Διαλεύκανση της δομής της τρίτης διαμεμβρανικής περιοχής του τύπου 1 υποδοχέα του CRF, καθώς και των αλληλεπιδράσεών του με τον CRF και των αναλόγων του
Authors: Σπυριδάκη Αικατερίνη 
Published: September 2021

Ο τύπου 1 υποδοχέας (CRF1R) του εκλυτικού παράγοντα της κορτικοτροπίνης (CRF)ανήκει στην οικογένεια Β των υποδοχέων που συζευγνύονται με τις G-πρωτεΐνες (GPCRs) και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης, ρυθμίζοντας νευρικές καιενδοκρινικές λειτουργίες . Δυσλειτουργία των CRF/CRF1R συστημάτων στον οργανισμό, σχετίζεται με την εκδήλωση ασθενειών, όπως το άγχος και η κατάθλιψη. Ο σημαντικός ρόλος του CRF1R ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι CRF1R-εκλεκτικοί μη πεπτιδικοί μικρομοριακοί ανταγωνιστές έχει δειχθεί ότι έχουν αγχολυτικές και αντικαταθλιπτικές δράσεις σε πειραματόζωα. Όπως όλοι οι GPCRs, έτσι και ο CRF1R αποτελείται από μια εξωκυττάριο αμινοτελική Ν-περιοχή και επτά α-ελικοειδείς διαμεμβρανικές περιοχές (ΤΜ1-ΤΜ7), οι οποίες συνδέονται εξωκυττάρια μεταξύ τους με τρεις βρόγχους (EL1-EL3). Ο CRF και τα συγγενή του πεπτίδια, όπως η σοβαγίνη, δεσμεύονται στις εξωκυττάριες περιοχές του CRF1R και τον ενεργοποιούν. Αντίθετα, οι μικρομοριακοί μη πεπτιδικοί CRF ανταγωνιστές έχει προταθεί ότι αλληλεπιδρούν με τις ΤΜs του CRF1R και ανταγωνίζονται αλλοστερικά τη δέσμευση του CRF και των συγγενών του πεπτιδίων-αγωνιστών και την ενεργοποίηση του υποδοχέα .Πρόσφατα, μελέτη του εργαστηρίου μας έδειξε ότι οι ΤΜs του CRF1R, παρόμοια με άλλουςGPCRs, αναδιπλώνονται στο χώρο της πλασματικής μεμβράνης με τέτοιο τρόπο ώστε νασχηματίζουν μια υδρόφιλη κοιλότητα που ονομάζεται κοιλότητα θέσεων δέσμευσης. Τα αμινοξέα των ΤΜs που αλληλεπιδρούν με τα μη πεπτιδικά μόρια θα πρέπει να βρίσκονται πάνω στην επιφάνεια της κοιλότητας θέσεων δέσμευσης του CRF1R. Επιπρόσθετα τα αμινοξέα των ΤΜs των υποδοχέων της οικογένειας Α των GPCRs, έχει δειχθεί ότι συμμετέχουν σε δίκτυα δεσμών που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίησή τους . Όμως οι μηχανισμοί ενεργοποίησης του CRF1R και ανταγωνισμού του από τους μικρομοριακούς CRF ανταγωνιστές είναι ακόμα άγνωστοι.Η παρούσα εργασία στοχεύει 1) στη λήψη δομικών πληροφοριών για τις TMs τουCRF1R, ξεκινώντας από τη ΤΜ3, 2) στον προσδιορισμό δομικών αλλαγών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του υποδοχέα, 3) στον προσδιορισμό των αμινοξέων των ΤΜs πουαλληλεπιδρούν με τους μη πεπτιδικούς ανταγωνιστές και 4) διαλεύκανση των μοριακώνμηχανισμών ανταγωνισμού της ενεργοποίησης του υποδοχέα από μη πεπτιδικούς CRFπροσδέτες. Επιλέξαμε την ΤΜ3 γιατί σε πλήθος διαφορετικών υποδοχέων επιτρέπει, λόγω της θέσης της, τη δημιουργία αλληλεπιδράσεων μεταξύ των αμινοξέων της με διάφορουςπροσδέτες, με αμινοξέα άλλων ΤΜs καθώς και με τις G-πρωτεΐνες . Με σκοπό να λάβουμε πληροφορίες για τη δομή της ΤΜ3 του CRF1R, προσδιορίσαμε ποια από τα αμινοξέα της, έχουν τις πλευρικές τους αλυσίδες προσανατολισμένες στην επιφάνεια της κοιλότητας θέσεων δέσμευσης μιας ανενεργού, apo (απουσία προσδέτη) κατάστασης του υποδοχέα. Για να επιτύχουμε αυτό, μεταλλάξαμε, ένα τη φορά, τα αμινοξέα της ΤΜ3 σε κυστεΐνες (τεχνητές κυστεΐνες ή Cys) και προσδιορίσαμε τις διαθεσιμότητες τους, εφαρμόζοντας τη μέθοδο διαθεσιμότητας των κυστεϊνών-υποκαταστατών (SCAM) .Ανάμεσα στα είκοσι δύο αμινοξέα της ΤΜ3 που εξετάστηκαν, εκείνα στις θέσεις (άνω μισότμήμα της TM3) 1893.26, 1923.29, 1933.30, 1953.32, 1963.33, 1993.36 και 2033.40 βρέθηκαν να έχουν τις πλευρικές τους αλυσίδες προσανατολισμένες στην κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του CRF1R. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η ΤΜ3 της ανενεργού apo κατάστασης του CRF1R, τοποθετείται με τέτοιο τρόπο στη πλασματική μεμβράνη ώστε το άνω μισό τμήμα της συμμετέχει στο σχηματισμό μιας ευρύχωρης κοιλότητας θέσεων δέσμευσης, ενώ το κατώτερο τμήμα της βρίσκεται σε στενή επαφή με τις άλλες TMs. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε απόλυτη συμφωνία με εκείνα που ελήφθησαν από μια πρόσφατη κρυσταλλογραφική μελέτη μιας ανενεργού, δεσμευμένου με μη πεπτιδικό CRF ανταγωνιστή, κατάστασης του CRF1R.Από τα αμινοξέα της ΤΜ3 που εξετάστηκαν, εκείνα στις θέσεις 2033.40 και 2103.47φάνηκε να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του CRF1R. Μετάλλαξη της G2103.47 σε Cys (G2103.47C) μείωσε σημαντικά την υψηλής συγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης καθώς επίσης και την ισχύ της να διεγείρει την παραγωγή ενδοκυττάριου cAMP σε κύτταρα που εξέφραζαν τον υποδοχέα αυτό. Σύμφωνα με το μοριακό μας πρότυπο το οποίο κατασκευάστηκε με βάση τις κρυσταλλικές δομές του ανενεργού υποδοχέα της γλυκαγόνης (GCGR) και του CRF1R, η G2103.47 βρίσκεται κάτω από τη Μ2063.43 και σε απόσταση μιας ελικοειδούς στροφής. Η Μ2063.43 σχηματίζει έναν δεσμό υδρογόνου με την Ν2835.54 της ΤΜ5. Η μετάλλαξη της G2103.47 σε Cys εισάγει μια πλευρική αλυσίδα στη θέση 2103.47 που μπορεί να σχηματίσει έναν επιπλέον δεσμό υδρογόνου με την πλευρική αλυσίδα της N2835.54 ο οποίος ενισχύει περαιτέρω την διεπιφάνεια μεταξύ ΤΜ3 και ΤΜ5, σταθεροποιώντας έτσι ακόμη περισσότερο την ανενεργό κατάσταση του υποδοχέα. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στην υπόθεση ότι μετατόπιση των ΤΜ3 και ΤΜ5 που παρατηρείται κατά την ενεργοποίηση των υποδοχέων της οικογένειας Α των GPCRs , πιθανόν να συμβαίνει και στους υποδοχείς της οικογένειας Β και να παρεμποδίζεται ενισχύοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΤΜ3 και ΤΜ5 αμινοξέων. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι μετάλλαξη της G2103.47 σε Ala (G2103.47A) επηρέασε πολύ λιγότερο, τόσο τη συγγένεια δέσμευσης, όσο και την ισχύ της σοβαγίνης. Αντίθετα με τη Cys, η Ala στη θέση 2103.47 του CRF1R δεν σχηματίζειδεσμό υδρογόνου με τη N2835.54, επηρεάζοντας έτσι σε πολύ μικρότερο βαθμό τηνενεργοποίηση του υποδοχέα. Παρόμοια με τη G2103.47, η F2033.40 της TM3 φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του υποδοχέα. Μετάλλαξη της F2033.40 σε Cys (F2033.40C) μείωσε σημαντικά την ικανότητα του υποδοχέα να μεταβαίνει στην ενεργό κατάστασή του και να δεσμεύει με υψηλή συγγένεια τη σοβαγίνη. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η εισαγωγή πλευρικής αλυσίδας τύπου λυσίνης στον F2033.40C έπειτα από την αντίδρασή του με το θετικά φορτισμένο MTSEA, αποκατέστησε τη δέσμευση της σοβαγίνης σε φυσιολογικά επίπεδα. Παρόμοια, η εισαγωγή της πλευρικής αλυσίδας της Lys στη θέση 2033.40 μετά από τη μετάλλαξη της F2033.40 σε Lys(F2033.40K) δεν τροποποίησε σημαντικά την υψηλής συγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης.Όπως παρατηρήθηκε για την F2033.40K, έτσι και η μετάλλαξη της F2033.40 σε Trp (F2033.40 W) ή σε Ile (F2033.40 I) δεν μείωσε την υψηλής συγγένειας δέσμευση και ισχύ της σοβαγίνης.Αντίθετα η αφαίρεση της υδρόφοβης πλευρικής αλυσίδας στη θέση 2033.40 μετά από τημετάλλαξή της σε Ala, μείωσε σημαντικά τη συγγένεια δέσμευσης και ισχύ της σοβαγίνης.Βασιζόμενοι στα αποτελέσματά μας και στη σύγκριση της κρυσταλλικής δομής τουανενεργού CRF1R με τις κρυσταλλικές δομές του ανενεργού και ενεργού β2 αδρενεργικούυποδοχέα (β2AR) που ανήκει στην οικογένεια Α των GPCRs, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι η F2033.40 της TM3 και η L3236.44 της TM6 του CRF1R, πιθανόν να σχηματίζουν μια αρωματική- αλειφατική αλληλεπίδραση στην ανενεργό κατάσταση του υποδοχέα. Παρόμοια με τον β2AR, η ενεργοποίηση του CRF1R, σχετίζεται με αλλαγή του προσανατολισμού της F2033.40 σχετικά με τη L3236.44, προς κάποιο γειτονικό αρωματικό αμινοξύ με το οποίο πιθανόν να αλληλεπιδρά.Μια τέτοια αρωματική-αρωματική αλληλεπίδραση πιθανόν να σταθεροποιεί την υψηλήςσυγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης της ενεργού κατάστασης του CRF1R. Το γεγονός ότι ηF2033.40K μετάλλαξη δεν τροποποίησε τη δέσμευση της σοβαγίνης ενισχύει περαιτέρω τηνυπόθεση αυτή. Η Lys (όπως η K2033.40) έχει δειχθεί ότι μπορεί να σχηματίζει κατιόν-παλληλεπιδράσεις με αρωματικά αμινοξέα .Παρά το γεγονός ότι η μετάλλαξη της F2033.40 στην υδρόφιλη Lys (F2033.40K) δεν άλλαξε την ικανότητα του CRF1R να μεταβαίνει στην ενεργό του κατάσταση, η τροποποίηση αυτή κατήργησε την δέσμευση του υδρόφοβου μη πεπτιδικού CRF ανταγωνιστή, ανταλαρμίνη στον υποδοχέα αυτόν. Παρόμοια, η μετάλλαξη F2033.40A κατήργησε την ικανότητα του υποδοχέα να δεσμεύει την ανταλαρμίνη. Αντίθετα, οι υδρόφοβες υποκαταστάσεις F2033.40W και F2033.40I δεν μείωσαν τη δέσμευση και τις ανταγωνιστικές ιδιότητες της ανταλαρμίνης. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η F2033.40 αλληλεπιδρά με τους μη πεπτιδικούς CRF ανταγωνιστές, όπως παρατηρήθηκε και στη κρυσταλλική δομή του CRF1R δεσμευμένου με τον μη πεπτιδικό ανταγωνιστή CP-376395 . Η αλληλεπίδραση των μη πεπτιδικών CRF ανταγωνιστών με τις ΤΜs του CRF1R πιθανόν να παρεμποδίζει μετατοπίσεις των περιοχών αυτών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πρόσφερε δομικές πληροφορίες για τον CRF1R και διαλεύκανε τους μοριακούς μηχανισμούς ενεργοποίησης του υποδοχέα και ανταγωνισμού της από τους μη πεπτιδικούς CRF ανταγωνιστές. Επιπρόσθετα στη μελέτη αυτή σχεδιάστηκαν, συντέθησαν και χαρακτηρίστηκαν φαρμακολογικά μη πεπτιδικά ανάλογα του CRF. Ανάμεσαστα 50 ανάλογα που εξετάστηκαν, τέσσερα παρουσίασαν ικανοποιητικές συγγένειεςδέσμευσης για τον CRF1R και επιλέχθηκαν ως ανάλογα «οδηγοί» με βάση τα οποία θασυντεθούν νέα μόρια. Όλα τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θέτουν τη βάση για τοσχεδιασμό νέων μη πεπτιδικών CRF1R-εκλεκτικών ανταγωνιστών με βελτιωμένεςφαρμακοδυναμικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες που θα εμπλουτίσουν το φαρμακευτικόοπλοστάσιο εναντίον παθήσεων στις οποίες εμπλέκεται ο CRF1R όπως η κατάθλιψη και τοάγχος.