Estudio de los efectos de la actividad constitutiva del receptor de dopamina tipo 1 (D1R) sobre los canales de calcio operados por voltaje (CaV) y su rol en neuronas de la corteza prefrontal
Authors:   , McCarthy Clara Inés 
Published: August 2022

Las neuronas de la corteza prefrontal (CPF) tienen una abundante inervación dopaminérgica y expresan altos niveles de receptores para dopamina. Numerosas evidencias sostienen que desbalances tanto en la sensibilidad a dopamina como en el nivel de expresión del receptor de dopamina tipo 1 (D1R) en la CPF contribuyen a la fisiopatología de enfermedades psiquiátricas como esquizofrenia y al deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. Por otro lado, mediante ensayos in vitro reportó que D1R posee actividad constitutiva, es decir, que adquiere una conformación activa en ausencia de agonista. Una estrategia para estudiar la actividad constitutiva de los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) es la aplicación de agonistas inversos, ligandos que reducen su señalización en ausencia de agonista. En particular para el D1R no se conocen aún agonistas inversos endógenos, pero se descubrió mediante ensayos in vitro que distintos fármacos antipsicóticos, originalmente descriptos como antagonistas del receptor D2R, funcionan como agonistas inversos de los receptores tipo-D1R (D1R y D5R). Los canales de calcio operados por voltaje (CaV) son proteínas que controlan el ingreso de calcio extracelular y son críticas para muchas funciones neuronales, por lo que se encuentran estrictamente reguladas. En general, se observó que muchos CaV son particularmente sensibles tanto a la actividad evocada por agonista como a la constitutiva de los GPCRs. En este sentido, se reportó que D1R interacciona físicamente con el subtipo CaV2.2, favoreciendo su tráfico hacia la membrana postsináptica de neuronas piramidales presentes en la capa 5/6 de la CPF medial (CPFm). En este trabajo de tesis estudiamos el efecto de la actividad constitutiva de los receptores tipo-D1R en las conductancias CaV nativas y su impacto funcional en neuronas piramidales de la CPFm de ratón. Utilizamos clorpromazina, un antipsicótico y agonista inverso de los receptores tipo-D1R, administrada in vitro e in vivo para modular la actividad constitutiva de estos receptores. Acompañamos los experimentos en neuronas ex vivo de la CPFm con ensayos en un sistema de expresión heteróloga para evaluar la sensibilidad de cada subtipo de CaV a la actividad basal de D1R, el receptor tipo-D1R más abundante en la CPFm. En el primer capítulo de resultados, mostramos que clorpromazina reduce las corrientes CaV evocadas a altos voltajes (HVA) en neuronas piramidales de la CPFm, mediante dos mecanismos diferentes: uno que involucra a la actividad basal de los tipo-D1R y reduce las corrientes CaV2.2, y otro que inhibe las corrientes CaV1 en forma independiente de la actividad constitutiva de los tipo-D1R. En el segundo capítulo de resultados, mostramos que la coexpresión de D1R tiene un efecto dual sobre las corrientes CaV2.2 recombinantes. Por un lado, la actividad constitutiva de D1R aumenta la amplitud de las corrientes CaV2.2 como consecuencia de una mayor densidad de canales funcionales en la membrana plasmática, y este efecto dependería tanto de la interacción física entre el loop 2 de D1R y la región C-terminal de CaV2.2, así como de la presencia de la proteína Gs activa en forma crónica. Por otro lado, demostramos que el efecto inhibitorio sobre los CaV2.2 en células que expresan elevadas concentraciones de D1R no se debe a su actividad constitutiva y planteamos la posibilidad de que esté relacionado a la formación de dímeros entre receptores D1R. Finalmente, en el tercer capítulo de resultados mostramos que la actividad evocada por agonista y la actividad constitutiva de D1R presentan efectos opuestos sobre las corrientes CaV2.2. Encontramos que modular la actividad constitutiva de los receptores tipo-D1R in vivo redujo la sensibilidad de las corrientes CaV HVA nativas al agonista específico tipo-D1R, SKF38393. Este resultado sugiere que el grado de actividad constitutiva de los tipo-D1R influye sobre los efectos de su actividad evocada, aunque no logramos observar estas diferencias en células HEK293T transfectadas. Adicionalmente, demostramos que clorpromazina reduce en forma crónica las corrientes postsinápticas excitatorias, mientras que SKF38393 las facilita en forma aguda; y observamos una tendencia a que clorpromazina aumente las corrientes postsinápticas inhibitorias, generando un desbalance excitatorio/inhibitorio en las neuronas piramidales de la CPFm. En conjunto, nuestros datos nos permiten proponer que la actividad constitutiva de los receptores tipo-D1R tiene un rol fisiológico en la CPFm, aumentando la expresión de CaV2.2 en la postsinapsis y favoreciendo un mayor ingreso de calcio que podría impactar en la neurotransmisión excitatoria.