Development of analytical methods based on sample preparation and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry for the determination of emerging contaminants
Authors: Καλαμπόκα Μαρία 
Published: September 2021

Τα νέα τεχνολογικά επιτεύγματα καθώς και οι ανθρωπογενείς δραστηριότητες που σχετίζονται με την ιατρική, τη γεωργία, την κτηνοτροφία, τη βιομηχανία τροφίμων και τις οικιακές ανέσεις έχουν αναδείξει ένα νέο περιβαλλοντικό ζήτημα που αφορά την καινούρια κατηγορία ρύπων των αποκαλούμενων αναδυόμενων ρύπων. Οι αναδυόμενοι ρύποι μπορούν να απελευθερωθούν στο περιβάλλον και θεωρούνται ως εν δυνάμει επιβλαβείς για το περιβάλλον και στην ανθρώπινη υγεία. Ως τώρα δεν περιλαμβάνονται στους υπάρχοντες κανονισμούς της ποιότητας των υδάτων και μπορούν να ανιχνευθούν σε χαμηλές ή πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (ng/L) με τη χρήση αναλυτικών τεχνικών προκαλώντας ιδιαίτερη ανησυχία, λόγω των μακροπρόθεσμων αρνητικών τους επιπτώσεων. Στην κατηγορία των αναδυόμενων ρύπων περιλαμβάνονται χημικές ενώσεις όπως φαρμακευτικές δραστικές ουσίες, προϊόντα προσωπικής φροντίδας, φυτοφάρμακα, βιομηχανικά χημικά, και κάποια από αυτά καταλήγουν στο περιβάλλον μέσω διεργασιών απέκκρισης και μεταβολισμού. Οι κύριοι αποδέκτες αυτών των χημικών ενώσεων είναι οι μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων (ΜΕΥΑ), οι οποίες δεν είναι σχεδιασμένες να απομακρύνουν αποτελεσματικά τέτοιους ρύπους σε τόσο χαμηλές συγκεντρώσεις με αποτέλεσμα τα επεξεργασμένα λύματα να περιέχουν αυτές τις ενώσεις σε σημαντικά επίπεδα. Για το λόγο αυτό, απαιτούνται δεδομένα σχετικά με την ύπαρξή τους. Η ανίχνευση αυτών των ρύπων σε περιβαλλοντικά υποστρώματα όπως τα υγρά απόβλητα είναι ιδιαίτερα δύσκολη εξαιτίας των χαμηλών ορίων ανίχνευσης που απαιτούνται, την πολυπλοκότητα της φύσης του υποστρώματος και τη δυσκολία διαχωρισμού αυτών των ουσιών από τυχόν παρεμποδίσεις. Για αυτό το λόγο αναπτύχθηκαν τεχνικές προκατεργασίας γρήγορες, οικονομικές, αποτελεσματικές και φιλικές προς στο περιβάλλον σε συνδυασμό με ένα χρωματογραφικό σύστημα συζευγμένο με αναλυτή μάζας Orbitrap (UHPLC-Orbitrap MS) με υψηλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα για τον προσδιορισμό επιλεγμένων αναδυόμενων ρύπων σε υγρά απόβλητα. Οι τεχνικές προκατεργασίας που μελετήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιλαμβάνουν : τη μαγνητική εκχύλιση δια της στερεάς φάσης (MSPE), την εκχύλιση με προσρόφηση σε ύφασμα (FPSE) και την εκχύλιση δια της στερεάς φάσης (SPE). Συγκεκριμένα, αξιοποιήθηκαν οι δυνατότητες υψηλής ακρίβειας μάζας του υβριδικού τροχιακού αναλυτή Orbitrap, για τον προσδιορισμό 33 αναδυόμενων ρύπων των αντιπροσωπευτικών κατηγοριών των φαρμακευτικών ουσιών, των προϊόντων προσωπικής φροντίδας καθώς και των τεχνητών γλυκαντικών. Ονομαστικά οι ενώσεις που επιλέχθηκαν ήταν οι: σουλφακεταμίδη, σουλφαδιαζίνη, ολανζαπίνη, σοθλφαθιαζόλη, σουλφαπυριδίνη, τριμεθοπρίμη, σουλφαμεθιζόλη, σουλφαμεθαζίνη, σουλφαμεθόξυ-πυριδαζίνη, σουλφαμεθοξαζόλη, ρισπεριδόνη, βενλαφαξίνη, σουλφακινοξαλίνη, οξολινικό οξύ, παροξετίνη, κυκλομπενζαπρίνη, ερυθρομυκίνη, αμιτριπτυλίνη, φλουοξετίνη, καρμπαμαζεπινη, κλομιπραμίνη, ακεσουλφάμη, σακχαρίνη, σοθκραλόζη, ασπαρτάμη, φλορφενικόλη, σαλικυλικό οξύ, ινδομεθακίνη, γεμφιβροζίλη, μεφεναμικό οξύ, τρικλοζάνη και τολφαιναμικό οξύ. Για την ταυτοποίηση των μελετώμενων αναλυτών σε χαμηλές συγκεντρώσεις αξιολογήθηκαν οι παράμετροι λειτουργίας του υβριδικού τροχιακού αναλυτής μάζας Orbitrap όπως παράμετροι ηλεκτροψεκασμού (ESI), διακριτική ικανότητα, ελέγχος αυτόματης απολαβής ιόντων (AGC), δυναμικό δακτυλιοειδούς φακού εστίασης (tube lens), χρόνος έγχυσης (IT) καθώς και οι χρωματογραφικές συνθήκες (χρωματογραφική στήλη, κινητή φάση κτλ.). Η ακρίβεια μάζας των επιλεγμένων αναλυτών χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο ήταν μικρότερη από 5ppm και στις δύο λειτουργίες ιονισμού, θετική και αρνητική. Αναπτύχθηκε μαγνητική εκχύλιση δια της στερεάς φάσης με χρήση C18 υλικών με βάση την πυριτία, καθώς και μαγνητικών νανοϋλικών με βάση το γραφένιο για τον προσδιορισμό 16 και 19 αναδυόμενων ρύπων, αντίστοιχα, σε νερό βρύσης και υγρά απόβλητα. Η τεχνική αυτή βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε. Τα μαγνητικά νανοϋλικά συντέθηκαν επιτυχώς και χαρακτηρίστηκαν με τεχνικές περίθλασης ακτινών Χ (XRD), με φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR), και μικροσκόπιο ηλεκτρονικής σάρωσης (SEM), παρέχοντας τα επιθυμητά μορφολογικά και δομικά χαρακτηριστικά. Η μέθοδος MSPE-UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS χρησιμοποιώντας ως προσροφητικά μαγνητικά υλικά τα νανοσωματίδια των C18 και mrGO, επέδειξε εξαιρετικές αναλυτικές επιδόσεις με συντελεστές γραμμικότητας (R2) μεγαλύτερους από 0.99, υψηλή επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα και ανακτήσεις που κυμάνθηκαν από 58.4% έως 102.6% και για τις δύο τεχνικές. Οι μαγνητικές εκχυλίσεις με χρήση C18 και mrGO μαγνητικά νανοϋλικά παρείχε υψηλή ευαισθησία με ελάχιστα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης έως 0.6 και 1.8 ng/L, αντίστοιχα. Επιπλέον η MSPE αποδείχθηκε μια αποτελεσματική τεχνική για τη μείωση της επίδρασης του υποστρώματος (matrix effect) σε ένα πολύπλοκο δείγμα όπως είναι τα υγρά απόβλητα. Ένα νέο πρωτόκολλο βασισμένο στην εκχύλιση με προσρόφηση σε ύφασμα (FPSE) αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε στο πλαίσιο των πράσινων περιβαλλοντικών απαιτήσεων για τον προσδιορισμό 21 αναδυόμενων ρύπων σε υγρά απόβλητα και νερό βρύσης. Η FPSE σε συνδυασμό με το χρωματογραφικό σύστημα και τον υβριδικό τροχιακό αναλυτή μάζας Orbitrap αξιοποιεί στο έπακρο τα οφέλη αυτής της καινούριας τεχνολογίας προκατεργασίας δείγματος για την προσυγκέντρωση των επιλεγμένων αναλυτών, μαζί με τις δυνατότητες για υψηλή ακρίβεια μάζας του ισχυρού αναλυτή. Ως κύριο προσροφητικό υλικό της FPSE χρησιμοποιήθηκε ένα υφασμάτινο μέσο αποτελούμενο από ένα υπόστρωμα από υαλοΐνες και μία sol-gel επίστρωση πολυμερούς PEG, το οποίο συντέθηκε και χαρακτηρίστηκε. Υπό τις βέλτιστες συνθήκες πραγματοποιήθηκαν πειράματα επικύρωσης για δύο υδατικά υποστρώματα, νερό βρύσης και υγρά επεξεργασμένα απόβλητα και η μέθοδος παρουσίασε εξαιρετική γραμμικότητα, επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα και για τα δυο υποστρώματα. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της μεθόδου κυμάνθηκαν από 3.1-149.4 ng/L και 9.3-447.7 ng L/, τιμές αρκετά χαμηλές αν λάβουμε υπόψιν τον παράγοντα προσυγκέντρωσης αλλά σχετικά υψηλές για έναν συστηματικό περιβαλλοντικό έλεγχο αναδυόμενων ρύπων σε μονάδες επεξεργασίας αποβλήτων. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε η ευρύτατα διαδεδομένη εκχύλιση δια της στερεάς φάσης (SPE) για τον προσδιορισμό και των 33 επιλεγμένων αναδυόμενων ρύπων σε υγρά επεξεργασμένα απόβλητα στο πλαίσιο ενός περιβαλλοντικού ελέγχου διάρκειας ενός έτους. Για τη βελτιστοποίηση, ελέγχθηκαν διαφορετικά αναλυτικά πρωτόκολλα εξετάζοντας έτσι διαφορετικές μικροστήλες εκχύλισης, διαφορετικά pH δείγματος και διαφορετικούς διαλύτες. Η επικύρωση της μεθόδου επέδειξε υψηλή ευαισθησία με ελάχιστα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης έως 0.3 ng/L και 1.0 ng/L, αντίστοιχα. Η εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα νερού από τις εξόδους των ΜΕΥΑ Ιωαννίνων (πόλης και νοσοκομείου) και Αμαλιάδας επιβεβαίωσε την παρουσία 28 ενώσεων από διαφορετικές χημικές και θεραπευτικές κατηγορίες. Ενδεικτικά οι ενώσεις με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις ήταν η ακεσουλφάμη (4862.5 ng/L), η σουκραλόζη (993.8 ng/L) και το σαλικυλικό οξύ (981.8 ng/L). Τα επίπεδα συγκεντρώσεων, η συχνότητα ανίχνευσης, οι χρονικές και εποχιακές διακυμάνσεις ερευνήθηκαν και συγκρίθηκαν με σχετικές μελέτες. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μια προσπάθεια εκτίμησης της παρουσίας των αναδυόμενων ρύπων ανάλογα με τα καταναλωτικά πρότυπα ή τις εκάστοτε ανθρωπογενείς δραστηριότητες. Τέλος η επιβεβαίωση των θετικών ανιχνεύσεων βασίστηκε επίσης σε θραυσματοποίηση MS/MS για την περεταίρω ταυτοποίηση τους.