Διαφοροποίηση γεωγραφικής προέλευσης δειγμάτων καλλιεργούμενης ρίγανης (Origanum vulgare subsp. hirtum) με ενόργανη ανάλυση, ανάλυση DNA και χημειομετρία
Authors: Τσουμάνη Ελευθερία 
Published: December 2023

Στην παρούσα έρευνα έγινε προσπάθεια χαρακτηρισμού και διαφοροποίησης φυτών καλλιεργούμενης ρίγανης σύμφωνα με τη γεωγραφική περιοχή προέλευσης, χρησιμοποιώντας ενόργανη ανάλυση, ανάλυση DNA και χημειομετρία. Για το σκοπό αυτό, ελήφθησαν συνολικά 142 δείγματα εμπορικά διαθέσιμων φυτών ρίγανης (Origanum vulgare subsp. hirtum) που συγκομίστηκαν κατά τα ημερολογιακά έτη 2017-2018 από βιολογικές καλλιέργειες. Τα δείγματα προήλθαν από πέντε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας (Ήπειρος, Μακεδονία, Κρήτη, Πελοπόννησος και Θεσσαλία) και συγκεκριμένα αφορούσαν: πέντε καλλιέργειες από το νομό Ιωαννίνων, δύο από το νομό Πρεβέζης, δύο από το νομό Κοζάνης, μια από το νομό Τρικάλων, δύο από το νομό Μαγνησίας, μια από το νομό Πιερίας, μια από το νομό Κιλκίς, δύο από το νομό Θεσσαλονίκης, μια από το νομό Αχαΐας, μια από το νομό Ηλείας, μια από το νομό Ρεθύμνου και μια από το νομό Ηρακλείου. Τα φυτά ρίγανης υποβλήθηκαν αρχικά σε υδροαπόσταξη (hydrodistillation - HD) και στα προκύπτοντα αιθέρια έλαια έγινε προσδιορισμός της περιεκτικότητάς τους σε ολικό φαινολικό περιεχόμενο (Total Phenolic Content - TPC) με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, της αντιοξειδωτικής τους δράσης (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - TEAC) με τη μέθοδο DPPH, της εκατοστιαίας τους σύστασης, καθώς και ποσοτικός προσδιορισμός των τεσσάρων βασικών συστατικών τους (καρβακρόλη, θυμόλη, γ-τερπινένιο και π-κυμένιο) και ημιποσοτικός προσδιορισμός όλων των υπολοίπων συστατικών με τη συνδυασμένη τεχνική της Αέριας Χρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μάζας (GC-MS). Τα επίπεδα απόδοσης σε αιθέριο έλαιο των φυτών ρίγανης κυμάνθηκαν στο σύνολό τους από ~ 4% μέχρι 7%, με τη μεγαλύτερη απόδοση να καταγράφεται στα δείγματα ρίγανης από την περιοχή της Ηλείας και τη μικρότερη στα δείγματα ρίγανης από την περιοχή της Θεσσαλονίκης. Η χρωματογραφική ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση 35 συνολικά ενώσεων στα αιθέρια έλαια των δειγμάτων, ενώ 15 από αυτές βρέθηκαν παρούσες σε όλα τα δείγματα. Τα συστατικά των αιθέριων ελαίων στο μεγαλύτερο τους μέρος αποτελούνταν από οξυγονωμένα μονοτερπένια (65,67 − 83,98%) και μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες (10,80 − 30,43%), ενώ σε χαμηλότερα ποσοστά ακολούθησαν οι σεσκιτερπενικοί υδρογονάνθρακες (2,44 − 3,97%) , τα οξυγονωμένα σεσκιτερπένια (0,40 − 1,92%) και οι λοιπές ενώσεις (0,10 − 1,29%). Το κυρίαρχο συστατικό στα αιθέρια έλαια όλων των δειγμάτων βρέθηκε να είναι η καρβακρόλη, με εξαίρεση μόνο τα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Ηλείας όπου βρέθηκε η θυμόλη. Τα ποσοστά της καρβακρόλης κυμάνθηκαν από 28,74% έως 68,8%, με το υψηλότερο ποσοστό να καταγράφεται στα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Θεσσαλονίκης και το μικρότερο στα δείγματα από την περιοχή της Ηλείας. Το δεύτερο σε εκατοστιαία αναλογία συστατικό βρέθηκε να είναι η θυμόλη, με ποσοστά από 7,4% έως 35,2%, με το υψηλότερο ποσοστό αυτής να καταγράφεται στα δείγματα από την Ηλεία και το μικρότερο στα δείγματα αιθέριου ελαίου από το Ηράκλειο. Το σύνολο των ποσοστών των τεσσάρων βασικών συστατικών των αιθέριων ελαίων ρίγανης (καρβακρόλη, θυμόλη, γ-τερπινένιο και π-κυμένιο) κυμάνθηκε από 85,10% έως 89,54%, με την υψηλότερη τιμή να καταγράφεται στα δείγματα από την περιοχή του Ρεθύμνου και τη χαμηλότερη στα δείγματα από την περιοχή της Κοζάνης.Επιπλέον, οι συνολικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων βασικών ενώσεων των αιθέριων ελαίων των δειγμάτων καλλιεργούμενης ρίγανης, όπως υπολογίστηκαν κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό τους, κυμάνθηκαν από 6230 mg/L έως 16540 mg/L, με τη σειρά κατάταξης των δειγμάτων σε φθίνουσα σειρά να διαμορφώνεται ως εξής Ηλεία > Ηράκλειο > Πρέβεζα > Κιλκίς > Ιωάννινα > Πιερία > Κοζάνη > Μαγνησία > Τρίκαλα > Θεσσαλονίκη > Ρέθυμνο > Αχαΐα (οι περιοχές αντιπροσωπεύουν τα δείγματα που προέρχονται από αυτές). Η ένωση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση βρέθηκε να είναι η καρβακρόλη (10700 ± 1500 mg/L, Ηράκλειο), ενώ οι υψηλότερες τιμές των συγκεντρώσεων των υπολοίπων τριών ενώσεων καταγράφηκαν στα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Ηλείας και ήταν 8170 ± 260 mg/L για τη θυμόλη, 860 ± 180 mg/L για το γ-τερπινένιο και 920 ± 53 mg/L για το π-κυμένιο. Από τις ενώσεις που μελετήθηκαν με ημιποσοτικό προσδιορισμό, η ένωση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση βρέθηκε να είναι το α-τερπινένιο (112±14 mg/L, Ηλεία), ακολουθούμενη από το καρυοφυλλένιο (101±10 mg/L, Πιερία) και το β-μυρκένιο (91±14 mg/L, Ηλεία). Το συνολικό άθροισμα των συγκεντρώσεων των ενώσεων που προσδιορίστηκαν ημιποσοτικά κινήθηκε από 406,23 mg/L έως 721,02 mg/L, με τη σειρά κατάταξης των δειγμάτων σε φθίνουσα σειρά να διαμορφώνεται ως εξής: Κιλκίς > Αχαΐα > Ηλεία > Κοζάνη > Ιωάννινα > Μαγνησία > Τρίκαλα > Πρέβεζα > Πιερία > Ηράκλειο > Θεσσαλονίκη > Ρέθυμνο. Οι τιμές TPC των αιθέριων ελαίων όλων των δειγμάτων ρίγανης κυμάνθηκαν από 74,5 ± 3,6 mg GAE/g EO έως 89,0 ± 4,8 mg GAE/g EO, με την υψηλότερη τιμή να καταγράφεται στα δείγματα της Αχαΐας και τη μικρότερη στα δείγματα από την περιοχή του Ηρακλείου. Αντίστοιχα, οι τιμές TEAC κυμάνθηκαν μεταξύ 306,8 ± 5,0 μmol TE/g EO και 461,3 ± 7,3 μmol TE/g EO, με τα δείγματα από την περιοχή της Αχαΐας να καταγράφουν τη μικρότερη τιμή, ενώ τα δείγματα από την περιοχή του Ρεθύμνου την υψηλότερη.Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν από τις χημικές αναλύσεις συνδυάστηκαν με τις χημειομετρικές μεθόδους ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA), πολυμεταβλητής ανάλυσης διακύμανσης (MANOVA) και γραμμικής διακριτικής ανάλυσης (LDA) για τη διερεύνηση της δυνατότητας ταξινόμησης των δειγμάτων ρίγανης ως προς τη γεωγραφική προέλευση. Για τη διευκόλυνση της ταξινόμησης, τα δείγματα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες (Ομάδα Α – Ηλεία, Ηράκλειο, Τρίκαλα, Θεσσαλονίκη, Κιλκίς και Πρέβεζα και Ομάδα Β – Αχαΐα, Ρέθυμνο, Μαγνησία, Πιερία, Κοζάνη και Ιωάννινα). Παρόλο που ενσωματώθηκαν αρχικά όλοι οι παράμετροι των χημικών αναλύσεων στην στατιστική ανάλυση, επιλέχθηκαν τελικά να χρησιμοποιηθούν μόνο εκείνες των οποίων ο συνδυασμός έδωσε ποσοστά διαχωρισμού άνω του 50%. Συγκεκριμένα, επιλέχθηκαν ως εξαρτημένες μεταβλητές οι επί τοις εκατό αναλογίες των συστατικών των αιθέριων ελαίων και οι τιμές TPC και TEAC. Τέλος, ως ύστατη μέθοδος ταξινόμησης χρησιμοποιήθηκε η σταδιακή εφαρμογή LDA (Stepwise LDA, SLDA) μέσω μιας διαδικασίας κλιμακωτής επιλογής μεταβλητών για τη διάκριση και τον εντοπισμό αυτών που διαθέτουν την υψηλότερη διακριτική δύναμη (markers) προκειμένου να βελτιστοποιηθεί περαιτέρω ο διαχωρισμός των δειγμάτων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των δύο ομάδων έδειξε ότι το μεγαλύτερο μέρος του συνόλου των παρατηρήσεων κατατάχθηκε σωστά με τη μέθοδο της ενδοεπικύρωσης. Συγκεκριμένα, οι επί τοις εκατό αναλογίες των συστατικών των αιθέριων ελαίων σε συνδυασμό με τις τιμές TPC και TEAC της Ομάδας Α έδωσαν ποσοστό διαχωρισμού 93,3%, ενώ της Ομάδας Β έδωσαν 82,7% αντίστοιχα. Τέλος, από τις συνολικές 33 παραμέτρους της Ομάδας Α που εξετάστηκαν, η ανάλυση SLDA κατέδειξε 16 μεταβλητές ως markers, ενώ από τις 32 της Ομάδας Β που εξετάστηκαν, η ανάλυση SLDA κατέδειξε 14 μεταβλητές ως markers. Η χρήση των συνδυασμών των μεταβλητών αυτών στην στατιστική ανάλυση βρέθηκε ότι βελτίωσε τα ποσοστά διαχωρισμού και στις δυο περιπτώσεις: για την Ομάδα Α, από ποσοστό 93,3% ανέβηκε στο 100% και για την Ομάδα Β από 82,7% ανέβηκε στο 87,8%. Κατά την ανάλυση DNA, επιλέχθηκαν 20 αντιπροσωπευτικά δείγματα ρίγανης (ένα από κάθε καλλιέργεια) από τα οποία και απομονώθηκε γενωμικό DNA (nrDNA). Στη συνέχεια εφαρμόσθηκε αρχικά η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase chain reaction -PCR) για την ενίσχυση της ενδομεταγραφόμενης (Internal Transcribed Spacer -ITS) περιοχής του πυρηνικού ριβοσωμικού DNA χρησιμοποιώντας ως μήτρα το απομονωμένο γενωμικό DNA από τα υπό μελέτη δείγματα ρίγανης και τους καθολικούς εκκινητές ITS1 και ITS4. Τα προϊόντα των αντιδράσεων PCR, αφού καθαρίστηκαν, στάλθηκαν προς προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας σε κατάλληλο εργαστήριο. Οι παραγόμενες αλληλουχίες συγκρίθηκαν με αλληλουχίες της βάσης δεδομένων και στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκαν με τη βοήθεια κατάλληλου προγράμματος. Μετά την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών, κατασκευάστηκαν τα φυλογενετικά δέντρα με δύο μεθόδους, τις NJ (Neighbor-Joining) και UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean), ενώ η αξιοπιστία και η σταθερότητα των σχέσεων του δενδρογράμματος εκτιμήθηκε μέσω 1000 επαναλήψεων (bootstraps). Η φυλογενετική ανάλυση οδήγησε σε πλήρη διαχωρισμό των δειγμάτων και με τις δύο μεθόδους, ακόμα και σε αυτά που προήλθαν από την ίδια περιοχή.Για τον περαιτέρω προσδιορισμό της γενετικής ποικιλότητας μεταξύ των δειγμάτων ρίγανης δοκιμάστηκαν 15 μοριακοί δείκτες RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA- Τυχαία Ενισχυμένα Πολυμορφικά Τμήματα DNA) για την ανίχνευση του πολυμορφισμού του DNA. Από τους 15 εκκινητές που δοκιμάσθηκαν, ευκρινή αριθμό ζωνών έδωσαν οι 13. Ο συνολικός αριθμός των ενισχυμένων ζωνών DNA που έδωσαν οι τυχαίοι εκκινητές ήταν 107, από τις οποίες πολυμορφικές ήταν οι 66. Το συνολικό ποσοστό πολυμορφισμού, επομένως, ανήλθε στο 62%. Αφού υπολογίστηκαν οι συντελεστές ομοιότητας του Jaccard για όλα τα δείγματα, κατασκευάστηκε μια μήτρα ομοιότητας με βάση την οποία υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις. Οι αποστάσεις αυτές αναλύθηκαν και πάλι με τη χρήση κατάλληλου προγράμματος και τις μεθόδους UPGMA και NJ. Όπως και παραπάνω, προέκυψαν δύο φυλογενετικά δενδρογράμματα, στα οποία, σε συμφωνία με τη φυλογενετική ανάλυση με βάση τις αλληλουχίες της περιοχής ITS, παρατηρήθηκε πλήρης διαχωρισμός των δειγμάτων και με τις δύο μεθόδους.