Μελέτη μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά στελεχών της stenotrophomonas maltophilia
Authors: Μασγαλά Αικατερίνη 
Published: January 2014

H ερευνητική μας εργασία αφορούσε τις ευαισθησίες, την επιδημιολογική τυποποίηση και τη διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά 25 κλινικών στελεχών S.maltophilia που απομονώθηκαν στη διάρκεια ενός έτους από τριτοβάθμια νοσοκομεία της Αθήνας. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά χρησιμοποιήθηκαν οι μικρομέθοδοι αραίωσης σε ζωμό PASCO και Sensititre και οι μέθοδοι διάχυσης, αυτή των δίσκων και το E test. Η μικρομέθοδος αραίωσης σε ζωμό Sensititre χρησιμοποιήθηκε σα μέθοδος αναφοράς και εκτιμήθηκαν οι αποκλίσεις στα αποτελέσματα μεταξύ αυτής και των υπολοίπων μεθόδων. Οι μικρομέθοδοι αραίωσης σε ζωμό έδειξαν το μεγαλύτερο μεταξύ τους συσχετισμό και σύμφωνα με αυτές η τριμεθοπρίμη/σουλφομεθοξαζόλη ήταν το πιο αποτελεσματικό αντιβιοτικό, με 24% από τα στελέχη να είναι ευαίσθητα με την PASCO και 32% με τη Sensititre. Ακολούθησε η επιδημιολογική τυποποίηση των στελεχών με ηλεκτροφόρηση εναλασσόμενου πεδίου (PFGE) κατά την οποία μόνο δύο στελέχη παρουσίασαν πανομοιότυπο ηλεκτροφορητικό πρότυπο τα οποία είχαν απομονωθεί από το ίδιο τμήμα ενός νοσοκομείου. Σύμφωνα με τα κριτήρια του Tenover μοναδικά (με περισσότερες από 7 ζώνες διαφορά) κρίθηκαν 12 στελέχη, ενώ τα υπόλοιπα θεωρήθηκαν πιθανά σχετιζόμενα (διαφορά 4-6 ζώνες). Η διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στις β-λακτάμες έγινε κατ’αρχήν με τον έλεγχο της υδρολυτικής ικανότητας των εξεταζομένων στελεχών.. Χρησιμοποιώντας τη σπεκτοφωτομετρική μέθοδο το μεγαλύτερο ποσοστό υδρόλυσης παρουσίασε η μεροπενέμη με δεύτερη την πιπερακιλλίνη. Ακολούθησαν η ιμιπενέμη, η πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη, η κεφοταξίμη, η αζτρεονάμη και τελευταία η κεφταζιντίμη. Mε δεδομένο το γεγονός ότι η μεροπενέμη αποτελεί ειδικό υπόστρωμα για την L1 β-λακταμάση ενώ η κεφταζιντίμη αποτελεί ειδικό υπόστρωμα για την L2 β-λακταμάση, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η πλειονότητα των στελεχών εκφράζει περισσότερο την L1 από την L2 β-λακταμάση, Με τη μικροβιολογική μέθοδo ανιχνεύθηκε υδρόλυση της ιμιπενέμης στα σημεία εστίασης της L1 και L2 αντίστοιχα, οπότε και επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των παραπάνω λακταμασών. O προσδιορισμός των ισοηλεκτρικών σημείων των β-λακταμασών στα στελέχη που εξετάσθηκαν κατέδειξε την ύπαρξη β-λακταμασών με pI μεγαλύτερο ή ίσο του 8,2 στην πλειονότητά τους (18 από τα 25 στελέχη). Τα στελέχη αυτά υδρόλυαν την ιμιπενέμη. Οκτώ από αυτά τα στελέχη παρήγαγαν και άλλες λακταμάσες με pI από 5.4 έως 8.2, ενώ πέντε παρήγαγαν λακταμάσες με pI από 7.6 έως 8.0. Ο έλεγχος πιθανής συνέργειας μεταξύ κλαβουλανικού και ιμιπενέμης ανίχνευσε σωστά 13 από τα 18 στελέχη που έφεραν την L2 λακταμάση. Βάσει του ισοηλεκτρικού σημείου που αναφέρεται στη βιβλιογραφία για την L1-β- λακταμάση (6.9) κανένα από τα στελέχη που εξετάσθηκαν δεν έφερε L1-β-λακταμάση. Ωστόσο μεταλλο-β-λακταμάσες με pI από 4.8 έως 6.8 έχουν αναφερθεί σε στελέχη S.maltophilia. Tα στελέχη αυτά υδρόλυαν τις πενέμες (ιμιπενέμη, μεροπενέμη), και αναστέλλονταν από το EDTA. Στην μελέτη μας το EDTA ανέστειλε 11 από τα 25 στελέχη. Έξι από τα 11 στελέχη έφεραν λακταμάσες με pI από 5.4 έως 7.8. Eίναι λοιπόν πιθανόν τα στελέχη αυτά να φέρουν άλλες εκτός της L1 μεταλλο-β-λακταμάσες, γεγονός που υποστηρίζεται και από τα αποτελέσματα της υδρόλυσης.. Δεν ανιχνεύθηκαν τα γονίδια που κωδικοποοιούν τις λακταμάσες VIM και TEM σε κανένα από τα στελέχη. Από τις αμινογλυκοσίδες και λαμβάνοντας σα μέθοδο αναφοράς τη Sesititre, η αμικασίνη φαίνεται η πιο δραστική από όλες αναστέλλοντας το 44% των στελεχών και ακολουθούν η τομπραμυκίνη και η γενταμυκίνη (36% και 28% των στελεχών ευαίσθητα αντίστοιχα). Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο διάχυσης σε άγαρ προκειμένου να προσδιορίσουμε το φαινότυπο αντοχής (AGRPs) των εξεταζομένων στελεχών.και στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ειδικό πρόγραμμα στον ηλεκτρονικό υπολογιστή (Schering-Plough, Bloomfield, New Jersey, USA) που υπολογίζει βάσει των διαμέτρων των ζωνών αναστολής και συγκεκριμένων βιβλιογραφικών δεδομένων,τους πιθανούς μηχανισμούς αντοχής (μειωμένη διαπερατότητα, ύπαρξη αμινογλυκοσιδοτροποποιητικών ενζύμων) καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η πλειονότητα των στελεχών που εξετάσθηκαν (23 στα 25) παρουσίαζε ελαττωμένη διαπερατότητα. Επιπλέον με τη μέθοδο του in situ υβριδισμού δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα στέλεχος S.maltophilia αμινογλυκοσιδοτροποποιητικό ένζυμο των ομάδων: AAC (6)-I (aac (6)-Ib, aac(6)-1c), AAC (3) (aac(3)-Ia, aac(3)-Va), ANT (2) (ant (2’’)-Ia) και APΗ (3) (aph (3’)-Ia, aph (3’)-Via). ...