Structural and functional relationship of high-density lipoprotein (HDL) and its role in development of atherosclerosis
Authors: Δαλακούρα-Καραγκούνη Αικατερίνη 
Published: December 2024

Η καρδιαγγειακή νόσος είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) και αφορά σε διαταραχές της καρδιάς και των αιμοφόρων αγγείων, όπως η στεφανιαία νόσος (ΣΝ). Η ΣΝ προκαλείται από την αθηροσκλήρωση, μια χρόνια φλεγμονώδη διαταραχή του αρτηριακού τοιχώματος, που προκύπτει από μια ανισορροπία στο μεταβολισμό των λιπιδίων και τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Μέχρι σήμερα, πολυάριθμες επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του κινδύνου ανάπτυξης ΣΝ και των επιπέδων χοληστερόλης των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (High-Density Lipoprotein, HDL) στο πλάσμα. Ο παραπάνω συσχετισμός οδήγησε σε αρκετές κλινικές προσπάθειες που είχαν ως στόχο μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ΣΝ με φαρμακολογική αύξηση των επιπέδων της HDL χοληστερόλης. Ωστόσο, τα δυσμενή και παράδοξα ευρήματα που προέκυψαν από διαφορετικές κλινικές, επιδημιολογικές, πληθυσμιακές και γενετικές μελέτες έχουν μετατοπίσει το σύγχρονο επιστημονικό ενδιαφέρον από τη συγκέντρωση (ποσότητα) της HDL χοληστερόλης στη λειτουργικότητα (ποιότητα) των σωματιδίων της HDL η οποία ενσωματώνει πολλές πρωτεΐνες και λιπίδια με μοναδικές λειτουργίες. Δεδομένου ότι η διάκριση μεταξύ της ποσότητας και της ποιότητας της HDL χοληστερόλης είναι κρίσιμη και αντανακλά τις ευεργετικές πλειοτροπικές επιδράσεις της HDL έναντι της αθηροσκλήρωσης, ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι να διερευνήσει τη σχέση δομής-λειτουργίας της HDL και το ρόλο της στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης. Στο Υποκεφάλαιο 3.1 μελετήσαμε την επίδραση του ενζύμου μυελοϋπεροξειδάση (myeloperoxidase, MPO) στη δομή και τη λειτουργικότητα της HDL in vivo. Η MPO, μια υπεροξειδάση που προέρχεται από τα λευκοκύτταρα, εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και συνδέεται με την HDL μειώνοντας τη λειτουργικότητά της και συμβάλλοντας στην αθηροσκλήρωση. Επιπλέον, η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (αποA-I), το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό της HDL, κατέχει κεντρικό ρόλο στη βιοσύνθεση, τη δομή και τη λειτουργία της HDL αλληλοεπιδρώντας με έναν αριθμό υποδοχέων και ενζύμων. Οι προαναφερθείσες αλληλεπιδράσεις πυροδοτούν την ενεργοποίηση των αθηροπροστατευτικών ιδιοτήτων της HDL όπως την εκροή χοληστερόλης καθώς και τις αντι-οξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντι-αποπτωτικές και αντιθρομβωτικές της ιδιότητες. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε ανασυνδυασμένους αδενοϊούς που εκφράζουν την αγρίου τύπου και τις μεταλλαγμένες μορφές, Μet148Αla (M148A) και Tyr192Αla (Y192A), της ανθρώπινης αποA-I και της ανθρώπινης MPO και τους ενέσαμε σε ποντίκια με έλλειψη στο γονίδιο της αποΑ-Ι (αποΑ-Ι-/-). Μετά την ένεση των αδενοϊών, διαπιστώσαμε ότι τα ποντίκια με υπερεκφρασμένη MPO είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αποA-I και HDL στο πλάσμα χωρίς να επηρεάζεται η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη σύνθεση ή τον καταβολισμό της HDL στο ήπαρ. Στη συνέχεια, εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της υπερεκφρασμένης MPO στο ήπαρ ποντικών με έλλειψη στο γονίδιο της αποΑ-Ι αναλύοντας τα επίπεδα mRNA των προ- και αντι φλεγμονωδών κυτταροκοκινών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (αγγλ. qRT-PCR). Διαπιστώθηκε λοιπόν οτι η υπερέκφραση MPO μείωσε την μεταγραφική έκφραση των προ-φλεγμονωδών και αύξησε ή δεν επηρέασε την έκφραση των αντιφλεγμονωδών γονιδίων υποδηλώνοντας ότι η MPO δεν είχε τοξικές επιδράσεις στο ήπαρ. Επιπλέον, διερευνήσαμε την επίδραση της αγρίου τύπου ή μεταλλαγμένων μορφών της αποΑ-Ι και MPO στα παραγόμενα σωματίδια της HDL πραγματοποιώντας πειράματα ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων (2D electrophoresis) και χρωματογραφίας πρωτεϊνών υγρής φάσης (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC). Στο πλάσμα των ποντικών που υπερεκφράζουν την MPO, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στο μέγεθος της HDL ή στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα με εξαίρεση τα ποντίκια που εκφράζουν την αποA-I (M148A) στα οποία παρατηρήθηκε σημαντική παρουσία pre-β HDL σωματιδίων σε σχέση με τα σωματίδια άλφα (α), υποδηλώνοντας ότι η μετάλλαξη αποΑ-Ι (M148A) μπορεί να επηρεάσει την αναδιαμόρφωση της HDL. Τέλος, δείξαμε ότι η υπερέκφραση της MPO συσχετίστηκε με μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα των σωματιδίων HDL σε όλα τα ποντίκια. Είναι ενδιαφέρον ότι τα σωματίδια HDL που φέρουν την μεταλλαγή αποΑ-Ι (Y192A) παρουσίασαν ενισχυμένη εκροή χοληστερόλης μέσω του μεταφορέα ABCA1 (ATP binding cassette subfamily A member 1) στα μακροφάγα, ανεξάρτητη από την παρουσία της μυελοπεροξειδάσης, και αυτά τα ποντίκια είχαν μειωμένα επίπεδα χοληστερόλης χαμηλής πυκνότητας (αγγλ. LDL). Η μελέτη που συζητήθηκε στο Yποκεφάλαιο 3.2 πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το εργαστήριο της Καθηγήτριας Φαρμακογονιδιωματικής στην Ιατρική σχολή Αθηνών, κυρίας Δέσποινας Σανούδου και η συμμετοχή του εργαστηρίου μας σε αυτή αφορούσε στη διερεύνηση του αθηροπροστατευτικού δυναμικού της ανασυσταθείσας HDL (reconstituted HDL) που περιέχει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Ε3 (rHDL-apoE3), in vivo. Συγκεκριμένα, αξιολογήσαμε την δράση της rHDL-apoE3 υπό παθολογικές καταστάσεις. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια με απαλοιφή στο γονίδιο της αποΕ3 (αποΕ-/-), ένα καλά μελετημένο μοντέλο ποντικών με υπερχοληστερολαιμία, αθηροσκλήρωση και ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. Μετά την ένεση rHDL-apoE3 σε ποντίκια αποΕ-/-, βρήκαμε ότι μια εφάπαξ δόση οδήγησε σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα LDL στο πλάσμα συνοδευόμενα από αυξημένη συγκέντρωση χοληστερόλης στο ήπαρ, υποδηλώνοντας γρήγορη κάθαρση των σωματιδίων LDL μέσω δέσμευσης της αποΕ στους ηπατικούς υποδοχείς. Επιπλέον, η ανάλυση λιπιδίων του ορού σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία έδειξε ότι τα επίπεδα τριγλυκεριδίων αυξήθηκαν παροδικά σε ποντίκια που έλαβαν rHDL-apoE3 λόγω της γρήγορης κάθαρσης της αποΕ από την κυκλοφορία. Τέλος, για να αξιολογήσουμε την επίδραση της rHDL-apoE3 στην αγγειακή διαπερατότητα, χρησιμοποιήσαμε την μπλε χρωστική Evans blue, η οποία συνδέεται με τη λευκωματίνη και μεταφέρεται σε γειτονικούς ιστούς υπό παθολογικές συνθήκες όπου το ενδοθήλιο καθίσταται διαπερατό. Με βάση αυτό, διερευνήσαμε ότι μία μόνο ένεση rHDL-apoE3 στην ουραία φλέβα των αποΕ-/- ποντικών ήταν ικανή να βελτιώσει την αγγειακή διαπερατότητα, όπως αποδεικνύεται από τη μειωμένη συγκέντρωση της χρωστικής σε ορισμένους ιστούς όπως το στομάχι, η γλώσσα και η ουροδόχος κύστη. Στη συνέχεια, στο Υποκεφάλαιο 3.3 δημιουργήσαμε ανασυνδυασμένο αδενοϊό που εκφράζει την ανθρώπινη GALNT2 και την αναλύσαμε σε ποντίκια με έλλειψη στο ενδογενές γονίδιο της αποΑ-Ι, που τρέφονταν με κανονική ή πλούσια σε λιπαρά δίαιτα προκειμένου να διερευνήσουμε την επίδραση της ανθρώπινης GALNT2 στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών in vivo. Η ανθρώπινη GALNT2 είναι μια γλυκοτρανσφεράση και συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την γλυκοζυλίωση, μια από τις πιο σημαντικές μορφές μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων που επηρεάζει την αναδίπλωση, την επεξεργασία, την έκκριση και τις λειτουργίες των πρωτεϊνών. Οι αλλαγές στην κατάσταση γλυκοζυλίωσης των πρωτεϊνών σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις όπως η δυσλιπιδαιμία και η αθηροσκλήρωση. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, η υπερέκφραση της ανθρώπινης GALNT2 δεν επηρέασε το λιπιδαιμικό προφίλ των ποντικών που τρέφονταν με δίαιτα πλούσια σε λιπαρά HFD, αλλά αύξησε τη συνολική χοληστερόλη και την LDL και μείωσε τα επίπεδα HDL, τριγλυκεριδίων και VLDL σε ποντίκια που τρέφονταν με κανονική τροφή. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της GALNT2 ρυθμίζει το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών και υποδεικνύουν πιθανές πρωτεΐνες που σχετίζονται με το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών ως τροποποιητικά υποστρώματα για γλυκοζυλίωση. Ένα ενδιαφέρον εύρημα της παρούσας μελέτης ήταν ότι η υπερέκφραση της ανθρώπινης GALNT2 σε ποντίκια που τρέφονταν με κανονική τροφή είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στα επίπεδα mRNA των κύριων μεταβολικών ενδιάμεσων στην οδό της ενδοκυτταρικής σύνθεσης χοληστερόλης, που ελέγχεται από το SREBP-2. Το εάν η ανθρώπινη έκφραση GALNT2 σε συστήματα trans-Golgi και ER επηρεάζει την ενεργοποίηση του SREBP2 άμεσα ή έμμεσα μέσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Τέλος, η μελέτη που συζητήθηκε στο Υποκεφάλαιο 4.4 παρείχε τα εργαλεία για περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των συγκεκριμένων καταλοίπων της αποΑ-Ι στη δομή και τις λειτουργίες της HDL και στην πρόληψη και θεραπεία της αθηροσκλήρωσης. Δεδομένου ότι η μελέτη των μεταλλάξεων αποΑ-Ι με αδενο-διαμεσολαβούμενη μεταφορά σε ασθένειες που αναπτύσσονται σε μεγάλες περιόδους, όπως η αθηροσκλήρωση, ήταν απαγορευτική, αναπτύξαμε περαιτέρω ιικούς φορείς που σχετίζονται με αδενοειδείς φορείς που προάγουν τη μακροπρόθεσμη έκφραση του γονιδίου ενδιαφέροντος σε διάφορα ζωικά μοντέλα, καθιστώντας δυνατή την εξέταση χρόνιων ασθενειών. Για το λόγο αυτό, δημιουργήσαμε, ενισχύσαμε και καθαρίσαμε ανασυνδυασμένους αδενο-συσχετισμένους ιούς που εκφράζουν της αγρίου τύπου αποΑ-Ι (apoA-I wt) και τις μεταλλαγές αποΑ-Ι(Asp89Ala/Glu91Ala/Glu92Ala) [apoA-I(D89A/E91A/E92A)] και αποΑ-Ι(Leu218Ala/Leu219Ala/Val221Ala/Leu222Ala) [apoAI(L218A/L219A/V221A/L222A)] για μελλοντική χρήση και in vitro και in vivo μελέτες.