Η Επίδραση της Camelina sativa και της Spirulina στο ανοσοποιητικό σύστημα, στο μικροβίωμα της μεγάλης κοιλίας και στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των προβατινών
Authors: Χριστοδούλου Χρήστος 
Published: December 2022

Η αυξημένη ζήτηση και παραγωγή κτηνοτροφικών προϊόντων υψηλής διατροφικής αξίας λόγω αύξησης του παγκόσμιου πληθυσμού και των προτιμήσεων των καταναλωτών, ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες που χαρακτηρίζονται από ευημερία, οδηγεί στη μελέτη καινοτόμων ζωοτροφών. Οι ζωοτροφές αυτές είναι πλούσιες σε βιολειτουργικά συστατικά, όπως τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (polyunsaturated fatty acids, PUFA) και τα αντιοξειδωτικά τα οποία συμβάλουν στην ενίσχυση της ποιότητας των κτηνοτροφικών προϊόντων, όπως το γάλα, ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα των ζώων γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στον περιορισμό της χρήσης των αντιβιοτικών και κατ’ επέκταση της αντίστασης στα αντιβιοτικά πέραν της μείωσης του κόστους παραγωγής. Επίσης, δύνανται να τροποποιούν το μικροβίωμα της μεγάλης κοιλίας (Μ.Κ.) των μηρυκαστικών. Η σπουδαιότητα στην τροποποίηση του μικροβιώματος της Μ.Κ. έγκειται στο γεγονός ότι αυτό είναι αρχικά υπεύθυνο για την αποδόμηση των PUFA σε κορεσμένα λιπαρά οξέα (saturated fatty acids, SFA) τα οποία μεταφέρονται στο αίμα και στη συνέχεια στο παραγόμενο γάλα, αλλά και στο ότι συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί (μεθανοβακτήρια) είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή ενός από τα σημαντικότερα αέρια του θερμοκηπίου, το μεθάνιο (CH4). Επομένως, σκοπός των δύο πειραματισμών της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης τριών διαφορετικών επιπέδων ενσωμάτωσης και η αξιολόγηση του βέλτιστου επιπέδου ενσωμάτωσης δύο διαφορετικών διατροφικών καινοτόμων ζωοτροφών και συγκεκριμένα των σπερμάτων καμελίνας (Camelina sativa seeds, CS) και της σπιρουλίνας (Spirulina, SP) α) στη γαλακτοπαραγωγή και στη χημική σύσταση του γάλακτος, β) στο προφίλ των λιπαρών οξέων του υγρού της Μ.Κ. (Υ.Μ.Κ.), του πλάσματος του αίματος και του γάλακτος, γ) στην έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος και δ) στη σχετική αφθονία μικροοργανισμών στο υγρό και στερεό περιεχόμενο της Μ.Κ.Για τον πρώτο πειραματισμό, σαράντα οκτώ (48) προβατίνες φυλής Χίου επιλέχθηκαν και χωρίστηκαν σε τέσσερις ισοδύναμες ομάδες (n = 12) από πλευράς διορθωμένης ως προς τη λιποπεριεκτικότητα γαλακτοπαραγωγής (6 %) (1,85 ± 0,3 kg/ημέρα), ηλικίας (2 - 4), ημέρες γαλακτικής περιόδου (67 ± 8) και σωματικού βάρους (55.0 ± 6,5 kg). Τα ζώα σταβλίζονταν ομαδικά ανά ομάδα και για τη διατροφή τους μεταφέρονταν σε ειδικά διαμορφωμένα ατομικά κελιά προκειμένου να επιτευχθεί ατομική διατροφή. Οι προβατίνες τρέφονταν ατομικά με σανό μηδικής, άχυρο σίτου και μείγμα συμπυκνωμένων ζωοτροφών (ΣΖ). Το μείγμα ΣΖ της ομάδας του μάρτυρα (CON) δεν περιείχε σπέρματα καμελίνας, ενώ στις υπόλοιπες τρεις διατροφικές επεμβάσεις, σπέρματα καμελίνας ενσωματώθηκαν στα μείγματα ΣΖ σε ποσοστά 6 % (CS6), 11 % (CS11) και 16 % (CS16), προς μερική αντικατάσταση του σογιάλευρου και του αραβοσίτου. Η χορήγηση του σιτηρεσίου γινόταν δύο φορές ημερησίως σε ισάριθμες ποσότητες, μετά το πέρας της μηχανικής άμελξης.Η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ δεν επηρέασε τη γαλακτοπαραγωγή, ενώ όσον αφορά τη χημική σύσταση του γάλακτος, στην ομάδα CS16 η λιποπεριεκτικότητα του μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την CON (P = 0,046). Η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ, βελτίωσε την ποιότητα του γάλακτος τροποποιώντας τη συγκέντρωση σε SFA (P < 0,001), α-λινολενικό (C18:3 n-3) (P < 0,001), cis-9, trans-11 C18:2 (CLA) (P < 0,001) και τον λόγο ω6/ω3 (P < 0,001) προς την επιθυμητή κατεύθυνση για τον καταναλωτή. Επιπλέον, στο πλάσμα του αίματος, η δραστικότητα της καταλάσης (CAT) αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,006) στις ομάδες CS11 και CS16 και η δραστικότητα της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD) αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,014) στη CS16. Επίσης, η ολική αντιοξειδωτική κατάσταση αυξήθηκε στις ομάδες CS σύμφωνα τις μεθόδους ABTS (P < 0,001) και FRAP (P = 0,008). Ωστόσο, τα επίπεδα της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA), βιοδείκτη οξειδωτικού στρες, αυξήθηκαν σημαντικά (P < 0,001) για την ομάδα CS11 σε σύγκριση με τις CON και CS6 και για την ομάδα CS16 σε σύγκριση με την CS6. Στην ομάδα CS16, τα πρωτεϊνικά καρβονύλια (PC) αυξήθηκαν σημαντικά (P < 0,001). Τέλος, στις ομάδες CS, η οξειδωτική σταθερότητα του γάλακτος ενισχύθηκε, όπως υποδηλώθηκε από τις τροποποιήσεις (P < 0,050) στις δραστικότητες των SOD, CAT και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-Px), στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα και στους βιοδείκτες οξειδωτικού στρες.Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία των προβατινών, χρησιμοποιήθηκε πλατφόρμα PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της ιντερφερόνης-β (TRIF) (P = 0,005), του σχετιζόμενου με τον υποδοχέα TNF παράγοντα 3 (TRAF3) (P = 0,010), του ρυθμιστικού παράγοντα 5 ιντερφερόνης (IRF5) (P = 0,002) και της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης (MAPK) (P = 0,005) που επάγει τον προσαρμογέα TIR, αυξήθηκαν στα μονοκύτταρα των προβατινών της ομάδας CS11. Επιπλέον, στα μονοκύτταρα των προβατινών της CS6, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL1B) αυξήθηκαν (P = 0,015) σε σύγκριση με την CON, ενώ στα ουδετερόφιλα της ίδιας ομάδας τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων IL1B (P < 0,001), Ιντερλευκίνης-8 (IL8) (P = 0,017) και Ιντερλευκίνης-10 (IL10) (P = 0,007) αυξήθηκαν σε σύγκριση με τις CON και CS16. H απόκριση των μονοκυττάρων σχετίζεται με τις διαφορές που παρατηρήθηκαν στο προφίλ των αμινοξέων (κυρίως θρεονίνη, τυροσίνη, σερίνη και λυσίνη) των τεσσάρων μειγμάτων ΣΖ και είναι διαφορετική από αυτή των ουδετερόφιλων.Η σχετική αφθονία των μικροοργανισμών της Μ.Κ. προσδιορίστηκε μέσω πλατφόρμας RT-qPCR. Η σχετική αφθονία των αρχαίων (P < 0,001) και των μεθανοβακτηρίων (P = 0,025) μειώθηκε σημαντικά στο στερεό περιεχόμενο των CS11 και CS16. Επιπλέον, η σχετική αφθονία των πρωτοζώων αυξήθηκε σημαντικά τόσο στο υγρό (P < 0,001) όσο και στο στερεό περιεχόμενο (P = 0,010) της Μ.Κ. της CS6, ενώ αυτή των μυκήτων μειώθηκε σημαντικά (P = 0,043) στο στερεό περιεχόμενο της CS16. Στο Υ.Μ.Κ., η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogens (P < 0,001) και Ruminobacter amylophilus (P = 0,002) αυξήθηκε σημαντικά στις CS6 και CS11, αντίστοιχα. Στο στερεό περιεχόμενο της CS11, η σχετική αφθονία του είδους Ruminococcus flavefaciens μειώθηκε σημαντικά (P = 0,022), ενώ των Ruminobacter amylophilus (P < 0.001) και Butyrivibrio proteoclasticus (P = 0.001) αυξήθηκε σημαντικά. Επίσης, η σχετική αφθονία του είδους Selenomonas ruminantium αυξήθηκε σημαντικά (P = 0.001) στο στερεό περιεχόμενο των CS11 και CS16.Συμπερασματικά, η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ των προβατινών βελτίωσε το προφίλ των λιπαρών οξέων και την οξειδωτική σταθερότητα του γάλακτος προς την επιθυμητή για τον καταναλωτή κατεύθυνση. Επίσης, το υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα των ΣΖ (CS16) δεν είχε αρνητικό αντίκτυπο στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία των προβατινών. Τέλος, η μείωση των μεθανοβακτηρίων και οι τροποποιήσεις στον βακτηριακό πληθυσμό των προβατινών της ομάδας CS16, αναδεικνύουν σημαντικά ευρήματα σχετικά τόσο με τη μείωση των εκπομπών CH4 και κατ’ επέκταση τη μείωση του περιβαλλοντικού αποτυπώματος μίας κτηνοτροφικής εκμετάλλευσης, όσο και για τις ζυμωτικές διεργασίες εντός της Μ.Κ., καθώς οι τροποποιήσεις αυτές δεν επηρέασαν αρνητικά την παραγωγικότητα.Για τον δεύτερο πειραματισμό της διδακτορικής διατριβής, 48 προβατίνες φυλής Χίου επιλέχθηκαν και κατανεμήθηκαν σε 4 ισοδύναμες ομάδες (n = 12) από πλευράς διορθωμένης ως προς τη λιποπεριεκτικότητα γαλακτοπαραγωγής (6 %) (1,85 ± 0,3 kg/ημέρα), ηλικίας (2 - 4), ημέρες γαλακτικής περιόδου (67 ± 8) και σωματικού βάρους (54 ± 6 kg). Οι προβατίνες σταβλίζονταν ομαδικά ανά ομάδα και για τη διατροφή τους μεταφέρονταν σε ειδικά διαμορφωμένα ατομικά κελιά προκειμένου να επιτευχθεί ατομική διατροφή. Οι προβατίνες κατανάλωναν ημερησίως σανό μηδικής, άχυρο σίτου και μείγμα ΣΖ. Η ομάδα του μάρτυρα (CON) κατανάλωνε βασικό σιτηρέσιο χωρίς την ενσωμάτωση σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ, ενώ ανά ζώο σε ημερήσια βάση στις υπόλοιπες τρεις διατροφικές επεμβάσεις, 5 g (SP5), 10 g (SP10) και 15 g (SP15) σπιρουλίνας ενσωματώθηκαν ως πρόσθετο στα μείγματα ΣΖ. Η διάθεση του σιτηρεσίου γινόταν δύο φορές ημερησίως σε ισάριθμες ποσότητες, μετά τη μηχανική άμελξη.Η γαλακτοπαραγωγή και η χημική σύσταση του γάλακτος δεν επηρεάστηκαν από την προσθήκη σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ. Η συγκέντρωση των λιπαρών οξέων μικρής αλύσου αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,001) στο γάλα των προβατινών των ομάδων SP5 και SP10 ενώ των μεσαίας αλύσου μειώθηκε σημαντικά (P = 0,024) στο γάλα της SP10 σε σύγκριση με την CON. Η προσθήκη σπιρουλίνας στο υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης (SP15) στα μείγματα ΣΖ ενίσχυσε τη συγκέντρωση των PUFA (P = 0,027) και μείωσε τον δείκτη θρομβογένεσης (P = 0,046) στο γάλα. Σχετικά με την οξειδωτική κατάσταση των προβατινών, η δραστικότητα της SOD αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,014) στις ομάδες SP. Το ίδιο παρατηρήθηκε για τις δραστικότητες της CAT (P = 0,031), της GSH-Px (P < 0,001) και της μεταφοράσης της γλουταθειόνης (GST) (P = 0,026) στο πλάσμα του αίματος των προβατινών των ομάδων SP10, SP15 και SP5, αντίστοιχα. Αντίθετα, τα επίπεδα των PC μειώθηκαν (P < 0,001) στο πλάσμα του αίματος των προβατινών των ομάδων SP. Η οξειδωτική σταθερότητα του πρόβειου γάλακτος βελτιώθηκε για τις ομάδες SP, όπως αποδείχθηκε από την αύξηση της δραστικότητας των SOD (P = 0,007), CAT (P = 0,011) και GSH-Px (P < 0,001) και της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας [προσδιορισμένη με της μεθόδους ABTS και FRAP (P < 0,001)]. Τέλος, το υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ (SP15) προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση (P = 0,034) στο επίπεδο των PC στο γάλα. Επιπλέον, στα μονοκύτταρα των προβατινών της SP5 αυξήθηκαν σημαντικά τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων TRIF (P = 0,012), MAPK (P = 0,010) και JUND (P = 0,008) σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του IRF5 αυξήθηκαν σημαντικά (P = 0,016) σε σύγκριση με την CON. Στα ουδετερόφιλα, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του MYD88 μειώθηκαν σημαντικά (P < 0,001) στις ομάδες SP10 και SP15 σε σύγκριση με την CON, ενώ του NFKB μειώθηκαν σημαντικά (P = 0,010) στην ομάδα SP10 σε σύγκριση με την CON. Επίσης, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του STAT3 μειώθηκαν σημαντικά (P < 0,001) στις ομάδες SP. Αντίθετα, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του TRIF αυξήθηκαν σημαντικά (P = 0,011) στην SP5 σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες.Στο Υ.Μ.Κ. η σχετική αφθονία του είδους Prevotella brevis αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,001) στις SP5 και SP10 σε σύγκριση με τις CON και SP15. Επίσης, η σχετική αφθονία του Ruminobacter amylophilus μειώθηκε σημαντικά (P = 0,012) στην ομάδα SP10, ενώ στην SP15 η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogenes και Eubacterium ruminantium αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,008 και P = 0,005, αντίστοιχα). Στο στερεό περιεχόμενο, η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogenes στις SP5 και SP10 και Selenomonas ruminantium στις SP5 και SP15 μειώθηκε σημαντικά (P = 0,017 και P = 0,001, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την CON. Επιπλέον, η σχετική αφθονία των Ruminobacter amylophilus (P < 0.001) και Streptococcus bovis (P < 0.001) μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες SP, ενώ του είδους Ruminococcus albus αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,046) στην SP15 σε σύγκριση με την CON. Εν κατακλείδι, το μεγαλύτερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ των προβατινών (15 g/προβατίνα/ημέρα, SP15), βελτίωσε την ποιότητα του παραγόμενου γάλακτος διασφαλίζοντας και την υγεία των προβατινών, όπως διαπιστώθηκε από τη μελέτη του προφίλ των λιπαρών οξέων και της οξειδωτικής σταθερότητας του γάλακτος, της οξειδωτικής κατάστασης του οργανισμού, της σχετικής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία και του μικροβιώματος της μεγάλης κοιλίας.