Ανίχνευση RAS family και BRAF μεταλλάξεων σε κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου με ή χωρίς μετάλλαξη στον πρωτοπαθή όγκο, οι οποίοι υποβάλλονται σε θεραπεία με βιολογικούς παράγοντες
Authors: Ματίκας Αλέξιος 
Published: September 2021

1. Εισαγωγή: Περίπου 40-50% των περιπτώσεων ορθοκολικού καρκίνου (ΟΚΚ) παρουσιάζουν μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS και 5-10% στο γονίδιο BRAF. Η παρουσία ή μη των μεταλλάξεων έχει σημασία: μόνο οι RAS άγριου τύπου (wild type, WT) ασθενείς ωφελούνται από αντι-EGFR θεραπεία. Εντούτοις, η ανάδυση αντίστασης κατά τη θεραπεία με τα αντισώματα αυτά είναι αναπόφευκτη εξαιτίας μιας ποικιλίας μηχανισμών, όπως είναι οι νεοεμφανιζόμενες KRAS μεταλλάξεις. Έτσι, η κατάλληλη επιλογή ασθενών και η έγκαιρη τροποποίηση της θεραπείας ανάλογα με τους μηχανισμούς αντίστασης θα μπορούσε να βελτιστοποιήσει τη θεραπεία των ασθενών. Η μέτρηση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ) έχει σημαντική προγνωστική ισχύ σε ασθενείς με μεταστατικό ΟΚΚ (ΜΟΚΚ), ενώ η γονοτυπική τους ανάλυση παρουσιάζει προβλεπτική ισχύ για τη λήψη αντι-EGFR παραγόντων. Το σύστημα ISET (Rarecells, France) βασίζεται στην απομόνωση βάσει του μεγέθους των κυττάρων και έχει δειχθεί ότι απομονώνει ευρύ πληθυσμό ΚΚΚ από ασθενείς με ΜΟΚΚ. Στόχος της διατριβής ήταν ο γονοτυπικός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET. 2. Ασθενείς και μέθοδοι: Επρόκειτο για μια προοπτική μελέτη παρατήρησης με στόχο την καταμέτρηση και μοριακό χαρακτηρισμό των ΚΚΚ που απομονώνονται από ασθενείς με ΜΟΚΚ και η οποία πραγματοποιήθηκε στην Παθολογική – Ογκολογική κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο ΜΟΚΚ και μη προηγούμενη λήψη θεραπείας για μεταστατική νόσο εντάσσονταν κατόπιν έγγραφης συγκατάθεσης. Δείγματα 10 ml αίματος λαμβάνονταν αμέσως πριν την έναρξη θεραπείας, κατά την στιγμή της ακτινολογικής εκτίμησης της νόσου και κατά τη διαπίστωση εξέλιξης της νόσου και η επεξεργασία με το σύστημα ISET γινόταν εντός 2 ωρών. Μία θέση (spot) από τη μεμβράνη του ISET χρησιμοποιήθηκε για την καταμέτρηση των ΚΚΚ με βάση κυτταρομορφολογικά κριτήρια, χρησιμοποιώντας διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-CD45 αντίσωμα για την αρνητική επιλογή αιμοποιητικών κυττάρων και χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης. Η απομόνωση του DNA γινόταν από 5 spot της μεμβράνης ISET κάθε δείγματος. Στο απομονωθέν γενετικό υλικό ακολούθησε ποσοτική αντίδραση αλυσωτής πολυμεράσης (qPCR) για την ανίχνευση των μεταλλάξεων KRAS εξώνιο 2. 3. Αποτελέσματα: Συνολικά εντάχθηκαν 28 ασθενείς, 15 ήταν WT, 8 είχαν μετάλλαξη στο εξώνιο 2 του KRAS (6 τη μετάλλαξη G12D και 2 τη G12V), 1 στο εξώνιο 4 (Α146Τ), 1 στο γονίδιο NRAS και 3 στο γονίδιο BRAF. Ελήφθησαν 57 δείγματα ΚΚΚ και σε όλα ανιχνεύθηκε τουλάχιστον 1 ΚΚΚ / 1 ml αίματος, με διάμεση τιμή ΚΚΚ=6 (εύρος, 1 – 32) και μέση τιμή 8.22 ΚΚΚ / 1 ml. Tόσο ο αριθμός των συνολικών ΚΚΚ όσο και των αθροίσεων 2 ή περισσοτέρων κυττάρων (διάμεση και μέση τιμή) έχουν αυξητική τάση από την 1η (baseline) στη 2η αιμοληψία, ενώ στη συνέχεια ο αριθμός τους πέφτει ξανά. Μόνο η αύξηση των αθροίσεων ήταν στατιστικά σημαντική. Μεταξύ των ασθενών με WT πρωτοπαθή όγκο, οι 9/15 (60%) είχαν τουλάχιστον 1 θετικό για μετάλλαξη δείγμα, 11/28 (39.2%) σε επίπεδο δειγμάτων. Κατά την αρχική αιμοληψία, 3/11 ασθενείς (27%) βρέθηκε να έχουν μετάλλαξη KRAS στο εξώνιο 2 ενώ κατά την εξέλιξη της νόσου, 3/8 δείγματα ήταν θετικά για την παρουσία μετάλλαξης (37.5%). Από τους 3 αυτούς ασθενείς, σε κανέναν δεν είχε ανιχνευθεί αντίστοιχη μετάλλαξη σε προηγούμενη αιμοληψία και 2 εξ αυτών είχαν λάβει θεραπεία με αντι-EGFR παράγοντα. Οι συχνότερα εντοπιζόμενες μεταλλάξεις ήταν οι G13D και G12C (n=3). Από τα 21 δείγματα ΚΚΚ από ασθενείς με RAS mutated πρωτοπαθείς, διαπιστώθηκε η μετάλλαξη G13D σε 6 δείγματα και από 1 φορά οι G12V και G12C. Τέλος, ήταν διαθέσιμα 6 δείγματα από 3 ασθενείς με τη BRAF V600E μετάλλαξη. Σε κανένα δεν διαπιστώθηκε η μετάλλαξη με τη χρήση αλληλούχισης κατά Sanger. Όμως, σε έναν ασθενή διαπιστώθηκε στο δείγμα εξέλιξης της νόσου η μετάλλαξη STK11 F354L η οποία επίσης ανευρέθηκε στον πρωτοπαθή όγκο του ασθενούς. Η ανίχνευση μετάλλαξης στο baseline δείγμα δεν προέβλεπε την έκβαση των ασθενών. 4. Συζήτηση: Στην παρούσα μελέτη φάνηκε ότι η κινητική των ΚΚΚ μετά από απομόνωση με τη μέθοδο ISET δεν ακολουθούσε την πορεία των ασθενών με ΜΟΚΚ όπως αυτή εκτιμήθηκε με τις απεικονιστικές μεθόδους. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία και με τα αποτελέσματα άλλης ομάδας. Πιθανές ερμηνείες αποτελούν ο μικρός αριθμός των ασθενών που εντάχθηκαν στη μελέτη, η υποκειμενική φύση του χαρακτηρισμού των ΚΚΚ βάσει μορφολογικών κριτηρίων, η αμφίβολη σημασία του ευρέος πληθυσμού ΚΚΚ που απομονώνεται με το ISET και, τέλος, το φαινόμενο της κινητοποίησης των ΚΚΚ από τους όγκους λόγω της χορηγούμενης θεραπείας. Η τρέχουσα μελέτη αποτελεί κατά βάση μία απόδειξη αρχής σχετικά με τη δυνατότητα γονοτυπικής ανάλυσης των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET. Η ανίχνευση μεταλλάξεων αφορούσε τόσο WT όσο και μεταλλαγμένους πρωτοπαθείς όγκους και επιτεύχθηκε σε όλες τις φάσεις της θεραπεία πρώτης γραμμής. Σημειακή μετάλλαξη ανιχνεύσιμη στον πρωτοπαθή όγκο δεν έγινε δυνατό να ανιχνευθεί στα ΚΚΚ. Tο γεγονός αυτό έχει πολλές πιθανές ερμηνείες: μεθοδολογικά θέματα, η ασυμφωνία να οφείλεται στην διαφορετική τεχνική με την οποία έγιναν τα δείγματα των ΚΚΚ με τον πρωτοπαθή όγκο ή, τέλος, η εικόνα αυτή να είναι αντιπροσωπευτική της αληθινής μοριακής ετερογένειας. Παρά τις αδυναμίες της μελέτης, ο μοριακός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET είναι εφικτός και μπορεί να δώσει πληροφορίες σχετικά με τη γενετική ετερογένεια της νόσου και την ανάδυση αντίστασης στην αντι-EGFR θεραπεία πριν αυτή να γίνει κλινικά αντιληπτή. Η προτυποποίηση των χρησιμοποιούμενων μεθόδων είναι απαραίτητο βήμα πριν αυτές αξιολογηθούν σε μεγαλύτερης κλίμακας κλινικές μελέτες.