Συγκριτική μελέτη μεθόδων έμμεσης ανίχνευσης αυτόλογης μετάγγισης αίματος και διέγερσης ερυθροποίησης με εντοπισμό βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα για τον έλεγχο ντόπινγκ αθλητών
Authors: Σακελλαρίου Παναγιώτης 
Published: September 2021

Παρά την απαγόρευση από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Αντι-Ντόπινγκ (WADA), το ντόπινγκ αίματος, κυρίως με τη χρήση παραγόντων διέγερσης της ερυθροποίησης (ESAs) και τη μετάγγιση αίματος, χρησιμοποιείται από αθλητές που θέλουν να αποκτήσουν αθέμιτο πλεονέκτημα, αυξάνοντας την αερόβια ικανότητά τους, μέσω αύξησης της παραγωγής των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η ομόλογη μετάγγιση αίματος και κάποιοι ESAs μπορούν να εντοπιστούν στα δείγματα των αθλητών με άμεσες μεθόδους ανίχνευσης. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει διαθέσιμη μέθοδος άμεσης ανίχνευσης της αυτόλογης μετάγγισης αίματος. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη δυσκολία εντοπισμού νέων συνεχώς αναδυόμενων απαγορευμένων ουσιών, καθώς και τη χρήση πολλών διαφορετικών ανασυνδυασμένων ερυθροποιητινών σε μικροδόσεις, οδήγησε την επιστήμη του αντι-ντόπινγκ στην ανάπτυξη μεθόδων έμμεσης ανίχνευσης. Το Βιολογικό Διαβατήριο Αθλητή (ABP), ως στρατηγική για την έμμεση ανίχνευση ντόπινγκ αίματος μέσω της διαχρονικής παρακολούθησης των επιπέδων των αιματολογικών παραμέτρων και των ενδογενών στεροειδών σε ατομικό επίπεδο, αποτελεί σημαντική κατάκτηση. Νέες προσεγγίσεις, όμως, στο ντόπινγκ αίματος δημιουργούν νέες αναλυτικές προκλήσεις και ως εκ τούτου δημιουργείται η ανάγκη για περαιτέρω ενίσχυση αυτού του εργαλείου. Ο συνδυασμός του ABP με άλλους έμμεσους βιοδείκτες ανίχνευσης, όπως το προφίλ σιδήρου και οι μεταβολίτες, εκτιμάται ότι θα ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των ελέγχων ντόπινγκ αίματος. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αναζήτηση βιοδεικτών έμμεσης ανίχνευσης απαγορευμένων ουσιών ή/και μεθόδων από τον Κατάλογο Απαγορευμένων Ουσιών του WADA που μπορούν να συσχετιστούν με το ντόπινγκ αίματος. Ιδιαίτερη σημασία δόθηκε στη μελέτη της πιθανής επίδρασης της χρήσης των ουσιών ή/και των μεθόδων αυτών στη διαδικασία της ερυθροποίησης, καθώς και στη μελέτη των μεταβολών που μπορεί να προκαλέσει η χρήση τους στις παραμέτρους του ΑBP, κυρίως της αιματολογικής, αλλά και της στεροειδούς ενότητας, καθώς και στο προφίλ σιδήρου και στα επίπεδα έκφρασης της ερυθροποιητίνης. In vivo μεταβολική μελέτη πραγματοποιήθηκε μετά από απλή χορήγηση 10 mg μεθυλονορτεστοστερόνης σε εθελοντή. Τα δείγματα ούρων αναλύθηκαν με αεριοχρωματογραφία συνδεδεμένη με διπλή φασματομετρία μαζών (GC-MS/MS), οδηγώντας στην ταυτοποίηση επτά μεταβολιτών (Μ1-Μ4 και S1-S3). Οι μεταβολίτες φάσης ΙΙ Μ2, Μ3, Μ4 και S2, S3 της μεθυλονορτεστοστερόνης ανιχνεύθηκαν μέχρι το τέλος της μελέτης απέκκρισης (192 h), ενώ οι Μ1, S1 ανιχνεύθηκαν για 72 h. Οι δύο συζευγμένοι με γλυκουρονικό οξύ μεταβολίτες Μ3 και Μ4 και οι τρεις συζευγμένοι με θειικό οξύ μεταβολίτες S1, S2 και S3 ανιχνεύονται για πρώτη φορά. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι η απλή χορήγηση μεθυλονορτεστοστερόνης μεταβάλει τις παραμέτρους του προφίλ των στεροειδών τουλάχιστον για 48 h μετά τη χορήγηση, ενώ δεν επηρεάζει τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης στα ούρα, μετά από ανάλυσή τους με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. In vivo μεταβολική μελέτη πραγματοποιήθηκε μετά από απλή χορήγηση 10 mg LGD-4033 σε εθελοντή. Τα δείγματα ούρων αναλύθηκαν με υγροχρωματογραφία συνδεδεμένη με φασματομετρία μαζών (LC-MS). Εντοπίστηκαν έξι μεταβολίτες φάσης Ι Μ1-Μ6, με τον Μ5 να έχει το μεγαλύτερο παράθυρο ανίχνευσης (20,5 ημέρες) αποτελώντας το βασικό βιοδείκτη ελέγχου κατάχρησης LGD-4033 σε δείγματα ούρων που έχουν υποστεί υδρόλυση. Ο Μ6 ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε ανθρώπινα ούρα. Ακόμη, μετά από απλή αραίωση των δειγμάτων ούρων η μητρική ουσία και οι Μ1, Μ2, Μ3 ανιχνεύτηκαν ως μεταβολίτες φάσης ΙΙ συζευγμένοι με γλυκουρονικό οξύ. Το γλυκουρονίδιο του LGD-4033 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την ανίχνευση της ουσίας έως και 2,5 ημέρες μετά τη χορήγηση σε δείγματα που αναλύονται μετά από απλή αραίωσή τους. Η απλή χορήγηση LGD-4033 δεν προκάλεσε μεταβολές στο προφίλ των στεροειδών, ούτε στα επίπεδα έκφρασης της ερυθροποιητίνης στα ούρα. Η ανίχνευση ντόπινγκ αίματος, με έλεγχο δειγμάτων αίματος αθλητών για μεταβολές στις αιματολογικές παραμέτρους του ABP, μπορεί να πραγματοποιηθεί από το Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ της Αθήνας μετά από επικύρωση της λειτουργίας και έλεγχο της ορθότητας των μετρήσεων των αιματολογικών αναλυτών Sysmex XT-2000i και Sysmex XN-1000. H ανάλυση δειγμάτων ούρων με LC-MS μετά την πολλαπλή χορήγηση εισπνεόμενης σαλμετερόλης σε εθελοντή με 100 μg / 12 h απέδειξε τη βιοσυσσώρευση της μητρικής ουσίας και του μεταβολίτη της α-υδροξυσαλμετερόλη, με αυξανόμενες συγκεντρώσεις στα ούρα που φτάνουν μέχρι τα 3,53 ng/mL για τη σαλμετερόλη και τα 11,11 ng/mL για τον μεταβολίτη της. Επιπλέον, η ανάλυση των δειγμάτων αίματος της μελέτης έδειξε ότι η βιοσυσσώρευση σαλμετερόλης μπορεί να προκαλέσει μεταβολές στις αιματολογικές παραμέτρους του ABP και στο προφίλ σιδήρου, ενώ επηρεάζει και τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης στα ούρα, μετά από ανάλυσή τους με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι οι β2-αδρενεργικοί υποδοχείς συμμετέχουν στα πρώτα στάδια της ερυθροποίησης κατά τα οποία τα προγονικά κύτταρα δεν φέρουν υποδοχείς ερυθροποιητίνης.