Zur Chemie des Bilirubins. VIII
Authors: KERPPOLA WILLIAM , LEIKOLA ERKKI 
Published: August 2010

Man hat durch Musterversuche und Versuche mit bilirubinhaltigen Körperflüssigkeiten feststellen können, dass das Bilirubin augenscheinlich im Körper nur in zwei verschiedenen Formen auftritt, nämlich als reines Bilirubin und als dessen Alkalisalz.

Das Bilirubin lässt sich nach folgendem Prinzip aus Körperflüssigkeiten extrahieren. Freies Bilirubin löst sich einfach in Chloroform. Wasserlösliches Alkalibilirubin wird erst mit Hilfe von Säure in Bilirubin verwandelt und kann danach ebenfalls mit Chloroform extrahiert werden. Bei dieser Extraktion sind jedoch gewisse Manipulationen erforderlich. Die Extraktionsmethode umfasst Bilirubinbestimmungen an Galle, Stuhl, Harn und Blutserum.

Das freie Bilirubin wird aus verschiedenen Flüssigkeiten in folgender Weise extrahiert. 1 cm3 Serum wird in ein Zentrifugenröhrchen abpipettiert, mit 2 cm3 Chloroform versetzt, mindestens eine Minute kräftig geschüttelt und dann zentrifugiert. Man entnimmt nun der klaren Chloroformlösung 0.5 cm3 behufs kolorimetrischer Bestimmung. Der Harn wird unfiltriert mit Chloroform im Verhältnis 2:l extrahiert, die Galle in der Verdünnung 1:1000 desgleichen. Für die Fäzes ist eine zehnfache Chloroformmenge nötig.

Das Bilirubin wird in seiner Gesamtheit aus den vorerwähnten Körperflüssigkeiten wie folgt extrahiert. 3 cm3 Galle oder Harn werden mit der gleichen Menge 10 %iger Essigsäure und mit 1.5 cm3 Chloroform versetzt, gründlich geschüttelt und zentrifugiert. Dabei geht der grösste Teil des Bilirubins in das Chloroform über, während ein geringerer Teil sich an der Oberfläche des Chloroforms absetzt. Diese Fällung wird in 0.5 cm3 Eisessig gelöst und mit 1.5 cm3 Chloroform versetzt, worauf man den Eisessig mit reichlich Wasser (etwa 8 cm3) austreibt. Beide Chloroformextrakte enthalten sämtliches in der Untersuchungsflüssigkeit befindliche Bilirubin, und je 0.5 cm3 von beiden Extrakten werden zum Zweck der kolorimetrischen Bestimmung vereinigt. Die Fäzes werden in ähnlicher Weise behandelt. Man löst 0.5 g Fäzes in 3 cm8 Eisessig, fügt 5 cm3 Chloroform und weiter ungefähr 20 cm3 Wasser hinzu, 0.5 cm3 der erhaltenen Chloroformlösung werden zur kolorimetrischen Bestimmung benutzt. In Serum gestaltet sich die Extraktion wegen des hohen Albumingehalts komplizierter. 1 cm3 Serum wird mit 2 cm3 Alkohol geschüttelt und dann zentrifugiert, worauf man die Alkohollösung mit 2 cm3 Chloroform, der gleichen Menge 20 %iger Trichloressigsäure und ca. 10 cm3 Wasser versetzt. Man löst den nach dem Alkoholzusatz entstandenen Niederschlag in 2 cm3 Eisessig und fügt 2 cm3 Chloroform, und Trichloressigsäurelösung und etwa 10 cm3 Wasser hinzu. Alles Serumbilirubin findet sich in den Chloroformlösungen, von welchen je 0.5 cm3 zu der kolorimetrischen Bestimmung benutzt werden.

Das Bilirubin lässt sich somit in seiner Gesamtheit aus Körperflüssigkeiten in Chloroform extrahieren, wo es entweder durch seine Eigenfarbe oder die Azofarbe kolorimetrisch bestimmt werden kann. Durch die Extraktion werden die meisten Farbstoffe der Körperflüssigkeiten wegen ihrer Chloroformunlöslichkeit ausgeschaltet. Soweit bekannt, können jene Flüssigkeiten aber auch chloroformlösliche Farben, sog. Lipochrome, enthalten. In den vorliegenden Versuchen scheint indessen der Farbstoff der Chloroformlösungen in seiner Gesamtheit die Eigenschaften des Bilirubins zu besitzen; demnach wäre die Eigenfarbe des Extraktes als ein quantitatives Mass seines Bilirubingehalts zu betrachten. Die Diazoreaktion wurde bei den Bestimmungen in Chloroform mit Alkoholzusatz ausgeführt.

Um eine exakte Vergleichsbasis für die kolorimetrische Messung zu erhalten, wurde nach Küster reines Bilirubin aus menschlichen Gallensteinen dargestellt. 0.0076 mg dieses Bilirubins geben in 1 cm3 Lösung beinahe dieselbe Farbe wie die entsprechende Menge einer 0.05 % igen Kaliumbichromatwasserlösung. Bei den quantitativen Bestimmungen kam jedoch ein neuer, nach einem von Leikola und Kerppola ausgearbeiteten Prinzip konstruierter Universalkomparator zur Anwendung, der eine durchaus genaue Farbenbestimmung möglich macht. Wie die Messungen darlegen, entspricht eine Komparatoreinheit 0.000 15 mg Bilirubin in 1 cm3 der untersuchten Flüssigkeit, wenn die Eigenfarbe des Bilirubins als Massstab dient, aber 0.00012 mg, wenn die Diazofarbe zur Anwendung kommt. Man benutzte dabei 0.5 cm3 Extrakt, 1.6 cm3 Alkohol und 0.5 cm3 Diazoreagens.

Die quantitativen Versuche haben dargelegt, dass die Eigenfarbe des Extraktes ein besserer und stabilerer Indikator der Bilirubinmenge ist als die Diazofarbe. Dies beruht darauf, dass die Körperflüssigkeiten oft die Diazoreaktion hemmende Stoffe enthalten.

Das Extrakt direkt aus Serum liefert in einem Fall 16 gelbe Komparatoreinheiten, die alkoholische Lösung gibt 56 und die Fällung 11. In den untersuchten Chloroformlösungen befindet sich das Bilirubin in doppelt so stark verdünnter Lösung wie im Serum. Eine Komparatoreinheit entspricht, wie gesagt, in 1 cm3 0.00015 mg Bilirubin, wenn die Eigenfarbe als Massstab dient, in 100 cm3 0.0 15 mg. Das untersuchte Serum enthält somit alles in allem 56 times 11 times 2 × 0.015 = 2.0 mg % Bilirubin. Die Menge des freien Bilirubins beträgt 16 times 2 × 0.015 = 0.5 mg%. Wenn man das freie Bilirubin vbn der Gesamtmenge abzieht, ergibt sich der Wert des Alkalibilirubins = 1.5 mg %.

Tabellen veranschaulichen die mit Hilfe der bescbriebenen Methode aus verschiedenen Körperflüssigkeiten erhaltenen quantitativen Bilirubinmengen.