Απομόνωση και χαρακτηρισμός γονιδίων παραγωγής θερμοφιλίνης του γαλακτικού βακτηρίου Streptococcus thermophilus
Authors: Βασιλειάδης Αναστάσιος 
Published: September 2021

Ο Streptococcus thermophilus είναι ένα θετικό κατά Gram βακτήριο, προαιρετικά αναερόβιο, μη παθογόνο, άλφα αιμολυτικό και μέλος της ομάδας viridians του γένους Streptococcus. Ανήκει στα θερμόφιλα βακτήρια γαλακτικού οξέος (L.A.B.) και θεωρείται ασφαλής για κατανάλωση (Generally recognized as safe, G.R.A.S.). Χρησιμοποιείται ευρέως ως εναρκτήρια καλλιέργεια για την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων και θεωρείται ο δεύτερος πιο σημαντικός οργανισμός στη βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων. Το στέλεχος S. thermophilus ACA-DC 0040 από τη συλλογή του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών παράγει την βακτηριοσίνη θερμοφιλίνη T, η σύνθεση της οποίας φαίνεται ότι σχετίζεται με τον ρυθμό ανάπτυξης του οργανισμού και αποτέλεσε το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διατριβής. Αρχικά διερευνήθηκε η ανάπτυξη του στελέχους ACA-DC 0040 σε μία σειρά θρεπτικών μέσων συναρτήσει της παραγωγής βακτηριοσίνης, της απομόνωσης γενετικού υλικού και της επιδεκτικότητας σε πειράματα μετασχηματισμού και επιλέχθηκαν τα βέλτιστα κατά περίπτωση. Βάσει κατατεθειμένων αλληλουχιών DNA άλλων στελεχών S. thermophilus, διερευνήθηκε και ανιχνεύθηκε ένας αντίστοιχος γενετικός τόπος blp στο ACA-DC 0040 ο οποίος ενδεχομένως σχετίζεται με την παραγωγή της θερμοφιλίνης Τ, κλωνοποιήθηκε και ταυτοποιήθηκε η αλληλουχία του. Ο γενετικός αυτός τόπος αποτελείται από 13092 ζεύγη βάσεων και εντοπίζονται σε αυτόν 16 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν πιθανά δομικά πεπτίδια της θερμοφιλίνης Τ και πεπτίδια ανοσίας, ένα ρυθμιστικό σύστημα 3 στοιχείων, πρωτεΐνες για την εξωκυττάρια μεταφορά της φερομόνης και της θερμοφιλίνης, και μία πρωτεΐνη τροποποίησης των δομικών πεπτιδίων της. Μεταξύ αυτών εδράζονται γονίδια τρανσποζασών και άγνωστης λειτουργίας.Η έκφραση και η οργάνωση των γονιδίων της περιοχής blp μελετήθηκε σε μεταγραφικό επίπεδο με πειράματα RT-PCR και Northern, από τα οποία αποκαλύφθηκε η ύπαρξη 5 πιθανών οπερονίων. Επιπλέον, τα πιθανά δομικά γονίδια της βακτηριοσίνης blpU και blpK παρουσίασαν τόσο συμμεταγραφή, όσο και ξεχωριστή μεταγραφή τουλάχιστον στην περίπτωση του πρώτου και για το λόγο αυτό μελετήθηκαν περαιτέρω μέσω PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR). Τα πειράματα αυτά αποκάλυψαν αυξημένα επίπεδα εμφάνισης των μεταγράφων σε συνθήκες παρουσίας αντιμικροβιακής δραστικότητας και διαφορετικά επίπεδα εμφάνισης των συμμεταγραφόμενων πεπτιδίων blpU-blpK από την ανεξάρτητη μεταγραφή του blpU ανά συνθήκη αλλά πάντα με μεγαλύτερα επίπεδα μεταγραφής του blpU.Στη συνέχεια επιχειρήθηκε η εύρεση ενός κατάλληλου συστήματος μεταφοράς και έκφρασης στο ACA-DC 0040. Στα πλαίσια αναζήτησης ή και κατασκευής κατάλληλου πλασμιδιακού φορέα εντοπίστηκε ένα φυσικό πλασμίδιο στο ACA-DC 0040 του οποίου η αλληλουχία ταυτοποιήθηκε και στην παρούσα εργασία. Το πλασμίδιο, μεγέθους 2780 ζευγών βάσεων, ονομάστηκε pST0040 και διαθέτει τρία ORFs που ομοιάζουν με γονίδιο αντιγραφής κυλιόμενου κύκλου, με γονίδιο παραγωγής πρωτεΐνης άγνωστης λειτουργίας και πρωτεΐνης θερμικού σοκ μικρού μοριακού βάρους, των οποίων οι ιδιότητες μελετήθηκαν. Το pST0040 χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πλασμιδιακού φορέα με τον οποίο πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός, αν και σε πολύ μικρή συχνότητα, στο S. thermophilus LMG 18311. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα των μετασχηματισμών επιβεβαίωσαν τα δημοσιευμένα ευρήματα χαμηλών ποσοστών επιτυχίας του μετασχηματισμού και την ανάγκη για επιπρόσθετες έρευνες στον τομέα.Τέλος, τα πιθανά δομικά πεπτίδια της θερμοφιλίνης Τ, blpU και blpK, κλωνοποιήθηκαν, το καθένα ξεχωριστά, σε φορέα υπερέκφρασης στο E. coli και τα ανασυνδυασμένα πεπτίδια που παρήχθησαν παρουσίασαν κάποιας μορφής αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι του ευαίσθητου στη θερμοφιλίνη Τ Lactococcus lactis CNRZ 117.