Μελέτη του μικροβιώματος του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος σε υγιή πληθυσμό της Βορείου Ελλάδος και έλεγχος της μεταβολής του σε αναπνευστικές λοιμώξεις
Authors: Σιάσιος Παναγιώτης 
Published: February 2022

Ενώ τα μικρόβια, που περιβάλλουν τον άνθρωπο και βρίσκονται εντός του σώματος του, έχουν αναγνωρισθεί από την εποχή του Koch ως σημείο κλειδί για την κατανόηση και την ερμηνεία μιας ποικιλίας ασθενειών του ανθρώπου, μόλις πρόσφατα έχουμε αρχίσει να κατανοούμε και τον εξίσου κρίσιμο ρόλο τους στην διατήρηση της ανθρώπινης υγείας. Η μελέτη του ανθρώπινου μικροβιώματος στην υγεία και τη νόσο είναι ένα καινούριο και ταχέως εξελισσόμενο πεδίο έρευνας με κύρια εργαλεία τις σύγχρονες τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας- NGS (Next Generation Sequencing). Οι μέθοδοι αλληλούχισης νέας γενιάς κατέστησαν δυνατή τη μελέτη και την αξιολόγηση της σύστασης των οικοσυστημάτων των μικροβίων που διαβιούν στις διάφορες ανατομικές περιοχές του ανθρώπινου σώματος, την εξερεύνηση της ποικιλομορφίας τους και της σχετικής τους αφθονίας μέχρι το επίπεδο του είδους, δίνοντας συγχρόνως τη δυνατότητα να προσδιοριστεί η σχέση του μικροβιώματος με την υγεία και τη νόσο στον άνθρωπο. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση και ο ταξινομικός χαρακτηρισμός του ανθρώπινου μικροβιώματος στο φάρυγγα (φαρυγγικό μικροβίωμα) με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η παραπέρα μελέτη της ποικιλίας του, ανάλογα με τον πληθυσμό που εξετάζεται, το φύλο, την κατάσταση της υγείας, την ηλικία και το περιβάλλον. Απώτερος στόχος ήταν ο καθορισμός στο φάρυγγα ενός πυρήνα μικροβιώματος (core microbiome), δηλαδή μικροοργανισμών που ανευρίσκονται σε όλα τα υγιή άτομα και η θέσπιση ορίων (baselines) ικανών να διακρίνουν τη φυσιολογική χλωρίδα του φάρυγγα υγιών ατόμων από την αντίστοιχη ατόμων που νοσούν από λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος. Στόχος της μελέτης επίσης, ήταν ο προσδιορισμός των παραγόντων που επηρεάζουν τη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος, του τρόπου με τον οποίο οι ανωτέρω παράγοντες αλληλοεπιδρούν μεταξύ τους και του ρόλου που διαδραματίζουν οι μεταβολές στη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος στην κατάσταση της υγείας του ανθρώπου. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 46 εθελοντές εκ των οποίων 29 άτομα (63%) ήταν υγιή. Η σχετική αφθονία των μικροβιακών κοινοτήτων αναγνωρίστηκε με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) του γονιδίου 16S rRNA στην πλατφόρμα Ion Torrent PGM.Συνολικά αναγνωρίστηκαν 14 φύλα (phyla),138 οικογένειες (families), 160 γένη (genera) και 259 είδη (species). Τα πιο άφθονα φύλα που ανιχνεύθηκαν ήταν τα Proteobacteria, Firmicutes και Bacteroidetes ακολουθούμενα από τα φύλα Actinbacteria και Fusobacteria. Όσον αφορά το επίπεδο του γένους, τα πέντε πιο άφθονα γένη στους υγιείς εθελοντές ήταν τα ακόλουθα Streptococcus, Prevotella, Gemella, Veillonella και Neisseria, ενώ στους πάσχοντες από λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος τα πιο άφθονα κατά σειρά συχνότητας γένη ήταν τα Prevotella, Streptococcus, Achromobacter, Rhizobium και Veillonella. Στο τελευταίο ταξινομικό επίπεδο του είδους τα πέντε πιο άφθονα είδη στους υγιείς ήταν τα Gemella haemolysans, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Veillonella atypica και Prevotella salivae ενώ στους ασθενείς τα Achromobacter spanius, Prevotella pallens, Prevotella melaninogenica, Rothia mucilaginosa και Veillonella atypica. Η ανάλυση γραμμικής διάκρισης μεγέθους αποτελέσματος (LDA-LEfSe) κατέδειξε 93 μικροβιακά είδη που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στο διαχωρισμό του φαρυγγικού μικροβιώματος μεταξύ ασθενών και υγιών, 17 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να διακρίνουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε σχέση με το φύλο (άνδρας- γυναίκα) και 35 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να κατατάξουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε αυτό των καπνιστών ή των μη καπνιστών. Προσδιορίστηκε επίσης με τη βοήθεια του πακέτου λογισμικού Microbiome της γλώσσας R ένας πυρήνας φαρυγγικού μικροβιώματος για κάθε ομάδα των υποκείμενων της μελέτης (άνδρες, γυναίκες, υγιείς και ασθενείς), ενώ η δημιουργία δικτύου αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μικροβιακών ειδών που συνθέτουν το φαρυγγικό μικροβίωμα (με το πακέτο λογισμικού NetCoMi) αποκάλυψε έναν κεντρικό κόμβο (hub) στο μικροβίωμα του φάρυγγα των ανδρών, την οικογένεια Lachnospiraceae του φύλου Firmicutes που φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανατομική αυτή περιοχή. Από τη σύγκριση του φαρυγγικού μικροβιώματος ανδρών και γυναικών προέκυψε μεγαλύτερη ποικιλομορφία όσον αφορά τον μικροβιακό πλούτο (richness) του φαρυγγικού μικροβιώματος στους άνδρες σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα από το φύλο (phylum) έως το είδος (species). Το αντίθετο, δηλαδή ελάττωση του μικροβιακού πλούτου όσον αφορά τον αριθμό των διαφορετικών μικροβιακών ειδών διαπιστώθηκε στο φαρυγγικό μικροβίωμα των καπνιστών σε σχέση με τους μη καπνιστές. Αύξηση της μικροβιακής ποικιλομορφίας διαπιστώθηκε επίσης και με την πρόοδο της ηλικίας, με πιο πλούσια ηλικιακή ομάδα όσον αφορά των αριθμό των διαφορετικών μικροβιακών ειδών την ομάδα 41-49 ετών, ακολουθούμενη από τα υποκείμενα ηλικίας >60 ετών. Κατά τη μελέτη της α- ποικιλομορφίας διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ υγιών και ασθενών σε ταξινομικό επίπεδο φύλου και γένους, ενώ όσον αφορά τη β-ποικιλομορφία διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα. Τέλος, με την ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCoA) ανευρέθηκαν 35 μικροβιακά είδη που συνέβαλλαν περισσότερο στο σχηματισμό των αξόνων της PCoA στην διάκριση υγιών και ασθενών. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας αποτελούν ένα μικρό μέρος από το παζλ που συνθέτει το σύνολο των μικροβιακών ειδών που αποικίζουν τον ανθρώπινο φάρυγγα, ωστόσο η παρούσα εργασία παρέχει τους τρόπους μελέτης της σύστασης και εκτίμησης της ποικιλομορφίας του φαρυγγικού μικροβιώματος και φιλοδοξεί να αποτελέσει τη βάση για περαιτέρω έρευνες στην ευρύτερη γεωγραφική περιοχή της Ελλάδας με σκοπό την καλύτερη κατανόηση της σύστασης και της ποικιλομορφίας του μικροβιώματος του φάρυγγα και του τρόπου που αυτό μεταβάλλεται ανάλογα με το περιβάλλον, την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση της υγείας.