Membrane protein nanoclustering as a functional unit of immune cells : from nanoscopy to single molecule dynamics
Authors:   , Torreño Piña Juan Andrés 
Published: October 2023

State-of-the-art biophysical techniques featuring high temporal and spatial resolution have allowed for the first time the direct visualization of individual transmembrane proteins on the cell membrane. These techniques have revealed that a large amount of molecular components of the cell membrane do not organize in a random manner but they rather grouped together forming so-called clusters at the nanoscale. Moreover, the lateral behavior of these clusters shows a great dependence on the compartmentalization of the cell membrane by, e.g., the actin cytoskeleton at multiple temporal and spatial scales. Since these lateral and temporal organizations have been shown to be crucial for the regulation of the biological activity by these transmembrane proteins, the understanding of the spatiotemporal behavior of membrane receptors, and of proteins in general, is a necessary step towards understanding the biology of the cell. Protein nanoclustering and membrane compartmentalization have been shown to play a crucial role on leukocytes, particularly on the surface of antigen presenting cells. Hence, the direct visualization of membrane proteins on the cell membrane of antigen presenting proteins represents a crucial step in understanding how an immune response can be controlled by leukocytes at the molecular level.
In Chapter 1, the immune system, the membrane receptor DC-SIGN and the antigen presenting protein CD1d are briefly introduced. Moreover, recent advances in superresolution microscopy and single particle tracking techniques which allow the study of membrane proteins at the nanoscale are discussed. Finally, an updated review of protein nanoclustering on the cell membrane shows examples of the importance of protein nanoclustering in regulating biological function in the immune system. Chapter 2 presents the quantitative methodology for analyzing STED nanoscopy images and multi-color single particle tracking data used throughout this thesis. Chapter 2 also describes the single-molecule fluorescence sensitive microscopes implemented in this thesis for multi-color single particle tracking experiments and the corresponding data analysis. At the end of Chapter 2, cartography maps combining high temporal with micron-scale spatial information on the basis of single-molecule detection are presented.
The following chapters in this thesis describe the major results obtained on two important receptors of the immune system. In Chapter 3, we address the role of the neck region of DC-SIGN in fine-tuning the nanoclustering degree of DC-SIGN on the cell membrane. Moreover, Chapter 3 also links the nanoclustering capability of DC-SIGN with its virus binding capability. The meso-scale organization of DC-SIGN and its dependence on a glycan-based connectivity is addressed on Chapter 4. This glycosylation network enhances the interaction between DC-SIGN and clathrin beyond stochastic random encountering. In Chapter 5, we showed that DC-SIGN shows subdiffusive behavior and weak ergodicity breaking (wEB) that cannot be described using the continuous time random walk (CTRW) model. Instead, our data are more consistent with a model in which the plasma membrane is composed of "patches" that change in space in time. In Chapter 6, we demonstrate that the antigen presenting protein CD1d organizes in nanoclusters on the cell membrane of antigen presenting cells whose size and density are tightly controlled by the actin cytoskeleton. Moreover, we also showed that this cytoskeletal control of the CD1d nanoclustering predominantly occurs on the pool of CD1d that has undergone lysosomal recycling, including under inflammatory conditions. Finally, in Chapter 7 we summarize the main results of this thesis and highlight future experiments that will expand the knowledge obtained so far regarding the role of plasma membrane organization and biological regulation.

Gracias a su alta resolución temporal y espacial, las técnicas biofísicas de última generación han permitido la observación directa de proteínas de transmembrana de forma individual en la membrana celular. Estas técnicas han mostrado que la organización de una gran parte de las proteínas de transmembrana no es aleatoria sino que éstas están agrupadas en la membrana celular formando nano-agregados, o "clusters". En el caso concreto del sistema inmune, se ha demostrado que el agrupamiento de proteínas y los compartimentos de la membrana celular juegan un papel determinante en las células presentadoras de antígenos a la hora de controlar la iniciación de una respuesta inmune. Por tanto, la visualización directa de proteínas de membrana en células presentadoras de antígenos a la escala nanométrica representa un paso crucial en el entendimiento del sistema inmune y en un futuro desarrollo de terapias basadas en el sistema inmune humano. En el primer capítulo de esta tesis, se presentará al lector una breve introducción del sistema inmune y una descripción general de las dos proteínas que se han estudiado extensivamente en esta tesis: el receptor reconocedor de patógenos DC-SIGN y la proteína presentadora de antígenos glicolipídicos CD1d. Se discutirán además los últimos avances en técnicas de microscopía de fluorescencia con alta resolución temporal y espacial que permiten el estudio de proteínas a la escala nanométrica. Finalmente, el primer capítulo concluye con una revisión de los últimos avances en la caracterización de la organización lateral de proteínas de membrana mostrando cómo dicha organización determina la función biológica de estas proteínas. En el capítulo 2, se presentan los distintos tipos de metodología utilizados en esta tesis para cuantificar imágenes de microscopía de super-resolución STED así como para analizar datos provenientes del seguimiento de partículas individuales usando varios colores. Al final del capítulo 2 se presenta una nueva metodología desarrollada en esta tesis que permite el estudio lateral de proteínas de membrana con una alta resolución temporal y una escala espacial de orden de micras y a la que hemos denominado mapas cartográficos. Los siguientes capítulos de esta tesis se enfocan en el estudio de dos importantes proteínas involucradas en el sistema inmune. En el capítulo 3 se describe como la parte central de la estructura del receptor captador de patógenos DC-SIGN determina su grado de nano-agrupamiento sobre la membrana celular. A su vez, este agrupamiento tiene una incidencia clave en la capacidad de DC-SIGN en unirse a partículas virales. La organización de DC-SIGN a la escala mesoscópica y la dependencia de dicha organización de una conectividad en la membrana celular basada en la glicosilación de proteínas es descrita en el capítulo 4. En el capítulo 5 descubrimos que DC-SIGN tiene un comportamiento que no solo es sub-difusivo en la membrana celular sino que también conlleva a la ruptura de ergodicidad por parte de este receptor. Esta rotura de ergodicidad no puede ser descrita por el modelo "continous time random walk" (CTRW) sino por un modelo nuevo donde la difusión de la partícula cambia constantemente en el espacio y en el tiempo. En el capítulo 6 de esta tesis describimos como la molécula CD1d forma nano-agrupamientos en la membrana celular cuyo tamaño y densidad son controlados por el citoesqueleto de actina. Además, observamos que dicho control mayoritariamente sucede cuando CD1d ha sido reciclado a través de compartimentos lisosomales, incluyendo procesos inflamatorios. Finalmente, en el capítulo 7 se discuten las conclusiones generales de esta tesis y se sugieren experimentos a futuro de manera de incrementar, en base a los resultados obtenidos en esta tesis, nuestro conocimiento de la membrana celular y el papel que la organización espacial y temporal juega en el control del sistema inmune.