Μελέτη των βιοχημικών, λειτουργικών και τεχνολογικών ιδιοτήτων των εντεροκόκκων
Authors: Σαραντινόπουλος Παναγιώτης 
Published: January 2014

Οι εντερόκοκκοι αποτελούν μια από τις πιο ενδιαφέρουσες, σημαντικές, αλλάταυτόχρονα και μια από τις πλέον αμφισβητούμενες ομάδες οξυγαλακτικών βακτηρίων. Η παρούσα εργασία είχε ως σκοπό τη μελέτη διαφόρων βιοχημικών και λειτουργικών ιδιοτήτων των εντεροκόκκων, και την αξιολόγηση τους μέσω της in situ εφαρμογής τους κατά την παρασκευή ζυμώσιμων προϊόντων. Αρχικά, ένα σύνολο 172 στελεχών εντεροκόκκων, που ανήκαν στα πιο γνωστά είδη (Ε. faecium, Ε. faecalis και Ε. durons) και είχαν απομονωθεί από διαφορετικές πηγές (τρόφιμα, ζώα και ανθρώπους), εξετάστηκαν ως προς διάφορες βιοχημικές ιδιότητες που σχετίζονται με την τεχνολογική τους εφαρμογή για την παρασκευή ζυμώσιμων προϊόντων. Επίσης, ελήφθησαν υπόψη η παραγωγή βακτηριοσινών, και ορισμένοι βασικοί χαρακτήρες παθογένειας, όπως είναι η ανθεκτικότητα έναντι αντιβιοτικών, η παραγωγή βιογενών αμινών και η αιμόλυση. Η πλειοψηφία των στελεχών είχαν χαμηλή ικανότητα οξύνισης στο γάλα, και χαμηλή πρωτεολυτική δραστικότητα. Τα στελέχη παρουσίασαν επίσης χαμηλή πεπτιδολυτική δραστικότητα, αλλά με εξειδίκευση κυρίως έναντι του 4-νιτροανιλιδίου του γλουταμινικού οξέος και της γλυκυλο-προλίνης. Αντίθετα, η λιπολυτική και εστερολυτική δραστικότητα των περισσοτέρων στελεχών ήταν σχετικά μεγαλύτερη. Η ανίχνευση εστερασών με ασυνεχή ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου έδειξε ότι το εστερολυτικό σύστημα των εντεροκόκκων είναι αρκετά πολύπλοκο. Παρατηρήθηκε ακόμα ότι η πλειοψηφία ων στελεχών είχε την ικανότητα καταβολισμού του κιτρικού οξέος σε αρκετά υψηλό βαθμό. Τέλος, τα περισσότερα στελέχη παρουσίασαν αντιμικροβιακή δράση, ευαισθησία έναντι αντιβιοτικών, παρήγαγαν μόνο τυραμίνη και ήταν μη αιμολυτικά. Οι βιοχημικές ιδιότητες καθώς επίσης και οι πιθανοί παράγοντες παθογένειας συσχετίστηκαν, τόσο ως προς την προέλευση όσο και ως προς το είδος των στελεχών. Τα περισσότερο δραστικά στελέχη ανήκαν στο είδος Ε. faecalis, και κατά δεύτερο λόγο στο είδος Ε. faecium, ή είχαν απομονωθεί από τρόφιμα. Με βάση τα συνολικά αποτελέσματα επιλέχθηκε τελικά ένα στέλεχος, το οποίο μελετήθηκε εκτενέστερα κατά τη διάρκεια των επόμενων πειραμάτων. Αυτό ήταν το στέλεχος ACA-DC 1681 (FAIR-E 198), που ανήκει στη Συλλογή ACA-DC του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών), είχε απομονωθεί από Φέτα και ταυτοποιήθηκε ως Enterococcus faecium. Πιο συγκεκριμένα, εξετάστηκε αναλυτικότερα ο τρόπος μεταβολισμού του κιτρικού οξέος από το στέλεχος E. faecium ACA-DC 1681, και για λόγους σύγκρισης και από το Ε. faecalis FAIR-E 229. Χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά υποστρώματα που περιείχαν κιτρικό οξύ είτε ως μόνη πηγή άνθρακα είτε σε συνδυασμό με γλυκόζη. Στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecium έλαβε χώρα ταυτόχρονος μεταβολισμός του κιτρικού οξέος και της γλυκόζης, ενώ κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε για το στέλεχος Ε. faecalis. Ωστόσο, και για τα δύο στελέχη αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις κιτρικού οξέος σε MRS broth ενίσχυσαν την παραγωγή βιομάζας και την κατανάλωση γλυκόζης. Διαπιστώθηκε ότι και τα δύο στελέχη μπορούν να χρησιμοποιήσουν το κιτρικό οξύ για ανάπτυξη και παραγωγή ενέργειας, όταν αυτό αποτελεί την μοναδική πηγή άνθρακα, παράγοντας οξικό οξύ ως το κύριο τελικό προϊόν. Η κατανάλωση του κιτρικού οξέος ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecalis, και συνεπώς παράχθηκε περισσότερο οξικό και μυρμηγκικό οξύ. Εν τούτοις, όταν το κιτρικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως μόνη πηγή άνθρακα στην περίπτωση του στελέχους Ε. faecium,παρατηρήθηκε σημαντικά μεγαλύτερη παραγωγή μυρμηγκικού οξέος υπό αναερόβιες συνθήκες. Αυτά τα πειράματα αποκαλύπτουν ότι οι εντερόκοκκοι διαθέτουν το μεταβολικό δυναμικό για να αφομοιώσουν το κιτρικό οξύ και συνεπώς να συνεισφέρουν ενεργά στην ανάπτυξη του αρώματος των ζυμώσιμων προϊόντων. Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων συνθηκών ανάπτυξης στην ενεργότητα της εντεροσίνης που παράγεται από το στέλεχος Ε. faecium AC Α-DC 1681. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπό συνθήκες που προσομοίωναν, ως ένα βαθμό, αυτές που επικρατούν κατά την παρασκευή της Φέτας. Η μέγιστη ενεργότητα καθώς και ο μεγαλύτερος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης παρατηρήθηκαν ύστερα από ανάπτυξη του στελέχους σε MRS broth, στους 37°C και σε pH 6.5. Η βακτηριοσίνη ανιχνεύτηκε καθ' όλη τη διάρκεια ανάπτυξης, παρουσιάζοντας μέγιστη ενεργότητα στο μέσο της εκθετικής φάσης. Όταν τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε γάλα παρουσία ρεννίνης, CaCl2 και εναρκτήριων καλλιεργειών, αν και το στέλεχος είχε την ικανότητα να αναπτυχθεί καλά, τελικά ανιχνεύτηκε ελάχιστη ή μηδενική ενεργότητα. Τα πειράματα αυτά αποκαλύπτουν την ανάγκη μεγιστοποίησης της ποσότητας της βιοδιαθέσιμης βακτηριοσίνης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης των τροφίμων, επιλέγοντας εναρκτήριες καλλιέργειες, οι οποίες έχουν το δυναμικό παραγωγής βακτηριοσινών σε υψηλά ποσοστά, και οι οποίες προσαρμόζονται εύκολα και γρήγορα στο περιβάλλον του τροφίμου. Στην τελευταία φάση, χρησιμοποιήθηκαν το στέλεχος Ε. faecium AC Α-DC 1681, το στέλεχος Ε. faecium FAIR-Ε 243 και ο συνδυασμός τους, ως συμπληρωματικές εναρκτήριες καλλιέργειες για την παρασκευή Φέτας. Βρέθηκε ότι η προσθήκη των εντεροκόκκων ευνόησε την ανάπτυξη των εναρκτήριων καλλιεργειών, των NSLAB, των μικρόκοκκων και των κολοβακτηριδίων. Η προσθήκη των στελεχών Ε. faecium επηρέασε ελάχιστα τα περισσότερα από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της Φέτας, όπως το pH, την υγρασία, την τέφρα, το συντελεστής άλατος, και το λίπος επί ξηρού. Ωστόσο, οι μεγαλύτερες μεταβολές παρατηρήθηκαν σε σχέση με την πρωτεόλυση, αφού η χρήση των εντεροκόκκων είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του συντελεστή ωρίμανσης και τη μεγαλύτερη υδρόλυση των as1-και β-καζεϊνών. Επίσης, επέφερε διαφοροποίηση στα χρωματογραφήματα της RP-HPLC σε σχέση με το τυφλό. Επιπλέον, ενίσχυσε την κατανάλωση του κιτρικού οξέος και είχε σημαντικά θετική (γεύση, άρωμα, χρώμα και δομή). Τέλος, δεν ανιχνεύτηκε αντιμικροβιακή δράση από τους εντερόκοκκους υπό τις πραγματικές πια συνθήκες παρασκευής και ωρίμανσης της Φέτας. Παρ' όλο που το γένος των εντεροκόκκων αποτελεί μια αμφισβητούμενη ομάδα μικροοργανισμών, αν ληφθούν υπόψη τόσο όλα εκείνα τα επιθυμητά βιοχημικά και τεχνολογικά χαρακτηριστικά τους, όσο και οι πιθανοί χαρακτήρες παθογένειας, θα ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία, μαζί με άλλες οξυγαλακτικές καλλιέργειες, για την παρασκευή ζυμώσιμων, γαλακτοκομικών προϊόντων.