ικανότητα των παθογόνων να δημιουργούν βιοϋμένια σε στερεές επιφάνειες, με δόσο- και pH- εξαρτώμενο τρόπο. Η μεγαλύτερη μείωση της βιωσιμότητας καταγράφηκε έναντι της S. enterica μετά από επίδραση με CFCS από το στέλεχος SP5. Παράλληλα, μείωση στην έκφραση βασικών ρυθμιστών της δημιουργίας βιοϋμενίων παρατηρήθηκε μετά από επιδράσεις με CFCS. Συμπερασματικά, η ικανότητα των λακτοβακίλλων να περιορίζουν τον σχηματισμό βιοϋμενίων αποδίδεται κυρίως στην παραγωγή αντιμικροβιακών μεταβολιτών και δευτερευόντως στη μεταβολή έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή τους. Στη συνέχεια, η ικανότητα των λακτοβακίλλων να προλαμβάνουν τη λοίμωξη από τα τρία παθογόνα εξετάστηκε σε κυτταρικά μοντέλα. Αρχικά βρέθηκε ότι οι S. aureus και E. coli ασκούν κυτταροτοξική δράση σε συνεπώαση με την κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του εντέρου HT-29. Από τα βακτήρια που εξετάστηκαν, το στέλεχος L125 απέτρεψε τον κυτταρικό θάνατο σχετιζόμενο με τη μόλυνση, μετά από συνεπώαση με τα κύτταρα HT-29, για 4 ώρες. Ο προστατευτικός φαινότυπος ήταν συγκρίσιμος με αυτόν του στελέχους LGG, το οποίο έχει καλά μελετημένη ικανότητα να μειώνει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το παθογόνο S. aureus (El-Chami et al., 2022; Spacova et al., 2022). Η δράση του στελέχους L125 αποδόθηκε στην ικανότητα του να αποκλείει την προσκόλληση και την ενδοκυττάρωση των παθογόνων στα επιθηλιακά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, κατά την περίοδο της προεπώασης, το στέλεχος αυτό προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα, μέσω των επιφανειακών του πρωτεϊνών που περιέχουν περιοχές με συγγένεια για πρωτεΐνες του ξενιστή και μόρια της εξωκυττάριας μήτρας. Πράγματι, προσομειώσεις σύνδεσης (protein-protein docking) κατέδειξαν ότι οι επιφανειακές, αυτές, πρωτεΐνες παρουσιάζουν ικανότητα αλληλεπίδρασεις με μουκίνες, υποδοχείς τύπου Toll (Τoll-like receptors, TLRs), φιμπρονεκτίνες και ιντιμίνες. Πρέπει να αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες αυτές, παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα με αυτές που κωδικοποιούνται από τα παθογόνα, οπότε μπορούν να συμμετέχουν στον ανταγωνιστικό αποκλεισμό της προσκόλλησής τους. Εκτός από περιοχές αγκυροβόλησης των βακτηριών, αυτοί οι προσδέτες εμφανίζουν ανοσορρυθμιστική ικανότητα, ενώ επίσης συμμετέχουν και στην αναδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού και τον πολλαπλασιασμό και χρησιμοποιούνται από παθογόνα βακτήρια για την ενδοκυττάρωση τους στο κύτταρο στόχο. Το μεταγραφωματικό προφίλ των L125 και HT-29 κυττάρων κατά τη διάρκεια της συνεπώασης τους μελετήθηκε με αλληλούχιση RNA (dual RNA-seq). Πιο συγκεκριμένα, στο στέλεχος L125 παρατηρήθηκε αύξηση των μεταγράφων που κωδικοποιούν για επιφανειακές προσκολλητίνες, ενώ στα κύτταρα του ξενιστή παρατηρήθηκε μείωση των μεταγράφων για πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται στην προκόλληση και ενδοκυττάρωση βακτηριακών παθογόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συνεπώαση με το στέλεχος L125 δεν προκάλεσε ανοσορυθμιστικές αλλαγές σε επίπεδο μεταγραφώματος, ενώ μείωσε την απέκκριση κυτταροκινών στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι το στέλεχος L125 το οποίο διαθέτει αντιμικροβιακή δράση, μπορεί να εμποδίζει τον αποικισμό και τη μολυσματικότητα βακτηριακών παθογόνων μέσω ανταγωνιστικού αποκλεισμού και τροποποίησης μονοπατιών ενδοκυττάρωσης του ξενιστή. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής η ομάδα μας ανέπτυξε μία νέα μεθοδολογία για τον εντοπισμό στελεχών ενδιαφέροντος σε σύνθετα δείγματα. Η στελεχοειδική ανίχνευση βακτηρίων μπορεί να βρει εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων, όσο και στη βασική και εφαρμοσμένη έρευνα. Πιο συγκεκριμένα, η ανίχνευση σε προϊόντα ζύμωσης επιτρέπει την παρακολούθηση της βιωσιμότητας στελεχών ενδιαφέροντος κατά τις διαφορετικές φάσεις της παρασκευής, αποθήκευσης και διακίνησης των προϊόντων. Παράλληλα, ο εντοπισμός συγκεκριμένων στελεχών στο μικροβίωμα του ξενιστή επιτρέπει την καλύτερη μελέτη των βιολογικών τους ιδιοτήτων. Οι διαθέσιμες μοριακές μέθοδοι για βακτηριακή ανίχνευση, όπως η ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου [pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)], και η πολυτοπική τυποποίηση αλληλουχίας [multi-locus sequence typing (MLST)] είναι χρονοβόρες και κοστοβόρες, με χαμηλή ικανότητα διάκρισης στο επίπεδο στελέχους (Prete et al., 2021; Karapetsas et al., 2010). Η αυξημένη προσβασιμότητα σε γονιδιωματικές αλληλουχίες βακτηρίων δίνει την ικανότητα ανάπτυξης νέων τεχνικών με αυξημένη διακριτική ικανότητα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιεί αλγορίθμους συγκριτικής γονιδιωματικής για την ανίχνευση αλληλουχιών οι οποίες είναι μοναδικές για το στέλεχος ενδιαφέροντος. Οι περιοχές αυτές χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό εκκινητών οι οποίοι παράγουν ένα ειδικό, στελεχοειδικό μοτίβο σε πήκτωμα αγαρόζης μετά από πολυπλεκτική αντίδραση PCR (multiplex PCR). Η μεθοδολογία αυτή έχει επιτυχώς χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των στελεχών L33, L125 (Kiousi et al., 2023) και Lc. paracasei SRX10 (Kamarinou et al., 2024) σε καθαρές καλλιέργειες και προϊόντα ζύμωσης. Τέλος, η ομάδα μας ανέπτυξε μια βάση δεδομένων η οποία συγκεντρώνει και παρουσιάζει μελέτες για τις in vitro προβιοτικές ικανότητες μικροβιακών στελεχών. Σήμερα, η σχετική βιβλιογραφία αυξάνεται εκθετικά, και έτσι ο μεγάλος όγκος της διαθέσιμης πληροφορίας δυσχεραίνει την εύρεση και αξιολόγηση των υπαρχουσών ερευνών. Για τον λόγο αυτό, δημιουργήσαμε την Probio-ichnos, μια μη-αυτόματη βάση δεδομένων που βασίζεται στη διαθέσιμη βιβλιογραφία, και παρουσιάζει στελέχη τα οποία έχουν μελετηθεί ή/και παρουσιάζουν εφτά βασικά χαρακτηριστικά: αντοχή στα οξέα και στα χολικά άλατα, ικανότητα προσκόλλησης, αντιμικροβιακή, ανοσορρυθμιστική, αντιπολλαπλασιαστική ή/και αντιοξειδωτική δράση. Κατά τη συγγραφή της παρούσας διδακτορικής διατριβής, η Probio-ichnos περιέχει 12,993 καταχωρήσεις, για 11,202 στελέχη τα οποία ανήκουν σε 407 είδη και 143 γένη. Επιπρόσθετα, η Probio-ichnos εμπεριέχει 789 γονιδιώματα. Τα στοιχεία για κάθε χαρακτηριστικό και βακτηριακό στέλεχος παρουσιάζονται με ποιοτικό τρόπο, με βάση τα συμπεράσματα των συγγραφέων από τις μελέτες από τις οποίες αντλήθηκαν τα δεδομένα. Η Probio-ichnos επιτρέπει τη συγκριτική μελέτη μικροοργανισμών ενδιαφέροντος, ενώ παράλληλα υποστηρίζει τον εντοπισμό διφορούμενων αποτελεσμάτων ή και ελλείψεων στα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα. Παράλληλα, μέσω της βάσης μπορούν να εντοπιστούν πιθανά προβιοτικά στελέχη με επαναλήψιμα αποτελέσματα τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως στελέχη-μάρτυρες για την αξιολόγηση των προβιοτικών ιδιοτήτων νέων στελεχών. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην πολυεπίπεδη μελέτη των προβιοτικών χαρακτηριστικών τριών λακτοβακίλλων αγρίου τύπου και δύο εμπορικών στελεχών, με τη χρήση in silico, in vitro και ομικών τεχνολογιών. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε ένα καινούργιο εργαλείο που διευκολύνει τη στελεχοειδική ανίχνευση βακτηρίων ενδιαφέροντος με πιθανή εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων όσο και στη βασική και εφαρμοσμένη έρευνα, και η Probio-ichnos, μια βάση δεδομένων που υποστηρίζει τη συγκριτική μελέτη προβιοτικών μικροοργανισμών και των ιδιοτήτων τους. Η εις βάθος κατανόηση του προβιοτικού δυναμικού στελεχών ενδιαφέροντος σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο αποτελεί εφαλτήριο για την επιτυχή ενσωμάτωση τους στην κλινική πράξη.