Developing an individual-based model to study the bacterial denitrification process
Authors:   , Araujo Granda Pablo Alejandro 
Published: July 2023

It is crucial to study the denitrification process driven by bacteria as it is one of the most important environmental processes for several reasons: i) it has an application in the removal of nitrogen (N) from high-N waste materials ii), it is one of the mechanisms to N-fertilizer¿s loss, iii) it contributes to the emissions of gasses with large global warming potential, and iv) it is the mechanism by which the global nitrogen cycle is balanced.
Many models have been developed in the framework of continuous models to deal with the complexity of the denitrification process in order to become predictive models, but some of the assumptions contained in them are not realistic enough in those contexts, and also they have their own constraints and limitations. On the other hand, the researchers have paid more attention to the role of microbial activity with the advance of experimental techniques.
Discrete models, such as individual-based models (IBMs), can be developed and applied to microbial systems due to the fact that they allow representation of some intracellular characteristics regarding the complexity of the micro-organisms, which constitutes a key advantage of this modelling approach in the study of the different biotechnological processes. The IBM is able to incorporate and accommodate the behaviour of denitrifying bacteria, and investigate their metabolism from different and attractive perspectives.
A key factor in modelling the microbial activity is the methodology followed to represent metabolic pathways. A cellular metabolic model could be based on a non-equilibrium thermodynamic approach such as the Thermodynamic Electron Equivalents Model (TEEM), which is developed for biomass yield prediction using the associated standard Gibbs free energies and the bioenergetics growth efficiency between cell anabolism and catabolism.
The main objective of this doctoral thesis is to develop an IBM to study denitrification processes driven by denitrifying bacteria, using TEEM to write microbial metabolic reactions (MMRs) which represent the metabolic pathways as the center of the individual sub-model.
Two new computational models of the INDISIM family, INDISIM-Paracoccus and INDISIM-Denitrification have been designed, implemented on the NetLogo platform, parameterized and calibrated with experimental data to analyze the system dynamics in a bioreactor in batch and continuous culture with denitrifying bacteria growing in it. The bioreactor conditions can be aerobic and/or anaerobic, and the growing media is liquid medium with an electron donor, C-source, N-source, and oxygen and all N-oxides as electron acceptors.
An open access and open source tool has been developed to write MMRs based on TEEM. It is called MbT-tool which stands for Metabolism-based on Thermodynamics. Using MbT-Tool three sets of MMRs have been written, which are the centre of the individual sub-model for INDISIM-Paracoccus and INDISIM-denitrification, representing reactions involved in: i) cellular maintenance, ii) individual mass synthesis, and iii) individual mass degradation to reduce cytotoxic products.
The simulation results obtained with INDISIM-Paracoccus and INDISIM-Denitrification have been compared with experimental data published by Felgate et al. (2012) regarding the growth of Paracoccus denitrificans and Achromobacter xylosoxidans in a bioreactor. According to the statistical analysis of the simulations results, for both denitrifying bacteria tested, the IBMs developed show better adjustments in the assays with electron donor limited than in the assays with electron acceptor limited.

L’estudi del procés de desnitrificació és rellevant, ja que és un important procés mediambiental, a causa que: i) és un dels mecanismes que ocasiona una pèrdua dels fertilitzants de nitrogen (N), ii) és d’utilitat en l’eliminació de N en residus amb un alt contingut en N, iii) contribueix en les emissions de gasos d’alt potencial sobre l’escalfament global, i iv) és el mecanisme pel qual es tanca el cicle del N. S’han desenvolupat diversos models continus per tractar la complexitat del procés de desnitrificació en sistemes ambientals per tal de que puguin ser models amb capacitat predictiva, però alguns dels supòsits que es fan no són prou realistes i tenen les seves mancances i limitacions. D’altra banda, els investigadors estan posant més atenció en el rol que juga l’activitat microbiana, des de que en els darrers anys s’ha desenvolupat i avançat en tècniques experimentals de manera important. Models discrets, com els models basats en l’individu (IBMs), poden ser desenvolupats i utilitzats en sistemes microbians ja que permeten la representació d’algunes característiques intracel·lulars atenent a la complexitat dels microorganismes, cosa que resulta clau a l’hora d’abordar aquest nou enfoc per l’estudi de diversos processos biotecnològics. Els IBMs són capaços d’incorporar el comportament de les bactèries desnitrificants i d’investigar el seu metabolisme des de perspectives diferents. Un factor clau en la modelització de l’activitat microbiana és la metodologia seguida per a representar les rutes metabòliques. Un model de metabolisme cel·lular podria estar basat en l’enfoc de la termodinàmica de no-equilibri, com per exemple el denominat Model Termodinàmic d’Electrons Equivalents (TEEM). TEEM va ser desenvolupat per predir el rendiment de la biomassa utilitzant les energies lliures estàndards de Gibbs associades i l’eficiència bioenergètica de creixement entre els processos anabòlics i catabòlics de la cèl·lula. L’objectiu principal d’aquesta tesis doctoral és desenvolupar un IBM per l’estudi dels processos de desnitrificació duts a terme per bactèries desnitrificants, mitjançant l’ús del TEEM per descriure les reaccions metabòliques microbianes (MMRs) que representen les vies metabòliques i són el centre del sub-model individual. Dos nous models computacionals de la família d’INDISIM, l’INDISIM-Paracoccus i l’INDISIM-Denitrification han estat dissenyats, implementats en la plataforma de NetLogo, i parametritzats i calibrats amb dades experimentals per analitzar la dinàmica d’un sistema format per bactèries desnitrificants en un bioreactor en un cultiu tancat i/o continu, en condicions aeròbies i/o anaeròbies. El medi de cultiu és líquid i conté un donador d’electrons, oxigen i òxids de N com acceptors d’electrons, una font de carboni i una de N. S’ha creat una eina d’accés i codi obert per escriure les MMRs basades en el TEEM i és anomenada MbT-tool (Metabolisme basat en la Termodinàmica). Utilitzant MbT-tool es poden descriure tres grups de MMRs, que seran el centre del sub-model individual per l’INDISIM-Paracoccus i l’INDISIM-denitrification, i que són reaccions involucrades en: i) el manteniment cel·lular, ii) la síntesi individual de massa, i iii) la degradació individual de massa per reduir els productes citotòxics. Els resultats de simulació obtinguts amb INDISIM-Paracoccus i INDISIM-Denitrification han estat comparats amb les dades experimentals publicades per Felgate et al. (2012), sobre el creixement de Paracoccus denitrificans i Achromobacter xylosoxidans en un bioreactor. Segons l’anàlisi estadístic dels resultats, per les dues bactèries desnitrificants amb les quals s’ha testat, els IBMs desenvolupats mostren millors ajustos en els assajos amb donadors d’electrons limitants que en els assajos amb acceptors d’electrons limitants. El desenvolupament d’un IBM i la seva aplicació amb cert nivell de detall i complexitat intracel·lular constitueix una avantatge per la investigació de la desnitrificació bacterià.

Es relevante estudiar la desnitrificación ya que es un importante proceso medioambiental, debido a que: i) es uno de los mecanismos que explica la pérdida de fertilizantes de nitrógeno (N), ii) tiene aplicación en la remoción de N proveniente de residuos con alto contenido de N, iii) contribuye a las emisiones de gases que presentan gran potencial de calentamiento global, y iv) es el mecanismo por el cual se balancea el
ciclo del N.
Varios modelos han sido desarrollados usando el enfoque de la modelización continua para hacer frente a la complejidad del proceso de la desnitrificación, con la finalidad de obtener modelos predictivos, pero algunas de sus suposiciones no son suficientemente reales en este contexto, además estos modelos tienen sus propias restricciones y limitaciones. Por otro lado, los investigadores están prestando más atención al rol de la actividad microbiana, desde que en los últimos años se han desarrollado y avanzado las técnicas experimentales de manera importante.
Modelos discretos, como los modelos-basados en el individuo (IBMs), pueden ser desarrollados y aplicados a sistemas microbianos ya que permiten representar algunas de las características intracelulares relacionadas con la complejidad de los microorganismos, lo cual constituye una ventaja clave de este enfoque de modelización en el estudio de diversos procesos biotecnológicos. El IBM es capaz de incorporar y adaptar el
comportamiento de las bacterias desnitrificantes e investigar su metabolismo desde perspectivas distintas. Un factor clave para modelizar la actividad microbiana es la metodología utilizada para representar las rutas metabólicas. Un modelo metabólico celular puede estar basado en la termodinámica del no equilibrio como el Modelo Termodinámico de Electrones Equivalentes (TEEM), el cual está desarrollado para la predicción del rendimiento de la biomasa usando las energías estándar de Gibbs junto con la eficiencia bioenergética de crecimiento entre anabolismo y catabolismo celular.
El objetivo principal de esta tesis doctoral es desarrollar un IBM para estudiar la desnitrificación bacteriana, usando el TEEM para escribir reacciones metabólicas microbianas (MMRs) las cuales representan a las rutas metabólicas y son el centro del sub-modelo individual. Dos nuevos modelos computacionales de la familia INDISIM, el INDISIM-Paracoccus y el INDISIM-Denitrification, han sido diseñados, implementados en la plataforma NetLogo, parametrizados y calibrados con datos experimentales para estudiar la dinámica del crecimiento de las bacterias desnitrificantes dentro de un bioreactor en cultivos cerrados y continuos, en condiciones aerobias o anaerobias. El medio de cultivo es líquido y contiene un donador de electrones, oxígeno y los óxidos de N como aceptores de electrones, una fuente de carbono y una fuente de N. Una
herramienta de acceso libre y código abierto ha sido desarrollada para escribir las MMRs basadas en TEEM y es llamada MbT-Tool (Metabolismo basado en la Termodinámica).
Utilizando MbT-Tool se pueden escribir tres grupos de MMRs que han sido el centro del sub-modelo individual para INDISIM-Paracoccus e INDISIM-Denitification, y que representan las reacciones involucradas en: i) el mantenimiento celular, ii) la síntesis de masa individual, y iii) la degradación de la masa individual para reducir productos citotóxicos.
Los resultados de simulación obtenidos con INDISIM-Paracoccus e INDISIMDenitrification han sido comparados los datos experimentales publicados por Felgate et al. (2012) relacionados con el crecimiento de Paracoccus denitrificans y Achromobacter xylosoxidans dentro de un bioreactor. De acuerdo con el análisis estadístico de los resultados de simulación, los IBMs desarrollados muestran mejores ajustes para los
experimentos con donador de electrones limitado que para los ensayos con aceptor de electrones limitado. El desarrollo y aplicación de IBMs con algunos detalles y complejidad intracelular, constituyen una ventaja clave en la investigación y comprensión de los diferentes pasos de la desnitrificación bacteriana.