Acoustic based technologies combined with enzymatic amplification for the analysis of point mutations in Tissue and Liquid biopsy
Authors: Ναούμη Νικολέττα 
Published: February 2022

Παρόλο που ο πρώτος βιοαισθητήρας ανακαλύφθηκε το 1962 από τον Leyland C. Clark, εκθετική άνοδος στις δημοσιεύσεις του αντίστοιχου τομέα καταγράφηκε μετά τα τέλη της δεκαετίας του 1980. Επιπλέον, η όλο και αυξανόμενη ζήτηση για οικονομικούς, εύχρηστους, ευαίσθητους και αξιόπιστους αισθητήρες έχει οδηγήσει σε μεγάλη ανάπτυξη της αγορά των βιοαισθητήρων, η οποία για το έτος 2020 υπολογίστηκε στα 26 δισεκατομμύρια δολάρια ενώ αναμένεται να ανέλθει στα 43,4 δισεκατομμύρια δολάρια το 2027 με προβλεπόμενο σύνθετο ετήσιο ρυθμό ανάπτυξης (CAGR) 7,3%. Ο κλάδος των βιοαισθητήρων βρίσκει εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα τομέων, όπως αυτόν της ιατρικής διάγνωσης και αναμένεται να επηρεαστεί θετικά από τη νέες αναδυόμενες τάσεις της ιατρικής ακριβείας και της επίσης πολύ μεγάλης και ραγδαίας αναπτυσσόμενης αγοράς που αφορά την Υγρή βιοψία.Σύμφωνα με τα δεδομένα, προκειμένου να επιτευχθεί η πλέον αποτελεσματική αντιμετώπιση του καρκίνου, απαραίτητη είναι η έγκαιρη και τακτική ταυτοποίηση τυχόν καρκινικών μεταλλάξεων τόσο για τη σωστότερη διάγνωση όσο και για την επιλογή καταλληλότερης θεραπείας και για έλεγχο της ανταπόκρισης του ασθενούς σε αυτήν. Αν και τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί εξαιρετικές τεχνικές για την αξιόπιστη ταυτοποίηση των καρκινικών μεταλλαγών, όπως η αλληλούχιση DNA νέας γενιάς (next-generation sequencing) και η ψηφιακή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης τεχνολογίας σταγονιδίων (digital droplet PCR, ddPCR), αυτές οι τεχνικές εξακολουθούν να έχουν σημαντικά υψηλό κόστος και στερούνται απλότητας και ταχύτητας ως προς την έκδοση των αποτελεσμάτων. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων για την ανίχνευση εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων ανθρώπινου καρκινικού DNA και των φερόμενων σε αυτό σημειακών μεταλλαγών. Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με τη χρήση ακουστικών βιοαισθητήρων σε συνδυασμό με μοριακές μεθόδους ενίσχυσης του DNA.Σε πρώτη φάση, επικεντρωθήκαμε στην ανάπτυξη μία καθολικής μεθόδου για την ακουστική ανίχνευση του DNA, η οποία περιλαμβάνει την άμεση ακινητοποίηση μικρών συγκεντρώσεων (pM - nM) βιοτινυλιωμένου DNA στην επιφάνεια του αισθητήρα ακολουθούμενη από την ανίχνευσή του μέσω λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα, είναι μεγάλα μόρια (για παράδειγμα εδώ γίνεται χρήση λιπωμάτων διαμέτρου 200 nm) που δρουν ως ενισχυτές του ακουστικού σήματος αυξάνοντας κατά πολύ τη διάχυση ενέργειας (energy dissipation). Για την ακινητοποίηση του DNA πάνω στη επιφάνεια του αισθητήρα, αναπτύξαμε ένα υπόστρωμα αποτελούμενο από βιοτινυλιωμένη-BSA και νιουτραβιδίνη (ΝΑv); η NAv χρησιμεύει στην άμεση και αυθόρμητη ακινητοποίηση του βιοτινυλιωμένου DNA μέσω της πολύ ισχυρής συγγένειας που έχει η βιοτίνη για τη NAv. Το DNA είναι ειδικά σχεδιασμένο, έτσι ώστε εκτός από τη βιοτίνη στο ένα άκρο, να φέρει ένα μόριο χοληστερόλης στο άλλο άκρο του. Έτσι, η πρόσδεση των λιποσωμάτων στο DNA επιτυγχάνεται μέσω της χοληστερόλης η οποία αυθόρμητα εισέρχεται στη λιπιδική διπλοστοιβάδα τους. Το υπόστρωμα ελέγχθηκε ως προς (α) την επαναληψιμότητα στη σύνθεσή του, (β) την τυχόν μη ειδική πρόσδεση των λιποσωμάτων σε αυτό απουσίας DNA και (γ) την σταθερότητά του κατά την εισαγωγή μη προ-καθαρισμένων μοριακών αντιδράσεων. Ενώ για τα παραπάνω πειράματα χρησιμοποιήσαμε την τυπική QCM-D συσκευή και έναν QCM αισθητήρα των 5 MHz, δοκιμάσαμε, επίσης, αισθητήρες QCM υψηλής θεμελιώδους συχνότητας (HFF-QCM) σε συνδυασμό με μια νέα ακουστική συσκευή. Αναφορικά με αυτό, ήταν μία διάταξη 24 μικροσκοπικών αισθητήρων που λειτουργούν στα 150 MHz. Η διάταξη αυτή, επέτρεπε την ταχύτερη και οικονομικότερη ανάλυση έως και έξι διαφορετικών δειγμάτων και την εξαγωγή έως και 24 μετρήσεων. Η προαναφερθείσα ακουστική μεθοδολογία, δηλαδή, βιοτινυλιωμένη-BSA/NAv σε συνδυασμό με τα λιποσώματα για την ακινητοποίηση και την ανίχνευση των DNA στόχων χρησιμοποιώντας τη συσκευή QCM-D, συνδυάστηκε αρχικά με μια μοριακή αντίδραση ενίσχυσης του DNA χωρίς PCR, την αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης (LCR). Για την LCR χρησιμοποιήσαμε ολιγονουκλεοτίδια (probes) τροποποιημένα με βιοτίνη και χοληστερόλη προκειμένου να παράγουμε τροποποιημένα προϊόντα LCR έτοιμα για ακινητοποίηση στον αισθητήρα και ακουστική ανίχνευση. Έπειτα από εκτεταμένη βελτιστοποίηση της όλης μεθοδολογίας, καταφέραμε να ανιχνεύσουμε 3300 μόρια DNA που φέρουν τη σημειακή μετάλλαξη BRAF V600E. Ωστόσο, η συνολική δοκιμασία έπασχε από ορισμένους περιορισμούς, όπως τα παραπροϊόντα που δημιουργούνταν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ανεξάρτητα από την παρουσία του DNA στόχου, οδηγώντας σε περιορισμένη ευαισθησία και μειωμένη ειδικότητα της αντίδρασης. Από την άλλη πλευρά, η αλληλοειδική PCR (AS-PCR) σε συνδυασμό με την προαναφερθείσα ακουστική μεθοδολογία βελτίωσε το όριο ανίχνευσης σημαντικά, επιτρέποντας την ανίχνευση 1 μορίου γενωμικού DNA στόχου που φέρει τη BRAF V600E μετάλλαξη σε περίσσεια 10000 μορίων αγρίου τύπου, αλλιώς με ευαισθησία 0,01%. Για την ενίσχυση του μεταλλαγμένου DNA μέσω της PCR, χρησιμοποιήθηκαν και πάλι εκκινητές τροποποιημένοι με βιοτίνη και χοληστερόλη για την παραγωγή τροποποιημένων AS-PCR προϊόντων, ενώ για την ακουστική ανίχνευση, χρησιμοποιήθηκε το βιοτσίπ με τη διάταξη βιοαισθητήρων που λειτουργούν στα 150 MHz. Δεδομένου ότι το αρχικό πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε για την ανίχνευση της μετάλλαξης BRAF V600E παρείχε μόνο ποιοτικά αποτελέσματα, η τεχνική βελτιστοποιήθηκε περαιτέρω και εφαρμόστηκε για την ανάλυση της μετάλλαξης KRAS G12D επιτυγχάνοντας τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά αποτελέσματα με ευαισθησία 0,05%. Τέλος, η επιτυχής εφαρμογή και η αξιοπιστία της μεθόδου επικυρώθηκε με την ανίχνευση και των δύο σημειακών μεταλλάξεων σε πραγματικά δείγματα μονιμοποιημένου ιστού ενσωματωμένου σε παραφίνη (FFPE) και σε πραγματικά δείγματα πλάσματος προερχόμενα από ασθενείς με μελάνωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου και καρκίνο του πνεύμονα. Τα λυφθέντα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά που καταγράφηκαν από τις κλασσικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για βιοψία ιστού και υγρή βιοψία, δηλ. με την αλληλούχιση κατά Sanger και τη ddPCR.