Μοριακοί μηχανισμοί ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία με πλατίνη
Authors: Στεφάνου Δήμητρα 
Published: September 2021

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών. Με την χρήση των πλατινούχων παραγόντων στη χημειοθεραπεία του καρκίνου αυτού παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στα ποσοστά πενταετούς και συνολικής επιβίωσης, χωρίς, όμως, να επιτυγχάνεται ίαση της νόσου. Μία από τις βασικές αιτίες της τελικής αποτυχίας είναι η ανάπτυξη αντοχής στα φάρμακα αυτά. Πολλές ερευνητικές εργασίες έχουν δείξει ότι οι μηχανισμοί αντοχής είναι πολυπαραγοντικοί, με την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA να συμβάλλει σε σημαντικό ποσοστό. ΣΤΟΧΟΙ: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της βλάβης που προκαλείται στο DNA από πλατινούχους παράγοντες και η διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Με δεδομένη τη σημασία της επιδιόρθωσης στην επιβίωση του καρκινικού κυττάρου και ως εκ τούτου στην ανταπόκριση του ασθενούς στη χημειοθεραπεία καθώς και το γεγονός ότι οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για τον προσδιορισμό της δεν μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν στη κλινική πρακτική, αναπτύξαμε κατ΄αρχήν τρεις καινούργιες ευαίσθητες μεθοδολογίες (ποσοτική PCR, η αλκαλική μέθοδος δημιουργίας κομητών, μέτρηση της επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας), που δίνουν αξιόπιστα αποτελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών. Στα κύτταρα αυτά μετά την ex vivo χορήγηση πλατινούχων παραγόντων (σισπλατίνης, καρβοπλατίνης) μελετήθηκε το είδος των βλαβών στο DNA που προκαλούνται από τους παράγoντες αυτούς και η κινητική σχηματισμού/επιδιόρθωσης των βλαβών χρησιμοποιώντας ανάλυση κατά Southern και ποσοτικό PCR. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας έγινε διερεύνηση των μορίων (γΗ2ΑΧ, ΑΤΜ, ΑΤR, Chk1, Chk2) που επάγονται μετά την αναγνώριση της βλάβης από το κύτταρο. Τέλος, εφαρμόζοντας τις μεθοδολογίες, που αναπτύξαμε, μετρήθηκαν τα επίπεδα βλάβης/επιδιόρθωσης του DNA ή/και των ενδιαμέσων της επιδιόρθωσης της βλάβης. Τέλος, έγινε πιστοποίηση των τριών μεθοδολογιών σε επίπεδο βιολογικών δειγμάτων (απομονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) που ελήφθησαν από 9 υγιείς δότες και 18 ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών πριν τη χορήγηση χημειοθεραπείας και τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με την κλινική απόκριση των ασθενών στη χημειοθεραπεία. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, σε κάθε μέθοδο ξεχωριστά επιλέχθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες που εξασφαλίζουν την ποσοτικοποίηση της σχέσης δόσεις πλατίνης-επιπέδων της επαγόμενης βλάβης του DNA. Σε πρώτη φάση, διερευνήθηκε το είδος των βλαβών της πλατίνης που ανιχνεύεται με τη μέθοδο του ποσοτικού PCR και η κινητική σχηματισμού τους χρησιμοποιώντας ως μέθοδο ελέγχου την ανάλυση κατά Southern. Μετά από σύγκριση των επιπέδων βλαβών που μετρώνται με τη ποσοτική PCR με εκείνα που ανιχνεύονται με την ανάλυση κατά Southern στα ίδια δείγματα, βρέθηκε ότι η μέθοδος της ποσοτικής PCR μετράει το σύνολο των βλαβών που δημιουργούνται από τα παράγωγα της πλατίνης. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα των ολικών βλαβών που προκαλούνται από τη σισπλατίνη φτάνουν σε πλατό μέσα στις 3 πρώτες ώρες χορήγησης, ενώ οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Αντιθέτως, στην περίπτωση της καρβοπλατίνης οι ολικές βλάβες καθώς και οι σταυροδεσμοί αυξάνονται συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζοντας μέγιστη τιμή στις 24 ώρες. Με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας αποδείχθηκε ότι η γH2Ax είναι το πρώτο μόριο που επάγεται, στη συνεχεία, ενεργοποιείται το μονοπάτι ATR - Chk1 και ακολούθως το μονοπάτι ATM - Chk2. Χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών βρήκαμε ότι οι βλάβες που δημιουργούνται από τη καρβοπλατίνη στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν (p=0,05). Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος Olive Tail Moment (OTM, αυθαίρετες μονάδες που αποτελούν μέτρο του επιπέδου βλαβών του DNA), που μετρήθηκε στους ευαίσθητους ασθενείς βρέθηκε 13927,42 ενώ στους ανθεκτικούς ήταν 7834,25. Χρησιμοποιώντας το προσδιορισμό επαγωγής γH2AX με τη βοήθεια του ανοσοφθορισμού και της συνεστιακής μικροσκοπίας οι μετρήσεις οδήγησαν στα ίδια ακριβώς συμπεράσματα όπως και στην αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών με στατιστική σημαντικότητα (p=0,03). Συγκεκριμένα, μετρώντας τα επίπεδα επιδιορθωτικής ικανότητας μεταξύ των ασθενών, όπως αυτά εκφράζονται με τη μέτρηση του εμβαδού της περιοχής κάτω από την καμπύλη [(% ποσοστό με >5 εστίες γH2AX) x δόση], βρέθηκε ότι ευαίσθητοι ασθενείς εμφανίζουν τιμή 15765,83, ενώ οι ανθεκτικοί 12846,66. Επίσης, και με τις δύο μεθοδολογίες διαπιστώθηκε ότι οι ενδογενείς βλάβες των υγιών δοτών είναι στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες σε σχέση με τους ασθενείς (p<0,001). Τέλος, μια άλλη παρατήρηση ήταν ότι οι υγιείς δότες επάγουν χρώση όλου του πυρήνα του κυττάρου (panuclear, αποτελεί μέτρο της αποπτωτικής διαδικασίας) σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με τους ασθενείς που σημαίνει ότι οι τελευταίοι εμφανίζουν μικρότερη ικανότητα επαγωγής της αποπτωτικής διαδικασίας (p=0,01), ένα βιολογικό χαρακτηριστικό που μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Στη παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε η επαγωγή των μορίων που εμπλέκονται στα κυτταρικά μονοπάτια αναγνώρισης της βλάβης από τη πλατίνη και μεταγωγής του σήματος (γH2AX, ATR, Chk1, ATM, Chk2). Ακόμα αποδείχτηκε ότι η επιδιόρθωση των βλαβών DNA αποτελεί σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στο αποτέλεσμα της χημειοθεραπείας με παράγωγα πλατίνης. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι οι αλλαγές στην ικανότητα επιδιόρθωσης των καρκινικών κυττάρων αντικατοπτρίζεται στα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (ιστός δείκτης) κάτι που σημαίνει ότι η μέτρηση βλάβης/επιδιόρθωσης σε λεμφοκύτταρα μπορεί να αποτελέσει μοριακό δείκτη πρόγνωσης του θεραπευτικού αποτελέσματος. Τέλος, χρησιμοποιώντας την αλκαλική μέθοδο δημιουργίας κομητών και τη μέτρηση των επιπέδων του γH2AX με ανοσοφθορισμό βρήκαμε ότι οι ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό ενδογενών γονοτοξικών βλαβών από τους υγιείς δότες (κάτι που πιθανά συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου) και από την άλλη μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε τα άτομα που θα ωφεληθούν από τη μετέπειτα χορήγηση της χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να αξιοποιηθούν στην ανάπτυξη ευαίσθητων μοριακών δεικτών για τη έγκαιρη διάγνωση της ασθένειας και τη πρόγνωση της κλινικής απόκρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών στη χημειοθεραπεία με παράγοντες πλατίνης.