Μελέτη της συνδυαστικής δράσης ζιζανιοκτόνων σε φωτοσυνθέτοντες οργανισμούς μη στόχους με τη χρήση βιοδεικτών και βιοσημαντών
Authors: Μουζάκη-Παξινού Ακριβή-Χαρά 
Published: August 2021

Ο κλάδος της οικοτοξικολογίας έχει αναπτυχθεί ταχύτατα τα τελευταία χρόνια καθώς τα προβλήματα στα οικοσυστήματα από την χρήση ξενοβιοτικών έχουν αυξηθεί εκθετικά. Ανάμεσα στα ξενοβιοτικά εξέχουσα θέση έχουν τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα, από τα οποία το μεγαλύτερο ποσοστό της παγκόσμιας αγοράς αποτελούν τα ζιζανιοκτόνα. Καθώς τα ζιζανιοκτόνα καταλήγουν στα υδάτινα οικοσυστήματα μπορούν να είναι ιδιαιτέρως τοξικά για τους υδρόβιους οργανισμούς, οι οποίοι εκτίθενται τελικά κυρίως σε μίγματα ζιζανιοκτόνων. Υπάρχει συνεπώς ανάγκη για μελέτη της τοξικότητας των ζιζανιοκτόνων σε υδρόβιους οργανισμούς, τόσο όσο αφορά στη δράση τόσο κάθε ενός μεμονωμένα όσο και των μιγμάτων τους.Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε στόχο την μελέτη της τοξικότητας των ζιζανιοκτόνων terbuthylazine, metribuzin (παρεμποδιστές του PSII), tritosulfuron και tribenuron methyl (παρεμποδιστές της βιοσύνθεσης αμινοξέων της ομάδας του πυροσταφυλλικού οξέος), τόσο ως μεμονωμένων όσο και των διαφόρων συνδυασμών τους, στον βιοδείκτη Lemna minor L. Για τον λόγο αυτό μετρήθηκε η ανάπτυξη, η φωτοσύνθεση (μέσω του φθορισμού της χλωροφύλλης) και τα αντιοξειδωτικά ένζυμα. Δευτερευόντως, στόχος ήταν η δημιουργία ενός φωτοσυνθετικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων που παρεμποδίζουν το PSII.Για την εκτίμηση των καμπυλών δόσης-απόκρισης για τα τέσσερα ζιζανιοκτόνα, μετά από τοξικολογικές δοκιμές 7 ημερών, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά κριτήρια αξιολόγησης της ανάπτυξης (αριθμός φυλλιδίων, μέσος ειδικός ρυθμός αύξησης αριθμού φυλλιδίων, επιφάνεια φυλλιδίων, μέσος ειδικός ρυθμός αύξησης επιφάνειας φυλλιδίων). Για τις καμπύλες αυτές υπολογίστηκαν τα EC50, NOEC και LOEC. Ενδεικτικά, τα EC50 για τον μέσο ειδικό ρυθμό αύξησης αριθμού φυλλιδίων ήταν: terbuthylazine 188,8 μg/l, metribuzin 70,33 μg/l, tritosulfuron 145 μg/l, και tribenuron methyl 7,57 μg/l. Η σειρά τοξικότητας σύμφωνα με την ανάπτυξη ήταν: tribenuron methyl > metribuzin > tritosulfuron > terbuthylazine.Για την μελέτη της συνδυασμένης τοξικότητας έγιναν τοξικολογικές δοκιμές με μίγματα των εκάστοτε δύο δραστικών ουσιών στις ακόλουθες πέντε αναλογίες: 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 και 100:0. Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με την βοήθεια του Mixtox model και για κάθε μίγμα σχεδιάστηκαν τα αντίστοιχα ισοβολογραφήματα. Το μοντέλο της προσθετικής δράσης (CA) προέβλεψε με ακρίβεια τα αποτελέσματα του μίγματος terbuthylazine και metribuzin, στο μίγμα του tritosulfuron και του tribenuron methyl βρέθηκε συνεργισμός και τα μίγματα των terbuthylazine με το tritosulfuron και του metribuzin με το tritosulfuron είχαν κυρίως ανταγωνιστική δράση. Για όλους τους συνδυασμούς η προσθετική δράση (CA) προέβλεψε την τοξικότητα των μιγμάτων καλύτερα από την ανεξάρτητη δράση (IA).Η επίδραση των ζιζανιοκτόνων του PSII στους παραμέτρους του φθορισμού της χλωροφύλλης ήταν, όπως αναμενόταν, πολύ μεγαλύτερη από αυτή των ζιζανιοκτόνων που παρεμποδίζουν την βιοσύνθεση αμινοξέων. Ήταν, συνεπώς, δυνατό να γίνει εκτίμηση της καμπύλης δόσης-απόκρισης για τα ζιζανιοκτόνα του PSII και, σύμφωνα με αυτές, η ευαισθησία των παραμέτρων του φθορισμού είχε ως εξής: λειτουργική φωτοχημική απόδοση της φωτοχημείας του PSII (ΦPSII) = ρυθμός ροής ηλεκτρονίων στη φωτοχημική αλυσίδα (ETR) > φωτοχημική απόσβεση (qP) > μέγιστη φωτοχημική απόδοση της φωτοχημείας του PSII (ΦPSIIo). Οι παράμετροι αυτές, με εξαίρεση την ΦPSIIo, ήταν πιο ευαίσθητες, όσο αφορά στην τοξικότητα των ζιζανιοκτόνων του PSII, από τις παραμέτρους της ανάπτυξης. Επιπρόσθετα, η τοξικότητα από την χρήση τους μπορούσε να διαπιστωθεί μέσα σε λίγες ώρες από την έκθεση. Όσο αφορά στα ζιζανιοκτόνα που παρεμποδίζουν την βιοσύνθεση αμινοξέων της ομάδας του πυροσταφυλλικού οξέος, η ΦPSII μαζί με την μη φωτοχημική απόσβεση-NPQ, ήταν οι πιο ευαίσθητες παράμετροι. Από τα αποτελέσματα εξήχθει το συμπέρασμα ότι η ΦPSII ήταν συνολικά η καλύτερη παράμετρος για την εκτίμηση της τοξικότητας των υπό μελέτη ζιζανιοκτόνων. Για την παράμετρο αυτή η συνδυασμένη τοξικότητα είχε προσθετική δράση σε όλα τα μελετημένα μίγματα.Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα, συγκεκριμένα η υπεροξειδάση (POX), η καταλάση (CAT), η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GR) και οι S-μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) (με τρία διαφορετικά υποστρώματα) μετρήθηκαν μετά από έκθεση για 48 ώρες στα terbuthylazine, tritosulfuron και στα μίγματά τους. Η δραστικότητα των POX, GR και GST’s αυξήθηκε σημαντικά στις υψηλότερες συγκεντρώσεις των terbuthylazine και tritosulfuron, επιβεβαιώνοντας την ύπαρξη οξειδωτικής καταπόνησης. Από την άλλη μεριά η CAT μειώθηκε στα φυτά που εκτέθηκαν στο terbuthylazine και δεν είχε διαφορά από τον μάρτυρα στα φυτά που εκτέθηκαν στο tritosulfuron. Επιπρόσθετα, η συνδυασμένη τοξικότητα είχε κυρίως προσθετική δράση στα αντιοξειδωτικά ένζυμα.Τέλος, για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων του PSII κατασκευάστηκε βιοαισθητήρας με ακινητοποίηση θυλακοειδών της L.minor. Αυτός είναι ο πρώτος φωτοσυνθετικός αισθητήρας με θυλακοειδή από L.minor. Το φωτοσυνθετικό υλικό απομονώθηκε από τα φυτά και ακινητοποιήθηκε στην επιφάνεια ηλεκτρόδιων μεταξοτυπίας χρυσού με διαμοριακή σύνδεση γλουταραλδεΰδης-αλβουµίνης βόειου ορού, ενώ το DCPIP χρησιμοποιήθηκε ως τεχνητός ηλεκτρονιοδέκτης. Η ανίχνευση του ηλεκτρικού σήματος, που προέκυπτε από τα θυλακοειδή μετά τον φωτισμό τους, γινόταν αμπερομετρικά. Η αναλογία του σήματος κατά την παρουσία και την απουσία ζιζανιοκτόνων μετρήθηκε για διαφορετικές συγκεντρώσεις. Δημιουργήθηκαν καμπύλες βαθμονόμησης για το terbuthylazine και το metribuzin και υπολογίστηκαν τo EC50 και τα όρια ανίχνευσης (LOD). Το LOD του terbuthylazine ήταν 9,884*10-9 M (2,27 μg/l), λίγο χαμηλότερο δηλαδή από αυτό που αναφέρεται στη βιβλιογραφία (2,52*10-8 Μ). Ο βιοαισθητήρας αυτός θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μια πρώτη διαλογή δειγμάτων πριν την εφαρμογή, στις περιπτώσεις που είναι απαραίτητο, των ακριβών και πολύπλοκων κλασικών αναλυτικών τεχνικών (π.χ. χρωματογραφία).