The role of important non-coding RNAs and related protein components in translation and transcription
Authors: Καλιάτση Ελένη 
Published: February 2023

Σε λιγότερο από μια δεκαετία από την αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος, κατέστη σαφές ότι περίπου το 85% του γονιδιώματος κωδικοποιεί RNA μόρια τα οποία δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνες. Τα μετάγραφα αυτά είναι γνωστά ως μη-κωδικά μόρια RNA (ncRNAs) και αντιπροσωπεύουν ένα δυναμικό μεταγράφωμα το οποίο περιλαμβάνει RNA που διατηρούν τη κυτταρική λειτουργία (housekeeping) όπως το μεταφορικό RNA (tRNA), το ριβοσωμικό RNA (rRNA), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snoRNAs), το RNA της ριβονουκλεάσης P και το RNA της τελομεράσης (Zhang et al., 2019). Επιπλέον, το μεταγράφωμα αυτό περιλαμβλανει και ρυθμιστικά μόρια όπως τα microRNAs (miRNAs), τα μεγάλου μήκους μη κωδικά RNAs (long ncRNAs), τα PiWi RNAs (piRNAs), τα νέα θραύσματα των tRNAs (tRNA- derived RNA fragments; tRFs), τα vault RNAs και άλλα ncRNAs τα οποία συμμετέχουν και ελέγχουν διάφορες μεταβολικές διεργασίες στα κύτταρα (Morris and Mattick, 2014- Schimmel, 2018- Lorenzi et al., 2021). Όλα αυτά τα μη-κωδικά μόρια RNA έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί βιοδείκτες σε επιγενετικό, μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο (Schimmel, 2018; Slack and Chinnaiyan, 2019). Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της μεταγραφής τους υφίστανται διάφορα στάδια ωρίμανσης, τα οποία διαμεσολαβούνται από σημαντικά ένζυμα, ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα ή ακόμα και από πρωτεΐνες-ικριώμα (scaffold proteins) γνωστές ως RNA-binding proteins (RBPs). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μορίων RNA και πρωτεϊνών καθορίζουν όχι μόνο τη λειτουργία και τη τύχη του RNA αλλά και τους ρυθμούς της μεταγραφής και μετάφρασης του κυττάρου. Η διερεύνηση του ρόλου αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τόσο τα ncRNAs όσο και τις αντίστοιχες πρωτεΐνες, καθώς επίσης για την αποσαφήνιση του πιθανού ρόλου τους στην εμφάνιση διαφόρων ασθενειών και νεοπλασιών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου σημαντικών πρωτεϊνών που δεσμεύουν RNA μόρια και συμμετέχουν τόσο στη βιογένεση των tRNA μορίων, αλλά και σε επιπρόσθετες σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε ο ρόλος της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης La (Lupus antigen) στον καρκίνο. Η υπερέκφραση της La πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα και οδήγησε σε σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων ενώ πειράματα αλληλουχισης νέας γενιάς (NGS) έδειξαν τη συμμετοχή της La στη μετάφραση και στο μεταβολισμό του RNA. Επιπρόσθετα, η συσσώρευση της La επηρέασε την έκφραση του συμπλόκου mTORC2 καθώς και σημαντικών παραγόντων που συμμετέχουν στην ωρίμανση του tRNA αλλά και στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του tRF-1001 και του tRNASerUGA. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα δέσμευσης του μοτίβου LAM, το οποίο έχει βρεθεί ότι παρουσία του RRM1 (LAM-RRM1) είναι υπέυθυνο για τη δέσμευση του RNA. Η βιοχημική μελέτη έδειξε ότι το μοτίβο LAM μόνο του, μπορεί να δεσμεύσει τόσο oligo(U) RNA όσο και πρόδρομα μετάγραφα tRNAs κάτι που επιβεβαιώνεται και από τα υπάρχοντα δομικά δεδομένα (NMR). Η ιδιότητα αυτή του μοτίβου LAM θα μπορούσε να εξηγήσει τη συμμετοχή της La στη δέσμευση μιας ποικιλίας RNAs και το ρυθμιστικό ρόλο της στην καρκινογένεση.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9 για την απαλοιφή κάθε επιμέρους πρωτεϊνικής υπομονάδας του ολοενζύμου RNase P στη καρκινική κυτταρική σειρά ΗeLa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρωτεϊνικές υπομονάδες POP1 και RPP30 είναι απαραίτητες για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, σε αντίθεση με τη πρωτεϊνική υπομονάδα RPP25. Τα κύτταρα που δεν παρήγαγαν τη πρωτεΐνη RPP25 έδειξαν αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης τους. Πειράματα αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS) στο μεταγράφωμα των κυττάρων έδειξαν ότι η RPP25 συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό των στεροειδών, ενώ επίσης παρατηρήθηκε απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης διαφόρων μη κωδικών RNAs που συμμετέχουν στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων και των long-intergenic RNAs. Επιπλέον, αλληλούχιση νέας γενιάς των μικρών RNAs έδειξε ότι συγκεκριμένα miRNAs, tRNAs και tRFs απορρυθμίστηκαν ενισχύοντας τα παραπάνω αποτελέσματα για τη συμμετοχή της RPP25 στον καρκίνο. Στη συνέχεια, απουσία της RPP25 παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα μετάφρασης. Τέλος, η ανασυνδυασμένη RPP25 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) εκφράστηκε στην επεξεργασμένη κυτταρική σειρά για μελέτη του υποκυττάριου εντοπισμού της και τη διερεύνηση της πιθανής συμμετοχής της στο διαχωρισμό φάσεων με τη μεσολάβηση RNA (RNA-phase separation). Συνοψίζοντας, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να αναδείξει μια ολοκληρωμένη εικόνα της συναρμολόγησης, του συντονισμού και της ετερογένειας σημαντικών RBPs, όπως η La και η RPP25, υπό διαφορετικές συνθήκες και να προσδιορίσει μονοπάτια που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε επίπεδο μεταγραφής και μετάφρασης, τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν περαιτέρω για θεραπευτικούς σκοπούς.