Development of computational methods to investigate the stochastic dynamic behavior of microbial communities
Authors: Μπαλωμένος Αθανάσιος 
Published: April 2021

Η ανάπτυξη μεθόδων και εργαλείων πληροφορικής για την αξιοποίηση των κυτταρικών ταινιών (cell movies) που να επιτρέπουν την ακριβή εξαγωγή των χαρακτηριστικών των βακτηρίων σε επίπεδο του μεμονωμένου κυττάρου (single-cell), την οπτικοποίηση και τη στατιστική μοντελοποίηση αυτών των χαρακτηριστικών, καθώς και την διεξαγωγή πειραμάτων ανάπτυξης μικροβιακών κοινοτήτων in silico, μέσω ρεαλιστικής προσομοίωσης, αποτελεί σήμερα πρόκληση του τομέα της υπολογιστικής συστημικής μικροβιολογίας. Στη διεθνή βιβλιογραφία απαντώνται μέθοδοι που αναλύουν κυτταρικές ταινίες με βακτήρια και ποσοτικοποιούν την πληροφορία που εξάγεται από χρονοσειρές εικόνων που απεικονίζουν αναπτυσσόμενες μικροβιακές αποικίες. Παραταύτα αυτές οι μέθοδοι μειονεκτούν σε αρκετά σημεία, π.χ. παρουσιάζουν χαμηλά ποσοστά επιτυχίας κατάτμησης πολύπλοκων κυτταρικών ταινιών με χιλιάδες κύτταρα, ενώ συχνά απαιτούν λεπτομερή παραμετροποίηση και έτσι χαρακτηρίζονται ως μη φιλικές προς το χρήστη-βιολόγο. Επιπλέον είναι σαφής η έλλειψη μιας ενιαίας υπολογιστικής στρατηγικής (pipeline), ικανής να αναλύει αυτόματα κυτταρικές ταινίες, να χαρακτηρίζει με αξιόπιστο τρόπο τη στοχαστικότητα στις κυτταρικές ιδιότητες, να παρέχει δυνατότητες οπτικοποίησης της κυτταρικής ποικιλομορφίας, αλλά και να επιτρέπει τη ρεαλιστική προσομοίωση της συμπεριφοράς μικροβιακών κοινοτήτων, λαμβάνοντας υπόψιν την εγγενή στοχαστικότητα των βιολογικών φαινομένων. Βασικό στόχο της εν λόγω διδακτορικής διατριβής λοιπόν αποτέλεσε η ανάπτυξη μιας τέτοιας ενιαίας στρατηγικής με τρία στάδια για τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς μικροβιακών κοινοτήτων. Το πρώτο στάδιο αποτελεί η ανάπτυξη αυτοματοποιημένης μεθόδου ανάλυσης κυτταρικών ταινιών, η οποία συλλέγει και οργανώνει ιεραρχικά την εξαγόμενη πληροφορία χωρίς να απαιτείται η παρέμβαση του ανθρώπου-χρήστη. Το δεύτερο στάδιο περιλαμβάνει τη δημιουργία ενός πληροφοριακού συστήματος (single-cell analytics and visualization platform) το οποίο επιτρέπει στο χρήστη να χαρακτηρίζει στατιστικά και να οπτικοποιήσει με διαφορετικούς τρόπους τις εξαγόμενες πληροφορίες από την ανάλυση εικόνας. Το τρίτο στάδιο υποστηρίζει την ανάπτυξη ενός πρότυπου «ψηφιακού διδύμου» που προσομοιώνει την ανάπτυξη μικροβιακών κοινοτήτων λαμβάνοντας υπόψιν την εγγενή στοχαστικότητα του φαινομένου αλλά και τις συνθήκες του μικροπεριβάλλοντος. Αρχικά, αναπτύχθηκε πρωτότυπη μέθοδος αντιστοίχισης κυττάρων (cell tracking) μεταξύ συνεχόμενων στιγμιότυπων εικόνας (frames) κυτταρικών ταινιών και δημιουργίας δέντρων κυτταρικής γενεαλογίας (cell lineage tree construction). Η μέθοδος αυτή μπορεί να παρακολουθεί και να ποσοτικοποιεί τις ιδιότητες των κυττάρων (π.χ. κυτταρική επιφάνεια, μήκος, πλάτος κ.α.) ανά γενιά και απεικία. Η πολύ μεγάλη ακρίβεια αντιστοίχισης βακτηρίων που επιτυγχάνεται (98,7%) είναι υψηλότερη σε σύγκριση με αυτή των υπαρχόντων μεθόδων. Κατά τη διάρκεια της κατάτμησης και της παρακολούθησης των βακτηρίων (δηλαδή με τη δημιουργία των δέντρων κυτταρικής γενεαλογίας), η προτεινόμενη μεθοδολογία ανάλυσης κυτταρικών ταινιών παράγει πληθώρα «μεγάλων δεδομένων» (“big data”), τα οποία χαρακτηρίζουν κάθε μεμονωμένο κύτταρο σε κάθε χρονική στιγμή (στιγμιότυπο εικόνας) μιας πολύπλοκης κυτταρικής ταινίας με πιθανά εκατοντάδες στιγμιότυπα και χιλιάδες κύτταρα. Δημιουργήθηκε λοιπόν ένα ολοκληρωμένο σύστημα ανάλυσης υψηλής ακρίβειας το οποίο συμβάλλει καθοριστικά στην πρόοδο της συστημικής βιολογίας και της ανάλυσης δεδομένων μεγάλης κλίμακας, όπως οι ταινίες ανάπτυξης βακτηριακών κοινοτήτων πολλαπλών στιγμιότυπων. Με την ολοκλήρωση των παραπάνω σταδίων, είχε αναπτυχθεί πλέον μια ολοκληρωμένη μέθοδος ανάλυσης κυτταρικών ταινιών, η οποία έλαβε την κωδική ονομασία BaSCA (Bacterial Single-Cell Analytics). Το σύστημα BaSCA αξιολογήθηκε ενδελεχώς και επετεύχθη ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό F-measure, 98%, γεγονός που αποδεικνύει την ευρωστία (robustness) του αλγορίθμου κατάτμησης. Σε σχέση με υπάρχοντα λογισμικά, το BaSCA επιτυγχάνει σημαντικά υψηλότερο ποσοστό F-measure στα δεδομένα από διαφορετικά εργαστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην αξιολόγηση. Το ποσοστό F-measure παραμένει πολύ υψηλό (πάνω από 96.7%) ακόμα και για πολύπλοκες ταινίες που παρουσιάζουν μεγάλο συνωστισμό βακτηρίων. Η πληροφορία που μπορεί να εξαχθεί από την ανάλυση ταινιών, οργανώνεται σε σχεσιακή βάση βιοδεδομένων (relational bio-database), που επιτρέπει την εξόρυξη πληροφοριών από τα δεδομένα σε επίπεδο μεμονωμένων κύτταρων (single-cell analytics). Ένα ακόμα καινοτόμο χαρακτηριστικό, είναι η δυνατότητα δημιουργίας διαφορετικών «όψεων» στα δεδομένα, με στόχο την άμεση και φιλική οπτικοποίηση της πληροφορίας (visual analytics). Με τον τρόπο αυτό το σύστημα επιτρέπει στο χρήστη να επιλέγει υποπληθυσμούς (αποικίες, γενιές, συγγενείς στο δέντρο) και να διεξάγει στατιστικές αναλύσεις και εκτιμήσεις κατανομών. Επιπλέον για να επεκτείνουμε τις δυνατότητες οπτικοποίησης του BaSCA, η εργασία αυτή υποστήριξε και τη δημιουργία R πακέτου που ονομάστηκε ViSCAR (Visualization and Single-Cell Analytics in R). Με στόχο την υλοποίηση in silico μοντελοποίησης της ανάπτυξης μικροβιακών κοινοτήτων σε δύο διαστάσεις με ρεαλιστικά και ατομοστραφή μοντέλα (Individual-based models), τροποποιήθηκε και επεκτάθηκε σημαντικά το λογισμικό ανοιχτού κώδικα Cellmodeller. Έτσι διαμορφώθηκε ένα ευέλικτο υπολογιστικό περιβάλλον στο οποίο μπορούμε να «προγραμματίζουμε» διαφορετικές συμπεριφορές κυττάρων, και να προσομοιώνουμε την ανάπτυξη μιας ποικιλόμορφης κοινωνίας ενόσω αυτά αλληλεπιδρούν στοχαστικά κάτω από διαφορετικές συνθήκες μικροπεριβάλλοντος και πιθανά αλλάζουν φαινότυπο δυναμικά. Έτσι, κατέστη δυνατή η in silico προσομοίωση μικροβιακών κοινοτήτων που αναπτύσσονται με βάση στοχαστικά ατομοστραφή μοντέλα εξέλιξης για κάθε κύτταρο που εισέρχεται στη προσομοίωση. Δημιουργήθηκε ένας «ψηφιακός δίδυμος» (digital twin) μικροβιακής κοινότητας και εφαρμόστηκε η προτεινόμενη ενιαία στρατηγική για την περίπτωση της Σαλμονέλλας (Salmonella enterica serovar Typhimurium). Επιπλέον, ενσωματωθήκαν στα ατομοστραφη μοντέλα τα ρυθμιστικά δίκτυα γονιδιακής έκφρασης (gene regulatory networks) που αφορούν το μηχανισμό διακυτταρικής χημικής επικοινωνίας (quorum sensing), τον μηχανισμό ανάπτυξης της λοιμοτοξικότητας (virulence) της S. typhimurium, αλλά και την μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Στη προσομοίωση λαμβάνεται υπόψη η εγγενής στοχαστικότητα που διέπει την ανάπτυξη και διαίρεση των μεμονωμένων βακτηρίων, η οποία επηρεάζει την αλλαγή φαινοτυπικής κατάστασης των κυττάρων ως προς τη λοιμοτοξικότητα. Επιβεβαιώθηκε έτσι η πρακτική εφαρμογή της ενιαίας προτεινόμενης στρατηγικής (pipeline) που είναι ικανή να αναλύει αυτόματα κυτταρικές ταινίες από πειράματα μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων (live cell imaging), να απεικονίζει με αποτελεσματικό τρόπο και να εξάγει στατιστικά μοντέλα για τα χαρακτηριστικά των κυττάρων σε αυτές. Επιπλέον επιδείχθηκε πως τα μοντέλα αυτά συμβάλουν στη δημιουργία ρεαλιστικών συνθετικών ταινιών που προσομοιώνουν στοχαστικά τη δυναμική συμπεριφορά μικροβιακών κοινοτήτων στο χώρο και στο χρόνο, όπως αυτές του παθογόνου S. typhimurium, σε μικροπεριβάλλον που οδηγεί στην αλλαγή φαινοτυπικής κατάστασης (phenotypic switching) κύτταρα που το καθένα ακολουθεί τη δική του εξατομικευμένη «λογική».