Μελέτη του παθοφυσιολογικού ρόλου του Dnajc11 γονιδίου σε ένα μοντέλο νευρομυϊκής νόσου στο ποντίκι
Authors: Βιολιτζή Φωτεινή 
Published: September 2021

Οι μιτοχονδριακές ασθένειες εμφανίζονται κυρίως με νευρολογικά συμπτώματα, ενώ στη πλειοψηφία τους παραμένουν ανίατες λόγω της άγνωστης αιτιολογίας τους. Η μελέτη της μοριακής βάσης και των παθοφυσιολογικών μηχανισμών είναι δύσκολη στη περίπτωση των μιτοχονδριακών ασθενειών καθώς δεν υπάρχουν τα κατάλληλα γενετικά μοντέλα. Πρόσφατα, το γονίδιο Dnajc11 αναγνωρίστηκε ως ένα νέο γενετικό αίτιο για την εμφάνιση ενός θνησιγόνου νευρομυϊκού φαινοτύπου στα DnaJC11spc/spc ποντίκια που χαρακτηρίζεται από δομικές αλλαγές των μιτοχονδρίων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η DNAJC11 πρωτεΐνη εντοπίζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και φαίνεται να αλληλεπιδρά με μέλη του συμπλόκου MICOS που οργανώνει τις αναδιπλώσεις της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Ωστόσο, η λειτουργία της πρωτεΐνης DNAJC11 παραμένει άγνωστη και η ανάλυση των DnaJC11spc/spc ποντικιών αναμένεται να διελευκάνει τους παθογενετικούς μηχανισμούς που επάγονται από την απουσία της. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε: α) Ανάλυση της ενεργότητας των μιτοχονδρίων σε πληθώρα ιστών από DnaJC11spc/spc ποντίκια προκειμένου να ανιχνευθεί η επίδραση της έλλειψης της DNAJC11 πρωτεΐνης στη μιτοχονδριακή λειτουργία, β) Ανίχνευση απορυθμισμένων πρωτεϊνικών δικτύων και μονοπατιών στον εγκέφαλο DnaJC11spc/spc ποντικιών με πρωτεομική ανάλυση για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών, γ) Μελέτη των αλληλεπιδράσεων της DNAJC11 (ποντικού και ανθρώπου) για την κατανόηση της λειτουργίας της μέσω σήμανσης με το πεπτίδιο FLAG (DNAJC11-FLAG), έκφρασής της στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά ΗΕΚ293FΤ, ανοσοκατακρήμνισης με αντι-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων που περιέχουν την DNAJC11-FLAG με πρωτεομική ανάλυση, δ) Δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακών ποντικιών που εκφράζουν την DNAJC11-FLAG πρωτεΐνη (TgDNAJC11-FLAG), για την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων της DNAJC11 in vivo ώστε να διαπιστωθούν ιστοειδικές αλληλεπιδράσεις και ε) Λειτουργικός χαρακτηρισμός των περιοχών J και DUF3395 της DNAJC11 πρωτεΐνης ώστε να διαπιστωθεί η εμπλοκή της καθεμίας τόσο στις αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες όσο και στην μιτοχονδριακή τοπολογία της DNAJC11.Η μιτοχονδριακή ανάλυση έδειξε σημαντική μείωση της μιτοχονδριακής ενεργότητας σε ποικίλους ιστούς των DnaJC11spc/spc ποντικιών, όπως σε εγκέφαλο, παρεγκεφαλίδα, καρδιά, νεφρούς, σπλήνα και θύμο, συμβαδίζοντας με την ανώμαλη μορφολογία των μιτοχονδρίων που είχε παρατηρηθεί στο παρελθόν. Συγκριτική πρωτεομική ανάλυση ολικού εκχυλίσματος εγκεφάλου από DnaJC11spc/spc και WT ποντίκια φανέρωσε δραματική μείωση στις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες, κυρίως στις πρωτεΐνες της εσωτερικής μεμβράνης, καθώς και πρωτεϊνών που εντοπίζονται στις συνάψεις. Επίσης, ανιχνεύτηκε αυξημένη ουβικιτινυλίωση της πρωτεΐνης GS, που συμμετέχει στην ανακύκλωση νευροδιαβιβαστών, στον εγκέφαλο των DnaJC11spc/spc ποντικών, χωρίς ωστόσο να επηρεάζονται τα επίπεδα έκφρασης της. Προκειμένου να κατανοηθεί η λειτουργία της DNAJC11 μελετήθηκε το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της με έκφραση της DNAJC11-FLAG πρωτεΐνης τόσο στην κυτταρική σειρά HEK293FT όσο και σε διαγονιδιακά ποντίκια TgDNAJC11-FLAG. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν τις αλληλεπιδράσεις της DNAJC11 με μέλη του συμπλόκου ΜΙCOS που καθορίζει στην αναδίπλωση της μεμβράνης cristae και για πρώτη φορά εντόπισε αλληλεπιδράσεις με μιτοχονδριακές πρωτεΐνες τόσο της εξωτερικής μεμβράνης (VDACs) όσο και της εσωτερικής (ANTs) που εμπλέκονται στην παραγωγή και τη διάθεση του ΑΤP στο κύτταρο, και στα δύο συστήματα που μελετήθηκαν. Στην κυτταρική σειρά αναδείχθηκαν αλληλεπιδράσεις με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες όπως HSP70s, ένζυμα και ριβοσωμικές υπομονάδες, ενώ στον εγκέφαλο αναγνωρίστηκαν αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες που είναι εμπλουτισμένες στην περιοχή των συνάψεων, αναδεικνύοντας διαφοροποιήσεις που πιθανόν σχετίζονται με ιστοειδική δράση της DNAJC11 αλλά και με το μεταβολικό στάδιο κάθε βιολογικού συστήματος. Λειτουργικός χαρακτηρισμός της WT DNAJC11 και δομικών μεταλλαγμάτων της έδειξε πως η περιοχή J ευθύνεται για τη μιτοχονδριακή τοπολογία της DNAJC11, ενώ η περιοχή DUF3395 εμπλέκεται στις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποδεικνύουν τη συμβολή της DNAJC11 στη φυσιολογική λειτουργία και δομή των μιτοχονδρίων στους περισσότερους ιστούς. Οι μιτοχονδριακές ανωμαλίες των DnaJC11spc/spc ποντικιών και το πλούσιο δίκτυο αλληλεπιδράσεων της DNAJC11, αναδεικνύουν την εμπλοκή της σε βασικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν το μιτοχόνδριο με την παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών.Τα DnaJC11spc/spc ποντίκια και τα TgDNAJC11-FLAG ποντίκια αποτελούν μοναδικά γενετικά εργαλεία για την κατανόηση νευρομυϊκών παθήσεων όπου εμπλέκονται τα μιτοχόνδρια.