Possibility of Using the SARS-CoV-2 Coronavirus Nucleoprotein as an Antigenic Component of the COVID-19 Serodiagnosis Kit
Authors: Бельская И.В. , Амвросьева Т.В. , Поклонская Н.В. , Казловский И.С. , Богуш З.Ф. , Казинец О.Н. , Колтунова Ю.Б. 
Published: March 2022

Введение. Коронавирусная инфекция COVID-19 является одним из главных вызовов для человечества за последние десятилетия. Изучение возможности использования макромолекул коронавируса SARS-CoV-2 и разработка технологий создания на их основе диагностических средств и вакцин является сегодня одним из приоритетных направлений исследований. Цель. Получение полного нуклеопротеина SARS-CoV-2 и полипептидов на его основе с последующим изучением их антигенных свойств и возможности использования в качестве антигенного компонента при создании наборов для серологической диагностики COVID-19.Материалы и методы. Дизайн исследований включал в себя: поиск антигенных детерминант с помощью сервиса Predicted antigenic peptides, получение полного нуклеопротеина коронавируса SARS-CoV-2 и его фрагментов с помощью современных методов биотехнологии, а также проверку их антигенной активности методом иммуноферментного анализа (ИФА). Источником гена N служила геномная РНК коронавируса SARS-CoV-2, выделенная из пробы носоглоточного аспирата пациента с COVID-19. Штаммы-продуценты целевых полипептидов были получены на основе бактериальной белок-синтезирующей системы Escherichia coli BL21(DE3). Апробацию их антигенной активности осуществляли с использованием сывороток крови, в которых присутствие или отсутствие противовирусных антител было подтверждено наборами реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-M» и «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-G» («Диагностические системы», Россия).Результаты. Анализ аминокислотной последовательности, базирующейся на первичной структуре белка, позволил обнаружить 16 антигенных эпитопов, локализованных в N-белке. Нуклеотидные последовательности, соответствующие полипептидам с коэффициентом антигенности не менее 1,0 ед. и отличающиеся высокой степенью аминокислотных отличий/замен, были экспрессированы в клетах E. coli. Проверку антигенной активности рекомбинантных полипептидов проводили по эффективности связывания белков-кандидатов и выборки заведомо отрицательных и заведомо положительных (не содержащих и содержащих антитела классов М и G к коронавирусу SARS-CoV-2 соответственно) сывороток крови.При исследовании 100% заведомо положительных образцов в ИФА на основе созданных рекомбинантных полипептидов был получен положительный результат, а при исследовании 100% заведомо отрицательных сывороток крови – отрицательный результат.Заключение. Полученные результаты указывают на перспективность использования созданных полипептидов для разработки на их основе диагностических наборов, предназначенных для детекции антиSARS-CoV-2 иммуноглобулинов в сыворотке/плазме крови пациентов методом ИФА.

Introduction. The coronavirus infection COVID-19 has been one of the main challenges for humanity in recent decades. The study of the possibility and development of technologies of using SARS-CoV-2 coronavirus macromolecules for the creation of diagnostic tools and vaccines on their basis is one of the priority areas of research today.Purpose. To obtain the complete SARS-CoV-2 nucleoprotein and polypeptides based on it, followed by the study of their antigenic properties and the possibility of using them as an antigenic component for serological kits for diagnostics of COVID-19.Materials and methods. The research design included the following: searching for antigenic determinants using the “Predicted antigenic peptides” service, obtaining the complete nucleoprotein of the SARS-CoV-2 coronavirus and its fragments using modern biotechnological methods, and testing their antigenic activity with ELISA. The source of the N gene was the genomic RNA of the SARS-CoV-2 coronavirus, isolated from a sample of the nasopharyngeal aspirate of a patient with COVID-19. The strains-producers of the target polypeptides were obtained on the base of the bacterial protein-synthesizing system Escherichia coli BL21 (DE3). The approbation of their antigenic activity was carried out using the blood sera, in which the presence or absence of antiviral antibodies was confirmed with the sets of reagents of “Diagnostic Systems” (Russia).Results. Analysis of the amino acid sequence, based on the primary structure of the protein, revealed 16 antigenic epitopes located in the N-protein. Nucleotide sequences corresponding to polypeptides with the antigenicity index of at least 1.0 units and characterized by a high degree of amino acid differences / substitutions, were expressed in E. coli cells. The antigenic activity of the recombinant polypeptides was tested by the efficiency of binding of candidate proteins and a sample of the known negative and positive (not containing and containing M and G antibodies to SARS-CoV-2 coronavirus, respectively) blood serum. In the study of 100% of the known positive samples in ELISA based on the created recombinant polypeptides, a positive result was obtained; and in the study of 100% of the known negative blood sera, a negative result was obtained.Conclusion. The obtained results indicate that the created polypeptides are promising as a base for the development of diagnostic kits for the detection of antiSARS-CoV-2 antibodies in the serum / plasma of patients with the ELISA method.