Μελέτη του μηχανισμού παρασκευής in vitro ανασυνδυασμένων στελεχών πολιοϊών και εντεροϊών της ομάδας EV-C
Authors: Δημητρίου Τηλέμαχος 
Published: September 2021

Οι εντεροϊοί ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae. Το γένωμα τους είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας μήκους περίπου 7.500bp και περιβάλλεται από ένα εικοσαεδρικό πρωτεϊνικό καψίδιο. Οι εντεροϊοί που προσβάλλουν τον άνθρωπο ταξινομούνται σε τέσσερις ομάδες: EV-A, EV-B, EV-C και EV-D. Οι πολιοϊοί, το σημαντικότερο μέλος της ομάδας C, διακρίνονται σε τρεις ορότυπους (PV1, PV2, PV3) και είναι οι αιτιολογικοί παράγοντες της παραλυτικής πολιομυελίτιδας. Από το 1960 χρησιμοποιούνται δύο εμβόλια για την εξάλειψη της ασθένειας, αρχικά το IPV (inactivated polio vaccine) και κατόπιν το πιο αποτελεσματικό OPV (oral polio vaccine). Ωστόσο, το OPV εμφάνισε το μειονέκτημα της εμβολιοσυνδεόμενης παραλυτικής πολιομυελίτιδας (VAPP: Vaccine-associated paralytic poliomyelitis) και της κυκλοφορίας των εμβολιοπροερχόμενων πολιοϊών (VDPVs: Vaccine Derived Polioviruses) μέσω της συσσώρευσης μεταλλάξεων ή και ανασυνδυασμών στο γένωμα των εξασθενημένων εμβολιακών στελεχών Sabin.Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη μεθόδων με σκοπό τη μελέτη του μηχανισμού παρασκευής in vitro ανασυνδυασμένων στελεχών πολιοϊών και εντεροϊών της ομάδας EV-C. Στο πρώτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε μια Multiplex-PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών. Τα αποτελέσματα της τεχνικής αυτής σε πρότυπα αλλά και κλινικά στελέχη ανέδειξαν την τεχνική αυτή ως ένα χρήσιμο εργαλείο για την γρήγορη και ακριβή ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε μια τεχνική αλληλούχησης ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών χρησιμοποιώντας μόνο τέσσερις PCR αντιδράσεις. Η δυνατότητα αυτή παρέχεται μέσω της χρήσης ενός ειδικού εκκινητή (DOP), μέσω του οποίου πραγματοποιήθηκε αρχικά μια προενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος. Στο τρίτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε σε κλινικά δείγματα μια Multiplex-PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών από τη VP1 έως και τη 3D γενωμική περιοχή εμβολιοσυνδεόμενων πολιοϊών. Τα αποτελέσματα της Multiplex-PCR απέδειξαν την ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει και να ταυτοποιεί σπάνιους αλλά και κύριους τύπους ανασυνδυασμού με τη χρήση μόνο τεσσάρων Multiplex-PCR αντιδράσεων.Στο τέταρτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε μια ειδική Stem-Loop RT-PCR μέθοδος για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών μέσω ανίχνευσης του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε αρχικά στο πρότυπο στέλεχος Sabin 1, όπου ανιχνεύτηκε η αντιγραφική ενεργότητα του στελέχους σε υψηλό αλλά και χαμηλό ιικό τίτλο, αρκετά νωρίτερα από την εμφάνιση της χαρακτηριστικής εικόνας CPE, των ενεργών εντεροϊών σε κυτταροκαλλιέργεια. Επιπλέον, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την διάκριση μεταξύ αντιγραφικά ενεργών και ανενεργών πρότυπων στελεχών CAV που δεν εμφάνιζαν CPE σε κυτταροκαλλιέργειες. Στο τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε η μελέτη των ανασυνδυασμών που προέκυψαν έπειτα από ταυτόχρονη μόλυνση κυττάρων Rd με πρότυπο στέλεχος Sabin 1 και CAV13. Παράλληλα, με τη χρήση ειδικών προγραμμάτων βιοπληροφορικής σχεδιάστηκαν πιθανά μοντέλα της δευτεροταγούς δομής των RNA μορίων στις θέσεις ανασυνδυασμού. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής επαλήθευσαν την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης ετεροτυπικών ανασυνδυασμών στην 2Α ή 2Β γενωμική περιοχή και εμφάνισαν μια ένδειξη που επιβεβαιώνει τη σύνδεση μεταξύ ανασυνδυασμού και δευτεροταγούς δομής του RNA μορίου.