Μελέτη της ρύθμισης του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1a μέσω φωσφορυλίωσης και του ρόλου του στον κυτταρικό μεταβολισμό
Authors: Κούρτη Μαρία 
Published: August 2021

Ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας HIF-1 είναι ένας ετεροδιμερής μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την προσαρμογή των κυττάρων σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου. Ο HIF-1 αποτελείται από μια αλφα υπομονάδα (HIF-1α), που επάγεται από την υποξία, και μια βήτα υπομονάδα (HIF-1β ή ARNT) η οποία εκφράζεται συνεχώς. Η σταθερότητα του HIF-1α εξαρτάται από τη συγκέντρωση οξυγόνου αλλά η δράση του HIF-1 ρυθμίζεται και από ανεξάρτητους του οξυγόνου μηχανισμούς που δρουν μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως είναι η φωσφορυλίωση. Η κινάση ERK φωσφορυλιώνει τον HIF-1α στην επικράτεια ETD και διεγείρει τη δράση του, αναστέλλοντας την έξοδό του από τον πυρήνα. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής εξατάσθηκε η υπόθεση ότι η έκφραση της επικράτειας ETD ή μεταλλαγμένων μορφών της ως ανασυνδυασμένα ανεξάρτητα πολυπεπτίδια, σε κύτταρα που καλλιεργούνται σε συνθήκες υποξίας είναι δυνατόν να εμποδίσει την φωσφορυλίωση και συνεπώς την ενεργοποίηση του ενδογενούς HIF-1α. Πειράματα με διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης και σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια ETD τα οποία περιέχουν τις θέσεις φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK (ETD wt, ETD I→A) ή μετάλλαξη που μιμείται την φωσφορυλίωση (ETD S→E) εντοπίστηκαν κυρίως στον πυρήνα, προκάλεσαν την εξαγωγή του HIF-1α στο κυτταρόπλασμα και μείωσαν σημαντικά την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 στην υποξία. Αντίθετα, το μεταλλαγμένο πολυπεπτίδιο που δεν μπορεί να φωσφορυλιωθεί από την ERK (ETD S→A) εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και δεν επηρέασε σημαντικά τον εντοπισμό και τη δραστικότητα του HIF-1α. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, η επικράτεια ETD μπορεί πράγματι να χρησιμοποιηθεί ως βάση σχεδίασης ειδικών και αποτελεσματικών πεπτιδικών αναστολέων του HIF-1.Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η επίδραση της κινάσης CK1δ, που φωσφορυλιώνει την επικράτεια PAS του HIF-1α και αναστέλλει τη δράση του, στον σχηματισμό συμπλόκων HIF-1α/ ARNT σε ακέραια ή ζωντανά κύτταρα, χρησιμοποιώντας τις μικροσκοπικές μεθόδους σύνδεση εγγύτητας in situ (in situ PLA) και επαναφορά φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση από τη CK1δ εμποδίζει τον ετεροδιμερισμό του HIF-1α με τον ARNT και την δέσμευσή του στη χρωματίνη. Επιπλέον, με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης δείχθηκε ότι η αναστολή της CK1δ ενισχύει την αλληλεπίδραση του HIF-1α με τον υποκινητή του γονιδίου της λιπίνης-1, ενζύμου που συμμετέχει στη σύνθεση τριγλυκεριδίων στην υποξία. Ταυτόχρονα η αναστολή της CK1δ ενίσχυσε τον σχηματισμό λιποσταγονιδίων και τον πολλαπλασιασμό τόσο καρκινικών όσο και πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων σε συνθήκες υποξίας, με εξαρτώμενο από τον HIF-1α και τη λιπίνη-1 τρόπο. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν την εμπλοκή της CK1δ στη μεταβολική προσαρμογή των κυττάρων σε συνθήκες υποξίας και αναδεικνύουν νέους τρόπους ρύθμισης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά την υποξία.Συνολικά, τα παραπάνω ευρήματα διελευκάνουν περαιτέρω τη ρύθμιση της δράσης του HIF-1 μέσω φωσφορυλίωσης από τις κινάσες ERK1/2 και CK1δ και επιτρέπουν την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, όπου είναι απαραίτητη η καταστολή της δράσης του HIF-1α, ή οι ισχαιμικές παθήσεις, όπου, αντίθετα, είναι επιθυμητή η ενίσχυση της λειτουργίας του HIF-1.