Ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών αυξητικών ή/και οστεογενετικών παραγόντων και εκτίμηση της οστεο-αναγεννητικής ικανότητας τους σε in vitro μοντέλα πριν και έπειτα από την ενσωμάτωσή τους σε μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης (electrospinning)
Authors: Μούζουρα Παναγιώτα 
Published: December 2024

Σήμερα, αρκετές είναι οι παθήσεις οστικών ελλειμμάτων που παραμένουν μια σημαντική πρόκληση στην ορθοπεδική χειρουργική, αφού η αντιμετώπισή τους και η ανάπλαση των οστικών ελλειμμάτων είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στην παγκόσμια υγεία. Τα κρίσιμα μεγάλου μεγέθους ελλείμματα των μακρών οστών αντιπροσωπεύουν μία από τις κύριες αιτίες της μη συνένωσης καταγμάτων (Non-unions). Τα αυτομοσχεύματα προσφέρουν ιδανική συμβατότητα, ωστόσο συχνά δεν είναι κατάλληλα για μεγάλα ελλείμματα και αρκετές φορές επηρεάζονται από την ανοσοαπόκριση. Έτσι, η περιορισμένη αποτελεσματικότητα των στρατηγικών με συμβατότητα για μεγάλα ελλείμματα οστών και η μεγάλη ηλικία των ασθενών, οδηγούν την ερευνητική κοινότητα σε μελέτες για την εύρεση μίας αποτελεσματικής θεραπευτικής προσέγγισης. Η οστική αναγέννηση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία απαιτεί την εξαιρετικά συντονισμένη (τοπικά και χρονικά) παρουσία βιοχημικών μορίων/σημάτων για την προώθηση των διαφόρων σταδίων αγγειογένεσης και οστεογένεσης. Τα πιο σημαντικά βιοχημικά μόρια που παίζουν ρόλο στις παραπάνω διαδικασίες είναι οι αυξητικοί παράγοντες, όπως ο μορφογενετικός παράγοντας οστών 2 (BMP-2), ο αγγειογενετικός αυξητικός παράγοντας (PDGF) και ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF). Μεγάλη σημασία έχει ο χωροχρόνος έκφρασης των παραγόντων αυτών για την αναγέννηση του οστού. Για να μπορεί να ρυθμιστεί χωροχρονικά η έκφραση των αυξητικών παραγόντων απαιτείται η χρήση ικριωμάτων ή/και βιολογικά συμβατών νανοφορέων. Τα ικριώματα μπορούν να αποτελούνται από διάφορα βιοσυμβατά πολυμερή (PCL, PVA, PLGA) και μέσω της τρισδιάστατης δομής που σχηματίζουν, να προσφέρουν την μηχανική υποστήριξη για την ανάπτυξη ιστών καθώς και το κατάλληλο περιβάλλον για τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Από την άλλη, σημαντικοί νανοφορείς για την αναγέννηση οστών αποτελούν τα λιποσώματα, τα οποία παρουσιάζουν βιοσυμβατότητα, είναι μη-τοξικά, και μπορούν να προσφέρουν αυξημένο εγκλωβισμό φαρμάκων σε σύγκριση με άλλους νανοφορείς, ελεγχόμενο ρυθμό απελευθέρωσης, ικανότητα στόχευσης συγκεκριμένων κυττάρων και ιστών, προστασία ενεργών συστατικών και ικανότητα υπέρβασης βιολογικών φραγμών. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών, αυξητικών παραγόντων (ΒMP2, PDGF) και βιοδραστικών λιπιδίων (FTY720, S1P), μέσω της τεχνικής ανάμιξης μικροροών (microfluidic flow focusing), η ενσωμάτωση τους σε ηλεκτροϊνοποιημένες ίνες και η μελέτη της βιολογικής δραστικότητας τους in vitro. Τα βιοδραστικά μόρια που μελετήθηκαν εμπλέκονται στην διαδικασία της αναγέννησης οστών, πυροδοτώντας διαδικασίες οστεογένεσης, αγγειογένεσης, πολλαπλασιασμού και χημειοτακτισμού των οστεοβλαστών. Οι λιποσωμικοί παράγοντες αρχικά μελετήθηκαν για την ικανότητα πολλαπλασιασμού και οστεογένεσης, σε δυο κυττατικές σειρές, τους ινοβλάστες (L929 κύτταρα) και τους προ-οστεοβλάστες (3T3 κύτταρα). Επιπλέον, μελετήθηκε ο χημειοτακτισμός των κυττάρων και η αγγειογένεση, έπειτα από την επίδραση του λιποσωμικού FTY720. Στη συνέχεια οι λιποσωμικοί παράγοντες ενσωματώθηκαν σε μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης (coaxial electrospinning) σύμφωνα με τις βέλτιστες συνθήκες που προέκυψαν από τα πειράματα βελτιστοποίησης της τεχνικής χρησιμοποιώντας το πρότυπο μοντέλο λιποσωμικής καλσεΐνης. Έπειτα πραγματοποιήθηκαν πειράματα πολλαπλασιασμού και οστεογενετικής δραστικότητας των ινοβλαστών, για την επίδραση της ηλεκτροϊνοποίησης στους ενσωματωμένους λιποσωμικούς παράγοντες και τις ενσωματωμένες ελεύθερες μορφές αντίστοιχα. Τέλος, μελετήθηκε η σταθερότητα των ελεύθερων, λιποσωμικών και λιποσωμικών παραγόντων ενσωματωμένων σε μεμβράνες κατά την πάροδο του χρόνου (και μέχρι τους 6 μήνες) στους 37˚C. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα λιποσώματα που παρασκευάστηκαν ήταν αιμοσυμβατά, μη τοξικά/γενοτοξικά και είχαν μέγεθος 68-112nm και δείκτη πολυδιασποράς 0.150-0.231. Επιπλέον, είχαν αποτελεσματική δραστικότητα στις in vitro μελέτες, προκαλώντας αυξημένη βιωσιμότητα/πολλαπλασιασμό και οστεογενετικής ικανότητας των κυττάρων. Ακόμη, ο λιποσωμικός παράγοντας FTY720, προκάλεσε αύξηση του χημειοτακτισμού των κυττάρων και παρουσιάστηκε η αγγειογενετική του δράση στο ex vivo μοντέλο χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης νεοσσών. Στην συνέχεια από τα πειράματα ενσωμάτωσης των ελεύθερων και λιποσωμικών παραγόντων στις μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης, τα αποτελέσματα πολλαπλασιασμού και οστεογενετικής ικανότητας των παραγόντων στους ινοβλάστες, έδειξαν ότι τα λιποσώματα προστατεύουν την δραστικότητα των εγκλωβισμένων μορίων κατά την τεχνική ηλεκτροϊνοποίησης, ενώ οι ελεύθεροι παράγοντες επηρεάζονται σε μεγαλύτερο βαθμό και μειώνεται η δραστικότητα τους. Η μελέτη σταθερότητας ανέδειξε την ανάγκη για χρήση λιποσωμικής μορφής των παραγόντων (ενσωματωμένων ή μη σε μεμβράνες), ώστε να διατηρείται η βιολογική τους δράση στην πάροδο του χρόνου ακόμη και μετά από 6 μήνες, σε θερμοκρασία σώματος. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μέρος του Ευρωπαϊκού προγράμματος Smart Bone Regeneration (H2020) το οποίο έχει ως στόχο την δημιουργία ενός τρισδιάστατου ‘έξυπνου’ εμφυτεύματος (smart implant) που απορροφάται και παρέχει μηχανική υποστήριξη των ιστών, ενώ μπορεί παράλληλα να ενσωματώνει βλαστοκύτταρα και βιοδραστικούς παράγοντες που εκλoύονται με ρυθμιζόμενη κινητική, με σκοπό την αναγέννηση μακρών οστών.