Διατροφικές προκλήσεις και μικροβίωμα πεπτικού συστήματος σε εκτρεφόμενους υδρόβιους οργανισμούς
Authors: Παντελή Νικόλας 
Published: November 2023

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, η ραγδαία βελτίωση των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς έχει διευκολύνει το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό των μικροβιοκοινότητων υπό το πρίσμα περιβαλλοντικών και/ή διατροφικών επιδράσεων, αποκαλύπτοντας ένα πλήθος μικροοργανισμών που αποικίζουν τον εντερικό αυλό σε ένα καθεστώς ενδοσυμβίωσης. Στα πλαίσια της ανάπτυξης και εδραίωσης μιας βιώσιμης βιομηχανίας υδατοκαλλιεργειών, όπου επικρατεί η παραγωγή θαλασσινών προϊόντων με μειωμένο οικολογικό αποτύπωμα, επιτάσσεται η εύρεση εναλλακτικών πηγών πρωτεϊνών για τις ιχθυοτροφές. Ως εκ τούτου, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στην αποσαφήνιση του αντίκτυπου της μερικής υποκατάστασης του ιχθυάλευρου με άλευρα από προνύμφες εντόμων (Tenebrio molitor, Hermetia illucens και Musca domestica) στην μικροβιακή οικολογία του εντέρου τριών ειδών υδρόβιων ζωικών οργανισμών, της τσιπούρας (Sparus aurata) και του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax), καθώς και ενός δυνητικά εκτρεφόμενου δεκάποδου καρκινοειδούς, της γαρίδας της Βαλτικής (Palaemon adspersus). Η βακτηριακή εκτίμηση στο DNA των μεσεντερικών δειγμάτων υλοποιήθηκε επιστρατεύοντας την τεχνολογία Illumina MiSeq για την αλληλούχιση της περιοχής V3-V4 του γονιδίου 16S rRNA.Προτού πραγματοποιηθεί η μελέτη των μικροβιακών κοινοτήτων, η παρούσα διατριβή εστίασε στον καθορισμό του δειγματοληπτικού μεγέθους που είναι επαρκές να αποδώσει με στατιστική ασφάλεια αντιπροσωπευτικά συμπεράσματα για το σύνολο του πληθυσμού σε μεταγονιδιωματικές αναλύσεις μικροβιοκοινοτήτων εκτρεφόμενων ιχθύων. Για το σκοπό αυτό, τα αποτελέσματα της αλληλούχισης από 12 άτομα ανά διατροφική ομάδα τυχαιοποιήθηκαν σε όλους τους πιθανούς συνδυασμούς n-1 ατόμων και ακολούθως υπολογίστηκε η πιθανότητα καταγραφής των μέσων παραμέτρων αφθονίας και ποικιλότητας. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής ανέδειξαν ότι η αύξηση του μεγέθους δείγματος μπορεί να περιορίσει την επικράτηση ατόμων με υψηλό μικροβιακό φορτίο στα αποτελέσματα και να εξασφαλίσει τη στατιστική εμπιστοσύνη που απαιτείται για την αξιόπιστη εκτίμηση των διατροφικά επαγόμενων μετατοπίσεων στις μικροβιοκοινότητες του εντέρου. Περαιτέρω, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επιλογή του δειγματοληπτικού μεγέθους οφείλει να συνάδει με τον πρωταρχικό σκοπό της έρευνας, δεδομένου ότι τρία δείγματα καθίστανται επαρκή για τη μερική εκτίμηση της μέσης ποικιλότητας, ενώ αντίθετα για τον προσδιορισμό του πραγματικού πλούτου ειδών και την καταγραφή μεταβολών ως απόκριση σε διατροφικές προκλήσεις απαιτείται αριθμός δειγμάτων που ανέρχεται στα εννέα. Η μερική υποκατάσταση με εντομοάλευρα διατήρησε την επικράτηση των Firmicutes, Proteobacteria και Actinobacteria ως τα κυρίαρχα βακτηριακά φύλα στις μικροβιακές κοινότητες των δύο ειδών ιχθύων χωρίς σημαντικές μεταβολές στους δείκτες ποικιλότητας. Εντούτοις, τα δύο είδη υπέδειξαν ειδο-ειδική απόκριση στις ιχθυοτροφές, με τις μικροβιακές κοινότητες του S. aurata να παρουσιάζουν μεγαλύτερη διαφοροποίηση και δια-ατομική διακύμανση μεταξύ των διατροφικών ομάδων. Τα εντομοάλευρα ευνόησαν τη δημιουργία οικοθέσεων στις κοινότητες για εμφάνιση ή και κυριαρχία διάφορων ωφέλιμων βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων βακτηρίων του γαλακτικού οξέος που χρησιμοποιούνται ευρέως στις υδατοκαλλιέργειες ως προβιοτικά. Η ανάλυση δικτύων συνύπαρξης ανέδειξε πληθώρα μοναδικών βακτηριακών αλληλεπιδράσεων που ευνοούνται από τα εντομοάλευρα και συμβάλλουν στον καθορισμό της λειτουργικότητας και στην οικολογική σταθερότητα των μικροβιοκοινοτήτων. Επιπρόσθετα, το προβλεπόμενο λειτουργικό προφίλ των εντερικών κοινοτήτων υπέδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις σε γονίδια που σχετίζονται με ποικίλες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολικών μονοπατιών. Οι επαγόμενες από τα εντομοάλευρα αλλαγές στις μικροβιακές κοινότητες ενδέχεται να επηρέασαν ιστο-ειδικά το βασικό ενδιάμεσο μεταβολισμό, όπως παρατηρήθηκε σύμφωνα με την ενζυμική δραστικότητα. Όσον αφορά το P. adspersus, η προκαταρκτική εκτίμηση υπέδειξε την επικράτηση του φύλου Proteobacteria στις μικροβιακές κοινότητες, ενώ η μερική υποκατάσταση με τα εντομοάλευρα συνέβαλε στον εμπλουτισμό των Firmicutes ενδεχομένως λόγω της παρουσίας της χιτίνης και επιπρόσθετων αλλαγών στην πηγή των υδατανθράκων. Ανάμεσα στα υπό μελέτη εντομοάλευρα, η μερική υποκατάσταση με H. illucens πιθανώς προώθησε τη μικροβιακή ισορροπία και ευνόησε δείκτες της φυσιολογικής κατάστασης όπως ο λόγος Firmicutes προς Bacteroidetes, συμβάλλοντας έμμεσα στη βελτίωση της αύξησης του P. adspersus. Εν αντιθέσει, τα αποτελέσματα σχετικά με το T. molitor ως υποκατάστατο του ιχθυαλεύρου υπέδειξαν διαταραχές στην ποικιλότητα και ομοιομορφία των μικροβιακών οικοσυστημάτων, ευνοώντας την ανάπτυξη εντερικής δυσβίωσης και την εμφάνιση ευκαιριακών παθογόνων και μη βακτηρίων.Εν κατακλείδι, η παρούσα διατριβή παραθέτει σημαντικά ευρήματα για τον πειραματικό σχεδιασμό μελλοντικών μεταγονιδιωματικών μελετών σε εκτρεφόμενους ιχθείς και επισημαίνει την επιτακτική ανάγκη επιλογής επαρκούς δειγματοληπτικού μεγέθους, ικανού να αποτυπώσει με αξιοπιστία τις διατροφικές επιδράσεις στις εντερικές μικροβιακές κοινότητες. Περαιτέρω, τα παρόντα ευρήματα υπογραμμίζουν τη συμβολή της διατροφής στη διαμόρφωση και ισορροπία των μικροβιοκοινοτήτων και υποδεικνύουν ότι η χρήση των αλεύρων από διάφορα έντομα ως συστατικά των ζωοτροφών δύναται να προκαλούν ειδικές για το εκάστοτε είδος διαφοροποιήσεις της δομικής και λειτουργικής δυναμικής των μικροβιακών κοινοτήτων του εντέρου.