Ανάλυση περιοχών με διαφορική μεθυλίωση σε ανευπλοειδίες
Authors: Χριστοπούλου Γεωργία 
Published: September 2021

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις του DNA αποτελούν ευρύ αντικείμενο μελέτης σε ότι αφορά τους μηχανισμούς, το ρόλο τους και τις δυνητικές εφαρμογές τους στην πρόβλεψη, διάγνωση και παρακολούθηση παθολογικών καταστάσεων. Η καλύτερα μελετημένη επιγενετική τροποποίηση είναι η μεθυλίωση του DNA.Η διερεύνηση της γενετικής σύστασης του εμβρύου αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα στην προγεννητική διάγνωση. Η διάγνωση ανευπλοειδιών του εμβρύου, με συχνότερη την τρισωμία 21 (σύνδρομο Down), πραγματοποιείται με τη διεξαγωγή του καρυοτύπου του εμβρύου και μεθοδολογίες της μοριακής κυτταρογενετικής μετά από επεμβατική λήψη ιστών του. Τέτοιες διαδικασίες είναι η λήψη χοριονικών λαχνών και η αμνιοπαρακέντηση, ενώ σπανιότερα γίνεται λήψη εμβρυϊκού αίματος. Οι μέθοδοι αυτές συνδέονται με κίνδυνο επιπλοκών στην κύηση και αποβολής του εμβρύου. Για την αποφυγή επιπλοκών, πραγματοποιούνται βιοχημικοί και υπερηχογραφικοί έλεγχοι οι οποίοι οδηγούν σε εκτίμηση του κινδύνου να πάσχει ένα έμβρυο, ωστόσο, η ανιχνευσιμότητά τους δεν είναι αρκετά ικανοποιητική.Η ανακάλυψη της κυκλοφορίας εμβρυϊκών κυττάρων και ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffDNA, cell free fetal DNA) στο περιφερικό αίμα της εγκύου άνοιξε νέους ορίζοντες για την μη επεμβατική ανίχνευση ανευπλοειδιών. Τα τελευταία χρόνια, οι περισσότερες έρευνες εστιάζουν στη μελέτη του cffDNA μέσω τεχνολογιών αλληλούχησης του DNA (NGS, Next Generation Sequencing) και μελέτης της διαφορικής μεθυλίωσης του DNA μητέρας και εμβρύου. Οι τεχνολογίες οι οποίες βασίζονται σε NGS είναι δυναμικές και έχουν σήμερα κλινική εφαρμογή. Παρουσιάζουν, παρ’ όλα αυτά, σημαντικούς περιορισμούς ορισμένους από τους οποίους θα μπορούσαν οι «επιγενετικές» προσεγγίσεις να υπερκεράσουν.Μια από τις επιγενετικές προσεγγίσεις βασίζεται στις διαφορές μεθυλίωσης μητρικού και εμβρυϊκού DNA (DMRs, Differentially Methylated Regions) στο περιφερικό αίμα της εγκύου και τον εμπλουτισμό του cffDNA με την ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP, Methylation Dependent Immuno Precipitation). Μετά τον εμπλουτισμό του cffDNA με MeDIP ακολουθεί ποσοτική ανίχνευση των περιοχών DMRs με τελικό αποτέλεσμα την ανίχνευση ή όχι τρισωμίας 21 στο έμβρυο. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε αποδείχθηκε ότι έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ωστόσο, επιδέχεται βελτιώσεων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τροποποιήσεις σε ορισμένα κομβικά σημεία της μεθοδολογίας, οι οποίες αξιολογήθηκαν για την επίδραση τους στην απόδοση των σταδίων αυτών προκειμένου να ενσωματωθούν σε αυτήν. Επιπλέον, λόγω της κρισιμότητας της διαδικασίας της συλλογής, διατήρησης και μεταφοράς των δειγμάτων μέχρι την ανάλυση, εξετάστηκε η καταλληλότητα της συλλογής δειγμάτων περιφερικού αίματος της εγκύου σε ειδικά σωληνάρια STRECK αντί των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων, τα οποία περιέχουν αντιπηκτικό Κ+/EDTA.Η μελέτη έδειξε ότι η επεξεργασία των δειγμάτων περιφερικού αίματος δεν είναι απαραίτητο να γίνει άμεσα και ότι είναι δυνατή η μεταφορά τους χωρίς ο χρόνος που μεσολαβεί και οι δεδομένες συνθήκες μεταφοράς να είναι καθοριστικές παράμετροι για την καταλληλότητα των δειγμάτων και τη διεξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Το στάδιο της ανοσοκατακρήμνισης μεθυλιωμένου DNA είναι ίσως το κρισιμότερο στάδιο της μεθοδολογίας, καθώς είναι σχετικά πολύπλοκο, απαιτεί ακριβείς και λεπτούς χειρισμούς και κατά το οποίο είναι δυνατή η εισαγωγή σφαλμάτων. Η σύμπτυξη των δυο σταδίων επώασης (αντίσωμα-DNA και συμπλόκου Ab-DNA-μαγνητικών σφαιριδίων) ήταν επιτυχής μειώνοντας το χρόνο από 4 σε 3 ώρες, την πολυπλοκότητα και τον κόπο για τους χειρισμούς καθώς και την συνακόλουθη εισαγωγή σφαλμάτων. Η μείωση του όγκου της αντίδρασης ανοσοκατακρήμνισης του μεθυλιωμένου DNA οδήγησε σε αποτελέσματα τα οποία είναι το ίδιο καλά σε σχέση με το αρχικό πρωτόκολλο, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την οικονομικότερη διαχείριση της ήδη περιορισμένης ποσότητας του cffDNA, εξασφαλίζοντας τη μεγαλύτερη διαθεσιμότητά του για περεταίρω διερευνήσεις. Η μείωση της ποσότητας του αντισώματος και των μαγνητικών σφαιριδίων ανά αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης οδήγησε και αυτή σε αποτελέσματα συγκρίσιμα με αυτά της αρχικής μεθοδολογίας μειώνοντας το κόστος της. Στη συνέχεια διεξήχθη μελέτη της αποτελεσματικότητας και της ευαισθησίας της ανίχνευσης DMRs. Δείχθηκε ότι η τροποποιημένη μεθοδολογία επιτρέπει την αποτελεσματική ανίχνευση των DMRs.Η παρούσα μελέτη έδειξε την επιτυχή βελτιστοποίηση της υπάρχουσας προσέγγισης (MeDIP-qPCR) για την μη επεμβατική ανίχνευση της τρισωμίας 21 από το περιφερικό αίμα της εγκύου. Η μέθοδος είναι υποσχόμενη, με δυνατότητα επέκτασης σε περισσότερες ανευπλοειδίες ή και άλλες χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Είναι σημαντική η διερεύνηση παραμέτρων για την περαιτέρω βελτιστοποίηση της προκειμένου να είναι εφικτή η μελέτη της γενετικής σύστασης του εμβρύου με επιγενετικές προσεγγίσεις.