Μοριακή προσέγγιση δομικών και λειτουργικών στοιχείων του μιτοχονδριακού DNA του Mytilus galloprovincialis
Authors: Κυριακού Ελένη 
Published: September 2021

To φαινόμενο της Διπλής Μονογονεϊκής Κληρονομικότητας (ΔΜΚ) αποτελεί μια ιδιαιτερότητα στο ζωικό βασίλειο. Είναι η μοναδική περίπτωση συστηματικής παραβίασης του γενικού κανόνα της μονογονεϊκής (μητρικής) κληρονόμησης του μιτοχονδριακού DNA. Η ΔΜΚ έχει ανιχνευτεί σε περισσότερα από 50 είδη διθύρων μαλακίων. Στα είδη αυτά υπάρχουν δύο τύποι μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, F και Μ, τα οποία παρουσιάζουν ίδια γονιδιακή οργάνωση αλλά διαφέρουν στη νουκλεοτιδική αλληλουχία σε σημαντικό βαθμό που ποικίλει από είδος σε είδος. Το μητρικό μιτοχονδριακό DNA (τύπος F) μεταβιβάζεται σε ολόκληρο τον θηλυκό απόγονο και κατ’ επέκταση στα αυγά του. Από την άλλη, το πατρικό μιτοχονδριακό DNA (τύπος Μ), το οποίο σύμφωνα με την Αυστηρά Μητρική Κληρονόμηση που παρατηρείται στην πλειοψηφία των ζωικών ειδών, θα έπρεπε να καταστρέφεται στο ζυγωτό,στα είδη με ΔΜΚ όχι μόνο δεν καταστρέφεται, αλλά μεταβιβάζεται συστηματικά στη σπερματική γραμμή του αρσενικού απογόνου και κατ’ επέκταση στα ώριμα σπερματοζωάριά του. Στόχο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο επιτυγχάνεται η εξάλειψη του γονιδιώματος F και η διατήρηση του Μ στη σπερματική γραμμή του αρσενικού ατόμου. Ως πειραματόζωο χρησιμοποιήθηκε το πιο άφθονο είδος με ΔΜΚ στην Ελλάδα, το μύδι Mytilus galloprovincialis. Εκτενής in silico ανάλυση αλληλουχιών μιτοχονδριακού DNA τύπου F και Μ από υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα υπέδειξε μέρος της πρώτης μεταβλητής περιοχής (VD1)της κύριας ρυθμιστικής περιοχής (CR) ως την πιθανότερη θέση αλληλουχιών που εμπλέκονται στην κληρονόμηση του κάθε τύπου γονιδιώματος. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του VD1 διαφέρει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των F και Μ. Το CR βρίσκεται μεταξύ των γονιδίων l-rRNAκαι tRNATyr και έχει τριμερή δομή: μια συντηρητική περιοχή (CD) με δύο μεταβλητές περιοχές (VD1 και VD2) εκατέρωθεν αυτής. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, στο VD1 του γονιδιώματος F του Mytilus υπάρχει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) το οποίο πιθανόν να κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Ένα ORF έχει επίσης εντοπιστεί σύμφωνα με τη βιβλιογραφία και στο VD1 του Μ. Κατά την διάρκεια της παρούσας μελέτης προέκυψαν στοιχεία που συνηγορούν κατά της υπόθεσης της εμπλοκής αυτών των ORF στο μηχανισμό απάλειψης του F από το σπέρμα.Κατά συνέπεια στραφήκαμε στην αναζήτηση πιθανών θέσεων πρόσδεσης πυρηνικών πρωτεϊνικών παραγόντων για τη ρύθμιση της κληρονόμησης των γονιδιωμάτων. Από την insilico ανάλυση αλληλουχιών VD1 από διάφορα είδη Mytilus και σε συνδυασμό με υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, εντοπίστηκε στο γονιδίωμα Μ μια αλληλουχία 152 bp (VD1-M161-312) η οποία πιθανότατα εμπλέκεται στην κληρονόμηση του γονιδιώματος Μ. Υποτέθηκε ότι η αλληλουχία αυτή αποτελεί cis-στοιχείο, δηλαδή θέση πρόσδεσης trans-πρωτεϊνικών παραγόντων. Η υπόθεση αυτή εξετάστηκε με διεξοδική σειρά πειραμάτων Μείωσης Κινητικότητας Συμπλόκου (EMSA). Παρατηρήθηκε σχηματισμός σταθερού συμπλόκου τουVD1-M161-312 που χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής, με πρωτεϊνικό εκχύλισμα γονάδας αρσενικού ατόμου. Σχηματισμός συμπλόκου δεν υπήρξε στην περίπτωση που το πρωτεϊνικό εκχύλισμα προερχόταν από γονάδα θηλυκού ατόμου ή από σωματικό ιστό (πόδι) αρσενικού ή θηλυκού ατόμου. Συνεπώς, πρόκειται για παράγοντα/ες που δρα/ουν φυλο-ειδικά αλλά και ιστο-ειδικά. Η παρουσία δύο ζωνών συμπλόκου στο πείραμα EMSA, υποδηλώνει την πρόσδεση δύο παραγόντων (όπου ο κάθε παράγοντας θα μπορούσε να είναι ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών) στον ανιχνευτή. Δεν είναι γνωστό, ωστόσο, εάν πρόκειται για δύο ίδιους παράγοντες (ομοδιμερές) ή για διαφορετικούς (ετεροδιμερές). Ιδιαίτερο εύρημα αποτελεί επίσης το γεγονός ότι οι παράγοντες του συμπλόκου προέρχονται από το πυρηνικό κλάσμα και όχι από το κυτταροπλασματικό, όπως θα αναμενόταν. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι στο πυρηνικό κλάσμα βρέθηκαν περιπυρηνικά μιτοχόνδρια. Με βάση τη βιβλιογραφία, δεν είναι η πρώτη φορά που τα περιπυρηνικά μιτοχόνδρια διαδραματίζουν έναν ξεχωριστό ρόλο,πέραν της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Ακολούθησαν πειράματα EMSA ανταγωνισμού που επιβεβαίωσαν την ειδικότητα αλλά και τη σταθερότητα του συμπλόκου. Σε προσπάθεια εύρεσης μικρότερου τμήματος του VD1-M161-312 που δίνει όμοια εικόνα σε πείραμα EMSA,προέκυψε το τμήμα VD1-M180-255, το οποίο περιλαμβάνει μια αλληλουχία 26 αδενινών περίπου στο μέσο του, αλληλουχία 27 bp στα αριστερά της και μια αλληλουχία 23 bp στα δεξιά της. Με πείραμα αποτυπώματος DNase Ι βρέθηκε ότι στην αλληλουχία των 23 bp μετά τις αδενίνες, εντοπίζεται το στοιχείο πρόσδεσης του VD1-M161-312. Περαιτέρω πειράματαEMSA για την εξιχνίαση του ρόλου αυτών των επιμέρους αλληλουχιών, οδήγησαν στη διατύπωση του εξής μοντέλου για το σχηματισμό του συμπλόκου: η αλληλουχία των αδενινών κατά πάσα πιθανότητα κάμπτεται, επιτρέποντας έτσι την πρόσδεση της πρώτης υπομονάδας του διμερούς παράγοντα στο στοιχείο πρόσδεσης. Ιδιαίτερος και πρωτότυπος είναι ο ρόλος της αλληλουχίας στα αριστερά των αδενινών, η οποία είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση και συγκράτηση του συμπλόκου. Ακολουθεί και η πρόσδεση της δεύτερης υπομονάδας για την ολοκλήρωση του διμερούς. Ο σχηματισμός του συμπλόκου, κατά πάσα πιθανότητα προστατεύει το γονιδίωμα Μ και κατ’ επέκταση τα πατρικά μιτοχόνδρια από την αποικοδόμηση στο σπέρμα.Θέση πρόσδεσης παραγόντων αναζητήθηκε και στο VD1 του γονιδιώματος F με πείραμα EMSA. Πράγματι σχηματίστηκε σύμπλοκο συγκεκριμένου ανιχνευτή από το VD1 με εκχύλισμα γονάδας αρσενικού ατόμου, το οποίο όμως ήταν αρκετά ασθενές, με μη ικανοποιητική επαναληψιμότητα και ειδικότητα. Επομένως, πιθανότατα το εν λόγω σύμπλοκο να μη σχηματίζεται in vivo. Επίσης, εφόσον το γονιδίωμα F δε διαθέτει αλληλουχία παρόμοια με το VD1-M180-255 του Μ, δεν μπορεί να σχηματίσει αντίστοιχο σύμπλοκο προστασίας και συνεπώς εξαλείφεται από τη σπερματική γραμμή μέσω αποικοδόμησης των μητρικών μιτοχονδρίων. Κατά τη διερεύνηση της λειτουργικότητας των ORF στο VD1 των F και Μ βρέθηκαν πολυαδενυλιωμένα μετάγραφα διαφόρων μεγεθών από την κύρια ρυθμιστική περιοχή. Σε ευρύτερη μελέτη μεταγράφων μη-πρωτεϊνικών γονιδίων, βρέθηκαν επίσης κομμένα, πολυαδενυλιωμένα ή μη μετάγραφα των rRNA γονιδίων, καθώς επίσης και tRNA μετάγραφα πολυαδενυλιωμένα μετά την προσθήκη του CCA. Όλα αυτά τα πολυαδενυλιωμένα μεν, μη λειτουργικά δε, μετάγραφα και απομεινάρια μεταγράφων που προκύπτουν από τον τρόπο που γίνεται η μεταγραφή στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, μαρτυρούν τη δράση αποικοδομοσώματος στα μιτοχόνδρια του Mytilus. Επίσης σε αυτή τη σειρά πειραμάτων απεδείχθη ότι το 3’ άκρο του γονιδίου του l-rRNA βρίσκεται 49 νουκλεοτίδια πριν από το αρχικά ορισμένο άκρο.Επομένως τα 49 νουκλεοτίδια που περισσεύουν, ανήκουν τελικά στο CR, που έπεται του εν λόγω γονιδίου.Tέλος, σε μια πρώτη προσπάθεια εύρεσης των παραγόντων που προσδένονται στοVD1 του γονιδιώματος Μ, εντοπίστηκε με in silico ανάλυση, μια οικογένεια πρωτεϊνών(forkhead proteins), που αναγνωρίζουν το μοτίβο του στοιχείου πρόσδεσης στο VD1.Μάλιστα, ένα μέλος της οικογένειας αυτής, το Foxl2, ανιχνεύτηκε σε παλαιότερη μελέτη, σε ένα δίθυρο μαλάκιο χωρίς ΔΜΚ. Στο είδος αυτό, το Foxl2 εμπλεκόταν στον φυλοκαθορισμό και την ωρίμανση των γονάδων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής έγινε εφικτή η εύρεση ενός τμήματος της αλληλουχίας του Foxl2 στο πυρηνικό γονιδίωμα του Mytilus και αποτελεί μελλοντικό στόχο η διαπίστωση της έκφρασής του και η μελέτη μεταγράφου και πρωτεΐνης