Δομικός-λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου LBR
Authors: Λιοκάτης Σταμάτιος 
Published: August 2021

Ο υποδοχέας της λαμίνης B (Lamin Β Receptor, LBR) είναι μία συντηρημένη σε όλους τους ανώτερους οργανισμούς πρωτεΐνη της έσω πυρηνικής μεμβράνης. Αναγνωρίστηκε από την ικανότητά της να συνδέεται στη λαμίνη Β. Είναι πλέον γνωστό ότι ο LBR συμμετέχει σε μεγάλα πολυδύναμα σύμπλοκα, τα οποία συμμετέχουν στον επανασχηματισμό του πυρηνικού φακέλου στο τέλος της μίτωσης, συνδέουν τον πυρηνικό φάκελο και την πυρηνική λάμινα με την περιφερική ετεροχρωματίνη κατά τη μεσόφαση και πιθανώς λειτουργούν ως ‘παγίδες συγγένειας’ για συστατικά του πυρήνα που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην ενεργοποίηση-απενεργοποίηση της μεταγραφής. Ο ανθρώπινος LBR περιέχει 615 αμινοξέα και αποτελείται από ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο που κείτεται προς το πυρηνόπλασμα και πιθανολογείται ότι ευθύνεται για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης, από πολλαπλά διαμεμβρανικά τμήματα που παρουσιάζουν ομολογία με αναγωγάσες των στερολών και από ένα μικρό καρβοξυτελικό άκρο. Αναλύσεις με εργαλεία βιοπληροφορικής έδειξαν ότι το αμινοτελικό άκρο του LBR αποτελείται από τρεις διακριτές περιοχές: α) από ένα domain που με βάση την αλληλουχία του μπορεί να ανήκει στην κατηγορία των Tudor domains (αμινοξέα 1-60), β) ένα τμήμα 110 αμινοξέων που δεν παρουσιάζει ομοιότητες στην αλληλουχία του με άλλες πρωτεΐνες, και γ) μία ισχυρά φορτισμένη περιοχή 40 αμινοξέων, πλούσια σε διπεπτίδια σερίνης-αργινίνης, η οποία υπόκειται σε φωσφορυλιώσεις από τις κινάσες SRPK1 και cdc2 και έχει όλα τα χαρακτηριστικά των ‘intrinsically unstructured” πρωτεϊνών. Τα Tudor domains είναι σχετικά μικρά (50-70 αμινοξέα) πρωτεϊνικά μοτίβα, τα οποία πήραν το όνομά τους από τη πρωτεΐνη Tudor της drosophila. Επειδή βρέθηκαν αρχικά κυρίως σε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούσαν με RNA, θεωρήθηκαν μοτίβα που συνδέονται σε RNA. Παρόλα αυτά, δεν υπήρξαν έως τώρα πειραματικές ενδείξεις που να επιβεβαιώνουν τη παραπάνω υπόθεση. Πρόσφατα, μετά από εκτεταμένη σύγκριση πρωτεϊνικών αλληλουχιών και δομών, φάνηκε ότι τα Tudor μαζί με άλλα μοτίβα (PWWP, chromodomain, ΜΒΤ, Agenet) που αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη σχηματίζουν μια υπεροικογένεια μοτίβων με κοινά δομικά χαρακτηριστικά. Παρά τις εκτεταμένες μελέτες των τελευτών ετών ο ακριβής ρόλος των Tudor domains παραμένει αδιευκρίνιστος. Οι έως τώρα δομικές μελέτες αναφέρουν ότι πιθανώς τα συγκεκριμένα μοτίβα αλληλεπιδρούν με πρωτεϊνικούς παράγοντες και υπάρχουν ενδείξεις ότι μεθυλιωμένες λυσίνες ή αργινίνες αποτελούν τους φυσιολογικούς προσδέτες τους. Σε όλες τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν αναδείχθηκε ο ρόλος του αρωματικού κλωβού ως δομικό χαρακτηριστικό στην επιφάνεια των Tudor domains στον οποίο εισέρχονται τα μεθυλιωμένα κατάλοιπα, παρόμοια με το τρόπο αναγνώρισης των τροποποιημένων ιστονικών αμινοτελικών ουρών από τα chromodomains. Οι τροποποιήσεις των ιστονών θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση, καθώς σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με τη διαδικασία αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Σε μία προσπάθεια να διερευνήσουμε σε μοριακό επίπεδο τις αλληλεπιδράσεις του LBR με τη χρωματίνη και τον τρόπο οργάνωσης του μορίου του, μελετήσαμε ξεχωριστά τα τρία διακριτά τμήματα της αμινοτελικής του περιοχής. Αρχικά, υπολογίστηκε σε ατομική λεπτομέρεια η τρισδιάστατη δομή του Tudor domain με φασματοσκοπία NMR και μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του με βιοχημικές και βιοφυσικές τεχνικές. To Tudor domain του LBR αναδιπλώνεται σε μία δομή β-βαρελιού, παρόμοια με αυτή που αποκτούν και τα άλλα μέλη της Tudor υπεροικογένειας. Τα αποτελέσματα των βιοχημικών δοκιμών με πυρηνικά εκχυλίσματα, φυσικές και ανασυνδυασμένες ιστόνες έδειξαν ότι το Tudor domain του LBR αλληλεπιδρά ειδικά με το κεντρικό τμήμα της ιστόνης Η3, ανεξάρτητα από τη παρουσία τροποποιήσεων. Η συγκεκριμένη αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα όταν η Η3 βρίσκεται ελεύθερη, ενώ δεν παρατηρείται όταν η Η3 βρίσκεται ενσωματωμένη στο νουκλεόσωμα, κάτι που υποδεικνύει μία παροδική αλληλεπίδραση μεταξύ LBR και Η3 σε πρωταρχικά στάδια του σχηματισμού της περιφερικής χρωματίνης ή μία αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη να βρίσκεται σε στάδιο αναδιοργάνωσης όπου η Η3 δεν έχει τροποποιηθεί και πιθανώς ούτε έχει αναδιπλωθεί ακόμα. Τα δομικά χαρακτηριστικά της παραπάνω αλληλεπίδρασης δείχνουν ότι το Tudor domain του LBR αλληλεπιδρά με την Η3 διαφορετικά από το καθιερωμένο τρόπο που χρησιμοποιούν άλλα Tudor domains, τα οποία αναγνωρίζουν μεθυλιωμένα κατάλοιπα. Ο τρόπος αναγνώρισης της Η3 από το Tudor domain του LBR δείχνει ότι στην αλληλεπίδραση συμμετέχουν αμινοξέα που βρίσκονται και στις δύο β-πτυχωτές επιφάνειες και σχηματίζουν μία εκτεταμένη επιφάνεια στη μία πλευρά του μορίου. Βιοχημικές δοκιμές χρησιμοποιώντας και τις άλλες περιοχές του αμινοτελικού άκρου του LBR έδειξαν ότι η περιοχή με τα SR διπεπτίδια παίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση του LBR με τη χρωματίνη, καθώς συνδέεται σε απομονωμένα νουκλεοσώματα και σε απομονωμένες ιστόνες Η3 και Η4. Η περιοχή RS φάνηκε επίσης να ευθύνεται για τον ολιγομερισμό του LBR, καθώς μπορεί και αλληλεπιδρά με ολόκληρη τη φυσική πρωτεΐνη αλλά και με το ανασυνδυασμένο αμινοτελικό τμήμα της. Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία και αναλυτική υπερφυγοκέντρηση επιτεύχθηκε η αναπαράσταση των ολιγομερών σωματιδίων του LBR και η εκτίμηση του μεγέθους τους.