Η μεθυλίωση του DNA σε μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) ασθενών με αυτοάνοση ηπατίτιδα (ΑΗ) και πρωτοπαθή χολική χολαγγειίτιδα (ΠΧΧ)
Authors: Αρβανίτη Πηνελόπη 
Published: September 2021

Η αυτοάνοση ηπατίτιδα (ΑΗ) και η πρωτοπαθής χολική χολαγγειίτιδα (ΠΧΧ) είναι τα δύο κύρια αυτοάνοσα νοσήματα του ήπατος τα οποία χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγμονή, η οποία οδηγεί σε κίρρωση αν αφεθεί χωρίς θεραπεία. Καθώς οι γενετικοί παράγοντες, μόνοι τους, αδυνατούν να εξηγήσουν την αιτιοπαθογένειά των αυτοανόσων νόσων του ήπατος, η μελέτη των επιγενετικών παραγόντων θα μπορούσε να διαφωτίσει μέρος των μηχανισμών που σχετίζονται με την παθογένεση και την εξέλιξή τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη της συμμετοχής των επιγενετικών μηχανισμών στην αιτιοπαθογένεια της ΑΗ και της ΠΧΧ με στόχο την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Για το σκοπό αυτό περιφερικά μονοκύτταρα (PBMCs) 10 ασθενών με ΑΗ κατά τη διάγνωση (σε 8 από αυτούς έγινε μελέτη και κατά την επίτευξη πλήρους ανταπόκρισης μετά από χορήγηση ανοσοκαταστολης), 9 ασθενών με ΠΧΧ και 10 υγιών μαρτύρων (ΥΜ) χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση CD19(+) B και CD4(+) T λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Στη συνέχεια έγινε προσδιορισμός της ολικής μεθυλίωσης (5mC)/υδροξυμεθυλίωσης (5hmC) του DNA με τη χρήση ELISA, ενώ η έκφραση των ενζύμων μεθυλίωσης (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)/υδρόξυμεθυλίωσης (ΤΕΤ1, ΤΕΤ2, ΤΕΤ3) σε μεταγραφικό επίπεδο, έγινε με τη χρήση ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR). Περαιτέρω ανάλυση της μεθυλίωσης των επιμέρους CpG αλληλουχιών κατά μήκος του γονιδιώματος έγινε με την αλληλουχία 850k της Illumina.Αυξημένη DNMT3A και χαμηλή ΤΕΤ1 χαρακτηρίζει τα CD19(+) και CD4(+) λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΑΗ κατά τη διάγνωση συγκριτικά με τους ασθενείς με ΠΧΧ και τους ΥΜ αντίστοιχα. Τα επίπεδα mRNA της DNMT3A σχετιζόταν αρνητικά με την IgG ανοσοσφαιρίνη κατά τη διάγνωση της ΑΗ υποδηλώνοντας τη συσχέτισή της DNMT3A με τη δραστηριότητα της νόσου. Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικής αγωγής βρέθηκε ότι μειώνει τα επίπεδα της DNMT3A στους ασθενείς με ΑΗ κατά την ύφεση της νόσου τόσο στα CD19(+) όσο και στα CD4(+) λεμφοκύτταρα. Οι αλλαγές στα επίπεδα των DNMT3A και ΤΕΤ1 δε συμβάδιζαν με σημαντικές διαφορές στο επίπεδο ολικής 5mC/5hmC, παραπέμποντας στην παρουσία εντοπισμένων επιγενετικών αλλαγών που επιδρούν στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Υπέρ του ευρήματος αυτού, συνηγορούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης της μεθυλίωσης του συνόλου του γονιδιώματος των CD4(+) T λεμφοκυττάρων, που ανέδειξαν σημαντικές διαφορές στη μεθυλίωση μεμονωμένων γονιδίων μεταξύ ασθενών με ΑΗ έναντι των ΥΜ και των ασθενών με ΠΧΧ. Συγκεκριμένα, η πλειοψηφία των διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων στους ασθενείς με ΑΗ κατά τη διάγνωση βρέθηκαν υπομεθυλιωμένα, ενώ στους ασθενείς με ΠΧΧ παρατηρήθηκε υπερμεθυλίωση του πλείστου των διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων. Επιπλέον, η υπομεθυλίωση των γονιδίων στην ΑΗ επηρεαζόταν από την ανοσοκατασταλτική αγωγή. Μεταξύ των πλέον διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων αναδειχθηκαν γονίδια, που εμπλέκονται σε μονοπάτια φυσικής ανοσίας καθώς και γονίδια που συμμετέχουν σε μηχανισμούς ανάπτυξης χολόστασης και ηπατοκαρκινογένεσης. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώθηκε η σημασία του χρωμοσώματος Χ στην παθογένεια της ΠΧΧ, ενώ στην ΑΗ δεν υπήρχε αντίστοιχο εύρημα (τα περισσότερα διαφορετικά μεθυλιωμένα γονίδια εδράζονταν σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα). Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει για πρώτη φορά, ότι η ΑΗ χαρακτηρίζεται από αλλαγές στην έκφραση των ενζύμων μεθυλίωσης/υδροξυμεθυλίωσης, που σχετίζονται με τη δραστηριότητα της νόσου, αλλά και από αλλαγές στη μεθυλίωση μεμονωμένων γονιδίων, που επηρεάζονται από τη χορήγηση ανοσοκαταστολτικής αγωγής. Αντίθετα, η ΠΧΧ χαρακτηρίζεται από υπερμεθυλίωση των περισσότερων διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων. Τα ευρήματα αυτά ανοίγουν νέους δρόμους για την κατανόηση της αιτιοπαθογένειας των αυτοανόσων νοσημάτων του ήπατος και την εύρεση νέων, στοχευμένων θεραπειών.