Μοριακή επιδημιολογία κλινικών στελεχών Staphylococcus aureus στα παιδιά
Authors: Τσιριγωτάκη Μαρία 
Published: April 2023

Εισαγωγή: O χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus, S. aureus) είναι ένα συχνό παθογόνο που προκαλεί μεγάλο εύρος λοιμώξεων στον άνθρωπο. Ποσοστό 20% του γενικού πληθυσμού είναι φορείς του S. aureus και η φορία παρουσιάζει δικόρυφη κατανομή με υψηλά ποσοστά κατά τις πρώτες 8 εβδομάδες ζωής και κατά τη διάρκεια της εφηβείας. Ο S. aureus αποτελεί το αίτιο πολλών διεισδυτικών και μη διεισδυτικών λοιμώξεων όπως είναι η βακτηριαιμία, πνευμονία, μηνιγγίτιδα, λοιμώδης ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις οστών και αρθρώσεων και λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων καθώς και νόσων διαμεσολαβούμενων από τοξίνη. Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναδυθεί και εξαπλωθεί στελέχη κοινότητας ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη (CA-MRSA) που προκαλούν επιδημίες λοιμώξεων δέρματος και μαλακών μορίων παγκοσμίως. Η αύξηση αυτή είναι πιο εμφανής σε μικρές ηλικίες και φαίνεται να σχετίζεται με την επικράτηση συγκεκριμένων κλώνων ανά γεωγραφική περιοχή. Επίσης πρόσφατα έχει περιγραφεί η αύξηση των περιπτώσεων σταφυλοκοκκικού συνδρόμου αποφολίδωσης του δέρματος (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome, SSSS), μιας νόσου διαμεσολαβούμενης από τοξίνη που απαντάται σπάνια σε ενήλικες με υποκείμενα νοσήματα ή ανοσοκαταστολή ενώ είναι συχνή στα νεογνά και στα παιδιά. Υπεύθυνα είναι στελέχη S. aureus που παράγουν αποφολιδωτικές τοξίνες (ETA, ETB). Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον στρέφεται στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που έχουν προκαλέσει την αύξηση των λοιμώξεων από S. aureus και την επικράτηση συγκεκριμένων κλώνων όπως στελεχών CA-MRSA με λοιμογόνους παράγοντες όπως η λευκοκτονίνη Panton-Valentine (PVL) και η α-αιμολυσίνη. Υλικά και μέθοδοι: Μελετήθηκαν παιδιά και έφηβοι κάτω των 18 ετών που νοσηλεύτηκαν λόγω λοίμωξης από S. aureus επιβεβαιωμένης με καλλιέργεια υλικού στα παιδιατρικά τμήματα και στις ειδικές μονάδες του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου από 1η Ιανουαρίου 2015 έως και 31 Δεκεμβρίου 2018. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν καλλιέργειες δερματικών βλαβών, πύου, υλικού παρακεντήσεων, αίματος, πτυέλων, βρογχικού εκπλύματος, εγκεφαλονωτιαίου υγρού καθώς και καλλιέργειες ρινικού επιχρίσματος σε περιπτώσεις νόσου διαμεσολαβούμενης από τοξίνη. Οι λοιμώξεις ταξινομήθηκαν με βάση το ιατρικό ιστορικό σε λοιμώξεις κοινότητας (Community-associated, CA), νοσοκομειακές λοιμώξεις (Hospital-associated, HA) και νοσοκομειακές λοιμώξεις με έναρξη στην κοινότητα (Community onset, Healthcare-Αssociated, COHA) και καταγράφηκαν οι κλινικές εκδηλώσεις, η διάρκεια νοσηλείας και η έκβασή τους. Για τις καλλιέργειες των κλινικών δειγμάτων ακολουθήθηκαν οι συμβατικές μέθοδοι. Η ταυτοποίηση των στελεχών S. aureus έγινε με βάση τη μορφολογία των αποικιών, τη χρώση Gram, τη δοκιμασία καταλάσης και πηκτάσης και με τη χρήση του αυτοματοποιημένου συστήματος Vitek2 (bioMérieux, Marcy l’ Etoile, France). Για τη ερμηνεία των αποτελεσμάτων ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά χρησιμοποιήθηκαν τα κριτήρια Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) του 2018. Για τον ποιοτικό έλεγχο χρησιμοποιήθηκαν τα πρότυπα στελέχη S. aureus ATCC 25923 και S. aureus ATCC 43300. Τα στελέχη ταξινομηθήκαν φαινοτυπικά σε ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη (MSSA) ή ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη (MRSA) με βάση τη δοκιμασία διάχυσης δίσκων κεφοξιτίνης και τη δοκιμασία latex συγκόλλησης για την ανίχνευση της PBP2a (bioMerieux). Για την ανίχνευση της επαγώγιμης αντοχής στην κλινδαμυκίνη χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία D-test σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI. H παρουσία των γονιδίων που κωδικοποιούν την λευκοκτονίνη Panton–Valentine (lukS/lukF-PV), του γονιδίου της τοξίνης του συνδρόμου της τοξικής καταπληξίας I (tst), των γονιδίων των αποφολιδωτικών τοξινών (eta, etb) και των προσκολλητινών A και B (fnbA,fnbB) ελέγχθηκαν με PCR. Ακολούθως τα στελέχη S. aureus τυποποιήθηκαν με τη χρήση ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). Τα αποτελέσματα της PFGE συσχετίσθηκαν και σχεδιάστηκε ένα δενδρόγραμμα συγκρίνοντας τα μοριακά βάρη των θραυσμάτων DNA μέσω του προγράμματος FPQuest (Bio-Rad). Στη μελέτη μας, πραγματοποιήθηκε πολυτοπική νουκλεοτιδική ανάλυση (Multi Locus Sequence Typing, MLST) σε αντιπροσωπευτικά στελέχη με βάση το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά και τους τύπους PFGE. Χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα eBURST (http://eburst.mlst.net) προκειμένου να καθοριστούν τα κλωνικά συμπλέγματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με την εφαρμογή των δοκιμασιών χ2 ή two-tailed Fisher’s exact test για τις κατηγορικές μεταβλητές και υπολογίστηκαν τα p values και odds ratios. Για τις συνεχείς μεταβλητές, η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με τη χρήση της δοκιμασίας Mann–Whitney. Οι τάσεις σε ότι αφορά την αντοχή στα αντιμικροβιακά και στους τύπους κατά MLST αναλύθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας χ2 chi square for trend. Το όριο της στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε ως p value <0.05. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού Graphpad version 9.1.0.Αποτελέσματα: Κατά την διάρκεια της τετραετίας 2015 έως 2018, εντοπίσθηκαν 139 στελέχη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου από παιδιά και εφήβους που νοσηλεύτηκαν με διεισδυτικές και μη διεισδυτικές λοιμώξεις στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 77 αγόρια και 62 κορίτσια. Η πλειοψηφία των στελεχών ήταν MSSA (123 στελέχη, 88.5%) και 16 ήταν MRSA (11.5%). Η μέση ηλικία διάγνωσης ήταν τα 3.8 έτη (διάμεσος 2.02 έτη). Ποσοστό 67.7% των στελεχών (94/136) απομονώθηκαν από λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων ενώ οι διεισδυτικές λοιμώξεις (22/139, 15.8%) και οι λοιμώξεις διαμεσολαβούμενες από τοξίνη (ΤΜD) ήταν σπανιότερες (23/139, 16.5%). Τα περισσότερα στελέχη ανήκαν σε στελέχη κοινότητας (CA), ενώ τα νοσοκομειακά στελέχη και τα νοσοκομειακά στελέχη με έναρξη στην κοινότητα ήταν λιγότερο συχνά [CA (102/139, 73.4%), HA (20/139,14.4%) και COHA 17/139; 12.2%, αντίστοιχα]. Συνολικά 52 στελέχη ανήκαν σε παιδιά με χρόνια νοσήματα ή παρατεταμένη ενδονοσοκομειακή νοσηλεία. Η μέση διάρκεια νοσηλείας ήταν 7.5 ημέρες (1-70 ημέρες). Παιδιά με λοιμώξεις από στελέχη MRSA δεν διέφεραν ως προς την διάρκεια νοσηλείας σε σχέση με MSSA στελέχη (p 0.87). Κατά το διάστημα παρακολούθησης δεν διαπιστώθηκαν θάνατοι. Σε ότι αφορά τους φαινότυπους αντοχής, ποσοστό 93.5% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη, 35.9% στο φουσιδικό οξύ, 7.2% στη μουπιροσίνη, 22.3% στην τομπραμυκίνη, 18.7% στην ερυθρομυκίνη, 16.5% στην κλινδαμυκίνη και 9.3% στην τετρακυκλίνη. Ανάμεσα στα 26 στελέχη που παρουσίαζαν αντοχή στην ερυθρομύκινη, ποσοστό 53.9%, 34.6%, και 11.5% αντίστοιχα παρουσίαζαν φαινότυπο αντοχής cMLSB, iMLSB και MS αντίστοιχα. Τα στελέχη MRSA και MSSA δεν διέφεραν ως προς τους φαινοτύπους αντοχής cMLSB και iMLSB (OR 0.20, 95% CI 0.03-1.39, p 0.16). Κανένα στέλεχος δεν παρουσίαζε αντοχή στην βανκομυκίνη, ριφαμπικίνη, λινεζολίδη και τεϊκοπλανίνη. Όλα τα στελέχη που ήταν φαινοτυπικά ανθεκτικά στην κεφοξιτίνη, ήταν επίσης ανθεκτικά στην οξακιλλίνη και έφεραν το γονίδιο mecA. Κατά την διάρκεια μελέτης, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων από στελέχη MSSA [OR 3.32 95%CI (1.18-8.96) p 0.03, x2 5.56 df:1, p 0.02] καθώς και στατιστικά σημαντική αύξηση των περιπτώσεων SSSS (x2 for trend 5.36, df1, p 0.02). Παράλληλα, παρατηρήθηκε μια σημαντική αύξηση της αντοχής σε φουσιδικό οξύ και μουπιροσίνη (φουσιδικό οξύ, x2 test for trend, p 0.01; μουπιροσίνη x2 test for trend, p <0.0001). Οι αυξητικές τάσεις της αντοχής της μουπιροσίνης συσχετίσθηκαν με αύξηση των ανθεκτικών στη μουπιροσίνη στελεχών MSSA (p <0.0001). Όλα τα στελέχη (Ν=139) εξετάστηκαν για την ύπαρξη λοιμογόνων γονιδίων. Από αυτά, 13 στελέχη (9.4%) ήταν lukS/lukF-PV θετικά, 27 (19.4%) eta θετικά, έξι (4.3%) etb θετικά, 13 (9.4%) tst θετικά, 125 (89.9%) fnbA θετικά και 21 (15.1%) fnbB θετικά. Τα στελέχη MRSA παρουσίαζαν υψηλότερα ποσοστά γονιδίων lukS/lukF-PV και tst σε σύγκριση με τα MSSA ενώ τα MSSA είχαν υψηλότερα ποσοστά γονιδίων eta (Πίνακας 8). Τα στελέχη MSSA παρουσίασαν πολυκλονικότητα κατά PFGE και ταξινομήθηκαν σε 20 τύπους κάθε ένας από τους όποιους περιελάμβανε 1 έως 40 στελέχη. Ανιχνεύτηκαν δυο κυριάρχοι τύποι, ο τύπος 1 με 10 υποτύπους (ST121) που περιελάμβανε 40 στελέχη και ο τύπος 2 με 7 υποτύπους και 16 στελέχη. Συνολικά, 16 PFGE τύποι συμπεριέλαβαν ένα έως 8 στελέχη MSSA ο καθένας. Επιπλέον, δύο στελέχη MSSA ταξινομήθηκαν στους PFGE τύπους C (ST80) και H (ST225). Τα στελέχη MRSA ανήκαν σε 4 τύπους: στον τύπο Α ανήκαν 4 στελέχη (ST30), στον τύπο Β: 4 στελέχη (ST239), στον τύπο C: 5 στελέχη (ST80) και στον τύπο Η: 3 στελέχη (ST225). Κατά MLST μελετήθηκαν 58 αντιπροσωπευτικά στελέχη εκ των οποίων όλα τα στελέχη απομονώθηκαν από παιδιά με λοιμώξεις διαμεσολαβούμενες από τοξίνη (SSSS). Ανάμεσα στα στελέχη που απομονώθηκαν από SSSS, o τύπος PFGE 1, ST121 ήταν ο κυρίαρχος τύπος (13/23, 56.5%, p 0.002). Στη μελέτη μας, 40 στελέχη ανήκαν στον τύπο ST121, εκ των οποίων όλα ήταν MSSA και παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα αντοχής στο φουσιδικό οξύ (80%), στην τομπραμυκίνη (35%), μουπιροσίνη (25%) και στην κλινδαμυκίνη (25%), σπανίως έφεραν γονίδια PVL και tst (3/40 και 0/40 αντίστοιχα) αλλά ήταν θετικά για γονίδια eta ή/και etb (eta 27/40, etb 6/40, eta και etb 4/40) καθώς και γονίδια που επιτρέπουν την προσκόλληση στο επιθήλιο (fnbA 40/40). Ο τύπος PFGE 1 προκαλούσε κυρίως SSTIs (26/40) και SSSS (13/40) ενώ καταγράφηκε μία περίπτωση διεισδυτικής νόσου. Συγκριτικά με τους άλλους τύπους, η αντοχή στη μουπιροσίνη και η παρουσία των γονιδίων eta/etb ήταν αποκλειστικά συνδεδεμένη με τον τύπο 1 (p<0.0001). Συμπεράσματα: Ο CA-MSSA είναι το κύριο αίτιο λοιμώξεων δέρματος και μαλακών μορίων καθώς και σταφυλοκοκκικού συνδρόμου αποφολίδωσης δέρματος στα παιδιά και στους εφήβους στην περιοχή μελέτης. Ο κλώνος ST121, ο οποίος χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα αντοχής στο φουσιδικό οξύ και στη μουπιροσίνη είναι ο κυρίαρχος ανάμεσα στα στελέχη που προκαλούν SSSS. Η γνώση των φαινοτυπικών, των μοριακών χαρακτηριστικών καθώς και της επιδημιολογίας των στελεχών S. aureus μπορεί να δώσει χρήσιμες πληροφορίες στην κλινική πρακτική ενώ ο χαρακτηρισμός του γενετικού τους υποβάθρου μπορεί να ερμηνεύσει τις τρέχουσες αλλαγές που παρατηρούνται στην επιδημιολογία και στις κλινικές εκδηλώσεις των λοιμώξεων από S. aureus.