Διερεύνηση μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά κλινικών στελεχών streptococcus pneumoniae
Authors: Φλούντζη Αναστασία 
Published: August 2021

Σκοπός: Προσδιορισμός και διερεύνηση των επικρατέστερων μηχανισμών MLSB αντοχής και αντοχής στην τετρακυκλίνη μεταξύ στελεχών Streptococcus pneumoniae, καθώς και των μηχανισμών αντοχής στα β-λακταμικά αντιβιοτικά σε στελέχη Streptococcus pneumoniae που απομονώθηκαν στην Ελλάδα την περίοδο 2001-2004.Μεθοδολογία: Συνολικά 1.033 στελέχη S. pneumoniae απομονώθηκαν από ασθενείς των τριών παιδιατρικών νοσοκομείων της Αθήνας. Η οροτυπία έγινε με εμπορικά διαθέσιμους αντιορούς (αντίδραση Quellung). Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά ερυθρομυκίνη και κλινδαμυκίνη, τετρακυκλίνη έγινε με την μέθοδο διάχυσης δισκίων κατά Kirby-Bauer, ενώ οι φαινότυποι αντοχής MLSB και TetR, προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία επαγωγής διπλού δισκίου. H ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (ΕΑΠ) της πενικιλλίνης (Pen) και κεφοταξίμης (Ctx) προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ταινιών διαβαθμισμένης συγκέντρωσης (E-test, bioMerieux) σε τρυβλία Mueller-Hinton άγαρ εμπλουτισμένο με 5% ερυθρά προβάτου. Η ανίχνευση των MLSB και TetR μηχανισμών αντοχής έγινε με πολλαπλασιασμό τμήματος των γονιδίων mefΑ/Ε, ermB, ermTR, tetO και tetM με την τεχνική της PCR. Προσδιορισμός των υποτύπων του γονιδίου mefA/Ε έγινε μέσω PCR-RFLP και της BamH1 περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Η διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στα β-λακταμικά, στα στελέχη που ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη ή/και την κεφοταξίμη έγινε με πολλαπλασιασμό τμήματος 1150 ζευγών βάσεων των γονιδίων των πρωτεϊνών PBP1A, 2B και 2X και επακόλουθο προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τo λογισμικό DAMBE και την χρήση του αλγορίθμου ClustalW. Η σύγκριση έγινε με αλληλουχίες προτύπων στελεχών, ευαίσθητων στα β-λακταμικά αντιβιοτικά.Αποτελέσματα: Μεταξύ των 1.033 στελεχών S. pneumοniae, 186, 641 και 206 απομονώθηκαν από διεισδυτικές λοιμώξεις (βακτηριαιμίες και μηνιγγίτιδες), μη διεισδυτικές λοιμώξεις (οξεία μέση ωτίτιδα, οφθαλμικές και λοιμώξεις κατώτερου αναπνευστικού) και από ρινο-φαρυγγική φορεία, αντίστοιχα. Συνολικά, 450 από τα 1.033 (43.6%) στελέχη ήταν ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη (EryR). Ο M φαινότυπος επικρατούσε (306/450, 68%), ενώ ο CR (128/450, 28%) και ο IR (16/450, 3.6%) ακολουθούσαν. Οι τέσσερεις συχνότεροι ορότυποι (19F, 14, 6B και 23F), αντιπροσώπευαν το 75% του συνόλου των στελεχών και περιελάμβαναν το 92% όλων των EryR στελεχών. Ο Μ φαινότυπος κυριαρχούσε μεταξύ των οροτύπων 19F και 14 (81% και 64% των EryR στελεχών από κάθε ορότυπο, αντίστοιχα), ενώ ο CR φαινότυπος κυριαρχούσε μεταξύ των οροτύπων 6B και 23F (65% και 67% των EryR στελεχών από κάθε ορότυπο, αντίστοιχα). Συνολικά, αντοχή στην τετρακυκλίνη (TetR) ανιχνεύθηκε σε 358 (35%) από όλα τα στελέχη. Οι τέσσερεις συχνότεροι ορότυποι (19F, 14, 6B, και 23F) περιελάμβαναν το 94% όλων των TetR στελεχών, ενώ τα ποσοστά ανά ορότυπο ήταν 74%, 15%, 29% και 39%, αντιστοίχως.Ο μοριακός έλεγχος των μηχανισμών αντοχής πραγματοποιήθηκε σε 273 από τα 450 EryR και σε 207 από τα 358 TetR στελέχη, τα οποία κατανέμονταν ομοιόμορφα μεταξύ των οροτύπων.161Η φαινοτυπική αντοχή τύπου M, CR και IR αποδόθηκε στην παρουσία των mef, ermB και ermTR, αντίστοιχα, γονιδίων, σε 201 EryR στελέχη, ενώ σε 72 στελέχη (48 με M , 21με CR και 3 με IR φαινότυπο) δεν ανιχνεύθηκε κανένα γονίδιο. Επιπλέον, σε 3 στελέχη με φαινότυπο CR βρέθηκαν αμφότερα τα γονίδια mefΕ και ermB, ενώ σε ένα στέλεχος με φαινότυπο IR, βρέθηκαν αμφότερα τα γονίδια mefE και ermTR. Όσον αφορά στον προσδιορισμό του mef υποτύπου, επικρατούσε ο mefE (86% των mef-θετικών στελεχών), αλλά ο mefA υπερείχε μεταξύ στελεχών του οροτύπου 14, ενώ μεταξύ των στελεχών όλων των άλλων οροτύπων ο επικρατών υπότυπος ήταν ο mefE. Μεταξύ των 207 TetR στελεχών, 167 παρουσίασαν μόνο το tetM γονίδιο, σε 7 στελέχη βρέθηκαν και τα δύο γονίδια tetM και tetO, ενώ σε 33 από τα στελέχη κανένα γονίδιο δεν ανιχνεύθηκε.Πλήρης αντοχή ή ενδιάμεση ευαισθησία στην πενικιλλίνη ανιχνεύθηκε στο 12,9% και 31,8%, αντίστοιχα, ενώ το 1,2% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην κεφοταξίμη. Τα ανθεκτικά στελέχη κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με τις τιμές ΕΑΠ, ως εξής: ομάδα Α (14 στελέχη) με ΕΑΠ Pen ≥2 και ΕΑΠ Ctx ≥2, και ομάδα Β (116 στελέχη) με ΕΑΠ Pen ≥2 και ΕΑΠ Ctx ≤ 1. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των PBPs 1A,2B και 2X, σε συνολικά εννέα στελέχη της ομάδoς Α και 18 στελέχη της ομάδoς Β, που επιλέχθηκαν τυχαία, έδειξε ότι με βάση τις αλληλουχίες των τριών PBPs, τα πολυανθεκτικά στελέχη οροτύπου 19F της ομάδας Α κατηγοριοποιούνται μαζί, ενώ τα λοιπά στελέχη της ομάδας Β κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικούς κλώνους.Συμπεράσματα: Μεταξύ των στελεχών S. pneumoniae που απομονώθηκαν στην Ελλάδα, η αντοχή στην ερυθρομυκίνη ανιχνεύεται σε συγκεκριμένους οροτύπους και αποδίδεται στον μηχανισμό αντλίας εκροής (mef γονίδιο) μεταξύ των οροτύπων 19F και 14 και στον μηχανισμό μεθυλίωσης ριβοσώματος (ermB γονίδιο) μεταξύ των οροτύπων 6B και 23F. Η αντοχή στην τετρακυκλίνη επίσης ανιχνεύεται σε συγκεκριμένους οροτύπους και αποδίδεται σε μηχανισμό προστασίας ριβοσώματος (tetM γονίδιο). Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα αποτελέσματα και των τριών PBPs, μια ομάδα ανθεκτικών και στα δύο β-λακταμικά αντιβιοτικά στελεχών οροτύπου 19F, μαζί με ένα στέλεχος οροτύπου 6Β ομαδοποιούνται μαζί υποδηλώνοντας κοινή καταγωγή των συγκεκριμένων γονιδίων. Αντίθετα, η ομαδοποίηση των λοιπών στελεχών, διαφόρων οροτύπων, με αντοχή στην πενικιλλίνη και ευαισθησία στην κεφοταξίμη δεν είναι σταθερή στις τρεις PBPs. Η συνεχιζόμενη επιτήρηση των επικρατούντων μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά, είναι απαραίτητη για την διαρκή προσαρμογή των στρατηγικών πρόληψης στις πνευμονιοκοκκικές λοιμώξεις.