Η μοριακή μελέτη της διακίνησης του μεταφορέα γλυκόζης GLUT4 στα λιποκύτταρα ατόμων με νοσογόνο παχυσαρκία
Authors: Μουρελάτου Ρόζα 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Η παχυσαρκία συνιστά μια επιδημία παγκόσμιας εμβέλειας, που συχνά συνοδεύεται από Αντίσταση στην Ινσουλίνη (ΑΙ), Μεταβολικό Σύνδρομο (ΜΣ), Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ (ΣΔ ΙΙ) και αυξημένη επίπτωση καρδιαγγειακών συμβαμάτων, ιδιαίτερα στα άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία (ΒΜΙ≥40). Στην παχυσαρκία των ενηλίκων η παθολογική αναδιαμόρφωση του λιπώδους ιστού (ΛΙ), χαρακτηρίζεται από υπερτροφία, φλεγμονή και διαταραχή της έκκρισης αντιποκινών, ορμονών που παράγονται στον ΛΙ (π.χ. χαμηλή έκκριση αντιπονεκτίνης), με τελικό αποτέλεσμα την ανάπτυξη τοπικής και στη συνέχεια συστηματικής ΑΙ. Τα λιποκύτταρα ατόμων με νοσογόνο παχυσαρκία και ΑΙ συνήθως εμφανίζουν διαταραχές στο ενδοκυττάριο σηματοδοτικό μονοπάτι της ινσουλίνης και της αντιπονεκτίνης, με κεντρικό παθοφυσιολογικό γεγονός, την αδυναμία μεταφοράς στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (ΚΠΜ) του μεταφορέα γλυκόζης, GLUT4. Φυσιολογικά η ινσουλίνη ενεργοποιεί τον υποδοχέα της και ακολουθεί αλυσιδωτή ενεργοποίηση των εξής μορίων: IRS1 (υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης), PI3K (κινάση της 3-φωσφατίδυλοϊνοσιτόλης) και ΡΚΒ/Akt ΙΙ (πρωτεϊνική κινάση Β). Επιπλέον, η αντιπονεκτίνη ασκεί αυτοκρινή δράση στο ΛΙ και συνδεόμενη με τον υποδοχέα της, AdipoR1, ενεργοποιεί το APPL1 (πρωτεΐνη προσαρμογέας του υποδοχέα της αδιπονεκτίνης). Τελικό αποτέλεσμα των παραπάνω σηματοτοδοτήσεων, είναι η μεταφορά του GLUT4 στην ΚΠΜ για την πρόσληψη γλυκόζης. Η GTPάση Rab5, ενεργοποιείται από το Gapex5 και συμμετέχει ενεργά και στα δύο προαναφερόμενα σηματοδοτικά μονοπάτια. Επιπλέον στην παθοφυσιολογία της ΑΙ, φαίνεται ότι συμμετέχει η ακουαγλυκεροπορίνη7 (AQP7), η οποία μεσολαβεί την έξοδο της παραγόμενης από τη λιπόλυση γλυκερόλης, στην κυκλοφορία. Σκοπός: Να μελετηθούν οι ενδοκυττάριοι μηχανισμοί διακίνησης της γλυκόζης και της γλυκερόλης από τον GLUT4 και την AQP7, αντίστοιχα και η πιθανή συμμετοχή των μεταγωγικών μονοπατιών της ινσουλίνης (p85 υπομονάδα της ΡΙ3Κ, Akt ΙΙ, Rab5 και Gapex5) και της αντιπονεκτίνης (AdipoR1 και APPL1) των ώριμων λιποκυττάρων, στην παθοφυσιολογία της Νοσογόνου Παχυσαρκίας, της Αντίστασης στην Ινσουλίνη και του Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, που εμφανίζουν ορισμένοι παχύσαρκοι. Μεθοδολογία: Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ώριμων λιποκυττάρων από χειρουργικές βιοψίες Ενδοκοιλιακού (Ενδ), Υποδόριου κοιλιακού (ΥποΚ) και υποδόριου Γλουτιαίου (Γλτ) λίπους, από 20 λεπτόσωμους (ΒΜΙ≤ 25 Kg/m2) και 36 νοσογόνα παχύσαρκους (ΒΜΙ>40 Kg/m2), που διαιρέθηκαν σε δύο ομάδες, βάσει της ύπαρξης ΣΔ ΙΙ (ΝΠΣΔ) ή όχι (ΝΠΧ). Η σχετική έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης των μορίων GLUT4, ΡΙ3Κp85, Akt ΙΙ, Rab5, Gapex5, αντιπονεκτίνη, AdipoR1, APPL1και AQP7 προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο RT-PCR και Ανοσοαποτύπωση κατά Western, αντίστοιχα. Πλήρης βιοχημικός έλεγχος διενεργήθηκε σε δείγματα αίματος. Τα επίπεδα της ινσουλίνης, της HMW (High Molecular Weight) αντιπονεκτίνης και της γλυκερόλης ορού μετρήθηκαν με τη μέθοδο ELISA και υπολογίστηκε ο δείκτης ινσουλινοαντίστασης HOMA-IR. Αποτελέσματα: Όσον αφορά τις μετρήσεις στον ορό του αίματος, η γλυκερόλη βρέθηκε αυξημένη, ενώ αντίθετα η HMW αντιπονεκτίνη μειωμένη, στους ΝΠΧ και ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους. Η μελέτη της έκφρασης των μορίων του μονοπατιού της ινσουλίνης, ανέδειξε ότι: 1) η πρωτεΐνη του GLUT4 ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη στο Ενδ και στο ΥποΚ στους παχύσαρκους, τους ΝΠΧ και τους ΝΠΣΔ και στο Γλτ στους παχύσαρκους και τους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και 2) το Akt II mRNA ήταν μειωμένο στο ΥποΚ στους παχύσαρκους, στους ΝΠΧ και ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους. Στην ανοσοαποτύπωση κατά Western αναγνωρίστηκαν δύο ζώνες του Akt II, στα 60 και 65kDa, που ονομάστηκαν Akt II και pAkt II, αντίστοιχα. 3) Το pAkt II (που αντιπροσωπεύει τη φωσφορυλιωμένη ισομορφή του Akt II στη βασική κατάσταση) μειωνόταν στο ΥποΚ των ΝΠΧ, συγκριτικά με τους ΝΠΣΔ, ενώ το Akt II μειωνόταν στο ΥποΚ στους ΝΠΧ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους, 4) η έκφραση του PI3Kp85 mRNA στο Γλτ στους παχύσαρκους ήταν υψηλότερη, συγκριτικά με τις άλλες αποθήκες ΛΙ και στους ΝΠΧ και στους ΝΠΣΔ ήταν αυξημένη, συγκριτικά με το Ενδ, ενώ το PI3Kp85 mRNA στο Ενδ στους παχύσαρκους και ειδικά στους ΝΠΣΔ, συσχετίστηκε θετικά με την Ινσουλίνη ορού και τον HOMA-IR. 5) H πρωτεΐνη PI3Kp85 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στο ΥποΚ στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και τους ΝΠΧ. 6) Το Rab5 mRNA στο Ενδ των λεπτόσωμων είχε χαμηλότερη έκφραση, σε σχέση με το Γλτ, ενώ 7) η Rab5 πρωτεΐνη στο Γλτ ήταν αυξημένη στους παχύσαρκους και ιδιαίτερα στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με το ΥποΚ και οι παχύσαρκοι, οι ΝΠΧ και οι ΝΠΣΔ είχαν μειωμένη Rab5 στο ΥποΚ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και 8) οι ΝΠΣΔ είχαν αυξημένο Gapex5 στο ΥποΚ, συγκριτικά με τους ΝΠΧ. Αναφορικά με το μονοπάτι της αντιπονεκτίνης, βρέθηκε ότι: 1) η ενδοκυττάρια αντιπονεκτίνη ήταν αυξημένη στο ΥποΚ και Γλτ στους παχύσαρκους, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους, 2) το AdipoR1 mRNA ήταν αυξημένο στο Ενδ και στο Γλτ στους παχύσαρκους και τις υποκατηγορίες τους, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και αυξημένο στο Γλτ στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με το ΥποΚ, 3) η AdipoR1 πρωτεΐνη ήταν αυξημένη στο Γλτ στους παχύσαρκους και στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και συγκριτικά με το Ενδ, 4) το APPL1 mRNA βρέθηκε μειωμένο στο Ενδ και στο Γλτ στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους ΝΠΧ, ενώ ειδικά στο Γλτ ήταν μειωμένο στους ΝΠΣΔ σε σχέση με τους λεπτόσωμους και 5) η πρωτεΐνη APPL1 παρουσίαζε μείωση στο Ενδ στους παχύσαρκους και τους ΝΠΧ και στο ΥποΚ στους παχύσαρκους και τους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους, ενώ στο Γλτ οι ΝΠΣΔ είχαν μειωμένο APPL1, συγκριτικά με τους ΝΠΧ. Η μελέτη της πρωτεΐνης της ακουαγλυκεροπορίνης 7 ανέδειξε μία νέα ισομορφή παρατηρούμενου μοριακού μεγέθους 37kDa. Η 41kDa ισομορφή δεν παρουσιάζει στατιστικώς σημαντικές διαφορές, αλλά οι 37 και 34kDa ισομορφές της AQP7 βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικά μειωμένες στο Ενδ και στο ΥποΚ στους παχύσαρκους και τις υποκατηγορίες τους, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους. Ειδικά η 34kDa ισομορφή της AQP7 εμφάνιζε μειωμένη έκφραση στο ΥποΚ στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους ΝΠΧ.Συμπεράσματα: Οι ΝΠΣΔ έχουν αναπτύξει πλήρη-προχωρημένη δυσλειτουργία του μονοπατιού της ινσουλίνης, λόγω της μειωμένης πρωτεϊνικής έκφρασης (ΠΕ) του GLUT4 σε όλες τις αποθήκες του λιπώδους ιστού, καθώς έχει δειχθεί ότι από μόνη της η χαμηλή έκφραση του GLUT4 του ΛΙ, δύναται να διαταράξει την συνολική ομοιόσταση της γλυκόζης στον οργανισμό. Στον υποδόριο γλουτιαίο ΛΙ η ΠΕ του GLUT4 στους ΝΠΧ, του APPL1 στους παχύσαρκους συνολικά και ειδικά στους ΝΠΧ, των pAkt II/Akt II και των 37 και 34kDa ισομορφών της AQP7 στους ΝΠΧ και ΝΠΣΔ, διατηρείται στα επίπεδα των λεπτόσωμων. Παράλληλα η έκφραση του mRNA της PI3Kp85 στους ΝΠΧ και ΝΠΣΔ και του Rab5 mRNA στους λεπτόσωμους βρέθηκαν αυξημένα στο Γλτ σε σύγκριση με το Ενδ, ενώ η Rab5 πρωτεΐνη ήταν αυξημένη στους παχύσαρκους και ιδιαίτερα στους ΝΠΣΔ, στο Γλτ συγκριτικά με το ΥποΚ. Οι παχύσαρκοι και ειδικά οι ΝΠΣΔ στο Γλτ παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση του AdipoR1, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και σε σχέση με τις υπόλοιπες αποθήκες. Τα παραπάνω ευρήματα, πιθανόν αντικατοπτρίζουν την προσπάθεια του υποδόριου γλουτιαίου λίπους, ως πιο ενεργής μεταβολικά αποθήκης ΛΙ, να αυξήσει την ευαισθησία του στην ινσουλίνη, μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της ινσουλίνης και της αντιπονεκτίνης, που είναι αποτελεσματική για τους ΝΠΧ, αλλά δεν επαρκεί στα πλαίσια της συστηματικής ΑΙ των ΝΠΣΔ. Τόσο οι ΝΠΧ όσο και οι ΝΠΣΔ στο ΥποΚ μειώνουν την πρωτεϊνική έκφραση της Rab5, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους, ενώ οι ΝΠΣΔ αυξάνουν το Gapex5 και το pAkt II, σε σύγκριση με τους ΝΠΧ. Στους ΝΠΣΔ η ενίσχυση του Gapex5, ως ενεργοποιητή της Rab5 και του pAkt II, δηλαδή της μόνης ισομορφής του Akt ΙΙ, που μπορεί να ενεργοποιηθεί από την ινσουλίνη, πιθανά αντανακλά αντιρροπιστικό μηχανισμό για την ενίσχυση του μονοπατιού της ινσουλίνης, σε αυτή την επιβαρυμένη, μεταβολικά, ομάδα ασθενών. Επιπλέον και η p85 υπομονάδα της ΡΙ3Κ ασκεί ρυθμιστικό ρόλο στην Rab5, καθώς επιτρέπει την μετατόπιση της Rab5 στην ΚΠΜ, ώστε να ενεργοποιηθεί διαδοχικά η καταλυτική δράση της ΡΙ3Κ και το Akt ΙΙ. Η ΡΙ3Κp85, εν συνεχεία απενεργοποιεί την Rab5. Το μονοπάτι ΡΙ3Κ/Akt επάγει την λιπογένεση, που κυριαρχεί στα υπερτροφικά λιποκύττραρα της παχυσαρκίας και ειδικά η ΡΙ3Κp85 σχετίζεται με την ΑΙ και τον ΣΔ ΙΙ. Στα δικά μας αποτελέσματα στους ΝΠΣΔ στο ΥποΚ, η ΠΕ της ΡΙ3Κp85 βρέθηκε αυξημένη, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους και τους ΝΠΧ, ενώ της Rab5 και του GLUT4 μειωμένοι, σε σχέση με τους λεπτόσωμους. Το PI3Kp85 mRNA στους παχύσαρκους και ειδικά στους ΝΠΣΔ σχετίστηκε θετικά με την Ινσουλίνη ορού και τον δείκτη HOMA-IR. Συνεπώς, στον ΥποΚ ΛΙ των ΝΠΣΔ, η υπερέκφραση της p85 υπομονάδας της PI3K είναι πιθανό να οφείλεται για την δυσλειτουργία του μονοπατιού της ινσουλίνης, όπως αντανακλάται από τα χαμηλά επίπεδα του GLUT4, ασκώντας ανασταλτική επίδραση στην Rab5. Η υπερέκφραση της ΡΙ3Κp85 ενισχύει ή ευθύνεται για την Αντίσταση στην Ινσουλίνη του υποδόριου κοιλιακού λιπώδους ιστού και επάγει την περαιτέρω συσσώρευση λιπιδίων στα ήδη υπερτροφικά λιποκύτταρα, συμβάλλοντας στην παθολογική εξάντληση του ΥποΚ και τελικά την ανάπτυξη συστηματικής ΑΙ των ΝΠΣΔ. Αναφορικά με την μελέτη του μονοπατιού της αντιπονεκτίνης, παρατηρήθηκε μειωμένη συγκέντρωση της HMW αντιπονεκτίνης στον ορό των παχύσαρκων και των υποκατηγοριών τους, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες. Επιπλέον βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη APPL1 μειώνεται στους παχύσαρκους και τους ΝΠΧ στο Ενδ και στους παχύσαρκους και τους ΝΠΣΔ στο ΥποΚ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους. Οι ΝΠΣΔ στο Γλτ μειώνουν το APPL1 mRNA και την πρωτεΐνη, συγκριτικά με τους ΝΠΧ, ενώ οι ΝΠΧ παρουσιάζουν παρόμοια των λεπτόσωμων επίπεδα. Αντίθετα η ΠΕ του AdipoR1 δεν μεταβάλλεται στο Ενδ και ΥποΚ, ενώ αυξάνεται στους ΝΠΣΔ στο Γλτ, συγκριτικά με τους λεπτόσωμους. Συνεπώς η διαταραχή του μονοπατιού της αντιπονεκτίνης, εκφράζεται με μειωμένη έκφραση του APPL1 και μάλιστα το APPL1 φαίνεται να είναι το αίτιο που προκαλεί μεταβολική δυσλειτουργία των ιστών αυτών και διαταραχή στην ομοιόσταση της γλυκόζης, που χαρακτηρίζει τα λιποκύτταρα των νοσογόνα παχύσαρκων, όπως αποδίδεται από την μειωμένη ΠΕ του GLUT4, σε όλες τις αποθήκες λιπώδους ιστού και με μεγαλύτερη επίπτωση στους ΝΠΣΔ. Όσον αφορά την ακουαγλυκεροπορίνη 7, που οφείλεται για την έξοδο της γλυκερόλης, έχουν μελετηθεί οι ισομορφές μοριακού βάρους 41kDa και 34kD, αλλά για πρώτη φορά περιγράφεται η ισομορφή μοριακού βάρους 37kDa. Ενώ οι 37 και 34kDa ισομορφές της AQP7 μειώνονται στο Ενδ και το ΥποΚ, συνολικά στους παχύσαρκους και στις υποκατηγορίες τους, παρατηρήθηκε αύξηση της γλυκερόλης ορού στους παχύσαρκους. Μια πιθανή εξήγηση συνιστά η ενισχυμένη δράση της AQP7 στα μυοκύτταρα. Επιπλέον η 34kDa ισομορφή στο ΥποΚ μειώνεται και στους ΝΠΣΔ, συγκριτικά με τους ΝΠΧ, άρα πιθανά συνιστά έναν δείκτη της ευαισθησίας στην ινσουλίνη στα πλαίσια της νοσογόνου παχυσαρκίας. Αντίθετα η 41kDa ισομορφή δεν παρουσιάζει μεταβολές μεταξύ λεπτόσωμων και παχύσαρκων. Έχει προταθεί ότι οι διαφορετικές ισομορφές της AQP7 προκύπτουν από την αρχική πρωτεΐνη με μετα-μεταφραστική τροποποίηση, που διαφέρει από την Ν-γλυκοζυλίωση, πιθανά πρόκειται για Ο-γλυκοζυλίωση. Ενίσχυση της Ο-γλυκοζυλίωσης σχετίζεται με γλυκοτοξικότητα, ΑΙ και ΣΔ ΙΙ, καθώς αναστέλλει το μονοπάτι της ινσουλίνης. Συνεπώς υποθέτουμε ότι η αύξηση της GlcNAc τρανσφεράσης, του ενζύμου που καταλύει την Ο-γλυκοζυλίωση, μεσολαβεί στην δημιουργία των πιο γλυκοζυλιωμένων ισομορφών 41 και 37 kDa της AQP7, πιθανά τις πιο ενεργές, σε μια προσπάθεια να αντιρροπιστεί η δυσλειτουργία των λιποκυττάρων στην παχυσαρκία, που χαρακτηρίζονται από μειωμένη βασική λιπόλυση και διαταραχή στην ομοιόσταση της γλυκόζης, με διατήρηση της εξόδου της γλυκερόλης στην κυκλοφορία, προς αποφυγή της υπερτροφίας. Τα caveolae συνιστούν μικροδομές εντός των πλούσιων σε χοληστερόλη λιπιδικών σχεδιών της ΚΠΜ, που εμπλέκονται στην έναρξη του ΡΙ3Κ/Akt κλάδου του μονοπατιού της ινσουλίνης και παρέχουν την αναγκαία διαμόρφωση της ΚΠΜ για τη σύντηξη των κυστιδίων μεταφοράς του GLUT4. Στην παχυσαρκία η μείωση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στα caveolae, οδηγεί σε υπερτροφία, αναστολή της σηματοδότησης της ινσουλίνης και μειωμένη έκφραση του GLUT4 στα λιποκύτταρα, τα οποία χαρακτηρίζονται από μειωμένη βασική και επαγόμενη από κατεχολαμίνες λιπόλυση. Συνεπώς στους νοσογόνα παχύσαρκους η μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση των 37 και 34 kDa ισομορφών της AQP7 πιθανά αντανακλά την μειωμένη βασική λιπόλυση των υπερτροφικών λιποκυττάρων, τα οποία συν τοις άλλοις έχουν και μειωμένη χοληστερόλη στα caveolae της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Στην παχυσαρκία η συσσώρευση των τριγλυκεριδίων στη λιποσταγόνα επιδεινώνει την ήδη υπάρχουσα υπερτροφία και έχει ως αποτέλεσμα την διαταραχή του μονοπατιού της ινσουλίνης, όπως αποδεικνύεται από την μειωμένη έκφραση του GLUT4 σε όλες τις αποθήκες λιπώδους ιστού και ανεξάρτητα από την ύπαρξη συνοδού ΣΔ ΙΙ ή όχι και μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη συστηματικής αντίστασης στην ινσουλίνη και να αυξήσει τον κίνδυνο για Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ.