Ανάπτυξη και συγκριτική αξιολόγηση νέων μεθόδων για τον μη επεμβατικό οπτικό χαρακτηρισμό και την ανάλυση φυσιολογικών και παθολογικών νευρικών ιστών
Authors: Βαζγιουράκη Ελευθερία 
Published: August 2021

Η σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣκΠ) χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη φλεγμονής και την παρουσία απομυελινωμένων βλαβών κυρίως στη λευκή ουσία (WM: white matter) του κεντρικού νευρικού συστήματος (CNS), κατάσταση που οδηγεί σε μόνιμη νευρολογική αναπηρία (αισθητηριακή και κινητική). Η έρευνα για τη ΣκΠ πραγματοποιείται κυρίως με τη βοήθεια του μοντέλου της πειραματικής αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας (experimental allergic encephalomyelitis, ΕΑΕ) σε ποντίκια.Οι τρέχουσες διαγνωστικές απεικόνισης των αλλοιώσεων της μυελίνης βασίζονται είτε στη μικροσκοπία μονιμοποιημένων ιστών είτε σε μια ποικιλία σύγχρονων μεθόδων. Η μικροσκοπία του φθορισμού είναι ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο, το οποίο συνήθως συνοδεύεται με τεχνικές ανοσοφθορισμού. Κατά την τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ένα αντισώμα υψηλής ειδίκευσης σε κάποιο στο αντιγόνο, για την επισήμανση συγκεκριμένων κυτταρικών πρωτεϊνών ή άλλων μορίων μέσα στο κύτταρο. Αυτή η μέθοδος απαιτεί τη χορήγηση φθοριζουσών χρωστικών. Δυστυχώς, πολλοί από αυτούς τους δείκτες έχουν την τάση να διαταράσσουν τη δομή των λιπιδίων της μυελίνης, ενώ μπορεί να συμβεί και ουσιαστική συρρίκνωση των ινών της κατά τη διαδικασία της σταθεροποίησης και της αφαίρεσης του νερού. Επιπλέον, οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται είναι συνήθως ακριβές και μπορεί να υποστούν χημική φθορά και να χάσουν την ικανότητά τους να φθορίζουν, αν ακτινοβοληθούν με φως υψηλής ισχύος, πράγμα που περιορίζει αυτόματα το χρόνο εξέτασης του δείγματος.Μια ποικιλία σύγχρονων οπτικών μεθόδων (coherent anti-stokes raman scattering, CARS; third harmonic generation microscopy) έχει χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση της κατάστασης των νευρώνων, των αλλοιώσεων των αξόνων, ή της διήθησης των ανοσοκυττάρων σε ποντίκια που έχει επαχθεί η ΕΑΕ. Αν και αυτά τα συστήματα απεικόνισης και οι εφαρμοζόμενες μέθοδοι είναι αρκετά ελπιδιφόρα για την ανιχνεύση των αλλοιωμένων περιοχών κατά τη διάρκεια της ΣκΠ και της ΕΑΕ, έχουν υψηλό κόστος αφοράς και συντήρησης, ενώ είναι ογκώδη, μη φορητά και περίπλοκα στη χρήση τους. Επιπλέον, η ενέργεια και η ισχύς του φωτός λέιζερ που πέφτει πάνω στο δείγμα πρέπει να ρυθμιστεί προσεκτικά, προκειμένου να επιτευχθεί αφ’ ενός το μέγιστο βάθος διείσδυσης του φωτός μέσα στον υπό εξέταση ιστό και αφ΄ετέρου να μην αλλοιωθεί το δείγμα.Η φασματική απεικόνισης είναι μια μέθοδος η οποία συνδυάζει τις δύο καθιερωμένες τεχνολογίες, της φασματοσκοπίας και της απεικόνισης. Το αποτέλεσμα της εφαρμογής της φασματικής απεικόνισης είναι η συλλογή ενός τρισδιάστατου σύνολου δεδομένων, που αποτελείται από ένα σύνολο εικόνων του δείγματος, που αποκτήθηκες με απεικόνιση σε διαφορετικές φασματικές ζώνες. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της φασματικής απεικόνισης είναι ότι επιτρέπει την λεπτομερή επιθεώρηση των χαρακτηριστικών του δείγματος σε στενές φασματικές ζώνες, κατά μήκος μιας ευρείας φασματικής περιοχής. Αυτό επιτρέπει την ανάδειξη και την άμεση αξιολόγηση των «αόρατων» χαρακτηριστικών του δείγματος ή εκείνων των χαρακτηριστικών που εμφανίζουν χαμηλή αντίθεση. Επιπλέον, η φασματική απεικόνιση επιτρέπει τη μέτρηση του φάσματος σε κάθε σημείο ή περιοχή της εικόνας. Μια βασική διάταξη υλοποίησης της φασματικής απεικόνισης βασίζεται στη σύζευξη των ανιχνευτών απεικόνισης με τους μονοχρωμάτορες. Λόγω της έλλειψης οργάνων που να κυκλοφορούν στο εμπόριο, η φασματοσκοπία απεικόνισης πραγματοποιείται γενικά με αναπτυχθέντα συστήματα επί σκοπώ.Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιείται ένας αναπτυχθέντας μονοχρωμάτορας απεικόνισης σε συνδυασμό με ένα εμπορικό μικροσκόπιο, προκειμένου να αξιολογηθούν βλάβες μυελίνης στο νωτιαίο μυελού ποντικιών. Το βασικό συστατικό του συστήματος είναι ένας μονοχρωμάτορας απεικόνισης που συνίσταται από ένα περιστρεφόμενο δίκσο πάνω στον οποίο έχουν προσαρτηθεί διάφορα φίλτρα διέλευσης του φωτός. Ο μονοχρωμάτορας είναι ενσωματωμένος με ένα μονόχρωμο CMOS αισθητήρα των 5 MPixel [complementary metal–oxide semiconductor (CMOS)] και περιλαμβάνει 24 φίλτρα παρεμβολής που καλύπτουν τη φασματική περιοχή του ορατού (400 nm) για τους εγγύς υπερύθρου (1200 nm). Το σύστημα είναι ευαίσθητο σε συνθήκες χαμηλού φωτισμού και είναι εύκολο στη χρήση του από οποιοδήποτε χρήστη. Το ανεπτυγμένο λογισμικό είναι σχεδιασμένο σε LabView (National Instruments) περιβάλλον προγραμματισμού και χρησιμοποιείται για τη βαθμονόμηση του συστήματος, για τον έλεγχο της κάμερας και του μονοχρωμάτορα αλλά και για τη λήψη και ανάλυση των φασματικών εικόνων.Το σύστημα λειτουργεί με δύο τρόπους: φασματοσκοπικά και φασματομετριτικά. Ο φασματοσκοπικός τρόπος λειτουργίας επιτρέπει την προβολή, σε πραγματικό χρόνο, των επιθυμητών φασματικών εικόνων, ενώ κατά τον φασματομετριτικό τρόπο λειτουργίας εκτελείται συγχρονισμένη φασματική σάρωση, η αποθήκευση των εικόνων και ο υπολογισμός ενός πλήρους φάσμα ανά εικονοστοιχείο. Οι προααναφερθείσες διαδικασίες (απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο, φασματική σάρωση, η αποθήκευση των εικόνων και ο υπολογισμός των φασμάτων) ελέγχονται μέσω του λογισμικού.Η ΕΑΕ επάχθηκε σε θηλυκά ποντίκια C57BL/6 (B6) (6-10 εβδομάδων). H ανοσοποίηση έγινε με 100 mg πεπτιδίου MOG35-55 γαλακτωματοποιημένου σε ανοσοενισχυτικό του Freud (CFA Freud’s adjuvant, Sigma) χορηγούμενο υποδόρια, στη βάση της ουράς, καθώς και με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις των 200ng τοξίνη του κοκκύτη (Sigma) κατά το χρόνο της ανοσοποίησης και 48 ώρες αργότερα. Για τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια που 10 ημέρες μετά την ανοσοποίηση κατέληξαν στην κλινική βαθμολογία 3-4. Πέντε θηλυκά ποντίκια C57/BL6 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου και τα οποία ανοσοποιήθηκαν μόνο με το CFA και την τοξίνη του κοκκύτη. Τομές των 40 ή 50μm κόπηκαν με κρυοτόμο, κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης. Οι τομές εμποτίστηκαν με το αντίσωμα της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης, anti-ΜΒΡ 1:500 (ab980; Chemicon), το αντίσωμα anti-cluster of differentiation 3 (anti-CD3, ebiosciences purified Rat anti-mouse CD3) και τέλος με δευτερογενή αντισώματα (Alexa Fluor 488, and 633; 1:1000 σε TBST 0.1%). Τέλος τα δείγματα επικαλύφθηκαν με Antifade Gold με DAPI (Invitrogen). Πριν την ένερξη οποιουδήποτε συνόλου μετρήσεων, το πολυφασματικό μικροσκόπιο βαθμονομείται. Μετά την επιτυχημένη ολοκλήρωση της διαδικασίας της βαθμονόμισής του, οι τομές του νευρικού ιστού από το νωτιαίο μυελό των ποντικιών σαρώνονται προκειμένου να εντοπιστούν πιθανές αλλοιώσεις και οι απομυελινωμένες περιοχές σημειώνονται και ελέγχονται μία προς μία αντίστοιχα με τις συμβατικές απεικονιστικές μεθόδους του ανοσοφθορισμού. Η ανάλυση των δεδομένων που συλλέγθηκαν έδειξε ότι η παράμετρος διαφοροποίησης της έντασης, ΠΔΕ(λ) είναι μια σημαντική διαγνωστική παράμετρος που εξαρτάται από τη φασματική περιοχή μελέτης και εντοπίζει τις περιοχές που έχουν υποστεί απώλεια στη μυελίνη. Η ΠΔΕ(λ) υπολογίστηκε και κάθε φασματική περιοχή παρατήρησης. Η όλη διαδικασία σάρωσης του δείγματος, ανάλυσης και εξαγωγής των αποτελεσμάτων διαρκεί μόλις λίγα λεπτά. Η πολυφασματική απεικόνιση του ιστού δείχνει ότι το οπισθοσκεδαζόμενο σήμα αυξάνεται στην περιοχή της λευκής ουσίας λόγω του μεγάλου αριθμούς των μυελινωμένων νευροαξόνων, ενώ τα σώματα των νευρικών κυττάρων και οι δενδρίτες παρουσιάζουν χαμηλή ανάκλαση. Επιπλέον, τα όρια μεταξύ της λευκής και της φαιάς ουσίας του νωτιαίου μυελού απεικονίζονται ευκρινώς σε αρκετές φασματικές ζώνες. Ο ιστός γίνεται σταδιακά διαφανής σε μεγάλα μήκη κύματος (υπέρυθρη περιοχή του φάσματος), με τα όρια μεταξύ λευκής και φαιάς ουσίας να γίνονται δύσκολα ανιχνεύσιμα στις εικόνες που αντιστοιχούν σε ζώνες άνω των 800nm.Το DAPI είναι μία εγγενώς φθορίζουσα χρωστική, η οποία δεσμεύεται στο DNA, και αναδεικνύει τα εμπύρηνα κύτταρα. Η πυκνότητα των φθοριζόντων μορίων είναι αυξημένη στις περιοχές που παρουσιάζουν αλλοίωση, υποδεικνύοντας τον αυξημένο αριθμό εμπύρηνων κυττάρων. Η επαγωγή της αυτοάνοσης αντίδρασης και η αύξηση της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού που επάγεται η χορήγηση της τοξίνης του κοκκύτη επιφέρουν την είσοδο των ενεργοποιημένων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος εντός του ΚΝΣ. Εκτός από τη χρήση του DΑΡΙ ως φθορίζουσας χρωστικής έγινε και απεικόνιση του φθορισμού του αντισώματος της ΜΒΡ (βασική πρωτεϊνη της μυελίνης). Πράγματι, η ΜΒΡ είναι ένα σημαντικό συστατικό της μυελίνης, η οποία περιβάλλει τους άξονες των νευρώνων στο ΚΝΣ. Η περιοχή της αλλοίωσης χαρακτηρίζεται από ένα χαμηλότερο σήμα φθορισμού του anti-ΜΒΡ, υποδεικνύοντας τα μειωμένα επίπεδα της μυελίνης σε ορισμένες περιοχές που παρουσιάζονται ως μαύρες τρύπες που περιβάλλονται από ένα φθορίζον φόντο. Προκειμένου να γίνει ταυτοποίηση των εμπύρηνων κυττάρων που συγκεντρώθηκαν στην περιοχή της βλάβης, έγινε χρώση των τομών του νωτιαίου μυελού με αντισώματα έναντι του αντιγόνου CD3. Το CD3 είναι ένας ειδικότατος δείκτης των Τ-λεμφοκυττάρων σε αλλοιωμένες περιοχές και δείχνει την διείσδυση αυτών των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που σχετίζονται με την απώλεια της μυελίνης. Η διαφορετική ανακλαστικότητα μεταξύ της κανονικής και της αλλοιωμένης περιοχής αποτυπώθηκε ξεκάθαρα και στις εικόνες που συλλέχθηκαν με το σύστημα της πολυφασματικής απεικόνισης.Η αποτελεσματικότητα του συστήματος της πολυφασματικής απεικόνισης στην ανίχνευση περιοχών που παρουσιάζουν απώλεια μυελίνης ελέγθηκε μέσω της συγκριτικής απεικόνισης των ίδιων αλλοιώσεων με το πολυφασματικό σύστημα μικροσκοπίου και με τα μικροσκόπια και τις μεθόδους του ανοσοφθορισμού. Στις εικόνες του πολυφασματικού μικροσκοπίου, στην περιοχή της βλάβης, το οπισθοσκεδαζόμενο σήμα ελαχιστοποιείται και η περιοχή απεικονίζεται ως μια μαύρη τρύπα σε ένα σημαντικά ανοιχτόχρωμο φόντο. Η σύγκριση των εικόνων που συλλέγονται με το μικροσκόπιο του φθορισμού και του συστήματος της πολυφασματικής απεικόνισης δείχνει σαφώς ότι η τελευταία μέθοσος ανιχνεύει με ακρίβεια την έκταση της βλάβης.Στην περιοχή της βλάβης τα συσσωρευμένα κυττάρα που έχουν διεισδύσει εκτοπίζουν τις γειτονικές εμμύελες ίνες, και τα έλυτρα της μυελίνης διαταράσσονται και διαστέλονται, με αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας εικόνας απομυελίνωσης. Είναι έτσι δυνατόν η απώλεια του σήματος της οπισθοσκεδαζόμενης ακτινοβολίας να αποδοθεί στην απώλεια της ανακλαστικότητας των ινών της μυελίνης, στην ύπαρξη των συγκεντρωμένων φλεγμονωδών κυττάρων της ανοσολογικής απόκρισης τα οποία απορροφούν το προσπίπτον φως, και στην αυξημένη πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων. Ένα μέρος του προσπίπτοντος φωτός περνάει απευθείας μέσα από την περιοχή της βλάβης σχεδόν ανεπηρέαστο από τις κατεστραμμένες ίνες της μυελίνης, και ένα άλλο μέρος οπισθοσκεδάζεται ανάλογα με τον συντελεστή απορρόφησης και την συγκέντρωση των συσσωρευμένων κυττάρων και των αιμοφόρων αγγείων εντός της βλάβης. Κατά συνέπεια, η περιοχή της βλάβης χάνει το ιδιαίτερο σήμα ανάκλασης που εμφανίζεται στην άθικτη λευκή ουσία. Η μορφολογία της περιοχής που παρουσιάζει απώλεια μυελίνης και που ανιχνεύεται με τις συμβατικές μεθόδους απεικόνισης είναι συγκρίσιμη με εκείνη που λαμβάνεται με το πολυφασματικό σύστημα.Ο υπολογισμός της παραμέτρου διαφοροποίησης της έντασης, ΠΔΕ(λ) υποδεικνύει ότι η μέγιστη διάκριση μεταξύ καταστραμμένων και άθικτων περιοχών επιτυγχάνεται με απεικόνιση του ιστού στη φασματική ζώνη των 500 nm. Οι φασματικές διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των κανονικών και των αλλοιωμένων περιοχών αντικατοπτρίζουν τις διαφορετικές πυκνότητες και τη διαφορετική σύσταση των ιστών στις περιοχές αυτές. Πράγματι, στην περιοχή της βλάβης, τα έλυτρα μυελίνης είναι διεσταλμένα/κατεστραμένα και επομένως η προσπίπτουσα ακτινοβολία παρουσιάζει μικρότερη διασπορά.Τέλος, η σύγκριση της αναπτυχθήσας μεθόδου με τις κλασικές μεθόδους ανοσοφθορισμού δείχνει ότι η ευαισθησία του πολυφασματικού συστήματος για την ανίχνευση περιοχών του νωτιαίου μυελού με απώλεια μυελίνης είναι 90,4% και η θετική προγνωστική αξία είναι 92,2%.Στο τελευταίο πειραματικό κομμάτι της παρούσας διατριβής έγινε εφαρμογή της πολυφασματικής απεικόνισης στην ανίχνευση της καταστροφής των στιβάδων του αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού ποντικιών κατόπιν επαγωγής τοξικότητας με τη χορήγηση ΑΜΡΑ. Με επιλεκτική απεικόνιση των τομών των ποντικιών που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου (PBS) φάνηκε ότι οι στιβάδες του αμφιβληστροειδή χιτώνα έχουν διαφορετικά φασματικά χαρακτηριστικά μεταξύ τους, μέσω της καταγραφής του οπισθοσκεδαζόμενου φωτός από αυτές. Τα φασματικά χαρακτηριστικά αυτά αλλοιώνονται στην περίπτωση τομών στις οποίες επάχθηκε τοξικότητα, με φυσική συνέπεια η σχεδόν ολική απώλεια του οπισθοσκεδαζόμενου σήματος της πολυφασματικής απεικόνισης να σχετιστεί με την μερική ή ολική νέκρωση των κυττάρων.