Ρύθμιση της έκφρασης και σχέσεις δομής-λειτουργίας μεταφορέων πουρινών
Authors: Γουρνάς Χρήστος 
Published: September 2021

Η παρούσα διατριβή είχε ως σκοπό τη διερεύνηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας και του μηχανισμού μετα-μεταφραστικής ρύθμισης της έκφρασης του UapA μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του Aspergillus nidulans, πρότυπου μέλους της οικογένειας μεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων-Ασκορβικού οξέος (Nucleobase-Ascorbate Transporters, NAT). Για την περαιτέρω διερεύνηση και καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας του UapA, μελετήθηκε ο ρόλος τριών συντηρημένων πολικών αμινοξικών καταλοίπων, των Glu356, Gln382 και Lys439. Τα κατάλοιπα αυτά υποκαταστάθηκαν με in vitro στοχευόμενη μεταλλαξιγένεση σε αμινοξικά κατάλοιπα με πλευρικές ομάδες παρόμοιου α) δομικού ή β) λειτουργικού χαρακτήρα, και γ) ουδέτερου χαρακτήρα ως προς το φορτίο ή την ικανότητα αλληλεπίδρασης. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν υποκαταστάσεις σε αμινοξικά κατάλοιπα που βρίσκονται στις συγκεκριμένες θέσεις των πρωτοταγών αλληλουχιών άλλων μεταφορέων της οικογένειας ΝΑΤ με γνωστή λειτουργία. Τα μεταλλαγμένα αλλήλια μελετήθηκαν εκτεταμένα με δοκιμασίες ανάπτυξης, μικροσκοπία επιφθορισμού και μελέτες πρόσληψης ραδιοσημασμένου υποστρώματος για τον καθορισμό των αλλαγών της λειτουργίας και κινητικής τους συμπεριφοράς. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν υποδηλώνουν πως τα Gln382 και Lys439 δεν είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του μεταφορέα αφού δεν συμμετέχουν σημαντικά στον καθορισμό των κινητικών του χαρακτηριστικών. Το Glu356, απολύτως συντηρημένο στην οικογένεια, είναι απολύτως απαραίτητο για την ικανοποιητική ταχύτητα μεταφοράς των υποστρωμάτων, ενώ φαίνεται να συμμετέχει, άμεσα ή έμμεσα, στη δέσμευση των υποστρωμάτων και σε λειτουργικές αλληλεπιδράσεις κατά την ολοκλήρωση του κύκλου μεταφοράς. Όσον αφορά τη μετα-μεταφραστική ρύθμιση του μεταφορέα, μελετήθηκαν το φαινόμενο της αρνητικής του ρύθμισης από τα υποστρώματά του και ο μηχανισμός ενδοκύτωσής του μέσω ουβικουιτινυλίωσης. Πιο συγκεκριμένα, δείχθηκε πως ο UapA, κατά την προσθήκη υποστρωμάτων του στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, ενδοκυτώνεται από την πλασματική μεμβράνη του μύκητα μέσω διαλογής στα ενδοσώματα και τελικά οδηγείται στο χυμοτόπιο προς αποικοδόμηση. Χρήση αναλόγων υποστρώματος και μεταλλαγμένων αλληλίων πλήρους απώλειας λειτουργίας έδειξαν πως η ενδοκύτωση είναι απολύτως εξαρτώμενη της λειτουργίας του μεταφορέα. Απαραίτητη είναι αυτή καθαυτή η μεταφορά του υποστρώματος δια μέσου αυτού και όχι απλώς η δέσμευση αναλόγων υποστρωμάτων που δεν μεταφέρονται. Η χρήση στελεχών που φέρουν μεταλλαγές που επηρεάζουν τη λειτουργία του θετικού μεταγραφικού ρυθμιστή του μονοπατιού καταβολισμού πουρινών, UaY, έδειξε πως η μεταγραφική αυτή επαγωγή δεν σχετίζεται με την ενδοκύτωση από υπόστρωμα. Χρήση στελέχους που φέρει μεταλλαγή πλήρους απώλειας λειτουργίας της ουρικάσης έδειξε πως υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις ουρικού οξέος δεν αποτελούν σήμα για την ενδοκύτωση του UapA. Η συγκέντρωση του ουρικού οξέος στο συγκεκριμένο στέλεχος μετρήθηκε με χρήση HPLC να είναι 10 περίπου φορές μεγαλύτερη από αυτή στελέχους φυσικού τύπου και 20 φορές από την ελάχιστη που είναι ικανή να προκαλέσει ενδοκύτωση όταν παρασχεθεί εξωκυτταρικά. Τέλος, η μελέτη της ενδοκύτωσης από υπόστρωμα μεταλλαγμένων μορφών του μεταφορέα με τροποποιημένη κινητική ή/και εξειδίκευση επιβεβαίωσε περαιτέρω την αναγκαιότητα μεταφοράς για την πρόκληση ενδοκύτωσης, ενώ έδωσε ενδείξεις πως το σήμα για την ενδοκύτωση προκαλείται από δυναμικές δομικές διαμορφώσεις του μεταφορέα κατά την ολοκλήρωση του κύκλου μεταφοράς. Σχετικά με το μηχανισμό που πραγματοποιείται η ενδοκύτωση, μελετήθηκε η εμπλοκή της HulARsp5 λιγάσης της ουβικουιτίνης. Πραγματοποιήθηκε απαλοιφή του γονιδίου της HulA, η οποία αποδείχθηκε θνησιγόνος, αλλά και αντικατάσταση του γονιδίου της από ένα που κωδικοποιεί για μια μορφή μειωμένης λειτουργίας της. Η μορφή αυτή (HulAΔC2) αφορά την απαλοιφή της C2 περιοχής της, η οποία έχει δειχθεί σε ομόλογά της σε άλλους οργανισμούς να είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδρασή της με φωσφολιπίδια της μεμβράνης και κατά συνέπεια για την ικανότητα ουβικουιτινυλίωσης διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Στο στέλεχος που φέρει την hulaΔC2 μεταλλαγή o UapA δείχθηκε να παραμένει στην πλασματική μεμβράνη, τόσο κατά την προσθήκη ουρικού οξέος, όσο και κατά την προσθήκη αμμωνιακών ιόντων, μια προτιμώμενη για το μύκητα πηγή αζώτου, προσθήκη της οποίας είχε δειχθεί παλαιότερα να οδηγεί το μεταφορέα προς αποικοδόμηση στο χυμοτόπιο. Η HulA δείχθηκε να ουβικουιτινυλιώνει το μεταφορέα στην Lys572, αφού κατέστη δυνατή η απομόνωση ζωνών μειωμένης κινητικότητας άμεσα εξαρτώμενων από την Lys572, οι οποίες απουσιάζουν επίσης σε στέλεχος HulAΔC2.H πρόκληση ενδοκύτωσης από υπόστρωμα δείχθηκε να είναι δυνατή και in trans, αφού ανενεργά μόρια UapA ενδοκυτώνονται από υπόστρωμα παρουσία ενός ενεργού, έστω με ανικανότητα ουβικουιτινυλίωσης μορίου. Η ενδοκύτωση αυτή δεν οδηγεί απαραίτητα σε αποικοδόμηση του μεταφορέα στο χυμοτόπιο και είναι επίσης εξαρτώμενη από ουβικουιτινυλίωση. Το φαινόμενο της in trans ενδοκύτωσης υποδεικνύει την εμπλοκή μιας διαδικασίας μεταγωγής σήματος κατά τη διαδικασία ενδοκύτωσης από υπόστρωμα, ή τη χωροθετική σύναξη των μορίων του UapA σε μεμβρανικές υποδομές, ή τον ομοδιμερισμό-ομοολιγομερισμό τους. Για τη μελέτη της πιθανότητας χωροθετικής σύναξης των μορίων του UapA σε δομές υποοργάνωσης της πλασματικής μεμβράνης, μελετήθηκε η πιθανότητα εντοπισμού του μεταφορέα σε γνωστές τέτοιες περιπτώσεις, όπως τα εισοσώματα, παρόλο που ο ομοιόμορφος εντοπισμός του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη δεν υποστήριζε κάτι τέτοιο. Αντίστοιχα ομοιόμορφη όμως φάνηκε να είναι και η κατανομή της εργοστερόλης της πλασματικής μεμβράνης του μύκητα, μετά από χρώση με filipin. Έτσι, μελετήθηκε η ικανότητα εκχύλισης μορίων UapA από την πλασματική μεμβράνη παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων μη-ιονικών τασιενεργών και βρέθηκε πως ο UapA δε τοποθετείται σε περιοχές της μεμβράνης με ιδιαίτερη σύσταση ως προς τη συγκέντρωση εργοστερόλης. Από στη συγκεκριμένη εργασία τέθηκαν οι βάσεις για την πληρέστερη κατανόηση της ρυθμιζόμενης διακίνησης του UapA. Η εμπλοκή της HulA υποδεικνύει πως το είδος και ο υποκυτταρικός τόπος της ουβικουιτινυλίωσης πιθανώς ρυθμίζουν τη στόχευση του μεταφορέα. Επιπλέον αναγκαία φαίνεται η ύπαρξη πρωτεϊνών προσαρμοστών μεταξύ του UapA και της HulA, μιας και ο UapA, όπως όλοι οι μέχρι στιγμής μελετημένοι μεταφορείς, δεν διαθέτει γνωστές αλληλουχίες αναγνώρισης από την HulA. Το γεγονός πως διακριτά σήματα ενδοκύτωσης συγκλίνουν σε ουβικουιτινυλίωση από την ίδια λιγάση προτείνει την εμπλοκή διαφορετικών προσαρμοστικών μορίων. Η μελέτη της αλληλεπίδρασης του μεταφορέα με τα μόρια-προσαρμοστές θα ήταν καινοτόμος. Τέλος, το φαινόμενο της in trans ενδοκύτωσης αφήνει ανοικτό το ενδεχόμενο ολιγομερισμού του UapA και της πιθανής εμπλοκής της κατάστασης ολιγομερισμού του στην υποκυτταρική του στόχευση.