Προσδιορισμός της διαφορικής μοριακής υπογραφής τριών αιμοποιητικών ιστών κατά την ανθρώπινη οντογένεση και εφαρμογή της στη θεραπευτική των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου
Authors: Χονδρού Βασιλική 
Published: September 2021

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι μια ετερογενής ομάδα κληρονομικών διαταραχών που προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών του ανθρώπου. Από κλινικής άποψης οι πιο σημαντικές είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β-θαλασσαιμία, οι οποίες οφείλονται σε ποιοτικές και ποσοτικές διαταραχές αντίστοιχα. Ο κλινικός φαινότυπος των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου ποικίλλει, γεγονός που οφείλεται αφενός στη μεγάλη ποικιλία των μεταλλάξεων που εντοπίζονται στο γονίδιο της β-σφαιρίνης κι αφετέρου, σε γονίδια εκτός του β-γονιδιακού τόπου που εμπλέκονται στον ερυθροειδικό και μη μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης αυτού.Η υδροξυουρία (HU) αποτελεί το μόνον εγκεκριμένο από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής φαρμακευτικό παράγοντα που συντελεί στην επαγωγή της παραγωγής της HbF και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και της β-θαλασσαιμίας. Στα πλαίσια της εξατομικευμένης θεραπείας και λαμβάνοντας υπόψην τη διαφορική απόκριση των ασθενών, η στοχευμένη χορήγηση της HU σε συγκεκριμένους ασθενείς κρίνεται απαραίτητη γεγονός, όμως, που προϋποθέτει την κατανόηση των λόγων που η απόκριση των ασθενών στο φάρμακο διαφοροποιείται.Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία, αλλά και τα αποτελέσματα ερευνών που έχουν προηγηθεί στο εργαστήριό μας, μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί γονιδίων εντός και εκτός του συμπλέγματος των β-σφαιρινών έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με τα αυξημένα επίπεδα HbF σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία, οι οποίοι παρουσιάζουν ήπιο κλινικό φαινότυπο, αλλά και με την απόκριση ασθενών με β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες στη χορήγηση HU ως φαρμακευτική αγωγή.Στην παρούσα διατριβή με βάση τις διαφορετικές θέσεις ερυθροποίησης κατά την οντογένεση του ανθρώπου και το χρόνο μεταστροφής από τη γ- στη β-σφαιρίνη μελετήθηκε το διαφορικό μεταγραφικό προφίλ προγονικών ερυθροειδικών κυττάρων εμβρυϊκού ήπατος, ομφαλοπλακουντικού αίματος και περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών. Από τη λίστα των γονίδιων που εκφράζονταν διαφορετικά μεταξύ αυτών, κατόπιν διερεύνησης της βιβλιογραφίας, αλλά και των μονοπατιών στα οποία εμπλέκονται, επιλέξαμε να μελετήσουμε περαιτέρω το γονίδιο VEGFA. Το συγκεκριμένο γονίδιο βρέθηκε να υπερεκφράζεται στα μεταγενέστερα στάδια της οντογένεσης, εκεί, όπου απαντώνται χαμηλά επίπεδα HbF. Κατόπιν, διερευνήθηκε περαιτέρω η διαφορική έκφραση του γονιδίου VEGFA κατά τη διαφορoποίηση των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων, δύο ιστών με υψηλά επίπεδα HbF (ανθρώπινο εμβρυϊκό ήπαρ και αίμα από ομφάλιο λώρο ανθρώπου), σε ερυθροβλάστες. Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκε το μοριακό αποτύπωμα των BFU-Es, των CFU-Es και των ερυθροβλαστών με τη μέθοδο της αλληλούχισης του RNA. Το γονίδιο VEGFΑ βρέθηκε να υπερεκφράζεται στις πιο πρώιμες μορφές των ερυθροειδικών κυττάρων σε σχέση με τις πιο ώριμες μορφές σε αυτούς τους ιστούς. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε ο ρόλος του γονιδίου VEGFA ως τροποποιητή της κλινικής εικόνας των ασθενών με β-θαλασσαιμία, αλλά και ως φαρμακογονιδιωματικού δείκτη, όσον αφορά την απόκριση των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου στη λήψη HU. Για το σκοπό αυτό, κατόπιν in silico ανάλυσης, επιλέξαμε να μελετήσουμε για τον Καυκάσιο πληθυσμό τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς rs2146323, rs3024997 και rs10434 κατά μήκος του γονιδίου VEGFA. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση ως προς τους παραπάνω πολυμορφισμούς πέντε πληθυσμιακών ομάδων: υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία, ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι και μη στη χορήγηση HU. Για τους πολυμορφισμούς rs2146323 και rs10434 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αλληλούχισης κατά Sanger και για τον πολυμορφισμό rs3024997 η μέθοδος της Αllele-Specific PCR.Η παρουσία του πολυμορφισμού rs2146323 βρέθηκε να σχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα HbF κι άρα τον ήπιο φαινότυπο των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία. Αντίθετα, η παρουσία του πολυμορφισμού rs3024997 φαίνεται να σχετίζεται με την πιο βαριά κλινική εικόνα των ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Όσον αφορά τη συσχέτιση των υπό μελέτη πολυμορφισμών με την απόκριση των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία στη λήψη HU, ο πολυμορφισμός rs2146323 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά.Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, το γονδίο VEGFA υπερεκφράζεται στα πλαίσια χαμηλών επιπέδων HbF. Επίσης, τα αποτελέσματα της γονοτυπικής ανάλυσης υπόσχονται πολλά, όσον αφορά τη χρήση του στην εξατομικευμένη θεραπεία ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου.