Διερεύνηση της εξέλιξης των εξειδικεύσεων των διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών
Authors: Γιαλελής Βασίλειος 
Published: September 2021

Οι μεταφορείς πουρινών-πυριμιδινών των βακτηρίων κατανέμονται σε δύο οικογένειες, τις NCS1 και NAT/NCS2, στις οποίες τα ομόλογα του ανθρώπου εμφανίζουν διαφορετική εξειδίκευση. Ειδικότερα, η οικογένεια NAT/NCS2 χωρίζεται σε δύο φυλογενετικά υποσύνολα, τα οποία αντιπροσωπεύονται από μεταφορείς ουρακίλης και ξανθίνης και/ή ουρικού (ομάδα NAT/COG2233) και μεταφορείς υποξανθίνης, γουανίνης και/ή αδενίνης (ομάδα AzgA-like/COG2252), αντίστοιχα. Μέχρι σήμερα η ομάδα AzgA-like δεν έχει μελετηθεί εκτενώς και δεν έχει αναλυθεί κρυσταλλογραφικά η δομή κάποιου μέλους της. Ωστόσο, τα λειτουργικώς γνωστά ομόλογα AdeP και GhxP της E. coli Κ-12, εμφανίζουν δύο ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά: α) υψηλή ταυτότητα αλληλουχίας με μεγάλη ομοιότητα στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης, αλλά αυστηρά διακριτές εξειδικεύσεις για την μεταφορά αδενίνης ή υποξανθίνης/γουανίνης αντίστοιχα και β) υψηλή συγγένεια για κλασσικούς αντιμεταβολίτες που χρησιμοποιούνται στην ιατρική πρακτική ως αντικαρκινικά ή ανοσοκατασταλτικά φάρμακα εδώ και πολλές δεκαετίες. Στόχος της διατριβής ήταν να χαρτογραφήσουμε τα διαφορετικά προφίλ εξειδίκευσης των AzgA-like μεταφορέων και να διερευνήσουμε την μοριακή βάση της διάκρισης εξειδικεύσεων των AdeP και GhxP, καταλήγοντας στον εντοπισμό αμινοξέων της αλληλουχίας τους που πιθανώς ελέγχουν την εξειδίκευση. Η στρατηγική που ακολουθήσαμε στηρίζεται σε α) φυλογενετική ανάλυση και ανάλυση μοτίβων αλληλουχίας της AzgA-like, β) ανάλυση μεταλλαξιγένεσης στους AdeP και GhxP για συγκεκριμένες θέσεις όπως υποδεικνύονται από την φυλογενετική ανάλυση, γ) ανάλυση του προφίλ εξειδίκευσης φυσικών μεταφορέων και των μεταλλαγμάτων τους με μια σειρά αναλόγων αδενίνης/γουανίνης ώστε να διερευνηθεί το εύρος των διαφορών εξειδίκευσης και δ) μελέτη της επίδρασης αντιμεταβολιτών με βάση τις αδενίνη/γουανίνη σε πειράματα κυτταροτοξικότητας in vivo. Από την φυλογενετική ανάλυση προέκυψε ότι η διατήρηση δύο τουλάχιστον ομολόγων με διακριτές εξειδικεύσεις αντίστοιχων των AdeP και GhxP, εντοπίζεται κατά βάση σε γ-Πρωτεοβακτήρια συμβιωτικών οικογενειών και κυρίως του εντέρου μεταζώων (τάξεις Enterobacterales, Pasteurellales και Aeromonadales). Οι μεταφορείς AdeP και GhxP διαχωρίζονται φυλογενετικά σχηματίζοντας δύο διακριτούς κλάδους ομολόγων που φαίνεται να σχετίζονται με την μεταφορά αδενίνης ή υποξανθίνης/γουανίνης αντίστοιχα. Για να εξετάσουμε την ενδεχόμενη συσχέτιση συγκεκριμένων περιοχών της αλληλουχίας με την λειτουργία των AzgA-like μεταφορέων, εντοπίσαμε με πληροφορική ανάλυση χαρακτηριστικά μοτίβα αλληλουχίας μεταξύ των ομολόγων από όλα τα Πρωτεοβακτήρια. Στα μοτίβα αλληλουχίας περιλαμβάνονται καταρχήν όλες οι απόλυτα συντηρημένες θέσεις αμινοξέων του προβλεπόμενου κέντρου δέσμευσης των AdeP και GhxP, οι οποίες είχαν μελετηθεί λειτουργικά σε προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου (Papakostas, Botou, and Frillingos, 2013, J. Biol. Chem. 288, 36827-36840). Παρατηρήσαμε επίσης, ότι εντός των μοτίβων αλλά σε περιφερειακές ή απομακρυσμένες από το κέντρο δέσμευσης θέσεις, συντηρούνται αμινοξέα διαφορετικού χαρακτήρα πλευρικής ομάδας μεταξύ των κλάδων των AdeP και GhxP. Είναι πιθανό αυτές οι διαφορές να δικαιολογούν την διάκριση των εξειδικεύσεων τους. Για να εντοπιστούν οι ισχυρά συντηρημένες θέσεις διαφορών ανάμεσα στα ομόλογα του AdeP και στα ομόλογα του GhxP, έγινε εξαγωγή και ανάλυση της αλληλουχίας των προγονικών αλληλουχιών του κάθε κλάδου (AncAdeP/AncGhxP). Οι θέσεις διαφορών αμινοξέων που εντοπίστηκαν από την σύγκριση των προγονικών αλληλουχιών στις περιοχές των μοτίβων, αποτέλεσαν τους στόχους μεταλλαξιγένεσης της παρούσας διατριβής στους AdeP και GhxP. Αρχικά, έγινε μεταλλαξιγένεση σε όλες τις θέσεις-στόχους στον AdeP και στην συνέχεια, οι θέσεις μεταλλαγών που εμφάνισαν σημαντικές λειτουργικές επιπτώσεις στον AdeP, αντικαταστάθηκαν και στον GhxP (με την αντίστροφη αλλαγή σε κάθε περίπτωση). Η μεταλλαξιγένεση στον AdeP αποκάλυψε δώδεκα θέσεις της αλληλουχίας, όπου οι αντικαταστάσεις που εισήχθησαν δεν επηρεάζουν σημαντικά την ενεργότητα αδενίνης, αλλά τροποποιούν το προφίλ εξειδίκευσης του φυσικού τύπου. Τα μεταλλάγματα αυτά διακρίνονται σε τρείς κατηγορίες ανάλογα με την αλλαγή που επιφέρουν στην εξειδίκευση: α) τα N49V, G93S και N95T στην περιπλασματική πλευρά των διαμεμβρανικών τμημάτων (ΤΜs) 1 και 3 εμφανίζουν μειωμένη συγγένεια για υποστρώματα που αναγνωρίζει ο φυσικού τύπου AdeP (όπως πουρίνη, 2,6-διαμινοπουρίνη) αλλά αυξημένη για υποστρώματα του GhxP (κυρίως υποξανθίνη, 6-μερκαπτοπουρίνη, αλλά και γουανίνη), β) τα I45S, M92I και S268A περιμετρικά του κέντρου δέσμευσης μειώνουν την συγγένεια για όλα τα ανάλογα πουρινών που εξετάσθηκαν, γ) τα R145A, A315V, S320A, S321A, S324A και V325A στην κυτταροπλασματική πλευρά των ΤΜs 5 και 10 φαίνεται να διευρύνουν το προφίλ εξειδίκευσης, καθώς διατηρούν την υψηλή συγγένεια για τα υποστρώματα που αναγνωρίζει ο φυσικού τύπου AdeP (αδενίνη, 2,6-διαμινοπουρίνη, πουρίνη) αλλά εμφανίζουν σημαντική συγγένεια και για ορισμένα από τα υποστρώματα του GhxP (υποξανθίνη, 6-μερκαπτοπουρίνη, αλλά όχι γουανίνη ή 6-θειογουανίνη), ενώ επιπλέον, το μετάλλαγμα AdeP_R145A (και το διπλό R145A/V146H) εμφανίζει την ιδιότητα να μεταφέρει και υποξανθίνη με πολύ υψηλή συγγένεια (KΜ στα επίπεδα του φυσικού τύπου GhxP). Στις αντίστοιχες θέσεις έγινε μεταλλαξιγένεση και στο υπόβαθρο του GhxP. Στον GhxP οι αντικαταστάσεις που εισήχθησαν οδήγησαν είτε σε πλήρη απώλεια της λειτουργίας με οποιοδήποτε υπόστρωμα (V46N, C87P, T92N, P316S/V319A) είτε σε απώλεια ενεργότητας ειδικά για την γουανίνη (S90G, I89M/S90G, A324S/A325S) είτε, σε μία περίπτωση (V319A), απώλεια ενεργότητας ειδικά για την υποξανθίνη. Σε όλες τις περιπτώσεις δεν ανιχνεύτηκαν σημαντικές αλλαγές στις συγγένειες αναγνώρισης των φυσικού τύπου υποστρωμάτων ή αναλόγων, από τα πειράματα ανταγωνισμού (τα μεταλλάγματα που μεταφέρουν μόνο το ένα από τα δύο υποστρώματα αναγνωρίζουν με υψηλή συγγένεια ακόμη και το υπόστρωμα που δεν μεταφέρουν). Κανένα από τα μεταλλάγματα του GhxP δεν εμφάνισε ικανότητα αναγνώρισης ή μεταφοράς αδενίνης ή αναλόγων της. Τα αποτελέσματα φανερώνουν ότι οι αντικαταστάσεις περιφερειακά του κέντρου δέσμευσης, αλλά και σε πιο απομακρυσμένες θέσεις, μπορεί να έχουν σημαντική επίπτωση στο προφίλ εξειδίκευσης, αλλά μεταξύ των AdeP και GhxP πιθανώς να λειτουργούν με διαφορετικό τρόπο. Οι θέσεις που εντοπίστηκαν στον AdeP ενισχύουν τα δεδομένα για την ύπαρξη δομικών περιοχών αλλά και ειδικών μοριακών “φίλτρων” που εμπλέκονται στην διαλογή των υποστρωμάτων κατά την πορεία μεταφοράς τους. Η ανάλυση της μεταλλαξιγένεσης στους AdeP και GhxP έδειξε ότι η αυστηρή διάκριση της εξειδίκευσης χαλαρώνει μόνο για την υποξανθίνη, ενώ δεν επιτεύχθηκε η άρση της διάκρισης μεταξύ αδενίνης και γουανίνης με κανένα από τα μεταλλάγματα. Για την εντόπιση διαφορών στην προτίμηση αναλόγων καθώς και διαφορών σε θέσεις της αλληλουχίας που πιθανά συνδέονται με την αναγνώριση αδενίνης-γουανίνης, μελετήθηκε εκτενώς στην E. coli, ο μεταφορέας αδενίνης/γουανίνης/υποξανθίνης Q92VC3 του S. meliloti και συγκρίθηκε το προφίλ εξειδίκευσης και η αλληλουχία του με τους συγγενικούς AdeP και GhxP καθώς και με τα μεταλλάγματα τους. Ο Q92VC3 βρέθηκε ότι παρουσιάζει ευρεία εξειδίκευση, περιλαμβάνοντας μεταξύ των υποστρωμάτων του ανάλογα πουρινών που αναγνωρίζονται τόσο από τον AdeP όσο και από τον GhxP. Επιπρόσθετα, ο Q92VC3 βρέθηκε να αναγνωρίζει και ανάλογα που δεν αναγνωρίζονται ούτε από τον AdeP ούτε από τον GhxP, όπως ορισμένες κυτοκινίνες (ανάλογα αδενίνης με υποκατεστημένη την αμινομάδα στη θέση 6) οι οποίες πιθανόν να σχετίζονται με την ρύθμιση της αλληλεπίδρασης φυτού-ριζοβίου για τον σχηματισμό φυματίων. Η υψηλή συγγένεια των μεταφορέων της AzgA-like για αντιμεταβολίτες αναδεικνύει την σημασία της μελέτης των βακτηριακών ομολόγων της οικογένειας αυτής. Οι αντιμεταβολίτες θα μπορούσαν να λειτουργήσουν και ως βακτηριοτοξικά φάρμακα με μειωμένες παρενέργειες στον ξενιστή λόγω της δυνατότητας ειδικής στόχευσης των AzgA-like μεταφορέων που δεν έχουν ομόλογα στον άνθρωπο. Στα πλαίσια της διατριβής, ελέγξαμε όλα τα πουρινικά ανάλογα/αντιμεταβολίτες για τα οποία εμφανίζουν υψηλή συγγένεια οι AdeP και GhxP, για πιθανή βακτηριοτοξική δράση τους στην E. coli K-12. Στις συνθήκες που μελετήθηκαν, το μόνο ανάλογο που παρουσίασε αναστολή της αύξησης της E. coli ήταν η 2-φθοροαδενίνη. Αν και η κυτταροτοξικότητα άλλων αντιμεταβολιτών στην E. coli είχε ήδη συσχετιστεί με την λειτουργία του GhxP, η 2-φθοροαδενίνη είναι το πρώτο κυτταροτοξικό ανάλογο/αντιμεταβολίτης που συνδέεται από τα πειράματά μας με την λειτουργία του AdeP.