Εκτίμηση των επιπτώσεων χημικών παραγόντων με ιδιαίτερο περιβαλλοντικό ενδιαφέρον στο μοντέλο οργανισμό zebrafish (Danio rerio)
Authors: Χουσίδης Ιερεμίας 
Published: November 2022

Τα νανοϋλικά είναι μια κατηγορία υλικών με μοναδικές ιδιότητες και πολλά υποσχόμενα χαρακτηριστικά καθώς και πολλές εφαρμογές στους τομείς της υγείας, της τεχνολογίας και των περιβαλλοντικών επιστημών. Τα τελευταία χρόνια, μια συγκεκριμένη κατηγορία νανοϋλικών, οι νανοκουκκίδες άνθρακα (Carbon NanoDots, CNDs) έχουν τραβήξει την προσοχή της επιστημονικής κοινότητας και τα επόμενα χρόνια αναμένεται να αντικαταστήσουν τις κουκκίδες άνθρακα που προκύπτουν από βαρέα μέταλλα. Σε αντίθεση με τις κβαντικές κουκκίδες βαρέων μετάλλων, οι CNDs προκύπτουν από φυσικές, μη τοξικές πρώτες ύλες ή καθαρές χημικές ουσίες αποτελούμενες από βασικά στοιχεία (άνθρακα, υδρογόνο, οξυγόνο, άζωτο, θείο κ.α.) διατηρώντας, παράλληλα, όλα τα πλεονεκτήματα των συμβατικών κουκκίδων. Παρόλο, όμως, που οι CNDs θεωρούνται ως πιο φυσικά, μη τοξικά υλικά έναντι των κουκκίδων των βαρέων μετάλλων, υπάρχει η ανάγκη για μελέτη των επιπτώσεων τους, στους οργανισμούς και το περιβάλλον καθώς όπως φαίνεται, τα επόμενα χρόνια θα χρησιμοποιούνται ευρέως. Οι παραπάνω νανοκουκίδες άνθρακα αποτελούν ένα μέρος της διατριβής.Ένα άλλο μέρος της διδακτορικής διατριβής αφορά την τοξικότητα των αλογονομένων βενζοκινονών. Οι ενώσεις αυτές προκύπτουν υπό την επίδραση του υποχλωριώδους νατρίου στην οργανική ύλη που υπάρχει στο νερό. Η χλωρίωση του νερού αποτελεί, εδώ και πολλά χρόνια, μία επιτυχημένη μέθοδο απολύμανσης και προστασίας της δημόσιας υγείας. Μέσω της χλωρίωσης απομακρύνονται από αυτό παθογόνοι μικροοργανισμοί ώστε αυτό να καταστεί ασφαλές. Ωστόσο, η χλωρίωση οδηγεί στη δημιουργία παραπροϊόντων που δυνητικά αποτελούν κίνδυνο για την δημόσια υγεία. Σε αυτά τα προϊόντα ανήκουν οι αλογονοβενζοκινόνες, όπως διχλωρο-. τριχλωρο-, διχλωροβρωμο-βενζοκινόνες κ.α, με ενδείξεις καρκινογόνου δράσης και πρόκλησης δερματικών ασθενειών στον άνθρωπο, σε εγκαταστάσεις όπως κολυμβητήρια. Αν και τέτοιου είδους χημικοί παράγοντες παράγονται στο χλωριωμένο νερό λόγω της απολύμανσης, μέχρι πρόσφατα δεν ήταν δυνατή η ανίχνευσή τους. Αυτό, τελικά, έγινε πραγματικότητα λόγω των εξελίξεων στη σύγχρονη χημική οργανολογία (π.χ. φασματομετρία μάζας). Οι πρώτες μελέτες τοξικότητας των ενώσεων αυτών εγείρουν ανησυχία και υπάρχει ανάγκη για μελέτη της τοξικότητάς τους στους οργανισμούς. Οι μελέτες αυτές κάνουν λόγο για καρκινογόνο δράση και πρόκληση δερματικών ασθενειών στον άνθρωπο σε εγκαταστάσεις όπως κολυμβητήρια.Για την μελέτη της τοξικότητας διαφόρων χημικών παραγόντων τα τελευταία 20 χρόνια, μεταξύ άλλων, χρησιμοποιούνται οι ιχθύες. Οι ιχθύες προτιμώνται έναντι άλλων οργανισμών μοντέλων καθώς η χρήση τους συνοδεύεται από σημαντικά πλεονεκτήματα. Με την μελέτη της τοξικότητας στους ιχθύες δίνεται η δυνατότητα να μελετηθούν οι διαταραχές που προκαλούνται σε έναν ανώτερο οργανισμό και να προκύψουν ασφαλή συμπεράσματα αναφορικά με τις επιπτώσεις διαφορών χημικών παραγόντων.Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη της τοξικότητας δυο σημαντικών και αναδυόμενων χημικών παραγόντων: α) των νανοκουκκίδων άνθρακα (CNDs) και β) των αλογονοβενζοκινονών. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκαν οι διαταραχές στην εμβρυική ανάπτυξη του zebrafish μετά από την έκθεση σε νανοκουκκίδες άνθρακα (CNDs) καθώς και στην 2,6-διχλωρο-3-υδροξυ-1,4-βενζοκινόνη (2,6-DCBQ-OH). Διερευνήθηκαν οι επιπτώσεις όσο αφορά την ανάπτυξη, τη συμπεριφορά και συγκεκριμένες μεταβολικές διεργασίες.Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε στο επίκεντρο μελέτης δύο ομάδες χημικών παραγόντων. Πέρα από τα συμπεράσματα που προέκυψαν για τις ομάδες αυτές, σκοπός ήταν να προκύψει μια ακολουθία διαδικασιών και πειραματικών τεχνικών που θα χρησιμοποιείται από επιστήμονες και φορείς που προβαίνουν στην εκτίμηση τοξικότητας διαφόρων ουσιών.Οι νανοκουκκίδες άνθρακα (CNDs) που χρησιμοποιήθηκαν συντέθηκαν από απλές οργανικές πρόδρομες ενώσεις (κιτρικό οξύ, γλυκόζη) ως η βασική πηγή άνθρακα. Συνολικά, έγινε σύνθεση τριών παραλλαγών των εξεταζόμενων ουσιών: Non doped (χωρίς ένθεση), Ν-doped (ένθεση με άζωτο), N,S-doped (ένθεση με άζωτο και θείο). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, αποδείχθηκε πως η έκθεση στις CNDs οδήγησε σε τοξικότητα κατά την εμβρυική ανάπτυξη, προκάλεσε μορφολογικές ανωμαλίες, μείωση του ρυθμού αύξησης και διαταραχές στην συμπεριφορά των ατόμων zebrafish. Η τοξικότητα των CNDs αυξανόταν με την ένθεση με άζωτο (N) και θείο (S). Η τοξικότητα αυξανόταν, επιπλέον και με την αύξηση της συγκέντρωσης. Οι τιμές για τις θνησιγόνες δόσεις για το 50% των ατόμων για το κάθε υλικό, βρέθηκαν στα 584,48 μg/mL, 399,95 μg/mL, 149,92 μg/mL για τις Non doped CNDs, N-doped CNDs και N,S-doped CNDs, αντίστοιχα. Οι τιμές αυτές χαρακτηρίζονται ως υψηλότερες σε σχέση με τις τιμές τοξικότητας των νανοκουκκίδων βαρέων μετάλλων(οι μελετώμενες CNDs προκαλούν χαμηλότερη θνησιμότητα). Η χαμηλότερη τοξικότητα των CNDs που μελετήθηκαν, πιθανά να οφείλεται στο ότι πρόκειται για υλικά των οποίων η σύνθεση προκύπτει από απλά και φυσικά, μη τοξικά υλικά. Οι μορφολογικές ανωμαλίες που παρατηρήθηκαν στα άτομα zebrafish κατά την διάρκεια της έκθεσης στα CNDs αυξανόταν κατά την ένθεση με άζωτο (N) και θείο (S) και με την αύξηση της συγκέντρωσης των διαλυμάτων, όπως ακριβώς αυξανόταν η θνησιμότητα. Επιπλέον, η έκθεση στις CNDs προκάλεσε σοβαρή μείωση του ρυθμού αύξησης, το οποίο συνδέθηκε με τα χαμηλά ποσοστά επιβίωσης μετά το πέρας της έκθεσης. Τα αποτελέσματα από τον έλεγχο της επίδρασης της έκθεσης στην συμπεριφορά των ατόμων zebrafish έδειξαν ότι τα άτομα εμφάνιζαν υπερδραστηριότητα. Μετά την έκθεση στις νανοκουκκίδες με την μεγαλύτερη τοξικότητα (N,S-doped CNDs) παρατηρήθηκε πολύ υψηλή κινητικότητα των εκτεθειμένων ατόμων, ακολουθούσαν τα εκτεθειμένα άτομα στις νανοκουκκίδες με μεσαία τοξικότητα (N-doped CNDs) και τελευταία σε κινητικότητα βρέθηκαν τα εκτεθειμένα άτομα στις λιγότερο τοξικές νανοκουκκίδες (Non doped CNDs). Η μελέτη της τοξικότητας της 2,6-DCBQ διεξήχθηκε μετά την μελέτη της σταθερότητας της ένωσης. Έγιναν μελέτες σχετικά για τον έλεγχο της σταθερότητας της ένωσης και εξετάστηκαν οι περιβαλλοντικοί παράμετροι που οδηγούν στην μετατροπή της 2,6-DCBQ στην υδροξυλιωμένη μορφή (2,6-DCBQ-OH). Εξετάστηκαν διαφορετικές συνθήκες φωτισμού, διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας και διαφορετικές τιμές pH. Ενδεικτικά διαπιστώθηκε ότι η 2,6-DCBQ εντός 2 ωρών μετατρέπεται στην υδροξυλιωμένη της μορφή, 2,6-DCBQ-OH. Αποδείχθηκε ότι η υδροξυλιωμένη μορφή της ένωσης είναι αυτή που συναντάται στο περιβάλλον και με την οποία οι οργανισμοί όπως έρχονται σε επαφή. Επιλέχθηκε να μελετηθεί η τοξικότητα αυτής την μορφής. Αποδείχθηκε πως κατά την έκθεση προκλήθηκε δοσοεξαρτώμενη τοξικότητα, μορφολογικές, αναπτυξιακές και συμπεριφορικές ανωμαλίες. Συγκεκριμένα, οι τιμές για την θνησιγόνο δόση για το 50% των ατόμων (LC50) βρέθηκε στα 186,072 μg/L. Ακόμα μελετήθηκε η ανάπτυξη και η λειτουργία της καρδιάς διαμέσου της εξέτασης του καρδιακού ρυθμού. Ο μέσος καρδιακός ρυθμός ήταν σημαντικά διαφοροποιημένος μεταξύ των εκτεθειμένων ατόμων σε σχέση με τα μη εκτεθειμένα (control). Η έκθεση προκάλεσε σημαντική βραδυκαρδία στα zebrafish που εξετάστηκαν. Τα zebrafish που εκτέθηκαν στην μεγαλύτερη συγκέντρωση εμφάνισαν τον χαμηλότερο καρδιακό ρυθμό. Από τη μελέτη των μεταβολωμάτων του zebrafish μετά την έκθεσή του στη 2,6-DCBQ-OH προέκυψε πως υπάρχουν διαφορές τόσο σε σχέση με το δείγμα ελέγχου, όσο και μεταξύ των ατόμων που εκτέθηκαν στις διάφορες συγκεντρώσεις. Η μεταβολομική ανάλυση επικεντρώθηκε σε εκείνα τα μεταβολικά μονοπάτια που είτε εμφανίζονται μόνο στα εκτεθειμένα άτομα zebrafish είτε αποσιωπώνται στα εκτεθειμένα σε σχέση με τα άτομα ελέγχου. Σε όλα τα εκτεθειμένα άτομα βρέθηκε η ενεργοποίηση του μεταβολικού μονοπατιού της γλουταθειόνης. Οι διαταραχές σε αυτό το μονοπάτι συνδέονται σε άλλες μελέτες με την πρόκληση οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, η αποσιώπηση του μεταβολισμού της β-αλανίνης σε όλα τα εκτεθειμένα άτομα πιθανά μπορεί να συνδέεται με τις συμπεριφορικές, κινητικές διαταραχές και με τις βλάβες στην απόκριση των ατόμων σε εξωτερικά ερεθίσματα. Ακόμα αποδείχθηκε η αποσιώπηση μονοπατιών βιοσύνθεσης γλυκεροφωσφολιπιδιών. Η αποσιώπηση του μεταβολισμού των γλυκεροφωσφολιπιδιών σε όλα τα εκτεθειμένα άτομα zebrafish πιθανά να συνδέεται με την πρόκληση ενδοκρινικής διαταραχής. Τέλος, παρατηρήθηκε συνολική απορρύθμιση και μεταβολική κατάρρευση του οργανισμού και σε αυτή αποδίδονται οι αναπτυξιακές, μορφολογικές, συμπεριφορικές και άλλες διαταραχές που περιγράφηκαν.Συμπερασματικά, στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιώντας το zebrafish, εξετάστηκαν οι βλάβες που προέκυψαν μετά από την έκθεση σε χημικούς παράγοντες (CNDs, 2,6-DCBQ-OH). Η επιλογή των CNDs έγινε καθώς είναι χημικοί παράγοντες που εμφανίστηκαν τα τελευταία χρόνια, έχουν πολύ καλές ιδιότητες, αναμένεται ότι θα αντικαταστήσουν τις συμβατικές κουκκίδες βαρέων μετάλλων ενώ δεν έχει μελετηθεί η τοξικότητα τους. Η επιλογή της 2,6-DCBQ-OH έγινε καθώς παρόλο που δημιουργείται στο χλωριωμένο στο νερό εδώ και πάρα πολλές δεκαετίες, ανιχνεύτηκε πολύ πρόσφατα (2010) και μέχρι σήμερα υπάρχουν ελάχιστες μελέτες για την τοξικότητα της. Μελετώντας τις επιδράσεις αυτών των χημικών παραγόντων σε μέρος του κύκλου ζωής του zebrafish προέκυψαν σημαντικά συμπεράσματα που συμβάλουν στην κάλυψη κενών αναφορικά με τις επιπτώσεις των δύο αυτών ουσιών.