Ανάπτυξη κυτταρογενετικών μεθοδολογιών για την εκτίμηση της ατομικής ακτινοευαισθησίας και αξιολόγηση σύγχρονων εξατομικευμένων τεχνικών ακτινοθεραπείας
Authors: Νικολακοπούλου Αγγελική 
Published: November 2021

Παρόλο που οι σύγχρονες τεχνικές ακτινοθεραπείας επιτρέπουν την αύξηση της δόσης στον όγκο-στόχο για μεγιστοποίηση του ποσοστού ίασης της νόσου και ελαχιστοποίηση της δόσης στους υγιείς ιστούς, υπάρχει σημαντική ανάγκη να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στο πολύπλοκο δίκτυο της κυτταρικής απόκρισης στις ακτινοεπαγόμενες βλάβες του DNA γνωστό ως “DNA Damage response” (DDR), καθώς και να υπερνικήσουμε την ακτινοαντοχή του όγκου. Οι ATM, ATR και Chk1 είναι οι βασικές κινάσες που εμπλέκονται άμμεσα στην ενεργοποίηση του DDR και την αντοχή του όγκου στην ακτινοβολία. Είναι σημαντικό επομένως, να καθιερωθεί μία κυτταρογενετική δοκιμασία (assay) έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) που να προσφέρει αξιόπιστα και γρήγορα αποτελέσματα για την εκτίμηση τόσο της ακτινοευαισθησίας όσο της ακτινοευαισθητοποίησης των κυττάρων με τη χρήση αναστολέων DDR. Η παρούσα διατριβή στοχεύει: (1) Στην ανάπτυξη μιας κυτταρογενετικής μεθόδου (G2-assay) για την εκτίμηση της χρωμοσωματικής ακτινοευαισθησίας χρησιμοποιώντας αναστολείς του DDR και του σημείου ελέγχου G2/M του κυτταρικού κύκλου. (2) Στην αξιολόγηση του G2-assay, ως εναλλακτική έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) ως προς το χρόνο που απαιτείται για την ανάλυση των αποτελεσμάτων. (3) Στην ανάδειξη των πλεονεκτημάτων της μεθοδολογίας που αναπτύσεται στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ως εργαλείο για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας διαφορετικών αναστολέων του DNA Damage response – DDR για την ακτινοευαισθητοποίηση των κυττάρων. Σε αυτό το μέρος της πειραματικής διαδικασίας, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (ινοβλάστες 82-6 hTERT και επιθηλιακά κύτταρα RPE) ακτινοβολήθηκαν κατά τη διάρκεια της μετάβασής τους από τη φάση G2 του κυτταρικού τους κύκλου στη Μίτωση (Μ), και αξιολογήθηκε η συμβολή της αναστολής των οδών ATR, ATM και Chk1 αναλύοντας τις επαγόμενες χρωματιδικές αλλοιώσεις. Τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα που επωάστηκαν με καφεΐνη (αναστολέας ATM/ATR), με VE-821 (αναστολέας της ATR) και με UCN-01 (αναστολέας Chk1) ώστε να επιτευχθεί η κατάργηση της ενεργοποίησης του G2/Μ σημείου ελέγχου. Τα πειραματικά αποτελέσματα οδήγησαν στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση ενός τροποποιημένου G2-assay που υιοθετεί τον ATR αναστολέα VE-821, επιτρέποντας τη σύντομη χρονικά εκτίμηση της ακτινοευαισθησίας των κυττάρων. Η συνδυασμένη αυτή μεθοδολογία θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο εργαλείο για τον έλεγχο της ακτινοευαισθητοποίησης που θα μπορούσαν να επιφέρουν μελλοντικοί αναστολείς DDR. Επίσης, τα αποτελέσματά του μέρους αυτού της διατριβής ενισχύουν την ιδέα ότι τα ATM, ATR και Chk1 αποτελούν ελκυστικούς στόχους φαρμάκων στην ογκολογία.Επιπλέον, υπάρχει σημαντική ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των νέων τεχνικών ακτινοθεραπείας εκτιμώντας την απορροφούμενη δόση με κυτταρογενετικές μεθόδους βιοδοσιμετρίας, καθώς και για τη διερεύνηση της πιθανής επίδρασης του ρυθμού δόσης των νέων τεχνικών στο βιολογικό αποτέλεσμα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής εξήχθησαν αποτελέσματα σχετικά με την απορροφούμενη δόση σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3, μετά από ακτινοβόληση με τρεις διαφορετικές τεχνικές ακτινοθεραπείας (3D-CRT, IMRT και VMAT) με συνταγογραφούμενη δόση 2Gy. Για κάθε δείγμα αίματος ασθενούς και για τα κύτταρα PC3, πραγματοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές ακτινοβολήσεις χρησιμοποιώντας τις τεχνικές 3D-CRT, IMRT και VMAT με δόση 2 Gy. Η απορροφούμενη δόση υπολογίστηκε με τη μέθοδο βιοδοσιμετρίας η οποία βασίζεται στην ανίχνευση δικεντρικών χρωµοσωµάτων σε κύτταρα. Τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν μία υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης της τάξης του ~4% για τις τεχνικές IMRT και VMAT συγκριτικά με τη συμβατική 3D-CRT ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά για τις τεχνικές VMAT και IMRT. Η παρατηρούμενη υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης στα κύτταρα με τις τεχνικές VMAT και IMRT, πιθανόν να οφείλεται στο μικρότερο ρυθμό δόσης που επιτυγχάνεται με τις τεχνικές αυτές.