Δομικές μελέτες του μηχανισμού συσσωμάτωσης πρωτεϊνών ή πεπτιδίων που σχηματίζουν αμυλοειδή με παθολογική ή / και με λειτουργική σημασία
Authors: Νάση Γεωργία 
Published: December 2022

Οι σφαιρικές υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες για να μπορέσουν να εκτελέσουν τις λειτουργίες τους πρέπει να αποκτήσουν τη φυσιολογική στερεοδιάταξή τους. Ωστόσο, υπό ορισμένες συνθήκες, η διαδικασία δημιουργίας μίας ορθά διπλωμένης πρωτεΐνης αποτυγχάνει, με αποτέλεσμα οι πρωτεΐνες να οδηγούνται σε ένα εναλλακτικό, μη-κανονικό, δίπλωμα της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας. Αυτό έχει συχνά ως συνέπεια τα μη-κανονικά διπλωμένα μόρια να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, οδηγώντας στον σχηματισμό είτε άμορφων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων είτε υψηλά οργανωμένων συσσωματωμάτων. Τα δεύτερα παρουσιάζουν χαρακτηριστικές ιδιότητες και ονομάζονται αμυλοειδή ινίδια. Οι πρωτεΐνες οι οποίες έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν αμυλοειδή ινίδια χαρακτηρίζονται ως πρωτεΐνες με «τάση να σχηματίζουν αμυλοειδή ινίδια» ή «αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες», και αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο πρωτεϊνών. Η ανεξέλεγκτη εξωκυτταρική εναπόθεση ή/και ενδοκυτταρική συσσώρευση των αμυλοειδών ινιδίων σε κύτταρα και ιστούς αποτελεί την αιτία πρόκλησης μίας ποικιλίας ασθενειών, οι οποίες είναι γνωστές ως αμυλοειδώσεις. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αμυλοειδώσεων αποτελούν οι νευροεκφυλιστικές νόσοι του Alzheimer και του Parkinson, οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες και ο διαβήτης τύπου ΙΙ. Εντυπωσιακό είναι ότι ορισμένοι οργανισμοί – από τα βακτήρια έως τον άνθρωπο – εκμεταλλεύονται τις ιδιότητες των αμυλοειδών για να εκτελέσουν ένα πλήθος δομικών και λειτουργικών διεργασιών, απαραίτητων για την επιβίωσή τους. Οι δομές αυτές χαρακτηρίζονται ως προστατευτικά αμυλοειδή και ένας από τους πιο αντιπροσωπευτικούς εκπροσώπους τους είναι το προστατευτικό κάλυμμα των ωοκυττάρων ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο, καθώς δεν παρουσιάζουν καμία μεταξύ τους συσχέτιση ή ομολογία, τόσο σε επίπεδο αλληλουχίας όσο και σε επίπεδο δομής. Ωστόσο, τα αμυλοειδή – ανεξάρτητα από το αν σχηματίζονται in vivo ή in vitro – εμφανίζουν κοινά μορφολογικά χαρακτηριστικά και παρόμοια «γενική» οργάνωση, γνωστή ως «cross-β» δομή. Επιπρόσθετα, φαίνεται ότι δεν έχουν όλες οι περιοχές μίας πολυπεπτιδικής αλυσίδας την ίδια σημασία για τον σχηματισμό των αμυλοειδών ινιδίων. Πιο συγκεκριμένα, πειραματικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι το αμυλοειδογόνο δυναμικό των πρωτεϊνών συγκεντρώνεται σε συγκεκριμένες περιοχές της αμινοξικής αλληλουχίας, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως «επίκεντρα συσσωμάτωσης» (hot-spots) ή «αμυλοειδογόνοι καθοριστές». Τα μικρά αυτά τμήματα καθοδηγούν τη συσσωμάτωση των πρωτεϊνών σε αμυλοειδή, χωρίς να απαιτείται ολόκληρη η πρωτεΐνη να συμμετέχει στον αμυλοειδογόνο πυρήνα των ινιδίων. Βάσει των παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αναζήτηση και πειραματική επιβεβαίωση των αμυλοειδογόνων καθοριστών ή/και ιδιοτήτων ενός ετερογενούς συνόλου πρωτεϊνών, με γνωστά ή άγνωστα αμυλοειδογόνα χαρακτηριστικά. Τα μικρά αμυλοειδογόνα τμήματα εντοπίστηκαν με υπολογιστικές μεθόδους, ενώ η πειραματική επιβεβαίωση των υποψήφιων τμημάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συνόλου βιοφυσικών τεχνικών, όπως είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης, η περίθλαση ακτίνων-Χ, η πολωτική μικροσκοπία, η φθορισμομετρία και η φασματοσκοπία υπερερύθρου, σε ένα εύρος συνθηκών. Επιπλέον, αξιοποιήθηκαν μέθοδοι δομικής βιοπληροφορικής, με στόχο την πρόταση πιθανών τρισδιάστατων μοντέλων πολυμερισμού των υπό μελέτη συστημάτων. Ακόμα, μέθοδοι δομικής βιοπληροφορικής και δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων αξιοποιήθηκαν για να εξηγήσουν τον πιθανό ρόλο της αμυλοειδογονικότητας στη λειτουργία των μελετώμενων πρωτεϊνικών συστημάτων. Η πρώτη περίπτωση πρωτεΐνης που μελετήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής είναι το πεπτίδιο που σχετίζεται με το γονίδιο της καλσιτονίνης (Calcitonin Gene Related Peptide – CGRP), το οποίο απαντάται στον ανθρώπινο οργανισμό με δύο ισομορφές, γνωστές ως αCGRP και βCGRP. Το αCGRP αποτελεί την επικρατούσα μορφή και εμφανίζει υψηλή ομολογία με τις πρωτεΐνες αμυλίνη και καλσιτονίνη, οι οποίες έχουν συσχετιστεί άμεσα με τον σχηματισμό αμυλοειδών ινιδίων και την πρόκληση αμυλοειδώσεων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε το αμυλοειδογόνο δυναμικό τόσο ολόκληρης της αλληλουχίας του αCGRP όσο και τριών υπολογιστικά προσδιορισμένων αμυλοειδογόνων καθοριστών του. Οι δομικές μελέτες ανέδειξαν τις αμυλοειδογόνες ιδιότητες τόσο ολόκληρου του αCGRP όσο και δύο τμημάτων του με αυξημένη τάση για συσσωμάτωση. Η επιβεβαίωση της εγγενούς τάσης για συσσωμάτωση του αCGRP οδήγησε στην πρόταση δύο εναλλακτικών μονοπατιών πολυμερισμού του, τα οποία εμπλέκουν τα πειραματικά επιβεβαιωμένα αμυλοειδογόνα τμήματα ως θέσεις διεπαφής μεταξύ γειτονικών πρωτοϊνιδίων.Ο ανθρώπινος λευκοκυτταρικός χημειοτακτικός παράγοντας 2 (Leukocyte Chemotactic Factor-2 – LECT2) είναι μία πολυλειτουργική πρωτεΐνη, η οποία παράγεται στο ήπαρ των εμβρύων ή ενηλίκων και εκκρίνεται στο αίμα, ήταν η δεύτερη πρωτεΐνη που εξετάστηκε. Πέρα από τις πολυάριθμες λειτουργίες που έχουν αποδοθεί στη συγκεκριμένη πρωτεΐνη, αυτή έχει συσχετιστεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως ο καρκίνος και ο διαβήτης. Ενδιαφέρον είναι ότι σχετικά πρόσφατα συνδέθηκε με έναν συστημικό τύπο αμυλοείδωσης, την ALECT2 αμυλοείδωση. Αν και η παθογένεση της συγκεκριμένης νόσου είναι ακόμα άγνωστη, φαίνεται ότι δεν προκαλείται από τον καταγεγραμμένο, στους πάσχοντες, πολυμορφισμό στη θέση 40 της ώριμης αμινοξικής αλληλουχίας, ο οποίος είναι υπεύθυνος για την αλλαγή του αμινοξικού καταλοίπου ισολευκίνη (Ile) σε βαλίνη (Val). Στην παρούσα διατριβή ανιχνεύτηκαν κρίσιμα τμήματα της αλληλουχίας της LECT2, τα οποία φαίνεται να καθοδηγούν τη διαδικασία ινιδογένεσής της. Παράλληλα, συνδέοντας πειραματικές και υπολογιστικές αναλύσεις, συζητήθηκε η επίπτωση του νουκλεοτιδικού πολυμορφισμού στους ασθενείς με ALECT2 αμυλοείδωση. Τα αποτελέσματα της διατριβής αποκάλυψαν τον αμυλοειδογόνο πυρήνα της ανθρώπινης LECT2 και βοήθησαν στην πρόταση του πιθανού μηχανισμού συσσωμάτωσής της. Παράλληλα, αποσαφήνισαν τον ρόλο του πολυμορφισμού στη συσσωμάτωση της LECT2. Η πρωτεΐνη καθεψίνη D (Cathepsin D – CathD) που ανήκει στην οικογένεια των λυσοσωμικών ασπαρτικών πρωτεασών και αποτελεί ένα από τα ένζυμα που έχουν συσχετιστεί με αρκετές in vivo αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες, υπεύθυνες για την πρόκληση αμυλοειδώσεων, αποτέλεσε την τρίτη προς μελέτη πρωτεΐνη. Μελέτες έχουν δείξει ότι η καθεψίνη D διαθέτει βασικό ρόλο στη φυσιολογική και πλήρη αποικοδόμηση της αμυλοειδούς Α πρωτεΐνης του ορού, ενώ αποτελεί την κύρια πρωτεάση του εγκεφάλου και έχει την ικανότητα να αποικοδομεί την πρωτεΐνη Tau. Η σύνδεση της καθεψίνης D με πρωτεΐνες που σχηματίζουν αμυλοειδή ινίδια in vivo αποτέλεσε το έναυσμα για τη μελέτη του αμυλοειδογόνου δυναμικού της στην παρούσα διατριβή. Η υπολογιστική ανάλυση του αμυλοειδογόνου προφίλ της επέτρεψε τον σχεδιασμό τόσο μικρών τμημάτων όσο και διευρυμένων περιοχών τους. Οι βιοφυσικές μελέτες επιβεβαίωσαν την τάση των τμημάτων αυτών της καθεψίνης D να αυτοσυγκροτούνται σε ινίδια με τα τυπικά χαρακτηριστικά των αμυλοειδών ινιδίων, ενώ ανέδειξαν και τον πολυμορφισμό που αυτά παρουσιάζουν σε ένα εύρος συνθηκών. Επιπλέον, προτάθηκε ο πιθανός λειτουργικός ρόλος των αμυλοειδογόνων τμημάτων της καθεψίνης D στην αλληλεπίδρασή της με τις αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες.Το φυτικό νατριουρητικό πεπτίδιο του Arabidopsis thaliana (Arabidopsis thaliana Plant Natriuretic Peptide – AtPNP-A) διαθέτει μία περιοχή 34 αμινοξικών καταλοίπων, γνωστή ως AtPNP-A36-69, η οποία αποτελεί τμήμα κλειδί για τη βιολογική του λειτουργία. Η συγκεκριμένη περιοχή είναι συντηρημένη μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας των PNPs και έχει μακρινή ομολογία με το ανθρώπινο ANP. Το τελευταίο σχηματίζει αμυλοειδή ινίδια και η εναπόθεσή του προκαλεί την κολπική αμυλοείδωση της καρδιάς. Η καλά μελετημένη αμυλοειδογονικότητα του ανθρώπινου ANP, σε συνδυασμό με τη λειτουργική ομοιότητά του με το ομόλογό του στο A. thaliana, αποτέλεσαν το έναυσμα για τη μελέτη των ανεξερεύνητων ιδιοτήτων πολυμερισμού της περιοχής που αντιστοιχεί στη βιολογικά ενεργή και λειτουργικά συντηρημένη αυτοτελή δομική περιοχή του AtPNP-A. Τα βιοφυσικά αποτελέσματα έδειξαν την ικανότητα του συγκεκριμένου τμήματος να αυτοσυγκροτείται σε αμυλοειδή ινίδια, σε τρεις διαφορετικές συνθήκες pH. Οι πειραματικές παρατηρήσεις σε συνδυασμό με αυτές από το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του AtPNP-A, παρέχουν ενδείξεις για τον πιθανό λειτουργικό ρόλο της αμυλοειδούς κατάστασης του AtPNP-A. Συνολικά, τα δεδομένα πρόσθεσαν άλλο ένα μόριο στην λίστα των φυτικών πρωτεϊνών που σχηματίζουν αμυλοειδή.Η προσκολλητίνη FimH αποτελεί την πιο σημαντική πρωτεϊνική υπομονάδα των ινιδίων τύπου Ι, δηλαδή των προσκολλητικών αποφύσεων των κατά Gram αρνητικών βακτηρίων, καθώς συμβάλλει στην ενδοκυττάρωση των βακτηριακών κυττάρων από τα κύτταρα του ξενιστή, όπου προστατεύονται από το ανοσοποιητικό σύστημα του δεύτερου και τα αντιβακτηριακά φάρμακα, προκαλώντας με αυτόν τον τρόπο χρόνιες λοιμώξεις. Η συνηθέστερη θεραπεία έναντι αυτών είναι η σύντομη χορήγηση αντιβιοτικών. Ωστόσο, τα στελέχη τα οποία είναι ανθεκτικά στα αντιβιοτικά έχουν αυξηθεί τα τελευταία χρόνια, εντείνοντας την ανάγκη για εύρεση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Έτσι, η συγκεκριμένη διατριβή επιχείρησε να αξιοποιήσει το αμυλοειδογόνο δυναμικό της πρωτεΐνης FimH για να προτείνει πιθανά πεπτίδια-αναστολείς. Η υπολογιστική ανάλυση της αλληλουχίας της ανέδειξε πλήθος πιθανών αμυλοειδογόνων καθοριστών, από τους οποίους επιλέχθηκε να μελετηθούν τέσσερα πεπτιδικά τμήματα, τα οποία εντοπίζονται στην περιοχή σύνδεσης της FimH με τους υποδοχείς των κυττάρων του ξενιστή. Τα πειραματικά αποτελέσματα ανέδειξαν την ικανότητα τριών εκ των τεσσάρων περιοχών να αυτοσυγκροτούνται σε αμυλοειδή ινίδια. Σε επόμενο βήμα, έγινε προσπάθεια εντοπισμού των πιο εξειδικευμένων πεπτιδίων-αναλόγων έναντι της πρωτεϊνικής αλληλουχίας της FimH, αναδεικνύοντας δύο αμυλοειδογόνους καθοριστές ως τα καταλληλότερα υποψήφια θεραπευτικά μόρια. Παράλληλα, με τη βοήθεια μεθόδων δομικής βιοπληροφορικής μελετήθηκε η συγγένεια πρόσδεσης των τεσσάρων πεπτιδίων-αναλόγων για την περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης FimH, προτείνοντας έναν επιπλέον τρόπο αξιοποίησής τους. Το χόριο του μεταξοσκώληκα είναι μια πρωτεϊνική δομή που διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στην προστασία του αναπτυσσόμενου εμβρύου από τις περιβαλλοντικές συνθήκες, όσο και στη γονιμοποίηση του ωοκυττάρου. Επιπλέον, το χόριο έχει χαρακτηριστεί ως προστατευτικό αμυλοειδές, ενώ έχει αποδειχθεί η αμυλοειδογονικότητα των πρωτεϊνών που το απαρτίζουν. Κατά την έκκριση των πρωτεϊνών Α και Β του χορίου, ορισμένες αλληλεπιδρούν με τον εαυτό τους και μεταξύ τους, σχηματίζοντας ομο- ή/και ετεροδιμερή. Βάσει των παραπάνω, στην παρούσα διατριβή έγινε προσπάθεια αποσαφήνισης του μηχανισμού δημιουργίας του χορίου, μέσω της μελέτης των αλληλεπιδράσεων των αμυλοειδογόνων τμημάτων της κεντρικής συντηρητικής περιοχής των πρωτεϊνών της οικογένειας Α του χορίου του μεταξοσκώληκα. Για αυτό το λόγο, πραγματοποιήθηκαν αναμείξεις μεταξύ πεπτιδίων-αναλόγων με επιβεβαιωμένα αμυλοειδογόνα χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής υπέδειξαν ότι τα διαφορετικά πεπτίδια-ανάλογα έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, καθώς σχηματίζουν αμυλοειδή ινίδια με διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά από αυτά των μεμονωμένων συστατικών. Τα δεδομένα αυτά έρχονται να επιβεβαιώσουν τον προτεινόμενο ομοδιμερισμό των πρωτεϊνών της οικογένειας Α, καθώς και να προτείνουν το τμήμα που κατά κύριο λόγο καθοδηγεί το δίπλωμα.Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν τη σημασία των μικρών τμημάτων της αλληλουχίας με υψηλό αμυλοειδογόνο δυναμικό για την καθοδήγηση του διπλώματος των πρωτεϊνών στην αμυλοειδή κατάσταση. Οι περιοχές αυτές μπορούν να αξιοποιηθούν για τον μελλοντικό σχεδιασμό τόσο στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι των αμυλοειδώσεων, όσο και αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Παράλληλα, τα δεδομένα που προέκυψαν συνέβαλαν στην αύξηση του καταλόγου των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών τόσο στον άνθρωπο όσο και σε άλλους οργανισμούς.