Ανίχνευση, χαρακτηρισμός και λειτουργική μελέτη μεταλλαγών σε ογκοκατασταλτικά και επιδιορθωτικά γονίδια που σχετίζονται με την καρκινογένεση
Authors: Βαγενά Ανδρομάχη 
Published: September 2021

Ο κληρονομικός καρκίνος αντιπροσωπεύει ένα μικρό ποσοστό των περιστατικών του καρκίνου που διαγνώσκονται και χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη κακοηθειών σε νεαρή ηλικία και την παρουσία πολλαπλών περιστατικών σχετιζόμενων καρκίνων στα μέλη των οικογενειών. Ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνή κακοήθεια και η κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες τόσο στις αναπτυγμένες, όσο και στις αναπτυσσόμενες χώρες. Περίπου στο 30% των περιπτώσεων του καρκίνου του μαστού διαγνώσκονται τουλάχιστον δύο συγγενείς (οικογενής) με κακοήθεια, ενώ στο 5-10% έχουν χαρακτηριστεί σαφείς μοριακές αλλαγές (κληρονομικός). Τα δύο κύρια γονίδια, μεταλλαγές των οποίων έχουν συσχετιστεί με κληρονομική προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού, είναι τα BRCA1 και BRCA2 που συμμετέχουν στο μονοπάτι του ομόλογου ανασυνδυασμού. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι ένας μηχανισμός επιδιόρθωσης των θραύσεων της διπλής αλυσίδας του DNA. Ο δια βίου κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του μαστού σε γυναίκες που φέρουν μεταλλαγές στο γονίδιο BRCA1 είναι 57-65%, ενώ ο αντίστοιχος κίνδυνος για το γονίδιο BRCA2 είναι 35-57%. Τα τελευταία χρόνια η χρήση της Αλληλούχισης DNA Νέας Γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) έχει αναδείξει και άλλα γονίδια προδιάθεσης στον καρκίνο του μαστού, υψηλής και ενδιάμεσης διεισδυτικότητας, όπως είναι τα PALB2, ATM και CHEK2. Τα γονίδια αυτά εμπλέκονται επίσης στο μονοπάτι του ομόλογου ανασυνδυασμού. Εκτός από τα παραπάνω γονίδια, με τον κληρονομικό καρκίνο έχουν συσχετιστεί και τα γονίδια που εμπλέκονται στο μονοπάτι επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων, τα γονίδια MMR (MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2). Η παρουσία παθογόνων μεταλλαγών σε αυτά τα γονίδια έχει συσχετιστεί με προδιάθεση ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών, ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του συνδρόμου Lynch.Η ανίχνευση μεταλλαγών σε γονίδια προδιάθεσης εξηγεί ένα ποσοστό των περιστατικών του καρκίνου που διαγνώσκονται. Παραμένει όμως ένα ποσοστό περιστατικών με οικογενή χαρακτήρα στο οποίο δεν έχει ανιχνευθεί ο γενετικός παράγοντας που είναι υπεύθυνος για την εμφάνιση της νόσου. Αυτό οδηγεί στην ανάγκη διερεύνησης εναλλακτικών μηχανισμών που μπορεί να συμβάλλουν στην καρκινογένεση, όπως είναι οι επιγενετικές τροποποιήσεις και συγκεκριμένα η μεθυλίωση. Η αλλαγή των επιπέδων της μεθυλίωσης έχει συσχετιστεί με την καρκινογένεση, κυρίως μέσω της τροποποίησης της έκφρασης των γονιδίων επάγοντας τη γενετική αστάθεια. Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του γενετικού υπόβαθρου σε ασθενείς Ελληνικής καταγωγής με καρκίνο μαστού, ωοθηκών και σχετιζόμενων κακοηθειών με το σύνδρομο Lynch με τη χρήση διαφορετικών προσεγγίσεων/τεχνικών, ώστε να χαρακτηριστούν νέα γονίδια και μεταλλαγές που σχετίζονται με τις διάφορες μορφές καρκίνου. Παράλληλα, έγινε διερεύνηση μηχανισμών αποσιώπησης, όπως είναι η μεθυλίωση, των γονιδίων που πιθανά επηρεάζουν την ανάπτυξη καρκίνου σε ασθενείς που δεν είχε αποσαφηνιστεί το γενετικό υπόβαθρο της νόσου.Αρχικά, αναλύθηκαν 172 ασθενείς με καρκίνο του μαστού για τα γονίδια BRCA. Από την ανάλυση αυτή προέκυψε ότι το 12,2% έφερε μεταλλαγές στο BRCA1 και 5,2% στο BRCA2. Στη συνέχεια οι ασθενείς που ήταν αρνητικές για σημειακές μεταλλαγές αυτών των γονιδίων υποβλήθηκαν σε έλεγχο με τη τεχνική MLPA για την ανεύρεση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων. Κατά την ανάλυση αυτή δεν ανιχνεύθηκε καμία γενετική αναδιάταξη. Για να είναι εφικτός ο καθορισμός της παρουσίας αναδιατάξεων στον Ελληνικό πληθυσμό, η ανάλυση με MLPA διευρύνθηκε σε επιπλέον 443 ασθενείς και ανιχνεύθηκαν δύο απαλοιφές (0,5%), μία στο BRCA1 (απαλοιφή των εξονίων 1-2) και μία στο BRCA2 (απαλοιφή των εξονίων 12-13). Η τελευταία αποτελεί ένα σχετικά συχνό έλλειμμα στον Ελληνικό πληθυσμό. Στη συνέχεια αναλύθηκαν ασθενείς με καρκίνο του μαστού (108), οι οποίες ήταν αρνητικές για μεταλλαγές στα γονίδια BRCA και είχαν εξαιρετικά βεβαρημένο οικογενειακό ιστορικό. Για την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία NGS και συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το γονιδιακό πάνελ «TruSight Cancer Panel», το οποίο περιλαμβάνει 94 γονίδια προδιάθεσης σε διαφόρους τύπους κακοήθειας. Η ανάλυση ανέδειξε την παρουσία 17 (15,7%) μεταλλαγών σε γνωστά και νέα γονίδια προδιάθεσης στον καρκίνο του μαστού. Ειδικότερα, ανευρέθηκαν 5 παραλλαγές στο PALB2, 4 στο CHEK2, 2 στο ATM, 2 στο RAD51C, 2 στο TP53, και από μία στο ALK και στο FANCM. Τα ATM και CHEK2 είναι γνωστά γονίδια προδιάθεσης ενδιάμεσης διεισδυτικότητας, ενώ το PALB2 έχει αναδειχθεί πλέον σε γονίδιο υψηλής διεισδυτικότητας. Το RAD51C έχει συσχετιστεί με προδιάθεση στον καρκίνο των ωοθηκών, διαφαίνεται όμως ότι συγκεκριμένες μεταλλαγές μπορεί να συσχετίζονται και με προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται και από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής. Τέλος, το FANCM είναι ένα γονίδιο που έχει συσχετιστεί πρόσφατα με προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού, οι μεταλλαγές του οποίου ανευρίσκονται σε μικρή συχνότητα, όπως και στην παρούσα μελέτη (0,9%). Η ανάλυση με NGS ανέδειξε ότι η μεταλλαγή c.2257C>T του γονιδίου PALB2 ανευρίσκεται σχετικά συχνά στις Ελληνίδες ασθενείς. Αυτό αποτέλεσε το έναυσμα να αναλυθούν για τη συγκεκριμένη μεταλλαγή επιπλέον 2496 ασθενείς με καρκίνο του μαστού και 697 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Συνολικά ανευρέθηκαν 6 (0,24%) με καρκίνο του μαστού που έφεραν την μεταλλαγή, ενώ μόνο μία ασθενής με καρκίνο των ωοθηκών (0,14%) έφερε τη c.2257C>T μεταλλαγή. Ακολούθησε ανάλυση απλοτύπων με τη χρήση 7 πολυμορφικών δεικτών σε όλα τα άτομα που έφεραν τη μεταλλαγή και προέκυψε ότι όλοι έφεραν ένα κοινό απλότυπο μεγέθους 1,2 Kb. Η ύπαρξη του κοινού απλοτύπου “157-228-127-166-263” ανέδειξε ότι η c.2257C>T μεταλλαγή προέκυψε από έναν κοινό πρόγονο πριν από περίπου 1600 χρόνια. Με τον κληρονομικό καρκίνο, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, έχουν συσχετιστεί και τα γονίδια MMR, οπότε σε επόμενο βήμα ελέγχθηκαν 93 ασθενείς βάση του ατομικού (νεαρή ηλικία διάγνωσης) ή/και του οικογενειακού ιστορικού τους (παρουσία σχετιζόμενων καρκίνων με το σύνδρομο Lynch). Η ανάλυση αυτή οδήγησε στην ανίχνευση συνολικά 29 μεταλλαγών στα γονίδια αυτά και συγκεκριμένα 17 μεταλλαγών στο MLH1 (18,3%), 7 στο MSH2 (7,5%), 4 στο MSH6 (4,3%) και 1 στο PMS2 (1,1%). Στη συνέχεια, οι ασθενείς που ήταν αρνητικοί για σημειακές μεταλλαγές των γονιδίων MMR ελέγχθηκαν για την ανίχνευση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων των γονιδίων MLH1 και MSH2, γονίδια τα οποία αριθμούν το μεγαλύτερο αριθμό παραλλαγών. Από την ανάλυση αυτή ανευρέθηκαν 8 απαλοιφές στο γονίδιο MSH2 (8,6%), ειδικότερα ανιχνεύθηκαν οι απαλοιφές των εξονίων 1-6, 1-7, 1-8, 3-4, 9-10 και 7-16, καταδεικνύοντας τη μεγάλη συχνότητα ανεύρεσης αναδιατάξεων στο συγκεκριμένο γονίδιο. Τέλος, καθορίστηκαν τα ακριβή όρια θραύσης των ελλειμμάτων 1-6, 3-4, 9-10 και 7-16. Επιπλέον, μετά την ανάλυση με NGS παρέμενε ένα ποσοστό ασθενών στο οποίο δεν ανιχνεύθηκε μεταλλαγή σε κανένα από τα γονίδια προδιάθεσης που αναλύθηκαν. Για το λόγο αυτό προχωρήσαμε σε ανάλυση των επιπέδων μεθυλίωσης των υποκινητών 22 γονιδίων σε επιλεγμένες ασθενείς με νεαρή ηλικία διάγνωσης και τριπλά αρνητικούς όγκους. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα από ασθενείς, με αντίστοιχες διαγνώσεις, οι οποίες όμως έφεραν μεταλλαγές στο γονίδιο BRCA1, δηλαδή γνωστό γενετικό υπόβαθρο. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 5 γονίδια με υπερμεθυλιωμένους υποκινητές (ποσοστό μεθυλίωσης >30%), τα CDH1, HIC1, PYCARD, RASSF1 και TP73, καταδεικνύοντας πιθανή συσχέτιση της επιγενετικής αποσιώπησης αυτών των γονιδίων με την ανάπτυξη της νόσου. Συμπερασματικά από την παρούσα διατριβή αναδείχθηκε τόσο η γενετική ποικιλομορφία όσο και η παρουσία ιδρυτικών μεταλλαγών που χαρακτηρίζουν τον κληρονομικό καρκίνο και ιδιαίτερα τον καρκίνο μαστού και ωοθηκών στον Ελληνικό πληθυσμό. Επιπλέον, δείχθηκε η συμβολή της επιγενετικής αποσιώπησης, υπερμεθυλίωση, συγκεκριμένων γονιδίων τα οποία εμπλέκονται σε καθοριστικά σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγουν την καρκινογένεση. Η κατανόηση και η αποσαφήνιση του γενετικού υπόβαθρου και των μηχανισμών που συμμετέχουν στην παθογένεια της νόσου είναι πολύ σημαντική, ώστε να παρέχεται στους ασθενείς και στα μέλη των οικογενειών τους, η κατάλληλη γενετική συμβουλή και να πραγματοποιείται η βέλτιστη κλινική διαχείριση.