Μελέτη των γονιδίων της οικογένειας Groucho/TLE κατά την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου του ποντικού
Authors: Χυτούδης-Περούδης Χαράλαμπος-Χρυσοβαλάντης 
Published: July 2022

Ο τελεγκέφαλος των θηλαστικών αναπτύσσεται στην πλέον πολύπλοκη δομή του ΚΝΣ, στα εγκεφαλικά ημισφαίρια. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει μεγάλες προσπάθειες για να χαρακτηριστούν, μέσω της ανάλυσης των προτύπων έκφρασης διαφορετικών μεταγραφικών παραγόντων, οι τελεγκεφαλικές περιοχές από τις οποίες προκύπτουν συγκεκριμένοι τύποι νευρώνων, αποκαλύπτοντας έναν τύπο μοριακού κώδικα σύμφωνα με τον οποίο ο αναπτυσσόμενος τελεγκέφαλος χωρίζεται σε ανατομικά και μοριακά διακριτές περιοχές, ήτοι το χιτώνιο και το υποχιτώνιο, που υποδιαιρούνται σε μικρότερες, μοριακά διακριτές περιοχές. Αν και ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει επικεντρωθεί στους μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στο σχηματισμό νευρωνικών προγονικών κυττάρων και στη διαμόρφωση και τον χαρακτηρισμό των ανατομικών υποδιαιρέσεων του τελεγκεφάλου, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και το ρόλο των συμπαραγόντων και ιδιαίτερα των συγκατασταστολέων στις εν λόγω αναπτυξιακές διαδικασίες. Τα μέλη της οικογένειας συγκαταστολέων Groucho/Transducin-like Enhancer of split (Grg/TLE) είναι πυρηνικές πρωτεΐνες που στερούνται εγγενούς επικράτειας πρόσδεσης στο DNA, αλληλεπιδρούν με μία ποικιλία μεταγραφικών παραγόντων και εμπλέκονται σε πλήθος αναπτυξιακών διαδικασιών, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου και ασθένειες. Οι Grg/TLE κατηγοριοποιούνται σε δύο υποομάδες με βάση τη δομή τους: στους πλήρους-μήκους Grg/TLE, που, όπως το πρωτότυπο μέλος της οικογένειας Groucho αποτελούνται από πέντε συντηρημένες επικράτειες και συγκεκριμένα τις Q, GP, CcN, SP και WD40 και στους ελλιπούς μήκους Grg/TLE. Στον ποντικό υπάρχουν τέσσερις Grg πλήρους μήκους (Grg1-4) και δύο ελλιπούς (Grg5 και 6). Επιπλέον, ορισμένες Grg ελλιπούς μήκους κωδικοποιούνται μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Οι πρωτεΐνες Grg/TLE θεωρούνταν παραδοσιακά ως καθολικά εκφραζόμενοι συμπαράγοντες των οποίων η κατασταλτική δραστηριότητα ρυθμίζονταν από τη διαθεσιμότητα των μεταγραφικών παραγόντων με τους οποίους αλληλεπιδρούν. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, γίνεται όλο και πιο προφανές, ότι κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης, η έκφραση των Grg/TLE βρίσκεται υπό αυστηρό χωρικό και χρονικό έλεγχο, δημιουργώντας τοπικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής συγκριτική ανάλυση της χωροχρονικής έκφρασης των πλήρους μήκους μελών της οικογένειας Grg/TLE, δηλαδή των Grg1-4, κατά την εμβρυϊκή νευρογένεση στον αναπτυσσόμενο τελεγκέφαλο του ποντικού όπου ελάχιστα είναι γνωστά από προηγούμενες μελέτες. Επίσης, πραγματοποιήθηκε μελέτη in silico προκειμένου να προσδιοριστούν υποψήφιοι μεταγραφικοί παράγοντες που δρουν ανoδικά των προαναφερθέντων Grg.Πραγματοποιήθηκαν πειράματα υβριδοποίησης in situ σε οβελιαίες και στεφανιαίες τομές κατά τις Ε11,5 - Ε18,5. Το Grg1 εκφράζεται κυρίως στην κοιλιακή ζώνη του τελεγκεφάλου, το Grg2 κυρίως στο κοιλιακό υποχιτώνιο και τα παράγωγά του, το Grg3 εκφράζεται ευρέως στις βλαστικές ζώνες του τελεγκεφάλου, και το Grg4 εκφράζεται κυρίως σε μετα-μιτωτικά κύτταρα του υποχιτωνίου. Ακολούθησε συγκριτική ανάλυση σε διαδοχικές τομές και συγκριτική ανάλυση με τους καλά χαρακτηρισμένους δείκτες Gsh2, Dlx2, Nkx2.1, Arx, Lhx6 and Lhx7/8 η οποία αποκάλυψε ένα πολύπλοκο πρότυπο έκφρασης με διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς που χαρακτηρίζονται από τη συνδυασμένη έκφραση των μελών της οικογένειας Grg. Συγκεκριμένα, πολλές δομές εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς των Grg, ωστόσο από τα πειράματα της υβριδοποίησης in situ δεν ήταν δυνατό να εξακριβωθεί σε μία προγονική επικράτεια ή δομή κατά πόσο διαφορετικά Grg εκφράζονταν σε διαφορετικά κύτταρα ή συνδυασμοί των Grg συνεκφράζονταν στο ίδιο κύτταρο, αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές στην περίπτωση των Grg2 και Grg4. Προς διελεύκανση αυτού του ερωτήματος πραγματοποιήσαμε πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού σε κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας MGE που απομονώθηκε από έμβρυο ποντικού ηλικίας E13,5 με αντισώματα που ήταν ειδικά έναντι των πρωτεϊνών Grg2 και Grg4. Τα εν λόγω πειράματα έδειξαν ότι τουλάχιστον στην MGE, με βάση την έκφραση των Grg2 και Grg4, είναι δυνατόν να χαρακτηριστούν οι υποπληθυσμοί Grg2+/Grg4+, ένας ασθενής υποπληθυσμός Grg2+, ένας ισχυρός υποπληθυσμός Grg2+ και ένας υποπληθυσμός Grg4+. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι σε αντίθεση με την επικρατούσα άποψη, τουλάχιστον κατά την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου οι πρωτεΐνες Grg1-4 εκφράζονται με πολύπλοκο αλλά διακριτό πρότυπο έκφρασης τροποποιώντας διαφορικά τη δράση μεταγραφικών παραγόντων που περιορίζονται χωρικά σε αυτήν την περιοχή ή δομή, σχηματίζοντας τελικώς έναν «χάρτη μεταγραφικής καταστολής». Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση in silico των πιθανών ρυθμιστικών περιοχών (έως 2000 bp ανοδικά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής και του πρώτου ιντρονίου, των γονιδίων Grg1-4) του ποντικού, στις βάσεις δεδομένων MatInspector και Transfac. Ακολούθησε αναζήτηση των συγκεκριμένων θέσεων αναγνώρισης στις αντίστοιχες περιοχές των ομολόγων των Grg1-4 του αρουραίου και του ανθρώπου, επειδή ενδεχόμενη συντήρησή τους μεταξύ των τριών ειδών θα αποτελούσε ισχυρή ένδειξη για κάποιο βιολογικό-ρυθμιστικό ρόλο. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με ανάλυση των δεδομένων έκφρασης των υποψήφιων ρυθμιστικών παραγόντων στις βάσεις δεδομένων χωρικής έκφρασης Genepaint και Allen Brain και τελικώς προσδιορίστηκαν 71 πιθανοί ρυθμιστές της έκφρασης των Grg.