Αξιοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και της χημειοφωταυγούς ανίχνευσης για τον προσδιορισμό μοριακών δεικτών του καρκίνου του προστάτη σε περιφερικό αίμα
Authors: Εμμανουηλίδου Ευαγγελία 
Published: August 2021

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια από τις συχνότερα εμφανιζόμενες μορφές καρκίνου στον ανδρικό πληθυσμό των ανεπτυγμένων χωρών. Η ευαισθησία των σύγχρονων μεθόδων σταδιοποίησης του καρκίνου του προστάτη είναι ανεπαρκής με αποτέλεσμα μεγάλο ποσοστό ασθενών (-40%) που αρχικά διαγνώσθηκαν με εντοπισμένο καρκίνο να βρίσκονται εκ των υστέρων ότι είχαν μετάσταση. Τα τελευταία χρόνια έχει επικρατήσει η άποψη ότι η ανίχνευση καθώς και ο ποσοτικός προσδιορισμός προστατικών καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα αποτελεί ισχυρή ένδειξη ύπαρξης μεταστάσεων.Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη δύο μεθόδων για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA δύο ειδικών προστατικών καρκινικών δεικτών, του PSA και PSMA, σε περιφερικό αίμα. Επιπρόσθετα, παρουσιάζεται μεθοδολογία για την ταυτόχρονη ανίχνευση του mRNA των μορίων αυτών σε περιφερικό αίμα. Όλες οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν βασίζονται στην τεχνική της RT-PCR και σε χημειοφωταυγή ανίχνευση των προϊόντων μέσω δοκιμασίας υβριδισμού σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης.Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA του PSA, η μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση εσωτερικού προτύπου (IS) που διαθέτει τις ίδιες περιοχές σύνδεσης εκκινητών με το mRNA του γονιδίου-στόχου. Τα προϊόντα της RT-PCR (PSA και PSA-IS) έχουν το ίδιο μέγεθος και διαφέρουν μόνο ως προς μια κεντρική αλληλουχία 24 b η οποία και επιτρέπει τελικά τη διάκρισή τους. Από δείγμα ολικού αίματος (5 ml) γίνεται απομόνωση ολικού RNA παρουσία σταθερής ποσότητας PSA-IS RNA και τμήμα του ολικού RNA υποβάλλεται σε RT-PCR. Τα προϊόντα της RT-PCR είναι επισημασμένα με βιοτίνη στο 5' τελικό άκρο τους και δεσμεύονται σε δύο σειρές φρεατίων μέσω υβριδισμού σε συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια (ανιχνευτές). Ακολουθεί προσθήκη στρεπταβιδίνης με ALP και η ανίχνευση των προϊόντων υβριδοποίησης γίνεται με προσθήκη χημειοφωταυγούς υποστρώματος της ALP. Η ακινητοποίηση των ανιχνευτών επιτυγχάνεται μέσω σύζευξής τους με BSA και προσρόφηση της πρωτεΐνης στη στερεή επιφάνεια. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων για το PSA mRNA και το PSA-IS RNA είναι ανάλογος της αρχικής ποσότητας του PSA mRNA στο αρχικό δείγμα.Η ταυτόχρονη ανίχνευση του PSA mRNA και του PSMA mRNA πραγματοποιείται με το ίδιο σύστημα ακινητοποίησης των παραγόμενων DNA τμημάτων μέσω σύζευξης των αντίστοιχων ανιχνευτών με BSA. Ολικό RNA απομονώνεται από το δείγμα, τμήμα αυτού υποβάλλεται σε RT-PCR και τα βιοτινυλιωμένα PSA και PSMA προϊόντα ανιχνεύονται με διαφορετικές δοκιμασίες υβριδισμού με μέτρηση της χημειοφωταύγειας.Όπως και στην περίπτωση του PSA, ο ποσοτικός προσδιορισμός του mRNA του PSMA βασίζεται στην κατασκευή εσωτερικού προτύπου (PSMA-IS RNA) με αντίστοιχα χαρακτηριστικά. Όμως, το PSMA-IS RNA προστίθεται τώρα στο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής κι όχι της απομόνωσης του ολικού RNA. Μετά από RT-PCR, τα βιοτινυλιωμένα προϊόντα (PSMA και PSMA-IS) ακινητοποιούνται στην επιφάνεια δύο σειρών φρεατίων επικαλυμένων με στρεπταβιδίνη. Ακολουθεί προσθήκη του ανιχνευτή ο οποίος είναι ιχνηθετημένος με ALP και η ανίχνευση των προϊόντων υβριδοποίησης γίνεται με προσθήκη χημειοφωταυγούς υποστρώματος της ALP. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων για το PSMA mRNA και το PSMA-IS RNA συσχετίζεται γραμμικά με την αρχική ποσότητα του PSMA mRNA στο δείγμα.Οι αντιδράσεις σύνθεσης των προϊόντων σύζευξης μεταξύ ολιγονουκλεοτιδίων και πρωτεϊνών που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται διεξοδικά. Δεδομένου ότι πρόκειται για πορείες που περιλαμβάνουν περισσότερα του ενός στάδια, αναλύονται οι παράμετροι που βελτιστοποιήθηκαν ώστε το προϊόν σύζευξης να είναι σταθερό και να παρέχει την καλύτερη δυνατή ευαισθησία.Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των προτεινόμενων μεθόδων συνηγορούν στο ότι πρόκειται για μεθόδους με εξαιρετική ευαισθησία, ευρεία γραμμική περιοχή και πολύ καλή επαναληψιμότητα. Η εγκυρότητα κάθε μεθοδολογίας ελέγχθηκε με προσδιορισμό των mRNA των γονιδίων-στόχων σε ολικό RNA από την προστατική καρκινική σειρά, LNCaP. Μέχρι και 1 ισοδύναμο καρκινικό κύτταρο σε 10 mL δείγματος ολικού αίματος ήταν δυνατό να προσδιοριστεί με αξιοπιστία.Η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του PSA mRNA και η μέθοδος ταυτόχρονης ανίχνευσης των PSA mRNA και PSMA mRNA εφαρμόστηκαν σε δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο του προστάτη και υγιών εθελοντών. Στην πρώτη περίπτωση 50% των δειγμάτων των ασθενών έδωσαν αποτελέσματα πάνω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Κανένα από τα δείγματα υγιών ατόμων δεν έδωσε ανιχνεύσιμο αριθμό καρκινικών κυττάρων. Στη δεύτερη περίπτωση η ανάλυση των κλινικών δειγμάτων επιβεβαίωσε την άποψη ότι σε επίπεδο ανίχνευσης mRNA, η ταυτόχρονη ανίχνευση PSA/PSMA παρέχει υψηλότερη ευαισθησία σε σύγκριση με τη μεμονωμένη ανίχνευση του PSA ή του PSMA.-