Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός της απόπτωσης και ποσοτική εκτίμηση αυτής σε νεκροτομικό υλικό μυοκαρδίου
Authors: Τσίπης Άγγελος 
Published: July 2014

ΕΙΣΑΓΩΓΗ : Σημαντική εξέλιξη έχει επιτευχθεί, τα τελευταία χρόνια, στον καθορισμό του ρόλου της απόπτωσης στις καρδιαγγειακές παθήσεις καθώς και στη διαλεύκανση των αποπτωτικών μοριακών μηχανισμών στα μυοκαρδιακά κύτταρα. Η βαθμιαία και σταθερή απώλεια των μυοκαρδιακών κυττάρων αποτελεί σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα της καρδιακής ανεπάρκειας. Η διερεύνηση της απόπτωσης στο καρδιαγγειακό σύστημα είναι ύψιστης σημασίας, αφού η παρεμπόδιση της αποπτωτικής διαδικασίας μπορεί να αποτελέσει βασικό θεραπευτικό εργαλείο στην αντιμετώπιση διάφορων καρδιαγγειακών παθήσεων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση και ανάδειξη των αποπτωτικών μηχανισμών σε περιπτώσεις εμφράγματος του μυοκαρδίου και διατατικής μυοκαρδιοπάθειας και ο συσχετισμός τους με την καρδιακή λειτουργία.ΥΛΙΚΟ – ΜΕΘΟΔΟΙ: Μελετήθηκαν 40 περιπτώσεις νεκροτομικού υλικού μυοκαρδίου με αλλοιώσεις προσφάτου εμφράγματος (ομάδα Α1), 40 περιπτώσεις με αλλοιώσεις παλαιού εμφράγματος (ομάδα A2), 40 περιπτώσεις με αλλοιώσεις διατατικής μυοκαρδιοπάθειας (ομάδα B) και 30 περιπτώσεις μάρτυρες όπου είχε αποκλεισθεί η ύπαρξη καρδιακής νόσου (ομάδα Γ). Όλες οι περιπτώσεις εξετάσθηκαν με τη συμβατική παθολογοανατομική μέθοδο σε τομές παραφίνης και με χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης. Επιπλέον εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος δύο βημάτων με τη χρήση των αντισωμάτων Bax (Polyclonal Rabbit, Dako, Denmark), αραίωση 1:500, Bak (Polyclonal Rabbit, Dako, Denmark), αραίωση 1:100, Bcl-xL (clone NC1 FP, Novocastra, Newcastle, upon Tyne, U.K), αραίωση 1:50, Bcl-2 (clone 100/D5) (Dakopatts, Glostrup, Denmark), αραίωση 1:50, p53 (clone DO-7, Dakopatts, Glostrup, Denmark), αραίωση 1:100. Η ανοσοïστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών p53, bcl-2, bclxL, Bax, Bak ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος Histoscore (HSC), που κυμαινόταν από 0 έως 12 βαθμούς, και υπολογίστηκε από το γινόμενο του βαθμού του ποσοστού θετικών κυττάρων (0-5%=0, 5-25%=1, 26-50%=2, 51-75%=3 και 76-100%=4) με το βαθμό της έντασης της χρώσης (1=ήπια, 2=μέτρια και 3=έντονη ανοσοέκφραση).160ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα περισσότερα δείγματα διατατικής μυοκαρδιοπάθειας παρουσίασαν έντονη ανοσοέκφραση για το p53 (50% των δειγμάτων) συγκριτικά με τους μάρτυρες στους οποίους υπήρχε ήπια ανοσοέκφραση p53 (46% των δειγμάτων). Η ανοσοέκφραση για bcl-2, bclxL, Bax, Bak ήταν πιο ομοιογενής. Τα περισσότερα δείγματα διατατικής μυοκαρδιοπάθειας παρουσίασαν έντονη ανοσοέκφραση για τα Bax, Bak (58%-55% των δειγμάτων, αντίστοιχα) συγκριτικά με τους μάρτυρες στους οποίους υπήρχε ήπια ανοσοέκφραση Bax, Bak (50%-43% των δειγμάτων, αντίστοιχα) Ήπια ανοσοέκφραση για bcl-2 και bclxL παρατηρήθηκε στο 70% και 68% αντίστοιχα των περιπτώσεων της διατατικής μυοκαρδιοπάθειας, ενώ παρατηρήθηκε αρνητική έκφραση στο 60%-65% αντίστοιχα των μαρτύρων. Η ανοσοχρώση για bcl-2 και bclxL γενικά ήταν ήπια και ομοιογενής στη διατατική μυοκαρδιοπάθεια, όπως και στους μάρτυρες με θετική έκφραση.Στις περιπτώσεις εμφράγματος του μυοκαρδίου, έντονη ανοσοέκφραση για Bcl-xL και Bcl-2 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις οξέος εμφράγματος, ενώ ήταν ήπια στις απομακρυσμένες περιοχές. Το Bcl-xL και το Bcl-2 δεν εκφράσθηκαν σε εμφραγματικές περιοχές στις περιπτώσεις οξέος εμφράγματος. Σε περιπτώσεις παλαιού εμφράγματος στα υγιή μυοκύτταρα παρατηρήθηκε ήπια έκφραση Bcl-xL και Bcl-2, ενώ στους μάρτυρες η έκφραση ήταν ήπια ή αρνητική. Χαμηλή έκφραση των Bax, bak, p53 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις οξέος εμφράγματος. Το Bax εκφράσθηκε στην εμφραγματική περιοχή. Αυξημένη έκφραση των Bax, bak και του p53 παρατηρήθηκε σε υγιή μυοκύτταρα στη ζώνη κινδύνου που περιβάλλει την εμφραγματική περιοχή σε περιπτώσεις παλαιού εμφράγματος. Χαμηλή έκφραση των Bax, bak, p53 παρατηρήθηκε στους μάρτυρες.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Στη διατατική μυοκαρδιοπάθεια η καρδιακή ανεπάρκεια και η δυσλειτουργία των κοιλοτήτων της καρδιάς θέτουν τα μυοκαρδιακά κύτταρα απέναντι σε αυξημένο διαστολικό φορτίο και σε υψηλά επίπεδα τάσης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της διαδικασίας της απόπτωσης. Από την άλλη πλευρά η αυξημένη έκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών πιθανώς αντιπροσωπεύει το μηχανισμό άμυνας κατά της προοδευτικής απώλειας μυοκαρδιακών κυττάρων λόγω απόπτωσης και161στα πρώτα στάδια της καρδιακής ανεπάρκειας στοχεύει στην επιβράδυνση της εξέλιξης της νόσου. Στην οξεία ισχαιμία τίθενται σε δράση οι αντιαποπτωτικοί παράγοντες που αποτελούν και σε αυτήν την περίπτωση μηχανισμό άμυνας και επιβίωσης του μυοκαρδιακού κυττάρου. Σε αντίθεση, στη χρόνια ισχαιμία, υπερισχύουν οι προαποπτωτικοί παράγοντες, πιθανώς, γιατί εξαντλούνται τα ενεργειακά αποθέματα και οι μηχανισμοί άμυνας του κυττάρου. Επομένως, τόσο στην καρδιακή ανεπάρκεια, όσο και στην ισχαιμία του μυοκαρδίου, η υπεροχή των αντιαποπτωτικών ή προαποπτωτικών παραγόντων παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση του μυοκυττάρου ή στην επιτάχυνση της κυτταρικής βλάβης.