Μελέτη φυτών της οικογένειας Lamiaceae ως προς την παραγωγή μεταβολιτών που αναστέλλουν τη δράση του υποδοχέα AhR, με εφαρμογή στις δερματικές παθήσεις
Authors: Καλλιμάνης Παναγιώτης 
Published: December 2022

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθεί η δραστικότητα συγκεκριμένων δευτερογενών μεταβολιτών, που προέρχονται από φυτά της οικογένειας των Χειλανθών, ως προς τον υποδοχέα των αρυλοϋδρογονανθράκων (AhR).Η ενεργοποίηση του (AhR) από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες, ιδιαίτερα δε από μικροβιακούς μεταβολίτες που βρίσκονται στο ανθρώπινο δέρμα, εμπλέκεται σε μια σειρά φλεγμονωδών δερματοπαθειών, όπως η σμηγματορροϊκή δερματίτιδα (SD), αλλά και στην ανάπτυξη καρκίνου του δέρματος. Ως εκ τούτου, θα ήταν πολύ σημαντικό να εντοπιστούν φυσικές ενώσεις που θα μπορούσαν να αναστείλουν την ενεργοποίηση του AhR από προσδέματα μικροβιακής προέλευσης όπως η 6-φορμυλινδολο[3,2-b]καρβαζόλη (FICZ), η ιντιρουμπίνη (IND) και η πιτυριαζεπίνη (PZ) ή από το πρωτότυπο πρόσδεμα 2,3,7,8-τετραχλωροδιβενζο-ρ-διοξίνη (TCDD). Δεδομένα από ασθενείς έδειξαν ότι η τοπική εφαρμογή κρέμας που περιέχει ξηρό εκχύλισμα φύλλων Rosmarinus officinalis L. είναι αποτελεσματική στην αντιμετώπιση της SD.Συνεπώς παρασκευάστηκαν με συγκεκριμένη μέθοδο 5 εκχυλίσματα Rosmarinus officinalis L. που διέφεραν μεταξύ τους ως προς το διαλύτη ή το χρόνο εμβροχής. Τα εν λόγω εκχυλίσματα αναλύθηκαν ποιοτικά και ποσοτικά με την μέθοδο της φασματοσκοπίας 1H-NMR και ύστερα ελέγχθηκαν in vitro, σε κύτταρα ινδικού χοιριδίου, σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος (HG2L7.5c1) και σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (SIK 28), ως προς την συμπεριφορά τους έναντι του AhR, απουσίας και παρουσίας της TCDD (2,3,7,8-τετραχλωροδιβενζο-παρα-διοξίνη) ή των παραγόμενων ουσιών από την Malassezia (FICZ, IND, PZ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: Α.) όλα τα εκχυλίσματα του Rosmarinus officinalis L. που ερευνήθηκαν: i.) δεν εμφάνισαν αγωνιστική δράση ii.) ήταν σε θέση να ανταγωνίζονται τη δράση της TCDD στον AhR, με το μεθανολικό εκχύλισμα των 7 ημερών εμβροχής [ROS-7d] να εμφανίζει την μεγαλύτερη δραστικότητα iii.) ο ανταγωνισμός ήταν συναγωνιστικού τύπου Β.) το εκχύλισμα [ROS-7d] (10 μg/mL) έδειξε in vitro σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ότι ανταγωνίζεται την δράση των TCDD, FICZ, PZ και IND στον AhR κατά 97,65%, 44,96%, 82,09% και 90,09% αντίστοιχα. Στην πορεία λήφθηκαν σε καθαρή μορφή τα βασικά δραστικά συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος [ROS-7d], ήτοι το καρνοσικό οξύ (CA), η καρνοσόλη (CS), η 7-Ο-μεθυλ-epi-ροσμανόλη (7MER), η 4’,7-O-διμεθυλαπιγενίνη (DΜA) και το μπετουλινικό οξύ (BA). Κατόπιν οι απομονωμένες ουσίες ελέγχθηκαν αν είναι σε θέση να ανταγωνίζονται τη δράση της TCDD στον AhR. Το πείραμα που ακολούθησε έδειξε ότι οι μεταβολίτες CA, CS, BA, DMA και 7MER (100 μM έκαστο), μείωσαν τη δράση της TCDD κατά 81,93%, 78,41%, 82,96%, 70,18% και 66,59% αντίστοιχα. Στο ίδιο πείραμα το [ROS-7d] προκάλεσε μείωση της τάξης του 101,07%. Το ότι βρέθηκαν παράγοντες που συμπεριφέρονται ως ανταγωνιστές του AhR είναι κάτι πολύ σημαντικό γιατί μπορεί να βρει εφαρμογή στην πρόληψη της τοξικότητας των διοξινών ή στην αντιμετώπιση της εγκατεστημένης τοξικότητας τους, όπως για π.χ. συμβαίνει στην περίπτωση της χλωρακμής, στην πρόληψη-θεραπεία διάφορων μορφών του καρκίνου του δέρματος και των φλεγμονωδών δερματοπαθειών. Κατόπιν ερευνήθηκαν ποσοτικά και ποιοτικά με τη μέθοδο της φασματοσκοπίας 1H-qNMR, ως προς τους μεταβολίτες CA, CS, 7MER, BA, DΜA, ροσμανόλη (RO, απομονωμένη από Rosmarinus officinalis L. και Salvia fruticosa Mill.) και 12-Ο-μεθυλοκαρνοσικό οξύ (12MCA, απομονωμένο από Rosmarinus officinalis L. και Salvia microphylla Kunth) τα μεθανολικά εκχυλίσματα 61 φυτών που φύονται-καλλιεργούνται στην Ελλάδα της οικογένειας των Χειλανθών από τα ακόλουθα γένη: Ballota, Hyssopus, Lavandula, Μarrubium, Nepeta, Phlomis, Ocimum, Origanum, Rosmarinus, Salvia, Stachys, Coridothymus, Mentha, Melissa, Sideritis, Satureja, Teucrium, Lamium και Betonica, με το σκεπτικό μήπως κάποιο άλλο φυτό αποτελεί καλύτερη πηγή για μία ή για μερικές ή για όλες τις προαναφερόμενες ουσίες. Ως δρόγη χρησιμοποιήθηκαν τα αποξηραμένα φύλλα του εκάστοτε βοτάνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες ενώσεις ανιχνεύθηκε σε 23 είδη (Rosmarinus (2), Salvia (14), Melissa, Ocimum, Mentha (2) Lavandula (3)). Η 7MER και η RO δεν ταυτοποιήθηκε σε κανένα εκχύλισμα, ενώ το CA, η CS και το 12MCA, ανιχνεύθηκαν όλα μαζί ταυτοχρόνως μόνο σε είδη των γενών Salvia (7) και Rosmarinus (2). Η μεγαλύτερη ποσότητα CA βρέθηκε στη Salvia somalensis Vatke (32,15±0,93 mg/g αποξηραμένης δρόγης)> Salvia pomifera subsp. pomifera L. (21,64±0,6 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (12,5±1,56 mg/g α.δ)> Salvia officinalis L. (11,66±4,33 mg/g α.δ), της CS στη Salvia somalensis Vatke (4,24±0,04 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (1,57±0,38 mg/g α.δ)> Salvia officinalis L. (1,11±0,43 mg/g α.δ)> Salvia canariensis L. (1,13±0,32 mg/g α.δ), του 12MCA στη Salvia microphylla Kunth (10,68±3,27 mg/g α.δ)> S. officinalis (6,12±2,3 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (3,05±0,29 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis L.(2,03±0,66 α.δ), της DMA στο Rosmarinus officinalis L. (0,41±0,1 mg/g α.δ)> Salvia viscosa Jacq. (0,33±0,05 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (0,12±0,02 mg/g α.δ), του ΒΑ στο Rosmarinus officinalis L. (7,55±1,06 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (3,88±0,04 mg/g α.δ). Τα γένη Salvia και Rosmarinus ήταν οι καλύτερες πηγές για το CA, την CS και το 12MCA. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η φασματοσκοπία 1H-qNMR προσφέρει ένα χρήσιμο εργαλείο για την ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των εξεταζόμενων ενώσεων σε σύνθετα εκχυλίσματα, με απλό, γρήγορο και άμεσο τρόπο χωρίς την αλλοίωση του δείγματος. Θέλοντας να δώσουμε μια πιο πρακτική διάσταση στο όλο θέμα σχεδιάστηκε μια σειρά πειραμάτων με εγχύματα, αφεψήματα, εκχυλίσματα με τυρβώδη ροή, ελαιόλυτα, φαρμακευτικά βάμματα και οινόλυτα, που αφορούσαν τα φυτά που παρουσίαζαν την μεγαλύτερη περιεκτικότητα στους εν λόγω μεταβολίτες αλλά και που κατείχαν την πιο ευρεία αναγνωρισιμότητα-διάδοση παγκοσμίως. Επιλέχτηκαν λοιπόν η Salvia fruticosa Mill., η Salvia officinalis L. και το Rosmarinus officinalis L. Ο απώτερος σκοπός ήταν να ανακαλυφθεί πια φαρμακοτεχνική μορφή είναι η πιο κατάλληλη, πια μέθοδος παρασκευής είναι η καλύτερη όσον αφορά τις εξεταζόμενες ουσίες, (π.χ. για ένα συγκεκριμένο φυτό είναι αποδοτικότερο να το χρησιμοποιούμε ως αφέψημα ή ως έγχυμα; ή για πόσο χρόνο πρέπει να μείνει σε επαφή η δρόγη με τον διαλύτη; ή πια είναι η βέλτιστη αναλογία δρόγης/διαλύτη; επίσης, σε ποια περίπτωση έχουμε κυρίαρχη ουσία τον ένα ή τον άλλο μεταβολίτη κάτι που είναι επίσης πολύ σημαντικό) δίνοντας με αυτό τον τρόπο για πρώτη φορά απαντήσεις με μαθηματική πλέον ακρίβεια σε βασικά και χρόνια ερωτήματα που αφορούν τις δρόγες που ερευνήθηκαν. Σύμφωνα με αποτελέσματα, για τα 3 εξεταζόμενα φυτά η μέθοδος της αφέψησης ήταν αποδοτικότερη από την έγχυση ενώ η εκχύλιση με τυρβώδη ροή εν θερμώ ήταν εφάμιλλη της αφέψησης. Επίσης διαπιστώθηκε ότι το φαρμακευτικό βάμμα δεν είναι κατάλληλη φαρμακευτική μορφή για τα διτερπένια αβιετανίου λόγω της αστάθειας που παρουσιάζουν οι ουσίες αυτές σε υδατοαλκοολικό διαλύτη 45 και 70 αλκοολικών βαθμών. Επιπλέον ερευνήθηκαν τα ελαιόλυτα του Rosmarinus officinalis L. στα οποία αποδείχθηκε ότι οι μεταβολίτες CA, CS, 12MCA, BA και DMA διαλύονται στο έξτρα παρθένο ελαιόλαδο και, ιδιαίτερα σημαντικό για τα διτερπένια αβιετανίου, παραμένουν σταθεροί στο μέσο αυτό. Στο οινόλυτο του Rosmarinus officinalis L., που παρασκευάστηκε με τη μέθοδο που εισήγαγε ο Διοσκουρίδης, ταυτοποιήθηκε το ροσμαρινικό οξύ (το οποίο απομονώθηκε από τα φύλλα του εν λόγω φυτού). Τέλος, δόθηκαν παραδείγματα ποσοτικής αντιστοιχίας μεταξύ των φαρμακευτικών μορφών που ερευνήθηκαν. Η ανάλυση όλων των δειγμάτων έγινε με 1H-qNMR.