Ηλεκτροφυσιολογική και βιοχημική μελέτη υποδοχέων σχετιζομένων με ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος
Authors: Χρόνη Δάφνη 
Published: September 2021

Οι νευρωνικοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) εντοπίζονται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και εμπλέκονται στην ταχεία μεταβίβαση της νευρικής ώσης καθώς και στη ρύθμιση της έκκρισης νευροδιαβιβαστών για τη μεταβίβαση πληροφοριών από έναν σε άλλον ή σε μυϊκό κύτταρο. Μερικά παραδείγματα νευροδιαβιβαστών είναι η ακετυλοχολίνη (ACh), η σεροτονίνη, το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) και η γλυκίνη (Glycine).Οι νευρωνικοί nAChRs ανήκουν στην υπεροικογένεια πενταμερών ιοντικών καναλιών (pentameric Ligand Gated Ionic Channels - pLGIC) ή Cys-loop υπεροικογένεια, επειδή διαθέτουν μία χαρακτηριστική θηλιά (Cys-loop) 13 υψηλά συντηρημένων αμινοξέων μεταξύ δύο αμινοξικών καταλοίπων κυστεΐνης (Cys) στην εξωκυτταρική τους περιοχή. Στην υπεροικογένεια αυτή περιλαμβάνονται και οι υποδοχείς γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA και GABAC), γλυκίνης (GlyR) και σεροτονίνης (5-ΗΤ3). Οι νευρωνικοί nAChRs απαρτίζονται από 9 α (α2-α10) και 3 β (β2-β4) υπομονάδες σε διάφορους συνδυασμούς που κατανέμονται παντού στον εγκέφαλο ως ομοπενταμερή ή ετεροπενταμερή μόρια. Οι α7 και α9 υπομονάδες είναι οι μόνες ανθρώπινες υπομονάδες nAChRs που μπορούν να σχηματίζουν και ομοπενταμερή μόρια.Οι νευρωνικοί nAChRs συμμετέχουν σε διάφορες νευρολογικές παθήσεις, όπως οι νόσοι Alzheimer και Parkinson, η ελλειμματική προσοχή, η υπερκινητικότητα, η κατάθλιψη, ο νευροπαθητικός πόνος, και η εξάρτηση από ουσίες. Έτσι, η ανάπτυξη φαρμάκων για αυτούς τους υποδοχείς αποτελεί προτεραιότητα. Επειδή οι νευροδιαβιβαστές προσδένονται σε ειδικά σημεία πρόσδεσης (ορθοστερικά σημεία πρόσδεσης) στo εξωκυττάριο τμήμα (ECD: extracellular domain) των υποδοχέων αυτών, είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τη δομή της περιοχής αυτής. Γενικά, τα ECD των υπομονάδων των nAChRs αποτελούνται από μία αμινο-τελική α-έλικα και από έναν υδρόφοβο πυρήνα 10 β-πτυχωτών φύλλων (β1-β10). Μεταξύ μερικών από τα πτυχωτά αυτά φύλλα δημιουργούνται χαρακτηριστικές θηλιές που συμμετέχουν στο σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης των υποκαταστατών. Οι θηλιές αυτές είναι η Α, Β και C, οι οποίες συνεισφέρουν στο σχηματισμό της κύριας (+) πλευράς πρόσδεσης και οι θηλιές D, E και F που βρίσκονται στη γειτονική υπομονάδα και οι οποίες απαρτίζουν τη συμπληρωματική (-) πλευρά πρόσδεσης των υποκαταστατών. Oι κύριες πλευρές πρόσδεσης παρουσιάζουν μια αρκετά υψηλή ομολογία μεταξύ των νευρωνικών nAChRs, σε αντίθεση με τις συμπληρωματικές, οι οποίες είναι και αυτές που καθορίζουν την επιλεκτικότητα έκαστου nAChR υποτύπου έναντι διαφόρων φαρμάκων. Επομένως, ο σχεδιασμός ειδικών και αποτελεσματικών φαρμάκων για τους διάφορους nAChRs είναι μια δύσκολη διαδικασία και απαιτεί την άντληση περισσότερων δομικών και λειτουργικών πληροφοριών για έκαστο υπότυπο nAChR. Πρόσφατα, από μέλη του εργαστηρίου μας πραγματοποιήθηκαν δομικές μελέτες για τα ECDs δύο ανασυνδυασμένων υπομονάδων ανθρωπίνων nAChRs, της α9 και της α2. Στη φύση η α9 υπομονάδα σχηματίζει είτε ομοπενταμερή υποδοχέα, είτε ετεροπενταμερή μαζί με την α10, ενώ η α2 σχηματίζει ετεροπενταμερή με την β2. Αξίζει να σημειωθεί ότι η α2 παρουσιάζει υψηλή ομολογία με την α4 υπομονάδα (78%), η οποία είναι η επικρατέστερη υπομονάδα nAChR στον ανθρώπινο εγκέφαλο. Στις πρόσφατες δομικές μελέτες του εργαστηρίου παρουσιάστηκαν δομικά στοιχεία για τη (+) πλευρά της θέσης πρόσδεσης της α9 υπομονάδας της οποίας το ECD κρυσταλλώθηκε ως ελεύθερο μονομερές, αλλά και ως σύμπλοκο με τους ανταγωνιστές μεθυλ-κακονιτίνη (MLA) και α-Bungarotoxin (α-Bgtx), καθώς και δομικά στοιχεία για ολόκληρη τη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών στην διεπιφάνεια μεταξύ ECDs α2 υπομονάδων από την κρυστάλλωση του α2-ECD ως ομοπενταμερούς μορίου σε σύμπλοκο με τον αγωνιστή επιβατιδίνη (Epi). Στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκαν με ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες μερικά χαρακτηριστικά δομικά στοιχεία που ελήφθησαν για τα ECDs των α9 και α2 υπομονάδων, όσον αφορά τη λειτουργική τους σημασία . Πιο συγκεκριμένα, η κρυσταλλική δομή της α9-ECD αποκάλυψε μια αλληλεπίδραση μεταξύ των β7-β10 πτυχωτών φύλλων και συγκεκριμένα μεταξύ της Thr203 (αυστηρά συντηρημένη στις α υπομονάδες των nAChR) και της Thr147 (μοναδική στις α9 και α10 υπομονάδες). Στη διατριβή αυτή, δείχθηκε με μεταλλάξεις και ακολούθως με ηλεκτροφυσιολογική μελέτη, ότι αυτή η μοναδική αλληλεπίδραση στα β7-β10 πτυχωτά φύλλα στους α9α10 nAChRs είναι κρίσιμη για την πρόσδεση αγωνιστών για το άνοιγμα του διαύλου.Επιπλέον, με βάση τη λύση της δομής της α2-ECD, πραγματοποιήθηκαν στοχευμένες μεταλλάξεις, των οποίων ο αντίκτυπος στη λειτουργία ολόκληρων των α2/β2 υποδοχέων μελετήθηκε επίσης με ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες. Με τις μελέτες αυτές αντλήθηκαν κυρίως λειτουργικά δεδομένα για τα δομικά στοιχεία τα οποία εμπλέκονται στην πρόσδεση διαφόρων αγωνιστών στους α2β2 nAChRs καθώς και στην ενεργοποίηση και απευαισθητοποίησή τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο α2β2 nAChR υπάρχει σε δύο στοιχειομετρίες ή υποτύπους: ο (α2)3(β2)2 είναι ο χαμηλής ευαισθησίας (όσον αφορά την απόκριση σε αγωνιστές) υπότυπος (LS: low sensitivity), και ο (α2)2(β2)3 είναι ο υψηλής ευαισθησίας (HS: high sensitivity) υπότυπος. Το πρώτο αμινοξικό κατάλοιπο που μελετήθηκε ήταν η αυστηρά συντηρημένη στις α-υπομονάδες Trp84 της α2-υπομονάδας (βρίσκεται στη συμπληρωματική πλευρά της α2 υπομονάδας). Συγκεκριμένα στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι το κατάλοιπο αυτό εμπλέκεται στην πρόσδεση και την δραστικότητα της ACh στον LS υπότυπο του α2β2 nAChR αλλά και στον ρυθμό απευαισθητοποίησής του. Το πιο σημαντικό είναι ότι, μέσω ηλεκτροφυσιολογικών δεδομένων συγκεκριμένων μεταλλάξεων στην α2 υπομονάδα, παραθέτουμε ισχυρή απόδειξη για την παρουσία της θέσης πρόσδεσης α2(+)/α2(-) στον α2β2 LS-υπότυπο. Επίσης, από τη δομή του συμπλόκου της α2 με την επιβατιδίνη (α2-Epi), παρατηρήθηκε ότι η θηλιά F αλληλεπιδρά με τη θηλιά C μεταξύ γειτονικών α2 υπομονάδων, καθώς η πλευρική αλυσίδα της Tyr199 (Θηλιά F, συμπληρωματική πλευρά της α2 υπομονάδας) σχηματίζει έναν δεσμό υδρογόνου με το καρβονύλιο της Cys221 (Θηλιά C, κυρίως πλευρά α2 ). Έτσι, διερευνήσαμε το λειτουργικό ρόλο της Tyr199 στην α2 αλλά και του αντίστοιχου αμινοξέος στη β2 υπομονάδα (Phe169). Δείξαμε με μεταλλάξεις και ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες, ότι η θηλιά F κατέχει έναν ξεχωριστό ρόλο σε αυτές τις δύο υπομονάδες αφού μεταλλάξεις στη συγκεκριμένη θέση της τόσο στην α2 όσο και στην β2 υπομονάδα επηρεάζουν τόσο το EC50 στην ACh και στους δύο υπότυπους του α2β2 nAChR (LS και HS).Συμπερασματικά, ακολουθώντας δομο-επαγόμενες μεταλλάξεις, τα ηλεκτροφυσιολογικά μας δεδομένα επιβεβαίωσαν την παρουσία της θέσης πρόσδεσης α2(+)/α2(-) στον α2β2 LS-υπότυπο και επικύρωσαν τη λειτουργική σημασία συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων στις α2 και β2 υπομονάδες του nAChR. Δεδομένης της παθολογικής σημασίας της α2 υπομονάδας του nAChR και της υψηλής ομολογίας της με την υπομονάδα α4 (78%) και με άλλες υπομονάδες νευρωνικών nAChR, τα ευρήματα αυτά παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για τη μοντελοποίηση αρκετών nAChRs και επιτρέπουν το σχεδιασμό ειδικών φαρμάκων, βασισμένων στη δομή, έναντι ασθενειών σχετιζόμενων με τους nAChRs. Επιπλέον των παραπάνω, συμμετείχα σε δύο εργασίες που έγιναν σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Δρ Ρ. Μάτσα και Δ. Θωμαΐδου στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ. H πρώτη αφορούσε σε σωματικά κύτταρα που αποδιαφοροποιήθηκαν και στη συνέχεια τους δόθηκε νευρωνικός προσανατολισμός (iPSCs derived neurons) για την έρευνα της νόσου Parkinson, και η δεύτερη αφορούσε τον επαναπρογραμματισμό των αστροκυττάρων και MEFs σε νευρώνες. Η νόσος Parkinson (PD) είναι μια ανίατη νευροεκφυλιστική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από κινητικά και μη κινητικά ελλείμματα, συμπεριλαμβανομένης της νοητικής πτώσης και της άνοιας. Η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη συνδέεται έντονα με την παθογένεια της PD, ενώ οι μεταλλάξεις της α-συνουκλεΐνης, όπως η σημειακή μετάλλαξη ρ.Α53Τ, προκαλούν οικογενείς μορφές PD. Η συμβολή μου σε αυτή τη μελέτη έγινε με την άντληση ηλεκτροφυσιολογικών δεδομένων, προκειμένου να αξιολογηθούν κατά πόσο οι επαγόμενοι νευρώνες είχαν φθάσει σε τέτοια ωρίμανση ώστε να μπορούν να έχουν τις ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων. Τα ευρήματα μας έδειξαν ότι οι επαγόμενοι νευρώνες πράγματι είχαν ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων.Τέλος, στη δεύτερη εργασία παρουσιάστηκαν ηλεκτροφυσιολογικά δεδομένα όπου καταδεικνύουν ότι υπερέκφραση του Cend1 συνεργιστικά με την neurogenin 2, σε υψηλά επίπεδα, οδηγεί τα νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα σε έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση ειδικά προς το νευρωνικό φαινότυπο. Έτσι, η ηλεκτροφυσιολογική μελέτη των κυττάρων αυτών έδειξε ότι τα κύτταρα αυτά παρουσίασαν ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων.