Διερεύνηση της χρήσης των ελεύθερων νουκλεϊνικών οξέων (cell free DNA & miRNAs) στο καλλιεργητικό υλικό των εμβρύων ως προγνωστικών δεικτών της ποιότητας των εμβρύων και της δυνατότητας εμφύτευσης τους
Authors: Σιαλακούμα Αφροδίτη 
Published: July 2023

Η επιλογή των κατάλληλων εμβρύων για μεταφορά αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση που καλούνται να αντιμετωπίσουν οι κλινικοί εμβρυολόγοι παγκοσμίως από τα πρώτα κιόλας χρόνια εφαρμογής της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, μέχρι σήμερα. Διάφορες τεχνικές και μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί και συνεχώς διερευνώνται καινούργιες, ώστε να γίνει εφικτή η επιλογή εκείνων των εμβρύων που θα έχουν το δυναμικό να οδηγήσουν σε επιτυχημένη κύηση και τελικά στην γέννηση υγιών μωρών. Οι προσεγγίσεις που έχουν αναπτυχθεί μπορούν να χωριστούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στις επεμβατικές και τις μη επεμβατικές. Η παγκόσμια τάση βέβαια είναι η εισαγωγή στην κλινική πράξη μη επεμβατικών διαδικασιών επιλογής εμβρύων, οι οποίες είναι απαλλαγμένες από τις αρνητικές επιδράσεις των επεμβατικών τεχνικών, ώστε να είναι δυνατή η επιλογή ενός και μόνο υγιούς εμβρύου κάθε φορά, αυξάνοντας τα ποσοστά κυήσεων και υγιών γεννήσεων χωρίς τους κινδύνους μιας πολύδυμης εγκυμοσύνης. Τα τελευταία χρόνια, η κατανόησή μας για τη βιολογία των ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων, όπως το cell free DNA (cfDNA) και τα microRNAs (miRNAs) έχει προχωρήσει πολύ και έχουν αναπτυχθεί ισχυρές τεχνολογίες για την ανάλυσή τους. Πολλές ερευνητικές μελέτες αναφέρουν την χρήση αυτών των μορίων ως προγνωστικά εργαλεία διαφόρων μορφών καρκίνου, διαταραχών στις ωοθήκες και το ενδομήτριο, στην διάγνωση ανευπλοειδιών στα έμβρυα, αλλά και στην παρακολούθηση της υγείας των εμβρύων πριν την εμφύτευση στις διαδικασίες Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής.Στην συγκεκριμένη εργασία διερευνώνται τα ελεύθερα νουκλεϊκά οξέα, cfDNA και microRNAs, τα οποία απελευθερώνονται στο καλλιεργητικό υλικό ανθρώπινων εμβρύων στο εργαστήριο, (Spend Culture Medium, SCM), στα πλαίσια εφαρμογής τεχνικών Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής. Καταρχήν, σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ελεγχθεί αν τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να συλλεχθούν από το καλλιεργητικό υλικό, να απομονωθούν και να ενισχυθούν. Σε δεύτερη φάση, στόχος είναι να διερευνηθεί αν αυτά τα νουκλεϊκά οξέα που απελευθερώνονται στο καλλιεργητικό υλικό μπορούν να συσχετιστούν με το χρωμοσωμικό προφίλ των εμβρύων που έχει προκύψει από την γενετική ανάλυση των βιοψιών τροφοεκτοδέρματος των αντίστοιχων εμβρύων, ώστε να χρησιμοποιηθούν ως μη επεμβατικοί δείκτες προεμφυτευτικής διάγνωσης. Μελετήθηκαν συνολικά 130 δείγματα, 65 για το cell free DNA και 65 για τα microRNAs. Εξ αυτών, 50 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για το καθορισμό των συνθηκών του πειράματος. Για το cf-DNA, 40/40 δείγματα ενισχύθηκαν μέσω ολικής ενίσχυσης γονιδίωματος (WGA) και αναλύθηκαν μέσω NGS. Τα δείγματα από το SCM συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα από τις βιοψίες τροφοεκτοδέρματος των αντίστοιχων εμβρύων. Το ποσοστό πλήρους συμφωνίας μεταξύ του επεμβατικού (invasive, i,) PGT-A και του μη επεμβατικού (non invasive, ni) PGT-A των αντίστοιχων εμβρύων ήταν 63,6%. Το ποσοστό συνολικής συμφωνίας (ευπλοειδικό ή ανευπλοεικό προφίλ) μεταξύ iPGT-A και niPGT-A των αντίστοιχων εμβρύων ήταν 81,8%. Το ποσοστό συμφωνίας των φυλετικών χρωμοσωμάτων μεταξύ iPGT-A και niPGT-A ήταν 100%.Για την τελική μελέτη των microRNAs χρησιμοποιήθηκαν 40 δείγματα, 50% ευπλοειδικά και 50% ανευπλοειδικά. Μελετήθηκαν οχτώ miRNAs, αλλά πραγματοποιήθηκε απομόνωση και ενίσχυση στα πέντε μόνο, τα miR-20a-5p, miR-518d-5p, miR-196a-5p, miR-191-5p, miR-372-3p, ενώ δεν παρατηρήθηκε απομόνωση και ενίσχυση των μορίων miR-661, miR-142-3p και miR-30c-5p σε κανένα από τα 40 δείγματα που μελετήθηκαν. Το miR-20a-5p ανιχνεύεται με μεγαλύτερη συχνότητα στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από ευπλοειδικά έμβρυα, με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,05. Το miR-518d-5p ανιχνεύεται μόνο στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από ευπλοειδικά έμβρυα, αλλά σε χαμηλή συχνότητα, p=0,0602. Το miR-196a-5p ανιχνεύεται στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από όλα τα έμβρυα, ανεξαρτήτως του πλοειδικού τους προφίλ. Το miR-191-5p εμφανίζεται με ελαφρώς αυξημένο ποσοστό στο καλλιεργητικό υλικό ευπλοειδικών εμβρύων, αλλά όχι με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,0619. Το miR-372-3p εμφανίζεται με σημαντικά υψηλότερο ρυθμό ανίχνευσης στο καλλιεργητικό υλικό ευπλοειδών εμβρύων, με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,0210.Σε αυτή τη μελέτη, πράγματι, κατέστη εφικτή η απομόνωση και ανάλυση του cfDNA και κάποιων microRNAs και ο συσχετισμός τους με το χρωμοσωμικό προφίλ των αντίστοιχων εμβρύων. Ο μικρός αριθμός των δειγμάτων είναι ένας περιορισμός, ωστόσο όσον αφορά το niPGTA έγινε και ανάλυση της γενετικής σύνθεσης ολόκληρων βλαστοκύστεων που αποτελεί το gold standard για τον προσδιορισμό της ακρίβειας και αξιοπιστίας αυτής της μεθοδολογίας. Παρά τους περιορισμούς, από αυτήν τη μελέτη μπορεί να επιβεβαιωθεί ότι το niPGT-A, είναι αξιόπιστο και ακριβές και μπορεί να χρησιμοποιηθεί, τουλάχιστον παράλληλα με το επεμβατικό PGTA ως εναλλακτική λύση, ειδικά σε περιπτώσεις μωσαϊκισμού. Όσον αφορά τα microRNAs, κάποια από αυτά που μελετήθηκαν φαίνεται να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ισχυροί μοριακοί προγνωστικοί δείκτες του χρωμοσωμικού προφίλ των αντίστοιχων εμβρύων. Μεγάλης κλίμακας τυχαιοποιημένες μελέτες ελέγχου θα είναι σε θέση να επικυρώσουν αυτήν την πολλά υποσχόμενη μεθοδολογία.Η συγκεκριμένη ερευνητική μελέτη έχει εγκριθεί από την Eπιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης.