Οι μοριακοί μηχανισμοί της σσύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης κατά τη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων
Authors: Δρούγκας Ευάγγελος 
Published: December 2021

Η ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση (ΑΚΔ) ενός μητρικού κυττάρου παράγει θυγατρικά κύτταρα εγγενώς προγραμματισμένα να ακολουθήσουν διαφορετικές αναπτυξιακές πορείες. Στην περίπτωση αυτή, συγκεκριμένες πρωτεΐνες, RNA και άλλα μακρομόρια κατανέμονται ασύμμετρα στην μία πλευρά του υπό διαίρεση κυττάρου και με αυτό τον τρόπο το θυγατρικό κύτταρο που έχει τους προαναφερθέντες παράγοντες θα ακολουθήσει διαφορετική αναπτυξιακή πορεία από το άλλο επιτρέποντας στα κύτταρα να αυτοανανεώνονται και ταυτόχρονα να διατηρούν το αναπτυξιακό δυναμικό τους. Αυτό ισχύει στα βλαστικά κύτταρα αλλά και σε άλλες διεργασίες, όπως η αγγειογένεση, η δημιουργία του δέρματος και ο καρκίνος.Η RhoD GTPάση εντοπίζεται στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα και στο πρώιμο ενδόσωμα. Η μόνιμα ενεργή μορφή της RhoD, RhoDG26V, προκαλεί ανεπαρκή διαφοροποίηση των επιδερμικών κυττάρων όταν εκφράζεται στο δέρμα διαγονιδιακών ποντικιών. Η επέκταση των στιβάδων της επιδερμίδας στην περίπτωση της RhoDG26V, οδηγεί στην έκφραση της Κερατίνης 14, στις ανώτερες στιβάδες, κάτι που είναι συμβατό με αλλαγή του τύπου της κυτταρικής διαίρεσης από ασύμμετρη σε συμμετρική. Με βάση αυτά τα δεδομένα έγινε εστίαση στην έρευνα στην επίδραση της RhoD στους μηχανισμούς της ΑΚΔ και πιο συγκεκριμένα η επίδραση της απάλειψης του RHOD γονιδίου.Αρχικά, έγιναν λειτουργικές δοκιμασίες για την επίδραση της απάλειψης της RhoD. Το γονίδιο RHOD απαλείφθηκε επιτυχώς σε κύτταρα ΗΕΚ293 κάτι που δεν έγινε εφικτό στα βλαστοκύτταρα Η1 λόγω κυτταρικού θανάτου. Το γεγονός πως η RhoD αποτελεί μια ενδοσωματικά εντοπισμένη πρωτεΐνη σε συνδυασμό με αποτελέσματα τα οποία υποδήλωναν αλληλοεπίδραση της RhoD με τη SMAD2, έγινε έλεγχος της επίδρασης της αποσιώπησης του RHOD γονιδίου στην επαγωγή από παράγοντες ανάπτυξης που είναι γνωστό πως σηματοδοτούν από τα ενδοσώματα όπως η Activin A, μέλος της υπεροικογένειας του TGFβ η οποία συμμετέχει σε πλήθος κυτταρικών διεργασίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απάλειψη του RHOD γονιδίου οδήγησε σε αυξημένη επαγωγή της φωσφορυλίωσης της SMAD2, και λιγότερο της SMAD3, από την Activin A, υποδηλώνοντας πως η παρουσία της RhoD παίζει κατασταλτικό ρόλο στη φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες SMAD1/5/9 έμειναν ανεπηρέαστες. Καθώς δεν έχουμε ανιχνεύσει φυσική σύνδεση των SMAD2/3 με τη RhoD, μια εξήγηση της αύξησης των p-SMAD2/3 μετά από επαγωγή με Ακτιβίνη Α, απουσία RhoD, είναι η δυνατότητα έμμεσων αλληλοεπιδράσεων τους λόγω συνύπαρξής τους στο ίδιο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Επειδή η διακίνηση μεμβρανών πιθανά επηρεάζεται από την απάλειψη της RhoD, εξετάστηκαν δείκτες του ενδοκυτταρικού διαμερίσματος για να ελεγχθούν αλλαγές της σύστασής του. Πράγματι, τα αποτελέσματα έδειξαν πως βρέθηκαν μειωμένα τα επίπεδα των ΕΕΑ1, CD63 και Rabankyrin 5. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων αυτό επιτυγχάνεται δεν είναι γνωστοί και αυτό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Η ΑΚΔ δεν είναι όπως αναφέρθηκε μια διαδικασία αποκλειστικά στα βλαστικά κύτταρα αλλά παρατηρείται και σε άλλα κύτταρα και διεργασίες όπως στα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την αγγειογένεση. Η απάλειψη της RhoD GTPάσης στα κύτταρα HUVE μείωσε τόσο το μεταναστευτικό δυναμικό τους όσο και την ικανότητά τους να αναπτύξουν ένα σταθερό αγγειακό δίκτυο σε υπόστρωμα Matrigel μετά από 12 ώρες. Επίσης τα κύτταρα HUVE έδειξαν μειωμένη ωριμότητα και σταθερότητα του αγγειακού δικτύου σε συγκαλλιέργεια με μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία σταθεροποιούν περαιτέρω την αγγειογένεση. Τέλος, οι αγγειογενετικές δοκιμασίες έδειξαν και μειωμένο αριθμό θετικών στον δείκτη CD34 κυττάρων HUVE κάτι που τα καθιστά ασύμβατα με τη διαδικασία της αγγειοποίησης. Μετά τις λειτουργικές δοκιμές και τις βιοχημικές δοκιμές οι οποίες έγιναν για την επίδραση της απάλειψης/αποσιώπησης της RhoD, έγινε ο έλεγχος της επίδρασης σε δοκιμασίες που σχετίζονται με την ΑΚΔ. Το μοντέλο του τεχνητού δέρματος το οποίο ήταν η πρώτη προσέγγιση δεν δούλεψε παρότι προέκυψε 100% πληθυσμός κυττάρων θετικών στο δείκτη της κερατίνης 14. Εξαιτίας αυτού, μελετήθηκε η επίδραση της μείωσης των επιπέδων της RhoD στην ΑΚΔ στον τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού και πιο συγκεκριμένα στην κυτταρική σειρά των MDA-MB-468 η οποία χαρακτηρίζεται από κυτταρική ετερογένεια και ΑΚΔ που δίνουν κύτταρα θετικά στην κερατίνη 14. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως στην περίπτωση της μείωσης των επιπέδων της RhoD, δεν εντοπίστηκε καμία ΑΚΔ κάτι που παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου σε επίπεδα συμβατά με τη βιβλιογραφία. Επίσης, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων θετικών στην Κερατίνη 14, ήταν αισθητά μειωμένος στην περίπτωση της μείωσης των επιπέδων της RhoD. Δεδομένου πως ο αυξημένος πληθυσμός της κερατίνης 14 στον τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού σχετίζεται με αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων, η μείωση αυτή μπορεί να κάνει τις συγκεκριμένες μορφές καρκίνου λιγότερο επιθετικές. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν μια σημαντική συσχέτιση της RhoD στον τρόπο που ελέγχεται το κυτταρικό διαμέρισμα και η κυτταρική διαίρεση κάτι που μπορεί να είναι αντικείμενο περαιτέρω διερεύνησης σε όλα τα επίπεδα.