Πεπτιδικά ανάλογα της αιμοπεταλιακής ιντεγκρίνης αΙΙbβ3
Authors: Γκουρογιάννη Αλεξία 
Published: August 2021

Ο σχηματισμός του αιμοπεταλιακού θρόμβου είναι μια αναγκαία, φυσιολογική αλλά και παθολογική αντίδραση που εξαρτάται από την ικανότητα των αιμοπεταλίων να συσσωρεύονται. Η αιμοπεταλιακή συσσώρευση μεσολαβείται από την αιμοπεταλιακή ιντεγκρίνη αΙΙbβ3 (GPIIb/IIIa). Στα εφησυχασμένα αιμοπετάλια η αΙΙbβ3 βρίσκεται στην ανενεργή της κατάσταση μη μπορώντας να αλληλεπιδράσει με το διαλυτό ινωδογόνο. Κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, η ‘μέσα-έξω’ σηματοδότηση της αΙΙbβ3 επάγει το διαχωρισμό των κυτταροπλασματικών της ουρών μέσω της πρόσδεσης της ταλίνης στη β3 υπομονάδα, καθώς και διαμορφωτικές αλλαγές στην ιντεγκρίνη, οι οποίες αυξάνουν δραματικά τη συγγένεια της ιντεγκρίνης για το πρόσδεμα. Έπειτα από τη πρόσδεση του ινωδογόνου, επάγεται η ‘έξω-μέσα’ σηματοδότηση της, η οποία ενισχύει περεταίρω την ενεργοποίηση και τη σταθεροποίηση του θρόμβου. Η αύξηση της συγγένειας της αΙΙbβ3 για το πρόσδεμα βασίζεται σε διαμορφωτικές αλλαγές, γνωστές ως ‘επέκταση’ της ιντεγκρίνης στα γόνατα, διαχωρισμός των υπομονάδων της και μια κίνηση προς τα έξω της διεπαφής ανάμεσα στη βΙ και υβριδική περιοχή της β3 υπομονάδας, μετατρέποντας τη κεφαλή από «κλειστή» σε «ανοιχτή» διαμόρφωση, διευκολύνοντας τη πρόσδεση του ινωδογόνου.Έχει αποδειχτεί ότι οκταπεπτίδιο που αντιστοιχεί στη 313-320 αλληλουχία της β-προπέλας της αΙΙb υπομονάδας αποτελεί ισχυρό αναστολέα της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης. Μετά από πειράματα κρυσταλλοποίησης της εξωκυττάριας περιοχής της ιντεγκρίνης στην ανενεργή διαμόρφωση, φάνηκε ότι η YMESRADR αλληλουχία λειτουργεί ως μια θηλειά, φουρκέτα «μανταλάκι» που συγκρατεί κοντά τη βΙ και υβριδική περιοχή της β3 υπομονάδας διαμέσου των: D319(αΙΙb)-K384(β3) και R320(αΙΙb)-E356(β3) γεφυρών άλατος. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η περεταίρω διερεύνηση και εξήγηση του μηχανισμού της ανασταλτικής δράσης του 313YMESRADR320 πεπτιδίου στην ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης. Οι δομικές προαπαιτήσεις της περιοχής αυτής ως προς την έκφραση της βιολογικής της δράσης μελετήθηκε i) με τη μέθοδο της συσσωρευομετρίας σε πλυμένα ανθρώπινα αιμοπετάλια, ii) με πειράματα κυτταρομετρίας ροής, iii) με πειράματα προσκόλλησης CHO κυττάρων στο ακινητοποιημένο ινωδογόνο υπό συνθήκες ροής και iv) με τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης της ταλίνης με την ιντεγκρίνη έπειτα από ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με θρομβίνη.Στη παρούσα εργασία, φάνηκε ότι το YMESRADR ανέστειλε τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, τη πρόσδεση του ινωδογόνου και του PAC-1 στην ενεργοποιημένη ιντεγκρίνη, η υποκατάσταση με αλανίνη αμινοξέων σε διαφορετικές θέσεις της 313-320 αλληλουχίας, τόνισε τη σημασία των D319, R317, R320 και Y313 ως προς την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου. Επίσης, παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή της προσκόλλησης των CHO κυττάρων στο ινωδογόνο έπειτα από επώαση τους με 500 μΜ YMESRADR, ενώ σε CHO κύτταρα που εξέφρασαν τη μετάλλαξη β3 Κ384/A δεν παρατηρήθηκε η παραπάνω αναστολή. Τέλος, έπειτα από πειράματα ανοσοαποτύπωσης φάνηκε ότι το οκταπεπτίδιο δεν επηρέασε καθόλου την αλληλεπίδραση της ταλίνης με τη β3-ιντεγκρίνη, η οποία επάγεται κατά την ενεργοποίηση από θρομβίνη. Έτσι, από τα παραπάνω προκύπτει ότι η θηλειά αυτή διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της ιντεγκρίνης στην ανενεργή της μορφή, πράγμα το οποίο εμποδίζει την αλλαγή στη διαμόρφωση της ιντεγκρίνης που επάγεται κατά την κατάληψη της από το πρόσδεμα.Από προηγούμενα πειράματα βρέθηκε ότι, ένα λιπιδιακά τροποποιημένο πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην όξινη, ενδοκυττάρια, απόμακρη από τη μεμβράνη 1000LEEDDEEGE1008 αλληλουχία (pal-1000-1008) της αΙΙb υπομονάδας αποτελεί πολύ ισχυρό αναστολέα της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης και έπειτα από μελέτες, σε τροποποιημένα με αλανίνη πεπτίδια της ίδιας αλληλουχίας, βρέθηκε ότι το συνολικό φορτίο, μέγεθος και η πρωτοταγής δομή του διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο ως προς την έκφραση της βιολογικής του δράσης. Έπειτα από πειράματα κυτταρομετρίας ροής φάνηκε ότι το pal-1000-1008 στα 100 μΜ ανέστειλε τη πρόσδεση του ινωδογόνου και του PAC-1 σε ενεργοποιημένα από ADP αιμοπετάλια. Ακολούθησε η διερεύνηση του μηχανισμού της ανασταλτικής δράσης ως προς τη πρόσδεση της ταλίνης με την ιντεγκρίνη, βήμα ικανό και αναγκαίο στη ‘μέσα-έξω’ σηματοδότηση της ιντεγκρίνης. Η πρόσδεση της ταλίνης επάγει το διαχωρισμό των κυτταροπλασματικών αΙΙb και β3 άκρων, το οποίο αποδεδειγμένα ενεργοποιεί την ιντεγκρίνη. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το pal-1000-1008 τροποποίησε τη παραπάνω αλληλεπίδραση. Με την παρουσία του πεπτιδίου, η αλληλεπίδραση αυτή γίνεται παροδική και σταματά από το δεύτερο λεπτό της ενεργοποίησης και έπειτα. Έτσι, με την αναστολή της αλληλεπίδρασης ταλίνης-ιντεγκρίνης, το πεπτίδιο φαίνεται να αποκαθιστά τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην αΙΙb και β3 υπομονάδα και να επαναφέρει έτσι την ισορροπία που υπάρχει στην ανενεργή μορφή της ιντεγκρίνης και στα μη ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Αυτή η προσέγγιση της ιντεγκρίνης, μέσω ενδοκυττάριων αναστολέων, μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη για την ανάπτυξη μελλοντικών αντιθρομβωτικών φαρμάκων.Ο τελικός στόχος της παρούσας διατριβής, ήταν η διερεύνηση ύπαρξης συνεργιστικής δράσης του ενδοκυττάριου με τον εξωκυττάριο αναστολέα στην αιμοπεταλιακή συσσώρευση και ενεργοποίηση, στη ‘μέσα-έξω’ ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης καθώς και στη φωσφορυλίωση των δύο σηματοδοτικών πρωτεϊνών όπως η FAK και η ERK. Τα πεπτίδια σε συγκεντρώσεις κατωφλίου ως προς την αναστολή φάνηκαν να είναι ικανά να προκαλούν σχεδόν 100% αναστολή της συσσώρευσης. Η επώαση πρώτα με το pal-1000-1008 στα 50 μΜ και έπειτα με το YMESRADR στα 75 μΜ έδειξε συνεργιστική ανασταλτική δράση ως προς την αναστολή της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης. Η συνεργιστική ανασταλτική τους δράση ως προς τη πρόσδεση του ινωδογόνου και του PAC-1 στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια έδειξε την ικανότητα τους να αναστέλλουν την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης. Επιπλέον θέλαμε να διερευνήσουμε το μηχανισμό της παραπάνω αναστολής ως προς την αναστολή της αλληλεπίδρασης της ταλίνης με την β3-ιντεγκρίνη. Πολύ ενδιαφέρον παρουσίασε το αποτέλεσμα το οποίο έδειξε ότι η συνεργιστική δράση των πεπτιδίων ανέστειλε την παραπάνω αλληλεπίδραση με αποφασιστικό τρόπο στο 4 λεπτό της ενεργοποίησης. Η φωσφορυλίωση της FAK είναι ένα μετα-συσσωρευματικό γεγονός, ενώ η δράση της ERK δεν εξαρτάται από την αιμοπεταλιακή συσσώρευση και βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση της αυξάνεται από τους RGD- ανταγωνιστές της πρόσδεσης του ινωδογόνου. Ο συνδυασμός των πεπτιδίων, στις συγκεντρώσεις κατωφλίου ως προς την αναστολή, ανέστειλε τη φωσφορυλίωση της FAK αλλά και της ERK2.Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη δείχνει για πρώτη φορά ότι η αλλοστερική αναστολή, επαγόμενη από τον συνδυασμό του όξινου ενδοκυττάριου αναστολέα μαζί με τον εξωκυττάριο, σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, μπορεί να παρέχει μια εναλλακτική φαρμακολογική προσέγγιση έναντι των μέχρι τώρα RGD πεπτιδικών ανταγωνιστών της ιντεγκρίνης καθώς και μια δυναμική θεραπευτική προσέγγιση στο σχηματισμό του θρόμβου και σε παθολογικές ασθένειες.