Διαφορική έκφραση πρωτεϊνών σε παγκρεατικά β κύτταρα υπό την επίδραση της γλυκόζης
Authors: Αλμπέρτη Αύρα 
Published: January 2014

Η χρόνια υπεργλυκαιμία εμπλέκεται σημαντικά στην παθογένεια του διαβήτη και η έκθεση των βήτα κυττάρων στις υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης οδηγεί σε τοξικά αποτελέσματα που αναφέρονται ως "τοξικότητα γλυκόζης". Υπάρχουν πολλές μελέτες που σχετίζουν την τοξικότητα της γλυκόζης με το οξειδωτικο stress, την ελαττωματική έκκριση ινσουλίνης, την μειωμένη έκφραση γονιδίων ινσουλίνης και την απόπτωση των βήτα κυττάρων. Παρά τις μελέτες που υπάρχουν για την τοξικότητα της γλυκόζης, το φαινόμενο δεν είναι πλήρως κατανοητό και πρόσφατα η πρωτεομική ανάλυση προσέφερε σημαντικές πληροφορίες για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην παθογένεια του διαβήτη. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να μελετηθεί η διαφορική έκφραση πρωτεϊνών σε παγκρεατικά βήτα κύτταρα υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης. Στη συνέχεια, η μελέτη εστιάστηκε στην ERp46, μια πρωτεΐνη του ενδοπλασματικού δικτύου, αναλύοντας τη συμμετοχή της στην τοξικότητα της γλυκόζης και στη βιοσύνθεση της ινσουλίνης. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της υψηλής γλυκόζης στα παγκρεατικά βTC-6 κύτταρα μέσω της πρωτεομικής ανάλυσης. Η πρωτεομική ανάλυση οδήγησε στον προσδιορισμό 46 διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνικών κηλίδων, που αντιστοιχούν σε 23 πρωτεΐνες οι οποίες έχουν μια ευρεία σειρά λειτουργιών και ταξινομήθηκαν κυρίως ως καταλυτικές και συνοδοί πρωτεΐνες. Ανάμεσα στις 23 πρωτεΐνες που προσδιορίστηκαν με διαφορική έκφραση, σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ERp46, η οποία δεν έχει μελετηθεί ως τώρα εκτενώς και δεν έχει συσχετιστεί επαρκώς με την τοξικότητα της γλυκόζης. 1εδομένου ότι η ERp46 είναι μια νέα πρωτεΐνη με έναν πιθανά κρίσιμο ρόλο στα εκκριτικά κύτταρα, μελετήθηκε περαιτέρω ο ρόλος της στη λειτουργία των β κυττάρων. Η πρωτεομική ανάλυση έδειξε ότι η ERp46 μειώνεται υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης συγκριτικά με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης, ενώ οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίσταται δεν μεταβάλλονται με την επίδραση της γλυκόζης. Οι μελέτες συνεχίστηκαν σε απομονωμένα παγκρεατικά νησίδια μυών όπου η έκφραση της ERp46 βρέθηκε να Περίληψη 178 μειώνεται στην υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε την υψηλή έκφραση της ERp46 στα παγκρεατικά νησίδια συγκριτικά με την εξωκρινή μοίρα του παγκρεατικού ιστού και αυτό αποτελεί ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον αποτέλεσμα, καθώς η έντονη παρουσία της ERp46 στο ενδοκρινές τμήμα του παγκρέατος πιθανά να σχετίζεται με μια συγκεκριμένη λειτουργία. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον προκαλεί και η χαρακτηριστική μείωση που παρατηρήθηκε στην έκφραση της ERp46 στα παγκρεατικά νησίδια διαβητικών μυών db/db, δείχνοντας τη συμμετοχή της ERp46 στην τοξικότητα της γλυκόζης, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τα αποτελέσματα μας και καταδεικνύοντας ότι η μείωση της έκφρασης της ERp46 μπορεί να αποτελεί μέρος των διαβητικών καταστάσεων. Αν λάβουμε υπόψη τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ότι η ERp46 μειώνεται υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης, ότι εμπλέκεται στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών, ότι η χρόνια έκθεση σε υψηλή γλυκόζη μειώνει τα επίπεδα της ινσουλίνης και ότι η ινσουλίνη διαθέτει δισουλφιδικούς δεσμούς, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η μείωση της έκφρασης της ERp46 στα παγκρεατικά β κύτταρα σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης πιθανά να σχετίζεται με τη μείωση της ινσουλίνης που προκαλείται από την υψηλή γλυκόζη. Αυτή η υπόθεση μελετήθηκε σε πειράματα καταστολής της έκφρασης της ERp46 μέσω siRNA σε καλλιεργημένα β TC-6 κύτταρα όπου παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση στην έκκριση και στην περιεκτικότητα της ινσουλίνης χωρίς όμως να παρατηρηθεί καμία αλλαγή στα επίπεδα του mRNA της ινσουλίνης. Ανάλογη μελέτη πραγματοποιήθηκε και σε δύο άλλες πρωτεΐνες που διαθέτουν δισουλφιδικούς δεσμούς, η PDI και η καλρετικουλίνη, στις οποίες δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά υπό αυτές τις συνθήκες. Επιπλέον, η καταστολή της έκφρασης της ERp46, που προκλήθηκε μέσω siRNA, αύξησε την έκφραση των πρωτεϊνών Chop και peIF2a, μόρια που ενοχοποιούνται για την ανάπτυξη του stress του ενδοπλασματικού δικτύου. Συμπερασματικά καταλήγουμε ότι η πρωτεομική ανάλυση ανέδειξε μια σειρά από πρωτεΐνες που ενοχοποιούνται στην τοξικότητα της γλυκόζης ενώ περαιτέρω μελέτη ανέδειξε την πρωτεΐνη ERp46 ως ένα σημαντικό συστατικό καθώς εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της ινσουλίνης σε επίπεδο μετα-μεταφραστικό, προτείνοντας την ως ένα υποθετικό κρίσιμο μόριο των διαβητικών καταστάσεων