Nanoengineering approaches for guiding cellular behavior
Authors:   , Gugutkov Dencho 
Published: July 2023

Tissue engineering aims to replace restore or help regeneration of injured tissue or organ with scaffolds that mimic the natural extracellular matrix (ECM). The design of such scaffolds requires deeper understanding of the factors that determine the cellular behavior. This thesis is focused on the cell-biomaterials interaction, but it strives to go beyond the classical material science, looking for new options to obtain control over the cell behavior. Cellular interaction with artificial substrata is a well-described paradigm usually attributed to the adsorption of adhesive proteins from the surrounding medium. The recognition of these proteins triggers an order of specific signaling events, reminiscent of the natural interaction of cells with ECM, affecting strongly their behavior. One important aspect of such interaction, however, is the organization of the matrix proteins - a hallmark for the ordinary ECM. Recent studies in our group showed that also in-vitro the cells tend to create organization. They remodel the adsorbed matrix proteins (in a fibril-like pattern) as an attempt to make their own provisional ECM. This phenomenon, described basically for fibronectin (FN), appears to involve also other matrix proteins, such as fibrinogen (FBG), and even collagen IV and vitronectin, which, being non fibrillar proteins by their nature, also undergo linear reorganization. Thus, cells somehow “prefer” fibrillar assemblies trying to imprint such patterns in their microenvironment. Other types of protein arrangements, however, for example network-like assemblies, which are also typical for the ECM, are insufficiently studied and this comprises an essential part of this work. In the first part of the thesis, particular attention is devoted on the peculiar behavior of adsorbed FN and FBG in the nanoscale observed by atomic force microscopy (AFM). Joint work with the group of Prof Salmeron-Sanches from the Polytechnic University in Valencia revealed that apart from the classical view for rather stochastic adsorption of matrix proteins, the lateral protein-protein interactions prevail on some surfaces giving rise to self-assembly in a network-like structures with significant consequences on the cell behavior. The thesis focuses particularly on the biological activity of these networks. The performed studies clearly suggested that the modulation of the network formation (using model surfaces with varying density of -OH groups) has evident impact on cell adhesion and functionality ¿ a fact, confirmed with two different cell systems: fibroblasts and endothelial cells. Another line of performed research lie on the fact that matrix proteins can sequestrate from the surrounding liquid phase to form structures of various shapes, including fibres with a diameter of only few nanometres and lengths up to centimetres; thus resembling the natural ECM components. A fascinating possibility to mimic similar structures is to engineer nanofibers, based on matrix proteins, via electrospinning technology - an approach extensively explored in the second part of the thesis. It was evidently shown that the cells readily recognize such fibrils and attach to them much faster than on planar substrata. Thus, one can anticipate that mimicking the organization of ECM with nanofibers will help to understand how cells respond to such an environment, an issue that is fundamental for biology. Besides, this approach represents an additional tool for controlling the cell behavior as proposed in this thesis. Therefore nanofibers based on natural matrix proteins (e.g., fibrinogen, fibronectin) and synthetic polymers (e.g. polylactic acid, (PLA); poly(ethylacrilate), (PEA)) were systemically elaborated. Their implication as a model system revealed that by varying with the composition, the organization and the mechanical properties of these fibres a tight control over the cellular response may be obtained.

La ingeniería de tejidos tiene el objetivo de reemplazar, restaurar o regenerar tejidos dañados con matrices que mimetizan la matriz extracelular natural (MEC). El diseño de dichas matrices requiere un profundo conocimiento de los factores que gobiernan el comportamiento celular. Esta tesis se centra en las interacciones entre células y biomateriales, pero pretende ir más allá de los límites de la ciencia de materiales con el fin de contribuir al desarrollo de nuevos métodos para controlar el comportamiento celular. Las interacciones de las células con sustratos artificiales son un paradigma bien caracterizado, atribuido a la adsorción de proteínas adhesivas del medio circundante. El reconocimiento de dichas proteínas desencadena eventos de señalización celular reminiscentes de las interacciones naturales célula-MEC que afectan al comportamiento de las células adherentes. Un aspecto importante de dicha interacción es la organización de las proteínas de la matriz, que caracteriza la MEC. Estudios recientes han demostrado que in vitro las células tienden a crear organización, remodelando las proteínas de matriz adsorbidas (en un patrón fibrilar) a fin de generar su propia MEC provisional. Este fenómeno descrito básicamente para la fibronectina (FN), parece involucrar otras proteínas de la matriz como el fibrinógeno (FBG), el colágeno IV y la vitronectina, las cuales, no siendo proteínas fibrilares por naturaleza, experimentan una reorganización linear. Así, las células, de alguna manera, “prefieren” una disposición “fibrilar” intentando grabar dichos patrones en su microambiente. Otros tipos de disposición típicos en la MEC, p.ej. en forma de red, han sido poco estudiados, y constituirán una parte esencial de esta tesis. En la primera parte del trabajo, se presta atención especial al comportamiento peculiar de la FN y la FBG adsorbidas, observado mediante microscopía de fuerza atómica (MFA). Un trabajo conjunto con el Prof. Salmerón-Sánchez de la Universidad Politécnica de Valencia reveló que aparte de adsorción estocástica, en algunas superficies las interacciones laterales proteína-proteína prevalecen, dando lugar al auto-ensamblaje en estructuras de red con efectos significativos sobre el comportamiento celular. Esta tesis se centra especialmente en la actividad biológica de estas redes. Los estudios realizados claramente sugieren que la modulación de la reticulación (usando superficies modelo con densidad variable de grupos hidroxilo) tiene un evidente impacto en la adhesión y funcionalidad celular- confirmado mediante dos sistemas celular: fibroblastos y células endoteliales. Otra línea de investigación se basa en el hecho de que las proteínas de la matriz en solución se pueden secuestrar de la fase líquida circundante, formando estructuras diversas, incluyendo fibras con un diámetro de unos nanómetros, similares a los componentes de la MEC. La ingeniería de nanofibras basada en las proteínas de la matriz, mediante tecnología de “electrospinning”, ofrece posibilidades fascinantes para mimetizar estas estructuras. Esta aproximación se explora en la segunda parte de esta tesis, en la que se demuestra que las células se anclan más rápido y reconocen más fácilmente estas fibras. Por lo tanto, puede anticiparse que mimetizar la organización fibrilar de la MEC mediante nanofibras puede contribuir a comprender como las células responden a su entorno, un fenómeno esencial para la biología. Además, este método representa una herramienta adicional para controlar el comportamiento celular como se propone en esta tesis. Por lo tanto, nanofibras basadas en las proteínas naturales de la matriz (p.ej. FBG o FN) así como en polímeros sintéticos (p.ej. ácido poliláctico (PLA), o el polietacrilato (PEA)) fueron sistemáticamente elaboradas. Su implicación como sistemas modelo reveló que variando la composición, organización y propiedades mecánicas de estas fibras puede obtenerse un control preciso sobre las respuestas celulares.

Тъканното инженерство цели възстановяване или регениране на увредени тъкани или органи посредством матрици (“scaffolds”), които имитират естествения екстрацелуларен матрикс (ЕЦМ). Разработването на такива подложки обаче изисква дълбоко познаване на факторите, определящи клетъчното поведение. Тази дисертация се фокусира върху взаимодействието клетка-биоматериал като се стреми да надникне отвъд класическото материалознание, тъсейки нови подходи за осъществяване на контрол върху поведението на клетката.
Клетъчното взаимодействие с изкуствени субстрати е добре описан парадигъм, който обикновено се свързва с адсорбцията на адхезивни протеини от заобикалящата среда. Разпознаването на тези протеини запуска редица сигнални мехамизми, наподобяващи естественото взаимодействие на клетките с екстрацелуларния матрикс, и повлиява поведението на адхериралите клетки. Важен аспект на едно такова взаимодействие е организацията на адхезивните матриксни протеини – знакова характеристика за нативния екстрацелуларен матрикс.
Предишни изследвания в нашата група показаха, че дори in-vitro клетките са склонни да създават организация. Те ремоделират адсорбираните матриксни протеини (най- често във фибриларна форма) в опит да създадат собствен, кратковременен екстрацелуларен матрикс. Въпреки, че този феномен е установен и описан предимно за фибронектина (ФН), се оказва, че той включва и други матриксни протеини, например фибриноген (ФБГ), и дори колаген тип IV и витронектин (ВН), които, макар и нефибриларни по своята природа, също претърпяват линейна реорганизация. Следователно, клетките по някакъв начин „предпочитат“ фибриларната организация на протеините и се опитват да „отпечатат“ подобни структури в най-непосредствено си обкръжение. Други типове организация, обаче, като например мрежовиднaта, също типичнa за ЕЦМ, са недосатъчно изследвани и това съставлява съществена част от настоящата дисертация.
Първата част на този тезис обръща особено внимание на специфичното поведение на адсорбирани ФН и ФБГ в наноразмерната област, което може да бъде наблюдавано посредством атомно-силова микроскопия (АФМ). Съвместната работа с групата на проф. Салмерон-Санчес от Политехническия университет на Валенсия (в момента в Университета на Глазгоу (Шотландия)), показа, че отделно от класическото разбиране за стохастична адсорбция на матриксните протеини, върху някои повърности може да пробладава латералното взаимодействие между техните молекули, водещо до самоорганизирането им в мрежоподобни структури, имащи значителни последствия както върху поведението на протеина, така и върху неговата биоактивност. Настоящият труд е фокусиран именно върху биологичната активност на тези супрамолекулни структури, докато феноменът на образуването им сам по себе си, както и неговите наноинженерни аспекти, са обект на отделни изследвания. Проучванията, проведени в обхвата на тази дисертация ясно доказаха, че чрез промяна в повърхностната плътност на –ОН групи може силно да се повлияе способността за мрежовидна самоорганизация на някои белтъци, а от там и клетъчното поведение – факт, потвърден при две отделни клетъчни системи: фибробласти и ендотелни клетки.
Друга линия на изследвания се основава на факта, че, в разтвор, белтъците могат да секвестират от заобикалящата ги течна фаза и да формират различни структурни форми, включително фибри с диаметър от само няколко нанометра и дължина до сантиметри, наподобяващи естественната организация на ЕЦМ. Интригуваща възможност за имитиране на подобни структури е разработването на нановлакна, базиращи се на матриксни протеини, посредством технологията на електроовлакняване (електроспининг) – подход, който е широко застъпен във втората част на дисертацията. Там безспорно е показано, че клетките се прикрепят по- добре към такива нановлакна и явно ги разпознават – феномен, който макар и не напълно разбран, бе потвърден в редица изследвания. Следователно, имитирането на фибриларната организация на ЕЦМ би спомогнала да разберем как клетките реагират на подобна среда – въпрос, който е фундаментален за клетъчната биология. Наред с това, подобен подход предствавлява и допълнителен инструмент за контрол на клетъчното поведение, въпрос които подробно е застъпен в настоящия тезис. И така, базирайки се на естествени матриксни протеини, какъвто е фибриногенът, и на синтетични полимери, каквито са полимлечната киселина (PLA) и полиетилакрилатът (PEA), бяха разработени нов тип хибридни нановлакна и тяхното използване като модална система разкри, че варирайки с тяхната композиция, организация и механични свойства би могло да се осъществи прецизен контрол върху клетъчния отговор. Настоящата дисертация се базира на пет оригинални публикации, организирани в пет отделни глави (Глава 2 до Глава 6), подредени в логична и йереархична последователност, и носещи едноименни със съответната публикация заглавия. Подробното Въведение (Глава 1) и кратките уводни бележки към всяка глава отразяват същественото в публикуваната работа и негйното положение спрямо цялостната тематика на дисертацията, формулирана ясно в раздела “Цел и задачи”.