Διερεύνηση του ρόλου των πολυμορφισμών στη λειτουργικότητα και στο μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος
Authors: Τουρκοχρήστου Ευανθία 
Published: December 2023

Η βιταμίνη D προσδένεται στον υποδοχέα της VDR (Vitamin D receptor), για να επιτελέσει τη βιολογική της λειτουργία, η οποία έχει αναφερθεί να επηρεάζεται από την παρουσία πολυμορφισμών στο γονίδιο του VDR. Η παρουσία των VDR πολυμορφισμών έχει συσχετιστεί με χρόνιες ηπατικές νόσους. Τέσσερις κοινοί πολυμορφισμοί, οι ApaI, BsmI, TaqI και FokI, έχουν προσδιοριστεί στο γονίδιο του VDR. Η προγνωστική σημασία των VDR πολυμορφισμών έχει αναδειχθεί στη σοβαρότητα της νόσου και στην επιβίωση σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος. Ειδικότερα, κιρρωτικοί ασθενείς, οι οποίοι ήταν φορείς του ApaI πολυμορφισμού ήταν κυρίως CP σταδίου C και είχαν αυξημένα επίπεδα προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β και IL-8 και της πρωτεΐνης οξείας φάσης LBP (Lipopolysaccharide binding protein). Κιρρωτικοί ασθενείς που έφεραν τους BsmI και TaqI πολυμορφισμούς είχαν αυξημένο MELD σκορ και ήταν κυρίως CP σταδίου C σε σύγκριση με αυτούς που δεν είχαν τους πολυμορφισμούς. Η παρουσία του FokI πολυμορφισμού αποτέλεσε προγνωστικό δείκτη αυξημένης επιβίωσης στους κιρρωτικούς ασθενείς και συσχετίστηκε με χαμηλά επίπεδα προ-φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-1β. Στόχο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η διασαφήνιση του πιθανού μηχανισμού, μέσω του οποίου οι VDR πολυμορφισμοί ApaI, BsmI, TaqI και FokI επηρεάζουν την λειτουργικότητα του VDR γονιδίου και επακόλουθα την εξέλιξη της ίνωσης και την επιβίωση των ασθενών με κίρρωση του ήπατος ανεξαρτήτου αιτιολογίας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η απομόνωση του γενωμικού DNA από το ολικό αίμα ασθενών με κίρρωση και υγιών μαρτύρων. Ακολούθησε η γονοτύπηση των δειγμάτων μέσω της τεχνολογίας TaqMan SNP Genotyping Assays για τον προσδιορισμό των ApaI, BsmI, TaqI και FokI πολυμορφισμών. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) από ολικό αίμα υγιών και ασθενών με την μέθοδο φυγοκέντρησης βαθμίδωσης φικόλης και φαινοτύπιση των PBMCs για τον προσδιορισμό των κυτταρικών υποπληθυσμών CD3+VDR+ και CD14+VDR+, με κυτταρομετρία ροής. Με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA έγινε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης του VDR στο πλάσμα υγιών και ασθενών. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση του mRNA των γονιδίων που ρυθμίζονται από το σηματοδοτικό μονοπάτι D-VDR, μέσω real time PCR. Τέλος, εφαρμόστηκαν προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής για τη μελέτη των διαφορετικών δομών της πρωτεΐνης VDR και της αλληλεπίδρασης D-VDR, παρουσία και απουσία (wt) του FokI πολυμορφισμού. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σημαντική αρνητική συσχέτιση των επιπέδων του CD14+VDR+ κυτταρικού υποπληθυσμού με τον δείκτη κλινικής σοβαρότητας της νόσου MELD score. Η παρουσία του ApaI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική μείωση των επιπέδων των CD3+VDR+ κυττάρων στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία του FokI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση των επιπέδων των CD3+VDR+ κυττάρων τόσο στους υγιείς όσο και στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία των BsmI και TaqI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης VDR στο πλάσμα. Η παρουσία των ApaI και BsmI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της έκφρασης του γονιδίου Gpx στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η παρουσία των BsmI και TaqI VDR πολυμορφισμών συσχετίστηκε με σημαντική μείωση του PMCA γονιδίου. Η παρουσία του BsmI πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντική μείωση του JMJD1A γονιδίου και των επιπέδων ηπατικής ακαμψίας στους κιρρωτικούς ασθενείς. Μέσω των προσομοιώσεων ΜΔ, παρατηρήθηκε ότι ο FokI πολυμορφισμός εκφράζει ένα πρωτεϊνικό προϊόν, το οποίο στην περιοχή διασύνδεσης της επικράτειας δέσμευσης της βιταμίνης D και της επικράτειας δέσμευσης στο DNA έχει 5 αμινοξέα λιγότερα σε σχέση με τη φυσιολογική ισομορφή. Στην παρούσα μελέτη η κλινική βαρύτητα της κίρρωσης συσχετίστηκε με τα επίπεδα VDR και η παρουσία των VDR πολυμορφισμών στους κιρρωτικούς ασθενείς συσχετίστηκε σημαντικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης VDR. Επομένως θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι οι πολυμορφισμοί στο γονίδιο του VDR πιθανόν να σχετίζονται με την εξέλιξη της κίρρωσης επηρεάζοντας τα επίπεδα πρωτεΐνης VDR. Η συσχέτιση των VDR πολυμορφισμών με την έκφραση γονιδίων, τα οποία ρυθμίζονται από τη δραστηριότητα D-VDR και εμπλέκονται σε σημαντικές βιολογικές διεργασίες για τη φυσιολογική λειτουργία του ηπατοκυττάρου και την ομοιόσταση των ανοσολογικών αποκρίσεων αποτελεί άλλο ένα πιθανό σημείο συμβολής των VDR πολυμορφισμών στην εξέλιξη της κίρρωσης. Τέλος, η επίδραση του FokI πολυμορφισμού στην περιοχή διασύνδεσης των δύο επικρατειών που συνεργάζονται για την πρόσδεση του VDR στο DNA, αναδεικνύει την πιθανότητα επίδρασης του πολυμορφισμού στη λειτουργικότητα της επικράτειας δέσμευσης στο DNA, με πιθανό αντίκτυπο στη δραστηριότητα μεταγραφής του υποδοχέα VDR.