Μηχανισμοί καταστροφής των επιθηλιακών κυττάρων σε αυτοάνοσες οργανοειδικές νόσους
Authors: Ταπεινός Νικόλαος 
Published: August 2021

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η αναγνώριση μορίων που συμμετέχουν στην ανοσοπαθολογία του συνδρόμου Sjögren. Αρχικά εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες μικρών σιελογόνων αδένων ασθενών με σύνδρομο Sjögren προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση διαφόρων αποπτωτικών πρωτεϊνών. Ο στόχος της προσέγγισης αυτής ήταν να διαλευκάνουμε τον μηχανισμό καταστροφής των επιθηλιακών κυττάρων στους μικρούς σιελογόνους αδένες των ασθενών. Τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν τις αποπτωτικές πρωτεΐνες Fas, Fas-Ligand και Bax και απέπιπταν όπως φάνηκε με την εφαρμογή της μεθόδου TUNEL. Εξάλλου, τα μονοπύρηνα διηθούντα κύτταρα εξέφραζαν Fas-Ligand, Bcl-2, διατορίνη και Θρυμματίνη-Β. Λόγω της έκφρασης του Bcl-2 τα μονοπύρηνα κύτταρα ήταν ανθεκτικά στην απόπτωση ενώ, προκαλούσαν τον αποπτωτικό θάνατο των επιθηλιακών κυττάρων μέσω της έκφρασης της διατορίνης και της Θρυμματίνης-Β. Τέλος τα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών εξέφραζαν την αναγεννητική πρωτεΐνη pS2 σαν ένα πιθανό μηχανισμό άμυνας έναντι των διαφόρων αποπτωτικών μηνυμάτων. Σε δεύτερο στάδιο, μελετήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών p53 και p21 σε βιοψίες μικρών σιελογόνων αδένων ασθενών με σύνδρομο Sjögren. Η μελέτη αυτή έγινε με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση κατά Western και ανέδειξε αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών αυτών στις βιοψίες των ασθενών σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Στη συνέχεια απομονώσαμε γενομικό DNA από ασθενείς με σύνδρομο Sjögren καθώς και από ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και in situ non-Hodgkin λέμφωμα, προκειμένου να πολλαπλασιάσουμε το γονίδιο p53 με PCR και να αναλύσουμε την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του. Το γονίδιο p53 στους ασθενείς με σύνδρομο Sjögren αποδείχτηκε ότι ήταν φυσικού τύπου, το οποίο υποδηλώνει την πιθανή ύπαρξη ενός παράγοντα βλάβης του DNA ο οποίος ενεργοποιεί τα γονίδια p53 και p21. Αντίθετα στους ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και in situ non-Hodgkin λέμφωμα αναδείχτηκαν δύο νέες μεταλλάξεις στο εξώνιο 5 του γονιδίου p53. Οι μεταλλάξεις ήταν σημειακές και προκαλούσαν αντικατάσταση αμινοξέων στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Είναι πιθανό, ότι εξαιτίας των μεταλλάξεων αυτών, το p53 χάνει την ικανότητά του να επιτηρεί την αρτιότητα του κυτταρικού κύκλου και έτσι τα κύτταρα χάνουν τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού τους και αναπτύσσεται λέμφωμα. Το επόμενο στάδιο της μελέτης μας ήταν να εφαρμόσουμε την τεχνική της διαφορικής έκθεσης σε δείγματα RNA από μικρούς σιελογόνους αδένες ασθενών και μαρτύρων έτσι ώστε να απομονώσουμε διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που παίζουν ρόλο στην παθοφυσιολογία του συνδρόμου Sjögren. Για την τεχνική αυτή χρησιμοποιήσαμε οκτώ διαφορετικά ζευγάρια τυχαίων ολιγονουκλεοτιδικών προωθητών. Απομονώθηκαν αρκετά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια τα οποία κλωνοποιήθηκαν και έγινε ανάλυση της αλληλουχίας τους και σύγκριση με την παγκόσμια τράπεζα γονιδίων μέσω του προγράμματος BLAST. Ένας κλώνος είχε 98% ομολογία με το γονίδιο CRISP-3. Η οικογένεια των γονιδίων CRISP αποτελείται από τρία μέλη (CRISP-1,2,3) τα οποία αρχικά απομονώθηκαν από αρσενικά ποντίκια, ενώ στους ανθρώπους εκφράζονται στους γεννητικούς και τους σιελογόνους αδένες των ανδρών. Στα ποντίκια η έκφραση του CRISP-3 εξαρτάται από τα ανδρογόνα. Αφού οι γυναίκες με σύνδρομο Sjögren έχουν έλλειψη ανδρογόνων και καθώς στην βιβλιογραφία δεν είναι γνωστός ο ρόλος ή η ρύθμιση του γονιδίου CRISP-3, υποθέσαμε ενεργοποίηση του γονιδίου από ανοσο-εξαρτώμενους μηχανισμούς. Για να αποδείξουμε την υπόθεση αυτή, πραγματοποιήσαμε RT-PCR σε δείγματα mRNA από 4 ασθενείς και 2 μάρτυρες και στη συνέχεια τα προϊόντα της αντίδρασης τα μετατρέψαμε in vitro σε RNA ιχνηθέτες για να πραγματοποιήσουμε in situ υβριδισμό. Το γονίδιο CRISP-3 εκφραζόταν και στους 4 ασθενείς ενώ η έκφραση του CRISP-3 mRNA ήταν εντοπισμένη στα διηθούντα μονοπύρηνα κύτταρα των ασθενών. Στη συνέχεια απομονώσαμε φυσιολογικά λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και τα ενεργοποιήσαμε με διάφορους πολυκλωνικούς ενεργοποιητές (PMA, ΡΗΑ, ιονομυκίνη, anti-CD3, anti-CD28, Σταυροσπορίνη) για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Το γονίδιο CRISP-3 εκφραζόταν μόνο στα ενεργοποιημένα με ΡΜΑ λεμφοκύτταρα μεταξύ μισής ώρας και έξι ωρών ενώ η Σταυροσπορίνη ανέστειλε αυτή την ενεργοποίηση. Χαρακτηρίσαμε έτσι το γονίδιο CRISP-3 σαν ένα νέο γονίδιο άμεσης ανταπόκρισης το οποίο είναι δυνατό να ενεργοποιηθεί μέσω των πρωτεϊνικών κινασών του κυττάρου. Τέλος, προκαταρκτικά πειράματα διαμόλυνσης με το CRISP-3 σε λέμφοβλαστοειδείς Β κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι αυξάνεται η έκφραση των CD25, CD20 και HLA-DR στην επιφάνεια των διαμολυσμένων κυττάρων. Είναι πιθανό ότι το γονίδιο CRISP-3 ενεργοποιείται κατά την πολυκλωνική ενεργοποίηση των διηθούντων κυττάρων στο σύνδρομο Sjögren και μετέχει στην διαδικασία της επικοινωνίας και απάντησης των λεμφοκυττάρων. Βέβαια είναι ακόμα νωρίς για να βγάλουμε τελικά συμπεράσματα για την δράση του CRISP-3 αλλά η συνέχιση των πειραμάτων θα μας οδηγήσει στην κατανόηση του ρόλου του CRISP-3 στην παθοφυσιολογία του συνδρόμου Sjögren.