Glutamate and ischemia-induced changes in ion homeostasis in the neuronal culture and cerebral cortex of mice expressing Ca2+-sensor GCаMP6f
Authors: Кислухина Е.Н. , Лизунова Н.В. , Лисина О.Ю. , Шарипов Р.Р. , Красильникова И.А. , Бакаева З.В. , Пинелис В.Г. , Сурин А.М. 
Published: October 2023

Актуальность. При исследованиях внутриклеточного сигналинга и межнейрональной передачи сигнала в мозге в норме и при патологии все большее применение находят трансгенные животные, экспрессирующие в нейронах флуоресцентный Са2+-сенсор. Вместе с тем, пока недостаточно исследовано, насколько изменения кальциевого гомеостаза в интактном мозге соотносятся с гораздо более подробно изученными изменениями этого важнейшего параметра в нейроглиальных культурах, служащих модельными системами живого мозга. Целью работы было на модели ишемического инсульта выяснить в какой степени изменения внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]) в мозге трансгенной мыши, измеренные с помощью флуоресцентного белкового сенсора GCaMP6f, соотносятся с изменениями [Ca2+] в первичных нейроглиальных культурах из кортекса этих животных. Методы. Методом широкопольной оптической нейровизуализации (ШОН) измерены изменения концентрации свободного Са2+ в цитозоле нейронов ([Ca2+]c) головного мозга мышей. Измерения проводили перед и после фотоиндуцированного инсульта в сенсомоторной зоне коры. Изменения [Ca2+]c отслеживали по флуоресценции GCaMP6f, экспрессируемого в нейронах кортекса. На первичных нейроглиальных культурах из коры головного мозга мышей той же линии проверено влияние эксайтотоксических доз глутамата (Glu) на [Ca2+]c и на изменения средней концентрации свободного Са2+ в цито- и нуклеоплазме ([Ca2+]i). Измерения [Ca2+]i выполнены методом флуоресцентной микроскопии с использованием синтетических Са2+- индикаторов Fura-2 и Fura-FF. В культивируемых нейронах дополнительно к измерениям кальциевого гомеостаза выполнены измерения внутриклеточного рН (pHi), митохондриального потенциала (ΔΨm) и эндогенной флуоресценции NADH. Результаты. Фотоиндуцированная ишемия вызывает сильный рост [Ca2+]c в зоне облучения ~1,1 мм2 (n=9). В течение сутокобласть высокой [Ca2+]c расширяется до ~6 мм2, но к 7-м сут практически возвращается к размерам необратимого повреждения. В нейроглиальных культурах из коры головного мозга мышей этой же линии кинетика изменений [Ca2+]c, индуцированных Glu, напоминает кинетику [Ca2+]i, однако [Ca2+]c имеет значительно меньшую амплитуду при развитии отсроченной кальциевой дисрегуляции (ОКД). Сопоставление изменений [Ca2+] и pHi показывает, что различия могут быть обусловлены тушением флуоресценции GCaMP6f при закислении цитозоля в результате эксайтотоксического действия Glu. Заключение. Сопоставление сигналов экспрессируемого нейронами Са2+-сенсора GCaMP6f в мозге и синтетических Са2+-индикаторов в первичных нейроглиальных культурах, полученных из животных той же линии, показывает, что феномен ОКД, впервые обнаруженный в культурах, вероятно, реализуется и в нейронах целого мозга при инсульте. Вместе с тем, необходимо учитывать, что относительные изменения [Ca2+]c на разных стадиях развития ишемического повреждения и последующего восстановления мозга после фотоиндуцированного инсульта, могут быть искажены за счет влияния pHi на флуоресценцию белкового сенсора.

Relevance. In studies of brain intracellular and intercellular signaling in normal and pathological conditions, transgenic animals expressing a fluorescent Ca2+ sensor in neurons are increasingly used. Calcium homeostasis was studied in detail in primary neuroglial cultures, which serve as model systems of the living brain. But how change in calcium homeostasis during ischemic conditions in the intact brain correlate with experiments on cell cultures has been poorly studied so far. The aim of this work was to compare ischemia-driven changes in the intracellular concentration of Ca2+ ([Ca2+]) in vivo and in vitro: in the brain of transgenic mice, using the GCaMP6f fluorescent protein sensor, and in the neuroglial cell culture, obtained from the cortex of these animals. Methods. Changes in the cytosolic concentration of free Ca2+ ([Ca2+]c) in the neurons was measured by wide-field optical imaging (WFOI). Measurements were taken before and after photothrombotic stroke performed in the sensorimotor cortex. Changes in [Ca2+]c were monitored by the fluorescence of GCaMP6f expressed in cortical neurons. In primary neuroglial cultures from the cerebral cortex glutamate (Glu) in excitotoxic doses was used to model ischemic injury. Measurements of averaged Ca2+ concentration in the cyto- and nucleoplasm ([Ca2+]i) were carried out by fluorescence microscopy using synthetic Ca2+ indicators Fura-2 and Fura-FF. In addition, measurements of intracellular pH (pHi) and mitochondrial potential (ΔΨm) were carried out in vitro. Results. Photothrombotic stroke caused a strong increase in [Ca2+]c in the illuminated zone ~1.1 mm2 (n=9). During the 24 hours, the area with high [Ca2+]c expands to ~6 mm2, but by the 7th day it almost returns to the size of the primary damage. In neuroglial cultures from the cerebral cortex of the same mice strain, the [Ca2+]c kinetics measured by GCaMP6f resembles the [Ca2+]i kinetics, but [Ca2+]c has a significantly lower amplitude during the development of delayed calcium deregulation (DCD). Comparison of changes in [Ca2+]i and pHi shows that the differences may be due to the quenching of GCaMP6f fluorescence due to cytosol acidification as a result of the excitotoxic Glu action. Conclusion. Comparison of measurements by the genetically-encoded GCaMP6f Ca2+ sensor in vivo and by the synthetic Ca2+ indicators in primary neuroglial cultures shows that the DCD phenomenon, first discovered in cultures, is probably realized in intact brain neurons in stroke. It should be taken into account that the relative changes in [Ca2+]c can be distorted due to the effect of pHi on the fluorescence of the protein sensor at different stages of ischemia development and subsequent brain recovery after a photothrombotic stroke.