Η έκφραση της Ε3, Ε4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στον καρκίνο
Authors: Αντωνίου Νικόλαος 
Published: September 2021

Η ομοιόσταση συνιστά θεμελιώδη ιδιότητα των οργανισμών και εξασφαλίζεται μέσω πληθώρας κυτταρικών αποκρίσεων έναντι ενδογενών και εξωγενών παραγόντων (Lloyd, Aon et al. 2001). Η διαταραχή των μηχανισμών που ελέγχουν τις διαδικασίες αυτές οδηγεί στη συσσώρευση βλαβών και γενικά στην απορρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας με επακόλουθο την εμφάνιση νόσων, όπως ο καρκίνος (Gorgoulis and Halazonetis 2010, Hanahan and Weinberg 2011). Στους όγκους παρατηρείται συχνά διατάραξη της ομαλής εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, που υπό προϋποθέσεις, μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση γενωμικής αστάθειας (Negrini, Gorgoulis et al. 2010). Η τελευταία έχει καθιερωθεί τα τελευταία χρόνια ως χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων (Hanahan and Weinberg 2011).Μια βιολογική διεργασία που έχει δειχθεί ότι είναι άμεσα συμβατή με το αντιγραφικό στρες και επομένως οδηγεί σε γενωμική αστάθεια, είναι ο προκαλούμενος από ογκογονίδιο κυτταρικός πολλαπλασιασμός (Halazonetis, Gorgoulis et al. 2008). Υπό φυσιολογικές συνθήκες μόλις εντοπιστεί κάποια βλάβη στο DNA, ενεργοποιούνται πρωτεΐνες που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο με σκοπό τη διακοπή του τελευταίου στα πλαίσια ενός προηγμένου κυτταρικού δικτύου που ονομάζεται μηχανισμός απόκρισης γενωμικών βλαβών (DDR) (Jackson and Bartek 2009). Εφόσον δεν καταφέρουν να επιδιορθωθούν οι εντοπισμένες βλάβες τότε το κύτταρο οδηγείται είτε σε απόπτωση είτε σε γήρανση, διεργασίες που μπορούν δυνητικά να λειτουργήσουν ως εμπόδιο έναντι της καρκινογένεσης (Jackson and Bartek 2009). Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις αποτελούν γενικά μια σημαντική στρατηγική που δίνει τη δυνατότητα στα κύτταρα να ανταποκρίνονται δυναμικά σε ενδογενείς ή περιβαλλοντικές αλλαγές, προκαλούμενες από στρεσογόνους, αυξητικούς παράγοντες ή από σήματα διαφοροποίησης (Weissman 2001). Τροποποιήσεις μιας πρωτεΐνης μπορεί να προκληθούν μέσω διαφόρων διεργασιών όπως είναι η μεθυλίωση, η ακετυλίωση, η υδροξυλίωση, η φωσφορυλίωση, η ουβικουïτινίωση ή η προσθήκη πρωτεϊνικών ομάδων που είναι συναφείς με εκείνες της ουβικουϊτίνης (Weissman 2001, Sun and Chen 2004). Η ουβικουïτινίωση είναι ένα είδος μετα-μεταφραστικής τροποποίησης αποτελώντας έναν στοιχειώδη κυτταρικό μηχανισμό που παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες λειτουργίες όπως η κυτταρική αύξηση και ανάπτυξη, η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού, η μεταγραφική ρύθμιση, η μεταγωγή σημάτων εντός του κυττάρου, η αυτοφαγία, ο κυτταρικός κύκλος και ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (Hershko and Ciechanover 1998, Chondrogianni and Gonos 2012, Streich and Lima 2014). Το σύστημα ουβικουϊτινίωσης ανακαλύφθηκε αρχικά ως ένας μηχανισμός που στοχοποιεί πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος για αποικοδόμηση μέσω του πρωτεασώματος (Ravid and Hochstrasser 2008). Όντας μια πολυσταδιακή διαδικασία, η ουβικουϊτινίωση επιτελείται από διαφορετικά ένζυμα που ονομάζονται Ε1,E2, E3 λιγάσες ουβικουϊτίνης με τελικό σκοπό την αποικοδόμηση της σημασμένης πρωτεΐνης από το πρωτεάσωμα (Shenoy 2007, Hoeller and Dikic 2009, Berndsen and Wolberger 2014). Πολλές E3 λιγάσες έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου, κυρίως εξαιτίας της ικανότητά τους να προάγουν την αποικοδόμηση ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικών παραγόντων (Hoeller, Hecker et al. 2006, Nakayama and Nakayama 2006, Bernassola, Karin et al. 2008). Οι E3 λιγάσες διακρίνονται ανάλογα με τη δομή του ενεργού τους κέντρου σε HECT, RING και U-BOX (Ardley and Robinson 2005). Aρκετά καλά μελετημένες E3 λιγάσες με ογκογόνο ρόλο, είναι η τύπου RING Ηdm2, ένας σημαντικός αρνητικός ρυθμιστής του ογκοκατασταλτικού παράγοντα p53, καθώς και οι SCF λιγάσες (διαθέτουν πολλές υπομονάδες), που ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Εξαρτώμενη από την υποστρωματική της επιλεκτικότητα μια E3 λιγάση μπορεί να δράσει είτε προωθώντας την ογκογόνο ανάπτυξη είτε καταστέλλοντάς τη ενώ η συμπεριφορά της μπορεί να ποικίλλει και ανάλογα με το είδος του ιστού στον οποίο εκφράζεται (Bond, Hu et al. 2005, Vousden and Prives 2005). Ο παράγοντας ουβικουϊτινίωσης Ε4Β (UBE4B) στον άνθρωπο αποτελεί την ομόλογη πρωτεΐνη της UFD2 η οποία έχει βρεθεί στο σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae (Hatakeyama, Yada et al. 2001, Caren, Holmstrand et al. 2006). Το γονίδιο της UBE4B βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 1 και θεωρείται πιθανά ογκοκατασταλτικό στην περίπτωση του νευροβλαστώματος, ενός τύπου καρκίνου που επιδρά στο συμπαθητικό νευρικό σύστημα κατά την παιδική ηλικία (Caren, Holmstrand et al. 2006).Η ανθρώπινη UBE4B/UFD2a είναι μια σχετικά νεοεμφανιζόμενη E3 λιγάση ουβικουϊτίνης που φέρει ένα καταλυτικό κέντρο τύπου U-BOX (Hatakeyama, Yada et al. 2001). Η ομόλογη πρωτεΐνη που φέρει η ζύμη, UFD2, εμπλέκεται σε ένα όχι και τόσο πρόσφατα περιγραφόμενο μονοπάτι αποικοδόμησης μέσω του πρωτεασώματος, που ονομάζεται UFD (ubiquitin fusion degradation) μονοπάτι (Johnson, Ma et al. 1995). Αργότερα, ανακαλύφθηκε μια καινούργια οικογένεια λιγασών που ονομάζονται Ε4 λιγάσες ουβικουϊτίνης όπου εντάχθηκε και η UFD2 (Koegl, Hoppe et al. 1999). Σε αντίθεση με τις E3 λιγάσες που μονοουβικουϊτινιώνουν ή πολυμονοουβικουϊτινιώνουν τα υποστρώματά τους, οι Ε4 λιγάσες συνεργαζόμενες με τις υπόλοιπες λιγάσες καταλύουν την επέκταση της ήδη υπάρχουσας ολιγοουβικουϊτινικής αλυσίδας (Park, Yoon et al. 2009, McDowell and Philpott 2013). Mε βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία, το UBE4B έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται στην πλειοψηφία ασθενών με καρκίνο μαστού και ήπατος (Zhang, Lv et al. 2014, Zhang, Pan et al. 2016). Επίσης υπάρχουν ενδείξεις ότι το UBE4B λειτουργεί ως ογκογόνος παράγοντας και σχετίζεται με ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων που είναι η αντίσταση στην απόπτωση. Έχει βρεθεί ότι σε μια ποικιλία ανθρώπινων κυτταρικών σειρών, η πρωτεΐνη UBE4B αλληλεπιδρά με τον αρνητικό ρυθμιστή HDM2 (Ε3 λιγάση), του αποπτωτικού παράγοντα p53, και επάγει την πολύ-ουβικουϊτινίωση του τελευταίου στοχεύοντάς το προς αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα (Wu, Pomeroy et al. 2011, Zhang, Lv et al. 2014). Ο ογκογόνος ρόλος της UBE4B ενισχύεται αφού μετά από πρόκληση γενωμικών βλαβών με γ-ακτινοβολία σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, η UBE4B πολυ-ουβικουïτινιώνει τη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη p53 στις θέσεις σερίνη 15 και 392. Η τελευταία είναι ιδιαίτερα σημαντική πρωτεΐνη καθώς η ενεργοποίησή της μέσω της φωσφορυλίωσής της στις παραπάνω θέσεις οδηγεί στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου προκειμένου να γίνει η επιδιόρθωση των βλαβών (Du, Wu et al. 2016). Τέλος, η ομόλογη της UBE4B, Ε4 λιγάση στο νηματώδη σκώληκα σχετίζεται με δύο σημαντικές βιολογικές διαδικασίες για την ανάπτυξη και προαγωγή του καρκίνου όπως είναι η απόπτωση και ο ομόλογος ανασυνδυασμός που αποτελεί έναν από τους βασικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης δικλωνικών θραύσεων στο DNA. Λειτουργεί λοιπόν, ως ένα μόριο διαμεσολαβητής που συμβάλλει στην ενδοεπικοινωνία μεταξύ των δύο διαδικασιών ύστερα από τη δημιουργία βλαβών στο DNA, ώστε αυτές να μην συμβαίνουν ταυτόχρονα (Ackermann, Schell et al. 2016). Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη διερεύνηση της έκφρασης και του ρόλου της Ε3,4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στην προαγωγή και ανάπτυξη του καρκίνου, σε συνάρτηση με τους μηχανισμούς απόπτωσης, απόκρισης και επιδιόρθωσης βλαβών του DNA. H μελέτη πραγματοποιήθηκε τόσο σε in vitro συστήματα (καρκινικές και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές) όσο και in vivo συστήματα (αρχειακό βιοπτικό υλικό). Μεταξύ των τελευταίων χρησιμοποιήθηκαν βιοψίες παχέος εντέρου που αντιπροσωπεύουν όλα τα στάδια εξέλιξης της καρκινογένεσης, ώστε να διευκρινισθεί πόσο πρώιμα εκφράζεται η UBE4B και αν τελικά έχει ογκογόνο ή ογκοκατασταλτικό ρόλο. Η μελέτη διεξήχθη με τη εφαρμογή βιοχημικών, μοριακών μεθόδων, καθώς και μεθόδων οπτικής μικροσκοπίας. Πιο συγκεκριμένα στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκαν τα παρακάτω επιστημονικά ερωτήματα: 1) Ποιά είναι η έκφραση της Ε3, Ε4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B in vivo (αρχειακό βιοπτικό υλικό) σε καρκίνους παχέος εντέρου και πνεύμονα; 2) Υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της UBE4B και της έκφρασης του “αγρίου τύπου” p53 (wtp53), που αποτελεί το κύριο υπόστρωμα του ενζύμου σε ιστούς παχέος εντέρου και πνεύμονα; 3) Πού οφείλεται η αύξηση της έκφρασης της UBE4B που παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των εξεταζόμενων ιστών στον καρκίνο σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό; 4) Εκφράζεται η λιγάση UBE4B σε πρώιμα στάδια κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και εκείνου της κεφαλής και τραχήλου; 5) Τί συμβαίνει με την έκφραση της σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μετά από επαγόμενη πρόκληση βλαβών στο DNA; Παίζει κάποιο ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA και στην απόπτωση;Οι απαντήσεις στα παραπάνω ερωτήματα παρουσιάζονται αναλυτικά στο 3ο Κεφάλαιο. Συμπερασματικά ωστόσο θα λέγαμε ότι από τη συγκεκριμένη μελέτη προκύπτουν βάσιμες ενδείξεις που καθιστούν τη λιγάση UBE4B ως έναν νέο και δυνητικά υποψήφιο ογκογόνο παράγοντα ο οποίος υπερεκφράζεται από τα πρώτα κιόλας καλοήθη στάδια στην πορεία της καρκινογένεσης σε παχύ έντερο και πνεύμονα. Το γεγονός αυτό φαίνεται πως οφείλεται στα αυξημένα επίπεδα mRNA ή και σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε επίπεδο πρωτεΐνης. Σε συνάρτηση με άλλες επιστημονικές μελέτες που εστιάζονται στη διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης UBE4B σε επιδιορθωτικούς μηχανισμούς, η συγκεκριμένη εργασία αναδεικνύει το συγκεκριμένο μόριο ως ένα σημαντικό παράγοντα στα πλαίσια του μηχανισμού απόκρισης γενωμικών βλαβών (DDR) όπως επίσης και της μοριακής καρκινογένεσης. Τέλος περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου της Ε3,4 λιγάσης ουβικουϊτίνης UBE4B στην καρκινογένεση καθίσταται αναγκαία ενώ αποτελεί ένα πρωτότυπο και πολλά υποσχόμενο πεδίο έρευνας που θα μπορούσε να ενισχύσει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης αυτής σε μελλοντικές θεραπευτικές παρεμβάσεις με πιθανά σημαντικό κλινικό αντίκτυπο.