Molecular characterization of pesticide resistance in Bemisia tabaci and Tetranychus urticae and the development of diagnostics
Authors: Παπαποστόλου Κυριακή-Μαρία 
Published: February 2022

Η ικανότητα του αλευρώδη B. tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) να μεταδίδει ιϊκές ασθένειες, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα και τη γρήγορη εξάπλωση νέων βιοτύπων σε νέες περιοχές, καθιστούν αυτό το είδος έναν από τους σημαντικότερους εχθρούς καλλιεργειών. Το άκαρι T. urticae είναι επίσης ένας από τους πιο σημαντικούς εχθρούς καλλιεργειών καθώς προσβάλλει πάνω από 1000 διαφορετικά είδη φυτών, δημιουργώντας σημαντικά προβλήματα σε αγροτικές καλλιέργειες περιοχών με αυξημένες θερμοκρασίες, όπως οι Μεσογειακές χώρες. Πολλές δραστικές ουσίες έχουν εγκριθεί για την καταπολέμησή τους, αλλά λόγω της εκτεταμένης και συχνά, λάθος χρήσης τους, έχει εμφανιστεί ανθεκτικότητα. Ο στόχος της Διδακτορικής αυτής διατριβής είναι η απόκτηση βαθύτερης κατανόησης στους μηχανισμούς ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα, η αποσαφήνιση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός ανθεκτικών φαινοτύπων και η ανάπτυξη ενός διαγνωστικού εργαλείου με απώτερο σκοπό τη συμμετοχή στην προσπάθεια διαχείρισης της ανθεκτικότητας στο πεδίο. Στο 2ο κεφάλαιο της διατριβής, ένας πληθυσμός τετρανύχου, ο οποίος συλλέχθηκε από θερμοκήπιο στην Τροιζήνα της Πελοποννήσου, εξετάσθηκε ως προς την ανθεκτικότητα του, χρησιμοποιώντας εντομοκτόνα αλλά και συνεργιστές εντομοκτόνων, πραγματοποιώντας βιοδοκιμές τοξικότητας. Οι βιοδοκιμές αυτές έδειξαν πως ο πληθυσμός ήταν ανθεκτικός σε πολλά εντομοκτόνα διαφορετικού στόχου (abamectin, etoxazole, clofentezine, cyflumetofen, fenpyroximate και spirodiclofen). Επιπροσθέτως, η ανάλυση μεταγραφώματος έδειξε την υπερέκφραση κάποιων κυτοχρωμικών οξειδασών (P450) και UDP-γλυκουρονιλ-τρανσφερασών (UGT), σε συνάρτηση με γνωστές μεταλλαγές στόχου οι οποίες έχουν ήδη συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στόχου. Νέες αμινοξικές αλλαγές βρέθηκαν σε τρεις στόχους εντομοκτόνων, στη D υπομονάδα της σουκινικής δεϋδρογονάσης (SdhD) που είναι στόχος των ΜΕΤΙ ΙΙ εντομοκτόνων, στο τρίτο κανάλι χλωρίου (GluCl3) που είναι στόχος του εντομοκτόνου abamectin και στην καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α (ACC) που είναι στόχος των κετοενολών, οι οποίες εν συνεχεία χαρακτηρίστηκαν, χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις. Στο 3ο κεφάλαιο της διατριβής, στόχος ήταν ο λειτουργικός χαρακτηρισμός μεταλλαγών στόχου που έχουν βρεθεί σε ανθεκτικούς πληθυσμούς πεδίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική γενετικής τροποποίησης CRISPR-Cas9, στο μοντέλο-οργανισμό Drosophila melanogaster. Πιο συγκεκριμένα, σε έναν Ισπανικό πληθυσμό αλευρώδη (B. tabaci) ο οποίος ήταν ανθεκτικός στις κετοενόλες, βρέθηκε μία μεταλλαγή (A2083V) στην καρβοξυτελική περιοχή του γονιδίου στόχου των κετοενολών, την καρβοξυλάση του ακετυλο-συνενζύμου Α (ACC). Σε πληθυσμούς τριαλευρώδη (Trialeurodes vaporariorum) και τετρανύχου (T. urticae), συλλεγμένους από το πεδίο και μετά από πίεση επιλογής με εντομοκτόνα κετοενολών, βρέθηκαν οι μεταλλαγές Ε645Κ και Α1079Τ, αντίστοιχα, στο γονίδιο της καρβοξυλάσης του ακετυλο-συνενζύμου Α. Επιπροσθέτως, σε πληθυσμούς τετρανύχου ανθεκτικούς στην αβερμεκτίνη abamectin, που στοχεύει τα κανάλια χλωρίου (GluCl), βρέθηκε η σημειακή μεταλλαγή I321T στο τρίτο κανάλι χλωρίου (GluCl3). Διαφορετικές σειρές μυγών δημιουργήθηκαν, όπου η κάθε μία έφερε μία από τις μεταλλαγές A2083V, A1079T και I321T σε ομοζυγωτία, εκτός από τη μεταλλαγή E645K, η οποία ήταν θνησιγόνος σε ομόζυγη κατάσταση. Βιοδοκιμές τοξικότητας με τετρονικά οξέα (spirodiclofen, spiromesifen and spirotetramat) σε μύγες που έφεραν τη μεταλλαγή A2083V, επιβεβαίωσαν τον πολύ σημαντικό ρόλο της στον ανθεκτικό φαινότυπο που είχε βρεθεί, καθώς ήταν 870 φορές πιο ανθεκτικές σε σχέση με το αρνητικό κοντρόλ. Οι μύγες οι οποίες έφεραν τη μεταλλαγή I321T σε ομοζυγωτία, έδειξαν μέτρια ανθεκτικότητα στην αβερμεκτίνη abamectin κατά τις βιοδοκιμές τοξικότητας, όπου συμπληρωματικά πειράματα υπέδειξαν έναν περίπλοκο ρόλο της μεταλλαγής στον ανθεκτικό φαινότυπο. Εν αντιθέσει, η μεταλλαγή Α1079Τ του τετρανύχου δεν έδειξε καμία συμμετοχή στον ανθεκτικό φαινότυπο στα τετρονικά οξέα.Στο 4ο κεφάλαιο, ο πληθυσμός τετρανύχου που συλλέχθηκε από την Πελοπόννησο, διερευνήθηκε περαιτέρω σε σχέση με την ανθεκτικότητά του στις κετοενόλες (ketoenols: spirodiclofen) και στους αναστολείς μεταφοράς ηλεκτρονίων στο μιτοχονδριακό σύμπλεγμα ΙΙ (ΜETI-II: cyflumetofen). Ο ήδη ανθεκτικός αυτός πληθυσμός επιλέχθηκε για αρκετές γενιές με την κετοενόλη spirodiclofen, έως ότου η ανθεκτικότητα υπερέβαινε τα 5000 mg L-1 εντομοκτόνου. Έπειτα, διασταυρώθηκε με έναν ευαίσθητο πληθυσμό με τους απογόνους της διασταύρωσης να χωρίζονται σε υποπληθυσμόυς όπου 9 εξ’ αυτών διατηρήθηκαν χωρίς επιλογή εντομοκτόνου (control), εννέα διατηρήθηκαν υπό αυξανόμενες συγκεντρώσεις spirodiclofen (spirodiclofen-selected) ενώ εννέα διατηρήθηκαν υπό αυξανόμενες συγκεντρώσεις cyflumetofen (cyflumetofen-selected), με σκοπό την πραγματοποίηση μαζικής ανάλυσης διαχωρισμού (BSA). Μετά από αρκετές γενιές επιλογής, άτομα από τους υποπληθυσμούς συλλέχθηκαν για ανάλυση γονιδιώματος, ώστε να βρεθούν γονιδιωματικές περιοχές οι οποίες σχετίζονται με την ανθεκτικότητα στα δύο αυτά εντομοκτόνα. Η ανθεκτικότητα στην αβερμεκτίνη abamectin του τετρανύχου έχει συσχετισθεί με μία P450, την CYP392A16, η οποία έχει χαρακτηρισθεί λειτουργικά in vitro και έχει δειχθεί πως έχει την ικανότητα να μεταβολίζει το abamectin σε ένα λιγότερο τοξικό μεταβολίτη. Στο 5ο κεφάλαιο, η CYP392A16 από ένα ανθεκτικό στέλεχος τετρανύχου έχει «εισαχθεί» σε ένα ευαίσθητο στέλεχος, όπου μέσω βιοδοκιμών τοξικότητας και PCR πραγματικού χρόνου (qPCR), δείχθηκε πως το αλληλόμορφο που προέρχεται από το ανθεκτικό στέλεχος προσδίδει 3.6 φορές μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στο abamectin και πως μετά την εισαγωγή του σε στέλεχος με ευαίσθητο γενετικό υπόβαθρο, εκφράζεται στα ίδια επίπεδα σε σχέση με το ανθεκτικό στέλεχος. Επιπροσθέτως, σίγηση της CYP392A16 του ανθεκτικού στελέχους έδειξε πως τα επίπεδα έκφρασής της μειώνονται περίπου στο 50% ενώ τα επίπεδα ανθεκτικότητας στο abamectin μειώθηκαν από τις 3400- στις 1900- φορές, σε σχέση με ευαίσθητο στέλεχος. Στο 6ο κεφάλαιο, έξι πληθυσμοί τετρανύχου και έντεκα πληθυσμοί αλευρώδη συλλέχθηκαν από διαφορετικά σημεία της Κρήτης και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη διαγνωστικών αναλύσεων, που έχουν ως απώτερο στόχο τη διαχείριση της ανθεκτικότητας που παρατηρείται στο πεδίο. Πιο συγκεκριμένα, γνωστές μεταλλαγές στόχου που έχουν συσχετισθεί με ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα διαφορετικού τρόπου δράσης, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της συχνότητας των ανθεκτικών και ευαίσθητων αλληλομόρφων σε πληθυσμούς πεδίου. Δημιουργήθηκε μία πλατφόρμα με έντεκα TaqMan αναλύσεις για τον τετράνυχο και τέσσερις TaqMan αναλύσεις για τον αλευρώδη, όπου άτομα τετρανύχου και αλευρώδη μπορούν να αναλυθούν. Επιπροσθέτως, μία πρωτότυπη, υψηλής τεχνολογίας και ευαισθησίας αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιήθηκε, η droplet digital PCR (ddPCR), η οποία προσφέρει μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια σε δείγματα πολλών ατόμων που αναλύονται ταυτόχρονα και μπορεί να ανιχνεύσει ανθεκτικά αλληλόμορφα, ακόμα και όταν αυτά βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συχνότητα (ένα ανθεκτικό αλληλόμορφο σε εννιακόσια ενενήντα εννέα ευαίσθητα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις περιοχές της Κρήτης υπάρχουν και ανθεκτικοί αλλά και ευαίσθητοι πληθυσμοί τετρανύχου και αλευρώδη.