The organization of the fungal plasma membrane in the quiescent state
Authors: Μεγαριώτη Αμαλία 
Published: September 2023

Η πλασματική μεμβράνη των κυττάρων αποτελεί πλατφόρμα εκτέλεσης πληθώρας βιολογικών διεργασιών. Για τον συντονισμό των πολύπλοκων αυτών διεργασιών η πλασματική μεμβράνη εμφανίζει πλευρική οργάνωση σε εξειδικευμένα διαμερίσματα/επικράτειες. Στην πλασματική μεμβράνη του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae έχουν μέχρι σήμερα αναγνωριστεί 8 διακριτά μεμβρανικά διαμερίσματα. Ένα από τα πιο εκτενέστερα μελετημένα διαμερίσματα είναι το μεμβρανικό διαμέρισμα που φιλοξενεί τον μεταφορέα αργινίνης Can1. Το μεμβρανικό διαμέρισμα της Can1 (MCC) συνεντοπίζεται με ένα υποφλοιώδες πρωτεϊνικό σύμπλοκο που είναι γνωστό με τον όρο εισόσωμα. Προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα αναφέρoυν ότι τα εισοσώματα στο ζυμομύκητα εκτελούν ρόλους ‘αποθηκών’ μεταφορέων σε συνθήκες σύντομης και αναστρέψιμης έλλειψης θρεπτικών. Ωστόσο, ο ρόλος των εισοσωμάτων σε συνθήκες μακροπρόθεσμης έλλειψης θρεπτικών δεν έχει μελετηθεί. Η μελέτη των εισοσωμάτων σε μακροπρόθεσμη έλλειψη θρεπτικών είναι ιδιαιτέρως σημαντική, λόγω του σχηματισμού αδρανών κυττάρων στη συνθήκη αυτή. Πιο συγκεκριμένα, σε μία κλειστή καλλιέργεια του ζυμομύκητα τα κύτταρα αρχικά μεταβολίζουν τη γλυκόζη μέσω αλκοολικής ζύμωσης και αυξάνονται εκθετικά. Μετά την εξάντληση της γλυκόζης (φάση διαύξησης), οι ζύμες προσαρμόζουν τον μεταβολισμό τους σε οξειδωτική φωσφορυλίωση, ώστε να μεταβολίσουν αερόβια την αιθανόλη που παρήγαγαν κατά την εκθετική φάση. Σε αυτή τη φάση ανάπτυξης, τα κύτταρα της ζύμης διαφοροποιούνται σε διακριτούς πληθυσμούς: τα αδρανή, τα γηρασμένα και τα νεκρά κύτταρα. Εξ ορισμού, τα αδρανή κύτταρα εμφανίζουν αναστρέψιμη παύση του κυτταρικού τους πολλαπλασιασμού και μπορούν να ανακτήσουν αύξηση όταν τα θρεπτικά γίνουν και πάλι διαθέσιμα. Επιπλέον, τα αδρανή κύτταρα της ζύμης και άλλων μυκήτων εμφανίζουν αυξημένη ανθεκτικότητα σε διάφορα στρες και μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα. Τα αδρανή κύτταρα της ζύμης, συγκεκριμένα, είναι επίσης ικανά να πραγματοποιήσουν αερόβιο καταβολισμό της αιθανόλης/ κυτταρική αναπνοή στα μιτοχόνδριά τους. Αντίθετα, τα γηρασμένα και τα νεκρά κύτταρα είναι ανίκανα να ανακτήσουν αύξηση, εμφανίζουν χαρακτηριστικά απόπτωσης και αδυναμία καταβολισμού της αιθανόλης. Η κυτταρική αδράνεια είναι ιδιαίτερα σημαντική για όλους του οργανισμούς. Αποτελεί το πιο κοινό στάδιο του κύκλου ζωής των μικροοργανισμών στη φύση και είναι απαραίτητη για διασπορά των μικροοργανισμών στο περιβάλλον. Παράλληλα, όπως έχει δειχθεί από προηγούμενες μελέτες, η ικανότητα αδράνειας εμπλέκεται στην παθογένεια των μικροοργανισμών. Πιο συγκεκριμένα, τα αδρανή κύτταρα εμφανίζουν επίμονη ανθεκτικότητα (μία μορφή μη γενετικά καθοριζόμενης ανθεκτικότητας) σε διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα, τα οποία στοχεύουν κατά κανόνα αυξανόμενα κύτταρα και όχι αδρανή. Παρά την αδιαμφισβήτητη σημασία των αδρανών κυττάρων, η μελέτη τους παραμένει σχετικά περιορισμένη και οι μηχανισμοί που προωθούν τη διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας μόνο τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να μελετώνται συστηματικά.Η συγκεκριμένη διατριβή είχε σαν στόχο τη μελέτη και τον χαρακτηρισμό του φυσιολογικού ρόλου των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα της ζύμης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν ότι ο αριθμός των εισοσωμάτων αυξάνει συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα της ζύμης μετά την εξάντληση γλυκόζης και ότι τα εισοσώματα χρειάζονται για τη μακροημέρευσή τους. Ο προστατευτικός ρόλος των εισοσωμάτων σχετίζεται με τις ελλειπώς μελετημένες πρωτεΐνες της οικογένειας των φλαβοδοξινών που φιλοξενούνται στην πλασματική μεμβράνη, οι οποίες είναι ευρέως γνωστές σαν Flavodoxin-Like Proteins ή εν συντομία FLPs. Οι πρωτεΐνες FLPs εμφανίζουν ενεργότητα οξειδοαναγωγασών του λιπιδίου ουβικουινόνη, ανακυκλώνοντας έτσι την ανηγμένη μορφή του λιπιδίου (ουβικουινόλη) στην πλασματική μεμβράνη. Η ουβικουινόλη, συγκεκριμένα, δρώντας σαν λιπόφιλο αντιοξειδωτικό, προστατεύει τα αδρανή κύτταρα από υπεροξείδωση λιπιδίων και από μία μορφή κυτταρικού θανάτου γνωστή με τον όρο φερρόπτωση (ferroptosis). Η φερρόπτωση είναι μια πρόσφατα χαρακτηρισμένη μορφή μη-αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από συσσώρευση υπεροξειδωμένων λιπιδίων λόγω των οξειδωτικών ιδιοτήτων του σιδήρου.Πιο αναλυτικά, αποτελέσματα πρωτεομικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα εισοσώματα εμφανίζονται μεταξύ των κυτταρικών διαμερισμάτων με τη μεγαλύτερη επέκταση κατά την μετάβαση των κυττάρων σε αδράνεια. Δεδομένα συνεστιακής μικροσκοπίας και ανάλυσης western έδειξαν ότι οι κύριες πρωτεΐνες των εισοσωμάτων [οι πρωτεΐνες με επικράτεια BAR (for Bin1, Amphiphysin and Rvs proteins) Pil1 και Lsp1 και η πρωτεΐνη της οικογένειας MARVEL (MAL and Related proteins for VEsicle trafficking and membrane Link) Nce102] εμφανίζουν πολλαπλάσια επαγωγή μετά την εξάντληση γλυκόζης. Τόσο ο αριθμός των εισοσωμάτων όσο και τα πρωτεϊνικά επίπεδα των Pil1, Lsp1 και Nce102 αυξάνουν σταδιακά όσο η γλυκόζη καταναλώνεται και εμφανίζουν περαιτέρω επαγωγή κατά την φάση μεταβολισμού της αιθανόλης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα εισοσώματα έχουν πιθανά σημαντικό ρόλο κατά την μετάβαση των κυττάρων στην κατάσταση αδράνειας.Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επαγωγή και οργάνωση των εισοσωμάτων μετά την εξάντληση γλυκόζης. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες κυττάρων κατά την εκθετική φάση, η οργάνωση των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα χρειάζεται τις πρωτεΐνες Pil1 και Nce102. Επιπροσθέτως, δεδομένα της παρούσας διατριβής προτείνουν ένα ρόλο της Lsp1 στη φάση αυτή. Πιο συγκεκριμένα, η Lsp1 βρέθηκε να είναι αναγκαία για τη βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων, αλλά και ικανή για τη συγκρότηση λειτουργικών εισοσωμάτων ακόμα και σε κύτταρα που φέρουν απαλοιφή του γονιδίου της Pil1. Δεδομένου ότι η Lsp1 δεν εμπλέκεται στην οργάνωση των εισοσωμάτων στην εκθετική φάση, τα παραπάνω αποτελέσματα προτείνουν ότι ο φυσιολογικός ρόλος της Lsp1 σχετίζεται συγκεκριμένα με την κυτταρική αδράνεια. Συνεπώς, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα του ζυμομύκητα κατασκευάστηκε μεταλλαγμένο στέλεχος με απαλοιφές τόσο του γονιδίου PIL1 όσο και του LSP1.Η επαγωγή των εισοσωμάτων εμφάνισε ετερογένεια στα κύτταρα της ζύμης μετά την εξάντληση γλυκόζης. Σχετίζεται η ετερογένεια αυτή με τους διακριτούς πληθυσμούς κυττάρων που δημιουργούνται μετά τη εξάντληση γλυκόζης; Το ερώτημα αυτό προσεγγίστηκε με δύο διαφορετικούς τρόπους. Πρώτον, τα αδρανή κύτταρα, τα οποιά απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση σε κλίση συγκέντρωσης στον πυκνό κλάσμα, ελέγχθηκαν ως προς την επαγωγή των εισοσωμάτων. Πράγματι, τα κύτταρα στο πυκνό κλάσμα εμφάνισαν βέλτιστη επαγωγή εισοσωμάτων. Δεύτερον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η μορφολογία των μιτοχονδρίων αποτελεί αξιόπιστο μικροσκοπικό δείκτη της κυτταρικής αδράνειας και της μεταβολικής κατάστασης των κυττάρων. Δεδομένα συνεστιακής μικροσκοπίας έδειξαν ότι τα εισοσώματα επάγονται συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα που χαρακτηρίζονται από κυστιδιακή μορφολογία του δικτύου των μιτοχονδρίων τους. Τα κύτταρα αυτά, έχει επιπλέον δειχθεί ότι διαθέτουν ικανότητα κυτταρικής αναπνοής μετά την εξάντληση της γλυκόζης. Αντίθετα, τα κύτταρα με σφαιρικά συσσωματώματα των μιτοχονδρίων τους, που είναι γηρασμένα και μη-ικανά οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, εμφάνισαν ελλιπή επαγωγή εισοσωμάτων. Συνολικά η επαγωγή των εισοσωμάτων έδειξε υψηλή συσχέτιση με την κυτταρική αδράνεια. Κύτταρα με βέλτιστη επαγωγή εμφάνισαν πάνω 89% πιθανότητα να είναι αδρανή, σε όλες τις φάσεις που μελετήθηκαν. Αντιθέτως, κύτταρα με μειωμένη επαγωγή συνήθως ήταν γηρασμένα ή νεκρά.Σε συμφωνία με την επαγωγή των εισοσωμάτων συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα κατά τη φάση μεταβολισμού της αιθανόλης, η βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων φαίνεται να προϋποθέτει ενεργή κυτταρική αναπνοή. Αποτελέσματα από συνεστιακή μικροσκοπία και ανάλυση western έδειξαν ότι τεχνητή εξάντληση των πηγών άνθρακα από το θρεπτικό των κυττάρων δεν αρκεί για να προκαλέσει τη βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων. Απεναντίας, η παρουσία πηγής άνθρακα στο θρεπτικό που μεταβολίζεται αερόβια στα μιτοχόνδρια π.χ. αιθανόλη, ήταν απαραίτητη προϋπόθεση για την επαγωγή. Παρομοίως, στελέχη που φέρουν απαλοιφές σε γονίδια της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων εμφάνισαν ελλιπή επαγωγή της Pil1 μετά την εξάντληση γλυκόζης. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν στο ότι η επαγωγή των εισοσωμάτων μετά την εξάντληση γλυκόζης συμβαίνει συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα και προϋποθέτει την ενεργή λειτουργία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης.Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος των εισοσωμάτων στην κυτταρική αδράνεια. Το στέλεχος χωρίς εισοσώματα εμφάνισε προβληματική ανάπτυξη μετά την εξάντληση γλυκόζης και μειωμένο καταβολισμό της αιθανόλης λόγω προβληματικής λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Κύτταρα χωρίς εισοσώματα εμφάνισαν μειωμένη μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα αλλά και ελλιπή διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας. Πιο συγκεκριμένα, ο μεταλλαγμένος πληθυσμός, ενώ εμφάνισε κανονικά αδρανή κύτταρα με κυστιδιακά μιτοχόνδρια μετά την εξάντληση γλυκόζης, συσσώρευσε νωρίτερα στην καλλιέργεια αυξημένο ποσοστό γηρασμένων και νεκρών κυττάρων με βάση την μορφολογία του δικτύου των μιτοχονδρίων τους. Συμπερασματικά, τα εισοσώματα φαίνεται να χρειάζονται για τη διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας. Τα εισοσώματα βρέθηκαν να προωθούν την κυτταρική αδράνεια μέσω των φλαβοδοξινών/FLPs που φιλοξενούν. Όπως και οι κύριες πρωτεΐνες των εισοσωμάτων έτσι και οι FLPs εμφάνισαν πολλαπλάσια επαγωγή στα αδρανή κύτταρα φυσικού τύπου. Ωστόσο, απουσία των εισοσωμάτων τα πρωτεϊνικά επίπεδα των FLPs μειώθηκαν 3-8 φορές. Επιπλέον, η τοπολογία τους φάνηκε αλλοιωμένη σε σχέση με τα κύτταρα φυσικού τύπου. Πιο συγκεκριμένα, απουσία των εισοσωμάτων η κατανομή των FLPs στην πλασματική μεμβράνη μετατράπηκε από στικτή σε ομοιογενή, ενώ η στρατολόγηση των FLPs στην πλασματική μεμβράνη ήταν μειωμένη. Σε συμφωνία με την υπόθεση ότι οι φαινότυποι του στελέχους χωρίς εισοσώματα οφείλονται στα μειωμένα επίπεδα FLPs στην πλασματική μεμβράνη, το στέλεχος που φέρει απαλοιφές των γονιδίων FLPs προσομοίασε φαινοτυπικά το στέλεχος χωρίς εισοσώματα. Συνολικά, τα δεδομένα υποστηρίζουν πως ένας σημαντικός ρόλος των εισοσωμάτων κατά την κυτταρική αδράνεια είναι η σταθεροποίηση των FLPs στην πλασματική μεμβράνηΠαράλληλα, διερευνήθηκε ο μηχανισμός μέσω του οποίου oι FLPs εμπλέκονται στην διατήρησης της αδράνειας. Παλαιότερα δεδομένα έχουν δείξει ότι οι FLPs έχουν πιθανούς αντιοξειδωτικούς ρόλους και μία τουλάχιστον από τις FLPs εμφανίζει ενζυμική ενεργότητα αναγέννησης της ουβικουινόλης. Η ουβικουινόλη είναι ένα ισχυρό λιπόφιλο αντιοξειδωτικό που προστατεύει τα κύτταρα από υπεροξείδωση λιπιδίων και φερρόπτωση. Ο όρος φερρόπτωση ή ferroptosis αναφέρεται σε μία πρόσφατα χαρακτηρισμένη μορφή μη-αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από υπεροξείδωση φωσφολιπιδίων με πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα λόγω των οξειδωτικών ιδιοτήτων του σιδήρου (ferrous iron). Ένα ένζυμο με βιοχημική ενεργότητα ανάλογη των FLPs στα κύτταρα των θηλαστικών, με το όνομα Ferroptosis Suppressor Protein 1 (Fsp1), έχει βρεθεί να εμπλέκεται στην προστασία από φερρόπτωση. Σε συμφωνία με την υπόθεση ότι τα FLPs έχουν ανάλογους ρόλους με το Fsp1, κύτταρα χωρίς εισοσώματα ή FLPs εμφάνισαν ευαισθησία σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία είναι πιο επιρρεπή στην οξείδωση σε σχέση με τα μονο- ακόρεστα. Επιπλέον δεδομένα από στοχευμένη επιλιπιδομική ανάλυση έδειξαν ότι κύτταρα χωρίς εισοσώματα ή FLPs συσσωρεύουν πολλαπλάσια αυξημένα επίπεδα υπεροξειδωμένων μορφών του λιπιδίου φωσφατιδυλαιθανολαμίνη. Προς υποστήριξη του ερευνητικού μοντέλου, η ελλιπής ανάπτυξη στη φάση μεταβολισμού της αιθανόλης και η μειωμένη βιωσιμότητα των μεταλλαγμένων στελεχών μπορούσε να αναστραφεί με προσθήκη του λιπόφιλου αντιοξειδωτικού α-τοκοφερόλη. Όπως και στα ανθρώπινα κύτταρα, έτσι και στη ζύμη, οι FLPs φάνηκε να προστατεύουν από υπεροξείδωση λιπιδίων παράλληλα με τον μηχανισμό της γλουταθειόνης- υπεροξειδασών γλουταθειόνης Gpx1/2/3. Στέλεχος που φέρει συνδυαστικές απαλοιφές των γονιδίων των FLPs και Gpx1/2/3 εμφάνισε αυξημένη ευαισθησία σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα και ραγδαία αύξηση στα ποσοστά νεκρών κυττάρων παρουσία πολυ-ακόρεστων λιπαρών οξέων. Τα ποσοστά αυτά μπορούσαν να αναστραφούν είτε με την προσθήκη του λιπόφιλου αντιοξειδωτικού α-τοκοφερόλη, είτε με την προσθήκη ενός χειλικού παράγοντα που δεσμεύει σίδηρο. Κατά συνέπεια, ο κυτταρικός θάνατος που εμφάνισε το στέλεχος φαίνεται να εξαρτάται από υπεροξείδωση λιπιδίων και από τονσίδηρο και άρα προσομοιάζει την φερρόπτωση. Τέλος, γενετικά δεδομένα υποστήριξαν ότι οι FLPs είναι πράγματι απαραίτητες για την αναγέννηση της ουβικουινόλης σε μεμβράνες εκτός των μιτοχονδριακών. Πιο συγκεκριμένα, το μεταλλαγμένο στέλεχος cqd1Δ έχει προηγουμένως δειχθεί να περιέχει περίσσεια εξω-μιτοχονδριακής ουβικουινόνης. Απαλοιφή του CQD1 μπορούσε να καταστείλει την ευαισθησία του στελέχους με απαλοιφές των GPX1/2/3 σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα. Ωστόσο, η καταστολή αυτή δεν παρατηρήθηκε όταν το στέλεχος έφερε επιπλέον απαλοιφές των FLPs, καθώς απαλοιφή των FLPs ήταν επιστατική στην απαλοιφή του CQD1. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι οι FLPs είναι οι κύριες οξειδοαναγωγές της ουβικουινόνης εκτός των μιτοχονδρίων.Τα αποτελέσματα που περιέχονται στην παρούσα διατριβή αποκαλύπτουν ένα σημαντικό φυσιολογικό ρόλο της διαμερισματοποίησης της πλασματικής μεμβράνης στην κυτταρική αδράνεια. Τα εισοσώματα, σταθεροποιώντας τα FLPs, προστατεύουν τα αδρανή κύτταρα της ζύμης από υπεροξείδωση λιπιδίων και από φερρόπτωση. Τα δεδομένα αυτά προτείνουν για πρώτη φορά την παρουσία φερρόπτωσης στα κύτταρα του ζυμομύκητα και ταυτοποιούν δύο ανεξάρτητους προστατευτικούς μηχανισμούς ως απαραίτητους για την μακροημέρευση των αδρανών κυττάρων. Ο προστατευτικός ρόλος των εισοσωμάτων και των FLPs συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα, τα καθιστά υποσχόμενους στόχους για την αντιμετώπιση της επίμονης ανθεκτικότητας των αδρανών κυττάρων σε αντιμυκητιακά. Επιπλέον, η παρούσα διατριβή εισαγάγει την χρήση κυττάρων ζύμης, αναπτυσσομένων σε θρεπτικό με προσθήκη πολυ-ακόρεστων λιπαρών οξέων, σαν σύστημα μοντέλο για την μελέτη της φερρόπτωσης. Τέλος, στην διατριβή αυτή περιλαμβάνονται ολοκληρωμένα δεδομένα πρωτεομικής ανάλυσης των αδρανών κυττάρων φυσικού τύπου αλλά και σχετικών μεταλλαγμάτων. Τα δεδομένα αυτά αναμένεται να αποκαλύψουν ανεξερεύνητες εκφάνσεις της κυτταρικής αδράνειας σε μελλοντικές έρευνες.