Estudo estrutural e de conservação de sequências e produção de fitase por Pichia pastoris visando sua aplicação para o aumento da digestibilidade de rações para monogástricos
Authors:   , Pires Elizabeth Bárbara Epalanga 
Published: May 2023

A utilização eficiente dos nutrientes pelos animais é fator de grande relevância para indústria de nutrição animal. Esse resultado depende da eficiência da fitase sobre o complexo fitato-minerais, o qual representa, nos alimentos, um fator antinutricional pelo aprisionamento de nutrientes essenciais requeridos para o bom desempenho dos animais. No entanto, a pouca resistência a altas temperaturas e ao ambiente gástrico dos animais podem comprometer a aplicação dessa enzima, reduzindo assim a eficiência de utilização de nutrientes, com consequente problemas econômicos e ambientais. Para tal efeito, torna-se necessário a obtenção de uma fitase que seja capaz de hidrolisar o fitato nestas condições. Assim, entender o mecanismo de ação das fitases permitiria a obtenção de fitases com características adequadas requeridas para sua aplicação. Este trabalho teve como objetivos análise estrutural e estudos de conservação de fitases para otimização de uma fitase para aplicação industrial. Dessa forma, a primeira parte deste trabalho compreende a formação de um banco de dados de fitases e análises comparativas estruturais em relação às propriedades bioquímicas destas enzimas, a fim de compreender fatores que influenciam na estabilidade dessas enzimas. Outra etapa da pesquisa, consistiu no estudo de expressão e caracterização da fitase de Dendroctonus frontalis, selecionada entre as fitases estudadas por apresentar estabilidade térmica satisfatória. Foram também avaliados estudos de secagem dos extratos de fitase obtidos a partir desta, pelos métodos de liofilização e Spray Dryer. Com base nas propriedades bioquímicas e no alinhamento de sequências de aminoácidos, observamos alta variabilidade entre as fitases estudadas, com propriedades bioquímicas bastante distintas, apesar destas apresentarem semelhança estrutural. No entanto, na análise estrutural comparativa, o número de interações de Van der Waals, interações iônicas, hidrogênio e ligações dissulfeto que constituem essas fitases não explicaram asdiferenças nas suas propriedades bioquímicas. A sequência codificadora da fitase selecionada foi sintetizada no plasmídeo pPICZαB e expressa em Pichia pastoris. Após a clonagem e seleção dos transformantes, a expressão da fitase foi avaliada em diferentes composições de meios de cultivo e pHs. O uso dos meios mBMMH e BMMY em pH 5,0 promoveram um aumento de 3 vezes no nível de expressão da fitase em relação à expressão realizada em BMMH. A enzima expressa possuiu maior atividade em pH 4,0 e temperatura de 42 °C. Entretanto, sua estabilidade foi drasticamente reduzida quando submetida a temperaturas de 70 e 80 °C, por apenas 1 min. A secagem dos extratos por liofilização preservou 62 % da atividade enzimática, na presença de maltodextrina a 5 %. Na ausência desse composto, apenas 41 % de atividade foi recuperada. Os extratos submetidos a secagem por Spray Dryer, apresentaram maior atividade residual a 100 °C e 5 % de maltodextrina, acima desta condição a atividade reduziu significativamente. Embora a secagem dos extratos por Spray Dryer tenha causado redução significativa na atividade enzimática, o seu uso permitiu que o pó seja armazenado por pelo menos 240 dias à temperatura ambiente, sem perda de atividade. A partir deste estudo podemos concluir que o mecanismo de ação de uma fitase está intimamente relacionada a sua estrutura e sua eficiência precisa ser analisada individualmente de acordo ao sistema de expressão escolhido. Este trabalho pode auxiliar para uma melhor compreensão do mecanismo de ação das fitases e obtenção de novas fitases para aplicação comercial. Palavras-chave: Ácido fítico. Fitase. Conservação de sequências enzimáticas. Aplicação industrial. Estabilidade enzimática.