Μελέτη της ετερόλογης έκφρασης της α-συνουκλεΐνης στον ζυμομύκητα και της αλληλεπίδρασής της με ενδογενείς μεταβολικούς παράγοντες
Authors: Σφήκας Ευάγγελος 
Published: September 2021

Η α-συνουκλεΐνη αποτελεί μία πρωτεΐνη 140 αμινοξέων η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο SNCA και εκφράζεται κυρίως στο προσυναπτικό άκρο των ντομαπινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας των βασικών γαγγλίων του ανθρώπινου εγκεφάλου. Η συσσώρευσή της στο εσωτερικό των νευρώνων οδηγεί στην εκφύλισή τους με αποτέλεσμα την εκδήλωση της νόσου Parkinson. Ο Saccharomyces cerevisiae χρησιμοποιείται για τη μοντελοποίηση ανθρώπινων νόσων, ειδικότερα νευροεκφυλιστικών διαταραχών, λόγω της υψηλής διατήρησης ουσιωδών μηχανισμών στο υποκυτταρικό επίπεδο μεταξύ νευρώνων και ζυμομύκητα. Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η εγκατάσταση ενός μοντέλου της νόσου του Parkinson η οποία θα στηριζόταν στη μεταφορά μορφών γονιδίων της α-συνουκλεΐνης στον Saccharomyces cerevisiae. Παράλληλα, επιλέχθηκε η επακόλουθη μελέτη της αλληλεπίδρασης της α-συνουκλεΐνης με μεταβολικά μονοπάτια του ζυμομύκητα που εμπλέκονται στην βιοσύνθεση της τρεχαλόζης και παράγοντες που η παρουσία αυτής ρυθμίζει. Η τρεχαλόζη είναι ένας μη αναγωγικός δισακχαρίτης που απαντάται στους ζυμομύκητες και χαρακτηρίζεται από την ιδιότητά της να διατηρεί τις πρωτεΐνες στην σωστά αναδιπλωμένη τους μορφή και να εμποδίζει το σχηματισμό συσσωματωμάτων, ενώ βοηθά στην αντιμετώπιση πολλών κυτταρικών στρες. Στα αποτελέσματα της διατριβής πραγματοποιήθηκε και τεκμηριώθηκε η μεταφορά και η έκφραση όλων των διαθέσιμων μορφών της α-συνουκλεΐνης στα κύτταρα του ζυμομύκητα και αποδείχθηκε πως η πρωτεΐνη δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για τον ζυμομύκητα στις πρώτες 24 ώρες της ανάπτυξής του, ενώ οι τοξικές επιδράσεις της εμφανίζονται είτε σε συνδυασμό με την εξωγενή παροχή 1,4-διθειο-θρεϊτόλης (DTT) είτε κατά την χρονολογική γήρανση των κυττάρων Saccharomyces cerevisiae που την εκφράζουν. Κατά τη μελέτη της βιωσιμότητας εφαρμόσθηκε η συνθήκη υψηλής εξωτερικής οσμωτικότητας (ΗΕΟ) στα κύτταρα με σκοπό να αυξηθεί το εύρος ζωής των ζυμομυκήτων στην χρονολογική γήρανση και αποδείχθηκε πως η συνθήκη ευνόησε την βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία και απουσία του SNCA. Ακολούθως, διαπιστώθηκε η βαθμιαία αύξηση των επιπέδων έκφρασης της α-συνουκλεΐνης στις τέσσερις φάσεις ανάπτυξης των κυττάρων, όπου παρατηρήθηκε μόνο αρχόμενη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης στον φαινότυπο της χρονολογικής γήρανσης. Στο πλαίσιο αυτό μέσω μελετών της γονιδιακής έκφρασης στην φάση της χρονολογικής γήρανσης διαπιστώθηκαν κατασταλτικά φαινόμενα από την έκφραση της α-συνουκλεΐνης στα μεταγραφικά επίπεδα της συνθάσης της τρεχαλόζης, παρότι το ερέθισμα για την παραγωγή τρεχαλόζης φερόταν αυξημένο. Ακόμη, ανιχνεύτηκαν κατεσταλμένα μεταγραφικά επίπεδα στο σκέλος της αυτοφαγίας από την συνεχόμενη και αυξανόμενη έκφραση του SNCA. Στην συνέχεια, οι μελέτες επεκτάθηκαν σε μεταλλαγμένα στελέχη S. cerevisiae ως προς τα τρία μελετώμενα γονίδια του μεταβολισμού της τρεχαλόζης, τα tps1Δ, tps2Δ και tsl1Δ. Στο tps1Δ είναι αδύνατη η βιοσύνθεση τρεχαλόζης και εμφάνισε καθ’ όλη την διάρκεια της μελέτης του τοξικότητα στην παρουσία της α-συνουκλεΐνης με αυξημένα επίπεδα έκφρασης του SNCA, μειωμένη βιωσιμότητα κυρίως στην χρονολογική γήρανση και κυτταροπλασματικά συσσωματώματα από την εκθετική φάση ανάπτυξης. Οι μελέτες γονιδιακής έκφρασης ανέδειξαν ένα προφίλ απόκρισης στο στρες από την εκθετική φάση και κατεσταλμένα επίπεδα έκφρασης στις απώτερες φάσεις ανάπτυξης μαρτυρώντας την τοξική κατάληξη των κυττάρων, οπότε φάνηκε πως η συνθήκη ΗΕΟ αδυνατούσε να βελτιώσει την βιωσιμότητα των κυττάρων απουσία της συνθάσης της τρεχαλόζης. Αντίστοιχα για τα κύτταρα tps2Δ, τα οποία δεν βιοσυνθέτουν φωσφατάση της τρεχαλόζης και συσσωρεύουν 6-φωσφο-τρεχαλόζη ως παραπροϊόν, οι μελέτες βιωσιμότητας παρουσία της α-συνουκλεΐνης έδειξαν σημαντική καταστολή και τοξικά φαινόμενα σε σταθερή έκφραση της πρωτεΐνης σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης, ενώ παρατηρήθηκε καθολική εμφάνιση κυτταροπλασματικών εγκλείστων σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης, αναδεικνύοντας τον πιο τοξικό φαινότυπο μεταξύ αυτών που διερευνήθηκαν. Ακόμη, διαπιστώθηκε μια γενικευμένη καταστολή της έκφρασης των περισσοτέρων μελετώμενων γονιδίων παρουσία της α-συνουκλεΐνης, αναδεικνύοντας τοξικά φαινόμενα στο μεταβολικό προφίλ των κυττάρων και την αναγκαιότητα της φωσφατάσης για την πλήρωση της συνθήκης ΗΕΟ. Τέλος, στο στέλεχος tsl1Δ, στο οποίο το σύμπλοκο βιοσύνθεσης της τρεχαλόζης έχει απωλέσει μερικώς την ρυθμιστική ευαισθησία του, τα φαινόμενα που παρατηρήθηκαν από την έκφραση της α-συνουκλεΐνης ήταν πολύ ήπια, χωρίς μεγάλη πτώση της βιωσιμότητας των κυττάρων, χωρίς κυτταροπλασματικά συσσωματώματα της πρωτεΐνης, αλλά με πτώση της έκφρασης του SNCA στην στατική φάση, γεγονός που μπορεί να ερμηνεύει τον μη τοξικό φαινότυπο και τα εξισορροπημένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν. Επίσης, φάνηκε πως η δράση της συνθήκης ΗΕΟ δεν επηρεάζεται από την απουσία του Tsl1p. Με την δοκιμή της θεραπείας όλων των κυττάρων με χορήγηση εξωγενούς τρεχαλόζης στη στατική φάση ανάπτυξης παρατηρήθηκε ότι με αυτή την παρέμβαση η βιωσιμότητα των κυττάρων αυξήθηκε, ενώ δεν παρατηρήθηκαν κυτταροπλασματικά έγκλειστα στα κύτταρα που προηγουμένως τα έφεραν. Από τις μελέτες γονιδιακής έκφρασης φάνηκε πως η τρεχαλόζη ενεργοποίησε μεταγραφικά τον μηχανισμό της αυτοφαγίας στα κύτταρα αγρίου τύπου, αλλά αυτό δεν συνέβη στα κύτταρα tps1Δ, γεγονός που υποδηλώνει την σημαντικότητα της συνθάσης της τρεχαλόζης ως μόριο απαραίτητο για την μεταγραφική ενεργοποίηση του αυτοφαγικού μηχανισμού. Τέλος, διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση της α-συνουκλεΐνης με πρωτεΐνες του ζυμομύκητα. Για το σκοπό αυτό υπερεκφράστηκε μία χιμαιρική α-συνουκλεΐνη που υπεβλήθη σε αλληλεπίδραση με ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των αγρίου τύπου κυττάρων και των μεταλλαγμένων κυττάρων tps1Δ. Το μόριο που ταυτοποιήθηκε κατ’ εξοχήν να αλληλεπιδρά με την α-συνουκλεΐνη ήταν η αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) και δευτερευόντος η αλδολάση της διφωσφορικής φρουκτόζης. Οι πρωτεΐνες αυτές φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλά κυτταρικά μονοπάτια των κυττάρων S. cerevisiae.