Charakterisierung von Isothiocyanatmodifiziertem α‐Lactalbumin ‐ Auswirkungen auf die molekulare Struktur und biologische Eigenschaften des Proteins
Authors: Spöttel Jenny , Rohn Sascha 
Published: June 2023

In komplexen Lebensmittelmatrices können ungerichtete Reaktionen zwischen bioaktiven sekundären Pflanzenmetaboliten, wie den Isothiocyanaten, und Lebensmittelproteinen zu unerwünschten und erwünschten Änderungen der dreidimensionalen Struktur, der Eigenschaften und der Funktionalitäten der Proteine führen. Aus lebensmittelchemischer und ‐technologischer Sicht ist eine umfassende Grundlagenforschung erforderlich, um ein besseres Verständnis der Folgen kovalenter Proteinmodifikationen zu erlangen.

Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Wechselwirkung zwischen Benzylisothiocyanat (BITC), einem bioaktiven Metaboliten aus der Gartenkresse (Lepidium sativum L.), und dem Molkenprotein α‐Lactalbumin (α‐LA) auf die molekulare Struktur und auf die biologischen Eigenschaften des Molkenproteins, hier im Speziellen die Verdaubarkeit und die Allergenität, untersucht. Nach erfolgreicher Synthese der BITC‐Proteinkonjugate erfolgte die Quantifizierung der Reaktion durch die spektrophotometrische Bestimmung der frei verfügbaren Aminogruppen der unmodifizierten und BITC‐modifizierten Proteinderivate unter Einsatz von o‐Phthaldialdehyd. Mit zunehmender Menge an gebundenem BITC wurde eine Abnahme der freien Aminogruppen festgestellt, was auf die erfolgreiche Synthese von irreversiblen Thioharnstoffderivaten und einen zunehmenden Grad der BITC‐Modifikation von α‐LA hindeutet. Schließlich wurde die molekulare Struktur, die Oberflächenhydrophobizität, das Aggregationsverhalten, der hydrodynamische Radius sowie die biologischen Eigenschaften, wie die Verdaubarkeit und Allergenität, in Abhängigkeit des Modifikationsgrads bestimmt.

Bei der Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der α‐LA‐Derivate wurde als Folge der kovalenten Modifikation mit BITC eine Veränderung der Sekundärstruktur des Proteins nachgewiesen. Mit zunehmendem Modifikationsgrad konnte eine Abnahme der α‐helicalen Strukturanteile von 29 % auf 17 %, bei gleichzeitiger Zunahme der Anteile der β‐Faltblattstrukturen von 12 % auf 28 % dokumentiert werden. Darüber hinaus wurde die temperaturinduzierte Konformationsänderung von unmodifiziertem und BITC‐modifiziertem α‐LA im Bereich von 20 bis 80 °C untersucht. Hierbei konnte festgestellt werden, dass mit zunehmendem Modifikationsgrad die Unterschiede der Zusammensetzung der Sekundärstruktur in Abhängigkeit der Temperatur immer kleiner wurden. Weiterhin konnte mit steigender Menge an gebundenem BITC eine Zunahme der Oberflächenhydrophobizität und des hydrodynamischen Radius von 1.8 nm auf maximal 89.4 nm festgestellt werden. Die Addition des hydrophoben Liganden BITC an die polaren Aminogruppen der Proteinseitenketten hatte eine Abnahme der Polarität, ein Verlust der Ladung und damit eine Erhöhung der Oberflächenhydrophobizität zur Folge. Die BITC‐induzierte Umstrukturierung könnte zu einer verstärkten Freilegung hydrophober Gruppen an die Proteinoberflächen führen, was wiederum die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen mehreren Proteinmolekülen begünstigen und somit die Zunahme des hydrodynamischen Radius und die Bildung von Aggregaten bei den Proteinderivaten erklären könnte. Schließlich galt es, den Einfluss der kovalenten Bindung von BITC auf die Proteinstruktur und auf die Epitopstrukturen in einen Zusammenhang zu bringen und daraus unmittelbare Konsequenzen für die allergenen Eigenschaften des Molkenproteins abzuleiten. Die immunologische Detektion nach vorangeschalteter Hochleistungsdünnschichtchromatographie konnte erfolgreich zur Abschätzung der Antigenität der unmodifizierten und BITC‐modifizierten Proteine eingesetzt werden. Da die molekulare Grundlage für ein verändertes allergenes Potential in der Änderung von Epitopstrukturen liegt, ist es nahe liegend, dass durch die BITC‐induzierte Änderung der dreidimensionalen Proteinstruktur vermutlich Epitope inaktiviert oder zerstört, gleichzeitig aber auch die zuvor im Inneren des Proteins verborgene Epitope freigelegt oder neue Epitope gebildet wurden, was zu einer Erhöhung der allergenen Aktivität der BITC‐Protenderivate führte. Weiterhin konnte mit Hilfe der spezifischen Antikörper die Restantigenität von proteolytisch verdauten unmodifizierten und BITC‐modifizierten Proteinen erfasst werden. Trotz der Proteinmodifikation und der enzymatischen Hydrolyse durch Trypsin blieb eine gewisse, aber reduzierte Restantigenität in Form von kurzen Peptidfragmenten erhalten, was bedeutet, dass einige der Epitope immunologisch aktiv blieben.

Darüber hinaus wurde das proteolytische Abbauverhalten von unmodifiziertem und BITC‐ modifiziertem α‐LA durch Trypsin untersucht. Mit Hilfe der ein‐ und zweidimensionalen Hochleistungsdünnschichtchromatographie konnte eine qualitative Untersuchung zur Differenzierung von unmodifizierten und BITC‐modifizierten Proteinhydrolysaten auf Grundlage des visuellen Vergleichs der erhaltenen Chromatogramme durchgeführt werden. Durch den zweidimensionalen Ansatz konnte eine verbesserte Trennung des komplexen Peptidgemisches und somit eine optimierte Differenzierung der Proteinmodifikationen erzielt werden. Die Analyse mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie mit nachgeschalteter Tandem‐Massenspektrometrie ermöglichte eine Identifizierung der unmodifizierten und BITC‐modifizierten Peptide. Die Untersuchungsergebnisse der tryptischen Hydrolyse von unmodifiziertem und BITC‐modifiziertem α‐ LA zeigten, dass die Bindung von BITC an die Aminogruppen der Lysinseitenketten die tryptischen Proteolysestellen sterisch blockierten. Infolge der partiellen Hemmung der enzymatischen Hydrolyse der BITC‐Proteinderivate durch Trypsin konnten elongierte, modifizierte Peptide nachgewiesen werden. Mit zunehmender Menge an gebundenem BITC wurde eine sukzessive Erhöhung der Anzahl an modifizierten (elognierten) Peptiden beobachtet. Für zwei der BITC‐modifizierten Peptide gelang es sogar, den genauen Reaktionsort, also die modifizierten Aminosäuren (K32 und K113), in der Primärsequenz von α‐LA zu identifizieren.

Die Ergebnisse der beiden chromatographischen Trennmethoden ließen die Schlussfolgerung zu, dass infolge der Addition des hydrophoben Liganden BITC an die polaren Aminogruppen der Lysinseitenketten eine geringere Polarität und somit ein verändertes chromatographisches Verhalten verursacht wurde. Die geringere Polarität der BITC‐modifizierten Peptide steht im Einklang mit den Untersuchungsergebnissen, die mit zunehmenden Modifikationsgrad eine erhöhte Oberflächhydrophobizität verzeichneten.