Παραγωγή ικριώματος τραχείας για την αντιμετώπιση σοβαρών παθήσεων της αναπνευστικής οδού
Authors: Δήμου Ζαχαρούλα-Γεωργία 
Published: September 2021

Η αναγεννητική ιατρική είναι ένας εξελισσόμενος τομέας που συνδυάζει την ιστομηχανική και τις κυτταρικές θεραπείες και θεωρείται πλέον ότι μπορεί να ανοίξει νέες προοπτικές για ένα πολλά υποσχόμενο μέλλον στην ιατρική επιστήμη. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η παραγωγή ικριώματος τραχείας για την αντιμετώπιση σοβαρών παθήσεων της αναπνευστικής οδού χωρίς τη χρήση βιοαντιδραστήρα. Ο επίκτητος ή ιατρογενής τραυματισμός των αεραγωγών και συγκεκριμένα της τραχείας είναι σχετικά συχνός και θεωρείται θανατηφόρος για τον ασθενή. Ως εκ τούτου, η αποκατάσταση/αντικατάσταση τμημάτων της τραχείας εξαιτίας είτε τραυματισμού είτε βλάβης είτε συγγενούς ανωμαλίας και η ενίσχυση της αναγεννητικότητας των ιστών συνεχίζει να αποτελεί ευρύ ερευνητικό πεδίο. Για την πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης αφαιρέθηκαν οι τραχείες από επίμυες και αποκυτταροποιήθηκαν με ήδη εφαρμοσμένα πρωτόκολλα αποκυτταροποίησης. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η απουσία γενετικού υλικού και η διατήρηση της μορφολογίας του ιστού. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με αξιολόγηση της αποκυτταροποίησης με ιστολογικό, ποσοτικό και ποιοτικό έλεγχο των ικριωμάτων. Πραγματοποιήθηκαν χρώσεις των ιστών με Αιματοξυλίνη-Ηωσίνη, Τολουιδίνη μπλε, τρίχρωμη χρώση (Masson’s Trichrome), Elastic Van Gieson και 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Έπειτα, ποσοτικοποιήθηκαν το DNA, οι γλυκοζαμινογλυκάνες και το κολλαγόνο τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε αποκυτταροποιημένες τραχείες. Επίσης, έγινε ποιοτική αξιολόγηση των ιστών με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης. Οι παραπάνω έλεγχοι επιβεβαίωσαν την απομάκρυνση πυρηνικών και κυτταρικών στοιχείων του ιστού ενώ παράλληλα έδειξαν τη διατήρηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας των ικριωμάτων. Εμβιομηχανικός έλεγχος πίεσης-επιμήκυνσης (Ultimate Tensile Strength-UTS) εφαρμόστηκε σε χόνδρινους δακτυλίους και λωρίδες εγγενούς και αποκυτταροποιημένου ιστού. Ο αποκυτταροποιημένος ιστός εμφάνισε σημαντικά αυξημένη παραμόρφωση αστοχίας αλλά μειωμένη τάση αστοχίας και μέγιστο μέτρο ελαστικότητας σε σύγκριση με τον εγγενή ιστό, μόνο στη διαμήκη κατεύθυνση. Δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των εγγενών και των αποκυτταροποιημένων τραχειών στην περιφερειακή κατεύθυνση. Στις εγγενείς τραχείες, μεγαλύτερες τιμές παραμέτρων βρέθηκαν κατά μήκος σε σχέση με την περιφέρεια, με όλες τιςκατευθυντήριες διαφορές να έχουν μεγάλη στατιστική σημασία. Σε αντίθεση με τις εγγενείς τραχείες, δεν υπήρχαν διαφορές στην κατεύθυνση όσον αφορά στην τάση αστοχίας στις αποκυτταροποιημένες τραχείες, ενώ η παραμόρφωση αστοχίας ήταν σημαντικά υψηλότερη κατά μήκος και το μέγιστο μέτρο ελαστικότητας ήταν σημαντικά υψηλότερο περιφερειακά-εγκάρσια. Οι εμβιομηχανικές δοκιμές αποκάλυψαν ορισμένες διαφορές στις παραμέτρους αστοχίας μεταξύ εγγενών και αποκυτταροποιημένων τραχειών, υποδηλώνοντας ότι οι τελευταίες ήταν σημαντικά ασθενέστερες και πιο μαλακές αλλά πιο εκτάσιμες από τις πρώτες, αν και μόνο κατά μήκος. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε in vitro κυτταροτοξικός έλεγχος των ικριωμάτων με τη χρήση ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (hMSCs). Παρατηρήθηκε επιτυχής ανάπτυξη των κυττάρων γύρω από το αποκυτταροποιημένο ικρίωμα υποδηλώνοντας την απομάκρυνση μεγάλου μέρους των τοξικών βιολογικών και χημικών στοιχείων που θα ανέστειλλαν το κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη. Τέλος, μετά τη διεξαγωγή των ανωτέρω ελέγχων, πραγματοποιήθηκε in vivo δοκιμασία ελέγχου βιοσυμβατότητας και επανακυτταροποίησης του αποκυτταροποιημένου ικριώματος σε επίμυες (n=8) για χρονικό διάστημα 1 μήνα. Οι αποκυτταροποιημένες τραχείες εμφυτεύτηκαν στη ράχη επίμυων ενώ βιοψίες λήφθηκαν ώστε να ελεγχθεί η επανακυτταροποίηση της τραχείας και η ανοσολογική απόκριση. Μετά την ευθανασία των επίμυων διεξήχθη ιστολογικός και φαινοτυπικός έλεγχος στους εμφυτευμένους ιστούς. Πραγματοποιήθηκε σήμανση με τους ανοσολογικούς δείκτες CD3, CD4, CD11-b και S100 καθώς και χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη για επιβεβαιωτικό έλεγχο. Στις αποκυτταροποιημένες τραχείες δε φάνηκε καθόλου έκφραση του δείκτη CD4 ενώ πολύ μικρή ήταν η παρουσία των CD3 και CD11b. Επομένως, οι αποκυτταροποιημένες τραχείες που εμφυτεύθηκαν παρουσίασαν μικρή ανοσολογική απάντηση γεγονός που επιβεβαιώνεται και από τη ιστολογική χρώση αιματοξυλίνης και εοσίνης (H&E). Επίσης παρατηρήθηκε η έκφραση του S100 και η παρουσία κυττάρων που προσομοιάζουν ινοβλάστες, χαρακτηριστικό αναγέννησης και επανακυτταροποίησης του ιστού. Ο χόνδρινος ιστός παρουσίασε στοιχεία ανάπλασης και αναγέννησης υποδεικνύοντας πως ο οργανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως βιοαντιδραστήρας για να αποκατασταθεί η δομή και η λειτουργία του ιστού Τα παραπάνω υποδεικνύουν την έναρξη ιστικήςαναγέννησης και την ύπαρξη χαμηλής ανοσογονικότητας του αποκυτταροποιημένου ικριώματος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η δημιουργία ενός κυτταρικού, ιστομηχανικού αεραγωγού μέσω αποκυτταροποίησης και επανακυτταροποίησης, χωρίς τη χρήση βιοαντιδραστήρα, ο οποίος να μπορεί να έχει τη δομή και τη λειτουργία του εγγενούς ιστού χωρίς να υπάρχει ο κίνδυνος ανοσολογικής απόκρισης. Αυτή η έρευνα είχε ως σκοπό να αξιολογήσει το αποκυτταροποιημένο ικρίωμα και να μελετήσει αν ο οργανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως βιοαντιδραστήρας για να αποκατασταθεί η δομή και η λειτουργία του ιστού ώστε στο μέλλον να υπάρχουν επιτυχείς λειτουργικές λύσεις για σοβαρές κλινικές διαταραχές της αναπνευστικής οδού.