Φωτοκαταλυτική αντικαρκινική δράση διοξειδίου του τιτανίου (TiO2)
Authors: Λαγοπάτη Νεφέλη 
Published: September 2021

To διοξείδιο του Τιτανίου (TiO2) είναι ένα υλικό με ευρύ φάσμα κοινών εφαρμογών, αλλά και εφαρμογών υψηλής τεχνολογίας. Κρυσταλλώνεται σε μορφή ρουτιλίου, ανατάση και μπρουκίτη, ενώ σε χαμηλές θερμοκρασίες υπάρχει σε άμορφη κατάσταση. Χαρακτηρίζεται ως ημιαγωγός n τύπου. Χρησιμοποιείται σε χρώματα, πλαστικά, τρόφιμα, καλλυντικά, φάρμακα, τεχνητά εμφυτεύματα οστών (λόγω της βιοσυμβατότητάς του), σε οπτικές επιστρώσεις σε διηλεκτρικούς καθρέπτες, στον καθαρισμό τοξικών αποβλήτων, στην καταπολέμηση ανάπτυξης μικροοργανισμών, σε αποστειρώσεις χώρων. Τα τελευταία χρόνια, εργασίες που εστιάζουν στο πεδίο της έρευνας για τη θεραπεία του καρκίνου, υποστηρίζουν ότι οι μηχανισμοί ρύθμισης του κυτταρικού θανάτου και συγκριμένα η απόπτωση, παίζουν εξίσου σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση με τους μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Απόπτωση συναντάται στα περισσότερα κακοήθη νεοπλάσματα, ενώ εντονότερη αποπτωτική δραστηριότητα εμφανίζεται σε ταχέως αναπτυσσόμενους όγκους. Οι διάφορες μορφές θεραπείας του καρκίνου (χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, ορμονοθεραπεία), υπό συνθήκη, επάγουν την απόπτωση. Πρόσφατα, πολλές έρευνες, μεταξύ των οποίων και η παρούσα μελέτη, εστιάζουν στην πιθανή χρήση του, φωτο-ενεργοποιημένου με υπεριώδη ακτινοβολία, TiO2 σε ιατρικές εφαρμογές που στοχεύουν στη θεραπεία του καρκίνου. Δεδομένης της υψηλής συχνότητας του καρκίνου του μαστού, εισάγεται η ιδέα της δοκιμής της επίδρασης του TiO2 σε νεοπλασίες αυτής της μορφής. Στόχος είναι η αύξηση του αυθόρμητου κυτταρικού θανάτου στα κύτταρα του όγκου (το φωτο-ενεργοποιημένο (με UV-Α) ΤiΟ2, οδηγεί σε σχηματισμό ζευγών ηλεκτρονίων–οπών, που αντιδρούν με το νερό και το οξυγόνο, σχηματίζοντας ROS (reactive oxygen species) που τελικά οδηγούν σε οξειδωτικό στρες) αλλά και η μείωση της αντοχής των νεοπλασματικών κυττάρων στις διάφορες μορφές θεραπείας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της πιθανής κυτταροτοξικής δράσης του φωτο-ενεργοποιημένου ΤiΟ2 στα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, το ΤiΟ2 εισάγεται στα κύτταρα και εν συνεχεία πυροδοτεί ενδοκυτταρικές βιοχημικές αντιδράσεις, καθώς ενεργοποιείται με υπεριώδη ή και ορατή ακτινοβολία. Δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα μαστού, η μία χαμηλής (MCF-7) και η άλλη εντονότερης (MDA-MB-468) διαφοροποίησης, χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του TiO2, μέσω της μελέτης ειδικών παραμέτρων (ποσοστιαία σύσταση φάσεων ανατάση / ρουτιλίου, μέγεθος των νανοσωματιδίων, συγκέντρωση, χημική τροποποίηση), παρουσία ακτινοβολίας UV-A ή ορατού φωτός, στην επιβίωση των κυττάρων. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση λύματος-πηκτής (sol-gel) αλλά και εναιωρημάτων TiO2, ή χημικά τροποποιημένου TiO2, σε διαφορετικές φάσης κρυστάλλωσης, διαφορετικά μεγέθη και συγκεντρώσεις, μετά από πλήρη χαρακτηρισμό (micro Raman και DLS). Οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν ήταν το MTT assay, η κυτταρομετρία ροής (χρώση με P.I.), η τεχνική Western Blotting και η ανίχνευση του κατακερματισμένου DNA (DNA laddering). Παρατηρήθηκε επιλεκτική δράση του sol-gel TiO2 (2.6nm - 20nm) στα κύτταρα MDA-MB-468, ενώ τα MCF-7 δεν πλήττονται σοβαρά. Το φωτο-ενεργοποιημένο TiO2, οδήγησε σε μείωση (70%) του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G1. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται βαθμιαία, αυξανομένης της συγκέντρωσης του TiO2. Σε συγκέντρωση 16 μM TiO2 επιβιώνει το 50% των κυττάρων MDA-MB- 468 και το 80% των MCF-7. Επιπλέον, συγκεντρώσεις μεταξύ των 14-15 μM φωτο-ενεργοποιημένου TiO2 οδηγούν σε ποσοστό επιβίωσης 40-50% για τα MDA-MB- 468, ενώ για τα MCF-7 το ποσοστό είναι 75–85%. Η επίδραση του φωτο-ενεργοποιημένου ή μη, TiO2 επάγει τη θραύση της PARP, που αποτελεί έναν αποπτωτικό δείκτη. Επιπλέον, οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της Bcl-2, και ταυτόχρονη αύξηση της έκφρασης της Bax, επιβεβαιώνοντας το παραπάνω συμπέρασμα (τα επίπεδα των Bcl-xL και Bad παραμένουν αμετάβλητα). Τέλος, προκαλεί κατακερματισμό (laddering) του DNA στα κύτταρα MDA-MB-468. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του εναιωρήματος TiO2 Evonik P25 (ανατάσης 75%/ρουτίλιο 25%) (138.5 nm και ζ δυναμικό: ZP=(-11.7±8) mV), για συγκεντρώσεις >20μM. Σε συγκέντρωση 24μM επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και ποσοστό ~70% των MCF-7. Σε συγκέντρωση 19 μM φωτο-ενεργοποιημένου (με UV-Α) TiO2 Evonik P25 επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και ποσοστό ~80% των MCF-7 κυττάρων. Το φωτο-ενεργοποιημένο εναιώρημα TiO2 στα MDA-MB-468, επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί ασθενές DNA laddering. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του εναιωρήματος TiO2 (Sigma Aldrich) (ανατάσης 100%) (111.3 nm και ζ δυναμικό: ZP=(-16.7±9) mV). Για συγκέντρωση >20 μM επιβιώνει το 50% των κυττάρων MDA-MB-468 και το 70% των MCF-7. Σε συγκέντρωση 17 μM φωτο-ενεργοποιημένου (με UV–Α) TiO2 Sigma Aldrich επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και το 75% των MCF-7 κυττάρων. Η επίδραση του φωτο-ενεργοποιημένου ή μη, TiO2 (Sigma Aldrich), στα MDA-MB-468, επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί DNA laddering. Για συγκεντρώσεις ακόμη και 100μΜ εναιωρήματος τροποποιημένου με άζωτο TiO2 (N-doped TiO2) (129.2 nm) και ζ δυναμικό: ZP=(-11.4±7) mV) επιβιώνει περισσότερο από το 80% των κυττάρων MDA-MB-468 και των MCF-7. Το φωτο-ενεργοποιημένο με ορατή ακτινοβολία, N-doped TiO2, μειώνει βαθμιαία τον πληθυσμό των κυττάρων και των δύο κυτταρικών σειρών, με ελαφρά εντονότερη δράση στα MDA-MB-468. Σε συγκέντρωση 40μΜ επιβιώνει το 70% του πληθυσμού των MDA-MB-468 και το 90% των MCF-7 κυττάρων. Επάγεται η θραύση της PARP, σε πολύ μικρό ποσοστό, οδηγεί σε πολύ μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί ασθενές DNA laddering. Η συγκέντρωση 21μΜ εναιωρήματος τροποποιημένου με Άργυρο TiO2 (Ag-doped TiO2) (144.5 nm) και ζ δυναμικό: ZP=(-14.8±8) mV), επάγει το θάνατο στο 50% των κυττάρων MDA-MB-468, αφήνοντας το 80% των κυττάρων MCF-7 σχεδόν ανεπηρέαστο. Σε συγκέντρωση 18 μΜ φωτο-ενεργοποιημένου (με UV–Α) Ag-doped TiO2 επιβιώνει τελικά περίπου το 50% των κυττάρων MDA-MB-468 και το 70% των MCF-7. Το φωτο-ενεργοποιημένο με UV-A ή μη, Ag-doped TiO2 επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μείωση της Bcl-2, σε αύξηση της Bax και προκαλεί DNA laddering. Συμπερασματικά, τα σημαντικότερα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται ως εξής:•Το sol-gel TiO2, είναι πιο δραστικό από όλα τα εναιωρήματα που δοκιμάστηκαν. Είναι περισσότερο ομοιογενές από τα εναιωρήματα, επιτρέποντας ακριβέστερη εκτίμηση της τελικής συγκέντρωσης TiO2 στα δείγματα. Επιπλέον, η κατανομή του μεγέθους των νανοσωματιδίων σε μορφή sol-gel, δείχνει ότι κατά μέσο όρο είναι πολύ μικρότερα στο τελικό διάλυμα, συγκρινόμενα με τα εναιωρήματα, αφού σε μορφή εναιωρήματος ευνοείται ο σχηματισμός συσσωματωμάτων, που αυξάνει το μέγεθος των σωματιδίων. •Το εναιώρημα TiO2 Sigma Aldrich είναι δραστικότερο από το Degussa P25, λόγω της διαφορετικής φάσης κρυστάλλωσης. Το Sigma Aldrich, είναι 100% ανατάσης, ενώ στο Degussa P25, συνυπάρχουν ανατάσης (75%) και ρουτίλιο (25%). Η ύπαρξη φάσης ρουτιλίου μειώνει τη δραστικότητα. Ο καθαρός ανατάσης αυξάνει την ποσότητα των ROS. Η δραστικότητα του TiO2 μειώνεται μεταβαίνοντας από το άμορφο TiO2, στον καθαρό ανατάση, στον ανατάση/ρουτίλιο και τέλος στο καθαρό ρουτίλιο.•Το N-doped TiO2 παρ’ όλο που δεν έδειξε θεαματική κυτταροτοξική δράση, εν τούτοις προσφέρει αποτελέσματα ιδιαίτερα ενθαρρυντικά, αφού επιτρέπει την ενεργοποίηση με ορατή ακτινοβολία. Το Ag-doped TiO2 είναι αρκετά δραστικό.•Η κυτταροτοξικότητα του φωτο-ενεργοποιημένου TiO2 σχετίζεται με το μηχανισμό της απόπτωσης. Το φωτο-ενεργοποιημένο TiO2 επάγει τη θραύση της PARP στα κύτταρα MDA-MB-468, αλλά όχι και στα MCF-7, ενώ η μείωση της Bcl-2 και η αύξηση της Bax, επιβεβαιώνουν κατά περίπτωση, το συμπέρασμα αυτό, σε συνδυασμό με την εικόνα του κατακερματισμένου DNA. • Η επιλεκτική τοξικότητα των νανοσωματιδίων TiO2 μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, πιθανώς σχετίζεται με τις ιδιότητες της επιφάνειας των κυττάρων. Η διαφορετική σύσταση της κυτταρικής μεμβράνης ίσως διαφοροποιεί και τις αλληλεπιδράσεις μεμβρανικών πρωτεϊνών με το TiO2, που για τα MCF-7 είναι μάλλον ασθενέστερες, με αποτέλεσμα τον επιλεκτικό θάνατο των MDA-MB-468. •Η βελτιστοποίηση της μεθόδου θα μπορούσε να περιλαμβάνει την προσπάθεια αντικατάστασης ης ακτινοβολίας UV-A, με ορατό φως. Αυτό επιτυγχάνεται με τροποποίηση του TiO2 με άζωτο, αλλά με μέθοδο που να συμβάλλει στη δραστικότητά του.