Μελέτη μοριακών μηχανισμών απόκρισης του κυττάρου στις βλάβες του DNA που επάγονται από αλκυλιωτικούς παράγοντες
Authors: Επισκόπου Χαρίκλεια 
Published: January 2014

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Είναι γενικά αποδεκτό σήμερα ότι ένας από τους βασικούς παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται η έκβαση της χημειοθεραπείας του καρκίνου με γονοτοξικά φάρμακα είναι η ικανότητα επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ικανότητα επιδιόρθωσης του γονιδίου p53 μετά από επίδραση μελφαλάνης σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με Πολλαπλούν Μυέλωμα (Π.Μ.) σχετίζεται με την κλινική απόκριση ενώ παρατηρήθηκε ότι η επιδιόρθωση του DNA σε τέσσερα γονίδια (β-ακτίνη, p53, N-ras, δ-γλοβίνη) διαφοροποιείται ανάλογα με τη μεταγραφική τους ενεργότητα και το βαθμό συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης στις συγκεκριμένες περιοχές. ΣΤΟΧΟΣ: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού επιδιόρθωσης των βλαβών που επάγονται στο DNA από αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως η μελφαλάνη καθώς και του τρόπου με τον οποίο συμβάλλει η δομή της χρωματίνης και η μεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων που μελετώνται στην επιδιόρθωση του DNA. Τελικός σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης είναι η ανεύρεση κατάλληλου μοριακού δείκτη πρόγνωσης απόκρισης ασθενών με Π.Μ. στη χημειοθεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες και η κλινική εφαρμογή του.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει (α) τέσσερις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές ανθρώπινων ινοβλαστών (VH25: GGR+/TCR+; CSB: GGR+/TCR-; XPC: GGR-/TRC+; XP-A: GGR-/TCR-) οι οποίες διαφέρουν ως προς τον επιδιορθωτικό τους μηχανισμό (β) την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 και (γ) απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με Π.Μ.. Στα κύτταρα αυτά μετά την ex vivo χορήγηση μελφαλάνης προσδιορίζονται τα επίπεδα σχηματισμού και επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA σε διαφορετικές γονιδιακές περιοχές εφαρμόζοντας ανάλυση κατά Southern και ποσοτικό PCR. Η μεταγραφική ενεργότητα των εξεταζόμενων γονιδίων προσδιορίζεται με στύπωμα κηλίδος και run off ανάλυση ενώ ο βαθμός συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης των υπό μελέτη γενωμικών περιοχών αναλύεται με την επίδραση μικροκοκκικής νουκλεάσης σε απομονωμένους πυρήνες των κυττάρων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Αρχικά μελετώνται οι κινητικές σχηματισμού και επιδιόρθωσης των βλαβών που επάγει η μελφαλάνη στις δύο αλυσίδες των παραπάνω γονιδίων μετά την επίδραση 10 μg/ml του φαρμάκου για μία ώρα στις τέσσερις κυτταρικές σειρές ινοβλαστών. Απουσία του μηχανισμού επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίου (Νucleotide Excision Repair-NER) στα κύτταρα XPA τα επίπεδα της συσσωρευμένης βλάβης είναι τα ίδια και στα τέσσερα γονίδια, υποδηλώνοντας ότι ο ρυθμός επαγωγής της βλάβης δεν διαφοροποιείται στις συγκεκριμένες περιοχές. Οι βλάβες της μελφαλάνης αποτελούν υπόστρωμα και για τους δύο υπομηχανισμούς του NER, δηλαδή τον μηχανισμό που επιδιορθώνει τις βλάβες κατά μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος (Global Genome Repair- GGR) και εκείνον που εξειδικεύεται στην επιδιόρθωση των βλαβών κατά μήκος μόνο των μεταγραφόμενων αλυσίδων του DNA των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων (Transcription Coupled Repair – TCR), με τον GGR, όμως, να επιδιορθώνει ταχύτερα του TCR. Στα φυσιολογικά κύτταρα VH25 οι κινητικές βλάβης/επιδιόρθωσης συμπίπτουν με αυτές των κυττάρων CSB, στα οποία ενεργός είναι μόνο ο GGR, υποδηλώνοντας ότι παρουσία και των δύο παραπάνω μηχανισμών ο GGR είναι αυτός που κυριαρχεί. Η επιδιορθωτική ικανότητα και των δύο μηχανισμών σχετίζεται με τα επίπεδα μεταγραφικής ενεργότητας καθώς και με τη χαλαρότητα της δομής της χρωματίνης των τεσσάρων γονιδίων που μελετάμε και ακολουθεί τη σειρά: β-ακτίνη>p53>N-ras>δ-γλοβίνη. Επίσης, οι βλάβες της μελφαλάνης επιδιορθώνονται σε δύο διακριτές φάσεις: μία αρχική ταχύτατη φάση η οποία οδηγεί στην απομάκρυνση ~80% των συνολικών βλαβών κατά τη διάρκεια της πρώτης ώρας χορήγησης του φαρμάκου η οποία ακολουθείται από μία βραδύτερη φάση στη διάρκεια της οποίας ο χρόνος ημίσειας ζωής των βλαβών είναι 36-48 ώρες. Για την περαιτέρω διερεύνηση της παρατηρούμενης αρχικής ταχύτατης φάσης επιδιόρθωσης χορηγείται στα ίδια κύτταρα υψηλή δόση μελφαλάνης (100 μg/ml) για 5 λεπτά και μετρώνται τα επίπεδα βλάβης/επιδιόρθωσης για 2 ώρες μετά το τέλος της χορήγησης. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι ενώ απουσία του NER ο ρυθμός επαγωγής της βλάβης είναι ο ίδιος και στα τέσσερα γονίδια, στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές σημαντικό ποσοστό των συνολικών βλαβών (~60-75%) επιδιορθώνονται κατά τη διάρκεια της αρχικής ταχύτατης φάσης. Ενα βασικό ερώτημα που ανακύπτει είναι εάν η ταχύτατη αυτή επιδιόρθωση είναι χαρακτηριστικό του συνολικού γονιδιώματος ή μόνο κάποιων περιοχών. Για το λόγο αυτό μελετώνται η ταχύτητα επιδιόρθωσης των βλαβών της μελφαλάνης και ο βαθμός συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης σε επιμέρους γονιδιακές περιοχές που εντοπίζονται τόσο κατά μήκος όσο και εκτός της κωδικής περιοχής των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων p53 and N-ras καθώς και του μη μεταγραφόμενου γονιδίου της δ-γλοβίνης. Η μελέτη έγινε στα κύτταρα XPA, CSB και XPC καθώς και σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς δότες και ασθενείς με Π.Μ.. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι ενώ τα επίπεδα σχηματισμού της βλάβης είναι περίπου τα ίδια σε όλες τις εξεταζόμενες περιοχές του γονιδιώματος, η ταχύτητα με την οποία επιδιορθώνουν και οι δύο υπομηχανισμοί του NER την μεταγραφόμενη αλυσίδα των γονίδιων p53 και N-ras είναι υψηλότερη εντός της κωδικής περιοχής τους σε σύγκριση με περιοχές εκτός γονιδίου. Αντίθετα, στην περίπτωση του ανενεργού γονιδίου της δ-γλοβίνης δεν παρατηρείται διαφορά στο ρυθμό επιδιόρθωσης εντός και εκτός του γονιδίου. Επιπλέον, στην περίπτωση των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων p53 και N-ras η ταχύτητα επιδιόρθωσης, παρουσία είτε του GGR είτε του TCR, εμφανίζει την υψηλότερη τιμή της στις περιοχές εντός του γονιδίου και γειτονικές με τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής ενώ μειώνεται βαθμιαία από το 5′ προς το 3′ άκρο της μεταγραφόμενης αλυσίδας του γονίδιου. Ανάλογη εικόνα προκύπτει και στην περίπτωση των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος από υγιείς δότες και ασθενείς με Π.Μ.. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις κυττάρων τα σχετικά επίπεδα συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης εντός και κατά μήκος των γονιδίων διαφοροποιούνται αντιστρόφως ανάλογα με τα αντίστοιχα επίπεδα επιδιορθωτικής ενεργότητας. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ασθενείς που δεν αποκρίνονται στη χημειοθεραπεία εμφανίζουν μεγαλύτερη επιδιόρθωση σε σύγκριση με εκείνους που αποκρίνονται, με τη μέγιστη διαφορά να παρατηρείται σε περιοχές κοντά στο 5′-άκρο του γονιδίου. Όσον αφορά τη δ-γλοβίνη, στα λεμφοκύτταρα των υγειών εθελοντών και των ασθενών με Π.Μ. που αποκρίνονται στη χημειοθεραπεία δεν βρέθηκε διαφορά στη ταχύτητα επιδιόρθωσης των περιοχών εντός και εκτός γονιδίου. Είναι ενδιαφέρον ότι στους μη-αποκριθέντες ασθενείς παρατηρείται μια πολύ σημαντική επαγωγή της ικανότητας επιδιόρθωσης στις περιοχές που εντοπίζονται εντός του γονιδίου της δ-γλοβίνης σε συνδυασμό με επαγωγή της μεταγραφικής ικανότητας και αύξηση της χαλαρότητας της δομής της χρωματίνης του γονιδίου. Με δεδομένη τη σημασία της επιδιόρθωσης στην πρόγνωση της ανταπόκρισης στη χημειοθεραπείας με αλκυλιωτικούς παράγοντες καθώς και το γεγονός ότι οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για τον προσδιορισμό της είναι χρονοβόρες και απαιτούν επίπονες διαδικασίες όπως η ανάλυση κατά Southern, στη συγκεκριμένη διατριβή αναπτύσσεται μεθοδολογία βασισμένη στη χρήση του ποσοτικού PCR για τη μέτρηση της βλάβης που προκαλείται από τη μελφαλάνη στο γονίδιο p53. Χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, σε πρώτη φάση επιλέχθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες που εξασφαλίζουν την ποσοτικοποίηση των βλαβών της μελφαλάνης από την συγκεκριμένη μέθοδο. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ως μέθοδο ελέγχου την ανάλυση κατά Southern, διερευνήθηκε το είδος των βλαβών της μελφαλάνης που ανιχνεύεται από τη συγκεκριμένη μέθοδο. Έτσι, τα επίπεδα βλαβών που μετρώνται από την ποσοτική PCR ταυτίζονται με τα επίπεδα των σταυροδεσμών που ανιχνεύονται με την ανάλυση κατά Southern στα ίδια δείγματα ενώ δεν είναι δυνατή η ανίχνευση των μοναδιαίων βλαβών που επάγει το φάρμακο στο γονιδίωμα των κυττάρων. Τέλος, έγινε πιστοποίηση της μεθοδολογίας Q-PCR σε επίπεδο βιολογικών δειγμάτων (ολικό αίμα και απομονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) που ελήφθησαν από 22 ασθενείς με Π.Μ. πριν τη χορήγηση χημειοθεραπείας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι μετρούμενες βλάβες στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν (p=0.002). Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος των βλαβών του DNA που μετρήθηκαν στους αποκριθέντες ασθενείς βρέθηκε 176.8+67.3 βλάβες/106 νουκλεοτίδια με εύρος τιμών από 41 έως 273 βλάβες/106 νουκλεοτίδια ενώ στους μη αποκριθέντες είναι 65.1+39.4 βλάβες/106 νουκλεοτίδια με το εύρος των τιμών να κυμαίνεται από 22 έως 135 βλάβες/106 νουκλεοτίδια. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ενα από τα σημαντικά ευρήματα της συγκεκριμένη διατριβής είναι ότι η επιδιόρθωση των βλαβών της μελφαλάνης σε ανθρώπινα κύτταρα πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο από τον μηχανισμό GGR. Επίσης, αποδεικνύεται η στενή αλληλεπίδραση της επιδιορθωτικής ενεργότητας με τη μεταγραφική ενεργότητα και την τοπική δομή της χρωματίνης της υπό μελέτη περιοχής, γεγονός που καθιστά και τους τρεις παραπάνω παράγοντες υποψήφιους μοριακούς δείκτες επιλογής των ασθενών με Π.Μ. που πρόκειται να ωφεληθούν από τη χορήγηση μελφαλάνης. Επιπλέον, βρέθηκαν συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος, όπως το 5΄ άκρο των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων, στις οποίες υπάρχει στατιστικά σημαντικός συσχετισμός μεταξύ της ταχύτητας επιδιόρθωσης και της απόκρισης του ασθενούς στη χημειοθεραπεία. Τέλος, η μεθοδολογία της ποσοτικής PCR που αναπτύξαμε καθιστά δυνατή τη μέτρηση σε επίπεδο γονίδιου της επιδιόρθωσης του DNA σε εύκολα προσβάσιμο βιολογικό υλικό, όπως είναι τα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος, καθιστώντας δυνατή τη μελέτη, σε επίπεδο ασθενούς, της σχέσης του μοριακού δείκτη “επιδιόρθωση των κυτταροτοξικών βλαβών του DNA με τη κλινική απόκριση στη χημειοθεραπεία ή με τις μακροπρόθεσμες επιπλοκές της.