Μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεση του μεταβολικού συνδρόμου με μεθόδους βιολογίας συστημάτων
Authors: Νάσιας Δημήτριος 
Published: September 2021

Το Μεταβολικό Σύνδρομο (ΜΣ) αποτελεί μία πολυπαραγοντική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από ένα σύμπλεγμα συνοδών νοσημάτων τα οποία προδιαθέτουν για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων και διαβήτη. Η μακροχρόνια λήψη διατροφής πλούσιας σε λιπαρά αποτελεί βασικό παράγοντα για την ανάπτυξη παχυσαρκίας και ΜΣ. Ωστόσο, τα μέχρι στιγμής διαθέσιμα ζωικά μοντέλα για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που αποτελούν τη βάση της παθολογίας του ΜΣ έχουν σημαντικούς περιορισμούς. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αρχικά να προσδιοριστούν οι αλλαγές της συνολικής γονιδιακής έκφρασης σε μεταβολικούς ιστούς καθώς και οι αλλαγές των κυκλοφορούντων miRNAs σε ένα μοντέλο ποντικού με επαγόμενο μέσω της διατροφής ΜΣ, τους ποντικούς apoE3L.CETP. Δεύτερον, επιδιώξαμε να αξιολογήσουμε την επίδραση της αποσιώπησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1 στο ήπαρ ποντικών apoE3L.CETP κατά την ανάπτυξη του ΜΣ.Σε αρσενικούς ποντικούς apoE3L.CETP χορηγήθηκε δίαιτα με υψηλή (HFD) ή χαμηλή (LFD) περιεκτικότητα σε λιπαρά για διαφορετικές χρονικές περιόδους και παρακολουθήθηκε η εξέλιξη της παθολογίας ΜΣ. Σε μια παράλληλη μελέτη που έγινε σε συνεργασία με την ομάδα του Δρα Thomas Lutz στην Ζυρίχη, μια ξεχωριστή ομάδα ποντικών χωρίστηκε σε ανταποκρινόμενους (R) ή μη ανταποκρινόμενους (NR) και έλαβε την ίδια HFD δίαιτα για 16 εβδομάδες. Το μεταγραφικό προφίλ του ήπατος αναλύθηκε σε μικροσυστοιχίες της Affymetrix. Διαπιστώσαμε ότι οι ποντικοί που έλαβαν HFD δίαιτα ανέπτυξαν προοδευτικά εκδηλώσεις του ΜΣ και ένας αυξανόμενος αριθμός διαφορικά εκφρασμένων μεταγράφων ταυτοποιήθηκε στις 4, 8 και 12 εβδομάδες σε σύγκριση με τους ποντικούς που έλαβαν την LFD. Σημαντικά αλλαγμένα γονίδια συσχετίστηκαν λειτουργικά με μεταβολικές ασθένειες που περιλαμβάνουν την ανοχή στην ινσουλίνη, την ηπατική στεάτωση, το μεταβολικό σύνδρομο και διαταραχές του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων. Η ανάλυση των μοριακών μονοπατιών αποκάλυψε την υποέκφραση των γονιδίων βιοσύνθεσης της χοληστερόλης και των λιπαρών οξέων, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή σε γονίδια της γλυκόλυσης ή της γλυκονεογένεσης. Μία ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με σχηματισμό σταγονιδίων λιπιδίων βρέθηκε ότι υπερεκφράζονται στην ομάδα HFD και αυτό ευθυγραμμίζεται με την ανάπτυξη της ηπατικής στεάτωσης στους συγκεκριμένους ποντικούς. Στον ορό των ποντικών apoE3L.CETP ταυτοποιήσαμε 3 miRNAs τα οποία υπερκφράζονται στην ομάδα HFD αλλά όχι στην ομάδα LFD. Βρήκαμε ότι οι ποντικοί που αποκρίνονται στη δίαιτα (R) έχουν ξεχωριστή γονιδιακή υπογραφή που τα διαφοροποιεί από ποντικούς που δεν ανταποκρίνονται καλά στη διατροφή (NR). Η σύγκριση των δύο μελετών διατροφικής παρέμβασης (HFD έναντι LFD και R έναντι NR) αποκάλυψε έναν περιορισμένο αριθμό κοινών διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, ωστόσο η έκφραση των κοινών γονιδίων επηρεάστηκε με παρόμοιο τρόπο και στις δύο μελέτες.Ως επόμενο βήμα, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε μεταγραφικές αλλαγές στο ήπαρ που σχετίζονται με βαριατρικές επεμβάσεις στο πλαίσιο του ΜΣ. Η βελτίωση των συνοδών νοσημάτων του ΜΣ και η συνεχής και μακροπρόθεσμη απώλεια βάρους μπορούν να επιτευχθούν με τη γαστρική παράκαμψη Roux-en-Y (RYGB). Για το σκοπό αυτό, συνεργαστήκαμε με την ίδια επιστημονική ομάδα στη Ζυρίχη προκειμένου να λάβουμε δείγματα ήπατος και να εκτελέσουμε μεταγραφωματικές αναλύσεις. Σε αρσενικούς ποντικούς apoE3L.CETP χορηγήθηκε δίαιτα HFD για 6 εβδομάδες και κατόπιν οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση RYGB ή υπέστησαν χειρουργική επέμβαση χωρίς εφαρμογή βαριατρικής μέθοδου ως ομάδα έλεγχου (Sham). Οι ομάδες ελέγχου είτε έλαβαν τροφή σε συνθήκες ad libitum είτε στερηθηκαν τροφής ώστε να επιτύχουν την απώλεια βάρους σώματος ανάλογη των ποντικών που εγχειρήθηκαν (Body Weight Matced, BWm), για τη διάκριση και τον εντοπισμό των χειρουργικών επιδράσεων από σχετιζόμενα με την απώλεια σωματικού βάρους αποτελέσματα. Οι ποντικοί που χειρουργήθηκαν με RYGB πέτυχαν σημαντική απώλεια βάρους. Επιπρόσθετα, η χειρουργική επέμβαση RYGB βελτίωσε τον μεταβολισμό της γλυκόζης και το μεταβολισμό των λιπιδίων και τροποποίησε το ηπατικό μεταγράφωμα σύμφωνα με την ανάλυση σφαιρικών αλλαγών του μεταγραφώματος στο ήπαρ των ομάδων ποντικών Rygb, Sham ΑL και BWm. Η σύγκριση των ποντικών RYGB με BWm ή Sham AL ποντίκια αποκάλυψε 1137 διαφορικά εκφρασμένα μετάγραφα (656 ↑, 481 ↓) και 411 μετάγραφα (300 ↑, 206 ↓), αντίστοιχα. Η ανάλυση με το λογισμικό πρόγραμμα “Ingenuity Pathway Analysis” (IPA) έδειξε ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στις τρεις διαφορετικές ομάδες που συγκρίθηκαν σχετίζονταν κυρίως με τον μεταβολισμό των λιπιδίων όπως η «συγκέντρωση των λιπιδίων, του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων, της συγκέντρωσης της χοληστερόλης και της σύνθεσης των λιπιδίων» στο επίπεδο των βιολογικών λειτουργιών.Επιπρόσθετα, εξετάσαμε τις μεταγραφικές μεταβολές που εμφανίζονται στον γοναδικό λευκό λιπώδη ιστό (gWAT) των ποντικών apoE3L.CETP σε διακριτά στάδια ανάπτυξης του ΜΣ, καθώς ο λιπώδης ιστός είναι βασικός καθοριστικός παράγοντας της μεταβολικής υγείας και των μεταβολικών διαταραχών. Το RNA από τον λιπώδη ιστό αναλύθηκε σε μικροσυστοιχίες Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST, ενώ ακολούθησε βιοπληροφορική ανάλυση. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι το μεταγραφικό προφίλ του λιπώδους ιστού (WAT) μεταβλήθηκε σε μεγάλο βαθμό σε σύγκριση με το ηπατικό μεταγραφικό προφίλ σε ποντικούς apoE3L.CETP. Πράγματι, η στατιστική ανάλυση των δεδομένων του μεταγραφώματος κάτω από συγκεκριμένα κριτήρια (p <0.05 και | log2FC (λόγος μεταβολής) | ≥1.5) ανέδειξε συνολικά 481, 946 και 1377 γονίδια τα οποία βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ομάδων ποντικών HFD και LFD στις 4, 8 και 12 εβδομάδες, αντίστοιχα. Η λειτουργική ανάλυση επέτρεψε την ταυτοποίηση μιας σειράς γονιδίων που εμπλέκονται σε στατιστικά σημαντικές ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αποκρίσεις, ειδικά στις 8 και 12 εβδομάδες. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που σχετίζονται με την εξωκυττάρια ουσία (ECM) εκφράζεται διαφορικά, υποδηλώνοντας την αναδιαμόρφωση του ιστού κατά την εξέλιξη του ΜΣ. Η υποέκφραση των μεταβολικών μονοπατιών, συμπεριλαμβανομένων της Γλυκόλυσης, της Βιοσύνθεσης της Χοληστερόλης και της Βιοσύνθεσης των Λιπαρών Οξέων, θα μπορούσε να συσχετιστεί με τη ρύθμιση του μεταβολισμού των θρεπτικών συστατικών κατά την χορήγηση δίαιτας HFD. Τέλος, γονίδια με αναγνωρισμένο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού του λιπώδους ιστού και την εύρυθμη διατήρησή του ή με συστημική επίδραση στην ομοιόσταση ολόκληρου του οργανισμού βρέθηκε ότι εκφράζονται διαφορικά κατά την εξέλιξη του ΜΣ, συμπεριλαμβανομένης της λεπτίνης (lep), του μεταφορέα γλυκόζης, Slc2a4 (Solute carrier family 2, member 4), του υποδοχέα Insulin receptor substrate 1 (Irs1) και του γονιδίου Cidea (cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A).Για να διαλευκανθεί η επίδραση της αποσιώπησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1 στο ήπαρ των ποντικών apoE3L.CETP κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ΜΣ, ενήλικοι αρσενικοί ποντικοί ενέθηκαν ενδοφλέβια με τους ανασυνδυασμένους συσχετιζόμενους ιούς AAV-scControl ως ομάδα ελέγχου ή με τους AAV-sh-FΟΧΟ1. Όλοι οι ποντικοί διατρέφονταν με συμβατική δίαιτα για 15 εβδομάδες μετά την ένεση πριν μεταβούν σε δίαιτα HFD για 3 μήνες. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν για το σωματικό τους βάρος, το λιπιδιακό προφίλ και τα επίπεδα γλυκόζης πριν και μετά την διατροφική παρέμβαση. Εντοπίσαμε μια μείωση του FOXO1 τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεϊνών σε ορισμένους sh-FOXO1 ποντικούς (5 από τους 11 ποντικούς). Επιπλέον, με την χρήση μικροσκοπίας φθορισμού προχωρήσαμε στον εντοπισμό του FOXO1 στους πυρήνες της ομάδας ελέγχου, ενώ ο FOXO1 ανιχνεύθηκε οριακά στην ομάδα AAV-shFOXO1. Η αποσιώπηση του FΟΧΟ1 στο ήπαρ των ποντικών apoE3L.CETP προκάλεσε μεταβολές μόνο σε ορισμένες κλινικές παραμέτρους της κυκλοφορίας. Πιο συγκεκριμένα, ο κλινικός χαρακτηρισμός των ποντικών έδειξε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της γλυκόζης και των λιπιδίων και επιπλέον οι ιστολογικές μεταβολές ήταν παρόμοιες και στις δύο ομάδες ποντικών, και σχετίζονται με την δίαιτα HFD. Είναι σημαντικό ότι υπήρξε σημαντική βελτίωση όσον αφορά την ανοχή στη γλυκόζη και την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε συστημικό επίπεδο. Επιπλέον, η ανάλυση αλληλούχισης του RNA αποκάλυψε μια σημαντική απόκριση του ηπατικού μεταγραφώματος και σε μικρότερο βαθμό του μεταγραφώματος των σκελετικών μυών. Σχετικά με τις αλλαγές στο μεταγράφωμα του ήπατος, τα γονίδια που σχετίζονται με το μονοπάτι σηματοδότησης FOXO (mmu04068) και επίσης με την αντίσταση στην ινσουλίνη (mmu04931) βρέθηκε ότι υποεκφράζονται, όπως ο υποδοχέας ινσουλίνης (Insr, ρ-0.019758593), προς τα πάνω του καταρράκτη σηματοδότησης FOXO1. Η γλυκονογένεση μπορεί να μειωθεί λόγω της σημαντικής κατάλυσης του FOXO1 και σχετικών οδών που θα μπορούσαν να ρυθμίσουν την παραγωγή και πρόσληψη γλυκόζης όταν η HFD αυξάνει τη γλυκόζη αίματος νηστείας και στις δύο ομάδες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του MetS. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι ο έλεγχος του FOXO1 θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση βασικών στοιχείων της παθολογίας του ΜΣ.Συνοψίζοντας, η παρούσα μεταγραφωματική ανάλυση στο ήπαρ και στον ορό ποντικών apoE3L.CETP που έλαβαν δίαιτα HFD ή LFD και στο ήπαρ ποντικών apoE3L.CETP που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση RYGB, συνδυάστηκε με εκτεταμένη ανάλυση βιοπληροφορικής, αποκαλύπτοντας χαρακτηριστικές γονιδιακές υπογραφές του ήπατος, ενδεικτικές των μοριακών μεταβολών που εμφανίζονται στα διάφορα στάδια της παθογένεσης του ΜΣ. Αυτή η προσέγγιση ολοκληρώθηκε περαιτέρω μέσα από τον χαρακτηρισμό μεταγραφικών υπογραφών στον λιπώδη ιστό των ποντικών apoE3L.CETP και μέσα από την αξιολόγηση των κλινικών μεταβολών που παρατηρήθηκαν μετά την αποσιώπηση του FOXO1 στο ήπαρ στο πλαίσιο της εξέλιξης του ΜΣ. Συνολικά, τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης και κυκλοφορούντων miRNAs που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχουν μια λεπτομερή εικόνα της παθολογίας του ΜΣ και θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για διαγνωστικούς ή θεραπευτικούς σκοπούς.