Identification of synthetic lethal interactions with DNA replication licensing aberrations
Authors: Μπατρά-Φατζάρντο Νεμπάλ 
Published: April 2023

Ο ακριβής και πλήρης διπλασιασμός του γονιδιώματος είναι ζωτικής σημασίας για ένα σωματικό κύτταρο που διαιρείται, ώστε να διασφαλιστεί η κληρονόμηση ενός ακριβούς αντιγράφου του μητρικού DNA από τους απογόνους. Ωστόσο, συνήθως προκύπτουν πολλαπλά εμπόδια στο DNA που διαταράσσουν την κανονική πρόοδο των ρεπλισωμάτων κατά μήκος της αντιγραφής, αποτελώντας απειλή για την έγκαιρη ολοκλήρωση της σύνθεσης του DNA εντός ενός κυτταρικού κύκλου. Η αδειοδότηση του DNA ελέγχει την αντιγραφή για να διασφαλίσει τον πλήρη διπλασιασμό του γονιδιώματος, ενώ περιορίζει την πυροδότηση μιας θέσης έναρξης αντιγραφής σε μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Ο παράγοντας αδειοδότησης CDT1 είναι ιδιαίτερα σημαντικός κατά τη διάρκεια της αδειοδότησης λόγω της κρίσιμης λειτουργίας του στην στρατολόγηση μιας ανενεργής μορφής της αντιγραφικής ελικάσης MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Προκειμένου να αποτραπεί η ανεπιθύμητη πυροδότηση των θέσεων έναρξης, η αδειοδότηση περιορίζεται κατά την εκκίνηση των θέσεων έναρξης και την εκτύλιξη της ελικάσης του DNA μέσω στενής ρύθμισης κάθε παράγοντα αδειοδότησης. Έχει αποδειχθεί ότι ο CDT1 υφίσταται πολλαπλά στάδια ελέγχου στα θηλαστικά, τονίζοντας την κρίσιμη σημασία του κατά την πρόοδο της αδειοδότησης του DNA. Κατά συνέπεια, η υπερέκφραση του CDT1 επιφέρει γονιδιωματική αστάθεια και κακοήθη συμπεριφορά in vitro και in vivo και αποτελεί γονιδιωματικό χαρακτηριστικό διαφόρων τύπων όγκων. Ένας από τους μηχανισμούς που ελέγχουν τη δραστηριότητα του CDT1 περιλαμβάνει τη Geminin, μια πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από τον κυτταρικό κύκλο και η οποία λειτουργεί μετά την εκτύλιξη του DNA από την ελικάση κατά την έναρξη της φάσης S μέχρι τη φάση G2, δεσμεύοντας και αναστέλλοντας τον Cdt1. Ορισμένες μελέτες προτείνουν ότι η Geminin θα μπορούσε να λειτουργήσει ως εφεδρική οδός για τον περιορισμό της δραστηριότητας του CDT1 σε έντονα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όπου η δραστηριότητα του CDT1 βρίσκεται σε αυξημένη ρύθμιση. Η πιθανή εξάρτηση των ιδιαίτερα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων από τη Geminin θα μπορούσε να είναι ένα χαρακτηριστικό με θεραπευτική σημασία, για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων στη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στον κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων που παρουσιάζουν ανωμαλίες στην αδειοδότηση απέχουν ακόμη πολύ από το να διευκρινιστούν. Κατά τη διάρκεια των αρχικών βημάτων της παρούσας μελέτης, επικυρώσαμε ότι η υπερέκφραση του CDT1 οδηγεί σε αναδιπλασιασμό και βλάβη του DNA σε ανθρώπινα κύτταρα και ότι αποτελεί γονιδιωματικό χαρακτηριστικό πολλαπλών τύπων όγκων που σχετίζονται με κακή επιβίωση. Στη συνέχεια επικεντρωθήκαμε στον αναστολέα της αδειοδότησης Geminin και αποδείξαμε ότι η δραστηριότητά του είναι απαραίτητη για την παρεμπόδισης της εκ νέου αδειοδότησης των θέσεων έναρξης αντιγραφής και της εκ νέου αντιγραφής επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα στα οποία είχε απαλοιφεί η Geminin, παρουσίαζαν περισσότερα από δύο αντίγραφα DNA, εμφανές από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και αυξημένες βλάβες του DNA σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον, δείξαμε ότι η αποσιώπηση της Geminin προκαλεί αντιγραφικό στρες ακόμη και από τον πρώτο γύρο της αντιγραφής, επηρεάζοντας την πρόοδο της διχάλας αντιγραφής και την ολοκλήρωση της σε γενετικούς τόπους που αντιγράφονται αργά. Παρατηρήθηκε ότι τα κενά μονόκλωνου DNA συσσωρεύονται μετά από προοδευτικούς γύρους αντιγραφής σε καρκινικά κύτταρα με ανεπάρκεια της Geminin, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απενεργοποίηση της Geminin πυροδοτεί την απορρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής. Σε συμφωνία με αυτό, η ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου G2/M για βλάβες στο DNA ήταν απαραίτητη για την επαναντιγραφή, ενώ η αναστολή της σηματοδότησης του σημείου ελέγχου οδήγησε σε μιτωτική καταστροφή και αυξημένη γονιδιωματική αστάθεια κατά τον επόμενο κυτταρικό κύκλο. Δεδομένου ότι η απορρυθμισμένη αδειοδότηση αποτελεί χαρακτηριστικό του καρκίνου, επιδιώξαμε στη συνέχεια να εντοπίσουμε στοχεύσιμα μοριακά μονοπάτια που σηματοδοτούν και ανταποκρίνονται σε αυτό το φαινόμενο, με χρήση τεχνικών μικροσκοπίας υψηλής απόδοσης, με διαλογή συνθετικής θνησιμότητας σε κυτταρικά μοντέλα με ανώμαλη αδειοδότηση, εξετάζοντας τον πολλαπλασιασμό και τη βλάβη του DNA. Μετά την επαλήθευση των βασικών μορίων-στόχων, αποδείξαμε ότι ο κεντρικός τελεστής του μονοπατιού επιδιόρθωσης της αναιμίας Fanconi, FANCD2 είναι κρίσιμος κατά την προστασία των κυττάρων ότα σε αυτά επάγεται επαναντιγραφή. Τα κύτταρα που στερούνται διπλά την Geminin και τον FANCD2 παρουσίασαν μειωμένη επιβίωση και αυξημένη βλάβη του DNA. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν επίσης σε κύτταρα FANCD2-KO προερχόμενα από ασθενείς με αποσιώπηση της Geminin. Είναι αξιοσημείωτο ότι παρατηρήσαμε ότι η απουσία Geminin επάγει τη σηματοδότηση του μονοπατιού FA νωρίς κατά τη διάρκεια του πρώτου γύρου της αντιγραφής, όπως καταδεικνύεται από χρώση ανοσοφθορισμού και δοκιμασίες κλασμάτωσης χρωματίνης. Οι εστίες FANCD2 ήταν εν μέρει διακριτές από τις δίκλωνες θραύσεις, υποδεικνύοντας θέσεις μειωμένης προόδου της διχάλας αντιγραφής που ακολουθείται από θραύση του DNA. Οι επακόλουθες αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα που υποβάλλονται σε επαναντιγραφή απαιτούν τόσο την κανονική όσο και τη μη κανονική δραστηριότητα του FANCD2 για τον περιορισμό της εκτεταμένης γονιδιωματικής αστάθειας. Η απώλεια του FANCD2 σε κύτταρα με αποσιώπηση της Geminin προκάλεσε απορρυθμισμένη έναρξη της αντιγραφής και αυξημένη εξέλιξη του ρεπλισώματος, προκαλώντας με τη σειρά της αντιγραφή σε μονόκλωνα τμήματα του DNA, κατάρρευση της αντιγραφικής διχάλας και χρωμοσωμική αστάθεια. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν μια νέα συνθετική θανατηφόρα αλληλεπίδραση με θεραπευτική σημασία σε στοχευμένες μελέτες, κορεννύοντας την ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA των καρκινικών κυττάρων που παρουσιάζουν ζητήματα αδειοδότησης, για την επιλεκτική θανάτωση τους.