Έλεγχος προβιοτικών ιδιοτήτων σε στελέχη της ανθρώπινης εντερικής μικροχλωρίδας
Authors: Κιρτζαλίδου Αικατερίνη 
Published: August 2021

Εισαγωγή: Η εντερική χλωρίδα συχνά αναφέρεται ως ένα ξεχωριστό ή ανεξάρτητο όργανο που φιλοξενείται μέσα τον εντερικό σωλήνα (το έντερο). Αποτελείται από διαφορετικά είδη κυττάρων που έχουν όμως την ικανότητα να επικοινωνούν μεταξύ τους αλλά και με τον ξενιστή. Έχουν την ικανότητα να καταναλώνουν, να αποθηκεύουν και να μετατρέπουν την ενέργεια, μεσολαβούν σε χημικά μονοπάτια και μπορούν να αναγεννηθούν από μόνα τους. Το γονιδίωμά τους περιέχει πάνω από 100 φορές περισσότερα γονίδια από το ανθρώπινο, προικίζοντας με δυνατότητες και χαρακτηριστικά, για τα οποία δεν χρειάστηκε να εξελιχθεί το ανθρώπινο γονιδίωμα. Η εντερική μικροχλωρίδα θεωρείται ότι δρα προς όφελος της υγείας του ατόμου, αλλά δεν είναι ούτε στατική, αλλά ούτε και αποκομμένη από το περιβάλλον. Αρκετά μικρόβια της εντερικής μικροχλωρίδας έχουν βρεθεί να φέρουν ανθεκτικά γονίδια στα αντιβιοτικά, χωρίς το άτομο να έχει νοσήσει ή να έχει λάβει αντιβιοτικό. Φαίνεται ότι εντερικά μικρόβια ανταλλάσουν γονίδια τόσο μεταξύ τους, όσο και με μικρόβια που περνούν από το παχύ έντερο. Η ύπαρξη μικροβίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά είναι πιθανή απειλή για την υγεία, αφού πολλά τέτοια μικρόβια έχουν εμπλακεί σε μετεγχειρητικές μολύνσεις.Στην παρούσα μελέτη εκτός από την εντερική μικροχλωρίδα των νεογνών μελετήθηκαν επιπλέον και οι προβιοτικές ιδιότητες στελεχών λακτοβακίλλων. O όρος «προβιοτικά» χρησιμοποιείται για να περιγράψει τα μικροβιακά στελέχη, τα οποία ενδέχεται να φιλοξενούνται στην εντερική μικροχλωρίδα του ανθρώπου και τα οποία βοηθούν στη βελτίωση της υγείας του ξενιστή. Ένα βακτηριακό στέλεχος για να θεωρηθεί προβιοτικό πρέπει να έχει καλές τεχνολογικές ιδιότητες ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε τρόφιμα χωρίς να χάνει την λειτουργικότητα του ή να δημιουργεί δυσάρεστες οσμές ή γεύση. Πρέπει να επιβιώνει καθώς περνά από το ανώτερο γαστρεντερικό σύστημα και να φτάνει ζωντανό στο σημείο δράσης. Πρέπει ακόμη να διατηρεί την ιδιότητά του να λειτουργεί στο εντερικό περιβάλλον. Θα πρέπει να επιδεικνύει αντοχή στα οξέα, στα χολικά άλατα, να προσκολλάται στο εντερικό επιθήλιο και να έχει μακρά επιβίωση στον εντερικό σωλήνα, να επάγει την ανοσοδιέγερση και να έχει ανταγωνιστική δράση εναντίον παθογόνων βακτηρίων.Μεθοδολογία: Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η εντερική χλωρίδα 62 νεογνών. Πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία κοπράνων την 4η, την 30η και την 90η ημέρα μετά τη γέννηση. Στη συνέχεια έγινε καταμέτρηση της ολικής αερόβιας και αναερόβιας χλωρίδας, όπως και καταμέτρηση και απομόνωση στελεχών εντεροκόκκων, λακτοβακίλλων και βακτηρίων του γένους Bifidobacterium. Ακολούθησε μοριακή ταυτοποίηση όλων των στελεχών των εντεροκόκκων και των βακτηρίων του γένους Bifidobacterium, ενώ για τους λακτοβακίλλους έγινε επιλογή. Τα στελέχη εξετάστηκαν ως προς την ευαισθησία τους στα αντιβιοτικά. Στη συνέχεια τα στελέχη εντεροκόκκων εξετάστηκαν ως προς την παρουσία γονιδίων ανθεκτικότητας στη τετρακυκλίνη [tet(K), tet(L), tet(M), tet(O), tet(S)], την ερυθρομυκίνη (ermB) και τη βανκομυκίνη (vanΑ, vanΒ, vanC1 και vanC2/C3). Τα στελέχη λακτοβακίλλων και τα βακτήρια του γένους Bifidobacterium εξετάστηκαν ως προς την πιθανή προβιοτική τους δράση: ικανότητα ανάπτυξης παρουσία χολικών αλάτων, την αντοχή τους σε χαμηλό pH, την ικανότητα προσκόλλησης τους σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου, την αντιμικροβιακή τους δράση, την δυνατότητα ανάπτυξής τους σε πρεβιοτικές ενώσεις και προσδιορίστηκαν τα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου που παράγουν. Εξετάστηκε επίσης η βιωσιμότητα και η μεταβολική δραστηριότητα των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου (Caco-2) και των περιφερειακών μονοπύρηνων κυττάρων (PBMC) μετά την επίδραση των υποψήφιων προβιοτικών στελεχών, η πιθανή παραγωγή ΝΟ2-, Η2Ο2 από τα ευκαρυωτικά κύτταρα και τέλος, ελέγχθηκε η ανοσοδιέγερση που προκαλούν στα περιφερειακά μονοπύρηνα κύτταρα (παραγωγή κυτταροκινών TNF-α, IL-6, IL-8 και adiponectin). Αποτελέσματα: Κατά τη μελέτη της εντερικής μικροχλωρίδας των νεογνών κατά τις τρεις δειγματοληψίες φαίνεται ότι δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των ολικών μεσόφιλων αερόβιων μικροοργανισμών κατά τους τρεις πρώτους μήνες της ζωής των νεογνών, ενώ υπάρχει σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των ολικών μεσόφιλων αναερόβιων μικροοργανισμών κατά τη σύγκριση της μέσης τιμής της 1ης δειγματοληψίας με τη 3η με p=0,012. Επίσης δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των εντεροκόκκων, των λακτοβακίλλων και των μικροβίων του γένους Bifidobacterium. Απομονώθηκαν 121 Gram θετικοί κόκκοι. Το είδος που υπερίσχυσε είναι το E. faecalis (54,5%) και ακολουθούν οι E. faecium, E. casseliflavus/ E. flavescens, E. gallinarum και E. hirae. Απομονώθηκαν συνολικά 71 στελέχη λακτοβακίλλων, ενώ ταυτοποιήθηκαν τα 44. Ομαδοποιημένα τα αποτελέσματα είναι: L. gasseri (19 στελέχη), L. paracasei (7 στελέχη), L. crispatus (5 στελέχη), L.oris (3 στελέχη), L. salivarius (3 στελέχη), L. rhamnosus (2 στελέχη), L. plantarum (1 στέλεχος), L. brevis (1 στέλεχος), L. fermentum (2 στελέχη), L. reuteri (1 στέλεχος). Από τα 26 στελέχη Bifidobacterium μόνο τα 6 ταυτοποιήθηκαν μοριακά. Τα τέσσερα ταυτοποιήθηκαν ως B. lonqum και δύο ως B. bifidum.Τα στελέχη εντερόκοκκων και στρεπτόκοκκων εξετάστηκαν ως προς την ευαισθησία που παρουσιάζουν σε δώδεκα αντιμικροβιακούς παράγοντες. Η μεγαλύτερη αναλογία (46,28%) ανθεκτικών στελεχών εμφανίζεται στη rifampicin. Ακολουθεί η tetracycline (44,63%) η erythromycin (36,36%). Σε 13 στελέχη εντοπίστηκαν γονίδια ανθεκτικότητας και πιο συγκεκριμένα βρέθηκαν 2 στελέχη E. gallinarum με το γονίδιο vanC1 και 11 στελέχη E. casseliflavus/ flavescens με το γονίδιο vanC2/C3. Το γονίδιο ermB εντοπίστηκε σε 25 στελέχη, ενώ 19 στελέχη ήταν θετικά για την παρουσία κάποιου από αυτά τα γονίδια tet.Όλα τα στελέχη λακτοβακίλλων ήταν ευαίσθητα στα ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, tetracycline, erythromycin, cephalothin, chloramphenicol και rifampicin. Στα υπόλοιπα αντιβιοτικά (bacitracin, vancomycin, amikacin, kanamycin και ciprofloxacin) η ευαισθησία εξαρτιόταν από το στέλεχος. Ένα στέλεχος του γένους Bifidobacterium ήταν ανθεκτικό στη τετρακυκλίνη.Είκοσι στελέχη λακτοβακίλλων επιδεικνύουν σημαντική αντοχή στη παρουσία χολικών αλάτων και 4 από τα 5 Bifidobacterium. Ως προς την ικανότητα προσκόλλησης στα Caco-2 ξεχώρισαν ο L. Salivarius-C3 και ο L. Rhamnosus-C44. Το C3 εμφανίζει μεγαλύτερη ανάπτυξη στον φρουκτοολιγοσακχαρίτη (Actilight®), στο γαλακτοολιγοσακχαρίτη (GOS) και στη γλυκόζη, ενώ το C44 μόνο στο GOS και στη γλυκόζη. Το C3 εμφάνισε αύξηση των ολικών λιπαρών οξέων μετά από την επώασή του στο υπόστρωμα με το φρουκτοολιγοσακχαρίτη και το γαλακτοολιγοσακχαρίτη (GOS). Το στέλεχος C44 εμφάνισε αύξηση στα ολικά λιπαρά οξέα σε όλες τις διαφορετικές πηγές άνθρακα, εκτός από το Actilight στο οποίο όμως έχει την τάση να εμφανίσει. Η μιτοχονδριακή δραστηριότητα των Caco-2 κυττάρων μετά από την συν-επώασή τους με το υπό εξέταση προβιοτικό στέλεχος μετρήθηκε με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Μόνο το απενεργοποιημένο θερμικά στέλεχος L.rhamnosus C44HI προκάλεσε σημαντική αύξηση στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα των Caco-2 επιθηλιακών κυττάρων. Η παραγωγή του NO2- από τα Caco-2 δεν μεταβάλλεται από κανένα από τα δύο υποψήφια προβιοτικά στελέχη. Το επίπεδο του H2O2 μετά από την παρέμβαση με το στέλεχος C3 καθώς και με το C3HI ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από τον μάρτυρα (p-value=0,002 και p-value=0,000 αντίστοιχα), όπως επίσης και από τους απενεργοποιημένους λακτοβακίλλους του C44ΗΙ (p-value=0,004). Η βιωσιμότητα των PBMC καθορίστηκε με καταμέτρηση τους μετά από χρώση με Trypan blue. Κανένα από τα δύο εξεταζόμενα υποψήφια προβιοτικά στελέχη δεν προκάλεσε τοξικότητα στα περιφερειακά πολυμορφοπύρηνα κύτταρα του αίματος. Η παραγωγή του NO2- από τα PBMC είναι σημαντικά αυξημένη μετά από την συν-επώαση με τις δύο απενεργοποιημένες μορφές των δύο λακτοβακίλλων C3HI (p= 0,001) και C44HI (p= 0,000). Τα C3 και C44 βρέθηκε να επάγουν μεγαλύτερη ποσότητα H2O2 από τα ίδια κύτταρα σε σχέση με τον μάρτυρα (p-values 0,011, 0,060 αντίστοιχα). Η παραγωγή του TNFa και της IL-6 από τα PBMC είναι μεγαλύτερη μετά από την επώαση με το στέλεχος C44 και την απενεργοποιημένη μορφή του (C44ΗΙ) από το C3, χωρίς όμως να μπορούν τα αποτελέσματα αυτά να ελεγχθούν στατιστικά.Συμπεράσματα: Στη παρούσα μελέτη ανιχνεύτηκαν υψηλά επίπεδα ολικής αερόβιας και αναερόβιας μικροχλωρίδας. Πάνω από 50% των νεογνών είχε εντερόκοκκους την 4η ημέρα και το ποσοστό ξεπέρασε το 80% την 30η ημέρα και παρέμεινε σχεδόν στα ίδια επίπεδα την 90η ημέρα. Τα επίπεδα των λακτοβακίλλων δεν μεταβάλλονται με τη πάροδο της δειγματοληψίας και δεν επηρεάζονται από τον τρόπο γέννησης. Τα μπιφιδοβακτήρια που απομονώθηκαν είναι κυρίως B. longum και σε μικρότερο βαθμό B. bifidum και φαίνεται να προέρχονται κυρίως από νεογνά που γεννήθηκαν με φυσιολογικό τοκετό.Το 50,4% των εντερόκοκκων εμφανίζουν πολυανθεκτικότητα. Η ανθεκτικότητα στη βανκομυκίνη ήταν ενδογενής, ενώ τα 19 από τα 53 στελέχη, που ήταν ανθεκτικά στη τετρακυκλίνη, φέρουν γονίδια ανθεκτικότητας tet. Το ermB γονίδιο εντοπίστηκε στα 25 στελέχη από τα 44 που εμφάνισαν ανθεκτικότητα στην ερυθρομυκίνη. Η ανθεκτικότητα των λακτοβακίλλων σε διάφορα αντιβιοτικά συνδέεται αρκετές φορές με ενδογενή ανθεκτικότητα. Μάλιστα η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά ορισμένων προβιοτικών στελεχών μπορεί να θεωρηθεί επιπλέον προσόν, αφού θα μπορούν να χορηγηθούν μαζί με αντιβιοτικά και να μην επηρεαστεί η βιωσιμότητα τους. Τα βακτήρια του γένους Bifidobacterium δεν εμφάνισαν ιδιαίτερη ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά.Από όλους τους λακτοβακίλλους που εξετάστηκαν για τις προβιοτικές τους ιδιότητες ξεχώρισαν τελικά δύο στελέχη, ο L. salivarius-C3 και ο L. rhamnosus-C44. Τα στελέχη αυτά δεν έχουν την ικανότητα να χρησιμοποιήσουν ως πηγή άνθρακα την ινουλίνη και την ολιγοφρουκτόζη, αλλά προτιμούν τους φρουκτο- και γαλακτο-ολιγοσακχαρίτες.Η επίδραση της παρουσίας των υποψηφίων προβιοτικών στελεχών L. salivarius-C3 και L. rhamnosus-C44 (ζωντανών και θερμικά απενεργοποιημένων) στη μεταβολική δραστηριότητα των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου Caco-2, αλλά και στη βιωσιμότητα των PBMC φαίνεται ότι δεν υπόκειται σε κάποιον κανόνα, αλλά αντίθετα είναι εξαρτώμενη από το κάθε στέλεχος. Η ιδιότητα των προβιοτικών βακτηρίων να επάγουν την παραγωγή νιτρωδών και υπεροξειδίου του υδρογόνου έχει προστατευτικό ρόλο στον ξενιστή, αφού θανατώνουν ενδοκυτταρικά παθογόνα, καρκινικά κύτταρα και κύτταρα προσβεβλημένα από ιούς. Στη παρούσα μελέτη υπήρχαν διαφορές ανάλογα με τον τύπο των κύτταρων, του στελέχους και την ύπαρξη ζωντανών ή θερμικά απενεργοποιημένων παραγόντων. Επιπρόσθετα, φαίνεται ότι τα στελέχη επάγουν την παραγωγή κυτταροκινών.