Effects of dimethoate, an organophosphate pesticide, on photosynthesis of selected phytoplankton species
Authors: Μαυρογένης Μάρτιν-Κωνσταντίνος 
Published: June 2023

Στη διατριβή αυτή εξετάστηκε η επίδραση του dimethoate στη διεργασία της φωτοσύνθεσης των φυτοπλαγκτονικών ειδών C. reinhardtii, D. tertiolecta, Tetraselmis sp., P. tricornutum, T. pseudonana, Anabaena sp. και Porphyridium sp.. Το dimethoate είναι ένα οργανοφωσφορικό εντομοκτόνο. Χρησιμοποιήθηκε ως καθαρή ουσία (technical grade) ή ως δραστική ουσία (37%) του εμπορικού σκευάσματος Perfekthion. Το Perfekthion χρησιμοποιείται στις αγροκαλλιέργειες για την χημική καταπολέμηση των εντόμων όπως του δάκου. Το dimethoate συγκρίθηκε με το DCMU που είναι αναστολέας του φωτοσυστήματος δύο (PSII) και εν μέρει με το DBMIB που είναι αναστολέας του κυτοχρώματος b6f. Το Dimethoate συγκρίθηκε επίσης με το Perfekthion το οποίο περιέχει διαλύτες όπως το κυκλοεξάνιο, διαλυτή νάφθα και οξικό ανυδρίτη, προκειμένου να εξεταστεί εάν οι διαλύτες επηρεάζουν την φωτοσύνθεση των φυτοπλαγκτονικών ειδών. Εκτός από τη σύγκριση της επίδρασης των ζιζανιοκτόνων ανά φυτοπλαγκτονικού είδους, έγινε σύγκριση των επιλεγμένων φυτοπλαγκτονικών ειδών ως προς την απόκρισή τους στο dimethoate και στο Perfekthion. Χρησιμοποιήθηκαν κορεσμένες συγκεντρώσεις και συγκεκριμένα 3 µmol dimethoate/μg Chl a, 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a, οι οποίες έδειξαν παρόμοια επιρροή στον φθορισμό OJIP στα αναφερόμενα φυτοπλαγκτονικά είδη. Η αντίστοιχη εφαρμοζόμενη συγκέντρωση DBMIB ήταν 0,5 nmol/μg Chl a.Πραγματοποιήθηκαν εισαγωγικά πειράματα με θυλακοειδή του αρακά που απομονώνονται ευκολότερα από τα φυτοπλαγκτονικά θυλακοειδή, προκειμένου να αντληθούν πληροφορίες σχετικά με την περιοχή δράσης του dimethoate/Perfekthion στον μηχανισμό της φωτοσύνθεσης. Το Perfekthion έδειξε ισχυρότερη αναστολή της παραγωγή του οξυγόνου από το dimethoate στο φυτό του αρακά. Και τα δύο εντομοκτόνα δεν επηρέασαν το PSI ή την ATP-συνθάση, τουλάχιστον όταν χρησιμοποιήθηκαν χαμηλές εως μεσαίες συγκεντρώσεις.Αυτές οι πληροφορίες χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των κατάλληλων πειραμάτων για τα επιλεγμένα φυτοπλαγκτονικά είδη. Οι μετρήσεις της παραγωγής οξυγόνου έγιναν με την συσκευή Clark electrode, οι μετρήσεις φθορισμού χλωροφύλλης α (OJIP και NPQ) με συσκευή PAM και η ανάλυση των ξανθοφυλλών με αέρια χρωματογραφία. Για να προσδιοριστεί η περιοχή δράσης του dimethoate και του Perfekthion στα φυτοπλακτονικά είδη συγκρίθηκε η επίδραση κορεσμένων συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων στις παραπάνω μετρήσεις.Η αναστολή της παραγωγής του οξυγόνου των επτά φυτοπλαγκτονικών ειδών αυξήθηκε με αύξουσα συγκέντρωση του εντομοκτόνου. 45 pmol DCMU/μg Chl a είχαν παρόμοια επίδραση στον ρυθμό παραγωγής οξυγόνου σε σχέση με 3 µmol dimethoate/μg Chl a, ενώ 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a είχαν δύο φορές ισχυρότερη επιρροή από τo dimethoate. Αυτό δείχνει ότι το εμπορικό σκεύασμα ενεργούσε διαφορετικά στη φωτοσύνθεση του φυτοπλαγκτού από την καθαρή ουσία του dimethoate. Το είδος C. reinhardtii και πιθανόν το Porphyridium sp. επηρεάστηκαν λιγότερο από την κορεσμένη συγκέντρωση dimethoate σε σύγκριση με τα άλλα εξεταζόμενα είδη. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a έδειξαν παρόμοια αναστολή της παραγωγής οξυγόνου σε όλα τα φυτοπλαγκτονικά είδη (90-100%). Υψηλές συγκεντρώσεις dimethoate μείωσαν τον ρυθμό αναπνοής του D. tertiolecta και του Tetraselmis sp. και υψηλές συγκεντρώσεις Perfekthion μείωσαν τον ρυθμό αναπνοής του Tetraselmis sp..Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις φθορισμού OJIP για να προσδιοριστεί η περιοχή δράσης του dimethoate και του Perfekthion στην αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων. Και τα δύο εντομοκτόνα καθώς και το DCMU παρεμπόδισαν την μεταφορά των ηλεκτρονίων στο PSII μετά την πλαστοκινόνη QA και η παρεμπόδιση ήταν ισχυρότερη με αύξουσα συγκέντρωση των ζιζανιοκτόνων. 3 µmol dimethoate/μg Chl a προκάλεσαν μια μέτρια παρεμπόδιση στο PSII, ενώ 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a μια υψηλή έως ολική παρεμπόδιση της μεταφοράς των ηλεκτρονίων. Ολική παρεμπόδιση σημειώθηκε στα είδη C. reinhardtii, Τ. pseudonana, Anabaena sp. και Porphyridium sp.. Η επιρροή του DBMIB στον φθορισμό OJIP συγκρίθηκε με το dimethoate/Perfekthion καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι τα εντομοκτόνα δεν παρεμποδίζουν την λειτουργία του PSI, τουλάχιστον σε χαμηλές εως μέτριες συγκεντρώσεις.Η επίδραση των ζιζανιοκτόνων στη μέγιστη φωτοχημική απόδοση (Fv/Fm) μετρήθηκε με την συσκευή PAM για να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα της λειτουργίας του PSII υπό την παρουσία του ζιζανιοκτόνου. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a μείωσαν σημαντικά το Fv/Fm σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου στα 3 εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και στα 2 Bacillariophyceae, εκτός από το Fv/Fm του P. tricornutum όπου υψηλότερες συγκεντρώσεις Perfekthion ήταν απαραίτητες. Η συγκεκριμένη συγκέντρωση Perfekthion προκάλεσε την ισχυρότερη μείωση του Fv/Fm στο είδος D. tertiolecta. Πιθανόν οι διαλύτες του Perfekthion να απομόνωσαν το σύμπλεγμα συγκομιδής φωτός (light harvesting complex) από το PSII. Οι ελεύθερα κινούμενες κεραίες ενδεχομένως να φθόριζαν πιο έντονα, με αποτέλεσμα την ελάττωση του Fv/Fm σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a παρουσίασαν παρόμοια επιρροή στο Fv/Fm σε σχέση με το δείγμα ελέγχου στα εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και Bacillariophyceae. Περισσότερα από 18 µmol dimethoate/μg Chl a ήταν απαραίτητα για να φανεί μια ελαφριά μείωση της μέγιστης φωτοχημικής απόδοσης σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου.Η μη φωτοχημική απόσβεση (non-photochemical quenching = NPQ) των φυτοπλαγκτονικών ειδών μετρήθηκε με την συσκευή PAM στο φως (NPQL) και στο σκοτάδι (NPQDR) (φάση χαλάρωσης) κατόπιν προσθήκης του εκάστοτε ζιζανιοκτόνου. Το NPQL αναφέρεται στην θερμική διασπορά της παραπανίσιας ενέργειας φωτός. Το NPQL μειώθηκε με αύξουσα συγκέντρωση του dimethoate, που αποτελεί άλλη μια ένδειξη ότι η αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων ήταν παρεμποδισμένη. Όταν η αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων παρεμποδίζεται, λιγότερα πρωτόνια φτάνουν στο εσωτερικό των θυλακοειδών των κυττάρων. Τα πρωτόνια ενεργοποιούν άμεσα ή έμμεσα το NPQL και η μείωση των πρωτονίων συνεπάγεται σε μείωση του NPQL. Το NPQL του είδους C. reinhardtii αυξήθηκε με αυξανόμενο χρόνο ύστερα από προσθήκη 0,5-1 µmol Perfekthion/μg Chl a σε σύγκριση με 250 nmol/μg Chl a. Οι υψηλές συγκεντρώσεις του εντομοκτόνου πιθανόν να προκάλεσαν φωτοαναστολή, παρεμποδίζοντας ολοκληρωτικά την μεταφορά των ηλεκτρονίων από το PSII προς το PSI. Τα ηλεκτρόνια πιθανόν να κατέστρεψαν τα φωτοσυστήματα, το επίπεδο του φθορισμού ελαττώθηκε λόγω της ελάττωσης των ακέραιων χλωροφυλλών, το οποίο οδήγησε στην αύξηση του NPQL. Η υψηλή τιμή NPQDR στο σκοτάδι είναι επίσης ένα πιθανό δείγμα φωτοαναστολής στο είδος C. reinhardtii. Στο είδος D. tertiolecta, το NPQL μειώθηκε στις υψηλότερες εξεταζόμενες συγκεντρώσεις Perfekthion. Η χρονική ανάπτυξη του NPQL ήταν παρόμοια στα δείγματα των 3 ειδών Chlorophyceae και των 2 ειδών Bacillariophyceae (με εξαίρεση το είδος D. tertiolecta) ύστερα από προσθήκη 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a και οι τιμές NPQL ήταν κάτω από τις τιμές των δειγμάτων ελέγχου. Η κορεσμένη συγκέντρωση Perfekthion προκάλεσε υψηλότερες τιμές NPQL από την κορεσμένη συγκέντρωση του dimethoate και του DCMU στα είδη C. reinhardtii, Tetraselmis sp. και P. tricornutum.0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a αύξησαν έντονα το NPQDR και μείωσαν την παραγωγή της διατοξανθίνης (Dt) σε σύγκριση με τον δείγμα ελέγχου στο είδος P. tricornutum, υποδεικνύοντας ότι πιθανόν να υπήρχε μια απόσβεση εξαρτώμενη από την διατοξανθίνη (diatoxanthin dependent quenching = qZ), ενδεχομένως σε συνδυασμό με φωτοαναστολή. Το NPQDR ήταν το NPQ που μετρήθηκε στο τέλος της φάσης ανάκτησης, στο σκοτάδι, προκειμένου να εξετασθεί η χαλάρωση των κυττάρων. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a αύξησαν το NPQDR στο 80% σε σχέση με το δείγμα ελέγχου στο είδος C. reinhardtii, πιθανόν υποδεικνύοντας μια φωτοαναστολή. Στο ίδιο είδος και στο είδος P. tricornutum 3 µmol dimethoate/μg Chl a δεν προκάλεσαν σημαντική διαφορά στο NPQDR σε σχέση με τον δείγμα ελέγχου. Αν και η επίδραση των 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a ήταν παρόμοια στον φθορισμό OJIP των C. reinhardtii και P. tricornutum, η κορεσμένη συγκέντρωση dimethoate δεν προκάλεσε φωτοαναστολή σε αυτά τα δύο είδη σε αντίθεση με την πιθανή φωτοαναστολή που προκάλεσε το Perfekthion. Οι τιμές NPQDR δεν υπερέβησαν τις τιμές δειγμάτων ελέγχου κατόπιν προσθήκης 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a στα εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και τα Bacillariophyceae (με εξαίρεση το είδος D. tertiolecta). Στο είδος Tetraselmis sp. πιθανόν συνέβη το φαινόμενο state transition, όπου ένα μέρος των κεραιών επέστρεψε στο PSII στο σκοτάδι, αυξάνοντας τον φθορισμό κατά την φάση χαλάρωσης των κυττάρων.Για να προστεθούν επιπλέον στοιχεία για την περιοχή δράσης του dimethoate/Perfekthion στο εσωτερικό των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις ξανθοφύλλης με την αέρια χρωματογραφία. Διερευνήθηκε η αναλογία Ax/Vx και Dt/(Dd+Dt) στα 3 είδη Chlorophyceae και 2 Bacillariophyceae αντίστοιχα, υπό συνθήκες υψηλού φωτισμού. Οι μεσαίες έως υψηλές συγκεντρώσεις dimethoate και DCMU που χρησιμοποιήθηκαν μείωσαν την μετατροπή του Vx σε Ax και του Dd σε Dt σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Αυτή είναι μια ένδειξη ότι το dimethoate δρα παρόμοια με το DCMU, αναστέλλοντας την λειτουργία του PSII. Η αναστολή του PSII μείωσε την συγκέντρωση πρωτονίων που είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη μετατροπή της ξανθοφύλλης Vx σε Ax και Dd σε Dt. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a δεν προκάλεσαν σημαντική διαφορά στην αναλογία Dt/(Dd+Dt) στο φυτοπλαγκτονικό είδος T. pseudonana σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. Η ίδια συγκέντρωση του Perfekthion μείωσε την αναλογία Ax/Vx στα 3 είδη Chlorophyceae και την αναλογία Dt/(Dd+Dt) στο P. tricornutum σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου και η αναστολή ήταν παρόμοια με την αναστολή που παρουσίασαν 3 µmol dimethoate/μg Chl a σε αυτά τα φυτοπλαγκτονικά είδη.