Μελέτη της πολυμορφίας του HCV στην Ελλάδα
Authors: Παπαχρήστου Ελένη 
Published: September 2021

Η ανακάλυψη και ταυτοποίηση του ιού HCV ως τον αιτιολογικό παράγοντα των περιστατικών μη-Α, μη-Β ηπατίτιδας ήταν η αρχή για την ανάπτυξη διαφόρων μεθόδων και τεχνολογιών για την ανίχνευση και τυποποίησή του. Ο ιός HCV ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae, γένος hepacivirus και το γονιδίωμά του είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας που κωδικοποιεί μια πολυπρωτεϊνη από την οποία προκύπτουν οι δομικές και οι μη δομικές πρωτεϊνες του. Κύτταρα-στόχοι του ιού – στα οποία εισέρχεται με ενδοκύτωση μετά από πρόσδεση σε ειδικούς υποδοχείς- είναι τα ηπατοκύτταρα αλλά αναφέρονται και τα λεμφοκύτταρα (Β και Τ) καθώς και τα δενδριτικά και τα μονοκύτταρα. Παρόλο που το ανοσοποιητικό σύστημα καταφέρνει να περιορίσει τη λοίμωξη και να οδηγήσει σε αυτοϊαση, εντούτοις ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών (80-85%) μεταπίπτουν σε χρονιότητα από τους οποίους το 5-25% θα φθάσουν σε στάδιο κίρρωσης διατρέχοντας τον κίνδυνο εμφάνισης ηπατικής νόσου τελικού σταδίου και ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Ο ιός HCV παρουσιάζει μεγάλη γενετική ετερογένεια, έχει παγκόσμια εξάπλωση και έχει μολύνει πάνω από 150 εκ. ανθρώπους στην υφήλιο. Διακρίνεται σε 7 γονότυπους και πολλούς υπότυπους.Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός του HCV RNA δίνουν πολύτιμες πληροφορίες τόσο για τη διάγνωση της χρόνιας λοίμωξης όσο και για την παρακολούθηση της πορείας της θεραπείας. Επιπλέον, η γνώση του γονότυπου του ιού με τον οποίο είναι μολυσμένος ο ασθενής καθορίζει τη δόση και τη διάρκεια του θεραπευτικού σχήματος και αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την παρακολούθηση και τη δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε διάφορους πληθυσμούς.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη in-house μεθόδων α) για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του HCV RNA και β) για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ιού HCV προκειμένου να μελετηθεί η πολυμορφία του HCV στην Ελλάδα.Σε ότι αφορά στη μέθοδο του ποσοτικού προσδιορισμού του HCV RNA στοχεύσαμε το 3΄άκρο του γονιδιώματος του ιού σε αντίθεση με όλες τις εμπορικά διαθέσιμες μεθόδους που βασίζονται στην ενίσχυση του 5΄άκρου. Μετά από πολλές δοκιμές με διάφορες πλατφόρμες και συνδυασμούς αντιδραστηρίων τελικά καταλήξαμε στη χρησιμοποίηση της τεχνολογίας της one step real time PCR (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου σε ένα βήμα) στην πλατφόρμα Light Cycler (Roche) και η αξιοπιστία της μεθόδου ελέγχθηκε τόσο με διεθνή standards όσο και με τη σύγκρισή της με δύο εγκεκριμένες εμπορικές μεθόδους των εταιρειών Abbott και Roche. Έτσι δημιουργήθηκε μια μέθοδος που είναι γρήγορη, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους και η οποία μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω.Σε ότι αφορά στη μέθοδο γονοτύπησης η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν ο άμεσος προσδιορισμός της αλληλουχίας με τη διαδικασία του sequencing που αποτελεί και τη μέθοδο αναφοράς. Αρχικά σχεδιάστηκαν εκκινητές (primers) από την πολύ καλά συντηρημένη περιοχή NS5B του ιού και δοκιμάστηκαν διάφορα πρωτόκολλα PCR (αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης). Ακολούθησε η διαδικασία του sequencing για τη λήψη των αλληλουχιών οι οποίες στη συνέχεια επεξεργάζονταν με μεθόδους φυλογενετικής ανάλυσης. Η μέθοδος αξιολογήθηκε με διεθνή πρότυπα και έλαβε πιστοποίηση από το ΕΣΥΔ. Με τη μέθοδο αυτή τυποποιήθηκαν τα περισσότερα δείγματα που ήταν απροσδιόριστα (με τη μέθοδο του αντίστροφου υβριδισμού (LiPA)) στο εργαστήριό μας και ήταν η μέθοδος με την οποία μελετήθηκε η δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε ΧΕΝ (χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών) στα πλαίσια του προγράμματος «Αριστοτέλης» τα δεδομένα της οποίας δημοσιεύτηκαν σε έγκυρο επιστημονικό περιοδικό.