Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται στις συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού (CAKUT)
Authors: Μητσιώνη Άρτεμις 
Published: January 2014

Οι συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού συστήματος ανευρίσκονται περίπου στο 0,5% όλων των κυήσεων και αποτελούν την πλέον συχνή αιτία τελικού σταδίου χρόνιας νεφρικής νόσου στα βρέφη και μικρά παιδιά. Περίπου το 30-40% των παιδιών με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια ή τελικού σταδίου νεφρική ανεπάρκεια εμφανίζουν συγγενείς ανωμαλίες του ουροποιητικού. Από τις πιο συχνές είναι η κυστεοουρητηρική παλινδρόμηση (ΚΟΠ), η οποία συχνά συνοδεύεται από νεφρική υποπλασία/δυσπλασία (ΝΥΔ). Έως σήμερα η κληρονομικότητα και η παθογένεια αυτών των ανωμαλιών δεν έχει εξακριβωθεί. Το γονίδιο ROBO2 συμμετέχει στο αρχικό στάδιο της νεφρογένεσης που χαρακτηρίζεται από την επαγωγή ανάπτυξης της ουρητηρικής καταβολής (ΟΚ). Ωστόσο, δεν υπάρχει ομοφωνία στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με την συμμετοχή αυτού του γονιδίου στην παθογένεια της ΚΟΠ.ΣκοπόςΟ σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι ο έλεγχος για την ύπαρξη μεταλλάξεων του γονιδίου ROBO2 σε παιδιά με ΚΟΠ και ΚΟΠ-ΝΥΔ. Επιπλέον ελέγχθηκαν in silico παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν επιγενετικά την έκφραση του γονιδίου. Υλικά και μέθοδοι Ελέγχθηκαν για νουκλεοτιδικές αλλαγές 103 παιδιατρικοί ασθενείς: 65 με ΚΟΠ (10 με οικογενή ΚΟΠ) και 38 με ΚΟΠ-ΝΥΔ. Επιπλέον ελέγχθηκαν 200 παιδιά παρόμοιας ηλικίας και φύλου με τους ασθενείς που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου.Η ανάλυση στους ασθενείς πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ή MRF-SSCP (Multiple Restriction Fragment-SSCP), σε δύο διαφορετικές συνθήκες. Στα δείγματα που τα πρότυπα ζωνώσεων απέκλιναν από το φυσιολογικό, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αλληλουχίας DNA (DNA sequencing). Η ομάδα ελέγχου ελέγχθηκε με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ή με MRF-SSCP. Πραγματοποιήθηκε στατιστική (χ2 τέστ) και in silico ανάλυση για τις νουκλεοτιδικές αλλαγές που βρέθηκαν (ESEfinder και SplicePort). In silico ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης για την περιεκτικότητα του γονιδίου σε CpG νησίδες (EMBOSS CpGPlot), την ομολογία του με miRNAs (miRBase) και την περιεκτικότητα του σε μεταθετά στοιχεία (UCSC Genome Bioinformatics, RepeatMasker).Αποτελέσματα Από την ανάλυση του γονιδίου, εντοπίστηκαν δύο πολυμορφισμοί: o IVS1-53G>A (rs9874095) και ο IVS5-31A>G (rs76571990). Για τον IVS1-53, το χ2 τεστ έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά υπέρ των μαρτύρων και η in silico ανάλυση έδειξε ότι δεν επηρεάζεται η αντίστοιχη περιοχή ματίσματος. Ο IVS5-31 ο οποίος αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία, παρόλο που είναι καταγεγραμμένος στη βάση δεδομένων, βρέθηκε μόνο σε έναν ασθενή. Τα in silico αποτελέσματα για την επίδραση του στο μάτισμα του mRNA έδειξαν αλλαγή της σύνδεσης δύο SR πρωτεϊνών (ESEfinder) και δύο επιπλέον αλληλουχίες δέκτες (SplicePort), επομένως πιθανότατα αυτός ο πολυμορφισμός επηρεάζει το μάτισμα. Όσο αφορά την περιεκτικότητα του γονιδίου σε CpG νησίδες φέρει συνολικά οκτώ, μεγέθους >200 νουκλεοτίδια. Η αλληλουχία του ROBO2 έχει ομολογία με 17 ώριμα και 60 ανώριμα miRNAs. Μεγαλύτερη βαθμολογία και e-value<0,1 παρουσιάζουν 3 ώριμα και 25 ανώριμα. Η στοίχιση στα ώριμα έχει διαφορά από 1-3 νουκλεοτίδια ενώ στα ανώριμα miRNAs, τα περισσότερα έχουν διαφορά >10 νουκλεοτίδια. Η περιεκτικότητα του γονιδίου ROBO2 σε μεταθετά στοιχεία είναι 25,9% συμπεριλαμβανομένου των DNA τρανσποζονίων (4,55%), τα οποία όμως μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν σε κάποια βιολογική διεργασία. ΣυμπεράσματαΟι νουκλεοτιδικές αλλαγές του γονιδίου ROBO2 δε βρέθηκε να είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση ΚΟΠ ή ΚΟΠ-ΝΥΔ στον πληθυσμό της μελέτης, ενισχύοντας την υποκείμενη γενετική ετερογένεια αυτών των νοσημάτων. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις του γονιδίου ROBO2 συσχετίζονται με την παρουσία ΚΟΠ, η παρούσα μελέτη δεν επιβεβαίωσε μια τέτοια συσχέτιση, υπογραμμίζοντας το γεγονός ότι η ΚΟΠ και η ΚΟΠ-ΝΥΔ είναι πολυπαραγοντικά νοσήματα. Ωστόσο, εκτός από τις αλλαγές στη αλληλουχία του DNA, η έκφραση του γονιδίου μπορεί να επηρεαστεί επιγενετικά από παράγοντες όπως είναι η μεθυλίωση, μέσω των CpG νησίδων, τα miRNAs ή τα μεταθετά στοιχεία. Από τα αποτελέσματα της μελέτης βρέθηκε ότι το γονίδιο ROBO2 είναι πιθανό να επηρεάζεται από αυτούς τους παράγοντες, καθώς (1) περιέχει οκτώ CpG νησίδες, (2) έχει ομολογία με υψηλή στοίχιση με 3 ώριμα miRNAs και με μικρότερη με 25 ανώριμα miRNAs και (3) το 21,35% της αλληλουχίας του είναι μεταθετά στοιχεία. Αυτοί οι παράγοντες ρύθμισης είναι πιθανό να μειώνουν την έκφραση του γονιδίου, ή να το αποσιωπούν, και έτσι να συμβάλουν στην εμφάνιση των ανωμαλιών που μελετήθηκαν, παρά την απουσία συγκεκριμένων νουκλεοτιδικών αλλαγών. Συνολικά, από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η προσέγγιση των συγγενών ανωμαλιών του ουροποιητικού στον άνθρωπο είναι εξαιρετικά δύσκολη και θα πρέπει να επικεντρωθεί σε πιο ολοκληρωμένα μοντέλα μελέτης, με κυτταρικές σειρές ή όπου είναι δυνατόν να μελετηθεί ιστός από νεφρικές βιοψίες.