Epizootiology, risk assessment and effects on productivity of ovine progressive pneumonia in intensively reared dairy sheep
Authors: Καλογιάννη Αφροδίτη 
Published: December 2023

Η προϊούσα πνευμονία, επίσης γνωστή ως maedi-visna, είναι ένα ιογενές, βραδείας εξέλιξης, χρόνιο νόσημα των προβάτων που οδηγεί σε ισόβια λοίμωξη και προκαλείται από τους λεντιιούς των μικρών μηρυκαστικών. Τα χρόνια μολυσμένα ζώα αναπτύσσουν διάμεση πνευμονία, μαστίτιδα, αρθρίτιδα, και εγκεφαλίτιδα και εκδηλώνουν προοδευτική αδυναμία καταλήγοντας έως και το θάνατο. Παρά την παγκόσμια εξάπλωση των λεντιιών των μικρών μηρυκαστικών, τα δεδομένα σχετικά με τη σημασία των οδών μετάδοσης, των δυνητικών παραγόντων κινδύνου, καθώς και των επιπτώσεων των μολύνσεων στην υγεία και την παραγωγικότητα των προβάτων γαλακτοπαραγωγικής κατεύθυνσης είναι ελλιπή και προέρχονται από συγχρονικές οροεπιδημιολογικές μελέτες. Επίσης, δεν υπάρχει παγκοσμίως διαθέσιμη διαγνωστική δοκιμή αναφοράς, ενώ δεν έχει αναπτυχθεί έως σήμερα ένα διαγνωστικό εργαλείο με με καθολική εφαρμογή για την πρώιμη και αξιόπιστη διάγνωση των μολύνσεων από τους λεντιιούς. Παρότι έχουν αναφερθεί κλινικά περιστατικά προΐούσας πνευμονίας σε εκτροφές προβάτων γαλακτοπαραγωγικής κατεύθυνσης στην Ελλάδα, η έλλειψη επικαιροποιημένων επιζωοτιολογικών δεδομένων δεν επιτρέπει το σχεδιασμό και την εφαρμογή στοχευμένων εθνικών προγραμμάτων ελέγχου. Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω, οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: i) η ανάπτυξη και η αξιολόγηση ενός διαγνωστικού πρωτοκόλλου για την πρώιμη και αξιόπιστη διάγνωση των μολύνσεων από τους λεντιιούς των μικρών μηρυκαστικών με το συνδυασμό ορολογικών και μοριακών δοκιμών, ii) η επιζωοτιολογική διερεύνηση των λεντιιών των μικρών μηρυκαστικών στη χώρα με έμφαση στον υπολογισμό των δεικτών νοσηρότητας, την εκτίμηση της σημασίας των δυνητικών παραγόντων κινδύνου των μολύνσεων, και την αξιολόγηση της σημασίας της κάθετης και της οριζόντιας μετάδοσης των μολύνσεων, και iii) η ποσοτικοποίηση των επιπτώσεων των μολύνσεων στην ποσότητα και την ποιότητα του παραγόμενου γάλακτος, την υγεία και την ευζωία των εντατικά εκτρεφόμενων προβάτων γαλακτοπαραγωγικής κατεύθυνσης. Συνολικά 660 θηλυκά πρόβατα και 195 αρνιά από τέσσερις αντιπροσωπευτικές εντατικές γαλακτοπαραγωγές εκτροφές καθαρόαιμων προβάτων της φυλής Χίου και Lacaune συμπεριληφθήκαν στην έρευνα. Αρχικά, για την ορολογική διάγνωση των μολύνσεων στις εκτροφές της μελέτης χρησιμοποιήθηκε και αξιολογήθηκε μία έμμεση εμπορική δοκιμή ΕLISA ολόκληρου ιού (ELISA, CAEV/MVV Total Ab Test, IDEXX). Επίσης, στα δείγματα DNA των ζώων της έρευνας χρησιμοποιήθηκαν 13 διαφορετικά ζεύγη εκκινητών σε πέντε πρωτόκολλα επάλληλης (nested) και τρία πρωτόκολλα ενός σταδίου απλής PCR (αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης) στη gag, pol, env, και LTR περιοχή του ιικού γονιδιώματος. Αντιπροσωπευτικά PCR προϊόντα των πρωτοκόλλων αυτών αλληλουχήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε φυλογενετικές αναλύσεις. Πραγματοποιήθηκαν συγκρίσεις αλληλουχιών κατά ζεύγη ανάμεσα στις αλληλουχίες της παρούσας μελέτης, των στελεχών που έχουν ήδη απομονωθεί στη χώρα, και αντιπροσωπευτικών στελεχών που ανήκουν στους Α, Β, C, και Ε γενοτύπους. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα φυλογενετικά δέντρα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood method). Τα αποτελέσματα των φυλογενετικών αναλύσεων χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη ενός real-time PCR πρωτοκόλλου για την πρώιμη και αξιόπιστη διάγνωση των μολύνσεων από τα διαδεδομένα στελέχη των λεντιιών στις εκτροφές της έρευνας. Το real-time PCR πρωτόκολλο αξιολογήθηκε για την ειδικότητά του μετά από αλληλούχιση των PCR προϊόντων, και για τη διαγνωστική του ικανότητα με την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης και τον υπολογισμό της αποτελεσματικότητας και του ελάχιστου ορίου ανίχνευσης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μία προοπτική επιζωοτιολογική μελέτη διετούς διάρκειας στα θηλυκά πρόβατα και στα αρνιά τους, τα οποία ομαδοποιήθηκαν ανά εκτροφή σύμφωνα με το είδος πρωτογάλακτος (απαστερίωτο και παστεριωμένο) και το σύστημα γαλουχίας (φυσική ή τεχνητή). Στα θηλυκά πρόβατα οι δειγματοληψίες αίματος για την ορολογική και μοριακή διάγνωση των μολύνσεων από τους λεντιιούς πραγματοποιούνταν δύο φορές το χρόνο, την περίοδο πριν από τις οχείες και πριν από τον τοκετό. Οι αντίστοιχες δειγματοληψίες αίματος στα αρνιά πραγματοποιήθηκαν τέσσερις φορές κατά τη διάρκεια της έρευνας, τον 1ο, τον 3ο, τον 8ο (πριν τις οχείες), και τον 13ο μήνα (πριν τον τοκετό) της ζωής τους. Σε κάθε δειγματοληψία τα ζώα κατηγοριοποιούνταν ως οροθετικά και οροαρνητικά σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ΕLISA, ως PCR θετικά και αρνητικά σύμφωνα με τα αποτελέσματα του real-time PCR πρωτοκόλλου, και ως μολυσμένα και μη μολυσμένα σύμφωνα με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων της ΕLISA και του real-time PCR πρωτοκόλλου (στα αρνιά μόνο τα αποτελέσματα του real-time PCR πρωτοκόλλου λήφθηκαν υπόψιν για τον προσδιορισμό της μόλυνσης). Στο τέλος της μελέτης τα ζώα κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με το ορολογικό τους μοτίβο ως συνεχώς οροθετικά (αποκλειστικά οροθετικά αποτελέσματα κατά τη διάρκεια της έρευνας), συνεχώς οροαρνητικά (αποκλειστικά οροαρνητικά αποτελέσματα κατά τη διάρκεια της έρευνας), ζώα που έκαναν ορομετατροπή (οροαρνητικά ζώα στην αρχή της έρευνας που μετατράπηκαν σε οροθετικά κατά τη διάρκειά της), ζώα που έκαναν οροαντιστροφή (οροθετικά ζώα στην αρχή της έρευνας που μετατράπηκαν σε οροαρνητικά κατά τη διάρκειά της), και ζώα με διαλείπουσα παρουσία αντισωμάτων (ζώα με εναλασσόμενο οροθετικό και οροαρνητικό αποτέλεσμα κατά τη διάρκεια της έρευνας ανεξαρτήτως του ορολογικού αποτελέσματος στην αρχή της έρευνας). Επίσης, τα θηλυκά πρόβατα κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με το μοτίβο μόλυνσης που παρουσίασαν κατά τη διάρκεια της έρευνας ως μολυσμένα οροθετικά (ζώα που βρέθηκαν PCR θετικά και συνεχώς οροθετικά ή με διαλείπουσα παρουσία αντισωμάτων ή παρουσίασαν ορομετατροπή μέχρι το τέλος της έρευνας), μολυσμένα οροαρνητικά (ζώα που βρέθηκαν PCR θετικά και συνεχώς οροαρνητικά ή με οροαντιστροφή μέχρι το τέλος της έρευνας), και μη μολυσμένα (ζώα που βρέθηκαν συνεχώς PCR αρνητικά και οροαρνητικά κατά τη διάρκεια της έρευνας). Οι δείκτες νοσηρότητας υπολογίστηκαν είτε λαμβάνονονας υπόψιν τα αποτελέσματα της ELISA ή το συνδυασμό των αποτελεσμάτων της ELISA και του real-time PCR πρωτοκόλλου και περιελάμβαναν το σημειακό (ορο)επιπολασμό, τον (ορο)επιπολασμό περιόδου, την επίπτωση και την αθροιστική επίπτωση. Η εκτίμηση των δυνητικών παραγόντων κινδύνου των μολύνσεων από τους λεντιιούς στα θηλυκά πρόβατα και τα αρνιά πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μικτών μοντέλων διωνυμικής λογιστικής παλινδρόμησης. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν γαλακτομετρήσεις και λήφθηκαν ατομικά δείγματα γάλακτος από τα θηλυκά πρόβατα της έρευνας στην αρχή, τη μέση, και το τέλος της αρμεκτικής περιόδου. Μετά τη χημική ανάλυση των δειγμάτων γάλακτος και την μέτρηση των σωματικών κυττάρων, υπολογίστηκαν η ημερήσια ποσότητα γάλακτος, λίπους, πρωτεϊνών, λακτόζης, και ολικών στερεών άνευ λίπους, καθώς και ο λογάριθμος των σωματικών κυττάρων. Στο τέλος της έρευνας, υπολογίστηκαν η συνολική ποσότητα γάλακτος, λίπους, πρωτεϊνών, λακτόζης, και ολικών στερεών άνευ λίπους για τις πρώτες 120 ήμερες της αρμεκτικής περιόδου. Κατά τη διάρκεια της διετούς προοπτικής μελέτης, σε κάθε δειγματοληψία τα πρόβατα υποβάλλονταν σε κλινική εξέταση και 17 ατομικοί δείκτες υγείας και ευζωίας αξιολογούνταν. Επιπλέον, στην τελευταία δειγματοληψία της έρευνας πραγματοποιήθηκαν αιματολογικές αναλύσεις στα δείγματα αίματος των ζώων της έρευνας περιλαμβάνοντας 21 παραμέτρους αξιολόγησης χαρακτηριστικών των λευκοκυττάρων, των ερυθρών αιμοσφαιρίων, και των αιμοπεταλίων. Οι επιπτώσεις των μολύνσεων των λεντιιών στη γαλακτοπαραγωγή και στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του γάλακτος, καθώς και στην υγεία και ευζωία των ζώων της έρευνας αξιολογήθηκαν με τη χρήση μικτών μοντέλων γραμμικής και διωνυμικής λογιστικής παλινδρόμησης. Η εμπορική δοκιμή ΕLISA ανίχνευσε μολυσμένα ζώα σε όλες τις εκτροφές της έρευνας και η ευαισθησία, η ειδικότητα και η τιμή kappa coefficient (k-value) βρέθηκαν 82,8%, 93,8%, και 0,620, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ως αποτέλεσμα αναφοράς το θετικό αποτέλεσμα σε ένα τουλάχιστον απλό πρωτόκολλο PCR από αυτά που αρχικά χρησιμοποιήθηκαν. Η φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα στελέχη των εκτροφών που συμμετείχαν στην έρευνα αποκάλυψε τη διάδοση ιικών στελεχών που ανήκουν στους γενοτύπους Α και Β. Oι εκκινητές σχεδιάστηκαν σε συντηρημένες περιοχές του gag γονιδίου, και ένα SYBR Green real-time PCR πρωτόκολλο δύο σταδίων που πολλαπλασιάζει ένα τμήμα DNA μεγέθους 126 ζευγών βάσεων αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε για την ανίχνευση των μολύνσεων και των δύο γενοτύπων με 99,52% αποτελεσματικότητα και ελάχιστο όριο ανίχνευσης τα 178 αντίγραφα του ιού. Συνολικά το 15,2% των θηλυκών προβάτων ήταν συνεχώς οροαρνητικό, το 46,2% συνεχώς οροθετικό, ενώ το 20,1% εμφάνισε ορομετατροπή, το 8,1% οροαντιστροφή, και το 9,8% διαλείπουσα παρουσία αντισωμάτων. Όσον αφορά τα μοτίβα μόλυνσης, μόλις το 7,1% των θηλυκών προβάτων παρέμεινε μη μολυσμένο μέχρι το τέλος της έρευνας, ενώ το 76,2% ήταν μολυσμένο οροθετικό και το 16,7% μολυσμένο οροαρνητικό. Ο σημειακός οροεπιπολασμός κυμαινόταν από 57,5% (1η δειγματοληψία) έως 75,4% (4η δειγματοληψία), ενώ ο σημειακός επιπολασμός κυμαινόταν από 70,0% (1η δειγματοληψία) έως 88,3% (5η δειγματοληψία). Ο οροεπιπολασμός περιόδου για τη συνολική διάρκεια της έρευνας, η επίπτωση, και η αθροιστική επίπτωση ήταν 84,8% (95% ΔΕ, 80,9–88,0%), 33,6 νέα περιστατικά μολύνσεων ανά 100 προβατο-εξάμηνα (95% ΔΕ, 27,8–40,3%), και 64,2% (95% ΔΕ, 56,8–70,9%) σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ELISA. Οι αντίστοιχες τιμές σύμφωνα με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων της ΕLISA και της real-time PCR ήταν 90,7% (95% ΔΕ, 87,4–93,1%), 40,6 νέα περιστατικά μολύνσεων ανά 100 προβατο-εξάμηνα (95% ΔΕ, 32,6-50,0), και 68,9% (95% ΔΕ, 60,2-76,4%). Σύμφωνα με την εκτίμηση των παραγόντων κινδύνου, η αύξηση της ηλικίας κατά ένα έτος συσχετίστηκε με αύξηση του σχετικού κινδύνου κατά 1,78 φορές για την οροθετικότητα (95% ΔΕ, 1,41-2,25, p<0,001), 1,69 φορές για την μόλυνση (95% ΔΕ, 1,25-2,29, p= 0,001), 1,60 φορές για το συνεχώς οροθετικό μοτίβο (95% ΔΕ, 1,35-1,91, p<0,001), και 1,31 φορές για το μολυσμένο οροθετικό μοτίβο (95% ΔΕ, 1,08-1,60, p<0,01). Από την άλλη πλευρά, η αύξηση της ηλικίας των ζώων κατά ένα έτος συσχετίστηκε με περίπου 30% μειωμένη πιθανότητα για την εμφάνιση συνεχώς οροαρνητικών και μολυσμένων οροαρνητικών ζώων, καθώς και ζώων που εμφανίζουν ορομετατροπή ή διαλείπουσα παρουσία αντισωμάτων. Τα πρόβατα της φυλής Lacaune ήταν 2,63 φορές (95% ΔΕ, 1,35-5,00, p<0,01) πιο πιθανό να είναι οροθετικά κατά τη διάρκεια της έρευνας, ενώ τα θηλυκά πρόβατα της φυλής Χίου ήταν 4,53 φορές (95% ΔΕ, 1,61-12,76, p<0,01) πιο πιθανό να εμφανίσουν διαλείπουσα παρουσία αντισωμάτων. Επιπλέον, τα θηλυκά πρόβατα ήταν 1,72 φορές (95% ΔΕ, 1,28-2,33, p<0,001), 2,94 φορές (95% ΔΕ, 1,82-4,76, p<0,001), και 3,23 φορές (95% ΔΕ, 1,85-5,53, p<0,001) πιο πιθανό να βρεθούν οροθετικά, μολυσμένα, ή με ορομετατροπή, αντίστοιχα, στη δειγματοληψία πριν από τον τοκετό σε σύγκριση με τη δειγματοληψία πριν από τις οχείες. Συνολικά 78,1% και 43,4% των αρνιών που κατανάλωσαν απαστερίωτο και παστεριωμένο πρωτόγαλα, αντίστοιχα, βρέθηκαν μολυσμένα κατά τη διάρκεια της έρευνας. Η οροαντιστροφή και ορομετατροπή συνέβη μέχρι την ηλικία των 8 μηνών σε περισσότερα από το 90,0% και το 70,0% των ζώων που εμφάνισαν οροαντιστροφή και ορομετατροπή, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της έρευνας. Τα αρνιά που κατανάλωσαν απαστερίωτο πρωτόγαλα ήταν 19,29 φορές (95% ΔΕ, 2,37-156,85, p<0,01) και 6,07 φορές (95% ΔΕ, 2,42-15,21, p<0,001) πιο πιθανό να βρεθούν οροθετικά ή μολυσμένα σε ηλικία 13 μηνών συγκριτικά με τα αρνιά που κατανάλωσαν παστεριωμένο πρωτόγαλα. Τέλος, ο σχετικός κίνδυνος για μόλυνση των αρνιών τους πρώτους 13 μήνες βρέθηκε αυξημένος κατά 2,07 φορές (95% ΔΕ, 1,22-5,88, p<0,05) για τα αρνιά που προέρχονταν από μολυσμένες μητέρες.Οι μέσες ημερήσιες ποσότητες γάλακτος, λίπους, πρωτεϊνών, λακτόζης και ολικών στερεών άνευ λίπους βρέθηκαν στατιστικά σημαντικά μειωμένες κατά περίπου 15,0% στα μολυσμένα οροαρνητικά ζώα σε σύγκριση με τα μη μολυσμένα (p<0,05). Επιπλέον, η μέση ημερήσια ποσότητα λιπαρών βρέθηκε μειωμένη κατά περίπου 10,0% στα μολυσμένα οροαρνητικά ζώα σε σχέση με τα μολυσμένα οροθετικά (p<0,05). Οι απώλειες στις συνολικές ποσότητες γάλακτος, λιπαρών, πρωτεϊνών, λακτόζης και ολικών στερεών άνευ λίπους για τις 120 μέρες αρμεκτικής περιόδου άγγιξαν το 20,0% για τα μολυσμένα οροαρνητικά ζώα σε σχέση τόσο με τα μη μολυσμένα όσο και με τα μολυσμένα οροθετικά ζώα (p<0,05). Τέλος, η διάρκεια της γαλακτικής περιόδου ήταν 1,25 φορές (95% ΔΕ, 1,10-1,45, p= 0,001) και 1,16 (95% ΔΕ, 1,04-1,30, p<0,01) πιο πιθανό να είναι συντομότερη στα μολυσμένα οροαρνητικά ζώα σε σχέση με τα μη μολυσμένα και τα μολυσμένα οροθετικά, αντίστοιχα. Όσον αφορά τις επιπτώσεις των μολύνσεων των λεντιιών στην υγεία και την ευζωία των ζώων, τα μολυσμένα οροαρνητικά θηλυκά πρόβατα ήταν 4,17 φορές (95% ΔΕ, 1,25-14,29, p<0,05) πιο πιθανό να αναπτύξουν αρθρίτιδα τουλάχιστον μία φορά κατά τη διάρκεια της έρευνας σε σχέση με τα μη μολυσμένα ζώα. Επίσης, τα μολυσμένα οροαρνητικά ζώα ήταν 3,03 φορές (95% ΔΕ, 1,25-7,14, p<0,05) και 2,08 φορές (95% ΔΕ, 1,10-3,85, p<0,05) πιο πιθανό να εμφανίσουν διογκωμένους οπισθομαστιαίους λεμφαδένες τουλάχιστον μία φορά κατά τη διάρκεια της έρευνας σε σχέση με τα μη μολυσμένα και τα μολυσμένα οροθετικά ζώα, αντίστοιχα. Τα μη μολυσμένα ζώα, επίσης, παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερες τιμές λευκοκυττάρων, λεμφοκυττάρων, και μονοκυττάρων συγκριτικά με τα μολυσμένα (p<0,05). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί την πρώτη προοπτική επιζωοτιολογική μελέτη που διερεύνησε τον επιπολασμό των λεντιιών των μικρών μηρυκαστικών, τους δυνητικούς παράγοντες κινδύνου των μολύσεων από αυτούς, και τις επιπτώσεις αυτών στην παραγωγικότητα, την υγεία και την ευζωία των εντατικά εκτρεφόμενων προβάτων των φυλών Χίου και Lacaune, μέσω της ανάπτυξης και της χρήσης ενός διαγνωστικού πρωτοκόλλου για την πρώιμη και αξιόπιστη διάγνωση των μολύνσεων με το συνδυασμό ορολογικών και μοριακών δοκιμών. Η παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε τις ενδείξεις που υπήρχαν σχετικά με τον αυξημένο επιπολασμό των λεντιιών στα εντατικά εκτρεφόμενα πρόβατα γαλακτοπαραγωγικής κατεύθυνσης στη χώρα μας και επικαιροποίησε τα επιζωοτιολογικά δεδομένα, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό τεκμηριωμένων προγραμμάτων ελέγχου των μολύνσεων. Τα ευρήματα της έρευνας ανέδειξαν τις αδυναμίες των συγχρονικών οροεπιζωοτιολογικών μελετών στην ανίχνευση των μολύνσεων και τη διερεύνηση των επιπτώσεών τους στην παραγωγικότητα και την υγεία των ζώων. Παράλληλα, απέδειξαν την αναγκαιότητα της συνδυαστικής χρήσης των ορολογικών και μοριακών διαγνωστικών δοκιμών στα προγράμματα ελέγχου ώστε να επιτυγχάνεται η ανίχνευση των μολυσμένων ζώων που παραμένουν οροαρνητικά και συνεχίζουν τη διασπορά του ιού. Επίσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, η χορήγηση παστεριωμένου πρωτογάλακτος στα αρνιά, ο ορολογικός έλεγχος των ζώων αντικατάστασης στην ηλικία των 8 μηνών, ο ορολογικός έλεγχος όλων των ενήλικων ζώων και ο μοριακός έλεγχος των οροαρνητικών ζώων την περίοδο πριν τον τοκετό, και η άμεση απομάκρυνση των μολυσμένων οροαρνητικών ζώων προτείνονται ως διαχειριστικά μέτρα στο πλαίσιο εφαρμογής προγραμμάτων ελέγχου των μολύνσεων από τους λεντιιούς των μικρών μηρυκαστικών.