Ταυτοποίηση και μελέτη της έκφρασης νέων mRNA ισομορφών των γονιδίων των καλλικρεϊνών και της ριβονουκλεάσης κ καθώς και των μορίων miRNAs που τα στοχεύουν σε καρκινικά κύτταρα και συμπαγείς όγκους
Authors: Αδαμόπουλος Παναγιώτης 
Published: September 2021

Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, τα πρόδρομα μετάγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (pre-mRNAs), περιλαμβάνουν τόσο αλληλουχίες εσωνίων όσο και εξωνίων. Όλα τα pre-mRNAs υποβάλλονται σε επεξεργασία από το σωμάτιο συρραφής (spliceosome), κατά την οποία αποβάλλονται τα εσώνια και συρράπτονται τα εξώνια, ώστε για να δημιουργηθούν τα αντίστοιχα ώριμα mRNAs. Ωστόσο, το φαινόμενο της εναλλακτικής συρραφής επιτρέπει διαφορετικούς τρόπους συρραφής των εξωνίων, οδηγώντας στην παραγωγή αρκετών mRNA μεταγράφων από ένα γονίδιο. Η εναλλακτική συρραφή αποτελεί μια πολυβάθμια βιολογική διαδικασία, η οποία ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και το αναπτυξιακό στάδιο. Παρόλα αυτά, αρκετές ρυθμιστικές δυσλειτουργίες μπορεί να οδηγήσουν σε αλλοιώσεις των θέσεων ματίσματος, προκαλώντας έτσι δυσμενείς επιδράσεις στην κυτταρική ομοιόσταση. Πιο συγκεκριμένα, το εναλλακτικό μάτισμα των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο είναι ένας κοινός κυτταρικός μηχανισμός, ο οποίος σχετίζεται άμεσα με την πολυπλοκότητα του μεταγραφώματος του καρκινικού κυττάρου και επηρεάζει τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την αγγειογένεση, τη διήθηση και την μετάσταση. Για το λόγο αυτό, αρκετά εναλλακτικά μετάγραφα που παράγονται με παρεκκλίνοντα γεγονότα συρραφής μπορεί να αντιπροσωπεύουν ελπιδοφόρους βιοδείκτες καρκίνου ή θεραπευτικούς στόχους.Η γονιδιακή οικογένεια των καλλικρεϊνών (KLKs), η οποία αποτελείται από 15 μέλη (KLK1-KLK15), κωδικοποιεί τη μεγαλύτερη ομάδα πρωτεασών σερίνης στον άνθρωπο. Η πρώτη KLK πρωτεΐνη ανακαλύφθηκε το έτος 1930. Tο ανθρώπινο γονίδιο που την κωδικοποιούσε παρέμενε ακόμα άγνωστο και ανακαλύφθηκε αρκετά χρόνια μετά, συγκεκριμένα το 1985, παίρνοντας την ονομασία KLK1. Τα γονίδια KLK2 και KLK3 (το γνωστό PSA) ανακαλύφθηκαν τη δεκαετία του 1980. Τα υπόλοιπα 12 νέα μέλη των καλλικρεϊνών ανακαλύφθηκαν τα έτη 1998-2000 από τους Yousef, Scorilas και Diamandis. Τα ανθρώπινα γονίδια KLKs μοιράζονται πολλά κοινά χαρακτηριστικά και παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα, καθώς αποτελούνται από πέντε κωδικά εξώνια παρόμοιου μεγέθους με συντηρημένες περιοχές εσωνίων. Μερικά από τα γεγονότα εναλλακτικής συρραφής, που έχουν παρατηρηθεί να οδηγούν στην παραγωγή KLK μεταγράφων, περιλαμβάνουν την παράλειψη εξωνίων, την εναλλακτική 5' και 3' θέση συρραφής, τη διατήρηση εσωνίων, τις επεκτάσεις ή περικοπές εξωνίων και τη χρήση εναλλακτικών θέσεων πολυαδενυλίωσης. Ωστόσο, πολλά από τα μετάγραφα των γονιδίων KLKs χαρακτηρίζονται από μη φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης σε διάφορες κακοήθειες και κατά συνέπεια διαθέτουν σημαντική προγνωστική και / ή διαγνωστική αξία. Επιπρόσθετα, το ανθρώπινο γονίδιο RNASEK κωδικοποιεί την πρωτεΐνη RNase κ, η οποία εκφράζεται ευρέως σε όλους τους ιστούς και στα στάδια εξέλιξης, παρουσιάζοντας ενδοριβονουκλεολυτική δραστικότητα και συνεπώς έχει πολύ σημαντική βιολογική λειτουργία. Tο ανθρώπινο γονίδιο RNASEK κλωνοποιήθηκε το έτος 2007 από τους Economopoulou, Fragoulis και Sideris. Στο γονίδιο αυτό έχουν παρατηρηθεί εναλλακτικά γεγονότα ματίσματος μικρής έκτασης, τα οποία οδηγούν στο σχηματισμό εναλλακτικών μεταγράφων που δεν περιέχουν ή περιλαμβάνουν μικρό αριθμό νουκλεοτιδίων, οδηγώντας στην έκφραση πρωτεϊνικών ισομορφών. Ένα άλλο ταχέως αναπτυσσόμενο επιστημονικό πεδίο στην έρευνα για τον καρκίνο είναι η μελέτη των microRNAs (miRNAs). Τα miRNAs αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια μικρών μορίων που ρυθμίζουν αρνητικά, στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, τη γονιδιακή έκφραση. Πρόσφατα επιστημονικά δεδομένα έχουν αναδείξει την αξιοσημείωτη απορρύθμιση των επιπέδων miRNA σε ανθρώπινες κακοήθειες και υποδηλώνουν ότι μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέους υποσχόμενους βιοδείκτες καρκίνου.Τα τελευταία χρόνια, η εναλλακτική συρραφή μπορεί να μελετηθεί σε βάθος με τη χρήση της τεχνολογίας της αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Η αλληλούχηση RNA υψηλής απόδοσης (RNA-seq), μία από τις πιο βασικές εφαρμογές της τεχνολογίας NGS, καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό, τον χαρακτηρισμό και την ποσοτικοποίηση των εκφρασμένων μορίων RNA στα υπό μελέτη δείγματα και συνεπώς μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικές βιολογικές ανακαλύψεις σχετικά με το ανθρώπινο μεταγράφωμα. Η εφαρμογή RNA-seq διαθέτει αρκετά σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την ανάλυση της έκφρασης γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ευαισθησίας και ακρίβειας, της ευρείας δυναμικής εμβέλειας, της ανάλυσης σε επίπεδο νουκλεοτιδίου και της ανάλυσης του mRNA εναλλακτικού ματίσματος και για την ανίχνευση νέων μεταγράφων. Η τεχνολογία NGS συνδυασμένη με τεχνικές μοριακής κλωνοποίησης, όπως η ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (RACE), μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τις εναλλακτικές θέσεις έναρξης μεταγραφής και τις θέσεις πολυαδενυλίωσης που συνήθως χρησιμοποιούνται και οι οποίες αυξάνουν την πολυπλοκότητα του μεταγραφώματος.Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανακάλυψη νέων εναλλακτικών μεταγράφων των ανθρώπινων γονιδίων KLKs και RNASEK, με τη χρήση nested 3' RACE και NGS. Επιπλέον, ο δεύτερος στόχος ήταν η ανάλυση δεδομένων miRNA-seq για την ανίχνευση νέων miRNAs που προβλέπεται να στοχεύουν τα ανθρώπινα γονίδια KLKs και / ή RNASEK. Προκειμένου να επιτευχθούν αυτοί οι στόχοι, πραγματοποιήθηκε nested 3' RACE με τη χρήση ειδικών ζευγών εκκινητών, επιτρέποντας την ενίσχυση των ανθρώπινων μεταγράφων των γονιδίων KLKs και RNASEK. Στη συνέχεια, μετά την ολοκλήρωση της κατασκευής και ποσοτικοποίησης της βιβλιοθήκης, καθώς και των διαδικασιών προετοιμασίας και εμπλουτισμού του εκμαγείου αλληλούχησης, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις NGS για κάθε γονίδιο-στόχο, εφαρμόζοντας νέα πειραματικά πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν για το σκοπό αυτό. Η ανάλυση των δεδομένων NGS που προέκυψαν αποκάλυψε την ύπαρξη νέων εναλλακτικών σημείων συρραφής που περιλαμβάνουν νέα εξώνια, νέες 3' αμετάφραστες περιοχές (3' UTRs), επεκτάσεις και περικοπές εξωνίων, καθώς και εναλλακτικά γεγονότα ματίσματος μεταξύ αυτών των εξωνίων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε nested RT-PCR σε ένα σύνολο 55 ανθρώπινων κυτταρικών σειρών που προέρχονταν από δεκαεπτά καρκινικούς και δύο φυσιολογικούς ιστούς με τη χρήση ειδικών ζευγών εκκινητών, με σκοπό την ανάλυση έκφρασης του κάθε νέου εναλλακτικού μεταγράφου, ενώ μέσω αλληλούχησης κατά Sanger των αντίστοιχων αμπλικονίων επιβεβαιώθηκε η δομή των εναλλακτικών μεταγράφων που ανακαλύφθηκαν.Συνολικά, ανακαλύφθηκαν και χαρακτηρίστηκαν συνολικά 61 νέα εναλλακτικά μετάγραφα της γονιδιακής οικογένειας των KLKs, από τα οποία τα 36 νέα μετάγραφα διαθέτουν ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) και προβλέπεται να κωδικοποιούν νέες πρωτεϊνικές ισομορφές, ενώ τα υπόλοιπα 25 περιέχουν πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού και πιθανώς αντιπροσωπεύουν μη κωδικά μόρια mRNA. Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά τα γονίδια των κλασσικών καλλικρεϊνών (KLK1-KLK3), ταυτοποιήθηκε η ύπαρξη 2 νέων μεταγράφων του γονιδίου KLK1, 9 νέων μεταγράφων του γονιδίου KLK2, καθώς και 2 νέων μεταγράφων του γονιδίου KLK3, τα οποία βρέθηκαν να εκφράζονται αποκλειστικά σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Παράλληλα, ανιχνεύτηκαν 3 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK5, 6 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK6, 2 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK7, 9 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK8 και 10 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK9, τα οποία βρέθηκαν να εκφράζονται σε σημαντικά επίπεδα σε αρκετές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές από διάφορες ανθρώπινες νεοπλασίες. Συμπληρωματικά, στο γονίδιο KLK10 επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη 8 νέων εναλλακτικών μεταγράφων, αλλά και μιας νέας 3' UTR που τα χαρακτηρίζει. Τέλος, ανακαλύφθηκαν 3 νέα μετάγραφα του γονιδίου KLK11, 1 νέο μετάγραφο του γονιδίου KLK12, καθώς και 6 νέα εναλλακτικά μετάγραφα του γονιδίου KLK15.Επιπλέον, ανακαλύφθηκαν συνολικά 8 νέα εναλλακτικά μετάγραφα του γονιδίου RNASEK, 6 από τα οποία διαθέτουν ORF και προβλέπεται να είναι κωδικά μετάγραφα, ενώ τα υπόλοιπα 2 περιέχουν πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού και πιθανώς αντιπροσωπεύουν μη κωδικά μόρια mRNA. Τέλος, η εκτεταμένη ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε ένα μεγάλο σύνολο δεδομένων από πειράματα miRNA-seq οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός νέου μικρού μη κωδικού μορίου RNA (sncRNA), πιθανού miRNA, το οποίο προβλέπεται να στοχεύει την 3' UTR του ανθρώπινου γονιδίου KLK4.Τα νέα μετάγραφα, λόγω του υψηλού δυναμικού τους ως βιοδείκτες, το οποίο προέκυψε από τα πειραματικά δεδομένα, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για διαγνωστικούς και προγνωστικούς σκοπούς σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες. Είναι γνωστό ότι οι KLKs έχουν προσελκύσει μεγάλο μέρος της προσοχής της επιστημονικής κοινότητας κατά τις τελευταίες δεκαετίες. Η αποκρυπτογράφηση της πολυπλοκότητας των μεταγράφων που προέρχονται από τη συγκεκριμένη γονιδιακή οικογένεια είναι πολύ σημαντική και η τεχνολογία NGS θα αποτελέσει σίγουρα ένα βασικό παράγοντα για αυτό το επίτευγμα στο εγγύς μέλλον. Τα νέα εναλλακτικά μετάγραφα, τα οποία ταυτοποιήθηκαν από την παρούσα διδακτορική διατριβή, μπορεί να αποτελούν πολύτιμους διαγνωστικούς ή/και προγνωστικούς βιοδείκτες σε διάφορες ανθρώπινες νεοπλασίες και για το λόγο αυτό απαιτείται περαιτέρω μελέτη της έκφρασής τους σε στατιστικά σημαντικό μέγεθος δειγμάτων ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου.