Ανίχνευση, κλωνοποίηση, μελέτη του προτύπου έκφρασης και λειτουργικός ρόλος του γονιδίου chick Nscl1
Authors: Θεοδωράκης Κωνσταντίνος 
Published: January 2014

Oι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας bHLH κατέχουν κεντρικό ρόλο στις διαδικασίες του κυτταρικού καθορισμού και διαφοροποίησης. Οι bHLH πρωτεΐνες έχουν κατηγοριοποιηθεί σε επτά τάξεις. Η πρώτη τάξη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που εκφράζονται σε πολλούς ιστούς και σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή, όπως οι ME1a, E2 και daughterless. Η δεύτερη τάξη περιλαμβάνει μόρια που έχουν ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης όπως οι Mash1, Math1, NeuroD και NSCL1, και σχηματίζουν επί το πλείστον, ετεροδιμερή με μόρια της πρώτης τάξης. Kατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας έγινε δυνατή η απομόνωση του γονιδίου cNscl1 της όρνιθας. H πρωτεΐνη chick NSCL1, μεγέθους 130 αμινοξέων, παρουσιάζει πολύ υψηλό βαθμό συντήρησης με τις ομόλογες πρωτεΐνες NSCL1 του ανθρώπου και του ποντικού, οι οποίες αποτελούνται από 133 αμινοξέα. Στην περιοχή bHLH διαφέρουν μόνο κατά ένα αμινοξύ, έχοντας ποσοστό ομολογίας 98%. Kατά την εξέταση του προτύπου έκφρασης του γονιδίου cNscl1 διαπιστώσαμε ότι η έκφρασή του περιορίζεται αποκλειστικά σε νευρικές δομές τόσο του KNΣ όσο και του ΠNΣ, όπως συμβαίνει με τα ομόλογα γονίδια του ανθρώπου και του ποντικού. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε έκφρασή του σχεδόν σε όλες τις νευρικές δομές, όπως: το νευρικό σωλήνα, τα κρανιακά και τα αισθητικά γάγγλια, τον ιππόκαμπο, το διεγκέφαλο, το νωτιαίο μυελό, τον οπίσθιο εγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα. Με πειράματα in situ υβριδοποίησης παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του cNscl1 εντοπίζεται σε μεταμιτωτικούς νευρώνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού, που βρίσκονται στη φάση διαφοροποίησής τους, ενώ στην παρεγκεφαλίδα εντοπίζεται σε μιτωτικούς νευροβλάστες και μεταμιτωτικούς προμεταναστευτικούς νευρώνες της εξωτερικής κοκκώδους στοιβάδας. Σε στελέχη μυών με απώλεια δράσης του γονιδίου Hoxb1 διαπιστώσαμε ότι παύει η έκφρασή του mNscl1 στους προσωποκινητικούς νευρώνες, ενώ χρησιμοποιώντας μύες με απώλεια δράσης του γονιδίου mNscl1 διαπιστώσαμε υστέρηση στη φυσιολογική εξέλιξη της έκφρασης των γονιδίων Hoxb1, Hoxb2, Plzf και Engrailed-1 στον οπίσθιο εγκέφαλο, η οποία είναι πολύ πιθανόν να οφείλεται σε επιβράδυνση της διαδικασίας διαφοροποίησης των περιοχών αυτών του οπίσθιου εγκεφάλου. Η μελέτη μας αποκάλυψε νέες περιοχές έκφρασης του Nscl1. Διαπιστώσαμε ότι εκφράζεται στα ρομβομερή και στα όρια των ρομβομερών, καθώς και σε όρια τα οποία δημιουργούνται μετά από μικροχειρουργική επέμβαση η οποία επιφέρει γειτνίαση ενός περιττού και ενός άρτιου ρομβομερούς, ενώ δεν εκφράζεται στις περιπτώσεις γειτνίασης ρομβομερών με την ίδια αρτιότητα, οπότε δε δημιουργείται νέο όριο. Προκαλέσαμε υπερέκφραση και έκτοπη έκφραση του chick Nscl1 με τη χρήση του ρετροϊικού φορέα έκφρασης RCAS(BP)-cNSCL1, και παρατηρήσαμε ότι προκαλείται σμίκρυνση του ματιού και ανώμαλη ανάπτυξη του εγκεφάλου. Μελετήσαμε τη μεταγραφική ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα NSCL1 και βρήκαμε ότι ομοδιμερισμός του cNSCL1 που είναι σε σύντηξη με την περιοχή πρόσδεσης στο DNA του γονιδίου GAL4, επιφέρει καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου της λουσιφεράσης σε ένα πλασμίδιο αναφοράς. Απεναντίας, ετεροδιμερή του mNSCL1 με το ΜE1a προκαλούν ισχυρή μεταγραφική ενεργοποίηση προσδενόμενα σε Ε-boxes, τα οποία βρίσκονται ανοδικά του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. Η ενεργοποιητική ικανότητα του mNSCL1 πρέπει να εντοπίζεται σε μια πολύ βασική περιοχή (β’), η οποία βρίσκεται ανοδικά της bHLH περιοχής.