Τεχνικές ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων σε καρκινώματα παχέος εντέρου
Authors: Μουρτζίκου Αντωνία 
Published: September 2021

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTCs) είναι κύτταρα που έχουν διαφύγει από τον πρωτοπαθή όγκο και έχουν εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος. Οι μεταστάσεις είναι η κύρια αιτία θανάτου των ασθενών με συμπαγείς επιθηλιακούς κακοήθεις όγκους, που είναι ανθεκτικές στις συμβατικές θεραπείες (π.χ. Ca μαστού, παχέος εντέρου, προστάτου). Η αιματογενής διασπορά των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο είναι το καθοριστικό βήμα για τη δημιουργία μεταστάσεων και επιδρά σημαντικά στην πρόγνωση των ασθενών. Τα καρκινικά κύτταρα μεθίστανται και εγκαθίστανται σε διάφορα όργανα κάνοντας αδύνατη την εξάλειψη της νόσου με το χειρουργείο, τις ακτινοβολίες, τη χημειοθεραπεία ή τις βιολογικές θεραπείες. Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων θεωρείται ότι συμβάλλει στην πρώιμη διάγνωση, στην παρακολούθηση των ασθενών, ειδικά στους ασθενείς με μετάσταση, στην ανταπόκριση στις θεραπείες, αλλά και στην επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού σχήματος και την εξατομικευμένη θεραπεία. Οι τεχνικές ανίχνευσης των CTCs μπορούν να διαχωριστούν αδρά σε κυτταρομετρικές που εξετάζουν το κύτταρο σαν ολότητα και στην κατηγορία αυτή ανήκουν η ανοσοϊστοχημεία, η κυτταρομετρία σάρωσης με laser, το σύστημα CellSearch και η κυτταρομετρία ροής και σε μοριακές τεχνικές οι οποίες βασίζονται στην ανίχνευση νουκλεϊνικών οξέων με την RT-PCR.Με δεδομένο ότι τα CTCs αποτελούν σπάνια συμβάντα (1 καρκινικό κύτταρο σε 106-107 λευκοκύτταρα) καθίσταται αναγκαίο ένα στάδιο διαχωρισμού από τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος, που προηγείται της ανίχνευσης. Ο διαχωρισμός των κυττάρων μπορεί να γίνει α) βάσει των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών τους, όπως πχ. το μέγεθος και την πυκνότητα του κυττάρου χρησιμοποιώντας τη βαθμίδωση πυκνότητας (ficoll gradient) ή φίλτρα και β) με τη χρήση ειδικών δεικτών για τα καρκινικά κύτταρα (ανοσοαπομόνωση) χρησιμοποιώντας ανοσομαγνητικά σφαιρίδια. Επιπλέον, η επιλογή των κυττάρων μπορεί να είναι αρνητική (μειώνοντας τα λευκοκύτταρα) οπότε χρησιμοποιείται το CD45, θετική με τη χρήση αντισωμάτων για κάποιο αντιγόνο κοινό για πολλαπλών τύπων καρκινικά κύτταρα (EpCAM) ή ειδικό για ένα συγκεκριμένο είδος όγκου.Οι μοριακές τεχνικές αποτελούν το gold standard στην ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων καθώς χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Λίγες έως τώρα μελέτες έχουν γίνει με κυτταρομετρία ροής (ΚΡ), όμως αυτό που χαρακτηρίζει την ΚΡ είναι ότι πλεονεκτεί σε ταχύτητα και απλότητα.Σκοπός της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η συγκριτική μελέτη μεθόδων ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκινώματα παχέος εντέρου, η συσχέτιση τους ως προς την ευαισθησία και ειδικότητα τους, το όριο ανίχνευσης (traceability) τους και τέλος η συμβολή μας στις προτεινόμενες βιβλιογραφικά πολυκεντρικές μελέτες για τον καθορισμό cutoff values και την επιλογή των κατάλληλων “Tumor specific” δεικτών, από την πληθώρα των επί του παρόντος χρησιμοποιούμενων.Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 84 δείγματα από λήψεις περιφερικού αίματος ασθενών κατά τις φάσεις: 1) προ χειρουργείου και πριν την εφαρμογή αναισθησίας, και 2) την επόμενη της χειρουργικής επέμβασης, ενώ την ομάδα ελέγχου απετέλεσαν 16 ασθενείς χωρίς ένδειξη για ύπαρξη καρκινώματος παχέος εντέρου.Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μοριακές τεχνικές (PCR, Nested PCR και RT-PCR) καθώς και κυτταρομετρία ροής (ΚΡ).Η μελέτη εκπονήθηκε στο Πανεπιστημιακό Γ.Ν «ΑΤΤΙΚΟΝ», στο Εργαστήριο Διαγνωστικής Κυττταρολογίας, σε συνεργασία με την Δ’ Πανεπιστημιακή Χειρουργική Κλινική. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου «ΑΤΤΙΚΟΝ», από όπου και έχει παρθεί η σχετική έγκριση.Η στατιστική ανάλυση και επεξεργασία των δεδομένων έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS statistics for Windows Version: 20.0. Για ανεξάρτητα δείγματα έγινε ο στατιστικός έλεγχος t-test που αφορούσε την σύγκριση της μέσης τιμής συνεχών παραμέτρων (ηλικία, αριθμός κυττάρων) στις κατηγορίες ασθενών-υγιών μαρτύρων (ποιοτικές μεταβλητές) και για κατηγορικές μεταβλητές το Fisher’s exact test. Για την συσχέτιση δύο μεταβλητών εφαρμόστηκε ο στατιστικός έλεγχος Spearman correlation (rho). Στατιστικά σημαντικές θεωρήθηκαν διαφορές με p<0.05.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη συνοψίζονται ως εξής:Μοριακές τεχνικέςΣτατιστικά σημαντική αύξηση στα παθολογικά δείγματα αναγνωρίστηκε μόνο με την ανίχνευση των CK19 μεταγράφων (p=0.024) με την nested μέθοδο, με ασθενή συσχέτιση με το στάδιο του όγκου (Grade, p=0.012). Μεγαλύτερη ευαισθησία (SN) παρουσίασε η CK19 nested (67.6%) με ειδικότητα (SP) 66.2%. Για τις CK20 και την απλή PCR για την CK19 τα ποσοστά ήταν αρκετά χαμηλότερα (SN: 2.9%, 30.9%, SP: 100%, 75%).H ανίχνευση EGFR nested παρουσίασε SN: 22.1%, SP: 71.2%.Κυτταρομετρία ροής (ΚΡ)Οι σημαντικότερες συσχετίσεις που αναγνωρίστηκαν ήταν για την έκφραση CK με τα καρκινώματα (0.256, p=0.044), με ύπαρξη διήθησης λεμφαδένων (0.380 p=0.008) και το στάδιο της νόσου (0.391, p=0.003). Για το άμεσο πρωτόκολλο βρέθηκε σημαντική συσχέτιση με τα δείγματα από το δεξί κόλον (0.369, p=0.002) και με την θετικότητα για nested CK19 (0.241, p=0.042).H ανίχνευση με το άμεσο πρωτόκολλο παρουσίασε με όριο τα 3 κύτταρα/mL (cut off value) SN: 49.2% με SP: 58.3%, ενώ το ένδοκυττάριο με όριο τo 1 κύτταρο/mL (cut off value) SN: 62.7% με SP: 70%.Συμπερασματικά η σύγκριση μεταξύ των δύο τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μοριακών (PCR, Nested PCR και RT-PCR) και κυτταρομετρίας ροής (ΚΡ), κατέδειξε τη δυναμική υπεροχή της κυτταρομετρίας ροής, χωρίς ωστόσο να μειώνεται η αξία των μοριακών τεχνικών και ειδικότερα η εισαγωγή και χρήση πλέον σήμερα στα σύγχρονα εργαστήρια της ποσοτικής PCR (qPCR) και της πραγματικού χρόνου ποσοτικής PCR [Real‐Time Quantitative PCR (qPCR].Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν επιπρόσθετο προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη της νόσου σε νεοδιαγνωσθέντες με καρκίνο ασθενείς και χαρακτηρίζονται ως «πραγματικού χρόνου υγρή βιοψία» (“real-time liquid biopsy”).