Συμβιωτικά βακτήρια, γενετική δομή πληθυσμών και ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα στους εχθρούς των καλλιεργειών Bemisia tabaci και Trialeurodes vaporariorum
Authors: Καπανταϊδάκη Δέσποινα 
Published: September 2021

Ο αλευρώδης των θερμοκηπίων, Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae) και ο αλευρώδης του καπνού Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), είναι δύο από τους σημαντικότερους εχθρούς των καλλιεργειών, καθώς επηρεάζουν μεγάλο αριθμό λαχανοκομικών και καλλωπιστικών φυτών διαφόρων οικογενειών. Μάλιστα, η σημαντικότητά του B. tabaci ως εχθρός, ενισχύεται από το ότι το συγκεκριμένο είδος αποτελεί ένα σαφώς καθορισμένο σύμπλοκο με περισσότερα από σαράντα δύο (42), μορφολογικά απαράλλακτα κρυπτικά είδη με διαφορετικές ιδιότητες. Τα πιο διαδεδομένα και καταστροφικά μέλη του συμπλόκου είναι αυτά που ανήκουν στην ομάδα Middle East-Asia Minor Ι προηγουμένως γνωστή ως βιότυπος Β (MEAM1) και στην ομάδα Mediterranean, προηγουμένως γνωστή ως βιότυπος Q (MED). Τα τελευταία χρόνια, ο κύριος τρόπος ελέγχου των πληθυσμών των αλευρωδών είναι η χημική καταπολέμηση, έχοντας ως συνέπεια την ανάπτυξη υψηλών επιπέδων ανθεκτικότητας σε διάφορες ομάδες εντομοκτόνων. Η πλειονότητα των εντόμων αναπτύσσει συμβιωτικές σχέσεις με διάφορα ενδοσυμβιωτικά βακτήρια, τα οποία ανήκουν σε δύο κατηγορίες: α) τα πρωτεύοντα συμβιωτικά που κατά κύριο λόγο παρέχουν στους ξενιστές τους απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την επιβίωσή τους και β) τα δευτερεύοντα συμβιωτικά τα οποία επηρεάζουν ποικίλες παραμέτρους της βιολογίας των ξενιστών τους (μεταβολισμός, διατροφή, μακροβιότητα, αμυντική ικανότητα, ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα), συμπεριλαμβανομένων και των μεταβολών στις αναπαραγωγικές διαδικασίες των ξενιστών τους. Οι συμβιωτικές σχέσεις μεταξύ τους είναι στενές και ποικίλουν. Οι πληθυσμοί του B. tabaci έχει βρεθεί ότι αποικίζονται από το πρωτεύον συμβιωτικό Portiera aleurodidarum και από επτά δευτερεύοντα ενδοσυμβιωτικά με διαφορετικούς συνδυασμούς μόλυνσης: Candidatus Hamiltonella defensa, Arsenophonus spp., Wolbachia spp., Rickettsia spp., Candidatus Cardinium hertigii, Candidatus Fritschea bemisiae και Candidatus Hemipteriphilus asiaticus. Σε πληθυσμούς του T. vaporariorum εμφανίζονται εκτός του πρωτεύοντος ενδοσυμβιωτικού P. aleurodidarum, τα δευτερεύοντα ενδοσυμβιωτικά Arsenophonus spp., Candidatus Hamiltonella defensa, Wolbachia spp., Rickettsia spp. και Candidatus Cardinium hertigii. Η κατανομή και η πυκνότητα των βακτηρίων εντός των ξενιστών τους εξαρτώνται από πλήθος παραγόντων, που αφορούν από τη μία στο είδος του ξενιστή και από την άλλη στον τύπο του βακτηριακού στελέχους. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, προσδιορίστηκε η γενετική δομή και ποικιλομορφία και οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ 38 πληθυσμών του αλευρώδη T. vaporariorum από διάφορες περιοχές της Ελλάδας και του υπόλοιπου κόσμου, χρησιμοποιώντας τρεις μοριακούς μιτοχονδριακούς δείκτες (κυτοχρωμική οξειδάση I - COI, κυτόχρωμα b - cytb, υπομονάδα 5 της NADH αφυδρογονάσης - ND5). Τα επίπεδα ενδοειδικής ποικιλομορφίας είναι ιδιαίτερα χαμηλά, καθώς οι εννιά απλότυποι που προέκυψαν διαχωρίζονται σε δύο μόνο μητρικές γραμμές συγγένειας. Επίσης, έγινε εξέταση των ίδιων πληθυσμών για την παρουσία και την κατανομή των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων Wolbachia, Rickettsia, Cardinium, Arsenophonus, Hamiltonella και Fritschea. Η ποικιλομορφία των ενδοσυμβιωτικών βρέθηκε να είναι επίσης χαμηλή. Το βακτήριο Arsenophonus εμφανίζεται ως το κυρίαρχο, με συχνότητες που αγγίζουν και το 100%, ενώ οι συχνότητες μόλυνσης των άλλων δύο ενδοσυμβιωτικών που εντοπίζονται, Wolbachia και Cardinium, είναι πολύ χαμηλές. Ακολούθησε ανάλυση της γενετικής διαφοροποίησης του επικρατέστερου ενδοσυμβιωτικού Arsenophonus, με τη χρήση του συστήματος MLST (Multi Locus Sequence Typing), αλλά μεταξύ των ατόμων που εξετάστηκαν δεν βρέθηκε γενετική διαφοροποίηση εντός του βακτηριακού είδους. Φαίνεται ότι το φαινόμενο της θανάτωσης των αρσενικών που προκαλεί το βακτήριο Arsenophonus, δεν εμφανίζεται στον T. vaporariorum καθώς και τα δύο φύλα φέρουν το βακτήριο. Η υψηλή κυριαρχία του βακτηρίου Arsenophonus στον T. vaporariorum είναι πιθανό να υποδεικνύει μια στενή σχέση αμοιβαιότητας όπου το συγκεκριμένο βακτήριο πιθανώς να επηρεάζει τον εμπλουτισμό της θρέψης του ξενιστή και να συμπληρώνει το ρόλο του πρωτεύοντος βακτηρίου Portiera στην παροχή θρεπτικών στοιχείων. Από την άλλη, η συνύπαρξη των βακτηρίων Portiera και Arsenophonus μπορεί να υποδεικνύει μια διαδικασία κατά την οποία το πρώτο βακτήριο αντικαθίσταται από το δεύτερο, όπως έχει ήδη προταθεί σε προηγούμενες μελέτες. Το σχεδόν 100% ποσοστό μόλυνσης από το βακτήριο Arsenophonus στον αλευρώδη T. vaporariorum, συνδυαζόμενο με την εντυπωσιακά χαμηλή μιτοχονδριακή γενετική διαφοροποίηση, μπορεί να αντικατοπτρίζει τις συνέπειες μιας επιλεκτικής κίνησης, κατά την οποία ένα στέλεχος από το συμβιωτικό θα μπορούσε να έχει εξαπλωθεί στο έντομο – ξενιστή, μεταφέροντας μαζί του και ένα συσχετιζόμενο μιτοχονδριακό απλότυπο. Η συνδυασμένη συμβιωτική και μιτοχονδριακή ποικιλομορφία ενισχύει το συμπέρασμα ότι ο αλευρώδης T. vaporariorum είναι ένα μοναδικό είδος. Στα πλαίσια της διερεύνησης των βακτηριακών κοινοτήτων χρησιμοποιήθηκε επίσης η Τεχνολογία Βαθιάς Αλληλούχησης (454 και Illumina amplicon sequencing), ώστε να καταγραφεί η ολική σύνθεση της βακτηριακής ποικιλότητας 13 πληθυσμών B. tabaci, των ομάδων MED και MEAM1, και πληθυσμών T. vaporariorum από μία εκτεταμένη γεωγραφική κατανομή. Η βακτηριακή κοινότητα των δύο ειδών αλευρωδών φαίνεται να είναι υψηλά εμπλουτισμένη και ο διαχωρισμός των δύο ειδών βάση του βακτηριακού προφίλ είναι αρκετά ξεκάθαρος, παρουσιάζοντας σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ τους. Παρά τις λίγες διακυμάνσεις στα μοτίβα συσχέτισης μεταξύ των γενετικών ομάδων και των ενδοσυμβιωτικών που φιλοξενούν, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σύσταση των συμβιωτικών βακτηρίων των αλευρωδών εξαρτάται από το είδος του εντόμου αλλά και τις διαφορετικές γενετικές ομάδες μέσα στο ίδιο είδος. Τα Gammaproteobacteria είναι η κυρίαρχη ομάδα σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν, με εύρος 63-99%. Τα βακτήρια Portiera και Hamiltonella είναι εκείνα που κυριαρχούν στα δείγματα του B. tabaci, ενώ τα βακτήρια Portiera και Arsenophonus στα δείγματα του T. vaporariorum. Η σχετικά ξεκάθαρη σχέση που προκύπτει μεταξύ των βακτηρίων που εντοπίστηκαν και των διαφορετικών γενετικών ομάδων του B. tabaci αλλά και των διαφορετικών ειδών αλευρωδών, δηλώνει αρχέγονα σημάδια συνεξέλιξης μεταξύ τους. Η διαταραχή της ισορροπίας σύνδεσης μεταξύ των ενδοσυμβιωτικών κοινοτήτων και των μιτοχονδριακών τύπων που προκαλείται από τη διασπορά των συμβιωτικών στον πληθυσμό ενός ξενιστή, είναι πιθανόν να προκαλέσει επιλεκτικές κινήσεις οι οποίες επηρεάζουν την ποικιλότητα του μιτοχονδριακού DNA και οι οποίες μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα ακόμη και την ειδογένεση. Βέβαια, η παραπάνω συσχέτιση - ειδικότητα μπορεί να επηρεάζεται από διάφορες οικολογικές παραμέτρους (π.χ γεωγραφία, δίαιτα του ξενιστή), γεγονός που έχει επιβεβαιωθεί σε προηγούμενες μελέτες με άλλα είδη εντόμων. Αναφορικά με την ανθεκτικότητα, διερευνήθηκαν τα επίπεδα και οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας 35 πληθυσμών T. vaporariorum από την Ελλάδα και άλλες γεωγραφικές περιοχές του κόσμου, στα νεονικοτινοειδή, στα πυρεθροειδή και στις κετοενόλες (τετρονικά και τετραμικά οξέα), συνδυάζοντας κλασικές βιοδοκιμές με μοριακές και λειτουργικές αναλύσεις. Υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας παρατηρούνται σχεδόν σε όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Οι λειτουργικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του πιθανού ρόλου των ομολόγων της BtCYP6CM1, γνωστής για το ρόλο της στο μεταβολισμό των νεονικοτινοειδών στον αλευρώδη B. tabaci, TvCYP6CM2 και TvCYP6CM3, έδειξαν ότι οι εν λόγω οξειδάσες δεν φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο αποτοξικοποίησης των νεονικοτινοειδών στον αλευρώδη T. vaporariorum. Επιπροσθέτως, η συχνότητα και διασπορά της μεταλλαγής ανθεκτικότητας Ε645Κ στο γονίδιο της καρβοξυλεστεράσης του ακέτυλο-συνενζύμου Α (ACCase), που έχει συνδεθεί με την ανθεκτικότητα στο spiromesifen σε άλλες εργασίες, δεν παρουσιάζει συσχέτιση με τα τοξικολογικά δεδομένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ρόλος της μπορεί να μην είναι σημαντικός, αλλά στην ανθεκτικότητα του T. vaporariorum στο spiromesifen να εμπλέκονται άλλοι μηχανισμοί.Τέλος, αναπτύχθηκε ένα διαγνωστικό τεστ για την παρακολούθηση της παρουσίας και της συχνότητας των μεταλλαγών L925I και T929I στο γονίδιο καναλιού μεταφοράς ιόντων νατρίου (VGSC) στις οποίες οφείλεται η ανθεκτικότητα στα πυρεθροειδή, ώστε να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της ανθεκτικότητας και την υποστήριξη προγραμμάτων φυτοπροστασίας.Η ανθεκτικότητα που έχουν αναπτύξει οι πληθυσμοί των αλευρωδών παγκοσμίως σχεδόν σε όλες τις ομάδες εντομοκτόνων, χρήζει επιτακτική την ανάγκη εύρεσης νέων στρατηγικών καταπολέμησης, που θα βασίζονται στην ολοκληρωμένη αντιμετώπιση. Η χρήση των ενδοσυμβιωτικών βακτηρίων, που επιδρούν με τους ξενιστές τους και προκαλούν αναπαραγωγικές ανωμαλίες, ως μέσο καταπολέμησης των εντόμων, κερδίζει όλο και περισσότερο έδαφος. Η πληρέστερη μελέτη των συμβιωτικών σχέσεων μεταξύ βακτηρίων και εντόμων – εχθρών των καλλιεργειών, και ο σχηματισμός μιας ολοκληρωμένης εικόνας σχετικά με τις σχέσεις και το δυναμικό των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει το κάθε βακτήριο με τον ξενιστή του, αποτελεί ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τον έλεγχό των ξενιστών και για την ανάπτυξη φιλικών μεθόδων καταπολέμησης. Ιδιαίτερα δε, λαμβάνοντας υπόψιν ότι κάποια βακτήρια αποτελούν παράγοντες ειδογένεσης και επιδρούν στα διάφορα χαρακτηριστικά προσαρμοστικότητας των ειδών, η μελέτη τους και η συσχέτισή τους με το γενετικό υπόβαθρο και τη γενετική ποικιλομορφία των ξενιστών τους, και ειδικότερα σε θέματα που αφορούν στα μοτίβα διασποράς και στη γονιδιακή ροή, αποτελεί σημαντικό βήμα για την υιοθέτηση αποτελεσματικών στρατηγικών καταπολέμησης.