Γονιδιωματική ρύθμιση της έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών
Authors: Παπαγιαννόπουλος Χρήστος 
Published: February 2022

Τα ριβοσώματα αποτελούν εξαιρετικά συντηρημένες μοριακές μηχανές, υπεύθυνες για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών σε όλα τα ζωντανά κύτταρα. Για την βιογένεση κάθε ριβοσώματος απαιτείται η στοιχειομετρική συναρμογή 80 ριβοσωμικών πρωτεϊνών (Ribosomal Proteins- RPs) και 4 ριβοσωμικών RNAs σε δυο ριβοσωμικές υπομονάδες, τις 40S και 60S. Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι οι μεταλλάξεις πολλαπλών RP γονιδίων σχετίζονται με την ανάπτυξη και την προώθηση μιας ομάδας γενετικών διαταραχών που ονομάζονται ριβοσωμοπάθειες καθώς και επίκτητων ασθενειών, όπως ο καρκίνος. Στις συγκεκριμένες ασθένειες διαπιστώνεται μια ευαισθησία της αναπτυξιακής διεργασίας της ερυθροποίησης, καθώς οι ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες εκδηλώνουν σχεδόν αποκλειστικά αδυναμία παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων (ανεπαρκής ερυθροποίηση) χωρίς άλλες εμφανείς διαταραχές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής καταγραφή του ρόλου και της λειτουργίας του ριβοσώματος σε κύτταρα που υπόκεινται ερυθροκυτταρική διαφοροποίηση, της διαδικασίας δηλαδή η οποία απορρυθμίζεται δραματικά σε ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες. Ως εκ τούτου, κεντρικοί στόχοι της διατριβής αποτελούν: α) Η καταγραφή των επιπέδων των ριβοσωμάτων, β) ο λεπτομερής χαρακτηρισμός της ριβοσωμικής σύνθεσης, μέσω της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης απομονωμένων ριβοσωμάτων από στάδια της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης και γ) Ο εντοπισμός ρυθμιστών της ριβοσωμικής βιογένεσης με στόχο την φαρμακολογική αξιοποίησή τους στις ριβοσωμοπάθειες ή στον καρκίνο. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων αξιοποιήθηκαν καθιερωμένα κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης, ιδιαιτέρως η ερυθρολευχαιμική σειρά Murine Erythroleukemia (MEL) Cells. Για την μελέτη των ριβοσωμάτων καθιερώθηκε και εκτελέσθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης βασισμένο στην υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας σακχαρόζης. Τα απομονωμένα και καθαρισμένα ριβοσώματα αναλύθηκαν με τη χρήση της τεχνικής φασματομετρίας μάζας σε σειρά. Παρατηρήθηκε ότι τα ριβοσώματα υφίστανται αυστηρή ρύθμιση στη διάρκεια της διαφοροποίησης, που χαρακτηρίζεται από αύξηση των επίπεδων των μονοσωμάτων και μείωση των πολυσωμάτων. Επιπλέον, στα πλαίσια της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης των ριβοσωμάτων στα MEL κύτταρα εντοπίσθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες και 1183 πρωτεΐνες που συνδέονται με το ριβόσωμα. Η ποσοτική πρωτεϊνωματική ανάλυση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ανέδειξε ότι η στοιχειομετρία της βασικής δομής του ριβοσώματος (των 78 ριβοσωμικών πρωτεϊνών) παραμένει αμετάβλητη στην διάρκεια της ερυθροδιαφοροποίησης. Η συγκεκριμένη παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι 7 ριβοσωμικών πρωτεϊνών καθώς και με την ανάλυση δημοσιευμένων πρωτεϊνωματικών δεδομένων από 4 επιπλέον κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης. Ακόμη, διερευνήθηκε η ρύθμιση των πρωτεϊνών που συνδέονται με το ριβόσωμα στα απομονωμένα ριβοσώματα των MEL κυττάρων. Στο πλαίσιο αυτής της ανάλυσης παρατηρήθηκε ότι οι 169 πρωτεΐνες ρυθμίζονται θετικά και οι 85 πρωτεΐνες μειώνουν τη συνδεσιμότητά τους με το ριβόσωμα στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Η μοριακή λειτουργία των παραπάνω πρωτεϊνών βρέθηκε να αφορά ενδοκυτταρικές λειτουργίες, όπως η σύνδεση με RNA, το εναλλακτικό μάτισμα και η μιτοχονδριακή λειτουργία. Τέλος, παράλληλα με την εκτέλεση του κύριου μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στο πλαίσιο του εντοπισμού ρυθμιστών της ερυθροδιαφοροποίησης που επηρεάζουν τη λειτουργία του ριβοσώματος, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή της δράσης του microRNA: miR-16-5p σε διάφορα καρκινικά κυτταρικά μοντέλα. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ένα πολύπλευρο ογκοκατασταλτικό ρόλο του miR-16-5p σε κύτταρα ερυθρολευχαιμικά και καρκίνου του μαστού. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αποτελεί μια ολοκληρωμένη ανάλυση του πρωτεϊνωματικού φάσματος του ριβοσώματος στην ερυθροδιαφοροποίηση με σημαντικές προεκτάσεις για την κατανόηση των ριβοσωμοπαθειών και των αιματολογικών νεοπλασιών.