Διερεύνηση του ρόλου πρωτεϊνών µε ικανότητα πρόσδεσης hnRNA και mRNA στην επαγωγή, εξέλιξη και καθιέρωση του καρκίνου του πνεύµονα σε πειραµατικά πρότυπα καρκινογένεσης
Authors: Παπαδοπούλου Χριστίνα 
Published: January 2014

Κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της εµπλοκής πρωτεϊνών µε ικανότητα πρόσδεσης RNA (πρωτεΐνες RBP) στην επαγωγή και εξέλιξη καρκίνου του πνεύµονα σε κυτταρικά και ζωικά πειραµατικά πρότυπα. Η µελέτη εστίασε στον ειδικό ρόλο πρωτεϊνών της οικογένειας των ετερογενών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνών (hnRNP), κατά κύριο λόγο στις hnRNP τύπου Α/Β (hnRNP A1, A2/B1 και A3), γνωστά σταθερά συστατικά συµπλόκων hnRNP και mRNP και µε συµµετοχή σε όλα σχεδόν τα στάδια βιογένεσης του mRNA. Παράλληλα µελετήθηκαν τα πρότυπα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών RBP, µε έµφαση στην πρωτεΐνη HuR µε πλέον γνωστό ρόλο την σταθεροποίηση/µετάφραση mRNA-στόχων. Με δεδοµένη την βιολογική σηµασία της διαφαινόµενης συµµετοχής πρωτεϊνών hnRNP (κατεξοχήν της Α2/Β1) και της ΗuR στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύµονα, εφαρµόστηκαν πειραµατικά µοντέλα επαγωγής καρκίνου του πνεύµονα στον ποντικό. Συνολικά, έγινε εφικτή η εξέταση τριών διαφορετικών στελεχών ποντικού και δύο σχηµάτων χηµικής επαγωγής καρκίνου του πνεύµονα [(ουρεθάνη, και συνδυασµός αρωµατικών πολυκυκλικών υδρογονανθράκων (PAH))]. Έγινε ανοσοχηµικός προσδιορισµός των πρωτεινών hnRNP και HuR σε ολικά εκχυλίσµατα του πνεύµονα, καθώς και παράλληλη ιστολογική/ανοσοϊστοχηµική ανάλυση. Συνοπτικά, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από την εφαρµογή των τριών πειραµατικών µοντέλων έδειξαν απουσία σηµαντικής αύξησης έως και µείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών στον καρκινικό έναντι του φυσιολογικού πνευµονικού ιστού. Τα ευρήµατα είναι σε γενική συµφωνία µε πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδοµένα από τους Peebles KA et al (2007) αναφορικά µε τις αλλαγές των επιπέδων της hnRNPA2/B1. Επισηµαίνεται ότι τα αποτελέσµατα από την εφαρµογή των πειραµατικών ζωικών µοντέλων είναι σε προφανή αντιδιαστολή µε αυτά που αφορούν τις ανθρώπινες βιοψίες καρκίνου του πνεύµονα, όπου διαπιστώνεται η σε υψηλά ποσοστά υπερέκφραση των hnRNP Α/Β και HuR σε σχέση µε τον παρακείµενο φυσιολογικό ιστό. Κατά συνέπεια, σηµειώνεται η ανάγκη να ληφθούν υπόψη στην επέκταση και εφαρµογή των ζωικών µοντέλων στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύµονα. Με βάση γνωστά κοινά βιοχηµικά και µοριακά χαρακτηριστικά πρωτεϊνών hnRNPA/B και HuR, προχωρήσαµε στη ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισµό των µεταξύ τους διασυνδέσεων µε την εφαρµογή πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης σε πυρηνικά και κυτταροπλασµατικά κλάσµατα κυττάρων Α549 (αδενοκαρκίνωµα πνεύµονα ανθρώπου). Διαπιστώθηκε η ευρεία συµµετοχή της HuR σε σύµπλοκα hnRNP και mRNP. Ειδικότερα, χαρακτηρίστηκαν πυρηνικές διασυνδέσεις της HuR µε τις hnRNP A1 και C1/C2, καθώς και κυτταροπλασµατική διασύνδεση µε την hnRNP A1, οι οποίες είναι τύπου πρωτεΐνης/RNA. Επιπλέον, διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση πρωτεΐνης/πρωτεΐνης της HuR µε το καρβοξυτελικό άκρο της hnRNP A3, in vitro. Η επίδραση θερµικού στρες σε κύτταρα A549 είχε σαν αποτέλεσµα αλλαγή στην πυρηνική κατανοµή της HuR και στην διασύνδεσή της µε τα σύµπλοκα hnRNP. Τα αποτελέσµατα αυτά ανοίγουν τον δρόµο για την ταυτοποίηση του mRNA στο ανοσοσύµπλοκο hnRNP Α1:HuR, σε κύτταρα µε ή χωρίς απαλοιφή της HuR, προκειµένου να διερευνηθεί η βιολογική σηµασία της παρουσίας της HuR στα σύµπλοκα hnRNP και mRNP.