Διερεύνηση του επιγενετικού μηχανισμού επανέκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο (MDS) μετά από θεραπεία με απομεθυλιωτικό παράγοντα και αναζήτηση της προγνωστικής σημασίας της επανέκφρασης αυτής για την ανταπόκριση στη θεραπεία των ασθενών
Authors: Χατζηλυγερούδη Θεοδώρα 
Published: December 2024

Εισαγωγή : τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) χαρακτηρίζονται από επιγενετική απορρύθμιση και οι απομεθυλιωτικοί παράγοντες (HMAs), δεσιταμπίνη (DAC) και αζακυτιδίνη (AZA), είναι έως και σήμερα η κύρια θεραπευτική επιλογή για την αναχαίτηση της εξέλιξης των υψηλού κινδύνου ΜΔΣ (HR-MDS) σε οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Αν και ο ακριβής τρόπος δράσης των HMA έχει μελετηθεί συστηματικά και σε βάθος, ωστόσο δεν είναι απόλυτα σαφής έως και σήμερα. Καθώς αναδύονται νέες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με HR-MDS, η αναγνώριση εύκολα αποκτώμενων προγνωστικών δεικτών για την ανταπόκριση στη θεραπεία με HMA και η κατανόηση των μηχανισμών των καθυστερημένων και βραχυπρόθεσμων ανταποκρίσεών τους είναι απαραίτητη. Παρά την γνωστή δράση τους έναντι των μεθυλτρανσφερασών DNMT1 και DNMT3A, παραμένει αβεβαιότητα σχετικά με την προγνωστική αξία της επαγωγής υπομεθυλίωσης στο γονιδίωμα. Στοιχεία από τις έως τώρα μελέτες σε κύτταρα περιφερικού αίματος έχουν δείξει επαναφορά των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA στο τέλος του κύκλου των 28 ημερών θεραπείας με HMA, μετά την αρχική υπομεθυλίωση, ενώ δεδομένα ανάλυσης της μεθυλίωσης του DNA από μυελικά αναρροφήματα ασθενών με ΜΔΣ με υψηλής ευκρίνειας νεότερες τεχνικές είναι πενιχρά στην βιβλιογραφία. Λόγω της επιγενετικής τροποποίησης και αποσιώπησης της έκφρασης των γ-γονιδίων της αιμοσφαιρίνης, η επαγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) έχει προταθεί ως προγνωστικός δείκτης για ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με DAC. Επιπλέον, αν και υπήρχε σοβαρή υποψία ότι επιγενετικοί μηχανισμοί εμπλέκονται, τα μεθυλιώματα των ασθενών με ΜΔΣ δεν έχουν εξεταστεί διεξοδικά για να προσεγγίσουν τον μηχανισμό της επανέκφρασής της. Στόχος μας αυτής της διατριβής ήταν να διευκρινιστεί η κινητική της HbF και η προγνωστική της αξία σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με AZA. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι μεταβολές του επιγενετικού τοπίου των ασθενών που λαμβάνουν HMA σε επίπεδο ολικού γονιδιώματος/χρωμοσωμάτων, αλλά και οι αλλαγές στην μεθυλίωση ρυθμιστών έκφρασης της HbF μετά από θεραπεία με AZA, καθώς και η κλινική τους σημασία. Αποτελέσματα: Στο σύνολο των ασθενών που έλαβαν HMA και αναλύθηκαν με αλληλούχιση DNA επόμενης γενιάς για την ανίσχνευση μεθυλίωσης σε επίπεδο γονιδιώματος (MeD-seq), χρησιμοποιώντας το περιοριστικό ένζυμο LpnPI (n=13), φάνηκε η συνολική αύξηση της μέσης μεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων με ταυτόχρονη σχετική μείωση της σε συγκεκριμένες περιοχές, που αφορούν κυρίως μη-κωδικά RNA, στους ανταποκριθέντες ασθενείς (n=6), στο τέλος έξι ή περισσότερων κύκλων HMA. Αντίθετα, στους μη ανταποκριθέντες ασθενείς (n=7) καταγράφηκε υπομεθυλίωση στα περισσότερα χρωμοσώματα, η οποία όμως δεν οδήγησε σε βελτίωση του κλινικού τους φαινοτύπου, αλλά πιθανώς να προήγαγε την εξέλιξη της νόσου, όπως παρατηρείται και σε άλλους τύπους νεοπλασμάτων, με εξαίρεση τα χρωμοσώματα 21, Χ, και Y τα οποία ήταν έντονα υπερμεθυλιωμένα. Οι διαδοχικές μετρήσεις της HbF με χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (n=20) έδειξαν επαγωγή της HbF μόνο μεταξύ των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στην AZA (p=0.030). Επιπλέον, η αύξηση των επιπέδων της HbF, αμέσως μετά τον πρώτο κύκλο θεραπείας με ΑΖΑ διαπιστώθηκε να έχει προγνωστική αξία για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) (p=0.032, HR=0.19, CI:0.24-1.63). Επιπλέον, σε ασθενείς που έλαβαν ΑΖΑ, με ανάλυση MeD-seq (n=7) αποκαλύφθηκαν αλλαγές στα πρότυπα μεθυλίωσης για τα γονίδια FOG-1, RCOR-1, ZBTB7A καθώς και για γονίδια των υπομονάδων του συμπλόκου NuRD. Η στοχευμένη μέθοδος πυροαλληλούχισης (pyrosequencing) (n=28) αποκάλυψε ισχυρή ανάστροφη συσχέτιση μεταξύ του βαθμού μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου της γ-αλυσίδας (HBG2) και των αρχικών επιπέδων της HbF (p=0.003, rs=-0.663). Με την ίδια μέθοδο αναδείχθηκε ένας πιθανός επιγενετικός μηχανισμός επανέκφρασης της HbF στους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν στην AZA, μέσω υπομεθυλίωσης της θέσης -53 του υποκινητή του HBG2 (p=0.039, rs=-0.504), η οποία αντιστοιχεί στη θέση σύνδεσης MBD2-NuRD, καθώς και υπερμεθυλίωσης της νησίδας CpG326 του ZBTB7A (p=0.05, rs=0.482), ενός γνωστού καταστολέα της HbF. Αξιοσημείωτο είναι ότι αυτές οι μεταβολές συσχετίστηκαν με την κάθαρση των βλαστικών κυττάρων (pHBG2=0.011, rs=0.480 / pZBTB7A=0.026, rs=0.427) και έδειξαν προγνωστική αξία για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (pZBTB7A=0.037, HR=1.14, CI:0.34-3.8). Η μείωση της έκφρασης του ZBTB7A σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (TF1, MV4-11) έδειξε τάση μείωσης του πολλαπλασιασμού τους, χωρίς ωστόσο μείωση της κλωνογονικότητας ή της ευαισθησίας τους στην AZA. Η θεραπεία με μικρή δόση AZA σε ωριμάζοντα προς ερυθροκύτταρα, κύτταρα της σειράς TF1 έδειξε πράγματι την αύξηση της έκφρασης του HBG2, με ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης του ZBTB7A. Συμπεράσματα: Η ανταπόκριση στους HMA φαίνεται να σχετίζεται με μοτίβα μέσης υπερμεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων στο τέλος τουλάχιστον 6 κύκλων θεραπείας και η υπομεθυλιωτική δράση τους αφορά συγκεκριμένες γονιδιωματικές περιοχές, που συμπεριλαμβάνουν μη-κωδικά RNA. Αντίθετα, συνολική υπομεθυλίωση παρατηρείται σε μη ανταποκριθέντες ασθενείς στα περισσότερα χρωμοσώματα, με εξαίρεση τα χρωμοσώματα 21, Χ, και Y που υπερμεθυλιώνονται έντονα. Η πρώιμη επαγωγή της HbF αναδεικνύεται ως ένας εύκολα προσβάσιμος προγνωστικός δείκτης για τη θεραπεία με HMA, και ο προτεινόμενος επιγενετικός μηχανισμός επανέκφρασης της HbF σε ασθενείς που ανταποκρίνονται στην AZA περιλαμβάνει την υπομεθυλίωση του υποικινητή του γονιδίου της γ-αλυσίδας και την υπερμεθυλίωση της ρυθμιστικής νησίδας CpG326 του ZBTB7A. Η συσχέτιση αυτών των προτύπων μεθυλίωσης με την κάθαρση των βλαστικών κυττάρων στο μυελό και η προγνωστική τους αξία για το PFS, καθώς και τα μοτίβα μεταβολής της μεθυλίωσης σε επίπεδο χρωμοσωμάτων ανάλογα με την ανταπόκριση στην θεραπεία, ανοίγουν τον δρόμο για μια βαθύτερη συζήτηση σχετικά με τον επιγενετικό μηχανισμό δράσης των HMA.