Μελέτη του ρόλου των ιστικών καλλικρεϊνών 7 και 14 στον καρκίνο του παχέος εντέρου
Authors: Δεβετζή Μαρίνα 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου ή ορθοκολικός καρκίνος αποτελεί την τρίτη αιτίαθανάτου από καρκίνο τόσο στους άντρες όσο και στις γυναίκες στις Η.Π.Α. και είναι έναςαπό τους κυρίαρχους τύπους καρκίνου στις δυτικές βιομηχανοποιημένες χώρες. Οιανθρώπινες ιστικές καλλικρεΐνες (KLKs) αποτελούν μια υποοικογένεια 15 εκκρινόμενωνπρωτεασών σερίνης, οι οποίες κωδικοποιούνται από 15 δομικά όμοια γονίδια πουεδράζονται σε στενή διαδοχή στο χρωμόσωμα 19q13.4. Κύρια θέση εντόπισής τους είναιτο κυτταρόπλασμα των αδενικών επιθηλιακών κυττάρων, από όπου εκκρίνονται.Πληθώρα μελετών έχει δείξει ότι η έκφραση των καλλικρεϊνών σε επίπεδο mRNA ή/καιπρωτεΐνης απορρυθμίζεται στον καρκίνο και έχει συσχετιστεί με την πρόγνωση, γι’ αυτόοι καλλικρεΐνες έχουν προταθεί ως νέοι υποσχόμενοι βιοδείκτες καρκίνου ή ως πιθανοίθεραπευτικοί στόχοι.Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 7 (KLK7) είναι μια εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνηςμε ειδικότητα χυμοθρυψίνης. Η μεταγραφή του γονιδίου KLK7 παράγει 4 εναλλακτικάmRNA μετάγραφα, που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την έλλειψη ενδιάμεσωνκωδικών εξωνίων και τη δομή των 5΄ και 3΄ αμετάφραστων περιοχών τους. Το ώριμοένζυμο συμμετέχει στον πρωτεολυτικό καταρράκτη αντιδράσεων κατά τη φυσιολογικήαπολέπιση του δέρματος, αλλά και στη μετάβαση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα και στηνπέψη συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας κατά την καρκινογένεση. Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη 14 (KLK14) είναι εκκρινόμενη πρωτεάση σερίνης μεδιττή ειδικότητα, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης. Το γονίδιο KLK14 μεταγράφεταιπαράγοντας ένα μοναδικό mRNA μετάγραφο. Φυσιολογικά, συμμετέχει στουςπρωτεολυτικούς καταρράκτες της απολέπισης της κεράτινης στιβάδας του δέρματος μαζίμε την KLK7 και της ρευστοποίησης του σπέρματος, αλλά και στην αποδόμησηπρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και στη διάσπαση πρωτεϊνών πουδεσμεύουν τους αυξητικούς παράγοντες τύπου ινσουλίνης (IGFBPs) κατά την ανάπτυξη,τη διήθηση και τη μετάσταση του καρκίνου.Σκοπός της παρούσας Διατριβής είναι η ανάλυση και η κλινική αξιολόγηση τηςέκφρασης των γονιδίων KLK7 και KLK14 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης τόσο σεκαρκινικούς και όσο και σε μη καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου, η μελέτη των mRNAμεταγράφων των δυο γονιδίων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου καιιστούς, καθώς και η διερεύνηση του βιολογικού τους ρόλου στον καρκίνο του παχέοςεντέρου.Η συνολική έκφραση mRNA των γονιδίων KLK7 και KLK14 προσδιορίστηκε ποσοτικάσε καρκινικούς, φυσιολογικούς και αδενωματώδεις ιστούς παχέος εντέρου. H έκφρασηmRNA των KLK7 και KLK14 είναι σημαντικά αυξημένη στον καρκίνο σε σύγκριση με τοφυσιολογικό ιστό (p<0,001 και p=0,035, αντίστοιχα), όπως επίσης και στον καρκίνο σεσύγκριση με τα αδενώματα (p<0,001 και για τα δυο). Τα επίπεδα έκφρασής τους δίνουντη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ καρκινικού και αδενωματώδους ιστού (AUC=0,669 γιατο KLK7 και AUC=0,708 για το KLK14, p<0,001 και για τα δυο), με την έκφραση mRNA τουKLK14 να έχει πιο ισχυρή διακριτική ικανότητα. Επίσης, δείχθηκε ότι τα δυο γονίδια συν-εκφράζονται σε μέτριο βαθμό και στους τρεις τύπους ιστού που εξετάστηκαν(φυσιολογικοί ιστοί rs=0,667, p<0,001; αδενώματα rs=0,373, p=0,001; καρκινώματαrs=0,478, p<0,001), οπότε η έκφρασή τους απορρυθμίζεται συγχρονισμένα στον καρκίνο.H υψηλή έκφραση mRNA του KLK7 και του KLK14 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με τηδιήθηση στους λεμφαδένες (p=0,015 και p=0,019, αντίστοιχα) και με προχωρημένοστάδιο ΤΝΜ της νόσου (p=0,004 και p=0,043, αντίστοιχα). Η υψηλή έκφραση mRNA τουKLK14 σχετίζεται σημαντικά με μικρότερο χρόνο ελεύθερης νόσου (DFS) και ολικής (OS)επιβίωσης (p=0,003 και p=0,016, αντίστοιχα) των ασθενών με καρκίνο, ενώ η υψηλήέκφραση mRNA του KLK7 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά μόνο με συντομότερη DFS επιβίωση (p=0,004). Συνεπώς, η έκφραση mRNA τόσο του KLK7 όσο και του KLK14 θαμπορούσε να αποτελέσει υποψήφιο δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς μεκαρκίνο στο παχύ έντερο, ωστόσο αλλά κανένας από τους δυο πιθανούς δείκτες δενείναι ανεξάρτητος.Προσδιορίστηκε ανοσοϊστοχημικά η έκφραση των πρωτεασών KLK7 και KLK14 σετομές παραφίνης καρκινικών, φυσιολογικών και αδενωματωδών ιστών παχέος εντέρου.Το πρότυπο εντόπισης των KLK7 και KLK14 εμφανίζει κατά βάση μεγάλη ομοιότητα στατρία είδη ιστού που εξετάστηκαν. Δεν παρατηρήθηκε έκφραση των δυο πρωτεασών σταφυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, εκτός από κάποια ασθενή χρώση της KLK14 σεστρωματικά κύτταρα. Αντίθετα, στα νεοπλασματικά αδενικά επιθήλια, αδενωματώδη ήκαρκινικά, και οι δυο πρωτεάσες εντοπίστηκαν με έντονη έκφραση, ιδιαίτερα προς τηναυλική επιφάνεια αλλά και στα εκκρίματα, εικόνα που συμβαδίζει με την εκκριτική τουςφύση. Η κυτταρική εντόπισή τους είναι κυτταροπλασματική, ομοιογενής για την KLK7 καικοκκιώδης για την KLK14. H ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η έκφραση της KLK7 είναισημαντικός ανεξάρτητος δείκτης δυσμενούς πρόγνωσης για την DFS επιβίωση (p=0,02)και οριακά για την OS (p=0,054) των ασθενών, ενώ η έκφραση της KLK14 δεν βρέθηκε νααποτελεί σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την επιβίωση.Τα εναλλακτικά mRNA μετάγραφα των γονιδίων KLK7 και KLK14 ανιχνεύτηκαν σεκαρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου (HT-29, HCT 116, DLD-1, Caco2, LS 180) καισε δεξαμενές cDNA από ιστούς παχέος εντέρου ταξινομημένους με βάση τον ιστολογικότους τύπο. Τα εναλλακτικά μετάγραφα 1, 2 και 3 του KLK7 εκφράζονται στις κυτταρικέςσειρές και στις δεξαμενές cDNA, ενώ το KLK7 μετάγραφο 4 όχι. Η έκφραση των KLK7μεταγράφων 1 και 2, των οποίων η μετάφραση παράγει την ίδια λειτουργική πρωτεΐνη,αυξάνεται στα αδενώματα και στον καρκίνο. Αντίθετα, η έκφραση του KLK7 μεταγράφου3, το οποίο πιθανώς μεταφράζεται σε πρωτεΐνη που δεν διαθέτει ενεργότητα πρωτεάσηςσερίνης, εμφανίζει την υψηλότερη τιμή της στη φυσιολογική δεξαμενή cDNA, ενώ κατάτην πορεία της καρκινικής εξαλλαγής βαθμιαία μειώνεται και τελικά χάνεται, οπότε ίσωςέχει κάποιο φυσιολογικό ρυθμιστικό ρόλο. Το KLK14 mRNA μετάγραφο εκφράζεταιέντονα στις κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, στην οποία εκφράζεται ασθενώς. Στιςδεξαμενές cDNA, η έκφραση του KLK14 mRNA μεταγράφου παρουσιάζει την υψηλότερηαύξησή της στα αδενώματα, ενώ στην πορεία της νόσου εμφανίζεται ελαφρώς αυξημένη σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Ίσως το KLK14 μετάγραφο παίζει ρόλο στα αρχικάστάδια της νεοπλασίας. Στις καρκινικές κυτταρικές σειρές, εκτός της Caco2, και σεορισμένες δεξαμενές cDNA εντοπίστηκε ένα νέο KLK14 mRNA μετάγραφο μικρότερουμήκους από το κλασικό, από το οποίο απουσιάζει το ενδιάμεσο κωδικό εξώνιο 5.Μετά την αποσιώπηση της έκφρασης του KLK7 με τη χρήση μικρώνπαρεμβαλλόμενων μορίων RNA (siRNAs), διαπιστώθηκε μείωση της τάξης του 50% στηνικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου HCT 116 για διήθηση στουπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,016). Ομοίως, μετά από καταστολή της έκφρασης τουKLK14 με τη χρήση siRNAs, διαπιστώθηκε ιδιαίτερα μεγάλη μείωση της τάξης του 80%στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου DLD-1 να διηθούν τουπόστρωμα GFR MatrigelTM (p=0,006). Συνεπώς, η έκφραση των πρωτεασών KLK7 καιKLK14 συμβάλλει στο διηθητικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου invitro ενισχύοντας τον μεταστατικό φαινότυπο, αλλά δεν βρέθηκε να έχει επίπτωση στορυθμό πολλαπλασιασμού τους.Η αποσιώπηση του γονιδιου KLK7 είχε ως αποτέλεσμα μεταβολή στο πρωτεϊνικόπροφίλ των καρκινικών κυττάρων HCT 116, όπως έδειξε η Πρωτεομική ανάλυση. Μεταξύτων πρωτεϊνών με πολύ σημαντική (p<0,01) μείωση της έκφρασής τους μετά τηνκαταστολή του KLK7 βρέθηκαν δυο μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών θερμικού σοκ(heat shock proteins), τα HSP90B1 και HSPA4, τα οποία ενέχονται στην απόκριση σεκυτταρικό στρες, καθώς και ο μεταγραφικός συμπαράγοντας TRIM28. Αντίθετα, τημέγιστη αύξηση έκφρασης εμφάνισε η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη ANP32B και δυο μέλητης οικογένειας των αννεξινών, τα ΑΝΧΑ1 και ΑΝΧΑ3, τα οποία απορρυθμίζονται στονκαρκίνο και έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του όγκου, τη διήθηση και τη μετάσταση.Συμπερασματικά, οι KLK7 και KLK14 έχουν σημαντικά αυξημένη έκφραση στιςνεοπλασίες του παχέος εντέρου, μεταβάλλουν την έκφρασή τους συγχρονισμένα κατάτην πορεία της νόσου και σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο ΤΝΜ και διήθηση στουςλεμφαδένες, αλλά και με την επιβίωση των ασθενών. Μπορούν να συμβάλλουν στηνπρόγνωση, αλλά όχι ως ανεξάρτητοι δείκτες. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα τωνεπιθηλιακών κυττάρων των αδενωμάτων και των αδενοκαρκινωμάτων, από όπουεκκρίνονται και η υπερ-έκφρασή τους ενισχύει σημαντικά το διηθητικό και μεταστατικόδυναμικό των καρκινικών κυττάρων.