Ανασχεδιασμός της δομής του ενζύμου τρανφεράση της γλουταθειόνης με στόχο την τροποποίηση των καταλυτικών και δομικών του ιδιοτήτων
Authors: Πούλιου Φωτεινή 
Published: September 2021

Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης είναι μια μεγάλη υπεροικογένεια ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ξενοβιοτικών ενώσεων. Kαταλύουν τη διπλή πυρηνόφιλη σύζευξη στην οποία προάγεται η GSH προς όφελος των ηλεκτρονιόφιλων, υδρόφοβων και κυτταροτοξικών υποστρωμάτων. Το προϊόν της αντίδρασης εκκρίνεται από το κύτταρο, παρέχοντας έτσι έναν αμυντικό μηχανισμό έναντι των βλαβερών επιδράσεων των τοξικών ενώσεων και του οξειδωτικού στρες.Όσον αφορά στην πρώτη ενότητα της διατριβής, έπειτα από σάρωση της βιβλιοθήκης μεταλλαγμένων μορφών, επιλέχθηκαν τρεις αποικίες, οι sh4, sh15 και sh19, με βάση την ενζυμική δραστικότητα για το σύστημα GSH/alachlor, οι οποίες αποτέλεσαν μήτρα για την κατευθυνόμενη ενζυμική εξέλιξη. Aυτές κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν ετερόλογα και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Ακολούθησε κινητική ανάλυση για το σύστημα GSH/CDNB όπου και υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας των ισοενζύμων με διαφορετικά υποστρώματα για να ελεγχθούν πιθανές δράσεις που παρουσιάζουν. Επιπλέον, λύθηκε η κρυσταλλοδομή του ισοενζύμου sh4 με ανάλυση 2,27 Å. Στην προσπάθεια να διευρυνθεί η πολυπλοκότητα, πραγματοποιήθηκε ένας τρίτος κύκλος κατευθυνόμενης ενζυμικής εξέλιξης. Μελετήθηκαν και σε αυτή την περίπτωση τρεις αποικίες, οι shII5, shII6 και shII7. Ακολούθησε η ίδια διαδικασία χαρακτηρισμού των ισοενζύμων. Μελετήθηκε η θερμοδυναμική συμπεριφορά τους και υπολογίστηκε το σημείο τήξεως. Παρατηρήθηκε πως μέσω των επαναλαμβανόμενων κύκλων κατευθυνόμενης ενζυμικής εξέλιξης αυξήθηκε το σημείο τήξεως περίπου κατά 10 ºC. Ακολούθησε σάρωση φυτοπροστατευτικών προϊόντων ως δυνητικών αναστολέων του shII5 και φάνηκε ότι οι στρομπιλουρίνες αναστέλλουν την ενζυμική δραστικότητα του shII5. Έτσι, υπολογίστηκαν οι δείκτες ανασταλτικής ισχύος, όπου το pyrachlostrobin εμφάνισε τη μικρότερη τιμή. Επιπλέον, μελετήθηκε το είδος της αναστολής που επιφέρει το pyrachlostrobin στο ένζυμο μέσω κινητικής μελέτης, όπου φαίνεται να εμφανίζει μικτού τύπου αναστολή έχοντας ως μεταβαλλόμενα υποστρώματα τόσο το CDNB όσο και τη GSH. Τέλος, βασιζόμενοι στην αναστολή που παρουσιάζει το shII5 έναντι του pyrachlostrobin αναπτύχθηκε βιοαισθητήρας ανίχνευσής του σε περιβαλλοντικά δείγματα. Αρχικά το ένζυμο ακινητοποιήθηκε και πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη για το σύστημα GSH/CDNB. Υπολογίστηκε ο δείκτης IC50 για τo pyrachlostrobin με το ακινητοποιημένο ισοένζυμο. Τα αποτελέσματα των φασματοφωτομετρικών μετρήσεων χρησιμοποιώντας το ακινητοποιημένο ενζύμο σε διαφορετικές συγκεντρώσεις pyrachlostrobin έδειξαν ότι η σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του pyrachlostrobin και της παραμένουσας δραστικότητας φαίνεται να είναι γραμμική, για το συγκεκριμένο εύρος τιμών, με R2 99,5%. Η ευαισθησία, της μεθόδου που αναπτύχθηκε, βασίζεται στην ικανότητα που έχει το pyrachlostrobin να αναστέλλει ολοκληρωτικά την ενζυμική του δραστικότητα. Στην επόμενη ενότητα, διερευνήθηκαν GST ισοένζυμα που προέρχονται από φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ισοένζυμο που προέρχεται από τη Glycine max καθώς και δύο ισοένζυμα που προέρχονται από το Phaseolus vulgaris, τα οποία κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν σε Ε. Coli και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Τα αποτελέσματα φανερώνουν ότι τα ισοένζυμα PvGSTU8.1 και PvGSTU8.2 εμφανίζουν περιορισμένη εκλεκτικότητα σε σύγκριση με το ισοένζυμο GmGSTU5-5. Επίσης, πραγματοποιήθηκε κινητική ανάλυση για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι έναντι διαφορετικών ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων, καθώς και αναλόγων GSH. Επιπλέον, μελετήθηκαν δύο ισοένζυμα που προέρχονται από Mus musculus. Το cDNA των ενζύμων απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR, κλωνοποιήθηκε, εκφράστηκε σε Ε. Coli και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Πραγματοποιήθηκε κινητική ανάλυση για να προσδιοριστούν οι κινητικές παράμετροι έναντι διαφορετικών ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων. Tέλος, λύθηκε η κρυσταλλοδομή του ισοενζύμου MmGSTP1-1 σε σύμπλεγμα με S-(4-νιτροβενζυλ)-GSH με ανάλυση 1,28 Α.