Μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού WNT στην καρκινογένεση
Authors: Ζούγρος Αλέξανδρος 
Published: April 2022

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και στην ομοιόσταση ενηλίκων ιστών, ρυθμίζοντας βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt έχει παρατηρηθεί στην καρκινογένεση και επέρχεται μέσω μεταλλαγών, επιγενετικών τροποποιήσεων και μεταβολών της έκφρασης γονιδίων του μονοπατιού καθώς και μέσω αλληλεπίδρασης με διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Δεδομένης της συμμετοχής του μονοπατιού στον καρκίνο παχέος εντέρου, καθώς και της ανάπτυξης φαρμάκων που στοχεύουν σε αυτό, η μελέτη του αποκτά ιδιαίτερη σημασία τόσο για την ανάδειξη προγνωστικών όσο και δυνητικά προβλεπτικών βιοδεικτών για τις στοχευμένες θεραπείες. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Αναλύθηκαν 102 δείγματα καρκίνου παχέος εντέρου. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και Real-Time PCR για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, CTNNB1 (β-κατενίνη), TCF4, LEF1 και AXIN2 με την μέθοδο 2-ΔΔCt. Σε 55 δείγματα DNA πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την παρουσία μεταλλαγών στα γονίδια KRAS, NRAS, BRAF του μονοπατιού MAPK, στα γονίδια PIK3CA, AKT1 του μονοπατιού PI3K/Akt, στο γονίδιο της β-κατενίνης (CTNNB1) καθώς και για την παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI). Επιπλέον, διενεργήθηκε έλεγχος της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου APC σε 38 δείγματα. Ελέγχθηκε ακόμα η έκφραση της β-κατενίνης σε επίπεδο πρωτεΐνης με την χρήση ανοσοϊστοχημείας σε 26 δείγματα. Ακολούθησε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, αναζήτηση γραμμικών συσχετίσεων της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων και συσχετίσεις με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης κατέδειξε αυξημένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, WNT11, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, β-κατενίνης, TCF4, LEF1, AXIN2 σε ποσοστό 59%, 60%, 34%, 26%, 32%, 25%, 37%, 32%, 22%, 46%, 48%, 31%, αντίστοιχα, ενώ μειωμένα επίπεδα έκφρασης καταγράφηκαν στο 20%, 24%, 29%, 49%, 34%, 33%, 29%, 37%, 57%, 31%, 38%, 39% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του WNT11 με τους όγκους κατηγορίας Τ3-Τ4 (p=0.037). Ακόμα, η μειωμένη mRNA έκφραση της β-κατενίνης συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με τους όγκους κατηγορίας Ν2 (p=0.037). Επιπλέον, τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης της GSK3B συσχετίστηκαν με την μεγαλύτερη ηλικία των ασθενών (p=0.045) καθώς και με την κατηγορία T1-T2 των όγκων (p=0.010). Σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της αυξημένης έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων TCF4 και LEF1 με την κατηγορία Τ3-Τ4 των όγκων (p=0.041 & p=0.027, αντίστοιχα). Μεταλλαγές στα γονίδια KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, AKT1, CTNNB1 καθώς και παρουσία MSI παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 36%, 2%, 11%, 11%, 0%, 2% και 7%, αντίστοιχα. Καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μη-κανονικού συνδέτη WNT11 με την παρουσία μεταλλαγών στο γονίδιο BRAF (p=0.033), καθώς και των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μη-κανονικού υποδοχέα FZD6 με την απουσία μεταλλαγών στο γονίδιο KRAS (p=0.013). Μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου APC παρατηρήθηκε στο 45% των δειγμάτων. Προέκυψε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της μεθυλίωσης με τους άνδρες ασθενείς (p=0.011) και της απουσίας μεθυλίωσης με τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων FZD6 και β-κατενίνης (p=0.027 & p=0.054, αντίστοιχα). Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της έκφρασης της β-κατενίνης κατέδειξε μειωμένη έκφραση μεμβρανικής β-κατενίνης στο 77% των περιπτώσεων, αυξημένη κυτταροπλασματική έκφραση στο 73% των περιπτώσεων, καθώς και θετική πυρηνική έκφραση στο 77% των δειγμάτων. Οριακά στατιστικά σημαντική συσχέτιση προέκυψε μεταξύ της αυξημένης μεμβρανικής έκφρασης με το στάδιο I-II (p=0.053). Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση προέκυψε μεταξύ των μεμβρανικών/κυτταροπλασματικών επιπέδων έκφρασης με την mRNA έκφρασή της (p=0.039 & p=0.046, αντίστοιχα). Ακόμα, παρατηρήθηκε οριακά στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των κυτταροπλασματικών επιπέδων της β-κατενίνης και της έκφρασης της AXIN2 (p=0.053). Πολλαπλές στατιστικά σημαντικές θετικές γραμμικές συσχετίσεις καταγράφηκαν μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων Wnt. Ο αριθμός των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt που εμφανίζουν ταυτόχρονα αυξημένη ή μειωμένη έκφραση συσχετίστηκε θετικά ή αρνητικά, αντίστοιχα, με την έκφραση του γονιδίου-στόχου AXIN2 (p<0.001 και στις 2 περιπτώσεις). Επιπλέον, σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της αυξημένης έκφρασης σε 1 ή περισσότερα γονίδια του κανονικού μονοπατιού με το στάδιο I-II (p=0.046). ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: •Συμπερασματικά, παρατηρήθηκε σημαντική απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt στον καρκίνο παχέος εντέρου. •Μεταβολή των επιπέδων έκφρασης γονιδίων του μονοπατιού Wnt καταγράφηκε σε σημαντικό ποσοστό των δειγμάτων.•Η έκφραση των γονιδίων WNT11, β-κατενίνης, GSK3B, TCF4 και LEF1 αποτελεί πιθανό δείκτη βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων παχέος εντέρου. •Η αλληλεπίδραση των μονοπατιών Wnt-MAPK στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου υποστηρίζεται από τις συσχετίσεις των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του μη-κανονικού μονοπατιού WNT11 και FZD6 με την παρουσία μεταλλαγών στα γονίδια BRAF και KRAS, αντίστοιχα. •Η απορρύθμιση σηματοδότησης Wnt αποτυπώθηκε και στην πρωτεϊνική έκφραση της β-κατενίνης, η οποία παρουσιάστηκε αυξημένη στο κυτταρόπλασμα, μειωμένη στην μεμβράνη και με θετική έκφραση στον πυρήνα στην πλειονότητα των περιπτώσεων.•Η σημαντικότητα της έκφρασης mRNA της β-κατενίνης στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου υπογραμμίζεται από την συσχέτιση της mRNA έκφρασής της τόσο με την πρωτεϊνική της έκφραση όσο και με την κατηγορία Ν του όγκου.•Απεικονίστηκε μια πολυεπίπεδη απορρύθμιση του μονοπατιού, όπως υποδεικνύεται από τις πολλαπλές στατιστικά σημαντικές θετικές γραμμικές συσχετίσεις που σημειώθηκαν μεταξύ των γονιδίων Wnt, με ταυτόχρονη αυξημένη/μειωμένη έκφραση να παρατηρείται σε υψηλό ποσοστό των δειγμάτων•Η ταυτόχρονη αυξημένη έκφραση των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt πιθανά ενισχύει την μεταγραφή γονιδίων-στόχων του μονοπατιού και κατ’ επέκταση την σηματοδότηση Wnt, όπως προέκυψε από την συσχέτιση του αριθμού των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt που εμφανίζουν ταυτόχρονα αυξημένη έκφραση με την αυξημένη έκφραση του γονιδίου-στόχου AXIN2.•Η αυξημένη έκφραση των γονιδίων του κανονικού μονοπατιού Wnt (ενός ή περισσοτέρων ταυτόχρονα) φαίνεται ότι αποτελεί πρώιμο γεγονός στην καρκινογένεση και ένα πιθανό δείκτη καλής πρόγνωσης, καθώς συσχετίσθηκε με το στάδιο I-II του όγκου.•Τα παραπάνω ευρήματα τονίζουν την σημασία της μελέτης του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και αναδεικνύουν την πιθανή σημασία της διερεύνησης των επιπέδων έκφρασης ως προς την επιλογή ασθενών για την χορήγηση στοχεύουσας θεραπείας έναντι του μονοπατιού Wnt.