Ο ρόλος της PCSK9 στην αθηροθρόμβωση
Authors: Τσούκα Αικατερίνη 
Published: July 2023

Εισαγωγή- Σκοπός: Η PCSK9 είναι μια σερινο-πρωτεάση οποία εκτός από τον κύριο ρόλο της στην ενδοσωμική και λυσοσωμική αποικοδόμηση του υποδοχέα της LDL, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της LDL-χοληστερόλης στο πλάσμα, παρουσιάζει αρκετές, ανεξάρτητες, από τον LDL υποδοχέα, δράσεις σε πληθώρα κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοπεταλίων. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η PCSK9 συμμετέχει στην παθοφυσιολογία της φλεγμονής και εμφανίζει δράσεις και σε άλλους κυτταρικούς τύπους, όπως αιμοπετάλια, μονοκύτταρα κ.α. Υλικά-Μέθοδοι: Αρχικά μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της PCSK9 με τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος απομονώνοντας αυτές με τη μέθοδο των διαδοχικών υπερφυγοκεντρήσεων και προσδιορίζοντας τα επίπεδα τους σε PCSK9 με τη μέθοδο ELISA. Παράλληλα, μελετήσαμε την κατανομή της PCSK9 στα σωματίδια της HDL λιποπρωτεΐνης με το σύστημα Lipoprint ενώ η μορφή της PCSK9 που υπάρχει σε κάθε λιποπρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting). Για να διερευνήσουμε τη δράση της PCSK9 στη θρόμβωση προσδιορίσαμε τα επίπεδα της ενδογενούς PCSK9 σε πλυμένα αιμοπετάλια που απομονώθηκαν από νορμολιπιδαιμικούς δότες ενώ προσδιορίστηκαν και στα πλυμένα αιμοπετάλια υπερχοληστερολαιμικών ασθενών που λάμβαναν μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της PCSK9. Η δράση της recombinant PCSK9 μελετήθηκε τόσο στη συσσώρευση πλυμένων αιμοπεταλίων όσο και στην ενδοθηλιακή λειτουργία σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs ως προς τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση της MCP-1. Στα παραπάνω συστήματα μελετήθηκε και η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και HDL λιποπρωτεΐνη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι της PCSK9. Προκειμένου να διερευνήσουμε πιθανές πλειοτροπικές δράσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χορηγούνται έναντι της PCSK9, μελετήθηκε η συσσώρευση των αιμοπεταλίων των υπερχοληστερολαιμικών ασθενών τόσο στο PRP όσο και στα πλυμένα αιμοπετάλια πριν και μετά από 4 δόσεις του αντισώματος. Επιπλέον στο PRP των ασθενών προσδιορίσαμε τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L στις δύο παραπάνω χρονικές στιγμές. Στη συνέχεια, στους ασθενείς αυτούς προσδιορίσαμε τις αλληλεπιδράσεις των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα σε ολικό αίμα με κυτταρομετρία ροής. Τέλος, διερευνήθηκε η ικανότητα τόσο της recombinant όσο και της συνδεδεμένης στην HDL και LDL PCSK9, στην αγγειογένεση μέσω του σχηματισμού αυλών σε κύτταρα HUVECs. Αποτελέσματα: Οι απομονωμένες υπερφυγοκεντρικά λιποπρωτεΐνες περιέχουν PCSK9, δείχνοντας ότι λόγω υπερφυγοκέντρησης ένα μέρος της PCSK9 αποσυνδέεται από τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Η κατανομή στα σωματίδια της HDL έδειξε ότι τα S-HDL διαθέτουν περισσότερη PCSK9 ενώ στην HDL υπάρχουν και οι δυο μορφές της PCSK9 (ώριμη και furin-cleaved μορφή). Τα πλυμένα αιμοπετάλια τόσο των ασθενών όσο και τον νορμολιπιδαιμικών διαθέτουν και τις δυο μορφές PCSK9 ενώ η ενδογενής PCSK9 δεν επηρεάζει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. H recombinant PCSK9 ενισχύει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων που επάγεται από θρομβίνη και αραχιδονικό οξύ ενώ μόνη της δεν επάγει τη συσσώρευση. Επίσης, οι LDL και HDL αναστέλλουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Επιπλέον, τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 σε ασθενείς που τα λαμβάνουν δεν τροποποιήσαν στατιστικά σημαντικά την συσσώρευση των αιμοπεταλίων πριν και μετά το αντίσωμα τόσο σε PRP όσο και σε πλυμένα αιμοπετάλια, καθώς επίσης και τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L. Όμως τα πλυμένα αιμοπετάλια μετά την χορήγηση του αντισώματος περιέχουν περισσότερη PCSK9. Επιπλέον, στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs η PCSK9 ενισχύει τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 που επάγεται από τον TNF-α καθώς και την έκκριση της MCP-1. Παράλληλα, οι LDL και HDL ανέστειλαν τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 ενώ παρουσία αντισώματος έναντι της PCSK9 η αναστολή αυτή μειώθηκε στατιστικά σημαντικά υποδηλώνοντας τη συμμετοχή της PCSK9 των λιποπρωτεϊνών σε αυτό, ενώ αναφορικά με την MCP-1 οι λιποπρωτεΐνες προκάλεσαν επαγωγή της έκκρισης του. Επιπλέον, η recombinant PCSK9 ενίσχυσε τη δημιουργία αυλών ενώ οι HDL και LDL ανέστειλαν τη δημιουργία αυλών που επάγεται από VEGF. Τέλος, στους ασθενείς υπό μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 υπήρξε αύξηση του ενδοθηλιακού φαινοτύπου των CD34+πρόδρομων κυττάρων και των αλληλεπιδράσεων των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα. Συμπεράσματα: Η παρούσα διδακτορική διατριβή δείχνει ότι η PCSK9 πέραν του κλασσικού ρόλου της στην αποικοδόμηση του LDL υποδοχέα και την αύξηση της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα, εμπλέκεται σε διάφορους μηχανισμούς αθηροθρόμβωσης όπως είναι η συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η μεμβρανική έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 καθώς και η έκκριση της MCP-1, λειτουργίες που αποδεικνύουν την συμβολή της στη θρόμβωση και τη φλεγμονή, ενώ παράλληλα εμφανίζει και αγγειογενετικές δράσεις συμβάλλοντας στην ενδοθηλιακή αναγέννηση. Επίσης, λόγω των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων που διαθέτουν PCSK9 φαίνεται και η εμπλοκή της PCSK9 στην αθηροσκλήρωση. Επιπροσθέτως, η εργασία μας απέδειξε ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 πέραν του βασικού τους ρόλου, εμπλέκονται στη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων των ασθενών και βασικότερα στον ενδοθηλιακό φαινότυπο των CD34+ κυττάρων καθώς και στις αλληλεπιδράσεις τους με τα αιμοπετάλια.