Ανάπτυξη νέας γενιάς αντι-αιμοπεταλιακών παραγόντων με συνδυαστική παρέμβαση σε διαφορετικά μονοπάτια ενεργοποίησης και συσσώρευσης των ανθρώπινων αιμοπεταλίων
Authors: Αγγελής Ιωάννης 
Published: May 2021

Η υψηλή ευαισθησία των αιμοπεταλίων σε διάφορες παθοφυσιολογικές καταστάσεις, τα ανέδειξε ως έναν από τους πιο προσιτούς βιολογικούς δείκτες. Μέσω της δράσης των υποδοχέων τους ενεργοποιούνται, δρώντας ως μόρια προσκόλλησης που αλληλεπιδρούν με το κατεστραμμένο ενδοθήλιο, ή με άλλα αιμοπετάλια και λευκοκύτταρα.Η ερευνά μας επικεντρώθηκε στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς των αιμοπεταλίων και πιο συγκεκριμένα στην διαμεμβρανική πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης MRP4 (Multidrug resistance protein 4). Γενικά η πρωτεΐνη MRP4, στα κύτταρα που εκφράζεται, δρα σαν αντλία εκροής ευρέος φάσματος υποστρώματος, συμπεριλαμβανομένων νουκλεοσιδικών αναλόγων, αντιικών και αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων όπως η ασπιρίνη. Για την πραγματοποίηση της διαδικασίας εξώθησης απαιτείται ενέργεια, την οποία λαμβάνει μέσω υδρόλυσης του ATP. Η υδρόλυση διαδραματίζεται στις δύο ενδοκυττάριες υπομονάδες της πρωτεΐνης, μέσω πρόσδεσης του ATP σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των αμινοξέων κάθε υπομονάδας. Οι αλληλουχίες που συμμετέχουν στην πρόσδεση και υδρόλυση του ATP, αναφέρονται στην βιβλιογραφία ως Walker A, C-motif και Walker B.Συγκεκριμένα στα αιμοπετάλια, η πρωτεΐνη MRP4, εκφράζεται τόσο στην κυτταρική τους μεμβράνη όσο και στην μεμβράνη ενδοαιμοπεταλιακών οργανιδίων, τα δ-κοκκία. Η πρωτεΐνη εμπλέκεται στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση λαμβάνοντας μέρος στο μεταβολικό μονοπάτι του cAMP δρώντας με δύο τρόπους. Είτε αποθηκεύει το cAMP εντός των δ-κοκκίων (MRP4 πυκνών κοκκίων), είτε το εξωθεί από το κύτταρο (κυτταροπλασματική MRP4). Η εξώθηση του cAMP, που λειτουργεί ως σηματοδότηση για γειτονικά αιμοπετάλια, συνεργατικά με την μείωση του cAMP λόγο διαμερισματοποίησης του, μέσω της δράσης της MRP4, συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Ουσιαστικά, η δράση της MRP4 στα αιμοπετάλια είναι cAMP-εξαρτώμενη.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν, η ανάπτυξη και ανάδειξη νέων αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων πεπτιδικής φύσεως, προερχόμενοι από την πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης MRP4 δρώντας ως ενδοκυττάριοι αναστολείς της ενεργοποίησης και συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, επιλέχθηκαν προσεχτικά και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα της MRP4 που φέρουν στην αλληλουχία τους, τα λειτουργικά για τη δράση της πρωτεΐνης μοτίβα Walker A, C-motif και Walker-B. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν να συντεθούν πεπτιδικά ανάλογα, αλληλουχιών των ενδοκυττάριων υπομονάδων της MRP4, που βοηθούν στις διαμορφωτικές αλλαγές της πρωτεΐνης για την εκροή υποστρωμάτων. Τέλος, τα πεπτιδικά ανάλογα συμπλέχθηκαν, μέσω θειοαιθερικό δεσμό, με πεπτιδικούς φορείς Τat(48-60) και Ac-CPSOC, που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων, με σκοπό την μελέτη ενδοκυττάρια στόχευση στην αναστολή της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης.Με την ολοκλήρωση της σύνθεσης και καθαρισμού των συμπλεγμάτων, των φορέων με τα πεπτιδικά ανάλογα της MRP4, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανασταλτικής δράσης στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση τόσο σε πλυμένα ανθρώπινα αιμοπετάλια όσο και σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια. Για να προσομοιωθούν οι συνθήκες του μεταβολικού μονοπατιού του cAMP, οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν και με την παρουσία προσταγλανδίνης PGE1. Η συγκέντρωση της PGE1 που χρησιμοποιήθηκε ήταν τέτοια ώστε να προκαλεί το πολύ 10-11% συνολική ανασταλτική δράση. Τέλος, διερευνήθηκε και πιθανή συνδυαστική παρέμβαση σε άλλα μονοπάτια της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης και συσσώρευσης, μέσω πειραμάτων κυτταρομετρίας ροής.Αρχικά, από τις μελέτες των πεπτιδικών φορέων, αποδείχτηκε ότι ο πεπτιδικός φορέας Τat(48-60)-Cys(Acm), αναστέλλει την αιμοπεταλιακή συσσώρευση τόσο σε πλυμένα αιμοπετάλια όσο και σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια και συνεργατικά με τη χρήση της προσταγλανδίνης PGE1. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής και την αναστολή πρόσδεσης του ινωδογόνου, αποδεικνύεται μια δραστικότητα έναντι της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων, η οποία μπορεί να χαρακτηριστεί από μια πιθανή μη ειδική εξωκυττάρια δράση εκτός της γνωστής ενδοκυττάριας δράση του. Απεναντίας, ο φορέας Ac-CPSOC, δεν επηρέασε την αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση, ούτε σε πλυμένα αιμοπετάλια ούτε σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια, είτε με τη χρήση της προσταγλανδίνης είτε χωρίς. Το αποτέλεσμα αυτό σε συνδυασμό με την μη εμφάνιση δράσης και στα πειράματα κυτταρομετρίας, δείχνουν ότι ο φορέας Ac-CPSOC, δεν εμφανίζει καμία δραστικότητα στην αιμοπεταλιακή λειτουργία ούτε εξωκυττάρια και πιθανώς ούτε ενδοκυττάρια. Συμπεραίνουμε λοιπόν, ότι η εμφάνιση δραστικότητας του φορέα είναι συνδεδεμένη με την δραστικότητα του βιολογικού φορτίου με το οποίο συμπλέκεται. Αυτό μπορεί να αποτελέσει βάση για σχεδιασμό ενδοκυττάριων αναστολέων. Συνεπώς, ο φορέας Ac-CPSOC αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για την μετατόπιση βιολογικών-φορτίων ενδοκυττάρια, ειδικά σε ευαίσθητα κύτταρα όπως τα αιμοπετάλια, χωρίς παράλληλες αλληλεπιδράσεις του φορέα στην λειτουργικότητα των κυττάρων.Στη συνέχεια, από την βιολογική μελέτη (συσσωρευομετρία και κυτταρομετρία ροής) των συμπλεγμάτων των πεπτιδικών αναλόγων της MRP4 με τους φορείς, δεδομένου ότι ο φορέας Ac-CPSOC δεν επιφέρει οποιαδήποτε αναστολή στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, αποδείχθηκε ότι δύο πεπτιδικά ανάλογα της MRP4 εμφανίζουν πιθανή ενδοκυττάρια ανασταλτική δράση στην αιμοπεταλιακή λειτουργεία. Η σύμπλεξη τους με τον δραστικό φορέα Τat(48-60)-Cys(Acm), επιβεβαίωσε την αρχική υπόθεση και επιπρόσθετα παρατηρήθηκε ενίσχυση της ανασταλτικής του δράσης μελετώντας τα συνεργατικά και με την παρουσία προσταγλανδίνης PGE1. Το γεγονός αυτό οδήγησε στο συμπέρασμα, ότι τα δραστικά πεπτιδικά ανάλογα που αναδείχτηκαν από την σύμπλεξη τους με τον φορέα Ac-CPSOC, πιθανών δρουν συνεργατικά με τον φορέα Τat(48-60)-Cys(Acm) και συνεργιστικά με την προσταγλανδίνη έναντι της αιμοπεταλιακής λειτουργίας. Συμπερασματικά, η εργασία αυτή προτείνει για πρώτη φορά, μια νέα αντιαιμοπεταλιακή προσέγγιση μέσω της ανάπτυξης νέας γενιάς αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων πεπτιδικής φύσεως, προερχόμενων από την πρωτεΐνη MRP4, με ενδοκυττάρια στόχευση. Οι νέοι αυτοί αναστολείς, θα μπορούσαν πιθανών να δράσουν σαν μη ειδικοί αναστολείς σε διαφορετικά μονοπάτια της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης και συσσώρευσης, αναστέλλοντας ενδοκυττάρια την ενεργοποίηση τους συνεργιστικά με την προσταγλανδίνη PGE1, αλλά και την πρόσδεση του υποδοχέα αIIbβ3 στο ινωδογόνο.