Απομόνωση και ταυτοποίηση ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων από φυμάτια καλλιεργούμενων ψυχανθών και αξιολόγηση της βιολογικής δράσης τους στην ανάπτυξη των φυτών
Authors: Ευσταθιάδου Ευδοξία 
Published: July 2023

Τα ριζόβια έχουν ικανότητα αζωτοδέσμευσης και αφομοίωσης του αζώτου κατά τη συμβιωτική σχέση που αναπτύσσουν με ψυχανθή φυτά, στα οποία σχηματίζουν ριζικά φυμάτια. Εκτός από ριζόβια, στα φυμάτια εντοπίζονται επιπλέον μη φυματιογενή ενδοφυτικά ριζοβακτήρια, τα οποία προωθούν την ανάπτυξη των φυτών καθώς και την αντοχή σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις και ορισμένα απ’ αυτά έχουν αξιοποιηθεί εμπορικά. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονη ερευνητική δραστηριότητα τόσο για τα ριζόβια όσο και για τα ενδοφυτικά ριζοβακτήρια γιατί αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της βιώσιμης γεωργίας.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή απομονώθηκαν 166 ριζόβια και 38 ενδοφυτικά ριζοβακτήρια από φυμάτια καλλιεργούμενων [κουκί (Vicia faba), φασόλι (Phaseolus vulgaris, Phaseoli coccineus) και άγριων ψυχανθών [φτερωτό μπιζέλι (Tetragonolobus purpureus), έβενος (Ebenus cretica)], από διαφορετικές περιοχές της ηπειρωτικής και νησιωτικής Ελλάδας. Η μελέτη της γενετικής ετερογένειας των ριζοβίων επέτρεψε τη διάκριση τους σε συνολικά 33 αντιπροσωπευτικά στελέχη ριζοβίων προερχόμενα από το κουκί, τη φασολιά και το φτερωτό μπιζέλι τα οποία μελετήθηκαν περαιτέρω. Η ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο γένους ή/ και είδους βασίστηκε στη φυλογενετική ανάλυση ευρέως χρησιμοποιούμενων γονιδίων π.χ. 16S rRNA, recA, glnII, gyrB, κ.α. Η ταξινομική θέση των απομονωμένων ριζοβίων σε επίπεδο συμβιότυπου καθορίστηκε από τη φυλογένεια γονιδίων που σχετίζονται με τη συμβίωση, όπως τα γονίδια nifH και nodC. Τα ριζόβια από το κουκί ταξινομήθηκαν ως Rhizobium hidalgonense με τη συντριπτική πλειοψηφία να ανήκουν στα γονιδιωματικά είδη gsF-2, gsB και gsA του Rhizobium leguminosarum species complex καθώς και των Rhizobium laguerreae και Rhizobium ruizarguesonis. Το Rhizobium VFEP82 το οποίο είναι φυλογενετικά πλησιέστερο στο Rhizobium grahamii, κατά πάσα πιθανότητα ανήκει σε μια νέα γενεαλογική σειρά. Με εξαίρεση την απομόνωση VFEP82 όπου δεν κατέστη εφικτή η ενίσχυση του γονιδίου nodC, οι υπόλοιπες απομονώσεις ταξινομήθηκαν στο συμβιότυπο viciae και προσδιορίστηκαν τέσσερις απλότυποι του γονιδίου nodC (A – D). Ένα σημαντικό εύρημα ήταν ο εντοπισμός του συμβιότυπου viciae σε στελέχη Rhizobium hidalgonense (VFEP162), καθώς αυτό αναφέρθηκε για πρώτη φορά. Στην περίπτωση των ριζοβίων της φασολιάς, οι απομονώσεις ταξινομήθηκαν σε καλά καθορισμένα είδη των Rhizobium redzepovicii, Rhizobium hidalgonense, Rhizobium anhuiense, Rhizobium croatiense, Rhizobium sophoriradicis, Rhizobium azibense, Rhizobium tropici. Εξαίρεση αποτέλεσε ένα πλήθος ριζοβίων με αντιπροσωπευτικό στέλεχος το PVKV3, που αν και είναι φυλογενετικά πλησιέστερο στο Rhizobium etli, κατά πάσα πιθανότητα συνιστά νέα γενεαλογική σειρά. Τα περισσότερα από τα ριζόβια φασολιάς ταξινομήθηκαν στο συμβιότυπο phaseoli και έφεραν τα αλληλόμορφα α-, γ-a και γ-b του γονιδίου nodC. Ο συμβιότυπος των υπολοίπων προσδιορίστηκε ως sv gallicum και tropici. Επιπλέον σημαντικό εύρημα ήταν η καταγραφή στελέχους Rhizobium sophoriradicis με αλληλόμορφο γ-b καθώς κάτι τέτοιο δεν έχει αναφερθεί ξανά σε ευρωπαϊκά εδάφη. Τα ριζόβια του φτερωτού μπιζελιού ομαδοποιήθηκαν μαζί με τα Mesorhizobium ciceri και εμφάνισαν τον συμβιότυπο biserrulae. Επιπλέον, η ταυτοποίηση των μη φυματιογενών ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων των φυματίων κατέταξε τις 38 απομονώσεις ως Enterobacter sp., Bacillus sp., Ochrobactrum sp, Shinella spp, Pseudomonas spp, Achromobacter sp., Microbacterium spp., Georgenia sp., Kocuria spp., Roseomonas sp., Sphingomonas sp. και Phyllobacterium sp.Ο έλεγχος της ικανότητας των ριζοβίων του κουκιού και της φασολιάς να μολύνουν τον ξενιστή από τον οποίο προήλθαν, επιβεβαίωσε ότι είναι πραγματικοί μικροσυμβιώτες για τα φυτά αυτά. Η αξιολόγηση της ικανότητας προώθησης της ανάπτυξης του κουκιού μετά από εμβολιασμό του σπόρου με στελέχη Rhizobium έδειξε ότι το στέλεχος VFLE1 συνέβαλε στην αύξηση του μήκους και της ξηρής βιομάζας του βλαστού των φυτών, ενώ ο μέγιστος αριθμός φυματίων παρατηρήθηκε σε φυτά εμβολιασμένα με το VFEP162. Xαρακτηριστικά γνωρίσματα που σχετίζονται με την προώθηση της ανάπτυξης των φυτών εξετάστηκαν σε αντιπροσωπευτικά στελέχη ριζοβίων κουκιού, φασολιάς και φτερωτού μπιζελιού καθώς και σε επιλεγμένα ενδοφυτικά ριζοβακτήρια Enterobacter VFAT314 και Bacillus VFFN21 που απομονώθηκαν στην παρούσα διατριβή. Παρόμοια ανάλυση έγινε σε ριζόβια και ενδοφυτικά ριζοβακτήρια που είχαν απομονωθεί σε προγενέστερο χρόνο, όπως τα Bradyrhizobium spp (VUCR24, VUEP21, VULI11), Ensifer sp. VUKA2, Enterobacter spp (C1.2, C1.5, C3.1) και Lelliottia sp. D2.4. Όλα τα στελέχη που εξετάστηκαν είχαν ικανότητα διαλυτοποίησης του φωσφόρου και παραγωγής σιδηροφόρων. Ικανότητα παραγωγής αυξίνης καταγράφηκε μόνο στα Rhizobium, στα Bradyrhizobium, VUCR24 και VULI11, και στο Enterobacter sp. VFAT314. Ικανότητα παραγωγής βιοεπιφανειοδραστικών ενώσεων καταγράφηκε μόνο στο Bradyrhizobium VUEP21 και στο Bacillus VFFN21. Η μελέτη της ικανότητας επιβίωσης των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων σε αβιοτικές συνθήκες καταπόνησης (θερμοκρασία, αλατότητα pH, υδατική καταπόνηση), έδειξε διαφορετικό αβιοτικό προφίλ ανοχής μεταξύ των εξεταζομένων γενών. Τα ριζόβια και ο Bacillus VFFN21 ήταν τα πιο ευαίσθητα σε αυτές τις καταπονήσεις με διαφοροποιήσεις αναλόγως της εξεταζόμενης βιοδοκιμασίας, ενώ τα Enterobacter και η Lelliottia D2.4 ξεχώρισαν για την ανοχή τους στις περισσότερες συνθήκες αβιοτικής καταπόνησης.Η μελέτη της ανταγωνιστικότητας των εξεταζομένων ριζοβακτηρίων έναντι τεσσάρων φυτοπαθογόνων μυκήτων Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum, Verticillium dahliae και 14 βακτηρίων Pseudomonas syringae (3), Dickeya solani, Acidovorax citrulli (3), Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, Pectobacterium brasiliense (2), και Clavibacter (3) ανέδειξε τα Enterobacter, Lelliottia D2.4 και Bacillus VFFN21 ως βιολογικούς παράγοντες ελέγχου (Β.Π.Ε.). Από τα ριζόβια μόνο το Bradyrhizobium VULI11 εμφάνισε παρεμποδιστική δάση κατά των Clavibacter. Τα Enterobacter, Lelliottia D2.4 και Bacillus VFFN21 χρησιμοποιήθηκαν ως εμβολιαστικό υλικό σε μη ψυχανθή φυτά. Η μελέτη προώθησης της ανάπτυξης φυτών τομάτας μετά από εφαρμογή των παραπάνω ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων έδειξε ότι φυτά εμβολιασμένα με το στέλεχος D2.4 είχαν μεγαλύτερη νωπή και ξηρή βιομάζα βλαστού και περισσότερη ξηρή βιομάζα ρίζας. Επιπλέoν, η δράση του D2.4 ήταν ωφέλιμη στην ανάπτυξη φυτών τομάτας που ήταν μολυσμένα με Clavibacter και στο μετριασμό των συμπτωμάτων της ασθένειας. Φυτά εμβολιασμένα με το στέλεχος Enterobacter VFAT314 είχαν μεγαλύτερο μήκος, νωπή και ξηρή βιομάζα και ήταν περισσότερο υγιή σε σχέση με τα φυτά που είτε είχαν εμβολιαστεί με τους υπόλοιπους Β.Π.Ε., είτε όχι. Η αξιολόγηση της βιολογικής προστασίας κονδύλων πατάτας και καρότου από το φυτοπαθογόνο D. solani IPO 2222 έδειξε ότι η εφαρμογή των παραπάνω Β.Π.Ε. δεν παρεμπόδισε την πρόκληση μαλακής σήψης, παρότι in vitro λειτούργησαν ανταγωνιστικά. Η εφαρμογή των Β.Π.Ε. σε φυτά τομάτας και μελιτζάνας για βιολογική προστασία από το φυτοπαθογόνο μύκητα Botrytis cinerea, ανέδειξε τα βακτήρια Enterobacter C1.5 και το Enterobacter C1.2 που λειτούργησαν φυτοπροστατευτικά. Σε φυτά τομάτας και μελιτζάνας εμβολιασμένα με το C1.5 και το C1.2, αντίστοιχα, η θνησιγόνος και μολυσματική δράση του μύκητα ήταν μικρότερη.Η παρούσα μελέτη συνέβαλε στη δημιουργία συλλογής βιολογικού υλικού με ριζοβακτήρια (ριζόβια και ενδοφυτικά ριζοβακτήρια) που εν δυνάμει προωθούν την ανάπτυξη των φυτών και έχουν φυτοπροστατευτική δράση. Οι μικροοργανισμοί αυτοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη βιοδιεγερτών και να εφαρμοστούν μελλοντικά σε συστήματα βιολογικής γεωργίας.