Μελέτη του πρoτύπου έκφρασης των miRNAs στην Προεκλαμψία
Authors: Λυκούδη Αλεξάνδρα 
Published: January 2023

Σκοπός: Σκοπός της μελέτης είναι η ταυτοποίηση miRNAs που σχετίζονται με την πρόβλεψη και τον παθογενετικό μηχανισμό της Προεκλαμψίας μετά από μελέτη της έκφρασης τους σε υλικό βιοψίας πλακούντα κατά τον τοκετό και το περιφερικό αίμα εγκύων το 1ο τρίμηνο της κύησης που αργότερα (μετά την 20η εβδομάδα κύησης), εμφάνισαν την επιπλοκή σε σχέση με εγκύους με φυσιολογική πορεία και έκβαση της κύησης. Βιολογικό υλικό της μελέτης & Μεθοδολογία: Στην πρώτη φάση της μελέτης έγινε ταυτοποίηση της έκφρασης των miRNAs του πλακούντα με τη χρήση miRNA μικροσυστοιχιών σε υλικό βιοψίας από 24 εγκύους, 11 από αυτές διαγνώστηκαν με τον πρώιμο τύπο της επιπλοκής, 5 με Προεκλαμψία όψιμης έναρξης και 8 από εγκύους με νορμοτασικές κυήσεις (ομάδα ελέγχου). Στη δεύτερη φάση πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης των miRNAs με σύστημα μαζικής παράλληλης αλληλούχισης, σε δείγματα πλάσματος από εγκύους στο πρώτο τρίμηνο της κύησης, από τις οποίες 5 εμφάνισαν αργότερα Προεκλαμψία (μετά την 20η εβδομάδα) και 5 από εγκύους χωρίς την επιπλοκή. Στη φάση αυτή, η μελέτη επικεντρώθηκε στην Προεκλαμψία όψιμης έναρξης (> 34 εβδ. κύησης) η οποία αποτελεί ποσοστό 80% των περιστατικών με την επιπλοκή. Και στις δύο περιπτώσεις ακολούθησε ανάλυση των miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση μεταξύ των δύο ομάδων με προγράμματα βιοπληροφορικής, για την ταυτοποίηση των γονιδίων στόχων, των σηματοδοτικών οδών στις οποίες συμμετέχουν και την ανάλυση Γονιδιακής Οντολογίας (Gene Ontology) (βιολογική διαδικασία, μοριακή λειτουργία και κυτταρική σύσταση). Σύμφωνα με τη διεθνή πρακτική, η διαφοροποιημένη έκφραση των miRNA που διαπιστώθηκε με τη χρήση των μικροσυστοιχιών ή/και του συστήματος μαζικής παράλληλης αλληλούχισης miSeq επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο qRT-PCR η οποία αποτελεί μέθοδο αυξημένης ευαισθησίας και αξιοπιστίας για την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών. Αποτελέσματα: Μελέτη του προτύπου έκφρασης των miRNAs σε υλικό βιοψίας πλακούντα εγκύων με Προεκλαμψία σε σχέση με εγκύους χωρίς την επιπλοκή οδήγησε στη ταυτοποίηση 10 miRNAs (miR-500a, miR-383, miR-518a-5p/miR-527, miR-431, miR-423-3p, miR-124*, miR-1183, miR-130b, miR-3942 και miR-544b) με σημαντικά διαφοροποιημένη έκφραση στην Προεκλαμψία σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Στατιστική ανάλυση με κατασκευή καμπυλών ROC και μονομεταβλητή λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε σημαντική συσχέτιση των miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση με τον υπότυπο της επιπλοκής και τη βαρύτητα των συμπτωμάτων. Συγκεκριμένα διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση των miR-423, miR-124* και miR-431 και η μειωμένη έκφραση των miR-544b και miR-3942 στον πλακούντα σχετίζεται με τη διάγνωση Προεκλαμψίας με πρώιμη έναρξη και βαριά συμπτωματολογία ενώ η υπερέκφραση του miRNA-518a-5p/miR-527 σε πλακούντες από κυήσεις με Προεκλαμψία πρώιμης έναρξης κύησης σε σχέση με τον όψιμης έναρξης υπότυπο συνδέεται με παρουσία ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης του εμβρύου και πρωτεϊνουρία γεγονός που καθιστά το μόριο αυτό πιθανό βιοδείκτη για διάγνωση, διαφορική διάγνωση και πρόβλεψη της βαρύτητας της επιπλοκής. Συγκριτική ανάλυση του προτύπου έκφρασης των miRNAs πλάσματος εγκύων από κυήσεις με όψιμης έναρξης Προεκλαμψία και κυήσεις χωρίς την επιπλοκή οδήγησε στον εντοπισμό 4 miRNAs με σημαντικά διαφοροποιημένη έκφραση στο πλάσμα εγκύων με όψιμης έναρξης Προεκλαμψία, 2 με σημαντική υπερέκφραση (miR-525-5p, miR-548e-3p) και 2 με μειωμένη έκφραση (miR-99b-5p, miR-23b-5p). In silico ανάλυση με μεθόδους βιοπληροφορικής αποκάλυψε ότι τα γονίδια-στόχοι των miRNAs εμπλέκονται σε ρυθμιστικές οδούς που σχετίζονται με την ανοσολογική απάντηση και τη διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων, τη φλεγμονώδη αντίδραση, την αγγειογένεση και την αντίσταση στην ινσουλίνη. Πολυπαραγοντική λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων επιλεγμένων miRNA (miR-525-5p, miR-548e-3p, miR-99b-5p και miR-23b-5p (p60% και ειδικότητα >70%. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ο συνδυασμός miR-525-5p - PAPP-A - MAP που παρουσιάζει 100% ειδικότητα και 73% ευαισθησία και ο συνδυασμός miR-548e-3p - PAPP-A - UtPI με 90% ευαισθησία και 76% ειδικότητα. Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιβεβαιώνουν τη διαφοροποιημένη έκφραση των miRNAs στο πλακούντα και το περιφερικό αίμα εγκύων με Προεκλαμψία και υπογραμμίζουν τη δυνατότητα χρησιμοποίησης των μορίων αυτών ως βιοδείκτες για τη διάγνωση, πρόβλεψη, πρόληψη και θεραπευτική αντιμετώπιση της επιπλοκής. Παρά το ότι απαιτείται περαιτέρω αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, σε ευρείας κλίμακας μελέτες ώστε να εξαχθούν πιο ασφαλή συμπεράσματα, είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών που θα μπορούσαν να αυξήσουν σημαντικά το ποσοστό ανίχνευσης κυήσεων υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση Προεκλαμψίας, να βελτιώσουν τις δυνατότητες θεραπευτικής παρέμβασης και να προσφέρουν εφησυχασμό στους υποψήφιους γονείς για την πορεία και την έκβαση της κύησης.