Μελέτη της δράσης των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών στις λειτουργίες των κυττάρων του ινοσαρκώματος και διερεύνηση του ρόλου των αυξητικών παραγόντων
Authors: Κουβίδη Αικατερίνη 
Published: August 2021

Το ινοσάρκωμα αποτελεί μια σπάνια μορφή καρκίνου των μαλακών μορίων, που προέρχεται από τους ινοβλάστες. Παρατηρείται σε νεογνά, σε μεσήλικες και ηλικιωμένους και αποτελεί το 10-20 % των όγκων που εμφανίζονται στην παιδική ηλικία. Περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς πεθαίνουν σε διάστημα 5 ετών. Η θεραπεία επιλογής είναι αφαίρεση του όγκου και χημειοθεραπεία. Η κυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και η διάγνωσή του, αρκετές φορές γίνεται συνήθως με τον αποκλεισμό των άλλων τύπων σαρκώματος.Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία είναι μια σύνθετη δομική οντότητα, η οποία περιβάλλει και υποστηρίζει τα κύτταρα που απαρτίζουν τους ιστούς. Τα κύρια δομικά συστατικά της είναι το κολλαγόνο, οι γλυκοπρωτεΐνες, οι πρωτεογλυκάνες (PGs) και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs). Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελεί ένα φυσικό σκελετό για την κυτταρική προσκόλληση και είναι εξαιρετικά σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την διαφοροποίηση τους. Το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), μια μη-θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη υψηλού μοριακού βάρους, αποτελεί ένα από τα βασικά συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) και διατηρεί την ομοιόσταση των ιστών.Υψηλά επίπεδα HA που έχουν βρεθεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έχει προταθεί ότι αποτελούν σημαντικούς προγνωστικούς δείκτες μειωμένης επιβίωσης σε καρκίνους του μαστού, των ωοθηκών και του παχέος εντέρου. Στο μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων, το HA μεταδίδει σήματα από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία προς το εσωτερικό του κυττάρου και αλλαγές στο μεταβολισμό του οδηγούν σε αύξηση της κυτταρικής κινητικότητας, της προσκόλλησης, της μετανάστευσης και της μετάστασης. Σημαντικά ευρήματα καταδεικνύουν ότι το HA ρυθμίζει αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασής του με τους ειδικούς υποδοχείς του, CD44 και RHAMM.Ο CD44 είναι ο καλύτερα χαρακτηρισμένος υποδοχέας του HA και έχει δειχθεί ότι είναι ο κύριος ρυθμιστής του. Ο RHAMM (receptor for hyaluronic acid-mediated motility) διαφέρει απ’ τους υπόλοιπους υποδοχείς του HA λόγω του ότι εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα, στο πυρήνα καθώς επίσης και στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη. H διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης, και τα εμπλεκόμενα σε αυτή μόρια, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Έχει αναφερθεί ότι η ελάττωση των προσκολλητικών δυνάμεων μεταξύ των κυττάρων και μεταξύ κυττάρου-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας επιτρέπει σε μερικά καρκινικά κύτταρα να αποχωριστούν μεταξύ τους και να αποκολληθούν από την αρχική καρκινική εστία και να μεταναστεύσουν σε άλλο όργανο. Στα σημεία κυτταρικής προσκόλλησης εντοπίζεται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), η οποία επάγει την προσκολλητική ικανότητα των κυττάρων ενεργοποιώντας ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια. Η δράση της FAK ενεργοποιείται από διάφορα μόρια που επάγουν τη φωσφωρυλίωσή της, κάποια απ’ τα οποία είναι οι κινάσες Src και ERK. Η καρκινογένεση αποτελεί μια κυτταρική λειτουργία που χαρακτηρίζεται από τη διαταραχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με την ταυτόχρονη καταστολή της απόπτωσης με αποτέλεσμα το σχηματισμό όγκων. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση σημαντικών γονιδίων που συμμετέχουν σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η κυτταρική διαφοροποίηση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Έχει δειχθεί ότι η διαταραχή της λειτουργίας του Wnt σηματοδοτικού μονοπατιού έχει συσχετιστεί με την εμφάνιση καρκίνου σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Η β-catenin είναι μια πρωτεΐνη με πολλές λειτουργίες που συμμετέχει στο Wnt μονοπάτι διεγείροντας την κυτταρική αύξηση και ρυθμίζοντας λειτουργίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την καρκινογένεση. Η πρωτεΐνη αυτή έχει την ικανότητα να επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη μετατόπισή της στον πυρήνα. Ο ρόλος της εκεί είναι να ρυθμίζει τη μεταγραφική ικανότητα των T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) και πιο συγκεκριμένα να ενεργοποιεί γονίδια όπως η cyclin-D1, c-jun, c-myc. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της δράσης της HA/RHAMM αλληλεπίδρασης σε δύο βασικές κυτταρικές λειτουργίες, αυτές της προσκόλλησης και του πολλαπλασιασμού των HT1080 κυττάρων του ινοσαρκώματος. Επίσης βασιζόμενοι στη προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, διερευνήσαμε πιθανά εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια μονοπάτια σηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση των συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών. Απώτερος στόχος μας ήταν ο εντοπισμός νέων διαγνωστικών δεικτών για το ινοσάρκωμα καθώς και μορίων-στόχους κατάλληλων για τη θεραπευτική αντιμετώπισή του. Πιο συγκεκριμένα, στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάσαμε τη δράση της HA/RHAMM σηματοδότησης στην ικανότητα προσκόλλησης των HT1080 κυττάρων ινοσαρκώματος πάνω σε υπόστρωμα ινονεκτίνης. Το χαμηλού μοριακού βάρους HA (LMWHA), αύξησε σημαντικά την προσκολλητική ικανότητα των HT1080 κυττάρων, ενώ το υψηλού μοριακού βάρους HA τη μείωσε. Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων στα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM, μειώθηκε σημαντικά (p ≤ 0,001), ενώ σε αυτά που είχε ανασταλεί η έκφραση του CD44 δεν διαπιστώθηκε αλλαγή σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι η επίδραση του LMWHA στην κυτταρική προσκόλληση των ΗΤ1080 κυττάρων καταργήθηκε στα κύτταρα τα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM. Αντιθέτως, τα ίδια κύτταρα δεν έδειξαν καμία αλλαγή με την προσθήκη του υψηλού μοριακού βάρους HA, γεγονός που καταδεικνύει τον RHAMM σαν ένα εξειδικευμένο και απαραίτητο μόριο για τη δράση του LMWHA. Οι τεχνικές της ανοσοαποτύπωσης κατά Western και της PCR έδειξαν ότι το LMWHA αυξάνει σημαντικά την mRNA έκφραση του RHAMM (p ≤ 0,05) καθώς και τα επίπεδα πρωτεϊνικών ισομορφών του RHAMM (53% 45kDa, 95 kDa 37%, 73 kDa) σε κύτταρα ινοσαρκώματος. Επιπλέον, η ανοσοαποτύπωση κατά Western έδειξε ότι το LMWHA μέσω του RHAMM ενισχύει τόσο τα βασικά επίπεδα κυτταρικής προσκόλλησης όσο και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK1/2 και της κινάσης της προσκόλλησης (FAK). Με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προέκυψε πλήρης αναστολή (p ≤ 0,001) της δράσης του LMWHA στην προσκόλληση των κυττάρων, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Αντίστοιχα, με τη χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προκλήθηκε σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της FAK γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ενεργοποιητή της FAK.Στην συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της σηματοδότησης του ΗΑ, μέσω του RHAMM υποδοχέα του, στον πολλαπλασιασμό κυττάρων του ινοσαρκώματος. Μία in vitro δοκιμή πολλαπλασιασμού έδειξε ότι τόσο το χαμηλού μοριακού βάρους ΗΑ (LMWHA) όσο και το υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ (HMWHA) αύξησαν σημαντικά (p ≤ 0,01 και p ≤ 0,05 αντίστοιχα) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ1080. Προκειμένου να μελετηθεί ο άμεσος ρόλος του RHAMM στον επαγόμενο από το ΗΑ πολλαπλασιασμό των ΗΤ1080 κυττάρων, έγινε αναστολή της έκφρασης του RHAMM με χρήση RNA παρεμβολής (siRNA). Κύτταρα μετασχηματισμένα με siRHAMM έδειξαν σημαντική μείωση στο βασικό (p ≤ 0,01) και στον επαγόμενο από το LMWHA (p ≤ 0,001) ρυθμό ανάπτυξης. Στην προσπάθεια εντοπισμού υποψήφιων μορίων που συμμετέχουν στο ΗΑ/RHAMM μονοπάτι σηματοδότησης, εξετάστηκαν παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του RHAMM. Πιο συγκεκριμένα, με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 μειώθηκαν τόσο τα βασικά επίπεδα καθώς και ο επαγόμενος από το LMWHA πολλαπλασιασμός των κυττάρων του ινοσαρκώματος, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Στη συνέχεια, μετά από αναστολή του RHAMM μειώθηκε σημαντικά η έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,05) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,01). Έπειτα, εξετάστηκε η δράση της στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ινοσαρκώματος. Η αναστολή του γονιδίου της β-catenin οδήγησε σε αναμενόμενη μείωση τόσο των βασικών επιπέδων αλλά και του επαγόμενου από το LMWHA κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το LMWHA άλλαξε σημαντικά την έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,01) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,05). Πιο συγκεκριμένα, η προσθήκη LMWHA οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της β-catenin που εντοπίζεται στον πυρήνα. Ακόμη, μετά από αναστολή της έκφρασης της β-catenin καθώς και του RHAMM υποδοχέα μειώθηκε σημαντικά η έκφραση των γονιδίων c-myc (p ≤ 0,001; p ≤ 0,01) και c-jun (p ≤ 0,001; p = στατιστικά μη σημαντικό) αντίστοιχα, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.Με την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι η RHAMM/HA αλληλεπίδραση ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης των FAK και ERK1/2 μονοπατιών σηματοδότησης. Επίσης, τα δεδομένα που προκύπτουν αναδεικνύουν για πρώτη φορά την ύπαρξη μιας ενδοκυττάριας αλληλεπίδρασης του RHAMM με τη β-catenin η οποία οδηγεί στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα c-myc. Από τα παραπάνω λοιπόν, συνάγεται ότι ο RHAMM υποδοχέας και το LMWHA μπορούν να αποτελέσουν περαιτέρω πεδίο έρευνας για την άντληση χρήσιμων συμπερασμάτων που θα στοχεύουν στην ανάδειξη του υποδοχέα σε διαγνωστικό δείκτη και το LMWHA μαζί με RHAMM υποδοχέα ως πιθανά μόρια-στόχοι για τη θεραπευτική αντιμετώπιση του ινοσαρκώματος.