Monitoring of ochratoxin A production of aspergillus carbonarius isolates from greek grapes through gene expression studies under different ecophysiological factors
Authors: Λάππα Ιλιάδα 
Published: September 2021

Η ωχρατοτοξίνη Α (ΩΤΑ) είναι ένας δευτερογενής μεταβολίτης που αποτελεί μια από τις πλέον διαδεδομένες μυκοτοξίνες, καθώς η παρουσία της στη διατροφική αλυσίδα προκαλεί σοβαρούς κινδύνους στην ανθρώπινη υγεία. Η επιμόλυνση των σταφυλιών με ΩΤΑ οφείλεται κυρίως στην παρουσία των μαύρων Ασπέργιλλων (Aspergillus section Nigri) μεταξύ των οποίων ο μύκητας Αspergillus carbonarius έχει αναγνωριστεί ως ο κύριος παραγωγός ΩΤΑ στα σταφύλια και στα παράγωγα προϊόντα (χυμός σταφυλιών, σταφίδες και οίνος). Ο μύκητας είναι δυνητικά παθογόνος, παρουσιάζει ευρεία διασπορά στο περιβάλλον και χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη ικανότητα να ανθίσταται σε διάφορους παράγοντες καταπόνησης, γεγονός που του επιτρέπει να επιβιώνει σε μεγάλο εύρος κλιματολογικών συνθηκών και θρεπτικών υποστρωμάτων. Η συχνή παρουσία του μύκητα οφείλεται στην ταχεία ανάπτυξή του, η οποία συντελεί στην επιμόλυνση των σταφυλιών, ειδικότερα προς το τέλος του σταδίου του περκασμού (veraison). Σήμερα, η ΩΤΑ εξακολουθεί να αποτελεί σημαντική πρόκληση στο πλαίσιο των συνεχών προσπαθειών τήρησης των προδιαγραφών ασφάλειας των τροφίμων για την παραγωγή ποιοτικών οίνων και επιτραπέζιων σταφυλιών. Οι πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η παραγωγή της ΩΤΑ είναι συνέπεια διαφόρων οικοφυσιολογικών αλληλεπιδράσεων σε μοριακό επίπεδο. Επομένως, τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει εστιαστεί στη μελέτη των γενετικών παραμέτρων που σε συνδυασμό με περιβαλλοντικούς και βιολογικούς παράγοντες επηρεάζουν την παραγωγή ωχρατοξίνης. Στο πλαίσιο της εν λόγω διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν διαφορετικοί φαινότυποι του μύκητα A. carbonarius ως προς το δυναμικό παραγωγής τοξίνης, εστιάζοντας στην έκφραση των γονιδίων εκείνων που σχετίζονται με την παραγωγή ΩΤΑ υπό την επίδραση διαφορετικών οικοφυσιολογικών παραγόντων σε επίπεδο μεταγραφής. Αρχικά μελετήθηκε η συσχέτιση μεταξύ παραγωγής ΩΤΑ και διαφορετικών μεθόδων προσδιορισμού της ανάπτυξης (μεταβολή της διαμέτρου, της βιομάζας, του ξηρού βάρους και της επιφάνειας της μυκηλιακής αποικίας) του μύκητα A. carbonarius σε σχέση με το χρόνο, χρησιμοποιώντας συνθετικό υπόστρωμα χυμού σταφυλιών (SGM) (Κεφάλαιο 3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι μέθοδοι προσδιορισμού της ανάπτυξης που μελετήθηκαν συσχετίστηκαν τόσο με την παραγωγή τοξίνης όσο και μεταξύ τους, τονίζοντας επίσης την ενδο-στελεχιακή παραλλακτικότητα που παρατηρήθηκε. Διαπιστώθηκε επίσης ότι οι απομονώσεις του μύκητα A. carbonarius που παρουσίασαν υψηλότερη παραγωγή τοξίνης συσχετίστηκαν καλύτερα με τις εκάστοτε παραμέτρους ανάπτυξης. Τέλος, έγινε προσπάθεια ανάπτυξης πρωτογενών μοντέλων συσχέτισης της ΩΤΑ με το χρόνο, λαμβάνοντας υπόψη τη διαστελεχική παραλλακτικότητα, τα οποία έδειξαν υψηλή συσχέτιση της κινητικής της ΩΤΑ με την ανάπτυξη του μήκυτα. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η έκφραση σε μεταγραφικό επίπεδο των βιοσυνθετικών γονιδίων της ΩΤΑ, AcOTApks, AcOTAnrps και του μεταγραφικού παράγοντα laeA, που σχετίζεται με την παραγωγή της ΩΤΑ, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-qPCR) (Κεφάλαιο 4). Τα επίπεδα μεταγραφής των παραπάνω γονιδίων εκτιμήθηκαν κατά την ανάπτυξη του μύκητα A. carbonarius σε υγρό θρεπτικό μέσο SGM σε διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας, ενεργότητας ύδατος και χρόνου ανάπτυξης. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε στα ίδια χρονικά σημεία μαζί με τη βιομάζα του μύκητα και την παραγωγή τοξίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν μεμονωμένες συσχετίσεις και όχι κάποια ευκρινή τάση σε σχέση με την επίδραση της θερμοκρασίας, της ενεργότητας ύδατος ή του χρόνου ανάπτυξης επί της γονιδιακής έκφρασης. Επίσης, τα αποτελέσματα εξαρτήθηκαν από το στέλεχος του μήκητα, γεγονός που υποδεικνύει την πολυπλοκότητα των αποκρίσεων σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης Η πρώιμη ενεργοποίηση των δύο βασικών βιοσυνθετικών γονιδίων της ωχρατοξίνης υπογράμμισε την προρρητική φύση της ανάλυσης RT-qPCR, εφόσον τα εν λόγω γονίδια, ως μοριακοί δείκτες εκφράζονται πριν την φαινοτυπική ανίχνευση της τοξίνης. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των αιθερίων ελαίων γαρίφαλλου, κανέλλας, λεμονόχορτου και μανταρινιού στην ανάπτυξη του μύκητα A. carbonarius και στη βιοσύνθεση της ΩΤΑ (Κεφάλαιο 5). Η έκφραση των σχετιζόμενων με την παραγωγή τοξίνης γονιδίων προσδιορίστηκε σε υγρό υπόστρωμα SGM στο οποίο είχαν προστεθεί διαφορετικές συγκεντρώσεις των ανωτέρω αιθερίων ελαίων. Η αντιμυκητιακή τους δράση επηρεάστηκε από τις διαφορετικές απομονώσεις του μύκητα A. carbonarius καθώς και τα διαφορετικά υποστρώματα (ΜΕΑ, CYA, SGM). Η ανασταλτική δράση των διαφορετικών αιθερίων ελαίων ήταν ανάλογη της συγκέντωσης που χρησιμοποιήθηκε σε κάθε περίπτωση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η γονιδιακή έκφραση παρουσίασε παρόμοια τάση με την παραγωγή τοξίνης μεταξύ των μεταχειρήσεων (παρουσία αιθερίου ελαίου) και του μάρτυρα, γεγονός που μπορεί να υποδεικνύει πιθανή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεταγραφής των γονιδίων και της αντι-ωχρατοξινογόνου δράσης. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την πιθανή επίδραση των συγκεκριμένων αιθερίων ελαίων στην έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων και επομένως στην παραγωγή ΩΤΑ. Τέλος, μελετήθηκαν οι επιπτώσεις στην ανάπτυξη του μύκητα Α. carbonarius και στην παραγωγή ΩΤΑ κατά την in vitro συγκαλλιέργεια του μύκητα με διαφορετικά στελέχη του οξυγαλακτικού βακτηρίου Lactobacillus plantarum (Κεφάλαιο 6). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση της ανάπτυξης του μύκητα και της παραγωγής ΩΤΑ σε όλες τις περιπτώσεις συγκαλλιέργειας με τα οξυγαλακτικά βακτήρια. Διερευνήθηκε επίσης in situ η ικανότητα προσκόλλησης των βακτηριακών κυττάρων στην επιφάνεια των σταφυλιών και η επίδρασή τους στην αναστολή της παραγωγής ΩΤΑ με θετικά αποτελέσματα. Τέλος, η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης έδειξε μικτές αποκρίσεις για όλα τα εξεταζόμενα γονίδια γεγονός που τονίζει την επίδραση της παραλλακτικότητας του στελέχους, όσον αφορά στις διαφορετικές απομομώσεις του μύκητα A. carbonarius αλλά και τα διαφορετικά στελέχη του βακτηρίου L. plantarum που χρησιμοποιήθηκαν