Μοριακή και γενετική ανάλυση γονιδίων του αγωγού συστήματος και ο λειτουργικός τους ρόλος στην ανάπτυξη του φυτού arabidopsis thaliana
Authors: Ποδιά Βαρβάρα 
Published: September 2021

Το αγωγό σύστημα των φυτών είναι εσωτερικά τοποθετημένο στο φυτικό σώμα και αποτελείται από δύο ξεχωριστούς ιστούς, το ξύλωμα και το φλοίωμα. Η ανάπτυξή του περιλαμβάνει την εξειδίκευση, την εγκαθίδρυση, τη συντήρηση και τη διαφοροποίηση των επιμέρους κυττάρων του. Οι διεργασίες αυτές ξεκινούν με κοινά σηματοδοτικά μονοπάτια κατά την εμφάνιση του καμβίου στην εμβρυογένεση, στο στάδιο του πρώιμου σφαιρικού εμβρύου και στη συνέχεια διαχωρίζονται σε διακριτά μονοπάτια στους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Κατά την τελική διαφοροποίηση που λαμβάνει χώρα μετεμβρυακά, τα ηθμώδη στοιχεία τροποποιούν τα κυτταρικά τους τοιχώματα και υφίστανται επιλεκτική αυτόλυση, ενώ στα τραχειακά στοιχεία επιτελούνται οι διεργασίες της εναπόθεσης δευτερογενούς κυτταρικού τοιχώματος, του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, της αυτόλυσης και της λιγνινοποίησης. Τα ηθμώδη άρθρα περιλαμβάνουν παχυμένα πρωτογενή κυτταρικά τοιχώματα τα οποία αποτελούνται από κυτταρίνη, ημικυτταρίνες, πηκτίνες και πρωτεΐνες ενώ τα δευτερογενή κυτταρικά τοιχώματα των τραχειακών στοιχείων αποτελούνται από κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη που μετατρέπουν τα υδαταγωγά στοιχεία σε συμπαγείς και άκαμπτους σωληνοειδείς σχηματισμούς κατάλληλους για τη μεταφορά νερού. Το μονοπάτι των TDIF-TDR συντονίζει τη διατήρηση του καμβίου και τη διαφοροποίησή του σε κύτταρα φλοιώματος και ξυλώματος.Ο ρόλος του αγωγού συστήματος περιλαμβάνει τη μεταφορά του νερού και των οργανικών και ανόργανων θρεπτικών συστατικών που είναι ζωτικής σημασίας για τα φυτά και την ανάπτυξή τους. Επίσης, ο αγωγός ιστός στηρίζει το φυτικό σώμα και συμμετέχει στην μεταφορά ή/και τη βιοσύνθεση σηματοδοτικών μορίων, μεταξύ των οποίων και σήματα απόκρισης του φυτού σε βιοτική και αβιοτική καταπόνηση. Η χρήση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, που προέρχεται κατά κύριο λόγο από τα παχυμένα δευτερογενή κυτταρικά τοιχώματα του δευτερογενούς ξυλώματος, στη βιομηχανία παραγωγής χαρτιού και βιοκαυσίμων, έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον των ερευνητών εδώ και πολλές δεκαετίες και έχει εντατικοποιήσει τις μελέτες των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη του αγωγού συστήματος και κυρίως τη διαφοροποίηση των τραχειακών στοιχείων. Ενώ οι αρχικές μελέτες περιελάμβαναν in planta αναλύσεις και παρατηρήσεις σε ολόκληρους πολυκύτταρους οργανισμούς και σε in vitro συστήματα κυτταροκαλλιεργειών, οι προσεγγίσεις αυτές είχαν αρκετούς περιορισμούς. Ωστόσο, η ανάπτυξη των μεθοδολογιών της προς τα εμπρός και αντίστροφης γενετικής όπως επίσης και των μεθοδολογιών των μικροσυστοιχιών, έχουν συντελέσει στην ταυτοποίηση αρκετών πρωτεϊνών και στη διαλεύκανση βιοχημικών μονοπατιών και ρυθμιστικών δικτύων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του αγωγού συστήματος. Μεθοδολογίες όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης, η ανοσοκατακρήμνιση συμπλόκων και το σύστημα κυτταροκαλλιέργειας VISUAL, έχουν δώσει σημαντική ώθηση τα τελευταία χρόνια στην καλύτερη κατανόηση των επιμέρους μοριακών μονοπατιών και ρυθμιστικών δικτύων που εμπλέκονται στα στάδια διαφοροποίησης των τραχειακών και ηθμωδών στοιχείων του αγωγού συστήματος. Ωστόσο, παρ’ όλη την πρόοδο που έχει επιτευχθεί στον συγκεκριμένο τομέα, πολλές πτυχές των παραπάνω μηχανισμών παραμένουν ασαφείς και χρήζουν περαιτέρω επιστημονικής έρευνας. Στην παρούσα έρευνα, μελετήθηκε ο αναπτυξιακός ρόλος των γονιδίων VPNB1 και RASD1 από το Arabidopsis thaliana, τα οποία κωδικοποιούν για πρωτεΐνες άγνωστης μέχρι σήμερα λειτουργίας. Τα συγκεκριμένα γονίδια, αν και εκφράζονται στο αγωγό σύστημα, παρουσιάζουν διακριτούς ρόλους σε αυτό. Το VPNB1 κωδικοποιεί για μία armadillo επαναλαμβανόμενη πρωτεΐνη, η οποία εκφράζεται αποκλειστικά στο αγωγό σύστημα και συγκεκριμένα στο κάμβιο και στα διαφοροποιούμενα κύτταρα του ξυλώματος και του φλοιώματος. Πειράματα υποκυτταρικής τοπολογίας έδειξαν ότι η VPNB1 είναι εντοπισμένη σε πυρηνοπλασμικές δομές, που δεν σχετίζονται με τα cajal bodies. Η in silico ανάλυση του υποκινητή αποκάλυψε την παρουσία ρυθμιστικών στοιχείων που απαντούν σε υποκινητές γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση τραχειακών και ηθμωδών στοιχείων, όπως τα SMRE, SNBE, M46RE και E-boxes, ενώ η in planta μελέτη του επιβεβαίωσε τη συμμετοχή των στοιχείων αυτών στην επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου VPNB1. Τα μεταλλάγματα vpnb1 παρουσιάζουν ένα φαινότυπο καθυστερημένης ανάπτυξης και ένα μη κανονικό πρότυπο ξυλώματος, ενώ σε εγκάρσιες τομές της ρίζας παρατηρείται αποδιοργάνωση του προτύπου του κεντρικού κυλίνδρου. Σε αντίθεση, οι σειρές υπερέκφρασης παρουσιάζουν έναν αντίστροφο φαινότυπο αυξημένης ανάπτυξης, που συνοδεύεται από αυξημένη εναπόθεση φλοιωματικών και ξυλωματικών κυτταρικών στοιβάδων. Σε συμφωνία με τα παραπάνω δεδομένα, ποσοτική PCR ανάλυση αποκάλυψε την απορρύθμιση της έκφρασης διαφόρων σημαντικών γονιδίων ρυθμιστών της βιοσύνθεσης του δευτερογενούς τοιχώματος, όπως τα NST1, MYB46, MYB58, IRX5, IRX8 και IRX12, υπογραμμίζοντας την εμπλοκή της VPNB1 στη ρύθμιση της διαφοροποίησης του αγωγού ιστού της ρίζας και του βλαστού. Το γονίδιο RASD1 (RESPONSIVENESS TO ABA SALT AND DROUGHT 1) κωδικοποιεί για μία C2-δομικών μοτίβων CAR-όμοια πρωτεΐνη που εκφράζεται κυρίως στο αγωγό σύστημα του Arabidopsis. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του στην ανάπτυξη του φυτού, εφαρμόστηκε ένας συνδυασμός μοριακών, γενετικών και φυσιολογικών προσεγγίσεων. Τα δεδομένα υπέδειξαν ότι η RASD1 εντοπίζεται στον πυρήνα και στην περιφέρεια του κυττάρου, ενώ τα rasd1 μεταλλάγματα δεν αποκρίνονται στο εξωγενές ABA. Ο μη ευαίσθητος αυτός φαινότυπος στον φυτοαυξητικό ρυθμιστή ΑΒΑ καθιστά τα ολικής απώλειας μεταλλάγματα ευαίσθητα στην καταπόνηση από ξηρασία και ανθεκτικά στην καταπόνηση από NaCl, τόσο κατά τη διάρκεια της φύτρωσης των σπερμάτων όσο και κατά την ανάπτυξη. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η RASD1 εμπλέκεται σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος που σχετίζονται με το ABA, ως ένας πιθανός σημαντικός ρυθμιστής, ο οποίος καθιστά ικανά τα φυτά να ενεργοποιούν μηχανισμούς που σχετίζονται με τη φύτρωση των σπερμάτων και την ανάπτυξη τους σε αβιοτικές καταπονήσεις.