Πρωτεομική ανάλυση του πράσινου θειοβακτήριου Chlorobium tepidum
Authors: Αϊβαλιώτης Μιχαήλ 
Published: August 2021

To Chlorobium tepidum είναι ένα θερμόφιλο Gram-αρνητικό, πράσινο θειοβακτήριο (Chlorobia), είναι αποκλειστικά αναερόβιο φωτολιθοαυτότροφο και είναι ευρέως διαδεδομένο σε υδατικά περιβάλλοντα, όπου ανοξικά στρώματα που περιέχουν ανηγμένες ενώσεις θείου εκτίθενται σε φως. Προσφάτως, το γονιδίωμα του πράσινου θειοβακτήριου Chl. tepidum αναλύθηκε πλήρως αλλά η λειτουργία ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων παραμένει άγνωστη. Πολλά γονίδια βρέθηκε ότι είναι υψηλά συντηρητικά μεταξύ των φωτοσυνθετικών οργανισμών με μη ξεκάθαρο ρόλο στο Chl. tepidum, αλλά αυτά τα γονίδια πιθανών να έχουν συγκεκριμένους ρόλους στην φωτοσύνθεση και στην φωτοβιολογία. Χαρακτηρισμός διαφόρων προϊόντων γονιδίων μπορεί να πραγματοποιηθεί με πρωτεομικές μεθόδους. Τα αντίστοιχα γονίδια μπορούν να ταυτοποιηθούν από την αλληλουχία του γονιδιώματος με προσδιορισμό της Ν-τερματικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης ή με την χρήση μεθόδων ταυτοποίησης με φασματοσκοπία μάζας. Μία εκτεταμένη πρωτεομική προσέγγιση εξαρτάται από την δυνατότητα εμφάνισης και ανάλυσης διαφόρων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων και των μεμβρανικών πρωτεϊνών, οι οποίες σπανίως ανιχνεύονται στην δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (2-DE). Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την πρωτεομική ανάλυση του υδατοδιαλυτού και μεμβρανικού μέρους του Chlorobium tepidum. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε εμπλουτισμός των μεμβρανικών πρωτεϊνών του Chlorobium tepidum με απομόνωση των μεμβρανών. Οι απομονωμένες μεμβράνες διαλυτοποιήθηκαν με Triton X-100 και μετά από υπερφυγοκέντρηση, από το υπερκείμενο ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία μάζας 58 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η χρήση του ιοντικού δωδεκυλoθειϊκού νατρίου (SDS) για τη διαλυτοποίηση των μεμβρανικών πρωτεϊνών σε συνδυασμό με καταβύθιση των πρωτεϊνών με ακετόνη, είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση του μοτίβο της 2-DE και την αύξηση των συνολικά ταυτοποιημένων πρωτεϊνών στις 117. Η καταβύθιση των πρωτεϊνών με ακετόνη βελτίωσε το αποτέλεσμα εκχυλίζοντας ενώσεις που επηρεάζουν την διακριτική ικανότητα της 2-DE. Όμως, η τιμή GRAVY των επιπλέον πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν από την χρήση του SDS δεν μπορούν να χαρακτηριστούν υδρόφοβες αλλά πρωτεΐνες που διαλυτοποιούνται δυσκολότερα. Στην συνέχεια έγιναν προσπάθειες επιλεκτικής εκχύλισης των πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης χρησιμοποιώντας την μέθοδο της όξινης εκχύλισης. Το εκχύλισμα που προέκυψε αναλύθηκε με 2-DE και οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία μάζας. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 37 πρωτεΐνες από τις οποίες 14 προβλέφθηκε ότι περιέχουν σηματοδοτική αλληλουχία που δηλώνει την τοποθέτηση τους στο περιπλασματικό χώρο ή στην εξωτερική μεμβράνη. Η ταυτοποίηση ενός σημαντικού αριθμού υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών, κυρίως ριβοσωμικών, στο μεμβρανικό κλάσμα του Chl. tepidum δείχνει την ανάγκη απομάκρυνσης τους από τις μεμβράνες πριν από οποιαδήποτε ανάλυση. Για αυτόν τον λόγο, οι απομονωμένες μεμβράνες του Chl. tepidum πλύθηκαν με δύο διαφορετικά αλάτια, το EDTA και το NaBr. Οι πλυμένες μεμβράνες και στις δύο περιπτώσεις συλλέχθηκαν με υπερφυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο και οι μεμβράνες που προέκυψαν και από τις δύο διαδικασίες αναλύθηκαν με φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού και Tricine-SDSPAGE, ενώ η συνολική ποσότητα πρωτεΐνης που περιέχουν προσδιορίστηκε με την μέθοδο Bradford. Η Tricine-SDS-PAGE και η μέθοδος Bradford έδειξαν ότι οι πλυμένες με EDTA μεμβράνες περιείχαν περισσότερες πρωτεΐνες από τις πλυμένες με NaBr μεμβράνες. Συνολικά, με την χρήση φασματοσκοπίας μάζας, 119 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από την Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων με EDTA μεμβρανών, ενώ μόνο 93 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από την Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων με NaBr μεμβρανών. Το υπερκείμενο στην περίπτωση των πλυμένων με EDTA μεμβρανών ήταν διαυγές με ελαφρύ κόκκινο-καφέ χρώμα, ενώ το υπερκείμενο στην περίπτωση του NaBr περιείχε δύο διακριτές φάσεις. Μία παχύρρευστη με βαθύ πράσινο χρώμα φάση και μία διαυγή με ελαφρύ πράσινο-λαδί χρώμα φάση. Και οι δύο φάσεις εμφάνισαν σχετικά υψηλή απορρόφηση στα 750 nm που δηλώνει την παρουσία BChlc. Αντίθετα, το υπερκείμενο από τις πλυμένες με EDTA μεμβράνες εμφάνισαν χαρακτηριστικές κορυφές που οφείλονται σε καροτενοειδή και κυτόχρωμα τύπου c. Η ποιότητα της Tricine-SDS-PAGE του υπερκείμενου από την διαδικασία με το EDTA ήταν καλύτερη όσον αφορά την διακριτική ικανότητα και τον αριθμό των διαχωριζομένων πρωτεϊνικών ζωνών. Επιπλέον, ο συνολικός αριθμός των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών από την Tricine- SDS-PAGE του υπερκείμενου από την διαδικασία με το EDTA ήταν 106, ενώ στην περίπτωση του NaBr ταυτοποιήθηκαν 60 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ήταν υδατοδιαλυτές και κυρίως ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Στην περίπτωση του NaBr παρατηρήθηκε η απομάκρυνση διαφόρων περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών από τα μεμβρανικά τους σύμπλοκα (όπως η PscD από RC) η οποία πιθανών να προκαλεί την αστάθεια ή την απενεργοποίηση των μεμβρανικών συμπλόκων. Μεγάλο εμπόδιο στην πρωτεομική ανάλυση των μεμβρανών του Chl. tepidum είναι τα χλωροσώματα που περιέχουν έναν τεράστιο αριθμό χρωστικών που επηρεάζουν αρνητικά οποιαδήποτε ηλέκτροφορητική ανάλυση. Απομόνωση μεμβρανών που δεν περιέχουν χλωροσώματα επιτεύχθηκε με υπερφυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας ζάχαρης. Οι απομονωμένες μεμβράνες χαρακτηρίστηκαν με μίας- και δύο- διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (1-DE, 2-DE) σε συνδυασμό με φασματοσκοπία μάζας, φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Βελτίωση της διαλυτοποίησης των μεμβρανικών πρωτεϊνών πριν από την 2-DE πραγματοποιήθηκε με την χρήση διαφόρων αμφοτερικών απορρυπαντικών. Βασιζόμενοι στον αριθμό των πρωτεϊνικών στιγμάτων που διαχωρίστηκαν από την 2-DE, συμπεραίνουμε ότι ο συνδυασμός του ASB-14 με το Triton X-100, είναι περισσότερο αποτελεσματικός από τον συνδυασμό των CHAPS, SB 3-10 και Triton X-100. Από την εφαρμογή της 1- και 2-DE, 167 και 202 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν αντιστοίχως. Συνολικά, και από τις δύο μεθόδους ταυτοποιήθηκαν 291 διαφορετικές πρωτεΐνες από τις οποίες μόνο οι 88 προβλέφθηκε ότι είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες που δηλώνει τα όρια του προσδιορισμού των μεμβρανικών πρωτεϊνών έπειτα από διαχωρισμό με ηλεκτροφορητικές μεθόδους. Επιπροσθέτως, 53 από αυτές, ταυτοποιήθηκαν ως πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης, γεγονός που δηλώνει την στενή σχέση των πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις στο μεμβρανικό και το υδατοδιαλυτό κλάσμα του Chl. tepidum μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας μη-αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (BNPAGE), σε συνδυασμό με δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (2-D BN/Tricine-SDSPAGE) και ταυτοποίηση των διαχωριζομένων πρωτεϊνών με φασματοσκοπία μάζας. Για την απομάκρυνση των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών και των χλωροσωμάτων από τις μεμβράνες, επιλέχθηκε ο συνδυασμός της κατεργασίας των απομονωμένων μεμβρανών του Chl. tepidum με EDTA και NaBr, και της υπερφυγοκέντρησης σε διαβάθμιση ζάχαρης των πλυμένων μεμβρανών, πριν από την λειτουργική μελέτη τους. Διακρίθηκαν τρεις κύριες ζώνες, ενώ συνολικά το αποτέλεσμα της διαβάθμισης ζάχαρης χωρίστηκε σε 9 ζώνες οι οποίες μελετήθηκαν με φασματοσκοπία ορατού και Tricine-SDS-PAGE. Τα χλωροσώματα απομονώθηκαν σε μία ζώνη ψηλά στην διαβάθμιση ζάχαρης ενώ οι ζώνες με την χαμηλότερη απορρόφηση στα 750 nm και την υψηλότερη στα 810 nm αναλύθηκαν με ΒΝ-PAGE και 2-D BN/Tricine-SDSPAGE. Συγκρίνοντας τις πηκτές ΒΝ-PAGE που προέκυψαν από τις διαφορετικές συνθήκες πλυσίματος των μεμβρανών διαπιστώνεται ότι εκτός από τον διαφορετικό αριθμό πρωτεϊνικών συμπλόκων (18 στο NaBr και 17 στο EDTA) η κύρια διαφορά είναι η ύπαρξη μιας ευρείας ζώνης πρωτεϊνικού συμπλόκου στο μέσο της πηκτής ΒΝ-PAGE με φαινομενικό μοριακό βάρος περίπου 232 kDa. Αυτή η πρωτεϊνική ζώνη αποτελείται κυρίως από την υποθετική πρωτεΐνη Q8KBI3, που έχει ταυτοποιηθεί σε όλες τις έως τώρα μελέτες μας στις μεμβράνες του Chl. tepidum, και έχει χαρακτηριστικά πρωτεΐνης της εξωτερικής μεμβράνης. Η πρωτεΐνη αυτή φαίνεται να υφίσταται σε περισσότερες από δύο ισομορφές οι οποίες σχηματίζουν διαφορετικού μεγέθους πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 33 διαφορετικές πρωτεΐνες μετά τον διαχωρισμό με ΒΝ-PAGE και ανάλυση με MALDI TOF MS. Η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών είναι μεμβρανικές και σχετίζονται με τον μεταβολισμό της ενέργειας. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες με μικρές ή καθόλου υδρόφοβες περιοχές στην αλληλουχία αμινοξέων τους. Από την 2-D BN/Tricine-SDSPAGE προέκυψαν περίπου 100 πρωτεϊνικά στίγματα από τα οποία ταυτοποιήθηκαν τα 89 που αντιστοιχούν σε 120 διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες πιο υδρόφοβες σε σχέση με αυτές που ταυτοποιήθηκαν στην 1-D BN-PAGE. Η μεγάλη υπομονάδα του RC του Chl. tepidum ταυτοποιήθηκε σε 8 πρωτεϊνικά σύμπλοκα στην κορυφή της ΒΝ-PAGE πηκτής. Σε 7 από αυτά τα σύμπλοκα ταυτοποιήθηκε και η FMO. Το φαινομενικό μοριακό βάρος των συμπλόκων αυτών συμφωνεί με το μοριακό βάρος του πρωτεϊνικού συμπλόκου του RC που έχει υπολογιστεί στα 581 kDa. Οι πρωτεΐνες του RC, PscΒ, PscC και PscD δεν ανιχνεύθηκαν με το MALDI TOF MS σε κανένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο στην ΒΝ-PAGE, αλλά το φαινομενικό μοριακό βάρος των συμπλόκων στα οποία ταυτοποιήθηκε η PscA, συνηγορούν στην ύπαρξη ολόκληρου του φωτοσυνθετικού συμπλόκου του RC. Η πρωτεΐνη FMO φαίνεται να υφίσταται σε διάφορα σύμπλοκα του RC προσδεμένη πιθανότατα είτε ως δύο τριμερή είτε ως ένα τριμερές, αλλά και ως ελεύθερα τριμερή FMO. Οι μεμβράνες χωρίς χλωροσώματα που προέκυψαν από την διαβάθμιση ζάχαρης των πλυμένων μεμβρανών διαλυτοποιήθηκαν με DDM και αναλύθηκαν με 1-D BN-PAGE. Προέκυψαν περίπου 24 πρωτεϊνικά σύμπλοκα και στις τρεις ζώνες, από τις οποίες ταυτοποιήθηκαν 18 διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες με μικρές ή καθόλου υδρόφοβες περιοχές στην αλληλουχία αμινοξέων τους. Από την 2-D BN/Tricine- SDS-PAGE προέκυψαν περίπου 47 πρωτεϊνικά στίγματα που ταυτοποιήθηκαν με MALDI TOF MS και αντιστοιχούν σε 25 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η πλειοψηφία αυτών προβλέφθηκε ότι είναι μεμβρανικές, ενώ οι περισσότερες από αυτές σχετίζονται με τον μεταβολισμό. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες. Οι πρωτεΐνες που αποτελούν το φωτοσυνθετικό RC, PscA και PscC ταυτοποιήθηκαν στην 1-D πηκτή αλλά δεν ταυτοποιήθηκαν στην 2η διάσταση. Το RC του Chl. tepidum υφίσταται διαλυτοποιημένο σε διάφορα ενδιάμεσα υποσύμπλοκα. Το φαινομενικό μοριακό βάρος αυτών των συμπλόκων μπορεί να εκτιμηθεί ότι είναι από 400 έως και 800 kDa που συμφωνεί με τα βιβλιογραφικά δεδομένα. Επιβεβαιώνεται με την 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE η διαπίστωση από την 1-D ΒΝ-PAGE, ότι οι υποθετικές πρωτεΐνες Q8KBI3 και Q8KE01 συμμετέχουν στην δημιουργία ενός μεμβρανικού συμπλόκου. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν παραπλήσιο μοριακό βάρος με αποτέλεσμα τον μη διαχωρισμό τους στην 2η διάσταση. Η μεγαλύτερη ποσότητα αυτών των πρωτεϊνών φαίνεται να βρίσκεται σε μία ευρεία ζώνη με φαινομενικό μοριακό βάρος γύρω στα 40 kDa, ενώ στην ίδια κατακόρυφο ταυτοποιήθηκαν μικρότερα πρωτεϊνικά στίγματα της πρωτεΐνης Q8KBI3, με φαινομενικά μοριακά βάρη από 24-30 kDa. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα της 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων μεμβρανών πριν από τη διαβάθμιση ζάχαρης. Από την BN-PAGE των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών του Chl. tepidum διαχωρίστηκαν 42 πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία αναλύθηκαν με MALDI TOF MS για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 62 πρωτεΐνες οι πλειοψηφία των οποίων προβλέφθηκε ότι είναι κυτταροπλασματικές, ενώ οι περισσότερες από αυτές προβλέφθηκε ότι συμμετέχουν στον μεταβολισμό του κυττάρου. Η 1-D BN-PAGE συνδυάστηκε με την 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE για την διασαφήνιση της ταυτότητας των διαχωρισμένων πρωτεϊνικών συμπλόκων όσον αφορά την σύσταση των υπομονάδων. Ταυτοποιήθηκαν συνολικά 188 διαφορετικές πρωτεΐνες, από τις οποίες οι 141 (75%) δεν ταυτοποιήθηκαν στο 1-D BN-PAGE, γεγονός που ισχυροποιεί την αναγκαιότητα της 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE για την ταυτοποίηση όλων των πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Χαρακτηριστικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα του κυτταροπλάσματος όπως είναι η RNA πολυμεράση και η σαπερονίνη (GroEL) ταυτοποιήθηκαν. Επίσης, πρωτεΐνες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό και ιδιαίτερα στον μεταβολισμό του θείου ταυτοποιήθηκαν και προέκυψαν σημαντικές ενδείξεις για την αλληλεπίδραση τους με συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Συνολικά, από την πρωτεομική ανάλυση που πραγματοποιήσαμε στο Chl. tepidum ταυτοποιήθηκαν συνολικά 602 πρωτεΐνες από τις συνολικά 2,288 πρωτεΐνες που προβλέπονται από το γονιδίωμα. Ο αριθμός αυτός αποτελεί το 26.31% του θεωρητικού πρωτεόματος του Chl. tepidum. Για πρώτη φορά ταυτοποιήθηκαν πειραματικά 109 υποθετικές πρωτεΐνες, οι 39 από τις οποίες είναι συντηρημένες ανάμεσα σε διάφορους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς και πιθανών να παίζουν σημαντικό ρόλο στην φωτοσύνθεση και γενικότερα στην φωτοβιολογία.