Daphnia magna bioassays to detect novel eco-toxicological effects of prioritary and emergent contaminants
Authors:   , Campos Bruno 
Published: August 2023

There is increasing evidence that the presence of many emerging pollutants in aquatic ecosystems may have detrimental effects on aquatic biota. Of special concern are those emerging pollutants that may act as putative endocrine disrupters in non-vertebrate species, causing unexpected effects.
In chapters 2, 3 and 4, I assessed the effects of two pharmaceuticals belonging to the group of "SSRIs": fluoxetine and fluvoxamine, used to treat depression; and the detergent 4-nonylphenol. SSRIs and 4-nonylphenol, increased offspring production and SSRIs also increased the juvenile developmental rates at limiting but not at high food ration levels. SSRIs increased juvenile development rate, clutch size, and decrease offspring size at low and intermediate levels of food rations, changing the perception of food levels making them to behave like they grew at higher food levels. Enhanced reproductive effects of SSRIs were reversed by the presence of the 5-HT antagonist cyproheptadine, indicating that in D. magna SSRIs targeted serotonin metabolic paths like in humans. Physiological assays showed that adult females exposure to SSRIs increased oxygen consumption rates and decreased carbohydrate levels. These changes did not affect survival under starving conditions, but they significantly affected the capacity of the exposed animals to survive under anoxic conditions. 4-nonylphenol increased offspring number but decreased offspring size. These responses have detrimental fitness effects since smaller offspring takes longer to mature and reproduce and having less offspring directly affects population growth rates. The analysis of the D. magna transcriptome showed that serotonin metabolism, neuronal developmental processes, carbohydrates and lipid metabolism pathways appeared as selectively affected by SSRIs treatment, whereas 4-nonylphenol
deregulated genes from the carbohydrate metabolism and the ecdysone regulatory pathway. SSRIs show a MoA consistent with its pharmacological effect in humans while 4-nonylphenol effect seems to be performed through changes in the ecdysone regulatory pathways.
In chapter 5 I evaluated the extent to which different forms of nano-TiO2 aggregate with microalgae, edible particle concentration.
Effects were assessed using different assays. Assays included standard chronic reproduction 21-day tests, but also custom designed tests. The latter included two exposure scenarios: semi-static and re-suspension of algae. Results indicated the aggregation of nanoparticles. Nanoparticle aggregates interacted with the algae cells, forming clusters. Large TiO2-algae agglomerates settled readily, dramatically depleting the concentration of available food for Daphnia with dramatic effects on reproduction and fitness. These results indicate that nano-TiO2 may affect the transfer of energy throughout the planktonic aquatic food webs increasing the settlement of edible particles from the water column.
In chapter 6 I tried to characterize the presence and activity of the multixenobiotic resistance proteins (MXR) in D. magna. I sequenced new partial DNA sequences, coding for full transporters and studied their transcriptional pattern across lifestages and with juveniles exposed to MXR inducers. All the genes were transcribed early in embryos and some of them were induced in juvenile stages by pentachlorophenol and mercury. Associated efflux activity was monitored using three fluorescent substrate dyes that are specific of different mammalian transporter types, combined with specific MXR transporter inhibitors (chemosensitizers). Dye accumulation assays indicated that MXR is functional in juveniles and induced by
pentachlorophenol, mercury and dacthal. Toxicity bioassays performed with model substrates of ABCB1 (mitoxantrone) and ABCC (chlorambucil) transporters applied in combination chemosensitizers showed synergic toxic effects. This means that the MXR system is active and plays an important role detoxifying contaminants.

El efecto negativo que los contaminantes emergentes presentes en ecosistemas acuáticos tienen sobre la biota, es cada vez más evidente. En los capítulos 2, 3 y 4 se han evaluado los efectos sobre D. Magna del detergente 4-nonilfenol y de dos fármacos pertenecientes al grupo de los inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (ISRS): fluoxetina y fluvoxamina, empleados en el tratamiento de la depresión. Cuando la disponibilidad de alimento es intermedia o se reduce al límite, la presencia de ISRS o de 4-nonilfenol produce un aumento en la descendencia. Además, los ISRS también aceleran el desarrollo de los juveniles. La presencia de ISRS modifica la percepción de los niveles de comida, provocando que D. magna se comporte como si dispusiera de abundante alimento. Este incremento en la tasa de reproducción se invirtió en presencia de Ciproheptadina, un antagonista de los receptores 5-HT, indicando que, al igual que en humanos, los ISRS afectaban a las rutas metabólicas de la serotonina. Ensayos fisiológicos mostraron que las hembras adultas expuestas a ISRS aumentaban su consumo de oxígeno y que los niveles de carbohidratos descendían. Estos cambios no afectaron la supervivencia, pero si la capacidad de los animales expuestos a sobrevivir en condiciones anóxicas. 4-nonilfenol produce un aumento en el número de descendientes, mas éstos tienen menor tamaño y por tanto tardan más en madurar y reproducirse. El análisis del transcriptoma de D. magna muestra que el metabolismo de la serotonina, los procesos de desarrollo neural y el metabolismo de lípidos y carbohidratos están afectados por el tratamiento con ISRS, mientras que 4- nonilfenol desregula genes del metabolismo de los carbohidratos y provoca cambios en la ruta que regula la edicsona. En el Capítulo 5, se evalúa hasta qué punto diferentes formas de nano-TiO2 se agregan con microalgas y deste modo afectar la concentration de partículas comestibles.Se usaron diferentes ensayos para valorar los efectos. Dichos ensayos incluyen el test estándar de exposición crónica durante 21 días, así como otros tests diseñados específicamente para este estudio. Éstos últimos contemplan dos escenarios: exposición a algas de um modo semiestático y exposición a algas con resuspensin continua. Los resultados indican que las nanoparticulas se agregan y sus agregados interaccionan con las algas formando clusters. Los aglomerados TiO2-Alga de mayor tamaño sedimentan rápidamente, reduciendo drásticamente la concentración de alimento disponible y, por tanto, afectando gravemente a estado general y reproductivo de la Daphnia. Estos resultados alertan del efecto que el nano-TiO2 puede tener en los procesos de transferencia de energía a lo largo de toda la cadena alimentaria planctónica. En el capítulo 6 se caracteriza la presencia y actividad MXR en D. Magna. Se secuenciaron RNA, que codifican para estos transportadores y se estudiaron los patrones transcripcionales a lo largo de diferentes estadios de D. magna y, también, con juveniles expuestos a inductores de MXR. Los resultados mostraron que ya en los embriones se observa transcripción de todos los genes, y algunos de éstos se inducían en juveniles expuestos a pentaclorofenol y mercurio. Mediante el uso de tres sustratos fluorescentes específicos a distintos tipos de transportadores, se monitorizó la actividad de expulsión del pigmento combinada con inhibidores específicos del transportador MXR. Los ensayos de acumulación de estos sustratos indican que MXR es funcional en juveniles y que es inducido por pentaclorofenol, mercurio y Dacthal. Los ensayos de toxicidad realizados con sustratos modelo de los transportadores ABCB1 (mitoxantrona) y ABCC (clorambucil) en combinación con chimiosensibilizadores, demostraron efectos tóxicos sinérgicos. Estos resultados indican que el sistema MXR está activo y juega un papel muy importante en los procesos de detoxificación