Μελέτη του Β κυτταρικού υποδοχέα σε κακοήθη λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα
Authors: Μπίκος Βασίλειος 
Published: August 2021

Η παρούσα διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει τρεις διακριτές ενότητες στις οποίες πραγματοποιείται μελέτη των αντιγονικών υποδοχέων των Β λεμφοκυττάρων σε πληθυσμούς κακοήθων και φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων.1ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΥΠΕΡΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΠΛΗΝΙΚΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΤΗΣ ΟΡΙΑΚΗΣ ΖΩΝΗΣΠραγματοποιήθηκε ανοσογενετική ανάλυση σε 345 αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ που ενισχύθηκαν από 337 περιπτώσεις ασθενών με πρωτοπαθές σπληνικό λέμφωμα από μικρά Β λεμφοκύτταρα με προέλευση την οριακή ζώνη. Τρία γονίδια IGHV χρησιμοποιούνταν στο 45.8% των αναδιατάξεων (IGHV1-2: 24.9%, IGHV4-34: 12.8%, IGHV3-23: 8.1%). Ειδικότερα, για το γονίδιο IGHV1-2, ανιχνεύθηκε ισχυρή επιλεκτικότητα στο επίπεδο των διαφορετικών αλληλόμορφων του, καθώς σε 79 από τις συνολικά 86 αναδιατάξεις IGHV1-2 (92%) χρησιμοποιείται το αλληλόμορφο *04. Η συχνότητα αναδιάταξης του αλληλόμορφου IGHV1-2*04, στο υποσύνολο των περιπτώσεων που διαγνώστηκαν ως ΣΛΟΖ με βάση ανοσοϊστοχημική εξέταση υλικού σπληνεκτομής έφτασε στο 31%. Οι αναδιατάξεις IGHV1-2*04 χαρακτηρίζονταν από σημαντικά μακρύτερη περιοχή VΗ CDR3 σε σύγκριση με όλες τις υπόλοιπες περιπτώσεις κι εμφάνιζαν επιλεκτικότητα στη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHD που οδηγούσε στο σχηματισμό περιοχών CDR3 με κοινά αμινοξικά μοτίβα. Η πλειονότητα των αναδιατάξεων που αναλύθηκαν (299/345, 86.7%) ήταν μεταλλαγμένες. Ειδικότερα, 75/79 (95%) αναδιατάξεις του αλληλόμορφου IGHV1-2*04 ήταν μεταλλαγμένες, ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές (56/75 cases, 74.6%) έφεραν λίγες μεταλλάξεις κι εμφάνιζαν 97-99.9% ταυτότητα με το μη αναδιαταγμένο αλληλόμορφο. Μάλιστα, οι μεταλλάξεις ήταν συντηρητικού χαρακτήρα κι επικεντρώνονταν σε συγκεκριμένες θέσεις της μεταβλητής περιοχής. Αυτά τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των αντιγονικών υποδοχέων υποδηλώνουν την πιθανότητα συμμετοχής συγκεκριμένων (υπερ)αντιγόνων στην παθογένεση του ΣΛΟΖ. Επιπλέον, ενισχύουν την άποψη ότι ιδιαίτερα υποσύνολα περιπτώσεων ΣΛΟΖ, όπως το υποσύνολο με κλωνοτυπικές αναδιατάξεις IGHV1-2*04, προέρχονται από προγονικούς κυτταρικούς πληθυσμούς που φέρουν αντιγονικούς υποδοχείς με περιορισμένο εύρος ειδικοτήτων, καθώς έχουν προσαρμοστεί στην αντιμετώπιση συγκεκριμένων αντιγονικών προκλήσεων.2ΜΕΛΕΤΗ ΕΝΔΟΚΛΩΝΙΚΗΣ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΠΛΗΝΙΚΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΤΗΣ ΟΡΙΑΚΗΣ ΖΩΝΗΣ ΜΕ IGHV1-2*04 ΚΛΩΝΟΤΥΠΙΚΟΥΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣΗ εντυπωσιακή επιλεκτικότητα ρεπερτορίου στο ΣΛΟΖ, μ’ επικράτηση του γονιδίου IGHV1-2 και μάλιστα συγκεκριμένου αλληλόμορφου (*04), και τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά τους (επιλεκτική χρησιμοποίηση των γονιδίων IGHD3-3 και IGHD3-22, χωρίς όμως αυξημένη συχνότητα VH CDR3 στερεοτυπίας, αυξημένο μήκος της περιοχής VH CDR3 και περιορισμένο φορτίο σωματικών μεταλλάξεων με χαρακτηριστικές αμινοξικές αντικαταστάσεις), εγείρουν ερωτήματα αναφορικά με το ενδεχόμενο και τον τύπο της αντιγονικής διέγερσης, τα οποία εξετάζονται με την προσέγγιση της υποκλωνοποίησης των αναδιατάξεων V(D)J για την αναζήτηση ενδοκλωνικής ετερογένειας (ΕΕ). Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε 11 ασθενείς με ΣΛΟΖ τεκμηριωμένο σε υλικό σπληνεκτομής (n=10) ή οστεομυελικής βιοψίας (n=1), οι οποίοι εξέφραζαν κλωνοτυπικές αναδιατάξεις IGHV1-2. Έξι και 2 αναδιατάξεις, αντιστοίχως, χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHD3-3 και IGHD3-22. Οι περιοχές VH CDR3 εμφάνιζαν αυξημένο μήκος (διάμεσο μήκος: 21 αμινοξέα, εύρος: 19-27). Εκτός από μια αναδιάταξη με νουκλεοτιδική ταυτότητα 93.1%, οι υπόλοιπες εμφάνιζαν λίγες μεταλλάξεις (διάμεση νουκλεοτιδική ταυτότητα: 98.3%). Συνολικά αναλύθηκαν 201 υποκλώνοι, 8-28 ανά περίπτωση (διάμεση τιμή: 18). Δέκα από τις 11 αναδιατάξεις που αναλύθηκαν έφεραν επιβεβαιωμένες μεταλλάξεις (μεταλλάξεις που εμφανίζονταν τουλάχιστον σε δύο υποκλώνους) και θεωρήθηκε ότι εμφανίζουν ΕΕ. Επιβεβαιώθηκαν 60 διαφορετικές μεταλλάξεις σε 51 θέσεις κατά μήκος της μεταβλητής περιοχής, καθώς σε επτά θέσεις συνέβαιναν δύο διαφορετικές αλλαγές και σε μια συνέβαιναν και οι τρεις πιθανές αλλαγές. 39/60 μεταλλάξεις (65%) προκαλούσαν αντικατάσταση αμινοξέος (μεταλλάξεις αντικατάστασης, R), ενώ 21/60 (35%) ήταν σιωπηρές (S). Η ανάλυση της κατανομής και των ιδιοτήτων των επιβεβαιωμένων μεταλλάξεων ανέδειξε: (i) κοινά πρότυπα ΕΕ, υπό την έννοια της εισαγωγής ταυτόσημης μετάλλαξης σε υποκλώνους διαφορετικών ασθενών, (ii) έντονη στόχευση επιλεγμένων κωδικόνιων (ιδίως IMGT/HFR2-39), (iii) συντηρητικές αντικαταστάσεις, δηλαδή αντικατάσταση αμινοξέος από άλλο αμινοξύ της ίδιας λειτουργικής ομάδας, (iv) περιορισμένη παραλλακτικότητα στην περιοχή VH CDR3. Επίσης, σε 5/11 περιπτώσεις οι υποκλώνοι κατατάσσονταν σε δύο κύριες ομάδες, ένδειξη για πρώιμη «διακλάδωση» του κλωνικού πληθυσμού σε υποπληθυσμούς με ιδιαίτερα πρότυπα μεταλλάξεων. Συμπερασματικά: (i) επιβεβαιώνεται έντονη ΕΕ στην υποομάδα ασθενών με ΣΛΟΖ με κλωνοτυπικές ανοσοσφαιρίνες IGHV1-2*04, ανεξάρτητα από το φορτίο μεταλλάξεων, (ii) αποκαλύπτεται ότι η ΕΕ στο ΣΛΟΖ είναι κατευθυνόμενη και όχι τυχαία διεργασία, (iii) προκύπτουν ισχυρές ενδείξεις για το ρόλο της αντιγονικής διέγερσης όχι μόνο στην επιλογή των κλωνογενών κυττάρων αλλά και στην πορεία του νοσήματος. Συνεπώς, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ενισχύουν την άποψη ότι το ΣΛΟΖ προέρχεται από νεοπλασματική εξαλλαγή ενός αντιγονικά έμπειρου κυττάρου, τουλάχιστον στο υποσύνολο ασθενών με ανοσοσφαιρίνες IGHV1-2.3ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΩΝ IGHV-IGHD-IGHJ ΣΕ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥΣ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΝΗΜΗΣ ΑΠΟ ΥΓΙΕΙΣ ΔΟΤΕΣΣτον άνθρωπο έχει ταυτοποιηθεί η ύπαρξη διακριτών υποπληθυσμών Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Ωστόσο, προς το παρόν δεν έχει αποδειχθεί αν τα διαφορετικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους αντικατοπτρίζουν την προέλευσή τους από διαφορετικούς τύπους άνοσων απαντήσεων. Στα πλαίσια της μελέτης διακρίθηκαν έξι υποπληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων μνήμης, με βάση το φαινότυπό τους και, ιδίως, τη διαφορική έκφραση του δείκτη CD27 και του ισότυπου της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών. Η συγκριτική ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών των Β κυτταρικών υποδοχέων αποκάλυψε (i) διαφορές στο ρεπερτόριο γονιδίων ΙGHV, IGHD και IGHJ, (ii) διαφορές στο βαθμό επίδρασης του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης, (iii) διαφορετική κατανομή μεταλλάξεων τόσο μεταξύ όλων των αναδιατάξεων που ανήκουν σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς, όσο και μεταξύ των αναδιατάξεων διαφορετικών υποπληθυσμών που χρησιμοποιούν γονίδια IGHV της ίδιας υποομάδας (π.χ. IGHV1, IGHV3, IGHV4) και (iv) διαφορές στα χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR3, ιδίως στο μήκος της. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης παρέχουν ενδείξεις που υποδηλώνουν την πιθανότητα ότι τα διαφορετικά υποσύνολα Β λεμφοκυττάρων μνήμης δημιουργήθηκαν μέσω διαφορετικών μονοπατιών οντογένεσης και παρέχουν τη δυνατότητα μελέτης και συσχέτισης καθενός από αυτά με συγκεκριμένες διαταραχές του ανοσοποιητικού συστήματος.