Μελέτη και αξιοποίηση των λειτουργικών ιδιοτήτων των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων διαφόρων πηγών
Authors: Γεωργομανώλη Μαρία 
Published: July 2014

Η κατασκευή λεντιικών φορέων για την διόρθωση του θαλασσαιμικούφαινοτύπου, χρησιμοποιώντας το γ-γονίδιο της σφαιρίνης, αναπτύσσεται δυναμικάως ένα δυνητικά αποτελεσματικό εργαλείο θεραπείας των αιμοσφαιρινοπαθειών. Ηεπιλογή του γ-γονιδίου βασίζεται στην ισχυρή αντι-δρεπανοκυτταρική δράση της γ-σφαιρίνης και την ικανότητά της να συνδέεται με την α-σφαιρίνη για τον σχηματισμόHbF. Σημαντικό πρόβλημα στην κατασκευή των φορέων αυτών αποτελεί ο χαμηλόςτίτλος, η διακύμανση της έκφρασης του διαγονιδίου καθώς και η αποσιώπηση τουφορέα. Στα πλαίσια της αντιμετώπισης αυτών των προβλημάτων, προηγούμενεςμελέτες από το εργαστήριό μας χρησιμοποίησαν επιτυχώς τον ενισχυτή τηςκληρονομικής παραμονής της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης-2 (HPFH-2) σε συνδυασμόμε τον υποκινητή του Αγ-γονιδίου που περιείχε την -117 Eλληνική HPFH μετάλλαξηκαθώς και τον ενισχυτή HS-40 από τον γονιδιακό τόπο της α-σφαιρίνης, σε μια σειράογκορετροϊικών φορέων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ηκατασκευή αυτό-αδρανοποιούμενων (Self-Inactivating, SIN) λεντιικών φορέων οιοποίοι φέρουν τα ανωτέρω ρυθμιστικά στοιχεία και η περαιτέρω αξιολόγησή τους σεκυτταρική ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL-585), αλλά και του ελέγχου τηςθεραπευτικής ικανότητάς τους in vivo σε μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίας αλλά καιin vitro σε ανθρώπινα θαλασσαιμικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ μεπεραιτέρω στόχο την κλινική εφαρμογή τους στη γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας. Ειδικότερα:• Ειδικός στόχος 1: Κατασκευή του αυτο-αδρανοποιούμενου LV GGHI καιέλεγχος της ικανότητας μεταγωγής της κυτταρικής σειράς ποντικού MEL-585.O SIN λεντιικός φορέας (LV) GGHΙ (Papanikolaou et al., 2011) είναι, λεντιικόςφορέας 3ης γενιάς και περιέχει στο 5' άκρο της κασέτας έκφρασής του το Αγ-γονίδιομε τον υποκινητή του που φέρει την -117 Eλληνική HPFH μετάλλαξη, καθώς και τονενισχυτή HS-40, ενώ στο 3' άκρο περιλαμβάνει τον ενισχυτή HPFH-2. Επιπλέον,στην περιοχή 3' LTR περιλαμβάνει τον μονωτή χρωματίνης cHS4, για τηνεξασφάλιση ομοιογένειας έκφρασης ασχέτως θέσης ενσωμάτωσης. Για τηνπαρασκευή του LV, πραγματοποιήθηκε συνδιαμόλυνση με σύστημα 4 πλασμιδίων,σε κύτταρα συσκευασίας της κυτταρικής σειράς HEK-293T και αφού ο ιόςσυγκεντρώθηκε με υπερ-φυγοκέντρηση 100 φορές ακολούθησε μεταγωγή των MEL-585 κυττάρων με πολλαπλότητα μόλυνσης MOI= 1-100. Μετά από ερυθροειδικήεπαγωγή των MEL κυττάρων με αίμη και ΗΜΒΑ ακολούθησε τιτλοποίηση του ιού σεδιαφορετικές αραιώσεις με κυτταρομετρία ροής. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος τηςΠερίληψηxxviiiσταθερότητας του ιού με αποτύπωση κατά Southern με ραδιο-σημασμένο ανιχνευτήσε γενωμικό DNA που απομονώθηκε από τα MEL κύτταρα που είχαν μεταχθεί(transduced) με διαφορετικές αραιώσεις του GGHI φορέα. Σε επίπεδο ανεξάρτητωνκλώνων πραγματοποιήθηκε έλεγχος της έκφρασης του θεραπευτικού διαγονιδίου τηςγ-σφαιρίνης τόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο με κυτταρομετρία ροής, όσο και σε επίπεδομετάγραφου με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RealTime- PCR).Αποτελέσματα Στόχου 1: Ο μέσος λειτουργικός τίτλος του φορέα GGHIυπολογίσθηκε σε 2×108 Μονάδες Μεταγωγής ανά ml (TU/ml) μετά από 100 φορέςσυγκέντρωση με υπερ-φυγοκέντρηση. Ο προϊός δεν παρουσιάζει σημείαανακατατάξεων, καθώς εντοπίστηκε να υπάρχει ολόκληρος (10 Kb) στο γενωμικόDNA που απομονώθηκε από MEL κύτταρα που είχαν μεταχθεί με διαφορετικέςαραιώσεις του GGHI φορέα. Ο GGHI είναι ικανός να επάγει υψηλά επίπεδαέκφρασης της γ-σφαιρίνης, όπως υπολογίσθηκε σε 9 ανεξάρτητους κλώνους MEL μεκυτταρομετρία ροής με συνολική καθαρή μέση ένταση φθορισμού (MFI-MeanFluorescent Intensity) 697.11 με τυπική απόκλιση ±347.9 μονάδες. Τα επίπεδα τηςέκφρασης της Αγ-σφαιρίνης σε επίπεδο RNA στους ίδιους κλώνους ύστερα απόερυθροειδική επαγωγή έδειξαν ότι ο φορέας GGHI μπορεί να επιτύχει έκφραση τηςAγ-σφαιρίνης σε ποσοστό 282.1% με τυπική απόκλιση ±491.2% ανά αντίγραφοέκφρασης του γονιδίου της α-σφαιρίνης του ποντικού. Τέλος, ο αριθμός τωναντιγράφων του φορέα GGHΙ ανά κύτταρο (VCN/κύτταρο), όπως υπολογίσθηκε μεPCR πραγματικού χρόνου για τους MEL-585 βρίσκεται μεταξύ των τιμών 0.65-3.11με μέσο όρο 1.52 VCN/κύτταρο. Συνεπώς, ο GGHI φορέας είναι ικανός να επάγειυψηλή έκφραση της γ-σφαιρίνης, με ιστοειδικό και παν-κυτταρικό τρόπο,ανεξαρτήτως της θέσης ενσωμάτωσης και χωρίς γενωμικές αναδιατάξεις.• Ειδικός στόχος 2: Αξιολόγηση της θεραπευτικής ικανότητας του GGHI LV invitro σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ από θαλασσαιμικούςασθενείς.Απομονώθηκαν θαλασσαιμικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ από δείγματαΜΟ ή ΠΑ ασθενών (n=20). Τα κύτταρα αυτά αφού καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλομέσο με κυτοκίνες, χωρίστηκαν σε δύο υποπληθυσμούς˙ στον ένανπραγματοποιήθηκε μεταγωγή με το φορέα GGHI, ενώ στον άλλο έγινε μεταγωγή μεψευδή (mock) ιϊκά σωμάτια, με πολλαπλότητα μόλυνσης MOI=100. Μετά από 18 hμεταγωγής, τα CD34+ κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω είτε σε ημι-σταθερό μέσομεθυλοκυτταρίνης για 15 ημέρες, με σκοπό τη δημιουργία ερυθροειδικών κλώνωνBFUe, είτε σε υγρές καλλιέργειες διαφοροποίησης ώριμων ερυθροβλαστών για 18Περίληψηxxixημέρες, αφού πρώτα είχαν εξασφαλιστεί οι κατάλληλες συνθήκες σε υγρέςκαλλιέργειες ερυθροβλαστών από φυσιολογικά CD34+ κύτταρα ΜΟ ή ΟΠΑ.Πραγματοποιήθηκε συλλογή 15-20 ξεχωριστών κλώνων BFUe από κάθε ασθενή καιέγινε έλεγχος της ικανότητας μεταγωγής του φορέα με ημι-ποσοτική αλυσιδωτήαντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Επίσης, υπολογίστηκε ο αριθμός τωνVCN/κύτταρο για κάθε θετικό κλώνο από κάθε ασθενή και στη συνέχειαυπολογίστηκε ένας μέσος όρος από όλα τα θετικά BFUe από κάθε ασθενή. Σεεπίπεδο υγρών καλλιεργειών ερυθροβλαστών, υπολογίστηκε το ποσοστόδιαφοροποίησης των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής για τον ερυθροειδικό δείκτηΓλυκοφορίνη Α, το ποσοστό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ο αριθμός τωνορθοχρωματικών ερυθροβλαστών σε παρασκευάσματα κυτταροφυγοκέντρου.Επίσης, η έκφραση της HbF μετρήθηκε τόσο με κυτταρομετρία ροής, όπουυπολογίσθηκε το ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων που εκφράζουν HbFκαι η μέση ένταση φθορισμού-MFI, όσο με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης(HPLC) και σε επίπεδο μετάγραφου με RT-PCR. Τέλος, αξιολογήθηκε μεκυτταρομετρία ροής για το μονοκλωνικό αντίσωμα Ανεξίνη V, η ικανότητα του GGHIφορέα να μειώνει το ποσοστό της απόπτωσης στους μεταγμένους με το φορέα GGHIερυθροβλάστες από τις υγρές καλλιέργειες σε σχέση με τα ψευδώς μεταγμένακύτταρα.Αποτελέσματα Στόχου 2: Ο τυπικός αριθμός κυττάρων που απομονώθηκαναπό τον ΜΟ κυμαινόταν από 1-2 ×106 CD34+ κύτταρα, ενώ από 20 ml περιφερικούάιματος κυμαινόταν από 104 έως 4 ×105 CD34+ κύτταρα. Σε επίπεδο κλώνων BFUe,o GGHI φορέας ενεφάνησε μέση ικανότητα μεταγωγής 40.3% μέ μέσο όρο 1.1VCN/κύτταρο για κάθε ασθενή. Οι συνθήκες διαφοροποίησης των CD34+ κυττάρωνστις υγρές καλλιέργειες φάνηκε να μην επηρεάζουν τo ποσοστό της HbF, το οποίοεξαρτάται σημαντικά από την πηγή προέλευσης των κυττάρων και είναι τρεις φορέςμικρότερο in vitro (26.7±19,9%) σε σχέση με το μέσο ποσοστό in vivo(67.52±41,56%), όπως υπολογίστηκε με HPLC στους θαλασσαιμικούς ασθενείς.Συνεπώς, η αύξηση της HbF και η συνακόλουθη φαινοτυπική διόρθωση πουπαρατηρείται στις υγρές καλλιέργειες οφείλεται αποκλειστικά στον φορέα GGHI.Έτσι, στα μεταγμένα κύτταρα παρατηρείται υψηλότερο ποσοστό διαφοροποιημένωνκυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα που είναι ψευδώς μεταγμένα με κενά ιικάσωμάρια (GGHI κύτταρα: 25.2%, Μάρτυρας: 14.5%, p=0.00077), καθώς καιαυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού τη 17η ημέρα (GGHI κύτταρα: 200%,Μάρτυρας: 32%). Επίσης, τα διορθωμένα κύτταρα παρουσίασαν αύξηση τηςέκφρασης της HbF, όπως υπολογίστηκε με κυτταρομετρία ροής σε σχέση με ταΠερίληψηxxxψευδώς μεταγμένα κύτταρα τόσο στο ποσοστό των κυττάρων F (%HbF: GGHIκύτταρα: 51.6%, Μάρτυρας: 47.3%, p=0.09), αλλά και της μέσης MFI (GGHI κύτταρα:449, Μάρτυρας: 409.4, p=0.005), όπως υπολογίστηκε συνολικά από όλους τουςασθενείς. Πιο συγκεκριμένα, όπως υπολογίστηκε με HPLC τα μεταγμένα κύτταραπαράγουν μεγαλύτερη ποσότητα γ-αλυσίδων σφαιρίνης σε σχέση με τα ψευδώςμεταγμένα, με 32.9% (p=0.001) μέση αύξηση από όλους τους ασθενείς. Τέλος, αυτήη αύξηση της HbF σε πρωτεϊνικό επίπεδο επιβεβαιώθηκε και σε επίπεδο μετάγραφουόπου παρατηρήθηκε αύξηση περίπου 29.1 φορές στα μεταγμένα κύτταρα. Επιπλέον,η μεταγωγή με το GGHI φορέα επιφέρει σημαντική μείωση του ποσοστού τηςαπόπτωσης κατά 50%, όπως υπολογίστηκε με κυτταρομετρία ροής, όπου η μέσηMFI στα κύτταρα μάρτυρα ήταν 106.6 έναντι αυτής των μεταγμένων κυττάρων πουήταν 50.2 (p=0.007). Επίσης, η ίδια τάση παρατηρήθηκε στο ποσοστό τωναποπτωτικών κυττάρων, όπου παρατηρήθηκε 27.2% (p=0.007) μείωση. Τααποτελέσματα αυτά αξιολογήθηκαν περαιτέρω ξεχωριστά σε ασθενείς τόσο με βoόσο και με β+ θαλασσαιμία. Συμπερασματικά, ο αυτο-αδρανοποιούμενοςκαινοτομικός λεντιικός φορέας GGHI, είναι ικανός να επάγει υψηλά επίπεδαέκφρασης της HbF, με μεγάλη ικανότητα μεταγωγής και χαμηλά VCN/κύτταρο,βελτιώνοντας σημαντικά το θαλασσαιμικό φαινότυπο, όπως αξιολογήθηκε σε CD34+κύτταρα από θαλασσαιμικούς ασθενείς.• Ειδικός στόχος 3: In vivo αξιολόγηση της θεραπευτικής ικανότητας του LVGGHI μετά από μεταγωγή και μεταμόσχευση κυττάρων μυελού των οστών(ΜΜΟ) σε μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίας.Αρχικά, απομονώθηκαν κύτταρα ΜΟ από μοντέλο ποντικού β-θαλασσαιμίαςCy57BL6/Hbbth3 (th3/+) και αφού καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο μέσο με κυτοκίνες,πραγματοποιήθηκε μεταγωγή των κυττάρων με τον φορέα GGHI σε διαδοχικέςπολλαπλότητες μόλυνσης ΜΟΙ=20, 50 και 100. Τα μεταγμένα κύτταρα του μυελούκαλλιεργήθηκαν σε ημι-σταθερό μέσο μεθυλοκυτταρίνης που ευνοεί την ανάπτυξημονάδων «εκρηκτικής αύξησης» ερυθροειδών κυττάρων, BFUe για προσδιορισμότης ικανότητας μεταγωγής του GGHI καθώς και των VCN/κύτταρo με ημι-ποσοτικήαντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για κάθε πολλαπλότητα μόλυνσης.Στη συνέχεια, έγινε αξιολόγηση εναλλακτικού φαρμακευτικού πρωτοκόλου με τηχρήση μυελοκατασταλτικού (Bu, βουσουλφάνη) και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων(Cy, κυκλοφωσφαμίδη, CsA, κυκλοσπορίνη) με σκοπό την επιτυχημένη ΜΜΟ και τηφαινοτυπική διόρθωση της β-θαλασσαιμίας στα th3/+ ποντίκια. Στα μεταμοσχευμέναποντίκια th3/+ με τα διορθωμένα θαλασσαιμικά κύτταρα του μυελού, έγινε έλεγχοςτης έκφρασης της HbF στο περιφερικό αίμα (ΠΑ) των μεταμοσχευμένων ποντικών μεΠερίληψηxxxiκυτταρομετρία ροής καθώς και αξιολόγηση της φαινοτυπικής διόρθωσης τωναιματολογικών παραμέτρων (αιματοκρίτης-HCT, αριθμός ερυθροκυττάρων-RBC,Αιμοσφαιρίνη-HBG) καθώς και της μορφολογίας των ερυθροκυττάρων μετά απόεπίστρωση και χρώση σε αντικειμενοφόρους πλάκες.Αποτελέσματα Στόχου 3: Παρατηρήθηκε ότι ο GGHI μπορεί να μετάγειεπιτυχώς τα κύτταρα από ΜΟ θαλασσαιμικού ποντικού th3/+ για ΜΟΙ=50 μεικανότητα μεταγωγής 100% και με μέσο VCN/κύτταρο=1.3. Εφαρμόστηκεφαρκακευτικό πρωτόκολο για ΜΜΟ το οποίο περιλαμβάνει συνδυασμόβουσουλφάνης (Bu-συνολική δόση 80 mg/kg ποντικού) με κυκλοφωσφαμίδη (Cy-200 mg/kg ποντικού) πριν τη ΜΜΟ και κυκλοσπορίνη (CsA-250μg/kg/δόση) γιαπροφύλαξη μετά τη ΜΜΟ, καθώς ο συνδυασμός αυτός αποδείχτηκε ότι επιφέρει τηνκαλύτερη ανοσοκαταστολή με τη καλύτερη δυνατή εμφύτευση σε ποσοστό 56%,όπως υπολογίστηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με ειδικούς εκκινητές γιατο φορέα, στο μυελό των μεταμοσχευμένων ποντικών (n=9) και χωρίς τοξικολογικέςπαρενέργειες, όπως φάνηκε μετά από τοξικολογική μελέτη κρεατινίνης στον ορό τουαίματος ποντικών (n=7). Επίσης, Ο GGHI φορέας είναι ικανός να επάγει υψηλή αλλάπαροδική έκφραση της HbF στο ΠΑ των μεταμοσχευμένων ποντικών με μέση τιμήτης HbF 70% (n=15), σε διάστημα 7-10 εβδομάδων, με συνακόλουθη διόρθωση τωναιματολογικών παραμέτρων (HCT- th3/+: 25.3%, th3/+/GGHI: 32.4%, p=0.0025,RBC- th3/+: 6.54x106 κύτταρα/μl, th3/+/GGHI: 8.34 x106 κύτταρα/μl, p=0,0001, HGBth3/+:9.19 g/dl, th3/+/GGHI: 10.46 g/dl, p=0,01). Μερική βελτίωση παρατηρήθηκε καιστη μορφολογία των ερυθροκυττάρων μετά από επίστρωση των κυττάρων σεαντικειμενοφόρους πλάκες και χρώση. Συνεπώς ο GGHI φορέας είναι ικανός ναμετάγει τα κύτταρα του ΜΟ των th3/+ ποντικών και να επάγει υψηλή αλλά παροδικήέκφραση της HbF μετά από in vivo μεταμόσχευση ΜΜΟ με συνακόλουθη διόρθωσητων αιματολογικών παραμέτρων