Μικρορευστομηχανικές διατάξεις για τη μελέτη της συμπεριφοράς κυττάρων
Authors: Κεφαλληνού Διονυσία 
Published: December 2023

Οι μικροδιατάξεις οργάνων σε ψηφίδα (organs-on-chips/OoCs) έχουν αναδειχθεί τις τελευταίες δεκαετίες από το γόνιμο συγκερασμό της μικρορευστονικής τεχνολογίας με την κυτταρική βιολογία, αποτελώντας την επιτομή των βιομιμητικών συστημάτων. Αποτελούν αξιόπιστα προκλινικά μοντέλα, δίνοντας απάντηση στις σύγχρονες προκλήσεις στον τομέα της βιοϊατρικής και της βιολογικής έρευνας, που σήμερα περιορίζονται σε συμβατικές στατικές κυτταροκαλλιέργειες και σε πειράματα σε ζώα. Ο μυελός των οστών, λόγω του ζωτικού ρόλου του στον ανθρώπινο οργανισμό με το μηχανισμό της αιμοποίησης, αποτελεί βασικό όργανο μελέτης. Έτσι, η ανάπτυξη μικροδιάταξης μυελού των οστών σε ψηφίδα (bone marrow-on-a-chip/BMoC) αποτελεί σημαντικό εργαλείο για την κατανόηση της βιολογίας του ίδιου του οργάνου, τη χαρτογράφηση σχετιζόμενων ασθενειών, όπως το πολλαπλό μυέλωμα και η λευχαιμία, και τέλος, για τον έλεγχο απόκρισης των κυττάρων του σε φάρμακα, ακτινοβολία και χημειοθεραπείες. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας μικροδιάταξης μυελού των οστών σε ψηφίδα για την αμιγώς in vitro και απουσία ικριωμάτων δημιουργία και συντήρηση της ανθρώπινης περιαγγειακής αιμοποιητικής περιοχής του μυελού. Αρχικά, αναπτύσσονται όλα τα στάδια κατασκευής της μικροδιάταξης, από το σχεδιασμό μέχρι και τη σφράγισή της, που οδήγησαν σε επιτυχή και επαναλήψιμη ολοκλήρωση της μικροδιάταξης. Αυτή αποτελείται από δύο κυλινδρικούς μικροθαλάμους πολυ(διμεθυλοσιλοξάνης) (PDMS), ένα για την τροφοδοσία με θρεπτικό υλικό και ένα για την καλλιέργεια κυττάρων, τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω παρεμβαλλόμενης πορώδους μεμβράνης, με την όλη διάταξη να σφραγίζεται με γυαλί. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την υλοποίησή της ήταν λιθογραφία μαλακής ύλης (τεχνική αντιγραφής μήτρας – replica molding) και επιφανειακή τροποποίηση με χρήση τεχνολογίας πλάσματος. Προτάθηκε πρωτόκολλο επιτυχούς και επαναλήψιμης κατασκευής πορώδους μεμβράνης PDMS, στηριζόμενο σε δύο βασικούς πυλώνες, τη χημική επιφανειακή τροποποίηση και την ενίσχυση της μηχανικής της αντοχής. Για λόγους απλούστευσης και επιτάχυνσης της παραγωγικής διαδικασίας μικροδιατάξεων, μελετήθηκε και επιλέχθηκε τελικά η ενσωμάτωση εμπορικής μεμβράνης πολυεστέρα τερεφθαλικού πολυαιθυλένιου (PET). Στοχεύοντας στην επίτευξη μακροπρόθεσμης καλλιέργειας κυττάρων στη μικροδιάταξη, προτάθηκε μονοβηματική, απλή μέθοδος επιφανειακής τροποποίησης μικροδιατάξεων βασισμένων σε PDMS πριν την επίστρωση κολλαγόνου, προς αντιμετώπιση της εγγενούς υδροφοβικότητας του υλικού. Πρόκειται για την προκατεργασία με πλάσμα αέρα, ένα βήμα ήδη ενσωματωμένο στην κατασκευαστική διαδικασία της μικροδιάταξης στο στάδιο της σφράγισης. Δοκιμή καλλιέργειας μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MSCs) σε μικροθαλάμους κατεργασμένους με την προτεινόμενη μέθοδο, εγχείρημα ελάχιστα δοκιμασμένο στην ερευνητική κοινότητα, ανέδειξε ενισχυμένη κυτταρική ανάπτυξη και πλήρη επιφανειακή κάλυψη την 5η ημέρα, τη μεγαλύτερη στη βιβλιογραφία. Τα παραπάνω συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου προκατεργασίας με πλάσμα για την ακινητοποίηση κολλαγόνου σε βασισμένες σε PDMS μικροδιατάξεις, με σκοπό τη μακροπρόθεσμη καλλιέργεια MSCs. Για τη βελτιστοποίηση της λειτουργίας της μικροδιάταξης υπό ροή (ενεργή τροφοδοσία), μελετήθηκε το φαινόμενο και τα αίτια δημιουργίας φυσαλίδων σε χαμηλές και υψηλές ροές, και διερευνώνται βελτιωτικές ενέργειες για τον περιορισμό του, αλλά και την εξαφάνισή του με την ενσωμάτωση εμπορικής παγίδας. Συνολικά αποδεικνύεται ότι η δημιουργία φυσαλίδων είναι συνυφασμένη με τη λειτουργία ενός μικρορευστονικού συστήματος υπό ροή για μεγάλα χρονικά διαστήματα, και συγκεκριμένα, με την ίδια τη διάταξη, το υλικό, τα εξαρτήματα και τη συνδεσμολογία της, αλλά και τις βαθμίδες θερμοκρασίας/πίεσης μεταξύ τροφοδοσίας και μικροδιάταξης.Για το λόγο αυτό, προτείνεται τελικά μικροδιάταξη παθητικής τροφοδοσίας με ενσωματωμένη εμπορική μεμβράνη PET. Προς επιβεβαίωση της επιλογής μεμβράνης PET, σε σύγκρισή της με την κατασκευασμένη PDMS, αυτή εμφάνισε μεγαλύτερη ομοιομορφία ανάπτυξης MSCs. Με ενσωμάτωση της μεμβράνης PET λοιπόν, συγκρίθηκαν μεταξύ τους οι μικροδιατάξεις υπό ροή και παθητικής τροφοδοσίας, όπου αποδείχθηκε ταχύτερη αλλά ανομοιογενής ανάπτυξη MSCs στην πρώτη, και περισσότερο ομαλή και ομοιόμορφη στη δεύτερη. Λόγω του προβλήματος εισόδου φυσαλίδων στη μικροδιάταξη υπό ροή, επιλέχθηκε εκείνη της παθητικής τροφοδοσίας για την εξασφάλιση ομοιόμορφου υποστηρικτικού στρωματικού ιστού πριν την εισαγωγή HSCs. Έτσι, συγκαλλιέργεια των MSCs με αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), αμιγώς in vitro και απουσία ικριωμάτων για 3 ημέρες, απέδειξε την ικανότητα της μικροδιάταξης να συντηρήσει και να πολλαπλασιάσει τα HSCs, στην κατεύθυνση της δημιουργίας ενός αιμοποιητικού οργανοειδούς μυελού των οστών. Τέλος, παρουσιάζονται αποτελέσματα σχεδιασμού μικροδιάταξης με ενσωματωμένους τρεις μικροθαλάμους καλλιέργειας, για την παράλληλη διεξαγωγή 3 ταυτόχρονων καλλιεργειών υπό ροή, ως μέρος μελλοντικών επεκτάσεων της διατριβής. Η γεωμετρία των μικροθαλάμων τροφοδοσίας διερευνήθηκε τόσο αναλυτικά όσο και υπολογιστικά, ώστε να εξασφαλίζεται πλήρωση και ισότιμη λειτουργία και των τριών μικροθαλάμων.