Μελέτη της παρουσίας, της κατανομής και της παθογένειας των αμυλοειδικών πλακών στα εγκεφαλικά ημισφαίρια, στην παρεγκεφαλίδα, στον προμήκη μυελό και στο οπτικό νεύρο προβάτων με τυπική και άτυπη μορφή της τρομώδους νόσου
Authors: Τσαούση Παναγιώτα 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της παρουσίας, της κατανομής και της παθογένειας των πλακών αμυλοειδούς στον εγκέφαλο καθώς και των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων και της εντόπισης της PrPSc στον οφθαλμό και στο οπτικό νεύρο προβάτων με τυπική και άτυπη ΤΝ. Για την έρευνα αυτή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 33 πρόβατα. Τα ζώα προέρχονταν από 15 ποίμνια και με βάση την κλινική εξέταση που διενεργήθηκε, θεωρήθηκαν ύποπτα προσβολής από την κλασική και την άτυπη μορφή της ΤΝ (30 και 3 πρόβατα αντίστοιχα). Πριν από τη θανάτωση των ζώων δείγματα αίματος λαμβάνονταν σε φυαλίδιο που περιείχε αντιπηκτικό EDTA, με στόχο την απομόνωση γενετικού υλικού και την ανίχνευση των πολυμορφισμών του γονιδίου που κωδικοποιεί την prion πρωτεΐνη. Ακολουθούσε η θανάτωση των ζώων, η εξαίρεση των οφθαλμών τους με μέρος του οπτικού νεύρου μήκους 1 εκ. περίπου και η λήψη ιστοτεμαχίων από οχτώ περιοχές του εγκεφάλου (προμήκης μυελός στα επίπεδα του μοχλού και του τραπεζοειδούς σώματος, μέσο της γέφυρας, μέσος εγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα, εγκάρσιες τομές στο ύψος του μαστίου και του οπτικού χιάσματος και προσθίως του μεσολοβίου), για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση, καθώς και για την ανίχνευση της PrPSc με τη μέθοδο WB. Για τη μελέτη της ιστοπαθολογικής εικόνας των προαναφερόμενων περιοχών του εγκεφάλου, των οφθαλμών και του οπτικού νεύρου τομές παραφίνης χρωματίζονταν με ΗΕ. Για την ανίχνευση της PrPSc εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος LSAB. Επιπρόσθετα, σε διαδοχικές τομές εγκεφάλου σημάνθηκαν ανοσοϊστοχημικά με τη μέθοδο ΑBC οι πρωτεΐνες SAP, 4-HNE, ΑpoE και τα πεπτίδια Αβ40, Αβ42 και Αβ43. Συνεκτιμώντας τα ευρήματα από την ιστοπαθολογική, ανοσοϊστοχημική και τη WB εξέταση, η κλασική ΤΝ επιβεβαιώθηκε σε 30 πρόβατα. Αντίθετα, η παθολογική prion πρωτεΐνη δεν ανιχνεύτηκε με τις παραπάνω τεχνικές στον εγκέφαλο κανενός από τα πρόβατα, τα οποία είχαν θεωρηθεί ύποπτα προσβολής από την άτυπη ΤΝ. Παράλληλα, από τη μελέτη των πολυμορφισμών του PRNP γονιδίου στα κωδικόνια 136, 154 και 171 στα 30 πρόβατα με κλασική ΤΝ ταυτοποιήθηκαν συνολικά 7 γονότυποι (ARQ-ARQ, ARQ-ARH, ARQ-AHQ, VRQ-VRQ, ARQ-TRQ, ARQ-ARR και AHQ-THQ). Οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν στον εγκέφαλο των προβάτων με ΤΝ ήταν εκφυλιστικές, είχαν αμφοτερόπλευρη και συμμετρική κατανομή και χαρακτηρίζονταν από κενοτοπίωση των νευρώνων, σπογγίωση του νευροπιλήματος, γλοίωση, ενώ διαπιστώθηκαν και σφαιροειδή. Παράλληλα, με την εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής εξέτασης ανιχνεύτηκαν στον εγκέφαλο η παρουσία της PrPSc και οι ενδοκυτταρικοί (ενδονευρωνικός, ενδοαστροκυτταρικός), οι σχετικοί με τα κύτταρα της νευρογλοίας (περιαγγειακός, υποεπενδυματικός, υπό τη χοριοειδή μήνιγγα) και το νευροπίλημα (διάστικτος, γραμμικός, περινευρωνικός) τύποι εναπόθεσής της. Στο νευροπίλημα συχνό εύρημα αποτελούσε η παρουσία μη ινιδιακού τύπου πλακών αμυλοειδούς. Στις πλάκες αυτές, ανιχνεύτηκε η prion πρωτεΐνη PrPSc του αμυλοειδούς. Οι πλάκες αυτές διακρίνονταν σε δύο κατηγορίες, τις διάχυτες και τις αστεροειδείς. Οι πλάκες αμυλοειδούς ανιχνεύθηκαν με μεγαλύτερη συχνότητα σε ζώα με ARQ/ARQ γονότυπο. Επιπρόσθετα, στον εγκέφαλο 1 προβάτου με VRQ/VRQ γονότυπο και 2 προβάτων με ARQ/ARQ γονότυπο παρατηρήθηκαν εναποθέσεις της PrPSc του αμυλοειδούς με τη μορφή CAA. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας καταδεικνύεται ότι η CAA ανευρίσκεται με χαμηλή συχνότητα στον εγκέφαλο προβάτων με φυσική μορφή της ΤΝ. Παράλληλα, η διαπίστωση CAA σε πρόβατα που δεν έφεραν το αλληλόμορφο γονίδιο V136 πιθανότατα υποδηλώνει την επίδραση και άλλων παραγόντων στην παθογένειά της, όπως του στελέχους του παθογόνου παράγοντα. To SAP ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο όλων των προβάτων στα οποία διαγνώσθηκε ΤΝ και εντοπίστηκε στο τοίχωμα των εγκεφαλικών αγγείων, στον ορό του αίματος και στο κυτταρόπλασμα ορισμένων νευρώνων. Η ανίχνευση του SAP στον εγκέφαλο προβάτων με ΤΝ, ανεξάρτητα από το γονότυπο της PrPC, θα μπορούσε να αποδοθεί σε διαταραχή της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού στην ΤΝ. H ApoE ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο ενός μόνο προβάτου με γονότυπο VRQ/VRQ και εντοπίστηκε στο τοίχωμα των αγγείων του φλοιού, στα οποία είχε προηγηθεί η ανίχνευση της παθολογικής prion πρωτεΐνης. Αντίθετα, δεν ανιχνεύτηκε στις μή ινιδιακού τύπου πλάκες που παρατηρήθηκαν στο νευροπίλημα. Η ΑpoE στην ΤΝ ενδεχομένως δε διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη συσσώρευση της ΡrPSc με τη μορφή εναποθέσεων αμυλοειδούς. Ο δείκτης οξειδωτικής καταπόνησης 4-HNE ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο όλων των προβάτων με ΤΝ. Η παρουσία του 4-HNE στον εγκέφαλο δε συνδεόταν με το γονότυπο της PrPC, γεγονός που καταδεικνύει ότι ο εγκέφαλος στην ΤΝ υφίσταται οξειδωτική καταπόνηση ανεξάρτητα από την ευαισθησία του ξενιστή στη νόσο. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση του 4-ΗΝΕ στα αστροκύτταρα καταδεικνύει πιθανές αρνητικές συνέπειες στη νευροτροφική τους λειτουργία. Το πεπτίδιο Αβ42 ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο 1 παρήλικου προβάτου (7 ετών), το οποίο δεν είχε ΤΝ και εντοπίστηκε στα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος. Η παρουσία της Αβ στον εγκέφαλο του προβάτου συνδεόταν με την ηλικία και όχι με την παθογένεια της ΤΝ. Παράλληλα, στον αμφιβληστροειδή χιτώνα σε 7 πρόβατα με ΤΝ και με γονότυπο ARQ/ARQ διαπιστώθηκαν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις οι οποίες περιελάμβαναν κατά περίπτωση ατροφία της εξωτερικής δικτυωτής στιβάδας, αποδιοργάνωση της αρχιτεκτονικής δομής της εσωτερικής κοκκώδους στιβάδας, παρουσία κενοτοπίων στο σώμα των γαγγλιακών κυττάρων και σε κάποιες περιπτώσεις υπερτροφία των κυττάρων Μϋller, απώλεια του εξωτερικού αφοριστικού υμένα και της αρχιτεκτονικής δομής της εξωτερικής κοκκώδους στιβάδας. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στους υπόλοιπους χιτώνες του οφθαλμού και στο οπτικό νεύρο κανενός από τα πρόβατα που διαγνώσθηκαν με ΤΝ. Με την τεχνική της ανοσοϊστοχημείας, η PrPSc ανιχνεύτηκε στον αμφιβληστροειδή χιτώνα των 7 προβάτων και εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των γαγγλιακών κυττάρων, ενώ δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα οπτικό νεύρο. Σύμφωνα με τα παραπάνω ευρήματα θα μπορούσαμε να καταλήξουμε στο συμπέρασμα ότι η PrPSc πιθανότατα δε μεταφέρεται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα μέσω του οπτικού νεύρου, αλλά μέσω κάποιων άλλων οδών, όπως για παράδειγμα από τον υπαραχνοειδή χώρο στον περινευρικό χώρο του οπτικού νεύρου και ακολούθως στο σκληρό, στο χοριοειδή και στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλμού.