Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος
Authors: Βαλμάς Αλέξανδρος 
Published: September 2021

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνών φαρμακευτικού (ινσουλίνη, ιικές πρωτεΐνες) και βιοτεχνολογικού (TtPPO πολυφαινολοξειδάση) ενδιαφέροντος, καθώς και στην ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την αξιολόγηση της σταθερότητας μικροκρυστάλλων μακρομορίων σε μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Σχετικά με την ανθρώπινη ινσουλίνη, πραγματοποιήθηκε μια ενδελεχής μελέτη του πολυμορφισμού (κρυσταλλικού και μοριακού), παρουσία τριών οργανικών μορίων-προσδετών (4-ethylresorcinol, m-nitrophenol και p-coumaric acid), συναρτήσει του pH (8ο κεφάλαιο). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων περίθλασης ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά (XRPD) όσο και με πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο (SCXD). Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, δύο εκ των οποίων δεν έχουν καταγραφεί έως τώρα ξανά βιβλιογραφικά, ενώ εξετάζονται επίσης οι μεταξύ τους μεταβάσεις κρυσταλλικών φάσεων. Ένα από τα νέα μονοκλινή πολύμορφα, χαρακτηρίζεται από το πυκνότερο έως τώρα καταγεγραμμένο πακετάρισμα μορίων ινσουλίνης (ανάμεσα στα γνωστά μονοκλινή πολύμορφα στο ίδιο space group), με την ιδιαίτερη μοριακή του δομή να αποσαφηνίζεται μέσω πειραμάτων SCXD, παρέχοντας πληροφορίες που μπορούν δυνητικά να έχουν ιδιαίτερο φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Πρωτεϊνικά μόρια με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια του ιικού κύκλου ζωής, έχουν χαρακτηριστεί ως στόχοι κατάλληλοι για την ανάπτυξη αντιικών σκευασμάτων. Στο 9ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής αναλύεται η έκφραση, απομόνωση, κρυστάλλωση, δομικός χαρακτηρισμός καθώς και πρωταρχικά πειράματα εντοπισμού μορίων-αναστολέων (fragment screening) για δυο ιικές πρωτεΐνες: H πρωτεΐνη 3Cpro, η κύρια πρωτεάση του ιού Coxsackie B3, υπεύθυνου για πολυάριθμα περιστατικά μυοκαρδίτιδας παγκοσμίως, και της επικράτειας μεθυλτρανσφεράσης (MTase domain) της μη δομικής πρωτεΐνης 5 (NS5) του ορότυπου 3 του ιού Dengue. Πολυκρυσταλλικά δείγματα κατάλληλα για μετρήσεις XRPD παρήχθησαν και για τις δυο πρωτεΐνες, ενώ ακολούθησε ο πρωταρχικός δομικός χαρακτηρισμός των μικροκρυστάλλων στο επίπεδο της μοναδιαίας κυψελίδας. Για την περίπτωση της 3Cpro και με τη χρήση μονοκρυστάλλων, διεξήχθη, τέλος, ένα πλήρες πείραμα για τον εντοπισμό χημικών θραυσμάτων-δυνητικών αναστολέων (fragment screening) έναντι του συγκεκριμένου μορίου. Το 10ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής ερευνά το πώς μεταβολές περιβαλλοντικών παραγόντων όπως η σχετική υγρασία (rH) επηρεάζουν την εσωτερική οργάνωση των πρωτεϊνικών κρυστάλλων, που αποτελούνται από υψηλό ποσοστό διαλύτη. Η αναδιοργάνωση των μορίων που παρατηρείται στις περιπτώσεις αυτές μπορεί να καταγραφεί σε διακριτά προφίλ περίθλασης. Στο κεφάλαιο αυτό καταγράφεται η συμπεριφορά πολυκρυσταλλικών δειγμάτων λυσοζύμης, μονοκλινούς και τετραγωνικής συμμετρίας, σε συνθήκες μεταβαλλόμενης σχετικής υγρασίας, μέσω πειραμάτωνXRPD, με τη χρήση δεδομένων περίθλασης που καταγράφονται σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια αφυδάτωσης ή ενυδάτωσης του πολυκρυσταλλικού υλικού. Μέσω ανάλυσης Pawley στα δεδομένα εξάχθηκαν με ακρίβεια οι τιμές των πλεγματικών σταθερών, αποκαλύπτοντας μια χαρακτηριστική τάση εξέλιξης των τιμών τους συναρτήσει των υφιστάμενων περιβαλλοντικών μεταβολών. Επιπρόσθετα, εντοπίσθηκε το κατώτατο επίπεδο σχετικής υγρασίας στο οποίο διατηρείται η ακεραιότητα του κρυσταλλικού πλέγματος. Οι παρατηρήσεις αυτές, υπογραμμίζουν το εύρος των δυνατοτήτων των μετρήσεων ΧRPD, ως ένα ισχυρό εργαλείο καταγραφής των σταδιακών δομικών μεταβολών κατά τη μεταβολή των επιπέδων σχετικής υγρασίας με εφαρμογές στις διαδικασίες σχεδιασμού και παραγωγής φαρμακευτικών σκευασμάτων βασισμένων σε μικροκρυστάλλους πρωτεϊνών. Οι πολυφαινολοξειδάσες (PPOs) είναι μια ομάδα ενζύμων που φέρουν χαλκό στο ενεργό τους κέντρο και χρησιμοποιούνται ως βιοκαταλύτες σε πολυάριθμες βιοχημικές αντιδράσεις με εφαρμογές στη Βιομηχανία Τροφίμων, Φαρμάκων και Καλλυντικών. Μία από τις πιο σημαντικές, αν και λιγότερο μελετημένες εφαρμογές των PPOs, είναι πως αποτελούν έναν εξαιρετικά ευαίσθητο ανιχνευτή παραγώγων φαινόλης (όπως οι χλωροφαινόλες, CPs) σε μολυσμένα νερά, ενώ τα ίδια μόρια (PPOs) αποτελούν αποτελεσματικά εργαλεία για τη βιοαποικοδόμηση των ουσιών αυτών. Το κεφάλαιο 11 της παρούσας διατριβής επικεντρώνεται στην κρυσταλλογραφική μελέτη των χαρακτηριστικών της πολυφαινολοξειδάσης προερχόμενης από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila, TtPPO. Σημειακές μεταλλάξεις οδήγησαν στην παραγωγή μεταλλαγμάτων με τροποποιημένη ενεργότητα έναντι των χλωροφαινολών. Το κεφάλαιο αυτό επικεντρώνεται στο δομικό χαρακτηρισμό του μεταλλάγματος G292N, απουσία και παρουσία υποστρώματος στοχεύοντας στη βαθύτερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας. Πληροφορίες που σχετίζονται με την πρόσδεση διαφορετικών υποστρωμάτων στο ενεργό κέντρο του ενζύμου όπως η καταγραφή των αμινοξέων που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή, που μπορούν να εξαχθούν από υψηλής ποιότητας δομικά μοντέλα, μπορούν να οδηγήσουν στο σχεδιασμό και παραγωγή ακόμα πιο αποδοτικών καταλυτών για τη βιοαποικοδόμηση χλωροφαινολών, παρέχοντας ένα οικονομικό, αποδοτικό και βιώσιμο εργαλείο για τη διαχείριση υδατικών λυμάτων. Η συλλογή δεδομένων XRPD πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων και παρουσιάζεται μια συστηματική σύγκριση των δεδομένων που συλλέχθηκαν. Εργαστηριακά περιθλασίμετρα χρησιμοποιήθηκαν συστηματικά τόσο κατά τα πειράματα διαβάθμισης σχετικής υγρασίας όσο και για τον πρωταρχικό έλεγχο πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πριν τη συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού Σύγχροτρον ESRF. Επιπρόσθετες μετρήσεις για τα πιο αντιπροσωπευτικά δείγματα πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό X04SA του Ελβετικού Σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του ανιχνευτή MYTHEN II, που επέτρεψε την ανίχνευση μικρών, προηγουμένως μη ανιχνεύσιμων προσμίξεων και βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης ακόμα και σε δείγματα χαμηλής κρυσταλλικότητας. Τέλος, τα πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1 - 14.2 & P14) του Σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού Σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα. Το σύνολο των αποτελεσμάτων και παρατηρήσεων της παρούσας διατριβής υπογραμμίζουν την αποτελεσματικότητα της συνδυαστικής χρήσης διαφορετικών τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ, για τη συστηματική μελέτη της δομικής συμπεριφοράς μακρομορίων, σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας σε μικρό χρόνο ουσιαστική πληροφορία.