Μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων της ριβονουκλεάσης κ και του BCL2L12 μέσω miRNAS, στον καρκίνο του μαστού του προστάτη
Authors: Κλάδη-Σκανδάλη Αθηνά 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του μαστού και του προστάτη βρίσκονται στην πρώτη θέση των πιο συχνά απαντώμενων τύπων καρκίνου. Ωστόσο, η μεγάλη πρόοδος τόσο στην αποκρυπτογράφηση και στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της καρκινογένεσης των συγκεκριμένων αδένων όσο και στην κλινική διαχείριση των ασθενών, αναδεικνύει την παραδοξότητα των προαναφερθέντων υψηλών ποσοστών. Το παράδοξο αυτό οφείλεται αφενός στην μοριακή και κλινική ετερογένεια των συγκεκριμένων καρκίνων και αφετέρου στην αδυναμία των εφαρμοζόμενων δεικτών πρόγνωσης για την πρόβλεψη της έκβασης της ασθένειας ή/και της ανταπόκρισης των ασθενών στην χορηγούμενη θεραπεία. Συνεπώς καθίσταται επιτακτική η ανάγκη εύρεσης νέων ευαίσθητων και αξιόπιστων μοριακών δεικτών ικανών να παρέχουν αξιόπιστες και εξατομικευμένες πληροφορίες για την πορεία της ασθένειας και την κατάλληλη θεραπεία. Το γονίδιο BCL2L12 ανήκει στη BCL2 γονιδιακή οικογένεια, η οποία σχετίζεται με την απόπτωση. Ο κλινικός ρόλος του BCL2L12 στον καρκίνο έχει μελετηθεί εκτενώς σε διάφορους τύπους καρκίνου και τα μέχρι τώρα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά για την πιθανή τους χρήση σαν νέοι μοριακοί καρκινικοί δείκτες. Η RNase κ κωδικοποιείται από ένα γονίδιο τριών εξωνίων και δύο εσωνίων, το οποίο υφίσταται εναλλακτικό μάστισμα με αποτέλεσμα τη σύνθεση έντεκα εναλλακτικών μεταγράφων. Έχει αναφερθεί απορρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της RNase κ σε διάφορους τύπους καρκίνου, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει την πιθανή κλινική του χρησιμότητα σαν ένας νέος μοριακός καρκινικός δείκτης. Ένα ιδιαίτερα γρήγορα αναπτυσσόμενο πεδίο έρευνας για τον καρκίνο είναι η μελέτη των μικρομοριακών RNAs (miRNAs). Τα miRNAs αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια μικρών μορίων RNA, τα οποία ρυθμίζουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Πρόσφατα δεδομένα παρουσιάζουν τα miRNAs ως πολλά υποσχόμενους καρκινικούς δείκτες. Το miR-182 στοχεύει το BCL2L12 ενώ το miR-423-5p προτείνεται από πολλούς ειδικούς αλγορίθμους ότι στοχεύει το RNase κ. Τα συγκεκριμένα miRNAs σχετίζονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη πολλών νεοπλασιών ενώ παράλληλα φαίνεται να μπορούν να συμβάλλουν στην καλύτερη κλινική αντιμετώπιση της συγκεκριμένης νόσου.Στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάλυση της έκφρασης και η κλινική αξιολόγηση συγκεκριμένων εναλλακτικών BCL2L12 μεταγράφων, του RNase κ καθώς και των miR-183/182/96 και miR-423-5p στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη ως νέων μοριακών δεικτών για τη διάγνωση και πρόγνωση της νόσου. Ένας επιπλέον στόχος είναι η διερεύνηση και η πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του RNase κ από το miR-423-5p. Για τους σκοπούς αυτούς πραγματοποιήθηκε επεξεργασία ενός στατιστικά σημαντικού μεγέθους δείγματος καρκινικών και καλοηθών ιστών μαστού και προστάτη. Αρχικά, τα δείγματα των ιστών ομογενοποιήθηκαν και απομονώθηκε ολικό RNA, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNΑ. Ακολούθησε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθοδολογιών ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο και η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης των εξεταζόμενων μορίων σε ιστούς μαστού και προστάτη. Για την ανάλυση της έκφρασης του συνόλου των μελετώμενων μορίων χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης της χρωστικής SYBR Green και η μέθοδος της σχετικής ποσοτικοποίησης. Η αξιολόγηση της κλινικής αξίας των μελετώμενων mRNAs και miRNAs πραγματοποιήθηκε μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η πιθανή αλληλεπίδραση του miR-423-5p με τη 3'-UTR του RNase κ με χρήση μεθόδων βιοπληροφορικής και μοριακής βιολογίας. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι τα BCL2L12 v.1 ,v.2 και v.4 παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης στον καρκίνο του μαστού (v.1 p<0.001, v.2 p=0.009 v.4 p=0.004). Η αυξημένη έκφραση του BCL2L12 v.4 βρέθηκε ότι σχετίζεται με δείκτες δυσμενούς πρόγνωσης και πιο συγκεκριμένα με αυξημένο βαθμό κακοήθειας (p=0.002), μειωμένα επίπεδα έκφρασης των ER (p=0.015) και PR (p<0.001) υποδοχέων, αυξημένα επίπεδα του αντιγόνου Ki-67 (p=0.007) και αυξημένες τιμές του δείκτη ΝΡΙ (p=0.033). Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η υπερέκφραση του BCL2L12 v.2 αποτελεί ισχυρό και ανεξάρτητο δείκτη ευμενούς πρόγνωσης (HR=0.45, p=0.010). Αναφορικά με τα δείγματα του προστάτη βρέθηκε ότι τα BCL2L12 v.1 και v.5 (v.1 p=0.016, v.5 p=0.011) παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στους ασθενείς με καρκίνο σε σχέση με αυτούς που πάσχουν από ΒΡΗ. Επίσης παρατηρήθηκε μία στατιστικά σημαντική αύξηση (p=0.039) των mRNA επιπέδων του BCL2L12 v.5 σε δείγματα σταδίου ≥pT2b και κυρίως σταδίου pT2c και pT3a. Η αντίστοιχη ανάλυση για το γονίδιο της RNase κ αποκάλυψε στατιστικώς σημαντικά ευρήματα μόνο για τα δείγματα του προστάτη. Παρατηρήθηκε σημαντική υποέκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου στους καρκινικούς ιστούς προστάτη σε σύγκριση με τους ιστούς από ασθενείς που πάσχουν από ΒΡΗ (p=0.002). Η υπερέκφραση του RNase κ σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου και παρουσιάζει σημαντική διαφοροδιαγνωστική αξία ανεξάρτητα από το επίπεδα του PSA στον ορό (p=0.001). Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του RNase κ σε ασθενείς με λιγότερο επιθετικούς (p=0.001) και προχωρημένους (p=0.018) όγκους καθώς και με μεγαλύτερα διαστήματα επιβίωσης χωρίς πρόοδο της νόσου (p=0.003). Η ανάλυση επιβίωσης αποκάλυψε ότι τα επίπεδα έκφρασης του RNase κ αποτελούν ισχυρό δείκτη ευμενούς πρόγνωσης (HR = 0.85, p = 0.002). Αναφορικά με τα επίπεδα έκφρασης των miR-183/182/96 στα δείγματα του μαστού, παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων τους στον καρκινικό σε σχέση με το αντίστοιχο μη καρκινικό μέρος του ιστού (miR-96: p<0.001, miR-182: p<0.001, miR-183: p<0.001). Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης των συγκεκριμένων miRNAs στις ασθενείς με TNBC όγκους (miR-96: p=0.013, miR-182: p=0.021, miR-183: p=0.04). Μάλιστα η ανάλυση καμπυλών ευαισθησίας-ειδικότητας ROC ανέδειξε τη σημαντική αξία των miR-183/182/96 στη διάκριση των μαστικών όγκων που ανήκουν στην κατηγορία των TNBC από αυτούς που ανήκουν στους υπότυπους Luminal A, B ή HER-2 θετικοί (miR-96: AUC=0.652, p=0.013, miR-182: AUC=0.642, p=0.021, miR-183: AUC=0.620, p<0.05). Η ανάλυση επιβίωσης οδήγησε σε στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα μόνο για το miR-183, σύμφωνα με την οποία η υπερέκφραση του αποτελεί ισχυρό και ανεξάρτητο δείκτη δυσμενούς πρόβλεψης (HR= 0.13, p=0.004). Όσον αφορά τον καρκίνο του προστάτη παρατηρήθηκε υπερέκφραση των συγκεκριμένων miRNAs (miR-96: p=0.007, miR-182: p=0.004, miR-183: p=0.001). Η μελέτη της έκφρασής τους μπορεί να βοηθήσει σημαντικά στη διαφορική διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, όπως αποδεικνύεται και από την ανάλυση μέσω καμπύλης ROC (miR-96: AUC= 0.611, p = 0.007, miR-182: AUC= 0.617, p = 0.004, miR-183: AUC= 0.643, p = 0.001). Τα επίπεδα έκφρασης των miR-182 και miR-183 βρέθηκαν να είναι αυξημένα σε όγκους προχωρημένου σταδίου (miR-182: p=0.002 και miR-183: p<0.001) και πιο επιθετικούς (miR-182: p=0.03 και miR-183: p=0.001), ενώ η υπερέκφραση του miR-96 αποτελεί έναν ισχυρό και ανεξάρτητο δείκτη ευμενούς πρόγνωσης για τον καρκίνο του προστάτη. Όσον αφορά το miR-423-5p, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων του στους καρκινικούς ιστούς μαστού (p<0.001). Παράλληλα βρέθηκε μία στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης του σε όγκους μικρού βαθμού κακοήθειας (p=0.001), ER-θετικούς (p=0.019), Ki-67-αρνητικούς (p=0.035) και μη-TNBC (p=0.004). Η ανάλυση της έκφρασης του miR-423-5p στους ιστούς προστάτη έδειξε ότι το συγκεκριμένο miRNA αυξάνεται στους ασθενείς με ΒΡΗ σε σχέση με αυτούς που πάσχουν από καρκίνο του προστάτη (p<0.001). Σύμφωνα με την ανάλυση καμπυλών ROC, τα επίπεδα έκφρασης του miR-423-5p θα μπορούσαν να αποτελέσουν χρήσιμο δείκτη διαφοροδιάγνωσης του καρκίνου του προστάτη και της ΒΡΗ (AUC= 0.713, p < 0.001). Τέλος αναπτύχθηκαν επιτυχώς οι κατάλληλες μεθοδολογίες για την πειραματική επιβεβαίωση της στόχευσης του RNase κ από το miR-423-5p. Η εφαρμογή αυτών των διαδικασιών οδήγησε στο ήδη πειραματικά επιβεβαιωμένο συμπέρασμα ότι το miR-423-5p στοχεύει την 3'-UTR του Ogt και παρείχε μία πρώτη πειραματική ένδειξη της στόχευσης της 3'-UTR του RNase κ από το miR-423-5p. Πιο αναλυτικά η ενεργότητα της λουσιφεράσης παρουσιάζει μία σταδιακή μείωση από 0,89 RLU μετά την προσθήκη 0.05μg πλασμιδίου pCMV-miR-423-5p σε 0.69 RLU μετά την προσθήκη 0.2μg του εν λόγω πλασμιδίου. Τα αντίστοιχα ποσοστά μείωσης της ενεργότητας της λουσιφεράσης κυμαίνονται από 11% έως 31%Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποστηρίζουν ότι η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των εξεταζόμενων μορίων με μία οικονομική, εύκολη, ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία θα μπορούσε να συμβάλλει στη βελτίωση της κλινικής αντιμετώπισης του καρκίνου του μαστού και του προστάτη παρέχοντας σαφείς πληροφορίες για το μοριακό προφίλ και την επιθετικότητα των όγκων καθώς και για την πιθανότητα υποτροπής των ασθενών.