Ανάπτυξη και αξιολόγηση πειραματικού συστήματος κυτταρικής ανοσοθεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών
Authors: Λανίτης Ευριπίδης 
Published: August 2021

Η μεταφορά αυτόλογων Τ λεμφοκυττάρων που έχουν υψηλή ικανότητα αναγνώρισης και δραστικότητας κατά συγκεκριμένων αντιγόνων του καρκίνου των ωοθηκών αποτελεί μια ισχυρή θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Ένας περιοριστικός παράγοντας στις τρέχουσες ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν μηχανισμούς καταστολής της ανοσολογικής επιτήρησης τους. Έτσι τα Τ κύτταρα που έχουν υψηλή ειδικότητα και δραστικότητα κατά διαφόρων καρκινικών αντιγόνων απουσιάζουν από τους όγκους των ωοθηκών. Με στόχο την δημιουργία Τ κυττάρων με ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα προχωρήσαμε στη γενετική τροποποίηση Τ κυττάρων με: Α. Φυσιολογικούς Τ κυτταρικούς υποδοχείς (TCRs) με ειδικότητα για καρκινικά πεπτίδια προσδεδεμένα σε MHC μόρια τάξεως Ι. Β. Χιμαιρικούς Τ ανοσοϋποδοχείς (CARs) οι οποίοι αναγνωρίζουν εξωκυττάριες πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση των MHC μορίων.Τα ωοθηκικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν ένα πλήθος αντιγόνων τα οποία είναι στενά συνδεδεμένα με την εξέλιξη και την επιθετικότητα του όγκου. Ένα από τα ελκυστικότερα αντιγόνα-στόχους είναι το ErbB2 (HER2/neu). Το εύρος όμως της έκφρασης αυτού του υποδοχέα στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων παραμένει αμφισβητούμενο. Γι' αυτό το λόγο πραγματοποιήσαμε εκτενή ανάλυση της έκφρασης του ErbB2 σε ένα μεγάλο αριθμό πρωτογενών όγκων και καρκινικών σειρών. Με εφαρμογή πιο ευαίσθητων μεθόδων ανίχνευσης και ανάλυσης, όπως είναι η κυτταρομετρία ροής, η ανοσοαποτύπωση και η ποσοτική PCR αποδείξαμε την ευρεία έκφραση του ErbB2 σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που προήλθαν από πρωτοπαθείς στερεούς όγκους και ασκίτες καθώς επίσης και από ωοθηκικές καρκινικές σειρές.Για τη στόχευση του υποδοχέα του ErbB2 κλωνοποιήσαμε ένα καινοτόμο Τ κυτταρικό υποδοχέα με ειδικότητα για τον ErbB2 επίτοπο 369-377 από ErbB2-ειδικά Τ κύτταρα. Γενετικά τροποποιημένα Τ κύτταρα που εξέφραζαν τον ανασυνδυασμένο ErbB2-ειδικό Τ κυτταρικό υποδοχέα αντέδρασαν κατά ορισμένων καρκινικών σειρών Οι συγκεκριμένες σειρές παρουσιάζαν σε επαρκή ποσότητα τον ErbB2 αντιγονικό επιτόπο 369-377 με μόρια MHC τάξεως I (HLA-A2) πάνω στην κυτταρική επιφάνεια. Αντιθέτως, γενετικά τροποποιημένα Τ κύτταρα που εξέφραζαν ένα ErbB2-χιμαιρικό ανοσοϋποδοχέα αντέδρασαν κατά όλων των πρωτοπαθών καρκινικών κυττάρων και καρκινικών σειρών με επακόλουθο την έκκριση κυτταροκινών και τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων.Για την ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών προσέγγισεων έναντι άλλων αντιγόνων κατασκευάσαμε έναν χιμαιρικό ανοσοϋποδοχέα (P4) με ειδικότητα για τη μεσοθηλίνη η οποία εκφράζεται ευρέως στον καρκίνο των ωοθηκών. T κύτταρα που είχαν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να εκφράζουν το P4 χιμαιρικό ανοσουποδοχέα παρουσίασαν ισχυρή δραστικότητα κατά καρκινών κυττάρων που εκφράζουν μεσοθηλίνη και ικανότητα εξολόθρευσης συμπαγών όγκων in vivo. Επίσης βρήκαμε ότι η ενεργότητα των P4 CAR Τ κυττάρων δεν επηρεάστηκε από τα υψηλά επίπεδα μεσοθηλίνης που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα.Λόγω του χαμηλού αλλά ανιχνεύσιμου επιπέδου έκφρασης της μεσοθηλίνης στα φυσιολογικά μεσοθηλιακά κύτταρα, η ασφάλεια της χρήσης γενετικά τροποποιημένων P4 Τ κυττάρων εγκυμονεί τον κίνδυνο καταστροφής φυσιολογικών ιστών. Με στόχο την αύξηση της επιλεκτικότητας των T κυττάρων έναντι των καρκινικών κυττάρων αναπτύξαμε μια καινοτόμο πλατφόρμα γενετικής τροποποίησης αυτών με δύο χιμαιρικούς ανοσοϋποδοχείς ειδικότητας για τα καρκινικά αντιγόνα μεσοθηλίνη και υποδοχέα του φυλλικού οξέος (FRα). Για τηπλήρη λειτουργία αυτών των Τ κυττάρων πρέπει να υπάρχει δυνατότητα ταυτόχρονης πρόσδεσης και των δύο υποδοχέων στους αντιγονικούς τους στόχους. Τα διπλής ειδικότητας T κύτταρα παρουσιάσαν ισχυρή δραστικότητα μόνο κατά καρκινικών κύτταρων τα οποία εκφράζουν και τις δύο πρωτεΐνες. Αντιθέτως, τα Τ αυτά κύτταρα επέδειξαν δραματικά μειωμένο βαθμό λειτουργιών έναντι κυττάρων που εξέφραζαν μόνο μεσοθηλίνη. Συνεπώς η στρατηγική αυτή καθιστά δυνατή την αποτελεσματική εξολόθρευση καρκινικών κυττάρων και την ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης στόχευσης φυσιολογικών ιστών.Ανακεφαλαιώνοντας, στη παρούσα διατριβή περιγράψαμε την ανάπτυξη και δοκιμή διαφόρων προσεγγίσεων με τις οποίες μπορούν να δημιουργηθούν Τ κύτταρα με ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Τέλος για την ασφαλή εφαρμογή αυτών των προσεγγίσεων σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές με ασθενείς καρκίνου των ωοθηκών αναπτύξαμε μια μέθοδο για την ελαχιστοποίηση της Τ κυτταρικής δραστικότητας κατά των φυσιολογικών ιστών.