Leucine-Rich Repeat Malectin Receptor Kinases: a novel group of Arabidopsis thaliana Pattern Recognition Receptors required for cell wall-derived glycans perception and plant immunity activation
Authors:   , Martín Dacal Marina 
Published: October 2024

Plants are constantly challenged by environmental conditions and are exposed to different organisms. Plant cell walls, mainly composed of carbohydrates, are the first barrier that pathogens and other plant-interacting organisms encounter and must overcome to produce a successful infection/invasion. As a consequence of these interactions, a diverse bouquet of glycans, peptides and biocompounds from microorganisms (Microbe-Associated Molecular Patterns, MAMPs) and plants (Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs) are released and perceived by plant Pattern Recognition Receptors (PRRs) activating one of the first layers of immunity in plants, the Pattern-Triggered Immunity (PTI). However, most of the PRRs described perceive peptidic MAMPs and DAMPs, even though in recent years numerous glycans triggering immunity in plants have been characterized.

In this context, the main objective of this thesis is the identification and functional characterization of molecular components involved in the plant immune response mediated by cell wall-derived glycans, to expand the knowledge in this field. For this, a genetic screening of a chemically mutagenized Arabidopsis thaliana population was carried out to identify mutants impaired in glycan perception (igp). Using this strategy, Arabidopsis thaliana igps impaired in perception of Mixed-Linked Glucans (such as MLG43) and cellulose-derived oligosaccharides, such as cellotriose (CEL3), were isolated.

The characterization of igps resulted in the identification of mutations in the genes that encode three receptor kinases (RKs) - AT1G56145 (IGP1), AT1G56130 (IGP2/IGP3) and AT1G56140 (IGP4) - with Leucine-Rich-Repeats (LRR) and malectin (MAL) domains in their ectodomains. igp1 and igp2/3 mutant plants contain a point mutation E906K and G773E, respectively, in their kinase domains, while igp4 is a loss-of-function mutant with a T-DNA insertion (identified in the laboratory in parallel in a Genome-Wide Association Study (GWAS)-type experimental approach). Notably, Isothermal Titration Calorimetry (ITC) assays showed that the ectodomain of IGP1 binds with high affinity CEL3 and cellopentaose (CEL5), but not MLG43, supporting its function as a PRR of cellulose-derived oligosaccharides. These data suggest that IGP1 is the main cellulose receptor, and that IGP3 and IGP4 can be considered molecular components that participate as co-receptors of CEL3 and MLG43 since mutations in their coding sequences render plants unable to perceive these compounds.

On the other hand, we have demonstrated that these LRR-MAL RKs also participate in the perception of additional glycans, since igp mutants are affected in different PTI hallmarks such as calcium influxes, Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) phosphorylation and upregulation of defence genes after treatments with xylotetraose (XYL4) and 33--L-arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX). These facts raise the relevance of IGPs in glycans perception and downstream signalling activation.

The results obtained in this Thesis highlight the importance of glycan in plant immunity and represent a step forward in the field of cell wall-derived immunity through the discovery of a new group of RKs that participate in glycan perception. The LRR-MAL RKs family opens new research opportunities that would allow to identify other PRRs involved in the perception of carbohydrates. A further understanding of these mechanisms of glycan perception by IGPs identified will help to develop bio-protection strategies for crop resistance.

RESUMEN

Las plantas se enfrentan a un desafío constante provocado por factores de estrés (a)bióticos procedentes del entorno que las rodea. Las paredes celulares de las plantas, compuestas principalmente por carbohidratos, son la primera barrera a la que se enfrentan los patógenos y otros organismos y tienen que superar para producir una infección/invasión exitosa. Como consecuencia de esta interacción, numerosos glicanos, péptidos y material genético tanto de los microorganismos (Microbe-Associated Molecular Patterns MAMPs) como de la planta (Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs) son liberados y percibidos por los receptores de reconocimiento de patrones o PRRs (Pattern Recognition Receptors) activando una de las primeras capas de inmunidad en las plantas mediada por patrones o PTI (Pattern-Triggered Immunity). Sin embargo, la mayor parte de PRRs descritos perciben MAMPs y DAMPs de naturaleza peptídica, a pesar de que en los últimos años se han caracterizado numerosos glicanos capaces de activar inmunidad en plantas.

En este contexto, el principal objetivo de esta Tesis es la identificación y caracterización funcional de componentes moleculares implicados en la respuesta inmune de las plantas mediada por glicanos derivados de la pared celular, con el fin de expandir el conocimiento en este campo. Para ello, se llevó a cabo un cribado genético de plantas mutadas químicamente. De esta manera, se aislaron y caracterizaron mutantes de Arabidopsis thaliana denominados igps (impaired in glycan perception), incapaces de percibir -glicanos, debido a su falta de respuesta ante tratamientos con glucanos mixtos (Mixed-Linked Glucans; como el MLG43) y oligosacáridos derivados de celulosa como la celotriosa (CEL3).

La caracterización de estos mutantes nos permitió identificar mutaciones en genes que codifican para tres receptores de tipo kinasa (RKs) denominados- AT1G56145 (IGP1), AT1G56130 (IGP2/IGP3) y AT1G56140 (IGP4). Estas proteínas portan un ectodominio compuesto por una sección con repeticiones ricas en leucina (LRR) y un dominio malectina (MAL). igp1 e igp2/3 contienen una mutación puntual de tipo E906K y G773E, respectivamente, en sus dominios kinasa, mientras que igp4 es un mutante de pérdida de función con una inserción de T-DNA (identificado paralelamente en una aproximación de asociación de genoma completo o GWAS). Cabe destacar que los ensayos de Calorimetría de Titración Isotérmica (ITC) mostraron que el ectodominio de IGP1 une con alta afinidad CEL3 y celopentaosa (CEL5), pero no MLG43, apoyando su función como un PRR de oligosacáridos derivados de celulosa. Estos datos sugieren que, a pesar de ser IGP1 el principal receptor de celulosa, IGP3 e IGP4 pueden considerarse componentes moleculares que participan como co-receptores de CEL3 y MLG43 ya que los respectivos mutantes no son capaces de percibir estos compuestos.

Por otro lado, se comprobó que estas RKs participan en la percepción de glicanos adicionales derivados de xilosa como xilotetraosa (XYL4) y 33--L-arabinofuranosil-xilotetraosa (XA3XX). Los mutantes igp están afectados en la PTI tras los tratamientos con estos glicanos, presentando una respuesta baja o nula de la activación de flujos de calcio, fosforilación de proteínas kinasa y transcripción de genes de defensa en respuesta a XYL4 y XA3XX. Estos hechos elevan la relevancia de los IGPs en la percepción de glicanos.

Los resultados obtenidos en esta Tesis no solo apoyan la importancia de la percepción de glicanos en la inmunidad de las plantas, sino que también suponen un gran avance para el campo ya que se ha descrito un nuevo grupo de RKs que participan en la percepción de los mismos. La familia LRR-MAL RKs abre una nueva vía a futuras investigaciones que permitan encontrar nuevos PRRs implicados en la percepción de carbohidratos. Una mayor comprensión de estos mecanismos ayudará a desarrollar estrategias de bioprotección permitiendo una mayor resistencia de los cultivo.