Παράγοντες που επηρεάζουν τον in vitro και με φυλλοφόρα μοσχεύματα πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς
Authors: Στουρνάρας Βασίλειος 
Published: August 2021

Η ξυλοκερατιά (κν. χαρουπιά) (Ceratonia siliqua L.) είναι δένδρο αειθαλές, βραδείας ανάπτυξης, το οποίο ευδοκιμεί από την αρχαιότητα στην περιοχή της Μεσογείου. Η ξυλοκερατιά, λόγω των πολλών χρήσεών της (ζωοτροφή, βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων, καλλυντικών και χημικών, μελισσοκομικό και καλλωπιστικό φυτό, παραγωγή βιοαιθανόλης,) αλλά και των μικρών απαιτήσεών της σε έδαφος και καλλιεργητικές φροντίδες, θα μπορούσε να επεκταθεί σε διάφορες περιοχές με ήπιες κλιματικές συνθήκες, κυρίως της νότιας Ελλάδας. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των σπουδαιότερων παραγόντων (νεανικότητα, έκφραση γονιδίων, βιοχημικοί παράγοντες, φυτορυθμιστικές ουσίες, κ.ά.), που επηρεάζουν τον in vitro όσο και με φυλλοφόρα μοσχεύματα πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς. Η απομόνωση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε ενήλικο και νεανικό βλαστό ξυλοκερατιάς πραγματοποιήθηκε με την τεχνική του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού (suppression subtractive hybridization, SSH). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την ύπαρξη αρκετών διαφορετικά εκφραζόμενων γονιδίων στους βλαστούς της ξυλοκερατιάς, η έκφραση των οποίων εξαρτάται από τη φυσιολογική ηλικία και την εποχή συλλογής του βλαστού. Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν ένζυμα (π.χ. συνθάση I του αμύλου, τύπος Ρ ΑΤΡάσης, διγουανυγική φωσφοδιεστεράση, κινάση), πρωτεΐνες (π.χ. MdMads2.1, GTP-binding, FRUITFUL-like, χλωροπλαστικής τοπολογίας, άγνωστες), κ.ά. Τα γονίδια που εντοπίστηκαν, είτε όταν εκφράζονται είτε όταν καταστέλλεται η έκφρασή τους, ενδεχομένως να σχετίζονται με ορισμένες από τις μορφολογικές και φυσιολογικές εκδηλώσεις της νεανικότητας στην ξυλοκερατιά. Για παράδειγμα, τα γονίδια που κωδικοποιούν το ένζυμο συνθάση I του αμύλου καθώς και διάφορες πρωτεΐνες πιθανόν να συμβάλλουν, δια της παραγωγής αμύλου και πρωτεϊνών, στην ευκολία ριζογένεσης των νεανικών της μοσχευμάτων. Κατά τον πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς με φυλλοφόρα μοσχεύματα διερευνήθηκαν διάφοροι παράγοντες, όπως η φυσιολογική ηλικία του μοσχεύματος, η εποχή συλλογής του καθώς ο τύπος και η συγκέντρωση της εξωγενώς εφαρμοζόμενης αυξίνης. Σε ενήλικους και νεανικούς βλαστούς ξυλοκερατιάς προσδιορίστηκαν, σε όλες τις εποχές του έτους, βιοχημικοί παράγοντες που σχετίζονται με τη ριζογένεση, όπως τα διαλυτά σάκχαρα (ολικά και τα κυριότερα, αναλυτικά), το άμυλο, οι ολικές φαινολικές ουσίες, οι ολικές ο-διφαινόλες, το ολικό άζωτο (Ν) καθώς και η σχέση των ολικών μη δομικών υδατανθράκων προς το άζωτο (C/N). Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση μεταξύ των ανωτέρω βιοχημικών παραγόντων και του ποσοστού ριζοβολίας, καθώς και του αριθμού και του μέσου μήκους των ριζών των μοσχευμάτων. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι σε όλες τις εποχές τα νεανικά μοσχεύματα παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών ανά μόσχευμα, σε σύγκριση με τα ενήλικα και στις δύο πειραματικές χρονιές. Τα μοσχεύματα που συλλέχθηκαν την άνοιξη παρουσίασαν υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες εποχές. Η εμβάπτιση της βάσης των μοσχευμάτων σε ινδολυλοβουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) έδωσε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, σε σύγκριση με το β-ναφθαλινοξικό οξύ (β-ΝΑΑ) και το μάρτυρα, σε όλες τις εποχές και στις δύο ηλικίες μοσχευμάτων και επίσης και στις δύο χρονιές. Οι ενήλικοι βλαστοί είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση ολικού αζώτου, σε σύγκριση με τους νεανικούς, σε όλες τις εποχές και στις δύο χρονιές. Επίσης, οι ενήλικοι βλαστοί - πλην ελάχιστων εξαιρέσεων - είχαν υψηλότερη συγκέντρωση ολικών φαινολικών ουσιών, ολικών ο-διφαινολών, σακχαρόζης, πινιτόλης, φρουκτόζης, ολικών σακχάρων, ολικών μη δομικών υδατανθράκων, καθώς και μεγαλύτερη σχέση ολικών μη δομικών υδατανθράκων προς άζωτο, σε σύγκριση με τους νεανικούς, σε όλες τις εποχές και στις δύο χρονιές. Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε η ύπαρξη στατιστικά σημαντικής αρνητικής συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού ριζοβολίας και του αριθμού και του μέσου μήκους των παραγομένων ριζών των μοσχευμάτων (ενήλικων και νεανικών) της ξυλοκερατιάς που δεν μεταχειρίστηκαν με αυξίνη (μάρτυρας) με τη συγκέντρωσή τους σε ολικό άζωτο, ολικές φαινολικές ουσίες (μόνο το έτος 2004 για το μέσο μήκος), ολικές ο-διφαινόλες (μόνο το έτος 2004 για το μέσο μήκος) και πινιτόλης και στις δύο πειραματικές χρονιές. Επίσης, διαπιστώθηκε η ύπαρξη στατιστικά σημαντικής θετικής συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού ριζοβολίας και του αριθμού και του μέσου μήκους των παραγόμενων ριζών των μοσχευμάτων με τη συγκέντρωσή τους σε άμυλο καθώς και με τη σχέση ολικοί μη δομικοί υδατάνθρακες προς άζωτο (μόνο το έτος 2005 για το μέσο μήκος) και στις δύο χρονιές. Κατά τον in vitro πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς έκφυτα, προερχόμενα από νεαρά σπορόφυτα, εγκαταστάθηκαν επιτυχώς, έπειτα από απολύμανση με 10% NaOCl για 12 λεπτά. Κατά το στάδιο της βλαστογένεσης, βρέθηκε πως τα έκφυτα της ξυλοκερατιάς έδειξαν καλύτερη ανταπόκριση (μεγάλος αριθμός και μέσο μήκος βλαστών ανά έκφυτο και μεγάλος αριθμό κόμβων ανά βλαστό) και συμπεριφορά στην ανάπτυξή τους (αποφυγή ξήρανσης κορυφής και νεκρώσεις στα φυλλάριά τους) στο θρεπτικό υπόστρωμα των Murashige και Skoog (MS). Επίσης, προέκυψε πως αύξηση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης είχε ως αποτέλεσμα αφενός την αύξηση του αριθμού των βλαστών ανά έκφυτο καθώς και του κάλλου και αφετέρου τη μείωση του μέσου μήκους των βλαστών ανά έκφυτο καθώς και του αριθμού των κόμβων ανά βλαστό. Η βενζυλαδενίνη (ΒΑ) έδωσε, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση, μεγαλύτερο αριθμό βλαστών ανά έκφυτο, σε σύγκριση με την 2-ισοπεντυλαδενίνη (2iP). Όμως, η 2iP έδωσε, για την ίδια συγκέντρωση, μεγαλύτερο αριθμό κόμβων ανά βλαστό, σε σύγκριση με τη ΒΑ. Στο στάδιο της ριζοβολίας, η χρησιμοποίηση μεθόδου δύο σταδίων έδωσε υψηλά ποσοστά ριζοβολίας στα έκφυτα της ξυλοκερατιάς. Ως καλύτερη επέμβαση είναι δυνατό να θεωρηθεί ο συνδυασμός 1 mg L⁻¹ IBA και χρόνου παραμονής 10 ημερών των εκφύτων στο ΙΒΑ, καθώς έδωσε, μετά από συνολική παραμονή τριών εβδομάδων των εκφύτων στο θάλαμο ανάπτυξης, υψηλό ποσοστό ριζοβολίας (95%), ικανοποιητικό αριθμό ριζών (σχεδόν 6 ρίζες ανά έκφυτο), σχετικά μεγάλο μέσο μήκος ριζών (1,8 cm) και μικρό κάλλο. Τα έρριζα έκφυτα, μετά την ολοκλήρωση του σταδίου του εγκλιματισμού και της σκληραγώγησής τους, παρουσίασαν υψηλά ποσοστά επιβίωσης, περίπου 90%. Συμπερασματικά, η ξυλοκερατιά πολλαπλασιάζεται με επιτυχία με φυλλοφόρα μοσχεύματα καθώς και in vitro. Η χρησιμοποίηση φυτικού υλικού, που βρίσκεται στη φάση της νεανικότητας, είχε θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό της τόσο με φυλλοφόρα μοσχεύματα, καθώς έδωσε υψηλά ποσοστά ριζοβολίας, μεγάλο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, όσο με την in vitro τεχνική, καθώς επέτρεψε την εγκατάσταση της καλλιέργειας χωρίς ιδιαίτερα προβλήματα. Η χρησιμοποίηση φυτορυθμιστικών ουσιών είχε θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό της και με τις δύο τεχνικές, ενώ η απομόνωση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και ο προσδιορισμός βιοχημικών παραγόντων στους βλαστούς της βοήθησε στην ερμηνεία του πολλαπλασιασμού της, με φυλλοφόρα μοσχεύματα.