Ανάπτυξη της τεχνολογίας μεμβρανικής μηχανικής στους κυτταρικούς βιοαισθητήρες για τον προσδιορισμό του σουπεροξειδίου και εφαρμογή της στη μελέτη φαινομένων κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης
Authors: Μοσχοπούλου Γεωργία 
Published: July 2014

Η μεμβρανική μηχανική είναι μια γενική, καινοτόμος μεθοδολογία για την αύξηση της ευαισθησίας των κυτταρικών βιοαισθητήρων έναντι των μορίων-στόχων, ηλεκτροεισάγοντας τον ειδικό υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια. Σημείο εκκίνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη, σε προηγούμενη μελέτη, ενός ευαίσθητου αισθητήρα για την ανίχνευση σουπεροξειδίου (O2−) βασισμένου σε ακινητοποιημένα κύτταρα, τα οποία τροποποιήθηκαν μεμβρανικά με το ένζυμο δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD). Στην παρούσα μελέτη, τεκμηριώνεται ότι η αντίδραση του O2− με την SOD προκαλεί αλλαγές στο μεμβρανικό δυναμικό των μεμβρανικώς τροποποιημένων κυττάρων Vero, όπως επιβεβαιώνεται από τις ηλεκτροφυσιολογικές και φθορισμομετρικές μετρήσεις. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν με αλλαγές της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου, όπως φαίνεται μετά την εκλεκτική παρεμπόδιση του ενδοκυτταρικού μονοπατιού ασβεστίου. Επιπλέον, εφαρμόζοντας εκλεκτικούς παρεμποδιστές, αποδεικνύεται ότι τα ηλεκτροεισαχθέντα μόρια της SOD διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Ερευνήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης της ηλεκτροεισαχθείσας SOD. Τέλος, αυξήθηκε η ευαισθησία του αισθητήρα κατά 100 φορές, με όριο ανίχνευσης 1 pM O2−, σαν συνέπεια της μεταβολής της συγκέντρωσης των ακινητοποιημένων κυττάρων στον αισθητήρα.Μελετήθηκε η πιθανή σχέση ανάμεσα στα επίπεδα των ελευθέρων ριζών (ROS) και της κυτταρικής διαίρεσης κατά την in vitro επταήμερη καλλιέργεια του υδρόβιου φυτού Spirodela polyrrhiza. Πιο συγκεκριμένα, καταγράφτηκε η συγκέντρωση του σουπεροξειδίου χρησιμοποιώντας τον εξελιγμένο βιοαισθητήρα. Μια σημαντική μείωση των ROS αλλά και της συγκέντρωσης του O2−, παρατηρήθηκε κατά τις δύο πρώτες ημέρες της καλλιέργειας, ενώ η S. polyrrhiza βρίσκονταν κοντά στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Επιπλέον, αποπτωτικοί δείκτες όπως είναι η συγκέντρωση του κυτοπλασματικού κυτοχρώματος C, η αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η δραστικότητα της κασπάσης-3 φθίνουν κατά τη περίοδο καλλιέργειας τουλάχιστον πριν την ωρίμανση των φυλλιδίων. Θεωρείται ότι η διαίρεση των φυλλιδίων του S. polyrrhiza μπορεί να δραστηριοποιήθηκε από παρατηρούμενη μείωση των ελευθέρων ριζικών και τη σχετική αποφυγή των κυτταρικών αποπτωτικών μονοπατιών των καλλιεργούμενων φυτών.Επίσης οι ROS έχει φανεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα νευροβλαστώματος διαφοροποιήθηκαν με φορσκολίνη και κυκλική μονοφωσφορική διβουτυρυλαδενοσίνη (db-cAMP) . Η διαφοροποίηση εκφράστηκε σαν ανάπτυξη των νευριτών χρησιμοποιώντας τη χρωστική coomassie brilliant blue μετά από 48 ώρες επώασης των ουσιών διαφοροποίησης. Η διαφοροποίηση συνοδεύτηκε με αύξηση των ROS και του μιτοχονδριακού O2−, και τα δύο ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Παράλληλα έγινε καταγραφή της συγκέντρωσης O2− με τον βιοαισθητήρα για την αξιολόγηση του συγκρίνοντάς τον με μια κλασική μέθοδο όπως είναι η κυτταρομετία ροής. Όπως παρατηρήθηκε, υπήρξε μεγάλη συσχέτιση των αποτελεσμάτων.Επιπροσθέτως, ο βιοαισθητήρας δοκιμάστηκε στην κλινική ιατρική, με σκοπό την καταγραφή των επιπέδων O2− σε ασθενείς σε μεταγχειριτική κατάσταση. Έχει συχνά προταθεί ότι το οξειδωτικό στρες είναι πιθανός εμπλεκόμενος παράγοντας του μετεγχειριτικού στρες. Τα αποτελέσματα, αν και πρώϊμα, λόγω του μικρού ακόμα μεγέθους δείγματος, κατέδειξαν ότι τα επίπεδα του Ο2- ήταν πιο αυξημένα στους ασθενείς με δυσμενή μετεγχειρητική εξέλιξη.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα των ανεξαρτήτων επιμέρους πειραματικών ενοτήτων της παρούσας διατριβής (1) αποσαφήνισαν τις βαθύτερες πτυχές του μηχανισμού λειτουργίας της μοριακής αναγνώρισης μέσω μεμβρανικής μηχανικής και (2) επιβεβαίωσαν την αποτελεσματικότητα και τις σημαντικές προοπτικές εφαρμογής του βιοαισθητήρα σουπεροξειδίου που αναπτύχθηκε με βάση τη συγκεκριμένη τεχνολογία.