Αξιολόγηση και βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων
Authors: Φώτη Χρυσάνθη-Λαμπρινή 
Published: November 2021

Η καλλιέργεια της φακής υπόκειται σε μία πληθώρα βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, οι οποίες περιορίζουν την αύξηση και ανάπτυξη και επιφέρουν σημαντικές απώλειες απόδοσης. Στοχεύοντας στην εξασφάλιση της βιωσιμότητας της καλλιέργειας, η χρήση ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων αποτελεί την πλέον αποτελεσματική, αειφόρο και οικονομική προσέγγιση. Βάσει των δυνητικών επιπτώσεων στην καλλιέργεια, οι περισσότερο επιζήμιες καταπονήσεις είναι η ξηρασία, η υψηλή αλατότητα και η ασθένεια της φουζαρίωσης, που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. lentis (Fol). Με δεδομένη την έλλειψη ερευνητικών δεδομένων σχετικά με τους μηχανισμούς που ελέγχουν την ανθεκτικότητα έναντι των ανωτέρω καταπονήσεων καθώς και την έλλειψη κατάλληλων μεθόδων επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε αρχικά στην αξιολόγηση γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι της καταπόνησης που επιφέρει η ξηρασία και η υψηλή αλατότητα καθώς και στην ταυτοποίηση του παθογόνου που προκαλεί την ασθένεια της φουζαρίωσης σε εγχώριες ζώνες καλλιέργειας φακής. Ακολούθως, ως ερευνητικοί στόχοι τέθηκαν η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα έναντι της ξηρασίας και της φουζαρίωσης, μέσω μελέτης της μεταβολικής απόκρισης γενετικού υλικού φακής στις ανωτέρω καταπονήσεις. Τέλος, η έρευνα εστίασε στη δημιουργία ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου γενετικού μετασχηματισμού της φακής, κατάλληλου προς αξιοποίηση σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Στα Κεφάλαια 2 και 3 διερευνήθηκε η δυνατότητα αξιολόγησης γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, βάσει του προσδιορισμού του δυναμικού βλάστησης των σπόρων και ανάπτυξης των σποροφύτων υπό συνθήκες καταπόνησης. Τα ευρήματα καταδεικνύουν τις δραστικές επιπτώσεις των ανωτέρω καταπονήσεων στη βλάστηση και ανάπτυξη, με τις επιδράσεις να είναι ανάλογες της έντασης της καταπόνησης, ενώ παράλληλα υπογραμμίζουν τη δυνατότητα αξιοποίησης της συγκεκριμένης μεθόδου για την ανάδειξη της υπάρχουσας γενετικής παραλλακτικότητας σχετικά με την ανθεκτικότητα έναντι της ξηρασίας και της αλατότητας. Στο πλαίσιο αυτό, οι ποικιλίες ¨Ελπίδα¨, ¨Σάμος¨ και ¨Θεσσαλία¨ εμφάνισαν την καλύτερη επίδοση υπό συνθήκες υδατικής καταπόνησης, ενώ η ποικιλία ¨Σάμος¨ αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική ποικιλία έναντι της υψηλής αλατότητας. Τα συνολικά αποτελέσματα παρέχουν σημαντικές ενδείξεις σχετικά με την καταλληλόλητα της μεθόδου για διενέργεια πρώιμων επιλογών ανθεκτικών γονοτύπων. Υπό την προϋπόθεση της επιβεβαίωσης της αξιοπιστίας των ευρημάτων μέσω συσχέτισής τους με δεδομένα από πειραματισμό αγρού, η προσέγγιση αυτή αναμένεται να συμβάλλει προς την αναβάθμιση της αποτελεσματικότητας των διαδικασιών που στοχεύουν στη βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Ακολούθως, μελετήθηκε η μεταβολική απόκριση γενετικού υλικού φακής στην υδατική καταπόνηση με στόχο την κατανόηση των βιοχημικών μηχανισμών που διέπουν την ανθεκτικότητα και τον προσδιορισμό πιθανών βιοδεικτών προς ενσωμάτωση σε διαδικασίες έμμεσης επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων (Κεφάλαιο 4). Για το σκοπό αυτό, προσδιορίστηκε το μεταβολικό προφίλ 2 ποικιλιών φακής, οι οποίες βάσει της προηγηθείσας αξιολόγησης διαφέρουν ως προς την ανθεκτικότητα στην ξηρασία (Κεφάλαιο 3), υπό συνθήκες υδατικής καταπόνησης. Η ανάλυση κατέδειξε τη σημαντική επίδραση της υδατικής καταπόνησης στο μεταβολισμό της φακής, με τις επιδράσεις της καταπόνησης να υπόκεινται σε σημαντική γονοτυπική εξάρτηση. Πλέον των διαφορών που εντοπίστηκαν σε ένα εύρος μεταβολιτών με διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες, σε επίπεδο ποικιλίας, έντασης της καταπόνησης και αλληλεπίδρασής τους, η ανάλυση κατέδειξε τη διαφορική συσσώρευση των συστατικών D-φρουκτόζη, a,a-τρεχαλόζη, μυο-ινοσιτόλη και L-τρυπτοφάνη στην ανθεκτική και ευαίσθητη ποικιλία, παρέχοντας προοπτικές αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για τον εντοπισμό ανθεκτικών γονοτύπων. Δεδομένης της έλλειψης ερευνητικών δεδομένων σχετικά με τα είδη του γένους Fusarium που προσβάλλουν την καλλιέργεια φακής στον ελλαδικό χώρο, αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η ταυτοποίηση των απομονώσεων του παθογόνου στις κύριες ζώνες καλλιέργειας της φακής (Κεφάλαιο 5). Για το σκοπό αυτό, έγινε συλλογή εδαφικών δειγμάτων από αγρούς, όπου τα φυτά παρουσίαζαν χαρακτηριστικά συμπτώματα της φουζαρίωσης, και ακολούθησε η απομόνωση του Fusarium spp.. Έπειτα από ταυτοποίηση, μέσω μακροσκοπικών και μικροσκοπικών παρατηρήσεων, έγινε μοριακός χαρακτηρισμός των απομονώσεων βάσει in silico ανάλυσης των αλληλουχιών που κωδικοποιούν τα γονίδια TEF-1α, b-tubulin και calmodulin. Αναφορικά με το γονίδιο TEF-1α, η ανάλυση κατέδειξε υψηλή ομολογία με απομονώσεις του Fusarium spp. (99 %), ενώ οι απομονώσεις που προέρχονται από αγρούς της Λευκάδας και της Φλώρινας, όπου η φακή αποτελεί μονοκαλλιέργεια, εμφάνισαν υψηλή ομολογία με το Fol. Η ανάλυση των γονιδίων b-tubulin και calmodulin, ανέδειξε υψηλή ομολογία με απομονώσεις του F. oxysporum, χωρίς ωστόσο να επιτευχθεί ταυτοποίηση του formae specialis (f.sp. lentis). Η προκαταρκτική αυτή μελέτη συνιστά την πρώτη προσπάθεια ταυτοποίησης απομονώσεων του Fusarium spp. σε εγχώριες ζώνες καλλιέργειας της φακής. H ταυτοποιηση του φουζαριου σε ζωνες καλλιέργειας της φακης μπορει να συμβάλλει θετικά προς το σχεδιασμό κατάλληλων σχημάτων για τη βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής στην ασθένεια της φουζαρίωσης. Στοχεύοντας στην ανάπτυξη ποικιλιών με ανθεκτικότητα έναντι της φουζαρίωσης, οι βελτιωτικές διαδικασίες πρόκειται να επωφεληθούν σημαντικά από την απόκτηση μοριακών δεδομένων σχετικά με το βιολογικό σύστημα Fol-φακής. Στο πλαίσιο αυτό, αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 αποτέλεσε η συγκριτική αξιολόγηση της μεταβολικής απόκρισης δύο ποικιλιών φακής, που διαφέρουν ως προς την ανθεκτικότητα στην ασθένεια, υπό συνθήκες τεχνητής μόλυνσης με το Fol. Πέραν της κατανόησης των αμυντικών μηχανισμών έναντι της φουζαρίωσης, απώτερο σκοπό αποτέλεσε ο πιθανός εντοπισμός βιοδεικτών για την πρώιμη επιλογή ανθεκτικών γονοτύπων. Η ανάλυση του GC/MS μεταβολικού προφίλ ρίζας και βλαστού επέτρεψε τον προσδιορισμό των συστατικών που εμφάνισαν σημαντική μεταβολή στη συσσώρευσή τους σε επίπεδο ποικιλίας ή/και μεταχείρισης ή/και αλληλεπίδρασής τους. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν την ύπαρξη σημαντικών διαφορών στο μεταβολικό περιεχόμενο μεταξύ της ανθεκτικής και ευαίσθητης ποικιλίας καθώς και μεταξύ των Fol-φυτών και των μαρτύρων. Πέραν των μεταβολών που εντοπίστηκαν σε ένα εύρος μεταβολιτών, τα συνολικά αποτελέσματα υποδεικνύουν τη σημαντική συνεισφορά των συστατικών παλατινιτόλη και L-προλίνη 2 στη μεταβολική απόκριση των ριζών και του βλαστού αντίστοιχα, υποδεικνύοντας τη δυνατότητα αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για το χαρακτηρισμό γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι της φουζαρίωσης. Με δεδομένη τη δυστροπία της φακής ως προς το γενετικό μετασχηματισμό και την αναγέννηση ιστών, η μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ενός σύντομου και αποτελεσματικού πρωτοκόλλου μετασχηματισμού της φακής μέσω του φορέα Agrobacterium rhizogenes (Κεφάλαιο 7). Στο πλαίσιο βελτιστοποίησης του πρωτοκόλλου, μελετήθηκε η επίδραση τριών βακτηριακών στελεχών (R1000, K599 και Arqua) καθώς και της σύστασης των θρεπτικών μέσων, αναφορικά με την παρουσία ακετοσιριγκόνης και MES ως μέσα επαγωγής του μετασχηματισμού. Τα ευρήματα υποδεικνύουν τη θετική επίδραση του βακτηριακού στελέχους R1000, σε συνδυασμό με τον εμπλουτισμό των μέσων με ακετοσυριγκόνη/MES, στη συχνότητα του μετασχηματισμού. Η διαγονιδιακή φύση των ριζών επιβεβαιώθηκε μέσω της ένθεσης του γονιδίου rolB2 και της ταυτόχρονης απουσίας της virCD αλληλουχίας του A. rhizogenes. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν ότι ο μετασχηματισμός, μέσω του A. rhizogenes, αποτελεί μία εναλλακτική προσέγγιση δημιουργίας διαγονιδιακών ιστών στη φακή, η δυστροπία της οποίας δυσχεραίνει τις προσπάθειες σταθερού μετασχηματισμού και αναγέννησης ολόκληρων φυτών. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη αναφορά σχετικά με την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου για την επαγωγή διαγονιδιακών ριζών στη φακή, προσθέτοντας ένα ελκυστικό εργαλείο στις έρευνες σχετικά με τη βιολογία ριζών. Τέλος, η Γενική Συζήτηση (Κεφάλαιο 8) πλαισιώνει την υφιστάμενη κατάσταση της καλλιέργειας της φακής σε παγκόσμιο επίπεδο, ιδιαίτερα υπό το πρίσμα των άμεσων και μελλοντικών προκλήσεων και των ενεργειών που στοχεύουν στην επιτυχή αντιμετώπισή τους. Προς την κατεύθυνση αυτή, γίνεται μνεία στις προοπτικές αναβάθμισης των διαδικασιών βελτίωσης της φακής αξιοποιώντας τις δυνατότητες που προσφέρουν οι σύγχρονες μοριακές προσεγγίσεις.