Μελέτη μηχανισμών δράσης της υδροξυουρίας σε συνδυασμό με άλλες κυτταροκίνες σε καλλιέργειες αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων
Authors: Λυκούση Σοφία 
Published: August 2021

Στην αρχή του 1960, σε ποικίλες γενετικές και βιοχημικές μελέτες περιγράφηκε ο παθοφυσιολογικός ρόλος της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στη θαλασσαιμία. Η επιβίωση ασθενών με σοβαρές ανωμαλίες στη β αλυσίδα αποδόθηκε στην ύπαρξη HbF. Έγινε επομένως ξεκάθαρο ότι η παραγωγή σε αφθονία της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης μπορεί να βοηθήσει σημαντικά την κλινική εικόνα ασθενών με β θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν διάφορες φαρμακευτικές ουσίες, αρχικά σε πειραματόζωα και ακολούθως σε ασθενείς, οι οποίες οδήγησαν σε αύξηση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης. Το επόμενο στάδιο των ερευνών κατευθύνθηκε στη μελέτη των φαρμακευτικών ουσιών που επάγουν την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη με στόχο τη διερεύνηση των μηχανισμών δράσης των υποκειμένων. Με τα έως τώρα δεδομένα οι μηχανισμοί δράσης των διαφόρων επαγωγικών ουσιών της HbF ποικίλουν και συνήθως αφορούν επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων ή άμεσα στη μεταγραφή του γ γονιδίου, με αύξηση των επιπέδων των γ-μεταγράφων καθώς και αλληλεπίδραση ενδοκυτταρικών σημάτων. Ακόμη και σήμερα υπάρχει αμείωτο ενδιαφέρον αφενός μεν για τη μελέτη του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης της έκφρασης του γ γονιδίου, αφετέρου για την εύρεση νέων φαρμακολογικών παραγόντων που αυξάνουν την παραγωγή της HbF. Οι ουσίες που αυξάνουν την HbF επιτυγχάνουν επιλεκτική προαγωγή των κυττάρων BFU-EF, τα οποία διατηρούν το πρόγραμμα παραγωγής γ αλυσίδων και παράλληλη απουσία των φυσιολογικών BFU-E. Οι βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με τη συμμετοχή μετα-μεταγραφικών και μεταφραστικών μηχανισμών στην έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης και στη δράση επαγωγικών για την HbF ουσιών είναι περιορισμένες. Στην παρούσα μελέτη επικεντρωνόμαστε στη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της υδροξυουρίας στην επαγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, προστιθέμενη μόνη της ή και με παράλληλη χορήγηση κυτταροκινών, ερυθροποιητίνης και SCF σε επίπεδο μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες CD34+ κυττάρων από περιφερικό αίμα ενηλίκων, αποτελεί το σύστημα μελέτης που επιτρέπει τη διαφοροποίηση των κυττάρων προς την ερυθρά σειρά και υπερτερεί των υπολοίπων συστημάτων καλλιέργειας προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός δράσης της HU και των συνδυασμών της με Ερο και SCF. Παρακολουθήσαμε την εξέλιξη της καλλιέργειας και τη μεταβολή των αντιγονικών δεικτών CD34, CD71, CD117, Γλυκοφορίνη A (GPA), καθώς και την παραγωγή κυττάρων που συνθέτουν HbF. Η συνολική διάρκεια της καλλιέργειας είναι 14 ημέρες. Σε αυτό το χρονικό διάστημα τα CD34+ κύτταρα διαφοροποιούνται σε ώριμα ερυθροειδικά κύτταρα με υψηλή έκφραση CD71 και γλυκοφορίνης, μειωμένη έκφραση CD117 και μέτρια επίπεδα HbF. Η αύξηση της συγκέντρωσης της ερυθροποιητίνης (από 4 σε IOu/πιΙ), επηρεάζει τη διαφοροποίηση των κυττάρων και οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού έκφρασης των GPA+, GPA+/HbF+ και των F+ κυττάρων. Η αύξηση των GPA+ κυττάρων και των ενδοκυττάριων επιπέδων έκφρασης του CD71 υποδηλώνει ταχύτερη ωρίμανση των κυττάρων με δυνατότητα αυτών να οδηγηθούν σε τελική διαφοροποίηση. Με τη χρήση του επαγωγικού παράγοντα (υδροξυουρία-HU) στις καλλιέργειες αυξάνετε ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν HbF και διατηρείται υψηλότερος αυτού των κυττάρων μαρτύρων, ακόμη και τη 14η ημέρα καλλιέργειας. Όμως τελικά συνδυασμένη δράση υψηλής συγκέντρωσης Ερο και HU δεν εξασφαλίζει περαιτέρω αύξηση του ποσοστού των F+ κυττάρων . Η παρουσία του SCF είναι απαραίτητη στα αρχικά στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας των κυττάρων μαρτύρων για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων καθώς και για την παραγωγή της HbF. Καθώς προχωρά η διαφοροποίηση των κυττάρων και πραγματοποιείται η μεταστροφή της αιμοσφαιρίνης, ελαττώνεται ο αριθμός των F+ κυττάρων. Παρατηρήσαμε όμως ότι η παραμονή του SCF στην καλλιέργεια μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης σε κύτταρα που εκτελούν φυσιολογική ερυθροποίηση (κύτταρα μάρτυρες), έχει σαν αποτέλεσμα αύξηση του αριθμού των κυττάρων και την μειωμένη παραγωγή HbF+ σε σχέση με τα κύτταρα που σταματά η χορήγηση του. Αντιθέτως στα κύτταρα που εκτελούν ερυθροποίηση υπό stress (λαμβάνουν HU), η παραμονή του οδηγεί σε υψηλότερα ποσοστά F+ κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα όπου διακόπτεται η χορήγηση του. Αποδεικνύεται επομένως ότι το μονοπάτι που ενεργοποιείται με τη σύνδεση του SCF με τον υποδοχέα του CD117, δρα σε κύτταρα σε προχωρημένο στάδιο ανάπτυξης που υπόκεινται σε stress ερυθροποίηση, όπως συμβαίνει παρουσία της HU, γεγονός που σηματοδοτεί συνέργια μεταξύ του SCF και της HU προκειμένου για την αύξηση των F+ κυττάρων. Με τη συνύπαρξη αυτών των παραγόντων πριμοδοτείται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, με άμεσο αποτέλεσμα την ελάττωση των θρεπτικών αποθεμάτων τους που με τη σειρά του οδηγεί σε καθυστέρηση της διαφοροποίησή τους. Η παραγόμενη αιμοσφαιρίνη μετράται με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) για ανάλυση αλυσίδων και παρατηρούμε ότι μετά από την επίδραση HU και με παραμονή του SCF μετά από το στάδιο της προερυθροβλάστης, αυξάνεται το πηλίκο Gy/Αγ το οποίο ισοδυναμεί με πριμοδότηση της Θγ αλυσίδας( εμβρυϊκό πρότυπο ανάπτυξης). Η ποσότητα όμως της παραγόμενης HbF είναι μειωμένη έως τη 11η ημέρα της καλλιέργειας, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες και αυξάνεται τη 14η. Τελικά σε καλλιέργεια ώριμων ερυθροβλαστών μετά από τη δράση της HU και με συνεχή προσθήκη SCF αυξάνεται ο αριθμός των F+ κυττάρων, παράγεται HbF με πριμοδότηση της Θγ αλυσίδας και η παραγωγή αιμοσφαιρίνης HbF αυξάνεται τη 14η ημέρα της καλλιέργειας. Αντιθέτως σε καλλιέργειες όπου διακόπτεται ο SCF μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης και προστίθεται HU, το κύτταρο προχωρά τη διαφοροποίησή του πιο γρήγορα. Τη 12η ημέρα έχει αυξήσει την παραγωγή της HbF, ως αποτέλεσμα της δράσης της HU στα ίδια με προηγουμένως επίπεδα, αλλά με πριμοδότηση της Αγ αλυσίδας (πρότυπο ανάπτυξης ενηλίκου) και ακολουθεί ελάττωση της παραγωγής τη 14η ημέρα έως τα επίπεδα παραγωγής των μαρτύρων. Μελετώντας παράλληλα την παραγωγή των γ- μεταγράφων καταγράφεται ότι στα κύτταρα μάρτυρες αυξάνεται η παραγωγή τους μεταξύ 6ης και 8ης ημέρας καλλιέργειας, ενώ τη 12η ημέρα ελαττώνεται η παραγωγή τους καθώς έχει προχωρήσει η ωρίμανσή τους και έχει αυξηθεί η σύνθεση των β-μεταγράφων. Τα κύτταρα που λαμβάνουν ΙΟΟμΜ HU για μία ημέρα με συνεχή χορήγηση ή με παλμό, αυξάνουν τα επίπεδα παραγωγής των γ-μεταγράφων τη 12η ημέρα της καλλιέργειας. Η παραγωγή της HbF, όπως αυτή εκφράζεται από το λόγο (γ/β+γ) μεταγράφων, αυξάνεται μετά την επίδραση ΙΟΟμΜ HU για μία ημέρα με συνεχή χορήγηση ή με παλμό και είναι υψηλότερη την 8η ημέρα. Αντιθέτως η προσθήκη της HU δεν επηρεάζει την HbA (β/β+γ). Μεταβολές των γ- και β-μεταγράφων παρατηρούνται μετά από τη δράση SCF σε ώριμους ερυθροβλάστες και την αύξηση της χορηγούμενης Ερο (από 4 σε 10u/ml). Η παρουσία του SCF αυξάνει τη παραγωγή των γ-μεταγράφων . Η αύξηση αυτή είναι μικρή την 6Π ημέρα για τα κύτταρα που λαμβάνουν HU, αυξάνει σημαντικά την 12η ημέρα τόσο στα κύτταρα μαρτύρων με δράση και των δύο συγκεντρώσεων Ερο (4 και 10u/ml), όσο και μετά από τη δράση HU. Είναι ξεκάθαρο ότι ο SCF και η Ερο δρουν επικουρικά με την HU για την παραγωγή των γ-μεταγράφων . Εκτός όμως από τη δράση σε μεταγραφικό επίπεδο φάνηκε και δράση της HU στην ωρίμανση των γ-μεταγράφων καθώς αυξάνονται τα γ-μετάγραφα μετά την παράλληλα δράση της HU με έναν αναστολέα της μεταγραφής , την ακτινομυκίνη-D. Επίσης δεν παρατηρήθηκε ύπαρξη μεταφραστικού μηχανισμού καθώς με διακοπή της μετάφρασης με τη χρήση κυκλοεξαμίδης δεν διαταράχθηκε η επαγωγική δράση της HU επί των γ-μεταγράφων. Η περαιτέρω αύξηση των επιπέδων των γ-μεταγράφων παρουσία υδροξυουρίας και ταυτόχρονη προσθήκη κυκλοεξαμίδης αλλά και ακτινομυκίνης-D αποδίδεται στη δράση της υδροξυουρίας σε επίπεδο μεταγραφής και μετα-μεταγραφικής ωρίμανσης, με πιθανή τη σταθεροποιητική δράση της HU στα γ-μετάγραφα. Επομένως στην παρούσα εργασία δείξαμε ότι υπάρχει: • δράση της HU σε επίπεδο μεταγραφής • δράση της HU σε μετα-μεταγραφική τροποποίηση. Σταθερότητα του γ-mRNA. • Η HU δεν χρησιμοποιεί μεταφραστικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων να οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση HbF. • Δράση της HU για αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν HbF. Επικουρικά με την HU σε αυτή την κατεύθυνση δρα η παρουσία του SCF. • Η προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης Ερο δεν συνεργεί προκειμένου να αυξηθεί το ποσοστό των F+ κυττάρων. • Η παρουσία του SCF σε ώριμους ερυθροβλάστες πριμοδοτεί την σύνθεση Θγ αλυσίδας (πρότυπο ενηλίκου) και οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα σύνθεσης HbF την 15η ημέρα της καλλιέργειας. • Η διακοπή της χορήγησης SCF πριμοδοτεί την σύνθεση της Αγ αλυσίδας (πρότυπο εμβρύου) και αυξάνει τα επίπεδα σύνθεσης της Hb F την 12η ημέρα της καλλιέργειας. • Σε ώριμους ερυθροβλάστες που λαμβάνουν HU , stress ερυθροποίηση, το μονοπάτι μετάδοσης σήματός που ενεργοποιείται με τη σύνδεση του SCF με τον υποδοχέα του συνεχίζει να λειτουργεί και επικουρεί στη σύνθεση HbF. Σε ώριμους ερυθροβλάστες των κυττάρων που λαμβάνουν HU χωρίς τη προσθήκη SCF μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης, η έκφραση του CD117 μειώνεται με την ωρίμανση των κυττάρων και λόγο της έλλειψης του παράγοντα και τελικά η σύνθεση της HbF είναι μειωμένη. • Η αύξηση της συγκέντρωσης Ερο από 4 σε 10 u/ml οδηγεί σε αύξηση του CD117 στα κύτταρα μάρτυρες που όμως παρουσία του SCF δεν οδηγεί σε αύξηση της παραγόμενης HbF . Επομένως η Ερο δεν χρησιμοποιεί το μονοπάτι του SCF/CD117 και προωθεί μόνο την ωρίμανση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής μας έδωσε σημαντικές πληροφορίες για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στη δράση της υδροξυουρίας στα γονίδια των σφαιρινών παρουσία ή απουσία και άλλων κυτταροκινών και την πιθανή συνδυαστική χρήση τους σε ασθενείς με θαλασσαιμικά σύνδρομα. Η κατανόηση των μηχανισμών δράσης της υδροξυουρίας μπορεί να οδηγήσει στην αναζήτηση άλλων παρόμοιων επαγωγικών ουσιών με στόχο τη χρήση τους σε ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στις ήδη εφαρμοζόμενες θεραπείες.