Enzyme-catalyzed cascade reactions with (nano)biocatalytic systems
Authors: Γιαννακοπούλου Αρχόντω 
Published: August 2023

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στο σχεδιασμό, την ανάπτυξη και την εφαρμογή καινοτόμων πολυενζυμικών βιοκαταλυτικών συστημάτων σε αλυδιδωτές αντιδράσεις βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Αυτά τα συστήματα αποτελούνται από περισσότερα του ενός ένζυμα που προέρχονται είτε από διαφορετικούς οργανισμούς είτε από διαφορετικές τάξεις ενζύμων (π.χ. υδρολάσες, οξειδοαναγωγάσες κ.τ.λ.) και μπορεί να είναι είτε ελεύθερα είτε συν-ακινητοποιημένα σε νανοφορείς που φέρουν χαρακτηριστικά ιδιαίτερου ενδιαφέροντος. Η παρούσα διατριβή εξετάζει διαφορετικές προσεγγίσεις για τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη πολυενζυμικών συστημάτων και ερευνά τη δυνατότητα εφαρμογής τους σε αλυσιδωτές αντιδράσεις βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Πιο αναλυτικά, η διατριβή παρουσιάζει τα ερευνητικά αποτελέσματα των δημοσιεύσεων που προέκυψαν και αφορούν στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πολυενζυμικών συστημάτων για την υδρόλυση της κυτταρίνης, τη βιομετατροπή της ελευρωπαΐνης σε υδροξυτυροσόλη και την ενζυμική τροποποίηση διαφόρων πολυμερών. Ο χαρακτηρισμός των παραπάνω συστημάτων ως προς τη δομή, τη δραστικότητα και τη λειτουργική τους σταθερότητα βασίστηκε σε μια συνδυαστική προσέγγιση διαφόρων τεχνικών, όπως για παράδειγμα η Φασματοσκοπία ορατού-υπεριώδους, η Φασματοσκοπία Φθορισμού και ο Κυκλικός Διχρωισμός. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσφέρει νέες γνώσεις και καινοτόμες προσεγγίσεις για το σχεδιασμό πολυενζυμικών (νανο)συστημάτων με σκοπό τη βελτίωση της απόδοσης και της εκλεκτικότητας διαφόρων βιοκαταλυτικών αντιδράσεων και την ανάπτυξη καινοτόμων βιοϋλικών με βελτιωμένες ιδιότητες. Στο πλαίσιο αυτής της διδακτορικής διατριβής, ερευνήθηκαν διαφορετικές μέθοδοι σχεδιασμού πολυενζυμικών συστημάτων, όπως η συνδυαστική χρήση ανόργανων και οργανικών υλικών υποστήριξης, η συνδυαστική χρήση ενζύμων που προέρχονται από διαφορετικές ομάδες, καθώς και η συνδυαστική χρήση διαφορετικών συνθηκών αντίδρασης για την επίτευξη υψηλών αποδόσεων. Το πρώτο ερευνητικό θέμα της διατριβής αυτής εστιάζει στην παρασκευή, τον χαρακτηρισμό και την εφαρμογή ενός νέου μαγνητικού νανοβιοκαταλύτη αποτελούμενου από τέσσερα ένζυμα που αναπτύχθηκε μέσω της ταυτόχρονης ομοιοπολικής συν-ακινητοποίησης της κυτταρινάσης (CelDZ1), της β-γλυκοσιδάσης (bgl), της οξειδάσης της γλυκόζης (GOx) και της υπεροξειδάσης του χρένου (HRP) στην επιφάνεια μαγνητικών νανοσωματιδίων (MNPs) τροποποιημένων με (3-αμινοπροπυλ)τριαιθοξυσιλάνιο (ΑPTES). O νανοβιοκαταλύτης που παρασκευάστηκε χαρακτηρίστηκε με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές. Η διαδικασία της συν-ακινητοποίησης απέδωσε τη μέγιστη απόδοση ακινητοποίησης (CelDZ1: 42%, bgl: 66%, GOx: 94% και HRP: 78%) σε συγκέντρωση γλουταραλδεΰδης (δι-λειτουργικό αντιδραστήριο σύνδεσης των ομάδων μεταξύ του ενζύμου και του υλικού) 10% v/v, έπειτα από 2 ώρες επώασης του νανοϋλικού με το ένζυμο και σε αναλογία ολικής μάζας ενζύμων ως προς νανοϋλικό 1:1. Η συν-ακινητοποίηση οδήγησε σε αύξηση της φαινόμενης σταθεράς συγγένειας Km και σε ταυτόχρονη μείωση της μέγιστης ταχύτητας Vmax των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων. Οι μελέτες σχετικά με τη θερμική σταθερότητα των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων έδειξαν έως και 2 φορές αύξηση στη σταθερά του χρόνου ημιζωής και έως και 1.5 φορά αύξηση στην ενέργεια απενεργοποίησης σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα. Η ενίσχυση των θερμοδυναμικών παραμέτρων των τεσσάρων συν-ακινητοποιημένων σε MNPs ενζύμων υποδηλώνει επίσης αύξηση στη θερμική τους σταθερότητα. Επιπλέον, τα συν-ακινητοποιημένα ένζυμα διατήρησαν σημαντικό μέρος της καταλυτικής τους δραστικότητας (έως και 50%) μετά από 5 διαδοχικούς κύκλους αντίδρασης στους 50 °C και ακόμη και μετά από 24 ημέρες επώαση στους 5 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης εφαρμόστηκε με επιτυχία σε μια αλυσιδωτή αντίδραση τεσσάρων σταδίων που περιλάμβανε την υδρόλυση της κυτταρίνης.Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένα καινοτόμο πολυενζυμικό νανοβιοκαταλυτικό σύστημα αποτελούμενο από τα ένζυμα λιπάση Α από τον οργανισμό Candida antarctica (CalA) και β-γλυκοσιδάση από τον οργανισμό Thermotoga maritima (bgl) τα οποία συν-ακινητοποιήθηκαν ομοιοπολικά στην επιφάνεια μαγνητικών νανοσωματιδίων επικαλυμμένων με χιτοζάνη (CS-MNPs). Αρκετές παράμετροι που επηρεάζουν τη διαδικασία της συν-ακινητοποίησης (συγκέντρωση γλουταραλδεΰδης, χρόνος επώασης νανοϋλικού-ενζύμου, αναλογία μάζας CS-MNPs προς ένζυμο και αναλογία μάζας bgl προς CalA) αξιολογήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν. Ο νανοβιοκαταλύτης που αναπτύχθηκε χαρακτηρίστηκε με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές. Αξιολογήθηκαν επίσης οι βιοχημικές παράμετροι όπως οι φαινόμενες κινητικές σταθερές και η θερμική σταθερότητα τόσο των ελεύθερων όσο και των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων. Τα συν-ακινητοποιημένα ένζυμα παρουσίασαν αύξηση στη φαινόμενη σταθερά Km ακολουθούμενη από μείωση της τιμής Vmax σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα, ενώ σημαντική αύξηση (>5 φορές μεγαλύτερη) της θερμικής σταθερότητας της ακινητοποιημένης CalA, τόσο στη μεμονωμένα ακινητοποιημένη όσο και στη συν- ακινητοποιημένη μορφή, παρατηρήθηκε μετά από επώαση 24 ωρών στους 60 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης εφαρμόστηκε αποτελεσματικά για τη βιομετατροπή της ελευρωπαΐνης σε υδροξυτυροσόλη, ένα από τα πιο ισχυρά αντιοξειδωτικά φυσικής προέλευσης, και επαναχρησιμοποιήθηκε αποτελεσματικά για έως και 10 κύκλους αντίδρασης (240 ώρες συνεχόμενης λειτουργίας) στους 60 °C, διατηρώντας περισσότερο από 50% της αρχικής του δραστικότητας.Στην τρίτη μελέτη της παρούσας διατριβής μια σειρά πολυμερών, συμπεριλαμβανομένης της χιτοζάνης (CS), της καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης (CMC) και ενός υβριδικού πολυμερούς χιτοζάνης-ζελατίνης (CS-GEL), τροποποιήθηκε με φερουλικό οξύ (FA) που προέκυψε από την ενζυμική επεξεργασία της αραβινοξυλάνης μέσω της συνεργιστικής δράσης δύο ενζύμων, της ξυλανάσης και της εστεράσης του φερουλικού. Ακολούθως, το φερουλικό οξύ αξιοποιήθηκε ως υπόστρωμα από το ένζυμο λακάση από τον οργανισμό Agaricus bisporus (AbL) για την ενζυμική τροποποίηση των παραπάνω πολυμερών. Η επιτυχής ενσωμάτωση των προϊόντων οξείδωσης του φερουλικού οξέος στα διάφορα πολυμερή επιβεβαιώθηκε μέσω διαφόρων τεχνικών όπως η φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) και η φασματοσκοπία της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (ATR). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ενίσχυση των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων των τροποποιημένων πολυμερών με δύο πρωτόκολλα. Τέλος, τα τροποποιημένα πολυμερή παρουσίασαν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση έναντι των βακτηριακών πληθυσμών του στελέχους Escherichia coli BL21DE3, υποδηλώνοντας την πιθανή εφαρμογή τους στη φαρμακευτική, την κοσμετολογία και τη βιομηχανία τροφίμων.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποτελούν μια σημαντική συνεισφορά στο ερευνητικό πεδίο της βιοκατάλυσης, καθώς καταδεικνύουν τη σημασία της ανάπτυξης καινοτόμων πολυενζυμικών βιοκαταλυτικών συστημάτων για πλήθος εφαρμογών. Η αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών παραπροϊόντων και η παραγωγή βιοκαυσίμων αποτελούν μόνο μερικές από τις εφαρμογές που μπορούν να επιτευχθούν με τη χρήση τέτοιων συστημάτων. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής καταδεικνύουν επίσης τη δυνατότητα ανάπτυξης καινοτόμων βιολογικών συστημάτων in vitro με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανταγωνιστικότητα της βιομηχανίας στον σύγχρονο κόσμο. Τέλος, μέσα από την εργασία αυτή αναδεικνύεται η σημασία της νανοτεχνολογίας στη βιοκαταλυτική έρευνα ανοίγοντας το δρόμο για περαιτέρω μελλοντική έρευνα στο συγκεκριμένο ερευνητικό πεδίο.