Γενετική μελέτη, εξελικτικές σχέσεις και δομική ανάλυση απακετυλασών
Authors: Ανδρέου Αθηνά 
Published: September 2021

Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών (PDAs) είναι ένζυμα που ανήκουν στις υδατανθρακικές εστεράσες της οικογένειας 4 (CE4) και δρουν σε πολυσακχαρίτες όπως είναι η πεπτιδογλυκάνη, η χιτίνη, η χιτοζάνη, και η ακετυλοξυλάνη. Τα μέλη της CE4 είναι κυρίως μεταλλοεξαρτώμενες υδρολάσες, από ένα ιόν συνήθως Zn2+ ή Co2+. Έχουν μια κοινή καταλυτική δομική ενότητα που ονομάζεται NodΒ.Τα γονιδιώματα των Bacillus cereus, και Bacillus anthracis, δύο συγγενικών ειδών που ανήκουν στην ομάδα B. cereus, έχουν πολλαπλά γονίδια απακετυλάσης πολυσακχαρίτη. Στην παρούσα διατριβή, προσδιορίστηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και παρουσιάζονται οι ακόλουθες πρωτεϊνικές δομές: οι φερόμενες απακετυλάσες πολυσακχαρίτη, Ba0331 (διακριτικότητας 2,59Å) και Βa0330 (διακριτικότητας 1,48Å) από το βακτήριο B. anthracis, το οποίο είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της ασθένειας του άνθρακα, καθώς και η απακετυλάση της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης, Bc1974 (διακριτικότητας 1,80Å), του B. cereus. Επίσης προσδιορίστηκαν και παρουσιάζονται οι κρυσταλλικές δομές συμπλόκων της Βc1974 με έξι προσδέτες, διακριτικότητας 1,45 Å έως 3,05Å οι οποίες αποτελούν τις πρώτες δομές συμπλόκων απακετυλάσης της πεπτιδογλυκάνης με μικρά-μόρια προσδέτες. Για τον καθορισμό φυλογενετικών σχέσεων στις οικογένειες γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη του Β. anthracis Ames (12 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) και του B. cereus ATCC14579 (11 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) χρησιμοποιήθηκαν οι αμινοξικές και οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που απαρτίζουν χωριστά τις δομικές ενοτήτες των PDAs. Η απεικόνιση των εξελικτικών γεγονότων στις δύο οικογένειες συνδυάστηκε και με την ανάλυση γονίδιων των PDAs από άλλα στελέχη του γένους Bacillus προκειμένου να ερευνηθούν εξελικτικές σχέσεις των γονιδίων PDAs. Διαδοχικά γεγονότα διπλοποίησης έχουν οδηγήσει σε ομάδες γονιδίων (ή υποοικογένειες) που εμφανίζουν μεταξύ τους μεγαλύτερη ομολογία σε σύγκριση με οποιοδήποτε άλλο γονίδιο εντός της κάθε οικογένειας. Αναλύθηκαν τα δύο παράλογα γονίδια bα0330 και ba0331 του Β. anthracis μέσω συγκεκριμένων διαφορών στην αλληλουχία των γονιδίων, στην αλληλουχία των πρωτεϊνών, στην δομή των πρωτεϊνών, καθώς και μέσω της διάταξής τους στο γονιδίωμα, της ανίχνευσης της δράσης της επιλογής στην εξέλιξη της γονιδιακής διπλοποίησης, και του κυτταρικού εντοπισμού των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους. Οι τρισδιάστατες δομές απακετυλασών της οικογένειας των γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη χρησιμοποιήθηκαν για την εξελικτική μελέτη της θέσης δέσμευσης μετά από γεγονότα διπλοποίησης. Μέσα από την εργασία αυτή υπογραμμίζεται η σημασία της επίστασης στην εξέλιξη των πρωτεϊνών. Η δομική συγκριτική ανάλυση συνολικά επτά (τεσσάρων υπαρχουσών στη βιβλιογραφία και τριών από την παρούσα εργασία) προσδιορισμένων PDAs των B. anthracis και B. cereus υποστηρίζει τα συμπεράσματα της ανάλυσης αλληλουχίας και καταδεικνύει την ύπαρξη δομικών τροποποιήσεων στον σχηματισμό της θέσης δέσμευσης, παρά την υψηλή συντήρηση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας της και του επίπεδου αναδίπλωσής της. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι τα τμήματα της αλληλουχίας που σχηματίζουν τη θέση δέσμευσης βρίσκονται υπό εξελικτική πίεση για να φιλοξενήσουν και να αναγνωρίσουν διακριτά κατάλοιπα πολυσακχαριτών ανάλογα με την κυτταρική θέση, τη χρήση ή το περιβάλλον. Εν κατακλείδι, η σύγκριση των κοιλοτήτων δέσμευσης του υποστρώματος μεταξύ των διαφόρων φερόμενων απακετυλασών πολυσακχαρίτη του Β. anthracis και του B. cereus αποκάλυψε αξιοσημείωτη ποικιλότητα ως προς το μέγεθος και το σχήμα της κοιλότητας, καθώς επίσης και ως προς τον τύπο των αμινοξέων που τις συνθέτουν, εντοπίζοντας στοιχεία απόκλισης στα λειτουργικά χαρακτηριστικά με ταυτόχρονη διατήρηση των διακριτών τοπικών δομικών χαρακτηριστικών στην οικογένεια των PDAs.