Μελέτη της κυτταρικής σηματοδότησης του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR) στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2
Authors: Παναγιώτου Χριστίνα 
Published: September 2021

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 (ΣΔτ2) είναι μια χρόνια νόσος που χαρακτηρίζεται από διαταραχή του μεταβολισμού των υδατανθράκων (υπεργλυκαιμία), των λιπών και των πρωτεϊνών και οφείλεται σε μειωμένη έκκριση ή/και σε δράση της ινσουλίνης, με αποτέλεσμα την απόλυτη ή σχετική έλλειψη αυτής. Ένας σημαντικός παράγοντας στην πρόληψη και στην αντιμετώπιση του ΣΔτ2 είναι η σωστή και ελεγχόμενη διατροφή που συχνά περιλαμβάνει γλυκαντικές ουσίες (πχ γλυκοζίτες στεβιόλης). Ο ΣΔτ2 αποτελεί παγκοσμίως μια από τις κυριότερες αιτίες αυξημένης νοσηρότητας και πρόωρης θνητότητας και παρατηρείται θεαματική αύξηση του στους ενήλικες καθώς και στα παιδιά και στους εφήβους. Για όλους τους παραπάνω λόγους είναι επιτακτικό να διευρυνθεί η επιστημονική γνώση πάνω στους μηχανισμούς που είναι διαταραγμένοι στο ΣΔτ2, να ανοιχτούν νέοι ορίζοντες για τη εύρεση θεραπευτικών στρατηγικών σε νέα μοριακά μονοπάτια και να διερευνηθεί η πιθανή δράση των γλυκαντικών ουσιών στα μονοπάτια αυτά. Οι μέχρι τώρα μελέτες υποστηρίζουν τη σημαντική επίπτωση του στρες και την αυξημένη δραστηριότητα του άξονα υποθαλάμου–υπόφυσης-επινεφριδίων (ΗΡΑ) στο ΣΔτ2 με συνέπεια την υπερκορτιζολαιμία. Είναι γνωστό ότι οι δράσεις των γλυκοκορτικοειδών (GC) στη ρύθμιση του άξονα HPA διαμεσολαβούνται από τον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR). Ωστόσο το σηματοδοτικό μονοπάτι του υποδοχέα δεν έχει μελετηθεί σε ασθενείς με ΣΔτ2. Επιπλέον, είναι εντελώς άγνωστο αν οι πιθανές διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR σχετίζονται με τις διαταραχές του μεταβολισμού και τη φλεγμονή που χαρακτηρίζει το ΣΔτ2. Πρωταρχικός λοιπόν σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του πιθανού ρόλου του GR ως ο «βιολογικός σύνδεσμος» μεταξύ της υπερκορτιζολαιμίας και των μεταβολικών διαταραχών και της φλεγμονής που παρατηρούνται στο ΣΔτ2. Εξετάστηκε λοιπόν η υπόθεση που υποστηρίζει ότι «στους ασθενείς με ΣΔτ2 υπάρχει μειωμένη λειτουργία του GR στον άξονα ΗΡΑ η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υπερδραστηριότητά του καθώς και σε υπερκορτιζολαιμία». Οι διαταραχές αυτές του υποδοχέα GR πιθανά να ευθύνονται για την υπερκορτιζολαιμία και τις δυσμενείς συνέπειές της στους περιφερικούς μεταβολικούς ιστούς (υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία) και την αυξημένη φλεγμονή στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που παρατηρούνται στο ΣΔτ2. Λόγω της δυσκολίας που υπάρχει στο να απομονωθούν και να μελετηθούν τα κύτταρα του εγκεφάλου σε άτομα εν ζωή, διεξήγαμε την έρευνά μας σε περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) δεδομένου ότι οι υποδοχείς GR ρυθμίζονται κατά παρόμοιο τρόπο με αυτόν των κυττάρων του εγκεφάλου. Επιπλέον, τα κύτταρα PBMC θεωρούνται ένα πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας του ΣΔτ2 και των επιπλοκών του. Σε κύτταρα PBMC από 31 ασθενείς με ΣΔτ2 και από 24 υγιή άτομα αξιολογήσαμε α) διάφορες σημαντικές παραμέτρους του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR, β) παραμέτρους της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου (ως μέτρο αξιολόγησης της δραστηριότητας του άξονα ΗΡΑ) καθώς και γ) τις πιθανές συσχέτισες των παραπάνω παραμέτρων με δείκτες γλυκαιμίας, λιπιδαιμίας, φλεγμονής και ενεργειακού μεταβολισμού. Αναλυτικότερα, όσον αφορά τις παραμέτρους του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR προσδιορίσαμε: τα ολικά επίπεδα της πρωτεΐνης του υποδοχέα GR, τα πρωτεϊνικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του υποδοχέα (pGR-S211), το λόγο έκφρασης των γονιδίων GRα/GRβ και την ευαισθησία στα γλυκοκορτικοειδή. Η ευαισθησία στα γλυκοκορτικοειδή αξιολογήθηκε μέσω της βασικής και της επαγόμενης από τη δεξαμεθαζόνη (DEX) έκφρασης των γονιδίων GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) και FKBP5 (FK506 binding-protein) καθώς και από τα βασικά επίπεδα της πρωτεΐνης της ιντερλευκίνης 1β (IL-1β). Όσον αφορά τη καμπύλη ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου, κατασκευάστηκε μετά από λήψη τεσσάρων δειγμάτων σιέλου και υπολογίστηκαν παράμετροι όπως η απόκριση της κορτιζόλης στην αφύπνιση (cortisol awaking response (CAR), η κλίση αφύπνισης (reactivity slope, slopeT0-T30), η ολική κλίση της καμπύλης (slopeT0-T23), η ημερήσια έκκριση κορτιζόλης (ως η συνολική περιοχή κάτω από την καμπύλη) (total area under the curve, AUCtotal) και η μεταβολή στην έκκριση της κορτιζόλης κατά την αφύπνιση (area under the curve with respect to increase, AUCi). Επιπλέον, προσδιορίστηκαν βιοχημικοί δείκτες [γλυκόζη νηστείας, ινσουλίνη, τριγλυκεριδία, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA1), HDL- και LDL- χοληστερόλη], δείκτες φλεγμονής (επίπεδα ενδοκυττάριας IL-1β), δείκτες ενεργειακού μεταβολισμού [επίπεδα φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης ΑΜΡΚ (pAMPKα-Thr172), αντιπονεκτίνης πλάσματος και mRNA του γονιδίου της κινάσης της αφυδρογονάσης του πυροσταφυλικού οξέος (PDK4)] καθώς και η απόπτωση. Τέλος, τόσο οι παράμετροι του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR όσο και οι παράμετροι της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου συσχετίστηκαν με δείκτες γλυκαιμίας, λιπιδαιμίας, φλεγμονής και ενεργειακού μεταβολισμού. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι στον πληθυσμό των διαβητικών παρατηρούνται αυξημένες τιμές δείκτη μάζας σώματος (BMI), κοιλιακού λίπους, γλυκόζης νηστείας, ινσουλίνης, τριγλυκεριδίων και επίπεδων γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1) ενώ μειωμένα είναι τα επίπεδα αντιπονεκτίνης, HDL- και LDL- χοληστερόλης καθώς και της έκφρασης του γονιδίου PDK4 σε σύγκριση με τον υγιή πληθυσμό. Τα δεδομένα αυτά συνάδουν με την παρουσία μεταβολικών διαταραχών στο ΣΔτ2. Επιπλέον, οι ασθενείς με ΣΔτ2 έχουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης του υποδοχέα GR και του γονιδίου GRβ, ενώ εμφανίζουν μειωμένα πρωτεϊνικά επίπεδα του βιοδραστικού pGR-S211 συγκριτικά με τους υγιείς. Η αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στους διαβητικούς ασθενείς επιβεβαιώθηκε μέσω της μειωμένης έκφρασης των γονιδίων GILZ και FKBP5 (GR-ελεγχόμενα γονίδια) καθώς και των αυξημένων πρωτεϊνικών επιπέδων IL-1β στα κύτταρα PBMC στη βασική κατάσταση. Επιπλέον, η πολυπαραγοντική ανάλυση στις καμπύλες δόσης-απόκρισης (gene-response curves) των γονιδίων GILZ και FKBP5 έδειξε ότι οι ασθενείς με ΣΔτ2 έχουν μειωμένη έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5 και ενισχύει τα αποτελέσματα που δείχνουν την ύπαρξη αντίστασης στα GC στους ασθενείς με ΣΔτ2. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν διαταραχή στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR στο ΣΔτ2. Οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν μειωμένο προφίλ έκκρισης κορτιζόλης σιέλου καθώς παρατηρούνται πεπλατυσμένες καμπύλες ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου, μειωμένες τιμές CAR, slopeT0-T30 και AUCi και αυξημένες AUCtotal συγκριτικά με τους υγιείς. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν τη διαταραχή στη λειτουργία του άξονα ΗΡΑ στους ασθενείς με ΣΔτ2. Τα αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα IL-1β και τα μειωμένα pAMPKα-Thr172 στους ασθενείς με ΣΔτ2 συνάδουν με τη παρουσία αυξημένης φλεγμονής και μειωμένου ενεργειακού μεταβολισμού. Τέλος, οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν χαμηλότερο ποσοστό απόπτωσης στα κύτταρα PBMC. Σημαντικό εύρημα της παρούσας μελέτης είναι οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των παραμέτρων του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR με τις παραμέτρους της φλεγμονής και του μεταβολισμού, οι οποίες υποστηρίζουν ότι η διαταραγμένη λειτουργία του GR όπως αυτή προσδιορίστηκε στα κύτταρα PBMC (και πιθανόν αντανακλά τις δράσεις του GR στον άξονα ΗΡΑ) πιθανά να είναι παθογενετικός μηχανισμός που οδηγεί σε υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία και σε αυξημένη φλεγμονή στο ΣΔτ2. Οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις που εντοπίστηκαν μεταξύ των παραμέτρων της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου και των παραμέτρων του μεταβολισμού και της φλεγμονής υποστηρίζουν ότι η υπερδραστηριότητα του άξονα ΗΡΑ μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχές του μεταβολισμού και σε αυξημένη φλεγμονή στο ΣΔτ2. Όλες οι παραπάνω συσχετίσεις φαίνεται να επιβεβαιώνουν την αρχική υπόθεση της μελέτης σύμφωνα με την οποία στο ΣΔτ2 η διαταραγμένη λειτουργία του GR οδηγεί σε αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στα κύτταρα PBMC η οποία πιθανόν αντανακλά τη μειωμένη λειτουργία του GR στον άξονα HPA και κατ’ επέκταση την υπερδραστηριότητά του και την υπερκορτιζολαιμία. Η υπερκορτιζολαιμία με τη σειρά της οδηγεί σε διαταραχές στους μεταβολικούς ιστούς (υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία). Από την άλλη πλευρά, η αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στα κύτταρα PBMC οδηγεί σε αυξημένη φλεγμονή. Συμπερασματικά, η μελέτη μας υποστηρίζει ότι οι διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR αποτελούν τον «βιολογικό σύνδεσμο» μεταξύ της υπερκορτιζολαιμίας και των μεταβολικών διαταραχών και της φλεγμονής που υπάρχει στον ΣΔτ2. Αναφορικά με τη σχέση της διατροφής και του ΣΔτ2 οι κατευθυντήριες οδηγίες άσκησης κλινικής πρακτικής τονίζουν τη σημασία της διατροφής στην πρόληψη και στην αντιμετώπιση του ΣΔτ2. Για το λόγο αυτό οι ασθενείς συχνά ενθαρρύνονται να χρησιμοποιούν εναλλακτικές γλυκαντικές ουσίες, όπως οι γλυκοζίτες στεβιόλης. Παρ’ όλο που η κατανάλωση γλυκοζιτών στεβιόλης θεωρείται ασφαλής, τελευταία δεδομένα υποστηρίζουν ότι η στεβιοσίδη (γλυκοζίτης στεβιόλης) εμφανίζει δράση διαμεσολαβούμενη μέσω αλληλουχιών απόκρισης στα GC (glucocorticoid response elements, GRE) όμοια με αυτή της δεξαμεθαζόνης σε μακροφάγα κύτταρα. Επειδή μία τέτοια δράση των γλυκοζιτών στεβιόλης θα είχε δυσμενείς επιδράσεις στο μεταβολισμό, ένας άλλος σημαντικός σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των γλυκοζιτών στεβιόλης στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR σε υγιή άτομα. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων GILZ και FKBP5, της ολικής πρωτεΐνης του GR καθώς και τη κυτταρική διαμερισματοποίηση του GR σε κύτταρα PBMC από 4 υγιείς συμμετέχοντες μετά από έκθεση σε στεβιόλη, γλυκοζίτες στεβιόλης και Ελληνικής-προέλευσης εκχυλίσματος στέβιας. Επίσης εκτιμήθηκε η έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5 στο περιφερικό αίμα υγειών ατόμων μετά από κατανάλωση ενός μείγματος υψηλής περιεκτικότητας σε γλυκοζίτες στεβιόλης. Οι ενώσεις στεβιόλη, γλυκοζίτες στεβιόλης και Ελληνικής-προέλευσης εκχύλισμα στέβιας δεν επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5, τα ολικά επίπεδα της πρωτεΐνης του GR ή την υποκυτταρική του διαμερισματοποίηση. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ότι προαναφερθείσες υπο-εξέταση ενώσεις δεν εμφανίζουν GR-διαμεσολαβόυμενη δράση στα κύτταρα PBMC υγιών ατόμων και επομένως οι γλυκοζίτες στεβιόλης δεν αναμένεται να επηρεάζουν δυσμενώς τον μεταβολισμό.