Μελέτη μηχανισμών κυτταρικού επαναπρογραμματισμού μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων διαφορετικής προέλευσης
Authors: Πλιάτσκα Μαρία 
Published: September 2021

Ο επαγώμενος από τους μεταγραφικούς παράγοντες κυτταρικός επαναπρογραμματισμός στην πολυδύναμη κατάσταση απαιτεί ριζικές αλλαγές στο επιγενετικό τοπίο των σωματικών κυττάρων καθιστώντας την όλη διαδικασία εξαιρετικά αναποτελεσματική. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι η macroH2A1.2 (mH2A1.2), μία ασυνήθιστη ιστονική ποικιλομορφή που απαντά μόνο στα σπονδυλωτά με υψηλό βαθμό συντήρησης, δρα ως εμπόδιο στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό των σωματικών κυττάρων τόσο του ποντικού όσο και του ανθρώπου. Μέχρι στιγμής, η mH2A1.2 ήταν συνδεδεμένη με την αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, σε πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας αποδείχθηκε ότι τα mH2A1.2-μονονουκλεοσώματα απαντούν στο σημείο έναρξης της μεταγραφής (TSS) σε υποσύνολο τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων με ειδικό για τον κάθε κυτταρικό τύπο τρόπο καθώς επίσης ότι η στρατηγική θέση και σταθεροποίηση αυτών σε συγκεκριμένους υποκινητές γονιδίων ανθρώπου ορίζουν εύρωστα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Επομένως, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού και ο προσδιορισμός του ρόλου της mH2A1.2 σε αυτή τη διαδικασία κατά τη μελέτη κυττάρων ανθρώπου. Για το σκοπό αυτό, πρώτο βήμα της μελέτης ήταν ο σχεδιασμός μεθοδολογίας γένεσης επαγώμενων πολυδύναμων κυττάρων (iPSCs) ανθρώπου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η στοιχειομετρία των παραγόντων επαναπρογραμματισμού, Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM), είναι σημαντική για τον επαναπρογραμματισμό, κατασκευάστηκε ένας επαγώμενος από δοξικυκλίνη λεντιϊκός φορέας που φέρει την κασέτα έκφρασης και των τεσσάρων παραγόντων. Ως εκ τούτου, η ισχυρή επίδραση του κάθε κυτταρικού τύπου στην ικανότητα να επαναπρογραμματίζονται, συμπεριλαμβάνοντας την αποτελεσματικότητα και την κινητική της διαδικασίας, προσδιορίστηκε κατά τη μελέτη τριών διακριτών κυτταρικών τύπων ανθρώπου μεσοδερμικής προέλευσης. Επιπλέον, κυτταρικές σειρές iPS ανθρώπου που επαληθεύτηκαν για την πολυδυναμία και την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς τύπους δημιουργήθηκαν από ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου καθότι απομονώνονται εύκολα με βιοψία από το δέρμα υγειών εθελοντών και ασθενών ενώ αποτελούν το πιο κοινό κυτταρικό τύπο για τη γένεση iPSCs και την εφαρμογή τους σε θεραπευτικές προσεγγίσεις. Δεύτερο βήμα της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των φαινοτυπικών και των μεταγραφικών αλλαγών κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό ινοβλαστών ανθρώπου και σύγκριση με τα αποτελέσματα που προέρχονται από την αντίστοιχη μελέτη στο ποντίκι. Οι ομοιότητες που τονίζονται από τα αποτελέσματα της παρούσας ανάλυσης επιβεβαιώνουν ότι η διαδικασία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού είναι συντηρημένη μεταξύ των δύο οργανισμών ακόμη κι αν εμφανίζουν διαφορετική κινητική και αποτελεσματικότητα. Τέλος, τρίτο βήμα της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλο της mH2A1.2 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού των ινοβλαστών ανθρώπου. Ακόμη κι αν ο κατασταλτικός της ρόλος έχει προσδιοριστεί στα κύτταρα του ποντικού και στα κερατινικά κύτταρα του ανθρώπου ο υποκείμενος μηχανισμός με τον οποίο η mH2A1.2 μπλοκάρει αυτή τη διαδικασία παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα εργασία επιβεβαιώθηκε ο κατασταλτικός της ρόλος και στους ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου. Αξιοσημείωτο είναι ότι το αρχικό επίμηκες σχήμα των κυττάρων διατηρείται κατά την υπερέκφραση της mH2A1.2 υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα παγιδεύονται στα πρώιμα στάδια της διαδικασίας όταν λαμβάνει χώρα η ΜΕΤ καθότι εμποδίζεται η ενεργοποίηση της έκφραση της E-CAD. Αντίθετα, η μεταγραφική εναλλαγή της N-CAD στην E-CAD διευκολύνεται κατά την αποσιώπηση αυτής. Από την αλληλούχιση των DNA θραυσμάτων της ανοσοκατακρημνισμένης χρωματίνης (ChIP-seq) σε συνδυασμό με το μεταγραφικό προφίλ που είχε προηγούμενα ταυτοποιηθεί (RNA-seq) στους ινοβλάστες ανθρώπου και στα ESCs ανθρώπου, νέα δεδομένα προκύπτουν για το μηχανισμό με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον επαναπρογραμματισμό. Καταρχήν, επιβεβαιώθηκε ότι ο μηχανισμός εναπόθεσης των mH2A1.2–νουκλεοσωμάτων είναι ειδικός για τον κάθε κυτταρικό τύπο του ίδιου οργανισμού αλλά εξελικτικά συντηρημένος για τον ίδιο κυτταρικό τύπο μεταξύ διαφορετικών ειδών όπως προέκυψε από τη σύγκριση με το ποντίκι. Επιπλέον, επαληθεύτηκε η ευρεία γενομική κατανομή των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στο TSSs υποσυνόλου τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων. Αξιοσημείωτη όμως είναι η παρουσία των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στα μη-εκφραζόμενα γονίδια στους ινοβλάστες ανθρώπου χωρίς να εμφανίζει ιδιαίτερη προτίμηση εντοπισμού σε συγκεκριμένες γονιδιακές θέσεις, ενώ στα ESCs ανθρώπου στα εκφραζόμενα γονίδια με μεγάλη συχνότητα εντοπισμού σε περιοχές που εκτείνονται γύρω από το TSS. Περαιτέρω εξέταση των DNA αλληλουχίων που υπόκεινται στις θέσεις εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων αποκάλυψε ότι στους ινοβλάστες ανθρώπου τα mH2A1.2-νουκλεοσώματα καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης ενεργοποιητών στα μη-εκφραζόμενα γονίδια, ενώ στα εκφραζόμενα γονίδια καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης καταστολέων. Αντίθετα, στα ESCs ανθρώπου, δεν παρατηρήθηκε κάποιος συγκεκριμένος DNA κώδικας στις αντίστοιχες θέσεις εντοπισμού. Ωστόσο, η παρουσία αυτών κυρίως γύρω από το TSS των ενεργών γονιδίων υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο τους στην άριστη ρύθμιση της μεταγραφής. Καθότι οι πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό λειτουργίας των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων δεν ερμηνεύουν επαρκώς τον τρόπο με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό, σχεδιάστηκαν γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα (GRNs) ειδικά για τον κάθε κυτταρικό τύπο που εστιάζουν στους στόχους της mH2A1.2 βασισμένα σε πειραματικά επαληθευμένες αλληλεπιδράσεις ενσωματώνοντας τα αποτελέσματα της RNA-seq ανάλυσης. Οι αναπαραστάσεις των GRNs υποστηρίζουν το κυτταρικό φαινότυπο των ινοβλαστών ανθρώπου και των ESCs ανθρώπου τα οποία καθιερώνονται και διατηρούνται από την παροδική ρύθμιση και δυναμική των δικτύων των συ-ρυθμιζόμενων γονιδίων ενώ αποδεικνύεται ότι η στρατηγική θέση εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων σε ρυθμιστικά γονίδια με ρόλο «κλειδί» μειώνει τη μεταβλητότητα στη γονιδιακή έκφραση παρά την εκτεταμένη διασταυρούμενη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφόρων παραγόντων που διαταράσσουν το φυσιολογικό σύστημα. Συνεπώς, η mH2A1.2 φαίνεται να προστατεύει την απόφαση του κυττάρου περιορίζοντας τη μετάβαση σε εναλλακτικές κυτταρικές μορφές.