Expression of programmed death-1 (PD-1) and PD-1 ligands in human and murine tissue and their role in immunological tolerance
Authors: Μπέρτσιας Γεώργιος 
Published: January 2014

Το ανοσολογικό σύστημα των θηλαστικών έχει αναπτυχθεί με στόχο την προστασία του οργανισμού έναντι ξένων παθογόνων μικροοργανισμών. Προϋπόθεση για τη λειτουργία αυτή είναι η δυνατότητα που έχουν τα Τ λεμφοκύτταρα να διακρίνουν τα ξένα αντιγόνα από τα αντιγόνα εαυτού, να αναγνωρίζουν δηλαδή και να αντιμετωπίζουν τους λοιμώδεις μικροοργανισμούς χωρίς να προξενούν βλάβη στον ίδιο τον οργανισμό. Η ιδιότητα αυτή των λεμφοκυττάρων εξασφαλίζεται μέσω σειράς περίπλοκων μηχανισμών που ξεκινούν με τον περιορισμό των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα. Ωστόσο, ο μηχανισμός αυτός της «κεντρικής» ανοσολογικής ανοχής είναι ατελής με συνέπεια ορισμένοι κλώνοι αυτοδραστικών λεμφοκυττάρων να περνούν στην περιφέρεια όπου και ελέγχονται πλέον από μηχανισμούς «περιφερικής» ανοσολογικής ανοχής. Τυχόν διαταραχή της ανοσολογικής ανοχής (κεντρικής ή περιφερικής) οδηγεί σε αυτοανοσία. Μεταξύ των μηχανισμών περιφερικής ανοσολογικής ανοχής, οι υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης B7/CD28 είναι σημαντικοί για τον έλεγχο της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα ο υποδοχέας programmed death-1 (PD-1) αναστέλλει τις ανοσολογικές αποκρίσεις των λεμφοκυττάρων και έχει ιδιαίτερο ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής ανοχής λόγω κάποιων χαρακτηριστικών που τον διαφοροποιούν από άλλους Β7 υποδοχείς, όπως: η έκφρασή του στα ενεργοποιημένα Τ- αλλά και Β- λεμφοκύτταρα, το ευρύ πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων του (PD-L1, PD-L2) σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος αλλά και σε ενεργοποιημένα ιστικά παρεγχυματικά κύτταρα, και ο ειδικός μηχανισμός δράσης. Ο ανοσορρυθμιστικός ρόλος του PD-1 αναδείχθηκε σε μελέτες ποντικών με γενετική απαλοιφή (knock-out) του γονιδίου του PD-1, οι οποίοι αναπτύσσουν ποικίλες αυτοάνοσες διαταραχές, όπως επίσης σε χρόνιες ιογενείς λοιμώξεις όπου διαπιστώνεται ενισχυμένη έκφραση του PD-1 σε αντιγονο-ειδικά Τ λεμφοκύτταρα που βρίσκονται σε ανενεργή («ανοσο-ανεπαρκή») κατάσταση. Στους ανθρώπους, ο πιθανός ρόλος του PD-1 στον έλεγχο των ανοσολογικών αποκρίσεων προέκυψε από μελέτες συσχέτισης πολυμορφισμών του γονιδίου του PD-1 με διάφορα αυτοάνοσα νοσήματα. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, εξετάσαμε το ρόλο του PD-1 και των συνδετών του (PD-1 ligands) στην ρύθμιση της λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ), το πρότυπο αυτοάνοσης διαταραχής στον άνθρωπο. Στο ΣΕΛ παρατηρείται υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων που καθοδηγούν την παραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα και προκαλούν ιστική βλάβη σε όργανα-στόχους. Εξετάστηκαν 289 ασθενείς με ΣΕΛ και 256 υγιείς εθελοντές για την παρουσία του PD1.3 (+7146G/A) μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού με τεχνική PCR και χρήση ειδικής νουκλεάσης περιορισμού (PCR-based restriction fragment length polymorphism analysis). Διαπιστώθηκε αυξημένη συχνότητα του πολυμορφικού αλληλίου Α στους ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με τους υγιείς (σχετικός κίνδυνος 2.23, 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1.55-3.38). Ο PD1.3 πολυμορφισμός εντοπίζεται σε μια πιθανή ρυθμιστική περιοχή στο intron 4 του γονιδίου PD-1 και το Α αλλήλιο καταργεί μια θέση πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα RUNX1 με πιθανή επίπτωση στη μεταγραφή του γονιδίου. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε με πειράματα μόλυνσης (transfection) Jurkat T κυττάρων με πλασμιδιακές κατασκευές (constructs) που εκφράζουν το γονίδιο luciferase υπό τον έλεγχο του πολυμορφικού Α ή του άγριου τύπου G αλληλίου. Υπερέκφραση του RUNX1 προκάλεσε έκφραση του γονιδίου luciferase η οποία ήταν σημαντικά αυξημένη παρουσία του G σε σχέση με το πολυμορφικό Α αλλήλιο κατά 36 ± 4%, υποδεικνύοντας πιθανή τροποποίηση της έκφρασης του PD-1 παρουσία του PD1.3A πολυμορφισμού. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής ανέδειξαν μηδαμινή έκφραση του PD- 1 στην επιφάνεια ενεργοποιημένων CD4⁺ CD25+, CD4+ CD69+ και CD4+ HLA-DR⁺ T λεμφοκυττάρων σε 2 ασθενείς ΣΕΛ ομοζυγώτες για το Α αλλήλιο του PD1.3 (Α/Α), σε σχέση με ετεροζυγώτες (G/A) και άγριου τύπου (G/G) ασθενείς. Επιπλέον, οι PD1.3 A/A ασθενείς παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση PD-1 σε CD4⁺ T λεμφοκύτταρα μετά από ενεργοποίηση με χαμηλές –αλλά όχι αυξημένες– συγκεντρώσεις anti-CD3/anti-CD28 αντισωμάτων, και αντιστοίχως μειωμένη δράση του PD-1 ως προς την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της έκκρισης IFN-γ. Για να μελετηθεί περαιτέρω ο ρόλος του PD-1 στις ανοσολογικές αποκρίσεις στο λύκο, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες Τ λεμφοκυττάρων με αυτόλογα μη-Τ κύτταρα τα οποία είχαν ακτινοβοληθεί ώστε να προκληθεί μικρού βαθμού απόπτωση (autologous mixed lymphocyte rections, AMLR). Οι καλλιέργειες αυτές αποτελούν πειραματικό πρότυπο για τη μελέτη της αυτοδραστικότητας έναντι ιδίων αποπτωτικών αντιγόνων, και κινητοποιούν ρυθμιστικούς μηχανισμούς καταστολής της δράσης των Τ λεμφοκυττάρων. Διαπιστώθηκε μειωμένη έκφραση του PD-1 στα CD4⁺ CD25⁺ και CD4⁺ CD69⁺ T κύτταρα των αυτόλογων καλλιεργειών στους ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με τους εθελοντές. Επιπλέον, ασθενείς με τον PD1.3A πολυμορφισμό είχαν σημαντικά μειωμένη έκφραση του PD-1. Αντιθέτως, η έκφραση του PD-L1 στα CD14⁺ μονοκύτταρα/μακροφάγα δε διέφερε μεταξύ ασθενών και εθελοντών. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, αποκλεισμός του PD-1/PD-L1 συστήματος με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα ενίσχυσε τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό στις καλλιέργειες από υγιείς εθελοντές αλλά όχι από ασθενείς με ΣΕΛ. Επειδή το PD-1 συμμετέχει στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο σημείο της φλεγμονής μέσω αλληλεπίδρασης με ενεργοποιημένα παρεγχυματικά κύτταρα που εκφράζουν PD-L1, θελήσαμε να μελετήσουμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση του PD-1/PD-L1 σε βιοψίες νεφρού από ασθενείς με νεφρίτιδα του ΣΕΛ. Διαπιστώθηκε σπειραματική έκφραση του PD-1 σε 8 από τα 13 (62%) δείγματα νεφρίτιδας ΣΕΛ, σε σχέση με κανένα από τα 9 (0%) δείγματα υγιούς νεφρικού ιστού. Η έκφραση του PD-1 συσχετίστηκε με αυτή του Τ κυτταρικού δείκτη CD3. Έκφραση του PD-L1 ανιχνεύθηκε στα νεφρικά σωληνάρια ασθενών (10 από 15, 67%) και υγιών (5 από 9, 56%), υποδεικνύοντας συμμετοχή του PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των φλεγμονωδών Τ κυτταρικών αποκρίσεων σε ιστικό επίπεδο. Παρά την έκφραση του PD-1 στο περιφερικό αίμα και τους προσβεβλημένους ιστούς (νεφροί) των ασθενών, η λειτουργία του ανοσορρυθμιστικού συστήματος PD-1/PD-L1 ενδεχομένως να τροποποιείται στο φλεγμονώδες περιβάλλον του λύκου. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε με καλλιέργειες φυσιολογικών CD4+ T λεμφοκυττάρων παρουσία ορού από υγιείς εθελοντές ή από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ. Η δράση του PD-1 μετά από ενεργοποίηση με την πρωτεΐνη PD-L1.Fc, εκτιμήθηκε μέσω του βαθμού αναστολής του Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε συνθήκες μερικής ενεργοποίησης, διαπιστώθηκε μειωμένη ανασταλτική δράση του PD-1 παρουσία ορού από ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με υγιείς εθελοντές (μείωση πολλαπλασιασμού κατά 6.7 ± 3.6% έναντι 16.3 ± 2.7%). Ωστόσο, ενεργοποίηση του PD-1 με αυξημένες συγκεντρώσεις PD-L1.Fc προκάλεσε σημαντικού βαθμού αναστολή του Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού ακόμα και παρουσία ορού από ΣΕΛ. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του ανασταλτικού συστήματος PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο ΣΕΛ. Τεκμηριώνεται διαταραχή της έκφρασης και λειτουργίας του PD-1 ως συνέπεια «άμεσων» (PD1.3 πολυμορφισμός, καλλιέργειες με αυτόλογα αποπτωτικά κύτταρα) και «έμμεσων» (φλεγμονώδες περιβάλλον) επιδράσεων στο λύκο. Η έκφραση του PD- 1/PD-L1 σε πειραματικά πρότυπα αυτοδραστικότητας και σε προσβεβλημένους ανθρώπινους ιστούς υποδεικνύουν συμμετοχή του ανοσορρυθμιστικού αυτού συστήματος στην Τ ανοσολογική ανοχή με δυνατότητα παρέμβασης για θεραπευτικούς σκοπούς.