Μοριακή δικτύωση γονιδίων και ενζύμων στην παραγωγή μεταβολιτών γνωστών για τις θεραπευτικές ιδιότητες στην ελιά
Authors: Θωμοπούλου Μαργαρίτα 
Published: April 2024

Η οικογένεια των Oleaceae όπου ανήκει και η καλλιεργήσιμη ελιά είναι προικισμένη με την δυνατότητα βιοσύνθεσης μιας ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών που είναι γνωστά ως ολεοσίδια, τα οποία λόγω μοναδικότητας έχουν χημειοταξινομικό χαρακτήρα για την οικογένεια. Το μονοπάτι της βιοσύνθεσης τους είναι κέντρο ερευνητικού ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια, για τρεις βασικούς λόγους. Τα μόρια αυτά μαζί με την ολευρωπαΐνη, που είναι η πιο άφθονη μέσα στην ελιά, έχουν σημαντική αμυντική δράση για τα φυτά της οικογένειας, έχουν εξέχουσα βιοδραστική δράση για τον άνθρωπο και καθορίζουν διάφορα ποιοτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των βρώσιμών καρπών και του λαδιού. Στην παρούσα εργασία μελετώνται τρεις διαφορετικοί ενζυματικοί κόμβοι. Στην προσπάθεια να χαρακτηριστούν συγκεκριμένες ομάδες ενζύμων αναπτύχθηκαν βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις με στόχο να μελετηθεί in vivo η λειτουργία τους. Πιο συγκεκριμένα εφαρμόστηκε για πρώτη φορά η ιικοεπαγώμενη μέθοδος VIGS με επιτυχία σε φυτάρια ελιάς. Μετά την επιτυχία της μεθόδου στην ελιάς, η μέθοδος VIGS εφαρμόστηκε για να αποσιωπηθεί η β-γλυκοσιδάση της ολευρωπαΐνης OeGLU, ως συνέχεια των ερευνών του εργαστηρίου μας, αφού η δραστικότητας της είχε εξακριβωθεί σε in vitro αντιδράσεις. Το αποτέλεσμα της αποσιώπησης οδηγεί σε αναπάντεχα αποτελέσματα για τον δευτερογενή μεταβολισμό της ελιάς, υποδεικνύοντας πιθανή ανάδρομη ρύθμιση του μονοπατιού και αναδεικνύοντας τη μεθόδο VIGS σε πολύ χρήσιμη βιοτεχνολογική προσέγγιση. Στην συνέχεια, παρουσιάζεται η προσπάθεια χαρακτηρισμού της πρώτης γλυκοζυλίωσης που δέχεται το μονοπάτι πάνω στο άγλυκο μόριο του 7-δεοξυλογανικού οξέος (7-δεοξυλογανετικό οξύ) κατά την δημιουργία των σεκοϊριδοειδών. Στα πλαίσια της έρευνας πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση με χαρακτηρισμένες φυτικές γλυκοζυλοτρασφεράσες, ανάλυση του προτύπου έκφρασης σε διάφορα μέρη του φυτού, συγκρινόμενα με άλλα γνωστά γονίδια του μονοπατιού, πειράματα υποκυτταρικής τοποθέτησης, in silico αναλύσεις κ.α. Τα πειράματα καταδεικνύουν 4 αλληλουχίες πιθανές για το συγκεκριμένο ενζυμικό βήμα, ενώ η μέθοδος VIGS για τα τέσσερα αυτά ένζυμα δείχνει ότι πιθανώς δύο από αυτές να γλυκοζυλιώνουν το 7-δεοξυλογανετικό οξύ, καθώς αποσιώπηση των μεταγραφημάτων τους από τα φυτά ελιάς είχε σαν αποτέλεσμα μειωμένη συγκέντρωσης της ολευρωπαΐνης στα φύλλα της ελιάς. Η υποκυτταρική τοποθέτηση των ένζύμων σε πυρήνα και κυτταρόπλασμα αν και μένει να επιβεβαιωθεί και με άλλα πειράματα, αναδεικνύει όμως τον ιδιαίτερο ρόλο του πυρήνα στην διαμερισματοποίηση ενζύμων του δευτερογενή μεταβολισμού. Παρόλα αυτά εκκρεμεί η επιβεβαίωση της ενζυμικής δράσης, λόγω έλλειψης διαθεσιμότητας του υποστρώματος, που θα αποδείξει ποιο ή ποια από τα υπό μελέτη OeUGTs πραγματοποιούν την συγκεκριμένη αντίδραση. Το τελευταίο ενζυμικό βήμα που μελετήθηκε στην παρούσα εργασία είναι αυτό την δράσης μιας μεθυλεστεράσης (OeEAME2), που δρα μετά την απογλυκοζυλίωση της ολευρωπαΐνης από την OeGLU για να δημιουργηθεί η ολεασίνη. Οι αναλύσεις μεταγραφημάτων δείχνουν πως το ένζυμο αυτό πιθανώς να δρα κατά την ωρίμανση του καρπού καθώς εκεί παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον ύστερα από ετερόλογη έκφραση στο φυτό N. benthamiana βρέθηκε ότι τοποθετείται με στον πυρήνα των κυττάρων καθώς και στο κυτταρόπλασμα. Πειράματα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών μέσω φθορισμού έδειξαν όχι μόνο ότι το ένζυμο αλληλεπιδρά με τον εαυτό του αλλά και ότι μπορεί να αλληλεπιδράσει με το καρβόξυ- άκρο της OeGLU. Μάλιστα η αλληλεπίδραση αυτή εντοπίστηκε τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα δείχνοντας ότι η παρουσία της OeEAME2 μπορεί να διαταράξει την υποκυτταρική διαμερισματοποίηση ανάμεσα στην OeGLU και στην ολευρωπαΐνη. Τέλος η χρωματογραφία μοριακής διήθησης έδειξε ότι η OeEMAE2 φέρει τεταρτοταγή δομή και συγκεκριμένα ομοδιμερίζεται, ενώ πειράματα συνέκφρασης των OeGLU και OeEAME2 σε φύλλα καπνού, έδειξαν ότι τα δύο ένζυμα είναι δυνατόν να δημιουργούν μια ετεροπολυμερή μεγαλομοριακή δομή in planta η οποία πιθανώς να ευνοεί την συνεργιστική δράση των δυο ενζύμων προκειμένου να παραχθεί η ολεασίνη.