Μελέτη συζευγμάτων σακχαριτών με πεπτίδια
Authors: Γκίκα Αρετή 
Published: January 2024

Η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια, φλεγμονώδης, ανοσολογικά ελεγχόμενη νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) η οποία χαρακτηρίζεται από καταστροφή της μυελίνης. Η μυελίνη είναι μια εξαιρετικά εξειδικευμένη, συμπαγής πολυστρωματική μεμβράνη, η οποία τυλίγεται γύρω από τους άξονες των νευρόνων σχηματίζοντας το έλυτρο μυελίνης και βοηθώντας στη γρήγορη μετάδοση των νευρικών ερεθισμάτων. Μελέτες έχουν δείξει ότι η μυελινική γλυκοπρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG), παρότι αποτελεί δευτερεύον συστατικό της μυελίνης, αποτελεί σημαντικό αυτοαντιγόνο στην εμφάνιση της ΣΚΠ και της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), το ζωικό πειραματικό μοντέλο για τις απομυελινωτικές νόσους. Συγκεκριμένα, ο επίτοπος 35-55 της MOG πρωτεΐνης είναι το κυρίαρχο αντιγόνο το οποίο προκαλεί της εμφάνιση της ΕΑΕ στα πειραματόζωα και αποτελεί στόχο ανoσολογικών αποκρίσεων στη ΣΚΠ, επάγοντας την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων.Η ανάπτυξη συζευγμάτων πεπτιδίων με σάκχαρα με σκοπό να στοχεύσουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι μία συνηθισμένη τεχνική στην ανάπτυξη νέων καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η μαννάνη (πολυμανόζη, από τη ζύμη Saccharomyces Cerevisiae), χρησιμοποιείται ευρέως για τη μεταφορά πρωτεϊνών και πεπτιδίων στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, αφού στοχεύει τον υποδοχέα μανόζης των κυττάρων αυτών. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο επίτοπος 35-55 της MOG πρωτεΐνης συζευγμένος με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη στην οξειδωμένη του μορφή, μέσω μιας γέφυρας [Lys-Gly]5, μπορεί να τροποποιήσει την ανοσολογική απόκριση της ΕΑΕ και να προστατεύσει τα ποντίκια από την εμφάνιση συμπτωμάτων της νόσου. Η ενδελεχής μελέτη του εν λόγω συζεύγματος και των χημικών χαρακτηριστικών της αντίδρασης σύζευξης καθώς επίσης και η εύρεση μίας κατάλληλης μεθόδου για την αναγνώριση του MOG35-55 πεπτιδίου συζευγμένο με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη που θα χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των πιθανών τροποποιήσεων του πεπτιδίου κατά τη δημιουργία του συζεύγματος καθώς και για τη μελέτη της σταθερότητας των συντεθειμένων συζευγμάτων, αποτελούν σημαντικούς στόχους, οι οποίοι αναπτύχθηκαν στη παρούσα διδακτορική διατριβή. Η μελέτη των συζευγμάτων έγινε με δύο τρόπους. Η πρώτη προσέγγιση αφορά τη μελέτη του συζεύγματος αυτού και των συστατικών του με ΠυρηνικόΜαγνητικό Συντονισμό (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) μίας (1H, 13C) και δύο διαστάσεων (2DCOSY, 2D ROESY, 2D TOCSY, 2D HSQC και 2D HMBC). Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκαν δείγματα μανόζης, μαννάνης, οξειδωμένης μαννάνης και συζεύγματος οξειδωμένης μαννάνης με το πεπτιδικό ανάλογο [KG]5MOG35-55. Μέσω της μελέτης NMR πραγματοποιήθηκε: i) η ανάλυση της δομής των δειγμάτων που αναφέρθηκαν, ii) ο έλεγχος του σχηματισμού αλδεϋδομάδων κατά την αντίδραση οξειδωτικής διάσπασης του πολυσακχαρίτη, iii) ο υπολογισμός του ποσοστού οξείδωσης και iv) ο έλεγχος του σχηματισμού βάσεων Schiff στο σύζευγμα. Η δεύτερη προσέγγιση αφορά την ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για τη μελέτη της σταθερότητας των συντεθειμένων συζευγμάτων και για την παρακολούθηση πιθανών τροποποιήσεων που δύναται να υποστούν. Για τον σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μεθοδολογία ανταγωνιστικής ELISA με βάση τον επίτοπο [KG]5MOG35-55 και παράχθηκαν (από την Davids Biotechnologies) πολυκλωνικά αντισώματα κατά του MOG36-55 μέσω ανοσοποίησης κουνελιών. Η μέθοδος ελέγχθηκε ως προς την ακρίβεια και την επαναληψιμότητά της, αλλά και ως προς την πιθανότητα λανθασμένης δραστικότητάς της με μόρια διαφορετικά του αντιγόνου. Ακολούθησε η μελέτη της σταθερότητας του συζεύγματος κατά την αποθήκευση του. Επιπλέον μέσω της μεθοδολογίας ELISA έγινε παρακολούθηση πιθανών τροποποιήσεων τους συζεύγματος. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν μετατροπές οι οποίες μπορούν να συμβούν στον επίτοπο α) είτε κατά τη σύζευξη με τη μαννάνη σε βασικό pH 9,0, όπως η απαμίδωση της Asn σε Asp και iso-Asp, β) είτε κατά την πεπτιδική σύνθεση με την Fmoc/tBu μεθοδολογία, όπου υπό τις όξινες συνθήκες κατά την επεξεργασία με TFA, η μεθειονίνη μπορεί να οξειδωθεί στο αντίστοιχο σουλφοξείδιο, γ) είτε in vivo, όπως για παράδειγμα η μετατροπή των καταλοίπων Arg σε Cit από τη δράση των ενζύμων PAD(Peptidylarginine Deiminase enzymes) ή η πρωτεολυτική διάσπαση της πρωτεΐνης από το ένζυμο θρυψίνη. Για τον σκοπό αυτό συντέθηκαν σε στερεή φάση, με την Fmoc/tBu μεθοδολογία επί της 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου ρητίνης (ClTR-Cl) τα ανάλογα: i) [KG]5MOG35-55 (Asp53); ii) [KG]5MOG35-55 (isoAsp53); iii) [KG]5MOG35-55 (Met(O)35); iv) [KG]5MOG35-55 (Cit41, 46, 52) και v) [KG]5MOG35-46. Τα συντηθέμενα πεπτίδια καθαρίστηκαν με χρήση ημιπαρασκευαστικού RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν μέσω φασματομετρίας ESI-MS, συζεύχθηκαν με την οξειδωμένη μαννάνη και μελετήθηκαν μέσω της μεθοδολογίας ELISA