Metal-regulated transcription
Authors: Διαλυνάκη Δήμητρα 
Published: November 2021

Η ομοιόσταση του χαλκού στα κύτταρα είναι μια θεμελιώδης και συνεχής διαδικασία σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου του ζυμομύκητα S. cerevisiae. Ωστόσο, όταν η πρόσληψη υπερβαίνει την ικανότητα απομόνωσής του από το κύτταρο, ο χαλκός γίνεται τοξικός. Έτσι, ο ζυμομύκητας έχει αναπτύξει διάφορους μηχανισμούς για τον έλεγχο της ομοιόστασης του χαλκού. Ένας σημαντικός ρυθμιστής είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Mac1 ("Metal-binding Activator"), ο οποίος έχει τον κρίσιμο ρόλο ανίχνευσης μεταβολών στη συγκέντρωση ιόντων χαλκού και την ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων που εμπλέκονται στην πρόσληψη του χαλκού από το κύτταρο. Τα αρχικά πειράματα της ομάδας μας αποκάλυψαν μια απροσδόκητη διασύνδεση μεταξύ της επαγόμενης βλάβης στο DNA και της ομοιόστασης του χαλκού. Συγκεκριμένα, με την χρήση του φαρμάκου Zeocin για την πρόκληση βλαβών στο DNA αποδείξαμε ότι η λειτουργία και πιο συγκεκριμένα η ικανότητα πρόσδεσης του Mac1 στο DNA, παρεμποδίζεται. Η Zeocin είναι ένα ραδιομιμητικό φάρμακο το οποίο πέρα από επαγωγή βλαβών στο DNA, χρησιμοποιείται επιπλέον ως αντικαρκινικό φάρμακο και ως αντιβιοτικό, λόγω του ευρέος φάσματος τοξικότητας. Το σκεπτικό ήταν να διερευνηθούν οι προϋποθέσεις πρόσδεσης του Mac1 στους υποκινητές των γονιδίων στόχων και να προσδιοριστεί ποιες από αυτές διαταράσσονται παρουσία Zeocin. Προέκυψαν τρεις υποθέσεις οι οποίες θα ελεγχθούν και θα συζητηθούν στα επόμενα κεφάλαια.Στο κεφάλαιο 2 της διατριβής, αναλύεται η διασύνδεση της ομοιόστασης του χαλκού με το πολυ-πρωτεϊνικό σύμπλοκο TORC1 στον S. cerevisiae. Ο συνδετικός κρίκος αυτής της συσχέτισης είναι η κινάση Ksp1. Συγκεκριμένα, η Ksp1 είναι ένας κατάντη ρυθμιστής του TORC1 και επιπλέον φωσφορυλιώνει τον μεταγραφικό παράγοντα Mac1. Διαπιστώσαμε ότι η Zeocin διαταράσσει την Ksp1-ρυθμιζόμενη φωσφορυλίωση του Mac1 οδηγώντας στην απορρύθμιση της ομοιόστασης του χαλκού. Επιπλέον, η ανάλυση του μεταγραφώματος του S. cerevisiae παρουσία Zeocin, σε σύγκριση με άλλες συνθήκες επαγωγής βλαβών στο DNA, έδειξε ότι η απορρύθμιση της ομοιόστασης χαλκού δεν συσχετίζεται με την γενική απόκριση του κυττάρου σε βλάβες του DNA, αλλά παρατηρείται αποκλειστικά στη Zeocin. Παρατηρήθηκε επίδραση σε σηματοδοτικά μονοπάτια του TORC1 όπως στην βιογένεση ριβοσωμάτων και στην αυτοφαγία. Επιπλέον, αποκαλύφθηκε επαγωγή της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Επαληθεύοντας τα αποτελέσματα του μεταγραφώματος με μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων, συμπεραίνεται ότι η Zeocin προκαλεί μεταβολικό αναπρογραμματισμό στον S. cerevisiae, μέσω της απορρύθμισης της λειτουργίας του TORC1.Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας ισχυρίζονται μια λειτουργική διασύνδεση μεταξύ της χαλκο-εξαρτώμενης, Mac1-ρυθμιζόμενης μεταγραφής και του σηματοδοτικού μονοπατιού TORC1. Δείξαμε δύο νέες επιδράσεις του φαρμάκου Zeocin, πέρα την επαγωγή βλαβών στο DNA. Πρώτον, η Zeocin διαταράσσει την ομοιόσταση χαλκού/σιδήρου παρεμποδίζοντας τη δέσμευση του μεταγραφικού παράγοντα Mac1 στο DNA. Δεύτερον, η Zeocin προκαλεί μεταβολικό αναπρογραμματισμό στο S. cerevisiae, μέσω της λειτουργίας του πρωτεϊνικού συμπλέγματος TORC1, ένα εύρημα με δυνητική βιοϊατρική εφαρμογή.Στο κεφάλαιο 3 της διατριβής, διερευνούμε την υπόθεση εάν η δυσλειτουργία του Mac1 παρουσία Zeocin οφείλεται στην απορρύθμιση της λειτουργικής σχέσης με την πρωτεΐνη Sod1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επίδραση της Zeocin στη λειτουργία του Mac1 δεν είναι μέσω της Sod1, παρόλα αυτά, παρέχουμε στοιχεία ότι η Sod1 παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική δραστηριότητα του Mac1, σε πλούσιες θρεπτικές συνθήκες. Η Cu/Zn δισμουτάση του υπεροξειδίου Sod1 είναι ένα πολυδύναμο κυτταροπλασματικό και μιτοχονδριακό ένζυμο, του οποίου η κύρια λειτουργία είναι η αποτοξίνωση του κυττάρου από ρίζες οξυγόνου. Επιπλέον, μελέτες αναφέρουν ότι η Sod1 εισέρχεται στον πυρήνα επηρεάζοντας τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων, ορισμένα από τα οποία εμπλέκονται στην ομοιόσταση χαλκού, είτε σε συνθήκες επαγόμενης έλλειψης χαλκού, είτε σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Διαπιστώσαμε ότι η Sod1 αλληλεπιδρά με τον Mac1 σε συνθήκες πλούσιες σε θρεπτικά συστατικά. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Sod1 είναι σημαντική για τον Mac1 τόσο για την ενεργοποίηση της μεταγραφής όσο και για τη πρόσδεση στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων του. Από την άλλη πλευρά, ένα μετάλλαγμα του Mac1 που του επιτρέπει να είναι συνεχώς μεταγραφικά ενεργός, δεν επηρεάζεται λειτουργικά απουσία του ενζύμου Sod1. Συνδυάζοντας τα ευρήματά μας, προτείνουμε ότι η αλληλεπίδραση της Sod1 με τον Mac1 είναι σημαντική για τη λειτουργικότητα του Mac1, λόγω της διαμόρφωσης της δομής του μεταγραφικού παράγοντα. Η ενζυμική δραστηριότητα της Sod1 μπορεί να συμβάλει στη διατήρηση του αναγωγικού κυτταρικού περιβάλλοντος και να αποτρέπει την οξείδωση η οποία συνεπάγεται την αδρανοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Mac1. Στο κεφάλαιο 4 αυτής της διατριβής, σκοπεύαμε να διερευνήσουμε την υπόθεση της άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Mac1 και του φαρμάκου Zeocin. Έχοντας ενδείξεις ότι η Zeocin μπορεί να αναστέλλει τη λειτουργία άλλων μεταγραφικών παραγόντων που περιέχουν την διαμόρφωση Cu-fist, προχωρήσαμε στον καθαρισμό της πρωτεΐνης Mac1 καθώς και τμημάτων της πρωτεΐνης προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-φαρμάκου χρησιμοποιώντας ακουστικό βιοαισθητήρα.