In vivo και ex vivo γονιδιακή θεραπεία της θαλασσαιμίας με χρήση ενός αδενο-ιικού φορέα γ-σφαιρίνης
Authors: Γεωργακοπούλου Αφροδίτη 
Published: July 2022

Τα τρέχοντα πρωτόκολλα για τη γονιδιακή θεραπεία της θαλασσαιμίας περιλαμβάνουν τη συλλογή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSPCs) από τους ασθενείς, την in vitro καλλιέργεια και διαμόλυνσή τους με λεντι-ιικούς φορείς και τέλος τη μεταμόσχευση των γενετικά τροποποιημένων HSPCs στους μυελοκατασταλμένους ασθενείς. Το αυξημένο κόστος και η πολυπλοκότητα της μεθόδου, δυσχεραίνουν την εφαρμογή τέτοιων πρωτοκόλλων στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου η ανάγκη για θεραπεία της β-θαλασσαιμίας είναι τεράστια. Αναπτύχθηκε μια απλοποιημένη και ελάχιστα επεμβατική μέθοδος in vivo γονιδιακής θεραπείας, που περιλαμβάνει την κινητοποίηση των HSPCs από τον μυελό των οστών στην περιφέρεια του αίματος και την ενδοφλέβια έγχυση ενός υβριδικού, εξαρτώμενου συστήματος αδενο-ιικών φορέων (HDAd5/35++) και της Sleeping Beauty τρανσποζάσης (SB100X), που στοχεύει τον υποδοχέα CD46 του ανθρώπου, τροποποιώντας τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (HSCs) στην περιφέρεια. Τα γενετικά πλέον διορθωμένα κύτταρα, επιστρέφουν από την περιφέρεια του αίματος, όπου έγινε η διαμόλυνση, πίσω στο μυελό των οστών, όπου και παραμένουν μακροπρόθεσμα. H προσέγγιση αυτή ελέγχθηκε σε ένα ζωικό μοντέλο ποντικού που προσομοιάζει το φαινότυπο της ενδιάμεσης β-θαλασσαιμίας του ανθρώπου (CD46+/+/Hbbth-3). Οχτώ εβδομάδες μετά την in vivo γενετική τροποποίηση, χορηγήθηκε θεραπεία 4 δόσεων με χημειοτακτικούς παράγοντες (O6BG/BCNU) για την in vivo επιλογή των γενετικά διορθωμένων HSCs, αυξάνοντας την έκφραση της γ σφαιρίνης στο 76,0±5,7% των κυκλοφορούντων ερυθροκυττάρων, την εβδομάδα 29 μετά την in vivo γενετική τροποποίηση. Οι αιματολογικές παράμετροι βελτιώθηκαν σημαντικά, σε σημείο που δεν διακρίνονταν από τις φυσιολογικές τιμές, υποδηλώνοντας σχεδόν πλήρη φαινοτυπική διόρθωση. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία εμφάνισαν σημαντική μείωση α) στο μεγέθους του σπλήνα, β) στην εξωμυελική ερυθροποίηση και γ) στην παρεγχυματική αιμοσιδήρωση. Η ασφάλεια αποδείχθηκε από την καλή ανεκτικότητα της θεραπείας, την απουσία αλλαγών στην αιμοποίηση, τη φυσιολογική κλωνογενή ικανότητα των κυττάρων του μυελού των οστών και το πρότυπο τυχαίας ενσωμάτωσης του φορέα. Η αυξημένη παραγωγή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) κατά την ενήλικη ζωή, μια καλοήθης κατάσταση γνωστή ως Κληρονομική Παραμονή της Εμβρυϊκής Αιμοσφαιρίνης (HPFH), έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει τον κλινικό φαινότυπο της β-θαλασσαιμίας. Πρόσφατα, οι προσεγγίσεις επεξεργασίας γονιδιώματος (gene editing) οδήγησαν στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, επιτρέποντας τη στοχευμένη επανενεργοποίηση της HbF. Αναπτύχθηκε ένα σύστημα εξαρτώμενων, αδενοϊικών φορέων (HDAd5/35++), που στοχεύει τα HSCs μέσω του υποδοχέα CD46, με σκοπό την επανενεργοποίηση της έκφρασης της HbF. Αποτελείται από ένα σύστημα CRISPR/Cas9 για την ταυτόχρονη στόχευση, του ερυθροειδικού ενισχυτή του καταστολέα της HbF (BCL11A) και ταυτόχρονα της περιοχής πρόσδεσής του, στους υποκινητές HBG1/HBG2 της HbF (ΗDAd-CRISPR-Dual). Για τον έλεγχο αυτής της προσέγγισης, δημιουργήσαμε ένα θαλασσαιμικό ζωικό μοντέλο ξενομεταμόσχευσης, μεταμοσχεύοντας σε ποντίκια NBSGW, CD34+ κύτταρα από ασθενείς με β-θαλασσαιμία για να εδραιωθεί θαλασσαιμική αιμοποίηση, παρόμοια με του ανθρώπου. Έξι εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, τα HSCs από το χιμαιρικό μυελό των οστών ποντικού κινητοποιήθηκαν επιτυχώς στην περιφέρεια μετά από χορήγηση G-CSF (250 μg/kg για 6 ημέρες) και Plerixafor (50 μg/kg για 4 ημέρες). Σαράντα λεπτά μετά την τελευταία δόση του Plerixafor, εγχύθηκε ενδοφλεβίως ο φορέας HDAd-CRISPR-Dual, που επιτρέπει την επιλεκτική in vivo γενετική τροποποίηση των HSCs του ανθρώπου, καθώς ο υποδοχέας CD46 δεν εκφράζεται στα HSCs του ποντικού. H ταυτόχρονη γενετική τροποποίηση των περιοχών BCL11A και HBG1/2, δεν αποδείχθηκε τοξική για τα θαλασσαιμικά CD34+ κύτταρα, ενώ τόσο in vitro, όσο και in vivo παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της HbF, που οδήγησε σε βελτίωση της ερυθροποίησης. Ένα πιθανό θέμα ασφάλειας όταν προκαλείται διπλό ρήγμα, καθώς στοχεύονται διπλές θέσεις στο γονιδίωμα ή/και περιοχές με σημαντική ομολογία μεταξύ τους, είναι οι χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. Για το λόγο αυτό έγινε καρυοτυπική ανάλυση, η οποία σημαντικά, δεν κατέδειξε χρωμοσωμικές αναδιατάξεις ή/και απαλοιφές σε (τουλάχιστον) 20 μεταφάσεις που μελετήθηκαν, σε όλα τα δείγματα των ασθενών. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή προτείνεται μια οικονομική και εύκολα μεταφράσιμη μέθοδο, η οποία καταργεί την ανάγκη λευκαφαίρεσης, μυελοκαταστολής και εξειδικευμένης εμπειρίας και μπορεί να οδηγήσει σε μια ευρύτερη κλινική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας της θαλασσαιμίας.