Επισήμανση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-CEA με Sm-153
Authors: Φάνη Μελπομένη 
Published: January 2014

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επισήμανση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-CEA και της πολυκλωνικής ανθρώπειου ανοσοσφαιρίνης Sandoglobuline, με το ραδιοϊσότοπο 153Sm. Το σαμάριο-153 (t1/2 = 46.75 h) εκπέμπει κυρίως σωματίδια β- (Eβ = 227 keV) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς, ενώ η ταυτόχρονη εκπομπή ακτινοβολίας-γ (Eγ = 103 keV, 28%) διευκολύνει στη λήψη σπινθηρογραφικής απεικόνισης. Γι’ αυτό, τα επισημασμένα με 153Sm μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να βρουν συνδυασμένη εφαρμογή στη ραδιοανοσοσπινθηρογράφηση και ραδιοανοσοθεραπεία. Για την επισήμανση χρησιμοποιείται ο δικυκλικός ανυδρίτης του DTPA (cDTPAa) ως το χηλικό μέσο διπλής δράσης, το οποίο συνδεδεμένο στα μόρια του αντισώματος, δύναται να δεσμεύσει το 153Sm. Η επισήμανση λαμβάνει χώρα με την προσθήκη του 153Sm, με τη μορφή διαλύματος 153SmCl3, στο διάλυμα του ανοσοσυμπλέγματος Ab-DTPA, σε pH στην περιοχή 5.0-5.5. Το μίγμα της αντίδρασης επωάζεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και το ελεύθερο 153Sm απομακρύνεται με χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε πηκτή, σε στήλη Bio Gel P30. Ο έλεγχος της επισήμανσης γίνεται με ένα συνδυασμό ραδιοχημικών τεχνικών (χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε πηκτή, HPLC, ITLC-SG και SDS-PAGE). Μελετώνται οι παράγοντες οι οποίοι πιθανόν επηρεάζουν την απόδοση της επισήμανσης, ώστε να βρεθούν εκείνοι που οδηγούν σε ένα τελικό προϊόν, με μεγάλη απόδοση και υψηλή ραδιοχημική καθαρότητα. Η κατάλληλη επιλογή των παραγόντων (pH, συγκέντρωση Ab και Ab-DTPA κ.ά) οδηγεί σε απόδοση επισήμανσης > 90%. Το τελικό προϊόν παραλαμβάνεται με ραδιοχημική καθαρότητα > 98%, ποσοστό που επιτρέπει τη χρήση του σε in vivo μελέτες. Το ανοσοσύμπλεγμα anti-CEA-DTPA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις anti-CEA (3 έως 15 mg/ml) και διαφορετικές γραμμομοριακές αναλογίες anti-CEA:cDTPAa (1:3.5 έως 1:45). Προσδιορίστηκε ο αριθμός των μορίων του DTPA που συνδέονται ανά μόριο anti-CEA (DTPA/anti-CEA) και μελετήθηκε η επίδραση της σύμπλεξης του DTPA στο μόριο του αντισώματος με HPLC και SDS-PAGE. Ο αριθμός DTPA/anti-CEA αυξάνεται με την αύξηση είτε της γραμμομοριακής αναλογίας anti-CEA:cDTPAa είτε της συγκέντρωσης του αντισώματος. Είναι προφανές ότι αυτό οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού της επισήμανσης και σε υψηλότερη ειδική ραδιενέργεια του τελικού προϊόντος. Εντούτοις, έχει ως συνέπεια το σχηματισμό πολυμερών. Η επίδραση της σύμπλεξης του DTPA στην in vivo κατανομή του επισημασμένου αντισώματος αξιολογήθηκε σε φυσιολογικούς μυς, όπου οι διαφορές στην βιοκατανομή ήταν εμφανείς, στις περιπτώσεις της παρουσίας πολυμερών. Ο οριακός αριθμός DTPA/anti-CEA, ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός πολυμερών, είναι 1.5 και αντιστοιχεί σε συγκέντρωση anti-CEA 3 mg/ml και γραμμομοριακή αναλογία anti-CEA:cDTPAa 1:10. Για την παραλαβή του επισημασμένου αντισώματος με υψηλή ειδική ραδιενέργεια είναι προτιμότερο να χρησιμοποιηθεί διάλυμα 153SmCl3 με υψηλή ειδική ραδιενέργεια. Στις παραπάνω οριακές συνθήκες η ειδική ραδιενέργεια του τελικού προϊόντος φτάνει μια μέγιστη τιμή ίση με 1.2 mCi/mg, με την χρήση διαλύματος 153SmCl3 ειδικής ραδιενέργειας 763 mCi/mg. Η in vivo κατανομή του [153Sm]DTPA-anti-CEA αξιολογήθηκε με ανατομικές και απεικονιστικές τεχνικές σε άθυμους μυς, στους οποίους είχε προκληθεί πειραματικός όγκος. Ο όγκος αναπτύχθηκε μετά από τοπική εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων Colo 205 που εκφράζουν το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA). Η φαινομένη σταθερά σύνδεσης Ka του [153Sm]DTPA-anti-CEA για τη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, όπως αυτή υπολογίστηκε βάση της ανάλυσης Scatchard, είναι ίση με 2 / 107 M-1. Παράλληλα, με τη μελέτη βιοκατανομής στους άθυμους μυς πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική μελέτη σε φυσιολογικούς μυς, ώστε να εκτιμηθεί η επίδραση της ύπαρξης του όγκου στην κατανομή του αντισώματος μέσα στον οργανισμό. Το [153Sm]DTPA-anti-CEA παρουσιάζει βραδεία αιματική κάθαρση, συγκεντρώνεται κυρίως στο ήπαρ, τον σπλήνα και τους πνεύμονες, ενώ απεκκρίνεται μέσω των νεφρών. Η συγκριτική μελέτη βιοκατανομής σε φυσιολογικούς και άθυμους μυς δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στη συγκέντρωση της ραδιενέργειας στους υγιείς ιστούς, για το χρονικό διάστημα από 4 ώρες έως 2 ημέρες μετά τη χορήγηση. Διαφορές ήταν εμφανείς 3-5 ημέρες μετά τη χορήγηση, όπου οι τιμές στους προαναφερόμενους ιστούς ήταν αυξημένες στους άθυμους μυς σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς. Παρατηρήθηκε επίσης μια σταδιακή αύξηση της ραδιενεργού συγκέντρωσης στα οστά με την πάροδο του χρόνου, η οποία βρισκόταν στα ίδια επίπεδα και για δύο είδη πειραματόζωων. Το [153Sm]DTPA-anti-CEA αξιολογήθηκε σε άθυμους μυς με όγκους από 0.5 έως 2.5 g. Εστιάζοντας στην συγκέντρωση της ραδιενέργειας στον όγκο, η υψηλότερη συγκέντρωση παρατηρήθηκε στους όγκους με βάρος 0.5-0.8 g, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους βάρους 1.5-2.5 g, 24 ώρες μετά τη χορήγηση. Στους άθυμους μυς με όγκους περίπου ίδιου μεγέθους η πρόσληψη από τον όγκο αυξάνεται με το χρόνο, φτάνοντας μια μέγιστη τιμή 2 ημέρες μετά την χορήγηση. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με τις σπινθηρογραφικές μελέτες σε γ-κάμερα. Ο όγκος μπορεί να διακριθεί 4-24 ώρες μετά τη χορήγηση, αλλά λόγω του υψηλού υπόβαθρου, μπορεί να διαχωριστεί ευκρινώς από τους υπόλοιπους ιστούς 2 ημέρες μετά τη χορήγηση.