Comparative study of in vitro cell based assays versus in vivo toxicity tests to monitor environmental hazard of pesticides
Authors:   , Alañón Ribas Maria del Pilar 
Published: October 2023

Carbofuran and chlorpyrifos are two well-known pesticides widely investigated, and its effects on different organisms have been previously reported in separate studies. For this reason were considered to be good model subtances, relevant from the environmental perspective. On the other hand, we selected this kind of compounds because they are used in many tones annually in agriculture and horticulture and they are significant especially in greenhouse-based production of vegetables and fruits in southern Europe, particularly Spain.<br><br/>The general objective of this work was to compare the response of in vitro assays using cell lines with assays using fish in vivo in order to contribute to the development of alternative methods to the use of laboratory animals. Furthermore, we compared two types of cells, a fish cell line from an established culture and mammalian cells obtained from a primary cell culture, in order to see if there are similar responses based on common mechanisms of toxicity. A better knowledge of these mechanisms facilitates the interspecies extrapolation of the impact of environmental contaminants, which is one of the major challenges to ecotoxicologists.<br><br/>In order to have a general point of view of the toxicity of these pesticides, single and in mixture, acute toxicity was evaluated using a battery of ecotoxicological model systems and indicators representative of a wide range of organisms. The systems studied included: RTG-2 fish cell line, primary cell cultures from bovine granulosa cells, the marine bacteria (Vibrio fischeri), three species of freshwater microalgae (Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum) and the vertebrates zebra fish (Danio rerio). Sublethal effects were also evaluated in both types of cells using several biomarkers such as assessment of the DNA damage as genotoxic indicator, inhibition of production of progesterone as indicator of the aromatase activity and inhibiton of acetylcholinesterase activity as indicator of exposure to pesticides measured also in zebra fish.<br> <br/>By comparing the obtained in vitro fish cell line and mammalian primary cell cultures results with currently used bacteria, algae and fish acute toxicity tests, it was possible to compare its sensitivity against these conventional toxicity tests.<br> <br/>As conclusions of the study we can say: 1) fish cell lines can be used as an alternative to the use of fish in laboratory; 2) the simultaneous use of in vitro fish cell lines with fish species allow to assess whether cellular responses in vitro could mimic toxicity responses of individual fish, thus to directly assess the ecological relevance of the proposed in vitro cell based test; 3) cell lines are the most sensitive bioassay of the studied battery; 4) the use of a battery of multispecies tests to determine the toxicity of any product is recommended; 5) The aquatic test using bacteria or microalgae are quite interesting, but they cannot be considered as a substitute for the studies on fish, because of they assess the effect of toxicants on other trophic levels, not on fish and 6) synergistic and antagonistic toxicity effects were observed with pesticide cocktails relative to pure compound toxicities.

Carbofuran i chlorpyrifos són dos pesticides àmpliament investigats. Els seus efectes en diferents organismes han estat prèviament estudiats en diferents treballs. Per aquesta raó es va considerar que serien bones substàncies model, rellevants des de una perspectiva medi ambiental. Per altra banda, aquesta classe de compostos són utilitzats anualment en moltes tones en agricultura i horticultura i són especialment importants en la producció de vegetals i fruites en hivernacles en el sud d'Europa, particularment en Espanya. <br><br/>L'objectiu general d'aquest treball és comparar la resposta de assaigs in vitro utilitzant cèl·lules amb assaigs in vivo utilitzant peixos, per tal de contribuir al desenvolupament de mètodes alternatius a l'ús d'animals de laboratori. A més a més dintre dels assaigs in vitro, és van comparar dos tipus de cèl·lules, una línia cel·lular establerta de peix i un cultiu primari de cèl·lules de mamífer, per veure les diferents respostes basades en mecanismes comuns de toxicitat. El fet d'assolir un millor coneixement d'aquestos mecanismes facilita l'extrapolació entre espècies per l'avaluació de l'impacte de contaminants medi ambientals, la qual cosa és un dels majors reptes dels ecotoxicolegs.<br><br/>La toxicitat aguda d'aquestos pesticides, individuals i en barreja, es va avaluar emprant una barreja de sistemes i indicadors de models ecotoxicològics . Els sistemes estudiats inclouen: la línia cel·lular RTG-2 , cultius primaris de cèl·lules de la granulosa d'ovaris de bovins, la bactèria marina Vibrio fischeri, tres espècies de microalgues, Chlorella vulgaris, Scenedesmus susbspicatus i Selenastrum capricornutum i com a model de vertebrat, el peix zebrafish, Danio rerio. Els efectes subletals també van ser avaluats en els dos tipus cel·lulars utilitzant biomarcadors, tals com l'avaluació del dany a l'ADN com indicador genotòxic, la inhibició de la producció de progesterona com indicador de l'activitat de l'aromatasa i la inhibició de la activitat de l'enzim acetilcolinestarasa com indicador de l'exposició als pesticides la qual també es va mesurar en zebra fish.<br><br/>Al comparar els resultats obtinguts amb la línia cel·lular de peix i els cultius primaris de mamífer amb els resultats dels tests de toxicitat aguda amb bactèries, microalgues i peixos, va estar possible comparar la sensibilitat de les cèl·lules respecte els test de toxicitat convencionals.<br><br/>Es poden extreure les següents conclusions d'aquest estudi:1) les línies cel·lulars poden ser utilitzades com alternativa al ús de peixos en laboratori; 2) l'utilització simultània de línies cel·lulars derivades de peixos amb peixos in vivo permet avaluar si les respostes in vitro poden imitar les respostes de toxicitat obtingudes amb els peixos, així es permet avaluar la rellevància ecològica del test basat en cèl·lules in vitro; 3) les línies cel·lulars són el bioassaig més sensible dels utilitzats en aquesta bateria; 4) es recomana l'ús d'una bateria de test multiespècies per determinar la toxicitat de qualsevol producte; 5) els tests aquàtics que empren bactèries o microalgues són interessants però no poden considerar-se substitutius dels estudis amb peixos, perquè avaluen l'efecte dels tòxics a un altra nivell tròfic i ; 6) s'observen efectes toxicològics sinèrgics i antagonistes quan s'utilitzen les barreges de pesticides en front dels compostos purs.

Carbofuran y chlorpyrifos son dos pesticidas ampliamente investigados. Sus efectos en diferentes organismos han sido previamente estudiados en diferentes trabajos. Por esta razón se considero que serian unas buenas sustancias modelo, relevantes desde una perspectiva medioambiental. Por otra parte, esta clase de compuestos son utilizados anualmente en muchas toneladas en agricultura y horticultura y son especialmente importantes en la producción de vegetales y frutas en invernaderos en e l sur de Europa, particularmente en España.<br><br/>El objetivo general de este trabajo es comparar la respuesta de los ensayos in vitro utilizando células y los ensayos in vivo utilizando peces, para contribuir al desarrollo de métodos alternativos al uso de animales de laboratorio. Además dentro de los estudios in vitro se compararon dos tipos de células, una línea celular establecida de pez y un cultivo primario de células de mamífero, para ver las diferentes respuestas basadas en mecanismos comunes de toxicidad. El hecho de alcanzar un mejor conocimiento de estos mecanismos facilita la extrapolación entre especies para la evaluación del impacto de contaminantes medio ambientales, lo cual es uno de los mayores retos de los ecotoxicólogos.<br><br/>La toxicidad aguda de estos pesticidas, individuales y en mezcla, se evaluó utilizando una mezcla de sistemas y indicadores de modelos ecotoxicológicos. Los sistemas estudiados incluyen: la línea celular RTG-2, cultivos primarios de células de granulosa de ovarios bovinos, la bacteria marina Vibrio fischeri, tres especies de microalgas, Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus y Selenastrum capricornutum como modelo de vertebrado, el pez zebra fish, Danio rerio. Los efectos subletales también fueron evaluados en los dos tipos celulares utilizando biomarcadores tales como la evaluación del daño al ADN como indicador geonotóxico, la inhibición de la producción de progesterona como indicador de la actividad aromatasa y la inhibición de la actividad del enzima acetilcolinesterasa como indicador de la exposición a los pesticidas la cual también se midió en zebra fish.<br><br/>Al comparar los resultados obtenidos con la línea celular de pez y los cultivos primarios de mamífero con los resultados de los tests de toxicidad aguda con bacterias, microlagas y peces, fue posible comparar la sensibilidad de las células con los test de toxicidad convencionales.<br><br/>Se pueden extraer las siguientes conclusiones de este estudio: 1) las líneas celulares pueden ser utilizadas como alternativa al uso de peces en laboratorio; 2) la utilización simultánea de líneas celulares derivadas de peces con los peces in vivo permite evaluar si las respuestas in vitro pueden imitar las respuestas de toxicidad obtenidas con los peces in vivo, así se permite evaluar la relevancia ecológica del test basado en células in vitro; 3) las líneas celulares son el bioensayo más sensible de los utilizados en esta batería; 4) se recomienda el uso de una batería de test multiespecies para determinar la toxicidad de cualquier producto; 5) los test acuáticos que utilizan bacterias o microalgas son interesantes pero no pueden considerarse substitutos de los estudios con peces, porque evalúan el efecto de los tóxicos a otro nivel trófico y; 6) se observan efectos toxicológicos sinérgicos y antagonistas cuando se utilizan las mezclas de pesticidas respecto los compuestos puros.