Παράγοντες που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό υποκειμένων πυρηνοκάρπων
Authors: Τσαφούρος Αθανάσιος 
Published: November 2021

Ο αγενής πολλαπλασιασμός αποτελεί το βασικό τρόπο αναπαραγωγής φυτών με ίδια γενετικά χαρακτηριστικά τόσο μεταξύ τους όσο και με το μητρικό φυτό από το οποίο προήλθαν. Μεταξύ των διαφόρων μεθόδων αγενούς πολλαπλασιασμού, ο πολλαπλασιασμός με μοσχεύματα βλαστού είναι ένας από τους πιο διαδεδομένους τρόπους αγενούς πολλαπλασιασμού των υποκειμένων πυρηνοκάρπων. Έκτος της χρήσης μοσχευμάτων και των άλλων μεθόδων, τα τελευταία χρόνια, αν και αποτελούσε αρχικά ένα χρήσιμο ερευνητικό εργαλείο, έχει αρχίσει να αναπτύσσεται και ο in vitro πολλαπλασιασμός, ως μέσο για τον εμπορικό πολλαπλασιασμό των προαναφερθέντων ειδών. Ωστόσο, μεταξύ των διαφόρων υποκειμένων παρατηρούνται σημαντικές διαφορές στο δυναμικό και την ικανότητα ριζοβολίας των μοσχευμάτων τους, αλλά και ως προς την ικανότητα βλαστογένεσης και ριζοβολίας σε in vitro συνθήκες. Αντικείμενο της παρούσας διατριβής απετέλεσε η μελέτη διαφόρων φυσιολογικών, βιοχημικών και θρεπτικών παραγόντων, οι οποίοι εμπλέκονται στη ριζοβολία φυλλοφόρων μοσχευμάτων, ξυλοποιημένων μοσχευμάτων και στη βλαστογένεση και ριζοβολία εκφύτων υποκειμένων πυρηνοκάρπων, τα οποία χαρακτηρίζονται από διαφορετικό δυναμικό ριζοβολίας. Για τη μελέτη των διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων τα ξυλοποιημένα μοσχεύματα προέρχονταν από τα υποκείμενα ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’ και ‘Rootpac R’, ενώ τα φυλλοφόρα από τα ‘Myrobalan 29C’ και ‘GF 677’. Για τα in vitro πειράματα επιλέχθηκε το υποκείμενο ‘Krymsk 5’, ενώ για τη μελέτη της επίδρασης διαφόρων ουσιών στη ριζοβολία επιλέχθηκαν τα υποκείμενα ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’, ‘Garnem’ και ‘Krymsk 86’. Αρχικά (Kεφ. ΙΙο), για τη μελέτη των παραγόντων που εμπλέκονται στη ριζοβολία ξυλοποιημένων μοσχευμάτων υποκειμένων πυρηνοκάρπων μελετήθηκε η επίδραση του μήνα (Νοέμβριος, Δεκέμβριος, Ιανουάριος) και του τμήματος λήψης των μοσχευμάτων (κορυφαίο, μεσαίο, βασικό), από το μητρικό βλαστό, των υποκειμένων ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Rootpac R’ και ‘Myrobalan 29C’. Αναλύθηκαν επίσης, βιοχημικοί και θρεπτικοί παράγοντες όπως φαινολικά συστατικά, πολυαμίνες, σάκχαρα, άμυλο και θρεπτικά στοιχεία για να βρεθεί πιθανή συσχέτιση της ριζοβολίας με κάποιον από αυτούς. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων βρέθηκε ότι το ‘Cadaman’ χαρακτηριζόταν από το μικρότερο δυναμικό ριζοβολίας, ενώ το ‘Rootpac R’ από το υψηλότερο. Ο μήνας λήψης δεν είχε σημαντική επίδραση στο ποσοστό ριζοβολίας για το ‘GF 677’, ενώ το τμήμα είχε σημαντική επίδραση μόνο για το ‘Rootpac R’. Ωστόσο, δεν βρέθηκε άμεση σύνδεση συγκεκριμένου μήνα ή τμήματος με σταθερά υψηλά ή χαμηλά ποσοστά ριζοβολίας. Τέλος, δεν βρέθηκε συσχέτιση κάποιου βιοχημικού ή θρεπτικού παράγοντα με τη ριζοβολία μεταξύ των τεσσάρων υποκειμένων που μελετήθηκαν. Κατά το δεύτερο και τρίτο πείραμα μελετήθηκαν οι διακυμάνσεις διαφόρων βιοχημικών παραγόντων κατά τις πρώτες 15 ημέρες της ριζοβολίας τόσο ξυλοποιημένων όσο και φυλλοφόρων μοσχευμάτων των υποκειμένων πυρηνοκάρπων ‘Myrobalan 29C’ και ‘GF 677’. Μελετήθηκαν διάφορες ομάδες φαινολικών ενώσεων και μεμονωμένες φαινολικές ενώσεις, η διακύμανση υδατανθράκων (σακχάρων και αμύλου) και πολυαμινών, και οι μεταβολές των ενεργοτήτων διαφόρων ενζύμων σχετιζομένων με τη ριζοβολία. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι και για τους δύο τύπους μοσχευμάτων το ‘GF 677’ ριζοβόλησε σε χαμηλότερα ποσοστά από το ‘Myrobalan 29C’. Στα φυλλοφόρα μοσχεύματα βρέθηκε ότι η συγκέντρωση των ελεύθερων πολυαμινών και ειδικότερα της ελεύθερης πουτρεσκίνης ήταν υψηλότερη στο ‘GF 677’, όμως το υποκείμενο χαρακτηριζόταν από χαμηλότερη ενεργότητα διάμινο-οξειδάσης (DAO) και υψηλότερη ενεργότητα καταλάσης (CAT). Kαι στους δύο τύπους μοσχευμάτων η συγκέντρωση του αμύλου ήταν υψηλότερη στο ‘Myrobalan 29C’. Επίσης, η συγκέντρωση των ταννινών ήταν χαμηλότερη στο ‘Myrobalan 29C’, ενώ τόσο η συγκέντρωση των φλαβανολών όσο και η συγκέντρωση των ο-κινονών ήταν υψηλότερη. Τέλος, η ενεργότητα της οξειδάσης του ινδολυλοξικού οξέος (ΙΑΑ-oxidase) ήταν χαμηλότερη για το συγκεκριμένο υποκείμενο, ανεξαρτήτως τύπου μοσχεύματος. Στο κεφάλαιο ΙΙΙ μελετήθηκε το υποκείμενο κερασιάς ‘Krymsk 5’ σε in vitro συνθήκες κατά τα στάδια της βλαστογένεσης και της ριζοβλίας. Εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων κυτοκινινών στην βλαστογένεση όπως και η επίδραση διαφόρων πηγών άνθρακα για το ίδιο στάδιο. Βρέθηκε ότι η βενζυλ-αδενίνη (ΒΑ) ήταν η αποδοτικότερη κυτοκινίνη, ενώ αντικατάσταση της ευρέως χρησιμοποιούμενης σακχαρόζης από τη φρουκτόζη και από αναλογία σακχάρων που ανιχνεύθηκαν ενδογενώς, δύναται να βελτιώσει ορισμένες παραμέτρους βλαστογένεσης.Μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση του pH με τα χαμηλότερα μεταποστειρωτικά pH να ευνοούν την παραγωγή αυξημένου αριθμού βλαστών και αριθμού κόμβων ανά έκφυτο. Τέλος, ελέγχθηκε η ανταπόκριση εκφύτων του υποκειμένου στις ουσίες θειϊκή αδενίνη, τριακοντανόλη, σεροτονίνη, μελατονίνη, ντοπαμίνη και αδρεναλίνη σε συνδυασμό με την αποδοτικότερη συγκέντρωση ΒΑ, με τα έκφυτα να ανταποκρίνονται θετικά στις τρεις πρώτες ουσίες. Για το στάδιο της ριζοβολίας, αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση των αυξινών ινδολο-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) και 1-ναφθαλινοξικό οξύ (1-ΝΑΑ), όπου με συνδυασμό τους επετεύχθη το μέγιστο ποσοστό ριζοβολίας των εκφύτων. Ακολούθως, συγκρίθηκαν τα ποσοστά ριζοβολίας των εκφύτων μεταξύ υποστρωμάτων, εφοδιασμένων με διαφορετικές πηγές άνθρακα, απουσία αυξινών και βρέθηκε ότι έκφυτα καλλιεργούμενα σε υπόστρωμα εφοδιασμένο με φρουκτόζη ριζοβόλησαν σε υψηλότερα ποσοστά. Ακόμη, από συνδυαστικά πειράματα μεταξύ του τμήματος του καλλιεργούμενου εκφύτου και του χρησιμοποιούμενου σακχάρου βρέθηκε ότι οι βλαστοκορυφές δύνανται να ριζοβολούν σε υψηλότερα ποσοστά από τα κομβικά έκφυτα, ενώ καλλιεργούμενες σε υπόστρωμα εφοδιασμένο με φρουκτόζη ριζοβόλησαν ταχύτερα από αντίστοιχου τύπου έκφυτα όταν αυτά καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα με σακχαρόζη. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δύο πειράματα στα οποία διερευνήθηκαν οι μεταβολές ορισμένων ενδογενών βιοχημικών παραγόντων στα έκφυτα κατά τις αρχικές φάσεις της in vitro ριζοβολίας (πρώτες 15 ημέρες παραμονής στο υπόστρωμα). Κατά το πρώτο πείραμα, έκφυτα τοποθετήθηκαν σε υποστρώματα ισομοριακών συγκεντρώσεων είτε φρουκτόζης είτε σακχαρόζης, ενώ κατά το δεύτερο είτε κομβικά έκφυτα είτε βλαστοκορυφές τοποθετήθηκαν σε υπόστρωμα που περιείχε φρουκτόζη. Από τις αναλύσεις των ενδογενών παραγόντων προέκυψε πως οι επεμβάσεις με την υψηλότερη ριζοβολία (δηλ. υπόστρωμα φρουκτόζης και βλαστοκορυφές) χαρακτηρίζονταν από σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση ο-κινονών, πουτρεσκίνης και ολικών πολυαμινών. Στο τελευταίο κεφάλαιο (Κεφ. IV) πραγματοποιήθηκαν επεμβάσεις για τη βελτίωση του δυναμικού της ριζοβολίας μοσχευμάτων και εκφύτων in vitro ύστερα από συνεκτίμηση των αποτελεσμάτων των κεφαλαίων II και III. Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα από τα υποκείμενα ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘Garnem’ και ‘Krymsk 86’, ενώ για τις in vitro επεμβάσεις χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα του υποκειμένου ‘Krymsk 5’. Βρέθηκε ότι η ηλικία της μητρικής φυτείας είχε αρνητική επίδραση επί της ριζοβολίας των ξυλοποιημένων μοσχευμάτων του υποκειμένου ‘GF 677’, ενώ ήταν απαραίτητη η χρήση αυξίνης για βελτίωση των ποσοστών ριζοβολίας. Επίσης, βρέθηκε ότι το H2O2 σε συνδυασμό με ΙΒΑ μπορεί να βελτιώσει το δυναμικό ριζοβολίας φυλλοφόρων μοσχευμάτων του ίδιου υποκειμένου, ενώ αντίστοιχη επίδραση είχε και η εφαρμογή σπερμίνης. Μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση της μελατονίνης στη ριζοβολία φυλλοφόρων μοσχευμάτων των υποκειμένων ‘Myrobalan 29C’, ‘Garnem’, ‘Krymsk 86’ και ‘Cadaman’ από την οποία προέκυψε θετική επίδραση μόνο σε δύο από τα τέσσερα υποκείμενα (‘Myrobalan 29C’ και ‘Krymsk 86’), αρνητική σε ένα (‘Garnem’) και καμία επίδραση στο τέταρτο (‘Cadaman’). Επεμβάσεις με ντοπαμίνη αύξησαν το ποσοστό ριζοβολίας για τα φυλλοφόρα μοσχεύματα των ‘GF 677’ και ‘Cadaman’, ενώ στα ξυλοποιημένα μοσχεύματα δεν βρέθηκε αντίστοιχη επίδραση. Ακόμη, το χλωρογενικό οξύ αύξησε το ποσοστό ριζοβολίας των ξυλοποιημένων μοσχευμάτων του ‘Cadaman’ αλλά μόνο για το ένα από τα δύο έτη εφαρμογής. Τέλος, το ποσοστό ριζοβολίας φυλλοφόρων μοσχευμάτων του ‘Cadaman’ αυξήθηκε από την εφαρμογή των κινονών 1,4-benzoquinone και 2-hydroxy-1,4-naphthaquinone, ενώ για το ‘GF 677’ δεν παρατηρήθηκε αύξηση. Όσον αφορά τις in vitro επεμβάσεις σε έκφυτα, μελετήθηκε η επίδραση φαινολικών ενώσεων και κινονών στη ριζοβολία τους. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων βρέθηκε ότι η κινόνη 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone αύξησε σημαντικά τα ποσοστά ριζοβολίας απουσία ΙΒΑ, ενώ παρουσία ΙΒΑ η ντοπαμίνη, το χλωρογενικό οξύ, η 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone και η p-benzoquinone αύξησαν σημαντικά τα ποσοστά της in vitro ριζοβολίας. Συμπερασματικά, μπορεί να υποστηριχθεί ότι οι μεταβολές των διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων πιθανώς να είναι σημαντικότερες από την αρχική τους συγκέντρωση σε σχέση με το δυναμικό ριζοβολίας των μοσχευμάτων. Επίσης, υποδηλώνεται ο ενδεχόμενος προωθητικός ρόλος του H2O2 και της οξειδάσης των διαμινών και ο παρεμποδιστικός της καταλάσης, ενώ επαναλαμβάνεται ο παρεμποδιστικός ρόλος της ΙΑΑ οξειδάσης κατά τις αρχικές φάσεις της ριζοβολίας. Ακόμη, επιβεβαιώνεται η ευνοϊκή επίδραση της 6-benzyladenine, αλλά και ουσιών οι οποίες προκαλούν τη συσσώρευση ενδογενώς παραγόμενων κυτοκινινών, στην in vitro βλαστογένεση των Prunus. Προτείνεται, επίσης, ο πειραματισμός με διάφορα σάκχαρα πριν την επιλογή του πλέον κατάλληλου. Επιπροσθέτως, φάνηκε ότι μπορεί να υπάρξουν περιπτώσεις ειδών που δύναναται, απουσία αυξινών, να ριζοβολήσουν in vitro σε υψηλά ποσοστά με το τμήμα του εκφύτου και το επιλεχθέν σάκχαρο να επηρεάζουν τη ριζοβολία. Τέλος, οι ο-διφαινόλες ντοπαμίνη και χλωρογενικό οξύ αλλά και διάφορες κινόνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση του δυναμικού ριζοβολίας.