Αξιοποίηση οργανικών υγρών αποβλήτων με τη χρήση βιοδιυλιστηρίου μικροφυκών μέσω ετερότροφης και μικτότροφης καλλιέργειας για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας
Authors: Κορόζη Ευαγγελία 
Published: December 2023

Στη σημερινή εποχή η βιοτεχνολογία μικροφυκών έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής και βιομηχανικής κοινότητας ως πρωτογενής βιολογικός πόρος για την παραγωγή ενός μεγάλου εύρους προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (αντιοξειδωτικά, πρωτεΐνες, λιπαρά οξέα, βιταμίνες, φυσικές χρωστικές κλπ.), τα οποία βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων, ενέργειας, υγείας κλπ.. Τα μικροφύκη θεωρούνται ένας σημαντικός πυλώνας της κυκλικής βιοοικονομίας γιατί θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν στο πλαίσιο της διαχείρισης οργανικών αποβλήτων για τη παραγωγή βιομάζας υψηλής οικονομικής αξίας. Τυπικά, είναι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί αλλά μπορούν παράλληλα να αναπτυχθούν αξιοποιώντας οργανικό άνθρακα όπως, σάκχαρα, γλυκερόλη, οξικό οξύ κλπ. Παρόλο που στην πλειονότητα τους είναι αυτότροφοι μικροοργανισμοί, βιομηχανικά μπορούν αξιοποιηθούν σε ετερότροφα και μικτότροφα συστήματα καλλιεργειών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως κύριο αντικείμενο την αξιοποίηση βιομηχανικής γλυκερόλης (παραπροϊόν βιοντίζελ) και τη βιομετατροπή της σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου μικροφυκών. Η αξιοποίηση της ακατέργαστης γλυκερόλης έγινε μέσω βιοδοκιμών με τις οποίες αξιολογήθηκαν διάφορα είδη μικροφυκών γλυκού νερού: Chlorella vulgaris, Auxenochlorella protothecoides, Scenedesmus obliquus, Scenedesmus quadricauda καθώς και ένα θαλάσσιο μικροφύκος το Tetraselmis chuii. Όλες οι πειραματικές δοκιμές είχαν ως στόχο τη διερεύνηση της δυναμικότητας του κάθε είδους μικροφύκους σε περιβάλλοντα ανάπτυξης με κύρια πηγή άνθρακα την ακατέργαστη γλυκερόλη σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, το βιοχημικό προφίλ των μικροφυκών (περιεκτικότητα σε πρωτογενείς και δευτερογενείς μεταβολίτες) επηρεάζεται από τις καλλιεργητικές παραμέτρους που επιλέγονται κάθε φορά και μπορεί συνεπώς να επιτευχθεί αύξηση της συγκέντρωσης ορισμένων μεταβολιτών στόχων (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, λιπίδια και χρωστικές) μεταβάλλοντας την ένταση και την ποιότητα (μήκος κύματος) του φωτός που παρέχεται στην καλλιέργεια ή με την απουσία συγκεκριμένων θρεπτικών στοιχείων (π.χ. το άζωτο) από το υπόστρωμα. Η παρούσα μελέτη εστίασε στη διερεύνηση αξιοποίησης των παραπάνω μικροφυκών τόσο μέσω ετερότροφων, όσο και μικτότροφων συστημάτων καλλιέργειας, με δοκιμές σε διαλείποντος έργου και ημιδιαλείποντος έργου συστήματα καλλιέργειας και ακολούθως σε συνεχή συστήματα (με τη χρήση βιοαντιδραστήρα) για πιο ασφαλή συμπεράσματα ως προς την παραγωγικότητα σε βιομηχανικό επίπεδο. Κατά τις πειραματικές δοκιμές που έγιναν χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης με σκοπό τη μελέτη της επίδρασής της στον μεταβολισμό των μικροφυκών. Δοκιμάστηκαν επίσης, διαφορετικές μονοχρωματικές πηγές φωτός σε μικτότροφα συστήματα καλλιέργειας, τα οποία όπως αποδείχθηκε ενεργοποιούν διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια και οδηγούν σε παραγωγή διαφορετικών μεταβολικών προϊόντων. Μελετήθηκε επίσης, η επίδραση του φωτισμού στον φαινότυπο των υπό εξέταση μικροφυκών., καθώς και της έλλειψης αζώτου από το θρεπτικό μέσο στην παραγωγικότητα λιπιδίων ορισμένων ειδών μικροφυκών. Στο ετερότροφο σύστημα καλλιέργειας παρατηρήθηκε η υψηλότερη παραγωγή σε βιομάζα, (18.4 g/L ξηρής βιομάζας), καθώς και η υψηλότερη απόδοση βιομάζας ως προς την κατανάλωση της ακατέργαστης γλυκερόλης (Yx/s=0.23g/g), κατά την ανάπτυξη του A. protothecoides, σε υπόστρωμα με 80 g/L συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης. Ετερότροφα, σε ικανοποιητικό βαθμό, αλλά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης αναπτύχθηκαν και τα στελέχη C. vulgaris (με μέγιστη παραγωγή βιομάζας ίση με 0.79 g/L και με απόδοση Yx/s=0.07g/g) ) και S. quadricauda (με 1.47 g/L παραχθείσα βιομάζα, Yx/s=0.16 σε 10 g/L αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο υπόστρωμα). Το S. obliquus αποκλείστηκε από περαιτέρω δοκιμές λόγω χαμηλής ποσότητας παραχθείσας βιομάζα και το T. chuii λόγω αδυναμίας ανάπτυξης με πηγή άνθρακα την ακατέργαστη γλυκερόλη στο υπόστρωμα. Η απόδοση σε βιομάζα, ο μέγιστος ρυθμός αύξησης και η συσσώρευση των λιπιδίων ήταν μεγαλύτερη κατά την μικτότροφη συγκριτικά με την ετερότροφη ανάπτυξη για τα στελέχη S. quadricauda και C. vulgaris, σε αντίθεση με το A. protothecoides που έδωσε καλύτερα αποτελέσματα κατά την ετερότροφη ανάπτυξη. Σε μικτοτροφικές συνθήκες, για 10 g/L αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στο υπόστρωμα η παραγωγή βιομάζας του S. quadricauda ήταν υψηλότερη (1.86 g/L) στο πορτοκαλί φως. Το C. vulgaris έδωσε την μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας (1.68 g/L) στο μπλε φως σε 20 g/L αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στο υπόστρωμα. Το μήκος κύματος του φωτός επηρέασε σημαντικά τη μορφολογία και τον φαινότυπο των κυττάρων, τον ρυθμό αύξησης και την παραγωγή βιομάζας και μεταβολιτών και για τα δύο μικροφύκη, δυνητικά ρυθμίζοντας τη δραστηριότητα διαφορετικών μεταβολικών οδών. Τα δεδομένα που προέκυψαν κατά τις δοκιμές σε ημιδιαλείποντος έργου συστήματα καλλιέργειας έδωσαν ασφαλή συμπεράσματα για την επίδραση της πηγής αζώτου στην ανάπτυξη των μικροφυκών. Η διαθεσιμότητα αζώτου ασκεί ισχυρή επίδραση στη βιοχημική σύνθεση των μικροφυκών. Πράγματι, υπό συνθήκες επάρκειας αζώτου στο θρεπτικό μέσο υπήρχε μια τάση για συσσώρευση πρωτεϊνών, ενώ υπό συνθήκες πενίας αζώτου η βιομάζα ήταν πλούσια σε λιπίδια. Το σύστημα συνεχούς καλλιέργειας ήταν μια αποτελεσματική μέθοδος για τη μελέτη της κινητικής αύξησης, της κατανάλωσης του υποστρώματος και της παραγωγής μεταβολιτών υψηλής αξίας του A. protothecoides σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης (30 g/L και 50 g/L) και του C. vulgaris σε συγκεντρώσεις (20g/L και 30 g/L), υπό ετερότροφες και μικτότροφες συνθήκες. Για το A. protothecoides, η αυξημένη αρχική συγκέντρωση ακατέργαστης γλυκερόλης στην ετερότροφη καλλιέργεια προκάλεσε μειωμένη παραγωγικότητα βιομάζας και αυξημένη συγκέντρωση εναπομένουσας γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο που δεν καταναλώθηκε, ενεργώντας πιθανότατα ως περιοριστικός για την αύξηση παράγοντας. Το A. protothecoides, σε αντίθεση με άλλα είδη Chlorella, εμφάνισε καλύτερες παραμέτρους ανάπτυξης σε ετερότροφες συνθήκες σε σύγκριση με τις μικτότροφες, όπως προσδιορίστηκε από την υψηλότερη παραγωγικότητα του συστήματος (Pmax), τον υψηλότερο ρυθμό αύξησης,, πράγμα που σημαίνει ότι το συγκεκριμένο μικροφύκος μπορεί να αναπτυχθεί καλύτερα και γρηγορότερα, αξιοποιώντας πιο αποτελεσματικά το υπόστρωμα. Φαίνεται λοιπόν ότι το A. protothecoides αποδίδει καλύτερα υπό ετερότροφες συνθήκες. Η ετεροτροφία είχε επίσης θετικό αντίκτυπο στην παραγωγή λιπιδίων, πρωτεϊνών και υδατανθράκων, αλλά όχι σημαντική επίδραση στα προφίλ λιπαρών και αμινοξέων. Αντίστοιχα για το C. vulgaris το συμπέρασμα που προέκυψε, ήταν ότι τα διαφορετικά μήκη φωτός οδηγούν σε ενεργοποίηση διαφορετικών μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης και συσσώρευσης διαφορετικών μεταβολικών προϊόντων, πράγμα που δεν είχε μελετηθεί επαρκώς έως τώρα και χρίζει περαιτέρω διερεύνησης σε μελλοντικές ερευνητικές δραστηριότητες με σκοπό διερεύνηση του μεταβολικού φαινοτύπου το μικροοργανισμού και πως αντιδρά στις διαφορετικές καλλιεργητικές στρατηγικές. Τέλος, κατά την ανάπτυξη του μικροφύκους σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας, τόσο υπό ετερότροφες όσο και υπό μικτότροφες συνθήκες, διαπιστώθηκε ότι μικτότροφα, η αύξηση και η παραγωγή μεταβολιτών ήταν πολύ υψηλότερη συγκριτικά με την ετερότροφη ανάπτυξη, ενώ και η ακατέργαστη γλυκερόλη αφομοιώθηκε πιο αποδοτικά. Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική έρευνα έδωσε νέες γνώσεις σχετικά με την εφαρμογή των μικροφυκών στην αξιοποίηση ακατέργαστης γλυκερόλης, εστιάζοντας στην παραγωγικότητα βιομάζας, τη βιοσύνθεση μεταβολιτών καθώς και το βιοχημικό προφίλ της βιομάζας, ενώ διερευνήθηκαν οι καλλιεργητικές παράμετροι, ώστε να προσδιοριστούν οι άριστες συνθήκες γι’ αυτό το σκοπό.