Συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση θαλάσσιων βακτηριοφάγων
Authors: Σκληρός Δημήτριος 
Published: September 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και/ή πλήρης χαρακτηρισμός, συμπεριλαμβανομένου του γονιδιωμάτος και των γονιδίων τους, για πέντε λυτικούς βακτηριοφάγους των οικογενειών Myoviridae και Siphoviridae, όπου ονομάστηκαν φGrn1, φSt2, Aphrodite1, Athena1 and Ares1 και θεωρούνται καλοί υ-ποψήφιοι για εφαρμογή φαγοθεραπείας στις υδατοκαλλιέργειες απέναντι στα παθογό-να των ψαριών του γένους Vibrio. H φυλογενετική ανάλυση και η συγκριτική γονιδιωματική έδειξε ότι οι φGrn1 και φSt2 ανήκουν στον κλάδο “schizoT4like”, o Aphrodite1 στον κλάδο “phiKZlikevirus”, o Athena1 σε μη καταταγμένους σε κλά-δους φάγους της οικογένειας Myoviridae και ο Ares1 σε μη καταταγμένους σε κλά-δους φάγους της οικογένειας Siphoviridae. Μετά την αλληλούχιση των φGrn1 και φSt2, πραγματοποιήθηκε λειτουργική γονιδιωματική με ανάλυση των μεταγραφημά-των του ιού και του βακτηρίου, ώστε να μελετηθούν τα γονίδια που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση των δύο την ώρα της μόλυνσης. Αν και οι αναφορές με νεοαλληλου-χημένα γονιδιώματα έχουν προσφέρει μεγάλο και χρήσιμο όγκο πληροφορίας τα τε-λευταία χρόνια, η βασική έρευνα σχετιζόμενη με τον μεταβολικό χειρισμό που βιώνει ο ξενιστής από τον ιό την ώρα της μόλυνσης από τους “schizoT4like” φάγους απου-σιάζει. Η λειτουργία πολλών ανοιχτών αναγνωστικών πλαισίων των βακτηριοφαγικών γονιδιωμάτων παραμένει άγνωστη. Όμως, η in silico πρόβλεψη γονιδίων αποκάλυψε πολλά από αυτά που σχετίζονται με την βιοσύνθεση του NAD+, μία πρωτεΐνη με δρά-ση σιρτουίνης (Sir2/cobB πρωτεΐνη), αλλά και γονιδίων που συμμετέχουν στην βιο-σύνθεση νουκλεοτιδίων, απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό του φαγικού DNA. Αυτά τα γονίδια κλειδιά μελετήθηκαν περαιτέρω μέσω μεταγραφομικής ανάλυσης κα-τά τη διάρκεια της μόλυνσης. Ακόμα, η συγκριτική γονιδιωματική χρησιμοποιήθηκε για να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν μεταθετές ενδονουκλεάσες που φέρουν τα φαγικά γονιδιώματα, μαζί με τα tRNAs και τις φαγικές λυσοζύμες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνει μία πολύπλοκη μεταβολική αλληλεπίδραση του δυαδικού συστήματος Vibrio-λυτικός φάγος, αλλά και έναν μεταβολικό χειρισμό που υπόκειται ο ξενιστής από τον ιό συμπεριλαμβανομένης μίας μεταμεταφραστικής πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης με στόχο την ενεργοποίηση πολλών ενζύμων. Μοναδικά και ενδια-φέροντα στοιχεία των άλλων τριών βακτηριοφάγων επίσης αναλύονται και συζητιού-νται. Ο βιολογικός έλεγχος παθογόνων βακτηρίων με βακτηριοφάγους, ή αλλιώς φαγοθεραπεία, έχει επανέλθει στο προσκήνιο τα τελευταία χρόνια σε μια προσπάθεια να αντιμετωπιστούν τα βακτήρια που είναι ανθεκτικά στα αντιβιοτικά. Παρόλα αυτά όμως η εφαρμογή καθυστερεί, με έναν από τους λόγους να είναι η ανθεκτικότητα που εμφανίζουν τα βακτήρια στους ιούς. Αν και πολλοί μοριακοί ενδοκυτταρικοί μηχανι-σμοί έχουνε περιγραφεί και μελετηθεί τα τελευταία χρόνια και ευθύνονται για την αν-θεκτικότητα, η έρευνα γύρω από μηχανισμούς άμυνας που συμπεριλαμβάνουν την αναδιάταξη των πρωτεϊνών-καναλιών της κυτταρικής μεμβράνης των ανθεκτικών στελεχών παραμένει ανεπαρκής. Τα βακτήρια μπορούν να αναπτύξουν ανθεκτικότητα σε λυτικούς φάγους, όχι μόνο μέσα από ενεργειακά δαπανηρές μεταλλάξεις, αλλά και μέσα από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών που λειτουργούν ως υποδοχείς του ιού. Αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που παρατηρήθηκαν σε μεμ-βρανικές και διαμεμβρανικές πρωτεΐνες δείχνουν ότι μπορούν να προσφέρουν ανθε-κτικότητα έναντι λυτικών βακτηριοφάγων στο Vibrio alginolyticus. Τα ανθεκτικά στους ιούς στελέχη παρουσίασαν επίσης και φαινοτυπικές αλλαγές, όπως στο ρυθμό ανάπτυξης, αλλά και τους ενδοκυτταρικούς μεταβολίτες. Αυτές οι διαφορές συσχετί-στηκαν με αλλαγές στα σχετικά ποσοστά έκφρασης σακχάρων και αμινοξέων ABC, PTS και άλλων μεταφορέων. Ποιο συγκεκριμένα, οι μεταφορείς στόχοι έδειξαν πολύ μειωμένη έκφραση σε σχέση με τα μη ανθεκτικά στελέχη, ενώ κάποια επίπεδα έκφρα-σης ήταν κοντά στο μηδέν. Τέλος έγινε μελέτη στο μεταγραφικό πρότυπο βιοχημικών μονοπατιών που σχετίζονται με τον κύκλο του κιτρικού οξέος και τη βιοσύνθεση δια-φόρων απαραίτητων αμινοξέων. Πολλοί μηχανισμοί άμυνας των βακτηρίων έναντι των βακτηριοφάγων έχουν αναφερθεί ως τώρα, παρόλα αυτά οι μηχανισμοί που ενορ-χηστρώνουν τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό στα ανθεκτικά στελέχη παραμέ-νουν αρκετά ανεξερεύνητοι. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ανθεκτικά στελέχη μπορούν να μειώσουν την μεταγραφή μεμβρανικών πρωτεϊνών, όπως οι μεταφορείς θρεπτικών, και να επαναπρογραμματίσουν τον μεταβολισμό τους. Η παρούσα διδα-κτορική διατριβή προωθεί το γένος Vibrio για μελέτη των μηχανισμών άμυνας των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, απέναντι στους φυσικούς τους εχθρούς, εστιάζο-ντας στην ανθεκτικότητα που προκύπτει ως αποτέλεσμα μεταβολικής προσαρμογής και επαναπρογραμματισμού, ενώ ταυτόχρονα ενισχύει την πεποίθηση ότι για την α-ντιμετώπιση της ανάπτυξης ανθεκτικότητας των βακτηρίων κατά τη φαγοθεραπεία, απαιτείται η χρήση φαγικών κοκτέιλ.