Ανάπτυξη νέας τεχνικής επιφανειακής ενίσχυσης της σκέδασης raman (SERS) για ποσοτικές μετρήσεις ενεργών ουσιών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις
Authors: Μανίκας Αναστάσιος 
Published: January 2014

Η φασματοσκοπία Raman θεωρείται αξιόπιστη μέθοδος χαρακτηρισμού της μοριακής δομής της ύλης. Τελευταία δε καταβάλλεται μεγάλη προσπάθεια να αναδειχθεί και ως μη επεμβατική τεχνική ανίχνευσης ουσιών φαρμακευτικού και βιολογικού ενδιαφέροντος. Επειδή όμως το φαινόμενο Raman είναι ασθενές και τα όρια ανίχνευσης των ουσιών αυτών ιδιαίτερα χαμηλά, η συμβατική φασματοσκοπία Raman ανταποκρίνεται με μεγάλη δυσκολία στις απαιτήσεις μιας μη επεμβατικής τεχνικής. Τα τελευταία χρόνια με την ανακάλυψη της επιφανειακής ενίσχυσης της σκέδασης Raman (Surface Enhanced Raman Scattering) και την ανάπτυξη της ομώνυμης τεχνικής SERS αυξήθηκε η πιθανότητα του φαινομένου κατά τάξεις μεγέθους. Στο πλαίσιο αυτό, έχουν αναφερθεί και μελέτες SERS με ανίχνευση σκέδασης Raman ακόμη και από ένα μόνο μόριο (single molecule detection).Προϋπόθεση όμως ανάπτυξης φαινομένου SERS είναι η γειτνίαση της εξεταζόμενης ουσίας με νανοσωματίδια αργύρου (Ag) ή χρυσού (Au). Τα νανοσωματίδια αυτά χρησιμοποιούνται κυρίως είτε υπό μορφή κολλοειδών διαλυμάτων είτε υπό την μορφή νανοδομημένων επιφανειών. Μια επιπλέον παράμετρος που πρέπει να συνυπολογισθεί ώστε η μέθοδος αυτή να χαρακτηριστεί αναλυτική είναι η δυνατότητα πραγματοποίησης με SERS ποσοτικών μετρήσεων. Στην παρούσα εργασία ως “υπόστρωμα” εμφάνισης του φαινομένου SERS χρησιμοποιήθηκαν κολλοειδή διαλύματα Au και Ag (~2 mL), στα οποία προστίθεντο 25-100 μL διαλύματος της προς ανίχνευσης ουσίας. Η χρησιμοποίηση της γεωμετρίας σκέδασης 90ο, της πλέον ενδεδειγμένης για λήψη φασμάτων Raman από υγρά και κολλοειδή διαλύματα νανομετρικής κλίμακας (10-100 nm), έδωσε τη δυνατότητα ανίχνευσης συγκεντρώσεων ουσιών-στόχων ακόμη και της τάξης των fg/mL. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση μιας κυψελίδας με συνεχή ταλάντωση σε κάθετη ως προς το επίπεδο σκέδασης διεύθυνση (oscillating or shaking cell), επέτρεψε την πραγματοποίηση ποσοτικών μετρήσεων SERS σε συγκεντρώσεις της τάξης των (sub)-ng & (sub)-pg/mL. Η διάταξη αυτή φωταψίας δείγματος και συλλογής σκεδαζόμενης ακτινοβολίας εφαρμόστηκε σε αντικαρκινικά φάρμακα (Novantrone® & Doxorubicin), αντιβιοτικό (Ciproxin®) και βάσεις του DNA. Στην περίπτωση του αντιβιοτικού με ενεργή ουσία το Ciprofloxacin ελήφθησαν ποσοτικά αποτελέσματα σε διαλύματα τεχνητών δακρύων της τάξης των ng/mL, κάτω από την συνολική κλίμακα της μέσης ανασταλτικής πυκνότητας (minimum inhibitory concentration range) του φαρμάκου. Στόχος και φιλοδοξία είναι η τεχνική αυτή να αναδειχθεί ως μια ταχεία μη επεμβατική αναλυτική μέθοδος μέτρησης φαρμακευτικών ή/και βιολογικών ουσιών σε σωματικά υγρά (π.χ. σίελος, δάκρυα, …), για την μελέτη της φαρμακοκινητικής, την έγκαιρη διάγνωση ασθενειών καθώς και τη μελέτη ελεγχόμενης αποδέσμευσης ενεργών ουσιών από πολυμερικές μήτρες σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, έγινε προσπάθεια μελέτης/ανίχνευσης μορίων Ε18 primary rat cortical cells με την χρήση του SERS σε συνθήκες προσομοίωσης ηλεκτροχημικού εμφυτεύματος. Για τον λόγο αυτό σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε ένας μικρο-επωαστής (micro-incubator) που επιτρέπει αφ’ ενός μεν τη συντήρηση των κυττάρων σε περιβάλλον κατάλληλο για τη μελέτη τους (layer of Neurobasal-culture medium with a 95% air & 5% CO₂ gas flow at 37°C), αφ’ ετέρου δε την προσαρμογή του σε χώρο υποδοχής δείγματος ενός φασματοφωτόμετρου μικρο-Raman για τη λήψη φασματοηλεκτροχημικών μετρήσεων Raman/SERS. Το κύριο σημείο ενδιαφέροντος στο οποίο εστιάσαμε στην παρούσα εργασία αναφέρεται στην διερεύνηση ανίχνευσης βασικών/θεμελιωδών μορίων των κυττάρων στo θρεπτικό υγρό του πειράματος για την ταχεία εκτίμηση ενδεχόμενης αποδέσμευσης DNA που θα αντικατόπτριζε την κατάσταση των κυττάρων.