Ανάπτυξη καινοτόμων μεθοδολογιών για την αξιοποίηση φυτοχημικών από φαρμακευτικά φυτά της Ηπείρου, με στόχο την αναστολή της δράσης των ενζύμων ελαστάσης, υαλουρονιδάσης και τυροσινάσης, με σκοπό την ανάπτυξη καλλυντικού προϊόντος
Authors: Παπαεμμανουήλ Χριστίνα 
Published: January 2022

Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει σκοπό τη μελέτη και ανάπτυξη εκχυλισμάτων από επιλεγμένα φαρμακευτικά φυτά και βότανα με πλούσιο αντιοξειδωτικό προφίλ και ισχυρή αντιγηραντική και αντιμελανογενετική δράση, με στόχο την αξιοποίησή τους από φαρμακευτικές εταιρείες για την ανάπτυξη καλλυντικών προϊόντων βασισμένων σε φυσικά προϊόντα. Τα φαρμακευτικά φυτά έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον αρκετά, λόγω των ποικίλων βιολογικών δράσεων που παρουσιάζουν και χρησιμοποιούνται ως θεραπεία για την αντιμετώπιση αρκετών παθοφυσιολογικών καταστάσεων και ασθενειών. Όλα τα φαρμακευτικά φυτά αφθονούν σε δευτερογενείς μεταβολίτες (ο αριθμός των οποίων ξεπερνάει το 1.000.000), στους οποίους οφείλουν τις υψηλές αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές, αντικαρκινικές και πολλές άλλες ιδιότητές τους. Από την άλλη, οι δομές μεγάλου αριθμού δευτερογενών μεταβολιτών έχουν χρησιμοποιηθεί σαν πρόδρομα μόρια για την ανάπτυξη και σύνθεση καινούριων φαρμάκων με ενισχυμένη δράση. Η συμβολή τους στην ανάπτυξη φαρμάκων, τροφίμων και καλλυντικών είναι καίριας σημασίας για τη συνεχή αναζήτηση καινούριων φαρμακευτικών προϊόντων με σκοπό τη βελτίωση της ποιότητας και του προσδόκιμου ζωής. Τα προβλήματα που προκαλούνται στην υγεία του δέρματος και τα οποία αποτελούν κυρίως αποτέλεσμα της υπερβολικής έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία, απασχολούν πλέον όλο και περισσότερο τους ερευνητές. Τα αποτελέσματα που επιφέρει η απορρόφηση της UVA ακτινοβολίας από το δέρμα αφορούν κυρίως την ανάπτυξη βλαβών στο DNA και την υπερβολική παραγωγή ελευθέρων ριζών. Ομοίως, η απορρόφηση της UVB ακτινοβολίας από την επιδερμίδα προκαλεί ηλιακά εγκαύματα, χρωματισμούς του δέρματος καθώς και ανάπτυξη ερυθήματος. Όλα αυτά, οδηγούν στην ανάπτυξη μελανώματος (καρκίνου του δέρματος) το οποίο αποτελεί έναν από τους βασικούς τύπους καρκίνου. Από την άλλη, η “υποβάθμιση” της ακεραιότητας του δέρματος πραγματοποιείται και ενδογενώς από πολλούς ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες, οδηγώντας σταδιακά στην απώλεια της υγείας του, με αποτέλεσμα τη σταδιακή γήρανσή του. Η πρόωρη γήρανση του δέρματος και η ανάπτυξη μελανώματος ενδιαφέρουν αρκετά τις φαρμακευτικές εταιρείες αλλά και τις εταιρείες καλλυντικών οι οποίες προσπαθούν συνεχώς να βρίσκουν αποτελεσματικούς παράγοντες για την προστασία της υγείας του δέρματος. Σε αυτόν τον προβληματισμό την απάντηση την έχει δώσει η φύση, καθώς περιέχει αρκετούς φυσικούς θησαυρούς οι οποίοι έχουν χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά σε καλλυντικά προϊόντα λόγω του υψηλού αντιοξειδωτικού και βιοδραστικού προφίλ τους. Ωστόσο, η συνεχής αναζήτηση καινούριων φυσικών πηγών παραμένει αέναη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν φυτά από την ευρύτερη περιοχή της Ηπείρου, με σκοπό τη χρήση τους ως φαρμακευτικοί παράγοντες στην ανάπτυξη καλλυντικών προϊόντων. Τα φυτά που επιλέχθηκαν για μελέτη είναι τα: Melissa Officinalis (Μελισσόχορτο), Rosmarinus Officinalis (Δεντρολίβανο), Salvia Officinalis (Φασκόμηλο), Thymus Vulgaris (Θυμάρι), Origanum Vulgare (Ρίγανη), Cistus Albidus (Λαδανιά), και Hypericum Perforatum (Βαλσαμόχορτο). Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα των φυτών αυτών, τα οποία μελετήθηκαν για τις αντιοξειδωτικές τους δράσεις, αλλά και για τις ανασταλτικές τους ιδιότητες έναντι τριών ενζύμων που σχετίζονται με την πρόωρη γήρανση του δέρματος και την ανάπτυξη μελανώματος: ελαστάση, υαλουρονιδάση και τυροσινάση.Για τη μελέτη των εκχυλισμάτων εφαρμόστηκαν μεθοδολογίες οι οποίες βασίζονται κυρίως στη φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance-NMR).Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε λεπτομερής μελέτη της διερεύνησης των συνθηκών εκχύλισης που εφαρμόστηκαν για την παραγωγή εκχυλισμάτων με πλούσιο φυτοχημικό προφίλ. Επίσης, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση των συνολικών φαινολικών ομάδων και η αντιοξειδωτική τους ικανότητα με εφαρμογή βασικών in vitro μεθοδολογιών. Προκειμένου να γίνει αποτελεσματικός και σαφής προσδιορισμός της συγκέντρωσης των συνολικών φαινολικών ομάδων που περιέχονται στα πολύπλοκα φυτικά εκχυλίσματα, αναπτύχθηκε στη συνέχεια μια μεθοδολογία. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθοδολογίας συνεκρίθησαν με τα αντίστοιχα αποτελέσματα της in vitro μεθοδολογίας Folin-Ciocalteu, η αποτελεσματικότητα της οποίας έχει τεθεί αρκετά υπό αμφισβήτηση. Επιπλέον μελέτες ενίσχυσαν την αποτελεσματικότητα της νέας μεθοδολογίας. Στη συνέχεια, η νέα μεθοδολογία αξιοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των φαινολικών συστατικών των αιθανολικών εκχυλισμάτων μέσω του χαρακτηρισμού των φαινολικών (-ΟΗ) ομάδων. Επίσης, πραγματοποιήθηκε και ποσοτικός προσδιορισμός των επιμέρους βιοδραστικών συστατικών με συνδυασμό μεθοδολογιών NMR, χωρίς να προηγηθεί διαχωρισμός των μειγμάτων στα συστατικά του.Αφού συλλέχθηκαν όλα τα δεδομένα για την παραγωγή εκχυλισμάτων πλούσιων σε αντιοξειδωτικές ουσίες, στη συνέχεια έγινε λεπτομερής μελέτη των τριών ενζύμων-στόχων: ελαστάση, υαλουρονιδάση και τυροσινάση όπου αποτέλεσε βάση για την ανάπτυξη μιας ηλεκτρονικής βάσης δεδομένων, η οποία παρέχει πληροφορίες από in silico υπολογισμούς για την περιγραφή του προφίλ αλληλεπίδρασης φυσικών προϊόντων και με τα τρία ένζυμα-στόχους. Η ανάπτυξη αυτής της ηλεκτρονικής βάσης δεδομένων βασίστηκε στη συλλογή πληροφοριών που αφορούν όλους τους φυσικούς δευτερογενείς μεταβολίτες και τις φυσικές πηγές τους που έχουν ήδη μελετηθεί για τις ανασταλτικές ιδιότητές τους ως προς τα τρία ένζυμα-στόχους.Στη συνέχεια πραγματοποιείται λεπτομερής μελέτη των ενζυμικών αντιδράσεων των τριών ενζύμων-στόχων, καθώς και της αναστολής τους από τα παραγόμενα εκχυλίσματα. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε κυρίως με εφαρμογές της φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), όπου και αναπτύχθηκε και μια νέα μεθοδολογία για την in situ μελέτη των ενζυμικών αντιδράσεων σε πραγματικό χρόνο, όπως αυτές εξελίσσονται σε ένα σωληνάκι NMR. Πραγματοποιήθηκε επίσης ταυτοποίση των ενδιάμεσων και των προϊόντων των ενζυμικών αντιδράσεων, όπου αυτό ήταν εφικτό, χωρίς να διακοπεί η ενζυμική αντίδραση, ή να γίνει διαχωρισμός του μείγματος στα συστατικά του. Ακόμη, στα πλαίσια της ανάπτυξης της νέας μεθοδολογίας για τη μελέτη των ενζυμικών αντιδράσεων, πραγματοποιήθηκε μελέτη της αναστολής της κάθε ενζυμικής αντίδρασης από φυσικό προϊόν και από φυτικό εκχύλισμα, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό της απόδοσης της ενζυμικής αντίδρασης παρουσία αναστολέα, με άμεση μέτρηση της συγκέντρωσης του προϊόντος που παράγεται κάθε φορά. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της αλληλεπίδρασης ενός φυσικού προϊόντος και ενός φυτικού εκχυλίσματος με το κάθε ένζυμο σε ατομικό επίπεδο μέσω μεθοδολογιών της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR). Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε προκειμένου να προσδιοριστεί το ενδεχόμενο στερεοεκλεκτικότητας κάθε ενζύμου, έτσι ώστε να ξεχωρίσουν εκείνοι οι αναστολείς που βρίσκονται σε πολύπλοκα φυτικά μείγματα και που αλληλεπιδρούν με το ενεργό κέντρο των ενζύμων, επηρεάζοντας την δραστικότητά τους.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη των ενζυμικών αντιδράσεων, αποτέλεσαν βασικό βήμα για την ενίσχυση της λειτουργικότητας της νέας μεθοδολογίας. Αυτό επιτεύχθη με τη δοκιμή μιας in situ μελέτης και των τριών ενζυμικών αντιδράσεων (τυροσινάση, υαλουρονιδάση και ελαστάση), όταν αυτές πραγματοποιούνται ταυτόχρονα σε ένα κοινό υδατικό περιβάλλον, μέσα στο ίδιο σωληνάκι NMR. Η προσπάθεια αυτή έγινε με σκοπό η νέα μεθοδολογία να μπορεί να εφαρμόζεται στη μελέτη και ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και πολύπλοκων μειγμάτων που θα στοχεύουν ταυτόχρονα σε περισσότερους από έναν ενζυμικούς στόχους. Η ανάπτυξη αυτής της νέας μεθοδολογίας αποτελεί πρωταρχικό στάδιο μελετών, με πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα στο πεδίο ανάπτυξης όχι μόνο καλλυντικών, αλλά και φαρμάκων που θα στοχεύουν σε περισσότερους από έναν στόχους, όχι μόνο ενζυμικούς αλλά και πρωτεϊνικούς με σκοπό την αντιμετώπιση ασθενειών και διαφόρων άλλων παθοφυσιολογικών καταστάσεων.