Regulation of PTN expression by hypoxia and hypoxia-induced factors and possible functional significance
Authors: Ποιμενίδη Ευαγγελία 
Published: August 2021

Η αγγειογένεση αποτελεί βασικό βήμα στην βιολογία του καρκίνου. Οι ταχέως αναπτυσσόμενοι όγκοι καθίστανται γρήγορα υποξικοί και ο σχηματισμός νέο-αγγείων είναι απαραίτητος για την εξάπλωση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Η υποξία και οι μεταγραφικοί παράγοντες HIF είναι παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που ενεργοποιούν τον ''αγγειογενετικό διακόπτη''. Από αυτά, ο VEGF-A και οι υποδοχείς του VEGF-R1 και VEGFR-2 είναι οι πιο γνωστοί επαγωγείς της αγγειογένεσης τόσο σε συνθήκες υποξίας όσο και σε νορμοξία. Η ερευνητική μας ομάδα έχει πρόσφατα δείξει σε μελέτη της ότι VEGF165 δεσμεύεται άμεσα στον υποδοχέα RPTPβ/ζ με αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 της ιντεγκρίνης αvβ3 στην τυροσίνη 773 και τον μεμβρανικό εντοπισμό της πολυ-λειτουργικής πρωτεΐνης NCL. Η μεμβρανική NCL είναι γλυκοζυλιωμένη και έχει βρεθεί ότι διαμεσολαβεί την αγγειογενετική δράση διαφόρων αυξητικών παραγόντων μεταξύ των οποίων ο VEGF και η PTN. Η PTN είναι ένας αυξητικός παράγοντας που παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια για την ηπαρίνη και είχε αρχικά ανακαλυφθεί στον εγκέφαλο αρουραίων ως παράγοντας που προάγει την ανάπτυξη των νευριτών κατά την διάρκεια της όψιμης εμβρυικής ανάπτυξης. Έκτοτε, η PTN έχει βρεθεί ότι υπέρ-εκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και εμπλέκεται στην αγγειογένεση των όγκων. Ωστόσο λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με την ρύθμιση της έκφρασης της. Η ερευνητική μας ομάδα σε προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι ο FGF-2, τα ROS και το NO επάγουν την έκφραση και έκκριση της PTN μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της από τον μεταγραφικό παράγοντα AP-1. Ο RPTPβ/ζ είναι ο κύριος υποδοχέας μέσω του οποίου έχει βρεθεί ότι η PTN επάγει την μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων. Υπάρχουν ωστόσο και κάποιες μελέτες που υποδεικνύουν ότι η PTN ασκεί και αντι-αγγειογενετικές δράσεις: η PTN δεσμεύεται άμεσα στον VEGF165 και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τον σχηματισμό αυλών από ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, αναστολή της έκφρασης της PTN επάγει την αγγειογένεση σε διάφορα μοντέλα in vitro και in vivo. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος της υποξίας και του VEGF στην έκφραση της PTN και της δράσης της τελευταίας σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα. Με την χρήση μεθόδων ανοσοαποτυπώματος, ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και την μέθοδο της λουσιφεράσης δείξαμε ότι η υποξία επάγει την έκφραση και έκκριση της PTN μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της. Σε πειράματα διαμόλυνσης με ολιγονουκλεοτίδια δολώματα φάνηκε ότι οι HIF και εν μέρει, ο AP-1 διαμεσολαβούν τις παραπάνω δράσεις της υποξίας. Ο VEGF δεν εμπλέκεται στις παραπάνω δράσεις της υποξίας αφού ανέστειλε την έκκριση της PTN τόσο σε υποξία όσο και σε νορμοξία. Σε πειράματα κυτταρικής μετανάστευσης σε γενετικά τροποποιημένα καρκινικά κύτταρα που δεν εκφράζουν PTN δείξαμε ότι η PTN αναστέλλει την επαγόμενη από υποξία μετανάστευση ανεξάρτητα από τον RPTPβ/ζ. Με την χρήση μεθόδων ανοσοαποτυπώματος, ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και την μέθοδο της λουσιφεράσης δείξαμε ο VEGF αναστέλλει την έκφραση και έκκριση της PTN λόγω αναστολής της μεταγραφής του γονιδίου της. Η περιοχή δέσμευσης του VEGF στους υποδοχείς του δεν εμπλέκεται στην παραπάνω δράση του όπως δείξαμε με προεπώαση των κυττάρων με το μονοκλωνικό αντίσωμα bevacizumab. Επιπρόσθετα, το bevacizumab είχε απο μόνο του επαγωγικό ρόλο στην έκφραση και έκκριση της PTN. Το πεπτίδιο HB-19 που στοχεύει την μεμβρανική NCL ανέστειλε τις παραπάνω δράσεις του VEGF σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εν αντιθέσει, το HB-19 ανέστειλε από μόνο του την έκκριση και μεταγραφή του γονιδίου της PTN σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος και ο εξωγενώς χορηγούμενος VEGF δεν είχε περεταίρω δράση. Με την χρήση γενετικά τροποποιημένων κυττάρων δείξαμε ότι η επαγόμενη από VEGF αναστολή της έκκρισης της PTN εξαρτάται από την παρουσία της β3 ή/και και την φωσφορυλίωση της στην τυροσίνη 773. Το λειτουργικό αντίσωμα LM-609, το οποίο δεν επηρεάζει τον μεμβρανικό εντοπισμό της NCL δεν ανέστειλε την επαγόμενη από VEGF αναστολή της έκκρισης της PTN. Ωστόσο, αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ με τεχνολογία siRNA που εμποδίζει την φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 ανέστειλε την παραπάνω δράση του VEGF. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι o RPTPβ/ζ διαμεσολαβεί την επαγόμενη από ανβ3 μεμβρανική εντόπιση της NCL η οποία εμπλέκεται στην ανασταλτική δράση του VEGF στην έκκριση της PTN. Σε πειράματα μετανάστευσης δείξαμε ότι η PTN αναστέλλει μερικώς την επαγόμενη από VEGF μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ το πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (PTN112-136) αναστέλλει πλήρως την επαγωγική δράση του VEGF. Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης/ ανοσοαποτυπώματος στα οποία δείξαμε ότι η δέσμευση του VEGF στον RPTPβ/ζ αναστέλλεται από την PTN ή την PTN112-136. Το HB-19 και οι ελεύθερες αλυσίδες CS-E ανέστειλαν επίσης την επαγόμενη από VEGF κυτταρική μετανάστευση. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί απο το γεγονός οτι το HB-19, αλλά και οι ελέυθερες αλυσίδες CS-E όπως προκύπτει με την μέθοδο του προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, αναστέλλουν την αλληλεπίδραση VEGF-NCL. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η υποξία επάγει, ενώ ο VEGF αναστέλλει την έκκριση και έκφραση της PTN. Η PTN παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της αγγειογέννεσης απο την υποξία ή/και τον VEGF, λειτουργώντας σαν ενδογενής ανασταλτικός παράγοντας στην υπερ-ενεργοποίηση της αγγειογένεσης από τον VEGF. Μηχανιστικά, η δράση της υποξίας φαίνεται να εξαρτάται από τον HIF και τον AP-1, ενώ τη δράση του VEGF διαμεσολαβεί η μεμβρανική εντόπιση της NCL που εξαρτάται από την επαγόμενη από τον RPTPβ/ζ φωσφορυλίωση της ιντεγκρίνης αvβ3 στην τυροσίνη 773. Η PTN112-136, το HB-19 και οι ελεύθερες αλυσίδες CS-E αναστέλλουν την αλληλεπίδραση του VEGF με τον RPTPβ/ζ ή την NCL και την επαγόμενη από VEGF κυτταρική μετανάστευση και χρήζουν περεταίρω διερεύνησης σαν πιθανοί αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες.