Διερεύνηση της συχνότητας παρουσίας και της δυνατότητας επιβίωσης των campylobacter spp. στο κρέας της αίγας και του προβάτου
Authors: Λάζου Θωμαή 
Published: September 2021

Τα βακτήρια του γένους Campylobacter είναι Gram αρνητικοί βάκιλοι με σπειροειδώς κυρτό σχήμα και μέχρι στιγμής ταξινομούνται σε 31 είδη και 11 υποείδη. Τα Campylobacter spp. είναι ευρέως γνωστά ως τροφιμογενή παθογόνα του ανθρώπου και τα θερμόφιλα είδη Campylobacter jejuni (C. jejuni) και C. coli απομονώνονται συχνότερα από περιστατικά ασθενών. Σύμφωνα με τις ετήσιες εκθέσεις της Ευρωπαϊκής Αρχής για την Ασφάλεια των Τροφίμων (European Food Safety Authority, EFSA), η καμπυλοβακτηριδίαση αποτελεί σταθερά την πρώτη σε συχνότητα καταγεγραμμένη ζωανθρωπονόσο στην Ευρωπαϊκή Ένωση από το 2005, ενώ ο αριθμός των επιβεβαιωμένων περιστατικών καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου παρουσιάζει μια στατιστικά σημαντική αυξητική τάση κατά τα τελευταία πέντε χρόνια.Η συχνότητα μόλυνσης των προβάτων και των προϊόντων τους με Campylobacter δεν έχει μελετηθεί τόσο εκτενώς όπως σε άλλα παραγωγικά είδη ζώων, ωστόσο, έχει τεκμηριωθεί η ομοιότητα του γενετικού προφίλ μεταξύ στελεχών καμπυλοβακτηριδίων, τα οποία απομονώθηκαν από κρέας και εδώδιμα σπλάχνα προβάτων και ασθενείς με καμπυλοβακτηριδιακή εντερίτιδα. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τη συχνότητα παρουσίας των ειδών Campylobacter στις αίγες και τα προϊόντα τους είναι εξαιρετικά περιορισμένα, με αποτέλεσμα ο ρόλος του κρέατος και των εδώδιμων σπλάχνων των αιγών στην επιδημιολογία της καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου να παραμένει προς το παρόν αδιευκρίνιστος. Αν και δεν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα για την παρουσία των Campylobacter spp. στα μικρά μηρυκαστικά στην Ελλάδα, το κρέας και τα εδώδιμα σπλάχνα τους αποτελούν βασικά συστατικά παραδοσιακών ελληνικών γευμάτων, ιδιαίτερα κατά την περίοδο του Πάσχα. Κατά συνέπεια, η μόλυνση του κρέατος της αίγας και του προβάτου με Campylobacter θα μπορούσε να αναδειχθεί σε ένα σημαντικό ζήτημα Δημόσιας Υγείας για τη χώρα μας.Η παρούσα μελέτη σχσχεδιάστηκε με στόχο να διερευνηθούν: Η συχνότητα μόλυνσης του κρέατος της αίγας και του προβάτου με Campylobacter spp. Η ευαισθησία των απομονωθέντων στελεχών Campylobacter σε αντιμικροβιακούς παράγοντες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τη Δημόσια Υγεία. Η επιβίωση του Campylobacter σε κρέας αμνού κατά τη διάρκεια συντήρησης σε συνθήκες ψύξης.Το πειραματικό μέρος της διατριβής πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια.Στο πρώτο στάδιο διερευνήθηκε η συχνότητα παρουσίας, ο προσδιορισμός των γενοτυπικών διαφορών και η αντιμικροβιακή ευαισθησία των Campylobacter spp. σε σφάγια αιγών και προβάτων σε επίπεδο σφαγείου:Συνολικά, συλλέχθηκαν 851 δείγματα (343 από επιφάνειες κρέατος, 282 από εντερικά περιεχόμενα, 226 από επιφάνειες ήπατος) σε δύο βιομηχανικά σφαγεία της κεντρικής Μακεδονίας από τον Αύγουστο του 2007 μέχρι το Φεβρουάριο του 2009. Aνιχνεύθηκαν 835 στελέχη (isolates) Campylobacter σε 274 από τα 343 σφάγια που εξετάστηκαν (116 ερίφια, 110 αμνοί, 63 αίγες, και 54 πρόβατα). Τα επιμέρους ποσοστά μόλυνσης ανά κατηγορία ζώου ήταν 78,4% για τα ερίφια, 94,5% για τους αμνούς, 63,5% για τις αίγες, και 72,2% για τα πρόβατα. Κατά μέσο όρο, η παρουσία των καμπυλοβακτηριδίων ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 30,0% των εντερικών περιεχομένων και σε ποσοστό μεγαλύτερο από 70,0% των επιφανειών κρέατος και ήπατος. Η ανάλυση των απομονωθέντων στελεχών με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (multiplex PCR, m-PCR) και της ανάλυσης πολυμορφισμού του μήκους περιοριστικών θραυσμάτων (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) ταυτοποίησε το C. coli ως το συχνότερα απομονωμένο είδος (76,2%) ακολουθούμενο από το C. jejuni (21,4%) ενώ στο 2,4% των εξετασθέντων τυπικών αποικιών επιβεβαιώθηκε η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο ειδών. Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης σε παλλόμενο πεδίο (Pulsed Field GelElectrophoresis, PFGE) εφαρμόστηκε σε μια ομάδα των απομονωθέντων Campylobacter για τη γενετική τους τυποποίηση. Η μέθοδος SmaI-PFGE ομαδοποίησε επιτυχώς 222 στελέχη σε 82 παλσοτύπους υποδηλώνοντας μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των στελεχών. Πολλαπλοί παλσότυποι ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα στην επιφάνεια ενός σφαγίου στην πλειοψηφία των ζώων που εξετάστηκαν. Η PFGE παρείχε πληροφορίες σχετικά με τις πιθανές οδούς μόλυνσης των σφαγίων. Το προφίλ της αντιμικροβιακής ευαισθησίας των απομονωθέντων Campylobacter (n=240), όπως προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της διάχυσης με δίσκους, υποδήλωσε αντοχή στην τετρακυκλίνη (47,9%), τη στρεπτομυκίνη (22,9%) και τη σιπροφλοξακίνη μαζί με το ναλιδιξικό οξύ (18,3%). Παρατηρήθηκε χαμηλή αντοχή των εξετασθέτων στελεχών στην ερυθρομυκίνη (2,5%) και καθολική ευαισθησία στη γενταμικίνη.Στο δεύτερο στάδιο διερευνήθηκε η συχνότητα παρουσίας, ο προσδιορισμός των γενοτυπικών διαφορών και η αντιμικροβιακή ευαισθησία των Campylobacter spp. σε σφάγια εριφίων και αμνών σε επίπεδο λιανικής πώλησης κρέατος:Συνολικά, 200 δείγματα αποτελούμενα από 100 επιφάνειες κρέατος και 100 επιφάνειες ήπατος συλλέχθηκαν από 53 σφάγια εριφίων και 47 σφάγια αμνών σε 23 σημεία λιανικής πώλησης κρέατος στην ευρύτερη περιοχή της Θεσσαλονίκης κατά την περίοδο της Μεγάλης Εβδομάδας του 2009 και 2010 και απομονώθηκαν 125 στελέχη (isolates) Campylobacter από 36 επιφάνειες κρέατος (36,0%) και 44 επιφάνειες ήπατος (44,0%). Με τις μεθόδους m-PCR και RFLP ταυτοποιήθηκε το C. coli ως το συχνότερα απομονωμένο είδος (59,2%) ακολουθούμενο από το C. jejuni (40,8%). Η μέθοδος PFGE εφαρμόστηκε για τη γενοτυπική ανάλυση μιας ομάδας (n=80) απομονωθέντων στελεχών (isolates). H μέθοδος SmaI-PFGE ομαδοποίησε επιτυχώς τα 80 στελέχη σε 38 SmaI-PFGE γενοτύπους, υποδηλώνοντας μεγάλη ετερογένεια ανάμεσα στα στελέχη που εξετάστηκαν, και παρείχε πληροφορίες σχετικά με τη διασπορά του Campylobacter μεταξύ των σφαγίων που συντηρούνταν στο ίδιο κατάστημα λιανικής πώλησης κρέατος. Το προφίλ της αντιμικροβιακής ευαισθησίας των απομονωθέντων Campylobacter, όπως προσδιορίστηκε από τη μέθοδο της διάχυσης με δίσκους, υποδήλωσε ότι 31 στελέχη (24,8%) παρουσίασαν πολυαντοχή, και ότι συχνότερα παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αντοχή στην τετρακυκλίνη και τη στρεπτομυκίνη. Συνολικά, ποσοστό 56,8% των στελεχών (n=71) εμφάνισε αντοχή σε μία τουλάχιστον αντιμικροβιακή ουσία (τετρακυκλίνη 34,4%, κινολόνες 27,2%, και στρεπτομυκίνη 20,8%). Ωστόσο, όλα τα στελέχη Campylobacter που εξετάστηκαν ήταν ευαίσθητα στην ερυθρομυκίνη και τη γενταμικίνη.Στο τρίτο στάδιο διερευνήθηκε η ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων (καλλιεργήσιμων και βιώσιμων αλλά μη καλλιεργήσιμων-VBNC) του C. coli σε κρέας αμνού σε συνθήκες ψύξης:Κατά τη διάρκεια του πειραματισμού έγινε τεχνητός ενοφθαλμισμός τεμαχίων κρέατος αμνού με γνωστό πληθυσμό C. coli στην εκθετική φάση της ανάπτυξης και ποσοτικός προσδιορισμός των βιώσιμων καμπυλοβακτηριδίων κατά τη συντήρηση του κρέατος σε συνθήκες ψύξης (4°C) για μια εβδομάδα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των βιώσιμων κυττάρων του C. coli πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της κλασικής καλλιέργειας σε δύο στερεά υποστρώματα (modified charcoal cefoperazone desoxycholate agar, mCCDA, και Columbia Blood Agar, CBA) και με μια βελτιστοποιημένη μοριακή δοκιμή ποσοτικού προσδιορισμού και διαχωρισμού των βιώσιμων από τα νεκρά καμπυλοβακτηρίδια (viable-PCR, v-PCR) που αναπτύχθηκε με βάση την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (quantitative real-time PCR, q-PCR) σε συνδυασμό με το μονοαζίδιο του προπιδίου (propidium monoazide, ΡΜΑ). Ο πειραματισμός επαναλήφθηκε τρεις φορές σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα και σε κάθε ημερήσιο έλεγχο του πληθυσμού του C. coli εξετάζονταν τρία ξεχωριστά τεμάχια κρέατος. Κατά τη συντήρηση του τεχνητά ενοφθαλμισμένου κρέατος αμνού σε συνθήκες ψύξης, παρατηρήθηκε μείωση του πληθυσμού των βιώσιμων C. coli κατά τη διάρκεια των τριών πειραματισμών σύμφωνα με όλες τις μεθόδους καταμέτρησης. Ωστόσο, ο βαθμός μείωσης της συγκέντρωσης των βιώσιμων C. coli διέφερε ανάλογα με τη μέθοδο. Κατά μέσο όρο στους τρεις πειραματισμούς, ο πληθυσμός των καμπυλοβακτηριδίων μειώθηκε στο διάστημα των επτά ημερών συντήρησης κατά 0,44 ± 0,03, 0,76 ± 0,06, και 2,89 ± 1,72 λογαρίθμους ανά τεμάχιο κρέατος (επιφάνεια 25 cm2) σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη μοριακή μέθοδο, την καλλιέργεια σε CBA και την καλλιέργεια σε mCCDA, αντίστοιχα. Επιπλέον, ο ημερήσιος μέσος ρυθμός πτώσης του πληθυσμού των βιώσιμων καμπυλοβακτηριδίων κατά τη διάρκεια της συντήρησης του κρέατος προσδιορίστηκε σε 0,06 ± 0,005, 0,11 ± 0,009, και 0,41 ± 0,245 λογαρίθμους βακτηριακών κυττάρων ανά τεμάχιο κρέατος (επιφάνεια 25 cm2) σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη μοριακή μέθοδο, την καλλιέργεια σε CBA και την καλλιέργεια σε mCCDA, αντίστοιχα.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης: Επιβεβαιώθηκε η μόλυνση των σφαγίων αιγών και προβάτων μετά τη σφαγή με ετερογενείς πληθυσμούς θερμόφιλων καμπυλοβακτηριδίων και η ενδεχόμενη συμβολή τους στην επιδημιολογία της καμπυλοβακτηριδίασης του ανθρώπου. Επιβεβαιώθηκε η μόλυνση των σφαγίων των μικρών μηρυκαστικών σε επίπεδο λιανικής πώλησης με ετερογενείς πληθυσμούς θερμόφιλων καμπυλοβακτηριδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι το κρέας και το ήπαρ των εριφίων και των αμνών που πωλούνται στα κρεοπωλεία μπορούν να αποτελέσουν μέσα για τη μόλυνση του καταναλωτή με Campylobacter. Η καθολική (100,0%) ευαισθησία στη γενταμικίνη καθώς και τα χαμηλά επίπεδα αντοχής στην ερυθρομυκίνη και της ταυτόχρονης αντοχής σε περισσότερες από δύο κατηγορίες αντιμικροβιακών ουσιών που παρουσίασαν τα απομονωθέντα Campylobacter αποτελούν θετικά ευρήματα για τη Δημόσια Υγεία. Τα σχετικά υψηλά επίπεδα αντοχής που εμφάνισαν τα απομονωθέντα Campylobacter στους αντιμικροβιακούς παράγοντες τετρακυκλίνη, στρεπτομυκίνη και κινολόνες, αποτελούν ενδείξεις της διαδεδομένης χρήσης των αντίστοιχων κτηνιατρικών σκευασμάτων σε επίπεδο εκτροφής μικρών μηρυκαστικών στη χώρα μας. Το βελτιστοποιημένο μοριακό πρωτόκολλο v-PCR με PMA, που αναπτύχθηκε κατά την παρούσα έρευνα, προσδιορίζει ποσοτικά τα βιώσιμα (καλλιεργήσιμα και VBNC) κύτταρα του Campylobacter σε σύντομο χρόνο (≈ 8 ώρες) παρουσιάζοντας μεγάλη ειδικότητα ανίχνευσης και μεγάλο εύρος ποσοτικού προσδιορισμού (2,6 x 102 – 5,2 x 108 κύτταρα/ml). Επιβεβαιώθηκε η επιβίωση του C. coli σε κρέας αμνού συντηρημένου σε συνθήκες ψύξης. Η μικρή μεταβολή του πληθυσμού των βιώσιμων βακτηρίων μέχρι και τη χρονική στιγμή της σήψης του κρέατος, που το καθιστά ακατάλληλο για κατανάλωση, επιβεβαίωσε την πιθανότητα διασποράς λοιμογόνων κυττάρων Campylobacter κατά τη συντήρηση του κρέατος στο οικιακό περιβάλλον μέσω της διασταυρούμενης μόλυνσης και τον συνεπαγόμενο κίνδυνο μόλυνσης του καταναλωτή.