Νέες αναλυτικές μεθοδολογίες για τον έλεγχο υπολειμμάτων και μεταβολιτών φαρμακευτικών ενώσεων στο θαλάσσιο περιβάλλον ιχθυοκαλλιεργειών
Authors: Καλογεροπούλου Αγγελική 
Published: December 2021

Η ταχεία αστικοποίηση της ελεύθερης γης, η βιομηχανική πρόοδος και η βελτίωση της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής οδήγησε στην ανάπτυξη και την αυξημένη κατανάλωση διαφόρων χημικών ουσιών που αναγνωρίζονται ως περιβαλλοντικοί ρυπαντές. Οι αποκαλούμενοι ως «αναδυόμενοι ρύποι» (emerging contaminants) είναι χημικές ουσίες, οι οποίες αποτελούν πιθανό κίνδυνο τόσο για το περιβάλλον όσο και για την ανθρώπινη υγεία, σύμφωνα με την υπηρεσία περιβάλλοντος των ΗΠΑ (US EPA – Environmental Protection Agency) και βρίσκονται σε εύρος συγκεντρώσεων από ng L-1 έως μg L-1. Στην κατηγορία αυτή, ανήκουν οι φαρμακευτικές ουσίες, εξαιτίας της ευρείας χρήσης τους, των φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους και της ατελούς απομάκρυνσής τους από τις μονάδες επεξεργασίας λυμάτων (wastewater treatment plants, WWTPs). Μία ομάδα τέτοιων ουσιών ευρέως χρησιμοποιούμενων αποτελούν οι φαρμακευτικές ουσίες και τα προϊόντα προσωπικής φροντίδας (Pharmaceuticals and Personal Care Products, PPCPs), που προορίζονται για ανθρώπινη και κτηνιατρική χρήση. Εκτός από τα συνταγογραφούμενα φάρμακα, στα προϊόντα αυτά ανήκουν επίσης οι διαγνωστικές και θρεπτικές ουσίες, τα αρώματα, τα αντηλιακά, πλήθος καλλυντικών και άλλα. Οι φαρμακευτικές ουσίες και οι ενεργοί μεταβολίτες τους εισέρχονται συνεχώς στο υδάτινο περιβάλλον, ως πολύπλοκα μίγματα, μέσω διαφόρων οδών. Έχουν ανιχνευτεί υπολείμματά τους τόσο στα υπόγεια και επιφανειακά ύδατα, όσο και στα αστικά και νοσοκομειακά υγρά απόβλητα.Οι κυριότερες πηγές των φαρμακευτικών αυτών ουσιών στο περιβάλλον είναι οι αστικές μονάδες επεξεργασίας λυμάτων, γεωργικές εγκαταστάσεις, υδατοκαλλιέργειες, νοσοκομεία και εγκαταστάσεις παραγωγής φαρμάκων. Ως εκ τούτου, τα τελευταία 15 χρόνια έχει πραγματοποιηθεί ουσιαστική έρευνα για να προσδιοριστεί η παρουσία, η τύχη, τα αποτελέσματα και οι κίνδυνοι των φαρμακευτικών αυτών ουσιών στο περιβάλλον. Σε εθνικό επίπεδο, οι έρευνες που αφορούν τις επιπτώσεις σε παράκτιες περιοχές είναι περιορισμένες, ενώ ακόμα λιγότερες είναι οι έρευνες που αφορούν περιοχές με έντονη δραστηριότητα υδατοκαλλιεργειών, που αποτελούν σημαντική εν δυνάμει πηγή θαλάσσιας ρύπανσης. Προκειμένου να εξαχθεί ένα ασφαλές συμπέρασμα για τη ρύπανση ενός οικοσυστήματος είναι επιτακτική ανάγκη η ανάλυση εκτός των υδατικών δειγμάτων και άλλων υποστρωμάτων όπως τα ιζήματα και οι φυτικοί-ζωικοί οργανισμοί.Παρότι η Ελλάδα θεωρείται μια μικρή Ευρωπαϊκή χώρα, κατατάσσεται στις χώρες με την υψηλότερη κατανάλωση φαρμακευτικών ουσιών κατ’ άτομο, μετά τις Ηνωμένες Πολιτείες και τον Καναδά. Παρόλα αυτά βέβαια, το πραγματικό ποσοστό των χρησιμοποιούμενων φαρμάκων είναι ανακριβές και σημαντικά υψηλότερο για κάποιες ουσίες, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η ετήσια κατανάλωση ενός φαρμάκου δεν είναι εύκολο να προσδιοριστεί και συχνά βασίζεται σε εκτιμήσεις.Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της διατριβής είναι αρχικά: (α) η ανάπτυξη, η βελτιστοποίηση και η επικύρωση αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό υπολειμμάτων φαρμακευτικών ενώσεων σε νερό, ίζημα και ψάρια ιχθυοκαλλιεργειών, καθώς και ο συστηματικός έλεγχος για τον προσδιορισμό των επιπέδων συγκέντρωσης των υπολειμμάτων των επιλεγμένων φαρμακευτικών ενώσεων και των μεταβολιτών τους στα ανωτέρω υποστρώματα σε διάστημα ετήσιας παρακολούθησης (monitoring). Ακολούθησε η επιλογή δύο χαρακτηριστικών εκπροσώπων των φαρμακευτικών ουσιών (των αντιβιοτικών sulfathiazole και sulfamethoxypyridazine) για περεταίρω έρευνα της συμπεριφοράς τους, όπου πραγματοποιήθηκε: (β) μελέτη της φωτολυτικής τους αποικοδόμησης σε διαφορετικούς τύπους επιφανειακών υδάτων (ποτάμιο, λιμναίο, θαλάσσιο, απεσταγμένο) τόσο σε συνθήκες περιβάλλοντος όσο και σε συνθήκες εργαστηρίου, όπου μελετήθηκαν τα εξής: κινητική, προσδιορισμός προϊόντων μετασχηματισμού, μελέτη τοξικότητας, προσδιορισμός ανόργανων ιόντων και ολικού οργανικού άνθρακα.Αναπτύχθηκε, βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε μια απλή αναλυτική μέθοδος προσδιορισμού των φαρμακευτικών ουσιών στα υδατικά δείγματα ιχθυοκαλλιέργειας. Η μέθοδος βασίστηκε στην εφαρμογή της εκχύλισης δια της στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE). Όσον αφορά τα άλλα δύο υποστρώματα που μελετήθηκαν (ίζημα, ψάρια) αναπτύχθηκε, βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε μία απλή, γρήγορη, οικονομική και φιλική προς το περιβάλλον μέθοδος, η πολυ-υπολειμματική μέθοδος QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe). Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των επιλεγμένων φαρμακευτικών ενώσεων βασίστηκε στη χρήση υγρής χρωματογραφίας υπερ-υψηλής απόδοσης (ultra-high performance liquid chromatography, UHPLC) συζευγμένο με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικάνοτητας και ακρίβειας (high-resolution-accurate-mass spectrometry, HRMS) και πιο συγκεκριμένα με τον υβριδικό αναλυτή LTQ/Orbitrap MS.Επιλέχθηκαν συνολικά 21 δραστικές φαρμακευτικές ουσίες (citalopram, venlafaxine, fluoxetine hydrochloride, erythromicin, carbamazepine, sulfadiazine, sulfamethazine, sulfamethizole, sulfamethoxazole, sulfamethoxypyridazine, sertraline hydrochloride, sulfapyridine, sulfaquionoxaline, sulfathiazole, caffeine, paracetamol, trimethoprim, carbamazepine, phenazone, oxytetracycline, oxolinic acid) και 5 προϊόντα μετασχηματισμού (O-desmethyl venlafaxine, norfluoxetine hydrochloride, N-acetylsulfamethoxazole, carbamazepine-10,11-epoxide, N-desmethyl sertraline hydrochloride). Η επιλογή των φαρμακευτικών αυτών ενώσεων βασίστηκε στην υψηλή ετήσια κατανάλωσή τους και στην ανίχνευσή τους στα επιφανειακά ύδατα, καθώς επίσης και τη σχετική ανησυχία που υπάρχει για τις πιθανές επιπτώσεις τους τόσο στους ανθρώπινους όσο και στους υδάτινους οργανισμούς. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη των αναλυτικών μεθόδων για τα υποστρώματα που μελετήθηκαν (θαλασσινό νερό, ψάρι, ίζημα) καθώς και τα πραγματικά δείγματα που εφαρμόστηκαν οι βελτιστοποιημένες και επικυρωμένες μέθοδοι συλλέχθηκαν από ιχθυοκαλλιέργεια που βρίσκεται στην περιοχή της Ηπείρου (Ιόνιο Πέλαγος). Πραγματοποιήθηκε ετήσιος συστηματικός έλεγχος για τα δείγματα του θαλασσινού νερού και των ψαριών (τσιπούρας, S.aurata), από τον Ιούλιο 2020 μέχρι τον Ιούνιο 2021, ενώ για τα πραγματικά δείγματα ιζήματος από ιχθυοκαλλιέργεια πραγματοποιήθηκε εποχιακή δειγματοληψία, καλύπτοντας τις τέσσερις εποχές: φθινόπωρο 2020 (Σεπτέμβριος), χειμώνας 2021 (Φεβρουάριος), άνοιξη 2021 (Μάιος) και καλοκαίρι 2021 (Ιούνιος).Η καταλληλότητα της SPE για τον προσδιορισμό των επιλεγμένων ενώσεων στο θαλασσινό νερό επιβεβαιώθηκε από τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου. Οι ανακτήσεις για το μεσαίο επίπεδο κυμάνθηκαν από 64.8% έως 115.4%, για το υψηλό επίπεδο βρέθηκαν μεταξύ 62.4% και 118.8% και για το χαμηλό επίπεδο από 61.6% έως 98.2%. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου (RSDr) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 0.6% έως 1.8%, για το μεσαίο επίπεδο από 0.5% έως 3.9% και για το υψηλό επίπεδο οι τιμές κυμάνθηκαν από 0.5% έως 2.2%. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (RSDR) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 1.1% έως 3.2%, για το μεσαίο επίπεδο από 1.1% έως 3.1% και για το υψηλό επίπεδο από 0.9% έως 4.8%. . Τα όρια ανίχνευσης κυμάνθηκαν από 0.3 ng L-1 έως 9.8 ng L-1, ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης βρέθηκαν από 1.2 ng L-1 έως 26.4 ng L-1.Η βελτιστοποιημένη αναλυτική μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα με μελέτη παρακολούθησης (monitoring study) διάρκειας δώδεκα μηνών (Ιούλιος 2020- Ιούνιος 2021). Θετικές ανιχνεύσεις βρέθηκαν για τις ουσίες oxytetracycline με μέγιστη συγκέντρωση 43817 ng/L (Φεβρουάριος ’21), sulfadiazine 1092 ng/L (Φεβρουάριος ’21), trimethoprim με συγκέντρωση 34.2 ng/L (Μάϊος ’21), paracetamol 343.5 ng/L (Δεκέμβριος ’20) και caffeine με μέγιστη συγκέντρωση 59.7 ng/L (Δεκέμβριος ’20). Η καταλληλότητα της πολυ-υπολειμματικής μεθόδου QuEChERS για τον προσδιορισμό των επιλεγμένων ενώσεων στα δείγματα ψαριού (τσιπούρα) επιβεβαιώθηκε από τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου. Οι ανακτήσεις για το χαμηλό επίπεδο κυμάνθηκαν από 61.8% έως 99.2%, οι ανακτήσεις για το μεσαίο επίπεδο βρέθηκαν μεταξύ 64.0% έως 107.0%, ενώ για το υψηλό επίπεδο από 64.4% έως 103.2%. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου (RSDr) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 0.6% έως 2.9%, για το μεσαίο επίπεδο από 0.5% έως 3.9% και για το υψηλό επίπεδο οι τιμές κυμάνθηκαν από 0.5% και 3.7%. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (RSDR) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 1.2% έως 5.5%, για το μεσαίο επίπεδο από 2.1% έως 6.2% και για το υψηλό επίπεδο από 0.9% έως 6.9%. Τα όρια ανίχνευσης κυμάθνηκαν από 0.3 έως 7.0 ng g-1, ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης κυμάνθηκα από 0.5 έως 19.0 ng g-1.Η βέλτιστη αναλυτική μεθοδολογία που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα με μελέτη παρακολούθησης (monitoring study) διάρκειας δώδεκα μηνών (Ιούλιος 2020-Ιούνιος 2021). Θετική ανίχνευση βρέθηκε για το αντιβιοτικό trimethoprim 26.4 ng/g (Νοέμβριος ’20). Η καταλληλότητα της μεθόδου QuEChERS για τον προσδιορισμό των επιλεγμένων ενώσεων στα δείγματα ιζήματος επιβεβαιώθηκε από τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου. Οι ανακτήσεις για το χαμηλό επίπεδο κυμάνθηκαν από 60.4% έως 95.4%, οι ανακτήσεις για το μεσαίο επίπεδο βρέθηκαν μεταξύ 63.0% έως 96.2%, ενώ για το υψηλό επίπεδο από 64.0% έως 99.2%. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου (RSDr) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 0.8% έως 2.5%, για το μεσαίο επίπεδο από 0.6% έως 2.8% και για το υψηλό επίπεδο οι τιμές κυμάνθηκαν από 0.7% έως 2.2%. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (RSDR) για το μικρό επίπεδο κυμάνθηκε από 1.1% έως 4.2%, για το μεσαίο επίπεδο από 1.6% έως 4.2% και για το υψηλό επίπεδο από 1.0% έως 5.8%. Τα όρια ανίχνευσης κυμάνθηκαν από 0.4 ng g-1 έως 12.3 ng g-1, ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης βρέθηκαν από 1.5 ng g-1 έως 35.5 ng g-1. Η αναλυτική μεθοδολογία που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα ιζήματος από ιχθυοκαλλιέργεια σε εποχιακή δειγματοληψία (αναλύθηκε ένα δείγμα για κάθε εποχή). Δεν ανιχνεύτηκε καμία από τις υπό μελέτη φαρμακευτικές ενώσεις πέραν της caffeine που και αυτή βρέθηκε σε συγκέντρωση κάτω του ορίου ποσοτικοποίησης. Η εκτίμηση της επικινδυνότητας (οξείας και χρόνιας) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του πηλίκου και του αθροίσματος των τοξικών μονάδων για τα τρία τροφικά επίπεδα (ψάρια, ασπόνδηλα, μικροφύκη). Από τους υπολογισμούς των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα οξείας τοξικότητας, σοβαρότερες πιέσεις δέχονται οι ταξινομικές ομάδες των ασπόνδηλων και των μικροφυκίων. Συγκεκριμένα, υψηλή τοξικότητα εμφάνισαν οι ενώσεις paracetamol και sulfadiazine στα ασπόνδηλα και τα μικροφύκη, αντίστοιχα (RQ>1), καθώς και το αντιβιοτικό oxytetracycline, το οποίο εμφάνισε υψηλή οξεία τοξικότητα και στις τρεις ταξινομικές ομάδες. Ο υπολογισμός των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα χρόνιας τοξικότητας εμφάνισε υψηλό κίνδυνο για το αντιβιοτικό oxytetracycline στις ταξινομικές ομάδες των ασπόνδυλων και των μικροφυκίων.Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μελέτη της φωτολυτικής αποικοδόμησης των δύο επιλεγμένων οργανικών ενώσεων (sulfathiazole και sulfamethoxypyridazine). Η επιλογή των δύο ενώσεων βασίστηκε κυρίως στην ευρεία και εκτεταμένη χρήση τους παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια και στα υψηλά ποσοστά ανίχνευσής τους στα επιφανειακά ύδατα. Η μελέτη της φωτολυτικής αποικοδόμησης των δύο ουσιών, πραγματοποιήθηκε σε απεσταγμένο νερό και σε τρείς διαφορετικούς τύπους φυσικών νερών (ποτάμιο, λιμναίο, θαλάσσιο), υπό την επίδραση τόσο τεχνητής (συσκευή προσομοίωσης ηλιακής ακτινοβολίας Suntest), όσο και φυσικής ηλιακής ακτινοβολίας. Και στις δύο περιπτώσεις, η φωτόλυση των ουσιών στα φυσικά νερά ήταν γρηγορότερη όταν πραγματοποιήθηκε υπό την επίδραση της τεχνητής ηλιακής ακτινοβολίας, από ότι υπό την επίδραση της φυσικής ηλιακής ακτινοβολίας. Ωστόσο, οι δύο ουσίες παρουσίασαν και στις δύο περιπτώσεις μικρότερο ρυθμό φωτολυτικής διάσπασης στο απεσταγμένο νερό από ότι στα επιφανειακά ύδατα, υποδεικνύοντας ότι η ύπαρξη της οργανικής ύλης στα φυσικά νερά, αυξάνει την κινητική, οδηγώντας σε πιο γρήγορη φωτολυτική διάσπαση των επιλεγμένων αντιβιοτικών. Η χρήση των χουμικών οξέων και των νιτρικών ιόντων ως φωτοεαυαισθητοποιητών επιβράδυνε τη φωτοδιάσπαση των σουλφοναμίδων με αύξηση της συγκέντρωσής τους. Η διάσπαση των δύο ουσιών παρουσίασε κινητική ψευδο-πρώτης τάξης. Η ταυτοποίηση των ενδιάμεσων προϊόντων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του UHPLC/LTQ-ORBITRAP, όπου προσδιορίστηκαν συνολικά 4 προϊόντα μετασχηματισμού για την ουσία sulfathiazole και 7 προϊόντα μετασχηματισμού για το αντιβιοτικό sulfamethoxypyridazine. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με χρήση φωτοευαισθητοποιητών σε απεσταγμένο νερό και στα τρία διαφορετικά επιφανειακά νερά (ποτάμιο, λιμναίο, θαλάσσιο), υπό την επίδραση τεχνητής ηλιακής ακτινοβολίας. Ως φωτοευαισθητοποιητές χρησιμοποιήθηκαν τα χουμικά οξέα και τα νιτρικά σε συγκεντρώσεις 2.5, 5, 10, 20 mg/L, αντίστοιχα. Μετά την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της κινητικής σχηματισμού και αποδόμησης των προϊόντων μετασχηματισμού των δύο ουσιών, μελετήθηκε η τοξικότητά τους με τη χρήση του συστήματος Microtox test (Microtox 500, Azur), όπου χρησιμοποιήθηκαν τα βακτήρια Vibrio Fischeri.Για τον προσδιορισμό των ανιόντων (φθοριούχων, χλωριούχων, βρωμιούχων, νιτρικών, νιτρωδών και θεϊκών) χρησιμοποιήθηκε σύστημα υγρής χρωματογραφίας LC-10AD VP συζευγμένης με ανιχνευτή αγωγιμότητας CDD-6A και ανιονική στήλη Shim-pack IC-A3 της εταιρίας Shimadzu. Οι μετρήσεις του ολικού οργανικού άνθρακα (Total Organic Carbon, TOC), με σκοπό την εκτίμηση του ποσοστού ανοργανοποίησης και οξείδωσης των δύο φαρμακευτικών ενώσεων, πραγματοποιήθηκαν στον αναλυτή TOC-L Series της εταιρίας Shimadzu.