Επιδημιολογική μελέτη και γενετική διερεύνηση της μικροβιακής αντοχής της escherichia coli στις κινολόνες
Authors: Βασιλάκη Όλγα 
Published: January 2014

Ο έλεγχος των νοσοκομειακών λοιμώξεων που προκαλούνται από Gram αρνητικά βακτηρίδια απασχολεί τα τελευταία χρόνια όλες τις ανεπτυγμένες χώρες ιδιαίτερα μετά την εισαγωγή νέων, ευρέως φάσματος αντιβιοτικών. Από τα βακτήρια αυτά, η E. coli (κολοβακτηρίδιο), που αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου, πρωταγωνιστεί στις λοιμώξεις των νοσηλευόμενων στα νοσοκομεία όσο και σε ασθενείς της κοινότητας. Είναι ένα κοινό βακτηρίδιο που προκαλεί κυρίως λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος, ωστόσο ευθύνεται και για πολλές άλλες νόσους από όλα τα συστήματα ακόμη και με βαρύτερη κλινική εικόνα ιδιαίτερα σε βρέφη και ηλικιωμένους ή εξασθενημένα άτομα. Οι κινολόνες είναι χημειοθεραπευτικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες ευρέως φάσματος με καλή φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική. Πλεονεκτούν μεταξύ των αντιμικροβιακών παραγόντων σε κλινική χρήση, διότι αναστέλλουν ταχύτητα τη σύνθεση του μικροβιακού DNA, με αποτέλεσμα το θάνατο του βακτηριακού κυττάρου σε βραχύ χρόνο. Διατηρούν την καλή δραστικότητα έναντι των Gram αρνητικών και άτυπων βακτηρίων, αλλά το φάσμα τους διευρύνεται με κάλυψη και των Gram θετικών. Οι κινολόνες χορηγούνται πολύ συχνά για τη θεραπεία διαφόρων λοιμώξεων από E. coli. Η καλή δράση τους τόσο στην αντιμετώπιση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων, όσο και σε λοιμώξεις σε ασθενείς της κοινότητας οδήγησε στην υπέρμετρη συνταγογράφηση και κατάχρηση. Αυτά τα υψηλά επίπεδα χρήσης, οδήγησαν στην ταχεία ανάπτυξη αντοχής στις κινολόνες, ακόμη και στην E. coli που θεωρείται ευαίσθητο βακτήριο. Ο πιο κοινός μηχανισμός αντοχής της E. coli στις κινολόνες είναι οι μεταλλάξεις στα γονίδια αντοχής gyrA και parC που κωδικοποιούν τη DNA γυράση και τη DNA τοποϊσομεράση IV αντίστοιχα. Ένας δεύτερος μηχανισμός είναι η ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων qnr που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη qnr, η οποία προστατεύει την DNA γυράση από τη δράση των κινολονών. Τέλος, η μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης του βακτηριακού κυττάρου και η απορρύθμιση των αντλιών ενεργητικής εκροής είναι μηχανισμοί που ευθύνονται σπανιότερα. Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό την ανεύρεση και καταγραφή ανθεκτικών στη σιπροφλοξασίνη στελεχών E. coli καθώς και τη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών αντοχής. Επιπλέον με την εφαρμογή των μοριακών μεθόδων τυποποίησης έγινε μοριακή επιδημιολογική ανάλυση των ανθεκτικών στελεχών, ώστε να προσδιοριστεί πιθανή κλωνική συγγένεια μεταξύ αυτών. Τέλος, έγινε έλεγχος επίσης της παρουσίας ESBLs στα στελέχη της μελέτης λόγω της συχνής συνύπαρξης πλασμιδιακών γονιδίων αντοχής στις κινολόνες με εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs). Για το λόγο αυτό εξετάσθηκαν 114 στελέχη E. coli τα οποία απομονώθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύθηκαν ή προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία σε τέσσερα ελληνικά Νοσοκομεία Βορείου και Κεντρικής Ελλάδας κατά τη χρονική διάρκεια περιόδου Απρίλιος 2005- Ιούλιος 2007. Από τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) της σιπροφλοξασίνης σε όλα τα απομονωθέντα κλινικά στελέχη προέκυψε ότι τα 75 (65,7%) παρουσίασαν υψηλού βαθμού αντοχή στη σιπροφλοξασίνη με MIC ≥ 32 μg/ml. Τα 114 ανθεκτικά στη σιπροφλοξασίνη στελέχη της E. coli ελέχθηκαν επιπλέον για την αντοχή τους σε σειρά αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των λοιμώξεων που οφείλονται στην E. coli. Ιδιαίτερα υψηλά ήταν τα ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη 90,3%, ενώ σημαντικά ήταν και τα ποσοστά αντοχής 47,3% στην αμοξυκιλλίνη/κλαβουλανικό και 38,5% στην κεφαμανδόλη. Επίσης ο φαινοτυπικός έλεγχος με E-test για την παραγωγή ESBL έδειξε ότι το 12,2% των στελεχών της μελέτης παράγει β-λακταμάσες. Με τη δοκιμασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) έγινε ανίχνευση και ταυτοποίηση τόσο των χρωμοσωμικών γονιδίων gyrA και parC, όσο και των πλασμιδιακών γονιδίων αντοχής qnr. Στη συνέχεια με την αλληλούχιση και σύγκριση των προϊόντων της PCR με πρότυπα στελέχη που είναι καταχωρημένα στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών, αποδείχθηκε ότι η αντοχή στη σιπροφλοξασίνη σε όλα τα στελέχη οφειλόταν σε μεταλλάξεις των γονιδίων αντοχής gyrA και parC. Επίσης με την αλληλούχιση των προϊόντων PCR, αποδείχθηκε ότι η αντοχή στη σιπροφλοξασίνη, στα 11 από τα 114 στελέχη (9,64%) οφειλόταν στην ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων αντοχής qnrS1. Ο έλεγχος της δυνατότητας μεταβίβασης της αντοχής στη σιπροφλοξασίνη στα θετικά qnr στελέχη που έγινε με τη μέθοδο της σύζευξης, είχε ποσοστό επιτυχίας (45%). Μετά από φαινοτυπικό έλεγχο αναστολής της δράσης των αντλιών εκροής, η υπερέκφραση των αντλιών δε θεωρήθηκε υπεύθυνος μηχανισμός αντοχής στις κινολόνες. Η συγγένεια των ανθεκτικών στελεχών μελετήθηκε τόσο με την εφαρμογή της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ERIC2-PCR, αλλά και με τη δοκιμασία της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο. Η πολυκλωνικότητα των στελεχών που ενδημούν στα ελληνικά νοσοκομεία φάνηκε από τους τουλάχιστον 13 κλώνους που απομονώθηκαν από τις δύο γεωγραφικές περιοχές της μελέτης Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η παρατηρούμενη αντοχή στη σιπροφλοξασίνη οφείλεται κυρίως σε μεταλλάξεις των γονιδίων αντοχής gyrA και parC. Επιπλέον αποδεικνύεται η ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων αντοχής qnrS1 καθώς και η δυνατότητα μεταφοράς μέσω σύζευξης, γεγονός που πιθανώς εξηγεί τη διασπορά της αντοχής. Από τις δύο μεθόδους μοριακής επιδημιολογίας ERIC2- PCR και PFGE προκύπτει ότι τα ανθεκτικά στη σιπροφλοξασίνη στελέχη E. coli έχουν γίνει ενδημικά. Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα εργασία μπορούν να συμβάλλουν στην αντιμετώπιση της διασποράς των ανθεκτικών στελεχών και την ορθολογική χορήγηση των κινολονών, ώστε να διατηρηθεί η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου.