Μελέτη της μοριακής βάσης της (υποκλινικής) αντοχής στις κινολόνες σε κλινικά στελέχη E. Coli
Authors: Χανιωτάκη Σοφία 
Published: August 2021

Οι λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος είναι από τις συχνότερες λοιμώξεις του ανθρώπου και ο συνηθέστερος μικροοργανισμός που τις προκαλεί είναι η E. coli. Οι φθοριοκινολόνες είναι μια σημαντική κατηγορία αντιβιοτικών με εξαιρετική δραστικότητα έναντι της E. coli. Με την ευρεία, όμως, χρήση των κινολονών τα τελευταία χρόνια παρατηρείται υψηλή συχνότητα απομόνωσης στελεχών E. coli ανθεκτικών στις κινολόνες (QREC). Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να μελετηθεί η συχνότητα απομόνωσης κλινικών στελεχών E. coli από εξωνοσοκομειακές ουρολοιμώξεις, που παρουσίαζαν μειωμένη ευαισθησία ή πλήρη αντοχή στις κινολόνες, να διευκρινιστούν οι αντίστοιχοι μηχανισμοί αυτής της αντοχής και να εκτιμηθούν οι παράγοντες κινδύνου λοίμωξης με στελέχη E. coli ανθεκτικά στις κινολόνες. Το υλικό της διατριβής αποτέλεσαν 170 κλινικά στελέχη E. coli, που απομονώθηκαν από καλλιέργειες ούρων εξωνοσοκομειακών ασθενών από τα Εξωτερικά Ιατρεία και τις Κλινικές του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Λαϊκό» και ενός Κέντρου Πρωτοβάθμιας Περίθαλψης σε χρονικό διάστημα 11 μηνών. Ο έλεγχος της ευαισθησίας σε 16 αντιβιοτικά έγινε με την μέθοδο διάχυσης των δίσκων (Kirby Bauer) με βάση τις οδηγίες της NCCLS. Ο έλεγχος της MIC όλων των κλινικών στελεχών E. coli σε 4 αντιβιοτικά (ναλιδιξικό οξύ, σιπροφλοξασίνη, τετρακυκλίνες, χλωραμφαινικόλη) έγινε με την μέθοδο E-test. Ακολούθησε ο πολλαπλασιασμός των QRDRs (quinolone resistance determing regions) των gyrA και parC γονιδίων των κλινικών στελεχών E. coli με τεχνική PCR. Καθορίστηκαν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες τους με έναν αυτόματο αναλυτή καθορισμού νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencer) και συγκρίθηκαν με τις υπάρχουσες δημοσιευμένες στο GeneBank μέσω του προγράμματος Blastn. Η συσχέτιση των ανθεκτικών στελεχών E. coli με τα επιδημιολογικά στοιχεία των ασθενών έγινε με την χρήση του x². Η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το μοντέλο πολλαπλής λογαριθμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το στατιστικό πρόγραμμα STATA 6 (STATA Corp.). Από τα 170 στελέχη βρέθηκαν 25 ανθεκτικά στο ναλιδιξικό οξύ, ποσοστό 14.7%. Τα 15 από αυτά (60% των QREC και 8,8% του συνόλου των εξωνοσοκομειακών λοιμώξεων) ήταν, επίσης, ανθεκτικά στην σιπροφλοξασίνη. Τα QREC παρουσίαζαν σημαντικά ποσοστά αντοχής και σε άλλα αντιβιοτικά. Όλα τα 25 QREC στελέχη έφεραν μεταλλαγές στην QRDR gyrA, ενώ σε 15 από αυτά βρέθηκαν μεταλλαγές και στην QRDR της parC. Οι πιο συχνές μεταλλαγές ήταν η υποκατάσταση της σερίνης (Ser)-83 από λευκίνη (Leu) στην gyrA (22 στελέχη), του ασπαρτικού οξέος (Asp)-87 από ασπαραγίνη (Asn) στην gyrA (15 στελέχη) και της σερίνης (Ser)-80 από ισολευκίνη (Ile) στην parC (14 στελέχη). Η υψηλού βαθμού αντοχή στην σιπροφλοξασίνη σχετίζονταν με μεταλλαγές και στα δύο κωδικόνια 83 και 87 του γονιδίου της gyrA και μία ή δύο επιπλέον μεταλλαγές στα κωδικόνια 80 και 84 της parC. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν απόλυτα με αναφορές από τη διεθνή βιβλιογραφία. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η απομόνωση QREC στελεχών είχε θετική συσχέτιση με την ηλικία (>65 ετών), την παρουσία χρόνιας νόσου, επιπλεγμένης ουρολοίμωξης, προηγούμενων επεισοδίων ουρολοίμωξης και πρόσφατης χρήσης κινολονών. Η πολλαπλή λογαριθμική ανάλυση απέδειξε ότι μόνο η χρόνια νόσος και η χρήση φθορισμένων κινολονών αποτελούσαν ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη με QREC στέλεχος. Ο συνδυασμός των παραπάνω πληροφοριών έδειξε ότι υπάρχει σημαντικό ποσοστό αντοχής στις κινολόνες σε κλινικά στελέχη E. coli από εξωνοσοκομειακές ουρολοιμώξεις στην Ελλάδα. Συγκεκριμένα υπάρχουν δύο υποπληθυσμοί, ο ένας με μονήρεις μεταλλαγές στην gyrA, που προκαλούν υποκλινική αντοχή, και ο άλλος με δύο μεταλλαγές στην gyrA και μία ή δύο μεταλλαγές στην parC, που συνοδεύεται από μεγάλου βαθμού αντοχή στις κινολόνες, ενώ δεν αποκλείεται η ταυτόχρονη παρουσία και άλλων μηχανισμών αντοχής. Επομένως, η ανίχνευση της παρουσίας του υποπληθυσμού που παρουσιάζει την υποκλινική αντοχή στις κινολόνες έχει σημασία στην εκτίμηση του κινδύνου εξάπλωσης QRECs. Είναι πολύ πιθανό τα κλινικά στελέχη να ανέπτυξαν αντοχή ως αποτέλεσμα πίεσης επιλογής κατά τη διάρκεια θεραπείας με κινολόνες, δεδομένου ότι όλα εκτός από δύο προέρχονταν από ασθενείς που ανέφεραν λήψη κινολονών τον τελευταίο χρόνο. Η χρόνια νόσος, που αποτελούσε τον δεύτερο ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου, ίσως αποτελεί έναν δείκτη κατανάλωσης αντιβιοτικών, και ενδεχομένως κινολονών, πριν από την χρονική περίοδο που κάλυπτε η παρούσα μελέτη. Παράλληλα, η πολλαπλή αντοχή που παρουσιάζουν τα περισσότερα QREC στελέχη, έχει παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές και ίσως αντανακλά την συχνή ανάγκη κατανάλωσης αντιβιοτικών από τους χρόνιους πάσχοντες. Τα συμπεράσματα της διατριβής δείχνουν την αυξανόμενη συχνότητα της μικροβιακής αντοχής στις κινολόνες στη χώρα μας και πρέπει να γίνεται με αυστηρά κριτήρια η χρήση τους, ώστε να περιοριστεί ο ρυθμός ανάπτυξης αυτής της αντοχής.