Βιοχημική και ανοσοχημική μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ασθενών με σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS)
Authors: Κητσιούλη Ειρήνη 
Published: August 2021

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της συνεισφοράς βιοχημικών και ανοσοχημικών παραμέτρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) στη διαδικασία εξέλιξης του Συνδρόμου Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας (ARDS) και η ανεύρεση προγνωστικών δεικτών της εξέλιξης της νόσου. Για το σκοπό αυτό έγινε: α) ανάπτυξη και αξιολόγηση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου για την ανίχνευση και διαφορικό προσδιορισμό των ενεργοτήτων της φωσφολιπάσης Α2 (PLase Α2) καιPAF-ακετυλυδρολάσης (PAF-AcH) σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και ορρό αίματος, β) προσδιορισμός των πρωτεϊνών, φωσφολιπιδίων, δεικτών φλεγμονώδους αντίδρασης^όπως ο παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίω ν (PAF), η PLase Α2 και οι μεταβολές των κυττάρων στο BAL κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ARDS, γ) διερεύνηση της ύπαρξης και εξειδίκευσης αυτοαντισωμάτων κατά φωσφολιπιδίων στο BAL ασθενών με ARDS, δ) προσδιορισμός των βιοχημικών χαρακτηριστικών, ανίχνευση και έλεγχος εξειδίκευσης αντιφωσφολιπιδικών αντισω μάτω ν στο BAL ασθενούς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο και ARDS και τέλος ε) μελέτη εάν ηχρωματογραφία στήλης συγγένειας πρωτεΐνη C καθαρίζει τις ανοσοσφαιρίνες G των βιολογικών υγρών από τα λιπίδια. α) Αρχικά έγινε ανάπτυξη φθορισμομετρικής μεθόδου για μέτρησηενεργότητας PLase Α2 και PAF-AcH σε βιολογικά υγρά. Η PLase Α2 προσδιορίστηκε με τη χρήση της Ο^-ΝΒϋ-φωσφατιδυλοχολίνης παρουσία Ca2+, από την κλίση της καμπύλης αύξησης της έντασης φθορισμού λόγω του σχηματισμού του C 12-N BD - λιπαρού οξέος. Η PAF-AcH προσδιορίστηκε με τη χρήση της C6-NBD φωσφατιδυλοχολίνης, από την κλίση της καμπύλης λόγω του σχηματισμού του C$-NBD-λιπαρού οξέος απουσία Ca2+. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν μετά από ανάλυση TLC. Εκτιμήθηκε η εξειδίκευση της μεθόδου σε σύγκριση με ραδιομετρικό προσδιορισμό. Στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες δεν παρατηρήθηκε παρεμβολή από σκέδαση του φωτός ούτε φαινόμενο εσωτερικού φίλτρου. Διερευνήθηκε η επίδραση του pH, της θερμοκρασίας και των ιόντων Ca2+. Οι πρωτεΐνες προκάλεσαν μια αρχική αύξηση του φθορισμού των δύο NBD-PCs. Οι"πρότυπες καμπύλες των NBD-λιπαρών οξέων είχαν όμοια κλίση. Η γραμμικότητα επεκτάθηκε μέχρι τουλάχιστον τα 4.5 nmoles λιπαρού οξέος ανά ml του μίγματος αντίδρασης ae pH 7.4. Ο φθορισμός των NBD-λιπαρών οξέων παρέμεινε σταθερός για αυξανόμενες συγκεντρώσεις του BAL και του ορρού καθώς και για BSA μέχρι τα 100 pg/ml του μίγματος αντίδρασης. Η παγκρεατική PLase Α2 έδειξε προτίμηση στην υδρόλυση της C 12-NBD-PC παρουσία Ca2+, ενώ απουσία Ca2+ η PAF-AcH υδρόλυσε μόνο την C6-NBD-PC. Η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, ακριβής και επαναλήψιμη καιμπορεί να εφαρμοστεί για το διαφορικό προσδιορισμό της PLase Α2 και της PAF-AcH στο BAL και στον ορρό. Ακολούθως, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της ενεργότητας PLase Α2 σε BAL ασθενών με ARDS. β) Σε 19 μηχανικά αεριζόμενους ασθενείς με ARDS και 10 ασθενείς χωρίς καρδιοπνευμονική πάθηση (ομάδα ελέγχου), έγινε λήψη BAL κατά τη διάρκεια της πρώιμης, ενδιάμεσης και όψιμης φάσης του ARDS. Υψηλά επίπεδα PAF, PLase Α2, ουδετερόφιλων και πρωτεϊνών καθώς και ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές των φωσφολιπιδίων ανιχνεύθηκαν στο BAL ασθενών με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα επίπεδα του PAF, των ουδετερόφιλων και των πρωτεϊνών βρέθηκαν υψηλότερα στο πρώιμο σε σύγκριση με το ενδιάμεσο ή το όψιμο ARDS. Τα επίπεδα των ολικών φωσφολιπιδίων παρουσίασαν αύξηση στην πρώιμη και μείωση στηνενδιάμεση και όψιμη φάση του συνδρόμου. Ο ι ποιοτικές μεταβολές του επιφανειοδραστικού παράγοντα συνίστανται σε μειωμένα επίπεδα φωσφολιπιδίων στο κλάσμα του επιφανειοδραστικού παράγοντα με καλές επιφανειοδραστικές ιδιότητες. Επιπλέον, υπήρξε μια σημαντική μείωση στο ποσοστό της φωσφατιδυλοχολίνης και φωσφατιδυλογλυκερόλης και αύξηση στηφωσφατιδυλαιθανολαμίνη φωσφατιδυλοσερίνη, φωσφατιδυλινοσιτόλη και σφιγγομυελίνη σε όλες τις φάσεις του ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η λυσο-φωσφατιδυλοχολίνη ήταν ανιχνεύσιμη μόνο στην όψιμη φάση του συνδρόμου. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες που μεταβλήθηκαν θα μπορούσαν να έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση και εξέλιξη της νόσου.γ) Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η παρουσία αυτοαντισωμάτων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με ARDS. To BAL αναλύθηκε αρχικά με ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του και ανοσοαποτύπωοη των ανοσοσφαιρινών G (IgG) χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα-lgG αντισώματα. Υπό αυτές τις συνθήκες, οι IgGs εμφάνισαν δύο ζώνες πρωτεϊνών, τις βαριές και ελαφρές (λιγότεροσημασμένες) αλυσίδες των IgG, στα 50 και 25 kDa αντίστοιχα. Η ζώνη στα 50 kDa ανιχνεύθηκε στο BAL όλων των ασθενών με ARDS, ενώ η ζώνη στα 25 kDa δεν ήταν πάντα ορατή. Υψηλά επίπεδα ανοσοσφαιρινών G έναντι διαφόρων φωσφολιπιδίων ανιχνεύθηκαν στο BAL των ασθενών με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η δέσμευση των αντισωμάτων του BAL με ELISA παρατηρήθηκε για διάφορα φωσφολιπίδια. Τα αυτοαντισώματα δεσμεύτηκαν με PS ή PG, ή μερικές φορές με ΡΙ, αλλά όλα αντέδρασαν με το φωσφατιδικό οξύ, πιθανώ ς διότι το ΡΑ είναι κοινότμήμα όλων των ανιονικών φωσφολιπιδίων. Δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική δέσμευση με σφιγγομυελίνη ή με PC και ΡΕ. Ασθενής δέσμευση παρουσιάστηκε με τη χοληστερόλη όχι όμως με την εστεροποιημένη χοληστερόλη. Τα καθαρισμένα αντισώματα από στήλη συγγένειας πρωτεΐνης G, παρουσίασαν την ίδια προτίμηση για PS και ΡΑ υποδεικνύοντας ότι αυτά τα αντιλιπιδικά αντισώματα αναγνωρίζουν τα λιπίδια που δοκιμάστηκαν απουσία οποιουδήποτε συμπαράγοντα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι αυτοαντισώματα υπάρχουν στο BAL ασθενών με ARDS και κατευθύνονται κατά των ανιοντικών φωσφολιπιδίων και αυτό μπορεί να υποδηλώνει συμμετοχή αυτοάνοσων μηχανισμών στην παθογένεση της ανεπάρκειας του επιφανειοδραστικού παράγοντα ή διαιώνιση της φλεγμονώδους αντίδρασης στο επίπεδο του πνευμονικού παρεγχύματος. δ) Μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά, η ύπαρξη και εξειδίκευση αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενούς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APLAS) και ARDS. Αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα βρέθηκαν στο BAL ασθενούς με APLAS. Συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα αντισωμάτων κατά της καρδιολιπίνης, φωσφατιδυλοσερίνης και φωσφατιδικού οξέος. Παρατηρήθηκε επίσης ποιοτική και ποσοτική ανεπάρκεια των φωσφολιπιδίων του επιφανειοδραστικού παράγοντα και αυξημένα επίπεδα ουδετερόφιλων. ε) Κατά τη διάρκεια της μελέτης εάν η στήλη χρωματογραφίας συγγένειας πρωτεΐνης G καθαρίζει τις περιεχόμενες ανοσοσφαιρίνες G βιολογικών υγρών από τα λιπίδια, διάφορα δείγματα BAL και ορρών καθώς και διάφορα λιπίδια δεσμευμένα με αλβουμίνη περάστηκαν από τη στήλη. Η έκλουση του υλικού πουσυγκρατήθηκε από τη στήλη έγινε με ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης pH 2.7. Βρέθηκε ότι όλα τα δείγματα BAL που δοκιμάστηκαν περιείχαν υψηλά επίπεδα IgG μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό. Στο λιπιδικό εκχύλισμα του κλάσματος των εκλουομένων IgG ανιχνεύθηκαν, μετά από διαχωρισμό HPTLC, ουδέτερα λιπίδια και ίχνη πολικών λιπιδίων. Τα πολικά λιπίδια μετατοπίστηκαν στο Rf της PC και PS, ενώ η ανάλυση τω ν ουδετέρων λιπιδίων έδειξε την παρουσία ενός λιπιδίου που μετατοπίστηκε στο Rf της χοληστερόλης. Χημικός χαρακτηρισμός αυτού του συστατικού με φασματομετρία μάζας απέδειξε ότι ήταν πράγματι η χοληστερόλη. Όταν πρότυπα διαλύματα χοληστερόλης με BSA χρωματογραφήθηκαν από τη στήλη πρωτεΐνης G, βρέθηκε ότι το έκλουσμα περιείχε χοληστερόλη όχι όμως ανιχνεύσιμες με ανάλυση SDS-ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ποσότητες BSA. Όταν αυξανόμενες συγκεντρώσεις μίγματος λιπιδίων σε διάλυμα BSA διαπέρασαν τη στήλη, παρατηρήθηκε ότι το λιπιδικό εκχύλισμα του εκλούσματος με το ρυθμιστικό διάλυματης γλυκίνης pH 2.7 περιείχε αυξανόμενες συγκεντρώσεις χοληστερόλης. Επίσης, ανιχνεύθηκαν σε αυτό PC, PS, PG και ΡΕ. Συμπερασματικά, το κλάσμα των καθαρισμένων IgG δειγμάτων BAL ή ορρών, περιέχει, εκτός από τις ανοσοσφαιρίνες, ίχνη φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης ως το κύριο λιπίδιο.