Methodological Approach to the Mucosal Lymphoid Cells Phenotyping in Patients with Crohn’s Disease
Authors: Нижегородова Д.Б. , Цеханович Д.А. , Шулейко А.Ч. , Старостин А.М. , Ванслав М.И. , Иванчик Г.И. , Величко А.В. , Зафранская М.М. 
Published: November 2023

Введение. В настоящее время общепринятым подходом к оценке иммунного статуса является характеристика лимфоидных клеток периферической крови. Вместе с тем актуальными остаются исследования показателей локального мукозального иммунитета желудочно-кишечного тракта при иммунопатологических состояниях и последующее сопоставление полученных данных с таковыми циркулирующих лимфоидных клеток – для выявления взаимосвязи локальных реакций с системными эффектами. В статье представлена методология выделения и предложен алгоритм фенотипирования интраэпителиальных лимфоидных клеток (IEL) и лимфоидных клеток собственной пластинки слизистых оболочек (LPL) тонкой и толстой кишки у пациентов с болезнью Крона. Цель. Оценить фенотипический состав лимфоидных клеток периферической крови и слизистой оболочки тонкой и толстой кишки у пациентов с болезнью Крона. Материалы и методы. Материал исследования – биопсийный материал тонкой и толстой кишки, а также периферическая кровь 10 пациентов с болезнью Крона в возрасте 28,0 (22,7÷36,8) года, из них – 6 мужчин и 4 женщины. Мукозальные лимфоидные клетки получали путем комбинированной программной диссоциации тканей кишки. Иммунофенотипирование лимфоидных клеток осуществляли с использованием набора моноклональных антител и проточного цитометра. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 8.0. Результаты. Основная популяция мукозальных лимфоидных клеток тонкой и толстой кишки у пациентов с болезнью Крона представлена СD3+Т-лимфоцитами, долевое содержание которых коррелировало с количеством Т-лимфоцитов периферической крови (R=0,7; p<0,05). При этом среди Т-клеток IEL тонкой кишки выявлена инверсия Т-хелперов и Т-киллеров. В обоих отделах кишки установлено увеличение количества минорных популяций γδIEL (преимущественно за счет Vδ1+T-клеток) относительно LPL (p<0,01) и мукозально-ассоциированных СD161+T-клеток относительно периферической крови (p<0,05). Мукозальные В-лимфоциты и NK-клетки локализировались преимущественно среди LPL-компартмента, при этом в толстой кишке большая половина В-клеток определялась как B1-лимфоциты (p<0,01). Заключение. С использованием предложенного алгоритма фенотипирования у пациентов с болезнью Крона выявлены изменения в основных и минорных популяциях мукозальных лимфоидных клеток врожденного и приобретенного иммунитета, которые, предположительно, вовлекаются в формирование аутоиммунного воспаления в тонкой и толстой кишке, а также циркулируют в периферической крови и могут являться диагностически значимыми маркерами развития рецидива заболевания.

The work was financially supported by the state research program "Biotechnologies-2", subprogram 3.1 "Molecular and cellular biotechnologies-2", registration number 20230295. Abstract Introduction. Currently the generally accepted approach to the immune status assessment is the characterization of lymphoid cells in the peripheral blood. However, the investigation of local mucosal gut immunity under immunopathological conditions remain highly relevant as well as its following comparison with circulating lymphoid cells for the identification the relationship between local reactions and systemic effects. This article presents a methodology for mucosal cells isolation and proposed an algorithm for the phenotyping of intraepithelial lymphoid cells (IEL) and lamina propria lymphoid cells (LPL) obtained from the small and large intestine in patients with Crohn’s disease. Purpose. To evaluate the phenotype of peripheral blood and mucosal lymphoid cells of the small and large intestine in patients with Crohn’s disease. Materials and methods. The study material was biopsy of the ileum and colon as well as peripheral blood from 10 patients with Crohn’s disease, aged 28.0 (22.7÷36.8) years, including 6 men and 4 women. Mucosal lymphoid cells were obtained by combined mechanical and enzymatic dissociation of intestinal tissues. Lymphoid cells were immunophenotyped using a set of monoclonal antibodies and a flow cytometer. Statistical data processing was done using the Statistica 8.0 program. Results. The major population of mucosal lymphoid cells in the small and large intestine of patients with Crohn’s disease was represented by CD3+T-lymphocytes, the percentage of which correlated with the number of peripheral blood T-lymphocytes (R=0.7; p<0.05). At the same time, the inversion of T-helpers and T-killers was revealed among T-cells of enteric IEL. An increase in the number of minor γδIEL subsets (mainly due to Vδ1+T- cells) as compared to LPL (p<0.01) and mucosa-associated CD161+T-cells as compared to peripheral blood (p<0.05) was established in both parts of the intestine. Mucosal B-lymphocytes and NK-cells were localized predominantly among the LPL compartment, while more than half of the B-cells were defined as B1-lymphocytes in the colon (p<0.01). Conclusion. Using the proposed phenotyping algorithm changes in the major and minor subsets of mucosal lymphoid cells of innate and acquired immunity were detected in patients with Crohn’s disease, assuming their involvement in the gut autoimmune inflammation as well as circulation in the peripheral blood what may be used as diagnostic significant markers for disease progression.