Μοριακοί μηχανισμοί της αγγειογένεσης
Authors: Μπέλλου Σοφία 
Published: August 2021

Τα μέλη της οικογένειας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) αποτελούν τους πιο σημαντικούς παράγοντες στην αγγειακή διαφοροποίηση και αγγειογένεση. Η υπερέκφραση του VEGF παίζει σημαντικό ρόλο στην δημιουργία παθολογικής αγγειογένεσης ανατρέποντας την ισορροπία διεγερτών και αναστολέων της. Πράγματι, οι περισσότεροι καρκίνοι εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα το mRNA του VEGF-A, γεγονός το οποίο έχει σημαντική προγνωστική σημασία για την έκβαση του όγκου και επηρεάζει τις θεραπευτικές επιλογές. Οι υποδοχείς του VEGF-A έχουν δραστικότητα τυροσινικής κινάσης και φωσφορυλιώνουν δευτερογενείς διαμεσολάβητες, οι οποίοι μετάγουν το σήμα στον πυρήνα, όπου και τροποποιούν το μεταγραφικό πρόγραμμα. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας ελέγχθηκε η έκφραση 22,000 γονιδίων σε ενδοθηλιακά κύτταρα παρουσία VEGF-A. Μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίστηκαν από τον VEGF-A, αναγνωρίστηκαν για πρώτη φορά δύο φωσφατάσες διπλής εξειδίκευσης (Dual Specificity Phosphatases, DUSPs), οι DUSP1 και DUSP5. Οι DUSPs ρυθμίζουν τη δραστικότητα των MAP κινασών μέσω αποφωσφορυλίωσης του «ΤΧΥ-μοτίβου» και παρουσιάζονται ως ιδιαιτέρως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης των MAP κινασών. Δείξαμε ότι η DUSP1 εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ η DUSP5 είναι αποκλειστικά πυρηνική πρωτεΐνη. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση του VEGF-A στα πρωτεϊνικά επίπεδα της DUSP1. Ο VEGF-A προκάλεσε την αύξηση της πρωτεΐνης DUSP1 φτάνοντας στο μέγιστο επίπεδο μετά από 2 ώρες και παρουσιάζοντας μία ασθενή ύφεση στη συνέχεια. Ωστόσο, πειράματα με αναστολέα της πρωτεϊνοσύνθεσης έδειξαν ότι η παρουσία του VEGF-A επιτάχυνε και την αποδόμηση της DUSP1. Έτσι λοιπόν μπορούμε να καταλήξουμε στο συμπέρασμα ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα της DUSP1 μετά την προσθήκη του VEGF-A είναι το αποτέλεσμα της ισορροπίας μεταξύ της πρωτεϊνοσύνθεσης, η οποία ακολουθεί τη μεταγραφική επαγωγή του γονιδίου DUSP1, και της πρωτεολυτικής αποδόμησης που ακολουθεί την αλληλεπίδραση των ΜΑΡΚ με την DUSP1. Καθώς οι ΜΑΡΚ αποτελούν βασικά μόρια στη σηματοδότηση από τον VEGF-A, ελέγξαμε τον πιθανό ρόλο της μεταγραφικής ενεργοποίησης των DUSP1 και DUSP5 από τον VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό μολύναμε ενδοθηλιακά κύτταρα με αδενοϊους που εκφράζουν είτε τις αγρίου τύπου DUSP1 and DUSP5 είτε τις καταλυτικά ανενεργές (αρνητικά επικρατούσες) μορφές αυτών και ελέγξαμε την επίδρασή τους στην από τον VEGF-A επαγόμενη φωσφορυλίωση των ρ38 και ERK1/2 ΜΑΡΚ. Τα πειραματικά δεδομένα προβάλλουν την DUSP1 ως κύρια, αν όχι τη μόνη, φωσφατάση διπλής εξειδίκευσης για τη ρύθμιση της από τον VEGF επαγόμενης φωσφορυλίωσης της ρ38 ΜΑΡΚ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η DUSP5 παίζει σημαντικό ρόλο στην αποφωσφορυλίωση των φωσφο-ΕΙΙΚ1/2, αν και η συνεισφορά και άλλων φωσφατασών θεωρείται πιθανή. Ωστόσο, η DUSP5 προκαλεί έντονη πυρηνική αγκυροβόληση και συσσώρευση των απενεργοποιημένων ERK1/2 στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό η DUSP5 αποσύρει τις ERK1/2 από τους κυτταροπλασματικούς διεγέρτες ΜΕΚ1/2, έτσι ώστε να μην είναι διαθέσιμες για παραπέρα ενερφοποίηση από τον VEGF-A συνεισφέροντας στο τερματισμό της μετάδοσης σήματος από τις ERK1/2 ΜΑΡΚ. Σε συμφωνία με τη ρύθμιση της δραστικότητας των ΜΑΡΚ από τις DUSPs δείξαμε ότι η DUSP1 παίζει καθοριστικό ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ η DUSP5 ρυθμίζει τον επαγόμενο από τον VEGF-A κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τέλος, εξετάσαμε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΜΑΡΚ και DUSP σε ζωντανά ενδοθηλιακά κύτταρα. Πειράματα μικροσκοπίας απεικόνισης χρόνου ζωής φθορισμού (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) και φασματοσκοπίας σχετικού συσχετισμού φθορισμού (Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy (FCCS) έδειξαν ότι οι φωσφατάσες DUSP1 και DUSP5 αλληλεπιδρούν με τις ΜΑΡΚ ρ38 και ERK2, αντίστοιχα. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η ισχύς των αλληλεπιδράσεων DUSPl/p38 και DUSP5/ERK2 μετρώντας την σταθερά διάστασης (Kd) τους, αλλά και η επίδραση της χορήγησης του VEGF-A στην Kd. Η παρουσία του VEGF-A επηρεάζει με διαφορετικό τρόπο τις παραπάνω αλληλεπιδράσεις στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα σύμπλοκα DUSPl/p38 και DUSP5/ERK2 συμπεριφέρονται διαφορετικά μετά από την επαγωγή των κυττάρων. Στην περίπτωση της αλληλεπίδρασης DUSP5/ERK2 η κινητική της Kd στον πυρήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά από χορήγηση VEGF-A είναι συμβατή με την πυρηνικής αγκυροβόληση που εξασκεί η DUSP5 στην ERK1/2. Καταλήγουμε, λοιπόν, στο συμπέρασμα ότι η επαγωγή των DUSP1 και DUSP5 φωσφατασών από τον VEGF-A χρησιμοποιείται ως μηχανισμός αυτορύθμισης που ελέγχει το βαθμό ενεργοποίησης των σηματοδοτικών καταρρακτών των ERK1/2 και ρ38 ΜΑΡΚ από τον ίδιο αυξητικό παράγοντα και ως εκ τούτου τη ρύθμιση των αγγειογενετικών αποκρίσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση.