Υπολογιστική ανάλυση των λειτουργιών των μη κωδικών μεταγραφών στη γονιδιωματική ρύθμιση
Authors: Καραγκούνη Δήμητρα 
Published: September 2021

Οι ραγδαίες τεχνολογικές εξελίξεις την τελευταία δεκαετία επέτρεψαν αναλύσεις μεγάλης κλίμακας στο πεδίο του «ρυθμιστικού RNA», μετατρέποντας τα μη-κωδικά μετάγραφα, που αρχικά θεωρούνταν «σκουπίδια», σε ερευνητικό «χρυσωρυχείο». Τα μη-κωδικά μετάγραφα διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο σε ένα αξιοσημείωτο αριθμό από φυσιολογικές και παθολογικές βιολογικές διεργασίες. Η τεράστια παραγωγή δεδομένων ήταν επίσης ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες της επιταχυνόμενης εξέλιξης του τομέα της βιοπληροφορικής, ενός τομέα εξειδικευμένου στην ανάλυση βιολογικών δεδομένων και την ανάπτυξη υπολογιστικών εργαλείων, απαραίτητων για την επεξεργασία και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων τους. Αυτή η εργασία επικεντρώνεται στο λεπτομερή και ακριβή συνδυασμό υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας δεδομένων και σύγχρονων τεχνικών μηχανικής μάθησης για την ανάπτυξη αλγορίθμων με στόχο το λειτουργικό χαρακτηρισμό των μη-κωδικών μεταγραφών.Η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται σε μια συγκεκριμένη κατηγορία μεταγραφών, τα microRNAs. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μονόκλωνα, μη-κωδικά μόρια RNA, μήκους ~ 22 νουκλεοτιδίων, που προσδένονται στην πρωτεΐνη Αργοναύτη (AGO) για να προκαλέσουν τη διάσπαση του μεταγράφου-στόχου, την αποικοδόμηση ή την καταστολή της μετάφρασής του. Ο ακριβής χαρακτηρισμός των στόχων τους θεωρείται θεμελιώδης για την αποσαφήνιση του ρυθμιστικού τους ρόλου. Τα τελευταία 15 χρόνια, έχει αναπτυχθεί μία πληθώρα υπολογιστικών και πειραματικών προσεγγίσεων με στόχο τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων των μικρών RNAs. Επί του παρόντος, οι τεχνικές υψηλής απόδοσης επέτρεψαν την εύρεση νέων πειραματικά υποστηριζόμενων αλληλεπιδράσεων των miRNAs σε όλο το μεταγράφωμα. Αυτός ο πλούτος των πληροφοριών είναι διασκορπισμένος σε μεγάλο αριθμό δημοσιεύσεων και ακατέργαστων δεδομένων. Κατά τη διάρκεια αυτής της διατριβής, σχεδιάστηκε το DIANA-TarBase v8.0, μια βάση δεδομένων αναφοράς, αφιερωμένη στην ευρετηρίαση πειραματικά υποστηριζόμενων στόχων των miRNAs. Η 8η έκδοση είναι η πρώτη βάση δεδομένων που αναφέρει περισσότερες από 1 εκατομμύριο καταχωρήσεις, που αντιστοιχούν σε ~700.000 μοναδικές miRNA-gene αλληλεπιδράσεις, υποστηριζόμενες από περισσότερες από 33 πειραματικές μεθοδολογίες, που έχουν εφαρμοστεί σε 592 κυτταρικούς τύπους/ιστούς, υπό~ 430 πειραματικές συνθήκες.Τα πειράματα με ανοσοκατακρήμνηση της πρωτεΐνης AGO (AGO-CLIP-Seq) αποτελούν τις πιο διαδεδομένες μεθοδολογίες υψηλής απόδοσης. Η AGO-PAR-CLIP τεχνική έχει πραγματοποιηθεί ευρέως για τη χαρτογράφηση miRNA-gene αλληλεπιδράσεων σε μεγάλη κλίμακα σε υγιείς ή ασθενείς τύπους κυττάρων. Οι υπολογιστικές μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί με στόχο την ανάλυση αυτών των δεδομένων παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα να διακρίνουν ένα μεγάλο μέρος των πραγματικών miRNA-στόχων. Για το σκοπό αυτό, ένας από τους σκοπούς της παρούσας διατριβής είναι να επανεξετάσει, να εντοπίσει και να αντιμετωπίσει τα τρέχοντα εμπόδια στην ανάλυση AGO-CLIP-Seq δεδομένων. Παρουσιάζεται, λοιπόν, το μοντέλο microCLIP, μία υπολογιστική προσέγγιση για την κατευθυνόμενη από CLIP-Seq δεδομένα αναγνώριση των αλληλεπιδράσεων των miRNAs. Το microCLIP είναι ένα καινοτόμο ensemble μοντέλο βαθειάς εκμάθησης (super learner) και η μόνη διαθέσιμη υπολογιστική προσέγγιση που αναλύει AGO-PAR-CLIP δεδομένα από το Α έως το Ω. Επεξεργάζεται όλες τις εμπλουτισμένες σε AGO περιοχές, παρέχοντας λειτουργικές περιοχές πρόσδεσης των miRNAs με ισχυρή προσβασιμότητα, που μέχρι πρότινος αγνοούνταν.Η ανάπτυξη του microCLIP ενέπνευσε τη δημιουργία ενός αλγόριθμου επόμενης γενιάς, για την εύρεση των στόχων των miRNAs απουσία πειράματος. Παρά την εκτενή ανάπτυξη σχετικών προσεγγίσεων που παρατηρείται τα τελευταία χρόνια, ακόμη και οι αλγόριθμοι αιχμής εξακολουθούν να επιτυγχάνουν χαμηλή ακρίβεια και αυξημένο αριθμό ψευδώς θετικών προβλέψεων. Για αυτόν το λόγο, αναπτύχθηκε το μοντέλο microT Super Learning που διατηρεί και αναβαθμίζει τη μεθοδολογία του microCLIP αλγορίθμου, ενισχύοντας την εκπαίδευσή του με ακόμη περισσότερα πειράματα υψηλής απόδοσης υπό έναν ιστο-ειδικό σχεδιασμό. Το νέο μοντέλο χαρακτηρίζει αλληλεπιδράσεις με ισχυρότερη λειτουργικότητα και ανιχνεύει σωστά 1.5 φορές περισσότερες πειραματικά επιβεβαιωμένες περιοχές πρόσδεσης των μικρών RNAs, όταν αντιπαρατίθεται με κορυφαίες υπολογιστικές προσεγγίσεις. Η αυξημένη απόδοση των αλγορίθμων microCLIP και microT στην ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων των miRNAs, αναδεικνύει ρυθμιστικά συμβάντα που μέχρι πρότινος αγνοούνταν και νέα μοριακά μονοπάτια που ελέγχονται από τα miRNAs.Κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας, η υποψήφια διδάκτωρ συμμετείχε σε 9 επιστημονικές δημοσιεύσεις που αφορούσαν υπολογιστικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της λειτουργίας των μη κωδικών μεταγραφών και σε δύο από αυτές είναι η πρώτη συγγραφέας. Η κύρια ερευνητική δραστηριότητα και η συμβολή της υποψήφιας στις δημοσιεύσεις αυτές αφορά την εφαρμογή αλγορίθμων, αυτοματοποιημένων ροών ανάλυσης για την επεξεργασία πειραματικών δεδομένων επόμενης γενιάς και τον κατάλληλο συνδυασμό τους με στόχο την αποσαφήνιση της λειτουργίας των μη-κωδικών RNAs και της συμμετοχής τους σε μηχανισμούς μετα-μεταγραφικής γονιδιακής ρύθμισης. Οι μελέτες έχουν δημοσιευθεί σε διεθνή περιοδικά υψηλής απήχησης και οι συνολικές ετεροαναφορές μέχρι σήμερα, σύμφωνα με το Google Scholar, είναι 942.