Ποικιλότητα Βασιδιομυκήτων (Agaricomycotina) σε οικοσυστήματα της Θράκης και αξιολόγηση του ενζυμικού δυναμικού τους
Authors: Σεργεντάνη Αθανασία 
Published: September 2021

Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο τη μελέτη της ποικιλότητας των Βασιδιομυκήτων του υποφύλου Agaricomycotina σε οικοσυστήματα της Θράκης, συγκεκριμένα του νομού Ξάνθης, καθώς και τη μελέτη του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού επιλεγμένων ειδών. Η περιοχή της Ξάνθης είναι ελάχιστα γνωστή από μυκητολογική άποψη, παρότι περιλαμβάνει προστατευόμενες περιοχές μεγάλης σπουδαιότητας (Εθνικά Πάρκα, Αισθητικά Δάση, Διατηρητέα Μνημεία της Φύσης, περιοχές Natura 2000 και περιοχές Ramsar). Ο νομός Ξάνθης περιλαμβάνει προς Βορρά τμήμα της οροσειράς της Ροδόπης, ενώ το νότιο τμήμα του καταλαμβάνει ο κάμπος της Ξάνθης. Από γεωλογική άποψη χαρακτηρίζεται από κρυσταλλοσχιστώδη και πυριγενή πετρώματα, καθώς και ιζηματογενείς σχηματισμούς. Η έρευνα βασίστηκε σε δείγματα Βασιδιομυκήτων που συλλέχθηκαν από ποικιλία φυσικών οικοτόπων του νομού Ξάνθης καθώς επίσης και σε στελέχη που απομονώθηκαν σε καθαρή καλλιέργεια. Η απομόνωση στελεχών είναι απαραίτητη για τη μελέτη του ενζυμικού δυναμικού των μυκήτων και παράλληλα συμπληρώνει την ταξινομική μελέτη με πρόσθετες πληροφορίες. Στο πλαίσιο της διατριβής πραγματοποιήθηκαν συλλογές Βασιδιομυκήτων από τον νομό Ξάνθης κατά τη διάρκεια επτά επισκέψεων με 15 ημέρες εργασίας στο πεδίο, τη φθινοπωρινή και ανοιξιάτικη περίοδο των ετών 2009–2011. Συλλέχθηκαν 598 δείγματα Βασιδιομυκήτων από 33 διαφορετικές θέσεις, οι οποίες περιλαμβάνουν αμιγή και μικτά δάση με Fagus sylvatica, Quercus spp., Betula pendula, Corylus avellana, Populus spp., Robinia pseudoacacia, Alnus glutinosa, Carpinus sp., Cornus mas, Pinus spp., Picea abies, θαμνώνες Juniperus communis και λιβαδικές εκτάσεις. Αμέσως μετά τη συλλογή έγινε προσπάθεια απομόνωσης στελεχών σε καθαρή καλλιέργεια και στη συνέχεια τα συλλεχθέντα δείγματα συντηρήθηκαν μετά την αποξήρανσή τους. Για την ταξινομική μελέτη των Βασιδιομυκήτων, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή των σημαντικότερων μακροσκοπικών και μικροσκοπικών ταξινομικών χαρακτήρων, τόσο των δειγμάτων όσο και των αντίστοιχων στελεχών. Για τον προσδιορισμό του υλικού χρησιμοποιήθηκε εκτεταμένη βιβλιογραφία (γενικές κλείδες, μονογραφίες γενών, εξειδικευμένα ταξινομικά άρθρα) και μελετήθηκε συγκριτικό υλικό. Το σύνολο των δειγμάτων και στελεχών που μελετήθηκαν έχουν κατατεθεί στη Συλλογή Αποξηραμένων Δειγμάτων Μυκήτων και στη Συλλογή Καλλιεργειών Μυκήτων ATHUM της Μυκητοθήκης του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Κάθε ταξινομική μονάδα συνοδεύεται από λεπτομερή ταξινομική περιγραφή, φωτογραφίες των κύριων μακροσκοπικών και μικροσκοπικών μορφολογικών χαρακτήρων, καθώς και ταξινομικές και οικολογικές παρατηρήσεις. Σε ορισμένες περιπτώσεις, καταγράφηκαν αποκλίσεις των μορφολογικών γνωρισμάτων συγκριτικά με τα βιβλιογραφικά δεδομένα, διευρύνοντας το εύρος της ποικιλομορφίας τους. Σε ορισμένα είδη, η διευκρίνιση των μορφολογικών χαρακτήρων που τα διακρίνουν από στενά συγγενικά τους είδη σε συνδυασμό με τη συνεκτίμηση των ορίων ποικιλομορφίας των ταξινομικών χαρακτήρων συνέβαλε στην αποσαφήνιση ταξινομικών προβλημάτων. Επίσης, έγινε διερεύνηση διαφόρων ονοματολογικών ζητημάτων. Κατά την ταξινομική μελέτη, προσδιορίστηκαν συνολικά 473 δείγματα που ανήκουν σε 244 taxa (243 είδη και 3 ποικιλίες), τα οποία κατατάσσονται σε 116 γένη, 48 οικογένειες, 13 τάξεις και 3 κλάσεις. Από τα 244 taxa που προσδιορίστηκαν, τα 75 (30,7%) θεωρούνται εκτομυκορριζικά ενώ τα 169 (69,3%) σαπροτροφικά ή παρασιτικά. Μελετήθηκαν 110 ξυλοσηπτικά είδη, η πλειονότητα των οποίων ανήκουν στους μύκητες λευκής σήψης, ενώ ελάχιστα προκαλούν καστανή σήψη. Από το σύνολο των 244 taxa, ένα γένος και 26 είδη αποτελούν νέες αναφορές για την Ελλάδα. Επιπλέον, 24 είδη αναφέρονται για δεύτερη φορά, ενώ 8 είδη και 2 ποικιλίες για τρίτη φορά από τη χώρα. Τα περισσότερα προσδιορισθέντα είδη (225 taxa) αναφέρονται για πρώτη φορά από τον νομό Ξάνθης. Επίσης, 16 είδη αναφέρονται σε νέα ενδιαιτήματα παγκοσμίως και 53 είδη σε νέα ενδιαιτήματα για την Ελλάδα. Ιδιαίτερη σημασία από ταξινομική και βιογεωγραφική άποψη έχει η ανεύρεση και μελέτη ειδών που θεωρούνται σπάνια στην Ευρώπη ή ακόμη και σε όλο τον κόσμο, καθόσον διευρύνονται τα γνωστά όρια εξάπλωσης των συγκεκριμένων ειδών. Σε καθαρή καλλιέργεια απομονώθηκαν 84 στελέχη από 415 δείγματα Βασιδιομυκήτων. Το ποσοστό επιτυχίας απομόνωσης στελεχών σε καθαρή καλλιέργεια ήταν 20,2%. Τα 84 στελέχη αντιστοιχούν σε 56 είδη, 48 γένη, 22 οικογένειες και 6 τάξεις. Τα περισσότερα είδη αντιπροσωπεύονται από ένα στέλεχος, ενώ ορισμένα είδη απομονώθηκαν σε καθαρή καλλιέργεια πάνω από μία φορά. Επιπλέον, στελέχη τεσσάρων ειδών κατατέθηκαν για πρώτη φόρα παγκοσμίως σε Συλλογή Καλλιεργειών εγγεγραμμένη στο Παγκόσμιο Κέντρο Δεδομένων για τους Μικροοργανισμούς (WDCM).Όσον αφορά τον έλεγχο του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού, 80 στελέχη δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας ως στερεό θρεπτικό υλικό το Basal Medium (BM), το οποίο περιέχει γλυκόζη ως πηγή άνθρακα. Στο ΒΜ προστέθηκαν οι ενώσεις Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Azo-CMC, Azo-Xylan ή MnCl2, για τη δημιουργία τεσσάρων διαφορετικών θρεπτικών υλικών. Από το BM, στο οποίο προστέθηκε η Azo-CMC ή η Azo-Xylan, αφαιρέθηκε η γλυκόζη ώστε η μοναδική πηγή άνθρακα να είναι η κυτταρίνη ή η ξυλάνη αντιστοίχως. Επισημαίνεται ότι στις ενώσεις Azo-CMC και Azo-Xylan μόρια RBBR είναι προσκολλημένα στα μόρια γλυκόζης ή ξυλόζης αντιστοίχως. Ο αποχρωματισμός της χρωστικής RBBR αποτελεί ένδειξη λιγνινολυτικής ικανότητας. Συνεπώς, ο αποχρωματισμός των τρυβλίων με RBBR, Azo-CMC ή Azo-xylan συνδέεται με ενδεχόμενη λιγνινολυτική ικανότητα κατά την ανάπτυξη των στελεχών σε γλυκόζη, κυτταρίνη ή ξυλάνη αντιστοίχως. Το κυτταρινολυτικό και ξυλανολυτικό δυναμικό αξιολογήθηκε με βάση τη μυκηλιακή ανάπτυξη σε τρυβλία που περιείχαν Azo-CMC και Azo-xylan αντιστοίχως. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα υποστρώματα Azo-CMC και Azo-Xylan χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως μοναδική πηγή άνθρακα σε στερεές καλλιέργειες, με σκοπό να εκτιμηθεί το πλήρες λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό των στελεχών συσχετίζοντας την κυτταρινολυτική και την ξυλανολυτική ικανότητα με τη λιγνινολυτική ικανότητα. Επίσης, τρυβλία με MnCl2 εξετάστηκαν για τυχόν σχηματισμό καστανών ή μαύρων κηλίδων του MnO2, που υποδηλώνει δράση της υπεροξειδάσης εξαρτώμενης από το μαγγάνιο (MnP). Από τα 80 στελέχη, λιγνινολυτική ικανότητα παρουσίασαν 51 στελέχη παρουσία γλυκόζης, 48 στελέχη παρουσία κυτταρίνης και 46 παρουσία ξυλάνης, αποχρωματίζοντας τη χρωστική RBBR στα αντίστοιχα θρεπτικά υλικά. Επίσης, 74 και 76 στελέχη έδειξαν κυτταρινολυτική και ξυλανολυτική ικανότητα, καθόσον αναπτύχθηκαν στο θρεπτικό υλικό με Azo-CMC και Azo-Xylan αντιστοίχως. Τέλος, 37 στελέχη έδωσαν θετική αντίδραση στα τρυβλία με το MnCl2.Για την παραγωγή των ενζύμων ενδο-1,4-β-γλυκανάση, ενδο-1,4-β-ξυλανάση, λακκάση, υπεροξειδάση της λιγνίνης (LiP) και MnP πραγματοποιήθηκαν υγρές καλλιέργειες. Επιλέχθηκαν 28 στελέχη που παρουσίασαν σημαντικό λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό στον έλεγχο με τις στερεές καλλιέργειες και εμβολιάστηκαν σε θρεπτικό υλικό που περιέχει πίτυρο σίτου και μια σειρά ανόργανων συστατικών. Για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας, ελήφθησαν δείγματα από το υγρό θρεπτικό των καλλιεργειών κατά τη διάρκεια της επώασης. Οι ενεργότητες των ενζύμων ενδο-1,4-β-γλυκανάση, ενδο-1,4-β-ξυλανάση, λακκάση, LiP και MnP, μετρήθηκαν με τη χρήση των ακόλουθων υποστρωμάτων: CMC, ξυλάνη οξιάς, ABTS, Azure B (ή βερατρυλική αλκοόλη) και ο-διανισιδίνη (ή βερατρυλική αλκοόλη) παρουσία MnSO4 αντιστοίχως. Επιπλέον, οι μετρήσεις της ενεργότητας πραγματοποιήθηκαν σε ένα εύρος τιμών pH ώστε να προσδιοριστεί το άριστο pH για κάθε ένζυμο και για κάθε στέλεχος. Η ενεργότητα τουλάχιστον δύο ενζύμων για κάθε στέλεχος ανιχνεύτηκε στο εξωκυτταρικό διάλυμα των καλλιεργειών. Τα ένζυμα LiP και MnP δεν ανιχνεύτηκαν σε κανένα στέλεχος, παρόλο που δοκιμάστηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι για τη μέτρηση της ενεργότητάς τους. Η ενεργότητα της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης και των 28 στελεχών ήταν ανιχνεύσιμη, με αρκετά στελέχη να παράγουν αξιόλογα επίπεδα ενεργότητας. Επίσης, υψηλές ενεργότητες ενδο-1,4-β-γλυκανάσης και λακκάσης παρήχθησαν από σημαντικό αριθμό στελεχών. Για την πλειονότητα των στελεχών, το άριστο pH της ενζυμικής ενεργότητας της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης και της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης προσδιορίστηκε στο 5.0, ενώ η μέγιστη ενεργότητα των περισσοτέρων λακκασών προσδιορίστηκε στο pH 2.5. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι στην παρούσα διατριβή η παραγωγή της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης από 15 είδη, της ενδο-1,4-β- ξυλανάσης από 13 είδη και της λακκάσης από 8 είδη αναφέρεται για πρώτη φορά παγκοσμίως. Συμπερασματικά, από τη μελέτη της σχεδόν άγνωστης ποικιλότητας των Βασιδιομυκήτων του νομού Ξάνθης διαπιστώθηκε ότι η περιοχή χαρακτηρίζεται από μεγάλο μυκητολογικό πλούτο, συμπεριλαμβανομένων αρκετών ειδών με ιδιαίτερο ταξινομικό και οικολογικό ενδιαφέρον. Η παρούσα διατριβή παρέχει εκτενείς πληροφορίες για τους ταξινομικούς χαρακτήρες των μελετηθέντων ειδών και συμβάλλει στην επίλυση ταξινομικών προβλημάτων και στη διευκρίνηση ονοματολογικών ζητημάτων. Τα αποτελέσματα της διατριβής συνεισφέρουν στην καλύτερη γνώση τόσο της ποικιλότητας και όσο και της εξάπλωσης των Βασιδιομυκήτων στην Ελλάδα. Επιπλέον, το υλικό της διατριβής έχει εμπλουτίσει τις συλλογές της Μυκητοθήκης του Πανεπιστημίου Αθηνών με σημαντικό αριθμό δειγμάτων και στελεχών Βασιδιομυκήτων. Αναφορικά με τη μελέτη του ενζυμικού δυναμικού, η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη εκτεταμένη μελέτη όπου εκτιμήθηκε η πλήρης λιγνινοκυτταρινολυτική ικανότητα αυτοχθόνων στελεχών Βασιδιομυκήτων από ορισμένη γεωγραφική περιοχή, μελετώντας την παραγωγή των σχετικών ενζύμων τόσο σε στερεές όσο και σε υγρές καλλιέργειες. Επίσης, η χρήση των υποστρωμάτων Azo-CMC και Azo-Xylan ως μοναδικής πηγής άνθρακα αποδείχτηκε ότι είναι μια νέα και επιτυχημένη προσέγγιση στην αξιολόγηση του πλήρους λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού στελεχών σε στερεές καλλιέργειες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, ένα μεγάλο ποσοστό των στελεχών που δοκιμάστηκαν εμφάνισαν αξιόλογο λιγνινοκυτταρινολυτικό δυναμικό, ενώ η ικανοποιητική παραγωγή ενζυμικών ενεργοτήτων επιβεβαιώθηκε στις υγρές καλλιέργειες για τα πιο υποσχόμενα στελέχη. Τέλος, η αξιολόγηση του λιγνινοκυτταρινολυτικού δυναμικού είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό νέων στελεχών Βασιδιομυκήτων με σημαντική λιγνινοκυτταρινολυτική ικανότητα, που δημιουργεί προοπτικές για απομόνωση και χαρακτηρισμό ενζύμων κατάλληλων για αξιοποίηση σε ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.