Ο ρόλος των miRNAs που ενέχονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης στην εκτίμηση της έκβασης ασθενών με καρκίνο μαστού
Authors: Θωμοπούλου Κωνσταντίνα 
Published: November 2024

Ο ρόλος των miRNAs που ενέχονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης στην εκτίμησητης έκβασης ασθενών με καρκίνο μαστού. 1. Εισαγωγή: O καρκίνος του μαστού (ΚΜ) αποτελεί την κύρια αιτία νόσησης και τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες. Οι ασθενείς με πρώιμο ΚΜ μετά τη χειρουργική εξαίρεση της νόσου λαμβάνουν συμπληρωματική συστηματική θεραπεία με ή χωρίς τοπική ακτινοθεραπεία, όμως παρά τη θεραπεία, ένα σημαντικό ποσοστό αυτών θα αναπτύξει μεταστάσεις οι οποίες και αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου. Η έννοια της ανοσοεπιτήρησης, η οποία περιγράφει τη δυναμική σχέση μεταξύ του καρκίνου και του ανοσοποιητικού συστήματος, βασίζεται σε τρία στάδια: εξάλειψη, ισορροπία και διαφυγή. Η φάση εξάλειψης αναφέρεται στην επίθεση των κυττάρων της έμφυτης και επίκτητης ανοσίας για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα που επέζησαν της ανοσολογικής καταστροφής μπορούν στη συνέχεια να εισέλθουν στη φάση ισορροπίας όπου λαμβάνει χώρα η ανοσοεπιτήρηση. Η φάση διαφυγής αντιπροσωπεύει την τελική φάση της διαδικασίας, όπου ο όγκος μπορεί να αναπτυχθεί, να γίνει πλέον κλινικά εμφανής και να δημιουργήσει ένα ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον που τελικά οδηγεί σε περαιτέρω εξάπλωση του. Και στα τρία στάδια, τα καρκινικά κύτταρα, διάφορα υποσύνολα ανοσοκυττάρων και μόρια που συμμετέχουν στην κυτταρική επικοινωνία, όπως οι κυτοκίνες και τα μικρά μη-κωδικά μόρια RNA (microRNAs; miRNAs), διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο. Τα miRNAs, μια κατηγορία μικρών μη-κωδικοποιών μορίων RNA αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Τα miRNAs λειτουργώντας είτε ως ογκογονίδια (‘oncomirs’), είτε ως ογκοκατασταλτικά γονίδια (‘anti-oncomirs’), εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάλυση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miR-10b,miR-19a, miR-20a, miR-126 και miR-155 και τα οποία ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του ανοσολογικού συστήματος κατά την ανοσοεπιτήρηση και την ανοσοδιαφυγή, στο πλάσμα ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό ΚΜ και η συσχέτιση της έκφρασης αυτών με την έκβαση των ασθενών και με τελικό σκοπό την ανεύρεση ασθενών που φέρουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής και ενδεχομένως θα ωφελούνταν από επιπρόσθετους θεραπευτικούς χειρισμούς. 2. Ασθενείς και Μέθοδοι: Στη μελέτη αυτή συμμετείχαν διακόσιοι δεκαπέντε (Ν=215) ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση ακολουθούμενη από επικουρική θεραπεία στην Παθολογική Ογκολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου (ΠαΓΝΗ) μεταξύ 2004 και 2011 και διαθέσιμο πλάσμα αυτών χρησιμοποιήθηκε από τα αρχεία της κλινικής. Δείγμα αίματος συλλέχθηκε από τις ασθενείς μετά τη χειρουργική επέμβαση και πριν από τη χορήγηση επικουρικής θεραπείας. Επιπλέον, συμπεριελήφθησαν 74 ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού (mBC) που υποβλήθηκαν σε χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής κατά την ίδια περίοδο στο ίδρυμά μας. Ελήφθησαν δείγματα πλάσματος πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας πρώτης γραμμής. 20 υγιή άτομα συμμετείχαν ως ομάδα ελέγχου. Η απομόνωση του ολικού RNA έγινε με τη χρήση Trizol LS (Ambion Life Technologies). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ποσοτική realtime PCR, χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription kit και ειδικούς για miRNA stem-loop εκκινητές (primers). Τα επίπεδα έκφρασης για κάθε miRNA υπολογίσθηκαν με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔCt χρησιμοποιώνταςτο U6 snRNA ως γονίδιο αναφοράς. Ακολούθως η διάμεση τιμή των μονάδων έκφρασης για κάθε miRNA χρησιμοποιήθηκαν ως σημειο λήψης της απόφασης (cut-off) και ασθενείς με έκφρασητου εκάστοτε miRNA ίση ή πάνω από τη διάμεση τιμή χαρακτηρίζονταν ως έχοντες υψηλή έκφραση, ενώ ασθενείς με έκφραση miRNA κάτω από τη διάμεση τιμή ως έχοντες χαμηλή έκφραση. Η σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των κυκλοφορούντων miRNA και της επιβίωσης ελεύθερης νόσου (DFS) ή της συνολικής επιβίωσης (OS) αξιολογήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, το log rank test (Mantel-Cox) και τα μοντέλα Cox proportional hazard regression. Για την εκτίμηση της αξίας των κυκλοφορούντων miRNAs στην πρόβλεψη της υποτροπής 6 κατασκευάσθηκαν καμπύλες ROC (receiver operating characteristics) και υπολογίσθηκε η περιοχή κάτω από την καμπύλη (area under the curve, AUC). 3. Αποτελέσματα: Για την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα πλάσματος από 140 ασθενείς με πρώιμο KM,64 ασθενείς με μεταστατικό KM και 20 υγιείς γυναίκες. Μετά από μια διάμεση περίοδο παρακολούθησης 108,3 μηνών, 94 ασθενείς παρέμειναν ελεύθερες νόσου και 46 από τις 140 ασθενείς υποτροπίασαν. Στις ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ, οι 45 από τις 64 ήταν de novoμεταστατικές και οι 19 ήταν ασθενείς που υποτροπίασαν. Eπίσης, 31 ασθενείς είχαν τριπλά αρνητικό καρκίνο μαστού. Τα δημογραφικά και τα κλινικά χαρακτηριστικά ήταν παρόμοια μεταξύ των ασθενών που δεν υποτροπίασαν και αυτών που υποτροπίασαν, με εξαίρεση την αναλογία των ασθενών με όγκους> 5 εκ. (Τ3), 4 ή περισσότερους διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες και βαθμό διαφοροποίησης ΙΙΙ που ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με υποτροπή (p= 0.031, p < 0.001 καιp=0.034 αντιστοίχως). Τα επίπεδα έκφρασης των 5 miRNAs συγκρίθηκαν μεταξύ των ασθενών: (i) που υποτροπίασαν (n=46) και αυτών που παρέμειναν ελεύθεροι υποτροπής κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου παρακολούθησης (n=94), (ii) με πρώιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή εντός 2 ετών μετά το χειρουργείο (n=16) και αυτών που υποτροπίασαν μετά τα 2 χρόνια (n=30) (iii) μεόψιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή τουλάχιστον 5 έτη μετά το χειρουργείο (n=17) και αυτές που παρέμειναν χωρίς υποτροπή (n=94) (iv) με πρώιμο καρκίνο μαστού και μεταστατικό καρκίνο μαστού. Μόνο η έκφραση miR-155 ήταν χαμηλότερη σε ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς γυναίκες (p =0,023), ενώ τα miR-155 και miR-10b ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς που παρουσίασαν υποτροπήσε σύγκριση με υγιείς γυναίκες (p = 0,039 και p = 0,002, αντίστοιχα). Η έκφραση MiR-155 σε συνδυασμό με διήθηση μασχαλιαίου λεμφαδένα και τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου κατέδειξε αυξημένη ικανότητα στη διάκριση των ασθενών που υποτροπίασαν από αυτές που παρέμειναν ελεύθερες νόσου [(περιοχή κάτω από την καμπύλη, (AUC = 0,861; p < 0,001)]. Συνδυασμός της έκφρασης του miR-19a και miR-20a είχε την υψηλότερη απόδοση στη διάκριση ασθενών με πρώιμη υποτροπή (AUC = 0,816, p < 0,001). Τέλος, το miR-10b σε συνδυασμό με τη διήθηση ή όχι των λεμφαδένων και τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου είχαν την υψηλότερη ακρίβεια στη διάκριση ασθενών με όψιμη υποτροπή (AUC = 0,971, p < 0,001). Αποκαλύψαμε ένα πάνελ 4-miRNA αποτελούμενο από miR-19a, miR-20a, miR-126 και miR-155 ικανό να διακρίνειτις ασθενείς με πρώιμο από ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ με AUC 0,802 (p < 0,001). Η ανάλυση επιβίωσης σε ασθενείς με πρώιμο ΚΜ αποκάλυψε ότι η χαμηλή έκφραση miR-10b και miR-155 συσχετίστηκε με μικρότερη επιβίωση χωρίς νόσο (DFS, p = 0,012 και p = 0,04, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την υψηλή έκφραση. Επιπλέον, η έκφραση miR-126 συσχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση (OS, p = 0,045). Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, ο αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων και η χαμηλή έκφραση miR-10b προέβλεπαν ανεξάρτητα για μικρότερο DFS (HR: 2.538; p = 0.002 και HR: 1.943; p = 0.033, αντίστοιχα), ενώ διηθημένοι μασχαλιαίοι λεμφαδένες με χαμηλό miR-126 μικρότερο OS (HR: 3,537, p = 0,001 και HR: 2,558,p = 0,018). Στην υποομάδα ασθενών με τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού (TNBC), η χαμηλή έκφραση miR-155 προέβλεψε ανεξάρτητα για μικρότερο DFS (HR: 5,056, p = 0,037). Αντίστοιχα ασθενείς με μεταστατικό ΚΜ που είχαν χαμηλή έκφραση miR-10b ,είχαν μικρότερο DFS και OSσε σύγκριση με ασθενείς με υψηλή έκφραση (p = 0,0017 και p = 0,042, αντίστοιχα). Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, η υποτροπιάζουσα νόσος και η χαμηλή έκφραση miR-10b προέβλεπαν ανεξάρτητα για μικρότερο PFS (HR: 2.657; p = 0.001 και HR: 1.920; p = 0.017, αντίστοιχα). 4. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση των συγκεκριμένων miRNA που ενέχονται στην ανοσολογική απάντηση στο πλάσμα μπορούν να προβλέψουν την υποτροπή της νόσου σε ασθενείς με πρώιμο ΚΜ χρόνια πριν από την κλινική ανίχνευση. Η επιτυχής ενσωμάτωση των κυκλοφορούντων miRNAs στην κλινική πρακτική ως μη επεμβατικών βιοδεικτών, θα μπορούσε να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών σε μια προσπάθεια αντιμετώπισης της σημαντικής πρόκλησης της κλιμάκωσης ή αποκλιμάκωσης της θεραπείας ανάλογα με τον κίνδυνο υποτροπής σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, λόγω του μικρού δείγματος ασθενών και των πολλαπλών ρόλων των miRNAs , χρειάζεται να αξιολογηθούν σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών.