Σύνθεση και μελέτη πεπτιδικών ανάλογων του φυσικού ανθρώπινου πεπτιδίου granulysin για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων
Authors: Τζιτζιλής Αθανάσιος 
Published: August 2022

Τα τελευταία χρόνια η επιτακτική ανάγκη για μια νέα γενιά αντιμικροβιακών μέσων, λόγω της αλόγιστης χρήσης των αντιβιοτικών, έχει οδηγήσει την προσοχή των ερευνητών σε μια νέα κατηγορία αντιμικροβιακών μέσων, τα κατιονικά αντιμικροβιακά πεπτίδια (AMPs). Τα πεπτίδια αυτά υπάρχουν ήδη μέσα σε ζωντανούς μικροοργανισμούς και αποτελούν τμήμα της φυσικής ανοσίας. Το φάσμα δράσης τους είναι ευρύ, αφού μπορούν να αντιμετωπίσουν ιούς, βακτήρια (gram-αρνητικά και gram-θετικά), μύκητες, πρωτόζωα αλλά και παράσιτα. Επίσης, έχουν αντικαρκινική δράση, συμβάλλουν στην επούλωση τραυμάτων και λειτουργούν ως μεσολαβητές για το ανοσοποιητικό σύστημα. Τα AMPs, που χαρακτηρίζονται και ως φυσικά αντιβιοτικά, είναι πεπτίδια μικρού μήκους, από 10 έως 50 αμινοξέα, μικρού μοριακού βάρους και φέρουν θετικό φορτίο. Αποτελούνται από 50% υδρόφιλα και 50 % υδρόφοβα αμινοξέα και όταν έρθουν σε επαφή με κυτταρικές μεμβράνες αναδιπλώνονται σε αμφιπαθητικές διαμορφώσεις. Με αυτόν τον τρόπο διευκολύνεται η διάρρηξη των μεμβρανών των παθογόνων μικροβίων. Επιπλέον τα ΑΜPs πρέπει να έχουν πρωτεολυτική σταθερότητα και χαμηλή αιμολυτική δραστικότητα. Μέχρι σήμερα έχει απομονωθεί και χαρακτηριστεί ένας μεγάλος αριθμός αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν δώδεκα κατιονικά πεπτιδικά ανάλογα της φυσικής ανθρώπινης πρωτεΐνης Granulysin με σκοπό την ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών. Οι αλληλουχίες των συντιθέμενων πεπτιδικών αναλόγων είναι οι ακόλουθες, με την 1η και 7η να αντιστοιχούν στα τμήματα 5-16 και 23-34 της φυσικής πρωτεΐνης, αντίστοιχα: 1A1FR: Arg5-Tyr-Cys7(Acm)-Leu8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys16-NH2, 1A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Leu-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1FR: Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1FR: Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1AC: Ac-Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 1A2FR: Gln23-Arg-Ser-Val-Ser-Asn28-Ala-Ala-Tyr31-Arg-Val-Cys34(Acm)-NH2, 1A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 3A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2 και 3A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση κατά Merrifield και την Fmoc/tBu στρατηγική. Ο καθαρισμός των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με ημιπαρασκευαστική και παρασκευαστική RP-HPLC. Ο έλεγχος της καθαρότητας έγινε με αναλυτική RP-HPLC ενώ η ταυτοποίηση τους πραγματοποιήθηκε με ESI-MS. Οι διαμορφωτικές μελέτες των πεπτιδίων έγιναν μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού. Τα πεπτίδια εξετάστηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση έναντι τριών Gram (-) βακτηρίων, δύο Gram (+) βακτηρίων και ενός μύκητα, ενώ πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελέγχου της κυτταροτοξικής δράσης τους έναντι της καρκινικής κυτταρικής σειράς Α-549, με τη μέθοδο ΜΤΤ. Επίσης μελετήθηκαν ως προς την τοξικότητά τους έναντί των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων. Η σύνθεση, ταυτοποίηση και ο καθαρισμός των πεπτιδίων έλαβαν μέρος στο εργαστήριο Πεπτιδοχημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, ενώ η αντιμικροβιακή μελέτη και η αιμολυτική σταθερότητα στο εργαστήριο Βιοχημείας. Η μελέτη της αντικαρκινικής δράσης πραγματοποιήθηκε στη Μονάδα Τεχνικών Υποδομών και Μεθόδων Χαρακτηρισμού και Ελέγχου Βιοδραστικότητας Ουσιών. Τα πειράματα του κυκλικού διχρωϊσμού πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μέτρια δράση έναντι των Gram (-) βακτηρίων, του μύκητα και των καρκινικών κυττάρων Α-549, ενώ έναντι των Gram (+) βακτηρίων δεν είχαν δράση. Κανένα πεπτίδιo δεν προκάλεσε αιμόλυση. Τα ποσοστά α-έλικας ήταν χαμηλά. Το πεπτίδιο 3A1FR είναι αυτό που ξεχώρισε, έχοντας τα μεγαλύτερα ποσοστά α-έλικας και την καλύτερη δράση (MIC Gram (-) βακτηρίων = 200 μg/ml), MIC μύκητα = 100 μg/ml, IC50 καρκινικών κυττάρων Α-549 = 130 μg/ml) ενώ στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις τα επίπεδα αιμόλυσης ήταν σχεδόν μηδενικά (EC = >500 μg/ml).