Implementation of rapid methods of analysis and model development in quality assessment of raw and processed poultry meat
Authors: Σπυρέλλη Ευγενία 
Published: June 2022

Η ραγδαία αύξηση της τεχνολογίας και η απαίτηση των καταναλωτών για ποιοτικά και ασφαλή τρόφιμα έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη και εφαρμογή ταχέων σύγχρονων αναλυτικών μεθόδων που έχουν ως στόχο της έγκαιρη ανίχνευση της υποβάθμισης της ποιότητας στα τρόφιμα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα των ταχέων, μη επεμβατικών τεχνικών της φασματοσκοπίας υπέρυθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR), της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) και της ηλεκτρονικής μύτης (Ε-nose) στην εκτίμηση της ποιότητας σε διάφορα προϊόντα κοτόπουλου. Οι τεχνικές αυτές εφαρμόστηκαν σε συντηρημένα δείγματα από φιλέτο στήθος κοτόπουλου, φιλέτο μπούτι κοτόπουλου, μαριναρισμένο κοτόπουλο και μπιφτέκι κοτόπουλου, και σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή ανάλυση δεδομένων (multivariate data analysis) αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν μοντέλα εκτίμησης του μικροβιακού πληθυσμού, της ποιότητας καθώς και του χρόνου από την σφαγή στα εν λόγω δείγματα. Ποσοτικά και ποιοτικά (γραμμικά και μη γραμμικά) μοντέλα αναπτύχθηκαν μετά από τη συσχέτιση των μικροβιολογικών, οργανοληπτικών και των δεδομένων που προήλθαν από τους αισθητήρες. Η επικύρωση των εν λόγω μοντέλων, πραγματοποιήθηκε με δεδομένα που συλλέχθηκαν από ανεξάρτητα πειράματα συντήρησης προϊόντων κοτόπουλου σε ενδιάμεσες θερμοκρασιακές συνθήκες ή σε δυναμικά χρονο- θερμοκρασιακά προφίλ, όπου η περίοδος σφαγής, η παρτίδα καθώς και ο αναλυτής διέφεραν. Πέρα από την ανάπτυξη και επικύρωση μεμονωμένων μοντέλων ανά αισθητήρα διερευνήθηκε επίσης και η επίδοση μοντέλων που είτε συνδύαζαν διαφορετικούς αλγόριθμους εκμάθησης (ενοποίηση, ensemble), είτε βασίζονταν στη συγχώνευση των δεδομένων από διαφορετικούς αισθητήρες (συγχώνευση δεδομένων, data fusion) για τη ανάπτυξη ενός ενιαίου μοντέλου πρόβλεψης της ποιότητας. Επιπλέον, εκτός από την εκτίμηση της ποιότητας στα προϊόντα κοτόπουλου εξετάστηκε και η συμπεριφορά του παθογόνου μικροοργανισμού Campylobacter spp. σε δείγματα μαριναρισμένου σουβλάκι κοτόπουλου που συντηρήθηκε υπό ψύξη.Ειδικότερα, στο κεφάλαιο 2, η μέθοδος της πολυφασματικής απεικόνισης (Multispectral imaging, MSI) εφαρμόστηκε σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις, παράλληλα με τη γραμμή παραγωγής σε τέσσερα είδη από προϊόντα κοτόπουλου: φιλέτο στήθος κοτόπουλου, φιλέτο μπούτι κοτόπουλου, μαριναρισμένο σουβλάκι κοτόπουλου και μπιφτέκι κοτόπουλου. Δείγματα από διαφορετικές παρτίδες παραγωγής αναλύθηκαν μικροβιολογικά ενώ παράλληλα ελήφθησαν φασματοσκοπικά δεδομένα με τη χρήση του εγκατεστημένου στην παραγωγή οργάνου πολυφασματικής απεικόνισης. Τα μικροβιολογικά αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τα αντίστοιχα φασματοσκοπικά δεδομένα για την ανάπτυξη μοντέλου εκτίμησης του χρόνου από την σφαγή (time to slaughter) μέσω της γραμμικής παλινδρόμησης με τη μέθοδο μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial-least Squares Regression, PLS-R). Η επίδοση των ανεπτυγμένων μοντέλων ήταν υψηλή σε όλες τις κατηγορίες προϊόντων, με τα μοντέλα εκτίμησης του χρόνου από τη σφαγή για το φιλέτο μπούτι κοτόπουλου και το μπιφτέκι κοτόπουλου να παρουσιάζουν την μικρότερη ρίζα μέσου τετραγωνικού σφάλματος (Root Mean Squared Error, RMSE) κατά την επικύρωση, με τιμή ίση με 0,160 και 0,285 αντιστοίχως. Στο κεφάλαιο 3, εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα των μεθόδων FT-IR και MSI για την ανάπτυξη μοντέλων εκτίμησης της μικροβιακής αλλοίωσης στην επιφάνεια φιλέτου από στήθος κοτόπουλου. Για το σκοπό αυτό, δείγματα συντηρήθηκαν σε τέσσερις ισοθερμοκρασιακές συνθήκες (0, 5, 10, 15 οC) και ανά τακτά χρονικά διαστήματα αναλύονταν για την εκτίμηση του μικροβιολογικού τους φορτίου (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα, ΟΜΧ και Pseudomonas spp.), ενώ παράλληλα στα ίδια χρονικά σημεία ελήφθησαν φάσματα FT-IR και MSI. Από τα αποτελέσματα των αναλύσεων αυτών αναπτύχθηκαν μοντέλα (γραμμικά και μη γραμμικά) για την εκτίμηση του πληθυσμού της OMX και του βακτηρίου Pseudomonas spp. με τη χρήση ενός εμπορικού λογισμικού προγράμματος ανάλυσης δεδομένων καθώς επίσης και με τη χρήση μίας διαδικτυακής πλατφόρμας επεξεργασίας δεδομένων. Η επικύρωση των μοντέλων πραγματοποιήθηκε με τον διαχωρισμό των φασματοσκοπικών δεδομένων σε αναλογία 70/30 (ανάπτυξη/επικύρωση), ενώ επιπλέον πραγματοποιήθηκε και εξωτερική επικύρωση (πρόβλεψη) με διαφορετική παρτίδα δειγμάτων κοτόπουλου. Κατά την εφαρμογή του εμπορικού προγράμματος ανάλυσης δεδομένων, η εκτίμηση της ΟΜΧ μέσω του μοντέλου PLS-R παρουσίασε τιμή RMSE κατά την πρόβλεψη ίση με 1,359 και 1,029 log CFU/cm2, για τα δεδομένα της MSI και της FT-IR ανάλυσης αντιστοίχως. Για την εκτίμηση των βακτηρίων του γένους Pseudomonas μέσω των φασματοσκοπικών δεδομένων της MSI, η τιμή RMSE της πρόβλεψης ήταν ίση με 1,574 log CFU/cm2, ενώ μέσω της ανάλυσης FT-IR η αντίστοιχη τιμή RMSE υπολογίστηκε σε 1,078 log CFU/cm2. Σε ότι αφορά στα μοντέλα που προέκυψαν μέσω της διαδικτυακής πλατφόρμας sorfML, το μοντέλο που παρουσίασε τη μικρότερη τιμή RMSE κατά την πρόβλεψη (0,717 log CFU/cm2) ήταν αυτό που αναπτύχθηκε με τη χρήση τεχνητών νευρωνικών δικτύων (Artificial Neural Networks, ANN) μέσω των δεδομένων της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) και την επικύρωση με δείγματα από την ίδια παρτίδα. Αντιθέτως, το μοντέλο least-angle regression (lars) προσαρμόστηκε καλύτερα στα φασματοσκοπικά δεδομένα από την ανάλυση FT-IR ) εμφανίζοντας τιμές RMSE ίσες με 0,904 και 0,851 log CFU/cm2 κατά την επικύρωση με δείγματα από την ίδια και διαφορετική παρτίδα αντιστοίχως.Στο κεφάλαιο 4, εφαρμόστηκαν οι ταχείες μέθοδοι FT-IR και MSI σε περισσότερα δείγματα και παρτίδες φιλέτου από στήθος κοτόπουλου για την ανάπτυξη ποιοτικών μοντέλων εκτίμησης της αλλοίωσης των δειγμάτων. Όμοια με την πειραματική διαδικασία του κεφαλαίου 3, δείγματα φιλέτου από στήθος κοτόπουλου συντηρήθηκαν σε οχτώ ισοθερμοκρασιακές συνθήκες συντήρησης και δύο δυναμικά χρονο-θερμοκρασιακά προφίλ. Κατά τη δειγματοληψία, τα δείγματα αναλύονταν μικροβιολογικά, φασματοσκοπικά (FT-IR και MSI) ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκε οργανοληπτική αξιολόγηση των δειγμάτων από ομάδα 14 ατόμων για την εκτίμηση του βαθμού αλλοίωσής τους (φρέσκο και αλλοιωμένο). Με βάση τα αποτελέσματα του οργανοληπτικού ελέγχου ορίστηκε το όριο μικροβιολογικής αλλοίωσης και τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες ποιότητας (φρέσκο και αλλοιωμένο). Εν συνεχεία, οκτώ μοντέλα μηχανικής μάθησης (μεμονωμένα και συνδυασμοί τους) αναπτύχθηκαν για κάθε κατηγορία φασματοσκοπικής μεθόδου και επικυρώθηκαν με δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα συντήρησης σε δυναμικά θερμοκρασιακά προφίλ. Ο συνδυασμός της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) με το ενοποιημένο μοντέλο subspace παρουσίασε το μεγαλύτερο ποσοστό συνολικής ακρίβειας (64,8 %). Αντιστοίχως, αποδεκτή ήταν και η επίδοση κατά την εφαρμογή του μοντέλου της διακριτικής ανάλυσης με τη μέθοδο μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Squares- Discriminant Analysis, PLS-DA) στα δεδομένα από τη φασματοσκοπία FT-IR, όπου το ποσοστό της συνολικής ακρίβειας ανήλθε σε 67,6 %.Στο κεφάλαιο 5, φιλέτο από μπούτι κοτόπουλου αναλύθηκε με όμοια πειραματική διαδικασία με τα κεφάλαια 3 και 4, ωστόσο τα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-IR και MSI αξιοποιήθηκαν για την ανάπτυξη ποσοτικών και ποιοτικών μοντέλων εκτίμησης της μικροβιακής ποιότητας στην επιφάνεια του φιλέτου από μπούτι κοτόπουλο. Επίσης, όπως και στο κεφάλαιο 4, κατά τη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε και οργανοληπτική αξιολόγηση των δειγμάτων κατά συντήρηση, τα αποτελέσματα της οποίας καθόρισαν ως όριο μικροβιακής αλλοίωσης στο συγκεκριμένο προϊόν την τιμή 6,99 log CFU/cm2 για την ΟΜΧ. PLS-R μοντέλα εφαρμόστηκαν στα φασματοσκοπικά δεδομένα από τις τεχνικές FT-IR και MSI για τον ποσοτικό προσδιορισμό της OMX και του βακτηρίου Pseudomonas spp. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκαν ποιοτικά μοντέλα (Linear Discriminant Analysis, LDA; Quadratic Discriminant Analysis, QDA; Support Vector Machines, SVM; Quadratic Support Vector Machines, QSVM) για τον διαχωρισμό των δειγμάτων σε δύο κατηγορίες ποιότητας (φρέσκο και αλλοιωμένο) με βάση το όριο που προσδιορίστηκε από την οργανοληπτική αξιολόγηση των δειγμάτων. Η εκτίμηση του πληθυσμού της ΟΜΧ και των βακτηριών του γένους Pseudomonas μέσω της τεχνικής MSI και του μοντέλου PLS-R ήταν ικανοποιητική, με τιμές RMSE κατά την επικύρωση 0,987 και 1,215 log CFU/cm2 αντιστοίχως. Η εφαρμογή του μοντέλου SVM στα φασματοσκοπικά δεδομένα της τεχνικής MSI παρουσίασε την καλύτερη επίδοση με ποσοστό συνολικής ακρίβειας κατάταξης των δειγμάτων στις δύο κατηγορίες ποιότητας που ανήλθε σε 94,4%. Ικανοποιητική κρίθηκε επίσης η χρήση του μοντέλου QDA στα φασματοσκοπικά δεδομένα της τεχνικής FT-IR, με ποσοστό συνολικής ακρίβειας κατά την ταξινόμηση των δειγμάτων σε κλάσεις ποιότητας ίσο με 71,4%.Στο κεφάλαιο 6, εκτός από την εφαρμογή των φασματοσκοπικών μεθόδων FT-IR και ΜSI, εξετάστηκε και η αποτελεσματικότητα της ηλεκτρονικής μύτης (E-nose) στην εκτίμηση της ποιότητας δειγμάτων από μαριναρισμένο σουβλάκι κοτόπουλο. Για τον σκοπό αυτό, τα δείγματα συντηρήθηκαν σε τρία ισοθερμοκρασιακά και σε ένα δυναμικά χρονο- θερμοκρασιακό προφίλ ψύξης. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, τα συντηρημένα δείγματα αναλύονταν μικροβιολογικά για την απαρίθμηση της ΟΜΧ και του βακτηρίου Pseudomonas spp., ενώ παράλληλα ελήφθησαν φασματοσκοπικά δεδομένα (FT-IR και MSI) και ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε καταγραφή του πτητικού αποτυπώματος των δειγμάτων μέσω της ηλεκτρονικής μύτης (E-nose). Μοντέλα PLS-R and SVM-R αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν για τον προσδιορισμό της OMX στα μαριναρισμένα δείγματα, για κάθε όργανο ξεχωριστά καθώς και συνδυαστικά. Επιπλέον, διερευνήθηκε η δυνατότητα ταξινόμησης των δειγμάτων σε τρεις (φρέσκο, αποδεκτό, αλλοιωμένο) ή δυο (φρέσκο, αλλοιωμένο) κατηγορίες ποιότητας, με την εφαρμογή ποιοτικών μοντέλων (LDA, LSVM, CSVM) που αναπτύχθηκαν είτε με τα δεδομένα του κάθε οργάνου ξεχωριστά είτε συνδυαστικά. Η επικύρωση όλων των μοντέλων πραγματοποιήθηκε με δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα συντήρησης των δειγμάτων κοτόπουλου από τρεις διαφορετικές παρτίδες που ελήφθησαν από διαφορετικό αναλυτή (έξι αναλυτές συνολικά). Σε ότι αφορά στα μοντέλα PLS-R για την εκτίμηση της OMX, η χρήση φασματοσκοπικών δεδομένων από την τεχνική MSI παρουσίασε την καλύτερη επίδοση με τιμή RMSE κατά την πρόβλεψη ίση με 0,998 log CFU/g, ενώ ο συνδυασμός δεδομένων από δύο φασματοσκοπικές μεθόδους FT-IR/MSI παρουσίασε επίσης καλή επίδοση με τιμή RMSE κατά την πρόβλεψη ίση με 0,983 log CFU/g. Ομοίως, τα μοντέλα SVM που αναπτύχθηκαν με τα φασματοσκοπικά δεδομένα της πολυφασματικής απεικόνισης (MSI) και του συνδυασμού FT-IR/MSI παρουσίασαν ικανοποιητική επίδοση με τιμές RMSE κατά την πρόβλεψη ίσες με 0,973 και 0,999 log CFU/g, αντιστοίχως. Κατά την επικύρωση των ποιοτικών μοντέλων κατηγοριοποίησης των δειγμάτων σε τρεις κλάσεις, η συνολική ακρίβεια ήταν μικρότερη από 60 %, για όλες τις εξεταζόμενες περιπτώσεις. Αντιθέτως, για τα μοντέλα των δυο κλάσεων, το μοντέλο CSVM που αναπτύχθηκε με τα δεδομένα που προήλθαν από το συνδυασμό των τεχνικών FT-IR/MSI εμφάνισε ποσοστό συνολικής ακρίβειας κατάταξης των δειγμάτων στις δύο κλάσεις 87,5 %, ενώ η ανάπτυξη του μοντέλου LSVM με τα δεδομένα της τεχνικής MSI παρουσίασε ποσοστό ταξινόμησης των δειγμάτων στη σωστή τους κλάση 80 % στο στάδιο της πρόβλεψης. Η συνδυαστική χρήση των φασματοσκοπικών δεδομένων των μεθόδων FT-IR και MSI αποδείχθηκε ως μία αποτελεσματική εναλλακτική λύση για την εκτίμηση της ποιότητας στο συγκεκριμένο προϊόν.Στο κεφάλαιο 7, μελετήθηκε η ασφάλεια ενός επεξεργασμένου προϊόντος κοτόπουλου σχετικά με τον παθογόνο μικροοργανισμό του γένους Campylobacter που συναντάται συχνά στο κοτόπουλο. Για τον σκοπό αυτό, δείγματα από μαριναρισμένο σουβλάκι κοτόπουλο εμβολιάστηκαν με έξι στελέχη Campylobacter (τέσσερα στελέχη C. coli και δύο στελέχη C. jejuni) και μελετήθηκε η συμπεριφορά του εν λόγω μικροοργανισμού καθώς και της αυτόχθονος μικροχλωρίδας του προϊόντος κατά την συντήρησή του σε θερμοκρασίες ψύξης (τρείς ισοθερμοκρασιακές συνθήκες και μία δυναμικά μεταβαλλόμενη θερμοκρασιακή συνθήκη). Παράλληλα, μελετήθηκε η συμπεριφορά της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας σε μη εμβολιασμένα με το παθογόνο βακτήριο δείγματα του ίδιου προϊόντος. Πρωτογενή και δευτερογενή μοντέλα της αύξησης της ΟΜΧ και του βακτηρίου Pseudomonas spp. σε σχέση με την θερμοκρασία συντήρησης αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν για τα ενοφθαλμισμένα και μη δείγματα. Επιπλέον, πρωτογενή μοντέλα επιβίωσης του Campylobacter spp. αναπτύχθηκαν με τα δεδομένα από τα τρία ισοθερμοκρασιακά προφίλ συντήρησης. Τέλος, η επιβίωση των στελεχών του παθογόνου βακτηρίου σε κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μοριακής μεθόδου Random amplified polymorphic DNA PCR (RAPD-PCR) σε απομονώσεις που πραγματοποιήθηκαν στο αρχικό, ενδιάμεσο και τελικό στάδιο κατά τη διάρκεια συντήρησης των δειγμάτων. Τα πρωτογενή μοντέλα για την εκτίμηση της κινητικής συμπεριφοράς της ΟΜΧ και του βακτηρίου Pseudomonas spp. εμφάνισαν τιμές RMSE μικρότερες από 0,941 log CFU/g για τα ενοφθαλμισμένα και μη δείγματα. Από τα μοντέλα επιβίωσης των στελεχών Campylobacter spp., το μοντέλο Weibull που αναπτύχθηκε με τα δεδομένα από τη θερμοκρασία 5 οC παρουσίασε ικανοποιητική επίδοση, με τιμή RMSE ίση με 0,112 log CFU/g. Τέλος, τα αποτελέσματα των μοριακών αναλύσεων έδειξαν ότι τα είδη C. coli και C. jejuni επιβίωσαν κατά την ψύξη του μαριναρισμένου κοτόπουλου, με μοναδική εξαίρεση τη θερμοκρασία 5 oC, όπου μόνο το είδος C. coli ήταν ανιχνεύσιμο.