Μελέτη του γονιδίου PRAME (εκλεκτικά εκφραζόμενου αντιγόνου μελανώματος) και του γονιδίου WT1 (Wilms' Tumour 1) σε αιματολογικές κακοήθειες της παιδικής ηλικίας
Authors: Σπανάκη Αδριανή 
Published: August 2021

Το γονίδιο PRAME εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε φυσιολογικούς ιστούς, ενώ έχει αναφερθεί αυξημένη έκφραση PRAME σε συμπαγείς όγκους, και αιματολογικές κακοήθειες ενηλίκων. Το γονίδιο WT1 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στο φυσιολογικό μυελό των οστών και στο περιφερικό αίμα και έχουν προσδιορισθεί υψηλά επίπεδα σε πολλές αιματολογικές κακοήθειες. Η έκφραση των παραπάνω γονιδίων στην οξεία λευχαιμία της παιδικής ηλικίας έχει μελετηθεί ελάχιστα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του PRAME και WT1 στο μυελό των οστών παιδιών στη διάγνωση της οξείας λευχαιμίας με τη χρήση RT-PCR και η συσχέτιση της έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων με καθιερωμένους προγνωστικούς παράγοντες και την κλινική έκβαση της νόσου. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών από 17 παιδιά στην διάγνωση ή υποτροπή οξείας λευχαιμίας (ΟΛΛ, ΟΜΛ). Σαν ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα μυελού οστών από παιδιά με μη κακοήθη αιματολογικά νοσήματα ή συμπαγείς όγκους χωρίς διήθηση μυελού των οστών. Χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας η κυτταρική σειρά Κ562. Απομονώθηκε ολικό RNA από δείγματα μυελού των οστών με εφαρμογή πρότυπου πρωτοκόλλου για δείγματα συντηρημένα στους -80°C. Ακολούθησε αντίστροφη μεταγραφή και μελέτη της έκφρασης των δύο γονιδίων με RT-PCR. Η σχετική έκφραση του PRAME υπολογίσθηκε με βάση τις τιμές για την Κ562, ενώ οι τιμές του WT1 εκφράζονται σε σχέση με αντίγραφα του ABL γονιδίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης PRAME κυμαίνονταν από μη ανιχνεύσιμα έως πολύ χαμηλά στην ομάδα ελέγχου. Η μέση τιμή της σχετικής έκφρασης του PRAME ήταν 0.11.±0.06x10⁻⁴ (εύρος 0- 0.46x10⁻⁴). Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά για το γονίδιο PRAME αν η έκφρασή τους ήταν μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από τη μέση τιμή της αντίστοιχης έκφρασης της ομάδας ελέγχου. Η σχετική έκφραση του PRAME στο σύνολο της ομάδας των ασθενών ανέδειξε μία μέση τιμή 7.57±4.04x10⁻⁴ (εύρος 0-67.2x10⁻⁴). Υψηλά επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν στο 52.9% των ασθενών (3 ΟΜΛ, 6 ΟΛΛ) και η μέση τιμή της σχετικής έκφρασης του PRAME στη συγκεκριμένη υποομάδα των ασθενών ήταν 14.3±2.9x10⁻⁴ (εύρος 1.12-67.2x10⁻⁴). Η διαφορά στην έκφραση του PRAME ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ των PRAME θετικών ασθενών και του συνόλου της ομάδας των ασθενών (p=0.049) και ανάμεσα στους PRAME θετικούς και στους PRAME αρνητικούς ασθενείς (p=0.00). Τα επίπεδα έκφρασης του WT1 κυμαίνονταν από μη ανιχνεύσιμα έως πολύ χαμηλά στα δείγματα της ομάδας ελέγχου. Η μέση τιμή των αντιγράφων WT1/10⁴ αντίγραφα ABL στην ομάδα ελέγχου ήταν 80.2±25.6 (εύρος 0.1- 178). Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά για WT1 αν η έκφρασή τους ήταν μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από το μέσο όρο της αντίστοιχης έκφρασης της ομάδας ελέγχου. Η Κ562 είχε υψηλή έκφραση (7896 αντίγραφα WT1/10⁴ αντίγραφα ABL). Η έκφραση του WT1 μελετήθηκε στη διάγνωση 14 παιδιών με οξεία λευχαιμία. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του WT1 σε ολόκληρη την ομάδα των ασθενών ανέδειξε μέση τιμή αντιγράφων 1559.71 ±810.11 WT1/10⁴ αντίγραφα ABL (εύρος 15-10542). Πέντε από τους 14 ασθενείς (35.7%) παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης WT1 με μέση τιμή 4250±1776.41 αντίγραφα WT1/10⁴ αντίγραφα ABL (εύρος 977-10542). Η διαφορά στην έκφραση του WT1 ήταν στατιστικά σημαντική ανάμεσα στους WT1 θετικούς ασθενείς και στην ομάδα ελέγχου (p=0.03) και ανάμεσα στους WT1 θετικούς και στους WT1 αρνητικούς ασθενείς (p=0.01). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του PRAME και σε κλινικά χαρακτηριστικά, όπως ηλικία, φύλο, αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων διάγνωσης, ανταπόκριση στη θεραπεία και συνολική επιβίωση στο 52.9% των ασθενών, οι οποίοι βρέθηκαν θετικοί για PRAME στην παρούσα μελέτη. Σημαντικά επίπεδα έκφρασης του WT1 παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 35.7% των παιδιών στη διάγνωση οξείας λευχαιμίας. Στην παρούσα μελέτη, οι ασθενείς που ήταν θετικοί για WT1, με την εξαίρεση ενός, είχαν δυσμενή κλινική έκβαση. Η πλειονότητα των WT1 αρνητικών ασθενών συνεχίζουν να βρίσκονται σε πλήρη ύφεση. Έξι από τους εννέα (66%) ασθενείς που ήταν αρνητικοί για WT1, βρέθηκαν θετικοί για PRAME. Δύο από τους πέντε ασθενείς που ήταν θετικοί για WT1 δεν είχαν ανιχνεύσιμα επίπεδα PRAME. Το γεγονός ότι δεν ανιχνεύονται σε όλους τους ασθενείς και τα δύο γονίδια υποδεικνύει ότι ένας πιθανός συνδυασμός των παραπάνω γονιδίων μπορεί να αυξήσει τις πιθανότητες ανίχνευσης μοριακής υποτροπής σε ασθενείς με οξεία λευχαιμία. Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν αυξημένη έκφραση τόσο του γονιδίου WT1 όσο και του γονιδίου PRAME σε σημαντικό ποσοστό παιδιών με οξεία λευχαιμία κατά τη διάγνωση, εύρημα που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί και στη χρήση των γονιδίων αυτών ως μοριακών δεικτών στην οξεία λευχαιμία της παιδικής ηλικίας.