Πρωτεϊνική μηχανική και χαρακτηρισμός του ενζύμου μεταφοράση του γλουταθείου
Authors: Αξαρλή Ειρήνη 
Published: August 2021

Πραγματοποιήθηκε μοριακή και κινητική μελέτη του ισοενζύμου GmGSTU4-4 από Glycine max. Ειδικότερα πραγματοποιήθηκε ετερόλογη έκφραση σε Ε. coli και καθαρισμός του ενζύμου μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της καταλυτικής αντίδρασης και προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές για διαφορετικά υποστρώματα. Μελετήθηκε και αναλύθηκε η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου και επιλέχτηκαν τα αμινοξικά κατάλοιπα Ser13, Asn48, Pro49, Tyr107, Arg111 τα οποία αποτέλεσαν στόχο κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης. Οι μεταλλαγμένες μορφές Ser13Ala, Asn48Ala, Pro49Ala, Tyr107Ala, Arg111Ala εκφράστηκαν σε Ε. coli καθαρίστηκαν και χαρακτηρίστηκαν με κινητική ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα παραπάνω αμινοξικά κατάλοιπα συμμετέχουν άμεσα η έμμεσα στον καταλυτικό μηχανισμό. Επίσης, μελετήθηκε η αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας από μεγάλη ποικιλία ξενοβιοτικών ενώσεων (φυτοφάρμακα, εντομοκτόνα τριαζινο χρωστικές). Στη συνέχεια έγινε ανασχεδιασμός του ενζύμου GmGSTU4-4 εφαρμόζοντας κατευθυνόμενη εξέλιξη. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενος εξελικτικός ανασχεδιασμός των γονίδιων τριών ισοενζύμων GmGSTU4-4, GmGST2, GmGST10 από Glycine max με τη μέθοδο της ανασυναρμολόγησης του DNA. Προέκυψε βιβλιοθήκη διαφορετικών μεταλλαγμένων μορφών και πραγματοποιήθηκε έλεγχος ενζυμικής δραστικότητας και προσδιορισμός της ειδικής δραστικότητας έναντι του 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζολίου του ζιζανιοκτόνου fluorodifen και του υπεροξειδίου του κουμενίου. Επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη η μορφή Sh14 η οποία εμφανίζει κατά περίπου 10 φορές υψηλότερη δραστικότητα έναντι του fluorodifen. Μελετήθηκε κινητικά και αναλύθηκε η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου και διαπιστώθηκε ότι από τις τέσσερις μεταλλάξεις που διαφοροποιούν τον άγριο τύπο από τη μορφή Sh14 αυτή που πιθανότατα επηρεάζει τις κινητικές σταθερές είναι η Trp114Cys. Το παραπάνω συμπέρασμα επιβεβαιώθηκε και με κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Η μορφή Sh14 (καθώς και ο άγριος τύπος του ένζυμου) υποβλήθηκαν σε χημική τροποποίηση χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια Φαινυλο-μεθυλο-σουλφονυλο-φθορίδιο και όξινο σεληνιούχο νάτριο και έγινε έλεγχος στο τροποποιημένο ένζυμο δραστικότητας έναντι του υδρουπεροξειδίου του κουμενίου. Η χημικά τροποποιημένη μορφή Sh14 επέδειξε σημαντική αύξηση στη σταθερά εξειδίκευσης για το υπόστρωμα υδρουπεροξείδιο του κουμενίου. Επίσης πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενη εξέλιξη των ισοενζύμων GSTA1-1 από άνθρωπο και αρουραίο με τη μέθοδο της ανασυναρμολόγησης του DNA. Από τη διαδικασία αυτή προέκυψε βιβλιοθήκη ανασχεδιασμένων μορφών του ενζύμου και επιλέχθηκε μια μεταλλαγμένη μορφή για περεταίρω μελέτη. Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παρουσιάζει υψηλή συγγένεια ως προς το υπόστρωμα GSH. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση Cys112 έτσι ώστε να δημιουργηθεί μια ανθεκτικότερη μορφή του ενζύμου σε οξειδωτικές συνθήκες. Από τη μελέτη επιλέχθηκε η μορφή Cys112Ser η οποία παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για το GSH και παραμένει σταθερή από την επίδραση των οξειδωτικών παραγόντων Cu⁺² και Η₂Ο₂. Τέλος, μελετήθηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά των παραπάνω μεταλλαγμένων μορφών και των άγριων τύπων του ενζύμου σε προσροφητή συγγένειας με ακινητοποιημένο GSH.