Μελέτη της προσκόλλησης, της ανάπτυξης και του φαινοτύπου λευχαιμικών βλαστικών κυττάρων επί επιφανειών επικαλυμμένων με φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη. Δοκιμασίες on vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες
Authors: Κόσσυβα Λυδία 
Published: August 2021

Η μεγάλη ετερογένεια των λευχαιμιών αφορά και στη σχέση των λευχαιμικών κυττάρων με το μικροπεριβάλλον του μυελού, σχέση ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα. Η παρούσα εργασία αναφέρεται στον έλεγχο προσκολλητικότητας λευχαιμικών κυττάρων επί επιφανειών «καθηλωμένης» φιμπρονεκτίνης και λαμινίνης και τη συμπεριφορά τους κατά την παραμονή τους επί των επιφανειών αυτών πέραν του 24ώρου. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα 4 λευχαιμικών σειρών (ηλικίας 5-11 ετών) και βλάστες από το αίμα ασθενών με οξεία, πρωτοδιαγνωσθείσα (de novo), λευχαιμία. Κυτταρικές σειρές: • ΚΓ-91: κύτταρα αρνητικά για ιντεγκρίνες α4β1 και α6β1 και αρνητικά ή με ασθενή έκφραση α5β1. Σε μικρό κυμαινόμενο ποσοστό εκφράζουν γλυκοφορίνη A και γ- σφαιρινική άλυσο. • ΚΑ-93: κύτταρα αρνητικά για τα μόρια α4β1, α5β1 και α6β1, με ασθενή έκφραση ερυθροειδών δεικτών γλυκοφορίνης A και γ-αλύσου. • ΖΑ-93: κύτταρα με έντονη έκφραση α4β1 και αρνητικά για α5β1 και α6β1. Παρουσιάζουν δείκτες Β-λεμφοκυττάρου με IgMk. • ΜΚ-97: κύτταρα με έκφραση α4β1, αρνητικά για α5β1 και α6β1, με έκφραση δεικτών Β- λεμφοκυττάρου με IgAk. Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: 8 οξείες μυελογενείς (1 MO, 3 ΜΙ, 2 M2, 1 M3, 1 Μ4) και 3 οξείες λεμφογενείς (2Β, 1Τ). Τα βλαστικά κύτταρα εκφράζουν τους ειδικούς δείκτες της τάξης τους και, σε ποικίλο βαθμό, ανεξάρτητα από το στάδιο διαφοροποίησής τους, τα μόρια προσκόλλησης α4β1 και α5β1, ενώ δεν εκφράζουν το μόριο α6β1. Η μεθοδολογία βασίζεται στην εναιώρηση κυττάρων με υψηλή ζωτικότητα σε θρεπτικό υγρό μέσο RPMI 1640 - Glutamax I και την τοποθέτησή τους επί επιφανειών επικαλυμμένων με φιμπρονεκτίνη ή λαμινίνη, σε συνδυασμό με αντίστοιχη τοποθέτηση σε επιφάνειες επικαλυμμένες με BSA (κύτταρα «μάρτυρες»). Η αρχική συγκέντρωση των κυττάρων αντιστοιχεί σε 120-500x105 κύτταρα/cm2. Αρχικά, εκτιμάται, με τη «δοκιμασία προσκόλλησης» για μία ώρα, το ποσοστό (%) προσκόλλησης των κυττάρων επί των πρωτεϊνικών επιφανειών, ενώ παράλληλα κύτταρα παραμένουν επί των πρωτεϊνικών επιφανειών (Fn, Lam, BSA) από 1-3 ή σε ορισμένες περιπτώσεις και περισσότερα 24ωρα, προκειμένου να ελεγχθεί η ανάπτυξή τους, ο φαινότυπος και η δυνατότητα προσκόλλησης επί αυτών. Τα αποτελέσματα, σε σύγκριση με τα κύτταρα μάρτυρες επί BSA, έδειξαν συνοπτικά τα κάτωθι. I. Δοκιμασίες επί φιμπρονεκτίνης. α) Κυτταρικές σειρές: Τα κύτταρα των σειρών ΚΓ-91 και ΚΑ-93 κατά τη «δοκιμασία προσκόλλησης» επί φιμπρονεκτίνης δεν εμφανίζουν προσκολλητικότητα. Κατά την παραμονή τους πέραν των 24 ωρών επί της «καθηλωμένης» φιμπρονεκτίνης, επάγεται και εντείνεται η έκφραση του μορίου α5β1, συνοδευόμενη από αύξηση της έκφρασης γλυκοφορίνης A και γ-αλύσου. Τα ευρήματα αυτά δεν ακολουθούν, τουλάχιστον εμφανή, προσκόλληση των κυττάρων επί φιμπρονεκτίνης. Οι σειρές διαφέρουν ως προς το ότι τα κύτταρα ΚΓ-91 επί φιμπρονεκτίνης εμφανίζουν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξής τους στο 1° 24ωρο. Και στις δύο σειρές με την τεχνική ανάστροφης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) διαπιστώθηκε στα κύτταρα επί φιμπρονεκτίνης, συγκριτικά με τα αντίστοιχα κύτταρα επί BSA, πολλαπλάσια έκφραση των ε και γ γονιδίων σφαιρινικών αλύσων. Τα κύτταρα των σειρών ΖΑ-93 και ΜΚ-97, διαφορετικής λευχαιμικής προέλευσης, αλλά με τον ίδιο φαινότυπο Β-λεμφοκυττάρου, δεν εκδηλώνουν προσκολλητικότητα κατά τη «δοκιμασία προσκόλλησης». Στη διάρκεια παραμονής τους επί τρία 24ωρα σε φιμπρονεκτίνη, τα κύτταρα ΖΑ-93 δεν επηρεάζονται ενώ τα ΜΚ-97, χάνουν την ιντεγκρίνη α4β1 και εκφράζουν την α5β1, εμφανίζοντας δυνατότητα προσκόλλησης. Οι σημειούμενες διαφορές μεταξύ των σειρών και ιδιαίτερα μεταξύ αυτών με τον ίδιο φαινότυπο, αποκαλύπτουν και υπογραμμίζουν τη διαφορετική φύση των κυττάρων. β) Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: Οι βλάστες των οξειών λευχαιμιών εκφράζουν, σε ποικίλο βαθμό, τις ιντεγκρίνες α4β1 και α5β1. Η έκφραση αυτή δε σχετίζεται με το στάδιο διαφοροποίησης, ούτε με τη δυνατότητα προσκόλλησης επί φιμπρονεκτίνης. Από τις 8 οξείες μυελογενείς λευχαιμίες, 4 έδειξαν κατά τη δοκιμασία προσκόλλησης, βαθμό προσκολλητικότητας κυμαινόμενο από 9-75% ενώ από τις οξείες λεμφογενείς λευχαιμίες, προσκόλληση εμφάνισαν 2 από τις 3 (προσκολλητικότητα 53% και 30% αντίστοιχα). Κατά την παραμονή τους επί των πρωτεϊνικών επιφανειών (φιμπρονεκτίνη και BSA), τα βλαστικά κύτταρα των οξειών μυελογενών λευχαιμιών, που διατήρησαν τη ζωτικότητά τους επί 3 ή και 5 24ωρα, παρουσιάζουν επίταση της έκφρασης του μορίου α5β1, με δυνατότητα προσκόλλησης επί φιμπρονεκτίνης, άσχετη με το αποτέλεσμα της δοκιμασίας προσκόλλησης. Σε 2 περιπτώσεις σημειώθηκε και επίταση ειδικών μυελικών δεικτών ενδεικτικών διαφοροποίησης. II. Δοκιμασίες επί λαμινίνης. Τόσο τα κύτταρα των λευχαιμικών σειρών, όσο και τα βλαστικά των οξειών λευχαιμιών δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α6β1, η οποία αποτελεί μόριο προσκόλλησης για τη λαμινίνη. Οι «δοκιμασίες προσκόλλησης» των κυττάρων και των 4 σειρών, καθώς και των βλαστών από οξεία μυελογενή λευχαιμία M3, ήταν αρνητικές. Κατά την παραμονή των κυττάρων επί 3 24ωρα επί λαμινίνης, δεν προκλήθηκε έκφραση της α6β1 ή διαφορά στην ανάπτυξη και το φαινότυπο των κυττάρων. Από τη συνεκτίμηση των αποτελεσμάτων της μελέτης, εξάγονται τα ακόλουθα συμπεράσματα: • Από τα πειράματα επί των σειρών με ερυθροειδή χαρακτηριστικά, διαφαίνεται η γνωστή ιδιαίτερη σχέση της φιμπρονεκτίνης με την ερυθροειδή διαφοροποίηση, η οποία, στη συγκεκριμένη μελέτη, εκδηλώνεται με επίταση της έκφρασης της γλυκοφορίνης Α, καθώς και επίταση της αιμοσφαιρινοσύνθεσης, γεγονός που επισημαίνεται για πρώτη φορά. • Διαπιστώνεται η ευ μεταβλητότητα των ιντεγκρινών α4β1 και α5β1 και η επαγωγή της έκφρασης, ιδίως της α5β1, από τη φιμπρονεκτίνη. • Η έκφραση και η λειτουργικότητα των μορίων προσκόλλησης επί των λευχαιμικών βλαστών, ποικίλει και δε σχετίζεται με το είδος της λευχαιμίας. Το στοιχείο αυτό πιθανώς οφείλεται στην ετερογένεια των λευχαιμιών. Σε αντίθεση με τη φιμπρονεκτίνη, η λαμινίνη δε φαίνεται να επάγει την έκφραση του ειδικού για αυτή μορίου προσκόλλησης α6β1. Η ποικιλία όμως των υποτύπων της λαμινίνης δεν επιτρέπει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.