Study for poly[(R)-3-hydroxybutyrate] production by bacterial strains and its modification for drug delivery systems
Authors:   , Rodríguez Contreras Alejandra María 
Published: September 2023

Nowadays biopolymers are a good alternative to petrochemical polymers. One of these biopolymers is Poly[(R)-3-
Hydroxybutyrate] (PHB) which is produced from renewable resources by various microorganisms and, after its use it can be
composted. It has different applications as bulk material in packing films, containers or paper coatings. Due to its excellent
biocompatibility and biodegradability, PHB is a potential material for applications in drug delivery. It is therefore important to
continue investigating the different strategies to ensure the competitiveness between these biopolymers and petroleumbased
polymers. The first part of the thesis is mainly focused on finding a new PHB-producing bacterium capable of
developing and producing a significant concentration of biopolymer using one of the conventional medium for PHB industrial
production. Therefore, four water and mud samples were taken from four Bolivian salty lakes and the microorganisms were
isolated in order to detect the best PHB-producing bacterial strain. A bacterium identified as a new strain of the genus
Bacillus was selected for polymer production studies. This microorganism was tested under fed-batch fermentations. The
results showed a high specific growth rate, and a percentage of 70% PHB in cell dry mass , with limitation in nitrogen source.
The strain not only grew properly in the industrial condition proposed, but it also produced and accumulated a larger content
of PHB than ever reached before for its genus. The strain was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), as
Bacillus megaterium uyuni S29. The characterization of the resultant biopolymers concluded that the strain synthesized PHB
homopolymer with two main molecular masses around 600 and 125 kDa with polydispersity index of 1.2 and 1.5 respectively.
Moreover, the thermal analyses of the biomaterial showed different properties compared to the ones of common PHB,
enlarging the application possibilities to this biopolyester. After obtaining the polymer from the bacteria, the second part was
focused on its transformation. A sustainable degradation process set out for an easy industrial scale application was
proposed in the second part of this thesis. A copolymer from PHA family, poly[3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate] , was
used to carry out an enzymatic degradation of the material. Two commercially available lipases were used to decrease the
polymer molecular mass to oligomers between 5 and 1 kDa. It was the first time that these triglyceride lipases were used for
this type of application and due to the positive results one of them was used for degradation of PHB. The results confirmed
the enzymatic reaction of the used lipase with PHB and showed a controlled decrease of the molecular mass from 300 kDa
to 4 kDa. In the third part of the study, the application of the PHB as a drug delivery system was analyzed. Doxycycline is a well
known broad-spectrum antibiotic but there are some concerns over its possible side effects. In order to avoid this problem
and reach the infection with an effective drug concentration, protection and controlled delivery of doxycycline are desirable.
Thus, different drug-entrapment and emulsification methods were studied in order to obtain optimal doxycycline -loaded PHB
micro- and nano-particles. The results showed that the combination of ultrasounds with high speed stirring in the preparation
of double emulsion is highly effective in obtaining doxycycline -loaded PHB particles with high drug loading and entrapment
efficiency, and with great method efficiency. Furthermore, the qualitative antibacterial activity found in different formulations
show that these particles are good candidates for drug delivery systems. These best methods were used with the PHAs
produced throughout the thesis in order to confirm their suitability for different PHAs and to study the possibility of improving
the results of drug entrapment and method efficiency.

Actualmente, los biopolímeros son una buena alternativa a los polímeros derivados del petróleo. Uno de estos biopolímeros
es el poli[(R)-3-hidroxibutirato] (PHB) producido a partir de recursos renovables por diversos microorganismos. Tiene
diferentes aplicaciones como material a granel para films de embalaje, recipientes o revestimientos de papel. Debido a su
excelente biocompatibilidad y biodegradabilidad, el PHB es un material con gran potencial para ser aplicado como vehículo
para administración de fármacos. La primera parte de la tesis se centra en la búsqueda de una nueva bacteria productora
de PHB capaz de desarrollar y producir una concentración significativa de biopolímero usando un medio convencional de
forma industrial. Se partió de cuatro muestras de agua y barro tomadas de cuatro lagos salados de Bolivia. Los
microorganismos se aislaron con el fin de detectar las mejores cepas bacterianas productoras de PHB. Para los estudios
de producción de polímeros, se seleccionó una nueva cepa del género Bacillus, identificada como Bacillus megaterium
uyuni S29. Se utilizó este microorganismo en diferentes fermentaciones fed-batch. Los resultados mostraron una alta tasa
de crecimiento específico y se llegó a un porcentaje final de PHB de 70% en masa celular, llegando a limitar la fuente de
nitrógeno. La cepa no sólo creció adecuadamente en las condiciones industriales propuestas, sino que también produjo y
acumuló un gran contenido de PHB que no se había logrado antes con este género. La caracterización de los biopolímeros
resultantes concluyó que Bacillus megaterium uyuni S29 sintetiza PHB homopolímero con dos masas moleculares
principales de alrededor de 600 y 125 kDa con índices de polidispersidad de 1,2 y 1,5 respectivamente. Además, los
análisis térmicos mostraron propiedades diferentes a las del PHB común, ampliando las posibilidades de aplicación de
este biopoliéster. Después de obtener el polímero, la segunda parte de la tesis se centró en el estudio de su
transformación. Por lo tanto, se estudió una propuesta de proceso sostenible de degradación de PHAs pensada para una
posterior aplicación a escala industrial. Se utilizó un copolímero de la familia de los PHAs, el poli(3-hidroxibutirato-co-4-
hidroxibutirato), para llevar a cabo su degradación enzimática. Se emplearon dos lipasas comerciales para disminuir la
masa molecular del polímero y obtener oligómeros con masa molecular entre 5 y 1 kDa. Fue la primera vez que dichas
lipasas de triglicéridos han sido utilizadas con este copolímero. Por consiguiente, se empleó una de ellas para la
degradación de PHB. Se confirmó que la reacción enzimática de esta lipasa con el PHB produjo una disminución controlada
de la masa molecular de 300 kDa a 4 kDa. En la tercera parte de la tesis se analizó la aplicación del PHB como sistema de
liberación de fármaco. Doxiciclina es un conocido antibiótico de amplio espectro. Con el fin de evitar efectos secundarios y
llegar a la infección con una concentración de fármaco eficaz, se requiere una protección y administración controlada de
doxiciclina . Así que se estudiaron diferentes métodos de atrapamiento molecular y de preparación de emulsificaciones con
el fin de obtener micro- y nano-partículas de PHB cargadas con doxiciclina . Los resultados mostraron que la combinación
de ultrasonidos con agitación a alta velocidad en la preparación de emulsión doble es muy eficaz para la obtención de estas
partículas. Además, los resultados de actividad antibacteriana llevados a cabo con estas partículas mostraron que son
buenas candidatas para la liberación doxiciclina . Los mejores métodos encontrados para la formación de partículas de
PHB se utilizaron con los PHAs producidos a lo largo de la tesis para confirmar su idoneidad con otros PHAs.