Μελέτη του ρόλου των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της Rab5 στα μονοπάτια ενδοκυττάρωσης ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων
Authors: Γαλανοπούλου Αικατερίνη 
Published: September 2021

Η ενδοκυττάρωση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία μέσω της οποίας τμήματα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και εξωκυττάριες θρεπτικές ουσίες εισέρχονται στο κύτταρο μέσω κυστιδίων τα οποία οδηγούνται στο ενδολυσοσωματικό σύστημα. Καθοριστικό ρόλο στην διακίνηση του εσωτερικευμένου φορτίου παίζουν οι Rab GTPασες. Η μικρή GTPαση Rab5 ρυθμίζει την κυστιδιακή διακίνηση προς τα πρώιμα ενδοσώματα αλλά και μεταξύ αυτών, και παίζει σημαντικό ρόλο στην βιογένεση του ενδολυσοσωματικού συστήματος . Για να ρυθμίσει η Rab5 τις παραπάνω λειτουργίες της εναλλάσσεται μεταξύ της GTP ενεργούς διαμόρφωσης και της GDP ανενεργούςδιαμόρφωσης. Ενδιαφέρον προκαλεί το πώς η Rab5 ρυθμίζει τα πολύπλοκα και σύνθετα στάδια της ενδοκυττάρωσης. Σε προηγούμενες μελέτες, αναπτύχθηκε μια μεθοδολογία χρωματογραφίας συγγένειας με την οποία ταυτοποιήθηκαν περισσότερες από 40 πρωτεΐνες που συνδέονται με την Rab5-GTP, ενώ μόλις μία πρωτεΐνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την Rab5-GDP. Με φασματομετρία μάζας ταυτοποιήσαμε την κυτταροπλασματική ακετυλο-CoA θειολάση 2 (ACAT2), ένα ένζυμο που καταλύει την μετατροπή του ακέτυλο-CoA σε ακετοακέτυλο-CoA, δηλαδή την πρώτη αντίδραση στο μονοπάτι του μεβαλονικού οξέος. Επιπλέον, η ACAT2 είναι ακετυλοτρανφεράση πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Με δοκιμασίες χρωματογραφίας συγγένειας (pull-down) επιβεβαιώθηκε η εξειδίκευση της πρόσδεσης της ACAT2 στην Rab5, έναντι άλλων μελών της οικογένειας των Rabs (όπως η Rab4 και Rab27). Στη συνέχεια, μελετήσαμε την σταθερά σύνδεσης μεταξύ των Rab5-GDP και ACAT2 ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με την μέθοδο ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), και διαπιστώσαμε ότι πρόκειται για μια ευνοούμενη θερμοδυναμικά, ασθενή σύνδεση, με Kd της τάξεως των μΜ, η οποία είναι τυπική για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών που σχηματίζουν δυναμικά πρωτεϊνικά δίκτυα. Προκειμένου να διαλευκάνουμε τη σημασία της αλληλεπίδρασης μεταξύ Rab5 καιACAT2, αρχικά, αποδείξαμε ότι η σύνδεση μεταξύ Rab5-GDP και ACAT2 μπορεί να συμβεί σε ανέπαφα κύτταρα. Πράγματι, πραγματοποιώντας τεχνητή μετατόπιση της Rab5 άγριου τύπου στην κυτταροπλασματική επιφάνεια των μιτοχονδρίων (χρησιμοποιώντας ένα σήμα μιτοχονδριακής στόχευσης), προκλήθηκε μετακίνηση της ενδογενούς ACAT2 από το κυτταρόπλασμα, στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Ακολούθως, χρησιμοποιώντας μία in vitro δοκιμασία σύντηξης ενδοσωμάτων, αποδείξαμε ότι η ACAT2 αναστέλλει τη Rab5- μεσολαβούμενη σύντηξη των πρώιμων ενδοσωμάτων, υποδηλώνοντας ότι ασκεί ανασταλτικό ρόλο στην Rab5. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι η μείωση των επιπέδων της ACAT2 επιταχύνει την εσωτερίκευση και την αποικοδόμηση του VEGFR2 σε κύτταρα HUVE. Επιπλέον, η μείωση των επιπέδων της ACAT2 προκαλεί αύξηση του αριθμού των πρώιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων σε κύτταρα HUVE και HepG2. Τέλος, με φασματομετρία μάζας ταυτοποιήσαμε την in vitro ακετυλίωση της Rab5-GDP από την ACAT2. Συνοψίζοντας τα δεδομένα της παρούσας διατριβής, συμπεραίνουμε ότι η ACAT2 είναι μια νέα πρωτεΐνηρυθμιστής της Rab5 και παίζει σημαντικό ρόλο στο μονοπάτι της ενδοκυττάρωσης. Τέλος,μελλοντικά πειράματα θα συμβάλλουν στην περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού της αλληλεπίδρασης, και θα διαλευκάνουν τον ακριβή ρόλο της στην διασύνδεση μεταξύ μεταβολισμού, ενδοκυττάρωσης και μεταγωγής του σήματος.