A study of membrane protein trafficking, endocytosis and degradation through the development of new genetic and biochemical tools
Authors: Μαρτζούκου Όλγα 
Published: September 2021

Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα ενσωματώνονται στη μεμβράνη του Ενδοπλασματικού Δικτύου (ΕΔ) συμμεταφραστικά. Προκειμένου να εξέλθουν από το ΕΔ με κυστίδια τύπου COPII, απαιτείται μία σειρά ελέγχων που αφορά τόσο παράγοντες που εντοπίζονται στο πρωτεϊνικό μόριο, όπως για παράδειγμα η παρουσία συντηρημένων μοτίβων εξόδου από το ΕΔ, όσο και η αλληλεπίδραση με ρυθμιστικές πρωτεΐνες που διασφαλίζουν τη σωστή αναδίπλωση του μορίου. Μετά την έξοδο από το ΕΔ, οι πρωτεΐνες διακινούνται μέσω του Golgi δικτύου, πακετάρονται σε κυστίδια, μεταφέρονται στον τελικό τους υποκυτταρικό προορισμό (πλασματική μεμβράνη και μεμβράνες οργανιδίων) και ενσωματώνονται στην κατάλληλη μεμβράνη. Επίσης, πολικά ευκαρυωτικά κύτταρα, όπως οι νευρώνες, τα μυϊκά ή οι παθογόνοι νηματοειδείς μύκητες (πχ. Aspergillus) διαθέτουν μηχανισμούς που διαφοροποιούν την στόχευση και τοπολογία κάθε πρωτεΐνης σε διακριτά σημεία της πλασματικής μεμβράνης. H εύρυθμη κυτταρική λειτουργία βασίζεται επίσης στη συνεχή μετακίνηση μορίων μεταξύ των διάφορων υποκυτταρικών οργανιδίων. Σε αρκετά βήματα αυτής της ενδοκυτταρικής κυκλοφορίας, συμμετέχουν ειδικά μεταφορικά ‘καλυμμένα’ κυστίδια τα οποία μεταφέρονται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων σε μια διαδικασία βάδισης που διεξάγεται από σχετιζόμενες κινητήριες πρωτεΐνες (κινεσίνη, δυνεΐνη). Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα προσαρμογής (Αdaptor Proteins, APs) φαίνεται να κατέχουν εξέχοντα ρόλο για τη δημιουργία κυστιδίων με κάλυμμα κλαθρίνης, στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ τα τρία μυκητιακά AP σύμπλοκα εμφανίζουν υψηλή ομολογία με τα αντίστοιχα των υπόλοιπων ευκαρυωτών (AP-1, AP-2, AP-3). Κατέχουν βασικό ρόλο στην επιλογή, διακίνηση, ενδοκύτωση και ανακύκλωση διαμεμβρανικών φορτίων, ενώ τόσο η παρουσία λειτουργικών υπομονάδων αυτών, όσο και της ίδιας της κλαθρίνης έχει αναδειχθεί ως απαραίτητη για την ομοιόσταση και επιβίωση των κυττάρων. Ωστόσο, υπό το φως ανακαλύψεων των τελευταίων 10 ετών υπάρχει εξαιρετικά έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον, που αφορά στην ύπαρξη και ανεξαρτήτων της κλαθρίνης, μονοπατιών διακίνησης πρωτεϊνών. Από τις πιο σημαντικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες είναι οι μεταφορείς υδατοδιαλυτών ουσιών και οι πρωτεΐνες που εμφανίζουν πολική εναπόθεση και συμμετέχουν σε διαδικασίες απαραίτητες για τη φυσιολογική ανάπτυξη του οργανισμού. Στη διατριβή αυτή μελετάται η σημασία του διμερισμού πριν την έξοδο από το ΕΔ και διερευνάται η συμμετοχή των AP συμπλόκων στη στόχευση των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών στην πλασματική μεμβράνη, αλλά και στην ακόμη πιο ταχεία απομάκρυνσή τους από αυτήν μέσω της διαδικασίας της ενδοκύτωσης, καθώς και ο ρόλος της κλαθρίνης σε αυτές τις διαδικασίες, μέσω της ανάπτυξης νέων γενετικών και βιοχημικών προσεγγίσεων. Ο νηματοειδής μύκητας Aspergillus nidulans, έχει αναδειχθεί ως μοναδικό σύστημα μελετών όπου εφαρμόζονται συνδυαστικές προσεγγίσεις γενετικής και μικροσκοπίας επιφθορισμού. Ο εκτενώς μελετημένος μεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης, UapA, χρησιμοποιήθηκε ως το βασικό μόριο για τη διερεύνηση βασικών ερωτημάτων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς που διέπουν την ενδοκυτταρική διακίνηση των μεταφορέων και το ρόλο του διμερισμού στην έξοδο από το ΕΔ, ενώ συγκεκριμένες πρωτεΐνες που εμφανίζουν πολική κατανομή στην κορυφαία περιοχή της πλασματικής μεμβράνης χρησιμοποιήθηκαν ως μόρια για τη μελέτη των γενικών μονοπατιών διακίνησης στα οποία εμπλέκονται τα AP σύμπλοκα. Συγκεκριμένα, διερευνούμε το ρόλο του AP-1 συμπλόκου στη διακίνηση φορτίων και δείχνουμε ότι είναι απαραίτητο για την αύξηση, λόγω της συμμετοχής του στη μετακίνηση κυστιδίων μέσω μικροσωληνίσκων, προς την κορυφαία περιοχή της αναπτυσσόμενης υφής. Ακόμη, ταυτοποιούμε μοτίβα δέσμευσης της κλαθρίνης στην καρβοξυτελική περιοχή της β1 υπομονάδας και παρέχουμε αποδείξεις για την εμπλοκή του AP-1 τόσο στην ορθόδρομη μεταφορά εκκριτικών κυστιδίων που περιέχουν το RabE, όσο και στην ανάδρομη, εξαρτώμενη από τα RabA/RabB, ανακύκλωση ενδοσωμάτων. Επίσης δείχνουμε πως το AP-1 είναι σημαντικό για την οργάνωση των μικροσωληνίσκων και των σεπτινών, ερμηνεύοντας έτσι την αναγκαιότητα του για τα κύτταρα που αντιμετωπίζουν την πρόκληση της εξαρτώμενης από τον κυτταροσκελετό, πολικής αύξησης. Μελετάμε επίσης τον ρόλο του AP-2 συμπλόκου, ο οποίος φαίνεται πως είναι ανεξάρτητος τοπολογικά και λειτουργικά από αυτόν της κλαθρίνης και σχετίζεται με τη διατήρηση της πολικής αύξησης στον A. nidulans. Παρέχουμε ακόμη κυτταρικές και γενετικές αποδείξεις πως το AP-2 αλληλεπιδρά με τους παράγοντες ενδοκύτωσης SlaB/End4 και SagA/End3 καθώς και τις λιπιδικές φλιππάσες, DnfA και DnfB, στην περιοχή συνεχούς ενδοκύτωσης των αναπτυσσόμενων υφών. Ο ρόλος του AP-2 στη διατήρηση της φυσιολογικής λιπιδικής σύστασης της κορυφαίας μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος, ενισχύεται από την αλληλεπίδρασή του με ένζυμα/πρωτεΐνες απαραίτητα για τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, για το σχηματισμό λιπιδικών περιοχών πλούσιων σε στερόλη και για τη φυσιολογική εναπόθεση χιτίνης. Τα ευρήματα μας αποδεικνύουν, για πρώτη φορά, την ύπαρξη ενός μονοπατιού ενδοκυτταρικής μεταφοράς των πιο εξελιγμένων μυκήτων που λειτουργεί βασιζόμενο αποκλειστικά στην ύπαρξη του AP-2 συμπλόκου, χωρίς τη συμβολή κλαθρίνης. Το σύνολο της διατριβής αυτής συνεισφέρει σημαντικά στην πρόωθηση της γνώσης που αφορά στην κατανόηση της λειτουργίας των ευκαρυωτικών κυττάρων τα οποία εμφανίζουν πολική αύξηση, με πιθανές προεκτάσεις και σε πολικά κύτταρα ανώτερων θηλαστικών, όπως οι νευρώνες. Ακόμη, δεδομένης της υψίστης σημασίας της μεμβρανικής διακίνησης στην εύρυθμη λειτουργία των κυττάρων, ανοίγονται νέοι δρόμοι στη εύρεση στοχευμένων προσεγγίσεων αντιμετώπισης παθογόνων μυκήτων.