Wege zur DNA-Manipulation durch künstliche Nukleasen und pseudokomplementäre PNA
Authors:   , Kost Catharina 
Published: December 2024

In der traditionellen Organischen Chemie erscheinen Phosphorsäureester in der Regel nur als Randnotiz. Ihre Rolle in der Biologie hingegen ist absolut zentral. Von der Replikation der Nukleinsäuren bis hin zum Energiestoffwechsel via ATP verläuft kaum einer dieser fundamentalen Prozesse ohne das Bilden und Brechen von P-O-Bindungen. Ein nukleophiler Angriff ist jedoch durch die negative Ladung, die Phosphorsäureester unter physiologischen Bedingungen stets aufweisen, dramatisch erschwert. Im Fall der Phosphosphodiester erfolgt dieser über pentakoordinierte, trigonal-bipyramidale Zwischenstufen oder Übergangszustände, vergleichbar mit einer SN2-Reaktion (siehe Abbildung 1). Typische Reaktionsgeschwindigkeiten sind wegen der elektrostatischen Repulsion zwischen Nukleophilen und dem Substrat außerordentlich niedrig. Dies erst ermöglicht die Speicherung genetischer Informationen in Form von DNA-Sequenzen. Enzyme können die Reaktionsträgheit der Phosphodiester leicht überwinden: Beschleunigung von 17 Zehnerpotenzen und mehr sind bekannt. Hierzu benötigt man ein kationisches Elektrophil, das die Ladungsdichte am Phosphat partiell neutralisiert, eine Säure zur Protonierung der Alkoholat-Abgangsgruppen sowie eine Base zur Deprotonierung eines angreifenden Nucleophils. Die Mehrheit der Phosphodiester-spaltenden Enzyme nutzt mindestens zwei Metallionen wie z.B. Mg2+ oder Zn2+. Diese können aber auch teilweise oder ganz durch Guanidinium- oder Ammoniumkationen ersetzt werden. Bekannte Beispiele sind die Staphylokokkennuklease und die Topoisomerase I, in der zwei Argininseitenketten vollständig die Rolle der aktivierenden Elektrophile übernehmen. Auf dieser Basis wurden in Vorgängerarbeiten Bisguanidiniumalkohole entworfen, die sich als metallfreie, sequenzunspezifische DNA-Spalter erwiesen. Dabei lag der Fokus verstärkt auf dem Finden des optimalen Alkohols. Durch computergenerierte Strukturen der hergestellten Verbindungen konnte gezeigt werden, dass die Guanidiumreste eher zu kurz sind, um die Abgangsgruppe zu protonieren. Demnach sollte in dieser Arbeit die Veränderung der Amine im Vordergrund stehen. Hierfür wurden Polyamine gewählt und eine entsprechende Synthese erarbeitet.
Dabei konnte eine Reihe neuer Spaltmoleküle hergestellt werden, die mitunter bei 50-fach niedriger Konzentration effizienter sind als die vorherigen Verbindungen. Zur Charakterisierung wurden Experimente zur pH-Abhängigkeit und Zeitkinetik durchgeführt. Des Weiteren wurde ein möglicher Einfluss von Metallionen untersucht. Das Gerüst von Verbindung 35 wurde durch den Einbau eines Linkers in Form einer Azo-Gruppe erweitert, der zur Verknüpfung eines Oligonukleotids und einer möglichen sequenzselektiven Spaltung dienen sollte. Gleichzeitig eignet sich die neue Verbindung durch die eingebaute Azo-Gruppe als Farbmarkierung.
Ein weiteres Augenmerk dieser Arbeit lag auf der Synthese von Verbindungen zur Regulation der Genexpression. Dabei dienen die meisten etablierten Substanzen der Inhibierung der Transkription. Die Hochregulierung der Genexpression ist hingegen schwieriger zu gestalten. Ein Konzept sieht die Aktivierung derer durch Umleitung von Transkriptionsfaktoren (TFs) mittels der Einführung von Adaptermolekülen vor, die aus einer DNA-bindenden Domäne (DBD) und einer Aktivierungsdomäne (AD) aufgebaut sind. In vorherigen Arbeiten konnten Konjugate, welche aus einem DNA-Hairpin und einem Pyrrol-Imidazol-Polyamid (PIP) aufgebaut sind, realisiert werden. Allerdings weisen diese Verbindungen mit Zunahme der zu erkennenden Basenpaare Einschränkungen in ihrer Bindungsaffinität auf. Als Alternative können pseudokomplementäre Peptidnukleinsäuren (pcPNAs) verwendet werden. An dieser Stelle setzt die vorliegende Arbeit an: Es wurden synthetische Adaptermoleküle auf Basis von pcPNA und DNA zur Umleitung von TFs hergestellt. pcPNAs zeichnen sich unter anderem durch den Austausch von Adenin und Thymin mit 2,6-Diaminopurin und 2-Thiouracil aus. Dies bewirkt eine höhere Bindungsaffinität gegenüber DNA, bei gleichzeitiger Abstoßung der pcPNAs untereinander aufgrund sterischer Hinderung. Diese Art von Konjugaten konnte in dieser Arbeit realisiert werden. Allerdings zeigte sich, dass die Bindungsaffinität der pcPNA durch die Konjugation mit einer DNA deutlich herabgesetzt wurde und diese Adapter gegenüber den bestehenden Systemen keine Verbesserung darstellten.
Aus Kombination eines DNA-Spalters in Part 1 sowie einer DNA-bindenden Domäne in Part 2 dieser Arbeit sollte eine sequenzspezifische künstliche Nuklease hergestellt werden. Die Synthese konnte in einem ersten Anlauf realisiert werden. Testexperimente bezüglich der DNA-Spaltung lieferten allerdings noch kein aussagekräftiges Ergebnis.