Προσδιορισμός φυσικών και συνθετικών αναστολέων αντλιών εκροής σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa
Authors: Ελευθεριάδου Ιωάννα 
Published: March 2023

Τα πολυανθεκτικά βακτήρια αποτελούν μια εξαιρετικά σοβαρή απειλή για τη δημόσια υγεία. Το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa αποτελεί συχνή αιτία ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων και έχει ταξινομηθεί από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ως επικίνδυνο παθογόνο εξαιτίας των υψηλών ποσοστών αντοχής που εμφανίζει. Τα βακτήρια μπορούν να αναπτύξουν αντοχή μέσω διαφόρων μηχανισμών. Η αποβολή φαρμάκων από τις αντλίες ενεργητικής εκροής αποτελεί έναν σημαντικό μηχανισμό μικροβιακής αντοχής. Οι αναστολείς αντλιών εκροής ως ενισχυτικά της υπάρχουσας αντιμικροβιακής θεραπείας είναι μια λογική και αποδοτική προσέγγιση, καθώς η έλλειψη νέων αντιβιοτικών απειλεί την παγκόσμια υγεία. Η συνδυαστική χορήγηση φυσικών ή συνθετικών ενώσεων μαζί με συμβατικά αντιβιοτικά αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική θεραπευτική λύση καθώς θα μπορούσε να επαναφέρει τη δράση αντιβιοτικών που δεν χρησιμοποιούνται λόγω αναποτελεσματικότητας. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε ο ρόλος των φυσικών ενώσεων καρβακρόλη και θυμόλη και των συνθετικών νανοσωματιδίων CuO@PEG, ZnO@PEG και CuZn@TrEG ως αναστολείς των αντλιών εκροής σε πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa. Ο τρόπος δράσης τους αξιολογήθηκε με τη διερεύνηση της συνεργιστικής τους αλληλεπίδρασης σε συνδυασμό με τα αντιβιοτικά μεροπενέμη, σιπροφλοξασίνη/λεβοφλοξασίνη και αζιθρομυκίνη σε υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις σε βακτηριακά στελέχη P. aeruginosa με ενεργό σύστημα εκροής. Η μεταξύ τους αλληλεπίδραση αξιολογήθηκε με τη μέθοδο checkerboard και τις καμπύλες κυτταρικού θανάτου. Οι φυσικές και συνθετικές ενώσεις διερευνήθηκαν με χρήση φθορισμόμετρου ως προς την ικανότητα να αναστέλλουν την εκροή της χρωστικής βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) και να προωθούν την ενδοκυτταρική της συγκέντρωση. Επίσης εξετάστηκε ο ρόλος τους στη βακτηριακή μεμβράνη, στη σχετική έκφραση των γονιδίων mexA, mexB και mexC των αντλιών εκροής MexAB-OprM και MexCD-OprJ αλλά και στην ικανότητα ταχείας ανάπτυξης αντοχής. Η ασφάλεια τους διερευνήθηκε in vitro με αναλύσεις τοξικότητας (MTT, NR) και τη δοκιμασία αιμόλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καρβακρόλη και η θυμόλη αλλά και τα εξεταζόμενα νανοσωματίδια έχουν συνεργιστική δράση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με αντιβιοτικά που υπόκεινται σε εκροή μειώνοντας τις τιμές MIC τους. Επιπλέον, όλες οι εξεταζόμενες ενώσεις σε υπο-ανασταλτική συγκέντρωση ενίσχυσαν την ενδοκυτταρική συσσώρευση του EtBr και μείωσαν την εκροή του από τα βακτηριακά κύτταρα. Ο μηχανισμός της δράσης τους μπορεί να εξηγηθεί από τη μείωση που παρατηρήθηκε στη σχετική έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων των αντλιών εκροής. Η συγχορήγηση των υποψήφιων αναστολέων με τις κινολόνες και την αζιθρομυκίνη είχε ως αποτέλεσμα παρατεταμένη μετα-αντιβιοτική δράση. Επιπλέον, οι φυσικοί αναστολείς καρβακρόλη και θυμόλη μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών μεταλλαγμάτων ενώ δεν παρουσίασαν τοξικότητα στις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για να ασκήσουν τη δράση τους. Τα νανοσωματίδια εμφάνισαν τοξική δράση εκτός από τα νανοσωματίδια ZnO που ήταν πλήρως βιοσυμβατά. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο οι φυσικές ενώσεις καρβακρόλη και θυμόλη όσο και τα συνθετικά νανοσωματίδια μπορούν να αποτελέσουν πηγή αναστολέων αντλιών εκροής για την αντιμετώπιση της μικροβιακής αντοχής.