Μελέτη της επίδρασης των μεταβολών της αιμάτωσης των όρχεων στη γονιμοποιητική ικανότητα του κριού
Authors: Ντέμκα Αικατερίνη 
Published: September 2021

Η συστηματική κλινική και εργαστηριακή αξιολόγηση της γονιμότητας των κριών αποτελεί παράγοντα διασφάλισης της οικονομικότητας των εκμεταλλεύσεων. Η υπερηχοτομογραφική εξέταση του γεννητικού συστήματος των αρσενικών μπορεί να χρησιμοποιηθεί συμπληρωματικά της κλινικής εξέτασης, παρέχοντας μεγαλύτερο εύρος πληροφοριών και ενισχύοντας την αξιοπιστία της. Επιπλέον, η εκτίμηση της ποιότητας του σπέρματος των κριών, εξασφαλίζει τον ολοκληρωμένο εργαστηριακό έλεγχο της γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων, που σε συνδυασμό με την κλινική και την υπερηχοτομογραφική εξέταση, ενδυναμώνει την πρόγνωση της γονιμότητας των αρσενικών. Στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης των παραγόντων που επηρεάζουν τη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος του κριού (ηλικία, εποχή, ένοιστρη ή άνοιστρη περίοδος) σε ετήσια βάση, μέσα από την αξιολόγηση των ποιοτικών χαρακτηριστικών του σπέρματος. Παράλληλα, εκτιμήθηκε η ποιότητα του σπέρματος υπερήλικων κριών φυλής Χίου (9-13 ετών) και έμμεσα αξιολογήθηκε η ωφελιμότητα ή μη της διατήρησής τους στα ποίμνια. Επιπλέον, καταγράφηκαν οι μεταβολές των δεικτών της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών σε ετήσια βάση, και παράλληλα διερευνήθηκε η επίδραση των παραγόντων που επηρεάζουν την αιμάτωση και την ηχητική υφή των όρχεων (ηλικία, εποχή, εκσπερμάτιση, ένοιστρη ή άνοιστρη περίοδος). Τέλος, διερευνήθηκε η ύπαρξη συσχέτισης των δεικτών αιμάτωσης και ηχητικής υφής των όρχεων με τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος κριών διαφορετικής ηλικίας, κατά τη διάρκεια τόσο της ένοιστρης όσο και της άνοιστρης περιόδου. Ο πειραματισμός διεξήχθη στη Μονάδα Βιοτεχνολογίας Αναπαραγωγής της Κλινικής Παραγωγικών Ζώων του Τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ. και στο Ινστιτούτο Αναπαραγωγής και Τεχνητής Σπερματέγχυσης της Διεύθυνσης Κτηνιατρικού Κέντρου Θεσσαλονίκης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε 7 κριούς-σπερματοδότες φυλής Χίου, οι οποίοι κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με την ηλικία τους: 3 κριοί 2-6 ετών (ενήλικοι) και 4 κριοί 9-13 ετών (υπερήλικοι). Τα δείγματα σπέρματος συλλέγονταν από κάθε κριό ανά δύο εβδομάδες, κατά τη διάρκεια ενός πλήρους ημερολογιακού έτους (ένοιστρη και άνοιστρη περίοδος). Στο εργαστήριο του Ινστιτούτου πραγματοποιούνταν ο προσδιορισμός του όγκου και της πυκνότητας των δειγμάτων σπέρματος, καθώς και μια αρχική υποκειμενική εκτίμηση της κινητικότητας. Ακολούθως, τα δείγματα έπειτα από αραίωση με το αραιωτικό μέσο Ovixcell® (37o C) σε τελική συγκέντρωση 250x106 σπερματοζωάρια/ml, μεταφέρονταν στη Μονάδα Βιοτεχνολογίας Αναπαραγωγής, όπου εφαρμόζονταν οι κατάλληλες δοκιμές για την εκτίμηση των εξής παραμέτρων: (i) κινητικότητα και επιμέρους μορφές κίνησης των σπερματοζωαρίων (CASA), (ii) ζωτικότητα του σπέρματος (χρώση εωσίνης-νιγροσίνης), (iii) μορφολογία των σπερματοζωαρίων (χρώση SpermBlue), (iv) αντοχή των σπερματοζωαρίων έναντι της καταπόνησης σε υπό-ωσμωτικό διάλυμα (Hypo-osmotic swelling test, HOST) και (v) ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρήνα (DNA) των σπερματοζωαρίων (δοκιμή της πορτοκαλόχρωμης ακριδίνης). Η διά των υπερήχων εξέταση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του φορητού υπερηχοτομογράφου Esaote MyLab™One, με ηχοβόλο κεφαλή γραμμικής σάρωσης 7,5 MHz. Η εξέταση περιλάμβανε τόσο την απεικόνιση με τη B-mode τεχνική, όσο και την απεικόνιση με την τεχνική του παλμικού Doppler. Οι εξετάσεις με τις τεχνικές B-mode και Doppler πραγματοποιούνταν 24 ώρες πριν και αμέσως μετά την εκσπερμάτιση των κριών, σε κάθε όρχη ξεχωριστά. Ειδικότερα, οι αιμοδυναμικοί δείκτες οι οποίοι εκτιμήθηκαν, είναι: (i) ο Δείκτης παλμικότητας (Pulsatility index-PI), (ii) ο Δείκτης αντίστασης (Resistive index-RI), (iii) η Τελοδιαστολική ταχύτητα ροής (End-diastolic velocity-EDV), (iv) η Διάμετρος της ορχικής αρτηρίας (Diameter-D), (v) η Μέγιστη ταχύτητα ροής αίματος στη διάρκεια ενός καρδιακού κύκλου (Time-averaged maximum velocity-TAVM) και (vi) ο Όγκος ροής αίματος (Blood flow volume-BFV). Οι παράμετροι της ηχητικής υφής των όρχεων οι οποίες εκτιμήθηκαν, είναι: (i) η Εντροπία (Entropy-E), (ii) η Αντίθεση (Contrast-Con), (iii) η Συσχέτιση (Correlation-Cor), (iv) η Διασπορά φωτεινότητας (Gradient variance-GV), (v) η Τυπική απόκλιση φωτεινότητας (Standard deviation-StD), (vi) η Έμφαση μακρών διαδρομών (Long run emphasis-LRunEm), (vii) η Μέση τιμή έντασης της φωτεινότητας (Mean value-MV), (viii) η Κατανομή επιπέδων του γκρι (Gray value distribution-GVD), (ix) η Κατανομή μήκους διαδρομών (Runlength distribution-RunLD) και (x) η Μέση τιμή φωτεινότητας (Gradient mean value-GMV). Σε ό,τι αφορά στα αποτελέσματα της ανάλυσης της επίδρασης της εποχικότητας στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος, το ποσοστό των ενεργοποιημένων σπερματοζωαρίων παρατηρήθηκε αυξημένο κατά τη διάρκεια της άνοιστρης περιόδου (p=0,011). Επιπλέον, το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που έφεραν ανωμαλίες στην κεφαλή τους ήταν υψηλότερο κατά την άνοιστρη περίοδο (p=0,001), ενώ το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που έφεραν ανωμαλίες στην ουρά τους βρέθηκε υψηλότερο κατά την ένοιστρη, σε σύγκριση με την άνοιστρη περίοδο (p=0,022). Παράλληλα, το ποσοστό των HOST+ σπερματοζωαρίων καταγράφηκε αυξημένο κατά την ένοιστρη έναντι της άνοιστρης περιόδου (p<0,001). Η ηλικία των κριών φάνηκε να επηρεάζει μόνο τον όγκο και την πυκνότητα του σπέρματος, παρατηρώντας αυξημένες τιμές στην ομάδα των υπερήλικων κριών σε σύγκριση με την ομάδα των ενήλικων (p=0,001 και p<0,001, αντίστοιχα). Οι τιμές των αιμοδυναμικών δεικτών και των παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά από την εκσπερμάτιση (p>0,05). Η διερεύνηση της επίδρασης της εποχικότητας στην αιμάτωση των όρχεων, οδήγησε σε υψηλότερες τιμές των δεικτών αντίστασης και παλμικότητας και των δύο όρχεων, τόσο πριν όσο και μετά την εκσπερμάτιση, κατά την ένοιστρη περίοδο συγκριτικά με την άνοιστρη (p<0,001). Επιπλέον, η διάμετρος της ορχικής αρτηρίας του αριστερού μόνο όρχη, καταγράφηκε μεγαλύτερη κατά την άνοιστρη περίοδο, σε σύγκριση με την ένοιστρη, πριν από την εκσπερμάτιση (p=0,012), αποτέλεσμα το οποίο διαπιστώθηκε και για την παράμετρο BFV (p<0,001). Σε ό,τι αφορά στην επίδραση της ηλικίας των κριών στην αιμάτωση των όρχεων, η διάμετρος της ορχικής αρτηρίας του δεξιού όρχη διαπιστώθηκε μεγαλύτερη στους υπερήλικες κριούς, τόσο πριν όσο και μετά την εκσπερμάτιση (p=0,038 και p<0,001, αντίστοιχα), ενώ του αριστερού όρχη, ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μόνο μετά την εκσπερμάτιση (p=0,005). Επιπρόσθετα, ο δείκτης BFV του αριστερού όρχη παρατηρήθηκε μεγαλύτερος μετά την εκσπερμάτιση, στους υπερήλικες κριούς, σε σύγκριση με τους ενήλικες (p<0,001).Διερευνώντας τις εποχικές και ηλικιακές μεταβολές της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών, διαπιστώθηκε ότι η τιμή της παραμέτρου GV του αριστερού όρχη πριν από την εκσπερμάτιση, ήταν μειωμένη κατά την ένοιστρη, συγκριτικά με την άνοιστρη περίοδο (p=0,01). Η τιμή της παραμέτρου Cor του αριστερού όρχη πριν την εκσπερμάτιση, καταγράφηκε μεγαλύτερη κατά την ένοιστρη, συγκριτικά με την άνοιστρη περίοδο (p=0,03). Παράλληλα, πριν την εκσπερμάτιση, οι τιμές των παραμέτρων Con και Cor του δεξιού όρχη διαπιστώθηκαν αυξημένες στην ομάδα των υπερήλικων κριών, ενώ μετά την εκσπερμάτιση, η τιμή της παραμέτρου Ent του δεξιού όρχη παρατηρήθηκε υψηλότερη στην ομάδα των ενήλικων κριών (p=0,03, p=0,05 και p=0,05, αντίστοιχα). Σχετικά με τη διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ των παραμέτρων του σπέρματος και της αιμάτωσης των όρχεων, διαπιστώθηκε ότι ο δείκτης παλμικότητας του αριστερού όρχη των ενήλικων κριών συσχετίσθηκε αρνητικά με τη συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων, μετά την εκσπερμάτιση, κατά την ένοιστρη περίοδο (r=-0,5, n=33, p=0,003). Επιπλέον, ο δείκτης αντίστασης και των δύο όρχεων, συσχετίσθηκε αρνητικά πριν την εκσπερμάτιση με τις συνολικές μορφολογικές ανωμαλίες (r=-0,5, n=33, p=0,008/r=-0,4, n=33, p=0,01, αντίστοιχα) και με τις ανωμαλίες της ουράς των σπερματοζωαρίων (r=-0,5, n=33, p=0,004/p=0,008, αντίστοιχα). Κατά την άνοιστρη περίοδο, ο δείκτης παλμικότητας του αριστερού και ο δείκτης αντίστασης του δεξιού όρχη των ενήλικων κριών πριν την εκσπερμάτιση, συσχετίσθηκαν θετικά με τον όγκο του εκσπερματίσματος (r=0,4, n=45, p=0,013 και r=0,6, n=45, p<0,001, αντίστοιχα). Οι δείκτες LRunEm, GVD και RunLD του δεξιού όρχη των υπερήλικων κριών συσχετίσθηκαν αρνητικά κατά την ένοιστρη περίοδο αμέσως μετά την εκσπερμάτιση, με τη βλάβη του DNA των σπερματοζωαρίων (r=-0,9, n=44, p<0,001). Σε ό,τι αφορά στους ενήλικες κριούς, μόνο ο δείκτης LRunEm του δεξιού όρχη συσχετίσθηκε αρνητικά με τη συγκεκριμένη παράμετρο του σπέρματος, πριν την εκσπερμάτιση (r=-0,6, n=33, p=0,001). Επιπλέον, στην ίδια ομάδα κριών, κατά την άνοιστρη περίοδο, ο δείκτης LRunEm του αριστερού όρχη συσχετίσθηκε αρνητικά με τις ανωμαλίες της ουράς και τις συνολικές μορφολογικές ανωμαλίες των σπερματοζωαρίων (r=-0,8/r=-0,7, n=45, p<0,001). Επιπρόσθετα, ο δείκτης Con συσχετίστηκε κατά τη διάρκεια της άνοιστρης περιόδου μετά την εκσπερμάτιση, με τα ακίνητα και τα ζωντανά σπερματοζωάρια (r=-0,6/r=0,6, n=60, p<0,001). Συνοψίζοντας, η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής οδήγησε στα ακόλουθα συμπεράσματα: (i) η εποχικότητα επηρεάζει ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος (WOB, υπερκινητικότητα, ανωμαλίες κεφαλής και ουράς των σπερματοζωαρίων, αντοχή των σπερματοζωαρίων έναντι της καταπόνησης σε υπό-ωσμωτικό διάλυμα), (ii) η ποιότητα του σπέρματος των υπερήλικων κριών διατηρείται σε υψηλά επίπεδα, καθιστώντας χρήσιμη την παραμονή τους στα ποίμνια, (iii) οι τιμές των αιμοδυναμικών δεικτών και των παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών δεν μεταβάλλονται σημαντικά μετά την εκσπερμάτιση, (iv) οι κύριοι δείκτες της αιμάτωσης των όρχεων (PI, RI) επηρεάζονται από την εποχικότητα, αλλά όχι από την ηλικία των κριών, (v) οι τιμές ορισμένων μόνο παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων επηρεάζονται από την εποχικότητα και την ηλικία των κριών (GV, Cor, Con, Ent), (vi) οι μεταβολές της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων εμφανίζουν μέτριας ισχύος συσχέτιση με τις παραμέτρους του σπέρματος, υπό την επίδραση των παραγόντων της εποχής, της εκσπερμάτισης και της ηλικίας των κριών και (vii) αποδεικνύεται η χρησιμότητα της διά των υπερήχων εξέτασης των όρχεων με τις τεχνικές B-mode και Doppler για την παροχή πρόσθετων πληροφοριών, οι οποίες σε συνδυασμό με την εργαστηριακή ανάλυση του σπέρματος, συμβάλλουν στην ασφαλέστερη επιλογή κατάλληλων κριών για την αναπαραγωγική διαδικασία.