Η μελέτη της επούλωσης του τραύματος σε σχέση με τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου
Authors: Οικονόμου Δημήτριος 
Published: August 2021

H παρούσα διατριβή πραγματεύεται τη μελέτη των μορίων του εξωκυττάριου χώρου -GAGs, MMPS και TIMPs- σε σχέση με τις διαδικασίες της επούλωσης του δέρματος, in vitro και in vivo. Xρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές και αναπτύχθηκαν κυτταροκαλλιέργειες στις οποίες εφαρμόστηκε το πειραματικό μας μοντέλο επούλωσης. Μελετήθηκαν διάφορα πλέγματα-ικριώματα στις κυτταροκαλλιέργειες με σκοπό την λειτουργικότητα και συμβατότητά τους με τις κυτταροκαλλιέργειες. Τέλος, εξετάστηκε η επούλωση σε πειραματόζωα, παρουσία και απουσία των πλεγμάτων. Αναλυτικότερα ολοκληρώθηκαν τα εξής πειράματα: 1) Σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών μελετήθηκε η επίδραση GAGs, συγκεκριμένα του υαλουρονικού οξέος (ΗΑ), της θεϊκής δερματάνης (DS), της θεϊκής χονδροϊτίνης (ChS) και της θεϊκής ηπαράνης (HS), στην επούλωση μετά από πρόκληση τραύματος πάνω σε μονοστιβάδα δερματικών ινοβλαστών σε σχέση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το HA και η DS διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ινοβλαστών στην περιοχή του τραύματος, συγκριτικά με τη ChS, τη HS και το μάρτυρα. Μετρώντας τη ζελατινολυτική δραστηριότητα των ινοβλαστών από τα υπερκείμενα των κυτταροκαλλιεργειών διαπιστώθηκε ότι το HA και η DS επάγουν σημαντικά την ενζυμική δραστηριότητα των ΜΜΡs μετά από 24 και 48 ώρες επώασης, σε αντίθεση με τις ChS και HS που δεν προκαλούν καμία αλλαγή. Η επαγωγή αυτή των ΜΜΡs από το ΗΑ και τη DS επιβεβαιώθηκε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με μέτρηση με ELISA. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι καμία από τις GAGs που μελετήθηκαν δεν προκάλεσε μεταβολή της έκφρασης του TIMP-1 παρουσία ή απουσία τραύματος. 2) Στη συνέχεια, μελετήσαμε την ικανότητα των ινοβλαστών να πολλαπλασιάζονται και να μεταναστεύουν σε κυτταροκαλλιέργειες παρουσία δύο τύπων πλεγμάτων-ικριωμάτων, (χιτίνης και PHB). Η μελέτη των πλεγμάτων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως έδειξε πως το πλέγμα χιτίνης δεν επιτρέπει την είσοδο των ινοβλαστών σε αυτό, πιθανόν λόγω της πυκνής δομής του. Αντίθετα, η δομή του PHB πλέγματος επέτρεψε τη είσοδο κυττάρων σε αυτό, καθώς και την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας από τα κύτταρα. 3) In vivo, μελετήθηκε η επούλωση τραυμάτων που προκλήθηκαν σε ράχες μυών Balb/c και αφέθηκαν να επουλωθούν παρουσία και απουσία των πλεγμάτων χιτίνης και PHB. Καμία διαφορά στην επούλωση δεν παρατηρήθηκε μακροσκοπικά στα τραύματα. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και τα ιστοτεμάχια δέρματος μελετήθηκαν στο οπτικό και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Το πλέγμα χιτίνης δεν απορροφήθηκε ούτε αφομοιώθηκε από τους γύρω ιστούς και έτσι η μικροσκόπισή του δεν πραγματοποιήθηκε. Το πλέγμα PHB επάγει την επούλωση κυρίως από την 3η έως και την 7η ημέρα μετατραυματικά, με αυξημένη κυτταροβρίθεια και παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας καθώς και κολλαγόνων ινών. Xρησιμοποιήσαμε μοριακές και βιοχημικές μεθόδους για τη μελέτη των ιστοτεμαχίων του δέρματος των μυών. και διαπιστώσαμε ότι το HA επάγεται στατιστικά σημαντικά την 1η και 3η ημέρα μετατραυματικά και επανέρχεται στα επίπεδα του μάρτυρα την 7η ημέρα. Τα δύο πλέγματα έδειξαν ότι προκαλούν επαγωγή της σύνθεσης του ΗΑ την 1η και 3η ημέρα, συγκριτικά με τις περιοχές όπου τα πλέγματα απουσίαζαν. Μελετήσαμε την ενζυμική δραστηριότητα των MMPs και παρατηρήσαμε ότι η proMMP-9 και η MMP-9 επάγονται στατιστικά σημαντικά την 3η και 7η ημέρα μετατραυματικά συγκριτικά με το μάρτυρα. Σε αντιδιαστολή η proMMP-2 και MMP-2 δεν παρουσιάζουν καμία διαφορά μετατραυματικά συγκριτικά με το μάρτυρα (ιστός χωρίς τραύμα). Σε ότι αφορά τα πλέγματα διαπιστώσαμε ότι το πλέγμα χιτίνης προκαλεί στατιστικά σημαντική επαγωγή στην έκφραση της MMP-9 ενώ το πλέγμα PHB αναστολή της. Η MMP-2 επάγεται και από τα δύο πλέγματα μόνο την 1η ημέρα μετατραυματικά. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής υποδεικνύουν πως το υαλουρονικό οξύ και η θειική δερματάνη ρυθμίζουν την ενζυμική δραστηριότητα και έκκριση των MMPs. Ενδεχόμενα τα μόρια αυτά καθώς και τα πλέγματα-ικριώματα PHB να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον για την επιτάχυνση και βελτιστοποίηση της επούλωσης των τραυμάτων.