Διερεύνηση της προστατευτικής δράσης της τοξίνης cholera-toxin του βακτηρίου Vibrio cholerae στην καρκινογένεση
Authors: Αφαλωνιάτη Χαρά 
Published: July 2024

Κατά την εξέλιξη των προνεοπλασματικών αλλοιώσεων σε νεοπλασία σημαντικό ρόλο παίζει εκτός από το μικροπεριβάλλον του όγκου και το μακροπεριβάλλον, και πιο συγκεκριμένα η αλληλεπίδραση ανάμεσα στο ανοσοποιητικό, το ενδοκρινικό και το νευρικό σύστημα, καθώς και στο μικροβίωμα του εντέρου. Τη σπουδαιότητα του ανοσοποιητικού συστήματος και του μικροβιώματος ενισχύει η θεωρία των «συνθηκών υγιεινής», σύμφωνα με την οποία τα αντιγονικά ερεθίσματα που λαμβάνουν δια της πεπτικής οδού οι κάτοικοι των αναπτυσσόμενων ή λιγότερο αναπτυγμένων χωρών σε νεαρή ηλικία, εξαιτίας των κακών συνθηκών υγιεινής, είναι πιθανό να τους προστατεύουν από αυτοάνοσα νοσήματα και αλλεργίες αργότερα στη ζωή τους. Πειραματικά δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι η θεωρία των «συνθηκών υγιεινής» μπορεί να ισχύει και στην περίπτωση της καρκινογένεσης. Στις σύγχρονες κοινωνίες, η έλλειψη αντιγονικών ερεθισμάτων, κυρίως κατά την περιγεννητική περίοδο και τα πρώτα χρόνια της ζωής του ανθρώπου, είναι πιθανόν να οδηγεί σε διαταραχή τόσο της βακτηριακής χλωρίδας του εντέρου όσο και του ανοσοποιητικού συστήματος, τα οποία συμβάλλουν στην ανάπτυξη της καρκινογένεσης. Ένα νόσημα που υπάρχει ακόμη στις αναπτυσσόμενες χώρες, αλλά έχει εξαλειφθεί από τις αναπτυγμένες, είναι η διαρροϊκή νόσος χολέρα που οφείλεται στην τοξίνη cholera toxin (CT) του βακτηρίου Vibrio cholerae. Η τοξίνη αποτελείται από δύο υπομονάδες, τη CTA και τη CTB. Η CTA προκαλεί τη διάρροια, ενώ τόσο η CTB όσο και ολόκληρη η τοξίνη CT έχουν ισχυρή ανοσοενισχυτική και ανοσορρυθμιστική δράση. Η επίδραση αυτή της CT στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, η αμφίδρομη αλληλεπίδραση του ανοσοποιητικού με το μικροβίωμα καθώς και η συσχέτιση του ανοσοποιητικού και της βακτηριακής χλωρίδας του εντέρου με τον καρκίνο ανέδειξαν τον πιθανό ρόλο της CT στην καρκινογένεση. Η επίδραση της CT στον καρκίνο έχει μελετηθεί σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Περιορισμένος αριθμός ερευνών σε πειραματόζωα-πρότυπα καταδεικνύουν το ρόλο της CT στη μείωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, του προστάτη και του μαστού οι οποίοι παράλληλα με την αντικαρκινική αγωγή χρειάστηκε να εμβολιαστούν κατά της χολέρας. Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνήσει εάν η χορήγηση της CT από το στόμα σε νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης μπορεί να λειτουργήσει προστατευτικά στην εξέλιξη της τελευταίας σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η CT ασκεί την πιθανή προστατευτική της δράση.Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματισμοί, ένας μακροπρόθεσμος διάρκειας 42 εβδομάδων και ένας βραχυπρόθεσμος διάρκειας 15 εβδομάδων. Ο πρώτος χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα της καρκινογένεσης, ενώ ο δεύτερος για να εξεταστούν διάφοροι παράγοντες στο μικροπεριβάλλον των δυσπλαστικών/ προνεοπλασματικών αλλοιώσεων και οι μεταβολές που ενδεχομένως θα προκαλούσε σε αυτούς η χορήγηση της CT. Για τους πειραματισμούς χρησιμοποιήθηκαν θηλυκοί ποντικοί της φυλής FVB/N. Η χορήγηση της CT γινόταν 1 φορά την εβδομάδα για 4 συνεχόμενες εβδομάδες, ξεκινώντας από την ηλικία των 2 εβδομάδων. Το καρκινογόνο 7,12-διμεθυλοβενζο ανθρακένιο [dimethylbenzanthracene (DMBA)] χορηγούνταν για 6 συνεχόμενες εβδομάδες, 1 δόση ανά εβδομάδα, ξεκινώντας από την ηλικία των 8 εβδομάδων. Με βάση τη χορήγηση της CT και του DMBA δημιουργήθηκαν οι παρακάτω πειραματικές ομάδες: Μάρτυρες, CT, DMBA και DMBA+CT. Τα αποτελέσματα του μακροπρόθεσμου πειραματισμού έδειξαν ότι η χορήγηση της CT από το στόμα σε νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης είχε προστατευτική δράση στην εξέλιξη της τελευταίας σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, οι ποντικοί που έλαβαν DMBA εμφάνισαν κυρίως καρκίνο στο μαστό, στον πνεύμονα και στη μη αδενική μοίρα του στομάχου. Η χορήγηση της CT οδήγησε στο μαστό σε μείωση του συνολικού αριθμού των καρκινικών όγκων, στον πνεύμονα σε μείωση του συνολικού αριθμού των όγκων (καλοήθεις και κακοήθεις) και μείωση του συνολικού αριθμού και του μέσου μεγέθους των καρκινικών όγκων, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου σε μείωση του ποσοστού εμφάνισης καρκίνου και του συνολικού αριθμού των καρκινικών όγκων. Επιπρόσθετα, η χορήγηση της CT μείωσε το συνολικό αριθμό όλων των καρκινικών όγκων και αύξησε το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών. Τα αποτελέσματα του βραχυπρόθεσμου πειραματισμού έδειξαν ότι η χορήγηση της CT δεν εμπόδισε τη δημιουργία προνεοπλασματικών αλλοιώσεων, αλλά πιθανώς τροποποίησε το περιβάλλον των προνεοπλασματικών αλλοιώσεων εμποδίζοντας με τον τρόπο αυτό την εξέλιξή τους σε νεοπλασία. Η χορήγηση της CT επηρέασε την έκφραση χαρακτηριστικών γονιδίων και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την καρκινογένεση. Η ομάδα DMBA+CT παρουσίασε αύξηση της έκφρασης του δείκτη απόπτωσης κασπάση 3 και στα τρία κύρια όργανα (μαστός, πνεύμονας, στόμαχος) που εμφάνισαν καρκίνο κατά το μακροπρόθεσμο πειραματισμό και μείωση του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ki-67 μόνο στον πνεύμονα. Στην ίδια ομάδα παρατηρήθηκαν: στο μαστό μείωση της έκφρασης των ογκογονιδίων Her2, c-Myc και Snai2 και αύξηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p21 στον πυρήνα των κυττάρων, στον πνεύμονα μείωση της Cyclin D1 στα κύτταρα του επιθηλίου, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου μείωση του αγγειογενετικού παράγοντα Vegfa. Από τη μελέτη κλασσικών γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή και την καρκινογένεση, στους ποντικούς που έλαβαν DMBA και CT παρατηρήθηκε: στο μαστό μείωση των Runx2, Stat3, και Id2, στον πνεύμονα αύξηση του Klf4, στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου μείωση των Id2 και Runx3, και στο σπλήνα αύξηση των Runx, Snai2, Stat3, Id2 και Id3. Η χορήγηση της CT επηρέασε, επίσης, κύτταρα και παράγοντες του ανοσοποιητικού συστήματος. Στην ομάδα DMBA+CT παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του πληθυσμού των ουδετερόφιλων στην κυκλοφορία του αίματος, στα λεμφικά όργανα, στο μαστό και στον πνεύμονα, αύξηση των ενεργών μορφών των μακροφάγων και των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων και μείωση των δραστικών Τ-λεμφοκυττάρων στο σπλήνα, καθώς και αύξηση των κυτταροτοξικών και των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων στους λεμφικούς ιστούς. Στους ποντικούς της ίδιας ομάδας παρατηρήθηκε, επίσης: στο σπλήνα αύξηση της έκφρασης του Gata3 (δείκτης κυττάρων Th2) και των κυτταροκινών Il1b, Ifng, Il12 και Il10, στο μαστό μείωση της έκφρασης του T-bet (δείκτης των κυττάρων Th1), του Rorc (δείκτης των κυττάρων Th17) και των κυτταροκινών Ifng και Il10, στον πνεύμονα μείωση του Rorc και των κυτταροκινών Il1b και Il10, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου αύξηση του T-bet. Σημαντικές μεταβολές εντοπίστηκαν και στη βακτηριακή χλωρίδα του εντέρου. Στους ποντικούς που έλαβαν DMBA και CT βρέθηκε να επικρατούν κυρίως βακτήρια της τάξης των βακίλων, όπως οι λακτοβάκιλλοι, ενώ στην ομάδα DMBA ήταν αυξημένος ο πληθυσμός βακτηρίων της τάξης των κλωστριδίων. Η ανάλυση PCoA επιβεβαίωσε ότι οι ποντικοί είχαν διαφορετική βακτηριακή χλωρίδα, καθώς βρέθηκαν να ομαδοποιούνται με βάση το εάν έλαβαν ή όχι CT. Τα βακτήρια που συνέβαλαν κυρίως σε αυτό το διαχωρισμό ήταν στην ομάδα DMBA τα Lachnospiraceae και στην ομάδα DMBA+CT τα Lactobacillaceae. Συμπερασματικά, η χορήγηση της CT σε πολύ νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης μείωσε την εμφάνιση καρκίνου στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου καθώς και σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα, όπως το μαστό και τον πνεύμονα, και αύξησε το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών. Η CT δεν κατέστειλε την καρκινογένεση παρεμποδίζοντας την εμφάνιση προνεοπλασματικών αλλοιώσεων, αλλά πιθανώς άλλαξε το περιβάλλον τους καθιστώντας το λιγότερο ευνοϊκό για την εξέλιξη τους σε νεοπλασία. Η δράση αυτή της CT συσχετίσθηκε κυρίως με μείωση του αριθμού των ουδετερόφιλων, αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων, αλλαγές στην έκφραση γονιδίων και μεταβολές στη βακτηριακή χλωρίδα του εντέρου.