Φωταυγή σύμπλοκα χαλκού και αργύρου και μελέτη της αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής τους δράσης
Authors: Βαρνά Δέσποινα 
Published: April 2023

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας από πολλά ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα στα συνήθη αντικαρκινικά φάρμακα, όπως επίσης και πολλών βακτηριακών κυττάρων στα κοινά αντιοβιοτικά, έχει εντείνει, τα τελευταία χρόνια, τις ερευνητικές επιστημονικές προσπάθειες για τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικότερων χημειοθεραπευτικών μέσων. Μια από τις προσεγγίσεις της σύγχρονης έρευνας προς την κατεύθυνση αυτή περιλαμβάνει το σχεδιασμό, την ανάπτυξη και τη διερεύνηση της αντικαρκινικής και αντιβακτηριακής δραστικότητας συμπλόκων μεταβατικών μετάλλων. Με εξαίρεση τα σύμπλοκα της ομάδας του Pt, τα οποία έχουν μελετηθεί και χρησιμοποιούνται εκτενώς σε αντικαρκινικές θεραπείες, ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζουν τα σύμπλοκα των μετάλλων της Ομάδας 11. Από αυτά, τα σύμπλοκα του Cu και του Ag έχουν μελετηθεί σε μικρότερο βαθμό, γεγονός που, μερικώς, σχετίζεται με τη συνήθως χαμηλή κινητική τους σταθερότητα σε υδατικά βιολογικά μέσα, εξαιτίας της οποία πιθανώς να ελαττώνεται η βιοδραστικότητά τους. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός νέων ετεροληπτικών συμπλόκων του Cu(I) και του Ag(I) που φέρουν ως ligand ετεροκυκλικά θειοαμίδια σε συνδυασμό με φωσφίνες (π.χ. PPh3) ή διφωσφίνες (P^P) ή Ν-ετεροκυκλικά καρβένια (ΝΗC), καθώς και η μελέτη της in vitro αντιμικροβιακής και αντικαρκινικής τους δραστικότητας. Η χρήση των συγκεκριμένων ligand με δότες άτομα S, P και C έχει σκοπό την κινητική σταθεροποίηση των αντίστοιχων συμπλόκων τους, μέσω της ανάπτυξης ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων μαλακών βάσεων/οξέων Lewis με τα ιόντα των δύο μετάλλων, σε συνδυασμό με την επίδραση χηλικού φαινομένου για τις διφωσφίνες. Επίσης, τα ιδιαίτερα στερεοχημικά και ηλεκτρονικά χαρακτηριστικά των ligand (π.χ. μέγεθος ετεροκυκλικού δακτυλίου, υποκαταστάτες δακτυλίου) έχουν άμεση επίδραση στα δομικά και χημικά χαρακτηριστικά των αντίστοιχων συμπλόκων τους, επηρεάζοντας και τη βιολογική τους δραστικότητα με διαφορετικό τρόπο, επιτρέποντας τελικά, την τεκμηρίωση της σχέσης δομής-βιοδραστικότητας. Ο προσδιορισμός των κρυσταλλικών δομών των σύμπλοκων που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της κρυσταλλογραφίας περίθλασης ακτίνων Χ. Όλα τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν στη στερεά κατάσταση με φασματοσκοπία FTIR ενώ τα δεδομένα φασματοσκοπίας NMR και UV-vis απορρόφησης προτείνουν τη σταθερότητα των δομών των συμπλόκων σε διαλύματά τους για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Επίσης, από τη φασματοσκοπία φθορισμού σε διαλύματα των συμπλόκων, αποκαλύφθηκε ο φωταυγής χαρακτήρας τους, καθώς εμφανίζουν ταινίες εκπομπής με μέγιστα που καλύπτουν την περιοχή μηκών κύματος 400-450 nm. Τα φωτοφυσικά χαρακτηριστικά κρίθηκαν κατάλληλα για την περαιτέρω εφαρμογή των συμπλόκων στη βιοδιαγνωστική. Η πρώτη ομάδα συμπλόκων που παρουσιάζονται περιλαμβάνει ουδέτερα και κατιοντικά σύμπλοκα του Ag(I) με τα ΝΗ2- ή CF3- υποκατεστημένα ετεροκυκλικά θειοαμίδια πενταμελούς δακτυλίου 5-amino-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (atdztH) και 4-methyl-5-(trifluoromethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-thiol (mtftH) σε συνδυασμό με φωσφίνες ή διφωσφίνες. Μελέτες της in vitro αντιβακτηριακής δραστικότητας έναντι επιλεγμένων σειρών Gram (+) και Gram (–) βακτηρίων και της κυτταροτοξικής τους δραστικότητας έναντι επιλεγμένων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, αποδεικνύουν την ισχυρή επίδραση της ΝΗ2-υποκαταστάσης του ετεροκυκλικού θειοαμιδίου στην βιοδραστικότητα των συμπλόκων συγκριτικά με τα σύμπλοκα που φέρουν το CF3-υποκαταστεστημένο ετεροκυκλικό θειοαμίδιο. Στην προσπάθεια αποσαφήνισης του πιθανού μηχανισμού δράσης τους, τα σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς την in vitro αντιοξειδωτική τους δραστικότητα, την αλληλεπίδρασή τους με το calf-thymus (CT) DNA που αποτελεί κύριο βιομόριο-στόχο των αντιβακτηριακών και αντικαρκινικών ενώσεων, με τις αλβουμίνες ορού που λειτουργούν ως μεταφορείς φαρμάκων, ενώ επίσης διεξήχθησαν υπολογιστικές μελέτες μοριακής πρόσδεσης των ενώσεων στη DNA-γυράση του βακτηρίου E. coli και στον υποδοχέα 1 του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών FGFR-1 που υπέρκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα. Για λόγους σύγκρισης και περαιτέρω διερεύνησης της επίδρασης των λειτουργικών ομάδων των ετεροκυκλικών θειοαμιδίων, συντέθηκε μία ομάδα ανάλογων συμπλόκων του Ag(I) με το επίσης μικρού μεγέθους ετεροκυκλικό θειοαμίδιο με CH3-υποκατάσταση 5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (mtdztH). Οι in vitro αντιμικροβιακές μελέτες υπέδειξαν την αποτελεσματικότερη δραστικότητα των συμπλόκων του mtdztH ως προς με τα ανάλογα σύμπλοκα του Ag(I) με το atdztH, ενώ οι in vitro αντικαρκινικές μελέτες υπέδειξαν τη μικρότερη εκλεκτικότητα τους συγκρτικά με τα σύμπλοκα Ag(I) που φέρουν το atdztH, ως προς τα φυσιολογικά κύτταρα των πνευμόνων MRC-5.Επίσης, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και η μελέτη της in vitro αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής δραστικότητας μιας σειράς ετεροληπτικών κατιοντικών ή ουδέτερων συμπλόκων του Ag(I) με το ετεροκυκλικό θειοαμίδιο εξαμελούς δακτυλίου 4,6-dimethyl-2-pyrimidinethiol (dmp2SH) και φωσφίνες. Τα ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά των συμπλόκων επηρεάζουν την βιοδραστικότητά τους, με τα μονοπυρηνικά κατιοντικά ή ουδέτερα σύμπλοκα που έχουν ακόρεστη σφαίρα συναρμογής του μετάλλου να εμφανίζουν ισχυρή αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα, κυρίως ως προς τα Gram (+) βακτήρια που μελετήθηκαν. Επιπλέον, τα συγκεκριμένα σύμπλοκα εμφάνισαν ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα με εκλεκτικό χαρακτήρα ως προς τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας συγκριτικά με τα καρκινικά κύτταρα του μαστού και αξιοσημείωτα χαμηλή κυτταροτοξικότητα ως προς τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών. Η βιοδραστικότητα των ενώσεων μελετήθηκε σε συνδυασμό με τις εξαιρετικές φωτοφυσικές ιδιότητες εκπομπής τους, που προσεφέραν τη δυνατότητα της εφαρμογής σε βιοαπεικονιστικές μελέτες για τον προσδιορισμό της βιοκατανομής τους στα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Ιn vitro και in silico μελέτες αλληλεπίδρασης με βιομόρια στόχους, όπως CT DNA, ογκοπρωτεΐνη του Ε6 του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων, προσέφεραν χρήσιμες πληροφορίες για την προσέγγιση του πιθανού μηχανισμού δράσης των συμπλόκων. Στη συνέχεια, στοχεύοντας στη μελέτη της επίδρασης των διαφορετικών μεταλλικών ιόντων και των υποκαταστατών των ετεροκυκλικών θειοαμιδίων εξαμελούς δακτυλίου στη βιοδραστικότητα, συντέθηκαν ανάλογα με τα παραπάνω σύμπλοκα του Cu(I) και του Ag(I) αλλά με το 4,6-diamino-2-pyrimidinethiol (dap2SH) και διαφορετικές φωσφίνες. Τα νέα σύμπλοκα εμφάνισαν αποτελεσματική δραστικότητα ως προς τα Gram (–) βακτήρια συγκριτικά με τα λιγότερο αποτελεσματικά σύμπλοκα του Ag(Ι) με το dmp2SH, ωστόσο υπήρξαν μη εκλεκτικά ως προς τα καρκινικά και υγιή κύτταρα κατά την αξιολόγηση της in vitro αντικαρκινικής τους δραστικότητας. Τέλος, αντιοξειδωτικές μελέτες που ακολούθησαν έδειξαν ότι οι ενώσεις είναι ικανές να δεσμεύουν τις ελέυθερες ρίζες των DPPH, ABTS και να προκαλούν αναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου.Η σύνθεση μίας σειράς συμπλόκων του Cu(I) και του Ag(I) με το ετεροκυκλικό θειοαμίδιο 2-mercaptopyrimidine (pymtH) σε συνδυασμό με τη διφωσφίνη 4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene (xantphos) ή το Ν-ετεροκυκλικό καρβένιo 1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1H-imidazol-3-ium-2-ide (IPr) επίσης πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης των βοηθητικών ligand στην in vitro βιοδραστικότητά των αντίστοιχων συμπλόκων τους. Από τις in vitro αντιβακτηριακές μελέτες ως προς επιλεγμένα Gram (+) και Gram (‒) βακτήρια και την in vitro δοκιμασία αντικαρκινικής δραστικότητάς σε επιλεγμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές βρέθηκε ότι τα σύμπλοκα του Ag(I) και του Cu(I) που φέρουν το IPr υπερτερούν των δομικώς ανάλογων συμπλόκων με το xantphos ως προς την αποτελεσματικότητα τους, εμφανίζοντας σημαντικά χαμηλές τιμές συγκεντρώσεων αναστολής του βακτηριακού και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η δραστικότητα των συμπλόκων με το IPr εξετάστηκε περαιτέρω με κυτταρομετρία ροής (δοκιμασία απόπτωσης) ώστε να προσδιοριστεί ο μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου.Τέλος, τα τρία αποτελεσματικότερα ως προς την αντικαρκινική τους δραστικότητα, αλλά λιπόφιλα, σύμπλοκα του Ag(I) με το dmp2SH ενθυλακώθηκαν σε κατάλληλο αμφίφιλο συμπολυμερές methoxy-poly(ethylene glycol)-poly(caprolactone) (mPEG-PCL) με σκοπό την ανάπτυξη νανοσυστημάτων χορήγησής τους (drug delivery systems) που πρόκεται να βελτιώσουν τη διαλυτότητα και τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες τους σε βιολογικά μέσα. Η αξιοποίηση των ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων οξέος-βάσεως Lewis και των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συμπλόκων και του συμπολυμερούς οδήγησε στο σχηματισμό νανοσωματιδίων σφαιρικού σχήματος, εξαιρετικά υψηλών ποσοστών φόρτωσης φαρμάκου (13-15%) και υψηλών αποδόσεων ενθηλάκωσης (80-88%). Τα νανοσωματίδια των συμπλόκων διαφοροποιούνται ως προς τα μεγέθη (200-600 nm) ωστόσο εμφανίζουν παρόμοια προφίλ απελευθέρωσης των συμπλόκων δύο σταδίων, απότομης απελευθέρωσης (2 ημέρες) και παρατεταμένης απελευθέρωσης (15 ημέρες), σε ουδέτερο και όξινο pH. Τέλος, η in vitro κυτταροτοξικότητα των συμπλόκων φαίνεται να βελτιώνεται κατόπιν την ενθηλάκωσής τους στο mPEG-PCL συγκριτικά με την ελεύθερη μορφή τους, ως προς τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, υποδεικνύοντας ότι τα νέα συστήματα χορήγησης αυξάνουν την αντικαρκινική τους δραστικότητα με τιμές συγκεντρώσεων αναστολής της κυτταρικής βιωσιμότητα 8 φορές μικρότερες συγκριτικά με τις αντίστοιχες των ελεύθερων ενώσεων.