Βιολογικός ρόλος της απολιποπρωτεΐνης J/Clusterin στη γήρανση και στην καρκινογένεση
Authors: Λούρδα Μαγδαληνή 
Published: August 2021

Η Απολιποπρωτεΐνη J/Clusterin (CLU) είναι μία υψηλά συντηρημένη γλυκοπρωτεΐνη που εμπλέκεται σε πλήθος φυσιολογικών ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών λειτουργιών και παθολογικών καταστάσεων, όπως είναι η γήρανση και οι ασθένειες που τη συνοδεύουν, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Τέσσερις βασικές ισομορφές της πρωτεΐνης έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα: η κυτταροπλασματική (c-CLU), η εκκρινόμενη (s-CLU), η πρόδρομη πυρηνική (pn-CLU) και η πυρηνική (n-CLU) ισομορφή. Η μετάφραση του πρωτογενούς μεταγράψου της CLU οδηγεί στη δημιουργία της c-CLU, από την ωρίμανση της οποίας προκύπτει τελικά η s-CLU που αποτελείται από δύο πεπτιδικές αλυσίδες, την α και τη β. Εναλλακτικό μάτισμα του πρωτογενούς μεταγράφου καθοδηγεί τη δημιουργία της pn-CLU, η οποία μετατρέπεται στην n-CLU ισομορφή, μεταβαίνει στον πυρήνα όπου συνδέεται με το σύμπλεγμα των ελικασών Ku70/Ku86 και επάγει κυτταρικό θάνατο. Παρά τις εκτεταμένες όμως μελέτες για τη διαλεύκανση της δράσης της CLU, ο ρόλος της στις διάφορες καταστάσεις στις οποίες εμπλέκεται δεν έχει αποσαφηνιστεί. Σκοπός λοιπόν της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου των ισομορφών της CLU στην απόκριση οστεοσαρκωματικών (OS) κυττάρων σε διάφορες καταστάσεις στρες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και διατήρησης ανθεκτικότητας OS κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αρχικά, τρεις OS κυτταρικές σειρές (U-2 OS, Sa OS και ΚΗ OS) με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών CLU και p53 εκτέθηκαν στο χημειοθεραπευτικό παράγοντα δοξορουβισίνη (DXR) για διάφορα χρονικά διαστήματα. Στα κύτταρα που επιβίωσαν της αγωγής με DXR παρατηρήθηκε αύξηση της CLU τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και πρωτεΐνης, ενώ στα νεκρά κύτταρα η CLU συσσωρεύτηκε σε πολύ υψηλότερα ποσά. Τα παραπάνω πειράματα έδειξαν ότι ο βαθμός επαγωγής της CLU είναι αντιστρόφως ανάλογος των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης στα κύτταρα και ρυθμίζεται κυρίως σε επίπεδο μεταγραφής. Επιπλέον, φάνηκε να υπάρχει μια μέγιστη ενδοκυτταρική ποσότητα της CLU που μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα όταν εκτίθενται σε στρες, η οποία αν ξεπεραστεί αποβαίνει τοξική γι’ αυτά. Τέλος, δείχθηκε ότι σε κύτταρα με πολύ χαμηλά ενδογενή επίπεδα της CLU (KH OS) η υπερπαραγωγή και έκκριση της s-CLU ήταν απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων που εκτέθηκαν στην DXR. Επόμενος στόχος ήταν η μελέτη του τρόπου δράσης των ισομορφών της CLU σε διαφορετικές καταστάσεις στρες σε OS κύτταρα που υπερεκφράζανε είτε τη c- CLU, είτε την pn-CLU ύστερα από μόνιμη επιμόλυνση. Οι δοκιμασίες επιβίωσης σε διάφορες συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών ουσιών έδειξαν ότι η δράση των c-CLU/sCLU πρωτεϊνών όταν τα κύτταρα εκτεθούν σε στρες εξαρτάται από τα ενδογενή ποσά της CLU, το γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων και την ένταση της καταπόνησης. Δηλαδή, όταν οι πληθυσμοί των U-2 OS (υψηλά ενδογενή επίπεδα της CLU) και Sa OS (μέτρια ενδογενή επίπεδα της CLU) κυττάρων που υπερεκφράζανε τις c-CLU/sCLU πρωτεΐνες μετά την επιμόλυνση εκτέθηκαν σε παράγοντες που προκαλούν γενοτοξικό ή οξειδωτικό στρες, η συσσώρευση των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών είτε δεν είχε καμία περαιτέρω δράση, είτε έδρασε προαποπτωτικά στα εν λόγω κύτταρα όταν χορηγήθηκε υψηλή συγκέντρωση του παράγοντα. Αντίθετα, στους πληθυσμούς των KH OS κυττάρων που υπερεκφράζανε τις c-CLU/s-CLU μετά την επιμόλυνση, παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά επιβίωσης σε συνθήκες έντονης καταπόνησης σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον άδειο φορέα έκφρασης (κυτταροπροστατευτική δράση της CLU). Όσον αφορά την pn-CLU ισομορφή, η επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί γι’ αυτή δεν προκάλεσε την παραγωγή της n-CLU, αλλά ούτε υπερέκφραση των c-CLU/s-CLU ισομορφών και τα κύτταρα ήταν βιώσιμα. Το γεγονός ότι η n-CLU ανιχνεύτηκε σε ορισμένες κυτταρικές σειρές που βρέθηκαν σε ένα δεδομένο περιβάλλον και όχι στα κύτταρα της εν λόγω εργασίας ή άλλων μελετών φανερώνει ότι πιθανότατα συγκεκριμένα ερεθίσματα προκαλούν την παραγωγή της pn-CLU ή τη μετατροπή της σε n-CLU. Επιπλέον, η υπερέκφραση είτε της pn-CLU είτε των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών στα κύτταρα της παρούσας μελέτης είχε την ίδια επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων που εκτέθηκαν σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή εμπλοκή της CLU στην εμφάνιση και διατήρηση ανθεκτικότητας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικές ουσίες, δημιουργήθηκαν διαδοχικές γενεές U-2 OS, Sa OS και ΚΗ OS κυττάρων ανθεκτικών στην DXR (DXR-R: RI, R2 και R3). Ο μοριακός χαρακτηρισμός των κυτταρικών σειρών έδειξε ότι η εμφάνιση ανθεκτικότητας στην DXR ήταν συνυφασμένη με σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών. Μόνο τα R2 και R3 κύτταρα παρουσίασαν αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα του δείκτη πολυφαρμακευτικής ανθεκτικότητας MDR1, η αναστολή του οποίου τα ευαισθητοποίησε στην DXR. Μετέπειτα ανάλυση στις R2 σειρές έδειξε ότι η χημειοαντοχή τους δεν περιοριζόταν στην DXR, αλλά επεκτεινόταν και σε άλλους κυτταροτοξικούς παράγοντες με διαφορετικό τρόπο δράσης. Αφού ολοκληρώθηκε ο γενικός χαρακτηρισμός των σειρών, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της CLU στα χημειοανθεκτικά κύτταρα. Η μελέτη αποκάλυψε μια μέτρια (~30%) αύξηση του mRNA της CLU και των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών στα U-2 OS R2 κύτταρα, αλλά μια έντονη επαγωγή (~4 φορές) στα ΚΗ OS R2 και R3 κύτταρα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πατρικά, προφίλ έκφρασης παρόμοιο με αυτό των πρωτεϊνών MDR1 και PARP στα συγκεκριμένα κύτταρα. Παρατηρήθηκε λοιπόν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU και του βαθμού επαγωγής της στα R2 και R3 κύτταρα. Τα υψηλά ενδοκυτταρικά επίπεδα της CLU συνοδεύονταν και από αυξημένα εξωκυττάρια ποσά, αλλά όχι από αλλαγή στην ενδοκυττάρια κατανομή της. Η n-CLU δεν ανιχνεύτηκε σε καμία κυτταρική σειρά. Η απενεργοποίηση της εξωκυττάριας S-CLU ισομορφής της πρωτεΐνης ή η αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου της CLU με τη βοήθεια της τεχνολογίας «μικρά RNA παρεμβολής» (siRNA), ευαισθητοποίησαν σημαντικά τα ΚΗ OS R2 κύτταρα, ακόμα και χωρίς ταυτόχρονη έκθεση σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Αντίθετα, η καταστολή της έκφρασης της CLU στις U-2 OS κυτταρικές σειρές απουσία DXR δεν ευαισθητοποίησε τα R2 κύτταρα περισσότερο από τα πατρικά, γιατί τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης στις U-2 OS κυτταρικές σειρές είναι ήδη πολύ υψηλά. Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα της διατριβής φαίνεται πως η CLU είναι ένα μόριο που εκτός από το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης ή εξωκυττάριου συνοδού μορίου εμπλέκεται και σε πλήθος ενδοκυτταρικών διαδικασιών. Όμως, παρά τη φαινομενική πολυπλοκότητα της δράσης της, θα μπορούσε απλά να ειπωθεί πως η πρωτεΐνη παρέχει μια ισορροπία μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης και θανάτου, ανάλογα με τα ερεθίσματα που δέχεται το κύτταρο σε ένα δεδομένο περιβάλλον. Το γεγονός ότι το προφίλ της επαγωγής της CLU στα R2 κύτταρα ήταν παρόμοιο με αυτό των πρωτεϊνών MDR1 και PARP καθώς και το γεγονός ότι η καταστολή της έκφρασης της CLU ευαισθητοποίησε τα R2 κύτταρα στην DXR αποτελούν ισχυρές ενδείξεις ότι η CLU εμπλέκεται άμεσα στην απόκτηση του χημειοανθεκτικού φαινοτύπου στα OS κύτταρα και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης χημειοανθεκτικότητας σε καρκινικά κύτταρα.