Ταυτόχρονος προσδιορισμός βιομορίων με οπτικούς αισθητήρες
Authors: Τσουνίδη Δήμητρα 
Published: January 2022

Η σήψη είναι ένα εξαιρετικά πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που εκδηλώνεται με δυσλειτουργία ζωτικών οργάνων ως αποτέλεσμα μη ρυθμισμένης ανοσολογικής απόκρισης του οργανισμού σε μία μικροβιακή λοίμωξη και αποτελεί μία από τις συχνότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Καθοριστικό ρόλο για την επιτυχημένη αντιμετώπιση περιστατικών σήψης είναι η έγκαιρη διάγνωσή τους έτσι ώστε να εφαρμοστεί στοχευμένη θεραπεία και να αυξηθούν τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών. Η ανάγκη αυτή έχει οδηγήσει στην καθιέρωση διαφόρων βιοδεικτών των οποίων ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης στο αίμα συμβάλλει τόσο για τη διάγνωση όσο και για την πρόγνωση της σήψης. Σε αυτήν την κατεύθυνση, οι βιοαισθητήρες προτείνονται ως αναλυτικό εργαλείο για τον προσδιορισμό των βιοδεικτών αυτών με απώτερο στόχο την ανάπτυξη αναλυτικών συστημάτων κατάλληλων για μετρήσεις στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. Στα πλαίσια αυτά, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη οπτικoύ ανοσοαισθητήρα φασματοσκοπίας ανάκλασης λευκού φωτός (White Light Reflectance Spectroscopy, WLRS) για τον ταυτόχρονο ανοσοχημικό προσδιορισμό βιοδεικτών για τη διάγνωση της σήψης χωρίς τη χρήση ιχνηθετών. Οι τρεις βιοδείκτες-στόχοι ήταν η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), η προκαλσιτονίνη (PCT) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και ο προσδιορισμός τους με τον βιοαισθητήρα βασίζεται στην ανίχνευση ανοσοαντιδράσεων σε πραγματικό χρόνο μέσω της παρακολούθησης της μετατόπισης του φάσματος συμβολής του φωτός που ανακλάται από επιφάνεια πυριτίου/διοξειδίου του πυριτίου στην οποία έχει ακινητοποιηθεί ειδικό αντίσωμα έναντι του κάθε βιοδείκτη.Αρχικά αναπτύχθηκαν για κάθε βιοδείκτη χωριστά ενζυμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης ώστε να αξιολoγηθούν τα διαθέσιμα αντιδραστήρια και να επιλεχθούν οι βασικές συνθήκες της ανάλυσης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μεταφορά των ανοσοπροσδιορισμών στον οπτικό βιοαισθητήρα, όπου βελτιστοποιήθηκε η χημική και βιολογική τροποποίηση των επιφανειών καθώς και οι συνθήκες της ανάλυσης για κάθε βιοδείκτη. Ο ανοσοπροσδιορισμός που αναπτύχθηκε στον βιοαισθητήρα WLRS για την CRP ήταν ταχύς (12 min), με όριο ανίχνευσης (1 ng/mL) που επέτρεπε τον προσδιορισμό της σε ορό αίματος αραιωμένο 20 έως 1000 φορές. Όσον αφορά τον ανοσοπροσδιορισμό των PCT και IL-6, τα πρωτόκολλα ανάλυσης που υιοθετήθηκαν μετά τη βελτιστοποίηση ήταν όμοια και συνεπώς επέτρεπαν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τους χρησιμοποιώντας επιφάνειες πυριτίου με δύο περιοχές διοξειδίου του πυριτίου διαφορετικού πάχους. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθηκαν ήταν 2 ng/mL και 0.01 ng/mL για την PCT και την IL-6, αντίστοιχα, και η διάρκεια του ανοσοπροσδιορισμού 35 min. Τέλος, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μια ολοκληρωμένη μικρού μεγέθους αυτοματοποιημένη βιοαναλυτική συσκευή βασισμένη στον βιοαισθητήρα WLRS για τον προσδιορισμό των τριών βιοδεικτών στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. Η αξιολόγηση των μεθόδων ανοσοπροσδιορισμού της CRP και ταυτόχρονου ανοπροσδιορισμού των PCT και IL-6 με την βιοαναλυτική συσκευή πραγματοποιήθηκε με μετρήσεις δειγμάτων ορού, τα οποία είχαν προηγουμένως αναλυθεί με πιστοποιημένη μέθοδο κλινικού εργαστηρίου και διαπιστώθηκε ικανοποιητική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που προσδιορίστηκαν με τις δύο μεθόδους. Επομένως οι αναπτυχθέντες ανοσοπροσδιορισμοί και η βιοαναλυτική συσκευή θα μπορούσαν να βρουν εφαρμογή στον επιτόπιο προσδιορισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τη διάγνωση/πρόγνωση της σήψης αλλά και άλλων παθολογικών καταστάσεων.