Ο ρόλος των αγγειογενών και αγγειοστατικών C-X-C χημειοκινών στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου
Authors: Εμμανουήλ Γεώργιος 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτου, μεταξύ των προκαλούμενων καρκινικών θανάτων στις Δυτικές χώρες. Περισσότεροι από τους μισούς θανάτους προκαλούνται από μεταστάσεις του που έχουν αναπτυχθεί μετά την χειρουργική αφαίρεση του όγκου παρά την εφαρμογή επιπλέον χημειοθεραπείας. Στην ανάπτυξη, και την μετάσταση του αρχικού όγκου οι CXC χημειοκίνες είναι ίσως τα μόρια με την μεγαλύτερη σημασία στην εξέλιξη καθώς συμμετέχουν σ όλα τα στάδια του όγκου, από την ανοσοκαταστολή και την αγγειογένεση έως τον πολλαπλασιασμό και την μετάστασή τους. Στο πλαίσιο αυτή της γνώσης σκοπός της μελέτης μας ήταν η ποσοτικοποίηση της έκφρασης 3 αγγειοδραστικών χημειοκινών και μίας αγγειογενούς κυτταροκίνης σε καρκινικά και υγιή κύτταρα καθώς και σε 2 καρκινικές εντερικές κυτταρικές σειρές.Οι 3 χημειοκίνες που επιλέξαμε να μελετήσουμε ανήκουν όλες στην ομάδα των CXC χημειοκινών και μάλιστα 2 εξ αυτών, οι CXCL8 και CXCL6 φέρουν το ELR αμινοξικό μοτίβο στην αλληλουχία τους και χαρακτηρίζονται από προ-καρκινικές και αγγειογενετικές ιδιότητες. Η τρίτη, η CXCL4, δεν φέρει το εν λόγω μοτίβο και χαρακτηρίζεται ως αγγειοστατική, αν και ο ρόλος της στην συνολική εξέλιξη του όγκου παραμένει σύμφωνα με διάφορες μελέτες αντιφατικός. Εκτός των τριών αυτών χημειοκινών μελετήσαμε και μία κυτταροκίνη, τον αγγειακό ενδοθηλιακό παράγοντα (VEGF) ο οποίος είναι το μόριο με την μεγαλύτερη επίδραση στην αγγειογένεση και χαρακτηρίζεται από ξεκάθαρες προ-καρκινικές ιδιότητες. Η ποσοτικοποίηση των 4 αυτών αγγειοδραστικών χημειοκινών έγινε αρχικά σε ομογενοποιήματα ιστών (καρκινικών και υγιών) προερχομένων εκ του ίδιου ασθενούς και ακολούθησε σύγκριση μεταξύ των τιμών των δυο αυτών ιστών. Επιπλέον των χημειοκινών στους ασθενείς αυτούς μετρήθηκαν και οι γνωστότεροι κλινικοπαθολογοανατομικοί δείκτες (Ki67, p53, p21, bcl2, EGFR και MLH1) και μελετήθηκε πιθανή σύνδεση μεταξύ της έκφρασης των χημειοκινών, της επιβίωσης και των τιμών τους. Επιπλέον σε καλλιέργειες καρκινικών ενδοθηλιακών κυττάρων του έντερου (οι κυτταρικές σειρές HT-29 και Caco2) πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις με ορό ασθενών, υγιών και FBS ώστε να μελετηθεί η απόκριση τους αλλά και η βασική τους λειτουργία στα αδιέγερτα controls.Αρχικά στα ιστοτεμάχια με την ανάλυση Western Blot επιβεβαιώσαμε την παρουσία των τεσσάρων αυτών χημειοκινών. Καθώς όμως η ποσοτικοιποίηση είναι εκτός των ορίων της μεθόδου για την επίτευξη της τελευταίας προχωρήσαμε στο επόμενο στάδιο των μετρήσεων.Οι μετρήσεις των χημειοκινών στα ιστοτεμάχια έγιναν με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) ενώ οι κλινικοπαθολογοανατομικοί δείκτες ημιποσοτικοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικά. Για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων στις μετρήσεις αυτές χρησιμοποιήσαμε τα test Wilcoxon και Χ τετράγωνο.Όσον αφορά τις κυτταρικές σειρές σ αυτές πραγματοποιήθηκαν 4 διαφορετικές επιδράσεις, μία με ορό καρκινοπαθών, μία με ορό υγιών, μία με FBS και τέλος μία με μόνο θρεπτικό υλικό ώστε να δούμε και την βασική τους έκφραση. Οι επιδράσεις σ όλες τις περιπτώσεις έγιναν σε πλάκες καλλιέργειας και σε χρονικό διάστημα 24 hr με ενδιάμεσα χρονικά σημεία μέτρησης στις 2, 4, 6, 12 και 24 ώρες. Όπως και στα ιστοτεμάχια οι μετρήσεις των χημειοκινών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών έγιναν με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων με την δοκιμασία one-way ANOVA και με Γενικό Γραμμικό μοντέλο για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις.Στα ιστοτεμάχια τα αποτελέσματα μας έδειξαν σημαντική αύξηση των CXCL6 (p=0.005) και VEGF (p-0.003) στα καρκινικά ιστοτεμάχια σε σχέση με τον φυσιολογικό εντερικό βλεννογόνο. Επιπλέον ασθενείς με χαμηλότερες τιμές των CXCL4 και CXCL8 είχαν μεγαλύτερη επιβίωση. Οι ασθενείς με απώλεια της έκφρασης του EGFR βρέθηκαν να παράγουν μεγαλύτερη ποσότητα CXCL8 ενώ η απώλεια της έκφρασης της p21 βρέθηκε να συνδέεται με υψηλότερη ποσότητα CXCL6. Όσον αφορά την κατηγοριοποίηση των καρκίνων κατά Duke’s και TNM δεν προέκυψε κάποια σύνδεσή τους με την παραγωγή των χημειοκινών. Για την p53 ακόμα προέκυψε μειωμένη επιβίωση για τους ασθενής με υψηλή έκφρασή της.Στις μελέτες των καλλιεργειών στις καρκινικές σειρές HT-29 και Caco2 βρέθηκε και για τις δύο έκφραση των αγγειοδραστικών αυτών χημειοκινών ακόμα και στην αδιέγερτη τους κατάσταση. Επιπλέον έκκριση των χημειοκινών αυτών μετρήθηκε και στις διεγερμένες καλλιέργειες τόσο με ανθρώπινο ορό όσο και με FBS. Παρ όλα αυτά η έκφραση των χημειοκινών όχι μόνο δεν ήταν ομοιόμορφη αλλά προέκυψε και ολότελα διαφορετική. Τα HT-29 παράγουν μεγαλύτερη ποσότητα CXCL8 και VEGF ανεξάρτητα της επίδρασης με ορό που εφαρμόσαμε ενώ αντίθετα τα Caco2 φαίνονται να μην αποκρίνονται καθόλου στις επιδράσεις αυτές. Το αντίθετο αποτέλεσμα προέκυψε για τις CXCL6 και CXCL4. Επιπλέον τα HT-29 φαίνονται να παράγουν την μέγιστη ποσότητα CXCL8 στο 24ωρο κατά την επίδραση με ορό ασθενών, επίδραση που έχει το ίδιο αποτέλεσμα στα Caco2 για την CXCL4.