Συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια
Authors: Νουτσόπουλος Δημήτριος 
Published: August 2021

Η ρύθμιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης παραμένει άγνωστη μέχρι σήμερα. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές οικογένειες ρετροτρανσποζονίων, συμπεριλαμβανομένων και των στοιχείων VL30, ενεργοποιούνται μεταγραφικά αλλά και κινητοποιούνται σε καρκινικά κύτταρα, χαρακτηριστικό των οποίων είναι η γενωμική αστάθεια. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης των στοιχείων VL30 με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια. Προς αυτή την κατεύθυνση κατασκευάσαμε: ένα ανασυνδυασμένο στοιχείο VL30 σημασμένο με ειδική κασσέττα ανίχνευσης και μέτρησης της ρετρομετάθεσης που βασίζεται στην έκφραση της πρωτεΐνης EGFP και ένα κυτταρικό μοντέλο μελέτης της ρετρομετάθεσης κυττάρων μυός ΝΙΗ3Τ3 σταθερά διαμολυσμένα με το ανασυνδυασμένο στοιχείο. Ανιχνεύσαμε και μετρήσαμε γεγονότα ρετρομετάθεσης μετά από διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου στοιχείου στις μετασχηματισμένες από τον SV40 κυτταρικές σειρές μυός SVTT1 και Ca. Η επαγωγή της συχνότητας της ρετρομετάθεσης βρέθηκε σε υψηλά επίπεδα μόνο στα κύτταρα αυτά αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Η εκτοπική έκφραση του αγρίου τύπου μεγάλου Τ αντιγόνου του SV40 ή του μεταλλαγμένου LE1135T, που δεν εκφράζει το μικρό t αντιγόνο, στο κυτταρικό μας μοντέλο επήγαγε τη ρετρομετάθεση σε υψηλές συχνότητες. Επιπλέον, μετά από μόλυνση με ιϊκά σωμάτια SV40 αποδείξαμε ότι η συχνότητα ρετρομετάθεσης επάγεται μόλις 24 ώρες μετά τη μόλυνση 8.200 φορές περισσότερο από τη αντίστοιχη φυσική και αυξάνεται εκθετικά σε υψηλά επίπεδα κατά χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, συσχετίζοντας άμεσα τη ρετρομετάθεση των στοιχείων VL30 με τον επαγόμενο από τον SV40 κυτταρικό μετασχηματισμό. Μελετώντας την κινητική του φαινομένου σε κύτταρα μετασχηματισμένα από τον SV40, παρατηρήθηκε αφενός μεταβολή της συχνότητας ρετρομετάθεσης με την πάροδο του χρόνου που περιγράφεται από μία διφασική συνάρτηση και αφετέρου φαινόμενα μαζικού κυτταρικού θανάτου σε πληθυσμό θετικό σε ρετρομετάθεση. Παρατηρήσαμε ότι η διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου VL30 μειώνει σημαντικά την κλωνογενετικότητα σε κύτταρα μετασχηματισμένα από τον SV40. Αναλύοντας μονήρεις κυτταρικούς κλώνους SVTT1 που εκφράζουν το ανασυνδυασμένο στοιχείο αποδείξαμε ότι η ρετρομετάθεση των στοιχείων VL30 επάγει κυτταρικό θάνατο, ο οποίος συνοδεύεται από την ταυτόχρονη παρουσία μορφολογικών χαρακτηριστικών διάφορων τύπων κυτταρικού θανάτου. Επιπρόσθετα, αποδείξαμε ότι ο επαγόμενος από ρετρομετάθεση των VL30 κυτταρικός θάνατος είναι ανεξάρτητος από την ενεργοποίηση κασπασών και εξαρτώμενος από την πρωτεΐνη p53, η οποία διαμέσω του μεταγραφικά-εξαρτώμενου και του μεταγραφικά-ανεξάρτητου προγράμματος της ενεργοποιεί τη μιτοχονδριακή πορεία θανάτου. Σε ένα επόμενο βήμα, χρησιμοποιήσαμε ως παράγοντα επαγωγής γενωμικής αστάθειας τον ανθρώπινο αδενοϊό. Η εκτοπική έκφραση αμφότερων των ογκογονιδίων EIA και E1B55k σε κύτταρα Pcl.10 επήγαγε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης σε υψηλά επίπεδα, συσχετίζοντας τον επαγόμενο από τον αδενοϊό κυτταρικό μετασχηματισμό με τη ρετρομετάθεση και επιβεβαιώνοντας τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας με τον ογκογόνο ιό SV40. Με σκοπό να διερευνήσουμε αν εμπλέκεται η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 στη ρύθμιση του φαινομένου χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές μυός LM και LME6. Μετά από διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου στοιχείου αποδείξαμε ότι παρουσία της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 (κύτταρα LM) δεν ανιχνεύονται γεγονότα ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η απουσία της (κύτταρα LME6) οδηγεί στην επαγωγή της συχνότητας ρετρομετάθεσης σε ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα συσχετίζοντας τη ρετρομετάθεση με τον επαγόμενο, από απώλεια της δράσης της p53, κυτταρικό μετασχηματισμό. Ακολούθως, μελετήσαμε αν η επαγόμενη, από τον σηματοδοτικό άξονα των ογκογονιδίων Ras-Myc, γενωμική αστάθεια συσχετίζεται με την επαγωγή του φαινομένου της ρετρομετάθεσης. Αποδείξαμε ότι η σηματοδότηση του μεταλλαγμένου γονιδίου Ha-RasV12 δεν αποτελεί ικανή συνθήκη πραγματοποίησης γεγονότων ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η εκτοπική έκφραση αμφότερων των ογκογονιδίων C-myc ή N-myc επήγαγε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης σε υψηλά επίπεδα, συσχετίζοντας τη ρετρομετάθεση με τον επαγόμενο από Myc κυτταρικό μετασχηματισμό. Χρησιμοποιώντας τη δοξορουβικίνη, ως παράγοντα επαγωγής γενωμικής αστάθειας και κυτταρικού θανάτου, αποδείξαμε ότι η συχνότητα ρετρομετάθεσης των VL30 επάγεται κατά δοσο- και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο σε ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα, φτάνοντας περίπου 483.000 φορές περισσότερο από τη φυσική συχνότητα, ενώ τα επαγόμενα γεγονότα ρετρομετάθεσης συνοδεύονταν από κυτταροτοξικά φαινόμενα. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η Ν-ακετυλο-κυστεΐνη αναστέλλει κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο την επαγόμενη από δοξορουβικίνη ρετρομετάθεση, γεγονός που υποδεικνύει την εμπλοκή του οξειδωτικού στρες στο μηχανισμό ρύθμισης του φαινομένου. Σε ένα τελικό στάδιο, αποδείξαμε ότι η απουσία ομόλογης αντίστροφης μεταγραφάσης, που πιθανώς λείπει σε ανθρώπινα κύτταρα, καθιστά αδύνατη την πραγματοποίηση γεγονότων ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η εκτοπική έκφραση ενός γονιδίου αντίστροφης μεταγραφάσης του MoMLV παρήγαγε γεγονότα ρετρομετάθεσης του ανασυνδυασμένου VL30, υποδηλώνοντας ότι οι προαναφερόμενοι παράγοντες πιθανώς επάγουν την έκφραση των ενδογενών γονιδίων αντιστρόφων μεταγραφασών του MoMLV ή άλλων συμβατών με αυτές. Καταλήγοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης στο σύνολό τους αποδεικνύουν τη άμεση συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια.