Νέες μοριακές προσεγγίσεις για την αύξηση των επιπέδων της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) στο ήπαρ και την θεραπεία της στεφανιαίας νόσου
Authors: Κανάκη Μαρία 
Published: September 2021

Οι κύριοι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν νααπαντηθούν ερωτήματα που αφορούν στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών πουρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό τωνλιποπρωτεϊνών στο ήπαρ και να τακτοποιηθούν νέες μοριακές στρατηγικές για τηναύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα.Ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών περιλαμβάνει τη μεταφορά λιπιδίων,ιδιαίτερα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων, από το έντερο και το ήπαρ προς τουςπεριφερικούς ιστούς και αντίστροφα από τη περιφέρεια πίσω στο ήπαρ (αντίστροφημεταφορά χοληστερόλης). Στα μονοπάτια αυτά εμπλέκονται πολλές πρωτεΐνες,συμπεριλαμβανομένων των απολιποπρωτεϊνών, μεμβρανικοί μεταφορείς, ένζυμα τουπλάσματος και υποδοχείς λιποπρωτεϊνών. Η λιποπρωτεινική λιπάση (LPL) παίζεισημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών καθώς καταλύει την υδρόλυσητων τριγλυκεριδίων που βρίσκονται στα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια πλούσια σετριγλυκερίδια, όπως είναι τα χυλομικρά και η VLDL (very low density lipoprotein).Τα λιπαρά οξέα που ελευθερώνονται στους ιστούς αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό ήχρησιμοποιούνται για παραγωγή ενέργειας από διάφορους ιστούς. Η LPL εκφράζεταισε υψηλά επίπεδα κυρίως στο λιπώδη ιστό και τους μύες, αλλά ανιχνεύεται σεχαμηλά επίπεδα σε άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του ήπατος. Ο ρόλοςτης LPL στο ενήλικο ήπαρ είναι αμφιλεγόμενος εξαιτίας των χαμηλών επιπέδωνέκφρασης της σ αυτόν τον ιστό. Παρ’ όλα αυτά, πρόσφατες μελέτες σε μοντέλαποντικών στα οποία υπερκεράζεται ή απαλείφεται η LPL στο ήπαρ, έχουν αναδείξειτη σημαντικότητα αυτού του ενζύμου στο μεταβολισμό των λιπιδίων και τηςγλυκόζης.Στην Ενότητα Ι, χαρακτηρίσαμε το μηχανισμό που ρυθμίζει την έκφραση τουγονιδίου LPL του ανθρώπου στα ηπατικά κύτταρα σε μεταγραφικό επίπεδο. Αρχικάκλωνοποιήσαμε τον υποκινητή της ανθρώπινης LPL και πραγματοποιήσαμε ανάλυσητων απαλοιφών του υποκινητή της LPL με πειράματα παροδικής διαμόλυνσηςκυττάρων HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η κοντινή περιοχή -109/-28 του υποκινητήείναι σημαντική για τη βασική ηπατική ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου LPL.Με βιοπληροφορική ανάλυση αυτής της περιοχής εντοπίστηκε μια πιθανή θέσηπρόσδεσης (-47/-40) για τον παράγοντα FOXA2 (HNF3β), ο οποίος παίζει σημαντικόρόλο στην ομοιόσταση των λιπιδίων και της γλυκόζης. Αποσιώπηση της έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 (χρησιμοποιώντας ένα ειδικόsiRNA), οδήγησε σε μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης και mRNA του γονιδίου LPL.Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης και αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνώνέδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXA2 προσδένεται στην κοντινή περιοχή -141/-10 του υποκινητή της LPL. Αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο χαρακτηρίστηκεπεραιτέρω με μεταλλαξιγένεση. Μεταλλάξεις πέντε βάσεων στη θέσης πρόσδεσηςτου FOXA2 (-47/-40) κατάργησαν την πρόσδεση του FOXA2 στη θέση αυτή καιμείωσαν σημαντικά τόσο τη βασική ενεργότητα του υποκινητή της LPL όσο και τηνενεργοποίηση του υποκινητή από τον παράγοντα FOXA2. Στη συνέχεια, μελετήσαμετην επίδραση της ινσουλίνης στην ηπατική ρύθμιση του γονιδίου LPL στα κύτταραHepG2. Παρατηρήσαμε ότι η ινσουλίνη αύξησε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης τηςΑΚΤ και οδήγησε σε αποκλεισμό του FOXA2 από τον πυρήνα, το οποίο στησυνέχεια προκάλεσε μείωση των επιπέδων mRNA του γονιδίου LPL και τηςενεργότητας του υποκινητή. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα νέο ρόλοτου παράγοντα FOXA2 στη ρύθμιση του γονιδίου LPL του ανθρώπου από τηνινσουλίνη, στα ηπατικά κύτταρα.Στην Ενότητα ΙΙ, διερευνήσαμε το μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου LPLτου ανθρώπου από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR (Liver X Receptors) στα ηπατικάκύτταρα. Προηγούμενες μελέτες σε μοντέλα ποντικών είχαν δείξει ότι η έκφρασή τουγονιδίου LPL στο ήπαρ επάγεται ισχυρά από δίαιτες υψηλές σε χοληστερόλη ή απόσυνθετικούς LXR αγωνιστές που ενεργοποιούν τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR καιRXR (Retinoid X Receptor). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, δείξαμε ότι επώασηκυττάρων HepG2 ή πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXRαγωνιστή T0901317 αύξησαν την έκφραση του γονιδίου της LPL τόσο σε επίπεδόRNA όσο και πρωτεϊνών. Επίσης η υπερέκφραση του ετεροδιμερούς LXRα/RXRα σεκύτταρα HepG2 παρουσία των συνδετών τους, ενεργοποίησε ισχυρά τον υποκινητή -883/+39 της ανθρώπινης LPL. ανάλυση των απαλοιφών του υποκινητή της LPLέδειξαν ότι η ελάχιστη περιοχή που απαιτείται για την ενεργοποίηση από ταετεροδιμερή LXRα/RXRα ήταν η -109/-28, η οποία περιλαμβάνει τη θέση πρόσδεσηςτου FOXA2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει, το γεγονός ότι οι υποδοχείς LXRα και RXRαπροσδένονται πολύ ασθενικά στον υποκινητή του γονιδίου LPL, όπως διαπιστώθηκεμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, υποδεικνύοντας ότι επιπλέονπαράγοντες απαιτούνται για την δράση των LXR. Αποσιώπηση της έκφρασης τηςενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 και σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA, προκάλεσε δραματική μείωση τηςεπαγωγής της έκφρασης του γονιδίου LPL από τον συνδέτη του LXR, T0901317, σεεπίπεδο πρωτεΐνης και mRNA. Αξιοσημείωτη είναι η διαπίστωση ότι η ινσουλίνη, ηοποία απενεργοποιεί τον παράγοντα FOXA2 μέσω πυρηνικού του αποκλεισμού,μείωσε την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες,υποδεικνύοντας της σημαντικότητα του παράγοντα FOXA2 στην ομοιόσταση τωνλιπιδίων στο ήπαρ. Έπειτα, παρατηρήσαμε ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση τηςπρωτεΐνης FOXA2 και των LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών τους,ενεργοποίησε τον υποκινητή της LPL κατά έναν συνεργατικό τρόπο.Καταστρέφοντας τη θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 (με τις μεταλλάξειςπου αναφέρθηκαν παραπάνω), αναστάλθηκε σημαντικά η συνεργατική ενεργοποίησητου υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα και τονπαράγοντα FOXA2.Τέλος, πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισηςκαι δοκιμασίες GST pull down και δείξαμε ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXA2και LXR/RXR αλληλεπιδρούν φυσικά in vivo και in vitro. Μια εκτεταμένη DBD(DNA binding domain) περιοχή του υποδοχέα LXRα απαιτείται για τη τις φυσικέςαλληλεπιδράσεις με τουλάχιστον μία από τις δύο περιοχές ενεργοποίησης(transactivation domains) του FOXA2. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα των Ενοτήτων Ικαι ΙΙ υποδεικνύουν ότι ή νέα θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 στονυποκινητή της LPL λειτουργεί σαν ένα νέο ρυθμιστικό στοιχείο LXRE, το οποίοδιευκολύνει την επαγωγή του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες μέσω τουπαράγοντα FOXA2. Μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού ινσουλίνης- AKTFOXA2-LPL η υπερέκφραση της LPL στο ήπαρ εμποδίζεται σε συνθήκες περίσσειαςχοληστερόλης, προστατεύοντας τον ιστό αυτό από τις τοξικές δράσεις της LPL.Στην Ενότητα ΙΙΙ, εστιαστήκαμε στην ρύθμιση γονιδίων που συμμετέχουν στηβιογένεση και αναδιαμόρφωση της HDL από τους μεταγραφικούς παράγοντεςFOXA2 και LXRs στα ηπατικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι σεποντίκια ετερόζυγα για τον παράγοντα FOXA2, τα επίπεδα της HDL στο πλάσμαείναι μειωμένα. Με βιοπληροφορική ανάλυση, εντοπίστηκαν πιθανές θέσειςπρόσδεσης για τον παράγοντα FOXA2 που βρίσκονται κοντά σε χαρακτηρισμέναρυθμιστικά στοιχεία LXRE, στους υποκινητές των γονιδίων ABCG1, LIPC καιCETP. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι η επώασηκυττάρων HepG2 και πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXRαγωνιστή , T0901317, προκάλεσε ισχυρή επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων ABCG1, ABCG5, ABCG8 και CETP, σε επίπεδο mRNA. Απενεργοποίηση τουπαράγοντα FOXA2, μέσω siRNA αποσιώπησης είτε μέσω επίδρασης με ινσουλίνη σεπρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ή σε κύτταρα HepG2, μείωσε τα βασικά επίπεδαmRNA αλλά και την επαγωγή των ABCG5 και ABCG8 γονιδίων, από τον αγωνιστήT0901317, υποδεικνύοντας ότι ο FOXA2 έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίησηαυτών των μεταφορέων λιπιδίων από τους συνδέτες των πυρηνικούς υποδοχείς LXR.Πραγματοποιώντας πειράματα παροδικής διαμόλυνσης σε κύτταρα HepG2παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης FOXA2 ή των υποδοχέωνLXRα/RXRα οδήγησε σε αύξηση της ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίωνABCG5 και ABCG8. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, αποσιώπηση τηςέκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης LXRα ή LXRβ στα κύτταρα HepG2, μέσωλεντιïών που εκφράζουν ειδικά shRNAs για κάθε ισομορφή των LXR, μείωσε ταεπιπέδων mRNA των γονιδίων ABCG5 και ABCG8. Επιπλέον, η ταυτόχρονηυπερέκφραση των πρωτεϊνών FOXA2 και LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετώντους ενεργοποίησε κατά έναν συνεργατικό τρόπο τον υποκινητή του γονιδίουABCG8, αλλά όχι τον υποκινητή του γονιδίου ABCG5. Αντίθετα, ο FOXA2ανέστειλε την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG5 από τους LXRs και τιςοξυστερόλες στα κύτταρα HepG2, υποδεικνύοντας την ύπαρξη απομακρυσμένωνρυθμιστικών στοιχείων και μεταγραφικών παραγόντων, τα οποία ίσως συνδέονται μελούπες του DNA και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίωνABCG5 και ABCG8. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με την συνεργατικήενεργοποίηση του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRακαι τον παράγοντα FOXA2, όπως περιγράφηκε παραπάνω.Η κατανόηση σε βάθος των μηχανισμών, με τους οποίους συνδέονται ταμεταβολικά μονοπάτια λιπιδίων και γλυκόζης στο ήπαρ από παράγοντες όπως οFOXA2 είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικώνστρατηγικών για την αύξηση των επιπέδων της HDL και την προστασία ασθενών μεμεταβολικές ασθένειες, όπως η καρδιαγγειακή νόσος, ο διαβήτης, οι δυσλιπιδαιμίεςκαι το μεταβολικό σύνδρομο.