La inflamación de la vía aérea aumenta la liberación de ATP mediada por canales de PANX1 y hemicanales de CX, produciendo hiperreactividad y alteraciones de la actividad ciliar y del clearance mucociliar
Authors:   ,   Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas, Arzola Martínez Llilian 
Published: April 2023

El asma es una enfermedad crónica obstructiva pulmonar que se caracteriza por hiperreactividad de la vía aérea (AHR) e inflamación. El epitelio respiratorio participa en el inicio y progresión de esta patología al ser el primer sitio de contacto con alérgenos. Está compuesto de dos tipos principales de células, las productoras de moco y las ciliadas, las cuales actúan de forma coordinada para remover de la vía aérea los patógenos, toxinas, y otras partículas, a través del “clearance mucociliar” (CM). La velocidad y efectividad del CM depende de la frecuencia de batido ciliar (FBC), que se modifica en respuesta a señales químicas y mecánicas, y de las propiedades reológicas del moco, ambas reguladas por la concentración de ATP extracelular y sus productos de degradación. Los pacientes asmáticos tienen un CM disminuido y elevadas concentraciones de ATP en el lavado broncoalveolar, sin embargo, aún no se ha establecido la relación entre ambos parámetros. El ATP tiene una acción autocrina/paracrina en la cascada inflamatoria, y además es un potente broncoconstrictor. Este nucleótido es liberado al medio extracelular a través de los mecanismos vesicular y conductivo. Este último incluye los canales de panexina (Panx) y hemicanales de conexina (Cx). Condiciones inflamatorias pueden modificar el estado de apertura de estos canales, así como su presencia en la membrana. Sin embargo, aún es necesario comprender la participación de estos canales en la respuesta inflamatoria y el aumento de la resistencia de la vía aérea que caracterizan la patología asmática. Teniendo en cuenta los antecedentes anteriores, medimos los niveles de ATP extracelular asociados a la inflamación de la vía aérea, y determinamos su efecto sobre la fisiología del epitelio ciliado, así como la expresión/funcionalidad y el rol de los canales que vinculados a la liberación del ATP en un modelo de ratón asmático sensibilizado a OVA. Se utilizó un protocolo de inmunización activa en ratones para recrear la respuesta inflamatoria que ocurre en humanos con asma atópica. Nuestro modelo ratón asmático desarrolló hiperreactividad de la vía aérea ante metacolina e inflamación pulmonar, caracterizada por un aumento en la expresión de citoquinas proinflamatorias Th2, así como infiltración de células inmunes y acumulación de moco en el parénquima pulmonar. Empleando un ensayo luminométrico se midió la concentración de ATP extracelular en el fluido traqueal de los ratones, encontrándose elevada en los animales sensibilizados a OVA. Nosotros planteamos que este parámetro podría ser utilizado en la caracterización de la patología asmática en ratones. Las propiedades mecánicas son fundamentales para el mantenimiento e integridad funcional del epitelio respiratorio. Se comparó la liberación de ATP por el epitelio traqueal de ratones controles y asmáticos ante un estímulo mecánico, concluyendo que el rango de respuesta del epitelio a un estímulo mecánico disminuye en los ratones sensibilizados a OVA. La actividad ciliar, medida por video-microscopía, ante un estímulo químico y mecánico también disminuye con el incremento de la concentración extracelular de un análogo estable de ATP, como fue comprobado en cultivos de epitelio de tráquea murina. Además, la velocidad del transporte de microesferas en la tráquea ex vivo obtenida a partir del análisis de secuencias de fotos y utilizada como una medida del CM, se encontró disminuida en los ratones sensibilizados a OVA. El efecto dual del ATP extracelular dependiente su concentración sobre la FBC, también puede ser extrapolado para el CM. Por tanto, una elevada concentración de ATP extracelular tiene un efecto deletéreo sobre el mecanismo básico de defensa de la vía aérea. Se comprobó por RT-PCR la expresión de Panx1 y Cx43 en el epitelio traqueal y en el parénquima pulmonar murino. El Western blot para la Panx1 en el parénquima pulmonar arrojó un mayor grado de glicosilación en los ratones sensibilizados a OVA, lo que se relaciona a una mayor translocación del canal a la membrana plasmática. Además, en los ratones alérgicos se midió un aumento en la captación de bromuro de etidio, lo que se relaciona a un incremento en la funcionalidad de los canales los formados por Cx43 y Panx1 en condiciones inflamatorias de la vía aérea. Esto podría explicar la mayor concentración de ATP extracelular medida en la vía aérea inflamada. La administración del inhibidor inespecífico carbenoxolona (CBX, 100 µM) y el péptido inhibitorio 10Panx (200 µM) disminuyeron la concentración de ATP en el fluido traqueal y lavado broncoalveolar de los ratones alérgicos, respectivamente. Además, el inhibidor 10Panx disminuyó la AHR en el modelo murino de la enfermedad, pero no tuvo efecto sobre otros indicadores de la inflamación del parénquima pulmonar. El inhibidor de hemicanales de Cx43, TATGap19 (55 µM) no tuvo efecto sobre la inflamación e hiperreactividad de la vía aérea, al menos a la concentración empleada. Esto indica a Panx1 como un blanco farmacológico prometedor para reducir la respuesta broncoconstrictora excesiva durante episodios de obstrucción del flujo de aire característicos de la patología asmática.El asma es una enfermedad crónica obstructiva pulmonar que se caracteriza por hiperreactividad de la vía aérea (AHR) e inflamación. El epitelio respiratorio participa en el inicio y progresión de esta patología al ser el primer sitio de contacto con alérgenos. Está compuesto de dos tipos principales de células, las productoras de moco y las ciliadas, las cuales actúan de forma coordinada para remover de la vía aérea los patógenos, toxinas, y otras partículas, a través del “clearance mucociliar” (CM). La velocidad y efectividad del CM depende de la frecuencia de batido ciliar (FBC), que se modifica en respuesta a señales químicas y mecánicas, y de las propiedades reológicas del moco, ambas reguladas por la concentración de ATP extracelular y sus productos de degradación. Los pacientes asmáticos tienen un CM disminuido y elevadas concentraciones de ATP en el lavado broncoalveolar, sin embargo, aún no se ha establecido la relación entre ambos parámetros. El ATP tiene una acción autocrina/paracrina en la cascada inflamatoria, y además es un potente broncoconstrictor. Este nucleótido es liberado al medio extracelular a través de los mecanismos vesicular y conductivo. Este último incluye los canales de panexina (Panx) y hemicanales de conexina (Cx). Condiciones inflamatorias pueden modificar el estado de apertura de estos canales, así como su presencia en la membrana. Sin embargo, aún es necesario comprender la participación de estos canales en la respuesta inflamatoria y el aumento de la resistencia de la vía aérea que caracterizan la patología asmática. Teniendo en cuenta los antecedentes anteriores, medimos los niveles de ATP extracelular asociados a la inflamación de la vía aérea, y determinamos su efecto sobre la fisiología del epitelio ciliado, así como la expresión/funcionalidad y el rol de los canales que vinculados a la liberación del ATP en un modelo de ratón asmático sensibilizado a OVA. Se utilizó un protocolo de inmunización activa en ratones para recrear la respuesta inflamatoria que ocurre en humanos con asma atópica. Nuestro modelo ratón asmático desarrolló hiperreactividad de la vía aérea ante metacolina e inflamación pulmonar, caracterizada por un aumento en la expresión de citoquinas proinflamatorias Th2, así como infiltración de células inmunes y acumulación de moco en el parénquima pulmonar. Empleando un ensayo luminométrico se midió la concentración de ATP extracelular en el fluido traqueal de los ratones, encontrándose elevada en los animales sensibilizados a OVA. Nosotros planteamos que este parámetro podría ser utilizado en la caracterización de la patología asmática en ratones. Las propiedades mecánicas son fundamentales para el mantenimiento e integridad funcional del epitelio respiratorio. Se comparó la liberación de ATP por el epitelio traqueal de ratones controles y asmáticos ante un estímulo mecánico, concluyendo que el rango de respuesta del epitelio a un estímulo mecánico disminuye en los ratones sensibilizados a OVA. La actividad ciliar, medida por video-microscopía, ante un estímulo químico y mecánico también disminuye con el incremento de la concentración extracelular de un análogo estable de ATP, como fue comprobado en cultivos de epitelio de tráquea murina. Además, la velocidad del transporte de microesferas en la tráquea ex vivo obtenida a partir del análisis de secuencias de fotos y utilizada como una medida del CM, se encontró disminuida en los ratones sensibilizados a OVA. El efecto dual del ATP extracelular dependiente su concentración sobre la FBC, también puede ser extrapolado para el CM. Por tanto, una elevada concentración de ATP extracelular tiene un efecto deletéreo sobre el mecanismo básico de defensa de la vía aérea. Se comprobó por RT-PCR la expresión de Panx1 y Cx43 en el epitelio traqueal y en el parénquima pulmonar murino. El Western blot para la Panx1 en el parénquima pulmonar arrojó un mayor grado de glicosilación en los ratones sensibilizados a OVA, lo que se relaciona a una mayor translocación del canal a la membrana plasmática. Además, en los ratones alérgicos se midió un aumento en la captación de bromuro de etidio, lo que se relaciona a un incremento en la funcionalidad de los canales los formados por Cx43 y Panx1 en condiciones inflamatorias de la vía aérea. Esto podría explicar la mayor concentración de ATP extracelular medida en la vía aérea inflamada. La administración del inhibidor inespecífico carbenoxolona (CBX, 100 µM) y el péptido inhibitorio 10Panx (200 µM) disminuyeron la concentración de ATP en el fluido traqueal y lavado broncoalveolar de los ratones alérgicos, respectivamente. Además, el inhibidor 10Panx disminuyó la AHR en el modelo murino de la enfermedad, pero no tuvo efecto sobre otros indicadores de la inflamación del parénquima pulmonar. El inhibidor de hemicanales de Cx43, TATGap19 (55 µM) no tuvo efecto sobre la inflamación e hiperreactividad de la vía aérea, al menos a la concentración empleada. Esto indica a Panx1 como un blanco farmacológico prometedor para reducir la respuesta broncoconstrictora excesiva durante episodios de obstrucción del flujo de aire característicos de la patología asmática.El asma es una enfermedad crónica obstructiva pulmonar que se caracteriza por hiperreactividad de la vía aérea (AHR) e inflamación. El epitelio respiratorio participa en el inicio y progresión de esta patología al ser el primer sitio de contacto con alérgenos. Está compuesto de dos tipos principales de células, las productoras de moco y las ciliadas, las cuales actúan de forma coordinada para remover de la vía aérea los patógenos, toxinas, y otras partículas, a través del “clearance mucociliar” (CM). La velocidad y efectividad del CM depende de la frecuencia de batido ciliar (FBC), que se modifica en respuesta a señales químicas y mecánicas, y de las propiedades reológicas del moco, ambas reguladas por la concentración de ATP extracelular y sus productos de degradación. Los pacientes asmáticos tienen un CM disminuido y elevadas concentraciones de ATP en el lavado broncoalveolar, sin embargo, aún no se ha establecido la relación entre ambos parámetros. El ATP tiene una acción autocrina/paracrina en la cascada inflamatoria, y además es un potente broncoconstrictor. Este nucleótido es liberado al medio extracelular a través de los mecanismos vesicular y conductivo. Este último incluye los canales de panexina (Panx) y hemicanales de conexina (Cx). Condiciones inflamatorias pueden modificar el estado de apertura de estos canales, así como su presencia en la membrana. Sin embargo, aún es necesario comprender la participación de estos canales en la respuesta inflamatoria y el aumento de la resistencia de la vía aérea que caracterizan la patología asmática. Teniendo en cuenta los antecedentes anteriores, medimos los niveles de ATP extracelular asociados a la inflamación de la vía aérea, y determinamos su efecto sobre la fisiología del epitelio ciliado, así como la expresión/funcionalidad y el rol de los canales que vinculados a la liberación del ATP en un modelo de ratón asmático sensibilizado a OVA. Se utilizó un protocolo de inmunización activa en ratones para recrear la respuesta inflamatoria que ocurre en humanos con asma atópica. Nuestro modelo ratón asmático desarrolló hiperreactividad de la vía aérea ante metacolina e inflamación pulmonar, caracterizada por un aumento en la expresión de citoquinas proinflamatorias Th2, así como infiltración de células inmunes y acumulación de moco en el parénquima pulmonar. Empleando un ensayo luminométrico se midió la concentración de ATP extracelular en el fluido traqueal de los ratones, encontrándose elevada en los animales sensibilizados a OVA. Nosotros planteamos que este parámetro podría ser utilizado en la caracterización de la patología asmática en ratones. Las propiedades mecánicas son fundamentales para el mantenimiento e integridad funcional del epitelio respiratorio. Se comparó la liberación de ATP por el epitelio traqueal de ratones controles y asmáticos ante un estímulo mecánico, concluyendo que el rango de respuesta del epitelio a un estímulo mecánico disminuye en los ratones sensibilizados a OVA. La actividad ciliar, medida por video-microscopía, ante un estímulo químico y mecánico también disminuye con el incremento de la concentración extracelular de un análogo estable de ATP, como fue comprobado en cultivos de epitelio de tráquea murina. Además, la velocidad del transporte de microesferas en la tráquea ex vivo obtenida a partir del análisis de secuencias de fotos y utilizada como una medida del CM, se encontró disminuida en los ratones sensibilizados a OVA. El efecto dual del ATP extracelular dependiente su concentración sobre la FBC, también puede ser extrapolado para el CM. Por tanto, una elevada concentración de ATP extracelular tiene un efecto deletéreo sobre el mecanismo básico de defensa de la vía aérea. Se comprobó por RT-PCR la expresión de Panx1 y Cx43 en el epitelio traqueal y en el parénquima pulmonar murino. El Western blot para la Panx1 en el parénquima pulmonar arrojó un mayor grado de glicosilación en los ratones sensibilizados a OVA, lo que se relaciona a una mayor translocación del canal a la membrana plasmática. Además, en los ratones alérgicos se midió un aumento en la captación de bromuro de etidio, lo que se relaciona a un incremento en la funcionalidad de los canales los formados por Cx43 y Panx1 en condiciones inflamatorias de la vía aérea. Esto podría explicar la mayor concentración de ATP extracelular medida en la vía aérea inflamada. La administración del inhibidor inespecífico carbenoxolona (CBX, 100 µM) y el péptido inhibitorio 10Panx (200 µM) disminuyeron la concentración de ATP en el fluido traqueal y lavado broncoalveolar de los ratones alérgicos, respectivamente. Además, el inhibidor 10Panx disminuyó la AHR en el modelo murino de la enfermedad, pero no tuvo efecto sobre otros indicadores de la inflamación del parénquima pulmonar. El inhibidor de hemicanales de Cx43, TATGap19 (55 µM) no tuvo efecto sobre la inflamación e hiperreactividad de la vía aérea, al menos a la concentración empleada. Esto indica a Panx1 como un blanco farmacológico prometedor para reducir la respuesta broncoconstrictora excesiva durante episodios de obstrucción del flujo de aire característicos de la patología asmática.