Otimização do protocolo de vitrificação e estabelecimento do sistema de cultivo in vitro para o tecido ovariano de cutias (dasyprocta leporina)
Authors:   , Praxedes Érica Camila Gurgel 
Published: December 2024

As cutias são mamíferos silvestres que apresentam importantes funções ecológicas por serem dispersadoras de sementes, além de contribuírem para o equilíbrio da cadeia alimentar. Esses animais são utilizados como modelo experimental tanto para o aperfeiçoamento de técnicas reprodutivas, quanto para a formação de bancos de germoplasma. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi utilizar a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) como ferramenta para o resgate e conservação do uso de gametas femininos de cutias (Dasyprocta leporina). A tese foi dividida em dois capítulos experimentais. No primeiro experimento foi analisado o uso do TCM-199 suplementado com diferentes concentrações de pFSH (10 e 50 ng/mL) sobre a morfologia, desenvolvimento e viabilidade de folículos ovarianos pré-antrais (FOPAS) inclusos em tecido ovariano. Em seguida, verificou-se o efeito desse sistema de cultivo in vitro (CIV) sobre os mesmos parâmetros dos FOPAS previamente à vitrificação. Após o cultivo, o grupo FSH50 apresentou maior porcentagem de folículos morfologicamente normais quando comparado ao grupo FSH10 (P < 0,05). Além disso, essa mesma resposta foi observada para os folículos primordiais. Independentemente das concentrações de FSH utilizadas durante o CIV, não foi observada diferença em relação ao percentual de folículos viáveis (P > 0,05). Assim, o grupo FSH50 foi utilizado para experimento posterior, no qual um total de 76,2 ± 7,2% de PAFs normais previamente vitrificados foi observado após a cultivo de 6 dias, apresentando os maiores valores (P < 0,05) para a morfologia dos folículos primordiais (95,2 ± 4,7 %). Contudo, o cultivo manteve a viabilidade dos FOPAS derivados de tecidos criopreservados (P > 0,05). No segundo experimento, os ovários de oito fêmeas foram recuperados e fragmentados, com quatro fragmentos de córtex imediatamente fixados e avaliados (grupo fresco). Os demais fragmentos foram processados pelo método de vitrificação de superfície sólida (SSV) ou ovarian tissue cryosystem (OTC) usando soro fetal bovino (SFB), etilenoglicol (EG) e sacarose (SAC) como crioprotetores, armazenados por duas semanas a -196 ºC e aquecidos. Posteriormente, os fragmentos foram submetidos a um cultivo in vitro de 24 h e avaliados quanto à carga microbiológica, morfologia dos FOPAS e integridade do DNA. Não houve contaminação fúngica; entretanto, as amostras vitrificadas de dois indivíduos apresentaram contaminação bacteriana de 79.200 unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC) / mL para SSV e 3.120 UFC / mL para OTC. Em relação à morfologia dos FOPAS, ambos os sistemas proporcionaram preservação adequada da morfologia, com valores superiores a 70% dos folículos normais observados antes e após a cultivo. O TUNEL revelou que tanto a SSV (52,39%) quanto o OTC (41,67%) podem preservar a integridade do DNA após a vitrificação e após 24 h de cultivo. Para a proliferação celular, baixas taxas foram detectadas para amostras frescas (11,53%) e SSV (29,87%); contudo, nenhuma evidência de proliferação foi encontrada quando OTC foi usado. Assim, o uso da MOIFOPA em cutias permitiu a conservação através da vitrificação em superfície sólida e utilizando o sistema OTC, bem como apresentou resultados promissores para o cultivo in vitro de FOPAS inclusos em tecido ovariano previamente vitrificados