Πειραματική μελέτη της παραγωγής ενζύμων και πολύ(υδροξυ αλκανοϊκών) εστέρων (PHAs) από θερμόφιλους και μεσόφιλους μικροοργανισμούς
Authors: Κρέτζα Ειρήνη-Αικατερίνη 
Published: August 2021

Στην παρούσα εργασία μελετάται η βιοτεχνολογική παραγωγή ενζύμων και βιοπολυμερών. Το ένζυμο που μελετάται είναι η θερμοάντοχη λιπάση από το βακτήριο Thermus thermophilus HB8. Για την αύξηση της παραγωγής της λιπάσης μελετήθηκε η επίδραση του αερισμούς και της πηγής άνθρακα. Οι καλύτερες συνθήκες αερισμού, αύξησαν τη βιομάζα και την παραγωγή της συνολικής λιπάσης. Οι πηγές άνθρακα που μελετήθηκαν είναι το ελαιόλαδο, η σουκρόζη και συνδυασμός τους. Η παρουσία του ελαιόλαδου, αύξησε την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης. Αντίθετα, η σουκρόζη δεν επηρέασε ιδιαίτερα την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης, αύξησε όμως την παραχθείσα ενδοκυττάρια λιπάση. Ο συνδυασμός ελαιόλαδου και σουκρόζης, αύξησε την παραγωγή της βιομάζας και της συνολικής λιπάσης. Για το χαρακτηρισμός της εξωκυττάριας λιπάσης, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός της. Τα στάδια καθαρισμού ήταν καθίζηση των πρωτεϊνών, με θειικό αμμώνιο και με αιθανόλη και με στήλη υδρόφοβής χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης. Το ένζυμο μετά το τελικό στάδιο καθαρισμού ήταν αρκετά καθαρό και δραστικό. Η εξωκυττάρια λιπάση που παράγεται από το βακτήριο έχει μοριακό βάρος 56 kDa και είναι σταθερή σε ουδέτερο και αλκαλικό περιβάλλον, καθώς και σε υψηλές θερμοκρασίες. Με σκοπό την αύξηση της δραστικότητας της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica με τη μέθοδο της καθήλωσης, μελετήθηκε η καθήλωση του ενζύμου με φυσική προσρόφηση σε σωματίδια χιτοζάνης, με ομοιοπολικό δεσμό σε σωματίδια Eupergit® C, και με εγκλεισμό σε αλγινικού και αλγινικού–πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια. Η καθήλωση της λιπάσης στα σωματίδια χιτοζάνης είχε ως αποτέλεσμα να μειώσει τη δραστικότητα του ενζύμου, σε αντίθεση με τον εγκλεισμό της σε σωματίδια αλγινικού, όπου αυξήθηκε σε σχέση με το ελεύθερο ενζύμο. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, εξετάστηκε η επίδραση των θρεπτικών συστατικών στην παραγωγή του πολυ-υδροξυαλκανοϊκού εστέρα (mcl-PHA) από το βακτήριο Pseudomonas putida KT2442. Μελετώντας την επίδραση δυο πηγών άνθρακα (οκτανοϊκό οξύ, γλυκόζη) στη παραγωγή του ΡΗΑ διαπιστώθηκε ότι η γλυκόζη καταναλώνεται προς παραγωγή βιομάζας ενώ το οκτανοϊκό οξύ προς παραγωγή ΡΗΑ. Μελετώντας την επίδραση διαφορετικών αρχικών συγκεντρώσεων της πηγής αζώτου στη διεργασία παραγωγής του ΡΗΑ διαπιστώθηκε ότι η αρχική συγκέντρωση του αζώτου στο μέσο ανάπτυξης δεν επηρεάζει την παραγωγή του ΡΗΑ. Οπότε, για την αύξηση της παραγωγής του ΡΗΑ, εξετάστηκε ο τρόπος τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα και αζώτου και διαπιστώθηκε ότι, μεγάλες μεταβολές της συγκέντρωσης της πηγής αζώτου, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, οδηγεί προς παραγωγή βιομάζας από παραγωγή ΡΗΑ. Ωστόσο, με συνεχή προσθήκη άνθρακα και αζώτου η παραγωγή του ΡΗΑ αυξήθηκε αυξάνοντας την παραγόμενη βιομάζα. Για την αύξηση του συσσωρευμένου ΡΗΑ, μελετήθηκε η επίδραση της έλλειψης φώσφορου και διαπιστώθηκε, ότι η έλλειψη του φωσφόρου δεν ενισχύει τη συσσώρευση του ΡΗΑ άλλα δρα παρεμποδιστικά στην περαιτέρω ανάπτυξη του βακτηρίου. Τέλος, ερευνήθηκε η επίδραση του μαγνησίου στη βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ και διαπιστώθηκε ότι, μια μεγάλη μεταβολή της συγκέντρωσης του μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, οδηγεί στον τερματισμό της ανάπτυξης του βακτηρίου ή στη μείωση του περιεχόμενου ΡΗΑ. Μελετώντας την επίδραση των διαφόρων θρεπτικών συστατικών στην παραγωγή του ΡΗΑ, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα και μαγνησίου, στην πορεία της καλλιέργειας, επηρεάζει την εξέλιξη του μοριακού βάρους του πολυμερούς.