Methods for verification of submicroscopic pathogenic copy number variations
Authors: Твеленёва А.А. , Шилова Н.В. 
Published: December 2020

Геномная вариабельность является основой эволюции генома человека и включает в себя вариации последовательности ДНК и структурную вариабельность. К структурной вариабельности относят вариации числа копий участка ДНК (copy number variation - CNV), размером от 1000 п.н. до нескольких десятков млн п.н. Среди них выделяют субмикроскопические CNV размером от 1000 п.н. до 3 млн п.н., часть из которых является клинически значимой, то есть ассоциирована с задержкой психомоторного развития, врожденными пороками и/или аномалиями развития, а также заболеваниями аутистического спектра. Для анализа CNV используют широкий спектр методов с различной разрешающей способностью. В качестве универсального метода детекции субмикроскопических CNV в клинической практике используется хромосомный микроматричный анализ. Однако все чаще для анализа CNV используются методы высокопроизводительного секвенирования. Наряду с развитием полногеномных технологий, разрабатывается большое количество биоинформатических алгоритмов анализа CNV, имеющих разную эффективность. В связи с этим возрастает потребность в подтверждении полученных данных с целью исключения ложноположительных результатов. Кроме того, информации только о наличии или отсутствии CNV недостаточно для медико-генетического консультирования. Для оценки повторного риска хромосомной патологии необходимо определить структуру и происхождение обнаруженной CNV. С этой целью используются молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы. Ряд молекулярно-генетических методов, основанных на использовании ПЦР, имеют разрешающую способность, достаточную для подтверждения субмикроскопических CNV. Молекулярно-цитогенетические методы включают в себя различные модификации метода флуоресцентной in situ гибридизации. Анализ субмикроскопических CNV с использованием FISH-метода ограничен длиной и спецификой фрагментов ДНК в зондах, используемых в традиционных протоколах исследования. Поэтому актуальным становится использование методов на основе in situ гибридизации с ДНК-зондами длиной порядка нескольких т.п.н., что позволяет не только подтвердить CNV и установить ее происхождение, но и определить структуру хромосомной перестройки, лежащей в основе хромосомного/геномного дисбаланса. В статье обсуждаются возможности, преимущества и недостатки различных методов, используемых для верификации клинически значимых CNV.

Genomic variability is the basis of genetic diversity and evolution and includes sequence and structural variability. Structural variability refers to variations in the number of copies of DNA (copy number variations - CNVs), ranging from 1000 bp up to several megabases (Mb) in size. Among them, some submicroscopic CNVs up to 3 Mb, can lead to clinical signs such as developmental delay, intellectual disability, congenital malformations and/or dysmorphic features, as well as autism spectrum disorders. A wide range of methods with different resolution is used for CNVs analysis. To date, chromosomal microarray analysis (CMA) is a universal method for CNVs detection. However, with the advent methods of next-generation sequencing, their applicability for CNV analysis is increasingly being estimated. Therefore, with the development of genome-wide technologies and bioinformatic tools for CNV analysis, there is an increasing need to confirm the obtained data in order to establish the true values of their sensitivity and specificity. In addition, information only about localization and gene content of CNVs is not enough for genetic counseling for the family. It is necessary to define structure and origin of the detected CNV to assess accurate recurrence risk of chromosome imbalance. For this purpose, molecular genetics and molecular cytogenetic methods are used. There are some methods of molecular genetics based on PCR with sufficient resolution to confirm submicroscopic CNV longer than 1000 bp. Analysis of submicroscopic CNVs by various modifications of FISH-method is limited by the length and specificity of DNA fragments in probes used in conventional FISH-protocols. Therefore, application of DNA probes of the order of several kb in length becomes relevant. If both group of methods allow to confirm CNVs detected by wide-genome technologies, than the latter are used to estimate the structure of chromosomal imbalance. Possibilities, advantages and disadvantages of different methods for CNVs verification are discussed.