Σύνθεση νέων βιοδραστικών μορίων και ανάπτυξη συστημάτων εγκλεισμού τους σε νανοφορείς
Authors: Μπαϊρακτάρη Μαρία 
Published: December 2023

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά η ανάπτυξη μιας «χημικής βιβλιοθήκης» με νέα συνθετικά ανάλογα της οικογένειας των κιναζολινονών και των ωρονών. Η «χημική βιβλιοθήκη αναπτύχθηκε με σκοπό τη μελέτη της σχέσης δομής-βιολογικής δράσης. Τα δομικά ανάλογα με την ισχυρότερη δράση αξιοποιήθηκαν περεταίρω μέσω του εγκλεισμού τους σε επιλεγμένους νανοφορείς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιτεύχθηκε ο σχεδιασμός, η σύνθεση καθώς και ο χαρακτηρισμός κιναζολινικών αναλόγων και ωρονών, τα περισσότερα από αυτά νέα στην βιβλιογραφία. Οι ενώσεις που συντέθηκαν ταυτοποιήθηκαν μέσω της φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1Η και 13C NMR), φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HR-MS) και φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR). Συγκεκριμένα, σχεδιάστηκαν πέντε σειρές κιναζολινικών παραγώγων Α, Β, Γ, Δ και Ε. Η Σειρά Α περιλαμβάνει τα ανάλογα της 3-αμινο-2-μεθυλο-6,7 υποκατεστημένων κιναζολινονών τα οποία συντέθηκαν σε δύο στάδια με τη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας ως μέθοδο φιλικότερη στο περιβάλλον. Η Σειρά Α εμπλουτίστηκε και με τα παράγωγα 2-μεθυλο-3,6,7 υποκατεστημένων κιναζολινονών τροποποιώντας την θέση 3 του κιναζολινικού δακτυλίου με τη χρήση διαμινών. Η Σειρά Β περιλαμβάνει κιναζολινικά παράγωγα βάσεων Schiff με κύριο δομικό συστατικό την παρουσία διπλού δεσμού στη θέση 3 και σχεδιάστηκε ώστε να μελετηθεί η σχέση δομής-βιολογικής δράσης και συγκεκριμένα η παρουσία του διπλού δεσμού. Η σύνθεση των βάσεων Schiff περιλαμβάνει τρία στάδια αρχικά την κυκλοποίηση του ανθρανιλικού οξέος προς κατάλληλης υποκατεστημένης βενζοξαζινόνης. Έπειτα ακολουθεί η προσθήκη ένυδρης υδραζίνης και τέλος η προσθήκη κατάλληλα υποκατεστημένης βενζαλδεΰδης καταλυόμενη από πιπεριδίνη. Η Σειρά Γ περιλαμβάνει αμιδικών κιναζολινικών παραγώγων με κύριο δομικό συστατικό την παρουσία αμιδικής ομάδας στην θέση 3. Η σύνθεση περιλαμβάνει 3 στάδια, αρχικά την κυκλοποίηση του ανθρανιλικού οξέος προς κατάλληλης υποκατεστημένης βενζοξαζινόνης και έπειτα την προσθήκη ένυδρης υδραζίνης προς σχηματισμό των παραγώγων της Σειράς Α με χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας και τέλος την προσθήκη ακέτυλοχλωριδίου για την σύνθεση των παραγώγων της σειράς αυτής. Σημειώνεται ότι το τρίτο στάδιο σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές αναφορές εκτελέστηκε με συμβατική θέρμανση αλλά μελετήθηκε και με την εισαγωγή της μικροκυματικής ακτινοβολίας. Οι Σειρές Δ, Ε και ΣΤ περιλαμβάνει την δεύτερη μεγάλη οικογένεια κιναζολινικών παραγώγων των 2,3 διςυποκατεστημένων κιναζολινονών. Πιο συγκεκριμένα οι Σειρές αυτές περιλαμβάνουν κιναζολινικά παράγωγα που συντέθηκαν σε ένα στάδιο μέσω αντίδρασης πολλαπλών συστατικών (MCR) και την χρήση φυσικών βαθέως ευτηκτικών διαλυτών (NADES) ως διαλύτες και καταλύτες των αντιδράσεων αυτών και την χρήση τεχνικών υψηλής ενέργειας για την βελτιστοποίηση της μεθοδολογίας. Η χρήση των NADES επιλέχθηκε ως φιλικότερων προς το περιβάλλον διαλυτών, καθώς ως μη τοξικοί αντικαθιστούν τους τοξικούς οργανικούς διαλύτες ενώ παράλληλα λειτουργούν και ως καταλύτες βελτιώνοντας τις αποδόσεις των τελικών προϊόντων. Σημειώνεται ότι η μεθοδολογία αυτή που αναπτύχθηκε φέρει αρκετά πλεονεκτήματα και λόγω της αντίδρασης MCR όπου δίνεται η δυνατότητα από απλές πρώτες ύλες να παραχθούν χημικές βιβλιοθήκες βιοδραστικών μορίων χωρίς απομόνωση ενδιάμεσων ενώσεων, προσθήκη επιπλεόν αντιδρώντων και διαλυτών κ.α. Πιο συγκεκριμένα, για η Σειρά Δ περιλαμβάνει παράγωγα 2,3 διςυποκατεστημένων κιναζολινονών όπου συντέθηκαν σε ένα στάδιο με προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη, κατάλληλα υποκατεστημένης ανιλίνης, κατάλληλα υποκατεστημένης βενζαλδεϋδης και NADES ως διαλύτη και καταλύτη της αντίδρασης. Σημειώνεται ότι πέρα από την ανάπτυξη της χημικής βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε και μελέτη της καταλυτικής δράσης 20 διαφορετικών NADES ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες για την μεθοδολογία αυτή. Η Σειρά Ε αντίστοιχα περιλαμβάνει 2,3-διςυποκατεστημένες κιναζολινόνες οι οποίες συντέθηκαν σε ένα στάδιο με την προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη ένυδρης υδραζίνης και κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης. Για το σχεδιασμό μιας φιλικότερης προς το περιβάλλον μεθοδολογίας και εδώ πραγματοποιήθηκε η προσθήκη κατάλληλου NADES με την χρήση υπερήχων για βελτιστοποίση της μεθοδολογίας. Η Σειρά ΣΤ περιλαμβάνει αντίστοιχα παράγωγα τα οποία συντέθηκαν σε ένα στάδιο με την προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη, κατάλληλα υποκατεστημένης ανιλίνης, κιναμικού χλωριδίου και επιλεγμένου NADES.Τέλος, η Σειρά Η και Ζ περιλαμβάνει την σειρά των χαλκονών και ωρονών αντίστοιχα. Η σύνθεση επιλεγμένων χαλκονών και ωρονών επιλέχθηκε ώστε να μελετηθεί η σχέση δομής δράσης, καθώς οι ωρόνες έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το DNA ως παρεμβολείς του DNA. Έτσι κρίθηκε σκόπιμο να δοκιμαστούν και ως προς την πιθανή ικανότητά τους να φωτοδιασπούν το DNA, ως ενδεχόμενοι φωτοευαισθητοποιητές. Αρχικά, η σύνθεση της Σειράς Η περιλαμβάνει την σύνθεση των χαλκονών μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης Claisen-Schmidt μεταξύ κατάλληλα υποκατεστημένων υδροξυ-ακετοφαινονών και κατάλληλα υποκατεστημένων βενζαλδεϋδών σε βασικές συνθήκες. Έπειτα ακολουθεί η σύνθεση της Σειράς Η που περιλαμβάνει την οξειδωτική κυκλοποίηση των αντίστοιχων χαλκονών χρησιμοποιώντας οξικό υδράργυρο (ΙΙ) ως οξειδωτικό παράγοντα. Στη συνέχεια για τα κιναζολινικά παράγωγα και τις ωρόνες που συντέθηκαν μελετήθηκε η σχέση δομής και in vitro βιολογικής δράσης. Πιο συγκεκριμένα, τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το DNA, την ικανότητα διάσπασης του DNA κάτω από την επίδραση ακτινοβολίας καθώς και της αντιοξειδωτικής τους δράσης μέσω της ικανότητας τους να αλληλεπιδρούν με την ελεύθερη ρίζα DPPH.Από την αξιολόγηση προέκυψαν σημαντικά αποτελέσματα για τη σχέση δομής- βιολογικής δράσης. Ορισμένα από τα παράγωγα παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, πιο συγκεκριμένα τα παράγωγα της Σειράς Α, Δ, Ε που φέρουν υδρόξυ-ομάδα στον κιναζολινικό δακτύλιο φαίνεται να βελτιώνουν σημαντικά την αντιοξειδωτική δράση. Ως προς την μελέτη της αλληλεπίδρασης τους με το DNA, τα υπολογιστικά αποτελέσματα και τα αποτελέσματα της τιτλοδότησης των μορίων και την αλληλεπίδρασης τους με DNA θύμου αδένα (CT-DNA) φάνηκαν να είναι ανάλογα σημειώνοντας ότι τα κιναζολινικά ανάλογα παρουσιάζουν εξωτερική αλληλεπίδραση στην μικκρή ή την μεγάλη αύλακα του DNA. Ως προς τη σχέση δομής-δράσης φαίνεται ότι οι υποκαταστάτες αλογονο-ομάδων, νιτρό-ομάδων, υδρόξυ-ομάδων, μεθόξυ ομάδων σε ορισμένα παράγωγα να είναι καθοριστικοί για την αλληλεπίδραση τους με το DNA καθώς όπως φάνηκε και από τα υπολογιστικά δεδομένα εμφάνιζαν ισχυρότερη αλληλεπίδραση σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου. Επίσης, τα κιναζολινικά παράγωγα μελετήθηκαν και αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να φωτοδιασπούν το DNA ως ενδεχόμενοι φωτοευαισθητοποιητές για την χρήση τους σε θεραπείες όπως καρκίνου, δερματικές παθήσεις (π.χ. ψωρίαση, ακμή) καθώς και ως αντιμικροβιακά. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα κιναζολινικά παράγωγα ως προς τις θέσεις 3, 6 και των ρόλο των υποκαταστατών σε αυτές τις θέσεις. Συγκεριμένα, μελετήθηκε η παρουσία και η απουσία αμινο-ομάδας στη θέση 3 καθώς και η επιμήκυνση της αλειφατικής ομάδας στη θέση αυτή, όπου φάνηκε καθοριστικός παράγοντας για την δράση. Ακόμη υποκαταστάτες στη θέση 6 όπως αλογονο-ομάδα, νίτρο ομάδα, υδρόξυ ομάδα παρουσιάζουν υψηλά ποσοστά φωτοδιάσπασης. Για τις σειρές των διϋδροκιναζολινονών σημαντικός δομικός παράγοντας αποτέλεσε η ύπαρξη αλογόνων-ομάδων και νιτρο-ομάδων ως υποκαταστάτες των αρωματικών δακτυλίων της θέσης 2 και 3 του κιναζολινικού δακτυλίου. Παρακάτω παρουσιάζονται ορισμένα παράγωγα που μπορούν να αποτελέσουν μόρια οδηγοί για την αλληλεπίδρασή τους και τον τρόπο δράσης τους με το DNA. Παρακάτω παρουσιάζονται ορισμένα από τα παράγωγα αυτά. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν πράσινοι διαλύτες και συγκεκριμένα φυσικοί βαθέως ευτηκτικοί διαλύτες για να βελτιώσουν τις αντιδράσεις σύνθεσης δίνοντας ένα πιο πράσινο χαρακτήρα στις αντιδράσεις αυτές. Οι Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (DES) καθώς και οι Φυσικοί Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (NaDES) είναι μίγματα δύο ή περισσότερων συστατικών τα οποία είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ανήκουν στην κατηγορία των πράσινων διαλυτών καθώς χαρακτηρίζονται από χαμηλή τοξικότητα, είναι ανακυκλώσιμοι και βιοαποικοδομήσιμοι. Έχουν ποικίλες εφαρμογές, μία πολλά υποσχόμενη εξ αυτών είναι η χρήση τους ως διαλύτες και καταλύτες στη σύνθεση οργανικών ενώσεων. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός τριών διαφορετικών σειρών NaDES με βάση την χολίνη, την βεταΐνη και αμινοξέα καθώς και οργανικά οξέα. Πραγματοποιήθηκε συνολικά η σύνθεση 20 NaDES και αξιολογήθηκαν συγκριτικά ως προς την απολεσματικότητά τους κατά την σύνθεση κιναζολινικών αναλόγων μέσω μιας αντίδρασης πολλαπλών συστατικών (Μulticomponent Reactions, MCRs) και χρήση υπερήχων. Υψηλότερη αποτελεσματικότητα έδειξε το NaDES που αποτελείται από χλωριούχο χολίνη και το γαλακτικό οξύ και για αυτό χρησιμοποιήθηκε στην πλειονότητα των αντιδράσεων. Με την παραπάνω μεθοδολογία συντέθηκαν 53 μόρια 2,3-διυδροκιναζολιν-4(1H)-ονών, ενώ παράλληλα εξετάστηκε συγκριτικά ο «πράσινος» χαρακτήρας της εκάστοτε σύνθεσης με χρήση ποσοτικών δεικτών και μελετήθηκε και η ανακύκλωση και η επαναχρησιμοποίηση των NaDES στις αντιδράσεις αυτές όπου εκτελέστηκαν έως και τρεις επαναλήψεις με επιτυχία και υψηλές αποδόσεις. Επιπλέον, οι φυσικοί βαθέως ευτηκτικοί διαλύτες (NADES) αξιολογήθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με το DNA ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτικοί διαλύτες σε βιολογικές εφαρμογές. Μελετήθηκε και αξιολογήθηκε η δράση τόσο των πρώτων υλών, δηλαδή των φυσικών συστατικών που αποτελείται κάθε NaDES, τα 20 συντιθέμενα NaDES καθώς και τα φυσικά μίγματα. Από τα αποτελέσματα που πάρθηκαν φάνηκε ότι η χρήση NaDES με βάση την χλωριούχο χολίνη εμφάνιζαν ισχυρότερη αλληλεπίδραση σε σχέση με εκείνα που συντέθηκαν με βάση την βεταϊνη.Τέλος, επιλεγμένα κιναζολινικά παράγωγα εγκλείστηκαν με επιτυχία σε επιλεγμένους βιοδιασπώμενους φορείς με σκοπό να τροποποιηθούν οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες π.χ. αύξηση της υδατοδιαλυτότητας. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν δομικά με φασματοσκοπία NMR και FT-IR, ως προς το μέγεθός τους και το ζ-δυναμικό με τη δυναμική σκέδαση φωτός (DLS), θερμικά με τις τεχνικές TGA και DSC και για την μορφολογία τους με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Ειδικότερα, στην παρούσα διδακτορική εργασία πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός των κιναζολινικών παραγώγων 4f, 10d σε μήτρες PLA και β-CD, ενώ για την ένωση οδηγό 3e χρησιμοποιήθηκαν τρία είδη κυκκλοδεξτρινών (β-CDs, Me-β-CD, HP-β-CD). Επιπλέον, επιτεύχθηκε η ανάπτυξη κατάλληλης μεθοδολογίας εγκλεισμού με PLA χρησιμοποιώντας διαύτη NaDES. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη του προφίλ απελευθέρωσης των μορίων καθώς και μελέτη και αξιολόγηση των συμπλόκων ως προς την αλληλεπίδρασή τους με το DNA.