Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων με τη χρήση νανοϋλικών και εφαρμογή τους στη βιοανάλυση
Authors: Σέρπη Κωνσταντίνα 
Published: August 2021

Τα νουκλεϊκά οξέα (ΝΑς), είναι τα µόρια –φορείς της γενετικής πληροφορίας ενόςκυττάρου. Στα µόρια των DNA βρίσκονται κωδικοποιηµένες όλες οι πληροφορίες, οιοποίες προσδιορίζουν τη φύση του κυττάρου, ελέγχουν την ανάπτυξη και τη διαίρεσητου. Λόγω, λοιπόν, του τόσο σηµαντικού τους ρόλου έχουν µελετηθεί εκτενώς µε έναπλήθος διαφορετικών τεχνικών.Από τη στιγµή που ο Paleček ανακάλυψε την ηλεκτροδραστικότητα τωννουκλεϊκών οξέων (ΝΑς), ξεκίνησε µια εκτενής έρευνα της ηλεκτροχηµείας τωνφυσικών και χηµικώς τροποποιηµένων νουκλεϊκών οξέων (ΝΑς). Η έρευνα αυτήοδήγησε σε µια σειρά από βολταµµετρικές προσεγγίσεις, τόσο για το γρήγορο καιανέξοδο ποσοτικό προσδιορισµό του DNA, όσο και για την ανίχνευση των αλλαγώνστη δοµή του. Έτσι οι ηλεκτροχηµικοί βιοαισθητήρες συγκέντρωσαν τεράστιαπροσοχή, καθώς συνδυάζουν τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των ηλεκτροχηµικώνµεθόδων, µε την ικανότητα αναγνώρισης των αλληλουχιών του DNA.Για τη βελτίωση της ευαισθησίας των ηλεκτροχηµικών βιοαισθητήρων DNAέχουν χρησιµοποιηθεί διάφορα νανοϋλικά, όπως οι νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs).Από την ανακάλυψή τους το 1991 από τον Iijima, οι νανοσωλήνες άνθρακα(CNTs) αποτέλεσαν αντικείµενο έντονης έρευνας και προσέλκυσαν µεγάλη προσοχήως αναλυτικά εργαλεία, για ένα ευρύ φάσµα εφαρµογών, λόγω των ιδιαίτερωνχηµικών, ηλεκτρικών και µηχανικών ιδιοτήτων τους. Λαµβάνοντας υπόψη ταπλεονεκτήµατα και των δύο τύπων νανοσωλήνων άνθρακα (CNTs), όπως η µεγάληεπιφάνεια, η καλή αγωγιµότητα και η εξαιρετική βιοσυµβατότητα, γίνεται φανερό ότιπροσφέρουν ένα περιβάλλον, το οποίο είναι κατάλληλο για την ακινητοποίησηβιολογικών συστατικών, ενώ επιπλέον ο υψηλός λόγος της επιφάνειας προς τον όγκοσυνεπάγεται και την αυξηµένη συσσώρευση των βιοµορίων. Γι΄ αυτό,χρησιµοποιούνται ευρέως στην κατασκευή αισθητήρων και βιοαισθητήρων.Αρχικά, κατασκευάστηκαν τρία ηλεκτρόδια πάστας νανοσωλήνων άνθρακα(MWNTPEs), χρησιµοποιώντας τρεις διαφορετικούς τύπους νανοσωλήνων άνθρακαπολλαπλών τοιχωµάτων (MWNTs), αντίστοιχα, οι οποίοι διέφεραν ως προς τις διαστάσεις τους. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, οι νανοσωλήνες άνθρακα σεσυνδυασµό µε την προσροφητική αναδιαλυτική βολταµµετρία αλλαγής µέσου(ΑdSTV) είναι κατάλληλοι για τον προσδιορισµό του dsDNA. ∆ιαπιστώθηκε αύξησητου σήµατος οξείδωσης της γουανίνης σε σύγκριση µε εκείνο που λαµβάνεται µε τασυµβατικά ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα (CPEs). Μεταξύ των τριών ηλεκτροδίωνMWNTPEs, το ηλεκτρόδιο MWNTPE3 παρουσίασε την καλύτερη ηλεκτροχηµικήσυµπεριφορά, λόγω της καταλληλότερης δοµής και µεγέθους των πόρων. Με βάση τοσήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενες αναλυτικές συνθήκες, πολύχαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούν µετά από σύντοµους χρόνουςακινητοποίησης και µε τα τρία ηλεκτρόδια MWNTPEs (MWNTPE1, MWNTPE2,MWNTPE3) µε όρια ανίχνευσης ίσα µε 2,64 mg L-1, 2,02 mg L-1και 1,46 mg L-1,αντίστοιχα.Καθώς πολλές προσπάθειες έχουν πραγµατοποιηθεί στον τοµέα τηςηλεκτροανάλυσης των νουκλεϊκών οξέων (ΝΑς) µε σκοπό την αντικατάσταση τωνυγρών ηλεκτροδίων υδραργύρου (ηλεκτρόδιο κρεµάµενης σταγόνας υδραργύρου(HMDE) και σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (DME)) µε ηλεκτρόδια, τα οποίαδιατηρούν τις ηλεκτροχηµικές ιδιότητες της επιφάνειας του υδραργύρου, αλλάταυτόχρονα διαθέτουν και τα πλεονεκτήµατα των στερεών ηλεκτροδίων (µη τοξικόυλικό, µηχανική αντοχή, εφαρµοσιµότητα σε απλές και φθηνές συσκευέςαισθητήρων, κ.λπ.), το επόµενο βήµα περιελάµβανε την κατασκευή ενός ηλεκτροδίουµε εναπόθεση υµενίου υδραργύρου σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα,τροποποιηµένου µε νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλών τοιχωµάτων (MF / MWNTs /GCE).Το MF / MWNTs / GCE χρησιµοποιήθηκε για την ανάλυση µονόκλωνου (ss)και δίκλωνου (ds) DNA, καθώς και για την ανάλυση ενζυµικά µεθυλιωµένου JurkatDΝΑ σε διαφορετικούς βαθµούς. Σύµφωνα µε τα πειραµατικά αποτελέσµατα και µεβάση τη µέγιστη µείωση της καθοδικής κορυφής της κυτοσίνης και της αδενίνης (CAκορυφή), η οποία δείχνει υψηλή ευαισθησία στη δοµή του DNA, εφόσον οιαναγόµενες περιοχές στην αδενίνη και την κυτοσίνη αποτελούν τµήµα των δεσµώνυδρογόνου και κρύβονται στο εσωτερικό της διπλής έλικας του µοντέλου WatsonCrick,το ηλεκτρόδιο MF / MWNTs / GCE µπορεί να ανιχνεύσει χαµηλά επίπεδα τωνµορίων του DNA, έπειτα από την ex situ προσρόφηση του, µε τη βοήθεια τηςπροσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίας (AdS) τετραγωνικού παλµού (SWV).Επίσης, τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το ηλεκτρόδιο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη διάκριση του δίκλωνου (ds) από το µονόκλωνο (ss) DNA και για την ανίχνευσηµεταβολών που προκύπτουν από την παρουσία µεθυλίωσης σε ένα µόριο DNA.Tα ιοντικά υγρά (ionic liquids, ILs), των οποίων η δοµή συνήθωςπεριλαµβάνει ένα µεγάλο οργανικό κατιόν και ένα µικρό ανόργανο ανιόν,παρουσιάζουν πολλά ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, όπως το µεγάλο ηλεκτροχηµικόπαράθυρο, την ικανότητα να προάγουν την µεταφορά ηλεκτρονίων, την υψηλήχηµική και θερµική σταθερότητα, τη σχετικά υψηλή αγωγιµότητα και την πολύ καλήβιοσυµβατότητα, µε αποτέλεσµα να βρίσκουν πολλές εφαρµογές στην ηλεκτροχηµείακαι στους ηλεκτροχηµικούς αισθητήρες.Λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους, τα ILs µπορούν ναχρησιµοποιηθούν είτε ως ηλεκτρολύτες είτε ως υλικό µορφοποίηησης ηλεκτροδίωνόπου η ανάµιξή τους µε σκόνη άνθρακα (συνήθως γραφίτη) οδηγεί σε ένα νέο είδοςχηµικώς τροποποιηµένων ηλεκτροδίων πάστας άνθρακα, που ονοµάζονταιηλεκτρόδια πάστας άνθρακα ιοντικού υγρού (carbon paste ionic liquid, CILE) και ταοποία παρουσιάζουν σηµαντικά µεγαλύτερη απόδοση από τα συµβατικά ηλεκτρόδιαεργασίας.Τα ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα ιοντικού υγρού (CILEs) χρησιµοποιούνταιγια την ανίχνευση διαφόρων ηλεκτροενεργών και µη ενώσεων είτε αυτούσια είτε ωςβάση για περαιτέρω µορφοποίηση. Πρόσφατα, τα ηλεκτρόδια πάστας ιοντικού υγρούCILEs, άρχισαν να χρησιµοποιούνται µε επιτυχία στο πεδίο της ηλεκτροχηµείας τωννουκλεϊκών οξέων (ΝΑς).Έτσι, στη συνέχεια της εργασίας, κατασκευάστηκε ένα ηλεκτρόδιο πάσταςνανοσωλήνων άνθρακα µε τη χρήση του 1-βουτυλο-4-µεθυλοπυριδινικούεξαφθοροφωσφορικού ιοντικού υγρού, ως συνδετικού µέσου (IL-CNTPE). Με τηχρήση του ηλεκτροδίου αυτού επιτεύχθηκε άµεση ηλεκτροχηµική µελέτη τουdsDNA. Συγκεκριµένα, έπειτα από ακινητοποίηση του dsDNA στην επιφάνεια τουηλεκτροδίου, εµφανίστηκαν δυο πολύ καλά σχηµατισµένες κορυφές, οι οποίεςαποδόθηκαν στην οξείδωση των καταλοίπων της γουανίνης και της αδενίνης τουµορίου του dsDNA. Με βάση το σήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενεςαναλυτικές συνθήκες, πολύ χαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούνµετά από σύντοµο χρόνο ακινητοποίησης και µε όριο ανίχνευσης ίσο µε 0,249 mg L-1, χρησιµοποιώντας την τεχνική της προσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίαςδιαφορικού παλµού (AdSDPV). Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ του DNA και των διαφόρων επιφανειοδραστικώνχηµικών οντοτήτων έχουν µελετηθεί εκτεταµένα τα τελευταία χρόνια. Πρόσφαταένας µεγάλος αριθµός δηµοσιευµένων µελετών, σχετικά µε το θέµα της σύνδεσης τουDNA µε τις επιφανειοδραστικές ουσίες, αναφέρουν ότι το DNA µπορεί νασχηµατίσει σταθερά σύµπλοκα µε τις τασενεργές ουσίες, µέσω υδρόφοβων ήηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων.Αξιοποιώντας λοιπόν, την ισχυρή αυτή αλληλεπίδραση, στο τελευταίοκοµµάτι της εργασίας, χρησιµοποιήθηκε ως βάση για την περαιτέρω τροποποίηση µεκατιονικές τασενεργές ουσίες · το βρωµιούχο δωδεκυλοτριµεθυλαµµώνιο (DTAB)και το βρωµιούχο τετραδεκυλοτριµεθυλαµµώνιο (TTAB), ένα ηλεκτρόδιο πάσταςάνθρακα τροποποιηµένο µε νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλών τοιχωµάτων(MWNTs/CPE)). Τα ηλεκτρόδια DTAB/MWNTs/CPE και ΤTAB/MWNTs/CPEχρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό του dsDNA. Συγκρίνοντας, την απόδοσητων ηλεκτροδίων αυτών και του ηλεκτροδίου MWNTs/CPE, αναφορικά µε τα όριαανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, διαπιστώθηκε µεγάλη βελτίωση. Σύµφωνα µε τααποτελέσµατα, η παρουσία των κατιονικών τασιενεργών µπορεί να ενισχύσει τηνπροσρόφηση του dsDNA στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου MWNTs / CPE. Με βάσητο σήµα οξείδωσης της γουανίνης, στις επιλεγόµενες αναλυτικές συνθήκες, πολύχαµηλά επίπεδα του dsDNA µπορούν να ανιχνευθούν µετά από σύντοµο χρόνοακινητοποίησης και µε όρια ανίχνευσης ίσα µε 0,650 mg L-1και 0,119 mg L-1,χρησιµοποιώντας την τεχνική της προσροφητικής αναδιαλυτικής βολταµµετρίαςδιαφορικού παλµού (DPΑSV), για τα ηλεκτρόδια DTAB/MWNTs/CPE καιΤTAB/MWNTs/CPE, αντίστοιχα.Συµπερασµατικά, τα παραπάνω αποτελέσµατα υποδηλώνουν ότι ταηλεκτρόδια που κατασκευάστηκαν αποτελούν ένα πολλά υποσχόµενο εργαλείο γιατην ανάπτυξη ηλεκτροχηµικών βιοαισθητήρων µε διάφορες εφαρµογές, όπως ηανίχνευση του υβριδισµού και των διαφόρων τροποποιήσεων του DNA, σεφαρµακευτικές και περιβαλλοντικές αναλύσεις και στον ποιοτικό έλεγχο γενικότερα,αποφεύγοντας το υψηλό κόστος, τις χρονοβόρες και περίπλοκες διαδικασίες και τηχαµηλή ευαισθησία.