Μελέτη του συμπλόκου αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA με μεθόδους λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων σε ανθρώπινα κύτταρα και της εμπλοκής αυτού στην καρκινογένεση
Authors: Συμεωνίδου Ιωάννα-Ελένη 
Published: August 2021

Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 και περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προ-αντιγραφικών συμπλοκών στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 οι οποίες έχουν ενεργότητα ελικάσης. Σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία συσσωρεύεται κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και απαιτείται για τη στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στα μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin, η οποία εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ, αποτελεί αναστολέα του παράγοντα Cdt1 και προσδένεται σε αυτόν παρεμποδίζοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 επάγει την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος συμβάλλοντας στην ογκογένεση. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων μαστού. Από την ανάλυση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, γεγονός που καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως διαγνωστικού βιοδείκτη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του συγκεκριμένου παράγοντα δείχθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με την παρουσία ή μη οιστρογονικών (ER) και προγεστερονικών υποδοχέων (PR). Επίσης, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 καθώς και του υποδοχέα HER2/neu. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 ενδέχεται να αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης στον όγκο μαστού. Επιπλέον η ανάλυση κατέδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε όγκους θετικούς για τον υποδοχέα HER2/neu σε σύγκριση με τα περιστατικά που δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα. Δεδομένου ότι στο 95% των περιπτώσεων όγκων μαστού όπου διαπιστώνεται υπερέκφραση του υποδοχέα HER2/neu, αυτή οφείλεται σε ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου, διερευνήθηκε κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί λειτουργική επίπτωση της ογκογόνου δράσης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού. Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Έχει δειχθεί ότι η ανθεκτικότητα στο φάρμακο αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή ενίσχυση του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (DHFR). Συνεπώς, είναι πιθανό η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 να συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Αρχικά αναπτύχθηκε ένα σύστημα μελέτης το οποίο βασίζεται στις μεθόδους FRAP και FLIP και επιτρέπει τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM και κατ’ επέκταση τη χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Η ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1, καθώς οι πρωτεΐνες MCM παρουσιάζουν πιο σταθερή αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη. Επίσης, διαπιστώθηκε σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1, περαιτέρω πρόσδεση μορίων MCM στο τέλος της φάσης αυτής και σταδιακή αποδέσμευση αυτών από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S. Πειράματα FLIP αποκάλυψαν ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Οι περιοχές αυτές αυξάνονται σε αριθμό με την πρόοδο της φάσης G1 και ελαττώνονται με την εξέλιξη της φάσης S. Η παρατήρηση των υποπεριοχών αυτών κατά τη φάση S κατέδειξε ότι δεν συμπίπτουν με τις υποδομές της πρωτεΐνης PCNA, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 δεν εντοπίζονται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχαν ως αποτέλεσμα τη μείωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 κατά τη διάρκεια της φάσης G1, καθώς και την αποσταθεροποίηση των ήδη δεσμευμένων μορίων στο τέλος της φάσης αυτής. Επίσης, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας καταδείχθηκε η πιθανή αξία του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού και προγνωστικού βιοδείκτη στον όγκο μαστού. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης, παρατήρηση που προτείνει ένα νέο μηχανισμό ογκογόνου δράσης του παράγοντα αυτού. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διαπιστώθηκε ότι η κινητική των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αλλάζει κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S. Επίσης, η πρωτεΐνη Geminin δείχθηκε ότι απαιτείται για την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη και για την πρόοδο των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S, παρατήρηση που καταδεικνύει ένα πιθανό θετικό ρόλο της πρωτεΐνης Geminin στην αντιγραφή του DNA.