Ανάλυση φυτικών προϊόντων με προηγμένες μεθόδους και διερεύνηση της επίδρασής τους στην in vivo δραστικότητα του μεταβολικού ενζύμου CYP1A2
Authors: Μπουνίτση Μαρία 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του φυτικού προϊόντος «Κρόκος Κοζάνης» στην in vivo δραστικότητα ενζύμων μεταβολισμού των ξενοβιοτικών στον άνθρωπο, με την χρήση της καφεΐνης ως φαρμάκου-δείκτη, με τους εξής επιμέρους στόχους: i) ανάπτυξη μιας αξιόπιστης μεθόδου χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης (Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography, RP-HPLC) για τον προσδιορισμό της in vivo δραστικότητας του CYP1A2 στο σίελο και ii) διερεύνηση της επίδρασης του κρόκου στην in vivo δραστικότητα των ενζύμων CYP1A2, CYP2A6, XO και ΝΑΤ2 σε δείγματα ούρων και σιέλου. Λόγω της γνωστής σύστασης του προϊόντος, δεν έγινε ανάλυσή του με προηγμένες μεθόδους. Για την υλοποίηση του πρώτου στόχου, απομονώθηκε η καφεΐνη και η παραξανθίνη σε δείγματα σιέλου με εκχύλιση υγρού-υγρού με την χρήση διαλύματος χλωροφορμίου/ισοπροπανόλης 85/15 v/v. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία και ανιχνεύθηκαν στα 273 nm. Οι χρόνοι έκλουσης της καφεΐνης και της παραξανθίνης ήταν <13 λεπτά χωρίς παρεμβολές από άλλους μεταβολίτες της καφεΐνης. Η απόκριση της ανίχνευσης ήταν γραμμική (0,10–8,00μg/ml, R2>0.99), η ανάκτηση ήταν >93% και το bias <4.47%. Η ακρίβεια εντός σειράς και μεταξύ σειρών <5,14% (n=6). Το όριο ποσοτικού προσδιορισμού ήταν 0,10μg/ml και το όριο ανίχνευσης ήταν 0,018±0,002μg/mL για την παραξανθίνη και 0,032±0,002μg/ml για την καφεΐνη. Ο λόγος παραξανθίνης/καφεΐνης σε δείγμα 34 υγιών εθελοντών ήταν στατιστικά υψηλότερος σε καπνιστές (p<0,001). Επίσης, βρέθηκε υψηλή συσχέτιση του λόγου παραξανθίνης/καφεΐνης μεταξύ δειγμάτων σιέλου και δειγμάτων ούρων (r=0,85, p<0,001). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αναπτυχθείσα μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου CYP1A2 σε δείγματα σιέλου. Για την υλοποίηση του δεύτερου στόχου ελήφθησαν δείγματα σιέλου και ούρων από 34 μη-καπνιστές εθελοντές (20 γυναίκες και 14 άνδρες) οι οποίοι κατανάλωσαν εκχύλισμα κρόκου Κοζάνης για 6 ημέρες υπό περιορισμένη δίαιτα (κατά την διάρκεια της οποίας είχαν αποκλεισθεί τροφές που επηρεάζουν τα υπό μελέτη ένζυμα καθώς και τροφές που περιέχουν καροτενοειδή). Ο φαινότυπος των ενζύμων προσδιορίσθηκε σε δείγματα σιέλου και ούρων με την χρήση των παρακάτω μεταβολικών λόγων: CYP1A2: 17X/137Χ (σίελος) και CYP1A2: (AFMU+1U+1X)/17U, CYP2A6: 17U/(17U + 17X), XO: 1U/(1U+1X) και NAT2: AFMU/(AFMU+1U+1X) (ούρα). Μετά την κατανάλωση κρόκου, ο μεταβολικός λόγος για το CYP1A2 μειώθηκε κατά ~13,7% στα δείγματα σιέλου (προ-: 0,51 ± 0,22, μετά-: 0,44 ± 0,14; p=0,002) και ~6.0% στα δείγματα ούρων (προ-: 3,81 ± 1,20, μετά-: 3,58 ± 0,92, p=0,054). Ο μεταβολικός λόγος για το ένζυμο CYP1A2 μειώθηκε στατιστικά σημαντικά μόνο στο δείγμα των ανδρών (σίελος, προ-: 0,65 ± 0,22, μετά: 0,51 ± 0,16, p=0,0001 και ούρα προ-: 4,53 ± 1,19, μετά-: 4,03 ± 0,87, p=0,017) υποδηλώνοντας σεξουαλικό διμορφισμό στην αναστολή της δραστηριότητας του ενζύμου CYP1A2. Δεν υπήρξε επίδραση της κατανάλωσης κρόκου στους μεταβολικούς λόγους των ενζύμων CYP2A6, XO ή NAT2. Συμπεραίνεται ότι η βραχύχρονη κατανάλωση κρόκου Κοζάνης δεν αλληλεπιδρά με συγχορηγούμενα φάρμακα που μεταβολίζονται από τα ένζυμα που μελετήθηκαν, με εξαίρεση την πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ κρόκου και υποστρωμάτων του ενζύμου CYP1A2 στον ανδρικό πληθυσμό.