Laser based micro- and nano- structured Si surfaces for neural tissue engineering
Authors: Αγγελάκη Δέσποινα 
Published: October 2022

Οι τραυματισμοί του περιφερικού νευρικού συστήματος προκαλούν νοσηρότητα, περιορίζουν τις αισθητηριακές ικανότητες των ασθενών και έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην ποιότητα ζωής τους. Παρά την αυθόρμητη ικανότητα αναγέννησης του περιφερικού νευρικού συστήματος, η επιδιόρθωση που επιτυγχάνεται είναι σχεδόν πάντα ατελής και με περιορισμένη λειτουργικότητα. Για να επιτευχθεί πλήρης ίαση των τραυματισμένων περιφερικών νεύρων, η χρήση αυτόλογων νευρικών μοσχευμάτων αποτελεί τον χρυσό κανόνα εδώ και δεκαετίες. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση εμπεριέχει πολλά μειονεκτήματα, όπως η νοσηρότητα στο σημείο λήψης του μοσχεύματος, η περιορισμένη διαθεσιμότητα μοσχευμάτων και το πιο σημαντικό, σπάνια επιτυγχάνεται η πλήρης ίαση του/της ασθενούς. Σαν απάντηση σε αυτούς τους περιορισμούς, η μηχανική νευρικών ιστών έχει προκύψει ως μια εναλλακτική προσέγγιση που στοχεύει στην ανάπλαση του τραυματισμένου νευρικού ιστού με τη χρήση κυττάρων.Η κατασκευή των ικριωμάτων, όπου θα πραγματοποιηθεί η ανάπτυξη των αναγεννώμενων ιστών, είναι ένα σημαντικό πεδίο έρευνας στη μηχανική νευρικών ιστών. Το φυσικό περιβάλλον των κυττάρων είναι ο εξωκυττάριος χώρος, ένα σύνθετο περιβάλλον που παρέχει τα κατάλληλα μηχανικά σήματα για να επιτρέψει την ανάπτυξη των κυττάρων, την ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση και τη διαμόρφωση των ιστών. Κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, ο εξωκυττάριος χώρος επιδρά σημαντικά στην ωρίμανση των νευρώνων και των νευριτών, μέσω της επιφανειακής του τοπογραφίας και των μηχανικών σημάτων του μικρο-περιβάλλοντός του. Συνεπώς, η τοπογραφία των ικριωμάτων που χρησιμοποιούνται στη μηχανική νευρικών ιστών παίζει πολύ σημαντικό ρόλο, καθώς μπορεί να επηρεάσει ζωτικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η προσκόλληση, ο πολλαπλασιασμός, η μορφολογία, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση.Πολλές διαφορετικές μέθοδοι κατασκευής, αλλά και μεγάλη ποικιλία υλικών, έχει χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη ικριωμάτων για εφαρμογές μηχανικής νευρικών ιστών. Εδώ, κατασκευάσαμε μικρο- και νανο- δομημένες επιφάνειες πυριτίου μέσω ακτινοβόλησης με λέιζερ υπέρ-στενών παλμών. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη υποστρωμάτων που θα επέτρεπαν την ελεγχόμενη ανάπτυξη των κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος. Ακόμα, η απάντηση στο ερώτημα κατά πόσον η τοπογραφία του υποστρώματος μπορεί να οδηγήσει σε ελεγχόμενη κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Ο απώτερος στόχος ήταν η καταγραφή νευρικών σημάτων μέσω του ημιαγώγιμου υποστρώματος του πυριτίου. Για να επιτευχθεί αυτός ο στόχος ήταν απαραίτητη αρχικά: 1. η κατασκευή ενός υποστρώματος που θα υποστήριζε την επιλεκτική και ελεγχόμενη κυτταρική προσκόλληση, και στη συνέχεια 2. η επιτυχής διαφοροποίηση των κυττάρων σε αυτό το υπόστρωμα.Για τον σκοπό αυτό, πυρίτιο ακτινοβολήθηκε σε διαφορετικά περιβάλλοντα (σε αντιδραστικό αέριο, σε κενό και σε νερό). Η ακτινοβόληση του πυριτίου με χαμηλή πυκνότητα ενέργειας σε κενό και σε νερό οδήγησε στον σχηματισμό νανο-κυματισμών με διαφορετική περιοδικότητα, ανάλογα με το περιβάλλον ακτινοβόλησης. Αυξάνοντας την πυκνότητα ενέργειας και σε περιβάλλον αντιδραστικού αερίου, κατασκευάστηκαν τρεις τύποι μικρο-κώνων (χαμηλής, μεσαίας και υψηλής τραχύτητας). Οι κώνοι αυτοί κατασκευάστηκαν τόσο με γραμμική, όσο και με κυκλική πόλωση του λέιζερ, και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα in vitro κυτταροκαλλιεργειών. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν οι μικρο-κώνοι που κατασκευάστηκαν με γραμμική πόλωση και οι νανο-κυματισμοί που κατασκευάστηκαν σε νερό για τη δημιουργία ενός συνδυαστικού υποστρώματος με νάνο- και μίκρο- δομές. Ο συνδυασμός δύο διαφορετικών τάξεων μεγέθους (μικρο-κώνων και νανο-κυματισμών) σε ένα υπόστρωμα οδήγησε στη δημιουργία μιας χωρικής πλατφόρμας με διαφορετικές ψευδο-περιοδικές δομές. Τα υποστρώματα αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς τη μορφολογία της επιφάνειάς τους και τις ικανότητες διαβροχής τους και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για την καλλιέργεια κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος in vitro. Πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες ενός είδους κυττάρων (μονο-καλλιέργειες) ινοβλαστών NIH 3T3, γλοιακών κυττάρων (Schwann – SW10) και κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρικά (neuro2a – N2a). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν συγκαλλιέργειες κυττάρων SW10 και N2a. Οι ινοβλάστες NIH 3T3 χρησιμοποιήθηκαν αρχικά ως ένα καλά μελετημένο πειραματικό μοντέλο για να μελετηθούν κάποιες βασικές παράμετροι του πειράματος, όπως η επιβίωση των κυττάρων και η πυκνότητά τους. Τα SW10 και N2a κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σαν τα γλοία και τους νευρώνες του περιφερικού νευρικού συστήματος αντίστοιχα. Η συγκαλλιέργειά τους πραγματοποιήθηκε ως πιο ακριβές μοντέλο για τη μελέτη του περιφερικού νευρικού συστήματος, καθώς η συνύπαρξη τόσο των γλοιακών κυττάρων, όσο και αυτών προσομοιάζουν σε νευρικά, ανταποκρίνεται καλύτερα στην πραγματική δομή του περιφερικού νευρικού συστήματος. Η ανάπτυξη των κυττάρων αξιολογήθηκε στις διαφορετικές δομημένες επιφάνειες σε σύγκριση με την επίπεδη επιφάνεια πυριτίου. Η προσκόλληση και η διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων μελετήθηκε σε σχέση με την τοπογραφία του υποστρώματος καλλιέργειας και με την παρουσία γλοιακών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η χρήση της συνδυασμένης μίκρο- και νάνο- τοπογραφίας, οδηγεί σε ελεγχόμενη προσκόλληση των κυττάρων. Η παρουσία των γλοιακών κυττάρων (SW10) επηρεάζει την προσκόλληση των κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρώνες (N2a). Συγκεκριμένα, στην συγκαλλιέργεια στα δομημένα υποστρώματα πυριτίου, τα N2a προσκολλώνται πάνω από τα προσανατολισμένα κύτταρα Schwann και μόνο στις περιοχές όπου προσκολλώνται τα Schwann. Συνεπώς, τα τοπογραφικά χαρακτηριστικά των συνδυαστικών υποστρωμάτων πυριτίου μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων και η συνδυαστική τοπογραφία μπορεί να σχεδιαστεί έτσι ώστε να περιέχει προκαθορισμένες περιοχές που να ευνοούν ή να εμποδίζουν την προσκόλληση των νευρικών κυττάρων, ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Ακόμα, οι νάνο- και μίκρο- δομημένες επιφάνειες πυριτίου χρησιμοποιήθηκαν ως πλατφόρμες για την μελέτη της επίδρασης της τοπογραφίας στη διαφοροποίηση των N2a κυττάρων, τόσο σε μονο-καλλιέργεια, όσο και σε συγκαλλιέργεια με γλοιακά κύτταρα. Βρέθηκε ότι η τοπογραφία των υποστρωμάτων εμποδίζει τη διαφοροποίηση, παρά τη χρήση χημικών μέσων που επάγουν τη διαφοροποίηση. Πιο συγκεκριμένα, όσο αυξάνεται η τραχύτητα του υποστρώματος, τόσο περιορίζεται η διαφοροποίηση των N2a κυττάρων. Το ίδιο ισχύει και για τη διαφοροποίηση των N2a σε συγκαλλιέργεια με τα SW10, δηλαδή και σε αυτήν την περίπτωση όσο αυξάνει η τραχύτητα του υποστρώματος, τόσο η διαφοροποίηση περιορίζεται. Άρα, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι παρόλο που η παρουσία των γλοιακών κυττάρων έχει τη δυνατότητα να επηρεάζει την προσκόλληση των κυττάρων που προσομοιάζουν σε νευρώνες, η ικανότητά τους προς διαφοροποίηση δεν επηρεάζεται από την παρουσία των γλοιακών κυττάρων. Αυτό σημαίνει ότι όσον αφορά τη διαφοροποίηση, η τοπογραφία παίζει πιο σημαντικό ρόλο από τον συνεργατικό ρόλο των γλοιακών κυττάρων. Περαιτέρω μελέτη του φαινομένου μέσω μεθόδων ελέγχου πρωτεϊνών, θα συμβάλει στην κατανόηση της μεταγωγής μηχανικών σημάτων στα κύτταρα και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα μεταφράζουν τα μηχανικά σήματα του περιβάλλοντός τους σε βιοχημικά σήματα που ελέγχουν τη διαφοροποίηση.