Μελέτη βιολογικών δράσεων νέων μεταλλικών συμπλόκων του βαναδίου με κυτταροτοξικές ιδιότητες
Authors: Ρουμπάτης Λεωνίδας 
Published: September 2021

Το σύστημα αντίδρασης NH4VO3/νικοτιναμίδιο (L) σε H2O έδωσε το πορτοκαλί στερεό(LH)4[VV10O26(OH)2].2L.2H2O (Nicotivan, 1). Η υδρόλυση των ιόντων NH4+ και ηπαρατεταμένη θέρμανση του υδατικού διαλύματος της αντίδρασης δημιουργούν τοκατάλληλο pH για το σχηματισμό του ανιόντος [VV10O26(OH)2]4-. Η πρωτονίωση τωντεσσάρων μορίων L λαμβάνει χώρα στο πυριδινικό άτομο N, που είναι το πιο βασικό. Ηδομή του ανιόντος αποτελείται από δέκα οκταεδρικές μονάδες {VVO6}, που έχουν κοινέςακμές. Το ανιόν έχει δύο μ6-Ο2-, δύο μ3-Ο2-, δύο μ3-ΟΗ-, δεκατέσσερα μ2-Ο2- και 8τερματικά Ο2-. Οι γεωμετρίες ένταξης των δέκα ιόντων VV είναι παραμορφωμένεςοκταεδρικές. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου σταθεροποιείται από δεσμούς Η και απόπ-π αλληλεπιδράσεις, μεταξύ των αρωματικών δακτυλίων.Το τελικό υπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του 1 είναι V2O5. Το 1H NMR φάσμα σεDMSO-d6 αποκαλύπτει την αποπρωτονίωση του ιόντος [VV10O26(OH)2]4- και το σχηματισμότου ιόντος [V10O28]6-.Η αντίδραση του NH4VO3 με πυριδίνη (py) σε Η2Ο, υπό θέρμανση, οδήγησε στηναπομόνωση πορτοκαλί στερεού, με τύπο (pyH)6[V10O28].2H2O (Pyrivan, 2), σε απόδοση40%. Η στοιχειομετρία, η διαμαγνητική φύση και τα μήκη δεσμού V-O αποδεικνύουν ότιόλα τα μεταλλικά κέντρα βρίσκονται στην οξειδωτική βαθμίδα +5. Η δομή του ανιόντοςαποτελείται από δέκα οκταεδρικές μονάδες {VVO6}, που έχουν κοινές ακμές.Αυτές οι μονάδες περιλαμβάνουν δύο μ6-Ο2-, τέσσερα μ3-Ο2-, δεκατέσσερα μ2-Ο2- και οκτώτερματικούς όξο- υποκαταστάτες. Υπάρχουν πέντε τύποι κρυσταλλογραφικώς ανεξάρ-τητων δεσμών Η, που σταθεροποιούν την κρυσταλλική δομή του συμπλόκου,σχηματίζοντας ένα 2D δίκτυο.Η ταινία στα 3138 cm-1 στο IR φάσμα οφείλεται στη δόνηση τάσεως του δεσμού N+-H,του ιόντος pyH+. Το 13C NMR φάσμα του 2 σε DMSO-d6 είναι απλό και αποτελείται απότρία σήματα, των τριών χημικά ανισοδύναμων ατόμων άνθρακα του pyH+. Το τελικόυπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του συμπλόκου είναι V2O5.Το σύστημα αντίδρασης NH4VO3/πιπεραζίνη (pipz) σε CH3COOH 1Μ στους 80 ºC έδωσεπορτοκαλί κρυστάλλους του ιοντικού πολυμερούς {(L’H2)[(VO3)]2}n (Pipervan, 3), όπουL’H2 είναι το δικατιόν του 1,2-Διαμινοβουτανίου. Η μετατροπή της pipz σε 1,2-διαμινοβουτάνιο προέρχεται από μια πολύπλοκη αντίδραση οξειδοαναγωγής, κατά τηνοποία τρία μόρια pipz ανάγονται προς L’ (που στη συνέχεια πρωτονιώνεται διπλά), ενώ τοτέταρτο μόριο οξειδώνεται προς πυραζίνη, που παραμένει στο διάλυμα. Η δομή τουσυμπλόκου περιέχει ανιοντικές αλυσίδες {[VO3]-}n, με την καθεμιά να αποτελείται απόάπειρο αριθμό τετραέδρων {VVO4}, που το καθένα έχει δύο κοινές κορυφές με τα δύογειτονικά του.Το περιβάλλον ένταξης γύρω από το VV είναι τετραεδρικό, και η απόσταση μεταξύ δύογειτονικών μεταλλικών κέντρων είναι 3.417 Å. Η κρυσταλλική δομή του 3 σταθεροποιείταιαπό δεσμούς -Η. Στο IR φάσμα του συμπλόκου, οι ισχυρές ταινίες στα 927 και 913 cm-1αποδίδονται σε δονήσεις τάσεως, των τερματικών δεσμών VV=O. Η παρατεταμένη θέρμανση του θειικού άλατος του δικατιόντος του 1,5-διαμινοπεντανίου(L’’), VOSO4.4H2O και NaOH σε H2O στους 80 ºC έδωσε πολύ σκούρους πράσινουςκρυστάλλους της ένωσης (L’’H2)3[VIV9VV6O36].14H2O (Cadivan, 4) με απόδοση 30-40%. Οιοξειδωτικές βαθμίδες των κέντρων V υπολογίσθηκαν με βάση τη μέθοδο BVS. Η ίδιαανάλυση έδειξε, ότι όλα τα άτομα Ο του δεκαπεντεβαναδικού ανιόντος είναι O2-. Το ιόν[V15O36]6- έχει σχήμα σφαίρας, με τα δεκαπέντε μεταλλικά κέντρα να βρίσκονται στηνεπιφάνεια της σφαίρας. Κάθε ιόν V είναι 5-ενταγμένο και σχηματίζει δεσμούς με ένατερματικό όξο- υποκαταστάτη και τέσσερα γεφυρωτικά (μ2-, μ3-) ιόντα οξειδίου.Η γεωμετρία ένταξης των ιόντων V είναι τετραγωνική πυραμιδική. Ο πλήρης δομικόςπυρήνας του ανιόντος είναι {VIV9VV6O15(μ2-Ο)3(μ3-Ο)18}6-. Παρά την παρουσίαπαραμαγνητικών κέντρων VIV και τη συνεπακόλουθη παραμαγνητική φύση του 4, το 1HNMR φάσμα του σε DMSO-d6 παρουσιάζει οξέα σήματα, που οφείλονται στα πρωτόνια,που είναι συνδεδεμένα με τα άτομα C του L’’H22+. Το EPR φάσμα σε σκόνη του συμπλόκουστους 77 Κ είναι χαρακτηριστικό ιόντων [V15O36]n-, μικτού σθένους.Η τιμή της ενεργού μαγνητικής ροπής του συμπλόκου στους 300 Κ (4.30 B.M.)υποδηλώνει σημαντικές αντισιδηρομαγνητικές αλληλεπιδράσεις ανταλλαγής. Το τελικόυπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του συμπλόκου είναι V2O5. Το σύστημα αντίδρασηςVOSO4.4H2O/H2O/NaN3/NaOH σε H2O υπό θέρμανση οδήγησε σε χακί-σκούρους πράσινουςκρυστάλλους του 3D πολυμερούς συμπλόκου {[VIV11VV7Na10O44(N3)(H2O)32].H2O}n(Azivan, 5) με απόδοση 35-40%. Η δομή του συμπλόκου αποτελείται από ανιόντα[VIV11VV7O44(N3)]10-, 1D κατιοντικές αλυσίδες με επαναλαμβανόμενη δομική μονάδα την{Na10(H2O)32}10+ και πλεγματικά μόρια H2O.Τα ανιόντα συνδέονται με τις κατιοντικές αλυσίδες σχηματίζοντας ένα 3D πολυμερέςδίκτυο. Οι θέσεις σύνδεσης των ανιόντων με τις κατιοντικές αλυσίδες είναι τερματικοί όξο-υποκαταστάτες του πολυοξοβαναδικού ανιόντος. Το βαναδικό ανιόν έχει σφαιρική δομή καιεγκλωβίζει ένα ιόν αζιδίου, που δεν σχηματίζει χημικούς δεσμούς με τα κέντρα V. Κάθεανιόν είναι το άθροισμα δεκαπέντε τετραγωνικών πυραμίδων {VO5}, που μοιράζονταικοινές ακμές και κορυφές. Από τους 44 όξο- υποκαταστάτες, οι δεκαοκτώ είναι τερματικοί,οι έξι μ2 και οι υπόλοιποι μ3. Τα ιόντα NaI είναι 6- και 5-ενταγμένα, με τους ύδατο-υποκαταστάτες να είναι τερματικοί και γεφυρωτικοί. Στο IR φάσμα του 5, οι ισχυρέςταινίες στα 962 και 940 cm-1 οφείλονται στις δονήσεις τάσεως των τερματικών δεσμώνVV=O και VIV=O, αντίστοιχα.Στις βιολογικές δράσεις τα πέντε σύμπλοκα του Βαναδίου που συνθέσαμε (Nikotivan,Azivan, Pyrivan, Pipervan, Cadivan) εμφανίζουν κάποιες δομικές αναλογίες όπως π.χ μιαανιονική πολυοξοβαναδική δομή του τύπου [VxOyOHz]n-, η οποία φαίνεται να είναιαποφασιστικής σημασίας για τις βιολογικές λειτουργίες, των εν λόγω συμπλόκων. Στηνδιδακτορική μας διατριβή μελετήσαμε μερικές θεμελιώδεις βιολογικές δράσεις των πέντεσυμπλόκων και συγκεκριμένα. Τις κυτταροτοξικές ιδιότητες σε τρείς διαφορετικούς τύπουςκυττάρων, δηλαδή στα νεοπλασματικά κύτταρα λειομυοσαρκώματος επίμυος Wistar, στανεοπλασματικά κύτταρα MCF – 7 καρκίνου του μαστού του ανθρώπου, καθώς και στα κύτταρα τύπου φυσιολογικού εμβρυονικού ινοβλάστη του ποντικού. Τον μηχανισμόθανάτωσης, εκ μέρους των πέντε συμπλόκων χωριστά, των νεοπλασματικώνλειομυοσαρκωματικών κυττάρων τύπου LMS, όπως αυτός αναδεικνύεται από τηνενσωμάτωση της φθορίζουσας ανεξίνης, όταν έχει ενεργοποιηθεί η απόπτωση, με τηνμέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Επίσης μελετήσαμε τις δράσεις των πέντε συμπλόκωνξεχωριστά στην συσσωρευτική λειτουργία των αιμοπεταλίων του ανθρώπου ex vivo,ενεργοποιώντας τα αιμοπετάλια μέσω των τριών διακεκριμένων οδών συσσώρευσης, τηνοδό του ADP, την οδό του PAF και την οδό του αραχιδονικού οξέος.Ανεξάρτητα από τα σύμπλοκα μελετήθηκαν και οι κυτταροτοξικότητα των πέντευποκαταστατών, όπως επίσης και οι αντίστοιχες δράσεις αυτών στην λειτουργία τηςαιμοπεταλιακής συσσώρευσηςΤα σύμπλοκα που χρησιμοποιήθηκαν εμφάνισαν κυτταροτοξικές δράσεις σε κακοήθηκυτταρα LMS, ενώ στους φυσιολογικούς ινοβλάστες δεν εμφάνισαν αξιόλογη δράση. Κατάσειρα το IC50 στα κακοήθη κυτταρα ήταν Cadivan (1,2250,238 μM) > Azivan (2,8 μM,LMS cells) > Nicotivan (4,767 ± 0,525 μM) > Pyrivan (10,60,883 μM) > Pipervan(15,90,455 μM). Στην σειρα MCF-7 οι τιμες IC50 στα σύμπλοκα είναι κατά σειρα Pyrivan(16,7 ± 0,23) > Pipervan (16,23 ± 0,74) > Nicotivan (6,93 ± 0,12) > Azivan (3,4 ± 0,37)> Cadivan (2.36 ± 0,37). Στους φυσιολογικους ινοβλάστες και την σειρα MRC-5 οι τιμεςIC50 στα σύμπλοκα εμφανίζουν την παρακάτω σειρά: Pipervan (34,23 ± 1,35) > Azivan(12,93 ± 1,33) > Cadivan (2,43 ± 0,13) > Pyrivan (12,3 ± 0,21) > Nicotivan (9,83 ±0,34).Στους υποκαταστάτες οι τιμές IC50 εχουν την παρακάτω σειρά: Πιπεραζίνη (126,6 ±1,6) >Πυριδίνη (107,6μΜ ±3,2) > Νικοτιναμίδιο (47,4 μΜ ±1,3) > Κανταβερίνη (10,8 μΜ ±0,4 >Αζίδιο του Νατρίου (2,3μΜ ±0,7).Στα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής στα κύτταρα LMS του επιμύος Wistar oέλεγχος των λειομυοσαρκωματικών κυττάρων LMS του επίμυος Wistar με την μέθοδο τηςκυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η χορήγηση των πέντε διαφορετικών συμπλόκων τουΒαναδίου σε δόσεις ίσες προς την IC50 εκάστου συμπλόκου έχουν ως αποτέλεσμα τουψηλό ποσοστό θανάτων μέσω αποπτωτικών φαινομένων. Όπως είδαμε όλα τα σύπλοκαεμφανίζουν δράση με πιο ισχυρή όσον αφορά το σύνολο των αποπτικών φαινομένων.Στο σύνολο των αποπτωτικών φαινομένων η σείρα είναι Azivan (60,16%) > Pipervan >(57,97%) > Cadivan (53,76%) > Nicotivan (46,33%) > Pyrivan (43,75%) και το Control(3,22%).Στα αποτελέσματα δράσεων των συμπλόκων του βαναδίου στην συσσώρευση τωναιμοπεταλίων του ανθρώπου Ex Vivo όλα τα σύμπλοκα του Βαναδίου, που συνθέσαμε στοπλαίσιο της παρούσας διατριβής αναστέλλουν την συσσώρευση των αιμοπεταλίων τουανθρώπου στο φυσιολογικό τους αιματικό πλάσμα (Ex Vivo), σε αιμοπετάλια τα οποίαείχαν ανοιχτές και τις τρείς φυσιολογικές οδούς συσσώρευσης. Συγκεκριμένα είχαμε ταεξής : Στο σύμπλοκο του Nicotivan: H τιμή IC50 του συμπλόκου κυμαίνεται για τον PAFμεταξύ 1 μM έως 2 μM, ενώ για το αραχιδονικό οξύ (ARA) μεταξύ 2 και 4 μM. Η τιμή IC50του Νικοτιβάν που αναστέλλει την δράση του ADP κυμαίνεται μεταξύ 20 και 30 μM.Στο σύμπλοκο του Azivan: Η τιμή IC50 κυμαίνεται για τον PAF μεταξύ 1μM – 2 μM, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 4 μM έως 6 μM και για το ADP μεταξύ 4 και 10 μM.Στο σύμπλοκο του Pyrivan: Η τιμή IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 20 – 40 M, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 20 – 40 μM. Επίσης η IC50 για το ADP κυμαίνεται μεταξύ 80– 120 μM.Στο σύμπλοκο του Pipervan: Η τιμή IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 20 μM και 40μM, ενώ για το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 20 μM – 40 μM. Επίσης η IC50 για το ADPκυμαίνεται μεταξύ 200 μM και 300 μM.Στο σύμπλοκο του Cadivan: H IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 2 μM και 6 μM, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 2 μM και 2,5 μM. Επίσης η IC50 για το ADP κυμαίνεταιμεταξύ 20 μM και 40 μM.Οι υποκαταστάτες των συμπλόκων, δηλαδή το νικοτιναμίδιο, το αζίδιο του νατρίου, ηπυριδίνη, η πιπεραζίνη και η κανταβερίνη εμφανίζουν επίσης ιδιότητες αναστολής τωναιμοπεταλίων και από τις τρείς οδούς, αλλά τελικά η παρουσία του βαναδίου φαίνεται ναενισχύει την αντιαιμοπεταλιακή δράση των συγκεκριμένων συμπλόκων ουσιών. Συνεπώς ηόλη μελέτη των εν λόγω συμπλόκων του στοιχείου Βαναδίου υποδεικνύει ότι αυτάεμφανίζουν σπουδαίες κυτταροτοξικές ιδιότητες, όπως επίσης και ιδιότητες αναστολής τωναιμοπεταλίων.Είναι πολύ σημαντικό η έρευνα επί της αιτιολογίας των εν λόγω ιδιοτήτων να εμβαθυνθείπεραιτέρω προκειμένω οι εν λόγω ουσίες να αποτελέσουν μια στερεή βάση ανάπτυξηςαντικαρκινικών φαρμάκων στοχευμένης κυτταροτοξικότητας, που να περιορίζεται μόνο στανεοπλασματικά κύτταρα και να αφήνει αλώβητα τα φυσιολογικά των ποικίλων ιστών τουοργανισμού. Αυτό φαίνεται να είναι κατ’ αρχάς εφικτό, αν θεωρήσουμε ότι η πλειονότητατων κακοήθων νεοπλασμάτων εμφανίζει κατά κύριο λόγο έναν ενεργειακό μεταβολισμόπεριορισμένου βεληνεκούς, εστιαζόμενο ουσιαστικά στην γλυκολυτική αλυσίδα, ενώ ημιτοχονδριακή λειτουργία είναι περιορισμένη. Είναι ενδεχόμενο οι ενώσεις του Βαναδίου ναλειτουργούν έτσι ώστε η γλυκόζη να μεταφέρεται κυρίως στο εσωτερικό τωνφυσιολογικών κυττάρων, ενώ να προκαλούν μια αυξημένη δυσχέρεια για την μεταφοράτους στο εσωτερικό των κακοήθων κυττάρων. Αν το φαινόμενο αυτό μπορεί να γενικευτείτότε μπορούμε να οδηγήσουμε τους περισσότερους γλυκολυτικούς κακοήθεις όγκους σεμαζικό θάνατο με σημαντικό βιολογικό κέρδος για έναν πάσχοντα οργανισμό.