Διερεύνηση της προγνωστικής και προβλεπτικής σημασίας επιγενετικών βιοδεικτών στον καρκίνο του μαστού και άλλους γυναικολογικούς καρκίνους
Authors: Παναγοπούλου-Πανταζή Μαρία 
Published: September 2021

Η DNA μεθυλίωση αποτελεί τον καλύτερα μελετημένο επιγενετικό μηχανισμό. Στον καρκίνο παρατηρείται παρεκκλίνουσα μεθυλίωση συνήθως στους υποκινητές ογκοκατασταλτικών γονιδίων και καταστολέων της μετάστασης με αποτέλεσμα την απώλεια του προστατευτικού τους ρόλου. Έχει αποδειχθεί ότι τα μη φυσιολογικά πρότυπα DNA μεθυλίωσης που υπάρχουν στις κακοήθειες μπορούν να ανιχνευτούν στα βιοϋλικά της «υγρής βιοψίας» των ασθενών και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να αξιολογηθούν περαιτέρω ως ελάχιστα επεμβατικοί βιοδείκτες με κλινική αξία. Το κυκλοφορούν ελεύθερο κυττάρων DNA (ccfDNA) μπορεί εύκολα να απομονωθεί από βιολογικά υγρά όπως το πλάσμα/ορό. Ως εκ τούτου, πλήθος ερευνών πραγματοποιούνται με σκοπό την ταυτοποίηση και αξιολόγηση υπογραφών της DNA μεθυλίωσης. Θέλοντας να ανιχνεύσουμε και να αξιολογήσουμε τέτοιου είδους βιοδείκτες, μελετήσαμε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης γονιδίων στον καρκίνο του τραχήλου και του μαστού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε τρία διακριτά μέρη.Στον τράχηλο της μήτρας έχει αποδειχθεί ότι η μόλυνση από τα υψηλού κινδύνου στελέχη των υποτύπων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (ΗRHPV) μπορεί να προκαλέσει την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήσαμε για πρώτη φορά τη DNA μεθυλίωση των γονιδίων BRMS1 και WNT5A σε τραχηλικά επιχρίσματα 64 γυναικών χωρίς μόλυνση από τα στελέχη HRHPV, σε 70 γυναίκες με αποδεδειγμένη μόλυνση από τα στελέχη HRHPV και σε βιοψίες τραχηλικού ιστού χρησιμοποιώντας ποσοτική ειδική για την μεθυλίωση PCR (qMSP). Η μεθυλίωση του BRMS1 ανιχνεύθηκε στατιστικώς σημαντικά συχνότερα στις γυναίκες χωρίς λοίμωξη από τους HRHPV σε σχέση με τις γυναίκες με λοίμωξη από τους HRHPV ή με παθολογική ιστολογία. Το αντίθετο παρατηρήθηκε στη περίπτωση του WNT5A όπου ανιχνεύθηκε στατιστικώς σημαντικά συχνότερα μεθυλιωμένο στις γυναίκες με λοίμωξη από τους HRHPV και με παθολογική ιστολογία. Επιπλέον αναλύθηκε η πρωτεϊνική έκφραση του BRMS1 με ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες τραχηλικού ιστού όπου αποκάλυψε πυρηνική θετική χρώση στο φυσιολογικό χωρίς HRHPV μόλυνση επιθήλιο, στις ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις και στον καρκινικό ιστό, όπου παρατηρήθηκε και περιστασιακή κυτταροπλασματική χρώση. Στον καρκίνο, η έκφραση ήταν ισχυρότερη στις περισσότερο διαφοροποιημένες καρκινικές βλάστες, ενώ απουσίαζε στις καρκινικές βλάστες χαμηλής διαφοροποίησης όπου πιθανόν να σχετίζεται με τη μεθυλίωση του γονιδίου. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν την αξία της προσθήκης επιγενετικών βιοδεικτών στα προγράμματα πρόληψης και στην κλινική διαχείριση του καρκίνου του τραχήλου.Στο δεύτερο μέρος, αναλύσαμε την κινητική και το μηχανισμό απελευθέρωσής του ccfDNA in vitro. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε καλλιέργειες HeLa και MCF-7 κυττάρων. Οι κανονικοποιημένοι δείκτες της συγκέντρωσης του ccfDNA ανά κυτταρικό πληθυσμό μειώθηκαν με το χρόνο της καλλιέργειας αλλά αυξήθηκαν στατιστικώς σημαντικά έπειτα από έκθεση των κυττάρων στην IC50 δόση του αποπτωτικού/απομεθυλιωτικού παράγοντα 5-Aζακετιδίνη. Η κατανομή των θραυσμάτων του ccfDNA ήταν αντιπροσωπευτική της ενεργής απελευθέρωσης, ενώ η έκθεση στην 5-Aζακετιδίνη προκάλεσε την παραγωγή αποπτωτικών θραυσμάτων. Επιπλέον, έπειτα από ανάλυση με qMSP, παρατηρήσαμε ότι το προφίλ της DNA μεθυλίωσης των γονιδίων SOX17, WNT5A, MSH2, KLK10 και GATA3 στο γενωμικό DNA (gDNA) των κυττάρων διατηρείται στο αντίστοιχο ccfDNA πριν και μετά την έκθεση στην 5-Aζακετιδίνη. Η παρούσα μελέτη εξέτασε για πρώτη φορά τη διατήρηση της DNA μεθυλίωσης στο ccfDNA μετά την απελευθέρωση του in vitro. Τα αποτελέσματα αυτά εμπλουτίζουν τη γνώση σχετικά με τη βιολογία του ccfDNA και ενισχύουν την αξιοπιστία του ως ένα κλινικά χρήσιμο βιοϋλικό. Στον καρκίνο του μαστού μελετήσαμε την προγνωστική και προβλεπτική δυναμική παραμέτρων του ccfDNA. Η ομάδες αποτελούνταν από 150 και 16 ασθενείς με καρκίνο του μαστού, υπό επικουρική και προ-εγχειρητική θεραπεία αντιστοίχως, 34 ασθενείς με μεταστατική νόσο και 35 υγιείς εθελοντές. Η απευθείας ποσοτικοποίηση του ccfDNA στο πλάσμα υπέδειξε αυξημένη συγκέντρωση η οποία συσχετίστηκε με τη συχνότητα των θανάτων, το βραχύτερο διάστημα ελεύθερο προόδου νόσου και την απουσία ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία στην ομάδα των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο. Επιπλέον, ο μεγαλύτερος αριθμός θραυσμάτων του ccfDNA σχετίστηκε με τα αυξημένα επίπεδα ccfDNA, το μέγεθος του όγκου και τη συχνότητα των θανάτων. Η κατάσταση μεθυλίωσης των εξεταζόμενων γονιδίων SOX17, MSH2, KLK10, WNT5A εκτός του GATA3, ανιχνεύτηκε συχνότερα θετική στο ccfDNA σε όλες τις ομάδες ασθενών από ότι στα υγιή άτομα. Επιπλέον, προέκυψαν στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις της μεθυλίωσης των γονιδίων WNT5A, KLK10 και SOX17 με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και τη πορεία της νόσου. Η ανάλυση ταξινόμησης με ένα πλήρως αυτοματοποιημένο λογισμικό μηχανικής μάθησης παρήγαγε ένα μονοπαραγοντικό γραμμικό μοντέλο για την συγκέντρωση του ccfDNA στο πλάσμα με μεγάλη διακριτική ισχύ για την πρόβλεψη ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία (AUC 0,803, 95% CI [0,606, 1,000]) στην ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Δύο επιπλέον πολυπαραγοντικές υπογραφές παρήχθησαν για την ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Τέλος, κατασκευάστηκε ένα μοντέλο πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης που διέκρινε τους ασθενείς από τους υγιείς. Έπειτα από προοπτική κλινική αξιολόγηση, όλοι οι παραγόμενοι ταξινομητές πιθανόν να βοηθήσουν στην ακριβή πρόγνωση και πρόβλεψη στον μεταστατικό καρκίνο του μαστού.Συνολικά, η μελέτη μας εμπλουτίζει σημαντικά τη γνώση σχετικά με τη βιολογία του ccfDNA στον καρκίνο και αποδεικνύει ότι αποτελεί πολύτιμη πηγή βιολογικού υλικού υγρής βιοψίας. Θεωρούμε ότι ειδικά μοτίβα μεθυλίωσης όπως ανιχνεύονται είτε στο τραχηλικό επίχρισμα είτε στο ccfDNA μπορεί να αποτελούν ελάχιστα επεμβατικούς επιγενετικούς/φαρμακοεπιγενετικούς βιοδείκτες, που θα συνδράμουν στην κλινική διαχείριση των υπό μελέτη νεοπλασιών.