Design and Synthesis of Inflammasome Inhibitors with potential cardioprotective activity
Authors: Πουρνάρα Δήμητρα 
Published: September 2021

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις προκαλούνται από διάφορους παράγοντες, όπως η αθηροσκλήρωση και η αγγειακή φλεγμονή, και αποτελούν μία από τις βασικότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Ο ρόλος της φλεγμονής στις καρδιαγγειακές νόσους γίνεται πιο εμφανής τα τελευταία χρόνια, όπου η ενεργοποίηση μιας κυτταρικής οδού από ποικίλα ερεθίσματα, όπως η μεταβολή της συγκέντρωσης της εξωκυττάριας ATP, οδηγεί στο σχηματισμό ενός πολυπρωτεϊνικού συμπλέγματος, γνωστό ως φλεγμονόσωμα, και εν τέλει στην έκκριση της βιολογικά ενεργής ιντερλευκίνης-1β. Η συγκεκριμένη κυτοκίνη παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειακή φλεγμονή, ενώ μπορεί να επιταχύνει την αθηροσκληρωτική διαδικασία. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αναστολή του φλεγμονοσώματος, στοχεύοντας σε δύο βασικά στάδια της φλεγμονώδους διαδικασίας˙ στον πουρινεργικό υποδοχέα Ρ2Χ7, που σχηματίζει ένα μη εκλεκτικό κανάλι, διαπερατό σε κατιόντα και μεγαλύτερα μόρια, και στο φλεγμονόσωμα NLRP3, το οποίο ρυθμίζει την έκκριση της ιντερλευκίνης-1β. Οι πιθανοί αναστολείς του φλεγμονώδους μονοπατιού φέρουν επίσης ομάδες, πιθανούς δότες μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) ή υδρόθειου (H2S), οι οποίοι έχουν αποδειχθεί ως ρυθμιστές του NLRP3 φλεγμονοσώματος ενώ είναι πιθανό να ενισχύουν την αντιφλεγμονώδη δράση. Δύο γενιές αναστολέων του Ρ2Χ7 υποδοχέα σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν. Η πρώτη γενιά περιλαμβάνει αμίδια και τα βιοϊσοστερή τους τριαζόλια, με βασικό πυρήνα το δακτύλιο του αδαμαντανίου. Υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, καθώς και η ανάπτυξη ενός φαρμακοφόρου μοντέλου, βασιζόμενο στις δομές των ενώσεων της πρώτης γενιάς (ligand-based) ανέδειξαν τα δομικά χαρακτηριστικά που είναι απαραίτητα για την αναστολή του υποδοχέα. Η δεύτερη γενιά είχε ως στόχο την αντικατάσταση του αδαμαντανίου με δομές που θα μπορούσαν να βελτιώσουν την ανασταλτική δράση των νέων ενώσεων. Με βάση τις δομές που παρουσίασαν τον υψηλότερο βαθμό προσαρμογής στο φαρμακοφόρο μοντέλο, επιλέχθηκαν οι ομάδες 3-φθορο-4-(τριφθορομεθυλ)φαινυλο και αρυλο-υποκατεστημένο κυκλοεξάνιο ως αντικαταστάτες του αδαμαντανίου. Όλα τα ανάλογα που συντέθηκαν, αξιολογήθηκαν βιολογικά ως προς την ανασταλτική τους δράση στον Ρ2Χ7 υποδοχέα, πραγματοποιώντας ηλεκτροφυσιολογικά πειράματα με τη χρήση κυττάρων Xenopus oocytes που επωάστηκαν με το φυσιολογικό αγωνιστή του υποδοχέα, την ΑΤΡ. Τα αποτελέσματα της βιολογικής δράσης των αναλόγων της πρώτης και δεύτερης γενιάς ανέδειξαν τα κυκλοεξανικά ανάλογα ως τα πιο δραστικά κατά της ενεργοποίησης του κατιονικού Ρ2Χ7 καναλιού, ανεξάρτητα από το είδος ή το μέγεθος του υποκαταστάτη. Παράλληλα με τη σύνθεση της δεύτερης γενιάς δημοσιεύτηκε η κρυσταλλική δομή του Ρ2Χ7 υποδοχέα του γιγαντιαίου panda (Ailuropoda melanoleuca, giant panda). Η κρυσταλλική δομή αυτού του θηλαστικού παρουσιάζει συγκρίσιμα χαρακτηριστικά με τον ανθρώπινο Ρ2Χ7 υποδοχέα και η δημοσίευση του επέτρεψε τη δημιουργία ενός ομόλογου ομοτριμερούς μοντέλου, με στόχο τη μελέτη των κρίσιμων αλληλεπιδράσεων για την πρόσδεση στον υποδοχέα. Τα πλέον δραστικά ανάλογα υποβλήθηκαν σε μελέτες μοριακής δυναμικής και οι πιο ευνοϊκές αλληλεπιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση του ομοτριμερούς μοντέλου. Επίσης, συντέθηκαν ανάλογα πουρινών με στόχο τη μελέτη της δράσης τους στο σχηματισμό του NLRP3 φλεγμονοσώματος. Προκαταρκτικά αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι ανάλογα 6-πιπεραζινυλο-πουρινών, που φέρουν μία ομάδα νιτρικού εστέρα παρουσιάζουν καρδιοπροστατευτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Καθώς ο ακριβής μηχανισμός δεν έχει ακόμη εξακριβωθεί, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μίας σειράς επιπλέον νέων πουρινικών αναλόγων με ποικίλα δομικά χαρακτηριστικά, που φέρουν ομάδες-πιθανούς δότες ΝΟ ή H2S, για να μελετηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης τους. Oι νέες ενώσεις μελετήθηκαν ως αναστολείς της ιντερλευκίνης-1β, επαγώμενης από λιποπολυσακχαρίτες, σε κύτταρα λείου μυός της αορτής. Προκαταρκτικά αποτελέσματα αυτών των μελετών έδειξαν ότι ανάλογα πουρινών, όπου η ομάδα νιτρικού εστέρα και η πιπεραζίνη συνδέονται με μακριά αλυσίδα, δρουν ως μέτριοι αναστολείς της έκκρισης ιντερλευκίνης-1β. Η σύνδεση του νιτρικού εστέρα με την πιπεραζινυλο-πουρίνη μέσω κοντής αλυσίδας δεν ευνοεί την ανασταλτική δράση, ενώ απευθείας σύνδεση του φουραξανίου με την πιπεραζίνη οδήγησε στην αύξηση των επιπέδων της παραγώμενης ιντερλευκίνης-1β. Η βιολογική αποτίμηση των ενώσεων που φέρουν πιθανούς δότες H2S ανέδειξαν ένα ανάλογο που φέρει μία αλυσίδα 6 ατόμων άνθρακα ως την πιο δραστική ένωση μεταξύ των αναλόγων που μελετήθηκαν.