Neurotoxicity and immunotoxicity of pesticides
Authors: Σιδηροπούλου Ερασμία 
Published: February 2022

Sidiropoulou E, Διδακτορική διατριβή (Doctor in Philosophy): Neurotoxicity and immunotoxicity of pesticides, Faculty of Health and Life Sciences, School of Veterinary Science, University of Liverpool (2014). Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση των βιοχημικών φαινομένων και μηχανισμών τοξικότητας δύο ευρείας χρήσης εξωπαρασιτοκτόνων παγκοσμίως, του fipronil, και του μεταβολίτη του diazinon, diazinon-oxon, στο νευρικό και ανοσοποιητικό σύστημα. Τα παρασιτοκτόνα αυτά έχουν την δυνατότητα να προκαλέσουν τοξικώσεις σε ζώα αλλά και στον άνθρωπο.Όσον αφορά το νευρικό σύστημα, χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές από επίμυ (C6 γλοιωματικά κύτταρα), ποντικό (N2α-νευροβλαστωματικά). Αρχικά, εφαρμόστηκε η φασματοφωτομετρική μέθοδος αναγωγής της ουσίας MTT (cell viability assays) για να προσδιορίσουμε συγκεντρώσεις των παρασιτοκτόνων που δεν προκαλούν κυτταρικό θάνατο (1, 5 και 10μΜ). Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε η ανοσοχημική μέθοδος κατά Western (Western blotting analysis) όπου με τη χρήση αντισωμάτων προσδιορίστηκαν τα επίπεδα πρωτεινών που σχετίζονται με την δυναμική του κυτταρικού σκελετού. Περαιτέρω, μελετήθηκε η επίδραση των δύο αυτών ουσιών στον σχηματισμό νευραξονικών προεκβολών (rat C6 glioma cells) ή νευραξόνων (mouse N2a-neuroblastoma cells)(inhibition of axon-like processes), που προσδιορίστηκε ποσοτικά με το μικροσκόπιο. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ακετυλοχολινεστεράσης -ενός σημαντικού ενζύμου για την λειτουργία του νευρικού συστήματος-, σε όλες τις υπό διερεύνηση συγκεντρώσεις των ουσιών αυτών.Πιο συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η επίδραση του βασικού μεταβολίτη του εξωπαρασιτοκτόνου diazinon, diazinon-oxon (DZO), σε νευροβλαστωματικά κύτταρα N2a ποντικού, υπό διαφοροποίηση. Σε συγκεντρώσεις που δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητά τους βρέθηκε ότι προκαλείται αναστολή του νευροαξονικών προεκβολών τους μετά από 24 ώρες έκθεση. Εφαρμόζοντας την μέθοδο Western Blotting analysis, προσδιορίστηκε η πυκνότητα πρωτεινών όπως της βαριάς αλύσου (NF-H) των νευρικών νηματίων και βρέθηκε αύξηση της φωσφορυλίωσης τους μόνο στις δύο υψηλότερες δόσεις, συγκριτικά με κύτταρα μάρτυρες. Σε αντίθεση, η πρωτείνη ανάπτυξης του νευράξονα-43 (GAP-43) παρουσίασε σημαντική μείωση σε όλες τις συγκεντρώσεις. Η νευροτοξική δράση αυτή του DZO βρέθηκε οτι δεν σχετίζεται με παράλληλη αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE).Περαιτέρω, ερευνήθηκε η επίδραση του μεταβολίτη DZO σε κυτταροσκελετικές πρωτείνες οπως η σωληνίνη, η GFAP (glial fibrillary acidic protein) και η κυτταροσκελετική πρωτείνη MAP1B που σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους σε υπό διαφοροποίηση γλοιωματικά κύτταρα C6 επίμυος. Η κατά Western ανάλυση έδειξε μείωση των πρωτεινών αυτών στη μεγαλύτερη συγκέντρωση του, ενώ η πρωτείνη GFAP βρέθηκε μειωμένη σε όλες τις συγκεντρώσεις. Αξιοσημείωτο είναι ότι το DZO προκαλεί αναστολή των προεκβολών των C6 κυττάρων.Παρόμοια, το FIP προκάλεσε σημαντική αναστολή των νευροαξονικών προεκβολών στα N2a κύτταρα χωρίς πάλι να επηρεάζει την βιωσιμότητά τους. Επίσης, επηρέασε σημαντικά την οδό κυτταρικής σηματοδότησης της ERK1/2-MAP κινάσης που παίζει ρόλο στην διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων αλλά και μείωσε τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων μορφών των ERK1/2 και MEK1/2. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι και το FIP ασκεί τοξική δράση στο νευρικό σύστημα.