Χρήση νανοσυστημάτων στην ανίχνευση μελών του γένους Leishmania
Authors: Ανδρεάδου Μαργαρίτα 
Published: August 2021

Η λεϊσμανίωση είναι μια παρασιτική νόσος του σκύλου που αποτελεί σημαντικόπρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση της ασθένειας είναικαθοριστικής σημασίας στην εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας και μειώνει τονκίνδυνο μετάδοσης, συμβάλλοντας στον περιορισμό του αριθμού των κρουσμάτωνκαι της γεωγραφικής εξάπλωσης. Η χρήση βιονανοσυστημάτων θα μπορούσε νασυνεισφέρει σημαντικά στη διευκόλυνση της ανίχνευσης του συγκεκριμένουπαθογόνου σε κλινικά δείγματα χωρίς τη χρήση εξειδικευμένων συσκευών υψηλούκόστους.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια εύκολα εφαρμόσιμη,γρήγορη, ειδική και αξιόπιστη μέθοδος ανίχνευσης της Leishmania spp. χρησιμοποιώντας κβαντικά κοκκία σεληνιούχου καδμίου και νανοσωματίδια χρυσού.Αρχικά, έγινε συγκριτική αξιολόγηση τεσσάρων μεθόδων PCR για ανίχνευση τηςLeishmania spp. προκειμένου να επιλεχθεί η κατάλληλη περιοχή-στόχος τουγενώματος της Leishmania που θα στόχευαν οι ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές καινα αναδειχθεί μια επαρκής μέθοδος αναφοράς. Σχεδιάστηκαν στη συνέχεια 4ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές που συνδέθηκαν με εμπορικά διαθέσιμανανοσωματίδια χρυσού για την ανίχνευση του DNA της Leishmania. Για τον ίδιοσκοπό (ανίχνευση DNA της Leishmania) σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτιδικοί- ανιχνευτές, ένας για σύνδεση με κβαντικά κοκκία και ο άλλος για σύνδεση μεμαγνητικά σφαιρίδια. Για την ανίχνευση ενός επιφανειακού αντιγόνου τηςLeishmania, τα κβαντικά κοκκία και τα μαγνητικά σφαιρίδια συνδέθηκαν με δύοειδικά για το παράσιτο αντισώματα. Η αξιολόγηση των υπό μελέτη μεθόδων έγινεαναφορικά με την ευαισθησία τους, την ειδικότητά τους, το ελάχιστο όριο ανίχνευσήςτους (Ε.Ο.Α.), και ειδικά για τις μεθόδους PCR, την επαναληψιμότητα και τηναναπαραγωγιμότητά τους. Το υλικό αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε συνίστατο απόστελέχη απομονωμένα σε καλλιέργεια και κλινικά δείγματα που συλλέχθηκαν απόσκύλους που είχαν προσκομιστεί σε κτηνιατρικές κλινικές με υποψία λεϊσμανίωσης.Με όλες τις μεθόδους PCR που εξετάστηκαν καταγράφηκαν παρόμοιααποτελέσματα κυρίως αναφορικά με τα καλλιεργημένα στελέχη. Το υψηλότεροποσοστό θετικών δειγμάτων ανιχνεύτηκε με τη μέθοδο Γ (58.1%). Με τις άλλες τρειςμεθόδους PCR, το ποσοστό θετικότητας ήταν σημαντικά χαμηλότερο και κυμάνθηκεσε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 19 και 25%. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότηταεκτιμήθηκε αναφορικά με τη μέθοδο Γ, με την οποία ανιχνεύτηκε το υψηλότεροποσοστό επιβεβαιωμένων θετικών και αρνητικών αποτελεσμάτων. Έτσι για τιςμεθόδους Α, Β, και Δ, η ευαισθησία και ειδικότητα διαμορφώθηκε αντίστοιχα στο 50.7% (33/65), 43% (28/65), 40% (26/65) και 90.8% (69/76), 93.4% (71/76) 89.5%(68/76). Το μέσο ελάχιστο όριο ανίχνευσης των μεθόδων Α-Δ σε επτά επαναλήψειςυπολογίστηκε αντίστοιχα στα 30.7, 5, 3.7, και 5 προμαστιγωτά/ml. Ηεπαναληψιμότητα ήταν εξαιρετική για όλες τις μεθόδους αφού ήταν υψηλότερη από0.75, κάτι που ήταν στατιστικά σημαντικό σε επίπεδο 5%, ενώ η αναπαραγωγιμότηταήταν καλή έως εξαιρετική ανάλογα με τα αντιδραστήρια PCR πουχρησιμοποιήθηκαν. Οι θετικοί και οι αρνητικοί μάρτυρες ανιχνεύτηκαν σωστά και μετους τρεις συνδυασμούς νανοσωματιδίων. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότητα τηςμεθόδου ανίχνευσης DNA με τα νανοσωματίδια χρυσού συγκριτικά με τη μέθοδοςαναφοράς, προσδιορίστηκε σε 92% και 100% αντίστοιχα αναλόγως του εξεταζόμενουυλικού, ενώ το Ε.Ο.Α., σε 11,5 ng/μl. Οι αντίστοιχες τιμές που καταγράφηκαν στοπλαίσιο του προσδιορισμού της ειδικότητας και της ευαισθησίας της μεθόδουανίχνευσης DNA με χρήση κβαντικών κοκκίων ήταν 3,125 ng/μl, ενώ η ειδικότητατης μεθόδου ανίχνευσης των κυττάρων του πρωτοζώου με κβαντικά κοκκία ήταν 103κύτταρα/ml. Οι τρεις μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχουν ένανεύκολο, γρήγορο και οικονομικό τρόπο για την ανίχνευση μελών του γένουςLeishmania με τη χρήση των συγκεκριμένου τύπου νανο-ανιχνευτών. Οιπροτεινόμενες μέθοδοι μπορεί να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη διαγνωστικώνμεθόδων ελέγχου για χρήση σε ενζωοτικές περιοχές ιδίως εάν λόγω διαθέσιμωνπόρων δεν αποτελεί προτεραιότητα η ανίχνευση πολύ μικρής ποσότητας τουπαρασίτου.