Developing affinity microscopy: Characterization and use of functionalized AFM tips to measure intermolecular forces
Authors:   , Corregidor Ortiz Daniel 
Published: February 2025

Atomic force microscopy is a near-field microscopy technique that has been used for the study of biological systems for several decades. This is because it is a technique that not only allows us to obtain images, but also allows us to measure other physical quantities such as forces, which allows the characterization of biological systems from different approaches. Furthermore, it is possible to carry out studies in environments that replicate the native physiological conditions of these systems. One of the most widespread applications is related to measuring the interaction forces between biomolecules that interact with one another. However, even though it is a powerful technique, it requires special preparation to be able to study this type of interactions, which means that the technique is not, procedurally, fast and straightforward. Thus, the usage of atomic force microscopy for the characterization of biological systems usually involves the chemical modification of the probes and the surfaces where the molecules to be studied are going to be fixed. For this reason, in this work, whose objective is to develop affinity atomic force microscopy, in order to detect interactions between biomolecules, novel probes and commercial surfaces already chemically modified with amino groups will be used. For all these reasons, this work is structured in three parts: the first part addresses a characterization process of commercial probes using various techniques to evaluate and understand their main features. The second part consists of developing a series of protocols to modify and fix, using different crosslinkers, the biomolecules of interest used in this work. And finally, a final part dedicated to the measurements of biomolecular interactions using the probes and surfaces prepared with some of the protocols developed, in addition to evaluating the performance of this type of commercial probes with respect to modified probes using alternative methods found in the bibliography.

From the entire experimental process, relevant information has been obtained after the characterization of the probes including, for example, the intrinsic parameters, the reactivity and temporal stability of the commercial probes or the initial state of the surfaces of these commercial products. Functionalized surfaces have also been chemically modified to switch the original amine groups to other reactive, such as stressed alkynes, azides or thiols, and with biomolecules such as biotin, streptavidin, as well as enzymes and antibodies. Biomolecular interactions have been measured with single-molecule resolution using two different model systems: biotin-streptavidin and antigen (lactate dehydrogenase, LDH)-antibody (anti-LDH).

RESUMEN

La microscopía de fuerza atómica es una técnica de microscopía de campo cercano utilizada para el estudio de sistemas biológicos desde hace varias décadas. Esto se debe a que es una técnica que no sólo permite obtener imágenes, sino que también permite medir otras magnitudes físicas tales como fuerzas, lo que permite la caracterización de sistemas biológicos desde diferentes perspectivas. Adicionalmente, es posible realizar estudios en entornos que replican las condiciones fisiológicas nativas de estos sistemas. Una de las aplicaciones más extendidas está relacionada con la medida de las fuerzas establecidas entre biomoléculas que interaccionan entre sí. Sin embargo, a pesar de ser una técnica potente, su uso implica una preparación laboriosa que permita el estudio de este tipo de interacciones. Esta característica hace que la técnica no sea, procedimentalmente, ni rápida ni sencilla. Así, la utilización de la microscopía de fuerza atómica para la caracterización de sistemas biológicos suele implicar la modificación química de las sondas y de las superficies donde se van a fijar las moléculas a estudiar, constituyendo procesos relativamente largos y complejos. Por ello, en este trabajo, cuyo objetivo es desarrollar la microscopía de fuerza atómica de afinidad para detectar interacciones entre biomoléculas, se utilizarán sondas y superficies comerciales funcionalizadas con grupos amino. Por todo ello, este trabajo se estructura en tres partes: la primera parte aborda la caracterización de las sondas comerciales utilizando diversas técnicas para evaluar y comprender sus características fundamentales y que hasta ahora no se han determinado con suficiente precisión. La segunda parte consiste en el desarrollo de una serie de protocolos para modificar y fijar, utilizando diferentes agentes entrecruzantes, las biomoléculas de interés utilizadas en este trabajo. Y finalmente, una última parte dedicada a las medidas de interacciones biomoleculares utilizando las sondas y superficies preparadas con algunos de los protocolos desarrollados, además de evaluar el rendimiento de este tipo de sondas comerciales respecto a sondas modificadas utilizando métodos alternativos más comunes encontrados en la bibliografía.

De todo el proceso experimental se ha obtenido información relevante tras la caracterización de las sondas incluidas, por ejemplo, los parámetros intrínsecos, la reactividad y estabilidad temporal de las sondas comerciales o el estado inicial de las superficies de dichos productos comerciales. Las superficies funcionalizadas también se han modificado químicamente para sustituir los grupos aminos originales por otros grupos reactivos tales como alquinos tensionados, azidas o tioles. A estos grupos se les han unido biomoléculas como biotina, estreptavidina, así como enzimas y anticuerpos, demostrándose que estas biomoléculas siguen siendo funcionales tras el proceso de unión. Y, por último, en el tercer bloque, se han medido las interacciones biomoleculares con resolución de molécula única utilizando dos sistemas modelo diferentes: biotina-estreptavidina y antígeno (lactato deshidrogenasa, LDH)-anticuerpo (anti-LDH).