Ο ρόλος της ενδοκυττάριας κυστιδιακής μετακίνησης στην αντιθρομβωτική δράση των εδνοθηλιακών κυττάρων
Authors: Παπανικολάου Αγαθή 
Published: August 2021

Η θρομβωρύθμιση, είναι μία λειτουργία ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ομαλής ροής του αίματος. Εξέχουσα θέση στη λειτουργία αυτή κατέχει το ένζυμο CD39 (NTPDase 1) που βρίσκεται στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία επενδύουν το αγγειακό τοίχωμα. Η σημασία του ενζύμου αυτού έγκειται στο γεγονός ότι υδρολύει με μεγάλη αποτελεσματικότητα το ADP που οδηγεί σε θρόμβωση. To CD39 εντοπίζεται σε ειδικές εγκολπώσεις της κυτταροπλασματικήςμεμβράνης, τα λεγόμενα caveolae. Τα caveolae έχουν μια ιδιαίτερη λιπιδιακή σύσταση σε σχέση με την υπόλοιπη μεμβράνη, καθώς είναι εμπλουτισμένα σε χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια. Η κύρια πρωτεΐνη των caveolae είναι η caveolin-1, ο ολιγομερισμός της οποίας είναι υπεύθυνος για την καμπή της μεμβράνης και το συνακόλουθο σχηματισμό των caveolae. Στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε εάν ο εντοπισμός του CD39 στα caveolae παίζει ρόλο στην αντιθρομβωτική του δράση. Η χρήση ιστών από ποντίκια από τα οποία απούσιαζε το γονίδιο της caveolin-1, και κατά συνέπεια και τα caveolae, κατέδειξε ότι η απουσία των οργανιδίων αυτών δεν επηρεάζει την ενζυμική δράση του CD39, ούτε και τη στόχευσή του στη μεμβράνη. Ωστόσο, εκτός από τα caveolae, εμπλουτισμό σε χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια εμφανίζουν και ανεξάρτητες μικροπεριοχές της μεμβράνης οι οποίες ονομάζονται rafts. Για να ελέγξουμε τον πιθανό εντοπισμό του CD39 σε rafts, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες επίπλευσης διαλυτοποιημένων μεμβρανών σε βαθμίδωση σακχαρόζης. Τα πειράματα αυτά κατέδειξαν ότι το CD39 συνδέεται τουλάχιστον εν μέρει με λιπιδιακά rafts και ότι η χοληστερόλη, στην οποία είναι εμπλουτισμένα τα rafts, ελέγχει την υδρολυτική δράση του ενζύμου. Συγκεκριμένα, απομάκρυνση της χοληστερόλης των μεμβρανών με το φάρμακο MßCD, προκάλεσε δραματική δοσοεξαρτώμενη ελάττωση της ενζυμικής και αντιαιμοπεταλιακής δράσης του CD39. Ο μηχανισμός με τον οποίο η χοληστερόλη ρυθμίζει την ενζυμική λειτουργία του CD39 διερευνήθηκε περαιτέρω και αποδείχθηκε ότι δεν οφείλεται σεμεταβολή της μεμβρανικής ρευστότητας, αλλά αντίθετα σε απευθείας αλληλεπίδραση ανάμεσα στη χοληστερόλη και το ένζυμο. Συνεπώς, ο εντοπισμός του CD39 στα caveolae, αλλά και στα rafts, φαίνεται να εξυπηρετεί την ανάγκη του ενζύμου να βρίσκεται σε περιοχές της μεμβράνης πλούσιες σε χοληστερόλη, προκειμένου να εμφανίζει βέλτιστη ενζυμική δραστικότητα. Ο εντοπισμός του CD39 στα rafts και ο γνωστός ρόλος των λιπιδιακών αυτών μικροπεριοχών στην πολωμένη μεταφορά μας οδήγησε στη μελέτη της πιθανής πολωμένης στόχευσης του CD39 και στη διερεύνηση των σημάτων διαλογής του. Με τη χρήση ενός πρότυπου συστήματος πολωμένων κυττάρων, δείξαμε ότι το CD39 όντως εμφανίζει πολωμένη εντόπιση και μάλιστα στην κορυφαία επιφάνεια της μεμβράνης. Επιπλέον, αποκαλύφθηκαν δύο ανεξάρτητα σήματα υπεύθυνα για τηνκορυφαία στόχευση, ένα στην εξωκυττάρια περιοχή του μορίου, κατά πάσα πιθανότητα τα σάκχαρα, και ένα στο αμινοτελικό του άκρο. Η εύρεση μάλιστα του δεύτερου σήματος ήταν απρόσμενη, δεδομένου ότι σήμερα πιστεύεται ότι η γλυκοζυλίωση αποτελεί κυρίαρχο σήμα για στόχευση στην κορυφαία μεμβράνη. Εκτός από το ρόλο της στην κορυφαία εντόπιση του CD39, η αμινοτελικήδίαμεμβρανική περιοχή έχει σημασία στην υδρολυτική δράση του ενζύμου, αφού κατάργησή της οδήγησε σε υποδιπλασιασμό της ενζυμικής ενεργότητας. Από την άλλη, η αφαίρεση του καρβοξυτελικού διαμεμβρανικού τμήματος του μορίου είχε ως αποτέλεσμα τη σχεδόν πλήρη απώλεια της ενεργότητας του ενζύμου. Η χαμηλή ενζυμική ενεργότητα, είτε απουσιάζει το ένα ή το άλλο διαμεμβρανικό τμήμα, αποδείξαμε ότι οφείλεται στην αδυναμία του μορίου να ενεργοποιηθεί από τη χοληστερόλη. Περαιτέρω δείξαμε ότι η δραματική μείωση της ενεργότητας του ενζύμου πουπροκαλείται από την αφαίρεση της καρβοξυτελικής διαμεμβρανικής περιοχής οφείλεται στην ελλιπή γλυκοζυλίωση του μορίου. Συνεπώς, η δίαμεμβρανική αυτή περιοχή εξασφαλίζει την επαρκή γλυκοζυλίωση του CD39 μέσω ενός μεταμεταφραστικού μηχανισμού. Το αποτέλεσμα αυτό είναι απρόσμενο δεδομένου ότι η επικρατούσα άποψη υποστηρίζει ότι η γλυκοζυλίωση είναι μία συν-μεταφραστική διαδικασία που δεν επηρεάζεται από περιοχές εκτός της συναινετικής αλληλουχίαςγλυκοζυλίωσης. Τέλος, αναδείξαμε το ρόλο της χοληστερόλης ως κυρίαρχο ρυθμιστικό μόριοστη διαδικασία της θρομβωρύθμισης. Εκτός από την ενεργοποίηση του αντιθρομβωτικού CD39 (NTPDase 1), επιπλέον η χοληστερόλη αναστέλλει το προθρομβωτικό ένζυμο NTPDase 2, που ανήκει στην ίδια οικογένεια ενζύμων με το CD39, αλλά σε αντίθεση με αυτό παράγει ADP αντί να το υδρολύει. Η ταυτόχρονη αντίρροπη ρύθμιση των δύο ενζύμων από τη χοληστερόλη, οδηγεί σε αθροιστική μείωση των επιπέδων του ADP και πιθανά σε συνεπακόλουθη προστασία από τηθρόμβωση.