Πρωτεολυτική δραστηριότητα στον εξωκυττάριο χώρο στη λοίμωξη από H. pylori
Authors: Καραγιάννης Ιωάννης 
Published: November 2023

Η εμμένουσα λοίμωξη από το Helicobacter pylori (H. pylori) προκαλεί χρόνια ενεργό γαστρίτιδα ενώ αποτελεί προεξάρχων παράγοντα κινδύνου ανάπτυξης γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Η αποδιοργάνωση του επιθηλίου στο πλαίσιο της λοίμωξης περιλαμβάνει αυξημένη πρωτεολυτική δραστηριότητα, διαμεσολαβούμενη και από μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs). Οι MMPs, προερχόμενες από το επιθήλιο και τα κύτταρα του στρώματος, αποδομούν συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, προωθώντας έτσι τη φλεγμονή και την ιστική εξαλλαγή. Προηγούμενα αποτελέσματα του εργαστηρίου ανέδειξαν την επαγωγή έκφρασης της Στρωμελυσίνης-1 (MMP-3) και της Ζελατινάσης Β (MMP-9) μετά από in vitro H. pylori λοίμωξη, σε συνάρτηση με την ενδοκυτταρική δράση της βακτηριακής ογκοπρωτεΐνης CagA. Η CagA, βασικός λοιμοτοξικός παράγοντας του H. pylori, ενίεται μέσω του εκκριτικού συστήματος τύπου 4 (T4SS) στο κυτταρόπλασμα, όπου αλληλεπιδρά με κινάσες του ξενιστή, απορρυθμίζοντας έτσι οδούς μεταγωγής σήματος που εμπλέκονται μεταξύ άλλων στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την κατάργηση της κυτταρικής πολικότητας, την κατάλυση των διακυτταρικών συνδέσμων και την κυτταρική κινητικότητα. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν αφενός, η μελέτη της επίπτωσης της δράσης της CagA στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9 γαστρικού ιστού, στο πλαίσιο πειραματικής in vivo H. pylori λοίμωξης, αφετέρου δε, η μελέτη της συμβολής των οδών μεταγωγής σήματος των MAPKs στην έκφραση των εν λόγω MMPs σε πειραματικά συστήματα in vitro H. pylori λοίμωξης γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων. Αναφορικά με το πρώτο σκέλος της μελέτης, C57BL/6 ποντικοί μολύνθηκαν με τα H. pylori στελέχη HPARE (CagA-θετικό: n ποντικών = 20), HPARE ΔCagA (n ποντικών = 20) και SS1 (CagA-θετικό, μη-λειτουργικό T4SS: n ποντικών = 20). Έξι (6) και 9 μήνες μετά την πρωτολοίμωξη συλλέχθηκαν γαστρικοί ιστοί από 10 ποντικούς ανά ομάδα μελέτης και χρονική στιγμή αντίστοιχα. Η μεταγραφική έκφραση των Mmp-3 και Mmp-9 μελετήθηκε με ποσοτική RT-PCR ενώ τα αντίστοιχα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ανοσοϊστοχημικά. Για την επιβεβαίωση της επιτυχούς H. pylori λοίμωξης έγινε ανίχνευση IgG αντισωμάτων ορού έναντι του βακτηρίου στους 2, 6 και 9 μήνες, μέσω in house-ELISA. Το σύνολο των ζώων στις ομάδες μελέτης κατέδειξε εγκαταστημένη H. pylori λοίμωξη, με το HPARE CagA-θετικό, με λειτουργικό T4SS στέλεχος να επάγει ανιχνεύσιμα αντισώματα ήδη από τους πρώτους 2 μήνες. Η μέγιστη θετικοποίηση καταγράφηκε 9 μήνες μετά τη λοίμωξη, όπου σε όλες τις ομάδες μελέτης παρατηρήθηκαν αντισώματα έναντι του H. pylori. Η λειτουργικότητα του T4SS κατά τη διάρκεια της λοίμωξης, επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της έκκρισης IL-8 στο υπερκείμενο επιθηλιακών κυττάρων μετά από συγκαλλιέργεια με το απομονωθέν στους 9 μήνες στέλεχος έναντι του αρχικά χορηγηθέντος HPARE στελέχους. Η κλωνική σχέση μεταξύ των δύο στελεχών επιβεβαιώθηκε μέσω RAPD PCR. Αναφορικά με την έκφραση των MMPs στο γαστρικό ιστό, παρατηρήθηκε μεταγραφική αυξορρύθμιση των Mmp-3 και Mmp-9 στους 9 μήνες, στις δύο ομάδες μελέτης με τα H. pylori CagA-θετικά στελέχη, ανεξάρτητα της λειτουργικότητας του T4SS. Ανοσοϊστοχημικά, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα MMP-3 και MMP-9 στους 6 μήνες, ειδικά στην ομάδα λοίμωξης με το CagA-θετικό στέλεχος HPARE. Στους 9 μήνες όλες οι ομάδες μελέτης εμφάνισαν συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης και των δύο MMPs. Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση ανέδειξε την ανάπτυξη χρόνιας ενεργού γαστρίτιδας με μέτρια έως έντονη βαρύτητα και ήπιας έως μέτριας δραστηριότητα, σύμφωνα με το αναθεωρημένο σύστημα αξιολόγησης της γαστρίτιδας κατά Sydney.Ακολούθως αξιολογήθηκε η συμβολή των οδών μεταγωγής σήματος των MAPKs στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9 και για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινης προέλευσης επιθηλιακά κύτταρα γαστρικού αδενοκαρκινώματος (AGS) καθώς και εμβρυϊκά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα αθανατοποιημένα μέσω SV40 λοίμωξης (GES-1). Αμφότερες κυτταρικές σειρές μολύνθηκαν για 24 ώρες με το H. pylori στέλεχος P12 (CagA-θετικό) παρουσία χημικών αναστολέων των οδών μεταγωγής σήματος JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059) και p38 (SB203580) και προσδιορίστηκε η μεταγραφική και πρωτεϊνική έκφραση των MMP-3 και MMP-9 με ποσοτική RT-PCR και Western blot, αντίστοιχα. Επιβεβαιώθηκε ότι οι ειδικοί αναστολείς των JNK και ERK1/2 οδήγησαν σε μειορρύθμιση της ενεργοποίησης των αντίστοιχων κινασών c-Jun και ERK1/2 στο υπόβαθρο της H. pylori λοίμωξης, ενώ αναστολή του p38 οδήγησε στη συσσώρευση της φωσφορυλιωμένης ισομορφής της κινάσης (pp38). Αναστολή των ERK1/2 είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης των MMP-3 και MMP-9 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ομοίως, τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης των δύο MMPs εμφανίστηκαν μειωμένα, παρουσία αναστολέα του JNK και στις δύο κυτταρικές σειρές. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα μεταγραφικά επίπεδα των δύο MMPs στο σύστημα αυτό μειορρυθμίστηκαν μόνο στην περίπτωση των GES-1 κυττάρων, καθώς η σηματοδοτική οδός ERK1/2 στα AGS κύτταρα είναι ενδογενώς ενεργοποιημένη λόγω παρουσίας της G12D KRAS μετάλλαξης. Παρόμοια ενεργοποίηση των ERK1/2 κινασών παρουσία του αναστολέα του p38 ανιχνεύθηκε και στις δύο κυτταρικές σειρές, υποδηλώνοντας διασταυρούμενη απόκριση μεταξύ των MAPKs. Στην παρούσα διατριβή αναδεικνύεται η υπερέκφραση των MMP-3 και MMP-9 κατά την in vivo H. pylori λοίμωξη με συνοδό ανάπτυξη γαστρίτιδας στο χόριο με μέτρια έως έντονη λεμφοκυτταρική παρουσία και ήπια έως μέτρια ουδετεροφιλική διήθηση. Αναδεικνύεται επίσης, ο ρόλος της CagA και του T4SS στην εν λόγω υπερέκφραση, ειδικά κατά τα αρχικά στάδια της λοίμωξης. Επιπλέον, υπογραμμίζεται ο κομβικός ρόλος των ERK1/2 και δευτερευόντως της JNK στην έκφραση των MMP-3 και MMP-9, καθώς και η διασταυρούμενη επικοινωνία μεταξύ των οδών μεταγωγής σήματος MAPKs, ως πιθανών θεραπευτικών στόχων για την πρόληψη της γαστρικής νεοπλασίας.