Μελέτη της μοριακής φυλογένεσης ειδών Phlebotomus, διαβιβαστών ξενιστών του πρωτόζωου παρασίτου Leishmania, από την Κρήτη και την Κύπρο και ανάπτυξη μοριακών εργαλείων για την τυποποίησή τους
Authors: Δοκιανάκης Εμμανουήλ 
Published: September 2021

Η Λεïσμανίαση αποτελεί μια από τις σοβαρότερες ασθένειες, παρασιτολογικής αιτιολογίας, για τον άνθρωπο. Το παράσιτο Leishmania ενδημεί, μεταξύ άλλων, σε όλες τις χώρες της λεκάνης της Μεσογείου και στην Πορτογαλία προκαλώντας σπλαχνική και δερματική νόσο. Η σπλαχνική μορφή (ΣΛ) είναι η πιο επιθετική και είναι θανατηφόρα χωρίς θεραπεία στο 95% των περιπτώσεων. Οι κλινικές εκδηλώσεις, μεταξύ άλλων, είναι πυρετός, διόγκωση λεμφαδένων και σπλήνας. Η δερματική μορφή (ΔΛ) είναι ήπια και εκδηλώνεται με δερματικά έλκη.Οι σκνίπες, γένος Phlebotomus, αποτελούν τους διαβιβαστές ξενιστές στον κύκλο ζωής του παρασίτου. Η διατροφή τους αποτελείται από σάκχαρα προερχόμενα από φυσικές πηγές. Τα θηλυκά όμως, για να ολοκληρώσουν την ωοτοκία, τρέφονται και με αίμα θηλαστικών όπως ο άνθρωπος. Κατά τη διάρκεια τέτοιων γευμάτων, η σκνίπα μεταφέρει το παράσιτο και άλλα παθογόνα (όπως βακτήρια του γένους Bartonella και Phlevoviruses) στον άνθρωπο και σε άλλα ζώα.Στον Παλαιό Κόσμο απαντώνται 31 είδη σκνιπών, του γένους Phlebotomus, που παίζουν το ρόλο του διαβιβαστή της Leishmania. Διαφορετικά είδη σκνίπας διαβιβάζουν διαφορετικά είδη Leishmania και έτσι, μελετώντας τη γεωγραφική κατανομή των πληθυσμών των διάφορων ειδών του εντόμου και γνωρίζοντας τα επίπεδα μόλυνσης των σκνιπών από το παράσιτο Leishmania, είναι δυνατόν να αξιολογηθεί το μέγεθος του κινδύνου για τη δημόσια υγεία σε κάθε περιοχή αλλά και να γίνει πρόβλεψη της εξάπλωσης της νόσου σε νέες περιοχές.Όπως είναι κατανοητό, η ακριβής τυποποίηση των ειδών του γένους Phlebotomus είναι σημαντική για τη Δημόσια Υγεία. Παραδοσιακά, η τυποποίηση γίνεται ως επί το πλείστο με βάση τις μορφολογικές τους διαφορές, εφαρμόζοντας μικροσκοπικές μεθόδους. Ωστόσο, έχει γίνει φανερό ότι η μορφολογική τυποποίηση των σκνιπών δεν είναι πάντα ακριβής. Για το λόγο αυτό αναπτύσσονται μοριακές μέθοδοι τυποποίησης με στόχο τη μείωση του χρόνου αναγνώρισης των ειδών και την αύξηση της ακρίβειας της ταυτοποίησης. Εντούτοις, δεν χρησιμοποιείται μια κοινή μοριακή μέθοδος τυποποίησης από τους ερευνητές ώστε να εγκαταλειφθεί ή να παραμείνει συμβουλευτική η μορφολογική τυποποίηση. Πέρα από τη ταυτότητα των ειδών σκνίπας που ενδημούν σε κάθε περιοχή, είναι απαραίτητη και η γνώση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ τους. Τα στενά συγγενικά είδη σκνιπών ενδέχεται να συμπεριφέρονται με παρόμοιο τρόπο ως διαβιβαστες ξενιστές του παρασίτου Leishmania. Παράλληλα, η έλλειψη βαθιάς γνώσης για τη συστηματική κατάσταση των σκνιπών οδηγεί σε διχογνωμίες μεταξύ των ειδικών σχετικά με τη ταξινόμηση πολλών ειδών.Οι φυλογενετικές σχέσεις και η τυποποίηση των ειδών Phlebotomus, από την Κρήτη και την Κύπρο έχουν αναλυθεί ακροθιγώς και δε γνωρίζουμε με ακρίβεια, πόσα και ποια είδη ενδημούν σε αυτές τις περιοχές. Το γεγονός ότι, τα τελευταία χρόνια, ο αριθμός των κρουσμάτων λεϊσμανίασης στα νησιά αυτά έχει αυξηθεί στον άνθρωπο και στο σκύλο επιβάλλει την, σε βάθος, μελέτη των σκνιπών, διαβιβαστών ξενιστών της νόσου που ενεργοποιούνται σε αυτές τις περιοχές.Η παρούσα διδακτορική διατριβή στόχευε στην εξακρίβωση των φυλογενετικών σχέσεων ειδών σκνιπών που απαντώνται στην Κρήτη και στην Κύπρο και περαιτέρω αποσκοπούσε στη δημιουργία νέων, αξιόπιστων, συστημάτων μοριακής αναγνώρισης των συγκεκριμένων ειδών. Η συγκέντρωση των ατόμων σκνίπας για τη μελέτη προήλθε από δειγματοληψίες κατά τα έτη 2011 – 2014 στα πλαίσια του προγράμματος της ΕΕ, FP7, EDENext. Η επιλογή των σκνιπών, τόσο σε αριθμό όσο και σε αναλογία φύλου, έγινε προσεκτικά με στόχο την πλήρη και ακριβώς σταθμισμένη αντιπροσώπευση των πληθυσμών των εντόμων που κυκλοφορούσαν την περίοδο εκείνη στα δύο νησιά.Η ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων των ειδών σκνίπας έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο DNA barcoding, μια διαδικασία αλληλούχισης ενός τμήματος του μιτοχονδριακού γονιδίου της κυτοχρωμικής οξειδάσης Ι (COI). Οι αλληλουχίες που προέκυψαν από το συγκεκριμένο γονίδιο μας έδωσαν τη δυνατότητα αφενός να αποκτήσουμε πληροφορίες για τη μοριακή ταυτότητα των ειδών που μελετήσαμε και αφετέρου να κατασκευάσουμε, βάσει των δεδομένων αυτών, το φυλογενετικό δέντρο που περιγράφει τη συστηματική κατάσταση κάθε είδους και τη σχέση του με τα υπόλοιπα είδη. Τα αποτελέσματα, μεταξύ άλλων, ανέδειξαν, για πρώτη φορά, τις barcode αλληλουχίες για τα είδη P. neglectus και P. similis, διαβιβαστές ξενιστές των παρασίτων L. infantum, υπεύθυνο για τη ΣΛ, και L. tropica υπεύθυνο για τη ΔΛ στην Ελλάδα, αντίστοιχα. Η αποσαφήνιση της φυλογενετικής θέσης των ειδών σκνίπας που ερευνήθηκαν, άνοιξε το δρόμο για να αναπτυχθεί ένα μοριακό εργαλείο τυποποίησης του υπογένους Larroussius χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR – RFLP. Το υπογένος αυτό εμπεριέχει τους διαβιβαστές ξενιστές του παρασίτου L. infantum, αιτιολογικό παράγοντα της ΣΛ, και η διακριτική ικανότητα ταυτοποίησης των ειδών αυτών, με τις υπάρχουσες μεθόδους, είναι ελλιπής. Το εργαλείο που αναπτύχθηκε είναι γρήγορο και αξιόπιστο στην τυποποίηση ατόμων του συγκεκριμένου, σημαντικού, υπογένους στη περιοχή μελέτης.Τέλος, αναπτύχθηκε ένα νέο, και πολλά υποσχόμενο, εργαλείο μοριακής τυποποίησης σκνιπών χρησιμοποιώντας την πληροφορία του πρωτεώματος του ατόμου, δηλαδή την πρωτεϊνική σύσταση του ιστού του εντόμου. Η μέθοδος χρησιμοποιεί τη τεχνολογία τυποποίησης φασματοσκοπίας μάζας (MALDI – TOF MS). Η ανάλυση έγινε σε δείγματα σκνίπας εργαστηριακής καλλιέργειας και αποτελεί την πρώτη μελέτη στο πεδίο παγκοσμίως. Αυτή η μέθοδος θα διαδραματίσει στο μέλλον πρωταγωνιστικό ρόλο στο έργο της τυποποίησης και ταυτοποίησης σκνιπών.