Ανάλυση του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών με μεθοδολογία αλληλούχησης μεγάλης κλίμακας σε ασθενείς με λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα
Authors: Γεμενετζή Αικατερίνη 
Published: June 2021

Ο Β κυτταρικός υποδοχέας (ΒκΥ) διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι νεόπλασμα Β λεμφοκυττάρων και εμφανίζει μεγάλη βιολογική και κλινική ετερογένεια. Ανοσογενετικές μελέτες στη ΧΛΛ που εστίασαν στα χαρακτηριστικά των κλωνοτυπικών αναδιατάξεων των ανοσοσφαιρινών ανέδειξαν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του φορτίου των σωματικών μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV της κλινικής πορείας των ασθενών. Επιπλέον, αναγνωρίστηκε η μοριακή στερεοτυπία του ΒκΥ που είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ και αφορά στην επιλεκτική έκφραση συγκεκριμένων συνδυασμών γονιδίων των ανοσοσφαιρινών με αποτέλεσμα να προκύπτουν περιοχές CDR3 με συντηρημένα αμινοξικά μοτίβα. Οι ασθενείς με ΧΛΛ που ανήκουν στο ίδιο στερεότυπο υποσύνολο μοιράζονται κλινικά χαρακτηριστικά και συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα σχετίζονται πλέον με ιδιαίτερη πρόγνωση. Στην εργασία 1 διερευνήθηκε ο αντίκτυπος της αντιγονικής διέγερσης στη διαμόρφωση του ρεπερτορίου του στερεότυπου ΒκΥ σε διαχρονικά δείγματα ασθενών που κατατάσσονται στο κλινικά ήπιο στερεότυπο υποσυνόλο #4 εφαρμόζοντας μεθοδολογία next generation sequencing (NGS). Ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε σύγκριση του ρεπερτορίου με αυτό ασθενών που έφεραν κλωνοτυπικές αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-34 αλλά δεν κατατάσσονται σε στερεότυπο υποσύνολο. Τα διαφορετικά ανοσογενετικά προφίλ που αναγνωρίστηκαν μεταξύ των ασθενών των δύο υποομάδων υποδεικνύουν την ύπαρξη παρόμοιων αλλά διακριτών μονοπατιών παθογένεσης και εξέλιξης. Τα διακριτά πρότυπα κλωνικής εξέλιξης στους ασθενείς του υποσυνόλου #4 είναι χαρακτηριστικά συνεχιζόμενης αλληλεπίδρασης με αντιγόνα. Τέλος, η ανάλυση των διαχρονικών δειγμάτων διευκόλυνε την μελέτη της κλωνικής εξέλιξης, η οποία έδειξε ότι τα πρότυπα αυτά καθορίζονται σε πρώιμο στάδιο κατά τη λευχαιμογένεση υπογραμμίζοντας περαιτέρω τη σημασία της επιλογής από αντιγόνα στη διαμόρφωση της δυναμικής του κλωνικού πληθυσμού. Tο στερεότυπο υποσύνολο #2 (IGHV3-21/IGLV3-21, ~2.5% του συνόλου της ΧΛΛ) αποτελεί «πρότυπο» επιθετικής νόσου ανεξάρτητα από το φορτίο της ΣΥΜ, ενώ το συγγενές υποσύνολο #169 εμφανίζει παρόμοια ανοσογενετικά και κλινικά χαρακτηριστικά. Στην εργασία 2 διερευνήθηκε περαιτέρω η σχέση των δύο υποσυνόλων με αλληλούχηση NGS και κρυσταλλογραφική ανάλυση του κλωνοτυπικού ΒκΥ. Ο κυρίαρχος κλώνος εμφάνισε ιδιαίτερη αρχιτεκτονική που προκύπτει από ενδοκλωνική ετερογένεια στα πλαίσια συνεχιζόμενης δράσης της ΣΥΜ τόσο στη βαριά όσο και στην ελαφριά αλυσίδα και των δύο υποομάδων. Οι μοριακές ομοιότητες μεταξύ των δύο υποομάδων υπογραμμίστηκαν από την ανεύρεση κοινών σωματικών μεταλλάξεων και στις δύο αλυσίδες είτε σε κλωνικό είτε σε υποκλωνικό επίπεδο. Επίσης, η κρυσταλλογραφική ανάλυση αποκάλυψε ότι ο ΒκΥ του υποσυνόλου #169 διατηρεί την ίδια γεωμετρία στον χώρο και πραγματοποιεί τις ίδιες αλληλεπιδράσεις που σχετίζονται με την ικανότητα αυτοαναγνώρισης με τον ΒκΥ του υποσυνόλου #2. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν τη συγγένεια των δύο υποσυνόλων που μπορεί να εξηγηθεί μόνο στο πλαίσιο κοινής αντιγονικής επιλογής.Προκειμένου να αναλυθούν τα ανοσογενετικά δεδομένα που παράχθηκαν στα πλαίσια των προηγούμενων δύο εργασιών, στην εργασία 3 σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε το “T-cell Receptor/Immunoglobulin Profiler (TRIP)”, μια πλατφόρμα λογισμικού που παρέχει υπηρεσίες ανάλυσης δεδομένων από αλληλουχίες υποδοχέων της προσαρμοστικής ανοσίας αξιοποιώντας τη βιβλιοθήκη R Shiny, η οποία επιτρέπει την κατασκευή διαδραστικών διαδικτυακών εφαρμογών απευθείας μέσω της γλώσσας R. Το TRIP παρέχει λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την χρήση των γονιδίων V, D, και J, την αμινοξική και νουκλεοτιδική σύνθεση της περιοχής CDR3 και την κλωνικότητα των εξεταζόμενων δειγμάτων, καθώς επίσης διευκολύνει τη μελέτη της δράσης της ΣΥΜ στη μεταβλητη περιοχή των αλυσίδων του ΒκΥ αλλά και την αξιολόγηση των μεμονωμένων μεταλλάξεων. Τέλος, το TRIP σχεδιάστηκε με σκοπό να διευκολύνει το έργο τόσο των έμπειρων όσο και των λιγότερο έμπειρων χρηστών.Συνολικά, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση της οντογένεσης της ΧΛΛ και της κλωνικής εξέλιξης των λευχαιμικών κυττάρων όσον αφορά στα ανοσογενετικά τους χαρακτηριστικά και τις οντογενετικές σχέσεις ασθενών με ΧΛΛ που ανήκουν σε διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα. Ταυτόχρονα, τα ευρήματα της μελέτης επισημαίνουν το ρόλο και τη σημασία των σωματικών μεταλλάξεων στην αντιγονική αναγνώριση και την σηματοδοτική ικανότητα του ΒκΥ.