Διερεύνηση του γενετικού - βιολογικού ρόλου των εισοσωμικών πρωτεϊνών του μύκητα Aspergillus nidulans
Authors: Αθανασόπουλος Αλέξανδρος 
Published: August 2021

Η πλασµατική µεµβράνη εµπλέκεται σε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες, ο συντονισµός των οποίων απαιτεί τη δυναµική οργάνωση των συστατικών της, σεµεµβρανικές περιοχές διαφορετικής λιπιδικής και πρωτεϊνικής σύστασης. Τα στικτάπρωτεϊνικά συµπλέγµατα που ονοµάζονται εισοσώµατα, τουλάχιστον εν µέρει, συµβάλλουν στη διαµερισµατοποίηση της πλασµατικής µεµβράνης των µυκήτων. Στονηµατοειδή µύκητα Aspergillus(Emericella) nidulans, οι εισοσωµικές πρωτεΐνεςPilA και PilB, οµόλογες των Pil1/Lsp1 του Saccharomyces cerevisiae, και η SurG, οµόλογη της Sur7, συναρµολογούνται και σχηµατίζουν πυκνές στικτές κοκκιώδειςδοµές στα προϊόντα του αφυλετικού κύκλου ζωής του µύκητα, τα κονιδιοσπόριαΣτην παρούσα διδακτορική διατριβή, µελετήθηκε η κατανοµή και η έκφρασητων εισοσωµικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του φυλετικού κύκλο ζωής τουA.nidulans. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι κύριες εισοσωµικές πρωτεΐνες, PilA, PilB και SurG δεν εκφράζονται στα κύτταρα hülle ή τα πρώιµα ασκοσπόρια αλλάαντίθετα εκφράζονται στα ώριµα ασκοσπόρια. Σε αδρανή ώριµα ασκοσπόρια, ηπρωτεΐνη PiłΑ σχηµατίζει στατικές στικτές δοµές στην πλασµατική µεµβράνη τωνασκοσπορίων. Παρόµοια, ηPilB εντοπίζεται στην περιφέρεια των ασκοσπορίων αλλάσυγκεντρώνεται κυρίως στις περιοχές όπου τα δύο µισά ενός ασκοσπορίουενώνονται. Τέλος, ηSurG εντοπίζεται τόσο στη µεµβράνη των ασκοσπορίων όσο καιπεριπυρηνικά - ενδοπλασµατικό δίκτυο. Σε εκβλαστηµένα ασκοσπόρια, οι στικτέςδοµές κατά µήκος της υφής αποτελούνται αποκλειστικά από την πρωτεΐνη PilΑ. ΗPilB εντοπίζεται διάχυτη στο κυτταρόπλασµα και ηSurG στοχεύετε στα χυµοτόπια, τα ενδοσώµατα αλλά εντοπίζεται και σε στικτούς κοκκιώδεις σχηµατισµούς στηνκεφαλή των υφών. Η κατανοµή αυτών των πρωτεϊνών είναι πανοµοιότυπη µε αυτήπου βρέθηκε σε νεαρές υφές προερχόµενες από κονιδιοσπόρια. Επιπλέον, σεεκβλαστηµένα ασκοσπόρια οιPiłΑ στικτοί σχηµατισµοί δεν συνεντοπίζονται µε τιςιδιαίτερα κινητικές στικτές δοµές της ΑbpΑ, ενός µάρτυρα ενδοκύττωσης κυστιδίωνκαλυµµένων µε πλέγµα κλαθρίνης. Παρουσία µυριοσίνης – ειδικού αναστολέα τηςβιοσύνθεσης σφιγγολιπιδίων – τα PiłΑ κοκκία των νεαρών υφών που προέρχονταιαπό ασκοσπόρια, είναι λιγότερα σε αριθµό και η τοπολογία τους έχει σηµαντικάαλλοιωθεί, υποδηλώνοντας συσχέτιση µεταξύ της εισοσωµικής PiłΑ και τηςβιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων. Επιπρόσθετα, καθώς η πρωτεΐνηNce102 του S. cerevisiae έχει προταθεί ότιαποτελεί µέρος ενός αισθητήρα των επίπεδων των σφιγγολιπιδίων, διερευνήθηκε ορόλος της AnNce102 στον A. nidulans. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η AnNce102 σχηµατίζει σταθερές δοµές µε χαµηλή κινητικότητα που συνεντοπίζονται µε ταεισοσώµατα και διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο στην πυκνότητα/αριθµό τωνPilA/SurG κοκκίων στην κεφαλή νεαρών υφών. Επιπλέον, δείχθηκε ότι οι πρωτεΐνεςAnNce102 και PilA ρυθµίζουν αρνητικά τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, καθώςαπαλοιφές των γονιδίων τους καταστέλλουν µερικώς τη θερµοευαισθησία τουστελέχους basA1, το οποίο κωδικοποιεί για την C4-υδροξυλάση, υπεύθυνη για τηµετατροπή της διϋδροσφιγγοσίνης σε φυτοσφιγγοσίνη. Επιπλέον, απαλοιφές τωνγονιδίων annce102 και pilA καταστέλλουν µερικώς τη µη φυσιολογική ανάπτυξη πουπαρατηρείται µετά από επώαση των κυττάρων µε τους αναστολείς της βιοσύνθεσηςτων σφιγγολιπιδίων, µυριοσίνη και αουρεοβασιδίνη Α. Ταυτόχρονα, δείχθηκε ότιαπενεργοποίηση της κινάσηςYpkA µιµείται τη γενετική ή τη φαρµακολογική µείωσητων σφιγγολιπιδίων, γεγονός, το οποίο υποδεικνύει την άµεση σχέση της κινάσης µετη ρύθµιση του µονοπατιού της βιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων. Στις ίδιες συνθήκεςπαρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση δραστικών µορφών οξυγόνου (∆ΜΟ- ROS), ηοποία µπορούσε εν µέρει να ξεπεραστεί µε την απαλοιφή των γονιδίων pilA καιannce102. Σε συµφωνία µε αυτά τα ευρήµατα, παρατηρήθηκε ευαισθησία ήανθεκτικότητα των annce102∆ ή/και pilA∆ στελεχών σε διαφορετικούς οξειδωτικούςπαράγοντες, ενώ η υπερέκφραση της AnNce102 αποκαθιστά τον αριθµό και τηνοργάνωση των PilA/SurG κοκκίων σε κύτταρα µε διαταραγµένα επίπεδασφιγγολιπιδίων και επιπρόσθετα οδηγεί στον « άτυπο» εντοπισµό τωνPilA κοκκίωνστα διαφράγµατα.