Ανίχνευση και ταυτοποίηση με κλασικές και μοριακές τεχνικές του αιτιολογικού παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε ασθενείς με κίρρωση
Authors: Μάλλη Εργίνα 
Published: September 2021

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια συχνή και σοβαρή επιπλοκή που αφορά στους ασθενείς με ασκίτη. Ορίστηκε για πρώτη φορά το 1971 ως η περιτονίτιδα που εμφανίζεται σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και συνοδό ασκίτη, στην οποία δεν ανευρίσκεται ενδοκοιλιακή πηγή λοίμωξης που να απαιτεί χειρουργική αντιμετώπιση (δευτεροπαθής βακτηριακή περιτονίτιδα). Κύριος παθογενετικός μηχανισμός της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας είναι η βακτηριακή διαμετάθεση, που ορίζεται ως η δίοδος ζώντων μικροβίων της εντερικής χλωρίδας, διαμέσου του εντερικού τοιχώματος σε εξωαυλικές εντοπίσεις. Είναι η πιο συχνή επιπλοκή λοιμώδους αιτιολογίας στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η διάγνωσή της βασίζεται στην αύξηση του απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπύρηνων στο ασκιτικό υγρό ≥250 κύτταρα/mm3, ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού. Ωστόσο η απομόνωση και η ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της λοίμωξης είναι πολύ σημαντική για τη χορήγηση της κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας. Σε μεγάλο ποσοστό ασθενών (60%) με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα, η καλλιέργεια, η οποία προτείνεται να γίνεται με ενοφθαλμισμό του ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών «παρά τη κλίνη» του ασθενούς, παραμένει στείρα. Το γεγονός αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη χαμηλή συγκέντρωση των μικροβιακών κυττάρων στο ασκιτικό υγρό (1 μικροοργανισμός ανά ml). Προκειμένου να διερευνηθεί ο αιτιολογικός μικροβιακός παράγοντας, παράλληλα με τη συμβατική καλλιέργεια έχουν χρησιμοποιηθεί μοριακές τεχνικές.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η δυνατότητα χρησιμοποίησης της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR στην ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε ασθενείς που νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας, κατά το διάστημα 2008-2017.Εξετάστηκαν 150 ασκιτικά υγρά (111 πυλαίας υπέρτασης και 39 μη πυλαίας υπέρτασης), 32 από τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα σύμφωνα με τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 10 ml ασκιτικού υγρού από κάθε ασθενή της μελέτης, ενοφθαλμίστηκαν σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών και άλλα 10 ml χρησιμοποιήθηκαν για την εφαρμογή ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR. Επιπλέον, η ίδια 16S rRNA PCR εφαρμόστηκε και στο υγρό της αιμοκαλλιέργειας που περιείχε το ασκιτικό υγρό, μετά την παρέλευση 14 ημερών επώασης. Στα δείγματα που η PCR έδωσε θετικό αποτελέσματα έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) προκειμένου να ταυτοποιηθεί ο μικροοργανισμός.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των καλλιεργειών, σε 4 από τις 32 περιπτώσεις αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας απομονώθηκε μικροοργανισμός (12.5%), ο οποίος ταυτοποιήθηκε ως Escherichia coli.H εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR απευθείας στο ασκιτικό υγρό των πασχόντων, ανέδειξε τον ίδιο μικροοργανισμό με την καλλιέργεια, μόνο σε μία περίπτωση (ευαισθησία 25%, ειδικότητα 100%, θετική και αρνητική προγνωστική αξία 100% και 92.3% αντίστοιχα). Αναφορικά με τον χρόνο του αποτελέσματος, το αποτέλεσμα της PCR προηγήθηκε κατά 3 ημερών του αποτελέσματος της καλλιέργειας. Από την άλλη μεριά, η εφαρμογή της μοριακής μεθόδου στα υγρά των φιαλιδίων της αιμοκαλλιέργειας ταυτοποίησε γενετικό υλικό συγκεκριμένου μικροοργανισμού σε 5 περιπτώσεις. Εκτός από τις 4 θετικές αιμοκαλλιέργειες, όπου ταυτοποιήθηκε E. coli, ταυτοποίησε και μια επιπλέον περίπτωση από Brucella spp, η οποία δεν είχε ανιχνευθεί με την καλλιέργεια. Ο συγκεκριμένος ασθενής είχε θετική αιμοκαλλιέργεια από τον ίδιο μικροοργανισμό και πολύ υψηλό τίτλο Wright-Coombs.Συμπερασματικά η εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR σε ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα απευθείας στο ασκιτικό υγρό, δε φαίνεται να είναι ιδιαίτερα βοηθητική. Αντίθετα η παράταση της επώασης των φιαλιδίων με το ασκιτικό υγρό από 5 ημέρες που είναι το σύνηθες, σε 14 ημέρες, βοηθά σημαντικά στην ανάδειξη του μικροοργανισμού. Η εφαρμογή της ευρέος φάσματος PCR σε όλα τα φιαλίδια που είναι αρνητικά μετά τον παρατεταμένο χρόνο επώασης βοηθά σημαντικά, ιδιαίτερα στην ανίχνευση απαιτητικών μικροοργανισμών.