Επιδράσεις του υδρόθειου στο καρδιαγγειακό σύστημα και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις
Authors: Γιαννακοπούλου Ευσταθία 
Published: September 2021

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως. Η στεφανιαία νόσος (CAD) είναι η πιο συνηθισμένη μεταξύ των καρδιαγγειακών νοσημάτων και προκύπτει από την αθηροσκλήρωση του αρτηριακού τοιχώματος των στεφανιαίων αρτηριών. Αυτή η διαδικασία προκαλείται από παράγοντες που προάγουν την αθηροσκλήρωση, όπως η υψηλή αρτηριακή πίεση, οι φλεγμονώδεις παράγοντες, η συσσώρευση λιπιδίων και η υπερομοκυστεϊναιμία και προκαλεί ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. Η φλεγμονή και η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο είναι δύο κύριες διαδικασίες στα αρχικά στάδια της αθηρογένεσης. Η προσκόλληση είναι μια διαδικασία που διαμεσολαβείται από μόρια προσκόλλησης στην επιφάνεια του ενδοθηλίου (ειδικά τα μόρια ICAM1 και VCAM1) και φλεγμονώδεις χημειοκίνες όπως η χημειοελκτική πρωτεΐνη-1 των μονοκυττάρων (MCP-1). Η διαδικασία της φλεγμονής επάγεται τόσο από τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (TNFα) όσο και από τις ιντερλευκίνες. Το υδρόθειο (H2S) είναι ένα άχρωμο αέριο με χαρακτηριστική οσμή χαλασμένου αυγού που παραδοσιακά θεωρούνταν τοξικός ρύπος. Πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ο τρίτος αέριος διαβιβαστής, μαζί με το μονοξείδιο του άνθρακα (CO) και το μονοξείδιο του αζώτου (NO), με πλειοτροπικές δράσεις που περιλαμβάνουν αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και καρδιοπροστατευτικές ιδιότητες. Το H2S εμπλέκεται στις φλεγμονώδεις διεργασίες που προάγουν την αθηρογένεση, οι οποίες εμφανίζονται στα πρώιμα στάδια της αθηροσκλήρωσης, επηρεάζοντας τις οδούς σηματοδότησης που εμπλέκουν τον TNFα. Επίσης, πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα έδειξαν ότι το H2S δρα ευεργετικά μειώνοντας το οξειδωτικό στρες των κυττάρων και δρα επίσης ως ενδογενής εξολοθρευτής των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Η οξειδάση NADPH (Νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδική φωσφορική οξειδάση) είναι ένα δεσμευμένο στην κυτταρική μεμβράνη ενζυμικό σύμπλοκο, υπεύθυνο για την παραγωγή των ROS στα κύτταρα.Το H2S μπορεί να παραχθεί σε ευκαρυωτικά κύτταρα από ομοκυστεΐνη και κυστεΐνη, μέσω των ενζύμων μεταβολισμού της L-κυστεΐνης. Η διαδικασία αυτή διαμεσολαβείται από τρία ένζυμα και πιο συγκεκριμένα τη β-συνθάση της κυσταθειονίνης (CBS), τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) και την 3-μερκαπτοπυροσταφυλική σουλφοτρανσφεράση (MST) σε συνδυασμό με την αμινοτρανσφεράση της κυστεΐνης (CAT). Η παραγωγή του H2S στο ενδοθήλιο αποδίδεται στην ενζυματική δράση του CSE χρησιμοποιώντας την κυστεΐνη ως υπόστρωμα, ενώ τα υπάρχοντα στοιχεία δείχνουν απουσία εμπλοκής του ενζύμου CBS στην ενδοθηλιακή παραγωγή του H2S. Σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις όπως η αθηροσκλήρωση, η διαταραγμένη βιοδιαθεσιμότητα του H2S μπορεί να είναι αποτέλεσμα μειωμένης έκφρασης του γονιδίου CTH που παράγει το ένζυμο σύνθεσης του H2S στο ενδοθήλιο. Η έκφραση του CTH μπορεί να επηρεάζεται από γενετικούς ή και επιγενετικούς παράγοντες.Σκοπός της διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο πιθανός αντι-αθηροσκληρωτικός / αντιφλεγμονώδης ρόλος του εξωγενούς H2S μελετώντας τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται σε αυτές τις διεργασίες, καθώς και η διερεύνηση πιθανών γενετικών και επιγενετικών συσχετίσεων του H2S σε αθηρωματικούς ασθενείς. Είναι γνωστό ότι η χειρουργική επέμβαση αορτοστεφανιαίας παράκαμψης (CABG) απευθύνεται σε ασθενείς με καλά τεκμηριωμένη και σοβαρή CAD. Ως εκ τούτου, η μελέτη της CAD σε έναν πληθυσμό ατόμων που έχουν υποστεί επέμβαση CABG, μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά και χρήσιμα συμπεράσματα σχετικά με την πιθανή γενετική αλλά και επιγενετική συσχέτιση της νόσου.Ενδοθηλιακά κύτταρα EAhy926 χρησιμοποιήθηκαν για το in vitro κυτταρικό μοντέλο προσομοίωσης της αθηρωμάτωσης και αναπτύχθηκαν σε καλλιεργητικά τριβλία των 12 φρεατίων. Τα κύτταρα παρέμειναν σε συνθήκες έλλειψης ορού και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις των δοτών H2S GYY4137 και θειογλυκίνης για 60min και μετά με ΤΝF-α (10ng/ ml) για 6h. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το καλλιεργητικό μέσο και πραγματοποιήθηκε συνεπώαση με τα μονοκύτταρα ΤΗΡ-1, 60min στους 37°C. Η προσκόλληση μετρήθηκε σε τυχαία επιλεγμένα πεδία του οπτικού μικροσκοπίου. Επιπρόσθετα, ολικό RNA απομονώθηκε από τα EAhy926 (τα οποία είχαν επωαστεί πρώτα με θειογλυκίνη και GYY4137 στις διάφορες συγκεντρώσεις για 60min και έπειτα με TNFα (10ng/ml) για 120min και δημιουργήθηκε το cDNA. Με τη βοήθεια της qPCR προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mRNA για τις πρωτεΐνες MCP-1 και ICAM1. Το καλλιεργητικό μέσο των EAhy926 συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των επιπέδων της εκκρινόμενης πρωτεΐνης ΜCP-1. Η έκφραση των επιπέδων των υπομονάδων της οξειδάσης NADPH ποσοτικοποιήθηκε με τη χρήση Western blotting, χρησιμοποιώντας ως γονίδιο αναφοράς αυτό της β-ακτίνης.Το αδιέγερτα ΕΑΗy926 κύτταρα έδειξαν ελάχιστη προσκόλληση μονοκυττάρων ΤΗΡ-1, ενώ η προσκόλληση των ΤΗΡ-1 αυξήθηκε σημαντικά στα διεγερμένα με ΤΝFα ΕΑHy926. Η επώαση των EAΗy926 με θειογλυκίνη για 60min προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της προσκόλλησης των ΤΗΡ-1 σε ποσοστό 48.2 ± 3.2% στη δόση των 500 μΜ (P = 0.001). Η επώαση με 300 μΜ και 500 μΜ GYY4137 για 60min πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε επίσης δοσοεξαρτώμενη αναστολή της προσκόλλησης των ΤΗΡ-1 σε ποσοστό 68.3% ± 2.5 (Ρ = 0.001). Τα επίπεδα mRNA της MCP-1 μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα EAΗy926 που συνεπωάστηκαν με ΤΝF-α και 500 μΜ GYY4137 (Ρ <0.001) ή και 500 μΜ θειογλυκίνης (Ρ <0.001), σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με ΤΝF-α. Τα επίπεδα mRNA του προσκολλητικού μορίου ICAM1 μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα EAΗy926 που συνεπωάστηκαν με ΤΝFα και 300 μΜ (Ρ = 0.041) και 500 μΜ θειογλυκίνης (Ρ<0.001) σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με ΤΝF-α. Αντίστοιχα, ο δότης GYY4137 έδειξε μια τάση μείωσης των επιπέδων mRNA του ICAM1 στη δόση 500 μΜ χωρίς όμως στατιστική σημαντικότητα. Επίσης τα επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτεΐνης MCP-1 έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη μείωση τόσο για το GYY4137 όσο και για τη θειογλυκίνη, αλλά χωρίς στατιστική σημαντικότητα. Όσον αφορά την έκφραση των υπομονάδων NADPH, τα επίπεδα της κυτταροπλασματικής p47phox και της φωσφορυλιωμένης ενεργοποιημένης υπομονάδας αυτής, phosphop47phox, αυξήθηκαν μετά από διέγερση με ΤΝFα (P = 0.02 και P = 0.035 αντίστοιχα), ενώ η έκφραση της βασικής μεμβρανικής υπομονάδας gp91phox παρέμεινε αμετάβλητη. Η επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων EAΗy926 με 500 μΜ θειογλυκίνης πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε μείωση της έκφρασης των υπομονάδων p47phox (P = 0.014) και της phosphop47phox (P = 0.028) συγκριτικά με τα κύτταρα EAΗy926 που επωάστηκαν μόνο με TNFα. Όσο αφορά το δότη GYY4137, η επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων EAΗy926 με 500 μΜ GYY4137 πριν από τη διέγερση με TNFα προκάλεσε μείωση της έκφρασης των υπομονάδων p47phox (P = 0.005) και της phosphop47phox (P = 0.043) συγκριτικά με τα κύτταρα EAΗy926 που επωάστηκαν μόνο με TNFα.Για τις γενετικές και επιγενετικές μελέτες χρησιμοποιήσαμε έναν πληθυσμό 334 ατόμων Καυκάσιας ελληνικής καταγωγής (178 άτομα με CAD που υποβλήθηκαν σε CABG και 156 άτομα της ομάδας ελέγχου). Στον πληθυσμό αυτό προσδιορίσαμε τις συχνότητες του πολυμορφισμoύ CTH 1364 G>T με τη χρήση της μεθόδου PCR-RFLP και επίσης μελετήσαμε το προφίλ μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου CTH χρησιμοποιώντας μια ποσοτική ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με βάση την SYBR Green (qMSP-PCR). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα των γονότυπων CTH 1364 G> T (P = 0.281) και των αλληλόμορφων (P = 0.265) μεταξύ των ασθενών με CABG και των ατόμων της ομάδας ελέγχου. Αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου CTH παρατηρήθηκαν στην ομάδα CABG (19.1%) συγκριτικά με τα άτομα της ομάδας ελέγχου (10.3%) (P = 0.024). Η ανάλυση ανά φύλο αποκάλυψε ότι η παραπάνω διαφορά παρατηρείται στους άνδρες (P = 0.032) αλλά όχι στις γυναίκες (P = 0.884). Χρησιμοποιώντας πολυπαραγοντική ανάλυση, μετά τη διόρθωση του στατιστικού μοντέλου για παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση CAD όπως το κάπνισμα, η ηλικία και το φύλο, διαπιστώθηκε ότι τα αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του CTH συσχετίστηκαν με την εμφάνιση CAD στο συνολικό δείγμα (OR = 2.163, 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI] 1.038-4.506, P = 0.039) και στους άνδρες (OR = 2.418, 95% CI 1.048-5.581, P = 0.039) αλλά όχι στις γυναίκες (OR = 0.542, 95% CI 0.094-3.140, P = 0.495).Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, το H2S τροποποεί διεργασίες που προάγουν τη φλεγμονή και την αθηρογένεση, αναστέλλοντας την προσκόλληση των μονοκυττάρων και εξασθενίζοντας την έκφραση των MCP-1 και ICAM1 σε φλεγμονώδη ενδοθηλιακά κύτταρα. Τόσο το GYY4137 όσο και η θειογλυκίνη μπορούν να διαδραματίσουν έναν πιθανό προστατευτικό ρόλο στην αθηροσκληρωτική παθογένεση, παρεμποδίζοντας την προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η θεραπεία με δότες H2S μπορεί να αποτελεί μια νέα προσέγγιση κατά της παθολογικής αυτής κατάστασης. Επιπλέον, οι δότες H2S φαίνεται να περιορίζουν τις γνωστές καταστροφικές επιδράσεις των αυξημένων επιπέδων ROS μέσω της τροποποίησης που ασκούν στο σηματοδοτικό μονοπάτι της οξειδάσης NADPH.Παρότι ο πολυμορφισμός του γονιδίου CTH 1364 G> T δεν συσχετίστηκε με CAD στον Καυκάσιο ελληνικό πληθυσμό, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, η υπερμεθυλίωση του CTH είναι ένας ανεξάρτητος προδιαθεσικός παράγοντας για εμφάνιση CAD μεταξύ των ανδρών. Από όσα γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που μελετά σε κλινικά δείγματα την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του υποκινητή του γονιδίου CTH σε σχέση με την εμφάνιση CAD. Συνολικά, τα ευρήματα που αναφέρονται σε αυτή τη διατριβή διευρύνουν περαιτέρω τις γνώσεις μας για τους ρόλους και τους μηχανισμούς με τους οποίους το H2S αλληλεπιδρά με την καρδιαγγειακή λειτουργία και την παθολογία του καρδιαγγειακού συστήματος. Η αποσαφήνιση των μοριακών, γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών στους οποίους εμπλέκεται το H2S μπορεί να συμβάλλει στην ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων με στόχο τη μείωση του καρδιαγγειακού κινδύνου μελλοντικά.