Analysis of the Results of Immunohistochemical Study of Biopsy Material of Patients with Chronic Hyperplastic Laryngitis
Authors: Шляга И.Д. , Колядич Ж.В. , Ачинович С.Л. , Мириленко Л.В. , Бич Т.А. , Киселев П.Г. , Шалыго И.Ф. 
Published: May 2023

Цель исследования. Провести анализ результатов иммуногистохимического исследования биопсийного материала пациентов с хроническим гиперпластическим ларингитом и дисплазией гортани. Материалы и методы. В исследование включен 51 пациент с клиническим диагнозом «хронический гиперпластический ларингит» (ХГЛ) – код по МКБ-10 J37.0 (35 (69%) мужчин и 16 (39%) женщин в возрасте от 21 года до 76 лет). Методами исследования были осмотр врача-оториноларинголога, морфологическое, в том числе иммуногистохимическое (ИГХ), исследование. Все пациенты, включенные в исследование, проходили лечение в УЗ «Гомельская областная клиническая больница» и УЗ «Гомельская областная специализированная клиническая больница» в 2017–2021 гг. по поводу ХГЛ: 1-я группа пациентов (n=30) имела дисплазию многослойного плоского эпителия (МПЭ) легкой степени, 2-я (n=21) – дисплазию МПЭ тяжелой степени. В 1-й группе мужчин было 17 (57%), женщин – 13 (43%), во 2-й – 3 (14%) и 18 (86%) соответственно. Возраст пациентов 1-й группы составил 45,0 (SD 13,5) года, от 21 года до 76 лет, пациентов 2-й группы – 56,6 (SD 7,8) года, от 47 лет до 71 года. Проведено патогистологическое, в том числе ИГХ, исследование биопсийного материала всех пациентов с ХГЛ. Для этого биопсийный материал фиксировался в 10% забуференном нейтральном формалине и подвергался стандартной парафиновой проводке: проводился через батарею спиртов, ксилол, парафин. Были изготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм, и гистологические препараты окрашивались гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование выполнялось с помощью системы визуализации MACH1 Universal HRP Polymer Kit (BioCare Medical, USA). В качестве хромогена применялся диаминобензидин. Использовались следующие первичные моноклональные антитела: p53, клон DO-7 (Leica Biosystems Newcastle, UK), BCL-2, клон bcl-2/100/D5 (Leica Biosystems Newcastle, UK), Epstein – Barr Virus, клон EBV6 (BioCare Medical, USA), Ki-67, клон ММ1 (Leica Biosystems Newcastle, UK), CD31, клон 1А10 (Leica Biosystems Newcastle, UK) и набор EGFR Kit (BioCare Medical, USA). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали при световой микроскопии: при позитивной экспрессии EGFR и CD31 оценивали окрашивание мембран, Ki-67 и р53 – ядер, Epstein – Barr Virus – мембран и парануклеарное окрашивание цитоплазмы, BCL-2 – ядерное и цитоплазматическое окрашивание. Экспрессию р53, BCL-2, Epstein – Barr Virus считали позитивной при окрашивании более 10% клеток. Результаты. При патогистологическом исследовании биопсийного материала в 1 (4%) случае были выявлены патогенные грибы рода Candida, в 46 (90%) случаях – морфологические признаки вирусной койлоцитотической атипии: увеличение ядер, пикноз и гиперхромазия ядер, перинуклеарное гало, анизоцитоз, утолщение цитоплазматической мембраны, образование многоядерных клеток. В 10 (20%) случаях определялись морфологические признаки неспецифической воспалительной инфильтрации. Экспрессия Epstein – Barr Virus выявлена при ИГХ-исследовании в 27 (53%) случаях. Было проведено сравнение экспрессии р53, bcl-2 и Ki-67 в группах с разной степенью дисплазии МПЭ. По числу случаев с экспрессией р53 в ядрах эпителиальных клеток (23% – в группе с дисплазией МПЭ легкой степени, 81% – в группе с дисплазией МПЭ тяжелой степени) исследуемые группы различались статистически значимо (р=0,005). По числу случаев экспрессии bcl-2 (13% – в 1-й группе и 76% – во 2-й) исследуемые группы также различались статистически значимо (р=0,001). По числу случаев с экспрессией Ki-67 в ядрах эпителиальных клеток в группах с дисплазией МПЭ легкой и тяжелой степени (30% и 57%) статистически значимых различий не было (р=0,16). Заключение. При медиане времени наблюдения за пациентами 29,6 мес. (от 4,4 до 41,7 мес.) по данным Белорусского канцер-регистра на 01.09.2022 в группе пациентов с ХГЛ с дисплазией МПЭ легкой степени выявлен 1 (3%) случай рака гортани, в то время как среди пациентов с дисплазией тяжелой степени число случаев рака гортани составило 10 из 21 (48%) (р<0,001), что свидетельствует о высоком потенциале малигнизации дисплазии МПЭ тяжелой степени. При наличии экспрессии р53 в биопсийном материале озлокачествление произошло в 37,5% случаев, bcl-2 – в 40% случаев, Ki-67 – в 33% случаев. Следовательно, степень дисплазии МПЭ для пациентов с ХГЛ является наиболее значимым показателем в прогнозе малигнизации процесса. В случаях затруднения точного определения степени поражения МПЭ рекомендуется проводить дополнительно ИГХ-исследование с вышеперечисленными маркерами для определения принадлежности пациента с ХГЛ к группе высокого риска малигнизации.

Purpose. To analyze the results of an immunohistochemical study of biopsy material from patients with chronic hyperplastic laryngitis and larynx dysplasia. Materials and methods. The study included 51 patients with a clinical diagnosis of chronic hyperplastic laryngitis (CHL) – MCD-10 code J37.0 (35 (69%) men and 16 (39%) women aged 21 to 76 years). The research methods included examination by an otorhinolaryngologist, morphological, including immunohistochemical (IHC) examination. All patients included in the study were treated at the Gomel Regional Clinical Hospital and at the Gomel Regional Specialized Clinical Hospital in 2017–2021 about CHL: the 1st group of patients (n=30) had mild stratified squamous epithelium (SSE) dysplasia, the 2nd (n=21) had SSE dysplasia. In the 1st group, there were 17 men (57%), women 13 (43%), in the 2nd group – 3 (14%) and 18 (86%), respectively. The age of patients in the 1st group was 45.0 (SD 13.5) years, from 21 to 76 years, in the 2nd group – 56.6 (SD 7.8) years, from 47 to 71 years. A pathohistological study, including IHC, of the biopsy material of all patients with CHL was performed. For this, the biopsy material was fixed in 10% buffered neutral formalin and subjected to standard paraffin wiring: it was passed through a battery of alcohols, xylene, and paraffin. Histological sections were made with a thickness of 4 μm and histological preparations were stained with hematoxylin and eosin. Immunohistochemical study was performed using the MACH1 Universal HRP Polymer Kit imaging system (BioCare Medical, USA). Diaminobenzidine was used as a chromogen. The following primary monoclonal antibodies were used: p53, clone DO-7 (Leica Biosystems Newcastle, UK), BCL-2, clone bcl-2/100/D5 (Leica Biosystems Newcastle, UK), Epstein-Barr Virus, clone EBV6 (BioCare Medical , USA), Ki-67, clone MM1 (Leica Biosystems Newcastle, UK), CD 31, clone 1A10 (Leica Biosystems Newcastle, UK) and EGFR Kit (BioCare Medical, USA). The results of the immunohistochemical reaction were assessed by light microscopy: with positive expression of EGFR and CD 31, membrane staining was assessed, Ki-67 and p53 – nuclei, Epstein – Barr Virus – membranes and paranuclear staining of the cytoplasm, BCL-2 – nuclear and cytoplasmic staining. Expression of p53, BCL-2, Epstein – Barr Virus was considered positive when more than 10% of cells were stained. Results. Histopathological examination of biopsy material in 1 (4%) case revealed pathogenic fungi of the genus Candida, in 46 (90%) cases – morphological signs of viral koilocytotic atypia: enlarged nuclei, pyknosis and hyperchromasia of nuclei, perinuclear halo, anisocytosis, thickening of the cytoplasmic membrane, the formation of multinucleated cells. In 10 (20%) cases, morphological signs of nonspecific inflammatory infiltration were determined. Expression of the Epstein – Barr Virus was detected by IHC study in 27 (53%) cases. The expression of p53, bcl-2 and Ki-67 was compared in groups with different degrees of SSE dysplasia. According to the number of cases with p53 expression in the nuclei of epithelial cells (23% in the group with mild SSE dysplasia, 81% in the group with severe SSE dysplasia), the studied groups differed statistically significantly (p=0.005). 2 (13% in group 1 and 76% in group 2), the study groups also differed statistically significantly (p=0.001). In terms of the number of cases with Ki-67 expression in the nuclei of epithelial cells in groups with mild and severe (30% and 57%) there were no statistically significant differences (p=0.16). Conclusion. With a median follow-up time of 29.6 months (from 4.4 to 41.7 months), according to the Belarusian Cancer Registry as of September 1, 2022, 1 (3%) case of laryngeal cancer was detected in the group of patients with CHL with mild SSE dysplasia, while among In patients with severe dysplasia, the number of cases of laryngeal cancer was 10 out of 21 (48%) (p<0.001), which indicates a high potential for malignancy of severe SSE dysplasia. In the presence of p53 expression in the biopsy material, malignancy occurred in 37.5% of cases, bcl-2 – in 40% of cases, Ki-67 – in 33%. Therefore, the degree of SSE dysplasia for patients with CHL is the most significant indicator in the prognosis of the process malignancy. In cases where it is difficult to accurately determine the degree of SSE damage, it is recommended to conduct an additional IHC study with the above markers to determine whether a patient with CHL belongs to a high-risk group for malignancy.