Βελτίωση των ζυμωτικών ικανοτήτων στελεχών Saccharomyces cerevisiae που χρησιμοποιούνται στην οινοποιία μέσω προσαρμοστικής εργαστηριακής εξέλιξης
Authors: Μαυρομμάτη Μαρία 
Published: October 2023

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών Saccharomyces cerevisiae με βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες, μέσω μιας καινοτόμου εργαστηριακής τεχνικής, βασιζόμενης στις αρχές της φυσικής επιλογής, της Προσαρμοστικής Εργαστηριακής Εξέλιξης (Adaptive Laboratory Evolution- ALE). Χρησιμοποιήθηκαν τα χαρακτηρισμένα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR. Το πρώτο πείραμα ALE διενεργήθηκε με σκοπό την απόκτηση κυτταρικών πληθυσμών ανθεκτικότερων (σε σχέση με τα άγρια στελέχη) σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες των κυττάρων σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 20 g/l γλυκόζη ακολουθούμενες από επιλογή υπό αυστηρή εξελικτική πίεση (1-3 h επώασης σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18%, 23% ή 25% v/v αιθανόλης), κυκλικά για 150 και 200 γενεές, για τα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR, αντίστοιχα. Κατόπιν 100 γενεών εξέλιξης, ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB επιβίωσε σε 25% v/v αιθανόλη για 4 h και ο εξελιγμένος πληθυσμός BLR σε 23% v/v αιθανόλη για 2 h. Και οι δύο εξελιγμένοι πληθυσμοί επέδειξαν βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες σε σύγκριση με τα άγρια στελέχη σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l γλυκόζη, περατώνοντας τη ζύμωση 166 h και 130 h νωρίτερα, αντίστοιχα, ενώ παρήγαγαν μέγιστες συγκεντρώσεις αιθανόλης 94,77 g/l και 98,67 g/l, σε σύγκριση με 84,91 g/l και 78,09 g/l των αγρίων στελεχών, αντίστοιχα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκη Ασύρτικου και Ροδίτη, τα άγρια στελέχη σε όλες τις περιπτώσεις ολοκλήρωσαν τη ζύμωση νωρίτερα από τους πληθυσμούς 100 γενεών εξέλιξης (20 h έως 428 h νωρίτερα), ενώ οι εξελιγμένοι πληθυσμοί στην πλειονότητα των περιπτώσεων είχαν μεγαλύτερη απόδοση σε αιθανόλη. Ο αυξημένος χρόνος ζύμωσης των εξελιγμένων πληθυσμών οφειλόταν στο χρόνο κατανάλωσης της φρουκτόζης του γλεύκους, ο οποίος ήταν σε όλες τις περιπτώσεις πολύ μεγαλύτερος (κατά 70-336 h) του χρόνου αφομοίωσης της γλυκόζης. Οι συγκεντρώσεις των περισσοτέρων πτητικών ενώσεων των οίνων οι οποίοι προέκυψαν από τα άγρια στελέχη και τους εξελιγμένους κυτταρικούς πληθυσμούς ήταν διαφορετικές μεταξύ τους.Το δεύτερο πείραμα ALE είχε ως στόχο την απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών S. cerevisiae, ανθεκτικότερων στην αιθανόλη, οι οποίοι ταυτοχρόνως θα έχουν τη δυνατότητα να αφομοιώνουν αποτελεσματικότερα τη φρουκτόζη. Για την υλοποίηση αυτού του στόχου πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες σε θρεπτικό υλικό με 20 g/l φρουκτόζη, ακολουθούμενες από επιλογή για 3 h σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18% v/v αιθανόλης, κυκλικά για 100 γενεές. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l φρουκτόζη, το άγριο στέλεχος CFB, ο πληθυσμός CFB 100 γενεών εξέλιξης και ο πληθυσμός BLR 100 γενεών εξέλιξης άφησαν αζύμωτες ποσότητες φρουκτόζης 54,27 g/l μετά από 2100 h επώασης, 17,54 g/l μετά από 2100 h επώασης και 11,99 g/l μετά από 2000 h επώασης, αντίστοιχα, ενώ το άγριο στέλεχος BLR περάτωσε τη ζύμωση σε 400 h. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 100 g/l γλυκόζη και 100 g/l φρουκτόζη (προσομοίωση γλεύκους) το άγριο στέλεχος CFB άφησε αζύμωτες ποσότητες γλυκόζης και φρουκτόζης 8,76 g/l και 36,31 g/l, αντίστοιχα μετά από 1000 h επώασης, ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 150 γενεές σε γλυκόζη ολοκλήρωσε τη ζύμωση σε 495 h και ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 170 h. Το άγριο στέλεχος BLR, ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 200 γενεές σε γλυκόζη και ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη περάτωσαν τη ζύμωση σε 354 h, 312 h και 436 h, αντίστοιχα. Οι διαφορετικές ζυμωτικές συμπεριφορές επιβεβαιώθηκαν από τις κινητικές παραμέτρους που ελήφθησαν μετά από προσαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Aiba στα πειραματικά δεδομένα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκος Ασύρτικου, το άγριο στέλεχος CFB και ο εξελιγμένος πληθυσμός 150 γενεών σε γλυκόζη, ολοκλήρωσαν τη ζύμωση σε 140 h, καταναλώνοντας ταυτόχρονα τη γλυκόζη και τη φρουκτόζη του γλεύκους και ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB 100 γενεών σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 236 h και κατανάλωσε τη γλυκόζη 71 h νωρίτερα από τη φρουκτόζη. Το άγριο στέλεχος BLR οδήγησε το γλεύκος σε πλήρη ξηρότητα στις 165 h, έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 25 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη, ο εξελιγμένος πληθυσμός 200 γενεών σε γλυκόζη το οδήγησε σε πλήρη ξηρότητα σε 380 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 144 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη και ο πληθυσμός εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη κατανάλωσε και τα δύο σάκχαρα σε 236 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 50 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών παραχθέντων οίνων παρατηρήθηκαν σε επτά αλκοόλες, πέντε εστέρες και πέντε οξέα. Οι εν λόγω διαφορές επιβεβαιώθηκαν μερικώς από τον οργανοληπτικό έλεγχο των οίνων.Η παρούσα διδακτορική διατριβή φιλοδοξεί να συμβάλει στην ευρύτερη εφαρμογή της εργαστηριακής εξέλιξης (ALE) τόσο στη βιομηχανία παραγωγής βιοαιθανόλης, όσο και στην οινοποιία, με στόχο την απόκτηση νέων στελεχών ζυμομυκήτων με βελτιωμένες ιδιότητες.