Comparison of in/ex vivo replication characteristics of different porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
Authors: Φρύδας Ηλίας 
Published: January 2024

Το αναπαραγωγικό και αναπνευστικό σύνδρομο των χοίρων (PRRS) είναι μια από τις πιο καταστροφικές ασθένειες που προκαλεί τεράστιες οικονομικές απώλειες στη βιομηχανία των χοίρων. Μόνο στις ΗΠΑ οι απώλειες έφτασαν τα 664 εκατομμύρια δολάρια το έτος 2013. Η ασθένεια προκαλείται από τον ιό PRRS (PRRSV), ο οποίος είναι ένας μονόκλωνος θετικός ιός RNA, ταξινομημένος στην οικογένεια των Arteriviridae. Ο ιός προσβάλλει χοίρους όλων των ηλικιών, με αποτέλεσμα αναπαραγωγικές ανεπάρκειες σε χοιρομητέρες και θηλυκούς χοίρους και αναπνευστικές διαταραχές στα χοιρίδια. Μια υψηλή γενετική ετερογένεια διαίρεσε τον PRRSV στον ευρωπαϊκό τύπο 1 και τον αμερικανικό τύπο 2. Ο ιός εμφανίζει υψηλό ποσοστό μετάλλαξης και εξελίσσεται γρήγορα, με αποτέλεσμα την εμφάνιση νέων εξαιρετικά παθογόνων παραλλαγών και των δύο γονότυπων στην Ευρώπη, τη Βόρεια Αμερική και την Ασία κατά την τελευταία δεκαετία. Συγκεκριμένα στην Ευρώπη, πρόσφατα εμφανίστηκαν στελέχη PRRSV υψηλής παθογονικότητας με αυξημένες αναπνευστικές διαταραχές και πιο σοβαρά κλινικά σημεία. Ως εκ τούτου, κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η εξέταση της παθογένειας των νεοεμφανισθέντων απομονώσεων και ο εντοπισμός των παραγόντων που συμβάλλουν στην αυξημένη λοιμογόνο δράση. Στο πρώτο μέρος του κεφαλαίου 1, γίνεται μια εισαγωγή με βάση την τρέχουσα βιβλιογραφία για το ιστορικό ιών, την ταξινόμηση, την ετερογένεια, την παθογένεση, την ανοσολογική απόκριση και τον εμβολιασμό. Στο δεύτερο μέρος, παρουσιάζεται μια σύντομη εισαγωγή για την ιστορία και τις εφαρμογές των συστημάτων καλλιέργειας μοσχευμάτων, καθώς και την ιστολογία και το ανοσοποιητικό σύστημα των αναπνευστικών βλεννογόνων. Στο κεφάλαιο 2 αναφέρεται ο γενικός στόχος της διπλωματικής εργασίας και παρουσιάζονται οι συγκεκριμένοι στόχοι. Στο κεφάλαιο 3, η διαφορετική κλινική, ιολογική, ορολογική και ιστική έκβαση τροπισμού δύο νέων στελεχών PRRSV (13V091 και 13V117), που απομονώθηκαν το 2013 από δύο διαφορετικά βελγικά αγροκτήματα με ενζωοτικά αναπνευστικά προβλήματα λίγο μετά τον απογαλακτισμό στο φυτώριο, συγκρίθηκαν με τα βελγικά στέλεχος 07V063 που απομονώθηκε το 2007. Πραγματοποιήθηκε πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος για να προσδιοριστεί η προέλευση των νέων απομονώσεων. Χοίροι ηλικίας δώδεκα εβδομάδων εμβολιάστηκαν ενδορινικά (ΙΝ) με 13V091, 13V117 ή 07V063 (9 χοίροι/ομάδα). Στις 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi), 4 ζώα από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και συλλέχθηκαν ιστοί για παθολογική, ιολογική και ορολογική ανάλυση. Η λοίμωξη 13V091 είχε ως αποτέλεσμα τις υψηλότερες βαθμολογίες αναπνευστικής νόσου και τη μεγαλύτερη περίοδο πυρετού. Οι μικτές βλάβες στους πνεύμονες ήταν πιο έντονες για το 13V091 (13%) από ό,τι για το 13V117 (7%) και το 07V063 (11%). Η ρινική έκκριση και η ιαιμία ήταν επίσης πιο εκτεταμένες με το 13V091. Η ομάδα που εμβολιάστηκε με το στέλεχος 13V091 έδειξε τον υψηλότερο πολλαπλασιασμό του ιού σε κόγχες, αμυγδαλές και οπισθοφάρυγγα λεμφαδένες. Η λοίμωξη με το στέλεχος 13V117 είχε ως αποτέλεσμα τη χαμηλότερη αντιγραφή του ιού στους λεμφικούς ιστούς. Το 13V091 έδειξε υψηλότερους αριθμούς μολυσμένων με σιαλοαδεσίνη κυττάρων/mm2 σε κόγχες, αμυγδαλές και σπλήνα από το 13V117 και το 07V063. Η απόκριση εξουδετερωτικού αντισώματος με 07V063 ήταν ισχυρότερη από ό,τι με τα 13V091 και 13V117. Συνοπτικά: (1) δύο νέα στελέχη PRRSV που ονομάζονται 13V091 και 13V117 απομονώθηκαν από χοίρους που εμφάνιζαν αναπνευστική δυσχέρεια. Παθογόνες και γενετικές μελέτες έδειξαν ότι το 13V091 είναι το πιο παθογόνο στέλεχος τύπου 1 υποτύπου 1 που έχει απομονωθεί μέχρι τώρα προκαλώντας πυρετό, αναπνευστικά προβλήματα, υψηλούς τίτλους ιού στις ρινικές εκκρίσεις, αυξημένο ποσοστό πνευμονικών βλαβών σε νεαρά ζώα και διευρυμένο κυτταρικό τροπισμό σε Sn- κύτταρα στο ρινικό βλεννογόνο και σε άλλους λεμφικούς ιστούς. (2) Παρά το γεγονός ότι τα 13V117 και 07V063 εμφανίζουν μόνο οκτώ διαφορές αμινοξέων, εμφάνισαν αντίθετα κλινικά και ιολογικά αποτελέσματα. Το 13V117 μπόρεσε να προκαλέσει πυρετό, υψηλή ιαιμία και αναπνευστικά προβλήματα στα αρχικά στάδια της μόλυνσης και ήταν σε θέση να αναπαραχθεί στον ρινικό βλεννογόνο αλλά όχι στους λεμφαδένες, ενώ το 07V063 έδειξε μόνο πυρετό, 10 φορές χαμηλότερη ιαιμία, χαμηλή τίτλους ιού στις ρινικές εκκρίσεις, αλλά υψηλότερους τίτλους ιού στους λεμφικούς ιστούς. Οι αυξημένες αναπνευστικές διαταραχές σε σύγκριση με τις σύγχρονες απομονώσεις PRRSV και ο διευρυμένος κυτταρικός τροπισμός που παρατηρήθηκε στα αποτελέσματα του κεφαλαίου 3 μας ώθησαν να μελετήσουμε εκτενέστερα την κινητική αντιγραφής του ιού στον ρινικό βλεννογόνο. Έτσι, στο κεφάλαιο 4.1, χρησιμοποιήθηκε ένα νέο πολωμένο σύστημα μοσχευμάτων ρινικού βλεννογόνου για τη μελέτη της εισβολής του στελέχους Lelystad (LV) υποτύπου 1 PRRSV χαμηλής λοιμογόνου δράσης και του στελέχους Lena του υποτύπου 3 PRRSV υψηλής λοιμογόνου δράσης στην πύλη εισόδου. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων της μονοκυτταρικής γενεαλογίας (κυψελιδικά μακροφάγα (PAM), καλλιεργημένα μονοκύτταρα αίματος και δενδριτικά κύτταρα προερχόμενα από μονοκύτταρα (moDC)) περιλήφθηκαν για να εξεταστούν οι κινητικές αντιγραφής και των δύο στελεχών στα υποτιθέμενα κύτταρα-στόχους τους. Στις 0, 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό (hpi), η παραγωγή του ιού αναλύθηκε και τα μολυσμένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν και ταυτοποιήθηκαν. Διαφορές στην αντιγραφή δεν βρέθηκαν στα μονοκύτταρα και στο moDC. Η ομοεστιακή μικροσκοπία έδειξε ότι για την LV, σχεδόν όλα τα θετικά για το αντιγόνο ιικά κύτταρα ήταν CD163+Sialoadhesin (Sn)+, τα οποία εντοπίζονταν κυρίως στο lamina propria του αναπνευστικού βλεννογόνου. Στον ρινικό βλεννογόνο μολυσμένο με Λένα, οι μονοκυτταρικοί υποτύποι CD163+Sn+, CD163+Sn- και σε μικρότερο βαθμό CD163-Sn- ενεπλάκησαν στη μόλυνση. Τα κύτταρα CD163+Sn- βρίσκονταν κυρίως εντός ή κοντά στο επιθήλιο. Συνοπτικά, προτείναμε ένα μοντέλο για τους διαφορετικούς μηχανισμούς εισβολής που παρατηρήθηκαν μεταξύ αυτών των δύο στελεχών PRRSV στον ρινικό βλεννογόνο. Από τη μία πλευρά, η ευαισθησία του LV περιοριζόταν κυρίως στα κύτταρα CD163+Sn+, τα οποία βρίσκονταν στο lamina propria. Ο μικρός αριθμός κυττάρων Sn+ (5,2/mm2) που υπάρχουν εντός της επιθηλιακής κυτταρικής στιβάδας πιθανότατα δεν επιτρέπει στο LV να φτάσει σε υψηλά επίπεδα μόλυνσης. Μόνο 2,5 μολυσμένα με LV κύτταρα/mm2 παρατηρήθηκαν στους 72 hpi, όλα εντοπίζονται στο lamina propria και το 97% από αυτά είχαν φαινότυπο CD163+Sn+. Από την άλλη πλευρά, η Lena βρέθηκε να αναπαράγει 10 έως 100 φορές πιο αποτελεσματικά από το LV και φαίνεται να πειράζει τα κύτταρα CD163+Sn+ και CD163+Sn- που βρίσκονται μέσα ή κοντά στο επιθήλιο για να αποκτήσει πρόσβαση σε βαθύτερα μέρη του βλεννογόνου. Μετά από 48 hpi, συστάδες κυττάρων κυρίως μολυσμένων με CD163+Sn-Lena παρατηρήθηκαν εντός ή κοντά στο επιθήλιο και συστάδες κυττάρων CD163+Sn+ στο lamina propria. Αυτά τα συμπλέγματα επεκτάθηκαν στους 72 hpi και σε μικρότερο βαθμό από τους άλλους φαινοτύπους, ανιχνεύθηκαν κύτταρα CD163-Sn- στην περιφέρειά τους. Στο κεφάλαιο 4.2, το σύστημα μοσχευμάτων χρησιμοποιήθηκε για την επέκταση της έρευνάς μας και τη μελέτη των χαρακτηριστικών αντιγραφής στον ρινικό βλεννογόνο τεσσάρων τύπου 1 (LV, 07V063, 08VA, 13V091), τριών τύπου 2 (VR2332, MN-184, VN) και δύο εξασθενημένα (MLV-DV, MLV-VR2332) στελέχη PRRSV. Μετά από 72 hpi, οι μέσοι τίτλοι του ιού έφτασαν τα 104,5 έως 4,8 TCID50/ml για LV και 08V204, 105,2 έως 5,4 TCID50/ml για Lena και VR2332, και 105,8 έως 6,3 TCID50/ml για 078, 07V3, TCID50/ml για 070, 07N3, 07, 10, 10, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 40 μετριασμένη στελέχη παρέμειναν γύρω από το όριο ανίχνευσης (0,9 TCID50/ml). Ο μέσος αριθμός θετικών σε PRRSV κυττάρων/mm2 στους 72 hpi ήταν 1,1 και 1,3 για τα εξασθενημένα στελέχη και LV, 13,3 για 08VA, 23,5 και 29,3 για VR2332 και 07V063, 31,1 και 33,29 και 33,10V και 33,1,9 και 33,1,9 και 33,1,9 και 31,5 και 1,5 και 1,5 για MN-184 και VN αντίστοιχα. Όλα τα μολυσμένα με LV και MLV-DV κύτταρα ήταν Sn+, ενώ όλα τα άλλα στελέχη μόλυναν επίσης Sn-μακροφάγους. Συμπερασματικά, (i) με βάση την αποβολή του ιού στα αναπνευστικά εκφυτεύματα, τα στελέχη PRRSV μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως φτωχά (MLV-DV, MLV-VR2332, LV, 08VA), μέτρια (Lena, VR2332) και ισχυρά (07V063, 13V091, MN -184, VN) εκκρίτες και (ii) με βάση τον αριθμό των μολυσμένων κυττάρων απομόνωσης μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως χαμηλά (MLV-DV, MLV-VR2332, LV), μέτρια (08VA, VR2332), υψηλά (07V063, Lena, 13V091 ) και υπερ (MN-184, VN) λοιμογόνος στον ρινικό βλεννογόνο. Τέλος, μια γενική συζήτηση για τα κύρια ευρήματα της παρούσας διατριβής και τις μελλοντικές προοπτικές παρουσιάζονται στο κεφάλαιο 5.