Διερεύνηση μηχανισμών που εμπλέκονται στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της α-συνουκλεΐνης
Authors: Κουκουράκη Πελαγία 
Published: September 2021

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια πρωτεΐνη, που εκφράζεται κυρίως στο νευρικό σύστημα και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις, όπως είναι η νόσος του Πάρκινσον (PD) και στις νόσους γνωστές με τον όρο α-συνουκλεϊνοπάθειες. Συγκεκριμένα, η α-συνουκλεΐνη αποτελεί κύριο συστατικό των σωμάτιων Lewy (LB) στη σποραδική μορφή της νόσου του Πάρκινσον και στην άνοια με LB. Μέχρι σήμερα, έχουν εντοπιστεί σημειακές μεταλλάξεις και διπλασιασμοί ή τριπλασιασμοί του γενετικού τόπου της α-συνουκλεΐνης σε οικογένειες με αυτοσωμική επικρατή μορφή της νόσου. Η φυσιολογική της λειτουργία δεν είναι πλήρως εξακριβωμένη ωστόσο είναι πιθανό να εμπλέκεται στη συναπτική νευροδιαβίβαση. Στόχος της διατριβής είναι η μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης της α-συνουκλεΐνης σε μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο μέσω του 3’ και 5’ αμετάφραστου άκρου του mRNA της. Σημαντικό ρόλο στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση φαίνεται πως έχουν οι πρωτεΐνες που προσδένονται στα mRNAs (RNA Binding Proteins, RBPs). Οι RBPs μπορούν και προσδένονται στις 3΄αμετάφραστες περιοχές (3’UTR) των mRNAs επιδρώντας στην αποικοδόμηση, σταθερότητα ή και την πολυαδενυλίωσή τους. Μπορούν επίσης να ρυθμίζουν την εναλλακτική συρραφή ή την έξοδο του mRNA στόχου από τον πυρήνα και να καταστέλλουν τη μετάφραση είτε μέσω σύνδεσης στο 5’ αμετάφραστο άκρο (5’UTR) είτε μέσω της κωδικοποιούσας περιοχής είτε μέσω του 3’ αμετάφραστου άκρου (3’UTR). Όσον αφορά το 5’UTR και την επίδρασή του στη διαδικασία της μετάφρασης, έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα τα στοιχεία απόκρισης στον σίδηρο (Iron-Responsive Elements, IREs), οι τετραπλές δομές πλούσιες σε γουανίνη (G-quadruplex structures, δομές G-q) και οι εσωτερικές θέσεις πρόσδεσης ριβοσώματος (Internal Ribosome Entry Sites, IRESes) που επιδρούν στην μετάφραση. Έτσι, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ύπαρξη τέτοιων δομών και στοιχείων στο 5’UTR του mRNA της α-συνουκλεΐνης αλλά και η ρύθμιση των πρωτεϊνικών επιπέδων της μετά από αλληλεπίδραση με RBPs όπως η οικογένεια των πρωτεϊνών Hu και ο παράγοντας πρόσδεσης σε περιοχές πλούσιες σε Αδενίνη και Ουρακίλη (A+U-Rich Element Binding Factor 1, AUF1).Στα πλαίσια της μελέτης του 5’UTR, με βιοπληροφορική ανάλυση, διαπιστώθηκε ότι το μήκος του είναι σχεδόν δύο φορές μεγαλύτερο σε σχέση με το μέσο μήκος του 5’UTR των θηλαστικών και περιέχει νουκλεοτίδια G και C σε μεγάλο ποσοστό, υποδεικνύοντας πως είναι πιθανόν να σχηματίζει μια περίπλοκη δευτεροταγή διαμόρφωση.Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του 5’UTR στα πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος Neuro2A, η οποία δεν εκφράζει ενδογενώς την α-συνουκλεΐνη, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση πλασμιδίων που φέρουν την α-συνουκλεΐνη με ή χωρίς το 5’UTR. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν σχεδόν 100% αύξηση της έκφρασής της παρουσία του 5’UTR, χωρίς όμως να μεταβάλλονται τα επίπεδα του mRNA. Με στόχο να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος του 5’UTR της α-συνουκλεΐνης, κλωνοποιήθηκε το συγκεκριμένο τμήμα ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης. Μέτρηση δραστικότητας λουσιφεράσης αποκάλυψε ενίσχυση της μετάφρασης, χωρίς πάλι να μεταβάλλονται τα επίπεδα του υβριδικού mRNA. Τα παραπάνω δεδομένα υπέδειξαν την ύπαρξη δευτεροταγών δομών στο 5’UTR της α-συνουκλεΐνης, δυνητικά τα μοτίβα IRES, IRE και G-q. Ωστόσο, τα IRE και G-q μοτίβα δεν ανιχνεύθηκαν ή φάνηκαν να είναι αρνητικοί ρυθμιστές της μετάφρασης της α-συνουκλεΐνης. Ακόμα, το 5’UTR δεν βρέθηκε να διαθέτει δραστικότητα «κρυφού» υποκινητή, να βελτιώνει την έξοδο του mRNA από τον πυρήνα, ή να ενισχύει τη σταθερότητα του μεταγράφου. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε, επίσης, η ύπαρξη ενεργότητας IRES στο 5’UTR της α-συνουκλεΐνης. Τα 5’UTR που έχουν ενεργότητα IRES, συνήθως, έχουν μεγάλο μήκος, μεγάλο ποσοστό σε γουανίνη-κυτοσίνη, σταθερές δευτεροταγείς διαμορφώσεις και μεταφράζονται ανεξάρτητα από τον μηχανισμό της καλύπτρας. Συνεπώς, το πρώτο βήμα ήταν να διερευνηθεί αν η α-συνουκλεΐνη μεταφράζεται ακόμα και όταν αναστέλλεται η μετάφραση μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε ραπαμυκίνη, ένας χημικός αναστολέας του σηματοδοτικού μονοπατιού mTORC1 που επάγει τη μετάφραση, σε κύτταρα HEK293 και Neuro2A. Από τα πειράματα αυτά φάνηκε αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης, χωρίς να μεταβάλλονται τα επίπεδα του mRNΑ. Ομοίως, διαπιστώθηκε ενίσχυση της έκφρασης της υβριδικής λουσιφεράσης μετά από έκθεση σε ραπαμυκίνη όταν ανοδικά του γονιδίου της υπήρχε το 5’ UTR της α-συνουκλεΐνης. Συμπερασματικά, φαίνεται πως το mRNA της α-συνουκλεΐνης μεταφράζεται ακόμα και σε συνθήκες αναστολής της μετάφρασης μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας, υποδεικνύοντας την ύπαρξη ενεργότητας IRES στο 5’UTR. Πειράματα εντοπισμού της δομής IRES αποκάλυψαν πως απαιτούνται όλες οι βάσεις για να είναι πλήρης η ενεργότητά της. Είναι γνωστό πως τα γονίδια που έχουν ενεργότητα IRES εκφράζονται σε μεγαλύτερο βαθμό υπό συνθήκες στρες. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε τιτλοδότηση της επίδρασης οξειδωτικών παραγόντων, σχετιζόμενων με τη νόσο του Πάρκινσον, σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η εκπόλωση με KCl και οι οξειδωτικοί παράγοντες 6-OHDA, MΡΡ+ και FeSO4 μπορούν να προκαλέσουν αύξηση των ενδογενών πρωτεϊνικών επιπέδων της α-συνουκλεΐνης, χωρίς να μεταβάλλουν τα επίπεδα του mRNA. Προσθήκη των ίδιων παραγόντων σε κύτταρα Neuro2A, που υπερεκφράζουν την α-συνουκλεΐνη με ή χωρίς το 5’UTR, αποκάλυψε πως η παρουσία του 5’UTR είναι θετικός ρυθμιστής της μετάφρασης σε συνθήκες στρες.Ακολούθως, εντοπίστηκαν περιοχές πιθανής αλληλεπίδρασης του mRNA της α-συνουκλεΐνης με τις πρωτεΐνες Hu και AUF1, μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης. Πράγματι, τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης RNA αποκάλυψαν σύνδεση του 3’UTR της α-συνουκλεΐνης με αυτές τις πρωτεΐνες και έτσι, μελετήθηκε η επίδραση αυτών στα πρωτεϊνικά επίπεδά της. Αποκαλύφθηκε πως οι HuR, HuB, HuC και AUF1 μειώνουν τα πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά HEK293, ενώ τα επίπεδα του mRNA μειώθηκαν μόνο μετά την επίδραση της AUF1. Επίσης, επιμόλυνση με αδενοϊούς που υπερεκφράζουν τις Hu μείωσε τα ενδογενή πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά SH-SY5Y. Ομοίως, αποδείχθηκε μείωση της ενδογενούς πρωτεΐνης και των επιπέδων mRNA της α-συνουκλεΐνης στην κυτταρική σειρά SK-N-SH, μετά από υπερέκφραση της AUF1. Συγκρίνοντας τα πρότυπα έκφρασης των mRNAs των Hu με την α-συνουκλεΐνη σε εγκεφάλους μυών, βρέθηκε πως υπάρχει αρνητική συσχέτιση σε περιοχές όπως ο φλοιός και ο μεσεγκέφαλος. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πως το μήκος του 3’UTR σχετίζεται με την παθογένεια της PD. Δείγματα ασθενών εμφανίζουν υψηλότερη αναλογία του mRNA της α-συνουκλεΐνης με μεγάλο μήκος 3΄UTR (2,550 βάσεις) σε σχέση με το μικρού μήκους. Επίσης, το μήκος του 3΄UTR φαίνεται να σχετίζεται με τη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης σε παθολογικές καταστάσεις. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε και η επίδραση των Hu και AUF1 στη ρύθμιση της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης του mRNA της α-συνουκλεΐνης. Φάνηκε πως μόνο οι HuC και ΗuD μπορεί να αποτελούν ρυθμιστές της πολυαδενυλίωσης στην κυτταρική σειρά HEK293 καθώς ευνοούν την ύπαρξη του μεγάλου μήκους 3’UTR. Συνολικά, φαίνεται πως η μετα-μεταγραφική ρύθμιση της α-συνουκλεΐνης διαμεσολαβείται τόσο από πρωτεΐνες που συνδέονται με το 3’UTR του mRNA της και παρεμποδίζουν την μετάφρασή του, όσο και από το 5’UTR που -αντίθετα-, ενισχύει τη μετάφραση του mRNA της, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες. Επιπλέον διαπιστώθηκε πώς το 5’UTR της α-συνουκλεΐνης εμπεριέχει δραστικότητα IRES γεγονός που σημαίνει πως το mRNA της α-συνουκλεΐνης μεταφράζεται ακόμα και σε συνθήκες αναστολής της μετάφρασης μέσω του μηχανισμού της καλύπτρας.