The crosslinking effect of photorefractive ablation with riboflavin evaluated with transmission electron microscopy
Authors: Борзенок С.А. , Корниловский И.М. , Бурцев А.А. , Шацких А.В. 
Published: December 2020

Трансмиссионная электронная микроскопия является одним из ключевых маркёров при рассмотрении патогенеза коллагенового кросслинкинга. Цель работы: оценить эффект кросслинкинга при фоторефракционной кератоабляции с рибофлавином по данным трансмиссионной электронной микроскопии. Материал и методы. Экспериментальное исследование было выполнено in vivo на 16 глазах 16 кроликов породы Шиншилла, с массой тела от 2,5 до 3,5кг, в возрасте от 1 до 1,5 лет. Животные были разделены на контрольную и опытную группы по 8 животных на каждый из способов проведения трансэпителиальной фоторефракционной кератоэктомии (ТрансФРК), без и с предварительным насыщением стромы 0,25% изотоническим раствором рибофлавина. На светооптическом уровне исследовали эпителий, наружные и глубокие слои стромы в проекции оперативного вмешательства. По данным трансмиссионной электронной микроскопии оценивали волокна и пучки коллагена, и их концентрацию на единицу площади, а также клеточный компонент стромы роговицы в проекции оперативного вмешательства. Результаты. На светооптическом уровне роговица кролика по завершению эпителизации сохраняла нормальную морфологию плоского многослойного неороговевающего эпителия, с практически полным восстановлением стратификации слоев. В случае образцов после абляции с предварительным насыщением стромы раствором рибофлавина наблюдались единичные вакуоли в клетках базального слоя и появление псевдомногорядности. Комплексной морфологической оценкой установлено, что роговицы из экспериментальной группы (с предварительным насыщением стромы рибофлавином) были подвержены изменениям соответствующим крослинкингу стромы с формированием стабильных поперечных сшивок коллагеновых волокон. В роговицах контрольной группы без насыщения стромы рибофлавином морфологически выявлено полное восстановление структуры после лазерного воздействия без признаков кросслинкинга стромы. Заключение. После проведения эксимерлазерной абляции с рибофлавином обнаруженные при трансмиссионной электронной микроскопии стабильные сшивки в коллагеновых структурах стромы роговицы подтверждают наличие эффекта крослинкинга при таком способе фоторефракционной кератоэктомии.

Transmission electron microscopy is one of the key methods in studying the pathogenesis of collagen crosslinking. Aim. To evaluate the effect of crosslinking induced by photorefractive ablation of the cornea with riboflavin using transmission electron microscopy. Material and methods. This experimental in vivo study was performed on 16 eyes of 16 Chinchilla rabbits weighing from 2.5 to 3.5 kg, aged from 1 to 1.5 years. Animals were divided into control and experimental groups, including 8 animals for each of the transepithelial photorefractive keratoectomy (TransFRK) methods, with and without prior saturation of the stroma with a 0.25% isotonic riboflavin solution., The epithelium and outer and deep layers of the stroma were studied in the projection of surgery at the light-optical level. Based on data of the transmission electron microscopy, collagen fibers and bundles, and their concentration per unit area, and the cellular component of corneal stroma were evaluated. Results. The rabbit cornea studied at the light-optical level upon completion of epithelialization maintained a normal morphology of the flat multi-layered non-squamous epithelium with almost complete recovery of the layer stratification. In post-ablation samples with the prior saturation of stroma with riboflavin solution, isolated vacuoles were observed in cells of the basal layer along with emergence of pseudostratified epithelium. According to results of the complex morphological evaluation, corneas of the experimental group (with riboflavin pre-saturation of the stroma) showed changes corresponding to the stroma crosslinking with formation of stable cross-links of collagen fibers. In the cornea of the control group (without riboflavin saturation of the stroma), the stromal structure completely recovered after the laser treatment without any signs of stromal crosslinking. Conclusion. As detected by transmission electron microscopy, the stable cross-links in collagen structures of the corneal stroma induced by excimer laser ablation with riboflavin confirm the presence of the crosslinking effect in using the given method of the photorefractive keratoectomy.