Βιολογική δράση του καρβοξαμιδικού μυκητοκτόνου fluopyram και χαρακτηρισμός ανθεκτικών στελεχών του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea
Authors: Βελούκας Θωμάς 
Published: September 2021

O μύκητας Botrytis cinerea (τέλεια μορφή Botryotinia fuckeliana (de Bary)Whetzel) προσβάλλει περισσότερα από 200 διαφορετικά φυτικά είδη σε όλοτον κόσμο. Η αντιμετώπιση της ασθένειας που προκαλεί στηρίζεται στην συν-δυασμένη χρήση πολλών καλλιεργητικών μέτρων καθώς και στη χρήση μυ-κητοκτόνων από διαφορετικές χημικές ομάδες.Παρόλα αυτά, ο B. cinerea,θεωρείται παθογόνο υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη της ανθεκτικότηταςκαι κατά το παρελθόν έχουν προκύψει πολύ σημαντικά προβλήματα ανθε-κτικότητας σε πολλές χημικές ομάδες μυκητοκτόνων.Επομένως, η εισαγωγή στα προγράμματα ψεκασμών μυκητοκτόνων μεδιαφορετικό (νέο) μηχανισμό δράσης είναι απαραίτητη προκειμένου να δια-τηρηθεί υψηλή η αποτελεσματικότητα καταπολέμησης της ασθένειας. Η χη-μική ομάδα των καρβοξαμιδικών μυκητοκτόνων χωρίζεται σε επτά υποομάδεςοι οποίες συνολικά αποτελούνται από 15 διαφορετικά μόρια. Όλα τα μυκη-τοκτόνα της ομάδας έχουν κοινό τρόπο δράσης, που συνίσταται στην παρε-μπόδιση του ενζύμου αφυδρογονάση του ηλεκτρικού οξέος (σύμπλοκο ΙΙ τηςαναπνοής). Το ένζυμο συμμετέχει στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέοςκαι στην μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων και η παρε-μπόδισή του οδηγεί στη διακοπή εφοδιασμού των κυττάρων με ενέργεια. Το fluopyram, είναι ένα μυκητοκτόνο με ευρύ φάσμα δράσης. Η βιολο-γική του δράση εκδηλώνεται σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του μύκητα από τημόλυνση ως τη βλάστηση των σπορίων.Η παρούσα εργασία έγινε με σκοπό: α) να μελετηθεί η βιολογική δράσητου fluopyram εναντίον του B. cinerea και να μετρηθεί η ευαισθησία άγριωνπληθυσμών, β) να χαρακτηριστούν μοριακά τα ανθεκτικά στελέχη και νααναπτυχθεί μοριακή μέθοδος με σκοπό τη γρήγορη ανίχνευση των ανθεκτικώνστελεχών, γ) να διερευνηθούν οι σχέσεις διασταυρωτής ανθεκτικότητας με-ταξύ των μελών της ομάδας των SDHis (Succinate Dexydrogenase inhibitors)και δ) να μετρηθούν διάφορες παράμετροι προσαρμοστικότητας με σκοπό να αξιολογηθεί η ενδεχόμενη επίδραση του κόστους προσαρμοστικότηταςστην ανάπτυξη και εξέλιξη της ανθεκτικότητας.Συνολικά, συλλέχθηκαν 192 μονόσπορες απομονώσεις από διαφορετικέςπεριοχές της Ελλάδας και από διαφορετικές καλλιέργειες, από αγρούς πουδεν είχαν δεχθεί καμμιά εφαρμογή με SDHi μυκητοκτόνα. Τα αποτελέσματαέδειξαν πως το πιο ευαίσθητο στο fluopyram στάδιο ανάπτυξης του μύκηταήταν η επιμήκυνση του βλαστικού σωλήνα των κονιδίων. Το fluopyram έδειξεεξαιρετική προστατευτική δράση σε καρπούς φράουλας που μολύνθηκαν τε-χνητά 96, 48 και 24 ώρες πριν τη μόλυνση και πολύ καλή θεραπευτική δράσηόταν εφαρμόσθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Σε όλους τους πληθυσμούς τουμύκητα που ελέγχθηκαν, η βασική γραμμή ευαισθησίας παρουσίαζε ένα μέ-γιστο και οι τιμές EC50 κυμάνθηκαν από 0.03 ως 0.29 μg ml-1. Επιπλέον, δενδιαπιστώθηκε σχέση διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ του fluopyramκαι χημικών ομάδων μυκητοκτόνων όπως του cyprodinil, fludioxonil, fenhexamid,iprodione και pyraclostrobin.Κατά την περίοδο 2008-2010, απομονώθηκαν από διαφορετικούς αγρούςφράουλας της Β. Ελλάδας, 122 μονόσπορες απομονώσεις του B. cinerea καιελέγχθηκε η ευαισθησία τους στο boscalid. Oι μετρήσεις, έδειξαν την παρου-σία τριών ξεχωριστών φαινοτύπων που περιελάμβαναν απομονώσεις πολύ να αξιολογηθεί η ενδεχόμενη επίδραση του κόστους προσαρμοστικότηταςστην ανάπτυξη και εξέλιξη της ανθεκτικότητας.Συνολικά, συλλέχθηκαν 192 μονόσπορες απομονώσεις από διαφορετικέςπεριοχές της Ελλάδας και από διαφορετικές καλλιέργειες, από αγρούς πουδεν είχαν δεχθεί καμμιά εφαρμογή με SDHi μυκητοκτόνα. Τα αποτελέσματαέδειξαν πως το πιο ευαίσθητο στο fluopyram στάδιο ανάπτυξης του μύκηταήταν η επιμήκυνση του βλαστικού σωλήνα των κονιδίων. Το fluopyram έδειξεεξαιρετική προστατευτική δράση σε καρπούς φράουλας που μολύνθηκαν τε-χνητά 96, 48 και 24 ώρες πριν τη μόλυνση και πολύ καλή θεραπευτική δράσηόταν εφαρμόσθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Σε όλους τους πληθυσμούς τουμύκητα που ελέγχθηκαν, η βασική γραμμή ευαισθησίας παρουσίαζε ένα μέ-γιστο και οι τιμές EC50 κυμάνθηκαν από 0.03 ως 0.29 μg ml-1. Επιπλέον, δενδιαπιστώθηκε σχέση διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ του fluopyramκαι χημικών ομάδων μυκητοκτόνων όπως του cyprodinil, fludioxonil, fenhexamid,iprodione και pyraclostrobin.Κατά την περίοδο 2008-2010, απομονώθηκαν από διαφορετικούς αγρούςφράουλας της Β. Ελλάδας, 122 μονόσπορες απομονώσεις του B. cinerea καιελέγχθηκε η ευαισθησία τους στο boscalid. Oι μετρήσεις, έδειξαν την παρου-σία τριών ξεχωριστών φαινοτύπων που περιελάμβαναν απομονώσεις πολύ ευαίσθητες. Η αλληλούχιση του γονιδίου sdhB, αποκάλυψε πέντε διαφορε-τικές μεταλλαγές για τις απομονώσεις του B. cinerea με μέτρια και υψηλή αν-θεκτικότητα στο boscalid. Στις μέτρια ανθεκτικές απομονώσεις διαπιστώθηκεαντικατάσταση της ασπαραγίνης από ισολευκίνη στο κωδικόνιο 230 (N230i)ή αντικατάσταση της ιστιδίνης από αργινίνη ή τυροσίνη στο κωδικόνιο 272(H272/R/Y). Στις υψηλά ανθεκτικές απομονώσεις διαπιστώθηκε αντικατά-σταση της προλίνης από φαινυλαλανίνη στο κωδικόνιο 225 (P225F) ή αντι-κατάσταση της ιστιδίνης από λευκίνη στο κωδικόνιο 272 (H272L).Με σκοπό τη γρήγορη ανίχνευση των παραπάνω μεταλλαγών, αναπτύ-χθηκε η μέθοδος της PiRA-PCR. Η μέθοδος εφαρμόστηκε με επιτυχία στουςπληθυσμούς του B. cinerea με μέτρια και ισχυρή ανθεκτικότητα και έδειξεπως η μεταλλαγή H272R ήταν η κυρίαρχη με συχνότητες 28.5, 37.5 και 30%κατά τα έτη 2008, 2009 και 2010, αντίστοιχα. Αντίθετα, η μεταλλαγή H272L,ανιχνεύτηκε σε συχνότητα 2.5% μόνο στον πληθυσμό του 2009 και η μεταλ-λαγή P225F ανιχνεύτηκε σε συχνότητα 7.5% μόνο στον πληθυσμό του 2010.Παρά τον κοινό τρόπο δράσης μεταξύ των SDHis, υπάρχει ισχυρή έν-δειξη πως η αποτελεσματικότητα καταπολέμησης των ανθεκτικών στελεχών πολλών παθογόνων από το μυκητοκτόνα αυτά είναι διαφορετική. Δεδομένουότι η ομάδα των SDHis παρουσιάζει εξαιρετική σπουδαιότητα στη καταπο-λέμηση σημαντικών παθογόνων, διερευνήθηκαν οι σχέσεις διασταυρωτήςανθεκτικότητας μεταξύ πολλών SDHis σε απομονώσεις του μύκητα με δια-φορετικές μεταλλαγές στo sdhB και αξιολογήθηκε in vivo η επίδραση αυτώντων μεταλλαγών στην αποτελεσματικότητα καταπολέμησης της ασθένειαςμε το boscalid και το fluopyram. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υφίστανταιδιαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας και διαφορετικές σχέσεις ανθεκτικότηταςμεταξύ των δομικά διαφορετικών SDHis. Τα στελέχη με την μεταλλαγή P225Fήταν ανθεκτικά σε όλα τα SDHi μυκητοκτόνα. Παρόμοια, οι απομονώσειςμε την μεταλλαγή H272L ήταν ισχυρά ανθεκτικές στο boscalid αλλά έδειξανμέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στα άλλα SDHis. Τα στελέχη με την μεταλ-λαγή N230i ήταν μέτρια ανθεκτικά στο boscalid, fluopyram και το fluxapyroxad,ενώ εμφάνιζαν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στο isopyrazam, bixafen,fenfuram, benodanil και carboxin. Τα στελέχη με την μεταλλαγή H272Rείχαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στο boscalid και χαμηλά επίπεδα αν-θεκτικότητας στο isopyrazam, fenfuram και carboxin, ενώ παρέμειναν ευαί-σθητα στο fluopyram, bixafen, fluxapyroxad και benodanil. Oμοίως, στελέχημε την μεταλλαγή H272Y έδειξαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στο boscalidκαι πολύ χαμηλά στο isopyrazam, bixafen, fenfuram και carboxin, αλλά πα-ρουσίαζαν αυξημένη ευαισθησία στο fluopyram και το benodanil. In vivo, τοboscalid παρείχε μέτρια ως υψηλή καταπολέμηση της ασθένειας όταν αυτήπροκλήθηκε από στελέχη με τις H272R/Y και N230i μεταλλαγές, αλλά η απο-τελεσματικότητα καταπολέμησης ήταν χαμηλή όταν η ασθένεια προκλήθηκεαπό στελέχη με τις P225F και H272L μεταλλαγές. Αντίθετα, το fluopyramέλεγξε αποτελεσματικά τις H272R/Y μεταλλαγές, ενώ παρείχε μέτρια επί-πεδα καταπολέμησης των μεταλλαγών H272L, N230i και P225F.Όσον αφορά τις μετρήσεις διαφορετικών παραμέτρων προσαρμοστι-κότητας, όλες οι απομονώσεις του μύκητα που έφεραν μεταλλαγές στην sdhB,είχαν και την G143A μεταλλαγή στο cytb. Δέκα από τις απομονώσεις της με-λέτης ήταν άγριας ευαισθησίας σε κάθε μυκητοκτόνο και δεν έφεραν καμμιάμεταλλαγή στη sdhB ή στο cytb. Επιπλέον, δέκα είχαν απλή ανθεκτικότηταμόνο στους Qois αφού έφεραν την G143A μεταλλαγή στο cytb, ενώ οι υπό-λοιπες έφεραν στην sdhB τις μεταλλαγές H272R, H272Y, H272L, N230i καιP225F καθώς και την μεταλλαγή G143A στο cytb (10, 10, 6, 10 και 9 απομο-νώσεις, αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μυκηλιακή ανάπτυξη πα-ρόμοια με τις άγριας ευαισθησίας απομονώσεις, είχαν αυτές με την μεταλλαγήH272R στους 7°C και αυτές με την μεταλλαγή H272L στους 20°C. Στην χα-μηλότερη θερμοκρασία των 7°C τη μικρότερη μυκηλιακή ανάπτυξη είχαν οιαπομονώσεις με τις P225Fκαι H272L μεταλλαγές. Στην άριστη θερμοκρασία των 20°C, η μικρότερη μυκηλιακή ανάπτυξη παρατηρήθηκε στις H272Y απο-μονώσεις, ενώ στην υψηλή θερμοκρασία των 30°C η μικρότερη μυκηλιακήανάπτυξη παρατηρήθηκε στις απομονώσεις με τις μεταλλαγές H272Y, H272Lκαι P225F.Η βλαστικότητα των κονιδίων επηρεάστηκε ισχυρά στη χαμηλή θερμο-κρασία επώασης των 7°C, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στηβλαστικότητα στους 20 και 30°C. Σε όλες τις θερμοκρασίες επώασης οι με-γαλύτερες τιμές βλαστικότητας των κονιδίων αφορούσαν τα άγριας ευαισθη-σίας στελέχη του μύκητα.Oι απομονώσεις με την μεταλλαγή H272L παράγουν σημαντικά περισ-σότερα (P<0.05) σκληρώτια από ότι οι απομονώσεις των άλλων γενότυπων,σε όλες τις θερμοκρασίες επώασης. Σχετικά μεγάλος αριθμός σκληρωτίωνπαράγεται και από τις H272R απομονώσεις. Το μικρότερο αριθμό παραγό-μενων σκληρωτίων και στις δυο θερμοκρασίες επώασης, δίνουν οι απομο-νώσεις με άγρια ευαισθησία, καθώς και αυτές με την μεταλλαγή G143A, μετις μεταλλαγές H272Y και P225F. Σημαντική μείωση της βιωσιμότητας τωνσκληρωτίων παρατηρήθηκε όταν αυτά αποθηκεύτηκαν για 2 μήνες στους37°C. Η μεγαλύτερη βιωσιμότητα παρατηρήθηκε στα άγριας ευαισθησίαςστελέχη καθώς και σε αυτά με την μεταλλαγή G143A, ενώ δεν υπήρξε καμιά βιωσιμότητα σκληρωτίων στα H272L στελέχη, τα οποία έχασαν πλήρως τηβιωσιμότητά τους.Oι τιμές μολυσματικότητας για τις H272R απομονώσεις ήταν παρόμοιες(P<0.05) με τις αντίστοιχες τιμές των άγριας ευαισθησίας στους 20 και 27°C,ενώ ήταν μεγαλύτερες (P>0.05) από αυτές της άγριας ευαισθησίας στους7°C. Στις τρεις θερμοκρασίες επώασης οι απομονώσεις με τις μεταλλαγέςH272L και P225F, εμφάνισαν μικρότερες τιμές διαμέτρου κηλίδας από αυτήπου προκλήθηκε από τις άγριας ευαισθησίας καθώς και με τις H272R/Y καιN230i απομονώσεις. Η υψηλότερη ικανότητα σποριοποίησης παρατηρήθηκεστις άγριας ευαισθησίας και στις H272R απομονώσεις. Αντίθετα, οι H272Lκαι P225F απομονώσεις εμφάνιζαν σημαντικά μικρότερη (P<0.05) ικανότητασποριοποίησης.Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι οι απομονώσεις με τιςsdhB μεταλλαγές ήταν πιο ευαίσθητες στην οξειδωτική καταπόνηση που προ-κλήθηκε όταν στο υπόστρωμα ανάπτυξης προστέθηκε diquat, σε σύγκρισημε της άγριας ευαισθησίας ή με αυτές που έφεραν μόνο την μεταλλαγήG143A. Η ευαισθησία στην οξειδωτική καταπόνηση που παρατηρήθηκε στιςαπομονώσεις με sdhB μεταλλαγές ίσως εξηγεί την μικρή μυκηλιακή ανάπτυξηκαθώς και την μικρή μολυσματική ικανότητα που αναφέρθηκαν στις μετρήσεις των μεμονωμένων παραμέτρων προσαρμοστικότητας. Τα ευρήματα αυτήςτης μελέτης αποδεικνύουν ότι η εισαγωγή στα προγράμματα ψεκασμών νέωνSDHi μυκητοκτόνων όπως το fluopyram ίσως οδηγήσουν σε αλλαγές στο εί-δος των μεταλλαγών που σχετίζονται με τη ανθεκτικότητα στους SDHis καιείναι κυρίαρχες στο πληθυσμό του παθογόνου.