Κινητικές μελέτες βιοσύνθεσης πολυσακχαριτών και λιπιδίων κατά την καλλιέργεια μακρομυκήτων
Authors: Διαμαντοπούλου Παναγιώτα 
Published: January 2014

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκαν οι φυσιολογικές παράμετροι της μικροβιακής αύξησης και μελετήθηκαν η παραγωγή μυκηλιακής μάζας, η κατανάλωση σακχάρων, η συσσώρευση και (σε κάποιες περιπτώσεις) η αποικοδόμηση ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων και η έκκριση εξωπολυσακχαριτών (EPS) σε στελέχη εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων καλλιεργούμενων κυρίως σε υγρές ζυμώσεις, με την έμφαση να δίνεται στις μελέτες για το μύκητα Volvariella volvacea. Ενδελεχής διερεύνηση της βιβλιογραφίας έδειξε σχετική έλλειψη συγκριτικών δεδομένων όσον αφορά στην φυσιολογική συμπεριφορά και τη βιοσυνθετική ικανότητα εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων σε συνθετικά υγρά θρεπτικά μέσα. Σε ένα πρώτο επίπεδο, αξιολογήθηκαν 9 βασιδιομύκητες: Ganoderma lucidum, G. applanatum, Auricularia auricula-judae, Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, Agrocybe aegerita, V. volvacea και 2 ασκομύκητες: Morchella elata, M. esculenta και μελετήθηκε συγκριτικά η ικανότητά τους για παραγωγή μυκηλιακής μάζας, EPS και λιπιδίων σε υγρές αναδευόμενες και μη-αναδευόμενες καλλιέργειες, σε διάφορα θρεπτικά μέσα με βάση τη γλυκόζη. Υψηλές τιμές ξηράς μυκηλιακής μάζας (~14-19 g/l), EPS (~1,0-1,3 g/l) και λιπιδίων (έως 22,0%, κ.β. επί ξηράς μάζας) αναφέρθηκαν για αρκετά από τα υπό μελέτη στελέχη. Η ανάλυση σε λιπαρά οξέα των κυτταρικών λιπιδίων των μακρομυκήτων έδειξε υψηλές συγκεντρώσεις του λινελαϊκού οξέος για τα περισσότερα από τα στελέχη που μελετήθηκαν. Έτσι, επιλέχθηκαν τα 6 πιο ενδιαφέροντα είδη (P. pulmonarius, G. applanatum, F. velutipes, A. aegerita, V. volvacea και M. esculenta) στα οποία πραγματοποιήθηκε ενδελεχής μελέτη της αύξησης και βιοσύνθεσης εξω- και ενδο-πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων. Επέκταση του χρόνου της ζύμωσης είχε ως αποτέλεσμα να επιτευχθούν υψηλότερες συγκεντρώσεις βιομάζας σε σχέση με το αρχικό πείραμα (μέγιστες τιμές μέχρι ~20-22,5 g/l), ενώ και ο συντελεστής απόδοσης της παραγόμενης βιομάζας προς την αναλωθείσα γλυκόζη (YX/Glc) ήταν σε αρκετές περιπτώσεις πολύ υψηλός (0,6-0,9 g/g). Επιπλέον, καταγραφή των μέγιστων τιμών των παραγόμενων EPS έδειξε μεγάλη διακύμανση ανάλογα το στέλεχος και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης. Ακόμα, παράχθηκαν σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις IPS (π.χ. 5,8-10,9 g/l), η σύσταση των οποίων σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο της ζύμωσης και χαρακτηριζόταν κατά κύριο λόγο από γλυκόζη και σε μικρότερα ποσοστά από φρουκτόζη, μαννιτόλη και ξυλιτόλη. Σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μυκηλιακής μάζας) καταγράφηκαν στα πρώιμα στάδια του αυξητικού κύκλου (μέχρι τη 12η ημέρα καλλιέργειας), φτάνοντας το 20,0-22,5%, κ.β. ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε αποικοδόμησή τους. Η σύσταση των λιπιδίων, με κύριο λιπαρό οξύ το λινελαϊκό (ποσοστό >50%, κ.β.) και ακόλουθα τα ελαϊκό (έως 40%, κ.β.) και παλμιτικό (10-30%, κ.β.), εμφάνισε διαφοροποιήσεις σε σχέση με το χρόνο ζύμωσης και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης, με το προφίλ των λιπαρών οξέων να σημειώνεται πιο κορεσμένο στους M. esculenta και V. volvacea. Σε άλλη σειρά πειραμάτων, μελετήθηκε εκτενέστερα η φυσιολογία του μύκητα V. volvacea, με συγκριτική αξιολόγηση της ταχύτητας αύξησης του μυκηλίου τεσσάρων στελεχών του είδους (188, 190, 191 και 192) που καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri και σε υγρές ζυμώσεις, προκειμένου να αξιολογηθεί η παραγωγή μυκηλιακής μάζας για τα τέσσερα στελέχη. Ανάλυση του κυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα για όλα τα στελέχη έδειξε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0), υποδεικνύοντας ότι αυτού του είδους το προφίλ λιπαρών οξέων είναι χαρακτηριστικό για το είδος V. volvacea. Ποσοτικοποίηση των κλασμάτων των παραγόμενων λιπιδίων έδειξε σχετικά υψηλότερη περιεκτικότητα του ουδέτερου κλάσματος (NL) από ό,τι το κλάσμα των γλυκολιπιδίων και σφιγκολιπιδίων (G+S), ενώ σε πολύ μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα φωσφολιπίδια (PL). Ανάλυση των κλασμάτων σε λιπαρά οξέα έδειξε ως πιο κορεσμένο κλάσμα αυτό των φωσφολιπιδίων. Στη συνέχεια, το στέλεχος 190 καλλιεργήθηκε σε αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και τόσο η κατανάλωση της γλυκόζης, όσο και η παραγωγή βιομάζας, IPS και EPS ήταν σχεδόν ταυτόσημες για αμφότερες τις καλλιέργειες. Μόνο η παραγωγή λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μάζας) εμφάνισε σχεδόν διπλάσιες τιμές στην αναδευόμενη σε σχέση με τη στατική καλλιέργεια, ενώ η ανάλυση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα επιβεβαίωσε τα προηγούμενα ευρήματα. Ποσοτικός προσδιορισμός των κλασμάτων στις διάφορες φάσεις του αυξητικού κύκλου έδειξε ότι στα πρώιμα στάδια της ζύμωσης όπου ανιχνεύτηκαν υψηλότερες ποσότητες λιπιδίων επί ξηράς μάζας, το ποσοστό του NL ήταν υψηλότερο και ενόσω καταναλώνονταν τα ενδοκυτταρικά λιπίδια, υπήρξε εκλεκτική κατανάλωση των NL με ταυτόχρονη αύξηση του ποσοστού των G+S και των PL. Επιπλέον, το στέλεχος V. volvacea 190 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης διαφορετικών πηγών C και Ν στη φυσιολογία του. Μεγάλη παραγωγή βιομάζας διαπιστώθηκε κατά την αύξησή του στη γλυκόζη και τη φρουκτόζη (14,5-15,2 g/l), τόσο σε αναδευόμενες όσο και σε στατικές καλλιέργειες, αλλά και στο άμυλο στις αναδευόμενες (15,5 g/l), ενώ ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας (π.χ. 11,3 g/l) και με υψηλό συντελεστή YX/Glc (~0,7 g/g) αναφέρθηκαν για την ξυλόζη στις στατικές καλλιέργειες. Πολύ μικρότερη παραγωγή βιομάζας σημειώθηκε στις μαλτόζη και σακχαρόζη, τόσο στις αναδευόμενες όσο και τις στατικές καλλιέργειες. Σχετικά με τις πηγές αζώτου, η πεπτόνη και το εκχύλισμα ζύμης έδωσαν πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα, ενώ περιορισμένη βιομάζα παρατηρήθηκε στην ουρία, το ΝΗ4ΝΟ3 και την L-τρυπτοφάνη. Σε ό,τι αφορά την παραγωγή των EPS, τα πιο ικανοποιητικά υποστρώματα ήταν οι γλυκόζη και φρουκτόζη υπό αναδευόμενες συνθήκες και οι ξυλόζη, άμυλο και φρουκτόζη υπό στατικές. Θα πρέπει να σημειωθεί ωστόσο ότι πολύ ικανοποιητική βιοσύνθεση EPS πραγματοποιήθηκε στα υποστρώματα που δεν ευνόησαν την παραγωγή βιομάζας. Η συγκέντρωση των IPS έδειξε να εξαρτάται από την πηγή C, με τις γλυκόζη και φρουκτόζη να ευνοούν την παραγωγή τους υπό αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και το άμυλο υπό αναδευόμενες. Κύριο συστατικό των παραγόμενων πολυσακχαριτών αναδείχθηκε η γλυκόζη, ανεξάρτητα από το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε. H βιοσύνθεση και η σύσταση των συνολικών λιπιδίων που μελετήθηκαν στις διάφορες πηγές άνθρακα και αζώτου και σε διάφορα χρονικά σημεία της ζύμωσης ήταν σε συνάφεια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, καθώς μεγαλύτερα ποσοστά λιπιδίων (σε %, κ.β. επί της ξηράς μυκηλιακής μάζας) αναφέρθηκαν στις πρώιμες φάσεις της αύξησης (μέγιστο ποσοστό λιπιδίων ~18%, κ.β.), με το ποσοστό λίπους να μειώνεται αξιοσημείωτα προϊούσης της ζύμωσης. Όπως και σε προηγούμενες αναλύσεις, παρατηρήθηκε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) επί των παραγόμενων μυκηλιακών λιπιδίων. Πάντως, καίτοι οι διάφορες πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζουν μεγάλη βιοχημική ομοιότητα σε μεταβολικό επίπεδο, η αύξηση του V. volvacea AMRL 190 σε αυτού του είδους τα υποστρώματα έδειξε αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις στο επίπεδο της σύστασης σε λιπαρά οξέα των συνολικών λιπιδίων. Επίσης, ποσοτικοποίηση των λιπιδιακών κλασμάτων έδειξε (σχετικά) υψηλή περιεκτικότητα των NL (47-65% κ.β. επί των συνολικών λιπιδίων), ενώ σε μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα G+S και (κυρίως) τα PL. Ανάλυση της σύστασης των φωσφολιπιδίων έδειξε διαφοροποιήσεις σχετιζόμενες με τις πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ τα κύρια PL που ανιχνεύτηκαν ήταν οι κλάσεις φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (PE), φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI), φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και φωσφατιδυλοχολίνη (PS). Τέλος, ο μύκητας V. volvacea 190 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις γλυκόζης (30 έως 95 g/l) και σταθερή αρχική συγκέντρωση αζώτου. Στα πρώιμα στάδια των ζυμώσεων, η αύξηση του αρχικού λόγου C/N (από 20 έως 60) είχε ως απόρροια αξιοσημείωτη αύξηση του ποσοστού των παραγόμενων ενδοκυτταρικών λιπιδίων (από ~14% σε ~31% κ.β. επί ξηράς μάζας), ενώ αυξήθηκε και η μέγιστη συγκέντρωση μυκηλιακής μάζας (μέγιστη τιμή βιομάζας ~22 g/l για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l). Παρόλα αυτά, ο συντελεστής YX/Glc μειώθηκε αξιοσημείωτα με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης, ενώ η ταχύτητα κατανάλωσης της γλυκόζης rGlc (σε g/l/d) αυξήθηκε σημαντικά. Ο αυξανόμενος περιορισμός του μέσου σε άζωτο είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση IPS σε πολύ μεγάλες και διαρκώς αυξανόμενες ποσότητες. Η μέγιστη συγκέντρωση IPS ανιχνεύτηκε για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l και ήταν 12,2 g/l, τιμή συγκρινόμενη με τις υψηλότερες της διεθνούς βιβλιογραφίας. Κινητική ανάλυση της βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικών λιπιδίων και πολυσακχαριτών έδειξε μια αλληλοδιαδοχή στη συσσώρευση των ενδοκυτταρικών προϊόντων, καθώς αρχικά συντέθηκαν σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπίδια και κατόπιν παρατηρήθηκε αύξηση της συσσώρευσης των IPS με ταυτόχρονη αποικοδόμηση των λιπιδίων. Στα υποστρώματα που εμφάνιζαν υψηλούς λόγους C/N υπήρχε σύνθεση λιπιδίων πλούσιων σε λινελαϊκό οξύ, ενώ η παρουσία των χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) μειωνόταν πολύ. Το κλάσμα των PL ήταν εκ νέου το πιο κορεσμένο, ενώ ανιχνεύτηκαν κυρίως οι κλάσεις PE, PI, PC και PS, το ποσοστό των οποίων μεταβάλλονταν με το λόγο C/N και το χρόνο της ζύμωσης. Τέλος, η σύσταση των παραγομένων IPS σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο καλλιέργειας, με τη γλυκόζη να είναι η κύρια δομική μονάδα των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών.