Ανάπτυξη in-vitro φαρμακοκινητικού/φαρμακοδυναμικού μοντέλου για την μελέτη της δράσης αντιμυκητιακών φαρμάκων και των συνδυασμών τους έναντι ειδών ασπεργίλλου
Authors: Ai-Saigh Rafal 
Published: September 2021

ΕΙΣΑΓΩΓΗ. Η in vitro δραστικότητα των αντιμυκητιακών έναντι ασπεργίλλων προσδιορίζεται μεπροτυποποιημένες μεθόδους στις οποίες η συγκέντρωση του φαρμάκου παραμένεισταθερή. Ωστόσο, η ενδοφλέβια χορήγηση αντιμυκητιασικών οδηγεί σε συγκεντρώσειςστο πλάσμα του αίματος που ελαττώνονται λόγω της απέκκρισης, του μεταβολισμού καιτης κατανομής του φαρμάκου. Επομένως, in vivo ο μύκητας εκτίθεται σε μη σταθερέςσυγκεντρώσεις φαρμάκων, γεγονός που δεν αναπαράγεται με τις κλασσικές μεθόδουςπροσδιορισμού των MIC. Σκοποί της παρουσας διατριβής ήταν ανάπτυξη ενός συστήματοςπροσομοίωσης της φαρμακοκινητικής της αμφοτερικίνης Β, της βορικοναζόλης και τηςκασποφουγκίνης όπως αυτή παρατηρείται μετά από ενδοφλέβια χορήγηση τηςενδεδειγμένης δοσολογίας στον άνθρωπο, καθώς και η μελέτη της δράσης των διαφόρωνδοσολογικών σχημάτων αυτών μόνα ή σε συνδυασμό έναντι κλινικών στελεχών A.fumigatus, A. flavus και Α. terreus.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ. Χρησιμοποιήθηκαν τρία κλινικά στελέχη A. fumigatus, A. flavus και Α. terreus που απομονώθηκαν από ασθενείς με διηθητική πνευμονική ασπεργίλλωση με MICs 1 mg/l γιατην αμφοτερικίνη Β και 0.5 mg/l για την βορικοναζόλη, και MECs για την κασποφουγκίνη0.5 mg/l. Το in vitro φαρμακοκινητική/φαρμακοδυναμική μοντέλο προσομοίωσηςαποτελείται από ένα σωλήνα διαπίδυσης 10-ml όγκου (εσωτερικό διαμέρισμα ΕΣΔ)κατασκευασμένο από μια ημιπερατή μεμβράνη κυτταρίνης (Float-Α-Lyzer; Breda, TheNetherlands) επιτρέποντας την ελεύθερη διάχυση μικρών μορίων (μοριακού βάρους, <20kDa). Αυτό τοποθετείται σε ένα γυάλινο ποτήρι που περιέχει 700 ml θρεπτικού μέσου(εξωτερικό διαμέρισμα ΕΞΔ) το περιεχόμενο του οποίου αραιώνεται συνεχώς από μίαπερισταλτική αντλία (Minipuls Evolution; Gilson Inc, Villiers le Bel, France)απομακρύνοντας θρεπτικό υλικό που περιέχει το φάρμακο μέσα από το ΕΞΔ καιπροσθέτοντας θρεπτικό υλικό χωρίς φάρμακο μέσο στο ΕΞΔ με ρυθμό ίσο με τον ρυθμόκάθαρσης του φαρμάκου στο ανθρώπινο πλάσμα. Κατά το χρόνο μηδέν, το ΕΣΔεμβολιάστηκε με 10 ml θρεπτικού που περιείχε 1Χ105CFU/ml του μύκητα. Το φάρμακοενίεται στο ΕΞΔ και στο ΕΣΔ ενώ η αντλία αραιώνει τη συγκέντρωση του φαρμάκου στο ΕΞΔ ώστε ο μέσος χρόνος ημίσειας ζωής να αντιστοιχεί με αυτόν που παρατηρείται στοανθρώπινο πλάσμα μετά την ενδοφλέβια χορήγηση αμφοτερικίνης Β, κασποφουγκίνης καιβορικοναζόλης σύμφωνα με προηγούμενες κλινικές μελέτες. Το ΕΞΔ τοποθετείται σεθερμαινόμενο μαγνητικό αναδευτήρα (37οC). Πριν την έναρξη και κατά την διάρκεια κάθεπειράματος, ελέγχεται η θερμοκρασία και ο ρυθμός ροής. Προσομοιώθηκαν οι παρακάτωδοσολογίες αντιμυκητιασικών φαρμάκων 0.25, 0.5, 1, 2 mg/kg για την αμφοτερικίνη Β,0.5, 1, 1.5 mg/kg για την κασποφουγκίνη, και 2, 3, 4, 5 mg/kg για τη βορικοναζόλη. Ταεπίπεδα γαλακτομαννάνης μετρήθηκαν με ανοσοενζυμική μέθοδο sandwich ELISA (PlateliaAspergillus, Bio-Rad Laboratories, Αθήνα, Ελλάδα), και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ωςδείκτης γαλακτομαννάνης (GI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο GIμετρήθηκε σε ΕΣΔ που εμβολιάσθηκαν με 105CFU/ml Α. fumigatus, Α. flavus, ή Α. terreusσε τακτά χρονικά διαστήματα μέχρι τις 72 ώρες. Τα φαρμακοδυναμικά δεδομέναυποβλήθηκαν σε ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης με βάση το σιγμοειδές Emaxμοντέλο. Διαφορετικές δοσολογίες συνδυαστικής θεραπείας με βορικοναζόλη καιαμφοτερικίνη Β προσομοιώθηκαν στο νέο in vitro PKPD μοντέλο με χρόνους ημιζωής 6ώρες για την βορικοναζόλη και 12 ώρες για την β φάση της αμφοτερικίνης Β. Το ΕΣΔεμβολιάστηκε με κονιδιακό εναιώρημα (103CFU/mL), ενώ τα διαλύματα φαρμάκουβορικοναζόλης και αμφοτερικίνης Β εγχύθηκαν στα δύο διαμερίσματα δις και άπαξημερησίως, αντίστοιχα. Οι φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με το μοντέλοανεξαρτησίας κατά Bliss.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Φαρμακοκινητική ανάλυση. α) Βορικοναζόλη. Το μονο-διαμερισματικόφαρμακοκινητικού μοντέλου περιέγραφε καλά τα επίπεδα του φαρμάκου στο ΕΣΔ (R2>0.97). Η διακύμανση των in vitro PK δεδομένων μεταξύ των πειραμάτων ήταν <10%. Η invitro φαρμακοκινητική της βορικοναζόλης ήταν κοντά με τις τιμές στόχους πουπαρατηρήθηκαν στο ανθρώπινο πλάσμα μετά από χορήγηση των 3, 4 και 5 mg/kgβορικοναζόλης. Ο χρόνος ημιζωής t1/2 της βορικοναζόλης στο in vitro μοντέλο ήταν 5.7-6,5ώρες.. β) Αμφοτερικίνη Β. Η Cmax και η AUCs στο ΕΣΔ των προσομοιωμένωνδοσολογιών 0.25, 0.5, 1 και 1.5 mg/kg ήταν πολύ κοντά στις αντίστοιχες τιμές στονάνθρωπινο πλάσμα με t1/2,α 0.2-2h, t1/2,β 10-17h και ο t1/2,γ 71h για την αμφοτερικίνη Β, αντιστοίχως. γ) Κασποφουγκίνη. Η in vitro φαρμακοκινητική της κασποφουγκίνηςπροσέγγισε τις τιμές στόχους που παρατηρήθηκαν στο ανθρώπινο πλάσμα μετά απόχορήγηση 0,5, 1 και 2 mg/kg caspofungin με χρόνο ημιζωής 11.6-14.8h.Φαρμακοδυναμική ανάλυση. α) Βορικοναζόλη. Όλες οι τρεις προσομοιωμένεςδόσεις βορικοναζόλης καθυστέρησαν την παραγωγή γαλακτομαννάνης από τον Α.fugimatus ενώ μόνο οι δύο υψηλότερες δόσεις μείωσαν την μέγιστη παραγωγήγαλακτομαννάνης σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Στην περίπτωση του Α. flavus, ηβορικοναζόλη δεν επηρέασε τον ρυθμό παραγωγής της γαλακτομαννάνης, ενώ η μέγιστηπαραγωγή γαλακτομαννάνης μειώθηκε συναρτήσει της δόσης. Όσον αφορά τον A. terreus,η βορικοναζόλη καθυστέρησε την παραγωγή γαλακτομαννάνης και μείωσε την μέγιστηπαραγωγή. Με βάση την κανονικοποιημένη PKPD σχέση, η fAUC0-24 που σχετίζεται με τημέγιστη δραστικότητα (10% ανάπτυξη) ήταν 18.9 (14.4–23.1) mg.h/l για A. fumigatus,26.6 (21.1 – 32.9) mg.h/l για Α. flavus και 36.2 (27.8–45.7) mg.h/l για Α. terreus (F2, 19 =17.22, p<0,0001). H τιμή fAUC0-24 18.9 συμφωνεί με την in vivo τιμή fAUC0-24 πουσχετίζεται με 90% επιβίωση σε ένα ζωικό μοντέλο πειραματικής ασπεργίλλωσης (Mavridouet al 2010) παρέχοντας έτσι μια επικύρωση του in vitro PKPD μοντέλο. Συσχετίζοντας το invitro PKPD δεδομένα με τα ανθρώπινα PK δεδομένα, το % των ασθενών που πέτυχε τοφαρμακοδυναμικό στόχο μέγιστης δραστικότητας με την ενδεδειγμένη δοσολογία των 4mg/kg ήταν υψηλό για τον Α. fumigatus (80%) αλλά όχι για τους Α. flavus και Α. terreusγια τους οποίους το ποσοστό επίτευξης του στόχου αυξήθηκε >68% για την δοσολογίατων 5 mg/kg. β) Αμφοτερισίνης Β. Οι καμπύλες GI-χρόνου υπό την επίδρασηδιαφορετικών δόσεων αμφοτερικίνης Β (R2> 0,86) χαρακτηριζόταν από την ίδια την τιμήEmax, αλλά διαφορετικές κλίσεις και T50s για τις διάφορες δόσεις αμφοτερικίνης Β και είδηAspergillus. Μεταξύ όλων των ειδών και των δόσεων, πλήρης αναστολή της παραγωγήςγαλακτομαννάνης παρατηρήθηκε μόνο ενάντια σε Α. fumigatus με δόσεις αμφοτερικίνη Βπου αντιστοιχούν σε Cmax ≥ 2,4 mg / l. Σε χαμηλότερες δόσεις, παρατηρήθηκε σημαντικήκαθυστέρηση στην παραγωγή γαλακτομαννάνης. Για Α. flavus, δεν υπήρχε πλήρηςαναστολή, αλλά μια προοδευτική καθυστέρηση της παραγωγής γαλακτομαννάνης μεαυξανόμενες δόσεις αμφοτερικίνης Β. Για Α. terreus, η καθυστέρηση στην παραγωγήγαλακτομαννάνης ήταν μέτρια. γ) Kασποφουγκίνη. Η κασποφουγκίνη δεν είχεσημνατική επίδραση στην παραγωγή γαλακτομαννάνης ενώ όταν το DNA των Aspergillus μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου, παρατηρήθηκαν 2.2-, 0.9-και 1.6-log μειώσεις στακονιδιακά ισοδύναμα (CE) των Α. fumigatus, Α. flavus και Α. terreus, αντίστοιχα, μετά από6 ώρες επώασης στο in vitro PKPD μοντέλο με Cmax=10 mg/L κασποφουγκίνης σεσύγκριση με τον χωρίς φάρμακο μάρτυρα.Συνδυστική θεραπεία. Ο συνδυασμός της βορικοναζόλης με αμφοτερικίνη Β ήτανανταγωνιστικός (-4 έως -13%) στις περισσότερες δοσολογίες που δοκιμάσθηκαν με Cmax1.7, 3.4 και 7.2 mg/l βορικοναζόλης και 0,6, 0,3 και 0,1 mg/L αμφοτερικίνης Β, ενώσυνεργικές αλληλεπιδράσεις σε ποσοστό από 26% παρατηρήθηκαν στις χαμηλότερεςδοσολογίας αμφοτερικίνης Β και βορικοναζόλης με Cmax 0.1 mg/L και 1.7 mg/l, αντίστοιχα.Οι τελευταίες συγκεντρώσεις αντιστοιχούν στα ελεύθερα επίπεδα των φαρμάκων πουεπιτυγχάνονται στο αίμα μετά από ενδοφλέβια χορήγηση των ενδεδειγμένων δοσολογιών.ΣΥΖΗΤΗΣΗ. Η παρούσα διατριβή περιγρέφει για πρώτη φορά, κατά τη γνώση μας, ένα νέο invitro φαρμακοκινητικό μοντέλο για είδη Aspergillus που μιμείται την ανθρώπινηφαρμακοκινητική στο πλάσμα τριών αντιμυκητιακών φαρμάκων τη βορικοναζόλη,αμφοτερικίνη Β και κασποφουγκίνη μετά από ενδοφλέβια χορήγηση. Για τηφαρμακοδυναμική ανάλυση αυτών των σχημάτων, η παραγωγή γαλακτομαννάνηςχρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μυκητιακής ανάπτυξης. Τρία στελέχη Aspergillus που είχαντην ιδια ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) και αντιπροσωπεύουν τα πιο σημαντικάκλινικά είδη Α. fumigatus, Α. flavus και Α. terreus μελετήθηκαν με αυτό το μοντέλο. Μεβάση αυτό το μοντέλο παρατηρήθηκαν φαρμακοδυναμικές διαφορές μεταξύ των ειδών οιοποίες δεν ήταν εμφανείς με τους συμβατικούς ελέγχους ευαισθησίας των μικροαραιωσεωνσε υγρό ζωμό όπου η συγκέτρωνση του φαρμάκου παραμένιε σταθερή στη διαρκεια τουχρονου (Lewis et αl, 2006).Μολονότι κάθε στέλεχος Aspergillus που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτηείχε την ίδια CLSI MIC (0.5 mg/L), το νέο in vitro PKPD μοντέλο αποκάλυψε σημαντικέςφαρμακοδυναμικές διαφορές, με τη βορικοναζόλη να εμφανίζει την μεγαλύτερηδραστικότητα έναντι Α. fumigatus και λιγότερο έναντι Α. terreus ενώ καμία η μικρότερηδράση ανιχνεύθηκε έναντι του A. flavus επιβεβαιώνοντας προηγούμενες in vivo και κλινικέςμελέτες (Takemoto et al 2009, Murphy et al 1997, Warn et al 2006, Herbrecht et al 2002,Steinbach et al 2004). Επίσης, PKPD ανάλυση των in vitro δεδομένων του μοντέλου έδειξε ότι ο PΚPD στόχος που σχετίζεται με την μεγίστη δραστικότητα της βορικοναζόλης είναι18,9 (14,4 - 23,1) mg.h/l fAUC0-24/MIC ο οποίος είναι πολύ κοντά στον αντίστοιχο στόχοπου βρέθηκε σε ιn vivo πειράματα σε ποντίκια (Μavridou et al 2005) επικυρώνοντας τααποτελέσματα του in vitro μοντέλου της παρούσας διατριβής. Συσχετίζοντας αυτό τονPKPD στόχο με PK δεδομένα από ανθρώπους, βρέθηκε ότι η τυπική δόση των 4 mg/kg,σχετίστηκε με υψηλά % επίτευξης του στόχου για είδη Α. fugimatus (80%), αλλά όχι γιαΑ. flavus (63%) και Α. terreus (36% ) για τα οποία παρατηρήθηκε ένα ευρύ φάσμα %επίτευξης στόχου που αντανακλά την μεγάλη διακύμανση των επιπέδων τηςβορικοναζόλης μεταξύ των ασθενών. Παρακολούθηση των επιπέδων η χρήση υψηλότερηδόσης βορικοναζόλης θα μπορούσε να αυξήσει την αποτελεσματικότητας του φαρμάκουγια αυτά τα είδη.Στην παρούσα μελέτη, τα στελέχη Aspergillus παρουσίασαν την ίδια MIC στηναμφοτερικίνη Β (1 mg /L), που ταξινομούνται ως ευαίσθητα (Cantón et al, 2009),υποδεικνύοντας παρόμοια δράση της αμφοτερικίνης Β. Ωστόσο, το νέο in vitro μοντέλοαποκάλυψε διαφορές στην αποτελεσματικότητα της αμφοτερικίνης Β για τα τρία είδηAspergillus, με την ακόλουθη σειρά: A. fumigatus>A. flavus>Α. terreus. Αυτά τα ευρήματαείναι σε συμφωνία με προηγούμενες συγκριτικές μελέτες σε ζώα, όπου η θεραπεία μεαμφοτερικίνη Β ήταν περισσότερο αποτελεσματική έναντι πειραματικών λοιμώξεων από Α.fumigatus από ότι έναντι λοιμώξεων από Α. flavus και λιγότερο αποτελεσματική έναντιπειραματικών λοιμώξεων από Α. terreus (Odds et αl, 1998; Walsh et al, 2003).Στο νέο in vitro μοντέλο, η κασποφουγκίνη δεν έδειξε σημαντικές δοσο-εξαρτώμενες αλλαγές στην παραγωγή γαλακτομαννάνης από τα τρία είδη Aspergillus πουμελετήθηκαν. Τα επίπεδα γαλακτομαννάνης μπορεί να παραμένουν σε υψηλά επίπεδαπαρά την αντιμυκητιακή δράση της κασποφουγκίνη. Έτσι, για την φαρμακοδυναμικήμελέτη των δράσεων της κασποφουγκίνης και των άλλων εχινοκανδίνων, μέτρηση τηςπαραγωγής γαλακτομαννάνης δεν φαίνεται να είναι κατατοπιστική όπως βρέθηκεπροηγουμένως σε in vitro και in vivo πειράματα (Petraitiene et al, 2002). Η PCRπραγματικού χρόνου έδειξε διαφορές στην δράση της κασποφουγκίνης μετξύ των ειδών.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή, αναπτύχθηκε ένα νέο in vitro PKPDμοντέλο το οποίο προσομοιώνει τη ανθρώπινη φαρμακοκινητική τριών αντιμυκητιασικών φάρμακων που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία της ασπεργίλλωσης (βορικοναζόλη,αμφοτερικίνη Β, κασποφουγκίνη) και αξιολογεί την αποτελεσματικότητά τους ενάντι το πιοκοινών ειδών Aspergillus (A fumigatus, A. flavus, A. terreus). Η in vitro PKPD ανάλυση τηςβορικοναζόλης έδειξε ότι απαιτείτε μεγαλύτερη έκθεση φαρμάκου για να αναστείλει τον Α.terreus και Α. flavus από ότι τον A. fumigatus. Επίσης, το νέο μοντέλο έδειξεφαρμακοδυναμικές διαφορές στη δράση της αμφοτερικίνης Β μεταξύ των τριών ειδώνAspergillus που δεν αντανακλώνται από τα MICs. Αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονταισε διαφορές στις δόσο- και χρόνο-εξαρτώμενες ανασταλτικές/μυκητοκτόνες και μέτα-αντιμυκητιακές δράσεις της αμφοτερικίνης Β εμφανίζοντας την μεγαλύτερη δραστικότηταέναντι Α. fumigatus και την μικρότερη έναντι Α. terreus. Σχετικά με κασποφουγκίνη, ταεπίπεδα γαλακτομαννάνης παραμένουν σε υψηλά επίπεδα σε όλες της συγκεντρώσεις μεαποτέλεσμα να μπορεί να περιγράψει την αντιμυκητιακή δράση της κασποφουγκίνης. Ηχρήση του κονιδιακού ισοδύναμου με PCR πραγματικού χρόνου θα μπορούσε να βοηθήσειστην μελέτη της φαρμακοδυναμικής των εχινοκανδινών.Τέλος, το νέο μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για την προσομοίωση συνδυαστικήςθεραπείας βορικοναζόλης+αμφοτερικίμης Β που συχνά χρησιμοποιείται στην θεραπεία τηςυποτροπιάζουσα ασπεργίλλωσης. Η μελέτη του συνδυασμού με το νέο μοντέλο έδειξεδόσο-εξαρτώμενες φαρμακοδυναμικές αλληλεπιδράσεις με τον συνδυασμό δοσολογιώνπου αντιστοιχούσαν στα ελεύθερα επίπεδα των δυο φαρμάκων μετά από χορήγηση τωνενδεδειγμένων δόσεων να είναι συνεργικός. Επομένως, ο συνδυασμόςβορικοναζόλη+αμφοτερικίνη Β μπορεί να αυξήσει την δράση της αντιμυκητιακής θεραπείαςενώ η παρακολούθηση των επιπέδων της συνδυαστικής θεραπείας θα μπορούσε ναοδηγήσει στην αύξηση των συνεργικών αλληλεπιδράσεων έναντι των ασπεργίλλων .