Μελέτη μεταγραφώματος της οδοντογενούς κερατινοκύστης
Authors: Καλογήρου Ελένη-Μαρίνα 
Published: June 2022

Σκοπός: Η οδοντογενής κερατινοκύστη (ΟΚΚ) εμφανίζει μεγάλο κλινικό και ερευνητικό ενδιαφέρον, λόγω της υψηλής συχνότητάς και της επιθετικής βιολογικής της συμπεριφοράς, δηλαδή της τάσης της να καταλαμβάνει μεγάλη έκταση στις γνάθους και να υποτροπιάζει. Επίσης, εκτός από το να αναπτύσσεται ως μοναδική βλάβη σε έναν ασθενή (σποραδική ΟΚΚ), μπορεί να αποτελεί εκδήλωση του Συνδρόμου Σπιλοειδών Βασικοκυτταρικών Καρκινωμάτων (συνδρομική ΟΚΚ). Σκοπός της μελέτης είναι να γίνει: α) ανάλυση του μεταγραφώματος του ολικού ιστού της ΟΚΚ με τη μέθοδο της RNA-αλληλούχησης (RNA-sequencing, RNA-seq), β) σύγκριση του μεταγραφώματος των πρωτοπαθών βλαβών και των υποτροπών της ΟΚΚ, γ) σύγκριση του μεταγραφώματος των σποραδικών και συνδρομικών ΟΚK, δ) έλεγχος επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων της RNA-seq με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time Polymerase Chain Reaction, qPCR) και την ανοσοϊστοχημική μέθοδο, ε) σύγκριση των αποτελεσμάτων της RNA-seq με τα δεδομένα προηγούμενης μελέτης που εξέτασε το μεταγράφωμα της ολικής ΟΚΚ με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (GSE38494) και στ) σύγκριση του ανοσοϊστοχημικού προφίλ των σποραδικών και συνδρομικών ΟΚK. Μέθοδοι: Το υλικό της μελέτης αποτελείτο από τους ιστούς 21 ΟΚΚ και 6 οδοντοθυλακίων εγκλείστων δοντιών (ΟΘΕ), που ήταν μονιμοποιημένοι στη φορμόλη για έως 48 ώρες και εγκιβωτισμένοι στην παραφίνη για έως 20 έτη. Έγινε απομόνωση του ολικού RNA, εξάντληση του rRNA με τη μέθοδο της RNase Η και κατασκευή της cDNA βιβλιοθήκης με τη χρήση τυχαίων εξαμερών εκκινητών. Πραγματοποιήθηκε διπλής κατεύθυνσης αλληλούχηση (μήκος ανάγνωσης 150bp) των 27 βιβλιοθηκών στο μηχάνημα HiSeq 4000 (Illumina Inc., San Diego, CA). Σε 7 βιβλιοθήκες επαναλήφθηκε δεύτερος κύκλος αλληλούχησης στο μηχάνημα NextSeq 500 (Illumina Inc., San Diego, CA). Η ποιότητα της αλληλούχησης ελέγχθηκε με το %Q30 Phred score. Έγινε ανάλυση κυρίων συνιστωσών και ιεραρχική συσταδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση για τον έλεγχο ύπαρξης ακραίων δειγμάτων. 18 περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν στη βιοπληροφορική ανάλυση. Η ανίχνευση των διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων (ΔΕΓ) πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο DESeq2, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα όρια στατιστικής σημαντικότητας: i) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value <0,05, ii)|log2Fold-Change (FC)|>1, iii) μέση τιμή των DESeq2’s normalized counts>20. Εφαρμόστηκαν 3 γενιές ανάλυσης εμπλουτισμού για τον εντοπισμό των γονιδιακών οντολογιών και των Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) μονοπατιών που ήταν υπερεκπροσωπημένα ανάμεσα στα επαγόμενα και κατεσταλμένα γονίδια. Έγινε έλεγχος της επαγωγής των γονιδίων ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, και TP63 με τη μέθοδο της qPCR και ανοσοϊστοχημικός έλεγχος της έκφρασης των πρωτεϊνών p63, SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2 και E-cadherin. Μέσω της διαδικτυακής πλατφόρμας GEO2R, με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις, συγκεντρώθηκαν τα ΔΕΓ που είχαν βρεθεί στην προηγούμενη μελέτη μεταγραφώματος με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (GSE38494). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε συστηματική ανασκόπηση της αγγλόφωνης βιβλιογραφίας μέσω των βάσεων δεδομένων MEDLINE/Pubmed, Web of Science, EMBASE μέσω OVID, καθώς και στην γκρίζα βιβλιογραφία, αναφορικά με τις μελέτες που συγκρίνουν το ανοσοϊστοχημικό προφίλ της σποραδικής και συνδρομικής ΟΚΚ. Η ποιοτική αξιολόγηση των μελετών έγινε με το Εργαλείο Κριτικής Αξιολόγησης για σειρές περιστατικών του Ινστιτούτου Joanna Briggs. Η ευαισθησία, η ειδικότητα, ο λόγος θετικών και αρνητικών πιθανοτήτων, ο λόγος διαγνωστικών πιθανοτήτων, η περιοχή κάτω από την καμπύλη και οι συνολικές εκτιμήσεις υπολογίστηκαν εφαρμόζοντας το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων. Αποτελέσματα: Προέκυψαν κατά μέσο όρο 19,3 εκατομμύρια paired-end reads ανά δείγμα, εκ των οποίων 73,5% (διάμεση τιμή) reads/δείγμα αντιστοιχήθηκαν μοναδικά στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ολικά reads ή σε αυτά που αντιστοιχήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς μεταξύ των πρόσφατα (≤36 μήνες) αποθηκευμένων και των παλαιότερων (≥82 μήνες) δειγμάτων. Μεταξύ των ΔΕΓ που ανιχνεύθηκαν στους δύο κύκλους αλληλούχησης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική επικάλυψη. Ανιχνεύθηκαν 2654 και 2427 ΔΕΓ που χαρακτήριζαν το μεταγράφωμα της σποραδικής και της συνδρομικής ΟΚΚ, αντίστοιχα, συγκριτικά με το ΟΘΕ. Οι γονιδιακές οντολογίες που σχετίζονται με την «ανάπτυξη επιδερμίδας/δέρματος» και τη «διαφοροποίηση κερατινοκυττάρων/επιδερμιδικών κυττάρων» ήταν εμπλουτισμένες μεταξύ των επαγόμενων γονιδίων (KRT10, NCCRP1, TP63, GRHL3, SOX21), ενώ οι γονιδιακές οντολογίες «οργάνωσης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ΕΘΟ)» (ITGA5, LOXL2) και της «οδοντογένεσης» (MSX1, LHX8) ήταν εμπλουτισμένες μεταξύ των κατεσταλμένων γονιδίων στην ΟΚΚ. Επίσης, παρατηρήθηκε επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό, για παράδειγμα του αραχιδονικού οξέος (ALOX12B, PLA2G4E) ή της γλουταθειόνης (GGT6, RRM1), και καταστολή μορίων προσκόλλησης κυττάρων-ΕΘΟ (PECAM1, VCAM1). Ένα αξιοσημείωτο εύρημα ήταν η επαγωγή δεικτών εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (EPHA1, SCNN1A) και γονιδίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό (SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2, CDH1) στην ΟΚΚ. Αυτά τα ευρήματα ήταν σε μεγάλο βαθμό κοινά μεταξύ των σποραδικών και των συνδρομικών ΟΚΚ, καθώς και μεταξύ πρωτοπαθών βλαβών και υποτροπών. Με τη μέθοδο της qPCR επιβεβαιώθηκε η επαγωγή των ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, και TP63, και με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο χαρτογραφήθηκε η έκφραση των SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2, CDH1/E-cadherin και p63, που εντοπίζονταν κυρίως στις υπερβασικές επιθηλιακές στιβάδες της ΟΚΚ. Επίσης, παρατηρήθηκε μεγάλος βαθμός επικάλυψης μεταξύ των ΔΕΓ της παρούσας μελέτης και της προηγούμενης μελέτης μικροσυστοιχιών (GSE38494) και εμπλουτισμός των γονιδιακών οντολογιών που σχετίζονται με την ανάπτυξη επιδερμίδας και τη διαφοροποίηση κερατινοκυττάρων μεταξύ των κοινών επαγόμενων γονιδίων. Η συστηματική ανασκόπηση συμπεριέλαβε 93 ανοσοϊστοχημικούς δείκτες από 71 μελέτες στην ποιοτική ανάλυση. Ο κίνδυνος μεροληψίας ήταν υψηλός σε 34 μελέτες, μέτριος σε 22, και χαμηλός σε 15. H έκφραση 29 δεικτών σε συνολικά 25 μελέτες διέφερε μεταξύ των δύο υποτύπων της ΟΚΚ, καθώς στις συνδρομικές ΟΚΚ παρατηρήθηκε μεγαλύτερος αριθμός θετικών στο δείκτη κυττάρων ή/και μεγαλύτερη ένταση χρώσης. Τα δεδομένα για 6 δείκτες (bcl-2, Cyclin D1, CD56, CK18, p53 και PCNA) από 11 μελέτες συμπεριλήφθηκαν στη μετα-ανάλυση, η οποία αποκάλυψε πως κανένας εξ αυτών δεν μπορούσε να διακρίνει τις συνδρομικές από τις σποραδικές ΟΚΚ, σε 95% διάστημα εμπιστοσύνης. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με τις δυνατότητες εφαρμογής της μεθόδου RNA-seq σε ιστούς μονιμοποιημένους στη φορμόλη και αποθηκευμένους στην παραφίνη έως 20 έτη. Η σποραδική (πρωτοπαθής βλάβη ή υποτροπή) και η συνδρομική ΟΚΚ χαρακτηρίζονται από κατά κανόνα κοινό πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης. Το μεταγράφωμα της ΟΚΚ διακρίνεται από αξιοσημείωτη επιδερμική διαφοροποίηση, με στοιχεία οδοντογενούς επιθηλιακής διαφοροποίησης και ενδείξεις περιορισμένης συμμετοχής του οδοντογενούς μεσεγχύματος, σημαντική αναδιαμόρφωση της ΕΘΟ, καθώς και υπερέκφραση δεικτών βλαστοκυττάρων. Επίσης, χαρακτηρίζεται από σημαντική επαγωγή οδών του μεταβολισμού, εύρημα που πιθανώς σχετίζεται με την τοπικά επιθετική βιολογική συμπεριφορά της, και από την καταστολή μορίων προσκόλλησης κυττάρων-ΕΘΟ, που συνάδει με την ιστοπαθολογικά παρατηρούμενη αποκόλληση του επιθηλίου από το κυστικό τοίχωμα. Πολυδύναμοι δείκτες βλαστοκυττάρων (SOX2, KLF4), γονίδια που συμμετέχουν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό (OVOL1, IRF6) ή επάγονται κατά τα αρχικά (CDH1/E-cadherin) ή τα ενδιάμεσα (TACSTD2/TROP2) στάδιά του, εκφράζονταν κυρίως στις υπερβασικές στιβάδες του επιθηλίου της ΟΚΚ. Τέλος, δεν υπάρχει δημοσιευμένος ανοσοϊστοχημικός δείκτης που να μπορεί να διακρίνει με ασφάλεια τη συνδρομική από τη σποραδική ΟΚΚ.