Mechanisms of membrane trafficking and endocytosis in Aspergillus nidulans
Authors: Ευαγγελινός Μίνωας 
Published: September 2021

Η κυτταρική ζωή απαιτεί τη συντονισμένη εκτέλεση διάφορων κυτταρικών διεργασιών – από την διαφορική μεταγραφή του DNA μέχρι την τελική αποικοδόμηση ή ανακύκλωση των γονιδιακών προϊόντων’ των πρωτεϊνών. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι οντότητες με υψηλή πολυπλοκότητα και διαμερισματοποίηση, η οποία απαιτεί τη διακίνηση υλικών και μορίων (όπως RNA, πρωτεΐνες, λιπίδια) μέσω του δικτύου των πολύπλοκων μεμβρανών και οργανιδίων τους, από ή προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον, ή ακόμη και την μεταφορά ολόκληρων οργανιδίων μέσα στο κυτταρόπλασμα. Η σπουδαιότητα της μεμβρανικής διακίνησης για την ομοιόσταση ενός κυττάρου αντανακλάται συχνά σε θνησιγόνους φαινότυπους και γενετικές ασθένειες του ανθρώπου, όπως η κυστική ίνωση. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, ερευνήσαμε διαφορετικές πτυχές της μεμβρανικής διακίνησης, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο οργανισμό το νηματοειδή μύκητα Aspergillus nidulans. Αυτός ο ασκομύκητας χρησιμοποιείται ως σύστημα μοντέλο εξαιτίας της γενετικής και μοριακής ευελιξίας του, αλλά και των αναδυόμενων δυνατοτήτων του ως κυτταρικό (πρότυπο) σύστημα για τη μελέτη της μεμβρανικής διακίνησης και άλλων διεργασιών, οι οποίες εξαρτώνται από τους μικροσωληνίσκους.Η παρούσα διδακτορική διατριβή διαιρείται σε τρία τμήματα. Το πρώτο μέρος περιγράφει την ανάπτυξη ενός καινοτόμου γενετικού εργαλείου, το οποίο βασίζεται στην τεχνολογία των μεταθετών στοιχείων για την επιλογή υπομορφικών ή υπερμορφικών μεταλλαγμένων στελεχών του A. nidulans. Αυτό το εργαλείο μεταλλαξιγένεσης αναμένεται να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για την κλωνοποίηση γονιδίων που συμμετέχουν στην μεμβρανική διακίνηση. Το δεύτερο μέρος διερευνά τους μοριακούς μηχανισμούς, οι οποίοι σχετίζονται με την διακίνηση, τη διαλογή και αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Τέλος, το τρίτο μέρος μελετά την μοριακή βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των μικροσωληνίσκων και των μεμβρανών κατά την τοποθέτηση των πυρήνων και κατά την εξωκύτωση.Μέρος Ι. Για την ανάπτυξη ενός εργαλείου μετάθεσης, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταθετό στοιχείο από την Drosophila hydeii, το οποίο ονομάζεται minos, και αποτελείται από δυο ανάστροφες επαναλήψεις 254 βάσεων, οι οποίες περιβάλλουν ένα γονίδιο μεταθετάσης. Το minos είχε ήδη δοκιμαστεί επιτυχώς σε διάφορα μετάζωα, σημειώνοντας αποδοτική συχνότητα στην διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης γονιδίων, σχεδόν χωρίς κάποια προτίμηση σε αλληλουχία εισδοχής. Τροποποιήσαμε το φυσικό μεταθετό minos, αφαιρώντας το γονίδιο της μεταθετάσης και εισάγοντας δυο γονίδια από τον Ασπέργιλλο: το yA, το οποίο κωδικοποιεί μια λακκάση των κονιδίων που παράγει την πράσινη χρωστική τους, και το inoB, το οποίο κωδικοποιεί την συνθάση της 1-φωσφορικής μυο-ινοσιτόλης, ένα ένζυμο απαραίτητο για την βιοσύνθεση της ινοσιτόλης. Το τροποποιημένο μεταθετό minos ενσωματώθηκε σε μία συγκεκριμένη θέση, -10 βάσεις πριν από την έναρξη του γονιδίου niaD, σε ένα στέλεχος, από το οποίο απουσίαζαν τα ενδογενή γονίδια yA και inoB, προκαλώντας την απενεργοποίηση της μεταγραφής του niaD. Το γονίδιο της μεταθετάσης δίχως ιντρόνια, υπό την ρύθμιση του υποκινητή gpdAmini του Ασπέργιλλου, ενσωματώθηκε σε τυχαία θέση μέσα στο γονιδίωμα. Αποκοπή του minos από την αρχική του θέση ενσωμάτωσης θα ενεργοποιούσε εκ νέου την μεταγραφή του γονιδίου niaD, το οποίο κωδικοποιεί μία αναγωγάση νιτρικών απαραίτητη για την αξιοποίηση των NO3- ως πηγή αζώτου. Έτσι, η επιλογή ενός συμβάντος μετάθεσης θα πραγματοποιούταν με επίστρωση κονιδίων σε θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο περιείχε NO3- ως μοναδική παροχή πηγής αζώτου. Το minos μετατίθεται επιτυχώς στον A. nidulans με συχνότητα μετάθεσης 0.21-5.6 x 10-6. Η αποκοπή του minos από την αρχική θέση αφήνει πίσω ένα αποτύπωμα από 4 βάσεις, οι οποίες περιβάλλονται από το δινουκλεοτίδιο ΤΑ. Το NkuA, μία πρωτεΐνη του συμπλόκου του μηχανισμού επιδιόρθωσης σύνδεσης μη-ομόλογων άκρων, αποδείχθηκε απαραίτητο για την επιδιόρθωση των σπασιμάτων της διπλής έλικας του DNA μετά την αποκοπή του minos από την αρχική θέση ενσωμάτωσής του. Το minos χρησιμοποιήθηκε δοκιμαστικά στην επιλογή μεταλλαγμένων στελεχών, τα οποία παρουσίαζαν μορφολογικούς φαινότυπους ή ανθεκτικότητα στην 5-φθορο-ουρακίλη. Ακόμη, έγινε επιλογή ορισμένων τυχαίων γεγονότων μετάθεσης. Η ανάλυση των αλληλουχιών DNA κοντά στο σημείο της ένθεσης έδειξε πως το minos μετατίθεται μέσα σε ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης, 5’ ή 3’ αμετάφραστες περιοχές εξωνίων, εσώνια, ρυθμιστικές αλληλουχίες πριν από την έναρξη των γονιδίων, ή σε αλληλουχίες ακριβώς μετά ή ενδιάμεσα σε γονίδια. Οι στόχοι του περιλάμβαναν μεταγραφικούς παράγοντες, κινάσες, ATPάσες, συνθάσες, μεταφορείς και μη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες με άγνωστη λειτουργία. Οι αλλαγμένοι φαινότυποι ήταν αποτέλεσμα μεταγραφικής επαγωγής ή αρνητικής μεταγραφικής ρύθμισης ή διακοπή ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης. Γι’ αυτό, το minos είναι ένα αποτελεσματικό και αποδοτικό εργαλείο για την επιλογή νέων γονιδίων βασιζόμενο σε φαινοτύπους, ανθεκτικότητα σε φάρμακα ή τοξικά ανάλογα, ή άλλα κριτήρια επιλογής.Μέρος ΙΙ. Στόχος του δεύτερου και κύριου μέρους αυτής της διατριβής ήταν η διευκρίνηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση λανθασμένα διπλωμένων πολυτοπικών μεμβρανικών φορτίων. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες διπλώνουν συμμεταφραστικά και ενσωματώνονται προοδευτικά στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Το σωστό δίπλωμα των νεοσυντιθέμενων μορίων είναι κρίσιμο για τη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών, και συχνά για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς η συσσωμάτωση μη διπλωμένων πρωτεϊνών προκαλεί κυτταροτοξικότητα και κυτταρικό θάνατο. Για το σκοπό μας, χρησιμοποιήσαμε μια ασταθή παραλλαγή μίας καλά μελετημένης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans, την περμεάση ξανθίνης-ουρικού οξέος, UapA, ως μοντέλο μη διπλωμένης πρωτεΐνης. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως πως ο UapA ενδοκυτώνεται από την πλασματική μεμβράνη παρουσία πλούσιας πηγής αζώτου, όπως τα ιόντα NH4+, ή ως απόκριση σε πλεόνασμα των υποστρωμάτων του. Μετά την εσωτερίκευση, πραγματοποιείται διαλογή του UapA στα ενδοσώματα, ακολουθούμενη τελικώς από την αποικοδόμησή του στα χυμοτόπια. Η ενδοκύτωση του UapA απαιτεί προηγουμένως την ουβικιτινιλύωσή του στη λυσίνη 572 (Lys572) της καρβοξυτελικής κυτταροπλασματικής ουράς του από την Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5. Μία πρωτεΐνη-προσαρμοστής, με όνομα ArtA, αλληλεπιδρά με την HulA μέσω του αμινοξικού μοτίβου PPxY και την στρατολογεί στην καρβοξυτελική ουρά του UapA.Ορισμένες μεταλλαγές στο γονίδιο uapA δημιουργούν ασταθή πρωτεϊνικά μόρια UapA, τα οποία συσσωρεύονται στο ΕΔ, εντοπίζονται ελάχιστα ή καθόλου στην πλασματική μεμβράνη και προωθούνται για αποικοδόμηση στο χυμοτόπιο, με αποτέλεσμα την απουσία λειτουργικότητας της πρωτεΐνης στο κύτταρο. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε εκτενώς μια συγκεκριμένη παραλλαγή του UapA, η οποία φέρει έλλειψη της αργινίνης 481 (Arg481) στο 13ο διαμεμβρανικό τμήμα του UapA, και η οποία ονομάστηκε ΔR481. Παρατηρήσαμε πως η έκφραση του ΔR481 προκαλεί την ενεργοποίηση του μηχανισμού απόκρισης μη διπλωμένων πρωτεϊνών (unfolded protein response, UPR) και της αποικοδόμισης που σχετίζεται με το ΕΔ (ER-associated degradation, ERAD). Έτσι, επιβεβαιώσαμε πως το ΔR481 είναι πράγματι ένα μη σωστά διπλωμένο φορτίο. Ωστόσο, μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν πως ορισμένα μόρια του ΔR481 διαφεύγουν του ERAD και κατευθύνονται κυρίως προς το χυμοτόπιο, αλλά και προς τη πλασματική μεμβράνη. Εστιάσαμε ειδικά στην κατανόηση του μηχανισμού της αποικοδόμησης του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Η κύρια Ε3 τύπου HECT λιγάση της ουβικιτίνης, HulARsp5, αποδείχθηκε απαραίτητη για την στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, ενώ η πρωτεΐνη-προσαρμοστής ArtA, η οποία συμμετέχει στην ενδοκύτωση του UapA, καθώς και ένας γενικός παράγοντας ενδοκύτωσης, ο SagAEnd3, δεν επηρέασαν τη διαδικασία, δείχνοντας πως η ενδοκύτωση συνεισφέρει ελάχιστα ή καθόλου στη στόχευση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν πως το ΔR481 αναγνωρίζεται ως μη σωστά διπλωμένο και επανα-προωθείται στο χυμοτόπιο κατά το βιοσυνθετικό μονοπάτι, πριν φτάσει στην πλασματική μεμβράνη. Μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στο ΕΔ, το BsdABsd2, φάνηκε να είναι απαραίτητη για την μη-ενδοκυτταρική αποικοδόμηση του ΔR481 στο χυμοτόπιο, πιθανώς μέσω αλληλεπίδρασης των αμινοξικών της μοτίβων, PPxY, με την λιγάση της ουβικιτίνης HulA. Απουσία του BsdA ή μεταλλαγές που αντικαθιστούν αμινοξέα μέσα στα μοτίβα PPxY, παρεμποδίζουν την καταστροφή του ΔR481, επιτρέποντας στην πλειονότητα των μορίων να φτάσουν στην πλασματική μεμβράνη. Παρά το σταθερό, συνεχόμενο εντοπισμό του ΔR481 στη πλασματική μεμβράνη σε γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ, το ΔR481 δεν είχε λειτουργικότητα μεταφορέα και υπόκειτο «φυσιολογικά» στην ρύθμιση υπό το ενδοκυτταρικό μονοπάτι των ArtA-SagA-HulA. Σημαντικό εύρημα αυτής της εργασίας είναι πως η συσσώρευση του ΔR481 στο ΕΔ πυροδοτεί την αυτοφαγία και τη στρατολόγηση μιας βασικής πρωτεΐνης της αυτοφαγίας, της Atg8, στο ΕΔ. Το BsdA αποδείχτηκε απαραίτητο μόνο για την μεταγενέστερη αποικοδόμηση του ΔR481, καθώς η επαγωγή της αυτοφαγίας εξαιτίας της συσσώρευσης του ΔR481 στο ΕΔ παρέμενε ανεπηρέαστη στο γενετικό υπόβαθρο bsdAΔ. Η γενετική απενεργοποίηση της αυτοφαγίας μέσω μεταλλαγών στα βασικά γονίδια atg9 ή rabO παρεμπόδισε μόνο μερικώς την αποικοδόμηση του ΔR481, υποστηρίζοντας πως ένα άλλο μονοπάτι καταστροφής δρα παράλληλα. Η παρεμπόδιση της λειτουργικότητας του Golgi μέσω μιας θερμοευαίσθητης μεταλλαγής στην συνταξίνη SedV παρεμπόδισε επίσης μόνο μερικώς την αποικοδόμιση του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Μόνο η ταυτόχρονη απενεργοποίηση τόσο της αυτοφαγίας όσο και της λειτουργικότητας του Golgi κατάφερε να εμποδίσει πλήρως την καταστροφή του ΔR481 στο χυμοτόπιο. Συμπερασματικά, πολλαπλά μονοπάτια δραστηριοποιούνται για την αποτοξίνωση των κυττάρων από λανθασμένα διπλωμένα φορτία. Μέρος ΙΙΙ. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, ακολουθήσαμε τη μετακίνηση των πυρήνων και των εκκριτικών κυστιδίων στις υφές του A. nidulans. Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως ο A. nidulans, επιμηκύνονται συνεχώς μέσω ακραίας επέκτασης, μια διαδικασία η οποία απαιτεί στοχευμένη έκκριση και ενδοκυτταρική ανακύκλωση στην κορυφή της υφής (tip). Κατά τα πρώτα στάδια της εκβλάστησης του μύκητα, η πολικότητα εγκαθιδρύεται και έκτοτε διατηρείται καθ’ όλη τη διάρκεια της ζωής του. Η κατευθυνόμενη αύξηση στην άκρη της υφής απαιτεί συνεχόμενη πολική μετακίνηση λιπιδίων και ενζύμων, μεμβρανική αναδιοργάνωση και ανακύκλωση φορτίων στην άκρη της υφής, διαδικασίες οι οποίες εμπλέκουν τους μικροσωληνίσκους και την F-ακτίνη. Οι μικροσωληνίσκοι παίζουν σημαντικό ρόλο στην μίτωση, καθώς σχηματίζουν την μιτωτική άτρακτο, αλλά και κατά τη διάρκεια της μεσόφασης στην κατανομή των πυρήνων και στην κυστιδιακή μετακίνηση. Σε αυτό το μέρος της διατριβής, εστιάσαμε στην λειτουργία πρωτεϊνών του κυτταρικού φλοιού, οι οποίες σχετίζονται με τους μικροσωληνίσκους. Προηγούμενες αναφορές είχαν χαρακτηρίσει τη δράση της πρωτεΐνης ApsANum1, μιας μεμβρανικής, αγκυροβολημένης πρωτεΐνης του φλοιού, η οποία αλληλεπιδρά με τους αστρικούς μικροσωληνίσκους κατά τη διάρκεια της μίτωσης, βοηθώντας στη δημιουργία ελκτικών δυνάμεων, οι οποίες απομακρύνουν περαιτέρω τους δύο πόλους της ατράκτου. Η ApsC, μια πρωτεΐνη με ομοιότητα ως προς την ApsA, ταυτοποιήθηκε ως δεύτερο ομόλογο της πρωτεΐνης Num1 του Saccharomyces cerevisiae. H ApsC εντοπίζεται σε συγκεκριμένες επικράτειες της πλασματικής μεμβράνης στον κεντρικό πόρο των σέπτων και στοχεύεται συνεχόμενα στην κορυφή της υφής, υποδεικνύοντας ένα ρόλο στην πολική αύξηση και την έκκριση. Χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασύστασης φθορισμού split YFP, αποδείξαμε αλληλεπίδραση μεταξύ της ApsA και ApsC στον κυτταρικό φλοιό, αλλά και με την κινεσίνη UncA, η οποία μετακινεί ενδοσώματα και εκκριτικά κυστίδια πάνω στους μικροσωληνίσκους, τη μυοσίνη MyoV, η οποία μετακινεί εκκριτικά κυστίδια πάνω στην F-ακτίνη, και τη διαμεμβρανική συνθάση της χιτίνης, ChsB, η οποία εκκρίνεται μέσω κυστιδίων στις θέσεις της αύξησης στην άκρη της υφής. Βασιζόμενο στις δοκιμές αλληλεπίδρασης και στην in vivo μικροσκοπία της ApsC, το μοντέλο μας προτείνει ότι η ApsC θα μπορούσε να εντοπίζεται σε εκκριτικά κυστίδια, τα οποία μετακινούνται από τους μικροσωληνίσκους στην F-ακτίνη, μέχρι τελικώς να συντηχθούν με την πλασματική μεμβράνη στο πολικό σημείο της αύξησης.