Ανάκτηση βιοδραστικών ουσιών από φύκη με χρήση πράσινων τεχνολογιών
Authors: Γεωργιοπούλου Ιουλία 
Published: March 2024

Η συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση για φυσικά βιοδραστικά προϊόντα σε συνδυασμό με τις σύγχρονες απαιτήσεις για την προστασία του ανθρώπου και του περιβάλλοντος υπογραμμίζουν όχι μόνο την αναγκαιότητα εκμετάλλευσης ανανεώσιμων φυσικών πρώτων υλών, αλλά και την αξιοποίηση μεθόδων εκχύλισης οι οποίες πληρούν τις προϋποθέσεις που αφορούν στην προστασία και τη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας και του οικοσυστήματος. Η βιομάζα των μικροφυκών παρουσιάζει σημαντικές προοπτικές ως πρώτη ύλη όσον αφορά στην ανάκτηση βιοδραστικών ουσιών με δυνατότητες εφαρμογής στη βιομηχανία τροφίμων, καλλυντικών, φαρμάκων κ.α. Επιπλέον, πέρα από τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης των εν λόγω συστατικών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχουν αποκτήσει οι εναλλακτικές μέθοδοι εκχύλισης, στοχεύοντας στη μείωση τόσο του ενεργειακού κόστους όσο και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων. Ανάμεσα στις πιο δημοφιλείς μεθόδους συγκαταλέγονται η υποβοηθούμενη εκχύλιση με μικροκύματα και η υπερκρίσιμη εκχύλιση. Η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στην ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών από τα μικροφύκη Chlorella vulgaris (C. vulgaris) και Scenedesmus obliquus (S. obliquus). Το πρώτο είναι ένα αντιπροσωπευτικό είδος το οποίο μελετάται, παράγεται και αξιοποιείται ήδη εμπορικά, ενώ το δεύτερο είναι ένα είδος το οποίο, εξαιτίας των σημαντικών προοπτικών του, έχει προσελκύσει το έντονο ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Η εν λόγω ανάκτηση επετεύχθη εφαρμόζοντας τις εξής πράσινες μεθόδους εκχύλισης: (α) συμβατική εκχύλιση στερεού-υγρού (SLE) με μίγμα αιθανόλης/νερού, 90/10 κ.ο., για λόγους σύγκρισης, (β) υποβοηθούμενη εκχύλιση με μικροκύματα (MAE) και διαλύτη μίγμα αιθανόλης/νερού, 90/10 κ.ο., και (γ) υπερκρίσιμη εκχύλιση (SFE) με διοξείδιο του άνθρακα (CO2). Οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς την απόδοσή τους, την περιεκτικότητα των εκχυλισμάτων σε φαινολικά συστατικά, χλωροφύλλες και καροτενοειδή, με ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην ασταξανθίνη, τη λουτεΐνη και το β-καροτένιο, και την αντιοξειδωτική τους δράση. Ειδικότερα, μελετήθηκε η επίδραση σημαντικών παραμέτρων, όπως η θερμοκρασία, 30-60 oC, ο χρόνος, 6-24 h, και η αναλογία διαλύτη/βιομάζας, 20-90 mLsolv/gbiom για την SLE, η θερμοκρασία, 40-60 oC, ο χρόνος, 5-25 min, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας, 20-90 mLsolv/gbiom, και ισχύς των μικροκυμάτων, 300-800 W, για τη ΜΑΕ, και η θερμοκρασία, 40-60 oC, η πίεση, 110-250 bar, ο ρυθμός ροής του διαλύτη, 20-40 gsolv/min, καθώς και η παρουσία συνδιαλύτη, αιθανόλη 10% κ.β., για την SFE με την εφαρμογή κατάλληλου πειραματικού σχεδιασμού. Ακολούθησε στατιστική επεξεργασία των δεδομένων, συσχέτιση μεταξύ των ανεξάρτητων (παράμετροι εκχύλισης) και εξαρτημένων μεταβλητών (εξεταζόμενες αποκρίσεις), και βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης με κριτήριο τόσο την απόδοση όσο και την ποιότητα των εκχυλισμάτων. Στη συνέχεια, δίνοντας ιδιαίτερη βαρύτητα στην υπερκρίσιμη εκχύλιση, διεξήχθη κινητική μελέτη της μεθόδου και επιχειρήθηκε η περιγραφή των πειραματικών δεδομένων στις εξεταζόμενες συνθήκες εφαρμόζοντας το μοντέλο των κατεστραμμένων και μη κυτταρικών δομών (Broken and Intact Cell Model) ή αλλιώς μοντέλο Sovová, το οποίο βασίζεται στην επίλυση διαφορικών ισοζυγίων μάζας. Στην περίπτωση του μικροφύκους C. vulgaris, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα θετικής επίδρασης για την απόδοση της SLE, και αρνητικής επίδρασης για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος. Η αύξηση της θερμοκρασίας, παρότι βελτιώνει τη διαλυτική ικανότητα του διαλύτη, συνδέεται με φαινόμενα αλλοίωσης και υποβάθμισης των θερμοευαίσθητων βιοδραστικών συστατικών. Επιπλέον, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα αρνητικής επίδρασης για την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε χλωροφύλλες και καροτενοειδή. Η αύξηση της αναλογίας ενισχύει τη βαθμίδα συγκέντρωσης του συστήματος διαλύτη-βιομάζας, συμβάλλοντας στην ταχύτερη εκχύλιση τόσο των εξεταζόμενων όσο και πληθώρας πρόσθετων συστατικών, μειώνοντας φαινομενικά τη συγκέντρωση των πρώτων στο εκχύλισμα. Τέλος, ο χρόνος εκχύλισης δεν αποτέλεσε εξίσου στατιστικά σημαντικό παράγοντα. Ωστόσο, η συνδυαστική του μεταβολή με τη θερμοκρασία και την αναλογία διαλύτη/βιομάζας επηρέασε σημαντικά τις εξεταζόμενες αποκρίσεις, διαμορφώνοντας τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης ως εξής: 30 °C, 24 h και 37 mLsolv/gbiom. Αναφορικά με τη ΜΑΕ, η παράμετρος αναλογίας διαλύτη/βιομάζας αποδείχθηκε ο πιο σημαντικός παράγοντας θετικής επίδρασης για την απόδοση, και αρνητικής επίδρασης για την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε χλωροφύλλες και ολικά καροτενοειδή. Ταυτόχρονα, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα αρνητικής επίδρασης για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος, και σύνθετης επίδρασης για την απόδοση εξαιτίας της ταυτόχρονης μεταβολής της ισχύος. Εξίσου σημαντική για τη συγκέντρωση των χλωροφυλλών προέκυψε η συνδυαστική επίδραση της θερμοκρασίας με την ισχύ και την αναλογία διαλύτη/βιομάζας. Επιθυμητά αποτελέσματα απόδοσης και ποιότητας του εκχυλίσματος προέκυψαν σε εκχυλίσεις υπό υψηλή θερμοκρασία και χαμηλή ισχύ ή σύντομες εκχυλίσεις υπό χαμηλή θερμοκρασία και αναλογία διαλύτη/βιομάζας, και υψηλή ισχύ. Τελικά, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 14 min, 22 mLsolv/gbiom, και 300 W. Σχετικά με την SFE, η αύξηση της πίεσης αποδείχθηκε ο σημαντικότερος παράγοντας θετικής επίδρασης για την απόδοση, την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε καροτενοειδή και την αντιοξειδωτική του δράση. Πράγματι, η αύξηση της πίεσης αυξάνει την πυκνότητα του CO2 και βελτιώνει τη διαλυτική του ικανότητα, ευνοώντας την εκχύλιση των βιοδραστικών συστατικών. Η θερμοκρασία παρουσίασε μια πιο σύνθετη συμπεριφορά, ωστόσο, δεν προέκυψε εξίσου στατιστικά σημαντικός παράγοντας. Η αύξηση της θερμοκρασίας συνδέεται με τη μείωση της πυκνότητας του CO2 και κατ’ επέκταση τη μείωση της διαλυτικής του ικανότητας, και ταυτόχρονα την αύξηση της τάσης ατμών των προς εκχύλιση συστατικών. Στις χαμηλές πιέσεις η μείωση της πυκνότητας κυριάρχησε έναντι της αυξημένης τάσης ατμών, γεγονός το οποίο δεν ευνόησε την εκχύλιση, ενώ η αύξηση της πίεσης εξομάλυνε τα δύο παρατηρούμενα φαινόμενα. Ακόμη, ο ρυθμός ροής του CO2 δεν προέκυψε στατιστικά σημαντικός παράγοντας επίδρασης. Ωστόσο, η αύξησή του βελτίωσε την ποιότητα του εκχυλίσματος, πιθανότατα εξαιτίας της μειωμένης αντίστασης της μεταφοράς μάζας, η οποία διευκόλυνε την εκχύλιση των βιοδραστικών συστατικών. Συνεπώς, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 250 bar και 40 gsolv/min. Επιπλέον, η προσθήκη συνδιαλύτη (αιθανόλη 10% κ.β.) βελτίωσε την απόδοση και την ποιότητα του εκχυλίσματος σε σύγκριση με τη χρήση του καθαρού CO2, καθώς μετέβαλε την πολικότητα του διαλύτη και επέτρεψε τη συνεκχύλιση περισσότερων πολικών βιοδραστικών συστατικών. Τέλος, η μοντελοποίηση της SFE διεξήχθη επιτυχώς με την εφαρμογή του μοντέλου Sovová και τη χρήση κατάλληλων παραδοχών, προσδιορίζοντας χρήσιμα μεγέθη στις εξεταζόμενες συνθήκες, όπως οι συντελεστές μεταφοράς μάζας στη στερεή και τη ρευστή φάση. Τη βελτιστοποίηση των μεθόδων εκχύλισης ακολούθησε η μεταξύ τους σύγκριση. Από τη σύγκριση προέκυψε ότι η SLE, παρά την υψηλή απόδοση, οδήγησε στη λήψη εκχυλίσματος με μειωμένη συγκέντρωση σε καροτενοειδή και λιγότερο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η εφαρμογή της ΜΑΕ μείωσε σημαντικά τον χρόνο εκχύλισης οδηγώντας σε μια αξιόλογη απόδοση, και ένα ανώτερης ποιότητας εκχύλισμα σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η εφαρμογή της SFE οδήγησε σε χαμηλή απόδοση και συγκέντρωση χλωροφυλλών. Ωστόσο, προέκυψε ένα βελτιωμένο εκχύλισμα αναφορικά με την περιεκτικότητα φαινολικών συστατικών και καροτενοειδών, και την αντιοξειδωτική του δράση σε σύγκριση με τις SLE και ΜΑΕ. Η προσθήκη συνδιαλύτη (αιθανόλη 10% κ.β.) κατά την SFE διπλασίασε την απόδοση και βελτίωσε συνολικά την περιεκτικότητα σε βιοδραστικά συστατικά και την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος. Επομένως, αν και η συμβατική SLE παρουσίασε την υψηλότερη απόδοση, η εφαρμογή των εναλλακτικών ΜΑΕ και SFE αποδείχθηκε πολλά υποσχόμενη οδηγώντας στη λήψη βελτιωμένων εκχυλισμάτων ανώτερης ποιότητας και πιο ισχυρής αντιοξειδωτικής δράσης. Το συμπέρασμα της λήψης βιοδραστικών εκχυλισμάτων ενισχύθηκε και από προκαταρκτικά ευρήματα τα οποία απέδειξαν ότι τα εκχυλίσματα C. vulgaris (SLE και SFE) παρείχαν αντιοξειδωτική άμυνα σε ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από λιπώδη ιστό (hMSC-AT). Την ισχυρότερη, μάλιστα, αντιοξειδωτική δράση παρουσίασε το εκχύλισμα της SFE. Αναφορικά με το μικροφύκος S. obliquus, η αύξηση της θερμοκρασίας επηρέασε κυρίως την απόδοση της SLE με θετικό πρόσημο, μειώνοντας, ωστόσο, τη συγκέντρωση των καροτενοειδών. Επιπλέον, η συνδυαστική επίδραση θερμοκρασίας και χρόνου αποδείχθηκε η πιο σημαντική παράμετρος για τη συγκέντρωση των φαινολικών συστατικών και των χλωροφυλλών, και της αντιοξειδωτικής δράσης του εκχυλίσματος με αρνητικό πρόσημο. Η αύξηση της αναλογίας διαλύτη/βιομάζας επέφερε είτε θετική είτε αρνητική επίδραση, ανάλογα με τις τιμές της θερμοκρασίας και του χρόνου εκχύλισης, ωστόσο, δεν αποτέλεσε στατιστικά σημαντική παράμετρο για τις περισσότερες αποκρίσεις. Σε αυτήν την περίπτωση, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 30 °C, 24 h και 90 mLsolv/gbiom. Ομοίως και για τη ΜΑΕ, η αύξηση της θερμοκρασίας ευνόησε κυρίως την απόδοση, ενώ η συνδυαστική επίδραση της θερμοκρασίας με τον χρόνο εκχύλισης αποδείχθηκε ο πιο καθοριστικός παράγοντας για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος επηρεάζοντάς την αρνητικά. Ο χρόνος εκχύλισης, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας και η ισχύς των μικροκυμάτων παρουσίασαν μια πιο σύνθετη επίδραση, διαμορφώνοντας τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης ως εξής: 60 °C, 5 min, 90 mLsolv/gbiom, και 300 W. Αναφορικά με την SFE, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον πιο σημαντικό παράγοντα θετικής επίδρασης στην απόδοση. Ωστόσο, η αύξηση της πίεσης συνέβαλε κυρίως στη βελτίωση του εκχυλίσματος αναφορικά με την περιεκτικότητα των εξεταζόμενων βιοδραστικών συστατικών και την αντιοξειδωτική του δράση. Επιπλέον, ο ρυθμός ροής του CO2 δεν προέκυψε στατιστικά σημαντικός παράγοντας επίδρασης, βελτιώνοντας, ωστόσο, τα αποτελέσματα στις υψηλές τιμές θερμοκρασίας και πίεσης. Όμοια με την περίπτωση του C. vulgaris, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 250 bar και 40 gsolv/min. Ακόμη, η προσθήκη αιθανόλης, 10% κ.β., βελτίωσε και πάλι την απόδοση και την ποιότητα του εκχυλίσματος σε σύγκριση με τη χρήση μόνο του CO2. Τέλος, η εφαρμογή του μοντέλου Sovová διεξήχθη επιτυχώς με τη χρήση κατάλληλων παραδοχών, οδηγώντας στη μοντελοποίηση της SFE του S. obliquus και παρέχοντας χρήσιμες πληροφορίες για τους συντελεστές μεταφοράς μάζας. Ακολούθως, η σύγκριση των μεθόδων για την περίπτωση του S. obliquus απέδειξε, αρχικά, ότι η SLE οδήγησε στη λήψη ενός εκχυλίσματος με χαμηλή συγκέντρωση καροτενοειδών και λιγότερο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η ΜΑΕ, από την άλλη, μείωσε εξαιρετικά τον χρόνο εκχύλισης βελτιώνοντας, ταυτόχρονα, την απόδοση, την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε όλα τα εξεταζόμενα βιοδραστικά συστατικά, και την αντιοξειδωτική του δράση σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η SFE συνδέθηκε με χαμηλότερες τιμές απόδοσης και συγκέντρωσης του εκχυλίσματος σε φαινολικά συστατικά και χλωροφύλλες, παρουσιάζοντας, ωστόσο, υψηλότερη συγκέντρωση σε καροτενοειδή και ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση σε σύγκριση με τις SLE και ΜΑΕ. Τέλος, η προσθήκη της αιθανόλης κατά την SFE αύξησε σημαντικά την απόδοση σε συναγωνίσιμα επίπεδα με αυτά της SLE, και βελτίωσε συνολικά την ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος σε σύγκριση με την απουσία συνδιαλύτη αλλά και τις SLE και ΜΑΕ. Συνεπώς, η ΜΑΕ, με την υψηλότερη απόδοση, και η SFE αποδείχθηκαν πολλά υποσχόμενες μέθοδοι οδηγώντας στη λήψη προϊόντων ανώτερης ποιότητας και αντιοξειδωτικής δράσης σε σύγκριση με την SLE. Η διατριβή ολοκληρώνεται με την Ανάλυση Κύκλου Ζωής (Life Cycle Analysis – LCA) των τριών εξεταζόμενων μεθόδων για την ανάκτηση βιοδραστικού εκχυλίσματος από τα μικροφύκη C. vulgaris και S. obliquus, με στόχο την αξιολόγηση του περιβαλλοντικού τους αποτυπώματος. Και στις δύο περιπτώσεις, η LCA υπέδειξε τη σημαντική συνεισφορά των διεργασιών υψηλής κατανάλωσης ενέργειας στο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, όπως είναι η θέρμανση εκχύλισης και η ανάκτηση των διαλυτών για την SLE, η εφαρμογή των μικροκυμάτων για τη ΜΑΕ, και η ψύξη και συμπίεση του διαλύτη για την SFE. Επιπλέον, από την αξιολόγηση των περιβαλλοντικών δεικτών προέκυψε ότι στην περίπτωση του μικροφύκους C. vulgaris, η SFE οδηγεί σε βελτιωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ακολουθούμενη από την SLE και τη ΜΑΕ. Αναφορικά με το μικροφύκος S. obliquus, η SFE οδήγησε και πάλι σε βελτιωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ακολουθούμενη από τη ΜΑΕ και την SLE. Συμπερασματικά, η εφαρμογή των μεθόδων ΜΑΕ και SFE στα μικροφύκη οδηγεί στην ανάκτηση ανταγωνιστικών προϊόντων, τα οποία παρουσιάζουν ανώτερη ποιότητα αναφορικά με τη σύστασή τους σε βιοδραστικά συστατικά και την αντιοξειδωτική τους δράση σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η εφαρμογή της SFE για το C. vulgaris, και των ΜΑΕ και SFE για το S. obliquus, χαρακτηρίζεται από μειωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα έναντι της SLE. Συνεπώς, η αξιοποίηση των προτεινόμενων μη συμβατικών μεθόδων διαχωρισμού, και κυρίως της SFE, στην ανάκτηση βιοδραστικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από την εναλλακτική πρώτη ύλη των μικροφυκών αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εφαρμογή, και η παρούσα συγκριτική μελέτη παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για τη διερεύνηση και τον μετέπειτα σχεδιασμό των εν λόγω διεργασιών.