Ανάπτυξη μικρο-αναλυτικών και διαγνωστικών μεθόδων με χρήση εντυπωμένων μικρορευστονικών αναλυτικών διατάξεων χαρτιού και νανοϋλικών
Authors: Κάππη Φωτεινή 
Published: September 2021

Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων ανίχνευσης και ανάγνωσης σήματος ως εργαλεία για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιοθειολών σε βιολογικά ρευστά που να συνδυάζουν απλότητα στην χρήση, χωρίς ενόργανες τεχνικές ανάλυσης και να χρησιμοποιούν σταθερά και εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια που δεν απαιτούν ειδικές διαδικασίες παρασκευής και προετοιμασίας (όπως στην περίπτωση των ενζυματικών ή ανοσοχημικών μεθόδων).Αρχικά περιγράφεται μια νέα μέθοδος για τον προσδιορισμό των ελεύθερων βιοθειολών σε βιολογικά υγρά εκμεταλλευόμενη μερικές από τις βασικές αρχές της χημείας της πρώιμης φωτογραφίας– που βασίζονταν σε φωτογραφικά υλικά από αλογονίδια του αργύρου - και χρησιμοποιεί ευρέως διαθέσιμες συσκευές απεικόνισης (επίπεδους σαρωτές), ως ανιχνευτές. Συγκεκριμένα, η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των βιοθειολών να δεσμεύον τα ιόντα αργύρου και να διασπούν τους κρυστάλλους αλογονιδίων αργύρου αλλάζοντας έτσι την φωτοευαισθησία του κρυσταλλικού αιωρήματος των αλογονιδίων αργύρου. Οι μεταβολές που προκαλούνται από τις βιοθειόλες, στην ένταση του φωτός που απορροφάται από το εναιώρημα των αλογονιδίων αργύρου μετά από τη φωτοχημική αναγωγή, καταγράφονται με μια απλοποιημένη φωτομετρική προσέγγιση χρησιμοποιώντας έναν επίπεδο σαρωτή. Η συνολική διαδικασία ανάλυσης για τον προσδιορισμό των βιοθειολών ήταν εύκολα εκτελέσιμη, γρήγορη και μπορεί να εφαρμοστεί με φθηνά υλικά και εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια χωρίς την ανάγκη σύνθεσης νέων υλικών. Επιπλέον, επιτρέπει την διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και μη φυσιολογικών επίπεδων βιοθειολών ακόμη και με γυμνό μάτι. Η μέθοδος που αναπτύξαμε εφαρμόστηκε με επιτυχία στον προσδιορισμό βιοθειολών σε δείγματα ούρων και πλάσματος αίματος με όρια ανίχνευσης 10μΜ, ικανοποιητικές ανακτήσεις (92-97%), καλή επαναληψιμότητα (6.7-8.8%) και υψηλή εκλεκτικότητα έναντι άλλων συστατικών των βιολογικών υγρών. Αποδείχθηκε επίσης η χρησιμότητα της μεθόδου για τον προσδιορισμό της αναλογίας ανηγμένων/οξειδωμένων βιοθειολών καθώς και η εφαρμογή της υπό φυσικό φωτισμό, χωρίς εξωτερικές πηγές ενέργειας. Αποδεικνύεται έτσι η δυνατότητα χρήσης της μεθόδου για εφαρμογές στο σημείο χρήσης ή σε εγκαταστάσεις με περιορισμένες δυνατότητες πραγματοποίησης βιοχημικών αναλύσεων (π.χ. αγροτικά ιατρεία).Στη συνέχεια περιγράφεται η ανάπτυξη μικροαναλυτικών διατάξεων χάρτου για τον προσδιορισμό βιοθειολών. Οι διατάξεις που κατασκευάστηκαν είναι φθηνές (καθώς αποτελούνται μόνο από χαρτί και δυσδιάλυτα άλατα αλογονιδίων αργύρου) και η αναλυτική πορεία είναι εύκολα εκτελέσιμη με ελάχιστη τεχνική εμπειρογνωμοσύνη και χωρίς την ανάγκη εξειδικευμένου εξοπλισμού. Ο χρήστης πρσθέτει το εξεταζόμενο δείγμα στην διάταξη, ακτιβοβολεί την περιοχή ανίχενυσης με ακτινοβολία UV και καταγράφει την αλλαγή χρώματος της περιοχής ανίχνευσης χρησιμοποιώντας μια απλή διάταξη απεικόνισης (όπως κάμερα κινητού τηλεφώνου) ή δια γυμνού οφθαλμού. Ο μηχανισμός ανίχνευσης των βιοθειολών βασίζεται στην φωτοδιέγερση που προκαλούν οι βιοθειόλες στους νανοκρυτάλλους χλωριούχου αργύρου που έχουν εναποτεθεί στην επιφάνεια του χαρτιού. Τα φωτοανηγμένα σωματίδια χλωριούχου αργύρου έχουν γκριζωπό χρώμα η ένταης του οποίου που εξαρτάται από τη συγκέντρωση των βιοθειολών στο εξεταζόμενο διάλυμα. Οι διατάξεις δοκιμάστηκαν για την ανίχνευση της συνολικής συγκέντρωσης των βιοθειολών σε δείγματα τεχνητών βιολογικών υγρών καθως και πλάσματος ανθρώπινου αίματος και τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά όσον αφορά την ευαισθησία, την εκλεκτικότητα, τις ανακτήσεις και την επαναληψιμότητα.Τέλος, περιγράφεται μια νέα προσέγγιση για την υλοποίηση ποσοτικών αναλύσεων σε αναλυτικές διατάξεις χάρτου. Η καινοτομία της προσέγγισης βασίζεται στην ενσωμάτωση των αρχών της μεθόδου βαθμονόμησης σταθερής προσθήκης πολλαπλών σημείων σε διατάξεις χάρτου. Συγκεκριμένα, πριν την ανάλυση ενός αγνώστου δείγματος οι περιοχές ανίχνευσης τροποποιούνται με την προσθήκη των αναγκαίων χρωματομετρικών αντιδραστηρίων και γνωστές ποσότητες (πρότυπα διαλύματα) του αναλύτη. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται ένα έγχρωμο προϊόν σε κάθε περιοχή ανίχνευσης. Μετά την προσθήκη του δείγματος, το αναλυτικό σήμα από κάθε περιοχή ανίχνευσης αντιστοιχεί στη συνολική συγκέντρωση του αναλύτη, η οποία είναι το άθροισμα της συγκέντρωσης του αναλύτη στο εξεταζόμενο δείγμα συν τη γνωστή ποσότητα του αναλύτη που έχει προστεθεί προηγουμένως στη διάταξη. Το συνολικό αναλυτικό σήμα που ανακτάται από κάθε ζώνη ανίχνευσης χρησιμοποιείται για την κατασκευή μιας καμπύλης βαθμονόμησης σταθερής προσθήκης από την οποία υπολογίζεται η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο δείγμα χρησιμοποιώντας γραμμικά ή μη γραμμικά μοντέλα (δηλ., πολυώνυμα πρώτης και υψηλότερης τάξης). Αυτή η νέα προσέγγιση απλοποιεί την ανάλυση καθώς δεν απαιτείται η επί τόπου βαθμονόμηση της μεθόδου, η οποία συνήθως πραγματοποιείται με την ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων που πρέπει να προετοιμαστούν ή να μεταφερθούν επί τόπου. Παράλληλα, μειώνει την επίδραση παρεμποδίσεων από τη μήτρα του υποστρώματος του δείγματος, από την ανομοιογένεια του χάρτου και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Η μέθοδος αυτή αναπτύχτηκε αρχικά με σκοπό την ανάλυση βιοθειολών όμως θεωρήθηκε σκόπιμη η περαιτέρω μελέτη και διερεύνηση των δυνατοτήτων αλλά και των περιορισμών της, χρησιμοποιώντας, μεθόδους που βασίζονται σε διαφορετικές αντιδράσεις και μηχανισμούς. Για τον λόγο αυτό εξετάστηκε (πλέον της ανάλυσης βιοθειολών με χρήση της φωτοχημικής αναγωγής αλογονιδίων το αργύρου) και σε πέντε μεθόδους (για τον προσδιορισμό σιδήρου, πρωτεϊνών, υπεροξειδίου του υδρογόνου, οξικού οξέος και ανθρακικών) οι οποίες βασίζονται σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης, οξείδωσης και εξουδετέρωσης. Με τον τρόπο αυτό αναδείχθηκαν όλες οι πτυχές της μεθόδου η οποία αποτελεί την πρώτη εφαρμογή της μεθόδου πολλαπλής σταθερής προσθήκης ειδικά σχεδιασμένης για αναλυτικές διατάξεις χάρτου και αναδεικνύει τη χρήση της για εφαρμογές στο σημείο χρήσης.