Μελέτη του ρόλου της κυτταροκίνης RANKL σε οστεοανοσολογικές αλληλεπιδράσεις με διαγονιδιακά ζωικά μοντέλα οστικής απώλειας
Authors: Παπαδάκη Μαρία 
Published: September 2021

Ο προσδέτης του υποδοχέα ενεργοποίησης του πυρηνικού παράγoντα-κΒ (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand, RANKL), ανήκει στην TNF υπερ-οικογένεια και συνιστά τον κύριο ρυθμιστή της οστικής απώλειας. Η πρωτείνη RANKL προσδένεται και ενεργοποιεί τον υποδοχέα RANK, επάγοντας την διαφοροποίηση, ωρίμανση και επιβίωση των οστεοκλαστών, κυττάρων που ευθύνονται για την οστική απορρόφηση. Στον άνθρωπο, λειτουργικές μεταλλάξεις στο γονίδιο RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση (Autosomal Recessive Osteopetrosis, ARO) λόγω απουσίας οστεοκλαστών, ενώ η υπερέκφραση του RANKL εμπλέκεται σε μία πληθώρα από οστεοεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η οστεοπόρωση και η ρευματοειδής αρθρίτιδα. Η στοχευμένη αναστολή της πρωτεΐνης RANKL, μέσω χορήγησης ενός μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής, του denosumab, μειώνει αποτελεσματικά το αυξημένο ποσοστό καταγμάτων που παρατηρείται στις εμμηνοπαυσιακές γυναίκες, αποτελώντας τη νέα θεραπευτική αντιμετώπιση της οστεοπόρωσης. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη RANKL επηρεάζει σημαντικά την ωρίμανση και ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος αφού ποντίκια ελλειματικά για το γονίδιο Rankl (Rankl KO mice) εκτός από οστεοπέτρωση εμφανίζουν υποπλασία στον θύμο, απουσία των λεμφαδένων και μείωση στον πληθυσμό των Β λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η περίσσεια της πρωτεΐνης RANKL επηρεάζει τους πληθυσμούς των λεμφικών οργάνων αλλά και τις φλεγμονώδεις ασθένειες των οστών, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα.Η ερευνητική ομάδα της Δρ Ε. Ντούνη, έχει δημιουργήσει στο παρελθόν δύο διαγονιδιακά πρότυπα οστεοπόρωσης (TgRANKL) που υπερπαράγουν την ανθρώπινη RANKL (huRANKL) πρωτεΐνη, το Tg5516 και το Tg5519, χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής. Το πρώτο αποτελεί πρότυπο ήπιας οστεοπόρωσης, ενώ το το δεύτερο πρότυπο σοβαρής οστεοπόρωσης, παράγοντας την πρωτεΐνη RANKL σε χαμηλά ή σε υψηλά επίπεδα, αντίστοιχα. Η ίδια ομάδα έχει επίσης δημιουργήσει με τυχαία μεταλλαξογένεση ποντίκια τα οποία φέρουν μία λειτουργική μετάλλαξη στο γονίδιο Rankl και αποτελούν πρότυπο οστεοπέτρωσης (RANKLtles/tles). Τα ζωικά αυτά πρότυπα, αποτελούν άριστα εργαλεία για να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης RANKL στο ανοσοποιητικό σύστημα αλλά και σε φλεγμονώδεις ασθένειες.Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε: α) εάν η υπερέκφραση του Rankl γονιδίου επηρεάζει την ωρίμανση των λευκοκυττάρων στα πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα, με σκοπό την κατανόηση των οστεοανοσολογικών αλληλεπιδράσεων σε συνθήκες οστεοπόρωσης, με τη χρήση των προτύπων οστεοπόρωσης (TgRANKL ποντίκια : Tg5519 και Τg5516),β) ο ρόλος της πρωτεΐνης RANKL στην φλεγμονώδη αρθρίτιδα, όπου με κατάλληλες διασταυρώσεις, επιτεύχθηκε η απενεργοποίηση του Rankl (RANKLtles/tles) ή η υπερέκφραση του huRANKL (TgRANKL) στο ΤΝF-εξαρτώμενο διαγονιδιακό πρότυπο αρθρίτιδας (TghuTNF, διαγονιδιακή σειρά ποντικιών Τg197) μελετώντας τους απογόνους (Τg197/ RANKLtles/tles, Tg197/Tg5516, Tg197/Tg5519) και τα αντίστοιχα ποντίκια ελέγχου, σε κλινικό, ιστοπαθολογικό, ανοσολογικό και οστικό επίπεδο, γ) το πρωτεϊνικό προφίλ της αρθρίτιδας που εμφανίζεται σε ποντίκια της ίδιας τοκετομάδας που υπερεκφράζουν huTNF και huRANKL (διπλά διαγονιδιακά, Tg197/Tg5519) σε σχέση με τα αρθριτικά που υπερεκφράζουν μόνο huTNF (Τg197) αλλά και τα οστεοπορωτικά που εκφράζουν μόνο huRANKL (Τg5519), προκειμένου να διερευνηθούν οι παθογενετικοί μηχανισμοί που επάγονται μέσω της υπερέκφρασης του Rankl σε φλεγμονώδεις ασθένειες.Η ανάλυση των λεμφικών οργάνων (μυελός των οστών, θύμος, σπλήνα και περιφερικό αίμα) με κυτταρομετρία ροής έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των Τg5519 και των αγρίου τύπου (Wild Type, WT) ποντικιών. Συγκεκριμένα, η ανάλυση του μυελού των οστών στα Τg5519 ποντίκια έδειξε μια σταδιακή μείωση του αριθμού των λευκοκυττάρων από τον 6o μήνα, εξαιτίας της αυξημένης λιπογένεσης στο μυελό των οστών που περιορίζει την αιμοποίηση. Επίσης, παρατηρήθηκε μια επιλεκτική αύξηση του ποσοστού των B λεμφοκυττάρων, υποδεικνύοντας μια πιθανή επιτάχυνση στην ωρίμανση τους. Στο θύμο, αν και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον συνολικό αριθμό των θυμοκυττάρων, ωστόσο ο πληθυσμός των ανώριμων διπλών θετικών CD4+CD8+ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένος, ενώ οι πληθυσμοί των ώριμων CD4+ και CD8+ ήταν αυξημένοι, κάτι που μπορεί να οφείλεται σε επιτάχυνση της διαδικασίας διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων στα Tg5519 ποντίκια. Η ανάλυση του σπλήνα έδειξε σημαντική μείωση των λευκοκυττάρων στην ηλικία των 8 μηνών, ως αποτέλεσμα της μειωμένης αιμοποίησης στον μυελό των οστών. Ωστόσο, σε νεότερες ηλικίες τα Tg5519 ποντίκια παρουσιάζουν μια σημαντική αύξηση στον πληθυσμό των Β λεμφοκυττάρων στον σπλήνα, κάτι που συμφωνεί με την ανάλυση του μυελού των οστών. Στο περιφερικό αίμα παρατηρείται επίσης σημαντική μείωση των λευκοκυττάρων στους 8 μήνες. Όσον αφορά την ανοσολογική ανάλυση της διαγονιδιακής σειράς Tg5516, αντίστοιχη ανάλυση με της διαγονιδιακής σειράς Tg5519 στην ηλικία των 6 μηνών, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στα λευκοκύτταρα των λεμφικών ιστών σε σχέση με τα ποντίκια αγρίου τύπου, κάτι που σχετίζεται με την μικρότερη έκταση λιπογένεσης στον μυελό των οστών των Tg5516 ποντικιών. Στο δεύτερο μέρος των μελετών εξετάστηκε αν η εκφυλιστική πρόοδος της TNF-εξαρτώμενης φλεγμονώδους αρθρίτιδας, επηρεάζεται από την γενετική απενεργοποίηση ή υπερέκφραση του Rankl. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική ύφεση της αρθρίτιδας στο TghuTNF ποντίκι απουσία λειτουργικής RANKL πρωτεΐνης, μέσω διασταυρώσεων με τα οστεοπετρωτικά ποντίκια (TghuTNF/ RANKLtles/tles), τόσο σε κλινικό επίπεδο με την δραματική μείωση των κλινικών συμπτωμάτων της αρθρίτιδας, όσο και ιστοπαθολογικά με την σημαντική μείωση της υπερπλασίας του αρθρικού υμένα και της φλεγμονής. Επιπλέον, μολονότι φάνηκε ότι η πρωτεΐνη RANKL είναι απαραίτητη για την φυσιολογική οστική αναδόμηση αλλά και την οστική καταστροφή που επάγεται από την φλεγμονή, η υπερέκφραση του huTNF δεν διέσωσε τον RANKL-εξαρτώμενο οστεοπετρωτικό φαινότυπο, προώθησε όμως τη δημιουργία περιορισμένων οστεοκλαστών στα σημεία επαφής οστού και φλεγμονής. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την ύπαρξη in vivo RANKL-ανεξάρτητων μηχανισμών οστεοκλαστογένεσης στις φλεγμονώδεις αρθρώσεις. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση huRANKL σε φλεγμονώδη TNF-εξαρτώμενη αρθρίτιδα, σε ποντίκια Τg197/Tg5519 ή Τg5516, επιτάχυνε την έναρξη της αρθρίτιδας και επιδείνωσε τον αρθριτικό φαινότυπο όπως αποδείχθηκε από εκτεταμένη υπερπλασία του αρθρικού υμένα, αύξηση του οστικού εκφυλισμού, και μαζική συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων, κυρίως της μυελικής σειράς σε σύγκριση με την εμφάνιση της νόσου στα TghuTNF ποντίκια. Η ανάλυση των οστών με microCT έδειξε επίσης ότι RANKL και TNF δρουν συνεργιστικά στην οστική καταστροφή, όχι μόνο τοπικά στην περιοχή της φλεγμονώδους ποδοκνημικής άρθρωσης αλλά και συστημικά στα μηριαία οστά. H πρωτεομική ανάλυση στις φλεγμονώδεις αρθρώσεις των Tg197/Tg5519 ποντικιών με φασματομετρία μάζας έδειξε εμπλουτισμό για πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην οστεοκλαστογένεση, σε προφλεγμονώδεις διεργασίες, στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σε σχέση αυτές με των ποντικιών ελέγχου Tg197 και Τg5519. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη RANKL τροποποιεί την TNF-εξαρτώμενη φλεγμονώδη αρθρίτιδα στο Tg197 πρότυπο, όχι μόνο προωθώντας την οστεοκλαστογένεση και την οστική απορρόφηση αλλά επηρεάζοντας και τη φλεγμονή και την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Συνεπώς, είναι πιθανό μια διπλή αναστολή των πρωτεϊνών RANKL και TNF να προσφέρει καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα στην Ρευματοειδή Αρθρίτιδα σε σχέση με τις υπάρχουσες θεραπείες αφού θα στόχευε ταυτόχρονα φλεγμονή και οστική καταστροφή.