Υπερμοριακά συστήματα σχηματιζόμενα από την αλληλεπίδραση λιποσωμάτων με δενδριτικά πολυμερή
Authors: Τσόγκας Ιωάννης 
Published: January 2014

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση δενδριτικών πολυμερών, τροποποιημένων στην επιφάνειά τους με την γουανιδική ομάδα, με λιποσώματα αποτελούμενα από PC:Chol:DHP, με το DHP να έχει ως πολική κεφαλή την φωσφορική ομάδα. Η αλληλεπίδραση των συστημάτων αυτών πραγματοποιείται μέσω της μοριακής αναγνώρισης των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων γουανιδικών-φωσφορικών ομάδων μέσω ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης και σχηματισμού δεσμών υδρογόνου. Δενδριμερή δυο διαφορετικών γενεών τροποποιήθηκαν με γουανιδικές ομάδες, διαφοροποιώντας τον ποσοστό τροποποίησής τους, την απόστασή τους από την επιφάνεια των δενδριμερών και την ισορροπία μεταξύ υδρόφιλων και υδρόφοβων επιφανειακών ομάδων, με στόχο την μελέτη της επίδρασης των παραπάνω χαρακτηριστικών στην διαδικασία της μοριακής αναγνώρισης. Επιπλέον, με δεδομένο το γεγονός ότι πολλοί μεμβρανικοί μεταφορείς οφείλουν την ιδιότητά τους αυτή στην παρουσία της L-αργινίνης και γουανιδικής ομάδας, μελετήθηκε η ικανότητα των γουανιδιωμένων δενδριμερικών να διαπερνούν την λιποσωμική μεμβράνη, θεωρώντας αυτήν ως ένα ικανοποιητικό μοντέλο της κυτταρικής μεμβράνης. Τέλος, χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά Α549 ελέγχθηκε η ορθότητα των αποτελεσμάτων με in vitro πειράματα. Για τον σκοπό αυτό οι επιφανειακές ομάδες των δενδριμερών τροποποιήθηκαν μερικώς με γουανιδικές ομάδες και οι υπόλοιπες αδρανοποιήθηκαν είτε με αντίδραση με οξικό ανυδρίτη είτε με προπυλενοξείδιο. Επιπλέον, συνετέθησαν δενδριμερή όπου μεταξύ των επιφανειακών ομάδων και της γουανιδικής ομάδας παρεμβάλεται μικρή επεκτατική αλυσίδα, καθώς και ένα δενδριμερές τροποποιημένο με L-αργινίνη. Τέλος, εισαγωγή γουανιδικών ομάδων έγινε και σε δυο γενιές δενδριτικών πολυ-λυσινών. Η μελέτη της αλληλεπίδρασης έδειξε πως σε μικρές μοριακές αναλογίες των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων ομάδων ή όταν χρησιμοποιούνται δενδριμερή με μικρό ποσοστό τροποποίησης, δεν παρατηρείται μεταβολή των διαστάσεων των αρχικών μικρών μονοστοιβαδικών λιποσωμάτων. Αντίθετα, σε μεγάλες μοριακές αναλογίες ή όταν χρησιμοποιούνται δενδριμερή με υψηλό ποσοστό γουανιδίωσης, σχηματίζονται μεγάλα συσσωματώματα. Συγκρίνοντας δενδριμερή του ίδιου ποσοστού τροποποίησης αλλά διαφορετικής γενιάς, το μεγαλύτερο δενδριμερές προκαλούσε εντονότερη συσσωμάτωση. Επιπλέον, η οργάνωση της λιπιδικής διπλοστοιβάδας επηρεάζει την αλληλεπίδραση, καθώς όταν αυτή βρίσκεται στην υγρή κρυσταλλική φάση η συσσωμάτωση γίνεται εντονότερη. Η εξέταση της μορφολογίας των συσσωματωμάτων έδειξε πως αυτά είναι ουσιαστικά μεγαλύτερες υπερμοριακές δομές λιποσωμικής φύσεως που σχηματίζονται λόγω της σύντηξης των αρχικών μικρών λιποσωμάτων προς νέες πολυκυστιδικές δομές. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα χωρίς διάσπαση των μεμβρανών των αρχικών λιποσωμάτων αλλά με συνένωσή τους και ανάμειξη των εσωτερικών υδατικών τους διαμερισμάτων. Η διαδικασία της σύντηξης ενισχύεται από την αύξηση της μοριακής αναλογίας των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων ομάδων, του ποσοστού τροποποίησης των δενδριμερών, της ρευστότητας της λιπιδικής μεμβράνης και της γενιάς του δενδριμερούς. Με μετρήσεις απόσβεσης φθορισμού και χρησιμοποιώντας επισημασμένα δενδριμερή με ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη (FITC) μελετήθηκε η ικανότητά τους να διαπερνούν την λιποσωμική μεμβράνη σε μικρές μοριακές αναλογίες γουανιδικής/φωσφορικής ομάδας. Η ικανότητά τους αυτή είναι εξαρτημένη από την γενιά του δενδριμερούς, το ποσοστό τροποποίησής τους και από την ρευστότητα της μεμβράνης. Τα υψηλώς γουανιδιωμένα δενδριμερή αδυνατούν να διαπεράσουν την λιπιδική μεμβράνη, ενώ για δενδριμερή του ίδιου ποσοστού τροποποίησης αυτό της μικρότερης γενιάς εμφάνισε δραστικότητα. Από τα αποτελέσματα καθίσταται εμφανές πως είναι απαραίτητη μια ισορροπία μεταξύ υδρόφιλων και υδρόφοβων ομάδων που επιτρέπει στο δενδριμερές να διασχίσει την λιποσωμική μεμβράνη. Τέλος, τα αποτελέσματα που προέκυψαν χρησιμοποιώντας τα λιποσώματα ως μοντέλα κυτταρικών μεμβρανών επιβεβαιώθηκαν και από in vitro πειράματα, όπου πιστοποιήθηκε η ικανότητα των δενδριμερικών παραγώγων να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και να εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα ή την πυρηνική μεμβράνη ή τον πυρήνα. Όλα τα παραπάνω συνηγορούν στην παρουσία ενός μηχανισμού που βασίζεται αρχικά στην εξουδετέρωση των φορτισμένων γουανιδικών ομάδων από τις φωσφορικές μέσω της μοριακής τους αναγνώρισης, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός μη πολικού συμπλόκου, το οποίο σε συνδυασμό με την παρουσία υδρόφοβων ομάδων στην επιφάνεια του δενδριμερούς, καταφέρνει να διασχίσει την λιπιδική διπλοστοιβάδα