Αξιοποίηση αποβλήτων ελαιουργείου μέσω μικροβιακών ζυμώσεων
Authors: Γιαννούτσου Ελένη 
Published: August 2021

Τα προβλήματα διάθεσης των αποβλήτων του τριφασικού συστήματος οδήγησαν τα τελευταία χρόνια σε μια νέα μεθοδολογία παραγωγής ελαιόλαδου: το διφασικό σύστημα. Κατά τη χρησιμοποίηση της νέας αυτής τεχνολογίας παράγονται μόνο δύο φάσεις: το ελαιόλαδο και τα παραπροϊόντα, τα οποία είναι μίγμα του ελαιοπυρήνα και των υγρών αποβλήτων. Στο διδακτορικό αυτό έγινε προσπάθεια αξιοποίησης του αποβλήτου που προέρχεται από διφασικά συστήματα παραγωγής ελαιολάδου (ελαιόπουλπα) μέσω μικροβιακών ζυμώσεων. Από μεγάλη εταιρεία διαχείρισης αποβλήτων ελαιουργείου ελήφθησαν δείγματα αποβλήτου προερχόμενα από διαφορετικά στάδια της διαδικασίας παραγωγής ελαιολάδου, τα οποία αναλύθηκαν ως προς τη χημική τους σύσταση. Η σχετικά χαμηλή περιεκτικότητα ταννινών στο απόβλητο (2,7%) καθώς και η επαρκής ποσότητα σακχάρων (2,3%) επιτρέπουν την ανάπτυξη πληθώρας μικροοργανισμών. Στο συγκεκριμένο απόβλητο έγινε ταυτοποίηση του μικροβιακού πληθυσμού μέσω των κλασικών μεθόδων μικροβιολογίας. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα βακτήρια ανήκαν κυρίως στα γένη Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas και Bacillus σε σχετικά μεγάλους πληθυσμούς (10⁴ - 10⁷ cfu/g αποβλήτου), ενώ τα στελέχη των ζυμών στα γένη Saccharomyces και Candida τα οποία απαντούσαν σε μικρότερη συχνότητα (10⁴ - 10⁶ cfu/g αποβλήτου). Μελέτες φυσιολογίας στο εργαστήριο έδειξαν ότι μερικά από τα απομονωθέντα βακτηριακά στελέχη είχαν την ικανότητα ανάπτυξης σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως εκείνη των 60°C (Aeromonas, Bacillus, Corynebacterium) καθώς και υπό αναερόβιες συνθήκες (Lactobacillus, Bifidobacterium, Gemmela). Επιλεγμένα στελέχη των απομονωθέντων βακτηρίων και ζυμών χρησιμοποιήθηκαν ως εμβόλια σε συστήματα μικρόκοσμου έχοντας ως υπόστρωμα απόβλητο ελαιόπουλπας. Ενώ τα βακτήρια αδυνατούσαν να αναπτυχθούν στις δοσμένες συνθήκες, ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε κατά 4 λογαριθμικές μονάδες με αποτέλεσμα την αλλαγή της χημικής σύστασης του αποβλήτου. Το προϊόν της ζύμωσης ήταν αρκετά πιο φιλικό προς το περιβάλλον σε σχέση με το αρχικό απόβλητο, τόσο λόγω της φρουτώδους οσμής, μετά το τέλος της ζύμωσης, όσο και της μείωσης της ποσότητας των φαινολών κατά 42 - 58%. Επειδή όμως δε σημειώθηκε αύξηση του πρωτεϊνικού περιεχομένου σ’ αυτή τη σειρά πειραμάτων, προχωρήσαμε στην αξιοποίηση του συγκεκριμένου αποβλήτου εμβολιάζοντας το απόβλητο ελαιόπουλπας με το ενδογενές μυκητιακό στέλεχος Paecilomyces variotii. Προηγήθηκε εκτενής μελέτη της μορφολογίας και της φυσιολογίας του στελέχους, για τον προσδιορισμό των καλύτερων συνθηκών ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Για τη διεξαγωγή αυτών των πειραμάτων εγκαταστάθηκε στο εργαστήριο μικροβιολογίας σύστημα στερεού ζυμωτήρα. Το σύστημα αυτό αποτελείται από 16 κολώνες ζύμωσης και είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να επιτρέπει τη ρύθμιση της θερμοκρασίας με βύθιση της κολώνας σε υδατόλουτρο, την ακριβή ρύθμιση του αερισμού και τη δυνατότητα ελέγχου των αερίων που παράγονται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η εκτίμηση της μεταβολικής δραστηριότητας του μικροοργανισμού έγινε εκτιμώντας το παραγόμενο CO₂ με τη βοήθεια αέριου χρωματογράφου συνδεδεμένου με το στερεό ζυμωτήρα. Στα πειράματα στερεών ζυμώσεων χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα δύο είδη ελαιόπουλπας: νωπή (δεν έχει υποστεί καμία επεξεργασία) και ξηρή (έχει ξηραθεί προηγουμένως) καθώς και διαφορετικές θερμοκρασίες επώασης (30°C και 35°C). Τα πρώτα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η νωπή όσο και η ξηρή ελαιόπουλπα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα και το τελικό ζυμωμένο προϊόν έχει αυξημένο πρωτεϊνικό περιεχόμενο κατά 20%. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε αραιωμένο διάλυμα μελάσσας ως παράγοντας εμπλουτισμού της ελαιόπουλπας βελτιστοποιώντας την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης και αυξάνοντας το πρωτεϊνικό περιεχόμενο του τελικού προϊόντος κατά 46%. Δεδομένων των παραπάνω αποτελεσμάτων και έχοντας υπόψη ότι ο Paecilomyces variotii είναι ένας ενδιαφέρον βιοτεχνολογικά μικροοργανισμός και στελέχη του έχουν χρησιμοποιηθεί για την αποτοξικοποίηση διαφόρων αποβλήτων (Romantschuk & Lehtomaki, 1978, Silva και συν., 1995) θεωρήθηκε σημαντική η περαιτέρω μελέτη του στελέχους σε μοριακό επίπεδο. Στην παρούσα διατριβή, έγινε προσπάθεια ανάπτυξης πρωτοκόλλων μοριακού χειρισμού του στελέχους Paecilomyces variotii που απομονώθηκε από απόβλητο ελαιουργείου. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν τα εξής βήματα: α) Μέσω της διαδικασίας της μεταλλαξογένεσης απομονώθηκε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος με νέες ιδιότητες, του οποίου η μορφολογία και η φυσιολογία μελετήθηκαν εκτενώς και το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σε πειράματα μετασχηματισμού, β) Δημιουργήθηκαν 2 γονιδιωματικές βιβλιοθήκες του στελέχους Paecilomyces variotii. Προκειμένου να ελεγχθεί η πληρότητα των ανωτέρω γονιδιωματικών βιβλιοθηκών, δηλαδή αν περιείχαν όσο το δυνατό πιο αντιπροσωπευτικό δείγμα του γονιδιώματος του συγκεκριμένου στελέχους, εντοπίστηκαν συντηρημένα γονίδια και έγινε προσπάθεια εισαγωγής των αντίστοιχων γονιδίων argB και actin της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης του Paecilomyces variotii σε άλλα μεταλλαγμένα στελέχη μυκήτων όπως του Aspergillus nidulans που παρουσιάζουν έλλειψη των φυσιολογικών γονιδίων. Στο πλαίσιο αυτό έγινε ένα τελευταίο βήμα που ήταν η βελτιστοποίηση της μεθόδου μετασχηματισμού πρωτοπλαστών με σκοπό τη δυνατότητα υποκλωνοποίησης γονιδίων. Η νέα μέθοδος αφορά την απομόνωση πρωτοπλαστών από σπόρια του μύκητα Aspergillus nidulans καθώς και πειράματα σύγκρισης της συγκεκριμένης μεθόδου με την ήδη υπάρχουσα, που αφορά απομόνωση πρωτοπλαστών από μυκήλιο του μύκητα. Είναι γνωστό ότι ο A. nidulans χρησιμοποιείται ως πρότυπο σύστημα για την ανάπτυξη ή βελτίωση πρωτοκόλλων μετασχηματισμού που θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μύκητες που παρουσιάζουν βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Η βελτίωση των συχνοτήτων μετασχηματισμού μέσω της νέας μεθόδου δίνει τη δυνατότητα λήψης μετασχηματισμένων κυττάρων ακόμα και σε θεωρητικά δύσκολες περιπτώσεις, όπως εκείνες των μυκήτων των οποίων ο μετασχηματισμός είναι χαμηλής απόδοσης ή δεν έχει περιγράφει.