Prenatal molecular genetic diagnosis technique for congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency
Authors: Е.В. Соловьёва, , М.М. Склеймова, , Д.А. Татару, , Л.И. Минайчева, , Л.П. Назаренко, 
Published: January 2023

Цель: представление метода пренатальной молекулярно-генетической диагностики (ПД) врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) с использованием анализа частых патогенных вариантов, косвенной диагностики и анализа пола. Методы. Молекулярно-генетические исследования выполнены на образцах ДНК, выделенных из образцов цельной крови и ворсин хориона. Стратегия исследования основана на методах из литературных источников, собственных модификациях и разработках. Исследование включало анализ частых патогенных вариантов гена CYP21A2 (P30L, IVS2AS A/C-G, -13, 8 bp del, I172N, V281L, Q318X, R356W, P453S), перестройки между геном и псевдогеном (делеция 30 т.п.н.), косвенных STR-маркеров (TNFa, D6S273, D6S2781, LH1, D6S1666, D6S2443) и пола плода (SRY и AMELX/AMELY). Базовым методом для всех этапов служила полимеразная цепная реакция (ПЦР). При анализе точковых мутаций гена CYP21A2 использовали подход двухраундовой ПЦР и последующего рестрикционного анализа. Для детекции применяли методы гель-электрофореза и фрагментного анализа на генетическом анализаторе. Результаты. В нашем исследовании детально описано пренатальное молекулярно-генетическое исследование ВГКН с особенностями всех этапов тестирования. В семье, планирующей ПД и имеющей ребенка с сольтеряющей формой ВГКН, проводилось предварительное молекулярно-генетическое обследование. У больного ребенка выявлен компаундный генотип с патогенными вариантами IVS2AS A/C-G, -13 материнского происхождения и комплексным мутантным аллелем P30L + 8 bp del + IVS2AS A/C-G, -13 отцовского происхождения. В образце плода нами выявлен гетерозиготный генотип с патогенным материнским вариантом во втором интроне. Исследованные полиморфные STR-локусы, фланкирующие ген CYP21A2, подтвердили нормальный отцовский и патогенный материнский гаплотипы у плода. Дополнительно данные по STR свидетельствовали об отсутствии контаминации материала плода материнской ДНК. У матери неинформативными (гомозиготными) были два микросателлитных маркера, у отца информативны были все шесть. Заключение. Предложенная нами система молекулярно-генетического тестирования, включающая анализ патогенных вариантов в сочетании с косвенной диагностикой по STR-маркерам и анализом пола позволяет обеспечить надежный вариант ПД ВГКН.

Aim: to present a technique for prenatal molecular genetic diagnosis (PD) of congenital adrenal hyperplasia (CAH), including test of common pathogenic CYP21A2 variants, linkage microsatellite markers and sex markers analysis. Methods. DNA samples were isolated from whole blood samples and chorionic villi sample. The research based on methods from literature and own developments. The assay included the analysis of common mutations in the CYP21A2 gene (P30L, IVS2AS A/C-G,-13, 8 bp del, I172N, V281L, Q318X, R356W, P453S), gene-pseudogene rearrangement (deletion of 30 kb), STR markers (TNFa, D6S273, D6S2781, LH1, D6S1666, D6S2443) and sex markers (SRY and AMELX/AMELY). PCR was baseline method for all steps. We performed a nested PCR approach and subsequent restriction analysis for point mutations of the CYP21A2 gene. Methods of gel electrophoresis and fragment analysis on a genetic analyzer were used for detection. Results. Our study describes the detailed approach of prenatal molecular genetic investigation of CAH. Preliminary molecular genetic examination of a family with a salt-wasting form of CAH child was carried out. A compound genotype with pathogenic maternal variants IVS2AS A/C-G, -13 and a complex mutant paternal allele P30L + 8 bp del + IVS2AS A/C-G, -13 was revealed in the affected child. In the fetal sample we identified a heterozygous genotype with a pathogenic maternal allele of the 2nd intron. The polymorphic microsatellite markers flanking the CYP21A2 gene confirmed the normal paternal and pathogenic maternal haplotypes in the fetus. Additionally STR data indicated that there was no contamination of maternal DNA fetal material. The mother was uninformative (homozygous) with two microsatellite markers, the father was informative with all six. Conclusions. We devised an improved stepwise molecular diagnostic strategy includes the direct analysis of pathogenic variants in combination with indirect diagnostics by STR markers and sex analysis for reliable PD of CAH.