Incorporation of natural bioactive components into matrices to enhance food functionality and shelf-life
Authors: Γαλάνη Ελένη 
Published: October 2024

Τα τελευταία χρόνια, η επιστημονική κοινότητα έχει βοηθήσει τη βιομηχανία τροφίμων να κάνει σημαντικά βήματα στην παροχή νέων ή βελτιωμένων προϊόντων για τους καταναλωτές και να επιλύσει προβλήματα που αφορούν την ασφάλεια των τροφίμων, να προάγει τη βιωσιμότητα και να έχει ως αποτέλεσμα λειτουργικά προϊόντα που προάγουν την ευημερία των καταναλωτών πέρα από τη βασική διατροφή. Οι απαιτήσεις των καταναλωτών έχουν αυξηθεί καθώς είναι πιο ενημερωμένοι και προσεκτικοί σχετικά με την υγεία τους και πώς να την προάγουν. Τα κολλοειδή έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στα τρόφιμα για να βελτιώσουν την υφή τους, να εγκλωβίσουν βιοδραστικές ενώσεις και να βελτιώσουν τη διαλυτότητα, κυρίως, των λιποδιαλυτών ενώσεων σε υδατικά μέσα. Ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η παρασκευή βρώσιμων και λειτουργικών Pickering γαλακτωμάτων (PEs), σταθεροποιημένων από σωματίδια φυσικής προέλευσης χωρίς τη βοήθεια οποιωνδήποτε συνθετικών ή χημικών γαλακτωματοποιητών, όπως οι επιφανειοδραστικές ουσίες. Ο ρόλος αυτών των PE ήταν να μεταφέρουν βιολογικά ενεργά συστατικά διαλυτά σε έλαιο, σε υδατικές βάσεις τροφίμων. Οι γαλακτωματοποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κυρίως φυτικής προέλευσης και επιλέχθηκαν προσεκτικά, ώστε εκτός από την προσέγγιση φιλική προς τους vegans, να εμπλουτίζουν και τα τελικά προϊόντα με επιθυμητά χαρακτηριστικά. Τα γαλακτώματα Pickering χρησιμοποιήθηκαν ως έμπνευση για τα συστήματα που παρουσιάζονται σε αυτό το έργο λόγω της έλλειψης επιφανειοδραστικών, της αυξημένης σταθερότητάς τους και της υψηλότερης περιεκτικότητας σε έλαιο, που μπορεί να αυξήσει την συγκέντρωση των εγκλωβισμένων βιοδραστικών. Ως συστατικά για την παρασκευή κολλοειδών σωματιδίων χρησιμοποιήθηκαν απομονωμένη πρωτεΐνη αρακά (PPI), απομονωμένη πρωτεΐνη σόγιας (SPI), φυκοκυανίνη (PC), μυκητιακή χιτοζάνη (FC), καθώς και τρία προβιοτικά στελέχη βακτηρίων γαλακτικού οξέος, συγκεκριμένα το Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 (Lb. fermentum ACA-DC 179), το Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87 (Lb. bulgaricus ACA-DC 87) και το Streptococcus thermophilus ACA-DC 26 (S. thermophilus ACA-DC 26). Η φυκοκυανίνη απομονώθηκε από Spirulina platensis και χρησιμοποιήθηκε μαζί με την PPI ως γαλακτωματοποιητής, φυσική χρωστική ουσία και αντιοξειδωτικό μόριο. Τα βακτήρια ανήκουν στη συλλογή ACA-DC του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Τα δύο πιο συχνά χρησιμοποιούμενα εδώδιμα έλαια στην Ελλάδα, συγκεκριμένα το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο (EVOO) και το ηλιέλαιο (SFO), χρησιμοποιήθηκαν ως η εσωτερική φάση του ελαίου. Ως εγκλωβισμένα μόρια, δοκιμάστηκαν η α-τοκοφερόλη και το σκουαλένιο. Κολλοειδή σωματίδια σφαιρικού σχήματος σχηματίστηκαν επιτυχώς μέσω της μεθόδου αλλαγής pH για τα FC, PPI και SPI. Η υπερήχηση ή η ομογενοποίηση υψηλής πίεσης (HPH) χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση του μεγέθους των παραγόμενων σωματιδίων για καλύτερη σταθερότητα και ομοιογένεια του τελικού προϊόντος. Επιπλέον, για την παρασκευή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκαν η Ομογενοποίηση Υψηλής Ταχύτητας Διάτμησης (HSH) μαζί με την Ομογενοποίηση Υψηλής Πίεσης (HPH), όπου ήταν απαραίτητο, για να βελτιώσουν την ομοιογένεια του μεγέθους των σταγόνων, τη σταθερότητα και την προσρόφηση πρωτεΐνης στην επιφάνεια νερού-ελαίου. Τόσο τα σωματίδια που χρησιμοποιήθηκαν όσο και τα προκύπτοντα γαλακτώματα χαρακτηρίστηκαν πλήρως. Για τα σωματίδια PPI, SPI και FC, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) για τον προσδιορισμό του μεγέθους τους και το ζ-δυναμικό για το επιφανειακό φορτίο, ενώ η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (FFTEM) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση της μορφολογίας τους. Για την χαρακτηρισμό των γαλακτωμάτων, χρησιμοποιήθηκε Στατική Σκέδση Φωτός (SLS) για τον προσδιορισμό του μεγέθους των σταγόνων τους, μικροσκοπία οπτική, η Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης με Λέιζερ (CLSM) και η Κρυογονική Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Cryo-SEM) χρησιμοποιήθηκαν για τον δομικό τους χαρακτηρισμό σε όρους μορφολογίας. Τα προκύπτοντα σωματίδια είχαν σφαιρικό σχήμα και ευρύ φάσμα μεγέθους, οδηγώντας σε πολυδιεσπαρμένα γαλακτώματα. Παρόλα αυτά, τα γαλακτώματα ήταν σε θέση να ενσωματώσουν έλαιο μέχρι 30% w/w και παρέμειναν σταθερά για 15 ημέρες. Τα γαλακτώματα PPI αποδείχθηκαν πιο σταθερά, επομένως το PPI επιλέχθηκε για περαιτέρω πειραματισμούς. Μετά την εφαρμογή της αλλαγής pH, τα σωματίδια PPI υποβλήθηκαν επίσης σε υψηλή πίεση, οδηγώντας σε μικρότερα και μονοδιεσπαρμένα σωματίδια που αύξησαν τη σταθερότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων. Για το σχηματισμό των γαλακτωμάτων, χρησιμοποιήθηκε η HSH μαζί με την HPH. Το έλαιο μπορούσε να ενσωματωθεί πλήρως μέχρι 50% w/w και το μέγεθος των σταγόνων μειώθηκε σημαντικά. Έτσι, η PC εισήχθη σε αυτά τα συστήματα ως γαλακτωματοποιητής, φυσική χρωστική και αντιοξειδωτικό μόριο. Τα προκύπτοντα γαλακτώματα ελέγχθηκαν μακροσκοπικά για αποσταθεροποίηση και μικροσκοπικά για την παρατήρηση των σταγόνων ελαίου και των πρωτεϊνικών δακτυλίων γύρω από αυτές χρησιμοποιώντας την CLSM. Η τεχνική pendant drop tensiometry χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η επίδραση των πρωτεϊνών/σωματιδίων στην επιφανειακή τάση νερού-ελαίου. Οι μετρήσεις ζ-δυναμικού χρησιμοποιήθηκαν ως μέσο για την εξέταση της σταθερότητας των σωματιδίων/πρωτεϊνών για να προβλεφθεί η σταθερότητα των προκύπτοντων γαλακτωμάτων. Ο συνδυασμός PC και PPI σχημάτισε σταθερά γαλακτώματα μπλε χρώματος που ήταν σε θέση να εγκλείσουν τα πρότυπα βιοενεργά συστατικά και είχαν τις δικές τους αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Η αντιοξειδωτική δραστηριότητα των γαλακτωμάτων δοκιμάστηκε με τη μέθοδο DPPH. Ένα άλλο ενδιαφέρον συστατικό που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ως σωματίδιο για τη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Pickering ήταν το πολυμερές FC. Το FC ήταν σε θέση να σχηματίσει σφαιρικά σωματίδια σε νανοκλίμακα με αλλαγή pH και υπερήχηση. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η FFTEM χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση των σωματιδίων και οι μετρήσεις ζ-δυναμικού για τη μέτρηση του φορτίου επιφάνειας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις που θα έδιναν μια ιδέα για τη σταθερότητά τους, άρα και για τη συνολική σταθερότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων. Τα γαλακτώματα που σχηματίστηκαν ενσωμάτωσαν επιτυχώς έως και 50% w/w έλαιο και ήταν σταθερά για πάνω από 60 ημέρες. Εκτός από τα δομικά και αντιοξειδωτικά χαρακτηριστικά των σχηματισμένων γαλακτωμάτων Pickering, δοκιμάστηκε και η αντιμικροβιακή τους δράση. Χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη παθογόνων βακτηρίων ως στόχοι, συγκεκριμένα το Escherichia coli (E. coli) και το Staphylococcus aureus (S. aureus). Αποδείχθηκε ότι τα γαλακτώματα ήταν αποτελεσματικά και στα δύο παθογόνα σε δύο διαφορετικές προσφερόμενες δόσεις, δηλαδή 10 και 50% v/v.Για να αυξηθεί περαιτέρω η λειτουργικότητα των γαλακτωμάτων σταθεροποιούμενων από FC, σχηματίστηκε ένα νέο είδος σωματιδίου, ένα σύμπλοκο προβιοτικών βακτηρίων γαλακτικού οξέος και FC. Για το σκοπό αυτό, δοκιμάστηκαν τα τρία στελέχη βακτηρίων που αναφέρθηκαν παραπάνω (L. fermentum ACA-DC 179, L. bulgaricus ACA-DC 87, και S. thermophilus ACA-DC 26). Τα βακτήρια, όταν επαναιωρούνταν σε διάλυμα FC, σχημάτισαν σύμπλοκα βακτηρίων-FC (BFCs). Για την παρασκευή των συμπλόκων, δεν προσφέρθηκε επιπλέον ενέργεια πέραν της ανάμιξης, οδηγώντας σε ηλεκτροχημική αλληλεπίδραση λόγω του αντίθετου φορτίου τους. Μετά από μια σειρά δοκιμών, συμπεριλαμβανομένων της παρασκευής γαλακτώματος (μέσω HSH), της σταθερότητας του γαλακτώματος, της βιωσιμότητας των κυττάρων, επιλέχθηκε το L. fermentum ACA-DC 179 ως το πιο υποσχόμενο στέλεχος για περαιτέρω αξιολόγηση. Αρχικά, η αλληλεπίδραση μεταξύ FC και L. fermentum ACA-DC 179 μετρήθηκε ενώ ήταν σε διαλύματα μόνα τους και με τη μορφή BFCs μέσω του ζ-δυναμικού. Επίσης, απεικονίστηκαν με την CLSM, όπως και οι σταγόνες του γαλακτώματος. Επιπλέον, η αντιμικροβιακή δραστηριότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων Pickering δοκιμάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τέλος, δεδομένου ότι το L. fermentum ACA-DC 179 είναι ένας μικροοργανισμός με αποδεδειγμένες προβιοτικές ιδιότητες, εξετάστηκε αν διατηρεί αυτή την ικανότητα ως συζευγμένο και προσροφημένο στην επιφάνεια ελαίου-νερού. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκαν ELISAs και Μεταβολομική. Βρέθηκε ότι αυτά τα νέα συμπλοκα όχι μόνο παράγουν γαλακτώματα που παραμένουν σταθερά για πάνω από 60 ημέρες αλλά έχουν και διπλή λειτουργικότητα ως αντιμικροβιακοί και αντιφλεγμονώδεις παράγοντες. Τα προτεινόμενα συστήματα είναι καινοτόμα και προσφέρουν πλήθος ευκαιριών για την Παρασκευή διάφορων φορέων για βιοενεργές ουσίες ενώ ταυτόχρονα διαθέτουν την δικιά τους λειτουργικότητα.