Ανοσοϊστοχημική μελέτη βιολογικών παραγόντων σε καλοήθη νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων
Authors: Χρυσολούρης Παναγιώτης 
Published: September 2021

Εισαγωγή:Η αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα κυτταρικά και μη (εξωκυττάρια θεμέλια ουσία) στοιχεία του μικροπεριβάλλοντός τους (στρώμα – tumor stroma) οδηγεί τελικά σε αποτυχία των ομοιοστατικών μηχανισμών του ιστού και ανάπτυξη του όγκου διαμορφώνοντας παράγοντες της καρκινογένεσης όπως επιθηλιακή – μεσεγχυματική μετάπτωση (epithelial-mesenchymal transition, EMT), μετανάστευση καρκινικών κυττάρων διαμέσου συνδετικού ιστού και διείσδυση σε φυσιολογικούς ιστούς, μετάσταση, νεοαγγειογένεση, απόπτωση και ρύθμιση της λειτουργίας των προγονικών καρκινικών κυττάρων.Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα, καλοήθων ή κακοήθων όγκων, αποκτούν μέσω γενετικής μετάλλαξης τη δυνατότητα να επιζούν και να πολλαπλασιάζονται χωρίς περιορισμούς με ελάχιστη προσκόλληση στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, να αποφεύγουν και σήματα ανάσχεσης του πολλαπλασιασμού ή σήματα απόπτωσης και να εξασφαλίζουν τα αναγκαία θρεπτικά συστατικά με νεοαγγειογένεση. Οι καλοήθεις όγκοι περιορίζονται σε επέκταση, μηχανική παρεκτόπιση και διάβρωση των γειτονικών ιστών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές καθορίζονται από δομικές και βιοχημικές ιδιότητες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας καθώς και από την επικοινωνία των κυττάρων του όγκου με μη νεοπλασματικά κύτταρα των ιστών. Σκοπός: Ο σκοπός της μελέτης μας είναι η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της έκφρασης των μακρομορίων BMP-2, MMP-2, MMP9, TGFβ1και οστεοποντίνη σε καλοήθεις όγκους σιαλογόνων αδένων, και ειδικότερα σε πλειόμορφα αδενώματα και κυσταδενολεμφώματα (όγκους Warthin).Υλικό-Μέθοδος: Το υλικό της έρευνας αφορούσε συνολικά 97 όγκους παρωτίδος που εξαιρέθηκαν σε διάστημα 10 ετών από 2000 – 2010 στο Γ.Ν.Α. «Ιπποκράτειο” από την Ωτορινολαρυγγολογική κλινική, από ασθενείς ηλικίας 21 έως 80 ετών, 46 εκ των οποίων αναγνωρίστηκαν ως όγκοι Warthin και 51 ως πλειόμορφα αδενώματα. Από το αρχείο ανευρέθηκαν οι αντίστοιχοι κύβοι παραφίνης. Από κάθε μονιμοποιημένο και εγκλεισμένο σε κύβο παραφίνης δείγμα έγινε λήψη τομών πάχους 4μm με τη βοήθεια υπερμικροτόμου και έγινε ανοσοϊστοχημική μελέτη με την ενζυμική μέθοδο συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC) για να εξετάσουμε την έκφραση των μακρομορίων που μας ενδιέφεραν.Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής:Για ανίχνευση της BMP – 2 :(baf355BMP2,4 , R&D) – μονοκλωνικό αντίσωμα αίγας σε αραίωση 1:150 με θετικούς μάρτυρες δείγματα θηλωδών καρκινωμάτων θυρεοειδούςΓια την ανίχνευση της Οστεοποντίνης: (Ε-3284, Spring Bioscience) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από αδενοκαρκινώματα μαστού.Για την ανίχνευση του TGFβ1: (SC-5289, Santa Cruz Biotechnology Inc) – πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε αραίωση 1:50 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από θηλώδη καρκινώματα θυρεοειδούς.Για την ανίχνευση του MMP-2: (Springe 18014) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από ακανθοκυτταρικό καρκίνο στόματοςΓια την ανίχνευση του MMP-9: (Ingenex 80404) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από ακανθοκυτταρικό καρκίνο στόματος.Η έκφραση των μακρομορίων αξιολογήθηκε σε κάθε πλακίδιο με μια ημιποσοτική κλίμακα βαθμολογίας 0-3. Η κλίμακα καθορίστηκε ως εξής: 0 στα δείγματα που εμφάνιζαν ασθενή χρώση σε <5% των κυττάρων κατά οπτικό πεδίο, 1 εάν εμφάνιζαν ασθενή χρώση σε < 75% των κυττάρων κατά οπτικό πεδίο (κ.ο.π.) ή έντονη χρώση σε 5 έως 30% των κυττάρων, 2 αν 30-75% των κυττάρων κ.ο.π. εμφάνιζαν έντονη χρώση ή >75% των κυττάρων ασθενή χρώση και 3 αν >75% των κυττάρων κ.ο.π. εμφάνιζαν έντονη χρώση (στην ανοσοϊστοχημική χρώση με το ειδικό για την κάθε ουσία αντίσωμα.Για τη διερεύνηση συσχέτισης μεταξύ του βαθμού έκφρασης του κάθε μακρομορίου και του είδους του όγκου χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος Fisher’s exact. Σε δεύτερο στάδιο, για να συνεκτιμηθεί τυχόν επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην παραπάνω συσχέτιση, χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης για διατάξιμα δεδομένα (ordinal logistic regression) και εκτιμήθηκε ο σχετικός λόγος συμπληρωματικών πιθανοτήτων (odds ratio, OR) καθώς και το σχετικό 95% διάστημα εμπιστοσύνης (95% CI). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας α=5% και ήταν αμφίπλευροι.Αποτελέσματα: Στη έρευνά μας ανιχνεύθηκαν MMP-2 και MMP-9 στο κυτταρόπλασμα και στα δύο νεοπλάσματα που εξετάσαμε και συγκεκριμένα παρατηρήθηκε κυτταροπλασματική έκφραση του MMP9 τόσο στα πλειόμορφα αδενώματα όσο και στους όγκους Warthin, χωρίς μάλιστα να διαπιστωθεί σημαντική διαφορά στο βαθμό έκφρασης, με την παρατηρούμενη πάντως έκφραση να είναι μέτρια και για τους δύο τύπους όγκων. Παρατηρήθηκε όμως εξαιρετικά σημαντική διαφορά στο βαθμό κυτταροπλασματικής έκφρασης της MMP2 ανάμεσα σε πλειόμορφα αδενώματα και όγκους Warthin, καθώς ο βαθμός έκφρασης ήταν 15 φορές πιθανότερο να είναι μεγαλύτερος σε όγκους Warthin σε σχέση με πλειόμορφα αδενώματα και επομένως διαπιστώνεται μια ισχυρή συσχέτιση της έκφρασης του MMP2 με τον τύπο του καλοήθους όγκους των σιελογόνων αδένων. Είναι η πρώτη φορά που διαπιστώνεται σημαντική διαφορά στην έκφραση του MMP2 ανάμεσα σε αυτούς τους δύο τύπους καλοήθων όγκων.Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε μηδενική πρακτικά έκφραση της οστεοποντίνης σε όγκους Warthin και χαμηλή γενικά αλλά και περιορισμένη σε περίπου 20% του δείγματος στα πλειόμορφα αδενώματα.Παρατηρήθηκε επίσης μηδενική πρακτικά έκφραση του TGFβ1 σε όγκους Warthin και χαμηλή αλλά και περιορισμένη στο περίπου 13% των πλειόμορφων αδενωμάτων του δείγματος. Παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση της ΒΜΡ-2 σε αμφότερους τους όγκους με στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκφραση στους όγκους Warthin. Αυτό το εύρημα καλύπτει το βιβλιογραφικό και ερευνητικό κενό. Έχει παρατηρηθεί υψηλή έκφραση BMP-2 σε πλειόμορφα αδενώματα αλλά όχι και σε άλλους όγκους σιαλογόνων αδένων, αν και έχει μελετηθεί σε κακοήθεις όγκους όπως κυσταδενοκαρκίνωμα αδενοκαρκίνωμα, μυοεπιθηλιακά καρκινώματα, βασικοκυτταρικά καρκινώματα. Συμπεράσματα: 1. Η σημαντικά υψηλότερη έκφραση BMP-2 σε όγκους Wathin σε σύγκριση με πλειόμορφα αδενώματα, αποτελεί ένα καινούργιο στόχο μελλοντικών ερευνών για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου αυτής της πρωτεϊνης στην παθογένεια του συγκεκριμένου καλοήθους όγκου των σιαλογόνων αδένων. 2. Η υψηλότερη έκφραση MMP-2 σε όγκους Warthin σε σχέση με πλειόμορφα αδενώματα υποδηλώνει ότι η MMP-2 πιθανότατα παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων αυτών και επηρεάζει τη βιολογική τους συμπεριφορά. 3. Το χαμηλό επίπεδο έκφρασης τόσο της οστεοποντίνης όσο και του TGFβ1 σε μικρό ποσοστό δειγμάτων πλειόμορφων αδενωμάτων υποδηλώνει ότι τα δύο αυτά μακρομόρια δεν φαίνεται να συμμετέχουν στην παθογένεια των καλοήθων αυτών όγκων των σιαλογόνων αδένων. Εν κατακλείδι, κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης αλλά και του μηχανισμού δράσης των βιολογικών αυτών μακρομορίων, ιδίως της BMP-2, αλλά και της MMP-2, ούτως ώστε να αποσαφηνιστεί ο ρόλος που διαδραματίζουν στην ανάπτυξη, την εξέλιξη και καθορισμό της βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων των σιαλογόνων αδένων, καλοήθων και κακοήθων, με στόχο διαγνωστικές, προγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές.