Πρωτεϊνική μηχανική και μοριακή μελέτη του ενζύμου τρανσφεράση της γλουταθειόνης
Authors: Περπεροπούλου Φερενίκη 
Published: September 2021

Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) αποτελούν μια σημαντική υπερ-οικογένεια ενζύμων και υπάρχουν σχεδόν σε όλους τους οργανισμούς (προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς) ως ισοένζυμα διαφορετικής εκλεκτικότητας. Πρόκειται για πολυλειτουργικά ένζυμα, τα οποία συμμετέχουν στο μηχανισμό αποτοξίνωσης του κυττάρου, αδρανοποιώντας ενδογενείς ή εξωγενείς τοξικές ενώσεις, μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικού δεσμού με την γλουταθειόνη. Τα σύμπλοκα που δημιουργούνται είναι λιγότερο τοξικά και πιο υδατοδιαλυτά, με αποτελέσμα να απεκρίνονται πιο εύκολα από τον οργανισμό. Ωστόσο, οι ρόλοι τους δε περιορίζονται μόνο στην αποτοξίνωση, αφού συμβάλλουν και σε άλλες λειτουργίες, όπως η μεταφορά και αποθήκευση διάφορων υδρόφοβων μορίων. Επιπλέον, παίζουν σημαντικό ρόλο σε διαφόρων ειδών καταπονήσεις, όπως καταπόνηση από βαρέα μέταλλα, ακτινοβολία, καθώς επίσης βιοτικό και αβιοτικό στρες, κ.α. Τα συγκεκριμένα ένζυμα βρίσκονται στο επίκεντρο της έρευνας, καθώς βρίσκουν πολλές εφαρμογές σε διάφορους τομείς, όπως η βιοτεχνολογία, η ιατρική, η γεωπονία κ.α. Στο πρώτο μέρος της διατριβής, σχεδιάστηκαν και μελετήθηκαν αρχέγονες μορφές του ενζύμου. Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση GST αλληλουχιών από Glycine max, Agrobacterium tumefaciens καθώς και GSTs διάφορων οργανισμών, με σκοπό να γίνει in silico σχεδιασμός αρχέγονων αλληλουχιών με τη χρήση του προγράμματος FastML. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του in silico σχεδιασμού, σχεδιάστηκαν τέσσερα αρχέγονα ένζυμα (N1 Ancient, N10 AtuGST, N20 Ancient & N1 Tau), προκειμένου να μελετηθούν τα κινητικά και δομικά τους χαρακτηριστικά. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλουχία του οργανισμού Thermosynechococcus elongates, ενός θερμόφιλου μονοκύτταρου κυανοβακτηρίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ένζυμο TeGST δεν εμφανίζει σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα υπόλοιπα αρχέγονα ένζυμα που μελετήθηκαν, όσον αφορά στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά τους.Το επόμενο κεφάλαιο της εργασίας αφορά τη μελέτη GSTs της tau τάξης από φυτικούς οργανισμούς και πιο συγκεκριμένα από φυτά σόγιας (Glycine max) και φασολιού (Phaseolus vulgaris), καθώς επίσης και μεταλλαγμένες μορφές του ενζύμου. Αρχικά, μελετήθηκε το ισοένζυμο GSTU2-2 από φασόλι καθώς επίσης και δυο μεταλλαγμένα ισοένζυμα του ίδιου οργανισμού (PvGSTU2-2.1 και PvGSTU2-2.10). Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση τους με τριάντα οκτώ διαφορετικά φυτοφάρμακα για την εύρεση πιθανών αναστολέων, προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές (Km, kcat) για τα υποστρώματα 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB) και γλουταθειόνη (GSH) και, τέλος, μελετήθηκαν για τη θερμική τους σταθερότητα. Όσον αφορά στις φυτοπροστατευτικές ενώσεις, το ισοένζυμο PvGSTU2-2.1 αναστέλλεται σημαντικά από την ένωση Teflubenzuron. Έτσι, υποβλήθηκε σε περαιτέρω μελέτη, προκειμένου να προσδιοριστεί η τιμή IC50, ο τύπος αναστολής καθώς επίσης και η σταθερά αναστολής Ki. Τέλος, πραγματοποιήθηκε επίλυση και ανάλυση της κρυσταλλικής δομής της μεταλλαγμένης μορφής PvGSTU2-2.1 με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, τα αποτελέσματα της οποίας έδειξαν ότι το ένζυμο δημιουργεί οκταμερή. Στο ίδιο κεφάλαιο, μελετήθηκε το ένζυμο GSTU8-8 από Glycine max. Οι κινητικές παράμετροι έδειξαν ότι το συγκεκριμένο ένζυμο έχει πολύ υψηλή συγγένεια ως προς τα δυο υποστρώματα που μελετήθηκαν. Επίσης, μελετήθηκε η εξειδίκευση του ως προς άλλα πιθανά υποστρώματα και φάνηκε ότι πρόκειται για ένα ένζυμο με ευρεία εκλεκτικότητα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη για να εξακριβωθεί ο ρόλος του σε μη καταλυτικές λειτουργίες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι είναι ικανό να δεσμεύει ενώσεις που δεν είναι υποστρώματα του. Τέλος, η μελέτη της θερμοσταθερότητας υπέδειξε ότι πρόκειται για ένα από τα πιο θερμοσταθερά ένζυμα της τάξης tau. Στον τελευταίο άξονα της διατριβής μελετήθηκαν δυο ένζυμα GSTs από καμήλα (Camelus dromedarius), διαφορετικών τάξεων, το CdGSTP1-1 και το CdGSTM1-1, και χαρακτηρίστηκαν τα κινητικά και δομικά τους χαρακτηριστικά, η θερμοσταθερότητά τους, καθώς και η εκλεκτικότητά τους έναντι διάφορων υποστρωμάτων και διάφορων φυτοπροστατευτικών ενώσεων. Τα δυο ένζυμα φάνηκε να υπακούουν στην εξίσωση κινητικής των Michaelis-Menten και δε φάνηκε να είναι ιδιαίτερα θερμοανθεκτικά. Η μελέτη ως προς τις μη καταλυτικές τους λειτουργίες έδειξε ότι δεν εμφάνισαν ιδιαίτερη ικανότητα δέσμευσης ξενοβιοτικών ενώσεων, που δεν λειτουργούν ως υποστρώματα. Τα δυο ένζυμα φάνηκε να εμφανίζουν ευρεία εκλεκτικότητα. Η μελέτη φυτοφαρμάκων ως πιθανών αναστολέων έδειξε ότι το CdGSTM1-1 αναστέλλεται πλήρως από το μυκητοκτόνο Zoxium zoxamide. Έτσι, μελετήθηκε περαιτέρω και προσδιορίστηκε η τιμή IC50, ο τύπος αναστολής καθώς επίσης και οι σταθερές αναστολής. Τέλος, μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά του ενζύμου CdGSTM1-1 ύστερα από επίλυση και ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του ενζύμου με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και φάνηκε ότι το ένζυμο εμφανίζει την κλασσική δομή των GSTs. Τέλος, επιλέχθηκε το ισοένζυμο με τα πιο επιθυμητά χαρακτηριστικά, προκειμένου να κατασκευαστεί ένας ενζυμικός βιοαισθητήρας, ικανός να ανιχνεύει μια φυτοπροστατευτική ένωση από δείγματα νερού. Η μεταλλαγμένη μορφή PvGSTU2-2.1, η οποία εμφάνισε εξαιρετική θερμοσταθερότητα και υψηλή αναστολή ως προς το Teflubenzuron επιλέχθηκε να ακινητοποιηθεί. Έπειτα από την επιτυχή ακινητοποίηση, μελετήθηκαν τα κινητικά χαρακτηριστικά της ακινητοποιημένης μορφής, η τιμή IC50, η επαναληψιμότητα των μετρήσεων, η ικανότητα ανίχνευσης της ένωσης σε δείγματα νερού και ο χρόνος ζωής του βιοαισθητήρα.