Ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής στον κυτταρικό κύκλο των βλαστικών και καρκινικών κύτταρων
Authors: Κανέλλου Αλεξάνδρα 
Published: September 2021

Προκειμένου να διατηρηθεί η γονιδιωματική ακεραιότητα, τα κύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς που εξασφαλίζουν ότι το DNA τους αντιγράφεται πιστά και μόνο μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Η γονιδιωματική αστάθεια μπορεί να προκύψει από ανεξέλεκγκτη αντιγραφή και οδηγεί σε ογκογένεση. Επομένως, η αντιγραφή του DNA υπόκειται σε αυστηρή ρύθμιση. Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA αποτελεί έναν ρυθμιστικό μηχανισμό που εξασφαλίζει την πιστή αντιγραφή του γονιδιώματος, μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο - pre-RC σχηματίζεται μετά από την έξοδο από τη μίτωση και κατά τη διάρκεια της G1 φάσης, σε αφετηρίες της αντιγραφής στις οποίες έχει προσδεθεί το σύμπλοκο ORC και με την προσέλκυση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1, Cdc6 στρατολογούνται τα σύμπλοκα ελικασών της αντιγραφής MCM2-7. Μόλις προσδεθεί το σύμπλοκο MCM2-7 στη χρωματίνη, το DNA αδειοδοτείται για αντιγραφή στην επόμενη S φάση. Προκειμένου να αποφευχθεί η επανα-αντιγραφή του γονιδιώματος, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των αδειοδοτικών παραγόντων Cdt1 και Cdc6 ρυθμίζονται αυστηρά καθόλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας είχε μελετηθεί η συμπεριφορά των MCM πρωτεϊνών, σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα, με τη χρήση ενός συστήματος αδειοδότησης και είχε δειχθεί ότι μετά την έξοδο από τη μίτωση μόνο ένα μικρό μέρος των MCM πρωτεϊνών αλληλεπιδρά με τη χρωματίνη, ενώ η πλειοψηφία τους προσδένεται κατά το τέλος της G1 φάσης (Symeonidou IE et al, 2013). Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η συμπεριφορά της κινητικής των MCM πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της G1 φάσης, αναλυθηκε η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 με τη χρωματίνη, με τη μέθοδο λειτουργικής μικροσκοπίας FRAP, σε ζωντανά κύτταρα MCF7 καρκίνου του μαστού. Παρατηρήθηκε ότι η πρόσδεση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη πραγματοποείται σε δύο διακριτά στάδια. Αρχικά με την έξοδο από τη μίτωση, στην αρχή της G1 φάσης, όπου ένα μικρό μέρος της πρωτεϊνης έχει προσδεθεί, καθώς επίσης και κατά το τέλος της G1 φάσης, λίγο πρίν την είσοδο στην S φάση, όπου παρατηρείται το μεγλύτερο δεσμευμένο κλάσμα της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη. Η ανάλυση της έκφρασης των αδειοδοτικών παραγόντων κατέδειξε ότι το χρονικό πρότυπο έκφρασης του Cdc6 ομοιάζει με τα στάδια πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη. Προκειμένου να διερευνηθεί η συμμετοχή του Cdc6 στη ρύθμιση των κυμάτων δέσμευση των MCM πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι λειτουργικής μικροσκοπίας FRAP και FLIP και αξιολογήθηκε η πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη, έπειτα από την αποσιώπηση ή την εκτοπική έκφραση του Cdc6 σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Η αποσιώπηση του Cdc6 κατά το τέλος της G1 φάσης έδειξε ότι η επανασυσσώρευση του Cdc6 κατά τη G1 / S μετάβαση είναι απαραίτητη για το επιπλεόν βήμα πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών πρίν από την είσοδο σε S φάση. Από την άλλη πλευρά, όταν το Cdc6 εκφράστηκε εκτοπικά νωρίς κατά τη G1 φάση, σε χρονικό σημείο που συνήθως απουσιάζει, ήταν επαρκές για να οδηγήσει την πλήρη πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών νωρίτερα στον κυτταρικό κύκλο. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα Cdc6 κατευθύνουν το χρόνο και την έκταση της πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη κατά τη διάρκεια της G1 φάσης.Η αξιπιστία της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA είναι πολύ σημαντική για τη κύτταρο και επομένως θελήσαμε να εξετάσουμε εάν η απαλοιφή του επιπλέον βήματος πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών κατα τη G1 / S μετάβαση θα επηρεάζε τόσο την αντιγραφή του DNA στην επακόλουθη S φάση, όσο και την καθολική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήθηκε ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες τα κύτταρα ήταν ικανά να αντιγράφουν το γενετικό υλικό καθώς και να προχωρήσουν στον κυτταρικό κύκλο. Παρ΄όλα αυτά, όταν τα κύτταρα υπεβλήθησαν σε αντιγραφικό στρες, συσσωρεύτηκαν στην S φάση με αυξημένα δείγματα βλάβης στο DNA. Περαιτέρω ανάλυση των ινών του DNA αποκάλυψε ότι κάτω από τις συνθήκες αντιγραφικού στρες, τα κύτταρα δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν τις ‘αδρανείς’ αφετηρίες της αντιγραφής. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι το επιπλέον βήμα πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών κατα το τέλος της G1 φάσης λειτουργεί ως προστατευτικός μηχανισμός των κυττάρων στο αντιγραφικό στρες, με το να αδειοδοτεί τις ‘αδρανείς’ αφετηρίες της αντιγραφής. Μελετήθηκε επίσης, εάν η πλήρης πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στο τέλος της G1 φάσης μπορεί να συνδέεται με το χρονικό πρόγραμμα της αντιγραφής και συγκεκριμένα με την ενεργοποίηση των αφετηριών που θα αντιγραφούν νωρίς κατά την S φάση, ωστόσο δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός μια τέτοιας συσχέτισης, αν και η υπόθεση αυτή χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Προκειμένου να κατανοηθούν καλύτερα οι ιδιότητες ενός ταχέως κυτταρικού κύκλου με πολύ σύντομη φάση G1, αναλύθηκε ο κυτταρικός κύκλος και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού (mouse embryonic stem cells - mESCs), τα οποία διαθέτουν αυτά τα χαρακτηριστικά. Παρατηρήθηκε ότι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται μετά την έξοδο από τη μίτωση και στην φάση G1 των mESCs και η MCM2 υπομονάδα αλληλεπιδρά με τη χρωματίνη από τη φάση G1 και κατά την είσοδο στη φάση S παρουσιάζει τα χαρακτηριστικά πρότυπα έκφρασης αρχής – μέσης – τέλους S φάσης, υποδηλώνοντας ότι η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA των mESCs εμφανίζει ομοιότητες με αυτή των σωματικών κυττάρων.Η διατήρηση της γονιδιακής σταθερότητας είναι πολύ σημαντική στα mESCs, αφού από αυτά μπορεί να προκύψει ένας ολόκληρος οργανισμός. Οι γενετικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από εξωγενή ή ενδογενή βλάβη του DNA μπορούν να αποδειχθούν καταστροφικές για την ομοιοστασία των ιστών και των οργανισμών. Συνεπώς, εξετάστηκε η απόκριση των mESCs μετά από βλάβη στο DNA που προκλήθηκε με τη χρήση ακτινοβολίας UV-C, σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού τους κύκλου. Παρατηρήθηκε ότι τα mESCs είναι ικανά να αναστείλλουν τον κυτταρικό κύκλο τους στη G1 / S μετάβαση, ακόμη και αν έχει αναφερθεί ότι δεν εμφανίζουν σημείο ελέγχου. Επιπρόσθετα, είναι σε θέση να προτεολύσουν ταχέως το Cdt1, μετά τη βλάβη στη G1 φάση, ένα χαρακτηριστικό που διαθέτουν και τα σωματικά κύτταρα, ενώ η φόρτωση της χρωματίνης MCM2 παρουσιάζει έναν ακανόνιστο φαινότυπο, πιθανώς λόγω αναστολής του κυτταρικού κύκλου. Η ακτινοβόληση των mESCs στη μίτωση αποκάλυψε σταθεροποίηση στην έκφραση του Cdt1, η οποία πραγματοποιείται μέσω της φωσφορυλίωσης της από ΜΑΡ κινάσες, ένας μηχανισμός που παρατηρείται και σε σωματικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι παρόμοια ρυθμιστικά μονοπάτια υπάρχουν στα πολυδύναμα κύτταρα για τη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας.