Cryo-electron microscopy studies of native cell extracts
Authors: Κυριλής Φώτιος 
Published: December 2024

Σήμερα η κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία (κρυο-ΗΜ) αποτελεί αναμφισβήτητα μια ανερχόμενη μέθοδο επιλογής στην κατανόηση της αρχιτεκτονικής των μοριακών συμπλόκων, των αλληλεπιδράσεων τους και των διαφορετικών στερεοδιαμορφώσεών τους σε σχεδόν ατομικό επίπεδο ανάλυσης. Μέχρι πρόσφατα, η κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία χρησιμοποιούταν για την κατανόηση της μοριακής οργάνωσης βιομορίων που είχαν απομονωθεί ομοιογενώς ή παρατηρηθεί in situ. Παρά ταύτα, τα εμπόδια προς την επίτευξη υψηλής ανάλυσης και συνεπώς λεπτομέρειας παρέμεναν. Πρόσφατα ο δομικός χαρακτηρισμός μεγάλου μεγέθους ετερογενών συμπλόκων έγινε πιο προσιτός εξαιτίας των εξελίξεων στον τομέα της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Μια νέα εποχή όπου μελετάται η μοριακή οργάνωση των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσπαθεί να γεφυρώσει το χάσμα των δύο προαναφερθέντων δομικών προσεγγίσεων: Ενώ οι μέθοδοι in situ παρατηρούν τα βιομόρια στο περιβάλλον τους, δεν είναι ικανές να τα ταυτοποιήσουν με ακρίβεια, και οι μέθοδοι ομοιογενούς απομόνωσης των βιομορίων περιγράφουν επακριβώς τα συστατικά τους, αλλά εκτός του κυτταρικού περιβάλλοντος. Η νέα αυτή εποχή, λοιπόν, της δομικής μελέτης των κυτταρικών εκχυλισμάτων, υπόσχεται τη βαθύτερη κατανόηση των «μοριακών υπογραφών» των βιολογικών συστημάτων -των μορίων της ζωής- σε υψηλή ανάλυση. Το 2017, η επίλυση της δομής της συνθετάσης των λιπαρών οξέων (FAS) στα 4.7 Å χρησιμοποιώντας ως οργανισμό μοντέλο ένα μύκητα, απευθείας από ευκαρυωτικά κυτταρικά εκχυλίσματα, συγκαταλέγεται μεταξύ των καλύτερων παραδειγμάτων σε αυτόν τον τομέα. Αποτελεί ουσιαστικά την πρώτη δομή που έφτασε σε σχεδόν ατομική ανάλυση από ένα εξαιρετικά πολύπλοκο βιολογικό δείγμα. Παραδόξως, παρατηρήθηκαν αλληλεπιδράσεις υψηλότερες από αυτή της τριτοταγούς δομικής οργάνωσης με την FAS, που ήταν προηγουμένως εντελώς άγνωστες. Στο παραπάνω δείγμα η FAS ήταν εμπλουτισμένη σε χαμηλά ποσοστά (λιγότερο από 50 %), όμως επιλύθηκε σε υψηλή ανάλυση. Παρά το γεγονός ότι κατά το στάδιο λύσης των κυττάρων για την παραγωγή των κυτταρικών εκχυλισμάτων θα μπορούσαν να δημιουργηθούν «artifacts», τα κυτταρικά εκχυλίσματα διατηρούν πολλές πτυχές και πληροφορίες της κυτταρικής λειτουργίας. Οι «πρωτεϊνικές κοινότητες» και όλες αυτές οι αλληλεπιδράσεις υψηλότερης τάξης, έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να διατηρηθούν στην (σχεδόν) ενδοκυττάρια τους κατάσταση από ό,τι οι εκτενώς και ομοιογενώς απομονωμένες ή τεχνητά υπερεκφρασμένες μορφές τους. Μια τέτοια προσέγγιση συμπληρώνει σε μεγάλο βαθμό τις παραδοσιακές μεθόδους μοριακής βιολογίας και συμβάλλει προς την κατεύθυνση της περαιτέρω κατανόηση της μοριακής λειτουργίας. Ένα εξαιρετικό παράδειγμα επιπλέον καθιέρωσης, βελτιστοποίησης, συστηματοποίησης και συνδυασμού των παραπάνω προσεγγίσεων περιγράφεται στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Στην παρούσα εργασία αποκαλύπτονται οι δυνατότητές των κυτταρικών εκχυλισμάτων σε σχέση με τη μελέτη μεγάλων συμπλόκων (της τάξης των MDa) που εμπλέκονται στην οξείδωση του πυροσταφυλικού. Η διαδικασία αυτή αποτελεί μια βασική μεταβολική αντίδραση και σημαντικό κομμάτι της κυτταρικής αναπνοής, στην οποία εμπλέκεται ένα γιγαντιαίο ενζυμικό σύμπλοκο γνωστό ως αφυδρογονάση του πυροσταφυλικού (PDHc). Η PDHc είναι ένα σύμπλοκο τριών βασικών λειτουργικών υπο-μονάδων (πρωτεϊνών) , των E1, E2/E3BP και E3 ενζύμων, σε πολλαπλά αντίγραφα το καθένα, που ως σκοπό έχουν τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακετυλο-συνένζυμο Α (Acetyl-CoA) παρέχοντας διοξείδιο του άνθρακα (CO2) και NADH (H+). Το ακετυλο-συνένζυμο Α μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί στον κύκλο του κιτρικού οξέος για τη διεξαγωγή της κυτταρικής αναπνοής και έτσι η PDHc συνδέει τη γλυκόλυση με τον κύκλο του κιτρικού οξέος. Όσων αφορούν στον δομικό χαρακτηρισμό της PDHc, λόγω της ετερογένειάς της, του σχετικά μεγάλου μεγέθους της, της πλαστικότητάς της, και μολονότι τα συστατικά της έχουν χαρακτηριστεί μεμονωμένα, η τεταρτοταγής δομή του πλήρους συμπλόκου δεν είχε ποτέ εξεταστεί λεπτομερώς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήθηκαν διάφορα σύμπλοκα α-κετοξικών αφυδρογονασών απευθείας από κυτταρικά εκχυλίσματα, με τη χρήση ενός θερμόφιλου οργανισμού μοντέλου που ονομάζεται Chaetomium thermophilum. Η οργάνωση των υποσυμπλόκων τους μελετήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία μάζας, δοκιμασίες ενζυμικής ενεργότητας, ηλεκτρονική μικροσκοπία και υπολογιστικά μοντέλα. Η δομή του πυρήνα της PDHc με τη χρήση κρυο-ΗM παρουσιάστηκε σε αυτή τη διδακτορική διατριβή και αποκαλύφθηκαν πολλά μοναδικά και άγνωστα μέχρι πρότινος χαρακτηριστικά της. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η δομική ανασύσταση της PDHc (συνολικού μεγέθους 10-MDa), χωρίς τη χρήση συμμετρίας, αποκάλυψε τη χωρική εγγύτητα των συστατικών της. Έτσι σε συνδυασμό με τα προτεινόμενα στοιχειομετρικά δεδομένα (60 E2p:12 E3BP:~20 E1p:≤12 E3), παρουσιάστηκε η ελάχιστη απαιτούμενη διαδρομή για την ολοκλήρωση ενός κύκλου αντίδρασης μεταξύ των συστατικών ενζύμων. Με αυτόν τον τρόπο, ορίζεται ένα δυναμικό υπο-διαμέρισμα που οργανώνεται από τις πρωτεΐνες του πυρήνα και των πρωτεϊνών περιφερικά του πυρήνα του συμπλόκου της PDH, όπου λαμβάνει χώρα η οξείδωση του πυροσταφυλικού. Μέσω αυτής της προσέγγισης μπορεί να κατανοηθεί πιο αποτελεσματικά η δομή και η λειτουργία του συμπλόκου της PDH και των α-κετοξικών αφυδρογονασών. Έτσι αποδεικνύεται στην πράξη η δυναμική της προσέγγισης/μεθοδολογίας αυτής στη μελέτη τεράστιων ενεργών συμπλόκων, που ονομάζονται «μεταβολώνια», απευθείας από κυτταρικά εκχυλίσματα. Το γεγονός ότι οδεύουμε προς μια εποχή όπου η αυτοματοποίηση συμβάλλει όλο και περισσότερο στην απεικόνιση των κυτταρικών εκχυλισμάτων και της ενδοκυττάριας οργάνωσής τους, σε συνδυασμό με εκσυγχρονισμένες προσεγγίσεις μοριακής/κυτταρικής βιολογίας, δίνει πολλές ελπίδες για αξιοσημείωτα επιτεύγματα. Μέσω της μελέτης πιο ρεαλιστικών βιομοριακών δεδομένων προερχόμενων από κυτταρικά εκχυλίσματα, οδηγούμαστε σε ευρήματα με μεγάλη βιοτεχνολογική και ιατρική σημασία. Επίσης, ιδιαίτερη βαρύτητα θα πρέπει να δοθεί στη συμβολή της τεχνητής νοημοσύνης στη μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων εντός κυτταρικών εκχυλισμάτων. Πολύπλοκα δίκτυα βιολογικών δεδομένων μπορούν να ανακατασκευαστούν και να συγκριθούν μετέπειτα με μέλη πρωτεϊνικών κοινοτήτων διαφόρων οργανισμών. Η επαλήθευση τέτοιων δεδομένων παραμένει εξαιρετικά σημαντική, όπως για παράδειγμα, με φασματοφωτομετρία μάζας ή με μεθόδους κυτταρικής βιολογίας. Επιπλέον η επεξεργασία εικόνων με τη χρήση τεχνητής νοημοσύνης μπορεί να βοηθήσει στην αποκάλυψη νέων δομικών χαρακτηριστικών. Με τέτοια βήματα προσεγγίζεται με έναν συνδυαστικό και ολιστικό τρόπο ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός των διαφόρων κυτταρικών λειτουργιών.