Φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική μελέτη του αντικαρκινικού συνθετικού πεπτιδίου PCK3145 και PEG-PCK3145 σε ζώα
Authors: Δανίκα Χαρίκλεια 
Published: September 2021

Η πρωτεΐνη PSP94 (γνωστή και ως β-μικροσεμινοπρωτεϊνη, με μοριακό βάρος 14kDa) παίζει ανασταλτικό ρόλο στη καρκινογένεση, επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και μειώνει την ανάπτυξη νεοπλασιών τόσο in vitro όσο και in vivo (Garde et al., 1999, Shukeir et al., 2003). Eρευνητικές ομάδες προσπάθησαν να μελετήσουν διεξοδικά τη δράση της πρωτεΐνης PSP94 και να αποσαφηνίσουν τη φαρμακοφόρο αλληλουχία που έχει την συγκεκριμένη προστατευτική αντικαρκινική δράση. Μετά τη μελέτη 12 αμινοξικών αλληλουχιών της PSP94, βρέθηκε ότι το 15-πεπτίδιο από το 31ο έως το 45ο αμινοξύ, με τη κωδική ονομασία PCK3145, έχει την καλύτερη αντι-αγγειογενετική και αντι-μεταστατική δράση σε in vitro και in vivo καρκινικά μοντέλα (Shukeir et al., 2004). Ο μηχανισμός δράσης του PCK3145 δεν είναι πλήρως γνωστός ωστόσο έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την έκκριση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9), μέσω ταχείας φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK, όσο και την επακόλουθη πρόσδεση της στην κυτταρική επιφάνεια οδηγώντας σε αντι-μεταστατική δράση (Annabi, Bouzeghrane, et al., 2006). Επιπλέον αναστέλλει την έκφραση της σηματοδότησης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) μέσω της φωσφορυλίωσης ERK γεγονός που αντικατοπτρίζει την αντι-αγγειογενετική δράση του (Lamy et al., 2006). Εν τούτοις, η χαμηλή in vivo σταθερότητα του πεπτιδίου PCK3145 καθώς και ο γρήγορος ρυθμός κάθαρσής του, περιορίζουν σημαντικά τη κλινική χρήση στον άνθρωπο (Hawkins et al., 2005). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στη διερεύνηση του φαρμακοκινητικού και φαρμακοδυναμικού προφίλ του PCK3145 κατόπιν σύζευξης με πολυαιθυλενογλυκόλη 20 (PEG 20). Η βιοχημική τροποποίηση μορίων με πολυαιθυλενογλυκόλη είναι γνωστό ότι αλλάζει τη φαρμακοκινητική, επιμηκύνοντας τον χρόνο ημιζωής και επιβραδύνοντας την κάθαρση πολλών βιολογικά δραστικών ενώσεων (Harris, Martin and Modi, 2001; Haubner et al., 2001; Dennis et al., 2002). Αρχικά αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν αναλυτικές μέθοδοι LC-MS/MS,UHPLC-UV και ELISA, με στόχο τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των πεπτιδίων PCK3145 και PEG-PCK3145 σε πλάσμα μυών. Συγκεκριμένα, η αναλυτική μέθοδος LC-MS/MS χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμό του μητρικού πεπτιδίου PCK3145 με εύρος γραμμικότητας από 0.125 έως 4.0 μg/mL και ακρίβεια και πιστότητα εντός της αποδεκτής περιοχής (15% από την πραγματική τιμή για τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου και το 20% για το κατώτατο επίπεδο συγκέντρωσης). Για τον προσδιορισμό του PEG-PCK3145 σε πλάσμα μυός χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος UHPLC-UV με εύρος της καμπύλης βαθμονόμησης από 0.05 έως 2.0 mg/mL και εξαιρετική ακρίβεια και πιστότητα εντός της αποδεκτής περιοχής (15% από την πραγματική τιμή για τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου και 20% για το κατώτατο επίπεδο συγκέντρωσης). Επιπροσθέτως, για τον προσδιορισμό του PCK3145 μετά τη σύζευξη με πολυαιθυλενογλυκόλη χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ELISA με καμπύλη βαθμονόμησης του πεγκυλιωμένου πεπτιδίου από 1.76 έως 56.3 ng/mL.Με τη βοήθεια των παραπάνω μεθόδων ελέγχθηκε η σταθερότητα των πεπτιδίων σε πλάσμα μυός κάτω από διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης. Τα ευρήματα της μελέτης σταθερότητας φανερώνουν ότι μετά από μια εβδομάδα παραμονής των δειγμάτων στους 4-8 °C, τρείς επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης και αποθήκευσή τους για 6 μήνες στους -20 °C παρέμειναν σταθερά. Επιπλέον, μελετήθηκε η πρωτεολυτική σταθερότητα των πεπτιδίων σε πλήρες αίμα και πλάσμα μυός, με αποτέλεσμα να παραμένουν άθικτα μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 °C (95% για το PCK3145 και 92% για το PEG-PCK3145). Στη συνέχεια μελετήθηκε το φαρμακοκινητικό προφιλ του PCK3145 πριν και κατόπιν σύζευξης με πολυαιθυλενογλυκόλη 20, σε δύο ομάδες των δώδεκα αρσενικών SCID μυών, μετά από ενδοπεριταναϊκή χορήγηση 100 μg/kg PCK3145 και 1000 μg/kg PEG-PCK3145 (αντιστοιχεί σε 75 μg/kg PCK3145). Τα αποτελέσματα της φαρμακοκινητικής μελέτης αποδεικνύουν ότι ότι ο χρόνος ημιζωής πρίν την πεγκυλίωση και μετά την πεγκυλίωση βρέθηκε 9.25 και 11.55 minutes (p=0.074), η κάθαρση ήταν 0.088 και 0.023 mL/min (p=0.081) και ο όγκος κατανομής ήταν 1.17 και 0.37 mL (p=0.067), αντίστοιχα. Τέλος, διερευνήθηκε η in vivo αντικαρκινική δράση του πεγκυλιωμένου πεπτιδίου PEG-PCK3145 μετά την ενδοπεριταναϊκή χορήγησή του σε SCID μύες που έφεραν εμφύτευμα καρκινικών κυττάρων προστάτου (PC3). Μετρήθηκε η μείωση του μεγέθους του όγκου στους SCID μύες, μετα από χορήγηση 1000 μg/kg και 100 μg/kg PEG-PCK3145, 100 μg/kg PCK3145, 1000 μg/kg PEG20 (αρνητικός μάρτυρας) και 10 mg/kg δοσεταξέλης (θετικός μάρτυρας), μια φορά ημερησίως για 6 εβδομάδες. Όλα τα σχήματα έδειξαν στατιστικά σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα PEG20 (p<0.05). Το PEG-PCK3145 σε δόση 1000 μg/kg (το οποίο αντιστοιχεί σε 75 μg/kg PCK3145) έδειξε την ίδια δράση αναφορικά με τη μείωση του όγκου συγκρινόμενη με τη δόση των 100 μg/kg PCK3145. Μία σαφής δόσο-εξαρτώμενη απόκριση παρατηρήθηκε για το πεγκυλιωμένο πεπτίδιο PEG-PCK3145 καθώς η χαμηλότερη δόση του PEG-PCK3145 των 100 μg/kg, (τα οποία αντιστοιχούν σε 7.5 μg/kg PCK3145) βρέθηκαν λιγότερο αποτελεσματικά από τη δόση των 1000 μg/kg του PEG-PCK3145 (p<0.05). Συνοψίζοντας, η πεγκυλίωσή του PCK3145 έδωσε ένα βιολογικά ενεργό μόριο, σταθερό σε συνθήκες αποθήκευσης, καθώς και στην ενζυματική διάσπαση σε ολικό αίμα και πλάσμα μυών. Το PEG-PCK3145 έδειξε να έχει αυξημένο μεν χρόνο ημιζωής και φαινόμενο όγκο κατανομής, μειωμένο δε ρυθμό κάθαρσης σε μύες σε σχέση με το μητρικό πεπτίδιο, χωρίς όμως στατιστική σημαντικότητα στις διαφορές των φαρμακινητικών παραμέτρων. Σε μύες που έφεραν εμφύτευμα όγκου, το PEG-PCK3145 βρέθηκε ελαφρά δραστικότερο από το μητρικό PCK3145 συγκρινόμενο ισομοριακά. Θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη μελλοντική κλινική χρήση, να βελτιστοποιηθούν οι φαρμακοκινητικές παράμετροι του νέου αντικαρκινικού συνθετικού πεπτιδίου PCK3145, πιθανώς με γλυκοζυλίωση ή κυκλοποίηση ή χρήση νανοσωμάτων/λιποσωμάτων.