Whole genome sequencing of the lactic acid bacteria lactobacillus zymae, lactobacillus acidipiscis and lactobacillus rennini
Authors: Κάζου Μαρία 
Published: September 2021

Τα οξυγαλακτικά βακτήρια είναι μία από τις πιο σημαντικές ομάδες βακτηρίων για τη βιομηχανία. Τα βακτήρια αυτά χρησιμοποιούνται στην παραγωγή τροφίμων και ζωοτροφών,στη βελτίωση της υγείας του ανθρώπου και των ζώων, στην παραγωγή μακρομορίων,ενζύμων και διαφόρων μεταβολιτών. Τα τελευταία χρόνια, η αλληλούχιση όλο και περισσότερων οξυγαλακτικών βακτηρίων καθώς και η ανάλυσή τους με εργαλεία βιοπληροφορικής μας έχει προσφέρει πρωτοφανείς ευκαιρίες για να ανακαλύψουμε σημαντικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων αυτών. Η αλληλούχιση ολόκληρων γονιδιωμάτων μπορούν να παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με το τεχνολογικό και το προβιοτικό δυναμικό ενός στελέχους. Επιπλέον, η γονιδιωματική ανάλυση ενός στελέχους ή η συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ φυλογενετικά κοντινών (ή μη) στελεχών/ειδών μπορεί να προσφέρει σημαντικές γνώσεις, όπως η βακτηριακή ποικιλομορφία και η προσαρμογή σε ποικίλους οικολογικούς θώκους. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, τρία "άγρια" στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων, ο Lactobacillus zymae ACA-DC 3411, ο Lactobacillus rennini ACADC 565 και ο Lactobacillus acidipiscis ACA-DC 1533, τα οποία έχουν απομονωθεί από παραδοσιακά Ελληνικά προϊόντα ζύμωσης και συγκεκριμένα από προζύμι, Μάνα Κοπανιστή και Κοπανιστή, αντιστοίχως, αλληλουχήθηκαν με τεχνικές υψηλής απόδοσης και τα γονιδιώματά τους σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας πληθώρα σύγχρονων εργαλείων βιοπληροφορικής. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτές είναι τα πρώτες ολόκληρες χρωμοσωμικές αλληλουχίες για κάθε ένα από τα αντίστοιχα είδη, καθώς οι υπόλοιπες αλληλουχίες που βρίσκονται στις διάφορες βάσεις δεδομένων είναι μερικώς αλληλουχιμένες. Η ανάλυση της χρωμοσωμικής αλληλουχίας του στελέχους L. zymae ACA-DC 3411 μεγέθους 2,7 Mbp αναγνώρισε ένα σύστημα περιορισμού-τροποποίησης (RM) τύπου Ι, 19 γονιδιωματικές νήσους που περιείχαν συνολικά 265 γονίδια τα οποία πιθανότατα να προήλθαν από οριζόντια μεταφορά, τέσσερις ημιτελείς και μία υπο αμφισβήτηση αλληλουχίες προφάγων και έξι επιβεβαιωμένα και έξι υπο αμφισβήτηση συστήματα που ονομάζονται συγκεντρωμένες τακτικές παρεμβαλλόμενες σύντομες παλινδρομικές επαναλήψεις (CRISPR). Επιπλέον, η λειτουργική ταξινόμηση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες στις διάφορες ορθόλογες ομάδες γονιδίων (COG) έδειξε ότι 1.930 γονίδια(περίπου 80%) εντοπίστηκαν σε τουλάχιστον μία κατηγορία COG. Η κατηγορία COG με τα περισσότερα γονίδια (14%) σχετίζεται με την αντιγραφή, τον ανασυνδυασμό και την επιδιόρθωση του DNA.H ανάλυση της χρωμοσωμικής αλληλουχίας του L. rennini ACA-DC 565 μεγέθους 2,4Mbp αναγνώρισε αρκετές πρωτεΐνες τοξίνης-αντιτοξίνης, ένα σύστημα RM τύπου II και πέντε συστήματα CRISPR με τις σχετικές πρωτεΐνες cas. Επιπλέον, προσδιορίστηκε μια ημιτελής αλληλουχία προφάγου μήκους 17,1 Kbp που περιείχε οκτώ γονίδια φάγων, επτά γονίδια βακτηρίων και δύο γονίδια με υποθετική λειτουργία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της κατανομής των γονιδίων στις διάφορες λειτουργικές κατηγορίες COG, 1.900 γονίδια (περίπου87,7%) κατατάχθηκαν κάποια κατηγορία COG, ενώ η κατηγορία COG με τα περισσότερα γονίδια (9,33%) σχετίζεται με τη μεταφορά και το μεταβολισμό των υδατανθράκων.Ενώ για τα είδη L. zymae και L. rennini, υπήρχε μόνο ένα γονιδίωμα μερικώς αλληλουχημένο στο Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών ο L. zymae DSM 19395Tκαι ο L. rennini DSM 20253T, αντίστοιχα, στην περίπτωση του L. acidipiscis υπήρχαν τέσσερα γονιδιώματα μερικώς αλληλουχημένα για τα στελέχη KCTC 13900, DSM 15353, JCM 10692Tκαι DSM 15836T. Παρόλα αυτά πρέπει να σημειωθεί ότι τα στελέχη KCTC 13900 και DSM 15353 είναι κλώνοι, όπως συμβαίνει και με τα στελέχη στελέχη JCM 10692T και DSM15836T το οποίο φάνηκε σε θερμικό χάρτη που υπολογίζει το ποσοστό ομοιότητας μεταξύ 2 αλληλουχιών. Λόγω του ότι η ανάγκη για την εύρεση διαφορών μεταξύ στελεχών γίνεται όλο και πιο απαραίτητη, κάναμε συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ των τριών στελεχών του L. acidipiscis (ACA-DC 1533, KCTC 13900 και JCM 10692T). Με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης του παν-γονιδιώματος, του κοινού γονιδιώματος μεταξύ των στελεχών, αλλά και των μοναδικών γονιδίων κάθε στελέχους, τα τρία στελέχη του L. acidipiscis παρουσίασαν υψηλό βαθμό συντήρησης σε επίπεδο γονιδιώματος. Επιπλέον, φάνηκε ότι τα στελέχη ACADC1533 και JCM 10692T δεν διαθέτουν συστήματα CRISPR αλλά έχουν δύο παρόμοιες περιοχές προφάγων στα γονιδιώματά τους παρόλο που έχουν απομονωθεί από διαφορετικά οικοσυστήματα, τα οποία είναι η Κοπανιστή και ζυμούμενο ψάρι, αντίστοιχα. Αντίθετα, η ανάλυση των συστημάτων CRISPR του στελέχους KCTC 13900 έδειξε ότι το βακτήριο έχει αποκτήσει ανοσία προφάγους που βρέθηκαν στα άλλα δύο στελέχη του L. acidipiscis. Παρόλα αυτά, μια αλληλουχία προφάγου που δεν βρέθηκε στα στελέχη ACA-DC 1533 και JCM10692T βρέθηκε στο στέλεχος KCTC 13900. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την ύπαρξη γενεαλογικού χαρακτήρα εντός του είδους. Από τα παραπάνω μοτίβα παρουσίας/απουσίας γενετικών χαρακτηριστικών στα τρία γονιδιώματα, φαίνεται ότι τα στελέχη ACA-DC 1533 καιJCM 10692T είναι περισσότερο κοντά παρόλο που έχουν απομονωθεί από διαφορετικάοικοσυστήματα.Δεδομένου ότι ο L. acidipiscis ανήκει στον κλάδο του Lactobacillus salivarius, ο οποίος αποτελείται κυρίως από συμβιωτικά είδη, πραγματοποιήθηκε συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ επιλεγμένων στελεχών του κλάδου για να διερευνηθεί το επίπεδο ποικιλομορφίας μεταξύ των γονιδιωμάτων. Η συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ τωνL. acidipiscis ACA-DC 1533, L. salivarius UCC118 και Lactobacillus ruminis ATCC 27782 αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στον αριθμό των πρωτεϊνών που σχετίζονται με μεταβολισμό των υδατανθράκων, των πρωτεολυτικών ενζύμων, των μεταφορέων, των αλληλουχιών εισαγωγής και των ρυθμιστικών πρωτεινών. Στη συνέχεια διερευνήθηκε το προβιοτικό δυναμικό του L. acidipiscis ACA-DC 1533 σε σύγκριση με τον προβιοτικό L.salivarius UCC118, ωστόσο δεν βρέθηκαν προφανή γονιδιωματικά χαρακτηριστικά που να υποστηρίζουν ένα προβιοτικό δυναμικό για το στέλεχος ACA-DC 1533. Επιπλέον, η εύρεση μεταφορέων γλυκίνης- βεταΐνης στο χρωμόσωμα του ACA-DC 1533 θα μπορούσε να εξηγήσει την ικανότητα του στελέχους / είδους να αναπτυχθεί σε ζυμούμενα τρόφιμα με υψηλές συγκεντρώσεις άλατος. Τέλος, εντοπίστηκαν αρκετά γονίδια στο γονιδίωμα του ACA-DC 1533 που κωδικοποιούν ένζυμα κλειδιά τα οποία εμπλέκονται σε μεταβολικά μονοπάτια (κυρίως κατά τον καταβολισμό των αμινοξέων) από τα οποία παράγονται πτητικές ενώσεις,συμβάλλοντας με αυτόν το τρόπο στην ιδιαίτερη πικάντικη γεύση της Κοπανιστής.