Υβριδικά υλικά με βάση νανοδομημένους άνθρακες και λειτουργικά δενδριτικά πολυμερή
Authors: Λύρα Κυριακή-Μαρίνα 
Published: February 2022

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός υβριδικών υλικών με βάση νανοδομημένους άνθρακες και κατάλληλα επιλεγμένα λειτουργικά δενδριτικά πολυμερή και ακολούθως η μελέτη τους σε βιολογικές εφαρμογές. Είναι γνωστό από την βιβλιογραφία, ότι οι νανοδομημένοι άνθρακες παρουσιάζουν εξαιρετικές ηλεκτρικές, μηχανικές και θερμικές ιδιότητες και έχουν μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά. Για το λόγο αυτό, έχουν μελετηθεί ως αισθητήρες, φορείς φαρμάκων και γονιδίων, αντιβακτηριακά υλικά και άλλες εφαρμογές. Στην συγκεκριμένη εργασία πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη υβριδικών νανοϋλικών με βάση τους τροποποιημένους νανοσωλήνες και τους νανοδίσκους άνθρακα, τα οποία στη συνέχεια μελετήθηκαν ως φορείς φαρμάκων με αντικαρκινικές ιδιότητες ή ως αντιβακτηριακά υλικά. Λόγω του ότι τα υλικά άνθρακα δεν έχουν καλή διασπορά σε διαλύτες και ειδικώς σε υδατικά μέσα, τροποποιήθηκαν με κατάλληλα επιλεγμένα λειτουργικά δενδριτικά πολυμερή ώστε αφενός να αυξηθεί η υδροφιλικότητα τους και άρα η συμβατότητα τους με τα υδατικά μέσα και αφετέρου να αποκτήσουν επιθυμητές ιδιότητες ανάλογα με την εφαρμογή. Για τον λόγο επιλέχθηκαν δενδριτικά πολυμερή που φέρουν ομάδες που διευκολύνουν την διέλευση δια μέσου της κυτταρικής μεμβράνης, αλλά και ομάδες που βελτιώνουν τις αντιβακτηριακές ιδιότητες των τελικών προϊόντων.Αναλυτικά, στο πρώτο τμήμα της διατριβής δόθηκε έμφαση στην τροποποίηση νανοσωλήνων άνθρακα με δενδριτικούς διαμεμβρανικούς μεταφορείς καθώς και στην τροποποίηση νανοδίσκων άνθρακα με φθορίζουσες νανοτελείες άνθρακα με στόχο να μελετηθούν ως φορείς φαρμάκων. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν υβριδικά υλικά με βάση τους οξειδωμένους νανοσωλήνες άνθρακα (oxCNTs) και λειτουργικά δενδριτικά πολυμερή, παράγωγα της υπερδιακλαδισμένης πολυαιθυλενιμίνης (PEI) δύο διαφορετικών μέσων μοριακών βαρών 5000 και 25000, των οποίων οι πρωτοταγείς αμινομάδες είχαν υποκατασταθεί ποσοτικά (~100%) με ομάδες γουανιδίνης (GPEI5K και GPEI25K). Η επιτυχής πρόσδεση των πολυμερών πάνω στους νανοσωλήνες μέσω ηλεκτροστατικών δεσμών, δεσμών υδρογόνου και δυνάμεων van der Waals βεβαιώθηκε με χρήση διαφόρων τεχνικών, όπως 1H και 13C NMR, FTIR, Raman, XPS, TGA και XRD, ενώ τα ποσοστά των GPEIs στα oxCNTs@GPEI5K και oxCNTs@GPEI25K βρέθηκε ότι είναι 22.7 και 27.5% w/w, αντίστοιχα. Επιπλέον, από τη μελέτη της μορφολογίας τους με μικροσκοπίες SEM, TEM και AFM βρέθηκε ότι τα πολυμερή είναι σταθερά προσδεδεμένα και περιβάλουν ομογενώς τα τοιχώματα των νανοσωλήνων. Η σταθερότητα των υδατικών τους διασπορών αξιολογήθηκε οπτικά, αλλά και με φασματοσκοπία UV-vis και μετρήσεις ζ-δυναμικού, όπου βρέθηκε ότι παραμένουν σταθερές για τουλάχιστον 6 μήνες εξαιτίας της παρουσίας των γουανιδινικών ομάδων που προσδίδουν υδροφιλικότητα στους νανοσωλήνες άνθρακα. Στη συνέχεια, για να αξιολογηθούν τα συστήματα αυτά ως νανοφορείς αντικαρκινικών φαρμάκων, η δοξορουβικίνη (DOX), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντικαρκινικό φάρμακο της ομάδας των ανθρακυκλινών, δεσμεύτηκε σε ποσοστό 44 και 52% w/w στα υβριδικά νανοϋλικά oxCNTs@GPEI5K και oxCNTs@GPEI25K, αντίστοιχα, κυρίως μέσω π-π αλληλεπιδράσεων. Μελέτη της αποδέσμευσης της DOX από τα υβριδικά υλικά σε δύο διαφορετικές συνθήκες pH, (7.4 και 5.5) έδειξε ότι στο όξινο περιβάλλον η DOX αποδεσμεύεται από τα νανοϋλικά με πιο γρήγορο ρυθμό από ότι στο φυσιολογικό pH. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αντικαρκινική δράση της δεσμευμένης DOX στα oxCNTs@GPEI5K και oxCNTs@GPEI25K καθώς και ο εντοπισμός της μέσα στα κύτταρα. Επίσης, διερευνήθηκε ο μηχανισμός της αντικαρκινικής δράσης της μέσω του προσδιορισμού του ποσοστού της απόπτωσης/νέκρωσης των κυττάρων. Με βάση τα αποτελέσματα, βρέθηκε ότι το σύστημα oxCNTs@GPEI5K/DOX εμφανίζει αυξημένη και εκλεκτική τοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα σε αντίθεση με τα μη καρκινικά, ενώ αντιθέτως το σύστημα oxCNTs@GPEI25K/DOX εμφανίζει σημαντικά μεγάλη τοξικότητα, ανεξάρτητα από τον τύπο των κυττάρων. Τέλος, βρέθηκε ότι και τα δύο συστήματα αυξάνουν σημαντικά τη δραστικότητα της DOX σε σχέση με την ελεύθερη, μέσω ενός νενκρωτικού, μη αποπτωτικού, γρήγορου και καταστροφικού μηχανισμού από τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν να ανακάμψουν. Συμπερασματικά, μεταξύ των δύο νανοφορέων, το oxCNTs@GPEI5K είναι πιο αποτελεσματικό σύστημα μεταφοράς της DOX, το οποίο παρουσιάζει σημαντική εκλεκτική τοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων, αποτελώντας ένα ελπιδοφόρο σύστημα για θεραπεία του καρκίνου.Αντίστοιχη μελέτη πραγματοποιήθηκε σε ένα νέο υβριδικό υλικό (oxCNDs@FCDs) με βάση τους τροποποιημένους νανοδίσκους άνθρακα, οι οποίοι αντιπροσωπεύουν μια εναλλακτική προσέγγιση του κλασικού γραφενίου, με φθορίζουσες τελείες άνθρακα ως ένα σύστημα ταυτόχρονης ανίχνευσης και μεταφοράς φαρμάκων (theranostics). Το υβριδικό αυτό υλικό χαρακτηρίστηκε φυσικοχημικά με φασματοσκοπίες φθορισμού, 1H NMR, FTIR και XPS, ενώ η δομή του χαρακτηρίστηκε με XRD και TGA. Η μορφολογία του μελετήθηκε με μικροσκοπίες SEM και ΤΕΜ. Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν συμπεραίνεται ότι οι φθορίζουσες νανοτελείες άνθρακα είναι ομοιόμορφα δεσμευμένες σε όλη την επιφάνεια των oxCNDs σε ποσοστό 23% w/w, χωρίς να προκαλούν σημαντική μεταβολή της γραφιτικής δομής τους. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητά τους να διασπείρονται αποτελεσματικά σε υδατικά μέσα, ενώ με φασματοσκοπία φθορισμού αποδείχθηκε ότι παρουσιάζουν ισχυρό μπλε φθορισμό μετά από διέγερση στην περιοχή UV. Ακολούθως το νέο υβριδικό υλικό μελετήθηκε ως προς τη δυνατότητα του να χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικό σύστημα ταυτόχρονης ανίχνευσης και μεταφοράς φαρμάκων. Αποδείχθηκε ότι η DOX δεσμεύεται επιτυχώς στα oxCNDs@FCDs κυρίως μέσω π-π αλληλεπιδράσεων, σε ποσοστό ~41% w/w. Στη συνέχεια μελετήθηκε η αντικαρκινική δράση της δεσμευμένης DOX καθώς και ο εντοπισμός τόσο της DOX, όσο και των oxCNDs@FCDs μέσα στα κύτταρα. Βρέθηκε ότι τα oxCNDs@FCDs αυξάνουν σημαντικά τη δραστικότητα της DOX σε σχέση με την ελεύθερη, μέσω ενός νεκρωτικού, μη αποπτωτικού, γρήγορου και καταστροφικού μηχανισμού. Συνεπώς, οι τροποποιημένοι νανοδίσκοι άνθρακα με φθορίζουσες νανοτελείες άνθρακα, οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλή τοξικότητα, εκλεκτική και ενισχυμένη μεταφορά της DOX στα καρκινικά κύτταρα καθώς και δυνατότητα εντοπισμού στα κύτταρα λόγω της ιδιότητας τους να φθορίζουν, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως ένα ασφαλές και αποτελεσματικό σύστημα ανίχνευσης και μεταφοράς φαρμάκων με εκλεκτικότητα στα καρκινικά κύτταρα.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκαν υβριδικά υλικά, τα οποία μελετήθηκαν ως προς τις αντιβακτηριακές τους ιδιότητες. Συγκεκριμένα, οξειδωμένοι νανοσωλήνες άνθρακα τροποποιήθηκαν μη ομοιοπολικά με παράγωγα της υπερδιακλαδισμένης πολυαιθυλενιμίνης των οποίων οι πρωτοταγείς αμινομάδες είχαν υποκατασταθεί με τεταρτοταγείς αμμωνιακές ομάδες (QPEI). Ο βαθμός υποκατάστασης των πρωτοταγών αμινομάδων της ΡΕΙ ήταν 30%, 50% και 80% και τα τελικά υβριδικά υλικά που προέκυψαν ήταν τα oxCNTs@30-QPEI, oxCNTs@50-QPEI και oxCNTs@80-QPEI. Η δομή τους καθώς και η επιτυχής πρόσδεση των πολυμερών πάνω στην επιφάνεια των νανοσωλήνων αξιολογήθηκε με FTIR, Raman, TGA και στοιχειακή ανάλυση. Το ποσοστό των QPEIs στα oxCNTs@30-QPEI, oxCNTs@50-QPEI και oxCNTs@80-QPEI υπολογίστηκε ότι είναι 16%, 20% και 23% w/w, αντίστοιχα. Επίσης, τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους μελετήθηκαν με μικροσκοπίες SEM, TEM και AFM, όπου βεβαιώνουν ότι τα τοιχώματα των oxCNTs περιβάλλονται ομογενώς από τα πολυμερή. Αποτέλεσμα αυτού είναι να αυξάνεται η υδροφιλικότητα των oxCNTs και κατά συνέπεια να αυξάνεται και η ικανότητα τους να διασπαρθούν σε υδατικά διαλύματα, λαμβάνοντας υδατικές τους διασπορές που παραμένουν σταθερές για τουλάχιστον 18 μήνες. Ακολούθησε αντιβακτηριακή μελέτη των υλικών σε μετασχηματισμένα gram (-) βακτήρια Escherichia coli XL1-blue, που εκφράζουν την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP). Βρέθηκε ότι όλα τα oxCNTs@QPEIs εμφανίζουν βελτιωμένες αντιβακτηριακές ιδιότητες σε σχέση με τα oxCNTs καθώς και ότι η δράση τους αυξάνεται όσο αυξάνεται και ο βαθμός υποκατάστασης της PEI από 30% στα 80%. Τέλος, η μελέτη κυτταροτοξικότητας των oxCNTs@QPEIs έδειξαν ότι δεν εμφανίζουν σχεδόν καμία τοξικότητα σε συγκεντρώσεις ίσες με αυτές που απαιτούνται για να θανατωθεί το 50% του αρχικού πληθυσμού των βακτηρίων (ΕC50) τιμές. Συνεπώς, τα υβριδικά υλικά oxCNTs@QPEIs είναι ελπιδοφόρα συστήματα για εφαρμογές ως ασφαλή, αντιβακτηριακά υλικά. Στην συνέχεια, μελετήθηκε η αντιβακτηριακή δράση των GPEIs στα gram (+) S. aureus βακτήρια και στα gram (-) E. coli βακτήρια. Βρέθηκε ότι και τα δύο γουανιδιωμένα παράγωγα είναι πιο τοξικά στο στέλεχος S. aureus σε σχέση με το E. coli, με το GPEI25K να είναι ελαφρώς πιο τοξικό στα E. coli από ότι το GPEI5K, ενώ στα S. aureus και τα δύο πολυμερή εμφανίζουν ανάλογη τοξικότητα. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα αυτά μελετήθηκε, στη συνέχεια η αντιβακτηριακή δράση των υβριδικών υλικά oxCNTs@GPEI5K και oxCNTs@GPEI25K στα δύο στελέχη βακτηρίων, E. coli και S. aureus. Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν, συμπεραίνεται ότι και τα δύο υβριδικά υλικά, με βέλτιστο το oxCNΤs@GPEI5Κ, εμφανίζουν βελτιωμένες αντιβακτηριακές ιδιότητες και ιδιαίτερα έναντι των κατά gram (-) E. coli βακτηρίων. Τέλος, η μελέτη κυτταροτοξικότητας των oxCNTs@GPEI5K και oxCNTs@GPEI25K έδειξε ότι εμφανίζουν χαμηλή τοξικότητα σε συγκεντρώσεις ίσες με τις ΕC50 τιμές τους. Συνεπώς, συμπεραίνεται ότι και τα δύο oxCNTs@GPEIs είναι ελπιδοφόρα συστήματα ικανά να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές ως ασφαλή, αντιβακτηριακά υλικά. Τέλος, λόγω των θετικών αποτελεσμάτων που προέκυψαν από την αντιβακτηριακή μελέτη των oxCNΤs@GPEIs αλλά και της διαπίστωσης ότι τα GPEIs παίζουν σημαντικό ρόλο στις αντιβακτηριακές ιδιότητες των υλικών, τροποποιήθηκαν οξειδωμένοι νανοδίσκοι άνθρακα (oxCNDs) με τα γουανιδιωμένα δενδριτικά πολυμερή GPEI5K και GPEI25K, προκειμένου να μελετηθεί η αντιβακτηριακή τους δράση. Η επιτυχής πρόσδεση των πολυμερών πάνω στους νανοδίσκους πιστοποιήθηκε με φασματοσκοπίες FTIR, Raman και XPS, ενώ η δομή τους μελετήθηκε με XRD και TGA. Το ποσοστό των πολυμερών στα υβριδικά υλικά υπολογίστηκε ότι είναι 8.4% και 10.5% w/w για τα oxCNDs@GPEI5K και oxCNDs@GPEI25K αντίστοιχα. Η μορφολογία τους μελετήθηκε με μικροσκοπίες SEM, TEM και AFM και βρέθηκε ότι τα πολυμερή δεσμεύονται ομοιογενώς πάνω στα φύλλα των νανοδίσκων. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε η αντιβακτηριακή μελέτη των νανοϋλικών στα gram (-) E. coli βακτήρια και στα gram (+) S. aureus βακτήρια. Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν, συμπεραίνεται ότι και τα δύο υβριδικά υλικά, με βέλτιστο το oxCNDs@GPEI5Κ, εμφανίζουν βελτιωμένες αντιβακτηριακές ιδιότητες και ιδιαίτερα έναντι των κατά gram (-) E. coli βακτηρίων. Τέλος, η μελέτη τοξικότητας των υβριδικών υλικών έδειξε ότι σε συγκεντρώσεις ίσες με τις τιμές ΕC50 δεν εμφανίζουν καμία τοξικότητα. Συνεπώς, και τα δύο oxCNDs@GPEIs είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές ως ασφαλή, αντιβακτηριακά υλικά εφόσον παρουσιάζουν ταυτόχρονα τόσο χαμηλή κυτταροτοξικότητα όσο και ενισχυμένες αντιβακτηριακές ιδιότητες.Συμπερασματικά, ο συνδυασμός νανοδομημένων υλικών άνθρακα με κατάλληλα επιλεγμένα λειτουργικά δενδριτικά πολυμερή οδηγεί στην ανάπτυξη καινοτόμων υβριδικών υλικών που παρουσιάζουν βελτιωμένες ιδιότητες σε σχέση με τα αρχικά υλικά και δυνατότητες εφαρμογής τους είτε ως φορείς φαρμάκων είτε ως αντιβακτηριακά υλικά.