Αξιολόγηση εναλλακτικών τεχνικών για την ανάπτυξη νέων και βελτιωμένων μεθόδων προσδιορισμού φαρμάκων σε πλάσμα με την τεχνική της δίδυμης φασματομετρίας μαζών
Authors: Αποστόλου Κωνσταντίνος 
Published: January 2014

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν εναλλακτικές τεχνικές κατεργασίας και ανάλυσης δειγμάτων πλάσματος για την ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων μεθόδων προσδιορισμού φαρμακευτικών ουσιών με χρήση υγροχρωματογραφίας συζευγμένης με δίδυμη φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC-MS/MS). Ο στόχος της μελέτης ήταν η αύξηση της ευαισθησίας των αναλυτικών μεθόδων με ταυτόχρονη μείωση του συνολικού χρόνου της αναλυτικής διαδικασίας. Μελετήθηκαν και τα τρία γενικά στάδια μιας τυπικής αναλυτικής μεθόδου, η κατεργασία, ο χρωματογραφικός διαχωρισμός και ο φασματομετρικός προσδιορισμός και εξετάστηκε η εφαρμογή εναλλακτικών τεχνικών στα στάδια αυτά με σκοπό την ανάπτυξη βελτιωμένων αναλυτικών μεθόδων. Όλες οι αναπτυχθείσες μέθοδοι περιλάμβαναν χρήση διάταξης 96 θέσεων σε συνδυασμό με την χρήση δύο ρομποτικών συστημάτων διαχείρισης υγρών δειγμάτων και ανάλυση με την τεχνική LC-MS/MS. Στο πρώτο σκέλος της διατριβής αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε πλήρως μέθοδος προσδιορισμού της σιμβαστατίνης και του υδροξυ-μεταβολίτη της σε ανθρώπινο πλάσμα με χρήση πηγής ιοντισμού Ηλεκτροψεκασμού (Electrospray Ionization, ESI) για το φασματόμετρο μαζών. Η κατεργασία έγινε σε 300 μL πλάσματος με συνδυασμένη τεχνική κατακρήμνισης πρωτεϊνών με ACN και υγρό-υγρό εκχύλισης δύο σταδίων (two-step extraction) με οργανικό διαλύτη MTBE. Το στάδιο της κατακρήμνισης πρωτεϊνών οδήγησε σε σημαντική αύξηση της ευαισθησίας, καθώς επίσης και περιορισμό της επίδρασης μητρικού φαινομένου (matrix effect). Παράλληλα το πρωτόκολλο εκχύλισης σε δύο διαδοχικά στάδια ολοκληρώθηκε με μεταφορά των εκχυλισμάτων από κάθε στάδιο σε μια κοινή πλάκα 96 θέσεων. Το πρωτόκολλο αυτό οδήγησε επίσης σε αύξηση της ευαισθησίας σε σχέση με την εκχύλιση ενός σταδίου. Ο συνδυασμός της κατακρήμνισης πρωτεϊνών με την υγρό- υγρό εκχύλιση δύο σταδίων επέτρεψε την υιοθέτηση της προνομιούχου διάταξης 96 θέσεων σε σχέση με τη συμβατική κατεργασία εντός δοκιμαστικών σωλήνων και την επίτευξη ιδιαίτερα χαμηλού ορίου ποσοτικοποίησης (0,1 ng/mL). Η αναπτυχθείσα μέθοδος περιλάμβανε το μικρότερο βιβλιογραφικά δημοσιευμένο χρωματογραφικό χρόνο ανάλυσης (1,9 min) και εφαρμόστηκε επιτυχώς σε μελέτη βιοϊσοδυναμίας σκευάσματος σιμβαστατίνης των 40 mg. Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο κατεργασίας προτάθηκε ως γενικό μοντέλο για αναλυτικές μεθόδους με ιδιαίτερα χαμηλά όρια ποσοτικοποίησης με σκοπό την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας σε συνδυασμό με τη διατήρηση της αυτοματοποίησης και της υψηλής ταχύτητας της συνολικής διαδικασίας. Στο δεύτερο σκέλος της διατριβής, συγκρίθηκε αναλυτικά η χρήση πηγής ESI με αυτή της πηγής Χημικού Ιοντισμού σε συνθήκες Ατμοσφαιρικής Πίεσης για τον προσδιορισμό αναστροζόλης σε πλάσμα με τεχνική LC-MS/MS. Μελετήθηκε η εφαρμογή των δύο πηγών ως προς την ευαισθησία και την επίδραση του μητρικού φαινομένου. Επίσης, μελετήθηκε και συγκρίθηκε η επίδραση του Δυναμικού Αποσύζευξης (Declustering Potential, DP) και του Δυναμικού Σύγκρουσης (Collision Energy, CE) με τη χρήση των δύο διαφορετικών πηγών ιοντισμού στην ευαισθησία του φασματομέτρου μαζών για τον προσδιορισμό της αναστροζόλης και του εσωτερικού προτύπου. Ως προς την κατεργασία των δειγμάτων, εφαρμόστηκε πρωτόκολλο κατεργασίας με συνδυασμό κατακρήμνισης πρωτεϊνών με ACN και υγρό-υγρό εκχύλιση με οργανικό διαλύτη MTBE. Η ευαισθησία της μεθόδου αυξήθηκε σημαντικά χάρη στην εφαρμογή του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου κατεργασίας επιτρέποντας την επίτευξη ιδιαίτερα χαμηλού ορίου ποσοτικοποίησης (0,1 ng/mL). Η τελική μέθοδος που αναπτύχθηκε με χρήση πηγής APCI περιλάμβανε τη χρήση του μικρότερου βιβλιογραφικά δημοσιευμένου όγκου πλάσματος (190 μL) και του μικρότερου χρωματογραφικού χρόνου ανάλυσης (1,6 min). Τέλος, η μέθοδος επικυρώθηκε πλήρως και εφαρμόστηκε στη μελέτη βιοϊσοδυναμίας μεταξύ δύο σκευασμάτων αναστροζόλης 1 mg. ..........................................................................................................................................................................................................