Μελέτη μοριακών δεικτών βλαστικών κυττάρων στο γυναικολογικό καρκίνο
Authors: Παπαμίχος Σπύρος 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η αξιόπιστη μελέτη έκφρασης των δύο εναλλακτικών ισομορφώντου γονιδίου OCT4 καθώς και του γονιδίου NANOG σε πρωτοπαθείς όγκους των ωοθηκών και τουενδομητρίου· έγινε προσπάθεια αναγνώρισης συσχέτισης μεταξύ της OCT4/ NANOG γονιδιακήςέκφρασης και της ιστολογικής διαβάθμισης των όγκων.Επιμέρους στόχο αποτέλεσε η διερεύνηση, εμμέσως, της πιθανής συμμετοχής της OCT4B-265πρωτεΐνης στη διεργασία της ογκογένεσης· οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο αλλήλιο(G) τουπολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 δεν δύνανται να εκφράσουν την OCT4B-265πρωτεΐνη. Πραγματοποιήθηκε μελέτη ασθενών-μαρτύρων επικεντρωμένη στην αναζήτηση τηςδύναμης συσχέτισης μεταξύ του GG γονότυπου και της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μηκαρκίνου των ωοθηκών.Υλικά και ΜέθοδοιΣτη μελέτη έκφρασης των 2 ισομορφών του γονιδίου OCT4 και του γονιδίου NANOG περιελήφθησαν79, μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης, αρχειακά δείγματα.Συγκεκριμένα, 46 πρωτοπαθείς επιθηλιακοί ορώδεις ωοθηκικοί όγκοι (28 κακοήθεις και 18 οριακήςκακοήθειας), 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα του ενδομητρίου (10 ΙΒΚ Ι, 12 ΙΒΚ ΙΙ, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ)καθώς και 9 δείγματα από μοροφολογικά μη νεοπλασματικούς παρακείμενους ιστούς (5 ωοθηκικοί και4 ενδομητρίου). Κατασκευάστηκαν συνολικά 7 νέοι κύβοι παραφίνης που περιελάμβαναν, σεμικροσυστοιχίες (ΤΜΑ), ιστικούς κυλίνδρους από τα διαθέσιμα δείγματα (4 ΤΜΑ κύβοι για τους 46ορώδεις ωοθηκικούς όγκους και 3 ΤΜΑ κύβοι για τα 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα τουενδομητρίου). Ελήφθησαν τουλάχιστον 3 ιστικοί κύλινδροι ανά δείγμα, διαμέτρου 1.5 mm. Για τοσύνολο των δειγμάτων, η εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε από τις τομές των μικροσυστοιχιών. Γιατις RT-PCR αντιδράσεις, σχεδιάστηκαν απολύτως ειδικοί ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές. Ωςμάρτυρας για την ποιότητα του RNA και του αντίστοιχου cDNA, ενισχύθηκε τμήμα του μετάγραφουτου γονιδίου της β-ακτίνης. Για τις OCT4A και NANOG PCR αντιδράσεις ως θετικός εσωτερικόςμάρτυρας χρησιμοποιήθηκε RNA που εκχειλίστηκε από ιστικό τεμάχιο σεμινώματος όρχεως. Για τηνOCT4B PCR αντίδραση χρησιμοποιήθηκε RNA που εκχειλίστηκε από μονοκύτταρα περιφερικούαίματος. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε τομές πάχους 2 μm, που ελήφθησαν από τους TMAκύβους παραφίνης, με τη χρήση των αντισωμάτων sc-5279 (anti-OCT4A) και sc-25401 (anti-OCT4B).Αξιολογήθηκαν, επιμέρους, η κυτταροπλασματική και η πυρηνική ανοσοϊστοχημική θετικότητα. Όσοναφορά στην OCT4A πρωτεΐνη, ως θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με, τουλάχιστον ήπιας έντασης,πυρηνική θετικότητα σε ποσοστό άνω του 10% των νεοπλασματικών κυττάρων, ως προτείνεται από τιςπλέον έγκυρες δημοσιεύσεις.Στη μελέτη του πολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 περιελήφθησαν 100 δείγματαπεριφερικού αίματος από γυναίκες στις οποίες είχε προηγουμένως διαγνωσθεί πρωτοπαθής όγκοςεπιφανειακού επιθηλίου-στρώματος ωοθηκών καθώς και 324 δείγματα περιφερικού αίματος απόενήλικες γυναίκες με ατομικό αναμνηστικό ελεύθερο για νεοπλασματική νόσο των ωοθηκών. Από ταδείγματα περιφερικού αίματος εκχειλίστηκε DNA και επακολούθησε μελέτη του πολυμορφισμούrs3130932 με ανάλυση του μήκους των περιοριστικών θραυσμάτων του PCR προϊόντος. Η δύναμη τηςσυσχέτισης μεταξύ της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών και τουγονοτύπου (TT/TG/GG) κατεδείχθει με τον υπολογισμό του λόγου πιθανοτήτων σχετικώνενδεχοµένων μετά 95% διαστημάτων εµπιστοσύνης.ΑποτελέσματαRT-PCR μελέτη: Από σύνολο 79 ιστολογικών παρασκευασμάτων, έκφραση mRNA της ισομορφήςOCT4A παρατηρήθηκε σε 28 νεοπλασματικά δείγματα καθώς και σε 1 μη νεοπλασματικό,παρακείμενο των όγκων, ιστό. Αξιοσημείωτο είναι το ότι το μη νεοπλασματικό δείγμα παρουσίαζεσημαίνουσα γειτνίαση με έναν κακοήθη ορώδη όγκο. Έκφραση mRNA της ισομορφής OCT4Βπαρατηρήθηκε σε 19 νεοπλασματικά δείγματα. NANOG γονιδιακή έκφραση παρατηρήθηκε, σχεδόν,επί του συνόλου των δειγμάτων της μελέτης και ανεξαρτήτως των ιστολογικών τους χαρακτηριστικών(όγκοι και μη νεοπλασματικοί, παρακείμενοι των όγκων, ιστοί). Χρήζει αναφοράς το ότι η έκφρασητων OCT4A/OCT4Β/ NANOG μεταγράφων στα δείγματα της μελέτης ήταν σημαντικά χαμηλότερησυγκρινόμενη με την αντίστοιχη των ενδογενών μαρτύρων γονιδιακής έκφρασης. Έκφραση mRNAτων ισομορφών OCT4A και OCT4B παρατηρήθηκε περισσότερο συχνά στα ωοθηκικά δείγματα έναντιτων δειγμάτων του ενδομητρίου (P value= 0.0283 και P value= 0.0025, αντιστοίχως).Η συσχέτιση της παράλληλης έκφρασης των 2 ισομορφών ανεδείχθη ως στατιστικά σημαντική (Pvalue= 0.0086). Ταυτόχρονη έκφραση mRNA των δύο ισομορφών παρατηρήθηκε σε 11 από τα 28 δείγματα κακοηθώνεπιθηλιακών ορωδών ωοθηκικών όγκων (39.3%), σε 3 από τα 18 δείγματα επιθηλιακών ορωδώνωοθηκικών όγκων οριακής κακοήθειας (16.67 %) καθώς και σε 1 ΙΒΚ III (4.17%) από τα 24 δείγματαενδομητριοειδών αδενοκαρκινωμάτων, ενώ δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα 9 δείγματα μηνεοπλασματικών, παρακείμενων των όγκων, ιστών. Ως ιδίως σημαίνουσα θεωρήθηκε η ανάδειξηθετικής συσχέτισης για την παράλληλη έκφραση mRNA των ισομορφών OCT4A και OCT4Β στουςκακοήθεις επιθηλιακούς ορώδεις ωοθηκικούς όγκους (P value= 0.0044).Μελέτη Ανοσοϊστοχημείας:Μόνο 2 κακοήθεις επιθηλιακοί ορώδεις ωοθηκικοί όγκοι παρουσίασαν θετικότητα για την πρωτεΐνηOCT4A (πυρηνική και κυτταροπλασματική, αντιστοίχως).Κυτταροπλασματική θετικότητα για την πρωτεΐνη OCT4Β παρατηρήθηκε σε 76 από τα 79 διαθέσιμαδείγματα. Πυρηνική θετικότητα παρατηρήθηκε σε 15 από τους 46 πρωτοπαθείς επιθηλιακούς ορώδειςωοθηκικούς όγκους, σε 6 από τα 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα καθώς και σε 3 από τους 9 μηνεοπλασματικούς, παρακείμενων των όγκων, ιστούς.Μελέτη ασθενών-μαρτύρων:Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική δύναμη συσχέτισης μεταξύ της σχετικής πιθανότηταςανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών και του GG γονότυπου.ΣυμπεράσματαΠαρατηρήθηκε χαμηλή σχετική έκφραση mRNA των OCT4A και OCT4B ισομορφών, κύρια σεκακοήθεις ωοθηκικούς όγκους καθώς και σε καρκινώματα ενδομητρίου υψηλού βαθμού ιστολογικήςκακοήθειας, η οποία αντανακλά, πιθανώς, την ύπαρξη εντός του όγκου ενός κυτταρικούυποπληθυσμού με χαρακτήρες πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων. Η παράλληλη mRNA έκφρασητων δύο ισομορφών πιθανόν να συσχετίζεται με το βαθμό της ιστολογικής κακοήθειας.Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας βρέθηκαν να μην συνάδουν με τα αντίστοιχα αποτελέσματατης γονιδιακής έκφρασης. Δεν ανιχνεύτηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα για την OCT4Aπρωτεΐνη σε κανέναν από τους όγκους που παρουσίαζαν OCT4A γονιδιακή έκφραση· μη γνωστοί, έωςσήμερα, μοριακοί μηχανισμοί μετα-μεταγραφικής/ μετα-μεταφραστικής ρύθμισης, πιθανόν νααναστέλλουν την παραγωγή της OCT4A πρωτεΐνης. Αξιοσημείωτο είναι το ότι τα sc-5279 και sc-25401 αντι- OCT4 αντισώματα δυνατόν να ανιχνεύουν πεπτίδια που κωδικοποιούνται από τα OCT4ψευδογονίδια καθώς και πεπτίδια μη σχετιζόμενα με το γονίδιο OCT4,αντιστοίχως.Χαμηλή έκφραση NANOG mRNA έκφραση παρατηρήθηκε , σχεδόν, επί του συνόλου των δειγμάτωντης μελέτης, τόσο σε όγκους όσο και σε μη νεοπλασματικούς, παρακείμενων των όγκων, ιστούς. Το ωςάνω προφίλ έκφρασης τεκμηριώθηκε πρόσφατα στη διεθνή βιβλιογραφία. Χρήζει αναφοράς το ότιπρόσφατα κατεδείχθει πως κύριο ρυθμιστή του υψηλού δυναμικού αυτό-ανανέωσης και τηςπολυδυναμίας των καρκινικών βλαστικών κυττάρων συνιστά η πρωτεΐνη NANOGP8, αντί τηςNANOG ως πρότερα θεωρούνταν.Οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο (G) αλλήλιο του SNP rs3130932 δεν παρουσιάζουν μεγαλύτερη ήμικρότερη σχετική πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση τόσο με τους ομοζυγώτεςγια το κυρίαρχο αλλήλιο (TT γονότυπος) όσο και με τους ετεροζυγώτες (TG γονότυπος). Οι OCT4B-265 και OCT4B1 πρωτεϊνικές ισομορφές, πιθανόν να μη μετέχουν στη διεργασία της ογκογένεσης.