Λειτουργική αξιολόγηση γνωστών παραλλαγών αγνώστου κλινικής σημασίας κια χαρακτηρισμός νέων μεταλλάξεων σε γονίδια που εμπλέκονται στον κληρονομικό καρκίνο μαστού - ωοθηκών
Authors: Δελημήτσου Αγγελική 
Published: September 2021

Στον ανθρώπινο οργανισμό, η κυτταρική απόκριση σε περίπτωση βλάβης στο DNA, συνίσταται σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου στα σημεία ελέγχου του και ενεργοποίηση των επιδιορθωτικών μηχανισμών του κυττάρου. Ενδεχόμενη αδυναμία επιδιόρθωσης αυτής οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση ή καρκινογένεση.Η κυτταρική απόκριση ρυθμίζεται από ένα δίκτυο μονοπατιών σηματοδότησης, με τη συμμετοχή πλήθους μορίων, μεταξύ των οποίων κρίσιμο ρόλο έχουν τα μόρια CHK2, NEK1, BRCA1 και BRCA2, τα οποία μελετήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή.Η πρωτεΐνη CHK2 είναι μια φυλογενετικά συντηρημένη κινάση σερίνης-θρεονίνης, η οποία μέσω φωσφορυλίωσης ποικίλων υποστρωμάτων, συμβάλλει στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, στην ενεργοποίηση επιδιορθωτικών μηχανισμών και στην απόπτωση. Η πρωτεΐνη ΝΕΚ1 παρουσιάζει διπλή δράση κινάσης, σερίνης-θρεονίνης και τυροσίνης, και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση, συμβάλλοντας μεταξύ άλλων στην ενεργοποίηση των κινασών CHK1 και CHK2, στη σωστή λειτουργία του μονοπατιού της ATR, καθώς και στη διατήρηση της χρωμοσωμικής σταθερότητας. Από την άλλη, τα μόρια BRCA1 και BRCA2 συμμετέχουν στο μηχανισμό επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, o οποίος αποτελεί τον κυριότερο και πιο αλάθητο μηχανισμό επιδιόρθωσης των θραύσεων της διπλής έλικας του DNA, μετά τη φάση S. Το BRCA1 κατέχει εξέχοντα ρόλο στο μηχανισμό αυτό, αφού συμμετέχει στη δημιουργία τουλάχιστον τεσσάρων λειτουργικά διαφορετικών συμπλόκων. Παράλληλα, συμμετέχει και στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, μέσω του μονοπατιού ATR-CHK1 και της αλληλεπίδρασης με τον μεταγραφικό παράγοντα p53, ενώ υπάρχουν ενδείξεις συμμετοχής του και σε άλλους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς.Η σπουδαιότητα των παραπάνω μορίων αναδεικνύεται με την επίδραση γενετικών αλλαγών στα γονίδια αυτών στο φαινότυπο των ατόμων που τις φέρουν.Μεταλλάξεις στο γονίδιο CHEK2 έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση κακοήθειας, κυρίως μαστού, αλλά και παχέος εντέρου, προστάτη, στομάχου και θυρεοειδούς. Η χρήση νέων μοριακών μεθόδων μαζικής παράλληλης αλληλούχησης στο γενετικό έλεγχο των ασθενών με καρκίνο, αποκάλυψε πληθώρα ευρημάτων στο γονίδιο αυτό, την πλειονότητα των οποίων συνιστούν παραλλαγές αγνώστου κλινικής σημασίας. Η ανάγκη κλινικής διαχείρισης των ασθενών που τις φέρουν, σε συνδυασμό με την απουσία τους από επιδημιολογικές μελέτες, ώθησε τη διατριβή αυτή στην ανάπτυξη μιας λειτουργικής δοκιμασίας για την αξιολόγησή τους, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο το σύστημα του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae.Με τη λειτουργική δοκιμασία αναλύθηκαν 122 παραλλαγές του γονιδίου CHEK2: 120 παρανοηματικές παραλλαγές και 2 μεγάλες γονιδιακές αναδιατάξεις που δεν τροποποιούν το πλαίσιο ανάγνωσης. Σύγκριση του ρυθμού ανάπτυξης των στελεχών που τις φέρουν με θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, έδειξε ότι 32 παρανοηματικές παραλλαγές και οι 2 γονιδιακές αναδιατάξεις συμπεριφέρθηκαν ως μη-λειτουργικές (παθογόνοι), 73 ως λειτουργικές (μη-επιβλαβείς) και 15 ως περιορισμένης λειτουργικότητας (ενδιάμεσης λειτουργικότητας). Η πλειονότητα των παθογόνων παραλλαγών εντοπίστηκε στην περιοχή κινάσης και στην περιοχή FHA της CHK2. Παράλληλα, ανάλυση με υπολογιστικά εργαλεία και σύγκριση των αποτελεσμάτων με εκείνα της λειτουργικής δοκιμασίας, αποκάλυψε συμφωνία για την πλειονότητα των παραλλαγών που συμπεριφέρθηκαν ως παθογόνοι. Επίσης, ο χαρακτηρισμός σχετίζεται με ισχυρό οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού, για τις παθογόνους παραλλαγές για τις οποίες υπήρχαν τα αντίστοιχα δεδομένα. Σύγκριση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης με δεδομένα άλλων λειτουργικών δοκιμασιών αποκάλυψε συμφωνία για 9 από 18 παραλλαγές που εξετάστηκαν, ενώ για ορισμένες παραλλαγές χρησιμοποιήθηκε και δομικό μοντέλο για την πρόβλεψη επίπτωσης στη δομή και λειτουργία της παραγόμενης πρωτεΐνης. Η μελέτη αυτή, η οποία αποτελεί παγκοσμίως τη μεγαλύτερη, μέχρι σήμερα, ανάλυση παραλλαγών του γονιδίου CHEK2, δύναται να συμβάλλει στην τελική κατηγοριοποίηση σπάνιων παραλλαγών του CHEK2 με ασαφή κλινική σημασία.Από την άλλη, μεταλλάξεις στο γονίδιο ΝΕΚ1 έχουν συσχετιστεί με την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση και το σύνδρομο βραχέας πλευράς-πολυδακτυλίας τύπου II. Η εύρεση δύο παραλλαγών στα εξόνια 20 και 26 του γονιδίου αυτού στο γενετικό υλικό ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος, που παρουσιάστηκε σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη, οδήγησε, στο πλαίσιο της διατριβής αυτής, σε ανάλυση 181 δειγμάτων DNA από περιφερικό αίμα ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος για γαμετικές μεταλλάξεις στα εξόνια 20, 21, 22, 25 και 26 του γονιδίου ΝΕΚ1.Κατά την ανάλυση, εντοπίστηκαν τρεις παρανοηματικές παραλλαγές του γονιδίου, οι p.ΑΙa626Thr, p.Αsn745Lys και p.Glu752Gly, σε ποσοστά 11,6%, 1,1% και 19,9%, αντίστοιχα. Παρόλο που η πλειονότητα των in silico εργαλείων με τα οποία αυτές αναλύθηκαν προτείνει την παθογονικότητα των συγκεκριμένων παραλλαγών, στοιχεία που συλλέχθηκαν από διεθνείς βάσεις δεδομένων αντιβαίνουν σε αυτόν το χαρακτηρισμό. Επομένως, από την παρούσα μελέτη, δεν αποδείχθηκε συσχετισμός των παραλλαγών του γονιδίου NEK1 με την εμφάνιση καρκίνου του παγκρέατος.Όσον αφορά τα γονίδια BRCA1 και BRCA2, παθογόνοι παραλλαγές στη γαμετική σειρά στα γονίδια αυτά έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση καρκίνου μαστού και ωοθηκών, αλλά και παγκρέατος, προστάτη, στομάχου και παχέος εντέρου. Η συμμετοχή των μορίων αυτών στο μηχανισμό επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, αποτέλεσε τη βάση για την ανάπτυξη μιας στοχευμένης θεραπείας που επιτελείται από τους αναστολείς της PARP, κατά την οποία η ανεπάρκεια των επιδιορθωτικών μηχανισμών μονής και διπλής αλύσου αποδεικνύεται καθοριστική, έχοντας ως συνέπεια τη «συνθετική θνησιμότητα» των καρκινικών κυττάρων.Λόγω της αναφερόμενης, στην πρόσφατη βιβλιογραφία, υψηλής συχνότητας εντοπισμού μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά σε δείγματα ιστών από καρκινώματα ωοθηκών επιθηλιακού τύπου, και κυρίως σε ορώδη καρκινώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας, αναλύθηκαν 133 δείγματα ασθενών με καρκίνο ωοθηκών επιθηλιακού τύπου, για σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2, χρησιμοποιώντας DNA από ιστούς εγκλεισμένους σε παραφίνη. Από την ανάλυση προέκυψαν 15 δείγματα θετικά για παθογόνους παραλλαγές στο γονίδιο BRCA1 και 2 στο BRCA2 (συνολικά και για τα δύο γονίδια ποσοστό 12,8%), με πιο συχνή την παραλλαγή p.Val1833Met, η οποία ανιχνεύθηκε σε 5 δείγματα. Οι ασθενείς που φέρουν τις εν λόγω σωματικές μεταλλάξεις έχουν ήδη ενταχθεί σε θεραπευτικά πρωτόκολλα με αναστολείς της PARP.