Ανταγωνιστές μπομπεσίνης επισημασμένοι με 99mTc για εφαρμογή στη διαγνωστική ογκολογία
Authors: Χαραλαμπίδης Δαυίδ 
Published: August 2021

Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί πολύ μεγάλη πρόοδος στη διαγνωστικήογκολογία με την εφαρμογή εξειδικευμένων ραδιοεπισημασμένων ενώσεων(ραδιοφαρμάκων) μοριακής στόχευσης. Κυρίως η έρευνα επικεντρώνεται στηνανάπτυξη ραδιοεπισημασμένων πεπτιδίων τα οποία παρουσιάζουν πολλάπλεονεκτήματα για εφαρμογή στη κλινική ογκολογία, όπως ταχεία βιοκινητική, μεγάληικανότητα διείσδυσης στον καρκινικό ιστό λόγω μικρού μοριακού βάρους και χαμηλήαντιγονικότητα. Τα ραδιοπεπτίδια αλληλεπιδρούν επιλεκτικά με βιομόρια-στόχους,δηλαδή πρωτεϊνικούς υποδοχείς, οι οποίοι υπερεκφράζονται στην επιφάνεια τωνκαρκινικών κυττάρων. Επομένως λειτουργούν ως μεταφορείς διαγνωστικών ήθεραπευτικών ραδιονουκλιδίων στους ιστούς στόχους (καρκινικές εστίες),παρέχοντας δυνατότητα απεικόνισης τους ή και καταστροφής τους.Η μπομπεσίνη (BBΝ) είναι ένα δεκατετραπεπτίδιο με μεγάλη συγγένεια γιατους υποδοχείς του γαστρινοεκλυτικού πεπτιδίου (GRP-Rs) οι οποίοιυπερεκφράζονται σε πολλούς συνήθεις ανθρώπινους όγκους, όπως σε καρκίνο τουπροστάτη και του μαστού.Στη παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση και η προκλινική αξιολόγησηνέων ανταγωνιστών μπομπεσίνης επισημασμένων με 99mTc για εφαρμογή στηστοχευμένη απεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων.Ως οδηγός-ένωση χρησιμοποιήθηκε ο ανταγωνιστής μπομπεσίνης [DPhe6,Leu-NHEt13]BBΝ(6-13), στην οποία έγιναν επεμβάσεις στο N-τελικό άκρο, στοC-τελικό άκρο και/ή στη πεπτιδική αλυσίδα.Ως ραδιονουκλίδιο επιλέχθηκε το 99mTc λόγω των ιδανικών του πυρηνικώνιδιότητων. Για τη σταθερή συναρμογή του 99mTc χρησιμοποιήθηκε τετραμίνη ανοικτήςαλυσίδας τύπου H2NCH2CH2NH(CH2)3NHCH2CH2NH2 (2,3,2-tet). Η επισήμανση ήτανσχεδόν ποσοτική και τα επισημασμένα πεπτίδια παραλήφθηκαν σε υψηλήκαθαρότητα όπως επιβεβαιώθηκε με ραδιοχημικό έλεγχο.Η συγγένεια των νέων αναλόγων για τον GRP-R μελετήθηκε με πειράματαανταγωνιστικής δέσμευσης έναντι [125Ι-Τyr4]BBN σε μεμβράνες κυττάρων PC-3 καιβρέθηκε ιδιαίτερα υψηλή, υψηλότερη ακόμα και από την ένωση αναφοράς [Tyr4]BBΝκαταδεικνύοντας την ευνοϊκή επίδραση του τετραμινικού υποκαταστάτη στο N-τελικό άκρο των πεπτιδίων αυτών. Η ικανότητα δέσμευσης μετά τη συναρμογή τουραδιομετάλλου μελετήθηκε αντιπροσωπευτικά για το [99gTc/99mTc]Demobesin 8 μεπειράματα δέσμευσης κορεσμού υποδοχέων σε κύτταρα PC-3. Η συγγένειαδέσμευσης για τον GRP-R ήταν ιδιαίτερα υψηλή, με τιμή Kd = 0.24±0.03 nM,καταδεικνύοντας ότι η παρουσία του (ραδιο)μεταλλικού συμπλόκου στο Ν-τελικόάκρο της πεπτιδικής αλυσίδας ευνοεί τη δέσμευση στον GRP-R.Πειράματα δέσμευσης των ραδιοπεπτιδίων της παρούσας διατριβής σεκύτταρα PC-3 έδειξαν ποσοστά δέσμευσης ανάλογα της συγγένειας του κάθεαναλόγου και την απουσία εσωτερίκευσης, η οποία είναι συμβατή με συμπεριφοράανταγωνιστή. Η ανταγωνιστική δράση επιβεβαιώθηκε επιλεκτικά για τα Demobesin 8και Demobesin 10 σε κύτταρα HEK-GRPR.Η μεταβολική σταθερότητα του [99mTc]Demobesin 8 μελετήθηκε σε πλάσμααίματος, ομογενοποίημα νεφρών ποντικού και ούρα ποντικιού. Το [99mTc]Demobesin8 αποικοδομείται αργά στο πλάσμα ενώ στα νεφρά αποικοδομείται ταχέως σευδρόφιλους μεταβολίτες. Ανάλυση με HPLC ούρων που συλλέχθηκαν 30 min μετάτην ενδοφλέβια χορήγηση του ραδιοπεπτιδίου έδειξε πλήρη αποικοδόμησή του.Τα αποτελέσματα των μελετών βιοκατανομής κατά την ενδοφλέβια χορήγησητων επισημασμένων αναλόγων σε υγιή και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώωνσυμφωνούν με τα αποτελέσματα των μελετών in vitro. Διαπιστώθηκε ταχείααπομάκρυνση από το αίμα και το υπόστρωμα με κύρια οδό απέκκρισης τοουροποιητικό σύστημα.Η κύρια οδός απέκκρισης του [99mTc]Demobesin 8 είναι διαμέσου των νεφρώνπρος τα ούρα και όχι μέσω του ηπατοχολικού συστήματος λόγω υψηλήςυδροφιλικότητας. Αυτό αναμένεται να οδηγήσει σε ταχύτερη κάθαρση και σε μείωσητης ραδιενέργειας υποστρώματος άρα και σε πιθανή ευκρινέστερη απεικόνιση GRPRθετικών όγκων. Η υψηλότερη ειδική πρόσληψη στα όργανα που εκφράζουνφυσιολογικά τον GRP-R όπως είναι το πάγκρεας παρατηρήθηκε για το[99mTc]Demobesin 8. Η διαδικασία για όλα τα ραδιοπεπτίδια διαμεσολαβείται απότους GRP-Rs, όπως αποδείχθηκε κατόπιν in vivo αποκλεισμού των θέσεωνδέσμευσης με συγχορήγηση περίσσειας [Tyr4]BBΝ με το εκάστοτε ραδιοπεπτίδιο. Σεποντίκια τύπου SCID στα οποία έχουν μεταμοσχευθεί ανθρώπινα ετερομοσχεύματαPC-3 το [99mTc]Demobesin 8 πέτυχε και πάλι τις υψηλότερες τιμές πρόσληψης στονόγκο. Σε σύγκριση με άλλα πεπτίδια ανταγωνιστές μπομπεσίνης της βιβλιογραφίαςτο [99mTc]Demobesin 8 έδειξε υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για τον GRP-R καιυψηλότερες τιμές πρόσληψης στον πειραματικό όγκο. Επιπλέον σύγκριση με ταραδιοπεπτίδια - αγωνιστές όπως [99mTc]Demobesin 3-6 επιβεβαιώνει τηναποτελεσματικότερη στόχευση GRP-R - θετικών καρκινωμάτων από ραδιοπεπτίδια-ανταγωνιστές.Η παρούσα διατριβή οδήγησε με επιτυχία στην ανάπτυξη νέων 99mTc-ραδιοεπισημασμένων ανταγωνιστών μπομπεσίνης για εφαρμογή στη στοχευμένηαπεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων στον άνθρωπο. Η προκλινική αυτήαξιολόγηση κατέδειξε ως ραδιοπεπτίδιο επιλογής το [99mTc]Demobesin 8 δεδομένουότι συνδυάζει σημαντικά κριτήρια για κλινική εφαρμογή, όπως σταθερότητα, ταχείακαι υψηλή in vivo στόχευση των GRP-Rs και ταχεία κάθαρση από παρακείμενουςιστούς και επομένως σε υψηλής ευκρίνειας απεικονίσεις.