Μελέτη της πρωτεϊνικής FLCN
Authors: Τσακίρη Καλλιόπη 
Published: January 2014

Στην παρούσα εργασία προσδιορίσαμε μεταλλάξεις στην τελομεράση που προκαλούν ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση των ενηλίκων, χρησιμοποιώντας συγκριτική σάρωση ολοκλήρου του γονιδιώματος με ανάλυση διασύνδεσης (whole genome linkage scan). Ελέγξαμε 46 οικογένειες με τουλάχιστο δύο μέλη προσβεβλημένα από την νόσο και 44 ασθενείς χωρίς οικογενειακό ιστορικό ιδιοπαθούς διάμεσης πνευμονίτιδας. Εντοπίσαμε επτά μεταλλάξεις στο γονίδιο TERT που κωδικοποιεί το πρωτεϊνικό μέρος της τελομεράσης και μια μετάλλαξη στο γονίδιο TERC που κωδικοποιεί το ριβονουκλεiκό μέρος του συμπλέγματος της τελομεράσης. Πέντε από τις μεταλλάξεις στο TERT αφορούν σε αλλαγή βάσης και εμπλέκουν αυστηρά συντηρημένα αμινοξέα ανάμεσα στα είδη. Οι υπόλοιπες δύο μεταλλάξεις στο TERT αφορούν σε έλλειψη βάσεων και οδηγούν στο σχηματισμό πρόωρων κωδικονίων τερματισμού. Η μετάλλαξη που εντοπίσαμε στο TERC αφορά σε αλλαγή βάσης και έχει ήδη περιγραφεί σε έναν ασθενή με συγγενή δυσκεράτωση και απλαστική αναιμία. Μετρήσαμε την ενεργότητα αυτών των μεταλλαγμένων συμπλόκων αφού πρώτα εκφράσαμε τις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, το μεταλλαγμένο μόριο του RNA και τα αντίστοιχα αγρίου τύπου σε in vitro συνθήκες. Η ενεργότητα των μεταλλαγμένων συμπλόκων βρέθηκε να κυμαίνεται από 30 εώς 100% για τις πέντε μεταλλάξεις αλλαγής βάσεως στο TERT και τη μετάλλαξη στο TERC, ενώ για τις δύο TERT μεταλλάξεις έλλειψης βάσεων η ενζυμική ενεργότητα ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. Επιπλέον, σχεδιάσαμε ένα πείραμα για να διαχωρίσουμε τον τρόπο δράσης μεταξύ επικρατούς-αρνητικής (dominant –negative) και απλοανεπάρκειας για μια από τις πιο δραματικές μας μεταλλάξεις V747fsX. H V747fsX μετάλλαξη οδηγεί στο σχηματισμό μιας πρωτεΐνης που υπολείπεται το καρβοξυτελικό άκρο της συντηρημένης περιοχής η οποία είναι απαραίτητη για την λειτουργία της ανάστροφης μεταγραφής. Στο πείραμα αναμείξαμε σε διαφορετικές αναλογίες μεταλλαγμένη τελομεράση και τελομεράση αγρίου τύπου και μετρήσαμε την ενεργότητα των συμπλόκων που προέκυπταν. Παρατηρήσαμε ότι η αύξηση της ενεργότητας ήταν ευθέως ανάλογη με την προσθήκη του αγρίου τύπου ενζύμου υποδεικνύοντας την απλοανεπάρκεια, δηλαδή την απουσία επαρκούς ποσότητας ενζύμου, ως τον μηχανισμό δράσης της συγκεκριμένης μετάλλαξης. Παράλληλα μετρήσαμε το μήκος των τελομεριδίων των ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική νόσο και των λοιπών μελών των οικογενειών τους και διαπιστώσαμε ότι οι φορείς μεταλλάξεων της τελομεράσης έχουν βραχύτερα τελομερίδια από τους μη φορείς. Αναλύοντας τα αποτελέσματα ανά οικογένεια προκύπτει ότι οι φορείς ασθενείς έχουν βραχύτερα τελομερίδια από τους φορείς μη ασθενείς και οι τελευταίοι βραχύτερα από τους μη φορείς μη ασθενείς συγγενείς τους συγκρίσιμης ηλικίας. Τέλος, υπολογίζοντας το ποσοστό των βραχύτερων τελομεριδίων ανά άτομο–καθώς τα βραχύτερα τελομερίδια καθορίζουν την μοίρα του κυττάρου και όχι το μέσο μήκος των τελομεριδίων- διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς φορείς έχουν το μεγαλύτερο ποσοστό βραχέων τελομεριδίων. Από την παρούσα εργασία προκύπτουν εργαστηριακά δεδομένα βάσει των οποίων η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση των ενηλίκων εντάσσεται στις νόσους δυσλειτουργίας των τελομεριδίων τουλάχιστο σε ένα ποσοστό 15% των οικογενών και σποραδικών μορφών της