Engineering yeast for the production of plant terpenoids and characterization of their biosynthetic enzymes from Salvia sp.
Authors: Ignea Codruta 
Published: January 2014

Μια σημαντική κατηγορία φυσικών προϊόντων, τα τερπενοϊδή και ισοπρενοϊδή συνισφέρουν περισσότερες απο 50,000 ουσίες στην χημική ποικιλότητα των φυτών. Πολλά τερπένια έχουν προσελκύσει εμπορικό ενδιαφέρον για τις βιομηχανικές και ιατρικές τους χρήσεις. Ένα σημαντικό εμπόδιο στην επέκταση της χρήσης τους, είναι οι περιορισμένες ποσότητες που παράγουν τα φυτά. Ο Saccharomyces cerevisiae είναι οργανισμός που επιτρέπει την μεταβολική μηχανική με στόχο την παραγωγή φυτικών τερπενών. Οι συνθάσες τερπενίων είναι τα ένζυμα που συνθέτουν τερπένια αξιοποιώντας το διφωσφοπικό γερανύλιο (GPP), το διφωσφορικό φαρνεσύλιο (FPP) ή το διφωσφορικό γερανυλ-γερανύλιο (GGPP) ως υποστρώματα. Στη ζύμη συνθέτονται από το μονοπάτι βιοσύνθεσης στερολών. Ένα στέλεχος ζύμης που βρέθηκε να παράγει υψηλές στερόλες χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω τροποποιήσεις. Ένα μετάλλαγμα του γονιδίου HMG2 (K6R), με αυξημένη σταθερότητα, ενσωματώθηκε στο ΗΟ τόπο του γονιδιώματος κάτω από τον έλεγχο του επαγώμενου εκκινητή γαλακτόζης (στέλεχος ΑΜ63). Μια σειρά χαρακτηρισμένων και νέων συνθασών τερπενίων που απομονώθηκαν απο τή Salvia fruticosa (φασκόμηλο) εκφράστηκαν στο στέλεχος ΑΜ63 και το πατρικό του. Το τροποποιημένο στέλεχος παράγει κατά μέσο όρο 1,5 φορές περισσότερο από το πατρικό του και εκλύει μειωμένους πτητικούς μη-ειδικούς μεταβολίτες. Αυτό επιτρέπει τον χαρακτηρισμό τριών νέων συνθασών τερπενίων που στο παρελθόν δεν είχαν καταλυτική δράση όταν εκφράστηκαν ως βακτηριακές πρωτεΐνες. Μία απο αυτές ήταν μια συνθάση μονοτερπενίων που παράγει κύρια σινεόλη, αλλά διαφέρει απο την ορθόλογη συνθάση σινεόλης. Δύο άλλες κωδικοποιούν για σεσκιτερπενικές συνθάσες, η πρώτη παράγει β-φαρνεσίνη και νερολιδόλη ενώ ή δεύτερη δ-καδινένιο, α-κουμπεμπένιο, α-κοπαένιο και trans-καρυοφυλένιο. Περαιτέρω μοριακή μηχανική του στελέχους ΑΜ63 στόχευσε στη μεγιστοποίηση της παραγωγικότητας σε τερπένια χωρίς να θυσιαστεί η βιωσιμότητα του οργανισμού κατά την διαδικασία της βιοζύμωσης. Δύο διαφορετικές τροποποιήσεις στόχευσαν στην υπερέκφραση της FPP συνθάσης που κωδικοποιείται από το γονίδιο ERG20 με ενσωμάτωση του GAL εκκινητή στο χρωμόσωμα του ΑΜ68 στελέχους και την αδρανοποίηση ενός αλληλόμορφου του erg9 που κωδικοποιεί την συνθάση σκουαλενίου (στέλεχος ΑΜ70) με αποτέλεσμα την περαιτέρω αυξημένη παραγωγή τερπενίων. Το ΑΜ68 παράγει 3 φορές περισσότερη σινεόλη, ενώ το ΑΜ70 παράγει 3,5 φορές περισσότερα σεσκιτερπένια από το πατρικό τους. Περαιτέρω τροποποιήσεις στόχευσαν το HMG1 γονίδιο αποκόπτωντας το Ν-terminus και υπερεκφράζοντας το αλληλόμορφο με ισχυρό σταθερό εκκινητή. Εστιάζοντας στην μονοτερπενική συνθάση ελέγξαμε κατά πόσο οι περαιτέρω τροποποιήσεις στο Ν-τελικό άκρο της ΣΣ στις αλληλουχίες χλωροπλαστικής στόχευσης μπορούν να επιρέασουν περαιτέρω την παραγωγή. Επιπρόσθετα χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη δύο υβριδίων απομονώσαμε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη συνθάση σινεόλης. Μια από αυτές η HSP90 οταν εκφράζεται μαζί με την συνθάση σινεόλης οδηγεί σε αύξηση της παραγωγής κατα 30%. Παράλληλη δουλειά στα πλαίσια των απαιτήσεων του προγράμματος ΠΕΝΕΔ εστιάστηκε στον in-vivo χαρακτηρισμό δύο πρόσφατα απομονωθέντων ενζύμων που συμμετέχουν στο δευτερογενή μεταβολισμό και την άμυνα, σε φυτά Arabidopsis. Έκθεση στην ακρολεΐνη επάγει οξειδωτικό στρές. Τα φυτά Arabidopsis που υπερεκφράζουν την υπεροξειδάση θειορεδοξίνης LeTPX1 παρουσίασαν μικρότερη ευαισθησία απο τα αγρίου τύπου φυτά. Αντίστοιχα η BI-GST μια τρανσφεράση της γλουταθειόνης και η LeTPX1 αύξησαν σημαντικά την φυτική αντοχή στον παθογόνο μικροοργανισμό Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000.