Βιοποικιλότητα ξυλοσηπτικών μυκήτων σε φυσικά και τεχνητά ενδιαιτήματα
Authors: Φρυσούλη Βασιλική 
Published: August 2024

Οι μύκητες αποτελούν ένα άθροισμα οργανισμών που απαντάται σε μεγάλο εύρος συνθηκών και οικοσυστημάτων, αποτελώντας σημαντικό κρίκο στη λειτουργία τους, κυρίως ως αποδομητές της οργανικής ύλης αλλά και ως συμβιωτές ή παρασιτικοί οργανισμοί αλληλεπιδρώντας με άλλα αθροίσματα οργανισμών. Ο άνθρωπος από νωρίς αναγνώρισε την αξία των μυκήτων ως τρόφιμο ή ως μέσο για την παρασκευή πληθώρας τροφίμων και ποτών, έχει υποστεί τις συνέπειες της δράσης τους ως παθογόνα, αλλά τους έχει επίσης αξιοποιήσει για την παραλαβή ενώσεων με φαρμακευτική – θεραπευτική δράση καθώς παράγουν ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών βιοδραστικών μεταβολιτών. Μέσω της επιστήμης, ιδίως τις τελευταίες δεκαετίες, έχει διερευνηθεί και αναδειχθεί το μέγεθος της βιοποικιλότητας και το πλήθος των ιδιοτήτων τους, με σημαντικές εφαρμογές σε πληθώρα πεδίων του αγροδιατροφικού, ιατροφαρμακευτικού, βιομηχανικού και ενεργειακού τομέα. Η παρούσα εργασία εστιάζει στη μελέτη της βιοποικιλότητας ξυλοσηπτικών μυκήτων, με προέλευση κυρίως από φυσικούς, αδιατάραχτους βιότοπους της ευρύτερης μεσογειακής ζώνης, με έμφαση στον Ελλαδικό χώρο, αλλά και σε αυτόχθονα στελέχη που αναπτύσσονται σε ρυπογόνα, τεχνητά ενδιαιτήματα με υψηλό οργανικό φορτίο. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκαν ομάδες βασιδιομυκήτων λευκής σήψης, με αναγνωρισμένες λιγνινοκυτταρινολυτικές ιδιότητες, οι οποίοι εμφανίζουν ταυτόχρονα ταξινομικό και οικολογικό ενδιαφέρον, όπως τα γένη Ganoderma και Sidera, και ο φυλογενετικός κλάδος Tyromyces - Skeletocutis. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αυτόχθονη, καλλιεργήσιμη, μυκητιακή ποικιλότητα σε απόβλητο διφασικού ελαιουργείου, το οποίο μελετήθηκε ως τεχνητό ενδιαίτημα που εμφανίζει υψηλή τοξικότητα αλλά ταυτόχρονα αποτελεί πηγή ανεξερεύνητης βιοποικιλότητας με σημαντικές προοπτικές αξιοποίησης. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποίηθηκε ένας αρχικός προσδιορισμός του αποδομητικού, ενζυμικού προφίλ στελεχών Ganoderma και μυκήτων που απομονώθηκαν από το απόβλητο. Όλες οι θεματικές προσεγγίστηκαν με τη χρήση σύγχρονων φυλογενετικών μεθόδων ταξινόμησης, σε συνδυασμό με συγκριτική ανάλυση μορφολογικών, οικολογικών, καλλιεργητικών ή ενζυμικών χαρακτηριστικών, και οι οποίες αποτέλεσαν τέσσερις ανεξάρτητες θεματικές που αναλύονται σε αντίστοιχα επιμέρους κεφάλαια. Το προς εξέταση βιολογικό υλικό Ganoderma διερευνήθηκε μέσω μίας εκτενούς φυλογενετικής μελέτης σε επίπεδο γένους και σε παγκόσμια κλίμακα, εστιάζοντας τόσο στο αντιπροσωπευτικό εύρος του δείγματος όσο και σε επαρκές πλήθος μοριακών δεικτών. Η βιοποικιλότητα του γένους υπολογίζεται ότι περιλαμβάνει 104 είδη με βάση τα διαθέσιμα φυλογενετικά δεδομένα, εκ των οποίων μόνο τα έξι επιβεβαιώθηκε πως απαντώνται στην Ευρώπη, και συγκεκριμένα τα G. adspersum, G. applanatum, G. carnosum, G. lucidum, G. pfeifferi και G. resinaceum. Μέσω της πολυγονιδιακής ανάλυσης και κάνοντας χρήση των μοριακών δεικτών ITS, 28S rRNA, TEF1-a, RPB1 και RPB2, αναγνωρίστηκαν πέντε κύριες γενεαλογικές γραμμές (Lineages I έως V), αποτελούμενες από 11 βασικούς κλάδους. Τα εν λόγω αποτελέσματα εμφάνισαν ορισμένες διαφορές σε σχέση με το εξελικτικό σενάριο που αρχικά μελετήθηκε και βασίστηκε αποκλειστικά σε αλληλουχίες ITS rDNA, οι οποίες προήλθαν από τα συνολικά διαθέσιμα σχετικά μεταδεδομένα των βάσεων INSDC και UNITE. Οι πρώιμες γενεαλογικές γραμμές Lineages I και III περιλαμβάνουν περιορισμένο αριθμών ειδών, με εξάπλωση στο Βόρειο Ημισφαίριο, ενώ τα Lineages IV και V εμφανίζουν παγκόσμια κατανομή, κυρίως σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές. Δεν επιβεβαιώνεται η υποδιαίρεση του γένους με βάση την εμφάνιση και την ανατομία της άνω επιφάνειας του πίλου, με τους ταξινομικούς χαρακτήρες που μελετήθηκαν να παρουσιάζουν πολυφυλετική προέλευση. Τα Lineages I και ΙΙΙ εμφανίζουν κατανομή στην Νότια Κίνα, ενώ στην ευρύτερη Νοτιοανατολική Ασία εντοπίζεται το 50% της βιοποικιλότητας με εκπροσώπηση σε όλους τους βασικούς κλάδους, καθιστώντας την πιθανότερη περιοχή προέλευσης του κοινού προγόνου. Τα ευδικότυλα αποτελούν τους κυρίαρχους ξενιστές του γένους, με κάποια είδη να εμφανίζουν μεγάλο εύρος ξενιστών, περιλαμβάνοντας μονοκότυλα και/ή γυμνόσπερμα, με σπάνιες περιπτώσεις προτίμησης σε ορισμένα από αυτά. Ο δείκτης ITS εμφανίζεται ως ο καταλληλότερος (δηλαδή με επαρκή διακριτική ικανότητα σε επίπεδο είδους στις περισσότερες των περιπτώσεων και υψηλή εκπροσώπηση της βιοποικιλότητας του γένους), ωστόσο ενίοτε κρίθηκε απαραίτητη πολυγονιδιακή προσέγγιση για την πλήρη διελεύκανση των φυλογενετικών σχέσεων. Η ταυτότητα καταχωρημένων αλληλουχιών όσο και γονιδιωμάτων στις διεθνείς βάσεις μοριακών δεδομένων διαπιστώθηκε πως ήταν συχνά εσφαλμένη, γεγονός το οποίο σε συνδυασμό με τη σχετικά περιορισμένη διαθεσιμότητα αλληλουχιών προερχόμενων από τυπικές συλλογές, καθιστούν γενικώς επισφαλή τα ταξινομικά συμπεράσματα που συνάγονται από αυτοματοποιημένες τακτικές προσδιορισμού βιολογικού υλικού (π.χ. ανάλυση BLAST). Η ανάλυση μεγάλου όγκου δεδομένων επέτρεψε τον εντοπισμό αλληλουχιών ITS1 ή/και ITS2 με διαγνωστική αξία για επιμέρους είδη (“signature sequences”) με προφανή εφαρμογή σε διαδικασίες εξειδικευμένης και ταχείας ταυτοποίησης. Σημαντική πληροφορία εντοπίστηκε στα διαθέσιμα δεδομένα των INSDC διευρύνοντας τη γνώση για τη βιοποικιλότητα των ειδών του γένους Ganoderma. Παρά τη σημαντική συμβολή των σύγχρονων μελετών στη διαλεύκανση της ταξινομικής του γένους επισημάνθηκαν ελλείψεις, ανακρίβειες αλλά και αμφισβητούμενα φυλογενετικά συμπεράσματα. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η χρήση αλληλουχιών γονιδίων που κωδικοποιούν υπεροξειδάσες σε φυλογενετικές αναλύσεις, τα οποία αν και προσφέρουν επαρκή διαχωρισμό των ειδών, εμφανίζουν υψηλό ενδοειδικό πολυμορφισμό, ετερόλογα αντίγραφα, αλλά και χαμηλή εκπροσώπηση της βιοποικιλότητας. Τέλος, εκτιμήθηκε η αποτελεσματικότητα των στελεχών Ganoderma σε διαδικασίες βιοαποδόμησης υγρού αποβλήτου ελαιουργίας, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως υποστρώμα ανάπτυξης. Το αποδοτικότερο καταλυτικό προφίλ εμφάνισαν στελέχη των ειδών G. resinaceum και G. adspersum.Το γένος Sidera μελετήθηκε φυλογενετικά με βάση δύο πυρηνικούς, ριβοσωμικούς δείκτες ITS και 28S. Η ανάλυση ανέδειξε την ύπαρξη 23 ειδών, που εντάσσονται σε τρεις κύριους κλάδους, εκ των οποίων τα 18 αντιστοιχούν σε ήδη περιγραφέντα είδη και τα πέντε σε πιθανά νέα είδη. Οι δύο κλάδοι συνιστούν μια διακριτή γενεαλογική γραμμή, περιλαμβάνοντας είδη αποκλειστικά με πορώδη υμενοφόρο. Το γένος Sidera εμφανίζει εξάπλωση κυρίως στο Βόρειο Ημισφαίριο, λιγότερο στο Νότιο, ενώ δεν έχει καταγραφεί στην Αφρική. Στην Ευρώπη απαντώνται τα S. americana, S. lenis και S. lunata, με εξάπλωση σε βορειότερες ζώνες, καθώς και το S. vulgaris, ολοαρκτικής κατανομής, το οποίο είναι το μοναδικό είδος με παρουσία στη Μεσογειακή ζώνη. Το πρόσφατα περιγραφέν είδος “S. tibetica" αναγνωρίστηκε ως ταξινομικό συνώνυμο του S. vulgaris. Επίσης, συλλογές που είχαν αρχικά ταυτοποιηθεί ως “S. vulgaris" και “S. lowei" με προέλευση τη Νέα Ζηλανδία διαπιστώθηκε ότι δεν ανήκουν στα αντίστοιχα είδη, αποδεικνύοντας ότι η εξάπλωση τους δεν περιλαμβάνει την Ωκεανία όπως αρχικά θεωρείτο. Ως σημαντικοί – διαγνωστικοί ταξινομικοί χαρακτήρες για τη διάκριση επιμέρους ειδών του γένους Sidera αναδείχθηκαν η μορφολογία της υμενοφόρου, η παρουσία και ο τύπος των κρυσταλλικών δομών, η παρουσία κεφαλοειδών άκρων αναπαραγωγικών υφών, και σε μικρότερο βαθμό η δομή του συστήματος των υφών. Τα προαναφερθέντα συνάδουν σε σημαντικό βαθμό με τη φυλογενετική υποδιαίρεση του γένους, δηλαδή αποτελούν μορφολογικά χαρακτηριστικά που εντοπίζονται στην πλειοψηφία των ειδών των κύριων κλάδων. Αρχικός στόχος του τρίτου κεφαλαίου της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της βιοποικιλότητας του γένους Skeletocutis στην ευρύτερη περιοχή της Μεσογείου, ωστόσο σύντομα διαπιστώθηκε ο ασαφής διαχωρισμός του από το συγγενές γένος Tyromyces, με προφανή την ανάγκη για ευρύτερη διερεύνηση ώστε να ταυτοποιηθεί επαρκώς το υπό εξέταση βιολογικό υλικό. Έτσι, μελετήθηκε ένα ευρύ σύνολο αλληλουχιών, αντιπροσωπευτικό της βιοποικιλότητας του φυλογενετικού κλάδου Tyromyces - Skeletocutis, με βάση τους δύο πυρηνικούς ριβοσωμικούς δείκτες ITS και 28S. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης επιβεβαίωσε τα ασαφή όρια εντός ενός μονοφυλετικού κλάδου των δύο γενών, υποδεικνύοντας το γένος Skeletocutis ως ταξινομικό συνώνυμο του παλαιότερου γένους Tyromyces, και κατά συνέπεια και των γενών Incrustoporia και Piloporia, τα οποία είχαν ήδη αναγνωριστεί ως συνώνυμα του πρώτου. Έτσι, η βιοποικιλότητα του γένους Tyromyces (συμπεριλαμβανομένου και του Skeletocutis) αποτελείται από συνολικά 62 είδη με βάση τις διαθέσιμες αλληλουχίες, τα οποία υποδιαιρούνται σε δύο κύριους κλάδους, με τα τυπικά είδη των δύο γενών να εμφανίζουν συγγενή τοπολογία. Επιπλέον, 13 καταληκτικοί κλάδοι δεν κατέστη εφικτό να αντιστοιχηθούν με ήδη περιγραφέντα είδη. Το γένος εμφανίζει παγκόσμια εξάπλωση, με το ένα τρίτο των ειδών (#21) να εντοπίζεται στην Ευρώπη, ενώ επιβεβαιώθηκε η παρουσία των S. alutacea, S. amorpha, S. biguttulata, S. carneogrisea, S. odora και S. percandida στην περιοχή της Μεσογείου. Ταυτόχρονα, επιβεβαιώθηκε η κατάταξη 15 ειδών που θεωρούνταν μέλη των γενών Tyromyces και Skeletocutis σε άλλα γένη/οικογένειες της τάξης Polyporales, ενώ επίσης προτείνεται η δημιουργία του νέου ταξινομικού συνδυασμού Sebipora (Tyromyces) amazonicus (Gelatoporiaceae). Το τέταρτο κεφάλαιο της διατριβής εστίασε στον προσδιορισμό της βιοποικιλότητας των καλλιεργήσιμων αυτόχθονων μυκήτων σε απόβλητο διφασικού ελαιοτριβείου και στην αξιολόγηση του λιγνινολυτικού δυναμικού τους. Για την απομόνωση όσο το δυνατόν μεγαλύτερου εύρους αυτών χρησιμοποιήθηκαν διάφορα εκλεκτικά υποστρώματα και τεχνικές εμβολιασμού, όπως και συνθήκες ανάπτυξης. Από τις 57 ταξινομικές μονάδες (OTU) που διακρίθηκαν μετά την απομόνωση των μυκήτων σε καθαρές καλλιέργειες, επιλέχθηκαν 96 αντιπροσωπευτικά στελέχη, τα οποία αφού ταυτοποιήθηκαν μοριακά με χρήση ενός (ITS rDNA) ή περισσοτέρων δεικτών (TUB, TEF1-α, ACT, CAL, RPB2, 28S rRNA), αποδείχθηκε ότι αντιπροσωπεύουν 25 είδη Ascomycota, τέσσερα είδη Basidiomycota και τρία είδη Mucoromycota, περιλαμβάνοντας τέσσερα πρόσφατα περιγραφέντα είδη και δύο προτεινόμενα νέα είδη. Μέσω βιοχημικών δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες μυκήτων σε στερεά υποστρώματα αξιολογήθηκε η ικανότητα αποικοδόμησης συστατικών της λιγνινοκυτταρίνης (κυτταρίνη, ξυλάνη, λιγνίνη) και της συνθετικής χρωστικής RBBR, αλλά και η παραγωγή λακκάσης. Τα 29 είδη εμφάνισαν ικανότητα διάσπασης κυτταρίνης και ξυλάνης (94% και 97% των στελεχών, αντίστοιχα), 24 είδη παρουσίασαν ικανότητα διάσπασης RBBR (75% των στελεχών), ενώ ικανότητα λιγνινόλυσης και δράση λακκάσης εντοπίστηκε σε μικρότερο βαθμό, με πέντε και οκτώ είδη, αντίστοιχα (16 και 25% των στελεχών, αντίστοιχα). Στη σύνθεση της αυτόχθονης μυκητιακής ποικιλότητας περιλαμβάνονται είδη με αναγνωρισμένη αποτελεσματικότητα σε διαδικασίες βιοαποδόμησης, αλλά και σε άλλες γεωργικές, βιοτεχνολογικές και βιομηχανικές εφαρμογές προσφέροντας νέες ερευνητικές προοπτικές.Συνοψίζοντας, στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η συνολική (σε παγκόσμια κλίμακα) ποικιλότητα σε τρία γένη ξυλοσηπτικών βασιδιομυκήτων με ιδιαίτερο ταξινομικό και βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον προερχόμενων από φυσικά (δασικά) ενδιαιτήματα. Επιπλέον, εξετάστηκε η ποικιλότητα των αυτόχθονων καλλιεργούμενων μυκήτων (με έμφαση στην απομόνωση – επιλογή όσων αποδομούν λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα) σε απόβλητο διφασικού ελαιοτριβείου, το οποίο αποτελεί ένα ιδιαίτερο τεχνητό ενδιαίτημα. Με τη υιοθέτηση μιας συνδυαστικής προσέγγισης (μορφολογικά, φυσιολογικά και οικολογικά κριτήρια) που περιελάμβανε την παραλαβή και μελέτη 434 αλληλουχιών μέσω της χρήσης οκτώ μοριακών δεικτών, διαλευκάνθηκε η ταξινομική και φυλογενετική των εν λόγω οργανισμών και προσδιορίστηκε η ύπαρξη 221 ειδών, ήτοι: 104 (εκ των οποίων 21 πιθανά νέα είδη για την επιστήμη) για το γένος Ganoderma, 23 (πέντε νέα είδη) για το γένος Sidera, 62 (13 νέα είδη) για το φυλογενετικό άθροισμα Tyromyces – Skeletocutis και 32 (δύο νέων ειδών) μυκήτων στο απόβλητο διφασικών ελαιοτριβείων. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μια αρχική αξιολόγηση της δυνατότητας διάσπασης λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων από επιλεγμένες ομάδες μυκήτων προς την κατεύθυνση μελλοντικής αξιοποίησης του βιοτεχνολογικού δυναμικού τους.