Ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονου ανοσοχημικού προσδιορισμού καρδιακών δεικτών με τη χρήση τριχοειδούς οπτικού ανοσοαισθητήρα
Authors: Νιώτης Αριστείδης 
Published: January 2014

Στη παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε τριχοειδής οπτικός ανοσοαισθητήρας για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό καρδιακών δεικτών στο ίδιο δείγμα. Ο ανοσοαισθητήρας χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση τoυ ισοενζύμου ΜΒ της κινάσης της κρεατίνης (CK-MB) και της υπομονάδας Ι του συμπλόκου της καρδιακής τροπονίνης (cTnI) ταυτοχρόνως σε δείγματα ανθρώπινου ορού αίματος. Τα μόρια αυτά εμφανίζουν υψηλή καρδιοειδικότητα και χρησιμοποιούνται ευρέως στα πλαίσια της εργαστηριακής ανάλυσης για την αντιμετώπιση των οξέων στεφανιαίων συνδρόμων. Ο ανοσοαισθητήρας βασίστηκε σε τριχοειδή που χρησίμευσαν ως οπτικοί κυματοδηγοί, στερεοί φορείς ακινητοποίησης βιομορίων αναγνώρισης και φιαλίδια ανοσοαντίδρασης. Οι λόγοι που οδήγησαν στην επιλογή της τριχοειδούς γεωμετρίας ήταν η αναμενόμενη αύξηση της ταχύτητας των ανοσοαντιδράσεων εξαιτίας του αυξημένου λόγου ενεργής επιφάνειας προς όγκο δείγματος και η μειωμένη κατανάλωση αντιδραστηρίων. Για την ακινητοποίηση των βιομορίων, αναπτύχθηκε μέθοδος επίστρωσης υπερλεπτών υμενίων πολυδιμεθυλο(σιλοξανίου) (PDMS) στην εσωτερική επιφάνεια των υάλινων τριχοειδών χρησιμοποιώντας γαλάκτωμα πολυμερούς. Η μέθοδος αυτή είναι απλή, ταχύτερη από άλλες μεθόδους της βιβλιογραφίας, κατάλληλη για μαζική παραγωγή, δεν χρησιμοποιεί οργανικούς διαλύτες, εμφανίζει μικρό κόστος και δύναται να εφαρμοστεί σε μη κυλινδρικές επιφάνειες. Τα επιστρωμένα με PDMS τριχοειδή συνδύασαν τις πολύ καλές οπτικές ιδιότητες της ύαλου με την υψηλή ικανότητα προσρόφησης πρωτεϊνών που παρέχουν τα πολυμερή. Επιπλέον παρείχαν υψηλότερη ομοιογένεια ακινητοποιημένων βιομορίων σε σύγκριση με υάλινα τριχοειδή χημικώς τροποποιημένα με 3-αμινοπροπυλο(τριεθοξυσιλάνιο) (APTES), ένα από τα συνηθέστερα αντιδραστήρια τροποποίησης υάλινων επιφανειών. Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των cTnI και CK-MB επιτεύχθηκε με την κατασκευή δύο βιοδραστικών ζωνών στο εσωτερικό του επιστρωμένου με PDMS υάλινου τριχοειδούς. Η κατασκευή των ζωνών πραγματοποιήθηκε με εναπόθεση κατάλληλου όγκου διαλύματος από το προς ακινητοποίηση ειδικό αντίσωμα κάθε καρδιακού δείκτη σε προκαθορισμένες θέσεις του τριχοειδούς, καθώς η μεθοδολογία αυτή ήταν ταχύτερη και απλούστερη σε σύγκριση με φωτολιθογραφικές και φωτοχημικές τεχνικές σχηματοποίησης που έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία. Ο ανοσοπροσδιορισμός κάθε καρδιακού δείκτη αναπτύχθηκε αρχικά σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης, με σκοπό να αποτελέσει μέθοδο σύγκρισης των αναλυτικών χαρακτηριστικών και της ακρίβειας των μετρήσεων σε δείγματα ορού αίματος του τριχοειδή ανοσοαισθητήρα. Για τη παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων των προσδιορισμών σε ανθρώπινο ορό αίματος χρησιμοποιήθηκαν CK-MB και το τριπλό σύμπλοκο της καρδιακής τροπονίνης (cTnICT). Η χρήση του συμπλόκου της τροπονίνης βασίστηκε στο γεγονός ότι η cTnI ελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος έπειτα από έμφραγμα του μυοκαρδίου συνδεδεμένη κυρίως με την υπομονάδα C ή και την Τ και ελάχιστα ως ελεύθερη. Για τον προσδιορισμό της CK-MB χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα ακινητοποίησης μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της CK-MB και ως αντίσωμα ανίχνευσης μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της CK-B καθώς ο συνδυασμός αυτός εξασφάλιζε την ειδικότητα της μεθόδου. Για τον προσδιορισμό της cTnI χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα ακινητοποίησης έναντι της cΤnΙ σε συνδυασμό με δύο μονοκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης. Το ένα εκ των οποίων συνδεόταν στην cTnI σε διαφορετικό επίτοπο του αναλύτη από ό,τι το αντίσωμα ακινητοποίησης ενώ το δεύτερο συνδεόταν με την cTnC. Ο συνδυασμός των τριών αντισωμάτων παρείχε δυνατότητα ανίχνευσης όλων των τύπων του αναλύτη στο αίμα και πολύ μικρότερων συγκεντρώσεων cTnI σε σχέση με άλλους συνδυασμούς αντισωμάτων που εξετάστηκαν. Τόσο στα φρεάτια μικροτιλοδότησης όσο και στα τριχοειδή εξετάστηκαν δύο ιχνηθέτες, το ένζυμο υπεροξειδάση της ραπανίδος και η R-φυκοερυθρίνη. Ο ενζυμικός ιχνηθέτης στα μικροφρεάτια συνδυάστηκε με χρωμογόνο υπόστρωμα ενώ στον τριχοειδή ανοσοαισθητήρα με παράγωγο τυραμιδίου συζευγμένο με τη φθορίζουσα Alexa fluor 488 (TSA-AF488) ως σύστημα ενίσχυσης του οπτικού σήματος. ............................................