Μοριακοί μηχανισμοί ρύθμισης της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης
Authors: Γερασίμου Χριστίνα 
Published: January 2014

Η διαλυτή Γουανυλική Kυκλάση (δΓΚ) αποτελεί τον κύριο, ενδοκυττάριο υποδοχέα του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Όταν η δΓΚ διεγείρεται, καταλύει την μετατροπή της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) σε κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη (cGMP) και μέσω αυτής συμμετέχει σε μια πληθώρα διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων της αγγειακής χάλασης, της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, της αγγειογένεσης, του ανασχηματισμού των αγγείων και της συναπτικής μετάδοσης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε δύο πτυχές της μοριακής ρύθμισης της δΓΚ: 1) την ρύθμιση της από την πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (heat shock protein 90 - Hsp90) και 2) την ρύθμιση της από τις Δραστικές Μορφές Οξυγόνου (ΔΜΟ), των οποίων αυξημένα επίπεδα σε πολλές παθοφυσιολογικές καταστάσεις έχουν συνδεθεί με διαταραχές του μονοπατιού ΝΟ/cGMP. Όσον αφορά το πρώτο μέρος της διατριβής, αφού επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών, δείξαμε στη συνέχεια πως και οι δυο υπομονάδες της δΓΚ, α1 και β1, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν με την Hsp90. Επιπλέον, με πειράματα in vitro ανάλυσης πρόσδεσης εντοπίσαμε τη περιοχή της Hsp90 που ευθύνεται για την πρόσδεση της στην β1 υπομονάδα στα κατάλοιπα 237 έως 628 της Μ περιοχής της, ενώ για τη περιοχή μέσω της οποίας η β1 υπομονάδα αλληλεπιδρά με την Hsp90 δείξαμε ότι αυτή δεν περιλαμβάνει τα πρώτα 100 αμινοξέα της υπομονάδας. Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης της Hsp90 με την δΓΚ μελετήθηκε επωάζοντας λεία μυϊκά κύτταρα αορτής αρουραίων (RASM) με τους αναστολείς της Hsp90 γελνταναμυκίνη (GA) και ραντισικόλη (RAD) και προσδιορίζοντας τόσο τα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων της δΓΚ, όσο και τη παραγωγή cGMP από αυτήν. Η μακράς διάρκειας (24 ή 48 ώρες) αναστολή της Hsp90 είχε σαν αποτέλεσμα την δραστική μείωση των επιπέδων και των α1 και β1 υπομονάδων και της cGMP. Επιπλέον, η επώαση του ίδιου τύπου κυττάρων με τον αναστολέα του πρωτεοσώματος MG-132 ανέστρεψε πλήρως την επίδραση της GA στη δΓΚ, υποδηλώνοντας ότι η διαταραχή του δΓΚ/Ηsp90 συμπλόκου καθιστά τις υπομονάδες της δΓΚ ευάλωτες στην πρωτεοσωμική αποικοδόμηση. Συμπερασματικά, αποδείξαμε πως η πρόσδεση της Ηsp90 στη δΓΚ ρυθμίζει τον αριθμό των διαθέσιμων ενεργών ενζύμων, επηρεάζοντας τα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων. Όσον αφορά το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, δείξαμε πως η μακράς διάρκειας (12 και 24 ώρες) έκθεση RASM κυττάρων στο υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) και στους παράγοντες απελευθέρωσης ΔΜΟ ξανθίνη/οξειδάση της ξανθίνης (Χ/ΧΟ) και νατριούχο θειώδες άλας της μεναδιόνης (ΜSB), είχε σαν αποτέλεσμα την δραστική μείωση τόσο των α1 και β1 πρωτεϊνικών επιπέδων, όσο και της από το SNP επαγόμενης συσσώρευσης της cGMP. Επιπλέον, δείξαμε ότι ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας (PDGF) έχει παρόμοια επίδραση αρνητικής ρύθμισης στα πρωτεϊνικά επίπεδα της δΓΚ με αυτή που παρατηρήθηκε προηγουμένως από τις ΔΜΟ και επιβεβαιώσαμε πως η δράση του PDGF είναι εξαρτώμενη από τις τελευταίες. Η έκθεση των RASM κυττάρων στους αναστολείς του πρωτεοσώματος ΜG-132 και λακτακυστίνη δεν επηρέασε την ελάττωση της δΓΚ από τις ΔΜΟ, υποδηλώνοντας πως η επίδραση των τελευταίων στα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων της δΓΚ και στην ενεργότητα της μεσολαβούνται από μηχανισμούς ανεξάρτητους του πρωτεοσώματος. .............................................................................................................................