Βιοδιυλιστήριο για παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης, εδώδιμων μυκήτων και πρόσθετων τροφίμων με βιοτεχνολογική αξιοποίηση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων
Authors: Γκανάτσιος Βασίλειος 
Published: August 2021

Για την επίτευξη των στόχων της αειφόρου ανάπτυξης, τα βιοδιυλιστήρια παίζουν κυρίαρχο ρόλο καθώς είναι το κλειδί για την πρόσβαση σε μια ολοκληρωμένη φιλική προς το περιβάλλον παραγωγή τροφίμων, ζωοτροφών, χημικών προϊόντων, υλικών και καυσίμων. Η εξεύρεση φθηνών πηγών πρώτης ύλης είναι κομβικής σημασίας καθότι οι περισσότερες βιοδιεργασίες χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη κυρίως γλυκόζη η αύξηση της τιμή της οποίας έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στην εξεύρεση εναλλακτικών πρώτων υλών. Ανάμεσα στις προτεινόμενες οικονομικές και αποδοτικές πρώτες ύλες είναι τα αγροτοβιομηχανικά και αστικά απόβλητα.Στο Πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζονται αναλυτικές πληροφορίες όπως προκύπτουν από την διεθνή και εγχώρια βιβλιογραφία και αφορούν:-Τα βιοδιυλιστήρια και τις πρώτες ύλες και τις διεργασίες αυτών-Τους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται-Τα προϊόντα και τα παραπροϊόντα της βιοδιύλισης-Τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και τα κύρια προϊόντα αξιοποίησης τουςΣτο Δεύτερο μέρος της διατριβής αναφέρονται αναλυτικά οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής ενώ στο Tρίτο μέρος γίνεται αναλυτική καταγραφή των μεθόδων και των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν για την εκπόνηση του πειραματικού μέρους.Η πρωτοτυπία της διατριβής στηρίζεται στην χρήση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας μέσω βιοτεχνολογικών διεργασιών. Πρωταρχικός σκοπός αυτής ήταν η αξιοποίηση των μικτών αποβλήτων για την ανάπτυξη διαφόρων μικροοργανισμών όπως Saccharomyces cerevisiae, Agaricus bisporus, Lipomyces starkeyi και μικτή καλλιέργεια κεφίρ με ζυμώσεις υγρής και στερεής κατάστασης. Κατόπιν η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα αναλύθηκε για την χρήση της ως μονοκυτταρική πρωτεΐνη. Οι παραγόμενες μικροβιακές βιομάζες χρησιμοποιήθηκαν είτε σε ελεύθερη μορφή είτε ακινητοποιημένες σε διάφορα κυτταρινούχα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα για την παρασκευή βιοκαταλυτών ώστε να διαμορφωθεί ένα βιοτεχνολογικό βιοδιυλιστήριο μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Τα απόβλητα πουχρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα διατριβή ήταν στερεά και υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Ειδικότερα αυτά ήταν κυτταρινούχα στερεά απόβλητα δασοκομείας (πριονίδι) και ζυθοποιίας (spent grains; BSG), η πούλπα των εργοστασίων παραγωγής χυμών εσπεριδοειδών, τα στερεά απόβλητα της μεταποίησης πατάτας, το τυρόγαλα των μονάδων παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων και η μελάσσα ως υποπροϊόν της βιομηχανίας ζάχαρης.Στο 4ο Κεφάλαιο έγινε μελέτη των κυτταρινούχων αποβλήτων ως φορείς ακινητοποίησης μικροοργανισμών όπου αναδείχθηκε η προωθητική ικανότητα της σωληνωτής κυτταρίνης (πορώδες κυτταρινούχο υλικό που προκύπτει από απολιγνινοποίηση πριονιδιού ξύλου) στην ζύμωση της μαλτόζης σε χαμηλές τιμές θερμοκρασίας. Πιο συγκεκριμένα η συγκριτική μελέτη της ζύμωσης μαλτόζης με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα του κρυοανθεκτικού και αλκοολανθεκτικού στελέχους S. cerevisiae ΑΧΑΖ-1 σε σωληνωτή κυτταρίνη ανέδειξε ότι το υλικό αυτό επιτάχυνε σημαντικά τον ρυθμό ζύμωσης της μαλτόζης σε χαμηλές τιμές θερμοκρασίας. Έτσι ενώ σε πολύ χαμηλές τιμές θερμοκρασίας (5οC) τα ελεύθερα κύτταρα σακχαρομυκήτων δεν έχουν την ικανότητα να μεταβολίσουν την μαλτόζη, τα ακινητοποιημένα κύτταρα ολοκλήρωσαν την ζύμωση της μαλτόζης σε διάφορες αρχικές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της σωληνωτής κυτταρίνης να προωθεί την δράση του ενζύμου μαλτάση ουσιαστικά μας οδήγησε στην διαμόρφωση ενός προτεινόμενου μηχανισμού δράσης ενώ η ενέργεια ενεργοποίησης της ζύμωσης της μαλτόζης έδειξε ότι μειώνεται κατά 42% όταν χρησιμοποιούνται ακινητοποιημένα κύτταρα. Στο 5ο Κεφάλαιο ακολούθησε η ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με βάση την παραγωγή μικροβιακής βιομάζας S. cerevisiae. Έγιναν πειράματα βελτιστοποίησης της σύνθεσης των μικτών υγρών αποβλήτων και ακολούθησε μελέτη της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH στην αύξηση της απόδοσης της μικροβιακής βιομάζας. Ως βέλτιστη αναλογία υγρών αποβλήτων ανεδείχθη η αναλογία υδατικού διαλύματος πούλπας πορτοκαλιού-μελάσσας 2:1 και ως βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης η τιμή θερμοκρασίας 30οC χωρίς ρύθμιση της τιμής pH. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας τριπλασιάζοντας την απόδοση. Η μελέτη της θρεπτικής αξίας της παραγόμενης μικροβιακής βιομάζας έδειξε ότι η βιοδιύλιση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων μπορεί να δώσει ένα τελικό προϊόν πλούσιο σε λιπαρά, πρωτεΐνη και μέταλλα. Η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα χρησιμοποιήθηκε είτε σε ελεύθερη μορφή είτε ακινητοποιημένη σε στερεά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα για την παραγωγή βιοκαταλυτών κατάλληλων για ζυμώσεις ζυθογλεύκους. Παρήχθησαν δύο διαφορετικοί βιοκαταλύτες (κύτταρα ακινητοποιημένα σε πούλπα πορτοκαλιού ή BSG) οι οποίοι είχαν ισότιμη ζυθοποιητική ικανότητα με τα ελεύθερα κύτταρα αλλά απέδωσαν ένα τελικό προϊόν με καλύτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Αρχικά έγινε συγκριτική μελέτη των κινητικών ζύμωσης ζυθογλεύκους με ελεύθερα κύτταρα που παρήχθησαν με μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και με ελεύθερα κύτταρα που παρήχθησαν σε συνθετικά θρεπτικά μέσα και ανεδείχθη η ισότιμη ζυθοποιητική τους ικανότητα. Ο πρώτος ζυθοποιητικός βιοκαταλύτης που παρασκευάστηκε με ακινητοποίηση S. cerevisiae σε πούλπα πορτοκαλιού μείωσε τον χρόνο ζύμωσης κατά 5-20% ενώ η παραγόμενη μπύρα είχε 30 φορές περισσότερα τερπένια και 6 φορές περισσότερους εστέρες δίνοντας ένα αρωματικότερο τελικό προϊόν. Ο δεύτερος ζυθοποιητικός βιοκαταλύτης παρασκευάστηκε με ακινητοποίηση S. cerevisiae σε BSG μείωσε τον χρόνο ζύμωσης κατά 20-30% με την περιεκτικότητα σε αιθανόλη και σε αζύμωτο σάκχαρο να είναι στα ίδια επίπεδα με μπύρες που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα. Οι ζυθοποιητικοί βιοκαταλύτες μετά από επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις ζυθογλεύκους παρελήφθησαν και αυτολύθηκαν με σκοπό την παρασκευή εναλλακτικών εκχυλισμάτων μικροβιολογίας. Τα εναλλακτικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας μελετήθηκαν συγκριτικά με τα εμπορικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας ως προς την απόδοση τους στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού S. cerevisiae. Η συγκριτική μελέτη ανάπτυξης έδειξε ότι τα εναλλακτικά εκχυλίσματα μπορούν να τριπλασιάσουν την απόδοση στην παραγωγή μικροοργανισμού. Επίσης η χρήση των εναλλακτικών εκχυλισμάτων μικροβιολογίας ως ενισχυτικά γεύσης σε σούπες πατάτας έδειξε ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν προκειμένου να αντικαταστήσουν το γλουταμινικό μονονάτριο που έχει κατηγορηθεί για την πρόκληση του λεγόμενου «συνδρόμου του κινέζικου εστιατορίου».Με βάση την μικροβιακή βιομάζα που αναπτύχθηκε σε μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα καθώς και των προϊόντων που παρήχθησαν με την χρήση της μικροβιακής βιομάζας ακολούθησε ο σχεδιασμός ενός πρωτότυπου βιοδιυλιστηρίου. Το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο μπορεί με 1 kg πούλπας πορτοκαλιού και 300 g αραιωμένης μελάσσας να δώσει 50,2 γραμμάρια μικροβιακής βιομάζας S. cerevisiae, 2,3 L μπύρας καλής ποιότητας και 8,52 g εναλλακτικού εκχυλίσματος μικροβιολογίας.Στο 6ο Κεφάλαιο τα μικτά στερεά και υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα αποτέλεσαν πρώτη ύλη και για την παραγωγή καρποσωμάτων και μικκυλίων του εδώδιμου μύκητα A. bisporus. Αρχικά σε διάφορα μίγματα υγρών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων έγινε εμβολιασμός του μύκητα ώστε να ευρεθεί η βέλτιστη αναλογία αποβλήτων για την παραγωγή μικκυλίων ενώ ακολούθησαν πειράματα μελέτης της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH. Ως ιδανικότερο υπόστρωμα στην ανάπτυξη μικκυλίων ανεδείχθη το υπόστρωμα με σύσταση: 59% υδατικό διάλυμα πούλπας πατάτας, 6% αραιωμένη μελάσσα, 17,5 % υδατικό διάλυμα πούλπας πορτοκαλιού και 17,5 % τυρόγαλο με την απόδοση να φτάνει στα 0,865 g ανά g σακχάρου (g/gs) σε τιμή θερμοκρασίας 25οC και τιμή pH 5,5. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικκυλίου με την απόδοση να φτάνει στα 1,224 g/gs.Η ανάλυση της θρεπτικής αξίας των μικκυλίων του A. bisporus έδειξε ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή καθώς τα ποσοστά πρωτεΐνης είναι στα ίδια επίπεδα με εδώδιμα μανιτάρια που αναπτύσσονται σε στερεά υποστρώματα (31%). Η ανάλυση με GC/MS των πτητικών προϊόντων του μικκυλίου έδειξε ότι είναι στα ίδια επίπεδα με εμπορικά μανιτάρια.Η μελέτη της ζύμωσης στερεάς κατάστασης του μύκητα A. bisporus σε στερεά μίγματα αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που αποτελούνταν από πούλπα πορτοκαλιού BSG και ΜSR έδειξε ως βέλτιστη αναλογία αυτή των BSG-MSR 6:1 δίνοντας 4,2 g καρποσωμάτων ανά 350 g υποστρώματος. Ωστόσο το υπόστρωμα ανάπτυξης του μύκητα ήταν πλούσιο σε πρωτεΐνη και από αυτό παρήχθη εναλλακτικό εκχύλισμα μικροβιολογίας με αυτόλυση το οποίο συγκριτικά με το εμπορικό εκχύλισμα μικροβιολογίας αύξησε την παραγωγή S. cerevisiae κατά 68%.Στο 7ο Κεφάλαιο της διατριβής έγιναν πειράματα προκειμένου να αναπτυχθεί ένα βιοδιυλιστήριο παραγωγής μικροβιακού λίπους από μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Αρχικά έγινε μελέτη της ανάπτυξης του ελαιογενή μικροοργανισμού L. starkeyi σε μικτά υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα καθώς και εύρεση των βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης. Ως βέλτιστο υπόστρωμα ανάπτυξης ανεδείχθη το υπόστρωμα με αναλογία μελάσσα-υδατικού διαλύματος πούλπας πορτοκαλιού 2:1 και ιδανικότερες συνθήκες η τιμή θερμοκρασίας 28οC και τιμή pH 5,5. Η απόδοση σε μεγαλύτερη κλίμακα έφτασε στα 0,513 g/gs αποδεικνύοντας ότι τα μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα μπορούν να αξιοποιηθούν για την παραγωγή ελαιογενών ζυμών.Τα λιγνοκυτταρινούχα απόβλητα χρησιμοποιήθηκαν και ως φορείς ακινητοποίησης ελαιογενών ζυμών. Πιο συγκεκριμένα κύτταρα της ελαιογενούς ζύμης L. starkeyi ακινητοποιήθηκαν σε σωληνωτή κυτταρίνη και μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης στην συσσώρευση μικροβιακού λίπους με ζύμωση τόσο συνθετικών θρεπτικών μέσων γλυκόζης όσο και μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Η χρήση ακινητοποιημένης ελαιογενούς ζύμης στην ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου αύξησε κατά 44% την συσσώρευση μικροβιακού λίπους και 8% την παραγωγικότητα βιομάζας σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Η αεριοχρωματογραφική ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων του παραγόμενου μικροβιακού λίπους έδειξε ότι η ακινητοποίηση ενίσχυσε κατά 6% τον σχηματισμό ακόρεστων λιπαρών οξέων και μείωσε κατά 5% τα κορεσμένα λιπαρά οξέα ενισχύοντας έτσι την θρεπτική αξία του παραγόμενου λίπους.Αξιολογώντας τα πειραματικά αποτελέσματα του Κεφαλαίου 7 σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε ένα βιοδιυλιστήριο ανάπτυξης ελαιογενούς ζύμης και παραγωγής μικροβιακού λίπους και βιοντίζελ από κύτταρα ελαιογενούς ζύμης που ακινητοποιήθηκαν σε σωληνωτή κυτταρίνη.Στο 8ο Κεφάλαιο της διατριβής παρουσιάζονται τα πειράματα που έγιναν προκειμένου να αναπτυχθεί ένα βιοδιυλιστήριο παραγωγής μικτής καλλιέργειας κεφίρ από μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Έγιναν πειράματα βελτιστοποίησης της αναλογίας των υγρών αποβλήτων και ακολούθησε μελέτη της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH στην αύξηση της απόδοσης της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας κεφίρ. Ωςβέλτιστο ανεδείχθη το μικτό απόβλητο που αποτελούνταν από 77% τυρόγαλο, 15% υδατικό διάλυμα πούλπας πορτοκαλιού 8% αραιωμένη μελάσσα και ως βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης η τιμή θερμοκρασίας των 32οC και τιμή pH 5,5 με την απόδοση βιομάζας να φτάνει 0,27 g/gs. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας διπλασιάζοντας την απόδοση. Η μελέτη της θρεπτικής αξίας της παραγόμενης μικροβιακής βιομάζας κεφίρ έδειξε ότι η βιοδιύλιση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων μπορεί να δώσει ένα τελικό προϊόν πλούσιο σε λιπαρά, πρωτεΐνη και μέταλλα.Η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα κεφίρ και μικροβιακή βιομάζα S. cerevisiae χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή ενός βιοκαταλύτη διπλής στοιβάδας σωληνωτής κυτταρίνης/γέλης αμύλου. Ο παραγόμενος βιοκαταλύτης χρησιμοποιήθηκε για την βιοδιύλιση μικτού αποβλήτου αραιωμένης μελάσσας-τυρογάλακτος. Οι κινητικές σχηματισμού οργανικών οξέων και αιθανόλης ανέδειξαν την ικανότητα του βιοκαταλύτη να παράγει μια ποικιλία οργανικών οξέων σε διάφορες συγκεντρώσεις ανάλογα με την τιμή θερμοκρασίας ζύμωσης. Πιο συγκεκριμένα η βιοδιύλιση του μικτού αποβλήτου αραιωμένης μελάσσας και τυρογάλακτος μπορεί να δώσει 6,47 g/L ηλεκτρικό οξύ, 15,1 g/L γαλακτικό οξύ, 1,22 g/L κιτρικό οξύ και 17,36 g/L αιθανόλη. Η ικανότητα του κεφίρ και του S. cerevisiae να αναπτύσσεται σε μικτά αγροτοβιομηχανικά αλλά και η ικανότητα του βιοκαταλύτη διπλής στιβάδας να παράγει μια μεγάλη ποικιλία οργανικών οξέων και αιθανόλης με βιοδιύλιση μικτού αποβλήτου μας οδήγησε στον σχεδιασμό βιοδιυλιστηρίου μικτών αποβλήτων.Συνολικά το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων έχει την ικανότητα να παράγει μια πληθώρα προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Έχει την ικανότητα να παράγει μικροβιακή βιομάζα διαφόρων μικροοργανισμών όπως L. starkeyi, S. cerevisiae, κεφίρ, μικκύλια και καρποσώματα του μύκητα A. bisporus, ζυμωτικούς βιοκαταλύτες ικανούς να παράγουν μπύρα με ανώτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, μικροβιακό λίπος, οργανικά οξέα, αιθανόλη, εναλλακτικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας και ζωοτροφή.