Διερεύνηση της εφαρμογής της φασματοσκοπίας ανάκλασης εγγύς υπερύθρου στην πρόβλεψη της διαιτητικής αξίας σύνθετων ζωοτροφών σε κόνικλους
Authors: Φορτάτος Ευστάθιος 
Published: October 2023

Ο προσδιορισμός της πεπτικότητας έχει ρόλο κλειδί στη διαιτητική εκτίμηση των ζωοτροφών, αλλά λόγω κόστους και χρόνου των κλασικών μεθόδων δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί σε πραγματικό χρόνο, όπου και έχει ιδιαίτερη σημασία. Η φασματοσκοπία ανάκλασης εγγύς υπερύθρου (NIRS) μπορεί να προβλέψει την πεπτικότητα σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιώντας χημειομετρικούς αλγόριθμους, που συσχετίζουν ποσοτικά τα φασματικά και αναλυτικά δεδομένα ζωοτροφών και κόπρου (εξισώσεις βαθμονόμησης). Η ακρίβεια όμως των προβλέψεων με τη σημερινή μεθοδολογία περιορίζει τις δυνατότητες της NIRS σε αδρές κατά κανόνα εκτιμήσεις της πεπτικότητας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, χρησιμοποιώντας τον κόνικλο ως ζώο αναφοράς, είχε ως στόχο τη βελτίωση της ακρίβειας πρόβλεψης της πεπτικότητας στη NIRS με δύο τρόπους: α) την ανάπτυξη και αξιολόγηση μίας υβριδικής προσέγγισης συνδυασμού των φασματικών δεδομένων κόπρου και τροφής, χρησιμοποιώντας έναν άπεπτο δείκτη (φυτογενές πυρίτιο – PS) ως συνδετικό κρίκο και β) την αξιολόγηση της χρήσης τεχνητών νευρωνικών δικτύων στη δημιουργία ισχυρών προγνωστικών μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας. Έτσι, η πρώτη υπόθεση που εξετάστηκε ήταν αν το PS θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως εσωτερικός δείκτης για τον υπολογισμό της πεπτικότητας στους κονίκλους διερευνώντας την ανάκτηση στην κόπρο (για να προσδιοριστεί αν είναι 100% άπεπτο) και την ευκολία ακριβούς ποσοτικοποίησης χρησιμοποιώντας απλές και αξιόπιστες μεθόδους σε πολύ μεγάλο αριθμό δειγμάτων και σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η δεύτερη υπόθεση που διερευνήθηκε ήταν αν μπορεί να πραγματοποιηθεί ανάπτυξη χημειομετρικών μοντέλων NIRS για τον ποσοτικό προσδιορισμό του PS μαζί με τα κύρια θρεπτικά συστατικά (ΞΟ, OΟ, ΑΟ, κ.λπ.), σε τροφές και κόπρο ώστε να αξιολογηθεί η δυνατότητα εφαρμογής μίας υβριδικής προσέγγισης υπολογισμού της πεπτικότητας με βάση τα χημικά χαρακτηριστικά των ζωοτροφών και της κόπρου και αποκλείοντας κάθε φυσική πληροφορία των φασματικών δεδομένων, που θα μπορούσε ενδεχομένως να επηρεάσει αρνητικά τις προβλέψεις της πεπτικότητας. Στην εξέταση διερευνήθηκε και η δυνατότητα χρήσης τεχνητών νευρωνικών δικτύων για την ανάπτυξη βέλτιστων μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας χρησιμοποιώντας μόνο τα φασματικά δεδομένα της κόπρου (που περιέχουν και φυσικές πληροφορίες). Η τρίτη υπόθεση που εξετάστηκε στην παρούσα διατριβή ήταν εάν και σε ποιο βαθμό μπορούν να αξιοποιηθούν τα σύγχρονα χαρακτηριστικά της NIRS ώστε να διαπιστωθεί αν η προτεινόμενη μεθοδολογία μπορεί να εφαρμοστεί σε πρακτικές συνθήκες σε διάφορες μορφές δειγμάτων (νωπά, μη αλεσμένα, αποξηραμένα κ.ο.κ). Στο πλαίσιο αυτό εξετάστηκε πάλι η χρήση τεχνητών νευρωνικών δικτύων ώστε να διερευνηθεί αν και κατά πόσο μπορούν να βελτιώσουν την προγνωστική ισχύ των μοντέλων της NIRS, όταν αυτά βασίζονται σε μη προετοιμασμένα δείγματα. Για τη διερεύνηση της πρώτης υπόθεσης χρησιμοποιήθηκαν τριάντα δείγματα κόπρου από προηγούμενη μελέτη για τον υπολογισμό του συντελεστή φαινόμενης πεπτικότητας (ΣΦΠ) της ξηράς ουσίας (ΞΟ) και της συνόλης ενέργειας (ΣΕ) του ίδιου βασικού σιτηρεσίου σύμφωνα με την ευρωπαϊκή μέθοδο αναφοράς (European Reference Method, ERM), την τεχνική της ΑΙΑ και την εξεταζόμενη τεχνική PS (n = 10 κόνικλοι/μέθοδο). Το PS είναι το κύριο κλάσμα της αδιάλυτης στο υδροχλωρικό οξύ τέφρας (AIA), η οποία χρησιμοποιείται ως εσωτερικός δείκτης στον προσδιορισμό της πεπτικότητας. Ωστόσο, σε σύγκριση με την ΑΙΑ, το PS μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με μεθόδους περισσότερο ταχείες και ευαίσθητες. Ως εκ τούτου, το παρόν πείραμα είχε ως στόχο να αξιολογήσει το PS ως εναλλακτικό της AIA δείκτη για τον υπολογισμό της πεπτικότητας σε κόνικλους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις της ΑΙΑ στην τροφή και την κόπρο ήταν 12,89 ± 0,066 και 31,58 ± 0,042 g/kg, ενώ εκείνες του PS ήταν 13,98 ± 0,066 και 36,59 ± 0,059 g/kg, αντίστοιχα (μέσος όρος ± SEM). Η ανάκτηση του δείκτη ήταν 100,3 ± 1,43 % και 100,8 ± 1,48 % για την AIA και την PS (P= 0,939) τεχνική, αντίστοιχα. Ο ΣΦΠ της ΞΟ δεν διέφερε μεταξύ των μεθόδων (P= 0,935) και ήταν 0,589 ± 0,0055, 0,591 ± 0,0056 και 0,588 ± 0,0060 για τις ERM, AIA και PS, αντίστοιχα. Επίσης, ο ΣΦΠ της ΣΕ ήταν παρόμοιος μεταξύ όλων των μεθόδων (P = 0,914) και ήταν 0,581 ± 0,0058, 0,585 ± 0,0060 και 0,584 ± 0,0064 για τις ERM, AIA και PS, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός του PS απαιτούσε πολύ μικρότερη ποσότητα δείγματος (κατά 98 %) και όγκους αντιδραστηρίων (κατά 68–82 %) και επέτρεψε την ανάλυση περισσοτέρων δειγμάτων (κατά 7 φορές περισσότερα) σε σύγκριση με την ΑΙΑ. Συμπερασματικά, το PS αξιολογήθηκε ως ένας αξιόπιστος εσωτερικός δείκτης που προσφέρει τη δυνατότητα υπολογισμού του ΣΦΠ με την ίδια ακρίβεια με τη μέθοδο αναφοράς στους κόνικλους. Για την εξέταση της δεύτερης και τρίτης υπόθεσης της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 27 δείγματα τροφής και 282 δείγματα κόπρου από in vivo πείραμα πεπτικότητας σε κονίκλους. Επιπλέον, συλλέχθηκαν 43 δείγματα ζωοτροφών από εμπορικές μονάδες για την επέκταση του συνόλου των δεδομένων. Κάθε σύνολο δεδομένων χωρίστηκε τυχαία σε σύνολα βαθμονόμησης και επικύρωσης. Πρώτον, αναπτύχθηκαν βαθμονομήσεις για την πρόβλεψη της χημικής σύστασης των ζωοτροφών και της κόπρου, συμπεριλαμβανομένου του PS. Τα δείγματα της τροφής εξετάστηκαν σε δύο μορφές (ακέραια σύμπηκτα, αλεσμένα σύμπηκτα), ενώ της κόπρου εξετάστηκαν σε τρεις μορφές (νωπά μη αλεσμένα, αποξηραμένα μη αλεσμένα και αποξηραμένα αλεσμένα). Τα φάσματα κόπρου χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη του ΣΦΠ της ξηράς ουσίας (ΞΟ), της οργανικής ουσίας (ΟΟ) και των ολικών αζωτούχων ουσιών (ΟΑ). Οι βαθμονομήσεις αξιολογήθηκαν α) εσωτερικά με διασταυρούμενη επικύρωση, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ελέγχου ένα τη φορά (leave-one-out) για την τροφή και τη μέθοδο ελέγχου ανά ομάδα (k-fold) για την κόπρο και β) εξωτερικά με ένα ανεξάρτητο σετ. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν με τεχνητά νευρωνικά δίκτυα (ΑΝΝ), μοντέλα εμπρόσθιας διάδοσης για τα δείγματα κόπρου στις τρείς προαναφερόμενες μορφές με σκοπό την αξιολόγηση πρόβλεψης της πεπτικότητας της ΞΟ, της ΟΟ και των ΟΑ χρησιμοποιώντας μόνο τα φασματικά δεδομένα της κόπρου. Οι περισσότερες χημικές παράμετροι των ζωοτροφών προβλέφθηκαν με ακρίβεια (R2val > 0,8), αλλά μόνο στα αλεσμένα δείγματα. Η ανάλυση των μη αλεσμένων δειγμάτων έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα μόνο για την ΞΟ και τις ΟΑ (R2val = 0,80 και R2val = 0,88, αντίστοιχα). Οι χημικές παράμετροι της κόπρου προβλέφθηκαν με ακρίβεια, μόνο για την ΞΟ και τις ΟΑ (R2val = 0,89 και R2val = 0,88, αντίστοιχα) στη νωπή κόπρο. Η ανάλυση των αποξηραμένων αλεσμένων δειγμάτων κόπρου έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα μόνο για τις ΟΑ (R2val = 0,92). Όσον αφορά τον δείκτη PS, προβλέφθηκε στην τροφή με ακρίβεια στο ανεξάρτητο σύνολο (R2val = 0,75) και με μικρότερη ακρίβεια, αλλά σχετικά ικανοποιητικά στην κόπρο (R2val = 0,70). Η πρόβλεψη του ΣΦΠ των θρεπτικών συστατικών από τα φάσματα της κόπρου είχε σχετικά καλή τιμή (R2val > 0,75), αλλά μόνο για τα αποξηραμένα και αλεσμένα δείγματα. Αντίθετα, η χρήση των τεχνητών νευρωνικών δικτύων (ΑΝΝ) βελτίωσε σημαντικά την προγνωστική ισχύ των μοντέλων τόσο στα νωπά (ακέραια σφαιρίδια κόπρου) όσο και στα αποξηραμένα ολόκληρα δείγματα, γεγονός που ήταν ιδιαίτερα εμφανές για το μοντέλο που προέβλεπε την πεπτικότητα των ΟΑ (R2val> 0,91). Το επόμενο βήμα ήταν ο υπολογισμός των ΣΦΠ των θρεπτικών συστατικών και στη συνέχεια η σύγκριση με τη μέθοδο ολικής συλλογής και την έμμεση NIRS (όπου προβλέφθηκαν οι ΣΦΠ με χρήση των φασματικών δεδομένων της κόπρου μόνο). Τα μοντέλα NIRS έδειξαν ακριβή πρόβλεψη του δείκτη PS και η σύγκριση των υπολογισμένων ΣΦΠ με αυτούς της μεθόδου αναφοράς δεν έδειξε σημαντικές διαφορές. Συμπερασματικά, η υβριδική προσέγγισή μπορεί να υπολογίσει με ακρίβεια το ΣΦΠ των θρεπτικών ουσιών και επιπλέον, βασίζεται μόνο στις χημικές πληροφορίες και όχι σε οποιαδήποτε φυσική ιδιότητα των τροφών και της κόπρου, η οποία μπορεί να επηρεάσει ενδεχομένως αρνητικά την πρόβλεψη της πεπτικότητας. Επιπλέον, η χρήση των ΑΝΝ μπορεί να βελτιώσει την ισχύ των μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας, ειδικά σε μη προετοιμασμένα δείγματα (νωπά μη αλεσμένα), κάτι που είναι ιδιαίτερης πρακτικής σημασίας.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, ακολουθούνται από κάποιους περιορισμούς που πρέπει να ληφθούν υπόψιν. Αρχικά, τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν αφορούν τα συγκεκριμένα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για βαθμονόμηση/επικύρωση, οπότε η χρήση των μοντέλων πέραν αυτών των δειγμάτων, δηλαδή σε μελλοντικά άγνωστα δείγματα, πιθανόν να μη δώσει παρόμοια αποτελέσματα. Για την ευρεία εφαρμογή των μοντέλων απαιτείται και διεύρυνση των ομάδων βαθμονόμησης. Όπως παρατηρήθηκε σε κάποιες από τις εξεταζόμενες παραμέτρους, τα μη ικανοποιητικά αποτελέσματα από τις ομάδες επικύρωσης, παρά τα πολύ καλά στατιστικά στις ομάδες βαθμονόμησης, δείχνουν ότι απαιτείται η διεύρυνση των δειγμάτων ώστε να αυξηθεί η παραλλακτικότητα της υπό εξέταση παραμέτρου.