Διερεύνηση της επίδρασης των κρυοσυντηρητικών μέσων στη βιωσιμότητα των εμβρύων
Authors: Οικονόμου Ζήνων 
Published: August 2021

Σκοπός: της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της επίδρασης δύο κρυοπροστατευτικών μέσων, του DMSO και της PrOH που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο της υαλοποίησης. Εξετάστηκε η άμεση βιωσιμότητα των βλαστομεριδίων και των εμβρύων και η κυτταροσκελετική ακεραιότητα σε έμβρυα ποντικού που βρίσκονται στο στάδιο της αυλάκωσης και του μοριδίου. Υλικό: Eλήφθησαν 240 έμβρυα από έγκυα θηλυκά ζώα, φυλής background CBA/C57BL6J, από τα οποία τα 65 ήταν φρέσκα και χρησιμοποιήθηκαν σαν ομάδα ελέγχου, τα 90 υαλοποιήθηκαν με το κρυοπροστατευτικό μέσο DMSO και τα 85 με το κρυοπροστατευτικό μέσο PrOH. Όλα τα έμβρυα κατανεμήθηκαν σε τρεις υποομάδες, ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης των εμβρύων (4-6 κυττάρων/8 κυττάρων/μοριδίου).Μέθοδοι: Η υαλοποίηση των εμβρύων με το κρυοπροστατευτικό DMSO/EG πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο kit υαλοποίησης της Cook, ενώ με το PrOH χρησιμοποιήθηκε το kit υαλοποίησης της Vitrolife. Η άμεση βιωσιμότητα των βλαστομεριδίων και των εμβρύων μετά την υαλοποίηση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο φθορίζοντες δείκτες, τον σουκινιμυδυλικό εστέρα της διοξικής καρβοξυφλουορεσκεΐνης (CFSE) ο οποίος συνδέεται στο κυτταρόπλασμα των βιώσιμων κυττάρων και το χρωματίζει πράσινο και (2) το ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), το οποίο εισέρχεται μόνο σε μη βιώσιμα κύτταρα, χρωματίζοντας τα κόκκινα. Φρέσκα και υαλοποιημένα/αποψυγμένα έμβρυα τοποθετούνται άμεσα σε διάλυμα με CFSE και μετά σε CFSE/PI και εξετάζονται σε μικροσκόπιο φθορισμού. Για την αξιολόγηση της μιτωτικής ατράκτου και της διάταξης των χρωμοσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν μικροσκόπιο φθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal) κατόπιν ανοσοϊστοχημικής χρώσης με ένα πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την α-τουμπουλίνη και ένα δευτερογενές αντίσωμα το οποίo συνδέεται στο πρωτογενές και χρωματίζει τις ατράκτους πράσινες, ενώ τα χρωμοσώματα χρωματίζονται με DAPI σε χρώμα μπλε. Οι άτρακτοι ταξινομήθηκαν ανάλογα με τη θέση ή το σχήμα των πόλων τους καθώς και τη διάταξη των χρωμοσωμάτων σε φυσιολογικές, ανώμαλου σχήματος και πολυπολικές.Αποτελέσματα: Όσον αφορά την άμεση βιωσιμότητα των φρέσκων και υαλοποιημένων εμβρύων ποντικού με DMSO/EG, τα υαλοποιημένα έμβρυα είχαν ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό κυττάρων που δεν είχαν υποστεί βλάβη σε σχέση με τα φρέσκα έμβρυα (54% έναντι 91,1%). Ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των εμβρύων με κατεστραμμένα βλαστομερίδια, παρατηρήθηκε στα υαλοποιημένα / αποψυγμένα έμβρυα με PrOH/EG σε σύγκριση με τα φρέσκα έμβρυα (57,8% έναντι 91,1%). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό βλάβης των βλαστομεριδίων ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης, τόσο στα υαλοποιημένα όσο και στα φρέσκα. Από τις 20 φρέσκες βλαστοκύστεις, οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση του κυτταροσκελετού, 17 (85%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους. Συνολικά, μελετήθηκαν 36 άτρακτοι, εκ των οποίων 72,2% ήταν φυσιολογικές, ενώ η μειονότητα είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων τους. Στο στάδιο των υαλοποιημένων 8 κυττάρων με DMSO, 15 /20 έμβρυα (75%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους. Συνολικά, μελετήθηκαν 22 άτρακτοι, εκ των οποίων 45,5% ήταν φυσιολογικές και το 54,5% είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων τους. Τέλος στο στάδιο του μοριδίου, 14/20 υαλοποιημένα με DMSO έμβρυα (70%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους και μελετήθηκαν 34 άτρακτοι, εκ των οποίων 50% ήταν φυσιολογικές, και 50% είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων. Στην ομάδα της PrOH, 15 από τα 20 (75%) υαλοποιημένα έμβρυα με PrOH στο στάδιο του μοριδίου επιβίωσαν μετά την απόψυξη και 10/15 (66,7%) έφτασαν στο στάδιο της βλαστοκύστης. Ωστόσο μόνο 5/10 είχαν ατράκτους στα στάδια της μετάφασης-ανάφασης. Στο στάδιο των 8 κυττάρων, 16 από τα 20 (80%) έμβρυα επιβίωσαν μετά την απόψυξη και 8/16 (50%) έφτασαν στο στάδιο της βλαστοκύστης αλλά κανένα από αυτά δεν είχε ατράκτους στα στάδια της μετάφασης – ανάφασης.Συμπεράσματα: Όλα τα υαλοποιημένα έμβρυα επιβίωσαν μετά την απόψυξη και δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό βλάβης των βλαστομεριδίων ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης των υαλοποιημένων και των φρέσκων εμβρύων. Tα υαλοποιημένα έμβρυα είχαν ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βλαστομεριδίων που είχαν υποστεί βλάβη σε σχέση με τα φρέσκα έμβρυα. Το ποσοστό των μη φυσιολογικών ατράκτων ήταν σημαντικά υψηλότερο στα υαλοποιημένα έμβρυα σε σύγκριση με τα φρέσκα. Τα συνολικά υψηλά ποσοστά επιβίωσης μετά την απόψυξη και η ικανότητα της συντριπτικής πλειοψηφίας των εμβρύων να αναπτυχθούν μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης, υποδηλώνουν ότι τα έμβρυα έχουν τη δυνατότητα να ανέχονται έναν περιορισμένο αριθμό κυττάρων με βλάβη και συνεχίζουν την ανάπτυξη τους.