Μελέτη της επαγωγής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα με αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών
Authors: Νινιός Ιωάννης 
Published: January 2014

Η απόπτωση συνοδεύεται από µεγάλες αναδιατάξεις στη στερεοδιαµόρφωση της χρωµατίνης. Στις αναδιατάξεις αυτές σηµαντικό ρόλο παίζουν επιγενετικές τροποποιήσεις όπως είναι η ακετυλίωση/αποακετυλίωση των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος, καθώς και ορισµένες ποικιλοµορφίες ιστονών, µε πρωτεύοντα ρόλο τις ιστόνες του συνδέτου DNA, H1. Αναστολείς των αποακετυλασών προκαλούν την συσσώρευση ακετυλιώσεων στις ουρές των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος, µε αποτέλεσµα να χαλαρώνει η δοµή της χρωµατίνης και να επάγεται η µεταγραφή ορισµένων γονιδίων, ένα εκ των οποίων είναι και το γονίδιο της ιστόνης αντικατάστασης, Η1.0, η οποία ανήκει στην οικογένεια των Η1 ιστονών του συνδέτου DNA. Η αλλαγή της µεταγραφικής ενεργότητας που επιφέρουν αυτές οι ουσίες έχει σαν τελικό αποτέλεσµα, ανάλογα µε το κυτταρικό σύστηµα, την αναστολή του κυτταρικού κύκλου, την επαγωγή της τερµατικής διαφοροποίησης, ή την επαγωγή της απόπτωσης. Επίσης, η χαλάρωση της χρωµατίνης, που επιφέρουν τα αυξηµένα επίπεδα ακετυλίωσης, δίνει την δυνατότητα πρόσβασης ενδονουκλεασών στο DNA, οι οποίες κατακερµατίζουν το DNA κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Πολύ σηµαντικό για την παρούσα µελέτη είναι το γεγονός πως ή ενδονουκλεάση, DFF40, η οποία παίζει µείζονα ρόλο κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης σε µεγάλο αριθµό κυτταρικών συστηµάτων και αποπτωτικών συνθηκών, έχει δειχτεί µε in vitro πειράµατα άλλων οµάδων πως ενεργοποιείται από πρωτείνες του συνδέτου DNA. Στο πρώτο µέρος της διατριβής µελετήθηκε η διαφορική επίδραση της τριχοστατίνης Α και του βουτυρικού νατρίου, δύο αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών, στην επαγωγή απόπτωσης σε έξι λευχαιµικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής παθολογικής προέλευσης. Μελετήθηκε η επίδραση των δύο αναστολέων στο βαθµό ακετυλίωσης της ιστόνης Η4, στην επαγωγή ή αύξηση της έκφρασης της ιστόνης του συνδέτου Η1.0, σε σύγκριση µε τα επίπεδα επαγωγής απόπτωσης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι έξι λευχαιµικές κυτταρικές σειρές εµφανίζουν διαφορετική ευαισθησία έναντι των δύο αναστολέων και εκτός από την ερυθρολευχαιµκή σειρά Κ562, η οποία αποδεικνύεται ανθεκτική στους δύο αναστολείς, η επαγόµενη απόπτωση στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές έχει τιµές που χαρακτηρίζουν την κάθε σειρά. Προκειµένου να απαντηθεί το ερώτηµα αν τόσο η ακετυλίωση της Η4 όσο και η αύξηση της έκφρασης της Η1.0 µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως προαποπτωτικοί δείκτες, πραγµατοποιήθηκε µια σειρά πειραµάτων κινητικής χρόνου σε τρεις επιλεγµένες µεταξύ των έξι λευχαιµικών σειρών (ΜΟLT-4, NB4 και HL60) στις οποίες εξετάστηκε ποια από τις τρεις παραµέτρους (ακετυλίωση της Η4, αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και επαγωγή απόπτωσης) προηγείται χρονικά, ποια έπεται και ποια ακολουθεί. Η ακετυλίωση της Η4 προηγείται χρονικά, ακολουθεί µε µικρή χρονική καθυστέρηση η αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και έπεται η επαγωγή του φαινοµένου της απόπτωσης. Σηµαντικό είναι το εύρηµα πως στα ανθεκτικά (ως προς την επαγωγή απόπτωσης) Κ562 κύτταρα, επίσης δεν παρατηρήσαµε αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης ή την επαγωγή της Η1.0. Αξίζει να αναφέρουµε πως κάτω από ορισµένες συνθήκες, η αποπτωτική διαδικασία ενδέχεται να ολοκληρωθεί και χωρίς αποδόµηση του DNA ή να εκτελεστεί η αποδόµηση µε άλλη ενδονουκλεάση. Εποµένως, η επιλογή της (των) καταλληλότερης σειράς βασίστηκε στην εµπλοκή της συγκεκριµένης ενδονουκλεάσης στην αποπτωτική πορεία κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Με βάση όλα αυτά τα αποτελέσµατα επιλέχτηκε η ΝΒ4 κυτταρική σειρά και η τριχοστατίνη Α για την συνέχιση της εργασίας. Το δεύτερο µέρος της διατριβής εστιάστηκε σε πειράµατα όπου µελετήθηκε η αλληλεπίδραση, καθώς και ο βαθµός αυτής της αλληλεπίδρασης, του DFF40 µε συγκριµένους υποτύπους της τάξης των Η1 ιστονών για να διερευνηθεί αν κάτω από τις συγκεκριµένες αποπτωτικές συνθήκες και στην συγκεκριµένη επιλεγµένη λευχαιµική σειρά, κάποιος Η1 υπότυπος παίζει έναν πιο εξειδικευµένο ρόλο στην ενεργοποίηση και στην αποπτωτική δράση του DFF40. Οι υπότυποι που µελετήθηκαν ήταν πρωτίστως η Η1.0, αλλά και οι υπότυποι Η1.5, Η1.3 και Η1.1, εφόσον, από βιβλιογραφικά δεδοµένα, οι διάφοροι υπότυποι της οικογένειας Η1 έχουν συνδεθεί µε λειτουργικές διαδικασίες κατά την αναδιάταξη της χρωµατίνης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε αποπτωτικές συνθήκες ο DFF (είναι το ανενεργό ετεροδιµερές αποτελούµενο από τον DFF40-DFF45) εντοπίζεται στο εσωτερικό του πυρήνα, και συγκεκριµένα στην χρωµατίνη. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι σηµαντικά διότι παλαιότερα πειραµατικά δεδοµένα από άλλες ερευνητικές οµάδες είχαν δείξει ότι ο DFF40-DFF45 βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα κάτω από µη αποπτωτικές συνθήκες και εισέρχεται στο πυρήνα µετά από αποπτωτικό ερέθισµα. Στην συνέχεια, µε in vivo πειράµατα συνανοσοκατακρήµνισης διαπιστώθηκε η αλληλεπίδραση του DFF40 µε την ιστόνη Η1 (ολικό κλάσµα) και µε όλους τους υποτύπους (Η1.1, Η1.3, Η1.5 και Η1.0) που µελετήθηκαν, τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε αποπτωτικές συνθήκες. Όµως κάτω από αποπτωτικές συνθήκες παρατηρήθηκε µία εκλεκτική (σηµαντικά αυξηµένη) αλληλεπίδραση του DFF40 µε τις Η1.5 και Η1.0 σε αντίθεση µε την Η1.3, η οποία είχε σαφέστατα χαµηλότερη αλληλεπίδραση. Το αποτέλεσµα αυτό είναι ουσιώδες εφόσον in vitro πειράµατα άλλης οµάδας, µε γυµνό DNA και µε µεταλλαγµένα κατασκευάσµατα, είχαν δείξει πως όλοι οι σωµατικοί υπότυποι (Η1.1, Η1.2, Η1.3, Η1.4, Η1.5), καθώς και ο υπότυπος αντικατάστασης, Η1.0, αλληλεπιδρούν εξίσου µε τον DFF40. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν πως ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά in vivo, εύρηµα που ενδέχεται να σχετίζεται όχι µόνο µε την συγκεκριµένη λευχαιµική σειρά αλλά και µε το συγκεκριµένο αποπτωτικό µέσο, καθώς και µε άλλους, ακόµη άγνωστους, παράγοντες της χρωµατίνης που φυσικά απουσίαζαν από τα πειράµατα της συγκεκριµένης ερευνητικής οµάδας µε γυµνό DNA. Επίσης, το ποσοστό αλληλεπίδρασης κάθε υποτύπου µε την ενεργή νουκλεάση µπορεί να σχετίζεται µε τον λειτουργικό ρόλο αυτού στη στερεοδιαµόρφωση της χρωµατίνης. Συµπερασµατικά, διαπιστώθηκε ότι η τριχοστατίνη Α αποτελεί έναν πολύ σηµαντικό αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών που είναι ικανός να επάγει το φαινόµενο της απόπτωσης σε µια σειρά από επιλεγµένες λευχαιµικές σειρές ανθρώπου (κατά ένα χρονο-εξαρτώµενο και κυτταρο-εξαρτώµενο τρόπο) µέσω της υπερακετυλίωσης των ιστονών. Συνοπτικά, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης οδηγούν στα ακόλουθα συµπεράσµατα: (α) η αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης από αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών ενδεχοµένως να αποτελέσει έναν επιπλέον χρήσιµο δείκτη για την αξιολόγηση της ικανότητας συγκεκριµένων αναστολέων να επάγουν απόπτωση σε συγκεκριµένες λευχαιµικές σειρές, (β) το ετεροδιµερές DFF40-DFF45 εντοπίζεται στον πυρήνα και µάλιστα στην χρωµατίνη, ακόµη και σε µη αποπτωτικές συνθήκες όπου ο µη πρωτεολυµένος (από την κασπάση 3) DFF45 διατηρεί τον DFF40 σε µη ενεργή µορφή και, (γ) ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά µε κάθε Η1 υπότυπο που αναλύθηκε στη παρούσα µελέτη κάτω από τις αποπτωτικές συνθήκες που επάγονται από το TSA στα ΝΒ4 προµυελοκυτταρικά λευχαιµικά κύτταρα.