Investigation of the molecular mechanisms underlying insecticide resistance in insects of medical importance
Authors: Μπαλάσκα Σοφία 
Published: December 2024

Κατά προσέγγιση, το 80% του παγκόσμιου πληθυσμού ζει υπό το ρίσκο μιας ή περισσότερων νόσων που μεταδίδονται από αρθρόποδα, οι οποίες παρουσιάζονται ενδημικές κυρίως στις τροπικές και υποτροπικές ζώνες. Η ελονοσία και η λεϊσμανίαση, που μεταδίδονται από τα κουνούπια του γένους Anopheles και τις σκνίπες, αντίστοιχα, αποτελούν τις σημαντικότερες παρασιτικές νόσους, υπεύθυνες για πάνω από μισό εκατομμύριο θανάτους ετησίως. Ο έλεγχος του εντόμου-φορέα με τη χρήση εντομοκτόνων έχει αποτελέσει θεμέλιο στην προσπάθεια εξάλειψης των ασθενειών αυτών, εδώ και αρκετές δεκαετίες. Παρόλα αυτά, η χρήση ενός περιορισμένου αριθμού εντομοκτόνων με μικρό εύρος στους τρόπους/ στόχους δράσης, με σκοπό την καταπολέμηση εντόμων υγειονομικής αλλά και αγροτικής σημασίας, έχει οδηγήσει την ανάπτυξη και εξάπλωση ανθεκτικότητας. Η διερεύνηση της μοριακής βάσης των ανθεκτικών αυτών φαινοτύπων (π.χ. ανθεκτικότητα στόχου, μεταβολική ανθεκτικότητα, κ.λπ.) είναι απαραίτητη για την επιτήρηση και επίλυση του προβλήματος. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, επικεντρώθηκα: (α) στην επιτήρηση της ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα σε πληθυσμούς σκνιπών από περιοχές που δεν έχουν ερευνηθεί έως τώρα, και στην ανάπτυξη ειδικών εργαλείων για τέτοιες διαδικασίες στις σκνίπες, και (β) στον βιοχημικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό της καρβοξυλεστεράσης COEAE6G, που έχει συσχετιστεί με ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, στον κύριο φορέα ελονοσίας στην Αφρική, το κουνούπι Anopheles coluzzii. Η ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα είναι ιδιαίτερα υπο-μελετημένη στις σκνίπες. Εδώ, αξιολογήθηκε η ανταπόκριση στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα, με τη χρήση βιοδοκιμών και μοριακών διαγνωστικών, σε συλλογές σκνιπών από (ημι)αγροτικές περιοχές της Ιταλίας, της Ελλάδας, της Τουρκίας, του Ιράν και της Κένυας. Κοινοί δείκτες ανθεκτικότητας στόχου στα πυρεθροειδή, δηλαδή οι kdr μεταλλαγές στο γονίδιο που κωδικοποιεί για το κανάλι νατρίου, εντοπίστηκαν σε υψηλές συχνότητες στην Τουρκία, σε χαμηλότερες συχνότητες αλλά για πρώτη φορά στην Ελλάδα και το Ιράν, ενώ ήταν απούσες απ’ τους πληθυσμούς της Ιταλίας. Επιπρόσθετα, πληθυσμοί μεικτών ειδών από την Ελλάδα και την Κένυα έδειξαν ευαισθησία στο πυρεθροειδές δελταμεθρίνη, σε βιοδοκιμές τύπου CDC, χρησιμοποιώντας ωστόσο τις διαγνωστικές σταθερές των κουνουπιών. Περί αυτού, και των δυσκολιών που εμφανίζονται επί του παρόντος στην εφαρμογή, ερμηνεία και σύγκριση τέτοιων ευρημάτων βιοδοκιμών, γίνεται εκτενής συζήτηση και σχολιασμός. Επίσης, σχεδιάστηκε ένα νέο πρωτόκολλο βιοδικών για ατομική έκθεση δειγμάτων σκνιπών, το οποίο προτείνεται να εφασμοστεί σε περιοχές με μεικτή σύνθεση ειδών, προκειμένου να αποκαλύπτονται οι διαφορετικές αποκρίσεις τους στα εντομοκτόνα. Πράγματι, χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο πρωτόκολλο σε πληθυσμούς πεδίου, αποκαλύπτονται στατιστικά σημαντικές διαφορές απόκρισης μεταξύ ειδών του γένους Phlebotomus. Τέλος, συνέβαλα μερικώς στην παραγωγή πληροφοριών σχετικών με το γονιδίωμα 11 διαφορετικών ειδών σκνίπας, με σκοπό την κατανόηση της προσαρμογής τους σε εντομοκτόνα/ξενοβιοτικές ουσίες, και στην μελλοντική ταυτοποίηση υποψήφιων γονιδίων σχετιζόμενων με ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα. Όσον αφορά στα κουνούπια του γένους Anopheles, τεχνολογίες υψηλής απόδοσης έχουν συμβάλλει σημαντικά στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, μέχρι στιγμής. Εδώ, ερευνάται μια περίπτωση μεταβολικής ανθεκτικότητας σε μια σειρά εντομοκτόνων διαφορετικών ομάδων, λόγω υπερέκφρασης του ενζύμου COEAE6G, μιας εστεράσης με προβλεπόμενο υπο-κυτταρικό εντοπισμό στα μιτοχόνδρια. Το γονίδιο Coeae6g έχει βρεθεί υπερεκφρασμένο σε Αφρικανικούς πληθυσμούς κουνουπιών Anopheles, ανθεκτικούς σε οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά εντομοκτόνα, και έχει επιπλέον συσχετιστεί με ανθεκτικότητα, λόγω αυξημένου αριθμού αντιγράφων γονιδίου, στο pirimiphos methyl, πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενο σε υπολειμματικούς ψεκασμούς για τον έλεγχο της ελονοσίας. Τα ευρήματα μας από προσεγγίσεις in vitro και in vivo επικυρώνουν τους συσχετισμούς με δεδομένα πεδίου. Αρχικά, έκφραση του γονιδίου Coeae6g στην κυτταρική σειρά Sf9 έδειξε, ότι η ενεργότητα του ενζύμου αναστέλλεται παρουσία ενεργών oxon αναλόγων οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, συμπεριλαμβανομένου του pirimiphos methyl oxon, καθώς και καρβαμιδικών εντομοκτόνων και του πυρεθροειδούς περμεθρίνη. Aναλύσεις μεταβολισμού με τις μεθόδους HPLC-UV και HPLC-MS/MS υποδεικνύουν ωστόσο, ότι το ένζυμο δεν έχει δυνατότητα υδρόλυσης των παραπάνω εντομοκτόνων, άρα ως πιθανότερος τρόπος δράσης εμφανίζεται η «δέσμευση» εντομοκτόνου (sequestration) απ’ τον τελικό του στόχο. Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκε μια διαγονιδιακή σειρά An. gambiae που να υπερ-εκφράζει συστηματικά, σε όλους τους ιστούς το γονίδιο Coeae6g, υπό τον έλεγχο του συστήματος GAL4/UAS, η οποία είχε ανθεκτικό φαινότυπο, κυρίως στο pirimiphos methyl, αλλά και στο malathion, το bendiocarb, το propoxur και την περμεθρίνη, σε συμφωνία με τα in vitro ευρήματά μας. Τέλος, το γονίδιο Coeae6g εκφράζεται ενδογενώς σε πολλαπλούς ιστούς του ενήλικου κουνουπιού, ενώ εξακριβώθηκε πως η πρωτεΐνη τοποθετείται υπο-κυτταρικά στο κυτταρόπλασμα, και όχι στα μιτοχόνδρια.