Νανοσωματίδια και βιοφωταυγείς ιχνηθέτες στην ανάλυση DNA
Authors: Τουμπανάκη Δήμητρα 
Published: August 2021

Η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος αποκάλυψε διαφοροποιήσεις του DNA που εμπλέκονται στην παθογένεση ασθενειών, στην προδιάθεση για διάφορες ασθένειες και στο μεταβολισμό φαρμάκων και άλλων ουσιών. Η ανίχνευση και ταυτοποίηση (γονοτύπηση) αυτών των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών αποτελεί πεδίο εντατικής έρευνας γιατί σχετίζεται άμεσα με την εύρεση νέων προγνωστικών ή διαγνωστικών δεικτών και την εφαρμογή εξατομικευμένων θεραπειών. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων μεθόδων γονοτύπησης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP), οι οποίες είναι ιδιαίτερα απλές στην εκτέλεση, έχουν χαμηλό κόστος και εκτελούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα. Οι μέθοδοι βασίζονται (α) σε βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, ο οποίος καθιστά εφικτή την άμεση οπτική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης χωρίς τη χρήση οργάνων ή (β) στη βιοφωταυγειομετρική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Στις μεθόδους ανίχνευσης με το βιοαισθητήρα αξιοποιούνται οι οπτικές ιδιότητες νανοσωματιδίων χρυσού ενώ στη βιοφωταυγειομετρική μέθοδο χρησιμοποιείται το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση ως ιχνηθέτης, σε συνδυασμό με κατάλληλο υπόστρωμα. Το Θεωρητικό μέρος της διατριβής αποτελείται από έξι κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1 περιγράφεται γενικά ο ρόλος των νανοσωματιδίων χρυσού σε αναλύσεις DNA. Αρχικά αναφέρονται οι οπτικές ιδιότητες των μεταλλικών νανοσωματιδίων και ακολουθεί η περιγραφή των νανοσωματιδίων Au, με έμφαση στις τεχνικές τροποποίησης της επιφάνειάς τους. Τέλος, παρουσιάζονται εφαρμογές τροποποιημένων νανοσωματιδίων Au σε μεθόδους ανάλυσης DNA. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται οι βιοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Αναφέρονται τα υλικά κατασκευής τους, τα συστήματα ακινητοποίησης των αναλυόμενων μορίων και οι τρόποι οπτικής ανίχνευσης και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3) παρουσιάζονται τα φαινόμενα της βιοφωταύγειας και χημειοφωταύγειας. Παρατίθενται οι συνηθέστεροι ιχνηθέτες και αναφέρεται η εφαρμογή τους σε αναλύσεις DNA. Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι οι μέθοδοι γονοτύπησης νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Περιγράφονται τα τρία διακριτά στάδια κάθε μεθόδου γονοτύπησης, δηλαδή ο πολλαπλασιασμός των αλληλουχιών-στόχων με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), η διάκριση (διαφοροποίηση) των διαφορετικών αλληλίων με κατάλληλες αντιδράσεις και οι μέθοδοι ανίχνευσης των αντίστοιχων προϊόντων. Στο Κεφάλαιο 5 παρουσιάζονται τα γονίδια και οι πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής. Αναλύθηκαν οι πολυμορφισμοί CYP2C19*2 και CYP2C19*3 στο γονίδιο CYP2C19, CYP2D6*3 και CYP2D6*4 στο γονίδιο CYP2D6, ADRA1A και ADRB3 στα αντίστοιχα γονίδια αδρενεργικών υποδοχέων, HRH2 στον προαγωγέα του γονιδίου του ισταμινικού υποδοχέα και οι HTR2A 1 και 2 στο γονίδιο του σεροτονεργικού υποδοχέα. Στο Κεφάλαιο 6 παρουσιάζονται οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής. Το Πειραματικό μέρος της παρούσας διατριβής αποτελείται από πέντε κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 7 παρατίθενται τα όργανα, τα αντιδραστήρια και τα διαλύματα, που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής εργασίας. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου η οποία συνδυάζει την αλληλομορφο-ειδική PCR τεσσάρων εκκινητών με τον προαναφερθέντα βιοαισθητήρα DNA. Η PCR τεσσάρων εκκινητών πλεονεκτεί έναντι άλλων μεθόδων στο ότι η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια του εκθετικού πολλαπλασιασμού του DNA και έτσι δεν απαιτείται ξεχωριστή αντίδραση γονοτύπησης. Όμως, μέχρι τώρα η ανάλυση των προϊόντων PCR τεσσάρων εκκινητών διεξάγεται με ηλεκτροφόρηση. Με τη χρήση βιοαισθητήρα απλοποιείται σε μεγάλο βαθμό η γονοτύπηση SNP και επιπλέον παρέχεται η δυνατότητα επιβεβαίωσης της αλληλουχίας των προϊόντων, μέσω υβριδοποίησης, σε αντίθεση με την ηλεκτροφόρηση η οποία παρέχει μόνο το μέγεθος του παραγόμενου DNA. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 9) αναπτύχθηκε μέθοδος που συνδυάζει την εξειδίκευση της αντίδραση λιγάσης στη διαφοροποίηση αλληλίων και την οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης με βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Η αντίδραση λιγάσης έχει συνδυαστεί με πληθώρα μεθόδων ανίχνευσης των προϊόντων αλλά είναι η πρώτη φορά που συνδυάζεται με βιοαισθητήρα τέτοιου τύπου. Στις προηγούμενες μεθόδους γονοτύπησης μέσω βιοαισθητήρων ξηρών αντιδραστηρίων, απαιτούνται δύο αισθητήρες για τον προσδιορισμό του γονοτύπου ενός δείγματος. Στην προσπάθειά για περαιτέρω απλοποίηση των μεθόδων γονοτύπησης αναπτύχθηκε (Κεφάλαιο 10) πρωτότυπος βιοαισθητήρας DNA για την ταυτόχρονη ανίχνευση δύο αλληλίων με έναν αισθητήρα. Ο νέος βιοαισθητήρας συνδυάστηκε με την αντίδραση λιγάσης. Τέλος, η ανάπτυξη φωταυγειομετρικής μεθόδου γονοτύπησης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης (Κεφάλαιο 11) κρίθηκε αναγκαία για την ανάλυση πληθώρας δειγμάτων ταυτόχρονα με προοπτική πλήρους αυτοματοποίησης. Οι μέθοδοι οι οποίες αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της διατριβής εφαρμόστηκαν επιτυχώς στη γονοτύπηση πολυμορφισμών γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό φαρμάκων ή γονιδίων αδρενεργικών, ισταμινικών και σεροτονεργικών υποδοχέων.