Μοριακός καρυότυπος στην προγεννητική διάγνωση
Authors: Ευαγγελίδου-Μαυρογένη Πάολα 
Published: August 2021

Η χρωμοσωμική εξέταση είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται στην προγεννητικήδιάγνωση για δεκαετίες, για τη διάγνωση αριθμητικών και μεγάλων δομικώνανωμαλιών (< 3-10 Mb). Με την εισαγωγή της μεθοδολογίας του συγκριτικούγενωμικός υβριδισμού με μικροστυστοιχίες (array CGH) στην μεταγεννητικήανάλυση και τη χρήση τους ως την πρώτη επιλογή εξέτασης σε περιπτώσεις ατόμωνμε διανοητική αναπηρία, έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η μέθοδος αυτή μπορεί κάποιαμέρα να αποτελέσει τη πρώτη μέθοδο επιλογής και στην προγεννητική διάγνωση. Ηarray CGH έχει αποδειχθεί να είναι μια τεχνολογία υψηλής απόδοσης, περιεκτική καιγρήγορη. Έχει επίσης την ικανότητα να ανιχνεύει αλλαγές σε γενετικό υλικό που ναείναι μη ανιχνεύσιμες στο μικροσκόπιο.Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η εφαρμογή υψηλής ευκρίνειας μικροσυστοιχιώνστην προγεννητική διάγνωση για τον εντοπισμό κρυπτικών μικροδιπλασιασμών καιμικροελλειμάτων σε έμβρυα με φυσιολογικό καρυότυπο αλλά με σοβαράυπερηχογραφικά ευρήματα (συγγενείς ανωμαλίες, δυσμορφίες) και επίσης ναδιερευνήσει περαιτέρω σε έμβρυα με ήδη ανιχνευμένες, με άλλες μεθόδους,ανωμαλίες με ισορροπημένες ή μη ισορροπημένες ανακατατάξεις με ή χωρίςυπερηχογραφικά ευρήματα. Αυτή η έρευνα είχε ως στόχο να προσφέρει νέεςεπιστημονικές γνώσεις και οφέλη στην εμβρυϊκή ιατρική και στη γενετική, και νααποδείξει ότι είναι δυνατή η εφαρμογή της array CGH στην προγεννητική διάγνωση.Array CGH πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση μικροσκοπικών χρωμοσωμικώνατυπιών, χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμες μικροσυστοιχίες με BAC κλώνουςκαι μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων (Cytochip, BlueGnome, UK), καθώς και μεμικροσυστοιχίες με BAC κλώνους με μερική αλληλοεπικάλυψη του ΙνστιτούτουSanger. Οποιεσδήποτε αλλαγές ανιχνεύθηκαν στον αριθμό αντιγράφων του DNAεπιβεβαιώθηκαν και από δεύτερη μέθοδο. Αναλύθηκαν συνολικά 202 περιστατικά, εκ των οποίων τα 129 ήταν προγεννητικές, και 64 δείγματα από γονείς. Οιπρογεννητικές παραπομπές έγιναν είτε διότι: 1) είχαν φυσιολογικό καρυότυπο ενώταυτόχρονα είχαν υπερηχογραφικά ευρήματα, 2) ισορροπημένη ανακατάταξη στονκαρυότυπο και υπερηχογραφικά ευρήματα, 3) ισορροπημένη ανακατάταξη στονκαρυότυπο χωρίς όμως υπερηχογραφικά ευρήματα, 4) ανωμαλία στον καρυότυποκαι υπερηχογραφικά ευρήματα, 5) ανίχνευση ανωμαλίας στον καρυότυπο /MLPA/QF-PCR χωρίς όμως υπερηχογραφικά ευρήματα τα οποία χρειάζοντανπεραιτέρω διερεύνηση, 6) κάποια περιστατικά που παρόλο ότι είχαν φυσιολογικόκαρυότυπο και καθόλου υπερηχογραφικά ευρήματα, διενεργήθηκε array CGH είτελόγω ανησυχίας των γονιών λόγω ύπαρξης ανωμαλίας σε προηγούμενη κύηση ή γιανα αποκλείσει μια πιθανή ανωμαλία που αποκαλύφθηκε κατά τη ανάλυση μεκαρυότυπο / MLPA / QF-PCR.Πενήντα προγεννητικές αναλύθηκαν με BAC arrays ευκρίνειας μίας Μεγαβάσης, 34με μικροστυστοιχίες 105,000 ολιγονουκλεοτιδίων και 11 με μικροστυστοιχίες 180,000ολιγονουκλεοτιδίων, και 34 δείγματα αναλύθηκαν με Tiling Path BAC array.Ανιχνεύθηκαν 17 ανώμαλα περιστατικά με την array CGH ποσοστό που ανέρχεταιστο 17.9% (17/95). Επτά από τα ανώμαλα περιστατικά προέρχονταν απόεγκυμοσύνες με φυσιολογικό καρυότυπο και ευρήματα στους υπέρηχους, ενώ 9(9/17, 53%) από τις ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν αποτελούσαν διερεύνησηπεριστατικών με ανωμαλίες που διαγνώστηκαν με άλλες μεθόδους (χρωμοσωμικήεξέταση, MLPA, QF- PCR). Αποκλείοντας τα εννέα αυτά περιστατικά από τουςυπολογισμούς μας το ποσοστό ανίχνευσης της μεθόδου αυτής είναι 8.1% (7/86).Το σύνολο των περιστατικών της μελέτης αυτής περιλάμβανε και 34 περιστατικά μεφυσιολογικό καρυότυπο στα οποία έγινε τερματισμός εγκυμοσύνης λόγω σοβαρώνυπερηχογραφικών ευρημάτων. Η ανάλυση κατά array CGH των 34 αυτών εμβρύωνφανέρωσε 627 αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων του DNA (CNC). Κατόπινσυγκρίσεως των αλλαγών αυτών στη γενετική σύσταση αυτών των εμβρύων με γνωστές ανωμαλίες που απαριθμούνται σε δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων,DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans usingEnsembl Resources), DGV (Database of Genomic Variants) καθορίστηκε ότι οιπλείστες περιέχονται στη λίστα πολυμορφισμών και εξαιρέθηκαν από περαιτέρωδιερεύνηση. Αυτές οι αλλαγές δεν θεωρήθηκαν κλινικής σημασίας εφόσον βρέθηκανκαι σε φυσιολογικούς μάρτυρες, κι επομένως το πιο πιθανόν να μην σχετίζονται μετις υπερηχογραφικές ανωμαλίες των εμβρύων αυτών.Τέλος ανάμεσα στα 202 δείγματα υπήρχαν και 73 περιστατικά από αυτόματεςαποβολές/ ενδομήτριος θάνατος /Θνησιγένεια (POC/SB) τα οποία είχαν αρχικάπαραπεμφθεί για χρωμοσωμική εξέταση. Λόγω όμως του γεγονότος ότι ταπεριστατικά αυτά δεν αναπτυχθήκαν στις καλλιέργειες επιπρόσθετο υλικό πουπαρακρατήθηκε από αυτά χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση DNA, ούτως ώστε ναχρησιμοποιηθεί για ανάλυση με άλλες μεθόδους (QF- PCR και array CGH).Από τα 73 POC/SB αυτά δείγματα, 16 περιστατικά ολοκληρώθηκαν μόνο με τημέθοδο της Ποσοτικής Φθορίζουσας Αλυσιδωτής αντίδρασης της Πολυμεράσης (QFPCR),καθώς με αυτή ανιχνεύθηκε επιτυχώς ο λόγος της αποβολής και δεν υπήρχελόγος να προχωρήσουμε σε περαιτέρω διερεύνηση. Στα υπόλοιπα 57 περιστατικάεφαρμόστηκε η array CGH.Από τις 16 ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν με την μέθοδο QF-PCR, οι 13 ήταναποβολές πρώτου τριμήνου και οι τρεις ήταν αποβολές δευτέρου τριμήνου. Σ’ αυτέςσυμπεριλαμβάνονταν 4 τριπλοειδίες, 8 αυτοσωμικές τρισωμίες και 4 ανωμαλίες τωνφυλετικών χρωμοσωμάτων. Από τα 57 περιστατικά των οποίων η ανάλυσηδιεκπεραιώθηκε με array CGH, τα 49 αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες BAC και τα 8αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Συνολικά ανιχνεύτηκαν 9ανευπλοειδίες με μικροσυστοιχίες BAC, από τις οποίες οι 7 ήταν αυτοσωμικές και οι2 ήταν ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Οκτώ από τις ανευπλοειδίες αυτές ήταν πρώτου τριμήνου και μία ήταν δευτέρου. Επιπρόσθετα με εφαρμογήμικροσυστοιχίας ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνεύθηκε και μια καλοήθης CNCκληρονομημένη από τον ένα γονιό.Η εφαρμογή της μεθόδου array CGH έχει αποδειχθεί ένα πολύτιμο εργαλείο για τονπροσδιορισμό των αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων σε παιδιά με συγγενείςανωμαλίες και έχει αντικαταστήσει τη χρωμοσωμική ανάλυση σε αρκετά εργαστήρια.Έχει αποδειχθεί επίσης η αξία της στη χρήση της και σε αποβολές/ Ενδομήτριουθανάτου /Θνησιμότητας, όπως φαίνεται στην παρούσα μελέτη έχοντας τοπλεονέκτημα να παρακάμψει τις τεχνικές δυσκολίες που συναντούμε συχνά καισχετίζονται με την αδυναμία ανάπτυξης ινοβλάστων σε καλλιέργεια, και ακολούθωςστη αποτυχία διάγνωσης του περιστατικού με την κλασσική κυτταρογενετική.Στη προγεννητική διάγνωση η χρωμοσωμική ανάλυση εξακολουθεί να αποτελεί τηνπρώτη επιλογή εξέτασης. Η μέθοδος αυτή πρέπει να ξεπεράσει κάποιους από τουςπεριορισμούς της πριν να μπορέσει να αντικαταστήσει ίσως τη χρωμοσωμικήεξέταση. Έχει αποδειχθεί όμως τόσο από εμάς όσο και από αποτελέσματα άλλων,ότι η συχνότητα ανίχνευσης των αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων με κλινικήσημασία αυξάνεται κατά 8%, με την εφαρμογή της array CGH σε περιπτώσεις μεφυσιολογικό καρυότυπο και υπερηχογραφικά ευρήματα στο έμβρυο, οπότε ημέθοδος αυτή ίσως να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρύτερα και στην προγεννητικήδιάγνωση. Επιπρόσθετα σε 9 περιπτώσεις η μέθοδος αυτή παρείχε πληροφορίεςπολύτιμες για την ερμηνεία των ευρημάτων που εντοπίστηκαν από άλλες μεθόδους.