Μελέτες δομής και αυτοσυγκρότησης αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών ή τμημάτων τους που σχετίζονται με αμυλοειδώσεις
Authors: Τσιολάκη Παρασκευή 
Published: September 2021

Κάτω από μη φυσιολογικές συνθήκες, σφαιρικές υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες αδυνατούν να αποκτήσουν τη φυσιολογική τους στερεοδιάταξη και οδηγούνται σε ένα εναλλακτικό – μη-κανονικό – δίπλωμα της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας στο χώρο. Ως συνέπεια αυτού του γεγονότος, τα μη-φυσιολογικά διπλωμένα πρωτεϊνικά μόρια αυτοσυγκροτούνται είτε σε άμορφα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, είτε σε οργανωμένα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, που εμφανίζουν ορισμένες εξειδικευμένες ιδιότητες και χαρακτηρίζονται ως αμυλοειδή ινίδια. Οι πρωτεΐνες με ‘τάση να δημιουργούν αμυλοειδή ινίδια’ ή ‘αμυλοειδογόνες’ πρωτεΐνες, είτε στη φυσιολογική είτε στη μεταλλαγμένη τους μορφή, προσβάλουν όργανα ή/και ιστούς και εναποτίθενται, σχηματίζοντας είτε εξωκυτταρικές συναθροίσεις (αμυλοειδείς πλάκες) είτε ενδοκυτταρικά έγκλειστα. Σε κάθε περίπτωση, η εναπόθεση των αμυλοειδών ινιδίων οδηγεί στην εμφάνιση μίας ευρείας ομάδας ασθενειών, οι οποίες ονομάζονται αμυλοειδώσεις. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αμυλοειδώσεων αποτελούν οι νευροεκφυλιστικές νόσοι Alzheimer’s και Parkinson’s, οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες και άλλες ασθένειες, όπως ο διαβήτης τύπου ΙΙ ή διάφοροι τύποι καρκίνου. Συνολικά, οι αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες είναι ένα ‘ιδιότυπο’ σύνολο μορίων, που διαφέρουν μεταξύ τους σε επίπεδο ακολουθίας, δομής, αλλά και λειτουργίας. Τουλάχιστον 35 διαφορετικές ανθρώπινες πρωτεΐνες έχει βρεθεί να εναποτίθενται με τη μορφή αμυλοειδών ινιδίων σε ιστούς, ενώ εξελικτικά η δημιουργία τους έχει συσχετιστεί με γενετικές τροποποιήσεις ή/και αλλαγές του μικροπεριβάλλοντος, που επιδρούν στη φυσιολογική διαδικασία διπλώματος των πρωτεϊνών. Το σύνολο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών εμπλουτίζεται συνεχώς, καθώς όλο και περισσότερες πρωτεΐνες, που προηγουμένως δεν είχαν συσχετιστεί με κάποια αμυλοείδωση, εμφανίζουν την τάση να δημιουργούν αμυλοειδή ινίδια in vitro. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε Α) ‘μακροσκοπική’ – υπολογιστική μελέτη στο ετερόκλητο σύνολο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, αλλά και Β) ‘μικροσκοπική’ – πειραματική μελέτη σε επιλεγμένα πρωτεϊνικά συστήματα, στα πλαίσια της αποκρυπτογράφησης των ιδιοτήτων, των μηχανισμών, καθώς και των ιδιαιτεροτήτων των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη δημιουργία αμυλοειδών ινιδίων. Α) Πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα μαρτυρούν την συν-εναπόθεση δύο ή και περισσότερων πρωτεϊνών στις συναθροίσεις αμυλοειδών ινιδίων ασθενών, με άγνωστη όμως μέχρι σήμερα τη συμμετοχή τους στην εξέλιξη των αμυλοειδώσεων. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής το βιολογικό ερώτημα της ‘συνεύρεσης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών’ σε ασθενείς μελετήθηκε μακροσκοπικά με εφαρμογή της θεωρίας γράφων, προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι ιδιότητες των πρωτεϊνών, που σχετίζονται με τη δημιουργία αμυλοειδών ινιδίων σε παθολογικές καταστάσεις, ως σύνολο. Το δίκτυο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών (Amyloid Interactome) που κατασκευάστηκε και οπτικοποιήθηκε υπολογιστικά 1) συσχέτισε ένα σύνολο από λειτουργικά μη-συσχετιζόμενες πρωτεΐνες σε ένα κοινό δίκτυο, 2) αποκάλυψε σημαντικές άμεσες και έμμεσες ‘διασυνδέσεις’ μεταξύ των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών και 3) ανέδειξε ελκυστικούς υποψηφίους για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών τακτικών στη μελέτη των αμυλοειδώσεων. Σύμφωνα με τα όσα γνωρίζουμε μέχρι σήμερα, η προσέγγιση αυτή αποκαλύπτει νέες οδούς επικοινωνίας στην πρωτεϊνική συσσωμάτωση και είναι η πρώτη προσπάθεια μελέτης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών ως ένα ενοποιημένο σύστημα. Αναμένεται ότι τα αποτελέσματα της υπολογιστικής αυτής ανάλυσης θα αξιοποιηθούν σε στοχευμένες πειραματικές προσεγγίσεις στο μέλλον.Β) Στον αντίποδα της συστηματικής ανάλυσης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, η πειραματική προσέγγιση της παρούσας διατριβής εστιάστηκε σε επιλεγμένα ανθρώπινα πρωτεϊνικά μόρια, τόσο επιβεβαιωμένων αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, όσο και πρωτεϊνών με ανεξερεύνητες, μέχρι σήμερα, αμυλοειδογόνες ιδιότητες. Τομή στη μελέτη των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών υπήρξε η πρόταση ότι ο σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων είναι μία εγγενής ιδιότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Έτσι, οι ιδιότητες των αμυλοειδών ινιδίων, οι οποίες αποκαλύπτονται με κατάλληλες μεθοδολογίες, αποτελούν διαγνωστικά κριτήρια για την καταγραφή των κοινών μορφολογικών και δομικών χαρακτηριστικών (cross-β αρχιτεκτονική) των ινιδιακών δομών, που είτε εντοπίζονται σε ασθενείς είτε εμφανίζονται σε μελέτες συσσωμάτωσης in vitro. Η ιδέα ότι μικρές, ‘επιρρεπείς προς συσσωμάτωση’, περιοχές των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, συμμετέχουν ενεργά στον πολυμερισμό τους σε ινίδια και κατ’ επέκταση στην εμφάνιση της αμυλοείδωσης, έστρεψε το ενδιαφέρον μας στη μελέτη τμημάτων των πεπτιδικών αλυσίδων των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, τα οποία πιθανά φέρουν συμπυκνωμένη την πληροφορία της αμυλοειδογονικότητας. Τα μικρά αμυλοειδογόνα τμήματα, που ονομάζονται αμυλοειδογόνοι καθοριστές, εντοπίστηκαν με υπολογιστικές μεθόδους, ενώ η πειραματική επιβεβαίωση των ιδιοτήτων τους πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συνόλου βιοφυσικών μεθόδων (ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης, περίθλαση ακτίνων-Χ, πολωτική μικροσκοπία, φασματοσκοπία υπερερύθρου), σε μεγάλο εύρος συνθηκών. Τέλος, η μελέτη των ιδιοτήτων πολυμερισμού και αυτοσυγκρότησης των αμυλοειδογόνων καθοριστών επέτρεψε την πρόταση πιθανών τρισδιάστατων μοντέλων πολυμερισμού, των υπό μελέτη πρωτεϊνικών συστημάτων. Οι πειραματικές μελέτες σε επιβεβαιωμένες αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες:-Η κυστατίνη C, η πρώτη αμυλοειδογόνος πρωτεΐνη που μελετήθηκε πειραματικά στα πλαίσια της διατριβής, είναι υπεύθυνη για μία σπάνια μορφή αμυλοείδωσης, που ονομάζεται εγκεφαλική αγγειοπάθεια Ισλανδικού τύπου, ενώ αποδεικνύεται ότι αυτοσυγκροτείται σε ολιγομερή, ακολουθώντας ένα πολύπλοκο μηχανισμό πολυμερισμού. Προκειμένου να εντοπίσουμε τμήματα της πρωτεΐνης με υψηλό αμυλοειδογόνο δυναμικό, τρεις πιθανοί αμυλοειδογόνοι καθοριστές της κυστατίνης C μελετήθηκαν πειραματικά και αξιολογήθηκε ο ρόλος τους στην αυτοσυγκρότηση της πρωτεΐνης. Η επιβεβαίωση της εγγενούς αμυλοειδογονικότητας των καθοριστών της κυστατίνης C μας οδήγησε στην πρόταση δύο πιθανών μοντέλων πολυμερισμού και αυτοσυγκρότησης, τα οποία εμπλέκουν τα μικρά αμυλοειδογόνα τμήματα και προτείνουν την ενεργή συμμετοχή τους στον cross-β πυρήνα των ινιδίων της ανθρώπινης κυστατίνης C.-Η ραγδαία αυτοσυγκρότηση της αμυλίνης που ευθύνεται για την πρόκληση του διαβήτη τύπου ΙΙ, υπήρξε το δεύτερο πεδίο πειραματικής μελέτης της διατριβής. Παρότι, η πεπτιδική αλυσίδα της αμυλίνης φέρει υψηλή αμυλοειδογονικότητα, η εκτενής ανάλυση των βιβλιογραφικών δεδομένων απέδειξε ότι το αμινοτελικό (N-terminal) και καρβοξυτελικό (C-terminal) τμήμα της, είναι δύο περιοχές στις οποίες δεν έχει πραγματοποιηθεί στοχευμένη και συστηματική μελέτη. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής εντοπίστηκαν αμυλοειδογόνοι καθοριστές στα ελλιπώς μελετημένα ακραία τμήματα της ορμόνης, ενώ παράλληλα σχεδιάστηκαν ομάδες μεταλλαγμένων αμυλοειδογόνων καθοριστών, των τμημάτων αυτών. Οι βιοφυσικές μέθοδοι κατέγραψαν τις ιδιότητες όλων των πεπτιδίων και τέλος, οι μελέτες συνδυαστικής επώασης με της αμυλίνης με τα υπό μελέτη πεπτίδια συνέβαλαν καθοριστικά στη μελέτη της συνεισφοράς του αμινοτελικού και του καρβοξυτελικού τμήματος στην αυτοσυγκρότηση της αμυλίνης. Συνολικά, η πειραματική προσέγγιση στην αμυλοειδογόνο ορμόνη αμυλίνη συνετέλεσε στην εξαγωγή σημαντικών συμπερασμάτων που σχετίζονται με τον πολυμερισμό της ορμόνης και μπορεί να επιτρέψουν στο μέλλον τη στοχευμένη σχεδίαση πεπτιδίων-αναστολέων της αμυλοειδογονικότητας της.Οι πειραματικές μελέτες σε πρωτεΐνες με ανεξερεύνητες αμυλοειδογόνες ιδιότητες:-Το C-πεπτίδιο της προϊνσουλίνης ή C-πεπτίδιο, ένα μόριο 31 αμινοξικών καταλοίπων, ήταν για πολλά χρόνια μία ξεχασμένη παράμετρος στις μελέτες που αφορούσαν την ινσουλίνη. Η εμπλοκή του C-πεπτιδίου στο διαβήτη υπήρξε το έναυσμα για τη σε βάθος μελέτη των ανεξερεύνητων ιδιοτήτων αυτοσυγκρότησης του πεπτιδίου. Ωστόσο, τo εξαιρετικά ασθενές αμυλοειδογόνο προφίλ του δεν επέτρεψε τον εντοπισμό μικρών αμυλοειδογόνων τμημάτων κατά μήκος της αλληλουχίας του και έτσι, στο συγκεκριμένο σύστημα μελέτης πραγματοποιήθηκαν πειράματα αυτοσυγκρότησης στην πλήρη ακολουθία του C-πεπτιδίου. Οι βιοφυσικές μελέτες, στα πλαίσια της διατριβής, αποκάλυψαν για πρώτη φορά την ικανότητά του C-πεπτιδίου να οργανώνεται σε ινιδιακές δομές, που πληρούν τα κριτήρια των αμυλοειδών ινιδίων, ενώ ταυτόχρονα, τμήματα του πεπτιδίου που αποτελούν αλληλουχίες-χαμαιλέοντες επέτρεψαν την πρόταση ενός πιθανού μοντέλου που καταγράφει το μονοπάτι της τρισδιάστασης αυτοσυγκρότησής του.-Η κλαστερίνη, μία σημαντική ετεροδιμερής πρωτεΐνη-συνοδός, που συνεντοπίζεται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις ασθενών με νευροεκφυλιστικές νόσους, αποτελεί ένα ακόμα σύστημα μελέτης με ανεξευρεύνητες αμυλοειδογόνες ιδιότητες. Η εγγενής μη-δομημένη φύση της κλαστερίνης, σε συνδυασμό με την ικανότητά της να αλληλεπιδρά ειδικά με ένα μεγάλο εύρος αμυλοειδογόνων μορίων μας ώθησε στη διεξοδική μελέτη της αμυλοειδογονικότητάς της. Η α-αλυσίδα της κλαστερίνης, η οποία φέρει σημαντικούς επιτόπους αλληλεπίδρασης με αμυλοειδογόνα μόρια, αναλύθηκε υπολογιστικά και τα πέντε πιθανά αμυλοειδογόνα τμήματα που εντοπίστηκαν σε αυτή, επιβεβαιώθηκαν πειραματικά με βιοφυσικές μεθόδους, ως αμυλοειδογόνοι καθοριστές. Η αναγνώριση των καθοριστών στην α-αλυσίδα της κλαστερίνης ανέδειξε δυνητικούς αναστολείς στις νευροεκφυλιστικές νόσους, καθώς αναμένεται ότι με τον κατάλληλο σχεδιασμό πεπτιδίων-αναστολέων που αλληλεπιδρούν ειδικά με την κλαστερίνη, μπορεί κανείς να ανακόψει την εξέλιξη του πολυμερισμού άλλων αμυλοειδογόνων μορίων που αλληλεπιδρούν με αυτή. -Τέλος, η στεφίνη Α, ένα συγγενικό μόριο της αμυλοειδογόνου κυστατίνης C, ακολουθεί παρόμοιο μονοπάτι πολυμερισμού, ωστόσο, δεν έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα ως αμυλοειδογόνο πρωτεϊνικό μόριο. Η στεφίνη Α δρα φυσιολογικά ως ενδοκυτταρικός αναστολέας πρωτεασών, ενώ τα ενδοκυτταρικά μη-φυσιολογικά ολιγομερή της παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον σε διάφορους τύπους καρκίνων. Στα πλαίσια διερεύνησης του αμυλοειδογόνου δυναμικού της πρωτεΐνης αναγνωρίστηκαν τέσσερις μικροί αμυλοειδογόνοι καθοριστές, οι οποίοι μελετήθηκαν πειραματικά. Ο εντοπισμός τμημάτων με αμυλοειδογόνα χαρακτηριστικά στη στεφίνη Α μπορεί να εξυπηρετήσει στη μελλοντική διερεύνηση ενός πιθανού μηχανισμού συσσωμάτωσης ολόκληρης της πρωτεΐνης σε αμυλοειδή ινίδια, με μηχανισμούς που ομοιάζουν σε εκείνους της αμυλοειδογόνου κυστατίνης C.