Συγκριτική μελέτη του mRNA της κυτταροκερατίνης-19, της MASPIN και του CEA στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού και διερεύνηση των μεταβολών τους κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας ή και ορμονοθεραπείας
Authors: Σταθοπούλου Αλίκη 
Published: August 2021

Στα πλαίσια αυτής της εργασίας ανήκει η ανάπτυξη και κλινική αξιολόγηση υπερευαίσθητων μεθόδων μοριακής διαγνωστικής για την πρώιμη ανίχνευση νεοπλασματικών κυττάρων στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού, όπως επίσης και η ανάπτυξη μεθοδολογίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA ενός μοριακού δείκτη καρκίνου μαστού, της κυτταροκερατίνης 19 (CK-19), στο αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Αρχικά πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη ανίχνευσης του mRNA των καρκινικών δεικτών CK-19, CEA και Maspin στο περιφερικό αίμα (ΡΒΜΝ) ασθενών με νεοπλασίες με τη μέθοδο RT-PCR, και η συσχέτισή της με άλλους κλινικοπαθολογικούς παράγοντες σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού, πριν και μετά τη συμπληρωματική θεραπεία, όπως επίσης και με το ελεύθερο νόσου διάστημα. Βάσει των αποτελεσμάτων, η CK-19 και η Maspin ήταν οι πιό ευαίσθητες (ανιχνεύοντας μέχρι και 1 MCF-7 κύτταρο στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα) συγκριτικά με το CEA (ανιχνεύοντας μέχρι και 10 COLO-205 κύτταρα στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα). Όσον αφορά την ειδικότητα των μεθόδων, η CK-19 έδωσε ένα πολύ χαμηλό ποσοστό θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών αιμοδοτών (3.7%), ενώ στα δείγματα του καρκίνου του μαστού έδωσε θετικό αποτέλεσμα για το 42% των δειγμάτων. To CEA, ενώ δεν ανιχνεύεται στα ΡΒΜΝ κύτταρα των υγιών αιμοδοτών, δε φαίνεται να παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα για τον καρκίνο του μαστού (10%), σε αντίθεση με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (19.3%). Η ανίχνευση του mRNA της Maspin παρουσιάζει, επίσης υψηλή ειδικότητα αφού δίνει αρνητικό αποτέλεσμα για ΡΒΜΝ δείγματα υγιών αιμοδοτών, ασθενών με αιματολογικές κακοήθειες και ασθενών με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου, ενώ για τους ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού δίνει ένα ποσοστό 14%. Τέλος πραγματοποιήθηκε ανίχνευση θετικών κυττάρων για το mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού (n=148) σε πρώιμο στάδιο, πριν την έναρξη της συμπληρωματικής θεραπείας και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η ανίχνευση του CK-19 mRNA δε συσχετίζεται με κανέναν από τους κλασσικούς προγνωστικούς παράγοντες. Συσχετίζοντας τον κίνδυνο υποτροπής των ασθενών με την παρουσία ή μη θετικών κυκλοφορούντων κυττάρων στο περιφερικό αίμα για το mRNA της CK-19, τα ποσοστά των ασθενών που υποτροπίασαν είναι αντίστοιχα 27.3% και 6.7%, με στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.001). Αυτή η ανάλυση υποδεικνύει ότι οι CK-19 mRNA+ ασθενείς έχουν κατά περίπου 6 φορές υψηλότερο κίνδυνο να υποτροπιάσει η νόσος από αυτόν των CK-19 mRNA- ασθενών. Επιπλέον, η ανίχνευση CK-19 mRNA+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα σχετίζεται και με μειωμένο ελεύθερου νόσου διάστημα (p=0.001). Η πολυπαραγοντική μελέτη έδειξε πως μόνο η παρουσία CK-19 mRNA- Θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα και ο αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων (≥ 4) αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες, σχετιζόμενοι και με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής (p=0.042). Επιπλέον επεξεργασία των στοιχείων εφαρμόζοντας την ανάλυση παλινδρόμησης του Cox έδειξε πως εκτός από την ανίχνευση θετικών κυττάρων για το CK-19 mRNA στο περιφερικό αίμα των ασθενών (p=0.001) και τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων (≥ 4 LN+) (p=0.038), σημαντική επίδραση στο ελεύθερο νόσου διάστημα παρουσιάζει και η κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER-) (p=0.042). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η CK-19 αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα πρόβλεψης, ιδιαίτερα για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε πρώιμο στάδιο που δεν παρουσιάζουν διήθηση λεμφαδένων. Το δεύτερο τμήμα της παρούσας μελέτης περιλαμβάνει την ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού του mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί συνδυασμό της ανταγωνιστικής RT- PCR (πρωτόκολλο Α) ή και nested-PCR (πρωτόκολλο Β) και δοκιμασίας υβριδισμού σε μικροπλακίδια με χημειοφωταυγή ανίχνευση. Βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση του mRNA της CK-19 με ένα ανασυνδυασμένο, ειδικά σχεδιασμένο εσωτερικό πρότυπο, ανάλογο του mRNA της CK-19, με τη μέθοδο της RT-PCR. Το εσωτερικό πρότυπο (RNA-IS) συνετέθει μέσω PCR αντιδράσεων, είναι του ίδιου μεγέθους και διαθέτει τις ίδιες θέσεις αναγνώρισης των εκκινητών με το mRNA της CK-19, ενώ διαφέρουν ως προς μια κεντρική αλληλουχία 21 βάσεων. Τα προϊόντα της RT-PCR επισημαίνονται με βιοτίνη μέσω κατάλληλων εκινητών και ακινητοποιούνται σε φρεάτια επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη. Τα ακινητοποιημένα υβρίδια ανιχνεύονται μέσω αντισωμάτων, συζευγμένων με αλκαλική φωσφατάση, έναντι της διγοξιγενίνης και ενός χημειοφωταυγούς υποστρώματος. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων (ένταση χημειοφωταύγειας) για την CK-19 και το εσωτερικό πρότυπο είναι ανάλογος του αριθμού των μορίων του mRNA της CK-19 στο δείγμα πριν την αντίδραση RT-PCR, το οποίο και αντιστοιχεί σε ένα σχετικό αριθμό κυττάρων. Η μέθοδος αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RNA δείγματα της καρκινικής κυτταρικής σειράς MCF-7. Οι λόγοι των αναλυτικών σημάτων του CK-19 RNA και του CK-19 mRNA-IS ήταν γραμμικά ανάλογοι με τον αρχικό αριθμό των MCF-7 κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Η εντός προσδιορισμού επαναληπτικότητα της μεθόδου, περιλαμβάνοντας το σύνολο της πειραματικής διαδικασίας, ήταν μεταξύ 7.4-24%. Τα όρια ανίχνευσης των δύο πρωτοκόλλων είναι τα 10 και το 1 καρκινικό κύτταρο στο 1x106 φυσιολογικά κύτταρα, αντίστοιχα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου δοκιμάστηκε σε μελέτη 26 φυσιολογικών δειγμάτων, όπου δεν ανιχνεύθηκε CK19-mRNA, ενώ σε δείγματα 14 ασθενών σε μεταστατικό στάδιο της νόσου το αποτέλεσμα (42.8%) φανερώνει την κλινική σημασία της εφαρμογή της.