Γενικευμένη επιγενετική (μεθυλίωση CpG) και τρανσκριπτομική ανάλυση στις βιολογικές επιπτώσεις των βιοανθεκτικών οργανικών ρύπων (POPs) σε ανθρώπινα λευκά κύτταρα αίματος
Authors: Βιδάλη Μαρία-Σοφία 
Published: February 2023

Στην παρούσα εργασία γίνεται εκτενής μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων αντιπροσωπευτικών χημικών ουσιών/ενώσεων μιας ευρείας ομάδας περιβαλλοντικών ρύπων που είναι γνωστοί ως επίμονοι οργανικοί ρύποι ή αλλιώς POPs (Persistent Organic Pollutants). Οι POPs είναι χημικές ουσίες παγκόσμιας ανησυχίας λόγω των σημαντικών συγκεντρώσεών τους στα υδάτινα οικοσυστήματα, της ικανότητάς τους να μεταφέρονται σε μεγάλες αποστάσεις, καθώς και των σημαντικών επιπτώσεών τους στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον. Η κύρια οδός έκθεσης σε POPs είναι μέσω της από του στόματος κατανάλωσης τροφίμων που ακολουθείται από βιοσυσσώρευση σε βιολογικές μήτρες, όπως ο λιπώδης ιστό και το πλάσμα του αίματος. Η ικανότητά τους να συσσωρεύονται μέσω της τροφικής αλυσίδας, τα καθιστά δυνητικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Μεταξύ των POPs, τα πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCBs) είναι υψίστης σημασίας, μιας και χρησιμοποιήθηκαν σε εκατοντάδες βιομηχανικές και εμπορικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων ηλεκτρικών και υδραυλικών εφαρμογών, εφαρμογών μεταφοράς θερμότητας, ως πλαστικοποιητές σε χρώματα, πλαστικά, και σε πολλές άλλες. Η ευρεία χρήση των PCBs, σε συνδυασμό με ακατάλληλες πρακτικές απόρριψης, έχει οδηγήσει σε σημαντική επιβάρυνση του περιβάλλοντος από εμπορικά σκευάσματα. Το 2016, ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC) αναβάθμισε τα PCBs από την προηγούμενη Ομάδα 2Α «Πιθανώς καρκινογόνο για τον άνθρωπο» στην Ομάδα 1 «Καρκινογόνα για τον άνθρωπο» βασιζόμενοι κυρίως σε επαρκή στοιχεία για αυξημένο κίνδυνο δερματικού κακοήθους μελανώματος. Επίσης, τα PCBs έχουν συνδεθεί με ανοσοκαταστολή, βλάβη των μακροφάγων και καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος μη Hodgkin (NHL). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι τα PCBs έχουν ανοσοτοξικές, προφλεγμονώδεις, ενδοκρινικές και αναπαραγωγικές επιπτώσεις, ενώ ευθύνονται και για νευροαναπτυξιακές ανωμαλίες, αλλαγές συμπεριφοράς και ανεπάρκειες στην ανάπτυξη των παιδιών. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της έκθεσης σε PCBs και των αλλαγών στη μεθυλίωση του DNA σε όλο το γονιδίωμα λευκοκυττάρων υγιών εθελοντών, παρέχοντας στοιχεία που υποστηρίζουν μια αιτιολογική σχέση μεταξύ των παρατηρούμενων αλλαγών της μεθυλίωσης CpG και της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Με βάση τα παραπάνω, η παρούσα μελέτη έχει στόχο να αποσαφηνίσει τις επιδράσεις των PCBs στη μεθυλίωση των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro. Ως εκ τούτου, η κυτταρική σειρά U937 και μονοκύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος (PBMCs) εκτέθηκαν σε PCB-118 (ενός PCB με μορφή διοξίνης), στο PCB-153 (ενός PCB που δεν έχει τη μορφή διοξίνης) και στο εξαχλωροβενζόλιο (HCB) και έγιναν λεπτομερείς αναλύσεις κυτταροτοξικότητας, γονοτοξικότητας και CpG μεθυλίωσης. Όλες οι ενώσεις που ελέγχθηκαν δεν έδειξαν κάποια σημαντική γονοτοξικότητα σε όλες τις περιόδους έκθεσης και τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Αντίθετα, εκτεταμένη δοσοεξαρτώμενη υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, σε διεγερμένα PBMCs στα οποία χορηγήθηκε PCB 118 και PCB 153, καθώς και μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική υπομεθυλίωση σε διεγερμένα κύτταρα με χορήγηση HCB. Στη συνέχεια, ακολούθησε ολιστική τοξικογενομική μελέτη σε ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs με χρήση της μικροσυστοιχίας InfiniumMethylEpic για να διαπιστωθούν αλλαγές στη CpG μεθυλίωση και αλληλούχηση Νέας Γενιάς για την μεταγραφομική ανάλυση. Στα ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs η διαφοροποίηση από τα δείγματα αναφοράς ακολουθεί την σειρά PCB 153>PCB 118>HCB και PCB 118>PCB 153>HCB, αντίστοιχα, ενώ βρέθηκαν πολλές κοινές διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις τόσο μεταξύ των δυο PCBs όσο και μεταξύ PCBs και HCB στα ενεργοποιημένα και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Οι πολύ χαμηλές τιμές σημαντικότητας μετά από υπεργεωμετρική ανάλυση υποδήλωσαν ότι οι μηχανισμοί που επιδρούν τα επιλεγμένα POPs στην CpG μεθυλίωση έχουν σημαντικές ομοιότητες. Μετά από βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων που αντιστοιχούν σε επιλεγμένες διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις με ασθένειες τόσο για τα ενεργοποιημένα όσο και για τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs βρέθηκαν συσχετίσεις με διάφορα είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της λευχαιμίας και την λεμφοειδούς λευχαιμίας, καθώς και πληθώρα ψυχικών και νευρογνωστικών διαταραχών. Στην ανάλυση των διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών βρέθηκε σαφής εμπλουτισμός ομοιοακόλουθων γονιδίων και στην βιοπληροφορική ανάλυση συσχετισμός με μεγάλο αριθμός καρκίνων του αίματος τόσο στα ενεργοποιημένα όσο και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Η μεταγραφομική ανάλυση έδειξε ότι αρχικά τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs στον χρόνο μελέτης δεν έχουν δώσει αρκετές πληροφορίες προς ανάλυση και στα ενεργοποιημένα PBMCs μεγάλο ποσοστό των RNAs που αναλύθηκαν ανήκουν στην κατηγορία των lncRNA. Η μεταγραφομική βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα βιολογικά μονοπάτια, έδειξε ότι τόσο το PCB 118 όσο και το PCB 153 επηρεάζουν βασικές αλληλεπιδράσεις της λειτουργίας των κυττάρων.