About oral application of a thrombolytic based on immobilized subtilisins for thrombosis treatment
Authors: Мишенина С.В. , Дыгай А.М. , Мадонов П.Г. , Ершов К.И. , Равилова Ю.Р. , Шишканова А.В. 
Published: March 2022

Введение. Тромболитическая терапия с применением активаторов плазминогена достаточно эффективна, но сопряжена с риском возникновения геморрагических осложнений и реализуется только внутривенным путём введения. Существует необходимость в пероральной тромболитической терапии. Среди возможных кандидатов для эффективного перорального фибринолиза/тромболизиса следует обратить внимание на сериновые протеиназы, не вызывающие сайт-специфического гидролиза факторов свёртывания крови. Необходимо изучить их энтеральную биодоступность и тромболитическую активность. Цель исследования: изучить путь поступления сериновой протеиназы субтилизина в системный кровоток при пероральном применении, а также сравнить тромболитическую активность протеолитических ферментов трипсина, химотрипсина и субтилизина. Материалы и методы. Проведено открытое сравнительное экспериментальное исследование в параллельных группах крыс по определению тромболитической активности изучаемых препаратов in vitro. Сформировано 4 группы животных: 3 для исследования лекарственных препаратов субтилизина, трипсина, химотрипсина и 1 контрольная. В каждой группе происходила инкубация фрагментированных тромбов с предполагаемым тромболитическим агентом. Для исследования всасывания иммобилизированного субтилизина (ИС) 30 крысам после срединной лапаротомии интубировали фрагмент тощей кишки для инфузии растворов. Для ИС, меченного флуоресцеин‑5‑изотиоцианатом (ФИТЦ), определены особенности всасывания из тощей кишки в систему кровь–лимфа. Меченный ИС экстрагировали из прилегающей к области интубации интерстициальной жидкости кишечника, слизистый слой которого был удален, и из паренхимы лимфатических узлов (I и II порядка). Для визуальной детекции абсорбции ИС на эпителии тощей кишки применили метод конфокальной микроскопии. Тромболитическая активность ИС, трипсина и химотрипсина исследована на фрагментированном тромбе. Результаты. In situ установлено, что ИС через 60 мин после начала инкубации в тощей кишке детектируется и в плазме крови и в лимфе (p < 0,01). Концентрация препарата в плазме крови из v. mesenterica (223,8 ± 39,8 мЕд/мл) более чем в 10 раз выше, чем в лимфе из цистерны грудного протока (19,27 ± 2,33 мЕд/мл). Снижение концентрации препарата в v. cauda (143,7 ± 24,4 мЕд/мл) по сравнению с v. mesenterica (p < 0,01) объясняется первичным метаболизмом в печени и последующим почечным клиренсом. При конфокальной микроскопии хорошо видно, что ИС активно абсорбируется на слизистой тонкого кишечника с накоплением в толще крипт и поступлением в сосудистую сеть. В экспериментах in vitro показано, что в условиях нормального или компенсированного кислотно-основного состояния крови достоверно наибольшую тромболитическую активность имеет препарат ИС (p < 0,05 по сравнению с контролем, трипсином и химотрипсином). За 30 мин инкубации ИС уменьшает площадь тромба более чем на 20%. Заключение. Энтеральная биодоступность ИС обеспечивается за счёт активной абсорбции на слизистой тонкого кишечника, прямого поступления в сосуды портальной системы и накопления в лимфатическом русле с дальнейшим дренажем в системный кровоток. Тромболитическое действие ИС существенно превосходит трипсин и химотрипсин, что позволяет считать малоперспективным разработку пероральных тромболитиков на основе трипсина и химотрипсина.

Background. Thrombolytic therapy with plasminogen activators is quite effective, but it is associated with the risk of hemorrhagic complications and is implemented only by intravenous administration. Need for oral thrombolytic therapy exists. Among the possible options for effective oral fibrinolysis/thrombolysis, attention should be paid to serine proteinases that do notcause site-specific hydrolysis of blood coagulation factors. It is necessary to study their enteral bioavailability and thrombolytic activity. Objectives: to study the route of entry of serine proteinase subtilisin into the systemic circulation after oral administration, and also to compare the thrombolytic activity of the proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, subtilisin. Materials/Methods. We carried out an open comparative experimental study in parallel groups of rats to determine the thrombolytic activity of the studied drugs in vitro. Four groups were formed: 3 groups to study subtilisin, trypsin, chymotrypsin and 1 control group. In each group, fragmented thrombi were incubated with the putative thrombolytic agent. To study the absorption of immobilized subtilisin (IS), 30 rats after midline laparotomy were intubated with a jejunum fragment for infusion of solutions. For IS labelled with fluorescein‑5‑isothiocyanate (FITC), the features of absorption from the jejunum into the blood-lymph system were determined. The labelled IS was extracted from the interstitial fluid adjacent to the intubation area, the mucous layer of which was removed, and from the parenchyma of the lymph nodes (sentinel and second-tier nodes). Confocal microscopy was used to detect visually the IS absorption on the jejunal epithelium. The thrombolytic activity of IS, trypsin, and chymotrypsin was studied on a fragmented thrombus. Results. It was found in situ that IS 60 min after the start of incubation in the jejunum was detected in both blood plasma and lymph (p < 0.01). Plasma drug concentration from the mesenteric vein (223.8 8 ± 39.8 mU/ml) is more than 10 times higher than that in the lymph from the thoracic duct cistern (19.27 ± 2.33 mU/ml). Reducing drug concentration in the caudal vena (143.7 ± 24.4 mU/ml) compared to the mesenteric vein (p < 0.01) is explained by primary hepatic metabolism and subsequent renal clearance. Confocal microscopy clearly shows that IS is actively absorbed at the mucous membrane of the small intestine with accumulation in the crypt and entering the vasculature. In vitro experiments have shown that under conditions of the normal or compensated acid-base blood state, the IS has significantly the highest thrombolytic activity (p < 0.05 compared to control, trypsin and chymotrypsin). After 30 minutes of incubation, IS reduces the thrombus area by more than 20%. Conclusions. IS enteral bioavailability is provided due to active absorption at the mucous membrane of the small intestine, direct entry into the vessels of the portal system and accumulation in the lymphatic bed with further drainage into the systemic circulation. IS thrombolytic effect is significantly superior to trypsin and chymotrypsin, which makes the development of oral thrombolytics based on trypsin and chymotrypsin unpromising.