Μοριακός χαρακτηρισμός, μελέτη των εξελικτικών σχέσεων και ανίχνευση ιών της οικογένειας Closteroviridae που σχετίζονται με την ασθένεια μικροκαρπίας της κερασιάς
Authors: Κατσιάνη Ασημίνα 
Published: August 2021

Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της παρουσίας της ασθένειας της μικροκαρπίας της κερασιάς (LChD) στην Ελλάδα και ο χαρακτηρισμός των ιών που σχετίζονται με αυτήν. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε επισκόπηση οπωρώνων κερασιάς και άλλων ειδών πυρηνοκάρπων για την παρουσία των Little cherry virus 1 και -2 (LChV-1 και -2). Στην περίπτωση του LChV-1, οι διαθέσιμες στη βιβλιογραφία δοκιμές RT-PCR παρουσίασαν περιορισμένη ευαισθησία ανίχνευσης και για το λόγο αυτό αναπτύχθηκε μία νέα εστιασμένη RT-PCR δοκιμή η οποία και χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του ιού στο φυτικό υλικό που συλλέχθηκε. Κατά τον έλεγχο δεν διαπιστώθηκε η παρουσία του LChV-2 σε κερασιά και βυσσινιά. Αντίθετα, ο LChV-1 είναι αρκετά διαδεδομένος στην κερασιά, ενώ ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα σε βυσσινιά, δαμασκηνιά και ροδακινιά. Επιπλέον, μελετήθηκε η γενετική διαφοροποίηση του LChV-1 και προσδιορίστηκαν οι εξελικτικοί μηχανισμοί που διαμορφώνουν τη δομή του πληθυσμού του. Για το σκοπό αυτό συλλέχτηκαν απομονώσεις από διάφορους ξενιστές και περιοχές της Ελλάδος και προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες τμημάτων των γονιδίων RdRp, HSP70h και CP. Οι φυλογενετικές αναλύσεις των περιοχών αυτών κατέταξαν τις Ελληνικές και τις κατατεθειμένες απομονώσεις σε τέσσερις διακριτούς κλάδους ανεξάρτητα από τον ξενιστή ή τη γεωγραφική τους προέλευση. Περαιτέρω ανάλυση θετικής επιλογής με τον υπολογισμό της αναλογίας των μη-συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά μη-συνώνυμη θέση (dN) προς τις συνώνυμες αντικαταστάσεις ανά συνώνυμη θέση (dS) έδειξε ότι οι τρεις γονιδιακές περιοχές που μελετήθηκαν υπόκεινται σε ισχυρή πίεση αρνητικής επιλογής. Επιπλέον, προσδιορίστηκε ένα σημείο ανασυνδυασμού στο 3΄ άκρο της RdRp μίας Ελληνικής απομόνωσης (Νο2 ISTO). Μία εκ των απομονώσεων του LChV-1 (G15 3) ήταν γενετικά απομακρυσμένη και στα τρία γονίδια που μελετήθηκαν και επιλέχθηκε να χαρακτηριστεί μοριακά με την πλατφόρμα αλληλούχησης νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS). Η συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας της έδειξε ότι η νέα απομόνωση είναι αρκετά διαφοροποιημένη από τις ήδη γνωστές με την παραλλακτικότητα σε νουκλεοτίδια στο σύνολο του γονιδιώματος της να κυμαίνεται από 26-27%, ενώ παρατηρήθηκαν σε σημαντικό αριθμό θέσεων πολυμορφισμοί τύπου προσθήκης ή/και απαλοιφής. Επιπλέον, προσδιορίστηκε τμήμα μήκους 10.794 νουκλεοτιδίων της αλληλουχίας μίας ακόμη διαφοροποιημένης Ελληνικής απομόνωσης (GR), η οποία παρουσίασε υψηλή εξελικτική συγγένεια με μία δημοσιευμένη απομόνωση. Στις απομονώσεις G15 3 και GR παρατηρήθηκε πολυμορφισμός στις ίδιες ακριβώς θέσεις μέσα στα ΑΠΑ που ενδέχεται να επηρεάζουν το μέγεθος των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών p4, HSP70h και CPm με πρόωρο τερματισμό της έκφρασής τους. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μία δοκιμή πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Real Time RT-qPCR) για την αξιόπιστη ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του LChV-1. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές και ιχνηλάτης Taqman από συντηρημένες περιοχές του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης (CP) και το εύρος ανίχνευσής τους αξιολογήθηκε με τη χρήση γενετικά διαφοροποιημένων απομονώσεων του ιού. Η απόδοση της αντίδρασης που αναπτύχθηκε ήταν 96,7%, ενώ το δυναμικό εύρος του ποσοτικού προσδιορισμού της ήταν 100-108 αντίγραφα RNA. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε για τη μελέτη της διακύμανσης της συγκέντρωσης του ιού στη διάρκεια του έτους σε βλαστό και φύλλα και προσδιορίστηκαν οι καταλληλότερες περίοδοι και φυτικοί ιστοί για δειγματοληψία.