Functional characterization of an LCK cysteine mutant
Authors: Κρητικός Ανδρέας 
Published: November 2023

Η επαγόμενη από αντιγόνο φωσφορυλίωση υποδοχέα Τ-κυττάρων είναι το πρώτο σηματοδοτικό συμβάν στα Τ κύτταρα για την ενεργοποίηση της προσαρμοστικής ανοσίας έναντι εισβολέων παθογόνων και καρκινικών κυττάρων. Τα PTK είναι βασικοί μεσολαβητές στη δημιουργία ενδοκυτταρικών σημάτων που καταλήγουν στην ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Το LCK ανήκει στα SFKs και είναι ζωτικής σημασίας κατά την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και την ανάπτυξη των Τ-κυττάρων. Η ρύθμιση της ενζυματικής δραστηριότητας της LCK λαμβάνει χώρα μέσω φωσφορυλίωσης δύο συντηρημένων υπολειμμάτων τυροσίνης: η φωσφορυλίωση του Y394 και το διαμορφωτικό άνοιγμα της LCK πιστεύεται ότι ενεργοποιούν την κινάση, ενώ η φωσφορυλίωση Y505 θεωρείται ότι δημιουργεί μια κλειστή, ανενεργή μορφή LCK. Πρόσφατα, επίσης διατηρημένα υπολείμματα κυστεΐνης έχουν κερδίσει την προσοχή πολλών ερευνητών επειδή εμπλέκονται στη ρύθμιση της δραστηριότητας των ΡΤΚ και ως εκ τούτου μπορούν να στοχευθούν στην ανάπτυξη νέων ειδικών αναστολέων ΡΤΚ. Στο πλαίσιο της διδακτορικής μου διατριβής, ανέλυσα τη λειτουργική συνάφεια του υπολείμματος κυστεΐνης 476 του LCK, το οποίο διατηρείται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των PTK. Για να μελετήσω τη λειτουργία του C476 στο LCK, έχω δημιουργήσει κατασκευές LCK που φέρουν μετάλλαξη κυστεΐνης σε αλανίνη. Ένα μετάλλαγμα LCK C476A εκφράστηκε στην παραλλαγή Τ-κυττάρου Jurkat με έλλειψη LCK (J.LCK) και αξιολογήθηκαν η σταθερότητα, η δραστικότητα και η λειτουργία του μεταλλάγματος. Πρώτον, έχω δείξει ότι το C476 ρυθμίζει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και τον υποκυτταρικό εντοπισμό της LCK. Επιπροσθέτως, τα Τ κύτταρα J.LCK που ανασυστάθηκαν με LCK C476A έδειξαν ισχυρά μειωμένη φωσφορυλίωση των ρυθμιστικών υπολειμμάτων, Υ394 και Υ505. Επιπλέον, η ανάλυση της δραστικότητας κινάσης του LCK C476A έδειξε ότι είναι ενζυματικά ανενεργό. Με βάση αυτά τα δεδομένα, καθώς και την ανάλυση της διαμορφωτικής του κατάστασης, φαίνεται ότι το LCK C476A υιοθετεί μια διαμόρφωση που μοιάζει με τη λεγόμενη «primed» διαμόρφωση LCK. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, είναι σαφές ότι η ικανότητα του LCK C476A να ανασυνθέτει τη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση TCR μειώνεται δραστικά. Επιπλέον, έχω έδειξε ότι η υπερέκφραση του συνοδηγού CDC37 διασώζει τη σταθερότητα και εν μέρει τη δραστηριότητα του μεταλλάγματος LCK C476A. Εκμεταλλευόμενος τις καθιερωμένες τεχνικές στην ομάδα μου, ερεύνησα εάν το C476 είναι στόχος αναστρέψιμης οξείδωσης (σουλφενυλίωση). Φαίνεται ότι το C476 δεν είναι άμεσος στόχος σουλφενυλίωσης. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής μου διατριβής δείχνουν επίσης ότι η υποκατάσταση C476A μετατρέπει το LCK σε ένα μεταλλαγμένο ευαίσθητο στη θερμοκρασία. Η ανάλυση του LCK C476A σε χαμηλότερες θερμοκρασίες αποκάλυψε ότι έχει ενισχυμένη δραστηριότητα και λειτουργία.Συλλογικά, φαίνεται ότι το C476 είναι ένα κρίσιμο υπόλειμμα που εμπλέκεται στη ρύθμιση της δραστηριότητας και της λειτουργίας του LCK. Στο μέλλον, περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη συμμετοχή των φωσφατάσης στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης LCK C476A καθώς και οι έρευνες άλλων τύπων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων του C476 που επηρεάζουν αυτό το υπόλειμμα θα συμβάλουν στην αποσαφήνιση της μηχανιστικής αιτιολογίας του ρυθμιστικού ρόλου του C476 υπόλειμμα.