Κλινική και γενετική μελέτη ασυμπτωματικής βακτηριουρίας σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2
Authors: Ματθιοπούλου Γεωργία 
Published: February 2023

Εισαγωγή: Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι η πιο συχνή ενδοκρινολογική νόσος με αξιοσημείωτη αύξηση του παγκόσμιου επιπολασμού του, από 108 εκατομμύρια περιπτώσεις το 1980 σε περισσότερες από 460 εκατομμύρια περιπτώσεις το 2019. Σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Διαβήτη εκτιμάται ότι πάνω από 700 εκατομμύρια άνθρωποι θα έχουν διαβήτη έως το 2045. Η ασυμπτωματική βακτηριουρία (ΑΣΒ) που ορίζεται ως η παρουσία ενός είδους μικροοργανισμού σε ποσότητα τουλάχιστον 10^5 μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά χιλιοστόλιτρο (colony forming units – cfu / ml) στα ούρα ασθενών χωρίς σημεία και συμπτώματα λοίμωξης ουροποιητικού (ΛΟΣ), εμφανίζεται με τριπλάσια σχεδόν συχνότητα σε ασθενείς με ΣΔ συγκριτικά με της ασθενείς χωρίς ΣΔ. Επιπλέον, οι διαβητικοί ασθενείς με ΑΣB χαρακτηρίζονται από υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης συμπτωματικών λοιμώξεων ουροποιητικού (ΛΟΣ) και συνοδών σοβαρών επιπλοκών. Η εμφάνιση της AΣB στους διαβητικούς ασθενείς έχει συσχετισθεί τόσο με κλινικούς και βιοχημικούς παράγοντες, όσο και με γενετικούς πολυμορφισμούς γονιδίων της μη ειδικής ανοσολογικής απόκρισης του ανθρώπου. Το πρωτεϊνικό μόριο C1q, που αποτελεί το αρχικό μόριο στο κλασσικό μονοπάτι του συμπληρώματος, κωδικοποιείται από το γονίδιο C1q. Γονιδιακοί πολυμορφισμοί (SNPs) του C1q γονιδίου αυξάνουν τον κίνδυνο βακτηριακών λοιμώξεων καθώς και άλλων νοσημάτων. Ο Toll-like υποδοχέας 4 (TLR4) ανήκει στους υποδοχείς που αναγνωρίζουν διατηρημένα προϊόντα του μεταβολισμού των παθογόνων μικροοργανισμών συμμετέχοντας με αυτό τον τρόπο στην ανίχνευση των παθογόνων μικροοργανισμών από τον ξενιστή. Γονιδιακοί πολυμορφισμοί στο γονίδιο του TLR4 επηρεάζουν τη γενετική ευαισθησία σε λοιμώξεις. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση πιθανών ανεξάρτητων κλινικών και εργαστηριακών παραγόντων και η ταυτοποίηση των υπεύθυνων παθογόνων μικροοργανισμών που σχετίζονται με την εμφάνιση της AΣB σε αυτή την ομάδα ασθενών καθώς και η σχέση των C1q rs292001 (G>A) και TLR4 rs4986790 (Asp299Gly) γενετικών πολυμορφισμών (SNPs) με την εμφάνιση της AΣB σε ασθενείς με ΣΔτ2. Ασθενείς και μέθοδοι: Η παρούσα προοπτική μελέτη ασθενών – μαρτύρων πραγματοποιήθηκε το χρονικό διάστημα 2012-2019 στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο (Πα.Γ.Ν.Η) και στο Βενιζέλειο Γενικό νοσοκομείο (Β.Γ.Ν.Η) του Ηρακλείου Κρήτης. Στην μελέτη συμμετείχαν 437 ασθενείς (267 γυναίκες και 170 άνδρες) με ΣΔτ2, που ήταν υπό παρακολούθηση στα διαβητολογικά εξωτερικά ιατρεία των δύο νοσοκομείων και στο υπερτασικό εξωτερικό ιατρείο του Πα.Γ.Ν.Η. Για της σκοπούς της μελέτης καταγράφηκαν για κάθε ασθενή δεδομένα από το ιατρικό ιστορικό καθώς και κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα όπως: ηλικία, φύλο, βάρος σώματος (ΒΣ), ύψος, δείκτης μάζας – σώματος (ΔΜΣ), ευρήματα φυσικής εξέτασης, οικογενειακό ιστορικό διαβήτη, διάρκεια διαβήτη, επίπεδα γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c), πρόσφατη χρήση αντιμικροβιακών, επεισόδιο ΛΟΣ εντός του τελευταίου έτους, υποτροπιάζουσες ΛΟΣ (ΥΛΟΣ), πρόσφατη σεξουαλική επαφή και δεδομένα εργαστηριακής ανάλυσης αίματος και ούρων. Οι ασθενείς με ΣΔτ2 και θετική καλλιέργεια ούρων για ΑΣΒ θεωρήθηκαν ως η ομάδα ασθενών στη συγκεκριμένη μελέτη, ενώ οι ασθενείς με ΣΔτ2 και αρνητική καλλιέργεια ούρων θεωρήθηκαν ως ομάδα ελέγχου (μάρτυρες). Οι ποσοτικές μικροβιακές καλλιέργειες των δειγμάτων ούρων των ασθενών, πραγματοποιήθηκαν με τεχνικές αναφοράς ενώ η ταυτοποίηση των βακτηριακών ειδών και ο προσδιορισμός της αντιμικροβιακής ευαισθησίας έγινε με τη χρήση βιοχημικών μεθόδων αναφοράς και με αυτοματοποιημένο σύστημα ταυτοποίησης μικροβίων και προσδιορισμού ελέγχου ευαισθησίας με βάση την ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (Vitek 2 BioMérieux SA). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων του κλινικού μέρους της μελέτης βασίστηκε στον έλεγχο Fisher’s exact test, Student’s t-test και Mann–Whitney U-test ανάλογα με τον τύπο των μεταβλητών. Οι στατιστικές εκτιμήσεις και μετρήσεις υπολογίστηκαν με το GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Η πολυπαραγοντική λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού προγράμματος, version 23.0 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA). Η γενετική ανάλυση βασίστηκε σε ένα υποπληθυσμό 76 ασθενών με ΣΔτ2 και AΣB και των δύο φύλων (ομάδα ασθενών) και 76 ασθενών με ΣΔτ2 χωρίς AΣB (μάρτυρες). Από τον πληθυσμό αυτό απομονώθηκε γενωμικό DNA και ακολούθησε γονοτύπηση των rs292001 και rs4986790 SNPs των C1q και TLR4 γονιδίων, αντίστοιχα. Η γενετική ανάλυση βασίστηκε στην αλυσιδωτή μέθοδο πολυμεράσης (PCR) και στη μέθοδο πολυμορφισμού μεγέθους περιοριστικών τμημάτων DNA (restriction fragment length polymorphisms/ RLFPs). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων του γενετικού μέρους της μελέτης βασίστηκε στο στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism (GraphPad Prism 9 Software, San Diego, CA). Οι γενετικές παραλλαγές του TLR4 και του C1q γονιδίου που διερευνήθηκαν στην παρούσα διατριβή, εκτιμήθηκαν για απόκλιση από την Hardy-Weinberg ισορροπία με τη χρήση του χ2 στατιστικού τεστ, ενώ για την ανίχνευση διαφορών στους γονότυπους και στις συχνότητες των αλληλόμορφων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων χρησιμοποιήθηκαν το χ2 στατιστικό τεστ με ένα ή δύο βαθμούς ελευθερίας ή το Fisher’s exact test.Αποτελέσματα: Η μέση ηλικία των ασθενών της μελέτης ήταν 70.5±9.6 έτη και ποσοστό 61.1% των ασθενών που συμμετείχαν στη μελέτη ήταν γυναίκες. Aσυμπτωματική βακτηριουρία εμφάνισε το 20.1% των ασθενών (88 ασθενείς). Εβδομήντα δύο γυναίκες από τις 267 (27%) και 16 άνδρες από τους 170 που συμμετείχαν στη μελέτη (9.4%), εμφάνισαν AΣB. Οι ασθενείς με ΣΔτ2 και AΣB ήταν στο μεγαλύτερο ποσοστό γυναίκες, είχαν μεγαλύτερη ηλικία, μεγαλύτερη διάρκεια διαβήτη και υψηλότερες τιμές HbA1c, συχνότερη εμφάνιση ΥΛΟΣ και ιστορικό ΛΟΣ το προηγούμενο έτος, συγκριτικά με τους ασθενείς με ΣΔτ2 χωρίς AΣB. Επιπλέον, οι διαβητικοί ασθενείς με AΣB είχαν πρόσφατη σεξουαλική επαφή, έκαναν χρήση αντιμικροβιακών το τελευταίο τρίμηνο και εμφάνισαν αλβουμινουρία, νιτρώδη και λευκοκυτταρική εστεράση στα δείγματα ούρων, σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο. Οι γυναίκες με ΣΔτ2 και AΣB είχαν υψηλότερο ΔΜΣ και εμφάνιζαν συχνότερα θετικό οικογενειακό ιστορικό διαβήτη συγκριτικά με της άνδρες με ΣΔτ2 και AΣB. Ο συχνότερος μικροοργανισμός που απομονώθηκε από τα δείγματα ούρων των ασθενών με AΣB ήταν η Escherichia coli (E. Coli), σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% των δειγμάτων. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση που εφαρμόστηκε με σκοπό την ταυτοποίηση ανεξάρτητων παραγόντων που πιθανά συσχετίζονται με την εμφάνιση AΣB στους διαβητικούς, οι υψηλότερες τιμές της HbA1c (OR 3.9) και το επεισόδιο ΛΟΣ τους προηγούμενους 12 μήνες (OR 15.876) συσχετίστηκαν θετικά και ανεξάρτητα με την εμφάνιση AΣB, ενώ τα υψηλότερα επίπεδα της βιταμίνης B12 (Β12) συσχετίστηκαν αρνητικά με την εμφάνιση της AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2 (OR 0.994 per ng/ml). Τα αποτελέσματα της γενετικής ανάλυσης έδειξαν ότι η συχνότητα του γονότυπου GG του επικρατούς αλληλόμορφου G του C1q rs292001 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με ΣΔτ2 και AΣB συγκριτικά με την ομάδα των μαρτύρων (p-value=0.0480, OR=0.3387, CI 95%: 0.1202-0.9545). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ του TLR4 rs4986790 και της εμφάνισης AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2.Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ο επιπολασμός της AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2 ήταν 20.1%. Ο επιπολασμός της AΣB στις γυναίκες με ΣΔτ2 ήταν 27% ενώ στους άνδρες με ΣΔτ2 ήταν 9,4%. Ο συχνότερος μικροοργανισμός που απομονώθηκε από τα δείγματα ούρων των ασθενών με ΣΔτ2 και AΣB ήταν η E. Coli. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η απώλεια του γλυκαιμικού ελέγχου όπως εκφράζεται από τις υψηλές τιμές της HbA1c και το πρόσφατο επεισόδιο ΛΟΣ ταυτοποιήθηκαν σαν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου εμφάνισης AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2. Σημαντικό εύρημα της πολυπαραγοντικής ανάλυσης ήταν η αρνητική συσχέτιση που παρατηρήθηκε μεταξύ υψηλότερων τιμών της Β12 και της εμφάνισης AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2. Εξίσου σημαντικό εύρημα της παρούσας μελέτης ήταν και η συσχέτιση που παρατηρήθηκε μεταξύ του πολυμορφισμού rs292001του C1q γονιδίου και της εμφάνισης AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2, ένα εύρημα που αναφέρεται για πρώτη φορά στα βιβλιογραφικά δεδομένα και αποτελεί ένδειξη ότι ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση AΣB στους ασθενείς με ΣΔτ2.