Σύνθεση και αναλυτικές εφαρμογές προϊόντων σύζευξης της φωτοπρωτεΐνης ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδια
Authors: Γλυνού Κυριακή 
Published: January 2014

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής παρασκευάστηκαν ενώσεις σύζευξης βιομορίων που συνδυάζουν την ιδιότητα συμπληρωματικότητας των ολιγονουκλεοτιδίων με την εξαιρετική ευαισθησία της φωτοπρωτεΐνης ακουορίνης ως ιχνηθέτη. Σημαντικό σημείο στις μεθόδους σύζευξης που αναπτύχθηκαν είναι η χρήση ανασυνδυασμένης ακουορίνης που φέρει ομάδα έξι ιστιδινών στο αμινο-τελικό άκρο της. Η παρασκευή των προϊόντων σύζευξης πραγματοποιήθηκε τόσο με τη χρήση ομοδιλειτουργικών όσο και με τη χρήση ετεροδιλειτουργικών αντιδραστηρίων. Σύμφωνα με την πρώτη μέθοδο, αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο αντιδρά με ομοδιλειτουργικό αντιδραστήριο που έχει δύο λειτουργικές ομάδες εστέρων του Ν-υδροξυ ηλεκτριμιδίου και στη συνέχεια το ενεργοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο αντιδρά με την (His)6-ακουορίνη. Σύμφωνα με τη δεύτερη μέθοδο, προστατευμένες σουλφυδρυλομάδες εισάγονται στην (His)6-ακουορίνη και στη συνέχεια, η ενεργοποιημένη (His)6-ακουορίνη αντιδρά με ετεροδιλειτουργικό αντιδραστήριο που περιέχει μία ομάδα εστέρα του Ν-υδροξυ-ηλεκτριμιδίου (η οποία αντιδρά με το αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο) και μία ομάδα μηλεϊναμιδίου. Η ισχυρή αλλά αντιστρεπτή δέσμευση της (His)6-ακουορίνης στη Ni2+-ΝΤΑ αγαρόζη χρησιμοποιήθηκε για την ταχεία και αποτελεσματική απομάκρυνση της περίσσειας του ελεύθερου ολιγονουκλεοτιδίου από το προϊόν της αντίδρασης σύζευξης. Η πλήρης απομάκρυνση του ελεύθερου ολιγονουκλεοτιδίου είναι απαραίτητη λόγω συναγωνιστικής δράσης του με το προϊόν σύζευξης για τη συμπληρωματική αλληλουχία στη δοκιμασία υβριδισμού. Οι ενώσεις σύζευξης ακουορίνης-ολιγονουκλεοτιδίου που απομονώθηκαν σε ένα στάδιο με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου ήταν εξίσου λειτουργικές με τις ενώσεις οι οποίες υποβλήθηκαν σε ένα επιπλέον στάδιο καθαρισμού με HPLC σε ανιονανταλλακτική στήλη. Οι ενώσεις σύζευξης χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη σύντομων δοκιμασιών υβριδισμού με βιοφωταυγή ανίχνευση. Η περιοχή γραμμικότητας μεταξύ εκπεμπόμενης ακτινοβολίας και συγκέντρωσης του αναλύτη είναι ευρεία και εκτείνεται από 2 έως 2.000 pM (τρεις τάξεις συγκέντρωσης). Η ακρίβεια της δοκιμασίας υβριδισμού (%CV) κυμαίνεται μεταξύ 2 και 9%. Η ποσότητα του αντιδραστηρίου σύζευξης που παρασκευάζεται από 10 nmol (His)6-ακουορίνης επαρκεί για περίπου 5.000 δοκιμασίες υβριδισμού. Ο μέθοδοι σύνθεσης και απομόνωσης προϊόντων σύζευξης ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδια που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή μπορούν να εφαρμοστούν και σε άλλες πρωτεΐνες που φέρουν ιστιδίνες και κωδικοποιούνται από κατάλληλα εμπορικά διαθέσιμα πλασμίδια. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε για τη σύνθεση και απομόνωση προϊόντων σύζευξης εφαρμόστηκε για τη σύζευξη της (His)6-ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο (dA)30 και την παρασκευή αντιδραστηρίου ανίχνευσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιαδήποτε δοκιμασία υβριδισμού ανεξαρτήτως της αλληλουχίας του αναλύτη. Το προϊόν σύζευξης (His)6-ακουορίνης-(dA)30 χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ευαίσθητης δοκιμασίας υβριδισμού για τον προσδιορισμό γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (GMO). Ανιχνεύθηκαν οι αλληλουχίες του τερματισμού της συνθετάσης της νοπαλίνης (nopaline synthase terminator) και του προαγωγέα της 35S υπομονάδας του ιού μωσαϊκού του κουνουπιδιού σε γενετικά τροποποιημένη σόγια. Επίσης, ανιχνεύθηκε το ενδογενές γονίδιο της λεκτίνης, που είναι ειδικό για τη σόγια, για τον έλεγχο της ποιότητας του απομονωμένου DNA. Σύμφωνα με την αναπτυχθείσα δοκιμασία υβριδισμού, βιοτινιλιωμένα (μέσω PCR) προϊόντα πολλαπλασιασμού κάθε αλληλουχίας ακινητοποιούνται σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη. Στη συνέχεια, ο μη βιοτινιλιωμένος κλώνος απομακρύνεται με κατεργασία με NaOH. Ο ακινητοποιημένος κλώνος υβριδοποιείται με ολιγονουκλεοτίδιο που αποτελείται από ένα τμήμα συμπληρωματικό προς αλληλουχία του αναλύτη και ουρά δεοξυνουκλεοτιδίων θυμίνης (dT) στο 3’ άκρο του. Ο προσδιορισμός και των τριών προϊόντων γίνεται με προσθήκη του αντιδραστηρίου (dA)30-ακουορίνης και μέτρηση της ακτινοβολίας της δεσμευμένης ακουορίνης μετά την προσθήκη Ca2+. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου που αναπτύχθηκε είναι 2 pM (100 amol/φρεάτιο) και για τις τρεις αλληλουχίες, με λόγο σήματος προς σήμα υποβάθρου περίπου 2. Η περιοχή γραμμικότητας εκτείνεται έως 2.000 pM. Με εφαρμογή της μεθόδου σε πρότυπα δείγματα γενετικά τροποποιημένης σόγιας ανιχνεύθηκαν GMOs περιεκτικότητας 0,05% με λόγο σήματος προς σήμα υποβάθρου 8,2. Η ακρίβεια της μεθόδου συμπεριλαμβανομένων της απομόνωσης του DNA, της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης και της δοκιμασίας υβριδισμού κυμαίνεται από 7,5 έως 19,8%. Επίσης, η μέθοδος που αναπτύχθηκε παρέχει δυνατότητα αυτοματοποίησης. Η χρήση του προϊόντος σύζευξης (dA)30-ακουορίνης καθιστά τη δοκιμασία υβριδισμού γενική για οποιαδήποτε αλληλουχία DNA αρκεί το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής να φέρει ουρά δεοξυνουκλεοτιδίων θυμίνης (dT).