Κυτταρική βιολογία του σήματος των γλυκοκορτικοειδών
Authors: Νικολαΐδης Νικόλας 
Published: September 2021

Τα γλυκοκορτικοειδή αποτελούν μέλη της οικογένειας των στεροειδών ορμονών τα οποία ασκούν τις δράσεις τους μέσω του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (hGR, human glucocorticoid receptor), ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγοντας επηρεάζοντας την έκφραση γονιδίων-στόχων. Εκτός από τις γενωμικές δράσεις, τα γλυκοκορτικοειδή ασκούν ορισμένες ταχείες μη γενωμικές δράσεις, οι οποίες φαίνεται να διαμεσολαβούνται από μεμβρανικούς υποδοχείς. Η S-παλμιτυλίωση αποτελεί μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση κατά την οποία καταλύεται η προσθήκη παλμιτικού οξέος σε κυστεΐνες. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών, πλην του υποδοχέα των αλατοκορτικοειδών, υφίστανται παλμιτυλίωση σε ένα μοτίβο 9 αμινοξέων στην περιοχή σύνδεσης με τον προσδέτη. Μια παρόμοια ομόλογη αλληλουχία είναι παρούσα στην ίδια περιοχή στον hGRα (663YLCMKTLLL671), οδηγώντας στην υπόθεση ότι ο hGRα ενδέχεται να παλμιτυλιώνεται. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση του ρόλου του μοτίβου 663YLCMKTLLL671 στη μεμβρανική εντόπιση του hGRα, στο συνεντοπισμό με την καβεολίνη-1 και στις ταχείες μη γενωμικές δράσεις των γλυκοκορτικοειδών μέσω ενεργοποίησης των MAPK και της PI3K. Επίσης, θα απαντηθεί το ερώτημα εάν ο hGRα παλμιτυλιώνεται. Η σύνθεση των μεταλλαγμένων υποδοχέων hGRαΥ663Α, hGRαC665A και hGRαLL670/671AA πραγματοποιήθηκε με σημειακή κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Ακολούθησε αλληλούχηση για την επιβεβαίωση των μεταλλάξεων. Στις δοκιμασίες ενεργοποίησης δείξαμε ότι συγκριτικά με τον hGRαWT, οι υποδοχείς hGRαC665A και hGRαLL670/671AA παρουσιάζουν ελαττωμένη ικανότητα ενεργοποίησης του υποκινητή του ΜΜΤV σε χαμηλές συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης και την ίδια ικανότητα ενεργοποίησης του υποκινητή αυτού σε υψηλότερες συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης. Ο υποδοχέας hGRαY663A παρουσίασε ελάττωση της ικανότητας ενεργοποίησης του υποκινητή ΜΜΤV σε όλες τις συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης. Σε δοκιμασίες μετατόπισης του hGRα στον πυρήνα, δείξαμε ότι ο hGRαC665A εμφανίζει καθυστέρηση μετατόπισης κατά 2,6 φορές, σε σχέση με τον hGRαWT. Σε πειράματα ανοσοφθορισμού δείξαμε ότι τόσο ο hGRαWT όσο και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού επιβεβαιώθηκαν με υποκυτταρική κλασμάτωση και στύπωμα κατά Western. Σε πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού δείξαμε ότι ο hGRαWT και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς συνεντοπίζονται με την καβεολίνη-1 στην κυτταρική μεμβράνη. Η προσθήκη του αναστολέα της παλμιτυλίωσης 2-βρωμοπαλμιτικού (2-Βr) δεν απέτρεψε τον εντοπισμό στην κυτταρική μεμβράνη και τον συνεντοπισμό με την καβεολίνη-1 τόσο του hGRαWT όσο και των μεταλλαγμένων υποδοχέων.Στις δοκιμασίες ενεργοποίησης των MAPK και της PI3K δείξαμε ότι τόσο ο hGRαWT όσο και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς επάγουν διφασικά την ενεργοποίηση των MAPK σε χρόνο 5 και 15 λεπτών. Η προσθήκη του αναστολέα 2-Βr δεν απέτρεψε την ενεργοποίηση του μονοπατιού αυτού. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της PI3K δεν φαίνεται να επηρεάζεται από τον hGRαWT ή τους μεταλλαγμένους υποδοχείς στην παρουσία ή απουσία του αναστολέα 2-Βr.Τέλος, στις μελέτες παλμιτυλίωσης δείξαμε ότι η καβεολίνη-1 υφίσταται παλμιτυλίωση, ενώ οι τιμές cpm για τον hGRαWT εμπίπτουν στις αντίστοιχες τιμές του αρνητικού προτύπου, αποτέλεσμα το οποίο δείχνει ότι ο hGRα δεν υφίσταται παλμιτυλίωση.