Μοριακά δίκτυα δυνητικών stem κυττάρων στο κακοήθες μελάνωμα του δέρματος
Authors: Καμπιλαυκός Παναγιώτης 
Published: August 2021

Εισαγωγή.Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος αποτελεί την πιο επιθετική μορφή καρκίνου του δέρματος και είναι ένα από τα επιθετικότερα κακοήθη νεοπλάσματα, με συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα. Η αξιοσημείωτη αντοχή που επιδεικνύει το μεταστατικό μελάνωμα στην τρέχουσα θεραπευτική αντιμετώπιση, επιβάλλει τον σχεδιασμό νέων, πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Ο καρκίνος θεωρείται σήμερα ένα πολύπλοκο Βιολογικό Σύστημα. Υπό αυτό το πρίσμα η κατανόηση της λειτουργίας των δυναμικών παθοβιολογικών Δικτύων στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, προϋποθέτει την εφαρμογή στρατηγικών Συστημικής Προσέγγισης. Σύμφωνα με το μοντέλο των Καρκινικών Stem Κυττάρων (CSCs), μόνο ένα υποσύνολο καρκινικών κυττάρων που εμφανίζει τα μοναδικά χαρακτηριστικά των Stem Κυττάρων, αυτοανανέωση και πολυδυναμία, είναι ογκογόνο. Επιπλέον, είναι καλά τεκμηριωμένο, ότι η ενεργοποίηση του προγράμματος της Επιθηλιο- Μεσεγχυματικής Μετάβασης (ΕΜΤ) προσδίδει στα καρκινικά κύτταρα ιδιότητες stem κυττάρων. Νεώτερα δεδομένα εισηγούνται, ότι τα καρκινικά stem κύτταρα του όγκου που προκύπτουν μέσω της επιθηλιο-μεσεγχυματικής-μετάβασης (ΕΜΤ), εντοπίζονται αρχικά στη διηθητική παρυφή του όγκου και χαρακτηρίζονται από πλαστικότητα, με εναλλαγές μεταξύ επιθηλιακού και μεσεγχυματικού φαινότυπου. Καίριοι εκπρόσωποι του αυτορρυθμιστικού δικτύου του stemness (ιδιότητες αυτοανανέωσης, πολυδυναμίας) είναι οι homedomain μεταγραφικοί παράγοντες SOX2 και Oct4, ενώ είναι πλέον καλά τεκμηριωμένη η σπουδαιότητα της διασυνομιλίας τους (cross-talk) με επιγενετικούς παράγοντες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Στους τελευταίους περιλαμβάνεται η μεθυλοτρανσφεράση EZH2, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Polycomb (PcG), και οι επιγενετικές τροποποιήσεις H3K4me2 και H3K27me3, η «αντιμαχόμενη» δράση των οποίων (χρωματίνη σε κατάσταση ισορροπίας–με διττό δυναμικό, bivalent domain) συνιστά έναν σημαντικό επιγενετικό μηχανισμό ελέγχου γονιδίων stem κυττάρων. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον η μορφολογική εκτίμηση, στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, της έκφρασης γνωστών παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα, αφού η μορφολογική προσέγγιση επιτρέπει την εκτίμηση και της διηθητικής παρυφής της υπό μελέτη επεξεργασίας.Σκοπός.Η παρούσα διδακτορική διατριβή, υπό το πρίσμα της συστημικής προσέγγισης, αφορά την μορφολογική - ανοσοϊστοχημική μελέτη στο κακόηθες μελάνωμα, των δυνητικών δεικτών καρκινικών stem κυττάρων SOX2, Oct4, EZH2, Η3Κ4me2 και H3K27me3, και διερευνά τον ρόλο τους στη παθογένεια του κακοήθους μελανώματος του δέρματος.Υλικό και μέθοδος.Με τη μορφολογική μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας εκτιμήθηκε το μέσο ποσοστό (LI%) έκφρασης των υπό μελέτη δεικτών σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου238Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Σε 14 δείγματα συνυπήρχαν κύτταρα σπίλου και μελανώματος. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA), H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA), SOX2 (R&D Systems, Inc.) και Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc). Σε κάθε ιστικό δείγμα και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε με το φωτονικό μικροσκόπιο το μέσο ποσοστό των κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI%). Επιπλέον, έγινε συγκριτική μελέτη της έκφρασης των υπό μελέτη δεικτών στα κύτταρα μελανώματος της διηθητικής παρυφής σε σχέση με την κυρίως μάζα του όγκου. Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα.Στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος ταυτοποιήθηκε η παρουσία των υπό μελέτη δεικτών SOX2, Oct4, EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, σε άλλοτε άλλο βαθμό. Πυρηνική ανοσοχρώση ανιχνεύθηκε για τους επιγενετικούς δείκτες EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ για τους homedomain παράγοντες SOX2 και Oct4 παρατηρήθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση, η οποία μελετήθηκε ξεχωριστά. Σημαντικό εύρημα της παρούσας διατριβής ήταν το ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας, με σημαντικά αυξημένο μέσο ποσοστό (LI%) κυττάρων μελανώματος με έκφραση των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή σε σχέση με την κυρίως μάζα του όγκου (p=0.035 και p<0.010 αντίστοιχα). Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο παράγων EZH2, χωρίς όμως αυτό το εύρημα να αποδειχθεί στατιστικά σημαντικό (p=0.080), ενώ ανάλογη τάση παρατηρήθηκε σε μικρό αριθμό περιπτώσεων κατά την μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα SOX2. Αυξημένα επίπεδα του επιγενετικού παράγοντα ΕΖΗ2 διαπιστώθηκαν στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κύτταρα σπίλου (p=0.020), ενώ, τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης των homedomain μεταγραφικών παραγόντων SOX2 και Oct4 βρέθηκαν αυξημένα στα κύτταρα σπίλου σε σχέση με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.003 και p=0.004 αντίστοιχα). Το μέσο ποσοστό πυρηνικής έκφρασης SOX2 και κυτταροπλασματικής έκφραση Oct4 ήταν αυξημένο στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045 και p=0.025 αντίστοιχα). Αυξημένη επίσης έκφραση στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα διαπιστώθηκε για τους επιγενετικούς δείκτες H3K4me2 και H3K27me3 (p=0.006 και p=0.030 αντίστοιχα). Η διερεύνηση της σχέσης των υπό μελέτη δεικτών με τα επί μέρους κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά του νεοπλάσματος, έδειξε αυξημένη έκφραση του πυρηνικού SOX2 και του H3K4me2 στα μελανώματα με μικρό πάχος όγκου(<1mm) κατά Breslow (p=0.045 και p< 0.001 αντίστοιχα), και αυξημένη έκφραση του H3K4me2 σε μελανώματα με μικρό επίπεδο διήθησης (Ι) κατά Clark (p=0.040), σε σχέση με νεοπλάσματα με μεγαλύτερο βαθμό διήθησης. Διαπιστώθηκε επίσης αυξημένη έκφραση του πυρηνικού SOX2 και του δείκτη H3K27me3239σε επεξεργασίες με χαμηλό αριθμό (≤6/mm2) μιτώσεων (p=0.015 και p=0.025 αντίστοιχα). Το μέσο ποσοστό έκφρασης των δεικτών SOX2 (πυρηνική), Oct4 (κυτταροπλασματική), H3K4me2 και H3K27me3 ήταν αυξημένο σε μελανώματα χωρίς εξέλκωση σε σχέση με αυτά που ενεφάνιζαν εξέλκωση (p=0.010, p=0.020, p<0.001, p=0.045 αντίστοιχα). Τέλος διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση των επιγενετικών παραγόντων ΕΖΗ2 και H3K27me3 σε μελανώματα με παρουσία λεμφοκυτταρικής διήθησης σε σχέση με αυτά χωρίς λεμφοκυτταρική διήθηση (p=0.010). Η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης των υπό μελέτη πέντε δυνητικών δεικτών καρκινικών stem κυττάρων SOX2, Oct4, EZH2, Η3Κ4me2 και H3K27me3 μεταξύ τους, στα κύτταρα του κακοήθους μελανώματος, έδειξε τα εξής: Θετική συσχέτιση μεταξύ των μεταγραφικών παραγόντων SOX2 και Oct4 τόσο για την πυρηνική (p<0.001) όσο και για την κυτταροπλασματική έκφρασή τους (p<0.001). Θετική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 με την έκφραση της μεθυλοτρανσφεράσης EZH2 (p=0.030), καθώς επίσης και με την πυρηνική (p=0.010) και κυτταροπλασματική έκφραση του Oct4 (p=0.004). Θετική συσχέτιση της επιγενετικής τροποποίησης H3K4me2 με την πυρηνική έκφραση του SOX2 (p=0.005). Θετική συσχέτιση μεταξύ των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 και H3K27me3 στα κύτταρα μελανώματος (p<0.010).Συμπεράσματα.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης εισηγούνται ότι οι επιγενετικοί δείκτες H3K4me2, H3K27me3 και ΕΖΗ2 και οι homedomain μεταγραφικοί παράγοντες SOX2 και Oct4, αποτελούν δείκτες εν δυνάμει καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, και ιδιαίτερα στην διηθητική παρυφή της επιθετικής κακοήθους αυτής επεξεργασίας. Επιπλέον, εισηγούνται ότι οι 5 υπό μελέτη δείκτες ενέχονται στην παθογένεια του κακοήθους μελανώματος του δέρματος. Αυτές οι υποθέσεις πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω, καθώς αναδύεται η προοπτική εισαγωγής στη καθημερινή κλινική πράξη νέων, πιο αποτελεσματικών διαγνωστικών μεθόδων και επιλεκτικών θεραπευτικών παρεμβάσεων στο επιγενετικό status των κυττάρων μελανώματος, αλλά και γενικότερα των καρκινικών κυττάρων, η οποία προϋποθέτει την περαιτέρω κατανόηση, στα πλαίσια της συστημικής προσέγγισης, των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την καρκινογένεση.