Wild boar as a source of selected emerging and re-emerging pathogens
Authors: Τουλούδη Αντωνία 
Published: August 2021

ΠΕΡΙΛΗΨΗΚεφάλαιο 1 – ΕισαγωγήΗ εισαγωγή της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει την ανασκόπηση των σύγχρονων δεδομένων για σημαντικά ιογενή, βακτηριακά και παρασιτικά νοσήματα των αγριόχοιρων, με έμφαση στη διάγνωσή τους, καθώς και την περιγραφή νέων διαγνωστικών τεχνολογιών και συγκεκριμένα των μικροσυστοιχιών και της πολυσύνθετης δοκιμής μαγνητικών σφαιριδίων.Κεφάλαιο 2 – Μία ορολογική μελέτη για επιλεγμένα παθογόνα στους ελληνικούς αγριόχοιρουςΟ σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να διερευνηθεί η συχνότητα της οροθετικότητας των αγριογούρουνων από διάφορες περιοχές της Ελλάδας έναντι 10 επιλεγμένων παθογόνων, σημαντικών για τα οικόσιτα ζώα ή τον άνθρωπο και να συσχετιστούν τα αποτελέσματα με περιβαλλοντικούς παράγοντες, που παρέχονται μέσω συστήματος γεωγραφικών πληροφοριών (ΣΓΠ). Εξετάστηκαν δείγματα ορών, που συλλέχθηκαν από 94 αγριόχοιρους κατά τη διάρκεια των κυνηγετικών περιόδων 2006-2010. Οι ορολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εμπορικά διαθέσιμες έμμεσες ανοσοενζυματικές δοκιμές ανοσοπροσρόφησης (ELISA) για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του κυκλοϊού-2 του χοίρου, του ιού του αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου του χοίρου (ΑΑΣΧ), του ιού της νόσου του Aujeszky, της γρίπης τύπου Α των χοίρων, των βακτηρίων Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Salmonella spp και του παρασίτου Trichinella spp και ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFAT) για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παρασίτων Toxoplasma gondii and Neospora caninum. Οι περιοχές απ’ όπου συλλέχθηκαν τα δείγματα, τοποθετήθηκαν στο πεδίο με τη χρήση του παγκοσμίου συστήματος εντοπισμού θέσης ή με τη χρήση πληροφοριών γεωγραφικού μήκους και πλάτους. Ένα ψηφιακό επίπεδο πληροφοριών δημιουργήθηκε ώστε να αντιπροσωπεύει τις γεωγραφικές θέσεις συλλογής των δειγμάτων καθώς και τη θέση των πλησιέστερων αγροκτημάτων ημιεκτατικής εκτροφής χοίρων. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση της διασποράς της οροθετικότητας για τουλάχιστον ένα από τα εξεταζόμενα παθογόνα. Επίσης διερευνήθηκε τυχόν συσχετισμός μεταξύ της οροθετικότητας για κάθε παθογόνο ξεχωριστά με το φύλο των αγριόχοιρων, διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες (υψόμετρο, απόσταση από το κοντινότερο αγρόκτημα ημιεκτατικής εκτροφής χοίρων, χρήση και κάλυψη της γης) καθώς και με την πυκνότητα του πληθυσμού των αγριόχοιρων. Αντισώματα έναντι του κυκλοϊού-2 του χοίρου, του ιού του ΑΑΣΧ, του ιού της νόσου του Aujeszky, των ιών γρίπης τύπου Α των χοίρων, των A. pleuropneumoniae, M. hyopneumoniae, Salmonella spp, Trichinella spp, T. gondii και N. caninum ανιχνεύθηκαν σε ποσοστό 19,1%, 12,8%, 35,1%, 1,1%, 57,4%, 0%, 4,3%, 6,4%, 5,2% και 1,1% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Η ανάλυση διασποράς κατέδειξε ως περιοχές έντονης οροθετικότητας, τις περιοχές που συνορεύουν με τη Βουλγαρία. Η οροθετικότητα έναντι του ιού της νόσου του Aujeszky ήταν μεγαλύτερη στους θηλυκούς αγριόχοιρους ενώ δε βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της οροθετικότητας και των περιβαλλοντικών παραγόντων ή της πυκνότητας του πληθυσμού των αγριόχοιρων, με μόνη εξαίρεση το ΑΑΣΧ που φαίνεται να συσχετίζεται οριακά (p=0.05) με την κάλυψη γης (υψηλότερη οροθετικότητα σε καλλιεργήσιμες και διαχειριζόμενες περιοχές). Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν έκθεση των αγριόχοιρων στα περισσότερα από τα παραπάνω παθογόνα, γεγονός που δημιουργεί υπόνοια πως το ζωικό αυτό είδος μπορεί να αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για τα οικόσιτα ζώα ή τη Δημόσια Υγεία.Κεφάλαιο 3 – Ανάπτυξη μιας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) για την ανίχνευση ορολογικών αντιδράσεων έναντι των ειδών Brucella, παρεμποδίζοντας τη διασταυρούμενη αντίδραση με την Yersinia enterocolitica O:9 σε οικόσιτους χοίρους και αγριόχοιρους.Ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η ανάπτυξη μιας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων με 3 αντιγόνα [εκχύλισμα λιποπολυσακχαρίτη κυτταρικού τοιχώματος Brucella R φάσης (rLPS), ολόκληρο κύτταρο Brucella S φάσης (B. suis 1330 smooth) και ολόκληρο κύτταρο Yersinia enterocolitica O:9.] η οποία να διαχωρίζει τα Brucella οροθετικά από τα Brucella οροαρνητικά ζώα και να ανιχνεύει τις διασταυρούμενες αντιδράσεις με την Y. enterocolitica O:9.Χρησιμοποιήθηκαν 126 οροί οικόσιτων χοίρων οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε 3 ομάδες. Η ομάδα Α (Brucella θετικοί) περιελάμβανε 29 ορούς από μολυσμένους και θετικούς στην καλλιέργεια χοίρους. Συγκεκριμένα, 25 από αυτά τα ζώα, προερχόμενα από την Ισπανία, ήταν μολυσμένα από το στέλεχος B.suis biovar 2 και τέσσερα, προερχόμενα από τη Νότιο Αμερική, ήταν μολυσμένα από το στέλεχος B. suis biovar 1. Η ομάδα Β (Brucella αρνητικοί) περιελάμβανε 80 τυχαία επιλεγμένους ορούς από χοίρους από τη Μεγάλη Βρετανία, η οποία είναι απαλλαγμένη από τη νόσο. Η ομάδα Γ περιελάμβανε 17 ορούς από κοπάδια της Μεγάλης Βρετανίας, που βρέθηκαν ψευδώς θετικοί, ύστερα από εξέταση με κοινές ορολογικές τεχνικές. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν 49 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία, οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες. Η ομάδα Α (Brucella οροθετικοί) περιελάμβανε 18 ορούς, ενώ η ομάδα Β (Brucella οροαρνητικοί) περιελάμβανε 31 ορούς.Το αντιγόνο rLPS ανίχνευσε 26 από τους 29 Brucella θετικούς οικόσιτους χοίρους (23/25 μολυσμένους από Β. suis biovar 2 και 3/4 μολυσμένους από B.suis biovar 1), ενώ όλοι οι ψευδώς θετικοί οροί (17/17) και 75/80 Brucella αρνητικοί οροί ήταν αρνητικοί. Το ίδιο αντιγόνο ανίχνευσε 15/18 οροθετικούς αγριόχοιρους, ενώ ήταν αρνητικό για όλους τους οροαρνητικούς (31/31). Το αντιγόνο B. suis 1330 ανίχνευσε όλους τους θετικούς οικόσιτους χοίρους (29/29), ήταν αρνητικό για όλους τους αρνητικούς (80/80), αλλά ήταν θετικό για 13/17 ψευδώς θετικούς ορούς. Στους αγριόχοιρους, το ίδιο αντιγόνο ανίχνευσε όλους τους οροθετικούς (18/18) και ήταν αρνητικό για 30/31 οροαρνητικούς. Τέλος, η αναλογία των τιμών διάμεσης έντασης φθορισμού (MFI) μεταξύ του αντιγόνου B. suis 1330 και του αντιγόνου της Y. enterocolitica O:9 διαχώρισε πλήρως τους Brucella θετικούς οικόσιτους χοίρους από τους ψευδώς θετικούς (ευαισθησία:100%, ειδικότητα:100%).Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη δυνατότητα εφαρμογής της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων για την επιτήρηση της βρουκέλλωσης στους οικόσιτους χοίρους και στους αγριόχοιρους, καθώς και την ικανότητά της να ανιχνεύει τη διασταυρούμενη αντίδραση με την Y. enterocolitica στους οικόσιτους χοίρους.Κεφάλαιο 4 – Η διαγνωστική αξία μίας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) και μίας τεχνολογίας μικροσυστοιχιών (microarray technology) ως οροδιαγνωστικών εργαλείων για την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παθογόνων Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis στους αγριόχοιρους.Ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να εκτιμηθεί η διαγνωστική αξία δύο πολυσύνθετων τεχνικών, μίας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) και μίας τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών (serology microarray), για την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παθογόνων Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis και να συγκριθούν τα αποτελέσματά τους με δύο συμβατικές τεχνικές ανοσοενζυμικής ανοσοπροσρόφησης (“in house” ELISA), μία για τη φυματίωση και μία για τη βρουκέλλωση, καθώς και με μία εμπορικά διαθέσιμη ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά της τριχινέλωσης στους αγριόχοιρους.Εκατόν εξήντα εννιά οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία με γνωστό ορολογικό προφίλ φυματίωσης (64 θετικοί, 105 αρνητικοί) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του multiplex bead assay και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του serology microarray. Για τον ίδιο σκοπό, χρησιμοποιήθηκαν 68 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία με γνωστό ορολογικό προφίλ για την βρουκέλλωση (29 θετικοί, 39 αρνητικοί) και 118 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία και την Ελλάδα με γνωστό ορολογικό προφίλ για την τριχινέλλωση (21 οροθετικοί, 97 οροαρνητικοί).Τα αντιγόνα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του multiplex bead assay ήταν ένα ανασυνδυασμένο αντιγόνο MPB83 για τη φυματιώση, ολόκληρο κύτταρο Brucella S φάσης (B. suis 1330) για τη βρουκέλλωση και το E/S T. spiralis για τη τριχινέλλωση. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η διαγνωστική αξία μίας ήδη ανεπτυγμένης τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών (serology microarray), η οποία περιείχε 116 διαφορετικά αντιγόνα, μεταξύ των οποίων ήταν και τα παραπάνω, για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι 63 ιϊκών, βακτηριακών και παρασιτικών παθογόνων. Λόγω του ότι δεν υπάρχουν εμπορικά διαθέσιμες ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι της βρουκέλλωσης και της φυματίωσης των αγριόχοιρων, αναπτύξαμε στο εργαστήριο δυο τεχνικές ELISA (“in house” ELISA), χρησιμοποιώντας στη μία το αντιγόνο MPB83 και στην άλλη το B. suis 1330. Τα αποτελέσματα του κάθε αντιγόνου (MPB83, B. suis 1330 , E/S T. spiralis) συγκρίθηκαν μεταξύ των ορολογικών τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν (πολλαπλή τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων, τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών, ELISA), καθώς και μεταξύ των ορολογικών τεχνικών και των μεθόδων αναφοράς.Η πολλαπλή τεχνική μαγνητικών σφαιριδίων διαχώρισε τους οροθετικούς στη φυματίωση αγριόχοιρους από τους οροαρνητικούς με ευαισθησία 98,4% και ειδικότητα 85,7%, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τη βρουκέλλωση ήταν 100% και 97,4% και για την τριχινέλλωση 90,5% και 99%. Ομοίως, η ευαισθησία και η ειδικότητα τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών ήταν ικανοποιητικές (92% και 92,4% για τη φυματίωση, 100% και 91,7% για τη βρουκέλλωση και 75% και 98,7% για την τριχινέλλωση, αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα και των δύο τεχνικών δεν διέφεραν στατιστικά από τις μεθόδους αναφοράς, με μόνη εξαίρεση τα αποτελέσματα της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων για τη φυματίωση, αλλά ούτε από τα αποτελέσματα της ELISA.Κεφάλαιο 5 – Καταληκτικά σχόλια και μελλοντικές έρευνεςΣτο κεφάλαιο αυτό συνοψίζονται οι λόγοι για τους οποίους είναι απαραίτητη η διαρκής παρακολούθηση της έκθεσης των αγριόχοιρων σε διάφορους παθογόνους παράγοντες, σε εθνικό επίπεδο, καθώς και η διαγνωστική αξία της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων και της τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών.