Ο ρόλος των ενεργών μορφών οξυγόνου στην αναγεννητική ικανότητα των πρωτοπλαστών
Authors: Παπαδάκη Αναστασία-Πολυξένη 
Published: August 2021

Προηγούμενα αποτελέσματα του Εργαστηρίου έδειξαν ότι η οξειδωτική καταπόνηση εμπλέκεται στην μείωση του αναγεννητικού δυναμικού των πρωτοπλαστών, όμως μόνο οι πρωτοπλάστες που είναι ικανοί να παράγουν εξωκκυταρικό H2O2 μπορούν να διαιρεθούν (Siminis et al., 1993, 1994, de Marco and Roubelakis-Angelakis, 1996a, 1996b, 1999). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η παραγωγή των ενεργών μορφών οξυγόνου (ΕΜΟ), του Ο2-. και του H2O2, κατά την απομόνωση αναγεννώμενων πρωτοπλαστών καπνού (Nicotiana tabacum L.) και μη αναγεννώμενων πρωτοπλαστών καπνού και αμπέλου (Vitis vinifera L.), καθώς και τα συστήματα παραγωγής τους. Η χρησιμοποίηση κυτταρινάσης Onozuka προκάλεσε ραγδαία συσσώρευση του O2-. και του H2O2 στο μέσο επώασης των φύλλων καπνού, ενώ η αντίστοιχη παραγωγή ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην άμπελο. Ο τραυματισμός των φύλλων ή η χρησιμοποίηση καθαρής κυτταρινάσης Worthington δεν οδήγησε σε αύξηση των ΕΜΟ. Η προσθήκη κυτταρινάσης Onozuka σε πρωτοπλάστες, που απομονώθηκαν με κυτταρινάση Worthington, προκάλεσε οξειδωτική έκρηξη στο μέσο καλλιέργειας, όπου η συσσώρευση των ΕΜΟ χαρακτηρίστηκε από σημαντικές ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές μεταξύ των δύο φυτών. Στους πρωτοπλάστες και σε απομονωμένες κυτταρικές μεμβράνες καπνού, ανιχνεύτηκαν δυο διαφορετικές ενεργότητες σύνθεσης ΕΜΟ: μία, που παρουσίασε εξειδίκευση στο NADPH και ευαισθησία στο DPI, ήταν υπεύθυνη για την παραγωγή του Ο2-. και αντιστοιχεί μάλλον σε ένα ένζυμο παρόμοιο με την NADPH οξειδάση των θηλαστικών, και μία δεύτερη NAD(P)H οξειδάση-υπεροξειδάση, ευαίσθητη στο KCN και το NaN3, που συμβάλλει στην παραγωγή και των δύο ΕΜΟ. Στην άμπελο, μόνο το δεύτερο ενζυμικό σύστημα ανιχνεύτηκε. Οι πρωτοπλάστες που απομονώθηκαν με κυτταρινάση Onozuka, παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα ΕΜΟ, κυρίως σε ενδοκυτταρικό επίπεδο, και χαμηλότερη βιωσιμότητα και διαιρετική ικανότητα, σε σχέση με εκείνους που προέκυψαν από κυτταρινάση Worthington. Η συγκέντρωση των ΕΜΟ μειώθηκε προοδευτικά κατά την καλλιέργεια, όμως στους μη αναγεννώμενους πρωτοπλάστες, οι ενδοκυτταρικές ΕΜΟ αυξήθηκαν την 8η ημέρα καλλιέργειας. Οι μη αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού και εντονότερα οι πρωτοπλάστες αμπέλου, χαρακτηρίστηκαν από χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό του ασκορβικού και της γλουταθειόνης, με τις οξειδωμένες μορφές να κυριαρχούν κατά την καλλιέργεια. Η ενεργότητα των ενζύμων που αποσβένουν τις ΕΜΟ, της SOD, της APO της MDΗAR, της DHAR, της GR και της GS-PER ήταν σημαντικά υψηλότερη στους αναγεννώμενους πρωτοπλάστες καπνού σε σχέση με τους μη αναγεννώμενους και με τους πρωτοπλάστες αμπέλου, όπου δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή κατά την καλλιέργεια. Η αύξηση στην ενεργότητα της SOD και της APO στους αναγεννώμενους πρωτοπλάστες καπνού οφειλόταν στην επαγωγή του κυτοπλασμικού ισοενζύμου. Πρωτοπλάστες από γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με αντιπληροφοριακό RNA για την APO, δεν παρουσίασαν διαφορές με τον μάρτυρα, όσον αφορά τη βιωσιμότητα και την αντιοξειδωτική μηχανή. Όμως, η αναστολή της ενεργότητας της ΑΡΟ, με την χρησιμοποίηση του παρεμποδιστή pCMB, πάνω από 45% οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο των πρωτοπλαστών. Οι αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού παρουσίασαν σταδιακή αύξηση των πολυαμινών κατά την καλλιέργεια, και τις υψηλότερες συγκεντρώσεις, με επικράτηση των διαλυτών συζευγμένων πολυαμινών, ενώ οι μη αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού και αμπέλου, με αυτή τη σειρά, παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η καταστολή της έκφρασης του ολοδυναμικού, που παρατηρείται στους μη αναγεννώμενους πρωτοπλάστες, μπορεί να σχετιστεί με την κατάρρευση του αμυντικού μηχανισμού κατά της οξειδωτικής καταπόνησης.