Συντονισμός της γονιδιακής ρύθμισης μετά από ιϊκή μόλυνση
Authors: Φουταδάκης Σπύρος 
Published: September 2021

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή είχε ως αντικείμενο μελέτης τους μηχανισμούς γονιδιακής έκφρασης που διέπουν την απόκριση των ανθρώπινων κυττάρων κατά τη διάρκεια Ιικών μολύνσεων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κατά μόνας ή σε συνδυασμό ο πλέον σύγχρονος και πρωτοποριακός τρόπος εφαρμογής των τεχνικών της γονιδιωματικής, μοριακής βιολογίας, βιοχημείας και υπολογιστικής βιολογίας. Κύριοι στόχοι ήταν η μελέτη σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και του μεταγραφόματος των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν σε ανθρώπινα κύτταρα κατά τη διάρκεια Ιικών μολύνσεων. Πιο συγκεκριμένα [1] η καταγραφή των ανθρώπινων γονιδίων των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται, [2] η ταυτοποίηση των ενισχυτών του DNA που ρυθμίζουν την έκφραση αυτών των γονιδίων καθώς και [3] η ενδελεχής μελέτη των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν το συντονισμό του φαινομένου της αντιϊκής κυτταρικής λειτουργίας. Το βασικό σύστημα μελέτης αποτέλεσαν οι δυο καλά χαρακτηρισμένοι κυτταρικοί τύποι HeLa (επιθηλιακά κύτταρα) και Namalwa (Β-λεμφοκύτταρα) και ως περιβαλλοντικό ερέθισμα της Ιϊκής μόλυνσης χορηγήθηκε ϊός Sendai στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. Αρχικά, μελετήσαμε τις αλλαγές στο μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων που μεταβάλουν την έκφρασή τους κατά τη κυτταρική αντιϊκή απόκριση σε Namalwa και HeLa κύτταρα. Εντοπίστηκε ένας πυρήνας περίπου 200 γονιδίων που επάγονται και στους δύο κυτταρικούς τύπους και σχετίζονται με ανοσολογικές λειτουργίες όπως το μονοπάτι των ιντερφερονών και η απόκριση σε κυτοκίνες. Στη συνέχεια με τις τεχνικές FAIRE-seq και DNaseI-seq εντοπίσαμε τις προσβάσιμες περιοχές στο γονιδίωμα και τις μεταβολές στη προσβασιμότητά τους κατά την εξέλιξη της αντιϊκής απόκρισης. Εντοπίστηκαν εκατοντάδες περιοχές με αυξημένη προσβασιμότητα κατά τη διάρκεια της αντιϊκής απόκρισης, οι οποίες είχαν τη τάση να βρίσκονται κοντά σε ιϊκά επαγόμενα γονίδια σύμφωνα με τα πειράματα RNA-seq και να φέρουν μοτίβα για σημαντικούς ρυθμιστές της αντιϊκής απόκρισης όπως οι παράγοντες IRF. Έπειτα για να μελετήσουμε το πρότυπο πρόσδεσης δύο καίριων μεταγραφικών παραγόντων για την αντιϊκή απόκριση, του IRF3 και του p65 πραγματοποιήσαμε πειράματα ChIP-seq από τα οποία διαπιστώθηκε ο ιϊκά επαγόμενος συνεντοπισμός των δύο παραγόντων σε εκατοντάδες περιοχές στο γονιδίωμα, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή συνέργεια των δύο παραγόντων στη ρύθμιση της αντιϊκής απόκρισης. Η πλειοψηφία των επαγόμενων θέσεων πρόσδεσης για τους παράγοντες IRF3 και p65 εδράζει σε περιοχές χρωματίνης που ήταν προσβάσιμες ήδη πριν από την ιϊκή μόλυνση και έφεραν επιπλέον χαρακτηριστικά των ενεργών ενισχυτών όπως πρόσδεση των συνενεργοποιητών CBP, Med1 καθώς και παρουσία της ιστονικής τροποποίησης H3K27ac. Παρόλα αυτά αξίζει να τονιστεί ιδιαίτερα η ύπαρξη περιοχών επαγόμενης πρόσδεσης του IRF3 με ή χωρίς το p65 σε περιοχές της χρωματίνης που είναι μη προσβάσιμες πριν από τη ιϊκή μόλυνση και οι οποίες επιπλέον δεν φέρουν χαρακτηριστικούς δείκτες όπως CBP, Med1 και H3K27ac. Στις περιοχές αυτές όμως παρατηρείται αύξηση της προσβασιμότητας της χρωματίνης και επαγόμενος συνεντοπισμός των παραπάνω δεικτών μετά την ιϊκή μόλυνση. Επιπλέον οι αλληλουχίες αυτές έχουν τη τάση να βρίσκονται κοντά σε ιϊκά επάγομενα γονίδια και να φέρουν μοτίβα για ρυθμιστές της αντιϊκής απόκρισης όπως οι παράγοντες IRFκαι Jun/Fos, γεγονός που ενισχύει περαιτέρω τη πιθανότητα να ρυθμίζουν κρίσιμα αντιϊκά γονίδια. Με τις τεχνικές FAIRE-seq, DNaseI-seq και ChIP-seq εντοπίστηκαν πιθανοί επαγόμενοι ενισχυτές με βάση αλλαγές σε δομικά χαρακτηριστικά της χρωματίνης όπως η αύξηση στη προσβασιμότητα της χρωματίνης και η πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων. Παρόλο που οι συγκεκριμένοι δείκτες σύμφωνα και με τη βιβλιογραφία χαρακτηρίζουν τους ενισχυτές, δεν αποδεικνύουν την ενεργότητά τους. Για να καλύψουμε αυτό το κενό και να μπορέσουμε να ελέγξουμε την ενεργότητα των πιθανών ενισχυτών που ανιχνεύσαμε in vivo, εφαρμόσαμε και τροποποιήσαμε τη πρωτοποριακή τεχνική ChIP-STARR-seq, μια ευρείας κλίμακας δοκιμασία αναφοράς (reporter assay) με την οποία εξετάσαμε ταυτόχρονα και μαζικά την ιϊκά επαγόμενη ενεργότητα των χιλιάδων περιοχών πρόσδεσης των μεταγραφικών ρυθμιστών της αντιϊκής απόκρισης IRF3 και p65. Το πολύ ενδιαφέρον εύρημα είναι ότι μόνο ένα ποσοστό περίπου 10% από τις περίπου 3000 αλληλουχίες με ισχυρή πρόσδεση του IRF3 λειτουργούν ως ενεργοί επαγόμενοι ενισχυτές. Από τη μελέτη των αλληλουχιών DNA των επαγόμενων ενισχυτών που προέκυψαν από τη μέθοδο STARR-seq διαπιστώθηκε ότι ένας σημαντικός αριθμός από αυτούς φέρουν στη σειρά επαναλαμβανόμενα μοτίβα πρόσδεσης των παραγόντων IRF. Πραγματοποιώντας σάρωση γονιδιωμάτων από διαφορετικά είδη χρησιμοποιώντας το consensus IRF μοτίβο, που αποτελεί τη δομική μονάδα των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών διαπιστώθηκε ότι οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες εντοπίζονται σε όλους τους οργανισμούς που εξετάστηκαν. Επιπλέον μεμονωμένες αλληλουχίες με επαναλαμβανόμενα μοτίβα IRF εντοπίζονται και στα γονιδιώματα διαφόρων ιών όπως οι ερπητοϊοί.