Ανάπτυξη καινοτόμου μεθοδολογίας για την ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων στα τρόφιμα
Authors: Παπαθεοδώρου Σπυρίδων-Ανδρέας 
Published: September 2024

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην αξιολόγηση και σύγκριση διαφορετικών μεθόδων ανίχνευσης για ή τρία κοινά τροφιμογενή παθογόνα, τη Listeria monocytogenes, την Escherichia coli και τη Salmonella Typhimurium, σε διάφορες μήτρες τροφίμων. Σκοπός αυτής της έρευνας είναι η ενίσχυση της ασφάλειας των τροφίμων με τη βελτίωση της ανίχνευσης και ταυτοποίησης αυτών των παθογόνων σε δείγματα τροφίμων μέσα από τη δημιουργία μίας microfluidic συσκευής που βασίζεται σε μοριακές τεχνικές (loop mediated isothermal amplification - LAMP) και με την οποία θα είναι δυνατό να πραγματοποιούνται μικροβιολογικές αναλύσεις σε δείγματα τροφίμων. Η μεθοδολογία περιελάμβανε τη διεξαγωγή μίας περιεκτικής βιβλιογραφικής ανασκόπησης για την απόκτηση γνώσεων σχετικά με τις υπάρχουσες μεθόδους ανίχνευσης παθογόνων βακτηρίων και τους περιορισμούς τους. Με βάση την ανασκόπηση, επιλέχθηκαν οι εξής τέσσερις συγκεκριμένες μέθοδοι ανίχνευσης για αξιολόγηση: η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), οι ανοσοαναλύσεις, οι βιοαισθητήρες και η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS).Στην παρούσα μελέτη δοκιμάστηκαν πρώτα 11 διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης DNA μικροοργανισμών και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν με τις μοριακές τεχνικές που αναφέρονται (PCR- LAMP). Στη συνέχεια επιλέχθηκε ο συνδυασμός της in-house μεθόδου που αναφέρεται σε συνδυασμό με τη LAMP (όντας πιο ευαίσθητη και ταχεία μοριακή τεχνική από την PCR) ως βέλτιστη από πλευράς χρόνου-κόστους-ευαισθησίας, και τέλος συνδυάστηκε με μία 3D συσκευή microfluidic. Για την αξιολόγηση της απόδοσης αυτών των μεθόδων, χρησιμοποιήθηκαν τεχνητά μολυσμένα δείγματα τροφίμων, όπως μαρούλι, γάλα και κοτόπουλο ως μήτρες δοκιμής. Κάθε μέθοδος αξιολογήθηκε με βάση την ευαισθησία, την εξειδίκευσή της, την απαίτηση χρόνου, το κόστος και την ευκολία χρήσης της. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η δυνατότητα αυτών των μεθόδων για τον εντοπισμό συγκεκριμένων παραγόντων λοιμογόνου δράσης και γονιδίων αντιμικροβιακής αντοχής που σχετίζονται με τα παθογόνα στόχους. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν διαφορετικές επιδόσεις μεταξύ των μεθόδων ανίχνευσης. Η PCR και η Nexr Generation Sequencing (NGS) παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση, επιτρέποντας την ακριβή ανίχνευση και ταυτοποίηση των παθογόνων στόχων. Οι 12 ανοσοδοκιμασίες έδειξαν καλή εξειδίκευση αλλά περιορισμένη ευαισθησία, ενώ οι βιοαισθητήρες προσέφεραν ταχεία ανίχνευση αλλά απαιτούσαν περαιτέρω βελτιστοποίηση για ενισχυμένη ευαισθησία. Συζητήθηκε επίσης η εφαρμογή αυτών των μεθόδων ανίχνευσης σε αναλυτικά εργαστήρια τροφίμων, συμπεριλαμβανομένων των απαιτήσεων εξοπλισμού, της διαθεσιμότητας αντιδραστηρίων και της σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητας. Επιπλέον, δόθηκαν κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα, δίνοντας έμφαση στην ανάγκη για εκτεταμένη ποικιλία στελεχών και δειγμάτων, ολοκληρωμένη επικύρωση έναντι μεθόδων αναφοράς και διερεύνηση αυτοματισμού και ανάλυσης υψηλής απόδοσης. H παρούσα συγκριτική μελέτη παρέχει πολύτιμες γνώσεις σχετικά με τις μεθόδους ανίχνευσης της Salmonella Typhimurium, της Listeria monocytogenes και της Escherichia coli σε δείγματα τροφίμων. Τα ευρήματα συμβάλλουν στην ανάπτυξη βελτιωμένων στρατηγικών για την έγκαιρη και ακριβή ανίχνευση των τροφιμογενών παθογόνων, συνεισφέροντας τελικά στην ασφάλεια των τροφίμων και τη δημόσια υγεία. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την αντιμετώπιση των περιορισμών που έχουν εντοπιστεί και για τη διερεύνηση νέων οδών για ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο σε διάφορα τρόφιμα.