Metabolische und wirkmechanistische Untersuchung sekundärer Pflanzenstoffe sowie chemotherapeutischer Agenzien mit den Schwerpunkten Topoisomerasen und DNA‐Integrität
Authors: Müller Lena , Esselen Melanie , Humpf Hans‐Ulrich 
Published: June 2023

Topoisomerasen sind essenzielle Enzyme, die an Replikationsprozessen der Desoxyribonukleinsäure (DNA) beteiligt sind. Die Aktivität dieser Enzyme ist daher für die Differenzierung, die Teilung und somit das Überleben der Zelle essenziell. Eine Modulation der Aktivität von Topoisomerasen ist bereits für diverse natürlich vorkommende Substanzen, wie beispielsweise den Flavonoiden, bekannt und wird in Zusammenhang mit verschiedenen adversen Effekten gebracht. Aufgrund des ubiquitären Vorkommens dieser Substanzen und der damit verbundenen täglichen humanen Exposition durch Lebensmittel und/oder Nahrungsergänzungsmittel ist die Identifizierung von Topoisomerase‐Hemmstoffen sowie den damit verbundenen zellulären Konsequenzen von hohem wissenschaftlichem Interesse. Daher lag der Fokus der vorliegenden Arbeit im ersten Teil (I) auf wirkmechanistischen Untersuchungen zur potenziellen Topoisomerase‐Hemmung durch das Flavonoid Nevadensin in zellfreien Testsystemen sowie in humanen Kolonkarzinom‐Zellen (HT29‐ Zellen). Des Weiteren wurde ein Zusammenhang zwischen metabolischer Umsetzung und in‐vitro‐ Toxizität in HT29‐, HepG2‐ (humane Leberkarzinom‐Zellen) und KG1‐Zellen (humane Erythroleukämie‐Zellen) experimentell überprüft. Im zweiten Teil (II) wurde eine Charakterisierung von Proanthocyanidinen aus Aronia melanocarpa (MICHX.) ELLIOT mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (engl. high performance liquid chromatography; HPLC), gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (engl. high‐resolution mass spectrometry; HRMS) durchgeführt, um die mögliche Polymerisationsgrad‐abhängige Topoisomerase‐Hemmung zu untersuchen. Die Enzymklasse der Topoisomerasen stellt ein Target für die Chemotherapie dar, weshalb diese sowohl einzeln als auch in Kombination in Form von Zytostatika zum Einsatz kommen. Der dritte Teil (III) fokussierte den Einfluss von chemotherapeutischen Agenzien auf die Isoform Topoisomerase Ila von humanen Blutzellen sowie weitere toxikodynamische Effekte, die im Rahmen einer Humanvorstudie untersucht wurden. Weiterhin wurde der Gehalt der chemotherapeutisch eingesetzten Agenzien im Blutplasma mittels HPLC gekoppelt mit Tandem‐Massenspektrometrie (MS/MS) analysiert.

Im ersten Teil (I) der Arbeit stand das in Basilikum vorkommende Flavonoid Nevadensin im Mittelpunkt der Untersuchungen. Unter Verwendung von zellfreien und zellbasierten in‐ vitro‐ Testsystemen wurden zunächst wirkmechanistische Untersuchungen mit dem Schwerpunkt Topoisomerasen durchgeführt. Weiterhin wurden verschiedene potenzielle adverse Effekte im Hinblick auf eine Reduktion der DNA‐Integrität, untersucht, die mit der Topoisomerase‐Hemmung assoziiert werden. Da auch direkte DNA‐bindende und ‐interkalierende Eigenschaften von Substanzen mit der Beeinflussung der enzymatischen Aktivität von Topoisomerasen in Verbindung gebracht werden, wurden diese zunächst mit Hilfe von zwei Verdrängungs‐Assays untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Nevadensin eine höhere Affinität zur kleinen Furche der DNA hat im Vergleich zur großen Furche (EC50 32 pM zu 297 pM). Im Folgenden wurde der Einfluss von Nevadensin auf die Aktivität der Isoenzyme Topoisomerase I und Topoisomerase lla im zellfreien Testsystem näher betrachtet. Für Nevadensin wurde im Konzentrationsbereich von 1‐500 pM sowohl eine Inhibierung von Topoisomerase I als auch von Topoisomerase lla beobachtet. Der Effekt auf Topoisomerase lla war dabei deutlich stärker ausgeprägt. Da jedoch auf Grundlage der Ergebnisse der zellfreien Assays keine Erkenntnisse über den Wirkmechanismus gewonnen werden konnten, wurde der isolating in vivo complex of enzyme to DNA (ICE)‐Assay in HT29‐Zellen durchgeführt. Dieser Assay ermöglicht eine Trennung zwischen freien Topoisomerasen und DNAgebundenen Enzymen. Mit Hilfe des ICE‐Assays wurde für Nevadensin eine Stabilisierung von Topoisomerase I/DNA‐Komplexen konstatiert, was auf einen Topoisomerase‐giftenden Wirkmechanismus hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte das Flavonoid im untersuchten Konzentrationsbereich keinen Einfluss auf die zelluläre Topoisomerase lla. Aufgrund der Topoisomerase‐I‐giftenden Eigenschaften von Nevadensin wurden anschließend nachgeschaltete zelluläre Reaktionen wie DNA‐schädigende Effekte, Zytotoxizität und Zellzyklusverteilung untersucht. Mit Hilfe des ICE‐Assays wurde für Nevadensin eine Stabilisierung von Topoisomerase I/DNA‐Komplexen konstatiert, was auf einen Topoisomerase‐giftenden Wirkmechanismus hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte das Flavonoid im untersuchten Konzentrationsbereich keinen Einfluss auf die zelluläre Topoisomerase Ila. Aufgrund der Topoisomerase‐I‐giftenden Eigenschaften von Nevadensin wurden anschließend nachgeschaltete zelluläre Reaktionen wie DNA‐schädigende Effekte, Zytotoxizität und Zellzyklusverteilung untersucht. Dabei wurde eine durch Nevadensin induzierte signifikante Zunahme von DNA‐Strangbrüchen festgestellt. Zudem wurden HT29‐Zellen durch die Inkubation mit Nevadensin in der G2/M‐Phase des Zellzyklus arretiert. Darüber hinaus zeigten Zytotoxizitätsuntersuchungen eine signifikante Abnahme der Zellviabilität nach der Behandlung mit Nevadensin. Morphologische Hinweise auf eine mögliche Apoptose‐Induktion wurden mit Hilfe der Hoechst‐33342‐Färbung erhalten. Zur näheren Bestätigung dieser Ergebnisse wurden zellbasierte Testsysteme angewandt, um die Art des Zelltodes näher zu charakterisieren. Da im Lactatdehydrogenase (LDH)‐Assay keine Freisetzung von LDH nachgewiesen werden konnte, wurde im Folgenden der apoptotische Zelltod untersucht. Die Gentranskriptionsanalyse von verschiedenen Apoptose‐assoziierten Genen erbrachte keine konkreten Hinweise auf die Aktivierung des extrinsischen oder intrinsischen Apoptoseweges. Daher wurde im Anschluss die enzymatische Aktivität der Initiatorcaspasen, Caspase‐8 für den extrinsischen und Caspase‐9 für den intrinsischen Apoptoseweg, bestimmt. Zusätzlich wurde die enzymatische Aktivität der durch beide Initiatorcaspasen aktivierten Effektor‐caspase‐3 analysiert. Basierend auf den Ergebnissen wird angenommen, dass durch Nevadensin der intrinsische Apoptoseweg induziert wird, der mit der Aktivierung von Caspase‐9 und Caspase‐3 verbunden ist. Der Wirkmechanismus von Nevadensin auf die humane Topoisomerase I sowie die daraus resultierenden zellulären Effekte, die im Rahmen dieser Arbeit in HT29‐Zellen nachgewiesen wurden, sind schematisch in Abbildung 1 zusammengefasst.

Unterschiede in den Wirkkonzentrationen zwischen zellfreien und zellulären Testsystemen sowie eine geringe Zytotoxizität (etwa 60% Zellviabilität nach 48 h‐Inkubation) deuten darauf hin, dass der Metabolismus und die zelluläre Aufnahme sowie DNA‐Reparaturmechanismen einen Einfluss auf die Effektstärke von Nevadensin besitzen. Daher wurde der Fokus im Folgenden auf einen möglichen Zusammenhang zwischen zellulärer metabolischer Kapazität und Toxizität von Nevadensin gelegt. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden HT29‐, HepG2‐ und KG1‐Zellen ausgewählt, da sie eine unterschiedliche Expression von Stoffwechselenzymen aufweisen. Es zeigte sich ein deutlicher Unterschied in der Effektstärke von Nevadensin bei der Betrachtung verschiedener toxikodynamischer Endpunkte. Dabei waren die Effekte in HepG2‐ und KG1‐Zellen bei den Endpunkten Zytotoxizität und DNA‐Schädigung deutlich stärker ausgeprägt als in HT29‐Zellen.

Mittels HPLC‐HRMS wurde gezeigt, dass in KGI‐Zellen keinerlei Metabolismus von Nevadensin stattfindet. Im Gegensatz dazu wurden in HT29‐ und HepG2‐Zellen fünf verschiedene Phase‐II‐ Metaboliten von Nevadensin nachgewiesen. Neben Nevadensin‐Glucuroniden wurden außerdem Nevadensin‐Sulfate und ‐Glucoside detektiert. Insgesamt wurde jedoch auf Grundlage der Daten vermutet, dass die Glucuronidierung unter den ausgewählten Inkubationsbedingungen in vitro den Hauptmetabolismusweg darstellt. Da die Glucuronidierung von Nevadensin an der Hydroxygruppe an Position C‐5 und C‐7 stattfinden kann, wurden zwei Referenzsubstanzen aus Schweinelebermikrosomen isoliert und deren Struktur mittels Kernspinresonanzspektroskopie (engl. nuciear magnetic resonance spectrometry, NMR) aufgeklärt. Mit Hilfe dieser Referenzsubstanzen wurde gezeigt, dass primär Nevadensin‐7‐O‐glucuronid von HT29‐ und HepG2‐Zellen gebildet wird. Die Analyse zur zellulären Aufnahme von Nevadensin sowie der metabolischen Umsetzung zu Nevadensin‐7‐O‐glucuronid ergab, dass HT29‐Zellen zu einer schnellen Glucuronidierung und einem effizienten Efflux von Nevadensin‐7‐O‐glucuronid aus der Zelle fähig sind. Im Gegensatz dazu zeigten HepG2‐Zellen zwar eine vergleichbare metabolische Umsetzung, reicherten jedoch das Glucuronid über den gesamten Inkubationszeitraum intrazellulär stark an (siehe Abbildung 2).

Zusammenfassend geht aus den Ergebnissen hervor, dass die Biotransformation von Nevadensin einen Einfluss auf die in‐vitro‐Toxizität besitzt. Der schnelle Efflux aus der Zelle und die Glucuronidierung von Nevadensin liefern deutliche Hinweise darauf, weshalb für zytotoxische und DNA‐schädigende Effekte in HT29‐Zellen im Vergleich zu HepG2‐ oder KG1‐ Zellen wesentlich höhere Konzentrationen erforderlich sind. Es wird daher vermutet, dass die in vitro beobachtbaren toxikodynamischen Effekte von Nevadensin nach oraler Aufnahme aufgrund der Glucuronidierungsmöglichkeiten im Darm in vivo von marginaler Relevanz sind.

Im zweiten Teil (II) der Arbeit wurden vier Oligomer‐angereicherte Proanthocyanidin‐Fraktionen aus Aronia meianocarpa (MICHX.) ELLIOT (Familie Rosaceae) mit einem Polymerisationsgrad (engl. degree of polymerization, DP) von drei (Trimer) bis sechs (Hexamer) mittels HPLC‐HRMS charakterisiert. Insgesamt wurden 14 strukturell unterschiedliche Proanthocyanidine anhand ihres spezifischen Fragmentierungsmusters in den Fraktionen identifiziert, wobei für die meisten Substanzen verschiedene Isomere nachgewiesen wurden. Unter den charakterisierten Proanthocyanidinen befanden sich drei Phenylpropanoid‐substituierte Flavan‐3‐ole mit einem DP von drei bis fünf, welche auch als Cinchonaine bezeichnet werden und erstmalig in Aronia melanocarpa (MICHX.) ELLIOT detektiert wurden. Nach erfolgreicher Charakterisierung der Oligomer‐angereicherten Proanthocyanidin‐Fraktionen wurde der Fokus auf eine mögliche Aktivitätsmodulation von Topoisomerasen in Abhängigkeit vom DP gelegt und zunächst im zellfreien Testsystem untersucht. Aufgrund zu geringer Menge wurde die Hexamerfraktion dabei für die Folgeuntersuchungen nicht berücksichtigt. Die angereicherten Fraktionen mit DP drei bis fünf wiesen sowohl ein hemmendes Potenzial auf Topoisomerase I als auch auf Topoisomerase Ila auf. Dabei wurde lediglich für Topoisomerase lla eine DP‐Abhängigkeit beobachtet; die Effektstärke wurde wie folgt gewichtet: Pentamere > Tetramere = Trimere. Weiterhin zeigte sich eine Konzentrationsabhängigkeit für die Trimer‐ und Tetramerfraktion. Zur näheren Betrachtung des zu Grunde liegenden Wirkmechanismus der Proanthocyanidin‐Fraktionen wurde der rapid isolation of topoisomerase cleavage complexes (RICC)‐Assay in HT29‐Zellen durchgeführt. Dabei waren die Proanthocyanidin‐Fraktionen in der Lage sowohl die Camptothecin‐stabilisierten Topoisomerase I/DNA‐Komplexe als auch die Etoposid‐stabilisierten Topoisomerase lla/DNA‐Komplexe zu reduzieren, weshalb eine direkte Hemmung der Enzymaktivität durch die Fraktionen postuliert wurde. Eine Abhängigkeit vom DP wurde vor allem für Topoisomerase lla konstatiert; die Effektstärke wird wie folgt gewichtet: Pentamere > Tetramere > Trimere (siehe Abbildung 3). Insgesamt sollte berücksichtigt werden, dass es sich bei den Fraktionen um komplexe Mischungen verschiedener Proanthocyanidine handelt, sodass additive oder synergistische Effekte nicht ausgeschlossen werden können. Daher bieten die Proanthocyanidine aus der Aroniabeere ein großes Spektrum für weitere Untersuchungen hinsichtlich ihrer Bioaktivität und damit assoziierter gesundheitsprotektiver sowie toxischer Effekte.

Der dritte Teil (III) der Arbeit beschäftigte sich mit möglichen adversen Effekten von chemotherapeutischen Agenzien des CHOEP‐Therapieschemas, welches Cyclophosphamid, Vincristin (Oncovicin®), Doxorubicin (Hydroxydaunorubicin), Etoposid und Prednisolon inkludiert, auf die Topoisomerasen von humanen Blutzellen. Für die Untersuchungen wurde zunächst eine geeignete Matrix für den ICE‐Assay ausgewählt. Die peripheren mononukleären Blutzellen (engl. peripheral blood mononuclear cells; PBMCs) wurden als adäquate Matrix identifiziert, wohingegen Plasma und Vollblut nicht geeignet waren. Die Analyse von Patientenproben ergab zwar einen Einfluss auf den Topoisomerase Να/DNA‐Komplex‐Gehalt, jedoch können aufgrund großer Divergenzen zwischen den untersuchten Proben sowie der geringen Probenanzahl nur die Hypothese der Topoisomerase‐giftenden Wirkung anhand der Zunahme der DNA‐gebundenen Topoisomerase Να aufgestellt werden. Weiterhin wurde eine sensitive HPLC‐MS/MS‐Methode entwickelt, um Etoposid und Doxorubicin in humanen Plasmaproben zu quantifizieren. Die Untersuchung der Realproben zeigte eine deutlich geringere Plasmakonzentration von Doxorubicin im Vergleich zu Etoposid, welche vermutlich auf die eingesetzte Dosis zurückzuführen ist. Aufgrund der geringen Probenzahl wurde die mögliche Dosis‐Abhängigkeit zwischen der Bildung von Enzym/DNA‐Komplexen und der Plasmakonzentration der beiden Topoisomerase‐Gifte nicht näher betrachtet. Des Weiteren wurde im Comet‐Assay eine Zunahme der DNA‐Schäden im Verlauf der Therapie mit den Zytostatika detektiert. Die Beeinflussung der Topoisomerasen und die Induktion an Strangbrüchen könnte als Biomarker der Therapie postuliert werden, sind aber aufgrund der geringen Kollektivgröße als kritisch zu betrachten.

Zusammengefasst verdeutlicht die vorliegende Arbeit das eine Vielzahl zellulärer Mechanismen durch in Lebensmitteln vorkommende Flavonoide beeinflusst werden kann. Die Ergebnisse geben erste Einblicke in potenzielle in‐vitro‐Effekte von Nevadensin, jedoch sollten diese im Hinblick auf die Exposition des Menschen noch genauer oder in vivo untersucht werden. Weiterhin wird deutlich, dass ein besseres Verständnis der umfangreichen Stoffwechselprozesse in Zellkulturmodellen für eine schlüssige Bewertung toxischer Endpunkte dringend erforderlich ist. Im Hinblick auf die Polymerisationsgrad‐abhängige Topoisomerase‐Inhibition, die für Proanthocyanidine der Aroniabeere beobachtet wurde, bleibt zu beachten, dass im Rahmen dieser Arbeit Mischfraktionen verwendet wurden. Daher sollten die Ergebnisse mit Hilfe von Reinsubstanzen validiert werden. Zusätzlich könnten Untersuchungen zur zellulären Aufnahme sowie eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen, beispielsweise Transportproteine, in Betracht gezogen werden. Des Weiteren konnte mit Hilfe der durchgeführten Humanvorstudie die Hypothese aufgestellt werden, dass das CHOEP‐Therapieschema einen Einfluss auf die Stabilisierung der Topoisomerase Ila/DNA‐ Komplexe der PBMCs hat. Diese Ergebnisse müssen jedoch durch eine größere Anzahl an Patientenproben validiert werden.