Mελέτη της δραστικότητας in vitro των συνδυασμών καρβαπενέμης – κολιμυκίνης όπως και πιπερακιλλίνης/ ταζομπακτάμης – κολιμυκίνης έναντι στελεχών εντεροβακτηριακών που παράγουν μέταλλο-β-λακταμάσες
Authors: Ρεκατσίνα Παναγιώτα-Δανάη 
Published: September 2021

Κατά την τελευταία δεκαετία, οι MBLs τύπου VIM έχουν εξαπλωθεί μεταξύ των Εντεροβακτηριακών, διακινδυνεύοντας τη δραστικότητα των καρβαπενεμών καθώς και των περισσότερων άλλων β-λακταμών. Οι καρβαπενέμες (ιμιπενέμη, μεροπενέμη και ερταπενέμη) είναι αντιβιοτικά εξαιρετικά χρήσιμα για τη θεραπεία νοσοκομειακών λοιμώξεων, δεδομένου ότι είναι δραστικές έναντι στελεχών που παράγουν ευρέως φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs) και επομένως είναι ανθεκτικά σε όλες τις άλλες β-λακτάμες. Στην Ελλάδα, η διαρκώς αυξανόμενη συχνότητα στελεχών Klebsiella pneumoniae που παράγουν VIM-1 στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας προκαλεί μια ενδημική κατάσταση. Ωστόσο, σποραδικά κρούσματα αλλά και επιδημίες οφειλόμενες σε Εντεροβακτηριακά που παράγουν MBLs (MBLs) έχουν αναφερθεί και στις πέντε ηπείρους. Επίκτητη αντοχή στις καρβαπενέμες περιγράφηκε στη χώρα μας από τα τέλη της δεκαετίας του 1990 αρχικά σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa που παρήγαγαν VIM-2 και σπανιότερα VIM-4 MBLs. Το 2002 περιγράφηκε επιδημία από στελέχη K.pneumoniae που παρήγαγαν VIM-1 σε πολλά τριτοβάθμια νοσοκομεία της Αθήνας.Δύο κύριες ομάδες MBLs έχουν αναγνωρισθεί, ο τύπος VIM και ο τύπος IMP και σύμφωνα με την πρόσφατη βιβλιογραφία έχουν πλέον παγκόσμια γεωγραφική κατανομή. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις MBL εδράζονται σε μεταθετές κασέτες γονιδίων που παρεμβάλλονται στα ιντεγκρόνια τύπου 1. Το γεγονός αυτό ευνοεί τη μετάδοσή τους από το ένα στέλεχος στο άλλο και συμβάλλει στην οριζόντια διασπορά των γονιδίων αυτών. Η συνύπαρξη MBL και ESBL στο ίδιο στέλεχος περιπλέκει ακόμη περισσότερο την κατάσταση και απαιτεί ακόμη μεγαλύτερη προσοχή. Η πλειοψηφία των στελεχών K. pneumoniae που φέρουν το γονίδιο blaVIM έχουν ΜΙCs που βρίσκονται στα όρια ευαισθησίας σύμφωνα με τα προτεινόμενα όρια του CLSI.Για παρόμοια πολυανθεκτικά στελέχη δραστικές in vitro είναι μόνο η κολιμυκίνη και η τιγεκυκλίνη. Η τιγεκυκλίνη παρουσιάζει in vitro δραστικότητα έναντι Gram αρνητικών βακτηρίων που παράγουν MBLs, αλλά τα στοιχεία για την in vivo αποτελεσματικότητά της είναι ακόμα περιορισμένα. Επιπλέον, η έλλειψη δραστικότητας έναντι της P. aeruginosa περιορίζει τη χρήση της ως εμπειρική μονοθεραπεία σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς που νοσηλεύονται στις Mονάδες Εντατικής Θεραπείας. Από την άλλη πλευρά, ως προς την κολιμυκίνη, τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τα κλινικά αποτελέσματα της χρήσης της ως μονοθεραπεία, είτε σχετικά με τη φαρμακοκινητική και τη φαρμακοδυναμική της είναι ελάχιστα. Εξάλλου, η πρόσφατη διαπίστωση ύπαρξης ανθεκτικών στην κολιμυκίνη στελεχών K. pneumoniae θέτει σε κίνδυνο τα αποτελέσματα των ήδη περιορισμένων θεραπευτικών επιλογών για τις λοιμώξεις στις ΜΕΘ. Για αυτούς τους λόγους, η χρήση συνδυασμών αντιμικροβιακών ουσιών σε νοσοκομεία με σχετικά υψηλά ποσοστά στελεχών που παράγουν MBLs αποτελεί συχνή εμπειρική επιλογή.Τα κλινικά δεδομένα για την καλύτερη θεραπευτική αντιμετώπιση των λοιμώξεων από εντεροβακτηριακά που παράγουν MBLs, ακόμα και αυτών με τις χαμηλές ΜΙCs, είναι διεθνώς ελλιπή. Το ευρύ φάσμα υδρόλυσης αυτών των ενζύμων αφήνει ελάχιστες θεραπευτικές επιλογές και είναι άγνωστο αν ο συνδυασμός μιας καρβαπενέμης ή της πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης με την κολιμυκίνη είναι δραστικός και αν παρουσιάζει in vitro συνέργια.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν κλινικά στελέχη K. pneumoniae που παρήγαγαν MBLs και απομονώθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο «Αττικόν» και στην Μονάδα Εντατικής Θεραπείας του Γενικού Νοσοκομείου «Ευαγγελισμός» από Φεβρουάριο 2004 ως Σεπτέμβριο 2006. Τα στελέχη προήλθαν κυρίως από αιμοκαλλιέργειες και βρογχικές εκκρίσεις και σε μικρότερο ποσοστό από ούρα, πύον ή κόπρανα. Ως εκ τούτου, ήταν στην πλειοψηφία τους στελέχη που προκάλεσαν κλινικές λοιμώξεις και όχι μόνο αποικισμό. Ένα μόνο στέλεχος από κάθε ασθενή συμπεριελήφθη στη μελέτη με εξαίρεση στελέχη που είχαν υποβληθεί σε επιδημιολογική τυποποίηση και είχε επιβεβαιωθεί ότι πρόκειται για διαφορετικό κλώνο. Η τυποποίηση έγινε με τις κλασσικές μεθόδους της κλινικής μικροβιολογίας και με τη χρήση βιοχημικών δοκιμασιών (API20E system, bioMérieux, Marcy L’Ėtoile, France) και ο προσδιορισμός των ευαισθησιών στα αντιβιοτικά της μελέτης ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη και κολιμυκίνη έγινε με τη δοκιμασία Etest (AB BIODISK, Solna, Sweden). Ο φαινοτυπικός έλεγχος της παραγωγής MBL έγινε με την μέθοδο συνέργιας EDTA-ιμιπενέμη με δίσκους. Η ανίχνευση του υπεύθυνου γονιδίου έγινε με PCR με κατάλληλους εκκινητές και αν πρόκειται για γονίδιο τύπου VIM, η διάκριση μεταξύ της ομάδας blaVIM-1 και blaVIM-2 έγινε με RFLP ανάλυση με την περιοριστική ενδονουκλεάση SacΙ. Η επιδημιολογική τυποποίηση στελεχών που προήλθαν από τον ίδιο ασθενή έγινε με REP-PCR και η αξιολόγηση έγινε με βάση κριτήρια της διεθνούς βιβλιογραφίας.Η αξιολόγηση της δραστικότητας των συνδυασμών ιμιπενέμης – κολιμυκίνης, μεροπενέμης – κολιμυκίνης, ερταπενέμης – κολιμυκίνης και πιπερακιλλίνης/ ταζομπακτάμης – κολιμυκίνης έναντι των στελεχών της μελέτης έγινε με τη μέθοδο της καμπύλης θανάτωσης στο χρόνο. Οι πυκνότητες των αντιβιοτικών που μελετήθηκαν ήταν ίσες α) με 4xMIC αν οι τιμές αυτές δεν υπερέβαιναν τη μέση πυκνότητα του φαρμάκου στο αίμα, και β) με τη μέση πυκνότητα κάθε φαρμάκου στο αίμα, για όλα τα στελέχη ανεξαρτήτως MIC. Μέτρηση των ζώντων αποικιών του μικροβίου έγινε στις ώρες 0, 1, 3, 5 και 24.Σαν συνέργια ορίστηκε η ≥2 log10 CFU/ml μείωση των ζώντων αποικιών στο συνδυασμό των δυο ουσιών σε σχέση με τις αποικίες που αναπτύχθηκαν παρουσία μόνο του πιο δραστικού παράγοντα σε κάθε δεδομένο χρονικό σημείο, με την προϋπόθεση ότι ο αριθμός των ζώντων αποικιών παρουσία του συνδυασμού ήταν ≥2 log10 CFU/ml χαμηλότερος από το αρχικό εναιώρημα και τουλάχιστον ένας από τους αντιμικροβιακούς παράγοντες ήταν σε συγκέντρωση τέτοια που να μην επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη του υπό μελέτη στελέχους. Ανταγωνισμός ορίστηκε η ≥2 log10 CFU/ml αύξηση των ζώντων αποικιών στο συνδυασμό των δυο ουσιών σε σχέση με τις αποικίες που αναπτύχθηκαν στον πιο δραστικό παράγοντα. Οποιαδήποτε διαφορετική αλληλεπίδραση ορίστηκε ως αδιαφορία. Η βακτηριοκτόνος δραστικότητα κάθε αντιβιοτικού ή κάθε συνδυασμού ορίστηκε ως η ≥3 log10 CFU/ml μείωση των αποικιών του αρχικού εναιωρήματος μετά από επώαση 24h. Το κατώτερο όριο ανίχνευσης αποικιών ήταν 1.6 log10 CFU/ml.Στα στελέχη που παρουσίαζαν ευαισθησία ή ενδιάμεση ευαισθησία σε τουλάχιστον ένα από τα αντιβιοτικά και παρατηρήθηκε ανάπτυξη μικροβίου μετά από 24ωρη επώαση με κάθε αντιβιοτικό μόνο του ή με το συνδυασμό, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για εμφάνιση αντοχής στις αποικίες που απομονώθηκαν με εκ νέου προσδιορισμό των MIC με τη μέθοδο αραίωσης σε άγαρ όπως περιγράφεται ανωτέρω.Για τη σύγκριση της βακτηριοκτόνου δραστικότητας κάθε αντιβιοτικού μόνου του σε σχέση με το συνδυασμό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος X2 με τη διόρθωση κατά Yates σε πίνακες 2 επί 2. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ήταν P < 0,05. Για τα στελέχη από τα οποία δεν απομονώθηκε καμία ζωντανή αποικία μετά από επώαση με αντιβιοτικό ή με συνδυασμό αντιβιοτικών, στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (καθορισμό αλληλεπιδράσεων και βακτηριοκτόνου δραστικότητας) και στη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η τιμή 1.6 log10.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΜελετήθηκαν 45 γενετικά διαφορετικά στελέχη K. pneumoniae που παρήγαγαν blaVIM-1 ως προς την αξιολόγηση της δραστικότητας του συνδυασμού κολιμυκίνης-ιμιπενέμης, κολιμυκίνης-μεροπενέμης, κολιμυκίνης-ερταπενέμης και κολιμυκίνης-πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης σύμφωνα με την παραπάνω μεθοδολογία. Σε όλα τα στελέχη επιβεβαιώθηκε η παρουσία MBL με τη μέθοδο συνέργιας EDTA-ιμιπενέμη με δίσκους και με την ανίχνευση του υπεύθυνου γονιδίου τύπου VIM. Ο προσδιορισμός των ευαισθησιών στα αντιβιοτικά της μελέτης ιμιπενέμη, ερταπενέμη, μεροπενέμη, πιπερακιλλίνη /ταζομπακτάμη και κολιμυκίνη έγινε σύμφωνα με τα προτεινόμενα όρια ευαισθησίας του CLSI.Στη μέθοδο της καμπύλης θανάτωσης στο χρόνο οι πυκνότητες αντιβιοτικών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ίσες με 4xMIC όταν οι τιμές αυτές δεν ξεπερνούσαν την τιμή της μέσης πυκνότητας του φαρμάκου στο αίμα και η μέση πυκνότητα του αντίστοιχου φαρμάκου στο αίμα (ιμιπενέμη 10 μg/ml, μεροπενέμη 10 μg/ml, ερταπενέμη 10 μg/ml, πιπερακιλλίνη /ταζομπακτάμη 35/7 μg/ml και κολιμυκίνη 5 μg/ml). Οι μετρήσεις των ζώντων αποικιών του μικροβίου στις ώρες 0, 1, 3, 5 και 24 κατέδειξαν τα εξής αποτελέσματα:Από τη μελέτη του συνδυασμού ιμιπενέμη-κολιμυκίνη προέκυψε ότι για τα στελέχη που ήταν ευαίσθητα στην κολιμυκίνη, από τους 52 συνδυασμούς συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν συνολικά, 16 (30.8%) έδειξαν συνέργια και μόνο ένας (1.9%) έδειξε ανταγωνισμό. Για τα στελέχη που ήταν ανθεκτικά στην κολιμυκίνη, από τους 19 συνδυασμούς συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν συνολικά, 10 (52.6%) έδειξαν ανταγωνισμό και μόνο 2 (10.5%) έδειξαν συνέργια. Τα δύο αυτά στελέχη είχαν χαμηλή MIC στην κολιμυκίνη (4 μg/ml). Όταν ο συνδυασμός χρησιμοποιήθηκε σε ευαίσθητα στην κολιμυκίνη στελέχη παρουσίασε βακτηριοκτόνο δραστικότητα σε στατιστικά υψηλότερο ποσοστό από καθένα αντιβιοτικό μόνο του (78.9% έναντι 20.7% για την ιμιπενέμη, p<0.0001 και έναντι 46.2% για την κολιμυκίνη, p=0.001). Για την ομάδα των ανθεκτικών στην κολιμυκίνη στελεχών, ο συνδυασμός δεν φάνηκε να πλεονεκτεί όσον αφορά τη βακτηριοκτόνο δραστικότητα. Μετά από έκθεση στο συνδυασμό ιμιπενέμη-κολιμυκίνη, σε κανένα στέλεχος ευαίσθητο στην ιμιπενέμη δεν διαπιστώθηκε επιλογή ανθεκτικού κλώνου ενώ από τα ευαίσθητα στην κολιμυκίνη στελέχη ανθεκτικός κλώνος επιλέχθηκε σε 15.4%.Ο συνδυασμός μεροπενέμης-κολιμυκίνης έναντι ευαίσθητων στην κολιμυκίνη στελεχών έδειξε συνέργια συνολικά σε 25% και ανταγωνισμό σε 9.6% των 52 συνδυασμών συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν ενώ για τα ανθεκτικά στην κολιμυκίνη στελέχη, συνέργια διαπιστώθηκε σε 10.5% και ανταγωνισμός σε 15.8% των 19 συνδυασμών συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν. Όταν ο συνδυασμός χρησιμοποιήθηκε σε ευαίσθητα στην κολιμυκίνη στελέχη παρουσίασε βακτηριοκτόνο δραστικότητα σε στατιστικά υψηλότερο ποσοστό από καθένα αντιβιοτικό μόνο του (69.2% έναντι της μεροπενέμης 13.8%, p<0.0001 και έναντι της κολιμυκίνης 46.2%, p=0.029). Για τα στελέχη που ήταν ανθεκτικά στην κολιμυκίνη, ο συνδυασμός έδειξε συνέργια σε 10.5% και ανταγωνισμό σε 15.8% των συνδυασμών συγκεντρώσεων που ελέγχθηκαν. Στην ομάδα αυτή κανένα αντιβιοτικό μόνο του ούτε και ο συνδυασμός έδειξαν βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα. Μετά από έκθεση στο συνδυασμό μεροπενέμη-κολιμυκίνη, 20% των στελεχών με MIC≤4μg/ml στη μεροπενέμη ανέπτυξαν αντοχή στη μεροπενέμη ενώ 23.1% των στελεχών που ήταν ευαίσθητα στην κολιμυκίνη ανέπτυξαν αντοχή.Ο συνδυασμός ερταπενέμη-κολιμυκίνη έναντι των ευαίσθητων στην κολιμυκίνη στελεχών παρουσίασε συνέργια σε 17 από τους 52 συνδυασμούς συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν (32.7%) και ανταγωνισμό σε 3 από τους 52 συνδυασμούς (5.8%) ενώ στην ομάδα των ανθεκτικών στην κολιμυκίνη στελεχών παρουσίασε συνέργια σε 5.3% και ανταγωνισμό σε 31.6% από τους 19 συνδυασμούς που μελετήθηκαν. Όσον αφορά τη βακτηριοκτόνο δραστικότητα του συνδυασμού, αυτή διαπιστώθηκε σε ποσοστό 78.9% των ελεγχθέντων συνδυασμών έναντι 23.1% για την ερταπενέμη (p<0.0001) και 46.2% για την κολιμυκίνη (p=0.001) στην ομάδα των ευαίσθητων στελεχών. Στην ομάδα των ανθεκτικών στην κολιμυκίνη στελεχών δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη βακτηριοκτόνο δραστικότητα του συνδυασμού και των μεμονωμένων αντιβιοτικών. Επιλογή ανθεκτικού στην ερταπενέμη κλώνου παρατηρήθηκε σε ένα στέλεχος (11.1%) ενώ επιλογή ανθεκτικού στην κολιμυκίνη κλώνου παρατηρήθηκε σε 19.2% των στελεχών μετά από έκθεση στον συνδυασμό.Ο συνδυασμός πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη-κολιμυκίνη έναντι των ευαίσθητων στην κολιμυκίνη στελεχών παρουσίασε συνέργια σε ποσοστό 44% και ανταγωνισμό σε ποσοστό 12% ενώ σε όλα τα ανθεκτικά στην κολιμυκίνη στελέχη παρουσίασε αδιαφορία. Ο συνδυασμός παρουσίασε βακτηριοκτόνο δραστικότητα έναντι των ευαίσθητων στην κολιμυκίνη στελεχών σε ποσοστό 68%, που ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερο έναντι της πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης μόνης (4%) αλλά χωρίς σημαντική διαφορά έναντι αυτού της κολιμυκίνης μόνης της (40%). Έναντι των ανθεκτικών στην κολιμυκίνη στελεχών δεν διαπιστώθηκε βακτηριοκτόνος δράση ούτε από τον συνδυασμό ούτε από το καθένα αντιβιοτικό μόνο του.ΣΥΖΗΤΗΣΗΜε βάση τα αποτελέσματα των πειραμάτων για το συνδυασμό ιμιπενέμης-κολιμυκίνης, θα μπορούσε να διεξαχθεί το συμπέρασμα ότι ο συγκεκριμένος συνδυασμός μπορεί να χρησιμοποιείται με ασφάλεια έναντι στελεχών με ευαισθησία ή χαμηλού επιπέδου αντοχή στην κολιμυκίνη (MIC ≤4 μg/ml), αναμένοντας συνέργια, ενίσχυση της βακτηριοκτόνου δραστικότητας και προστασία από επιλογή ανθεκτικών στην ιμιπενέμη κλώνων. Η χρήση του συνδυασμού θα πρέπει να αποφεύγεται σε στελέχη με υψηλού επιπέδου αντοχή στην κολιμυκίνη (MIC ≥8 μg/ml), δεδομένου ότι μπορεί να συνοδεύεται από ανταγωνισμό και δεν πλεονεκτεί σε βακτηριοκτόνο δραστικότητα.Σχετικά με το συνδυασμό μεροπενέμης-κολιμυκίνης, φαίνεται ότι είναι πλεονεκτικότερος των μεμονωμένων αντιβιοτικών κυρίως για στελέχη ευαίσθητα στην κολιμυκίνη οπότε αναμένεται και ισχυρότερο βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα σε σύγκριση με τη μεροπενέμη. Για τα ανθεκτικά στην κολιμυκίνη στελέχη δεν φαίνεται ο συνδυασμός να παρέχει πλεονεκτήματα.Ο συνδυασμός ερταπενέμης-κολιμυκίνης φαίνεται να παρέχει πλεονεκτήματα συνέργιας και ενίσχυσης του βακτηριοκτόνου αποτελέσματος κυρίως έναντι των ευαίσθητων στην κολιμυκίνη στελεχών ενώ φαίνεται να προστατεύει από την επιλογή ανθεκτικών στην ερταπενέμη κλώνων. Για τα ανθεκτικά στην κολιμυκίνη στελέχη δεν φαίνεται ο συνδυασμός να παρέχει πλεονεκτήματα, αντίθετα μπορεί να παρουσιάσει ανταγωνισμό σε σημαντικό ποσοστό.Σχετικά με το συνδυασμό πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη-κολιμυκίνη φαίνεται ότι η χρήση του μπορεί να συνοδεύεται από συνέργια και βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα μόνο όταν χρησιμοποιείται για ευαίσθητα στην κολιμυκίνη στελέχη.Παρά το γεγονός ότι οι συνδυασμοί κολιμυκίνης με καρβαπενέμες χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πράξη δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς in vitro ενώ δεν υπάρχουν καθόλου δεδομένα από πειραματικά μοντέλα σε ζωικά πρότυπα για τα πλεονεκτήματα τους σε σχέση με τη μονοθεραπεία. Ιδιαιτέρως πτωχή είναι η βιβλιογραφία για στελέχη που παράγουν VIM MBL καθώς η παρούσα είναι η μοναδική μελέτη. Παρόλο που τα αποτελέσματα για κάθε συνδυασμό φαίνεται να προσδιορίζονται από το στέλεχος, η παρατήρηση ότι η υψηλού επιπέδου αντοχή στην κολιμυκίνη επηρεάζει αρνητικά τα προσδοκώμενα οφέλη από το συνδυασμό φαίνεται ότι είναι σταθερή και πιθανότατα έχει κλινική σημασία.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑΟι συνδυασμοί ιμιπενέμης, μεροπενέμης, ερταπενέμης και πιπερακιλλίνης/ ταζομπακτάμης με κολιμυκίνη έναντι στελεχών K.pneumoniae που παράγουν VIM αναμένεται σε σημαντικό ποσοστό να εμφανίζουν συνέργια in vitro, υψηλότερο ποσοστό βακτηριοκτόνου δραστικότητας και να προστατεύουν από ανάπτυξη αντοχής στα μεμονωμένα αντιβιοτικά όταν χρησιμοποιούνται έναντι στελεχών με ευαισθησία ή χαμηλού επιπέδου αντοχή στην κολιμυκίνη. Είναι σκόπιμο όμως να αποφεύγεται η χρήση τους σε στελέχη με υψηλού επιπέδου αντοχή στην κολιμυκίνη γιατί μπορεί να οδηγήσει σε ανταγωνισμό ενώ δεν πλεονεκτεί σε βακτηριοκτόνο δραστικότητα. Η ακριβής MIC της κολιμυκίνης είναι απαραίτητη για την επιλογή και χρήση αυτών των συνδυασμών.