Los polimorfismos en los Avr de <i>Fulvia fulva</i> (<i>Sin: Cladosporium fulvum</i>) afectan la virulencia y el control de la cladosporiosis del tomate con la resistencia sistémica inducida y adquirida
Authors:   , Lucentini César Gustavo 
Published: April 2021

La Cladosporiosis o también conocida enfermedad del moho de la hoja en el tomate, es causada por Fulvia fulva (Syn. Cladosporium fulvum, Passalora fulva Cooke). Este hongo en base a su filogenia y morfología se ubica en el reino Fungi, phylum Ascomycota, clase Dothideomycetes, orden Capnodiales, familia Mycosphaerellaceae. La enfermedad del moho de la hoja predomina en zonas de producción de tomate de la Argentina en las que se dan condiciones de alta humedad y temperaturas medias a altas, lo que ocurre solo en algunos lugares a campo y luego en los invernaderos. El hongo F. fulva pasa las etapas con ambientes desfavorables como la temporada fría del invierno como saprótrofo o en estado conidial o en estructuras de resistencia, microesclerocios, sobre los residuos del cultivo y/o en el suelo por un período de hasta un año. Cuando la condición es favorable los microesclerocios germinan y genera conidios, que actúan como inóculo primario. La infección de F. fulva comienza con la dispersión de los conidios que en condiciones de alta humedad se adhieren a la superficie de la hoja, produciendo sobre esta, hifas que ingresan a los tejidos de la hoja por los estomas abiertos y colonizan el espacio intercelular. El hongo desarrolla en el espacio apoplástico hasta que despliega conidióforos que aparecen en la cara abaxial de las hojas infectadas. La interacción F. fulva-tomate cumple con la relación gen a gen, en la que cada producto genético de avirulencia de patógenos (avr) es reconocido por una proteína receptora codificada por el gen de resistencia dominante (Cf) del huésped correspondiente. En los últimos tiempos se han aislado las proteínas efectoras o de avirulencia de F. fulva (Avr2, Avr4, Avr4E, Avr5 y Avr9), así como también las proteínas extracelulares (Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5 y Ecp6). F. fulva tiene, al menos potencialmente, la capacidad de sintetizar no solo una gran diversidad de proteínas efectoras que además pueden combinarse y así de esa manera se ha definido la existencia de 17 razas de F. fulva las que difieren en su capacidad para sintetizar proteínas efectoras. La base de la patogenicidad que F. fulva tiene en las plantas de tomate es el resultado de la interacción de las efectoras que interaccionan con los híbridos de tomate y cuando no son detectadas por los genes de resistencia Cf vulneran los mecanismos de defensa de la planta. Así se planteó el objetivo general de esta tesis que fue ampliar el análisis de aislados de F. fulva, evaluar los mismos a nivel de los genes de avirulencia y evaluar de esta manera el potencial desarrollo de herramientas para el manejo del moho de la hoja del tomate. En cuanto a los objetivos específicos, estos consistieron en disponer de un análisis morfo-fisiológico y molecular de los aislados de F. fulva, e identificar y caracterizar las razas del hongo que conviven en las áreas de producción muestreadas y si hay una dinámica de cambios genéticos en la población del patógeno. Otro objetivo específico fue disponer de una caracterización a nivel de los efectores de F. fulva y genes que codifican proteínas extracelulares de manera de conocer no solo que razas del hongo están presentes en la región, sino también, si el sistema se encuentra evolucionando bajo presión de selección. Otro objetivo específico fue conocer la naturaleza química de las melaninas que sintetiza F. fulva y su vía de síntesis. Por último se planteó el objetivo de conocer los metabolitos secundarios que sintetiza F. fulva, que es hemibiótrofo, y su comparación con el perfil de un patógeno necrotrófico, que eventualmente podrían interactuar con las plantas de tomate y resultar en interacciones compatibles o incompatibles. Por ello en esta tesis en primer lugar, se procedió a aislar e identificar a partir de plantas de tomate con síntomas típicos del moho de la hoja del tomate, creciendo en lotes de producción, a F. fulva. Se amplió el número de aislados del hongo y se depositaron en la colección del Centro de Investigaciones de Fitopatología CIDEFI. Esto se realizó utilizando el medio de cultivo agar-agua en el que el hongo desarrolló un pigmento púrpura. Una vez que se obtuvieron cultivos monospóricos de F. fulva en un numero adicional de 8 lo que hizo un total de 14 aislados si consideramos los obtenidos y descritos en la mencionada colección, se confirmó la identidad de los aislados amplificando y secuenciando los amplicones de las secuencias intergénicas no transcriptas que fueron 100% homólogas a la secuencia del ITS de la cepa tipo de F. fulva. Se procedió a analizar el crecimiento y la diversidad genética con marcadores ISSR y se encontró que además mostró una considerable diversidad genética que no estuvo relacionada con el cultivar de origen del aislado ni con el sitio de aislamiento. Los nuevos aislados nuevamente se clasificaron dentro de las dos razas ya descritas anteriormente 0 y 2. Así se procedió a la amplificación de los genes de avirulencia de F. fulva y a las proteínas ECP con pares de primers homólogos a las secuencias descritas de los avr y de las ECP. La obtención de amplicones del tamaño esperado y la secuencia de los mismos confirmaron la identidad de los aislados que fueron todos representantes de F. fulva. Pero además se confirmó que estas dos razas se encuentran evolucionando ya que se describieron cambios en las secuencias de los genes avr y ecp. Siendo este el primer trabajo que describe la ocurrencia de polimorfismos a nivel de las proteínas Ecp. En cuanto al análisis de los pigmentos que sintetiza F. fulva las características químicas y fotoquímicas del pigmento oscuro sintetizado por F. fulva, así como la presencia de flaviolina cuando las reductasas fúngicas son inhibidas demuestran que el hongo sintetiza melanina-DHN. Por otro lado, se demostró que el gen pks1 está implicado en la síntesis de los pigmentos oscuros, puesto que codifica para un dominio KS ya asociado a otras PKS involucradas en la síntesis de melanina-DHN. Por último, en lo que hace al perfil de metabolitos secundarios sintetizados por F. fulva, éste sintetiza y libera cuantitativamente menoscompuestos orgánicos volátiles (COVs) que S. lycopersici, hongo necrotrófico que provoca mancha gris de la hoja del tomate. F. fulva sintetizó un espectro específico y más diverso de COVs, que contrasta con la cantidad de COVs liberada por S. lycopersici. La producción de alcoholes furfurilo y compuestos derivados por F. fulva y S. lycopersici se encontró que estuvo asociado al desarrollo de síntomas en las hojas. Por otro lado, es evidente que F. fulva produce compuestos que contribuyen a la colonización de los tejidos. Estos resultados constituyen las bases para futuros estudios destinados al control de estas enfermedades en las zonas de producción de tomate de la Argentina, como el Cinturón Hortícola Platense y Corrientes.