ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ТРИПСИНОПОДОБНЫХ ПРОТЕАЗ ПРИ ФРАКЦИОНИРОВАНИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ
Authors: О.В. Кожевникова 
Published: November 2024

Сохранение нативной конформации белков в биопрепаратах плазмы крови – важнейший критерий их безопасности. Однако присутствие в плазме и биопрепаратах на ее основе естественных протеаз приводит к фрагментации белков и снижению эффективности действующего вещества. Целью данной работы было исследование возможности ингибирования трипсиноподобных протеаз веществами, используемыми при фракционировании плазмы крови на фармацевтических предприятиях. В качестве модели для исследования возможности ингибирования был выбран трипсин, т. к. большинство протеаз, присутствующих в плазме крови, относится к трипсиноподобным. Измеряли скорости гидролиза трипсином субстрата N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (BAPNA) в нативных условиях и в присутствии фракционирующих и дезинфицирующих агентов. Определены кинетические и термодинамические параметры гидролиза трипсином, сделаны предположения о механизмах ингибирования реакции фракционирующими агентами, используемыми при производстве биопрепаратов из плазмы крови. Определены минимальные концентрации фракционирующих агентов и дезинфектантов, необходимые для инактивации естественных протеаз. Для нативного трипсина максимальная скорость реакции гидролиза составила 0,07 единиц оптической плотности (ед. ОП) в минуту, константа Михаэлиса ‒ 3,3 ммоль/л. Среди исследованных реагентов максимальную ингибирующую способность показал сульфат аммония. Полагаем, что он ингибирует реакцию гидролиза по бесконкурентному механизму.

Preservation of native conformation of proteins in blood plasma biopreparations is the most important criterion of their safety. However, the presence of natural proteases in blood plasma and blood products leads to protein fragmentation and decreases the efficacy of the active substance. The aim of this paper was to investigate the possibility of inhibition of trypsin-like proteases by substances used in fractionation of blood plasma at pharmaceutical plants. Trypsin was taken as a model to investigate the possibility of inhibition, since most of the proteases present in blood plasma are trypsin-like. The rates of trypsin hydrolysis of the substrate N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) under native conditions and in the presence of fractionating and disinfecting agents were measured. Based on the data obtained, graphs were plotted andthe maximum reaction rate and the Michaelis constant were determined. Kinetic and thermodynamic parameters of hydrolysis by trypsin were determined, and assumptions were made about the mechanisms of inhibition of the reaction by fractionating agents used in the production of biological products from blood plasma. The minimum concentrations of fractionating agents and disinfectants necessary for inactivation of natural proteases were determined. For native trypsin, the maximum rate of hydrolysis reaction was 0.07 units of optical density (ODU) per minute, Michaelis constant was 3.3 mmol/L. Among the reagents studied, ammonium sulfate showed the maximum inhibitory capacity. We assume that it inhibits the hydrolysis reaction by an uncompetitive mechanism.