Μελέτη της έκφρασης βιοδεικτών των καρκινικών βλαστοκυττάρων σε λευκοπλακία-δυσπλασία και καρκίνωμα από πλακώδη κύτταρα του βλεννογόνου του στόματος
Authors: Ζήσης Βασίλειος 
Published: February 2024

Εισαγωγή: Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα (CSCs) είναι υπεύθυνα για την εκκίνηση της διαδικασίας της καρκινογένεσης η οποία προϋποθέτει την αυτοανανέωση και τον αυτοπολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Η έγκαιρη ανίχνευση των CSCs στους ιστούς και το περιφερικό αίμα έχει σκοπό να προβλεφθεί η βιολογική και κλινική του συμπεριφορά και να αποφευχθεί η τοπική επέκταση-διήθηση, η μετάσταση και υποτροπή του καρκίνου. Η εύρεση δεικτών ειδικών για τα CSCs αποτελεί μια πρόκληση καθώς προυποθέτει την εντόπιση και ταυτοποίηση μοριακών στόχων οι οποίοι θα εκφράζονται σχεδόν αποκλειστικά στα CSCs. Σκοπός της μελέτης μας είναι η ανίχνευση των ειδικών δεικτών OCT3-4, SOX 2 και CD147 με χρήση ανοσοϊστοχημείας και qPCR σε δείγματα, που είναι σκηνωμένα σε παραφίνη. Μέθοδοι & Υλικά: Η μελέτη αφορά την σχετική έκφραση των γονιδίων των CD147 (Custom CD147 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) , SOX-2 (Qiagen QuantiTect Primer Assay (200) Hs_QSOX2_1_SG QuantiTect Primer Assay, Qiagen, Hilden, Germany) και OCT3/4 (Custom OCT3/4 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) μέσω της μεθόδου qPCR (Ποσοτική PCR) και μέσω του συστήματος της Qiagen σε ιστοτεμαχία από 12 περιστατικά λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας και 19 καρκίνου του πλακώδους επιθηλίου του στόματος χαμηλής και μέτριας διαφοροποίησης. Η μέση τιμή έκφρασης των υπό διερεύνηση γονιδίων ομαλοποιήθηκε μέσω της σύγκρισης με τη μέση έκφραση της β ακτίνης. Ειδικότερα, υπολογίσθηκε ο ΔCt (ο Ctmean των OCT3/4, SOX-2 και CD147 μείον τον Ctmean της β ακτίνης). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού SPSS17 και το Independent Paired T-test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο p<0.05. Οι βιοδείκτες οι οποίοι μελετήθηκαν είναι οι CD147 (sc-21746, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), SOX-2 (sc-365823, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) και OCT3/4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) των οποίων η ανοσοϊστοχημική χρώση επετεύχθη μέσω του συστήματος Dako Envision. Τα δείγματα κατηγοριοποιήθηκαν ως εξής: 21 περιστατικά καρκίνου εκ του πλακώδους επιθηλίου του στόματος με 2 διαβαθμίσεις βαθμού διαφοροποίησης, 30 περιστατικά δυνητικά κακοηθών βλαβών (Λευκοπλακία) με 2 διαβαθμίσεις δυσπλασίας και 5 περιστατικά της ομάδας ελέγχου με ιστολογικά υγιές επιθήλιο. Τα περιστατικά αξιολογούνται μέσω μιας κλίμακας 1-3 η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι: 1: Παρουσία θετικών κυττάρων στο ένα τρίτο του επιθηλίου, 2: Παρουσία θετικών κυττάρων στα δύο τρίτα του επιθηλίου, 3: Παρουσία θετικών κυττάρων σε όλο το εύρος του επιθηλίου. Οι βιοδείκτες OCT3-4 και SOX 2 αξιολογούνται περαιτέρω με βάση την ένταση της χρώσης σε μία κλίμακα 1-2 η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι: 1: ασθενής χρώση, 2: ισχυρή χρώση. Η στατιστική ακολούθως πραγματοποιήθηκε μέσω του SPSS 2017 Pearson chi square και το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο 0.05 (p=0,05). Τα ιστοτεμάχια προέρχονται από τα αρχεία του Εργαστηρίου Στοματολογίας, Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, της Κλινικής της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής του Νοσοκομείου Παπανικολάου και του Τμήματος της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής της Κλινικής Άγιος Λουκάς και ελήφθησαν κατά την περίοδο 2009-2019. Το σύνολο της εργαστηριακής διαδικασίας πραγματοποιήθηκε στους εργαστηριακούς χώρους του Εργαστηρίου Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος ΑΠΘ και στο τμήμα Φαρμακευτικής ΑΠΘ. Αποτελέσματα: Η πυρηνική και μεμβρανική χρώση της OCT3-4 παρατηρήθηκε σε μεμονωμένα περιστατικά καρκίνων. Η πυρηνική χρώση της SOX 2 παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των δειγμάτων, κυρίως στη βασική και παραβασική στιβάδα του επιθηλίου. Η μεμβρανική χρώση της CD147 παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των δειγμάτων, κυρίως στη βασική στιβάδα του επιθηλίου. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά αυξημένη έκφραση της SOX 2 σε περιστατικά καρκίνου έναντι περιστατικών λευκοπλακίας (p-value=0,007) και έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.065), στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.035), στον καρκίνο χαμηλής και μέτριας διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.003), και στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.048). Επίσης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκφραση της CD147 στη λευκοπλακία μέτριας-σοβαρής δυσπλασίας έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value=0,008), στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.058) και στην λευκοπλακία ήπιας και άνευ δυσπλασίας έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.012). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης της OCT3-4 μεταξύ της ομάδας των καρκίνων, των λευκοπλακιών και των φυσιολογικών. Όλα τα ιστοτεμάχια ήταν θετικά στην έκφραση των γονιδίων στην qPCR χωρίς ομώς να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Συζήτηση: Η έκφραση των OCT3-4, SOX 2 και CD147 σε καρκινικές βλάβες καθώς και σε δυνητικά κακοήθεις βλάβες υποδεικνύει την παρουσία καρκινικών βλαστοκυττάρων και την εμπλοκή τους στην καρκινογένεση. Η χρήση τους ως κλινικών προγνωστικών δεικτών προϋποθέτει την ερευνητική τους επαλήθευση σε μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος περιστατικών.