Επίδραση της ωκυτοκίνης στην in vivo και in vitro ανάπτυξη εμβρύων μυών, και η έκφραση του υποδοχέα της κατά την περίοδο της εμφύτευσης του προ-εμβρύου στη μήτρα
Authors: Μπερέτσος Παναγιώτης 
Published: August 2021

Η ωκυτοκίνη είναι μια μικρή, πεπτιδική ορμόνη, το προπεπτίδιο της οποίας συντίθεται κυρίως στα γιγαντοκύτταρα των νευρώνων του παρακοιλιακού και του υπεροπτικού πυρήνα του υποθαλάμου. Η σύνθεση της ωκυτοκίνης σε μικρότερες συγκεντρώσεις έχει επιβεβαιωθεί και σε άλλα όργανα και ιστούς, όπως είναι η μήτρα, οι ωοθήκες, το ωχρό σωμάτιο, οι όρχεις, η καρδιά, κ.α. Δρα μέσω του υποδοχέα της (OTR) και συμμετέχει, ως ένα βαθμό, σε πλήθος αναπαραγωγικών διαδικασιών, εκ των οποίων η σύσπαση των λειών μυών της μήτρας κατά τον τοκετό και η διέγερση της διαδικασίας του θηλασμού είναι αυτές που έχουν περισσότερο μελετηθεί και κατανοηθεί. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες διαπιστώνουν τη συμμετοχή του συστήματος OT/OTR στη διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (πλειοδύναμα κύτταρα της εσωτερικής μάζας της βλαστοκύστης) ποντικού in vitro, καθώς και την πιθανή εμπλοκή του στη διαφοροποίηση και στον πολλαπλασιασμό διαφόρων τύπων κυττάρων. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης διερευνήθηκε η επίδραση της ωκυτοκίνης στην in vitro ανάπτυξη προ-εμβρύων ποντικού, καθώς και η παρουσία του υποδοχέα της τόσο σε προ-έμβρυα όσο και σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού. Πέραν τούτου, παρόλο που η δράση της ωκυτοκίνης έχει μελετηθεί εκτενώς στο μυομήτριο κατά τον τοκετό, η ενδεχόμενη σύνθεση της ορμόνης και του υποδοχέα της στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού κύκλου, καθώς και οι ρόλοι τους, παραμένουν αρκετά ασαφείς. Για αυτό τον λόγο, διερευνήθηκε η έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο του ποντικού κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της κύησης, με έμφαση στο «παράθυρο» της εμφύτευσης του προ-εμβρύου στη μήτρα. Προς συμπλήρωση των παραπάνω, μελετήθηκε ταυτόχρονα η παρουσία της ωκυτοκίνης καθώς και ενός εκ των ρυθμιστών της έκφρασης του γονιδίου του υποδοχέα, της ιντερλευκίνης-6 (IL-6). Προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση της ωκυτοκίνης στην ανάπτυξη του προ-εμβρύου του ποντικού ελήφθησαν γονιμοποιημένα ωάρια από ποντίκια και καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ωκυτοκίνης (10⁻⁴ - 10⁻⁷ Μ), αφού πριν είχε επιβεβαιωθεί η έκφραση του mRNA για τον υποδοχέα σε διάφορα στάδια της ανάπτυξής του (ώριμο ωάριο, ζυγωτό, προ-έμβρυο σταδίου ανάπτυξης των 4-κυττάρων, μορίδιο και βλαστοκύστη) με την εφαρμογή της μεθόδου της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτής πολυμεράσης (RT-PCR). Σε καλλιεργημένα προ-έμβρυα παρουσία ωκυτοκίνης, τόσο το ποσοστό ανάπτυξης βλαστοκύστης όσο και η ποιότητα αυτής φάνηκαν να μην επηρεάζονται από την παρουσία της ορμόνης (p>0.05). Εντούτοις, με τη χρήση της RT-PCR και της μεθόδου της ανοσοστύπωσης (Western Blot) επιβεβαιώθηκε η έκφραση του mRNA για την ωκυτοκίνη και η σύνθεση της ορμόνης από τα αναπτυσσόμενα προ-έμβρυα κατά τη διάρκεια της in vitro καλλιέργειάς τους, με αποτέλεσμα να κριθεί απαραίτητη η χρησιμοποίηση του ανταγωνιστή της ωκυτοκίνης atosiban προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της στέρησης της ορμόνης στο προ-έμβρυο του ποντικού κατά την in vitro ανάπτυξή του. Κατά την καλλιέργεια γονιμοποιημένων ωαρίων παρουσία του ανταγωνιστή της ωκυτοκίνης, παρατηρήθηκε στην υψηλότερη συγκέντρωση του atosiban (10⁻⁴ Μ) διακοπή της ανάπτυξης των προ-εμβρύων στα τέσσερα κύτταρα σε όλα τα καλλιεργηθέντα έμβρυα, χωρίς όμως να υπάρξει εκφυλισμός τους (n>200 έμβρυα). Επιπλέον, κατά την καλλιέργεια παρουσία 10⁻⁵ Μ του ανταγωνιστή μόλις το 45% των προ-εμβρύων αναπτύχθηκε έως το στάδιο της βλαστοκύστης (p<0.01 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου). Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις του ανταγωνιστή δεν φάνηκαν να επηρεάζουν την ανάπτυξη των γονιμοποιημένων ωαρίων στο στάδιο της βλαστοκύστης. Τέλος, η ανάπτυξη προ-εμβρύων που είχαν προηγούμενα αναπτυχθεί in vitro έως το στάδιο των 4-κυττάρων υπό φυσιολογικές συνθήκες καλλιέργειας, χωρίς την παρουσία της ορμόνης ή του ανταγωνιστή της, διεκόπη στο αναπτυξιακό στάδιο των 6-8 κυττάρων. Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει η πιθανή συμμετοχή της ωκυτοκίνης στις διαδικασίες ανάπτυξης του προ-εμβρύου, και κυρίως στον πολλαπλασιασμό των βλαστομεριδίων του. Με το συμπέρασμα αυτό συγκλίνουν και μελέτες επί εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων και καρκινικών κυτταρικών σειρών ποντικού, στις οποίες περιγράφεται η ρυθμιστική δράση της ωκυτοκίνης στη διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό τους, αντίστοιχα. Προς αυτή την κατεύθυνση επιβεβαιώθηκε στα πλαίσια αυτής της μελέτης και η συνεχής έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης σε «εμβρυοειδή σωμάτια» που σχηματίστηκαν κατά την καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων ποντικού. Η μήτρα αποτελεί μια από τις πιο σημαντικές θέσεις δράσης αλλά και έκφρασης της ωκυτοκίνης και του υποδοχέα της. Έως σήμερα έχει ανιχνευθεί ο υποδοχέας της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο του πιθήκου, του επίμυ και του ανθρώπου, σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις. Έχει παρατηρηθεί μείωση της συγκέντρωσης του υποδοχέα στο μυομήτριο και ενδομήτριο των γυναικών κατά τη μέση του αναπαραγωγικού κύκλου και τα πρώτα στάδια της κύησης. Ο υποδοχέας ανιχνεύεται κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των ενδομητριακών αδενίων, με ελάχιστη έως καθόλου ύπαρξή του στο στρώμα. Όμοιο πρότυπο έκφρασης του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού κύκλου καταγράφεται και στον ποντικό κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης. Για τη διερεύνηση της σύνθεσης του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο της μήτρας κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της κύησης (εμφύτευση του προ-εμβρύου) ελήφθησαν μήτρες εγκύων ποντικών [New Zealand Black (ΝΖΒ) x New Zealand White (NZW)] κατά τις περιόδους της 4ης - 5ης ημέρας της κύησης (εμβρυϊκή επαφή με το ενδομήτριο και απόθεση) και 7ης – 8ης ημέρας της κύησης (διείσδυση του προ-εμβρύου στη μήτρα). Οι ιστοί υπέστησαν ιστολογική διαδικασία παραφίνωσης και μελετήθηκε η σύνθεση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης και η παρουσία της ωκυτοκίνης και της ιντερλευκίνης με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Κατά τη φάση της εμβρυϊκής εναπόθεσης στο ενδομήτριο, ο υποδοχέας της ωκυτοκίνης ανιχνεύθηκε κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των ενδομητριακών αδενίων, ενώ δεν παρατηρήθηκε η παρουσία του στο αδενικό επιθήλιο του αυλού της μήτρας και στα ενδομητριακά κύτταρα που περιέβαλαν το προ-έμβρυο. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά η παρουσία της ωκυτοκίνης και της ιντερλευκίνης-6 στο ενδομήτριο, με ελάχιστη έως καθόλου παρουσία τους στο μυομήτριο. Αντίθετα, κατά τη διαδικασία της διείσδυσης του προ-εμβρύου παρατηρήθηκε η σύνθεση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης τόσο στα κύτταρα του προ-εμβρύου, όσο και στα κύτταρα της τροφοβλάστης και σε κάποια από τα κύτταρα του ενδομήτριου που περιέβαλαν το εμφυτευόμενο προ-έμβρυο. Η ωκυτοκίνη και η ιντερλευκίνη-6 κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης της εμφυτευτικής διαδικασίας ανιχνεύθηκαν στο ενδομήτριο αλλά και στο μυομήτριο της μήτρας, με ιδιαίτερα αυξημένη παρουσία της ωκυτοκίνης περιφερειακά του προ-εμβρύου και στον φθαρτό του ενδομήτριου. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η αναστολή της συσταλτικότητας της μήτρας πιθανόν να αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την επιτυχή περάτωση της φάσης της εναπόθεσης του προ-εμβρύου, ενώ το αντίθετο φαίνεται να ισχύει κατά τη διείσδυση του προ-εμβρύου. Βάση των παραπάνω, το πρότυπο αυτό δραστηριότητας της μήτρας φαίνεται να συμφωνεί με το πρότυπο έκφρασης της ωκυτοκίνης και του υποδοχέα της που περιγράφεται από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης. Ο ρόλος της ωκυτοκίνης όμως στη μήτρα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της εμφύτευσης πιθανόν να μην περιορίζεται μόνο στον έλεγχο της συσταλτικότητάς της. Η αποδεδειγμένη δράση του συστήματος OT-OTR στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση πιθανόν να εξηγεί την έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης και τη συσσώρευση της ορμόνης που παρατηρήθηκαν στην παρούσα μελέτη στις περι-εμφυτευτικές περιοχές του ενδομήτριου και στην τροφοβλάστη κατά τη διείσδυση του προ-εμβρύου, μια διαδικασία στην οποία τα κύρια γεγονότα αποτελούν ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση της τροφοβλάστης και η ρύθμιση της ανάπτυξης του πλακούντα.