Μελέτες της οργάνωσης δομικών πρωτεϊνών σε εξωκυτταρικά συστήματα με ελικοειδή αρχιτεκτονική και ανάλογά τους
Authors: Οικονομίδου Βασιλική 
Published: August 2021

Διάφορες εξωκυττάριες ινώδεις δομές έχουν ελικοειδή αρχιτεκτονική. Τέτοιες δομές υπάρχουν στο κέλυφος (χόριο) αυγών εντόμων και ιχθύων (πρωτεϊνικές ίνες μέσα σε πρωτεϊνική μήτρα), στο δερμάτιο των αρθροπόδων (πολυσακχαριτικές ίνες μέσα σε πρωτεϊνική μήτρα), στο κυτταρικό τοίχωμα των φυτών (πολυσακχαριτικές ίνες μέσα σε πολυσακχαριτική μήτρα) κ.α. Η ευρεία διάδοση της ελικοειδούς αρχιτεκτονικής, καθώς και η συσχέτισή της με τη μηχανική αντοχή και τη θερμική μόνωση που προσφέρει, είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα. Στα πλαίσια της αναζήτησης ενός κοινού ‘μοριακού παρονομαστή’, ο οποίος, πιθανόν, υπαγορεύει έναν ομοιόμορφο τρόπο πρωτεϊνικής αναδίπλωσης και αυτοσυγκράτησης, για τη δημιουργία δομών με ελικοειδή αρχιτεκτονική, μελετήθηκαν τρία συστήματα: των πεπτιδίων-αναλόγων τμημάτων των πρωτεϊνών του χορίου των μεταξοσκωλήκων, του κελύφους (χορίου) των αυγών των ιχθύων και του δερματίου των εντόμων. Το κέλυφος (χόριο) των αυγών των μεταξοσκωλήκων χρησιμοποιείται, για μια εικοσαετία και πλέον, ως πρότυπο σύστημα μελέτης αναδίπλωσης και αυτοσυγκράτησης δομικών πρωτεϊνών, για τη δημιουργία πολύπλοκων, φυσιολογικά σημαντικών, βιολογικών δομών. Προκειμένου να καθοριστούν οι αρχές που διέπουν τη μοριακή αρχιτεκτονική του κελύφους των ωοθυλακίων των μεταξοσκωλήκων και τον τρόπο δημιουργίας του, και να συσχετιστεί η δομή του κελύφους με τις σπουδαίες φυσιολογικές λειτουργίες που επιτελεί, μελετήθηκαν οι ιδιότητες της δομής και οι μηχανισμοί αυτοσυγκρότησης δύο συνθετικών πεπτιδίων-αναλόγων της κεντρικής συντηρητικής περιοχής (ολόκληρης ή τμήματος) των πρωτεϊνών του χορίου των μεταξοσκωλήκων: ένα πεπτίδιο, 51-αμινοξικών καταλοίπων, ανάλογο ολόκληρης της κεντρικής περιοχής των πρωτεϊνών της A οικογένειας (cA-πεπτίδιο) και ένα πεπτίδιο 18-αμινοξικών καταλοίπων, ανάλογο τμήματος της κεντρικής περιοχής των πρωτεϊνών της Β οικογένειας, του χορίου των μεταξοσκωλήκων (Β-πεπτίδιο). Τα πεπτίδια-ανάλογα μελετήθηκαν τόσο σε στερεά κατάσταση, όσο και σε διαλύματα, υποθέτοντας ότι αυτή η ανάλυση θα μπορούσε να αποκαλύψει πρότυπα αναδίπλωσης και πακεταρίσματος, σημαντικά στην δομή και αυτοσυγκρότηση των πρωτεϊνών του χορίου. Στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής δείχτηκε, ότι τα πεπτίδια αυτά αυτοσυγκροτούνται σε ποικίλες συνθήκες και δημιουργούν πηκτώματα, τα συστατικά των οποίων είναι ινίδια ανάλογα με τα ινίδια των αμυλοειδών. Είναι, δηλαδή, ινίδια (στη συγκεκριμένη περίπτωση διπλές έλικες) απροσδιόριστου μήκους, με πάχος 100 Å (τα πρωτοϊνίδια έχουν πάχος 30-40 Å), που δεσμεύουν τη χρωστική Congo red, δίνοντας τη χαρακτηριστική κιτρινοπράσινη διπλοθλαστικότητα (με διασταυρωμένο πολωτή και αναλύτη) σε πολωτικό μικροσκόπιο, και δίνουν περιθλασίγραμμα ακτίνων-Χ χαρακτηριστικό ‘cross-β’ δομής. Επίσης, με χρήση φασματοσκοπιών υπερερύθρου (ATR FT-IR), FT-Raman και κυκλικού διχρωισμού (CD), υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι τα πεπτίδια, που απαρτίζουν τα ινίδια, αποκτούν δευτεροταγή δομή β-πτυχωτών επιφανειών. Ως πιθανές δομές προτείναμε τη δομή των αντιπαράλληλων β-πτυχωτών επιφανειών ή τη δομή των αριστερόστροφων β-ελίκων, με πιθανότερη την πρώτη. Τα πεπτίδια cA και Β αντιστοιχούν στο ~40% της συνολικής μάζας του χορίου, άρα είναι αντιπροσωπευτικά μεγάλου τμήματος της δομής των πρωτεϊνών του χορίου. Το γεγονός ότι οι μηχανισμοί αυτοσυγκρότησής τους δημιουργούν αμυλοειδή ινίδια κάτω από μια μεγάλη και διαφορετική ποικιλία συνθηκών, υποδεικνύει ότι, κατά πάσα πιθανότητα, διπλώνουν με αμυλοειδή τρόπο και στη φυσιολογική κατάσταση (in vivo). Ενδείξεις, ενισχυτικές αυτής της υπόθεσης, αποτελούν προηγούμενες μελέτες που έχουν γίνει στο χόριο του μεταξοσκώληκα, σύμφωνα με τις οποίες, στρώματα ινιδίων, με τις ίδιες διαστάσεις (70-100 Å) περίπου με τα ινίδια του πεπτιδίου cA, συνιστούν την ελικοειδή αρχιτεκτονική του. Επίσης, έχει δειχτεί ότι, τα ινίδια του χορίου του μεταξοσκώληκα αποτελούνται από πρωτοϊνίδια 30-40 Å με δομή έλικας, ενώ η in vivo κυρίαρχη μοριακή στερεοδιάταξη των πρωτεϊνών του χορίου είναι οι αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες. Συνεπώς, στα ‘αμυλοειδή’ των πρωτεϊνών του χορίου, η αμυλοειδογενής στερεοδιάταξη είναι φανερά η φυσική στερεοδιάταξη. Σύμφωνα με τα όσα γνωρίζουμε μέχρι σήμερα, αυτή είναι η πρώτη καλά τεκμηριωμένη περίπτωση, όπου αμυλοειδή ινίδια σχηματίζονται από πεπτίδια, τα οποία έχουν ακολουθία που διπλώνει τόσο καθαρά σε αντιπαράλληλες β- πτυχωτές επιφάνειες τύπου ‘cross-β’. Η φύση, μετά από εκατομμύρια χρόνια μοριακής εξέλιξης, σχεδίασε αυτά τα αμυλοειδή πεπτίδια του χορίου, για να παίξουν ένα σημαντικό λειτουργικό ρόλο: να προστατεύουν το ωοκύτταρο και το αναπτυσσόμενο έμβρυο από ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών κινδύνων. Πιστεύουμε ότι οι πρωτεΐνες του χορίου και τα πεπτίδια-ανάλογα παρέχουν ένα σύστημα-μοντέλο για τη μελέτη του σχηματισμού των αμυλοειδών. Επίσης, από τα αποτελέσματα αυτών των μελετών ανοίγονται νέοι δρόμοι, τόσο στην εύρεση του τρόπου με τον οποίο το, ελικοειδούς αρχιτεκτονικής, βιολογικό ανάλογο χοληστερικών υγρών κρυστάλλων, χόριο "χτίζεται" από τις συνιστώσες του πρωτεΐνες, όσο και στην ανακάλυψη νέων οδών, που αφορούν τη σύνθεση καινούριων βιοσυμβατών πολυμερών, με σημαντικές ιδιότητες και ίσως νέες βιοϊατρικές και βιομηχανικές εφαρμογές. Το γεγονός, ότι η ελασματοειδής υπερμοριακή δομή κυριαρχεί εκτός από τα χόρια των λεπιδοπτέρων και σε διάφορα χόρια αυγών ιχθύων (π.χ. πέστροφα), μας ώθησε να επεκτείνουμε τις μελέτες μας στο κέλυφος (χόριο) τριών τελεόστεων ιχθύων: στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax), στην τσιπούρα (Sparus aurata) και στη συναγρίδα (Dentex dentex). Μελέτες με ΗΜΣ έδειξαν ότι το χόριο των αυγών και των τριών τελεόστεων ιχθύων συνίσταται από ένα μικρό αριθμό ελασμάτων (~9-12), γεγονός που υποδεικνύει, παρ’ όλο που δεν το αποδεικνύει, ελικοειδή αρχιτεκτονική. Βιοχημική ανάλυση των πρωτεϊνών του χορίου ώριμων ωοθυλακίων των προαναφερθέντων ιχθύων με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακρυλαμίδης χώρισε τις πρωτεΐνες της τσιπούρας σε τρεις και της συναγρίδας και του λαβρακιού σε τέσσερις οικογένειες: των 45, 50 και 75 kDa και των 45, 50, 89 και 120 kDa, αντίστοιχα. Οι φασματοσκοπίες υπερερύθρου (ATR FT-IR) και FT-Raman, που χρησιμοποιήθηκαν σε δείγματα χορίων αυγών των τριών ιχθύων, έδωσαν μέγιστα αμιδικών ταινιών I, II και III, χαρακτηριστικά δομής β-πτυχωτών επιφανειών. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύθηκαν και από το χαρακτηριστικό β-πτυχωτών επιφανειών περιθλασίγραμμα ακτίνων-Χ, που συλλέχθηκε από τα ίδια χόρια, ενώ προσπάθειες ποσοτικοποίησης της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών τους, έδωσαν υψηλά ποσοστά δομής β-πτυχωτών επιφανειών, με μικρότερα β-στροφών. Βέβαια, παρά τα παραπάνω δεδομένα ο σχηματισμός αυτών των χορίων, ως μια αυθόρμητη διαδικασία, δεν έχει ακόμα κατανοηθεί. Για να κατανοήσουμε πώς αυτές οι β-δομές αλληλεπιδρούν για να σχηματίσουν μια τρισδιάστατη ελικοειδή αρχιτεκτονική, απαιτείται γνώση της αλληλουχίας των πρωτεϊνών του χορίου των ιχθύων. Δυστυχώς, μέχρι σήμερα, οι αλληλουχίες των πρωτεϊνών του χορίου των ιχθύων δεν είναι γνωστές. Παρόμοιες μελέτες έγιναν και στο σύστημα του δερματίου (ή εφυμενίδας), το οποίο αποτελεί το μεγαλύτερο και σημαντικότερο τμήμα του εξωσκελετού ή καλυπτήριου συστήματος των εντόμων και των άλλων αρθροπόδων (καρκινοειδών, αραχνίδων κ.λπ.). Το δερμάτιο διακρίνεται γενικά σε 'σκληρό' (άκαμπτο) και 'μαλακό' (ελαστικό). Το ενδιαφέρον για τις πρωτεΐνες του δερματίου έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια, με αποτέλεσμα η πρωτοταγής δομή διαφόρων πρωτεϊνών του, που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, όπως και διαφορετικά είδη από τα οποία προέρχονται, να είναι πλέον γνωστή. Περισσότερες από 100 ακολουθίες πρωτεϊνών του δερματίου (εξωδερματίου/ενδοδερματίου) είναι σήμερα διαθέσιμες, σύγκριση των οποίων έδειξε ομοιότητες μεταξύ τους. Μοιράζονται ένα κοινό πρότυπο, όμοιο με αυτό που είχε αναγνωριστεί, από τους Rebers & Riddiford (1988), σε 7 πρωτεΐνες, τη γνωστή ακολουθία συναίνεσης’ R&R: G-x(8)-G-x(6)-Y-x-A-x-E-x-G-Y-x(7)-P-x(2)-P Για κάθε μια από τις 100 πρωτεΐνες έγινε μεμονωμένη πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής, με το συνδυαστικό πακέτο πρόβλεψης δευτεροταγούς δομής SecStr που αναπτύχθηκε από τον Καθ. Σ. Χαμόδρακα, και κατασκευάστηκαν τα συνδυαστικά τους ιστογράμματα, ο μέσος όρος των οποίων προέβλεψε 4 β-κλώνους που εναλλάσσονται με β-στροφές/βρόχους για τις πρωτεΐνες του ‘σκληρού’ και 3 β-κλώνους που εναλλάσσονται με β-στροφές/βρόχους για τις πρωτεΐνες του ‘μαλακού’ δερματίου. Προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα θεωρητικά αποτελέσματα της πρόβλεψης δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών του δερματίου, έγιναν πειραματικές μελέτες σε δείγματα δερματίου του λεπιδοπτέρου Η. cecropia, με φασματοσκοπία υπερερύθρου και φασματοσκοπία FT-Raman. Για τις πρωτεΐνες του ‘μαλακού’ δερματίου, τα φάσματα και των δύο φασματοσκοπιών ταλάντωσης υπέδειξαν τις β-πτυχωτές επιφάνειες ως την επικρατούσα δευτεροταγή δομή τους, ενώ για τις πρωτεΐνες του ‘σκληρού’ δερματίου, το τοπίο δεν είναι ακόμα καλά ξεκαθαρισμένο. Ενισχυτικά αποτελέσματα, για το ίδιο συμπέρασμα, έδωσε και η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού. Άρα, τα ευρήματα και στο δερμάτιο, ενισχύουν την άποψη ότι η /3-πτυχωτή επιφάνεια υπαγορεύει το σχηματισμό όχι μόνο του ελικοειδούς χορίου, αλλά και του ελικοειδούς δερματίου. Συνεπώς, το συμπέρασμα από τη μελέτη και των τριών συστημάτων είναι ότι: ο κοινός ‘μοριακός παρονομαστής’ που υπαγορεύει τη δημιουργία της ελικοειδούς αρχιτεκτονικής είναι η δομή των β-πτυχωτών επιφανειών των πρωτεϊνικών τους συνιστωσών. Ειδικότερα συμπεράσματα για κάθε σύστημα χωριστά: 1. ΣΤΟ ΧΟΡΙΟ ΤΩΝ ΤΕΛΕΟΣΤΕΩΝ ΙΧΟΥΩΝ D. labrax, S. aurata και D. dentex: ■ έχει ελικοειδή αρχιτεκτονική ■ συνίσταται από πρωτεΐνες μεγάλου MB, που κυμαίνονται μεταξύ 45 και 120 kDa ■ οι πρωτεΐνες αυτές υιοθετούν, κυρίως, στερεοδιάταξη αντιπαράλληλων β-πτυχωτών επιφανειών, με ισχυρή συνεισφορά από β-στροφές ■ παρουσιάζει ομοιότητες στη δομή και τη βιοχημική σύσταση με το χόριο ενός άλλου τελέοστεου ιχθύος, της πέστροφας Salmo gairdneri, που μελετήθηκε στο εργαστήριό μας 2. ΣΤΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ-ΑΝΑΛΟΓA ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΧΟΡΙΟΥ ΤΩΝ ΜΕΤΑΞΟΣΚΩΛΗΚΩΝ: ■ Τα πεπτίδια cA και Β αυτοσυγκροτούνται σε ποικιλία συνθηκών σε ινίδια, ανάλογα με τα ινίδια των αμυλοειδών ■ Προτάθηκαν μοντέλα για τη δομή των πεπτιδίων που αποτελούν τα αμυλοειδή ινίδια, που πιθανόν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλα σε άλλες περιπτώσεις αμυλοειδώσεων ■ Η ομοιότητες στη δομή των ινιδίων αυτών με τα ινίδια του χορίου και βιοφυσικά δεδομένα, που έχουν ήδη συλλεγεί για τη δομή του χορίου των μεταξοσκωλήκων, εισηγούνται ότι το χόριο είναι ένα φυσικό προστατευτικό αμυλοειδές, που ‘θωρακίζει το ωοκύτταρο και το αναπτυσσόμενο έμβρυο από τις επιδράσεις του περιβάλλοντος, σε αντίθεση με τα αμυλοειδή που έχουν συνήθως ‘καταστρεπτικό’ ρόλο ■ Οι μελέτες των ιδιοτήτων και της δομής των αμυλοειδών ινιδίων των πεπτιδίων-αναλόγων των πρωτεϊνών του χορίου ανοίγουν νέους δρόμους για τη σύνθεση βιοσυμβατών πολυμερών με δυνητικές βιοϊατρικές και βιομηχανικές εφαρμογές ■ Η σύνθεση κατάλληλα σχεδιασμένων ‘μεταλλαγμένων’ πεπτιδίων μπορεί να επιτρέψει τη μελέτη βασικών μηχανισμών πρωτεϊνικής αναδίπλωσης (protein folding) και αυτοσυγκρότησης, με συστηματικό τρόπο 3. ΣΤΟ ΔΕΡΜΑΤΙΟ ΤΩΝ ΕΝΤΟΜΩΝ: ■ Στοίχιση των πρωτεϊνών του δερματίου και προγνώσεις δευτεροταγούς δομής υπέδειξαν την ύπαρξη εκτεταμένων ‘συντηρητικών’ δομικών στοιχείων στις δομές των πρωτεϊνών του δερματίου, στις οποίες κυριαρχεί η δομή των β-πτυχωτών επιφανειών ■ Οι προγνώσεις επαληθεύτηκαν με πειραματικές μεθόδους (φασματοσκοπία ATR FT-IR και FT-Raman) και είναι η πρώτη φορά που κάτι τέτοιο έγινε εφικτό διεθνώς ■ Επιπλέον, είναι φανερές, και πειραματικά και προγνωστικά, οι διαφορές μεταξύ πρωτεϊνών ‘μαλακών’ και ‘σκληρών’ δερματίων, που πιθανότατα σχετίζεται με τον φυσιολογικό τους ρόλο ■ Η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με τη χιτίνη, για τη δημιουργία της δομής του δερματίου, είναι θέμα για μελλοντικές μελέτες.