Συμπεριφορά και παρεμπόδιση του Listeria monocytogenes κατά την επεξεργασία και συντήρηση φιλέτων καπνιστής πέστροφας
Authors: Οικονόμου Σωτήριος 
Published: September 2021

Από τα σημαντικότερα αγροτικά προϊόντα που παράγει η Ελλάδα είναι τα αλιευτικά προϊόντα. Πρόκειται για τρόφιμα ευαλλοίωτα λόγω της υψηλής τους περιεκτικότητας σε θρεπτικά συστατικά που είναι δυνατό να επιμολυνθούν με παθογόνους μικροοργανισμούς σε διάφορα στάδια της παραγωγικής τους αλυσίδας από το περιβάλλον, τον άνθρωπο, τον εξοπλισμό και τους χώρους επεξεργασίας με αποτέλεσμα να καταστούν επικίνδυνα. Το L. monocytogenes, είναι ένα τροφιμογενές παθογόνο βακτήριο και μπορεί να απαντάται σε μια ευρεία γκάμα τροφίμων, επιβιώνει των διάφορων επεξεργασιών (κατάψυξη, αλάτιση, θερμική επεξεργασία) έχοντας ως κυριότερη πηγή τα ήπια επεξεργασμένα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα (RTE). Πολλές κατηγορίες τροφίμων και αλιευτικών προϊόντων έχουν συσχετιστεί επιδημιολογικά με σποραδικές περιπτώσεις λιστερίωσης. Τα φιλέτα καπνιστής πέστροφας (θερμής κάπνισης), ανήκουν στα ήπια θερμικώς επεξεργασμένα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα τα οποία μπορούν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη του L. monocytogenes και αποτέλεσαν το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Συγκεκριμένα, αφορά τη μελέτη της επίδρασης των συνθηκών επεξεργασίας και συντήρησης στη συμπεριφορά του L. monocytogenes στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας. Αρχικά, έγινε διερεύνηση της επίδρασης της αντιμικροβιακής δράσης εννέα (9) υδατοδιαλυτών συμπυκνωμάτων υγρών καπνών στο L. monocytogenes. Έγινε εκτίμηση της ελάχιστης παρεμποδιστικής (MIC) και βακτηριοκτόνου συγκέντρωσης (MBC) των υγρών καπνών, έναντι κανονικών κυττάρων (ελέγχου), κυττάρων βιοϋμενίων και ωσμωτικά προσαρμοσμένων κυττάρων του L. monocytogenes. Ο πιο αποτελεσματικός καπνός, με την κωδική ονομασία L9, είχε ισχυρή παρεμποδιστική (MIC) και βακτηριοκτόνο δράση (MBC) που ήταν 0.25 % και 0.50 % (v/v), αντίστοιχα και για τις δύο μελετώμενες θερμοκρασίες (7.9 και 37 oC), με μικρές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυττάρων που μελετήθηκαν. Η τιμή MIC για το δεύτερο αποτελεσματικότερο καπνό G6, ήταν 0.25 % (v/v) στους 7.9 oC, ενώ σε όλες τις υπόλοιπες περιπτώσεις ήταν > 2.00 % (v/v), όπως και για τα υπόλοιπα συμπυκνώματα υγρών καπνών, έναντι των κανονικών, ωσμωτικά προσαρμοσμένων και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes. Κατόπιν, έγινε έλεγχος της θερμοανθεκτικότητας κανονικών και ωσμωτικά προσαρμοσμένων (10.00 % w/v, NaCl για 12 ώρες) κυττάρων του L. monocytogenes, τα οποία υποβλήθηκαν σε θερμική καταπόνηση στους 60 oC, με ενοφθαλμισμό σε προ θερμασμένο θρεπτικό ζωμό TSBy.e. (60 oC) που περιείχε 0.50 %, 5.00 % και 10.00 % (w/v) NaCl. Ο χρόνος δεκαδικής μείωσης (D60oC) των κανονικών κυττάρων μειώνονταν καθώς αυξάνονταν η αλατότητα του μέσου θέρμανσης. Από την άλλη, τα ωσμωτικά προσαρμοσμένα κύτταρα παρουσίασαν αξιοσημείωτη θερμοαντοχή στους 60 oC, με τιμές D60oC 10.08 ± 1.41, 14.27 ± 1.66 και 8.28 ± 1.89 λεπτά σε μέσο θέρμανσης με 0.50 %, 5.00 % και 10.00 % (w/v) NaCl. Επιπλέον, έγινε έλεγχος της θερμοανθεκτικότητας των κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes, που αναπτύχθηκαν σε μεταλλικές πλάκες από ανοξείδωτο χάλυβα. Τα κύτταρα βιοϋμενίων καθώς και τα πλαγκτονικά κύτταρα του L. monocytogenes λήφθηκαν και υποβλήθηκαν σε θέρμανση στους 60 oC σε TSBy.e. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι ο χρόνος δεκαδικής μείωσης (D60oC) των κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes ήταν 6.29 λεπτά, ενώ για τα πλαγκτονικά κύτταρα ελέγχου ήταν 4.19 λεπτά. Συνεπώς, τα κύτταρα που προήλθαν από βιοϋμένια ήταν πιο θερμοανθεκτικά. Ταυτόχρονα, γίνονταν διερεύνηση των τραυματισμένων κυττάρων του L. monocytogenes μετά τις υποβαλλόμενες καταπονήσεις σε επιλεκτικά υλικά (PALCAM άγαρ και TSAy.e. + NaCl 5.00 %), όπου παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα υποθανάτιου τραυματισμού. Ο αριθμός των ωσμωτικά προσαρμοσμένων κυττάρων του L. monocytogenes ήταν υψηλότερος από τον αντίστοιχο των κανονικών κυττάρων ελέγχου που απαριθμήθηκαν στα επιλεκτικά υλικά σε όλες τις περιπτώσεις και η διαφορά αυξάνονταν καθώς αυξάνονταν και ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων στη θερμική καταπόνηση (60 oC). Τα κύτταρα βιοϋμενίων του L. monocytogenes, που απαριθμήθηκαν σε PALCAM άγαρ και TSAy.e. + NaCl 5.00 %, έφτασαν κάτω από το όριο ανίχνευσης (< 2.00 log CFU/mL) μετά από 1 και 6 λεπτά θερμικής καταπόνησης, αντίστοιχα. Τα κύτταρα βιοϋμενίων μετά από τη θερμική καταπόνηση, παρουσίασαν τη μεγαλύτερη ευαισθησία κατά την απαρίθμηση τους στο PALCAM άγαρ. Συμπυκνώματα υγρών καπνών (L9 και G6), ενσωματώθηκαν στα τρυβλία με TSAy.e σε κατάλληλες συγκεντρώσεις (0.25 % έως 1.00 %, v/v) με στόχο τη διερεύνηση της ευαισθησίας του L. monocytogenes στους υγρούς καπνούς μετά από καταπονήσεις όπως: α) το θερμικό σοκ σε πλαγκτονικά κύτταρα και κύτταρα βιοϋμενίων και β) διαδοχικές καταπονήσεις ωσμωτικού σοκ (10.00 %, w/v NaCl), και θερμικής καταπόνησης (60 oC). Ο υγρός καπνός L9, σε συγκεντρώσεις ≥ 0.50 % (v/v) προκάλεσε μείωση (κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης) του πληθυσμού των κανονικών και ωσμωτικά προσαρμοσμένα κυττάρων του παθογόνου πριν ή και μετά από τη θερμική επεξεργασία, χωρίς να παρουσιάσουν διαφορετική ανθεκτικότητα στην αντιμικροβιακή του δράση. Τα κύτταρα βιοϋμενίων, τα οποία είχαν υποστεί θερμική καταπόνηση στους 60 oC, ήταν πιο ανθεκτικά από τα πλαγκτονικά και μειώθηκαν μόλις 0.09 και 0.51 log CFU/mL παρουσία 0.25 % και 0.50 % (v/v) L9, αντίστοιχα. Η αποτελεσματικότητα του υγρού καπνού G6 ήταν πολύ μικρότερη συγκριτικά με τον L9. Συνεπώς, το διαφορετικό ιστορικό ανάπτυξης των κυττάρων του παθογόνου (ωσμωτικά προσαρμοσμένα, κύτταρα βιοϋμενίων και πλαγκτονικά κύτταρα) συντέλεσε στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στην επίδραση του υγρού καπνού, καθώς τα θερμικώς τραυματισμένα κύτταρα βιοϋμενίων ήταν ανθεκτικότερα. Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών φιλέτων καπνιστής πέστροφας από 2 περιοχές (Α και Β) σε συσκευασία κενού και συντηρούμενων στους 2.0 και 7.9 oC. Από τα αποτελέσματα της οργανοληπτικής εξέτασης των φιλέτων, προέκυψε ότι στη μη ορθή θερμοκρασία (7.9 oC) συντήρησης, τα φιλέτα απορρίφθηκαν μετά την 70η και 63η ημέρα (από την περιοχή Α και Β, αντίστοιχα), ενώ στους 2.0 οC η ΟΜΧ των φιλέτων ακόμη και μετά από 150 ημέρες και για τις δύο περιοχές δεν ξεπέρασε τους 7.00 log CFU/g αλλά η ημέρα αλλοίωσης, ορίστηκε στις 135 ημέρες. Η κυρίαρχη ομάδα μικροοργανισμών που επικράτησαν (με βάση τις καλλιεργητικές τεχνικές) και στις 2 θερμοκρασίες και περιοχές, ήταν τα οξυγαλακτικά βακτήρια που απαριθμήθηκαν σε MRS με διαφορετικές τιμές pH (5.4, 6.4 και 7.4). Οι αποικίες που απομονώθηκαν, ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση πρωτεωμικής ανάλυσης με MALDI-TOF MS. Από την ταυτοποίηση των αποικιών που απομονώθηκαν από το MRS με τις 3 τιμές pH (5.4, 6.4 και 7.4), προέκυψαν 3 διαφορετικά γένη μικροοργανισμών Συγκεκριμένα, 71 αποικίες ανήκαν στα Enterococcus spp., 383 στα Candida spp. και 113 στα Lactobacillus spp. εκ των οποίων κάποιες ήταν κοινές στα δείγματα των φιλέτων από τις διαφορετικές περιοχές. Στα φιλέτα από την περιοχή Α, εντοπίστηκαν οι μικροοργανισμοί C. zeylanoides και L. sakei. Μεγαλύτερη ποικιλομορφία εμφανίστηκε στα φιλέτα από την περιοχή Β, όπου εντοπίστηκαν οι μικροοργανισμοί, E. faecalis, C. zeylanoides, C. famata, C. guilliermondii, L. sakei και L. curvatus.Κατόπιν έγινε διερεύνηση της ανταγωνιστικής συμπεριφοράς που μπορεί να παρουσιάζεται μεταξύ των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών που απομονώθηκαν και του παθογόνου βακτηρίου L. monocytogenes. Μελετήθηκε ο ανταγωνισμός τους, έναντι πλαγκτονικών και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes, σε πραγματικά φιλέτα καθώς και σε μοντέλα ζωμού καπνιστής πέστροφας (μόνο- και πολυκαλλιέργειες) στους 4.0 και 7.9 oC. Στα φιλέτα, τα οξυγαλακτικά βακτήρια επικράτησαν και δε φάνηκε να επηρεάζεται η ανάπτυξη τους από την παρουσία των πλαγκτονικών κυττάρων του L. monocytogenes και έφτασαν τους 7.57 και 7.54 log CFU/g, έπειτα από 60 ημέρες στους 4.0 και 7.9 oC, αντίστοιχα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην ανάπτυξη των πλαγκτονικών και κυττάρων βιοϋμενίων του L. monocytogenes στα φιλέτα, αποθηκευμένα στους 4.0 και 7.9 oC.Σε όλες τις περιπτώσεις συγκαλλιέργειας του L. monocytogenes (πλαγκτονικά και κύτταρα βιοϋμενίων, 4.0 και 7.9 oC) με το μίγμα των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων βακτηρίων, σε μοντέλα ζωμού καπνιστής πέστροφας η ανάπτυξη του παθογόνου περιορίστηκε. Η συγκαλλιέργεια των πλαγκτονικών κυττάρων του παθογόνου με τον κάθε αλλοιωγόνο μικροοργανισμό ξεχωριστά, στους 4.0 oC φάνηκε να είναι συμβιωτική ενώ στους 7.9 oC, η ανάπτυξη των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων μικροοργανισμών περιορίστηκε από την παρουσία του L. monocytogenes. Το αντίθετο φαινόμενο παρατηρήθηκε για τα κύτταρα βιοϋμενίων του L. monocytogenes, με εξαίρεση στους 7.9 oC, όπου η ανάπτυξη του L. monocytogenes περιορίστηκε από τα C. famata και C. zeylanoides.Τέλος, αξιολογήθηκε ο συνδυασμός δύο συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 και G6) και της υπερκατάψυξης στους –80 oC με σκοπό τη μείωση της έντασης της εφαρμοζόμενης υδροστατικής πίεσης (ΥΥΠ) που απαιτείται για την εξάλειψη του παθογόνου L. monocytogenes σε φιλέτα νωπής και καπνιστής πέστροφας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στα 200 MPa για 15 λεπτά, ενώ τα δείγματα εμβολιάστηκαν με τρία διαφορετικά στελέχη του L. monocytogenes (LO28, EGD-e και 10403S). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το στέλεχος 10403S του L. monocytogenes ήταν το πιο ανθεκτικό κατά την εφαρμογή της υψηλής υδροστατικής πίεσης (200 MPa, 15 λεπτά) και το G6 ήταν το πιο αποτελεσματικό εκχύλισμα καπνού. Στη συνέχεια, η υπερκατάψυξη των προϊόντων στους –80 oC πριν από την ΥΥΠ, φάνηκε να δρα συνεργιστικά οδηγώντας σε μείωση 2.90 και 3.23 log CFU/mL του πληθυσμού του παθογόνου, σε θρεπτικό ζωμό BHI χωρίς NaCl, παρουσία του G6 και L9, αντίστοιχα. Η εφαρμογή της ΥΥΠ, στα δείγματα καπνιστής πέστροφας με ή χωρίς συμπυκνώματα υγρού καπνού, πριν την κατάψυξη οδήγησε σε μικρή μείωση πληθυσμού (< 0.30 log CFU/g), όπως και στα δείγματα νωπής πέστροφας. Ωστόσο, παρατηρήθηκε σημαντική συνεργιστική δράση της ΥΥΠ, των συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 ή G6) και της κατάψυξης στους –80 oC, όταν εφαρμόστηκαν στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, με αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού του L. monocytogenes κατά 5.48 log CFU/g. Τέλος, παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα τραυματισμένων κυττάρων του L. monocytogenes (10403S), από την εφαρμογή των διαφορετικών εμποδίων. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, προέκυψε πως τα κύτταρα του L. monocytogenes που υπέστησαν ωσμωτικό σοκ παρουσίασαν αυξημένη αντοχή στη θερμική επεξεργασία, όπως και τα κύτταρα βιοϋμενίων, συγκριτικά με τα πλαγκτονικά. Ωστόσο, στο επακόλουθο εμπόδιο των υγρών καπνών μόνο τα κύτταρα βιοϋμενίων του παθογόνου παρουσίασαν ανθεκτικότητα (μετά από θερμική επεξεργασία), έναντι του αποτελεσματικότερου καπνού (L9). Παρουσία των πιθανών ειδικών αλλοιωγόνων βακτηρίων που απομονώθηκαν από τα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, τα κύτταρα του L. monocytogenes (πλαγκτονικά ή βιοϋμενίων) σε άλλες περιπτώσεις επικράτησαν και σε άλλες όχι ή αναπτύσσονταν συμβιωτικά, δείχνοντας πόσο σημαντική είναι η διερεύνηση της συμπεριφοράς της φυσικής παρουσίας του μικροβιώματος. Τελικά, παρατηρήθηκε σημαντική συνεργιστική δράση της ΥΥΠ, των συμπυκνωμάτων υγρού καπνού (L9 ή G6) και της κατάψυξης στους –80 oC, όταν εφαρμόστηκαν στα φιλέτα καπνιστής πέστροφας, με αποτέλεσμα τη μείωση του πιο ανθεκτικού στελέχους του L. monocytogenes.