Μελέτη της συσχέτισης της εντερικής μικροχλωρίδας και του υποκείμενου ανοσολογικού συστήματος σε ασθενείς με ΙΦΝΕ με σκοπό την ανάδειξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων
Authors: Ταραπατζή Γεσθημανή 
Published: February 2025

Η Νόσος Crohn και η Ελκώδης κολίτιδα αποτελούν τις κύριες μορφές των Ιδιοπαθών Φλεγμονωδών Νόσων του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Οι συγκεκριμένες νόσοι χαρακτηρίζονται από παρατεταμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις που οδηγούν στη διαταραχή της αρχιτεκτονικής του τοιχώματος του εντέρου καθώς και σε πιθανή ανάπτυξη ίνωσης. Η καρκινική επιθηλιακή κυτταροσειρά HT-29 αποτελεί ένα εγκαθιδρυμένο in vitro μοντέλο μελέτης των ανοσοπαθολογικών μηχανισμών που ενέχονται στις ΙΦΝΕ, μεταξύ αυτών η ακεραιότητα του επιθηλιακού φραγμού και οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις του εντέρου. Οι εντερικοί υποεπιθηλιακοί μυοϊνοβλάστες (ΕΥΜ) είναι κύριοι ρυθμιστές των διαδικασιών της επούλωσης και της φλεγμονής του εντερικού βλεννογονίου συστήματος. Τα βακτηριακά στελέχη Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Heyndrickxia coagulans, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus rhamnosus και ο μύκητας Saccharomyces boulardii χρησιμοποιούνται ευρέος σε προβιοτικά συμπληρώματα, με την προοπτική να χορηγηθούν και ως επικουρική θεραπεία για τις ΙΦΝΕ. Κυρίαρχο σκοπό της παρούσας διατριβής αποτελούσε η μελέτη του αντίκτυπου των προαναφερθέντων προβιοτικών στελεχών, μεμονωμένων και σε προκατασκευασμένα μείγματα, σε γνωστά κυτταρικά μοντέλα έρευνας των ΙΦΝΕ, ούτως ώστε να διερευνηθεί η δυνητικότητα χρήσης αυτών ως επικουρικών θεραπειών για τις ΙΦΝΕ. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω προβιοτικών στην ταχύτητα πολλαπλασιασμού και στην mRNA έκφραση της φλεγμονώδους IL-8 και των στεγανών συνδέσμων στην κυτταροσειρά HT-29, καθώς και στο φλεγμονώδες και επουλωτικό δυναμικό των ΕΥΜ απομονωμένων από υγιή άτομα, από ασθενείς με Νόσο Crohn και από ασθενείς με Ελκώδη κολίτιδα.Τα HT-29 διεγέρθηκαν με 102 ή 104 ή 108 cfu/mL των προαναφερθέντων προβιοτικών, μεμονωμένων ή διαφόρων συνδυασμών αυτών, για 6 ώρες, και ο αντίκτυπος τους στην mRNA έκφραση της φλεγμονώδους χημειοκίνης CXCL8 και των πρωτεϊνών των στεγανών συνδέσεων Claudin1, JAMA, Occludin και Zonula Occludens 1 μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα HT-29 προ-διεγέρθηκαν επίσης με τις προ-φλεγμονώδεις IL-1α (5ng/ml) και TNF-α (50ng/ml) για 24 ώρες και έπειτα διεγέρθηκαν με 102 ή 104 ή 108 cfu/mL του μείγματος των Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactiplantibacillus plantarum και Saccharomyces boulardii για 6 ώρες, για τη μελέτη της έκφρασης των ίδιων παραγόντων. Ακόμα, πραγματοποιήθηκαν και 48ωρες διεγέρσεις με 102 ή 104 cfu/mL των προβιοτικών στελεχών και μειγμάτων για τη διερεύνηση της επίπτωσης τους στον πολλαπλασιαστικό ρυθμό των HT-29, με τη Δοκιμασία Επούλωσης Τραύματος. Επιπρόσθετα, λήφθηκαν ενδοσκοπικές βιοψίες παχέος εντέρου από υγιή άτομα ή από ασθενείς με Νόσο Crohn ή από ασθενείς με Ελκώδη κολίτιδα για την απομόνωση και τη μονοκαλλιέργεια πρωτογενών ανθρώπειων ΕΥΜ. Τα πρωτογενή αυτά κύτταρα διεγέρθηκαν με 102 ή 104 cfu/mL των μεμονωμένων προβιοτικών και συνδυασμών τους, με σκοπό τη μελέτη της επίδραση τους στις χημειοκινικές (CCL2, CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL14), κυτταροκινικές (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-22, IL-24, IL-26, IL-32α, IL-33, IFN-γ, TNF-α) και επουλωτικές (Κολλαγόνο Τύπου I, Κολλαγόνο Τύπου III, Φιμπρονεκτίνη, Tissue Factor, α-Smooth Muscle Actin) εκκρίσεις χρησιμοποιώντας qRT-PCR (έκφραση mRNA, 6ωρη επώαση), ELISA (πρωτεϊνικά επίπεδα χημειοκινών, 48ωρη επώαση) και Sircol Assay (εκκρινόμενο κολλαγόνο, 48ωρη επώαση). Τέλος, έγινε διέγερση των ΕΥΜ υγιών ατόμων και ασθενών με τα προβιοτικά για 48 ώρες, με στόχο τη διαλεύκανση της επιρροής τους στην ταχύτητα μετανάστευσης των ΕΥΜ, μέσω της Δοκιμασίας Επούλωσης Τραύματος. Οι υπό μελέτη προβιοτικοί οργανισμοί παραμένουν ζωντανοί και μεταβάλουν τη φλεγμονώδη και την επουλωτική συμπεριφορά των HT-29, των ΕΥΜ των υγιών ατόμων και των ΕΥΜ ασθενών με ΙΦΝΕ. Συγκεκριμένα, η προσθήκη του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii στα αδιέγερτα ΗΤ-29 ή στα προ-διεγερμένα με IL-1α και TNF-α ΗΤ-29 δεν επηρέασε την mRNA έκφραση των πρωτεϊνών των στεγανών συνδέσμων ClDN1, JAMA, OCLN και ZO-1, αλλά ούτε και της CXCL8. Όσον αφορά στην mRNA έκφραση της CXCL8, αυξήθηκε από την προσθήκη του μεμονωμένου L. plantarum και από την προσθήκη της μεγαλύτερης συγκέντρωσης 108 cfu/mL του H. coagulans, ενώ μειώθηκε από την προσθήκη των μικρότερων συγκεντρώσεων του H. coagulans, καθώς και από την προσθήκη του S. boulardii, του μείγματος των B. longum και L. rhamnosus και του μείγματος των B. longum, L. rhamnosus και L. acidophilus. Η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση των υπό μελέτη χημειοκινών και επουλωτικών παραγόντων από τους ΕΥΜ υγιών ατόμων ήταν άμεσα εξαρτώμενη από το στέλεχος ή τα στελέχη που χορηγήθηκαν, αλλά και από τη δόση που χρησιμοποιήθηκε. Η μικρότερη δόση B. lactis φάνηκε πως καταστέλλει την mRNA έκφραση των CXCL1, CXCL2 και CXCL6, ενώ η μεγαλύτερη δόση ωθεί την έκφραση των CCL2, CCL5, CXCL1 και CXCL2. H χορήγηση του L. acidophilus μείωσε την mRNA έκφραση της CXCL2, της CXCL6 και της CXCL8, ενώ αύξησε το mRNA της CXCL10. Το μεμονωμένο L. plantarum αύξησε την mRNA και την πρωτεϊνική έκφραση της CXCL8 και την mRNA έκφραση της CXCL10. Ο προβιοτικός μύκητας S. boulardii δείχθηκε πως αυξάνει τα mRNA της CCL5 και της CXCL5. Η έκφραση των mRNA του Κολλαγόνου τύπου Ι, του Κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, της Φιμπρονεκτίνης και του Tissue Factor αυξήθηκε από την προσθήκη του L. plantarum και μειώθηκε από την προσθήκη του L. acidophilus. Η mRNA έκφραση του Κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ μειώθηκε επίσης από τα μεμονωμένα B. lactis και S. boulardii, ενώ το B. lactis μείωσε και την mRNA έκφραση της Φιμπρονεκτίνης. Επιπλέον, το mRNA του Tissue Factor και η πρωτεϊνική έκκριση κολλαγόνου αυξήθηκαν από την χορήγηση του S. boulardii. Τέλος, η διέγερση των ΕΥΜ υγιών ατόμων με το μείγμα των προβιοτικών B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii οδήγησε στη μικρή αλλά στατιστικώς σημαντική αύξηση της mRNA έκφρασης των χημειοκινών CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL10, CCL2 και CCL5, στην αύξηση της mRNA έκφρασης της Φιμπρονεκτίνης και του Tissue Factor, ενώ παράλληλα μείωσε την mRNA έκφραση της α-SMA. Αξίζει να αναφερθεί ακόμα ότι η mRNΑ έκφραση των ιντερλευκινών ΙL-6, IL-8, IL-24 και IL-32 ήταν μη στατιστικώς σημαντικά αυξημένη στους αδιέγερτους ΕΥΜ από τους ασθενείς με Νόσο Crohn, και η προσθήκη του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii δεν την επηρέασε περεταίρω, με εξαίρεση μια μικρή αλλά επίσης μη στατιστικώς σημαντική αύξηση στο mRNA της IL-24.Όσον αφορά στα αποτελέσματα της χρήσης των μεμονωμένων στελεχών στον πολλαπλασιαστικό ρυθμό των HT-29 έπειτα από 48 ώρες διέγερσης, η χορήγηση των μεμονωμένων B. lactis, H. coagulans και S. boulardii φαίνεται πως τον ωθεί. Όσον αφορά στα αποτελέσματα της χορήγησης των μεμονωμένων προβιοτικών στελεχών στους ΕΥΜ υγιών ατόμων, το B. lactis, το L. plantarum, το S. boulardii και η μικρότερη δόση του H. coagulans αυξάνουν τη μεταναστευτική τους ικανότητα, ενώ το B. longum, το L. rhamnosus και η μεγαλύτερη δόση του H. coagulans τη μειώνουν. Προωθημένη είναι και η μετανάστευση των ΕΥΜ των ασθενών με Νόσο Crohn αλλά όχι των ασθενών με Ελκώδη κολίτιδα έπειτα από την προσθήκη του L. plantarum και του S. boulardii.Αν και η χρήση του κάθε μεμονωμένου στελέχους είχε διαφορετικές απόρροιες και στα δύο πειραματικά συστήματα, η παράλληλη χρήση πολλαπλών στελεχών ως προβιοτικών μειγμάτων έδειξε ικανή να εξισορροπήσει τα αποτελέσματα στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό τόσο των HT-29 όσο και των ΕΥΜ. Πιο λεπτομερώς, οι διεγέρσεις των HT-29 κυττάρων με το μείγμα των B. longum και L. rhamnosus και με το μείγμα των B. lactis και L. acidophilus επίσης αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό τους. Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρείται και στο πρώτο 24ωρο διέγερσης των HT-29 με το μείγμα των B. longum, L. acidophilus και L. rhamnosus, αν και στο τέλος του δευτέρου 24ωρου το μείγμα αυτό κατέστειλε τελικά τον πολλαπλασιασμό. Η προσθήκη της μικρότερης δόσης 102 cfu/mL του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum και S. boulardii δείχθηκε ικανή να ελαττώσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού HT-29, επίσης μόνο για τις πρώτες 24 ώρες. Αναφορικά με το μεταναστευτικό ρυθμό των ΕΥΜ υγιών ατόμων, φάνηκε πως ωθείται τόσο από το μείγμα των B. longum και L. rhamnosus όσο και την υψηλότερη δόση του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum και S. boulardii. Αντίθετα, το μεταναστευτικό δυναμικό των ΕΥΜ υγιών ατόμων μειώνεται από τη χορήγηση του μείγματος των B. lactis and L. acidophilus, και τη μικρότερη δόση του μείγματος των B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum and S. boulardii. Ο μεταναστευτικός ρυθμός τόσο των ΕΥΜ από άτομα με Ελκώδη κολίτιδα όσο και των ΕΥΜ ασθενών με Νόσο Crohn εμφανίστηκε δοσοεξαρτώμενα αυξημένος έπειτα από την προσθήκη του μείγματος των προβιοτικών B. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, S. boulardii. Επίσης, το μείγμα των Bifidobacterium longum και Lacticaseibacillus rhamnosus φάνηκε πως μειώνει το μεταναστευτικό δυναμικό των ΕΥΜ ασθενών με Νόσο Crohn.Συμπερασματικά, ο αντίκτυπος των διαφόρων προβιοτικών στελεχών φαίνεται πως ποικίλλει, με μεγαλύτερη ή μικρότερη σημαντικότητα στους χημειοκινικούς, κυτταροκινικούς και επουλωτικούς παράγοντες που εξετάστηκαν. Ωστόσο, η παρούσα διατριβή επαληθεύει πως η απόρροια των προβιοτικών είναι άμεσα εξαρτώμενη από το εκάστοτε στέλεχος που χρησιμοποιείται (ή το συνδυασμό στελεχών) και τη χορηγηθείσα συγκέντρωση. Εν κατακλείδι, η τρέχουσα εργασία αναδεικνύει πως η ταυτόχρονη χορήγηση διαφορετικών μικροοργανισμών μπορεί να ενεργοποιήσει το εντερικό ανοσοποιητικό βλεννογόνιο σύστημα και να προωθήσει τις διαδικασίες επούλωσης, προσφέροντας βελτιστοποιημένα αποτελέσματα συγκριτικά με τη χρήση των αντίστοιχων μεμονωμένων στελεχών.