Порівняння систем GeneXpert MTB/RIF і GenoType зі стрипами MTBDRplus для виявлення мутацій, пов’язаних із резистентністю M. tuberculosis до рифампіцину при туберкульозі
Authors: Журило О.А. , Барбова А.І. , Трофімова П.С. , Чередник Ю.О. , Павлова О.В. , Чернов О.В. 
Published: February 2023

Мета. Проаналізувати рівень відповідності двох молекулярно-генетичних методів – GeneXpert MTB/RIF і GenoTypeDRplus – щодо визначення медикаментозної чутливості Mycobacterium tuberculosis (МБТ) до рифампіцину (R) при виявленні мутацій у ділянці RRDR, пов’язаних зі стійкістю до препарату.

Матеріали та методи. Досліджувалися штами MБТ зі стійкістю до R, що була виявлена будь-яким із молекулярно-генетичних методів, які вивчаються. Відібрано 96 зразків мокротиння. Мазки мокротиння було досліджено на наявність кислотостійких бактерій шляхом мікроскопії після забарвлення за методом Циля – Нільсена. Посів матеріалу здійснювали в бульйон Middlebrook 7Н9 і щільне середовище Левенштейна – Єнсена. Інкубація рідкого середовища проводилася в системі ВАСТЕС МGIТ. Для ідентифікації штамів використовували імунохроматографічний тест. Тест медикаментозної чутливості MБТ до R виконувався в системі ВАСТЕС МGIТ. Тест GeneXpert MTB/RIF виконувався відповідно до інструкції виробника. Аналіз GenoTypeDRplus проводили на дезактивованих і концентрованих зразках мокротиння. Процес здійснювався в три етапи: екстракція ДНК з обробленого зразка мокротиння; ампліфікація ділянки RRDR за допомогою ПЛР; гібридизація продукту ПЛР на специфічних олігонуклеотидних зондах, іммобілізованих на тест-смужці. Для секвенування виділення ДНК МБТ здійснювали набором QIAamp® DNA Mini Kit. Концентрацію ДНК вимірювали на спектрофотометрі Denovix Quantus. Ампліфікація таргетної панелі проводилася за допомогою набору Deeplex Myc-TB. Очищення ампліконів виконували за допомогою магнітних кульок Agencourt AMPure XP. Кількісний аналіз очищених продуктів ампліфікації виконували флуориметром Qubit. Підготовка бібліотеки ДНК М. tuberculosis для секвенування зразків проводилася за допомогою набору Nextera XT DNA library preparation kit. Для бібліотеки використовували 5,0 мкл вихідної ДНК із концентрацією 0,2 нг/мкл. Секвенування виконувалося на обладнанні MiSeq із виконанням протоколу нормалізації та денатурації бібліотеки.

Результати та їх обговорення. Системи GeneXpert MTB/RIF і MTBDRplus націлені на одну й ту саму ділянку визначення резистентності R – 81 п. о. (RRDR) субодиниці бактеріальної РНК-полімерази (rpoB) для виявлення мутацій із використанням ДНК-зондів, тобто є відповідність зондів один одному й очікувана схожість зв’язування зондів. Нами проведено аналіз усіх зразків мокротиння з використанням методів GeneXpert MTB/RIF і GenoType MTBDRplus і фенотипового ВАСТЕС MGIT. Встановлено рівень відповідності двох молекулярно-генетичних методів виявлення пов’язаних із R мутацій у ділянці RRDR. Зону RRDR 81bp гена rpoB неузгоджених випадків було вивчено за допомогою секвенування.

GeneXpert MTB/RIF і GenoType DRplus збігалися з фенотиповим методом, відповідно, в 92,7 та 89,6 % випадків резистентності MБТ. Повний збіг результатів GeneXpert MTB/RIF і GenoTypeMTBDRplus відзначався в 92,7 % випадків. GeneXpert MTB/RIF і GenoType DRplus показали схожу схему збою зв’язування зондів дикого типу (WT-зондів) при скануванні ділянки 81 п. о. (RRDR), що призводить до діагностики стійкості через програмне забезпечення відмови зонда. Секвенування RRDR-ділянки «невідповідних» штамів показало, що зонди GeneXpert виявили сім таких випадків правильно, а GenoTypeDRplus був помилковим у всіх випадках. GeneXpert продемонстрував велику точність у виявленні R-стійкості для неузгоджених ізолятів порівняно з GenoTypeDRplus. GeneXpert MTB/RIF має низку інших переваг порівняно з GenoTypeDRplus. GeneXpert MTB/RIF відносно легше виконувати, вимоги до біологічної безпеки мінімальні, передбачаються менший час для дослідження й більша автоматизація процесу, що забезпечує нижчу ймовірність людських помилок і вищий рівень відтворюваності результатів. З огляду на ці факти та результати GeneXpert MTB/RIF, отримані в дослідженні, рекомендовано використовувати цей метод для виявлення мультирезистентного туберкульозу.

Висновки. Секвенування 81bp ділянки RRDR неузгоджених штамів M. tuberculosis показало, що GeneXpert MTB/RIF виконував аналіз точніше, ніж GenoTypeDRplus, у разі виявлення мутацій, пов’язаних зі стійкістю до R.

GeneXpert MTB/RIF відносно легше виконувати, вимоги до біологічної безпеки мінімальні, передбачаються менший час для дослідження й більша автоматизація процесу, що забезпечує нижчу ймовірність людських помилок і вищий рівень відтворюваності результатів, тому доцільно використовувати його для виявлення мультирезистентного туберкульозу.

Аналітичне рішення Deeplex Myc-TB дає можливість отримати великий обсяг вагомої інформації з маркерів медикаментозної стійкості до антимікобактеріальних препаратів і прискорити процес аналізу даних завдяки зручному використанню програмного забезпечення.