Ο ρόλος του CRH στην in vitro ανάπτυξη αρχέγονων ωοθυλακίων και η δράση αυτού στην εμφύτευση
Authors: Ντινοπούλου Βασιλική 
Published: August 2021

ΕισαγωγήΗ ορμόνη CRH (corticotropin releasing hormone, εκλυτική ορμόνη της φλοιοτρόπου ορμόνης) είναι ένα νευροπεπτίδιο που αποτελεί το βασικό ρυθμιστή του άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-επινεφρίδια (HPA axis). Εντοπίζεται στους περισσότερους γυναικείους αναπαραγωγικούς ιστούς, περιλαμβανομένου του πλακούντα, της μήτρας και των ωοθηκών, και αλληλεπιδρά με δύο υποδοχείς τον υποδοχέα 1 της CRH, CRH-R1 και τον υποδοχέα 2 της CRH, CRH-R2. Σύμφωνα με προηγούμενες έρευνες σε γυναίκες με επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης διαπιστώθηκε αύξηση των ποσοστών κυήσεων έπειτα από ενδομητρική έγχυση μονοκυττάρων περιφερειακού αίματος (PBMCs) ενισχυμένα με hCG ή/και CRH. Η CRH είναι μία ορμόνη κλειδί κατά τη φθαρτοποίηση του ενδομητρίου αλλά και κατά την ανοσοανοχή μητέρας-εμβρύου. Επιπλέον, οι ιντεγκρίνες είναι μία οικογένεια διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών με την αvβ3 να έχει προταθεί ως ένας πιθανός υποδοχέας πρόσδεσης του εμβρύου και την ανβ5 να είναι παρούσα στο ενδομήτριο την ώρα της εμφύτευσης.Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν να ερευνήσει το ρόλο της CRH στην in vitro ανάπτυξη των προκοιλοτικών ωοθυλακίων ποντικού. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε η επίδραση της ορμόνης CRH και του αναστολέα της, ανταλαρμίνη, στην in vitro ωρίμανση προκοιλοτικών ωοθυλακίων ποντικού, στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη αλλά και στη στεροειδογένεση, στην παραγωγή γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών και μιας πεπτιδικής ορμόνης. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε Real-Time PCR για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τον CRH-R1 και τον CRH-R2 στα προκοιλοτικά ωοθυλάκια ποντικού και στα έμβρυα ποντικού σταδίου 2-,4- και 8-κυττάρων και μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων. Στην παρούσα μελέτη επιλέξαμε να αξιολογήσουμε επίσης την επίδρασης της CRH στην εμφύτευση, σε συσχέτιση με την έκφραση των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και ιντεγκρινών, σε γυναίκες που συμμετείχαν στο πρόγραμμα εξωσωματικής γονιμοποίησης και είχαν παραπάνω από δύο αποτυχημένες προσπάθειες εμφύτευσης.Υλικά και ΜέθοδοιΘηλυκά ποντίκια F1 12-14 ημερών θυσιάστηκαν και οι ωοθήκες τους απομονώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε καλλιεργητικό μέσο DPBS ενισχυμένο με 10% BSA (Bovine Serum Alboumin). Απομονώθηκαν μηχανικά τα ωοθυλάκια τα οποία καλλιεργήθηκαν για 11 ημέρες σε a-MEM ενισχυμένο με FSH, LH, ITS and FBS, με ή χωρίς την προσθήκη CRH σε συγκέντρωση 10-7 mol/L και με CRH 10-7 mol/L και antalarmin 10-6 mol/L. Κάθε 48 ώρες γινόταν ανανέωση του καλλιεργητικού μέσου το οποίο φυλασσόταν στην κατάψυξη για τη μετέπειτα μέτρηση οιστραδιόλης, προγεστερόνης, τεστοστερόνης, β-hCG, FSH, LH και προλακτίνης με την ανοσολογική μέθοδο της ηλεκτροχημειοφωταύγειας. Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας προστέθηκαν 1.5 IU/ml HCG and 5 ng/ml EGF με σκοπό την ωορρηξία. Την 11η ημέρα εκτιμήθηκαν τα «σύμπλοκα» ωαρίων-κοκκωδών κυττάρων (COCs, Cummulus-oocyte complexes) και μεταφέρθηκαν έπειτα από την θυσία αρσενικών ποντικών F1 για in vitro γονιμοποίηση. Τα έμβρυα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε Ham's F10/BSA σε αναλογία 9/1 με σκοπό να εκτιμηθεί η πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη. Τέλος ολικό RNA απομονώθηκε από τα προκοιλοτικά ωοθυλάκια τις ημέρες καλλιέργειας 3, 5, 7, 9 και 11 όπως επίσης και από τα εμβρυικά στάδια 2-,4- και 8-κυττάρων και μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων με σκοπό να γίνει Real-Time RT-PCR για τη μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων CRH-R1 και CRH-R2.Το κλινικό πειραματικό πρωτόκολλο περιλάμβανε τρία στάδια σε αντιστοιχία τριών έμμηνων κύκλων των 7 γυναικών που συμμετείχαν στη συγκεκριμένη κλινική μελέτη. Ο πρώτος έμμηνος κύκλος ήταν φυσικός κύκλος και λειτουργούσε ως κύκλος ελέγχου για κάθε γυναίκα ξεχωριστά ενώ λαμβάνονταν δύο βιοψίες από τις γυναίκες, 5 ημέρες μετά την hCG και 8 ημέρες μετά την hCG. Ο δεύτερος κύκλος ήταν επίσης φυσικός αλλά σε αυτόν γινόταν απομόνωση των PBMCs, επεξεργασία με CRH και hCG, έγχυση στο ενδομήτριο και λαμβάνονταν και πάλι βιοψίες. Έπειτα ακολούθησε απομόνωση γενετικού υλικού και με τη βοήθεια της Real Time PCR έγινε μελέτη της έκφρασης των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και των ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 πριν και μετά την έγχυση με CRH. Στον τρίτο κύκλο οι ασθενείς έπαιρναν τα ανάλογα φάρμακα για πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας. Ταυτόχρονα γινόταν και εδώ απομόνωση των PBMCs, επεξεργασία με CRH και hCG και έγχυση στο ενδομήτριο με τη διαφορά ότι σε αυτό τον κύκλο πραγματοποιούσαμε τελικά εμβρυομεταφορά για να αξιολογήσουμε τα ποσοστά κυήσεων. ΑποτελέσματαΚαλλιεργήσαμε 732 ωοθυλάκια στην ομάδα ελέγχου, 1306 ωοθυλάκια στην ομάδα CRH 10-7 και 1202 ωοθυλάκια στην ομάδα CRH 10-7/antalarmin 10-6. Τα ποσοστά ωρίμανσης για την ομάδα ελέγχου ήταν 33,6% ενώ για την ομάδα CRH 10-7 26,18% εμφανίζοντας στατιστικά σημαντική μείωση (p<0,001). Επίσης στατιστικά σημαντική διαφορά υπήρξε μεταξύ της ομάδας ελέγχου και τη ομάδας CRH 10-7 σε όλα τα στάδια ανάπτυξης των προεμφυτευτικών εμβρύων όπως και μεταξύ της ομάδας CRH 10-7 και της ομάδας CRH 10-7/antalarmin 10-6. Η εκτίμηση του ορμονολογικού προφίλ έδειξε ότι η ομάδα CRH έχει αισθητά χαμηλότερα επίπεδα οιστραδιόλης, προγεστερόνης, τεστοστερόνης και β-χοριακής όσο αυξάνονται οι ημέρες καλλιέργειας σε σχέση με τις άλλες 2 ομάδες (p-value<0,05). Η Real-Time RT-PCR έδειξε ότι οι υποδοχείς CRH-R1, -R2 ανιχνεύονται σε όλα τα στάδια καλλιέργειας των προκοιλοτικών ωοθυλακίων ενώ σε ότι αφορά τα προεμφυτευτικά έμβρυα, μόνο στο μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων ανιχνεύεται ο CRH-R1.Στο κλινικό πρωτόκολλο έγινε σύγκριση της έκφρασης των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 στο ενδομήτριο πριν και μετά την έγχυση με CRH, 5 ημέρες μετά την hCG και 8 ημέρες μετά την hCG. Παρατηρήθηκε μία τάση μείωσης της έκφρασης της CRH η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική ενώ η μείωση των υποδοχέων CRH-R1, R2 ήταν στατιστικά σημαντική. Για τις ιντεγκρίνες υπήρξε μία τάση αύξησης της έκφρασης χωρίς να είναι στατιστικά σημαντική. Επίσης δεν υπήρξε στατιστική σημαντικότητα στα ποσοστά κυήσεων των γυναικών (3/7 έμειναν έγκυος, 42,9%, p> 0,05 Μc Nemar test) όταν συγκρίθηκαν με τη μη ύπαρξη κύησης στους προηγούμενους κύκλους πριν την έγχυση με CRH.Συμπεράσματα Στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι η CRH είχε αρνητική επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη και ωρίμανση όπως επίσης βρέθηκε μια στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ανάπτυξη των προεμφυτευτικών εμβρύων. Η προσθήκη του ειδικού CRH-R1 ανταγωνιστή, ανταλαρμίνη στις in vitro καλλιέργειες με CRH απέδωσε υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε όλα τα εμβρυικά στάδια, επιβεβαιώνοντας ότι η ανταλαρμίνη αναστρέφει την ανασταλτική δράση της CRH. Αποδείξαμε ότι η παρουσία του CRH σε μία in-vitro καλλιέργεια προκοιλοτικών ωοθυλακίων καταστέλλει τη στερεοειδογένεση ενώ ο υποδοχέας CRH-R1 ανιχνεύθηκε σε όλα τα στάδια καλλιέργειας των προκοιλοτικών ωοθυλακίων όπως και στα εμβρυικά στάδια του μοριδίου και της βλαστοκύστης. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την αρνητική επίδραση του CRH στα ποσοστά της πρώιμης εμβρυικής ανάπτυξης των in vitro γονιμοποιημένων ωαρίων. Εφόσον η CRH αποτελεί τη βασική ορμόνη του “stress”, θα μπορούσαμε χρησιμοποιώντας αυτή τη γνώση, να βελτιστοποιήσουμε την ποιότητα των ωαρίων αλλά και των πρώιμων εμβρύων κατά τη διάρκεια των τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης, ελέγχοντας τα επίπεδα “stress”των ασθενών.Επιπρόσθετα, σύμφωνα με αυτή την προκαταρτική κλινική πιλοτική μελέτη παρατηρήθηκε μία τάση αύξησης της έκφρασης των ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 και μία τάση μείωσης της έκφρασης της CRH στο ενδομήτριο πριν και μετά την έγχυση με CRH. Στατιστικά σημαντική όμως υπήρξε η μείωση στην έκφραση των υποδοχέων CRH-R1 και CRH-R2. Θα πρέπει να πραγματοποιηθούν περαιτέρω έρευνες ώστε να αυξήσουμε τον αριθμό των γυναικών και να αποδείξουμε την αποτελεσματικότητα της θεραπείας με CRH σε γυναίκες με επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης.