Study of the mechanism underlying premature suture closure in the animal model of ERF-related craniosynostosis
Authors: Βογιατζή Αγγελική 
Published: November 2021

Η ανάπτυξη της κεφαλής του ανθρώπου αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία που εμπλέκει την αλληλεπίδραση ιστών προερχόμενων από διαφορετικές βλαστικές στιβάδες του εμβρύου καθώς και την ενεργοποίηση ποικίλων μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα και τοπολογίες. Οι κρανιακές ραφές αποτελούν το συνδετικό ιστό που υπάρχει μεταξύ των οστών του κρανίου και κατέχουν κύριο ρόλο στην αύξησή τους κατά την ανάπτυξη. Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που εντοπίζονται στην κεντρική περιοχή της ραφής ακολουθούν την οδό της ενδομεμβρανώδους (ή υμενογενούς) οστεοποίησης και διαφοροποιούνται σε οστεοπρογονικά και προ-οστεοβλαστικά κύτταρα με ικανότητα αυτοανανέωσης, τα οποία στη συνέχεια με τη σειρά τους διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες που εναποθέτουν εξωκυττάρια ύλη στις άκρες των οστών προς αύξηση (οστεογονικά μέτωπα). Αργότερα κατά την ανάπτυξη, οστική απορρόφηση από τους οστεοκλάστες και αναδόμηση λαμβάνουν επίσης χώρα στις κρανιακές ραφές. Η ισορροπία μεταξύ όλων αυτών των διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών –από τα πρόδρομα μεσεγχυματικά κύτταρα μέχρι τους οστεοβλάστες και τους οστεοκλάστες- είναι κρίσιμη για το εάν η ραφή θα παραμείνει ανοιχτή, χωρίς να οστεοποιηθεί πρόωρα, και συνεπώς είναι καθοριστική για την συντονισμένη αύξηση κρανίου και εγκεφάλου. Η αλλοίωση αυτής της ισορροπίας δύναται να οδηγήσει στο πρόωρο κλείσιμο της ραφής, μία πάθηση που καλείται κρανιοσυνοστέωση και εμφανίζεται με συχνότητα μία στις 2500 γεννήσεις. Αποτέλεσμα είναι συχνά η παραμόρφωση του σχήματος της κεφαλής, καθώς επίσης και προβλήματα στην όραση, την ακοή και την νοητική λειτουργία αν δεν υπάρξει άμεση χειρουργική παρέμβαση. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών σημαντικές προσπάθειες καταβάλλονται στη διερεύνηση των μηχανισμών που οδηγούν στην εμφάνιση του φαινοτύπου της κρανιοσυνοστέωσης. Όμως η ύπαρξη πολλαπλών κυτταρικών πληθυσμών στις ραφές, η απουσία χαρακτηριστικών κυτταρικών μαρτύρων, καθώς και οι δυσκολίες στην απομόνωση και ταυτοποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων έχουν αποτελέσει τροχοπέδη στην πλήρη κατανόηση της παθοφυσιολογίας. Η απλοανεπάρκεια του μεταγραφικού καταστολέα ERF (ETS2 Repressor Factor) προκαλεί κρανιοσυνοστέωση στον άνθρωπο, αλλά και στα ποντίκια ErfLoxP/- τα οποία εκφράζουν μόνο το 29% των φυσιολογικών επιπέδων της πρωτεΐνης αυτής. Όπως οι άνθρωποι, έτσι και τα ποντίκια ErfLoxP/- εμφανίζουν δυσμορφία προσώπου, χωρίς όμως άλλες εμφανείς σκελετικές ανωμαλίες πέραν της συνοστέωσης και μια ελάττωση στην συνολική οστεοποίηση του κρανίου στις αρχές της μετεμβρυϊκής ζωής. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναδείξει την εμπλοκή του ERF στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθοδικά του σηματοδοτικού μονοματιού των ERK1/2 κινασών, καθώς επίσης και στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης με χαρακτηριστικότερα παραδείγματα τη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών κυττάρων της ερυθρής σειράς. Καμία όμως αναφορά δεν υπήρχε σχετικά με τον πιθανό ρόλο του ERF στο σχηματισμό των οστών ή στην ανάπτυξη του κρανιοπροσωπικού συμπλέγματος. Στόχος λοιπόν της παρούσας μελέτης είναι να συμβάλλει στην κατανόηση του μηχανισμού που οδηγεί στην εκδήλωση του φαινοτύπου της σχετιζόμενης με τον ERF κρανιοσυνοστέωσης, φαινότυπος ο οποίος έχει χαρακτηρισθεί και ως «ύπουλος» λόγω της ετερογένειας που εμφανίζει στο χρόνο αλλά και την ένταση των συμπτωμάτων. Στην παρούσα μελέτη καθιερώσαμε in vitro πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων κρανιακών ραφών και αναπτύξαμε μια μέθοδο επιλεκτικής επιβίωσης και επέκτασης των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ώστε να μελετηθεί ο ρόλος του παράγοντα ERF στις κρανιακές ραφές και την ενδομεμβρανώδη οστεογένεση του κρανίου. Μέσω ex vivo κυτταρικών δοκιμασιών και ανάλυσης του μεταγραφώματος, παρέχουμε στοιχεία που υποστηρίζουν ότι ο ERF είναι απαραίτητος για την αρχική δέσμευση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων προς την οστεογονική γενεαλογία, ενώ επιπλέον σε μετέπειτα στάδιο είναι σημαντικός για τη διατήρηση των πολλαπλασιαζόμενων οστεοπρογονικών κυττάρων που βρίσκονται καθ’ οδόν της πορείας διαφοροποίησης τους στις ραφές. Τα δεδομένα της μελέτης μας υποστηρίζουν ότι ο Erf ρυθμίζει τη δέσμευση και τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων προς οστεοπρογονικά κύτταρα μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού του ρετινοϊκού οξέος (RA). Συγκεκριμένα η ανεπάρκεια του Erf οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων του Cyp26b1, γονιδίου που κωδικοποιεί τον παράγοντα αποικοδόμησης του ρετινοϊκού οξέος, γεγονός που οδηγεί στη διατήρηση της αυτό-ανανέωσης των μεσεγχυματικών κυττάρων και της μείωσης του ρυθμού διαφοροποίησής τους. Η εξωγενής προσθήκη ρετινοϊκού οξέος επαναφέρει το φυσιολογικό πρότυπο in vitro διαφοροποίησης των ErfLoxP/- κυττάρων με βάση τα δεδομένα της μελέτης μας. Η παθολογική ασβεστιοποίηση των κρανιακών οστών δύναται να αποδοθεί στη διαταραχή της βαθμίδωσης συγκέντρωσης ρετινοϊκού οξέος. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται όμως για τον καθορισμό του ρόλου του Erf και του RA σηματοδοτικού μονοπατιού στα επιμέρους στάδια της οστεογένεσης. Η φαρμακολογική ενίσχυση της πυρηνικής δράσης του ERF στα κύτταρα καθώς και η ρύθμιση των επιπέδων ρετινοϊκού οξέος θα μπορούσαν δυνητικά να αποτελέσουν μια υποσχόμενη προοπτική στην αντιμετώπιση της κρανιοσυνοστέωσης και αναδεικνύουν ότι η συνεχής παρουσία του παράγοντα αυτού είναι αναγκαία για τη φυσιολογική ανάπτυξη του κρανιοπροσωπικού συμπλέγματος.