Biorefinery and bioprocess development for the production of bio-based succinic acid, protein isolate and bacterial nanocellulose
Authors: Ευθυμίου Μαρία-Νεφέλη 
Published: November 2022

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στην αξιοποίηση ανανεώσιμων πρώτων υλών που προέρχονται από τη βιομηχανία του βιοντίζελ και της ζαχαροπλαστικής (ηλιάλευρα (SFM), ακατέργαστη γλυκερόλη και ροές αποβλήτων της βιομηχανίας ζαχαροπλαστικής) για την παραγωγή τελικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (εκχυλίσματα πλούσια σε αντιοξειδωτικά και πρωτεΐνες, ηλεκτρικό οξύ, βακτηριακή κυτταρίνη, νανοδομές βακτηριακής κυτταρίνης και σύνθετα βιοφιλμ με βάση τις πρωτεΐνες) εφαρμόζοντας πρακτικές που διευκολύνουν τη μετάβαση στη νέα εποχή της βιο-οικονομίας.Σε αυτά τα πλαίσια, αναπτύχθηκε ένα νέο επιχειρηματικό μοντέλο βιοοικονομίας για την παραγωγή βιογενούς ηλεκτρικού οξέος και συμπροϊόντων προστιθέμενης αξίας, χρησιμοποιώντας υποπροϊόντα της βιομηχανίας βιοντίζελ. Εκχυλίσματα πλούσια σε αντιοξειδωτικά και πρωτεΐνες ελήφθησαν ως συμπροϊόντα προστιθέμενης αξίας μέσω της κλασματοποίησης του SFM. Η παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων (κυτταρινάσες, β-γλυκοσιδάση, ξυλανάσες, πρωτεάσες και φυτάσες) πραγματοποιήθηκε μέσω ζυμώσεων στερεής κατάστασης (SSF) από τον μικροοργανισμό Aspergillus awamori χρησιμοποιώντας μη επεξεργασμένο SFM. Μετά την παραλαβή των αντιοξειδωτικών και των πρωτεϊνικών κλασμάτων, το υπολειπόμενο SFM υδρολύθηκε μέσω χημικής και ενζυμικής επεξεργασίας με εφαρμογή των ακατέργαστων ενζύμων που παρήχθησαν. Η μέγιστη απόδοση μετατροπής ολικού αζώτου (Kjeldahl) προς άζωτο που περιέχεται στις ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων (free amino nitrogen-FAN) προσδιορίστηκε ίση με 0,35 g/g, ενώ οι αντίστοιχες αποδόσεις μετατροπής κυτταρίνης και ημικυτταρίνης βρέθηκαν ίσες με 0,56 g/g και 0,92 g/g. αντίστοιχα. Τα ακατέργαστα προϊόντα της υδρόλυσης του SFM χρησιμοποιήθηκαν κατά την καλλιέργεια ημισυνεχούς τροφοδοσίας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes και οδήγησαν στην παραγωγή 34 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση μετατροπής 0,6 g/g και παραγωγικότητα 0,71 g/L/h. Η αξιοποίηση ακατέργαστης γλυκερόλης εμπλουτισμένης με υδρόλυμα SFM είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 69,1 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση μετατροπής 0,39 g/g και παραγωγικότητα 1,26 g/L/h από την τροποποιημένη ζύμη Yarrowia lipolytica PSA02004. Σε αυτό το στάδιο της μελέτης το SFM που προκύπτει ως παραπροϊόν από τη διαδικασία παραγωγής βιοντίζελ χρησιμοποιήθηκε αποτελεσματικά για την εκχύλιση συμπροϊόντων (αντιοξειδωτικά και πρωτεϊνικά κλάσματα), την παραγωγή θρεπτικού μέσου ζύμωσης καθώς και την επιτόπια παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων.Για την παραγωγή της βακτηριακής κυτταρίνη (BC) ως θρεπτικό μέσω ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν ακατέργαστα προϊόντα ενζυμικής υδρόλυσης των απόβλητων της βιομηχανίας ζαχαροπλαστικής, τα οποία παρήχθησαν με χρήση ακατέργαστων ενζύμων που προέκυψαν μετά από SSF με το μυκητιακό στέλεχος A. awamori. Η υψηλότερη συγκέντρωση BC (5,7 g/L) επιτεύχθηκε από τον μικροοργανισμό Komagataeibacter sucrofermentans κατά την καλλιέργεια του υπό στατικές συνθήκες, σε αναλογία άνθρακα προς άζωτο ελεύθερων αμινομάδων 24,5 g/g και pH 5. Η BC υποβλήθηκε σε κατεργασία με H2SO4, HCl και μίγμα αυτών σε διαφορετικούς χρόνους επεξεργασίας με σκοπό την παραγωγή νανοδομών BC (BCNs) διαφορετικών ιδιοτήτων. Τα φάσματα FTIR όλων των BCN που παρήχθησαν, παρουσίασαν τυπικές ζώνες δόνησης κυτταρίνης, ενώ οι κορυφές στα 709 cm-1 και 746 cm-1 έδειξαν την παρουσία αλλόμορφων Ια και Ιβ. Η ανάλυση δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) υπέδειξε ότι τα εναιωρήματα των παραγόμενων ΒCN χαρακτηρίζονται από πολυδιασπορά, ενώ χαμηλότερες υδροδυναμικές ακτίνες (Rh) 56 nm και 385 nm παρατηρήθηκαν στην περίπτωση της υδρόλυσης με χρήση H2SO4 μετά από 48 ώρες επεξεργασίας. Ο δείκτης κρυσταλλικότητας (CrI) της BC (77,9%) ήταν χαμηλότερος από αυτόν των BCN, ενώ η υδρόλυση έως και 24 ώρες είχε σαν αποτέλεσμα CrI 90,9%, 98,4% και 98,1% κατά την εφαρμογή H2SO4, HCl και του μίγματος αυτών αντίστοιχα. Οι τιμές του ζ-δυναμικού των BCN μετά από 48 ώρες κατεργασίας έφθασαν έως -34,3 mV με χρήση H2SO4, -12,3 mV με χρήση HCl και -28,7 mV με εφαρμογή του μίγματος των δύο οξέων. Μορφολογικά, μετά από ανάλυση με χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM), οι BCN παρουσίασαν νανοκρυσταλλική δομή σε σχήμα ράβδου με έντονη τάση συσσωμάτωσης και επικάλυψης. Συμπερασματικά, η ex-situ τροποποίηση της BC μέσω όξινης υδρόλυσης οδήγησε στην αποτελεσματική παραγωγή νανοδομών με διακριτικές ιδιότητες και πιθανές εφαρμογές ως υλικά συσκευασίας.Σε επόμενο στάδιο της μελέτης, αξιολογήθηκε η παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων συσκευασιών τροφίμων με βάση τις αρχές της κυκλικής οικονομίας. Η BC παρήχθη μέσω ζύμωσης σε βιοαντιδραστήρες στατικού τύπου, χρησιμοποιώντας ροές παραπροϊόντων της βιομηχανίας βιοντίζελ με βάση τον ηλίανθο (ενζυμικά υδρολύματα από SFM και ακατέργαστη γλυκερόλη) ως πηγές άνθρακα και θρεπτικών συστατικών. Δημιουργήθηκαν καινοτόμα βιοφιλμ, χρησιμοποιώντας είτε απομονωμένες πρωτεΐνες από SFM (SFMPI) αποκλειστικά, είτε με χρήση SFMPI που ενισχύθηκαν με βιοπληρωτικά νανοκυτταρίνης εμπορικής ή βακτηριακής προέλευσης. Η ex-situ τροποποίηση της BC σε νανοδομές πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή όξινης υδρόλυσης. Τα βιοφιλμ που ενισχύθηκαν με δομές βακτηριακής νανοκυτταρίνης (SFMPI-BNC) παρουσίασαν 64,5% υψηλότερη αντοχή στον εφελκυσμό, 75,5% υψηλότερο μέτρο Young’s, 131,5% μεγαλύτερη επιμήκυνση στη θραύση, 32,5% χαμηλότερη διαλυτότητα στο νερό και 14,1% χαμηλότερη ικανότητα διαπερατότητας σε υδρατμούς συγκριτικά με τα μη ενισχυμένα βιοφιλμ (SFMPI). Τα βιοφίλμ αξιολογήθηκαν σε συσκευασία φρέσκων φρούτων (φράουλες). Λαμβάνοντας υπόψη τη μικροβιακή ανάπτυξη και το φυσικοχημικό προφίλ των συσκευασμένων φρούτων (απώλεια βάρους, χημικός χαρακτηρισμός, χρώμα, υφή και αναπνευστική δραστηριότητα), τα ενισχυμένα βιοφιλμ SFMPI-BNC παρουσίασαν ικανοποιητικά αποτελέσματα κατά την ισοθερμική συντήρηση στους 10°C. Συνεπώς τα βιοφιλμ SFMPI-BNC που παρήχθησαν θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε εφαρμογές συσκευασίας φρέσκων φρούτων.