Μελέτη του ρόλου του κυτταροστατικού παράγοντα Εmi2 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των ωοκυττάρων και των προεμφυτευτικών εμβρύων των θηλαστικών
Authors: Νιάκα Κωνσταντίνα 
Published: October 2022

Τα ωοκύτταρα των θηλαστικών εισέρχονται στη μείωση πριν από τη γέννηση, όπου παραμένουν ακινητοποιημένα στη φάση G2/πρόφαση Ι του κυτταρικού κύκλου. Στην εφηβεία, η αύξηση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού εμμηνορρυσιακού κύκλου προκαλεί την ενεργοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης B1/Cdk1 και οδηγεί στην είσοδο στην πρώτη μειωτική φάση Μ (MI) (Adhikari et al., 2012; Chesnel & Eppig, 1995; J. Eppig, 1996). Η πρόωρη εμμηνόπαυση και η εξάντληση του αποθεματικού ωοκυττάρων μπορεί να συμβεί εάν τα ωοκύτταρα εγκαταλείψουν αυθόρμητα τη G2/πρόφαση. Οι μηχανισμοί που επάγουν την ακινητοποίηση αυτή είναι η αναστολή της δραστηριότητας της κυκλίνης Β1/Cdk1. Κατά τη διάρκεια της ακινητοποίησης, το σύμπλοκο κυκλίνη Β1/Cdk1 παραμένει σε χαμηλά επίπεδα λόγω της δράσης της λιγάσης APC/C. Tα ωοκύτταρα αφού εξέλθουν της ακινητοποίησης αυτής εισέρχονται στη ΜΙ. Όπως και στη μίτωση έτσι και στη μείωση, η έξοδος από τη MI απαιτεί την πρωτεολυτική αποικοδόμηση της σεκιουρίνης (Securin) και της κυκλίνης Β1 μέσω της δράσης λιγάσης APC/C και την επακόλουθη αδρανοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης Β1/Cdk1 (Prinz, Hwang, Visintin, & Amon, 1998). Στη συνέχεια, το ωοκύτταρο εισέρχεται στη δεύτερη μειωτική φάση Μ και ακινητοποιείται στη μεταφάση II (MII) εν αναμονή της γονιμοποίησης (Masui, 2000). Η ακινητοποίηση στη μετάφαση ΙΙ της μείωσης συντηρείται από τη δραστηριότητα της κυτταροστατικής ενεργότητας CSF (Cytostatic Factor) που εμποδίζει τη δράση της λιγάσης APC/C (B. J. Tunquist & Maller, 2003). O CSF περιλαμβάνει το μονοπάτι Mos/MAPK και τον ωοκύτταρο-ειδικό αναστολέα της APC/C, Emi2 (Fbxo43) (Madgwick et al., 2006; Nishiyama et al., 2007). Ο Emi2 είναι ο τελικός στόχος μίας αλληλουχίας αντιδράσεων που έχουν ως αφετηρία την ωοκύτταρο-ειδική κινάση Mos. Ο παράγοντας Mos οδηγεί σε ενεργοποίηση την κινάση MAPK που φωσφορυλιώνει τον Emi2 και τον καθιστά διαθέσιμο στη PP2A φωσφατάση (Tung et al., 2005). Η επιτήρηση της ορθής πορείας της ΜΙ γίνεται από τον μηχανισμό ελέγχου της ατράκτου (Spindle Assembly Checkpoint ,SAC) . Και στη MI και στη μίτωση, ο ρόλος του SAC είναι να ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου της φάσης Μ και συγκεκριμένα να εμποδίσει τη δράση της APC/C, έτσι ώστε να καθυστερήσει η ανάφαση έως ότου όλα τα χρωμοσώματα να είναι ευθυγραμμισμένα και συνδεδεμένα στους μικροσωληνίσκους της ατράκτου. Τα μη ευθυγραμμισμένα χρωμοσώματα προκαλούν την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου και την καθυστέρηση ή την παρεμπόδιση της κυτταροδιαίρεσης (Musacchio & Salmon, 2007; Yu, 2002). Στα μιτωτικά κύτταρα, η παρατεταμένη SAC-εξαρτώμενη διακοπή της φάσης Mοδηγεί σε μιτωτική καταστροφή, ένα γεγονός κατά το οποίο ένα κύτταρο καταστρέφεται κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Δυσλειτουργία του SAC, τόσο στα μειωτικά όσο και στα σωματικά κύτταρα, οδηγεί σε μη σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και τη δημιουργία ανευπλοειδών θυγατρικών κυττάρων (Musacchio & Salmon, 2007). Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί σε βάθος ο ρόλος και η λειτουργία του κυτταροστατικού παράγοντα Εmi2 κατά τη μείωση των ωoκυττάρων, κατά την προεμφυτευτική ανάπτυξη των εμβρύων του ποντικού και στη μίτωση των σωματικών κυττάρων. Αρχικά ελέγχθηκε αν η ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ λόγω βλάβης της ατράκτου παρουσιάζει χαρακτηριστικά του CSF. Προκειμένου να εξεταστεί αυτό το ερώτημα προκλήθηκε μια εξαρτώμενη από τον SAC ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ, επωάζοντας ωοκύτταρα ποντικού με ταξόλη ή νοκοδαζόλη. Στη συνέχεια, τα ωοκύτταρα που είχαν ακινητοποιηθεί στη ΜΙ με κάποιο από αυτούς τους φαρμακολογικούς παράγοντες υποβλήθηκαν σε επίδραση με SrCl2 (που ενεργοποιεί τις ταλαντώσεις Ca2+) και σε πειραματικές διαδικασίες που επηρεάζουν παράγοντες, όπως η MAPK και η CaMKII, που σχετίζονται με την ακινητοποίηση από τον CSF. Τα ωοκύτταρα κατάφεραν να εξέλθουν της ακινητοποίησης. Επομένως, η ακινητοποίηση στα ωοκύτταρα ποντικού φαίνεται ότι ρυθμίζεται από τον CSF, με τρόπο παρόμοιο με τα ωοκύτταρα που έχουν ακινητοποιηθεί στη ΜΙΙ. Γνωρίζοντας από τη βιβλιογραφία ότι ο κυτταροστατικός παράγοντας Emi2 είναι ο κύριος ρυθμιστής του CSF στα ωοκύτταρα των σπονδυλωτών που βρίσκονται ακινητοποιημένα στη φάση ΜII (Madgwick et al., 2006; Shoji et al., 2006), εξετάστηκε αν είναι υπεύθυνος και για την ρύθμιση των χαρακτηριστικών τύπου CSF κατά την ακινητοποίηση στη ΜΙ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ισχυρή ακινητοποίηση στη MI που προκαλείται από τον SAC παρουσία βλάβης στο σχηματισμό και στη δομή της ατράκτου, διακόπτεται όταν ο Emi2 απουσιάζει.Ο φαινότυπος κατακερματισμένων ωοκυττάρων, η αποσυμπυκνωμένη χρωματίνη και ο σχηματισμός μικροπυρήνων/προπυρήνων, που εντοπίστηκαν στα ωοκύτταρα που είχε αποσιωπηθεί ο Emi2 παρουσία ενεργοποιημένου SAC και εξέρχονταν της ακινητοποίησης στη ΜΙ αποτέλεσαν κύριες ενδείξεις απενεργοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης Β1/Cdk1. Τα πειράματά μας, έδειξαν πως απουσία του Emi2, η απενεργοποίηση του συμπλόκου, παρουσία ταξόλης, συμβαίνει λόγω ενεργοποίησης της λιγάσης APC/C και πως και καταλήγει σε έξοδο από τη ΜΙ. Είναι γνωστό όπως αναφέραμε και παραπάνω πως ένα ισχυρό σημείο ελέγχου που εξαρτάται από το SAC ξεκινά ως απόκριση σε βλάβη της ατράκτου. Εντούτοις, θελήσαμε να δούμε αν η παρουσία του SAC επηρεάζεται κατά τη διάρκεια της ακινητοποίησης στη ΜΙ. Εντοπίσαμε ότι ο SAC φθίνει στην πορεία ακινητοποίησης στη ΜΙ. Επομένως, ο Emi2 είναι υπεύθυνος για την αντιστάθμιση της αποδυνάμωσης του SAC και επιτρέπει τη διατήρηση της ακινητοποίησης στη MI. Απουσία του Emi2, η σταδιακή αποδυνάμωση του SAC δεν επιτρέπει τη διατήρηση του σημείου ελέγχου, οδηγώντας σε πλήρη δραστηριότητα της APC/C και στην έξοδο από τη MI.Όταν ο Emi2 υπερεκφράστηκε σε ωοκύτταρα ποντικού αυτά παρέμειναν ακινητοποιημένα στη ΜΙ, η έκφρασή του εντοπίστηκε στην περιοχή της ατράκτου και διερευνήθηκε από ποιους παράγοντες επηρεάζεται αυτή η ακινητοποίηση. Διαπιστώθηκε πως ο Emi2 από μόνος του ήταν επαρκής για να προκαλέσει ακινητοποίηση στη MI στα ωοκύτταρα ποντικού και η εξαρτώμενη από τον Emi2 ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ ρυθμίζεται από τους ίδιους μηχανισμούς που ρυθμίζουν και την ακινητοποίηση στη φάση ΜΙΙ.Στη συνέχεια, εξετάσαμε τον ρόλο του Emi2 στη G2/πρόφαση Ι. Στα ωοκύτταρα που βρίσκονταν ακινητοποιημένα στη G2/πρόφαση Ι φάνηκε πως η αποσιώπηση του Emi2 οδηγεί σε αυθόρμητη έξοδο των ωοκυττάρων από την ακινητοποίηση αυτή. Αντίθετά, η υπερέκφρασή του Emi2 οδηγεί σε καθυστέρηση της αυθόρμητης εξόδου από τη G2/πρόφαση Ι. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων, μας οδηγούν στο συμπέρασμα πως ο Emi2 είναι απαραίτητος για τη διατήρηση της κατάστασης ακινητοποίησης στη G2/πρόφαση Ι των ωοκυττάρων του ποντικού. Επίσης, ο πυρηνικός εντοπισμός του Emi2 σε αυτή την φάση του κυτταρικού κύκλου μας ωθεί στη διαπίστωση ότι η δράση του στην πρόφαση των ωοκυττάρων του ποντικού αφορά την πυρηνική αναστολής της APC/C.Στη συνέχεια, μελετήσαμε τον ρόλο του Emi2 σε μιτωτικά κύτταρα, όπως εμβρυικά κύτταρα στη φάση της αυλάκωσης και κυτταροκαλλιέργειες σωματικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα στα εμβρυικά κύτταρα μας οδήγησαν στο συμπέρασμα πως ο Emi2 δεν εκφράζεται στο στάδιο των δύο ή τεσσάρων κυττάρων των εμβρύων ποντικού. Στις κυτταρικές σειρές HEK293 και HeLa, η υπερέκφραση του Emi2 δείχνει να οδηγεί σε ακινητοποίηση στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου στη μίτωση. Επιπλέον, ο Emi2, ενδεχομένως να δρα ως κυτταροστατικός παράγοντας στα σωματικά κύτταρα, καθώς η εξωγενής εισαγωγή του Emi2 επιβράδυνε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης κατέδειξαν τη μεγάλη σημασία του κυτταροστατικόυ ρόλου του Emi2 για την επιτήρηση της πορείας της μείωσης Ι. Επιπλέον, από τα πειραματικά μας αποτελέσματα, διαπιστώνουμε ότι ο Emi2 μπορεί να επιδρά κυτταροστατικά και στα σωματικά κύτταρα. Αυτή η παρατήρηση, ενδεχομένως να επιτρέψει στο μέλλον τη φαρμακευτική χρήση του Emi2 για την καταστολή πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, όπως είναι τα καρκινικά κύτταρα.