Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό πυρεθροειδών και νεονικοτινοειδών φυτοφαρμάκων σε δείγματα πειραματόζωων και εφαρμογή αυτών για την βιοπαρακολούθηση της έκθεσης σε αγροτικό και ειδικό πληθυσμό
Authors: Καββαλάκης Ματθαίος 
Published: September 2021

Στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαννέες αναλυτικές μέθοδοι με σκοπό τον προσδιορισμό των μεταβολιτών και τωνμητρικών ουσιών δύο νέων κατηγοριών φυτοφαρμάκων σε διάφορα βιολογικάδείγματα και μελετήθηκε in-vivo η τοξικότητά τους. Πιο συγκεκριμένα, επιλέχθηκαντα φυτοφαρμάκα cypermethrin και imidacloprid τα οποία αποτελούν δύο κύριεςαντιπροσωπευτικές χημικές δομές των πυρεθροειδών και νεονικοτινοειδών,αντίστοιχα. Οι αναλυτικοί μέθοδοι που αναπτύχθηκαν εφαρμόστηκαν τόσο σεδείγματα πειραματοζώων που ήταν επιβαρυμένα για μεγάλο χρονικό διάστημα σευποτοξικές δόσεις, όσο και για τη βιοπαρακολούθηση της έκθεσης σε αγροτικό καιμη πληθυσμό.Τα πυρεθροεϊδή και τα νεονικοτινοειδή είναι δύο ομάδες φυτοφαρμάκωνπου αποτελούν ίσως τις πλέον διαδεδομένες φυτοπροστατευτικές ομάδες ουσιώνμε ευρεία και εκτεταμένη χρήση τα τελευταία χρόνια. Το ενδιαφέρον για τιςσυγκεκριμένες ομάδες ολοένα και αυξάνεται εξαιτίας του γεγονότος ότι αποτελούντους αντικαταστάτες των έως πρότινος χρησιμοποιούμενων οργανοφωσφορικώνκαι καρβαμιδικών φυτοφαρμάκων στις καλλιέργειες. Ιδιαίτερο ενδιαφέροναποτελεί η διερεύνηση της επιβάρυνσης από τις νέες αυτές ομάδεςφυτοφαρμάκων, στο πληθυσμό της Κρήτης (μίγμα αστικού και αγροτικούπληθυσμού). Είναι πολύ μεγάλο το ποσοστό του πληθυσμού αυτού που ασχολείταιεπαγγελματικά αλλά και ερασιτεχνικά με καλλιέργειες. Επίσης, η πυκνότητα τωνκαλλιεργήσιμων περιοχών είναι αρκετά μεγάλη και συχνά εντοπίζονται δίπλα σεκατοικίες και οικισμούς, με συνέπεια την πολλαπλάσια επικινδυνότητα καιεπιβάρυνση σε φυτοπροστατευτικές ουσίες. Ολοένα αυξάνονται οι αναφορέςπεριστατικών οξείας ή χρόνιας τοξίκωσης από τις παραπάνω ομάδεςφυτοφαρμάκων στην διεθνή βιβλιογραφία και κλιμακώνεται η ανησυχία τηςδιεθνής επιστημονικής κοινότητας για τις επιδράσεις των ουσιών αυτών στην υγείατου πληθυσμού κάτι που αποτέλεσε εναύσματα για την παρούσα διατριβή. Το φυτοφάρμακο cypermethrin είναι ένα συνθετικό πυρεθροειδές πουχρησιμοποιείται ευρύτατα τόσο για οικιακή όσο και αγροτική χρήση. Η μοριακήδομή του είναι αντίστοιχη αυτής της φυσικής πυρεθρίνης. Πρόκειται για ουσίασχετικά χαμηλής τοξικότητας για ^ ν άνθρωπο, η οποία όμως είναι νευροτοξικήόταν έλθει σε επαφή με τα έντομα αναστέλλοντας τη δράση της αντλίας νατρίου-καλίου στην επιφάνεια των νευρικών κυττάρων. Γενικά, τα πυρεθροειδήμεταβολίζονται ταχύτατα στον οργανισμό και συνεπώς οι συγκεντρώσεις τους στηναιματική κυκλοφορία είναι πολύ μικρότερες από ότι των μεταβολιτών τους σταούρα. Οι ειδικοί μεταβολίτες για το cypermethrin είναι τα cis- και trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylic acids (cis- και trans-Cl2CA) καιο μη ειδικός μεταβολίτης 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA), ο οποίος είναι κοινός γιατουλάχιστον δέκα διαφορετικά πυρεθροειδή.Τα νεονικοτινοειδή είναι επίσης μια ομάδα συνθετικών φυτοφαρμάκων μεεντομοκτόνο δράση και έχουν βρει εφαρμογή κυρίως στη γεωργία, τις τελευταίεςτρεις δεκαετίες. Κύριος αντιπρόσωπος των ουσιών αυτών είναι το imidacloprid, ομεταβολισμός του οποίου οδηγεί σε σχηματισμό του μη ειδικού μεταβολίτη 6-chloronicotinic acid (6-ClNA). Παρά την περιορισμένη βιβλιογραφική αναφορά σεπεριστατικά έκθεσης σε αυτές τις ουσίες, αποδεικνύεται ότι η τοξικότητα τωννεονικοτινοειδών είναι ένα ζήτημα που πρέπει να εξεταστεί.Πυρεθροειδή και νεονικοτινοειδή φυτοφάρμακα χρησιμοποιούνται σεμεγάλο ποσοστό σε θερμοκηπιακές καλλιέργειες (ντομάτα, αγγούρι, μαρούλι κτλ)αλλά και σε αυτές τις ελιάς και της αμπέλου. Καλλιέργειες που είναι ευρέωςαπαντούμενες στο νησί της Κρήτης. Εκτός από την χρήση αυτών των ουσιών γιααγροτικές δραστηριότητες σε ποσοστό 78%, ένα 10% των ουσιών βρίσκουνεφαρμογή για οικιακή χρήση. Η ευρεία χρήση των φυτοφαρμάκων σε συνδυασμόμε την πολλές φορές αλόγιστη και μη ακολουθούμενη τους κανονισμούς εφαρμογήτων ουσιών, προσθέτουν επιπλέον παράγοντες στην επιβάρυνση του ανθρώπινουοργανισμού από τα φυτοφάρμακα αυτά.Πραγματοποιήθηκαν in-vivo πειράματα μελέτης της υποτοξικής δράσης τωνεν λόγω φυτοφαρμάκων. Χρησιμοποιήθηκαν πειραματόζωα (κουνέλια) ίδιου φύλου και ίδιας ηλικίας. Μελετήθηκαν τα επίπεδα των παραπάνω φυτοφαρμάκων και τωναντίστοιχων μεταβολιτών τους σε βιολογικά δείγματα πειραματόζωων (τρίχες,ούρα, αίμα), τα οποία είχαν επιβαρυνθεί per os με συγκεκριμένες δοσολογίες. Οισυγκεντρώσεις αυτές υπολογίστηκαν έτσι ώστε να αντιπροσωπεύουν το 1/15 και1/30 της LD5o (lethal dose) όπου αυτή ήταν διαθέσιμη, για τις συγκεκριμένες ουσίεςγια χρονικό διάστημα περίπου 6 μηνών. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτωνσυλλέχθηκαν βιολογικά δείγματα (πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στην αρχήτου πειράματος και στο τέλος κάθε διμήνου χορήγησης), ώστε να μελετηθεί, όσοναφορά τα δείγματα ούρων, ο μεταβολισμός των υπό ανίχνευση ουσιών, αλλά και ηπιθανή εναπόθεση τους στην τρίχα (μητρικής ουσίας και μεταβολιτών) για τονπροσδιορισμό της επιβάρυνσης του οργανισμού σε βάθος χρόνου.Αναπτύχθηκαν πρότυπες μέθοδοι ανάλυσης των μητρικών ουσιών(cypermethrin και imidacloprid) και των μεταβολιτών τους χρησιμοποιώνταςτεχνικές χρωματογραφίας συζευγμένες με φασματομετρία μάζας. Οι αναλυτικέςμέθοδοι αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν με τον υπολογισμό διάφορωναναλυτικών παραμέτρων (γραμμικότητα, ανάκτηση, ακρίβεια, ορθότητα, όριαανίχνεσης - LOD, όρια ποσοτικοποίησης - LOQ). Επιπλέον, τα αναλυτικάαποτελέσματα σχετίστηκαν με παραμέτρους που επηρεάζουν την εναπόθεση (π.χ.χορηγούμενη δόση, χρόνος έκθεσης).Συνοπτικά, για την ανίχνευση του φυτοφαρμάκου imidacloprid και τουμεταβολίτη του, 6-ClNA, αναπτύχθηκε μέθοδος ανίχνευσης με σύστημα υγρήςχρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS). Τα όρια ανίχνευσης για ταδείγματα τριχών που αναλύθηκαν ήταν 0.02 ng/mg για το imidacloprid και 0.01ng/mg για το 6-ClNA, ενώ για τα δείγματα ούρων που αναλύθηκαν ήταν 0.002 μg/mlγια το imidacloprid και 0.008 μg/ml για το 6-ClNA. Ο χρόνος έκλουσης τουimidacloprid ήταν 11.13 min και 12.46 min για το 6-ClNA. Η γραμμικότητα τωνπρότυπων διαλυμάτων αλλά και των φορτισμένων δειγμάτων ήταν ικανοποιητικήτόσο για το πρωτόκολλο των δειγμάτων τρίχας όσο και για αυτό των ούρων (>0.99).Η μέση ανάκτηση για το imidacloprid ήταν 97.13% (n=9) και 91.42% (n=9) για το 6-ClNA για τα δείγματα τριχών, ενώ για τα δείγματα των ούρων οι αντίστοιχες ανακτήσεις ήταν 96.11% (n=9) και 103.44% (n=9). Η ακρίβεια της μεθόδου(accuracy) ήταν >98.71% για το imidacloprid και >100.25% για το 6-ClNA για τοπρωτόκολλο της τρίχας και >98.93% για το imidacloprid και >97.82% για το 6-ClNAγια το πρωτόκολλο των ούρων. Οι αντίστοιχες τιμές της ακρίβειας (precision)κυμαίνονταν <12.43% για όλες τις περιπτώσεις.Στα δείγματα τριχών των πειραματόζωων που αναλύθηκαν διαπιστώθηκανστατιστικά σημαντικές διαφορές στις ανιχνευόμενες συγκεντρώσεις ανάμεσα στιςομάδες των ζώων (control, χαμηλή δόση, υψηλή δόση) για το διάστημα 0 έως 6μηνών έκθεσης για το imidacloprid (p<0.001) αλλά όχι και για το 6-ClNA (p=0.571).Οι συγκεντρώσεις του imidacloprid στα δείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου(control) κυμαίνονταν από 0.62 έως 1.61 ng/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσηςαπό 0.99 έως 41.91 ng/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από 0.26 έως 58.87ng/mg. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του 6-ClNA στα δείγματα τριχών για τηνομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD σε όλη τη διάρκεια του πειράματος, για τηνομάδα της χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 0.21 ng/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 2.88 ng/mg.Τα δείγματα ούρων των πειραματόζωων που αναλύθηκαν έδωσανστατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων έκθεσης για το διάστημα 0έως 6 μήνες έκθεσης τόσο για το imidacloprid (p=0.008), όσο και για το 6-ClNA(p=0.032). Οι συγκεντρώσεις του imidacloprid και του 6-ClNA στα δείγματα ούρωνγια την ομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Γιατην ομάδα της χαμηλής δόσης οι συγκεντρώσεις του imidacloprid κυμαίνονταν από<LOD έως 125.02 μg/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 343.17μg/ml. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του 6-ClNA στα δείγματα τριχών για την ομάδατης χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 1.29 μg/ml και για την ομάδα τηςυψηλής δόσης από <LOD έως 4.25 μg/ml. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματαυπέδειξαν ως καταλληλότερο βιοδείκτη έκθεσης για το imidacloprid την ίδια τημητρική ουσία σε δείγματα τριχών συγκριτικά με τους μεταβολίτες της. Επιπλέον, ταδείγματα τριχών μπορούν να προσφέρουν μια σε βάθος χρόνου και ανάλογη τηςδόσης εικόνα επιβάρυνσης. Επιπλέον, για την ανίχνευση των μεταβολιτών του φυτοφαρμάκουcypermethrin, cis-Cl2CA, trans-Cl2CA και 3-PBA, αναπτύχθηκε μέθοδος ανίχνευσηςμε σύστημα αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC-MS). Τα όριαανίχνευσης για τα δείγματα τριχών που αναλύθηκαν ήταν 4.0 pg/mg για το cis-Cl2CA, 3.9 pg/mg για το trans-Cl2CA και 1.0 pg/mg για το 3-PBA, ενώ για τα δείγματαούρων που αναλύθηκαν ήταν 1.4 ng/ml για το cis-Cl2CA, 0.8 ng/ml για το trans-Cl2CAκαι 0.3 ng/ml για το 3-PBA. Η γραμμικότητα των πρότυπων διαλυμάτων αλλά καιτων φορτισμένων δειγμάτων ήταν ικανοποιητική τόσο για το πρωτόκολλο τωνδειγμάτων τρίχας όσο και για αυτό των ούρων (>0.99). Η μέση ανάκτηση για το cis-Cl2CA ήταν 84.8% (n=8), για το trans-Cl2CA 87.2% (n=8) και για το 3-PBA ήταν 96.4%(n=8) για τα δείγματα τριχών, ενώ για τα δείγματα των ούρων οι αντίστοιχεςανακτήσεις ήταν 102.1% (n=3), 111.2% (n=3) και 87.1% (n=3). Η ακρίβεια τηςμεθόδου (accuracy) υπολογίστηκε >91.8% για το cis-Cl2CA, >96.7% για το trans-Cl2CAκαι >90.5% για το 3-PBA για το πρωτόκολλο της τρίχας και >89.2% για το cis-Cl2CA,>71.6% για το trans-Cl2CA και >86.0% για το 3-PBA για το πρωτόκολλο των ούρων.Οι αντίστοιχες τιμές της ακρίβειας (precision) κυμαίνονταν <13.6% για όλες τιςπεριπτώσεις.Τα δείγματα τριχών των πειραματόζωων που αναλύθηκαν έδωσανστατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες των ζώων (control, χαμηλήδόση, υψηλή δόση) για το διάστημα 0 έως 4 μήνες έκθεσης για όλους τουςμεταβολίτες, cis-Cl2CA (p=0.009), trans-Cl2CA (p=0.003), 3-PBA (p=0.012). Οισυγκεντρώσεις του cis-Cl2 CA στα δείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου (control)κυμαίνονταν από <LOD έως 112.6 pg/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσης από<LOD έως 1022.0 pg/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 5361.4pg/mg. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του trans-Cl2CA στα δείγματα τριχών για τηνομάδα ελέγχου (control) κυμαίνονταν από <LOD έως 112.0 pg/mg, για την ομάδατης χαμηλής δόσης από <LOD έως 1367.0 pg/mg και για την ομάδα της υψηλήςδόσης από <LOD έως 5448.2 pg/mg. Τέλος για το 3-PBA οι συγκεντρώσεις σταδείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου (control) κυμαίνονταν από 16.5 έως 42.8pg/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσης από <LOD έως 146.7 pg/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 659.9 pg/mg. Τα αποτελέσματα πουπροέκυψαν από την ανάλυση των τριχών των πειραματόζωων έδειξαν αύξηση τωνεπιπέδων όλων των μεταβολιτών με τη πάροδο του χρόνου και η αύξηση αυτή ήτανανάλογη της χορηγούμενης δόσης.Οι συγκεντρώσεις όλων των μεταβολιτών στα δείγματα ούρων για τηνομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD για όλη τη διάρκεια του πειράματος. Για τηνομάδα της χαμηλής δόσης οι συγκεντρώσεις για το cis-Cl2CA από <LOD έως 1365.6ng/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 5396.9 ng/ml. Οιαντίστοιχες συγκεντρώσεις του trans-Cl2 CA στα δείγματα τριχών για την ομάδα τηςχαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 2311.4 ng/ml και για την ομάδα τηςυψηλής δόσης από <LOD έως 7453.9 ng/ml. Τέλος για το 3-PBA οι συγκεντρώσειςστα δείγματα τριχών για την ομάδα της χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως813.1 ng/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 2072.8 ng/ml.Επιπλέον, μελετήθηκαν και για τα δύο φυτοφάρμακα οι δείκτες οξειδωτικούστρες (oxidative stress), (TBARS, protein carbonyls, TAC), αλλά και ο έλεγχος τηςγενοτοξικότητας αυτών. Συνοπτικά, από αυτές τις μελέτες προέκυψε ότι τοcypermethrin δεν επηρεάζει κάποιον από τους δείκτες του oxidative stress στιςχορηγούμενες δόσεις. Αντίθετα, το imidacloprid επηρεάζει το oxidative stress, αφούπαρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) στα επίπεδα των TBARS καιγια τις δύο ομάδες χορήγησης. Επιπλέον για την αξιολόγηση της γενοτοξικήςδράσης των δύο υποτοξικών δόσεων χορήγησης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδοςCytokinesis Block Micronuclei (CBMN). Έγινε καταμέτρηση των μικροπυρήνων μετάτην έκθεση των πειραματόζωων για παρατεταμένο χρονικό διάστημα, ωστόσο οιδιαφορές που παρατηρήθηκαν ήταν μόνο μεταξύ της ομάδας ελέγχου (control) καιτων εκτεθειμένων πειραματοζώων, χωρίς η διαφορά μεταξύ των δύο εκτεθειμένωνομάδων να είναι στατιστικά σημαντική (p>0.05).Η πληθυσμιακή μελέτη επικεντρώθηκε στην μελέτη επιβάρυνσης διάφορωνπληθυσμιακών ομάδων της ευρύτερης περιοχής της Κρήτης, οι οποίες είναι είτεεπιβαρυμένες από φυτοφάρμακα λόγω επαγγέλματος (αγροτικός πληθυσμός,ψεκαστές-εφαρμοστές κτλ), είτε γενικός πληθυσμός (χωρίς επαγγελματική έκθεση σε αυτά). Ο επαγγελματικά εκτεθειμένος πληθυσμός περιελάμβανε άτομαδιάφορων ηλικιών που κατοικούν σε αγροτικές περιοχές της Κρήτης και είτε έχουνάμεση ενασχόληση με αγροτικές καλλιέργειες είτε λόγω της παρακείμενηςδιαμονής τους σε αγροτικές δραστηριότητες (θερμοκήπια, ανοικτές καλλιέργειεςκτλ) ενδέχεται να έχουν παρατεταμένη και χρόνια έκθεση σε φυτοπροστατευτικέςουσίες. Ο μη επαγγελματικά εκτεθειμένος πληθυσμός περιελάμβανε άτομαδιαφόρων ηλικιών που κατοικούν σε αστικές περιοχές και δεν υπάρχει κάποιαγνωστή πηγή έκθεσης σε φυτοπροστατευτικές ουσίες. Συλλέχθηκαν δείγματατριχών από κάθε συμμετέχοντα στη μελέτη και παράλληλα συμπληρώθηκεκατάλληλο ερωτηματολόγιο, όπου καταγράφηκαν βασικά κοινωνικοοικονομικά καικλινικά στοιχεία, πιθανή έκθεση σε φυτοφάρμακα, διατροφικές συνήθειες, όπωςεπίσης χρόνια προβλήματα υγείας. Η δειγματοληψία τριχών, έγινε από το τριχωτότης κεφαλής, όσο το δυνατό κοντύτερα στο δέρμα, λίγο πίσω από την κορυφή τηςκεφαλής. Συνολικά συλλέχθηκαν 58 δείγματα τριχών, 32 από κατοίκους αγροτικώνπεριοχών της Κρήτης και 26 δείγματα από κάτοικους αστικής περιοχής της Κρήτης.Η μέση ηλικία των κατοίκων της αστικής ήταν τα 35 έτη, ενώ το 50% των κατοίκωντης αγροτικής περιοχής ήταν ηλικίας μεγαλύτερης των 50 ετών. Το 38.5% τωνκατοίκων της αστικής περιοχής ήταν άνδρες, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τουςκατοίκους της αγροτικής περιοχής ήταν 21.9%. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σεόλο το διαθέσιμο της μήκος της τρίχας ώστε να μελετηθεί η επιβάρυνση από τιςμελετώμενες ουσίες σε βάθος χρόνου. Από την ανάλυση των δειγμάτωνπαρατηρήθηκαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του imidacloprid μόνο για τους κατοίκους τηςαγροτικής περιοχής. Ωστόσο, καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δενπαρατηρήθηκε εξετάζοντας την πληθυσμιακή ομάδα αυτή ανά φύλο ή ανά ηλικία.Το ποσοστό ανίχνευσης του imidacloprid για τους κατοίκους της αγροτικής περιοχήςήταν αρκετά υψηλό (65.6%), κάτι που βάση των ερωτηματολογίων πουαπαντήθηκαν μπορεί να αποδοθεί στον διαφορετικό τρόπο ζωής αλλά και τηνενασχόληση αυτών με αγροτικές δραστηριότητες ή και την εγγύτητα της κατοικίαςτου με αγροτικές δραστηριότητες. Τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν κατά τη παρούσα διδακτορική διατριβήμπορούν να εφαρμοστούν με επιτυχία με σκοπό την εκτίμηση κινδύνου ή τηνβιοπαρακολούθηση στις συγκεκριμένες φυτοπροστατευτικές ουσίες και την πιθανήσυσχέτιση με προβλήματα υγείας ή άλλες ανεπιθύμητες παρενέργειες. Επίσης ταπρωτόκολλα αυτά είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για την διερεύνησηπεριστατικών οξείας δηλητηρίασης με σκοπό την εκτίμηση της κλινικής εικόνας τουασθενούς. Και στις δύο περιπτώσεις, η σπουδαιότητα της δυνατότητας μέτρησηςτων προαναφερθέντων ουσιών σε δείγματα τριχών μπορεί να αποβεί χρήσιμη καινα προσφέρει σπουδαίες πληροφορίες για την παρελθοντική ή/και χρόνια έκθεσηστα φυτοφάρμακα αυτά. Η δυνατότητα αυτή δεν ήταν μέχρι στιγμής εφικτή μιας καιδεν υπήρχαν ανάλογα πρωτόκολλα διαθέσιμα στη βιβλιογραφία.