Μελέτη των θέσεων δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος σε φυσιολογική και ατροφική ανθρώπινη παρεγκεφαλίδα
Authors: Τσιώτος Παναγιώτης 
Published: January 2014

Στη παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι ιδιότητες δέσμευσης, η επίδραση των ιόντων Cl⁻ στη δέσμευση, οι φαρμακολογικές ιδιότητες, η οντογένεση και η τοπογραφική κατανομή των θέσεων δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος σε μεμβρανικό κλάσμα παρεγκεφαλίδας ανθρώπου. Επίσης έγιναν πειράματα διαλυτοποίησης των θέσεων δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος με τη χρήση διαφόρων απορρυπαντικών, όπως το CHAPS, το Zwittergent 3-12 και η διγιτονίνη. Τέλος έγινε προσπάθεια συγκριτικής μελέτης των ιδιοτήτων της δέσμευσης του L-[³Η]γλουταμικού οξέος σε παρεγκεφαλίδα φυσιολογικών ατόμων και ατόμων που πέθαναν από ελαιογεφυρό-παρεγκεφαλιδική ατροφία. Τα αποτελέσματα των παραπάνω μελετών έχουν ως εξής: 1. Διαπιστώθηκε μια θέση δέσμευσης για το L-γλουταμικό οξύ, παρουσία ή απουσία ιόντων Cl⁻, με τιμές Κd της τάξης των 150 Χ 10⁻⁹. Η ανάλυση κατά Hill σε όλες τις περιπτώσεις έδωσε ευθεία γραμμή και η σταθερά Hill ήταν περίπου 1. Τα ιόντα Cl⁻ προκάλεσαν σημαντική αύξηση της δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος με αναλογία Cl⁻ εξαρτωμένων/ Cl⁻ ανεξάρτητων θέσεων δέσμευσης περίπου 4/1. Το L-γλουταμικό, L-ασπαρτικό, κισκαλικό, L-ομοκυστεικό και ιμποτενικό οξύ απεδείχθηκαν ισχυροί αναστολείς της ειδικής δέσμευσης του L-[³H] γλουταμικού οξέος στις μεμβρανικές θέσεις δέσμευσης του. Αντίθετα το D,L-APB, το καινικό οξύ και το NMDA ήσαν ασθενείς αναστολείς. Η δέσμευση του L-[³H] γλουταμικού οξέος έδειξε μια σημαντικού βαθμού στερεοεξειδίκευση μεταξύ των L- και D- ισομερών του γλουταμικού και ασπαρτικού. Με εξαίρεση το κισκαλικό, όλα τα ανάλογα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές της ικανότητας αναστολής παρουσία ή απουσία ιόντων Cl⁻. Παρουσία ιόντων Cl⁻ η καμπύλη αναστολής του κισκαλικού ήταν διφασική (IC50=6,30nM και 15,85μΜ), ενώ απουσία ιόντων Cl⁻ η καμπύλη αναστολής ήταν μονοφασική με τιμή IC50 παρόμοια της θέσης χαμηλής συγγένειας που παρατηρήθηκε παρουσία ιόντων Cl⁻. Η οντογενετική μελέτη της δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος στην ανθρώπινη παρεγκεφαλίδα έδειξε ότι δεν παρατηρούνται σημαντικές μεταβολές των τιμών της Kd με την ηλικία, ενώ η μεγαλύτερη τιμή Bmax παρατηρήθηκε τον 1ο χρόνο μετά τη γέννηση. Η αυτοραδιογραφική μελέτη των θέσεων δέσμευσης του L-γλουταμικού έδειξε δέσμευση στη κοκκώδη και μοριακή στοιβάδα της ανθρώπινης παρεγκεφαλίδας. Παρουσία ιόντων Cl⁻ παρατηρήθηκε αύξηση στη μοριακή στοιβάδα περίπου 2,5 φορές, ενώ απουσία ιόντων Cl⁻ η δέσμευση ήταν μεγαλύτερη στη κοκκώδη στοιβάδα. 2. Τα πειράματα διαλυτοποίησης έδειξαν ότι το Zwittergent 3-12 είναι το απορρυπαντικό που διαλυτοποιεί σε μεγαλύτερο ποσοστό τις θέσεις δέσμευσης του L-γλουταμικού οξέος σε σχέση με το CHAPS και την διγιτονίνη. 3. Στην ατροφική παρεγκεφαλίδα παρατηρήθηκε μια πολύ σημαντική ελάττωση της ειδικής δέσμευσης του L-[³Η] γλουταμικού οξέος (Bmax) παρουσία ή απουσία ιόντων Cl⁻, ενώ οι τιμές της Kd δεν μετεβλήθησαν. Οι φαρμακολογικές ιδιότητες των θέσεων δέσμευσης του L-[³H] γλουταμικού στην ελαιογεφυροπαρεγκεφαλιδική ατροφία ήσαν παρόμοιες με αυτές της φυσιολογικής παρεγκεφαλίδας. Η δέσμευση του [³H]-QNB, εκφραζόμενη σε fmoles/mg πρωτεΐνης, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ φυσιολογικής και ατροφικής παρεγκεφαλίδας.