Μελέτη της ύπαρξης κυκλοφορούντων νεοπλασματικών κυττάρων και νεοπλασματικών κυττάρων με βλαστικό φαινότυπο και φαινότυπο επιθηλιακής μεσεγχυματικής μετατροπής σε μυελό οστών και περιφερικό αίμα ασθενών με ΚΑΠΕ και συμπαγείς όγκους
Authors: Μπούσιος Στέργιος 
Published: September 2021

Τα ΚΑΠΕ αντιπροσωπεύουν κατά προσέγγιση το 3% όλων των κακοηθειών του ανθρώπου. Οι ασθενείς με ΚΑΠΕ εκδηλώνονται με μεταστατική νόσο για την οποία δεν είναι δυνατόν να καθορισθεί η πρωτοπαθής εντόπιση κατά τον χρόνο της διάγνωσης μετά από ενδελεχή κλινική-εργαστηριακή διερεύνηση. Μέχρι σήμερα,προηγμένες και περίπλοκες διαγνωστικές μέθοδοι ή και επεμβατικές διαδικασίες απέτυχαν να αυξήσουν τη διαφοροδιαγνωστική ακρίβεια σ' αυτούς τους όγκους όσο και να συνεισφέρουν στο θεραπευτικό όφελος. Ως εκ τούτου έχει γίνει αποδεκτό σήμερα ότι μια περιορισμένη διαφοροδιαγνωστική διαδικασία αρκεί για τη διάγνωση των ΚΑΠΕ. Σ' αυτή συμπεριλαμβάνονται πέραν του λεπτομερούς ιστορικού και της ενδελεχούς φυσικής εξέτασης, βασικός αιματολογικός και βιοχημικός έλεγχος,απεικονιστικές εξετάσεις στις οποίες συμπεριλαμβάνονται ακτινογραφία θώρακος και αξονικές υπολογιστικές τομογραφίες και ενδοσκοπήσεις. Βασική κρίνεται η ανασκόπηση του βιοπτικού υλικού με εκτεταμένη ανοσοϊστοχημική μελέτη. Η τελευταία παρέχει την δυνατότητα ταυτοποίησης χημειοευαίσθητων καρκινωμάτων.Η γνώση της υποκείμενης βιολογίας των ΚΑΠΕ είναι ελλιπής. Από τις υπάρχουσες κλινικές μελέτες είναι γνωστό ότι πρόκειται για μεταστατικούς όγκους ετερογενούς αρχής, οι οποίοι εκδηλώνουν κοινά κλινικά χαρακτηριστικά και προφανώς κοινή βιολογική ταυτότητα. Η σε βάθος γνώση της βιολογίας τους εκτιμάται ότι θα μπορούσε να συνεισφέρει σε ορθολογικότερο σχεδιασμό κλινικών θεραπευτικών σχεδιασμών.Πληθώρα δεδομένων που προκύπτουν από μελέτες με καρκινικές σειρές και μοντέλα ζώων, καθώς και από ασθενείς με καρκίνο, υποδεικνύουν ότι η δημιουργία μεταστάσεων είναι μία πολυσύνθετη διαδικασία. Τα κύρια στάδια του μεταστατικού μηχανισμού είναι αρχικά ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων στην πρωτοπαθή εστία, η διείσδυσή τους στο μεσοκυττάριο χώρο που περιβάλει τον πρωτοπαθή όγκο και η είσοδός τους στη συστηματική κυκλοφορία (ενδαγγείωση),όπου μετακινούνται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα, είτε ως συσσωματώματα κυττάρων.Ακολουθεί η μετανάστευσή τους σε απομακρυσμένα σημεία, η έξοδος από την κυκλοφορία (εξαγγείωση) και η διείσδυση σε νέους ιστούς προκειμένου να σχηματίσουν μικρομεταστάσεις. Τέλος, ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός τους στα δευτερεύοντα όργανα που έχουν προσβληθεί οδηγεί στην ανάπτυξη μακροσκοπικά ορατών μεταστάσεων. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί που ανιχνεύονται είτε ως ΔΚΚ σε δευτεροπαθείς εστίες, είτε ως ΚΚΚ στο περιφερικό αίμα των ασθενών, αποτελούν τα μικρομεταστατικά κύτταρα.Έως σήμερα, απουσιάζουν μελέτες σχετιζόμενες με ανίχνευση ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με ΚΑΠΕ. Απεναντίας, σε διαγνωσμένες ασθενείς με καρκίνο μαστού, η παρουσία ΚΚΚ αποτελεί ανεξάρτητο και ισχυρό δείκτη αυξημένης πιθανότητας υποτροπής και μειωμένης ολικής επιβίωσης, τόσο στην πρώιμη όσο και τη μεταστατική νόσο. Επιπλέον, η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με καρκίνο μαστού έχει συσχετιστεί με μειωμένη ανταπόκριση στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα. Πέραν όμως της εκτίμησης της παρουσίας των ΚΚΚ, ο μοριακός και φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους αποτελεί κεντρικό θέμα σημαντικής ερευνητικής προσπάθειας από πολλές ομάδες,καθώς δεν διαθέτουν όλα τα ΚΚΚ το ίδιο μεταστατικό δυναμικό. Η περαιτέρω μοριακή ανάλυσή τους θα μπορούσε να αναδείξει τα χαρακτηριστικά εκείνα που ευοδώνουν τη μεταστατική διαδικασία, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της μετάστασης. Επιπλέον, η μελέτη των ΚΚΚ παρέχει τη δυνατότητα του προσδιορισμού του μοριακού προφίλ του όγκου ανά πάσα χρονική στιγμή και επομένως θεωρείται ως μια υγρή βιοψία «πραγματικού χρόνου». Η ανίχνευση χαρακτηριστικών που σχετίζονται με επιθετική κλινική συμπεριφορά ή με αντίσταση στη θεραπεία στα ΚΚΚ είναι δυνατόν να ταυτοποιήσει υποομάδες ασθενών με φτωχή πρόγνωση. Οι ασθενείς αυτοί πιθανόν είναι υποψήφιοι για πιο επιθετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις ή για θεραπεία με νέους στοχεύοντες παράγοντες, οι οποίοι θα μπορούσαν να επιλεγούν ακόμη και με βάση την έκφραση μορίων-στόχων στα ίδια τα ΚΚΚ. Για τους παραπάνω λόγους, τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται ολοένα και περισσότερες τεχνικές για την ανίχνευση και τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με κακοήθειες Μία σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη μεταστάσεων είναι η EMT των καρκινικών κυττάρων, δηλαδή η σταδιακή μετατροπή του επιθηλιακού τους φαινότυπου σε φαινότυπο μεσεγχυματικών κυττάρων. Ο μεσεγχυματικός φαινότυπος που αποκτούν τα καρκινικά κύτταρα διευκολύνει όχι μόνον την αρχική τους διείσδυση μέσω του πρωτοπαθούς όγκου, αλλά και την ενδαγγείωση και μετακίνησή τους μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας, καθώς επίσης και την εξαγγείωση και τελικά τη διείσδυσή τους στο νέο όργανο. Μία από τις κύριες αλλαγές που παρατηρούνται κατά την EMT αφορά στο πρότυπο έκφρασης των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού, όπου παρατηρείται γενικά σημαντική μείωση στην έκφραση της κυτταροκερατίνης, με παράλληλη αύξηση στην έκφραση της βιμεντίνης, η οποία αποτελεί έναν ισχυρό δείκτη EMT και εμφανίζεται απαραίτητη για τη διείσδυση και ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, σημαντική αλλαγή παρατηρείται στην έκφραση των μορίων που ενέχονται στις διακυτταρικές επαφές, η οποία έχει βρεθεί ότι επάγεται μέσω μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων,όπως είναι οι TWIST, SNAIL και SLUG. Ο μεταγραφικός παράγοντας TWISTαποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό δείκτη EMT, ο οποίος ενέχεται σε διάφορα στάδια της μεταστατικής διαδικασίας, όπως η αρχική διείσδυση και η ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες έχουν συσχετίσει την παρουσία χαρακτηριστικών συμβατών με EMT στον πρωτοπαθή όγκο των ασθενών με αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και μειωμένη επιβίωση. Όπως υποδεικνύεται από πολλές μελέτες τα τελευταία χρόνια, η EMT σχετίζεται άμεσα με τη γένεση ΚΒΚ. Τα ΚΒΚ έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου,συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ως ένας μικρός υποπληθυσμός κυττάρων με ιδιότητες χαρακτηριστικές των βλαστικών κυττάρων. Σύμφωνα με το μοντέλο των ΚΒΚ, τα κύτταρα αυτά θεωρούνται ως τα μόνα ικανά να «αυτοανανεώνονται»,να πολλαπλασιάζονται απεριόριστα και να διαφοροποιούνται,επάγοντας το σχηματισμό όλων των κυτταρικών υποπληθυσμών που απαρτίζουν τον πρωτοπαθή όγκο. Επιπλέον είναι γνωστό ότι τα ΚΒΚ συμμετέχουν ενεργά στην ανάπτυξη μεταστάσεων, καθώς ευθύνονται για τη διασπορά του πρωτοπαθούς όγκου,δίνοντας γένεση σε όλους τους υποπληθυσμούς του. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η EMT και η προτεινόμενη θεωρία των ΚΒΚ πιστεύεται ότι κατέχουν σημαντική θέση στην βιολογία των ΚΚΚ. Η παρουσία δεικτών ΚΒΚ ή EMT στα ΚΚΚ πιθανόν ταυτοποιεί έναν κυτταρικό υποπληθυσμό με αυξημένη ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία και ενισχυμένη ικανότητα να δημιουργεί μεταστάσεις. Όλο και περισσότερες μελέτες τα τελευταία χρόνια διερευνούν με διάφορες μεθοδολογίες την παρουσία δεικτών για EMT και ΚΒΚ στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, εντούτοις δεν υπάρχουν κλινικές μελέτες που να περιγράφουν το φαινόμενο σε καλά καθορισμένες ομάδες με μεγάλους αριθμούς ασθενών. Επιπλέον,δεν έχει δειχθεί έως σήμερα η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και EMT στα ΚΚΚ σε επίπεδο μονήρων κυττάρων. Με βάση τα παραπάνω, σχεδιάστηκε η παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση της παρουσίας ΚΚΚ που φέρουν παράλληλα φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης EMT σε ασθενείς με καρκίνο μαστού. Στόχος ήταν η διερεύνηση της συχνότητάς τους σε ασθενείς με πρώιμη και μεταστατική νόσο, η εκτίμηση της πιθανής αντίστασής τους στη χημειοθεραπεία, καθώς επίσης της προγνωστικής τους αξίας.Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μία νέα μεθοδολογία τριπλού ανοσοφθορισμού σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών, μέσω της οποίας ελέγχθηκε η έκφραση των κυτταροκερατινών 8, 18 και 19 για τον εντοπισμό των ΚΚΚ, ενώ ως δείκτες ΚΒΚ και EMT χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα η ALDH1 και το TWIST. Η συνέκφραση των παραπάνω μορίων αξιολογήθηκε σε επίπεδο μονήρων κυττάρων μέσω του ημι-αυτοματοποιημένου συστήματος μικροσκοπίας φθορισμούARIOL. Επιπλέον, μέσω μίας σειράς πειραμάτων ελέγχου με τη χρήση των παραπάνω καρκινικών σειρών, καθώς επίσης και δείγματος φυσιολογικών αιμοδοτών,επιβεβαιώθηκε η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου ανίχνευσης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα, ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία για τοχαρακτηρισμό των ΚΚΚ ως προς τη συνέκφραση δύο πολύ σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και EMT. Τέλος, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η συνέκφραση δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και EMT σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ, ενισχύοντας ακόμη περισσότερο τη μεταξύ τους συσχέτιση.Στη συνέχεια, διερευνήθηκε εάν τα ΚΚΚ που εμφανίζουν το φαινότυπο ΚΒΚ όπως ορίστηκε βάσει της υψηλής έκφρασης του ισοένζυμου ALDH1Α1, φέρουν και λειτουργικά χαρακτηριστικά των ΚΒΚ. Ως δείκτης λειτουργικότητας ΚΒΚ χρησιμοποιήθηκε η ενζυμική ενεργότητα της ALDH, ο έλεγχος της οποίας πραγματοποιήθηκε μέσω κατάλληλης μεθοδολογίας, γνωστής ως δοκιμήALDEFLUOR με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η μέθοδος ανίχνευσης της ενεργότητας ALDH στα ΚΚΚ αναπτύχθηκε μέσω μίας σειράς πειραμάτων σε διαδοχικές αραιώσεις των καρκινικών κυττάρων της κάθε σειράς σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα αίματος φυσιολογικών αιμοδοτών (αραιώσεις των 10, 102, 103 και 104 κυττάρων ανά 106 αιμοποιητικών κυττάρων). Η ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέσω της ανίχνευσης της έκφρασης των μορίων της επιφάνειας EpCAM και CD45, έναντι της κυτταροκερατίνης, καθώς η δοκιμήALDEFLUOR δεν επιτρέπει τη σύγχρονη ταυτοποίηση ενδοκυττάριων μορίων. Σε συμφωνία με άλλες μελέτες ανίχνευσης ΚΚΚ μέσω κυτταρομετρίας ροής, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η μέθοδος εμφανίζει υψηλή ευαισθησία, ωστόσο στις μεγάλες αραιώσεις των 10 και 100 καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε υπερεκτίμηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η ανίχνευση της ενεργότητας της ALDHπραγματοποιήθηκε με μεγάλη ευαισθησία στο σύνολο των αραιώσεων, ωστόσο και εδώ παρατηρήθηκε μείωση της ποσοστιαίας ενεργότητας με την αυξανόμενη αραίωσητων καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ενδείκνυται για ασθενείς με υψηλό φορτίο ΚΚΚ. Τέλος, μέσω της κυτταρομετρίας ροής ήταν δυνατή η εκτίμηση της ενεργότητας της ALDH στο σύνολο CD45-αρνητικών κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση τουEpCAM, στα οποία συμπεριλαμβάνεται μεταξύ άλλων ο υποπληθυσμός των ΚΚΚ με πλήρη απώλεια έκφρασης επιθηλιακών δεικτών στα πλαίσια της ολοκληρωμένης EMT.Όπως διαπιστώθηκε, η ενεργότητα της ALDH στο συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων ήταν αυξημένη συγκριτικά με τον πληθυσμό των EpCAM-θετικών/CD45-αρνητικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η παραπάνω προσέγγιση επιτρέπει την ανίχνευση του πληθυσμού των ΚΚΚ με πλήρη EMT και παράλληλα λειτουργικό χαρακτήρα ΚΒΚ. Λιγότερα των 5 ΚΚΚ ταυτοποιήθηκαν στο 65,2% του πληθυσμού των ασθενών με ΚΑΠΕ της μελέτης, ενώ στο 14,6% ανευρέθηκαν ≥ 5 ΚΚΚ με ανοσοφθορισμό. Επιπροσθέτως του ανοσοφθορισμού, εφαρμόστηκε και κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση ΚΚΚ. Η διενεργηθείσα ανάλυση σε ανεξάρτητο πληθυσμό ασθενών με ΚΑΠΕ συγκριτικά με τον ανοσοφθορισμό, αποκάλυψε την παρουσία ΚΚΚ στο 64%των περιπτώσεων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαπίστωση ότι στο 28% του συγκεκριμένου πληθυσμού, βρέθηκαν περισσότερα των 50 ΚΚΚ κατά περίπτωση. Αναφορικά με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, δεν ανιχνεύτηκε συσχέτιση μεταξύ των ΚΚΚ και της ηλικίας κατά τη διάγνωση της νόσου, της εντόπισής της, της λειτουργικής κατάστασης των ασθενών ή της λευκοκυττάρωσης (P>0.05). Επίσης καθορίστηκε η συσχέτιση της παρουσίας ΚΚΚ με την επιβίωση. Η διαφορά στη συνολική επιβίωση μεταξύ των δύο υποομάδων ασθενών με ΚΚΚ ≥ 5 έναντι <5 όπως αυτά ανιχνεύτηκαν με τον ανοσοφθορισμό, δεν ήταν στατιστικώς σημαντική, ενώ ασθενής συσχέτιση προέκυψε από την κυτταρομετρία ροής (P= 0.049).Επιπλέον, στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων και της συνολικής επιβίωσης των ασθενών με ΚΑΠΕ. Η περιτοναϊκή καρκινωμάτωση, τα καλά διαφοροποιημένα καρκινώματα και η ικανοποιητική λειτουργική κατάσταση των ασθενών συνδέονται με βελτιωμένη επιβίωση. Συνοψίζοντας, αυτή η μελέτη υποδεικνύει ότι η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με ΚΑΠΕ, δε συνοδεύεται από φτωχή επιβίωση ενώ καμία συσχέτισή τους δεν αναγνωρίστηκε με μια σειρά κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων. Επομένως, τα ΚΚΚ δεν αποτελούν προγνωστικό παράγοντα των ΚΑΠΕ. Καλά σχεδιασμένες κλινικές δοκιμές σε ικανό αριθμό ασθενών με ΚΑΠΕ επιβάλλεται να πραγματοποιηθούν στο μέλλον, προκειμένου να επικυρωθεί η διαπίστωση αυτή. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε μία φαινοτυπική ανάλυση των ΚΚΚ ασθενών με ΚΑΠΕ, ως προς την παρουσία χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ενδιάμεσης EMT. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα μεθοδολογία για την ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση της συνέκφρασης δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ καιEMT στα ΚΚΚ σε επίπεδο κυττάρου. Επίσης περιγράφηκε για πρώτη φορά η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και EMT στο ίδιο κύτταρο, επιβεβαιώνοντας τη συσχέτιση μεταξύ των δύο χαρακτηριστικών στα ΚΚΚ. Η προγνωστική αξία της ανίχνευσης ΚΚΚ ως προς την επιβίωση των ασθενών μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. Με την παρούσα μελέτη αναδεικνύεται αφενός η σημασία της εκτενούς φαινοτυπικής μελέτης των ΚΚΚ για την αποσαφήνιση του ρόλου τους στη μεταστατική διαδικασία και αφετέρου η ανάγκη εύρεσης εναλλακτικών θεραπειών που θα στοχεύουν σε μόρια που σχετίζονται άμεσα με τα χαρακτηριστικά ΚΒΚ και EMT. Μια τέτοια προσέγγιση θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με ΚΑΠΕ.