Αξιολόγηση ανοσορυθμιστικών, αντιυπερτασικών και αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων γαλακτοκομικών υποπροϊόντων
Authors: Νταλάκα Ελένη 
Published: November 2023

Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η συλλογή και επεξεργασία όλων εκείνων των δεδομένων που συντελούν στην εύρεση βιολειτουργικών ιδιοτήτων γαλακτοκομικών υποπροϊόντων με έμφαση στις ανοσορυθμιστικές, αντιυπερτασικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του τυρογάλακτος και του όξινου ορού γιαούρτης (ΟΟΓ). Το τυρόγαλα είναι υποπροϊόν της τυροκόμησης, ενώ ο ΟΟΓ προέρχεται κατά την παρασκευή στραγγιστής γιαούρτης. Οι σημαντικότερες διαφορές τους είναι ότι ο ΟΟΓ έχει χαμηλότερο pH και μικρότερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες σε σχέση με το τυρόγαλα. Η ραγδαία αύξηση του παγκόσμιου πληθυσμού, η ανάγκη του ανθρώπου για στροφή σε λειτουργικά τρόφιμα σε συνδυασμό με την εξέλιξη της επιστήμης και της τεχνολογίας οδήγησε στην έρευνα για την αξιοποίηση των γαλακτοκομικών υποπροϊόντων, συμπεριλαμβανομένου του τυρογάλακτος και του ΟΟΓ. Η συνεχής αύξηση της παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων οδηγεί σε τεράστιες ποσότητες υποπροϊόντων, για αυτό κρίνεται επιτακτική ανάγκη της αξιοποίησής τους με νέους τρόπους για την παραγωγή καινοτόμων προϊόντων με ποικίλες εφαρμογές. Αρχικά, συλλέχθηκαν γαλακτοκομικά υποπροϊόντα από αγελαδινό, πρόβειο, αίγειο και αιγοπρόβειο (μόνο για το τυρόγαλα) γάλα από διάφορες βιομηχανίες παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων και μικρά τυροκομεία της ηπειρωτικής Ελλάδας κατά τη διάρκεια του έτους. Ακολούθησε λυοφιλίωση των δειγμάτων και in vitro προσομοίωση της γαστρεντερικής πέψης με ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο στατικό μοντέλο. Έπειτα έγινε χρήση μεμβρανών διήθησης μοριακού βάρους αποκοπής 10 kDa και 3 kDa για το διαχωρισμό των πεπτιδίων. Για τη μελέτη των ανοσορυθμιστικών ιδιοτήτων (πρώτο μέρος της πειραματικής μελέτης) χρησιμοποιήθηκαν η ανθρώπινη κυτταρική σειρά μονοκύτταρων/ μακροφάγων THP-1 (με και χωρίς πρόκληση LPS) και η κυτταρική σειρά μακροφάγων μυός RAW 264.7 (μόνο με πρόκληση LPS). Για τη διερεύνηση της ανοσιακής ρύθμισης, μελετήθηκε η επίδραση του κλάσματος της πέψης αποτελούμενο από πεπτίδια μοριακού βάρους <3 kDa (D-P3) στη γονιδιακή έκφραση κυτοκινών, μεταγραφικών παραγόντων και άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ανοσιακή απόκριση καθώς και η αναστολή παραγωγής του νιτρικού οξέος (NO). Παρατηρήθηκαν αρκετές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και ενδεικτικά αναφέρονται μερικές από αυτές. Εντοπίστηκαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης mRNA των IL1B και ICAM1 σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε πρόβειο και αιγοπρόβειο τυρόγαλα και μειωμένα επίπεδα έκφρασης mRNA των IL6 και TLR4 μόνο για το πρόβειο τυρόγαλα. Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής έκφρασης CXCL8 για αγελαδινό, πρόβειο και αιγοπρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με το BL-D-P3. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων mRNA του STAT2, NFE2L2, HMOX, SOD και CAT στα THP-1 κύτταρα που εκτέθηκαν σε τυρόγαλα σε σχέση με τα BL-D-P3. Μετά την έκθεση των κυττάρων σε LPS, εντοπίστηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση των CXCL8 και CAT για το τυρόγαλα ανεξαρτήτως ζωικής προέλευσης σε σχέση με τα κύτταρα που είχαν εκτεθεί στο BL-D-P3, ενώ παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης του IRF5. Τα επίπεδα TNF και STAT1 ήταν στατιστικώς υψηλά μόνο για το πρόβειο τυρόγαλα και η γονιδιακή έκφραση των ICAM1, STAT2, MYD88 και HMOX1 σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε αγελαδινό τυρόγαλα. Περαιτέρω, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης των IL1B, TGFB, LST1, NFKB1, STAT2, MYD88, CXCL8 και TLR2 στα THP-1 μακροφάγα που εκτέθηκαν σε πρόβειο ΟΟΓ. Μετά την έκθεση των κυττάρων σε LPS, εντοπίστηκε μείωση των TLR4 και IRF5 για τον πρόβειο ΟΟΓ, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του IL10 και STAT1 για αγελαδινό και αίγειο ΟΟΓ. Αναφορικά με το αντιφλεγμονώδες δυναμικό που μελετήθηκε σε RAW 264.7 ενεργοποιημένα κύτταρα παρουσία D-P3 τυρογάλακτος παρουσιάστηκε μείωση της γονιδιακής έκφρασης του Nos2 για το αίγειο και πρόβειο τυρόγαλα σε σύγκριση με το BL-D-P3. Η μείωση αυτή μεταφράστηκε σε μείωση παραγωγής NO μόνο στο πρόβειο τυρόγαλα. Αντίστοιχα, παρατηρήθηκε μειωμένη παραγωγή NO για το πρόβειο και αίγειο ΟΟΓ τόσο με το BL-D-P3 όσο και με το αγελαδινό ΟΟΓ, χωρίς ωστόσο να υπάρχει ανάλογη μείωση των επιπέδων mRNA του Nos2. Για τη μελέτη των αντιυπερτασικών ιδιοτήτων (δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας), προσδιορίστηκε η ACE ανασταλτική δράση του τυρογάλακτος και του ΟΟΓ, πριν και μετά την in vitro πέψη για το κλάσμα D-P3 και το κλάσμα της πέψης αποτελούμενο από πεπτίδια μοριακού βάρους <10 kDa (D-P10), καθώς έχει αναφερθεί πως η αντιυπερτασική δράση συνδέεται με τα χαμηλού μοριακού βάρους πεπτίδια που προκύπτουν από τη γαστρεντερική πέψη. Η αναστολή του ACE μετά την in vitro πέψη ήταν σημαντικά υψηλότερη τόσο για το D-P10 όσο και για το D-P3 σε σύγκριση με τα αρχικά γαλακτοκομικά υποπροϊόντα. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε αυξημένη ανασταλτική δράση του ACE στο πρόβειο τυρόγαλα για D-P10 και D-P3 σε σχέση με το αίγειο και αγελαδινό. Τα δείγματα τυρογάλακτος που συλλέχθηκαν από τη Δυτική Ελλάδα και Θεσσαλία είχαν καλύτερη αντιυπερτασική δράση για τα D-P3 σε σύγκριση με τις άλλες περιφέρειες. Ο παράγοντας της εποχικότητας δεν επηρέασε την ανασταλτική δράση του ACE για το τυρόγαλα, ενώ για τον ΟΟΓ παρατηρήθηκε βελτίωση της δράσης αυτής μετά την in vitro πέψη, για το κλάσμα D-P10, στα δείγματα που συλλέχθηκαν τους καλοκαιρινούς μήνες.Για τη μελέτη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων (τρίτο μέρος της πειραματικής διαδικασίας), προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική δράση των γαλακτοκομικών υποπροϊόντων με τις βιοχημικές μεθόδους ORAC, ABTS, FRAP και P-FRAP πριν και μετά την in vitro πέψη καθώς και του κλάσματος D-P3. Συνολικά, μετά την in vitro πέψη παρατηρήθηκε αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα κατά 3-10 φορές, ανάλογα της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε. Εντοπίστηκε αύξηση πριν την πέψη, με τη μέθοδο ORAC για το αγελαδινό τυρόγαλα, με αυτήν τη διαφορά να απουσιάζει μετά την πέψη. Αντιθέτως, μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση παρατηρήθηκε στο πρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με το αγελαδινό με τη μέθοδο ABTS πριν και μετά την πέψη. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξημένη αντιοξειδωτική δράση για τον πρόβειο ΟΟΓ μετά την πέψη με τη μέθοδο ORAC. Με την ίδια μέθοδο, εντοπίστηκαν διαφορές για το κλάσμα D-P3 ως προς την εποχικότητα, με τα καλοκαιρινά να εμφανίζουν καλύτερη αντιοξειδωτική δράση. Όσον αφορά τη γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων, τα δείγματα που συλλέχθηκαν από την Πελοπόννησο και τη Στερεά Ελλάδα έδειξαν αυξημένη αντιοξειδωτική δράση πριν την πέψη με την ABTS μέθοδο. Τέλος, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική δράση του D-P3 σε κυτταρικό επίπεδο με τη χρήση της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς του παχέος εντέρου HT-29 παρουσία H2O2. Παρατηρήθηκε αυξημένη αναστολή των ROS για το πρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με τα κύτταρα που είχαν εκτεθεί σε H2O2, καθώς επίσης παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα ROS για τα δείγματα που συλλέχθηκαν από τη Μακεδονία και Θράκη. Τέλος, τα δείγματα τυρογάλακτος κατά τους καλοκαιρινούς μήνες έδειξαν μειωμένη παραγωγή ROS. Αναφορικά με τον ΟΟΓ, το πρόβειο D-P3 είχε αυξημένη αναστολή ROS.Συμπερασματικά, το τυρόγαλα και ο όξινος ορός γιαούρτης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, θα μπορούσε να αξιοποιηθεί σε μεγαλύτερο βαθμό στη βιομηχανία παραγωγής τροφίμων και ζωοτροφών λόγω των ωφέλιμων δράσεων που επέδειξαν. Συνολικά, τα αποτελέσματα στοιχειοθετούν πως τα πρόβεια γαλακτοκομικά υποπροϊόντα είχαν καλύτερο προφίλ από τα γαλακτοκομικά υποπροϊόντα με αγελαδινή ή αίγεια προέλευση γάλακτος ως προς τις αντιυπερτασικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες ενώ ανέδειξαν και πιο ισχυρή ανοσορυθμιστική δράση. Επιπρόσθετα, η επιβεβαίωση των παρατηρούμενων διαφορών θα μπορούσε να επιτευχθεί με in vivo μελέτες σε ζώα ή κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους. Περαιτέρω έρευνα κρίνεται επίσης αναγκαία για να προσδιοριστούν οι αλληλουχίες των πεπτιδίων από γαλακτοκομικά υποπροϊόντα με πιθανή ανοσορυθμιστική, αντιυπερτασική, αντιοξειδωτική δράση ή πλειοτροπική δράση in vivo.