Μελέτη της βιολογικής λειτουργίας του ενδοκυττάριου παράγοντα ELAV1 / HuR με χρήση διαγονιδιακών τεχνολογιών επιλεκτικής ρύθμισης
Authors: Κατσάνου Βασιλική 
Published: August 2021

Ο μεταμεταγραφικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί ένα θεμελιώδη ενδοκυττάριο μηχανισμό καθορισμού του ρυθμού της πρωτεϊνοσύνθεσης που αποσκοπεί στην έγκαιρη κυτταρική απάντηση, ενώ παράλληλα συμβάλει στη διατήρηση της ομοιόστασης. Πιο συγκεκριμένα, οι μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν μια σειρά διαδικασιών οι οποίες καθορίζουν τα επιμέρους στάδια του μεταβολισμού του mRNA (σταθερότητα, υποκυτταρικός εντοπισμός, μετάφραση) και ελέγχονται από τις δυναμικές αλληλεπιδράσεις μορίων RNA με ειδικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες που τα αναγνωρίζουν. Η απορρύθμιση των παραπάνω διεργασιών μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογικές κυτταρικές αντιδράσεις, οι οποίες με τη σειρά τους θα αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη παθολογίας, όπως έχει δειχθεί σε περιπτώσεις χρόνιας φλεγμονής και αυτοάνοσων παθολογιών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρωθήκαμε στη μελέτη του λειτουργικού ρόλου μιας ριβονουκλεοπρωτεΐνης η οποία εμπλέκεται στις διαδικασίες του μεταμεταγραφικού ελέγχου και ονομάζεται HuR (ή HuA/Elavl1). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η HuR αλληλεπιδρά με mRNAs τα οποία κωδικοποιούν φλεγμονώδεις παράγοντες, ή παράγοντες που ελέγχουν τις αντιδράσεις του κυττάρου στο στρες. Τα mRNAs αυτά χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός συγκεκριμένου μοτίβου στην 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή τους, το οποίο ονομάζεται στοιχείο πλούσιο σε αδενίνη και ουρακίλη (ARE). In vitro μελέτες υπέδειξαν ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων της έμφυτης ανοσιακής απόκρισης από βακτηριακά και φλεγμονώδη ερεθίσματα προκαλεί την αλληλεπίδραση της HuR με mRNAs κυτταροκινών που περιέχουν ARE στοιχεία. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της σταθερότητας των mRNAs και ακολούθως της μετάφρασης τους. Επιπλέον, κλινικές μελέτες υπέδειξαν ότι η μη φυσιολογική έκφραση της HuR σχετίζεται με σοβαρές παθολογικές αντιδράσεις. Παρ’ όλα αυτά, ο λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης αυτής στον καθορισμό των φυσιολογικών και παθολογικών κυτταρικών αντιδράσεων in vivo ήταν μέχρι σήμερα άγνωστος. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναλύθηκε ο λειτουργικός ρόλος της HuR in vivo, μέσα από την εφαρμογή διαγονιδιακών μεθοδολογιών επιλεκτικής γονιδιακής τροποποίησης στον ποντικό. Στην πρώτη φάση των μελετών μας, αναλύθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης αυτής στη ρύθμιση των έμφυτων ανοσιακών αντιδράσεων μέσα από τη διαγονιδιακή της υπερέκφραση σε διαφοροποιημένους υποπληθυσμούς μακροφάγων και σε χρονικά περιορισμένο πλαίσιο. Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατή η άμεση αποτίμηση της δράση της HuR στη γονιδιακή έκφραση κατά τη φλεγμονώδη απόκριση καθώς και η απευθείας συσχέτιση με την ανάπτυξη φλεγμονώδους παθολογίας in vivo. Σε αντίθεση με τις υπάρχουσες θεωρήσεις, η υπερέκφραση της HuR στα μακροφάγα κύτταρα in vivo, προκάλεσε τη καταστολή της μετάφρασης των mRNAs συγκεκριμένων κυτταροκινών παρά τις διαφορικές αντιδράσεις στο ρυθμό της αποικοδόμησης τους. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένους ποντικούς από τους οποίους υπολείπονται δύο ριβονουκλεοπρωτεΐνες που σχετίζονται άμεσα με τη φλεγμονή- οι ΤΙΑ-1 και ΤΤΡ- καθώς και ένα πρότυπο σύστημα στο οποίο έχει απορυθμιστεί η λειτουργική ικανότητα του ARE στοιχείου, υποδείξαμε την παρουσία μιας ιεραρχίας με ομοιοστατική δράση στον έλεγχο της φλεγμονής. Σύμφωνα με την ιεραρχία αυτή, η πρωτεΐνη HuR συνεργάζεται με το μεταφραστικό καταστολέα ΤΙΑ-1 προκειμένου να μειωθεί η μετάφραση συγκεκριμένων mRNAs κυτταροκινών, πριν αυτά αποικοδομηθούν από τη δράση της πρωτεΐνης ΤΤΡ. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη HuR έχει πλειοτροπική δράση στη φλεγμονή μέσω των λειτουργικών της αλληλεπιδράσεων με συγκεκριμένα υποσύνολα mRNAs και με μεταμεταγραφικούς ρυθμιστές που έχουν κατασταλτική δράση. Αυτές οι μοριακές αλληλεπιδράσεις έχουν άμεσο και ουσιαστικό αντίκτυπο στην ανάπτυξη της φλεγμονής. Σύμφωνα με τις μελέτες μας, η διαγονιδιακή υπερέκφραση της HuR σε μακροφάγα κύτταρα in vivo λειτούργησε ως αντιφλεγμονώδης διαδικασία και κατέστειλε παθολογικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι η εφαρμογή στρατηγικών οι οποίες αποβλέπουν στη θεραπευτική ρύθμιση της HuR θα μπορούσαν να έχουν πιθανό κλινικό όφελος στην αντιμετώπιση της φλεγμονής. Η πλειοτροπική δράση της HuR αναδείχθηκε και μέσα από ένα δεύτερο διαγονιδιακό σύστημα επιλεκτικής απαλοιφής του γονιδίου της, το οποίο δημιουργήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής για την ανάλυση του φυσιολογικού ρόλου αυτής της ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα αυτή, δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένοι ποντικοί που υπολείπονται καθολικά του γονιδίου της HuR. Οι μελέτη των ποντικών αυτών υπέδειξε το βασικό ρόλο της HuR στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και συγκεκριμένα στο στάδιο της γαστριδίωσης και της δημιουργίας του πλακούντα. Τέλος, η κατασκευή του μεταλλαγμένου γονιδιακού τόπου της HuR επιτρέπει την ιστοειδική απαλοιφή της από κυτταρικούς τύπους με σημαντικό παθοφυσιολογικό ρόλο. Τα νέα ζωικά πρότυπα τα οποία δημιουργήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής σε συνδυασμό με μελλοντικές κυτταρικές και μοριακές αναλύσεις αναμένεται ότι (α) θα αποτελέσουν νέα πειραματικά πρότυπα παθολογίας, (β) θα οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων γενετικών δικτύων που εμπλέκονται σε σημαντικές παθολογίες, (γ) θα αποκαλύψουν πιθανούς θεραπευτικούς στόχους και διαγνωστικά εργαλεία και (δ) θα δώσουν βασικές γνώσεις για τους θεμελιώδεις μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.