Κρυσταλλογραφική μελέτη βιοδραστικών συμπλόκων του Ρουθηνίου με μοντέλα πρωτεϊνών
Authors: Χηνιάδης Λυκούργος 
Published: April 2022

Οι ενώσεις συναρμογής του Ru ελκύουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως εναλλακτικά αντικαρκινικά μεταλλοφάρμακα καθώς εμφανίζουν χαμηλότερη τοξικότητα και υψηλότερη εκλεκτικότητα έναντι συγκεκριμένων καρκινικών σειρών σε σχέση με τις ευρέως χρησιμοποιούμενες ενώσεις συναρμογής του Pt. Προηγούμενες μελέτες, εστιασμένες στη σύνθεση και βιολογική αξιολόγηση μεταλλοφαρμάκων Ru, έχουν αποδώσει τις ευνοϊκές ιδιότητες τους και το φαρμακολογικό τους προφίλ κυρίως στις αλληλεπιδράσεις τους με πρωτεΐνες καθώς το DNA δεν αποτελεί τον βασικό στόχο τους. Ως εκ τούτου, η διερεύνηση ερωτημάτων σχετικά με τον τρόπο πρόσδεσης, τις αλληλεπιδράσεις και την εκλεκτικότητα τους σε πρωτεϊνικές περιοχές πρόσδεσης αποτελούν κλειδιά για τη κατανόηση της δράσης τους ανοίγοντας νέους δρόμους στον σχεδιασμό ενώσεων συναρμογής του Ru με βέλτιστες φαρμακολογικές ιδιότητες. Στην παρούσα διατριβή τα ερωτήματα αυτά διερευνήθηκαν με δομική μελέτη, μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ, συμπλόκων μεταξύ ενώσεων συναρμογής Ru(II)/Ru(III) και πρωτεϊνικών στόχων. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες ενώσεις συναρμογής: Η Ένωση Συναρμογής-1 (ΕΣ-1) [RuII(1,4,7-trithiacyclononane) (ethane-1,2-diamine)Cl]+, η οποία αποτελεί ένωση συναρμογής τύπου «half-sandwich» του Ru(II) και η Ένωση Συναρμογής-2 (ΕΣ-2) [ImidazoleH]trans-[RuCl4(dmso-S)(imidazole)], η ευρέως γνωστή ως ΝΑΜΙ-Α ένωση συναρμογής του Ru(III), πολλά υποσχόμενο μεταλλοφάρμακο του Ru που έχει περάσει ήδη στις Φάσεις Ι/ΙΙ κλινικών δοκιμών. Ως πρωτεϊνικοί στόχοι για την ΕΣ-1 επιλέχθηκαν δύο ένζυμα: η Λυσοζύμη (hen egg-white lysozyme, HEWL), η οποία αποτελεί σύνηθες μοντέλο για τη διερεύνηση της πρόσδεσης μεταλλοφαρμάκων σε αυτήν, και η πρωτεϊνάση Κ (PK), η οποία χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ως μοντέλο πρωτεΐνης σε μελέτες μετάλλωσης, αναδεικνύοντας έναν πολύ καλό οδηγό για παρόμοιες έρευνες. Για την ΕΣ-2, η μελέτη έγινε με στόχο αποκλειστικά τη λυσοζύμη. Ο προσδιορισμός των κρυσταλλικών δομών επετεύχθη σε υψηλή (ατομική) διακριτότητα και από την ανάλυσή τους προέκυψαν τα ακόλουθα αποτελέσματα και συμπεράσματα. Η ΕΣ-1 (RuTE) συναρμόζεται μέσω ενός ομοιοπολικού δεσμού με τα εκτεθειμένα στο διαλύτη αμινοξικά κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος των ενζύμων-στόχων (Asp101 στην HEWL, Asp200 και Asp260 στην PΚ), έπειτα από απελευθέρωση του χλωρίου υποκαταστάτη ενώ παραμένουν οι δύο χηλικοί υποκαταστάτες της ένωσης. Οι κρυσταλλογραφικά προσδιορισμένες δομές παρουσιάζουν για πρώτη φορά την πρόσδεση σε πρωτεΐνη μίας ένωσης τύπου «half sandwich» του Ru(II) με τη σφαίρα συναρμογής της σχεδόν ακέραια. Από τη δομική ανάλυση προκύπτουν σημαντικά συμπεράσματα για τις περιοχές και τον τρόπο πρόσδεσης του RuTE σε συγκεκριμένα αμινοξικά κατάλοιπα των πρωτεϊνών και για τον ρόλο των υποκαταστατών του Ru(II) τόσο στην εκλεκτικότητα του RuTE σε σχέση με το ηλεκτροστατικό δυναμικό των ενζύμων-στόχων όσο και στην σταθεροποίηση των συμπλόκων μέσω δεσμών υδρογόνου, υδροφοβικών και αρωματικών αλληλεπιδράσεων. Η ΕΣ-2 (ΝΑΜΙ-Α) μελετήθηκε στο σύμπλοκό της με λυσοζύμη, μέσω της ανάλυσης 4 δομών που προσδιορίστηκαν από κρυστάλλους λυσοζύμης εμβαπτισμένους σε ΝΑΜΙ-Α για διαφορετικά χρονικά διαστήματα και συγκεκριμένα για 1.5, 8.0, 26 και 98 ώρες αντίδρασης. Οι 3 πρώτες δομές αποκαλύπτουν για πρώτη φορά την αρχική, μη ομοιοπολική, αλληλεπίδραση ακέραιου ΝΑΜΙ-Α με τη λυσοζύμη, ακολουθούμενη από μία σταδιακή ανταλλαγή όλων των υποκαταστατών του Ru εκτός του ιμιδαζολίου μέχρι τις 26 ώρες. Στα σύμπλοκα αυτά, εμφανίζονται 3 θέσεις πρόσδεσης του ΝΑΜΙ-Α στη HEWL, με το ιμιδαζόλιο να καθορίζει τη σταθεροποίηση τους. Στην τελική ένωση προσθήκης του Ru στις 98 ώρες, ένα ιόν Ru βρίσκεται συναρμοσμένο στην ιστιδίνη-15 της λυσοζύμης. Η δομή του συμπλόκου στις 98 ώρες βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες όμοιες κρυσταλλογραφικές μελέτες. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν έναν μηχανισμό δύο βημάτων στην πρωτεϊνική ρουθηνίωση και φανερώνουν τον ρόλο των υποκαταστατών στο βήμα της αναγνώρισης κατά τη διαδικασία αυτή.