Η εκτίμηση της έκφρασης της μεθυλίωσης του DNA στα γονίδια του αναστολέα της μεταλλοπρωτεϊνάσης 3 του υποστρώματος (TIMP-3) και της κινάσης της πρωτεΐνης της σχετιζόμενης με τον θάνατο (DAPK) σε ασθενείς με προκαρκινικές και καρκινικές αλλοιώσεις ενδοστοματικά, ως μέσο πρώιμης διάγνωσης και πρόβλεψης της εξέλιξης των αλλοιώσεων
Authors: Παπαδόπουλος Πέτρος 
Published: February 2024

Εισαγωγή: Οι δυνητικά κακοήθεις βλάβες στην στοματική κοιλότητα όπως ο ομαλός λειχήνας (ΟΛ) ή η λευκοπλακία(Λ) διαφόρων βαθμών δυσπλασίας εμφανίζουν σημαντικό δυναμικό κακοήθους εξαλλαγής με αποτέλεσμα πολλές φορές να αποτελούν προπομπό της ανάπτυξης καρκινώματος του πλακώδους επιθηλίου (ΚΠΕ) στη στοματική κοιλότητα. Το τελευταίο με τη σειρά του αποτελεί σημαντική αιτία θανάτου προκαλώντας περίπου 325 .000 θανάτους ετησίως. Έτσι γίνεται κατανοητό ότι η πρώιμη ανίχνευση της πιθανότητας κακοήθους εξαλλαγής των δυνητικά κακοήθων βλαβών αλλά και η εκτίμηση της πρόγνωση της εξέλιξης του ΚΠΕ πιθανώς να είναι ικανή να αποτρέψει την εξέλιξη μιας βλάβης σε κακοήθεια όπως και την επέκταση της κακοήθειας μέσω διήθησης, την μετάσταση και τέλος την υποτροπή της με αποτέλεσμα την βελτίωση του προσδόκιμου ζωής των ασθενών. Υπό το πρίσμα αυτών των αναγκών η εύρεση δεικτών που θα μπορούν να τις εξυπηρετήσουν είναι εξαιρετικά σημαντική. Ειδικότερα η μελέτη τους, μέσω της σκιαγράφησης του προφίλ των επιγενετικών τους μεταβολών και ιδιαίτερα της μεθυλίωσης, αποδεικνύεται ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα όπως και η διαδικασία επαλήθευσης αυτής της συμπεριφοράς μέσω της διερεύνησης της πρωτεϊνικής τους έκφρασης στις κατηγορίες βλαβών που περιγράφονται παραπάνω. Με βάση τα παραπάνω ως σκοπός της μελέτης μας ορίστηκε η διερεύνηση της έκφρασης αφενός της υπερμεθυλιωμένης –ανενεργής μορφής των γονιδίων DAPK-1 (9q21.33) και TIMP-3 (22q12.1–q13.2) με τη χρήση ms-PCR, αφετέρου της πρωτεϊνικής έκφραση τους σε δείγματα ΟΛ, Λ διαφόρων βαθμών δυσπλασίας και χωρίς δυσπλασία , αλλά και ΚΠΕ χαμηλής, μετρίας και καλής διαφοροποίησης, τα οποία προηγουμένως σκηνώθηκαν σε παραφίνη, με τη χρήση ανοσοιστοχημείας. Μέθοδοι κα Υλικά: Η μελέτη αναφέρεται στην αξιολόγηση της υπερμεθυλίωσης των γονιδίων DAPK ή όπως αλλίως ονομάζεται DAPK-1( VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor,USA) και TIMP-3( VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor,USA) μέσω της μεθόδου της ειδικής της μεθυλίωσης αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (ms-PCR/ Methylation Specific Polymerase Chain Reaction) σε ιστοτεμάχια από 21 περιστατικά ΟΛ , 11 δικτυωτής και 10 διαβρωτικής μορφής, 62 περιστατικά λευκοπλακίας , 21 χωρίς δυσπλασία,22 με ήπια δυσπλασία , 19 με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία όπως και από 39 περιστατικά ΚΠΕ της στοματικής κοιλότητας. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 12 ιστοτεμάχια από φυσιολογικό επιθήλιο το οποίο ήταν παρακείμενο σε εξαιρεθέντα ινώματα εξ ‘ ερεθισμού. Η αξιολόγηση της υπερμεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων πραγματοποιήθηκε αφού προηγήθηκε αρχικά η απομόνωση και ποσοτικοποίηση του γενετικού υλικού από τους παραφινοποιημένους ιστούς με τη χρήση των Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification kit του οίκου PROMEGA Αμερικής και προτοκόλλου Nanodrop ND-1000, Qubit HS αντίστοιχα. Στη συνέχεια έλαβε χώρα η προσθήκη δισουλφιδικών με την χρήση ειδικού κιτ (EZ DNA Methylation Gold kit. ZymoResearch,USA ) και τέλος η μεθυλίωση με τη μέθοδο ms –PCR(methylation specific PCR). H στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS 29.0 και την εφαρμογή των Pearson chi-square test και Fisher’s exact test ενώ το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p<0.05. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης διερευνήθηκε η ανοσοιστοχημική έκφραση του βιοδείκτη DAPK-1( NBP2-38468Novus Biologicals a biotechne brand,Centennial, Colorado, USA) του οποίου η χρώση ολοκληρώθηκε με τη βοήθεια του συστήματος Dako Envision System Flex + (Dako Denmark A/S). Τα ιστοτεμάχια προήλθαν από 6 περιστατικά ΟΛ , 3 δικτυωτής και 3 διαβρωτικής μορφής, 30 περιστατικά λευκοπλακίας , 10 χωρίς δυσπλασία , 10 με ήπια δυσπλασία και 10 με μέτρια και σοβαρή δυσπλασία, όπως και 22 περιστατικά ΚΠΕ(5 καλής διαφοροποίησης, 16 μέτριας διαφοροποίησης και 1 χαμηλής διαφοροποίησης. Η χρώση αξιολογήθηκε ποσοτικά ,μιας και δεν παρατηρήθηκε διακύμανση στην ένταση της στα διάφορα δείγματα , μέσω μίας κλίμακας από το 0 έως το ΙΙΙ η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι : 0: <5% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, Ι: 6-25% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, ΙΙ: 26-50% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, ΙΙΙ: >50% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν. ). H στατιστκή ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS 29.0 και την εφαρμογή του Mann-Whitney U test ενώ το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p<0.05. Τα ιστοτεμάχια προέρχονται από το τα αρχεία του Εργαστηρίου Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, της Κλινικής της και του Τμήματος της Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής της Κλινικής του Αγίου Λουκά κατά την χρονική περίοδο 2014-2019. Η εργαστηριακή διαδικασία πραγματοποιήθηκε και ολοκληρώθηκε στους εργαστηριακούς χώρους του τμήματος Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του ΑΠΘ και στους αντίστοιχους του τμήματος Μοριακής Βιολογίας της Βιοιατρικής Αθηνών( Bioiatriki S.A. Athens, Greece). Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε καθολική απουσία της μεθυλίωσης του TIMP-3 στο σύνολο των βλαβών όλων των κατηγοριών πλην 2 περιστατικών λευκοπλακίας με ήπια δυσπλασία και 1 περιστατικού ΚΠΕ. Αναφορικά με την μεθυλίωση του DAPK-1 , στις βλάβες ΟΛ διαβρωτικής μορφής εμφανίστηκε στατιστικά αυξημένη έναντι των αντίστοιχων του ΟΛ δικτυωτής μορφής(p=0,007 Fisher’s exact Test). Επίσης , στον ΟΛ συνολικά η μεθυλίωση ήταν μειωμένη συγκριτικά με την μεθυλίωση στα ΚΠΕ(p<0,001 chi- square Test). Η μεθυλίωσης του DAPK-1 στις βλάβες Λ με ήπια δυσπλασία ήταν μεγαλύτερη από αυτήν στις βλάβες Λ με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία (p<0,001 chi- square Test) και μικρότερη έναντι της μεθυλίωσης στις βλάβες ΚΠΕ(p<0,001 chi- square Test). Επίσης η κατανομή της μεθυλίωσης ήταν μεγαλύτερη στα ΚΠΕ έναντι των φυσιολογικών ιστών(p<0,001 Fisher’s exact Test). Επιπλέον διαπιστώθηκε μεγαλύτερη παρουσία μεθυλίωσης στις βλάβες ΚΠΕ έναντι τόσο των βλαβών Λ χωρίς δυσπλασία (p<0,001 Fisher’s exact Test), όσο και έναντι των αντίστοιχων Λ οποιουδήποτε βαθμού δυσπλασίας (p<0,001 Fisher’s exact Test). Αναφορικά με την ανοσοιστοχημική έκφραση της DAPK-1 (η οποία ήταν κυρίως κυτταροπλασματική ,ενίοτε μεμβρανική και σπανιότερα πυρηνική) σε αντίστοιχες βλάβες ΟΛ, Λ και ΚΠΕ διαπιστώθηκαν ότι η έκφραση της DAPK-1 ήταν εντονότερη (ποσοτικά) στους φυσιολογικούς ιστούς (p=0,013 Mann-Whitney U Test) και στον ΟΛ (p=0,002 Mann-Whitney U Test) στην Λ χωρίς δυσπλασία ( p=0.019 Mann-Whitney U Test) και στην Λ με ήπια δυσπλασία( p=0.019 Mann-Whitney U Test) έναντι της Λ με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία. Επιπλέον όπως αναμενόταν η χρώση της DAPK-1 ήταν ηπιότερη στα ΚΠΕ έναντι των φυσιολογικών ιστών(p=0,003 Mann-Whitney U Test), έναντι του ΟΛ (p<0,001 Mann-Whitney U Test), έναντι των Λ χωρίς δυσπλασία( p=0.003 Mann-Whitney U Test) και έναντι των Λ με ήπια δυσπλασία( p=0.003 Mann-Whitney U Test). Συζήτηση: Το προφίλ μεθυλίωσης του DAPK-1 στις βλάβες ΟΛ έναντι του αντίστοιχου των κακοήθων βλαβών επιβεβαιώνει την χρησιμότητα του στην πράξη ως πρώιμου δείκτη πρόβλεψης πιθανής κακοήθους εξαλλαγής ιδιαίτερα των βλαβών ΟΛ διαβρωτικής μορφής. Επίσης, η έκφραση της μεθυλίωσης του DAPK-1 παρουσιάζει διαγνωστική και προγνωστική αξία κυρίως στην μετάπτωση της λευκοπλακίας με ήπια δυσπλασία στην λευκοπλακία με μέτρια και σοβαρή δυσπλασία και δευτερευόντως στην μετάπτωση από την τελευταία στα ΚΠΕ. Επιπλέον, η έκφραση του πρωτεϊνικού προϊόντος του DAPK-1 εγείρει ενδείξεις ως προς την εκτίμηση της φλεγμονής ως δείκτη κακοήθους εξαλλαγής σε βλάβες ΟΛ. Βέβαια η χρήση της DAPK-1 ως δείκτη στην καθημερινή κλινική πράξη προϋποθέτει την ερευνητική μελέτη του σε ένα μεγάλο δείγμα βλαβών και τη συσχέτιση τόσο της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου DAPK-1, όσο και της έκφρασης της πρωτεΐνης της κινάσης DAPK-1 με παραμέτρους όπως το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ αλλά και η λήψη κάποιων φαρμάκων.