Μελέτη του συμπλόκου αποικοδόμησης της β-κατενίνης σε σποραδικά και κληρονομικά διηθητικά καρκινώματα μαστού
Authors: Θεοχάρη Ειρήνη 
Published: August 2021

Ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συνηθισμένη κακοήθεια που εμφανίζεται στις γυναίκες. Μέχρι στιγμής, παρόλη την πρόοδο που έχει γίνει στον εντοπισμό και τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού, η θνησιμότητα παραμένει ακόμη υψηλή. Σήμερα η έρευνα εστιάζεται στη μελέτη ανεύρεσης μοριακών προγνωστικών δεικτών που θα συμβάλλουν στην καλύτερη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών αυτών. Μεταξύ των βιολογικών δεικτών που μελετώνται, είναι οι δείκτες που έχουν σχέση με τις οδούς μηνυματοδότησης. Αυτές οι οδοί σχετίζονται με την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη έχει θεωρηθεί σαν μια κεντρική ρυθμιστική οδός μετάφρασης πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αύξησης, της μετανάστευσης και της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων και ως εκ τούτου συμμετέχει στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού.Οι πρωτεΐνες Wnt αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών που δεσμεύονται στους αντίστοιχους υποδοχείς Frizzled. Το Wnt ρυθμίζει τουλάχιστον τρία διαφορετικά μονοπάτια, αλλά το καλύτερα μελετημένο είναι εκείνο της β-κατενίνης. Έχει δειχθεί πως ανωμαλίες αυτής της οδού οδηγούν σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες, όπως ο σχηματισμός όγκων και γενετικές ανωμαλίες των οστών.Σύμφωνα με το μοντέλο που είναι αποδεκτό για το μονοπάτι της β-κατενίνης, όταν το Wnt δεν δρα στα κύτταρα, σχηματίζεται ένα σύμπλοκο αποτελούμενο από τις πρωτεΐνες CKIα (κινάση Ια της καζεΐνης), GSK-3β (κινάση-3β της συνθάσης του γλυκογόνου), APC ( πρωτεΐνη της αδενωματώδους πολυποδίασης) και AXIN (αξίνη). Το σύμπλοκο αυτό φωσφορυλιώνει τη β-κατενίνη με επακόλουθο την αποικοδόμησή της στο κυτταρόπλασμα.Η ύπαρξη μεταλλάξεων στο εξώνιο 3 του γονιδίου της β-κατενίνης συνδέεται με επιθετικό φαινότυπο σε ορισμένα καρκινώματα, όπως του προστάτη, του ενδομητρίου και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Στον καρκίνο του μαστού, ωστόσο, μεταλλάξεις σ’ αυτό το εξώνιο είναι σπάνιες ή απούσες.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του προτύπου έκφρασης των πρωτεϊνών του συμπλόκου αποικοδόμησης της β-κατενίνης AXIN, και GSK-3β σε 232 διηθητικά καρκινώματα μαστού (154 σποραδικά και 78 οικογενή) και της ύπαρξης τυχόν μεταλλάξεων στα εξώνια 1 και 2 του γονιδίου της β-κατενίνης σε 124 περιπτώσεις. Τα αποτελέσματα των ανωτέρω δεικτών υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση της σχέσης τους με α) Κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (ηλικία, εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, μέγεθος όγκου, ιστολογικός τύπος, ιστολογικός και πυρηνικός βαθμός κακοήθειας, στάδιο της νόσου και ορμονικοί υποδοχείς), β) Ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών, γ) Νεότερους βιολογικούς δείκτες. Με βάση τις συσχετίσεις που προέκυψαν γίνεται εκτίμηση της πιθανής συμμετοχής των πρωτεϊνών αυτών, καθώς και των μεταλλάξεων της β-κατενίνης, στην επιθετικότητα και πρόγνωση του καρκίνου του μαστού.Το υλικό αποτέλεσαν 232 πρωτοπαθή διηθητικά καρκινώματα μαστού από τα οποία 154 ήταν σποραδικά και 78 οικογενή, 188 πορογενή και 44 λοβιακά, προερχόμενα από 232 θήλεις ασθενείς ηλικίας από 25 έως 87 έτη. Το μέσο διάστημα παρακολούθησης για την ολική επιβίωση των ασθενών ήταν 161 μήνες. Ογδόντα δύο ασθενείς εκδήλωσαν υποτροπές, με μέσο διάστημα παρακολούθησης 161 μήνες. Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων του συμπλέγματος αβιδίνης – βιοτίνης – υπεροξειδάσης, ενώ για τη μελέτη της ύπαρξης μεταλλάξεων στα εξώνια 1 και 2 του γονιδίου της β-κατενίνης η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε 124 περιπτώσεις διηθητικών καρκινωμάτων μαστού. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των επιμέρους συσχετίσεων έγινε με μονοπαραγοντική (chi-square test και log rank test) και πολυπαραγοντική (Cox’s hazard regression model) ανάλυση.Αποτελέσματα: Η πρωτεΐνη Axin εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε 159 (68.5%) και 101 (43.5%) περιπτώσεις, αντίστοιχα, καθώς και στις στρωματικές ινοβλάστες σε 159 (68.5%) περιπτώσεις. Ταυτόχρονη καρκινική και στρωματική ανοσοεντόπιση παρατηρήθηκε σε 121 (52.2%) περιπτώσεις. Η διατηρημένη κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε παράλληλα με τη διήθηση των επιχωρίων λεμφαδένων (p=0.022), παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και GSK-3β (p=0.020 και p=0.027, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση των πρωτεϊνών Ki-67 και τοποϊσομεράση ΙΙα (p=0.011 και p=0.031, αντίστοιχα). Η θετική κυτταροπλασματική έκφραση της AXIN συσχετίστηκε παράλληλα με το στάδιο της νόσου (p=0.028) και η πυρηνική της έκφραση παράλληλα με το μέγεθος του όγκου (p=0.025). Η εντόπιση της πρωτεΐνης στις στρωματικές ινοβλάστες συσχετίσθηκε παράλληλα με τη διήθηση των επιχωρίων λεμφαδένων (p=0.048) και με την έκφραση της πρωτεΐνης HER-2 (p<0.001). Η ταυτόχρονη ανοσοέκφραση της AXIN στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων και στις στρωματικές ινοβλάστες συσχετίστηκε ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 (p=0.016). Καμία από τις ανοσοεντοπίσεις της πρωτεΐνης δεν βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση στο σύνολο των ασθενών. Ωστόσο, στην υποομάδα των ασθενών με διηθητικό καρκίνο του μαστού λοβιακού ιστολογικού τύπου, η διατηρημένη κυτταροπλασματική εντόπιση της AXIN βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ολική επιβίωση των ασθενών (p=0.024), στη μονοπαραγοντική στατιστική ανάλυση. Η πρωτεϊνική κινάση GSK-3β εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων σε ποσοστό 57.1% (133/233 περιπτώσεις) και στο 28.7% των στρωματικών ινοβλαστών (67/233 περιπτώσεις). Η κυτταροπλασματική εντόπιση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και Akt (p=0.045 και p=0.039, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN (p=0.011). Η στρωματική έκφραση της GSK-3β συσχετίστηκε παράλληλα με την έκφραση της κασπάσης-3 (p=0.020) και ανάστροφα με την έκφραση των ER (p=0.035) και των πρωτεϊνών Ki-67 και Akt (p=0.015 και p=0.046, αντίστοιχα). Καμία από τις ανοσοεντοπίσεις δεν συσχετίστηκε με κάποια από τις κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους ούτε βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση, στο σύνολο των ασθενών. Ωστόσο, στην υποομάδα των ασθενών με HER-2 – αρνητικά καρκινώματα μαστού, η κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ελευθέρα νόσου επιβίωση (p=0.021), στη μονοπαραγοντική στατιστική ανάλυση.Στο εξώνιο 1 του γονιδίου της β-κατενίνης ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε ποσοστό 13.7% (17/124 περιπτώσεις), οι οποίες αφορούσαν υποκαταστάσεις βάσεων σε διάφορες νουκλεοτιδικές θέσεις. Με τη χρήση του αλγορίθμου BLAST παρατηρήσαμε μια απόλυτη ταύτιση (100% ομολογία) μεταξύ των 7 πρώτων ζευγών βάσεων της εσωτερικής αλληλουχίας εισόδου των ριβοσωμάτων (IRES) της 5’ αμετάφρασης περιοχής του γονιδίου c-myc και των νουκλεοτιδικών θέσεων 111-117 του εξωνίου 1. Αναφορικά με το εξώνιο 2 μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν συνολικά σε ποσοστό 18.5% (23/124 περιπτώσεις), οι οποίες αφορούσαν υποκαταστάσεις βάσεων σε διάφορες νουκλεοτιδικές θέσεις. Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των μεταλλάξεων (22/23, 95.6% των περιπτώσεων) ανιχνεύθηκαν εγγύς της νουκλεοτιδικής θέσης 405, η οποία εντοπίζεται εντός του 2ου εσωνίου του γονιδίου. Μεταξύ αυτών των μεταλλάξεων, παρατηρήσαμε μια συχνή αλλαγή της αλληλουχίας από GAATTG σε GAATAG, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός δινουκλεοτιδίου AG, το οποίο θα μπορούσε δυνητικά να αποτελέσει μια εναλλακτική θέση συρραφής και ματίσματος. Η άλλη μετάλλαξη εντοπίστηκε εντός του κωδικονίου έναρξης της μετάφρασης (ATG).Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα των πρωτεϊνών Axin και GSK-3β υποδηλώνουν ότι το σύμπλεγμα αποικοδόμησης της β-κατενίνης είναι δυσλειτουργικό στα διηθητικά καρκινώματα μαστού της μελέτης αυτής. Παράλληλα, φαίνεται ότι η ίδια η β-κατενίνη υφίσταται αρνητική ρύθμιση σε γονιδιακό επίπεδο, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι το ογκογόνο μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη είναι ενεργοποιημένο στο υλικό της μελέτης μας.