Development of analytical methods and metabolomic approaches employing LC-MS for the investigation of the role of natural products and nutrition in different biological systems
Authors: Μικροπούλου Ελένη-Βασκανή 
Published: December 2022

Τα φυσικά προϊόντα (ΦΠ) είναι οι πιο μακροχρόνιοι φυτοθεραπευτικοί παράγοντες που χρησιμοποιεί η ανθρωπότητα. Μία από τις πιο πλούσιες πηγές ΦΠ είναι τα βρώσιμα φυτά, τα τρόφιμα και τα φυτικά προϊόντα διατροφής. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η εφαρμογή ομικών προσεγγίσεων, και ιδιαίτερα της τεχνολογίας μεταβολομικής, στον τομέα των ΦΠ έχει φέρει επανάσταση στην ανακάλυψη νέων βιοδραστικών συστατικών, καθώς και στη φαρμακολογική αξιολόγηση απομονωμένων ενώσεων ή πολύπλοκων μιγμάτων, όπως τρόφιμα ή φυτικά εκχυλίσματα. Σε αυτό το πλαίσιο, στην παρούσα διατριβή, εφαρμόστηκαν προσεγγίσεις μεταβολομικής με βάση τη φασματομετρία μάζας για τη διερεύνηση της επίδρασης δύο χαρακτηριστικών ΦΠ της Ελλάδας, ενός βρώσιμου άγριου χόρτου (Cichorium spinosum – σταμναγκάθι) και ενός φυτοθεραπευτικού προϊόντος με πολλαπλές εφαρμογές στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών (μαστίχα Χίου – ΜΧ), σε διαφορετικά πολύπλοκα βιολογικά συστήματα. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, ελέγχθηκε η επίδραση της ΜΧ, ενός προϊόντος προστατευόμενης ονομασίας προέλευσης (ΠΟΠ) της Ελλάδας, με αποδεδειγμένη φαρμακολογική δράση, σε μία κλινική μελέτη με ασθενείς με μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος / μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NAFLD/NASH). Το πρώτο βήμα σε αυτή τη διαδικασία ήταν η προμήθεια αναλυτικών προτύπων υψηλής καθαρότητας για το μαστιχαδιενονικό και ισομαστιχαδιενονικό οξύ, τα πιο χαρακτηριστικά τριτερπενικά οξέα της ΜΧ, μέσω της διαδικασίας της απομόνωσης και προσδιορισμού της δομής. Τα απομονωμένα πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν για τον ποσοτικό τους προσδιορισμό σε δείγματα πλάσματος και κοπράνων ασθενών που συμμετείχαν στην κλινική μελέτη, με τη χρήση μίας μεθόδου UPLC-ESI-TripleTOF-HRMS. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε μία μη στοχευμένη μεταβολομική προσέγγιση σε δείγματα πλάσματος και κοπράνων των εθελοντών της μελέτης, με τη χρήση μιας πλατφόρμας UPLC-Orbitrap-HRMS και προηγμένων εργαλείων στατιστικής επεξεργασίας. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση των ελεύθερων αμινοξέων σε δείγματα πλάσματος ασθενών που συμμετείχαν στη δοκιμή, χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης atraq και μια τροποποιημένη πλατφόρμα UPLC-TripleTOF-SWATH-HRMS. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη διερεύνηση των πτυχών του μεταβολισμού για τα χαρακτηριστικά τριτερπένια της ΜΧ. Το δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής εστιάζει στο Cichorium spinosum (σταμναγκάθι), ένα πολύτιμο και ευρείας κατανάλωσης ενδημικό φυτό της περιοχής της Μεσογείου. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε εκτενής χαρακτηρισμός του φυτοχημικού προφίλ του υδατικού εκχυλίσματος με τη χρήση UPLC-HRMS & HRMS/MS. Παράλληλα, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο μη στοχευμένης μεταβολομικής χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση UPLC-ESI-Orbitrap-HRMS, προκειμένου να διερευνηθούν τα αποτελέσματα της προσθήκης εκχυλίσματος C. spinosum στη διατροφή της Drosophila melanogaster. Ο χαρακτηρισμός των ενδογενών μεταβολιτών της D. melanogaster ακολουθήθηκε από την ανάλυση αρκετών δειγμάτων του είδους, των οποίων η διατροφή είχε προηγουμένως εμπλουτιστεί με αφέψημα C. spinosum σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε την ταυτοποίηση σημαντικών μεταβολιτών που με τη σειρά τους οδήγησαν στην εξερεύνηση ορισμένων βιολογικών οδών που επηρεάζονται από το εκχύλισμα του C. spinosum. Τέλος, πραγματοποιήθηκε επίσης ποσοτικοποίηση αμινοξέων στο ίδιο σύνολο δειγμάτων, με τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης atraq και μια πλατφόρμα UPLC-TripleTOF-SWATH-HRMS. Συνοψίζοντας, η τρέχουσα μελέτη υπογραμμίζει την αξία της χρήσης διαφορετικών βιολογικών πλατφορμών σε συνδυασμό με προηγμένες προσεγγίσεις μεταβολομικής βασισμένες στη φασματομετρία μάζας, για την αξιολόγηση της φαρμακολογικής δραστικότητας των ΦΠ ή των βιοδραστικών τροφίμων.