Σύνθεση, κινητική και κρυσταλλογραφική µελέτη δυνάµει αναστολέων της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου
Authors: Μαμάης Μιχαήλ 
Published: September 2021

Ο σακχαρώδης διαβήτης αποτελεί ένα χρόνιο, µεταβολικό, µη-µεταδιδόµενο νόσηµα που οφείλεται στον µη φυσιολογικό µεταβολισµό της γλυκόζης από τον οργανισµό και την αυξηµένη συγκέντρωσή της στο αίµα, µε αποτέλεσµα να προκαλεί µια σειρά διαταραχών. Πρόκειται για µια από τις αρχαιότερες ασθένειες η οποία, στις µέρες µας έχει λάβει τον χαρακτήρα παγκόσµιας επιδηµίας µε σηµαντικότατες οικονοµικές και κοινωνικές επιπτώσεις. Αν και δεν θεραπεύεται ριζικά, αντιµετωπίζεται αρχικά µε αλλαγή στον τρόπο ζωής και στη συνέχεια µε χορήγηση αντιδιαβητικών φαρµάκων όπως διγουανίδες (µετφορµίνη), σουλφονυλουρίες και ινσουλίνη µε συνεχή αύξηση των δόσεων, µε σκοπό την κατά το δυνατόν διατήρηση φυσιολογικών επιπέδων γλυκαιµίας. ∆υστυχώς οι θεραπευτικοί στόχοι συνήθως αποτυγχάνουν και τα υπάρχοντα φάρµακα εµφανίζουν σοβαρές παρενέργειες. Συνεπώς, υπάρχει διαρκής ανάγκη για ανακάλυψη νέων ουσιών µε βελτιωµένα φαρµακολογικά αποτελέσµατα έναντι του σακχαρώδους διαβήτη. Το ήπαρ είναι υπεύθυνο κυρίως για το µεταβολισµό της γλυκόζης και για το λόγο αυτό αρκετές πρωτεΐνες του έχουν αποτελέσει αντικείµενο έρευνας για την ανάπτυξη θεραπειών. Μοριακοί στόχοι αποτελούν ο υποδοχέας γλυκαγόνης (Glucagon Receptor, GR), η φωσφατάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PASE), η φωσφατάση της 1,6-διφωσφορικής φρουκτόζης (F16BPASE), η εξοκινάση IV (GK) και η φωσφορυλάση του γλυκογόνου (GP).Η τελευταία, στην ενεργή της µορφή (GPa) καταλύει το πρώτο στάδιο της αποικοδόµησης του γλυκογόνου προς γλυκόζη. Η GP είναι ένα από τα ένζυµα που εµπλέκονται άµεσα στην αποικοδόµηση του γλυκογόνου στο ήπαρ. Προηγούµενες µελέτες, στο δικό µας και άλλα εργαστήρια, έδειξαν ότι αποτελεί µοριακό στόχο για το σχεδιασµό και την ανάπτυξη νέων δυνάµει αναστολέων έναντι της γλυκογενόλυσης, µε σκοπό τη διατήρηση των φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης στην κυκλοφορία του αίµατος. Πολλές ενώσεις έχουν σχεδιαστεί µε τη µέθοδο του κατευθυνόµενου από τη δοµή σχεδιασµού φαρµάκων, ως αναστολείς της GP. Στο εργαστήριο µας έχουν αναπτυχθεί 4-υποκατεστηµένες β-D-γλυκοπυρανοζυλοπυριµιδίνες οι οποίες προσδένονται ισχυρά στο καταλυτικό κέντρο του ενζύµου. Το αντικείµενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν (α) η ανάπτυξη ενός βελτιστοποιηµένου και γενικού συνθετικού σχήµατος για την εύκολη πρόσβαση σε Ν4αρυλο και αλκυλο υποκατεστηµένες β-D-γλυκοπυρανοζυλο-κυτοσίνες, (β) η εφαρµογή του νέου συνθετικού σχήµατος για την εισαγωγή µιας ευρείας οµάδας αρυλαµινών και αλκυλαµινών, που περιέχουν νέες χαρακτηριστικές οµάδες στην 4-θέση των παραπάνω ενώσεων οδηγών, (γ) η κινητική µελέτη της αναστολής που επιφέρουν τα παραπάνω συνθετικά µόρια στην in vitro δραστικότητα της GP, (δ) η κρυσταλλογραφική µελέτη συµπλόκων ενζύµου αναστολέα για τον προσδιορισµό των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται κυρίως στο β-υποκέντρο του καταλυτικού κέντρου και µπορούν να εξηγήσουν την παρατηρούµενη αναστολή και τέλος, (ε) η εξαγωγή ενός χάρτη θετικών αλληλεπιδράσεων που θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί στο σχεδιασµό νέων αναστολέων. Συνθετικά, µελετήθηκαν διάφορες µέθοδοι ενεργοποίησης της β-D-γλυκοπυρανοζυλοουρακίλης στην 4- θέση και βρέθηκε ότι ο συνδυασµός Ν1-(2,3,4,6-τετρα-Ο-ακετυλο)-βD-γλυκοπυρανοζυλο--(1,2,4-τριαζολυλο)πυριµιδιν-2-όνης µε µικροκυµατική ακτινοβολία οδήγησε σε µια εύκολη, ευέλικτη και υψηλής απόδοσης συνολική συνθετική πορεία: Με τον τρόπο αυτό συντέθηκαν 17 νέοι, δυνάµει αναστολείς της GP (σελ 7, οι ενώσεις 60b και 63b είχαν συντεθεί ήδη και χρησίµευσαν ως ενώσεις-οδηγοί), οι οποίοι µελετήθηκαν µε ενζυµική κινητική ως προς την ανασταλτική τους ισχύ. Ο προσδιορισµός των τιµών IC50 όλων των νέων αναστολέων και της σταθεράς Ki των ισχυρότερων από αυτούς, ανέδειξε αρκετούς αναστολείς µε τιµή σταθεράς αναστολής στην χαµηλή περιοχή των nM και, κυρίως, τον δεύτερο ισχυρότερο µέχρι σήµερα αναστολέα του καταλυτικού κέντρου, που αποτελεί η ένωσηΝ1-β-D-γλυκοπυρανοζυλοΝ4-[4-ακριδινο-9(10Η)-οξο]κυτοσίνη (90b, σελ. 9) µε τιµή Ki = 71 nM. Ο τρόπος σύνδεσης των νέων αναστολέων ως σύµπλοκα µε την GP διερευνήθηκε µε χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Η λεπτοµερής χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων που σχηµατίζουν οι ενώσεις κατά τη σύνδεσή τους στο καταλυτικό κέντρο του ενζύµου και η γνώση που προέκυψε εξήγησε τα κινητικά συµπεράσµατα και τη συσχέτισή τους µε τη δοµή ενός αναστολέα, ενώ αξιοποιήθηκε στο σχεδιασµό και τη σύνθεση ενώσεων µε βελτιωµένα χαρακτηριστικά.