The role of the replication licensing factor CDC6 in oncogenesis
Authors: Ζαμπετίδης Χρήστος-Νεκτάριος 
Published: February 2022

Η ομοιόσταση συνιστά θεμελιώδη ιδιότητα των οργανισμών και εξασφαλίζεται μέσω πληθώρας κυτταρικών αποπκρίσεων έναντι ενδογενών και εξωγενών παραγόντων. Η διαταραχή των μηχανισμών που ελέγχουν τις διαδικασίες αυτές οδηγεί στη συσσώρευση βλαβών και γενικά στην απορρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας με επακόλουθο την εμφάνιση νόσων, όπως ο καρκίνος. Στους όγκους παρατηρείται συχνά διατάραξη της ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, που υπό προϋποθέσεις μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση γενωμικής αστάθειας. Η τελευταία έχει καθιερωθεί τα τελευταία χρόνια ως χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων και σχετίζεται στενά με την διαταραχή του μηχανισμού αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA.Ο παράγοντας CDC6 αποτελεί κύριο συστατικό αυτής της λειτουργίας. Το CDC6 μαζί με τις πρωτεΐνες ORC και CDT1 διευκολύνουν την στρατολόγηση των παραγόντων MCM2-7 στη χρωματίνη κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, προκειμένου να σχηματιστεί το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο. Έτσι η αδειοδότηση των θέσεων έναρξης της αντιγραφής θα συμβεί μια φορά ανά κυτταρικό κύκλο πράγμα το οποίο εξασφαλίζει την απρόσκοπτη αντιγραφή του γενετικού υλικού πριν την κυτταρική διαίρεση. Επίσης, το CDC6 συμμετέχει στα σημεία ελέγχου που ρυθμίζουν την φάση S του κυτταρικού κύκλου καθώς και την μίτωση. Όλο και περισσότερα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η απορρυθμισμένη έκφραση του CDC6 έχει ογκογόνο δυναμικό. Συγκεκριμένα, το CDC6 είναι συχνά υπερ-εκρφρασμένο από τα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης και συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο ζωής των ασθενών. Επίσης, η υπερ-έκφραση του CDC6 έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε επαναντιγραφή του DNA και τελικά σε βλάβη του γενετικού υλικόυ και γενωμική αστάθεια. Η επακόλουθη ενεργοποίηση των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στην βλάβη του DNA πυροδοτεί τους αντικαρκινικούς φραγμούς της κυτταρικής γήρανσης και της απόπτωσης, ενώ η απώλεια του ογκο-κατασταλτικού γονιδίου p53 προωθεί την ανάπτυξη κακοήθειας και τελικά την επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Πιο πρόσφατα βρέθηκε ότι το CDC6 εμπλέκεται στην μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA (rRNA). Προκειμένου να μελετήσουμε τον ρόλο του CDC6 στην ογκογένεση η ερευνητική μας ομάδα ανέπτυξε ένα κυτταρικό σύστημα το οποίο έχει την δυνατότητα να υπερ-εκφράζει τον παράγοντα CDC6 μέσα σε αθανατοποιημένα φυσιολογικά κύτταρα βρογχικού επιθηλίου (Human Bronchial Epithelial Cells, HBECs). Η αθανατοποίηση των κυττάρων έγινε με συνδυαστική υπερ-έκφραση τελομεράσης και της πρωτεΐνης CDK4. Τα κύτταρα αυτά διατηρούν τον επιθηλιακο τους φαινότυπο και έχουν άθικτο το μονοπάτι ελέγχου μέσω του p53. Έτσι, αντιπροσωπεύουν ένα φυσιολογικό επιθηλιακό περιβάλλον και αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη της καρκινογένεσης, καθώς η πλειοψηφία των κακοηθειών έχει επιθηλιακή προέλευση και συγκεκριμένα ο καρκίνος του πνεύμονα βρίσκεται μεταξύ των πιο συχνών τύπων καρκίνου στον άνθρωπο.Η υπερ-έκφραση του CDC6 για 6 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κυτταρικής γήρανσης, ενώ η παρατεταμένη υπερ-έκφρασή του καθιστά τα κύτταρα ικανά να διαφύγουν της κυτταρικής γήρανσης μετά από περίπου 30 ημέρες. Παρόλα αυτά, τα γεγονότα που οδηγούν στην διαφυγή από την κυτταρική γήρανση δεν έιναι ξεκάθαρα. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι να μελετήσει τους μηχανισμούς που συμμετέχουν σε αυτή την διαδικασία.Σύντομα μετά την ενεργοποίηση του CDC6, εμφανίζονται βλάβες στο DNA και ως συνέπεια αυτού, οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του DNA ενεργοποιούνται. Όμως, τα μονοπάτια επιδιόρθωσης που ενεργοποιήθηκαν οδήγησαν στην εμφάνιση λαθών κατά την επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Έτσι, γενετικές αλλοιώσεις προέκυψαν και μεταξύ αυτών η πιο αξιοσημείωτη είναι μια εκτεταμένη αναστροφή του γενετικού υλικού στο χρωμόσωμα 3. Η περιοχή του χρωμοσώματος που αντιστρέφεται, περιλαμβάνει το γονίδιο BHLHE40. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το γονίδιο είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση του κιρκάδιου ρυθμού. Σημαντικό κρίνεται το γεγονός ότι ο παράγοντας BHLHE40 ρυθμίζει >68% των γονιδίων που εμφανίζουν διαφορετική έκφραση ανάμεσα στα κύτταρα πριν και μετά την διαφυγή από την γήρανση. Επιπρόσθετα, ο παράγοντας BHLHE40 υπερ-εκφράζεται στα κύτταρα που διαφεύγουν από την κυτταρική γήρανση και επίσης παίζει κεντρικό ρόλο στην διατήρηση του φαινοτύπου τους. Για αυτό τον σκοπό, κατασκευάσαμε μια τεχνητή γενετική αναστροφή στο χρωμόσωμα 3, μιμούμενοι με αυτό τον τρόπο την αναστροφή που προέκυψε με φυσικό τρόπο. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα που φέρουν την αναστροφή διαφεύγουν από την κυτταρική γήρανση. Παρόμοια αποτελέσματα παρήχθησαν κατόπιν εισαγωγής στα HBECs του γονιδίου BHLHE40. Είναι επίσης πολύ ενδιαφέρον να τονισθεί ότι η αναδιαμόρφωση της τρισδιάστατης διαμόρφωσης της χρωματίνης στην περιοχή του γονιδίου BHLHE40 συμπίπτει με την ενεργοποίησή του.Τα προαναφερθέντα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το CDC6 μπορεί να είναι ένας υποσχόμενος στόχος για την παρεμπόδιση της καρκινογένεσης. Δεδομένου ότι η υπερ-έκφραση του CDC6 συσχετίζεται επίσης με κακή πρόγνωση των ασθενών, βρήκαμε κυτταρικές σειρές μαστού που εκφράζουν σε περίσσεια τον εν λόγω παράγοντα και τον αποσιωπήσαμε. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η αποσιώπηση του CDC6 προκαλεί βλάβες στο DNA και ενεργοποιεί την κυτταρική γήρανση και την απόπτωση. Σημαντικό κρίνεται το γεγονός ότι τα κύτταρα προερχόμενα από τριπλό αρνητικό καρκίνο μαστού πέθαναν μέσω μιτωτικής καταστροφής, πράγμα το οποίο συμπίπτει και με την κατάργηση του σημείου ελέγχου των G2/M φάσεων του κυτταρικού κύκλου.Συγκεντρωτικά, κατά την διάρκεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, ανακαλύφθηκε ο μηχανισμός που βρίσκεται πίσω από την διαφυγή από την επαγόμενη από την ενεργοποίηση ογκογονιδίων κυτταρική γήρανση. Γεγονότα που συμβαίνουν τις πρώτες ημέρες μετά την ενεργοποίηση του CDC6 αποδείχθηκαν ότι παίζουν καθοριστικό ρόλο στην διαφυγή και συγκεκριμένα οι γενετικές αλλοιώσεις είναι ιδιαιτέρως σημαντικές στην εμφάνιση επιθετικών κυτταρικών κλώνων. Ανάμεσα τους μια αναστροφή στο χρωμόσωμα 3 οδήγησε στην αναδιαμόρφωση της τρισδιάστατης μορφής της χρωματίνης και επακόλουθα στην υπερ-έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα BHLHE40. Αυτό με την σειρά του τροποποίησε την έκφραση μιας σειράς γονίδιων και με αυτό τον τρόπο προωθήθηκε η διαφυγή από τον αντικαρκινικό φραγμό της κυτταρικής γήρανσης. Γνωρίζοντας πλέον ότι το CDC6 είναι το γεγονός που πυροδότησε τον κακοήθη φαινότυπο και επίσης συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών, η φαρμακευτική του αποσιώπηση θα μπορούσε να είναι μια έξυπνη προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου.