Engineered interfaces with polyelectrolyte multilayers, lipid bilayer membranes and virosomes for biomedical applications
Authors: Διαμαντή Ελευθερία 
Published: March 2023

Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει διαφορετικές προσεγγίσεις για την επιφανειακή μηχανική μέσω πολυστρωματικών πολυηλεκτρολυτών (PEM), μόνες ή σε συνδυασμό με λιπιδικές διπλές στοιβάδες και ιοσώματα γρίπης για βιοϊατρικές εφαρμογές.Στο κεφάλαιο 1, τα PEM της πολυ-L-λυσίνης (PLL) και του άλατος νατρίου αλγινικού οξέος (Alg) κατασκευάζονται με την εφαρμογή της τεχνικής στρώσης προς στρώμα (LbL) και ανόπτονται σε σταθερές θερμοκρασίες. 37, 50 και 80 °C, για 72 ώρες. Το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM) αποκαλύπτει αλλαγές στην τοπογραφία του PEM, το οποίο αλλάζει από ινώδη σε λεία επιφάνεια μετά την ανόπτηση. Η γωνία επαφής προώθησης στο νερό κυμαίνεται από 36° πριν από την ανόπτηση έως περίπου 93°, 77° και 95° μετά την ανόπτηση στους 37, 50 και 80°C αντίστοιχα. Οι αλλαγές στην επιφανειακή ενέργεια μετά την ανόπτηση υπολογίστηκαν από μετρήσεις γωνίας επαφής προώθησης και υποχώρησης που πραγματοποιήθηκαν με νερό και με οργανικούς διαλύτες. Οι αλλαγές στις φυσικές ιδιότητες των ΡΕΜ ερμηνεύονται ως αποτέλεσμα της αναδιοργάνωσης των πολυηλεκτρολυτών στα ΡΕΜ από μια πολυεπίπεδη δομή σε σύμπλοκα όπου ενισχύεται η αλληλεπίδραση πολυκατιόντων και πολυανιόντων. Τα PEM βιολογικής προέλευσης έχουν πολλές πιθανές εφαρμογές στη μηχανική ιστών και την αναγεννητική ιατρική. Ωστόσο, η απαλότητα των βιοσυμβατών PEM έχει ως αποτέλεσμα περιορισμένη κυτταρική προσκόλληση. Η θερμική ανόπτηση προτείνεται ως μια νέα στρατηγική για την ενίσχυση της κυτταρικής προσκόλλησης στα PEM. Μελετάται η επίδραση της θερμικής ανόπτησης στους 37 °C, στην προσκόλληση των κυτταρικών γραμμών του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα A549 και του μυοβλάστου C2C12. Η κυτταρική προσκόλληση, που μετράται από την προβαλλόμενη μέση εξάπλωση των κυττάρων και την εστιακή επαφή, είναι αξιοσημείωτα βελτιωμένη για τα ανοπτημένα PEM. Μικροϊσορροπία κρυστάλλων χαλαζία με διάχυση (QCM-D), γωνία επαφής και μετρήσεις φασματοσκοπίας φθορισμού δείχνουν σημαντική μείωση στην προσρόφηση της πρωτεΐνης λευκωματίνης ορού βοοειδών στα PEM μετά την ανόπτηση. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια απλή μέθοδο για τον συντονισμό της διαβρεξιμότητας των βιο-ΡΕΜ, τη βελτίωση της κυτταρικής πρόσφυσης και την παροχή αντιρρυπαντικών χαρακτηριστικών.Στο κεφάλαιο 2, η αυτοσυναρμολόγηση μικρών λιποσωμάτων (SUVs) μικτών λιπιδίων αμφιτεριονικής φωσφατιδυλοχολίνης (DOPC, PC) και ανιονικής φωσφατιδυλοσερίνης (DOPS, PS) φωσφολιπιδίων πάνω από PEM της υδροχλωρικής πολυ(αλλυλαμίνης), ως α (PAH) πολυκατιόν, και το πολυ(4-στυρενοσουλφονικό νάτριο) (PSS), ως πολυανιόν, διερευνάται ως συνάρτηση της σύνθεσης των συναρμολογημένων κυστιδίων μέσω QCM-D, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας κρυοδιαβίβασης (CryoTEM), AFM και ατομικής δύναμης φασματοσκοπία (AFS). Κυστίδια με μοριακά ποσοστά PS μεταξύ 50 % και 70 % έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας διπλοστοιβάδας λιπιδίων πάνω από τα PEM. Μελέτες AFS που πραγματοποιήθηκαν με πρόβολο τροποποιημένου με PAH που πλησιάζει και αποσύρεται από τα συγκροτήματα λιπιδίων αποκαλύπτουν ότι η κύρια αλληλεπίδραση μεταξύ PAH και λιπιδίων λαμβάνει χώρα μέσω δεσμών υδρογόνου μεταξύ των αμινών ομάδων του PAH και των καρβοξυλικών και φωσφορικών ομάδων του PS και με τις φωσφορικές ομάδες του Η/Υ.Η επίδραση της επιφανειακής χημείας των ΡΕΜ στο σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων μελετάται επίσης για ΡΕΜ με πολυ(χλωριούχο διαλλυλδιμεθυλαμμώνιο) (PDADMAC) ως πολυκατιόν και ανώτερο στρώμα και PSS ως πολυανιόν. Τα SUV που αποτελούνται από DOPC και DOPS σε μοριακή αναλογία 50:50 εναποτίθενται πάνω από φιλμ PEM και μελετώνται μέσω QCM-D και ανάκτησης φθορισμού μετά τη φωτολεύκανση (FRAP). Η εναπόθεση των SUV σε PDADMAC/PSS έχει ως αποτέλεσμα την προσρόφηση κυστιδίων ενώ σε PAH/PSS υπό τις ίδιες συνθήκες σχηματίζεται μια διπλή στιβάδα. Οι μετρήσεις FRAP επιβεβαιώνουν ότι τα SUV δεν έχουν υποστεί ρήξη πάνω από το PDADMAC/PSS. Αναλύεται επίσης ο ρόλος των φωσφορικών ιόντων, σε διάλυμα, στο σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων. Η φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίου ακτίνων Χ (XPS) δείχνει τη συμπλοκοποίηση των φωσφορικών αλάτων με τις πρωτοταγείς αμίνες του PAH και καμία αλληλεπίδραση με τις τεταρτοταγείς αμίνες του PDADMAC. Οι μετρήσεις δυναμικού (z-potential) δείχνουν δυναμικό κοντά στα 0 mV για τα πολυστρωματικά PAH/PSS στο PBS ενώ τα PDADMAC/PSS εμφανίζουν δυναμικό 38 mV. Παρουσιάζεται ένα μοντέλο για το σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων σε PAH/PSS PEM λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των φωσφορικών ιόντων στη μείωση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ SUV και PEM και τον σχηματισμό δεσμών υδρογόνου μεταξύ των φωσφολιπιδίων και των πρωτοταγών αμινών της PAH.Τα πειράματα QCM-D και FRAP δείχνουν ότι όταν κυστίδια με λιπιδική σύνθεση 50:50 DOPC:DOPS απορροφώνται σε PEM όπου το PSS αντικαθίσταται από Alg ή πολυ(ακρυλικό οξύ) (PAA), η εναπόθεση κυστιδίων δεν οδηγεί σε σχηματισμό διπλής στιβάδας αλλά σε επιθέματα διπλής στιβάδας μαζί με προσροφημένα άθικτα κυστίδια. Επομένως, η σύντηξη της διπλής στιβάδας λιπιδίων δεν επηρεάζεται μόνο από το τελευταίο στρώμα που εναποτίθεται που αλληλεπιδρά κυρίως με τα λιπίδια αλλά και από τη συνολική σύνθεση του φιλμ ΡΕΜ.Στο κεφάλαιο 3, τα SUV που παρασκευάζονται από ένα μείγμα DOPC:DOPS 30:70 συναρμολογούνται πάνω σε ένα μαξιλάρι PEM PAH/PSS και οι ηλεκτρικές ιδιότητες της διπλής στρώσης μελετώνται με φασματοσκοπία ηλεκτροχημικής αντίστασης (EIS). Η διπλή στρώση που υποστηρίζεται στα PEM παρουσιάζει υψηλή αντίσταση, της τάξης των 107 Ω cm2, η οποία είναι ενδεικτική μιας συνεχούς, πυκνής διπλής στρώσης. Αυτή η αντίσταση είναι συγκρίσιμη με την αντίσταση των μαύρων λιπιδικών μεμβρανών, καθώς είναι η πρώτη φορά που αυτές οι τιμές λαμβάνονται για διπλές στοιβάδες λιπιδίων που υποστηρίζονται σε PEM. Η συναρμολόγηση πολυηλεκτρολυτών πάνω από μια λιπιδική διπλοστοιβάδα μειώνει την αντίσταση της διπλής στιβάδας έως και 2 τάξεις μεγέθους. Έτσι η συναρμολόγηση των πολυηλεκτρολυτών στη λιπιδική διπλοστοιβάδα προκαλεί ελαττώματα ή πόρους στη διπλή στιβάδα που ακολουθείται από μια επακόλουθη μείωση της αντίστασης.Τέλος, αυτή η διατριβή πραγματεύεται, στο Κεφάλαιο 4, τη σύντηξη ανοσοδιεγερτικών ανασυσταθέντων ιοσωμάτων γρίπης (IRIVs) με τη λειτουργική γλυκοπρωτεΐνη ιικού φακέλου, αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ), σε τεχνητές υποστηριζόμενες λιπιδικές μεμβράνες που συναρμολογούνται σε PAH/PSS PEMs τόσο στα κολλοειδή όσο και στα υποστρώματα. . Ο προσδιορισμός R18 χρησιμοποιείται για να αποδείξει τη σύντηξη των IRIV σε εξάρτηση από το pH, τη θερμοκρασία και τη συγκέντρωση ΗΑ. Τα IRIV εμφανίζουν μηχανισμό σύντηξης που εξαρτάται από το pH, που συντήκεται σε χαμηλό pH σε αναλογία με τον ιό της γρίπης. Η συμπεριφορά που εξαρτάται από το pH επιβεβαιώνεται από το QCM-D. Η απεικόνιση AFM δείχνει ότι σε χαμηλό pH τα ιοσώματα είναι ενσωματωμένα στην υποστηριζόμενη μεμβράνη εμφανίζοντας κολακευμένα χαρακτηριστικά και μειωμένο κατακόρυφο πάχος. Η σύντηξη IRIVs προσφέρει μια νέα στρατηγική για τη μεταφορά βιολογικών λειτουργιών σε τεχνητές υποστηριζόμενες μεμβράνες με πιθανές εφαρμογές στη στοχευμένη παροχή και ανίχνευση.