Μελέτη του παθογενετικού ρόλου του μιτοχονδριακού μεταφορέα SLC25A46 σε ένα γενετικό μοντέλο νευρολογικής νόσου στο ποντίκι
Authors: Τερζενίδου Μαρία-Ειρήνη 
Published: September 2021

Ακολουθώντας την προσέγγιση της Πρόσθιας Γενετικής μέσω τυχαίας μεταλλαξογένεσης με αιθυλνιτροζουρία (N-ethyl-N-nitrosourea, ENU), η ερευνητική ομάδα της Δρ. Ελένης Ντούνη ταυτοποίησε ένα νέο μοντέλο αυτοσωμικής υπολειπόμενης νευρολογικής νόσου στο ποντίκι. Τα συμπτώματα εμφανίζονται με πλήρη διεισδυτικότητα εξίσου στα δύο φύλα την τρίτη εβδομάδα από την γέννηση και χαρακτηρίζονται από αταξία, αστάθεια στην κίνηση, κρίσεις επιληψίας, απώλεια αντανακλαστικού έκτασης των οπίσθιων άκρων, μειωμένο σωματικό βάρος και μυϊκή δύναμη και πρόωρη θνησιμότητα. Λόγω των κλινικών συμπτωμάτων, το νέο αυτό μοντέλο ονομάστηκε αταξικό. Εφαρμόζοντας γενετική ανάλυση σύνδεσης εντοπίστηκε μια μη νοηματική σημειακή μετάλλαξη (C σε T) στην κωδική περιοχή του γονιδίου Slc25a46, μέλους της οικογένειας των μιτοχονδριακών μεταφορέων SLC25 (Solute Carrier Family 25, SLC25). Η μετάλλαξη αυτή εισάγει ένα πρόωρο κωδικόνιo λήξης κωδικοποιώντας ένα πολυπεπτίδιο 95 αμινοξέων αντί της άγριου τύπου πρωτεΐνης που αποτελείται από 418 αμινοξέα. Η SLC25A46 πρωτεΐνη του ανθρώπου εντοπίζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και τελευταία δεδομένα προτείνουν τη συμμετοχή της σε διαδικασίες της μιτοχονδριακής δυναμικής και της διατήρησης της δομής των αναδιπλώσεων της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Πρόσφατα, ανιχνεύτηκαν μεταλλάξεις στο ανθρώπινο SLC25A46 γονίδιο σε ένα ευρύ φάσμα νευρολογικών ασθενειών που συμπεριλαμβάνουν οπτική ατροφία, τη νόσο Charcot-Marie-Tooth τύπου 2, το σύνδρομο Leigh, την προοδευτική μυοκλονική αταξία και τη θνησιγόνο συγγενή γεφυροπαρεγκεφαλιδική υποπλασία. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός του αταξικού μοντέλου και η συσχέτιση με την παθολογία στον άνθρωπο, η γενετική επιβεβαίωση της υπεύθυνης μετάλλαξης στο Slc25a46 γονίδιο και η μελέτη του προτύπου έκφρασης του άγριου τύπου και του μεταλλαγμένου Slc25a46 γονιδίου για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας στις SLC25A46-επαγόμενες ασθένειες. Τα αποτελέσματα της φαινοτυπικής και ιστοπαθολογικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα αταξικά ποντίκια εμφανίζουν τα κύρια χαρακτηριστικά που εκδηλώνονται στους αντίστοιχους ασθενείς, όπως αλλοιώσεις στην παρεγκεφαλίδα και στους νευράξονες των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, ενδεικτικό της οπτικής ατροφίας. Επίσης, τα αταξικά ποντίκια εμφανίζουν ένα διακριτό φαινότυπο στο ανοσοποιητικό σύστημα που εκδηλώνεται με υποπλασία σε θύμο και σπλήνα. Η απουσία των ώριμων λεμφοκυττάρων δεν αναστρέφει τα νευρολογικά συμπτώματα, δείχνοντας ότι το ανοσοποιητικό σύστημα δεν ευθύνεται για το νευρολογικό φαινότυπο. Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί γενετικά ότι η μετάλλαξη στο γονίδιο Slc25a46 είναι υπεύθυνη για τον αταξικό φαινότυπο, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν το ανθρώπινο hSLC25A46 γονίδιο. Διασταύρωση των διαγονιδιακών αυτών ποντικών με τα αταξικά ποντίκια έδειξε ότι ο αταξικός φαινότυπος αναστρέφεται πλήρως παρουσία του ανθρώπινου διαγονιδίου, επιβεβαιώνοντας ότι η μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο.Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του Slc25a46 γονιδίου τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης έδειξε υψηλή έκφραση στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) ποντικών άγριου τύπου. Όσον αφορά στη μετάλλαξη δε φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου αλλά την παραγωγή της πρωτεΐνης μιας και η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη απουσιάζει από τα αταξικά ποντίκια. Mε ανοσοαποτύπωμα Western σε κλάσματα ιστών του ΚΝΣ και με υπερέκφραση της άγριου τύπου SLC25A46-ΕGFP πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά Ν2Α, διαπιστώσαμε ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού επίσης εντοπίζεται στο μιτοχονδριακό κλάσμα. Επιπλέον, υπερεκφράζοντας τη μεταλλαγμένη SLC25A46-ΕGFP πρωτεΐνη, παρατηρήσαμε ότι το πεπτίδιο των 95 αμινοξέων δεν μπορεί να ενσωματωθεί στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Περαιτέρω πειράματα, φανέρωσαν ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού είναι μια μιτοχονδριακή πρωτεΐνη της εξωτερικής μεμβράνης, όπως και η ανθρώπινη ομόλογή της. Καθώς η SLC25A46 πρωτεΐνη εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο, προχωρήσαμε στη μελέτη της μιτοχονδριακής λειτουργίας στο αταξικό μοντέλο για να ελέγξουμε αν η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης επηρεάζει βασικές λειτουργίες του μιτοχονδρίου. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόσαμε διάφορες μιτοχονδριακές δοκιμές σε πρωτογενείς καλλιέργειες ποντικών άγριου τύπου και αταξικών καθώς και σε ένα κυτταρικό μοντέλο επαγόμενης αποσιώπησης της ανθρώπινης SLC25A46 πρωτεΐνης που δημιουργήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής. Συγκεντρωτικά, η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης δεν φάνηκε να επιφέρει δραματικές αλλαγές στη μιτοχοδριακή λειτουργία, όπως και στους αντίστοιχους ασθενείς. Πρωτεομική ανάλυση σε μιτοχονδριακά εμπλουτισμένα δείγματα από εγκέφαλο, παρεγκεφαλίδα και ήπαρ ποντικών άγριου τύπου και αταξικών, φανέρωσε ότι ειδικά στην παρεγκεφαλίδα των αταξικών ποντικών η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή δυναμική και τη διατήρηση των αναδιπλώσεων της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και πιθανώς αυτό να συσχετίζεται με τους παθογενετικούς μηχανισμούς. Το αταξικό μοντέλο που μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή αποτελεί το πρώτο ζωικό μοντέλο που φέρει μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο. Δεδομένου ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού και του ανθρώπου παρουσιάζουν μεγάλη συντήρηση, σε συνδυασμό με την πλήρη αναστροφή του φαινοτύπου από το ανθρώπινο διαγονίδιο και την καταγραφή SLC25A46 μεταλλάξεων σε ασθενείς, καθιστούν το αταξικό μοντέλο ιδανικό για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών και την εφαρμογή νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.