Ανάπτυξη και επικύρωση υπερ-ευαίσθητων συνοδών διαγνωστικών εξετάσεων στα πλαίσια της υγρής βιοψίας (κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα και ελεύθερο-κυττάρων DNA)
Authors: Τζανίκου Ελένη 
Published: September 2021

Τα τελευταία χρόνια, η προσέγγιση της "υγρής βιοψίας" (liquid biopsy) έρχεται να υπερκεράσει τους περιορισμούς της βιοψίας του όγκου αλλάζοντας σημαντικά τη θεραπευτική στρατηγική σε ασθενείς με καρκίνο. Η «υγρή βιοψία», βασισμένη στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (Circulating Tumor Cells, CTCs) και του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) παρέχει μία μη-επεμβατική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, σε πραγματικό χρόνο. Οι DNA μεταλλάξεις δημιουργούν ένα ξεχωριστό γενετικό προφίλ στον ασθενή και στο οποίο η εξατομικευμένη ιατρική στηρίζεται, ώστε να παρέχει τη σωστή θεραπεία στον ασθενή τη σωστή χρονική στιγμή.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά αξιολογήθηκε η παρουσία των PIK3CA μεταλλάξεων σε δείγματα ctDNA ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο μαστού χρησιμοποιώντας μια εξαιρετικά ευαίσθητη και αναλυτικά επικυρωμένη μεθοδολογία που βασίζεται στον συνδυασμό αλληλοειδικής ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης. Ακόμα, διεξήχθει άμεση σύγκριση της παρουσίας των PIK3CA μεταλλάξεων σε δείγματα DNA που απομονώθηκαν από CellSearch® cartridges και από το αντίστοιχο πλάσμα ασθενών με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο μαστού. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης επικυρώθηκαν με την μεθοδολογία της ddPCR, καταγράφοντας υψηλή συμφωνία μεταξύ των δυο μεθοδολογιών.Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν τέσσερις νέες μεθοδολογίες για την ανίχνευση των ESR1 μεταλλάξεων (Y537C, Y537N, Y537S, D538G) σε δείγματα υγρής βιοψίας. Η εν λόγω μεθοδολογία βασίζεται στον συνδυασμό αλληλοειδικής ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης. Η κλινική επικύρωση αυτών των προσδιορισμών πραγματοποιήθηκε σε δείγματα DNA που απομονώθηκαν από τα CTCs των CellSearch® cartridges ασθενών με μεταστατικό ER(+) καρκίνο μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ανίχνευση των ESR1 μεταλλάξεων σε υψηλό ποσοστό σε δείγματα στα οποία υπήρχαν ανιχνεύσιμα CTCs σύμφωνα με το σύστημα CellSearch®.Επιπρόσθετα, διεξήχθει άμεση σύγκριση των επιδόσεων δύο εξαιρετικά ευαίσθητων μεθοδολογιών, της ddPCR και ενός συνδυασμού αλληλοειδικής, ασύμμετρης PCR και ανάλυσης καμπυλών τήξης για την ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E στα ίδια δείγματα ctDNA πλάσματος σε ασθενείς με μελάνωμα. Η συνολική συμφωνία μεταξύ αυτών των δύο μεθοδολογιών ήταν πολύ υψηλή, υποδεικνύοντας ότι οι προσδιορισμοί δίνουν συγκρίσιμα αποτελέσματα για την αξιολόγηση του προφίλ της μετάλλαξης στο πλάσμα. Υψηλά ποσοστά συμφωνίας παρατηρήθηκαν όταν συγκρίθηκε η ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E στο πλάσμα χρησιμοποιώντας και τις δύο μεθόδους με την ιστική ανάλυση. Τα μισά από τα κλινικά δείγματα τα οποία ήταν BRAF V600E θετικά στα δείγματα ιστού, βρέθηκαν να είναι θετικά και στα αντίστοιχα δείγματα ctDNA πλάσματος για την ίδια μετάλλαξη. Είναι ενδιαφέρον ότι η εν λόγω μελέτη έδειξε μια επίπτωση στην ορθότητα των αποτελεσμάτων της ανάλυσης με βάση το πλάσμα στη διάρκεια της αποθήκευσης του δείγματος υπογραμμίζοντας την επίδραση των προ-αναλυτικών παραγόντων.Στο τελευταίο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και αξιολογήθηκε μια εξαιρετικά ευαίσθητη RT-qPCR μεθοδολογία για την mRNA έκφραση του γονιδίου PIM-1 σε EpCAM(+) κλάσμα περιφερικού αίματος ασθενών με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη (mCRPC). Η υπερέκφραση του PIM-1 σε EpCAM(+) κλάσμα ανιχνεύθηκε σε υψηλό ποσοστό. Τα δεδομένα μας δείχνουν για πρώτη φορά την υπερέκφραση του PIM-1 σε CTCs, καταδεικνύοντας τη χρήση αυτού του μορίου ως πιθανό βιοδείκτη για τη διαχείριση του καρκίνου του προστάτη. Περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων καθίσταται αναγκαία, προκειμένου να αποδειχτεί η κλινική χρησιμότητα του βιοδείκτη.