Investigation of the aggregation mechanism of the pathological ataxin-1 protein and potential pharmacological inhibitory approaches
Authors: Γκέκας Ιωάννης 
Published: July 2024

Οι ασθένειες πολυγλουταμίνης (polyQ diseases) αποτελούν μια ομάδα νευροεκφυλιστικών διαταραχών που προκαλούνται από επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων CAG στην κωδική περιοχή γονιδίων. Μία από αυτές τις ασθένειες είναι η νωτιαίο-παρεγκεφαλιδική αταξία τύπου 1. Για να διερευνήσουμε τον ρόλο των αδιάλυτων ενδοπυρηνικών εγκλείστων ΑΤΧΝ1 στην παθογένεια της νωτιαίου-παρεγκεφαλιδικής αταξίας τύπου 1, κατασκευάσαμε ένα νέο μοντέλο πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης με επαγώγιμη υπερέκφραση της μεταλλαγμένης ισομορφής του γονιδίου ATXN1(Q82) σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y. Στη συνέχεια, αναπτύξαμε ένα πρωτόκολλο για την απομόνωση των αδιάλυτων εγκλείστων ATXN1. Βιοφυσικές μελέτες έδειξαν ότι αυτά τα έγκλειστα περιέχουν μόρια RNA, τα οποία αναλύθηκαν μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς. Η ανάλυση δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η δέσμευση κρίσιμων μεταγράφων RNA από τα έγκλειστα ATXN1(Q82) διαταράσσει τη λειτουργία των ριβοσωμάτων, προκαλώντας σφάλματα στη σύνθεση πρωτεϊνών και επηρεάζοντας τη συνολική σταθερότητα του πρωτεώματος. Η παθολογική δράση της ataxin-1 τροποποιείται από πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν μαζί της. Μια από αυτές, η MED15, ενισχύει την τοξικότητα και τη συσσωμάτωση της, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ ataxin-1 και MED15 επηρεάζει την εξέλιξη της νόσου. Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της MED15 στη συσσωμάτωση της παθολογικής πρωτεΐνης ataxin-1, κατασκευάσαμε ένα κυτταρικό μοντέλο σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που χαρακτηρίζεται από σταθερή έκφραση του διαγονιδίου mCherry-MED15 και επαγώγιμη έκφραση του διαγονιδίου YFP-ATXN1(Q82). Στη συνέχεια, προβλέψαμε τις δομές των πρωτεϊνών ATXN1 και MED15 και προσομοιώσαμε την αλληλεπίδρασή τους. Χρησιμοποιώντας τη βιοδοκιμασία LuTHy, η οποία διακρίνεται για την ικανότητά της να ανιχνεύει και να ποσοτικοποιεί πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με εξαιρετική ακρίβεια, επιβεβαιώθηκε in vitro η αμινοξική περιοχή 99-163 της ataxin-1 και 548-665 της MED15 ως τόπος αλληλεπίδρασης μεταξύ των δυο πρωτεϊνών. Έπειτα, διεξήχθη μια εικονική (in silico) σάρωση χημικής βιβλιοθήκης και εντοπίσαμε 24 μόρια που συνδέονται στη θέση αλληλεπίδρασης στην πρωτεΐνη ataxin-1. Οι ουσίες που αναγνωρίστηκαν αξιολογήθηκαν μέσω βιοδοκιμασιών LuTHy. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι η αμινοξική περιοχή 99-163 της πρωτεΐνης ataxin-1 είναι κρίσιμη για τον διμερισμό της, τονίζοντας περαιτέρω τη σημασία της στη συσσωμάτωση της. Επιπλέον, εστιάσαμε στην περιοχή AXH της ataxin-1, η οποία είναι εξίσου σημαντική για την παθογένεια της νόσου καθώς επάγει σε μεγάλο βαθμό τον διμερισμό/ολιγομερισμό της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια δεύτερη εικονική σάρωση χημικής βιβλιοθήκης για μόρια που συνδέονται στη περιοχή ΑΧΗ. Εντοπίστηκαν 42 μόρια που συνδέονται σε αυτήν την περιοχή. Παράλληλα εγκαθιδρύθηκε μια in vitro βιοδοκιμασία LuTHy για την ποσοτικoποίηση του διμερισμού της περιοχής ΑΧΗ της ataxin-1. Οι ουσίες που προέκυψαν από την εικονική σάρωση προστέθηκαν σε βιοδοκιμασίες LuTHy όπου ποσοτικοποιήθηκε η επίδρασή τους στο διμερισμό της περιοχής ΑΧΗ. Στη συνέχεια, οι ουσίες που βρέθηκαν ότι αναστέλλουν την αλληλεπίδραση ΑΤΧΝ1-ΜΕD15 και τον διμερισμό της περιοχής AXH αξιολογήθηκαν περαιτέρω ως προς την ικανότητα τους να αναστέλλουν το διμερισμό της πλήρους-μήκους πρωτεΐνης ataxin-1. Τέλος, μόρια εγνωσμένης νευροπροστατευτικής δράσης, εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν τη συσσωμάτωσή της παθολογικής πρωτεΐνης ataxin-1 σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα με την μέθοδο dot-blot. Διαπιστώθηκε ότι η ουσία G4-Mal μπορεί να μειώσει την ποσότητα των αδιάλυτων συσσωματωμάτων της πρωτεΐνης ataxin-1. Ωστόσο, το καφεϊκό οξύ, το γαλλικό οξύ και τα παράγωγα τους δεν έδειξαν τέτοια αποτελέσματα.