Φαινοτυπική και γονοτυπική μελέτη της ανθεκτικότητας του Ureaplasma urealyticum στη Βόρειο Ελλάδα
Authors: Κοτρώτσιου Δήμητρα-Τζιμούλα 
Published: August 2021

Εισαγωγή: Το U.urealyticum spp. είναι ένας μικροοργανισμός πολύ διαδεδομένος στον άνθρωπο, που αποικίζει διάφορες περιοχές του σώματός του και συχνά προκαλεί οξείες ή χρόνιες λοιμώξεις. Καθώς ο μικροοργανισμός στερείται κυτταρικού τοιχώματος, η αντιμετώπιση των λοιμώξεων που προκαλεί περιορίζεται κυρίως στις κινολόνες, τις μακρολίδες και τις τετρακυκλίνες. Η περιορισμένη πλέον παραγωγή νέων αντιμικροβιακών καθιστά επιτακτική την ανάγκη ορθής και αποτελεσματικής χορήγησης αυτών που υπάρχουν. Η παγκόσμια επιστημονική κοινότητα είναι ήδη ευαισθητοποιημένη, καθώς τα ουρεαπλάσματα έχουν ήδη από ετών αποκτήσει ικανά επίπεδα ανθεκτικότητας σε ορισμένα από τα χορηγούμενα αντιμικροβιακά. Σκοπός: Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν να ελέγξει την ανθεκτικότητα των στελεχών του U.urealyticum spp., που κυκλοφορούν στη Βόρεια Ελλάδα, στα χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά φάρμακα, σε φαινοτυπικό όσο και σε γονιδιακό επίπεδο.Υλικό και μέθοδος: Επρόκειτο για συγχρονική μελέτη (cross-sectional study) χρονικής στιγμής σε σχέση με τον επιπολασμό, η οποία περιλαμβάνει έλεγχο της ανθεκτικότητας του U.urealyticum spp. στα χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά με συμβατικές και μοριακές τεχνικές. Το υλικό της εργασίας αποτέλεσαν 100 θετικά δείγματα για U.urealyticum spp. που προήλθαν από νοσοκομεία της Θεσσαλονίκης, το διάστημα 2010-2011. Τα κλινικά δείγματα ήταν τραχηλικά επιχρίσματα γυναικών και ουρηθρικά εκκρίματα ανδρών, στα οποία ο μικροοργανισμός απομονώθηκε με καλλιέργεια σε άγαρ Α7. Και τα 100 θετικά δείγματα για U.urealyticum spp. που επιλέχθηκαν είχαν συγκέντρωση μικροβίου >104 CFU/ml και δεν υπήρχε συλλοίμωξη του γεννητικού συστήματος των ασθενών με άλλο γεννητικό μυκόπλασμα. Ακολούθησε φαινοτυπικός έλεγχος ανθεκτικότητας του μικροοργανισμού με προτυποποιημένη μέθοδο. Επιβεβαιωτικά έγινε ανίχνευση του γονιδίου της ουρεάσης με real-time PCR στα δείγματα με θετική καλλιέργεια. Πραγματοποιήθηκε μοριακός διαχωρισμός του U.urealyticum spp. στα είδη του και μοριακός διαχωρισμός στελεχών U.parvum στους γονοτύπους τους. Για την ανίχνευση πιθανών μεταλλάξεων στις υπομονάδες-στόχους των χρησιμοποιούμενων αντιμικροβιακών, έγινε ενίσχυση όλων των υπομονάδων-στόχων των κινολονών σε όλα τα στελέχη, όλων των υπομονάδων-στόχων των μακρολιδών στα μη ευαίσθητα στελέχη και του γονιδίου tetM για τις τετρακυκλίνες σε όλα τα στελέχη. Η ανίχνευση των γονιδίων ουρεάσης και tetM πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά βιβλιογραφικά με εφαρμογή τεχνικών Real Time PCR. Ακολούθησε αλληλούχηση των προϊόντων ενίσχυσης για τις κινολόνες και τις μακρολίδες σε επιλεγμένα στελέχη και έγινε σύγκριση των αλληλουχιών με αυτές των αντίστοιχων πρότυπων στελεχών. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος χ2 και οι παραλλαγές της και το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 17.0. Αποτελέσματα: Η συχνότητα ανεύρεσης του U.urealyticum spp. σε υγιείς ασυμπτωματικές γυναίκες ηλικίας 20-70 ετών στην Βόρεια Ελλάδα βρέθηκε σε ποσοστό 16,13%. Οι υγιείς φορείς του μικροοργανισμού σε υψηλές συγκεντρώσεις (≥104CFU/ml) είναι στην πλειοψηφία τους γυναίκες σε αναπαραγωγική ηλικία, ενώ το κυρίαρχο είδος στα στελέχη του μικροοργανισμού βρέθηκε το U.parvum. Η ομάδα των τετρακυκλινών προκρίνεται, ως η πιο αποτελεσματική φαινοτυπικώς θεραπευτική αγωγή (αντοχή 0%), ακολουθούμενη από τις μακρολίδες (αντοχή 4%), ενώ αντίθετα η ανθεκτικότητα του μικροοργανισμού στις κινολόνες είναι ιδιαίτερα υψηλή (>50%). Η οφλοξασίνη υπερέχει στατιστικά σημαντικά της σιπροφλοξασίνης ως προς την ευαισθησία στο σύνολο των θετικών δειγμάτων για U.urealyticum spp., και στα δύο είδη του μικροοργανισμού. Οι περισσότερες νουκλεοτιδικές/αμινοξικές αλλαγές που σχετίζονται με ανθεκτικότητα στις κινολόνες σημειώνονται στις πρωτεϊνικές υπομονάδες της τοποϊσομεράσης IV, ειδικότερα στην υπομονάδα ParC. Σε ότι αφορά τις μακρολίδες, στελέχη με χαμηλές MIC εμφανίζουν μεταλλάξεις στους γνωστούς στόχους των εν λόγω αντιβιοτικών. Σε περισσότερα από το ένα τρίτο των φαινοτυπικώς ευαίσθητων στελεχών του U.urealyticum spp. στις τετρακυκλίνες ανιχνεύθηκε το γονίδιο ανθεκτικότητας tetM. Ανιχνεύθηκαν 11 νέοι πολυμορφισμοί στην υπομονάδα ParC, 1 στην υπομονάδα ParE για τις κινολόνες και 1 στο γονίδιο της πρωτεΐνης L22 για τις μακρολίδες, που αναφέρονται για πρώτη φορά διεθνώς. Δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της κλινικής εικόνας και της παρουσίας ή όχι μεταλλάξεων και γονιδίων ανθεκτικότητας.Συμπεράσματα: Οι υγιείς φορείς του μικροοργανισμού υπολογίζονται σε περίπου μία στις 6 γυναίκες στη Βόρεια Ελλάδα, με το υψηλότερο ποσοστό στην αναπαραγωγική ηλικία. Οι κινολόνες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται με περίσκεψη και αν υπάρχει η δυνατότητα επιλογής, συνιστάται η οφλοξασίνη. Τα στελέχη που απομονώθηκαν από ασθενείς και φορείς δεν διέφεραν στατιστικά ως προς την ευαισθησία στις κινολόνες. Ανιχνεύθηκαν νέοι πολυμορφισμοί που αναφέρονται για πρώτη φορά διεθνώς. Διαπιστώθηκε ότι στελέχη με την ίδια φαινοτυπική ευαισθησία παρουσιάζουν διαφορετικές μεταλλάξεις, που οδηγούν στην υπόθεση ότι όλες οι μεταλλάξεις δεν σχετίζονται ισχυρά με ανθεκτικότητα. Επίσης, η σημασία της παρουσίας του γονιδίου tetM αξιολογείται με περίσκεψη. Συμπερασματικά: α) η χορηγούμενη θεραπευτική αγωγή καλόν είναι να βασίζεται στον έλεγχο φαινοτυπικής ευαισθησίας του μικροοργανισμού, αντί της εμπειρικής θεραπείας που συνήθως δίνεται στην καθ’ημέρα κλινική πράξη β) για την επιδημιολογική επιτήρηση του U.urealyticum spp. έχει σημασία η συσχέτιση της φαινοτυπικής ανθεκτικότητας με το γονοτυπικό του προφίλ.