Μιτοχονδριακή στόχευση της ανθρώπινης γλουταμικής αφυδρογονάσης
Authors: Καλέφ-Εζρά Έστερ 
Published: August 2021

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένα πολύ άφθονο ένζυμο της μιτοχονδριακής μήτρας, έχει βρεθεί σε όλους σχεδόν τους ζώντες οργανισμούς. Στον άνθρωπο εμφανίζεται με δύο ισομορφές, την hGDH1 και την hGDH2, οι οποίες έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS) αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53). Το Ν53 έχει την τάση σχηματισμού δύο αμφιπαθών α-ελίκων (α1, α2). Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε σκοπό τον χαρακτηρισμό του πεπτιδίου Ν53 των hGDHs και την μελέτη της εξέλιξης του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών.Στο πρώτο τμήμα της διατριβής, βρήκαμε ότι οι in vitro συντιθέμενες hGDHs μπορούν να εισέλθουν, να κοπούν και να σχηματίσουν εξαμερή σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα με τρόπο που εξαρτάται από το κανάλι TIM23, το ηλεκτροχημικό δυναμικό της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη συγκέντρωση των δισθενών μεταλλικών ιόντων. Bρέθηκε ότι η ισομορφή hGDH2 μπαίνει ή/και αποκόπτεται ταχύτερα στα μιτοχόνδρια από ότι η hGDH1. Με το ερώτημα αν υπάρχουν διαφοροποιήσεις στην μιτοχονδριακή στόχευση στον άνθρωπο λόγω της μεταλλαγής G35R στην hGDH2 που προκύπτει από τον συχνό στον πληθυσμό πολυμορφισμό του γονιδίου GLUD2 c.G103A, μελετήσαμε την επίδρασή της μεταλλαγής αυτής σε μιτοχόνδρια και είδαμε ότι δεν επηρεάζει την είσοδό της hGDH2 στα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Μελετήσαμε το πεπτίδιο Ν53 κατά τμήματα και επίσης ξεχωριστά από την υπόλοιπη hGDH, ώστε να κατανοήσουμε της ιδιότητές του. Πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια έδειξαν ότι το πεπτίδιο Ν53 είναι απαραίτητο για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs και είναι ικανό από μόνο του να οδηγήσει την μη μιτοχονδριακή πρωτεΐνη DHFR στα μιτοχόνδρια. Επίσης, βρέθηκε ότι όταν απουσιάζει η α1 έλικα της hGDH2, η hGDH2 χάνει την ικανότητά της για μιτοχονδριακή στόχευση. Παρατηρήθηκε ότι η α1 της hGDH2, αλλά όχι η α2, μπορεί να οδηγήσει το πεπτίδιο DHFR στα μιτοχόνδρια. Παρατηρήθηκε ότι το συζευγμένο πεπτίδιο α1α2, αλλά όχι το πεπτίδιο α1 από μόνο του, είναι ικανό να οδηγήσει στα μιτοχόνδρια την ώριμη hGDH2. Τα ευρήματά μας είναι σε συμφωνία με πειράματα που έγιναν από τους συνεργάτες μας του Εργαστηρίου Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών με τον επίτοπο EGFP. Ως εκ τούτου, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή στόχευση της hGDH2 στηρίζεται στη συνεργατική δράση των δύο α-ελίκων και ότι η α1 έχει πρωταγωνιστικό ρόλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ηλεκτρικό φορτίο στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου Ν53 της hGDH2 είναι πιο σημαντικό για την μιτοχονδριακή στόχευση της από ότι η αμφιπαθικότητα, η ελικοειδής διαμόρφωση και η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53.Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής, μελετήθηκε η εξέλιξη του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών χρησιμοποιώντας in silico προγράμματα πρόβλεψης για ~170 διαφορετικές πρωτεϊνικές αλληλουχίες GDH. Προβλέφθηκε ότι η εμφάνιση ύπαρξης αποκοπτόμενου MTS πιθανώς να ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα και να εξελίχθηκε σταδιακά σε ένα πολύ ισχυρό και πολυπλοκότερο σινιάλο MTS στα θηλαστικά, με πιθανή εξαίρεση την GDH στα πτηνά και τα ερπετά. Πειραματικές μελέτες σε συνεργασία με το Εργαστήριο Νευρολογίας έδειξαν ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila, C. elegans, D. melanogaster και X. laevis είναι ικανά να στοχεύσουν τις πρωτεΐνες DHFR και EGFP στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την ώριμη hGDH2 στα μιτοχόνδρια.