Structural studies of the oncoproteins c-Myc and PI3Kα and development of new synthetic molecules inhibiting their function
Authors: Ευαγγελίδης Θωμάς 
Published: September 2021

Το ογκογονίδιο MYC βρίσκεται στο σταυροδρόμι πολλών σημαντικών βιολογικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην νεοπλασματική κυτταρική αύξηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Το MYC εμπλέκεται ευρέως σε πολλούς τύπους καρκίνου, όπου μάλιστα υπολογίζεται ότι η έκφραση του είναι αυξημένη ή απορυθμισμένη έως και 70%. Οι όγκοι με αυξημένη έκφραση του MYC συχνά παρουσιάζουν επιθετικούς φαινοτύπους. Παρά την ολοένα αυξανόμενη κατανόηση της βιολογίας του MYC, προς το παρόν δεν υπάρχει κλινικά διαθέσιμη στοχευμένη θεραπεία των όγκων που έχουν αποκτήσει αυξημένη έκφρασή του. Η λεπτομερής γνώση της δομής μιας πρωτεΐνης είναι επιτακτική ανάγκη για την κατανόηση της μηχανικής και της λειτουργίας της. Ωστόσο, εγγενώς αδιάτακτες πρωτεΐνες όπως η c-Myc, υπό φυσικές συνθήκες λαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα δομικά άσχετων διαμορφώσεων, καθιστώντας έτσι τη μελέτη της δομής τους αρκετά πολύπλοκη. Δεδομένου ότι δενέχει προταθεί δομή για το μονομερές c-Myc μέχρι στιγμής, προσπαθήσαμε να προτείνουμε ένα δυνατό σύνολο δομών διαμέσου μιας σειράς προηγμένων πειραμάτων NMR και φασματοσκοπίας CD. Καθένα από αυτά παρέχει διαφοτερικού τύπου δομική πληροφορία, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως περιορισμός κατά την διάρκεια των δομικών υπολογισμών. Συλλογικά, τα πειραματικά και τα υπολογιστικά δεδομένα μας συμφωνούν ότι το φερμουάρ λευκίνης (LZ) του c-Myc είναι προδιατεταγμένοπριν από την δέσμευση στο Max και μπορεί να προβάλει την παρακείμενη αδιάτακτη αλυσίδα στην κατάλληλη κατεύθυνση ώστε να επιτευχθεί ισχυρότερη αλληλεπίδραση με το Max. Σε αντίθεση, η βασική περιοχή έλικας-βρόχου-έλικας (BHLH) είναι εντελώς αδιάτακτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν μπορεί να έχει άμεσο ρόλο στην έναρξη του ετεροδιμερισμού. Μάλιστα, μια έκταση 23 αμινοξέων στην περιοχή LZ είναι καλά προδιατεταγμένη σε α-έλικα. Αξίζει να σημειωθεί, ότι αυτή η περιοχή του c-Myc πιστεύετο ότι αλληλεπιδρά με ένα 9-μερές πεπτίδιο που προέρχεται από την LZ του Max, το οποίο μπορεί να βλάψει την μεταγραφική δραστικότητα της c-Myc in vivo. Χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό πειραμάτων (NMR, CD) και προσομοιώσεων μεταδυναμικής (metadynamics), προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε λεπτομερέστερα τη δυναμική αυτών των σημαντικών πεπτιδίων. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το 23μερές πεπτίδιο διατηρεί την ελικοειδή δομή του LZ αλλά λυγισμένη στη μέση. Σε αντιπαραβολή, το 9μερές πεπτίδιο είναι εντελώς αδιάτακτο. Επιπλέον, τα δύο πεπτίδια δεν αλληλεπιδρούν, σύμφωνα με τις NMR και CD μετρήσεις μας. Μια βασική προϋπόθεση για να σταματήσει η πορεία της c-Myc πρωτεΐνης προς τον καρκίνο είναι να διακοπεί η αλληλεπίδραση με τον συν-ενεργοποιητή της, Max. Επειδή το μονομερές c-Myc διατηρεί ελάχιστη δομή, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό υπολογισμών σχεδιασμού φαρμάκων βάση ομοιότητας σε γνωστούς προσδέτες (ligand-based drug design), οι οποίοι βασίζονται στη γνώση γνωστών αναστολέων με στόχο την ανακάληψη νέων επιλεκτικών αναστολέων του διμερισμού c-Myc/Max. Από τα 34 υποψήφια μόριαπου παραγγείλαμε και δοκιμάσαμε πειραματικά μέσω των τεχνικών microscale thermophoresis (MST) και surface plasmon resonance (SPR), ένα είχε σταθερά διάστασης (Kd) αρκετά κοντά στη Kd της Max πρωτεΐνης (1 μΜ), η οποία είναι ο φυσικός προσδέτης της c-Myc. Αυτό το μόριο βρέθηκε ότι έχει επίσης αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν το c-Myc και πλέον υποβάλεται σε μετρήσεις ιδιοτήτων απορρόφησης, κατανομής, μεταβολισμού και απέκκρισης (ADME) σε ποντίκια που φέρουν c-Myc προκαλούμενους όγκους. Η αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου απαιτεί πολυεπίπεδη στόχευση ογκοπρωτεϊνών. Δεδομένου ότι υπάρχειμια διασύνδεση μεταξύ c-Myc/Max και PI3Kα διαμέσου διασταυρούμενων μονοπατιών, προσπαθήσαμε επίσης να σχεδιάσουμε in silico PI3Kα αναστολείς. Πρώτα μελετήθηκε η δυναμική της άγριου τύπου PI3Kα καθώς και της πρωτεΐνης με τη μετάλλαξη H1047R σε σύμπλοκο μετον αναστολέα PIK-108 διαμέσου προσομοιώσεων επιταχυνόμενης μοριακής δυναμικής (accelerated molecular dynamics) και υπολογισμών ελεύθερης ενέργειας (free energy calculations). Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο παραλλαγών της πρωτεΐνης. Παρόλα αυτά, αντιπροσωπευτικές διαμορφώσεις από τις μοριακές τροχιές (trajectories) χρησιμοποιήθηκαν για σάρωση in silico χημικών βιβλιοθήκων. Αυτή η εικονική διαδικασία οδήγησε στην ανακάλυψη δύοισχυρών αναστολέων της PI3Kα (με IC50 2.9 και 11.7 μΜ αντίστοιχα), σύμφωνα με τα in vitro πειράματα πρόσδεσης καθώς και τα κυτταρικά πειράματα.