Μοριακή και βιοχημική ανάλυση των βακτηριακών παρβουλινών και κυκλοφιλινών
Authors: Σκαγιά Αγγελική 
Published: August 2021

Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες (PPIάσες, EC: 5.2.1.8) αποτελούν μια υπεροικογένεια ενζύμων που καταλύουν την αργή διαδικασία της cis/trans ισομερίωσης των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται της προλίνης, σε διαφορετικά στάδια αναδίπλωσης των πρωτεϊνών στόχων, ως ένζυμα πουβοηθούν την αναδίπλωση. Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες, είναι ένζυμα που απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς και σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας τωνPPIασών διακρίνονται στις εξής οικογένειες: τις κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το FK506 (FKBPs) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι τρεις οικογένειες PPIασών έχουν διακριτά υποστρώματα ενώ έχουν αποδειχθεί ευαίσθητες σε διαφορετικούς τύπους αναστολέων. Η πλειονότητα τωνPPIασών, εκτός από την ενεργότητα PPIάσης, εμφανίζουν και ενεργότητα τσαπερόνης μέσω της οποίας επιτελείται η αναδίπλωση πρωτεϊνών και παρεμποδίζεται η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων.Επίσης, οι PPIάσες έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών διεργασιών όπως είναι η απόκριση θερμικού στρες, η μεταγραφή και η μετάφραση, η μεταγωγή σήματος, η μετάσταση όγκου, η μολυσματικότητα παθογόνων, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και άλλα. Οι βακτηριακές PPIάσες ενώ δε φαίνεται να είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη υπό εργαστηριακές συνθήκες, έχουν σημαντικούς ρόλους στην επιβίωση σε ιδιαίτερες περιβαλλοντικές συνθήκες.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μελών, δύο οικογενειών των PPIασών, των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών, του μικροοργανισμού Escherichiacoli. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση του πλήρως αλληλουχημένου γονιδιώματος του βακτηρίου μέσω της οποίας εντοπίστηκαν τρία και δύο γονίδια αντίστοιχα, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ανήκουν στις παρβουλίνες και στις κυκλοφιλίνες. Ο φυσιολογικός ρόλος των παρβουλινών και των κυκλοφιλινών μελετήθηκε μέσω της ανάπτυξης, σε διαφορετικές συνθήκες, των E. coli στελεχών ΔppiC,ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA στα οποία έχει απαλοιφθεί το συγκεκριμένο γονίδιο. Η απουσία κάποιων παρβουλινών και κυκλοφιλινών είχε ως αποτέλεσμα πλειοτροπικούς φαινοτύπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αυξημένη ικανότητα κολυμβητικής και επιφανειακής ομαδικής κίνησης, καθώς καιαυξημένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου, συγκριτικά με το στέλεχος αγρίου τύπου.Εξετάστηκε εάν η ενεργότητα PPIάσης αυτών των ενζύμων εμπλέκεται στους παρατηρούμενους φαινότυπους. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήθηκαν στελέχη τα οποία φέρουν κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων που μετέχουν στον ενεργό κέντρο PPIάσης κάθε πρωτεΐνης (PpiBF99A, PpiBR43A,PpiAF128A, PpiCC41A) και ελέγχθηκε εάν αυτά τα στελέχη συμπληρώνουν τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη στην ομαδική και κολυμβητική κίνηση και στο σχηματισμό βιοϋμενίου. Η έκφραση των γονιδίων αγρίου τύπου αλλά και των μεταλλαγμένων γονιδίων των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη επανέφερε σε όλες τις περιπτώσεις τους φαινοτύπους του στελέχους αγρίου τύπου. Εξαίρεση αποτέλεσε το μεταλλαγμένο γονίδιο της κυκλοφιλίνης PpiBR43A, όπου δεν επανέφερε το φαινότυπο του σχηματισμού βιοϋμενίου, υποδηλώνοντας τη αναγκαιότητα της δραστικότητας ΡΡΙάσης της κυκλοφιλίνης σε αυτή τη συμπεριφορά.Ο φαινότυπος των μεταλλαγμένων στελεχών ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA επανήλθε στα επίπεδα αγρίου τύπου μέσω υπερέκφρασης της πλειοψηφίας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις PPIάσες του E. coli, υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατή μια λειτουργική υποκατάσταση ανάμεσα στα μέλητης υπεροικογένειας των PPIασών.Η αυξημένη ικανότητα ομαδικής, κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου του στελέχους ΔppiB επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από την υπερέκφραση πρωτεϊνών που αποτελούν πιθανούς στόχους της PpiB, των οποίων τα μεταλλαγμένα στελέχη σε αρκετές περιπτώσεις παρουσίασα νανάλογους φαινότυπους με το στέλεχος ΔppiB. Επιβεβαιώθηκαν αρκετές αλληλεπιδράσεις των πιθανών πρωτεϊνών στόχων με την PpiB χρησιμοποιώντας διάφορες in vivo και in vitro μεθόδους αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Πολλές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εμπλέκουν το ενεργό κέντρο PPIάσης της, αφού με την παρουσία των πιθανών αυτών στόχων παρατηρήθηκε μείωση της in vitro ενεργότητας PPIάσης της κυκλοφιλίνης. Στην περίπτωση, των DnaK, AccC και PtA βρέθηκε ότι η κυκλοφιλίνη διαδραματίζει έναν ρόλο στον άμεσο λειτουργικό έλεγχο αυτών των πρωτεϊνών, αφού η παρουσία της αυξάνει την μετρούμενη ενζυμική ενεργότητα της καθεμίας πρωτεΐνης. Επίσης, η PpiB εμπλέκεται στον υποκυτταρικό εντοπισμό της DnaK ενώ φαίνεται ότι είναι υπεύθυνη για την ορθή αναδίπλωση της AccC.Εξετάζοντας την κυτταρική μορφολογία των στελεχών που υπερεκφράζουν την κυκλοφιλίνη PpiB και την παρβουλίνη PpiC παρατηρήθηκε μια σημαντική κυτταρική επιμήκυνση, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή των παραπάνω ενζυμών στην κυτταρική διαίρεση. Αντίθετα, τα στελέχη τα οποία υπερεκφράζουντα μεταλλαγμένα στο ενεργό κέντρο γονίδια, ppiBF99A, ppiBR43A και ppiCC41A, παρουσιάζουν κυτταρική μορφολογία όμοια με αυτή του αγρίου τύπου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργότητα PPIάσης των δυο πρωτεϊνών είναι αναγκαία. Επιπλέον, οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις FtsZ και ZipA πρωτεΐνες της κυτταρικής διαίρεσης. Η παρουσία της PpiB μειώνει τη ενεργότητα GTPάσης της FtsZ και έχει αρνητική επίδραση στη σωστή τοποθέτησή της στις μελλοντικές θέσεις διαίρεσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν τη συμμετοχή των PpiB και PpiC στην κυτταρική διαίρεση μέσω της λειτουργικής τους συσχέτισης με πρωτεΐνες άμεσα εμπλεκόμενες σε αυτήν τη διαδικασία.