Συγκριτική μελέτη στελεχών Aeromonas veronii ως νοσογόνου παράγοντα σε εκτρεφόμενα λαβράκια
Authors: Σμυρλή Μαρία 
Published: November 2021

Αντικείμενο της μελέτης είναι ασθένεια εκτρεφόμενων λαβρακιών που οφείλεται στο βακτήριο Aeromonas veronii bv. sobria. Η ασθένεια επηρεάζει εκτρεφόμενα λαβράκια βάρους > 50 g σε ιχθυοτροφικές εκμεταλλεύσεις στο Αιγαίο, κυρίως δυτικά. Εμφανίζεται σε θερμοκρασίες > 18oC ενώ οι εξάρσεις σημειώνονται κυρίως τους θερινούς μήνες σε θερμοκρασία > 21oC. Η αθροιστική θνησιμότητα μπορεί να φτάσει μέχρι το 80% του εκτρεφόμενου πληθυσμού. Η εργασία αφορά αναδυόμενη παθολογία για την ιχθυοκαλλιέργεια λαβρακιού και αρχικά αποτέλεσε/θεωρήθηκε τοπικό και μεμονωμένο περιστατικό. Μελετήθηκε η παθολογία και τα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της ασθένειας. Η ποικιλότητα των βακτηριακών στελεχών του παθογόνου μελετήθηκε με μοριακά (16S rRNA και gyrB) και βιοχημικά (Biolog και API20E) εργαλεία. Στα πλαίσια της εργασίας αναπτύχθηκε πρωτόκολλο ανίχνευσης του γένους. Η λοιμογονικότητα του παθογόνου ελέγχθηκε in vivo με πειραματικές μολύνσεις σε υγιή λαβράκια και zebrafish και in vitro σε στερεό αιματούχο θρεπτικό υπόστρωμα. Αλληλουχήθηκαν τα γονιδιώματα αντιπροσωπευτικών στελεχών και μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις, και η αντιγονική φύση και ποικιλότητα του παθογόνου. Εφαρμόστηκαν οι αρχές της αντίστροφης εμβολιολογίας για τον εντοπισμό συντηρημένων μεμβρανικών πρωτεϊνών–αντιγόνων και την επιλογή στελεχών για την ανάπτυξη εμβολίου Aeromonas veronii ευρείας εφαρμογής. Τέλος, παρασκευάστηκε εμβόλιο βακτηρίνης (υδατοδιαλυτό και ελαιώδες). Ελέγχθηκε η αποτελεσματικότητα του εμβολίου με τεχνητή μόλυνση των εμβολιασμένων ιχθύων, καθώς και με τη μέτρηση του τίτλου αντισωμάτων (ELISA) στον ορό του αίματος και τον έλεγχο έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα μέσω qPCR. Εντοπίστηκαν τρεις φαινότυποι του παθογόνου που διακρίνονται ως προς την κινητικότητα και την παραγωγή χρωστικής και αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του Αιγαίου. Τα στελέχη διαφορετικών περιοχών δεν διακρίνονται μεταξύ τους με τα γονίδια οικιακής οικονομίας που εξετάστηκαν πλην του ppsA. Τα συμπτώματα της ασθένειας αναπαρήχθησαν στις τεχνητές μολύνσεις σε λαβράκι, επιβεβαιώνοντας την παθογονικότητα του A. veronii. Η χρήση zebrafish για τη μελέτη μολυσματικότητας βακτηρίων στα είδη της ελληνικής ιχθυοκαλλιέργειας ενθαρρύνεται από τα αποτελέσματα εφόσον, όπως και στο λαβράκι προκλήθηκε θνησιμότητα των μολυσμένων ατόμων. Οι γονιδιωματικές αναλύσεις έδειξαν υψηλή ομοιότητα μεταξύ των στελεχών A. veronii από λαβράκι στις διαφορετικές περιοχές του Αιγαίου. Ωστόσο, η διάκριση τους έγινε εφικτή μέσω των σημειακών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών που αντιστοιχούν στις φαινοτυπικές ομάδες που αναφέρθηκαν παραπάνω και στη διαφορετική γεωγραφική προέλευση των στελεχών (Ανατολικό/Δυτικό Αιγαίο). Οι αντιγονικές πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης παρουσίασαν επίσης υψηλό ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινoξικής αλληλουχίας, εντοπίστηκαν ωστόσο διαφορές στην πρωτεΐνη S-layer, τη maltoporin LamB και το O-antigen που συνηγορούν στη χρήση πολυσθενούς εμβολίου για το εκτρεφόμενο στο Αιγαίο λαβράκι. Το ελαιώδες δισθενές (NS+PDB+Montanide) εμβόλιο βακτηρίνης που χορηγήθηκε με ένεση σε ενήλικα λαβράκια έδωσε προστασία στον εμβολιασμένο πληθυσμό έναντι μόλυνσης με μπάνιο με το στέλεχος PDB (RPS = 62.5%). Το υδατικό δισθενές (NS+PDB) εμβόλιο που χορηγήθηκε με εμβάπτιση σε ιχθύδια λαβρακιού έδωσε επίσης προστασία έναντι του στελέχους PDB (RPS = 89,4%). Ο τίτλος αντισωμάτων για τα αντιγόνα NS και PDB διατηρήθηκε σταθερός για τουλάχιστον 60 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με ένεση με το ελαιώδες δισθενές (NS+PDB+Montanide) εμβόλιο. Η γονιδιακή έκφραση των γονιδίων MHCII-β, IgM και κυρίως του TCR-β στον μεσονεφρικό ιστό παρουσίασε αυξητική τάση μέχρι την ημέρα 15 μετά τον εμβολιασμό με ενέσιμο ελαιώδες και υδατικό εμβόλιο με το στέλεχος NS, ενώ η κυτταρική ανοσία (CD4) φαίνεται να ενεργοποιείται την ημέρα 30 μόνο στην ομάδα που εμβολιάστηκε με την ελαιώδη παρασκευή. Με τα αποτελέσματα που παρήχθησαν εδώ ενθαρρύνεται η χρήση των αυτεμβολίων για την αντιμετώπιση ασθενειών έναντι του παθογόνου A. veronii. Η εφαρμογή επαναληπτικών εμβολιασμών ή/και η αύξηση της δόσης αντιγόνου στα επί μέρους εμβόλια προτείνονται μελλοντικά για την αύξηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων.