Ανάπτυξη μη επεμβατικής προγεννητικής διαγνωστικής μεθόδου για την ανίχνευση της β-θαλασσαιμίας στον κυπριακό πληθυσμό
Authors: Παπασάββα-Ρούσου Θεσσαλία 
Published: July 2014

Η β-θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο κοινές κληρονομικές παθήσεις στην Κύπρο με ποσοστό φορέων που ανέρχεται στο 14% του πληθυσμού. Έχουν βρεθεί 7 διαφορετικές μεταλλάξεις της β-θαλασσαιμίας που αποτελούν το 98% των περιπτώσεων με τη μετάλλαξη IVSI-110 να είναι η πιο κοινή και αποτελεί το 79.8% του συνόλου. Για την προγεννητική διάγνωση της β-θαλασσαιμίας, χρησιμοποιείται κυρίως βιοψία του πλακούντα κατά την 11η εβδομάδα της κύησης ή αμνιοκέντιση στη 15η εβδομάδα. Οι δύο μέθοδοι είναι επεμβατικές και εμπεριέχουν περίπου 1-2% κίνδυνο για αυτόματη αποβολή του εμβρύου καθώς και ψυχολογική κόπωση και σωματική δυσφορία. Η πρόσφατη ανακάλυψη της παρουσίας εξωκυτταρικού ελεύθερου εμβρυϊκού γενετικού υλικού στην μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης σε συνδυασμό με την εφαρμογή των νέων μοριακών τεχνικών για την ανάλυση γονιδιωματικών δεικτών άνοιξε νέους ορίζοντες και οδήγησε πολλά ερευνητικά κέντρα στην μελέτη της παρουσίας αυτού του γενετικού υλικού κατά τη διάρκεια της κύησης και την χρησιμοποίησή του στην μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Το γεγονός ότι το εμβρυϊκό DNA στο μητρικό πλάσμα έχει πάρα πολύ μικρή συγκέντρωση, αποτελεί μέχρι 10% του συνολικού, ενώ μετρημένο με ψηφιακή PCR έχει βρεθεί να είναι μεγαλύτερο το ποσοστό, μέχρι και 20%, είναι θρυμματισμένο και κατακερματισμένο, και το ότι λίγα είναι γνωστά για το εμβρυϊκό DNA αποτελεί μία τεχνική πρόκληση και καθιστά δύσκολη την ανίχνευσή του. Ο βασικός σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη μη επεμβατικής προγεννητικής μεθόδου για τη διάγνωση της β-θαλασσαιμίας με την ανίχνευση των πατρικών κληρονομουμένων αλληλομόρφων που βρίσκονται στο εμβρυϊκό DNA το οποίο κυκλοφορεί στο μητρικό πλάσμα. Η προσέγγιση βασίζεται στην ανάλυση πολυμορφισμών που βρίσκονται στο σύμπλεγμα γονιδίων της β-σφαιρίνης. Για την ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου χρησιμοποιήθηκαν και αναλύθηκαν οι τεχνολογίες AS-RTPCR, μικροσυστοιχίες thalassochip/APEX, και στοχευμένη αλληλούχιση νέας γενιάς με την πλατφόρμα Illumina και δοκιμάστηκαν οι ανιχνευτές PNAs με αυτόματη αλληλούχιση. Για την εύρεση της καταλληλότερης μεθόδου για την απομόνωση του εμβρυϊκού DNA από το πλάσμα έγινε συγκριτική μελέτη μεταξύ των QIAamp DNA Blood Mini Kit και του QIAamp DSP Virus kit της Qiagen η οποία έδειξε ότι η QIAamp DSP Virus kit της Qiagen να είναι η βέλτιστη επιλογή και η οποία χρησιμοποιήθηκε κατά κύριο μέρος στην παρούσα μελέτη. Αργότερα αξιολογήθηκε η δυνατότητα του καινούριου kit από την Qiagen, το QIAamp circulating nucleic acid kit, συγκρίνοντας το παράλληλα με το QIAamp DSP Virus kit και αφού έδειξε ότι αποδίδει περισσότερο, επιλέχθηκε ως το κύριο kit απομόνωσης εμβρυϊκού DNA και χρησιμοποιήθηκε κατά τα τελευταία στάδια της παρούσας διατριβής. Στα αρχικά στάδια της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης για το Y χρωμόσωμα σε δείγματα μητρικού πλάσματος με άρρεν έμβρυο για επιβεβαίωση ανίχνευσης εμβρυϊκού DNA, και ως ρύθμιση και τυποποίηση των συνθηκών για την ανίχνευση εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα στην προσπάθεια ανάπτυξης της μεθόδου για την διάγνωση της β-θαλασσαιμίας, αλλά και ως εσωτερικός μάρτυρας θετικής ανίχνευσης εμβρυϊκού DNA. Η εύρεση κατάλληλων πολυμορφισμών που θα χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ έγινε ως εξής: Για την αναγνώριση πολυμορφισμών με υψηλή ετεροζυγωτία πραγματοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση 140 πολυμορφισμών που βρίσκονται στη συστάδα γονιδίων της β-σφαιρίνης σε 75 τυχαία δείγματα από τον ελληνικό πληθυσμό της Κύπρου. Η διαδικασία αυτή έγινε με τη μέθοδο της MALDI TOF Mass Array της Sequenom. Οι πολυμορφισμοί που παρουσίασαν ψηλό βαθμό ετεροζυγωτίας, αξιολογήθηκαν στη συνέχεια, σε 101 ζευγάρια φορείς για να καθοριστεί η καταλληλότητα τους για ΜΕΠΔ. 49 πολυμορφισμοί παρουσίασαν πάνω από 10% ετεροζυγωτία και ως εκ τούτου επιλέχθηκαν με σκοπό να εξεταστεί η καταλληλότητα και η δυναμική τους αξία ως δείκτες για ΜΕΠΔ β-θαλασσαιμίας και να προσδιοριστεί ο αριθμός των οικογενειών που επωφελούνται από αυτή, καθορίζοντας τους πληροφοριακούς πολυμορφισμούς ανά οικογένεια. Η αξιολόγηση αυτή έδειξε ότι 72.27% των ζευγαριών είχαν 3 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς και πάνω και ως εκ τούτου κρίθηκαν κατάλληλα για ΜΕΠΔ. Μία από τις προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ της β-θαλασσαιμίας ήταν η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για ενίσχυση ειδικών αλληλομόρφων (AS-RTPCR). Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου εξετάστηκαν για τον πολυμορφισμό rs10837631 χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA όπου ανιχνεύτηκε το αναμενόμενο έλασσον αλληλόμορφο. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε δείγματα μητρικού πλάσματος για τον πιο πάνω πολυμορφισμό όπου παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ανίχνευση πατρικού κληρονομούμενου αλληλομόρφου. Λόγω της χαμηλής ευαισθησίας που παρουσίασε η μέθοδος όμως, αποφασίστηκε η μη συνέχισή της. Η δεύτερη μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη της ΜΕΠΔ ήταν η τεχονολογία των μικροσυστοιχιών και η ανάπτυξη του Τhalassochip, το οποίο βασίζεται στη μέθοδο της μονοβασικής επέκτασης του εκκινητή, APEX. Επιλέχθηκαν αρχικά 21 πολυμορφισμοί και οι οποίοι αξιολογήθηκαν για την καταλληλότητα τους για να τοποθετηθούν στο thalassochip και να αναλυθούν με τη μέθοδο APEX. Μετά την αξιολόγησή τους το τελικό thalassochip που προέκυψε περιέχει συνολικά 18 πολυμορφισμούς. Η μέθοδος εξετάστηκε ως προς την ευαισθησία και ειδικότητα της χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA. Στη συνέχεια η μέθοδος εφαρμόστηκε σε δείγματα μητρικού πλάσματος από ζευγάρια φορείς με κίνδυνο θαλασσαιμικού εμβρύου. Σε πρώτη φάση αναλύθηκαν 34 δείγματα μητρικού πλάσματος σε 3 πολυμορφισμούς οι οποίοι ήταν πληροφοριακοί για τις επιλεγμένες οικογένειες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την πρώτη φάση παρατηρήθηκε ότι ποσοστό 79.3%, έδωσαν το σωστό αποτέλεσμα ενώ παρατηρήθηκε ψευδή αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 1 δείγμα και ψευδής θετική ανίχνευση σε 5 δείγματα. Σε δεύτερη φάση αναλύθηκαν 10 οικογένειες οι οποίες είχαν από 2 μέχρι 6 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν ανιχνεύθηκε με επιτυχία το πατρικό αλληλόμορφο σε 18 από τις 30 (60%) περιπτώσεις που αναλύθηκαν. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ψευδής αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 5 (16.7%) περιπτώσεις, και ψευδής θετική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 7 (23.3%) περιπτώσεις. Με τη μέθοδο αυτή η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου ήταν κατορθωτή, παρουσιάζοντας όμως αρκετά τεχνικά προβλήματα. Παρόλη την προσπάθεια που καταβλήθηκε να βελτιωθεί η μέθοδος, αυτό δεν έγινε δυνατό, οπότε δοκιμάστηκαν νέες τεχνολογιών.Προκειμένου να βελτιωθούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης του μητρικού πλάσματος διερευνήθηκαν εναλλακτικές μέθοδοι για επιλεκτική ενίσχυση του εμβρυϊκού αλληλομόρφου όπως οι ανιχνευτές PNAs. Η αποδοτικότητα των PNAs αξιολογήθηκε κατά τις οποίες παρατηρήθηκε η καταστολή του μείζονος αλληλομόρφου και η επιλεκτική ενίσχυση του ελάσσονος στον ένα πολυμορφισμό ενώ για τον άλλο παρατηρήθηκε ψευδή ανίχνευση του άλλου αλληλομόρφου. Ωστόσο, η χρονοβόρα αξιολόγηση των ανιχνευτών PNA που είναι απαραίτητο να καθοριστεί για την κάθε μετάλλαξη/πολυμορφισμό και το κάθε υπό εξέταση δείγμα σε συνδυασμό με το υψηλό κόστος αγοράς τους καθιστούν την προσέγγιση αυτή όχι και τόσο ελκυστική. Ως εκ τούτου, αποφασίστηκε η μη συνέχιση αυτής της προσέγγισης. Στην συνέχεια της παρούσης μελέτης αξιολογήθηκε επίσης η εφαρμογή της στοχευμένης αλληλούχισης νέας γενιάς με την πλατφόρμα Illumina. Αρχικά έγινε μια προκαταρκτική μελέτη σε 5 πολυμορφισμούς όπου έγινε κατορθωτή η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου στις περιπτώσεις που κληρονομήθηκε για τους 3 πολυμορφισμούς. Στη συνέχεια, καθορίστηκε η ειδικότητα της μεθόδου με την ανάλυση γενωμικού DNA. Η αξιοπιστία της μεθόδου αξιολογήθηκε με την ανάλυση μητρικού πλάσματος από 10 οικογένειες οι οποίες είχαν 3 μέχρι 4 πληροφοριακούς πολυμορφισμούς. Έγινε κατορθωτή η διαφοροποίηση και η ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου σε 8 περιπτώσεις, ενώ σε 18 περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκε κανένα διαφορετικό αλληλόμορφο από αυτό της μητέρας που υποδηλώνει την αρνητική ανίχνευση του πατρικού αλληλομόρφου. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν 4 ψευδή αρνητικά αποτελέσματα και 4 ψευδή θετικά. Τα δεδομένα που προέκυψαν έδειξαν ότι η παρατηρούμενη διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου είναι 66.7% και 81.8% αντίστοιχα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι με τη μέθοδο της στοχευμένης αλληλούχισης και την ανάλυση των πολυμορφισμών είναι εφικτή η ανίχνευση του πατρικού κληρονομούμενου αλληλομόρφου. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για βελτίωση των ποσοστών αυτών και για απάλειψη των ψευδών θετικών. Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια να διαπιστωθεί αν είναι εφικτή η ΜΕΠΔ με την ανάλυση απλοτύπων από τα αποτελέσματα που προέκυψαν. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν και με την ανάλυση απλοτύπων, ΜΕΠΔ πραγματοποιήθηκε σε 7 από τις 10 οικογένειες. Με την ανάλυση των απλοτύπων, τονίστηκε η αναγκαιότητα και σημασία του ψηλού αριθμού πολυμορφισμών για την κάθε οικογένεια ούτως ώστε να εκμηδενίζεται η πιθανότητα λάθους ΜΕΠΔ. Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα:1.Οι προσεγγίσεις που ακολουθήθηκαν στην παρούσα διατριβή και τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν το σημαντικό ρόλο των πολυμορφισμών στη ΜΕΠΔ και την αναγκαιότητα ύπαρξης πολλών πληροφοριακών πολυμορφισμών για κάθε οικογένεια που ενδέχεται να αυξήσει το συνολικό ποσοστό της ευαισθησίας της ΜΕΠΔ και να εκμηδενίσει το ποσοστό σφάλματος. Με τη χρησιμοποίηση πολλαπλών πολυμορφισμών είναι εφικτή η ανάλυση των απλοτύπων για ΜΕΠΔ. 2.Η ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων πατρικής προέλευσης στο μητρικό πλάσμα και ΜΕΠΔ είναι δυνατή με διάφορες τεχνολογίες. Παρατηρήθηκαν όμως προβλήματα στην ευαισθησία και ειδικότητά τους που χρήζουν βελτίωσης. Αξιοσημείωτο συμπέρασμα που προέκυψε είναι η παρουσία των ψευδών θετικών. 3.Η Νέας Γενιάς Αλληλούχιση, ωστόσο, παρουσιάζει μεγαλύτερη ακρίβεια και αξιοπιστία στη διαφοροποίηση και ανίχνευση εμβρυϊκών αλληλομόρφων πατρικής προέλευσης και αποτελεί σήμερα την κύρια τεχνολογία ανάλυσης του μητρικού πλάσματος για τη ΜΕΠΔ στον επιστημονικό τομέα. 4.Η ανάλυση των πατρικών αλληλομόρφων στο μητρικό πλάσμα περιορίζεται μόνο στο 50% των κυήσεων, αυτών δηλαδή που φέρουν το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Ωστόσο, αυτός ο περιορισμός μπορεί να ξεπεραστεί με τη χρησιμοποίηση προσέγγισης κατάλληλης για ανίχνευση του μητρικού αλληλομόρφου όπως την Ανάλογη Δοσολογία Μετάλλαξης (Relative Mutation Dosage-RMD).Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στην τυποποίηση αποτελεσματικής μεθοδολογίας μη επεμβατικής διάγνωσης για τη β-θαλασσαιμία. Εισηγήσεις για μελλοντική ανάπτυξη θα ήταν να βελτιωθεί η διαγνωστική αποτελεσματικότητα, ακρίβεια και αξιοπιστία της στοχευμένης νέας γενιάς αλληλούχισης με την εξάλειψη των ψευδών θετικών και ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων με τη χρησιμοποίηση περισσότερων δειγμάτων με περισσότερα αντίγραφα. Επίσης, χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο αριθμό πολλαπλών πολυμορφισμών ανά δείγμα προς ανάλυση, θα βελτιωθεί η ευαισθησία και η ακρίβεια της ΜΕΠΔ και θα εκμηδενιστεί η πιθανότητα διαγνωστικού λάθους.