Εκτίμησης μοριακών παραγόντων σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέoς εντέρου που έχουν λάβει θεραπεία πρώτης γραμμής και συσχέτισή τους με την ανταπόκριση στην θεραπεία και την επιβίωση
Authors: Παπαδάτος-Πάστος Διονύσιος 
Published: September 2021

Ο ορθοκολικός καρκίνος (OKK) αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Κάθεχρόνο διαγιγνώσκονται περισσότερες από ένα εκατομμύριο νέες περιπτώσεις παγκοσμίως.Η πλειοψηφία των περιπτώσεων είναι σποραδικοί καρκίνοι, δηλαδή καρκίνοι που δενσχετίζονται με κάποιο κληρονομικό σύνδρομο ή προϋπάρχουσα νόσο.Παράγοντες κινδύνου για τον ΟΚΚ είναι η ηλικία, το ανδρικό φύλο, το ιστορικό πολυπόδωντου εντέρου καθώς και περιβαλλοντικοί παράγοντες.Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος όσον αφορά την επιβίωσηασθενών με ΟΚΚ λόγω των σύγχρονων τεχνικών έγκαιρης διάγνωσης και τωναποτελεσματικότερων θεραπειών. Η έγκαιρη διάγνωση επιτυγχάνεται με τη χρήση τηςδοκιμασίας ανίχνευσης αίματος στα κόπρανα σε συνδυασμό με τεχνικές επισκόπησης τουβλεννογόνου του εντέρου, όπως η σιγμοειδοσκόπηση και η κολονοσκόπηση.Η αποτελεσματικότητα των θεραπειών έχει βελτιωθεί σημαντικά. Αυτό είναι αποτέλεσματης χρήσης νέων εξελιγμένων φαρμάκων αλλά και της επιλογής θεραπείας με βάση τα χαρακτηριστικά του όγκου του ασθενούς.Αναλυτικότερα, η θεραπεία περιλαμβάνει τη χειρουργική εξαίρεση του όγκου όπου αυτήείναι εφικτή και η χορήγηση συνδυασμού χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Τα τελευταίαπέντε χρόνια στο οπλοστάσιο των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία τουΟΚΚ προστέθηκε μία νέα κατηγορία φαρμάκων – οι στοχευμένες θεραπείες. Το βασικότους χαρακτηριστικό είναι ότι αναστέλλουν ζωτικές λειτουργείες των καρκινικών κυττάρωνχωρίς να επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τα υγιή κύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να είναιλιγότερο τοξικά σε σχέση με τα συμβατικά χημειθεραπευτικά φάρμακα που επηρεάζουν τηλειτουργία κυττάρων που βρίσκονται σε φάση πολλαπλασιασμού χωρίς να διακρίνουν ταυγιή από τα καρκινικά.Η πληθώρα θεραπευτικών επιλογών και η σωστή επιλογή ασθενών σε θεραπείες που έχουνμεγαλύτερες πιθανότητες επιτυχίας έχουν ως αποτέλεσμα την ίαση ή τη μακροχρόνιαεπιβίωση ασθενών με ΟΚΚ. Δυστυχώς, όμως, η χρήση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων έχεισε πολλές περιπτώσεις σημαντικές παρενέργειες χωρίς τα προσδοκόμενα οφέλη. Θα ήτανπολύ χρήσιμο να υπάρχουν κριτήρια επιλογής ασθενών οι οποίοι να έχουν μεγάλεςπιθανότητες να οφεληθούν από τη θεραπεία.Η πρωτείνη BRAF συμμετέχει σε ένα σημαντικό ενδοκυττάριο μοριάκο μονοπάτι το οποίο,όταν είναι υπερενεργοποιημένο, συμβάλλει στην καρκινογέννηση. Η ενεργοποίηση τουμονοπατιού αυτού μπορεί να γίνει με διάφορα ερεθίσματα που δέχεται το κύτταρο, κυρίωςαπό εξωκυττάριους αυξητικούς παράγοντες. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού χωρίςερέθισμα μπορεί να γίνει όταν η BRAF πρωτείνη έχει υποστεί μετάλλαξη. Μεταλλάξεις τηςBRAF έχουν βρεθεί σε διάφορους καρκίνους όπως για παράδειγμα στο μελάνωμα, σταχαμηλής κακοήθειας καρκινώματα των ωοθηκών και στα καλά διαφοροποιημένακαρκινώματα του θυρεοειδούς. Ο ρόλος της πρωτείνης BRAF στον ΟΚΚ δεν έχειαποσαφηνιστεί.Η μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) του DNA είναι ένας δείκτης της λειτουργείας τωνενζύμων επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού. Όταν τα ένζυμα αυτά δυσλειτουργούν τότεοι πιθανότητες καρκινογέννησης αυξάνουν. Ο ρόλος του MSI έχει διερευνηθεί σε ασθενείςπου έλαβαν συμπληρωματική χημειοθεραπεία για ΟΚΚ. Συγκεκριμένα, ασθενείς με ΟΚΚσταδίου Dukes Β που χειρουργήθηκαν και έχουν υψηλό δείκτη MSI δεν οφελούνται απόσυμπληρωματική χημειοθεραπεία. Ο ρόλος του MSI στον μεταστατικό ΟΚΚ δεν έχειαποσαφηνιστεί.Η κυκλίνη D1 έχει καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση του κυτταρικού κύκλου και τονπολλαπλασιασμό του κυττάρου. Η σημασία της έκφρασης της κυκλίνης D1 σε ασθενείς μεOKK δεν είναι γνωστή.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή γίνεται προσπάθεια να αναγνωριστούν μοριακοίπαράγοντες στους όγκους ασθενών με ΟΚΚ οι οποίοι έλαβαν χημειοθεραπεία πρώτηςγραμμής και να συσχετίσουμε τους πράγοντες αυτούς με την ανταπόκριση στη θεραπείακαι την επιβίωση. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η V600E μετάλλαξη του BRAF, ημικροδορυφορική αστάθεια του DNA (microsatellite instability – MSI) και η έκφραση τηςκυκλίνης D1 στον πρωτοπαθή όγκο των παραπάνω ασθενών. ΜΕΘΟΔΟΣΣτην μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης από τον πρωτοπαθή όγκο 144 ασθενώνπου έλαβαν θεραπεία πρώτης γραμμής για ΟΚΚ από τον Ιανουάριο του 2002 έως τονΔεκέμβριο του 2006 στην Πανεπιστημιακή Παθολογική-Ογκολογική Κλινική τουΠανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου.Η εργαστηριακή ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογίας του Καρκίνου καιστο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Ιατρικού τμήματος του Π.Κ. Για τηνανίχνευση μεταλλάξεων του BRAF χρησιμοποιήθηκε μέθοδος διαχωρισμού αλληλίων με τηχρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-qPCR).Για την ανίχνευση της μικροδορυφορικής αστάθειας του DNA χρησιμοποιήθηκε η μέθοδοςτης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης των δεικτών που προτείνονται από το NCI καθώςκαι ανοσοϊστοχημική μέθοδος για τις πρωτεΐνες του MMR συστήματος.Για την ανίχνευση της κυκλίνης D1 στον ιστό των ασθενών χρησιμοποιήθηκεανοσοϊστοχημική μέθοδος.Όλες οι τεχνικές αναφέρονται λεπτομερώς στο πλήρες κείμενο της διδακτορικής διατριβής.Οι συσχετισμοί ανάμεσα στην πρωτείνη BRAF το MSI, την έκφραση της κυκλίνης D1 και τωνχαρακτηριστικών των ασθενών έγινε με τη χρήση του Fisher exact test για κατηγορικέςμεταβλητές και λογιστικής παλινδόμισης για συνεχείς μεταβλητές. Ο χρόνος που η νόσοςδεν επιδεινώθηκε (progression free survival–PFS) υπολογίστηκε από την ημέρα πουξεκίνησε η χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής μέχρι την αύξηση της διαμέτρου των όγκωνόπως μετρήθηκε στην αξονική τομογραφία. Η επιβίωση των ασθενών υπολογίστηκε απότην μέρα διάγνωσης της μεταστατικής νόσου μέχρι την ημέρα θανάτου από ΟΚΚ. Οισυσχετισμοί ανάμεσα στους προαναφερθέντες μοριακούς παράγοντες και το PFS και τηνεπιβίωση έγιναν με τη χρήση του Cox proportional hazards regression models.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΗ διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν τα 64 έτη και το 57% (n=82) ήταν άνδρες.Mεταλλαγμένο BRAF (μετάλλαξη στην θέση V600E) ανιχνεύτηκε στο 8% των ασθενών(n=12), ενώ 22 ασθενείς (15%) χαρακτηρίστηκαν ως MSI-H. Αναφέρουμε ότιανοσοϊστοχημεία και μοριακές τεχνικές είχαν ταυτόσημα αποτελέσματα όσον αφορά τονχαρακτηρισμό των όγκων MSI-H ή MSS. Η κυκλίνη D1 βρέθηκε να υπερεκφράζεται στο 18%(n=26) των ασθενών, να έχει ασθενή έκφραση στο 44% (n=63) και τέλος να μην εκφράζεταικαθόλου σε 55 ασθενείς.Μεταλλάξεις του BRAF βρέθηκαν σε ασθενείς με MSI-H και MSI-L/S σε ποσοστό 45% και1.6% αντίστοιχα (p<0.001). Η ύπαρξη του BRAF V600E στον πρωτοπαθή όγκο συσχετίστηκεκαι με την έκφραση της κυκλίνης D1. Ειδικότερα, η κυκλίνη D1 βρέθηκε να υπερεκφράζεταιστο 58% των ασθενών που έφεραν μετάλλαξη του BRAF σε σύγκριση με το 14% στουςασθενείς χωρίς μετάλλαξη του BRAF (wtBRAF) (p<0.001).Στο σύνολο του πληθυσμού, η διάμεση περίοδος χωρίς επιδείνωση της νόσου (PFS) ήταν9.5 μήνες (95% CI 8.4-10.8) και αντίστοιχα η διάμεση επιβίωση (OS) 31.5 μήνες (95% CI26.4-37.7).Μονοπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε σαν σημαντικούς παράγοντες για μειωμένο PFS (α) τηχαμηλή διαφοροποίηση του πρωτοπαθούς όγκου (p=0.001), (β) μεταλλαγμένο BRAF(p<0.001) και (γ) και τη μη πραγματοποιήσιμη μεταστασεκτομή (p<0.001). Επιπλέον, ημονοπαραγοντικη ανάλυση ανέδειξε σαν σημαντικούς παράγοντες για μειωμένη επιβίωση(OS) (α) όγκους υψηλού βαθμού ιστολογικής κακοήθειας (p<0.001), (β) BRAF (p<0.0001), (γ)μεταστασεκτομή (p=0.03) και (δ) το σύνολο των χημειοθεραπειών που έλαβαν οι ασθενείς(p=0.02).Στο σύνολο του πληθυσμού οι ασθενείς με μετάλλαξη στο BRAF είχαν στατιστικά σημαντικήμικρότερη διάρκεια PFS (p=0.05) και μικρότερη επιβίωση (p=0.004). Για τους ασθενείς πουέλαβαν θεραπεία με cetuximab η ύπαρξη μετάλλαξης είτε στο KRAS είτε στο BRAFσχετίζεται με μικρότερο PFS (p=0.013) και μικρότερη επιβίωση (p=0.003) σε ασθενείς πουέλαβαν CET. Επίσης, η μετάλλαξη στο BRAF γονίδιο παραμένει προγνωστική για το PFS (p=0.003) και την επιβίωση (p=0.001) στον πληθυσμό των ασθενών που δεν έλαβανcetuximab σε κανένα στάδιο της θεραπείας τους.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑΟ ΟΚΚ είναι ένα από τα πιο συχνά νεοπλάσματα. Ευθύνεται για 49.920 θανάτους στις ΗΠΑτο 2009. Νεότερα χημειοθεραπευτικά φάρμακα προστέθηκαν στην θεραπεία του ΟΚΚ πουέχουν ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση της συνολικής επιβίωσης των ασθενών μεμεταστατική νόσο σε δύο χρόνια. Η προσθήκη στη χημειοθεραπεία των θεραπειώνμοριακής στόχευσης με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του αυξητικού παράγοντα τωνενδοθηλιακών αγγειακών κυττάρων (VEGF, bevacizumab) και έναντι του υποδοχέα τουεπιδερμοειδούς αυξητικού παράγοντα (EGFR, cetuximab, panitumumab) βελτίωσε τηδιάμεση επιβίωση περαιτέρω. Η χρησιμοποίηση των θεραπειών μοριακής στόχευσης(ΘΜΣ) έχει γίνει αντικείμενο εκτενούς μελέτης μετά από την παρατήρηση ότι ασθενείς πουφέρουν συγκεκριμένες αλλαγές στο γενετικό τους υλικό έχουν καλύτερες πιθανότητες ναοφεληθούν από την χρήση ΘΜΣ. Για παράδειγμα, έχει δειχθεί ότι ασθενείς με μετάλλαξηστην πρωτείνη KRAS έχουν μικρές πιθανότητες να οφεληθούν από το μονοκλωνικόαντισωμα cetuximab.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε (α) τον ρόλο των πρωτεινών BRAF και (β)της κυκλίνης D1 ως προγνωστικούς ή/και προβλεπτικούς παράγοντες στην θεραπεία τουΟΚΚ. Επιπλέον, μελετήσαμε (γ) την αστάθεια του γενετικού υλικού και, συγκεκριμένα, τωνμικροδορυφόρων του DNA (μικροδορυφορική αστάθεια – microsatelliteinstability, MSI). Ηαστάθεια των μικροδορυφόρων του DNA οφείλεται στη δυσλειτουργία του mismatchrepair (MMR) συστήματος.Γίνεται συσχέτιση των παραπάνω τριών παραμέτρων με την ανταπόκριση στην θεραπείακαι την επιβίωση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία πρώτης γραμμής για ΟΚΚ. Από τηνσυσχέτιση αυτή εξάγωνται χρήσιμα συμπεράσματα για την προγνωστική και προβλεπτικήτους αξία και τα αποτελέσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαστρωμάτωση τωνασθενών σε μελλοντικές κλινικές μελέτες. Τέλος, η εξαιρετικά δυσμενής πρόγνωση τωνασθενών που φέρουν μετάλλαξη του BRAF στον πρωτοπαθή όγκο δικαιολογεί την ένταξη αυτών των ασθενών σε ερευνητικές μελέτες με νέους παράγοντες (π.χ. αναστολείς τηςBRAFV600E, αναστολείς της ERK).