Μοριακή και βιοχημική μελέτη μιας νέας ανθρώπινης ριβονουκλεάσης
Authors: Οικονομοπούλου Αγγελική-Μαρία 
Published: August 2021

Είναι γνωστό ότι ο μεταβολισμός των διαφόρων RNA μορίων περιλαμβάνει μια μεγάλη ποικιλία ενζυμικών αντιδράσεων, στις οποίες το σημαντικότερο ρόλο διαδραματίζουν αυτές που καταλύονται από τις ριβονουκλεάσες. Οι ριβονουκλεάσες είναι ένζυμα διάσπασης του RNA και απαρτίζουν μια μεγάλη υπεροικογένεια πρωτεϊνικών μορίων, που απαντούν σε όλους τους οργανισμούς. Την αρχική απομόνωση και χαρακτηρισμό της βόειας παγκρεατικής RNase A ακολούθησε η απομόνωση πληθώρας ριβονουκλεολυτικών ενζύμων από ένα ευρύ φάσμα προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών. Εκτεταμένες μελέτες στον τομέα αυτό έχουν οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην ταυτοποίηση πολλών ομόλογων ριβονουκλεασών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ορισμένες από τις ριβονουκλεάσες αυτές, εκτός από ριβονουκλεολυτική ενεργότητα, διαδραματίζουν σημαντικό βιολογικό ρόλο σε βασικές βιολογικές και κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αγγειογένεση, η ανοσοκαταστολή, η αντικαρκινική και αντιβακτηριακή δράση κ.α. Οι ανθρώπινες ριβονουκλεάσες βρίσκονται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια και έχουν μελετηθεί εκτεταμένα. Στο εργαστήριο Βιοχημείας του Πανεπιστημίου της Αθήνας έχει απομονωθεί και μελετηθεί σε βιοχημικό επίπεδο μια ριβονουκλεάση από το έντομο Ceratitis capitata, η οποία ονομάστηκε Cc RNase. Στόχος της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η μοριακή και βιοχημική μελέτη της ομόλογης ανθρώπινης πρωτεΐνης, δηλαδή της ανθρώπινης RNase κ. Για το σκοπό αυτό αρχικά εντοπίστηκε και κλωνοποιήθηκε το cDNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Από την αντίστροφη μεταγραφή απομονωμένου από ανθρώπινο πλακούντα poly (Α)⁺ mRNA με τη βοήθεια κατάλληλων εκκινητών προέκυψε ένας cDNA κλώνος μήκους 466 ζευγών βάσεων, ο οποίος περιλαμβάνει ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης μήκους 297 ζευγών βάσεων αλλά και τις 5' και 3' αμετάφραστες περιοχές του. Το ανοικτό αυτό πλαίσιο ανάγνωσης κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μήκους 98 αμινοξικών καταλοίπων, την ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη RNase κ (MGC71993) εντοπίζεται σε ένα μοναδικό αντίγραφο στο χρωμόσωμα 17 και συγκεκριμένα στη θέση 17ρ13.1 του γενετικού χάρτη (LOC440400 gene locus), ενώ ταυτόχρονα διατηρεί το πρότυπο της γονιδιακής οργάνωσης των υπόλοιπων μελών της οικογένειας αποτελούμενο από 3 εξώνια και 2 εσώνια. Η έρευνα ομολογίας της προβλεπόμενης αμινοξικής ακολουθίας της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ σε πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων δεν έδειξε την ύπαρξη ομολογίας μεταξύ της πρωτεΐνης αυτής και άλλων γνωστών ριβονουκλεασών. Αντίθετα, η TBLASTN έρευνα ομολογίας σε νουκλεοτιδικές βάσεις δεδομένων αποκάλυψε ότι ένας μεγάλος αριθμός αλληλουχιών, που κωδικοποιούν υποθετικές πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργικότητας παρουσιάζει υψηλό βαθμό ομοιότητας με την αμινοξική αλληλουχία της ανθρώπινης RNase κ. Οι αλληλουχίες αυτές απαντούν σε 65 τουλάχιστον διαφορετικούς οργανισμούς και κωδικοποιούν πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποτελούμενες από 93-101 αμινοξέα. Η υψηλότατη αμινοξική ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνικών αυτών μορίων εισάγει με νέα ορθόλογη οικογένεια πρωτεϊνών, συντηρημένη από τον C. elegans έως τον άνθρωπο, η οποία ονομάστηκε οικογένεια των ριβονουκλεασών κ. Σε ό,τι αφορά στην έκφραση της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ μελέτη των EST αλληλουχιών που προέκυψαν από την αναζήτηση στις διάφορες βάσεις δεδομένων, οδήγησε στην αποκάλυψη ότι η ανθρώπινη RNase κ εκφράζεται σε μια πληθώρα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών αλλά και σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Επιπρόσθετα, ανάλυση κατά Northern αποκάλυψε την ύπαρξη ενός κύριου μεταγράψου που εκφράζεται σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, αλλά και 2 μεγαλύτερων μεταγράφων που εκφράζονται μόνο στον εγκέφαλο, τον πλακούντα και το πάγκρεας. Για την έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ σε βακτηριακά συστήματα δοκιμάστηκε μια σειρά διαφορετικών πλασμιδιακών φορέων, όπως οι pET-15b, pET-20b, pET-29b, pET-cocol και pET-39b. Σε όλες τις περιπτώσεις η επαγωγή της βακτηριακής καλλιέργειας είχε σαν αποτέλεσμα την έντονη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή τοξική δράση της επαγόμενης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ στα κύτταρα της E. coli. Σε μια προσπάθεια να μειωθεί η κυτταροτοξική δράση, η κωδικοποιούσα περιοχή της ανθρώπινης RNase κ υποκλωνοποιήθηκε στο φορέα pSCREEN l(b)+, όπου η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης με την κύρια πρωτεΐνη του καψιδίου του βακτηριοφάγου Τ7. Η έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ στο φορέα αυτό δεν συνοδεύτηκε από φαινόμενα τοξικότητας, γεγονός που είχε σαν αποτέλεσμα την επιτυχή έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Για τον καθαρισμό της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης RNase κ χρησιμοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο που περιλαμβάνει χρωματογραφία σε στήλη Ni⁺⁺, πέψη της πρωτεΐνης σύντηξης με θρομβίνη και επαναχρωματογραφία των προϊόντων της πέψης στην ίδια στήλη. Η εφαρμογή του πρωτοκόλλου αυτού είχε σαν αποτέλεσμα την απομόνωση πολύ μικρών ποσοτήτων ισχυρά υδρόφοβης καθαρής ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, η οποία εμφάνιζε πάρα πολύ χαμηλή ριβονουκλεολυτική ενεργότητα. Για το λόγο αυτό ακολούθησαν προσπάθειες έκφρασης της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης πρωτεΐνης στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αρχικά, προκειμένου να εκφραστεί η ανθρώπινη RNase κ το cDNA που την κωδικοποιεί υποκλωνοποιήθηκε στο φορέα έκφρασης pPICZa A, ο οποίος αφού έγινε γραμμικός ενσωματώθηκε στο γονιδίωμα του στελέχους ΚΜ71 του ζυμομύκητα. Ακολούθησε επιλογή των κλώνων που είχαν ενσωματώσει το επιθυμητό cDNA, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε επαγωγή της έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Από το σύνολο των κλώνων που εξετάστηκαν ένας κλώνος Βρέθηκε να εκφράζει την ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RNase κ σε ικανοποιητική ποσότητα, όπως διαπιστώθηκε από SDS ηλεκτροφόρηση αλλά και από ανάλυση κατά Western. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ καθαρίστηκε σε ομογενή μορφή με χρωματογραφία σε στήλη Ni⁺⁺ και η μελέτη της έδειξε ότι παρουσίαζε σημαντική ριβονουκλεολυτική ενεργότητα. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ έδειξε ότι η ανασυνδυασμένη ριβονουκλεάση: • Διασπά κατά σειρά προτίμησης ApU>ApG>UpU φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. • Διασπά το συνθετικό υπόστρωμα poly (U), αλλά και τα φυσικά tonila yeast RNA, 28S και 18S rRNA. • Η ενεργότητα της εξαρτάται ανάλογα από το χρόνο επώασης και τη συγκέντρωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. • Η ενεργότητα της δεν επηρεάζεται από την παρουσία μονοσθενών ιόντων αλλά και των δισθενών ιόντων Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ και Mn⁺⁺, ενώ αναστέλλεται από τα ιόντα Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺ και Fe⁺⁺. • Είναι θερμοευαίσθητη και λειτουργεί σε ένα εύρος τιμών pH μεταξύ 5- 8, ενώ παρουσιάζει βέλτιστο pH δράσης 8. • Η ριβονουκλεολυτική της ενεργότητα αναστέλλεται πλήρως παρουσία του αναγωγικού παράγοντα DTT, ενώ οι αλκυλιωτικοί παράγοντες ΝΕΜ και ιοδοακεταμίδιο δεν επηρεάζουν την ενζυμική ενεργότητα. • Τέλος, η ενεργότητα του ενζύμου δεν αναστέλλεται από τον placental RNase inhibitor, τον πιο σημαντικό αναστολέα των ριβονουκλεασών της υπεροικογένειας Α. Συνοψίζοντας, η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, ως το δεύτερο μέλος της οικογένειας των ριβονουκλεασών κ, εδραιώνει την αναγνώριση της καινούριας αυτής πρωτεϊνικής οικογένειας στα μετάζωα. Η νουκλεοτιδική εξειδίκευση της ανθρώπινης RNase κ, η απουσία οποιασδήποτε ομολογίας με τις ριβονουκλεάσες της υπεροικογένειας A και η αδυναμία αναστολής της ριβονουκλεολυτικής της ενεργότητας από τον αναστολέα των ριβονουκλεασών (RI) ουσιαστικά αποδεικνύουν την ανυπαρξία οποιασδήποτε εξελικτικής συγγένειας των ριβονουκλεασών της υπεροικογένειας A και της οικογένειας κ. Τα πολύ υψηλά ποσοστά συντηρητικότητας που παρουσιάζουν οι ριβονουκλεάσες της οικογένειας κ σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η ανθρώπινη RNase κ έχει βρεθεί να εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ανθρώπινους ιστούς αλλά και σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια υποδεικνύουν ένα σημαντικό βιολογικό ρόλο για τα μέλη αυτής οικογένειας ριβονουκλεασών.