New processing and applications of collagen containing calcium phosphate cements
Authors:   , Pérez Antoñanzas Román 
Published: October 2023

When bone regeneration is needed, natural bone grafts are widely used. They are the best option since they present the same composition to that of bone, contain living cells with osteogenic potential, growth factors that induce cell differentiation into osteoblasts and extracellular matrix proteins that facilitate bone healing. However, this system presents some drawbacks, such as pain, morbidity, possible transmission of diseases in some cases, as well as limited availability. That is why synthetic bone grafts are one of the main objectives of the research in regenerative medicine and tissue engineering. This new discipline is based on the development of new biomaterials and on the comprehension of the interactions between the cells and the material in order to enhance the bone healing response.
The present thesis is focused on calcium phosphate cements-based materials. CPC have the ability to transform an injectable paste made of calcium phosphates, into a phase similar to that of bone, hydroxyapatite. The CPC are well known for their osteoconductive properties. Nevertheless, these may be improved from a biological point of view and can be further processed to obtain materials with new morphologies and different applications. Therefore, the incorporation of collagen in these CPC was though as a way to enhance their biological performance. Furthermore, new processing approaches were studied, as well as their applications in new fields. The thesis is divided in three main parts: i) injectable composite cements; ii) composite macroporous scaffolds for tissue engineering and iii) composite microcarriers.
In the first part, the fabrication of injectable composite cements is described as well their physico-chemical and morphological features. It is observed that the setting reaction is delayed in the presence of collagen during the initial minutes of reaction. Already after 1 hour the kinetics are similar in the presence and absence of collagen, without affecting the final product of reaction. The presence of collagen increases the injectability of the cements, whereas the mechanical properties decrease as the collagen concentration increases. From a biological point of view, the addition of collagen results in an increase in the initial cell adhesion as well as an increase in the cell proliferation rates. In the second part, macroporous scaffolds made of collagen and CPC are fabricated. These scaffolds are prepared through the freeze-drying of a collagen-CPC slurry. Different amounts of CPC are incorporated in the scaffolds. When mesenchymal stem cells are cultured on these scaffolds, it is observed that as the CPC content increases in the scaffolds, the cell differentiation increases, whereas the proliferation decreases. Further improvement of the scaffolds can be achieved though the incorporation of a BMP-7 gene into the scaffolds, in order to stimulate their osteoinductivity. The results show that as the gene incorporated in the scaffolds increases, there is an increase in the BMP-7 production, although this increase is associated with an increase in cell proliferation. In the third and final part, spherical microcarriers containing either gelatin or collagen are produced through the setting reaction of the CPC in a water in oil emulsion. The emulsion and CPC compositions can be adjusted in order to control the final features of the microcarriers. The in vitro characterization of the microcarriers reveals that under static and dynamic culturing conditions, microcarrieres are able to support cell attachment, proliferation and differentiation.

Cuando la regeneración ósea es necesaria, los injertos de hueso natural son ampliamente utilizados. Son la mejor opción debido a que presentan la misma composición que el hueso, contienen células vivas con potencial osteogénico, factores de crecimiento que inducen la diferenciación de las células a osteoblastos y proteínas de la matriz extracelular que facilitan la regeneración ósea. A pesar de esto, este sistema presenta algunos inconvenientes, tales como el dolor, morbidez, posible transmisión de enfermedades en algunos casos, al igual que una disponibilidad limitada. Por ello, los injertos de hueso sintético son uno de los principales objetivos de la investigación en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Esta nueva disciplina se basa en el desarrollo de nuevos biomateriales y en la comprensión de las interacciones entre las células y los materiales con el fin de incrementar la regeneración ósea.
La presente tesis se centra en materiales basados en los cementos de fosfato de calcio (CPC). Los CPC tienen la habilidad de transformar una pasta inyectable formada por fosfatos de calcio, en una fase similar a la del hueso, que es la hidroxiapatita. Los CPC son bien conocidos por sus propiedades de osteoconductividad. Sin embargo, estos se pueden mejorar des de un punto de vista biológico y pueden ser procesados con el fin de obtener nuevos materiales con nuevas morfologías y aplicaciones. Por ello, la incorporación de colágeno en estos CPC fue pensada como una manera de incrementar el comportamiento biológico. Se estudiaron nuevas rutas de procesado, al igual que sus aplicaciones. La tesis está dividida en tres partes: i) cementos compuesto inyectables; ii) andamios compuestos macroporosos para ingeniera de tejidos y iii) microtransportadores compuestos.
En la primera parte, se describe la fabricación del cemento de fosfato de calcio compuesto y la caracterización físico-química y morfológica del material. Se observa que la reacción de fraguado se retrasa en presencia del colágeno durante los minutos iniciales de reacción. Sin embargo, después de solamente una hora, se observa como la presencia de colágeno no afecta a la cinética de reacción ni al producto final de reacción. La presencia del colágeno incrementa la inyectabilidad de los cementos, mientras que las propiedades mecánicas bajan al incrementar la concentración de colágeno. Desde un punto de vista biológico, la incorporación de colágeno resulta en un incremento de la adhesión celular inicial y un incremento de la proliferación celular. En la segunda parte, se fabrican andamios macroporosos de colágeno con CPC. Estos andamios se preparan a través de la liofilización de mezclas de colágeno y CPC. Se incorporan diversas cantidades de CPC en los andamios. Cuando se cultivan células mesenquimales en los andamios, se ve que a medida que se incrementa la cantidad de CPC en el andamio, la diferenciación celular se incrementa, mientras que la proliferación disminuye. Los andamios se pueden mejorar mediante la incorporación de un gen para expresar la proteína BMP-7 con el fin de incrementar la osteoinducción. Los resultados muestran que al aumentar la cantidad de gen incorporado en el andamio, se incrementa la producción de BMP-7, aunque este incremento va asociado con un incremento en la proliferación celular. En la tercera y última parte, se fabrican microtransportadores esféricos que contienen gelatina o colágeno mediante la reacción de fraguado del CPC en una emulsión de agua en aceite. La emulsión y la composición del CPC se pueden ajustar con el fin de controlar las propiedades finales de los microtransportadores. La caracterización in vitro de los microtransportadores revela que bajo condiciones de cultivo estáticas y dinámicas, los microntransportadores son capaces de soportar adhesión celular, proliferación y diferenciación.