Ο ρόλος των ριβοενζύμων στην αποδόμηση του παθολογικού mRNA κολλαγόνου τύπου Ι στην ατελή οστεογένεση
Authors: Λαδά Ζωή 
Published: January 2014

Τις τελευταίες δεκαετίες έχει καταρριφθεί η γενίκευση ότι όλα τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες. Μικρά μόρια RNA έχουν καταλυτικές ιδιότητες και αποδομούν συμπληρωματικό mRNA, που διαθέτει μετάλλαξη η οποία διαφέρει από το φυσιολογικό κατά μία μόνο βάση. Έτσι δεν εκφράζεται το μεταλλαγμένο γονίδιο μιας μονογονιδιακής νόσου, ενώ υπάρχουν και άλλες εφαρμογές όπως οι ιογενείς λοιμώξεις. Τα μικρά αυτά μόρια RNA ονομάστηκαν ριβοένζυμα. Ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να μελετηθούν τα χαρακτηριστικά της δράσης των ριβοενζύμων in vitro και in cellulo και να δημιουργηθεί ριβοένζυμο, που είναι πιο σταθερό ενδοκυττάρια και επομένως πιο αποτελεσματικό. Το μοντέλο της εργασίας ήταν η ατελής οστεογένεση, η οποία είναι μονογονιδιακή, συστηματική νόσος του συνδετικού ιστού και αφορά το κολλαγόνο τύπου Ι. Τα COL1A1 και COL1A2 είναι τα δύο γονίδια που κωδικοποιούν το κολλαγόνο τύπου Ι και η πλειοψηφία των ασθενών με ατελή οστεογένεση έχει μεταλλάξεις στα δύο αυτά γονίδια. Δημιουργήθηκε στόχος με βάση το COL1A1 και τρεις σημειακές μεταλλάξεις στο στόχο αυτό με σκοπό να πλησιάσουμε τις μεταλλάξεις που υπάρχουν πραγματικά στην ατελή οστεογένεση. Στη συνέχεια δημιουργήθηκαν τα ριβοένζυμα που στοχεύουν τις τρεις μεταλλάξεις. Δημιουργήθηκαν επίσης πολυμερή ριβοενζύμων, που έχουν τη δυνατότητα να αυτοκαταλύονται σε μονομερή και να καταλύουν το στόχο. Πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμασίες in vitro σε διαφορετικές θερμοκρασίες και μοριακές αναλογίες. Έπειτα δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές που περιέχουν το στόχο και κάποιο από τα ριβοένζυμα. Δημιουργήθηκε ακόμη ένα τροποποιημένο πολυμερές το οποίο καταλύει το στόχο, χωρίς να αυτοκαταλύεται σε μονομερή. Επομένως διατηρεί το μεγάλο του μέγεθος και ενδεχομένως να είναι πιο σταθερό όσο αφορά την καταστροφή του από ριβονουκλεάσες του κυττάρου και πιο αποτελεσματικό στην αποδόμηση του στόχου. Έγιναν δοκιμασίες για τη μελέτη του χρόνου ημίσειας ζωής των ριβοενζύμων και δοκιμασίες υπολογισμού της αποδόμησης του στόχου. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα in vitro πειράματά μας έδειξαν ότι τα ριβοένζυμα επιτυγχάνουν απολύτως εξειδικευμένη αποδόμηση του στόχου τους, ο οποίος διαφέρει από το φυσιολογικό κατά μία μόνο βάση. Τα ομοπολυμερή (πολυμερή ενός ριβοενζύμου) και τα ετεροπολυμερή (πολυμερή διαφορετικών ριβοενζύμων) διατηρούν την εξειδίκευση της κατάλυσης, όπως ακριβώς τα μονο-ριβοένζυμα, ενώ συγχρόνως εμφανίζουν αυξημένη καταλυτική δράση. Στις in vitro δοκιμασίες φάνηκε πράγματι ότι το ετεροπολυμερές ήταν πιο αποτελεσματικό από τα ομοπολυμερή και από τα αντίστοιχα μονοριβοένζυμα στην κατάλυση του στόχου με τις τρεις μεταλλάξεις. Τα δεδομένα αυτά είναι ενθαρρυντικά για τη χρησιμοποίηση ετεροπολυμερών σε συστήματα με πολλαπλούς στόχους, όπως ο ΗΙV ή άλλοι ιοί. Οποιαδήποτε αντι-ιική στρατηγική που θα βασιζόταν σε ένα μόνο ριβοένζυμο, θα ήταν από την αρχή καταδικασμένη σε αποτυχία, αφού είναι γνωστό πως οι ιοί μεταλλάσσονται συνεχώς. Τα ετεροπολυμερή θα εξασφάλιζαν πιο παρατεταμένη αποτελεσματικότητα. Επίσης σε μονογονιδιακές νόσους όπως η ατελής οστεογένεση, κάποιες μεταλλάξεις είναι πιο συχνές. Θα μπορούσαν λοιπόν ετεροπολυμερή που στοχεύουν αυτές τις συχνές μεταλλάξεις, να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικοί παράγοντες σε μεγάλο αριθμό ασθενών. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια να σχεδιασθούν ριβοένζυμα με μεγαλύτερη ενδοκυττάρια σταθερότητα και αποτελεσματικότητα. Έχουν τροποποιηθεί χημικά και έχουν μελετηθεί διαφορετικές δομές τους, ώστε να επιτευχθεί μεγαλύτερη αντοχή στην καταστροφή από νουκλεάσες και βελτίωση της καταλυτικής δράσης τους. Έτσι στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε όπως αναφέρθηκε, η κατασκευή ενός πολυμερούς που διατηρεί μεγαλύτερο μέγεθος. Στις in vivo δοκιμασίες έγινε φανερό ότι το τροποποιημένο πολυμερές μπορούσε να δρα ενδοκυττάρια με την ίδια εξειδίκευση όπως και το μονομερές. Επίσης το τροποποιημένο πολυμερές είχε μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής από το αντίστοιχο πολυμερές που καταλυόταν σε μονομερή και ήταν έντεκα φορές πιο αποτελεσματικό. Ο περαιτέρω σχεδιασμός πιο σταθερών και δραστικών ριβοενζύμων λοιπόν θα μπορούσε να βασιστεί στην ιδέα που εφαρμόστηκε στην εργασία μας. Συμπερασματικά θα λέγαμε πως είναι σημαντικό να συνεχιστεί η προσπάθεια κατανόησης και βελτίωσης των ριβοενζύμων, ώστε να σκιαγραφηθεί ο ρόλος που μπορεί να έχουν στη βιολογία και στην ιατρική.