Μελέτη κλωνικότητας σε ασθενείς με χρόνια λεμφική λευχαιμία και συσχέτιση με κλινικά και βιολογικά δεδομένα
Authors: Δημητριάδου Ευαγγελία 
Published: August 2021

Μέχρι πρότεινος η άποψη που επικρατούσε ήταν ότι η μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη που εκφράζουν τα κύτταρα της Β χρονίας λεμφογενούς λευχαιμίας (ΧΑΛ) είναι πανομοιότυπη σε όλα τα κύτταρα του κλώνου. Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι >50% των ασθενών με Β ΧΛΛ εμφανίζουν διαφοροποίηση στην αλληλουχία της μονοκλωνικής lg ανοσοσφαιρίνης τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός των συνεχιζόμενων σωματικών μεταλλάξεων διατηρείται ενεργός σε κάποια ΧΛΛ λεμφοκύτταρα. Η μελέτη αυτού του φαινομένου εσωκλείει κίνδυνο πειραματικών artifacts. Επίσης άγνωστα παραμένουν η συχνότητα εμφάνισης της ΕΔ και ο τρόπος ανάπτυξής της, πλην του αίματος, στον μυελό και τους λεμφαδένες. Προκειμένου να απαντηθούν κάποια από αυτά τα ερωτήματα, αναλύθηκαν συνολικά 648 αλληλουχίες ανοσοσφαιρίνης από 9 ασθενείς με ΧΛΛ. Έγινε απομόνωση γενωμικού DNA από το αίμα 3 ασθενών (1η ομάδα: ασθ. 1-3) και από το αίμα, τον μυελό, τους λεμφαδένες και τον σπλήνα από 6 ασθενείς (2η ομάδα: ασθ. 4-9). Τα δείγματα αίματος, μυελού, λεμφαδένων και σπληνός της 2ης ομάδας ελήφθησαν από τους ασθενείς την ίδια χρονική στιγμή με σκοπό αποφυγή τυχόν επιπρόσθετων μεταλλάξεων με την πάροδο του χρόνου. Έγινε PCR για 40 κύκλους με Taq platinum πολυμεράση και εκκινητές leader ή FR1 για τις 6 οικογένειες των ανοσοσφαιρινών (VH1-6) και έναν κοινό JH εκκινητή. Ακολούθησε σύζευξη των μονοκλωνικών PCR προϊόντων στον ΤΑ βέκτορα και 13-60 κλώνοι αναλύθηκαν ως προς την αλληλουχία των βάσεων τους και προς τις δύο κατευθύνσεις. Το ποσοστό λάθους της πολυμεράσης υπολογίστηκε σε 4.4x10⁻⁴ μετά από 40 κύκλους. Οι μεταλλάξεις των βάσεων που παρατηρήθηκαν σε δύο ή περισσότερες αλληλουχίες 20 κλώνων, επιβεβαιώθηκαν όταν το πείραμα επαναλήφθηκε από την αρχή και επομένως καθορίστηκε ότι αντιπροσωπεύουν αληθή ενδοκλωνική διαφοροποίηση. Με βάση τον ορισμό αυτό, ενδοκλωνική διαφοροποίηση παρατηρήθηκε σε 6 από τους 9 ασθενείς (66.6%) (ασθ. 1, 3, 4, 5, 7, 8,). Ο ασθ. 3 εμφάνιζε σωματικές υπερμεταλλάξεις (ΣΥ) στα γονίδια της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης, ο ασθ.2 είχε δύο διαφορετικούς κλώνους (έναν με ΣΥ και έναν χωρίς) ενώ οι υπόλοιποι (ασθ. 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9) ήταν αμετάλλακτοι. Οι ασθ. 4, 5, 7 και 8 της 2ης ομάδας εμφάνισαν ενδοκλωνική διαφοροποίηση σε κάποιο ή όλα τα διαμερίσματα νόσου (αίμα/λεμφαδένα/μυελό/σπλήνα) που αναλύθηκαν. Το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων βάσεων που παρατηρήθηκαν σε έναν μόνο κλώνο βρέθηκε κοντά στο ποσοστό του λάθους της πολυμεράσης και δεν επιβεβαιώθηκαν σε δεύτερο ανεξάρτητο πείραμα. Ο ασθ. 4 εμφάνιζε ΕΔ μόνο στο αίμα σε 6 από 29 αλληλουχίες (20.68%), δύο από τις οποίες μάλιστα έχοντας και δεύτερη μετάλλαξη διαφοροποίησης, αποτελούσαν εξελικτικούς κλώνους. Οι 22 αναλυθείσες αλληλουχίες του μυελού και οι αντίστοιχες 26 του σπλήνα στον ασθενή αυτό δεν ανέδειξαν ΕΔ. Στον ασθ. 5, ΕΔ υπήρχε μόνο στους κλώνους του αίματος (2/26, 7.69%) αλλά όχι στους 27 κλώνους του μυελού. Στον ασθ. 7 ΕΔ υπήρχε μόνο στον μυελό (2/49, 4.08%) και όχι στους 67 αναλυθέντες κλώνους του αίματος και τους αντίστοιχους 49 του λεμφαδένος. Ο ασθ. 8 εμφάνιζε ΕΔ στο αίμα, τον μυελό και τον λεμφαδένα αλλά με διακριτό πρότυπο ανάπτυξης: στο αίμα παρατηρήθηκαν 5 διαφορετικοί τύποι διαφοροποίησης σε 56 από 57 κλώνους (98.24%). Στον μυελό, και οι 64 αλληλουχίες είχαν ΕΔ με πρότυπο ανάπτυξης που ακολουθούσε αυτό του αίματος αλλά εμφάνιζε έναν επιπλέον νέο τύπο διαφοροποίησης. Στο δείγμα του λεμφαδένα διατηρήθηκε το βασικό πρότυπο διαφοροποίησης του μυελού αλλά με μία νέα θέση ΕΔ. Και στα τρία δείγματα (αίμα, μυελό, λεμφαδένα) ήταν δυνατή η αναγνώριση εξελικτικών κλώνων. Στις μεταλλάξεις ΕΔ, η αναλογία μεταλλάξεων μετάβασης : μεταστροφής ήταν 24:7 (3.42:1) και η αναλογία μεταλλάξεων αντικατάστασης προς σιωπηλών ήταν 23:8 (2.875:1). Από τις 31 συνολικά θέσεις ΕΔ, οι 9 (29.03%) συνιστούσαν μοτίβα θερμού σημείου σωματικών μεταλλάξεων. Όλες οι μεταλλάξεις ΕΔ στόχευαν τα FR τμήματα της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης με το μεγαλύτερο ποσοστό τους στις FR1 περιοχές (FR1: FR3, 2.1:1). Συμπερασματικά, ΕΔ υφίσταται μόνο εάν πανομοιότυπες αντικαταστάσεις βάσεων παρατηρούνται σε δύο τουλάχιστον κλώνους. Ο τύπος και η συχνότητα διαφοροποίησης είναι δυνατό να διαφέρουν μεταξύ των ΧΑΛ κυττάρων του αίματος, του μυελού και του λεμφαδένος ενός ασθενούς. Ο τύπος των μεταλλάξεων και η προτίμηση των FR παρά των CDR περιοχών της ανοσοσφαιρίνης υποδηλώνουν απουσία αντιγονικής διέγερσης. Η διατήρηση ενεργού μηχανισμού σωματικών μεταλλάξεων στα ΧΑΛ λεμφοκύτταρα και η δυνατότητα ανάπτυξης ΕΔ με διαφορετική συχνότητα και ανομοιογενή τύπο μεταξύ αίματος, μυελού και λεμφαδένων, υποδηλώνουν σημαντική επίδραση του μικροπεριβάλλοντος στην εξέλιξη του νεοπλασματικού κλώνου.