Οι μεταλλάξεις και οι πολυμορφισμοί των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε πάσχοντες από ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος
Authors: Κωστάκης Γεώργιος 
Published: August 2021

Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας αποτελεί μια υποκατηγορία του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της κεφαλής και του τραχήλου και περιλαμβάνει τους βλεννογόνους της στοματικής μοίρας της γλώσσας, της φατνιακής απόφυσης της άνω και κάτω γνάθου, του εδάφους του στόματος, της παρειάς, του οπισθογόμφιου τριγώνου, του χείλους και της σκληράς υπερώας. Η επίπτωση του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας αυξάνει σε παγκόσμια κλίμακα. Υπολογίζεται ότι βρίσκεται μεταξύ 11ης και 13ης θέσης σε θανάτους από καρκίνο παγκοσμίως (2). Η καρκινογένεση των όγκων αυτών θεωρείται ότι προκαλείται από τη συσσώρευση γενετικών αλλαγών, παρόλο που, μέχρι σήμερα, οι ακριβείς γενετικοί μηχανισμοί παραμένουν σύνθετοι και αδιευκρίνιστοι (123). Οι κινάσες των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης (PI3Ks) περιλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια ετεροδιμερών λιπιδιακών κινασών που ανήκουν σε τρεις τάξεις και αποτελούνται από μια καταλυτική υπομονάδα και μια υπομονάδα υποδοχέα. Οι κινάσες αυτές είναι σημαντικοί ρυθμιστές της κυτταρικής αύξησης, του μετασχηματισμού, της προσκόλλησης, της απόπτωσης, της επιβίωσης και της κινητικότητας (51). Μόλις ενεργοποιηθούν από τις τυροσινικές κινάσες των αυξητικών παραγόντων, οι κινάσες των φωσφολιπιδίων της ινοσιτόλης μεταφέρονται στο εσωτερικό της κυτταρικής μεμβράνης, όπου φωσφορυλιώνουν το υπόστρωμά τους, δηλαδή την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη (ΡΙΡ2) στην 3-θέση του δακτυλίου της ινοσιτόλης, σχηματίζοντας έτσι έναν δεύτερο αγγελιοφόρο την 3,4,5, τριφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη (ΡΙΡ3), που με τη σειρά της, μεταφέρει την κινάση σερίνης-θρεονίνης AKT και εξαρτώμενη από την ΡΙΡ3 κινάση (PDK), στο εσωτερικό της μεμβράνης (6). Η PDK φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την AKT, που ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών με πολλές ενδοκυττάριες λειτουργίες. Το γονίδιο PIK3CA βρίσκεται στο γενετικό τόπο 3q26.3 και κωδικοποιεί για την καταλυτική υπομονάδα p110α της τάξης ΙΑ ΡΙ3Κ (11). Στο γονίδιο αυτό έχουν αναφερθεί γενετικές αλλαγές όπως αύξηση του αριθμού των αντιγράφων, διαγραφές και πιο πρόσφατα μεταλλάξεις με λάθος νόημα, σε πολλούς τύπους καρκίνου, όπως του παχέως εντέρου, του μαστού, του εγκεφάλου, του στομάχου και του πνεύμονα (60,61,62). Οι μεταλλάξεις με λάθος νόημα έχουν ενοχοποιηθεί για αύξηση της δραστηριότητας του PIK3CA. Περισσότερες από 75% αυτών των μεταλλάξεων βρίσκονται στην περιοχή της έλικας (εξόνιο 9) και στην περιοχή της κινάσης (εξόνιο 20) του γονιδίου (59). Επιπλέον, οι τρεις συχνότερες από αυτές τις μεταλλάξεις, δηλαδή οι Ε542Κ, Ε545Κ και H1047R ονομάζονται και θερμές μεταλλάξεις, και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ενεργότητα της κινάσης φωσφορυλιώνοντας την AKT, οδηγώντας το κύτταρο σε εξαλλαγή in Vitro (124). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το PIK3CA λειτουργεί σαν ογκογονίδιο σε πολλούς τύπους καρκίνου. Μέχρι σήμερα, οι έρευνες δείχνουν ότι το PIK3CA υπερεκφράζεται στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της γλώσσας. Επιπλέον, θερμές μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου και συγκεκριμένα σε προχωρημένα στάδια της νόσου σε Ιάπωνες ασθενείς (7,5%). Πιο πρόσφατα οι Murugan και συν. (66) πρότειναν ότι το ποσοστό των μεταλλάξεων διαφέρει ανάλογα με την εθνικότητα (Ινδοί 10,5% και Βιετναμέζοι 0%). Απουσία επίσης θερμών μεταλλάξεων έχει επίσης αναφερθεί σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της κεφαλής και του τραχήλου στους Γερμανούς (69). Μέχρι σήμερα η ανάλυση των μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA και της κλινικοπαθολογικής σημασίας του δεν έχει πραγματοποιηθεί στον Ελληνικό πληθυσμό. Η ερευνητική αυτή εργασία είχε σαν στόχο τη διερεύνηση των θερμών μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας στον Ελληνικό πληθυσμό. Η υπόθεση που διερευνήθηκε ήταν ότι οι θερμές μεταλλάξεις του γονιδίου PIK3CA εμφανίζονται σε προχωρημένα στάδια του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας, όπως αρχικά προτάθηκε από τους Kozaki και συν. (44). Για τη διερεύνηση αυτής της υπόθεσης, έγινε έλεγχος των βάσεων του DNA των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε 86 πάσχοντες από ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας που χειρουργήθηκαν για τον καρκίνο τους. Υλικό και μέθοδος: Για την ερευνητική αυτή εργασία χρησιμοποιήθηκε υλικό από τους πρωτοπαθείς όγκους 86 ασθενών με ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας που χειρουργήθηκαν για τη νόσο τους. Οι ασθενείς χειρουργήθηκαν στην Πανεπιστημιακή Κλινική της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής του νοσοκομείου Ευαγγελισμός από τον Ιανουάριο του 2003 μέχρι το Δεκέμβριο του 2007. Επιπλέον, σαν ομάδα ελέγχου ελήφθη περιφερικό αίμα από 26 υγιείς εθελοντές αντιστοίχου φύλου και ηλικίας με τους πάσχοντες. To DNA των κυττάρων του αίματος και το DNA των κυττάρων του βλεννογόνου του στόματος στους υγιείς μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ταυτόσημο. Έτσι, η λήψη ιστοτεμαχίου βλεννογόνου του στόματος στους υγιείς δεν κρίθηκε αναγκαία. Στους υγιείς ζητήθηκε και εδόθη συγκατάθεση. Η επιλογή του παθολογοανατομικού υλικού έγινε σε συνεργασία με τους ιατρούς της Παθολογικής Ανατομικής κλινικής με ιδιαίτερη έμφαση στην επιλογή κυρίως καρκινικών κυττάρων και όχι υγιούς ιστού. Στη συνέχεια έγινε εξαγωγή του γενωμικού DNA με τη βοήθεια του QIAmp extraction DNA kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τον πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος PCR. Δύο σετ εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση σημειακών αλλαγών των εξονίων και στη συνέχεια ακολούθησε άμεση αλληλούχιση του DNA. Τα δημογραφικά στοιχεία, τόσο τα προεγχειρητικά, όσο και τα μετεγχειρητικά, ήταν διαθέσιμα για όλους τους ασθενείς. Οι ασθενείς σταδιοποιήθηκαν σύμφωνα με το International Union Against Cancer (3). Η εργασία αυτή εγκρίθηκε από τις επιτροπές ηθικής και δεοντολογίας του Ευαγγελισμού και της Οδοντιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Αποτελέσματα Από τους 86 ασθενείς οι 17 (19,8%) ήταν σταδίου I, οι 12 (14%) σταδίου II, οι 14 (16,3%) σταδίου III και οι 43 (50%) σταδίου IV σύμφωνα με τη σταδιοποίηση pTNM. Τριανταένα ασθενείς (36%) είχαν καρκίνο της γλώσσας, 8 (9,3%) καρκίνο του εδάφους του στόματος, 25 (29,1%) καρκίνο της φατνιακής απόφυσης της κάτω γνάθου, 4 (4,7%) καρκίνο της φατνιακής απόφυσης της άνω γνάθου, 9 (10,5%) είχαν ως εντόπιση του καρκίνου τους την παρειά, 6 (7%) το οπισθογόμφιο τρίγωνο και 3 (3,5%) το βλεννογόνο του χείλους. Ο βαθμός της ιστολογικής διαφοροποίησης χαρακτηρίστηκε υψηλός σε 17 ασθενείς (21%), μέτριος σε 56 (69,1%) και χαμηλός σε 8 (9,9%) ασθενείς. Σε αντίθεση με τις προσδοκίες των ασθενών δεν ανευρέθησαν θερμές μεταλλάξεις στα εξόνια 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA σε κανένα από τα δείγματα. Στα δείγματα ανευρέθησαν δύο πολυμορφισμοί στις περιοχές του ιντρονίου 9, δηλαδή οι IVS8 -55 C>T (rs45455192) και IVS9 +105 T>G (rs17849071). Ο πολυμορφισμός IVS8 βρέθηκε σε 18,6% των ασθενών (16 άτομα), ενώ ο πολυμορφισμός IVS9 σε ποσοστό 19,8% (17 ασθενείς). Σε όλους τους ασθενείς οι πολυμορφισμοί βρίσκονταν σε ετερόζυγη κατάσταση. Στην ομάδα ελέγχου οι πολυμορφισμοί IVS8 και IVS9 βρέθηκαν σε ποσοστά 7,5 και 11,5% αντίστοιχα. Η διαφορά αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική (p>0,05). Ο πολυμορφισμός IVS8 βρέθηκε στα δείγματά μας σε αυξημένη συχνότητα στο βλεννογόνο της παρειάς (44%, 4 στα 9 δείγματα). Επιπλέον ο πολυμορφισμός IVS9 βρέθηκε κυρίως στο βλεννογόνο της φατνιακής απόφυσης της κάτω γνάθου (44%, 11 στα 25 δείγματα) και στο βλεννογόνο της παρειάς (33,3%, 3 στα 9 δείγματα). Οι διαφορές αυτές στη συχνότητα της εντόπισης των πολυμορφισμών ήταν στατιστικά σημαντικές (Κριτήριο χ²= 28.2, p-τιμή 0.005), αν και το μέγεθος του δείγματος ήταν μικρό. Συζήτηση: Αναλύοντας 86 δείγματα από ιστολογικά παρασκευάσματα πρωτοπαθών ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων του βλεννογόνου του στόματος δε βρέθηκαν μεταλλάξεις στα εξόνια 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA. Αντίθετα, άλλοι ερευνητές έχουν ανιχνεύσει μεταλλάξεις σε ποσοστό ως και 10,5% (66). Αυτό πιθανό να εξηγείται από το ότι οι μεταλλάξεις μερικών γονιδίων σε ανθρώπινους καρκίνους πιθανόν να σχετίζονται με την εθνικότητα (90,91). Κάτι αντίστοιχο μπορεί να ισχύει και για το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος. Στα δείγματα ανευρέθησαν δύο πολυμορφισμοί στις περιοχές του ιντρονίου 9, δηλαδή οι IVS8 -55 C>T (rs45455192) και IVS9 +105 T>G (rs17849071) (92). Ο πολυμορφισμός IVS9 έχει περιγραφεί πάλι σε ακανθοκυτταρικά καρκινώματα κεφαλής και τραχήλου σε 4 από τα 38 δείγματα (10,5%) (67). Αντίθετα ο πολυμορφισμός IVS8 είναι ένα νέο εύρημα στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος. Συμπεράσματα: Οι μεταλλάξεις των εξονίων 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA δεν θεωρείται πιθανό ότι παίζουν σημαντικό τουλάχιστον ρόλο στην παθογένεση του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας στον Ελληνικό πληθυσμό. Άλλοι μηχανισμοί ενεργοποίησης του γονιδίου PIK3CA ή μεταλλάξεις σε άλλα ογκογονίδια είναι πιθανόν να εμπλέκονται με την παθογένεση της νόσου.