Απομόνωση, κλωνοποίηση, υπερπαραγωγή, βιοχημικός και βιοφυσικός χαρακτηρισμός ενός χιτινολυτικού ενζύμου από το ψυχρόφιλο βακτήριο Moritella marina
Authors: Στεφανίδη Ελένη 
Published: August 2021

Η χιτίνη είναι ένα βιοπολυμερές που αποτελείται από γραμμικά επαναλαμβανόμενες μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1.4 γλυκοσιδικό δεσμό και αποτελεί το δεύτερο μετά την κυτταρίνη φυσικό βιοπολυμερές. Στο υδάτινο περιβάλλον υπολογίζεται ότι ανακυκλώνονται ετησίως περισσότεροι από 10¹¹ τόνοι χιτίνης. Στις συνθήκες του βυθού των υδάτινων οικοσυστημάτων, που χαρακτηρίζονται από υψηλές πιέσεις και χαμηλές θερμοκρασίες, ανιχνεύονται ελάχιστες μόνο ποσότητες χιτίνης. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η μικροβιακή κοινότητα που αναπτύσσεται σε αυτές τις συνθήκες ευθύνεται σε σημαντικό βαθμό για την ανακύκλωση της χιτίνης. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω, αναμένεται ότι τα ένζυμα που αποικοδομούν τη χιτίνη και παράγονται από τα βακτήρια αυτού του οικοσυστήματος έχουν υψηλή καταλυτική ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες. Ως ψυχρόφιλους χαρακτηρίζουμε τους οργανισμούς εκείνους που επιβιώνουν σε περιβάλλοντα με χαμηλές θερμοκρασίες και αρκετά συχνά σε θερμοκρασία κοντά στους 0°C. Τέτοιους οργανισμούς συναντάμε στην Ανταρκτική, στους παγωμένους ωκεανούς και τα παγόβουνα, αλλά και σε ορεινές περιοχές. Αντιπρόσωποί τους βρίσκονται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς, όπως μύκητες και φύκη, αλλά και στα αρχαιοβακτήρια. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών, ήταν η απομόνωση ενός γονιδίου που κωδικοποιεί χιτινολυτικό ένζυμο, η υπερπαραγωγή της αντίστοιχης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και η ενζυμική, δομική και θερμοδυναμική μελέτη της τελευταίας από το ψυχρόφιλο και θαλάσσιο βακτήριο Moritella marina. Η χιτινάση αυτή αποτελεί, μέχρι σήμερα, το πέμπτο ψυχρόφιλο χιτινολυτικό ένζυμο που έχει απομονωθεί και ένα από τα τέσσερα που έχουν μελετηθεί τόσο διεξοδικά. Στο αρχικό στάδιο της μελέτης αυτής διερευνήθηκαν αρκετοί παράγοντες που επηρέασαν την ανάπτυξη της καλλιέργειας και την επαγωγή της χιτινολυτικής ενεργότητας του ψυχρόφιλου αυτού βακτηρίου, όπως το είδος της χιτίνης και οι συνθήκες της βακτηριακής καλλιέργειας. Το βακτήριο Μ. marina αναπτύχθηκε στο εργαστήριό μας στους 15°C, με τη χρήση δύο τύπων θρεπτικού υλικού, το επαγωγικό, που περιέχει χιτίνη, ως αποκλειστική πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας, και το μη επαγωγικό, στο οποίο η χιτίνη έχει αντικατασταθεί από πλήρες θρεπτικό υλικό. Μελετήθηκαν ο ρυθμός κυτταρικής αύξησης, καθώς και ο ρυθμός αύξησης της χιτινολυτικής ενεργότητας σε συνολικό χρονικό διάστημα επώασης 48 h. Διαπιστώθηκε ότι το ψυχρόφιλο βακτήριο Μ. marina παράγει μια σειρά από χιτινολυτικά ένζυμα, μετά από επαγωγή με διάφορες μορφές χιτίνης. Η εντονότερη επαγωγή εκδηλώθηκε παρουσία κολλοειδούς χιτίνης (ημι-διαλυτή μορφή χιτίνης), ενώ τα υψηλότερα επίπεδα κυτταρικής αύξησης παρατηρήθηκαν παρουσία του πλήρους θρεπτικού μέσου Marine Broth, το οποίο αποτελείται από εκχύλισμα ζύμης, πεπτόνη και διάφορα άλατα που ανιχνεύονται στο θαλασσινό νερό. Όπως αποδείχθηκε με τη χρήση ενζυμογράμματος χιτινάσης και ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων, το βακτήριο Μ. marina παράγει περισσότερες από μια χιτινάσες, οι οποίες εντοπίζονται τόσο ενδοκυτταρικά όσο και εξωκυτταρικά. Στα επόμενα στάδια του πειραματικού μέρους της διατριβής, απομονώθηκε ένα γονίδιο χιτινάσης από το ψυχρόφιλο βακτήριο Μ. marina. Το αντίστοιχο ένζυμο υπερπαράχθηκε σε κύτταρα E. coli, καθορίσθηκε και μελετήθηκε βιοχημικά και βιοφυσικά. Πρόκειται για μια νέα χιτινάση, την MmChi60. Η απομόνωση του γονιδίου χιτινάσης από το βακτήριο Μ. marina, ακολούθησε την παρακάτω διαδικασία. Εφόσον είχε ήδη ανιχνευθεί χιτινολυτική ενεργότητα από το βακτήριο αυτό, σχεδιάστηκαν συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια βάσει ομόλογων περιοχών που αναδείχθηκαν από τη στοίχιση προκαρυωτικών χιτινασών που καταγράφονται στις διεθνείς βάσεις δεδομένων. Τα παραπάνω ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές σε αλυσιδωτές αντιδράσεις της πολυμεράσης. Συνολικά απομονώθηκαν τρία τμήματα DNA. Το τμήμα μήκους 1500 bp απομονώθηκε από το χρωμοσωμικό DNA, ενώ τα τμήματα μήκους 170 bp and 340 bp απομονώθηκαν από μια χρωμοσωμική βιβλιοθήκη του Μ. marina. Τα παραπάνω τμήματα συνθέτουν το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης ενός γονιδίου χιτινάσης του Μ. marina και τμήματα που εκτείνονται πέρα των 3' και 5' άκρων του γονιδίου αυτού. Το γονίδιο χιτινάσης Mmchi60, μήκους 1653 bp, απομονώθηκε ως προϊόν από αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης με τη χρήση χρωμοσωμικού DNA του βακτηρίου Μ. marina. Το γονίδιο Mmchi60 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό υποδοχέα pCR 2.1-TOPO, με σκοπό την αλληλούχιση και στον πλασμιδιακό υποδοχέα pET-11a, με σκοπό την υπερπαραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης υπό τον έλεγχο του Τ7 υποκινητή. Η πρωτεΐνη MmChi60 αποτελείται από 550 αμινοξέα και περιέχει τρεις δομικές περιοχές, σύμφωνα με ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της: το αμινοτελικό “πεπτίδιο οδηγό” (1-22 αμινοξικά κατάλοιπα), την αμινοτελική καταλυτική περιοχή που χαρακτηρίζει τις γλυκοσύλ-υδρολάσες της οικογένειας 18 (110-154 αμινοξικά κατάλοιπα) και τη καρβοξυτελική δομική περιοχή πρόσδεσης στη χιτίνη (507-550 αμινοξικά κατάλοιπα). Η υπερπαραγωγή της χιτινάσης MmChi60 πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα E. coli BLR(DE3) και σε υψηλά επίπεδα. Η πρωτεΐνη εντοπίστηκε στο ενδοκυτταρικό και ευδιάλυτο κλάσμα. Ο καθαρισμός της MmChi60 ολοκληρώθηκε επιτυχώς σε τρία βήματα: κλασμάτωση των ευδιάλυτων πρωτεϊνών του κυτταρικού εκχυλίσματος με θεϊικό αμμώνιο, χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων σε στήλη Phenyl Sepharose CL-6B και ανιοανταλλακτική χρωματογραφία σε στήλη Q-Sepharose Fast Flow. Ακολούθησε πλήρης βιοχημικός χαρακτηρισμός χρησιμοποιώντας καθαρά κλάσματα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Προσδιορίστηκε, έτσι, το βέλτιστο pH στο 5.0 και η βέλτιστη θερμοκρασία ενζυμικής αντίδρασης στους 28°C, με τη χρήση του συνθετικού υποστρώματος της παρα-νιτροφαινυλ-β-1,4-Ν,Ν'-δυακετυλ-χιτοβιόζης. Η MmChi60 είναι μια μονομερής πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 60.7 kDa και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο 4.32. Η χιτινάση MmChi60 παρουσίασε σημαντική θερμοευαισθησία, αλλά και υψηλή ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες, όπως 0, 10 και 20°C. Επίσης αξιοσημείωτη ήταν η χημική σταθερότητά της έναντι μιας σειράς αλκυλιωτικών, αναγωγικών και αποδιατακτικών παραγόντων, η μη εξάρτησή της από μέταλλα και η καταστολή της ενεργότητας της από το φυσικό συναγωνιστικό αναστολέα της χιτινολυτικής ενεργότητας, την αλλοζαμιδίνη. Η ενεργότητα της MmChi60 μελετήθηκε παρουσία φυσικών και συνθετικών υποστρωμάτων που προέρχονται από τη χιτίνη και από άλλους πολυσακχαρίτες. Η MmChi60 ήταν ενεργή έναντι μόνο των φυσικών υποστρωμάτων χιτίνης, όπως η κολλοειδής χιτίνη και χιτοζάνη, καθώς και των συνθετικών υποστρωμάτων χιτίνης, όπως η παρα-νιτροφαινυλ-β-1,4-Ν,Ν'-δυακετυλ-χιτοβιόζη, για την οποία προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι Vmax, Km, kcat, Εα, ΔG, ΔΗ και TΔS. Τα προϊόντα ενζυμικής δράσης της MmChi60 σε υποστρώματα Ν-ακετυλ-χιτοολιγομερή και κολλοειδούς χιτίνης αναλύθηκαν με τη χρήση HPLC. Η MmChi60 αποδείχθηκε ότι είναι μια ενδοχιτινάση, που υδρολύει υποστρώματα χιτίνης σε τυχαίες θέσεις. Η θερμοδυναμική ανάλυση της MmChi60, με τη χρήση των μεθόδων κυκλικού διχρωισμού και μικροθερμιδομετρίας διαφορικής σάρωσης, έδειξε ότι η θερμοκρασία τήξης της πρωτεΐνης είναι 56.5°C. Επίσης ιδιαίτερα σημαντικό αποτέλεσμα είναι ότι η πρωτεΐνη αποδιατάχθηκε αντιστρεπτά ακόμα και μετά από επώαση στους 65°C, γεγονός που περιγράφεται για πρώτη φορά σε ψυχρόφιλα ένζυμα των γλυκοσύλυδρολασών της οικογένειας 18 και παρέχει σημαντικές δυνατότητες για τη χρήση της ψυχρόφιλης αυτής πρωτεΐνης στην πρωτεϊνική μηχανική. Η δομική περιοχή πρόσδεσης στη χιτίνη της MmChi60 παρουσίασε ομοιότητα σε ποσοστό 36% με την αντίστοιχη περιοχή της χιτινάσης C από το βακτήριο Streptomyces griseus. Η ένδειξη αυτή μας επέτρεψε την κατασκευή του δομικού προτύπου της περιοχής πρόσδεσης στη χιτίνη της MmChi60 βάσει ομολογίας με τη δομή της χιτινάσης C του S. griseus (PDB 1wvu). Το πρότυπο αυτό ανέδειξε μια δομή με β-πτυχωτά φύλλα, με δύο τρυπτοφάνες, Trp-533 και Trp-534, να εκτείνονται προς το διάλυμα, οι οποίες προτείνονται ότι πιθανόν να σχετίζονται με την αλληλεπίδραση του ενζύμου με το υπόστρωμα της χιτίνης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των τιμών της βέλτιστης θερμοκρασίας δράσης και θερμοκρασίας τήξης της MmChi60 και ψυχρόφιλων χιτινασών, καθώς και της περιεκτικότητας σε αργινίνες, προλίνες και γλυκίνες της MmChi60 και της μεσόφιλης χιτινάσης C του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ξεκάθαρα ότι η MmChi60 παρουσιάζει χαρακτηριστικά ψυχρόφιλου ενζύμου.