Μελέτη της επίδρασης του εξωτερικού περιβάλλοντος στη γονιδιακή έκφραση και λειτουργία κυττάρων μεσοσπονδύλιου δίσκου
Authors: Κουρούμαλης Αναστάσιος 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των συνθηκών του μικροπεριβάλλοντος του μεσοσπονδύλιου δίσκου (δηλαδή συνθήκες απουσίας ορρού, μειωμένης συγκέντρωσης γλυκόζης, αυξημένης ωσμωμοριακότητας και υποξίας) α. στη λειτουργία και την γονιδιακή έκφραση των κυττάρων πηκτοειδούς πυρήνα, έπειτα από την επίδραση οξειδωτικού στρες, στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του ιστού και β. στο χαρακτηριστικό φλεγμονώδη και καταβολικό φαινότυπο των γηρασμένων κυττάρων. Επίσης, σκοπό αποτέλεσε επίσης και η μελέτη της επίδρασης γνωστών σενολυτικών και σενομορφικών ενώσεων, στα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου. Υλικά και μέθοδος. Στη παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες νεαρών και γηρασμένων κυττάρων του πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου. Συγκεκριμένα, έγινε η μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων που συνθέτουν τις συνθήκες του μικροπεριβάλλοντος του ιστού, δηλαδή των συνθηκών απουσίας ορρού, μειωμένης συγκέντρωσης γλυκόζης, αυξημένης ωσμωμοριακότητας και υποξία (IVD συνθήκες), σε σχέση με τις κλασικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων, όσον αφορά την απόκριση των κυττάρων στο οξειδωτικό στρες. Επιπλέον, μελετήθηκε η παράμετρος τριδιάστατων κυτταροκαλλιεργειών σε σφαιρίδια αλγινικού οξέος σε σχέση με τις κλασικές διδιάστατες καλλιέργειες, μια συνθήκη που προσομοιάζει πιστότερα τις συνθήκες διαβίωσης των κυττάρων στον ιστό in vivo. Η μελέτη της κυτταροτοξικότητας έγινε με τη μέθοδο ΜΤΤ, τα επίπεδα ενδοκυτταρικών ενεργών μορφών οξυγόνου προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο DCFH-DA, ενώ η ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες μελετήθηκε με ανάλυση Western. Για την επαγωγή κυτταρικής γήρανσης χρησιμοποιήθηκε η έκθεση των κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία. Ο φαινότυπος νεαρών και γηρασμένων κυττάρων, σε κλασικές συνθήκες και σε συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου, έγινε ως εξής: Με τη μέθοδο ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου προσδιορίστηκαν, σε κλασικές και συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των πρωτεϊνικών δεικτών της κυτταρικής γήρανσης, p16WAF1 και p21INKA4, αλλά και σημαντικών πρωτεϊνικών εκπροσώπων του φλεγμονώδους και καταβολικού φαινοτύπου των γηρασμένων κυττάρων. Εκτός της αυξημένης έκφρασης των συγκεκριμένων πρωτεϊνικών δεικτών, ο γηρασμένος αυτός φαινότυπος των κυττάρων αυτών πιστοποιήθηκε σε κάθε περίπτωση με τις μεθόδους ενσωμάτωσης SA-β-Gal και πυρηνικής χρώσης BrdU στις συνθήκες που μελετήθηκαν. Παράλληλα, με μεθόδους ανάλυσης FRET και ενζυμογραφίας, εξετάστηκαν τα συνολικά αλλά και τα ενεργά επίπεδα των σημαντικών κατά την εκφύλιση του δίσκου μεταλλοπρωτεασών MMP-1, -2 και -3, ανάμεσα σε κλασικές και στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου.Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι εκτίμησης κυτταροτοξικότητας, δοκιμασίας ΜΤΤ και Neutral Red ευρείας κλίμακας για την πιθανή ανίχνευση νέων σενολυτικών ενώσεων στο καλά χαρακτηρισμένο σύστημα νεαρών και γηρασμένων βόειων κυττάρων. Αποτελέσματα. Στη παρούσα διδακτορική διατριβή διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα παρουσιάζουν παρόμοια ανθεκτικότητα στην επίδραση υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε όλες τις παραμέτρους των IVD συνθηκών που εξετάστηκαν, τόσο σε διδιάστατες όσο και σε τριδιάστατες καλλιέργειες κυττάρων. Ακόμα, επιδεικνύουν παρόμοια πρότυπα ενεργοποίησης γνωστών σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες έπειτα από επίδραση του οξειδωτικού παράγοντα, σε κλασικές διδιάστατες συνθήκες καλλιέργειας και τριδιάστατες καλλιέργειες κυττάρων σε συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Επίσης, στη παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν καλά χαρακτηρισμένα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα, στα οποία ανιχνεύθηκε η έκφραση κλασικών δεικτών κυτταρικής γήρανσης, μαζί με τον χαρακτηριστικό για τα γηρασμένα κύτταρα εκκριτικό φαινότυπο SASP. Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι τόσο αυτοί οι δείκτες κυτταρικής γήρανσης όσο και ο χαρακτηριστικός καταβολικός και φλεγμονώδης φαινότυπος (SASP) των γηρασμένων κυττάρων διατηρούνται, από τις κλασικές συνθήκες καλλιέργειας και στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τέλος, ανιχνεύθηκε η ένωση σουλφοραφάνη ως μια ένωση με πιθανή σενολυτική δράση για τα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα βόειου μεσοσπονδύλιου δίσκου. Συμπεράσματα. Το βασικό συμπέρασμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ότι η βιωσιμότητα και η ικανότητα ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες των κυττάρων πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου απέναντι στο οξειδωτικό στρες, αλλά και ο χαρακτηριστικός καταβολικός και φλεγμονώδης φαινότυπος των γηρασμένων κυττάρων, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστοι από τις συνθήκες που χαρακτηρίζουν το μικροπεριβάλλον του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Αυτό επιτρέπει τη γενίκευση αποτελεσμάτων κυτταρικής γήρανσης που ήδη υπάρχουν σε κύτταρα δίσκου, σε κλασικές συνθήκες καλλιέργειας και σε αυτές του ιδιαίτερου περιβάλλοντος του ιστού. Επίσης, στη παρούσα διδακτορική διατριβή ανιχνεύθηκε η ένωση σουλφοραφάνη ως μια νέα πιθανή σενολυτική ένωση για τα κύτταρα βόειου μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τέλος, το κυτταρικό σύστημα που αναπτύχθηκε μπορεί να αποτελέσει εργαλείο για την ανίχνευση περισσότερων ενώσεων με πιθανή σενολυτική ή σενομορφική δράση, αλλά και για την εξεύρεση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους επιτελούνται οι δράσεις αυτές.