Η αλληλεπίδραση μεταβιβαστών φλεγμονής και υποεπιθηλιακών μυοϊνοβλαστών στην ινωτική διεργασία των ιδοπαθών φλεγμονωδών εντεροπαθειών ως στόχος νέων θεραπευτικών στρατηγικών
Authors: Φιλίδου Ειρήνη 
Published: September 2021

Εισαγωγή - Οι Ιδιοπαθείς Φλεγμονώδεις Νόσοι του Εντέρου (ΙΦΝΕ), Νόσος του Crohn (ΝC) και Ελκώδης Κολίτιδα (ΕΚ), αποτελούν χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα του γαστρεντερικού συστήματος, αγνώστου αιτιολογίας, των οποίων η αιτιοπαθογένεια διέπεται από ανοσολογικούς μηχανισμούς. Η ανάπτυξη διατοιχωματικής ίνωσης του εντέρου αποτελεί ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της NC και χαρακτηρίζεται από αυξημένη παραγωγή μεταβιβαστών της φλεγμονής και προ-ινωτικών παραγόντων που οδηγούν στην ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε μυοϊνοβλάστες στον εντερικό βλεννογόνο, καθώς και προσέλκυση νέων μυοϊνοβλαστών. Η αιτιοπαθογένεια της ίνωσης μέχρι στιγμής παραμένει άγνωστη, αλλά δεδομένα αναφέρουν πως οι ανοσολογικές αποκρίσεις της έμφυτης (TL1A) και της ειδικής ανοσίας (Th1, Th2, Th17 και Treg) συμβάλλουν σημαντικά στην ανάπτυξη εντερικής ίνωσης.Ο TL1A (tumor necrosis factor (TNF)-like cytokine 1A, TL1A) ανήκει στην υπεροικογένεια του TNF, προσδένεται στους υποδοχείς, death-domain receptor 3 (DR3) και decoy receptor 3 (DcR3) και μέχρι στιγμής, υπάρχουν αρκετές αναφορές στην βιβλιογραφία που συσχετίζουν τον TL1A και τους 2 υποδοχείς του με τις ΙΦΝΕ. Οι φλεγμονώδεις μεταβιβαστές της έμφυτης ή της ειδικής ανοσίας (Th1, Th2 και Th17) προκαλούν αντίστοιχες ινωτικές αντιδράσεις στους μυοϊνοβλάστες, οδηγώντας τους σε έναν ινωτικό φαινότυπο. Συγκεκριμένα, φλεγμονώδεις παράγοντες της Th2 και της Th17 ανοσολογικής απόκρισης, όπως η interleukin (IL)-13 και η IL-17 αντίστοιχα, οδηγούν κατά κύριο λόγο σε ινωτικές διεργασίες, ενώ αντίθετα, παράγοντες της Th1 ανοσολογικής απόκρισης φαίνεται να μην συνδράμουν ενεργά στη δημιουργία της ίνωσης, αλλά να δρουν προς την αντίθετη κατεύθυνση, με την IFN-γ να εμφανίζει αντι-ινωτικές ιδιότητες. Η μελέτη της έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3, στους εντερικούς υποεπιθηλιακούς μυοϊνοβλάστες (ΕΥΜ) και στα κολονικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΤ-29, καθώς και η επίδραση των ανοσολογικών αποκρίσεων, Th1, Th2 και Th17, στη βιολογία των ΕΥΜ και στην εμπλοκή τους στην ιστική αναδιοργάνωση και στην ίνωση, αποτελούν πεδίο έρευνας ελάχιστα μελετημένο και επομένως, χρήζει ιδιαίτερου ενδιαφέροντος η διερεύνηση της επίδρασης των στοιχείων της φλεγμονής στη φυσιολογία αυτών των κυττάρων και στη διεργασία της ίνωσης. Σκοπός και Στόχοι - Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου και της εμπλοκής των υποεπιθηλιακών μυοϊνοβλαστών στις φλεγμονώδεις διεργασίες που διέπουν τις ΙΦΝΕ και οδηγούν στην ανάπτυξη ίνωσης. Για τον σκοπό αυτό, διερευνήθηκαν οι παθογενετικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ινωτική διαδικασία και οι παράγοντες που τους ρυθμίζουν άμεσα ή έμμεσα, οι οποίοι θα μπορούσαν να αποτελέσουν νέους θεραπευτικούς στόχους.Συγκεκριμένα, κατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στόχος ήταν ο έλεγχος της έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3, σε πρωτογενείς ανθρώπειους ΕΥΜ φυσιολογικών μαρτύρων, υπό συνθήκες φλεγμονής που σχετίζονται με τις ΙΦΝΕ και σε ΕΥΜ ασθενών με NC. Επιπλέον, έγινε διερεύνηση της έκφρασης των υποδοχέων DR3 και DcR3 σε κολονικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΤ-29, υπό συνθήκες φλεγμονής, καθώς και μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ΕΥΜ και των ΗΤ-29 κυττάρων. Κατά το δεύτερο σκέλος, στόχος ήταν ο έλεγχος και η χαρτογράφηση της έκφρασης όλων των υποδοχέων των ιντερλευκινών, που σχετίζονται με τις ΙΦΝΕ, σε πρωτογενείς ανθρώπειους ΕΥΜ φυσιολογικών μαρτύρων, καθώς και η μελέτη της επίδρασης των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών της έμφυτης ανοσίας στην τροποποίηση της έκφρασης των συγκεκριμένων υποδοχέων στους ΕΥΜ. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των ανοσολογικών αποκρίσεων (Th1, Th2, Th17 και Treg) στην επαγόμενη έκφραση προ-ινωτικών μορίων από τους ΕΥΜ και στην μεταναστευτική τους ικανότητα. Απώτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η κατανόηση των αιτιοπαθογενετικών μηχανισμών που διέπουν την εντερική ίνωση, καθώς και η πιθανή ανάδειξη νέων φαρμακολογικών στόχων για τον σχεδιασμό καινοτόμων και αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση της εντερικής ίνωσης. Υλικά και Μέθοδοι - Προκειμένου να επιτευχθούν οι παραπάνω στόχοι, τόσο του πρώτου, όσο και του δεύτερου σκέλους, έγινε απομόνωση ΕΥΜ από κολονικές βιοψίες φυσιολογικών μαρτύρων και ασθενών με NC. Επιπλέον, καλλιεργήθηκαν οι κυτταρικές σειρές, ΗΤ-29 και 18CO, οι οποίες είναι κολονικά επιθηλιακά κύτταρα και κολονικοί εμβρυικοί ινοβλάστες, αντίστοιχα. Ως προς το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αρχικά έγινε διέγερση των ΕΥΜ και των 18CO με IL-1α ή/και tumor necrosis factor α (TNF-α) και μελετήθηκε η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3. Κατόπιν, έγινε διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α, και interferon γ (IFN-γ) και καλλιέργεια εντερικών ιστοτεμαχίων από ασθενείς με NC και το υπερκείμενο αυτών, χρησιμοποιήθηκε ως διεγέρτης σε καλλιέργειες ΕΥΜ για τον έλεγχο της mRNA και πρωτεϊνικής έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3. Παράλληλα, μελετήθηκε η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3 σε ΕΥΜ από ασθενείς με NC. Στη συνέχεια, έγινε διέγερση των ΗΤ29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α και IFN-γ, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA και η πρωτεϊνική έκφραση των υποδοχέων του TL1A, DR3 και DcR3. Τέλος, έγινε διέγερση των ΗΤ29 κυττάρων με TL1A, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA έκφραση της IL-8.Ως προς την επίτευξη των στόχων του δεύτερου σκέλους της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αρχικά, έγινε διέγερση των ΕΥΜ με IL-1α ή/και TNF-α, καθώς και με Lipopolysaccharide (LPS) προκειμένου να μελετηθεί η βασική και η επαγόμενη από τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, mRNA και πρωτεϊνική έκφραση των υποδοχέων των ιντερλευκινών. Στη συνέχεια, ακολούθησε διέγερση των ΕΥΜ με κυτταροκίνες της Th1 (TNF-α ή/και IFN-γ), της Th2 (IL-4 ή/και IL-13), της Th17 (IL-17 ή/και IL-22 ή/και IL-23) και της Treg (IL-10 ή/και transforming growth factor β (TGF-β)) ανοσοαπόκρισης, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA έκφραση των προ-ινωτικών παραγόντων, κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, φιμπρονεκτίνης, α smooth muscle actin (α-SMA), tissue factor (TF), μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (metalloproteinase-1, MMP-1), MMP-9, αναστολέα των μεταλλοπρωτεϊνασών-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) και ΤΙΜΡ-2 και η πρωτεϊνική έκφραση των προ-ινωτικών παραγόντων, κολλαγόνου και φιμπρονεκτίνης. Τέλος, έγινε διέγερση των ΕΥΜ με κυτταροκίνες της Th1 (TNF-α ή/και IFN-γ), της Th2 (IL-4 ή/και IL-13), της Th17 (IL-17 ή/και IL-22 ή/και IL-23) και της Treg (IL-10 ή/και TGF-β) ανοσοαπόκρισης, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδρασή τους στην μεταναστευτική ικανότητα των ΕΥΜ, μέσω της δοκιμασίας επούλωσης τραύματος.Για τις mRNA μελέτες έκφρασης, έγινε απομόνωση ολικού RNA από τα κύτταρα, δημιουργία συμπληρωματικού DNA και μελέτη της έκφρασης με την χρήση της μεθόδου real time rt-PCR. Οι μελέτες πρωτεϊνικής έκφρασης έγιναν είτε με την μέθοδο του ανοσοφθορισμού, είτε με την μέθοδο της ELISA. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του κολλαγόνου μετρήθηκαν με την μέθοδο Sircol. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με Student's t test. Αποτελέσματα - Ως προς το πρώτο σκέλος, η διέγερση των ΕΥΜ και των 18CO κυττάρων με τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α ή/και TNF-α, οι οποίες έχουν βρεθεί αυξημένες στον φλεγμαίνοντα εντερικό βλεννογόνο ασθενών με ΙΦΝΕ, οδήγησε στην αύξηση της mRNA και της πρωτεϊνικής έκφρασης του TL1A. Ιστικά υπερκείμενα από καλλιέργειες βιοψιών ασθενών με NC προκάλεσαν την mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A στους ΕΥΜ. ΕΥΜ από ασθενείς με NC βρέθηκαν θετικοί στην έκφραση του TL1A. Η διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α και IFN-γ οδήγησε στην επαγωγή της έκφρασης του DR3 και τα υπερκείμενα αυτών, προκάλεσαν την mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A στους ΕΥΜ. Η διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με TL1A οδήγησε στην επαγωγή της mRNA έκφρασης της IL-8.Ως προς το δεύτερο σκέλος, σε ΕΥΜ από φυσιολογικούς μάρτυρες ανιχνεύθηκε μία βασική έκφραση των υποδοχέων ιντερλευκινών (Τh1: IFNGR1, IFNGR2, TNFRSF1A, IL12RB2, IL1R1 και IL1R2, Th2: IL4R και IL13RA2, Th17: IL22RA1, Treg: IL10RA, IL10RB, TGFBR1 και TGFBR2). Η διέγερση των ΕΥΜ με τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α ή/και TNF-α επηρέασε, είτε θετικά, είτε αρνητικά την έκφραση αυτή. Αντίθετα, η διέγερση των ΕΥΜ με LPS δεν προκάλεσε οποιοδήποτε στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα στην έκφραση των υποδοχέων. Η διέγερση των ΕΥΜ με Th1 κυτταροκίνες είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης του mRNA του TF και της ΜΜP-1, της πρωτεΐνης του κολλαγόνου και της φιμπρονεκτίνης, καθώς και την μείωση της έκφρασης του mRNA της α-SMA και της ΜΜΡ-9 και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ. Η διέγερση των ΕΥΜ με Th2 κυτταροκίνες προκάλεσε την αύξηση του mRNA του κολλαγόνου, TF, α-SMA, ΜΜΡ-1 και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ και την μείωση της πρωτεΐνης της φιμπρονεκτίνης και του mRNA της ΜΜΡ-9. Οι Th17 κυτταροκίνες είχαν μεικτή επίδραση στους ΕΥΜ, καθώς οι IL-17 και IL-23 προκάλεσαν την αύξηση της φιμπρονεκτίνης, ενώ η IL-22, την μείωσή της και την ελάττωση της παραγωγής του TF. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα στην μεταναστευτική ικανότητα των μυοϊνοβλαστών: οι IL-17 και IL-22 προκάλεσαν την μείωση του ρυθμού μετανάστευσης, ενώ η IL-23, το αντίθετο. Επιπλέον, η IL-23 προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης τόσο της MMP-1, όσο και της ΤΙΜΡ-1. Τέλος, ως αναμένετο, ο TGF-β αποδείχθηκε ως ο πιο αποτελεσματικός προ-ινωτικός παράγοντας, καθώς προκάλεσε την αύξηση όλων των υπό μελέτη προ-ινωτικών μορίων, καθώς και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ. Συμπεράσματα - Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναδεικνύεται πως οι ΕΥΜ εμπλέκονται άμεσα στην εντερική φλεγμονή και πως οι ανοσολογικές αποκρίσεις της έμφυτης και της ειδικής ανοσίας διαδραματίζουν ενεργό ρόλο στην ανάπτυξη εντερικής ίνωσης. Επιπλέον, η παρούσα διδακτορική διατριβή αναδεικνύει νέους πιθανούς θεραπευτικούς στόχους, η μελέτη των οποίων, ίσως, να οδηγήσει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για την αντιμετώπιση της εντερικής ίνωσης.