The DnaB-τ interaction in Bacillus
Authors: Χαρωνίτη Άννα 
Published: November 2022

Η DNA πολυμεράση ΙΙΙ είναι απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA στα βακτήρια. Το ολοένζυμο της DNA πολυμεράσης ΙΙΙ αποτελείται από τρία υποσύμπλοκα. Η κεντρική πολυμεράση έχει μία υπομονάδα με ενεργότητα πολυμεράσης 5′→3′ και μία υπομονάδα με ενεργότητα εξωνουκλεάσης 3′→5′. Ο ολισθαίνων συνδετήρας (β υπομονάδα) σχηματίζει έναν δακτύλιο γύρω από το DNA, προσδένοντας το υπόλοιπο ολοένζυμο της πολυμεράσης στο DNA. O φορτωτής του συνδετήρα (γ,τ,δ,δ,’χ,ψ υπομονάδες ) τοποθετεί τον ολισθαίνοντα συνδετήρα γύρω από το DNA. Στην διχάλα αντιγραφής ο μηχανισμός της καταλύει τη συντονισμένη σύνθεση DNA στον προπορευόμενο και στον καθυστερημένο κλώνο. Η υπομονάδα τ δρα επίσης ως κεντρικός οργανωτής στη διχάλα αντιγραφής συνδέοντας τις δύο πολυμεράσες του πυρήνα στον προπορευόμενο και τον καθυστερούμενο κλώνο και το πριμόσωμα με το ρεπλισώμα μέσω μιας άμεσης αλληλεπίδρασης με την ελικάση. Η υπομονάδα τ μεσολαβεί στη δραστηριότητα της ελικάσης DnaB και κατά συνέπεια, ρυθμίζει το ρυθμό της προόδου του ρεπλισώματος. Επομένως, η αλληλεπίδραση DnaB-τ είναι ζωτικής σημασίας για την οργάνωση και την ταχεία εξέλιξη της διχάλας αντιγραφής του DNA.Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση ελικάσης-τ και να κατανοηθεί καλύτερα το σύστημα αντιγραφής σε θετικά κατά Gram βακτήρια, το γονίδιο Bacillus subtilis dnaX κλωνοποιήθηκε και η πρωτεΐνη τ καθαρίστηκε. Μελέτες πρωτεόλυσης υποδεικνύουν ότι έχει δομική οργάνωση παρόμοια με την αντίστοιχη του E. coli. Η λειτουργική ανάλυση του ενζύμου αποκαλύπτει ότι παρουσιάζει δράση ATPάσης αλλά, σε αντίθεση με αυτή του E. coli τ, δεν ενεργοποιείται in vitro από το DNA.Πειράματα μοριακής διήθησης και υπερφυγοκέντρησης αποκάλυψαν ότι η τ υπομονάδα σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με την Bacillus stearothermophillus DnaB και ότι ένα τ πενταμερές αλληλεπιδρά με ένα εξαμερές DnaB.Πειράματα με το σύστημα δύο υβριδίων στο ζυμομύκητα και τη τεχνική συντονισμού πλασμονίου επιφανείας παρείχαν άμεσες ενδείξεις ότι είναι η καρβοξυτελική περιοχή της τ υπομονάδας που αλληλεπιδρά με την ελικάση. Ταυτοποιήθηκαν επίσης μεμονωμένα αμινοξέα της C-καρβοξυτελικής περιοχής που μπορεί να εμπλέκονται άμεσα στην αλληλεπίδραση DnaB-τ. Η υπομονάδα αλληλεπίδρασης του DnaB εντοπίστηκε επίσης στο C-καρβοξυτελικό του άκρο. Λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι αυξανόμενες ποσότητες της τ αναστέλλουν τη δραστηριότητα της ελικάσης DnaB αλλά όχι τη δράση της ως ΑΤΡάση. Μελέτες με μικροσκοπία ατομικής δύναμης αποκάλυψαν ότι η τ πρωτεΐνη υιοθετεί ένα σχήμα ημισελήνου που μοιάζει με τον φορτωτή του E. coli και οι εικόνες του συμπλόκου τ-ελικάσης μας επέτρεψαν να προτείνουμε ένα μοντέλο για την ευρύτερη αρχιτεκτονική του ρεπλισώματος συμπεριλαμβανομένης της ελικάσης.Τέλος, το μεμονωμένο αμινοξύ L381 ανακαλύφθηκε ότι είναι κρίσιμο για την ακεραιότητα της τ πρωτεΐνης και για την αλληλεπίδρασή της με την ελικάση. Η μετάλλαξη αυτού του αμινοξέος σε αλανίνη και οι ιδιότητες της αντίστοιχης παραγόμενης πρωτεΐνης μελετήθηκαν με πειράματα μοριακής διήθησης, κυκλικού διχρωισμού, διασύνδεσης και τέλος με πειράματα γενετικής αντικατάστασης του γονιδίου wt dnaX με το μεταλλαγμένο γονίδιο L381A dnaX in vivo.Η σύγκριση των ιδιοτήτων μεταξύ των πρωτεϊνών με την μετάλλαξη L381A και την αγρίου τύπου αποκάλυψε τη σημασία του αμινοξέος L381. Αντίθετα, η προλίνη στη θέση 465, η οποία αναφέρθηκε ότι είναι σε θέση μιας σημαντικής θερμοευαίσθητης μετάλλαξης, δεν εμπλέκεται στον σχηματισμό ολιγομερών της τ ή στην αλληλεπίδραση DnaB-τ. Αντίθετα, μπορεί να είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση της τ με την κεντρική πολυμεράση.