Απομόνωση και χαρακτηρισμός μεσεγχυματικών κυττάρων και μελέτη της επίδρασης βιοϋλικών και μικροπεριβάλλοντος στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση
Authors: Ταρασλιά Βασιλική 
Published: September 2021

Τα κύτταρα, για να χαρακτηριστούν βλαστικά, πρέπει να παρουσιάζουν δύο ιδιότητες: την ικανότητα διαφοροποίησης προς ποικίλους κυτταρικούς τύπους και την δυνατότητα αυτο-ανανέωσης, πολλαπλασιασμού, δηλαδή, προς όμοια κύτταρα. Οι δύο βασικοί τύποι βλαστικών κυττάρων που έχουν περιγραφεί είναι τα εμβρυ(ον)ικά βλαστικά κύτταρα (ESCs {Embryonic Stem Cells}), που απομονώνονται από την εσωτερική μάζα της βλαστοκύστης και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα (ADSs {Adult Stem Cells}), στα οποία συμπεριλαμβάνονται και τα μεσεγχυματικά κύτταρα, και τα οποία απομονώνονται από διάφορους ιστούς, όπως ομφάλιος λώρος, λίπος και δόντια. Η διαδικασία της απομόνωσης και του χαρακτηρισμού των μεσεγχυματικών κυττάρων αποτελεί, ακόμα και σήμερα, σημείο – κλειδί για την επιτυχημένη μελέτη και χρήση τους, καθώς τα κριτήρια που θέσπισε, το 2006, ο Διεθνής Οργανισμός Κυτταρικής Θεραπείας (ISCT {International Society for Cellular Therapy}) για την αναγνώριση και κατηγοριοποίηση των πληθυσμών τους, δεν επαρκούν για τον πλήρη χαρακτηρισμό τους, λόγω της μεγάλης ετερογένειας που εμφανίζουν. Για το λόγο αυτό, είναι σημαντικό να θεσπιστούν συνεπικουρικά κριτήρια αναγνώρισης και χαρακτηρισμού των μεσεγχυματικών κυττάρων, που θα συντελέσουν στην καθολική αποδοχή των γενικών χαρακτηριστικών των πληθυσμών τους και, άρα, και στην άμεση χρήση τους.Τα μεσεγχυματικά κύτταρα ενηλίκων έχουν απομονωθεί επιτυχώς από πληθώρα ανθρώπινων και ζωϊκών ιστών στους οποίους εδράζονται, έχουν καλλιεργηθεί και χαρακτηριστεί με βάση τα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, και έχουν διαφοροποιηθεί in vitro προς εξειδικευμένους κυτταρικούς πληθυσμούς, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στην Αναγεννητική Ιατρική. Χαρακτηριστικό παράδειγμα μεσεγχυματικών κυττάρων που έχουν εκτενώς μελετηθεί, με σκοπό να χρησιμοποιηθούν στον κλάδο της Αναγεννητικής Ενδοδοντολογίας, προς αναγέννηση ή ανάπλαση του οδοντικού ιστού, αποτελούν οι πληθυσμοί που ανευρίσκονται στον οδοντικό ιστό, στους οποίους συμπεριλαμβάνονται οι εξής υποπληθυσμοί: α) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό νεογιλών δοντιών (Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth, SHEDs), β) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό ενήλικων δοντιών (Dental Pulp Stem Cells, DPSCs), γ) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον περιοδοντικό σύνδεσμο (Periodontal Ligament Stem Cells, PDLSCs), και δ) Μεσεγχυματικά κύτταρα από την οδοντική θηλή (Stem Cells from the Apical Papilla, SCAPs). Οι παραπάνω υποπληθυσμοί έχουν καλλιεργηθεί επιτυχώς και έχει γίνει προσπάθεια ex vivo και in vivo εφαρμογής τους, μέσω χρήσης κατάλληλων ικριωμάτων, προκειμένου της δημιουργίας οδοντίνης και πολφοειδούς ιστού. Ταυτόχρονα, σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η συμβατότητά τους με βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται εκτενώς κατά την επιδιόρθωση ή / και αποκατάσταση τραυματισμών. Χαρακτηριστικά βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται στην Ενδοδοντολογία είναι το ΜΤΑ (Mineral Trioxide Aggregate), που ευρίσκεται σε διάφορες μορφές στο εμπόριο, όπως τα MTA Angelus και ProRoot MTA, το Bio-Oss® και το Super-EBA βιοϋλικό. Η συμβατότητα των κυττάρων με τα διάφορα βιοϋλικά, αλλά και η ικανότητα προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού τους παρουσία αυτών, αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά σημεία στην Αναγεννητική Ενδοδοντολογία για την επιτυχημένη εφαρμογής τους in vivo. Η επούλωση ή αναγέννηση ενός ιστού, που πραγματοποιείται μέσω της εισαγωγής μεσεγχυματικών κυττάρων, προϋποθέτει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό τους. Έτσι, είναι φανερό, ότι το αναπτυξιακό πρότυπο με το οποίο τα κύτταρα αυτά χάνουν το μεσεγχυματικό τους χαρακτήρα και υπεισέρχονται σε κατάσταση διαφοροποίησης πρέπει να ελέγχεται προσεκτικά, ώστε να δημιουργούνται εξειδικευμένα κύτταρα και ιστοί οι οποίοι δε θα αποτελούν κίνδυνο για τον οργανισμό. Τα τελευταία χρόνια, αναφέρεται ολοένα και περισσότερο η ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων να μεταναστεύουν και να εγκαθίστανται σε καρκινικούς όγκους, όπου επάγουν διεγερτικές ή ανασταλτικές αποκρίσεις στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, αλλά και στην ικανότητά τους για διήθηση σε ιστούς και μετάσταση, μέσω είτε έμμεσων είτε άμεσων αλληλεπιδράσεων με τα καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, τα μεσεγχυματικά κύτταρα μπορούν να επηρεάζουν το περιβάλλον του ιστού στον οποίο βρίσκονται, ενισχύοντας τον σχηματισμό όγκων και ρυθμίζοντας την επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ: Epithelial to Mesenchymal Transition) των καρκινικών κυττάρων, μέσω ενεργοποίησης μηχανισμών αποδιαφοροποίησης. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η επιτυχής απομόνωση και ο πλήρης χαρακτηρισμός διάφορων (υπο)πληθυσμών μεσεγχυματικών κυττάρων, εν συνεχεία, η επιλογή του (υπο)πληθυσμού που συγκεντρώνει τα περισσότερο μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά προς in vitro ανάπτυξη και διαφοροποίησή του παρουσία βιοϋλικών Ενδοδοντολογίας, καθώς και η μελέτη του ρόλου που διαδραματίζουν οι απομονωμένοι (υπο)πληθυσμοί μεσεγχυματικών κυττάρων σε γεγονότα καρκινογένεσης.Οι (υπο)πληθυσμοί των μεσεγχυματικών κυττάρων που μελετήθηκαν ήταν μεσεγχυματικά κύτταρα από το λιπώδη ιστό (ADSCs {Adipose – Derived Stem Cells}), μεσεγχυματικά κύτταρα από τη γέλη του Wharton (hUCMSCs {Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord}), μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό νεογιλών δοντιών (SHEDs {Stem Cells from Human Exfoliated Teeth}) και μεσεγχυματικά κύτταρα από τον περιοδοντικό σύνδεσμο (PDLSCs {Stem Cells from Periodontal Ligament}). Τα κύτταρα αυτά απομονώθηκαν με ενζυμ(ατ)ικές μεθόδους, καλλιεργήθηκαν σε πλαστικές επιφάνειες για την εκτίμηση της ικανότητας προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού τους, καθώς και των τυπικών μορφολογικών χαρακτηριστικών τους, και αναλύθηκαν μέσω Κυτταρομετρίας Ροής ως προς τους μοριακούς δείκτες επιφάνειας που εκφράζουν, ενώ συγχρόνως προσδιορίστηκε και η ικανότητα in vitro διαφοροποίησής τους προς οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα, όπου κατέστη φανερό ότι όλοι οι (υπο)πληθυσμοί που μελετήθηκαν εμφάνιζαν τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κυττάρων σε ικανοποιητικό βαθμό. Εντούτοις, οι διαφορές που εντοπίστηκαν ανάμεσά τους, όπως για παράδειγμα το διαφορικό δυναμικό πολλαπλασιασμού ή η ποσοστιαία έκφραση μοριακών δεικτών, μας οδήγησε να εστιάσουμε στα μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό ιστό. Έτσι, εν συνεχεία, διερευνήσθηκε το δυναμικό πολλαπλασιασμού των μεσεγχυματικών κυττάρων SHEDs και PDLSCs, το μοριακό προφίλ έκφρασης μίας πλειάδας δεικτών επιφάνειας, και η ικανότητα «επούλωσης πληγής» τους, ενώ πραγματοποιήθηκε ένας, εις βάθους, χαρακτηρισμός του πρωτεϊνικού περιεχομένου τους, μέσω υγρής χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας, τύπου nano-LC-MS/MS. Με τις παραπάνω τεχνικές, παρατηρήθηκε, ότι ενώ τα PDLSCs εμφανίζουν υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, τα SHEDs φαίνεται να διαθέτουν υψηλότερη μεταναστευτική ικανότητα και να εκφράζουν σε υψηλότερα ποσοστά όλους τους μοριακούς δείκτες αναγνώρισης μεσεγχυματικών κυττάρων, πλην του δείκτη CD13. Επίσης, μέσω της πρωτεωμικής τεχνολογίας nano-LC-MS/MS αναγνωρίστηκε, για πρώτη φορά, ένας εξαιρετικά υψηλός αριθμός πρωτεϊνικού περιεχομένου των κυττάρων αυτών, και συγκεκριμένα 2.032 πρωτεΐνες στα κύτταρα SHEDs και 3.235 στα PDLSCs. Ανάμεσά τους βρίσκονται πρωτεΐνες χαρακτηριστικές των μεσεγχυματικών κυττάρων, αλλά και πλήθος κοινών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταροσκελετό και τον ενεργειακό μεταβολισμό. Έπειτα από ανάλυση των δεδομένων, προκύπτει ότι τα κύτταρα SHEDs εξειδικεύονται σε γεγονότα κυτταρικής πλαστικότητας, μετανάστευσης, προσκόλλησης και μεταγωγής σήματος, ενώ τα PDLSCs είναι περισσότερο μεταβολικά ενεργά κύτταρα, και περιέχουν μεγάλο αριθμό επιπλέον πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Ο πλήρης πρωτεωμικός χαρακτηρισμός των κυττάρων αυτών, που επιτεύχθηκε στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, θα μπορούσε να συντελέσει στη δημιουργία τράπεζας μεσεγχυματικών κυττάρων από οδοντικό ιστό, καθώς τα κύτταρα αυτά διαφαίνεται ότι παρουσιάζουν άριστα χαρακτηριστικά και λειτουργίες, είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένα, και προέρχονται από ιστό ο οποίος απορρίπτεται φυσιολογικά από το ανθρώπινο σώμα.Έπειτα από τον πλήρη χαρακτηρισμό και την αναγνώριση σχεδόν του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζονται από τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs και PDLSCs, πραγματοποιήθηκε διαφοροποίησή τους προς εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους, και εκτίμηση της έκφρασης μορίων – δεικτών που σχετίζονται με τα επίπεδα της διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών κυττάρων αυτών, από όπου και προέκυψε ότι τα κύτταρα SHEDs εκφράζουν, γενικότερα, πιο πρώϊμους δείκτες διαφοροποίησης προς λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα, και πιο ώριμους δείκτες για οστεοβλάστες, και πιθανόν αποτελούν πιο «προγονικό» πληθυσμό μεσεγχυματικών κυττάρων. Έτσι, τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs αποτέλεσαν τον κύριο πληθυσμό στον οποίο μελετήθηκε η ικανότητα διαφοροποίησης και ανάπτυξής τους, παρουσία των βιοϋλικών τύπου ΜΤΑ, Bio-Oss® και ρινισμάτων οδοντίνης, σε διάφορους πειραματικούς σχεδιασμούς, από όπου προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: α) τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs αναπτύσσονται καλύτερα επί των ρινισμάτων οδοντίνης και του ΜΤΑ, β) τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται επί της επιφάνειας όλων των μελετηθέντων υλικών και να αποκτούν αποφυάδες τύπου «ινίδια στρες», γ) το Bio-Oss® προκαλεί τη δημιουργία συσσωματωμάτων και αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων, και δ) καλύτερη προσέλκυση και μετανάστευση των SHEDs επάγουν τα ρινίσματα οδοντίνης. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε και η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων, παρουσία των εν λόγω βιοϋλικών, όπου παρατηρήθηκε ότι το Bio-Oss® εμφανίζει τις καλύτερες ιδιότητες επαγωγής οστεογένεσης, αφού, παρουσία του, τα κύτταρα υπερεκφράζουν δείκτες ώριμων οστεοβλαστών, ενώ παρουσία ΜΤΑ δεν ανιχνεύτηκε η έκφραση πρώϊμων δεικτών οστεογένεσης. Τα ρινίσματα οδοντίνης, τέλος, πιθανόν να συνδράμουν περισσότερο στην επαγόμενη οστεογένεση, αυξάνοντας την έκφραση γονιδίων δεικτών, όπως είναι οι μεταγραφικοί παράγοντες Runx2 και Osterix. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προτείνεται η δημιουργία ενός βιοϋλικού με βασικό συστατικό τα ρινίσματα οδοντίνης, καθώς αυτό θα μπορούσε να συνεισφέρει σημαντικά στην επιδιόρθωση του οδοντικού ιστού in vivo.Στο τελευταίο κομμάτι της Διδακτορικής Διατριβής, θελήσαμε να εστιάσουμε σε μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους, πιθανόν, τα μεσεγχυματικά κύτταρα να εμπλέκονται σε διαδικασίες ογκογένεσης, και έτσι επικεντρωθήκαμε στην πρωτεΐνη CCDC6, μία καλά συντηρημένη, εξελικτικά, πρωτεΐνη, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο Coiled-Coil Domain Containing 6, Ccdc6. Η πρωτεΐνη CCDC6 απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε λόγω της εμπλοκής της σε μία παρακεντρική χρωμοσωμική αναστροφή που παρατηρείται, σε ποσοστό της τάξης του 20%, σε ασθενείς με θηλωματώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα, ενώ συχνά συμμετέχει στη δημιουργία χιμαιρικών (υβριδικών) γονιδίων, τα οποία συνδέονται με την εκδήλωση νεοπλασίας, όπως είναι ο καρκίνος του θυρεοειδούς αδένα και οι λευχαιμίες, και θεωρείται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας και στην επιβίωση των κυττάρων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η κατανομή της CCDC6 (φυσιολογικής ή μη) στα κύτταρα SHEDs και PDLSCs, καθώς και η επίδραση που έχει η απώλεια της φυσιολογικής έκφρασής της στο «μορφο-φαινότυπο» των κυττάρων, σε ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος και στο δυναμικό πολλαπλασιασμού αυτών. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι έλλειψη της CCDC6 επιφέρει δραματική μείωση των επιπέδων α- και γ-τουμπουλίνης στα SHEDs, και αλλαγή προτύπου κατανομής και έκφρασης βιμεντίνης (κύριος μεσεγχυματικός δείκτης και ρυθμιστής). Επίσης, έλλειψη της CCDC6 επάγει διαφοροποίηση των SHEDs, τα οποία παρουσιάζουν ημι-πεπλατυσμένο σχήμα με ελάφρυνση των ατρακτοειδών (ινοβλαστικών) στοιχείων στο χώρο, ενώ όσα διατηρούν τη μορφολογία τύπου ινοβλάστη εμφανίζουν πολύ μεγαλύτερο μέγεθος, και συγχρόνως προκαλεί επιβράδυνση στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, μέσω αύξησης επιπέδων των p21, p-Cdc2 και p-Chk1 πρωτεϊνών. Στον αντίποδα, υπερέκφραση της CCDC6, σχετίζεται, κυρίως, με ένα διάχυτο πρότυπο κατανομής της στον κυτταροσκελετό των SHED κυττάρων, ενώ η έκφραση της μεταλλαγμένης μορφής αυτής, φέρουσα τη σημειακή μεταλλαγή S351A, εμφανίζει ταυτόχρονα διάχυτη και εντοπισμένη περιπυρηνικά κατανομή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το εύρημα, ότι η πρωτεΐνη CCDC6 φαίνεται να φωσφορυλιώνεται από την κινάση σερίνης / θρεονίνης Akt. Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι η πρωτεΐνη CCDC6 παρουσιάζει χαρακτηριστικά Akt πρωτεΐνης στόχου, είναι απαραίτητη για τη συγκρότηση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και παίζει καθοριστικό ρόλο στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στα μεσεγχυματικά κύτταρα