Dormancy at single cell level, colony growth dynamics and gene networks regulation under oxidative stress in Listeria monocytogenes
Authors: Αρβανίτη Μαριάννα 
Published: May 2024

Ο τροφιμογενής παθογόνος μικροοργανισμός Listeria monocytogenes απαντάται συχνά στη φύση και αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα της νόσου Λιστερίωσης, που χαρακτηρίζεται από ποσοστό θνησιμότητας 20-30%. Σε περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων, ο μικροοργανισμός L. monocytogenes αντιμετωπίζει απρόβλεπτες περιβαλλοντικές αλλαγές που προκαλούν έκθεση σε διαφορετικά επίπεδα στρες, από υποθανάτιο έως θανατηφόρο. Η προσαρμοστική απόκριση του L. monocytogenes σε συνθήκες υποθανάτιου στρες μπορεί να επάγει φαινόμενα ληθάργου που εκφράζονται στοχαστικά σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, με διαφορετική ικανότητα ανάκαμψης. Δύο στενά συνδεδεμένες καταστάσεις λήθαργου είναι τα Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα (VBNC) κύτταρα και η βακτηριακή ανθεκτικότητα. Η είσοδος σε λήθαργο είναι μια εξελικτική στρατηγική αντιστάθμισης του κινδύνου που επιτρέπει την ανοχή των επιβλαβών συνθήκων. Η επαγωγή της κατάστασης VBNC είναι ζωτικής σημασίας για τα τροφιμογενή παθογόνα, των οποίων η ανίχνευση βασίζεται σχεδόν αποκλειστικά στη χρήση τεχνικών καλλιέργειας.Οι κυριότεροι στόχοι της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν (i) η διερεύνηση φαινομένων λήθαργου σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων που προκαλούνται από καταστάσεις στρες που σχετίζονται με τα τρόφιμα, (ii) η εκτίμηση της ετερογένειας των παραμέτρων κινητικής κατά την αποικιακή ανάπτυξη και (iii) η αποκρυπτογράφηση της ρύθμισης των γονιδιακών δικτύων υπό οξειδωτικό στρες στο μικροοργανισμό L. monocytogenes. Η προσέγγιση που ακολουθήθηκε για την επίτευξη αυτών των στόχων ήταν, πρώτον, να ποσοτικοποιηθεί η αναλογία των μεταβολικά ενεργών, υποθανάτια τραυματισμένων, VBNC και νεκρών κυττάρων μετά από έκθεση σε συνθήκες στρες που σχετίζονται με τα τρόφιμα, όπως το όξινο στρες και τα απολυμαντικά, και να προσδιοριστούν διαφορές στο μέγεθος των αποικιών (SCV) που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, πειράματα μικροσκοπίας φθορισμού σε συνδυασμό με χρώση CFDA / PI υποστηρίχθηκαν από τη μέθοδο επίστρωσης σε τρυβλία. Με βάση αυτά τα ευρήματα, τα ακόλουθα πειράματα επικεντρώθηκαν στην αξιολόγηση της φυσιολογικής κατάστασης και της ικανότητας ανάκαμψης του υποπληθυσμού των μεταβολικά ενεργών (CFDA+PI-) κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα άγαρ (αποικιακή ανάπτυξη) έναντι υγρού θρεπτικού υποστρώματος (πλαγκτονική ανάπτυξη), χρησιμοποιώντας κυτταροδιαχωριστή ροής. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η ετερογένεια στη δυναμική της ανάπτυξης των αποικιών και ακολουθήθηκε μια στοχαστική προσέγγιση για την πρόβλεψη της μεταβλητότητας κατά την ανάπτυξη. Τέλος, βασικά στοιχεία που εμπλέκονται στην απόκριση στρες που επάγεται από ΡΑΑ και στη ρύθμιση των δικτύων γονιδίων που επάγονται υπό οξειδωτικό στρες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης (RNA-sequencing). Τα αποτελέσματα του 2ου κεφαλαίου έδειξαν ότι το υπεροξικό οξύ (peracetic acid, PAA) επάγει τον υποθανάτιο τραυματισμό και την κατάσταση VBNC στον μικροοργανισμό L. monocytogenes. Σε επίπεδο πληθυσμού, εντοπίστηκαν δύο διακριτοί υποπληθυσμοί με διαφορετικούς μορφότυπους αποικιών μετά από έκθεση σε PAA, ένα φαινόμενο που πιθανώς επάγεται από εξωτερικούς παράγοντες για την ενίσχυση της ικανότητας επιβίωσης των κυττάρων. Στο 3ο κεφάλαιο δείχθηκε ότι το CFDA-/PI- κλάσμα κυττάρων παρέμεινε μη ανιχνεύσιμο και επομένως μη καλλιεργήσιμο στο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (TSAYE). Επιπλέον, ανιχνεύθηκε φαινοτυπική ετερογένεια (SCVs) μετά από έκθεση σε οξικό οξύ (acetic acid, AA) pH 2.7 στους 20oC σε επίπεδο πληθυσμού. Σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, ύστερα από έκθεση σε υδροχλωρικό οξύ (hydrochloric acid, HCl) ανιχνεύθηκε στοχαστική αλλαγή στη μορφολογία oρισμένων κυττάρων από σχήμα ράβδου σε σφαιρικό. Η μοριακή ανάλυση έδειξε ότι μετά από έκθεση σε AA pH 2.7 στους 20 oC τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων relA, clpP, mazE, mazF, gadB ήταν αυξημένα σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η έκθεση σε ΑΑ pH 2.7 στους 20oC επάγει την αντοχή του μικροοργανισμού L. monocytogenes. Στο 4o κεφάλαιο , η αξιολόγηση της ικανότητας ανάκαμψης των μεταβολικά ενεργών κυττάρων ύστερα από έκθεση σε PAA σε TSAYE και TSBYE οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά ανάκαμψης στο TSAYE σε σύγκριση με το TSBYE (20 ppm για 90 min, 30 και 40 ppm για 30 min στους 20oC), υποδεικνύοντας ότι το πρόσθετο στρες που βιώνουν τα κύτταρα λόγω του αποικιακού τύπου ανάπτυξης, προκαλεί υψηλότερα ποσοστά λήθαργου, δηλ. κατάσταση VBNC, σε σύγκριση με τον πλαγκτονικό τύπο ανάπτυξης. Από την άλλη πλευρά, το όξινο στρες προκάλεσε σημαντικά υψηλότερα ποσοστά επαγωγής της κατάστασης VBNC στον πλαγκτονικό τύπο ανάπτυξης. Η αξιολόγηση της ετερογένειας στη δυναμική ανάπτυξης των αποικιών, στο κεφάλαιο 5, αποκάλυψε ότι η φαινοτυπική εναλλαγή επάγεται και σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, αφού μετά την έκθεση σε 30 ppm PAA για 3 ώρες στους 20oC δύο υποπληθυσμοί ανιχνεύθηκαν στις πρώτες γενιές (1, 2 και 3). Το ίδιο μοτίβο παρατηρήθηκε μετά από έκθεση σε AA pH 2,5 για 5 ώρες στους 20oC. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μεμονωμένα κύτταρα του μικροοργανισμού L. monocytogenes ακολουθούν τις αρχές της αντιστάθμισης κινδύνου. Στο κεφάλαιο 6, η ανάλυση της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης ύστερα από έκθεση σε PAA αποκάλυψε 12 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια. Όλα τα γονίδια σχετίζονταν με την απόκριση στο βακτηριακό στρες. Το σύστημα προστασίας από την τοξικότητα οργανικού υπεροξειδίου (OhrA-OhrR), το οπερόνιο LMRG_00319-LMRG_00320 που ρυθμίζεται από το Rli47 sRNA, ο μηχανισμός επιβίωσης αυστηρού ελέγχου και ένα γονίδιο που σχετίζεται με την απόκριση SOS επάχθηκαν κατά την έκθεση του μικροοργανισμού L. monocytogenes σε PAA.Η συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή στοχεύει να διαλευκάνει τον τρόπο που τα φαινόμενα ληθάργου που επάγονται στον παθογόνο μικροοργανισμό L. monocytogenes επηρεάζουν την ασφάλεια των τροφίμων. Τονίζεται επίσης η σημασία της χρήσης μεθόδων μεμονωμένων κυττάρων σε συνδυασμό με τεχνικές ανίχνευσης σε επίπεδο πληθυσμού, προκειμένου να καθοριστεί η έκταση της βακτηριακής ετερογένειας και του λήθαργου.