The role of the E(spl) bHLH-Orange genes in Tribolium castaneum embryogenesis
Authors: Kux Kristina 
Published: January 2014

Οι πρωτεΐνες E(spl)/Hes bHLH-Orange είναι μια υποκατηγορία της οικογένειας των bHLH μεταγραφικών παραγόντων με σημαντικούς ρόλους σε πληθώρα αναπτυξιακών διαδικασιών των μεταζώων. Η χαρακτηριστική bHLH δομική περιοχή τους αποτελείται από ένα βασικό τμήμα (b: basic) που χρησιμεύει για πρόσδεση στο DNA και μια HLH (Helix-Loop-Helix) περιοχή απαραίτητη για ομο- ή ετεροδιμερισμό. Η επιπρόσθετη περιοχή Orange (επιφάνεια αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεïνών) και το καρβοξυτελικό WRPW αμινοξικό μοτίβο (αλληλεπίδραση με συγκαταστολείς της μεταγραφής) αποτελούν χαρακτηριστικά των E(spl)/Hes πρωτεϊνών και τις κατατάσσουν στην υπο-ομάδα Ε των bHLH. Οι εν λόγω πρωτεΐνες δρουν ως μεταγραφικοί καταστολείς προσδενόμενες στο μοτίβο EB (CACGTG) και σε παραλλαγές αυτού (CACGCG και CACNAG) που εντοπίζονται σε ενισχυτές γονιδίων-στόχων. Για τη ρύθμιση της μεταγραφής οι E(spl)/Hes bHLH-Orange αλληλεπιδρούν με προνευρικές πρωτεΐνες της ομάδας Α. Η καταστολή συχνά διαμεσολαβείται από το μονοπάτι σηματοδότησης Notch, όπως για παράδειγμα κατά την διαδικασία της πλευρικής αναστολής στην εμβρυϊκή νευρογένεση της Δροσόφιλας ή κατά τη ρυθμική σωμιτογένεση των σπονδυλωτών. Παρά την σημασία τους στην ανάπτυξη της Δροσόφιλας και των σπονδυλωτών, τα ομόλογα των E(spl) πρωτεϊνών δεν έχουν μελετηθεί σε άλλα αρθρόποδα. Σε αυτή την εργασία μελετήσαμε λεπτομερώς την λειτουργία των E(spl) κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του κολεόπτερου εντόμου Tribolium castaneum, το οποίο έχει μία πιο “βασική” φυλογενετική τοποθέτηση από τη Δροσόφιλα. Το γονιδίωμα του Tribolium κωδικοποιεί δύο ομόλογα των E(spl), τα οποία ονομάζουμε Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται σε συνεχή διάταξη στο γονιδίωμα μαζί με ένα ομόλογο της οικογένειας bearded και τέσσερα ακόμα γονίδια, οι ρυθμιστικές περιοχές των οποίων περιλαμβάνουν πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Su(H), καθώς επίσης και θέσεις πρόσδεσης miRNA (k-box και brd-box) που δείχνουν ότι αποκρίνονται στο Notch. Η δομή των δύο πρωτεϊνών είναι πανομοιότυπη στην περιοχή bHLH και πολύ καλά συντηρημένη με τα δροσοφιλικά ομόλογα E(spl) mγ και mβ. Η περιοχή Orange διαφέρει περισσότερο μεταξύ των Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 και μόνο η Tc E(spl)1 δείχνει ομολογία με τις Δροσοφιλικές mγ και mβ. Κατά την εμβρυογένεση τα Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 έχουν παρόμοια έκφραση στο κοιλιακό νευροεκτόδερμα (VNC) σε ένα πρότυπο που αντικατοπτρίζει την πλευρική αναστολή. Η ευρεία έκφρασή τους συμπίπτει χωροχρονικά με την έκφραση του Tc ASH και προηγείται της έκφρασης του ase στους νευροβλάστες. Εντούτοις η έκφραση των Tc E(spl) και Tc ASH διαφέρει καθώς η έκφραση των E(spl) δεν εντοπίζεται στον κεντρικό νευροβλάστη αλλά περιορίζεται στα κύτταρα που τον περιβάλλουν. Επιπροσθέτως, το Tc E(spl)1 εκφράζεται στο οπίσθιο άκρο της ζώνης ανάπτυξης. Άρα σύμφωνα με το ρόλο τους στην πλευρική αναστολή, οι λειτουργικές μας μελέτες δείχνουν ότι τα γονίδια Tc E(spl) ρυθμίζονται τόσο από το Notch όσο και από τη δράση των προνευρικών γονιδίων. Συγκεκριμένα, η μείωση της δράσης του Notch οδηγεί σε νευρογόνο φαινότυπο, η πλευρική αναστολή καταστέλλεται και οι προνευρικοί συναθροισμοί αποκτούν την αναπτυξιακή τύχη του νευροβλάστη. Κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο Tribolium η ρυθμιζόμενη από Notch πλευρική αναστολή καθορίζει το πρότυπο του εμβρυϊκού VNC. Επιπλέον, ανωμαλίες στην κοιλιακή περιοχή δείχνουν έναν επιπρόσθετο ρόλο του Notch. Δείξαμε ότι η έκφραση του twist, που καθορίζει τη μεσοδερμική τύχη, αλλάζει σε Notch RNAi έμβρυα και οι μεταμερείς λωρίδες έκφρασης του engrailed ακολουθούν σε κοντινή απόσταση υποδεικνύοντας ένα ρόλο του Notch στην μεταμεριδίωση. Παρά το ότι ταυτόχρονη μείωση της δράσης των E(spl)1 and E(spl)3 προσομοιάζει την μείωση του Notch υποδεικνύοντας ότι η πλευρική αναστολή διαμεσολαβείται από τα E(spl), είδαμε ότι μείωση της δράσης του κάθε γονιδίου μεμονωμένα ήταν ικανή να δώσει νευρογόνους φαινότυπους. Το E(spl)1 RNAi δεν έχει καμία επίδραση στη εμβρυϊκή ανάπτυξη, ενώ το E(spl)3 RNAi προκαλεί έντονους κοιλιακούς φαινοτύπους με αλλαγή στην έκφραση του twist παρόμοια με το Notch RNAi. Οι κοιλιακοί φαινότυποι παρουσιάζουν παρόμοια συχνότητα και διεισδυτικότητα με αυτούς που προκαλούνται από το Notch RNAi, γεγονός που υποδεικνύει ότι η φυσιολογική μεταμερική ανάπτυξη επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης ενεργότητας των E(spl) από το Notch. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το E(spl)3 είναι ο κύριος ρυθμιστής σε αυτή τη διαδικασία, ενώ το E(spl)1 δεν είναι απολύτως απαραίτητο. Τέλος, εκφράσαμε εκτοπικά διαγονίδια Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 στη Δροσόφιλα και είδαμε ότι και τα δύο αποτελούν δραστικούς καταστολείς σε δύο καλά χαρακτηρισμένα συστήματα στους αναπτυξιακούς δίσκους των φτερών: (α) στον καθορισμό των εξωτερικών αισθητηρίων οργάνων, δηλαδή των μικρο- και μακροχαιτών του θώρακα και των χαιτών του εμπρόσθιου περιθωρίου του φτερού, και (β) στη δημιουργία των φλεβώσεων του φτερού. Επιπλέον, πειράματα σε κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες του Tribolium μπορούν να δράσουν τόσο με απ’ευθείας πρόσδεση στο DNA, όσο και αλληλεπιδρώντας με προνευρικές πρωτεΐνες που προσδένονται στο DNA. Οι Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 αλληλεπιδρούν με την ενεργοποιητική περιοχή της προνευρικής πρωτεΐνης Scute, αλλά μόνο η Tc E(spl)1 έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Daughterless. Αυτό καταδεικνύει την αμινοξική διαφοροποίηση της περιοχής Orange που κάνει το Tc E(spl)1 να μοιάζει με τις E(spl) της Δροσόφιλας που έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με Daughterless. Παρότι το Tc E(spl)3 δεν αλληλεπιδρά με Daughterless, είναι ένας ισχυρός καταστολέας σε όλες τις περιπτώσεις που ελέγχθηκαν υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση αυτή δεν είναι απαραίτητη για καταστολή, όπως συμβαίνει και στη Δροσόφιλα.