Biochemical studies on blood coagulation mechanism
Authors: Ahmed Salar 
Published: January 2014

Το αιμοστατικό σύστημα είναι ένα ζωτικός μηχανισμός για τον έλεγχο υπερβολικής αιμορραγίας μετά από τραυματισμό στο αγγειακό σύστημα, καθώς και για την πρόληψη μιας κατάστασης υπερπηκτικότητας κατά τη διάρκεια της απόκρισης πήξης. Ένα από τα πιο σημαντικά συστήματα στο ανθρώπινο σώμα είναι το αγγειακό, επειδή όλα τα όργανα και οι ιστοί εξαρτώνται από αυτό για επιβίωση. Το αίμα είναι ένα ζωτικό μέρος της ανθρώπινης φυσιολογίας, ένα σύστημα μεταφοράς που φέρει θρεπτικά και οξυγόνο για να συντηρήσει τα ζωντανά κύτταρα και ταυτόχρονα να διευκολύνει την απομάκρυνση διοξειδίου του άνθρακα και μεταβολικών άχρηστων προϊόντων από τους ιστούς του σώματος. Για τον λόγο αυτό η συντήρηση του αγγειακού συστήματος, που καλείται αιμόσταση, είναι ζωτική για την επιβίωση και είναι η ελεγχόμενη διακοπή της αιμορραγίας, ενώ διατηρεί την ακεραιότητα του αγγείου με ελάχιστη απώλεια αίματος. Για να διασφαλιστεί η συνέχεια των λειτουργιών αυτών, είναι μέγιστης σημασίας η διατήρηση της ροής του αίματος μέσα στο αγγειακό σύστημα με κάθε κόστος. Η σύνθετη διεργασία της πήξης του αίματος οδηγείται μέσω ενός πολύπλοκου ενζυμικού μηχανισμού που αφορά μερικά μονοπάτια μετατροπής ζυμογόνου σε ένζυμο και επιτρέπει μεγάλη εσωτερική ενίσχυση της αντίδρασης. Το τελικό βήμα σε αυτές τις διαδοχικές αντιδράσεις είναι η μετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου σε ένα αδιάλυτο ινικό δίκτυο. Η θρομβίνη παίζει ένα κεντρικό ρόλο και είναι η τελευταία ένωση που ενεργοποιείται. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της πήξης, η θρομβίνη είναι το μόνο ένζυμο που είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην κυκλοφορία του αίματος, όπου συναντά διαφορετικά υποστρώματα. Το πιο κατάλληλο υπόστρωμα είναι το ινωδογόνο που μετατρέπεται σε ινώδες μέσω της θρομβίνης. Επιπλέον, στην κυκλοφορία του αίματος, η θρομβίνη μπορεί να επάγει φυσιολογικές αλλά συχνά και παθολογικές διεργασίες που εξαρτώνται από την ποσότητα της διαθέσιμης θρομβίνης. Η πρωτεάση σερίνης, παράγοντας Xa (FXa), που λειτουργεί κυρίως σε διαδοχικές αντιδράσεις πήξης καταλύει τη μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη στις περιοχές του αγγειακού τραυματισμού. Η περιοχή της πρωτεάσης σερίνης του παράγοντα FXa είναι από τους πιο αποτελεσματικούς στόχους για την ανάπτυξη των άμεσων αντιπηκτικών για τις ανωμαλίες πήξης. Η διεργασία πήξης επιταχύνεται παρουσία ασβεστίου και μιας φωσφολιπιδικής επιφάνειας που συνήθως εμφανίζουν τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, και τελικά σχηματίζει ένα σταθεροποιημένο ινικό δίκτυο που θα διασφαλίσει την επικάλυψη του αιμοπεταλίου μέχρι το αγγειακό τοίχωμα να αποκατασταθεί. Ο παράγοντας van Willebrand (vWF) είναι μια πρωτεΐνη του πλάσματος που εκτελεί δύο βασικές λειτουργίες στην αιμόσταση: μεσολαβεί στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στην επούλωση του τραυματισμένου αγγειακού τοιχώματος που οδηγεί στον σχηματισμό θρόμβων αιμοπεταλίων και την επακόλουθη διακοπή της αιμορραγίας. Επιπλέον, ο vWF προστατεύει τον παράγοντα πήξης VIII (FVIII) από τη γρήγορη πρωτεολυτική αδρανοποίηση. Οι καρδιαγγειακές ασθένειες είναι από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας στα ανεπτυγμένα κράτη. Παρά τις συνεχείς προσπάθειες από πολυάριθμα εργαστήρια ανά τον κόσμο, δεν έχουν προσδιοριστεί αποτελεσματικά θεραπευτικά εργαλεία για ασθένειες όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου και τα εγκεφαλικά επεισόδια. Έτσι σήμερα αυτό το ερευνητικό πεδίο βρίσκεται ακόμα στα πρώτα στάδια της εξέλιξής του. Υπάρχουν ακόμα πολυάριθμα ερωτήματα σε αυτό το επιστημονικό πεδίο τα οποία παραμένουν αναπάντητα. Εφόσον η θρομβίνη και ο FXa έχουν έναν θεμελιώδη ρόλο στον μηχανισμό της πήξης, είναι λογικό ότι ο υπολογισμός των επιπέδων τους, εκτός από πλήθος άλλων σημαντικών πληροφοριών, αποτελεί τον πιο ενδεδειγμένο τρόπο για την μελέτη της αιμοποιητικής λειτουργίας των ασθενών, επομένως βοηθά στην παρακολούθηση της κατάστασης των ασθενών. Παραδείγματος χάριν , αυτή η προσέγγιση προσφάτως έχει χρησιμοποιηθεί τόσο για τον προσδιορισμό πιθανών επιπρόσθετων αιμοστατικών επιδράσεων όσο και για την ταυτοποίηση ασθενών που βρίσκονται σε κίνδυνο επαναλαμβανόμενων φλεβικών θρομβικών εμβολών. Η πληροφορία αυτή καθιστά εξαιρετικά ενδιαφέρουσα την ανάπτυξη μεθόδων για την παρακολούθηση της παραγωγής της θρομβίνης και του FXa in vitro. Σχετικά με αυτόν τον ευρύ τομέα της επιστήμης, στην παρούσα εργασία αναπτύξαμε εξαιρετικά απλουστευμένες μεθόδους για τον προσδιορισμό της παραγωγής θρομβίνης και του FXa, οι οποίες μπορούν να αυτοματοποιηθούν. Εφαρμόστηκε το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο χρωμογόνο υπόστρωμα, εξετάστηκαν πολλαπλές παράμετροι που σχετίζονται με την αντίδραση και βελτιστοποιήθηκαν ώστε να καθιερωθεί μια μη χρονοβόρα ,κατάλληλη και ταχεία μέθοδος ρουτίνας για την αξιολόγηση μεγάλου αριθμού κλινικών δειγμάτων. Οι ρυθμοί παραγωγής θρομβίνης και του FXa συγκρίθηκαν σε δείγματα πλάσματος πριν και μετά την αφαίρεση θρόμβου. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε ο συσχετισμός των τιμών της παραγωγής της θρομβίνης και του FXa. Επιπροσθέτως μελετήθηκαν οι επιδράσεις της φυσικής άσκησης, της συγκέντρωσης των αιμοπεταλίων, του FVIIa και του ιστικού παράγοντα (tissue factor TF) στην παραγωγή της θρομβίνης και του FXa. Επιπλέον προσδιορισμός ρουτίνας αυτού του παράγοντα (θρομβίνη) διεξήχθη σε νοσηλευόμενους διαβητικούς ασθενείς υπό διαφορετικές αντιπηκτικές θεραπείες. Καθώς αυτός ο μηχανισμός πήξης προχωρά σαν μια σειρά συνδεόμενων πρωτεολυτικών αντιδράσεων, τα ένζυμα που δημιουργούνται από αυτές τις διεργασίες δεν είναι διαθέσιμα άμεσα για ποσοτική μέτρηση επειδή αδρανοποιούνται ταχέως από ενδογενώς παραγόμενους αναστολείς πρωτεασών. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος εστιάσαμε στην ανάπτυξη τεχνικών ανοσοαποτύπωσης για να μελετηθεί ο παράγοντας της πήξης FX και η ενεργή του μορφή. Επιπρόσθετα στα πλαίσια αυτής της εργασίας μελετήσαμε την πιθανή λειτουργία της απομονωμένης επικράτειας Α1 του vWF στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στη φυσιολογική διαδικασία της αιμόστασης, ώστε να κατανοηθεί πλήρως ο ιδιαίτερος ρόλος της στην διατήρηση της ακεραιότητας της διαδικασίας της πήξης του αίματος. Γι’ αυτόν τον σκοπό η συγκεκριμένη αμινοξική περιοχή (Α1 επικράτεια) του vWF, κλωνοποιήθηκε σε ευκαρυωτικά και βακτηριακά κύτταρα, απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως βακτηριακή αλλά και ευκαρυωτική πρωτεΐνη.