Ο ρόλος πρωτεολυτικών μηχανισμών στον μεταβολισμό λιπιδίων
Authors: Γεωργιλά Κωνσταντίνα 
Published: September 2021

Η απολιποπρωτεΐνη Α1 (ApoA-I) , ως κύριο συστατικό της HDL, εμπλέκεται στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, ενώ παράλληλα παρουσιάζει αντιθρομβωτικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες, οι οποίες είναι συναφείς του προστατευτικού της ρόλο σε καρδιαγγειακές, φλεγμονώδεις και κακοήθεις παθολογίες. Oι στόχοι αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι (1) ο προσδιορισμός μετα-μεταγραφικών μηχανισμών ρύθμισης των ενδοκυττάριων επιπέδων της ApoA-I και (2) η διερεύνηση πιθανών ενδοκυττάριων λειτουργιών της, φαινόμενα τα οποία έχουν ελάχιστα διερευνηθεί. Το αντικείμενο της μελέτης που περιγράφεται στο κεφάλαιο 1 σχετίζεται με τη ρύθμιση της ApoA-I στα ηπατοκύτταρα από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς και πρωτεολυτικά συστήματα. Χρησιμοποιήσαμε την καρκινική σειρά ηπατοκυττάρων HepG2 και πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ως in vitro μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης γενετικών και χημικών παρεμποδιστών της αυτοφαγίας και του πρωτεοσώματος, και εξετάσαμε την ApoA-I με ανοσοαποτύπωση, ανοσοφθορισμό και ηλεκτρονική μικροσκοπία. Διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό με παρεμποδιστές του mTOR προκειμένου να προσομοιάσουμε την επίδραση περιορισμένων θρεπτικών σε σύγκριση με επάρκεια θρεπτικών στη ρύθμιση της ApoA-I. Η έκφραση της ApoA-I στο ήπαρ μελετήθηκε σε ποντίκια που θράφηκαν με δίαιτα υψηλών λιπαρών και παρουσιάζουν παρεμπόδιση της αυτοφαγίας. Τα αποτελέσματα μας κατέδειξαν ότι η φαρμακολογική παρεμπόδιση της αυτοφαγίας και όχι του πρωτεοσώματος συνεπάγεται τη συσσώρευση της ApoA-I στα ηπατοκύτταρα. Για να εξετάσουμε λεπτομερώς τα μοριακά μονοπάτια που διέπουν την αποικοδόμηση της ApoA-Ι από την αυτοφαγία χρησιμοποιήσαμε γενετική αποσιώπηση σημαντικών ρυθμιστών της αυτοφαγικής μηχανής και παρακολουθήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της ApoA-I. Παρατηρήσαμε ότι η πρωτεόλυση της ApoA-I διέπεται από ένα κανονικό μονοπάτι αυτοφαγίας στο οποίο συμμετέχει η Beclin1, η ULK1 και η πρωτεΐνη p62 που φαίνεται να στοχεύει την ApoA-I στα αυτοφαγοσώματα. Στη συνέχεια αναλύσαμε τα επίπεδα της ApoA-I υπό συνθήκες περιορισμένων θρεπτικών, οι οποίες επάγουν αυτοφαγία ενώ παράλληλα μπλοκάρουν αναβολικές διαδικασίες, όπως η μετάφραση, μέσω του mTORC1 μονοπατιού. Διαπιστώσαμε ότι εφαρμόζοντας στέρηση θρεπτικών παρατηρείται ότι η καταστολή της σύνθεσης της ApoA-I επικρατεί στη ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης σε σχέση με την επίδραση της πρωτεόλυσης της ApoA-I μέσω της αυτοφαγίας. Αυτά τα δεδομένα αναδεικνύουν τη μεγάλη συνεισφορά μετα-μεταγραφικών μηχανισμών στη ρύθμιση των επιπέδων της ApoA-I στην οποία εμπλέκεται η εξαρτωμένη mTORC1 σηματοδότηση που αναλόγως με τις συνθήκες διαθέσιμων θρεπτικών καθορίζει την αυτοφαγία ή την πρωτεϊνική σύνθεση ως το κύριο μηχανισμό ελέγχου των επίπεδών της. Δεδομένου του εδραιωμένου ρόλου της ApoA-I στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η ρύθμιση αυτή της ApoA-I θα μπορούσε να αντανακλά μια ηπατική απάντηση σε οργανικές απαιτήσεις για την διατήρηση των αποθηκών χοληστερόλης και λιπιδίων υπό αντίξοες θρεπτικές συνθήκες. Καθώς παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της ApoA-I σε ηπατοκύτταρα μπορεί να ρυθμιστεί ανάλογα στη διαθεσιμότητα των θρεπτικών, μας ενδιέφερε να μελετήσουμε αν η ApoA-I μπορεί να λειτουργήσει ως διαμεσολαβητικό μόριο ανταποκρινόμενο στις μεταβολικές ανάγκες του κυττάρου. Στο κεφάλαιο 2 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της μελέτης που εστιάζει στην αποσαφήνιση πιθανής ενδοκυττάριας λειτουργίας της ApoA-I στη ρύθμιση του λιπιδικού μεταβολισμού. Με αφορμή τις δημοσιευμένες παρατηρήσεις (1) ότι η καταστολή της αυτοφαγίας οδηγεί σε συσσώρευση μεγάλου μεγέθους λιπιδικών σταγόνων σε κυτταρικά συστήματα και σε στεάτωση σε πειραματικά μοντέλα, (2) ότι η απαλοιφή της ApoA-I σε ποντίκια που έχουν θραφεί με δίαιτα υψηλών λιπαρών οδηγεί σε στεάτωση και (3) ότι η ApoA-I συσσωρεύεται όταν παρεμποδίζεται η αυτοφαγία, υποθέσαμε ότι η ενδοκυττάρια ApoA-I θα μπορούσε φυσιολογικά να λειτουργήσει κατασταλτικά στην υπέρμετρη συγκέντρωση λιπιδίων και χοληστερόλης υπό συνθήκες αυτοφαγικής παρεμπόδισης. Πράγματι, βρήκαμε ότι η αποσιώπηση της ApoA-I σε κυτταρική σειρά ηπατοκυττάρων HepG2 συνεπάγεται την συσσώρευση μεγάλων λιπιδικών σταγόνων, ένα φαινόμενο το οποίο ενισχύθηκε από ταυτόχρονη παρεμπόδιση της αυτοφαγίας. Η δράση της ApoA-I στον έλεγχο του ενδοκυττάριου λιπιδικού φορτίου είναι ανεξάρτητη της αυτοφαγίας, καθώς η αποσιώπηση της ApoA-Ι δεν επηρέασε σημαντικά την αυτοφαγική ροή. Για να συγκεντρώσουμε πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό με τον οποίο η ApoA-I επηρεάζει τις ενδοκυττάριες λιπιδικές αποθήκες, διερευνήσαμε το μεταγράφωμα κυττάρων στα οποία έχει γίνει γενετική αποσιώπηση της ApoA-I. Η βιοπληροφορική ανάλυση κατέδειξε εμπλουτισμό βιολογικών διαδικασιών που σχετίζονται με το μεταβολισμό λιπιδίων και χοληστερόλης και συσχέτιση με τη νόσο του λιπώδους ήπατος και άλλων μεταβολικών νοσημάτων. Είναι ενδιαφέρον πως ένας σημαντικός αριθμός γονίδιων – σχετιζόμενων με τη βιογένεση λιπιδίων και χοληστερόλης – παρουσίασε αύξηση στην έκφραση και έπειτα από τη παρεμπόδιση της αυτοφαγίας αλλά και από τη γενετική αποσιώπηση της ApoA-I. Η συνδυαστική επίδραση οδήγησε σε μια αξιοσημείωτη αύξηση της γονιδιακής έκφρασης των μεταβολικών οδών σε σχέση με τις μεμονωμένες επιδράσεις. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σε συμφωνία με τη συσσώρευση λιπιδικών σταγόνων που προκύπτει από αυτές τις επιδράσεις, και υποστηρίζουν ότι η ενδοκυττάρια ApoA-I και η αυτοφαγία συγκλίνουν στο μεταγραφικό έλεγχο της de novo βιοσύνθεσης λιπιδίων και χοληστερόλης. Επιβεβαιωτικά πειράματα ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης που πραγματοποιήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες επιβεβαίωσαν ότι η μείωση των επιπέδων της ApoA-I σχετίζεται με την υπερέκφραση των γονιδίων βιοσύνθεσης λιπιδίων και χοληστερόλης. Η σημασία αυτών των ευρημάτων για τον άνθρωπο αναδεικνύεται από το γεγονός ότι η ανάλυση δεδομένων αλληλούχισης του μεταγραφώματος ιστών ασθενών με ηπατοκυτταρικό καρκίνο αποκάλυψε την ίδια συσχέτιση- δηλαδή ότι η έκφραση της ApoA-I είναι αντιστρόφως ανάλογη της έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση λιπιδίων και χοληστερόλης όπως τα HMGCR, HMGCS1, FASN, LPIN1 and ACACA. Ανάλυση της έκφρασης βασικών μεταγραφικών ρυθμιστών των γονιδίων που σχετίζονται με βιοσυνθετικά μονοπάτια λιπιδίων και χοληστερόλης υπό συνθήκες γενετικής αποσιώπησης της ApoA-I ή/και αυτοφαγικής παρεμπόδισης κατέδειξε ότι η παρεμπόδιση της αυτοφαγίας επηρεάζει την ωρίμανση του SREBP2 και όχι τη φωσφορυλίωση ή έκφραση του FOXO1/3. Αντίστροφα, η γενετική αποσιώπηση της ApoA-I οδήγησε σε αύξηση της φωσφορυλιωσης του FOXO1/3 αλλά δεν επιδρά στα επίπεδα και την πρωτεολυτική εκτομή του SREBP2. Αυτά τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με την επίδραση της ApoA-I και της αυτοφαγίας στην αλλαγή των επιπέδων έκφρασης των μεταβολικών γονιδίων αλλά και στην ενίσχυση των δράσεων τους όταν συνυπάρχουν. Καθώς η φωσφορυλίωση του FOXO1/3 καθοδηγείται από την ενεργοποίηση της Akt, σε συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της γενετικής αποσιώπησης της ApoA-I στο μονοπάτι σηματοδότησης της Αkt. Παρατηρήσαμε ότι η γενετική αποσιώπηση της ApoA-I οδηγεί σε εξαρτώμενη από mTORC2 φωσφορυλίωση της Akt στη σερίνη 473 και καταστολή του άξονα mTORC2/Αkt μειώνει την επίδραση της αποσιώπησης της ApoA-I στην έκφραση των HMGCR και ΗΜGCS1. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ApoA-I είναι σε φυσική αλληλεπίδραση τόσο με την Αkt1 όσο και με την Αkt2, τουλάχιστον όταν αυτά τα μόρια βρίσκονται σε συνθήκες υπερέκφρασης στη κυτταρική σειρά HEK293T. Επιπρόσθετες μελέτες χρειάζονται για τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο η ApoA-I καθοδηγεί την ενεργοποίηση της Αkt. Πέρα από την αύξηση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με βιοσύνθεση λιπιδίων και χοληστερόλης, το μεταγράφωμα κυττάρων, τα οποία έχουν υποστεί ταυτόχρονα γενετική αποσιώπηση του γονίδιου της ApoA-I και παρεμπόδιση της αυτοφαγίας, είναι εμπλουτισμένα σε υποεκφραζόμενα γονίδια σχετιζόμενα με λειτουργίες ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και με νεοπλασματικές ασθένειες. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η μείωση της ApoA-I σε συνδυασμό με την παρεμπόδιση της αυτοφαγίας μπορεί να διαμορφώσει ένα κυτταρικό περιβάλλον αυξημένου λιπιδικού φορτίου και ένα δυναμικό ανεξέλεγκτου κυτταρικού πολλαπλασιασμού το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε κακοήθεις φαινοτύπους του ήπατος. Σε συμφωνία με αυτή τη θεωρία παρατηρήσαμε ότι η γενετική αποσιώπηση της ApoA1 σε ΗepG2 κύτταρα προστατεύει από την λιποτοξικότητα και την τοξικότητα από γενωμικό stress, ενώ παράλληλα παρέχει αντίσταση στο stress του ενδοπλασματικού δικτύου, όπως διαφαίνεται από την καταστολή της μεταγραφής των σχετικών γονιδίων. Εν κατακλείδι, τα προκαταρκτικά in vivo δεδομένα είναι σε συμφωνία με τα in vitro αποτελέσματα μας που καταδεικνύουν ότι η γενετική απαλοιφή της ApoA-I σε ποντίκια τα οποία έχουν ιστοειδική απαλοιφή του ATG5 στο ήπαρ οδηγεί σε επιδείνωση της παθολογίας στεάτωσης και μπορεί να καθοδηγήσει κακοήθεις φαινοτύπους του ήπατος. Συμπερασματικά, η ερευνά μας ρίχνει φως στη ρύθμιση της ApoA-I στο ήπαρ καθορίζοντας ένα κύριο μετα-μεταγραφικό μονοπάτι υπεύθυνο για τον έλεγχο των ενδοκυττάριων επιπέδων της. Κάτω από συνθήκες πλούσιων σε θρεπτικά η έκφραση της ApoA-I διατηρείται από την ισορροπιστική δράση της αυτοφαγίας και της εξαρτώμενης από mTORC1 de novo πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπρόσθετα, αποκαλύψαμε ένα καινούριο ρόλο της ApoA-I στη ρύθμιση της λιπιδικής ομοιόστασης στο ήπαρ. Η ApoA-I φαίνεται να λειτουργεί ως φρένο στην αμετροεπή συσσώρευση λιπιδίων που προκύπτει από την αυτοφαγική παρεμπόδιση. Παρατηρήσαμε ότι η αυτοφαγική παρεμπόδιση, πέραν της γνωστής επίδρασης της μέσω της λιποφαγίας και της ρύθμισης λιπολυτικών μηχανισμών, επιδρά και στην επαγωγή της έκφρασης μεταβολικών γονιδίων στον καθορισμό του ενδοκυττάριου λιπιδικού φορτίου μέσω της ωρίμανσης του SREBP2. Η επίδραση της αυτοφαγικής παρεμπόδισης στη γονιδιακή έκφραση ενισχύεται από την γενετική αποσιώπηση της ApoA-I, η οποία διαμεσολαβείται από την εξαρτώμενη από την mTORC2 αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt και της συνεπακόλουθης φωσφορυλίωσης και απενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1/3 που δρα ως καταστολέας της μεταγραφής μεταβολικών γονιδίων. Οι νέες λειτουργίες της ΑpoA-I που περιγράφονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή είναι πιθανό να επαναδιαμορφώσουν την κατανόηση του μεταβολισμού των λιπιδίων και της χοληστερόλης αλλά και τον ρόλο της ίδιας της ApoA-I. Η διαφαινόμενη φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση της ApoA-I με την Akt, που διαμορφώνει το δυναμικό ενεργοποίησης της κινάσης και τη συνεπακόλουθη ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που σχετιζονται με το μεταβολισμό λιπιδίων, χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει ότι τα ελαττωμένα επίπεδα της ApoA-I υπό συνθήκες παρεμπόδισης της αυτοφαγίας, όπως αυτές επικρατούν και στο ηπατοκυτταρικο καρκίνο, σχετίζονται με ενισχυμένη έκφραση γονιδίων σχετικά με τη βιοσύνθεση των λιπιδίων και της χοληστερόλης, με τη συσσώρευση λιπιδικών σταγόνων, με αυξημένη επιβίωσή in vitro, και με επιδείνωση καρκινογένεσης in vivo. Μελλοντικές έρευνες θα μπορούσαν να στοχεύσουν στην αποσαφήνιση του μηχανισμού με τον οποίο η ApoA-I φοσφωρυλιώνει την Akt, καθοδηγώντας και καθορίζοντας επιπρόσθετες κυτταρικές δράσεις, αλλά και στη συμμετοχή της ApoA-I στην αιτιοπαθολογία νόσων του ήπατος που σχετιζονται με αυξημένο λιπιδικό φορτίο και κακοήθεια.