Μοριακή μελέτη γονιδίων και πρωτεϊνών του εμβρύου και του πλακούντα σε καρκίνο μαστού
Authors: Κωσταδήμα Φερενίκη-Λήδα 
Published: June 2022

Ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος που εμφανίζεται στις γυναίκες . Παρά την πρόοδο που έχει πραγματοποιηθεί τα τελευταία χρόνια στην αντιμετώπισή του, σχεδόν οι μισές ασθενείς που διαγιγνώσκονται με πρώιμο καρκίνο του μαστού θα υποτροπιάσουν και θα καταλήξουν από τη νόσο. Η δημιουργία μεταστάσεων είναι μία πολύπλοκη διαδικασία και τα τελευταία χρόνια η βασική έρευνα προσπαθεί να αναγνωρίσει γονίδια καταστολής της μετάστασης που δεν σχετίζονται με ην ανάπτυξη του πρωτοπαθούς όγκου.Μεταστίνη (KiSS-1)Υπόβαθρο: Το KiSS-1 είναι γονίδιο καταστολής της μετάστασης και η αδρανοποίηση του οδηγεί σε εμφάνιση καρκίνου προχωρημένου σταδίου καθώς και χειρότερη πρόγνωση για τις ασθενείς. Μελετήσαμε την ύπαρξη μεταλλάξεων του γονιδίου, την μεταγραφή του και την έκφραση της πρωτεΐνης του KiSS-1σε καλλιέργειες ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και δείγματα καρκίνου ασθενών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία:DNA και mRNA από τα εξόνια ΙΙΙ και ΙV του KiSS-1 προερχόμενο από τις καλλιέργειες ανθρώπινων καρκινικών σειρών και από βιοπτικά δείγματα μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη 50 ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού αναλύθηκαν με τις μεθόδους PCR- SSCP, RT-PCR και αλληλούχισης. Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός για την αξιολόγηση της έκφρασης της πρωτεΐνης KiSS-1 με ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα για τη μεταστίνη συνδεδεμένο με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη. Η παρουσία μεταλλάξεων του KiSS-1 γονιδίου, η μεταγραφή του και η ανοσοϊστοχημική έκφραση έγινε προσπάθεια να συσχετιστούν με τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών και μοριακών δεικτών του όγκου. Επιπλέον από δείγματα ιστού σε τομές παραφίνης 272 γυναικών που έπασχαν από καρκίνο του μαστού σταδίου ΙΙ ή και ΙΙΙ με θετικούς λεμφαδένες μασχάλης πραγματοποιήθηκε εξαγωγή mRNA του γονιδίου του KiSS-1 εξόνιο Ι/ΙΙ. Επίσης έγινε προσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA του KiSS-1 με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Μια υποκατάσταση/ αντικατάσταση της κυτοσίνης σε γουανίνη (P81R), 242 ζεύγη βάσεων από την έναρξη της μετάφρασης (242 C>G), η οποία προκαλεί αλλαγή της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης αναγνωρίστηκε στις κυτταρικές σειρές MCF-7, A549 και σε 5/50 δείγματα των όγκων (10%). Καθώς η αντικατάσταση αναγνωρίστηκε στη γαμετική σειρά 3/5 γυναικών που έφεραν τη σωματική μετάλλαξη, προκύπτει ότι η συχνότητα εμφάνισης της σωματικής μετάλλαξης του γονιδίου KiSS-1 στους όγκους των 50 ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού είναι 4%. Αν και η P81R αντικατάσταση φαίνεται ότι συσχετίζεται με τη μειωμένη ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης του KiSS-1 και με τον αυξημένο αριθμό διηθημένων λεμφαδένων μασχάλης, η στατιστική ανάλυση αυτών απέτυχε να αναδείξει στατιστικά σημαντικό συσχετισμό.Το mRNA του KiSS-1 γονιδίου αναδείχθηκε στα 15/48 των δειγμάτων και δεν υπήρξε κάποια συσχέτιση με την ύπαρξη μετάλλαξης ή την έκφραση της πρωτεΐνης.26 δείγματα είχαν θετική ανοσοϊστοχημική χρώση, σε αντίθεση με την ισχυρά κυτταροπλασματική χρώση που εμφανίζεται στο φυσιολογικό παρέγχυμα του μαστού και τους ιστούς του πλακούντα.Σε ένα μέσο διάστημα παρακολουθούσης 38 μηνών το 20% των γυναικών με μετάλλαξη στο KiSS-1 εμφάνισαν υποτροπή νόσου έναντι του 13% των γυναικών που δεν έφεραν τη μετάλλαξη. Η παρουσία μετάλλαξης του KiSS-1, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης δεν συσχετίζονται με το διάστημα επιβίωσης χωρίς υποτροπή. Στην ομάδα επικύρωσης μόνο 8/272 (3%) από τα δείγματα των όγκων παρουσίαζαν ανιχνεύσιμο mRNA του KiSS-1. Δεν υπήρξε καμία συσχέτιση της μεταγραφής του KiSS-1 με τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων, το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου, την έκφραση των ορμονικών υποδοχέων και το μέγεθος του όγκου.Από τις γυναίκες που εμφάνιζαν υψηλά επίπεδα του KiSS-1 mRNA το 87,5% ήταν μετεμμηνοπαυσιακές ενώ από τις γυναίκες που δεν είχαν μετρήσιμα επίπεδα του KiSS-1 mRNA μόνο το 48% αυτών ήταν μετεμμηνοπαυσιακές. Δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση της μεταγραφής του KiSS-1 με τη μεταγραφή των παρακάτω μορίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου: HER2, VEGF, p53, BCL2, PAEP και BIRC5. Με μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, φάνηκε ότι δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά όσο αφορά στην ολική επιβίωση και στην επιβίωση ελεύθερης νόσου μεταξύ των γυναικών που εμφάνιζαν ή όχι έκφραση του KiSS-1 Γλυκοδελίνη (PAEP) Υπόβαθρο: η Γλυκοδελίνη είναι πολυπεπτίδιo που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στην απόπτωση και την αγγειογένεση. Υπάρχουν αντιφατικά βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με το λειτουργικό της ρόλο στους καρκινικούςιστούς, για το λόγο αυτό μελετήσαμε τη μεταγραφή της στον πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία: Με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCRmRNA Γλυκοδελίνης απομονώθηκε από μονιμοποιημένα δείγματα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, 272 γυναικών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Υπολογίσθηκε και κανονικοποιήθηκε η έκφρασή της με βάση των διαχειριστικών γονιδίων GAPDH, RPL37A και έγινε προσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA της με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Συνολικά μελετήθηκαν 272 γυναίκες με σταδίου ΙΙΙ καρκίνο του μαστού (θετικοί λεμφαδένες μασχάλης και όγκοι > 2εκ). Το mRNA της Γλυκοδελίνης εκφράζονταν σε 68 ασθενείς (25%), η πλειοψηφία των οποίων ήταν προεμμηνοπαυσιακές και σε έκφραση του HER2 mRNA. Σε μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, δεν ανεδείχθκε καμία προγνωστική της σημασία για τη συνολική επιβίωση ή για την επιβίωση ελεύθερη νόσου σε μονοπαραγοντική ή πολυπαραγοντική ανάλυση.Επιβιωτίνη (BIRC5)Υπόβαθρο: η Επιβιωτίνη είναι πολυπεπτίδιo που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στην απόπτωση και την αγγειογένεση. Υπάρχουν αντιφατικά βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με το λειτουργικό της ρόλο στους καρκινικούς ιστούς, για το λόγο αυτό μελετήσαμε τη μεταγραφή της στον πρώιμο καρκίνο του μαστού.Υλικό και Μεθοδολογία: Με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCRmRNA Επιβιωτίνης απομονώθηκε από μονιμοποιημένα δείγματα σε φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, 272 γυναικών που διαγνώσθηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Υπολογίσθηκε και κανονικοποιήθηκε η έκφρασή της με βάση των διαχειριστικών γονιδίων GAPDH, RPL37A και έγινεπροσπάθεια να συσχετιστεί το mRNA της με την έκβαση των ασθενών, καθώς και με τη νόσο ή με μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου.Αποτελέσματα: Συνολικά μελετήθηκαν 272 γυναίκες με σταδίου ΙΙΙ καρκίνο του μαστού (θετικοί λεμφαδένες μασχάλης και όγκοι > 2 εκ). Σε 263 γυναίκες (97%) εκφράζονταν η επιβιωτίνη και συσχετίστηκε με υψηλό βαθμό πυρηνικής ατυπίας, με την έκφραση mRNA του VEGFκαι την έκφραση mRNA του p53.Όμως, εκτεταμένη βιοπληροφορική ανάλυση σε δημόσιες βάσεις δεδομένων σε συνάρτηση με τα αποτελέσματα μας ανέδειξε τα ακόλουθα: (α) Η επιβιωτίνη εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε πρωτοπαθείς όγκους μαστού σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα μαστού.(β) Όγκοι με διαστάσεις μεγαλύτερες των 2 εκ (Τ2) απέδωσαν υψηλότερα επίπεδα mRNA της επιβιωτίνης, αν και η παραπάνω συσχέτιση παρουσίασε μόνο μια τάση στατιστικής σημαντικότητας (p = 0,07).Η έκφραση της επιβιωτίνης φαίνεται ότι αυξάνεται με την πρόοδο της νόσου από το στάδιο Ι στο στάδιο IV στον καρκίνο του μαστού.(γ) Όγκοι μαστού με μεταλλαγμένο TP53 εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της επιβιωτίνης σε σχέση με όγκους του μαστού που δεν φέρουν τη μετάλλαξη ή σε σχέση με φυσιολογικά δείγματα μαστού.(δ) Σε μια μέση περίοδο παρακολούθησης 62 μηνών, δεν ανεδείχθηκε καμία προγνωστική της σημασία για τη συνολική επιβίωση ή για την επιβίωση ελεύθερη νόσου σε μονοπαραγοντική ή πολυπαραγοντική ανάλυση. Βέβαια, η βιοπληροφορική ανάλυση μας σε βάσεις δεδομένων που έχουν περισσότερα δείγματα κατέδειξε ότι οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα επιβιωτίνης έχουν χαμηλότερη ολική επιβίωση. (ε) Η ανάλυση με παλινδρόμηση πολλαπλών παραλλαγών Cox αποκάλυψε ότι η παρουσία του mRNA της επιβιωτίνης (p> 0,05), με υψηλό αριθμό θετικών λεμφαδένων και με αρνητική έκφραση ορμονικών υποδοχέων έχει δυσμενή πρόγνωση για τις ασθενείς. Αυτό επιβεβιαώθηκε και από βιοπληροφορική ανάλυση σε δημόσιες βάσεις δεδομένων, και κατέδειξε ότι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα επιβιωτίνης ανταποκρίνονται αποτελεσματικότερα στη χημειοθεραπεια.Τα αποτελέσματα συνολικά καταδεικνύουν ότι απαιτούνται περισσότερες μελέτες προκειμένου να διευκρινιστεί ο ρόλος της επιβιωτίνης στην καρκινογένεση του μαστού.