Mechanistic insights into lignocellulose-degrading enzymes using structural biology and protein engineering methods
Authors: Κοσίνας Χρήστος 
Published: February 2025

Η ενζυμική αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας αποκτά ολοένα και μεγαλύτερη δυναμική τα τελευταία χρόνια, συμπληρωματικά στις υπάρχουσες διεργασίες χημικής και μηχανικής προκατεργασίας. Η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των ενζύμων αλλά και ο σχεδιασμός βελτιωμένων βιοκαταλυτών μέσα από μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής, μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη εφαρμογή τους σε βιομηχανικές διεργασίες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν τέσσερα ένζυμα τα οποία προέρχονται από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus και συμβάλλουν στην αποικοδόμηση των τριών βασικών συστατικών της λιγνοκυτταρίνης: της κυτταρίνης, της ημικυτταρίνης και της λιγνίνης. Η μελέτη των συγκεκριμένων βιοκαταλυτών πραγματοποιήθηκε μέσω της συσχέτισης των δομής-λειτουργίας. Για τη δομική μελέτη χρησιμοποιήθηκε κυρίως Κρυσταλλογραφία Ακτίνων Χ, αλλά και τεχνικές Μοριακής Βιολογίας καθώς και υπολογιστικά εργαλεία προσομοίωσης των αλληλεπιδράσεων των ενζύμων με τα υποστρώματα τους. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε μία μια λυτική μονοοξυγενάση πολυσακχαριτών (ΤtLPMO9F), η οποία διασπά οξειδωτικά τους γλυκοζιδικούς δεσμούς της κυτταρίνης. Με τον προσδιορισμό της κρυσταλλογραφικής της δομής και την βιοχημική μελέτη διαφόρων σημειακών μεταλλαγμάτων, εντοπίστηκε η συνεισφορά συγκεκριμένων αμινοξέων στην καταλυτική δράση. Αξιολογήθηκε επίσης η συνεργιστική δράση της TtLPMO9F με εμπορικά σκευάσματα ενζύμων που αποικοδομούν την λιγνοκυτταρίνη. Επιπρόσθετα παρουσιάζεται η δομή μιας λακκάσης (TtLMCO1) η οποία παρουσιάζει ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον καθώς μπορεί να οξειδώνει διάφορες φαινολικές ενώσεις. Προσομοιώσεις της αλληλεπίδρασης του ενζύμου με διάφορα υποστρώματα (docking simulations), έδειξαν ότι η αρχιτεκτονική της περιοχής πρόσδεσης υποστρωμάτων σχετίζεται με την προτίμηση του ενζύμου για ορθο-υποκατεστημένες φαινολικές ενώσεις. Το 2ο σκέλος της διατριβής εστιάζει σε 2 υδρολυτικά ένζυμα που σχετίζονται με την αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης. Πιο συγκεκριμένα, ο προσδιορισμός κρυσταλλογραφικών δομών συμπλόκων μίας ξυλανάσης της υπο-οικογένειας GH30_7 (ΤtXyn30A) και ανενεργών μεταλλαγμάτων αυτής, με διάφορα υποστρώματα ολιγομερών ξυλάνης, επέτρεψε τον εντοπισμό των αμινοξέων που καθορίζουν το διπλό μηχανισμό δράσης του ενζύμου. Τέλος, στο πλαίσιο της διατριβής προσδιορίστηκε η πρώτη κρυσταλλική δομή εστεράσης οξικού οξέος της οικογένειας CE16 (ΤtCE16B). Η κρυσταλλογραφική δομή της ΤtCE16B καθώς και αυτή ενός ανενεργού μεταλλάγματος της (S19A) σε σύμπλοκο με ένα μόριο οξικού οξέος, οδήγησε στον εντοπισμό των καταλυτικών αμινοξέων που διαμορφώνουν το ενεργό κέντρο, καθώς και των δομικών χαρακτηριστικών που καθορίζουν την προτίμηση του ενζύμου για διαλυτούς ξύλο-ολιγοσακχαρίτες. Τα συμπεράσματα της παρούσας μελέτης συμβάλλουν στην βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης των συγκεκριμένων βιοκαταλυτών για την αξιοποίηση της φυτικής βιομάζας. Ταυτόχρονα, μέσα από την τροποποίηση της αρχιτεκτονικής των ενζύμων με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής ανοίγονται δρόμοι για την βέλτιστη χρήση τους σε βιομηχανικές διεργασίες αλλά και νέες βιοκαταλυτικές εφαρμογές.