Τροποποίηση και μελέτη βακτηριακών στελεχών Escherichia coli με στόχο την παραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών με μεθόδους συστημικής βιοτεχνολογίας
Authors: Γιαλαμά Δήμητρα 
Published: September 2021

Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν σημαντικές πρωτεϊνικές οικογένειες, όπως υποδοχείς συζευγμένους με πρωτεΐνες G, μεταφορείς και κανάλια. Το επιστημονικό ενδιαφέρον για αυτές είναι ιδιαίτερα αυξημένο και καθώς είναι εξαιρετικά σημαντικοί στόχοι για φάρμακα, προσελκύουν το ενδιαφέρον και της φαρμακοβιομηχανίας. Ενδιαφέρον υπάρχει για το χαρακτηρισμό των μεμβρανικών πρωτεϊνών όπως και για την απόκτηση πληροφοριών για τον ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων. Για αυτούς τους σκοπούς απαιτούνται μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης, οι οποίες συνήθως παράγονται από υπερέκφραση σε ετερόλογους οργανισμούς. Το βακτήριο Escherichia coli είναι το πιο δημοφιλές μέσο υπερπαραγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών, όμως, ακόμη και η ανασυνδυασμένη παραγωγή με αυτό το βακτήριο είναι πολλές φορές προβληματική. Οι αποδόσεις ανά κύτταρο είναι συνήθως μικρές και η παραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι συχνά τοξική για τα κύτταρα με αποτέλεσμα τη χαμηλή συνολική παραγωγικότητα. Οι στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν να κατασκευαστούν στελέχη Escherichia coli ικανά να ανθίστανται στην τοξικότητα υπερπαραγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών, αλλά και να διερευνηθούν στοιχεία του μηχανισμού της παρατηρούμενης κυτταροτοξικότητας. Έτσι, κατασκευάστηκαν βιβλιοθήκες από μεταλλαγμένα βακτήρια που έφεραν διαφορετικές γενετικές τροποποιήσεις και χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλες γενετικές αναλύσεις για την απομόνωση των επιθυμητών κλώνων. Οι αναλύσεις κατέληξαν στον εντοπισμό δύο νέων παραγόντων που κατά τη συνέκφρασή τους βελτιώνουν την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών, τα γονίδια djlA και rraA. Η DjlA είναι ένας ενεργοποιητής της μοριακής συνοδού DnaK, ενσωματωμένος στη μεμβράνη και είναι παρόμοιος με τη DnaJ, και η RraA είναι αναστολέας της ριβονουκλεάσης RNάσης E. Έτσι, κατασκευάστηκαν δύο στελέχη E. coli που υπερεκφράζουν το γονίδιο djlA ή rraA και ονομάστηκαν SuptoxD και SuptoxR, αντίστοιχα. Κατά την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών η ανάπτυξη των στελεχών αυτών είναι δραματικά βελτιωμένη σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα. Επιπροσθέτως, τα επίπεδα έκφρασης των μεμβρανικών πρωτεϊνών ανά κύτταρο είναι σημαντικά βελτιωμένα. Η εφαρμογή των στελεχών βρέθηκε να είναι γενική καθώς βελτιώνουν την υπερέκφραση πολλών ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών μεμβρανικών πρωτεϊνών σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα και με τα εμπορικά στελέχη που θεωρούνται κατάλληλα για την υπερπαραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών. Ανάμεσα σε αυτές τις πρωτεΐνες ήταν και ο υποδοχέας νευροτενσίνης 1, του οποίου η λειτουργικότητα εξετάστηκε και βρέθηκε ότι η επιπλέον παραγόμενη πρωτεΐνη είναι λειτουργική. Κατόπιν, διερευνήθηκαν στοιχεία του μηχανισμού λειτουργίας των δύο καταστολέων της τοξικότητας. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε ο ρόλος των διαφορετικών υπομονάδων της DjlA στην επίδραση της υπερπαραγωγής του υποδοχέα βραδυκινίνης 2 (BR2) και βρέθηκε ότι ολόκληρο το μόριο της DjlA απαιτείται για την καταστολή της τοξικότητάς του. Επίσης, η ευεργετική επίδραση της DjlA στην υπερπαραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών ήταν εξειδικευμένη, ενώ η εξειδίκευση της J υπομονάδας της DjlA ήταν περιορισμένη. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η μοριακή συνοδός DnaK παίζει κρίσιμο ρόλο, καθώς η αλληλεπίδραση με την DjlA είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της υπερπαραγωγής του BR2. H DjlA και η RraA βρέθηκαν να δρουν με ανεξάρτητο μηχανισμό η μία από την άλλη στη βελτίωση της υπερπαραγωγής της πρωτεΐνης BR2, με μη προσθετικό όμως τρόπο. Τέλος, όσον αφορά στο μηχανισμό λειτουργίας του RraA βρέθηκε ότι η υπερέκφραση του BR2 βελτιώνεται χωρίς να επηρεάζονται τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου του κατά την υπερέκφραση του rraA. Αναμένεται ότι τα στελέχη SuptoxD και SuptoxR θα χρησιμοποιηθούν ευρέως από την επιστημονική κοινότητα και θα διευκολύνουν τη διαλεύκανση του μηχανισμού της εν λόγω κυτταροτοξικότητας.