Investigation of interactions between porcine endogenous retroviruses (PERV) and susceptible host cells
Authors:   , Flecks Merle 
Published: February 2025

Die Xenotransplantation (XTx) vom Schwein auf den Menschen hat das Potenzial, den Mangel an menschlichen Allotransplantaten zu beheben. Trotz der erheblichen Fortschritte der letzten Jahre kann das zoonotische Risiko durch die potenzielle Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs) nicht ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zu den meisten porzinen Pathogenen können PERVs nicht durch eine pathogenfreie Zucht eliminiert werden, da sie in das Schweinegenom integriert sind. Daher ist die Erzeugung von PERV-freien Spendertieren und deren Schutz vor einer Reinfektion eine Voraussetzung für die Sicherheit der XTx.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Virus-Wirt Interaktion von PERV untersucht, um Strategien zur Verhinderung einer (Re-)Infektion und zur Bewertung des von PERV ausgehenden Infektionsrisikos zu entwickeln.
Im ersten Projekt wurde das Potential der retroviralen Superinfektionsresistenz (SIR) untersucht, primär infizierte Zellen vor einer Superinfektion mit einem Virus desselben Typs zu schützen. Um das Vorhandensein einer SIR für PERV zu bestätigen, wurde PERV-C zunächst mit einem Hämagglutinin-Anhang (HA-Anhang) versehen. Dies ermöglichte die Unterscheidung zwischen Viren aus einer Primärinfektion oder Superinfektion. Nachfolgend wurden die funktionellen PERV-C-HA Viren verwendet, um PERV-C-positive Zellen zu infizieren. Es wurde keine Superinfektion der PERV-C positiven Zellen nachgewiesen, wodurch der SIR-Mechanismus für PERV bestätigt wurde. Basierend auf dieser Beobachtung wurden Strategien zur Nutzung des SIR-Mechanismus zur Verhinderung einer PERV-Infektion untersucht. Daten zu anderen Retroviren deuten darauf hin, dass die SIR meist durch die intrazelluläre oder extrazelluläre Bindung von Hüllproteinen (Env) vermittelt wird. Ein vergleichbarer Mechanismus wird für PERV erwartet. Um das Potenzial der Expression von Env-Proteinen als Schutz gegen PERV-Infektionen zu untersuchen, wurden Env-exprimierende Zelllinien erzeugt und auf ihre Anfälligkeit für PERV-Infektionen untersucht. Im Rahmen dieser Studie konnte keine Resistenz gegen PERV erzielt werden. Dieses Ergebnis ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Env-Proteine nicht an die Zelloberfläche transportiert wurden. Folglich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PERV-SIR auf die extrazelluläre Bindung von Env an den Zelloberflächenrezeptor angewiesen ist.
In einem weiteren Ansatz wurden synthetische Peptide, die den Sequenzen der PERV-Rezeptor-Bindedomäne entsprachen, in kompetitiven Inhibitionsstudien verwendet. Die Ergebnisse zeigten die potenzielle Anwendbarkeit von Peptiden für die weitere Untersuchung des PERV-Rezeptor-Bindungsprozesses. Darüber hinaus deuten die vorläufigen Ergebnisse dieser Thesis darauf hin, dass die PERV-Infektion durch Peptide gehemmt werden kann.
Der zweite Teil der Thesis zielte auf die Identifizierung des/der PERV-C Rezeptor(en) ab. Hierzu wurden Env-Proteine für die Reinigung mittels Affinitätschromatographie und Rezeptor-Pull-Down-Assays exprimiert. Die Bindung der gereinigten Env-Proteine an ST IOWA-Zellen, welche natürlicherweise den PERV-C-Rezeptor tragen, zeigte die generelle Anwendbarkeit der verwendeten Expressionssysteme für die Produktion von EnvC-Proteinen als Liganden für nachfolgende Pull-Down-Assays. Jedoch wurde eine hohe Anzahl an co-eluierenden Proteinen beobachtet, was auf die Notwendigkeit einer Optimierung des Reinigungsprotokolls hinwies, um effiziente Pull-Down-Assays zu ermöglichen. Daher wurden die Experimente pausiert und alternative Strategien in Betracht gezogen. Hierbei wurden solute carrier (SLC)-Rezeptoren als potenzielle Gruppe von PERV-C-Rezeptoren untersucht. In einem theoretischen Ansatz wurden acht SLC-Rezeptoren ausgewählt, die als die viel-versprechendsten Kandidaten vorgeschlagen werden, um diese in einer Rezeptorbibliothek mit natürlicherweise nicht PERV-C-suszeptiblen Zellen zu testen.
Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Bewertung der Risiken, die mit der potenziellen Übertragung von PERV verbunden sind. Zu diesem Zweck wurde die Anzahl der neu integrierten PERV-Proviren, die aus der Infektion von ST-IOWA-Zellen mit PERV-C resultierten, quantifiziert und lokalisiert. Durch droplet digital PCR wurde das Vorhandensein von 2-13 proviralen Kopien pro Chromosomensatz gezeigt. Zusätzlich wurden mögliche chromosomale Positionen der Proviren bestimmt, um potentielle Auswirkungen der PERV-Integration auf die Wirtszelle zu untersuchen. Im Vergleich zu einer randomisierten Kontrolle konnte eine präferierte Integration in der Nähe von Transkriptionsstartstellen gezeigt werden. Ebenfalls wurde die Integration in genkodierende Bereiche bestätigt. Folglich ist das Risiko einer veränderten Genexpression mit potentiell negativen Effekten für den Transplantat-empfänger gegeben. Aufgrund der primären Integration in intergenische Bereiche ohne regulatorische Abschnitte ist die Berücksichtigung der proviralen Kopienzahl von Relevanz. Eine hohe Zahl an Proviren nach einer Infektion deutet dabei auf eine stärkere Expression funktionaler Viren hin. Weiterhin ist das statistische Risiko, dass bei der Integration wichtige regulatorische oder proteinkodierende Bereiche getroffen werden, erhöht.
Zusammenfassend tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zu einem umfassenden Verständnis der Virus-Wirt-Interaktionen von PERV bei. Durch die Bestätigung der SIR für PERV und erste Hinweise auf das Potential der Inhibition von PERV durch Env-Peptide wurden Möglichkeiten zur Prävention einer PERV (Re)Infektion vorgestellt. Die Kombination aus Kopienzahlquantifizierung und chromosomaler Lokalisierung bietet ein Instrument zur Bewertung des Risikos im Zusammenhang mit der Übertragung von PERV.