Γονιδιακή μελέτη του ρόλου των ανθρώπειων β-ντιφενσινών στην παθογένεια της λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού
Authors: Καζάκος Ευάγγελος 
Published: August 2021

To Helicobacter pylori (Hp) αποτελεί έναν επιλεκτικό αποικιστή του γαστρικού επιθηλίου ο οποίος προσβάλλει την πλειοψηφία (> 50%) του παγκόσμιου πληθυσμού. Οι κύριες Hp-σχετιζόμενες παθολογικές καταστάσεις περιλαμβάνουν γαστροδωδεκαδακτυλικά έλκη, γαστρικό καρκίνο και MALT λέμφωμα, οντότητες που συνετέλεσαν ώστε το Hp να καταταγεί ως καρκινογόνο τάξεως Ι από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας. Κατά την πορεία της Hp - λοίμωξης ο ξενιστής αναπτύσσει αρχικά, μία δυναμική φυσική ανοσιακή απάντηση η έναρξη της οποίας σηματοδοτείται από την ενεργοποίηση των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (pattern receptor recognition –PRR), Τoll-like receptors (TLRs), retinoic acid-inducible gene I (RIG I) – like helicase receptors (RLRs) και ΝΟD-like receptors (NLRs) με ταυτόχρονη επαγωγή τύπου Th1 και Τh17 ανοσιακών αποκρίσεων και παραγωγή σχετικών κυτταροκινών που ελέγχονται από τις κύριες κυτταροκίνες IL-23 και ΙL-12, παραγόμενες από ειδικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Το Hp, εκλύει ποικίλους φλεγμονώδεις και αντιφλεγμονώδεις (σχετιζόμενους με Τh2 ανοσιακή απόκριση) μεσολαβητές είτε άμεσα με βακτηριακά παράγωγα (κυτταροτοξίνη VacA, LPS, neutrophil activating factor, porins) είτε έμμεσα, αλληλεπιδρώντας με το γαστρικό επιθήλιο. Ειδικότερα, την ανοσιακή απάντηση αυτή επάγονται, μεταξύ άλλων μεσολαβητών, κυρίως οι κυτταροκίνες ΙL-1, IL-8 και TNF-α από cag(+) στελέχη που στρατολογούν και ενεργοποιούν ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα, συμβάλλοντας στις Hp-σχετιζόμενες παθολογίες του ανωτέρου πεπτικού.Τα αντιμικροβιακά πεπτίδια (antimicrobial peptides - AMPs) αποτελούν ουσιώδη εκτελεστικά μόρια της φυσικής ανοσίας με ευρεία αντιμικροβιακή, έναντι ποικίλων παθογόνων, και πλειοτρόπο ανοσορυθμιστική δράση. Στα θηλαστικά οι δύο κύριες κατηγορίες AMPs περιλαμβάνουν τις α- και β- ντιφενσίνες (α- and β- defensins) και την καθελισιδίνη, αποτελούν δε σημαντικούς ρυθμιστικούς παράγοντες της φυσικής και κυτταρικής ανοσιακής απόκρισης σε διαφορετικούς ιστούς. Oι ανθρώπειες β -ντιφενσίνες (human β-defensins - hβDs) 1 - 4, αποτελούν μικρά κατιονικά πεπτίδια τα οποία εκκρίνονται σταθερά ή ως απόκριση σε μολυσματικούς παράγοντες, εξασκώντας καίριο ρόλο ως πρώτη γραμμή άμυνας του βλεννογόνου του ξενιστή. Παράλληλα, η ανθεκτικότητα στις hβDs αναγνωρίζεται πλέον ως διακριτικό γνώρισμα ορισμένων σημαντικών παθογόνων. Εντούτοις, η γνώση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν αυτές τις σύνθετες αλληλεπιδράσεις μεταξύ βακτηρίων και εκκρινόμενων από το γαστρικό επιθήλιο hβDs παραμένει ελάχιστα κατανοητή.Σε φυσιολογικές συνθήκες, πληθώρα εκκρινόμενων AMPs στο γαστρικό περιβάλλον δημιουργεί τείχος προστασίας, συμβάλλοντας στην αποτελεσματική επιτήρηση των μικροβιακών πληθυσμών εγγύς της γαστρικής βλέννης. Εντούτοις, το Hp είναι ικανό να αποικίζει το γαστρικό βλεννογόνο, διαφεύγοντας ή πιθανόν καταστέλλοντας τους μηχανισμούς φυσικής ανοσίας, συμπεριλαμβανομένων των AMPs, γεγονός που παίζει σημαντικό ρόλο στη επιβίωση του βακτηριδίου στο γαστρικό περιβάλλον. Στη συνάφεια αυτή, η ικανότητα Hp-σχετιζόμενης δημιουργίας βιομεμβρανών με συνοδό παρουσία, εντός αυτών ‘εμμένοντων βακτηριακών κυττάρων’, έχει ιδιαίτερη σημασία για την πληρέστερη κατανόηση των μηχανισμών επιβίωσης του Hp σε αντίξοες συνθήκες του γαστρικού περιβάλλοντος και την παθογένεια της χρόνιας λοίμωξης. Ειδικότερα, οι μεταβολές της έκφρασης των hBDs κατά την Hp-επαγόμενη γαστρική φλεγμονή in vitro και in vivo δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Κατά συνέπεια, η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών δυναμικής αλληλεπίδρασης παθογόνου - ξενιστή σε συσχέτιση με την Hp – επαγόμενη λοίμωξη απαιτεί την διερεύνηση του ρόλου των hβDs ως βασικών συστατικών της φυσικής ανοσιακής απόκρισης. Tα υφιστάμενα δεδομένα δείχνουν ότι η διαμόρφωση της έκφρασης και λειτουργίας των hβDs, οι οποίες εκκρίνονται από τα επιθηλιακά κύτταρα, πιθανόν να αποτελεί καθοριστικό παράγοντα στην επιβίωση του βακτηρίου, τον επιτυχή χρόνιο αποικισμό του στο γαστρικό βλεννογόνο και τις συνακόλουθες Hp-σχετιζόμενες παθολογίες. Εντούτοις, απαιτούνται σχετικές μελέτες για την πληρέστερη κατανόηση των πιθανών μηχανισμών επιλεκτικής ανθεκτικότητας και ευαισθησίας του Hp έναντι διαφορετικών ΑMPs, με σκοπό την δυνητική εφαρμογή πιθανών καινοφανών θεραπευτικών στρατηγικών για την αντιμετώπιση της λοίμωξης.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των πρώιμων μεταγραφικών αλλαγών που επισυμβαίνουν κατά την έκθεση του Hp σε χαμηλές συγκεντρώσεις hβDs, οι οποίες υφίστανται στο γαστρικό επιθήλιο, και της επίδρασης των hβDs στη δημιουργία Ηp-βιομεμβρανών in vitro ως - πιθανού - προσαρμοστικού μηχανισμού αντοχής του Hp στα εκκρινόμενα από τα επιθηλιακά κύτταρα του στομάχου AMPs. Για το σκοπό αυτό η σχετική έρευνα έχει εστιαστεί στα ακόλουθα:α. Στην αποτύπωση της γενετικής ποικιλομορφίας των ‘πρότυπων’ εργαστηριακών Hp στελεχών 60190 και SS1, ώστε να κατανοηθεί πληρέστερα η δράση των hβDs έναντι των στελεχών αυτών σε μοριακό επίπεδο,β. Στην διερεύνηση πιθανών φαινοτυπικών διαφορών ανάπτυξης μεταξύ των Hp στελεχών 26695 και J99, για να διασφαλισθεί η αντικειμενικότερη εκτίμηση της βακτηριοκτόνου δράσης των hβDs με ταυτόχρονη συγκριτική εκτίμηση διαφορών των κλασικών και ταχύτερων εναλλακτικών μεθόδων ελέγχου για αποτελεσματικότερη ανάλυση των πειραματικών δεδομένων,γ. Στον έλεγχο της βακτηριοκτόνου ικανότητας διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων hβDs και ειδικότερα της hβD4 έναντι του Hp in vitro, για την οποία δεν υπάρχουν αντίστοιχα βιβλιογραφικά δεδομένα, και την προκαταρκτική διερεύνηση πιθανώς διαφορετικών μηχανισμών βακτηριοκτόνου δράσης των επιμέρους hβDs έναντι του Hp,δ. Στην εφαρμογή των μεθόδων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης και διέλευσης για την εκτίμηση πιθανών μορφολογικών αλλοιώσεων στα εκτιθέμενα βακτηριακά κύτταρα, ώστε να αποσαφηνισθεί περαιτέρω ο τρόπος δράσης των hβDs,ε. Στην μακροσκοπική και μικροσκοπική εκτίμηση πιθανών διαφορών (strain-to-strain variation) σχετικών με την ικανότητα των Hp στελεχών 26695 και J99 να σχηματίζουν διαφορετικού τύπου βιομεμβράνες, στ. Στη διερεύνηση της επίδρασης διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων hβDs στην ανάπτυξη Hp βιομεμβρανών in vitro ως ιδιαίτερου μηχανισμού προσαρμογής του βακτηρίου στις αντίξοες συνθήκες του γαστρικού περιβάλλοντος, καιζ. Στη διερεύνηση των πρώιμων μεταβολών γονιδιακής έκφρασης του Hp που επισυμβαίνουν υπό την επίδραση - παρόμοιων με αυτές που ανιχνεύονται στο γαστρικό επιθήλιο - μη βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων hβDs, συμβάλλοντας έτσι στην ταυτοποίηση πιθανών μηχανισμών προσαρμογής και ανοσιακής διαφυγής του βακτηριδίου in vivo. Aπό την ανάλυση των πειραματικών δεδομένων προέκυψαν τα ακόλουθα:α. Παρουσία ποικίλου βαθμού διαφοροποίησης της γονιδιακής σύστασης των Hp στελεχών 60190 και SS1 συγκριτικά με τα περιεχόμενα στις Hp-DNA μικροσυστοιχίες στελέχη αναφοράς 26695/J99. Επισημάνθηκε η απουσία, στα εξεταζόμενα στελέχη, γονιδίων που κωδικοποιούν δομικά συστατικά στοιχεία του τύπου 4 εκκριτικού συστήματος [ type 4 secretion system - tfs4 (dupA cluster)], το οποίο σχετίζεται άμεσα με την παθογένεια του βακτηρίου, τη δυνατότητα επιτυχούς αποικισμού στον γαστρικό βλενογόνο, την εμφάνιση συγκεκριμένων Hp- σχετιζόμενων νοσημάτων και πιθανώς σχετίζεται με την προέλευση των στελεχών αυτών. Επιπλέον, παρατηρήθηκε περιορισμένη παρουσία γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν DNA συστήματα (restriction/modification) και μεταθετά στοιχεία (transposases), υποδηλώνοντας πιθανώς ελαττωμένη ικανότητα γενετικού ανασυνδυασμού.β. Παρόμοιος ρυθμός βακτηριακής ανάπτυξης των εξετασθέντων Hp στελεχών 26695 και J99, και άριστη συσχέτιση μεταξύ της άμεσης μεθόδου καταμέτρησης των αποικιών (cfu counts) και της έμμεσης μέθοδου εκτίμησης της θολερότητας/οπτικής πυκνότητας (OD600) των βακτηριακών εναιωρημάτων. Επισημαίνεται ότι η χρήση της εμμέσου μεθόδου - μέτρησης του εκλυόμενου ΑΤΡ (BacTiter Glo® Microbial Cell Viability Assay) δεν παρέχει τη δυνατότητα αξιολόγησης μεταβολικά ενεργών βακτηριακών πληθυσμών κατά τη στατική φάση ανάπτυξης, λόγω πιθανώς, της μετάπτωσης του Hp σε κοκκοειδείς μορφές. γ. Διαφορετικού βαθμού ελάττωση της βιωσιμότητας των Hp στελεχών 26695 και J99 εντός του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση των δοκιμασιών ελέγχου της βακτηριοκτόνου δράσης των hβDs, και σημαντική επίπτωση της συγκέντρωσης του Hp εντός των βακτηριακών εναιωρημάτων, στην αντιμικροβιακή δράση των hβDs. Ειδικότερα, η έκθεση των Ηp στελεχών 26695 και J99 σε διαβαθμισμένες δόσεις ανασυνδυασμένων πεπτιδίων (10-6 M - 10-8 M) hβD 1- 4 προκάλεσε ταχεία και ποικίλου βαθμού ελάττωση της βιωσιμότητάς τους. Μεταξύ των ανασυνδυασμένων πεπτιδίων η hβD3 παρουσίασε την ισχυρότερη βακτηριοκτόνο δράση, ενώ η hβD4 εμφάνισε μετρίου βαθμού, ανάλογη της hβD2, βακτηριοκτόνο δράση.δ. Έκλυση ποικίλου βαθμού ATP από τα εκτιθέμενα στις hβDs βακτηριακά κύτταρα που πιθανώς αντικατοπτρίζει διαφορετικούς, (ΑΤΡ-εξαρτώμενους και μη), μηχανισμούς δράσης των επιμέρους hβDs παρατήρησης, η οποία ενισχύθηκε έμμεσα από την απουσία εμφανών μορφολογικών αλλαγών στο κυτταρικό τοίχωμα των εκτιθέμενων Hp στελεχών. Παράλληλα, παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμός εκλυόμενων κυστιδίων της εξωτερικής μεμβράνης (outer membrane vesicles - OMPs) που αντιπροσωπεύουν ένα πιθανό μηχανισμό μεταφοράς βακτηριακών στοιχείων (πεπτιδογλυκάνη, κυτταροτοξίνη VacA), με σκοπό την επαγωγή της παραγωγής hβDs.ε. Διαφορετικού βαθμού ικανότητα σχηματισμού των ακόλουθων τριών διακριτών τύπων βιομεμβρανών: 1) προσκολληθέντα επί υάλινων επιφανειών βακτήρια, 2) υμένια επί της επιφάνειας υγρού θρεπτικού μέσου και 3) συσσωματώματα. Οι διαπιστωθείσες διαφορές αποδόθηκαν σε πιθανή διαφορετική κινητικότητα των στελεχών.στ. Σημαντική, παρόμοιου βαθμού, καταστολή δημουργίας Ηp- βιομεμβρανών από τα δύο εξεταζόμενα στελέχη ως αποτέλεσμα έκθεσης του Hp σε υψηλές βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις (10-6 M) των hβD1-4 και αντίθετα, σημαντική επαγωγή της ικανότητας παραγωγής Ηp-βιομεμβρανών λόγω της επίδρασης ενδιάμεσων δόσεων 10-7 Μ και 10-8 Μ της hβD1 και 10-7 Μ της hβD3 αντίστοιχα, πιθανώς λόγω καταστολής του luxS οπερονίουζ. Σημαντικές μεταβολές του μεταγραφικού προφίλ των Hp στελεχών με την επαγωγή ή καταστολή πολλών γονιδίων συστατικών στοιχείων ρυθμιστικών μηχανισμών και/ή σηματοδοτικών οδών ενεργοποιούμενων κατά την απόκριση των βακτηρίων σε καταστάσεις στρες. Οι μεταβολές αυτές αφορούσαν: i. την τροποποίηση των κυριοτέρων συστατικών (LPS, λιπίδιο Α, πεπτιδογλυκάνη, λιποπρωτεΐνες) του Ηp κυτταρικού τοιχώματος με πιθανό σκοπό την αποτροπή πρόσδεσης των hβDs, την ενεργοποίηση διαμεμβρανικών αντλιών εξώθησής τους και την διατήρηση της ωσμωτικής ισορροπίας εκατέρωθεν της εξωτερικής μεμβράνης, ii. την ενεργοποίηση μηχανισμών επιδιόρθωσης του βακτηριακού DNA και προαγωγής γενετικού ανασυνδυασμού, iii. την αυξημένη επαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν παράγοντες σχετικούς με τη χημειοταξία και τη σύνθεση και λειτουργία του μαστιγίου, iv. την ενεργοποίηση μηχανισμών άμυνας άμεσα συνυφασμένων με την λοιμογόνο δύναμη του Hp, έναντι του οξειδωτικού στρες, v. την αυξημένη παραγωγή ουρεάσης υπό την ρυθμιστική δράση του ειδικού οπερόνιου (regulon) apo-fur που ενεργοποιεί παράλληλα την πρόσληψη και μεταφορά μεταλλικών ιόντων απαραίτητων για ορισμένες κυτταρικές διεργασίες του Hp. και vi. την καταστολή ρυθμιστών της αντιγραφής του RNA, ριβοσωμικών πρωτεϊνών και ενζύμων απαραίτητων για το μεταβολισμό αμινοξέων, εύρημα που πιθανώς αντικατοπτρίζει την επιλεκτική ελάττωση μεταβολικών λειτουργιών και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη δείχνει την πολύπλευρη επίδραση των hβDs στην παθογένεια του Hp, φαίνεται δε ότι η έκλυσή τους από τα επιθηλιακά κύτταρα του γαστρικού βλενογόνου πιθανώς να αποτελεί καθοριστικό στοιχείο επιλογής των θέσεων προσκόλλησης του Hp και να επάγει τον Hp αποικισμό του γαστρικού ιστού μέσω του σχηματισμού βιομεμβρανών - οι οποίες πιθανώς να ευθύνονται, εν μέρει, για τα ποσοστά αποτυχίας των θεραπευτικών σχημάτων εκρίζωσης καθώς και την εγκατάσταση της χρόνιας φλεγμονής λόγω της προκαλούμενης παραγωγής λοιμογόνων παραγόντων. Τα ευρήματα ποικίλης αλληλοεπιδράσεως AMPs και Hp της παρούσης μελέτης απαιτούν μελλοντικής προσεγγίσεως λόγω της σπουδαιότητας των αναφερόμενων ντιφενσινών ως φυσικών αντιβιοτικών του ξενιστή για την αντιμετώπιση της Hp λοίμωξης και άλλων παθογόνων παραγόντων.