Μελέτη της δράσης αδρενεργικών και χολινεργικών παραγόντων (αγωνιστών - ανταγωνιστών) σε λευχαιμικά κύτταρα. Δοκιμασίες In vitro σε υγρές καλλιέργειες
Authors: Τασιόπουλος Στέργιος 
Published: August 2021

Με βάση τη βεβαιωμένη πλέον νεύρωση του μυελού των οστών από το αυτόνομο νευρικό σύστημα και τη λειτουργική σχέση ανοσολογικού και αυτόνομου νευρικού συστήματος, επιχειρείται με αυτή την εργασία μελέτη της επίδρασης νευροπεπτιδίων, και συγκεκριμένα αδρενεργικών και χολινεργικών παραγόντων (αγωνιστών - ανταγωνιστών), επί λευχαιμικών κυττάρων. Το υλικό της μελέτης αφορά κύτταρα από 4 καθιερωμένες λευχαιμικές σειρές (ηλικίας 5-11 ετών) και βλαστικά κύτταρα από το αίμα 11 ασθενών με οξεία λευχαιμία (8 με AML και 3 με ALL). • Κυτταρικές σειρές: Οι σειρές ΚΓ-91 [ανάπτυξη από AML-M3 t(15;17)] και ΚΑ-93 [ανάπτυξη από HCLv 14q+] εκφράζουν μόνο ερυθροειδείς δείκτες (GlycA και γ- αλύσους). Οι άλλες δύο σειρές, η ΖΑ-93 [ανάπτυξη από AML-M1 t(8;21)] και η ΜΚ-97 [ανάπτυξη από AML-M4Eo inv16] είναι EBV(+), εκφράζουν δείκτες Β λεμφοκυττάρου, εκκρίνουν MIP1a και διαφέρουν στις ανοσοσφαιρίνες (ΖΑ-93: IgMK, ΜΚ-97: IgAK). • Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: AML (2 ΜΙ, 2 M2, 2 Μ3v, 2 Μ4), ALL (1 Β, 2 Τ). • Αδρενεργικοί παράγοντες: Μεθοξαμίνη (α1-αγωνιστής), κλονιδίνη (α2-αγωνιστής), φαιντολαμίνη (α-ανταγωνιστής), ισοπροτερενόλη (β-αγωνιστής), προπρανολόλη (β- ανταγωνιστής), βουτοξαμίνη (β2-ανταγωνιστής), επινεφρίνη (μικτός α και β αγωνιστής). • Χολινεργικοί παράγοντες: Καρβαμυλχολίνη (καρβαχόλη - αγωνιστής), ατροπίνη (ανταγωνιστής). Εφαρμόστηκαν υγρές κυτταρικές καλλιέργειες διάρκειας 1-4 ή και περισσότερων 24ώρων. Κύτταρα, με ζωτικότητα >80%, εναιωρούνται στο υγρό θρεπτικό μέσο (RPMI 1640 - Glutamax I με 15% FBS) με αρχική συγκέντρωση 0,1-0,5 X 106/ml, χωρίς την προσθήκη νευροπεπτιδίου (κύτταρα «μάρτυρες») και με προσθήκη νευροπεπτιδίου σε τελική συγκέντρωση 1aM - 1mM, και τοποθετούνται σε κλίβανο καλλιεργειών. Σε τακτά χρονικά διαστήματα λαμβάνεται καλλιεργητικό υλικό για αρίθμηση των κυττάρων, έλεγχο της ζωτικότητάς τους και ετοιμασία κυτταρικών παρασκευασμάτων για έλεγχο φαινοτύπου (ανοσοφαινότυπος με ΑΡΑΑΡ) και απόπτωσης (in situ TUNEL-test). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι αδρενεργικοί παράγοντες επιδρούν στα λευχαιμικά κύτταρα. Ειδικότερα, και συγκριτικά με τα κύτταρα «μάρτυρες», διαπιστώθηκαν τα εξής: Α. Αδρενεργικοί παράγοντες • α-Αδρενεργικοί παράγοντες: Οι αγωνιστές μεθοξαμίνη και κλονιδίνη δοκιμάστηκαν στα κύτταρα των 4 σειρών και διαπιστώθηκε ότι ασκούν στατιστικά σημαντική κυτταροστατική δράση σε συγκέντρωση 1mM (ή και 100μΜ περιστασιακά). Η μείωση της ανάπτυξης αρχίζει από το 2° 24ωρο, χωρίς επηρεασμό της ζωτικότητας ή απόπτωση των κυττάρων. Τα κύτταρα όλων των σειρών διατηρούν τη μορφολογία τους. Ανοσοφαινοτυπικά, στα κύτταρα ΚΓ-91 και ΚΑ-93 μειώνεται η έκφραση των ερυθροειδών δεικτών GlycA και γ-αλύσων. Στα κύτταρα ΖΑ-93 αυξάνεται σημαντικά η έκφραση της MIP1a και slgMK, ενώ οι αντίστοιχες εκφράσεις στα ΜΚ-97 δε μεταβάλλονται. Ο ανταγωνιστής φαιντολαμίνη ασκεί επίσης κυτταροστατική δράση στα κύτταρα ΚΓ-91, όχι όμως και στα ΚΑ-93. Τα ευρήματα παραλληλίζονται με εκείνα περιορισμένων μελετών σε φυσιολογικά προγονικά κύτταρα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. • β-Αδρενεργικοί παράγοντες: Τα κύτταρα όλων των σειρών, παρουσία ισοπροτερενόλης σε συγκέντρωση 100μΜ (ή και 10μΜ σε ορισμένες περιπτώσεις) εμφανίζουν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης από το 2°- 3° 24ωρο, συνοδευόμενη ενίοτε από μείωση της ζωτικότητάς τους ή σπανιότερα και από απόπτωση. Φαινοτυπικά, σημειώνεται μικρού βαθμού μείωση των ερυθροειδών δεικτών στα κύτταρα ΚΓ-91 και ΚΑ-93 και των Β λεμφικών δεικτών στα ΖΑ-93 και ΜΚ-97. Ειδικότερα, στα κύτταρα ΖΑ-93 διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της εκκρινόμενης MIP1a εντός 24 ωρών σε μικρές συγκεντρώσεις ισοπροτερενόλης (100nΜ - 10μΜ), χωρίς επηρεασμό της ανάπτυξης και της ζωτικότητάς των κυττάρων. Αντίθετα, στις ίδιες μικρές συγκεντρώσεις ισοπροτερενόλης και στον ίδιο χρόνο, τα κύτταρα ΜΚ-97 δεν επηρεάζονται. Ανάλογα αποτελέσματα, με μείωση της ανάπτυξης σε διάφορο βαθμό, διαπιστώνονται και στα βλαστικά κύτταρα από 4 οξείες λευχαιμίες (1 ΜΙ, 2 Μ3v και 1 Μ4). Η δράση της ισοπροτερενόλης ερμηνεύεται από την ιδιότητά της ως β-αδρενεργικού αγωνιστή να αυξάνει ενδοκυττάρια το cAMP, μέσω σύνδεσης με αντίστοιχους β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Η αύξηση του cAMP είναι γνωστό ότι προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης στη φάση G1 ή G0/G1 του κυτταρικού κύκλου και είναι δυνατόν να οδηγήσει ακόμη και σε απόπτωση. Από τους ανταγωνιστές, η προπρανολόλη συμπεριφέρεται ως αγωνιστής, μειώνοντας την ανάπτυξη των κυττάρων ΚΓ-91 και ΚΑ-93, σε αντίθεση με τη βουτοξαμίνη, η οποία δεν ασκεί καμία επίδραση στα ίδια κύτταρα. • Μικτοί α και β αγωνιστές: Η επινεφρίνη, σε συγκεντρώσεις 100μΜ (ή και 10μΜ σε ορισμένες περιπτώσεις) επιφέρει στα κύτταρα και των 4 σειρών, από το 1° 24ωρο, μείωση της ανάπτυξης και της ζωτικότητάς τους και κατά κανόνα απόπτωση. Στα κύτταρα της σειράς ΖΑ-93, σε μικρές συγκεντρώσεις επινεφρίνης (100nΜ - 10μΜ), στο 1° 24ωρο, χωρίς επηρεασμό της ανάπτυξης, σημειώνεται μείωση της εκκρινόμενης MIP1a, ανάλογη με την προκαλούμενη από την ισοπροτερενόλη. Αντίστοιχα, στα κύτταρα ΜΚ-97 παρατηρείται μείωση της ανάπτυξης και της ζωτικότητας, με στοιχεία απόπτωσης των κυττάρων, χωρίς, όμως, πραγματική μείωση της εκκρινόμενης MIP1a. Στα βλαστικά κύτταρα των οξειών λευχαιμιών η επινεφρίνη, στις ίδιες συγκεντρώσεις (10-100μΜ), προκαλεί μείωση της έκφρασης των ειδικών δεικτών, της ζωτικότητας των κυττάρων και απόπτωση σε ποικίλο βαθμό. Η εντονότερη κυτταροστατική και αποπτωτική δράση της επινεφρίνης αποδίδεται στην αθροιστική δράση α και β αδρενεργικού αγωνιστή που διαθέτει. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα από τη δράση των αδρενεργικών ουσιών στην ανάπτυξη και το φαινότυπο των λευχαιμικών κυττάρων είναι ενδεικτικά ότι αυτή είναι μη τοξική και ασκείται άμεσα, πιθανώς μέσω αδρενεργικών υποδοχέων. Συγκεκριμένα, όσον αφορά την ανάπτυξη των κυττάρων: i. οι α-αδρενεργικοί παράγοντες ασκούν κυτταροστατική δράση, ii. οι β-αδρενεργικοί ασκούν επίσης κυτταροστατική και δυνητικά αποπτωτική δράση και iii. οι μικτοί αδρενεργικοί παράγοντες δρουν κυρίως επάγοντας τα κύτταρα σε απόπτωση. Οι διαφορές στην ευαισθησία και ανταπόκριση των κυττάρων των σειρών στους αδρενεργικούς παράγοντες, ιδιαίτερα μεταξύ αυτών με τον ίδιο φαινότυπο, προφανώς σχετίζονται με τη διαφορετική προέλευση και φύση των κυττάρων. Αντίστοιχα, οι σημειωθείσες διαφορές στα βλαστικά κύτταρα των οξειών λευχαιμιών θα πρέπει να αποδοθούν στην ετερογένειά τους και σε ένα βαθμό και στην καθαρότητα του βλαστικού πληθυσμού. Β. Χολινεργικοί παράγοντες Σε αντίθεση με τους αδρενεργικούς, οι χολινεργικοί παράγοντες που δοκιμάστηκαν στα κύτταρα και των 4 λευχαιμικών σειρών, σε συγκεντρώσεις 1aM - 1mM, δεν έδειξαν να ασκούν κάποια δράση στην ανάπτυξη ή το φαινότυπο των κυττάρων. Οπωσδήποτε τα ευρήματα της μελέτης αποτελούν ενδείξεις για δράση των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν και απαιτούν ειδικότερη έρευνα για επιβεβαίωση.