Bacillus strains as feed additives: In vitro evaluation of its potential probiotic properties
Authors: Lee Jaekoo , Park Inkyung , Choi Yunjaie , Cho Jaiesoon 
Published: August 2024

Summary  Background: much recent attention has been devoted to the genuine value of Bacillus species as multifunctional probiotic products, which produce various extracellular enzymes that enhance feed digestibility as well as many antimicrobial compounds for the purpose of improving animal performance. Objective: to describe novel, in vitro potential probiotic properties such as acid tolerance, bile tolerance, safety, and antimicrobial activity of mesophilic and psychrophilic Bacillus strains in conjunction with their extracellular enzymatic activities. Methods: four Bacillus strains (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isolated from different sources were used. Strains were identified according to 16S rDNA sequences. Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus were used as indicator bacteria for the antimicrobial activity trial. Strains were activated and cultured in tryptic soy broth (pH 7.0) or broth solidified with 1.5% agar. Results: B. sp. JSP1 was fully resistant to both pH 2 and 3, whereas B. sp. SM2 showed relatively good viability at pH 3. All strains tolerated oxgall (0.3%) bile salt and were not cytotoxic to the HEK 293 human embryonic kidney cells. Three strains, except B. sp. T3, displayed differential production of extracellular enzymes including amylase, xylanase, cellulase, protease, phytase, and α-galactosidase. In particular, B. sp. SM2 inhibited six indicator pathogens: Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus. Conclusion: the single use of B. sp. SM2 or the mixed use of the strain combined with acid or bile tolerant Bacillus strains secreting extracellular enzymes may be an alternative to antibiotics as a feed additive in farm animal production. Key words: acid tolerance, animal performance, antimicrobial, bile tolerance, enzymes. Resumen Antecedentes: recientemente el valor de las especies de Bacillus como productos probióticos multifuncionales ha recibido bastante atención, debido a que estos producen varias enzimas extracelulares que potencian la digestibilidad de los alimentos, así como también compuestos antimicrobianos que mejoran el desempeño del animal. Objetivo: describir y evaluar potenciales propiedades probióticas "in vitro" -tales como acidez, tolerancia a la bilis, seguridad y actividad antimicrobiana- de cuatro cepas de Bacilos (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2 y B. sp. JSP1) aisladas de diferentes fuentes, en conjunción con sus actividades enzimáticas extracelulares. Métodos: se usaron cuatro cepas de Bacillus (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) aisladas de diferentes fuentes. Las cepas se identificaron de acuerdo a secuencias 16S rDNA. Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, y Staphylococcus aureus fueron empleadas como bacterias indicadoras para el ensayo de actividad antimicrobiana. Las cepas fueron activadas y cultivadas en caldo soya tripticasa (PH 7.0) o caldo solidificado con 1.5% de agar. Resultados: el B. sp. JSP1 resultó totalmente resistente tanto a pH 2 como a pH 3, mientras que el B. sp. SM2 mostró viabilidad relativamente alta a pH 3. Todas las cepas toleraron oxgall (0.3%) de sales biliares y no resultaron citotóxicas para las células humanas HEK 293 de riñón embrionario. Tres cepas, con excepción de B. sp. T3, presentaron producción diferencial de enzimas extracelulares -incluyendo amilasa, xilanasa, celulasa, proteasa, fitasa y α–galactosidasa. En particular, el B. sp. SM2 inhibió seis indicadores patógenos (Escherichia coli K88, E. coli O157: H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus). Conclusiones: el uso específico de B. sp. SM2, o el uso combinado de esta cepa junto con cepas secretoras de enzimas extracelulares y tolerantes a ácidos o bilis puede ser una alternativa para reemplazar los antibióticos frecuentemente usados como aditivos en alimentación animal. Palabras clave: antimicrobianos, desempeño animal, enzimas, tolerancia a la acidez, tolerancia a la bilis. Resumo Antecedentes: o valor das espécies de Bacillus como produtos probióticos multifuncionais tem recebido bastante atencäo recentemente, devido a que produzem várias enzimas extracelulares que potenciam a digestibilidade dos alimentos, como também compostos antimicrobianos que melhoram o desempenho do animal. Objetivo: descrever e avaliar as propriedades potenciais "in vitro" - como acidez, tolerancia á bile, seguranca e atividade antimicrobial- de quatro cepas de Bacilos (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isoladas de diferentes fontes, em conjunto com as suas atividades enzimáticas extracelulares. Métodos: foram usadas quatro cepas de Bacillus (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isoladas de diferentes fontes. As cepas foram identificadas de acordo ás sequéncias 16S rDNA. As seguintes bactérias foram empregadas como indicadoras no teste de atividade antimicrobiana: Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, y Staphylococcus aureus. As cepas foram ativadas e cultivadas em caldo soja tripticase (pH 7.0) ou caldo solidificado com 1.5 de Agar. Resultados: o B. sp. JSP1 foi totalmente resistente tanto no pH 2.0 como no pH 3.0, enquanto que o B. sp. SM2 mostrou viabilidade relativamente alta no pH 3.0. Todas as cepas toleraram oxgall (0.3%) de sais biliares e näo foram citotóxicas para as células humanas HEK 293 de rim embrionário. Tres cepas, com excecäo de B. sp. T3, apresentaram producäo diferenciada de enzimas extracelulares -incluindo amilase, xilanase, celulase, protease, fitase e α–galactosidase. Particularmente, o B. sp, SM2 inibiu seis indicadores patógenos (Escherichia coli K88, E. coli O157: H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus). Conclusöes: O uso específico de B. sp. SM2 ou o uso combinado desta cepa junto com as cepas secretoras de enzimas extracelulares e tolerantes a ácidos ou bile, pode ser uma alternativa para substituir os antibióticos frequentemente usados como aditivos na alimentacäo animal.Palavras chave: antimicrobianos, desempenho animal, enzimas, tolerancia á acidez, tolerancia á bile.