Εθνοφαρμακολογική μελέτη φυτών της ελληνικής χλωρίδας για τον εντοπισμό κυτταροτοξικών φυσικών προϊόντων και αναστολέων των ενζύμων ακετυλοχολινεστεράση, υαλουρονιδάση και φωσφολιπάση
Authors: Μιχαλέα Ροζαλία 
Published: September 2021

Η προσφορά των εθνοφαρμακολογικών μελετών στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων είναι σημαντική, αδιαμφισβήτητη και πολυετής. Τα τελευταία χρόνια ολοένα και περισσότεροι είναι οι επιστήμονες που στρέφονται προς αυτό το διεπιστημονικό πεδίο έρευνας το οποίο παρότι είναι χρονοβόρο και παρουσιάζει ποικίλες δυσκολίες μπορεί να οδηγήσει σε σπουδαία ευρήματα όπως συναίβει στις περιπτώσεις του κουραρίου, της γαλανθαμίνης και της αρτεμισινίνης.Αφετηρία της παρούσας εργασίας αποτέλεσαν δύο κείμενα Ελλήνων θεραπευτών - λόγιων οι οποίοι έζησαν σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, Νίκανδρος ο Κολοφώνιος (2ος αιώνας π.Χ.) και Νικόλαος Ιερόπαις (17ος αιώνας μ.Χ.), και συνέταξαν δύο διαφορετικού τύπου και περιεχομένου έργα με κοινό όμως χαρακτηριστικό τη χρήση των βοτάνων για τη θεραπεία των ασθενειών που πραγματεύονται. Το έργο του πρώτου συγγραφέα, Θηριακά, είναι ένα ποίημα αποτελούμενο από 958 στίχους, γραμμένο σε ομηρίζουσα διάλεκτο και με αρκετά δυσνόητο περιεχόμενο, το οποίο μεταφράστηκε στη νέα ελληνική γλώσσα το 2014 οπότε και έγινε δυνατή η χρησιμοποίησή του ως εθνοφαρμακολογική πηγή. Αποτελεί ένα κείμενο όπου περιγράφονται διάφορα είδη ιοβόλων ερπετών και εντόμων, οι επιπτώσεις που προκαλούνται στον άνθρωπο όταν προσβληθεί από αυτά καθώς και μια πληθώρα βοτάνων, υπό τη μορφή συνταγών, που χορηγούνται είτε per os είτε τοπικά, ικανών να λειτουργήσουν ως αντίδοτα και θεραπείες αυτών των καταστάσεων. Το έργο του Ιερόπαιδα είναι ένα χειρόγραφο μεταβυζαντινής περιόδου στο οποίο περιγράφονται οι ασθένειες και οι αντίστοιχες συνταγές φυτοθεραπευτικής. Από αυτό καταγράφηκαν και αξιοποιήθηκαν μόνο οι πληροφορίες που αφορούσαν φυτικές δρόγες ενάντια υπερπλασιών. Και στις δύο περιπτώσεις, η εξαντλητική μελέτη των κειμένων οδήγησε στην καταγραφή 217 φυτικών ειδών, κάποια από τα οποία είναι κοινά, ενώ καταρτίστηκαν δύο λίστες με τα φυτικά είδη που περιγράφονται στα έργα αυτά με αντιοφικές και αντικαρκινικές ιδιότητες, αντίστοιχα. Για κάθε φυτικό είδος έγινε χρήση κατάλληλων εγχειριδίων, βιβλιογραφίας και λεξικών, προκειμένου να επιτευχθεί μια εύστοχη αντιστοίχιση του αναφερόμενου βοτάνου με τη σύγχρονη λατινική του ονομασία. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε επιλογή 31 φυτικών ειδών τα οποία συλλέχθηκαν κατά τα έτη 2015-2016. Εν συνεχεία ορίστηκε η καταλληλότερη πειραματική πορεία η οποία θα μπορούσε να αποδείξει την αιτιολογική βάση των υπό μελέτη κειμένων και να οδηγήσει σε βιοδραστικά φυσικά προϊόντα. Οι φαρμακολογικοί στόχοι που πλαισίωσαν την συγκεκριμένη εθνοφαρμακολογική μελέτη είναι τρία διαφορετικά υδρολυτικά ένζυμα, η ακετυλοχολινεστεράση, η υαλουρονιδάση, η φωσφολιπάση τα οποία απαντώνται στο δηλητήριο των οφιοειδών και σχετίζονται με τα Θηριακά και τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές, στήθους (MCF-7), μελανώματος (A2058) και ηπατοκαρκινώματος (HepG2) και μια φυσιολογική σειρά ινοβλαστών CCD-25Sk, οι οποίες σχετίζονται με το κείμενο του Ιερόπαιδα. Τα συλλεχθέντα φυτικά είδη εκχυλίστηκαν με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας, διχλωρομεθάνιο, αλκοόλη, αλκοόλη/νερό 50/50. Τα παραληφθέντα εκχυλίσματα μαζί με κάποια ακόμη που προϋπήρχαν στο εργαστήριο αποτέλεσαν μια ‘εθνοφαρμακολογική’ βιβλιοθήκη εκχυλισμάτων. Ο έλεγχος του χημικού φορτίου αυτών έγινε με Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC) και με Υγρή Χρωματογραφία – Φασματομετρία Μάζας (LC - MS). Ακολούθησε ο in vitro βιολογικός έλεγχος των ολικών εκχυλισμάτων στους στόχους που αναφέρθηκαν παραπάνω. Επτά εκχυλίσματα επελέγησαν να αναλυθούν φυτοχημικά καθώς παρουσίασαν ενδιαφέρον τόσο ως προς το χημικό τους φορτίο όσο και ως προς τη δράση του επέδειξαν. Το είδος Aristolochia hirta παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς αποτελεί ενδημικό είδος των νήσων Ανατολικού Αιγαίου και Μικράς Ασίας, δεν υπάρχει προηγούμενη μελέτη που να αφορά τη φυτοχημεία των ριζών και των υπέργειων τμημάτων και περιέχει δευτερογείς μεταβολίτες που ανήκουν στην κατηγορία των αριστολοχικών οξέων. Επίσης το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους εμφάνισε ισχυρή ανασταλτική δράση ενάντια της AChE. Τα δύο υδατομεθανολικά εκχυλίσματα των ριζών (AHRC) και των υπέργειων τμημάτων (AHYC) του είδους Aristolochia hirta (Aristolochiaceae) κλασματώθηκαν με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Η επεξεργασία ορισμένων κλασμάτων του εκχυλίσματος των ριζών οδήγησε στο χρωματογραφικό διαχωρισμό και την απομόνωση των 7 κυριότερων δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των αριστολοχικών όπως τα αριστολοχικό οξύ I, II και IV και των κουμαρικών οξέων όπως, 6-O-π-κουμαροϋλο-α-D-γλυκοπυρανόση και 6-O-π-κουμαροϋλο-β-D-γλυκοπυρανόση. Το εκχύλισμα AHRC και τα CPC κλάσματά του δεν εμφάνισαν αξιοσημείωτη βιολογική δράση στη δοκιμασία αναστολής της φωσφολιπάσης. Στην περίπτωση των κλασμάτων που προήλθαν από το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους έγινε αξιολόγηση της ικανότητας αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης ενώ πραγματοποιήθηκε η λήψη των φασμάτων 1H – NMR. Ο υπεύθυνος για τη δράση μεταβολίτης απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ως το καφεοϋλομαλικό οξύ ενώ υπολογίστηκε η μέση ανασταλτική συγκέντρωση του στη δοκιμασία ανστολής της AChE με τη μέθοδο NA-FBB. Μέσω της μεθόδου ετεροσυνδιακύμανσης (HetCA) ήταν δυνατή η επαλήθευση της υπεύθυνης, για την παρατηρούμενη ισχυρή δράση, ουσίας. Επίσης αναδείχθηκε η συμβολή στη δράση και των μεθυλεστέρων του trans-καφεοϋλομαλικού οξέος και του trans-κουμαροϋλομαλικού οξέος. Το μεθανολικό εκχύλισμα των ριζών του είδους Anchusa undulata ssp. hybrida παρουσίασε ισχυρή αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης και ενδιαφέρον χημικό προφίλ. Κλασματώθηκε με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC) και τα παραληφθέντα κλάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης. H ισχυρότερη δράση εντοπίστηκε σε συγκεκριμένα κλάσματα. Ακολούθησε η απομόνωση του υπεύθυνου βιοδραστικού προϊόντος το οποίο ταυτοποιήθηκε ως η πρενυλοϋδροκινόνη, η οποία απομονώθηκε πρώτη φορά από το γένος Anchusa. Η ουσία παρουσίασε ισχυρή δράση ενάντι της AChE και με τις δύο μεθόδους αξιολόγησης. Επίσης απομονώθηκαν άλλες πέντε ουσίες όπως το ροσμαρινικό οξύ και αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της υαλουρονιδάσης και ακετυλοχολινεστεράσης. Το ροσμαρινικό οξύ εμφάνισε σημαντική δράση στη δοκιμασία αναστολής της AChE με τη μέθοδο NA-FBB και στη δοκιμασία αναστολής της υαλουρονιδάσης. Το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους Teucrium divaricatum ssp. divaricatum παρουσίασε αξιοσημείωτη κυττατοτοξική δράση έναντι των MCF-7 κυττάρων και ανασταλτική της ακετυλοχολινεστεράσης δράση με τη μέθοδο NA-FBB. Επίσης εμφάνισε ενδιαφέρον χημικό φορτίο. Για τους λόγους αυτούς πραγματοποιήθηκε η κλασμάτωση του με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Τα κλάσματα αυτού αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Μέσω χρωματογραφικών τεχνικών έγινε δυνατή η απομόνωση δέκα δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των φαινολικών όπως το χλωρογενικό οξύ, των φαινυλοπροπανοειδών όπως ο τεουκριοσίδης αλλά και των γλυκοζυλιωμένων φλαβονοειδών όπως η ισοκερκετίνη. Επίσης παραλήφθηκε το ιριδοειδές 8-Ο-(3,4-διμεθοξυκινναμοϋλο)μυοποροσίδης, για τον οποίο δεν υπάρχει προηγούμενη αναφορά. Στον έλεγχο της βιολογικής δράσης, ισχυρή αναστολή της AChE με τη μέθοδο NA-FBB προκάλεσαν τα φαινυλοπροπανοειδή, με ισχυρότερη τη δράση του τεουκριοσίδη. Το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους Adiantum capillus-veneris παρουσίασε μέτρια δράση στις δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας (μόνο το άπολο εκχύλισμα ήταν δραστικό έναντι των MCF-7 κυττάρων) και αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Ωστόσο οι εθνοφαρμακολογικές αναφορές και το χημικό του προφίλ αποτέλεσαν τις βασικότερες αιτίες για την περαιτέρω φυτοχημική του ανάλυση. Το εκχύλισμα κλασματώθηκε με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC) και τα κλάσματά του αξιολογήθηκαν ως πιθανοί αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Ακολούθησε η απομόνωση έξι δευτερογενών μεταβολιτών με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Οι καθαρές ουσίες δοκιμάστηκαν στα ένζυμα – στόχους όπου μόνο τα μίγματα των υδρολυόμενων ταννινών εμφάνισαν σημαντική δράση ενάντια στην AChE, και με τις δύο μεθόδους αξιολόγησης. Τα δύο υδατομεθανολικά εκχυλίσματα των ριζών και των υπέργειων τμημάτων του ελληνικού ενδημικού είδους Paeonia parnassica (Paeoniaceae) παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξική δράση και αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Η έλλειψη προηγούμενων αναφορών για τους δευτερογενείς μεταβολίτες των υπέργειων τμημάτων τους είδους και η ύπαρξη μόνο δύο για τις ρίζες αποτέλεσαν επιπλέον λόγους επιλογής του είδους προς περαιτέρω μελέτη. Τα εκχυλίσματα αυτά κλασματώθηκαν με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Ακολούθησαν η βιολογική αξιολόγηση των κλασμάτων ενάντια των υδρολυτικών ενζύμων και η παραλαβή των φασμάτων 1H - NMR. Για τον εντοπισμό των υπεύθυνων βιοδραστικών φυσικών προϊόντων στα κλάσματα, πριν πραγματοποιηθεί η απομόνωσή τους, εφαρμόσθηκε μια πρόσφατα ανεπτυγμένη μέθοδος ετεροσυνδιακύμανσης (Heterocovariance, HetCA) η οποία επιτρέπει το συσχετισμό δεδομένων NMR και βιολογικής δραστικότητας. Μέσω της μεθόδου HetCA έγινε δυνατή η ανίχνευση των ουσιών που προέρχονταν από το υδατομεθανολικό εκχύλισμα είτε των ριζών είτε των υπέργειων τμημάτων και οι οποίες συνεισέφεραν περισσότερο στις παρατηρούμενες δράσεις. Εν συνεχεία, προκειμένου να διαπιστωθεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων HetCA για τους δευτερογενείς μεταβολίτες που συνεισφέρουν ή όχι στη δράση, ακολούθησε στοχευμένη απομόνωση των ουσιών από τα κλάσματα που ανιχνεύθηκαν και αξιολόγηση της δραστικότητάς τους. Έτσι έγινε δυνατή η παραλαβή 13 ουσιών (παιωνιφλοριγενόνη, γαλλικός μεθυλεστέρας, παιωνιλακτόνη Β, παιωνιφλορίνη, οξυπαιωνιφλορίνη, αλμπιφλορίνη,) από το εκχύλισμα των ριζών και 19 ουσιών (4 κοινές ουσίες) από το εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων και η ταυτοποίησή τους πραγματοποιήθηκε με πειράματα NMR. Μέσω της βιολογικής αξιολόγησης αυτών αναδείχθηκε η ουσία 1,2,3,4,6 – πενταγαλλικός εστέρας της γλυκόζης ως ο πιο δραστικός μεταβολίτης ενώ ουσίες όπως το γαλλικό οξύ ως μέτριας δραστικότητας έναντι των ενζυμικών στόχων. Συμπερασματικά, δύο κείμενα θεραπευτικής μελετήθηκαν και από αυτά δημιουργήθηκαν λίστες των αναφερόμενων φυτικών ειδών. Πραγματοποιήθηκε η συλλογή ορισμένων από αυτά και η εκχύλιση τους με διαλύτες διαφορετικών πολικοτήτων. Επτά εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν περαιτέρω και επεξεργάστηκαν φυτοχημικά και φαρμακολογικά. Εν συνεχεία κλασματώθηκαν και από αυτά απομονώθηκαν 58 ουσίες, μετά από κατεργασία. Οι ουσίες ανήκουν σε ποικίλες χημικές κατηγορίες, όπως ιριδοειδή, μονοτερπένια, φαινολικά, φλαβονοειδή, αριστολοχικά οξέα κ.ά. Η ποικιλία των δευτερογενών μεταβολιτών ήταν εξ’αρχής στόχος της παρούσας μελέτης. Οι ουσίες αξιολογήθηκαν φαρμακολογικά στις δοκιμασίες αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Κάποιες από αυτές ήταν πολύ δραστικές στον πρώτο ενζυμικό στόχο π.χ. τεουκριοσίδης, πρενυλοϋδροκινόνη και άλλες στο δεύτερο ενζυμικό στόχο π.χ. ροσμαρινικό οξύ. Η παραλαβή δραστικών μεταβολιτών θα μπορούσε να υποστηρίξει την εθνοφαρμακολογική χρήση των φυτικών ειδών από τα οποία προήλθαν. Τέλος σημαντικό είναι ότι χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό εργαλείο HetCA, το οποίο επιτρέπει τη συσχέτιση βιολογικής δράσης και φασματοσκοπικών δεδομένων, ως ένας νέος, πιο σύντομος, τρόπος διαχείρισης και αξιολόγησης του μεγάλου όγκου των εθνοφαρμακολογικών δεδομένων.