Μελέτη της στοχαστικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σε ευκαριωτικούς οργανισμούς
Authors: Βαλάκος Δημήτριος 
Published: September 2023

Ο κυτταρικός επαναπρογραμματισμός είναι η διαδικασία μετατροπής σχεδόν οποιουδήποτε κυτταρικού τύπου σε κύτταρα τα οποία είναι σχεδόν ίδια με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (Embryonic Stem Cells, ESCs) και ονομάζονται επαγόμενα βλαστικά κύτταρα (induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs). Το παραπάνω επιτυγχάνεται μέσω της υπερέκφρασης τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων, των Οct4, Sox2, Κlf4 και c-Myc (OSKM) σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs) οι οποίοι μετά από 18 ημέρες θα μετατραπούν σε iPSCs. Προηγούμενα ευρήματα της ερευνητικής ομάδας επέδειξαν την εμπλοκή ενός δικτύου εννέα μεταγραφικών ρυθμιστών (των Taf1c, Tead4, Tfap4, Rcan1, Cbfa2t3, Gli2, Irf6, Ovol1 και Nanog) οι οποίοι όταν συνεκφρασθούν στα ίδια κύτταρα την 6η ημέρα της διαδικασίας, αυξάνεται σημαντικά η πιθανότητα το κύτταρα αυτά να μετατραπούν σε iPSCs, ενώ αναδείχθηκε και η συμμετοχή μία συγκεκριμένης ιστονικής παραλλαγής, της macroH2A στη διαδικασία του επαναπρογραμματισμού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους η macroH2A εμπλέκεται στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό κατά την εγκατάλειψη του σωματικού φαινοτύπου αλλά και κατά την υιοθέτηση της πολυδυναμίας και προσδιορίστηκε ο ρόλος των εννέα μεταγραφικών παραγόντων κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Όσον αφορά στο ρόλο της macroH2A, ερευνήθηκαν μηχανισμοί με τους οποίους οι ισομορφές macroH2A αναστέλλουν τον επαναπρογραμματισμό και ανακαλύψαμε ότι λειτουργούν ως φύλακες της κατάστασης των μεσεγχυματικών κυττάρων εμποδίζοντας την μετάβαση στο επιθήλιο (MET), ένα βήμα που απαιτείται για τον επαναπρογραμματισμό των ινοβλαστών. Πιο συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι μεμονωμένες ισομορφές macroH2A ρυθμίζουν την έκφραση καθορισμένων συνόλων γονιδίων, των οποίων η συνολική λειτουργία είναι να σταθεροποιούν το πρόγραμμα έκφρασης του μεσεγχυματικού φαινοτύπου, παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο αντίσταση για την πραγματοποίηση του επαναπρογραμματισμού. Εντοπίσαμε ένα νέο δίκτυο γονιδίων (μεσεγχυματικό δίκτυο, mesenchymal network, MSCN), το οποίο αποτελείται από 63 γονίδια ρυθμιζόμενα από τη macroH2A, τα οποία σχετίζονται με την εξωκυττάριο ουσία, την κυτταρική μεμβράνη, τη σηματοδότηση και με τους μεταγραφικούς ρυθμιστές Id2 και Snai2, λειτουργώντας ως φύλακας του μεσεγχυματικού φαινοτύπου. Τα πειράματα ChIP-seq και σίγησης αποκάλυψαν μια συνδυαστική στόχευση ειδική για κάθε ισομορφή macroH2A των γονιδίων που ανασυνθέτουν το MSCN, παρέχοντας σταθερότητα στα προγράμματα γονιδιακής έκφρασης, προκειμένου να αντισταθούν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Επιπλέον, δείχθηκε πως οι ισομορφές της macroH2A1 αλλά όχι της macroH2A2 παρουσιάζουν δυναμική ανακατανομή στο γονιδίωμα κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, η οποία λαμβάνει χώρα σε μεγάλο βαθμό κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής πληθώρας γονιδίων. Όσον αφορά στην ισομορφή macroH2A1.2, εμφανίζεται εξαφάνιση κατά την ημέρα 1 του επαναπρογραμματισμού και εναμεμφάνιση στα ίδια γονίδια την ημέρα 3 αλλά με μία μετατόπιση της νέας θέσης κατά μέσο όρο 50 βάσεων. Η μετατόπιση σχετίζεται με αλλαγή της κατάστασης έκφρασης των ρυθμιζόμενων γονιδίων τα οποία σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ειδικότερα, η μετατόπιση έχει ως αποτέλεσμα την κάλυψη θέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα E2F4 ο οποίος αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της κυτταρικής διαίρεσης, αναστέλλοντας έτσι την επικείμενη αρνητική δράση στον κυτταρικό κύκλο, συμβάλλοντας στην απελευθέρωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ηδραστηριότητα της macroH2A1.1 σχετίζεται με την κατάλληψη πληθώρας νέων γονιδιωματικών θέσεων στην κατάσταση της πολυδυναμίας, οι οποίες θέσεις αφορούν σε περιοχές πρόσδεσης αλλά και στόχους του βασικού δικτύου πολυδυναμίας, το οποίο απαρτίζεται από τους Oct-4, Sox2 και Nanog. Όσον αφορά στο ρόλο των εννέα μεταγραφικών ρυθμιστών, κατασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν παγίδες ρυθμιστικών στοιχείων (enhancer traps) για όλους τους μεταγραφικούς παράγοντες. Οι περιπτώσεις των ρυθμιστικών περιοχών των Ovol1 και Irf6 αποτελούν ειδικούς για τον επαναπρογραμματισμό ενισχυτές (Reprogramming Specific Enhancers, RSEs), δηλάδη ρυθμιστικών στοιχείων τα οποία ενεργοποιούνται μόνο κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Με αυτόν τον τρόπο, καταφέραμε να απομονώσουμε αμιγείς πληθυσμούς κυττάρων που εκφράζουν τα παραπάνω γονίδια. Και οι δύο υποπληθυσμοί εμφανίζουν μεγαλύτερη απόδοση στη δημιουργία αποικιών iPSC σε σχέση με τον υπόλοιπο κυτταρικό πληθυσμό, ενώ ανάλυση αλληλούχησης RNA (RNAseq) αποκάλυψε την ιδιαιτερότητα αυτών των κυττάρων να πραγματοποιούν τη μετάβαση από το Μεσέγχυμα στο Επθήλιο (MET), ενώ ανάλυση δικτύων σε αυτούς τους κυτταρικούς υποπληθυσμούς αποκάλυψε την εμπλοκή της μεταλοπεπτιδάσης 9 (MMP9). Αυτό το ένζυμο εξειδικεύεται στην τροποποίηση της εξωκυττάριας ουσίας και σχετίζεται βιβλιογραφικά με την ανάστροφη διαδικασία της ΜΕΤ. Φαρμακολογική αναστολή της ΜΜΡ9 είχε ως αποτέλεσμα την επιλεκτική αποσάθρωση των πρώιμων αποικιών σε αντίθεση κύτταρα τα οποία διαθέτουν ήδη το επιθηλιακό φαινότυπο όπως ηπατοκύτταρα, τα οποία δεν επηρεάζονται από τη δράση του αναστολέα. Ανάλυση ChIP-seq έναντι των Irf6 και Ovol1 έδειξε την επαγόμενη πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Mmp9, ενώ μελέτη των γεγονότων πρόσδεσης σε όλο το γονιδίωμα αποκάλυψε πως η πρόσδεση του Ovol1 συμπίπτει με τα γεγονότα πρόσδεσης του Tead4, ενός μεταγραφικού ρυθμιστή μέλος του αρχικού δικτύου μεταγραφικών ρυθμιστών ο οποίος εκφράζεται από την έναρξη της διαδικασίας. Με δοκιμασίες in vitro επαληθεύσαμε την πρόσδεση των παραγόντων αυτών σε συγκεκριμένους στόχους η οποία μπορεί να είναι κατά περίπτωση συνεργατική. Συμπερασματικά, ταυτοποιήθηκε το μόριο ΜΜΡ9 ως κρίσιμος ρυθμιστής της πορείας του επαναπρογραμματισμού μετά την ολοκλήρωση της ΜΕΤ ενώ αποκαλύφθηκε και ο κρίσιμος ρόλος ενδογενών παραγόντων (δηλαδή εκτός OSKM) οι οποίοι δρουν συνεργατικά για την εγκατάλειψη του μεσεγχυματικού χαρακτήρα και την υιοθέτηση καταρχάς του επιθηλιακού χαρακτήρα και εν τέλει την εγκαθίδρυση της πολυδυναμίας.