Φαρμακολογική αξιολόγηση και ανάπτυξη συστημάτων χορήγησης μορίων miRNA/siRNA για τη θεραπεία του καρκίνου
Authors: Γιασσαφάκη Λευκή-Παυλίνα 
Published: September 2021

Η αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί μεγάλη πρόκληση, τόσο για το πεδίο της βιοιατρικής/μοριακής έρευνας και φαρμακολογίας, όσο και για το πεδίο ανάπτυξης συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων/θεραπευτικών για τη στοχευμένη αποδέσμευσή τους στα καρκινικά κύτταρα και στους ιστούς. Στα πλαίσια αυτά, η εκμετάλλευση φυσικών συστημάτων αλλά και φυσιολογικώς παραγόμενων νανο-μορίων, όπως είναι τα εξωσώματα, εμφανίζεται ως μια ενδιαφέρουσα, εναλλακτική προσέγγιση καθώς τα συστήματα αυτά συνιστούν αξιόλογα φαρμακολογικά εργαλεία στη θεραπευτική και φαίνεται να παρέχουν λύσεις σε μια σειρά από μείζονα προβλήματα τα οποία αποτελούν απόρροια της χρήσης συμβατικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Τα κυστίδια αυτά αποτελούν πολύ καλούς υποψηφίους για τη μεταφορά πρωτεϊνών, miRNAs, siRNAs, φαρμάκων και άλλων μορίων, καθώς εμφανίζουν ιδιαίτερα φυσικοχημικά και μοριακά χαρακτηριστικά και πληθώρα πλεονεκτημάτων ως καινοτόμα συστήματα χορήγησης θεραπευτικών. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, στην παρούσα διατριβή επιχειρήθηκε, αρχικά, η ανάπτυξη, ο ενδελεχής φυσικοχημικός χαρακτηρισμός και η μελέτη της λιπιδικής και μοριακής ταυτότητας των εξωσωμάτων απομονωμένων από κυτταρικές καλλιέργειες, με σκοπό την απόκτηση πολύτιμων πληροφοριών για το προφίλ και τη συμπεριφορά των κυστιδίων. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν εξωσώματα απομονωμένα από φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές-δότες, αξιοποιώντας δύο βασικές πειραματικές μεθοδολογίες (διαφορική υπερφυγοκέντρηση και εμπορικά διαθέσιμο πολυμερικό αντιδραστήριο). Για το φυσικοχημικό χαρακτηρισμό των απομονωμένων κυστιδίων αξιοποιήθηκαν τεχνικές: α) αποτύπωσης της κατανομής μεγέθους τους και του φορτίου επιφανείας τους (τεχνική δυναμικής σκέδασης του φωτό), β) οπτικοποίησης της μορφολογίας τους (τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας), γ) αξιολόγησης της λιπιδικής σύστασης της μεμβράνης των εξωσωμάτων (διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης), δ) μελέτης των αλληλεπιδράσεων των εξωσωμάτων με λιπιδικά μόρια (θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης και φθορισμομετρία σταθερής κατάστασης) καθώς και, ε) ταυτοποίησης/ανάλυσης του συνόλου των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στα κυστίδια αυτά (καθολική ανάλυση του πρωτεϊνώματος) μέσω φασματοσκοπίας μάζας. Ακολούθως, τα παραγόμενα και χαρακτηρισμένα εξωσώματα αξιολογήθηκαν φαρμακολογικώς ως πιθανά, καινοτόμα «οχήματα» για την εκλεκτική μεταφορά πρότυπων μορίων-μαρτύρων ελέγχου σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών. Απώτερος σκοπός ήταν: α) η διερεύνηση της κυτταρικής επιδεκτικότητας ως προς τα παραγόμενα εξωσώματα ίδιας ή διαφορετικής προέλευσης με τους κυτταρικούς δέκτες, β) η αποκρυπτογράφηση και η κατανόηση των κύριων παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία εκλεκτικής πρόσληψης των εξωσωμάτων από κύτταρα σε καλλιέργεια, γ) η διερεύνηση-αξιολόγηση της διαδικασίας ενκαψακίωσης/εισαγωγής των επιθυμητών βιομορίων στα εξωσώματα αλλά των παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία αυτή και, δ) η μελέτη, η αξιολόγηση και η επιλογή των καταλληλότερων κυτταρικών σειρών ως δότες εξωσωμάτων τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως «καθολικά» συστήματα μεταφοράς βιομορίων για ποικίλα κύτταρα-δέκτες. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν ότι τα απομονωθέντα εξωσώματα από τις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές-δότες σε καλλιέργεια, εμφανίζουν ενδιαφέροντα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και ένα ιδιαίτερο λιπιδικό και μοριακό προφίλ που τους προσδίδουν πολλά πλεονεκτήματα ώστε να ελεγχθούν και να αξιοποιηθούν περαιτέρω ως φορείς θεραπευτικών μορίων και φαρμάκων. Επιπλέον, η ικανότητά τους να ενσωματώνουν και να μεταφέρουν σε κύτταρα-δέκτες κατάλληλα, εξωγενώς χορηγούμενα σε αυτά, φορτία, όπως το πρότυπο μόριο siRNA (scramble siRNA), το οποίο αξιοποιήθηκε στις συγκεκριμένες πειραματικές διαδικασίες, επιβεβαίωσε το συμπέρασμα πως τα κυστίδια αυτά μπορούν να καθιερωθούν μελλοντικά, ως καινοτόμοι φορείς στο πεδίο της έρευνας και ανάπτυξης νέων, βελτιστοποιημένων και περισσότερο εξειδικευμένων συστημάτων χορήγησης με θεραπευτικές προεκτάσεις.