Biorefinery development using winery waste streams processed via novel lignocellulose pretreatment technologies and industrial fermentations for the production of bioeconomy products
Authors: Φιλιππή Αικατερίνη 
Published: October 2023

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της δυνατότητας ανάπτυξης ενός ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου, χρησιμοποιώντας παράπλευρα ρεύματα που προκύπτουν από τη διαδικασία οινοποίησης (στέμφυλα, βόστρυχοι και οινολάσπη) για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας και χημικών ουσιών, χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνολογίες προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας. Η μελέτη ξεκίνησε με την ανάλυση της σύστασης στεμφύλων και βοστρύχων που προέκυψαν από την οινοποίηση της ποικιλίας Αγιωργίτικο. Αρχικά, τα στέμφυλα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση με νερό για την παραλαβή των ελεύθερων σακχάρων, ενώ ακολούθησε εκχύλιση με αιθανόλη και εξάνιο για παραλαβή των φαινολικών ουσιών και ελαίων αντίστοιχα. Τα υπολειπόμενα στερεά αναμίχθηκαν με βοστρύχους (αναλογία 1:1) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% (w/v) NaOH στους 100°C για 3 ώρες με στόχο την απομάκρυνση της λιγνίνης. Τα εναπομείναντα στερεά υδρολύθηκαν με χρήση διαφορετικών συγκεντρώσεων H2SO4 (3, 5, 7%, ν/ν) στους 120°C για 40 λεπτά, με σκοπό την υδρόλυση της ημικυτταρίνης. Στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε ενζυμική υδρόλυση χρησιμοποιώντας διαφορετικές αναλογίες κυτταρινασών και β-γλυκοσιδάσης που οδήγησε στην παραγωγή 22,7 g γλυκόζης ανά 100 g εναπομείναντων στερεών (48% υδρόλυση γλυκάνης). Το υδρόλυμα χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα σε ζυμώσεις με το βακτηριακό στέλεχος Actinobacillus succinogenes για παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η πηγή άνθρακα στην αρχή κάθε ζύμωσης ήταν υδρόλυμα ενώ η τροφοδοσία αποτελούνταν από ελεύθερα σάκχαρα στεμφύλων και προσθήκη εκχυλίσματος ζύμης. Με χρήση αυτών, επιτεύχθηκε η υψηλότερη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος (40,2 g/L) με απόδοση 0,67 g/g και παραγωγικότητα 0,79 g/(L·h). Έτσι αποδεικνύεται ότι τα στέμφυλα και οι βόστρυχοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος και άλλων προϊόντων προστιθέμενης αξίας, προτείνοντας με αυτό τον τρόπο μια βιώσιμη διαδικασία για την αξιοποίηση των αποβλήτων οινοποιείων. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένα πρότυπο βιοδιυλιστήριο με χρήση αποβλήτων οινοποιείων που προέρχονται από τέσσερις ελληνικές ποικιλίες οινοποίησης. Τα στέμφυλα αναμίχθηκαν και βελτιστοποιήθηκε ο διαχωρισμός διαφορετικών κλασμάτων. Αρχικά τα ελεύθερα σάκχαρα (12,3 g ανά 100 g) χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα προς παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνη με χρήση του βακτηριακού στελέχους Komagateibacter sucrofermentans. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση του ελαίου με γαλακτικό αιθυλεστέρα, έναν πιο φιλικό προς το περιβάλλον διαλύτη συγκριτικά με το συμβατικά χρησιμοποιούμενο εξάνιο. Επιτεύχθηκε ανάκτηση ελαίου 35,7%, ενώ σύμφωνα με τη σύσταση των λιπαρών οξέων το έλαιο ήταν πλούσιο σε λινελαϊκό οξύ. Οι φαινολικές ενώσεις που περιέχονταν στα υπολειπόμενα στερεά εκχυλίστηκαν με αιθανόλη σε διαφορετικές αναλογίες στερεού προς διαλύτη. Έπειτα, τα υπόλοιπα στερεά αναμίχθηκαν με βόστρυχους και υποβλήθηκαν σε απολιγνινοποίηση με ΝαΟΗ, διεργασία η οποία βελτιστοποιήθηκε με χρήση πειραματικού σχεδιασμού. Η χρήση της βέλτιστης συγκέντρωσης NaOH (1,19% w/v), της θερμοκρασίας (70°C) και της διάρκειας (30 λεπτά) είχε ως αποτέλεσμα τη μέγιστη απομάκρυνση λιγνίνης (50,8%) και χαμηλές απώλειες σε ημικυτταρίνη (29,8%) και κυτταρίνη (23,6%). Το πλούσιο σε λιγνίνη και ταννίνες ρεύμα που προέκυψε από το υγρό μετά την απολιγνινοποίηση υποβλήθηκε σε ανάλυση του αριθμού Stiasny (76%), ενώ το στερεό κλάσμα υποβλήθηκε σε ενζυμική υδρόλυση για την παραγωγή ενός πλούσιου σε σάκχαρα υδρολύματος (40,3 g/L σάκχαρα). Παράλληλα, αιθανόλη, αντιοξειδωτικά και τρυγικό οξύ ανακτήθηκαν από την οινολάσπη. Η περιεχόμενη στην οινολάσπη πρωτεΐνη υδρολύθηκε ενζυμικά για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή αζώτου σε βακτηριακές ζυμώσεις. Τα υδρολύματα που προέκυψαν συνδυάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος (SA), από το οποίο παράχθηκαν 24,9 g/L ηλεκτρικού οξέος σε ζύμωση ασυνεχούς λειτουργίας και 37,2 g/L σε ημισυνεχούς λειτουργίας ζύμωση. Τέλος, το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο καταλήγει στην παραγωγή 42,65 g βακτηριακής κυτταρίνης, 24,3 g ελαίου, 40,3 g εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινολικά (με 1,41 δείκτη αντιοξειδωτικής ικανότητας), 40,1 g αιθανόλης, 624,8 g εκχυλίσματος ταννινών, 20,0 g τρυγικού οξέος και 157,8 g ηλεκτρικού οξέος. Σε επόμενο στάδιο αυτής της μελέτης, εύτηκτοι διαλύτες (DES) χρησιμοποιήθηκαν για την επεξεργασία στεμφύλων και βοστρύχων στα πλαίσια του βιοδιυλιστηρίου. Τέσσερα διαλύματα DES που παρήχθησαν με χρήση χλωριούχου χολίνης (ChCl) ως δέκτη δεσμού υδρογόνου και τέσσερα καρβοξυλικά οξέα ως δότες δεσμών υδρογόνου, συγκεκριμένα μυρμηκικό οξύ, οξικό οξύ, γαλακτικό οξύ (LA) και οξαλικό οξύ, αξιολογήθηκαν λαμβάνοντας υπόψιν την αποτελεσματικότητα τους στην απομάκρυνση της λιγνίνης, στην ενζυμική υδρόλυση των πολυσακχαριτών σε πεντόζες και εξόζες και τέλος στην ικανότητα ανακύκλωσης και επαναχρησιμοποίησης του διαλύτη. Η επεξεργασία με το διαλύτη ChCl:LA, (1:10 αναλογία κατά mol), στους 120°C για 1 ώρα, οδήγησε σε 40% απομάκρυνση λιγνίνης ενώ ήταν αποδοτικός για τέσσερις κύκλους επεξεργασίας. Η ενζυμική υδρόλυση των υπολειπόμενων στερεών μετά τον πρώτο κύκλο προεπεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα απόδοση μετατροπής γλυκάνης και ημικυτταρίνης ίση με 92,7% και 36,6%, αντίστοιχα. Το υδρόλυμα που παράχθηκε χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα σε ασυνεχούς λειτουργίας καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα με το βακτηριακό στέλεχος Actinobacillus succinogenes και οδήγησε στην παραγωγή 36 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 0,62 gSA/g ολικών σακχάρων και παραγωγικότητα 0,65 g/(L·h). Χρησιμοποιώντας 2 κιλά στεμφύλων και βοστρύχων, το ηλεκτρικό οξύ που θα μπορούσε να παραχθεί σε πέντε διαδοχικούς κύκλους επεξεργασίας με DES ήταν 200,8 g, 208 g, 204,9 g, 184,5 g και 94,3 g. Στο τελευταίο μέρος της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκε ψυχρό πλάσμα εκκένωσης διηλεκτρικού φραγμού (DBD) με σκοπό μια πιο αειφόρα προεπεξεργασία λιγνοκυτταρινικούχας βιομάζας, καθώς δεν απαιτείται η χρήση χημικών ουσιών, υψηλών θερμοκρασιών και πιέσεων όπως στην περίπτωση συμβατικών θερμοχημικών διεργασιών επεξεργασίας λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας. Σε αυτό το πλαίσιο, διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της προεπεξεργασίας βοστρύχων με ψυχρό πλάσμα εκκένωσης διηλεκτρικού φραγμού με σκοπό την παραγωγή υδρολύματος ως θρεπτικό μέσο για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος με τον μικροοργανισμό A. succinogenes. Στα πλαίσια αυτού, αξιολογήθηκε η επίδραση διαφορετικών παραμέτρων λειτουργίας του ψυχρού DBD πλάσματος με χρήση αέρα (π.χ. μέγεθος σωματιδίων βοστρύχων, αερισμός, διάρκεια προεπεξεργασίας, κύκλος λειτουργίας, αρχική συγκέντρωση στερεών). Η προεπεξεργασία με 150 g/L βοστρύχων (<0,25 mm μέγεθος σωματιδίων) για 60 λεπτά, 20% κύκλο λειτουργίας και αερισμό 2,5 vvm οδήγησε σε απόδοση ενζυμικής υδρόλυσης γλυκάνης και ημικυτταρίνης 85,2% και 50,4%, αντίστοιχα, που ήταν δύο φορές και 3,3 φορές μεγαλύτερη από την απόδοση υδρόλυσης που επιτυγχάνεται χωρίς προεπεξεργασία του στερεού. Πρόσθετο πλεονεκτήματα της επεξεργασίας με πλάσμα αέρα DBD ήταν η επιτυχή χρήση τόσο στερεών όσο και υγρών κλασμάτων στην ενζυμική υδρόλυση και η δυνατότητα επίτευξης ταυτόχρονης προεπεξεργασίας και αποστείρωσης. Το υδρόλυμα βοστρύχων που παρήχθη χρησιμοποιήθηκε σε καλλιέργειες με το βακτηριακό στέλεχος A. succinogenes καταλήγοντας στην παραγωγή 37,1 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 0,68 gSA/g ολικών σακχάρων και 0,65 g/(L·h) παραγωγικότητα. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν παρόμοια με αυτά που επιτεύχθηκαν μετά τη ζύμωση με χρήση εμπορικής πηγής άνθρακα αποδεικνύοντας της αποτελεσματικότητα της διεργασίας.