Development of novel atomic mass spectrometric techniques for the analysis of single particles and single cells
Authors: Μαυράκης Εμμανουήλ 
Published: May 2023

Με σκοπό τον προσδιορισμό μετάλλων στο επίπεδο διακριτών σωματιδίων και κυττάρων, αυτή η διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη προχωρημένων μεθόδων βασισμένων στη φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS). Λόγω των φανερών πλεονεκτημάτων των διατάξεων μικρορευστονικής (microfluidics) στο χειρισμό βιολογικών δειγμάτων περιορισμένου όγκου, όπως τα δείγματα κυττάρων/σωματιδίων, δίδεται έμφαση στη σύζευξη διατάξεων microfluidics με ICP-MS. Δομικά, αυτή η διατριβή αποτελείται από 5 μελέτες.Η πρώτη μελέτη αφορά την ανάπτυξη κι εφαρμογή της τεχνικής single-cell (SC)-ICP-MS για τον προσδιορισμό της πρόσληψης αρσενικικών από διακριτά κύτταρα C. reinhardtii, ανεπτυγμένα σε 12.5, 22.5 και 30 μg As/mL. Συγκριτικά με τις συμβατικές αναλυτικές μεθόδους, προσδιορίστηκε η κατανομή του αρσενικού (As) στον κυτταρικό πληθυσμό μέσω του SC-ICP-MS. Τα κύτταρα C. reinhardtii επέδειξαν ετερογενή πρόσληψη As, όπως υπέδειξαν τα ιστογράμματα μάζας στα οποία προσαρμόστηκε κατανομή lognormal. Η πιο συχνά εμφανιζόμενη μάζα As παρέμεινε σχετικά σταθερή, μεταξύ 1.5-1.8 fg/κύτταρο, για όλες τις συγκεντρώσης έκθεσης As, το οποίο πιθανώς υποδεικνύει κορεσμό στην πρόσληψη As από την πλειοψηφία των κυττάρων. Ενώ η μέση lognormal μάζα As κυμαινόμενη μεταξύ 2.7-4.1 fg/κύτταρο υπέδειξε ότι ένα σημαντικό ποσοστό του κυτταρικού πληθυσμού προσέλαβε υψηλότερες ποσότητες αρσενικικών. Σημαντική μάζα κυτταρικού As ήταν προσδεμένη στο κυτταρικό τοίχωμα, όπως έδειξε μία πτώση του 30% στο κυτταρικό αρσενικό των κυττάρων που υπέστησαν πλύσεις. Η δεύτερη μελέτη αναφέρεται στην ανάπτυξη μίας μεθόδου ανάλυσης δεδομένων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ανάλυση νανοσωματιδίων (NPs) μέσω της τεχνικής του sp-ICP-MS με χρόνους καταγραφής μs. Έτσι, η ανεπτυγμένη τεχνική (A) DP-75μs-sp-ICP-MS επικυρώνεται μέσω συγκρίσεων με τη μέθοδο αναφοράς (B) DP-5σ-10ms-Syngistix Nano, αλλά και μέσω πειραμάτων ισοζυγίου μάζας αργύρου (Αg) σε δείγματα θαλάσσιου νερού. Η ανάλυση πρότυπων αιωρημάτων νανοσωματιδίων μεγέθους 60 nm έδειξε εξαιρετική συμφωνία μεταξύ μεθόδων A) και Β) ως προς την ένταση του σήματος NPs (38.8 και 37 counts από A και B, αντίστοιχα) και την απόδοση μεταφοράς (2.3 and 2.1 % από A και B, αντίστοιχα). Η ανάλυση δειγμάτων θαλάσσιου μεσοκόσμου, στα οποία προστέθηκαν νανοσωματίδια Ag 60 nm σε ένα εύρος συγκέντρωσης 50-500 ng/L, επέφερε ανακτήσεις Ag 83 ± 22% and 86 ± 21% μέσω των μεθόδων A and B, αντίστοιχα. Η χρησιμότητα της ανεπτυγμένης DP-μs-sp-ICP-MS αναδείχτηκε σε ένα πείραμα θαλάσσιου μεσοκόσμου, όπου κατέστη εφικτή η παρακολούθηση σωματιδιακών οντοτήτων Ag στα αρχικά στάδια σχηματισμού. Σε μία τρίτη μελέτη, επιτεύχθηκε η σύζευξη μίας διάταξης microfluidic με το ICP-MS με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων εξαρτημάτων, συμπεριλαμβανομένων ενός υψηλής απόδοσης γυάλινο εκνεφωτή και ειδικό θάλαμο ψεκασμού. Για να επιδείξουμε την απόδοση αυτής της σύζευξης, η τεχνική αραίωσης προτύπου (SDA) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σε ένα σύστημα διάταξης microfluidic με ICP-MS (chip-based ICP-MS). Υψηλές ανακτήσεις (97.4-100.1%) και χαμηλές σχετικές τυπικές αποκλίσεις (2.9-4.8%) επιτεύχθηκαν για τα προσδιορισθέντα μέταλλα (Cd, Co, Pb, Cr) σε αρκετές μήτρες δειγμάτων (με προσθήκες γνωστών ποσοτήτων) και πιστοποιημένα υλικά αναφοράς, ενώ 140 μL δείγματος αρκούν για τριπλή ανάλυση SDA ή 40 μL για μονή ανάλυση.Η τέταρτη μελέτη επιδεικνύει για πρώτη φορά την απευθείας σύζευξη ενός υπερηχητικού εκνεφωτή διάταξης microfluidic (chip-μf-Neb) σε ICP-MS. Tο σύστημα επέδειξε αποδοτική εκνέφωση σε χαμηλότατες ροές υγρών έως και 0.5 μL/min, με ελάχιστο νεκρό όγκο, ενώ η ευαίσθητη ανίχνευση μετάλλων αποδείχτηκε από την υψηλή ευαισθησία που ελήφθη ως προς το Ίνδιο (In), 40000 cps/ (μg/L) σε ροή υγρού 10 μL/min. Το σύστημα επέδειξε απόδοση μεταφοράς 46%, όπως αυτή προσδιορίστηκε με νανοσωματίδια Ag. Τέλος, οι δυνατότητες του συστήματος στην ανάλυση διακριτών κυττάρων αποδείχτηκαν με την ανίχνευση Se, As and P σε μεμονωμένα κύτταρα Chlamydomas reinhardtii.Η πέμπτη μελέτη αναφέρεται στην χρήση των inertial microfluidics για τον εμπλουτισμό κυττάρων και την ταξινόμησή τους βάση μεγέθους, πριν από την ανίχνευσή τους με SC-ICP-MS. Διατάξεις microfluidic που φέρουν κανάλια σπιράλ δουλεύτηκαν σε ένα εύρος συνθηκών Reynolds και Dean, ενώ πολλαπλά κανάλια εξόδου επέτρεψαν την συλλογή δειγμάτων εμπλουτισμένων σε κύτταρα και απουσία αυτών. Υψηλός βαθμός συγκέντρωσης κυττάρων επιτεύχθηκε για τα C. reinhardtii, αφού το 80% των εισαχθέντων κυττάρων συλλέχθηκαν από ένα κανάλι εξόδου. Η ανεξάρτητη ταξινόμηση κυττάρων BMDMS (μέσης διαμέτρου 12 μm) και C. reinhardtii (μέσης διαμέτρου 7 μm) σε συνθήκες De 69.9 υπέδειξε ότι οι 2 κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να συλλεχθούν με 100% και 70 % καθαρότητα, αντίστοιχα, αν βρίσκονταν σε μεικτό κυτταρικό αιώρημα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε προσδίδει στην τεχνική SC-ICP-MS χαρακτηριστικά κυτταρομετρίας ροής.