Μελέτη και χαρακτηρισμός ενζύμων για την αντιμετώπιση της ανθεκτικότητας έναντι βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων
Authors: Γεωργακής Νικόλαος 
Published: November 2021

Το φαινόμενο της γενικευμένης πολλαπλής ανθεκτικότητας, που πλέον παρατηρείται κατά την εφαρμογή παρασιτοκτόνων (π.χ. ζιζανιοκτόνων, εντομοκτόνων κ.τ.λ.), αλλά και κατά τη χορήγηση θεραπευτικών σκευασμάτων στον τομέα της υγείας, όπως είναι τα αντιβιοτικά, αντι-ρετροϊικά κ.ά. έχει καταστεί παγκόσμια απειλή και αποτελεί μείζον ζήτημα για την αειφορία του αγροτικού τομέα και της δημόσιας υγείας, αντίστοιχα. Η επιτυχής αλλά και εντατική εφαρμογή των αντιμικροβιακών ενώσεων, καθώς και των παρασιτοκτόνων, οδήγησε σε επαναλαμβανόμενα φαινόμενα ανθεκτικότητας, τα οποία οφείλονται κυρίως στο αποτέλεσμα της ανθρωπογενούς εξελικτικής πίεσης, που εφαρμόζεται λόγω μείωσης των πληθυσμών των ανεπιθύμητων μικροοργανισμών ή ζιζανίων. Στα πλαίσια της πολλαπλής ανθεκτικότητας, επιλέχθηκαν περιπτώσεις εμφάνισης του φαινομένου αυτού, οι οποίες διακρίνονται σε δύο βασικούς άξονες. Ο πρώτος περιλαμβάνει το φαινόμενο της πολλαπλής ανθεκτικότητας που εμφανίζεται σε βιοτικούς παράγοντες. Ένας σχετικός βιοτικός παράγων είναι τα πολυανθεκτικά βακτήρια, τα οποία προκαλούν επικίνδυνες λοιμώξεις σε όλο τον κόσμο, λόγω φαινομένων ανθεκτικότητας έναντι των αντιβιοτικών. Η άμεση απειλή για την ανθρώπινη υγεία καθοδηγεί την έρευνα στην ανάπτυξη νέων και καινοτόμων αντιβακτηριακών ενώσεων. Ο δεύτερος άξονας περιλαμβάνει την πολλαπλή ανθεκτικότητα, που οφείλεται σε αβιοτικούς παράγοντες, όπως τα ζιζανιοκτόνα, που σκοπό έχουν τον έλεγχο των πολυανθεκτικών ζιζανίων στις αγροτικές καλλιέργειες. Έχοντας σαν απώτερο σκοπό την εύρεση καινοτόμων τρόπων αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας, επιχειρήθηκε, αρχικά, η έρευνα στο πεδίο των πολυανθεκτικών βακτηρίων, με ιδιαίτερη έμφαση στα βακτήρια Acinetobacter baumannii και Staphylococcus aureus. Το ζητούμενο ήταν η εξεύρεση ενός τρόπου αντιμετώπισης μέσω υδρολυτικών ενζύμων (ενδολυσίνες), που προέρχονται από βακτηριοφάγους, τα οποία έχουν την ικανότητα να υδρολύουν την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Αν και η προσέγγιση είναι γνωστή από πιο παλιά, η διαφοροποίηση έρχεται ως προς την εξεύρεση ενζύμων με ιδιαίτερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά επιλέγοντας ως πηγή αναζήτησης μεταγονιδωματικές βιβλιοθήκες προερχόμενες από ακραία περιβάλλοντα βιοποικιλότητας. Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκε το περιβάλλον των θερμών πηγών από το νησί της Λέσβου. Με δειγματοληψίες χώματος σε τέσσερις διαφορετικές τοποθεσίες του νησιού, έγινε απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA και, στη συνέχεια, ακολούθησε αλληλούχηση της υπερμεταβλητής περιοχής V3-V4 του 16S rRNA με σκοπό τη μελέτη των βακτηριακών κοινοτήτων που αναπτύσσονται στα εν λόγω περιβάλλοντα. Η γενική επισκόπηση της βακτηριακής κοινότητας που υπάρχει, οδήγησε στην κατά προσέγγιση ταυτοποίηση ορισμένων θερμόφιλων και υπερθερμόφιλων βακτηριακών ειδών, όπου για την αναζήτηση γονιδίων υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης σχεδιάστηκαν εκκινητές για την εξεύρεση ομόλογων ακραιόφιλων ενζύμων. Η αναζήτηση οδήγησε στην ανακάλυψη μιας Ν-ακετυλομουραμοϋλ-L-αλανινο-αμιδάσης της πεπτιδογλυκάνης τύπου 2 (NALAA 2), η οποία παρουσιάζει οξεόφιλο χαρακτήρα, καθώς λειτουργεί σε περιβάλλον όξινου pH, και αυξημένη θερμική σταθερότητα, ενώ ταυτόχρονα, φαίνεται να εμφανίζει εξειδίκευση ως προς τα βακτήρια του γένους Staphylococcus. Παράλληλα, έγινε συγκριτική μελέτη δύο υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης, της LysK από τον βακτηριοφάγο Κ, που προσβάλλει τον S. aureus, και της LysAB2 από τον βακτηριοφάγο ΑΒ2 που προσβάλλει το A. baumannii. Τα δύο προαναφερθέντα ένζυμα εμφανίζουν συγκριτικά χαμηλότερη θερμική σταθερότητα σε σχέση με την αμιδάση της θερμής πηγής, ωστόσο, ως προς την εξειδίκευση, η LysK παρουσιάζει το μεγαλύτερο εύρος δράσης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, πραγματοποιήθηκε μελέτη ενζύμων, που εμπλέκονται στην εμφάνιση της πολλαπλής ανθεκτικότητας που αναπτύσσεται σε ζιζάνια εξαιτίας της εφαρμογής των ζιζανιοκτόνων. Δύο ζιζάνια τα οποία εμφανίζουν ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα πολυανθεκτικότητας είναι το Alopecurus myosuroides και το Lolium rigidum. Τα υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας έχουν συνδεθεί με αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου τρανσφεράση της γλουταθειόνης που ανήκει στην τάξη Phi (GSTF). Επιλέγοντας τις συγκεκριμένες GSTFs (AmGSTF και LrGSTF), καθώς και δύο ομόλογες αλληλουχίες από τα καλλιεργούμενα φυτά Triticum aestivum (TaGSTF) και Hordeum vulgare (HvGSTF) έγινε συγκριτική μελέτη των τεσσάρων ενζύμων και αξιολόγηση της ικανότητας ενός συνόλου ενώσεων, να προκαλεί αναστολή στα εν λόγω ένζυμα. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η συνδυαστική χρήση με ήδη υπάρχοντα εμπορικά σκευάσματα ζιζανιοκτόνων για τον μετριασμό των φαινομένων ανθεκτικότητας. Επιπρόσθετα, επιλύθηκε η κρυσταλλική δομή δύο εξ αυτών (AmGSTF και LrGSTF), γεγονός που παρέχει περισσότερη γνώση ως προς τον μηχανισμό δράσης των ενζύμων αυτών, που συμβάλλουν στην πολυανθεκτικότητα, αλλά και ως προς την ευκολία σχεδιασμού ειδικού φαρμακοφόρου για την πρόκληση αναστολής της ενζυμικής δράσης.