Εξερεύνηση καινοφανών μηχανισμών Delta-Notch σηματοδότησης που παρακάμπτουν την ουβικουιτυλίωση
Authors: Καλοδήμου Κωνσταντίνα 
Published: September 2024

Η σηματοδότηση Notch είναι ένας τύπος διακυτταρικής επικοινωνίας που συμμετέχει σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες και προϋποθέτει τη διακυτταρική επαφή, καθώς ο διαμεμβρανικός υποδοχέας Notch πρέπει να αλληλεπιδράσει με τους επίσης διαμεμβρανικούς προσδέτες του, τις DSL πρωτεΐνες. Στη Δροσόφιλα, τα μέλη της οικογένειας DSL πρωτεινών είναι η Delta (Dl) και η Serrate (Ser) και ενεργοποιούνται από δύο Ε3 λιγάσες ουβικουιτίνης τύπου RING, τη Neuralized (Neur) και την Mindbomb1 (Mib1) που μπορούν να καταλύσουν την ουβικουιτυλίωση των ενδοκυττάριων περιοχών τους. Γενικότερα, είναι καλά εδραιωμένο το γεγονός ότι η μόνο-ουβικουιτυλίωση και (καλύτερα) η πολύ- ουβικουιτυλίωση των μεμβρανικών πρωτεϊνών συνεισφέρει στη ενδοκύττωση τους. Γι αυτό έχει προταθεί ότι η Ubi τροποποίηση των Dl, Ser μεταφράζεται σε ενεργοποίηση της σηματοδότησης μέσω ενδοκύττωσης, αν και οι μηχανιστικές λεπτομέρειες δεν είναι γνωστές. Θεωρείται ότι η ενδοκύττωση των DSL πρωτεϊνών παρέχει την απαραίτητη δύναμη για να αλλάξει η στερεοδιαμόρφωση της NRR επικράτειας του trans προσδεμένου μορίου Notch (trans=από το γειτονικό κύτταρο), οδηγώντας σε καταρράκτη ενεργοποιητικών πρωτεολύσεων, που τελικά απελευθερώνουν το Notch ενδοκυττάριο τμήμα στον πυρήνα, που μπορεί πλέον να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων του. Πέραν των δύο λιγασών ουβικουιτίνης, δύο άλλα ενδοκυττωτικά μόρια έχουν υπονοηθεί στη λειτουργία των DSL προσδετών, η δυναμίνη και η εψίνη. Η δυναμίνη είναι μια GTPάση που παίζει καίριο ρόλο στην απόσχιση των ενδοκυττωτικών βοθρίων από την πλασματική μεμβράνη, περισφίγγοντας το λαιμό τους. Η εψίνη είναι ένα από τα μόρια-προσαρμογείς μεταξύ μεμβρανικών φορτίων και της κλαθρίνης, που εκτελεί τα βήματα της ενδοκύττωσης στην πλασματική μεμβράνη. Η ιδιαιτερότητα της εψίνης είναι ότι διαθέτει μοτίβα αλληλεπίδρασης με ουβικουιτίνη. Στη Δροσόφιλα η δυναμίνη απαιτείται σε όλες τις διεργασίες όπου εμπλέκεται το Notch και η εψίνη σε σχεδόν όλες. Αντίθετα, η δράση των Neur και Mib1 φαίνεται να είναι διαζευκτική: μία από τις δύο αρκεί για να ενεργοποιήσει τους DSL προσδέτες, ανάλογα με την περίσταση. Μάλιστα στα θηλαστικά η Mib1 φαίνεται να έχει πάρει πρωτεύοντα ρόλο, με τα ομόλογα της Neur να δείχνουν ελάχιστη συσχέτιση με Notch-εξαρτώμενες διαδικασίες.Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε αν οι Mib1 και Neur έχουν τον ίδιο μηχανισμό δράσης πάνω στον προσδέτη Delta. Αξιοποιήσαμε μία μεγάλη γκάμα από Delta και Neur παραλλαγές, που τις εξετάσαμε in vivo στο πλαίσιο των γενεαλογιών των βλαστοκυττάρων του ΚΝΣ. Δείξαμε ότι η Mib1 απαιτεί την παρουσία των ενδοκυττάριων λυσινών του Delta για να παράγει σήμα. Αντίθετα, η Neur δρα και χωρίς λυσίνες: η αλληλεπίδραση Delta-Neur αυτή καθαυτή είναι πιο σημαντική από την ουβικουιτυλίωση και από μόνη της δίνει χαμηλά επίπεδα σηματοδότησης. Όμως, η προσθήκη μορίων ουβικουιτίνης σε διαφορετικά σημεία του Delta-Neur συμπλόκου ενισχύει σημαντικά αυτή τη σηματοδότηση. Τα αποτελέσματά αυτά, συνεκτιμώμενα με το γεγονός ότι η δυναμίνη χρειάζεται για τη συγκεκριμένη διαδικασία (ενώ η εψίνη όχι), προτείνουν ότι η Neur δρα σαν ενδοκυττωτικός προσαρμογέας της Delta και το Dl-Neur σύμπλοκο είναι πιο ενεργό όταν τροποποιείται από ουβικουιτίνες, είτε αυτές προστίθενται στο Dl είτε κάπου αλλού. Ένας παρόμοιος μηχανισμός φαίνεται να τίθεται σε λειτουργία σε μία άλλη Neur εξαρτώμενη Notch διαδικασία, τη γένεση των ΝΒ στο έμβρυο, μέσω πλευρικής αναστολής. Προσπαθήσαμε να ανασυστήσουμε τη λειτουργική αλληλεπίδραση Delta και των δύο λιγασών σε κυτταροκαλλιέργειες. Αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι και οι δύο λιγάσες μπορούν να ουβικουιτυλιώσουν το Delta, εφόσον οι ενδοκυττάριες λυσίνες του είναι άθικτες. Όμως η προσπάθειά μας να ταυτοποιήσουμε αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες του Delta μέσω φασματομετρίας μάζας δεν απέδωσε καρπούς.