Μελέτη των μοριακών μηχανισμών αλληλεπίδρασης των μακροφάγων με το μύκητα Mucorales
Authors: Ανδριανάκη Αγγελική 
Published: September 2021

Εισαγωγή Η μουκορμύκωση αποτελεί μια σοβαρή λοίμωξη που συνοδεύεται από αρκετά υψηλή θνητότητα και προκαλείται από μύκητες της τάξης των Mucorales. Η μουκορμύκωση προσβάλλει κατά κύριο λόγο ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς καθώς επίσης και ασθενείς με μεταβολικές διαταραχές που επηρεάζουν τη ρύθμιση του σιδήρου. Την τελευταία δεκαετία έχει καταγραφεί σημαντική αύξηση της επίπτωσής της μουκορμύκωσης, καθιστώντας την πλέον τη δεύτερη σημαντικότερη διηθητική λοίμωξη από υφομύκητες μετά την ασπεργίλλωση σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς.Οι γνώσεις μας σχετικά με την παθοφυσιολογία της μουκορμύκωσης είναι λίγες. Μελέτες έχουν δείξει πως τόσο τα σπόρια όσο και οι υφές των Mucorales ανθίστανται στη θανάτωση από τα φαγοκύτταρα, γεγονός που αποδίδεται αφενός στην ιδιαίτερη σύνθεση του κυτταρικού τους τοιχώματος, που τους καθιστά εξαιρετικά ανθεκτικούς, και αφετέρου στην μη ικανοποιητική φαγοκυττάρωσή τους, συνεπεία του μεγάλου μεγέθους των σποριών τους, χωρίς όμως να έχουν μελετηθεί περαιτέρω οι υπεύθυνοι μηχανισμοί.Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η κατανόηση των μηχανισμών αλληλεπίδρασης των φαγοκυττάρων με το μύκητα Rhizopus oryzae της τάξης των Mucorales με έμφαση στη διαδικασία ωρίμανσης του φαγοσώματος κατά την φαγοκυττάρωσή του από τα μακροφάγα. Παράλληλα, αναζητήθηκαν οι αιτιολογικοί παράγοντες και οι μηχανισμοί που καθιστούν το μύκητα ανθεκτικό στη δράση των μακροφάγων, καθώς και ο ρόλος των τελευταίων στην παθοφυσιολογία της λοίμωξης.Υλικά και Μέθοδοι Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ανοσοεπαρκή black 6 (B6), διαγονιδιακά GFP-LC3 και CD11c-DTR ποντίκια ηλικίας 8-12 εβδομάδων. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα υψηλότερα πρότυπα φροντίδας και διαχείρισης ζώων, έχοντας λάβει την σχετική έγκριση από την αρμόδια Κτηνιατρική Υπηρεσία.Τα ex vivo πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε διαφοροποιημένα μακροφάγα προερχόμενα από τον μυελό των οστών των ποντικών (bone marrow derived macrophages – BMDMs). Για την μελέτη των διάφορων σταδίων της φαγοκυττάρωσης με ανοσοφθορισμό τα BMDMs μολύνθηκαν σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα με ζωντανά σπόρια Mucorales και Aspergillus fumigatus (ως μάρτυρας-control) και εξετάσθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο (Confocal microscopy).Για την μελέτη των μηχανισμών φαγοκυττάρωσης σε κυψελιδικά μακροφάγα (alveolar macrophages – AMs ) χρησιμοποιήθηκαν GFP-LC3 ποντίκια τα οποία μολύνθηκαν ενδοτραχειακά με 5*106 ζωντανά σπόρια Mucorales και Aspergillus fumigatus και αφού θυσιάστηκαν μετά από 2, 4 και 24 ώρες, ελήφθη βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL). Τα απομονωθέντα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και στη συνέχεια ακολούθησε η σήμανση των διαφόρων μορίων-πρωτεινών με τα πρωτόκολλα ανοσοφθορισμού. Τα σημασμένα κύτταρα εξετάσθηκαν στο confocal.Για τα in vivo πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ανοσοεπαρκή black 6 (B6), διαγονιδιακά GFP-LC3 και CD11c-DTR ποντίκια, τα οποία θανατώθηκαν σε διαδοχικά χρονικά διαστήματα. Οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν, μονιμοποιήθηκαν με παραφίνη και επεξεργαστηκαν με διάφορες χρώσεις, καθώς και ιστοχημικά. Σε διαφορετικά πειράματα απομονώθηκαν οι διαφορετικοί κυτταρικοί υποπληθυσμοί των φαγοκυττάρων του πνεύμονα σε διάφορα στάδια της λοίμωξης (1 και 5 ημέρες) με κυτταρομετρία ροής (sorting) και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Μελανίνη του κυτταρικού τοιχώματος ζωντανών σποριών Rhizopus, απομονώθηκε με χημικές μεθόδους, αναλύθηκε δομικά με φασματομετρία μάζας και χρησιμοποιήθηκε σε ex vivo πειράματα φαγοκυττάρωσης.BMDMs απο Β6 ανοσοεπαρκή ποντίκια μολύνθηκαν με ζωντανά σπόρια Mucorales σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Στη συνέχεια απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή RNA, τόσο απο τα μακροφάγα όσο και απο τα σπόρια του μύκητα. Με την τεχνική του υβριδισμού ακολούθησε ποσοτική ανάλυση του απομονωθέντος RNA και κατόπιν βιοπληροφορική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων. Αποτελέσματα Αρχικά, σε αντίθεση με την επικρατούσα άποψη, ότι το μεγάλο μέγεθος των σποριών Mucorales (με διάμετρο μέχρι και 10μm) συνεπάγεται την ανεπαρκή φαγοκυττάρωσή τους, διαπιστώσαμε οτι μολύνοντας τα BMDMs με ζωντανά σπόρια Mucorales, ο μύκητας όχι μόνο φαγοκυτταρώνεται επαρκώς αλλά ο ρυθμός της φαγοκυττάρωσης (phagocytic rate – PR) κυμαίνεται στα υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με τον A.fumigatus, που χρησιμοποιήθηκε ως control.Παράλληλα επιβεβαιώσαμε πως ενώ τα BMDMs θανατώνουν τα σπόρια του A.fumigatus, αδυνατουν να καταστρέψουν τα σπόρια Mucorales, που παραμένουν ζωντανά, ακόμα και 6 ώρες μετά τη φαγοκυττάρωσή τους από τα BMDMs, καταδεικνύοντας με τον τρόπο αυτό την ανθεκτικότητα του συγκεκριμένου μύκητα. Επίσης, διαπιστώσαμε την βιωσιμότητα των BMDMs μετά τη μόλυνση με τους δύο μύκητες, αποκλείοντας το ενδεχόμενο της επαγόμενης από τη μόλυνση απόπτωσης των BMDMs, αποδεικνύοντας με τον τρόπο αυτό ότι η παρατηρούμενη ανθεκτικότητα των σποριών Mucorales αποτελεί εγγενή ιδιότητα του μύκητα. Στην συνέχεια, εξετάσαμε την in vitro αποτελεσματικότητα των οξειδωτικών και μη οξειδωτικών μηχανισμών των μακροφάγων, επωάζοντας τα σπόρια Mucorales με Η202 και απομονωθέντα λυσσοσώματα αντίστοιχα. Από τα πειράματα προέκυψε πως οι οξειδωτικοί και μη μηχανισμοί των μακροφάγων είναι ικανοί να θανατώσουν τα σπόρια του μύκητα. Μελετώντας περαιτέρω με ex vivo πειράματα το μονοπάτι της φαγοκυττάρωσης, διαπιστώσαμε πως τα σπόρια Mucorales προκαλούν ενεργητική αναστολή της διαδικασίας, ήδη από τα αρχικά της στάδια (Rab5, LC3), με απώτερο αποτέλεσμα την αναστολής της φαγολυσοσωμικής ένωσης. Αυτή η ανακάλυψη επιβεβαιώθηκε σε διάφορα ήδη μακροφάγων (BMDMs, AMs) τόσο ex vivo όσο και σε in vivo πειράματα με μετέπειτα απομόνωση AMs σε διαφορετικά διαστήματα μετά από την ενδοτραχειακή λοίμωξη.Στην συνέχεια, έχοντας χαρακτηρίσει τη συμπεριφορά (τροπισμό) του μύκητα για τα μακροφάγα, μελετήσαμε τους υποκείμενους υπεύθυνους μηχανισμούς που συντελούν στην μακροχρόνια « ενδοκυττάρια λαθροβίωση» των σπορίων. Γνωρίζουμε ήδη πως τα σπόρια του A.fumigatus, αφού φαγοκυτταρωθούν, υφίστανται εξοίδηση (swelling). Επακολούθως, η απομάκρυνση της μελανίνης του κυτταρικού τους τοιχώματος οδηγεί σε αποκάλυψη της β-γλυκάνης, που μέσω σύνδεσής της με την dectin-1, οδηγεί σε ενεργοποίηση του μονοπατιού της NADPH oxidase και τελικά την παραγωγή ριζών οξυγόνου (ROS), που τελικά συντελούν στην θανάτωση των σποριών.Στη συνέχεια, αναλύθηκε η σημασία της μακροχρόνιας ενδοκυττάριας επιβιώσης των σποριών Mucorales στη φυσική εξέλιξη της λοίμωξης. Χρησιμοποιώντας φυσιολογικά μοντέλα πνευμονικής λοίμωξης σε πειραματόζωα αποδείξαμε πως τα ποντίκια παρέμειναν ζωντανά μετά την ενδοτραχειακή λοίμωξη με σπόρια Mucorales. Παράλληλα, αφού τα ζώα θυσιάστηκαν 5 ημέρες μετά την λοίμωξη, βρήκαμε πως τα σπόρια του μύκητα παραμένουν ζωντανά μέσα στα μακροφάγα. Το παραπάνω εύρημα επιβεβαιώθηκε και σε ιστοπαθολογική ανάλυση βιοψιών από ασθενή με μουκορμύκωση.Έπειτα, αφού επιβεβαιώσαμε την παρουσία μελανίνης στο κυτταρικό τοίχωμα των σποριών Mucorales, διατυπώσαμε διατυπώσαμε την ερευνητική υπόθεση ότι η μελανίνη διαδραματίζει καταλυτικό ρόλο στην αναστολή της φαγολυσοσσωμικής ένωσης. Παράλληλα μελετήσαμε ex vivo την μεταβολή του μεγέθους των σποριών Mucorales 1 ωρα και 24 ώρες μετά την φαγοκυττάρωση τους απο BMDMs σε σύγκριση με τα σπόρια A.fumigatus και παρατηρήσαμε πως τα σπόρια Mucorales δεν υπόκεινται σε ενδοκυττάρια εξοίδηση. Ως εκ τούτου συνάγεται το συμπέρασμα πως η αναστολή της ωριμάνσης του φαγοσώματος οφείλεται στο γεγονός οτι η μελανίνη παραμένει ανέπαφη στο κυτταρικό τοίχωμα των σποριών Mucorales μετά την φαγοκυττάρωση τους, σε αντίθεση με τα σπόρια A.fumigatus. Στην συνέχεια χρησιμοποιώντας σπόρια Mucorales από τα οποία είχε αφαιρεθεί χημικά η μελανίνη, μελετήσαμε την συγκέντρωση των πρωτεινών LC3 και Rab5 (δείκτες πρώιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων αντίστοιχα) στα φαγοσώματα και παρατηρήσαμε πως αποκαθίσταται η ενεργοποίηση της ωρίμανσης του φαγοσώματος, γεγονός που αποδεικνύει τον καθοριστικό ρόλο της μελανίνης στο συγκεκριμένο μονοπάτι.Μελετώντας περαιτέρω την φυσική εξέλιξη της πνευμονικής μουκορμύκωσης, αναζητήσαμε την κατηγορία φαγοκυττάρων που διαδραματίζει τον σημαντικότερο ρολο στην παθογενεση της λοίμωξη. Έπειτα από ενδοτραχειακή μόλυνση B6 ποντικιών με σπόρια Mucorales, πάρθηκε βροχγοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL). Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACS) και sorting παρατηρήσαμε πως τα σπόρια Mucorales φαγοκυτταρώνονται κυρίως από τα κυψελιδικά μακροφάγα (ΑΜs) (CD45+/CD11c+/MHC-II-low/F4/80+). Στην συνέχεια ακολούθησαν in vivo πειράματα, όπου μολύναμε ενδοτραχειακά ανοσοεπαρκή B6 ποντίκια με σπόρια Mucorales και A.fumigatus και τα θυσιάσαμε 5 ημέρες αργότερα. Απομονώθηκαν οι πνεύμονες και τόσο με καλλιέργειες (CFUs) όσο και με ανοσοϊστοχημικές χρώσεις παρατηρήσαμε πως τα σπόρια Mucorales παρέμεναν ζωντανα μέσα στα AMs, σε αντίθεση με τα σπόρια A.fumigatus, που είχαν θανατωθεί. Στην συνέχεια, μολύνοντας ενδοτραχειακά με σπόρια Mucorales διαγονιδιακά CD11c-DTR ποντίκια, στα οποία μικρές συγκεντρώσεις τοξίνης της διφθερίτιδας προσδένονται εκλεκτικά στα κυψελιδικά μακροφάγα προκαλώντας την θανάτωσή τους, βρήκαμε πως στις 5 ημέρες μετά την μόλυνση με σπόρια Mucorales όλα τα CD11c-DTR ποντίκια απεβίωσαν, ενώ τα ανοσοεπαρκή Β6 ποντικια-μάρτυρες παρέμειναν ζωντανά και υγιή, καταδεικνύντας έτσι πως τα AMs αποτελούν τον ακρογωνιαίο λίθο της φυσικής ανοσίας απέναντι στα στελέχη Mucorales.Τέλος, προσπαθήσαμε να συσχετίσουμε την ανοσολογική απάντηση με την χρήση του σιδήρου, που ως γνωστόν αποτελεί σημαντικό στοιχείο για την παθογένεση της λοίμωξης. Για τα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε BMDMs από GFP-LC3 ποντίκια, τα οποία μολύναμε για 30 λεπτά και 18 ωρες με ζωντανά σπόρια Mucorales. Το θρεπτικό υλικό εμπλουτίστηκε με τρισθενή σίδηρο (FeCl3), δεφεροξαμίνη (σιδηροδεσμευτική πρωτεϊνη) ή τον συνδυασμό τους. Στις 18 ώρες παρατηρήσαμε με το confocal μικροσκόπιο πως, ενώ στο control δείγμα (BMDMs- σπόρια Mucorales - standard θρεπτικό υλικό ) τα σπόρια Mucorales παρέμειναν μέσα στα BMDMs χωρίς να έχει αλλάξει το μέγεθός τους, στα εμπλουτισμένα με τρισθενή σίδηρο και δεφεροξαμίνη δείγματα τα σπόρια Mucorales είχαν εξοιδηθεί (swollen) και σε πολλές περιπτώσεις είχαν προκαλέσει λύση των κυττάρων και εξωκυττάρια ανάπτυξη υφών. Ως εκ τούτου, καταφέραμε για πρώτη φορά να αποδείξουμε πως η ενδοκυττάρια στέρηση σιδήρου διαδραματίζει καταλυτικό ρόλο στην αναστολή ανάπτυξης του μύκητα από το μακροφάγο. Τα απότελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με RNAseq ανάλυση, όπου βρήκαμε πως μετά την φαγοκυττάρωση σποριων Mucorales από τα BMDMs, στον μεν ξενιστή ενεργοποιήθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται με ομοιοστατικούς μηχανισμούς ενδοκυττάριας ένδειας σιδήρου, ενω στον υποδοχέα τα αντίστοιχα γονίδια είχαν κατασταλεί. Συζήτηση Τα αποτελέσματα της μελέτης ρίχνουν φως στους μηχανισμούς μοριακής αλληλεπίδραση των μυκήτων Mucorales με τα μακροφάγα με σημαντικές προεκτάσεις στην παθογένεση της νόσου.Δυο πολύ σημαντικά ευρήματα στην παθογένεση της νόσου προκύπτουν από τη μελέτη μας. Πρώτον, σε αντίθεση με όλους τους άλλους υφομύκητες οι Mucorales παρουσιάζουν μακροχρόνια ενδοκυττάρια λαθροβίωση στα μακροφάγα του πνεύμονα φυσιολογικών (μη ανοσοκατασταλμένων) ζώων. Η ικανότητα αυτή επιβεβαιώνεται και σε μεταγενέστερη μελέτη σε zebrafish (2). Αυτή η ανακάλυψη συνεπάγεται ότι, ενδεχομένως τα μακροφάγα να λειτουργούν σαν δούρειος ίππος της λοίμωξης και σε περίπτωση ανοσοκαταστολής η λοίμωξη να επέρχεται από την ενδοκυττάρια ανάπτυξη του μύκητα. Επιπλέον αυτό μπορεί να εξηγεί την αναζοπύρωση της λοίμωξης σε ανοσοκαταστολή, γεγονός που προκύπτει συχνά στην κλινική πράξη, όπως στην περίπτωση του ασθενή της μελέτης μας. Αξίζει να αναφερθεί ότι πειραματικά μοντέλα αναζωπύρωσης μουκορμύκωσης μετά από ανοσοκαταστολή υπάρχουν ήδη από τη δεκαετία του 1960 χωρίς ωστόσο να είναι γνωστός ο μηχανισμός της λαθροβίωση. Τέλος, τα ευρήματα αυτά ίσως εξηγούν την αξιοσημείωτη αντοχή των Mucorales στην υπάρχουσα φαρμακευτική αγωγή, επειδή ενδεχομένως μέσα στο φαγόσωμα να μην είναι δυνατή η εκκρίζωση των σπορίων με τις υπάρχουσες θεραπείες.Η μελέτη μας επίσης αναδεικνύει τον σημαντικό ρόλο της ανοσολογίας θρέψης στη φυσιολογική άμυνα των μακροφάγων και κατά συνέπεια των διαταραχών της στην παθογένεση της λοίμωξης. Στο σημείο αυτό ανοίγει ένα νέο κεφάλαιο στην ανοσοπαθογένεση αυτών των λοιμώξεων που αφορά την επίδραση του σιδήρου τόσο στην ανάπτυξη του παθογόνου όσο και στον μεταβολισμό και στη λειτουργία των μακροφάγων. Οι μοριακοί μηχανισμοί της ρύθμισης της άμυνας από το σίδηρο είναι ελάχιστα μελετημένοι και η κατανόηση τους θα οδηγήσει σε σημαντικές θεραπευτικές εφαρμογές.Τα παραπάνω ευρήματα, που πρώτη φορά περιγράφονται στην βιβλιογραφία σχετικά με τον μύκητα Mucorales, ρίχουν φως στην παθογένεση της μουκορμύκωσης, που τα τελευταία χρόνια εχει αναδειχθεί σε σημαντική απείλή των ανοσοκατεσταλμένων ασθενών, και ανοίγουν τον δρόμο για την αναζήτηση νέων θεραπευτικών μέσων.Μειονέκτημα της μελέτης μας είναι ότι δεν αποδείξαμε το ρόλο της διαταραχής της ανοσολογίας θρέψης στην αναζωπύρωση της λοίμωξης in vivo σε πειραματόζωα. Επιπλέον, το ότι η αναζωπύρωση της λοίμωξης ξεκινά από ενδοκυττάρια σπόρια παραμένει ακόμα υπόθεση. Τέλος η λειτουργία πολλών από τα μόρια που αναδείχθηκαν στην γονιδιωματική ανάλυση θα πρέπει να επιβεβαιωθούν με πειράματα εκλεκτικής γονιδιακής απαλοιφής σε μακροφάγα.