Μελέτη της δράσης φυσικών προϊόντων έναντι ενδοκυττάριων παρασιτικών οργανισμών
Authors: Κυριαζής Ιωάννης 
Published: August 2021

Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει εμβόλιο για καμιά μορφή των λεϊσμανιάσεων και τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται δεν είναι ασφαλή, αποτελεσματικά και οικονομικά προσιτά. Υπάρχει άφθονη επιστημονική πληροφορία για τα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται με αναγνωρισμένα μειονεκτήματα όπως η τοξικότητα, η ανάπτυξη αντοχής, η υποχρεωτική παραμονή στο νοσοκομείο και το υψηλό κόστος. Επιπλέον η συλλοίμωξη με τον ιό του AIDS (HIV/VL) έχει σοβαρές επιπτώσεις στην επιδημιολογία, τη διάγνωση και την πρόγνωση της νόσου. Είναι προφανές ότι η εκδήλωση της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης είναι “ευκαιριακή” όπως αποδεικνύεται από τα στοιχεία του Π.Ο.Υ., σύμφωνα με τα οποία οι ασθενείς με AIDS έχουν 3.000 φορές υψηλότερη συχνότητα VL σε σύγκριση με τον γενικό πληθυσμό.Για τα διάφορα είδη του γένους Leishmania υπάρχουν αξιόλογα ευρήματα από παρασιτολογικές, βιοχημικές, μοριακές και ανοσολογικές μελέτες, όμως τα θεραπευτικά πρωτόκολλα ενάντια των διαφορετικών κλινικών μορφών δεν είναι ικανοποιητικά. Γεγονός αποτελεί η αδήριτη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων κατά των λεϊσμανιάσεων που μαστίζουν έως και 1,7 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλη την γη. Σήμερα το ενδιαφέρον για φυσικά προϊόντα βρίσκεται σε επικαιρότητα κυρίως με την αναζήτηση νέων χημικών ενώσεων αλλά και την επανεξέταση παλαιοτέρων σε σύγχρονα πλέον πειραματικά πρωτόκολλα. Μεταξύ αυτών των προϊόντων η ελαιοευρωπεΐνη, που προέρχεται από το δένδρο της ελιάς (Olea europaea), χαρακτηρίζεται από αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση. Η βιοφαινόλη αυτή φαίνεται να συμβάλλει επίσης στην μακροζωία αλλά και όταν χορηγείται σε πειραματόζωα με καρκινικούς όγκους είναι ικανή στο να τους συρρικνώνει ή ακόμη και να τους εξαφανίζει.Ο σκοπός αυτής της διατριβής είναι η διερεύνηση φυσικών προϊόντων προερχόμενων από τα φύλλα και τους καρπούς του δέντρου της ελιάς αλλά και από πάρα-προϊόντα του όπως τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου. Επίσης εξετάσθηκαν δύο αδρά εκχυλίσματα από τον ερυθρό οίνο ποικιλίας ξινόμαυρο. Αμφότερες οι πηγές των εκχυλισμάτων αποτελούν θεμελιώδεις λίθους της Μεσογειακής διατροφής και οι βιβλιογραφικές αναφορές τα καθιστούν ως υποσχόμενους αντιλεϊσμανιακούς παράγοντες. Τα αποτελέσματά έδειξαν ότι τα δύο καθαρά φυσικά προϊόντα που εξετάσθηκαν, η υδροξυτυροσόλη και η ελαιοευρωπεΐνη επέδειξαν επιλεκτική και σημαντική αντιλεϊσμανιακή δραστικότητα εναντίον τριών ειδών πρωτοζώων του γένους Leishmania και συγκεκριμένα των L. infantum, L. donovani και L. major. Η διατριβή εστιάστηκε στη ελαιοευρωπεΐνη και αναδείχθηκε η ικανότητά της να προκαλεί ρυθμιζόμενο κυτταρικό θάνατο αποδεικνυόμενο από μορφολογικές αλλαγές σε προμαστιγότες L. donovani, λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης, με τη χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας. Η στρογγυλοποίηση των προμαστιγοτών, η συμπύκνωση της χρωματίνης καθώς και η έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταροπλασματικής μεμβράνης με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής είναι φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της επαγωγής ρυθμιζόμενου παρασιτικού θανάτου που αποδείχθηκε ότι ο μηχανισμός πρόκλησής του είναι ανεξάρτητος της παραγωγής ROS. Επιπλέον η ελαιοευρωπεΐνη προκάλεσε μια καθυστέρηση στο φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο του παρασίτου οδηγώντας στον κατακερματισμό του DNA. Η αντιλεϊσμανιακή δράση της ελαιοευρωπεΐνης αποδείχτηκε και εναντίον των αμαστιγωτικών μορφών του είδους L. donovani που είχαν in vitro παρασιτήσει σε μακροφάγα της κυτταρικής σειράς J774Α.1. Αυτή η δράση συνοδεύτηκε από μία ενδομακροφαγική αύξηση ROS ενώ η in vitro χορήγηση ελαιοευρωπεΐνης σε μυελοειδή DCs αύξησε τον πληθυσμό που παράγει IL-12 δίχως να προκαλεί παράλληλη ωρίμανσή τους.Τα ανωτέρω οδήγησαν στη μελέτη της δράσης της ελαιοευρωπεΐνης σε in vivo πειραματικό μοντέλο σπλαχνικής λεϊσμανίασης. Σε L. donovani μολυσμένα BALB/c ποντίκια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς ελαιοευρωπεΐνη κάθε δεύτερη ημέρα για 28 συνεχόμενες ημέρες σε τρεις διαφορετικές δόσεις (45, 15 και 5mg/kg σωματικού βάρους). Βρέθηκε ότι και οι τρεις δόσεις περιόρισαν το παρασιτικό φορτίο του σπλήνα και του ήπατος στις 3 ημέρες και στις 6 εβδομάδες μετά το πέρας της χορήγησης της ελαιοευρωπεΐνης. Διαπιστώθηκε ότι τα πειραματόζωα που έλαβαν ελαιοευρωπεΐνη και περιόρισαν την ενδοκυτταρική εξάπλωση του παρασίτου στο σπλήνα και στο ήπαρ ανέπτυξαν μια ενισχυμένη ΤΗ1 τύπου ανοσολογική απόκριση με χαρακτηριστικό ισοτυπικό προφίλ αντισωμάτων IgG2α/IgG1 και μεταγραφικών παραγόντων Tbx21/GATA-3. Η υπερ-έκφραση των IL-12p40, IFNγ, TNFα και iNOS επιβεβαιώνει την πόλωση προς τον ΤΗ1 υποτύπο ανοσολογικής απόκρισης, ενώ η έκφραση των κυτταροκινών ρυθμιστές της TΗ2 ανοσολογικής απάντησης δεν είχαν καμία αυξητική τάση. Αυτό το φαινόμενο που προέρχεται αρχικώς από την ικανότητα της ελαιοευρωπεΐνης να διατηρεί χαμηλά τα επίπεδα της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-1β, επιτρέπει τον ανοσολογικό μηχανισμό του ξενιστή να ενεργοποιηθεί (μεταγραφή του Tbx21) αποτρέποντας την είσοδο του ξενιστή σε κατάσταση χρόνιας φλεγμονικής διεργασίας που ευνοεί τον παρασιτικό πολλαπλασιασμό.Απεναντίας ενεργοποιούνται μηχανισμοί παραγωγής των μικροβιοκτόνων μορίων ROS και NO• στο σπλήνα και στο ήπαρ. Η παραγωγή των ROS σε σπληνοκύτταρα ποντικών μολυσμένων με L. donovani ήταν δοσοεξαρτώμενη ενώ αντιθέτως η παραγωγή των ΝΟ• ήταν μη-δοσοεξαρτώμενη τόσο σε κύτταρα του σπλήνα όσο και του ήπατος. Αυτή η παραγωγή των ΝΟ• φαίνεται να επιδρά στην επιβίωση των παρασίτων χωρίς να αλλοιώνει τη φυσιολογική λειτουργία των σπληνοκυττάρων και των ηπατοκυττάρων εφ’ όσον τα μόρια γλουταθειόνης στα κύτταρα του ξενιστή ήταν επαρκή για να συντηρούν τη συνεχή επιβίωση του κυττάρου ξενιστή όπως παρατηρήθηκε με την μη-ενεργοποίηση του NF-kB. Επίσης η ελαιοευρωπεΐνη επιλεκτικά ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση των ενζύμων που σχηματίζουν τη γλουταθειόνη και την τρυπανοθειόνη εις βάρος των αντιοξειδωτικών αμυντικών μηχανισμών του παρασίτου. Συμπερασματικά, το σύνολο των αποτελεσμάτων που περιεγράφηκαν στη διδακτορική αυτή διατριβή, προτείνουν ότι η ελαιοευρωπεΐνη δρα ως ένα αντιλεϊσμανιακό φάρμακο με ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες. Η διερεύνηση της συνδυαστικής δράσης κλασσικών αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων με ασφαλή, μη-τοξικά και “φθηνά” φυσικά προϊόντα όπως η ελαιοευρωπεΐνη, παραμένει μια υποσχόμενη μελλοντική προοπτική. Επιπροσθέτως, ενδιαφέρουσα θα ήταν η διερεύνηση της δράσης της ελαιοευρωπεΐνης στην έκφραση έτερων γονιδίων που κωδικοποιούν αντιοξειδωτικά ένζυμα καθώς και στους κυτταρικούς πληθυσμούς που εμπλέκονται επίσης σε in vivo πειραματικό μοντέλο σπλαχνικής λεϊσμανίασης όπως τα δενδριτικά κύτταρα, τα κύτταρα φυσικοί φονιάδες και τα CD8+. Τέλος η ελαιοευρωπεΐνη μπορεί να δοκιμασθεί σε HIV/L. donovani πειραματικό πρωτόκολλο αφού η ελαιοευρωπεΐνη είναι ικανή στο να σταματάει τον πολλαπλασιασμό του ιού HIV.