Μελέτη καρκινικών κυττάρων μαστού in vitro με βιοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους
Authors: Γεωργούλης Αναστάσιος 
Published: August 2021

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τη συχνότερη κακοήθεια του γυναικείου πληθυσμού παγκοσμίως. Η κυριότερη αιτία θανάτου των ασθενών με καρκίνο του μαστού είναι η ανάπτυξη απομακρυσμένων μεταστάσεων σε θέσεις όπως τα οστά, οι πνεύμονες, το ήπαρ και ο εγκέφαλος. Η μετάσταση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, κατά την οποία τα καρκινικά κύτταρα διηθούν τον περιβάλλοντα συνδετικό ιστό, εισέρχονται στη κυκλοφορία και κατόπιν εξαγγειώνονται και πολλαπλασιάζονται στη νέα θέση.Στα περισσότερα στάδια της μεταστατικής διαδικασίας συμμετέχουν οι ιντεγκρίνες, μια οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων προσκόλλησης που συνδέουν τον κυτταροσκελετό με την ΕΘΟ ή/και γειτονικά κύτταρα μεταξύ τους. Οι ιντεγκρίνες συνιστούν μια οικογένεια που αποτελείται από τουλάχιστον 24 διαμεμβρανικά ετεροδιμερή, τα οποία σχηματίζονται από τη μη ομοιοπολική σύνδεση 18 α και 8 β υπομονάδων. Κάθε ετεροδιμερές ιντεγκρινών παρουσιάζει εξειδίκευση για τους συνδέτες του, σύμφωνα με την οποία οι ιντεγκρίνες ταξινομούνται σε 4 μεγάλες κατηγορίες: εκείνες που συνδέονται με το κολλαγόνο, τις ιντεγκρίνες που αναγνωρίζουν το τριπεπτίδιο RGD (-Arg-Gly-Asp-) στα συστατικά της ΕΘΟ, τις ιντεγκρίνες που συνδέονται με τη λαμινίνη και τέλος τις ιντεγκρίνες που εκφράζονται ειδικά στα λευκοκύτταρα. Μετά τη πρόσδεση στους συνδέτες, το κυτταροπλασματικό τμήμα της β ιντεγκρινικής υπομονάδας συνδέεται με δομικές και σηματοδοτικές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και έχει ως αποτέλεσμα την ομαδοποίηση των ιντεγκρινών, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και την έναρξη σηματοδοτικών μονοπατιών που είναι απαραίτητα για τη κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό, επιβίωση και διαφοροποίηση.Οι περιοχές της πλασματικής μεμβράνης που οι ιντεγκρίνες συνδέουν τον κυτταροσκελετό της ακτίνης με την ΕΘΟ λέγονται θέσεις εστιακής προσκόλλησης. Η κυτταρική μετανάστευση πραγματοποιείται μέσω του συνεχούς πολυμερισμού των ινιδίων ακτίνης στο πρόσθιο άκρο και της ελεγχόμενης αποδιοργάνωσης των θέσεων προσκόλλησης στο οπίσθιο άκρο των καρκινικών κυττάρων. Ένας συνδυασμός στοχευόμενης ενδοκυττάρωσης/ανακύκλωσης και πλευρικής διάχυσης στη πλασματική μεμβράνη οδηγούν τις ιντεγκρίνες στις νεοσχηματιζόμενες θέσεις εστιακής προσκόλλησης στο πρόσθιο άκρο των μεταναστευτικών κυττάρων. Πρόσφατες εργασίες απέδειξαν ότι η ενδοκυττάρωση των ιντεγκρινών από τη πλασματική μεμβράνη στα πρώιμα ενδοσώματα και η επακόλουθη ανακύκλωσή τους στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση και διήθηση.Ειδικότερα, η ιντεγκρίνη ανβ3, γνωστή και ως υποδοχέας βιτρονεκτίνης, προσδένεται στα συστατικά της ΕΘΟ μέσω της αλληλουχίας RGD και έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στη παθοφυσιολογία και εξέλιξη αρκετών μεταστατικών όγκων όπως το μελάνωμα, το γλοίωμα, το καρκίνο των ωοθηκών, το καρκίνο του προστάτη και το καρκίνο του μαστού. Συγκεκριμένα στο καρκίνο του μαστού, η αυξημένη έκφραση της ενεργοποιημένης ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι της μη ενεργοποιημένης, συνδέεται με το πολύ επιθετικό μεταστατικό φαινότυπο και σηματοδοτεί την εκτεταμένη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων.Το ερευνητικό ενδιαφέρον στράφηκε στην ανάπτυξη στρατηγικών μπλοκαρίσματος της ιντεγκρίνης ανβ3 προκειμένου να αντιμετωπιστεί ένας μεγάλος αριθμός ασθενειών. Έτσι λοιπόν, σε in vitro μελέτες χρησιμοποιήθηκαν ανταγωνιστές της ιντεγκρίνης ανβ3 που περιλαμβάνουν RGD πεπτίδια, μικρά μόρια ανταγωνιστές, πεπτιδομιμητικά μόρια, ντισιντεγκρίνες και μονοκλωνικά αντισώματα. Η αλληλουχία RGD αποτελεί μια σημαντική θέση πρόσδεσης των ιντεγκρινών σε αρκετά συστατικά της ΕΘΟ. Τα συνθετικά RGD πεπτίδια μπορούν να αναστείλουν την αλληλεπίδραση των κυττάρων με τα συστατικά της ΕΘΟ που φέρουν την αλληλουχία RGD, η οποία είναι απαραίτητη για τη κυτταρική προσκόλληση και τη διήθηση των ιστών.Σε προκλινικές μελέτες, η αναστολή της λειτουργίας της ιντεγκρίνης ανβ3 κατέστειλε αποτελεσματικά την αγγειογένεση και ανέστειλε την εξέλιξη των όγκων. Αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα οδήγησαν τους ερευνητές και τη βιομηχανία στην ανάπτυξη φαρμάκων αναστολέων της ιντεγκρίνης ανβ3 προκειμένου να πραγματοποιηθούν κλινικές δοκιμές. Όμως, τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών δεν είχαν την επιτυχία που αναμενόταν. Βέβαια, οι περισσότερες προκλινικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση καθιερωμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών λόγω του εύκολου χειρισμού τους, του μεγάλου αριθμού κυττάρων και του υψηλού βαθμού ομοιογένειας που παρουσιάζουν. Ωστόσο, οι κυτταρικές σειρές μπορεί να παρουσιάζουν φαινοτυπικές αποκλίσεις από τον αρχικό όγκο από τον οποίο προήλθαν λόγω των γονοτυπικών και φαινοτυπικών αλλαγών που έχουν υποστεί κατά τη διάρκεια των συνεχών καλλιεργειών. Αντίθετα, οι πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύσσονται άμεσα από τους όγκους έχουν το πλεονέκτημα ότι τα καλλιεργούμενα κύτταρα απομονώνονται απευθείας από την πρωτοπαθή εστία του όγκου και ο φαινότυπος τους αναπαριστά σε σημαντικό βαθμό τη παθοβιολογία του αρχικού όγκου. Επίσης, τα κύτταρα καλλιεργούνται για μικρό χρονικό διάστημα και έχουν ελάχιστες πιθανότητες να υποστούν γονοτυπικούς μετασχηματισμούς. Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να αναπτυχθεί ένα πειραματικό μοντέλο πρωτογενών καλλιεργειών από βιοψίες μαστού για να μελετηθεί η έκφραση της ανβ3 και ο ρόλος της στην προσκολλητική και μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μαστού μετά την επίδραση ενός RGD πεπτιδίου.Πρωτογενείς καλλιέργειες από βιοψίες καρκινωμάτων μαστού και ινοαδενωμάτων αναπτύχτηκαν σε τεχνητό υπόστρωμα βιτρονεκτίνης χρησιμοποιώντας τη μη ενζυμική μέθοδο. Η βιτρονεκτίνη αποτελεί το κύριο μόριο πρόσδεσης και ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης ανβ3 μέσω της RGD αλληλουχίας. Επίσης, εντοπίζεται στην ΕΘΟ των λεμφαδένων που αποτελεί την αρχική θέση μετάστασης στο καρκίνο του μαστού και έχει βρεθεί ότι συσσωρεύεται τοπικά στην ΕΘΟ καρκινωμάτων μαστού. Οι συνθήκες των καλλιεργειών που εφαρμόστηκαν ευνοούν την ανάπτυξη καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων (~80%) και ενός ελεγχόμενου ποσοστού ινοβλαστών (~20%). Η παρουσία ινοβλαστών στις αναπτυσσόμενες πρωτογενείς καλλιέργειες θεωρείται απαραίτητη, καθώς προσομοιάζει καλύτερα το in vivo μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκεκριμένα, οι ινοβλάστες έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν με τα καρκινικά κύτταρα σε όλα τα στάδια εξέλιξης του όγκου και ενισχύουν τη μεταστατική διαδικασία.Στη παρούσα εργασία, για πρώτη φορά, μελετήθηκε η επίδραση του συνθετικού γραμμικού RGD εξαπεπτιδίου GRGDSP α) σε ιστοτεμάχια βιοψιών μαστού που προέρχονται απευθείας από την πρωτογενή εστία των όγκων καθώς και β) σε πλήρως ανεπτυγμένα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν με την τεχνική του ιστοτεμαχίου, με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο ρόλος αυτού του πεπτιδίου στην προσκόλληση και τη κινητικότητα αυτών των κυττάρων μέσω της έκφρασης της ιντεγκρίνης ανβ3 και της κατανομής του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επίσης, μελετήθηκε ο μηχανισμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 σε καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες και η επίδραση του γραμμικού εξαπεπτιδίου GRGDSP στη πορεία αυτή.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνεχής επώαση των ιστοτεμαχίων βιοψιών μαστού για μια εβδομάδα με το RGD πεπτίδιο προκάλεσε πλήρη αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων από τα ιστοτεμάχια, όπως φάνηκε στο SEM. Επίσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα στο ΤΕΜ, τα καρκινικά κύτταρα μαστού συναθροίστηκαν στη περιφέρεια των ιστοτεμαχίων και ο συνδετικός ιστός του στρώματος διατήρησε τη φυσιολογική εμφάνιση του.Η επώαση των καλά ανεπτυγμένων καρκινικών κυττάρων μαστού με το RGD πεπτίδιο για 2h προκάλεσε το στρογγύλεμα και τη συρρίκνωση των κυττάρων, το οποίο συνοδεύτηκε από αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Συγκεκριμένα, σε κάποια κύτταρα, η επώαση με το RGD πεπτίδιο προκάλεσε την αποκόλληση του κεντρικού κυτταρικού σώματος από το υπόστρωμα, αποδιοργανώνοντας τις θέσεις εστιακής προσκόλλησης στις θέσεις αυτές, ενώ τα κύτταρα παρέμειναν προσκολλημένα μέσω των λαμελιποδίων και των φιλοποδίων στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα αυτά, το πρότυπο κατανομής της ανβ3 μετατοπίστηκε στη περιφέρεια υπό τη μορφή γραμμικών συναθροίσεων στις θέσεις που τα κύτταρα παραμένουν προσκολλημένα ενώ αντίστοιχα ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε στο κεντρικό κυτταρικό σώμα και διατήρησε την ινώδη εμφάνισή του στη περιφέρεια των κυττάρων. Στα κύτταρα που η επώαση με το RGD προκάλεσε πλήρη αποστρογγυλοποίηση, η ιντεγκρίνη ανβ3 παρουσίασε ένα διάχυτο πρότυπο κατανομής σε όλη τη κυτταρική επιφάνεια ενώ ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποδιοργανώθηκε πλήρως. Επιπλέον, στα καρκινικά κύτταρα διηθητικού πορογενούς καρκινώματος βαθμού κακοήθειας ΙΙ, το RGD προκάλεσε εντονότερες μορφολογικές επιδράσεις σε σχέση με τα καρκινικά κύτταρα βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ. Αντίθετα, η επώαση με το RGD πεπτίδιο των κυττάρων ινοαδενώματος, στα οποία τα επίπεδα έκφρασης της ανβ3 είναι πολύ χαμηλά, δεν προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία τους και στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 και του κυτταροσκελετού της ακτίνης.Η ανοσοεντόπιση της ιντεγκρίνης ανβ3 με τη μέθοδο του κολλοειδούς χρυσού στο TEM, επιβεβαίωσε την αυξημένη εντόπιση της ιντεγκρίνης ανβ3 στη περιφέρεια των κυττάρων καθώς και την αποδιοργάνωση των θέσεων εστιακής προσκόλλησης μετά την επώαση των κυττάρων με το RGD. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 εντοπίστηκε σε μη καλυμμένα κυτταροπλασματικά κυστίδια αποδεικνύοντας έναν πιθανό ανεξάρτητο της κλαθρίνης μηχανισμό ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης αυτής στα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες. Ο διπλός ανοσοφθορισμός της ιντεγκρίνης ανβ3 με την GTPάση Rab11 καθώς και με τη GTPάση Rab4 έδειξε ότι ο κύριος μηχανισμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 στα καρκινικά κύτταρα μαστού από πρωτογενείς καλλιέργειες φαίνεται να είναι το εκτενές μονοπάτι καθώς στα περισσότερα κυτταροπλασματικά κυστίδια της ιντεγκρίνης ανβ3 παρατηρείται συνεντόπιση με την GTPάση Rab11. Η επώαση των κυττάρων με το RGD πεπτίδιο δε προκάλεσε αλλαγή του μηχανισμού ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3, καθώς συνεχίζει να ακολουθεί το εκτενές μονοπάτι. Παρατηρείται όμως αυξημένος ρυθμός ανακύκλωσης της ιντεγκρίνης ανβ3 στις κυτταρικές προσεκβολές, ο οποίος πιθανόν να εξυπηρετεί στη μεταφορά της στις περιοχές των κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένες στο υπόστρωμα μετά την επίδραση του RGD πεπτιδίου.Τέλος, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ημιποσοτικού RT PCR και του ανοσοστυπώματος κατά Western, η επώαση των καρκινικών κυττάρων μαστού με το RGD πεπτίδιο δεν επηρεάζει την έκφραση της ιντεγκρίνης ανβ3 και συνεπώς η αλλαγή στη κατανομή της ιντεγκρίνης ανβ3 είναι αποτέλεσμα της πλευρικής διάχυσης στην πλασματική μεμβράνη και της διακίνησης της ιντεγκρίνης αυτής.Συμπερασματικά, το μοντέλο των πρωτογενών καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων μαστού που αναπτύχθηκε με τη τεχνική του ιστοτεμαχίου, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σαν ένα πειραματικό μοντέλο για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμεταστατικών θεραπειών στον καρκίνο του μαστού μέσω της αναστολής της ιντεγκρίνης αvβ3.