Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που ρυθμίζονται από αυξητικούς παράγοντες σε κύτταρα θηλαστικών
Authors: Σαριδάκη Αγγελική 
Published: January 2014

Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της μεταγωγής σημάτων από αυξητικούς παράγοντες σε κύτταρα θηλαστικών. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, στις οποίες εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι της πρωτεωμικής τεχνολογίας για την ανίχνευση νέων μορίων μεταγωγής σήματος. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές A431 (ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα), MRC5 (ανθρώπινοι ινοβλάστες) και PC12 (κύτταρα φαιοκυτοχρώματος αρουραίου) χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα συστήματα για τη μελέτη των αυξητικών παραγόντων EGF, PDGF και NGF αντίστοιχα. Με τον τρόπο αυτό ταυτοποιήθηκαν 14 πρωτεΐνες. Κάποιες από αυτές είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι σχετίζονται άμεσα με τη επίδραση αυξητικών παραγόντων (π.χ. δισουλφιδική ισομεράση, PCNA, γαλεκτίνη-3, αφυδρογονάση του γαλακτικού, κινάση της αδενοσίνης). Κάποιες άλλες (προχιμπιτίνη, ΑΗΑ1, NDRG1, PAK2, EBP1) μπορούν να συσχετιστούν έμμεσα με τους αυξητικούς παράγοντες, καθώς η λειτουργία τους είναι σε συμφωνία με τις συνέπειες των αυξητικών παραγόντων στα αντίστοιχα κυτταρικά συστήματα. Μία τρίτη κατηγορία πρωτεϊνών, (p47, τρυπτοφανυλ-tRNA συνθετάση) περιλαμβάνει μόρια τα οποία εμπλέκονται με διαδικασίες, οι οποίες επίσης επηρεάζονται από αυξητικούς παράγοντες, όπως η ωρίμανση των μορίων RNA και η πρωτεϊνοσύνθεση. Υπάρχει, τέλος, το παράδειγμα της κατεψίνης D, της οποίας η λειτουργία δεν μπορεί να συσχετιστεί με τους αυξητικούς παράγοντες απουσία άλλων πειραματικών δεδομένων. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις παραπάνω πρωτεΐνες έγινε με την ημιποσοτική μέθοδο RT-PCR. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι στην περίπτωση των μορίων mRNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη NDRG1 παρατηρείται στατιστικά σημαντική μεταβολή έπειτα από την επίδραση με τον αυξητικό παράγοντα EGF. Οι ποσοτικές μεταβολές που αφορούν τις υπόλοιπες πρωτεΐνες δεν φαίνεται να οφείλονται σε αντίστοιχες μεταβολές του επιπέδου των μορίων mRNA και πιθανόν να οφείλονται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ενδοκυτταρικές μετατοπίσεις ή γενικότερα σε διαδικασίες που εμπλέκονται στο μετα-μεταφραστικό έλεγχο. Μια από αυτές τις πρωτεΐνες, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη προχιμπιτίνη, μελετήθηκε περαιτέρω με βιοχημικά πειράματα εξαιτίας του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και στην προστασία των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών από την αποικοδόμηση. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι οι αυξητικοί παράγοντες PDGF και NGF επιφέρουν αντίθετα αποτελέσματα στα επίπεδα της πρωτεΐνης, ενώ τα επίπεδα των μορίων mRNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη παραμένουν αμετάβλητα. Πειράματα ανάλυσης κατά Western έδειξαν ότι ενώ το συνολικό ποσό της πρωτεΐνης δεν επηρεάζεται από την επίδραση αυξητικών παραγόντων, το διαλυτό κλάσμα της προχιμπιτίνης είναι αυτό που μειώνεται έπειτα από επίδραση με PDGF. Σύμφωνα με πειράματα ανοσοκυτταροχημείας που έγιναν στην παρούσα μελέτη, η προχιμπιτίνη εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια των ινοβλαστών MRC5 και ο εντοπισμός αυτός είναι ανεξάρτητος της επίδρασης με PDGF. Τα ίδια πειράματα έδειξαν ότι ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων προκαλεί συγκέντρωση των μιτοχονδρίων στην περιπυρηνική περιοχή των ινοβλαστών αυτών, φαινόμενο το οποίο συνοδεύεται από παράλληλη μείωση της διαλυτότητας της προχιμπιτίνης. Παράλληλα, η μελέτη της επίδρασης των αυξητικών παραγόντων εστιάστηκε στο βιοχημικό μονοπάτι της κινάσης Αkt. Συγκεκριμένα, τα πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα που σχηματίζονται με την κινάση Akt απομονώθηκαν με στόχο την ανίχνευση νέων μορίων που αλληλεπιδρούν άμεσα με τη συγκεκριμένη κινάση. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στην απομόνωση του συμπλόκου που σχηματίζει η κινάση Akt με την πρωτεΐνη Hsp90. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκε και η τουμπουλίνη ως πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την κινάση Akt. Τέλος, μελετήθηκαν πρωτεϊνικά δείγματα που απομονώθηκαν από πνεύμονες ποντικών, στα οποία είχε απενεργοποιηθεί το γονίδιο της ισομορφής Akt3. Στα δείγματα αυτά διαπιστώθηκε ότι η αντιοξειδωτική πρωτεΐνη AOP2 υφίσταται οξείδωση στην κυστεΐνη του ενεργού της κέντρου. Αυτή η οξειδωτική τροποποίηση, σε συνδυασμό με την αύξηση των οξειδωμένων πρωτεϊνών στα δείγματα Akt3 -/- οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η απουσία της κινάσης Akt3 προκαλεί πιθανότατα οξειδωτικό stress στα κύτταρα των πνευμόνων. Η οξείδωση της κυστεΐνης του ενεργού κέντρου της AOP2 σε σουλφινικό οξύ καθιστά το μόριο ανενεργό, καθώς δεν μπορεί να ανάγει πλέον άλλες οξειδωμένες ομάδες και το γεγονός αυτό μειώνει την αντιοξειδωτική προστασία του κυττάρου. Παρόλο που δεν παρατηρήθηκε αυξημένη ευαισθησία των αθανατοποιημένων ινοβλαστών από τα ποντίκια Akt3 -/- στην χορήγηση εξωγενούς H2O2 σε σχέση με τους αντίστοιχους φυσικού τύπου, το γεγονός αυτό δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα την κατάσταση των κυττάρων in vivo. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή συνέβαλε στη μελέτη της μεταγωγής σημάτων από αυξητικούς παράγοντες και οδήγησε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών, οι οποίες ρυθμίζονται από τους παράγοντες PDGF, EGF ή NGF. Παράλληλα, μελετήθηκε το βιοχημικό μονοπάτι της κινάσης Akt, τόσο μέσω της απομόνωσης των συμπλόκων που σχηματίζει η κινάση, όσο και μέσω σύγκρισης του πρωτεϊνικού προτύπου κυττάρων Akt3 -/- με το αντίστοιχο κυττάρων φυσικού τύπου.