Μεθοδολογίες υπολογιστικής ανάλυσης και μετα-ανάλυσης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης
Authors: Βέννου Κωνσταντίνα 
Published: September 2021

Η παρούσα διδακτορική διατριβή ασχολήθηκε με την εμπεριστατωμένη μελέτη και εφαρμογή των μεθόδων και στατιστικών τεχνικών της μετα-ανάλυσης, σε δεδομένα υψηλής απόδοσης, και πιο συγκεκριμένα σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από πειράματα μικροσυστοιχιών. Η μετα-ανάλυση είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για τη σύνθεση των στοιχείων σε ένα ευρύ φάσμα μελετών, συμπεριλαμβανομένων των πειραμάτων υψηλής απόδοσης, όπως μελέτες συσχέτισης ολόκληρου του γονιδιώματος (GWAS) και μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Ένα από τα θέματα με τα οποία ασχολήθηκε η παρούσα διατριβή ήταν η διερεύνηση βέλτιστων πρακτικών στη μεθοδολογία μετα-ανάλυσης σε δεδομένα μικροσυστοιχιών. Πραγματοποιήθηκαν διάφοροι έλεγχοι, σε σχετικά μικρά καθώς και σε μεγαλύτερα δοκιμαστικά τυχαία σύνολα δεδομένων (99 και 462 ατόμων αντίστοιχα), χρησιμοποιώντας την παλιά αλλά κλασσική μέθοδο της διόρθωσης του Hedges και διερευνώντας την εμφάνιση καλύτερων ή όχι αποτελεσμάτων με χρήση της μεθόδου αναδειγματοληψίας Bootstrap (είτε με 200 είτε με 500 επαναλήψεις). Τα αποτελέσματα των ελέγχων έδειξαν ότι η χρήση της διόρθωσης του Hedges είναι σχεδόν αναγκαία σε μικρά σύνολα δεδομένων. Ακόμη διερευνήθηκε εάν όντως ισχύει ότι η διόρθωση με τη μέθοδο αναδειγματοληψίας Bootstrap (200 επαναλήψεων) δίνει καλύτερα αποτελέσματα σε σχέση μόνο με την διόρθωση του Hedges, κάτι που εξακριβώθηκε και στην παρούσα μελέτη, ωστόσο χρειάζεται πολύ περισσότερο χρόνο. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι η χρήση της μεθόδου αναδειγματοληψίας Bootstrap των 200 επαναλήψεων επιστρέφει σχεδόν ίδιας στατιστικής ισχύος και χρησιμότητας αποτελέσματα με την πολύ πιο χρονοβόρα μεθοδολογία αναδειγματοληψίας Bootstrap των 500 επαναλήψεων (το οποίο θεωρείται στην βιβλιογραφία ότι επιστέφει πολύ αξιόλογα αποτελέσματα). Στα πλαίσια διερεύνησης διαφόρων πολυπαραγοντικών ασθενειών πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση γονιδιακών δεδομένων από πειράματα μικροσυστοιχιών σχετικά με την ασθένεια της προεκλαμψίας, ώστε να ανακαλυφθούν διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια με σκοπό να βρεθούν και να ταυτοποιηθούν μηχανισμοί οι οποίοι θα μπορούσαν να ευθύνονται για την εμφάνιση της νόσου καθώς και για τους διαφορετικούς υποτύπους της. Με βάση αυτή την κατεύθυνση διερευνήθηκαν οι βάσεις δεδομένων Pubmed και GEO για την ύπαρξη δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα πλακούντα από μελέτες ασθενών-μαρτύρων. Πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση με την οποία βρέθηκαν 629 στατιστικώς σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια να συσχετίζονται με την προεκλαμψία σε επίπεδο σημαντικότητας 1%, τα οποία αναλύθηκαν περαιτέρω με εργαλεία Βιοπληροφορικής και προέκυψαν τα δίκτυα αλληλεπίδρασης και τα βιοχημικά μονοπάτια στα οποία συμμετέχουν. Η ανάλυση του δικτύου έδειξε λίγα γονίδια, πολύ διασυνδεδεμένα, τα οποία εμπλέκονται στην φυσική ανοσία και σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος, ενδεικτικά χαρακτηριστικά μιας πολύπλευρης νόσου με αιτιολογική ετερογένεια. Η ανάλυση των βιοχημικών μονοπατιών αποκάλυψε ότι αυτά τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια συμμετέχουν κυρίως στον μεταβολισμό υδατανθράκων, αμινοξέων και πυριμιδίνης, στο σύστημα του κιρκαδικού ρολογιού και σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Όπως αναφέρθηκε η μετα-ανάλυση είναι ισχυρό εργαλείο στη σύνθεση ερευνητικών μελετών. Υπάρχουν ωστόσο καταστάσεις στις οποίες έχουμε είτε πολλαπλά αποτελέσματα είτε πολλαπλές θεραπείες, σε αυτές είναι αναγκαίο ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο μετα-ανάλυσης, το οποίο θα εκτελεί κοινή μοντελοποίηση των διαφόρων ποσοτήτων ενδιαφέροντος όπου θα προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως την αύξηση της στατιστικής ισχύος και τη δυνατότητα διεξαγωγής συνολικών ελέγχων. Για τους λόγους αυτούς προσαρμόσαμε τη μεθοδολογία της πολυμεταβλητής μετα-ανάλυσης ώστε να εφαρμόζεται και σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, σε ένα εύκολο και αξιόπιστο λογισμικού, με τη χρήση του στατιστικού πακέτου Stata. Η υλοποίηση της μεθόδου είναι διαθέσιμη στο ευρύ κοινό στην ιστοσελίδα www.compgen.org/tools/multivariate-microarrays. Τέλος χρησιμοποιώντας το προαναφερθέν λογισμικό πραγματοποιήθηκε πολυμεταβλητή μετα-ανάλυση σε δεδομένα γονιδιακών δεδομένων από πειράματα μικροσυστοιχιών σχετικά με την νόσο του Crohn και την ελκώδη κολίτιδα, οι οποίες είναι οι κύριες μορφές της Ιδιοπαθούς Φλεγμονώδους Νόσου του Εντέρου. Οι δύο ασθένειες διαθέτουν κοινά συμπτώματα αλλά διαφέρουν στη θέση και την έκταση της φλεγμονής καθώς και στις επιπλοκές τους. 249 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια βρέθηκαν, από τη μετα-ανάλυση, στατιστικώς σημαντικά σχετιζόμενα με τη νόσο του Crohn και 38 με την ελκώδη κολίτιδα σε επίπεδο σημαντικότητας 1%. 20 από τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ήταν κοινά και στις δύο ασθένειες. Ένας συνολικός έλεγχος έδειξε 260 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σχετιζόμενα με την Ιδιοπαθή Φλεγμονώδη Νόσο του Εντέρου, εκ των οποίων 53 δεν θεωρήθηκαν σημαντικά σε καμία από τις δύο ασθένειες. Ακόμη ανακαλύφθηκαν στατιστικώς σημαντικά βιοχημικά μονοπάτια, με χρήση βιοπληροφορικών εργαλείων, τα οποία ενδεχομένως να εμπλέκονται στην παθογένεση της Ιδιοπαθούς Φλεγμονώδους Νόσου του Εντέρου. Χαρακτηριστικά είναι το μονοπάτι των μεταγραφικών παραγόντων των JAK/STAT και το σηματοδοτικό μονοπάτι της ιντερφερόνης γ. Επιπροσθέτως γονίδια τα οποία συμμετέχουν στην κυτταρική διαίρεση, στην απόπτωση και στην καρκινογέννεση, βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικά. Μεταξύ άλλων τα γονίδια BCAT2 και GZMB είναι δύο ενδιαφέροντα νέα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια τα οποία αξίζουν επικείμενη μελέτη σε πειραματικά μοντέλα.