Η χρήση της μεταβολονομικής στη διερεύνηση των νεφρικών παθήσεων
Authors: Ψυχογιός Νικόλαος 
Published: August 2021

Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (¹Η-NMR) των ούρων είναι μία μη επεμβατική τεχνική με την οποία καταγράφεται το σύνολο των απεκκρινόμενων μεταβολιτών μικρού μοριακού βάρους σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Η τεχνική αυτή προσφέρει δηλαδή μια αποτύπωση του μεταβολικού προφίλ των ούρων, το οποίο αποτελεί ένα σύνολο πολυμεταβλητών δεδομένων (multivariate dataset). Η ανάλυση των δεδομένων αυτών μπορεί να βελτιστοποιηθεί με τη χρήση κατάλληλων τεχνικών στατιστικής επεξεργασίας δεδομένων, όπως είναι οι τεχνικές αναγνώρισης προτύπων (pattern recognition). Η ανάλυση αυτή εντάσσεται στα πλαίσια της Μεταβονομικής (Metabonomics), η οποία είναι ένα σύστημα στατιστικής επεξεργασίας του συνολικού προφίλ των μεταβολιτών που ανιχνεύονται στα βιολογικά υγρά και το οποίο αντανακλά τόσο φυσιολογικές καταστάσεις, όσο και την απόκριση του οργανισμού σε παθολογικές οντότητες ή τοξικές επιδράσεις. Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιείται για πρώτη φορά με βάση τη φασματοσκοπία ¹H-NMR μια μεταβονομική προσέγγιση ανάλυσης του μεταβολικού προφίλ των ούρων, αφενός ενός υγιούς ελληνικού πληθυσμού και αφετέρου ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, οι οποίοι παρουσίαζαν ιστοπαθολογικά τεκμηριωμένες αλλοιώσεις του σωληναριοδιάμεσου ιστού ήπιου, μέτριου και σοβαρού βαθμού. Αρχικά προτείνεται και αναπτύσσεται μια μεθοδολογία για την ανάλυση των πολυμεταβλητών δεδομένων NMR και αξιολογούνται διάφορες τεχνικές όσον αφορά την προετοιμασία των δειγμάτων, τη λήψη των φασμάτων και την επεξεργασία των δεδομένων. Στη συνέχεια, διερευνάται η επίδραση του φύλου και της ηλικίας των υγιών ατόμων στο μεταβολικό προφίλ των ούρων και παράλληλα προσδιορίζονται οι τιμές αναφοράς των κυριότερων απεκκρινόμενων μεταβολιτών. Ο κύριος στόχος όμως της εργασίας είναι η συσχέτιση των ιστοπαθολογικά τεκμηριωμένων αλλοιώσεων του σωληναριοδιάμεσου ιστού με το μεταβολικό προφίλ των ούρων ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, βάσει της ¹Η-NMR μεταβονομικής. Συγκεκριμένα, εφαρμόζονται οι τεχνικές Principal Components Analysis (PCA), Partial Least-Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) και Orthogonal Signal Correction (OSC). Το πρώτο στάδιο της εφαρμογής των τεχνικών αναγνώρισης προτύπων αφορούσε τη μελέτη του συνολικού μεταβολικού προφίλ των ούρων ενός δείγματος 122 υγιών ατόμων, από την οποία προέκυψαν δυο στατιστικά μοντέλα ικανά να προβλέψουν ορθά το φύλο και την ηλικία αυτών. Αρχικά μέσω της τεχνικής PCA, έγινε μια γενική επισκόπηση των πολυμεταβλητών δεδομένων, με σκοπό την δημιουργία ενός συγκροτημένου συνόλου δειγμάτων και την αξιολόγηση της ομοιογένειας του πληθυσμού. Η ανάλυση με την τεχνική αυτή έδειξε μία αδρή τάση διαχωρισμού μεταξύ ανδρών και γυναικών και μεταξύ ατόμων ηλικίας κάτω των 35 ετών και άνω των 50 ετών. Η ανάλυση PLS-DA επέφερε έναν πιο ευδιάκριτο διαχωρισμό με σημαντικό βαθμό όμως αλληλοεπικάλυψης, ενώ η αποτελεσματική ελαχιστοποίηση της διατομικής μεταβλητότητας με την εφαρμογή της τεχνικής OSC, κατέδειξε μια σαφή διάκριση μεταξύ των ομάδων φύλου και ηλικίας. Με τον συνδυασμό των τεχνικών OSC και PLS-DA πρόεκυψαν στατιστικά μοντέλα που μπόρεσαν να προβλέψουν με απόλυτη επιτυχία, μέσω διαδικασιών εσωτερικής αξιολόγησης, το φύλο και την ηλικία (> 50 και < 35 ετών) για επίπεδο εμπιστοσύνης > 95%. Παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα της κρεατινίνης, του τριμεθυλο-Ν-αμινοξειδίου (ΤΜΑΟ), της ταυρίνης και σε μικρότερο βαθμό του 3-υδροξυβουτυρικού οξέος εντοπίστηκαν σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα στους άνδρες, ενώ τα επίπεδα του κιτρικού οξέος, της κρεατίνης, της γλυκίνης και σε μικρότερο βαθμό της φαινυλαλανίνης εντοπίστηκαν σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα στις γυναίκες. Αντίστοιχα φάνηκε ότι τα επίπεδα απέκκρισης του ΤΜΑΟ και του κιτρικού οξέος ήταν υψηλότερα στα άτομα ηλικίας > 50 ετών, ενώ τα επίπεδα της κρεατινίνης και του ιππουρικού οξέος ήταν χαμηλότερα στα άτομα ηλικίας < 35 ετών. Έγινε επίσης ποσοτικοποίηση των κυριοτέρων απεκκρινόμενων μεταβολιτών που ανιχνεύονται με την ¹Η-NMR φασματοσκοπία και για πρώτη φορά στον ελληνικό πληθυσμό προσδιορίστηκαν τιμές αναφοράς και διαστήματα εμπιστοσύνης για τα δυο φύλα καθώς και για άτομα ηλικίας > και ≤ 45 ετών. Σε δεύτερο στάδιο, η ¹Η-NMR μεταβονομική ανάλυση των ούρων 77 ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα συσχετίσθηκε με τη σοβαρότητα της νεφρικής βλάβης, όσον αφορά τις αλλοιώσεις του σωληναριοδιάμεσου ιστού βάσει των ιστοπαθολογικών ευρημάτων. Τα μεταβολικά προφίλ των ούρων των ασθενών παρουσίασαν σε κάθε ένα από τα τρία στάδια της νόσου (ήπια, μέτρια και σοβαρή νεφρική βλάβη) σαφείς διαφορές από τα αντίστοιχα προφίλ των υγιών. Οι αλλοιώσεις αυτές ήταν πιο εμφανείς στην ομάδα των ασθενών με σοβαρή νεφρική νόσο, αντανακλώντας την έκταση της βλάβης στα εγγύς σωληνάρια ή/και στο σωληναριοδιάμεσο ιστό, βάσει της κατάταξης που καθόρισε η ιστοπαθολογική διάγνωση. Παρατηρήθηκε ότι το αρχικό στάδιο των σωληναριοδιάμεσων αλλοιώσεων χαρακτηρίζεται από μειωμένη απέκκριση κιτρικού και ιππουρικού οξέος, γλυκίνης και κρεατινίνης. Περαιτέρω επιδείνωση οδηγεί σε πλήρη αναστολή της απέκκρισης κιτρικού και ιππουρικού οξέος, σε μειωμένη απέκκριση γλυκίνης, σε γλυκοζουρία και επιλεκτική αμινοξουρία (αυξημένη απέκκριση αλανίνης, ιστιδίνης και φαινυλαλανίνης), καθώς και σε σταδιακή αύξηση της απέκκρισης γαλακτικού και οξικού οξέος καθώς και ΤΜΑΟ. Η εφαρμογή των τεχνικών αναγνώρισης προτύπων επέτρεψε μια σαφή διαφοροποίηση όχι μόνο μεταξύ των ομάδων υγιών και ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, αλλά και μεταξύ των επιμέρους υποομάδων των ασθενών. Η τεχνική PCA ανέδειξε μια αδρή τάση διαφοροποίησης, ενώ η τεχνική PLS-DA μια ισχυρή τάση διαχωρισμού μεταξύ των δυο ομάδων. Η ελαχιστοποίηση της διατομικής μεταβλητότητας μέσω της εφαρμογής της τεχνικής OSC, συνετέλεσε στη δημιουργία στατιστικών μοντέλων που έδειξαν έναν σαφή και στατιστικά σημαντικό διαχωρισμό μεταξύ υγιών και ασθενών. Τα στατιστικά αυτά μοντέλα ήταν σε θέση να προβλέψουν την παρουσία νεφρικής βλάβης με ευαισθησία 96% και ειδικότητα 99% για επίπεδο εμπιστοσύνης > 95%. Οι ασθενείς με αλλοιώσεις ήπιου, μέτριου και σοβαρού βαθμού διαφοροποιήθηκαν σταδιακά από τα υγιή άτομα. Με την περεταίρω σύγκριση μεταξύ των επιμέρους υποομάδων των ασθενών, πρόεκυψαν μοντέλα OSC/PLS- DA που έδειξαν στατιστικά σημαντικό διαχωρισμό μεταξύ αυτών με ήπια και σοβαρή νεφρική βλάβη, καθώς και μια υψηλή ικανότητα πρόβλεψης της σοβαρότητας της νόσου. Κατά τη σύγκριση μεταξύ των υποομάδων μέτριας - ήπιας και μέτριας - σοβαρής βλάβης, ο διαχωρισμός ήταν εμφανής αλλά όχι στατιστικά σημαντικός. Η συνύπαρξη σωληναριοδιάμεσων αλλοιώσεων στη σπειραματονεφρίτιδα παίζει καθοριστικό προγνωστικό ρόλο στην εξέλιξη της σπειραματικής νεφρικής νόσου. Στα κρίσιμο αυτό σημείο, φαίνεται ότι η μεταβονομική ανάλυση της σύστασης των ούρων βάσει της φασματοσκοπίας NMR, ως μια γρήγορη και μη επεμβατική αναλυτική τεχνική, μπορεί να συμβάλει αφενός μεν στην έγκαιρη εκτίμηση της σοβαρότητας της νεφρικής βλάβης, αφετέρου δε στην παρακολούθηση της νεφρικής λειτουργίας. Τα αποτελέσματα της μεταβονομικής μελέτης τόσο των υγιών όσο και των ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, μπορούν να συμβάλουν στην προσπάθεια που καταβάλλεται για την πλήρη καταγραφή του μεταβολικού προφίλ των βιολογικών υγρών του ανθρώπου στα πλαίσια του Human Metabolome Project (http://www.metabolomics.ca/index.htm). Το ερευνητικό αυτό πρωτόκολλο έχει ως στόχο την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση όλων των ανιχνεύσιμων μεταβολιτών (> 1μΜ) του ανθρωπίνου οργανισμού και έχει οδηγήσει στην δημιουργία της πληρέστερης αυτή τη στιγμή τράπεζας μεταβολομικών δεδομένων στον κόσμο. Η παρούσα εργασία υπογραμμίζει επίσης την «επιτακτική ανάγκη» που εξέφρασε η Αμερικανική Εταιρεία Νεφρολογίας το 2004 για την ενσωμάτωση της μεταβολομικής στην έρευνα των νεφρικών παθήσεων, ιδιαίτερα στη στρατηγική αναζήτησης βιολογικών δεικτών για την διαβητική νεφροπάθεια (American Society of Nephrology, 2005).