Μελέτη της επίδρασης σωματιδιακών συστατικών της ρύπανσης σε μηχανισμούς επιβίωσης κυττάρων ανθρώπου
Authors: Μαυροφρύδη Όλγα 
Published: September 2021

Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα. Η πλειοψηφία των σχετικών ερευνών επικεντρώνεται στα αιωρούμενα σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο ≤10μm. Tα σωματίδια αυτά συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην επιφάνειά τους. Eξίσου σημαντικό ρόλο στις επιπτώσεις των σωματιδίων αυτών διαδραματίζουν και επιπλέον παράγοντες, όπως οι συνθήκες έκθεσης και η ατομική ευαισθησία.Σκοπός της παρούσας ΔΔ ήταν η καταγραφή των αποκρίσεων των επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549), παρουσία ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στην κυτταρική φυσιολογία και σηματοδότηση, που συμβάλλουν ενδεχομένως στην ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συγκριτική καταγραφή της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων δέρματος (Α431) και αντίστοιχων φυσιολογικών ινοβλαστών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στους τυπικούς καρκινικούς δείκτες, Αkt και ΗΙF-1α. Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν: α) ένα πολύπλοκο μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ10), από βιομηχανική εγκατάσταση, β) ένα μίγμα νανοσωματιδίων diesel (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ένα κοινό οργανικό συστατικό αυτών, το βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης των οργανικών ρύπων.Η μείωση της κυτταρικής επιβίωσης, παρουσία των ΡΜ10, ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των σωματιδίων. Η εντονότερη κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη μείωση στη φωσφορυλίωση της Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του HIF-1α.Τα DEP, σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες και άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επαναλαμβανόμενες δίωρες επωάσεις έδρασαν αθροιστικά στα επίπεδα του ΗΙF-1α, τα οποία δεν επανήλθαν, μετά την απομάκρυνση των ρύπων για 22 ώρες. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, σε σύστημα συγκαλλιέργειάς τους με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα. Η παρακρινική επικοινωνία των δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα νανοσωματίδια. Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα. Η πλειοψηφία των σχετικών ερευνών επικεντρώνεται στα αιωρούμενα σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο ≤10μm. Tα σωματίδια αυτά συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην επιφάνειά τους. Eξίσου σημαντικό ρόλο στις επιπτώσεις των σωματιδίων αυτών διαδραματίζουν και επιπλέον παράγοντες, όπως οι συνθήκες έκθεσης και η ατομική ευαισθησία.Σκοπός της παρούσας ΔΔ ήταν η καταγραφή των αποκρίσεων των επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549), παρουσία ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στην κυτταρική φυσιολογία και σηματοδότηση, που συμβάλλουν ενδεχομένως στην ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συγκριτική καταγραφή της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων δέρματος (Α431) και αντίστοιχων φυσιολογικών ινοβλαστών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στους τυπικούς καρκινικούς δείκτες, Αkt και ΗΙF-1α. Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν: α) ένα πολύπλοκο μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ10), από βιομηχανική εγκατάσταση, β) ένα μίγμα νανοσωματιδίων diesel (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ένα κοινό οργανικό συστατικό αυτών, το βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης των οργανικών ρύπων.Η μείωση της κυτταρικής επιβίωσης, παρουσία των ΡΜ10, ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των σωματιδίων. Η εντονότερη κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη μείωση στη φωσφορυλίωση της Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του HIF-1α.Τα DEP, σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες και άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επαναλαμβανόμενες δίωρες επωάσεις έδρασαν αθροιστικά στα επίπεδα του ΗΙF-1α, τα οποία δεν επανήλθαν, μετά την απομάκρυνση των ρύπων για 22 ώρες. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, σε σύστημα συγκαλλιέργειάς τους με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα. Η παρακρινική επικοινωνία των δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα νανοσωματίδια.Υψηλές συγκεντρώσεις Β[α]Ρ εκδήλωσαν ήπια κυτταροτοξικότητα και εκτεταμένη γενοτοξική δράση (σχηματισμός προϊόντων προσθήκης και θραύση του γενετικού υλικού). Η αλληλεπίδραση με τα τεχνητά νανοσωματίδια PLGA ενισχύει τις επιπτώσεις των λιγότερο κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων του ρύπου, πιθανά λόγο αύξησης της βιοδιαθεσιμότητάς του. Αντίθετα, μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις Β[α]Ρ ευνοούν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μέσω του ήπιου οξειδωτικού στρες, και επάγουν τον ΗΙF-1α, μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3Κ/Akt. Η επαγωγή των ΗΙF-1α και NrF2 συνοδεύεται από τη μεταγραφική τους ενεργοποίηση. Η απόκριση του ΗΙF-1α στο Β[α]Ρ επιβεβαιώθηκε και στα κύτταρα Α431, καθώς και σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος και πνεύμονα. Ανάλογα αποτελέσματα καταγράφηκαν και κατά την επίδραση του Β[α]Ρ, παρουσία επιπλέον στρεσογόνων συνθηκών, που χαρακτηρίζουν ποικίλες παθοφυσιολογικές καταστάσεις, όπως η υποξία. Τέλος, η αλληλεπίδρασή του Β[α]Ρ με διαύλους Ca2+, σε επίπεδο μεμβράνης, αυξάνει τα βασικά επίπεδα Ca2+ στο κυτταρόπλασμα και μειώνει το περιεχόμενο του ΕΔ ενισχύοντας το δυναμικό πρόσληψης ιόντων. Το σημειακό γεγονός της εισροής Ca2+, ενισχύει άμεσα τη φωσφορυλίωση της Αkt, συμβάλλοντας στην πρώιμη συσσώρευση του HIF-1α.