Χαρακτηρισμός και διερεύνηση της ανθεκτικότητας στη φωσφίνη πληθυσμών κολεοπτέρων αποθηκών με διαφορετική γεωγραφική προέλευση
Authors: Σακκά Μαρία 
Published: November 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκε και αξιολογήθηκε η ανθεκτικότητα πληθυσμών κολεοπτέρων αποθηκευμένων γεωργικών προϊόντων και τροφίμων με διαφορετική γεωγραφική προέλευση στο αέριο εντομοκτόνο φωσφίνη (ΡΗ3). Στο πλαίσιο αυτό, η διατριβή αυτή αποτελείται από αυτοτελείς δράσεις ως προς τον προσδιορισμό της ανθεκτικότητας στη φωσφίνη, οι οποίες περιλαμβάνουν την αξιολόγηση του επιπέδου ανθεκτικότητας με τη χρήση διαφορετικών πρωτοκόλλων, τη μελέτη των βιολογικών παραγόντων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα, την διερεύνηση της ανθεκτικότητας σε μοριακό επίπεδο, τη μελέτη άλλων εντομοκτόνων για την ύπαρξη διασταυρούμενης ανθεκτικότητας, τη χρήση της φωσφίνης σε εφαρμογές πεδίου και τέλος τις εναλλακτικές εφαρμογές για την αντιμετώπιση εντόμων αποθηκών. Σκοπός της έρευνας αυτής είναι η συμβολή στη γνώση του επιπέδου της ανθεκτικότητας σε διάφορες περιοχές του κόσμου (συμπεριλαμβανομένης και της χώρας μας), ο προσδιορισμός των επιπτώσεων της ανθεκτικότητας σε βασικές βιολογικές παραμέτρους των εντόμων, καθώς και η διερεύνηση γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Συνοψίζοντας, η έρευνα αυτή αποσκοπεί στην καλύτερη διαχείριση της ανθεκτικότητας με σκοπό τη διερεύνηση μεγάλου αριθμού παραγόντων που σχετίζονται με αυτή.Ειδικότερα στην πρώτη πειραματική ενότητα πραγματοποιήθηκε συλλογή εντόμων από διαφορετικές περιοχές στον κόσμο. Συλλέχθηκαν πάνω από 400 διαφορετικοί πληθυσμοί εντόμων αποθηκών. Στο πλαίσιο της διατριβής θα παρουσιαστούν 77 πληθυσμοί εντόμων αποθηκών λόγω του όγκου των δεδομένων, που ανήκουν στα εξής είδη: Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Sitophilus οryzae, Sitophilus granarius, Sitophilus zeamais, Oryzaephilus surinamensis, Rhyzopertha dominica, Lasioderma serricorne και Cryptolestes ferrugineus. Οι πληθυσμοί αυτοί στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για τον χαρακτηρισμό της ανθεκτικότητας τους στην φωσφίνη με την χρήση διαφόρων πρωτοκόλλων, τα οποία ήταν: 1. αυτό του FAO (Food and Agriculture Organization), το οποίο βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων για 20 ώρες σε σταθερή συγκέντρωση των 30 ppm, 2. αυτό της δόσης απόκρισης (το λεγόμενο dose response) το οποίο βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων σε 50, 100, 200, 500, 700 και 1000 ppm για 3 ημέρες έκθεσης, 3. αυτό του CORESTA (Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco) που βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων στα 200 ppm για 4 ημέρες και αν υπήρχαν ζωντανά άτομα, έκθεση αυτών των πληθυσμών σε 700 ppm για 10 ημέρες, και 4. αυτό του κιτ ανθεκτικότητας της PTT (Phosphine Tolerance Test) που βασίστηκε σε έκθεση των εντόμων στα 3000 ppm για 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 και 270 λεπτά. Το πρωτόκολλο του FAO, της δόσης απόκρισης και του CORESTA τροποποιήθηκαν ως προς τον χρόνο αξιολόγησης της καθυστερημένης θνησιμότητας (από 14 ημέρες σε 7 ημέρες), ενώ για το πρωτόκολλο PTT παρατάθηκε η καταγραφή των ζωντανών ακμαίων από τα 90 λεπτά στα 270 λεπτά και καταγράφηκε και η καθυστερημένη θνησιμότητα μετά από 7 ημέρες. Για όλα τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν, μετά το πέρας της έκθεσης των εντόμων στη φωσφίνη τα έντομα κατηγοριοποιήθηκαν σε ζωντανά, ακινητοποιημένα και νεκρά. Στη συνέχεια, τα έντομα μεταφέρθηκαν σε καθαρά τρυβλία για την αξιολόγηση της καθυστερημένης συμπεριφοράς, 7 ημέρες αργότερα. Για τη διάγνωση κάθε πληθυσμού ως ανθεκτικού, μετρίως ανθεκτικού και ευαίσθητου χρησιμοποιήθηκε η εξής κατηγοριοποίηση για το FAO μετά τις 7 ημέρες καθυστερημένης επίδρασης: καταγραφή 0-10 % ζωντανών ακμαίων ο πληθυσμός χαρακτηρίζοταν ως ευαίσθητος, από 11-80 % ως μετρίως ανθεκτικός και πάνω από 80 % ως ανθεκτικός. Για το είδος T. castaneum σύμφωνα με το πρωτόκολλο του FAO, 4 πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ως ανθεκτικοί και οι περισσότεροι πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ως ευαίσθητοι στη φωσφίνη. Για το T. confusum και οι 8 πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ευαίσθητοι στη φωσφίνη, ενώ για το S. oryzae από το σύνολο των 31 πληθυσμών 2 καταγράφηκαν ως ανθεκτικοί. Για το S. granarius ένας πληθυσμός χαρακτηρίστηκε ως μετρίως ανθεκτικός και οι υπόλοιποι ευαίσθητοι, όλοι οι πληθυσμοί του S. zeamais χαρακτηρίστηκαν ως ευαίσθητοι, ενώ για το O. surinamensis από τους 7 πληθυσμούς ο ένας χαρακτηρίστηκε ως ανθεκτικός. Τέλος, ένας πληθυσμός για τα R. dominica και L. serricorne, αντίστοιχα, χαρακτηρίστηκε ως ανθεκτικός. Όσον αφορά το πρωτόκολλο της δόσης απόκρισης οι πληθυσμοί που χαρακτηρίστηκαν ευαίσθητοι είναι αυτοί που δεν επιβίωσαν στη χαμηλότερη συγκέντρωση (50 ppm), οι μετρίως ανθεκτικοί θεωρήθηκαν αυτοί που επιβίωσαν μέχρι και τα 200 ppm και ανθεκτικοί αυτοί που επιβιώσαν από τα 500 ppm και πάνω, μετά από 7 ημέρες καθυστερημένης επίδρασης. Καταγράφηκαν πληθυσμοί που είχαν ζωντανά ακμαία στα 200-500 ppm. Ενδεικτικά, για τα T. castaneum, S. oryzae και R. dominica, καταγράφηκαν ζωντανά ακμαία σε 4, 2 και 1 πληθυσμούς, αντίστοιχα. Στο πρωτόκολλο CORESTA δεν παρατηρήθηκαν ζωντανά ακμαία σε κανέναν από τους πληθυσμούς που εξετάσθηκαν, με εξαίρεση τους πληθυσμούς T. castaneum RB1, S. oryzae 3Tusc και C. ferrugineus B1, οι οποίοι, εξετάσθηκαν στη συνέχεια και στο δεύτερο πρωτόκολλο CORESTA χωρίς να καταγραφούν όμως ζωντανά ακμαία. Όσον αφορά το κιτ ανθεκτικότητας PTT, καταγράφηκαν πληθυσμοί στους οποίους τα ακμαία ήταν δραστήρια μέχρι και τα 270 λεπτά έκθεσης. Αυτοί οι πληθυσμοί ήταν δύο για το T. castaneum (3SP18.1, D1), ένας για το T. confusum (9Cecy), έξι για το S. oryzae (Gerhin, IT2, IT1, 3Tusc, 2HornHun, G1) και δύο για το O. surinamensis (Vis17.1, Def3.1). Για τους περισσότερους πληθυσμούς, το σύνολο των ακμαίων βρέθηκαν να είναι ακινητοποιημένα στα 90 λεπτά, ή και σε ακόμα πιο σύντομα διαστήματα.Στην δεύτερη πειραματική ενότητα αξιολογήθηκαν διάφορες παράμετροι κινητικότητας των ακμαίων των T. castaneum και R. dominica σε πληθυσμούς με διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας. Για αυτό το λόγο, χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία petri, για την μέτρηση διαφόρων παραμέτρων που αφορούν την κινητικότητα ακμαίων των ανωτέρω ειδών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ανθεκτικών και των ευαίσθητων πληθυσμών. Όσον αφορά την ταχύτητα, μόνο για το R. dominica, τα ευαίσθητα άτομα κινούνταν ταχύτερα από τα ανθεκτικά. Επιπλέον, ο ανθεκτικός πληθυσμός παρουσίασε μειωμένη κινητικότητα για ορισμένες παραμέτρους που δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με τον ευαίσθητο πληθυσμό.Στην τρίτη πειραματική ενότητα, έγινε σύγκριση της δυνατότητας παραγωγής απογόνων μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων πληθυσμών των T. castaneum και L. serricorne. Χρησιμοποιήθηκαν πλαστικά κυλινδρικά φιαλίδια, με την χρήση δύο διαφορετικών υποστρωμάτων για κάθε πληθυσμό και η καταγραφή των απογόνων έλαβε χώρα μετά από 35, 50, 65, 80, 95 και 110 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ανθεκτικοί πληθυσμοί μπορεί να έχουν υψηλότερη παραγωγή απογόνων και ταχύτερη ανάπτυξη σε κάποιες περιπτώσεις σε σχέση με τους ευαίσθητους πληθυσμούς. Επιπλέον, η τροφή ήταν κρίσιμος παράγοντας για την παραγωγή απογόνων για όλους τους πληθυσμούς και τα είδη που δοκιμάστηκαν ανεξαρτήτως του επιπέδου ανθεκτικότητας. Ο ρυθμός ανάπτυξης μεταξύ των τροφών ήταν ανεξάρτητος από τον πληθυσμό, καθώς όλοι οι πληθυσμοί που δοκιμάστηκαν έδειξαν παρόμοιες προτιμήσεις ανεξάρτητα από το επίπεδο ανθεκτικότητας.Στην τέταρτη ενότητα εργασίας εξετάσθηκε η μοριακή ταυτοποίηση των μεταλλαγών που ευθύνονται για την υψηλή ανθεκτικότητα στην φωσφίνη, στο γονίδιο dld εντόμων αποθηκών στο rph2 τόπο. Συγκεκριμένα, έντομα ευαίσθητα και ανθεκτικά των ειδών T. castaneum, R. dominica και S. oryzae αξιολογήθηκαν για την καταγραφή των μεταλλαγών που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Επισημάνθηκε η παρουσία των μεταλλαγών P45S και P49S που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα στη φωσφίνη μόνο στα είδη T. castaneum και R. dominica, αντίστοιχα.Στην πέμπτη ενότητα εργασίας έγινε αξιολόγηση πληθυσμών ανθεκτικών και ευαίσθητων στη φωσφίνη σε πραγματικές συνθήκες εφαρμογής του αερίου για τα T. castaneum και S. oryzae. Τα έντομα τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια με διαφορετικό προϊόν ανά είδος και η θνησιμότητά τους μετρήθηκε μετά τον τερματισμό της κάθε δοκιμής. Στη συνέχεια, τα φιαλίδια διατηρήθηκαν σε θαλάμους επώασης στους 25 °C και σε 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες για τη μέτρηση της παραγωγής απογόνων. Στις περισσότερες περιπτώσεις καταγράφηκε 100 %θνησιμότητα για όλους τους πληθυσμούς με εξαίρεση τους ανθεκτικούς πληθυσμούς S. oryzae 3T και T. castaneum BTS. Δεν καταγράφηκε παραγωγή απογόνων στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ όπου υπήρχε παραγωγή απογόνων, κυμάνθηκε σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα.Στην έκτη πειραματική ενότητα, αξιολογήθηκε η γη διατόμων και το pirimiphos methyl σε ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς των T. castaneum και S. oryzae στη φωσφίνη. Τα εντομοκτόνα εφαρμόστηκαν σε δύο δημητριακά, το σιτάρι και το ρύζι σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: για τη γη διατόμων εφαρμόστηκαν οι συγκεντρώσεις 1000 και 2000 ppm και για το pirimiphos methyl οι συγκεντρώσεις 1 και 5 ppm. Η θνησιμότητα των ακμαίων μετρήθηκε μετά από 7, 14 και 21 ημέρες έκθεσης και αξιολογήθηκε η ικανότητα παραγωγής απογόνων μετά από 65 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πλήρης αντιμετώπιση των ακμαίων παρατηρήθηκε για δύο από τους τρεις πληθυσμούς του T. castaneum στα 2000 ppm της γης διατόμων, ενώ για τον τρίτο πληθυσμό, η θνησιμότητα έφτασε το 84 %. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στα επίπεδα θνησιμότητας μετά την έκθεση σε γη διατόμων μεταξύ των δύο πληθυσμών του S. oryzae. Επιπλέον, το pirimiphos methyl δεν ήταν αποτελεσματικό για κανέναν από τους πληθυσμούς του T. castaneum που αξιολογήθηκαν στο 1 ppm, αλλά 100 % θνησιμότητα καταγράφηκε για όλους τους πληθυσμούς στα 5 ppm. Γενικά, αμφότεροι οι πληθυσμοί του S. oryzae ήταν πιο ευαίσθητοι από εκείνους του T. castaneum και για τα δύο εντομοκτόνα.Στην έβδομη ενότητα εργασίας αξιολογήθηκε η χρήση αζώτου σε ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς στην φωσφίνη των Ο. surinamensis, T. castaneum και S. oryzae σε πειράματα με δοκιμές σε εμπορικούς θαλάμους αζώτου. Εννέα δοκιμές έλαβαν χώρα σε εμπορικούς θαλάμους με δύο διαφορετικές θερμοκρασίες, 28 και 40 °C, με διαφορετικά διαστήματα έκθεσης, 2.5, 3 και 9 ημέρες και επίπεδο Ο2 στο 1 %. Τα έντομα τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια με διαφορετικό προϊόν ανά είδος και η θνησιμότητά τους μετρήθηκε μετά τον τερματισμό κάθε δοκιμής. Μετά το τέλος κάθε δοκιμής, τα φιαλίδια διατηρήθηκαν σε θαλάμους επώασης στους 25 °C και 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες για τη μέτρηση της παραγωγής απογόνων. Ολική θνησιμότητα παρατηρήθηκε για τα O. surinamensis και S. oryzae, αλλά υπήρξε κάποια επιβίωση (3.3 %) για το T. castaneum στους 28 °C και 3 ημέρες έκθεσης. Γενικά, δεν καταγράφηκε παραγωγή απογόνων, με μόνο ορισμένες εξαιρέσεις. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το άζωτο είναι αποτελεσματικό για όλα τα είδη που δοκιμάστηκαν εδώ, ανεξάρτητα από το επίπεδο ανθεκτικότητάς τους στη φωσφίνη.Στην όγδοη ενότητα εργασίας μελετήθηκε η χρήση της θερμικής απεντόμωσης (heat treatment) σε πραγματικές συνθήκες με ανθεκτικούς και ευαίσθητους πληθυσμούς στην φωσφίνη των Τ. castaneum και S. oryzae. Η θνησιμότητα των εντόμων μετρήθηκε στο τέλος κάθε δοκιμής και στη συνέχεια, τα φιαλίδια με τα δημητριακά τους διατηρήθηκαν στους 25 οC με 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες ώστε να μετρηθεί η παραγωγή απογόνων. Στην πλειοψηφία των δοκιμών που έγιναν παρατηρήθηκε πλήρης αντιμετώπιση τόσο των ανθεκτικών όσο και των ευαίσθητων στη φωσφίνη πληθυσμών.