Διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της εκκρινόμενης ασυνουκλεΐνης
Authors: Κεραμιώτη Μαρία 
Published: September 2021

Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τους μηχανισμούς έκκρισης της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης και την επίδρασή της στην ομοιόσταση των κυττάρων. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν διαιρούμενα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y τα οποία ύστερα από επαγωγή εκφράζουν αυξημένα επίπεδα της αγρίου τύπου α-συνουκλεΐνης (WT). Η επίδραση με χημικούς αναστολείς, οι οποίοι αναστέλλουν συγκεκριμένα μη κλασσικά μονοπάτια έκκρισης, έδειξε ότι η έκκριση της α-συνουκλεΐνης εξαρτάται από τις μεταβολές της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου. Επειδή η α-συνουκλεΐνη έχει δειχθεί ότι εκκρίνεται μερικώς μέσω εξωσωμάτων, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην πρόσληψη των εξωσωμάτων από τα κύτταρα και συνεπώς την επίδραση της α-συνουκλεΐνης ως φορτίου αυτών. Για να μελετήσουμε το μηχανισμό πρόσληψης, αρχικά εξετάσαμε την ικανότητα των κυττάρων να προσλαμβάνουν τα εξωσώματα. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν διαιρούμενα και διαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y και πρωτογενείς νευρώνες. Η χρώση των απομονωμένων εξωσωμάτων με την ειδική χρωστική Bodipy-Tr- Ceramide και στη συνέχεια η εφαρμογή τους στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, έδειξε ότι πράγματι τα εξωσώματα εισέρχονται στα κύτταρα. Η πρόσληψη των εξωσωμάτων από τα κύτταρα πραγματοποιήθηκε με συνδυασμό διαφορετικών μηχανισμών ενδοκύτωσης, αλλά το συγκεκριμένο αποτέλεσμα χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Παράλληλα, προσπαθήσαμε να μελετήσουμε την επίδραση της α-συνουκλεΐνης ως φορτίο των εξωσωμάτων στην ομοιόσταση των νευρώνων. Ο μορφολογικός παράγοντας του κυττάρου που εξετάστηκε ήταν ο κυτταρικός όγκος, ο οποίος μετρήθηκε ύστερα από την εφαρμογή εξωσωμάτων που περιείχαν διαφορετικού τύπου α-συνουκλεΐνη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η μεταλλαγμένου (A53T) τύπου μορφή της πρωτεΐνης προκαλεί μια τάση για μείωση του κυτταρικού όγκου. Τέλος, με τη χρήση κυττάρων νευροβλαστώματος SH-SY5Y τα οποία ύστερα από επαγωγή εκφράζουν συγκεκριμένη μετάλλαξη της α-συνουκλεΐνης (ΔDQWT), η οποία δεν αποικοδομείται από το λυσόσωμα, εξετάσαμε την επίδραση της έλλειψης αυτοφαγίας διαμεσολαβούμενης από σαπερόνες (CMA) στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης ως ελεύθερης ή μέσω εξωσωμάτων. Η μελέτη μας έδειξε ότι η έκκρισή της μειώνεται σημαντικά στα κύτταρα που εκφράζουν τη μεταλλαγμένου τύπου μορφή της συγκριτικά με δείγμα ελέγχου κυττάρων που εκφράζουν την αγρίου τύπου μορφή της. Τα ενδοκυττάρια επίπεδα της πρωτεΐνης δε διαφέρουν. Επιπλέον παρατηρήσαμε αύξηση του φορτίου των εξωσωμάτων σε α-συνουκλεΐνη. Παράλληλα, παρατηρήσαμε και αύξηση στη φωσφορυλιωμένη μορφή της α-συνουκλεΐνης (p- S129) η οποία εντοπίστηκε κυρίως στον πυρήνα, μείωση της λειτουργίας του πρωτεασώματος και σχηματισμό πολυουβικιτινιλιωμένων αλυσίδων περιμετρικά του πυρήνα. Μάλιστα οι συγκεκριμένες αλυσίδες έχουν παρόμοια μορφολογία με εκείνες που δημιουργούνται ύστερα από επίδραση με αναστολείς του πρωτεασώματος σε κύτταρα που εκφράζουν αυξημένα επίπεδα της αγρίου τύπου μορφής της πρωτεΐνης. Συνοψίζοντας, στην εργασία μας διερευνήσαμε το ρόλο της α-συνουκλεΐνης στην εξάπλωση της παθογένειας της νόσου Πάρκινσον, μέσω της μελέτης των μηχανισμών έκκρισης της πρωτεΐνης, του μηχανισμού πρόσληψης των εξωσωμάτων από τα κύτταρα, της δράσης διαφορετικών μορφών της α-συνουκλεΐνης στη νευρωνική ομοιόσταση και του ρόλου της αυτοφαγίας στην έκκριση της πρωτεΐνης.