Ανάπτυξη συνθετικών πεπτιδίων και αντισωμάτων για τη μελέτη του νευροπροστατευτικού 24 - πεπτιδίου ουμανίνη ( Humanin )
Authors: Ευαγγέλου Αλεξάνδρα 
Published: January 2014

Η ουμανίνη (humanin ή HN, MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA) είναι ένα 24-πεπτίδιο που ανακαλύφθηκε το 2001 ως το προϊόν έκφρασης ενός γονιδίου με νευροπροστατευτική δράση. Συγκεκριμένα, η ΗΝ βρέθηκε να αποτρέπει in vitro το θάνατο των νευρικών κυττάρων που προκαλείται από μεταλλάξεις σχετιζόμενες με την οικογενή μορφή της νόσου Alzheimer και από άλλα αίτια που οδηγούν στην εμφάνισή της. Αργότερα, αναφέρθηκε ότι η ΗΝ ασκεί ευρύτερη in vitro κυτταροπροστατευτική δράση. Ιn vivo η ΗΝ καθώς και δραστικά της παράγωγα βρέθηκαν ότι βελτιώνουν τα προβλήματα μάθησης και μνήμης που δημιουργούνται σε πειραματικά μοντέλα ποντικών ή αρουραίων. Η βιολογική δράση της ΗΝ φαίνεται να εξαρτάται σημαντικά από την πρωτοταγή δομή του μορίου της. Με αντικατάσταση, π.χ., της Ser14 από Gly προκύπτει το πεπτίδιο HNG (HN[Gly14]), που παρουσιάζει αυξημένη δραστικότητα κατά 103 φορές σε σχέση με την ΗΝ, ενώ το παράγωγο AGA-(C8R)HNG17 φαίνεται να είναι δραστικότερο κατά 106 φορές. Το πιο δραστικό, μέχρι στιγμής, παράγωγο της ΗΝ είναι η κολιβελίνη (Colivelin), η οποία παρουσιάζει αυξημένη δραστικότητα κατά 108 φορές σε σχέση με την ΗΝ. Ο μηχανισμός με τον οποίο η ΗΝ και τα παράγωγά της ασκούν τη βιολογική τους δράση παραμένει αδιευκρίνιστος. Σύμφωνα, πάντως, με αναφορές της βιβλιογραφίας, η ΗΝ φαίνεται ότι συντίθεται in vivo, εκκρίνεται στην κυκλοφορία και δρα εξωκυτταρικά, μέσω υποδοχέων στην επιφάνεια των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, η ΗΝ πιθανόν να ασκεί και ενδοκυττάρια δράση, δρώντας στους μηχανισμούς ενεργοποίησης αποπτωτικών πρωτεϊνών και καταστέλλοντας έτσι την κυτταρική απόπτωση. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε: 1. Σύνθεση i) ΗΝ, ii) γνωστών από τη βιβλιογραφία, δραστικών πεπτιδικών παραγώγων της ΗΝ, και, iii) νέων παραγώγων της ΗΝ με εν δυνάμει υψηλή βιολογική δραστικότητα. Ορισμένα από τα παραπάνω συνθετικά πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν από συνεργαζόμενες ερευνητικές ομάδες σε in vivo βιολογικές μελέτες συμπεριφοράς καθώς και σε μελέτες δομής. 2. Εφαρμογή συγκεκριμένων συνθετικών παραγώγων της ΗΝ, επισημασμένων με το ραδιοϊσότοπο 125Ι, σε προκαταρκτικές βιολογικές μελέτες in vitro κυτταρικής δέσμευσης και in vivo βιοκατανομής. 3. Σύνθεση ΗΝ καθώς και πεπτιδικών παραγώγων της με πιθανή αντιγονική δράση και, στη συνέχεια, ανάπτυξη αντισωμάτων εναντίον τους, με άμεσο στόχο την αξιολόγησή τους και απώτερο την εφαρμογή τους σε συστήματα ανοσοανίχνευσης της ΗΝ σε βιολογικά δείγματα. Συγκεκριμένα, στα πλαίσια της διατριβής συνετέθη το 24-πεπτίδιο ουμανίνη και δώδεκα διαφορετικά πεπτιδικά παράγωγα του μητρικού πεπτιδίου. Τα πεπτιδικά παράγωγα που επιλέχθηκαν για σύνθεση προέκυψαν με αντικατάσταση, προσθήκη ή απομάκρυνση αμινοξέων σε διάφορες θέσεις του μητρικού πεπτιδίου ΗΝ. Η σύνθεση έγινε σε στερεά φάση, με την Fmoc/t-Bu στρατηγική. Τα συνθετικά πεπτίδια καθαρίστηκαν με ημι-παρασκευαστική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, ανάστροφης φάσης (RP-HPLC), χαρακτηρίστηκαν με αναλυτική RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο της φασματομετρίας μαζών μετά από ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS). Τόσο η ΗΝ όσο και τα συνθετικά πεπτιδικά της παράγωγα παρελήφθησαν σε υψηλή καθαρότητα. Κατά τη σύνθεση όλων των παραπάνω πεπτιδίων παρατηρήθηκε αργή αποπροστασία της Να-προστατευτικής ομάδας στην περιοχή Arg4-Leu10. Τα συνθετικά παράγωγα Tyr-des-Leu-AGA(C8R)-HNG17 (Υ-ΗΝ5) και Tyr-des-Leu-Colivelin (Y-HN8), που περιέχουν ένα αμινοξύ τυροσίνης στο Ν-τελικό άκρο τους, ραδιοεπισημάνθηκαν με 125Ι (Ακαδημία Επιστημών της Τσεχίας) και χρησιμοποιήθηκαν σε προκαταρκτικές in vitro μελέτες δέσμευσης στις κυτταρικές σειρές neuro-2A, SY5Y, HT22, U87Mg και σε μεμβράνες απομονωμένες από ιστούς εγκεφάλου και στομάχου ποντικών Swiss albino. Σύμφωνα με τα πρώτα αποτελέσματα, παρατηρήθηκε μικρή δέσμευση του παραγώγου 125Ι-Υ-ΗΝ8 στις μεμβράνες των ιστών στομάχου. Τα ραδιοεπισημασμένα παράγωγα 125Ι-Υ-ΗΝ5 και 125Ι-Υ-ΗΝ8 χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε προκαταρκτικές in vivo μελέτες βιοκατανομής σε ποντικούς Swiss albino (Εργαστήριο Ραδιοφαρμακευτικής Χημείας, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»). Σύμφωνα με τα πρώτα αποτελέσματα, ενδιαφέρον παρουσιάζει ο εντοπισμός ραδιενέργειας στο στομάχι των ποντικών 2 h μετά από ενδοφλέβια χορήγηση των παραγώγων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε επίσης ανάπτυξη και αξιολόγηση διαφορετικών αντισωμάτων για την ΗΝ, με τη χρήση διαφορετικών ανοσογόνων. Συγκεκριμένα, έγιναν ανοσοποιήσεις έναντι: - συνθετικής ΗΝ, μη συζευγμένης σε ανοσογονική πρωτεΐνη-φορέα, - συνθετικής ΗΝ συζευγμένης στην ανοσογονική πρωτεΐνη-φορέα KLH μέσω γλουταραλδεΰδης [HN/KLH(1)], - συνθετικής ΗΝ συζευγμένης σε ΚLH μέσω του αντιδραστηρίου (4-N-μηλεϊμιδομεθυλ) κυκλοεξαν-1-καρβοξυλο-3-σουλφο-N-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρα (sulfo-SMCC) [HN/KLH(2)]...