Μελέτη διεργασιών σύνθεσης νανοσυστημάτων και φιλμ χιτοζάνης
Authors: Ποντίλλο Αντονέλλα-Ροζάρια-Νεφέλη 
Published: February 2022

Η χιτοζάνη αποτελεί ένα γραμμικό πολυκατιονικό πολυσακχαρίτη, που προέχεται από τη χιτίνη. Αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες D-γλυκοζαμίνης και N ακετυλο-γλυκοζαμίνης ενωμένες με (1,4)-β γλυκοζιτικό δεσμό. Αξιοποιείται σε πολλές εφαρμογές της καθημερινότητας, όπως στη βιοϊατρική και φαρμακευτική τεχνολογία, στην τεχνολογία τροφίμων και τις συσκευασίες, την κοσμετολογία, τη γεωργία κ.α. καθώς παρουσιάζει πολύ ενδιαφέρουσες ιδιότητες . Η χιτοζάνη διαθέτει αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση, αιμοστατική και βλεννοσυγκολλητική ικανότητα, ενώ είναι ένα φιλικό προς το περιβάλλον πολυμερές, βιοαποικοδομήσιμο και βιοσυμβατό. Είναι ένα σχετικά εύκολα διαχειρίσιμο υλικό: διαλύεται σε αραιά υδατικά διαλύματα οξέων και διαθέτει τρεις λειτουργικές ομάδες, μία αμινομάδα και δύο υδροξυλομάδες, γεγονός που την καθιστά εύκολα τροποποιήσιμη με στόχο την προσαρμογή των ιδιοτήτων της στις ανάγκες τις εκάστοτε εφαρμογής. Τέλος, ιδιαιτέρως σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί η δυνατότητά της να οργανώνεται σε διαφορετικές μορφές: σχηματίζοντας νανοσωματίδια και νανοκάψουλες, ίνες, φιλμ ή υδρογέλες.Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκαν τρεις διεργασίες που περιέχουν τη χιτοζάνη:(α) η σύνθεση νανοσωματιδίων με εγκλεισμό βιοδραστικών μορίων και συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης με εγκλεισμένα βιοδραστικά μόρια (β) ο σχηματισμός ελαστικών φιλμ με ενσωμάτωση πράσινων διαλυτών και εκχυλισμάτων(γ) η σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με χιτοζάνη ως σταθεροποιητικό και κατευθυντήριο της δομής παράγονταΤο Κεφάλαιο 1 αποτελεί το εισαγωγικό κεφάλαιο της διατριβής όπου παρουσιάζονται οι βασικότερες πληροφορίες για τη χιτοζάνη, την Πράσινη Χημεία, τους πράσινους διαλύτες και τον πειραματικό σχεδιασμό. Η Πράσινη Χημεία είναι η βάση της αειφόρου ανάπτυξης και η αντικατάσταση των κοινώς χρησιμοποιούμενων διαλυτών με πράσινες εναλλακτικές αποτελεί προτεραιότητα. Στην παρούσα διατριβή έχουν χρησιμοποιηθεί Ιοντικά Υγρά και Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (Deep Eutectic Solvents, DESs) στη σύνθεση των νανοσωματιδίων αργύρου και στη διεργασία σχηματισμού φιλμ χιτοζάνης, αντίστοιχα. Ο πειραματικός σχεδιασμός έχει εφαρμοστεί σε διαφορά στάδια τα μελέτης καθώς αποτελεί εργαλείο για την ελαχιστοποίηση των πειραμάτων που πρέπει να διεξαχθούν. Ακολουθεί η μελέτη της πρώτης διεργασίας που είναι ο σχηματισμός νανοσωματιδίων χιτοζάνης και ο εγκλεισμός βιοδραστικών ενώσεων και συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης με εγκλεισμένα βιοδραστικά μόρια,Στο Κεφάλαιο 2, παρουσιάζονται θεωρητικά δεδομένα για τη νανοτεχνολογία, τα νανοσυστήματα, τις μεθόδους χαρακτηρισμού των νανοσωματιδίων καθώς και εφαρμογές που βρίσκουν αυτά στην καθημερινότητά μας. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η μέθοδος σχηματισμού των νανοσωματιδίων χιτοζάνης , που είναι η ιονική πηκτωμάτωση (ionic gelation) με τριπολυφωσφορικό ανιόν (ΤΡΡ), κατά την οποία πραγματοποιείται διασύνδεση (cross-linking) των πρωτονιωμένων αμινομάδων του πολυμερούς με το ανόργανο πολυανιόν. Αρχικά, στο Κεφάλαιο 3, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικά πειράματα για την καλύτερη κατανόηση της διεργασίας του σχηματισμού νανοσωματιδίων και τη αρχική αξιολόγηση των παραμέτρων σύνθεσης. Ακολουθεί, ο εγκλεισμός της τυροσόλης σε νανοσωματίδια χιτοζάνης (TYR/CS), καθώς και της χαλκόνης [(Ε)-1-(2΄-υδροξυφαινυλο)-3-(2,4,5-τριμεθοξυφαινυλο)προπ-2-ενόνη] (TYR/CHALC), η σύνθεση της οποίας πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας και παρουσιάζει ενδιαφέρουσα βιολογική δράση. Για το εκάστοτε σύστημα, εφαρμόστηκε πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών σύνθεσης και την εξαγωγή μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν το προφίλ των επιλεγμένων αποκρίσεων του συστήματος. Και για τα δύο νανοσυστήματα, προέκυψαν σωματίδια από 115 nm και ισχυρά θετική επιφανειακή φόρτιση, μέχρι 56.4 mV, λόγω της παρουσίας του πολυμερούς. Η συγκέντρωση της χιτοζάνης βρέθηκε να είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας για όλες τις αποκρίσεις που μελετήθηκαν, όπως το μέγεθος και η ομοιομορφία των σωματιδίων. Η απόδοση εγκλεισμού και για τα δύο συστήματα κυμάνθηκε μεταξύ 18 και 62% ενώ η συνολική απόδοση της διεργασίας ήταν σχετικά χαμηλή και κυμάνθηκε από 10 έως 31.5%. Οι θερμικές ιδιότητες των νανοσυστημάτων αξιολογήθηκαν με TGA και DSC και επιβεβαιώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις ο επιτυχής εγκλεισμός των δύο ενώσεων. Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 4, μελετήθηκε ο εγκλεισμός ενός συμπλόκου σε νανοσωματίδια χιτοζάνης. Πιο συγκεκριμένα, σχηματίστηκε σύμπλοκο εγκλεισμού της τυροσόλης με β-κυκλοδεξτρίνη (TYR-βCD), το οποίο στη συνέχεια, επικαλύφθηκε από το πολυμερές (TYR-βCD/CS). Εφαρμόστηκε η μεθοδολογία σχηματισμού των νανοσωματιδίων που αναπτύχθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο. Από τη συγκριτική μελέτη των νανοσωματιδίων TYR/CS και TYR-βCD/CS, παρατηρούνται κάποιες σαφείς ομοιότητες. Και στα δύο συστήματα, παρατηρήθηκε ότι τα μικρότερου μεγέθους σωματίδια παρουσίασαν ένα ισχυρά θετικό ζ δυναμικό, ενδεικτικό μιας σταθερής σύνθεσης. Η κύρια διαφοροποίηση μεταξύ των δύο συστημάτων νανοσωματιδίων είναι η επίδραση της ποσότητας του συμπλόκου στην τιμή του ζ δυναμικού. Ο λόγος αυτής της διαφοράς αποδίδεται στο γεγονός ότι το σύμπλοκο εγκλεισμού είναι αρνητικά φορτισμένο οπότε υπάρχει ισχυρή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο φορέων.Επιπλέον, από τη θερμική ανάλυση των δύο νανοσυστημάτων και τη μελέτη του προφίλ απελευθέρωσης της τυροσόλης σε υδατικό διάλυμα, βρέθηκε ότι η επιπλέον επικάλυψη του συμπλόκου με το πολυμερές, προστατεύει την τυροσόλη κατά τη θερμική επεξεργασία των δειγμάτων και επιβραδύνει την απελευθέρωσή της στο διάλυμα. Τέλος, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της τυροσόλης και των νανοσωματιδίων που σχηματίστηκαν με το DNA θύμου αδένα μόσχου (Calf-thymus DNA, ctDNA). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τυροσόλη σταθεροποιείται στην κοιλότητα της μικρής αύλακας του ctDNA. Ο ίδιος τρόπος δέσμευσης βρέθηκε για τα νανοσυστήματα TYR-βCD, και TYR-βCD/CS, ενώ δεν εντοπίστηκε αλληλεπίδραση μεταξύ του ctDNΑ και της χιτοζάνης ή του TYR/CS.Ακολουθεί η παρουσίαση της διεργασίας σχηματισμού ελαστικών φιλμ χιτοζάνης με ενσωμάτωση πράσινων διαλυτών και εκχυλισμάτων. Καινοτομία αυτής της μελέτης αποτελεί η απευθείας διάλυση της χιτοζάνης σε αραιά υδατικά διαλύματα φυσικών βαθέως ευτηκτικών διαλυτών. Το Κεφάλαιο 5 αποτελεί το εισαγωγικό κεφάλαιο του δεύτερου μέρους της διατριβής και συνοψίζονται τα ευρήματα της βιβλιογραφικής ανασκόπησης που αφορούν στο σχηματισμό φιλμ χιτοζάνης και την ενσωμάτωσή των βαθέως ευτηκτικών διαλυτών. Περιγράφονται οι πράσινες διεργασίες εκχύλισης βιοδραστικών ενώσεων από φυτά. Στο Κεφάλαιο 6, χρησιμοποιήθηκαν τα NaDES βεταΐνης:γαλακτικού οξέος (bet:LA NaDES) και χλωριούχου χολίνης:γαλακτικού οξέος (ChCl:LA NaDES). Σε συγκέντρωση 1%, τα υδατικά διαλύματα των δύο NaDESs ήταν αρκετά όξινα για τη διάλυση χιτοζάνης σε περιεκτικότητα 0.2%. Στη συνέχεια, μέσω της διαδικασίας χύτευσης (casting), δηλαδή την απομάκρυνση του νερού από το διάλυμα, σχηματίστηκαν φιλμ τα οποία ήταν ελαστικά, σε αντίθεση με τα φιλμ που προέκυψαν από τη διάλυση του πολυμερούς σε διαλύματα οξικού οξέος και γαλακτικού οξέος. Η προσθήκη των NaDESs προσέδωσε ελαστικότητα στα φιλμ και αύξησε την διαπερατότητα των υδρατμών (WVP) κατά 2.6 - 4.5 φορές, σε σύγκριση με τα φιλμ που περιέχουν οξικό οξύ. Επιπλέον τα φιλμ που περιέχουν NaDES παρουσίασαν 86 - 95% χαμηλότερη αντίσταση στη θραύση και 13 - 78% υψηλότερη ικανότητα επιμήκυνσης. Τα φιλμ που περιείχαν βεταΐνη ήταν δύο φορές πιο ελαστικά από εκείνα περιείχαν χλωριούχο χολίνη, ενώ η διαπερατότητα υδρατμών ήταν μειωμένη κατά 50%. Στα πλαίσια διερεύνησης των παραγόντων που επηρεάζουν τις ιδιότητες των συγκεκριμένων φιλμ βρέθηκε ότι η ενσωμάτωση των συστατικών των NaDESs ως ένα ήδη σχηματισμένο NaDES ή ως φυσικό μίγμα, οδηγούν στην παρατήρηση διαφοροποιήσεων στις τελικές ιδιότητες. Οι διαφοροποιήσεις αυτές δεν καθιστούν εφικτή την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων, αποτελούν όμως ένδειξη ότι στις τελικές ιδιότητες επιδρούν παράγοντες όπως ο διαλύτης που θα χρησιμοποιηθεί, αλλά και η ποσότητα και ο τρόπος με τον οποίο θα προστεθεί στο αρχικό διάλυμα. Στο Κεφάλαιο 7, αρχικά μελετάται διεξοδικά η εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από φυτά μέσω διαφορετικών μεθοδολογιών. Αρχικά, χρησιμοποιούνται συμβατικοί, υδροαιθανολικοί διαλύτες για την εκχύλιση των φύλλων δεντρολίβανου και πραγματοποιείται ενζυμική προκατεργασία του υλικού με στόχο να μελετηθεί η επίδραση αυτής της προκατεργασίας στο τελικό εκχύλισμα. Πραγματοποιήθηκε επίσης εκχύλιση του αποξηραμένου καρπού του άγριου τριαντάφυλλου με βαθέως ευτηκτικούς διαλύτες, και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης για τη μεγιστοποίηση του ολικού περιεχόμενου φλαβονοειδών στο εκχύλισμα. Από τα εκχυλίσματα που προέκυψαν, σχηματίστηκαν οχτώ φιλμ χιτοζάνης. Τα φιλμ που σχηματίστηκαν ήταν τα F/ChCl:LA από το NaDES χλωριούχου χολίνης:γαλακτικού οξέος, F/bet:LA από το NaDES βεταΐνης:γαλακτικού οξέος, F/L-Prο:LA από το NaDES L-προλίνης:γαλακτικού οξέος, F/β-Ala:LA από το NaDES β-αλανίνης:γαλακτικού οξέoς, F/bet:CA:W από το NaDES βεταΐνης:κιτρικού οξέος:νερού, F/L Prο:CA:W από το NaDES L προλίνης:κιτρικού οξέος:νερού, F/ChCl:CA από το NaDES χλωριούχος χολίνη:κιτρικό οξύ και F/bet:LevA από το NaDES βεταΐνη:λεβουλινικό οξύ. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι, η διαλυτότητα της χιτοζάνης είναι υψηλότερη παρουσία γαλακτικού οξέος σε σύγκριση με το κιτρικό οξύ, παρόλο που η τιμή του pH είναι παρεμφερής για τα υδατικά διαλύματα και των αντίστοιχων εκχυλισμάτων σε περιεκτικότητα 1%. Φαίνεται, δηλαδή, ότι η διαλυτότητα της χιτοζάνης δεν εξαρτάται αποκλειστικά από το pH του διαλύματος αλλά και από τα δομικά χαρακτηριστικά των συστατικών του και τις διαφορετικές αλληλεπιδράσεις με την πολυμερική αλυσίδα της χιτοζάνης.Στο τελευταίο μέρος, αποτελούμενο από το Κεφάλαιο 8, αναπτύχθηκε πράσινη μεθοδολογία σχηματισμού νανοσωματιδίων αργύρου ακανόνιστου σχήματος, χρησιμοποιώντας ένα νέο ιοντικό υγρό ως τον αναγωγικό παράγοντα και τη χιτοζάνη ως παράγοντα σταθεροποίησης των σωματιδίων και του σχήματός τους. Αρχικά σχηματίστηκε το ιοντικό υγρό αποτελούμενο από ασκορβικό οξύ και αιθανολαμίνη και μέσω φασματοσκοπίας FT-IR και NMR μίας και δύο διαστάσεων, προσδιορίστηκε η στερεοχημική αλληλεπίδραση των δύο συστατικών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε παρασκευή νανοσωματιδίων/μικροσωματιδίων αργύρου σε διάλυμα χιτοζάνης. Τα σωματίδια που σχηματίστηκαν παρουσίασαν μέγεθος από 268.4 nm μέχρι 1488.0 nm. Η απεικόνιση της μορφολογίας των σωματιδίων μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) έδειξε ότι το ακανόνιστο σχήμα τους με τις πολλές ακμές μοιάζει με εκείνη ενός λουλουδιού. Τέλος, οι ιδιότητες των νανοσωματιδίων, παρουσίασαν αξιοσημείωτη σταθερότητα στο χρόνο και αναπαραγωγισιμότητα.Τέλος, στο Κεφάλαιο 9 συνοψίζονται τα σημαντικότερα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις τρεις διεργασίες της χιτοζάνης, οι δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά και οι αναρτήσεις σε διεθνή και ελληνικά συνέδρια. Τέλος, αναφέρονται προτάσεις για μελλοντική έρευνα.