Προκλινική διερεύνηση αντιμικροβιακής δράσης μελιού σε πολυανθεκτικούς μικροοργανισμούς και εκτίμηση της ανοσοτροποποιητικής δράσης του σε συνθήκες ενδοτοξιναιμίας-σήψης
Authors: Σταυροπούλου Ελισάβετ 
Published: February 2025

Η Μικροβιακή Αντοχή αποτελεί αυξανόμενη απειλή για την Δημόσια Υγεία, ενώ παράλληλα η ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών καθυστερεί σε σχέση με τους εξελικτικούς μηχανισμούς αντοχής που αναπτύσσουν οι μικροοργανισμοί. Το μέλι εμφανίζεται ως εναλλακτική θεραπεία με πολλαπλές θρεπτικές και θεραπευτικές ιδιότητες, κάτι που έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Το μέλι Manuka μάλιστα, είναι γνωστό για την αντιμικροβιακή του δράση και έχει μάλιστα χαρακτηριστεί ως «μέλι ιατρικής ποιότητας» με εφαρμογές στην σύγχρονη ιατρική πράξη όπως σε χειρουργικά τραύματα. Παρά τον αυξανόμενο αριθμό μελετών, παραμένουν άγνωστοι πολλοί από τους μηχανισμούς της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού, που φαίνεται να είναι πολυπαραγοντική διαδικασία. Αν και υπάρχει πληθώρα ερευνών για την αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού, οι περισσότερες έχουν επικεντρωθεί στα Gram-θετικά βακτήρια με λιγότερες έρευνες να εξετάζουν τη δράση του μελιού έναντι των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η αυξανόμενη ανθεκτικότητα των Gram-αρνητικών βακτηρίων, σε συνδυασμό με την αργή πρόοδο στην έρευνα και ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών για την αντιμετώπιση των βακτηρίων που παράγουν καρβαπενεμάσες, διακυβεύεται από την ταχεία εξέλιξη των ιδίων των καρβαπενεμασών. Αυτή η πρόκληση υπογραμμίζει τη σπουδαιότητα και αναγκαιότητα του ερευνητικού θέματος που διερευνάται σε αυτή τη διδακτορική διατριβή.Το πρώτο μέρος της διατριβής περιλαμβάνει βιβλιομετρική ανάλυση κι αξίζει να αναφερθεί πως είναι η πρώτη φορά που το θέμα της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού εξετάζεται μέσω αυτής της μεθόδου. Η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας και η βιβλιομετρική ανάλυση αποτελούν βασικά στάδια στη διατριβή μας, παρέχοντας μια συνολική εικόνα της υφιστάμενης γνώσης γύρω από το αντικείμενο της αντιμικροβιακής δράσης του μελιού και προτείνοντας πιθανές κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα. Αυτή η μοναδική βιβλιογραφική ανάλυση στο συγκεκριμένο αντικείμενο, συμβάλλει στην διεύρυνση της επιστημονικής γνώσης, ενώ οι βιβλιομετρικοί δείκτες της παρούσας έρευνας σκιαγραφούν την ερευνητική παραγωγή γύρω από τις αντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του μελιού. Επόμενο βήμα της διατριβής ήταν να διερευνήσει την in vitro αντιμικροβιακή δράση ελληνικών μελιών (Ν=47) διαφορετικής βοτανικης προέλευσης που συλλέχθηκαν από μελισσοκόμους διαφορετικών γεωγραφικών περιοχών της Ελλάδας, έναντι Gram αρνητικών βακτηρίων. Οι αντιβακτηριακές ιδιότητες του μελιού έχουν αποδοθεί σε διάφορους φυσικοχημικούς παράγοντες, όπως η οξύτητα, η οσμωτική δράση και η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων, αλλά και στην παρουσία βακτηριοκτόνων ενώσεων όπως το Η2Ο2, διάφορα αντιοξειδωτικά και ένζυμα, όπως η λυσοζύμη, οι πολυφαινόλες και τα φλαβονοειδή. Στη μελέτη μας, εντάξαμε τέσσερα γονοτυπικά επιβεβαιωμένα θετικά στην καρβαπενεμάση κλινικά στελέχη: (1) Pseudomonas aeruginosa που παράγει VIM, (2) Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae που παράγει KPC, (3) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens που παράγει που παράγει VIM (4) K. pneumoniae. subsp. pneumoniae που παράγει VIM. Αυτά τα στελέχη απομονώθηκαν από αιμοκαλλιέργειες νοσηλευόμενων ασθενών Πανεπιστημιακών Νοσοκομείων Τριτοβάθμιας Περίθαλψης της Αττικής (Ελλάδα) και ανήκουν στη Βακτηριακή Συλλογή του Τμήματος Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Το μέλι Manuka επελέγη ως θετικός μάρτυρας και παρασκευάσαμε ένα τεχνητό μέλι ως αρνητικό μάρτυρα. Η αντιμικροβιακή δράση των εξεταζόμενων μελιών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πέντε αραιώσεις (75%, 50%, 25%, 12,5% και 6,25%) έναντι των τεσσάρων πολυανθεκτικών κλινικών στελεχών με τη μέθοδο διάχυσης σε δίσκους και προσδιορίστηκαν επιπλέον οι MIC (ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις) μετά από προσθήκη καταλάσης και πρωτεινάσης Κ ώστε ν’αξιολογηθεί ο ρόλος του Η2Ο2 και των πεπτιδίων στην αντιμικροβιακή δράση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πως η αντιμικροβιακή δράση ήταν στενά συνδεδεμένη με τον τύπο του μελιού, την μέθοδο αξιολόγησης, την αραίωση και τον μικροοργανισμό. Το μέλι κουμαριάς παρουσίασε υψηλότερη αντιμικροβιακή δράση έναντι των E. cloacae subsp. dissolvens στη συγκέντρωση 75%, ενώ το μέλι ελάτης ήταν πιο βακτηριοκτόνο για το ίδιο βακτήριο στη συγκέντρωση 25%. Αρκετά ελληνικά μέλια στη μελέτη μας υπερτερούσαν σε σχέση με το μέλι Manuka, ειδικά σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Είναι αξιοσημείωτο ότι, στη μέθοδο διάχυσης σε δίσκους, δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (μονόδρομη ANOVA για p < 0,005) μεταξύ των τεσσάρων πολυανθεκτικών μικροοργανισμών για τους διάφορους τύπους μελιού και για τις διάφορες συγκεντρώσεις, γεγονός που εξηγεί ότι η καταστροφική επίδραση στα βακτηριακά κύτταρα ήταν η ίδια ανεξάρτητα από το είδος ή το βακτηριακό στέλεχος. Επομένως, το μέλι εκδηλώνει την αντιμικροβιακή του δράση ανεξάρτητα από τον μικροοργανισμό, υποδηλώνοντας μια μη ειδική δράση. Από την άλλη πλευρά υπάρχουν σημαντικές χημικές διαφορές στη σύνθεση μεταξύ των διάφορων τύπων μελιού λόγω της διαφορετικής τοπογραφικής και βοτανικής προέλευσης. Η σήψη είναι το κυριότερο αίτιο θανάτου από λοίμωξη, με αυξημένη θνητότητα στις λοιμώξεις από πολυανθεκτικά βακτήρια και καθώς αυτή προκαλείται από ανεξέλεγκτη λειτουργία των μηχανισμών φλεγμονής, εξετάσαμε την επίδραση του μελιού ως αντιφλεγμονώδους παράγοντα σε μοντέλα σήψης και πολυμικροβιακής περιτονίτιδας ποντικών. Η ενδοτοξίνη από Gram-αρνητικά βακτήρια, όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), επάγει ταχέως σοβαρές και συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις που μπορούν να μιμηθούν τα αρχικά κλινικά χαρακτηριστικά της σήψης. Η ενδοτοξιναιμία σχετίζεται με εκδηλώσεις όπως καταιγίδα κυτταροκινών (cytokine storm) και ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος. Στην μελέτη μας, χρησιμοποιήθηκε ένα ζωικό μοντέλο ενδοτοξιναιμίας-σηψης ποντικών με LPS κι ένα μοντέλο περιτονίτιδας που προκαλείται κατόπιν Cecal Slurry (CS). Το μέλι Manuka χρησιμοποιήιηκε ως θετικός μάρτυρας και αλατούχο διάλυμα ως αρνητικός μάρτυρας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι όλα τα δείγματα ελληνικού μελιού που εξετάστηκαν είχαν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες καταστέλλοντας την επαγωγή των προφλεγμονωδών μεσολαβητών TNFα και iNOS ως απόκριση στη διέγερση LPS. Ο TNF-α και η IL-6 μειώνουν την ικανότητα βιομετατροπής του ήπατος, οδηγώντας σε δυσλειτουργία του. Η ηπατική λειτουργία αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της έκφρασης των CYP που αποτοξινώνουν και εξαλείφουν τις τοξικές ενδογενείς ουσίες ως αποτέλεσμα της φλεγμονής. Το LPS μείωσε σημαντικά την έκφραση των CYP. Χαμηλότερη δραστικότητα του CYP οδηγεί σε μειωμένο μεταβολισμό και έκκριση τοξικών μεταβολιτών, οδηγώντας σε συσσώρευση αυτών των μορίων και τοξικές επιδράσεις. Η χορήγηση του μελιού ελάτης και καστανιάς αύξησε την έκφραση των ενζύμων CYP στο ήπαρ των ποντικών που έλαβαν LPS, υποδηλώνοντας μια πιθανή αντιοξειδωτική επίδραση. Το βακτηριακό φορτίο αξιολογήθηκε στο αίμα, την περιτοναϊκή πλύση και τους ιστούς των ποντικών που υποβλήθηκαν σε CS. Δεν υπήρξε διαφορά στο βακτηριακό φορτίο στο αίμα και στην περιτοναϊκή πλύση μεταξύ των ομάδων που υποβλήθηκαν σε CS ενώ το βακτηριακό φορτίο ήταν χαμηλότερο στους ιστούς σπλήνα και πνεύμονα των επιμύων που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με μέλι. Σημαντικά μειωμένοι αριθμοί βακτηρίων βρέθηκαν στο ήπαρ των σηπτικών ποντικών που είχαν προηγουμένως λάβει θεραπεία μελιού καστανιάς και ελάτης σε σύγκριση με την ομάδα που υποβλήθηκε σε CS μόνο. Σημαντική μείωση του βακτηριακού φορτίου βρέθηκε επίσης στους πνεύμονες των ποντικών που υποβλήθηκαν σε CS κι έλαβαν μέλι κουμαριάς, ελάτης και μέλι Manuka. To τελικό μέρος της διατριβής αφορούσε τη χρήση μεθόδων μαζικής αλληλούχισης (sequencing) για τον εντοπισμό και την σύγκριση βακτηρίων και μυκήτων στα διάφορα δείγματα μελιού. Σκοπός αυτής της διαδικασίας ήταν να εξεταστεί η πιθανή επίδραση της μικροβιακής ποικιλότητας στην επαγωγή αντιμικροβιακής δράσης. Μέσω αυτής της προσέγγισης, επιδιώχθηκε η καλύτερη κατανόηση των μικροβιακών κοινοτήτων που συνυπάρχουν στο μέλι και η αξιολόγηση του ρόλου τους στην ενίσχυση των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων του. Στη μελέτη μας διαπιστώθηκε ότι οι Lactobacillus επικρατούν στο μέλι ελάτης, με τον πληθυσμό των Lactobacillus να είναι υψηλότερος στο μέλι ελάτης σε σύγκριση με το μέλι ελάτης-δρυ. Συνολικά, τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το μέλι μπορεί να αποτελέσει μια πολλά υποσχόμενη συμπληρωματική θεραπεία, όχι μόνο ως αντιμικροβιακός παράγοντας αλλά και ως ενισχυτικό στη θεραπεία λοιμώξεων. Η μελέτη αυτή ανοίγει νέους δρόμους για την αξιοποίηση των φυσικών ιδιοτήτων του μελιού στην ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών, ιδιαίτερα σημαντικών σε μια εποχή όπου η μικροβιακή αντοχή αυξάνεται με ανησυχητικούς ρυθμούς.