Μελέτη του μηχανισμού κατακράτησης στη χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (HILIC) και ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού υδατοδιαλυτών βιταμινών
Authors: Καραταπάνης Ανδρέας-Νικόλαος 
Published: January 2014

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο μηχανισμός κατακράτησης της HILIC με βάση τη χρωματογραφική συμπεριφορά των υδατοδιαλυτών βιταμινών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι στατικές φάσεις διόλης-πυριτίας, μη επικαλυμμένης πυριτίας και αμινο-πυριτίας. Οι χρωματογραφικές παράμετροι που μελετήθηκαν για κάθε στατική φάση ήταν η ισχύς του διαλύτη έκλουσης, το pH της κινητής φάσης, η συγκέντρωση του άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος, η παρουσία διαφορετικών ρυθμιστικών διαλυμάτων, η φύση του οργανικού διαλύτη και η θερμοκρασία της στήλης. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού κατακράτησης αξιολογήθηκε η προσαρμογή των δεδομένων κατακράτησης σε τρεις εξισώσεις που αφορούν το μηχανισμό κατανομής, το μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης και ένα τρίτο μοντέλο που συμπεριλαμβάνει τις αλληλεπιδράσεις του συστήματος αναλύτης-κινητή φάση-στατική φάση. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υδατοδιαλυτών βιταμινών σε δείγμα φαρμακευτικού σκευάσματος και βιταμινούχου αναψυκτικού. Με βάση τα αποτελέσματα που προκύπτουν από την εφαρμογή των τριών εξισώσεων-μοντέλων, σε συνδυασμό με τα θερμοδυναμικά δεδομένα της διατριβής, επιβεβαιώνεται ότι ο μηχανισμός κατακράτησης στην HILIC είναι μικτός με τους επιμέρους μηχανισμούς κατανομής και επιφανειακής προσρόφησης να δρουν συνεργιστικά. Το εύρος της περιεκτικότητας σε ύδωρ στο οποίο λαμβάνει χώρα επιφανειακή προσρόφηση εξαρτάται από τον όγκο της σχηματιζόμενης στιβάδας ύδατος, το φορτίο της στατικής φάσης και των ενώσεων και την παρουσία ιόντων του άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος. Για τις ουδέτερες βιταμίνες, η μετάβαση από το μηχανισμό κατανομής στο μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης λαμβάνει χώρα σε ποσοστό ACN ? 80% για τη στήλη διόλης-πυριτίας και σε ποσοστό ACN ? 75% για τις στήλες μη επικαλυμμένης πυριτίας και αμινο-πυριτίας. Η μετάβαση από το μηχανισμό κατανομής στο μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης για ενώσεις που φέρουν ομώνυμο φορτίο με τη στήλη λαμβάνει χώρα σε ποσοστά ACN ? 85%, όπου μειώνεται αισθητά η ηλεκτροστατική άπωση λόγω της προτιμώμενης κατανομής των ιόντων του άλατος στην υδατική στιβάδα. Στις ενώσεις που έλκονται ηλεκτροστατικά από την επιφάνεια της στατικής φάσης κυριαρχεί ο μηχανισμός της επιφανειακής προσρόφησης μέσω ιονανταλλαγής. Από τη μελέτη της επίδρασης διαφορετικών οργανικών διαλυτών στην κατακράτηση των υδατοδιαλυτών βιταμινών αναδεικνύεται η σημαντική συνεισφορά των δεσμών υδρογόνου στο μηχανισμό κατακράτησης. Με κριτήρια τη διαχωριστική ικανότητα, τη συμμετρία των χρωματογραφικών κορυφών, τις ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης και το συνολικό χρόνο ανάλυσης, επιλέχθηκε η στήλη διόλης-πυριτίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υδατοδιαλυτών βιταμινών. Οι χρωματογραφικές συνθήκες ήταν οι εξής: ACN/H2O 90/10 (v/v), CH3COONH4 10 mM, TEA 20 mM, pH 5,0. Επιπλέον, η θερμοκρασία της στήλης ήταν 25 oC, και η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ίση προς 0,8 mL/min. Η καταλληλότητα των χρωματογραφικών συνθηκών επιβεβαιώθηκε με βάση τη δοκιμή καταλληλότητας συστήματος. Η επικύρωση της αναλυτικής μεθόδου πραγματοποιήθηκε λαμβάνοντας υπόψη τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, την επαναληψιμότητα της μεθόδου την ίδια ημέρα και μεταξύ διαφορετικών ημερών και τις ανακτήσεις των βιταμινών από τα δείγματα.