Μοριακή ανάλυση μηχανισμών ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα και βιοτεχνολογικές μέθοδοι για την ανάπτυξη νέων εκλεκτικών δραστικών
Authors: Κάτσαβου Ευαγγελία 
Published: March 2023

Ως έντομα/ ακάρεα εχθροί ορίζονται τα έντομα και ακάρεα που προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στις αγροτικές καλλιέργειες, την κτηνοτροφία/πτηνοτροφία και στη δημόσια υγεία. Ο έλεγχος τους πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο με χρήση εντομοκτόνων. Παρόλα αυτά η λανθασμένη ή και αλόγιστη εφαρμογή τους στο πεδίο έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Η ανάλυση των μηχανισμών ανθεκτικότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη διαχείριση και την αντιμετώπιση του φαινομένου, παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες στην προσπάθεια ανακάλυψης νέων εντομοκτόνων ή και νέων στόχων εντομοκτόνων.Στο πρώτο κεφάλαιο μελετήθηκαν οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας του ερυθρού ακάρεως των πουλερικών (Dermanyssus gallinae) (Poultry Red Mite- PRM) σε πληθυσμούς από την Ελλάδα και την Ευρώπη, με έμφαση στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα και το Amitraz. Υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή και το Amitraz εντοπίστηκαν σε πληθυσμούς (GRC1, GRC2) που συλλέχθηκαν από τα Μέγαρα και το Ίλιον (Ελλάδα), αντίστοιχα, όπου φιλοξενείται σχεδόν το 40% της εκτροφής ορνίθων της χώρας. Παρατηρήθηκε η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή -cypermethrin, cyfluthrin και fluvalinate, ακαρεοκτόνα που χρησιμοποιούνται εκτενώς στην Ελλάδα εδώ και αρκετά χρόνια. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε 10.000 φορές περισσότερη συγκέντρωση ακαρεοκτόνου στα ανθεκτικά στελέχη, σε αντίθεση με ευαίσθητο εργαστηριακό στέλεχος ,για την θανάτωση του 50% του πληθυσμού των ακάρεων . Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η παρουσία και η συχνότητα μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή (οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί σε άλλα είδη), σε μεγάλο αριθμό πληθυσμών ερυθρού ακάρεως των πουλερικών σε όλη την Ευρώπη (53 δείγματα συνολικά από 15 ευρωπαϊκές χώρες). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μεταλλαγές M918L/Τ, L925V, T929I, F1534L, F1538L/Ι, F1537L ήταν ευρέως διαδεδομένες σε όλη την Ευρώπη, καθώς μόνο τρία από τα 53 δείγματα που εξετάστηκαν δεν είχαν καμία μεταλλαγή στις περιοχές του τασο- εξαρτώμενου καναλιού νατρίου, στόχου των πυρεθροειδών (VGSC (IIS4 -S5 και IIIS6)) που διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Παράλληλα, ο πληθυσμός GRC1 βρέθηκε ιδιαίτερα ανθεκτικός στο Amitraz (RR>740.000) και κατά την ανάλυση του β αδρενεργικού υποδοχέα, στόχου του Amitraz, βρέθηκε μια νέα μεταλλαγή (Α89V) η οποία εντοπίστηκε και στους τρεις από τους πληθυσμούς 11 Ευρωπαϊκών χωρών που εξετάστηκαν. Η μεταλλαγή αναλύθηκε για τον πιθανό ρόλο της στην ανθεκτικότητα με ετερόλογη έκφραση στο σύστημα Xenopus, χωρίς καταληκτικό συμπέρασμα. Για την περαιτέρω ανάλυση των μηχανισμών ανθεκτικότητας στο ερυθρό άκαρι των πουλερικών, έγινε ανάλυση μεταγραφώματος και στοχεύσαμε στην ανάλυση 3 υπερεκφρασμένων P450s, για τη διερεύνηση του πιθανού ρόλου τους στο φαινότυπο πολυανθεκτικότητας. Μετά την ετερόλογη έκφραση των λειτουργικών 59/ CYP4PG-like, 97/ CYP3012A-like, 51/ CYP3110A-like σε κύτταρα E. coli αναλύθηκε η ενεργότητά τους έναντι υποστρωμάτων (φθοριζόντων) και εντομοκτόνων (πυρεθροειδή και Amitraz) και δείχθηκε πως μόνο η 51/ CYP3110A-like έδειξε ενεργότητα έναντι των 7-ethoxycoumarin, EC, MC, EMC, BOMCC και EOMCC.Στο δεύτερο κεφάλαιο μελετήθηκαν μοριακά (για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία) οι πιθανοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας πληθυσμών ευδεμίδας (Lobesia botrana) που συλλέχθηκαν από Ελλάδα και Τουρκία. Οι Ελληνικοί πληθυσμοί είχαν χαμηλή ανθεκτικότητα (2-5 φορές) στα μελετώμενα εντομοκτόνα (chlorantraniliprole, alpha-cypermethrin, spinetoram, etofenprox, acetamiprid) ενώ οι Τουρκικοί είχαν μέτρια ανθεκτικότητα (4 και 30-φορές για το indoxacarb, 5-59 φορές για το spinosad και 18-30 φορές για το deltamethrin). Διερευνήθηκαν στόχοι εντομοκτόνων για πιθανές μεταλλαγές στους πληθυσμούς ευδεμίδας (σε σύγκριση με ένα ευαίσθητο εργαστηριακό στέλεχος), με αλληλούχιση των σχετικών γονιδιακών τμημάτων. Για όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν, δεν ανιχνεύθηκαν γνωστές ή/και νέες μεταλλαγές σε κανέναν από τους γονιδιακούς στόχους των πυρεθροειδών, οξαδιαζινών (VGSC), σπινοσυνών (nAChR_α6), διαμιδίων (RyR), αβερμεκτινών (GluCl) και οργανοφωσφορικών (ace). Παρόλα αυτά, μέσα από τη μελέτη αυτή, δημιουργήθηκε ένα σύνολο αλληλουχιών γονιδίων, καθώς και ένα μεταγράφωμα που θα βοηθήσουν σε επόμενες μελέτες στην ανάλυση πιθανών μηχανισμών ανθεκτικότητας στόχου στην ευδεμίδα. Από το μεταγράφωμα επίσης προέκυψαν γονίδια του κυτοχρώματος P450 που αναλύθηκαν φυλογενετικά για να βοηθήσουν την επιστημονική κοινότητα να μελετήσει το ρόλο της αποτοξικοποίησης (μεταβολισμός) στην ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα.Στο τρίτο κεφάλαιο της μελέτης συνοψίζεται η βιβλιογραφία που σχετίζεται με τα κυτοχρώματα P450s από έντομα (επιβλαβή και ωφέλιμα) και ακάρεα που έχουν συσχετιστεί λειτουργικά με την αποτοξικοποίηση ξενοβιοτικών με in vitro ή in vivo τεχνικές. Η φυλογενετικοί συσχετισμοί, τα συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση του ρόλου του κάθε ενζύμου παρουσιάζονται και συζητούνται οι εκάστοτε περιορισμοί. Η παραπάνω σύνοψη γίνεται στο πλαίσιο της πιθανής συμμετοχής των P450s στην ανάπτυξη εκλεκτικών εντομοκτόνων, καθώς τα P450s καταλύουν την αποτοξικοποίηση πολλών δραστικών ουσιών στους επικονιαστές και τα ωφέλιμα έντομα, αποτελώντας τελικά το κλειδί για την εκλεκτικότητα του εντομοκτόνου. Στο τέταρτο κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης GGPPS από Λεπιδόπτερα καθώς και χαρακτηρισμός της ως πιθανού στόχου για εντομοκτόνα. Μερική απαλοιφή του γονιδίου GGPPS με τη χρήση της τεχνικής γενετικής τροποποίησης CRISPR στο λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda υπέδειξε την αναγκαιότητα του γονιδίου αυτού για την ανάπτυξη των εντόμων. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη GGPPS εκφράζεται και είναι λειτουργική στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Escherechia.coli, και ότι η δράση της μπορεί να ανασταλεί από διφωσφονικούς αναστολείς, ευρήματα τα οποία αναδεικνύουν το ρόλο της μελλοντικά ως πιθανό στόχο εντομοκτόνων. Για τα παραπάνω, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο διαλογής το οποίο θα μπορούσε μελλοντικά να συμβάλει στην ανακάλυψη νέων εντομοκτόνων