Ανάπτυξη μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για την αναγνώριση μολυσματικών φύλων φουζαριού και μελέτη αλληλεπιδράσεων με φυτά
Authors: Ζαμπούνης Αντώνιος 
Published: January 2014

Η φουζαρίωση του βάμβακος που προκαλείται από τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (FOV) θεωρείται κύρια απειλή για την καλλιέργεια βάμβακος παγκοσμίως εξαιτίας των καταστρεπτικών συνεπειών που προκαλεί μέσω του αποικισμού του παθογόνου στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες των φυτών και της ικανότητας του να επιβιώνει για μεγάλες χρονικές περιόδους στο νερό, τους σπόρους και στο έδαφος. Επομένως, είναι αναγκαίος ο χαρακτηρισμός και η αξιόπιστη μοριακή ανίχνευση αυτών των απομονώσεων του FOV σε πιθανές πηγές μόλυνσης καθώς αποτελούν απαραίτητες προϋποθέσεις για την εφαρμογή προγραμμάτων φυτοπροστασίας. Η ενίσχυση με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) των επαναλαμβανόμενων τμημάτων των ριβοσωμικών ενδογονιδιακών περιοχών (IGS) και κοπή με τρία περιοριστικά ένζυμα (AluI, HaeIIIII, RsaI) είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία τριών ευδιάκριτων προτύπων (IGS απλότυποι 1,2,3) για αυτές τις απομονώσεις του Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, ικανές να τις διαχωρίζουν από άλλες ειδικές μορφές (formae speciales) του Fusarium oxysporum. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση των τμημάτων που συνορεύουν με το 5΄ άκρο των περιοχών αυτών και εντοπίστηκαν πολυμορφισμοί απλού νουκλεοτιδίου (SNPs). Χρησιμοποιώντας αυτά τα δεδομένα αναπτύχθηκαν δυο εξειδικευμένες δοκιμές PCR πραγματικού χρόνου για την απόλυτη ποσοτικοποίηση του γενωμικού DNA αυτών των απομονώσεων σε διάφορα εδάφη και φυτικούς ιστούς επιμολυσμένων φυτών. Τα πρότυπα διαγράμματα αναφοράς κατέδειξαν γραμμικές συσχετίσεις (r2=0.99) μεταξύ του λογάριθμου της ποσότητας του γενωμικού DNA και των κύκλων ανίχνευσης της PCR πραγματικού χρόνου. Η ευαισθησία ανίχνευσης όταν μολύνθηκαν τα εδάφη ήταν σε κάποιες περιπτώσεις λιγότερο από 104 κονίδια·g-1 εδάφους. Επιπλέον, με σκοπό να αναγνωριστεί η πιθανή ανάμειξη των εξαρτώμενων από το σαλικυλικό (SA) ή το ιασμονικό οξύ (JA) βιοχημικών οδών μεταγωγής σήματος στην ενεργοποίηση των αντιδράσεων άμυνας έναντι αυτών των απομονώσεων, εξετάστηκε η επίδραση της επέμβασης σε φυτά βαμβακιού (ευπαθούς και ανθεκτικής ποικιλίας) χημικών επαγωγέων όπως το ΒΙΟΝ (ένα ανάλογο του SA) και του μεθυλεστέρα του ιασμονικού οξέος (MeJA) πριν την μυκητολογική πρoσβολή με μια μολυσματική απομόνωση του μύκητα αυτού. Τα γονίδια του βάμβακος που εξετάστηκαν και σχετίζονται με την παθογένεση (PR γονίδια) ήταν αυτά του PR-10 (δράση ριβονουκλεάσης) και της χητινάσης (PR-3) και για τα οποία η φυλογενετική ανάλυση έδειξε χαμηλό βαθμό ομολογίας με άλλες παρόμοιες πρωτεΐνες. Η μελέτη των επαγόμενων αλλαγών σχετικής έκφρασης αυτών των δυο γονιδίων με PCR πραγματικού χρόνου στις ρίζες και στα υποκότυλα (μιας ευπαθούς ποικιλίας, της LACTA και μιας ανθεκτικής, της EMERALD) παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τις αντιδράσεις άμυνας σε αυτού του είδους τις αλληλεπιδράσεις φυτού-παθογόνου. Σημαντική επαγωγή της έκφρασης της χητινάσης στα υποκότυλα και τις ρίζες της ευπαθούς ποικιλίας παρατηρήθηκε ύστερα από επέμβαση με MeJA, ενώ τα επίπεδα των μεταγράφων του PR10 αυξήθηκαν πολύ πιο ραγδαία και στους δυο ιστούς της ίδιας ποικιλίας ύστερα από επέμβαση με ΒΙΟΝ. Σε αντίθεση με τα υποκότυλα της ευπαθούς ποικιλίας στην ανθεκτική τα επίπεδα έκφρασης και των δυο γονιδίων αυξήθηκαν ύστερα από μόλυνση με τη μολυσματική απομόνωση.