Ταυτοποίηση νέων αλληλόμορφων σε γονίδια προδιάθεσης για τον καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών
Authors: Αποστόλου Παρασκευή 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τον πιο συνηθισμένο τύπο καρκίνου που διαγιγνώσκεται στις γυναίκες στις ανεπτυγμένες χώρες. Περίπου 5-10% των περιστατικών καρκίνου του μαστού οφείλεται σε μεταλλάξεις των γονιδίων BRCA1 και BRCA2, ενώ ένα σημαντικό μέρος αυτών εξηγείται από μεταλλάξεις άλλων γονιδίων, υψηλής και μεσαίας διεισδυτικότητας. Έτσι, η γονιδιακή ανάλυση στον κληρονομικό καρκίνο του μαστού συμβάλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της καρκινογένεσης αλλά και τη βελτιστοποίηση της διαχείρισης των ασθενών.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός νέων μεταλλάξεων σε γονίδια προδιάθεσης καρκίνου του μαστού σε ασθενείς με βεβαρυμμένο οικογενειακό ή ατομικό ιστορικό, η ανίχνευση σπάνιων γενετικών φαινομένων, καθώς και ο χαρακτηρισμός μεταλλάξεων που εμφανίζονται με μεγάλη συχνότητα στον Ελληνικό πληθυσμό. Αρχικά αναλύθηκε το γενετικό υλικό 252 και 196 ασθενών με την αλληλούχιση κατά Sanger για μεταλλάξεις του γονιδίου BRCA1 και του γονιδίου BRCA2, αντίστοιχα όπου και ανιχνεύθηκαν 19 (7,53%) και 8 (4,1%) παθογόνοι μεταλλάξεις, αντίστοιχα. Οι ασθενείς εκείνες που ήταν αρνητικές για μεταλλάξεις, υποβλήθηκαν σε έλεγχο με ανεξάρτητη μέθοδο για την παρουσία γονιδιακών αναδιατάξεων, όπου και ανιχνεύθηκε απαλοιφή των εξονίων 23 και 24 του γονιδίου BRCA1 σε δύο ασθενείς. Στη συνέχεια, προσδιορίσθηκε η συχνότητα της απαλοιφής αυτής σε 2.092 ασθενείς με σοβαρό ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών, η οποία υπολογίστηκε στο 1,68%. Η ανάλυση απλοτύπων έδειξε πως αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη για τον Ελληνικό πληθυσμό και πιο συγκεκριμένα, με καταβολή από τα νησιά του Αιγαίου και την περιοχή της Μικράς Ασίας. Προκειμένου να αποσαφηνιστεί το γονιδιακό υπόβαθρο 226 ασθενών με ηλικία διάγνωσης καρκίνου <35 ετών ή/και βεβαρυμμένο οικογενειακό ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της νέας γενιάς αλληλούχισης (Next Generation Sequencing) και πιο συγκεκριμένα το BROCA πάνελ, το οποίο αναλύει ταυτόχρονα 50 γονίδια προδιάθεσης καρκίνου. Συνολικά, ανιχνεύθηκαν 29 παθογόνοι μεταλλάξεις σε 28 ασθενείς (12,4%) στα υπό μελέτη γονίδια προδιάθεσης, ενώ 20 ασθενείς έφεραν γενετικές αλλαγές αγνώστου παθογένειας. Εν συνεχεία, αναλύθηκαν 40 δείγματα γυναικών με σοβαρό οικογενειακό ιστορικό ή νεαρή ηλικία διάγνωσης (<45 ετών) καρκίνου μαστού χρησιμοποιώντας το γονιδιακό πάνελ TruSight Cancer panel, το οποίο περιλαμβάνει 94 γονίδια προδιάθεσης. Κατά την ανάλυση αυτή ανιχνεύθηκαν 2 παθογόνοι μεταλλάξεις και 4 γενετικές αλλαγές αγνώστου παθογένειας. Μέσω των παραπάνω αναλύσεων, ανιχνεύθηκε μία καινοφανής –για τον Ελληνικό πληθυσμό- γονιδιακή αναδιάταξη στο γονίδιο BRCA2, κατά την οποία απαλείφονται τα εξόνια 12 και 13 του γονιδίου. Στη συνέχεια, προσδιορίσθηκαν τα ακριβή σημεία θραύσης της μετάλλαξης, ενώ αναλύθηκαν 2.386 δείγματα DNA γυναικών με καρκίνο μαστού, εκ των οποίων οι 6 (6/2.386; 0,25%) έφεραν την εν λόγω μετάλλαξη. Η περαιτέρω ανάλυση απλοτύπων κατέδειξε πως αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη για τον Ελληνικό πληθυσμό, ενώ όλα τα άτομα που την έφεραν κατάγονταν από την Κρήτη. Το γονίδιο CHEK2 αποτελεί ένα από τα βασικά γονίδια προδιάθεσης καρκίνου μαστού, πέραν των γονιδίων BRCA1 & BRCA2. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, αξιολογήθηκε η συνεισφορά των μεταλλάξεων του γονιδίου αυτού στον Ελληνικό πληθυσμό. Αρχικά, ελέγχθηκαν 2.408 γυναίκες με καρκίνο του μαστού για τη μετάλλαξη c.1100delC, η οποία απαντάται σε υψηλή συχνότητα σε πληθυσμούς της Βόρειας Ευρώπης (~1% στο γενικό πληθυσμό), ενώ διαφάνηκε ότι συνεισφέρει σε πολύ μικρό βαθμό στην προδιάθεση για καρκίνο του μαστού στις Ελληνίδες ασθενείς, μιας και ανιχνεύθηκε στο 0,16% των ασθενών που μελετήθηκαν. Στη συνέχεια και με δεδομένη την ανίχνευση μιας καινοφανής γονιδιακής αναδιάταξης του γονιδίου CHEK2, κατά την οποία απαλείφεται το εξόνιο 6, ελέχθηκαν 2.355 ασθενείς με καρκίνο μαστού. Η εν λόγω μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στο 0.22% των ασθενών, ενώ η ανάλυση απλοτύπων έδειξε πως αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη για τον Ελληνικό πληθυσμό και με συγκεκριμένη καταγωγή την περιοχή της Δυτικής Ελλάδας. Η παθογένεια της συγκεκριμένης απαλοιφής προσδιορίσθηκε μέσω τεσσάρων διαφορετικών μεθόδων. Αρχικά, η in silico ανάλυση κατέδειξε την επιβλαβή της φύση, ενώ η ανάλυση της επίδρασης της μετάλλαξης στο μάτισμα του mRNA έδειξε ότι παράγεται ένα επιπλέον θραύσμα μικρότερου μεγέθους, το οποίο αντιστοιχεί σε μεταλλαγμένο mRNA από το οποίο απαλείφεται το εξόνιο 6. Επιπλέον, τόσο η λειτουργική δοκιμασία των κυττάρων ζύμης, όσο και η μελέτη της επίδρασης της μετάλλαξης στη δομή της πρωτεΐνης έδειξαν πως η γονιδιακή αναδιάταξη αλλάζει τη λειτουργία της πρωτεΐνης, καταργώντας την ενεργότητα κινάσης δεδομένης της απαλοιφής μιας α-έλικας στην περιοχή αυτή. Συνοψίζοντας, στην παρούσα διατριβή χαρακτηρίσθηκαν τρία σπάνια γενετικά φαινόμενα στα γονίδια BRCA1, BRCA2 και CHEK2 τα οποία ανιχνεύθηκαν συνολικά στο ~2% των Ελληνίδων ασθενών με νεαρή ηλικία διάγνωσης ή/και ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών. Οι εν λόγω γονιδιακές αναδιατάξεις παρουσιάζουν γεωγραφική κατανομή, γεγονός που καθιστά την πληροφορία αυτή αξιοποιήσιμη σε διαγνωστικό επίπεδο. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε η τεχνογνωσία της παράλληλης ανάλυσης πολλών γονιδίων, η οποία οδηγεί στην ανίχνευση πολλών γενετικών αλλαγών σε γνωστά και νέα γονίδια προδιάθεσης καρκίνου με την τεχνολογία της επόμενης γενεάς αλληλούχισης. Έτσι, εκτός από τη μελέτη των δύο βασικών γονιδίων προδιάθεσης καρκίνου μαστού (BRCA1 και BRCA2) καταγράφηκε και η συνεισφορά άλλων γονιδίων όπως τα CHEK2 και PALB2, γεγονός που συνέβαλε στην καλύτερη κατανόηση του γενετικού υπόβαθρου του κληρονομικού καρκίνου του μαστού στον Ελληνικό πληθυσμό.