Μελέτη της κλινικής σημασίας του ελεύθερου DNA (Free-DNA) στο περιφερικό αίμα σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις
Authors: Δεστούνη Ασπασία 
Published: January 2014

Ο κυτταρικός θάνατος (απόπτωση/νέκρωση) οδηγεί στην απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέων (ελεύθερο DNA/ελεύθερο RNA) στην περιφερική κυκλοφορία του ατόμου. Τα ελεύθερα νουκλεϊκά οξέα έχουν ανιχνευθεί στο πλάσμα υγιών καθώς και ασθενών και προέρχονται από κύτταρα που καταστρέφονται στα πλαίσια της ομοιόστασης και της νόσου, αντίστοιχα. Τα επίπεδα του ελεύθερου DNA στο πλάσμα έχουν συσχετισθεί με τη βαρύτητα και την πρόγνωση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων και μπορεί να αποτελέσουν δείκτη παρακολούθησης της ανταπόκρισης των ασθενών στη φαρμακευτική αγωγή, όπως για παράδειγμα στους ασθενείς με καρκίνο. Στόχο της παρούσας ερευνητικής προσπάθειας αποτέλεσε η διερεύνηση της κλινικής αξίας των επιπέδων του ελεύθερου DNA στο οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, στην οξεία και χρόνια φλεγμονή και στην πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα. Για το σκοπό αυτό, προτυποποίηθηκε μια ευαίσθητη και αξιόπιστη ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου στο σύστημα LightCycler (Roche) για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ελεύθερου DNA, το οποίο απομονώθηκε από δείγματα πλάσματος που συλλέχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας μελέτης. Αρχικά, προσδιορίστηκε η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα της μεθόδου (intra/inter- assay variation), ώστε να διαπιστωθεί η καταλληλότητά της για εφαρμογή στη συγκεκριμένη μελέτη. Στη συνέχεια, μετρήθηκε το ελεύθερο DNA στο πλάσμα 100 υγιών ατόμων προκειμένου να εξακριβωθεί το εύρος των φυσιολογικών τιμών. Έπειτα η μέθοδος εφαρμόστηκε για να μετρηθούν 235 δείγματα πλάσματος από 47 ασθενείς με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (ΟΕΜ) ως πρώτη εκδήλωση της στεφανιαίας νόσου καθώς και 15 δείγματα από αθλητές του «Σπάρταθλου» αγώνα δρόμου, 17 εθελοντών αθλούμενων και 39 παιδιών με πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα. Στην ομάδα των καρδιοπαθών, πραγματοποιήθηκε διαδοχική συλλογή δειγμάτων περιφερικού αίματος κατά τη διάρκεια της νοσηλείας (1 δείγμα/ημέρα νοσηλείας), προκειμένου να απομονωθεί το ελεύθερο DNA. Παράλληλα, συλλέχθηκε ορός για τη μέτρηση της CPK και της cTnI (1 δείγμα/ημέρα νοσηλείας) και προσδιορίστηκε το κλάσμα εξώθησης αριστερής κοιλίας (LVEF) την 1η μετεμφραγματική ημέρα και κατά την έξοδο από τη νοσηλεία. Στην ομάδα των Σπαρταθλητών, έγινε λήψη ενός δείγματος περιφερικού αίματος πριν την έναρξη του αγώνα, κατά τον τερματισμό και 48 ώρες μετά τη λήξη του αγώνα, με στόχο την απομόνωση ελεύθερου DNA από το πλάσμα. Ταυτόχρονα, σε αυτή την ομάδα ατόμων, ελήφθησαν δείγματα ορού για τον προσδιορισμό των επιπέδων των περιφερικών παραγόντων φλεγμονής (IL-6, CRP και SAA). Οι εθελοντικά αθλούμενοι, υποβλήθηκαν σε ένα πρωτόκολλο πολυ-αρθρικών ασκήσεων αντιστάσεως μέσω προοδευτικά αυξανόμενου προπονητικού όγκου κατά τη διάρκεια τεσσάρων προπονητικών περιόδων (Τ1 έως Τ4). Η συλλογή των δειγμάτων περιφερικού αίματος, με στόχο την απομόνωση του ελεύθερου DNA, πραγματοποιήθηκε 96 ώρες μετά από την περίοδο ηρεμίας (Το) και μετά από κάθε προπονητική περίοδο. Ταυτόχρονα, σε αυτή την ομάδα ατόμων ελήφθησαν δείγματα ορού για τη μέτρηση της CRP, της CPK και του UA. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε πως το ελεύθερο DNA είναι σημαντικά αυξημένο στους ασθενείς με ΟΕΜ καθ’ όλη τη διάρκεια της νοσηλείας τους σε σχέση με τα επίπεδα που μετρήθηκαν στα υγιή άτομα (P<0.001). Επίσης, τα επίπεδα του υπό μελέτη δείκτη είναι σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με επιπλοκές κατά τη νοσηλεία (1719.7, range 117.32-4996212.1 GenEq/ml plasma) σε σχέση με τα επίπεδα αυτών που είχαν ομαλή μετεμφραγματική πορεία έως την έξοδο από τη νοσηλεία (492.9,εύρος 56.43-4715.15 GenEq/ml plasma). Στην ομάδα των ασθενών με επιπλοκές, η συγκέντρωση του ελεύθερου DNA είναι υψηλότερη μεταξύ του ελεύθερου DNA της ημέρας μετά την επιπλοκή σε σχέση με τα επίπεδα που μετρήθηκαν την προηγούμενη και την επόμενη ημέρα (tpre vs. tc, 2.445 vs. 2.965, Ρ= 0.0171 and tpre vs. tpost 2.445 vs. 2.913, P=0.023). Επίσης, το ελεύθερο DNA φαίνεται πως έχει προγνωστική αξία στην περίπτωση της καρδιακής ανεπάρκειας (LVEF<40%). Στους αθλητές του «Σπάρταθλου» αγώνα, η στατιστική ανάλυση των μετρήσεων έδειξε πως το ελεύθερο DNA μπορεί να αποτελέσει αξιόπιστο δείκτη της οξείας φλεγμονής, καθώς μεταβάλλεται ανάλογα με τις πρωτεΐνες απόκρισης οξείας φάσης CRP και SAA. Στην περίπτωση των εθελοντικά αθλούμενων, στο μοντέλο της χρόνιας φλεγμονής, το ελεύθερο DNA φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητος δείκτης της χρόνιας επιβάρυνσης καθώς μεταβάλλεται ανάλογα με τον προπονητικό όγκο. Αντιθέτως, οι μεταβολές της CRP και του UA δεν είναι ανάλογες του προοδευτικά αυξανόμενου προπονητικού όγκου. Στην ομάδα των παιδιών με πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του ελεύθερου DNA μεταξύ των ασθενών και των υγιών παιδιών. Ωστόσο, στα παιδιά που προσήλθαν για επανεκτίμηση (έπειτα από θεραπεία), οι συγκεντρώσεις του ελεύθερου DNA είναι χαμηλότερες από αυτές της πρώτης μέτρησης (θέση πρώτης διάγνωσης). Συνεπώς, η ανάλυση των μετρήσεων έδειξε πως το ελεύθερο DNA μπορεί να αποτελέσει αξιόπιστο δείκτη της παρακολούθησης της ενδονοσοκομειακής πορείας των ασθενών με ΟΕΜ καθώς επίσης να χρησιμοποιηθεί και σαν δείκτης παρακολούθησης της έκτασης της φλεγμονής που προκαλείται από υπερπροπόνηση στους αθλητές. Τα δεδομένα της παρούσας εργασίας αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για την αξία του υπό μελέτη δείκτη. Απαιτείται όμως μελέτη με μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων, ώστε να αναδειχθεί περαιτέρω η κλινική χρήση του ελεύθερου DNA.