The role of lysosome function in degradation of proteins that are associated with Parkinson's disease
Authors: Παπαδόπουλος Βασίλειος 
Published: September 2021

Οι μεταλλάξεις του γονιδίου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GBA1) αποτελούν τον πιο συχνό γενετικό παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση νόσου του Parkinson (PD). Επιπλέον, οι μεταλλάξεις του GBA1 έχουν συσχετιστεί με ελαττωμένη ενεργότητα του λυσοσωμιακού ενζύμου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GCase) σε ασθενείς με PD, αλλά και ασθενείς PD που δεν φέρουν μετάλλαξη στο GBA1 παρουσιάζουν επίσης ελαττωμένη ενεργότητα της GCase στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Συνολικά, φαίνεται πως η ενεργότητα του συγκεκριμένου ενζύμου διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της PD. Όσον αφορά τον μηχανισμό δια του οποίου μεσολαβείται η συνεισφορά των μεταλλάξεων του GBA1 στον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου, είναι πιθανότερα η μεταβολή της λυσοσωμιακής οδού αποικοδόμησης πρωτεϊνών. Η α-συνουκλεΐνη, η πρωτεΐνη που κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της PD, έχει δειχθεί ότι εκκρίνεται εξωκυττάρια, τόσο ως ελεύθερη πρωτεΐνη, όσο και ως περιεχόμενο των εξωσωμάτων. Είναι πιθανό η δυσλειτουργία του μονοπατιού της ενδοκυττάρωσης μέσω δυσλειτουργίας της GCase να συμβάλλει σε αλλαγή της έκκρισης εξωσωμάτων και της σχετιζόμενης με εξωσώματα α-συνουκλεΐνης. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξεταστεί η αλλαγή στη συσσώρευση και την έκκριση της α-συνουκλεΐνης μέσω χειρισμών στη μορφή και την ενεργότητα του λυσοσωμιακού ενζύμου της GCase. Στο πρώτο στάδιο της διατριβής, κατασκευάστηκαν τέσσερις αδενοϊοί που εμπεριείχαν την αγρίου τύπου (WT), τις μεταλλαγμένες μορφές N370S και D409V της GCase ή το γονίδιο για την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ως μάρτυρα. Οι ιοί χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση πρωτοταγών καλλιεργειών φλοιϊκών νευρώνων από μύες. Η μεσολαβούμενη από αδενοϊό υπερέκφραση της WT GCase οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκκρισης εξωσωμάτων in vitro. Η ποσότητα της α-συνουκλεΐνης τόσο ενδοκυττάρια όσο και εξωκυττάρια παρουσίασε τάση αύξησης η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στο δεύτερο στάδιο της διατριβής, σε νέα in vitro πειράματα η συμβολή της ενεργότητας της GCase ελέγχθηκε με την υπερέκφραση της α-συνουκλεΐνης μέσω αδενοϊών, παρουσία ή μη του κονδουριτολικού β-εποξειδίου ομοιοπολικού αναστολέα (CBE), εκλεκτικού αναστολέα της GCase. Εκ νέου, παρουσία του αναστολέα CBE, παρατηρήθηκε τάση αύξησης της α-συνουκλεΐνης, που δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στο τρίτο στάδιο της διατριβής, διενεργήθηκαν in vivo πειράματα. Eπιλέχθηκαν διαγονιδιακοί μύες οι οποίοι ήταν ετερόζυγοι για την μετάλλαξη A53T του γονιδίου της α-συνουκλεΐνης (SNCA). Σε αυτό το μοντέλο ήταν δυνατή η χρόνια αναστολή του ενζύμου της GCase, μέσω της διαπεριτοναϊκής χορήγησης του CBE σε περιοδικά διαστήματα ώστε να προσομοιαστεί η συνεχώς μειωμένη ενεργότητα της GCase σε ασθενείς PD. Πράγματι, η ενδοκυττάρια ολιγομερής μορφή της α-συνουκλεΐνης ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη στους μύες που έλαβαν τον αναστολέα CBE. Μάλιστα, η αναστολή της GCase προκάλεσε μία αθρόα αύξηση των εγκεφαλικών εξωσωμάτων και της ολιγομερούς α-συνουκλεΐνης που εμπεριέχεται σε εξωσώματα. Στη συνέχεια, για να ελεγχθεί ο ρόλος της μεταλλαγμένης GCase σε ένα χρόνιο μοντέλο της PD, χρησιμοποιήθηκαν ιοί για την υπερέκφραση μεταλλαγμένης GCase στους διαγονιδιακούς για την A53T α-συνουκλεΐνη μύες. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της διαπίδυσης μπορέσαμε να μετρήσουμε την εκκρινόμενη α-συνουκλεΐνη στο ραβδωτό σώμα ζώντων μυών. Με ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρατηρήσαμε ότι οι μύες που υπερεξέφραζαν την μεταλλαγμένη N370S GCase είχαν αυξημένη έκκριση α-συνουκλεΐνης. Σε περαιτέρω πειράματα στα εν λόγω ζώα, φάνηκε ότι αυτή η αύξηση της έκκρισης της α-συνουκλεΐνης οφειλόταν σε δυσλειτουργία του λυσοσώματος, όπως αναδείχθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη αυτοφαγίας LC3.Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε σε ενδιαφέροντα, καινούρια ευρήματα. Τα αποτελέσματα των ανωτέρω πειραμάτων αποτελούν τα πρώτα στοιχεία για το ότι η μειωμένη ενεργότητα της φυσιολογικής GCase ή η υπερέκφραση μεταλλαγμένης GCase σε ένα χρόνιο in vivo περιβάλλον οδηγούν σε αύξηση της έκκρισης της α-συνουκλεΐνης. Φάνηκε ότι αυτή η μεταβολή οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, σε δυσλειτουργία της αυτοφαγίας. Αυτή η δράση της GCase μπορεί να οδηγεί σε ενίσχυση της διάδοσης της α-συνουκλεΐνης η οποία με τη σειρά της να συμβάλλει στην εξέλιξη της παθοφυσιολογίας στην PD που σχετίζεται με μεταλλάξεις στο γονίδιο GBA1. Η σχετιζόμενη με εξωσώματα ολιγομερής α-συνουκλεΐνη μπορεί να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο αλλά και να διερευνηθεί περαιτέρω ως πιθανός βιοδείκτης. Η μελέτη των παραγόντων που την επηρεάζουν, όπως η GCase, μπορεί πράγματι να έχει κλινική σημασία.