Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων με την αξιοποίηση νανοσωματιδίων
Authors: Χριστοπούλου Ναταλία-Μαρία 
Published: July 2024

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί συμβολή στο πεδίο της Αναλυτικής/Βιοαναλυτικής Χημείας και ιδιαίτερα στην ανάπτυξη και τις αναλυτικές εφαρμογές των χημικών αισθητήρων/βιοαισθητήρων αξιοποιώντας τα νανοσωματίδια ως ιχνηθέτες/σηματοδότες. Η διδακτορική διατριβή απαρτίζεται από δύο μέρη, το Γενικό Μέρος και το Πειραματικό Μέρος. Το Γενικό Μέρος (Κεφάλαιο 1) ξεκινάει παρουσιάζοντας τους κεντρικούς άξονες στους οποίους βασίζεται η ανάπτυξη πληθώρας μεθόδων ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού διαφόρων αναλυτών (από απλά ιόντα μέχρι μακρομόρια και μακρομοριακά σύμπλοκα) σε ποικιλία δειγμάτων. Στη συνέχεια επικεντρώνεται στους τρόπους με τους οποίους μπορεί να επιτευχθεί η ειδική μοριακή αναγνώριση του αναλύτη σε ένα δείγμα και η διασύνδεσή της με την παραγωγή σήματος, διαδικασία που αποτελεί τον πυρήνα για την ανάπτυξη (επινόηση, πειραματική μελέτη και αναλυτική εφαρμογή) των χημικών αισθητήρων/βιοαισθητήρων. Περιγράφονται οι αρχές των ανοσοχημικών μεθόδων ανάλυσης και των μεθόδων υβριδοποίησης DNA/RNA. Επίσης, παρουσιάζεται η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) ως τεχνική εκθετικής ενίσχυσης ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων. Για την παραγωγή σήματος, είναι αναγκαία η χρησιμοποίηση κατάλληλων ιχνηθετών. Η επιλογή του ιχνηθέτη επηρεάζει την ανιχνευσιμότητα των αναλυτικών μεθόδων και των αισθητήρων. Περιγράφονται, πιο συγκεκριμένα, οι χαρακτηριστικές οπτικές και καταλυτικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNPs) από όπου πηγάζουν οι ποικίλες εφαρμογές τους στην Αναλυτική/Βιοαναλυτική Χημεία. Οι ιδιότητες αυτές είναι η αιτία για τη γόνιμη συνάντηση του πεδίου της Αναλυτικής/Βιοαναλυτικής Χημείας με τη Νανοτεχνολογία. Επίσης παρουσιάζονται οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων χρυσού. Έπειτα περιγράφονται αντιπροσωπευτικά παραδείγματα αναλυτικών μεθόδων που βασίζονται στις ιδιότητες των AuNPs. Οι μέθοδοι έχουν επιλεγεί έτσι ώστε να καλύπτουν ποικιλία αναλυτών και δειγμάτων, καθώς και να υποδεικνύουν τρόπους σκέψης για την αξιοποίηση και άλλων τύπων νανοσωματιδίων. Ακολουθεί η περιγραφή των χημικών αισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων με έμφαση στην αρχιτεκτονική τους, τους τρόπους λειτουργίας και τα πλεονεκτήματά τους. Το Γενικό Μέρος κλείνει με την κάλυψη του φαινομένου του μακρομοριακού συνωστισμού και των ποικίλων επιπτώσεών του στη δομή και τη λειτουργικότητα των βιομακρομορίων. Επίσης, παρουσιάζονται και οι τρόποι αξιοποίησης του φαινομένου του μακρομοριακού συνωστισμού για την ανάπτυξη αναλυτικών αντιδραστηρίων και μεθόδων. Στο Πειραματικό Μέρος (Κεφάλαιο 2) περιγράφεται, για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία, η ανάπτυξη βιοαισθητήρων DNA για τη μοριακή ιχνηλασιμότητα της ποικιλιακής προέλευσης του ελαιολάδου και η εφαρμογή τους σε δείγματα DNA φύλλων ελιάς και ελαιολάδου. Η ταυτοποίηση των ποικιλιών βασίζεται στην ανίχνευση σειράς μονονουκλεοτιδικών αλλαγών στο DNA (μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs). Επιπλέον, οι βιοαισθητήρες που αναπτύχθηκαν έχουν τα εξής σημαντικά χαρακτηριστικά: (α) Είναι αισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων με ενσωματωμένα τα αντιδραστήρια αναγνώρισης του αναλύτη και παραγωγής σήματος, οπότε η χρήση τους είναι απλή. (β) Το σήμα ανιχνεύεται με γυμνό μάτι οπότε δεν υπάρχει ανάγκη για δαπανηρό εξοπλισμό. (γ) Είναι πολυαναλυτικοί αισθητήρες, δηλαδή καθιστούν εφικτή την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών αναλυτών/αλληλίων DNΑ. Η μέθοδος για την ταυτοποίηση της ποικιλιακής προέλευσης του ελαιολάδου περιλαμβάνει: (i) Πολλαπλή PCR (70 min). (ii) Πολλαπλή αντίδραση γονοτύπησης (15 min) για οκτώ αλλήλια. (iii) Απευθείας εφαρμογή των προϊόντων στους βιοαισθητήρες DNA όπου ανιχνεύεται σε 20 min η παρουσία ή μη οκτώ αλληλίων με τη μορφή έγχρωμων κηλίδων των οποίων ο συνδυασμός αποκαλύπτει την ταυτότητα της ποικιλίας της ελιάς. Η απλότητα, η πρακτικότητα, η φορητότητα και το χαμηλό κόστος είναι σημαντικά πλεονεκτήματα της προτεινόμενης μεθόδου σε σχέση με άλλες μοριακές τεχνικές. Τα Κεφάλαια 3 και 4 του Πειραματικού Μέρους επικεντρώνονται στους ανοσοχημικούς αισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, όπου η αναγνώριση του αναλύτη πραγματοποιείται με χρήση ειδικών αντισωμάτων, ενώ η παραγωγή σήματος επιτυγχάνεται με την αξιοποίηση έγχρωμων σωματιδίων, κυρίως νανοσωματιδίων χρυσού. Η πιο σημαντική πρόκληση στο πεδίο αυτό είναι η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των αισθητήρων χωρίς να επηρεάζεται η απλότητα και η πρακτικότητά τους. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενοι τρόποι βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας βασίζονται στον σχεδιασμό και την εφαρμογή νέων ιχνηθετών για επισήμανση των αντισωμάτων, δηλαδή, είτε νέων νανοσωματιδίων είτε ενζύμων σε συνδυασμό με ποικιλία υποστρωμάτων. Σε αντίθεση με τους παραπάνω τρόπους, η παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιεί το φαινόμενο του μακρομοριακού συνωστισμού για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας. Κύριο χαρακτηριστικό του μακρομοριακού συνωστισμού είναι ο περιορισμός του όγκου του νερού που είναι προσβάσιμος στα άλλα μόρια, ιδιαίτερα στα μεγαλομόρια και στα σωματίδια. Στο πολυσύχναστο μικροπεριβάλλον, η αποτελεσματική συγκέντρωση οποιονδήποτε αντιδρώντων μακρομορίων είναι υψηλότερη από την αναμενόμενη, με βάση τον ολικό όγκο, μοριακότητά τους. Οι συντελεστές διάχυσης των μακρομορίων μειώνονται καθώς αυξάνεται η έκταση του συνωστισμού. Επιπλέον, υπάρχει πληθώρα ασθενών αλληλεπιδράσεων που επηρεάζουν την τελική συμπεριφορά του συστήματος και προσθέτουν στην πολυπλοκότητά του. Η κατεύθυνση και το μέγεθος της επίδρασης εκτιμώνται μόνο πειραματικά και δεν μπορούν να προβλεφθούν με γενικευμένα μοντέλα. Στο Κεφάλαιο 3 αποδείχθηκε η επίδραση του μακρομοριακού συνωστισμού στην ανιχνευσιμότητα των ανοσοαισθητήρων χρησιμοποιώντας δύο από τους πιο ευρέως καθιερωμένους ανοσοαισθητήρες, παγκοσμίως, δηλαδή τους ανοσοαισθητήρες για την ανίχνευση της πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου του SARS-CoV-2 (που προκαλεί τη νόσο COVID-19) και την ανίχνευση του αντιγόνου Strep-A (που σχετίζεται με τη φαρυγγίτιδα και άλλες ασθένειες). Για άμεση απόδειξη της βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, οι παράγοντες μακρομοριακού συνωστισμού εφαρμόστηκαν απευθείας στους εμπορικά διαθέσιμους ανοσοαισθητήρες που ήταν ήδη βελτιστοποιημένοι ως προς τα αντιδραστήρια και τις συνθήκες. Παρουσία υδατοδιαλυτών παραγόντων μακρομοριακού συνωστισμού επετεύχθη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των ανοσοαισθητήρων κατά 5-10 φορές. Η βελτίωση αποδίδεται στο γεγονός ότι η έκθεση των αντισωμάτων και των συζευγμάτων των νανοσωματιδίων στο περιβάλλον μακρομοριακού συνωστισμού, ενώ παράλληλα κινούνται μέσω του πυκνού δικτύου των πόρων της μεμβράνης (λόγω δράσης τριχοειδών δυνάμεων), προάγει τις αλληλεπιδράσεις που είναι υπεύθυνες για την αναγνώριση του αναλύτη και την παραγωγή σήματος.Στο Κεφάλαιο 4 αξιοποιείται το φαινόμενο του μακρομοριακού συνωστισμού για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των ανοσοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για αλλεργιογόνα. Οι αλλεργίες αποτελούν μεγάλη πρόκληση για τη δημόσια υγεία και ο έλεγχος για την ύπαρξη αλλεργιογόνων ουσιών στα τρόφιμα είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη/προστασία των ευαίσθητων ατόμων. Ο έλεγχος βασίζεται στην ικανότητα των αναλυτικών μεθόδων να ανιχνεύουν χαμηλά επίπεδα αλλεργιογόνων σε δείγματα τροφίμων. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η επίδραση του μακρομοριακού συνωστισμού στην ανιχνευσιμότητα των ανοσοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για το αλλεργιογόνο των φιστικιών. Εξετάστηκε η επίδραση 14 υδατοδιαλυτών πολυμερών συνωστισμού διαφορετικών μοριακών μαζών και διαφορετικών συγκεντρώσεων στην ανιχνευσιμότητα του ανοσοαισθητήρα. Συνολικά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μακρομοριακοί παράγοντες συνωστισμού, σε βέλτιστες συγκεντρώσεις, προκαλούν σημαντική βελτίωση στην ανιχνευτική ικανότητα των ανοσοαισθητήρων μέσω ενίσχυσης σήματος χωρίς αύξηση της μη ειδικής δέσμευσης. Επιτεύχθηκε βελτίωση στην ανιχνευσιμότητα του ανοσοαισθητήρα κατά 10 φορές περίπου. Η πιο σημαντική πτυχή της μελέτης είναι ότι η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας επιτυγχάνεται χωρίς να επηρεάζεται η απλότητα και η πρακτικότητα των αναλύσεων. Η μέθοδος δεν αντικαθιστά τους άλλους τρόπους βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, οι οποίοι βασίζονται στη χρήση νέων ιχνηθετών, αλλά προτείνεται ως μια πρόσθετη και συμπληρωματική οδός για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας μέσω διαφορετικού μηχανισμού.Επειδή οι βιομακρομοριακές αλληλεπιδράσεις έχουν θεμελιώδη λειτουργικό ρόλο σε όλους τους τύπους των βιοαισθητήρων, τόσο για τη μοριακή αναγνώριση του αναλύτη όσο και για τη μετατροπή της αναγνώρισης σε ανιχνεύσιμο σήμα (π.χ. οπτικό, ηλεκτροχημικό), αναμένεται ότι η προτεινόμενη στρατηγική για τη βελτίωση της ανιχνευτικής ικανότητας με την αξιοποίηση παραγόντων μακρομοριακού συνωστισμού θα βρει εφαρμογές σε ποικιλία άλλων βιοαισθητήρων και αναλυτικών συσκευών ή/και αναλυτικών μεθόδων πέρα από τους ανοσοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων.