Συγκριτική μελέτη μεθόδων ανίχνευσης ολιγοκλωνικών δεσμών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό
Authors: Παπαϊωάννου Βασιλική 
Published: July 2014

Η ανάλυση των πρωτεϊνών του εγκεφαλονωτιαίου υγρού είναι χρήσιμη στη διερεύνηση φλεγμονωδών νοσημάτων, όπου λαμβάνει χώρα ενδοθηκική σύνθεση ανοσοσφαιρινών. Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας είναι νόσημα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (εγκέφαλος και νωτιαίος μυελός), πιθανότατα αυτοάνοσης αιτιολογίας, κατά το οποίο το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού στρέφεται έναντι αντιγόνων της μυελίνης ουσίας. Η νόσος, επομένως, χαρακτηρίζεται από φλεγμονή και απομυελίνωση. Πάσχοντες από Σκλήρυνση Κατά Πλάκας, αλλά και από άλλα νοσήματα, όπως ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος, η νευροσύφιλη, η Υποξεία Σκληρυντική Πανεγκεφαλίτιδα, εμφανίζουν συχνά αυξημένες συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, λόγω ενδοθηκικής σύνθεσης.Ποσοτικά, το γεγονός αυτό μπορεί να αποτυπωθεί με τη βοήθεια του δείκτη IgG, που αποτελεί τον λόγο (IgG ΕΝΥ/ IgG ορού) / (αλβουμίνη ΕΝΥ/ αλβουμίνη ορού). Οι τιμές αναφοράς του λόγου κυμαίνονται από 0,3 έως 0,7. Η τιμή του είναι αυξημένη σε ποσοστό περίπου 70% των πασχόντων από Σκλήρυνση Κατά Πλάκας. Ποιοτικά, από τις καλύτερες μεθόδους ανάδειξης της ενδοθηκικής παραγωγής IgG είναι η εξέταση του ΕΝΥ για την παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών, μετά από διαχωρισμό των πρωτεϊνικών κλασμάτων με τη βοήθεια της ηλεκτροφόρησης. Στην περίπτωση της ΣΚΠ, η IgG δεν αποτυπώνεται ως διάχυτη ζώνη στην ηλεκτροφόρηση του ΕΝΥ, όπως συμβαίνει φυσιολογικά, αλλά δημιουργεί ολιγάριθμες, ευδιάκριτες ζώνες. Η παρουσία στο ΕΝΥ δύο ή περισσότερων ζωνών που απουσιάζουν από το αντίστοιχο δείγμα του ορού, είναι ενδεικτική διέγερσης περιορισμένου κλώνου λεμφοκυττάρων. Η μέθοδος αναφοράς για την αναζήτηση των ολιγοκλωνικών ζωνών με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία, είναι η ισοηλεκτρική εστίαση ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση. Δεν εφαρμόζεται όμως από την πλειοψηφία των εργαστηρίων, καθώς είναι μέθοδος απαιτητική, χρονοβόρα, και με δυσκολία προτυποποίησης.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η σύγκριση δύο μεθόδων για την αναζήτηση ολιγοκλωνικών ζωνών, της ισοηλεκτρικής εστίασης ακολουθούμενης από ανοσοαποτύπωση (ΙΗΕ) (θεωρούμενη ως μέθοδος αναφοράς) και της εμπορικά διαθέσιμης ημιαυτοποιημένης μεθόδου της ηλεκτροφόρησης σε γέλη αγαρόζης υψηλής ηλεκτροφορητικής ευκρίνειας ακολουθούμενης από ανοσοκαθήλωση (ΗΥΗΕ), καθώς είναι ελάχιστα τα βιβλιογραφικά δεδομένα που συγκρίνουν τις συγκεκριμένες μεθόδους. Επιπλέον, υπολογίστηκε ο δείκτης IgG για όλα τα δείγματα και οι τιμές του συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα των ηλεκτροφορητικών μεθόδων. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 225 δείγματα Ε.Ν.Υ και ορού ασθενών που νοσηλεύτηκαν στη Νευρολογική Κλινική του ΠΓΝΑ “Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ” με την υποψία Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας σε χρονικό διάστημα τριάντα έξι μηνών.Προκειμένου για τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης εφαρμόστηκε η μέθοδος όπως υποδεικνύεται από τους Keir και συνεργάτες. Για την ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης υψηλής ηλεκτροφορητικής ευκρίνειας χρησιμοποιήθηκε η εμπορικά διαθέσιμη μέθοδος HYDRAGEL 6 CSF (Sebia, Lisses, France), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, σε συσκευή της εταιρείας Sebia. Ο δείκτης IgG υπολογίστηκε με βάση τον λόγο (IgG ΕΝΥ/ IgG ορού) / (αλβουμίνη ΕΝΥ/ αλβουμίνη ορού), όπου φυσιολογικές θεωρήθηκαν τιμές <= 0,7.Η συμφωνία μεταξύ των μεθόδων IHE και ΗΥΗΕ ήταν 98.7% και ο δείκτης kappa ήταν 0.97 (p<0.001) δείχνοντας άριστη συμφωνία μεταξύ των μεθόδων. Από τα 91 δείγματα που βρέθηκαν θετικά με τη μέθοδο IHE, 88 βρέθηκαν θετικά και με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Δεν υπήρξε ούτε ένα δείγμα ασθενούς που να είναι θετικό με τη μέθοδο ΗΥΗΕ και αρνητικό με τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης. Αντιθέτως, υπήρξαν τρία δείγματα ασθενών, που καταγράφηκαν ως θετικά με τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης και αρνητικά με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Εξετάζοντας τη συμφωνία μεταξύ της ΗΥΗΕ και των τιμών του δείκτη ΙgG καταγράφουμε ότι η συμφωνία ήταν 84.0% και ο δείκτης kappa ήταν 0.65 (p<0.001), δείχνοντας καλή συμφωνία μεταξύ των μεθόδων. Από τους 72 ασθενείς οι οποίοι είχαν αυξημένο δείκτη IgG, οι 62 είχαν και θετικό αποτέλεσμα για παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Ανάμεσα στους ασθενείς με φυσιολογικές τιμές δείκτη, υπήρχαν 28 οι οποίοι εμφάνιζαν ολιγοκλωνικές ζώνες στο ΕΝΥ τους. Εξάλλου, 9 από τους ασθενείς με αυξημένες τιμές δείκτη, είχαν αποτέλεσμα αρνητικό για ολιγοκλωνικές ζώνες. Το συμπέρασμα που προκύπτει είναι ότι όσον αφορά την εργαστηριακή αναζήτηση των ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ η εμπορικά διαθέσιμη ημιαυτοποιημένη μέθοδος ΗΥΗΕ, μπορεί επαρκώς να αντικαταστήσει την περισσότερο απαιτητική μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης. Ως μειονέκτημα της ΗΥΗΕ μπορεί να θεωρηθεί ο μικρότερος αριθμός ζωνών σε σχέση με την ΙΗΕ, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει ερμηνευτικά το αποτέλεσμα σε περισσότερο απαιτητικά δείγματα. Προκειμένου για τον δείκτη IgG εξάγεται το συμπέρασμα, ότι σε καμία περίπτωση δεν μπορεί να αντικαταστήσει τις ποιοτικές μεθόδους ανίχνευσης των ολιγοκλωνικών ζωνών, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τα υπόλοιπα δεδομένα (κλινικά και εργαστηριακά), προκειμένου να υποβοηθηθεί η διαγνωστική σκέψη.