Διερεύνηση του μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τη συνδυασμένη δράση ταξανών και υπερθερμίας
Authors: Μιχαλάκης Ιωάννης 
Published: January 2014

Εισαγωγή: Η δράση της υπερθερμίας στα κύτταρα εξαρτάται από την κυτταρική σειρά, την ένταση και τη διάρκεια της. Σε ήπια υπερθερμία προκαλείται αναστολή της έκφρασης πολλών γονιδίων και επαγωγή της έκφρασης heat-shock πρωτεϊνών. Γενικά αυξάνεται η διαπερατότητα των κυτταρικών μεμβρανών και αναστέλλεται ο κυτταρικός κύκλος. Σε συνθήκες αυξημένης έντασης και διάρκειας της υπερθερμίας τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση ή νέκρωση. Οι ταξάνες είναι μια ομάδα χημειοθεραπευτικών με πολύ θετικά αποτελέσματα στη θεραπεία διάφορων νεοπλασιών. Η κύρια δράση των ταξανών είναι η σύνδεσή τους στην β-τουμπουλίνη η οποία είναι υπομονάδα των μικροσωληνίσκων. Ως αποτέλεσμα έχουμε αλλαγή της δυναμικής και σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, η οποία οδηγεί σε ακινητοποίηση των κυττάρων στην G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα τελικά πεθαίνουν μέσω διάφορων οδών. Αρκετές in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός χημειοθεραπείας και υπερθερμίας είναι αποτελεσματικότερος, απ' ότι η κάθε αγωγή μόνη της, πιθανά ενεργώντας συνεργιστικά ή προσθετικά. Υπάρχουν όμως αντικρουόμενα δεδομένα όσον αφορά στη συνεργιστική δράση της υπερθερμίας στην κυτταροτοξικότητα των ταξανών. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε in vitro το μηχανισμό δράσης της πακλιταξέλης, της υπερθερμίας και τον συνδυασμό τους σε διάφορες κυτταρικές σειρές, σε συνθήκες που ισχύουν στην διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία. 17 Υλικά-Μέθοδοι: Για τη μέτρηση των ζωντανών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε χρώση με Trypan Blue και μέτρηση με το αιματοκυτταρόμετρο Malassez. Το ποσοστό των κυττάρων στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS), αφού έγινε πρώτα χρώση του DNA των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (PI).Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (απόπτωση) εκτιμήθηκε αρχικά παρατηρώντας στο μικροσκόπιο φθορισμού το βαθμό συμπύκνωσης του DNA των κυττάρων μετά από χρώση με DAPI. Κατόπιν χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία TUNEL και μέτρηση των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυτταρικών καλλιεργειών εκτιμήθηκε με το αντιδραστήριο MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazol blue). Η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου εκτιμήθηκαν μετά από χρώση του πυρηνικού φακέλου με ειδικά Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές HeLa (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τράχηλου μήτρας), MCF-7 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα μαστού) και SK-OV-3 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών). Το σχήμα της χημειοθεραπείας που εφαρμόσαμε, προσομοιάζει τις συνθήκες που εφαρμόζονται στη διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία (Continuous Hyperthermic Peritoneal Perfusion Chemotherapy, CHPPC): επώαση των κυττάρων για 2 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις (5-20 μΜ) πακλιταξέλης σε θερμοκρασία 37οC, 41,5οC, ή 43οC και στη συνέχεια την καλλιέργειά τους στους 37οC σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης για αρκετές ημέρες. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας προσδιορίστηκαν το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο αριθμός των ζωντανών, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων, τα ποσοστά της κατανομής των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου. 18 αντισώματα, ανοσοφθορισμό και παρατήρηση των δειγμάτων στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Αποτελέσματα Η νέκρωση των κυττάρων προσδιορίστηκε αμέσως μετά το τέλος της εφαρμογής του θεραπευτικού σχήματος (άμεση νέκρωση) και ανά 24ωρο κατά την διάρκεια της καλλιέργειας η οποία διήρκεσε 7 ημέρες (απώτερη νέκρωση). Η άμεση νέκρωση διαπιστώθηκε ότι εξαρτάται αναλογικά από την συγκέντρωση της πακλιταξέλης και το ύψος της θερμοκρασίας. Η υπερθερμία έδειξε ότι έχει κυτταροτοξικές ιδιότητες και ότι δρα συνεργιστικά με την πακλιταξέλη (μέχρι 80% νέκρωση στα κύτταρα HeLa). Στη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε σχήμα που πλησιάζει πιο πολύ στην κλινική πράξη και περιελάμβανε συγκέντρωση πακλιταξέλης 10μM και υπερθερμίας στους 41,5οC. Στη μελέτη της απώτερης νέκρωσης φάνηκε ότι η υπερθερμία δεν επηρεάζει τη δράση της πακλιταξέλης. Τα κύτταρα ΜCF-7 παρουσίασαν το μικρότερο ποσοστό νέκρωσης (30% : Επώαση των κυττάρων στους 41,5οC (ήπια υπερθερμία) προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε όλες τις κυτταρικές σειρές, χωρίς όμως να σημειωθεί μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροστατική δράση). Όταν τα κύτταρα επωάστηκαν στους 43οC παρατηρήθηκε κυτταροστατική δράση για την κυτταρική σειρά SKOV-3, ενώ μετρήθηκε μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροτοξική δράση) στα HeLa και MCF-7 κατά 30% και 60% αντίστοιχα. Η υπερθερμία δεν διαφοροποίησε την κυτταροτοξική ή την ήπια κυτταροστατική δράση της πακλιταξέλης που σημειώθηκε στα κύτταρα HeLa ή SK-OV-3, αντίστοιχα. Στα κύτταρα MCF-7 η πακλιταξέλη είχε κυτταροστατική δράση στους 37οC και 41,5οC και κυτταροτοξική δράση στους 43οC (μείωση του αρχικού πληθυσμού κατά 50% στους 43οC). 19 νεκρών κυττάρων μετά 7 ημέρες), ενώ τα SK-OV-3 παρουσίασαν ποσοστά νέκρωσης 70% στις 7 ημέρες και τα HeLa τα μεγαλύτερα ποσοστά νέκρωσης (80% στις 3 ημέρες)....