Μελέτη των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών στην αθηρωμάτωση
Authors: Μουστάρδας Πέτρος 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Η αθηρωμάτωση αποτελεί μια πάθηση του αρτηριακού τοιχώματος με εξαιρετικά μεγάλη νοσηρότητα και θνητότητα. Στόχος των παρεμβάσεων αντιμετώπισής της αποτελεί πλέον εκτός του μετριασμού του στενωτικού της χαρακτήρα, η σταθεροποίηση των αθηρωματικών πλακών, που με τη ρήξη τους μπορούν να προκαλέσουν πληθώρα καρδιαγγειακών συμβαμάτων. Η ασταθήςαθηρωματική πλάκα χαρακτηρίζεται μεταξύ άλλων από λεπτή ινώδη κάψα,μειωμένες συγκεντρώσεις των εξωκυττάριων συνδετικών πρωτεϊνών (κολλαγόνου και ελαστίνης), κι εκτεταμένη φλεγμονώδη αντίδραση. Η λύση του κολλαγόνου και της ελαστίνης αποδυναμώνει την αθηρωματική πλάκα, και καταλύεται από συγκεκριμένα πρωτεολυτικά ένζυμα, τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs), οι οποίες παράγονται κυρίως από τα φλεγμονώδη κύτταρα (μακροφάγα, αφρώδη κύτταρα) και τα λεία μυϊκά κύτταρα της αθηρωματικής περιοχής. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι οι MMPsκαι οι αναστολείς τους (TIMPs) βρίσκονται σε μια λεπτή ισορροπία που καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την κλινική έκβαση της νόσου. Οι στατίνες, που αποδεδειγμένα ασκούν αθηροπροστατευτικό ρόλο μέσω της μείωσης της χοληστερόλης στο αίμα, πιστεύεται τελευταία ότι ασκούν επιπλέον προστασία μέσω της ρύθμισης μονοπατιών σήμανσης που ελέγχουν τη φλεγμονώδη αντίδραση και επηρεάζουν την έκφραση και λειτουργία των MMPs και των αναστολέων τους. Η συστηματική, μακροχρόνια άσκηση είναι γνωστό ότι συμβάλλει στη μείωση της καρδιαγγειακής νοσηρότητας και θνητότητας.Η τροποποίηση των κλασσικών παραγόντων καρδιαγγειακού κινδύνου μπορεί μόνο εν μέρει να εξηγήσει τα ευεργετικά αποτελέσματα της άσκησης οδηγώντας τους ερευνητές να αναζητήσουν επιπλέον αντιαθηρογόνες δράσεις της, μεταξύ άλλων και της τροποποίησης της έκφρασης και λειτουργίας των MMPs και των TIMPs.Σκοπός: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης δύο θεραπευτικών στρατηγικών έναντι της αθηρωμάτωσης, της χορήγησης ατορβαστατίνης και της συστηματικής άσκησης, αλλά και του συνδυασμού τους, στη λειτουργία των MMPs και των αναστολέων τους και η συσχέτιση των επιδράσεων αυτών με την εξέλιξη της αθηρωματικής νόσου, όπως αυτή προσδιορίζεται από το μέγεθος και την σταθερότητα των αθηρωματικών αλλοιώσεων.Πειραματικός σχεδιασμός: Προοπτική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη παρέμβασης. Τοποθεσία: Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών. Πειραματόζωα: Αρσενικοί μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεϊνης Ε(ApoE-/- C57BL/6J knockout mice).Μέθοδος: Την 8η εβδομάδα ηλικίας τους οι μύες τυχαιοποιήθηκαν στις παρακάτω ομάδες: α) Ομάδα ελέγχου αθηρωμάτωσης (CO, n=10), β) Ομάδα χορήγησης ατορβαστατίνης. (ΑΤ, n=10) γ) Ομάδα άσκησης (EX, n=10). δ) Ομάδα συνδυασμένης παρέμβασης ατορβαστατίνης και άσκησης (AT+EX, n=10). Σε όλες τις ομάδες χορηγήθηκε ειδική αθηρογόνος τροφή, με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, για 24 εβδομάδες. Την 16η πειραματική εβδομάδα, ξεκίνησαν οι θεραπευτικές παρεμβάσεις στις ομάδες πλην τηs CO. Στους μύες της ομάδας AT χορηγήθηκε ατορβαστατίνη10mg/Kgr βάρους/ημέρα μέχρι το τέλος της μελέτης. Οι μύες της ομάδας EXυποβλήθηκαν σε πρόγραμμα εκγύμνασης σε ειδικό κυλιόμενο τάπητα μέχρι το πέρας της μελέτης, και οι μύες της ομάδας AT+EX έλαβαν ατορβαστατίνη ομοίως με τους μύες της ομάδας AT και ταυτόχρονα ακολούθησαν πρόγραμμα άσκησης ομοίως με τους μύες της ομάδας EX. Με το τέλος της μελέτης ακολούθησε ευθανασία των μυών. Έγινε λήψη του αορτικού τόξου των μυών προς έγκλειση σε παραφίνη και τομές μικροσκοπίας, και συντήρηση σε βαθιά κατάψυξη της θωρακικής αορτής. Με ιστολογική ανάλυση προσδιορίστηκε το εμβαδό του αγγειακού αυλού και των αθηρωματικών πλακών, και ο βαθμός στένωσης του αυλού κατά μήκος τους αορτικού τόξου. Επιπλέον, με ιστοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους προσδιορίστηκε το ποσοστό της επιφάνειας της αθηρωματικής πλάκας με θετική χρώση για κολλαγόνο,ελαστίνη, μακροφάγα, λεία μυϊκά κύτταρα, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-9,ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2 και TIMP-3. Αιμοληψίες έγιναν σε όλους τους μύες κατά την έναρξη της μελέτης, μετά την ανάπτυξη αθηρωμάτωσης (16η εβδομάδα) και κατά τη λήξη της μελέτης και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης, της ολικής χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, της ΜΜΡ-2, της ΜΜΡ-3, της ΜΜΡ-8, της MMP-9, του ΤΙΜΡ-1, του TIMP-2 και του TIMP-3 στο αίμα. Τα τμήματα της θωρακικής αορτής αναλύθηκαν με ζυμογραφία για προσδιορισμό της ενεργού/ανασταλτικής δράσης της MMP-2, της MMP-9, του TIMP-1 και του TIMP-2.Αποτελέσματα: Και οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις επιβράδυναν την εξέλιξη της αθηρωματικής πλάκας. Αυτό εκφράστηκε ως μειωμένη έκταση του αθηρώματος στις ομάδες που έλαβαν ατορβαστατίνη, και ως μειωμένος βαθμός στένωσης σε όλες τις ομάδες παρέμβασης. Επιπλέον, οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις εμφάνισαν συνέργεια επιτυγχάνοντας σημαντικά καλύτερα αποτελέσματα στην ομάδα συνδυασμένης παρέμβασης. Όλες οι παρεμβάσεις απέτυχαν να διαφοροποιήσουν τις ομάδες σε σχέση με την απώλεια βάρους και τη γλυκόζη αίματος, ενώ μόνο η χορήγηση ατορβαστατίνης πέτυχε μέτριου βαθμού μείωση των λιπιδίων του αίματος.Οι αθηρωματικές πλάκες εμφάνισαν σταθερότερο φαινότυπο στις ομάδες παρέμβασης, με περισσότερο κολλαγόνο κιι ελαστίνη, και με την ελαστίνη να είναι περεταίρω αυξημένη στην ομάδα συνδυασμού παρεμβάσεων. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύτηκαν από ευνοϊκή ρύθμιση των MMP-3, MMP-8 και MMP-9. Η λειτουργικότητα της MMP-8 φάνηκε να είναι σε στενή συνάρτηση με τα επίπεδα κολλαγόνου, ενώ η μείωση της MMP-9 σχετίζεται εν μέρει με τα αυξημένα επίπεδα ελαστίνης. Οι θεραπευτικές παρεμβάσεις δε μετέβαλλαν σημαντικά τη σύσταση της αθηρωματικής πλάκας σε λεία μυϊκά κύτταρα, μείωσαν όμως το περιεχόμενό της σε μακροφάγα, χωρίς ο συνδυασμός τους να επιφέρει επιπλέον οφέλη. Η παρέμβαση της άσκησης αύξησε τα επίπεδα του TIMP-1, μεταβάλλοντας την καθαρή πρωτεολυτική δραστηριότητα εντός της πλάκας. Αντίθετα, ο TIMP-2 μειώθηκε σε όλες τις ομάδες θεραπευτικής παρέμβασης, ενώ ο TIMP-3 δεν παρουσίασε μεταβολή. Τα επίπεδα των μορίων αυτών στο αίμα, αν και αυξήθηκαν σε συνάρτηση με την ανάπτυξη αθηρωμάτωσης (με εξαίρεση τον TIMP-3), δεν μετέβαλαν τις συγκεντρώσεις τους στο αίμα μετά από τις θεραπευτικές παρεμβάσεις αντίστοιχα με τα επίπεδά τους στην πλάκα. Η ενεργός μορφή της MMP-2 μειώθηκε μετά από χορήγηση ατορβαστατίνης,αυξήθηκε με την άσκηση και παρέμεινε σε σταθερά επίπεδα κατά τον θεραπευτικό συνδυασμό. Τα προένζυμα όμως της MMP-2 μειώθηκαν μετά από όλες τις παρεμβάσεις. Συμπεράσματα: Οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις παρουσιάζουν συνέργεια όσον αφορά στην έκταση των αθηρωματικών αλλοιώσεων και τη στένωση, με το συνδυασμό των δύο στρατηγικών να δίνει εμφανώς καλύτερα αποτελέσματα. Επίσης σταθεροποιούν το φαινότυπο της πλάκας, αυξάνοντας την περιεκτικότητα σε ελαστίνη και κολλαγόνο, δράσεις προς σταθεροποίηση της αθηρωματικής πλάκας που είναι σε μεγάλο βαθμό συνάρτηση της επίδρασής τους στα επίπεδα MMPs καιTIMPs. Ο μηχανισμός της αύξησης της ελαστίνης σχετίζεται με την ελαττωμένη τηςλύση, μέσω της ισορροπίας MMP-2/TIMP-2 και μέσω της μείωσης των επιπέδωνMMP-9 που προκύπτουν από τη μεταβολή της σύστασης της αθηρωματικής πλάκας σε μακροφάγα κύτταρα. Η συγκέντρωση της MMP-8 στην αθηρωματική πλάκα παρουσιάζει ισχυρή συσχέτιση με το μοτίβο συντήρησης του κολλαγόνου. Οι επιδράσεις της ατορβαστατίνης και της άσκησης στα επίπεδα των MMPs και τωνTIMPs σχετίζονται πρωτίστως με μεταβολές στο πλήθος και τον φαινότυπο των μακροφάγων, και όχι σε μεταβολές στα λεία μυϊκά κύτταρα. Η αύξηση των συγκεντρώσεων της MMP-2, MMP-3, MMP-8 και MMP-9, όπως επίσης και τωνTIMP-1 και TIMP-2 (αλλά όχι του TIMP-3) στο αίμα αποτελούν δείκτες αθηρωμάτωσης. Οι συγκεντρώσεις όμως των δεικτών των MMP-2, MMP-3 καιMMP-8 στο αίμα δεν σχετίζονται άμεσα με τις συγκεντρώσεις τους στην αθηρωματική πλάκα έπειτα από τις θεραπευτικές παρεμβάσεις και άρα δεν μπορούν να αποτελούν δείκτες της εξέλιξης της νόσου.