Optimization of microalgae growth and separation processes for the production of high added value products
Authors: Μακάρογλου Γεώργιος 
Published: November 2023

Τα μικροφύκη είναι μονοκύτταροι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί που μπορούν να αναπτυχθούν σε διαφορετικά περιβάλλοντα, αναπτύσσοντας μηχανισμούς προσαρμογής. Βρίσκονται σε γλυκό νερό, αλατούχο νερό, πάγο, έδαφος, ακόμη και σε υγρά απόβλητα. Σύμφωνα με τη χρώση τους, τις διατάξεις των φωτοσυνθετικών μεμβρανών ή άλλα μορφολογικά χαρακτηριστικά, τα μικροφύκη ταξινομούνται ως διάτομα, πράσινα φύκη, χρυσά φύκη και κυανοβακτήρια. Τα μικροφύκη μοιράζονται παρόμοιους μηχανισμούς ανάπτυξης με τα χερσαία φυτά, με τη διαφορά ότι είναι κυτταρικοί μικροοργανισμοί. Χρησιμοποιούν το ηλιακό φως για να δεσμεύσουν το CO2 που είναι διαλυμένο στο μέσο ανάπτυξης για παραγωγή βιομάζας και O2. Η καλλιέργεια των μικροφυκών λαμβάνει χώρα σε ανοιχτές λίμνες ή σε φωτοβιοαντιδραστήρες, που αποτελούνται από διάφορους τύπους. Το ηλιακό φως ή το τεχνητό φως (π.χ. φθορίζον, LED) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση της φωτοσύνθεσης. Ωστόσο, το φως μπορεί να είναι ένας περιοριστικός παράγοντας για την ανάπτυξη μικροφυκών, καθώς η υψηλή χλωροφύλλη προκαλεί ένα «φαινόμενο σκίασης» στα μικροφύκη που αναπτύσσονται κοντά στο κέντρο των φωτοβιοαντιδραστήρων. Τα μικροφύκη έχουν διάφορες εφαρμογές όπως σε βιοκαύσιμα, συμπληρώματα διατροφής, καλλυντικά και ζωοτροφές, καθώς είναι πλούσια σε πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες, λιπαρά οξέα, χρωστικές ουσίες και βιταμίνες. Η παραγωγή βιομάζας μικροφυκών θα μπορούσε να ενισχυθεί με τη διοχέτευση της παροχής CO2 κατά την καλλιέργεια. Με αυτόν τον τρόπο, μπορεί να αυξηθεί η παραγωγικότητα των τροφίμων και να μειωθεί το CO2 από τα καυσαέρια. Επιπλέον, τα βιομηχανικά καυσαέρια περιέχουν συνήθως 4-14% ή περισσότερο (v/v) συγκέντρωση CO2 και τοξικές ενώσεις όπως SOx, NOx και ιχνοστοιχεία, τα οποία εκπέμπονται με υψηλή ταχύτητα ροής και υψηλή θερμοκρασία που κυμαίνεται από 80 έως 120 ℃ ή υψηλότερη. Για το λόγο αυτό, τα μικροφύκη θα πρέπει να είναι σε θέση να αντέξουν αυτό το ακραίο περιβάλλον, ώστε να μετριάσουν το εκπεμπόμενο CO2. Τα καυσαέρια από φυσικό αέριο θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη μείωση των αρνητικών επιπτώσεων στην ανάπτυξη των μικροφυκών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από τέσσερα κύρια ερευνητικά μέρη. Ο αρχικός στόχος ήταν η μετάλλαξη του άγριου στελέχους μικροφυκών Stichococcus sp. που οδήγησε σε ένα νέο στέλεχος με μειωμένη περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη και αυξημένη παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων (ονομασία EMS1). Η μετάλλαξη επιτεύχθηκε με το χημικό αντιδραστήριο Ethyl Methanesulfonate (EMS) που προκαλεί τυχαίες μεταλλάξεις στο DNA. Ο σκοπός της μετάλλαξης είναι ότι η υψηλή χλωροφύλλη μπορεί να αναστείλει τη διείσδυση φωτός στο εσωτερικό μέρος της καλλιέργειας, που αναπτύσσεται σε φωτοβιοαντιδραστήρες. Έτσι, οδηγεί σε μειωμένη παραγωγικότητα βιομάζας. Το μεταλλαγμένο στέλεχος EMS1 έδειξε 51% λιγότερη χλωροφύλλη, 12% υψηλότερη βιομάζα και 45% υψηλότερη παραγωγή λιπιδίων, σε σχέση με τον άγριο τύπο. Ο δεύτερος στόχος ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των στελεχών και η επιλογή ενός που θα βελτιστοποιηθεί σε μικρή κλίμακα με απώτερο στόχο την κλιμάκωση σε πιλοτικούς φωτοβιοαντιδραστήρες και τη δέσμευση CO2 από βιομηχανικά απαέρια. Πειράματα με το άγριο και EMS1 στέλεχος Stichococcus sp. πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακή κλίμακα (ποτήρια ζέσεως, όγκος καλλιέργειας 150 mL) με μέσο ανάπτυξης Bold's Basal αραιωμένο σε τεχνητό θαλασσινό νερό. Τα μικροφύκη αναπτύχθηκαν προσαρτημένα σε οριζόντια γυάλινα πλακίδια αμμοβολής στο κάτω μέρος των δοχείων, ως μέτρο για την ελαχιστοποίηση του κόστους συγκομιδής. Εξετάστηκαν η ανάδευση, η αποτελεσματικότητα δέσμευσης CO2, η διάρκεια καλλιέργειας, η διάρκεια της πενίας αζώτου, η παραγωγή βιομάζας και βιο-προϊόντων. Διαπιστώθηκε ότι η απουσία ανάδευσης είχε μικρή επίδραση στη μείωση της παραγωγής βιομάζας. Η προσθήκη 5% αερίου CO2 είχε ως αποτέλεσμα έως και 300% αύξηση της βιομάζας και τα μικροφύκη χρειάστηκαν 25 ημέρες για να αναπτυχθούν επαρκώς. Επίσης, η εφαρμογή της πενίας αζώτου τρεις ημέρες πριν από τη συγκομιδή ενίσχυσε την ενδοκυτταρική παραγωγή λιπιδίων. Ο έλεγχος των δύο στελεχών οδήγησε στην επιλογή του μεταλλαγμένου στελέχους EMS1 για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής βιομάζας και βιο-προϊόντων (δηλαδή λιπίδια, χρωστικές ουσίες, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες). Η μέθοδος Taguchi – Design of Experiments (DOE) εφαρμόστηκε για να βρεθούν οι λιγότερο απαιτούμενες πειραματικές εκτελέσεις. Επίσης, τα μικροφύκη τροφοδοτήθηκαν με συνθετικά καυσαέρια (για δέσμευση CO2), με σκοπό την προσομοίωση πραγματικών συνθηκών από την καύση φυσικού αερίου από βιομηχανικούς σταθμούς ηλεκτροπαραγωγής. Από τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων βρέθηκαν πέντε βέλτιστοι συνδυασμοί των παραμέτρων ανάπτυξης, μεγιστοποιώντας κάθε ένα από τα μετρούμενα χαρακτηριστικά. Οι αλλαγές στον ρυθμό αερισμού δεν είχαν σημαντική επίδραση στη βιομάζα και τη συνολική παραγωγή βιο-προϊόντων. Η υψηλότερη ένταση φωτισμού (6.600 lux), ο συνεχής φωτισμός και η υψηλότερη συγκέντρωση NaNO3 (0,75 g L-1) είχαν ως αποτέλεσμα την υψηλότερη απόδοση σε βιομάζα και βιο-προϊόντα. Η μέγιστη τιμή για τη βιομάζα ήταν ίση με 45,7 ± 1,3 g m-2, ενώ τα βιο-προϊόντα και οι αντίστοιχες τιμές τους ήταν: λιπίδια 11,6 ± 0,4 g m-2, ολική χλωροφύλλη 0,22 ± 0,02 g m-2, πρωτεΐνες 9,5 ± 0,5 g m- 2, υδατάνθρακες 19,0 ± 1,5 g m-2 και συνολικά βιο-προϊόντα 34,8 ± 2,2 g m-2. Το στέλεχος Stichococcus sp. βρέθηκε ότι είναι εξαιρετικός παραγωγός υδατανθράκων, με περιεκτικότητα έως και 52%. Η παραγωγή λιπιδίων αποτελούσε έως και το 40% και η συνολική απόδοση βιο-προϊόντων ήταν έως και 91% της βιομάζας. Η επίδραση του φωτός με αναλαμπές (1.000 Hz) που εφαρμόστηκε αύξησε την παραγωγή χλωροφύλλης κατά μέσο όρο 8%, ενώ η πενία αζώτου τριών ημερών αύξησε την παραγωγή λιπιδίων κατά μέσο όρο 22%. Οι πειραματικές μέγιστες τιμές συγκρίθηκαν με μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης για καθεμία από τις πέντε βέλτιστες συνθήκες. Τα θεωρητικά και τα πειραματικά αποτελέσματα ήταν παρόμοια, με το R2 των μοντέλων να κυμαίνεται από 84 έως 99%. Έπειτα από τα πειράματα εργαστηριακής κλίμακας, το στέλεχος EMS1 Stichococcus sp. κλιμακώθηκε σε επίπεδο φωτοβιοαντιδραστήρα (όγκος καλλιέργειας 15 L) με τα μικροφύκη ακινητοποιημένα σε γυάλινα πλακίδια αμμοβολής. Οι πειραματικές συνθήκες επιλέχθηκαν για τη μεγιστοποίηση της βιομάζας και τα αποτελέσματα έδειξαν παραγωγή βιομάζας ίση με 49,2 g m-2, ενώ τα συνολικά βιο-προϊόντα αντιστοιχούσαν σε 41,7 g m-2 επιφάνειας. Τα μικροφύκη τροφοδοτήθηκαν επίσης με συνθετικά καυσαέρια. Ο τρίτος σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η δοκιμή του Stichococcus sp. σε πραγματικές συνθήκες με παροχή βιομηχανικών καυσαερίων για τη δέσμευση CO2. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν στον ηλεκτροπαραγωγικό σταθμό Λαυρίου, που βρίσκεται στην περιοχή της Αττικής. Το στέλεχος EMS1 Stichococcus sp. προσαρμόστηκε στο ακραίο αυτό περιβάλλον και παρήγαγε τιμές βιομάζας έως 50,5 g m-2 και τα συνολικά βιο-προϊόντα που μετρήθηκαν, ήταν ίσα με 39,8 g m-2. Ως τελικό αντικείμενο της παρούσας διατριβής, αξιολογήθηκαν οι διαδικασίες αφυδάτωσης και ξήρανσης μικροφυκών σε i) εναιώρημα και ii) ακινητοποιημένα. Καλλιέργειες αιωρούμενων μικροφυκών συλλέχθηκαν με διήθηση κενού, φυγοκέντριση και κροκίδωση χιτοζάνης σε συνδυασμό με τις προαναφερθείσες διαδικασίες. Η συγκομιδή των ακινητοποιημένων μικροφυκών έγινε με απόξεση των πλακιδίων με αμμοβολή, μειώνοντας έτσι το κόστος συγκομιδής. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα, παρόλο που η απόξεση βιομάζας έδειξε χαμηλότερα ποσοστά ανάκτησης κατά 18% σε σύγκριση με τη συγκομιδή αιωρούμενων μικροφυκών, έδειξε τη χαμηλότερη κατανάλωση ενέργειας (0,7 ± 0,1 kWh kg-1 νερού που αφαιρέθηκε), η οποία επαλήθευσε το εύρος της καλλιέργειας ακινητοποιημένης βιομάζας. Το μέσο ανάπτυξης που αφαιρέθηκε από τις ακινητοποιημένες καλλιέργειες μικροφυκών θα μπορούσε ενδεχομένως να διατηρηθεί για μελλοντική χρήση, καθώς περιέχει ένα μέρος της προηγούμενης καλλιέργειας και θρεπτικών συστατικών. Η συλλεγόμενη βιομάζα υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία με ξήρανση της περίσσειας υγρού. Η ξήρανση σε κλίβανο, ηλιακή ξήρανση και λυοφιλίωση δοκιμάστηκαν για την αποτελεσματικότητά τους και την επιρροή τους στη βιομάζα και στα βιο-προϊόντα των μικροφυκών. Η ξήρανση στον κλίβανο απαίτησε τη μεγαλύτερη κατανάλωση ηλεκτρικής ενέργειας (58,5 kWh kg-1 υγρής βιομάζας), αλλά ξήρανε τη βιομάζα σε σύντομο χρονικό διάστημα (5,5 ώρες). Τα ανακτημένα βιο-προϊόντα (δηλαδή, λιπίδια, χρωστικές ουσίες, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες) βρέθηκαν να συνδέονται με τις διαδικασίες ξήρανσης. Τα λιπίδια και η ολική ανάκτηση χλωροφύλλης ήταν μεγαλύτερη μετά την εφαρμογή λυοφιλίωσης με τις τιμές τους να είναι ίσες με 0,26 ± 0,01 g g-1 και 0,70 ± 0,04*10-2 g g-1 βιομάζας. Η ανάκτηση υδατανθράκων μεγιστοποιήθηκε με την εφαρμογή ηλιακής ξήρανσης και ξήρανσης σε κλίβανο, με μέγιστη τιμή 0,45 ± 0,01 g g-1 βιομάζας. Στην περίπτωση των πρωτεϊνών, κάθε διαδικασία ξήρανσης έδειξε παρόμοια ποσοστά ανάκτησης με μέση τιμή ίση με 0,19 ± 0,02 g g-1 βιομάζας. Τα παραπάνω δείχνουν ότι οι διαδικασίες ξήρανσης πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για τη μεγιστοποίηση των τελικών προϊόντων. Τα κύρια συμπεράσματα που προέκυψαν από την παρούσα διδακτορική διατριβή είναι ότι τα μικροφύκη αποτελούν βιώσιμη πηγή πολύτιμων προϊόντων και βιοκαυσίμων, μέσω της μετατροπής του CO2 για τον μετριασμό του φαινομένου του θερμοκηπίου. Η καλλιέργεια ακινητοποιημένων μικροφυκών σε θαλασσινό νερό με τις κατάλληλες συνθήκες μπορεί να μειώσει σημαντικά το κόστος καλλιέργειας, μεγιστοποιώντας την απόδοση βιομάζας και βιο-προϊόντων.