Mycobacterium tuberculosis
Authors: Φλώρου Ζωή 
Published: March 2021

Το Mycobacterium tuberculosis είναι ένα Gram θετικό βακτηρίδιο, οξεάντοχο και αλκαλοάντοχο, υποχρεωτικά αερόβιο, ακίνητο, με υψηλή περιεκτικότητα σε G+C. Είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της φυματίωσης, η οποία αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα δημόσιας υγείας με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η πιο πρόσφατη έκθεση (2017) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (Π.Ο.Υ.) εκτιμά 10 εκατομμύρια νέα κρούσματα και 1,6 εκατομμύρια θάνατοι από φυματίωση. Η θεραπεία της είναι μεγάλης διάρκειας και αποτελείται από δύο φάσεις. Η αρχική φάση περιλαμβάνει ριφαμπικίνη (RIF), ισονιαζίδη (INH), πυραζιναμίδη (PZA), αιθαμβουτόλη (EMB) ως αντι-φυματικούς παράγοντες πρώτης γραμμής. Η στρεπτομυκίνη (STR) ανήκει στα φάρμακα δεύτερης γραμμής, ωστόσο, εξακολουθεί να ενσωματώνεται σε θεραπευτικά σχήματα πρώτης γραμμή. Τα τελευταία χρόνια, ο αυξανόμενος επιπολασμός της ανθεκτικής φυματίωσης (DR-TB), ειδικότερα της πολυανθεκτικής φυματίωσης (MDR-TB, ταυτόχρονη αντοχή σε INH και RIF) ή της εκτεταμένης αντοχής (ταυτόχρονη αντοχή σε INH και RIF με συνοδό αντοχή σε μία κινολόνη και σε ένα δευτερεύον αντιφυματικό, ή αμικασίνη, ή καπρεομυκίνη ή καναμυκίνη) αποτελεί μείζον πρόβλημα. Η άμεση εφαρμογή της αντιφυματικής θεραπείας είναι εξαιρετικά σημαντική όχι μόνο για την επιτυχή έκβαση της πορείας του ασθενούς άλλα και για τον περιορισμό της διασποράς του μικροοργανισμού στο περιβάλλον. Δυστυχώς ο χρόνος γενεάς του μυκοβακτηριδίου είναι μεγάλος και γι’ αυτό η απομόνωση του και κατά συνέπεια ο έλεγχος ευαισθησίας του στα αντιφυματικά είναι εξαιρετικά χρονοβόρος. Η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών βοήθησε σημαντικά τόσο στην ταχεία ανίχνευση του μικροοργανισμού απευθείας στο κλινικό δείγμα όσο και στην ανίχνευση των κυριότερων μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός του ποσοστού αντοχής των στελεχών M. tuberculosis, που απομονώθηκαν από ασθενείς στην περιοχή της Θεσσαλίας, ο χαρακτηρισμός των μεταλλάξεων που σχετίζονται με την έκφραση αντοχής και η διερεύνηση της ύπαρξης πολυμορφισμών για επιδημιολογικές μελέτες. Τα στελέχη M. tuberculosis Complex (MTBC) που μελετήθηκαν απομονώθηκαν στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας (ΠΓΝΛ) από νοσηλευμένους ασθενείς την περίοδο 2009-2017. Η απομόνωση και ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με φαινοτυπικές μεθόδους και με μοριακές μεθόδους. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα πρώτης και δεύτερης γραμμής με τη μέθοδο αναφοράς σε υγρό θρεπτικό υλικό MGIT 960, με την μέθοδο μικροαραιώσεων σε υγρό μέσο καλλιέργειας Middlebrook 7H10 και με τη μέθοδο E-test. Η μοριακή τυποποίηση βασίστηκε στις μοριακές μεθόδους γονοτύπησης MST και MIRU-VNTR. Παράλληλα, ελέγχθηκαν για πιθανές μεταλλάξεις 35 γονίδια σχετιζόμενα με αντοχή στα αντιφυματικά φάρμακα και ακολούθησε διάκριση των μεταλλάξεων από τους πολυμορφισμούς. Από τα 265 απομονωμένα στελέχη MTBC, τα 37 (13,96%) ήταν ανθεκτικά στα αντιφυματικά φάρμακα, εκ των οποίων τα 31 ήταν M.tuberculosis/M. canettii και τα 6 M. bovis. O έλεγχος ευαισθησίας δεν ανέδειξε MDR-TB και XDR-TB στελέχη. Τα ποσοστά αντοχής των M. tuberculosis/ M. canettii ανήλθαν σε 6% στη STR, 5,2% στη INH, 1,5% στην PZA, 1,1% στην EMB και 0,4% στη RIF, ενώ τα M. bovis ήταν όλα ανθεκτικά μόνο στην PZA. Για περαιτέρω χαρακτηρισμό επιλέχθηκαν τυχαία επιπλέον 17 ευαίσθητα στελέχη M. tuberculosis/ M. canettii. Η πλειοψηφία των στελεχών απομονώθηκε από άντρες ασθενείς, Έλληνες άνω των 60 και αλλοδαπών μεταξύ 20-40ετών. Βάση της μεθόδου MIRU-VNTR, τα στελέχη ανήκαν στις οικογένειες Haarlem (33,3%). Τα εναπομείναντα στελέχη χαρακτηρίστηκαν από τους ακόλουθους γονοτύπους S-type (16,7%), Beijing (12,5%), X-type (4,2%), CAS/Delhi (2,1%), LAM (2,1%), Tur (2,1%), και δεκατρία στελέχη αταξινόμητα (unclassified) (27%). Βάση της μεθόδου MST, τα στελέχη διανέμονταν σε γνωστούς κλωνικούς τύπους ST6 (20,8%), ST13 (14,6%), ST3 (12,5%), ST23 (10,4%) , ST26 (8,3%), ST4 (6,3%), ST42 (2,1%), ST77 (2,1%), ST81 (2,1%), και σε νέους ST85 (2,1%), ST86 (2,1%), ST87 (2,1%), ST88 (4,2%), ST89 (4,2%), ST90 (2,1%), ST91(2,1%), ST92 (2,1%). Δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ των προφίλ ST και της αντοχής στα αντιφυματικά. Από τη συσχέτιση των δυο μεθόδων προέκυψε ως κυρίαρχη η γενεολογία Euro-American (lineage 4). Ο μοριακός έλεγχος των γονιδίων ανέδειξε γνωστές άλλα και νέες μεταλλάξεις που προσδίδουν αντοχή στα υπό μελέτη αντιφυματικά φάρμακα. Οι μεταλλάξεις (γονίδια katG, inhA, mabA και στους υποκινητές των γονιδίων inhA και ahpC) σχετιζόμενες με αντοχή στην INH εντοπίστηκαν σε ποσοστό 85,7% των στελεχών. Ενδιαφέρον εύρημα ήταν ότι μικρό ποσοστό των INH-ανθεκτικών στελεχών έφεραν τις πιο κοινές μεταλλάξεις S315T και c-15t, ενώ νέες ή λιγότερο συχνές ανιχνεύθηκαν σε αυτά. Τα στελέχη με αντοχή στην STR έφεραν μεταλλάξεις στα γονίδια rpsL και gidB σε ποσοστό 81,25%. Φυλογενετικοί πολυμορφισμοί βρέθηκαν σε δεκατέσσαρα γονίδια κατά τη μοριακή ανάλυση και σχετίστηκαν με συγκεκριμένους ST τύπους, οικογένειες MIRU-VNTR καθώς και με στελέχη M. bovis. Η μελέτη αυτή αποκαλύπτει την πολυπλοκότητα της εξέλιξης των μηχανισμών αντοχής στα αντιφυματικών φαρμάκων των στελεχών M. tuberculosis.