Μοριακή χαρτογράφηση μικροβιακών κοινοτήτων υδάτινων οικοσυστημάτων της Ηπείρου και μελέτη αξιοποίησής τους ως πηγών πιθανών αντικαρκινικών παραγόντων
Authors: Τούκα Αναστασία 
Published: September 2021

Τα αρχαία οικοσυστήματα προσελκύουν το ενδιαφέρον των ερευνητών καθώς η παρατεταμένη ζωή τους και η γεωγραφική τους απομόνωση τα καθιστούν μοντέλα μελέτης εξέλιξης ειδών και περιβαλλοντικών αλλαγών. Πολλές αρχαίες λίμνες βρίσκονται στον ελλαδικό χώρο. Μια από αυτές είναι η λίμνη Παμβώτιδα την οποία και μελετήσαμε. Η λίμνη Παμβώτιδα είναι μια ρηχή, ευτροφική λίμνη, στην οποία δεν έχουν διεξαχθεί μελέτες προσδιορισμού της ποικιλότητας Βακτηρίων και Αρχαίων. Θέμα επίσης της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η απομόνωση και η καλλιέργεια ετερότροφων Βακτηρίων και κυανοβακτηρίων από τη λίμνη και έπειτα η πραγματοποίηση δοκιμών κυτταροτοξικότητας μεθανολικών και υδατικών εκχυλισμάτων αυτών σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιήσαμε δείγματα νερού και ιλύος από τη λίμνη Παμβώτιδα από δυο σταθμούς, τις τέσσερις εποχές του έτους. Προσδιορίσαμε τις φυσικοχημικές παραμέτρους της ιλύος και του νερού και στη συνέχεια για να μελετήσουμε την ποικιλότητα Βακτηρίων/Αρχαίων προχωρήσαμε σε εκχύλιση DNA, PCR, πήκτωμα DGGE, κλωνοποίηση, αλληλούχιση, φυλογενετική ανάλυση και αλληλούχιση επόμενης γενιάς. Για την ποσοτικοποίηση των προκαρυωτικών κυττάρων στα δείγματα της λίμνης χρησιμοποιήσαμε real-time PCR. Με τη μέθοδο BIOLOG μελετήσαμε το βιοχημικό προφίλ των Βακτηρίων. Εφαρμόσαμε στατιστική ανάλυση θέλοντας να διαπιστώσουμε αν υπάρχει συσχέτιση των φυσικοχημικών παραμέτρων με την αφθονία Βακτηρίων και Αρχαίων. Στην περίπτωση των βακτηριακών καλλιεργειών, χρησιμοποιήσαμε θρεπτικά μέσα R2A και BG11 για την ανάπτυξη και απομόνωση ετερότροφων Βακτηρίων και κυανοβακτηρίων, αντίστοιχα. Πρωτόκολλα εκχύλισης σε μεθανόλη και νερό χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των βακτηριακών εκχυλισμάτων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμές τοξικότητας σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (A549, HepG2, MCF7) και σε φυσιολογικούς ινοβλάστες (MRC5). Στην παρούσα εργασία ανιχνεύσαμε μεγάλο ποσοστό Βακτηρίων (50.88%) και Αρχαίων (20.65%) στα δείγματα ιλύος της λίμνης Παμβώτιδας που ανήκουν σε νέα είδη/στελέχη και ακόμη μεγαλύτερα ποσοστά (84.21%, 95.65% αντίστοιχα) που ανήκουν σε μη καλλιεργούμενα είδη με βάση εισαγωγές στη βάση δεδομένων GenBank. Στα ιζήματα της λίμνης κυριαρχούν Proteobacteria, Cyanobacteria και μεθανογόνα Αρχαία. Επίσης, τα Αρχαία καταλαμβάνουν το 11.13%-23.88% του συνολικού αριθμού των προκαρυωτικών κυττάρων, ενώ τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την αφθονία των προκαρυωτικών κυττάρων είναι τα Ni,Cr,Ca,pH,TKN,As,TC. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε αλληλουχίες κυανοβακτηρίων οι οποίες διαπιστώσαμε πως σχηματίζουν μια φυλογενετικά ξεχωριστή ομάδα η οποία ονομάστηκε “Lake Pamvotis cluster”. Στο νερό της λίμνης ανιχνεύσαμε αλληλουχίες Βακτηρίων που ανήκουν σε νέα είδη/στελέχη. Τα Αρχαία καταλαμβάνουν το 0.14%-9.77% της μικροβιακής κοινότητας και για πρώτη φορά διαπιστώσαμε πως κυανοβακτήρια του γένους Synechococcus sp. πιθανόν δημιουργούν μια άνθιση την άνοιξη, διαφορετική από εκείνη του καλοκαιριού (Microcystis sp.).Στη συνέχεια, απομονώσαμε και καλλιεργήσαμε ετερότροφα Βακτήρια και κυανοβακτήρια, εκχυλίσματα των οποίων χρησιμοποιήσαμε σε δοκιμές τοξικότητες στις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ένα μεθανολικό εκχύλισμα από κυανοβακτήριο διαπιστώσαμε πως προκαλεί έντονα φαινόμενα απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου μαστού (MCF7) αλλά και στους φυσιολογικούς ινοβλάστες (MRC5). Το κυανοβακτήριο αυτό το οποίο χαρακτηρίσαμε μοριακά, ανήκει στο γένος Pseudanabaena/Limnothrix sp. και ο βιοδραστικός παράγοντας που παράγει δεν ανήκει στις γνωστές κυανοτοξίνες.