Ανάπτυξη φωταυγών αυτοματοποιημένων μεθόδων αναλύσεως
Authors: Βασιλείου Ευστάθιος 
Published: August 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται η ανάπτυξη αυτοματοποιημένων μεθόδων αναλύσεων, οι οποίες κάνουν χρήση της αναλυτικής τεχνικής FIA, μέσω της εφαρμογή της πάνω σε ιδιοκατασκευασμένους αναλυτές. Οι αναλυτές αυτοί κατασκευάστηκαν με τέτοιο τρόπο, ώστε να διευκολύνουν την ανίχνευση των υπό διερεύνηση μορίων, να παρέχουν τρόπο αυτόματου χειρισμού των αντιδραστηρίων και να επιτρέπουν και την επεξεργασία, παρουσίαση και αποθήκευση των ληφθέντων δεδομένων ανίχνευσης (σήματα που μεταδίδονται προς τους ανιχνευτές). Η διενέργεια των προαναφερθέντων διαδικασιών, που ουσιαστικά συνοψίζονται με την αναφορά των δύο παρακάτω όρων: Flow control (Έλεγχος της ροής λειτουργίας των αναλυτών) και Data Acquisition-Manipulation-Presentation (Διαδικασία λήψης και διαχείρισης δεδομένων ανίχνευσης), πραγματοποιείται με την βοήθεια δύο αυτοσχέδιων προγραμμάτων, συντεταγμένων σε προγραμματιστική γλώσσα Labview. Η κατασκευή αυτών των αναλυτών πραγματοποιήθηκε για να καλύψει επιστημονικά πεδία ευρέως φάσματος, όπως η ιατρική (1ος αναλυτής, για ανίχνευση H2O2 σε δείγματα εκπνεόμνου αέρα), το περιβάλλον (2ος αναλυτής, για έλεγχο δειγμάτων νερού για τοξικότητα) και τα τρόφιμα (3ος αναλυτής, για προσδιορισμό μεθυλεστέρων πηκτίνης). Με αυτόν τον τρόπο επιδεικνύεται σαφέστατα η ευκολία με την οποία μπορεί κάποιος να χρησιμοποιήσει την τεχνική FIA, για να αυτοματοποιήσει μεθόδους ανάλυσης, που τον αφορούν, αλλά ταυτόχρονα να επιτύχει και στόχους για: μείωση όγκου αντιδραστηρίων, ευκολότερο χειρισμό αντιδραστηρίων, σαφέστατο χρονισμό πραγματοποίησης αντιδράσεων, καθώς και για παρακολούθηση ασταθών προϊόντων (μέσω χρήσης της τεχνικής stop flow analysis – 2ος αναλυτής – κεφάλαιο 2).Στην διατριβή αυτή (κεφάλαιο 1), αναφέρονται μερικά βασικά στοιχεία για τον αυτοματισμό στο αναλυτικό εργαστήριο και τονίζονται τα σημεία εκείνα, που οδήγησαν σε όλο και μεγαλύτερη ανάγκη της επιστημονικής κοινότητας, για ανάπτυξη όλο και πιο αυτόματων μεθόδων ανάλυσης, αλλά και όλο και πιο εξειδικευμένων μεθόδων (εφαρμοζόμενων ανά περίπτωση). Στο ίδιο κεφάλαιο αναλύονται μερικά βασικά στοιχεία για τον αυτοματισμό συστημάτων ανάλυσης, όπως η κατηγοριοποίησή τους, καθώς και παραδείγματα σύγχρονων τάσεων στην αυτοματοποίηση των συστημάτων ανάλυσης.Στο κεφάλαιο 2, αναφέρονται μερικά θεωρητικά στοιχεία που ενδιαφέρουν την εν λόγω τεχνική. Τέτοια στοιχεία αφορούν σε: μια θεωρητική προσέγγιση της μεθόδου αυτής (με αναφορά στις παραμέτρους που την επηρεάζουν), τις τεχνικές αυτοματοποίησης, που προσφέρει αυτή η μέθοδος, οργανολογία που εμπλέκει και προοπτικές που δημιουργεί. Στα κεφάλαια 3-5, αναφέρονται αναλυτικά πληροφορίες για τον κάθε αναλυτή που κατασκευάστηκε. Πιο συγκεκριμένα, στο κεφάλαιο 3 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για ανάλυση δειγμάτων εκπνεόμενου αέρα για H2O2, στο κεφάλαιο 4 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για ανάλυση δειγμάτων νερού για τοξικότητα και στο κεφάλαιο 5 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για προσδιορισμό μεθυλεστέρων σε δείγματα πηκτίνης. Για τον κάθε αναλυτή αναφέρονται χρήσιμα στοιχεία που περιγράφουν αναλυτικά την κατασκευή του και η παρουσίαση αυτών των στοιχείων γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο: α) Παράθεση ενδεικτικού σχεδιαγράμματος του αναλυτή FIA και σύντομη περιγραφή λειτουργίας του, β) Αναλυτική περιγραφή του κάθε στοιχείου υλικού, με παράθεση περιγραφής του τρόπου λειτουργίας του και του τρόπου διασύνδεσής του με τα άλλα στοιχεία υλικού, που χρησιμοποιούνται, γ) Αναλυτική περιγραφή του αυτοσχέδιου προγράμματος που χρησιμοποιείται σε κάθε αναλυτή για την επιτέλεση των διαδικασιών της ροής του προγράμματος, ελέγχου και λήψης δεδομένων. Αυτό γίνεται με παράθεση καίριων κομματιών του κώδικα καθώς επίσης λογικών διαγραμμάτων ροής των προγραμμάτων, που περιγράφουν σαφέστατα τα βήματα, που ακολουθούνται για την αρμονική λειτουργία του αναλυτή. Αξιοσημείωτη είναι και η παράθεση πολλών σχεδιαγραμμάτων και εικόνων, σε κάθε σημείο του σταδίου αυτού, για καλύτερη οπτική απεικόνιση του κάθε στοιχείου υλικού που χρησιμοποιείται. Με τον τρόπο αυτό μπορεί κάποιος να κατανοήσει καλύτερα και τον τρόπο συνδυασμού των στοιχείων υλικού, προς την κατεύθυνση απόδοσης ενός αναλυτή.Το κεφάλαια 3-5, παρουσιάζουν και τις μεθόδους που εφαρμόστηκαν σε κάθε αναλυτή, για να πιστοποιηθεί η εύρυθμη λειτουργία, κατά τους προσδιορισμούς στους οποίους χρησιμοποιήθηκαν. Από αυτές τις μεθόδους μας ενδιαφέρει η αναφορά της 1ης μεθόδου (που εφαρμόστηκε στον πρώτο αναλυτή), γιατί οι έτερες μέθοδοι (που εφαρμόστηκαν στους αναλυτές 2 & 3) αναπτύχθηκαν από έτερους υποψήφιους διδάκτορες που αναφέρονται στην εισαγωγή της διατριβής. Η πρώτη μέθοδος στοχεύει στην ανίχνευση H2O2 σε δείγματα εκπνεόμενου αέρα από ασθενείς, που πάσχουν από πνευμονολογικές παθήσεις. Η ανάγκη μέτρησης του υπεροξειδίου του υδρογόνου οφείλεται στο ότι αυτό είναι άριστος δείκτης, που παρέχει κλινικές πληροφορίες, σε σχέση με φλεγμονώδεις καταστάσεις στους πνεύμονες ασθενών. Και αυτό, γιατί μπορεί να συνδεθεί άμεσα με την ύπαρξη οξειδωτικού στρες στο ανθρώπινο σώμα. Αυτό το γεγονός εξηγεί την ύπαρξη πολλών μεθόδων που υπάρχουν στην βιβλιογραφία για την ανίχνευση υπεροξειδίου του υδρογόνου σε τέτοια δείγματα. Το πρόβλημα όμως των προϋπαρχόντων μεθόδων είναι ότι είναι μη αυτοματοποιημένες, χρονοβόρες και δύσκολες στην εκτέλεση. Επίσης συνήθως δεν διαθέτουν φορητές συσκευές για δειγματοληψία. Για να αντιμετωπιστούν τα παραπάνω μειονεκτήματα αναπτύχθηκε η εν λόγω 1η μέθοδος, η οποία παρέχει φορητή συσκευή δειγματοληψίας δειγμάτων εκπνεόμενου αέρα από ασθενείς και εκτέλεση προσδιορισμού Η2Ο2, μέσω μιας πλήρως αυτοματοποιημένης FIA-χημειοφωταυγούς μεθόδου ανίχνευσης. Ο εν λόγω φορητός εξοπλισμός δειγματοληψίας παρέχει απόδοση συλλογής μεγαλύτερη από 86%, επιτρέποντας την συλλογή 2-3 mL δείγματος μέσα σε 20min. Η μέθοδος προσδιορισμού που αναπτύχθηκε, βασίζεται στην ανάμιξη ροής διαλύματος λουμινόλης (που χρησιμοποιείται σαν φορέας του δείγματος) με ροή διαλύματος κοβαλτίου (II), η οποία παράγει ένα χημειοφωταυγές παράγωγο, το οποίο δίνει φως, με ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ο αναλυτής παρέχει όριο ανίχνευσης 10 nM και καλή γραμμικότητα (R=0,997). Η επαναληπτικότητα που αποδίδει είναι καλύτερη από 6,0% RSD και η ανάκτηση που εμφανίζει η μέθοδος είναι μεγαλύτερη από 64,9%. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτής της μεθόδου, με τα αποτελέσματα της πιο συχνά χρησιμοποιούμενης μεθόδου ανάλυσης Η2Ο2 σε τέτοια δείγματα, έδωσε ισοδύναμα αποτελέσματα (P>0,001, συντελεστή συσχέτισης με R=0,94). Έτσι η μέθοδος που προτείνεται προσφέρει πλήρη αυτοματισμό στον χειρισμό αντιδραστηρίων, μεγάλο ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων (περίπου 180 δείγματα ανά ώρα), χαμηλό όριο ανίχνευσης και δυνατότητα για εξέλιξη του εξοπλισμού ανάλυσης σε φορητό (εγγενές πλεονέκτημα της μεθόδου FIA – Δες θεωρία).