Ανάλυση της έκφρασης, μελέτη και κλινική αξιολόγηση των καλλικρεϊνών KLK13 και KLK15 στον καρκίνο του προστάτη
Authors: Μαυρίδης Κωνσταντίνος 
Published: September 2021

Η εισαγωγή νέων μοριακών δεικτών για τη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να περιορίσει τα μειονεκτήματα που πηγάζουν από την εκτεταμένη χρήση του PSA. Οι καλλικρεΐνες αποτελούν μια οικογένεια από 15 γονίδια εκκρινόμενων πρωτεασών σερίνης που εμπλέκονται στην εξέλιξη των ανθρώπινων νεοπλασιών. Πρόσφατα δεδομένα παρουσιάζουν τα microRNAs (miRNAs) ως πολλά υποσχόμενους καρκινικούς δείκτες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο την ανάλυση της έκφρασης, τη μελέτη και την κλινική αξιολόγηση, των καλλικρεϊνών KLK13, KLK15 καθώς και του miR-224, που στοχεύει το γονίδιο KLK15,στον καρκίνο του προστάτη.Πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση καρκινικών και καλοηθών ιστών προστάτη, απομόνωση ολικού RNA και αντίστροφη μεταγραφή του RNA, έπειτα από πολυαδενυλίωση στην περίπτωση της ανάλυσης των miRNAs, σε cDNA. Σε πρώτο στάδιο, αναλύθηκε η έκφραση των κλασικών και εναλλακτικών μεταγράφων mRNA των γονιδίων KLK15 και KLK13, σε ιστούς και καρκινικές σειρές προστάτη, μέσω συμβατικής PCR, και πραγματοποιήθηκε ανοσοεντοπισμός της πρωτεΐνης KLK13 μετά από στύπωση Western. Ακολούθησε ανάλυση της έκφρασης των κλασικών mRNA μεταγράφων των γονιδίων KLK15 και KLK13, καθώς και του miR-224 σε ιστούς προστάτη μέσω ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο μετά από βελτιστοποίηση και κατάλληλο έλεγχο ποιότητας της μεθοδολογίας. Επιπρόσθετα, αναλύθηκε η επίδραση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, docetaxel και mitoxantrone στη βιωσιμότητα της ορμονοανεξάρτητης καρκινικής κυτταρικής σειράς προστάτη DU145, μέσω των μεθοδολογιών MTT και Trypan Blue, και στην έκφραση των κλασικών μεταγράφων mRNA των γονιδίων KLK13 και KLK15, μέσω qPCR. Η διερεύνηση της κλινικής αξίας των μελετώμενων βιομορίων πραγματοποιήθηκε μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης (μη παραμετρικές δοκιμασίες, καμπύλες ROC, ανάλυση επιβίωσης κατά Kaplan-Meier, μονομεταβλητή-πολυμεταβλητή λογιστική παλινδρόμηση κατά Cox).Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι τα γονίδια KLK15 και KLK13 εκφράζονται σε αυξημένα επίπεδα στον καρκίνο του προστάτη σε σχέση με την καλοήθη προστατική υπερπλασία. Χρησιμοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωμα παρατηρήθηκε έκφραση της πρωτεΐνης KLK13 σε ιστούς προστάτη. Η έκφραση του γονιδίου KLK13 σε επίπεδο mRNA αποτελεί ένα δείκτη ευμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (p=0,015). Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του κλασικού μεταγράφου του γονιδίου KLK15 έδειξε ότι η έκφρασή του είναι ιδιαίτερα αυξημένη στον καρκίνο του προστάτη (p<0,001), καθώς και σε όγκους προχωρημένου σταδίου (p=0,023). Η έκφραση του συγκεκριμένου μεταγράφου αποτελεί ένα νέο ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση βιοχημικής υποτροπής (HR=3,36, p=0,038). Όσον αφορά το miR-224 παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων του στον καρκίνο του προστάτη (p<0,001). Παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων του miR-224 σε περισσότερο επιθετικούς όγκους (p=0,017) και σε όγκους προχωρημένου σταδίου (p=0,018). Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η παρουσία του miR-224 αποτελεί ένα νέο δείκτη ευμενούς πρόγνωσης (p=0,021). Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μια ισχυρή αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων mRNA του γονιδίου KLK15 και των επιπέδων miR-224 στον καρκίνο του προστάτη (rs= -0,434,p<0,001). Επιπλέον, βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου KLK15 αυξάνονται με τη χορήγηση αντικαρκινικών παραγόντων στην κυτταρική σειρά DU145.Τα μελετώμενα μόρια αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενους μοριακούς δείκτες που θα μπορούσαν να ενισχύσουν τη διαφοροδιάγνωση και να συμβάλλουν στην έγκυρη πρόγνωση και στην παρακολούθηση της θεραπευτικής ανταπόκρισης των ασθενών με καρκίνο του προστάτη.