Study of the effects of mutant alpha-synuclein in models of Parkinson's disease
Authors: Ζυγογιάννη Ουρανία 
Published: September 2021

Η νόσος Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη σε συχνότητα νευροεκφυλιστική διαταραχή και χαρακτηρίζεται από την απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας που προβάλλουν τις απολήξεις τους στο ραβδωτό σώμα, καθώς και άλλων τύπων νευρώνων σε όλη την έκταση του εγκεφάλου. Μέχρι σήμερα δεν γνωρίζουμε αν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι η αιτία της έναρξης της ασθένειας ή αποτελεί την αναπόφευκτη συνέπεια πολλαπλών δυσλειτουργιών στον εγκέφαλο, ωστόσο αντιπροσωπεύει ένα κοινό παθολογικό χαρακτηριστικό που ευθύνεται για πολλά από τα κλινικά συμπτώματα. Μείζον νευροπαθολογικό γνώρισμα της ΝΠ είναι η συσσώρευση ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στα σώματα και τους νευρίτες των προσβεβλημένων νευρώνων, στα οποία εντοπίζεται κατά κύριο λόγο η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη (αSyn). Η αSyn είναι μικρή προσυναπτική πρωτεΐνη της οποίας η φυσιολογική λειτουργία δεν έχει διαλευκανθεί επαρκώς, ωστόσο η συμμετοχή της στην παθολογία της ΝΠ είναι ευρέως αποδεκτή. Στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων, η νόσος είναι σποραδική και πιθανώς οφείλεται στο συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου. Σε μια μειοψηφία περιπτώσεων (5-10%) η νόσος είναι κληρονομική με την ύπαρξη μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα γονίδια. Το γονίδιο SNCA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη αSyn συνδέεται με τη ΝΠ ενώ σημειακές μεταλλάξεις και διπλασιασμός ή τριπλασιασμός του γονιδιακού τόπου προκαλούν μία αυτοσωμική επικρατή μορφή της νόσου, που συχνά χαρακτηρίζεται από πρώιμη έναρξη και γενικά σοβαρό φαινότυπο. Η σημειακή μετάλλαξη αντικατάστασης G209A στο γονίδιο SNCA που συνεπάγεται τη σύνθεση της παθολογικής πρωτεΐνης p.A53T αSyn προσδιορίστηκε για πρώτη φορά σε οικογένειες ιταλικής και ελληνικής καταγωγής και αποτελεί την καλύτερα μελετημένη μετάλλαξη. Αν και η πλειοψηφία των περιπτώσεων της νόσου είναι σποραδικές, οι μελέτες σε οικογενείς μορφές που είναι κλινικά και νευροπαθολογικά παρόμοιες με τις σποραδικές συνέβαλαν σημαντικά στην κατανόηση της ΝΠ.Παρότι η ΝΠ περιγράφηκε για πρώτη φορά πριν 200 χρόνια και παρά τις έκτοτε εντατικές έρευνες σε ζωϊκά πειραματικά μοντέλα ή μεταθανάτιους ιστούς ανθρώπινου εγκεφάλου, οι αιτίες που ευθύνονται για την εμφάνιση και την εξέλιξη της νόσου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστες. Ένας σημαντικός ανασταλτικός παράγοντας ήταν η έλλειψη κατάλληλων μοντέλων που προσομοιάζουν επαρκώς τα χαρακτηριστικά της ασθένειας στον άνθρωπο. Έτσι θεραπευτικές προσεγγίσεις, πολλά υποσχόμενες σε προκλινικό επίπεδο, απέτυχαν όταν έφτασαν σε κλινικές δοκιμές. Σήμερα η επαναστατική τεχνολογία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού και η κατασκευή επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (iPSCs) από ενήλικα σωματικά κύτταρα ασθενών άνοιξαν νέες προοπτικές για την κατανόηση της ΝΠ. Οι προσεγγίσεις αυτές επιτρέπουν τη δημιουργία εξατομικευμένων κυτταρικών μοντέλων για τη μελέτη της παθογένειας και της εξέλιξης της ΝΠ και δίνουν μοναδικές ευκαιρίες για την ανακάλυψη ή επανατοποθέτηση φαρμάκων.Σε διάφορα μοντέλα που αναπτύχθηκαν την τελευταία επταετία με βάση την τεχνολογία των iPSCs από κύτταρα ασθενών και τη στοχευμένη διαφοροποίηση τους σε νευρώνες, αναδείχθηκαν φαινότυποι που σχετίζονται με τη ΝΠ, όπως αυξημένη ευαισθησία σε οξειδωτικό ή νιτρώδες στρες, μιτοχονδριακές ανωμαλίες, νευραξονική παθολογία και μειωμένη συναπτική συνδεσιμότητα. Στο Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας και Βλαστικών Κυττάρων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, αναπτύχθηκε ένα in vitro μοντέλο για οικογενή ΝΠ με χρήση iPSCs από δύο ασθενείς που φέρουν τη μεταλλαγή p.A53T-αSyn. Με κατευθυνόμενη διαφοροποίηση δημιουργήθηκε ένα κυτταρικό σύστημα που εμφανίζει νευροεκφυλιστικούς φαινοτύπους σχετιζόμενους με τη ΝΠ, όπως συσσώρευση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, μειωμένη συναπτική συνδεσιμότητα και παθολογία των νευραξόνων [420]. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε τους in vivo φαινοτύπους των κυττάρων αυτών μετά από μεταμόσχευση σε μοντέλο ποντικού στο οποίο είχε προκληθεί βλάβη με μονόπλευρη έγχυση 6-υδροξυντοπαμίνης (6-OHDΑ) στο ραβδωτό σώμα του εγκεφάλου ποντικών του ανοσοκατασταλμένου στελέχους NOD/SCID. Για τον σκοπό αυτό, εφαρμόσαμε ένα πρωτόκολλο επαγωγής εδαφιαίου νευρικού πετάλου σε iPSC κυτταρικές σειρές προερχόμενες από έναν p.Α53Τ ασθενή και έναν υγιή δότη προκειμένου να διαφοροποιηθούν προς τη ντοπαμινεργική γενεαλογία. Το πρωτόκολλο αυτό περιλαμβάνει μείγμα μικρών μορίων που αποτελούν είτε αναστολείς των μονοπατιών BMP/ TGF-β/ Activin είτε επαγωγείς του μονοπατιού sonic hedgehog και του μονοπατιού σηματοδότησης WNT, ακολουθούμενο από παράγοντες που ευνοούν τη στοχευμένη διαφοροποίηση σε νευρώνες. Με αυτό το πρωτόκολλο, την ημέρα 11 in vitro (11 DIV) πρακτικά όλα τα κύτταρα στην καλλιέργεια είναι θετικά για τον μεταγραφικό παράγοντα LMX1A που χαρακτηρίζει τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα του εδαφιαίου πετάλου ενώ περίπου τα μισά είναι διπλά θετικά για τους παράγοντες LMX1A και FOXA2 που χαρακτηρίζουν τα πρόδρομα κύτταρα της ντοπαμινεργικής γενεαλογίας. Νευρώνες κατάλληλοι για μεταμόσχευση αποκτήθηκαν μετά από 25 DIV και για να αποφευχθούν φαινόμενα υπερπλασίας in vivo, εφαρμόστηκε ανοσοεμπλουτισμός σε νευρωνικά κύτταρα με τη βοήθεια μαγνητικών σφαιριδίων επικαλυμμένων με αντίσωμα έναντι PSA-NCAM κατά την ημέρα 28 DIV. Πειράματα ανοσοφθορισμού την ημέρα 30 DIV, ακριβώς κατά τον χρόνο της μεταμόσχευσης, έδειξαν ότι η καλλιέργεια απαρτιζόταν κατά 70% από ανώριμους νευρώνες θετικούς για τους μάρτυρες της πρώιμης νευρικής διαφοροποίησης διπλοκορτίνη (DCX) και βΙΙΙ-τουμπουλίνη ενώ σημαντικό ποσοστό παρέμενε θετικό για τον μάρτυρα των πρόδρομων νευρικών κυττάρων, νεστίνη. Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο καλλιεργειών.Δεδομένου ότι το πρωτόκολλο στοχευμένης διαφοροποίησης που εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη διέφερε από αυτό που εφαρμόστηκε στην εργασία των Kouroupi και συνεργατών, κρίναμε σκόπιμο να διερευνήσουμε τα χαρακτηριστικά που αποκτούν οι καλλιέργειες από PD και υγιή δότη σε διάστημα μακρότερο των 30 ημερών, πριν προχωρήσουμε στη μεταμόσχευσή τους. Εξετάσαμε παραμέτρους που αφορούν στη μορφολογία και τη λειτουργικότητα των κυττάρων με ανοσοφθορισμό, ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές και απεικόνιση ιόντων ασβεστίου. Ανάλυση μεταξύ των ημερών 45-70 DIV έδειξε ότι τα PD κύτταρα παρουσίασαν εμφανή σημάδια εκφύλισης. Ανώριμοι PD νευρώνες θετικοί για διπλοκορτίνη (DCX) εμφάνισαν αυξημένες νευριτικές εκφύσεις και δευτερογενείς διακλαδώσεις ενώ ανιχνεύθηκε ενδοκυττάρια συσσώρευση πρωτεϊνών τόσο σε DCX-θετικούς νευρώνες όσο και σε ώριμους ντοπαμινεργικούς νευρώνες θετικούς για το ένζυμο υδροξυλάση της τυροσίνης (TH). Σε PD καλλιέργειες των 70 DIV, τα πυκνά δίκτυα των TH-θετικών νευρώνων παρουσίαζαν δυστροφικούς και κατακερματισμένους νευρίτες. Παρατηρήθηκε επίσης αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης αSyn, που αποτελεί παθολογική ένδειξη. Όσον αφορά τη λειτουργικότητα, οι ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των PD και υγιών νευρώνων στις ενεργητικές και παθητικές μεμβρανικές ιδιότητες. Η ακεραιότητα του νευρωνικού δικτύου σε PD και υγιείς καλλιέργειες αξιολογήθηκε με απεικόνιση των ιόντων ασβεστίου. Η μέθοδος φανέρωσε συχνότερες αυθόρμητες διακυμάνσεις στις συγκεντρώσεις του ενδοκυττάριου ασβεστίου στις PD καλλιέργειες σε σύγκριση με αυτές από υγιή δότη, με μεγαλύτερο μέσο εύρος διακύμανσης. Η παρατήρηση αυτή έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, δεδομένου ότι οι διακυμάνσεις των ιόντων ασβεστίου ρυθμίζουν πλήθος βιολογικών διεργασιών, μεταξύ των οποίων την αύξηση των νευριτών και τη συναπτική συνδεσιμότητα, όπου παρατηρούνται σημαντικές διαφορές μεταξύ PD και υγιών κυττάρων.Στη συνέχεια, προκειμένου να διερευνήσουμε τις ιδιότητες των PD κυττάρων in vivo μετά από μεταμόσχευση στον εγκέφαλο, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο χημικής βλάβης που αναπτύχθηκε μετά από στερεοτακτική έγχυση της τοξίνης 6-υδροξυντοπαμίνης (6-OHDA) στο ραβδωτό σώμα ποντικών του στελέχους NOD/SCID, το οποίο υποστηρίζει την επιβίωση ξενομοσχεύματος. Η 6-OHDA προκαλεί την ανάδρομη εκφύλιση των ΤΗ θετικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας με αποτέλεσμα την εμφάνιση κινητικής δυσλειτουργίας. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση της τοξίνης, η συμπεριφορική ανάλυση των ποντικών επιβεβαίωσε την προκαλούμενη καταστροφή τόσο με αξιολόγηση της επαγόμενης με αμφεταμίνη στροφικής ασυμμετρίας όσο και με καταγραφή της κινητικής δραστηριότητας των προσθίων και οπισθίων άκρων χωρίς τη χορήγηση αμφεταμίνης. Ωστόσο η λειτουργική ανάλυση σε μεγαλύτερο χρόνο, έως 15 εβδομάδες μετά την πρόκληση της βλάβης, αποκάλυψε την αυθόρμητη ανάκαμψη της κινητικής συμπεριφοράς των ποντικών. Ακόμη, αν και η απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας παρέμεινε σταθερή σε ποσοστό 60% σε διάστημα 15 εβδομάδων, παρατηρήθηκε επανεύρωση του ραβδωτού σώματος, όπου προβάλλουν οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες της μέλαινας ουσίας. Η παρατηρούμενη επανεύρωση του ραβδωτού είναι σύμφωνη με τη συμπεριφορική βελτίωση και μπορεί να εξηγηθεί με πιθανή εκβλάστηση/ ανάπτυξη των υπολειπομένων ντοπαμινεργικών απολήξεων που δεν καταστράφηκαν με τη χορήγηση 6-OHDA στο ραβδωτό ή/ και με συνεισφορά ντοπαμινεργικών ινών από το ετερόπλευρο ημισφαίριο.Για τη μελέτη των in vivo χαρακτηριστικών τους, PSA-NCAM ανοσοεμπλουτισμένες καλλιέργειες νευρικών κυττάρων τόσο από PD όσο και από υγιή δότη (30 DIV), μεταμοσχεύθηκαν 3 εβδομάδες μετά την έγχυση 6-OHDΑ στο ραβδωτό σώμα του εγκεφάλου ποντικών του στελέχους NOD/SCID. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση 12 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση έδειξε ότι τα PD κύτταρα, παρά τα σχετιζόμενα με τη νόσο χαρακτηριστικά που παρουσίασαν έως και 70 DIV, επιβίωσαν και διαφοροποιήθηκαν in vivo παρόμοια με τα κύτταρα του υγιούς δότη. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των μοσχευμάτων. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε αύξηση της πρωτεΐνης αSyn στα μοσχεύματα του ασθενούς, που αποτελεί μία πρώτη παθολογική ένδειξη. Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, φάνηκε ότι τα υγιή κύτταρα ενσωματώνονται καλύτερα στον εγκέφαλο του ξενιστή σε σύγκριση με τα PD, καθώς εξέτειναν προεκβολές που σχημάτιζαν περισσότερες συνδέσεις με τους μεσαίους ακανθώδεις νευρώνες του ραβδωτού σώματος του ξενιστή. Τέλος, τα PD κύτταρα είχαν την τάση να παραμένουν σε μία πιο αδιαφοροποίητη κατάσταση σε σύγκριση με τα υγιή. Το γεγονός αυτό πιθανά εξηγεί την περιορισμένη ικανότητά τους να σχηματίζουν συνδέσεις με τα κύτταρα του ξενιστή.Συνολικά τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι τα διακριτά χαρακτηριστικά εκφύλισης που παρουσιάζουν τα PD κύτταρα in vitro, εξασθενούν ή ενδεχομένως απαιτούν περισσότερο χρόνο για να εμφανιστούν in vivo μετά από μεταμόσχευση στον εγκέφαλο του ποντικού. Λαμβάνοντας υπόψιν το περιορισμένο ποσοστό ώριμων ντοπαμινεργικών νευρώνων στα μοσχεύματα τόσο του ασθενούς όσο και του υγιούς, είναι επιθυμητή η εξέταση των μοσχευμάτων σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, άνω του εξαμήνου, προκειμένου να δοθεί ικανός χρόνος για να διαφοροποιηθούν τα ανθρώπινα κύτταρα. Αυτό αποτελεί αρκετά δύσκολο στόχο με βάση το ποσοστό θνησιμότητας των NOD/SCID ζώων μετά τη χορήγηση 6-OHDA. Μακροχρόνιες μελέτες απαιτούνται επίσης για να διαλευκανθεί αν η αύξηση της αSyn στα μοσχεύματα του ασθενούς – χαρακτηριστικό που δεν σχετίζεται με την πιο ανώριμη κατάσταση των PD κυττάρων σε σύγκριση με τα υγιή- θα προκαλέσει εντέλει την εμφάνιση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων μέσα στο μόσχευμα. Ένα ακόμα ζήτημα είναι κατά πόσον η παθολογική p.A53T αSyn μπορεί να εξαπλωθεί από το μόσχευμα στον εγκέφαλο του ξενιστή, όπως έχει δειχθεί σε in vitro καλλιέργειες. Συγκεφαλαιώνοντας, η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη προσπάθεια να μελετηθεί η νόσος Πάρκινσον σε χιμαιρικό μοντέλο εγκεφάλου με μεταμόσχευση ανθρώπινων κυττάρων ασθενούς στον ποντικό. Περαιτέρω ανάλυση των φαινοτύπων που αποκτούν τα κύτταρα ασθενών σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, ενδεχομένως με τη χρήση εναλλακτικού ζωικού μοντέλου, καθώς και η ανάλυση πολλαπλών iPSC κλώνων από διαφορετικούς ασθενείς θα επεκτείνει την τρέχουσα μελέτη με σκοπό την ανάπτυξη in vivo χιμαιρικών μοντέλων για τη μελέτη της νόσου Πάρκινσον.