3-διάστατη απεικόνιση ιστολογικών δεδομένων στην οπτική μικροσκοπία διερχομένου φωτός
Authors: Κουδουνάς Παντελεήμων 
Published: November 2023

Η οπτική μικροσκοπία, γνωστή και ως μικροσκοπία φωτός, είναι μία ευέλικτη και ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για την απεικόνιση και τη μελέτη αντικειμένων σε επίπεδο μικροκλίμακας και νανοκλίμακας με τη χρήση ορατού φωτός και οπτικών φακών. Αποτελεί θεμελιώδες εργαλείο σε διάφορα επιστημονικά πεδία, όπως η βιολογία, η επιστήμη των υλικών, η χημεία και η ιατρική. Ειδικά η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, μία θεμελιώδης τεχνική στον τομέα της οπτικής μικροσκοπίας, είναι μια από τις απλούστερες και πιο κοινές μεθόδους για την παρατήρηση βιολογικών και άλλων διαφανών δειγμάτων. Όμως υπάρχει έλλειψη ολοκληρωμένων τεχνικών λήψης και ανάλυσης τρισδιάστατων ιστολογικών δεδομένων με τη χρήση συμβατικής οπτικής μικροσκοπίας διερχόμενου φωτός. Οι υπάρχουσες τεχνικές προσφέρουν κυρίως δισδιάστατα στιγμιότυπα τομών ιστών, παραβλέποντας την περίπλοκη τρισδιάστατη μικροαρχιτεκτονική που παίζει ζωτικό ρόλο στην κατανόηση της λειτουργίας των ιστών, της ανάπτυξης και της εξέλιξης των ασθενειών. Η τρισδιάστατη απεικόνιση είναι εφικτή με χρήση ειδικών μικροσκοπίων τα οποία συνήθως είναι αρκετά ακριβά. Συνεπώς, το ερώτημα που τίθεται είναι κατά πόσο είναι εφικτή η τρισδιάστατη απεικόνιση ενός ιστού με χρήση ενός συμβατικού οπτικού μικροσκοπίου διερχόμενου φωτός. Στην παρούσα διατριβή, αρχικά περιγράφονται οι βασικές αρχές μικροσκοπίας και οι συνήθεις εργαστηριακές τεχνικές στην ιστοπαθολογία. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται δύο τεχνικές για την τρισδιάστατη αναπαράσταση ιστών από εικόνες μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου. Η πρώτη τεχνική αφορά στην αυτοματοποίηση μιας σειράς βημάτων για τη δημιουργία ψηφιακού τρισδιάστατου όγκου ενός ιστού από εικόνες συμβατικού μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου. Συγκεκριμένα, συλλέγονται ψηφιακές εικόνες περιοχής ενδιαφέροντος (ορισμένη από ειδικό) από διαδοχικές τομές ιστού. Στη συνέχεια, χρησιμοποιούνται τεχνικές ευθυγράμμισης εικόνων και παρεμβολής βασισμένης στη βαθιά μάθηση για τη δημιουργία ενός τρισδιάστατου όγκου της περιοχής ενδιαφέροντος. Ειδικός ιστοπαθολόγος αξιολόγησε την πληροφορία που παρέχεται από τον τρισδιάστατο όγκο και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο τρισδιάστατος όγκος ενδέχεται να αποκαλύπτει λεπτομέρειες που δεν είναι σαφώς ορατές ή ακόμη και μη ανιχνεύσιμες στις εικόνες ενός συμβατικού μικροσκοπίου. Σε αντίθεση με άλλες τεχνολογίες τρισδιάστατης απεικόνισης ιστών, η εν λόγω τεχνική έχει τα εξής πλεονεκτήματα: (α) δεν εξαρτάται από την απόσταση του δείγματος από τους αντικειμενικούς φακούς, παράγοντας τρισδιάστατους όγκους ιστών σε οποιαδήποτε επιθυμητή μεγέθυνση. (β) Δεν απαιτεί ειδικό όργανο, μπορεί να εφαρμοστεί με οποιοδήποτε συμβατικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. (γ) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για οποιαδήποτε δεδομένη εφαρμογή ρουτίνας, όχι μόνο για ορισμένες εξειδικευμένες κλινικές μελέτες. Η δεύτερη τεχνική αφορά στην τομογραφική απεικόνιση μίας τομής ιστού με οπτικό τεμαχισμό (σε αντίθεση με την προηγούμενη τεχνική που αφορά σε φυσικό τεμαχισμό του υπό εξέταση ιστού). Αυτή η τεχνική βασίζεται στην ιδέα ότι κάθε τομή ιστού έχει πεπερασμένο πάχος και, επομένως, είναι δυνατή η δημιουργία εικόνων σε διαφορετικά επίπεδα (οπτικός τεμαχισμός) εντός της τομής του ιστού, αποκαλύπτοντας λεπτομέρειες που πιθανώς δεν θα φαίνονταν διαφορετικά. Ο οπτικός τεμαχισμός κατέστη εφικτός με την ανάπτυξη μιας ειδικής διάταξης (με χρήση βηματικού κινητήρα και Arduino) και λογισμικού, που επιτρέπουν την περιστροφή του πλακιδίου με την υπό εξέταση τομή γύρω από τον οριζόντιο άξονα και τη λήψη εικόνας σε κάθε θέση. Η περιστροφή αυτή μετατρέπει το οπτικό μικροσκόπιο σε γεωμετρία αξονικής τομογραφίας περιορισμένου αριθμού προβολών. Με τον τρόπο αυτό, μπορεί να γίνει χρήση αλγορίθμων τομογραφικής ανακατασκευής από προβολές για τον οπτικό τεμαχισμό της τομής ιστού. Δοκιμάστηκαν δύο κλασικοί αλγόριθμοι ανακατασκευής (η φιλτραρισμένη οπισθοπροβολή και η αλγεβρική τεχνική ανακατασκευής). Οι εικόνες που προέκυψαν ήταν ικανοποιητικής ποιότητας, αλλά παρουσίαζαν ορισμένα τεχνικά σφάλματα. Συμπερασματικά, η χρήση κλασικών αλγορίθμων τομογραφικής ανακατασκευής με περιορισμένες αριθμό προβολών, επιτρέπει τη διερεύνηση του δείγματος σε οποιοδήποτε επιθυμητό οπτικό επίπεδο, αποκαλύπτοντας πληροφορίες που θα ήταν δύσκολο να εντοπιστούν όταν εστιάζουμε μόνο στις συμβατικές δισδιάστατες εικόνες μικροσκοπίου.