Λειτουργικός χαρακτηρισμός διοξυγονασών σχάσης που μετέχουν στον μεταβολισμό του πρωτοκατεχοϊκού οξέος στο εδαφοβακτήριο Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3
Authors: Τσαγκογιάννης Επαμεινώνδας 
Published: December 2023

Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs) είναι διαδεδομένοι περιβαλλοντικοί ρυπαντές που παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω των τοξικών και/ή καρκινογόνων ιδιοτήτων τους. Οι PAHs αποτελούνται από δυο ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους διατεταγμένους σε διάφορους σχηματισμούς. Υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις εξυγίανσης μολυσμένων περιοχών και η βιοαποδόμηση είναι μια από τις πιο αποτελεσματικές. Οι διοξυγονάσες, ένζυμα που καταλύουν την εισαγωγή δυο ατόμων O2, παίζουν τον κεντρικό ρόλο στην αερόβια βιοαποδόμηση των PAHs. Το Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3, που απομονώθηκε από μια μολυσμένη με κρεοζοτέλαιο περιοχή στην Ήπειρο, έχει την ικανότητα να αποδομεί φαινανθρένιο και άλλους ρυπαντές με υψηλούς ρυθμούς. Φαίνεται επίσης να συνδυάζει στο γονιδίωμα του τις πληροφορίες για διαφορετικές πορείες καταβολισμού των ενώσεων αυτών. Μπορεί λοιπόν να χρησιμοποιηθεί ως οργανισμός μοντέλο για την αποδόμηση των PAHs και τη μελέτη των διαφόρων πορειών μέσω των οποίων αυτή επιτυγχάνεται. Εξετάζοντας συγκεκριμένα την βιοαποδόμηση των PAHs αλλά και άλλων ευρέως διαδεδομένων περιβαλλοντικών ρυπαντών όπως η λιγνίνη, γίνεται αντιληπτό ότι η βιοαποδόμηση πληθώρας τέτοιων ενώσεων διεξάγεται μέσω ενός περιορισμένου αριθμού κοινών μεταβολικών ενδιαμέσων. Τέτοια ενδιάμεσα είναι το πρωτοκατεχοϊκό (PCA), το γεντισικό και η κατεχόλη αλλά και τα 3- και 4-υδροξυβενζοϊκά οξέα. Η παρούσα εργασία εστίασε κατά ένα μέρος στον καταβολισμό του PCA και συγκεκριμένα στη μελέτη των διοξυγονασών που καταλύουν τη σχάση του αρωματικού του δακτυλίου. Ο καταβολισμός του PCA μπορεί να γίνει μέσω τριών πορειών: την πορεία της 2,3-, την πορεία της 3,4- και την πορεία της 4,5-σχάσης του. Στο γονιδίωμα του Sphe3 υπάρχει η πληροφορία τόσο για την 3,4- (ortho-σχάση) όσο και για την 4,5-σχάση (meta-σχάση) του PCA. Στην παρούσα Διατριβή ολοκληρώθηκε η μελέτη της 4,5-διοξυγονάσης του PCA (PCD45), η οποία είχε ξεκινήσει στο πλαίσιο της Μεταπτυχιακής μου Διατριβής, ενώ πραγματοποιήθηκε μελέτη και της 3,4-διοξυγονάσης του PCA (PCD34).Συγκεκριμένα, στην παρούσα Διατριβή ταυτοποιήθηκαν μέσω NMR τα προϊόντα της αντίδρασης της PCD45 με υπόστρωμα PCA και γαλλικού οξέος ως 4-καρβόξυ-2-υδροξυμουκονική-6-ημιαλδεΰδη (CHMS) και 4-οξαλομεσακονικό οξύ (ΟΜΑ) αντίστοιχα. Ήταν η πρώτη φορά που επετεύχθη η παρακολούθηση ενζυμικών αντιδράσεων σε πραγματικό χρόνο (in situ) με τη χρήση ελεύθερου και όχι ακινητοποιημένου ενζύμου. Ήταν επίσης η πρώτη φορά που μελετήθηκε η ισορροπία μεταξύ των δύο ισομορφών (κετονική και ενολική ισομορφή του CHMS) που παρουσιάζει το προϊόν της αντίδρασης με PCA, μέσω φασματοσκοπίας NMR. Σε μια προσπάθεια διεύρυνσης του συνόλου των υποστρωμάτων που αναγνωρίζονται από την PCD45 σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων της περιοχής του ενεργού κέντρου με γνώμονα τη δημιουργία μεγαλύτερου χώρου στην περιοχή αυτή. Δημιουργήθηκαν δύο μεταλλαγμένα ένζυμα: η PCD45/F93A όπου η Phe-93 αντικαταστάθηκε με ένα κατάλοιπο αλανίνης και η PCD45/VPA όπου πραγματοποιήθηκε διπλή αντικατάσταση των καταλοίπων Val-13 και Pro-14 με δύο αντίστοιχα κατάλοιπα αλανίνης. Στην περίπτωση της PCD45/F93A διαφορές παρατηρούνται (UV/Vis φάσμα) στην αλληλεπίδραση του ενζύμου με το καφεϊκό οξύ, το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ, το 3,5-δινιτροσαλικυλικό και την 2,4,6-τριχλωροφαινόλη. Στην περίπτωση του μεταλλαγμένου ενζύμου PCD45/VPA διαφορές παρατηρούνται στο φάσμα της αλληλεπίδρασης του ενζύμου με το 3- και το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ και με το ομοπρωτοκατεχοϊκό οξύ. Αντίστοιχες μεταβολές δεν παρατηρούνται στα φάσματα των αντιδράσεων με το αγρίου τύπου ένζυμο PCD45.Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας προσδιορίστηκε και η κινητική σταθερής κατάστασης της έτερης διοξυγονάσης του PCA που εντοπίζεται στο γονιδίωμα του Sphe3, της PCD34. H PCD34 ακολουθεί και αυτή κινητική Michaelis-Menten η οποία περιγράφεται από την εξίσωση v = Vmax*[S]/([S]+Km), με Vmax = 0,0076 mM/ min και Km = 7,11 μΜ και η βέλτιστη δραστικότητα της παρουσιάζεται σε τιμές pH = 9 – 9,5 και σε θερμοκρασία 30 oC. Από τα υποστρώματα που εξετάστηκαν, η PCD34 φαίνεται να αναγνωρίζει (πέραν του PCA) και το γεντισικό, το γαλλικό, το κουμαρικό, το καφεϊκό και το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ, ενώ διαφορές σημειώθηκαν και στα UV/Vis φάσματα της αντίδρασης της PCD34 με την 4-νιτρικατεχόλη, τη 2,3-δινιτροφαινόλη και το 3,5-δινιτροσαλικιλικό οξύ. Επιχειρήθηκε ακόμη και στην περίπτωση της PCD34 η διεύρυνση του συνόλου των υποστρωμάτων που αναγνωρίζει, ώστε να είναι σε θέση να καταλύει τη σχάση και άλλων κατεχολικών υποστρωμάτων. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποιήθηκε η σημειακή μετάλλαξη R123H, όπου η Arg-123 της α-υπομονάδας της PCD34 αντικαταστάθηκε με ένα κατάλοιπο ιστιδίνης. Η μετάλλαξη αυτή είχε ως αποτέλεσμα το μεταλλαγμένα ένζυμο (PCD34/R123H) να αναγνωρίζει τα υποστρώματα της κατεχόλης και του ομοπρωτοκατεχοϊκού οξέος. Μεταξύ των ενώσεων που το Sphe3 μπορεί να αξιοποιήσει ως πηγή άνθρακα και ενέργειας βρίσκονται και τα 3- και 4-υδροξυβανζοϊκά οξέα (3ΗΒ και 4ΗΒ αντίστοιχα). Τα υδροξυβενζοϊκά οξέα αλλά και οι εστέρες αυτών αποτελούν ρυπαντές που παρουσιάζουν αυξημένη συσσώρευση στο περιβάλλον κατά τις τελευταίες δεκαετίες, λόγω της εκτεταμένης χρήσης τους στην κοσμητική και φαρμακευτική βιομηχανία αλλά και ως συντηρητικά τροφίμων, ενώ αποτελούν δυνητικούς κινδύνους τόσο για την ανθρώπινη υγεία όσο και για τομείς της οικονομίας όπως οι καλλιέργειες. Μέρος της παρούσας έρευνας εστίασε στην αποσαφήνιση των καταβολικών πορειών των ενώσεων αυτών στο P. phenanthrenivorans Sphe3 καθώς και του ρόλου διαφόρων ενζύμων που συμμετέχουν ενδεχομένως σε αυτές. Για να επιτευχθεί αυτό πραγματοποιήθηκε μεταβολομική και μεταγραφομική ανάλυση σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα που αναπτύχθηκαν παρουσία των 3ΗΒ ή 4ΗΒ ως μοναδικές πηγές άνθρακα και ενέργειας. Από τα μεταλλαγμένα κύτταρα έχει εκδιωχθεί το ένα εκ των δύο καταβολικών πλασμιδίων του Sphe3, στο οποίο εντοπίζονται τα γονίδια για κάποια ένζυμα που φαίνεται να συμμετέχουν στις ανωτέρω πορείες καταβολισμού, όπως η διοξυγονάση του γεντισικού οξέος και η 2,3-διοξυγονάση της κατεχόλης. Από τις αναλύσεις αυτές προέκυψε ότι και τα δύο στελέχη καταβολίζουν τα 3ΗΒ και 4ΗΒ μέσω του PCA ενώ φαίνεται να ακολουθείται επικουρικά και η πορεία της 1,2-σχάσης της κατεχόλης. Προέκυψαν επίσης μη αναμενόμενες, για το Sphe3, ενδείξεις για την παρουσία πορειών καταβολισμού των ενώσεων αυτών όπως η πορεία της 3,4-σχάσης του πυροκατεχοϊκού οξέος ή η οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση του 4ΗΒ ή του PCA, πορείες για τις οποίες το Sphe3 δε φαίνεται να φέρει την γενετική πληροφορία όπως έχει προκύψει από την in silico ανάλυση του γονιδιώματος του. Η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτές τις πορείες θα επιτρέψει το σχεδιασμό συστημάτων τόσο για την εξυγίανση ρυπασμένων εδαφών όσο και για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, όπως το cis,cis-μουκονικό, αξιοποιώντας χαμηλότερου κόστους υποστρώματα όπως το 4ΗΒ, το PCA και η κατεχόλη.