The role of important ribonucleases in the regulation of gene expression
Authors: Σόκατ Αθανάσιος-Νασίρ 
Published: September 2023

Η περίπλοκη και δυναμική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από μη-κωδικοποιητικά RNAs είναι μια θεμελιώδης πτυχή της πολυπλοκότητας των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, η οποία είναι γνωστό ότι δεν οφείλεται στον αριθμό των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Οι ριβονουκλεάσες, τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την επεξεργασία του RNA, διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο σε αυτή τη ρύθμιση διαμορφώνοντας το τοπίο των μη-κωδικοποιητικών RNA μέσω της δράσης τους. Η Ριβονουκλεάση Ζ είναι το υπεύθυνο ένζυμο για την απομάκρυνση της 3' ακόλουθης αλληλουχίας από τα πρόδρομα tRNA και βρίσκεται σε όλες τις επικράτειες της ζωής. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιεί μια συγκριτική μελέτη σε δύο παράλογες μορφές της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ, την ELAC1/RNase ZS (40 kDa) και την ELAC2/RNase ZL (92,2 kDa), οι οποίες διαφοροποιήθηκαν νωρίς κατά την εξέλιξη των ευκαρυωτικών οργανισμών και παρά την προέλευσή τους από ένα κοινό προγονικό γονίδιο και έχουν αναπτύξει εξειδικευμένους ρόλους. Από την εμφάνισή της, η ELAC2 έχει τον κύριο ρόλο στην 3' επεξεργασία των πυρηνικών και μιτοχονδριακών πρόδρομων tRNA. Συμμετέχει επίσης στην ωρίμανση μακρών μη-κωδικοποιητικών μορίων RNA (lncRNA) που περιέχουν δομή που προσομοιάζει τα tRNA, όπως τα MALAT1 και NEAT1. Από την άλλη πλευρά, όπως φάνηκε πρόσφατα, η ELAC1 εμπλέκεται στην 3' επιδιόρθωση ώριμων tRNAs που απελευθερώνονται από ακινητοποιημένα ριβοσώματα και φέρουν 2'-3' κυκλικό φωσφορικό στη βάση διαχωριστή, έτσι ώστε να προστεθεί εκ νέου το CCA και στη συνέχεια να αμινοακυλιωθεί. Ωστόσο, οι ρόλοι της ELAC1 μπορεί να μην περιορίζονται στην επιδιόρθωση των tRNA, και λαμβάνοντας υπόψη ότι η ANGEL2 μπορεί να επιτελέσει παρόμοια λειτουργία, είναι σαφές ότι η ELAC1 μπορεί να έχει ένα ευρύτερο φάσμα ρόλων και λειτουργιών. Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας έχουν αναδείξει ότι η ELAC1 είναι επουσιώδης για το κύτταρο, καθώς μπορέσαμε να απαλείψουμε το γονίδιο ELAC1 με CRISPR-Cas9, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ELAC1 μπορεί να έχει έναν πιο εξειδικευμένο ρόλο. Από την άλλη πλευρά, το ELAC2 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα. Η βιοχημική και δομική σύγκριση αυτών των δύο παραλόγων έδειξε ότι η ELAC1 και η ELAC2 αν και φαίνεται να αναγνωρίζουν παρόμοια στοιχεία όπως ο η δομή αγκώνας του tRNA (tRNA elbow) ή το μήκος του στελέχους του αποδέκτη (acceptor stem), παρουσιάζουν διαφορετικές ειδικότητες υποστρώματος και βιοχημικές ιδιότητες. Διαπιστώθηκε ότι η ELAC2 είναι πιο αποτελεσματική και ακριβής στη διάσπαση των 3' ακόλουθων αλληλουχιών των πρόδρομων tRNA, ιδιαίτερα με τα πρόδρομα tRNA που δεν έχουν την ικανότητα να υιοθετήσουν την κατάλληλη διαμόρφωση, ενώ η ELAC1 επιδεικνύει την ικανότητα να κόβει το CCA τρινουκλεοτίδιο από τα ώριμα tRNAs. Δομικές έρευνες με τη χρήση προβλεπόμενων δομών προερχόμενες από το AlphaFold αποκάλυψαν σημαντικές δομικές ομοιότητες αλλά και διαφορές, κρίσιμες για την αναγνώριση του υποστρώματος και την καταλυτική δραστηριότητα. Πειράματα CLIP-seq που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τόσο της ELAC1 άγριου τύπου όσο και της καταλυτικά ανενεργής παραλλαγής ELAC1-H64A αποκάλυψαν ότι η ELAC1 μπορεί να αλληλεπιδράσει με ένα ευρύ φάσμα μεταγράφων της RNA πολυμεράσης III, συμπεριλαμβανομένων ώριμων tRNAs, snoRNAs, snRNAs, YRNAs, με τα vault RNAs να αναδεικνύονται ως το πιο σημαντικό υπόστρωμα. Αυτό υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο της σε μηχανισμούς όπως η αντίσταση στα φάρμακα και η έμφυτη ανοσία. Οι in vitro βιοχημικές δοκιμασίες επιβεβαίωσαν περαιτέρω την ικανότητα της ELAC1 να επεξεργάζεται μετάγραφα πέρα από tRNA, αποκαλύπτοντας διαφορετικά πρότυπα διάσπασης για τις ELAC1 και ELAC2. Ειδικότερα, η ELAC1 έδειξε αποκλειστική επεξεργασία των εξεταζόμενων snRNAs, YRNAs και vtRNAs. Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν την εξειδίκευση υποστρώματος της ELAC1, υποδηλώνοντας έναν ευρύτερο ρόλο στην επεξεργασία RNA από ότι είχε υποτεθεί προηγουμένως. Η αλληλούχιση ολόκληρου του μεταγραφώματος καθώς και των μικρών RNA μορίων αποκάλυψε ότι η ELAC1 επηρεάζει τη ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες καθώς και ένα ευρύ φάσμα μη-κωδικοποιητικών RNA. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τo φάσμα πιθανών υποστρωμάτων της ELAC1 περιλαμβάνει lncRNAs, snoRNAs, snRNAs, vtRNAs και miscRNAs, προσφέροντας νέες προοπτικές για τους πιθανούς ρόλους αυτού του ενζύμου. Ένα εντυπωσιακό αποτέλεσμα αυτής της μελέτης είναι τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των θραυσμάτων που προέρχονται από tRNA (tRF) σε συνθήκες knockout, υπερέκφρασης και επανεισαγωγής του ELAC1 σε knockout κύτταρα, υπογραμμίζοντας τον κρίσιμο ρόλο της ELAC1 στη διατήρηση της ισορροπίας των tRF και ενδεχομένως στην καθοδήγηση της επεξεργασίας αυτών. Επιπλέον, η εκτεταμένη ανάλυση δεδομένων small-RNAseq, υποδηλώνει ότι η ELAC1 ρυθμίζει τη βιογένεση διαφόρων μη-κανονικών μικρών RNAs, ιδίως εκείνων που προέρχονται από vtRNAs και YRNAs. Η έρευνα αυτή υποδεικνύει επίσης τον πιθανό ρόλο της ELAC1 στη ρύθμιση του 3' άκρου των μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ, το οποίο περιλαμβάνει το poly U-tract, μια κρίσιμη θέση πρόσδεσης για τη La και τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη La (La-related proteins). Η παρούσα διατριβή διερευνά τις αποκλίνουσες λειτουργίες των ELAC1 και ELAC2 και παρουσιάζει τον σημαντικό ρόλο της ELAC1 στη ρύθμιση της βιογένεσης πολλών σημαντικών μη-κωδικοποιημένων RNAs. Ο χαρακτηρισμός της ELAC1 ανέδειξε τη σημαντική επίδραση στην επεξεργασία RNA και στην κατανόηση του ρυθμιστικού δικτύου RNA και θέτει τις βάσεις για μελλοντική έρευνα σχετικά με την επεξεργασία μη-κωδικοποιητικών RNA και την πολυπλοκότητα της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς.