Εφαρμογή αισθητήρων βιοηλεκτρικής αναγνώρισης (BERA) νεότερης γενιάς στην ιολογία
Authors: Περδικάρης Αντώνιος 
Published: January 2014

Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η ανάπτυξη μια βασικής δομής κυτταρικών βιοαισθητήρων, οι οποίοι θα μπορούν να ανιχνεύουν σε ελάχιστο χρόνο και με ικανοποιητική ευαισθησία, αντιγόνα και αντισώματα ιών. Η μεθοδολογική προσέγγιση εστιάζεται στην χρήση γνωστών εργαστηριακών τεχνικών στη βιολογία, βασισμένων στη Βιοηλεκτρική Δοκιμή Αναγνώρισης (Bioelectric Recognition Assay – BERA) για την επίτευξη ενός απλού στη λειτουργία συστήματος ανίχνευσης ιών, σε φυτικούς και ανθρώπινους οργανισμούς. Επίσης, περιγράφεται η χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης για την δημιουργία εξειδικευμένων «τροποποιημένων» κυττάρων στην παρουσία συγκεκριμένων ιών. Σαν αντιπροσωπευτικό παράδειγμα χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες Vero, στην μεμβράνη των οποίων με τη χρήση της εν λόγω τεχνικής, εισήχθησαν αντισώματα των ιών CMV ή TRV ως προς την ανίχνευση των αντίστοιχων ιών που προσβάλουν φυτικούς οργανισμούς και αντισώματα και αντιγόνα του HBV. Σε σχέση με το πρώτο τμήμα του πειραματικού μέρους, η πρόσδεση του CMV στα κύτταρα του αισθητήρα και, σε δεύτερο πείραμα, του TRV, είχε σαν αποτέλεσμα την πρόκληση συγκεκριμένης και μετρήσιμης μεταβολής στο δυναμικό της μεμβράνης των «τροποποιημένων» κυττάρων του βιοαισθητήρα. Αντίθετα η παρουσία μη ομόλογων ιών όπως του CGMMV και του PVY δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στο δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με τη χρήση μικροσκοπίας φθορισμού, όπου η παρουσία ομόλογου ιού ως προς τα αντισώματα που έφεραν τα «τροποποιημένα» κύτταρα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων ασβεστίου του κυτταροπλάσματος. Επιπρόσθετα η εφαρμογή της ανωτέρω μεθόδου σε δείγματα καθαρού ιού σε διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0.0 ng ml-1 (control), 5.0, 7.0, 10.0, 13.0 και 20.0 ng ml-1, στην περίπτωση του TRV μας έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως προς τη δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του ιού. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση των TRV και CGMMV στο δυναμικό των ινοβλαστών Vero, καθώς και η πιθανότητα χρήσης μητροποποιημένων κυττάρων στην ανίχνευση των εν λόγω ιών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αντίδραση δεν είναι μεν εξειδικευμένη όμως είναι εμφανής η επίδραση των δύο ιών στο μεμβρανικό δυναμικό. Η ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα BERA ως εφαρμογή στην ανίχνευση της παρουσίας ηπατικών ιών βασίστηκε στις ίδιες τεχνικές, προσαρμοσμένες στις ιδιαιτερότητες των εν λόγω ιών. Η τροποποίηση των κυττάρων περιελάμβανε την εισαγωγή, με τη χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης, στην μεμβράνη των κυττάρων Vero του βιοαισθητήρα, αντισωμάτων (anti-HBs, anti-HBe) σαν πρώτη εφαρμογή για την ανίχνευση των αντίστοιχων αντιγόνων του HBV και ως δεύτερη εφαρμογή την εισαγωγή αντιγόνου του ιδίου ιού (HBsAg) για την ανίχνευση του αντίστοιχου αντισώματος. Η εφαρμογή έλαβε χώρα σε κλινικά δείγματα ορού αίματος ασθενών, ενώ ως ετερόλογος ιός χρησιμοποιήθηκε ο ιός C της ηπατίτιδας (HCV). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε πολύ μικρό χρόνο μόλις 45 δευτερόλεπτα είναι δυνατή η ανίχνευση των μολυσματικών στοιχείων του ιού, αλλά και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το στάδιο της μολυσματικότητας που βρίσκεται ο ασθενής. Η εκλεκτικότητα των βιοαισθητήρων BERA βασισμένων σε «τροποποιημένα» κύτταρα εξαρτάται πάντα από την εξειδίκευση των αντισωμάτων ή των αντιγόνων που έχουν εισαχθεί στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης. Συνεπώς η περιγραφείσα μεθοδολογική προσέγγιση ενσωματώνει πολλά από τα μειονεκτήματα που εμφανίζουν και οι ορολογικές μέθοδοι. Παρόλα αυτά όμως πλεονεκτεί σημαντικά ως προς την ευαισθησία, την ταχύτητα απόκρισης και την επαναληψιμότητα. Συγκριτικά με τους οπτικούς και ηλεκτροχημικούς αισθητήρες, το σύστημα που περιγράφεται στην παρούσα εργασία έχει τα επιπλέον πλεονεκτήματα της απλούστερης χρήσης και της ολοκλήρωσης της διαδικασίας ανίχνευσης σε ένα βήμα. Θα πρέπει όμως να επισημανθεί ότι αποτελεί ένα προκαταρκτικό στάδιο για την ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου συστήματος βιοαισθητήρα, το οποίο θα βασίζεται σε κύτταρα των οποίων η μεμβράνη έχει τροποποιηθεί κατάλληλαπροσδίδοντας τους εξειδίκευση ως προς το μόριο, χημική ένωση ή μικροοργανισμό που πρόκειται να αναλυθεί. Όπως και στην περίπτωση των TRV και CGMMV μελετήθηκε και η επίδραση της παρουσίας του HBsAg και του HCV στο δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων Vero για μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή και διαπιστώθηκε, ότι ναι μεν δεν μπορούν απλά κύτταρα να δώσουν εξειδικευμένη αντίδραση, οι τιμές όμως του δυναμικού για τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή μεταβάλλονται γραμμικά. Εξετάσθηκε εκ νέου η δυνατότητα ανάπτυξης βιοαισθητήρα ανίχνευσης ιών οι οποίοι προσβάλουν φυτικούς οργανισμούς, βασικά χαρακτηριστικά του οποίου ήταν η χρήση αυτοματοποιημένου συστήματος επαφής των ηλεκτροδίων με τους βιοαισθητήρες. ...