Ενδοφυτικοί μικροοργανισμοί των αρωματικών φυτών Teucrium polium και Hypericum hircinum που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών
Authors: Θωμλούδη Ειρήνη-Ευαγγελία 
Published: October 2022

Η αύξηση του πληθυσμού της γης και η επακόλουθη αύξηση στη ζήτηση τροφίμων, σε συνδυασμό με την απώλεια γεωργικών εδαφών και τη μείωση απόδοσης της παραγωγής λόγω της κλιματικής αλλαγής, έχουν οδηγήσει στην εκτεταμένη χρήση χημικών λιπασμάτων και φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Οι δυσμενείς επιδράσεις της υπερχρήσης αγροχημικών στην υγεία του ανθρώπου και του περιβάλλοντος δημιούργησαν την ανάγκη για την ανάπτυξη μεθόδων για την αύξηση της απόδοσης και τη μείωση των απωλειών των καλλιεργειών, με ταυτόχρονη μείωση των χημικών εισροών. Μία πολλά υποσχόμενη λύση για την αύξηση της απόδοσης και τη μείωση των απωλειών είναι η χρήση περιβαλλοντικά φιλικών και ταυτόχρονα αποτελεσματικών μεθόδων, όπως είναι η εφαρμογή μικροοργανισμών που προωθούν την ανάπτυξη των φυτών, με τα ενδοφυτικά βακτηριακά στελέχη να προσελκύουν όλο και περισσότερο ενδιαφέρον. Η συγκεκριμένη εργασία αφορά τη διερεύνηση των ικανοτήτων των ενδοφυτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από τη ρίζα και τα φύλλα των αρωματικών φυτών Teucrium polium και Hypericum hircinum με σκοπό την εύρεση στελεχών υποσχόμενων για χρήση ως εμβόλια στη γεωργική πρακτική, καθώς και τη διερεύνηση της αύξησης της αποτελεσματικότητάς τους ως μίγματα ανά ζεύγη. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης πραγματοποιήθηκε η ομαδοποίηση 37 βακτηριακών απομονώσεων βάσει της μορφολογίας των μοναδιαίων αποικιών τους και την προκαταρκτική 16S rDNA φυλογενετική ταξινόμηση. Η επιλογή αντιπροσωπευτικών στελεχών με πιθανή διαφορετική δράση βασίστηκε σε in vitro δοκιμές α) προώθησης της ανάπτυξης των φυτών, όπως η διαλυτοποίηση ιζηματοποιημένου φωσφόρου, η παραγωγή ρυθμιστών της ανάπτυξης των φυτών και η έκκριση λυτικών ενζύμων, β) περιβαλλοντικής προσαρμογής, όπως η αντοχή σε ακραίες θερμοκρασίες, γ) διερεύνησης πιθανής παθογόνου δράσης σε φυτά Arabidopsis thaliana Col-0 και δ) αλληλεπίδρασης των βακτηριακών στελεχών μεταξύ τους. Από αυτά επιλέχθηκαν 19 αντιπροσωπευτικά στελέχη, τα οποία υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε in vitro δοκιμές που αφορούσαν την ικανότητα ταχείας ομαδικής κίνησης σε επιφάνειες (swarming), κολυμβητικής κίνησης (swimming), σχηματισμού βιοϋμενίου (biofilm), καθώς και παρεμπόδισης φυτοπαθογόνων μυκήτων σημαντικών για τη γεωργία. Ακόμη, εξετάστηκε η επίδρασή τους στην ανάπτυξη του φυτού A. thaliana Col-0 in vitro, μετά τον εμβολιασμό τους σε επαφή με το ακρορρίζιο, σε απόσταση από αυτό και μέσω πτητικών ενώσεων. Κριτήριο επιλογής αποτέλεσε η αύξηση των πλευρικών ριζών και ριζικών τριχιδίων. Ακολούθησε η εξέταση της επίδρασής τους στη βλαστικότητα και την ανάπτυξη φυτών τομάτας in vitro μετά από βιοδιέγερση (biopriming) του σπόρου. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων των in vitro δοκιμών οδήγησε στην επιλογή των στελεχών Hil4 (Bacillus halotolerans), Hir139 (Bacillus velezensis), Tel34 (Bacillus safensis), Tel52 (Bacillus velezensis) και Ter90 (Bacillus subtilis), τα οποία συγκέντρωσαν τα περισσότερα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Διαπιστώθηκε ότι τα στελέχη Hil4, Hir139, Tel52 και Ter90 εκκρίνουν βιοεπιφανειοδραστικές ενώσεις με αντιμυκητολογική δράση σε υγρή καλλιέργεια, ενώ σχηματίστηκε ζώνη παρεμπόδισης εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων κατά τη διπλή καλλιέργεια τους in vitro. Για την μελέτη και ανίχνευση των εκκρινόμενων και διαχεόμενων μεταβολιτών, πραγματοποιήθηκε η εκχύλισή τους από τη ζώνη παρεμπόδισης που δημιουργήθηκε εναντίον του μύκητα Botrytis cinerea σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα και από ζώνη παρόμοιου μεγέθους αξενικής βακτηριακής καλλιέργειας. Τα εκχυλίσματα των Hil4, Hir139, Tel52, Ter90 ήταν βιοδραστικά έναντι του B. cinerea σε διπλή καλλιέργεια και διαπιστώθηκε πως οι αντιμυκητιακοί μεταβολίτες παράγονται ιδιοσυστατικά. Μετά από αλληλούχιση ολικού γονιδιώματος, τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους και διερευνήθηκε η παρουσία συστάδων γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση αντιμικροβιακών δευτερογενών μεταβολιτών, που ανταγωνίζονται άμεσα τα φυτοπαθογόνα ή λειτουργούν ως διεγέρτες της άμυνας των φυτών. Σε όλα τα στελέχη βρέθηκε η συστάδα βιοσύνθεσης ενώσεων της οικογένειας των κυκλικών λιποπεπτιδίων Surfactins, της σιδηροφόρου ένωσης Bacillibactin και της ένωσης Bacilysin. Στα γονιδιώματα των στελεχών Hil4, Hir139, Tel52 και Ter90 εντοπίστηκε η συστάδα βιοσυνθετικών γονιδίων της ένωσης Bacillaene, καθώς και η συστάδα βιοσύνθεσης ενώσεων της οικογένειας των κυκλικών λιποπεπτιδίων Fengycins. Στα γονιδιώματα των στελεχών Hil4 και Ter90 εντοπίστηκε η συστάδα βιοσύνθεσης της Subtilosin, ενώ οι συστάδες βιοσυνθετικών γονιδίων των ενώσεων Difficidin, Macrolactin H και Amylocyclicin εντοπίστηκαν μόνο στα γονιδιώματα των στελεχών Hir139 και Tel52. Η συστάδα βιοσύνθεσης της ένωσης Plantazolicin εντοπίστηκε στο γονιδίωμα του στελέχους Hir139, ενώ της ένωσης Mersacidin εντοπίστηκε στο γονιδίωμα του στελέχους Tel52. Το γονιδίωμα του στελέχους Tel34 περιέχει τη συστάδα βιοσύνθεσης της ένωσης Safencin. Τέλος, εντοπίστηκε συστάδα για τη βιοσύνθεση κυκλικών λιποπεπτιδίων της οικογένειας Iturins στα στελέχη Hil4 (Mojavensin), Hir139 και Tel52 (Bacillomycin D). Επίσης, στα γονιδιώματα των στελεχών διαπιστώθηκε η παρουσία πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται στον αποικισμό, την προώθηση της ανάπτυξης των φυτών και τη βιολογική αντιμετώπιση φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών, όπως εκείνα που κωδικοποιούν λυτικά ένζυμα. Ανάλυση UHPLC-HRMS του εκχυλίσματος των εκκρινόμενων και διαχεόμενων μεταβολιτών κατά την αξενική καλλιέργεια σε στερεό υπόστρωμα των Hil4 και Hir139 έδειξε την πιθανή παρουσία των ενώσεων Surfactin Α (C13-C15), Fengycin A (C16), Bacillaene, Bacilysin, Dihydroanticapsin (ενεργό μέρος της Bacilysin) αλλά και Azelaic Acid. Ακόμη, ανιχνεύθηκε η ένωση Bacillomycin D (C13-C17) και Oxydifficidin ως εκκρινόμενη από το στέλεχος Hir139, ενώ ανιχνεύθηκε η ένωση Mojavensin ως εκκρινόμενη από το στέλεχος Hil4. Τα επιλεγμένα στελέχη χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία μιγμάτων (ανά ζεύγη) μετά από δοκιμές in vitro συμβατότητας, συνδυάζοντας στελέχη με διαφορετικά χαρακτηριστικά και περιλαμβάνοντας in vitro συμβατά και μη συμβατά μίγματα. Συγκεκριμένα, τα μίγματα που δοκιμάστηκαν ήταν τα Hil4-Tel52, Tel34-Ter90 και Tel34-Hir139. Στη δοκιμή προώθησης της ανάπτυξης φυτών τομάτας σε συνθήκες θερμοκηπίου, το στέλεχος Ter90 είχε τη μεγαλύτερη επίδραση στο νωπό βάρος υπόγειου τμήματος, το ύψος, καθώς και το νωπό και ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος σε σύγκριση με όλες τις μεταχειρίσεις και το μάρτυρα. Τα υπόλοιπα στελέχη έδειξαν να προωθούν την ανάπτυξη των φυτών μόνο σε συνθήκες in vitro και όχι στο θερμοκήπιο. Η μεταχείριση του μίγματος Hil4-Tel52 εμφάνισε σε κάποια χαρακτηριστικά υψηλότερες τιμές από εκείνες των μεμονωμένων, γεγονός που ίσως οφείλεται στην αύξηση του πληθυσμού τους στη ριζόσφαιρα, αλλά σε σύγκριση με του μάρτυρα υπερίσχυε μόνο στο ύψος και το ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος του φυτού. Δοκιμή των στελεχών σε αποκομμένους καρπούς ελιάς εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Colletotrichum acutatum, έδειξε ότι οι μεταχειρίσεις Ter90 και Hir139 παρουσίασαν περίπου 45% και 57% μείωση του δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας σε σχέση με τη μεταχείριση του μάρτυρα, αντίστοιχα, ενώ 33% και 60% μείωση της έντασης της ασθένειας, αντίστοιχα. Επίσης, η εφαρμογή όλων των στελεχών μείωσε τη σοβαρότητα της τεφράς σήψης σε καρπούς αμπέλου και μικρόκαρπες τομάτες, με πιο αποτελεσματικό το στέλεχος Hir139, το οποίο μείωσε τη σοβαρότητα της ασθένειας περίπου 52.5% και 47% στους δύο καρπούς αντίστοιχα. Το μίγμα Hil4-Tel52 μείωσε σημαντικά τη σοβαρότητα της ασθένειας στα τοματίνια σε σύγκριση με τα μεμονωμένα στελέχη, ωστόσο δεν είχε διαφορά από το Hir139. Στη δοκιμή αντιμετώπισης του B. cinerea στα φύλλα μέσω επαγωγής της διασυστηματικής αντοχής φυτών τομάτας μετά από εμβολιασμό των στελεχών στη ριζόδφαιρα, το στέλεχος Hir139 αναδείχθηκε το αποτελεσματικότερο με περίπου 75% μείωση της έκτασης νεκρωτικής κηλίδας, ακολουθούμενο από τα Ter90 και Tel52 με περίπου 71% και 67% μείωση, αντίστοιχα. Επίσης, κάποιες από τις μεταχειρίσεις έδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων erf1 και aco1 24 ώρες μετά το πρώτο ριζοπότισμα με βακτήρια σε σύγκριση με τη μεταχείριση του μάρτυρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής ανέδειξαν δύο υποσχόμενα στελέχη, τα Hir139 και Ter90, με εξαιρετικά αποτελέσματα στην προώθηση της ανάπτυξης των φυτών και τη βιολογική αντιμετώπιση φυτοπαθογόνων μυκήτων. Όσον αφορά τα μίγματα που εξετάστηκαν, στις περισσότερες περιπτώσεις είχαν είτε αντίστοιχη δράση με το αποτελεσματικότερο στέλεχος του μίγματος, είτε μειωμένη δράση στην περίπτωση που ο πληθυσμός του υπέστη μείωση όταν εφαρμόστηκε σε μίγμα σε σχέση με την εφαρμογή ως μεμονωμένο στέλεχος, πιθανώς λόγω ανταγωνισμού. Ακόμη, οι in vitro δοκιμές συμβατότητας δεν αντικατόπτριζαν πάντα τη συμβατότητα in planta σε όλα τα συστήματα. Συμπερασματικά, η εργασία αυτή αποτελεί μια ενδελεχή μελέτη της αποτελεσματικότητας ενδοφυτικών βακτηριακών στελεχών ως βιοδιεγέρτες της ανάπτυξης των φυτών και ως παράγοντες βιολογικής αντιμετώπισης φυτοπαθογόνων μυκήτων, καθώς και έναν οδηγό για την αξιολόγηση υποσχόμενων βακτηριακών στελεχών. Επιπρόσθετα, εμβαθύνει στην κατανόηση της αλληλεπίδρασης των βακτηριακών στελεχών μεταξύ τους με σκοπό τη δημιουργία αποτελεσματικών μιγμάτων.