Φαρμακογονιδιωματική αξιολόγηση της δράσης της ανασυσταμένης HDL με απολιποπρωτεΐνη Ε3 κατά της αθηροσκλήρωσης
Authors: Βαλαντή Ευταξία-Κωνσταντίνα 
Published: November 2022

H αθηροσκληρωτική στεφανιαία νόσος (ASCAD) είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως, παρά την πλειάδα διαθέσιμων αντιλιπιδαιμικών φαρμάκων, καθιστώντας αναγκαία την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η αύξηση των επιπέδων της HDL (λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας) χοληστερόλης (HDL-C) του πλάσματος από μόνη της έχει αποδειχθεί ότι δεν επαρκεί για την επίτευξη αθηροπροστασίας, αλλά πρέπει να διασφαλίζεται η λειτουργικότητα της HDL. Προς αυτή την κατεύθυνση και δεδομένου των πολυάριθμων αθηροπροστατευτικών ιδιοτήτων της απολιποπρωτεΐνης Ε3 (apoE3), η ανασυγκροτημένη HDL που περιέχει ανθρώπινη apoE3 και φωσφολιπίδια (rHDL-apoE3) αντιπροσωπεύει μία υποσχόμενη αλλά σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη θεραπευτική προσέγγιση. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στην αξιολόγηση της αθηροπροστατευτικής δράσης της rHDL-apoE3 σε κυτταρικό, μοριακό και λειτουργικό επίπεδο. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν φαρμακογονιδιωματικές αναλύσεις αιχμής, όπου αξιολογήθηκε η συνολική γονιδιακή έκφραση σε πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (ΕΚ) αορτής (HAEC) μετά από επώαση με rHDL-apoE3 ή PBS (κύτταρα αναφοράς) με τη χρήση μικροσυστοιχιών και στη συνέχεια high-throughput ποσοτικής RT-PCR. Μέσω πολυεπίπεδης βιοπληροφορικής ανάλυσης ανακαλύψαμε ότι η rHDL-apoE3 προκάλεσε στατιστικά σημαντικές αλλαγές στην έκφραση 198 γονιδίων των ΗΑΕC, τα οποία σχετίζονται, κυρίως, με λειτουργίες που εμπλέκονται στην αποκατάσταση του τραυματισμένου αγγειακού ενδοθηλίου και στη ρύθμιση της εξέλιξης της αθηροσκλήρωσης. Μέσω ενδελεχών αναλύσεων εξόρυξης δεδομένων προσδιορίσαμε ότι η rHDL-apoE3 προκάλεσε αλλαγές γονιδιακής έκφρασης σε πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό (37 γονίδια), τη διαφοροποίηση (25), την απόπτωση (26) και την επιβίωση (14) των ΕΚ. Η μετανάστευση των ΕΚ ήταν η πιο στατιστικώς σημαντικά αλλαγμένη λειτουργία όπου κατηγοριοποιήθηκαν τα περισσότερα αλλαγμένα μετάγραφα (44). Εν τω βάθει μελέτη των συγκεκριμένων μεταγράφων και των αντίστοιχων πρωτεϊνών, υπέδειξε τον κεντρικό τους ρόλο στα καίρια σηματοδοτικά μονοπάτια μετανάστευσης των ΕΚ: 1) MEK1/2/ERK1/2, 2) PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9, 3) RHO-GTPασών και 4) ιντεγκρινών. H επαγόμενη από την rHDL-apoE3 υπερέκφραση τεσσάρων γονιδίων-κλειδιών των μονοπατιών αυτών - PIK3CG, EFNB2, ID1 και FLT1 - επιβεβαιώθηκε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο στα πρωτογενή ανθρώπινα ΕΚ στεφανιαίας αρτηρίας (HCAEC) και στην κυτταρική σειρά των ανθρώπινων ΕΚ EA.hy926. Η rHDL-apoE3 αύξησε επίσης τη φωσφορυλίωση βασικών μορίων-τελεστών των προαναφερόμενων μονοπατιών - ERK1/2, AKT, p38 MAPK και eNOS - στα κύτταρα αυτά. Επιπλέον, η rHDL-apoE3 αύξησε τη μετανάστευση των ΗCAEC και ΕΑ.hy926 κυττάρων, όπως προέκυψε από δοκιμασίες προσομοίωσης “επούλωσης πληγής” και τύπου “transwell”. Η αναστολή των κινασών ΜΕΚ1/2 μέσω του χημικού αναστολέα PD98059 εμπόδισε την επαγόμενη από την rHDL-apoE3 μετανάστευση των ΗCAEC και ενεργοποίηση των ΕRK1/2 κινασών στα κύτταρα αυτά. Ομοίως, η αναστολή της PI3K κινάσης μέσω του χημικού αναστολέα LY294002 μείωσε σημαντικά την επαγωγή της μετανάστευσης των HCAEC από την rHDL-apoE3 και εμπόδισε την επαγόμενη από την rHDL-apoE3 φωσφορυλίωση των κινασών ΑΚΤ και p38 MAPK στα κύτταρα αυτά. Η χημική αναστολή της PI3K δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της eNOS από την rHDL-apoE3 στα ΗCAEC, υποδηλώνοντας έναν εμπλεκόμενο μηχανισμό ανεξάρτητο της PI3K. Η γονιδιακή αποσιώπηση του μεταγραφικού παράγοντα ID1 μέσω siRNA μείωσε σημαντικά την επαγωγή της μετανάστευσης των EA.hy926 κυττάρων από την rHDL-apoE3 εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των ΕRK1/2 και ΑΚΤ. Τα συνολικά αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποδεικνύουν ότι η rHDL-apoE3 επιδρά σε ένα εύρος μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με την αθηροπροστασία. Εστιάζοντας συγκεκριμένα στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθοριστικό ρόλο στη δράση αυτή αποδεικνύεται ότι παίζουν τα μονοπάτια μετανάστευσης MEK1/2/ERK1/2, PI3K/AKT/eNOS-MMP2/9 και των RHO-GTPασών, τα οποία ενεργοποιούνται μέσω υπερέκφρασης του ID1. Μέσω αυτών των μηχανισμών η rHDL-apoE3 επάγει τη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο σύνολό τους τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την προοπτική η rHDL-apoE3 να επάγει την επανενδοθηλιοποίηση και την αποκατάσταση του τραυματισμένου αγγειακού ενδοθηλίου, με δυνητικές κλινικές εφαρμογές στη θεραπεία της ASCAD στο εγγύς μέλλον.