Ανάπτυξη καινοτόμων νανομορφών για στοχευμένη μεταφορά θεραπευτικών ή/και απεικονιστικών ουσιών στον εγκέφαλο
Authors: Κανναβού Μαρία 
Published: December 2021

Η μεταφορά θεραπευτικών και απεικονιστικών ουσιών στον εγκέφαλο, είναι σε αρκετές περιπτώσεις αδύνατη, λόγω της ύπαρξης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ). Η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος έχει αρχίσει προσφάτως να δείχνει σημάδια επιτυχίας. Λόγω της δυσκολίας αντιμετώπισης των νευροεκφυλιστικών νόσων και της επιτακτικής ιατρικής ανάγκης που δεν έχει ως σήμερα αντιμετωπιστεί επιτυχώς, γίνεται μεγάλη προσπάθεια προς αυτή την κατεύθυνση.Πρόσφατα έχει αναδειχτεί η εξαιρετική ικανότητα ορισμένων κυστιδίων που παράγονται από τα κύτταρα (εξωκυτταρικά κυστίδια ή εξωσώματα) να μεταφέρουν επιλεκτικά το φορτίο τους σε άλλα κύτταρα που βρίσκονται πολύ μακριά από τα κύτταρα προέλευσης. Ειδικά τα καρκινικά κύτταρα παράγουν εξωσώματα με πολύ καλό οργανοτροπισμό, ο οποίος έχει αναδειχτεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση.Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών μεταφοράς καθώς και των σημαντικών συστατικών που καθορίζουν την οργανοτροπική δράση κυτταρικών κυστιδίων, ώστε να αποτελέσουν τη βάση για τη μελλοντική ανάπτυξη καινοτόμων μορφών λιποσωμάτων με αυξημένη ικανότητα στόχευσης του εγκεφάλου.Στην παρούσα διατριβή έγινε μελέτη της ικανότητας στόχευσης του εγκεφάλου από κυτταρικά κυστίδια (CVs) που προέρχονται από διαφορετικούς τύπους κυττάρων (φυσιολογικά και καρκινικά) και έχουν διαφορετική ιστική προέλευση, ώστε να εντοπιστούν οι βέλτιστες συστάσεις για στόχευση του εγκεφάλου.Αρχικά, δοκιμάστηκε η απομόνωση κυτταρικών κυστιδίων από φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εγκεφάλου hCMEC/D3 και από καρκινικά κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10. Τα κυστίδια αυτά χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το δείκτη πολυδιασποράς και το ζ-δυναμικό, μελετήθηκε ο ρόλος των κυττάρων προέλευσης των CVs στη δυνατότητά τους να διευκολύνουν τη μεταφορά του περιεχομένου τους σε κύτταρα καθώς και η δυνατότητα τροποποίησής τους για βελτίωση της φαρμακοκινητικής τους. Τα κυστίδια αυτά είναι μη τοξικά και έχουν μέγεθος 100-200nm με αρνητικό επιφανειακό φορτίο. Απ' τα αποτελέσματα είναι εμφανής η αυξημένη αλληλεπίδραση των ομόλογων CVs με τα κύτταρα εγκεφάλου (hCMEC/D3) in vitro αλλά και in vivo επιτυγχάνοντας συσσώρευση μεγαλύτερωνποσότητων στον εγκέφαλο ποντικών. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των μέσων καλλιέργειας στη ικανότητα στόχευσης των CVs και αποδείχτηκε ότι το ειδικό θρεπτικό μέσο για τα hCMEC/D3 (EndoGRO) οδηγεί στη δημιουργία CVs με μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης του εγκεφάλου, σε σύγκριση με CVs μεγαλωμένα στο κοινό θρεπτικό μέσο κυττάρων RPMI. Ο εμπλουτισμός των CVs με χοληστερόλη για αύξηση της ακεραιότητας των κυστιδίων, ήταν δυνατός μόνο σε μεμβράνες με χαμηλή περιεκτικότητα χοληστερόλης (hCMEC/D3 CVs). Η προσθήκη PEG και χοληστερόλης στην επιφάνεια των CVs διευκόλυνε τη μεταφορά των ομόλογων CVs στον εγκέφαλο. Στο πλαίσιο της τροποποίησης των κυτταρικών κυστιδίων, μελετήθηκε και η σύντηξη των CVs με PEG-λιποσώματα. Η τεχνική της σύντηξης δοκιμάστηκε με διαφορετικούς τύπους λιποσωμάτων και κυτταρικών κυστιδίων ώστε να επιβεβαιωθεί η λειτουργικότητά της. Τα υβρίδια μεταξύ PEG-λιποσωμάτων και hCMEC CVs, παρόλο που εμφάνισαν μια ελαφρώς βελτιωμένη φαρμακοκινητική σε σχέση με τα αντίστοιχα CVs, δεν κατάφεραν να επαναλάβουν την ίδια στόχευση εγκεφάλου που πραγματοποιήθηκε από τροποποιημένα Chol/PEG CVs. Στη μελέτη του μηχανισμού δράσης των διάφορων τύπων κυστιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, φαίνεται πως τα CVs και τα υβρίδια αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα κυρίως μέσω του μονοπατιού της καβεολίνης, σε αντίθεση με τα τροποποιημένα Chol/PEG CVs που χρησιμοποιούν κυρίως το μονοπάτι της κλαθρίνης.Παράλληλα, μελετήθηκε η ικανότητα εγκλωβισμού καινοτόμων νευροπροστατευτικών και νευροαναγεννητικών συνθετικών μικρονευροτροφινών σε λιποσώματα. Τα μόρια αυτά είναι αρκετά λιπόφιλα και διαπερνούν τον ΑΕΦ. Παρόλα αυτά, η χαμηλή υδατοδιαλυτότητά τους και ο τρόπος χορήγησής τους, περιορίζει τη χρήση τους στη θεραπευτική. Αρχικά, με βάση τα πειράματα προμορφοποίησης προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συστάσεις και μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμικών μικρονευροτροφινών (ΒΝΝ27 και ΒΝΝ237). Στη συνέχεια, έγιναν προσπάθειες παρασκευής νανομορφών για ενδορρινική χορήγηση του ΒΝΝ27, με σκοπό την άμεση χορήγησή του στον εγκέφαλο και την αντιμετώπιση των μειονεκτημάτων που εμφανίζονται απ’ τη στόχευση του εγκεφάλου μέσω της ενδοφλέβιας οδού χορήγησης. Μελετήθηκε η επικάλυψη των λιποσωμάτων με χιτοζάνη, ένα παράγοντα με βλεννοσυγκολλητικές ιδιότητες, και προσδιορίστηκε η βέλτιστη σύσταση BNN27 λιποσωμάτων PC/PG (9/1) επικαλυμμένα με 0,1 w/w χιτοζάνη/ λιπίδιο, χρησιμοποιώντας τη χιτοζάνη μεσαίου μοριακού βάρους ως πολυμερές βλεννοπροσκόλλησης. Ακόμα, αναπτύχθηκαν νανογαλακτώματα ΒΝΝ27 με βλεννοσυγκολλητικούς παράγοντες (χιτοζάνη ή Carbopol), ως εναλλακτικοί φορείς ενδορρινικής χορήγησης ΒΝΝ27. Μετά τις κατάλληλες μελέτες προμορφοποίησης, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συστάσεις ΒΝΝ27 νανογαλακτώματος. Τα νανογαλακτώματα με 8% ή 10% w/w Capmul MCM και χιτοζάνη σε ποσοστό 0,3% w/w εμφάνισαν τα βέλτιστα χαρακτηριστικά σταθερότητας και βλεννοπροσκόλλησης. Ως μίγμα επιφανειοδραστικών χρησιμοποιήθηκαν τα έκδοχα Tween 80 / Transcutol / Propylene glycol σε αναλογία 4/1/1. Οι νανομορφές αυτές αφού χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος των σταγονιδίων, το δείκτη πολυδιασποράς, το ζ-δυναμικό και τη μορφολογία τους, μελετήθηκαν ως προς τη σταθερότητα των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων, την κυτταροτοξικότητα, την ικανότητα διαπέρασης ενός in vitro μοντέλου ΑΕΦ και την in vivo συμπεριφορά μετά από ενδορρινική χορήγηση.