Απομόνωση και εξωσωματικός (ex vivo) πολλαπλασιασμός στρωματικών στελεχιαίων κυττάρων από τον ανθρώπινο μυελό των οστών
Authors: Θεοδοσάκη Μαρία 
Published: September 2021

Τα ΣΣΚ είναι κύτταρα ινοβλαστικής μορφολογίας που παράγονται στο εργαστήριο, όταν καλλιεργηθεί κατάλληλα μυελός των οστών. Πιθανώς, το in vivo κύτταρο καταγωγής τους να είναι το περιαγγειακό κύτταρο (perivascular cell) ή περικύτταρο (pericyte). Οι in vitro ιδιότητες που χαρακτηρίζουν τα ΣΣΚ ως τέτοια είναι: η προσκόλλησή τους στην επιφάνεια του καλλιεργητικού μέσου, ο συγκεκριμένος ανοσοφαινότυπος, όπως προσδιορίζεται από την κυτταρομετρική ανάλυση και η ικανότητά διαφοροποίησή τους σε οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροβλάστες. Επιπλέον, παρουσιάζουν υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και καταστολή του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων σε μεικτές λεμφοκυτταρικές καλλιέργειες.Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έδειξαν ότι τα ΣΣΚ διαθέτουν και in vivo ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες, συμβάλλοντας στην επιβίωση του μοσχεύματος σε πειραματικά ζωικά μοντέλα. Επιπλέον, προσελκύονται στην περιοχή των τραυματισμένων ιστών προωθώντας τη λειτουργική αποκατάστασή τους με αντιφλεγμονώδη δράση. Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν στη χρησιμοποίησή τους και στον άνθρωπο για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών. Έτσι, έχουν διεξαχθεί πολλές κλινικές μελέτες φάσης Ι και ΙΙ, που αφορούν στην έγχυση ΣΣΚ για την υποβοήθηση της μεταμόσχευσης ΑΣΚ, τη θεραπεία της ανθεκτικής GVHD, την αντιμετώπιση αυτοάνοσων νοσημάτων και φλεγμονωδών νόσων του εντέρου, καθώς και την αναγέννηση ιστών με περιορισμένη ανανεωτική δυνατότητα ( καρδιακός, νευρικός, ιστοί του μυοσκελετικού συστήματος, κ. ά.).Με στόχο την παραγωγή εξωσωματικά εκπτυγμένων ΣΣΚ σε αριθμό επαρκή για την αντιμετώπιση της GVHD, αλλά και την ανεύρεση του καταλληλότερου πληθυσμού ΣΚ του ΜΟ για τη θεραπεία ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια, στο εργαστήριό μας μελετήσαμε δύο χαρακτηριστικούς πληθυσμούς ΣΣΚ (CD105+ και CD271+) και δύο, μέχρι προσφάτως θεωρούμενων, ΑΣΚ (CD34+ και CD133+).Από 23 δείγματα ΜΟ, 10ml το καθένα, απομονώθηκαν οι παραπάνω πληθυσμοί χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα αντισώματα και τη μέθοδο της θετικής ανοσομαγνητικής επιλογής. Ακολούθησαν καλλιέργειες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των διαχωρισθέντων κυττάρων σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα. Η φαινοτυπική ανάλυση των καλλιεργημένων κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής, ενώ η διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα ελέγχτηκε με την έκφραση των γονιδίων της LPL, της αλκαλικής φωσφατάσης και της COL2A1 αντίστοιχα.Και οι 4 πληθυσμοί έδωσαν γένεση σε προσκολλημένα κύτταρα ινοβλαστικής μορφολογίας, που διατηρούν το πολλαπλασιαστικό δυναμικό τους για 5 περίπου εβδομάδες και 9 συνεχείς ανακαλλιέργειες. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού και ο συνολικός αριθμός τους κατά το τέλος της καλλιέργειας, δε φαίνεται να διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ τους, ενώ, ο ανοσοφαινότυπος (CD29+, CD90+, CD44+, CD13+, CD105+, Class I – HLA+, CD14-, CD19-, CD31-, HLA-DR-, CD34- και CD45-) και η ικανότητα διαφοροποίησής τους σε λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα, όπως καταδεικνύεται και από την έκφραση των γονιδίων της LPL, της αλκαλικής φωσφατάσης και της COL2A1 αντίστοιχα, πιστοποιούν την ταυτότητά τους ως ΣΣΚ.Σημαντική διαφοροποίηση από τα παραπάνω αποτελέσματα παρατηρήθηκε σε ένα δείγμα CD271+ κυττάρων, στο οποίο, η αυτόματη δημιουργία ποικιλόμορφων κυτταρικών σχηματισμών μετά την 3η ανακαλλιέργεια, ανέστειλε τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό των ΣΣΚ.Τo εύρημα αυτό μας οδήγησε στην επιλογή του CD105+ πληθυσμού, προκειμένου να λαμβάνουμε αριθμό ΣΣΚ επαρκή για την αντιμετώπιση της GVHD, γεγονός που αποτελεί πλέον πρακτική του εργαστηρίου μας.Όσον αφορά στους πληθυσμούς των CD133+ και CD34+ κυττάρων, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ξεκάθαρα ότι, πέραν των αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, εμπεριέχουν και ΣΣΚ, επιβεβαιώνοντας το γεγονός που εκείνο το διάστημα είχε αρχίσει να διαφαίνεται για τον πρώτο και ανατρέποντας τα έως τότε βιβλιογραφικά δεδομένα για το δεύτερο.Στα ευρήματά μας αυτά στηρίχτηκε η κλινική μελέτη που ακολούθησε, κατά την οποία πραγματοποιήθηκε επιλογή των CD133+ και CD133-CD34+ κυττάρων από το ΜΟ 26 ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια και επαναχορήγησή τους στον ασθενή με ενδοστεφανιαία έγχυση. Η σήμανση με ραδιοφάρμακο των εγχεόμενων κυττάρων σε 8 περιπτώσεις έδειξε ότι σημαντικός αριθμός από αυτά εντοπίζονταν στην περιοχή του ουλοποιημένου μυοκαρδίου, έχοντας ως αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους των μη βιώσιμων περιοχών, την αύξηση της αιμάτωσής τους και τη βελτίωση των καρδιακών παραμέτρων, δικαιολογώντας έτσι τη διενέργεια μιας προοπτικής κλινικής μελέτης φάσης II.