Διερεύνηση μέτα-μεταγραφικών μηχανισμών που εμπλέκονται στις παθοφυσιολογικές διεργασίες του νευρικού συστήματος με έμφαση στον νευροεκφυλισμό
Authors: Καττάν Φαίδων-Γιασίν 
Published: November 2023

Η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη (SNCA) έχει συσχετιστεί κυρίως με το κεντρικό νευρικό σύστημα, εντοπίζεται κυρίως στις προσυναπτικές απολήξεις των νευρώνων και θεωρείται σημαντική για τη συναπτική πλαστικότητα και την κυψελιδική συσκευασία και διακίνηση. Αν και η λειτουργία της δεν έχει αποσαφηνισθεί πλήρως, πιστεύεται ότι ρυθμίζει την ποσότητα των συναπτικών κυστίτιδων που προσδένονται στη σύναψη κατά την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών. Μη φυσιολογική έκφραση της SNCA αποτελεί θεμελιώδες χαρακτηριστικό σε μια σειρά νόσων μεταξύ των οποίων της νόσου του Πάρκινσον (νΠ), της άνοιας με σωμάτια Lewy και της ατροφίας πολλαπλών συστημάτων, με κρίσιμο ρόλο στην έναρξη και επιδείνωση του νευροεκφυλισμού. Η κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την έκφραση της SNCA είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη πιθανών θεραπευτικών παρεμβάσεων. Η ερευνητική δραστηριότητα έως τώρα έχει επικεντρωθεί στις διεργασίες λανθασμένης αναδίπλωσης και συσσώρευσης της πρωτεΐνης με μικρή προσοχή να έχει δοθεί στα ρυθμιστικά δίκτυα που διαμορφώνουν το πεπρωμένο του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) της α-συνουκλεΐνης. Μελέτες έχουν αναφέρει μεταλλάξεις στο 3’ αμετάφραστο άκρο (3’UTR) του mRNA της α-συνουκλεΐνης νΠ και αλλαγές στην κατανομή μήκους του σε ασθενείς με νΠ σε σχέση με υγιή άτομα .Το 3’ αμετάφραστο άκρο της α-συνουκλεΐνης μέσα από το μηχανισμό της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης είναι ικανό να παράγει πολλά διαφορετικά μήκη στο τελικό mRNA. Πιο συγκεκριμένα έχουν αναγνωριστεί 3’UTR με μήκη 290, 480, 560, 1070 και 2520 βάσεων.Οι πρωτεΐνες δέσμευσης RNA (RNA-binding proteins, RBPs) συμβάλουν σε πληθώρα λειτουργειών στον κύκλο ζωής του mRNA, από το μάτισμα και την εναλλακτική πολυαδενυλίωση, στην μεταφορά του mRNA εκτός του πυρήνα και περαιτέρω στην τοποθέτηση στο κύτταρο, την σταθερότητα την δυναμική κοκκίων στρες, ακόμη και τα επίπεδα μετάφρασης. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν χαρτογράφηση των σημείων στον κύκλο ζωής του mRNA της α-συνουκλεΐνης στα οποία ασκείται ρυθμιστικός έλεγχος από δυο τέτοιες πρωτεΐνες, την AUF1 (ΑU-binding Factor 1) και hnRNPA1 (heterogenous ribonucleoprotein A1).Η ετερογενής πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη D (HNRNPD), επίσης γνωστή ως παράγοντας δέσμευσης AU 1 (AUF1), περιλαμβάνει τέσσερις πρωτεϊνικές ισομορφές (p37, p40, p42 και p45) ικανές να μετακινούνται μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Η AUF1 δεσμεύει αλληλουχίες πλούσιες σε U, GU και UG και συμμετέχει σε πολλές διεργασίες όπως η μεταγραφική ενεργοποίηση και η εναλλακτική ωρίμανση και είτε προάγει την αποσύνθεση είτε ενισχύει τη σταθερότητα και τη μετάφραση των mRNA-στόχων με μηχανισμούς που είναι ακόμη ελάχιστα κατανοητοί. Η πρωτεΐνη AUF1 κατακρημνίστηκε με χρήση βιοτινυλιωμένων τμημάτων του SNCA mRNA (5’UTR, κωδικεύουσα περιοχή, βραχύ 3’UTR, άπω 3’UTR) όπου βρέθηκε προδεδεμένο στα τμήματα 3’UTR και απών από τις άλλες λειτουργικές περιοχές του mRNA. Στην περίπτωση της ανεβασμένης παρουσίας AUF1, βρέθηκε ικανή να μειώσει τα επίπεδα SNCA mRNA αφήνοντας ανεπηρέαστα τα επίπεδα της μακριάς ισομορφής 3’UTR αποτελούμενη από 2520 βάσεις (3’UTR2520). Η μείωση των συνολικών επιπέδων συνέπεσε με αποσταθεροποίηση των βραχέων ισομορφών του mRNA και μείωση του μέσου μήκους της πολύ(Α) ουράς τους. Το μήκος της πολύ(Α) ουράς αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για το χρόνο ζωής ενός μορίου mRNA, με τη βράχυνση της να σηματοδοτεί διαδικασίες καταστροφής του. Περαιτέρω πειράματα κατακρήμνισης με βιοτινυλιωμένο RNA και συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν πως η AUF1 στρατολογεί το σύμπλοκο αποαδενυλίωσης CNOT1-CNOT7 στο mRNA της α-συνουκλεΐνης. Τέλος, αποτρέπει την πρόσδεση SNCA mRNA – ριβοσώματος, οδηγώντας συνολικά σε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων α-συνουκλεΐνης κατά 35%. Από την άλλη πλευρά, η μείωση των επιπέδων AUF1 επέφερε μείωση των επιπέδων α-συνουκλεΐνης της τάξης του 35%, δεδομένο που ξάφνιασε καθώς ανέβασε τα συνολικά επίπεδα mRNA της α-συνουκλεΐνης, όπως και της ισομορφής 3’UTR2520. Όχι μόνον αυτό, αλλά πρόσδωσε σταθερότητα στο βραχύ mRNA της α-συνουκλεΐνης και αύξησε το μέσο μήκος της πολύ(Α) ουράς. Πιθανή εξήγηση για την παρακώλυση της πρωτεϊνοσύνθεσης α-συνουκλεΐνης απουσία AUF1 αποτελεί η εντονότατη συγκράτηση τόσο των βραχέων όσο και των επιμηκών ισομορφών mRNA της α-συνουκλεΐνης στον πυρήνα. Δεδομένης της έντονης πυρηνικής παρουσίας της AUF1 φαίνεται σημαντική για την ‘υγιή’ έξοδο των mRNA της α-συνουκλεΐνης από τον πυρήνα. Τέλος, δεδομένης της βιβλιογραφικά γνωστής αλληλεπίδρασης της AUF1 με τα miRNA ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση της AUF1 με τους ισχυρούς αρνητικούς ρυθμιστές του mRNA της α-συνουκλεΐνης miRNA-7 και miRNA-153. Χειραγώγηση των επιπέδων AUF1 άφησε ανεπηρέαστα τα επίπεδα των miRNAs και δεν έδειξε να συμμετέχει σε ανατροφοδοτικό κύκλο με αυτά στην αναστολή της έκφρασης α-συνουκλεΐνης.Η ετερογενής πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη Α1 (hnRNPA1) είναι μια εξελικτικά συντηρημένη και υψηλά εκφραζόμενη πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε ποικίλα γεγονότα επεξεργασίας RNA, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής, της διατήρησης των τελομερών, της ωρίμανσης των miRNA, της σταθερότητας του mRNA και της μετάφρασης. Έχει συσχετιστεί με νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση και η πολυσυστηματική πρωτεϊνοπάθεια. Ομοίως με την AUF1 η hnRNPA1 προσδένεται τόσο στο εγγύς όσο και στο άπω 3’UTR χωρίς να παρουσιάζει συγγένεια με τα 5’UTR και την κωδική περιοχή του SNCA mRNA, υποδεικνύοντας πως δύναται να ασκήσει έλεγχο σε όλες τις ισομορφές 3’UTR. Η βιβλιογραφική γνώση πως η hnRNPA1 συμμετέχει στην έξοδο ορισμένων mRNA στόχων από τον πυρήνα μας οδήγησε στη διερεύνηση της επιρροής της στην υποκυτταρική τοποθέτηση του mRNA της α-συνουκλεΐνης, όπου και οδήγησε σε παρατεταμένη παραμονή της 3’UTR2520 ισομορφής στον πυρήνα (με την αποσιώπηση hnRNPA1 να οδηγεί σε αυξημένη έξοδο του mRNA από αυτόν). Επιπλέον, σε μοντέλο κατεχολαμινεργικών κυττάρων βρέθηκε ικανό να μεταβάλει την κυτταροπλασματική τοποθέτηση του mRNA ευνοώντας την παραμονή των πιο επιμήκων ισομορφών στο σώμα σε σχέση με την τους νευράξονες, γεγονός που είχε αντίκτυπο και στα επίπεδα πρωτεΐνης. Δεδομένης της τοξικής επίδρασης της υπερβολικής α-συνουκλεΐνης στους νευρώνες, η λειτουργία της hnRNPA1 ως ρυθμιστής της τοποθέτησης του mRNA και της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης υποδεικνύει την ενδεχόμενη σημαντικότητά της στον νευροεκφυλισμό διαμεσολαβούμενο από α-συνουκλεΐνη.Η hnRNPA1 φάνηκε ρυθμιστής της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης (ΕΠΑ), με την υπερέκφρασή του να οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας της μακριάς ισομοφής δια του συνόλου κατά 45%. Εξετάστηκαν τρεις πιθανοί μηχανισμοί που διέπουν την ΕΠΑ της α-συνουκλεΐνης, η παρεμβολή στους παράγοντες της επεξεργασίας του 3’ άκρου, η συνεργασία με το συστατικό του συναρμοσώματος U1 και τέλος η ενίσχυση των παραγόντων επιμήκυνσης της μεταγραφής μέσω της προώθησης της πρόσδεσης του φωσφορυλιωμένης-TEFb στην RNA πολυμεράση ΙΙ, το ένζυμο που συντελεί τη μεταγραφή (Pol II), μηχανισμός ο οποίος φάνηκε να είναι ο πιο πιθανός. Ο διαφορικός έλεγχος των ισομορφών του mRNA της α-συνουκλεΐνης από την hnRNPA1 αναγνωρίζεται και στο επίπεδο σταθερότητας του mRNA με την hnRNPA1 να οδηγεί σε αποσταθεροποίηση των βραχέων ισομορφών, με μηχανισμό άγνωστο έως τώρα. Φαίνεται ανεξάρτητη της ρύθμισης μέσω των miRNA-7 και miRNA-153, πιθανολογείται πως συντελείται με εμπλοκή του συμπλόκου CNOΤ1-CΝΟΤ7 καθώς η hnRNPA1 επέφερε αποαδενυλίωση χωρίς όμως να έχει βρεθεί άμεση αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο. Η hnRNPA1 έχει αναγνωριστεί ως ρυθμιστής των διαδικασιών αποδόμησης και ανακύκλωσης πρωτεϊνών. Επομένως, μελετήθηκε η επίδραση της στις παραπάνω διαδικασίες στο κυτταρικό μοντέλο νευροβλαστικών κυττάρων SK-N-SH, όπου βρέθηκε να ενισχύει την ενεργότητα του πρωτεασώματος, τον καταβολισμό των ουβικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών και να επιδρά θετικά στην αυτοφαγική ροή με την αποσιώπηση της να συνεπάγεται με επιβράδυνση των μηχανισμών πρωτεϊνικής καταστροφής. Η άμεση μείωση της συγγένειας SNCA mRNA - ριβοσώματος εξετάστηκε και φάνηκε πως δεν αποτελεί σημείο ρύθμισης. Άθροισμα των παραπάνω συνισταμένων ήταν η πτώση των πρωτεϊνικών επιπέδων α-συνουκλεΐνης παρουσία hnRNPA1 και αύξησή τους απουσία hnRNPA1.Εν κατακλείδι, η διερεύνηση των μηχανισμών εμπλεκομένων στον έλεγχο της SNCA μέσα από το 3’UTR της από τις AUF1 / hnRNPA1 αποκάλυψε δυο σημαντικούς προμεταφραστικούς ρυθμιστές της και τόνισε την σημασία της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης στην εύρυθμη παραγωγή και παρουσία α-συνουκλεΐνης. Η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων των RBP με τα mRNA στόχους τους είναι σημαντική για την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τη ρύθμιση μεταγράφων, την ισορροπία υγείας/παθογένειας και κατ’ επέκταση προσθέτουν στην ανθρώπινη ‘εργαλειοθήκη’ για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.