Απομόνωση και χαρακτηρισμός μεσεγχυματικών κυττάρων από μυελό των οστών παιδιών με οξεία λευχαιμία
Authors: Γενίτσαρη Στέλλα 
Published: September 2021

Εισαγωγή Τα μεσεγχυματικά κύτταρα στρώματος (ΜΚ) αποτελούν σημαντικό συστατικό του μυελικού μικροπεριβάλλοντος, το οποίο ρυθμίζει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ πλήρης χαρακτηρισμός τους δεν έχει επιτευχθεί. Δεδομένης της θεωρίας συμμετοχής του μικροπεριβάλλοντος του μυελού στην λευχαιμική εκτροπή, θα μπορούσε να ισχύσει η υπόθεση ότι και τα ΜΚ εμπλέκονται στη διαταραχή της φυσιολογικής αιμοποίησης. Η συμμετοχή των ΜΚ στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία στα παιδιά έχει πρόσφατα προταθεί και υπάρχουν ενδείξεις ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού τους είναι επιβραδυμένος και η ικανότητα υποστήριξης της αιμοποίησης σε μακροχρόνιες καλλιέργειες είναι επηρεασμένη. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο μορφολογικός, ανοσοφαινοτυπικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος από μυελό των οστών παιδιών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία στη διάγνωση της νόσου, ώστε να εκτιμηθεί η πιθανή επίδραση της λευχαιμίας στα βιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά τους. Επίσης, θα γίνει σύγκριση των χαρακτηριστικών τους στις φάσεις θεραπείας και στο τέλος αυτής, προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση της χημειοθεραπείας στα ΜΚ.Μεθοδολογία Το υλικό της μελέτης περιλαμβάνει δείγματα μυελού των οστών (ΜΟ) από παιδιά με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) στη διάγνωση, σε διάφορες φάσεις υπό θεραπεία και στο τέλος, μετά την ολοκλήρωση της. Μελετήθηκε η ικανότητα πολλαπλασιασμού των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων με υπολογισμό του χρόνου κυτταρικού διπλασιασμού (DT) σε όλα τα στάδια επανακαλλιέργειας, μετά από κάθε θρυψινοποίηση. Η κλωνογονικότητα των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων μελετήθηκε με την ικανότητα σχηματισμού αποικιών ινοβλαστών (CFU-F). Για την ανοσοφαινοτυπική ανάλυση των δειγμάτων προσδιορίστηκεη έκφραση συγκεκριμένων αντιγόνων επιφανείας, χαρακτηριστικών των μεσεγχυματικών και αιμοποιητικών κυττάρων, σε διάφορα στάδια καλλιέργειας. Η εκτίμηση της απόπτωσης και η μελέτη του κυτταρικού κύκλου έγιναν στις επανακαλιέργειες P2 και P4 με κυτταρομετρία ροής. Η ικανότητα των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων να διαφοροποιούνται προς λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα μελετήθηκε στα στάδια P2 ή P3 των καλλιεργειών. Η ιστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με χρώση Oil Red O για τα λιποκύτταρα, von Kossa για τα οστεοκύτταρα και Alcian Blue για τα χονδροκύτταρα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των παραγόντων SDF-1a και Angio-1 έγινεμε τη μέθοδοELISA στο υπερκείμενο των καλλιεργειών των πειραμάτων. Για ορισμένα από τα παραπάνω χαρακτηριστικά έγινε αξιολόγηση και μετά από κατηγοριοποίηση σε ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου (MR) και σε ομάδα υψηλού κινδύνου (HR), με βάση τους προγνωστικούς παράγοντες της ΟΛΛ σύμφωνα με το πρωτοκόλλο θεραπείας. Τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (mean± standard error of the mean, SEM). Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το Στατιστικό πακέτο για εφαρμογή στις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS, v18.0).ΑποτελέσματαΜορφολογία: Τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών εμφάνισαν στην πρώτη καλλιέργεια και διατήρησαν στις επόμενες το χαρακτηριστικό ατρακτοειδές σχήμα, χωρίς μορφολογικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων των διαφορετικών ομάδων.Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση: Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα μονοπύρηνα κύτταρα (D0) και στα μεσεγχυματικά κύτταρα των σταδίων P2 και P4. Δεν υπήρξαν διαφορές στην έκφραση των μονοκλωνικών αντισωμάτων μεταξύ των ομάδων. Στη διάγνωση, τα μεσεγχυματικά κύτταρα εκφράζουν σε πολύ υψηλό ποσοστό τους δείκτες CD90, CD105, CD146, CD29, CD44, CD95 και CD73, ενώ η έκφραση των αιμοποιητικών δεικτών CD34, CD45 και CD14 είναι μηδενική. Το ίδιο ανοσοφαινοτυπικό προφίλ παρέμεινε σε όλες τις φάσεις της θεραπείας, στο τέλος της χημειοθεραπείας και στην ομάδα ελέγχου. Διαφοροποίηση: Τα ex vivo εκπυγμένα μεσεγχυματικά κύτταρα διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς προς τους τρεις κυτταρικούς τύπους λιποκύτταρα (A), οστεοκύτταρα (O), χονδροκύτταρα (C). Στη διάγνωση η διαφοροποίηση και προς τις τρεις σειρές ήταν φτωχότερη σε σύγκριση με τις φάσεις θεραπείας της λευχαιμίας, όπου παρατηρήθηκε ίδια ικανότητα διαφοροποίησης με την ομάδα ελέγχου. Χρόνος κυτταρικού διπλασιασμού (DT): Τα μεσεγχυματικά κύτταρα στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων (D0) χρειάστηκαν περισσότερες ημέρες στη διάγνωση για το σχηματισμό στρώματος. Στις επόμενες επανακαλλιέργειες, ο χρόνος κυτταρικού διπλασιασμού ήταν παρόμοιος σε όλες τις ομάδες των δειγμάτων (διάγνωση λευχαιμίας, ημέρα 15 και 33 εισαγωγής στην ύφεση, εδραίωση της ύφεσης, διατήρηση της ύφεσης και τέλος θεραπείας). Τα αποτελέσματα αυτά, καταδεικνύουν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων στη διάγνωση, που απαρτίζεται κυρίως από λεμφοβλάστες, παρουσιάζουν βραδύτερο ρυθμό έκπτυξης σε σχέση με τα μεσεγχυματικά κύτταρα στις φάσεις θεραπείας της λευχαιμίας και της ομάδας ελέγχου. Η μειονεκτική αυτή ικανότητα πολλαπλασιασμού αποκαθίσταται γρήγορα, με την πρόοδο των καλλιεργειών. Διαπιστώθηκε ότι, όσο πιο προχωρημένο ήταν το στάδιο επανακαλλιέργειας, τόσο μεγαλύτερος ήταν και ο χρόνος κυτταρικού πολλαπλασιασμού (βραδύτερος ρυθμός πολλαπλασιασμού) σε όλες τις ομάδες δειγμάτων, χωρίς διαφορές μεταξύ των φάσεων της θεραπείας, αλλά και της ομάδας ελέγχου. Σε ό,τι αφορά στη μελέτη μετά από διαχωρισμό σε ομάδα υψηλού κινδύνου (HR) και ενδιάμεσου κινδύνου (MR), παρατηρήθηκε ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα των ασθενών υψηλού κινδύνου είχαν μικρότερο χρόνο κυτταρικού διπλασιασμού στη διάγνωση, στην αρχική καλλιέργεια και στα πρώτα στάδια επανακαλλιέργειας (μέχρι το P2).Σχηματισμός αποικιών CFU-F: Την ημέρα 0, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών CFU-F ήταν μειονεκτική στη διάγνωση σε σχέση με τις φάσεις θεραπείας, το τέλος της χημειοθεραπείας και την ομάδα ελέγχου. Ο αριθμός των CFU-F σταδιακά αυξάνεται ήδη από τη d15, αλλά εξακολουθεί να υπολείπεται έως και τη d33 σε σύγκριση με τις υπόλοιπες φάσεις θεραπείας. Το αποτέλεσμα αυτό προκύπτει από το μικρότερο αριθμό αποικιών μεσαίου και μεγάλου μεγέθους που αναπτύσσονται. Στα αρχικά στάδια προεξάρχουν οι αποικίες μεγάλου μεγέθους, ενώ σε προχωρημένα στάδια επανακαλλιέργειας ο πληθυσμός των CFU-F αποικιών απαρτίζεται, κυρίως, από αποικίες μικρού μεγέθους. Η ελαττωμένη κλωνογονικότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση ήταν σταθερό εύρημα και παρατηρήθηκε σε όλα τα στάδια επανακαλλιέργειας. Με την πρόοδο των καλλιεργειών, ο αριθμός των σχηματιζόμενων αποικιών εμφανίζεται μειωμένος σε όλες τις φάσεις και στα δείγματα της ομάδας ελέγχου, ενώ σε προχωρημένα στάδια επανακαλλιέργειας (P4, P5) προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά. Στη μελέτη της ομάδας υψηλού κινδύνου σε σχέση με την ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου, δε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών, παρά το γεγονός ότι στις περισσότερες περιπτώσεις, τα δείγματα ασθενών υψηλού κινδύνου ανέπτυξαν λιγότερες αποικίες από τα δείγματα ασθενών ενδιάμεσου κινδύνου. Η ελαττωμένη κλωνογονικότητα στη διάγνωση παρατηρήθηκε και στην κατάταξη στις ομάδες υψηλού και ενδιάμεσου κινδύνου. Στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων (MNCs) και στις 2 ομάδες κινδύνου παρατηρήθηκε μικρότερος αριθμός αποικιών CFU-F στη διάγνωση συγκριτικά με τις υπόλοιπες φάσεις, εύρημα που φαίνεται ότι οφείλεται στις αποικίες μεγάλου μεγέθους. Μελέτη και ανάλυση κυτταρικού κύκλου: Η μελέτη του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής στα στάδια επανακαλλιέργειας P2 και P4 και, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης, το μεγαλύτερο ποσοστό των μεσεγχυματικών κυττάρων βρίσκεται σε φάση ηρεμίας.Μελέτη και ανάλυση απόπτωσης: Η μελέτη της απόπτωσης πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με 7-AAD, επίσης στα στάδια επανακαλλιέργειας P2 και P4 και επιβεβαίωσε τη σταθερότητα των ΜΚ του μυελού των οστών σε συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας, τόσο στη διάγνωση της λευχαιμίας όσο και στις φάσεις χημειοθεραπείας. Παρατηρήθηκε μικρότερο ποσοστό απόπτωσης στις φάσεις και στο τέλος της θεραπείας σε σχέση με τη διάγνωση, με σταθερά όμως και εδώ ποσοστά στις επανακαλλιέργειες P2 και P4. Έκφραση παραγόντων SDF-1a και Angio-1: Η έκφραση του παράγοντα SDF-1a ήταν μεγαλύτερη στα κύτταρα του στρώματος και παρουσίασε μεγάλο εύρος διακύμανσης τιμών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση, ενώ στις φάσεις της θεραπείας η έκφρασή του ήταν πιο ομοιογενής. Στη διάγνωση της λευχαιμίας, διαπιστώθηκε μεγαλύτερο ποσοστό έκφρασης σε σχέση με τις φάσεις χημειοθεραπείας, χωρίς να υπάρξει στατιστικά σημαντική διαφορά. Επίσης, στα δείγματα της διάγνωσης, ήταν μεγαλύτερη η έκφραση του παράγοντα στους ασθενείς υψηλού κινδύνου και μικρότερη στους ασθενείς ενδιάμεσου κινδύνου. Στην ομάδα ελέγχου δε μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα. Η έκφραση του παράγοντα Ang-1 στους υποπληθυσμούς των μονοπύρηνων και των μεσεγχυματικών κυττάρων, ήταν συγκριτικά μεγαλύτερη στα κύτταρα του στρώματος και παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά. Δε διαπιστώθηκε διαφορά στα επίπεδα του παράγοντα μεταξύ της διάγνωσης και των φάσεων θεραπείας, ενώ ήταν ανεξάρτητα από το διαχωρισμό σε ομάδα υψηλού και σε ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου στη διάγνωση και στις φάσεις χημειοθεραπείας, ενώ στο τέλος της θεραπείας προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά.Συζήτηση Τα μεσεγχυματικά κύτταρα υποστηρίζουν και ρυθμίζουν την αιμοποίηση, αποτελώντας σημαντικό συστατικό του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών, παρά το γεγονός ότι αποτελούν μικρό μόνο ποσοστό των εμπύρηνων κυττάρων. Η δομή που αντιπροσωπεύει την αιμοποιητική φωλεά έχει βασικό ρόλο στη λειτουργική διατήρηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και την προστασία τους από εξωγενείς βλαπτικούς παράγοντες. Η διατήρηση της ομοιόστασης του αιμοποιητικού συστήματος προϋποθέτει την ισορροπία μεταξύ αυτοανανέωσης, διαφοροποίησης και απόπτωσης των αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και την αδιατάρακτη αλληλεπίδρασή τους με το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών. Τα ΜΚ συμμετέχουν στην οργάνωση της αιμοποιητικής φωλεάς, ασκώντας καθοριστικό ρόλο στη δέσμευση, κινητοποίηση και έξοδο των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΑΚ). Η παρουσία τους είναι απαραίτητη για την εγκατάσταση και διατήρηση των ΑΑΚ, ενώ, επιπλέον, ρυθμίζουν τη λειτουργία των αιμοποιητικών κυττάρων και διατηρούν την ομοιόσταση της φωλεάς, μέσω έκκρισης αυξητικών παραγόντων. Υπάρχουν βιβλιογραφικές ενδείξεις ότι οι αιματολογικές κακοήθειες συνδέονται με απορρύθμιση στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και ότι τα ΜΚ συμμετέχουν στη διαδικασία ανάπτυξης νεοπλασίας, είτε ενισχύοντας τη δημιουργία είτε τροποποιώντας το φαινότυπο νεοπλασιών του αιμοποιητικού συστήματος. Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία αποτελεί αγνώστου αιτιολογίας ετερογενές νόσημα του αιμοποιητικού ιστού, αποτέλεσμα συσσώρευσης μεταλλάξεων και ανώμαλου πολλαπλασιασμού των προγονικών Β λεμφοκυττάρων. Είναι ο συχνότερος κακοήθης όγκος στα παιδιά. Δεν έχει μελετηθεί πιθανός ρόλος ή η συμβολή των ΜΚ στην έναρξη της νόσου και στη μετέπειτα πορεία της καθώς και στην ανταπόκριση στη θεραπεία . Παράλληλα δε, υπάρχει το δεδομένο ότι, τα μεσεγχυματικά κύτταρα μυελού των οστών των παιδιών δεν είναι παρόμοια με τα αντίστοιχα των ενηλίκων. Τα δεδομένα που προέκυψαν για την πολλαπλασιαστική δυνατότητα, την κλωνογονικότητα και την ικανότητα διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών κυττάρων, καταδεικνύουν ότι η διήθηση του μυελού των οστών από λεμφοβλάστες στη διάγνωση της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας επηρεάζει αυτά τα χαρακτηριστικά τους, ενώ δεν έχει επίδραση η χορήγηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Την τελευταία δεκαετία εγείρεται η υπόθεση ότι διαταραχές στην ρύθμισή του κυτταρικού κύκλου και στην αλληλουχία των γεγονότων της απόπτωσης οδηγούν σε γενετική αστάθεια, με αποτέλεσμα την προδιάθεση σε κακοήθη εξαλλαγή. Ειδικότερα, εκφράζεται η πιθανότητα εμπλοκής της απορρύθμισης μεταξύ πολλαπλασιασμού των κυττάρων του αίματος και της ικανότητάς τους να οδηγηθούν σε απόπτωση στην παθογένεια, αλλά και την εξέλιξη της λευχαιμίας. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν τη σταθερότητα των ΜΚ του μυελού των οστών σε συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας, τόσο στη διάγνωση της λευχαιμίας όσο και στις φάσεις χημειοθεραπείας. Οι παράγοντες αγγειοποιητίνη-1 και SDF-1a έχουν πρόσφατα χαρακτηριστεί ως μείζονες ρυθμιστές της αλληλεπίδρασης μεταξύ προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών Η έκφραση του παράγοντα SDF-1a στα υπερκείμενα διαλύματα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων ΜΟ παιδιών με ΟΛΛ βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στα δείγματα της διάγνωσης της λευχαιμίας σε σύγκριση με τα δείγματα των φάσεων θεραπείας, χωρίς, όμως, να προκύπτει στατιστικά σημαντική διαφορά. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαπίστωση της συσχέτισης με τους προγνωστικούς παράγοντες, αφού στην ομάδα των ασθενών υψηλού κινδύνου η ποσοτική έκφραση ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με την ομάδα των ασθενών ενδιάμεσου κινδύνου. Η διαφορά αυτή παύει να υφίσταται με την έναρξη της χημειοθεραπείας. Οι χαμηλότερες τιμές αγγειοποιητίνης 1 που παρατηρήθηκαν εκφράζονται στο υπερκείμενο διάλυμα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση της λευχαιμίας και, μάλιστα, ανεξαρτήτως της ομάδας κινδύνου. Δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά μετά τη σύγκριση με τις φάσεις χημειοθεραπείας. Συμπερασματικά, τα βιολογικά χαρακτηριστικά και οι λειτουργικές ιδιότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων που μελετήθηκαν επηρεάζονται από τη διήθηση του μυελού των οστών στη διάγνωση της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας, ενώ οι μεταβολές παραμένουν και στις επανακαλλιέργειες. Αντίθετα, τα μεσεγχυματικά κύτταρα αναλαμβάνουν λειτουργικά με την έναρξη της χημειοθεραπείας και την επίτευξη της ύφεσης της νόσου και δεν επηρεάζονται από τη θεραπεία. Η ικανότητα έκκρισης αυξητικών παραγόντων (αγγειοποιητίνη-1) και χημειοκινών (παράγοντας SDF-1a) δεν επηρεάζεται από τη λευχαιμία. Τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αποσαφηνίσουν το ρόλο των μεσεγχυματικών κυττάρων στη λευχαιμογένεση και να απαντήσουν στο ερώτημα αν τα λευχαιμικά κύτταρα προστατεύονται ή εκτίθενται στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες από τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Δείχνουν, όμως, σαφώς ότι η οποιαδήποτε επίδραση του λευχαιμικού κλώνου στα βιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κυττάρων είναι παροδική και παύει να υφίσταται με την έναρξη της θεραπείας.