Study of the biotechnological production of 2,3-butanediol during growth of selected bacterial strains on sugar-based renewable substrates
Authors: Παλαιογεώργου Αναστασία-Μαρίνα 
Published: September 2021

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της αξιοποίησης άγριων βακτηριακών στελεχών, απομονωμένων από διάφορα είδη τροφίμων και δυνητικώς μη-παθογόνων,σχετικά με τη χρήση τους ως μικροβιακά κυτταρικά εργαστήρια, για την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Η παραγωγή των δύο αυτών μεταβολιτών παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς τα προϊόντα αυτά βρίσκουν πολυάριθμες εφαρμογές στη βιομηχανία μελανιών,αρωμάτων, πλαστικών, στη βιομηχανία των τροφίμων αλλά και στην φαρμακοβιομηχανία. Πολλοί μονοσακχαρίτες αλλά και βιομηχανικά απόβλητα πλούσια σε σάκχαρα, μετατρέπονται σε 2,3-βουτανοδιόλη και το παράγωγό αυτής, την ακετοΐνη, με τη χρήση μικροοργανισμών, μέσω του βιοσυνθετικού μονοπατιού παραγωγής 2,3-βουτανοδιόλης - οργανικών οξέων.Στο πρώτο μέρος της παρούσας έρευνας, μελετήθηκε η ικανότητα εννέα άγριων βακτηριακών στελεχών που απομονώθηκαν από τρόφιμα, να αφομοιώνουν τη γλυκόζη και τη σακχαρόζη προς παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Enterobacter ludwigii FMCC-204, Enterobacter aerogenes FMCC-9, Enterobacteraerogenes FMCC-10, Citrobacter freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197,Enterobacter sp. FMCC-208, Citrobacter freundii FMCC-8, Citrobacter farmeri FMCC-5 καιCitrobacter farmeri FMCC-7. Οι παραπάνω μικροοργανισμοί καλλιεργήθηκαν σε κλειστού τύπου ζυμώσεις οι οποίες πραγματοποιήθηκαν σε φιάλες Duran στους 30 °C. Πέραν των τριών τελευταίων στελεχών, τα υπόλοιπα έξι έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα αφού ήταν ικανά να καταναλώσουν τόσο τη γλυκόζη όσο και τη σακχαρόζη προς παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης. Από τα ειρημένα στελέχη, δύο, ήτοι τα K. oxytoca FMCC-197 και Enterobacter sp. FMCC-208,επελέγησαν για περαιτέρω έρευνα, αφού συνδύασαν ικανοποιητική απόδοση και παραγωγικότητα κατά την αύξησή τους και στις δύο πηγές ανωτέρω άνθρακα.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε ο τρόπος επίδρασης διαφορετικών παραγόντων στην αύξηση του στελέχους K. oxytoca FMCC-197 αλλά και στην παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας αλλά και της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος στην αύξηση του μικροοργανισμού και την τελική συγκέντρωση προϊόντος. Πιο συγκεκριμένα, το ανωτέρω στέλεχος έδωσε ιδιαίτερα ικανοποιητικά αποτελέσματα σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών κατά τη διάρκεια αερόβιων καλλιεργειών σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη σακχαρόζη, ενώ σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από τους 37 °C, η τελική απόδοση προϊόντος αλλά και η παραγωγικότητα μειώθηκαν αισθητά. Σε μία επόμενη σειρά πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχαρόζης και το στέλεχος K. oxytoca FMCC-197 έδειξε ιδιαίτερη ικανότητα να αναπτύσσεται ακόμα και σε συγκεντρώσεις υψηλότερες των 90 g l-1. Ωστόσο, σε συγκεντρώσεις σακχάρου μεγαλύτερες των 120 g l-1, παρατηρήθηκε το φαινόμενο της παρεμπόδισης εκ του υποστρώματος, με μειωμένη απόδοση παραγωγής και μη-αμελητέο μέρος του υποστρώματος να παραμένει ακατανάλωτο κατά το τέλος της διεργασίας. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους συνεχίστηκε με την καλλιέργειά του σε διαφορετικές πηγές άνθρακα. Έτσι σε μία σειρά αερόβιων ζυμώσεων σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιήθηκαν οι εξής πηγές άνθρακα: γλυκόζη, φρουκτόζη,μαννόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη και μελάσα. Τα αποτελέσματα των ζυμώσεων ήταν εξίσου ικανοποιητικά, αφού καταναλώθηκαν όλες οι πηγές άνθρακα αποδεικνύοντας ότι το στέλεχος Κ. oxytoca FMCC-197 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη κλίμακα για τη βιομετατροπή αποβλήτων πλούσιων στις παραπάνω πηγές άνθρακα προς 2,3-βουτανοδιόλη και ακετοΐνη. Επίσης κατά τη διάρκεια αναερόβιων και αερόβιων καλλιεργειών αξιολογήθηκε η ικανότητα αποχρωματισμού της μελάσας, όπου ξεπέρασε το 40% και στις δυο περιπτώσεις, χωρίς η μελέτη της διεργασίας του αποχρωματισμού να υφίσταται περαιτέρω αριστοποίηση. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα των παραπάνω ζυμώσεων και με στόχο την αύξηση της τελικής συγκέντρωσης του προϊόντος, πραγματοποιήθηκαν ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες ζύμωσης. Οι δύο πρώτες ημισυνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν στους 30 °C κάτω από αναερόβιες ή αερόβιες συνθήκες, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα μελάσας και εμπορικής σακχαρόζης.Τω όντι, η συγκέντρωση του τελικού προϊόντος αυξήθηκε πάρα πολύ στις αερόβιες συνθήκες οι οποίες είχαν επιβληθεί, όπου παρήχθησαν 101.1 g l-1 2,3-βουτανοδιόλης και 14.2 g l-1 ακετοΐνης. Οι τιμές αυτές είναι από τις πλέον ικανοποιητικές της διεθνούς βιβλιογραφίας στο εν λόγω επιστημονικό θέμα και για άγρια (μη-γενετικώς τροποποιημένα) βακτηριακά στελέχη χρησιμοποιούμενα ως κυτταρικά εργαστήρια. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας μελάσα και σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να συγκριθούν με τα αντίστοιχα που επετεύχθησαν στους 30 °C. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκε μικρή διαφορά στην τελική απόδοση, η παραγωγικότητα ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους 37 °C. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 30 °C χρησιμοποιώντας τη μελάσα ως τη μοναδική πηγή άνθρακα έτσι ώστε να μελετηθεί τυχόν παρεμπόδιση λόγω υποστρώματος, με την τελική συγκέντρωση προϊόντος και την παραγωγικότητα να είναι σημαντικά χαμηλότερες. Περαιτέρω υπήρξε ενδιαφέρον σχετικά με την πραγματοποίηση ζυμώσεων σε μη προηγουμένως αποστειρωθέν υπόστρωμα, γι’ αυτό πραγματοποιήθηκαν δυο ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας στην πρώτη περίπτωση αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο και στη δεύτερη περίπτωση μέσο που είχε υποστεί προηγούμενη παστερίωση. Η τελική παραγωγή προϊόντος ήταν ικανοποιητική ακόμα και στην περίπτωση τους προηγουμένως παστεριωμένου θρεπτικού μέσου.Στο τρίτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε αντίστοιχη μελέτη για το στέλεχος Enterobacter sp. FMCC-208 όπου προσδιορίστηκε η επίδραση διαφορετικών παραγόντων της ζύμωσης στην αύξηση και την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας, της τιμής του pH αλλά και της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος. To στέλεχος παρουσίασε σημαντική ικανότητα παραγωγής σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, αν και σε τιμές μεγαλύτερες από 37 °C, η παραγωγικότητα και η τελική απόδοση μειώθηκαν σημαντικά. Επίσης, καλύτερα αποτελέσματα σημειώθηκαν σε τιμές pH 6.5-7.0, ενώ δεν παρατηρήθηκε καθόλου αύξηση στην τιμή pH=5.0. Όσον αφορά στην παρεμπόδιση εκ του υποστρώματος, αυτή παρατηρήθηκε σε αρχική συγκέντρωση σακχαρόζης μεγαλύτερη από 90 g l-1,ενώ το στέλεχος κατανάλωσε τη συνολική πηγή άνθρακα στις μικρότερες αρχικές συγκεντρώσεις.Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους συνεχίστηκε όπως και για το προηγούμενο στέλεχος (K.oxytoca FMCC-197) με την καλλιέργειά του χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα(γλυκόζη, φρουκτόζη, μαννόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη και μελάσα). Σε όλεςτ ις περιπτώσεις καταναλώθηκε όλη η πηγή άνθρακα οδηγώντας στην παραγωγή ιδιαίτερα ικανοποιητικής συγκέντρωσης τελικού προϊόντος. Τέλος, αξιολογήθηκε η ικανότητα του στελέχουςEnterobacter sp. FMCC-208 να αποχρωματίζει τη μελάσα σε αναερόβιες και αερόβιες συνθήκες,με το ποσοστό να ξεπερνά το 25% και στις δυο περιπτώσεις.Λαμβάνοντας υπόψιν τα αποτελέσματα των παραπάνω ζυμώσεων, πραγματοποιήθηκαν ημισυνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες, με στόχο τη βελτιστοποίηση της βιοδιεργασίας. Οι δύο πρώτες ημι-συνεχείς τροφοδοτούμενες καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν στους 30 °C κάτω από αναερόβιες και αερόβιες συνθήκες,χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα μελάσας και σακχαρόζης. Η συγκέντρωση του τελικού προϊόντος ήταν σημαντικά υψηλότερη στην περίπτωση των αερόβιων συνθηκών. Πιο συγκεκριμένα, η τελική συγκέντρωση της 2,3-βουτανοδιόλης ήταν 90.3 g l-1 και της ακετοΐνης 10 gl-1. Οι τιμές αυτές μπορούν να χαρακτηριστούν ως αρκετά ικανοποιητικές σε σχέση με τη διεθνή βιβλιογραφία. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας μελάσα και σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να συγκριθούν με τα αντίστοιχα στους 30 °C. Αν και η τελική συγκέντρωση προϊόντος ήταν χαμηλότερη στους 37 °C, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην κατ’ όγκο παραγωγικότητα του συστήματος ζύμωσης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα στους 37 °C χρησιμοποιώντας τη μελάσα ως μοναδική πηγή άνθρακα. Η σημαντική μείωση της απόδοσης της ζύμωσης σχετίστηκε με την παρεμπόδιση λόγω αυξημένης παρουσίας προσμίξεων και τοξικών συστατικών οι οποίες υπάρχουν στο υπόστρωμα τύπου μελάσας. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δυο ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες, χρησιμοποιώντας στην πρώτη περίπτωση αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο και στη δεύτερη περίπτωση μέσο που είχε υποστεί παστερίωση. Το στέλεχος Enterobacter sp. FMCC-208 παρουσίασε ικανοποιητική αύξηση και τελική παραγωγή προϊόντος ακόμα και στην περίπτωση παστεριωμένου θρεπτικού μέσου.Η παρούσα μελέτη δεικνύει ότι τα δύο άγρια στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα, ήτοι τα στελέχη Κ. oxytoca FMCC-197 και Enterobacter sp. FMCC-208, μπορούν να αξιοποιηθούν ως μικροοργανισμοί για την παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης και ακετοΐνης,χρησιμοποιώντας μάλιστα μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων χαμηλού κόστους στην προτεινόμενη βιοδιεργασία.