Production of carbohydrates and polyhydrohybutyrate by cyanobacteria grown in wastewater
Authors:   , Arias Lizarraga Dulce María 
Published: July 2023

Cyanobacteria are prokaryotic aerobic photosynthetic microorganisms with the capacity to remove nutrients from wastewater and synthesize a large variety of bioactive compounds and valuable byproducts. Among those valuable byproducts, glycogen (carbohydrates) and polyhydroxybutyrates (PHB) are receiving increasing interest due to their potential as biofuel substrate and as bioplastic, respectively.
The main objective in this PhD thesis was to cultivate and select cyanobacteria from a mixed microalgae culture for carbohydrates and PHB production. In order to fulfil that main goal, the thesis was divided in two parts. The first consisted in evaluating the effect of nutritional and operational conditions on the selection and grow of wastewater-borne cyanobacteria in a mixed microalgae consortium fed with in secondary effluent and digestate. While the second was focused in the accumulation of carbohydrates and PHB throughout different strategies based on nutrients and carbon limitation.
In the first part, digestate diluted with secondary effluent wastewater was used to select a culture dominated by cyanobacteria from an initial mixed microalgae consortium in pilot scale (30 L) and lab scale (3L) closed-photobioreactors (PBRs). Through several essays, the PBRs were operated at different nutrients loadings (paying attention on N and P ratios and concentrations) and hydraulic regimes (i.e. continuous, semi-continuous and sequencing batch) in order to find conditions appropriated for cyanobacteria dominance over other wastewater-borne microorganisms (mainly with green microalgae).
During approximately one year of operation, the effect of nutrient variations in the influent and their ratios on the culture composition and biomass concentration was evaluated in a semi-continuous PBR operated at 10 days of HRT/SRT. The results evidenced that cyanobacteria species dominated over green algae when the influent had non-limited carbon conditions, N:P ratios between 16:1-49:1 (molar basis) and low phosphorus loads. Under these conditions, cyanobacteria were able to reach an average biomass production of 0.08 g L-1 d-1. Subsequently, short term studies testing operational strategies were performed in order to remove green algae also tolerating phosphorus limiting conditions. These strategies consisted on sequencing batch operation. According to the results, a sequencing batch operation consisting in a HRT of 6 days and SRT of 10 days provided suitable conditions to remove unsettled green algae Scenedesmus sp. and to improve
cyanobacteria dominance until reach 70% of the total population. While increasing the biomass production to 0.12 g L-1 d-1. On the contrary, lower HRT and SRT led to high volumetric loads that promoted the presence of other microorganisms (diatoms and protozoa) and bacterial activity.
In the second part, the cyanobacteria dominated culture previously obtained was submitted to different strategies to accumulate polymers. Among these, nutritional conditions (N and P limitation) and luminic (permanent light and light/dark alternation) were found to be a promising strategies to reach PHB content up to 6.5% and carbohydrates content of 75% in N limitation under light/dark alternation in batch test performed along two weeks. Subsequently, this time needed of accumulation was reduced through the adaptation of cyanobacteria to feast and famine regimes. Consisting in the submission of the biomass to a period of carbon availability and a subsequent absence of carbon. With the application of this procedure the culture was able to reach similar PHB and carbohydrates concentrations in less than 2 days. In addition, these results indicated that carbon uptake and the consequent polymers production from cyanobacteria can be enhanced through carbon and nutrient feeding strategies.

Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos aeróbicos procarióticos con la capacidad de eliminar nutrientes de las aguas residuales y sintetizar una gran variedad de compuestos bioactivos y subproductos valiosos. Entre esos subproductos, el glucógeno (carbohidratos) y el polihidroxibutirato (PHB) están recibiendo creciente interés debido a su potencial como sustrato de biocombustible y como bioplástico, respectivamente. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue cultivar y seleccionar cianobacterias de un cultivo mixto de microalgas para la producción de carbohidratos y de PHB. Para cumplir ese objetivo principal, la tesis se dividió en dos partes. La primera consistió en evaluar el efecto de las condiciones nutricionales y operativas en la selección y crecimiento de cianobacterias nativas de aguas residuales. Mientras que la segunda parte se centró en la acumulación de carbohidratos y PHB através de diferentes estrategias basadas en limitación de nutrientes y de carbono. En la primera parte, se consideró el efecto de las condiciones nutricionales y operativas en la selección y el crecimiento de cianobacterias nativas de aguas residuales cultivadas en aguas residuales secundarias y en digestato. En estaparte, las cianobacterias se seleccionaron de un consorcio inicial mixto de microalgas que trataban aguas residuales. En primer lugar, se evaluaron los efectos de los nutrientes (e.g., concentraciones, ratios y cargas) en un estudio a largo plazo realizado en un fotobiorreactor (FBR) a escala piloto (30L) operado en modo semicontinuo. Los resultados de esta sección evidenciaron que las especies de cianobacterias nativas en aguas residuales Aphanocapsa sp., Chrooccocus sp. y Pseudanabaena sp. fueron capaces de dominar sobre las algas verdes Chlorella sp. y Stigeoclonium sp. en un FBR piloto semicontinuo. Su dominio se logró bajo condiciones de carbono no limitado, relaciones N:P entre 16:1-49:1 (basemolar) y bajas cargas de fósforo inorgánico (IP) (~0.25 mgLd-1). Bajo estas condiciones, un cultivo dominado por cianobacterias fue capaz de alcanzar un promedio de producción de biomasa de 0.08 gL-1d-1. Por último, se llevaron a cabo estudio sacorto plazo en FBRs a escala de laboratorio (3L) para evaluar el efecto de las condiciones operacionales (e.g., regímenes hidráulicos, tiempo de retención de sólidos (TRS), tiempo de retención hidráulica (TRH)). Los resultados indicaron que el un TRH de 6 días y un SRT de 10 días proporcionaron condiciones adecuadas para eliminar las algas verdes suspendidas, tolerantes a bajos niveles de IP (e.g., Scenedesmussp.), y mejorar la concentración de cianobacterias de 2% hasta 70% de la población total, mientras que aumenta la producción de biomasa a 0.12 gL-1d-1. Por el contrario, la reducción de TRH y TRS afectó negativamente a la dominancia de las cianobacterias, favoreciendo el dominio de las algas verdes y una mayor actividad bacteriana. En la segunda parte, el cultivo dominado por cianobacterias obtenido previamente fue sometido a diferentes estrategias para acumular polímeros. Entre estas, las condiciones nutricionales (limitación de nitrogeno (N) y fósforo (P)) y lumínicas (luz permanente y alternancia de luz/oscuridad) se encontraron como estrategias prometedoras para alcanzar un contenido de PHB de hasta el 6,5% y un contenido de carbohidratos del 75% en condiciones de limitación de N y alternancia de luz/oscuridad, en doce días de incubación. Posteriormente, este tiempo necesario de la acumulación se redujo mediante la adaptación de las cianobacterias a regímenes de festín y hambre. Esta estrategia consiste en la alternancia de períodos con disponibilidad de carbono y una posterior ausencia de carbono durante el cultivo. Con la aplicación de esta estrategia, el cultivo acumuló similares cantidades en solo 24h de incubación bajo condiciones aeróbicas iluminadas.