Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού παρασιτοκτόνων σε ιχθυοκαλλιέργειες και εκτίμηση επικινδυνότητας
Authors: Καψή Μαργαρίτα 
Published: September 2021

Η εντατική χρήση των φυτοπροστατευτικών ενώσεων στις γεωργικές και μη δραστηριότητες έχει σαν αποτέλεσμα την ανίχνευση τους, τόσο αυτών όσο και των μεταβολιτών τους, στα επιφανειακά ύδατα. Η ανάγκη ανάπτυξης ευαίσθητων, αξιόπιστων, οικονομικών και φιλικών προς το περιβάλλον αναλυτικών μεθόδων, για τον έλεγχο της υπολειμματικότητάς τους σε διάφορα περιβαλλοντικά υποστρώματα έχει γίνει ευρέως αντιληπτή διεθνώς. Σε εθνικό επίπεδο, οι έρευνες που αφορούν τις επιπτώσεις σε παράκτιες περιοχές είναι περιορισμένες. Ακόμα λιγότερες είναι οι έρευνες που αφορούν περιοχές με έντονη δραστηριότητα υδατοκαλλιεργειών, που αποτελούν σημαντική εν δυνάμει πηγή θαλάσσιας ρύπανσης. Προκειμένου να εξαχθεί ένα ασφαλές συμπέρασμα για την ρύπανση ενός οικοσυστήματος είναι επιτακτική η ανάγκη ανάλυσης εκτός των υδατικών δειγμάτων και άλλων υποστρωμάτων όπως τα ιζήματα και οι φυτικοί- ζωικοί οργανισμοί. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή βελτιστοποιήθηκαν, επικυρώθηκαν και εφαρμόστηκαν αναλυτικές μεθοδολογίες με στόχο τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε υποστρώματα όπως νερά, ιζήματα, μύδια (Mytilus galloprovincialis), ψάρια-γοβιοί (gobio-gobio), αχινούς (Paracentrotus lividus) και στο υδρόβιο μακρόφυτο Lemna minor. Στη συνέχεια οι μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν στον υγρότοπο του Δέλτα των ποταμών Αξιού, Λουδία, Αλιάκμονα καθώς επίσης και σε επτά χώρες προκειμένου να εκτιμηθεί η ρύπανση από την παρουσία φυτοπροστατευτικών ενώσεων από γεωργική και υδατοκαλλιεργητική δραστηριότητα. Για τον προσδιορισμό των ενώσεων, χρησιμοποιήθηκε σύστημα αέριου χρωματογράφου συζευγμένο με φασματομετρία μάζας (GC-MS) και σύστημα υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας(LTQ/Orbitrap LC-MS). Η επικύρωση των μεθόδων πραγματοποιήθηκε βάσει της ισχύουσας νομοθεσίας της ΕΕ, όπως αυτή ορίζεται στην οδηγία 2002/657/ΕΚ. Για την ανάπτυξη της μαγνητικής εκχύλισης στερεάς φάσης (MSPE) συντέθηκαν νέα μαγνητικά υλικά σιδήρου τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως προσροφητικά υλικά στην (MSPE). Αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς την δομή- μορφολογία και τις ιδιότητες, με τεχνικές NMR, FT- IR, TGA, SEM, DSC, XRD, ESI-MS και BET. Για την αξιολόγηση των κύριων επιδράσεων και των τυχόν αλληλεπιδράσεων των σημαντικότερων παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση της MSPE, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη πειραματικού σχεδιασμού βασιζόμενη στο σχέδιο Box-Behnken Design (BBD). Τέλος οι βέλτιστες συνθήκες της προτεινόμενης μεθοδολογίας εκχύλισης, υπολογίστηκαν μέσω της συνάρτησης επιθυμητότητας (desirability function) του στατιστικού πακέτου STATISTICA7.0. Τα μαγνητικά υλικά χαρακτηρίζονται από μεγάλη σταθερότητα και παρέχουν τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης, χωρίς να παρατηρείται μεταφορά των αναλυτών από το προσροφητικό (carry- over effect). Η προτεινόμενη μέθοδος υδατικών δειγμάτων MSPE συγκρίθηκε με την υγρή στερεή εκχύλιση (SPE). Επιλέχθηκαν δύο αναλυτικά πρωτόκολλα, ένα για κάθε μείγμα ενώσεων (μείγμα Ι & ΙΙ), με διαφοροποιήσεις ως προς το προσροφητικό υλικό των μικροστηλών, τον διαλύτη ενεργοποίησης-έκλουσης και την ιοντική ισχύ. Για τις φυτοπροστατευτικές ενώσεις του μείγματος Ι στα ποτάμια νερά, οι τιμές των ανακτήσεων κυμάνθηκαν μεταξύ 71,3 και 99,1 % στο μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού ενώ για τα θαλασσινά νερά, οι ανακτήσεις ήταν ελαφρώς υψηλότερες 72-111 %. Η επαναληψιμότητα RSDr%-Intra και η αναπαραγωγιμότητα RSDR%-Inter ήταν μικρότερη από 14%. Τα όρια ποσοτικοποίησης ήταν μεταξύ 3,3 και 40 ng/L για το ποτάμιο νερό και 3,3 και 33 ng/L θαλασσινό. Για το μείγμα ΙΙ, οι ανακτήσεις σε θαλασσινό νερό κυμάνθηκαν μεταξύ 90,1 και 97,5 % στο μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού. Η επαναληψιμότητα RSDr%-Intra ήταν μικρότερη από 8,9 % και η αναπαραγωγιμότητα RSDR%-Inter ήταν μικρότερη από 11,2 % για όλους τους αναλύτες. Τέλος, τα όρια ποσοτικοποίησης κυμάνθηκαν μεταξύ 0,3 και 12,5 ng/L. Η εκχύλιση των επιλεγμένων ενώσεων από τα στερεά υποστρώματα όπως: αχινοί (Paracentrotus lividus), μύδια (Mytilus gallopoviancialis), ψάρια-γοβιοί (Gobio-gobio) και το υδρόβιο μακρόφυτο (Lemna Minor) πραγματοποιήθηκε με τη σύγχρονη, οικονομική και «φιλική προς το περιβάλλον» μέθοδο QuEChERS ακολουθούμενη από το στάδιο του καθαρισμού (clean-up) με εκχύλιση στερεάς φάσης σε διασπορά (d-SPE).Παράγοντες βελτιστοποίησης αποτέλεσαν το pH, η ποσότητα δείγματος, ο όγκος νερού, οι χρόνοι εκχύλισης και περιδίνησης καθώς επίσης και διαφορετικοί συνδυασμοί προσροφητικών για τον καθαρισμό των εκχυλισμάτων. Τα αποτελέσματα από την επικύρωση της μεθόδου QuEChERS για τα παραπάνω πρωτόκολλα, επιβεβαιώνουν την καταλληλόλητά της για τον προσδιορισμό των επιλεγμένων ενώσεων στα παραπάνω υποστρώματα. Πιο συγκεκριμένα, για το μείγμα Ι στα ιζήματα οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 51,2 και 118 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 29 ng/g. Στους γοβιούς (gobio-gobio), οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 53,6 και 109 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 26 ng/g. Για τα μύδια (Mytilus gallopoviancialis), οι ανακτήσεις υπολογίστηκαν εντός εύρους 51,6-108 %, τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ 3,3 και 16 ng/g, ενώ για τους αχινούς (paracentrotus lividus) οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 52,2 έως 103 %, το όρια ποσοτικοποίησης από 3,3 έως 33 ng/g. Για το υδρόβιο μακρόφυτο Lemna Minor οι ανακτήσεις υπολογίστηκαν μεταξύ 59,1 και 116 % ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης μεταξύ από 3,3 έως 33 ng/g. Για τις ενώσεις του μείγματος ΙΙ στα ιζήματα οι ανακτήσεις της μεθόδου QuEChERS κυμάνθηκαν μεταξύ 84,3 και 106 %, τα όρια ποσοτικοποίησης από 3,3 έως 29 ng/g, ενώ για το υπόστρωμα των αχινών, οι ανακτήσεις της μεθόδου QuEChERS κυμάνθηκαν μεταξύ 85,9 και 103 % και τα όρια ποσοτικοποίησης από 2,9 έως 31 ng/g.Με βάση τις παραπάνω μεθοδολογίες, ερευνήθηκε η παρουσία των επιλεγμένων φυτοπροστατευτικών ενώσεων στον υγρότοπο του Δέλτα των ποταμών Αξιού, Λουδία, Αλιάκμονα, έναν υδροβιότοπο μεγάλης περιβαλλοντικής σημασίας και έκτασης, ο οποίος προστατεύεται από τις συνθήκες Ramsar και Βέρνης. Συνολικά ορίστηκαν 15 σημεία δειγματοληψίας επί των ποταμών από τις πηγές μέχρι και τις εκβολές στον Θερμαϊκό κόλπο. Κατά την περίοδο Ιανουάριος 2018 έως Σεπτέμβριος 2018 πραγματοποιήθηκαν τρεις δειγματοληψίες και συλλέχθηκαν πάνω από 80 δείγματα. Οι συχνότερα απαντώμενες ενώσεις στα νερά ήταν οι resmethrin, parathion-methyl και irgarol, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν οι ενώσεις ethoxyquine, chlorothalonil και chlorpyriphos-methyl. Αναφορικά με τα ιζήματα, το 70 % των δειγμάτων ήταν απαλλαγμένα από φυτοπροστατευτικές ενώσεις. Συνολικά ανιχνεύθηκαν επτά φυτοπροστατευτικές ενώσεις τα εντομοκτόνα parathion-methyl, permethrin, chlorpyriphos και λ-cyhalothrin, τα ζιζανιοκτόνα atrazine και irgarol (βιοκτόνο) και το μυκητοκτόνο chlorothalonil. Τα επίπεδα συγκεντρώσεων που ανιχνεύθηκαν κυμαίνονται από 12,3 ng/g για το atrazine έως 78,2 ng/g για το permethrin. Στους γοβιούς (gobio-gobio) ανιχνεύθηκαν δύο φυτοπροστατευτικές ενώσεις, τα εντομοκτόνα chlorpyriphos (9,3 ng/g) και λ-cyhalothrin (18,1 ng/g), ενώ στα μύδια (Mytilus galloproviancialis) ανιχνεύθηκε μόνο το εντομοκτόνο chlorpyriphos με συγκεντρώσεις 10,1 ng/g (Απρίλιος ’18) και 14,1 ng/g (Σεπτέμβριος ’18) αντίστοιχα. Στο υδρόβιο μακρόφυτο L.Minor, δεν ανιχνεύθηκε καμία φυτοπροστατευτική ένωση πάνω από το όριο ποσοτικοποίησης. Επιπρόσθετα, στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού ερευνητικού έργου «Real-time monitoring of sea contaminants by an autonomous Lab-on-a-chip biosensor», οι προτεινόμενες μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν σε περιοχές της Ελλάδα και σε χώρες με έντονη υδατοκαλλιεργητική δραστηριότητα όπως η Αλβανία, Ιταλία, Ισπανία, Πορτογαλία, Νορβηγία και το Ηνωμένο Βασίλειο. Το βιοκτόνο irgarol ανιχνεύθηκε σε δείγματα ιζήματος που συλλέχθηκαν από την Πορτογαλία (95,2 ng/g) και από το Ην. Βασίλειο (1,3 ng/g). Η ίδια ένωση ανιχνεύθηκε και σε ένα υδατικό δείγμα από την Ιταλία με συγκέντρωση 4,3 ng/g. Τέλος, στα δείγματα αχινών δεν ανιχνεύθηκε καμία φυτοπροστατευτική ένωση πάνω από το όριο ποσοτικοποίησης.Η εκτίμηση της επικινδυνότητας (οξείας και χρόνιας) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του πηλίκου για τα τρία τροφικά επίπεδα (φύκη, ασπόνδυλα και ψάρια). Από τους υπολογισμούς των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα οξείας τοξικότητας, σοβαρότερες πιέσεις δέχεται η ταξινομική ομάδα του ζωοπλαγκτόν. Υψηλή τοξικότητα εμφάνισαν οι ενώσεις parathion-methyl, chlorpyriphos, resmethrin και permethrin. Τα ζιζανιοκτόνα atrazine και irgarol παρουσίασαν πολύ υψηλό κίνδυνο για τα άλγη RQ>1, γεγονός που σχετίζεται με την δράση τους έναντι των φυτών-εχθρών, μπλοκάροντας τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης. Για την ομάδα των ψαριών, υψηλό κίνδυνο εμφάνισαν οι ενώσεις chlorpyriphos, resmethrin, permethrin και λ-cyhalothrin. Ο υπολογισμός των πηλίκων επικινδυνότητας για τα δεδομένα χρόνιας τοξικότητας στα φύκη, κατέδειξε ότι καμία φυτοπροστατευτική ένωση δεν εμφανίστηκε υψηλή τοξικότητα. Η ταξινομική ομάδα των ψαριών δέχεται τις σοβαρότερες πιέσεις από την παρουσία των φυτοπροστατευτικών ενώσεων και συγκεκριμένα των εντομοκτόνων chlorpyriphos, resmethrin, permethrin και λ-cyhalothrin. Τέλος, για την ταξινομική ομάδα του ζωοπλακτόν, πολύ υψηλό κίνδυνο παρουσίασαν τα εντομοκτόνα chlropyriphos και λ-cyhalothrin.