Ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και συνθετικών αναλόγων τους με σκοπό την αντιμετώπιση διαταραχών της εμμηνόπαυσης και την αξιολόγηση της επίδρασής τους στη δραστικότητα του ενζύμου τυροσινάση
Authors: Βοντζαλίδου Αργυρώ 
Published: September 2021

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε i) η ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και συνθετικών αναλόγων τους με σκοπό την αντιμετώπιση της οστεοπόρωσης ως την κύρια διαταραχή της εμμηνόπαυσης και ii) η αξιολόγηση της επίδρασης των συνθετικών αναλόγων στη δραστικότητα του ενζύμου τυροσινάση. Αρχικά, γνωρίζοντας τις ευεργετικές επιδράσες της ραλοξιφαίνης και άλλων εκλεκτικών ρυθμιστών των οιστρογονικών υποδοχέων (SERM, Selective Estrogen Receptor Modulators) στη διατήρηση της οστικής μάζας, πραγματοποιήθηκε in silico αξιολόγηση ενός σημαντικού αριθμού ενώσεων της χημειοθήκης του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων (ΕΦΧΦΠ), οι οποίες ανήκουν σε διάφορες χημικές κατηγορίες, με σκοπό την ανακάλυψη νέων δομικών σκελετών (scaffolds) ή/και υποκαταστατών που ευνοούν τη σύνδεση με τους προαναφερόμενους υποδοχείς. Τα αποτελέσματα τόσο της in silico αξιολόγησης, όσο και προγενέστερων in vitro ελέγχων της οιστρογονικής δράσης φυσικών προϊόντων και αναλόγων τους, αποτέλεσαν τη βάση για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη ελπιδοφόρων παραγώγων επιλεγμένων φυσικών προϊόντων. Παράλληλα, συνδυάζοντας πληροφορίες της παραδοσιακής θεραπευτικής, οι οποίες προέρχονται είτε από κείμενα των αρχαίων Ελλήνων Ιατρών-Συγγραφέων, είτε από σύγχρονες εθνοβοτανικές μελέτες, αλλά και λαμβάνοντας υπόψη σύγχρονα επιστημονικά δεδομένα αναφορικά με τη χρήση φυσικών προϊόντων για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης, επιλέχθηκαν ως αντικείμενο μελέτης φυτικά είδη της ελληνικής χλωρίδας σε μια προσπάθεια ανάδειξής της ως μια πλούσια πηγή βιοδραστικών παραγόντων.Πιο συγκεκριμένα, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής καταρτίστηκε μία συλλογή από 39 φυτικές δρόγες προερχόμενες από 36 είδη της ελληνικής χλωρίδας, τα οποία σε ένα μεγάλο ποσοστό ανήκουν στην οικογένεια Leguminosae και με βάση τη βιβλιογραφική ανασκόπηση θεωρήθηκαν πλούσια πηγή των επιλεγμένων δευτερογενών μεταβολιτών. Με τη χρήση πράσινων τεχνικών εκχύλισης (ASE, SFE) παρασκευάσθηκαν 75 εκχυλίσματα, τα οποία μελετήθηκαν με σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές (HPLC-DAD, HPTLC, LC-HRMS), ώστε να αξιολογηθεί το χημικό τους φορτίο και να καθοριστεί το φυτοχημικό τους «αποτύπωμα». Στη συνέχεια, με τη χρήση μιας σειράς in vitro κυτταρικών ελέγχων, τα προαναφερόμενα παρασκευάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την οιστρογόνο (Ishikawa, MCF-7) και οστεοπροστατευτική (MC3T3-Ε1) δράση τους. Συνυπολογίζοντας τα αποτελέσματα της αξιολόγησης του φυτοχημικού περιεχομένου και των βιολογικών ιδιοτήτων, επιλέχθηκαν 9 εκχυλίσματα των ειδών Dorycnium hirsutum, Cytisus villosus, Hippocrepis comosa, Psoralea bituminosa, Lupinus albus, Ceratonia siliqua, Rhamnus sibthorpiana, Rhamnus lycioides και Rhamnus alpinus, με σκοπό τον εντοπισμό των βιοδραστικών μεταβολιτών τους. Επίσης, το μεθανολικό εκχύλισμα του είδους των ειδών Glycyrrhiza glabra και οι κονιοποιημένοι καρποί του Ceratonia siliqua (χαρουπάλευρο) επιλέχθηκαν για να υποβληθούν σε in vivo μελέτη της οστεοπροστατευτικής τους δράσης σε μοντέλο θήλεος ωοθηκεκτομημένου επίμυος. Όλα ταxviεπιλεγμένα εκχυλίσματα ελέγχθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να καταστέλλουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων κυττάρων RAW264.7 σε οστεοκλάστες. Εν συνεχεία, με χρήση διαφόρων χρωματογραφικών τεχνικών (CPC, Sephadex LC, Prep-TLC) απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 84 μεταβολίτες, οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, των φαινολοξέων, των φλαβονοειδών (ισοφλαβονών, φλαβονολών, φλαβανολών και φλαβονών), των κουμαρινών, των κουμεστανίων, των πτεροκαρπανών, των ακετοφαινονών, των βενζοφουρανίων και των ανθρακινονών. Αναφορικά με την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων των επιλεγμένων φυσικών προϊόντων, έλαβε χώρα ο σχεδιασμός και η παρασκευή συνολικά 60 συνθετικών ενώσεων, οι οποίες ανήκουν στις κατηγορίες των δεοξυβενζοϊνών, των διυδροστιλβενίων, των ισοφλαβονών, των χαλκονών, των διαρυλοπροπανίων, των 2,3-διφαινυλοπροπενικών και των 2,3-διφαινυλοπροπανοϊκών οξέων. Οι απομονωμένοι φυσικοί μεταβολίτες και τα συνθετικά ανάλογα ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1D και 2D NMR).Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση των φυσικών και συνθετικών ενώσεων ως προς την πιθανή οιστρογονική και οστεοπροστατευτική δράση τους. Έτσι, 63 από τους απομονωμένους μεταβολίτες και 57 από τις συνθετικές ενώσεις ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επάγουν τη διαφοροποίηση πρώιμων οστεοβλαστών (προ-οστεοβλαστικά κύτταρα MC3T3-E1) ή / και να καταστέλλουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων κυττάρων σε οστεοκλάστες (μακροφάγα κύτταρα RAW264.7). Επίσης, προσδιορίστηκε η οιστρογονικότητά τους μέσω επαγωγής της έκφρασης της αλκαλικής φωσφατάσης στα κύτταρα Ishikawa, καθώς και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF-7. Δευτερογενείς μεταβολίτες που ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, των ισοφλαβονών, των φαινολοξέων, των κουμεστανίων και των ανθρακινών, καθώς και συνθετικά ανάλογα δεοξυβενζοϊνών, ισοφλαβονών, χαλκονών και 2,3-διφαινυλοπροπενικών οξέων παρουσίασαν αξιόλογες βιολογικές ιδιότητες.Το επόμενο στάδιο της παρούσας διατριβής ήταν η in vivo αξιολόγηση του μεθανολικού εκχυλίσματος των ριζών της Glycyrrhiza glabra και του χαρουπάλευρου (καρπός του Ceratonia siliqua) σε οστεοπορωτικό μοντέλο θηλυκών αρουραίων. Η χρονική διάρκεια του κάθε πειράματος ήταν έξι μήνες και προσδιορίστηκε η οστική πυκνότητα της αριστερής κνήμης των πειραματοζώων με τη μέθοδο DEXA κατά την έναρξη, τον 3ο και τον 6ο μήνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις του σωματικού βάρους των επίμυων και κατά την ευθανασία μετρήθηκε το βάρος των ζωτικών τους οργάνων. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν το εκχύλισμα της Glycyrrhiza glabra ως σημαντικό οστεοπροστατευτικό παράγοντα, αλλά και το χαρουπάλευρο φάνηκε ικανό να αντισταθμίζει την προκαλούμενη από την ωοθηκεκτομή οστική απώλεια.Σε δεύτερο επίπεδο, με αφορμή τα αποτελέσματα προγενέστερων ερευνητικών μελετών, διερευνήσαμε την πιθανή επίδραση των συνθετικών ενώσεων έναντι μιας δευτερεύουσας διαταραχής της εμμηνόπαυσης, η οποία σχετίζεται με τη διαταραχή στην παραγωγή μελανίνης και την εμφάνιση καφέχροων κηλίδων στο δέρμα. Δεδομένου ότι η τυροσινάση αποτελεί το ένζυμο κλειδί στη διαδικασία της μελανογένεσης, 45 συνθετικές ενώσεις αξιολογήθηκαν σε in vitro ενζυμική δοκιμασία ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν ή να επάγουν τη δράση του ενζύμου κατά την οποία τα διυδροστιλβένια χαρακτηρίστηκαν ως σημαντικοί παράγοντες αναστολής της ενεργότητάς του. Στη συνέχεια, αντιπροσωπευτικά συνθετικά παράγωγα, ελέγχθηκαν περαιτέρω σε κυτταρικές σειρές μελανοκυττάρων B16F1 και B16F10, ως προς την ικανότητά τους να επιδρούν στην παραγωγή μελανίνης, ενώ πραγματοποιήθηκε και in silico μελέτη της πρόσδεσής τους με τον υποδοχέα του ενζύμου της τυροσινάσης. Τα αποτελέσματα του in vitro ελέγχου των ενώσεων που αξιολογήθηκαν, επιβεβαίωσαν εκείνα του ελεύθερου κυττάρων ενζυμικού προσδιορισμού και ανέδειξαν τα διυδροστιλβένια που αξιολογήθηκαν ως σημαντικούς παράγοντες αναστολής τόσο της ενεργότητας της τυροσινάσης, όσο και της παραγωγής μελανίνης.Συμπερασματικά θα μπορούσαμε να αναφέρουμε ότι η ανάδειξη ελπιδοφόρων δομικών σκελετών, με βάση τόσο τα αποτελέσματα της in silico αξιολόγησης αλλά και την αξιοποίηση τόσο προγενέστερων μελετών οιστρογονικής δράσης, όσο και σύγχρονων εθνοφαρμακολογικών δεδομένων, είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση φυσικών προϊόντων και την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων με πιθανές ευεργετικές επιδράσεις έναντι κύριων (οστεοπόρωση) αλλά και δευτερευουσών (εμφάνιση καφέχροων κηλίδων στο δέρμα) επιπτώσεων της εμμηνόπαυσης.