Κατασκευή, απομόνωση και παραγωγή ανασυνδυασμένων τμημάτων ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι καρκινικών αντιγόνων
Authors: Παπαδημητροπούλου Ανδριάνα 
Published: November 2021

Ένα κρίσιμο σημείο στην πορεία διήθησης και μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων αποτελεί η αποικοδόμηση του εξωκυτταρικού χώρου. Κύριοι πρωταγωνιστές στη διαδικασία αυτή είναι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, οι οποίες ρυθμίζονται από διάφορους παράγοντες, μεταξύ των οποίων και η EMMPRIN(Εxtracellular Matrix Metalloprotease Inducer), η οποία αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους ρυθμιστές της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών. Η EMMPRIN είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία ανιχνεύεται σε αφθονία στη μεμβράνη πολλών τύπων καρκινικών κυττάρων, γνωστή και ως basigin ή CD147, και ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών.Η EMMPRIN αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή 185 αμινοξέων, που περιέχει 2 περιοχές τύπου ανοσοσφαιρίνης (ΙgΙ και ΙgΙΙ), μια διαμεμβρανική περιοχή 24 αμινοξέων και μια κυτταροπλασματική περιοχή 39 αμινοξέων. Το εξωκυτταρικό τμήμα περιέχει 3 συντηρημένες περιοχές Ν-γλυκοζυλίωσης (1 θέση στην ΙgΙ και 2 στην ΙgΙΙ), οι οποίες παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία στη γλυκοζυλίωσή τους. Υπάρχουν μόρια της EMMPRIN με υψηλά ποσοστά γλυκοζυλίωσης (ΗG-CD147), ενώ άλλα μόρια είναι λιγότερο γλυκοζυλιωμένα (LG-CD147). Η ύπαρξη αυξημένης γλυκοζυλίωσης της EMMPRIN στον καρκίνο συνηγορεί στο ότι η γλυκοζυλίωση ενέχεται στην επαγωγή των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs).O σημαντικός ρόλος της EMMPRIN στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων αναδεικνύει το μόριο αυτό ως ένα καίριο θεραπευτικό στόχο, με την απομόνωση μορίων τα οποία θα μπορούσαν να αναστείλουν τη δράση της. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η απομόνωση ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι της EMMPRIN και η χρήση αυτών ως θεραπευτικά μόρια προκειμένου να παρεμποδιστεί η δράση της και συνεπώς η μετάσταση του καρκίνου. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε μια βιβλιοθήκη ανθρώπινων αντισωμάτων ενός ασθενούς με καρκίνο μαστού HΕR2+, η οποία είχε κατασκευαστεί με την τεχνολογία των «φάγων-αντισωμάτων». Για την κατασκευή της, χρησιμοποιήθηκαν Β λεμφοκύτταρα διηθημένων λεμφαδένων στα οποία είχε γίνει ενίσχυση με PCR των cDNA για το Fabτμήμα (VH-CH1 και VL-CL) του αντισώματος και στη συνέχεια κλωνοποίησή τους στο φορέα έκφρασης του φαγεμιδίου pComb3H.Για την διαδικασία της επιλογής των ειδικών φάγων-αντισωμάτων ήταν αναγκαία η ύπαρξη αντιγόνου σε μεγάλη ποσότητα και υψηλή καθαρότητα. Η παραγωγή του αντιγόνου, που στην προκειμένη περίπτωση ήταν η εξωκυτταρική περιοχή της EMMPRIN (ECD-ΕMMPRIN, ExtraCellular Domain), έγινε στο σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris, που προσφέρει υψηλή έκφραση διαλυτής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και σωστή διαμόρφωσή της. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη απομονώθηκε από το θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας με χρωματογραφία συγγένειας (Ni2+-NTA) και στη συνέχεια ελέγχθηκε η λειτουργικότητά της ως προς την επαγωγή της MMP-2 με τη μέθοδο της ζυμογραφίας. Μετά από επίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε ινοβλάστες δέρματος, παρατηρήθηκε μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη δραστικότητα της ενεργούς μορφής της MMP-2 (65 kDa). Tα αποτελέσματα έδειξαν 3.53, 9.57, 15.5 και 17.36 φορές αύξηση της επαγωγής της ΜΜΡ-2 κατόπιν προσθήκης 1.6, 3.2, 6.4, και 12.8 μg/φρεάτιο ΕCD-EMMPRIN αντίστοιχα, σε σχέση με τους ινοβλάστες που δεν είχαν δεχτεί επίδραση της εξωγενούς ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (αρνητικό δείγμα ελέγχου). Η αύξηση της ΜΜΡ-2 ήταν στατιστικά σημαντική μέχρι την προσθήκη 6.4 μg/φρεάτιο ΕCD-EMMPRIN, ενώ το φαινόμενο δεν ήταν στατιστικά σημαντικό όταν προστέθηκαν 12.8 μg/φρεάτιο (p = 0.999).Στη συνέχεια η ΕCD-EMMPRIN χρησιμοποιήθηκε σαν υπόστρωμα για την απομόνωση ενός ανθρώπινου αντισώματος, το οποίο θα εκφραζόταν στην επιφάνεια νηματοειδών βακτηριοφάγων σαν Fab τμήμα, μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων επιλογής (biopanning). Από το σύνολο των κλώνων που απομονώθηκαν από τη βιβλιοθήκη, μετά από ανάλυση DNA με «fingerprinting» και αλληλούχιση, ενισχύθηκε τελικά ένας κλώνος (Fab7) με ειδικότητα έναντι της ΕCD-EMMPRIN, και με υψηλή συγγένεια για το αντιγόνο. Επίσης, έγινε κατασκευή ολόκληρου του αντισώματος (mAb7) για έκφρασή του στο υπερκείμενο της καλλιέργειας κυττάρων θηλαστικών CHO. Tα Fab7 και mAb7 καλλιεργήθηκαν και απομονώθηκαν σε μεγάλη κλίμακα. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης, έδειξαν ότι τα αντισώματα ήταν ειδικά για το φυσικό μόριο της EMMPRIN, ενώ η ανάλυση κατά Western έδειξε πως αναγνώριζαν κυρίως τα υψηλής γλυκοζυλίωσης μόρια της EMMPRIN. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η ικανότητα των Fab7 και mAb7 να αναστέλλουν τη μεταστατικότητα των κυττάρων καρκινικών σειρών μαστού και ωοθηκών με τις μεθόδους «επούλωσης πληγής» (wound healing) και «διήθησης της εξωκυττάριας ουσίας» (matrigel invasion assays). Το αντίσωμα που απομονώθηκε έναντι της ECD-EMMPRIN, είτε σαν Fab τμήμα είτε σαν ολόκληρο μονοκλωνικό αντίσωμα, δεν ήταν ικανό να αναστείλει τη μεταστατικότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού και ωοθηκών. Αντιθέτως, μπορούσε να επάγει υψηλά επίπεδα MMPs σε σχέση με το δείγμα ελέγχου σε πειράματα ζυμογραφίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το αντίσωμα που απομονώθηκε έναντι της ECD-EMMPRIN δεν παρεμποδίζει τη δράση της EMMPRIN σχετικά με την επαγωγή της ΜΜP-2, αλλά αντίθετα φαίνεται να την ενισχύει. Για το λόγο αυτό κρίθηκε αναγκαίο να χρησιμοποιηθούν μικρότερα τμήματα, όπως οι υποπεριοχές IgI και IgIΙ της εξωκυτταρικής περιοχής της EMMPRIN, για την επιλογή παρεμποδιστικών ανασυνδυασμένων ανθρώπινων αντισωμάτων τα οποία θα ήταν ικανά να αναχαιτίσουν την δράση της EMMPRIN στην επαγωγή των ΜΜΡs. Η χρησιμοποίηση μικρότερης περιοχής για την επιλογή των αντισωμάτων στους κύκλους του biopanning, ίσως βοηθούσε σε μια πιο στοχευμένη επιλογή. Η επιλογή - εκτός της IgI περιοχής που θεωρείται η υπεύθυνη για την επαγωγή των MMPs - και της IgII σαν αντιγόνο επιλογής, έγινε διότι υπάρχουν ορισμένες ενδείξεις που της προσδίδουν και αυτή τη δράση. Παράλληλα, κρίθηκε αναγκαίο να διερευνηθεί η συμβολή των υποπεριοχών IgI και IgIΙ της εξωκυτταρικής περιοχής της EMMPRIN στην επαγωγή των μεταλλοπρωτεϊνασών και το ρόλο της γλυκοζυλίωσης στη διαδικασία αυτή. Για το λόγο αυτό, εκτός από την υποκλωνοποίηση και έκφραση των IgI και IgIΙ τμημάτων της ECD-EMMPRIN στο ζυμομύκητα P.pastoris, πραγματοποιήθηκε υποκλωνοποίηση και έκφραση στο βακτήριο E.coli, προκειμένου να παραχθούν σε γλυκοζυλιωμένη και μη μορφή, αντίστοιχα. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η λειτουργικότητα των υποπεριοχών IgI και IgIΙ της εξωκυτταρικής περιοχής της EMMPRIN στην επαγωγή των ΜΜΡs και στη συνέχεια έγινε σάρωση της βιβλιοθήκης ανθρώπινων αντισωμάτων, προκειμένου να απομονωθεί ένα παρεμποδιστικό αντίσωμα που θα μπορούσε να αναστείλει τη λειτουργία της EMMPRIN. Σε πειράματα ζυμογραφίας φάνηκε ότι οι ινοβλάστες που είχαν επωαστεί με τις γλυκοζυλιωμένες IgI και IgII περιοχές μπορούσαν να επάγουν σημαντικά την έκφραση της μεταλλοπρωτεΐνάσης-2 (MMP-2). Η επαγωγή αυτή ήταν υψηλότερη κατά 37.54, 15.07 και 27.06 φορές αντίστοιχα σε σχέση με τους ινοβλάστες που δεν είχαν υποστεί καμία επίδραση (αρνητικό δείγμα ελέγχου). Οι πρωτεΐνες που είχαν παραχθεί στα βακτήρια και δεν είχαν υποστεί μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, δεν μπορούσαν να επάγουν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό την MMP-2. Οι στατιστικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν μεταξύ των γλυκοζυλιωμένων και μη μορφών, έδειξαν πως μόνο οι γλυκοζυλιωμένες μορφές των ECD-EMMPRIN και ΙgII-EMMPRIN πρωτεϊνών μπορούσαν να επάγουν ικανοποιητικά την MMP-2. Η ΙgI-EMMPRIN δεν είχε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης της MMP-2 μεταξύ της γλυκοζυλιωμένης και μη μορφής. Η επαγωγική ικανότητα των τμημάτων ECD-EMMPRIN, ΙgI-EMMPRIN και ΙgII-EMMPRIN για την ΜΜΡ-2 διερευνήθηκε επίσης με ανάλυση κατά Western. Η ανάλυση πρωτεϊνών από κυτταρικά εκχυλίσματα έδειξε ότι η έκφραση της MMP-2 επάγεται μόνο στα κύτταρα στα οποία είχε γίνει επίδραση με τα γλυκοζυλιωμένα μόρια ECD-EMMPRIN, ΙgI-EMMPRIN και ΙgII-EMMPRIN, ενώ στα κύτταρα που είχαν επωαστεί με τα αντίστοιχα ανασυνδυασμένα μόρια που είχαν παραχθεί στα βακτήρια, η έκφραση της MMP-2 δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επιπλέον, αναλύθηκαν συμπυκνωμένα υπερκείμενα κυττάρων, όπου μόνο οι γλυκοζυλιωμένες μορφές των ECD-EMMPRIN, IgII-EMMPRIN και πολύ λιγότερο της IgI-EMMPRIN, ήταν ικανές να διεγείρουν την έκκριση της MMP-2 στο υπερκείμενο των ινοβλαστών. Για να διασαφηνιστεί ο μηχανισμός που ενέχεται στην επαγωγή της MMP-2 από τις γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες ECD-EMMPRIN, IgI-EMMPRIN και IgII-EMMPRIN, πραγματοποιήθηκε ποσοτική Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (RT-PCR) σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα του mRNA της MMP-2, μεταξύ των δειγμάτων που είχαν επωαστεί με τα γλυκοζυλιωμένα και μη γλυκοζυλιωμένα μόρια της EMMPRIN. Το αποτέλεσμα αυτό φανερώνει πως η ενεργοποίηση της έκφρασης της ΜΜP-2 από τις γλυκοζυλιωμένες μορφές των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, δεν οφείλεται σε μεταγραφικές αλλαγές αλλά πιθανόν σε μετα-μεταγραφικές / μεταφραστικές τροποποιήσεις. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι: 1) η γλυκοζυλίωση των εξωκυτταρικών περιοχών της EMMPRIN επάγει την έκφραση της MMP-2 και2) η IgII περιοχή ενέχεται σε αυτήν την επαγωγή.Οι γλυκοζυλιωμένες μορφές ΙgI-EMMPRIN και ΙgIΙ-EMMPRIN, οι οποίες εκφράστηκαν στην P.pastoris, χρησιμοποιήθηκαν σαν υποστρώματα για την σάρωση της ανθρώπινης βιβλιοθήκης “φάγων-αντισωμάτων”, που χρησιμοποιήθηκε και προηγουμένως, με σκοπό την απομόνωση λειτουργικών παρεμποδιστικών anti-EMMPRIN αντισωμάτων. Για το λόγο αυτό επαναλήφθηκε η διαδικασία επιλογής από τη βιβλιοθήκη, η οποία δεν οδήγησε στην απομόνωση κάποιου ειδικού αντισώματος. H αδυναμία απομόνωσης ενός αντισώματος που θα ανέστειλε τη δράση της EMMPRIN μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες: α) είναι πιθανό ο συνδυασμός βαριών και ελαφριών αλυσίδων κατά την κατασκευή της βιβλιοθήκης των φάγων-αντισωμάτων να μην αντικατοπτρίζει την in vivo κατάσταση στα Β λεμφοκύτταρα διηθημένων λεμφαδένων του ασθενούς, παρ’ όλο που κατά την κατασκευή της βιβλιοθήκης ο τίτλος ποικιλομορφίας ήταν ικανοποιητικός.β) η βιβλιοθήκη των φάγων-αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκε είχε δημιουργηθεί από τα Β λεμφοκύτταρα διηθημένων λεμφαδένων ενός ασθενή με καρκίνο μαστού, ο οποίος ήταν θετικός στο HER-2/neu. Είναι πιθανό ο ασθενής αυτός να μην είχε αντισώματα με παρεμποδιστική δράση έναντι της EMMPRIN και κατ’ επέκταση ούτε η βιβλιοθήκη των φάγων-αντισωμάτων που κατασκευάστηκε. γ) Είναι πιθανό το αντίσωμα που απομονώθηκε από τη βιβλιοθήκη να αλληλεπιδρά με την EMMPRIN και να σχηματίζει ετεροδιμερή, τα οποία στη συνέχεια ενεργοποιούν την έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών, καθώς είναι γνωστό ότι η EMMPRIN ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών και μοιάζει δομικά με το αντίσωμα. Αυτό όμως είναι δύσκολο να ελεγχθεί καθώς δεν υπάρχει υλικό πλέον από αυτόν τον ασθενή.Τα αποτελέσματα αυτά ενώ είναι αποτρεπτικά για τη χρήση του αντισώματος σε περιπτώσεις όγκων όπου υπερεκφράζεται η EMMPRIN, θα μπορούσε όμως να συμβάλλει ενεργά σε καταστάσεις όπου απαιτείται παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών, όπως στην επούλωση τραύματος, την αναδόμηση ιστών και την αγγειογένεση.