Διερεύνηση διασποράς στελεχών salmonella spp., σε ζώα, τρόφιμα ζωικής προέλευσης και στον άνθρωπο και ο ρόλος τους στη δημόσια υγεία
Authors: Παπαδόπουλος Θεόφιλος 
Published: September 2021

Οι σαλμονελώσεις αποτελούν μία από τις συχνότερες και περισσότερο διαδεδομένες τροφιμογενείς λοιμώξεις με αιτιολογικό παράγοντα τα βακτήρια του γένους Salmonella. Κάθε χρόνο περισσότερα από 100.000 κρούσματα αναφέρονται στις αρμόδιες αρχές στην Ευρωπαϊκή Ένωση, ενώ στην Ελλάδα η επίπτωσή τους κυμαίνεται στις 400. Συγκεκριμένοι ορότυποι σαλμονελών στον άνθρωπο προκαλούν λοιμώξεις που συχνά μπορούν να γίνουν συστηματικές και να οδηγήσουν στο θάνατο. Αν και οι οφειλόμενες στις σαλμονέλες τροφιμογενείς επιδημίες, συνήθως τυχαίνουν μεγάλης προβολής από τα Μέσα Μαζικής Ενημέρωσης, ένα ποσοστό της τάξης του 60% με 80% όλων των κρουσμάτων είτε δεν αναγνωρίζονται ως μέρος της επιδημίας και ταξινομούνται ως σποραδικά κρούσματα, είτε δεν αναφέρονται καθόλου στις αρμόδιες αρχές.Τα βακτήρια αυτά έχουν απομονωθεί από παραγωγικά ζώα, όπως πτηνά, χοίρους και βοοειδή, και από ζώα συντροφιάς κύρια ερπετά, σκύλους και γάτες. Οι σαλμονελώσεις στον άνθρωπο γενικά συνδέονται με την κατανάλωση μολυσμένων τροφίμων ζωικής προέλευσης (κυρίως αυγών, ερυθρού κρέατος, κρέατος πουλερικών και γάλακτος), αν και, πολλές φορές, άλλα τρόφιμα όπως φρούτα και λαχανικά φαίνεται να εμπλέκονται στη μετάδοση δρώντας ως μηχανικοί φορείς.Η Ευρωπαϊκή Ένωση, με γνώμονα την προστασία των καταναλωτών, έχει εφαρμόσει μια συνολική προσέγγιση για την αντιμετώπιση του θέματος καλούμενη «από το στάβλο στο πιάτο». Οι ορότυποι που εμπλέκονται κυρίως στα κρούσματα της ασθένειας στον άνθρωπο στις χώρες της Ε.Ε έχουν οριστεί από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή ως «ορότυποι σαλμονελών ιδιαίτερα σημαντικοί για τη Δημόσια Υγεία» (Salmonella Serovars of Public Health Significance) για τους οποίους εφαρμόζονται προγράμματα ελέγχου και καταπολέμησης από τις αρμόδιες αρχές. Η επιτήρηση και ο έλεγχος περιλαμβάνουν την οροτυποποίηση, την μελέτη της αντιμικροβιακής αντοχής καθώς και τη μοριακή υποτυποποίηση των στελεχών που απομονώνονται. Η μοριακή υποτυποποίηση εφαρμόζεται στην Ευρώπη, στις ΗΠΑ και σε άλλες χώρες, κυρίως με την Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE) και το Pulse-net Europe χρησιμοποιείται ως δίκτυο επιδημιολογικής επιτήρησης σε όλα τα κράτη μέλη για την επιτήρηση και την ανίχνευση επιδημιών σε πραγματικό χρόνο.Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανίχνευση πιθανών επιδημιολογικών διασυνδέσεων μεταξύ των σημαντικών για τη Δημόσια Υγεία οροτύπων σαλμονελών που απομονώνονται στη Ελλάδα από το 2007 έως το 2010 με τη βοήθεια φαινοτυπικών και μοριακών τεχνικών. Συνολικά 532 στελέχη απομονωμένα από διάφορες πηγές λήφθηκαν από τα Εργαστήρια Αναφοράς και μελετήθηκαν. Τα στελέχη ανήκαν στους 5 ορότυπους (Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser. Typhimurium, Salmonella ser. Hadar, Salmonella ser. Infantis and Salmonella ser. Virchow) για τους οποίους η ΕΕ έχει θέσει στόχο τη μείωση της επίπτωσής τους με βάση την παρούσα Ευρωπαϊκή Νομοθεσία. Διακόσια ογδόντα στελέχη απομονώθηκαν από νοσηλευόμενους ασθενείς σε 51 νοσοκομεία στην Ελλάδα, 83 προέρχονταν από υγιή ζώα και 69 από τρόφιμα ζωικής προέλευσης, όλα απομονωμένα στα πλαίσια των Επίσημων Ελέγχων και των Επίσημων Προγραμμάτων καταπολέμησης σε 38 περιοχές της χώρας. Το σύνολο των στελεχών που απομονώθηκαν στη χώρα μας το συγκεκριμένο χρονικό διάστημα από παραγωγικά ζώα και από τρόφιμα ζωικής προέλευσης συμπεριλαμβάνονται στην παρούσα διατριβή, με εξαίρεση τη Salmonella ser. Enteritidis για την οποία συμπεριελήφθησαν όλα τα στελέχη τα οποία απομονώθηκαν από το 2008 ως το 2010. Μεταξύ των στελεχών συμπεριλαμβάνονται όλα τα στελέχη που απομονώθηκαν από νοσοκομεία μεταξύ 2007 και 2010 για τους ορότυπους Salmonella ser. Hadar, Salmonella ser. Infantis και Salmonella ser. Virchow, όπως επίσης και ένα υποσύνολο των στελεχών για τις Salmonella ser. Enteritidis και Salmonella ser. Typhimurium.Όλα τα στελέχη ελέγχθηκαν για την αντοχή τους σε 20 αντιμικροβιακές ουσίες με χρήση της μεθόδου διάχυσης του αντιβιοτικού σε άγαρ (Agar Dilution Method). Η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση διασποράς των στελεχών και των πιθανών επιδημιολογικών διασυνδέσεων μεταξύ των στελεχών του κάθε ορότυπου με βάση το διεθνώς αποδεκτό πρωτόκολλο του Pulse-net που χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλή διακριτική ικανότητα. Τα ηλεκτροφορητικά μελετήθηκαν. Τα στελέχη ανήκαν στους 5 ορότυπους (Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser. Typhimurium, Salmonella ser. Hadar, Salmonella ser. Infantis and Salmonella ser. Virchow) για τους οποίους η ΕΕ έχει θέσει στόχο τη μείωση της επίπτωσής τους με βάση την παρούσα Ευρωπαϊκή Νομοθεσία. Διακόσια ογδόντα στελέχη απομονώθηκαν από νοσηλευόμενους ασθενείς σε 51 νοσοκομεία στην Ελλάδα, 83 προέρχονταν από υγιή ζώα και 69 από τρόφιμα ζωικής προέλευσης, όλα απομονωμένα στα πλαίσια των Επίσημων Ελέγχων και των Επίσημων Προγραμμάτων καταπολέμησης σε 38 περιοχές της χώρας. Το σύνολο των στελεχών που απομονώθηκαν στη χώρα μας το συγκεκριμένο χρονικό διάστημα από παραγωγικά ζώα και από τρόφιμα ζωικής προέλευσης συμπεριλαμβάνονται στην παρούσα διατριβή, με εξαίρεση τη Salmonella ser. Enteritidis για την οποία συμπεριελήφθησαν όλα τα στελέχη τα οποία απομονώθηκαν από το 2008 ως το 2010. Μεταξύ των στελεχών συμπεριλαμβάνονται όλα τα στελέχη που απομονώθηκαν από νοσοκομεία μεταξύ 2007 και 2010 για τους ορότυπους Salmonella ser. Hadar, Salmonella ser. Infantis και Salmonella ser. Virchow, όπως επίσης και ένα υποσύνολο των στελεχών για τις Salmonella ser. Enteritidis και Salmonella ser. Typhimurium.Όλα τα στελέχη ελέγχθηκαν για την αντοχή τους σε 20 αντιμικροβιακές ουσίες με χρήση της μεθόδου διάχυσης του αντιβιοτικού σε άγαρ (Agar Dilution Method). Η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση διασποράς των στελεχών και των πιθανών επιδημιολογικών διασυνδέσεων μεταξύ των στελεχών του κάθε ορότυπου με βάση το διεθνώς αποδεκτό πρωτόκολλο του Pulse-net που χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλή διακριτική ικανότητα. Τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα (παλσότυποι) που προέκυψαν συγκρότησαν μια βάση δεδομένων Ελληνικών στελεχών και υποβλήθηκαν για πρώτη φορά στη βάση δεδομένων Pulse-net με σκοπό τη σύγκριση τους με τα αντίστοιχα Ευρωπαϊκά. Για όλα τα στελέχη χρησιμοποιήθηκε η περιοριστική ενδονουκλεάση XbaI με εξαίρεση τα στελέχη Salmonella ser. Enteritidis για τα οποία χρησιμοποιήθηκε και η BlnI μόνη ή σς συνδυασμό με την XbaI. Επιπλέον, σε όλα τα στελέχη Salmonella ser. Hadar εφαρμόστηκε, για πρώτη φορά στη χώρα μας, η τεχνική της λυσιτυπίας, ενώ για ένα υποσύνολο των στελεχών που ανήκουν στους ορότυπους Enteritidis και Typhimurium χρησιμοποιήθηκε, επίσης για πρώτη φορά στην Ελλάδα, η πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (Multilocus Sequence Typing-MLST).Για τη Salmonella ser. Enteritidis η μελέτη αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες έδειξε αντοχή κυρίως στο ναλιδιξικό οξύ, σε ποσοστά που κυμάνθηκαν στο 25%, 26% και 5.9% μεταξύ των στελεχών που απομονώθηκαν από τρόφιμα, ζώα και τρόφιμα αντίστοιχα. Σαράντα πέντε παλσότυποι αναδείχθηκαν με βάση την περιοριστική ενδονουκλεάση XbaI, 48 με βάση την BlnI και 83 με βάση το συνδυασμό τους, μεταξύ των 175 στελεχών. Η υποβολή στη βάση δεδομένων Pulse-net Europe έδειξε πως 9 παλσότυποι είχαν παρόμοια προφίλ με αντίστοιχα στελέχη της βάσης με το SENTXB.0001 να είναι κυρίαρχο στην Ελλάδα (31.4%) όπως και στην Ευρώπη (56.4%). Ο συγκεκριμένος παλσότυπος ήταν παρών μεταξύ όλων των κατηγοριών στελεχών (τρόφιμα, ζώα και άνθρωποι) κάθε χρονιά μεταξύ 2007-2010 ενώ ο δεύτερος συχνότερος παλσότυπος ήταν ο SENTXB.0005 (16.58%). Η πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (MLST) έδειξε πως όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν, αν και ανήκαν σε διαφορετικούς παλσότυπους και παρουσίαζαν διαφορετικούς φαινότυπους αντοχής, κατατάχθηκαν στον MLST type ST11. Ο τύπος αυτός είναι ο πιο συχνός, μεταξύ των στελεχών που ανήκουν στον ορότυπο Enteritidis και έτσι αναδεικνύεται η αδυναμία της συγκεκριμένης μεθόδου για την υποτυποποίηση των στελεχών σε σχέση με τη διερεύνηση τυχόν επιδημιών για τα στελέχη αυτού του ορότυπου.Για τη Salmonella ser. Typhimurium η μελέτη αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες έδειξε εξαιρετικά υψηλά ποσοστά αντοχής. Όλα τα στελέχη ήταν ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη, ενώ τα ποσοστά αντοχής στη στρεπτομυκίνη, σουλφοναμίδες, τετρακυκλίνη και τριμεθοπρίμη ήταν 87%, 98%, 81% and 73%, αντίστοιχα, ενώ ο συχνότερος φαινότυπος αντοχής ήταν ο ASSuTmSpT. Η αντοχή στο αντιβιοτικό εκλογής για τη θεραπεία των ανθρώπινων λοιμώξεων, τη σιπροφλοξασίνη, ανήλθε συνολικά στο 23%, ενώ τα ποσοστά ήταν 31.5%, 2,4% και 9,5% για τα στελέχη από ανθρώπους, ζώα και τρόφιμα, αντίστοιχα. Η αντοχή στις κεφαλοσπορίνες τρίτης γενιάς (κεφτριαξόνη και κεφοταξίμη) κυμάνθηκε στο 7,9% και 7,4%, αντίστοιχα. Η ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου έδειξε υψηλή ετερογένεια μεταξύ των στελεχών στην Ελλάδα, όπως συμβαίνει και στην Ευρώπη, ενώ συνολικά 139 παλσότυποι αναδείχθηκαν μεταξύ των 189 στελεχών. Η υποβολή στη βάση Pulse-net Europe έδειξε πως μόνο 10 στελέχη κατατάχτηκαν μεταξύ των 30 συχνότερων παλσότυπων της βάσης. Η πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (MLST) έδειξε και εδώ πως αν και μελετήθηκαν στελέχη με διαφορετικούς παλσότυπους και φαινότυπους αντοχής, όλα κατατάχθηκαν στον MLST τύπο ST9 εκτός από ένα που κατατάχθηκε στον ST34. Τα αποτελέσματα και εδώ επιβεβαιώνουν την αδυναμία της MLST για τη παραπέρα υποτυποποίηση των στελεχών.Για τη Salmonella ser. Hadar εξαιρετικά υψηλά ποσοστά αντοχής παρατηρήθηκαν στην αμπικιλλίνη (85.8%), στρεπτομυκίνη (80.8%) και τετρακυκλίνη (75%) μεταξύ των 120 στελεχών. Παρατηρήθηκαν επίσης εξαιρετικά υψηλά αντοχής στο ναλιδιξικό οξύ (91.7%) και τη σιπροφλοξασίνη (88.3%), το εύρημα αυτό είναι πολύ σημαντικό γιατί αποτελει ένδειξη δυνητικής αποτυχίας της ακολουθούμενης θεραπείας με φθοριοκινολόνες. Σημαντικό επίσης εύρημα αποτέλεσε η κυριαρχία του παλσότυπου SHADXB.0001 στην Ελλάδα (58%), όπως και στην Ευρώπη, ενώ πολύ ενδιαφέρον στοιχείο αποτελεί πως ο κυρίαρχος λυσίτυπος ήταν ο PT1 (56%), ένας σπάνιος σχετικά λυσίτυπος για την υπόλοιπη Ευρώπη. Ο «κλώνος» SHADXB.0001 - PT1 (38%) βρέθηκε μεταξύ στελεχών απομονωμένων από ανθρώπους, τρόφιμα και πουλερικά και φαίνεται να απέκτησε πολλαπλή αντοχή κατά τη διάρκεια της εξέλιξής του, με τον φαινότυπο αντοχής ApSpTNxpCp να είναι ο κυρίαρχος (~25%) μεταξύ όλων των στελεχών. Φαίνεται λοιπόν πως ο κλώνος αυτός κυκλοφορούσε στην Ελλάδα τη συγκεκριμένη χρονική περίοδο μέσω της αλυσίδας διατροφής και πιθανόν ένας ενδημικός κλώνος του οποίου δεξαμενή ήταν πιθανόν οι πληθυσμοί των πουλερικών.Για τη Salmonella ser. Infantis, έναν σπάνιο ορότυπο για τη χώρα μας, η μελέτη την αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες έδειξε ανθεκτικότητα μόνο στη στρεπτομυκίνη σε ένα ποσοστό της τάξης του 25% μεταξύ των 40 στελεχών που μελετήθηκαν. Η αντοχή αυτή παρατηρήθηκε όμως μόνο μεταξύ των στελεχών ανθρώπινης προέλευσης σε ένα ποσοστό 43,5%, ενώ όλα τα υπόλοιπα στελέχη ήταν ευαίσθητα. Τριάντα ένα διαφορετικά ηλεκτροφορητικά πρότυπα αναδείχθηκαν μεταξύ των 40 στελεχών δείχνοντας υψηλού βαθμού ετερογένεια.Για τη Salmonella ser. Virchow μόνο 8 στελέχη μελετήθηκαν (5 ανθρώπινης προέλευσης και 3 από παραγωγικά ζώα), καθώς μόνο αυτά απομονώθηκαν στην Ελλάδα κατά την περίοδο της μελέτης. Τα 3 στελέχη από παραγωγικά ζώα αλλά και δύο από ανθρώπους ήταν ευαίσθητα στα αντιμικροβιακά που εξετάστηκαν, ενώ δύο στελέχη ανθρώπινης προέλευσης ήταν πολυανθεκτικά, με το ένα να έχει φαινότυπο αντοχής ApSAKTmpTNxpCp. Η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου έδειξε σημαντική ετερογένεια αναδείκνύοντας 8 διαφορετικούς παλσότυπους μεταξύ των 8 στελεχών.Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής μπορούν να αποτελέσουν μια βάση για τη διερεύνηση της επιδημιολογίας των σαλμονελώσεων στην Ελλάδα μέσω της χρήσης μοριακών τεχνικών. Η βάση δεδομένων η οποία δημιουργήθηκε, ακολουθώντας το διεθνώς αναγνωρισμένο πρότυπο του Pulse-net μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν αρχή για τη δημιουργία ενός συστήματος επιδημιολογικής επιτήρησης και ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο ενδεχόμενων τροφιμογενών επιδημιών.