Επίδραση του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του κεντρικού νευρικού συστήματος
Authors: Διβόλης Γεώργιος 
Published: September 2021

Η υπεροικογένεια του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β (TGFβ) συνίσταται από περισσότερα από 30 μέλη, που σχετίζονται δομικά μεταξύ τους, και περιλαμβάνει τους TGFβs, τις μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs), τις Ακτιβίνες και άλλα. Η σηματοδότηση από μέλη της συγκεκριμένης υπεροικογένειας έχει συνδεθεί με θεμελιώδεις διαδικασίες που διέπουν την ομοιόσταση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), συμπεριλαμβανομένων της νευρογένεσης, της διαφοροποίησης των κυττάρων της γλοίας, της συγκρότησης και διατήρησης της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και άλλων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες συσχετίζουν την υπεροικογένεια του TGFβ με παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ που αφορούν μεγάλο ποσοστό του παγκόσμιου πληθυσμού, όπως η νευροφλεγμονή, οι βλάβες μετά από μηχανικές τραυματικές κακώσεις και οι νευροεκφυλιστικές νόσοι. Μάλιστα, αρκετοί παράγοντες του συγκεκριμένου σηματοδοτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων προσδετών, υποδοχέων και ενδοκυττάριων τελεστών, υπερεκφράζονται σε επίπεδο mRNA ή/και πρωτεΐνης σε πειραματικά μοντέλα μηχανικού ή/και βιοχημικού τραυματισμού του νευρικού ιστού, μέσω χορήγησης νευροτοξινών. Επιπλέον, έχουν βρεθεί αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των ίδιων παραγόντων σε κακώσεις του ανθρώπινου νωτιαίου μυελού, καθώς και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή το ραβδωτό σώμα ασθενών με νόσο Πάρκινσον. Παρά την εκτενή μελέτη μεμονωμένων παραγόντων της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, τα δεδομένα που αφορούν στην ταυτότητα των κυτταρικών αποδεκτών της δράσης αυτής, καθώς και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα αυτά αποκωδικοποιούν τα περίπλοκα σήματα που δέχονται από κυτταροκίνες της υπεροικογένειας ώστε να εκδηλώσουν την κατάλληλη φυσιολογική απόκριση σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, παραμένουν ελλιπή και αρκετά ασαφή. Αδιευκρίνιστος παραμένει επίσης ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης των δύο βασικών κλάδων του συστήματος, της TGFβ- και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης, σε παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ. Υπάρχει αλληλεπίδραση των δύο σηματοδοτικών κλάδων σε αποκλίνουσες από την ομοιόσταση συνθήκες;Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αποσαφήνιση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς που αναπτύχθηκε στο ΙΙΒΕΑΑ μέσω διασταύρωσης δύο διαγονιδιακών σειρών που φέρουν στο γονιδίωμά τους τα γονίδια της κόκκινης (RFP) και της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) υπό τον έλεγχο καλά χαρακτηρισμένων αλληλουχιών ειδικής απόκρισης σε TGFβs/Ακτιβίνες (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) ή σε BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), αντίστοιχα. Οι δυνητικοί κυτταρικοί αποδέκτες της κανονικής TGFβ ή BMP σηματοδότησης εκφράζουν την πρωτεΐνη RFP ή eGFP, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο ζωικό μοντέλο διαπιστώθηκε ότι η σηματοδότηση από μέλη της υπεροικογένειας του TGFβ είναι ενεργή και οριοθετημένη σε διάφορες περιοχές του νεογνικού και του ενήλικου εγκεφάλου υπό ομοιοστατικές συνθήκες, όπως στους οσφρητικούς βολβούς, στο φλοιό, στα τοιχώματα των κοιλιών, στο χοριοειδές πλέγμα και στο αγγειακό δίκτυο. Μάλιστα, στους κυτταρικούς αποδέκτες της TGFβ ή/και της BMP σηματοδότησης περιλαμβάνονταν νευρώνες, αστροκύτταρα και δομικά κύτταρα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα. Προκειμένου να μελετηθεί η συμμετοχή των TGFβ και BMP κλάδων στην παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, εφαρμόστηκε ένα μοντέλο εστιακού διεισδυτικού εγκεφαλικού τραυματισμού. Συγκεκριμένα, ενήλικοι μύες αγρίου τύπου υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη οξεία κρανιοεγκεφαλική κάκωση και συλλέχθηκαν δείγματα εγκεφαλικού φλοιού που εμπεριείχαν τις τραυματισμένες και τις αντίστοιχες «υγιείς» περιοχές, σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον τραυματισμό. Χαρακτηριστικοί δείκτες ενεργοποίησης της υπεροικογένειας του TGFβ, όπως η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad και η mRNA έκφραση προσδετών και γονιδίων-στόχων, τόσο της TGFβ όσο και της BMP σηματοδότησης, αυξήθηκαν στην περιοχή του τραύματος τις πρώτες ημέρες μετά την κάκωση. Με τη βοήθεια διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς δείχθηκε ότι η ενεργοποίηση και των δύο σηματοδοτικών κλάδων αφορούσε κυρίως στα δραστικά αστροκύτταρα που οριοθετούσαν την περιοχή μεταξύ υγιούς και τραυματισμένου ιστού. Για την έμμεση διαλεύκανση του ρόλου της ενεργοποίησης της TGFβ- ή/και BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στα κύτταρα της γλοίας που συναθροίζονται στο τραύμα, αναπτύχθηκαν συστήματα απομόνωσης και καλλιέργειας πρωτογενούς γλοίας, καθώς και πρωτόκολλα διαχωρισμού αυτών μέσω κυτταρομετρίας ροής για τη λήψη αμιγών αστροκυτταρικών και μικρογλοιακών πληθυσμών. Τα αμιγή κύτταρα διεγέρθηκαν παρουσία ανασυνδυασμένων TGFβ1 και ΒΜΡ4 και το μεταγράφωμά τους αναλύθηκε με τη μέθοδο της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA-Seq). Τα αστροκύτταρα αποκρίθηκαν σημαντικά και στους δύο προσδέτες και μάλιστα παρουσίασαν ιδιαίτερα επικαλυπτόμενα μεταγραφικά προφίλ. Εντούτοις, η μικρογλοία ενώ αντέδρασε εξαιρετικά καλά στον TGFβ1, αποκρίθηκε πολύ ασθενώς παρουσία ΒΜΡ4, γεγονός που πιθανότατα σχετίζεται με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ΒΜΡ-σχετιζόμενων υποδοχέων και Smads συγκριτικά με τα αστροκύτταρα. H βιοπληροφορική ανάλυση του μεταγραφώματος των διεγερμένων με TGFβ1 και ΒΜΡ4 αστροκυττάρων ανέδειξε ένα σύνολο κυτταρικών διεργασιών που διέπουν την ιστική επιδιόρθωση και την αποκατάσταση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού έπειτα από τραυματισμό, όπως η βιοσύνθεση και μεταφορά χοληστερόλης, η έκφραση παραγόντων καθοδήγησης νευραξόνων, η παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας και η ρύθμιση της ομοιόστασης του γλουταμινικού οξέος. Επιπλέον, υπό την επίδραση και των δύο προσδετών στα αστροκύτταρα και παρουσία του TGFβ1 στη μικρογλοία, ο φαινότυπος της δραστικής γλοίας μετατοπίστηκε προς τους αντιφλεγμονώδεις και σχετιζόμενους με την ιστική επιδιόρθωση αστροκυτταρικό τύπου Α2 και μικρογλοιακούς τύπου Μ0/Μ2 φαινοτύπους, αντίστοιχα. Η αυξημένη έκφραση αφ’ ενός χαρακτηριστικών παραγόντων που συμμετέχουν στις παραπάνω in vitro ρυθμιζόμενες βιολογικές διεργασίες, και αφ’ ετέρου ειδικών μεταγράφων για τα αστροκύτταρα τύπου Α2, επιβεβαιώθηκε in vivo στην περιοχή του τραύματος, έπειτα από εστιακή κρανιοεγκεφαλική κάκωση, υποδεικνύοντας ότι οι διαδικασίες αυτές ρυθμίζονται πιθανότατα in situ από τη συνεργιστική δράση της TGFβ ή/και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης. Εκτός του μηχανικού διεισδυτικού τραυματισμού, εφαρμόστηκε κι ένα μοντέλο βιοχημικού τραυματισμού του εγκεφάλου, μέσω χορήγησης της μιτοχονδριακής νευροτοξίνης MPTP για την προσομοίωση παρκινσονικών συμπτωμάτων σε ενήλικους μύες. Παρατηρήθηκε σημαντική ενεργοποίηση του συστήματος της υπεροικογένειας του TGFβ κατά μήκος της μελαινοραβδωτής οδού στα πειραματόζωα όπου χορηγήθηκε ΜΡΤΡ. Και σε αυτό το μοντέλο εγκεφαλικού τραυματισμού, οι κυτταρικοί αποδέκτες της TGFβ και της BMP σηματοδότησης στο ραβδωτό σώμα και τη μέλαινα ουσία ήταν στην πλειοψηφία τους αστροκύτταρα. Στη συνέχεια, διεξήχθη στερεοτακτική υπερέκφραση ενεργοποιητών ή αναστολέων της BMP σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία των πειραματοζώων, πριν από τη χορήγηση MPTP, και μελετήθηκε η κινητική τους δραστηριότητα. Παρατηρήθηκε σχετική βελτίωση ορισμένων συμπεριφορικών παραμέτρων στα ζώα όπου υπερεκφράστηκε η Noggin, υποδεικνύοντας ότι αναστολή της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία παρέχει πιθανότατα νευροπροστατευτική δράση στην ομόπλευρη μελαινοραβδωτή οδό. Συνοψίζοντας, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο σύστημα μελέτης τον εγκέφαλο του μυός, αποκωδικοποιήθηκαν σημαντικές πτυχές της αλληλεπίδρασης μεταξύ των TGFβ και BMP κλάδων του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ και τονίστηκε η σημασία του σχετικού ισοζυγίου των κυτταροκινών της υπεροικογένειας για τη ρύθμιση της ομοιόστασης και την εξέλιξη της παθολογίας στο ΚΝΣ. Ακόμη, αναδείχθηκαν βασικές νευροπροστατευτικές ή/και νευροτοξικές διεργασίες υπό παθοφυσιολογικές συνθήκες, καθώς και συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα/μηχανισμοί, που αφορούν στα κύτταρα της γλοίας και μπορούν να αξιοποιηθούν μελλοντικά στην ανάπτυξη αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων στο πλαίσιο νευροφλεγμονωδών διαταραχών ή/και τραυματικών κακώσεων του ΚΝΣ.