Παραγωγή μικροβιακών ελαίων, ενδοπολυσακχαριτών και πολυολών κατά την αύξηση ζυμών σε υποστρώματα με βάση την ακάθαρτη γλυκερόλη, υποπροϊόν της διεργασίας παραγωγής καυσίμου τύπου βιοντίζελ
Authors: Φιλιππούση Ροζανίνα 
Published: March 2024

Η πειραματική διαδικασία για την πραγματοποίηση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της ικανότητας δύο στελεχών ζυμών, των Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 και Debaryomyces sp. FMCC Y69, να μεταβολίζουν τη βιομηχανική γλυκερόλη κατά τη διάρκεια ζυμώσεων κάτω από διαφορετικές συνθήκες υπό περιορισμό σε άζωτο, προς παραγωγή χρήσιμων βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας τα οποία παράγονταν όταν το άζωτο αποτελούσε το περιοριστικό στοιχείο στο μέσο της αύξησης. Όλες οι καλλιέργειες έλαβαν χώρα σε αναδευόμενες φιάλες των 250 mL, εκτός από λίγες περιπτώσεις όπου εμφανίστηκαν ικανοποιητικά αποτελέσματα σε σχέση με την παραγωγή των επιζητουμένων προϊόντων (λιπίδια για το μικροοργανισμό R. toruloides NRRL Y-27012 και αραβιτόλη για το μικροοργανισμό Debaryomyces sp. FMCC Y69) και όπου έλαβαν χώρα ζυμώσεις και σε κλειστού τύπου αναδευόμενους και αεριζόμενους εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες. Για το σκοπό αυτό, η πειραματική μελέτη χωρίστηκε σε δυο βασικά μέρη με βάση το μικροοργανισμό που χρησιμοποιήθηκε κάθε φορά. Στο πρώτο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής παρουσιάζονται οι μικροβιακές ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την ελαιογόνο ζύμη Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 σε υπόστρωμα γλυκερόλης (Glol) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και συνθήκες. Στόχος της συγκεκριμένης σειράς πειραμάτων ήταν η μελέτη της ικανότητας της συγκεκριμένης ζύμης να μεταβολίζει την παραπάνω πηγή άνθρακα προς παραγωγή βιομάζας, ενδοπολυσακχαριτών και λιπιδίων. Αρχικά μελετήθηκαν δύο διαφορετικοί τρόποι εκχύλισης για την ανάκτηση των λιπιδίων. Συγκεκριμένα εφαρμόστηκε η μέθοδος μίγματος διαλυτών χλωροφορμίου (CHCl3)–μεθανόλης (CH3OH), ενώ στη δεύτερη περίπτωση έγινε αρχικά όξινη υδρόλυση με HCl και στη συνέχεια εκχύλιση με μίγμα διαλυτών CHCl3–CH3OH. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της τιμής του pH στην αύξηση και παραγωγή των μεταβολικών προϊόντων σε τρεις διαφορετικές τιμές, 3,5, 5,5 και 6,5. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η τιμή του pH επηρεάζει την παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων χωρίς να μεταβάλει στη σύσταση των λιπαρών οξέων. Το pH 5,5 αποδείχτηκε το βέλτιστο για την παραγωγή λιπιδίων και βιομάζας. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της πηγής άνθρακα στη φυσιολογική λειτουργία του μικροοργανισμού. Προκειμένου να ερευνηθεί ο μεταβολισμός σε μικτό υπόστρωμα γλυκόζης-γλυκερόλης, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες κλειστού τύπου σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα μεμονωμένα ή σε κοινή ζύμωση. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια ζύμωση κλειστού τύπου σε γλυκόζη (Glc) με αρχική συγκέντρωση 80 g/L (μάρτυρας) και ζυμώσεις με μικτό υπόστρωμα γλυκόζης και γλυκερόλης σε αναλογίες Glc: Glol=1: 3 w/w, 3: 1 w/w, 1: 1 w/w, αντίστοιχα. Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν φαίνεται ότι η παρουσία γλυκόζης και γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο είχε ως απόρροια για τη συγκεκριμένη ζύμη την εμφάνιση της καταβολικής καταστολής για την κατανάλωση της γλυκερόλης δεδομένου ότι ο μικροοργανισμός επέλεξε να καταναλώσει αποκλειστικά τη γλυκόζη στα αρχικά στάδια της ζύμωσης, και η κατανάλωση γλυκερόλης εκκίνησε στα μεταγενέστερα στάδια της καλλιέργειας και όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης ήταν πολύ χαμηλή στο μέσο της αύξησης. Εντούτοις το υπόστρωμα που απέδωσε τη μέγιστη παραγωγή λίπους ήταν εκείνο που περιείχε αποκλειστικά γλυκερόλη με αρχική συγκέντρωση 80 g/L.Ο επόμενος παράγοντας που μελετήθηκε ήταν η επίδραση της συγκέντρωσης του χλωριούχου νατρίου (NaCl) στο υπόστρωμα, στην αύξηση της ζύμης καθώς επίσης και στην παραγωγή των μεταβολικών προϊόντων. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν έξι ζυμώσεις σε πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη χρησιμοποιώντας αυξανόμενη συγκέντρωση NaCl στο υπόστρωμα της καλλιέργειας (0,2; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0%, w/v). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη NaCl σε χαμηλές συγκεντρώσεις από 0,2-0,8%, w/v επέδρασε θετικά στη σύνθεση λιπιδίων καθώς η απόλυτη τιμή του λίπους αυξήθηκε έως και ~5 g/L σε σχέση με το μάρτυρα. Έτσι στην καλλιέργεια του μάρτυρα (χωρίς NaCl) η συγκέντρωση λιπιδίων ήταν 8,9 g/L ενώ όταν προστέθηκαν 0,2%, w/v NaCl, η συγκέντρωση λιπιδίων ήταν 13,3 g/L. Αντίθετα η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων άλατος (>1%, w/v NaCl) είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση τόσο της παραγόμενης βιομάζας όσο και των λιπιδίων, προφανώς λόγω παρεμπόδισης η οποία προκλήθηκε λόγω των υψηλών συγκεντρώσεων του άλατος. Άξιο αναφοράς είναι το γεγονός ότι η υπαγωγή της καλλιέργειας σε υψηλή συγκέντρωση άλατος (30 g/L) ευνόησε τη σύνθεση του ενδο-κυτταρικού α-λινολενικού οξέος (Δ9,12,15C18: 3), το ποσοστό του οποίου ήταν ίσο σε ~8,5%, w/w. Στις λοιπές καλλιέργειες, η σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα αποτελούταν κυρίως από ελαϊκό (Δ9C18: 1) με ποσοστά ~45-50%, w/w και παλμιτικό (C16: 0) ~28-35%, w/w. Αναφορικά με τα υπόλοιπα λιπαρά οξέα, το στεατικό (C18: 0), το λινελαϊκό οξύ (Δ9,12C18: 2) και το α-λινολενικό οξύ (Δ9,12,15C18: 3) κατείχαν συνολικά σχετικά μικρό ποσοστό της τάξεως του ~3-12%, w/w. Προκειμένου να μειωθεί το κόστος της διεργασίας στο μέσο της καλλιέργειας προστέθηκε ως ανασταλτικός παράγοντας ένα υδρογλυκερινικό εκχύλισμα από στερεά απόβλητα κρεμμυδιού (Onion Solid Wastes, OSWs). Ο απώτερος σκοπός του συγκεκριμένου πειράματος ήταν η μελέτη της προσθήκης του αποβλήτου στη φυσιολογική συμπεριφορά του μικροοργανισμού, η πιθανή αύξηση (ή μείωση) της συγκέντρωσης της βιομάζας και των λιπιδίων λόγω της παρουσίας των OSWs στο θρεπτικό μέσο, και τελικώς η πιθανή διενέργεια ζύμωσης υπό μη-ασηπτικές συνθήκες με την προσθήκη OSWs σε μέσο με πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη, εφόσον ένα σημαντικό κόστος της βιοδιεργασίας για παραγωγή των μικροβιακών λιπιδίων αποτελεί η αποστείρωση. Ωστόσο η παρουσία φαινολικών ουσιών στο εκχύλισμα οδήγησε στη μείωση της τελικής συγκέντρωσης των ολικών λιπιδίων (6,2 g/L) κατά ~2,5 g/L σε σχέση με το μάρτυρα. Στη συνέχεια ακολούθησαν πειράματα με διαφορετική αναλογία του λόγου C/N (50; 100; 160; 240 moles/moles) σε υπόστρωμα με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 90 g/L. Ο λόγος με αναλογία C/N=50 moles/moles ήταν ο βέλτιστος για την παραγωγή βιομάζας με τη μέγιστη τιμή της να είναι ίση με 30,2 g/L (ταυτόχρονη συγκέντρωση μικροβιακού λίπους L=10,1 g/L). Αντίθετα στη ζύμωση με λόγο C/N=100 moles/moles σημειώθηκε το μέγιστο ποσοστό λίπους επί ξηράς ουσία, περίπου ~50% με ταυτόχρονη συγκέντρωση λιπιδίων L=12,0 g/L. Καλλιέργεια σε μεγαλύτερο αρχικό λόγο C/N είχε ως απόρροια μείωση της λιποπεριεκτικότητας τόσο σε απόλυτες (g/L) όσο και σε σχετικές (% λίπους επί ξηρού) τιμές, υποδηλώνοντας την ύπαρξη ενός βέλτιστου αρχικού λόγου C/N για τη διεργασία. Τέλος για τη βελτιστοποίηση της διαδικασίας και την παραγωγή μεταβολικών προϊόντων σε υψηλότερη συγκέντρωση πραγματοποιήθηκε κλειστή ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα σε αρχική συγκέντρωση 90 g/L. Οι μέγιστές τιμές παραγόμενης βιομάζας και λιπιδίων σημείωσαν αύξηση σε σχέση με τις κωνικές φιάλες στο τέλος της ζύμωσης φτάνοντας τα 26,8 g/L και 13,5 g/L αντίστοιχα ενώ οι μέγιστες αποδόσεις βιομάζας και λιπιδίων ήταν 0,56 g/g και 0,16 g/g αντίστοιχα, οι οποίες δεν έδειξαν να επηρεάζονται σημαντικά σε σύγκριση με το πείραμα που διεξήχθη σε κωνικές φιάλες. Από την άλλη πλευρά, τόσο η κατανάλωση της γλυκερόλης όσο και η παραγωγή της βιομάζας και των λιπιδίων έλαβε χώρα αρκετά πιο γρήγορα (περίπου στο μισό διάστημα) σε σχέση με τη διεργασία στις αναδευόμενες φιάλες. Στο δεύτερο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής παρουσιάζονται οι μικροβιακές ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη ζύμη Debaryomyces sp. FMCC Y69 για τη παραγωγή αραβιτόλης. Αρχικώς, πραγματοποιήθηκε ζύμωση σε υπόστρωμα γλυκόζης με πολύ υψηλή συγκέντρωση της τελευταίας (50%, w/v), δεδομένου ότι με βάση τη βιβλιογραφία, αύξηση του στελέχους σε υπόστρωμα αρχικής συγκέντρωσης σακχάρου >50%, w/v θα κατεδείκνυε ότι το εν λόγω στέλεχος ανήκει στο είδος Debaryomyces prosopidis. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν κλειστού τύπου καλλιέργειες τόσο σε κωνικές φιάλες όσο και σε βιοαντιδραστήρα χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη σε αρχικές συγκεντρώσεις 80 g/L και 125 g/L. Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκε γλυκερόλη σε αρχική συγκέντρωση 80 g/L, παρήχθησαν περίπου 30 g/L αραβιτόλης (Ara) με απόδοση ~0,40 g/g, σε κωνικές φιάλες αλλά και στο βιοαντιδραστήρα. Ωστόσο αύξηση στη συγκέντρωση και την απόδοση του τελικού προϊόντος παρατηρήθηκε στην υψηλότερη συγκέντρωση γλυκερόλης τόσο στις ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες (Ara=70,9 g/L) αλλά και σε βιοαντιδραστήρα (Ara=65,5 g/L). Αξίζει να τονιστεί ότι, η απόδοση προϊόντος ως προς το αναλωθέν υπόστρωμα σημείωσε μία από τις μέγιστες τιμές που έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά μέχρι στιγμής (YAra/Glol=0,57 g/g). Συγκριτικά με το πείραμα το οποίο έλαβε χώρα στις φιάλες, η καλλιέργεια στο βιοαντιδραστήρα είχε ως απόρροια πολύ ταχύτερη κατανάλωση της γλυκερόλης, όπως επίσης και πολύ υψηλότερη παραγωγή βιομάζας και η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών (IPS) προσδιορίστηκε μεταξύ ~20-40%, w/w επί της ξηρής μάζας στη συγκέντρωση Glol~80 g/L και 20-32%, w/w στη συγκέντρωση Glol~125 g/L. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση του pH στο συγκεκριμένο στέλεχος κατά τη διάρκεια ζυμώσεων κλειστού τύπου σε γλυκερόλη. Το όξινο pH επηρέασε δυσμενώς την ανάπτυξη του στελέχους και τη σύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών. Ωστόσο, η βέλτιστη απόδοση του παραγόμενου προϊόντος σημειώθηκε στη τιμή pH 5,5. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις κλειστού τύπου σε κωνικές φιάλες σε διαφορετικά μίγματα γλυκόζης και γλυκερόλης με τελική συγκέντρωση 125 g/L. Η παρουσία γλυκόζης προκάλεσε καταβολική καταστολή στην κατανάλωση της γλυκερόλης και μείωση στη τελική συγκέντρωση προϊόντος. Συμπερασματικά, το στέλεχος έδειξε να αποδίδει καλύτερα σε υπόστρωμα που περιείχε αμιγώς γλυκερόλη. Συγκεκριμένα, στην αναλογία Glc: Glol=1: 1 w/w η τελική συγκέντρωση αραβιτόλης ήταν 67,7 g/L με απόδοση παραγόμενης αραβιτόλης προς αναλωθέν υπόστρωμα (γλυκόζη + γλυκερόλη) (YAra/S)=0,55 g/g. Ο επόμενος παράγοντας που μελετήθηκε ήταν η επίδραση της προσθήκης του χλωριούχου νατρίου στην αύξηση και την παραγωγή αραβιτόλης από το μικροοργανισμό D. prosopidis, πραγματοποιώντας ζυμώσεις σε αυξανόμενη συγκέντρωση NaCl (2,0; 5,0; 8,0; 12,0; 16,0%, w/v). Η ζύμη έδειξε εξαιρετική ωσμωανθεκτική ικανότητα ωστόσο η παραγωγή αραβιτόλης παρεμποδίστηκε σε συγκέντρωση NaCl≥5%, w/v. Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε και μια κλειστή καλλιέργεια με 5%, w/v NaCl και μη θερμικά επεξεργασμένο θρεπτικό μέσο. Η παρουσία του άλατος περιόρισε τη βακτηριακή επιμόλυνση και βοήθησε την επικράτηση της ζύμης και την παραγωγή πολυόλης (Ara=43,6 g/L). Στη συνέχεια ακολούθησαν τρία πειράματα με διαφορετική αρχική αναλογία του λόγου C/N (ήτοι C/N=79 moles/moles, 158 moles/moles, 246 moles/moles) σε αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 135 g/L με την υψηλότερη απόδοση για την αραβιτόλη να σημειώνεται στην τιμή C/N=158 moles/moles και ήταν ίση με 70,0 g/L και συντελεστή απόδοσης παραχθείσας αραβιτόλης προς αναλωθείσα γλυκερόλη (YAra/Glol) ~0,52 g/g. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω πειράματα, προέκυψε ότι οι βέλτιστες συνθήκες για παραγωγή αραβιτόλης είναι η χρήση της γλυκερόλης ως πηγή άνθρακα με pH=5,5 και λόγο C/N=158 moles/moles. Τέλος, για την αύξηση στην παραγόμενη ποσότητα αραβιτόλης αλλά και στην τελική απόδοση, πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής τροφοδοτούμενη καλλιέργεια σε κωνικές φιάλες των 250 mL χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα τη γλυκερόλη. Η παραγωγή αραβιτόλης ήταν ~91 g/L με απόδοση YAra/Glol~0,53 g/g. Η ανωτέρω επιτευχθείσα τιμή της αραβιτόλης, ήταν από τις υψηλότερες που έχουν αναφερθεί ποτέ στη διεθνή βιβλιογραφία για άγρια (μη γενετικώς τροποποιημένα) στελέχη ζυμών κατά την αύξησή τους σε οποιαδήποτε πηγή άνθρακα η οποία να χρησιμοποιείται ως υλικό εκκίνησης της διεργασίας. Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ότι τα στελέχη των ζυμών Rhodosporidium toruloides και Debaryomyces prosopidis μπορούν να μεταβολίζουν την ακάθαρτη γλυκερόλη προς παραγωγή μεταβολικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας όπως λιπίδια και αραβιτόλη συμβάλλοντας στην άρση ποικίλων προβλημάτων που σχετίζονται με την επισιτιστική και ενεργειακή κρίση και προωθώντας την πράσινη ανάπτυξη, την αειφορία και την κυκλική οικονομία.