Περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1882)
Authors: Γεώργα Ιωάννα 
Published: April 2022

Τα ψάρια αποτελούν μια ομάδα οργανισμών που εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Με τον ότο φαινοτυπική πλαστικότητα (phenotypic plasticity) χαρακτηρίζεται η ιδιότητα ενός γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς φαινοτύπους, όταν εκτίθεται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (Stearns 1989, West-Eberhard 1989, West-Eberhard 2005, Pigliucci et al. 2006). Η περιβαλλοντικά προκλειόμενη φαινοτυπική πλαστικότητα μπορεί να εξεταστεί και υπό το πρίσμα του ετεροχρονισμού, ο οποίος ορίζεται ως μια «ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας οντογενετικής διαδικασίας» (Rice 1997). Η μέτρηση του οντογενετικού χρόνου, της ηλικίας και ο καθορισμός του οντογενετικού σταδίου, αποτελούν ορόσημα κατά τη μελέτη του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παράγοντες που ήδη εμπεριέχουν τη λειτουργική έννοια του χρόνου στον ορισμό τους και την πρακτική εφαρμογή τους. Έτσι, επειδή στην παρούσα εργασία εξετάζεται η περιβαλλοντικά προκλειόμενη πλαστικότητα στο zebrafish, και η παρουσία ετεροχρονικών φαινομένων στην αλληλουχία της οντογένεσης, ένα από τα αντικείμενα της μελέτης βρέθηκε να αποτελεί και ο ακριβέστερος τρόπος προσδιορισμού των οντογενετικών σταδίων των ιχθύων σε dpf / dph ή SL / TL. Το μήκος του σώματος θεωρήθηκε ως το ιδανικότερο για τον προσδιορισμό των οντογενετικών σταδίων και σχετικά αποτελέσματα εξάχθηκαν και αναλύθηκαν σε σε συνάρτηση με αυτό. Απο ‘κει και πέρα, ο κύριος όγκος της παρούσας εργασίας αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (από τη γονιμοποίηση μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης) στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). Η επίδραση της θερμοκρασίας εξετάστηκε στην αναλογία φύλου, στο σχήμα του σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, osteocalcin, mgp, eda, cryaa, pes) και το φυλοκαθορισμό, άμεσα ή έμμεσα (ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9, hsd11b2, tp53) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων) (με την τεχνολογία των NanoString), όσο και δευτερογενώς σε ιστούς ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9) (με τη μέθοδο της Real Time q-PCR). Επίσης, εξετάζεται η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου στο SGR, στην αναλογία φύλου των zebrafish, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (μόνο υπό την επίδραση της πυκνότητας), και στο στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων (μόνο υπό τη συνεπίδραση θερμοκρασίας - φωτοπεριόδου). Στόχος ήταν μια όσο το δυνατόν πιο ολοκληρωμένη μελέτη της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης φαινοτυπική πλαστικότητας του είδους, υπό την επίδραση των παραπάνω περιβαλλοντικών παραγόντων, με κύριο τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Κάθε πείραμα διεξήχθει σε δύο πειραματικές επαναλήψεις. Στο πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας στην πλαστικότητα του zebrafish, η θερμοκρασία (22, 28 και 32°C) επέδρασε καθόλη τη διάρκεια του εμβρυικού και νυμφικού σταδίου, μέχρι και τη μεταμόρφωση (1η dpf μέχρι ~14mm TL). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22°C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων, με τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων (21,65% και 26,19% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) να είναι σημαντικά χαμηλότερα σε σχέση με τους 28°C (50,83% και 54,22% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test) και τους 32°C (47,24% και 56,80% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test). Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, καταγράφηκε το μέσο SL50 στο οποίο ολοκληρώνεται η εμφάνιση–ανάπτυξη των ακόλουθων οντογενετικών χαρακτήρων / γεγονότων: πρώτο υπουραίο οστό, επουραίο οστό, αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου, αριθμός των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου, προραχιαία οστά, ουρόστυλο, κοιλιακά πτερύγια, και οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου, του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου, και του επουραίου. Η θερμοκρασία των 32°C επιτάχυνε την ανάπτυξη όλων σχεδόν των μεριστικών χαρακτήρων, με εξαίρεση αυτή του επουραίου οστού, ενώ παρατηρήθηκαν πιθανά ετεροχρονικά φαινόμενα που διαφοροποιούν τους 22°C, από τους 28 και 32°C και αφορούν στην αλληλουχία της ανάπτυξης των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε στο σχήμα του σώματος των νυμφών zebrafish (Wilks' λ=0,0779, p<0,001), με τις δύο κανονικές μεταβλητές (CV1 and CV2) να διαχωρίζουν πλήρως τα άτομα των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, ενώ επέδρασε σημαντικά και στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,0315, p<0,001), με τη CV1 να διαχωρίζει τα άτομα με βάση το φύλο τους, και τη CV2 να διαχωρίζει τα άτομα αναπτύχθηκαν στους 22°C από τα άτομα των δύο θερμότερων συνθηκών. Θερμο-εξαρτώμενες διαφορές στη γονιδιακή έκφραση, των ενήλικων zebrafish, παρατηρήθηκαν μόνο στην έκφραση της myogenin (υψηλότερη στα αρσενικά των 22°C, σε σχέση με των 32°C) και της cyp19a1a (χαμηλότερη στα αρσενικά των 22°C, σε σχέση με των 32°C) (Mann-Whitney U test, p<0,05). Οι υπόλοιπες διαφορές αφορούσαν στα φυλοκαθοριστικά γονίδια και συνδέονταν με τις αναμενόμενες διαφοροποιήσεις μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων. Κατά τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, ως εξαιρετική σημασίας θα αναφερθούν τα αποτελέσματα που αφορούν στα γονίδια osteocalcin και tnni2a.3, που συνδέονται με την ανάπτυξη των οστών και των μυών αντίστοιχα. Μείωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου της έκφρασης αυτών των γονιδίων σε μεγαλύτερο μήκος σώματος (t-test, p<0,01), επιβεβαιώνοντας τη μερική αποσύνδεση του ρυθμού αύξησης από το ρυθμό διαφοροποίησης, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας. Επίσης, μελετήθηκε η ευαισθησία των zebrafish έναντι της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο δρα η θερμοκρασία και ανάλογα με το συνολικό χρόνο δράσης της. Αυτό πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας τα αποτελέσματα που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32°C) στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα I) όπου μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο στο σχήμα του σώματος των ενήλικων ατόμων, με αυτά της παρούσας εργασίας, όπου η δράση της θερμοκρασίας (22, 28, 32°C) πραγματοποιήθηκε για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο οντογενετικές περιόδους που εξετάζονται στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οντογενετική περίοδος και άρα η χρονική διάρκεια επίδρασης της θερμοκρασίας είναι αυτή που πρωτίστως διαχωρίζει τους πειραματικούς πληθυσμούς, και δευτερευόντως η θερμοκρασία ανάπτυξης. Σε ό,τι αφορά στην επίδραση της πυκνότητας στην πλαστικότητα του zebrafish, σχεδιάστηκαν δύο πειράματα. Το πρώτο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τα πρώιμα οντογενετικά στάδια και μέχρι τα ≈10 mm TL, ενώ το δεύτερο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας μετά από μήκος σώματος 8 mm TL. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορες στην αύξηση (G-test, p<0,05) μόνο εντός των ίδιων συνθηκών πυκνότητας μεταξύ της πρώτης και της δεύτερης φάσης ανάπτυξης, ενώ η τελική αναλογία φύλου δε φαίνεται να επηρεάστηκε. Τα αποτελέσματα της γεωμετρικής μορφομετρίς, κατέδειξαν μεγάλες διαφορές στην τελική διαμόρφωση του σχήματος του σώματος, τόσο μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων, όσο και μεταξύ των ατόμων που αναπτύχθηκαν στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας. Εφαρμόστηκαν έξι συνδυασμοί θερμοκρασίας νερού (22, 28, 32°C) και φωτοπεριόδου (14:10, 8:16 L:D) από την 1η dpf μέχρι τα 12-13 mm ΤL. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν σημαντική συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπερίοδου στο SGR (p<0,05). Στη φωτοπερίοδο 14:10 L:D ο SGR αυξήθηκε γραμμικά με την αύξηση της θερμοκρασίας και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28, 32°C), ενώ στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D ο SGR επηρεάστηκε σημαντικά μόνο στο εύρος των 22-28°C. Ο ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους αποδείχθηκε ανεξάρτητος της φωτοπεριόδου στις χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28˚C, p>0,05), ενώ στους 32˚C η αύξηση της φωτοπεριόδου προκάλεσε σημαντική αύξηση του SGR (p<0,05). Οι παραπάνω παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος συνεπιδρούν στο ρυθμό σωματικής αύξησης, με τον καθένα από αυτούς να ελέγχει τη δράση του άλλου. Μόνο στην θερμοκρασία των 22°C σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14:10 (L:D) και στη μία εκ των δύο πειραματικών επαναλήψεων, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (G-test, p<0,05) στην αναλογία φύλου, με τα θηλυκά άτομα να είναι λιγότερα από τα αρσενικά (31% θηλυκά έναντι 69% αρσενικά zebrafish) (Εικόνα 4.4.2 1, Πίνακας 26). Τέλος, εξετάστηκε η οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: Αρχή κάμψης της νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D και 8:16 L:D), σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22°C στους 28 ή στους 32°C, προκάλεσε επιτάχυνση της εμφάνισης – ολοκλήρωσης των εκάστοτε οντογενετικών χαρακτήρων. Με εξαίρεση την ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στους 22°C, σε κάθε άλλη περίπτωση που παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου, αυτή οφειλόταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή.