Μελέτη του βιολογικού ρόλου της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 και έλεγχος της λειτουργικότητάς της υπό την επίδραση μικρομοριακών ενώσεων
Authors: Σιγάλα Ιωάννα-Αγγελική 
Published: September 2021

Κυρίαρχη θέση στη ρύθμιση του ματίσματος, κατέχει η SRPK1, η οποία φωσφορυλιώνει σερίνες που αποτελούν μέρος διπεπτιδίων σερίνης/αργινίνης, μοτίβο το οποίο φέρουν και οι SR παράγοντες ματίσματος. Η έκφραση της SRPK1 στους διάφορους όγκους, εμφανίζεται διαταραγμένη χωρίς ο ρόλος της να είναι ταυτόσημος σε όλους τους καρκίνους. Το γλοιοβλάστωμα είναι ο πιο συχνά εμφανιζόμενος και επιθετικός κακοήθης καρκίνος των πρωτογενών εγκεφαλικών όγκων. Η SRPK1 εκφράζεται μόνο στους νευρώνες και όχι στα νευρογλοιακά κύτταρα, σε αντίθεση με τους όγκους γλοιοβλαστώματος, στους οποίους παρατηρήθηκε έκφραση της SRPK1, ενώ τα επίπεδα της συσχετίστηκαν με την επιβίωση των ασθενών. Περαιτέρω διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της SRPK1 στις τρεις γλοιωματικές κυτταρικές σειρές, U87MG, T98G, και U251MG αρχικά επιβεβαίωσε την έκφρασή της όπως και την κυτταροπλασματική εντόπισή της. Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 με shRNA, είχε περιορισμένη επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων ενώ οδήγησε σε μικρή αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στην cis-πλατίνη και την τεμοζολομίδη. Δεν παρατηρήθηκε κανένα συνδυαστικό αποτέλεσμα στην περίπτωση του 5-FU, καθώς το 5-FU μειώνει δραματικά τα επίπεδα έκφρασης της κινάσης, σε αντίθεση με τα άλλα δύο χημειοθεραπευτικά. Στα πλαίσια του ελέγχου της ανασταλτικής δράσης μικρομοριακών ενώσεων απέναντι στην SRPK1, συντέθηκαν 17 νέες ενώσεις με βάση τη δομή του γνωστού αναστολέα SRPIN340 και ελέγχθηκαν σε in vitro πειράματα φωσφορυλίωσης, τα αποτελέσματα των οποίων έδειξαν ότι δεν εμφάνιζαν ανασταλτική δράση συγκρίσιμη με του SRPIN340. Επίσης βρέθηκε ότι το φυσικά προερχόμενο διινδολικό πυρρόλιο, λυναμικίνη D δεν είχε ουσιαστική επίδραση στη βιωσιμότητα των καρκινικών σειρών HeLa, Α549 και T98G. Επηρέαζε όμως τόσο το ιδιοσύστατο όσο και το εναλλακτικό μάτισμα μινι-γονιδίων αναφοράς, κυρίως μέσω της αύξησης των επιπέδων έκφρασης της SRPK1. Διερευνώντας τους τρόπους ρύθμισης της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1 με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού, παρατηρήθηκε μετατόπιση της κινάσης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, μετά από επίδραση στρεσογόνων για τα HeLa κύτταρα ουσιών. Μέσω της ανίχνευσης της φωσφορυλιωμένης ιστόνης H2AX, η οποία σχετίζεται με την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA, βρέθηκε ότι η μετακίνηση της SRPK1 στον πυρήνα μετά από επίδραση διαφόρων παραγόντων ήταν ανάλογη της φωσφορυλίωσης της H2AX και κατά συνέπεια των δίκλωνων σπασιμάτων που προκαλούσαν οι συγκεκριμένοι παράγοντες στο DNA. Είναι λοιπόν πιθανόν η SRPK1 να εμπλέκεται στο μηχανισμό επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA. Στην αναζήτηση των πιθανών μηχανισμών οι οποίοι διέπουν τη μετακίνηση της SRPK1 στον πυρήνα, επιβεβαιώθηκε ότι η φωσφορυλίωση των δύο πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης της θρεονίνης 326 και της σερίνης 408, αποτελεί μια αναγκαία μετα-μεταφραστική τροποποίηση του μορίου της, καθώς μεταλλάγματα αυτών των θέσεων σε αλανίνη, αδυνατούσαν να εισέλθουν στον πυρήνα υπό την επίδραση Η2Ο2. Τα αντίστοιχα όμως φωσφομιμητικά μεταλλάγματα σε ασπαραγινικό οξύ, υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν εμφάνιζαν πυρηνική εντόπιση, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι απαιτείται κάποια συμπληρωματική τροποποίηση. Ο αλγόριθμος πρόβλεψης θέσεων ουβικιτίνωσης, UbPred έδωσε μεγάλη πιθανότητα ουβικιτίνωσης στις λυσίνες 329 και 377 και κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα στα οποία οι συγκεκριμένες λυσίνες αντικαταστάθηκαν με αργινίνη. Τα μεταλλάγματα αυτά δεν απώλεσαν την ικανότητά τους να εισέρχονται στον πυρήνα με H2O2, αναιρώντας την αρχική υπόθεση της ουβικιτίνωσης των θέσεων Lys329 ή Lys377, ως προϋπόθεση για την είσοδο της κινάσης στον πυρήνα.