Παράγοντες που επηρεάζουν τη διάρκεια και το ύψος της ιαιμίας και την ικανότητα μετάδοσης του ιού του καταρροϊκού πυρετού στο πρόβατο
Authors: Χατζηνάσιου Ευαγγελία 
Published: January 2014

Ο καταρροϊκός πυρετός είναι μία αρθροποδομεταδιδόμενη νόσος, που προσβάλλει το πρόβατο και άλλα κατοικίδια και άγρια μηρυκαστικά. Οφείλεται στον ιό Bluetongue (Bluetongue Virus, BTV), έναν dsRNA ιό, που αποτελεί το πρότυπο είδος του γένους Orbivirus, ανήκει στην οικογένεια Reoviridae, και μεταδίδεται με έντομα του γένους Culicoides. Μέχρι σήμερα ο BTV έχει 26 ορότυπους. Στο πρόβατο προκαλεί νόσο που χαρακτηρίζεται από πυρετό, αιμορραγία, φλεγμονή, εξοίδηση και κυάνωση του στοματικού και ρινικού βλεννογόνου, οίδημα κεφαλής και τραχήλου, στρεψαυχενισμό, ποδοδερματίτιδα και ενδονυχίτιδα. Στην τελευταία επιζωοτία που εμφανίστηκε στην Ελλάδα (1998 – 2001), η νόσος προκάλεσε ήπια συμπτώματα στα πρόβατα. Γενικώς, η διάρκεια και η βαρύτητα της νόσου διαφέρουν ανάλογα με τη φυλή του προβάτου, τον ορότυπο/στέλεχος του ιού και την ανοσολογική αντίδραση του κάθε ζώου.Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσο η ανοσοκαταστολή ή η ανοσοενίσχυση θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εξέλιξη της λοίμωξης και να παίξουν ρόλο στη μετάδοση του ιού, αυξάνοντας τον τίτλο του λοιμογόνου ιού στο αίμα, την παραμονή του στο ζώο και τη μετάδοσή του με τους ξενιστές.Πριν το κυρίως πείραμα προηγήθηκαν τρεις απαραίτητες βασικές προκαταρκτικές μελέτες. Η πρώτη είχε ως σκοπό τη διαμόρφωση του πειραματικού προτύπου μόλυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πρόβατα δύο ελληνικών φυλών, Καραγκούνικης και Χίου, που μολύνθηκαν με τον ορότυπο BTV–9 (GR 199/98RS) υποδόρια και ενδοδερμικά με 105,75-106 TCID50/ml, και τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν βάσει των συμπτωμάτων, της ιαιμίας και των νεκροτομικών αλλοιώσεων. Το πρόβατο της Καραγκούνικης φυλής ήταν πιο ευαίσθητο από εκείνο της Χίου κι έτσι επιλέχθηκε για τα επόμενα πειράματα. Η δεύτερη μελέτη αφορούσε στη διαμόρφωση της μεθόδου ανοσοκατατολής ή ανοσοενίσχυσης στο πρόβατο, για τα οποία η βιβλιογραφία είναι εξαιρετικά φτωχή. Επιλέχθηκε η χρήση κυκλοφωσφαμίδης για την πρόκληση ανοσοκαταστολής, της οποίας μία δόση των 37,5 mg/kg (ενδοφλεβίως) βρέθηκε ότι προκαλεί σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία, που αποτελούν δείκτες ανοσοκαταστολής. Συγκεκριμένα, υπήρξε μείωση των Τ- και Β- λεμφοκυττάρων από την 3η έως τη 12η ημέρα, και των βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων από την 3η έως την 8η ημέρα. Η ανοσοκαταστολή διατηρήθηκε τουλάχιστον 8 ημέρες μετά την έγχυση της φαρμακευτικής ουσίας, ενώ τα λευκοκύτταρα και οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί επανήλθαν στις φυσιολογικές τους τιμές μετά τη 12η ημέρα. Για την ανοσοενίσχυση επιλέχθηκε το πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund, στη δόση των 3 ml ανά ζώο, που όμως είχε ως αποτέλεσμα φυσιολογικές τιμές κυττάρων του αίματος. Στην τρίτη μελέτη συγκρίθηκαν έξι μέθοδοι εκχύλισης του ιικού γενώματος (dsRNA) του BTV, βελτιώθηκε το πρωτόκολλο αποδιάταξης του dsRNA του ιού και αξιολογήθηκε ο σχεδιασμός μιας ποσοτικής πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR), χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος πειραματικά μολυσμένων προβάτων. Η βελτιστοποίηση των μεθόδων εκχύλισης του BTV και της qRT-PCR θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν στις μελέτες της μετάδοσης της νόσου, στην παθογένεια και στην αξιολόγηση εμβολίων, καθώς και στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση και άλλων dsRNA ιών. Από το σύνολο των πειραματισμών αποδείχθηκε ότι ο τίτλος του ιού, εκφρασμένος σε EID50/ml, εμφάνισε υψηλό βαθμό συσχέτισης με τα dsRNA αντίγραφα του BTV που προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή παρουσιάζει γραμμικότητα μέχρι την 28η ημέρα μετά τη μόλυνση, γεγονός που καθιστά δυνατή τη χρήση της qRT-PCR για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του ιού στο αίμα του ζώου μέχρι την ημέρα αυτή, ώστε να αποφευχθεί ο ενοφθαλμισμός εμβρυοφόρων αυγών, που είναι χρονοβόρος και επίπονη διαδικασία.Στο τελικό πείραμα έγινε ανοσοκαταστολή ή ανοσοδιέγερση Καραγκούνικων προβάτων. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε 4 ομάδες, τις Α (Α1 & Α2), Β, Γ και Δ. Στα ζώα των υποομάδων Α1 και Α2 χορηγήθηκε κυκλοφωσφαμίδη και στα ζώα της ομάδας Β το πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund. Τα ζώα της υποομάδας Α1 και αυτά των ομάδων Β και Γ μολύνθηκαν με τον BTV–9, ενώ τα ζώα της ομάδας Δ χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες περιβάλλοντος. Παρατηρήθηκε ότι τα ανοσοκατεσταλμένα πρόβατα (υποομάδα Α1), σε σχέση με τα μη ανοσοκατεσταλμένα (ομάδα Γ), εμφάνισαν νωρίτερα πυρετό και ιαιμία (ανίχνευση ιού από την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση έναντι της 4ης), με υψηλότερο τίτλο ιού (0,73±0,11 log10 ECEs/ml ερυθροκυττάρων) από την 3η έως την 7η ημέρα μετά τη μόλυνση. Χαρακτηριστικό είναι ότι ανοσοκαταστολή προκάλεσε και ο ιός, αφού τα μολυσμένα με BTV ζώα παρουσίασαν σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία από την 1η ημέρα μετά τη μόλυνση. Συγκεκριμένα, υπήρξε μείωση των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD4+) και των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD8+) που διήρκησε 3 ημέρες περίπου, ενώ την 7η ημέρα επανήλθαν στις φυσιολογικές τους τιμές.Ωστόσο τα ανοσοκατεσταλμένα πρόβατα (υποομάδα Α1) είχαν μεγαλύτερη μείωση του αριθμού των λευκοκυττάρων και ιδιαίτερα των Β-λεμφοκυττάρων σε σχέση με τα μη ανοσοκατεσταλμένα (ομάδα Γ). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση, κατά μία ημέρα, της εμφάνισης αντισωμάτων στα ζώα της υποομάδας Α1. Εντούτοις, δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στους τίτλους των εξουδετερωτικών αντισωμάτων μεταξύ ανοσοκατεσταλμένων και μη προβάτων μέχρι το τέλος του πειράματος (93η ημέρα μετά τη μόλυνση). Επομένως, η κυκλοφωσφαμίδη στη δόση και στην οδό χορήγησης που χρησιμοποιήθηκε επηρέασε σε σχετικά μικρό βαθμό τη χυμική και την κυτταρική ανοσία του προβάτου, την ένταση της ιαιμίας και κατ’ επέκταση την ικανότητα μετάδοσης του ιού, αλλά μόνο για 10 ημέρες, επομένως ελάχιστα ή οριακά θα μπορούσε να συμβάλλει σε αυξημένη μετάδοση του ιού. Τέλος, σχετικά με την ομάδα Β (πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund) δεν υπήρξαν ενδείξεις ανοσοενίσχυσης, αφού οι ανοσολογικές εξετάσεις των ζώων έδειξαν ότι οι τιμές των Β- και Τ- λεμφοκυττάρων ήταν παρόμοιες με εκείνες των ζώων της ομάδας Γ. Επίσης ο ιός ανιχνεύτηκε με qRT-PCR και απομονώθηκε σε εμβρυοφόρα αυγά, όπως και στην ομάδα Γ, τέσσερις ημέρες μετά τη μόλυνση και οι τίτλοι του ιού ήταν παρόμοιοι.