Protein-peptide analysis using the Omnitrap technology coupled to high-resolution mass spectometry
Authors: Κοσμοπούλου Μαρία-Αγγελική 
Published: July 2023

Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει μια διεξοδική μελέτη των μηχανισμών κατακερματισμού πρωτεϊνών και πεπτιδίων στην αέρια φάση με φασματομετρία μάζας (MS) χρησιμοποιώντας τη νέα τμηματοποιημένη γραμμική παγίδα ιόντων που ονομάζεται πλατφόρμα OmnitrapTM. Η πολυδιάστατη και πολλαπλών σταδίων διαδοχική επεξεργασία πρωτεϊνικών ιόντων επιδεικνύεται με υψηλή αποτελεσματικότητα, ενώ η βελτιωμένη απόδοση είναι δυνατή χάρη την ενσωμάτωση ενός ευρέος φάσματος μεθόδων ενεργοποίησης ιόντων σε μια ενιαία πλατφόρμα με εξαιρετικά δυναμικό τρόπο. Το δίκτυο ενεργοποίησης ιόντων που διερευνήθηκε περιλαμβάνει εξωτερική έγχυση ιόντων αντιδραστηρίων, φωτονίων VUV, ηλεκτρονίων μεταβλητής ενέργειας, καθώς και συγκρούσεις με ουδέτερα μόρια. Πραγματοποιείται εις βάθος MSn χαρακτηρισμός πρωτεϊνών τόσο για την «από πάνω προς τα κάτω», όσο και για την «από κάτω προς τα πάνω» προσέγγιση, υπογραμμίζοντας τις μοναδικές δυνατότητες της πλατφόρμας Omnitrap. Το Κεφάλαιο 1 παρέχει το απαραίτητο θεωρητικό υπόβαθρο, συμπληρωματικό στο υλικό που παρουσιάζεται στα επόμενα κεφάλαια. Οι θεμελιώδεις πτυχές του κατακερματισμού των πρωτεϊνών στην αέρια φάση και οι διαφορετικές μέθοδοι διάσπασης που χρησιμοποιούνται στη φασματομετρία μάζας ανασκοπούνται εν συντομία. Τα χαρακτηριστικά σχεδιασμού της τεχνολογίας Omnitrap, καθώς και ένα νέο λογισμικό - που αναπτύχθηκε στην εταιρία Fasmatech - για την ανάλυση «από πάνω προς τα κάτω» δεδομένων παρουσιάζονται επίσης στο πρώτο κεφάλαιο. Η Fasmatech είναι μια εταιρεία κατασκευής οργάνων, όπου πραγματοποιήθηκαν όλες οι πειραματικές διαδικασίες που περιγράφονται σε αυτή τη διατριβή, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αιχμής τους. Ένας από τους κύριους στόχους αυτής της διατριβής είναι να επιδείξει τον σε βάθος χαρακτηρισμό άθικτων βιομορίων μέσω της «από πάνω προς τα κάτω» MS, ειδικά για τα μεγαλύτερα συστήματα όπου η χρήση διαφορετικού συνόλου μεθόδων ενεργοποίησης ιόντων μπορεί να δημιουργήσει συμπληρωματικές πληροφορίες, ενισχύοντας την κάλυψη αλληλουχίας και τις δομικές πληροφορίες. Στο Κεφάλαιο 2, η ικανότητα της πλατφόρμας Omnitrap να ενισχύσει την «από πάνω προς τα κάτω» MS προσέγγιση αποδεικνύεται από την πλήρη κάλυψη αλληλουχίας που επιτυγχάνεται για την μεσαίου μεγέθους πρωτεΐνη ουμπικουιτίνη (8+ κατάσταση φόρτισης) σε MS2 επίπεδο με τέσσερις διαφορετικές μεθόδους κατακερματισμού που περιλαμβάνουν ηλεκτρόνια, φωτόνια και ιόντα αντιδραστηρίου. Ο βαθμός συμπληρωματικότητας των ζευγών ιοντικών θραυσμάτων που επιτυγχάνεται σε αυτά τα πειράματα μπορεί να προσεγγιστεί μόνο με την υπεριώδη φωτοδιάσπαση (UVPD) (Shaw et al., 2013) και τη διάσπαση μεταφοράς ηλεκτρονίων σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση των ιόντων (AI-ETD) (Riley et al., 2017). Μια λεπτομερής ανάλυση των καναλιών κατακερματισμού που παρατηρούνται στην Διάσπαση μέσω ενεργοποίησης με ιόντα Υδρογόνου (HIAD), μια νέα μέθοδο διάστασης που χρησιμοποιείται για πρώτη φορά με εξαιρετική απόδοση, παρουσιάζεται επίσης στο Κεφάλαιο 2.Ο σχηματισμός πρωτεϊνικών ιόντων με ρίζα μέσω αποκόλλησης ηλεκτρονίων που οδηγεί σε αύξηση του επιπέδου φόρτισης προσφέρει νέες δυνατότητες στη διερεύνηση θεμελιωδών πτυχών των διεργασιών ενεργοποίησης-διάσπασης ιόντων. Ενδελεχής εξέταση των ανωτέρω παρουσιάζεται στο Κεφάλαιο 3 μέσω μιας σειράς διαδοχικών MS πειραμάτων πολλαπλών σταδίων που περιλαμβάνουν MS2 ιονισμό με ηλεκτρόνια της ουμπικουιτίνης και της αλυσίδας Β ινσουλίνης και MS3 διάσπαση μέσω συγκρούσεων (CID) των πρωτεϊνικών μορίων με έλλειψη υδρογόνου. Νέες σειρές θραυσμάτων εντοπίζονται και αποδίδονται σε εκτεταμένες ενδομοριακές αντιδράσεις αναδιάταξης ατόμων υδρογόνου που ξεκινούν με ιονισμό από ηλεκτρόνια και επακόλουθη ενεργοποίηση σύγκρουσης. Η έκταση των αντιδράσεων αναδιάταξης φαίνεται να εξαρτάται από την κατάσταση φόρτισης, βελτιώνοντας την κάλυψη αλληλουχίας για τα περισσότερα από τα μόρια με έλλειψη υδρογόνου που εξετάστηκαν. Παρατηρήθηκε αυξημένη προτίμηση σε οδούς διάσπασης ριζών που περιλαμβάνουν αρωματικά αμινοξέα, αναδεικνύοντας τα ως προτιμώμενη θέση για να συμβεί ιονισμός με ηλεκτρόνια, συμμετέχοντας δραστικά σε διαδικασίες μετανάστευσης των ριζών και σε αντιδράσεις ενδομοριακής αναδιάταξης ατόμων υδρογόνου. Το «από πάνω προς τα κάτω» MS3 CID των ιονισμένων πρωτεϊνών αντιπαραβάλλεται με το MS2 CID των ομολόγων τους με άρτιο αριθμό ηλεκτρονίων για να τονίσει τις μεταβολές στις οδούς κατακερματισμού για είδη που διαφέρουν μόνο κατά ένα άτομο υδρογόνου. Μια λεπτομερής σύνοψη αυτού που θεωρείται πλέον ως η τελευταία λέξη της τεχνολογίας στην «από πάνω προς τα κάτω» φασματομετρία μάζας για τον χαρακτηρισμό ενός άθικτου μονοκλωνικού αντισώματος (mAb) σε λειτουργία εκτός σύνδεσης παρέχεται στο Κεφάλαιο 4. Μια σειρά MS2, MS3 και MS4 εκτός σύνδεσης πειραμάτων με ανέπαφη μη ανηγμένη τραστουζουμάμπη (Herceptin), ιονισμένη τόσο σε φυσικές όσο και σε αλλοιωτικές (denaturing) συνθήκες και κατακερματισμένη με μια ποικιλία μεθόδων διάσπασης, όπως CID, διάσπαση επαγόμενη από ηλεκτρόνια (EID), διάσπαση με πρόσληψη ηλεκτρονίων (ECD), φωτοδιάσπαση VUV και HIAD. παρουσιάζονται, αναδεικνύοντας τις μοναδικές δυνατότητες της τεχνολογίας Omnitrap. Νέα πρότυπα στην κάλυψη της αμινοξικής ακολουθίας των άθικτων mAb ορίζονται με τη χρήση πολυδιάστατων πολλαπλών σταδίων MS4 πειραμάτων. Η υψηλότερη από όσο γνωρίζουμε κάλυψη αλληλουχίας >80% για την ελαφριά αλυσίδα που απελευθερώνεται από άθικτη μη ανηγμένη Herceptin επιτυγχάνεται με MS4 ενεργοποίηση μέσω συγκρούσεων της ελαφριάς αλυσίδας μειωμένου φορτίου που σχηματίζεται από πρόσληψη ηλεκτρονίων. Αυτή η συγκεκριμένη MS4 πειραματική ροή μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για de novo προσδιορισμό αλληλουχίας της μεταβλητής περιοχής μονοκλωνικών αντισωμάτων όσο και για σκοπούς Ποιοτικού Ελέγχου (QC) παρέχοντας λεπτομερείς πληροφορίες όσον αφορά στο δίκτυο δισουλφιδικών δεσμών και πιθανής αναδιάταξης τους. Αποδεικνύεται ότι τόσο το CID όσο και το ECD μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάσπαση των διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών για την απελευθέρωση της ελαφριάς αλυσίδας από άθικτα mAbs, ενώ συνδυασμός των παραπάνω μεθόδων μπορεί να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω για τη διάσπαση των ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών στην αέρια φάση. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται για τα άθικτα mAbs με την «από πάνω προς τα κάτω» MS τονίζουν ότι η πλήρης κάλυψη ακολουθίας ενός ανέπαφου mAb σε ένα εκτός σύνδεσης «από πάνω προς τα κάτω» πείραμα πολλαπλών σταδίων φαίνεται εφικτή. Επιπλέον, φάσματα MS2 EID και MS2 HIAD άθικτων αντισωμάτων ελήφθησαν για πρώτη φορά. Όλα τα «από πάνω προς τα κάτω» δεδομένα αναλύθηκαν στο Peak Finder, μια νέα πλατφόρμα λογισμικού όπου το βήμα αποσυνέλιξης (deconvolution) εξαλείφεται και εφαρμόζονται προηγμένοι αλγόριθμοι ειδικά για την επιτάχυνση της χειροκίνητης επεξεργασίας φασμάτων μάζας με υψηλή συμφόρηση. Στο τελευταίο Κεφάλαιο 5 εξετάζεται η «από κάτω προς τα πάνω» προσέγγιση χρησιμοποιώντας τις μεθόδους διάσπασης με ηλεκτρόνια που είναι διαθέσιμες στην πλατφόρμα Omnitrap. Ένα πλήρες σύνολο MS2 πειραμάτων με εξαρτώμενη από τα δεδομένα ανάλυση (Data Dependent Acquisition, DDA) διεξήχθη για τη θρυψινοποιημένη λευκωματίνη ορού βοοειδών (BSA) με διαχωρισμό νανο-υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με την πλατφόρμα Omnitrap-Q Exactive HF MS χρησιμοποιώντας ως μεθόδους κατακερματισμού EID, ECD και υψηλότερης ενέργειας διάσπαση σε C-trap (HCD). Τα «από κάτω προς τα πάνω» δεδομένα BSA συγκρίνονται τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο πεπτιδίων όσον αφορά την κάλυψη αλληλουχίας, τον αριθμό αντιστοιχιών φάσματος πεπτιδίου (PSM), τη συμπληρωματικότητα ιοντικών θραυσμάτων, τα μοτίβα κατακερματισμού και τα w διαγνωστικά ιόντα χρησιμοποιώντας ένα νέο λογισμικό της Fasmatech ως επέκταση στο Proteome Discoverer (PD). Αποδεικνύεται ότι οι μέθοδοι διάσπασης που βασίζονται σε ηλεκτρόνια παρέχουν υψηλότερη κάλυψη αλληλουχίας και συμπληρωματικότητα για τα πεπτίδία με φορτίο 3+ και 4+ και υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης μεταξύ λευκίνης και ισολευκίνης μέσω του σχηματισμού των διαγνωστικών ιόντων w, ενώ στο DDA MS2 EID προσδιορίζονται θραύσματα υψηλής αφθονίας με ουδέτερες απώλειες πλευρικής αλυσίδας. Τα μονοπάτια πρωτογενούς κατακερματισμού μέσω ExD (x = I, C) και οι απώλειες ουδέτερης πλευρικής αλυσίδας συζητούνται εις βάθος. Συνολικά, ο συνδυασμός των τριών μεθόδων κατακερματισμού (EID, ECD και HCD) μπορεί να παρέχει πλήρη κάλυψη αλληλουχίας για όλα τα αναγνωρισμένα πεπτίδια. Ο συμπληρωματικός χαρακτήρας των διαφορετικών εργαλείων κατακερματισμού που διερευνώνται μπορεί να αξιοποιηθεί περαιτέρω για την ενίσχυση της de novo «από κάτω προς τα πάνω» πρωτεωμικής ανάλυσης.