Structural and functonal analysis of membrane protein complexes from the photosynthetic bacterium Chlorobaculum tepidum
Authors: Λυρατζάκης Αλέξανδρος 
Published: December 2024

To Chlorobaculum tepidum (Cba tepidum) είναι ένα πράσινο θειούχο βακτήριο που χρησιμοποιεί σαν ηλεκτρονιοδότες θειούχα και θειοθιικά άλατα. Αυτά τα οξειδώνει και δημιουργεί εξωκυττάρια σφαιρίδια στοιχειακού θείου τα οποία χρησιμοποιούνται και αυτά σαν ηλεκτρονιοδότες. Για να αποκτήσουμε μια εικόνα του μεταβολισμού του θείου του, πραγματοποιήθηκε Label Free πρωτεωμική ανάλυση. Η δειγματοληψία περιελάβανε κυτταρόλυμα από διαφορετικές ώρες καλλιέργειας, συμπεριλαμβανομένης της αρχής παραγωγής θείου (10 ώρες μετά την επώαση), την έναρξη της μέγιστης παραγωγής θείου (20 ώρες) και το τέλος της κατανάλωσης θείου (40 ώρες), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Cba tepidum εκφράζει τα ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του θείου ως απόκριση στη διαθεσιμότητα ανηγμένων ενώσεων θείου και ένα μοντέλο που δείχνει την έκφραση πρωτεΐνης παρουσιάζεται σε αυτή τη μελέτη. Η βιοσύνθεση των σφαιριδίων πολυφωσφορικού (polyP) είναι σημαντική για την επιβίωση των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε διάφορες περιβαλλοντικές πιέσεις, αλλά η βιογένεση του polyP δεν είναι μελετημένη. Στο Cba tepidum αναφέρθηκε η παρουσία συσψματομάτων πλούσιων σε ηλεκτρόνια, αλλά δεν είχαν χαρακτηριστεί. Με βάση τα πρωτεομικά δεδομένα, ήταν δυνατό να εντοπιστεί η διαφορική έκφραση των ενζύμων που σχετίζονται με το polyP. Τέλος, ο δομικός χαρακτηρισμός και η τελική απόδειξη της ύπαρξης του πολυφωσφορικού πολυμερούς και της συνολικής περιεκτικότητας σε φωσφορικά στα κύτταρα επιτεύχθηκε με P31 NMR και φασματοσκοπία απορρόφησης αντίστοιχα.Οι φωτότρωφοι οργανισμοί μετατρέπουν την φωτεινή ενέργεια από τον ήλιο σε χημική ενέργεια, συντηρώντας έτσι τις περισσότερες μορφές ζωής στη Γη. Η φωτεινή ενέργεια συλλέγεται από τις κεραίες και στη συνέχεια μεταφέρεται στα κέντρα αντίδρασης (RC) για να ξεκινήσει μια σειρά αντιδράσεων διαχωρισμού φορτίου και μεταφοράς ηλεκτρονίων προς τους τερματικούς δέκτες ηλεκτρονίων. Τα χλωροσώματα, η κεραία συλλογής φωτός των πράσινων βακτηρίων, είναι μοναδικά συστήματα στα οποία οι χρωστικές είναι οργανωμένες σε συσσωματώματα αντί να συνδέονται με πρωτεΐνες. Πρόκειται για πεπλατυσμένες ελλειψοειδείς δομές και συνδέονται με την εσωτερική επιφάνεια της κυτταροπλασματικής μεμβράνης μέσω των περιοχών της «βάσης» τους. Αυτή η δομή διασφαλίζει ότι οι κεραίες συλλογής φωτός βρίσκονται σε άμεση επαφή με τα κέντρα αντίδρασης που είναι ενσωματωμένα στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Η σημασία της βιταμίνης Β12 έχει αποδειχθεί για πολλά στελέχη αυτής της οικογένειας και θεωρείται ζωτικός παράγοντας ανάπτυξης. Το Cba tepidum χρειάζεται τη βιταμίνη ως συμπαράγοντα κυρίως για τη βιοσύνθεση φωτοσυνθετικών χρωστικών. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές από το μεθανολικό εκχύλισμα από το κύτταρο που καλλιεργήθηκε με και χωρίς Β12. Το μέγεθος του απομονωθέντος χλωροσώματος υπολογίζεται χρησιμοποιώντας αρνητική χρώση και DLS, ενώ η λεπτή τομή των ολόκληρων κυττάρων έδειξε επίσης τη διαφορά στο μέγεθος των χλωροσωμάτων που απομονώθηκαν από καλλιέργειες με και χωρίς την βιταμίνη. Τέλος, με βάση την πρωτεομική ανάλυση καθώς και τη μεταβολομική ανάλυση με NMR Η1, ήταν δυνατό να κατασκευαστεί ένα μοντέλο που δείχνει την επίδραση της στέρησης της Β12 σε πρωτεομικό και μεταβολομικό επίπεδο. Με βάση τον τερματικό δέκτη ηλεκτρονίων, που είναι ένα κέντρο σιδήρου θείου, το Cba tepidum έχει RC Τύπου Ι. Το ενσωματωμένο στη μεμβράνη RC του Cba tepidum συνδεετε με έναν διαλυτό πομπό ενέργειας την πρωτεΐνη Fenna-Matthews-Olson (FMO). Όλα τα RC προέρχονται από ομοδιμερή RC παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στα βακτήρια πράσινου θείου (GSB) και στα ηλιοβακτήρια. Η δομική ανάλυση του RC του Cba tepidum θα δώσει πληροφορίες για την εξέλιξη των φωτοσυστημάτων. Η δομή ολόκληρου του συμπλόκου FMO-RC από το Cba tepidum αναλύθηκε σε ευκρίνεια 2,5 Α με Single Particle Analysis Cryo-EM. Η δομή αυτού του συμπλόκου, το οποίο παρουσιάζει χαρακτηριστικά και των δύο RC τύπου Ι και ΙΙ, καλύπτει ένα σημαντικό κενό στην κατανόησή μας για τη λειτουργία του φωτοσυνθετικών οργανισμών και παρέχει τη βάση για μια πιο ολοκληρωμένη εξέταση των διεργασιών μεταφοράς ενέργειας και ηλεκτρονίων μέσω πειραματικών και θεωρητικών προσεγγίσεων.Οι μοριακές δυναμικές προσομοιώσεις (MD), σε συνδυασμό με βιοπληροφορικά εργαλεία, παρείχαν την δομική και δυναμική πληροφορία σχετικά με το σύμλοκο των υπομονάδων μεμβράνης του RC. Πιο συγκεκριμένα, το δυναμικό μοντέλο περιελάβανε εκτεταμένη δειγματοληψία σε ατομική ανάλυση και σε αθροιστική χρονική κλίμακα 22 μs και αποκάλυψε τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) μεταξύ των υπομονάδων ενδιαφέροντος. Αυτά τα αποτελέσματα παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τη μεταφορά ηλεκτρονίων στην ομοδιμερή πυρήνα των GBS.