Μελέτη του δικτύου πρωτεόστασης κατά τη γήρανση και σε νόσους του γήρατος
Authors: Μανωλά Μαρία 
Published: October 2022

Η συνεχής επίδραση εξωγενών και ενδογενών στρεσσογόνων παραγόντων, η οποία κατά τη γήρανση συνοδεύεται από δυσλειτουργία των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες αυξάνουν τις πιθανότητες εκδήλωσης ηλικιοεξαρτώμενων παθολογικών φαινοτύπων. Συνεπώς, τα κύτταρα, τα οποία αποτελούνται από εξαιρετικά πολύπλοκες πρωτεϊνικές μηχανές, είναι άμεσα και συνεχώς εξαρτώμενα από την αποδοτική λειτουργία μηχανισμών ποιοτικού ελέγχου του πρωτεώματος, αλλά και την επαρκή προμήθεια ενεργειακών βιομορίων για τον περιορισμό της βιολογικής φθοράς και τη διατήρηση της ομοιοδυναμικής τους. Ως εκ τούτου η κατανόηση της λειτουργίας των συγκεκριμένων μηχανισμών, οι οποίοι εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ομοιοστασίας και/ή στην προσαρμογή του κυττάρου παρουσία στρες είναι ιδιαίτερα σημαντική. Πιο συγκεκριμένα, ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες, η καρκινογένεση, αλλά και διάφορα μεταβολικά νοσήματα, χαρακτηρίζονται από πρωτεωμική αστάθεια, η οποία αποτελεί ορόσημο της γήρανσης. Επομένως, η διατήρηση της ακεραιότητας και λειτουργικότητας του πρωτεώματος αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την εξασφάλιση της ποιότητας ζωής αλλά και την επιβίωση των οργανισμών. Ωστόσο, οι επιπτώσεις της πρωτεωμικής αστάθειας κατά τη γήρανση αλλά και σε νόσους του γήρατος στα ανώτερα μετάζωα παραμένουν σχετικά ανεξερεύνητες.Κυρίαρχο ρόλο στην εξασφάλιση της ακεραιότητας του πρωτεώματος κατέχει το δίκτυο της πρωτεόστασης, το οποίο αποτελεί έναν πολυεπίπεδο μηχανισμό ελέγχου της δομής και λειτουργίας των πρωτεϊνικών μορίων. Ένα από τα βασικότερα επίπεδα ρύθμισης του πρωτεοστατικού δικτύου είναι τα κύρια κυτταρικά πρωτεολυτικά μονοπάτια αυτοφαγίας-λυσοσώματος (autophagy-lysosome pathway, ALP) και ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (ubiquitin- proteasome pathway, UPP). Τα σηματοδοτικά αυτά μονοπάτια, τα οποία σε συνδυασμό με τη δράση μεταγραφικών παραγόντων και άλλων σηματοδοτικών μορίων κατέχουν κομβικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιοστασίας και προώθηση της μακροβιότητας.Στο εργαστήριο μας, έχει πραγματοποιηθεί εκτεταμένη μελέτη σε μοντέλα πρωτεωμικής αστάθειας στο έντομο Drosophila melanogaster, έπειτα από γενετικές παρεμβάσεις καταστολής ή ενεργοποίησης πρωτεασωμικών υπομονάδων, αλλά και έπειτα από τη φαρμακολογική πρόκληση πρωτεασωμικής δυσλειτουργίας (αναστολής πρωτεασώματος). Οι συγκεκριμένες μελέτες αποδεικνύουν τη σημαντικότητα του μονοπατιού UPP στην επιβίωση των οργανισμών, καθώς γενετική παρέμβαση καταστολής της έκφρασης (RNAi) πρωτεασωμικών γονιδίων είναι συνήθως θνησιγόνα για τα έντομα.Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επικεντρωθήκαμε στη μελέτη προσαρμογών της φυσιολογίας των εντόμων Drosophila melanogaster έπειτα από γενετική ή φαρμακολογική, καταστολή ή ενεργοποίηση πρωτεοστατικών παραγόντων ή ρυθμιστών του πρωτεοστατικού δικτύου. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψιν τη λειτουργική «συνομιλία» του πρωτεοστατικού δικτύου με άλλους κυτταρικούς μηχανισμούς διασφάλισης της ομοιοστασίας του οργανισμού, χαρτογραφήθηκαν προσαρμογές τόσο του ίδιου του πρωτεοστατικού δικτύου όσο και βασικών βιοενεργειακών σηματοδοτικών μονοπατιών του κυττάρου, κύριων μονοπατιών απόκρισης στο στρες, μηχανισμών διατήρησης της γενωμικής ακεραιότητας, αλλά και σηματοδοτικών μονοπατιών που ελέγχουν την επιβίωση των υπό εξέταση διαγονιδιακών οργανισμών- μοντέλων.Αρχικά, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε το πρώτο in vivo μοντέλο διαγενεακής πρωτεωμικής αστάθειας έπειτα από χρόνια, ήπια, μη θνησιγόνα, φαρμακευτική– μέσω Βortezomib– αναστολή του πρωτεασώματος στο έντομο Drosophila melanogaster. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την τοξική επίδραση του παρατεταμένου πρωτεοτοξικού στρες στη φυσιολογία του οργανισμού, ωστόσο γίνεται αντιληπτή η ικανότητα των ανώτερων μεταζώων να προσαρμόζονται στην παρατεταμένη ενεργοποίηση μηχανισμών απόκρισης στο στρες επαναπρογραμματίζοντας πρωτεοστατικά, μιτοστατικά και μεταβολικά μονοπάτια με σκοπό την επιβίωση. Μια από τις συγκεκριμένες φυσιολογικές προσαρμογές, η οποία είναι εξελικτικά συντηρημένη και σχετίζεται με την ενίσχυση της μακροβιότητας, είναι πιθανότατα η καταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού της ινσουλίνης/ IGF-1 [insulin/ insulin-like growth factor 1 (IGF-1) signaling, IIS]. Ωστόσο, η προσαρμογή σε παρατεταμένη πρωτεωμική αστάθεια έχει ως μακροχρόνιο αποτέλεσμα την επιταχυνόμενη γήρανση ή/και τη μειωμένη ικανότητα απόκρισης του οργανισμού σε περεταίρω αύξηση του στρες, πιθανά εξαιτίας της εξάντλησης της ρυθμιστικής ικανότητας των κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με τη μακροβιότητα.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση της γενετικής καταστολής της αποουβικιτινάσης Usp14 στη φυσιολογία των εντόμων Drosophila melanogaster. Η Usp14 αποτελεί πρωτεοστατικό παράγοντα, καθώς ως μια από τις τρεις αποουβικιτινάσες που συνδέονται στο πρωτεάσωμα ελέγχει τo πρωτεολυτικό μονοπάτι UPP σε τρία διακριτά επίπεδα: στο στάδιο της αναγνώρισης του ουβικιτινιωμένου υποστρώματος, στο στάδιο της εκκίνησης της μετατόπισης του υποστρώματος και στο στάδιο της ανακύκλωσης των αλυσίδων πολυουβικιτίνης. Οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν ότι η επίδραση της καταστολής της Usp14 στο πρωτεοστατικό δίκτυο και κατ’ επέκταση στην ομοιοστασία του οργανισμού εξαρτάται τόσο από το επίπεδο καταστολής της Usp14, όσο και από τον τύπο του στοχευόμενου ιστού. Συγκεκριμένα, η διαταραχή της ομοιοστασίας της ουβικιτίνης και του πρωτεοστατικού δικτύου έπειτα από μερική ή ολική καταστολή της Usp14 ενεργοποιεί δοσοεξαρτώμενες και ιστοειδικές φυσιολογικές προσαρμογές, έπειτα από τη λειτουργική αλληλεπίδραση του πρωτεοστατικού δικτύου με μεταβολικά σηματοδοτικά μονοπάτια, καθώς και μιτοστατικούς ρυθμιστικούς παράγοντες. Επιπλέον, η συγκεκριμένη μελέτη έδειξε ότι η διαταραχή του πρωτεοστατικού δικτύου προκαλεί μεταβολές στη συσσώρευση βλάβης στο γονιδίωμα, αλλά και στους κυτταρικούς μηχανισμούς απόκρισης στο γενοτοξικό στρες υπογραμμίζοντας το ρόλο της Usp14 σε διάφορες ασθένειες που χαρακτηρίζονται από γενωμική αστάθεια, όπως ο καρκίνος.Τέλος, έπειτα από την υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα foxo μελετήθηκαν οι φυσιολογικές προσαρμογές του πρωτεοστατικού δικτύου και των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες, η λειτουργία των μιτοχονδρίων, καθώς και η λειτουργική επικοινωνία του foxo με άλλους κυτταρικούς «αισθητήρες» στρες. Ο μεταγραφικός παράγοντας foxo εμπλέκεται (μεταξύ άλλων) στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με την εξασφάλιση της μεταβολικής ομοιοστασίας και την προώθηση της μακροβιότητας του οργανισμού. Τα δεδομένα της παρούσας εργασίας αποδεικνύουν ότι η καθολική υπερέκφραση του foxo διαταράσσει δοσοεξαρτώμενα τα κύρια μεταβολικά μονοπάτια, εξαντλεί τα ενεργειακά αποθέματα του οργανισμού, ενισχύει τη συσσώρευση βλάβης και μειώνει το προσδόκιμο ζωής των εντόμων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη σημασία της στόχευσης του κατάλληλου τύπου ιστού (ιστοειδικό πρότυπο λειτουργίας του foxo), καθώς και τη σωστή ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του foxo, ώστε να επιτευχθεί ενίσχυση της πρωτεόστασης, η οποία αναφορικά με το πρωτεάσωμα πιθανά προκύπτει μέσω της λειτουργικής «συνομιλίας» foxo- cncC/Nrf2, με στόχο τη διατήρηση της ομοιοστασίας του οργανισμού, και συνεπώς την προώθηση της μακροβιότητας.Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην περεταίρω διερεύνηση του ρόλου του πρωτεοστατικού δικτύου στη διατήρηση της ομοιοστασίας και την προώθηση της μακροβιότητας του οργανισμού. Τόσο η φαρμακολογική όσο και η γενετική παρέμβαση σε πρωτεοστατικούς παράγοντες επιβεβαιώνει ότι το ισχυρό, παρατεταμένο πρωτεοτοξικό στρες εξαντλεί τα ενεργειακά αποθέματα του οργανισμού, εξαιτίας της χρόνιας ενεργοποίησης κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες, με κόστος τη δυσλειτουργία σηματοδοτικών μονοπατιών που προωθούν τη μακροβιότητα. Από την άλλη πλευρά, το ήπιο πρωτεοτοξικό στρες, έπειτα από τη στόχευση του κατάλληλου τύπου ιστού, οδηγεί σε ήπια διέγερση των κυτταρικών αισθητήρων του στρες, οι οποίοι διεγείρουν τον επαναπρογραμματισμό του πρωτεοστατικού δικτύου. Τέλος τα ευρήματα της παρούσας εργασίας, αποδεικνύουν ότι παρουσία μεταβολικού, οξειδωτικού ή/και πρωτεοτοξικού στρες οι πρωτεοστατικοί παράγοντες «συνομιλούν» λειτουργικά (συστημική ρύθμιση) με παράγοντες που συμμετέχουν στη διατήρηση της μιτοχονδριακής ομοιοδυναμικής, στην εξασφάλιση της γενωμικής ακεραιότητας, αλλά και στη ρύθμιση του μεταβολισμού. Τα ευρήματα μας επιβεβαιώνουν ότι η επιλογή του κατάλληλου επιπέδου ενεργοποίησης ή καταστολής των πρωτεοστατικών παραγόντων, σε συνδυασμό με την επιλογή του κατάλληλου τύπου ιστού προς στόχευση μπορεί τελικά να προκαλέσει επιμήκυνση του υγειούς γήρατος και να προωθήσει τη μακροβιότητα.