Genomic and transcriptomic analysis of the olive fly reproductive system, aiming at novel control methods
Authors: Γρηγορίου Μαρία-Ελένη 
Published: September 2021

Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, είναι ο σημαντικότερος εχθρός των ελαιοκαλλιεργειών προκαλώντας την ποσοτική και ποιοτική υποβάθμιση της παραγωγής. Τα συζευγμένα θηλυκά έντομα, ωαποθέτουν στους καρπούς, εντός των οποίων εκκολάπτονται οι προνύμφες και αναπτύσσονται τρεφόμενες από το εσωτερικό του. Η σύζευξη επομένως, στα περισσότερα έντομα, είναι απαραίτητη πρoϋπόθεση για την αναπαραγωγή και κατ’ επέκταση για τη διατήρηση του πληθυσμού τους. Σήμερα, η καταπολέμησή του εντόμου γίνεται κυρίως με τη χρήση εντομοκτόνων. Η αλόγιστη χρήση όμως των εντομοκτόνων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη φαινομένων ανθεκτικότητας των εντόμων αλλά και σε περιβαλλοντικές συνέπειες καθιστώντας απαραίτητη την ανάγκη για την εύρεση αποτελεσματικότερων και φιλικότερων προς το περιβάλλον μεθόδων ελέγχου. Το αναπαραγωγικό σύστημα του εντόμου θα μπορούσε να είναι ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για την ανάπτυξη τέτοιων μεθόδων. Εμποδίζοντας είτε τη διαδικασία της σύζευξης είτε μειώνοντας την αναπαραγωγική ικανότητα των εντόμων, αναπόφευκτα θα υπάρξει και ελάττωση του πληθυσμού. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, ελάχιστες είναι οι πληροφορίες για το αναπαραγωγικό σύστημα του δάκου της ελιάς σε γονιδιωματικό και μεταγραφικό επίπεδο.Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, πραγματοποιήθηκε ανάλυση του αναπαραγωγικού συστήματος με έμφαση στην ταυτοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στη μετα-συζευκτική δραστηριότητα του εντόμου. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μεταγραφομική ανάλυση των ακόλουθων ιστών: 1. όρχεις και βοηθητικοί αδένες μαζί με εκσπερματική βαλβίδα από παρθένα (7 ημερών) και συζευγμένα αρσενικά έντομα αντίστοιχα και 2. αναπαραγωγικό σύστημα των θηλυκών (εκτός από ωοθήκες) από παρθένα και συζευγμένα θηλυκά έντομα αντίστοιχα. Η σύγκριση του μεταφραφώματος των ιστών μεταξύ παρθένων και συζευγμένων εντόμων ανέδειξε γονίδια που παρουσίασαν διαφορική έκφραση μετά τη σύζευξη. Για ότι αφορά τον ιστό των όρχεων εντοπίστηκαν 107 γονίδια να υπερ-εκφράζονται και 345 να υπο-εκφράζονται στα συζευγμένα έντομα. Αντίστοιχα, στους ιστούς των βοηθητικών αδένων με εκσπερματική βαλβίδα εντοπίστηκαν 1,608 γονίδια να υπερεκφράζονται και 383 να υποεκφράζονται, ενώ στο θηλυκό αναπαραγωγικό σύστημα 1,705 γονίδια να υπερεκφράζονται και 120 γονίδια να υποεκφράζονται στα συζευγμένα έντομα.Τα 100 πρώτα υπερεκφραζόμενα γονίδια από κάθε σύγκριση επισημειώθηκαν στο πρόσφατα αλληλουχημένο γονιδίωμα του δάκου της ελιάς και πραγματοποιήθηκε κατηγοριοποίηση τους με βάση τους όρους γονιδιακής οντολογίας (Go annotation). Από τη διαδικασία αυτή εντοπίστηκε μια αύξηση των βιολογικών διαδικασιών που συμμετέχουν σε μεταβολικά, κυτταρικά και καταλυτικά μονοπάτια. Η πλειοψηφία των γονιδίων κωδικοποιεί πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην ανοσοαπόκριση, αναστολείς πρωτεασών, εκκριτικές πρωτεΐνες και μουκίνες. Στη συνέχεια επαληθεύτηκαν τα αποτελέσματα της μεταγραφομικής ανάλυσης μέσω πραγματοποίησης ποσοτικής qRT-PCR σε ομάδα γονιδίων από κάθε ιστό. Για τον ιστό των όρχεων αναλύθηκαν 9 γονίδια από τα οποία επαληθεύτηκε η υπερέκφραση των c58283, c37552, hemolectin, mucin και cation transporter και η υποέκφραση του scribbler. Δεν επαληθεύτηκε η έκφραση για τα c15699, c52071 ενώ το c42528 έδωσε πολύ χαμηλή έκφραση. Για τον ιστό των βοηθητικών αδένων με εκσπερματική βαλβίδα επαληθεύτηκε η υπερέκφραση και των 6 γονιδίων που επιλέχθηκαν (timeless, c52416, c57257, c52655, yellow-g και c53574). Επιπλέον καθορίστηκε το προφίλ έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων από την πρώτη μέρα έκδυσης των ενήλικων εντόμων μέχρι και την έβδομη μέρα ζωής τους (σεξουαλικώς ώριμα έντομα). Αν ένα γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που συμμετέχει στην αναπαραγωγή θα πρέπει να εκφράζεται κατά τη σεξουαλική ωρίμανση του εντόμου ώστε αυτή να είναι διαθέσιμη κατά τη διάρκεια της σύζευξης. Σε συμφωνία με την παραπάνω υπόθεση, τα περισσότερα γονίδια παρουσίασαν μέγιστη έκφραση πριν από την ημέρα που πραγματοποιήθηκε η συλλογή ιστών για τη μεταγραφομική ανάλυση. Για το θηλυκό αναπαραγωγικό σύστημα αναλυθήκαν 6 γονιδιακοί τόποι. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR επιβεβαίωσαν την υπερέκφραση των lingerer, bestrophin-2, ornithine decarboxylase genes ενώ δεν επιβεβαίωσαν την υπερέκφραση των γονιδίων troponin C και glutathione S-transferase epsilon class. Η yolk protein-2 είχε ελάχιστη έκφραση. Για τα επιλεγμένα αυτά γονίδια καθορίστηκαν επιπλέον τα επίπεδα έκφρασής τους μέσω ποσοτικής qRT-PCR σε αναπαραγωγικούς ιστούς παρθένων θηλυκών εντόμων ηλικίας 7 ημερών και σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά τη σύζευξη (0, 3, 6, 9, 12, 24 h). Τα προφίλ έκφρασής τους ωστόσο παρουσίασαν διαφοροποιήσεις. Για παράδειγμα το γονίδιο ornithine decarboxylase antizyme έδειξε αυξημένη έκφραση 24 ώρες μετά τη σύζευξη ενώ τα γονίδια bestrophin-2 και lingerer 12 ώρες μετά. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση με παροδική σίγηση των γονιδίων είτε μέσω της έγχυσης δίκλωνων μορίων RNA στην αιμολέμφο είτε μέσω της τροφής. Παράλληλα καταγράφηκε η φαινοτυπική επίδραση της σίγησης στην αναπαραγωγική δραστηριότητα των εντόμων (καταγραφή σύζευξης και ωαπόθεσης). Για τα γονίδια yellow-g (από τους αρσενικούς βοηθητικούς αδένες) και troponin C (από το κατώτερο θηλυκό αναπαραγωγικό σύστημα) η έγχυση του dsRNA στα έντομα έγινε μέσω μικροενέσεων. Η παροδική σίγηση μέσω τροφής χρησιμοποιήθηκε για την αποσιώπηση του υποδοχέα του συζευκτικού πεπτιδίου (spr) λόγω της γνωστής συμμετοχής του στην αναπαραγωγή άλλων εντόμων.Για τα γονίδια yellow-g και troponin-C καταγράφηκε 81% και 70% σίγηση αντίστοιχα. Επίσης παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού ωαπόθεσης των εντόμων υποδηλώνοντας την πιθανή συμμετοχή των συγκεκριμένων γονιδίων στην αναπαραγωγή. Το ποσοστό σίγησης του υποδοχέα του συζευκτικού πεπτιδίου (spr) μέσω τροφής καθορίστηκε στο 90% στο αναπαραγωγικό σύστημα και 40% στο κεφάλι του εντόμου. Επίσης παρατηρήθηκε μείωση της ωαπόθεσης των εντόμων σε σύγκριση με τα έντομα ελέγχου. Συνολικά, μέσω της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε η πρώτη ανάλυση του αναπαραγωγικού συστήματος του δάκου της ελιάς, ταυτοποιώντας γονίδια που θα μπορούσαν να αποτελέσουν στόχους για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων καταπολέμησης του εντόμου. Παράλληλα, καταγράφηκε και η πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή της παροδικής αποσιώπησης γονιδίων μέσω της τροφής σε ενήλικα έντομα B. oleae, δίνοντας μια καινούρια προοπτική για τη χρήση της μεθόδου ως μοριακό εργαλείο.