Σύνθεση και μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με δυνατότητα πρόσδεσης σε βήτα αμυλοειδές
Authors: Τσολάκης Απόστολος 
Published: September 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν οι μέθοδοι και τεχνικές νανοτεχνολογίας για τη μελέτη της παθολογίας και αντιμετώπισης της Νόσου Alzheimer (NA), μίας εκ των πιο θανατηφόρων νευροεκφυλιστικών νόσων του 21ου αιώνα. Στοχεύοντας τη συσσωμάτωση του β-αμυλοειδούς, μία εκ των δύο βασικών υποθέσεων για τα αίτια της νόσου, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση, ενεργοποίηση και χαρακτηρισμός υπερπαραμαγνητικών νανοφορέων οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) με επικάλυψη πυριτίας και παρουσία της χρωστικής Θειοβλαβίνη T (ThT). Ο κύριος στόχος ήταν η δημιουργία ενός πολυ-λειτουργικού συμπλόκου, το οποίο έχει τη δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, διττή απεικονιστική λειτουργία (MRI και φθορισμός), και εν δυνάμει δράση ως θεραπευτικός παράγοντας για την αντιμετώπιση της ΝΑ. Προς αυτή την κατεύθυνση, και ύστερα από εκτενή βιβλιογραφική επισκόπηση και πολλαπλές πειραματικές προσπάθειες, η μέθοδος της συγκαταβύθισης δισθενούς/τρισθενούς Fe επιλέχθηκε ως η πιο αντιπροσωπευτική τεχνική για τη σύνθεση SPIONs. Εν συνεχεία, μέσω επιπλέον δοκιμών προσδιορίστηκαν οι παράμετροι της διαδικασίας που οδήγησε στη σύνθεση μαγκεμίτη (Fe3O4) μέσου μεγέθους μικρότερου των 15 nm. Έπειτα, περαιτέρω διερεύνηση της βιβλιογραφίας για παράγοντα που να φέρει όχι μόνο τη δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, αλλά και επιπλέον ιδιότητες που συνεισφέρουν στην απεικόνιση, διάγνωση, και αντιμετώπιση της δημιουργίας αμυλοειδικών πλακών, οδήγησαν στη χρωστική ΤhT. H ThT εκπέμπει πιο έντονα εφόσον προσδεθεί στο Αβ, ενώ σε πολλαπλές μελέτες έχει αναγνωριστεί και ως ανασταλτικός παράγοντας στην εμφάνιση/εξέλιξη της υπό εξέταση παθολογίας. Συνδυάζοντας τις δύο απαιτήσεις, και σύμφωνα με τα πειραματικά ευρήματα, ως δεύτερο στάδιο στη διαδικασία ακολουθήθηκε μία μέθοδο πηκτώματος για τον εγκλεισμό σε SiO2 δημιουργώντας μία δομή "core-shell", με αυτόχρονη προσθήκη και εγκλεισμό της ThT. Το αποτέλεσμα της συνολικής παρασκευαστικής διαδικασίας οδήγησε σε ένα νανοφορέα με υπερπαραμαγνητικό πυρήνα, βιο-συμβατή επικάλυψη SiO2, και ακροδέκτες με εξαιρετική δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, με παράλληλη ικανότητα φθορισμού. Το τελικό προϊόν ονομάζεται Τ-SPION και έχει μέσο μέγεθος της τάξης των 20 nm. Σε κάθε ένα από τα παραπάνω στάδια, εξετάστηκαν και τεκμηριώθηκαν οι χημικές, δομικές, μαγνητικές και οπτικές ιδιότητες των προϊόντων. Τα T-SPIONs δοκιμάστηκαν με Aβ1-42, όπου αποδείχτηκε η επιτυχής σύνδεση και απομάκρυνση από διάλυμα. Διαφορετικές συγκεντρώσεις και τρόποι ανάμιξης απέδειξαν μία αναλογική συσχέτιση για την ικανότητα πρόσδεσης στο Aβ. Ωστόσο, παρατηρήθηκε κορεσμός αυτής πάνω από μία συγκέντρωση T-SPIONs. Εν συνεχεία εξετάστηκε η τοξικότητα των T-SPIONs σε φαγοκύτταρα. Τα πειράματα έδειξαν αρχικά ότι η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης διενεργείται επιτυχώς, με ποσοστά που ξεπερνούν το 60% ακόμα και μετά από 24 hrs. Τα εν λόγω αποτελέσματα υποστηρίζονται τόσο με κυτταρομετρία ροής όσο και με εξέταση του φθορισμού. Εν συνεχεία, αποδείχθηκε η μη τοξικότητα των Τ-SPIONs με δύο χρωματομετρικές μεθόδους ανάλυσης της: α) κυτταρικής μεταβολικής δραστηριότητας (MTT assay), και β) βιωσιμότητας των κυττάρων (Trypan Blue). Η βιωσιμότητα των μακροφάγων δεν έπεσε κάτω από 60% στις πρώτες 2 hrs, ενώ παρέμεινε πάνω από 40% ακόμα και μετά από 48 hrs. Πλέον της τοξικότητας, εξετάστηκε και η ισορροπία μεταξύ προ-οξειδωτικών και αντι-οξειδωτικών, η οποία βρέθηκε ανεπηρέαστη ακόμα και μετά από 24 hrs. Τέλος, εξετάστηκε επιτυχώς η επαναχρησιμοποίηση των T-SPIONs για τη δέσμευση και αποδόμηση - μέσω φαγοκυττάρωσης - του Αβ, παρέχοντας υποσχόμενα αποτελέσματα για μια ανακυκλώσιμη διαδικασία δέσμευσης και "απομάκρυνσης" Αβ.