Διερεύνηση του ρόλου της συνδεδεμένης με τις λιποπρωτεΐνες φωσφολίπασης A2 (Lp - PLA2) στην πρόσληψη της οξειδωμένης LDL από τα μακροφάγα
Authors: Μαρκάκης Κωνσταντίνος 
Published: September 2021

Η αναγνώριση και η πρόσληψη της οξειδωμένης LDL (oxidized LDL, oxLDL) από τους εκκαθαριστές υποδοχείς των μακροφάγων και ο σχηματισμός των αφρωδών κυττάρων μεσολαβούνται από την οξειδωτικά τροποποιημένη απολιποπρωτεΐνη Β100 (apolipoproteinB100, ApoB100) και την λιπιδική ομάδα της oxLDL. Η λιπιδική ομάδα επιδεικνύει ένα διπλό ρόλο όσον αφορά στην αναγνώριση της oxLDL από τους εκκαθαριστές υποδοχείς.Προϊόντα οξείδωσης λιπιδίων έχουν την ικανότητα να συνδέονται στην ApoB με το σχηματισμό ενώσεων με κατάλοιπα λυσίνης, με αποτέλεσμα την αυξημένη αναγνώριση του μακρομορίου της ApoB από τους εκκαθαριστές υποδοχείς και επιπλέον οξειδωμένα λιπίδια λειτουργούν σαν ισχυροί συνδέτες των εκκαθαριστών υποδοχέων, ανεξάρτητα από τη σύνδεση τους με την ApoB. Μία σημαντική ποσότητα οξειδωμένης φωσφατιδυλοχολίνης (oxidized phosphatidylcholine, oxPC) της oxLDL υδρολύεται στην sn-2 θέση από τη συνδεδεμένη με τις λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση Α2 (lipoprotein associated phospholipaseA2, Lp-PLA2) σε λυσοφωφατιδυλοχολίνη (lysophosphatidylcholine, lysoPC) και μικρά προϊόντα υδρόλυσης. Η εργασία αυτή εξέτασε τη συμμετοχή της Lp-PLA2 στη σύνδεση καιστην πρόσληψη της oxLDL από μακροφάγα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν LDL με ακέραιη τη δραστικότητα της Lp-PLA2 [LDL(+)] και LDL με ανεσταλμένη τη δραστικότητα της Lp-PLA2 [LDL(-)]. Αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 επιτεύχθηκε με επώασηLDL με 1 mM pefabloc πριν την οξείδωση.Είναι γνωστό πως κατά τη διάρκεια της οξείδωσης της LDL η δραστικότητα της Lp-PLA2 προοδευτικά μειώνεται. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα, στα πειράματά μας κατά τη διάρκεια οξείδωσης LDL με 5μM CuSO4, η εναπομείνουσα δραστικότητα τηςLp-PLA2 μετά από 6 h ήταν περίπου 40–50%, και μετά από 24 h μόνο 10–15% της αρχικής δραστικότητας είχε διατηρηθεί. Η έκταση της υδρόλυσης της oxPC και της λιπιδικής υπεροξείδωσης εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό αντίστοιχα της μοριακής αναλογίαςlysoPC/PC και των επιπέδων MDA. Η μοριακή αναλογία lysoPC/PC ήταν ~ 0,05 στη φυσική LDL και ~ 0,24 και ~ 0,36 μετά από 6 h ή 24 h οξείδωσης, αντίστοιχα. Τα επίπεδα MDA, εκφραζόμενα σε nmoles/mg πρωτεΐνης LDL, ήταν ~ 1,8 στη φυσική LDL και ~ 33,5 και ~ 44,2 μετά από 6 h ή 24 h οξείδωσης, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκαν τα δύο αυτά χρονικά διαστήματα, και η LDL οξειδώθηκε για 6 h (μέτρια οξειδωμένη LDL, moderatelyoxidized LDL, MoxLDL) ή 24 h (ισχυρά οξειδωμένη LDL, heavily oxidized LDL,HoxLDL) για να ελεγχθεί η πιθανή διαφορά μεταξύ ενός βραχύτερου διαστήματος οξείδωσης με παρόν το μεγαλύτερο μέρος της δραστικότητας της Lp-PLA2 και ενός μεγαλύτερου διαστήματος κατά τη διάρκεια του οποίου σημαντικό μέρος της δραστικότηταςτης Lp-PLA2 έχει απωλεστεί. Η σύνδεση και η πρόσληψη MoxLDL και HoxLDL, παρασκευασμένων από LDL(+) ήLDL(-) και σημασμένες με FITC, εξετάστηκαν με επώαση με περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού στους 40C ή 370C αντίστοιχα. Η σύνδεση και η πρόσληψη της MoxLDL(-) ήταν περίπου κατά 30% αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες της MoxLDL(+), και η σύνδεση και η πρόσληψη της HoxLDL(-) ήταν περίπου κατά 20% αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες τηςHoxLDL(+). Επώαση με pefabloc στο τέλος της οξείδωσης δεν μετέβαλε τη σύνδεση και τη πρόσληψη της MoxLDL ή της HoxLDL που οξειδώθηκαν παρουσία της δραστικότητας τηςLp-PLA2, δεικνύοντας ότι δεν υπάρχει άλλη άμεση επίδραση του pefabloc στη σύνδεση και στην πρόσληψη της oxLDL εκτός από την αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2.Με δεδομένο ότι οι υποδοχείς των μακροφάγων αναγνωρίζουν και την πρωτεϊνική και τη λιπιδική ομάδα της oxLDL, ο επόμενος στόχος μας ήταν να διακρίνουμε για πρώτη φορά ποιά από τις δύο ομάδες ήταν υπεύθυνη για την αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη τηςoxLDL(-). Η εμπλοκή της ApoB εξετάστηκε αξιολογώντας τη σύνδεση και την πρόσληψηApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB απομονωμένη από oxLDL. Για το σκοπό αυτό, ApoB από oxLDL ενσωματώθηκε σε ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα αποτελούμενα από 1,2-διπαλμυτόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (dipalmitoyl-phoshatidylcholine, DPPC),χοληστερόλη και ApoB στην αναλογία 10:5:2 (αναλογία βάρους). Τα ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα παρασκευάστηκαν με μέθοδο διαλυτοποίησης με χρήση απορρυπαντικού και με ακόλουθη απομάκρυνσή του, χρησιμοποιώντας σαν απορρυπαντικό το octyl glycoside (OG), καθώς έχει δειχθεί οτι επώαση της ApoB με OG δεν επηρεάζει τη σύνδεση της ApoB από oxLDL στους υποδοχείς των μακροφάγων. Για να εξετάσουμε εάν ηApoB είναι συζευγμένη στα λιποσώματα, ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα σημάνθηκαν με[14C]DPPC και αυτά τα [14C]DPPC-ApoB-πρωτεϊνολιποσώματα υποβλήθηκαν σε υπερφυγοκέντρηση σε πυκνότητα 1,14 g/mL. Η ανάκτηση και της πρωτεΐνης και της[14C]DPPC ραδιενέργειας στην ανώτερη στοιβάδα ήταν μεγαλύτερες από 95%. Οι τιμές σύνδεσης και πρόσληψης των πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από oxLDL ήταν κατά πολύ μεγαλύτερες των αντίστοιχων τιμών των μη συνδεδεμένων με πρωτεΐνηλιποσωμάτων μαρτύρων. Η σύνδεση και η πρόσληψη των [14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από oxLDL αναστελλόταν με εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο από την oxLDL, ενώ η φυσική LDL είχε μόνο μικρή ανασταλτική επίδραση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν διατήρηση της ικανότητας σύνδεσης της ενσωματωμένης στα πρωτεϊνολιποσώματα ApoB με τους υποδοχείς των μακροφάγων. Η αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 δεν είχε επίδραση στη σύνδεση ή στην πρόσληψη των [14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν από ApoB απομονωμένη από MoxLDL(-), MoxLDL(+), HoxLDL(-), και HoxLDL(+). Η σύνδεση και η πρόσληψη των[14C]-ApoB-πρωτεϊνολιποσωμάτων που περιείχαν ApoB από MoxLDL ή HoxLDLέμεινε ανεπηρέαστη από την επώαση με pefabloc στο τέλος της οξείδωσης. Το εύρημα αυτό ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν ανωτέρω όσον αφορά στη σύνδεση και στην πρόσληψη της ακέραιης oxLDL, υποδεικνύοντας ξανά τη μή ύπαρξη άμεσης επίδρασης του pefabloc στη σύνδεση στους υποδοχείς.Για να εξετάσουμε την πιθανότητα προϊόντα υδρόλυσης της oxPC από την Lp-PLA2 να μπορούν να συνδέονται στην ApoB, χρησιμοποιήσαμε σαν υπόστρωμα 1-παλμιτόϋλο-2-[1-14C]αραχιδονόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1- palmitoyl – 2 - [1-14C]arachidonoyl –phosphatidylcholine, [14C]PAPC) η οποία είχε οξειδωθεί με επώαση με 5μM CuSO4 για 24h. Ox[14C]PAPC επωάστηκε με Lp-PLA2 μερικώς καθαρισμένη από LDL, και τα ραδιενεργά χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντα της υδρόλυσης που απελευθερώθηκαν από την Lp-PLA2 από την sn-2 θέση απομονώθηκαν. Επώαση αυτών των χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντων της υδρόλυσης με LDL(+) ή LDL(-) ανέδειξε για πρώτη φορά την ικανότητά τους να συνδέονται με την ApoB σε βαθμό παραπλήσιο αυτού που παρατηρήθηκε μετά από επώαση με ox[14C]PAPC. Μία εύλογη εξήγηση της παρόμοιας πρόσληψης τηςApoB από oxLDL(+) ή oxLDL(-) στην εργασία μας, θα μπορούσε να είναι το ότι χαμηλού μοριακού βάρους προϊόντα της υδρόλυσης της oxPC, που απελευθερώνονται από την Lp-PLA2 από την sn-2 θέση, είναι επίσης ικανά να τροποποιούν επαρκώς την ApoB.Ο ρόλος της Lp-PLA2 στη σύνδεση και στην πρόσληψη της oxLDL μέσω της λιπιδικής ομάδας εξετάστηκε χρησιμοποιώντας σημασμένα με [14C]DPPC λιποσώματα παρασκευασμένα από τα λιπίδια που εκχυλίστηκαν από MoxLDL(-), MoxLDL(+),HoxLDL(-), και HoxLDL(+). Η σύνδεση και η πρόσληψη αυτών των λιποσωμάτωνεπέδειξαν όμοιο πρότυπο με αυτό των αντίστοιχων σημασμένων με FITC λιποπρωτεϊνών. Επώαση με λιποσώματα από MoxLDL(-) λιπίδια οδήγησε σε μεγαλύτερη κατά ~ 40%σύνδεση και πρόσληψη σε σύγκριση με αυτές των λιποσωμάτων από MoxLDL(+) λιπίδια.Παρομοίως, η αναστολή της Lp-PLA2 οδήγησε σε αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη, αν και σε μικρότερο βαθμό, των λιποσωμάτων από HoxLDL(-) λιπίδια κατά ~ 30% σε σύγκριση με αυτές των λιποσωμάτων από HoxLDL(+) λιπίδια.Για να διερευνήσουμε περαιτέρω την αυξημένη σύνδεση και πρόσληψη της oxLDLμέσω της λιπιδικής ομάδας που προκαλείται από την αναστολή της Lp-PLA2, εξετάσαμε την ικανότητα της οξειδωμένης 1-παλμιτόϋλο-2-αραχιδονόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνης(oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, oxPAPC), τηςοξειδωμένης 1-παλμιτόϋλο-2-λινελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνης (oxidized 1-palmitoyl-2-linoneloyl- sn-glycero-3-phosphocholine, oxPLPC) και του λυσο-παραγώγουτους, της 1 – παλμιτόϋλο – sn – γλυκερο – 3 - φωσφοχολίνης (1 – palmitoyl – sn – glycerol– 3 -phosphocholine), όπως επίσης και την ικανότητα της οξειδωμένης 1,2-ελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (oxidized 1,2-dioleoyl-sn glycero-3-phosphocholine, oxDOPC) και του λυσο-παραγώγου της, της 1-ελαϊκόϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1 – oleoyl – sn –glycerol - phosphocholine), να μεσολαβούν στη σύνδεση και στην πρόσληψη. Η οξείδωση των φωσφολιπιδίων διενεργήθηκε με επώαση με 5μM CuSO4 για 24h. PAPC, PLPC καιDOPC συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη καθώς παριστούν κοινά μόρια φωσφατιδυλοχολίνης με πολυακόρεστες (PAPC, PLPC) ή μονοακόρεστες (DOPC) ακυλ- αλυσίδες στην sn-2 θέση.Επιπλέον, διάφορα μόρια προερχόμενα από την οξείδωση των PAPC και PLPC έχουν δειχθεί να λειτουργούν σαν συνδέτες για εκκαθαριστές υποδοχείς και περαιτέρω είναι δυνητικά ευάλωτα σε υδρόλυση από την LpPLA2, όπως έχει αποδειχτεί στην περίπτωση μορίων προερχόμενων από την οξείδωση PAPC, όπως η 1-παλμιτόϋλο-2-(5-κετοβαλερόϋλο)-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine, POVPC). Παρασκευάστηκαν λιποσώματα που περιείχαν χοληστερόλη,DPPC σαν συστατικό κορεσμένης φωσφατιδυλοχολίνης, και το υπό εξέταση μόριοφωσφατιδυλοχολίνης, σε μοριακή αναλογία 2:1 μεταξύ ολικών φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης. Λιποσώματα σημασμένα με [14C]DPPC χρησιμοποιήθηκαν σε άμεσες μελέτες σύνδεσης και πρόσληψης, ενώ μη σημασμένες παρασκευές χρησιμοποιήθηκαν σε μελέτες αναστολής. Tα oxPAPC λιποσώματα επέδειξαν σημαντική σύνδεση και πρόσληψη,φθάνοντας περίπου στο 60-70% της σύνδεσης και πρόσληψης των λιποσωμάτων απόHoxLDL(-) λιπίδια. Η επώαση με oxPLPC λιποσώματα ή lysoPC λιποσώματα είχε σαν αποτέλεσμα περίπου το 30% της σύνδεσης και της πρόσληψης που παρατηρήθηκε με τη χρησιμοποίηση oxPAPC λιποσωμάτων. Τα oxDOPC λιποσώματα έδειξαν ακόμη λιγότερη σύνδεση και πρόσληψη. Η σύνδεση και η πρόσληψη των λιποσωμάτων που περιείχαν μη οξειδωμένη PAPC ή μη οξειδωμένη PLPC ήταν πολύ μικρότερες αυτών που περιείχαν τα αντίστοιχα οξειδωμένα φωσφολιπίδια, ενώ η σύνδεση και η πρόσληψη λιποσωμάτων που περιείχαν αποκλειστικά DPPC σαν φωσφολιπιδικό συστατικό, ήταν αμελητέες. Τα oxPAPC λιποσώματα, όπως επίσης και τα oxPLPC λιποσώματα, αλλά και τα lysoPC λιποσώματα επέδειξαν πρότυπο σύνδεσης και πρόσληψης μεσολαβούμενων από υποδοχέα, καθώς παρατηρήθηκε μία δοσοεξαρτώμενη αναστολή της σύνδεσης και της πρόσληψης σημασμένων παρασκευών από μη σημασμένες παρασκευές του ίδιου λιποσώματος όπως και από MoxLDL(+) και HoxLDL(+) ή από λιποσώματα από MoxLDL(+) λιπίδια και λιποσώματα από HoxLDL(+) λιπίδια, όχι όμως από LDL(+) ή λιποσώματα από LDL(+)λιπίδια. Το πρότυπο των αποτελεσμάτων των μελετών που εξέτασαν την ικανότητα μη σημασμένων λιποσωμάτων να ανταγωνιστούν στη σύνδεση και στην πρόσληψη σημασμένες oxLDL ή σημασμένα λιποσώματα από oxLDL λιπίδια, ήταν αντίστοιχο αυτού των άμεσων μελετών σύνδεσης και πρόσληψης, με τα oxPAPC λιποσώματα να αναδεικνύουν ισχυρή ικανότητα να αναστέλλουν τη σύνδεση και την πρόσληψη της ακέραιης MoxLDL(+) και των λιποσωμάτων από MoxLDL(+) λιπίδια ή MoxLDL(-) περίπου κατά 70-80%.Στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 πριν από την οξείδωση της LDL, έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη αναγνώριση της λιπιδικής ομάδας από τους υποδοχείς των μακροφάγων και την επακόλουθη αυξημένη πρόσληψη τηςoxLDL. Η επίδραση αυτή είναι περισσότερο έκδηλη στη μέτρια οξείδωση (6h) από ότι στην ισχυρή οξείδωση (24h), πιθανότατα λόγω της προοδευτικής απενεργοποίησης της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης. Εκτός από την προοδευτική απώλεια της δραστικότητας της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης, η διατήρηση της αναγνώρισης μέσω τηςApoB και πιθανώς η παραγωγή οξειδωμένων φωσφολιπιδίων με μακρές αλυσίδες στην sn-2θέση, τα οποία θα μπορούσαν να δράσουν σαν συνδέτες των εκκαθαριστών υποδοχέων αλλά δεν είναι ευαίσθητα στην υδρόλυση από την Lp-PLA2, παριστούν πιθανούς παράγοντες που τείνουν να εξασθενίσουν τη διαφορά στη σύνδεση και στην πρόσληψη μεταξύ τηςoxLDL(+) και της oxLDL(-). Όσον αφορά στη μειωμένη αναγνώριση της λιπιδικής ομάδας της oxLDL από τους υποδοχείς των μακροφάγων η οποία προκαλείται από τη δραστικότητατης Lp-PLA2, αυτή πιθανώς οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στη μείωση των μορίων τηςoxPAPC τα οποία δρουν σαν ισχυροί συνδέτες για αυτούς τους υποδοχείς.Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η προοδευτική αναστολή της δραστικότητας της Lp-PLA2 κατά τη διάρκεια της οξείδωσης οδηγεί σε αυξημένη αναγνώριση της oxLDL από τους υποδοχείς των μακροφάγων και αυτό κυρίως αποδίδεται στην αυξημένη αναγνώριση της εμπλουτισμένης σε οξειδωμένα φωσφολιπίδιαλιπιδικής ομάδας της oxLDL.