Functional and structural analysis of tRNA-mediated gene regulation in pathogens
Authors: Γιαρίμογλου Νικολέτα 
Published: November 2023

Η tRNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της μεταγραφής είναι διαδεδομένη στα Gram θετικά βακτήρια και περιλαμβάνει ειδικές RNA-RNA αλληλεπιδράσεις με φορτισμένα και μη μόρια tRNA. Αυτός ο μηχανισμός βασίζεται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων tRNA και του ρυθμιστικού στοιχείου T-box που βρίσκεται στην 5' αμετάφραστη περιοχή των μορίων mRNA. Αυτή η αλληλεπίδραση ελέγχει την έκφραση ενός ευρέος φάσματος γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά και τη βιοσύνθεση αμινοξέων και την αμινοακυλίωση των μορίων tRNA. Μέσω μίας αλλαγής στη διαμόρφωση που μεσολαβείται από τη δέσμευση μορίων tRNA, οι T-boxes υιοθετούν δύο διακριτές διαμορφώσεις και ελέγχουν είτε τη μεταγραφή είτε τη μετάφραση των καθοδικών τους γονιδίων. Ο ρυθμιστικός μηχανισμός περιλαμβάνει την αρχική αναγνώριση ενός μορίου tRNA από τον βρόχο εξειδίκευσης του T-box, μέσω συμπληρωματικότητας μεταξύ του κωδικονίου εξειδίκευσης και του αντικωδικονίου του μορίου tRNA. Αυτή η αλληλεπίδραση σταθεροποιείται με πρόσθετες επαφές της δομής αγκώνα του tRNA και του κορυφαίου βρόχου του T-box. Τέλος, ο T-box αλληλεπιδρά με το 3' άκρο του tRNA και ανιχνεύει την κατάσταση αμινοακυλίωσής του. Απουσία αμινοξέος επιτρέπεται η μεταγραφή ή μετάφραση, ενώ η παρουσία ενός αμινοξέος, αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων. Οι T-boxes, ως δυναμικά ρυθμιστικά στοιχεία που ελέγχουν σημαντικά γονίδια του βακτηριακού μεταβολισμού, αποτελούν πολλά υποσχόμενους και καινοτόμους αντιβακτηριακούς στόχους.Στους σταφυλόκοκκους, ο glyS T-box αλληλεπιδρά με πέντε ισοδεκτικά μόρια tRNAGly και συντονίζει την παροχή γλυκίνης τόσο κατά την πρωτεϊνοσύνθεση όσο και κατά το σχηματισμό των γεφυρών πενταγλυκίνης του κυτταρικού τοιχώματος Αυτός ο T-box φέρει στην περιοχή τερματισμού/αντιτερματισμού ένα είδο-ειδικό στέλεχος Sa, το οποίο στο Staphylococcus aureus μπορεί να αλληλεπιδράσει με συγκεκριμένα αντιβιοτικά και να επηρεάσει άμεσα την T-box μεσολαβούμενη μεταγραφή. Η σημασία του στελέχους Sa διερευνήθηκε με μεταλλαξιγένεση και η διαγραφή του οδήγησε σε σημαντική μείωση της S. aureus glyS T-box μεσολαβούμενης μεταγραφής και κατάργησε την ικανότητα διάκρισης μεταξύ των διαφορετικών ισοδεκτικών μορίων tRNAGly, τόσο in vitro όσο και in vivo. Επιπρόσθετα, η διαγραφή του ανέστρεψε τις προηγουμένως παρατηρηθείσες διεγερτικές επιδράσεις της τιγεκυκλίνης στη μεταγραφή. Ωστόσο, η εισαγωγή του στελέχους Sa στο Geobacillus kaustophilus glyQ T-box, οδήγησε σε ενισχυμένη μεταγραφή παρουσία τιγεκυκλίνης και η παρουσία του διευκόλυνε τη διάκριση μεταξύ πρωτεϊνογενετικών και μη ισοδεκτικών μορίων tRNAGly. Συνολικά, φάνηκε ότι το στέλεχος Sa αποτελεί ένα σημαντικό ειδό-ειδικό δομικό στοιχείο, απαραίτητο για τη σωστή λειτουργία του S. aureus glyS T-box. Προκειμένου να διερευνηθεί ο βιολογικός ρόλος του γονιδιακού πλεονασμού για τα μόρια tRNAGly στο S. aureus, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9 για την απαλοιφή του ενός γονιδίου για το P1 tRNAGlyGCC και του συμπλέγματος γονιδίων για τα NP tRNA. Συγκεκριμένα, η απαλοιφή των NP tRNAs βρέθηκε να μην είναι βιώσιμη για το κύτταρο. Αντίθετα, η απαλοιφή του γονιδίου του P1 tRNAGly δεν επηρέασε το ρυθμό ανάπτυξης του S. aureus, αν και το επεξεργασμένο στέλεχος εμφάνισε αυξημένη ευαισθησία στα αντιβιοτικά που στοχεύουν το κυτταρικό τοίχωμα. Η ανάλυση του μεταγραφώματος του επεξεργασμένου στελέχους αποκάλυψε μείωση της ρύθμισης των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση αμινοξέων και βιταμινών, καθώς και τη διαφορική έκφραση γονιδίων που απαιτούνται για την ομοιόσταση του σιδήρου, το σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος την αντίσταση στα αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα μόρια tRNA είναι σημαντικοί ρυθμιστές της βακτηριακής ομοιόστασης και αποκαλύπτουν τη tRNA-διαμεσολαβούμενη διασύνδεση διακριτών κυτταρικών διεργασιών. Επιπλέον, σημειακές μεταλλάξεις σε συντηρημένα νουκλεοτίδια που συμμετέχουν στη δομή «διάκρισης» του G. kaustophilus glyQ T-box χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί ο ρόλος τους στη σωστή λειτουργία των T-boxes. Επιπρόσθετα, διεξήχθη δομική και λειτουργική ανάλυση των T-boxes της γλυκίνης από τέσσερα αντιπροσωπευτικά παθογόνα για τον άνθρωπο βακτήρια, Clostridium tetani, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae και Streptococcus pyogenes. Και οι τέσσερις T-boxes ανταποκρίθηκαν στην έλλειψη γλυκίνης in vivo. Η δομική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι δευτεροταγείς δομές των T-boxes των στρεπτόκοκκων αποκλίνουν από τις άλλες δύο που ακολουθούν το τυπικό δομικό T-box πρότυπο. Το μοτίβο K-turn φάνηκε να απουσιάζει και από τους δύο T-boxes των στρεπτόκοκκων, ο S. pneumoniae glyQS T-box φέρει μία ασυνήθιστα βραχεία περιοχή συνδέτη και ο S. pyogenes glyQS Τ-box περιέχει ένα στέλεχος ΙΙ, που τυπικά απουσιάζει από του T-box ριβοδιακόπτες της γλυκίνης. Τέλος, μια συνθετική ένωση που στοχεύει ειδικά τον κορυφαίο βρόχο του στελέχους Ι εντοπίστηκε στην παρούσα διατριβή, μετά από in silico, in vitro και in vivo αναλύσεις. H ένωση που ονομάστηκε arrêT-box, αναστέλλει την ανάπτυξη του S. aureus στοχεύοντας ειδικά τους T-boxes και η πιο σημαντικό παρατήρηση ήταν ότι δε φάνηκε να προκαλεί ανθεκτικότητα. Η ανάλυση του μεταγραφώματος του S. aureus παρουσία της ένωσης αποκάλυψε ότι περισσότερα από τα μισά γονίδια του S. aureus παρουσιάζουν διαφορική έκφραση και επηρεάζουν αρκετές κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες όπως τη μετάφραση, αρκετές βιοσυνθετικές διαδικασίες και την απόκριση στο στρες, θέτοντάς την ως υποψήφια για την ανάπτυξη νέων αντιβακτηριακών ενώσεων. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει καινοτόμες πληροφορίες σχετικά με τη δομή και τη λειτουργία των T-box ριβοδιακοπτών από διαφορετικά παθογόνα βακτήρια. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια ποικιλομορφία των δομικών χαρακτηριστικών μεταξύ διαφορετικών T-boxes που αντικατοπτρίζουν τις διαφορές στη προσαρμογή μεταξύ των παθογόνων. Ο ευρύτερος χαρακτηρισμός T-boxes από μια ποικιλία παθογόνων βακτηρίων, θα βοηθήσει την ανάπτυξη και τη βελτιστοποίηση των T-box στοχευμένων αντιβιοτικών.