Ο ρόλος του ογκογονιδίου KDM2B στην επιγενετική ρύθμιση του κυτταροσκελετού
Authors: Ζαχαροπούλου Νεφέλη-Εσμεράλντα-Όνειρο 
Published: September 2021

Ο καρκίνος δεν oφείλεται μόνο σε γενετικά αίτια. Μη-γενετικές κληρονομικές αλλαγές που επηρεάζουν την δομή της χρωματίνης και την έκφραση των γονιδίων, μπορούν επίσης να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου. Μέχρι τώρα, έρευνες δείχνουν ότι αλλαγές στους ρυθμιστές της χρωματίνης, όπως είναι μεθυλοτρανσφεράσες και οι απομεθυλάσες των ιστονών, μπορούν να απορρυθμίσουν τις λειτουργίες του κυτταροσκελετού και της διακυτταρικής προσκόλλησης, καθώς και να συμμετάσχουν στη διαδικασία της μετάστασης. Στον καρκίνο, πολλές φυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες μεταβάλλονται, με αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη δυνατότητα ενισχυμένης επιβίωσης και το διαφοροποιημένο κυτταρικό σχήμα. Η ελαττωματική κυτταρική μορφογένεση παρέχει στα καρκινικά κύτταρα τα χαρακτηριστικά εκείνα που τους προσδίδουν αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα και διηθητικότητα, χαρακτηριστικά απαραίτητα για την εξέλιξη της νόσου. Κατά τη μεταστατική διαδικασία, τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την πολικότητα τους και τη διακυτταρική προσκόλληση και αποκτούν μεσεγχυαμτικά χαρακτηριστικά, σε μια διαδικασία που ονομάζεται επιθηλιακή- μεσεγχυματική μετάβαση (EMT). Κατά την ΕΜΤ, παρατηρείται μία δραματική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, η οποία συνοδεύεται από το σχηματισμό μεμβρανικών προεξοχών. Πολλά ευρήματα μέχρι στιγμής, υποδηλώνουν ότι ο κυτταροσκελετός της ακτίνης ρυθμίζεται από διάφορους επιγενετικούς μηχανισμούς. Επιπλέον, αλλοιώσεις των ρυθμιστών της χρωματίνης έχουν συνδεθεί με απορρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών του κυττάρου. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί πίσω από αυτές τις διαδικασίες δεν είναι ευρέως γνωστοί. Στόχος της συγκεκριμένης μελέτης είναι η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η ρύθμιση της χρωματίνης και οι επιγενετικοί μηχανισμοί επηρεάζουν την εμφάνιση και την εξέλιξη του καρκίνου. Για το λόγο αυτό, επικεντρωθήκαμε στην επιγενετική ρύθμιση ενός από τα κυριότερα κυτταρικά συστήματα που εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία, τον κυτταροσκελετό. Η βασική μας υπόθεση είναι ότι, στον καρκίνο, οι επιγενετικές αλλοιώσεις συχνά οδηγούν στην απορρύθμιση των μηχανισμών που διατηρούν την φυσιολογική οργάνωση και λειτουργία του κυτταροσκελετού, γεγονός που με τη σειρά του προάγει την κινητικότητα και την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να διασαφηνίσουμε την υπόθεσή μας, εξετάσαμε την επίδραση του ρυθμιστή της χρωματίνης KDM2B. Το γονίδιο KDM2B κωδικοποιεί για μία ειδική απομεθυλάση ιστονών που στοχεύει τη τριμεθυλιωμένη λυσίνη Κ4 και τη διμεθυλιωμένη λυσίνη Κ36 της ιστόνης Η3 (H3K4me3 και H3K36me2), σημάδια που οδηγούν σε μεταγραφική καταστολή. Απομονώθηκε σε μία μελέτη για προσδιορισμό νέων ογκογονιδίων, έπειτα από πρόκληση μεταλλαξογένεσης μέσω ένθεσης ρετροϊών στο γονιδίωμα τρωκτικών. Η λειτουργία της εξαρτάται από την περιοχή CxxC-ZF της αλληλουχίας της, η οποία διαμεσολαβεί τη δέσμευσή της σε μη μεθυλιωμένες CpG νησίδες κατά μήκος όλου του γονιδιώματος. Εκτοπική έκφραση της KDM2B οδηγεί τους εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικιών (MEFs) σε αθανατοποίηση παρακάμπτοντας τη διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης (senescence), μέσω ενός πολύπλοκου μηχανισμού κατά τον οποίο συνεργάζονται τα σύμπλοκα καταστολής γονιδίων PRC. Ο μηχανισμός αυτός οδηγεί στην καταστολή του γονιδιακού τόπου Ink4a-Arf-Ink4b και περιλαμβάνει τη δράση της μεθυλοτρανσφεράσης EZH2, που είναι μέλος του PRC2 συμπλόκου και καταλύει τη δι- και την τρι-μεθυλίωση της λυσίνης Κ27 (H3K27), σημάδι που αναγνωρίζεται από το PRC1 σύμπλοκο, το οποίο περιλαμβάνει την KDM2B. Στη μελέτη μας, εστιάζοντας στο ρόλο του επιγενετικού παράγοντα KDM2B, αποσαφηνίσαμε το ρόλο του στην επιγενετική ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, τη διακυτταρική προσκόλληση, την κυτταρική ανάπτυξη, την κινητικότητα και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη DU-145 και των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου HCT-116. Ειδικότερα, στις κυτταρικές αυτές σειρές, οι οποίες εκφράζουν είτε ένα ειδικό shKDM2B έναντι της KDM2B είτε υπερεκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο, βρήκαμε ότι η απομεθυλάση αυτή των ιστονών διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων και οδηγεί στη διαφορετική έκφραση αρκετών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταροσκελετού, τη διακυτταρική προσκόλληση και την ομοιόσταση του Ca2+. Συγκεκριμένα, η KDM2B εκφράζεται λειτουργικά και στις δύο κυτταρικές σειρές και ενεργοποιείται από τον FGF-2. Επιπλέον, ρυθμίζει τις πρωτεΐνες των PRC συμπλόκων EZH2 και BMI1, αυξάνοντας την έκφρασή τους τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης έπειτα από την υπερέκφραση της, ενώ αντίθετα οδηγεί στη μείωση των επιπέδων τους μετά την αποσιώπησή της. Η αποσιώπηση της KDM2B προκάλεσε ισχυρή αύξηση της έκφρασης των επιθηλιακών δεικτών E-Καδερίνης και ZO-1, ενώ η υπερέκφραση της KDM2B μείωσε τα επίπεδά τους. Αντίθετο πρότυπο έκφρασης παρουσίασε ο μεσεγχυματικός δείκτης N-Καδερίνη, υποδεικνύοντας τον έλεγχο της EMT από την KDM2B. Αυτά τα αποτελέσματα καθιερώνουν έναν σαφή λειτουργικό ρόλο του επιγενετικού παράγοντα KDM2B στη ρύθμιση της ΕΜΤ στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου και περαιτέρω υποστηρίζουν τον ογκογονικό ρόλο αυτής της απομεθυλάσης των ιστονών σε διάφορους όγκους. Επίσης παρατηρήσαμε μία σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας των Rho GTPασών. Ειδικότερα, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των RhoA, RhoB και RhoC μειώθηκαν έπειτα από την αποσιώπηση την KDM2B, ενώ και οι τρεις μικρές GTPάσες αυξήθηκαν στους κυτταρικούς κλώνους DU-145 και HCT-116 που υπερεκφράζουν KDM2B. Ενώ τα επίπεδα μεταγραφής των τριών μικρών GTPασών παρέμειναν αμετάβλητα, η δραστικότητα των RhoA και RhoB ελαττώθηκε στους κλώνους με αποσιωποιημένη της έκφραση της KDM2B ενώ αυξήθηκε στους κυτταρικούς κλώνους που υπερεκφράζουν KDM2B. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επίπεδα της Rac1 GTPάσης εμφάνισαν αντίθετο πρότυπο έκφρασης από αυτή των μικρών Rho GTPασών, όντας αυξημένα στους κυτταρικούς κλώνους με αποσιωποιημένο τον επιγενετικό παράγοντα και μειωμένα στα κύτταρα με υπερεκφρασμένη την KDM2B. Η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης έγινε επίσης εμφανής, με σχηματισμό ινιδίων του στρες σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την KDM2B. Η αναδιοργάνωση αυτή δεν πραγματοποιήθηκε παρουσία της τρανσφεράσης C3 του αναστολέα των Rho. Επιπλέον, κύτταρα DU-145 που υπερεκφράζουν την KDM2B εμφάνισαν αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα, η οποία μειώθηκε παρουσία του αναστολέα της τρανσφεράσης C3. Η επιβράδυνση της κυτταρικής μετανάστευσης που παρατηρήθηκε σε κύτταρα με αποσιωποιημένη KDM2B, ενισχύθηκε ακόμα παραπάνω όταν προ-επωάστηκαν με τον αναστολέα αυτό, υποδηλώνοντας συμμετοχή σηματοδότησης των Rho-GTPασών στη διαδικασία της μετανάστευσης. Εκτός από τη σηματοδότηση μέσω των Rho-GTPασών, αναλύσαμε περαιτέρω εάν η KDM2B μπορεί να ελέγξει πρόσθετους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αναδιοργάνωση της ακτίνης, την κυτταρική ανάπτυξη και κινητικότητα. Για το λόγο αυτό, εστιάσαμε στο μεταβολικό μονοπάτι σηματοδότησης FAK/PI3K και αναλύσαμε τον υποκείμενο μηχανισμό κατά την αποσιώπηση ή/και την υπερέκφραση της KDM2B. Η υπερέκφραση ή η σίγηση της απομεθυλάσης ελέγχει τη δραστικότητα της κινάσης FAK στα κύτταρα, χωρίς ωστόσο να επηρεάζει τη γονιδιακή μεταγραφή ή την πρωτεϊνική έκφραση αυτής της κινάσης. Μετά την υπερέκφραση της KDM2B σε κύτταρα DU-145, παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων αυτών, η οποία ανεστάλη όταν τα κύτταρα αυτά προ-επωάστηκαν με τον αναστολέα της φωσφοϊνοσιτίνης-3 κινάσης (PI3K) LY294002, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή του FAK/PI3K σηματοδοτικού μηχανισμού στη διαδικασία της μετανάστευσης. Σε συμφωνία με αυτό, τα πρωτεϊνικά επίπεδα της υπομονάδας p85-ΡΙ3Κ αυξήθηκαν έπειτα από την υπερέκφραση της KDM2B, ενώ το αντίθετο έγινε εμφανές στα κύτταρα με αποσιωποιημένο το εν λόγω γονίδιο. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση και η ενεργοποίηση των μορίων καθοδικά των FAK/PI3K, ΑΚΤ και SGK1 δεν παρουσίασαν κάποια μεταβολή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων DU-145 παρέμεινε ανεπηρέαστος από την υπερέκφραση ή την αποσιώπηση της KDM2B, μια παρατήρηση που συνάδει με τα παρατηρούμενα αμετάβλητα επίπεδα έκφρασης και ενεργοποίησης των κινασών ΑΚΤ και SGK1. Από τα αποτελέσματα αυτά, προκύπτουν νέοι μοριακοί στόχοι (FAK και ΡΙ3Κ) και αποκαλύπτεται ένας νέος λειτουργικός ρόλος της KDM2B στη ρύθμιση της ενεργοποίησης και της σηματοδότησης μέσω FAK/ΡΙ3Κ. Τέλος, εξετάσαμε και την επίδραση της KDM2B στην ομοιόσταση του Ca2+. Υπερέκφραση της KDM2B στα κύτταρα DU-145 οδήγησε σε αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων Orai1 και Stim1, ενώ αντίθετα μειώθηκαν έπειτα από την αποσιώπηση του γονιδίου. Επιπλέον σημαντική ήταν και η αλλαγή στην απελευθέρωση του ασβεστίου από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν το γονίδιο της KDM2B σε σύγκριση με τα κύτταρα αναφοράς. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης μας, καθιερώνουν για πρώτη φορά μια σαφή λειτουργική σχέση μεταξύ του επιγενετικού παράγοντα KDM2B και της ρύθμισης της διακυτταρικής προσκόλλησης των κυττάρων, της σηματοδότησης μέσω Rho-GTPασών, της σηματοδότησης μέσω των κινασών FAK/PI3K και της ομοιοστασίας του Ca2+, που με τη σειρά τους ελέγχουν την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και τη μετανάστευση των κυττάρων. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι στα καρκινικά κύτταρα, οι ρυθμιστές της χρωματίνης μπορούν να συμβάλλουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ογκογένεσης με τον έλεγχο της έκφρασης και της λειτουργίας γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταροσκελετό, τη διακυτταρική προσκόλληση και τη μετανάστευση των κυττάρων. Διασαφηνίζοντας έτσι τον ρόλο της KDM2B στην επιγενετική ρύθμιση του κυτταροσκελετού, καθιερώσαμε μία σαφή μηχανιστική σύνδεση του πώς η επιγενετική ρύθμιση ελέγχει την δομή και λειτουργία του κυτταροσκελετού και πώς οι μεταβολές στους επιγενετικούς παράγοντες μπορούν να οδηγήσουν σε απορυθμισμένες κυτταροσκελετικές λειτουργίες και να επηρεάσουν βασικές πτυχές της κυτταρικής φυσιολογίας. Από όλα τα παραπάνω καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η συγκεκριμένη μελέτη είναι ιδιαίτερα καινοτόμος, καθώς αποτελεί την πρώτη εστιασμένη προσπάθεια για την αποσαφήνιση της ρύθμισης μεταξύ χρωματίνης και κυτταροσκελετού. Χρησιμοποιώντας ως παράδειγμα το μηχανισμό ρύθμισης του κυτταροσκελετού από την KDM2B, η μελέτη αυτή απαντά σε θεμελιώδη ερωτήματα και προσθέτει σημαντικά εργαλεία και τεχνογνωσία στον τομέα αυτό. Μελλοντικές μελέτες σχετικά με τη ρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών στη νόσο αυτή θα επαναπροσδιορίσουν την κατανόησή μας για το καρκινικό κύτταρο και θα αποκαλύψουν νέους πιθανούς φαρμακολογικούς στόχους.