Μελέτη του νευροειδικού μορίου BM88 του ποντικού
Authors: Σεργάκη Μαρία -Χριστίνα 
Published: August 2021

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι πρώιμος μάρτυρας της γενεαλογίας των νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η εμφάνισή της συμπίπτει με τη γέννηση των νευρώνων, ενώ η έκφρασή της επάγει τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων σε νευρώνες και παραμένει σε υψηλά επίπεδα στους διαφοροποιημένους νευρώνες του ενήλικου εγκεφάλου (Patsavoudi et al., 1989). Πειράματα in vitro έδειξαν ότι η υπερέκφραση της ΒΜ88 στην κυτταρική σειρά του νευροβλαστώματος του ποντικού (Neuro 2a) προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο και τη μορφολογική και μοριακή διαφοροποίησή τους προς το νευρωνικό φαινότυπο (Georgopoulou et al., 2006; Mamalaki et al., 1995). Το πρότυπο έκφρασης της ΒΜ88 in vivo σε συνδυασμό με την αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της διαφοροποίησης, όπως έχει μελετηθεί in vitro, υποστηρίζουν την άποψη ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συμμετέχει στη διαδικασία της διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων προς το νευρωνικό φαινότυπο. Για τα παραπάνω λειτουργικά της χαρακτηριστικά η βάση δεδομένων NCBI έχει καθιερώσει για τη ΒΜ88 την ονομασία Cell Cycle Exit and Differentiation 1 (CEND1), δηλαδή «έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση 1». Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν δείξει ότι η ΒΜ88 εντοπίζεται στις μεμβράνες ενδοκυτταρικών οργανιδίων, όπως τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο και τα συνοπτικά κυστίδια, αλλά και στην κυτταρική μεμβράνη (Patsavoudi et al., 1989). Για την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της πρωτεΐνης ΒΜ88 in vivo, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η δημιουργία μοντέλου απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88. Αρχικά μελετήθηκε η δομή του γονιδίου ΒΜ88 του ποντικού και συγκεκριμένα η δομή και λειτουργικότητα του βασικού υποκινητή του. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά σχεδιάστηκε κατάλληλη πλασμιδιακή κατασκευή για τη στόχευση και απαλοιφή της γενετικής περιοχής του ΒΜ88 σε μοντέλο ποντικού. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι επιπτώσεις της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88 στο φαινότυπο του knockout μοντέλου και συγκεκριμένα αναλύθηκε η ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας σε μεταγεννητικό στάδιο και η κινητική συμπεριφορά των ενήλικων ζώων. Η μελέτη της δομής του γονιδίου έδειξε ότι αυτό καλύπτει μια περιοχή ~3 kb και αποτελείται από δύο εξώνια και ένα εσώνιο. Το πρώτο εξώνιο υφίσταται εναλλακτική συρραφή μέσω δύο εναλλακτικών 5’ άκρων που απέχουν 42 bp. Η κωδική περιοχή βρίσκεται στο δεύτερο εξώνιο, ενώ η 5' μη μεταφραζόμενη περιοχή διακόπτεται από το εσώνιο. Η λειτουργική σημασία της ύπαρξης των δύο εναλλακτικών μεταγράφων δε φάνηκε να σχετίζεται με το αναπτυξιακό στάδιο του ζώου, όπως δείχθηκε σε πειράματα αντίστροφης μεταγραφής και PCR σε παρεγκεφαλίδες ποντικών διαφόρων ηλικιών. Η μελέτη του υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 έγινε με πειράματα παροδικής επιμόλυνσης κυτταρικών σειρών με μια σειρά πλασμιδιακών κατασκευών, στις οποίες είχαν κλωνοποιηθεί διάφορα τμήματα της 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής του γονιδίου πριν το γονίδιο της λουσιφεράσης. Έτσι διαπιστώθηκε ότι ο βασικός υποκινητής του γονιδίου ΒΜ88 περιέχεται σε τμήμα μήκους 122bp, το οποίο είναι ικανό να προάγει την έκφραση της λουσιφεράσης ειδικά στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ποντικού Neuro2A και όχι στη μη νευρικής προέλευσης σειρά COS7. Μάλιστα, δείχθηκε, ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Pax6, αυξάνει την ενεργότητα τμήματος του υποκινητή στην 5’ περιοχή του γονιδίου ΒΜ88, που περιλαμβάνει ειδική θέση πρόσδεσης για τον παράγοντα αυτό. In silico μελέτη της αλληλουχίας της περιοχής του υποκινητή έδειξε, ότι περιέχεται σε νησίδα CpG και ότι δεν διαθέτει στοιχεία κοινού υποκινητή, όπως αλληλουχία TATA, αλληλουχία έναρξης και καθοδικό στοιχείο έναρξης (Papadodima et al., 2005). Πράγματι, σε ανάλυση με τη νουκλεάση S1, βρέθηκε ότι η έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 γίνεται από πολλαπλές εναλλακτικές θέσεις. Στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 του ποντικού, υπάρχουν ακόμα 2 θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Spi, όμοια με το γονίδιο ΒΜ88 του ανθρώπου, για το οποίο η λειτουργικότητα και η απευθείας ενεργοποίηση από τον παράγοντα Spi έχουν δειχθεί (Papadodima et al., 2005). Για την απαλοιφή του γονιδίου ΒΜ88 σε μοντέλο ποντικού χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του ομόλογου ανασυνδυασμού, ώστε η κωδική περιοχή του γονιδίου ΒΜ88, αλλά και η 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή, να αντικατασταθεί από το γονίδιο της β-γαλακτοζιδάσης. Τα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα γεννιούνται και μεγαλώνουν κανονικά, είναι γόνιμα και δεν εμφανίζουν σοβαρές ανωμαλίες στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Για τη μελέτη των συνεπειών της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88 στο ζωικό αυτό μοντέλο, επιλέχθηκε η παρεγκεφαλίδα, καθώς αποτελεί μια καλά χαρακτηρισμένη περιοχή του εγκεφάλου με σαφή δομή και οργάνωση. Η έκφραση της ΒΜ88 στην παρεγκεφαλίδα εντοπίζεται στα κύτταρα Purkinje και στα κοκκιώδη κύτταρα. Αντίστοιχο πρότυπο έκφρασης παρατηρήθηκε για τη β-γαλακτοζιδάση στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Μακροσκοπική παρατήρηση της παρεγκεφαλίδας ομόζυγων ποντικών δεν έδειξε σημαντικές ανωμαλίες της περιοχής αυτής του εγκεφάλου σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Ωστόσο, λεπτομερέστερη εξέταση των διαφόρων στιβάδων του φλοιού της παρεγκεφαλίδας, έδειξε ότι, η εξωτερική κοκκιώδης στιβάδα (EGL) είναι παχύτερη στα ΒΜ88-/- ομόζυγα ζώα. Με μια σειρά πειραμάτων βρέθηκε, ότι η αύξηση αυτή οφείλεται αφενός σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των πρόδρομων κοκκιωδών κυττάρων και αφετέρου σε καθυστερημένη μετανάστευση προς την εσωτερική κοκκιώδη στιβάδα. Παράλληλα βρέθηκε μειωμένη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje της παρεγκεφαλίδας τόσο κατά την πρώιμη μεταγεννητική περίοδο, όσο και στα ενήλικα ζώα. Η αύξηση στον πολλαπλασιασμό φάνηκε να συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων της κυκλίνης D1, που ρυθμίζει τη μετάβαση από το σημείο ελέγχου της φάσης Gl του κυτταρικού κύκλου και συνδέεται με την απόφαση του κυττάρου να συνεχίσει να πολλαπλασιάζεται ή να οδηγηθεί σε μεταμιτωτική φάση. Έλεγχος παραγόντων, του σηματοδοτικού μονοπατιού που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων και οι οποίοι δρουν πριν την κυκλίνη D1, όπως ο παράγοντας Shh και οι υποδοχείς του Smoothened και Patched (Vaillant and Monard, 2009), σε πειράματα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA των μορίων αυτών μεταβάλλονται στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Οι αλλαγές αυτές πιθανώς συνδέονται με τον ελαττωματικό πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων και υποδεικνύουν την άμεση ή έμμεση συσχέτιση της ΒΜ88 με το μονοπάτι σηματοδότησης του Shh και της κυκλίνης D1. Για τη διερεύνηση των αιτίων της καθυστερημένης μετανάστευσης των κοκκιωδών κυττάρων, ελέγχθηκαν διάφοροι παράγοντες που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή. Έτσι, παρατήρηση των κυττάρων της γλοίας Bergmann, κατά μήκος των οποίων γίνεται η ακτινωτή μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων, με ανοσοϊστοχημική χρώση με το μάρτυρα nestin, δεν έδειξε διαφορές στην περίπτωση των ΒΜ88 knockout ομόζυγων ποντικών σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Pax6, ο οποίος έχει δειχθεί ότι συμμετέχει στη διαδικασία της μετανάστευσης των κυττάρων αυτών (Engelkamp et al., 1999), αποτέλεσμα που ήταν αναμενόμενο καθότι η μεταγραφή του γονιδίου ΒΜ88, φάνηκε να ρυθμίζεται από τον παράγοντα Pax6 και άρα βρίσκεται καθοδικά αυτού. Αντίθετα παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα mRNA για το νευροτροφικό παράγοντα BDNF, ο οποίος εκκρίνεται από τα διαφοροποιημένα κοκκιώδη κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων (Choi et al., 2005; Schwartz et al., 1997). Μάλιστα, ομόζυγα -/- ζώα για τον παράγοντα αυτό, παρουσιάζουν αντίστοιχη ανωμαλία στη μετανάστευση (Schwartz et al., 1997), με τα ΒΜ88 -/- ομόζυγα ζώα. Ο αυξημένος πολλαπλασιασμός και η καθυστέρηση στη μετανάστευση δεν φάνηκαν να επηρεάζουν το πρόγραμμα διαφοροποίησης των κοκκιωδών κυττάρων. Εντούτοις παρατηρήθηκαν ανωμαλίες στη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje και διαπιστώθηκε σαφής μείωση στην ανάπτυξη του δενδριτικού τους πλέγματος στα ΒΜ88-/- ομόζυγα σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Πειράματα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, με εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο της reelin, που έχει δειχθεί ότι συμμετέχει στην ανάπτυξη των δενδριτών των νευρώνων του ιπποκάμπου (Niu et al., 2004), έδειξαν στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων mRNA στα ομόζυγα ΒΜ88-/- σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Καθώς η ανώμαλη στιβάδωση του φλοιού της παραγκεφαλίδας αλλά και οι μορφολογικές ανωμαλίες στην ανάπτυξη του δενδριτικού πλέγματος των κυττάρων Purkinje, έχουν συσχετιστεί με προβλήματα κινητικής ισορροπίας, συντονισμού κινήσεων και κινητικής μάθησης, χρησιμοποιήθηκαν δυο δοκιμασίες ελέγχου των λειτουργιών αυτών στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Έτσι ελέγχθηκε αφενός η βάδιση και αφετέρου ο συντονισμός κινήσεων/ισορροπίας των ποντικών αυτών στη δοκιμασία της περιστρεφόμενης ράβδου. Και στις δυο δοκιμασίες, διαπιστώθηκε ότι τα ΒΜ88-/- ομόζυγα ζώα παρουσιάζουν μειωμένη κινητική ικανότητα, που αντικατοπτρίζεται σε αταξία στη βάδιση και έλλειψη συντονισμού στην κίνηση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η ΒΜ88 είναι απαραίτητη για την ορθή ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας και επιβεβαιώνουν τον ρόλο της πρωτεΐνης ΒΜ88 στη ρύθμιση της λεπτής ισορροπίας μεταξύ προόδου του κυτταρικού κύκλου και διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων. Πράγματι, διαπιστώθηκε ότι η ΒΜ88 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της κυκλίνης D1, οδηγώντας τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα σε διαφοροποίηση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα, φανερώνουν ένα νέο ρόλο για την πρωτεΐνη ΒΜ88 στη μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας, που πιθανώς ισχύει και για άλλες ομάδες νευρώνων του εγκεφάλου, όπως αυτών του εμβρυϊκού φλοιού, στους οποίους εκφράζεται η ΒΜ88. Οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, που εμπλέκονται στα μονοπάτια σηματοδότησης Shh/κυκλίνης Dl, BDNF και reelin στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα, δείχνουν την άμεση ή έμμεση επίδραση της ΒΜ88 στα μονοπάτια αυτά. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο δρά η ΒΜ88 στα παραπάνω μονοπάτια σηματοδότησης, αποτελεί αντικείμενο μελλοντικών μελετών. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της διεθνούς βιβλιογραφίας, δείχνουν ότι υπάρχει στενή συνεργασία μεταξύ κοκκιωδών νευρώνων και κυττάρων Purkinje κατά την ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας. Αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αυτών τύπων κυττάρων είναι απαραίτητες για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κοκκιωδών κυττάρων και τη σηματοδότηση του χρόνου κατά τον οποίο θα γίνουν μεταμιτωτικά και θα ξεκινήσουν τη μετανάστευσή τους. Από την άλλη πλευρά, καθώς τα κοκκιώδη κύτταρα μεταναστεύουν δια μέσου της περιοχής όπου αναπτύσσουν το δενδριτικό πλέγμα τους τα κύτταρα Purkinje, φαίνεται ότι επηρεάζουν και ελέγχουν τη διαδικασία αυτή. Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εμπλέκεται σε όλη τη διάρκεια των αναπτυξιακών αυτών διαδικασιών. Το μοντέλο που προτείνουμε για τη δράση της συνοψίζεται ως εξής. Τα πρόδρομα κοκκιώδη κύτταρα της παρεγκεφαλίδας, ακολουθούν ένα τέτοιο πρόγραμμα έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων και άλλων μορίων, που έχει σαν αποτέλεσμα την τελική ωρίμανση και διαφοροποίησή τους. Το πρόγραμμα αυτό ξεκινά με την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Mathl, που είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των κοκκιωδών κυττάρων από τα αρχικά στάδια της γέννησής τους, και συνεχίζεται με την έκφραση του παράγοντα Pax6. Ο τελευταίος μπορεί να προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 και να επάγει την έκφρασή του στα κύτταρα αυτά, με αποτέλεσμα να σηματοδοτείται η μείωση των επιπέδων της κυκλίνης D1, η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο και η διαφοροποίηση προς ώριμα κοκκιώδη κύτταρα. Παράλληλα, η έκφραση της ΒΜ88 στο ενδοπλασματικό δίκτυο και τα συναπτικά κυστίδια των μεταμιτωτικών κοκκιωδών κυττάρων, είναι πιθανό να επάγει την έκκριση των πρωτεϊνών reelin και BDNF, προάγοντας έτσι, τόσο τη μετανάστευση των κυττάρων αυτών, όσο και τη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje. Αντίστοιχα, η έκφραση της ΒΜ88 στα κύτταρα Purkinje, μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση ή και έκκριση παραγόντων, που είναι απαραίτητοι για τον πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων, όπως είναι το μιτογόνο Shh. Για την περαιτέρω διαλεύκανση του μονοπατιού στο οποίο συμμετέχει η ΒΜ88, βρίσκονται σε εξέλιξη πειράματα ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης (DNA microarrays) αλλά και του πρωτεόματος του ιστού της παρεγκεφαλίδας από ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα και από ζώα φυσικού τύπου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης η ανάλυση και άλλων περιοχών του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, στις οποίες εκφράζεται η ΒΜ88, προκειμένου να δειχθούν πιθανές συνέπειες της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88. Συμπερασματικά, η μελέτη της λειτουργίας της πρωτεΐνης ΒΜ88 αποτελεί καθοριστική συμβολή στην κατανόηση των κύριων κυτταρικών διεργασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός, η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο, η μετανάστευση και η νευρωνική διαφοροποίηση, οι οποίες οδηγούν στη δημιουργία των σωστών νευρικών δικτύων στο ενήλικο ζώο.