Influence of Cryopreservation Procedure on Activation and Cytotoxicity of Expanded NK Cells Obtained for Adoptive Immunotherapy
Authors: Вашкевич Е.П. , Мигас А.А. , Савич Ю.В. , Жерносеченко А.А. , Ласюков Е.А. , Шман Т.В. 
Published: February 2022

Введение. Экспансия в присутствии генетически модифицированных фидерных клеток (ФК) является перспективным методом ex vivo получения большого количества естественных киллерных (ЕК) клеток для адоптивной иммунотерапии. Использование криоконсервированных ЕК-клеток имеет ряд преимуществ по сравнению с применением свежих клеток, среди которых: возможность проведения многократных инфузий клеток, полученных в одной серии; однородное качество клеточного продукта для всех доз. Важным аспектом при криоконсервировании экспансированных ЕК-клеток является сохранение их жизнеспособности и функциональной активности. Цель. Анализ влияния процедуры криоконсервирования на активацию и цитотоксическую активность экспансированных ex vivo ЕК-клеток для целей адоптивной иммунотерапии. Материалы и методы. ЕК-клетки экспансировали в присутствии интерлейкина-2 (ИЛ-2) и облученных ФК K-562-4-1BBL+мИЛ-21, после чего проводили криоконсервирование и хранение в парах жидкого азота. До и после криоконсервирования оценивали количество клеток, их жизнеспособность, субпопуляционный состав и цитотоксическую активность (ЦТА). Результаты. При проведении экспансии получили клеточный продукт с высоким содержанием ЕК-клеток (95,2±1,1%), характеризующихся высоким уровнем активации при оценке экспрессии маркеров CD69, NKp44 и ЦТА. Криоконсервирование незначительно изменяло относительное содержание ЕК, Т и ЕК-подобных Т (ЕКТ)-клеток в размороженных продуктах. При проведении размораживания выход абсолютного количества живых ЕК-клеток составил 66,1±6,7%. Достоверно были снижены показатели жизнеспособности, ЦТА и процента NKp44+ при неизменном уровне CD69+ ЕК-клеток. Дополнительная инкубация размороженных ЕК-клеток в полной питательной среде способствовала повышению ЦТА по сравнению с показателями непосредственно после размораживания. Выводы. Использование ФК K-562-4-1BBL+мИЛ-21 позволяет получить ex vivo ЕК-клеточный продукт с высокой степенью чистоты, активации и противоопухолевой активности для целей иммунотерапии. Криоконсервирование сохраняет субпопуляционный состав клеточного продукта, но снижает показатели жизнеспособности, ЦТА и итоговый выход ЕК-клеток.

Introduction. Ex vivo expansion in the presence of genetically modified feeder cells is a promising method to obtain a large number of natural killer (NK) cells for adoptive immunotherapy. The use of cryopreserved NK cells has a number of advantages over freshly generated cells: enabling multiple infusions from single expansion; uniform cell product quality for all doses. An important aspect in cryopreservation of expanded NK cells is the ability to preserve the cells without loss of their viability and functions. Purpose. To analyze the effect of cryopreservation on the activation and cytotoxicity of ex vivo expanded NK cells for adoptive immunotherapy. Materials and methods. NK cells were expanded in the presence of interleukin (IL)-2 and irradiated K-562-4-1BBL+mIL-21, followed by cryopreservation and storage in liquid nitrogen vapor. The number of cells, their viability, subpopulation composition, and cytotoxicity were assessed before and after cryopreservation. Results. During the expansion, we yield a cell product with a high content of NK cells (95.2±1.1%), characterized by a high levels of activation markers CD69, NKp44, and cytotoxicity. Cryopreservation slightly changed the relative content of the NK, T cells and NK-like T cells in thawed products. During thawing, the recovery of the absolute number of live NK cells was 66.1±6.7%. Viability, cytotoxicity and the percentage of NKp44+ were significantly reduced but the level of CD69+ NK cells was constant. Pre-incubation of thawed NK cells in complete medium enhanced their cytotoxicity compared to cytotoxicity values immediately after thawing. Conclusions. Using K-562-4-1BBL+mIL-21 allows to obtain ex vivo NK-cell product with high purity, activation and antitumor activity for immunotherapy purposes. Cryopreservation maintains cell subpopulation composition of the product, but reduces the viability, cytotoxicity and the final recovery of NK cells.