Πειραματική διερεύνηση μηχανισμών δημιουργίας ανασυνδυασμών του γονιδιώματος με μοριακές τεχνικές
Authors: Σακάλογλου Πρόδρομος 
Published: July 2024

Η αστάθεια του γενώματος χαρακτηρίζεται από αυξημένη συχνότητα απλών ή σύνθετων μεταλλαγών, αλλαγές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία (υποκαταστάσεις, ελλείψεις, ενθέσεις βάσεων), θραύσεις του DNA, δομικές ή αριθμητικές ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων (ανευπλοειδίες, μεταθέσεις, ελλείψεις, διπλασιασμοί, αναστροφές, ενθέσεις, ανταλλαγές αδερφών χρωματίδων). Γίνεται αντιληπτό ότι η γενωμική αστάθεια αναφέρεται σε μία πληθώρα παραλλαγών του DNA, που περιλαμβάνει από την μεταλλαγή ενός νουκλεοτιδίου μέχρι την ανευπλοειδία (απώλεια ή επιπλέον αντίγραφο) ενός χρωμοσώματος. Η χρωμοσωματική αστάθεια είναι πολύ συχνή στους διάφορους τύπους καρκίνου, με το 90% των καρκίνων στον άνθρωπο να φέρουν δομικές και αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Η χρωμοσωματική αστάθεια προκύπτει λόγω σφαλμάτων κατά τη διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA. Οι βλάβες των αλυσίδων του DNA επιδιορθώνονται μέσω διάφορων μηχανισμών ανασυνδυασμού, ομόλογου ή μη ομόλογου. Λάθη κατά την επιδιόρθωση των θραύσεων της διπλής έλικας του DNA μέσω του μηχανισμού του ομόλογου ανασυνδυασμού, μπορεί να οδηγήσουν σε εσφαλμένες χρωμοσωματικές ανακατατάξεις. Τα ανθρώπινα χρωμοσώματα φέρουν επαναλαμβανόμενο DNA το οποίο δημιουργεί τμήματα με υψηλή ομολογία μεταξύ ομολόγων και μη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Οπότε, θραύση σε μία χρωμοσωματική περιοχή μπορεί να οδηγήσει στη συνένωση με μια περιοχή υψηλής ομολογίας ενός μη ομόλογου χρωμοσώματος η χρωματίδας. Η ανταλλαγή αδερφών χρωματίδων είναι ένα φυσικό φαινόμενο που συμβαίνει συχνά σε διαιρούμενα σωματικά και γαμετικά κύτταρα και αποτελεί έναν μηχανισμό ανασυνδυασμού που περιλαμβάνει την αμοιβαία ανταλλαγή ομόλογων τμημάτων DNA μεταξύ των αδελφών χρωματίδων ενός χρωμοσώματος. Σκοπός της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση δύο κύριων ερωτημάτων, εάν: 1. Η νόσηση από τον SARS-CoV-2 συσχετίζεται με γενωμική αστάθεια. 2. Η ρετρομετάθεση έχει επιπτώσεις στην ακεραιότητα του γενώματος. Στην παρούσα εργασία, το πρώτο ερώτημα προσεγγίστηκε μέσω της χρωμοσωμικής ανάλυσης μεταφασικών κυττάρων από δείγματα περιφερικού ολικού αίματος ασθενών COVID-19, όπου μελετήσαμε τα γεγονότα ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων ως δείκτη γενωμικής αστάθειας. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, δεν φανέρωσαν στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα SCE μεταξύ των ασθενών και υγιών ατόμων. Όσον αφορά το δεύτερο ερώτημα του σκοπού της παρούσης διατριβής, μελετήσαμε τα γεγονότα ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων σε κύτταρα ανθρώπινων γλοιωματικών κυτταρικών σειρών (U-373- και U-87 MG) στα οποία είχε γίνει επαγωγή της ρετρομετάθεσης μέσω διαμόλυνσης των κυττάρων με το μη-αυτόνομο, LTR-ρετροτρανσποζόνιο, HERV-K10, η οποία οδήγησε στην παραγωγή ποικίλης συχνότητας ρετρομετάθεση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Παρατηρήσαμε αυξημένη συχνότητα SCE μεταξύ των κυτταρικών σειρών U-87 που ακολουθούσε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης. Η περαιτέρω ανάλυση με μικροσυστοιχίες DNA aCGH, αποκάλυψε ότι στο γένωμα των κυττάρων των κλώνων με την χαμηλή κα μεσαία συχνότητα γεγονότων ρετρομετάθεσης, απουσίαζε σημαντικός αριθμός CNVs τα οποία είχαν εντοπιστεί στο DNA των κυττάρων κλώνων. Αντίθετα, στο γένωμα των κυττάρων των κλώνων με το υψηλό ποσοστό ρετρομετάθεσης, ο αριθμός των CNVs ήταν αυξημένος, αφορούσε όμως χρωμοσωμικές περιοχές στις οποίες είχαν ήδη εντοπιστεί σε CNVs σε ημιζυγωτία, στο γένωμα των κυττάρων των υπόλοιπων κυτταρικών σειρών U-87 που αναλύθηκαν. Ο μηχανισμός του αντιγραφικού ανασυνδυασμού των ρετρομεταθετών στοιχείων ενδεχομένως να αυξάνει τα hotspot ανασυνδυασμού στα χρωμοσώματα, επιτρέποντας την επιδιόρθωση των γενωμικών βλαβών μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Όταν τα ποσοστά ρετρομετάθεσης είναι υψηλά, πιθανώς ο αριθμός των θραύσεων της διπλής έλικας των αλυσίδων DNA (DSBs) που συσσωρεύεται στο γένωμα, να είναι πέρα του ορίου αντοχής για τον μηχανισμό επιδιόρθωσης του κυττάρου, και πλέον η ρετρομετάθεση να αποτελεί επιβαρυντικό παράγοντα.