Απομόνωση και καθορισμός του γενότυπου ανθεκτικών στη βανκομυκίνη στελεχών Enterococcus spp. από υγιή ζώα και ανθρώπους
Authors: Τζαβάρας Ιωάννης 
Published: August 2021

Την τελευταία εικοσαετία ανθεκτικοί στη βανκομυκίνη εντερόκοκκοι (vancomycin-resistant enterococci, VRE) έχουν αναδυθεί ως σημαντικά νοσοκομειακά παθογόνα λόγω της ευρείας χρήσης των γλυκοπεπτιδίων, κυρίως της βανκομυκίνης στα νοσοκομεία. Εν τω μεταξύ, η χρήση του γλυκοπεπτιδίου αβοπαρκίνη, ως αυξητικός παράγοντας στα παραγωγικά ζώα και τα πτηνά, είχε επίσης ως αποτέλεσμα την εμφάνιση των VRE σε αυτά παγκοσμίως, δείχνοντας ότι τα ζώα αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια δυνητική δεξαμενή ανθεκτικών στα γλυκοπεπτίδια γενετικών καθοριστών. Η χρήση της αβοπαρκίνης απαγορεύθηκε το 1997 στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Οδηγία 97/6 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής).Επικαιροποιημένα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι στην Ελλάδα τα ποσοστά επιπολασμού των κλινικών Enterococcus faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (VREF) είναι πολύ υψηλότερα σε σύγκριση με την πλειοψηφία των ευρωπαϊκών χωρών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του επιπολασμού των VRE στα παραγωγικά ζώα (πτηνά, χοίρους, βοοειδή) στον Ελλαδικό χώρο καθώς και σε άτομα που σχετίζονταν με αυτά (πτηνοσφαγείς και εκδοροσφαγείς), ο προσδιορισμός του van γενότυπου αυτών, καθώς και η αξιολόγηση της πιθανής επιδημιολογικής τους συσχέτισης με κλινικά VRE στελέχη απομονωμένα από νοσηλευμένους ασθενείς από τις ίδιες γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας, και κατά την ίδια χρονική περίοδο.Συνολικά πεντακόσια (500) δείγματα τυφλού εντέρου κρεοπαραγωγών ορνιθίων συλλέχθηκαν σε δύο σφαγεία πουλερικών, που προέρχονταν από οκτώ (8) πτηνοτροφεία κρεοπαραγωγών ορνιθίων της Βόρειας Ελλάδας. Κατά την ίδια χρονική περίοδο, σε δύο σφαγεία ζώων, συλλέχθηκαν δείγματα περιεχομένου παχέος (τυφλού) εντέρου από εξήντα (60) μόσχους και διακόσια πενήντα (250) παχυνόμενους χοίρους. Οι μόσχοι προέρχονταν από επτά (7) εκτροφές της Βόρειας Ελλάδας, ενώ οι χοίροι από έξι (6) εκτροφές της Βόρειας και Κεντρικής Ελλάδας. Επιπλέον, κατά την ίδια χρονική περίοδο, 50 δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από ισάριθμους πτηνοσφαγείς καθώς και 50 δείγματα κοπράνων από ισάριθμους εκδοροσφαγείς που εργάζονταν στα αντίστοιχα σφαγεία. Η απομόνωση VRE στελεχών επιχειρούνταν με εκλεκτικό προεμπλουτισμό σε υποστρώματα που περιείχαν βανκομυκίνη (6mg/l).Τέλος, εξετάστηκαν 63 ανθρώπινα κλινικά στελέχη VREF, που απομονώθηκαν την ίδια χρονική περίοδο, εκ των οποίων 48 προέρχονταν από δείγματα ενηλίκων (n=13) και νεογνών (n=35) από το Ιπποκράτειο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης και 15 προέρχονταν από δείγματα ενηλίκων ασθενών από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας.Για τον έλεγχο της αντοχής στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη όλα τα ύποπτα VRE στελέχη εξετάστηκαν με τη μέθοδο Kirby-Bauer. Επιπρόσθετα, υπολογίστηκε η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) αυτών με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων.Για την ανίχνευση των van γονιδίων αντοχής, όλα τα ύποπτα στελέχη με MIC βανκομυκίνης ≥ 2 μg/ml εξετάστηκαν με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (multiplex PCR). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση εκκινητών ειδικών για την ανίχνευση των γονίδιων vanA, vanB, vanC1-C2, vanD, vanE, vanG, ddl-E. faecium και ddl-E. faecalis. Συνολικά, 120 στελέχη VRE απομονώθηκαν από 112 (22,4%) δείγματα κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Στελέχη VREF που έφεραν το γονίδιο vanA επικρατούσαν και ανακτήθηκαν από 74 (14,8%) δείγματα από 5 από τα 8 (62,5%) συνολικά πτηνοτροφεία, ενώ στελέχη E. gallinarum που έφεραν το γονίδιο vanC ανακτήθηκαν από 39 (7,8%) δείγματα επίσης από 5 πτηνοτροφεία. VRE απομονώθηκαν από 14 (28%) δείγματα πτηνοσφαγέων εκ των οποίων 10 (20%) ήταν θετικά σε VREF και 4 (8%) σε E. gallinarum. Επιπρόσθετα, ένα στέλεχος VREF απομονώθηκε από 1 (1,7%) δείγμα μόσχων που έφερε το γονίδιο vanA. Δεν απομονώθηκαν VRE από τα δείγματα κοπράνων των χοίρων καθώς και από τα δείγματα κοπράνων των εκδοροσφαγέων. Τα ποσοστά του επιπολασμού των VREF στελεχών των ορνιθίων, δείχνουν μια αξιοσημείωτη εμμονή στο περιβάλλον κρεοπαραγωγής των κρεοπαραγωγών ορνιθίων ακόμα και πάνω από μια δεκαετία από την κατάργηση της αβοπαρκίνης και χωρίς καμία εμφανή πίεση από τη χρήση άλλων γλυκοπεπτιδίων. Όλα τα VRE στελέχη, επιπρόσθετα του ελέγχου της αντοχής τους στη βανκομυκίνη και τεϊκοπλανίνη, εξετάστηκαν για τον καθορισμό της αντοχής που παρουσίαζαν σε 12 αντιμικροβιακές ουσίες. Τα VREF στελέχη των ορνιθίων παρουσίαζαν σταθερά αντοχή στην τετρακυκλίνη (100%). Αντίθετα, η συντριπτική πλειοψηφία των κλινικών VREF στελεχών παρουσίαζαν αντοχή στην αμπικιλλίνη (93,7%) και την πενικιλλίνη (93,7%). Ωστόσο, χαμηλά ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (9,5%) και την αμπικιλλίνη (16,5%) παρατηρήθηκαν μεταξύ των κλινικών VREF και των VREF των ορνιθίων, αντίστοιχα. Τα στελέχη των πτηνοσφαγέων εμφάνισαν χαμηλά ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη (10%), ομοίως με των ορνιθίων. Επιπρόσθετα, εμφάνισαν μέτρια ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (40%). Μία άλλη αντιμικροβιακή ουσία στην οποία τα VREF στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά εμφάνισαν υψηλά ποσοστά αντοχής, ήταν η ερυθρομυκίνη (54,4% και 57,1%, αντίστοιχα). Η ανάλυση των φαινοτύπων αντοχής των VREF στελεχών, ανέδειξε 53 διακριτούς τύπους, με μόνο 5 από αυτούς να μοιράζονται μεταξύ των στελεχών από τις διαφορετικές πηγές. Εν τω μεταξύ, το 54,4% των VREF στελεχών των ορνιθίων, το VREF στέλεχος των μόσχων και το 92,1% των κλινικών, ήταν πολυάντοχα, δηλ. παρουσίαζαν αντοχή σε ≥5 κλάσεις αντιμικροβιακών, ενώ αντίθετα μόνο το 10% των VREF στελεχών που απομονώθηκαν από τους πτηνοσφαγείς ήταν πολυάντοχο.Οι διαφορές στα ποσοστά της αντοχής στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες σε συνδυασμό με την ύπαρξη διαφορετικών φαινοτύπων αντοχής μεταξύ των VREF από τις διαφορετικές πηγές (ορνίθια, μόσχοι, πτηνοσφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς) αντανακλούν το ευρύ (διαφορετικό) φάσμα της επιλεκτικής πίεσης που ασκείται από τη χρήση των αντιμικροβιακών ουσιών σε κάθε πηγή.Ο συσχετισμός των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής μεταξύ των VREF στελεχών από τις πηγές που απομονώθηκαν, καθορίστηκε με τη χρήση της Διαχωριστικής Ανάλυσης (Discriminant analysis, DA), βασισμένη στο σύνολο των 14 αντιμικροβιακών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ευαισθησίας. Όλα τα VREF στελέχη των κρεοπαραγωγών ορνιθίων και τα κλινικά ταξινομήθηκαν στην αντίστοιχη πηγή τους σε ποσοστό 100% και 85,7%, αντίστοιχα, δείχνοντας ένα σαφή διαχωρισμό και συσχετισμό με την πηγή προέλευσής τους. Αντίθετα, το ποσοστό ταξινόμησης των πτηνοσφαγέων στην πηγή τους ήταν μόλις 50%, δείχνοντας το χαμηλό συσχετισμό με την πηγή προέλευσής τους. Χαρακτηριστικό είναι ότι το 40% των στελεχών των πτηνοσφαγέων ταξινομήθηκαν κοντά στην πηγή των ορνιθίων, λόγω κοινών φαινοτύπων που μοιράζονταν με τα στελέχη των ορνιθίων.Για την γενετική-επιδημιολογική συσχέτιση των VREF στελεχών, επιλέχτηκε και εφαρμόστηκε η PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) που παρουσιάζει μεγάλη ικανότητα διαφοροποίησης στελεχών. Η PFGE ανάλυση αποκάλυψε ηλεκτροφορητικά DNA πρότυπα, τα οποία συσχετίζονταν σαφώς με την πηγή τους. Εν τω μεταξύ, μια υψηλή γενετική ποικιλότητα παρατηρήθηκε μέσα σε κάθε πηγή (ορνίθια, πτηνοσφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς), όπως αποδεικνύεται από την ύπαρξη πολυάριθμων κλώνων. Συγκεκριμένα, τα 71 από τα 79 στελέχη των ορνιθίων ομαδοποιήθηκαν σε 4 κλωνικές ομάδες, C1-C4, ενώ τα 37, από τα 63 νοσοκομειακά στελέχη ομαδοποιήθηκαν επίσης σε 4 κλώνους, τους Η1 - Η4, εμφανίζοντας κάτω από 60% ομοιότητα με τους C κλώνους. Όλα τα υπόλοιπα στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά στελέχη, τα στελέχη των πτηνοσφαγέων καθώς και το στέλεχος VREF των μόσχων έδωσαν μεμονωμένους κλώνους μη συσχετιζόμενους μεταξύ τους ή με τους κλώνους C ή Η.Η σύγκριση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων έδειξε ότι τα VREF στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά VREF αποτελούν μη συσχετιζόμενους γενετικά πληθυσμούς, αναδεικνύοντας τη μη κλωνική διασπορά μεταξύ των δύο πηγών. Επιπρόσθετα, κανένας κοινός κλώνος μεταξύ VREF των ορνιθίων και VREF των πτηνοσφαγέων, παρά τους κοινούς φαινοτύπους όπως υποστηρίζεται από την DA, δεν αναδείχτηκε, που καταρχήν δείχνει τη μη κλωνική διασπορά μεταξύ των δυο πηγών. Ωστόσο, η ύπαρξη γενετικά αδιαφοροποίητων PFGE προτύπων στελεχών VREF ορνιθίων μεταξύ πτηνοτροφείων από διαφορετικές γεωγραφικά περιοχές, όπως επίσης και το γεγονός ότι οι H1 και H2 κλώνοι μοιράζονταν στελέχη με κοινούς φαινοτύπους αντοχής, από διαφορετικά νοσοκομεία, δείχνει ότι η κλωνική διασπορά φαίνεται να συμβαίνει μέσα στην ίδια πηγή.Οι παραπάνω πληροφορίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βάση για να διευκρινιστεί περαιτέρω εάν «ειδικά» vanA γενετικοί καθοριστές κυκλοφορούν στο περιβάλλον των ορνιθίων ή στο περιβάλλον των ανθρώπων, όπως επίσης να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της μακρόχρονης παρουσίας των VREF στην Ελλάδα.