Νέα βιοδραστικά ανάλογα φυσικών προϊόντων και μελέτη εγκλεισμού τους σε βιοδιασπώμενα πολυμερή
Authors: Καβέτσου Ελένη 
Published: September 2021

Με γνώμονα τους φυσικούς αντιοξειδωτικούς, αντιφλεγμονώδους και αντικαρκινικούς παράγοντες, αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά η ανάπτυξη μιας «χημικής βιβλιοθήκης» με νέα συνθετικά ανάλογα φυσικών προϊόντων της οικογένειας των κουμαρινών. Η «χημική βιβλιοθήκη» αναπτύχθηκε με σκοπό τη μελέτη της σχέσης δομής-βιολογικής δράσης. Τα δομικά τροποποιημένα ανάλογα που παρουσίασαν in vitro βιολογική δράση εγκλείστηκαν σε βιοδιασπώμενους φορείς, προσφέροντας τη δυνατότητα περαιτέρω αξιοποίησης τους.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιτεύχθηκε ο σχεδιασμός, η σύνθεση και ο δομικός χαρακτηρισμός 100 κουμαρινικών παραγώγων, η πλειοψηφία των οποίων είναι νέα στη βιβλιογραφία. Ο δομικός χαρακτηρισμός πραγματοποιήθηκε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού NMR (1Η και 13C NMR) και φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HR-MS).Συγκεκριμένα, σχεδιάστηκαν τέσσερις Σειρές κουμαρινικών παραγώγων Α, Β, Γ και Δ. Η Σειρά Α αποτελείται από ανάλογα της 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνης με υδροξυ- ή διυδροξυ-υποκατάσταση στον αρωματικό δακτύλιο της κουμαρίνης, τα οποία συντέθηκαν μέσω αντίδρασης Pechmann χωρίς τη χρήση οργανικών διαλυτών αλλά παρουσία FeCl3 καθιστώντας τη μέθοδο φιλικότερη προς το περιβάλλον. Η Σειρά εμπλουτίστηκε με δομική τροποποίηση στα υδροξύλια των θέσεων 7- ή/και 5 με την εισαγωγή αλκυλο-ομάδων οδηγώντας στα αλκοξυ- και στα διαλκοξυ-ανάλογά τους. Η Σειρά Β περιλαμβάνει 5-ή 7-ακετυλοξυ-, υδροξυ- και πρενυλοξυ- παράγωγα με κύριο δομικό χαρακτηριστικό το φαινυλο-υποκαταστάτη στη θέση 3 του λακτονικού δακτυλίου της κουμαρίνης. Τα ακετυλοξυ-παράγωγα συντέθηκαν μέσω τροποποιημένης αντίδρασης Perkin-Oglialoro και στη συνέχεια με απομάκρυνση της ακετυλο-ομάδας, χρησιμοποιώντας μονοένυδρη υδραζίνη, συντέθηκαν τα αντίστοιχα 5- ή 7-υδροξυ-3-φαινυλο-κουμαρινικά ανάλογα. Τα πρενυλοξυ-παράγωγα της Σειράς Β προέκυψαν ύστερα από αντίδραση Williamson χρησιμοποιώντας πρενυλο-, γερανυλο- ή φαρνεζυλο βρωμίδιο σε βασικό περιβάλλον. Η Σειρά Γ σχεδιάστηκε συνδυάζοντας τις φαρμακοφόρες δομές της κουμαρίνης και της χαλκόνης οδηγώντας στο σχηματισμό υβριδικής σκελετικής διάταξης κουμαρίνης-χαλκόνης, ενώ η παρουσία του πρενυλοξυ-υποκαταστάτη στην θέση 7 του αρωματικού δακτυλίου της κουμαρίνης ενισχύει τον καινοτόμο χαρακτήρα. Τα υβριδικά μόρια κουμαρινών-χαλκονών που φέρουν πρενυλοξυ-υποκατάσταση συντέθηκαν σε τρία στάδια ύστερα από διερεύνηση των συνθηκών της αντίδρασης αλδολικής συμπύκνωσης. Η Σειρά Δ αποτελείται επίσης από υβριδικά μόρια κουμαρινών-φαινολικών οξέων, η σύνθεση των οποίων πραγματοποιήθηκε προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση του συνδυασμού της αντιοξειδωτικής δράσης των φαινολικών οξέων που συναντώνται σε τρόφιμα και φρούτα και της δραστικότητας των φυσικών κουμαρινών ουμπελιφερόνη (3a) και 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη (3b), στην βιολογική δράση. Τα επιθυμητά υβριδικά μόρια συντέθηκαν ύστερα από ανάπτυξη μεθοδολογίας σύνθεσης τριών σταδίων.Για τα κουμαρινικά παράγωγα που συντέθηκαν μελετήθηκε στη συνέχεια η σχέση δομής – in vitro βιολογικής δράσης. Συγκεκριμένα, τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν για την πιθανή αντιοξειδωτική τους δράση μέσω της ικανότητάς τους να αλληλεπιδρούν με την ελεύθερη ρίζα DPPH και την ικανότητα τους να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση (LP). Η αντιφλεγμονώδης δράση των ενώσεων εκφράστηκε από την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου λιποξυγονάση από σόγια (LOX), ένζυμο το οποίο στον ανθρώπινο οργανισμό σχετίζεται με την παραγωγή προφλεγμονωδών ενώσεων όπως είναι τα λευκοτριένια. Η κυτταροτοξικότητα των νέων κουμαρινών αξιολογήθηκε μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου νευροβλαστώματος (SK-N-SH), μήτρας (HeLa), πνεύμονα (A549) και μαστού (MCF-7). Από την αξιολόγηση προέκυψαν σημαντικά αποτελέσματα για τη σχέση δομής βιολογικής δράσης. Ορισμένα από τα παράγωγα παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, μέσω της ικανότητάς τους να αναστέλλουν την οξείδωση του λινελαϊκού οξέος (80-100%) και αξιόλογη ικανότητα αναστολής της LOX (IC50 10-40 μΜ). Στο μόριο με την καλύτερη αντιφλεγμονώδη δράση (IC50 10 μΜ) πραγματοποιήθηκε μελέτη της μοριακής πρόσδεσής του στη φυτική LOX, υποδεικνύοντας την αλλοστερική δέσμευση του μορίου στην λιποξυγονάση, εκτός του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Επιπλέον, τα κουμαρινικά παράγωγα εμφάνισαν αξιοσημείωτη κυτταροτοξικότητα έναντι κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπινου νευροβλαστώματος και τραχήλου της μήτρας με τιμές IC50 από 1.8 μΜ έως 13.6 μΜ. Σημειώνεται ότι τρία παράγωγα της Σειράς Β που φέρουν 3-φαινυλο-υποκαταστάτη με βρωμο- και μεθοξυ- ομάδες καθώς και ακετυλο- ή φαρνεζυλο-υποκατάσταση παρουσίασαν συνδυασμένη δράση, αποτελώντας προνομιούχες φαρμακευτικές δομές. Τα κουμαρινικά παράγωγα με την καλύτερη βιολογική δράση εγκλείστηκαν με επιτυχία σε επιλεγμένους βιοδιασπώμενους φορείς με σκοπό να τροποποιηθούν οι φυσικοχημικές ιδιότητες τους όπως η υδατοδιαλυτότητα, να ενισχυθεί ή και να βελτιωθεί η βιολογική τους δράση, να μειωθούν ανεπιθύμητες παρενέργειες και να επιτευχθεί στοχευμένη και ελεγχόμενη απελευθέρωση. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν δομικά με χρήση φασματοσκοπίας NMR (1H και 2D NMR) και FT-IR, ως προς το μέγεθος και το ζ-δυναμικό με τη δυναμική σκέδαση φωτός (DLS), θερμικά με τις τεχνικές DSC και TGA και μορφολογικά μέσω της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) και της μικροσκοπίας φθορισμού. Ειδικότερα, στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός των φυσικών κουμαρινών 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη και ωραπτένη καθώς και ορισμένων παραγώγων της Σειράς Β που παρουσίασαν σημαντική αντιφλεγμονώδη και κυτταροτοξική δράση.Η 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη εγκλείστηκε σε τρεις διαφορετικούς φορείς εγκλεισμού, το πολυ(γαλακτικό οξύ) (PLA), το πολυ(γαλακτικό-γλυκολικό οξύ) (PLGA) και τον ολιγοσακχαρίτη β-κυκλοδεξτρίνη. Τα πολυμερικά PLA και PLGA νανοσωματίδια που παρασκευάστηκαν παρουσίασαν μέγεθος της τάξης των 200 nm και 165 nm, αντίστοιχα. Το σύμπλοκο εγκλεισμού της β-κυκλοδεξτρίνης με την 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη που παρασκευάστηκε χαρακτηρίστηκε δομικά και μελετήθηκε το προφίλ απελευθέρωσης της εγκλεισμένης ουσίας από την κοιλότητα της β-κυκλοδεξτρίνης ακολουθώντας το κινητικό μοντέλο Higuchi. Το σύμπλοκο εξετάστηκε στη συνέχεια in vitro παρουσιάζοντας συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση (αναστολή της LP: 100%, αναστολή της δράσης της LOX: IC50 10 μΜ ενώ η 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη (3b) προκαλεί αναστολή της LP: 93% και είναι ανενεργή έναντι του ενζύμου) και αξιοποιήθηκε περαιτέρω με την ενσωμάτωσή του σε φαρμακευτικά δισκία. Συγκεκριμένα, η β-κυκλοδεξτρίνη στο σύμπλοκο αποτέλεσε ένα από τα έκδοχα ενώ η 4-μεθυλο-ουμπελιφερόνη (3b) αποτέλεσε τη δραστική φαρμακευτική ουσία (Active Pharmaceutical Ingredient, API). Προκειμένου να καθοριστούν οι συστάσεις των εκδόχων στα φαρμακευτικά δισκία, αρχικά πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικά πειράματα με μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων των φαρμακευτικών δισκίων και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ο πειραματικός σχεδιασμός (DoE) και ειδικότερα η μέθοδος του πειραματικού σχεδιασμού μίγματος (Mixture DoE) προκειμένου να οριστούν ο αριθμός των φαρμακευτικών δισκίων και οι συστάσεις των εκδόχων σε αυτά. Στόχος του Πειραματικού Σχεδιασμού ήταν η παρασκευή φαρμακευτικών δισκίων και η μελέτη της επίδρασης των συστάσεων των εκδόχων στο ρυθμό απελευθέρωσης της δραστικής ουσίας από τα φαρμακευτικά δισκία. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι ο συνδυασμός του άνυδρου φωσφορικού ασβεστίου με το σύμπλοκο εγκλεισμού β-CD-4-MU λειτουργεί επιβραδύνοντας την ποσοστιαία αθροιστική απελευθέρωση της ουσίας.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιτεύχθηκε επιπλέον η ανάπτυξη της κατάλληλης μεθοδολογίας εγκλεισμού φυτικών εκχυλισμάτων και αιθερίων ελαίων που περιέχουν βιοδραστικά φυσικά προϊόντα προκειμένου να προστατευθούν από την οξείδωση και την αποικοδόμηση, να αυξηθεί η υδατοδιαλυτότητά τους και να επιτευχθεί ελεγχόμενη απελευθέρωση. Το βιοδραστικό εκχύλισμα φύλλων ελιάς, το αιθέριο έλαιο της ρίγανης (Origanum onites L.) και του φλισκουνιού (Mentha pulegium) εγκλείστηκαν, σε νανοσωματίδια πολυ(γαλακτικού οξέος) (PLA), σε β-κυκλοδεξτρίνη (β-CD) και σε μικροσωματίδια ζυμομυκήτων (Saccharomyces cerevisiae), αντίστοιχα. Τα διαφορετικής φύσης νανοσυστήματα που παρασκευάστηκαν χαρακτηρίστηκαν με διάφορες τεχνικές χαρακτηρισμού (1Η 1D & 2D NMR, FT-IR, DLS, DSC, TGA και SEM) και στη συνέχεια μελετήθηκε το προφίλ απελευθέρωσης των ουσιών από τους φορείς ενώ πραγματοποιήθηκε κινητική μοντελοποίηση της απελευθέρωσης.Ο εγκλεισμός του αιθερίου ελαίου από φλισκούνι (Mentha pulegium) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα μη τοξικά κύτταρα ζυμομυκήτων (Saccharomyces cerevisiae) με την ανάπτυξη μιας απλής μεθοδολογίας εγκλεισμού που στηρίζεται στην παθητική διάχυση. Το αιθέριο έλαιο από το φλισκούνι εγκλείστηκε προκειμένου να μειωθεί η πτητικότητά του, να αυξηθεί η υδατοδιαλυτότητά του και να παραταθεί η εντομοκτόνος δράση του. Το αιθέριο έλαιο Mentha pulegium και τα εγκλεισμένα με έλαιο μικροσωματίδια ζυμομυκήτων αξιολογήθηκαν για την εντομοκτόνο δράση τους μέσω τις ικανότητάς τους να δρουν έναντι των αφίδων Μ. Persicae. Από τη μελέτη της απελευθέρωσης προέκυψε ότι το έλαιο Mentha pulegium απελευθερώθηκε σε χρονικό διάστημα 3 ημερών, χρόνος στον οποίο παρατηρήθηκε και το μεγαλύτερο ποσοστό θνησιμότητας των αφίδων Μ. Persicae, καθιστώντας τον εγκλεισμό ελπιδοφόρα τεχνική για την ανάπτυξη νέων φιλικότερων προς το περιβάλλον εντομοκτόνων παραγόντων. Το εκχύλισμα φύλλων ελιάς εγκλείστηκε σε νανοσωματίδια PLA, που εμφάνισαν μέγεθος 246 nm και ικανοποιητική σταθερότητα σε διασπορά. Τα νανοσωματίδια που παρασκευάστηκαν αξιολογήθηκαν για την αντιοξειδωτική τους δράση με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας που παράγεται από τη λουμινόλη με αξιόλογα αποτελέσματα. Από τη μελέτη απελευθέρωσης του εκχυλίσματος από τα πολυμερικά νανοσωματίδια παρατηρήθηκε το φαινόμενο της ταχείας απελευθέρωσης (“burst effect”) τις πρώτες δυο ώρες. Τα σύμπλοκα εγκλεισμού της β-CD με το αιθέριο έλαιο ρίγανης (Origanum onites L.) παρουσίασαν μέγεθος της τάξης των 450 nm και, όπως υπέδειξε η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης, παρασκευάστηκαν μη σφαιρικά νανοσωματίδια διαφορετικών μεγεθών γεγονός που αποδίδεται στην τάση των κυκλοδεξτρινών να συσσωματώνονται. Το προφίλ απελευθέρωσης του ελαίου μελετήθηκε σε διάφορες συνθήκες θερμοκρασίας και pH ακολουθώντας την ίδια τάση και στις εξεταζόμενες περιπτώσεις.