Μοριακοί μηχανισμοί δράσης των μικρών GTPασών στις αγγειογενετικές αποκρίσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων
Authors: Κύρκου Αθηνά 
Published: January 2014

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας των μικρών GTPασών Rho συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση του κυτταρικού σκελετού και η ρύθμιση αυτή εξαρτάται από τη μετατροπή των μορίων αυτών από την ανενεργή GDP μορφή τους, στην ενεργή GTP κατάσταση. Οι Rho GTPάσες συμβάλλουν στην εξέλιξη του κύκλου, από τις μεταβάσεις των φάσεων G1/S και G2/M, έως την ολοκλήρωση της μιτωτικής διαίρεσης (Jaffe and Hall, 2005). Τα πιο μελετημένα μέλη της οικογένειας είναι οι Rho A, B και C και η λειτουργική τους δράση επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης με καθοδικούς, στο μοριακό τους μονοπάτι, τελεστές. Η RhoD, αποτελεί ένα από τα πιο πρόσφατα, στην εξέλιξη, μέλη της οικογένειας. Η λειτουργία της έχει σχετισθεί με την ομοτυπική σύντηξη των πρώιμων ενδοσωμάτων (Murphy et al., 1996), την κυτταρική μετανάστευση (Tsubakimoto et al., 1999), (Murphy et al., 2001). (Nguyen et al., 2002), τη σταθεροποίηση του νευρικού κώνου (Zanata et al., 2002) (Negishi, 2007), αλλά και την κυτταροκίνηση (Tsubakimoto et al., 1999). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση της πρωτεΐνης RhoD στην εξέλιξη του κύκλου ζωής του κυττάρου. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την ύπαρξη μηχανισμού δράσης της RhoD κατά τη μετάβαση G1/S και ολοκλήρωση της M φάσης του κυτταρικού κύκλου, μέσω αλληλεπίδρασης με έναν καινούριο τελεστή, την πρωτεΐνη Diaphanous 1 (Diaph1/mDia1). Η RhoD συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (G1/S): Το ερέθισμα για να ασχοληθούμε με το θέμα αυτό, ήταν η παρατηρούμενη υπερπλασία στην επιδερμίδα διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν myc-RhoDG26V. Αρχικά θελήσαμε να επιβεβαιώσουμε την παρατηρούμενη επίδραση της RhoD στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σε συνθήκες καλλιέργειας. Το βασικό σύστημα μελέτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν τα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς οι αποκρίσεις τους επηρεάζουν άμεσα την αγγειογενετική διαδικασία και η θεματολογία αυτή ενδιαφέρει άμεσα το εργαστήριό μας. Συνδυασμένα πειράματα ενσωμάτωσης μεθυλο-θυμιδίνης, βρωμο-δεόξυ-ουρυδίνης και κυττταρομετρίας ροής έδειξαν ότι πράγματι η RhoD συμμετέχει στη μετάβαση G1/S. Αν και για αδιευκρίνιστους λόγους η myc-RhoDG26V δεν ενίσχυσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, η έκφραση της myc-RhoDWT ήταν αρκετή να αυξήσει τον πληθυσμό που ολοκλήρωσε την S φάση, ενώ η απενεργοποίηση της πρωτεΐνης/αποσιώπηση του γονιδίου οδήγησε σε αναστολή της G1/S μετάβασης. Στα πλαίσια ελέγχου της ειδικότητας που παρουσιάζουν τα siRNA ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν έναντι της RhoD, παρατηρήσαμε ότι ναι μεν είναι ειδικά, καθώς δε μειορυθμίζουν τα mRNA επίπεδα των συγγενικών Rho, ωστόσο οδηγούν στη μεταγραφική ενεργοποίηση της RhoB. Η αυξημένη όμως έκφραση της RhoB, έχει συσχετισθεί με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού(Liu and Prendergast, 2000; Mazieres et al., 2004). Πειράματα ταυτόχρονης αποσιώπησης των γονιδίων RhoD/RhoB έδειξαν πως παρά την αναστολή της μεταγραφικής ενεργοποίησης της RhoB, η αποσιώπηση της RhoD εξακολουθεί να επιδρά αρνητικά στη φάση S, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εν συνεχεία, θελήσαμε να ελέγξουμε την πιθανότητα η επίδραση της RhoD στον VEGF-επαγόμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό να οφείλεται σε αναστολή της μετάδοσης του σήματος VEGF στο μιτωτικό του μονοπάτι (ERK1/2). Τα φυσιολογικά επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERK1/2 από τoν VEGF καταδεικνύουν πως ο συγκεκριμένος ρόλος της RhoD δεν οφείλεται σε παρεμβολή μετάδοσης του σήματος VEGF, αλλά πιθανότερα σε άμεση ρύθμιση των μηχανισμών ελέγχου και εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε πως η δράση αυτή της RhoD δε φαίνεται να διαμεσολαβείται από το, μόνο μέχρι στιγμής, γνωστό τελεστή hDia2C. Η RhoD συμμετέχει στην κυτταρική διαίρεση: Η συσχέτιση της λειτουργίας με τη Μ φάση, προέκυψε όταν κατά την διαδικασία των πειραμάτων διαπιστώσαμε ότι η μόνιμα ενεργή myc-RhoDG26V προκαλεί φαινόμενα πυρηνικού κατακερματισμού και πολυπυρήνωσης. Ο πυρηνικός κατακερματισμός είναι αποτέλεσμα παρεμβολών κατά τη διάρκεια της καρυοκίνησης, ενώ η πολυπυρήνωση προκύπτει από αναστολή της κυτταροκίνησης. Η myc-RhoDG26V φαίνεται να επηρεάζει φαινόμενα σημαντικά για την πυρηνική και κυτταροπλασματική διαίρεση, όπως τη σύσταση κέντρου οργάνωσης μικροσωληνίσκων (πολλαπλά ή διαρρηγμένα κεντροσωμάτια) και τον προσανατολισμό της μυοσίνης 2. Ανάλυση της ενεργότητας της RhoD έδειξε ότι η πρωτεΐνη ενεργοποιείται στα πρώτα στάδια της φάσης Μ και απενεργοποιείται κατά την έξοδο από τη φάση αυτή. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός δείχνει ότι η δράση της ασκείται από τα ενδοσώματα τόσο σε μεσοφασικά όσο και μιτωτικά κύτταρα, ενώ και πάλι η hDia2C δε φαίνεται να διαμεσολαβεί τη δράση. Η Diaphanous 1 διαμεσολαβεί τη δράση της RhoD στην εξέλιξη του κύκλου: Η περιορισμένη συμμετοχή της hDia2C σε αυτές τις επιδράσεις της RhoD μας οδήγησε στην ανίχνευση νέου τελεστή της RhoD. Για το λόγο προχωρήσαμε στην τεχνική σάρωσης διπλού υβριδίου, από την οποία ταυτοποιήσαμε έναν καινούριο τελεστή, την πρωτεΐνη Diaphanous1. H πρωτεΐνη αυτή αποδείχθηκε με ανεξάρτητα βιοχημικά και μικροσκοπιακά πειράματα ότι αποτελεί πραγματικό τελεστή της RhoD και το συνδετικό κρίκο των επιπτώσεων της RhoD στη μετάβαση G1/S. Τα αποτελέσματά μας ενισχύονται από βιβλιογραφικές αναφορές που συνδέουν τη λειτουργία της Diaphanous1 με τις φάσεις αυτές. Ολοκληρώνοντας, η μελέτη μας υποδεικνύει ότι ο κύκλος ενεργοποίησης της RhoD χρειάζεται αυστηρή ρύθμιση, για τη διεξαγωγή ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και η δράση αυτή φαίνεται ότι διαμεσολαβείται από ένα νέο τελεστή, τη Diaphanous 1.