Ο ρόλος της φυσικής ανοσοαπάντησης στην παθογένεση παρεγχυματικών και αγγειακών παθήσεων του πνεύμονα
Authors: Βεργαδή Ελένη 
Published: August 2021

Το σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) ως αποτέλεσμα μηχανικού αερισμού, πνευμονικής λοίμωξης, εισρόφησης ή προωρότητας, αποτελεί την συχνότερη αιτία νοσηρότητας και θνητότητας στις μονάδες εντατικής θεραπείας ενηλίκων, παίδων και νεογνών. Αντίστοιχα, η πνευμονική υπέρταση πρωτοπαθής ή δευτεροπαθής σε προϋπάρχουσα διαταραχή, προκαλεί εξίσου σοβαρή νοσηρότητα, υποξαιμία, αναπνευστική και καρδιακή ανεπάρκεια. Καθώς οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί της βλάβης του πνεύμονα και της δημιουργίας πνευμονικής υπερτάσεως δεν είναι επαρκώς χαρακτηρισμένοι, η σε βάθος κατανόηση τους είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας και στις δύο καταστάσεις συγκαταλέγεται ανάμεσα στους πιθανούς παθογενετικούς μηχανισμούς.Με την χρήση μοντέλων μυών γενετικά τροποποιημένων σε γονίδια-κλειδιά για την φλεγμονή και την αγγειακή λειτουργία (Akt2 kinase deficient, lung specific inducible heme oxygenase HO-1 transgenic), στην παρούσα μελέτη διερευνούμε την φύση της φλεγμονώδους ανοσοαπάντησης και του φαινότυπου ενεργοποίησης των κυψελιδικών μακροφάγων που αναπτύσσεται πρώιμα σε ζωικά πρότυπα οξείας βλάβης πνεύμονα και πνευμονικής υπέρτασης και επιδιώκουμε να διασαφηνίσουμε τον πιθανά αιτιολογικό τους ρόλο στην ανάπτυξή τους.Για να διασαφηνίσουμε τον ρόλο της φυσικής ανοσίας και της ενεργοποίησης των μακροφάγων στην οξεία βλάβη πνεύμονα, προκαλέσαμε άσηπτη πνευμονική βλάβη κυρίως με εισρόφηση υδροχλωρικού οξέους σε ποντικούς φυσικού τύπου (WT) και σε Akt2-/- ποντικούς. H οξεία βλάβη πνεύμονα σε ποντικούς φυσικού τύπου οδήγησε σε μειωμένη πνευμονική ενδοτικότητα, εξοίδηση πρωτείνης και έκκριση κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό υγρό. Τα κυψελιδικά μακροφάγα απέκτησαν κλασσικό φαινότυπο ενεργοποίησης (M1). Η οξεία βλάβη πνεύμονα από υδροχλωρικό οξύ ήταν λιγότερο σοβαρή στα Akt2-/- ποντίκια συγκριτικά με τα WT ποντίκια. Τα κυψελιδικά μακροφάγα των Akt2-/- ποντικών ενέδειξαν εναλλακτικό φαινότυπο ενεργοποίησης (M2). Παρόλο όμως που η παρουσία M2 μακροφάγων σχετίστηκε με προστασία από την άσηπτη βλάβη πνεύμονα, οδήγησε σε αυξημένο μικροβιακό φορτίο στα Akt2-/- ποντίκια που μολύνθηκαν με ενδοτραχεική έγχυση Pseudomonas aeruginosa συγκριτικά με τα WT ποντίκια.Για να κατανοήσουμε την Μ1 ενεργοποίηση των μακροφάγων, μελετήσαμε το σηματοδοτικό μονοπάτι του υποδοχέα TLR στα μακροφάγα. Βρήκαμε ότι τα mRNA επίπεδα των σηματοδοτικών πρωτεινών TRAF6, IRF5 και STAT1 αυξήθηκαν στα κυψελιδικά μακροφάγα WT ποντικών μετά απο έκθεση σε υδροχλωρικό οξύ. Αντίθετα, τα Akt2-/- μακροφάγα είχαν χαμηλότερα επίπεδα TRAF6, IRF5, STAT1 και IRAK1 σε σύγκριση με τα μακροφάγα φυσικού τύπου. Τα επίπεδα mRNAs των IRAK1, TRAF6, STAT1 και IRF5 είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από το αντι-φλεγμονώδες miRNA miR-146a.Πράγματι, το μικρο-RNA miR-146a, αυξήθηκε στην όψιμη φάση της πνευμονικής βλάβης στα ποντίκια φυσικού τύπου ενώ η επαγωγή του στα Akt2-/- ποντίκια παρατηρήθηκε νωρίτερα, στην οξεία φάση. Μάλιστα, η υπερέκφραση του miR-146a στα μακροφάγα φυσικού τύπου κατέστειλε την επαγωγή της επαγώμενης συνθάσης του νιτρικού οξειδίου (iNOS) από τον LPS και οδήγησε σε Μ2 ενεργοποίηση των μακροφάγων. Η καταστολή του miR-146a στα Akt2-/- μακροφάγα αποκατέστησε την έκφραση της iNOS. Επιπλέον, η χορήγηση εξωγενούς miR-146a ή η σίγαση του γονιδίου Akt2 σε ποντίκια φυσικού τύπου που είχαν εκτεθεί σε υδροχλωρικό οξύ οδήγησε σε καταστολή της iNOS στα κυψελιδικά μακροφάγα. Συμπεραίνοντας, η καταστολή του Akt2 και η επαγωγή του miR-146a προάγει την εναλλακτική ενεργοποίηση των μακροφάγων και προστατεύει από την οξεία πνευμονική βλάβη. Τροποποίηση του φαινότυπου των κυψελιδικών μακροφάγων μέσω των Akt2 και miR- 146a θα μπορούσε να εφαρμοστεί θεραπευτικά σε περιπτώσεις μη – λοιμώδους ARDS. Όμως, μια τέτοια θεραπεία δεν θα ήταν ωφέλιμη σε περιπτωσεις λοιμώδους ARDS καθώς επηρεάζει την μικροβιοκτόνο δράση των μακροφάγων.Η πνευμονική αρτηριακή υπέρταση είναι μια σπάνια νόσος που χαρακτηρίζεται από αγγειοσυστολή και πάχυνση του αγγειακού τοιχώματος με τελικό αποτέλεσμα υπερτροφία και ανεπάρκεια της δεξιάς κοιλίας. Παρά την σημαντική πρόοδο σε αυτό το ερευνητικό πεδίο, οι μηχανισμοί που οδηγούν στην ανάπτυξη της νόσου παραμένουν ασαφείς. Η φλεγμονή του πνευμονικού παρεγχύματος όλο και περισσότερο και εμπλέκεται στην ανάπτυξη πνευμονικής υπερτάσεως. Η ιστική υποξία, ένα ευρέως γνωστό ερέθισμα που προκαλεί πνευμονική υπέρταση, προάγει μια φλεγμονώδη ανοσοαπάντηση στον πνεύμονα που προηγείται χρονικά της ανάπτυξης της υπερτάσεως. Η ιστοειδική, στους πνεύμονες, συστασιακή έκφραση της οξυγενάσης της αίμης (heme oxygenase-1, HO-1) μπορεί να καταστείλει τόσο την φλεγμονώδη απάντηση αλλά και μετέπειτα ανάπτυξη της νόσου. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού που υπερεκφράζει HO-1 στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα υπό τον έλεγχο της δοξυκυκλίνης με επαγόμενο τρόπο (tetΟΝ σύστημα). Ελέγχοντας έτσι την δράση της ΗΟ-1 και κατ’ επέκταση της πνευμονικής φλεγμονής, στόχος μας ήταν να διασαφηνίσουμε την φύση της φλεγμονώδους ανοσοαπάντησης στην υποξία και τον ρόλο της στην ανάπτυξη της πνευμονικής υπέρτασης.Η έκθεση των ποντικών στην υποξία σύντομα οδήγησε στην συγκέντρωση μονοκυττάρων/μακροφάγων και στην παραγωγή κυτοκινών/ κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Η υπερέκφραση της ΗΟ-1 κατέστειλε αυτην την φλεγμονώδη απάντηση. Τα κυψελιδικά μακροφάγα των υποξικών ποντικών εκδήλωσαν in vivo φαινότυπο ενεργοποίησης τυπικό της εναλλακτικής οδού, με έκφραση των δεικτών Fizz1, Ym1 και arginase-1 ενώ απέτυχαν να εκφράσουν δείκτες κλασσικής ενεργοποίησης όπως την επαγόμενη συνθάση του νιτρικού οξειδίου (iNOS), παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF-a) και ιντερλευκίνη-12 (IL-12p40). Για να επισημάνουμε το ρόλο της παραπάνω φλεγμονώδους απάντησης στην παθογένεση της νόσου, διακόψαμε την συνεχή χορήγηση δοξυκυκλίνης στα ζώα ώστε να επανέλθουν τα επίπεδα της ΗΟ στα φυσιολογικά. Η βραχεία – για 2 ημέρες – χορήγηση δοξυκυκλίνης (και επομένως βραχεία επαγωγή της ΗΟ-1) καθυστέρησε αλλά δεν κατέστελε την μέγιστη αύξηση των μονοκυττάρων/μακροφάγων και την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού, 7 ημέρες μετά τα οποία επακολούθησε πνευμονική υπέρταση. Όμως, παρατεταμένη χορήγηση – για 7 ημέρες - δοξυκυκλίνης (και επομένως συνεχή επαγωγή της ΗΟ-1) κατέστη επαρκής να αναστείλει τόσο την συγκέντρωση μονοκυττάρων/μακροφάγων και την εναλλακτική ενεργοποίηση των μακρόφάγων, να προκαλέσει υπερέκκριση IL-10 από τα μακροφάγα και να αναχαιτήσει την μετέπειτα εμφάνιση πνευμονικής υπέρτασης. Επιπλέον, το υπερκείμενο από τα υποξικά M2 μακροφάγα προήγαγε τον πολλαπλασιασμό και των λείων μυικών κυττάρων της πνευμονικής αρτηρίας ενώ η θεραπεία με μονοξείδιο του άνθρακα, κύριο ενζυματικό προϊόν της HO-1, κατέστειλε αυτό το φαινόμενο. Η πνευμονική διήθηση μακροφάγων και η εναλλακτική ενεργοποίησή τους στην υποξία είναι κρίσιμο φαινόμενο για την μετέπειτα ανάπτυξη πνευμονικής υπέρτασης. Η οξυγενάση της αίμης δρα προστατευτικά εν μέρει μέσω της τροποποίησης του φαινοτύπου ενεργοποίησης των μακροφάγων. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δύναται να βοηθήσουν στον σχεδιασμό στοχευμένων θεραπειών που πιθανά να βελτιώσουν την πρόγνωση που παραμένει πενιχρή.