Μικροχλωρίδα του εδώδιμου χερσαίου σαλιγκαριού Cornu aspersum και ενίσχυση του αμυντικού του συστήματος
Authors: Ντούσκου Εσμεράλντα 
Published: July 2023

Η εντερική μικροχλωρίδα έχει αναδειχθεί ως σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την υγεία του ανθρώπου και των ζώων. Το σύνολο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εντερικής μικροχλωρίδας και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, συνιστούν ένα βασικό μηχανισμό για τη διατήρηση και ενίσχυση της ομοιόστασης. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, που συμπεριλαμβάνουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς, μπορούν να διαταράξουν την ομοιόσταση του οργανισμού, οδηγώντας σε καταστάσεις δυσβίωσης και στην εμφάνιση φλεγμονωδών και μολυσματικών ασθενειών. H αναβίωση μπορεί να επιτευχθεί μέσω της χορήγηση προβιοτικών μικροοργανισμών. Ωστόσο, η γνώση μας έχει περιοριστεί κυρίως στο σύστημα των ανώτερων σπονδυλωτών, αφήνοντας πίσω αναπάντητα ερωτήματα για τη ρύθμιση της ανοσίας των ασπόνδυλων ζωών, συμπεριλαμβανομένων των σαλιγκαριών Cornu aspersum maxima. Σημαντικό εμπόδιο στο εγχείρημα αυτό αποτελεί η περιορισμένη γνώση για i) τους αυτόχθονους συμβιωτικούς μικροοργανισμούς της εντερικής μικροχλωρίδας των σαλιγκαριών που δρουν ευεργετικά στην υγεία των σαλιγκαριών και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως προβιοτικά, ii) για τους δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς των σαλιγκαριών που οδηγούν σε καταστάσεις δυσβίωσης και κατ’ επέκταση για iii) τη σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας και για τον τρόπο που αυτή αλληλεπιδρά με τους έμφυτους μηχανισμούς άμυνας των σαλιγκαριών. Στο πλαίσιο αυτό, αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εντερικής μικροχλωρίδας και του έμφυτου μηχανισμού άμυνας των σαλιγκαριών C. aspersum maxima σε καταστάσεις συμβίωσης και δυσβίωσης.Πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά απομόνωση και χαρακτηρισμός υποψήφιων προβιοτικών και δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών. Η έρευνα εστιάστηκε: α) στην πιθανή προβιοτική δράση των αυτόχθονων της εντερικής μικροχλωρίδας Lactobacillus στελεχών, και β) στη λοιμογόνο δράση δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών Listeria monocytogenes στελεχών, τα οποία είχαν απομονωθεί από εκτρεφόμενα σαλιγκάρια C. aspersum maxima και είχαν συσχετιστεί με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών. Συνολικά απομονώθηκαν και διερευνήθηκαν τόσο σε φαινοτυπικό, όσο και σε λειτουργικό ή/και γενετικό επίπεδο 48 υποψήφια προβιοτικά στελέχη του γένους Lactobacilllus και 15 δυνητικά παθογόνα L. monocytogenes στελέχη. Για τη διερεύνηση της ικανότητας των μικροοργανισμών να διέρχονται από τους εξωτερικούς και εσωτερικούς φραγμούς άμυνας των σαλιγκαριών, σχεδιάστηκε ένα ειδικό για τα σαλιγκάρια in vitro σύστημα κριτηρίων το οποίο βασίστηκε στην ικανότητα των στελεχών να αναπτύσσονται παρουσία της εξωτερικής βλέννας, της γαστρικής βλέννας, των γαστρικών εκκρίσεων, του όξινου pH και της αιμολέμφου των σαλιγκαριών, σε συνδυασμό με ιδιότητες της κυτταρικής επιφανείας των στελεχών όπως η επιφανειακή υδροφοβία, η ικανότητα αυτοσυσσωμάτωσης καθώς και ο σχηματισμόςβιοϋμενίων. Η προβιοτική δράση των Lactobacillus στελεχών συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να διέρχονται από τους φραγμούς άμυνας του γαστρεντερικού σωλήνα, να προσκολλώνται και αλληλοεπιδρούν με το εντερικό επιθήλιο των σαλιγκαριών και να ενισχύουν τις έμφυτες κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις της άμυνας των σαλιγκαριών, όπως η χημειόταξη και φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων, σε συνδυασμό με την ενίσχυση της αντιβακτηριακής δράσης του ορού της αιμολέμφου. Επιπλέον, στη παρούσα διατριβή αναδείχθηκε η πιθανή συμμετοχή ομόλογων των θηλαστικών TLR σηματοδοτικών μονοπατιών στην αλληλεπίδραση ανάμεσα στα βακτηριακά L. plantarum κύτταρα και τα κύτταρα του ξενιστή. Ορισμένα υποψήφια προβιοτικά στελέχη χαρακτηρίστηκαν επίσης από ισχυρή in vitro αντι-μικροβιακή δράση έναντι τόσο των παθογόνων L. monocytogenes των σαλιγκαριών, όσο και πλήθους παθογόνων των τροφίμων. Η ικανότητα των προβιοτικών L. plantarum Sgs14 και SgmB στελεχών να εισέρχονται μέσω της τροφής στον γαστρεντερικό σωλήνα των σαλιγκαριών και να ασκούν ισχυρή ανοσοτροποιητική και αντιβακτηριακή δράση συσχετίστηκε με αυξημένη ικανότητα αφομοίωσης τη προσλαμβάνουσας τροφής και αυξημένο ρυθμό αύξησης των σαλιγκαριών.Η λοιμογονικότητα των L. monocytogenes στελεχών των σαλιγκαριών χαρακτηρίστηκε από υψηλή ετερογένεια. Η ετερογένεια αυτή αποτυπώθηκε τόσο στο διαφορετικό βαθμό λοιμογονικότητας μεταξύ των στελεχών, όσο και στις διαφορές που εντοπίστηκαν σε γονιδιωματικό επίπεδο, μέσω της ανάλυσης των ηλεκτροφορητικών προτύπων περιορισμού (PFGE), και της αλληλούχισης του γονιδιώματος των στελεχών (WGS). Με βάση τα ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών τα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως υπερ-λοιμογόνα, λοιμογόνα ή μη λοιμογόνα. H υπερλοιμογονικότητα συσχετίστηκε με την ικανότητα των στελεχών να αντιστέκονται στην αντιμικροβιακή δράση του ορού της αιμολέμφου, να εισέρχονται στα αμοιβαδοκύτταρα και να τροποποιούν τις ανοσοαποκρίσεις του ξενιστή. Ως απόκριση στην παρουσία τους στην αιμόλεμφο των σαλιγκαριών παρατηρήθηκε υπέρμετρη αύξηση των αμοιβαδοκυττάρων, των υαλινοκυτταρων αλλά και νεκρών κυττάρων στην αιμολέμφο των σαλιγκαριών, με το βαθμό απόκρισης να συσχετίζεται με τη λοιμογονικότητα των στελεχών. Η ικανότητα των υπερ-λοιμογόνων στελεχών να διαφεύγουν της ανασοαπόκρισης συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να καταστέλλουν τη φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων και να επάγουν ανοσοαποκρίσεις που ενισχύουν τη λοιμογονική τους δράση, όπως η απόπτωση των κυττάρων της αιμολέμφου, η ενεργοποίηση του μονοπατιού της φαινολοξειδάσης και η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) και νιτρικών οξειδίων (ΝΟ-). Σε γονιδιωματικό επίπεδο η λοιμογονικότητα ή μη των στελεχών συνδέθηκε εν μέρει με τη παρουσία και τη λειτουργία του MogR μεταγραφικού καταστολέα της έκφρασης της φλαγγελίνης. Με βάση τη συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση, όλα τα λοιμογόνα στελέχη χαρακτηρίστηκαν από την παρουσία πλήρους λειτουργικής αλληλουχίας του γονιδίου mogR. Σε αντίθεση, στο γονιδίωμα του μη λοιμογόνου στέλεχος SOUR εντοπίστηκε πρόωρο κωδικόνιο λήξης οδηγώντας σε μετατόπιση του αναγνωστικού πλαισίου και στη κωδικοποίηση ενός μικρότερου μη λειτουργικού πεπτιδίου. Τέλος στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκε για πρώτη φορά ένα ζωικό μοντέλο δυσβίωσης και αναβίωσης στα σαλιγκάρια C. aspersum maxima. H με L. monocytogenes SN3-επαγώμενη δυσβίωση χαρακτηρίστηκε από αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας (>70%) και από ένα ειδικό κλινικοπαθολογικό φαινότυπο που περιλαμβάνει μορφολογικές αλλοιώσεις του εντερικού επιθηλίου, αύξηση των κυττάρων της βλέννας στο εντερικό επιθήλιο και στα κόπρανα των σαλιγκαριών, καθώς και έντονες συστημικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις στην αιμόλεμφο των σαλιγκαριών. Η χορήγηση του προβιοτικού στελέχους των σαλιγκαριών L. plantarum Sgs14, το οποίο χαρακτηρίστηκε από αυξημένη αντι-βακτηριακή και ανοσοτροποποιητική δράση, ανέστειλε την εμφάνιση των παραπάνω κλινικοπαθολογικών συμπτωμάτων και μείωσε τα ποσοστά θνησιμότητας πάνω από 50% συμβάλλοντας στην αναβίωση των οργανισμών. Συμπερασματικά, οι πληροφορίες που παρουσιάζονται στη διατριβή συμβάλλουν στην κατανόηση των έμφυτων μηχανισμών άμυνας που έχουν αναπτύξει οι ασπόνδυλοι οργανισμοί, όπως τα χερσαία γαστερόποδα, προκειμένου να αλληλεπιδρούν τόσο με τα στελέχη της αυτόχθονης μικροχλωρίδας τους όσο και με παθογόνους μικροοργανισμούς. Ταυτόχρονα για πρώτη φορά αναδεικνύεται η δυνατότητα χρήση των σαλιγκαριών ως ζωικών μοντέλων για τη διερεύνηση της δράσης υποψήφιων προβιοτικών στελεχών καθώς και δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών.