The role of megakaryocytes in controlling bone development in primary myelofibrosis
Authors: Καραγιάννη Αικατερίνη 
Published: January 2023

Οι αλλαγές στην ανάπτυξη και την ομοιόσταση των οστών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων είναι πολύπλοκες και χρειάζεται περαιτέρω έρευνα για τη διαλεύκανση των υπεύθυνων μηχανισμών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασα στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση, μια μορφή μυελοϋπερπλαστικού νεοπλασμάτος, που χαρακτηρίζεται από υπέρμετρο πολλαπλασιασμό μεγακαρυοκυττάρων και ίνωση του μυελού των οστών. Με βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία, η οστεοσκλήρυνση (ανώμαλη σκλήρυνση των οστών) αποτελεί σοβαρή επιπλοκή μερικών μορφών μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων. Παρόλο που σχετίζεται με προοδευτική ανεπάρκεια του μυελού των οστών και έντονο πόνο στις αρθρώσεις και τα οστά, η εκδήλωση και αιτιολογία της παραμένουν ακόμα άγνωστες. Ο αυξημένος αριθμός των μεγακαρυοκυττάρων θα μπορούσε να εμπλέκεται στις οστικές αλλαγές, καθώς έχει δειχθεί ότι τα μεγακαρυοκύτταρα μπορούν και επηρεάζουν τη διαφοροποίηση οστικών κυττάρων.Αρκετές μελέτες δείχνουν πως υπάρχει αυξημένος όγκος οστών στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση, χωρίς ωστόσο να γίνονται αναφορές και σύγκριση μεταξύ των δύο φύλων. Στους Σκοπούς 1 και 2 της παρούσας διατριβής, χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη μετάλλαξη JAK2V617F υπό τον υποκινητή Vav. Με τη χρήση τους, διερευνήσαμε πώς αυτή η μετάλλαξη επηρεάζει την οστική πυκνότητα και δύναμη στα δύο φύλα (Σκοπός 1). Με ανάλυση της τομογραφίας με μικροϋπολογιστή (micro-CT) παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές και στα δύο φύλα, αλλά η επίδραση στο σπογγώδες οστό ήταν αντίθετη μεταξύ αρσενικών και θηλυκών, με αυξημένο όγκο στα θηλυκά και μειωμένο στα αρσενικά συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου. Τα αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια παρουσίασαν οστεοπόρωση στην περιοχή της διάφυσης, έχοντας μικρότερη ποσότητα μεταλλικών στοιχείων και ελαττωμένο πάχος φλοιώδους οστού συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Επίσης, είχαν τάση για μικρότερες ροπές ενέργειας, που είναι ένας από τους βασικούς δείκτες αντοχής των οστών. Για αυτό προχωρήσαμε σε μηχανικό έλεγχο (mechanical testing ή αλλιώς three point bending) και διαπιστώσαμε ότι οι μηχανικές ιδιότητες των οστών τους είναι παρόμοιες ή ελαφρώς κατώτερες από την ομάδα ελέγχου. Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα αξιολογήσαμε τα οστά σε επίπεδο ιστού προκειμένου να εξετάσουμε τυχόν διαφορές στη διαδικασία ανοργανοποίησης. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι οι ιστοί από τα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F περιέχουν περισσότερο οστεοειδές, το οποίο είναι το μη μεταλλοποιημένο οργανικό τμήμα της μήτρας των οστών που σχηματίζεται πριν από την ωρίμανση του οστικού ιστού, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ποντίκια ελέγχου. Αυτό έδειξε ότι η φυσιολογική διαδικασία ανοργανοποίησης παρεμποδίζεται στα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F.Το επόμενο βήμα (Σκοπός 2 της διατριβής) ήταν να διερευνηθεί πώς τα μεγακαρυοκύτταρα που προέρχονται από αρσενικά ποντίκια JAK2V617F επηρεάζουν τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών που είναι υπεύθυνοι για τη διαδικασία ανοργανοποίησης. Έτσι προχωρήσαμε σε συγκαλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών με μεγακαρυοκύτταρα, χρησιμοποιώντας κύτταρα από αρσενικά ποντίκια και συνθήκες καλλιέργειας που προάγουν τη διαφοροποίηση προς οστεοβλάστες (για αυτό αναφέρεται επίσης ως συγκαλλιέργεια οστεοβλαστών-μεγακαρυοκυττάρων). Η παρουσία των JAK2V617F μεγακαρυοκυττάρων και/ή του υπερκειμένου τους, μείωσε σημαντικά τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών.Αναζητώντας πιθανά μόρια που ευθύνονται για την επίδραση των μεγακαρυοκυττάρων JAK2V617F στην οστεογένεση, χρησιμοποιήσαμε μια συστοιχία που εξετάζει mRNA σχετιζόμενα με οστεογένεση. Υπήρχε αυξημένη έκφραση των γονιδίων Noggin, Chordin, Alpha-2-HS-glycoprotein, Collagen type IV alpha 1 and Collagen type XIV alpha 1 (γνωστά για τις ανασταλτικές τους ιδιότητες ως προς τη διαφοροποίηση των οστών) και μειωμένη έκφραση των γονιδίων Alkaline phosphatase, Vascular cell adhesion molecule 1, Sclerostin, Distal-less homeobox 5 and Collagen type III alpha 1 (που σχετίζονται με οστεογένεση) στα μεγακαρυοκύτταρα των αρσενικών ποντικιών JAK2V617F συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Για τα γονίδια με μεγάλες αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης, προσπαθήσαμε να πραγματοποιήσουμε πειράματα για να εξετάσουμε τη συμβολή τους στην ανασταλτική επίδραση που παρατηρήσαμε στις συγκαλλιέργειες. Παρόλα αυτά, έγινε εμφανές ότι τα μεγακαρυοκύτταρα με τη μετάλλαξη JAK2V617F υφίστανται μία ολική αλλαγή στον προγραμματισμό των γονιδίων, περιλαμβάνοντας διάφορα μονοπάτια που συνδέονται με την αναστολή της οστεογένεσης. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι ένας συνδυασμός αλλαγών, και όχι μόνο μία αλλαγή, είναι υπεύθυνος για την ανασταλτική επίδραση των μεταλλαγμένων μεγακαρυοκυττάρων στη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Σε αντίθεση με τα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F, η ανάλυση micro-CT σε θηλυκά ποντίκια με αυτή τη μετάλλαξη έδειξε ότι έχουν αυξημένο όγκο οστών συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, έπειτα από διενέργεια μηχανικού ελέγχου διαπιστώθηκε ότι οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στα θηλυκά ποντίκια, οφείλονταν πιθανότατα σε διαφορές στη γεωμετρία των οστών και όχι σε διαφορές στις εγγενείς ιδιότητες υλικού του οστού. Αυτό υποδηλώνει πως η δύναμη του οστού και η ποιότητά του στα θηλυκά δεν επηρεάζονται σημαντικά από τη μετάλλαξη JAK2V617F. Προκαταρκτικά πειράματα με συγκαλλιέργειες οστεοβλαστών-μεγακαρυοκυττάρων, χρησιμοποιώντας κύτταρα από θηλυκά ποντίκια, έδειξαν ότι τα μεγακαρυοκύτταρα από θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια τείνουν να αναστέλλουν ή δεν επηρεάζουν τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Η ίδια συστοιχία που χρησιμοποιήθηκε για τα αρσενικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκε και για τα θηλυκά για να ανιχνευθούν τυχόν διαφορές στην έκφραση γονιδίων. Η πλειοψηφία των διαφορετικά εκφραζόμενων μεταγράφων φαίνεται και πάλι να έχει ανασταλτική επίδραση στους οστεοβλάστες. Ωστόσο, η αυξημένη έκφραση του Bmpr1b θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στο μεγαλύτερο όγκο οστών που παρατηρείται στα θηλυκά ποντίκια JAK2V617F. Μεταξύ άλλων παραγόντων, το ένζυμο της οξειδάσης της λυσίνης (LOX) έχει βρεθεί να εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα μεγακαρυοκύτταρα ασθενών αλλά και ζωικών μοντέλων με πρωτοπαθή μυελοΐνωση. Αυτό το ένζυμο έχει μελετηθεί στα πλαίσια του σχηματισμού των οστών και της ίνωσης του μυελού των οστών. Στον Σκοπό 3 της παρούσας διατριβής εξετάσαμε επίσης την καινοτόμο ιδέα ότι η οξειδάση της λυσίνης που προέρχεται από τα μεγακαρυοκύτταρα παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της οστικής ακεραιότητας υπό φυσιολογικές συνθήκες, κάτι που αν όντως ισχύει θα δώσει το έδαφος σε μελλοντικές μελέτες σχετικά με τις οστικές αλλαγές που παρατηρούνται στην πρωτοπαθή μυελοΐνωση. Προηγούμενες μελέτες εξέτασαν το ρόλο της οξειδάσης της λυσίνης στο σχηματισμό των οστών. Ωστόσο, ο ρόλος αυτού του ενζύμου όταν προέρχεται συγκεκριμένα από τα μεγακαρυοκύτταρα, στη φυσιολογική ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων και των οστών δεν έχει διερευνηθεί. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια με απενεργοποιημένο το γονίδιο της οξειδάσης της λυσίνης στα μεγακαρυοκύτταρα, αξιοποιώντας τη μέθοδο Cre-lox με την τεχνολογία CRISPR-Cas9. Η απενεργοποίηση του γονιδίου δεν επηρέασε τη φυσιολογική ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων, αφού ο αριθμός τους και ο αριθμός πολυπλοειδίας τους παρέμειναν αμετάβλητοι. Παρ’όλα αυτά, επηρέασε το σχηματισμό των οστών μόνο στο αρσενικό γένος. Υπήρχε αυξημένος οστικός σχηματισμός στα ποντίκια αρσενικού γένους που είχαν απενεργοποιημένο το γονίδιο της οξειδάσης της λυσίνης στα μεγακαρυοκύτταρά τους, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στα αντίστοιχα ποντίκια θηλυκού γένους συγκριτικά με τις ομάδες ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα θα χρησιμεύσουν ως βάση για μελλοντικές μηχανιστικές έρευνες. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη παρέχει σημαντική και καινούργια γνώση σχετικά με τις διαφορές που παρατηρούνται στον όγκο και στις ιδιότητες των οστών στα δύο γένη στην πρωτοπαθή μυελοϊνωση από τον επαναπρογραμματισμό των μεγακαρυοκυττάρων. Όπως προαναφέρθηκε, η βιβλιογραφία προτείνει ότι η οστεοσκλήρυνση αποτελεί σοβαρή επιπλοκή κάποιων μορφών μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασμάτων. Τα καινούργια ευρήματά μας σχετικά με τη μείωση του οστικού όγκου στα αρσενικά ποντίκια JAK2V617F τονίζουν το κενό που υπάρχει στην υπάρχουσα βιβλιογραφία, καθώς δεν έχει γίνει σύγκριση ανάμεσα στα δύο γένη. Επίσης, ανακαλύψαμε ότι η οξειδάση της λυσίνης που προέρχεται από τα μεγακαρυοκύτταρα συμβάλλει στην ομοιόσταση των οστών στα αρσενικά ποντίκια. Και οι δύο κύριοι στόχοι της μελέτης δίνουν έδαφος για μελλοντική διερεύνηση των επιπτώσεων των αλλαγών που σχετίζονται με τις ορμόνες του φύλου στα οστά στο πλαίσιο της πρωτοπαθούς μυελοΐνωσης.