Μελέτη του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου Geminin και της συγγενικής πρωτεΐνης Geminin cc-like σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα
Authors: Δημάκη Μαρία 
Published: August 2021

Για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας, είναι θεμελιώδους σημασίας η πραγματοποίηση της αντιγραφής του DNA με ακρίβεια και πιστότητα. Στη σωστή χρονικά έναρξη της αντιγραφής σημαντικό ρόλο κατέχει η «αδειοδότηση» της αντιγραφής, η οποία διασφαλίζει ότι η χρωματίνη είναι ικανή για τον επόμενο κύκλο αντιγραφής μόνο αφότου το κύτταρο έχει διέλθει από τη μίτωση. Η αδειοδότηση λαμβάνει χώρα μέσω της διαδοχικής συγκρότησης στις αφετηρίες της αντιγραφής, ενός πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου, του καλούμενου προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Απαραίτητος για τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Στα μετάζωα, ένα μικρό μόριο, η Geminin, αναστέλλει τη δράση του Cdtl κατά τις φάσεις S, G2 και Μ. Η Geminin είναι ένα μόριο με δομή σπειροειδούς σπειράματος, το οποίο συμμετέχει σε ευρύ φάσμα μοριακών αλληλεπιδράσεων και ελέγχει διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Η ρύθμιση της Geminin επιτυγχάνεται κύρια σε μεταγραφικό επίπεδο και μέσω πρωτεόλυσης, ενώ πρόσφατα δείχθηκε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του μορίου διασφαλίζουν την απενεργοποίησή του κατά την G1. Για την εκδήλωση της δράσης της Geminin απαιτείται η παρουσία της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Για την ενδοκυτταρική μελέτη της συμπεριφοράς της Geminin, δημιουργήσαμε υβριδικές μορφές του μορίου με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κατόπιν παροδικής διαμόλυνσης μελετήσαμε τον ενδοκυτταρικό του εντοπισμό. Η εξωγενής Geminin εντοπίζεται στον πυρήνα (όπως και το ενδογενές μόριο) σε έναν υποπληθυσμό ασύγχρονων κυττάρων αλλά επιπλέον, στα μισά κύτταρα του πληθυσμού, αποκλείεται από τον πυρήνα και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Η εμφάνιση της Geminin αποκλειστικά εκτός πυρήνα πραγματοποιείται σε κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα φαίνεται να λαμβάνει χώρα στο τέλος της G1 φάσης, πλησίον της μετάβασης από την G1 στην S. Κατά την είσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση ηρεμίας GO, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν την Geminin στο κυτταρόπλασμα αυξάνεται σημαντικά. Το γεγονός αυτό προσδίδει φυσιολογικό ρόλο στο φαινόμενο του αποκλεισμού της Geminin από τον πυρήνα και το συνδέει με την προαγωγή της αδειοδότησης της αντιγραφής πριν την είσοδο του κυττάρου στην S. Ανάλυση των επιμέρους περιοχών του μορίου με δημιουργία προοδευτικών απαλοιφών περιοχών της Geminin ανέδειξε το ρόλο της αμινοτελικής περιοχής του μορίου (aa 1-30) στον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του. Ο πυρηνικός εντοπισμός της Geminin επάγεται από την κεντρική περιοχή του μορίου ενώ ένα αμινοτελικό πιθανολογούμενο NLS δε φαίνεται από μόνο του -τουλάχιστον- στην ανθρώπινη Geminin να αρκεί για τον πυρηνικό εντοπισμό της. Από τους παράγοντες που μελετήθηκαν, οι οποίοι θα μπορούσαν να επηρεάζουν in trans τον εντοπισμό της Geminin, το Cdt1, ο μοριακός συνοδός της Geminin, είναι ικανός να κατευθύνει τον αναστολέα του στον πυρήνα μετά από συνδιαμόλυνση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Συνδιαμόλυνση με μορφές των δύο μορίων που δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν δεν οδηγεί σε πυρηνικό εντοπισμό της Geminin. Συμπεραίνουμε ότι το Cdt1 προκαλεί διαμετατόπιση της Geminin στον πυρήνα μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με αυτήν. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν έναν νέο τρόπο ρύθμισης της Geminin μέσω πυρηνικού αποκλεισμού και παρέχουν πληροφορίες για το πότε και πώς λαμβάνει χώρα αυτή η ρύθμιση. Πρόσφατα, στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων εντοπίσαμε έναν γονιδιακό τόπο που κωδικοποιεί για πρωτεϊνικό μόριο με μεγάλη ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα (çoiled-çoil) της Geminin (Geminin cc-like ή Castor). Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η χωρο-χρονική έκφραση της Geminin cc-like (Castor), οι αλληλεπιδράσεις με υποψήφια μόρια και η συμπεριφορά του μορίου σε συνθήκες υπερέκφρασης και αποσιώπησης σε ανθρώπινα κύτταρα. Για τη μελέτη αυτή δημιουργήθηκε υβριδική μορφή της πρωτεΐνης με την GFP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Geminin cc-like (Castor) είναι πυρηνική πρωτεΐνη, όπως και η ενδογενής Geminin και η ενεργότητα σήματος πυρηνικού εντοπισμού φαίνεται να εδράζεται στην καρβοξυτελική περιοχή του μορίου. Η Geminin cc-like (Castor) αλληλεπιδρά με την Geminin και μάλιστα αποτελεί έναν ακόμη παράγοντα, μαζί με το Cdtl, που μπορεί να κατευθύνει in trans την Geminin στον πυρήνα. Πειράματα υπερέκφρασης παρέχουν ενδείξεις για παρεμπόδιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S, ενώ αποσιώπηση της Geminin cc-like (Castor) με τη χρήση RNAi φαίνεται να αυξάνει το ποσό της φωσφορυλιωμένης μορφής της ιστόνης Η₂ΑΧ, δείκτη διπλών κατατμήσεων στο DNA. Από εξέταση για την ύπαρξη ορθολόγων σε άλλους οργανισμούς, βρέθηκε ορθόλογη πρωτεΐνη στον ιχθύ Oryzias latipes (medaka). Κλωνοποιήθηκε τμήμα του mRNA της 0.1 Castor πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης της Geminin cc-like (Castor) σε έμβρυα medaka καθώς και πειράματα υπερέκφρασης μετά από ένεση τμήματος του mRNA, τα οποία παρέχουν προκαταρκτικές ενδείξεις για ελαττωματικό σχηματισμό της κεφαλής και των οφθαλμών. Συμπερασματικά, μελετήσαμε μία νέα πρωτεΐνη στον άνθρωπο η οποία εμφανίζει μερική ομολογία προς την Geminin (Geminin cc-like ή Castor), και δείξαμε ότι αποτελεί ένα νέο μοριακό συνοδό της Geminin, με πιθανή συμμετοχή σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση.