Μελέτη της ειδικής χυμικής και κυτταρικής ανοσίας έναντι αυτοαντιγόνων σε ασθενείς με χρόνιες ηπατοπάθειες
Authors: Σπύρου Ηλίας 
Published: August 2021

Η Πρωτοπαθής Χολική Κίρρωση (ΠΧΚ) είναι μια χρόνια αυτοάνοση χολοστατική νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από προοδευτική φλεγμονώδη καταστροφή των μικρού μεγέθους ενδοηπατικών χοληφόρων που οδηγεί σε μη αναστρέψιμη κίρρωση και ηπατική ανεπάρκεια. Ορολογικά, η ΠΧΚ χαρακτηρίζεται από την παρουσία υψηλού τίτλου αντι-μιτοχονδριακών αντισωμάτων (anti-mitochondrial antibody, ΑΜΑ). Ο βασικός αντιγονικός στόχος των ΑΜΑ στην ΠΧΚ είναι η Ε2 υπομονάδα της πυρουβικής δευδρογενάσης (PDC-E2), η οποία και αναγνωρίζεται σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95% των ασθενών. Παλαιότερες μελέτες έχουν καταδείξει τη σημασία της κυτταρικής ανοσίας στην παθογένεια της νόσου. Παρά τον κατά γενική ομολογία πρωτεύοντα ρόλο της ειδικής έναντι του PDC-E2 CD4+ κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης στην παθογένεια της νόσου υπάρχει μόνο μια μελέτη σε Ιάπωνες ασθενείς με ΠΧΚ που προσδιορίζει τους CD4+ λεμφοκυτταρικούς PDC-E2 επιτόπους. Στην εν λόγω μελέτη έχει περιγραφεί ως επικρατών επίτοπος το πεπτίδιο της PDC-E2163-176. Παρεμένει ωστόσο άγνωστο αν αυτός ο επίτοπος αναγνωρίζεται και από τα CD4+ T λεμφοκύτταρα ασθενών από άλλες πληθυσμιακές ομάδες πλην των Ιαπώνων. Παράλληλα δεν είναι επίσης γνωστό αν ο συγκεκριμένος επίτοπος είναι και ο μοναδικός. Είναι επίσης ενδιαφέρον, ότι στη χώρα μας δεν υπάρχουν δεδομένα που να αφορούν στη χαρτογράφηση των επιτόπων της PDC-E2 ασθενών με ΠΧΚ σε επίπεδο χυμικής ανοσίας. Στην παρούσα διατριβή επιχειρήσαμε να συμπληρωθούν τα παραπάνω βιβλιογραφικά κενά. Από τη μελέτη και το χαρακτηρισμό των ΑΜΑ προέκυψε το συμπέρασμα ότι η ταυτοποίηση των αυτοαντισωμάτων αυτών με πολλαπλές και παράλληλες μεθόδους αυξάνει την ευαισθησία για την ανίχνευσή τους. Αναλυτικότερα, στα πειράματα για το χαρακτηρισμό των ΑΜΑ με πειράματα ανοσοφθορισμού θετικά ελέχθηκαν 86.2% σε υπόστρωμα HEp-2 ενώ αυτό το ποσοστό σε υπόστρωμα ήπατος-νεφρού-στομάχου αρουραίου ήταν 83.9%. Θετικοί για την παρουσία ΑΜΑ σε πειράματα ανοσοφθορισμού σε τουλάχιστον ένα υπόστρωμα ήταν το 90,1% των ασθενών με ΠΧΚ. Με την μέθοδο της ELISA με την υβριδική πρωτεΐνη ΜΙΤ-3 τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν για τα μεν IgG 89.6% τα δε IgA 79.3% (69 ασθενείς) ενώ το ποσοστό αυτό όταν μια από τις δύο αυτές κλάσεις ή και οι δύο ήταν θετικές ήταν 93.1% (81 ασθενείς). Ογδόντα έξι ασθενείς (98.85%) ελέγχθηκαν θετικοί για την παρουσία ΑΜΑ με τουλάχιστον μια από τις 4 μεθόδους. Φαίνεται ότι ο συνδιασμός ELISA και ΕΑΦ είναι η πιο αποτελεσματική προσέγγιση για την ανίχνευση των ΑΜΑ. Για το χαρακτηρισμό της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι 76 20μερών, αλληλεπικαλυπτομένων κατά 8 αμινοξέα πεπτιδίων που καλύπτουν ολόκληρο το εύρος της PDC-E2, χρησιμοποιήσαμε ορούς από 19 ασθενείς με ΠΧΚ με τεκμηριωμένη παρουσία ΑΜΑ και ειδικότερα αντι-PDC-E2 αντισωμάτων κατά της έσω λιποϋλικής περιοχής της PDC-E2. Αντιδραστικότητα σε τουλάχιστον ένα από τα πεπτίδια που αντιστοιχούν στο έξω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2 παρουσίασαν 5 ασθενείς (26.31%) και 1 μάρτυρας. Τα πεπτίδια που τουλάχιστον ένας ασθενής παρουσίασε αντιδραστικότητα ήταν τα 11, 15 και 16. Η αντιδραστικότητα κατά του πεπτιδίου 11 ήταν μη ειδική καθώς θετική απόκριση έδωσαν τόσο ένας ασθενής όσο και ένας μάρτυρας. Αντιδραστικότητα κατά του πεπτιδίου 15 και 16 είχαν 4 (21.05%) και 5 (26.31%) ασθενείς αντίστοιχα ενώ κανένας μάρτυρας δεν παρουσίασε αντιδραστικότητα κατά αυτών των πεπτιδίων. Ενώ όλοι οι ασθενείς ελέγχθηκαν θετικά για την παρουσία αντισωμάτων κατά της έσω λιποϋλικής περιοχής τόσο με πειράματα ανοσοαποτύπωσης όσο και με πειράματα ELISA, μόνο ένας ασθενής παρουσίασε αντιδραστικότητα σε ένα πεπτίδιο (πεπτίδιο 26) που αντιστοιχεί στο έσω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2. Τρεις υγιείς μάρτυρες παρουσίασαν αντιδραστικότητα σε κάποιο από τα πεπτίδια που αντιστοιχούν στο έσω λιποϋλικό τμήμα. Η έλλειψη αντιδραστικότητας κατά των πεπτιδίων από ορούς που αντιδρούν με το έσω λιποϋλικό τμήμα της PDC-E2 δυνατόν να συμβαίνει επειδή ο επίτοπος των ΑΜΑ στο έσω λιποϋλικό τμήμα είναι στερεοτακτικός. Το ποσοστό αντιδραστικότητας κατά της θέσης σύνδεσης των υπομονάδων Ε1/Ε3 ήταν 0% ανάμεσα στους ασθενείς με ΠΧΚ. Η περιοχή που αντιστοιχεί στο καταλυτικό κομμάτι της PDC-E2 ήταν η πλέον ενδιαφέρουσα από πλευράς αντιδραστικότητας. Συνολικά 13 ασθενείς (68.42%) παρουσίασαν αντιδραστικότητα σε τουλάχιστον ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καταλυτικό τμήμα της πρωτεΐνης. Συνολικά 4 περιοχές φαίνεται να ξεχωρίζουν ως προς την αντιδραστικότητα σε σχέση με τους μάρτυρες: οι περιοχές που καλύπτονται από τα πεπτίδια 51 και 52, 59, 64, 72 και 74. Σε σύνολο 35 ασθενών που μελετήθηκε η ειδική T λεμφοκυτταρική ανοσολογική απάντηση ως παραγωγή IFN-γ σαν απάντηση στη διέγερση με το πεπτίδιο PDC-E2163-176 (προηγούμενα περιγραφόμενος επίτοπος) μόνο 3 (8.57%) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική παραγωγή IFN-γ και είναι η πρώτη φορά που περιγράφεται ποσοστό αναγνώρισης του προηγούμενα χαρακτηριζόμενου επιτόπου σε Καυκάσιους ασθενείς. Στα πειράματα κυτταρομετρίας ροής που έγιναν, σημαντική παραγωγή IFN-γ από τα CD4+ λεμφοκύτταρα παρατηρήθηκε μόνο σε 2 από τους 21 ασθενείς (9.52%). Η περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων τόσο σε ασθενείς με ΠΧΚ όσο και σε υγιείς μάρτυρες έδειξε ότι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της ανοσολογικής απόκρισης μεταξύ των 2 ομάδων. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι ο επίτοπος αυτός δεν είναι ο επικρατούν ανάμεσα στους Έλληνες ασθενείς με ΠΧΚ και έτσι έγινε μια πιο συστηματική προσέγγιση στη μελέτη της κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης.Το επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της ειδικής ανοσολογικής απόκρισης της T κυτταρικής ανοσίας σε 21 ασθενείς με ΠΧΚ και 5 υγιείς μάρτυρες έναντι 26 πεπτιδίων που δημιουργήθηκαν και χωρίστηκαν σε 5 δεξαμενές πεπτιδίων (Pools) με τη μέθοδο της IFN-γ ELISpot. Οι 19 από τους 21 ασθενείς έδειξαν μεγαλύτερη αντιδραστικότητα όταν τα PBMCs τους καλλιεργήθηκαν με κάποια από τις Pools σε σχέση με την αντιδραστικότητα που παρουσίασαν όταν καλλιεργήθηκαν παρουσία μόνο καλλιεργητικού υλικού. Στατιστικά σημαντική αντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε μόνο σε 8 (38.1%) ασθενείς με ΠΧΚ σαν απάντηση σε κάποια από τις 5 Pools πεπτιδίων. Στην επόμενη και τελική φάση της μελέτης αναζητήθηκαν πιθανοί επίτοποι των CD4+ T λεμφοκυττάρων ανάμεσα σε 22 ασθενείς με ΠΧΚ με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, χρησιμοποιώντας 76 20μερή πεπτίδια που κάλυπτουν ολόκληρη την αλληλουχία της PDC-E2 και που χωρίσθηκαν σε 12 δεξαμενές πεπτιδίων. Παράλληλα, στους 10 από αυτούς τους 22 ασθενείς μελετήθηκε πώς τα CD4+ T λεμφοκύτταρα τους πολλαπλασιάζονται όταν καλλιεργηθούν με τις 12 Pools πεπτιδίων που δημιουργήσαμε. Σε σύνολο 22 ασθενών, οι 17 (77.27%) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική παραγωγή IFN-γ από τα CD4+ T λεμφοκύτταρα τους σε τουλάχιστον μια δεξαμενή όταν τα PBMCs καλλιεργούνταν παρουσία των δεξαμενών πεπτιδίων. Ο κάθε έκαστος ασθενής παρουσίαζε αντιδραστικοτήτητα σε διαφορετικές δεξαμενές πεπτιδίων ενώ η πλειονότητα των ασθενών παρουσίασε αντιδραστικότητα σε περισσότερες της μιας δεξαμενές πεπτιδίων. Όταν μελετήθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, από τους 10 ασθενείς με ΠΧΚ οι 9 (90%) έδειξαν να έχουν στατιστικά σημαντικό ποσοστό CD4+ Tλεμφοκυττάρων που πολλαπλασιάζονταν παρουσία τουλάχιστον μιας δεξαμενής πεπτιδίων σε σχέση με το πολλαπλασιασμό που παρατηρούταν όταν τα κύτταρα καλλιεργούνταν απουσία αντιγόνου. Τα λεμφοκύτταρα των 10 αυτών ασθενών παρουσίασαν κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε περισσότερες της μιας δεξαμενής πεπτιδίων (μέσος όρος 5.2). Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η ειδική Τ κυτταρική ανοσολογική απόκριση σε Έλληνες ασθενείς με ΠΧΚ είναι ετερογενής και πολυκλωνική.