Efectos de la genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión cardíaca mediante estudio mecánico-energético
Authors:   , Colareda Germán A. 
Published: August 2019

Esta tesis estudió los efectos directos del fitoestrógeno genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión: de no-flujo/reperfusión (I/R) en corazones enteros de rata y cobayo, y de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R) en corazones enteros de rata. En estos modelos se generó una recuperación contráctil parcial durante la reperfusión, sin infarto, denominado “corazón atontado”. La disfunción contráctil en estos modelos está acompañada por una elevada liberación de calor que conduce a la disminución de la economía muscular total. Los cambios energéticos reflejan alteraciones en la contractilidad, en la regulación de la [Ca2+]i, en los mecanismos activos de remoción y liberación de Ca2+ al citosol, y en la actividad metabólica mitocondrial. Aunque el fitoestrógeno genisteína es considerado protector cardiovascular, sus efectos directos en el miocardio atontado no estaban establecidos. Conocerlos es de importancia para evaluar una posible acción preventiva de este fitofármaco que se emplea en estados post-menopáusicos y como componente dietético principalmente aportado en la soja. La tesis estudió los efectos de perfundir 2 y 20 μM de genisteína previo a la I/R en corazones de rata o cobayo, puesto que ambos difieren en el grado de participación de mecanismos sarcoreticulares y sarcolemales. Además, puesto que la genisteína es considerado un fitoestrógeno, se evaluaron las diferencias de respuesta entre los dos sexos, tanto en I/R como en HIP/R. Se estudiaron los efectos desarrollados por la perfusión de genisteína directamente en los corazones aislados y contenidos en el interior de un calorímetro de flujo. En otras series experimentales, se estudiaron los efectos producidos después de la administración in vivo de 5 mg/Kg vía intraperitoneal un día antes del experimento de I/R en el corazón aislado. Experimentalmente, se midieron simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP en mmHg) y el flujo de calor total (Ht en mW/g tejido) de corazones enteros de rata y cobayo introducidos en la cámara interna de un calorímetro de flujo, en forma continua tanto durante la perfusión control (6 ml/min) como en isquemia de no-flujo (por corte global de la perfusión) o en hipoperfusión (por reducir el flujo a 1,2 ml/min). En los modelos de “atontamiento”, los períodos de I/R o de HIP/R se eligieron para lograr una recuperación de alrededor del 50% de la contractilidad inicial en condición control. En corazones de rata se estudió también un modelo de “atontamiento severo” en el que el control recuperó alrededor del 15% de la contractilidad inicial. Los corazones estabilizados dentro del calorímetro se expusieron a diversos protocolos de pretratamiento con genisteína (GST) y/o ciertos inhibidores selectivos de transportadores para evaluar su rol en el efecto. Se hallaron los siguientes resultados principales en los diferentes modelos: a) En el modelo de atontamiento por I/R: en corazones aislados de rata expuestos a 20 min I/45 min R a 37 ºC, GST 20 μM no cambió la recuperación contráctil post-isquémica (RCPI), pero aumentó la velocidad de relajación relativa (-dP/dt/P) de las contracciones en R. Además, mejoró la economía muscular total (P/Ht) sólo cuando estuvo presente desde antes de la I al final de la R. La perfusión de menor concentración de GST 2 μM a 37°C (descripta en plasma de pacientes que consumen fitoestrógenos en la dieta) tampoco modificó la RCPI ni la economía, observando similar efecto que a 20 µM aún en la relajación. Sin embargo, a 30 ºC, en los corazones expuestos a 45 min I/45 min R, GST 20 µM redujo la RCPI tanto en corazones de ratas como de cobayos macho (M), sin modificar la RCPI de las hembras (H), con similares comportamientos de la economía. La inhibición de tirosina fosfatasas con orto-vanadato (OVN) durante la perfusión con 20 μM GST previno la disminución de la RCPI en corazones de rata M, sugiriendo que el efecto inotrópico negativo de GST es debido a la inhibición de tirosina-quinasas (TK). Reperfundiendo los corazones isquémicos con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+ se indujo una contractura dependiente del contenido de Ca2+ sarcoreticular, y una liberación de calor que representa el ciclaje de Ca2+ a través de los varios transportadores involucrados. La relajación de la contractura depende principalmente de la recaptación mitocondrial de Ca2+ en estas condiciones, y GST redujo esa velocidad de relajación a 30⁰C. En corazones de cobayo, GST 20 μM mantuvo la protección del precondicionamiento (PC) isquémico previo a los 30 min I/45 min R, pero ambos efectos fueron reducidos (cayó la RCPI) por el bloqueante selectivo de los canales de K+ mitocondriales (KATPm) 5-hidroxidecanoato, sugiriendo la participación de los KATPm en el efecto de GST y del PC. b) En cardiomiocitos aislados de rata y perfundidos en medio aeróbico, GST 20 μM previno el aumento en la fluorescencia de Rhod-2 ([Ca2+]m libre) y demoró la caída de la señal fluorescente de Fluo-4 ([Ca2+]i libre citosólico) ambos provocados por la perfusión de un Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. c) Efectos de GST en el modelo de atontamiento con estimulación simpática: se encontró que 20 μM GST redujo la disfunción provocada por adrenalina en el modelo de atontamiento por I/R, mejorando la RCPI y la economía (P/Ht). Esta interacción sugirió que GST redujo la sobrecarga de Ca2+ inducida por adrenalina. d) En el modelo de atontamiento severo por I/R: en corazones aislados de rata a 37 ºC, GST 5 mg/Kg administrada vía intraperitoneal 24 horas antes del experimento mejoró la RCPI de corazones expuestos a 30 min I seguido de 45 min R, especialmente en corazones de rata macho. Este efecto no estuvo asociado a la inhibición de las tirosina-kinasas (no se modificaron por tratamiento previo con OVN), ni a cambios en el contenido de Ca2+ del RS (no alteró la contractura provocada por Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+). e) En el modelo de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R): inicialmente se caracterizó el rol de los transportadores de Ca2+ mitocondriales en este modelo. Se logró mejorar la RCPI y la economía durante la hipoperfusión cuando se pretrataron con clonazepam 10 μM, el cual inhibe al NXCm, sugiriendo el rol cardioprotector de conservar más Ca2+ en las mitocondrias durante la hipoperfusión. Otros transportadores mitocondriales (UCam y KATPm) no ejercieron un rol cardioprotector en la HIP/R. Luego, 20 μM GST generó el mismo patrón de comportamiento que en el atontamiento por I/R a 37°C, es decir que M y H no alteraron la RCPI ni la economía. Pero al combinar la perfusión de GST luego y en simultáneo con la de clonazepam se observó una disfunción muy acentuada: reducción de RCPI y economía, y gran contractura. Esta disfunción fue atenuada por la simultánea perfusión de ciclosporina A, lo cual sugiere que hay una gran alteración en la homeostasis de Ca2+ con apertura del mPTP al interferirse los transportadores mitocondriales UCam y NXCm. Por otro lado, cuando el modelo de HIP/R se realizó 24 horas después de la administración IP de 5 mg/Kg de GST en corazones de rata macho, se obtuvo cardioprotección con aumentos de la RCPI y la economía (P/Ht). Estos resultados sugieren que GST actúa en varios mecanismos que regulan la homeostasis de calcio miocárdica y la energética durante la I/R, los cuales difieren con la temperatura y el género. Entre ellos, hemos caracterizado a los siguientes: a) Una inhibición del influjo de Ca2+ por canales L, más notoria en machos que en hembras y a baja temperatura (30 ºC), que es dependiente de la inhibición de TK. b) un aumento de la velocidad de relajación de las contracciones, posiblemente por aumentar la captación sarcoreticular de Ca2+, el cual fue evidente tanto a 30ºC como a 37ºC pero fue enmascarado por la acción lusitrópica propia de la adrenalina. d) un aumento del leak de Ca2+ del RS dependiente de la temperatura, ya que fue evidenciado por el aumento de la LVEDP durante la R en los corazones tratados con GST a 37 ºC, aun en las condiciones de cardioprotección. e) una disminución de la captación de Ca2+ mitocondrial, evidenciado en cardiomiocitos aislados y en corazones en I/R a 30 ºC, cuando se perfundieron con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. e) una acción cardioprotectora cuando se administró in vivo, que podría estar asociada a la interacción agonista competitiva con el estradiol endógeno a nivel de los receptores estrogénicos, puesto que la RCPI y la economía mejoraron mucho mas en el tratamiento in vivo de rata macho que en el de rata hembra. La dosis de 5 mg/Kg evaluada en esta tesis es comparable a la administrada en humanos terapéuticamente (70 mg/día de isoflavonas de soja). En conclusión, esta tesis valida el efecto benéfico de la administración in vivo de GST en un individuo, especialmente si tiene reducido nivel estrogénico, como preventivo del atontamiento miocárdico disparado por la reducción del flujo coronario. Además, establece algunos de los mecanismos determinantes de tal protección a nivel de la homeostasis de Ca2+ y la energética miocárdica.