Szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára alkalmas módszerek kidolgozása Escherichia coliban
Authors: Zsibrita Nikolett 
Published: May 2024

Kidolgoztunk egy egyszerű módszert, amellyel a szekvencaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálható in vivo, Escherichia coliban. Az I-Block-nak nevezett módszer a laktóz-operon jól ismert szabályozási mechanizmusán alapszik. A módszer három alapvető eleme a lacI deléciós E.coli törzs ER1821 ΔlacI, az E. coli lacI gént hordozó pLacI plazmid, valamint az azzal kompatibilis pDBP plazmid, amely a vizsgált fehérje génjét kódolja. A vizsgált fehérje potenciális kötőhelyét a pLacI plazmid lacI promoterébe klónoztuk. Ha a vizsgált fehérje kötődik a célhelyhez, a konstitutív lacI transzkripció gátlódik, ami indukálja a genomban kódolt β-galaktozidáz termelődését. A specifikus DNS-fehérje kölcsönhatás így egyszerűen, a β-galaktozidáz aktivitás mérésével kimutatható. Az I-Block módszer működését 5 DNS-kötő fehérjével (két mesterségesen előállított cink-ujj fehérjével, a természetes ’helix-turn-helix’ DNS-felismerő doménnel rendelkező cI857 lambda fág represszorral és a Tet represszorral, valamint a CRISPR-dCas9 fehérjével) demonstráltuk. Az 5 fehérje 3 különböző DNS-felismerő fehérje-családba tartozik, ez azt jelzi, hogy a módszer várhatóan a DNS-kötő fehérjék széles körénél alkalmazható lesz. A módszer megfelelő működéséhez a Lac represszor alacsony szintű konstitutív termelésére van szükség, melyet egy kis kópiaszámú plazmidvektor használatával értünk el. Annak érdekében, hogy megtaláljuk a tesztszekvencia beépítésének a módszer működése szempontjából legjobb helyét, a lacI promoter 3 különböző pontján pontmutációval restrikciós klónozóhelyeket hoztunk létre. A legalkalmasabbnak a -10-es elemmel átfedő NheI hely bizonyult, amelyhez valószínűleg az is hozzájárult, hogy az NheI helyet létrehozó pontmutáció gyengítette a lacI promotert (lacIN promoter). A módszer működésének fontos feltétele, hogy a lacI promoterbe beépített szekvencia önmagában ne gátolja a lacI transzkripciót. A nagyon eltérő guanin- ill. citozintartalmú szálakkal rendelkező cink-ujj felismerőhelyekkel való munka során figyeltünk fel arra, hogy a nem-templát szálon a citozinban gazdag célszekvenciák gátolják a lacI transzkripciót. A módszer korábbi változatában a célszekvenciákat a -10-es promoter-elemmel átfedő NheI helybe, vagy az NheI és a tőle 3’ irányban lévő EcoRI hely közé építettük be. Újabb eredményeink azt mutatták, hogy a -10-es elemtől a a transzkripciós kezdőhelyig (+1) terjedő szakaszon célszerű meghagyni az eredeti szekvenciát. Ez azzal az előnnyel jár, hogy a transzkripció intenzitására hatással bíró diszkriminátor szekvencia és a transzkripciós kezdőhely a beépített célszekvenciáktól függetlenül mindig ugyanaz marad. Az I-Block módszer eredeti változatában csak kis számú fehérje – DNS kombináció vizsgálatára alkalmas. Továbbfejlesztettük a módszert egy „nagy áteresztőképességű” technika irányába azzal a céllal, hogy alkalmas legyen DNS-kötő fehérjék kötőhelyének egy komplex oligonukleotid-könyvtárból való azonosíthatására. Egy 18 bp hosszú randomizált szekvenciát, mint célhelyeket tartalmazó pLacI könyvtárból kapott transzformánsok között magas volt a LacI- klónok száma, ezek az álpozitív klónok zavarják a módszert. Összhangban korábbi, egyedi célszekvenciákkal tett megfigyelésünkkel, az Illumina szekvenálás azt mutatta, hogy a randomizált szekvenciákkal kapott LacI- klónok jelentős részében a beépített szekvencia nem-templát szála citozinban gazdag. A jelenségnek az inszertszekvencia citozintartalmától való függését az is alátámasztotta, hogy ha a random szekvencia kémiai szintézisekor a nukleotidarányt úgy módosítottuk, hogy ¼ helyett csak 1/10 arányban tartalmazzon citidint - az álpozitív, LacI- β-gal+ sejtek aránya a felére csökkent. A σ32 faktor függő promoterrel kapott eredményeink azt sugallják, hogy az egyes inszertszekvenciák következtében megjelenő LacI- fenotípus hátterében egy ismert jelenség, a transzkripció iniciációs fázisából az elongációba való átmenet megakadása áll. Ilyenkor az RNS polimeráz σ70 alegysége a kezdeti átírt szekvenciához tartósan kötődik, ezáltal megakadályozza vagy lelassítja az elongációba való átmenetet. Azonban a lacI transzkripciót olyan σ70 mutánsokkal, melyekről ismert, hogy toleránsabbak az elakadást kiváltó szekvenciákkal szemben, nem sikerült helyreállítani. A beépítés helyének 3’ irányba való tolásával megemelkedett a LacI koncentráció, azonban a transzkripciós kezdőhelytől távol (+10) beépített szekvenciával már nem volt hatékony a specifikus kötés kimutatása, mivel a tesztfehérje kötődése nem represszálta a lacI transzkripciót. A lacI transzkripció gátlását okozó szekvenciák számát sikerült azzal csökkenteni, és ezáltal az I-Block módszerrel vizsgálható szekvenciák számát növelni, hogy a lacIN promotert az erősebb, vad típusú lacI promoterre cseréltük. Kidolgoztunk egy rendszert a LacI+ sejtek szelektálásához. A lacI gént transzkripciós kapcsoltságba hoztuk az ampicillin rezisztenciát biztosító β-laktamáz génnel. Ez a bicisztronos konstrukció lehetővé teszi, hogy a LacI- s