Επίδραση μεταλλαγμένων μορφών p53 πρωτεΐνης στη διαταραχή του παλίνδρομου αρνητικού μηχανισμού ανάδρασης P53-MDM2 στον καρκίνο του πνεύμονα
Authors: Ζαχαράτος Παναγιώτης 
Published: January 2014

Σκοπός: Τα γονίδια TP53 και MDM2 αλληλεπιδρούν σε ένα παλίνδρομο αρνητικό μηχανισμό ανάδρασης. Έχει διαπιστωθεί ότι συνύπαρξη των p53 και MDM2 σε σαρκώματα και σε νεοπλάσματα πνεύμονα συνοδεύεται από χειρότερη πρόγνωση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τα γονίδια p53 και MDM2 στον καρκίνο του πνεύμονα, και διερευνήθηκε ο ρόλος των μεταλλαγμένων p53 στις περιπτώσεις που παρατηρείται διαταραχή του προαναφερόμενου μηχανισμού ανάδρασης. Υλικό και Μέθοδοι: Το υλικό αποτελείται από 21 επιδερμοειδή καρκινώματα, 19 αδενοκαρκινώματα και 10 μικροκυτταρικά καρκινώματα του πνεύμονα. Η εκτίμηση των πρωτεϊνών p53 και MDM2 έγινε σε κυτταρικό- ιστικό επίπεδο με τη χρήση της ανοσοϊστοχημείας και σε μοριακό επίπεδο με τη μέθοδο Western. Περαιτέρω, η έκφρασή τους συνδυάστηκε με τη μοριακή ταυτότητα του γονιδίου τους που αλλοιώνει το φυσιολογικό τους ρόλο. Συγκεκριμένα, η έκφραση της p53 συσχετίστηκε με την κατάσταση του γονιδίου TP53 [εξέταση μεταλλαγών με τις μέθοδους SSCP και Sequencing και ελλείψεως γονιδίου (έλεγχος απώλειας ετεροζυγωτίας) με τη μέθοδο Southern], ενώ η έκφραση της MDM2 συνδυάστηκε με τη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου [έλεγχος επίπεδων μεταγράφων με τη μέθοδο Northern] και την ύπαρξη γονιδιακής ενίσχυσης [με τη μέθοδο του διαφορικού-PCR]. Στη συνέχεια, σε επιλεγμένα δείγματα που διαπιστώθηκε διαταραχή του αρνητικού μηχανισμού ανάδρασης p53-MDM2 εξετάστηκε ο ρόλος των μεταλλαγμένων μορφών της p53. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ικανότητα των μεταλλαγμένων p53 αφενός να προσδένονται στα ειδικά στοιχεία ανταπόκρισης για το p53 της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου MDM2 (με τη μέθοδο EMSA) και αφετέρου η ικανότητά συγκεκριμένων από αυτά (κατασκευή μεταλλαγμένων p53 με τη μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης) για μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίου αναφοράς (λουσιφεράση) υπό τη ρύθμιση του συγκεκριμένου στοιχείου ανταπόκρισης (πειράματα διαμόλυνσης με γονίδιο αναφοράς αυτό της λουσιφεράσης). Αποτελέσματα: Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της p53 διαπιστώθηκε σε 28 περιστατικά (56%). Από αυτά βρέθηκε μετάλλαξη του γονιδίου σε 24 περιπτώσεις (86%) η οποία συνοδευόταν από απώλεια ετεροζυγωτίας σε 13 από τα 16 αξιολογίσιμα δείγματα (81%) (p<0.0001 και p=0.015, αντίστοιχα). Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της MDM2 παρατηρήθηκε σε 30 περιστατικά (60%), ενώ ανευρέθησαν τρείς πρωτεϊνικές ισομορφές: p90, p57 και p76/74. Τα αυξημένα επίπεδα της MDM2 οφείλονται σε αυξημένα επίπεδα mRNA τα οποία δεν σχετίζονται με γονιδιακή ενίσχυση. Ταυτόχρονη ανοσοϊστοχημική εντόπιση των p53 και MDM2 διαπιστώθηκε σε 21 από τα 28 περιστατικά με μεταλλαγμένη την p53 (p=0.0004). Τα αποτελέσματα της εξέτασης της δεσμευτικής ικανότητας στο στοιχείο ανταπόκρισης για το p53 του MDM2 δώδεκα επιλεγμένων μεταλλαγμένων p53 ήταν σε συμφωνία με τα παρατηρούμενα πρωτεϊνικά επίπεδα της MDM2. Τα πειράματα διαμόλυνσης με 4 κατασκευασμένα μεταλλαγμένα μόρια p53 έδειξαν τη σημασία τόσο της θέσης όσο και της φύσης των μεταλλάξεων για τη λειτουργικότητα του μορίου. Συμπεράσματα: Τουλάχιστον, σε μια ομάδα καρκινωμάτων του πνεύμονα διαπιστώθηκε ταυτόχρονη έκφραση των πρωτεϊνών p53 και MDM2. Το φαινόμενο αυτό, που συνδυάστηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και λεμφαδενικές μεταστάσεις, εν μέρει δικαιολογήθηκε με τη δράση συγκεκριμένων μεταλλαγμένων p53 πρωτεϊνών που παρουσιάζουν ογκογόνες ιδιότητες. Γενικότερα παρατηρήθηκε ότι ο ρόλος των μεταλλάξεων σχετίζεται με το είδος και τη θέση τους καθώς και με τη συνύπαρξη φυσιολογικής p53