A role of RGS proteins in opiate actions
Authors: Γασπαρή Σεβαστή 
Published: September 2021

Τα οποιοειδή αναλγητικά φάρμακα αποτελούν μια από τις πιο αποτελεσματικές θεραπείες σε περιπτώσεις οξέος πόνου, αλλά η χρόνια χρήση τους αντενδείκνυται λόγω της ανάπτυξης αναλγητικής αντοχής καθώς και φαινομένων εξάρτησης και εθισμού. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται τόσο για τις αναλγητικές τους ιδιότητες, όσο και για την εμφάνιση των ανεπιθύμητων παρενεργειών, θα αποτελούσε σημαντική συνεισφορά στην βελτίωση της θεραπείας κατά του χρόνιου πόνου. Υπό αυτό το πρίσμα, σκοπό της εν λόγω διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των RGS πρωτεϊνών (ρυθμιστές της σηματοδότησης μέσω G πρωτεϊνών) στις δράσεις των οποιοειδών. Οι RGS πρωτεΐνες αποτελούν κύριο ρυθμιστή της σηματοδότησης μέσω υποδοχέων συνδεδεμένων με G-πρωτεΐνες (GPCR), επηρεάζοντας τόσο την διάρκεια όσο και την κατεύθυνση της σηματοδότησης δια της αλληλεπίδρασής τους με τις ετεροτριμερείς Gα υπομονάδες. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε σε δύο μέλη της RGS οικογένειας, που εμπλέκονται στην σηματοδότηση μέσω του μ υποδοχέα των οποιοειδών (MOPR), την RGS9-2 και την RGSz1. Συγκεκριμένα, η διατριβή αποτελείται από τρείς επιμέρους ερευνητικούς σκοπούς:Πρώτο σκοπό αποτέλεσε η μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης RGS9-2 στις δράσεις της οξυκωδόνης με ή χωρίς την παρουσία χρόνιου πόνου. Η πρωτεΐνη RGS9-2 εκφράζεται κατά βάση στην περιοχή του ραβδωτού και είναι γνωστή η σημαντικότατη δράση της στην σηματοδότηση μέσω του MOPR. Αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή τόσο των αναλγητικών όσο και των ανταμοιβικών δράσεων της μορφίνης, ενώ παράλληλα συμβάλλει στην ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Αντιθέτως, φέρεται ως θετικός ρυθμιστής άλλων αγωνιστών του MOPR, όπως η μεθαδόνη και η φαιντανύλη. Εν προκειμένω διερευνήθηκε ο ρόλος της στις δράσης ενός ακόμη αγωνιστή του MOPR, ο οποίος παρουσιάζει εκθετικά αυξανόμενη χρήση καθώς και κατάχρηση τα τελευταία χρόνια, της οξυκωδόνης. Χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια με έλλειψη του Rgs9 γονιδίου (RGS9KO), παρατηρήθηκε ότι η RGS9-2 συμβάλλει στην εγκαθίδρυση των ανταμοιβικών δράσεων της οξυκωδόνης σε υγιή ζώα καθώς και σε ζώα που έχουν υποβληθεί σε μοντέλο χρόνιου νευροπαθητικού πόνου. Επιπλέον, ενώ η RGS9-2 δεν επηρεάζει τις άμεσες αναλγητικές δράσεις του φαρμάκου, παρεμποδίζει την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Σε γενικές γραμμές, τα ανωτέρω αναφερόμενα αποτελέσματα παρέχουν νέες πληροφορίες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν τις αναλγητικές και ανταμοιβικές δράσεις της οξυκωδόνης.Ο δεύτερος ερευνητικός στόχος της διατριβής αφορά τον ρόλο της RGSz1 στις δράσεις των οποιοειδών. Η RGSz1 είναι μια μικρή RGS πρωτεΐνη, εκφραζόμενη κατά κύριο λόγο στον εγκέφαλο, η οποία εμφανίζει ιδιαίτερα υψηλή ειδικότητα για τις Gαz υπομονάδες και φέρεται να10εμπλέκεται στην ρύθμιση του MOPR καθώς και του υποδοχέα σεροτονίνης 1Α (Htr1A). Με την χρήση γενετικά τροποποιημένων ποντικών με ολική ή μερική καταστολή έκφρασης της RGSz1, παρατηρήθηκε ότι οι αναλγητικές ιδιότητες διαφόρων αγωνιστών του MOPR αυξάνονται έπειτα από παρεμπόδιση της δράσης της πρωτεΐνης τόσο σε αρσενικά όσο και σε θηλυκά ποντίκια. Επιπλέον, σημειώθηκε καθυστέρηση στην ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής στη μορφίνη, με ταυτόχρονη μείωση των ανταμοιβικών δράσεων του φαρμάκου. Πειράματα αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing), σε συνδυασμό με βιοχημικά πειράματα προσδιορισμού επιπέδων έκφρασης καθώς και υποκυττάριου εντοπισμού πρωτεϊνών, ανέδειξαν τον μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου η RGSz1 στην περιϋδραγωγό φαιά ουσία (PAG) επηρεάζει την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής στην μορφίνη. Παρατηρήθηκε ότι η επανειλημμένη χορήγηση μορφίνης ενισχύει τη δράση της RGSz1 στο PAG, η οποία με τη σειρά της συμβάλλει στην καταστολή της σηματοδότησης μέσω του μονοπατιού Wnt/β-catenin προάγοντας την ανάπτυξη αναλγητικής ανοχής. Αντιστρόφως, παρεμπόδιση της δράσης της RGSz1 έχει ως αποτέλεσμα την διατήρηση σταθερότερων συμπλόκων Axin2-Gαz κοντά στην πλασματική μεμβράνη, γεγονός που οδηγεί σε ενεργοποίηση της β-catenin και αναστολή ανάπτυξης αναλγητικής ανοχής. Συνοψίζοντας, τα εν λόγω δεδομένα υποδεικνύουν την σημαντικότητα της στόχευσης των αλληλεπιδράσεων των RGS πρωτεϊνών, και συγκεκριμένα του συμπλόκου RGSz1-Gαz, για την βελτίωση της αναλγητικής δράσης των οποιοειδών χωρίς αύξηση της πιθανότητας ανάπτυξης εθισμού.Τέλος, ο τρίτος ερευνητικός σκοπός της μελέτης επικεντρώθηκε στον ρόλο της RGSz1, τόσο στις συμπεριφορικές αποκρίσεις όσο και στις βιοχημικές προσαρμογές, σε ζωικά μοντέλα χρόνιου πόνου. Χρησιμοποιώντας ευρέως εδραιωμένα ζωικά μοντέλα χρόνιου πόνου, παρατηρήθηκε ότι αναστολή έκφρασης της RGSz1 στο PAG θηλυκών ποντικών, οδηγεί σε παρατεταμένες αλγαισθητικές αποκρίσεις σε περιπτώσεις φλεγμονώδους ή νευροπαθητικού πόνου. Επιπλέον, συνδυάζοντας βασικές τεχνικές μοριακής βιολογίας (Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, ανοσοαποτύπωση) με πειράματα αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA sequencing) διαπιστώθηκε ότι υπό καταστάσεις χρόνιου φλεγμονώδους πόνου επάγονται μοναδικές μεταγραφικές αλλαγές στο PAG των θηλυκών ποντικών, συμπεριλαμβανομένων αλλαγών στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με παραγωγή και απελευθέρωση σεροτονίνης. Περεταίρω ανάλυση ανέδειξε ως ανώτερο ρυθμιστή των επαγόμενων προσαρμογών την σηματοδότηση μέσω του α-υποδοχέα των ιστογόνων (ERα). Τα ανωτέρω αποτελέσματα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τους φυλο-εξαρτώμενους ενδοκυττάριους μηχανισμούς που διέπουν τις αλγαισθητικές αποκρίσεις, τονίζοντας επιπλέον την χρησιμότητα της RGSz1 ως φαρμακευτικού στόχου για περιπτώσεις χρόνιου πόνου.