Μοριακή ανάλυση παραγόντων προσαρμοστικότητας του βακτηρίου Zymomonas mobilis σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης
Authors: Χριστογιάννη Αναστασία 
Published: August 2021

Το βακτήριο Ζ mobilis, είναι ένα αρνητικό κατά Gram, αιθανολοπαραγωγό βακτήριο, το οποίο χρησιμοποιεί την γλυκολυτική πορεία Entner-Doudoroff. Ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά του βακτηρίου αυτού είναι η ανθεκτικότητά του σε αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης μέσω ενός μηχανισμού ο οποίος παραμένει αδιευκρίνιστος. Στην παρούσα εργασία, έγινε προσπάθεια μελέτηςτου μηχανισμού αυτού. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το μεταλλαγμένο στέλεχος CU lRif 2, το οποίο δεν αναπτύσσεται σε στερεό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10% γλυκόζη, ενώ σε υγρό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10% γλυκόζη, αναπτύσσεται μετά από μία φάση εφησυχασμού 22 ωρών περίπου, χωρίς να υπάρχει πρόβλημα οσμωρύθμισης. Επιπρόσθετα, η πρόσληψη και η φωσφορυλίωση της γλυκόζης δεν φαίνεται να λειτουργεί σωστά στο μεταλλαγμένο στέλεχος όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο αυξηθεί. Από μία γονιδιακή βιβλιοθήκη του φυσικού τύπου απομονώθηκε ένα τμήμα DNA, το οποίο όταν εκφραστεί στα κύτταρα του στελέχους C U lR if2 αναπληρώνει την ανθεκτικότητά τους σε στερεό και υγρό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10%γλυκόζη, καθώς και την σωστή λειτουργία της πρόσληψης και της φωσφορυλίωσης της γλυκόζης.Στην παρούσα εργασία, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) βρέθηκε ότι το τμήμα αυτό το οποίο αποτελείται από ένα σύμπλεγμα τεσσάρων γονιδίων, τα ORF1, ORF2, ORF3 και O R F4, συμμεταγράφεται ως ένα αυτόνομο οπερόνιο, το οπερόνιο glc όπως ονομάστηκε και βρίσκεται υπό τον έλεγχο κοινού προαγωγού, του P9ie. Ο προαγωγός Pgic βρέθηκε ότι είναι οσμωρυθμιζόμενος και αλληλεπιδρά με το προϊόν του ORF4 υποδεικνύοντας μια λειτουργία αυτορύθμισης. Επιπρόσθετα βρέθηκε ότι η μεταγραφή του οπερονίου glc ρυθμίζεται από τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο και μάλιστα η ρύθμιση αυτή γίνεται στο μεταγραφικό επίπεδο. Τα τέσσερα ORFs υποκλωνοποιήθηκαν στον φορέα υπερέκφρασης pET29c(+) και υπερεκφράστηκαν με επιτυχία. Η ανάλυση της αλληλουχίας του O RF4 αποκάλυψε την απουσία του νουκλεοτιδίου στη θέση 2271 που ως αποτέλεσμα έχει τηδημιουργία ενός κωδικονίου τερματισμού (ΤΑΑ) 15 νουκλεοτίδια καθοδικά. Με βάση την εκ νέου ανάλυση της αλληλουχίας του οπερονίου glc, προτείνονται 5 πιθανές περιοχές έναρξης και μία τερματισμού για το ORF4. Από τα δεδομένα της παρούσας διατριβής το φυσιολογικό ORF4 είναι το μεγαλύτερο από τα 5 προτεινόμενα, το ORF4a καθώς έχει την ικανότητα από μόνο του να αναπληρώνει την ανθεκτικότητα του μεταλλαγμένου στελέχους τόσο σε στερεό όσο και σε υγρό θρεπτικό μέσο 107ο γλυκόζης και επιπρόσθετα αποκαθιστά και τη δραστικότητα της γλυκοκινάσης στο μεταλλαγμένο στέλεχος CUlRif2. Οι πρωτεΐνες που κωδικεύονται από τα 0RF1 και 0 R F 2 παρουσιάζουν ισχυρή ομολογία καθώς και εκτεταμένες συντηρημένες περιοχές με τις πρωτεΐνεςIspD και Isp F αντίστοιχα, οι οποίες εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των ισοπρενοειδών μέσω της πορείας της φωσφορικής δεοξυ-ξυλουλόζης (πορεία DOXP). Απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν με επιτυχία τα προϊόντα των 0RF1 και 0 R F2. Η πρωτεΐνη του 0RF1 υπολογίστηκε στα 37 kba και εμφανίζεται ως διμερές, ενώ η πρωτεΐνη του 0 R F2 υπολογίστηκε στα 120 kDa και πιθανότατα αποτελεί εξαμερές. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά για απομόνωση των εν λόγω πρωτεϊνών τουΖ mobiUsmb ετερόλογο σύστημα υπερέκφρασης. Δεν βρέθηκε ομολογία της πρωτεΐνης που κωδικεύεται από το 0 R F 3 με γνωστές πρωτεΐνες. Από τα μέχρι σήμερα δεδομένα φαίνεται ότι πρόκειται για μια νέα πρωτεΐνη. Αντίθετα, βρέθηκε ισχυρή ομολογία καθώς και εκτεταμένεςσυντηρημένες περιοχές μεταξύ της πρωτεΐνης που κωδικεύεται από το O RF4 και της πρωτεΐνης CinA (Competence-damaged protein). Η πρωτεΐνη CinA είναι η πρώτη που κωδικεύεται από το οπερόνιο tin (competence-inducible operon) και θεωρείται ότι απαιτείται σε κάποια φάση κατά την διάρκεια του μετασχηματισμού ορισμένων βακτηρίων όπως 5. pneumoniae, Β. subtilis και ΰ. radiodurans. Επετεύχθη μεταφορά του πλασμιδίου ρΒ ΖΙΡΙ στο φυσικό στέλεχος του Ζ. mobilis A TCC 10988 με χημικό μετασχηματισμό, όμως το μεταφερόμενο πλασμίδιο παρουσίασε δομική αστάθεια στο νέο ξενιστή. Εντοπίστηκε η μετάλλαξη στο οπερόνιο g!c στο μεταλλαγμένο στέλεχοςC U lR if2. Ένθεση χρωμοσωμικής προελεύσεως, μεγέθους 848 bp, εισήχθη στην περιοχή του O RF4. Το εύρημα αυτό πιθανόν να εξηγεί την αδυναμία του CU1 και των παραγωγών του (C U lR if2) να αναπτύσσονται σε αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Επιπρόσθετα, απομονώθηκε από το CU lR if 2 το οπερόνιο glc μεγέθους 5.341 bp. Τέλος, με βάση τα δεδομένα της παρούσας διατριβής προτείνεται ένα θεωρητικό μοντέλο για την ανθεκτικότητα του Ζ. mobilis at αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Σύμφωνα με αυτό η ανθεκτικότητα είναι αποτέλεσμα ενός ρυθμιστικού συστήματος δύο συστατικών.