Ανοσοβιολογική μελέτη της εμπλοκής των ερυθροκυττάρων στους παθογενετικούς μηχανισμούς της μη αλκοολικής ηπατικής νόσου
Authors: Παπαδόπουλος Χαράλαμπος 
Published: November 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάσαμε στον ρόλο των ερυθρών αιμοσφαιρίων στον ανοσομεταβολισμό και τη λιποτοξικότητα. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε το ρόλο των ερυρθών αιμοσφαιρίων στην ανοσοπαθογένεση της μη αλκοολικής λιπώδους ηπατικής νόσου (NAFLD). Η NAFLD είναι μία νόσος του ήπατος που παρατηρείται περίπου στο 25% του παγκόσμιου πληθυσμού, και χαρακτηρίζεται αρχικά από συσσώρευση λίπους τουλάχιστον στο 5% των ηπατοκυττάρων, απουσία κατανάλωσης αλκοόλ και ηπατοτοξικών φαρμάκων και ιογενούς λοίμωξης του ήπατος. Σταδιακά, η ικανότητα του ήπατος να συσσωρεύει λίπος στη μορφή τριακυλογλυκερολών υπερνικάται, με αποτέλεσμα το σχηματισμό άλλων προϊόντων του μεταβολισμού των λιπιδίων, όπως η 1-φωσφορική σφιγγοσίνη (S1P), το λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) και η χοληστερόλη. Η ενεργοποίηση φλεμονώδων μονοπατιών, η παρεμπόδιση της σηματοδότησης της ινσουλίνης και η πρόκληση δυσλειτουργίας των κυτταρικών οργανιδίων, μπορεί να οδηγήσει τελικά σε μετάβαση του ασθενούς από τη στεάτωση, στη στεατοηπατίτιδα, την ίνωση, την κίρρωση, το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ακόμα και το θάνατο. Σύμφωνα με τη θεωρία των παράλληλων πολλαπλών χτυπημάτων για την παθογένεια της NAFLD, η λιποτοξικότητα, η αντίσταση στην ινσουλίνη, το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου, η δυσλειτουργία του μιτοχονδρίου, η διαταραχή της αυτοφαγίας, το οξειδωτικό στρες, o κυτταρικός θάνατος, η απελευθέρωση μοριακών μοτίβων βλάβης (DAMP), η μεταβολή του εντερικού μικροβιώματος και των υποκυτταρικών πληθυσμών των ανοσοκυττάρων, δρουν παράλληλα και αλληλοενισχύονται. Παρ’ αυτά, δεν υπάρχει μέχρι σήμερα εγκεκριμένη θεραπεία για την αντιμετώπιση της NAFLD, κάτι το οποίο, εκτός από τη φυσική πορεία και την επιδημιολογία της νόσου, προκαλεί και τεράστια οικονομικά κόστη για τα συστήματα υγείας παγκοσμίως. Το ερυθρό αιμοσφαίριο, πέρα από την παροχή οξυγόνου προς- και την αποβολή διοξειδίου του άνθρακα από- τους ιστούς έχει πρόσθετες λειτουργίες. Συγκεκριμένα, μεταξύ άλλων, i) αποτελεί την κύρια πηγή S1P στο αίμα, ii) αποτελεί μία βασικά πηγή LPA στο αίμα, iii) συμμετέχει ενεργά στην αντίστροφή μεταφορά χοληστερόλης προς το ήπαρ, iv) προσδένει και απελευθερώνει χημειοκίνες, v) απελευθερώνει κυτταροκίνες που έχουν συντεθεί κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, vi) επηρεάζει το λειτουργικό φαινότυπο των μακροφάγων, των Τ λεμφοκυττάρων, των ουδετερόφιλων και των δενδριτικών κυττάρων. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πως η συσσώρευση τοξικών λιπιδίων και η διατροφή πλούσια σε λίπος μετατρέπουν το ερυθρό αιμοσφαίριο σε ένα προ-φλεγμονώδες κύτταρο. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη αποφασίσαμε, σε πρώτο χρόνο, να εξετάσουμε τα επίπεδα των λιπιδίων: S1P, LPA, χοληστερόλης και των κυτταροκινών: MCP1, RANTES, MIP1β, IL-8, IL-1β, IL-12p40, IL-17, TNF-α, IFN-γ που απελευθερώνονται από τα ερυθρά αιμοσφαίρια ασθενών NAFLD σε σχέση με υγιείς εθελοντές. Βρέθηκε πως τα ερυθρά αιμοσφαίρια από ασθενείς απελευθερώνουν περισσότερη χημειοκίνη MCP1 (P<0.05), χωρίς όμως να παρατηρηθεί κάποια διαφορά στους άλλους παράγοντες. Εν συνεχεία, εξετάσαμε την επίδραση των conditioned media ερυθροκυττάρων ασθενών και υγιών εθελοντών στην απελευθέρωση κυτταροκινών από μακροφάγα RAW 264.7 in vitro. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως τα ερυθροκύτταρα ασθενών προκαλούν αυξημένη απελευθέρωση TNF-α από τα μακροφάγα (P<0.05). Έπειτα, εξετάστηκε η σχέση της σφιγγομυελίνης της μεμβράνης του ερυθροκυττάρου με το πρότυπο των απελευθερώμενων κυτταροκινών από αυτό. Για το λόγο αυτό, αναπτύξαμε μία ποσοτική μέθοδο χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας για τη σφιγγομυελίνη με βάση την ένταση των τριών βασικών χρωμάτων, και συγκρίναμε 10 μεθόδους για την απομόνωσή της από τα ερυθροκύτταρα. Η μέθοδος ήταν γραμμική σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων (0,25-10 μg / spot). Τα καλύτερα αποτελέσματα δόθηκαν για το άθροισμα πράσινου και κόκκινου χρώματος. Η κλίση για το πράσινο+ κόκκινο χρώμα είναι y = -13,973x+391,85 και το R2 = 0,9636. Η μέθοδος διαχωρίζει αρκετά ικανοποιητικά τη χοληστερόλη, τη φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, την φωσφατιδυλοϊνοστόλη, τη φωσφατιδυλοσερίνη, τη φωσφατιδυλοχολίνη και τη σφιγγομυελίνη. Το δυναμικό εύρος των μεθόδων βρέθηκε να είναι 0,1-200 μg. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού ήταν 0,137 μg και 0,41 μg, αντίστοιχα. Η μέση ακρίβεια, εκφραζόμενη ως % ανάκτηση, ήταν 0,9101 ± 0,006. Ο συντελεστής διακύμανσης για όλες τις συγκεντρώσεις ήταν μικρότερος του 0,52%, υποδεικνύοντας άριστη επαναληψιμότητα. Έπειτα, αφού συγκρίναμε 9 μεθόδους με τη μέθοδο Folch (μέθοδος 1) που βαθμονομήθηκε ως απόδοση εκχύλισης 100%, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η χρήση μεθανόλης ως μέθοδος διαλύτη εκχύλισης παρέχει την καλύτερη απόδοση (135,35 ± 1,04%). Η μέθοδος μεθανόλης είναι σταστιστικά σημαντικά (p<0.05) πιο αποδοτική από τις 8/9 υπόλοιπες μεθόδους που εξετάστηκαν. Με τη μέθοδο αυτή, η σφιγγομυελίνη της μεμβράνης ερυθροκυττάρων σε ασθενείς με NALFD ήταν σημαντικά χαμηλότερη από τους υγιείς μάρτυρες (829.82±511.60 vs 1892.08±606.25 μg/ml συσκευασμένων ερυθροκυττάρων) (p <0.001). Ακόμη, στους ασθενείς τα επίπεδα της MCP1 που απελευθερώνεται από τα ερυθροκύτταρα σχετίζονται αρνητικά με τα επίπεδα της μεμβρανικής σφιγγομυελίνης (speraman’s correlation =-0,53, p<0.05, pearson’s correlation=-0,46, p<0.05). Για τη διερεύνηση των μηχανισμών απελευθέρωσης της MCP1 από τα ερυθροκύτταρα, εξετάσαμε την επίδραση του αγωνιστή του υποδοχέα P2X7 στα επίπεδα της MCP1, αλλά και το ρόλο της απομάκρυνσης χοληστερόλης από το ερυθροκύτταρο μέσω κυκλοδεξτρίνης στην παραπάνω διαδικασία. Η ενεργοπoίηση του υποδοχέα P2X7 οδηγεί στην αυξημένη απελευθέρωση της χημειοκίνης MCP1 (50,06±1,04 pg/ml) σε σχέση με τα ερυθροκύτταρα απουσία διέγερσης (34,34± 4,4) (p<0.05). Η αφαίρεση χοληστερόλης μέσω κυκλοδεξτρίνης πριν την διέγερση οδήγησε σε μείωση της απελευθέρωσης MCP1 από τα ερυθροκύτταρα (41,77±1,00) (p<0.05). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια αισθάνονται και ανταποκρίνονται σε βλάβη των ιστών με τη στρατολόγηση και πιθανώς ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, ο ρόλος της χοληστερόλης ερυθροκυττάρων αξίζει περαιτέρω διερεύνηση, καθώς τα αποτελέσματά μας υπονοούν έναν προφλεγμονώδη ρόλο.Η μελέτη μας καταδεικνύει το ρόλο των ερυθροκυττάρων στη φλεγμονή του ήπατος κατά την NAFLD. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας ενισχύουν την πεποίθηση ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια συμμετέχουν ενεργά στα ανοσομεταβολικά γεγονότα της NAFLD. Περαιτέρω μελέτες θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων μοριακών θεραπευτικών στόχων για την NAFLD. Τα αποτελέσματά μας καθιστούν σαφή τον ρόλο των ερυθροκυττάρων στον συστημικό ανοσομεταβολισμό, συνδέοντας το συστημικό μεταβολικό περιβάλλον με την ανοσιακή απόκριση.