Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικών μεθόδων για προσδιορισμό φαρμάκων και βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα
Authors: Μπέγου Όλγα-Αγγελική 
Published: April 2021

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικών μεθόδων για την εύρεση φαρμάκων και βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα, μέσω της μεταβολομικής ανάλυσης. Η μεταβολομική αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο έρευνας που συνδυάζει σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές, όπως φασματομετρία μάζας, φασματοσκοπία NMR, με προηγμένα στατιστικά μοντέλα, με στόχο την ολιστική περιγραφή των ενδογενών ενώσεων που εμπεριέχονται στα διάφορα βιολογικά υποστρώματα (βιολογικά υγρά, ιστοί, τρόφιμα, κ.α.). Βρίσκει εφαρμογή σε πληθώρα επιστημών, όπως οι επιστήμες ζωής, η βιολογία, η χημεία, κ.α., ενώ παράλληλα απαιτεί τη χρήση της βιοπληροφορικής προκειμένου να αναλυθεί ο μεγάλος όγκος δεδομένων που προκύπτει. Στις επιστήμες ζωής, η μεταβολομική χρησιμοποιείται ως πολυδύναμο εργαλείο για τη διερεύνηση του μεταβολικού προφίλ στην έγκαιρη διάγνωση νόσων, στην εξατομικευμένη θεραπεία, καθώς και στην αποτελεσματικότητα φαρμάκων ή στην τοξικότητα αυτών. Οι νέοι, εξαγόμενοι βιοδείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως περισσότερο αποτελεσματικό και λιγότερο επεμβατικό μέσο για τον σκοπό αυτό. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί, που δυσχεραίνουν την εφαρμογή της μεταβολομικής σε μεγάλης κλίμακας αναλύσεις σημαντικού αριθμού δειγμάτων. Για παράδειγμα, υπάρχοντες βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για ορισμένες ασθένειες διάγνωσης και παρακολούθησης, όπως π.χ. διαταραχές του θυρεοειδούς αδένα (συγγενής υποθυρεοειδισμός), νεφρική δυσλειτουργία σε βρέφη και νεογνά με συγγενή στένωση της πυελοουρητηρικής συμβολής (ΣΠΟΥΣ) και των καρδιαγγειακών παθήσεων (CAD) χαρακτηρίζονται από χαμηλή ειδικότητα. Επίσης, πολλοί από τους μεταβολίτες και τα ένζυμα κατανέμονται ευρέως στα νεογνά, ειδικά σε εκείνα που γεννιούνται πρόωρα, δίνοντας ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Άλλοι περιορισμοί έγκεινται στη χαμηλή αναπαραγωγιμότητα της μέτρησης ή στη δυσκολία ανάλυσης συγκεκριμένων κατηγοριών ενώσεων, όπως πολύ πολικών ενώσεων ή μη πολικών (π.χ. λιπίδια). Επιπροσθέτως, σε ορισμένες περιπτώσεις η ανάλυση ενδογενών ενώσεων είναι δύσκολη λόγω της απουσίας “λευκών” υποστρωμάτων ή κάποιου Πιστοποιημένου Υλικού Αναφοράς (Certified Reference Material, CRM), ενώ πολλές φορές σημαντικό πρόβλημα αποτελεί και η μόλυνση του αναλυτικού συστήματος από τα διάφορα βιολογικά υποστρώματα, ιδίως στην περίπτωση της υγρής χρωματογραφίας, οδηγώντας έτσι σε μειωμένη αποτελεσματικότητα της μέτρησης. Επομένως, η αποτελεσματική αντιμετώπιση των παραπάνω περιορισμών, έχει μεγάλη σημασία για την εφαρμογή της μεταβολομικής στην πράξη. Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας, επικεντρώνεται στην ανάπτυξη επικυρωμένων μεθόδων μεταβολομικής, καθώς και στην καθιέρωση βιβλιοθηκών δεικτών συγκράτησης στην υγρή χρωματογραφία, με στόχο την γρήγορη, αποτελεσματική και έγκυρη ταυτοποίηση άγνωστων ενώσεων σε μη στοχευμένες αναλύσεις μεταβολομικής. Η δημιουργία τέτοιων βιβλιοθηκών θα βοηθήσει στην αντιμετώπιση των προβλημάτων που προκύπτουν από την δυσκολία εύρεσης ή ακόμα και απουσίας αναλυτικών προτύπων, επισημασμένων προτύπων, καθώς και Πιστοποιημένων Υλικών Αναφοράς. Από την άλλη πλευρά, οι επιστήμες ζωής επικεντρώνονται στην ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών εργαλείων για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία διαφόρων ασθενειών με στόχο τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Για τους παραπάνω λόγους, επιστρατεύτηκαν τόσο στοχευμένες όσο και μη στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής για τον προσδιορισμό ενδογενών ενώσεων και ενός φαρμάκου σε διάφορα βιολογικά υποστρώματα. Όλα τα συλλεχθέντα βιολογικά δείγματα αναλύθηκαν με προηγμένες, “state-of-the-art” αναλυτικές πλατφόρμες, όπως είναι η αέρια και υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (GC-MS, UPLC-MS/MS, UHPLC-HRMS). Ακόμα, έγινε προσπάθεια εύρεσης του δείκτη συγκράτησης μιας πληθώρας ενδογενών ενώσεων, με σκοπό τη δημιουργία βιβλιοθήκης δεικτών συγκράτησης, η οποία θα μπορούσε να εφαρμοστεί καθολικά. Ο ακριβής προσδιορισμός του χρόνου συγκράτησης είναι πολύ σημαντικός στην επιβεβαίωση μιας άγνωστης ένωσης, ιδίως σε πολύπλοκα υποστρώματα. Συνήθως, η ταυτοποίηση μιας ένωσης βασίζεται στην απόλυτη αντιστοίχιση του χρόνου συγκράτησης και του φάσματος μαζών της άγνωστης ένωσης με μια αντίστοιχη πρότυπη ένωση. Ωστόσο, στην υγρή χρωματογραφία η διακύμανση του χρόνου συγκράτησης είναι συχνό φαινόμενο μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, οργάνων, αναλυτικών συστημάτων, κτλ., ενώ η χρήση πρότυπων ενώσεων αναφοράς δεν είναι πάντα εφικτή. Για αυτούς τους λόγους, μια πρόταση για την αντιμετώπιση του συγκεκριμένου προβλήματος, αποτελεί η δημιουργία – καθιέρωση βιβλιοθηκών δεικτών συγκράτησης καθολικού χαρακτήρα. Για το σκοπό αυτό, 95 ενδογενείς μεταβολές, συμπεριλαμβανομένων αμινοξέων, οργανικών οξέων, καρνιτινών, κ.α., καθώς και ένα υλικό αναφοράς αποτελούμενο από 20 ενώσεις μιας ομόλογης σειράς, αναλύθηκαν με μέθοδο υγρής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (RPLC-MS/MS). Ακολούθησε καταγραφή των χρόνων συγκράτησης για όλες τις ενώσεις, ενώ οι αντίστοιχοι δείκτες συγκράτησης υπολογίστηκαν με βάση την εξίσωση RI = RI0 + (RI1 - RI0) x [(RT-RT0)/(RT1-RT0)]. Παρόμοια πειραματική διαδικασία επιστρατεύτηκε και από άλλα 4 συνεργαζόμενα εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικές αναλυτικές πλατφόρμες, αλλά ακριβώς ίδιο αναλυτικό πρωτόκολλο, αναφορικά με την αναλυτική στήλη, την κινητή φάση, τη θερμοκρασία στήλης, τη ροή και τις πρότυπες ενώσεις. Τα δεδομένα που προέκυψαν, υπέδειξαν μια ικανοποιητική γραμμική συσχέτιση (R2> 0,8899) μεταξύ όλων των εργαστηρίων, αποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο την αναπαραγωγιμότητα, την ευρωστία των αποτελεσμάτων, αλλά και την εφαρμοσιμότητα μιας καθολικής βιβλιοθήκης μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων με διαφορετική οργανολογία. Οι επόμενες δυο μελέτες αφορούσαν την ανάπτυξη μεθόδων και επικύρωση αυτών για την ανάλυση ενός φαρμάκου στα ανθρώπινα ούρα και την ανάλυση τεσσάρων κηραμιδίων στον ανθρώπινο ορό, αντίστοιχα. Αρχικά, αναπτύχθηκε μέθοδος αέριας χρωματογραφίας – φασματομετρία μάζας (NICI-GC-MS) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ακεταζολαμίδης και άλλων σουλφοναμιδίων στα ανθρώπινα ούρα. Για πρώτη φορά γίνεται χρήση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης PFB-Br σε ήπιες συνθήκες για τον προσδιορισμό σουλφοναμιδίων. Η μέθοδος περιελάβανε μια έυκολη και γρήγορη προκατεργασία μικρού όγκου δείγματος ανθρώπινων ούρων (50 μL), παραγωγοποίηση των ενώσεων ενδιαφέροντος με 30% PFB-Br σε ACN (60 min, 30 °C), εξάτμιση μέχρι ξηρού και ανασύσταση με τολουόλιο. Ο προσδιορισμός της ακεταζολαμίδης και του αντίστοιχου εσωτερικού της προτύπου πραγματοποιήθηκε βάσει των παραγώγων R-SO2-N(PFB)2 με m/z 581 και m/z 584, αντίστοιχα. Η ακρίβεια και επαναληψιμότητα της μεθόδου κυμάνθηκε μεταξύ 95,3% - 109% και 0,3% - 4,2%, αντίστοιχα, ενώ το LOD και το LOQ ήταν 300 fmol και 1 μM, αντίστοιχα. Με την προτεινόμενη μέθοδο συν προσδιορίστηκαν τα σουλφοναμίδια μεθαζολαμίδη και δορζολαμίδη, υποδηλώνοντας ότι η χρήση του PFB-Br περιορίζεται στο μέγεθος της αλυσίδας της συγκεκριμένης κατηγορίας ενώσεων. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα ούρων ενήλικα εθελοντή, όπου πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της ακεταζολαμίδης σε διάφορα χρονικά σημεία πριν και μετά την κατανάλωση του φαρμακευτικού σκευάσματος Acemit. Η δεύτερη μέθοδος αφορούσε τον ποσοτικό προσδιορισμό τεσσάρων κηραμιδίων και συγκεκριμένα των Cer d18:1/16:0, Cer d18:1/18:0, Cer d18:1/24:0 και Cer d18:1/24:1, σε ανθρώπινο ορό με την τεχνική RPLC-MS/MS. Τα συγκεκριμένα κηραμίδια βρέθηκε ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως ο διαβήτης, οι καρδιαγγειακές παθήσεις, ο καρκίνος κ.α.. Διάφορα πρωτόκολλα προκατεργασίας δείγματος δοκιμάστηκαν για την ικανοποιητική εκχύλιση των κηραμιδίων από τον ανθρώπινο ορό, με την εκχύλιση υγρού-υγρού με διχλωρομεθάνιο:μεθανόλη, 2:1 v/v να παρουσιάζει τα βέλτιστα αποτελέσματα. Ωσττόσο, και η SLE παρουσίασε ικανοποιητικά αποτελέσματα, αναφορικά με την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα, την ανάκτηση εκχύλισης και την επίδραση του υποστρώματος. Το τελικό πρωτόκολλο προκατεργασίας δείγματος περιελάβανε εκχύλιση των ενώσεων ενδιαφέροντος από το υπόστρωμα, εξάτμιση της οργανικής φάσης μέχρι ξηρού και την ανασύσταση στην κινητή φάση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κηραμιδιων εξετάστηκε επίσης η χρήση υποκατάστατου υποστρώματος (surrogate matrix). Για το λόγο αυτό, 5% αλβουμίνη βόειου ορού συγκρίθηκε τόσο με μία εξωτερική καμπύλη, όσο και με αντίστοιχη καμπύλη σταθερής προσθήκης, δίνοντας ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η μέθοδος παρουσίασε καλή γραμμικότητα για όλες τις ενώσεις (R2>0,99), καθώς και ικανοποιητική ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Η ανάκτηση της εκχύλισης κυμάνθηκε από 82,2% έως 120,2% για όλα τα κηραμίδια. Και σε αυτή τη περίπτωση, η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα ασθενών με κάποια καρδιαγγειακή πάθηση προκειμένου να επιβεβαιωθεί η καταλληλότητα της μεθόδου σε αναλύσεις ρουτίνας. Τα επόμενα κεφάλαια παρουσιάζουν εφαρμογές της μεταβολομικής για την εύρεση βιοδεικτών σε δύο κλινικές μελέτες που αφορούν την πληθυσμιακή ομάδα των παιδιών και νεογνών και μία διατροφική παρέμβαση σε επίμυες. Η πρώτη μελέτη επικεντρώθηκε στο μεταβολικό προφίλ αποξηραμένων κηλίδων αίματος (dried blood spots, DBS) παιδιών με συγγενή υποθυρεοειδισμό (ΣΥ). Συνολικά, 36 δείγματα παιδιών με ΣΥ και 24 δείγματα υγιών μαρτύρων, αναλύθηκαν τόσο με στοχευμένη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας όσο και με μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση αέριας χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας. Από την στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση, μόνο 14 μεταβολίτες ανιχνεύτηκαν στο συγκεκριμένο υπόστρωμα συμπεριλαμβανομένων της κρεατινίνης, του βενζοϊκού οξέος, του νικοτιναμιδίου και άλλων, πιθανώς λόγω χαμηλής ευαισθησίας. Η στατιστική ανάλυση απέτυχε να αναδείξει οποιαδήποτε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Από την μη στοχευμένη ανάλυση που ακολούθησε, 347 μεταβλητές εξήχθησαν με τη χρήση των λογισμικών AMDIS και GaVIn, με τις 96 από αυτές να πληρούν όλα τα αναλυτικά κριτήρια. Από τη στατιστική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, τέσσερα αμινοξέα ξεχώρισαν και συγκεκριμένα το γλουταμινικό οξύ, η γλουταμίνη, η λυσίνη και η μεθειονίνη, με τα επίπεδά τους να είναι σημαντικά χαμηλότερα στην ομάδα του ΣΥ. Τα εξαγόμενα αποτελέσματα, έρχονται σε συμφωνία με τη διεθνή βιβλιογραφία, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι τα αμινοξέα είναι βασικές ενώσεις που σχετίζονται άμεσα με την κατάσταση του θυρεοειδούς αδένα. Η επόμενη μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάλυση συγκεκριμένου πάνελ μεταβολιτών, προκειμένου να βρεθούν τυχόν διαφορές μεταξύ του μεταβολικού προφίλ ορού και ούρων παιδιών και βρεφών με σοβαρή ή ήπια στένωση της πυελοουρητηρικής συμβολής (ΣΠΟΥΣ) συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες. Δύο στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής και συγκεκριμένα μία HILIC-MS/MS για τον προσδιορισμό 100 πολικών ενδογενών ενώσεων και μία GC-MS για την ανάλυση αμινοξέων και παραγώγων, καθώς και για τον προσδιορισμό του νιτρώδους, του νιτρικού και της μαλονδιαλδεΰδης, επιστρατεύτηκαν. Τόσο η μονοπαραμετρική όσο και η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση ξεχώρισε ένα πλήθος σημαντικών μεταβολιτών που διαφοροποιήθηκαν σημαντικά μεταξύ των δυο ομάδων. Μεταξύ των μεταβολιτών αυτών είναι η ομοκυστεΐνη, η χολίνη, η ισολευκίνη, η ομοαργινίνη, η μαλονδιαλδεΰδη και η ασύμμετρη διμεθυλαργινίνη στον ορό και το γλουταμινικό οξύ, ξανθίνη και η υποξανθίνη στα ούρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα πάνελ συγκεκριμένων μεταβολιτών μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην καθημερινή κλινική πράξη για την έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση και πρόγνωση της νόσου. Στο τελευταίο κεφάλαιο, αξιολογήθηκε η επίδραση του χαρουπιού στην καθημερινή δίαιτα επίμυων. Το χαρούπι θεωρείται υψηλής θρεπτικής αξίας τρόφιμο, καθώς είναι πλούσιο σε βιταμίνες, τανίνες και θρεπτικά συστατικά. Οι ευεργετικές επιδράσεις του χαρουπιού κατά του καρκίνου, του μεταβολικού συνδρόμου, του διαβήτη, της διάρροιας, της υπερλιπιδαιμίας και της γαστροοισοφαγικής παλινδρόμησης είναι μόνο μερικές από τις θεραπευτικές του δράσεις. Για το σκοπό αυτό, 8 αρσενικοί επίμυες τύπου Wistar τράφηκαν με σκόνη χαρουπιού για 15 συνεχόμενες ημέρες και συγκρίθηκαν με αντίστοιχη ομάδα επίμυων που δεν τράφηκε με χαρουπί. Δείγματα κοπράνων και ούρων συλλέχθηκαν σε 5 χρονικά σημεία (0, 1, 5, 10 και 15 ημέρες) και αναλύθηκαν τόσο με τη μέθοδο HILIC-MS/MS όσο και με τη μέθοδο RPLC-HRMS. Βάσει της στοχευμένης μεταβολομικής μελέτης, παρατηρήθηκε σαφής διαχωρισμός μεταξύ των δύο ομάδων την πρώτη και δέκατη πέμπτη ημέρα στα κόπρανα, ενώ ήπιες διαφορές παρατηρήθηκαν την πρώτη ημέρα στο υπόστρωμα των ούρων. Είκοσι ένας μεταβολίτες διαφοροποιήθηκαν στο υπόστρωμα των κοπράνων, συμπεριλαμβανομένων των αμινοξέων και των παραγώγων τους, των βιταμινών και των οργανικών οξέων, ενώ 7 μεταβολίτες βρέθηκαν να μεταβάλλονται σημαντικά στα δείγματα των ούρων. Από τη μη στοχευμένη προσέγγιση, σαφής διαχωρισμός μεταξύ των εξεταζόμενων ομάδων, παρατηρήθηκε στα κόπρανα τη 15η ημέρα. Είκοσι ένα μεταβλητές ξεχώρισαν στον θετικό ιονισμό, από τις οποίες ταυτοποιήθηκαν η φαινυλαλανίνη και το δωδεκανοδιοϊκό οξύ. Μεταβολές στο μεταβολικό ποφίλ των κοπράνων θα μπορούσαν ίσως να αποδοθούν σε βιοχημικές προσαρμογές που αντανακλούν τη διατροφική παρέμβαση.