Molecular genetic and functional investigation of microbial arylamine N-acetyltransferases
Authors: Γαρεφαλάκη Βασιλική 
Published: September 2021

Όλοι οι ζώντες οργανισμοί έρχονται διαρκώς σε επαφή με διάφορες ξενοβιοτικές ουσίες του περιβάλλοντός τους. Προκειμένου να προστατευθούν από επιβλαβή έκθεση σε τοξικές συγκεντρώσεις, οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει προσαρμοστικούς μηχανισμούς και μεταβολικά μονοπάτια που επιτρέπουν τη βιομετατροπή και εξάλειψη εξωγενών ουσιών. Ένα τέτοιο μονοπάτι περιλαμβάνει τα ένζυμα της οικογένειας των Ν-ακετυλοτρανσφερασών των αρυλαμινών (ΝΑΤ), τα οποία καταλύουν τη Ν-ακετυλίωση αρωματικών αμινών και υδραζινών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο χαρακτηρισμός γονιδίων ΝΑΤ σε μικροοργανισμούς, κυρίως βακτήρια, και η μελέτη των αντίστοιχων ενζύμων ως προς την ικανότητά τους να μεταβολίζουν ξενοβιοτικές ουσίες.Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, επιλέχθηκε προς μελέτη μία συλλογή ενενήντα τριών βακτηριακών στελεχών, απομονωμένων από διάφορα φυσικά ή επιβαρυμένα με ρύπους (κυρίως υδάτινα) περιβάλλοντα. Η επιλογή αυτή βασίστηκε σε συγκεκριμένα κριτήρια, μετά και από υπολογιστική αναζήτηση μικροβιακών γονιδίων ΝΑΤ σε γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων. Η συλλογή περιλάμβανε ταξινομικές ομάδες βακτηρίων που είτε παρουσιάζουν ενδιαφέρον ως προς την ικανότητά τους να βιοαποικοδομούν ξενοβιοτικές ουσίες, είτε διαθέτουν πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό. Η μοριακή ταξινόμηση των στελεχών πραγματοποιήθηκε με αλληλούχηση των γονιδίων 16S rRNA. Στη συνέχεια, ένα υποσύνολο 60 αντιπροσωπευτικών στελεχών μελετήθηκε για αντοχή στην 3,4-διχλωροανιλίνη (3,4-DCA), προσδιορίζοντας έτσι βακτηριακά είδη με δυνητική χρησιμότητα στη βιοαποκατάσταση του συγκεκριμένου βλαπτικού περιβαλλοντικού ρύπου που αποτελεί σύνηθες παραπροϊόν των βιομηχανικών δραστηριοτήτων και της χρήσης αγροχημικών σκευασμάτων.Η μελέτη ακολούθως εστίασε στη συγκριτική λειτουργική διερεύνηση 16 γονιδίων ΝΑΤ, τα οποία ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκαν από στελέχη της παραπάνω συλλογής. Μετά από έκφραση και καθαρισμό (μέσω χρωματογραφίας συγγένειας) των αντίστοιχων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνικών προϊόντων, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ενζυμικής ενεργότητας για προσδιορισμό της επιλεκτικότητας υποστρώματος δότη και δέκτη ακυλομάδας, δηλαδή για τα δύο διαδοχικά σκέλη της ενζυμικής αντίδρασης. Επιπλέον, εφαρμόστηκε η τεχνική της διαφορικής φθορισμομετρικής σάρωσης για εκτίμηση της θερμικής σταθερότητας των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ΝΑΤ, τόσο απουσία, όσο και παρουσία διαφορετικού κάθε φορά υποστρώματος-δότη ακυλομάδας. Η πλειοψηφία των ενζύμων ΝΑΤ που μελετήθηκαν έδειξε προτίμηση κυρίως για το ακέτυλο συνένζυμο Α (acetyl-CoA) και δευτερευόντως για το προπιόνυλο συνένζυμο Α (propionyl-CoA), σε συμφωνία με την πρότερη βιβλιογραφία. Oι χημικές ουσίες που παρήγαγαν υψηλότερη ενζυμική ενεργότητα ως δέκτες ακυλομάδας ήταν οι υδραλαζίνη (HDZ), 2-αμινοφαινόλη (2AP) και 5-αμινοσαλικυλικό οξύ (5AS). Πέντε από τα ομόλογα ένζυμα ΝΑΤ που μελετήθηκαν παρείχαν, ωστόσο, μόλις οριακά ανιχνεύσιμη ειδική ενεργότητα με όλους τους συνδυασμούς υποστρωμάτων που δοκιμάστηκαν. Τα συγκεκριμένα ομόλογα ανήκουν κυρίως σε βακτήρια που φέρουν περισσότερα από ένα γονίδια NAT, επομένως αυτά θα μπορούσαν είτε να είναι ανενεργά ως πλεονάζοντα, είτε να έχουν παρεκκλίνει λειτουργικά ώστε να καταλύουν διαφορετικές αντιδράσεις.Σημαντικές διαφοροποιήσεις ως προς την προτίμηση υποστρωμάτων παρατηρήθηκαν για δύο ομόλογα ένζυμα ΝΑΤ, το (STRVZ)NAT2 του στρεπτομύκητα του εδάφους Streptomyces zaomyceticus που παρουσίασε επιλεκτικότητα για τα υποστρώματα-δέκτες 2AP, π-ανισιδίνη (ANS) και 3,4-DCA, καθώς επίσης το (TSUPD)NAT1 του καρυνοβακτηρίου Tsukamurella paurometabola που παρουσίασε μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για το υπόστρωμα-δότη μαλόνυλο συνένζυμο Α (malonyl-CoA), διατηρώντας ωστόσο χαμηλότερη ενεργότητα και με τα υπόλοιπα υποστρώματα-δότες που δοκιμάστηκαν. Το ομόλογο (TSUPD)NAT1 μελετήθηκε περαιτέρω και με κινητική ανάλυση έναντι των προτιμώμενων υποστρωμάτων δότη και δέκτη ακυλομάδας. Επιπροσθέτως, υπολογιστική στοίχιση της αμινοξικής αλληλουχίας, καθώς και μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής του ομολόγου (TSUPD)NAT1 σε σχέση με άλλες γνωστές βακτηριακές πρωτεΐνες ΝΑΤ, αποκάλυψε μία ασυνήθιστη καταλυτική τριάδα αποτελούμενη από τα κατάλοιπα Cys, His και Glu αντί των συνηθισμένων Cys, His και Asp που χαρακτηρίζουν τη συγκεκριμένη οικογένεια ενζύμων.Ακολούθως, η έρευνα επεκτάθηκε στην πιλοτική εφαρμογή επιπλέον μεθοδολογιών, με σκοπό τη μελέτη του ενδοκυτταρικού ρόλου των μικροβιακών γονιδίων και πρωτεϊνών ΝΑΤ που χαρακτηρίστηκαν. Δοκιμάστηκε σειρά από μεθόδους λύσης βακτηριακών κυττάρων, ενώ πραγματοποιήθηκαν ακόμη δοκιμές μέτρησης της ενδογενούς ενζυμικής ενεργότητας ΝΑΤ με χρήση του αντιδραστηρίου του Ehrlich, καθώς επίσης και σχεδιασμός και εφαρμογή πρωτοκόλλων για απομόνωση βακτηριακού RNA, σύνθεση cDNA και εφαρμογή RT-PCR με απώτερο σκοπό την ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων ΝΑΤ. Αν και αντιμετωπίστηκαν δυσκολίες που παρεμπόδισαν την ολοκλήρωση αυτού του σκέλους της μελέτης, οι προσπάθειες αυτές ανοίγουν το δρόμο για μελλοντική έρευνα πάνω στον ενδογενή ρόλο των βακτηριακών πρωτεϊνών ΝΑΤ και τους παράγοντες που μπορεί να επηρεάζουν την έκφρασή τους στο κύτταρο, καθώς και την in vivo ενζυμική ενεργότητά τους.Τέλος, υποστηρίζοντας άλλη παράλληλη μελέτη του εργαστηρίου αναφορικά με τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών ΝΑΤ στους μύκητες, εκφράστηκαν σε ανασυνδυασμένη μορφή έξι πρωτεΐνες ΝΑΤ από τους φυτοπαθογόνους ασκομύκητες Fusarium verticillioides και Fusarium graminearum, υπό συνθήκες που να επιτρέπουν την ενσωμάτωση του τροποποιημένου αμινοξέος L-σεληνομεθειονίνη (Se-Met) στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, έτσι ώστε να καταστεί εφικτός μελλοντικά ο κρυσταλλογραφικός προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής τους. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη του ανασυνδυασμένου ισοενζύμου (GIBM7)NAT3 του F. verticillioides, έναντι του προτιμώμενου υποστρώματος-δότη ακυλομάδας (acetyl-CoA).Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτέλεσε αφετηρία μίας νέας διερεύνησης στο πεδίο, αποβλέποντας στη συγκριτική μοριακή γενετική και λειτουργική μελέτη των γονιδίων ΝΑΤ σε ένα ευρύ και αντιπροσωπευτικό ταξινομικό εύρος μικροοργανισμών. Επιπλέον, επέτρεψε περαιτέρω εξερεύνηση του ξενοβιοτικού μεταβολισμού των βακτηρίων, εστιάζοντας στα ένζυμα ΝΑΤ και προσδιορίζοντας λειτουργικές αποκλίσεις μεταξύ διαφορετικών ομολόγων. Παράλληλα, η πειραματική προσέγγιση που ακολουθήθηκε παρήγαγε πρωτότυπα υλικά (π.χ. κλώνους γονιδίων) τα οποία θα χρησιμεύσουν στη συνέχιση της έρευνας στο πεδίο.