Development of an integrated biosensor system for Toxicology and Pharmacology applications
Authors: Παϊβανά Γεωργία 
Published: April 2022

Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μια αναλυτική μελέτη σχετικά με τις ηλεκτρικές μετρήσεις σύνθετης αντίστασης (εμπέδησης) σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Με βάση τις αρχές της Φασματοσκοπίας Ηλεκτροχημικής Εμπέδησης (EIS) ως μια τεχνική που εφαρμόζεται κυρίως για βιολογικές δοκιμές, αξιολογήθηκαν οι ηλεκτρικές ιδιότητες του διαλύματος προς δοκιμή. Ο χαρακτηρισμός της σύνθετης αντίστασης καθώς και οι παραλλαγές της ανά πεδίο εφαρμογής περιγράφονται από την εμπέδηση. Μια κοινή προσέγγιση για διαφορετικούς ιατρικούς τομείς αποτελεί η βιο-εμπέδηση ως μια μέθοδος μη επεμβατική και παράλληλα οικονομικά αποδοτική. Η εφαρμογή διάφορων ουσιών που επηρεάζουν σημαντικά τις κυτταροκαλλιέργειες επιβεβαιώνει την σημασία αυτής της μεθόδου. Επιπρόσθετα, οι μετρήσεις εμπέδησης παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τις ιδιότητες της καλλιέργειας που δοκιμάστηκαν υπό συνθήκες ακινητοποίησης των κυττάρων. Για την εκτέλεση των μετρήσεων εμπέδησης χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένα ειδικά προσαρμοσμένα ηλεκτρόδια από διαφορετικά υλικά σε συνδυασμό με ειδικά κατασκευασμένη τρισδιάστατα εκτυπωμένη κοιλότητα. Η πρώτη πειραματική ενότητα παρουσιάζει την εφαρμογή ενός συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή κατεχολαμίνης. Πιο συγκεκριμένα, η ντοπαμίνη (DA) χρησιμοποιήθηκε ως διεγερτικό συστατικό στην ακινητοποιημένη κυτταρική καλλιέργεια για την αξιολόγηση των επιδράσεων της συγκεκριμένης βιοδραστικής ουσίας. Ο βασικός στόχος αυτής της ενότητας είναι η εξαγωγή των καμπυλών βαθμονόμησης για ένα συγκεκριμένο πεδίο συχνοτήτων με την εφαρμογή γνωστών συγκεντρώσεων ντοπαμίνης χρησιμοποιώντας μια συσκευή μέτρησης εμπέδησης. Για λόγους σύγκρισης, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις που αφορούν την συμπεριφορά ακινητοποιημένων κυττάρων και μη με την παρουσία των ίδιων συγκεντρώσεων ντοπαμίνης καθώς επίσης και μετρήσεις που αφορούν την συμπεριφορά των αντίστοιχων διαλυμάτων ντοπαμίνης χωρίς την παρουσία κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ηλεκτρική απόκριση του κυτταρικού μέσου εξαρτάται από την συχνότητα, θεωρώντας έτσι τις συνθήκες ακινητοποίησης ως κρίσιμο παράγοντα στις κυτταρικές καλλιέργειες. Επιπλέον, η ηλεκτρική απόκριση φαίνεται να επηρεάζεται από την απορρόφηση της ντοπαμίνης από τα κύτταρα, πληροφορία που πρέπει να ληφθεί υπόψιν για την ιατρική αξιολόγηση σχετικά με την σχιζοφρένεια, την νόσο του Πάρκινσον κτλ. Στην δεύτερη πειραματική ενότητα αξιολογούνται οι αντιδράσεις των ακινητοποιημένων κυττάρων υπό συνθήκες δύο διαστάσεων ή τριών διαστάσεων κατά την εφαρμογή μιας βιοδραστικής ουσίας. Συγκεκριμένα, οι δυο τύποι των κυτταρικών διατάξεων ακινητοποίησης είναι ικανοί να μιμούνται in vivo συνθήκες ιστού. Η ανάλυση της εμπέδησης διεξήχθη σε κύτταρα νευροβλαστώματος ποντικιού που υποβλήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο διεγερτικό στοιχείο. Από τα αποτελέσματα της προηγούμενης πειραματικής ενότητας, η ντοπαμίνη επιλέχθηκε και πάλι ως βιοδραστική ουσία για περαιτέρω έρευνα. Ο κύριος στόχος αυτής της ενότητας είναι η εξαγωγή καμπυλών βαθμονόμησης για διάφορες συχνότητες για την αναλυτική περιγραφή της συμπεριφοράς της ντοπαμίνης, αυτή τη φορά κατά την εφαρμογή της σε δισδιάστατες και τρισδιάστατες ακινητοποιημένες κυτταρικές καλλιέργειες. Η μέση τιμή της εμπέδησης αξιολογήθηκε για κάθε συχνότητα και για τους δυο τύπους ακινητοποίησης. Οι διαφορικές αποκρίσεις απέδειξαν την επίδραση της εμπέδησης όταν εφαρμόζεται μια συχνότητα και για τις δυο μεθόδους ακινητοποίησης και ειδικά για την περίπτωση της δυσδιάστατης ακινητοποίησης όπου η εμπέδηση είχε υψηλότερες τιμές. Επιπροσθέτως, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αύξηση στην συγκέντρωση της ντοπαμίνης σχετίζεται με την μείωση στην εμπέδηση για την περίπτωση της τρισδιάστατης ακινητοποίησης των κυττάρων, παρόλο που η δυσδιάστατη ακινητοποίηση παρουσίασε την αντίθετη συμπεριφορά. Η τρίτη και τελευταία πειραματική ενότητα εστιάζεται στην έρευνα και την αξιολόγηση αντικαρκινικών φαρμάκων. Στην βιβλιογραφία, οι επιστήμονες έχουν επισημάνει τον ουσιαστικό ρόλο που παίζουν οι καρκινικές κυτταρικές σειρές καθώς παρέχουν σημαντικές πληροφορίες από τις μετρήσεις εμπέδησης σε πραγματικό χρόνο σχετικά με την βιωσιμότητα των κυττάρων. Τέσσερις διαφορετικές προσκολλημένες καρκινικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών (SK-N-SH, HeLa, HEK293, and MCF-7) που ακινητοποιήθηκαν τρισδιάστατα σε τρεις διαφορετικούς πληθυσμούς (50.000, 100.000, and 200.000 cells/100μl) χρησιμοποιώντας υδρογέλη αλγινικού ασβεστίου εξετάστηκαν μέσω φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης. Η ουσία 5-φθοροουρακίλη (5-FU) χρησιμοποιήθηκε ως βασικός κυτταροστατικός παράγοντας σε κάθε κυτταρική καλλιέργεια. Η ενότητα αυτή στοχεύει στην αξιολόγηση της συμπεριφοράς των προαναφερθεισών κυτταρικών σειρών μετά την εφαρμογή του 5-FU εξάγοντας τις τιμές μέσης εμπέδησης για διαφορετικές συχνότητες. Για λόγους σύγκρισης, οι ίδιες μετρήσεις εμπέδησης διεξήχθησαν για καθαρές ακινητοποιημένες κυτταρικές καλλιέργειες. Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν καταδεικνύουν μια σχέση ανάλογα με τον κυτταρικό πληθυσμό μεταξύ κάθε κυτταρικής σειράς και της αντίστασης που εξαρτάται από την συχνότητα. Επίσης, το εύρος της εμπέδησης μπορεί να υποδεικνύει την δυνατότητα ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων μαζί με τα αποτελέσματα της χημειοθεραπείας χρησιμοποιώντας μετρήσεις εμπέδησης. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί λόγω της ικανότητας της μεθόδου να διαφοροποιεί τις μεταβολές μεταξύ της πυκνότητας του πληθυσμού και των μορφολογιών των κυττάρων. Η συμβολή της παρούσας ερευνητικής μελέτης περιλαμβάνει την ανάπτυξη καθώς επίσης και τον χαρακτηρισμό ενός συστήματος βιοαισθητήρα που βασίζεται σε μετρήσεις ηλεκτρικής αντίστασης στον τομέα της φαρμακολογίας και της τοξικολογίας. Το προτεινόμενο σύστημα βιοαισθητήρα αποτελεί μια οικονομική, αποδοτική και αποτελεσματική λύση για την εκτέλεση μετρήσεων εμπέδησης σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Όλες οι πειραματικές προσεγγίσεις παρουσίασαν μια επαρκή απόκριση του βιοαισθητήρα σχετικά με το διάλυμα που δοκιμάστηκε σε συνδυασμό με την συσκευή μέτρησης της εμπέδησης. Παρόλο που η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε για κάθε πείραμα επιτρέπει την επιλογή πέντε μόνο συχνοτήτων, τα αποτελέσματα της μέσης τιμής της εμπέδησης που υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τις τιμές του πλάτους για κάθε διάλυμα παρουσίασαν ένα μοτίβο ικανό να διακρίνει τις μεταβολές στην μορφολογία των κυττάρων με ή χωρίς την παρουσία βιοδραστικής ουσίας όταν εφαρμόζεται συχνότητα. Συνεπώς, το προτεινόμενο σύστημα βιοαισθητήρα θεωρείται πολλά υποσχόμενο για μελλοντική έρευνα μετά την εφαρμογή βελτιώσεων που αφορούν παράγοντες όπως ο τύπος των ηλεκτροδίων, το μέγεθος της κοιλότητας κτλ.