Quantitative Analytik von Gallensäuren in biologischen Matrices mittels LC‐ESI‐MS/MS
Authors: Reiter Sinah , Hofmann Thomas 
Published: June 2023

Gallensäuren sind steroidale Verbindungen, die ein wichtiges Endprodukt des CholesterinMetabolismus darstellen. Als zentrale Bestandteile des Fettstoffwechsels sind Gallensäuren essentiell für die Resorption von Lipiden, lipidlöslichen Vitaminen und Steroiden. Dabei bilden sie Mizellen aus, welche die lipophilen Substanzen einschließen und resorbierbar machen . Seit einigen Jahren werden Gallensäuren immer häufiger mit verschiedenen Krankheiten, unter anderem entzündliche Darmkrankheiten (IBD), Cholestase, Fettleibigkeit, Typ‐2‐Diabetes und Krebs assoziiert.

Da moderne Messmethoden im Bereich der quantitativen Gallensäureanalytik meist nur eine geringe Anzahl an Gallensäuren inkludieren oder zeitaufwändig sind, wurde im ersten Teil dieser Arbeit eine robuste und schnelle Messmethode entwickelt, um 45 Gallensäuren qualitativ und quantitativ zu erfassen. Darunter befanden sich 2 humane primäre, 2 murine primäre, 26 sekundäre unkonjugierte, 8 Taurin‐konjugierte und 7 Glycin‐konjugierte Gallensäuren. Zur Bestimmung wurde die Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie mit der hochauflösenden Tandem‐Massen spektrometrie gekoppelt und als Trennmaterial ein reversed phase C18‐Material verwendet. Dadurch konnte eine Trennung der 45 Gallensäuren, innerhalb von 22 Minuten ermöglicht werden.

Als Nachweis einer erfolgreichen Methodenentwicklung wurde eine ausführliche Validierung in humanen Faeces durchgeführt. Dabei wurden die Parameter Wiederfindung, Extraktionsverlust, Mess‐, Wiederholungs‐ und Methodenpräzision, Linearität, Selektivität sowie Nachweis‐ und Bestimmungsgrenze berücksichtigt. Als Ausgangsmaterial für die Ermittlung des linearen Arbeitsbereiches, Selektivität und Nachweis‐ sowie Bestimmungsgrenze war es notwendig, eine analytfreie Faeces‐Matrix herzustellen. Diese konnte durch Einwirken von Aktivkohle auf dem fäkalen Matrix‐Extrakt gewonnen werden, da endogene Gallensäuren gebunden und entfernt werden.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde die entwickelte und validierte Messmethode auf biologische Matrices tierischen Ursprungs angewendet, um das Gallensäureprofil verschiedener Tierarten, wie Rind, Schwein, Lamm und Geflügel, in unterschiedlichen Geweben zu analysieren. Dafür wurden verschiedene Kompartimente des enterohepatischen und systemischen Kreislaufs untersucht. Es konnten unterschiedlich dominierende Gallensäuren bei verschiedenen Tierspezies festgestellt werden, was auf einen unterschiedlichen Gallensäure‐Metabolismus hinweist. In Geflügel konnte Chenodesoxycholsäure als dominierende Gallensäure ausgemacht werden, die hauptsächlich an Taurin gebunden war, während in Rindern die Gallensäuren Cholsäure und Desoxycholsäure primär vorlagen. In Schweinen überwiegen die Gallensäuren Hyodesoxycholsäure und Chenodesoxycholsäure, die hauptsächlich an Glycin konjugiert vorliegen.

Des Weiteren wurden Gallensäuren in einer Studie mit Morbus Crohn‐Patienten bestimmt, um das Gallensäureprofil der Patienten nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu untersuchen. Zudem wurde das Gallensäureprofil in keimfreien IL‐10‐/‐ Mäusen als humanisiertes Modell nach einer Stuhltransplantation von erkrankten Patienten analysiert. Da die Mäuse im Vergleich zum Menschen eine geringere Varianz in den Gallensäurekonzentrationen aufwiesen, wurden die Vorteile der Verwendung eines Mausmodells verdeutlicht. Insbesondere bei den Mäusen konnten unterschiedliche Gallensäureprofile bei entzündeten und nichtentzündeten Phänotypen ermittelt werden. Dabei lieferten Taurin‐konjugierte Gallensäuren einen Hinweis auf Entzündungen im Wirt, was Aussagen über den Entzündungsstatus ermöglichen kann.