Παραγωγή τερπενοειδών από φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς
Authors: Βαλσαμή Ελευθερία-Αγγελική 
Published: September 2021

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η ετερόλογη παραγωγή του μονοτερπενίου β φελλανδρενίου από μεταλλαγμένα στελέχη του κυανοβακτηρίου Synechocystis. Το κυανοβακτήριο Synechocystis αποτελεί πρότυπο οργανισμό, ικανό να εφαρμόσει την προσέγγιση «καύσιμα από τη φωτοσύνθεση». Το γεγονός αυτό τον καθιστά μικροοργανισμό κατάλληλο για βιοτεχνολογική εκμετάλλευση και παραγωγή μεγάλου αριθμού προϊόντων, έχοντας ως πρώτες ύλες μόνο φως, νερό και διοξείδιο του άνθρακα. Μέσω της γενετικής και μεταβολικής μηχανικής δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένα στελέχη Synechocystis τα οποία ήταν ικανά να παράγουν β-φελλανδρένιο όταν καλλιεργήθηκαν σε φωτοαυτότροφες συνθήκες σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες. Η διαδικασία δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων και τη λειτουργία του φωτοσυνθετικού τους μηχανισμού. Στο γονιδίωμα των στελεχών αυτών εισήχθησαν τα νέα οπερόνια με τα γονίδια σύντηξης του γονιδίου των βελτιστοποιημένων κωδικονίων της συνθάσης του β φελλανδρενίου (PHLS) και του γονιδίου της συνθάσης του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPPS) με τις δύο κύριες υπομονάδες της φυκοκυανίνης (cpcB και cpcA) και εκφράστηκαν κάτω από τη δράση του ισχυρού cpc υποκινητή. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η ετερόλογη έκφραση της συνθάσης του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPPS), ενισχύει την παραγωγή του β φελλανδρενίου. Αντίθετα η χρήση ενός ισχυρού υποκινητή (cpc), σε συνδυασμό με τη χρήση της cpcB υπομονάδας ως αλληλουχίας οδηγό της PHLS φάνηκε να μην επάγει την έκφραση της σε υψηλότερα επίπεδα, όταν απουσιάζουν γονίδια του cpc οπερονίου. Επιπλέον, παρόλο που η σύντηξη της PHLS με την cpcB υπομονάδα της φυκοκυανίνης οδήγησε σε επιτυχή παραγωγή του β-φελλανδρενίου στα μεταλλαγμένα στελέχη, η συγχώνευση της με την υπομονάδα cpcA της φυκοκυανίνης οδήγησε σε παραγωγή μείγματος ισομερών τερπενοειδών (δ-3-καρένιο, καμφένιο και α-πινένιο). Σε δεύτερη φάση διαφοροποιήθηκαν οι συνθήκες ανάπτυξης των μεταλλαγμένων στελεχών Synechocystis. Οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν ήταν η καλλιέργεια των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με υψηλότερη αλκαλικότητα και αλατότητα σε σχέση με τις συνήθεις συνθήκες ανάπτυξης, όπως επίσης η υψηλότερη συγκέντρωση CO2 και φωτονιακή ακτινοβολία. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η ικανότητα των μεταλλαγμένων στελεχών να παράγουν β-φελλανδρένιο δεν παρεμποδίστηκε από την υψηλότερη αλκαλικότητα και αλατότητα του θρεπτικού μέσου. Τα συμπεράσματα αυτά αποτελούν σημαντικά ευρήματα για την περαιτέρω βιοτεχνολογική εκμετάλλευση μεταλλαγμένων στελεχών Synechocystis για την παραγωγή προϊόντων υψηλής εμπορικής αξίας. Ενδιαφέρον εύρημα της διατριβής ήταν ότι στις συνθήκες που παρατηρήθηκε υψηλότερη παραγωγή κυτταρικής βιομάζας, δεν οδήγησε απαραίτητα σε αύξηση της παραγωγής του β φελλανδρενίου. Ακινητοποιημένα κύτταρα Synechocystis σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου ήταν σε θέση να παράγουν β-φελλανδρένιο σε σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες, συγκριτικά με τα ελεύθερα κύτταρα, παραμένοντας μεταβολικά ενεργά για το χρονικό διάστημα των δώδεκα ημερών που μελετήθηκε. Τα συστήματα αυτά δίνουν μία προοπτική για μελλοντική εφαρμογή τους σε μεγαλύτερης κλίμακας βιοαντιδραστήρες.Βασικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι πως μέσω της γενετικής και μεταβολικής μηχανικής, τα κυανοβακτήρια Synechocystis καθίστανται ικανά να παράγουν ένα προϊόν με υψηλή ζήτηση και κόστος στη βιομηχανία έχοντας ως πρώτες ύλες μόνο φως, νερό και διοξείδιο του άνθρακα. Το β-φελλανδρένιο αποτελεί απλά ένα παράδειγμα μονοτερπενίου και η ετερόλογη παραγωγή του ανοίγει νέες προοπτικές για την παραγωγή συγγενικών δομικά τερπενοειδών μορίων με πολλαπλές χρήσεις. Η ευελιξία των μικροοργανισμών αυτών να προσαρμόζονται στις εκάστοτε συνθήκες ανάπτυξης, χωρίς πολλές φορές να επηρεάζεται η ικανότητα τους να παράγουν β φελλανδρένιο προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα όσον αφορά την εκμετάλλευση τους σε βιομηχανική κλίμακα. Οι προσεγγίσεις που παρουσιάστηκαν στην παρούσα διατριβή, αποτελούν ανανεώσιμες, φιλικές προς το περιβάλλον και οικονομικά βιώσιμες εναλλακτικές για τη μαζική παραγωγή οργανικών μορίων υψηλής βιομηχανικής αξίας.