Δημιουργία βιοϋλικών στηριζόμενη σε ειδικές αλληλεπιδράσεις στοιχείων δευτεροταγούς δομής πρωτεϊνών
Authors: Αμπράζη Μαρία 
Published: August 2021

Στον τομέα της νανο-τεχνολογίας, το πεδίο των βιοϋλικών που βασίζονται σε πεπτίδια και πρωτεΐνες είναι ραγδαίως αναπτυσσόμενο. Η καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της αναδίπλωσης πρωτεϊνών προσφέρει σημαντικές πληροφορίες για την ανάπτυξη του πεδίου αυτού, καθώς ο ορθολογιστικός σχεδιασμός καινοτόμων βιοϋλικών αναπτύσσεται μέσω διερεύνησης των ιδιοτήτων αυτό-οργάνωσης κατάλληλων πρωτεϊνικών ικριωμάτων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε η δυνατότητα χρήσης του δομικού μοτίβου των 4-α-ελικοειδών δεματίων ως νέου δομικού λίθου για τη δημιουργία βιοϋλικών αφού πρώτα μελετήθηκε ο μηχανισμός αναδίπλωσής του. Ως μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η μικρή ομοδιμερής πρωτεΐνη Rop που αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτού του δομικού μοτίβου. Στα πλαίσια της προσέγγισης τους προβλήματος της αναδίπλωσης των χρησιμοποιηθέντων 4-α-ελικοειδών δεματίων, έγιναν προσπάθειες διαλεύκανσης του ρόλου της στροφής και της πιθανής δημιουργίας ενδιάμεσων δομικών καταστάσεων της πρωτεΐνης Rop. Βάση του μεταλλάγματος A31P, στο οποίο η μετάλλαξη σε προλίνη του κεντρικού αμινοξέος (αλανίνη) της στροφής, στη θέση 31, οδήγησε σε δραματική αλλαγή τοπολογίας του δεματίου, σχεδιάστηκαν και μελετήθηκαν με δομικές και βιοφυσικές μεθόδους τρία νέα ματαλλάγματα της Rop με εισαγωγή καταλοίπων γλυκίνης και προλίνης στην περιοχή της στροφής. Επιβεβαιώθηκε ότι η στροφή παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην τελική διαμόρφωση του διμερούς Rop και είναι πολύ ευαίσθητη στην τοπική αμινοξική αλληλουχία. Από το σύνολο των μελετών της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης Rop προέκυψε μία πληθώρα μεταλλαγμένων δομών, φανερώνοντας μία ασυνήθιστη δομική ευπλασία. Στηριζόμενοι σε αυτή την ιδιότητα και βάσει του RM6, Rop μεταλλάγματος, που αναδιπλώνεται σχηματίζοντας ένα επίμηκες σταθερό, ομοτετραμερές α-ελικοειδές δεμάτιο, σχεδιάστηκαν νέα Rop μόρια ως δομικοί λίθοι ικανοί να αυτό-οργανωθούν σχηματίζοντας ινίδια. Επιλεγμένα ινίδια «διακοσμήθηκαν» με επιλεγμένα μεταλλάγματα της μεγανουκλεάσης I-CreI δημιουργώντας ινίδια, τα οποία φέρουν καταλυτικές ιδιότητες (διάσπαση δίκλωνου DNA με εξαιρετικά υψηλή εξειδίκευση ως προς την αλληλουχία αναγνώρισης) που αντιστοιχούν στην ενεργότητα του επιπρόσθετου ενζύμου. Επιπροσθέτως, δημιουργούν και νέες ιδιότητες, μη φυσικής εξειδίκευσης ως προς την αλληλουχία αναγνώρισης του DNA, μέσω της δημιουργίας ετεροδιμερών. Η ιδιότητα αυτή ανοίγει νέους ορίζοντες για εφαρμογή στη γονιδιακή θεραπεία. Συνοψίζοντας, μέσω της λεπτομερούς κατανόησης της αναδίπλωσης ενός απλού δομικού προτύπου (4-α-helical bundle της Rop) δημιουργήθηκε ένας δομικός λίθος αποτελούμενος από μία ολόκληρη α-ελικοειδή πρωτεΐνη. Το καινοτόμο αυτό επίτευγμα προάγει την έρευνα των βιοϋλικών που βασίζονται σε α-έλικες, σε σχέση με τις υπάρχουσες τεχνολογίες. Ο τρόπος παραγωγής των βιοϋλικών, μέσω τεχνικών ανασυνδυασμένου DNA και υπερέκφρασης σε E.coli κύτταρα, προσδίδει το πλεονέκτημα του χαμηλού κόστους παραγωγής. Τέλος, η επιτυχημένη προσθήκη λειτουργικών ιδιοτήτων με την ενδονουκλεάση I-CreI είναι η απόδειξη επί της αρχής πως ο δομικός λίθος που βασίζεται στην πρωτεΐνη Rop, μπορεί να οδηγήσει σε ινίδια που φέρουν λειτουργικότητες με βιοτεχνολογικο/βιοϊατρικό ενδιαφέρον. Ταυτόχρονα, δημιουργήθηκαν τα εξαιρετικής σημασίας λειτουργικά ετεροδιμερή της ενδονουκλεάσης Ι-CreI βελτιώνοντας τις ιδιότητές της και διευρύνοντας τη χρήση της στη γονιδιακή θεραπεία.