Valorisation of renewable resources produced by sugarcane mills and oilseed processing industries via microbial and enzymatic processes for the production of fumaric acid, wax esters, biolubricants and oleogels
Authors: Παπαδάκη Αικατερίνη 
Published: September 2021

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην επεξεργασία πρώτων υλών της βιομηχανίας τροφίμων, όπως ακατέργαστη ζάχαρη, μελάσα, σογιάλευρο και παράπλευρα ρεύματα από την επεξεργασία εξευγενισμού των βρώσιμων ελαίων, στα πλαίσια ανάπτυξης καινοτόμων βιοδιυλιστηρίων. Ο στόχος ήταν η ανάπτυξη των κατάλληλων βιοδιεργασιών που θα οδηγήσουν στην παραγωγή νέων προϊόντων βιο-οικονομίας, με ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός της χημικής σύστασης των πρώτων υλών με σκοπό να προσδιοριστούν τα κυριότερα συστατικά αυτών, όπως ελεύθερα σάκχαρα, άζωτο, πρωτεΐνη, φαινολικά συστατικά, τέφρα, περιεκτικότητα σε νερό, ιχνοστοιχεία και διαιτητικές ίνες. Με βάση τη χημική σύσταση των πρώτων υλών επιλέχθηκαν οι κατάλληλες μέθοδοι επεξεργασίας και αξιοποίησης αυτών για την βιοτεχνολογική παραγωγή ενδιάμεσων προϊόντων, όπως μικροβιακά λιπίδια, και πρόσθετων και βιολειτουργικών συστατικών τροφίμων, όπως φουμαρικό οξύ και καροτενοειδή. Επίσης, στο τελικό στάδιο της μελέτης παρήχθησαν καινοτόμα προϊόντα με ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων, όπως εστέρες λιπαρών οξέων και ελαιοπηκτές. Το πρώτο στάδιο της μελέτης εστίασε στην επεξεργασία του σογιαλεύρου με ενζυμικές βιοδιεργασίες, με στόχο την αξιοποίηση των πρωτεϊνών του σογιαλεύρου για την παραγωγή θρεπτικού μέσου κατάλληλου για μικροβιακές ζυμώσεις. Η διεργασία αυτή περιελάμβανε την παραγωγή ακατέργαστων πρωτεολυτικών ενζύμων μέσω ζύμωσης στερεής κατάστασης και χρήση των ενζύμων αυτών για την υδρόλυση του σογιαλεύρου. Η ενζυμική υδρόλυση βελτιστοποιήθηκε όσον αφορά τη θερμοκρασία υδρόλυσης και την αρχική ενζυμική ενεργότητα. Το παραχθέν υδρόλυμα σογιαλεύρου αξιολογήθηκε μέσω του χημικού προσδιορισμού του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων των αμινοξέων και των πεπτιδίων (free amino nitrogen - FAN) και του ανόργανου φωσφόρου.Το υδρόλυμα σογιαλεύρου χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο στην προκαλλιέργεια ανάπτυξης του μυκητιακού στελέχους Rhizopus arrhizus NRRL 2582 με στόχο τη βιοτεχνολογική παραγωγή φουμαρικού οξέος. Σε αυτό το στάδιο της μελέτης πραγματοποιήθηκαν ασυνεχείς και ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε αναδευόμενες φιάλες χρησιμοποιώντας διαφορετικές πρώτες ύλες, όπως μείγμα εμπορικής γλυκόζης-φρουκτόζης, ακατέργαστη ζάχαρη και μελάσα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεγαλύτερη παραγωγή φουμαρικού οξέος (40 g/L) με απόδοση 0,86 g/g επιτεύχθηκε στο υπόστρωμα ακατέργαστης ζάχαρης. Ο συνδυασμός υδρολύματος σογιαλεύρου και μελάσας δεν επέφερε ανάλογα αποτελέσματα, καθώς ο μεταβολισμός του μύκητα R. arrhizus στράφηκε προς την παραγωγή αιθανόλης. Επιπρόσθετα, ο ποσοτικός προσδιορισμός της σύστασης της μελάσας έδειξε ότι περιέχει σημαντικές ποσότητες συγκεκριμένων φαινολικών συστατικών και αυξημένη περιεκτικότητα ιχνοστοιχείων που επηρεάζουν το μεταβολισμό των μυκήτων του γένους Rhizopus. Στη συνέχεια μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής μικροβιακών λιπιδίων και καροτενοειδών από την ζύμη Rhodosporidium toruloides DSM 4444. Κατά την μελέτη ασυνεχών ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν σε αναδευόμενες φιάλες με υπόστρωμα ακατέργαστης ζάχαρης, η μεγαλύτερη παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων ήταν 8,1 g/L με 23,8 g/L ξηρή κυτταρική μάζα. Ακολούθησαν ασυνεχείς ζυμώσεις με στόχο την μελέτη της επίδρασης διαφορετικών θρεπτικών συστατικών (π.χ. φωσφορικών αλάτων και ιχνοστοιχείων) στην παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων. Τα καλύτερα αποτελέσματα (12,7 g/L συγκέντρωση μικροβιακών λιπιδίων με 59% κ.β. λιποπεριεκτικότητα) σημειώθηκαν με την προσθήκη τόσο των φωσφορικών αλάτων όσο και του μείγματος των ιχνοστοιχείων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα σε υπόστρωμα μελάσας με χρήση εμπορικών πηγών αζώτου ή υδρολύματος σογιαλεύρου. Η χρήση υδρολύματος σογιαλεύρου σε ημι-συνεχείς ζυμώσεις οδήγησε στη μεγαλύτερη παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων (18,4 g/L) με ταυτόχρονη παραγωγή καροτενοειδών με μέγιστη περιεκτικότητα 88,9 μg/g ξηρής κυτταρικής μάζας.Ακολούθως, η ερευνητική μελέτη επικεντρώθηκε στην παραγωγή διαφόρων χημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, ως καινοτόμες εφαρμογές της χρήσης μικροβιακών λιπιδίων αλλά και της αξιοποίησης και επεξεργασίας των παράπλευρων ρευμάτων που προκύπτουν από τον εξευγενισμό των φυτικών ελαίων. Αρχικά, η ενζυμική μετατροπή των μικροβιακών και φυτικής προέλευσης λιπιδίων για την παραγωγή εστέρων μελετήθηκε με την χρήση ελαϊκής, παλμιτικής και βεχενυλικής αλκοόλης. Οι εστέρες αυτοί που παράγονται από αλκοόλες μεγάλης ανθρακικής αλυσίδας ονομάζονται κηροί. Πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της ενζυμικής διεργασίας ως προς την θερμοκρασία και την αρχική ενζυμική ενεργότητα με χρήση εμπορικών (Novozyme 435, Lipozyme) και μη εμπορικών λιπασών, που οδήγησαν σε εξαιρετικά υψηλές αποδόσεις βιομετατροπής, έως και 94%. Μελετήθηκαν οι χημικές και φυσικές ιδιότητες των παραγόμενων βιογενών κηρών, όπως οξύτητα, αριθμός ιωδίου, αριθμός σαπωνοποποίησης, ιξώδες και θερμική συμπεριφορά με χρήση θερμιδομετρίας σάρωσης (differential scanning calorimetry, DSC), και βρέθηκαν παρόμοιες με αυτές των ευρέως χρησιμοποιούμενων φυτικών κηρών (π.χ. καρναουβικός κηρός, κηρός μέλισας κ.α.). Εν συνεχεία, η παραγωγή εστέρων με βιολιπαντικές ιδιότητες από μικροβιακά λιπίδια πραγματοποιήθηκε με χρήση των πολυολών νεοπεντυλογλυκόλη και τριμεθυλοπροπάνιο. Η ενζυμική αντίδραση καταλύθηκε από εμπορικές λιπάσες (Lipomod 34MDP) και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μέγιστος βαθμός εστεροποίησης που επιτεύχθηκε ήταν 88%, ενώ η καταλληλότητά τους για χρήση ως βιολιπαντικές ουσίες επιβεβαιώθηκε μέσω της μελέτης των ιδιοτήτων των εν λόγω εστέρων.Στο τελευταίο στάδιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η ανάπτυξη ελαιοπηκτωμάτων ως καινοτόμος εφαρμογή των παραχθέντων βιογενών κηρών. Οι ελαιώδεις βάσεις για την παραγωγή ελαιοπηκτωμάτων ήταν ελαιόλαδο, σογιέλαιο και μικροβιακά λιπίδια, ενώ οι βιογενείς κηροί που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν είτε από μικροβιακά λιπίδια είτε από παράπλευρα ρεύματα εξευγενισμένων ελαίων. Η αξιολόγηση των ελαιοπηκτωμάτων πραγματοποιήθηκε μέσω της μελέτης των ιδιοτήτων τους, όπως το χρώμα, η κρυσταλλική μορφή μέσω μικροσκοπίου πολωμένου φωτός (polarised light microscopy, PLM), η υφή μέσω αναλυτή υφής (texture analyser), η ρεολογική και η θερμική συμπεριφορά, με χρήση ρεομέτρου και θερμιδομετρία σάρωσης, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες των παραχθέντων ελαιοπηκτών ομοιάζουν με εκείνες τροφίμων, όπως λιπαρές ύλες επικάλυψης, και δύναται να χρησιμοποιηθούν ως υποκατάστατα κορεσμένων και trans λιπαρών υλών σε προϊόντα τροφίμων.