Προσδιορισμός της κατανομής βιοδραστικών μικροσυστατικών τροφίμων σε βιολογικά δείγματα
Authors: Βασιλακοπούλου Παρασκευή 
Published: November 2023

Τις τελευταίες δεκαετίες οι πολικές φαινολικές ενώσεις έχουν αναδειχθεί ως φυτοχημικά που εκδηλώνουν πλειοτροπικές ωφέλιμες δράσεις για την ανθρώπινη υγεία. Επιπλέον, διατροφικές συνήθειες που βασίζονται στην υψηλή κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε πολικές φαινόλες, όπως η Μεσογειακή Διατροφή, έχουν συσχετισθεί με μείωση του επιπολασμού χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται με τη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες, όπως οι καρδιαγγειακές παθήσεις, οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες κ.ά. Η εκδήλωση τοπικών δράσεων των πολικών φαινολών αλλά και η διερεύνηση της απορρόφησης, της κατανομής, του μεταβολισμού και της απέκκρισής τους αποτελούν ένα σύγχρονο πεδίο ερευνητικού ενδιαφέροντος προκειμένου να κατανοηθεί βαθύτερα η επίδραση τους στην ανθρώπινη υγεία.Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της κατανομής, στο αίμα αλλά και ιστοειδικά, βιοδραστικών μικροσυστατικών (πολικών φαινολών) μεσογειακού τροφίμου που χορηγήθηκε σε ζωικά πρότυπα (επίμυες) δια του στόματος συμπληρωματικά με τη διατροφή. Ως τρόφιμο για τη μελέτη επιλέχθηκε η Κορινθιακή σταφίδα, ένα ξηρό φρούτο με πλούσια ιστορία αλλά και σημαντικό οικονομικό ενδιαφέρον για την Ελλάδα, για την οποία συγχρόνως απουσιάζουν από τη βιβλιογραφία δεδομένα για την κατανομή των πολικών φαινολών της ιστοειδικά. Έλαβε χώρα ανάπτυξη και επικύρωση κατάλληλων βιοαναλυτικών μεθόδων με εφαρμογή της τεχνικής της υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μαζών τροχιακής παγίδευσης ιόντων (Orbitrap-MS) και ειδικότερα, αναπτύχθηκαν κατάλληλες μεθοδολογίες για τον προσδιορισμό πολικών φαινολών στο αίμα, στο ήπαρ, στους νεφρούς, στα επινεφρίδια, στην καρδιά και στον εγκέφαλο επίμυων. Η μέθοδος υγρής χρωματογραφίας συζευγμένη με φασματομετρία μαζών (Orbitrap-MS) εφαρμόστηκε, κατόπιν βελτιστοποίησης, για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό >40 πολικών φαινολικών ενώσεων. Στη συνέχεια, βελτιστοποιήθηκαν οι διαδικασίες προκατεργασίας των βιολογικών δειγμάτων. Αναφορικά με το αίμα εφαρμόστηκαν συγκριτικά δέκα τρόποι προκατεργασίας δειγμάτων πλάσματος αλλά και ορού. Αξιολογήθηκαν η πρωτεϊνική καθίζηση, η εκχύλιση υγρού-υγρού και η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE). Για τους ιστούς εφαρμόστηκε συγκριτική μελέτη νωπών και λυοφιλιωμένων δειγμάτων και διερεύνηση της επίδρασης του πληρωτικού υλικού των φυσιγγίων SPE. Επιπλέον, στο αίμα και σε κάποιους εκ των ιστών αξιολογήθηκε η εφαρμογή ενζυμικής υδρόλυσης (Helix pomatia, δραστικότητα γλυκουρονιδάσης και σουλφατάσης). Εφαρμόζοντας τις βέλτιστες συνθήκες ανάλυσης και προκατεργασίας βιολογικών δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε επικύρωση της μεθόδου για κάθε περίπτωση ιστού, βάσει των οδηγιών του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων (ΕΜΑ). Τα δείγματα επίμυων που αξιολογήθηκαν προέρχονταν από δύο διαφορετικά πρωτόκολλα διατροφικής παρέμβασης με Κορινθιακή σταφίδα. Η πρώτη παρέμβαση αφορούσε σε επίμυες που έλαβαν 3% w/w Κορινθιακή σταφίδα επί της διατροφής τους για διάστημα 38 ημερών και η δεύτερη σε επίμυες που έλαβαν 10% w/w Κορινθιακή σταφίδα επί της διατροφής τους για διάστημα 28 ημερών. Οι πλέον κατάλληλες συνθήκες για την ανάκτηση των πολικών φαινολών από το αίμα (πλάσμα και ορός) περιελάμβαναν την χρήση οξικού αιθυλεστέρα ως εκχυλιστικό μέσο. Η ανάκτηση της πλειονότητας των πολικών φαινολών από τους ιστούς βρέθηκε να είναι περισσότερο ικανοποιητική όταν χρησιμοποιήθηκαν φυσίγγια με πληρωτικό υλικό Oasis® HLB. Για την περίπτωση της ανάλυσης του εγκεφάλου σχετικά καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν με χρήση νωπού ιστού ενώ σε όλες τις άλλες περιπτώσεις ιστών επιλέχθησαν λυοφιλιωμένα δείγματα ως καταλληλότερα. Εντούτοις, η επίδραση της λυοφιλίωσης δεν αναδείχθηκε ως εξαιρετικά κρίσιμος παράγοντας για την ανάκτηση των πολικών φαινολών. Η ενζυμική υδρόλυση που εφαρμόστηκε στο αίμα καθώς και σε ιστούς (ήπαρ, νεφροί, καρδιά) επιβεβαίωσε τον εκτενή μεταβολισμό των πολικών φαινολικών ενώσεων στους ζωικούς οργανισμούς, αποδίδοντας σε αρκετές περιπτώσεις υψηλότερο περιεχόμενο φαινολών. Η πρόσληψη Κορινθιακής σταφίδας οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα ορισμένων πολικών φαινολών του τροφίμου στο αίμα και τους ιστούς των επίμυων. Μετά από διατροφική παρέμβαση με 3% w/w Κορινθιακή σταφίδα η ισοραμνετίνη ανιχνεύθηκε σε υψηλότερα επίπεδα στην καρδιά (22,97 ± 4,66 ng/g ιστού), ακολουθούμενη από το ήπαρ (20,45 ± 2,5 ng/g ιστού) και τους νεφρούς (17,49 ± 2,94 ng/g ιστού) και μετά το πλάσμα (3,36 ± 1,22 ng/mL). Η καμπφερόλη και η κερκετίνη βρέθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στους νεφρούς (16,92 ± 2,66 και 94,88 ± 11,77 ng/g ιστού, αντίστοιχα), έπειτα στο ήπαρ (8,7 ± 1,18 και 17,12 ± 1,14 ng/g ιστού, αντίστοιχα), στην καρδιά (6,59 ± 1,09 και 6,78 ± 0,87 ng/g ιστού, αντίστοιχα) και στο πλάσμα (24,32 ± 4,49 και 2,76 ± 0,56 ng/g πλάσματος, αντίστοιχα). Η χρυσίνη βρέθηκε σε υψηλότερη συγκέντρωση στο ήπαρ (2,73 ± 0,21 ng/g ιστού), ακολουθούμενη από τους νεφρούς (2,14 ± 0,32 ng/g ιστού) και την καρδιά (1,1 ± 0,23 ng/g ιστού), ενώ στο πλάσμα δεν ανιχνεύθηκε. Παρεμφερής εικόνα διαπιστώθηκε μετά από παρέμβαση με 10% w/w Κορινθιακή σταφίδα. Στον εγκεφαλικό ιστό, ο μετωπιαίος φλοιός φάνηκε να κυριαρχεί σε επίπεδα συσσώρευσης πολικών φαινολών, ακολουθούμενος από τον μεσεγκέφαλο, τον ιππόκαμπο, το ραβδωτό και τέλος την παρεγκεφαλίδα. Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη μελέτη που δείχνει την ιστοειδική κατανομή των πολικών ΦΕ μετά από κατανάλωση ενός τροφίμου ως έχει, και όχι κάποιου συμπληρώματος διατροφής ή/και εμπλουτισμένου εκχυλίσματος. Αποτελεί επίσης την πρώτη μελέτη που δείχνει ότι πολικές φαινόλες εντοπίζονται στον εγκέφαλο μετά από κατανάλωση ενός τροφίμου ως έχει. Το αποτέλεσμα αυτό αποκτά ακόμα μεγαλύτερη σημασία όταν κάτι τέτοιο δείχνεται για ένα παραδοσιακό Ελληνικό τρόφιμο όπως η Κορινθιακή σταφίδα. Η δυνατότητα των πολικών φαινολικών ενώσεων να διαπεράσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και να εισέλθουν στις διάφορες περιοχές του εγκεφάλου αποτελεί το εφαλτήριο για το πως τροφές πλούσιες σε βιοδραστικά μικροσυστατικά, όπως η Κορινθιακή σταφίδα, μπορούν να συμβάλλουν στην πρόληψη νευροεκφυλιστικών ασθενειών και της γνωστικής έκπτωσης/άνοιας. Η ικανότητα των πολικών φαινολικών ενώσεων να κατανέμονται στους διάφορους ιστούς μετά από μακροχρόνια συστηματική κατανάλωση τροφίμου πλούσιου σε αυτές, αναδεικνύει τη σημασία της κατανάλωσης τέτοιων τροφών για την προαγωγή της υγείας.