Γενετικοί και επιγενετικοί παράγοντες στην οστεοαρθρίτιδα
Authors: Ντούμου Ελένη 
Published: December 2023

Η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί τη πιο κοινή χρόνια εκφυλιστική νόσο των αρθρώσεων και είναι κύρια αιτία πόνου και αναπηρίας. Είναι μία νόσος που πλήττει όλες τις αρθρώσεις του σώματος με μεγαλύτερη επιβάρυνση στην άρθρωση του γονάτου, ενώ επηρεάζει και τα δομικά στοιχεία της άρθρωσης, με κύρια χαρακτηριστικά της τον εκφυλισμό του αρθρικού χόνδρου, το σχηματισμό οστεοφύτων, τη σκλήρυνση του υποχόνδριου οστού και την υπερτροφία του αρθρικού υμένα. Σε παγκόσμιο επίπεδο, εκτιμάται ότι περίπου 500 εκατομμύρια άτομα πάσχουν από ΟΑ. Διάφοροι παράγοντες κινδύνου, όπως η γήρανση, η παχυσαρκία, το φύλο, ο τραυματισμός των αρθρώσεων και η κληρονομικότητα, έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ΟΑ. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεια της ΟΑ παραμένουν ασαφείς. Παρά τη σημαντική επιβάρυνση της ΟΑ για τους ασθενείς και τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης, έως σήμερα δεν υπάρχουν ευαίσθητοι βιοδείκτες για την ανίχνευση της νόσου σε πρώιμα στάδια, ούτε αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές εκτός της αρθροπλαστικής χειρουργικής επέμβασης (γόνατος ή ισχίου) σε προχωρημένα στάδια της νόσου. Η τυπική μέθοδος για τη διάγνωση και την αξιολόγηση της βαρύτητας της ΟΑ γόνατος γίνεται με ακτινογραφική απεικόνιση με βάση τη κλίμακα κατάταξης κατά Kellgren/Lawrence. Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να εντοπιστούν μη επεμβατικοί και ευαίσθητοι βιοδείκτες για την έγκαιρη πρόγνωση και διάγνωση της ΟΑ, προκειμένου να αντιμετωπιστεί έγκαιρα και να βελτιστοποιηθεί η κλινική αντιμετώπιση της νόσου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα μικρά μη κωδικά μόρια RNA (miRNAs) αποτελούν πολλά υποσχόμενους βιοδείκτες για διάφορες ασθένειες, όπως καρκίνος, διαβήτης, καρδιαγγειακές παθήσεις κ.α. Τα miRNAs είναι μια oμάδα μικρών μη κωδικών μορίων RNA, μήκους περίπου 22-28 νουκλεοτιδίων, που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο μέσω της αποικοδόμησης ή αναστολής της μετάφρασης των mRNA στόχων. Κάθε miRNA μπορεί να ρυθμίσει μεγάλο αριθμό γονιδίων μέσω πρόσδεσης κυρίως στην 3' αμετάφραστη περιοχή (UTR) των mRNA στόχων. Τα miRNAs ενέχονται σε διαδικασίες που σχετίζονται με την παθογένεια της ΟΑ, όπως η ομοιόσταση του χόνδρου, η ρύθμιση της εξωκυττάριας μήτρας, η οστεοποίηση, ο μεταβολισμός των οστών, η απόπτωση, η αυτοφαγία, η φλεγμονή και ο μεταβολισμός των λιπιδίων. Επιπλέον, τα miRNAs έχουν βρεθεί και στη κυκλοφορία. Τα στοιχεία δείχνουν ότι τα miRNAs που κυκλοφορούν μπορούν να μεταφερθούν μέσω μικροκυστιδίων, εξωσωμάτων, συμπλεγμάτων πρωτεΐνης Ago ή λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) και μπορούν είτε να αντανακλούν το κυτταρικό περιεχόμενο είτε να μεσολαβούν στη διακυτταρική σηματοδότηση, παρέχοντας πληροφορίες για την παθοφυσιολογική κατάσταση του κυττάρου. Τα miRNAs θεωρούνται ελκυστικά μόρια ως βιοδείκτες λόγω της σταθερότητάς τους, της ιστοειδικής τους έκφρασης, της μη επεμβατικής ανίχνευσης και του ρυθμιστικού τους ρόλου στη γονιδιακή έκφραση. Παράλληλα, εξελίξεις στις τεχνικές της μοριακής βιολογίας έχουν διευκολύνει την ανίχνευση των miRNAs με μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια. Στο πλαίσιο αυτό, η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών αποτελεί ένα πολύτιμο εργαλείο για την διερεύνηση των προφίλ έκφρασης των miRNAs και τη συσχέτιση τους με την παθογένεια διαφόρων ασθενειών. Επιπλέον, τα miRNAs αποτελούν πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπευτικής αντιμετώπισης της νόσου. Ειδικότερα, το hsa-miR-140, το οποίο έχει μελετηθεί ευρέως στην ΟΑ, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση και τη χονδρογένεση και έχει δειχθεί ότι εμφανίζει διαφοροποιημένη έκφρασή στον ΟΑ χόνδρο και στο αρθρικό υγρό, αλλά όχι στον ορό. To hsa-miR-140 παράγει δύο ώριμα microRNAs: το hsa-miR-140-5p και το hsa-miR-140-3p.Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του συνολικού προφίλ έκφρασης των miRNAs στον ορό ατόμων με ΟΑ γόνατος, που ενέχονται σε σημαντικές διαδικασίες με την παθογένεια της ΟΑ, και η ανεύρεση πιθανού μηχανισμού δράσης τους. Απώτερος σκοπός ήταν η ανάδειξη miRNAs που θα μπορούσαν να αποτελέσουν πιθανούς προγνωστικούς βιοδείκτες για την ΟΑ. Για τη διεξαγωγή της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ορού και αρθρικού χόνδρου ασθενών με πρωτοπαθή οστεοαρθρίτιδα που είχαν υποβληθεί σε ολική αρθροπλαστική γόνατος. Τα άτομα που εμφάνιζαν ρευματοειδή αρθρίτιδα ή αρθρίτιδα στα πλαίσια άλλου αυτοάνοσου νοσήματος, καθώς και χονδροδυσπλασία, σηπτική ΟΑ και μετα–τραυματική ΟΑ αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Για την ομάδα ελέγχου, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από άτομα χωρίς ιστορικό πάθησης των αρθρώσεων, τα οποία είχαν υποβληθεί σε σοβαρή χειρουργική επέμβαση κατάγματος ή ακρωτηριασμό. Στη μελέτη πραγματοποιήθηκε ανάλυση του προφίλ έκφρασης των miRNAs χρησιμοποιώντας συστοιχίες miRNA υψηλής ευκρίνειας στον ορό ασθενών με ΟΑ και σε υγιή άτομα. Χρησιμοποιήθηκε η πλατφόρμα miRNA Microarray Agilent Human, η οποία ανιχνεύει την έκφραση 2.549 miRNAs. Οι καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για την αξιολόγηση της διαγνωστικής αξίας στον ορό, των miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση μεταξύ ΟΑ και υγιών ατόμων. Τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων miRNAs, που εμφάνιζαν τις μεγαλύτερες διαφορές στην έκφρασή τους στον ορό, μεταξύ ΟΑ και ομάδας ελέγχου, όπως hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p επαληθεύθηκαν και σε δείγματα αρθρικού χόνδρου ατόμων με ΟΑ. Με τη χρήση διαφόρων εργαλείων βιοπληροφορικής διερευνήθηκαν οι προβλεπόμενες μοριακές σηματοδοτήσεις και τα γονίδια στόχοι των διαφοροποιημένων miRNAs. Στην συνέχεια, επιλέχθηκε το hsa-miR-140-3p, προκειμένου να αναλυθεί περαιτέρω ο ρόλος του στην ΟΑ. Με εργαλεία βιοπληροφορικής, απεικονίστηκαν σε δίκτυα οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις των γονιδίων στόχων του hsa-miR-140-3p. Πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις με μιμητή του miR-140-3p σε ΟΑ χονδροκύτταρα και διερευνήθηκε η επίδραση του στα μεταγραφικά επίπεδα των πιθανών γονιδίων στόχων TGFa, BCL-2, SIRT-1, HMGCR και HDAC4 και μοριακών δεικτών ομοιοστασίας του χόνδρου και συγκεκριμένα της μεταλλoπρωτεϊνάσης ΜΜΡ-13, του TNFA και του COL2A1.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής ανέδειξαν 279 miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση στον ορό ασθενών με ΟΑ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Μεταξύ αυτών, 205 miRNA (73,5%) εμφάνισαν αυξημένη έκφραση και 74 miRNAs (26,5%) εμφάνιση μειωμένη έκφραση. Η ανάλυση ROC εντόπισε 77 miRNAs με AUC>0,8 και τιμές p<0,05 υποδεικνύοντας τη διαγνωστική τους δυνατότητα. Η ανάλυση βιοπληροφορικής αυτών των 77 miRNAs ανέδειξε τη συμμετοχή τους σε πολλαπλές σηματοδοτήσεις που σχετίζονται με την ΟΑ, όπως FoxO, mTOR, Wnt, PI3K/Akt, TGF-β, ECM-υποδοχέα και βιοσύνθεσης λιπαρών οξέων. Ο προσδιορισμός της έκφρασης των επιλεγμένων miRNAs (hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p) με qRT-PCR επιβεβαίωσε τη μείωση της έκφρασης τριών εξ αυτών, των miRNAs hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-671-3p και hsa-miR-140-3p στον ορό ασθενών με ΟΑ. Η μειωμένη έκφραση των hsa-miR-140-3p και hsa-miR-671-3p παρατηρήθηκε επίσης και σε δείγματα αρθρικού χόνδρου από ασθενείς με ΟΑ σε σχέση με υγιή άτομα, επιβεβαιώνοντας ότι πρόκειται για κυκλοφορούντα miRNA που υπάρχουν και στο περιβάλλον της ΟΑ άρθρωσης. Βιοπληροφορική ανάλυση του hsa-miR-140-3p ανέδειξε τα σχετιζόμενα με την ΟΑ γονίδια στόχους του. Οι σημαντικότερες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του δικτύου που δημιουργήθηκε μεταξύ των γονιδίων στόχων αποκαλύφθηκαν με την ανάλυση της τοπολογίας του δικτύου και με την ανάλυση μονοπατιών-γονιδιακών οντολογιών. Συνεκτιμώντας τις παραπάνω αναλύσεις βιοπληροφορικής, προέκυψε ότι το PTEN αποτελεί ένα γονίδιο που εμφάνισε έναν από τους υψηλότερους βαθμούς συνδεσιμότητας στο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (PPI, protein-protein interactions) και με συμμετοχή σε πολλαπλές σηματοδοτήσεις/διαδικασίες σημαντικές για την OA.Περαιτέρω, η μελέτη της 3’ UTR του mRNA του PTEN για την εύρεση λειτουργικών θέσεων σύνδεσης του hsa-miR-140-3p, με τη χρήση του εργαλείου βιοπληροφορικής TargetScanHuman 8.0, έδειξε την ύπαρξη αλληλουχιών, οι οποίες αναγνωρίζονται από το miR-140-3p μέσω των οποίων ασκεί τη δράση του στο ΡΤΕΝ. Συγκεκριμένα, βρέθηκαν δύο συμπληρωματικές αλληλουχίες για το miR-140-3p στη 3'UTR του PTEN, στη θέση 1763-1769 και θέση 2882-2888. Χορήγηση του miR-140-3p mimic για 72 ώρες (100 nm) σε καλλιέργειες ΟΑ χονδροκυττάρων έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων της mRNA έκφρασης του PTEN σε σχέση με αυτά που δεν τους χορηγήθηκε. Τα παραπάνω αποτελέσματα σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που έδειξαν αυξημένη μεταγραφική έκφραση του PTEN και μειωμένη έκφραση του hsa-miR-140-3p στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά, αναδεικνύουν την αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ του miR-140-3p και του PTEN, το ρόλο του miR-140-3p στη ρύθμιση της έκφρασης του PTEN και ένα πιθανό μοριακό μηχανισμό ο οποίος συμβάλλει στη διαφοροποιημένη έκφραση του PTEN στον ΟΑ χόνδρο. Επιπλέον, η χορήγηση του miR-140-3p mimic σε καλλιέργειες ΟΑ χονδροκυττάρων, επέφερε σημαντική μείωση των επιπέδων της mRNA έκφρασης των γονιδίων HMGCR, HDAC4 και ΜΜΡ-13 και αύξηση της mRNA έκφρασης του γονιδίου BCL-2, σε σχέση με αυτά που δεν τους χορηγήθηκε το hsa-miR-140-3p. Συμπερασματικά, αναδείχθηκε μια υπογραφή τριών miRNA (hsa-miR-140-3p, hsa-miR-671-3p και hsa-miR-33b-3p) στον ορό ασθενών με ΟΑ με τη χρήση μικροσυστοιχιών miRNAs. Αυτά τα miRNAs θα μπορούσαν να αποτελέσουν πιθανούς βιοδείκτες για την αξιολόγηση του κινδύνου και της εξέλιξης της ΟΑ. Επιπρόσθετα, αναδείχθηκε το hsa-miR-140-3p εκτός από βιοδείκτης και ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για την οστεοαρθρίτιδα. Η χρήση αναστολέων ή μιμητικών μορίων των miRNAs έχει αποδειχθεί ότι έχει θεραπευτικά οφέλη σε προκλινικά (ζωικά) μοντέλα της νόσου, υποδεικνύοντας ότι αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αναστολή της εξέλιξης της ΟΑ σε πρώιμα στάδια.