Ανάπτυξη και αξιολόγηση αντισωμάτων για τη μελέτη μικρομοριακών ενώσεων με βιοχημικό ενδιαφέρον
Authors: Παπασαράντος Ηλίας 
Published: January 2014

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν σε ποικίλα ανοσοχημικά συστήματα, πολυκλωνικά αντισώματα για τη βιοτίνη, μια μικρομοριακή ένωση (απτένιο) με μεγάλο βιοχημικό αλλά και βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Τα αντισώματα εναντίον βιοτίνης θεωρούνται σημαντικά βιοαναλυτικά εργαλεία, εφόσον μπορούν i) να χρησιμοποιηθούν στην έρευνα επί της βιοτίνης και των φυσικών βιοτινυλο-μακρομορίων του οργανισμού, ii) να λειτουργήσουν ως εναλλακτικά αντιδραστήρια σε ποικίλα συστήματα βιοτεχνολογίας (π.χ. συστήματα καθαρισμού, «ακινητοποίησης» ή ανίχνευσης βιομορίων), που χρησιμοποιούν συνδυασμό ειδικών βιοτινυλιωμένων αντιδραστηρίων με πρωτεΐνες που δεσμεύουν τη βιοτίνη (π.χ. αβιδίνη, στρεπταβιδίνη). Από μία διαφορετική οπτική γωνία, τα αντισώματα εναντίον βιοτίνης μπορούν να θεωρηθούν ως «πρότυπα αντισώματα εναντίον απτενίου», μιας και η λειτουργική δεσμευτική τους ικανότητα για το αντίστοιχο απτένιο μπορεί να αξιολογηθει εύκολα και αξιόπιστα χρησιμοποιώντας την αβιδίνη ή τη στρεπταβιδίνη ως θετικό μάρτυρα. Τα αντισώματα για τη βιοτίνη αναπτύχθηκαν εναντίον ειδικού συνθετικού παραγώγου, του παραγώγου βιοτίνη-αμινοκαπροϊκό οξύ-λυσίνη (BAL),το οποίο συζεύχθηκε με βόειο θυρεοσφαιρίνη, μέσω γλουταραλδεΰδης, και χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση λευκών κουνελιών Νέας Ζηλανδίας. Το παράγωγο BAL συνετέθη επί εμπορικά διαθέσιμης ρητίνης ακολουθώντας την Fmoc-στρατηγική σύνθεσης σε στερεή φάση, η οποία εφαρμόζεται ευρύτατα στη σύνθεση πεπτιδίων. Η προσέγγιση αυτή απλούστευσε εξαιρετικά την πειραματική διαδικασία, περιόρισε τις ανεπιθύμητες αντιδράσεις (λόγω της παρουσίας προστατευτικών ομάδων στους επί μέρους «δομικούς λίθους» της σύνθεσης), υπερέβη την αναγκαιότητα ενδιάμεσων σταδίων καθαρισμού και οδήγησε σε τελικό προϊόν υψηλής καθαρότητας και απόδοσης. Η «μακρά γέφυρα» αμινοκαπροϊκού οξεος - λυσίνης χρησιμοποιήθηκε για να απομακρύνει τα μόρια του απτενίου από τα μόρια της φέρουσας πρωτεΐνης, καθιστώντας τα περισσότερο προσιτά στο ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού-ξενιστή. Η λυσίνη επελέγη λόγω της Νε-αμινομάδας που περιέχει η πλευρική της αλυσίδα, μέσω της οποίας το τελικό παράγωγο BAL μπορεί να συζευχθεί, παρουσία γλουταραλδεΰδης, στη φέρουσα πρωτεΐνη. Τα αντι-BAL αντισώματα αξιολογήθηκαν σε σύστημα ELISA, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Σύζευγμα βιοτίνης - πολυλυσινικού δενδριμερούς χρησιμοποιήθηκε για την «ακινητοποίηση» (immobilization) της βιοτίνης στα φρεάτια ELISA. Το πολυλυσινικό δενδριμερές συνετέθη για πρώτη φορά στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ακολουθώντας τη στρατηγική της Fmoc-σύνθεσης σε στερεή φάση και χρησιμοποιώντας Fmoc-Lys(Nε-Fmoc)-OH και Fmoc-Lys(Nε-Boc)-OH ως δομικούς λίθους. Ο τίτλος των αντι-BAL αντισωμάτων ήταν 1 : 50.000. Καμπύλες εκτόπισης ελήφθησαν παρουσία αυξανομένων συγκεντρώσεων των συνθετικών παραγώγων BAL και ΒΑ αλλά και παρουσία ελεύθερης βιοτίνης (10 ng/mL - 10 μg/mL). Στα πλαίσια της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης πρωτόκολλο καμπύλης εκτόπισης με ενζυμοδεσμευτική μέθοδο, τύπου ELISA, στο οποίο χρησιμοποιήθηκαν βιοτίνη ακινητοποιημένη στα φρεάτια υπό τη μορφή συζεύγματος με το συνθετικό πολυλυσινικό δενδριμερές και στρεπταβιδίνη επισημασμένη με το ένζυμο HRP. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου, παρατηρήθηκε εκτόπιση της επισημασμένης στρεπταβιδίνης από τα φρεάτια ELISA παρουσία πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων βιοτίνης (100 pg/mL-800 μg/mL). Οι καμπύλες εκτόπισης της ELISA και της ενζυμοδεσμευτικής μεθόδου, τύπου ELISA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων βιοτίνης σε διαδοχικές αραιώσεις φαρμακευτικού σκευάσματος της βιταμίνης που κυκλοφορεί στο εμπόριο. .............................................................................................