Production of industrial enzymes and bioactive nanoparticles by cyanobacterium Pseudanabaena sp.
Authors: Καραγεώργου Δήμητρα 
Published: May 2023

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην παραγωγή βιομορίων και υψηλής αξίας προϊόντων από μικροοργανισμούς και πιο συγκεκριμένα από κυανοβακτήρια. Το στέλεχος του κυανοβακτηρίου που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα δουλειά έχει απομονωθεί από το επιβαρυμένο οικοσύστημα της λίμνης Παμβώτιδας. Τα παραγόμενα βιομόρια και προϊόντα είναι ένζυμα, λίπη και νανουλικά, που βρίσκουν εφαρμογές στους τομείς της βιομηχανίας, της ενέργειας και της ιατρικής. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των κυανοβακτηριακών κυττάρων, όπως η ικανότητα ανάπτυξής τους σε μια πληθώρα από διαφορετικά ενδιαιτήματα, χρησιμοποιώντας ακόμα και λύματα, καθώς και η ικανότητά τους να παράγουν υψηλής αξίας προϊόντα την ίδια στιγμή, έχουν προσεγγίσει το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας. Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε ένα νέο στέλεχος κυανοβακτηρίου, απομονωμένου από τη λίμνη Παμβώτιδα. Η φυλογενετική του ανάλυση, το κατέταξε ως ένα στέλεχος Pseudanabaena sp., το οποίο ονοματίστηκε ως Pamv7. Τα κύτταρά του έχουν την ικανότητα να μεγαλώνουν τόσο σε αυτοτροφικές, όσο και ετεροτροφικές συνθήκες. Στην δεύτερη περίπτωση, μπορούν να μεγαλώσουν σε πληθώρα διαφορετικών υποστρωμάτων, αλλά όταν χρησιμοποιείται σελλοβιόζη, έχουν την ικανότητα να παράγουν β-γλυκοζιδάση. Το παρόν ένζυμο βρίσκει πληθώρα εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων, αλλά και χαρτιού, χυμών, κρασιού κλπ, ενώ δεν έχει παραχθεί κατά το παρελθόν από το συγκεκριμένο τύπο μικροοργανισμών. Έτσι, μετά το φυλογενετικό χαρακτηρισμό του Pamv7 και της βιομηχανική του ανάλυσης, έλαβε χώρα μια αναλυτική μελέτη του ενζύμου. Αφού εξακριβώθηκε η παραγωγή του ενζύμου και της δράσης του, έλαβε χώρα η αριστοποίηση των συνθηκών ανάπτυξης (συγκέντρωση υποστρώματος, επιλογή πηγής αζώτου και συγκέντρωσής της, θερμοκρασία) του μικροοργανισμού και της παραγωγής του ενζύμου, με στόχο την αναβάθμιση της παραγωγής (scale-up). Χρησιμοποιώντας τις άριστες συνθήκες ανάπτυξης, έλαβε χώρα μεγαλύτερη παραγωγή του ενζύμου σε σύστημα βιοαντιδραστήρα 2L. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός της παραγόμενης β-γλυκοζιδάσης και προσδιορίστηκε το μοριακό της βάρος και τα θερμοδυναμικά της χαρακτηριστικά. Το ένζυμο με μοριακό βάρος 66 kDa και ενζυμική ενεργότητα 40U/L, με βέλτιστη θερμοκρασία δράσης και pH τους 40oCκαι 6.0 αντίστοιχα, εμφανίζεται ιδιαιτέρως σταθερό στο εύρος του όξινου0ουδέτερου pHs (6.0-7.0), ιδιότητα που το κάνει ιδιαιτέρως χρήσιμο για χρήση στη βιομηχανία. Καθώς τα Pseudanabaena sp. κύτταρα είχαν την ικανότητα να παράγουν β-γλυκοζιδάση, γεννήθηκε το ερώτημα του αν θα μπορούσαν να παράγουν και άλλα ένζυμα, όπως η α-γλυκοζιδάση. Έτσι, χρησιμοποιώντας μαλτόζη ως πηγή άνθρακα, παράχθηκε α-γλυκοζιδάση με ενζυμική ενεργότητα περίπου 1800 U/L. Καθώς και η α-γλυκοζιδάση εμφανίζει πληθώρα εφαρμογών, η μελέτη συνεχίστηκε ως προς την αριστοποίηση των συνθηκών παραγωγής της. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας αυτές τις συνθήκες, έγινε η παραγωγή μεγάλης ποσότητας του ενζύμου σε σύστημα βιοαντιδραστήρα 2L, ο καθαρισμό του και η μελάτη των κινητικών και θερμοδυναμικών του χαρακτηριστικών. Η παραγόμενη α-γλυκοζιδάση είχε μοριακό βάρος 52 kDa, άριστες συνθήκες δράσης τους 40oC και το pH 7.0, αλλά σταθερότητα στην όξινη κλίμακα του pH (4.0-6.0), κάτι που την κάνει κατάλληλη για διεργασίες όπου χρησιμοποιούνται τέτοιες συνθήκες. Εκτός των παραπάνω, τα μικροφύκη και τα κυανοβακτήρια αποτελούν καλούς παραγωγούς λιπιδίων. Επιπλέον η περιβαλλοντική μόλυνση και ιδιαιτέρως το φαινόμενο του θερμοκηπίου, καθώς και η μείωση των φυσικών πόρων, έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων, ανανεώσιμων μορφών ενέργειας, όπως το βιοντίζελ. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την ικανότητα των κυανοβακτηρίων να χρησιμοποιούν ακόμα και λύματα ως υποστρώματα για την ανάπτυξή τους, έθεσε τα θεμέλια για την εφαρμογή ενός σχεδίου βιο-επεξεργασίας και βιο-οικονομίας, που μειώνει το περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ενώ ταυτοχρόνως οδηγεί στην παραγωγή βιοντίζελ . Έτσι στην παρούσα διατριβή, τα κύτταρα χρησιμοποίησαν υδρολύματα από δύο σκανδιναβικά φυτά (silver birch and Norway spruce) για την ανάπτυξή τους και την παραγωγή λιπιδίων και βιοκαυσίμου. Η ανάλυση των παραγόμενων λιπιδίων υπέδειξε ένα λιπιδιακό προφίλ κατάλληλο για την παραγωγή βιοκαυσίμου, ενώ η ανάλυση των ιδιοτήτων του παραγόμενου βιοκαυσίμου υπέδειξε ικανοποιητική ποιότητα για πιθανή χρήση του. Τέλος τα κύτταρα Pseudanabaena sp. χρησιμοποιήθηκαν ως ‘εργοστάσια’ για την παραγωγή πολύ μικρών νανοσωματιδίων μέσω μιας πράσινης συνθετικής διαδικασίας. Το υδατικό εκχύλισμα του κυανοβακτηρίου δρα ως αναγωγικός και σταθεροποιητικός παράγοντας για τα Ag+ του AgNO3 προς τον σχηματισμό νανοσωματιδίων Agoκαι AgO. Επιπροσθέτων οι βιολογικές ενώσεις δρουν ως προστατευτικοί παράγοντες για τα νανοσωματίδια, προσδίδοντας τους πολλαπλές λειτουργίες. Τα μορφολογικά και δομικά χαρακτηριστικά τους προσδιορίστηκαν με τη χρήση τεχνικών όπως φασματομετρίες FTIR και XPS, X-ray Diffraction, μικροσκοπίες AFM και TEM. Επιπλέον τα παραγόμενα νανοσωματίδια εμφάνισαν εξαιρετικά ισχυρές αντιμοκροβιακές ιδιότητες που σχετίζονται άμεσα και με το χρόνο και με τη δόση, έναντι Gram-negativeEscherichiacoliκαιGram- positiveCorynebacteriumglutamicumβακτηριακών στελεχών (15μg/ml AgNPs (δηλ 3 μg/mlAg+ οδηγεί σε βακτηριακή μείωση πληθυσμού της τάξης του 95%). Εκτός από τις εφαρμογές όπου γίνεται χρήση της αντιμικροβιακής τους ικανότητας, τα νανοσωματίδια αργύρου μπουρούν να βρουν εφαρμογή και σαν νανοδομές σε περιβαλλοντικές, βιολογικές ή ιατρικές εφαρμογές. Συμπερασματικά, τα κύτταρα του κυανοβακτηρίου μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ‘εργοστάσιο’ για την παραγωγή μια πληθώρας βιομορίων και προϊόντων. Η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη λεπτομερή έρευνα που αφορά την παραγωγή ενζύμων από τον συγκεκριμένο τύπο μικροοργανισμού. Επιπλέον τα κύτταρα εκυπηρετούν την ιδέα της βιοοικονομίας, καταναλώνοντας υπολείμματα και παράγοντας βιώσιμα και φιλικά προς το περιβάλλον καύσιμα. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν ως εναλλακτική πλατφόρμα για την παραγωγή εξαιρετικά μικρών νανοσωματιδίων αργύρου, μέσω μιας διαδικασίας χαμηλού κόστους, γρήγορης και φιλικής προς το περιβάλλον.