Μελέτη του δομικού πλαισίου της λειτουργίας πρωτεϊνικών τομέων του Αντιγραφικού Συμπλέγματος ιών των οικογενειών Togaviridae και Coronaviridae, μέσω Φασματοσκοπίας NMR
Authors: Τσίκα Αικατερίνη 
Published: January 2023

Οι ιοί αποτελούν υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα, ενώ πολλά είδη τους έχουν αναγνωριστεί σήμερα ως ανθρώπινα παθογόνα. Η οργάνωσή τους εξαντλείται στην παρουσία του γενετικού τους υλικού μέσα σε ένα πρωτεϊνικής φύσης καψίδιο περιβαλλόμενο ορισμένες φορές από ένα λιποπρωτεϊνικής σύστασης περίβλημα. Παρά την απλή σύνθεσή τους, από το γονιδίωμά τους κωδικοποιείται πληθώρα πρωτεϊνών των οποίων οι λειτουργίες είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό τους. Οι ιικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε αυτές οι οποίες συνιστούν το ιικό περίβλημα (δομικές), και σε εκείνες οι οποίες επιτελούν, σε συνεργασία με μόρια του κυττάρου ξενιστή, όλες τις απαραίτητες λειτουργίες για τον επιτυχή ιικό πολλαπλασιασμό (μη δομικές-nsPs). Ακόμα, ορισμένες λειτουργίες τους «αξιοποιούνται» από τους ιούς για την αποφυγή των κυτταρικών μηχανισμών άμυνας, διαδικασία η οποία διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στην εξέλιξη μίας ιικής μόλυνσης. Γίνεται έτσι αντιληπτό ότι για τον περιορισμό και την αντιμετώπιση των ιώσεων είναι σημαντική η σε βάθος κατανόηση του βιολογικού ρόλου των ιικών πρωτεϊνών.Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν ανεξάρτητες επικράτειες της nsP3 συγκεκριμένων ιικών ειδών, των οικογενειών Togaviridae και Coronaviridae. Ειδικότερα αντικείμενο μελέτης αποτέλεσαν οι macro επικράτειες (macro domains-MDs) των ιών MAYV, CHIKV, SARS-CoV-1, MERS-CoV και SARS-CoV-2 και η Alphavirus Unique Domain (AUD) του MAYV. Οι MDs αποτελούν μία εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια δομών. Εντοπίζονται σε όλες τις μορφές ζωής και στους ιούς, εμφανίζοντας λειτουργικές διαφοροποιήσεις. Σήμερα έχει αποδειχθεί η συμμετοχή τους στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των ιών και στην καταπολέμηση της ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή. Καθοριστικής σημασίας για την τελευταία διαδικασία είναι η ικανότητά τους να «διαγράφουν» την ADP-ριβοζυλίωση, μία μεταφραστική τροποποίηση εμπλεκόμενη σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες. Η AUD είναι χαρακτηριστική επικράτεια η οποία εντοπίζεται μόνο στο γένος Alphavirus. Έπεται αλληλουχικά της MD και η αποσαφήνιση του βιολογικού της ρόλου βρίσκεται ακόμα υπό διερεύνηση, έχοντας συνδεθεί με τον πολλαπλασιασμό και τη μολυσματικότητα των ιών.Οι επικράτειες αυτές μελετήθηκαν ως προς την αρχιτεκτονική, τη λειτουργία τους και τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια εφαρμόζοντας μεθόδους και τεχνικές μοριακής και κυτταρικής βιολογίας, πρωτεϊνικής χημείας, βιοχημείας και βιοφυσικών αναλύσεων. Απώτερος στόχος ήταν η διερεύνηση της σχέσης δομής-δράσης τους για την εξαγωγή συμπερασμάτων τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν στο σχεδιασμό βιοδραστικών εκλεκτικών μορίων-προσδετών. Τα μόρια αυτά, δυνητικά, μπορούν να συνεισφέρουν στη σε βάθος κατανόηση ή και αναστολή της λειτουργίας τους.Για το λόγο αυτόν, στην παρούσα διατριβή, εκφράστηκαν και απομονώθηκαν επιτυχώς σε υψηλή απόδοση και με υψηλή καθαρότητα τα πολυπεπτίδια τα οποία αντιστοιχούν στις συγκεκριμένες ιικές επικράτειες και μελετήθηκαν τα διαμορφωτικά χαρακτηριστικά τους, η δυναμική τους σε κλίμακα χρόνου ps-ns, και οι αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια, μέσω τις NMR φασματοσκοπίας.Για τις MDs των Alphaviruses και Coronaviruses πραγματοποιήθηκε ενδελεχής συγκριτική μελέτη των δομικών τους χαρακτηριστικών αλλά και των αλληλεπιδράσεων τους με τον φυσικό προσδέτη, ADPr, άλλα νουκλεοτιδικά ανάλογα και νουκλεϊκά οξέα, υποδεικνύοντας τις ομοιότητες και τις διαφορές στη δυναμική συμπεριφορά των βρόγχων οι οποίοι δημιουργούν την κοιλότητα δέσμευσης του φυσικού προσδέτη. Ακόμα, ελέγχθηκε η ικανότητα απo-ADP-ριβοζυλίωσης υποστρωμάτων, ιδιότητα η οποία αξιοποιήθηκε στην ανάπτυξη ενός βιοχημικού πρωτοκόλλου αξιολόγησης μορίων για την ανασταλτική τους δράση ως προς την υδρολυτική ικανότητα των MDs. Τέλος, χαρακτηρίστηκε η ένωση GS- 441524 ως ειδικός αναστολέας της ενζυμικής δράσης της MD του SARS-CoV-2.Όσον αφορά στην AUD του MAYV, στην παρούσα μελέτη παρασκευάστηκαν και εξετάστηκαν διαφορετικού μήκους πολυπεπτίδια για τον δομικό χαρακτηρισμό της επικράτειας σε διάλυμα μέσω της NMR φασματοσκοπίας. Προσδιορίστηκε η σημασία του μεταλλικού κέντρου στη δομική ακεραιότητά του πολυπεπτίδιού και εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης νουκλεϊκών οξέων, ιδιότητα συνδεδεμένη με της λειτουργία της AUD.