Η πρωτεάση των χλωροπλαστών και ο ρόλος της στην αποδόμηση της LHCII αποπρωτεΐνης
Authors: Τζιβελέκα Αικατερίνη-Λητώ 
Published: August 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η φύση της πρωτεάσης της LHCII (Light Harvesting Complex) αποπρωτεΐνης των χλωροπλαστών από φύλλα φασολιού (Phaseolus vulgaris) και ο ρυθμιστικός της ρόλος τόσο στην βιογένεση όσο και στην λειτουργία της φωτοσυνθετικής μεμβράνης. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε με χρήση κυρίως βιοχημικών, αλλά και τεχνικών μοριακής βιολογίας (απομόνωση, διαχωρισμός και χαρακτηρισμός μακρομορίων (πρωτεϊνών/DNA)).Βρέθηκε ότι άθικτοι ωχροπλάστες φασολιού παρουσιάζουν πρωτεολυτική ενεργότητα ως προς εξωγενώς προστιθέμενη LHCII αποπρωτείνη, που αυξάνει παράλληλα με την ανάπτυξη του φυτού. Η ενεργότητα αυξάνει στο μεμβρανικό κλάσμα και όχι στο στρώμα, όπου εκεί παραμένει χαμηλή και σταθερή. Επομένως, η αύξηση που παρατηρούμε δεν οφείλεται σε μεταβαλλόμενη πρόσδεση της πρωτεάσης στα προθυλακοειδή κατά την ανάπτυξη, αλλά πιθανότατα αντικατοπτρίζει την de novo σύνθεση του πρωτεολυτικού συστήματος. H πρωτεολυτική ενεργότητα των θυλακοειδών είναι χαμηλή σε ωχροπλάστες ηλικίας 6-ημερών και αυξάνει σε φυτά που εκθέτονται σε μια αναλαμπή φωτός ή σε κύκλους περιοδικού φωτισμού, αλλά μειώνεται μετά από παρατεταμένη έκθεση σε συνεχή φωτισμό, παράλληλα με την συσσώρευση της χλωροφύλλης. Το φαινόμενο όμως αυτό εξαλείφεται όταν τα θυλακοειδή διαλυτοποιηθούν σε ΤΧ-100. Αντίθετα, η διαλυτοποίηση σε TX-100 των προθυλακοειδών και των πρωτογενών θυλακοειδών δεν επιδρά στην πρωτεολυτική τους ενεργότητα ως προς εξωγενή LHCII αποπρωτεΐνη. Επιπλέον, η προσθήκη ΤΧ-100 διαλυτοποιημένων ώριμων θυλακοειδών (πλούσιων σε χλωροφύλλη) σε αδιάλυτα πρωτογενή θυλακοειδή δεν έχει καμία επίδραση στην πρωτεολυτική ενεργότητα των δεύτερων. Συμπεραίνουμε επομένως, ότι η μείωση της ενεργότητας στα θυλακοειδή φυτών που εκθέτονται στον συνεχή φωτισμό, οφείλεται σε παρεμπόδιση της πρωτεολυτικής δράσης λόγω οργάνωσης του υποστρώματος και όχι λόγω αναστολής της πρωτεολυτικής δράσης από την χλωροφύλλη. Επομένως, ο σχηματισμός χλωροφυλλοπρωτεϊνικού συμπλόκου προστατεύει την LHCII αποπρωτεΐνη από την πρωτεάση.Βρέθηκε επίσης ότι φυτά που εκθέτονται σε περιοδικό φωτισμό και δέχονται τον ίδιο αριθμό αναλαμπών, έχοντας όμως διαφορετική διάρκεια σκοτόφασης (ίδια συσσώρευση χλωροφύλλης, διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης), παρουσιάζουν μεγαλύτερη ενεργότητα όσο μεγαλώνει η διάρκεια της σκοτόφασης (περισσότερο αναπτυγμένα). Φυτά που βρίσκονται στην ίδια αναπτυξιακή κατάσταση αλλά έχουν συσσωρεύσει διαφορετικά ποσά χλωροφύλλης έχουν την ίδια περίπου πρωτεολυτική ενεργότητα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πρωτεάση, η οποία μπορεί και δρα σε συνθήκες περιορισμένης συσσώρευσης χλωροφύλλης και εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, παίζει καθοριστικό ρόλο στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτεΐνης. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση του Cd2+ στην συσσώρευση χλωροφύλλης και στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτεΐνης κατά την ανάπτυξη των φυτών σε περιοδικό φωτισμό. Βρέθηκε ότι χορήγηση in vivo διαλυμάτων Cd2+ σε φυτά που αναπτύσσονται σε συνθήκες περιοδικού φωτισμού προκαλεί μείωση της ποσότητας LHCII που σταθεροποιείται στα πρωτογενή θυλακοειδή. Στις συνθήκες αυτές η συσσώρευση Chl μειώνεται, η ικανότητα πρωτεϊνικής σύνθεσης δεν επηρεάζεται, ενώ ο λόγος σταθεροποιημένης LHCII/Chl παραμένει σταθερός. Επιπλέον, η πρωτεολυτική ενεργότητα που αποδομεί την LHCII αποπρωτεΐνης των πρωτογενών θυλακοειδών αναστέλλεται παρουσία Cd2+ τόσο in vivo όσο και in vitro. Τέλος, βρέθηκε ότι η επίδραση της χορήγησης Cd2+ εκδηλώνεται στο μεταγραφικό στάδιο, προκαλώντας την μείωση του αριθμού των μεταγραφημάτων της LHCII.