Μελέτη διαγονιδιακών μυών που εκφράζουν την αγρίου τύπου hGDH2 (WT-hGDH2)
Authors: Πετράκη Ζωή 
Published: September 2021

Η γλουταμική αφυδρογονάση των θηλαστικών είναι ένα μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αντιστρεπτή οξειδωτική απαμίνωση του γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό και αμμωνία, χρησιμοποιώντας ως συνένζυμο το NAD+/NADP+. Απαντάται σε όλους τους οργανισμούς και έχει σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό, τόσο σε καταβολικές όσο και σε αναβολικές βιοσυνθετικές διεργασίες. Σε αντίθεση με τα περισσότερα είδη θηλαστικών που διαθέτουν μία GDH (hGDH1 στον άνθρωπο) που εκφράζεται σε όλους του ιστούς, ο άνθρωπος και κάποια πρωτεύοντα έχουν αποκτήσει, μέσω ρετρομετάθεσης του GLUD1 γονιδίου στο χρωμόσωμα Χ, ένα δεύτερο ισοένζυμο (hGDH2) με διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης και ιστο-ειδική έκφραση. Το γονίδιο της GLUD2 εξελίχθηκε ταχέως υπό την πίεση της φυσικής επιλογής και απέκτησε μία σειρά από αμινοξικές αλλαγές, επιτρέποντας στην hGDH2 να λειτουργεί σε συνθήκες ανασταλτικές για την hGDH1. Οι μοναδικές ιδιότητες της hGDH2 θωρείται πως επέτρεψαν την προσαρμογή του ενζύμου στις υψηλές ενεργειακές απαιτήσεις του νευρικού συστήματος και στις ειδικές ανάγκες των άλλων ιστών. Η hGDH2 στον άνθρωπο εκφράζεται, μαζί με την hGDH1, στον ανθρώπινο εγκέφαλο, τους νεφρούς, τους όρχεις και τα στεροειδοπαραγωγά όργανα, αλλά δεν εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στο ήπαρ. Με σκοπό να κατανοήσουμε τον ρόλο της hGDH2 στη βιολογία του ανθρώπινου οργανισμού, δημιουργήσαμε ένα διαγονιδιακό ζωικό πειραματικό μοντέλο μυός που εκφράζει την αγρίου τύπου hGDH2 μαζί με την ενδογενή mGDH. Μελέτες διπλού ανοσοφθορισμού σε τομές περιφερικών ιστών και εγκεφάλου διαγονιδιακών ζώων, αποκάλυψαν πως η διαγονιδιακή hGDH2 πρωτεΐνη παρουσιάζει πρότυπο έκφρασης που δεν διαφοροποιείται από αυτό του ανθρώπου. Με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων διαπιστώσαμε ότι η hGDH2 εκφράζεται στα κύτταρα Sertoli του όρχεως των διαγονιδιακών ζώων στα οποία η mGDH απουσιάζει ακριβώς όπως και στον άνθρωπο. Εκφράζεται επίσης μαζί με την ενδογενή mGDH στην πλειονότητα των υπολοίπων περιφερικών ιστών καθώς και στα β-κύτταρα του παγκρέατος των διαγονιδιακών ζώων. Με έναυσμα αυτές τις παρατηρήσεις, μελετήσαμε αν η έκφραση του διαγονιδίου επηρεάζει τον ομοιοστατικό μηχανισμό της γλυκόζης και διαπιστώσαμε πως τα επίπεδα γλυκόζης νηστείας των διαγονιδιακών ζώων ήταν σημαντικά χαμηλότερα έναντι των αγρίου τύπου ζώων (Τg: 95% CI: 90.6-96.8 mg/dL; N=26, WT:95% CI: 136.2-151.4 mg/dL; N=23; p<0.0001), προσεγγίζοντας τις φυσιολογικές τιμές γλυκόζης νηστείας των υγιή ενήλικων ανθρώπων. Τα επίπεδα ινσουλίνης ορού νηστείας των διαγονιδιακών ζώων ήταν 2.6 φορές μεγαλύτερα (mean±SD: 1.63±0.15 ng/ml; N=12) σε σχέση με τα αντίστοιχα επίπεδα των αγρίου τύπου ζώων (0.63±0.05 ng/ml; N=12; p=0.0001). Η αύξηση των επιπέδων ινσουλίνης μετά από φόρτιση με γλυκόζη (1 mg/g,i.p.) ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των διαγονιδιακών και αγρίου τύπου ζώων υποδηλώνοντας πως η έκφραση της διαγονιδιακής hGDH2 πρωτεΐνης δεν επηρέασε την γλυκοζο-εξαρτώμενη έκφραση ινσουλίνης. Η φόρτιση με το αμινοξύ L-λευκίνη (0.25 mg/g) είχε ως αποτέλεσμα τον διπλασιασμό των τιμών των επιπέδων ινσουλίνης των αγρίου ζώων, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στα ήδη υψηλές τιμές των επιπέδων ινσουλίνης των διαγονιδιακών ζώων, υποδηλώνοντας πως οι υψηλές συγκεντρώσεις του ADP που επικρατούν στα β-κύτταρα σε συνθήκες νηστείας έχουν ως αποτέλεσμα την μέγιστη ενεργοποίηση της hGDH2, οπότε και δεν επιτυγχάνεται περαιτέρω ενεργοποίηση παρά την προσθήκη ενός αλλοστερικού ενεργοποιητή. Παράλληλα η ύπαρξη του GLUD2 διαγονιδίου φαίνεται να προστατεύει τα διαγονιδιακά ζώα από την ανάπτυξη διαβήτη και παχυσαρκίας με το γήρας. Η έκφραση της hGDH2 στον εγκέφαλο ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρείται στον άνθρωπο. Η διαγονιδιακή πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στα αστροκύτταρα κατά μήκος των αποφυάδων τους και των ποδίσκων τους γύρω από τα αγγεία, σε ένα υποσύνολο νευρώνων με πυραμιδική μορφολογία και κυρίως στο νευροπίλημα. Σε αντίθεση με τον άνθρωπο, διαπιστώθηκε έκφραση της hGDH2 στα ολιγοδενδροκύτταρα. Τα αποτελέσματα των συμπεριφορικών μελετών δεν ανέδειξαν σημαντικές διαφορές στις δοκιμασίες κινητικότητας και χωρικής ή αναγνωριστικής μνήμης. Εντούτοις, τα διαγονιδιακά ζώα εμφάνιζαν σημαντικά μεγαλύτερη ευαισθησία στον πόνο και αυξημένα επίπεδα άγχους. Η λεπτή μορφολογική μελέτη του εγκεφάλου με τη χρώση Golgi-Cox, αποκάλυψε πως η έκφραση της διαγονιδιακής πρωτεΐνης στον εγκέφαλο των διαγονιδιακών ζώων σχετίζεται με αυξημένο αριθμό ώριμων δενδριτικών ακάνθων στον ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο λοβό, περιοχές με πλούσια γλουταματεργική νευροδιαβίβαση. Συμπερασματικά, το GLUD2 διαγονιδιακό μοντέλο ζώου θα μπορούσε να θεωρηθεί εξανθρωποποιημένο με βάση το πρότυπο έκφρασης του. Η χαρτογράφηση του φαινοτύπου μέχρι στιγμής, υποστηρίζει ότι η hGDH2 έχει εξελιχθεί με τέτοιο τρόπο, ώστε να λειτουργεί συμπληρωματικά της hGDH1 στους ιστούς στους οποίους εκφράζεται, με σκοπό την βέλτιστη εξυπηρέτηση των ειδικών αναγκών του καθενός. Υπό αυτό το πρίσμα, η έκφρασή της στο πάγκρεας είχε ως αποτέλεσμα την διασφάλιση, σε συνθήκες νηστείας, μια μικρού εύρους ευγλυκαιμίας, παρόμοιας με εκείνη του ανθρώπου. Φαίνεται επίσης να ασκεί προστατευτική δράση απέναντι στην ανάπτυξη διαβήτη και παχυσαρκίας κατά το γήρας. Τα πρώτα δεδομένα της επίδρασης της έκφρασης του διαγονιδίου στο κεντρικό νευρικό σύστημα υποδηλώνουν ότι η παρουσία του διαγονιδίου οδήγησε σε αύξηση των ώριμων δενδριτικών ακάνθων σε περιοχές με πλούσια γλουταματεργική νευροδιαβίβαση όπως ο ιππόκαμπος και ο προμετωπιαίος λοβός. Αν αυτό σημαίνει ότι αυξήθηκε η συναπτογένεση και μέσω αυτής ενισχύθηκε η γλουταματεργική νευροδιαβίβαση μέσω της οποίας διαμεσολαβούνται οι τόσο εξελιγμένες γνωστικές λειτουργίες του ανθρώπου μένει να αποδειχτεί σε μελλοντικές μελέτες.