Μοριακή ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων σε λεπιδόπτερα έντομα
Authors: Σουρμελή Σωτηρία 
Published: January 2014

Η χοριογένεση στα έντομα αποτελεί ένα πρότυπο σύστημα για τη μελέτη αναπτυξιακά ρυθμιζόμενων γονιδίων. Στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες του χορίου εκφράζονται αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων, ακολουθώντας ένα αυστηρό πρόγραμμα χρονικής ρύθμισης που περιλαμβάνει ενεργοποίηση και καταστολή γονιδίων ειδικών πρωτεϊνικών παραγόντων στα κύτταρα αυτά. Με βάση τη χρονική περίοδο στην οποία εκφράζονται, τα γονίδια του χορίου διακρίνονται ενδεικτικά σε πρώιμα, ενδιάμεσα και όψιμα. Η πολυγονιδιακή οικογένεια του χορίου αποτελείται από δύο τύπους γονιδίων, α και β, που οργανώνονται σε ζεύγη με αντίθετη κατεύθυνση μεταγραφής και κοινή 5’ ρυθμιστική περιοχή. Μέχρι σήμερα έχουν μελετηθεί υποκινητές ορισμένων ενδιάμεσων και όψιμων γονιδίων, ενώ ελάχιστα είναι γνωστά για τη ρύθμιση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων.. Η ανομοιογένεια των υποκινητών τους, η ύπαρξη αζευγάρωτων γονιδίων καθώς και η θέση τους στο γονιδίωμα είναι οι κύριοι λόγοι για τους οποίους μελετώνται. Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής είναι η in vitro και in vivo λειτουργική μελέτη των υποκινητών των πρώιμων γονιδίων του χορίου. Περιλαμβάνει την εύρεση cis-ρυθμιστικών στοιχείων, την ταυτοποίηση και απομόνωση μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην προγραμματισμένη έκφραση των πρώιμων χοριογενετικών γονιδίων. Απώτερος στόχος είναι η διαλεύκανση των μηχανισμών που ευθύνονται για τη σωστή χρονοειδική έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων του χορίου στο Bombyx mori. Η in vitro λειτουργική μελέτη των υποκινητών πραγματοποιήθηκε στα αντίγραφα του γονιδίου 6F6 (6F6.1, 6F6.2, 6F6.3: αζευγάρωτα, β-τύπου γονίδια), στο ζεύγος γονιδίων ErA/B.1 και στο αζευγάρωτο 5H4, ενώ για λόγους σύγκρισης χρησιμοποιήθηκε τμήμα του υποκινητή του όψιμου ζεύγους γονιδίων HcA/B.13. Πειράματα in vitro αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνών οδήγησαν στον εντοπισμό ενός νέου cis-ρυθμιστικού στοιχείου, το οποίο αντιστοιχεί στην αλληλουχία αναγνώρισης των CCAAT / Enhancer Binding Protein (C/EBP) παραγόντων. Το cis-στοιχείο αναγνωρίζεται από μία πρωτεΐνη μοριακού βάρους περίπου 65 kDa (pX2), που ονομάστηκε BmCbZ (Bombyx mori Chorion b-ZIP factor). Το σύμπλοκο του BmCbZ παράγοντα με τους υποκινητές των πρώιμων γονιδίων του χορίου εμφανίζει, σε πειράματα μείωσης της κινητικότητας συμπλόκου DNA-πρωτεϊνών, χαρακτηριστικό πρώιμο αναπτυξιακό πρότυπο. Αυτό εξηγείται από την αυξημένη συγκέντρωσή του στα πρώιμα εν συγκρίσει με τα όψιμα χοριογενετικά στάδια. Ο BmCbZ αναγνωρίζεται από τα αντισώματα έναντι της C/EBP της Drosophila melanogaster. Επίσης, τα αντισώματα αυτά αναγνωρίζουν και τον υποθετικό παράγοντα BCFII, ο οποίος συμμετέχει στην ενεργοποίηση των όψιμων γονιδίων του χορίου, γεγονός που υποδηλώνει είτε την ταύτιση των παραγόντων BmCbZ των πρώιμων σταδίων της χοριογένεσης και BCFII των όψιμων σταδίων είτε την ένταξή τους στην ίδια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων. Αλληλουχίες αναγνώρισης C/EBP υπάρχουν σε όλους του υποκινητές των γονιδίων του χορίου τουλάχιστον μία φορά. Το γεγονός ότι ο BmCbZ παρουσιάζει μεγαλύτερη συγγένεια για συγκεκριμένες αλληλουχίες στον κάθε υποκινητή και εντοπίζονται δύο διαφορετικές αλληλουχίες αναγνώρισης C/EBP στο σύνολο των υποκινητών των γονιδίων του χορίου, με τη μία να κυριαρχεί στα πρώιμα γονίδια και την άλλη στα ενδιάμεσα και όψιμα, υποδηλώνει μεταβολή στη συγγένεια δέσμευσης του BmCbZ καθώς και διαφορετική συνεργασία του με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες κατά τη διάρκεια της χοριογένεσης. Στη ρύθμιση των γονιδίων του χορίου συμμετέχει και ο μεταγραφικός παράγοντας GATA1, ο οποίος προσδένεται στους υποκινητές των πρώιμων γονιδίων από τα πρώιμα στάδια, ενώ η δέσμευσή του αυξάνεται προς τα όψιμα στάδια της χοριογένεσης. .......................