Προσδιορισμός του αριθμού και του τύπου των θέσεων EPIYA στην πρωτεϊνη CagA του Helicobacter pylori στον ελληνικό πληθυσμό
Authors: Παναγιωτοπούλου Ευφροσύνη 
Published: August 2021

Το Helicobacter pylori είναι ένα Gram-αρνητικό παθογόνο το οποίο προσβάλει το γαστρικό βλεννογόνοτου ανθρώπου και προκαλεί χρόνια λοίμωξη με επιπολασμό που αγγίζει το 50% παγκοσμίως. Στηνπλειοψηφία των φορέων η λοίμωξη εκδηλώνεται ως χρόνια πανγαστρίτιδα, η οποία παραμένεισυνήθως ασυμπτωματική. Παρόλα αυτά, στο 5% των παιδιών και το 10-15% των ενηλίκωναναπτύσσεται δωδεκαδακτυλικό ή γαστρικό έλκος. Επιπλέον, παρουσία λοίμωξης αυξάνεται 6 φορές οκίνδυνος ανάπτυξης αδενοκαρκινώματος του στομάχου μη καρδιακού τύπου και γαστρικού MALT(Mucosa-associated Lymphoid Tissue) λεμφώματος, κακοήθεις νεοπλασίες που παρατηρούνται στο 1%περίπου των ενηλίκων. Η παθογένεια του H. pylori εκδηλώνεται μέσω διαφόρων παραγόντων, εκ τωνοποίων το κύριο ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται στις κυτταροτοξίνες CagA (Cytotoxin-associatedgene A) και VacA (Vacuolating cytotoxin A). H CagA ενίεται στο γαστρικό επιθηλιακό κύτταρο μέσωεξειδικευμένου συστήματος μεταφοράς τύπου IV (Τ4SS) και η παθογένειά της καθορίζεται απόεπαναλαμβανόμενες περιοχές στο καρβοξυτελικό άκρο της που περιέχουν θέσεις φωσφορυλίωσηςτυροσίνης της μορφής EPIYA. Οι θέσεις EPIYA σε στελέχη από Δυτικούς πληθυσμούς είναι της μορφής A[KKELNEKFKNFNNNNNGLKN(ST)EPIYAKVNKKK], B [(A/T/V/S)GQ(V/A)ASPEPIY(A/T)(Q/K)VAKKVNAKIDRLNQIASGLGGVGQAAG] και C [FPLKRHDKVDDLSKVG(R/L)S(V/Α)SPEPIYATIDDLGGP]. Ο βαθμόςκυτταροτοξικότητας της VacA (απουσία, ήπιος, υψηλός) καθορίζεται από το συνδυασμό (sx/ix/mx) τωνενεργών (s1, i1, m1) και ανενεργών (s2, i2, m2) αλληλίων των τριών μεταβλητών περιοχών τουγονιδίου vacA (signal, intermediate και middle).Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η χαρτογράφηση των λειτουργικών πολυμορφισμών EPIYA τηςπρωτεΐνης CagA και των επιπέδων κυτταροτοξικότητας της VacA σε 313 κλινικά στελέχη H. pylori πουαπομονώθηκαν από Έλληνες ασθενείς (98 συμπτωματικά παιδιά, 144 ενήλικες με πεπτικό έλκος και μηελκωτικές αλλοιώσεις) και η εκτίμηση της κλινικής σημασίας τους. Μελετήθηκε επίσης ηφωσφορυλίωση της CagA στις θέσεις EPIYA και η επίδρασή της στη δομή και λειτουργικότητα τωνεστιακών συνδέσμων. Ο αριθμός των θέσεων EPIYA στην CagA εκτιμήθηκε μέσω νέας μεθόδου πουαναπτύχθηκε για τις ανάγκες της μελέτης, ενώ ο ακριβής τύπος και συνδυασμός τους προσδιορίστηκεμε ανάγνωση αλληλουχίας της 3’ μεταβλητής περιοχής του γονιδίου cagA. Η λειτουργικότητα του T4SSτων κλινικών στελεχών H. pylori προσδιορίστηκε μετά από in vitro επιμόλυνση γαστρικών επιθηλιακώνκυττάρων και μελέτη (α) της έκφρασης και φωσφορυλίωσης της CagA, (β) των επαγομένωνφαινοτυπικών αλλαγών στα προσβεβλημένα κύτταρα και (γ) της έκκρισης IL-8 από αυτά. Η κατανομήσυχνοτήτων των διαφορετικών πολυμορφισμών μελετήθηκε αναφορικά (α) με την ηλικία τωνασθενών στο άντρο του στομάχου και (β) τη θέση του στομάχου (άντρο, σώμα) ειδικά για τουςενήλικες. Η διερεύνηση των πιθανών συσχετίσεων με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και τηνκλινική εκδήλωση της Ελικοβακτηριδιακής γαστρίτιδας πραγματοποιήθηκε με ανάλυση λογιστικήςπαλινδρόμησης. Η κινητική της φωσφορυλίωσης της CagA στις θέσεις EPIYA και η επίδρασή της σερυθμιστικές και δομικές πρωτεΐνες των εστιακών συνδέσμων (FAK, PYK2, Paxillin, CRK, p130Cas, c-Src,SHP2) μελετήθηκε μετά από in vitro επιμόλυνση γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων με ισογονιδιακά στελέχη H. pylori με διαφορετικό αριθμό θέσεων EPIYA-C. Στο άντρο των παιδιών επικράτησαν στελέχη με μη λειτουργικό T4SS και μη κυτταροτοξική πρωτεΐνηVacA. Στα ενήλικα άτομα παρατηρήθηκαν ως επί το πλείστον απλές λοιμώξεις από στελέχη μελειτουργικό T4SS και 3 θέσεις EPIYA τύπου ABC, ενώ παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των στελεχώνπου έφεραν το ενεργό αλλήλιο vacA i1 και τάση αύξησης των κυτταροτοξικών τύπων της VacAσυγκριτικά με τα παιδιά. Και στις δύο ομάδες, η πλειοψηφία των στελεχών με λειτουργικό Τ4SS έφερε 3θέσεις τύπου ABC, ενώ τα επόμενα σε συχνότητες στελέχη έφεραν 4 θέσεις τύπου ABCC. Αν και δεδιαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στον αριθμό των θέσεων EPIYA στο πυλωρικό άντροπαιδιών και ενηλίκων, στελέχη με περισσότερες των 4 θέσεων EPIYA, τα οποία παρατηρήθηκαν σειδιαίτερα χαμηλές συχνότητες (περίπου 3%), απομονώθηκαν αποκλειστικά από ενήλικα άτομα. Τάσηαύξησης του αριθμού των θέσεων EPIYA-C παρατηρήθηκε επίσης στο σώμα συγκριτικά με το άντροτου στομάχου σε ενήλικες, υποδηλώνοντας εξελικτική τροποποίηση της CagA στο έδαφος της χρόνιαςλοίμωξης, δεδομένης της κλωνικής σχέσης των στελεχών άντρου-σώματος βάσει ανάλυσης με MLST.Εκτός των κλωνικών στελεχών άντρου-σώματος, στο σύνολο του δείγματος απομονώθηκαν 28περιπτώσεις μικτών λοιμώξεων από ισογονιδιακά στελέχη στο ίδιο βιοπτικό υλικό, τα οποία διέφερανμόνο ως προς τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C στην CagA, παρά το γεγονός ότι η υπόλοιπηαλληλουχία του γονιδίου cagA ήταν ταυτόσημη.Στα παιδιά δεν παρατηρήθηκε ουδεμία συσχέτιση με τα κλινικοπαθολογικά ευρήματα της ελικοβακτηριδιακής γαστρίτιδας. Στους ενήλικες, η παρουσία του αλληλίου vacA i1 και υψηλούβακτηριακού φορτίου στο άντρο του στομάχου χαρακτηρίστηκαν ως οι μόνοι ανεξάρτητοιπαράγοντες κινδύνου ανάπτυξης βαρύτερης γαστρίτιδας, όσον αφορά στην ενεργό δραστηριότητα καιστη χρόνια φλεγμονή. Επιπλέον, η παρουσία 3 θέσεων EPIYA (ABC) διαπιστώθηκε να αυξάνει τονκίνδυνο ανάπτυξης έλκους, ενώ η παρουσία τεσσάρων θέσεων EPIYA (ABCC) δεν διαφοροποίησεπεραιτέρω τον παρατηρούμενο κίνδυνο. Οι συγκεκριμένες συσχετίσεις πιθανόν καταδεικνύουνσυμμετοχή της VacA στη φλεγμονώδη απόκριση, ενώ η CagA φαίνεται να επηρεάζει τη δημιουργίασυγκεκριμένων κλινικών οντοτήτων.Αντίστοιχα, η παρουσία περισσοτέρων θέσεων EPIYA στην CagA, καθώς και η CagA per se, δενδιαφοροποίησαν σημαντικά τα επίπεδα εκκρινόμενης IL-8 από γαστρικά επιθηλιακά κύτταραεπιμολυσμένα in vitro με ζεύγη ισογονιδιακών κλινικών στελεχών με διαφορετικό αριθμό θέσεωνEPIYA-C. Η έκκριση IL-8 διαπιστώθηκε να εξαρτάται αποκλειστικά από την παρουσία λειτουργικούT4SS στο εκάστοτε στέλεχος H. pylori, δεδομένου ότι παρατηρήθηκε επαγωγή της από CagA-Knock οutμεταλλάγματα, στα οποία προκλήθηκε σίγηση του γονιδίου cagA μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού,χωρίς να διαταραχθεί το T4SS. Στο ίδιο in vitro σύστημα, διαπιστώθηκε ότι οι πρωτεΐνες CagA με τιςπερισσότερες θέσεις EPIYA σε όλα τα ζεύγη στελεχών εμφάνιζαν υψηλότερο ρυθμό και επίπεδαφωσφορυλίωσης σε κατάλοιπα τυροσίνης. Παρόλα αυτά παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σταεπίπεδα φωσφορυλίωσης της CagA μεταξύ ζευγών στελεχών, εξαρτώμενες πιθανόν από επιμέρουςαντικαταστάσεις στη νουκλεοτιδική αλληλουχία των θέσεων EPIYA-B κυρίως, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την έκταση των μορφολογικών αλλοιώσεων στα προσβεβλημένα κύτταρα.Οι εξαρτώμενες από το στέλεχος και τις θέσεις EPIYA διαφορές αυτές, αντικατοπτρίστηκαν επίσης στηνεπίδραση της CagA και των θέσεων EPIYA στη λειτουργικότητα των κινασών των εστιακών συνδέσμων FAK και PYK2. Όσον αφορά στην FAK, διαπιστώθηκε αποφωσφορυλίωσή της στη θέσηενεργοποίησης Υ397 στα πρώιμα στάδια της επιμόλυνσης των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων,κατά τρόπο εξαρτώμενο από τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C. Εκτός αυτού, παρατηρήθηκε πτώσητων συνολικών επιπέδων φωσφορυλιωμένης σε κατάλοιπα τυροσίνης FAK, ειδικά παρουσία τουζεύγους στελεχών H. pylori που προκάλεσε τις πιο χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλοιώσεις σταγαστρικά επιθηλιακά κύτταρα και κατά τρόπο εξαρτώμενο του αριθμού των θέσεων EPIYA-C.Διαπιστώθηκε επίσης πτώση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης προσαρμογέα Paxillin στα αρχικάστάδια της επιμόλυνσης, εξαρτώμενη από τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C, η οποία σε συνδυασμό μετην απενεργοποίηση της FAK υποδηλώνει παροδική αποικοδόμηση των εστιακών συνδέσμων. Εναντιθέσει, ταυτόχρονα με την απενεργοποίηση της κινάσης FAK διαπιστώθηκε επαγωγή τηςφωσφορυλίωσης της συγγενούς της FAK κινάσης PYK2, παρατήρηση η οποία πραγματοποιείται γιαπρώτη φορά στην ελικοβακτηριδιακή λοίμωξη. Η ενεργοποίηση της PYK2 ήταν ανεξάρτητη τουστελέχους και εν μέρει εξαρτώμενη των θέσεων EPIYA-C, καθώς παρατηρήθηκε σε μεταγενέστεραστάδια υπό την επίδραση στελεχών απουσία CagA (CagA-KO), υποδηλώνοντας τη συμμετοχή καιάλλων βακτηριακών παραγόντων στη διαδικασία ενεργοποίησης της PYK2. Παρόλα αυτά η εμπλοκήτης CagA και των θέσεων EPIYA επιβεβαιώθηκε μέσω της φυσικής αλληλεπίδρασης τη PYK2 με τηνCagA στα αρχικά στάδια της επιμόλυνσης κατά τρόπο εξαρτώμενο από τις θέσεις EPIYA-C κυρίως καιτην επακόλουθη μεταφορά της PYK2 στον πυρήνα του κυττάρου. Η μετατόπιση της PYK2, καθώς καιτης FAK, στον πυρήνα του κυττάρου αντικατοπτρίζει πιθανόν τη μεταφορά αντιαποπτωτικώνσημάτων υπό την επίδραση της CagA από την προσβεβλημένη περιφέρεια στον πυρήνα, όπου έχειδιαπιστωθεί ότι οι δύο κινάσες μετέχουν στην ουβικιτινίωση και πρωτεολυτική αποικοδόμηση τηςογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53, ως αναδραστικό μηχανισμό στην αποπτωτική και κυτταροτοξική δράση της VacA.Συμπερασματικά, οι πολυμορφισμοί των κυτταροτοξινών CagA και VacA φαίνεται να διαδραματίζουνσημαντικό ρόλο κατά την ενήλικη ζωή στην κλινική εκδήλωση της ελικοβακτηριδιακής λοίμωξης και τηβαρύτητα της αναπτυσσόμενης φλεγμονής αντίστοιχα. Εν αντιθέσει στα παιδιά η επίπτωσή τους δενείναι ξεκάθαρη, πιθανόν λόγω της απουσίας συσσωρευμένων αλλοιώσεων και των ηπιότερωνπαθογενετικών χαρακτήρων που εμφανίζει το βακτήριο, οι οποίοι μετεξελίσσονται στο έδαφος τηςχρόνιας λοίμωξης. Αντίστοιχα, η εκδήλωση της παθογένειας της CagA μέσω των θέσεων EPIYAπροϋποθέτει σε ένα βαθμό τη συμβολή και άλλων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του στελέχους, ταοποία πιθανόν διαμορφώνονται υπό την πίεση της αλληλεπίδρασης του βακτηρίου με τον εκάστοτεξενιστή. Η ποικιλομορφία αυτή αντικατοπτρίζει την πολυπαραγοντική φύση των αλληλεπιδράσεωνπου αναπτύσσονται στη μακροχρόνια εξέλιξη της ελικοβακτηριδιακής λοίμωξης και την ανάγκημελέτης της συμπεριφοράς διαφορετικών κλινικών στελεχών ex vivo για το χαρακτηρισμό τωνπαραγόντων εκείνων του ξενιστή και του παθογόνου που καθορίζουν την έκβασή της.