Ο ρόλος του μεταγραφικού καταστολέα ERF κατά την ογκογένεση και την επιθηλιομεσενχυματική μετάβαση
Authors: Ζαραγκούλιας Ανδρέας 
Published: September 2021

Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) είναι μεταγραφικός καταστολέας της οικογένειας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάτι RTK/RAS/ERK. Τα μέλη της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων ελέγχουν σημαντικές βιολογικές διαδικασίες, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, την αιμοποίηση, την αγγειογένεση και την ογκογένεση. Αντίστοιχα λοιπόν και ο ERF θα μπορούσε να έχει ανάλογες ποικίλες δράσεις αφού το Erf γονίδιο εκφράζεται παντού στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και σε όλους τους ιστούς στο ενήλικο και τις κυτταρικές σειρές που έχουν εξεταστεί. Η ERK-διαμεσολαβούμενη φωσφωρυλίωση του ERF έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του υποκυτταρικού εντοπισμού του. Έτσι, η φωσφωρυλιωμένη μορφή του ERF (κάτω από μιτογόνες συνθήκες που η ERK είναι ενεργή) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ όταν το Ras/Erk μονοπάτι αναστέλλεται, τότε ο ERF συσσωρεύεται γρήγορα στον πυρήνα, αποφωσφωρυλιώνεται και ασκεί τη δράση του ως μεταγραφικός παράγοντας, ρυθμίζοντας την έκφραση ποικίλων γονιδίων. Έχοντας ήδη πλέον ανακαλυφθεί η ρύθμιση του ERF αλλά και κάποιες βασικές του λειτουργίες, όπως η αναστολή του κυτταρικού κύκλου καταστέλλοντας το c-Myc με έναν Rb-εξαρτώμενο τρόπο, καθώς και η αναστολή του ets και ras επαγώμενου μετασχηματισμού και του σαρκώματος του Ewing’s σε κυτταρικά συστήματα, με την παρούσα διδακτορική διατριβή προχωρήσαμε τη μελέτη του ERF ένα βήμα παραπέρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο ρόλος του ERF στην επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) και την ογκογένεση στο μαστό, καθώς επίσης και στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs), μία κρίσιμη διαδικασία κατά την πλακουντογένεση. Η επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μία καθοριστική διαδικασία στην πρόοδο του καρκίνου και τη μετάσταση, απαιτώντας τη συνεργασία των EGF/Ras και TGFβ σηματοδοτικών μονοπατιών σε πολλαπλά επίπεδα. Παρόλα αυτά, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους η Ras σηματοδότηση συμβάλει στο ΕΜΤ, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε το κατά πόσον ο ERF είναι ικανός να παρεμβαίνει στο TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού (EpH4) που υπερεκφράζουν το ογκογόνο Ras (EpRas). Τα EpRas κύτταρα που υπερεκφράζουν τον ERF απέτυχαν να οδηγηθούν προς TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ, σχημάτισαν τρισδιάστατες σωληνοειδής δομές μέσα σε γέλη κολλαγόνου, και διατήρησαν την έκφραση επιθηλιακών μαρτύρων. Ανάλυση του μεταγραφήματος έδειξε ότι η TGFβ σηματοδότηση μέσω Smads ήταν κυρίως ανεπηρέαστη και ότι ο ERF ανέστειλε το TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ, μέσω καταστολής του Semaphorin-7a. Η αναστολή του Semaphorin-7a στα πατρικά EpRas κύτταρα ανέστειλε την ικανότητά τους να οδηγηθούν προς TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ. Τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι το ογκογόνο Ras μπορεί να παίζει έναν επιπλέον ρόλο στο ΕΜΤ μέσω του ERF, ρυθμίζοντας το Semaphorin-7a και παρέχοντας μία νέα διασύνδεση μεταξύ των Ras- και TGFβ- σηματοδοτικών μονοπατιών. Αφορμή από αυτά τα ευρήματα, ήταν να ξεκινήσει και η μελέτη απαλοιφής του Erf από το μαστό του ποντικού ή από τα ποντικίσια πρωτογενή μαστικά επιθηλιακά κύτταρα (PMECs), συσχετίζοντάς τον έτσι με την ογκογένεση του μαστού. Η μελέτη αυτή όμως είναι σε εξέλιξη, οπότε δεν υπάρχουν ακόμη κάποια ασφαλή συμπεράσματα. Επιπλέον, ασχοληθήκαμε με το ρόλο του ERF στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs), που συμβαίνει κατά την πλακουντογένεση, μία διαδικασία στην οποία παίζει αρκετά σημαντικό ρόλο το ΕΜΤ φαινόμενο που μελετήθηκε αρχικά παραπάνω. Η ομόζυγη απαλοιφή του Erf στο ποντίκι έχει δείξει παλιότερα ότι παρεμποδίζει τη χοριακή τροφοβλαστική διαφοροποίηση, οδηγώντας σε αποτυχία χοριοαλλαντοειδικής σύντηξης και εμβρυϊκό θάνατο. Η FGF σηματοδότηση είναι σημαντική για την κατάλληλη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs) και την ανάπτυξη του αιμοχοριακού πλακούντα. Η απουσία του Fgf2 προάγει τη διαφοροποίηση των TSCs, ενώ ο FGF4 ή FGF2 απαιτούνται για τη διατήρηση των TSCs στα ποντίκια. Με μοριακές και κυτταρικές προσεγγίσεις δείξαμε εδώ ότι χαμηλά επίπεδα Fgf2 mRNA μπορούν να ανιχνευτούν ex vivo στα TSCs. Η έκφραση αυτή αναστέλλεται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης του ERF με την Fgf2 μεταγραφική μονάδα, αυξάνεται απουσία ERF και μειώνεται παρουσία μεταλλαγμένου ERF που είναι ανθεκτικός στη φωσφορυλίωση από την ERK. Η αναστολή του Fgf2 από τον ERF φαίνεται να είναι απαραίτητη για την κατάλληλη διαφοροποίηση των χοριακών τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs) και μπορεί να ευθύνεται για το φαινότυπο του Erf knock out. Τέλος, η διαφοροποίηση των TS κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν ERF προτείνουν ότι πέραν από τις Fgf2 διαμεσολαβούσες επιρροές, το Erf μπορεί να έχει έναν επιπλέον ρόλο στη δέσμευση των χοριακών τροφοβλαστικών κυττάρων προς συγκυτιοτροφοβλάστες. Τέλος, δείχθηκε ότι μειωμένες δόσεις του ERF προκαλούν σύνθετη κρανιοσυνοστέωση (πρόωρο κλείσιμο κρανιακών ραφών) στον άνθρωπο και το ποντίκι. Χαρακτηριστικά αυτής της νέας αναγνωρισμένης κλινικής διαταραχής περιλαμβάνουν τη συνοστέωση ποικίλων κρανιακών ραφών, τη δυσμορφία κρανίου και προσώπου, τη δυσμορφία Chiari και γλωσσική καθυστέρηση. Στα πλαίσια λοιπόν αυτής της ευρύτερης δουλειάς, εδώ έγιναν πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης σε ποντικίσιους εμβρυϊκούς ινοβλάστες (MEFs) και μεγάλης κλίμακας αλληλούχιση (ChIP-seq) και βρήκαμε ότι ο ERF προσδένεται κατά προτίμηση σε γενωμικά στοιχεία μακριά από υποκινητές, που περιλαμβάνουν RUNX και AP1 μοτίβα πρόσδεσης στο DNA. Η δουλειά αυτή ταυτοποιεί τον ERF ως ένα νέο ρυθμιστή της οστεογένεσης που επάγεται από RAS-ERK σηματοδότηση, πιθανώς συναγωνιζόμενος τους ETS παράγοντες ενεργοποίησης στα πολυπαραγοντικά μεταγραφικά συμπλέγματα.