Αλληλεπιδράσεις και in situ οργάνωση διαμεμβρανικών πρωτεϊνών του πυρηνικού φακέλου
Authors: Μακατσώρη Δήμητρα 
Published: August 2021

Αρχικός έλεγχος φυσιολογικών και νεοπλασματικών κυττάρων ανθρώπου και ποντικού χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές για την HPΙα και ΗΡΙβ έδειξε ότι η έκφραση των πρωτεϊνών αυτών δεν διαφέρει σημαντικά. Παράλληλα, μελέτη φυσιολογικών ιστών και πρωτογενών καλλιεργειών που έγινε στο εργαστήριό μας έδειξε σύνθετα πρότυπα υποπυρηνικής κατανομής που δεν θα μπορούσαν εύκολα να αποδοθούν σε αυξομειώσεις της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης των ΗΡΙα/β, αλλά θα ήταν πιο συμβατά με έναν μηχανισμό ρύθμισης που εξαρτάται από αυξητικούς παράγοντες και μιτογόνα. Επί τη βάσει αυτών των δεδομένων επικεντρώσαμε τη μελέτη μας στις αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης ΗΡ1 (Heterochromatin Protein 1) με διαφορετικά χρωματινικά υποστρώματα υπό in vitro και in vivo συνθήκες. Η άποψη που ισχύει ως τώρα είναι ότι η ΗΡ1 εντοπίζεται σε μεταγραφικά ανενεργή, συστατική (constitutive) ετεροχρωματίνη συνδεόμενη ειδικά με την ιστόνη Η3 που είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένη (τριμεθυλιωμένη) στη λυσίνη 9 (me3K9-H3). Το παραπάνω πρότυπο, παρά την κομψότητα και την απλότητά του δεν επαρκεί όμως για να ερμηνεύσει το ευρύ φάσμα των αλληλεπιδράσεων της ΗΡ1 με την ετεροχρωματίνη πουπαρατηρούνται in vivo. Για αυτόν τον λόγο, μελετήσαμε τις αλληλεπιδράσεις ΗΡ1- χρωματίνης σε διαφορετικά επίπεδα πολυπλοκότητας και διερευνήσαμε κατά πόσον η me3K9-H3 αποτελεί τη μοναδική θέση πρόσδεσης της ΗΡ1. In vitro μελέτες έδειξαν ότι η ΗΡ1 προσδένεται επιλεκτικά σε μη τροποποιημένη ή μερικώς πρωτεολυμένη ιστόνη Η3, αλληλεπιδρώντας κυρίως με το κεντρικό τμήμα της (histone fold). Επίσης δείξαμε ότι η ΗΡ1 συνδέεται πιο ισχυρά στα διασπασμένα νουκλεοσώματα (Η3/Η4 υποσωματίδια) από ότι στα ακέραια σωματίδια. Τα αποτελέσματα της ανοσοαποτύπωσης κατά western και της φασματοσκοπίας μάζας έδειξαν ότι τα σωματίδια που επιλέγει η ΗΡ1 διαθέτουν ένα πολύπλοκο μοτίβο μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, δεν είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένασε me3K9-H3 και δεν ακολουθούν το σύνολο των κανόνων που υπαγορεύονται από τον ιστονικό κώδικα. Αυτές οι βιοχημικές μελέτες συνηγορούν στην ιδέα ότι οι πρωτεΐνες ΗΡ1 αλληλεπιδρούν μετα διαφορετικά χρωματινικά υποστρώματα με τρόπο που εξαρτάται από τη φυσική κατάσταση της χρωματίνης. Είναι επίσης φανερό ότι οι in vitro παρατηρήσεις μας σχετίζονται με μία τουλάχιστον «χρωματινική κατάσταση» που απαντάται in vivo. Για παράδειγμα, παρατηρήσαμε ότι, η HP1 και η me3K9-H3 δεν συνεντοπίζονται απόλυτα και παρουσιάζουν διακριτά πρότυπα. In vivo πειράματα έδειξαν επίσης ότι η σταθερή ενσωμάτωση της ΗΡ1 στις ετεροχρωματινικές εστίες εξαρτάται από την S φάση. Τα αποτελέσματα αυτά αμφισβητούν το δόγμα ότι η μεθυλίωση στη λυσίνη 9 της ιστόνης Η3 αποτελεί τη μοναδική θέση πρόσδεσης (creates a binding site...) για την ΗΡ1 καιυποστηρίζουν ένα μηχανισμό ενσωμάτωσης που βασίζεται στην αντιγραφή. Ένα άλλο τμήμα της μελέτης μας επικεντρώθηκε στις αλληλεπιδράσεις του πυρηνικού φακέλου με την ετεροχρωματίνη. Ένα βασικό συστατικό του πυρηνικού φακέλου είναι ο LBR (Lamin Β Receptor), μία πολυτοπική πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης που συμμετέχει στην αγκυροβόληση της χρωματίνης στην περιφέρεια. Δύο βασικοί παράμετροι στις αλληλεπιδράσεις LBR-χρωματίνης είναι η φυσική κατάσταση του LBR και τα μοριακά χαρακτηριστικά της χρωματίνης με την οποία συνδέεται. Για να προσεγγίσουμε τα ερωτήματα αυτά, απομονώσαμε τμήματα περιφερικής ετεροχρωματίνης που είναι προσκολλημένα στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Δείξαμε ότι το αμινοτελικό τμήμα του LBR συνδέεται άμεσα με μονονουκλεοσώματα. Ανάλυση των νουκλεοσωματικών σωματιδίων που αλληλεπιδρούν με τον LBR με φασματοσκοπία μάζας απεκάλυψε πολύπλοκα πρότυπα μεθυλιωμένων/ακετυλιωμένων ιστονών που δεν περιέχουν ευχρωματινικές επιγενετικές τροποποιήσεις. Επίσης, μερικοί από τους συνδυασμούς που ανιχνεύθηκαν δεν ήταν συμβατοί με τους κανόνες του «ιστονικού κώδικα». Πολλές από τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες του πυρηνικού φακέλου οργανώνονται σε πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα και σχηματίζουν πλατφόρμες αναδιαμόρφωσης χρωματίνης. Πειράματα in vitro έδειξαν ότι ο LBR αλληλεπιδρά με τον εαυτό του μέσω του αμινοτελικού τμήματος και σχηματίζει ολιγομερή στο επίπεδο του πυρηνικού φακέλου. Επίσης, χρησιμοποιώντας μία ποικιλία μορφολογικών τεχνικών, δείξαμε ότι ο ενδογενής LBRεντοπίζεται σε διακριτές νησίδες στον πυρηνικό φάκελο. Τέλος, μορφολογική ανάλυση τωνετερόζυγων μεταλλάξεων του LBR στα ποντίκια έδειξε ότι η φυσιολογική κατανομή καθώς και η οργάνωση των νησίδων που σχηματίζει ο LBR στον φάκελο διαταράσσεται σημαντικά προκαλώντας μία ποικιλία δομικών και πυρηνικών αλλοιώσεων