Ο ογκογενετικός ρόλος του σηματοδοτικού μορίου STAT3 στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος
Authors: Γκούβερης Ιωάννης 
Published: August 2021

Ο ογκογενετικός ρόλος του σηματοδοτικού μορίου STAT3 στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος.Γκούβερής ΙωάννηςΟ καρκίνος του στόματος είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο και η επίπτωση των νέων περιπτώσεων δείχνει μια συνεχή αύξηση στις αναπτυσσόμενες χώρες. Πολλές γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις διέπουν την προοδευτική απόκτηση ενός κακοήθους φαινοτύπου στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα κεφαλής-τραχήλου ( Head and Neck Squamous Cell Carcinoma-HNSCC). Η διαρκής διερεύνηση της ανώμαλης σηματοδότησης μορίων που συμπεριλαμβάνουν τα EGFR, Ras, NF-κB, Wnt/β-catenin, TGF-β και PI3K-AKT-mTOR μονοπάτια, έχει αυξήσει την κατανόηση των βασικών μηχανισμών ελέγχουν την εξέλιξη του HNSCC.Τα πρωτεϊνικά μόρια STAT (signal transducers and activators of transcription - διαβιβαστές σημάτων και ενεργοποιητές της μεταγραφής) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που βρίσκονται στο κύτταρο σε λανθάνουσα μορφή και γίνονται ενεργοί ανταποκρινόμενοι σε ερεθίσματα από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες και πεπτίδια. Η φωσφορυλίωση των STAT μορίων στην τυροσίνη αποτελεί το πρώτο ουσιαστικό βήμα για την ενεργοποίησή τους και συσχετίζεται άμεσα με την ικανότητα των STAT να συνδέονται με το DNA και να επάγουν μεταγραφική δραστηριότητα. Σε αντίθεση, η φωσφορυλίωση του STAT στη σερίνη, η οποία επίσης προκύπτει ως απάντηση σε ενεργοποίηση από αυξητικούς παράγοντες ή κυτταροκίνες, έχει συσχετιστεί με αρνητική ρύθμιση της STAT δράσης. Η STAT σηματοδότηση έχει εμπλακεί και στην ογκογένεση. Ειδικότερα, η ιδιοσυστασιακή ενεργοποίηση του STAT3, η οποία συσχετίζεται κυρίως με ανώμαλη σηματοδότηση μέσω των TGF-a/EGFR, έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με την εξέλιξη και επέκταση του καρκίνου κεφαλής-τραχήλου.Οι ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικές κινάσες (Mitogen-activated protein kinases, MAPK) είναι εξειδικευμένες κινάσες σερίνης/ θρεονίνης, που ανταποκρίνονται σε εξωκυττάρια ερεθίσματα (μιτογόνα) και ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η έκφραση γονιδίων, η μίτωση, η διαφοροποίηση, η κυτταρική επιβίωση και η απόπτωση. Οι ΜAP κινάσες (ΜΑPK) φωσφορυλιώνουν μόρια σερίνης και θρεονίνης σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες στόχους. Διαιρούνται σε τρεις υποομάδες, που περιλαμβάνουν τις ΕRKs (extracellular signal regulated kinases, τις p38 ΜAPKs, και τις JNKs (c-jun NH2-terminal κινάσες). Προηγούμενες μελέτες υποστηρίζουν τη σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης συγκεκριμένων μελών της οικογενείας ΜΑΡΚ και αρνητικής ρύθμιση των STAT3, η οποία εκδηλώνεται με την αρνητική ρύθμιση της STAT3 φωσφορυλίωση στην τυροσίνη και την επαγωγή της φωσφορυλίωσης στη σερίνη, σε διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και καρκινικών κυττάρων.ΣΚΟΠΟΣΟ σκοπός της παρούσας έρευνας είναι να αξιολογήσει κατά πόσον η ογκογόνος ιδιοσυστασιακή σηματοδότηση της STAT3 σε κύτταρα ακανθοκυτταρικού καρκινώματος του στόματος (Oral Squamous Cell Carcinoma-OSCC), μπορεί να τροποποιηθεί με τη ρύθμιση συγκεκριμένων ΜΑΡΚ. Επίσης καταγράφηκαν η έκφραση και η κατάσταση ενεργοποίησης των STAT3 και MAPK σε κυτταρικές σειρές HNSCC και μελετήθηκαν οι επιδράσεις της επιλεκτικής αναστολής ή ενεργοποίησης των MAPKs στη STAT3 σηματοδότηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σε μια προσπάθεια να φωτιστούν σημαντικές μοριακές πτυχές του καρκίνου του στόματος με πιθανά θεραπευτικά οφέλη.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣΚυτταρικές σειρές: Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο (2) κυτταρικές σειρές ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας (ΑΚΣ) του ανθρώπου. Συγκεκριμένα αγοράστηκαν οι σειρές 9 και 25 από την American Type Culture Collection (ATCC, τύποι 9 και 25) (Manassas, VA, USA).Φαρμακευτική αναστολή των MAPK: Στα κύτταρα χορηγήθηκε είτε μόνο το μέσο(DMSO) είτε ο ειδικός για κάθε MAPK αναστολέας (JNK1/2- SP600125, p38-SB203580, Erk1/2-U0126) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις για 24 ώρες.Φαρμακευτική επαγωγή των MAPK: Στα κύτταρα χορηγήθηκε είτε μόνο το μέσο (DMSO) είτε ο ειδικός για κάθε MAPK επαγωγέας (active Mek1/2-Erk1/2, active MKK7-JNK1/2) (ProSpec, Israel σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις για 48 ώρες.Διαμόλυνση με siRNA: H αποσιώπηση (silencing) της έκφρασης των JNK1/2 και ERK1/2 βασίστηκε σε αναγνωρισμένες ακολουθίες αναφοράς της τράπεζας γονιδίων NCBI (GenBank:Erk1: NM_002746 and Erk2: NM_002745) και εφαρμόστηκε η τεχνική της παροδικής διαμόλυνσης με λιποφεκταμίνη 2000(Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η διαμόλυνση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του ειδικού μηχανήματος διαμόλυνσης (electroporator) Amaxa Nucleofector II (Amaxa Biosystems-Lonza, Cologne, Germany). Ανάλυση κατά Western: Κατά την πειραματική διαδικασία με Western blot χρησιμοποιήθηκαν τα εξής αντισώματα: total STAT3, phospho-STAT3 (Tyr705), phospho-STAT3 (Ser727), total p44/42(Erk1/2) total p38, total JNK1/2, phospho-p38, phospho-c-Jun, cyclin D1 (Cell Signaling, Beverly, MA,USA), phospho-Erk1/2 (Upstate, Charlottesville, VA, USA), cyclin D1 (Cell Signaling) and β-actin (Sigma Chemical).Κυτταρική αύξηση και βιωσιμότητα: Η βιωσιμότητα και ο απόλυτος αριθμός των κυττάρων υπό δοκιμασία μετρήθηκε με την μέθοδο αρνητικής χρώσης trypan blue και μικροσκοπική παρατήρηση σε ανάστροφο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, με την βοήθεια κοινού αιματοκυτταρομέτρου εις τετραπλούν.Ανοσοϊστοχημική ανάλυση: Xρησιμοποιήθηκαν ιστοί ακανθοκυτταρικού καρκινώματος του στόματος, που προέρχονται από το αρχείο του Εργαστηρίου Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών (60 περιπτώσεις) που ταξινομήθηκαν σε 3 ομάδες των 20 περιπτώσεων με βάση το βαθμό διαφοροποίησης (υψηλής, μέτριας, χαμηλής). Διερευνήθηκε η έκφραση των εξής 5 πρωτεϊνών : phospho-STAT3 (Tyr705)(1:100), phospho-STAT3 (Ser727) (1:100), phospho-cJun (1:100), phospho-ERK1/2(1:100), phospho-p38(1:100). Στατιστική ανάλυση: Οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των μεταβολών του ποσοστού βιωσιμότητας και του αριθμού των ζωντανών κυττάρων ανά εφαρμοζόμενη συγκέντρωση φαρμάκου (αναστολέα, επαγωγέα, siRNA) εκτιμήθηκαν με τη δοκιμασία του Fisher. Οι πιθανές συσχετίσεις των ανοσοϊστοχημικών μεταβλητών μεταξύ των τριών ομάδων διαφοροποίησης εκτιμήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας t-test. Οι στατιστικές διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ο δείκτης πιθανότητας p ήταν <0.05.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΑπό τη μελέτη προέκυψαν τα ακόλουθα ευρήματα:Erk1/2 αναστολή: H χημική αναστολή των Erk1/2 μετά την εφαρμογή του U0126 ήταν πιο ισχυρή στην κυτταρική σειρά SCC25 και συνδέθηκε με αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στη σερίνη STAT3 αλλά και της κυκλίνης D1, χωρίς να επηρεάζει τη φωσφορυλίωση στην τυροσίνη.Η ειδική σίγαση των ERK1/2 οδήγησε στη μείωση της STAT3 φωσφορυλίωσης στη σερίνη και της έκφρασης της κυκλίνης D1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καθώς και σε αύξηση της STAT3 φωσφορυλίωσης στην τυροσίνη ιδιαίτερα στην SCC9 κυτταρική σειρά.Τόσο η χημική αναστολή(U0126) όσο και η ειδική σίγαση των ERK1/2, οδήγησαν σε δοσοεξαρτώμενη μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων και της κυτταρικής βιωσιμότητας σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.Erk1/2 επαγωγή: η επαγωγή των Erk1 / 2 προκάλεσε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της φωσφορυλιωμένης στη σερίνη STAT3 και της κυκλίνης D1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και μείωση της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη STAT3. Επίσης, είχε ως αποτέλεσμα σημαντική δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην ανάπτυξη των κυττάρων στην υψηλότερη συγκέντρωση, η οποία ήταν περισσότερο εμφανής στην SCC9 κυτταρική σειρά. Αντιθέτως, η επαγωγή δε φαίνεται να προκαλεί αξιοσημείωτες αλλαγές στην κυτταρική βιωσιμότητα και για τις δυο κυτταρικές σειρές.JNK1/2 αναστολή: Η χημική αναστολή της ενεργοποίησης των JNK1/2 μετά την εφαρμογή του SP600125 ήταν εμφανής και στις δύο κυτταρικές σειρές και συνδέθηκε με αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη STAT3 αλλά και της κυκλίνης D1, ταυτόχρονα με μείωση στη φωσφορυλίωση της σερίνης.Η ειδική σίγαση των JNK1/2 οδήγησε στην αύξηση της STAT3 φωσφορυλίωσης στην τυροσίνη και της έκφρασης της κυκλίνης D1 καθώς και σε μείωση της STAT3 φωσφορυλίωσης στην σερίνη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Παρόμοια με τις επιπτώσεις της χημικής αναστολής με SP600125, η διαμόλυνση με siRNA κατά των JNK1/2, οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων και της κυτταρικής βιωσιμότητας σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. JNK1/2 επαγωγή: Η επαγωγή των JNK 1 / 2 προκάλεσε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της φωσφορυλιωμένης στη σερίνη STAT3 και μείωση της έκφρασης της κυκλίνης D1 και της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη STAT3, σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.Η χορήγηση ενεργού ΜΚΚ7, είχε ως αποτέλεσμα σημαντική δοσοεξαρτώμενη μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων στην υψηλότερη συγκέντρωση και για τις δυο κυτταρικές σειρές. Τέλος, η χορήγηση ενεργού ΜΚΚ7 για 24 ώρες, προκαλεί μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα ιδιαίτερα στην SCC25 κυτταρική σειρά. P38 αναστολή: Η χημική αναστολή της p38 μετά την εφαρμογή του SB203580 ήταν εμφανής και στις δύο κυτταρικές σειρές, αλλα δεν προκάλεσε αξιόλογες μεταβολές στα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της STAT3(σερίνη /τυροσίνη) ή στην έκφραση της κυκλίνης D1. Επιπρόσθετα, δε φαίνεται να έχει κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στον απόλυτο αριθμό των κυττάρων και στην κυτταρική βιωσιμότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν. Ανοσοϊστοχημείαp-STAT3(ser): Παρόλο που τα χαμηλού βαθμού διαφοροποίησης νεοπλάσματα παρουσίασαν τους υψηλότερους μέσους όρους και στις τρεις υπό μελέτη μεταβλητές, σε σύγκριση με τα καλής διαφοροποίησης περιστατικά, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. p-STAT3(tyr): Η στατιστική ανάλυση κατέδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τριών μεταβλητών της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της πρωτεΐνης p-ΕRK1/2 και του βαθμού διαφοροποίησης των όγκων (p < 0,05), με τις υψηλότερες τιμές να εμφανίζονται στα νεοπλάσματα χαμηλής διαφοροποίησης. Στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των επιμέρους κατηγοριών των νεοπλασμάτων αποκάλυψαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p < 0.05) μεταξύ των νεοπλασμάτων καλής και χαμηλής διαφοροποίησης και για τις τρεις μεταβλητές έκφρασης της πρωτεΐνης p-STAT3(tyr). p-p38: Οι μέσοι όροι των τριών μεταβλητών δεν παρουσίασαν σημαντικές αποκλίσεις σε σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των περιπτώσεων και η στατιστική ανάλυση δεν κατέδειξε σημαντικές διαφορές. p-Erk1/2: Η στατιστική ανάλυση κατέδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τριών μεταβλητών της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της πρωτεΐνης p-ΕRK1/2 και του βαθμού διαφοροποίησης των όγκων (p < 0,05), με τις υψηλότερες τιμές να εμφανίζονται στα νεοπλάσματα χαμηλής διαφοροποίησης. Στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των επιμέρους κατηγοριών των νεοπλασμάτων αποκάλυψαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p < 0,05) μεταξύ των νεοπλασμάτων καλής και χαμηλής διαφοροποίησης και για τις τρεις μεταβλητές έκφρασης της πρωτεΐνης p-STAT3(tyr). p-cJun: Οι συγκρίσεις μεταξύ των επιμέρους κατηγοριών των νεοπλασμάτων αποκάλυψαν μειωμένες τιμές και στις τρεις παραμέτρους για την πρωτεΐνη p-cJun στα νεοπλάσματα χαμηλής διαφοροποίησης. Μάλιστα η τιμή της έντασης της χρώσης ήταν χαμηλότερη σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0,05) σε σύγκριση με τα νεοπλάσματα μέτριας διαφοροποίησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας, τα δεδομένα της παρούσας εργασίας εξάγονται τα εξής συμπεράσματα:- Οι ERK1 / 2 φαίνεται να διαθέτουν ογκογόνο δυναμικό στο ΑΚΣ ασκώντας θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.- Η ογκογόνος ιδιοσυστασιακή σηματοδότηση της STAT3 φαίνεται να ρυθμίζεται αρνητικά από τις ERK1 / 2 σε κύτταρα ΑΚΣ. Η αλληλεπίδραση ERK1/2-STAT3 αφορά κυρίως στην επαγόμενη από την ΕRK φωσφορυλίωση της STAT3 στη Ser727, ενώ η φωσφορυλίωση στην Tyr 705 δεν παρουσιάζει σημαντικές μεταβολές. - Το ογκοκατασταλτικό δυναμικό των JNK1 / 2 σε ΑΚΣ υποστηρίζεται από την ανασταλτική επίδραση που ασκούν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην κυτταρική βιωσιμότητα. - Η ογκογόνος ιδιοσυστασιακή STAT3 σηματοδότηση φαίνεται ότι ρυθμίζεται αρνητικά από τη JNK στα συγκεκριμένα κύτταρα ΑΚΣ. Η αλληλεπίδραση JNK-STAT3 εκδηλώνεται μέσω της μείωσης της STAT3 φωσφορυλίωσης στην Tyr 705 και της αύξησης της φωσφορυλίωσης στη Ser727. - Η p38 MAPK εμφανίζεται να μην επηρεάζει σημαντικά τη σηματοδότηση της STAT3 και τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των κυττάρων ΑΚΣ.- Οι ΕRK1/2, p38 και p-cJun εκφράζονται έντονα στο ΑΚΣ γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία τους σε αυτόν τον τύπο καρκίνου.- Ο ρόλος των JNK, p38 και ΕRK1/2 στη λειτουργία της STAT3 ποικίλει ανάλογα με τον τύπο των μελετώμενων καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας την ανάγκη για τον ακριβή προσδιορισμό του ρόλου της ενεργοποίησης των ΜΑΡΚ σε σχέση με τη STAT3 σηματοδότηση σε κάθε τύπο κυττάρου ξεχωριστά. - Η κατανόηση της πολυπλοκότητας του μονοπατιού των ΜΑΡΚ και της αλληλεπίδρασης μεταξύ άλλων σημαντικών μορίων όπως της πρωτεΐνης STAT3 θα αποτελέσουν χρήσιμους στόχους για την εφαρμογή νέων φαρμακολογικών θεραπειών στην πρόληψη του καρκίνου.