Μεταλλάξεις του γονιδίου της ενδογλίνης στην κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειεκτασία
Authors: Θεοδοσίου Βασιλική 
Published: January 2014

Προσδιορισμένη σχεδόν έναν αιώνα πριν η κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειεκτασία (ΗΗΤ) ή νόσος Rendu –Osler –Weber, θεωρούνταν για πολύ καιρό μία σπάνια περίπτωση που προκαλεί ελάχιστα δυσάρεστα συμπτώματα στα προσβεβλημένα άτομα. Οι αναγνωρισμένες εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειεκτασίας οφείλονται όλες σε ανωμαλίες της κατασκευής και της δομής των αγγείων. Οι πάσχοντες παρουσιάζουν μεγάλο εύρος συμπτωμάτων, ενώ οι κλινικές εκδηλώσεις συχνά διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των οικογενειών, αλλά και μεταξύ των μελών της ίδιας οικογένειας. Οι ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειεκτασίας περιλαμβάνουν αγγειακές διαταραχές (AVMs) στο ρινικό και στοματικό βλεννογόνο, στο δέρμα, στον εγκέφαλο, στον γαστρεντερικό βλεννογόνο, στο ήπαρ και στους πνεύμονες (PAVMs). Η HHT είναι γενετικά ετερογενής και διακρίνεται σε HHT-1 και HHT-2, HHT-3 και HHT-4, σύμφωνα με μεταλλάξεις στο γονίδιο της ενδογλίνης (ENG), στο γονίδιο ακτιβίνης Α υποδοχέα τύπου ΙΙ (ACVRL1) στο γονίδιο MADH4 και JPHT , αντίστοιχαΣκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αναζήτηση μεταλλάξεων του γονιδίου της ενδογλίνης σε έλληνες ασθενείς πάσχοντες από νόσο Rendu-Osler-Weber. Η χαρτογράφηση των μεταλλάξεων θα συμβάλει σημαντικά στην θεραπευτική παρέμβαση, πριν την εμφάνιση των συμπτωμάτων σε ασθενείς και μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την έκβαση της ασθένειας. Επιπλέον, σε οικογένειες στις οποίες υπάρχουν βαριές κλινικές εκδηλώσεις της νόσου, ο προγεννητικός έλεγχος δίνει στους γονείς την δυνατότητα να επιλέξουν διακοπή της κύησης ή όχι. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΥΛΙΚΟ: Χρησιμοποιήθηκαν ασθενείς της Πανεπιστημιακής Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Λάρισας, των οποίων έγινε μελέτη του οικογενειακού τους δένδρου. Οι 11 ασθενείς κατάγονται από τη Θεσσαλία και 28 κατάγονται από την Κρήτη. Επίσης μελετήθηκαν 10 μεμονομένα άτομα.ΜΕΘΟΔΟΙ: Τα δείγματα συλλέχθηκαν από τους ασθενείς σε μορφή αίματος. Ακολούθησε απομόνωση του DNA από το ολικό αίμα με τη μέθοδος της φαινόλης-χλωροφόρμιου-ισοαμυλικής αλκοόλης. Ακολούθησε πολλαπλασιασμός των εξονίων των υπεύθυνων γονιδίων με την μέθοδο της PCR. Το γονίδιο της ενδογλίνης αποτελείται από 14 εξόνια, από τα οποία τα 1 έως 13 είναι αυτά στα οποία έχουν εντοπιστεί οι έως τώρα γνωστές μεταλλάξεις. Για την διαδικασία της PCR χρησιμοποιήθηκαν περιβάλλοντες εκκινητές (flanking primers) για το κάθε εξόνιο, που έχει σχεδιαστεί στο εργαστήριό μας με βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων ENG που έχουν καταχωρηθεί στην GenBank (ENG – OMIM: 232295; 187300; GenBank: AH006911.1, BC014271.2). Στα περισσότερα από τα εξόνια χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της nested PCR, για περαιτέρω ενίσχυση του προϊόντος. Για τον προσδιορισμό της πρωτοταγούς νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA εφαρμόστηκε η ενζυμική μέθοδος κατά SangerΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΔιαπιστώθηκαν δύο νέες μεταλλάξεις, δύο γνωστές μεταλλάξεις και δύο πολυμορφισμοί. Οι νέες μεταλλάξεις περιλαμβάνουν 1) μία μεγάλη έλλειψη των εξονίων 2,3 και 4 (οικογένειες από την Κρήτη 4,5,6 και μεμονωμένοι ασθενείς 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 από την Κρήτη) και 2) μία επανάληψη στο εξόνιο 2 από την βάση 68 έως 523 (ασθενής 0.9 από την Κρήτη).Οι γνωστές μεταλλάξεις περιλαμβάνουν 1)μία απαλοιφή μίας C στην θέση 63 στο εξόνιο 1 (οικογένειες από την Κρήτη 1 και 2, ασθενείς 0.1, 0.2, 0.3 και 0.4 από την Κρήτη) και 2) απαλοιφή των βάσεων 332 έως 338 στο εξόνιο 3 (ασθενής 010 από την Κρήτη).Οι πιθανοί πολυμορφισμοί περιλαμβάνουν 1) μία ένθεση μιας C στην θέση 35 στο 1 (οικογένεια 7 από την Θεσσαλία) και 2) μία ένθεση μίας G στη θέση 315 στο ιντρόνιο μεταξύ των εξονίων 11 και 12(οικογένεια 10 από την Θεσσαλία). Οι διαφοροποιήσεις αυτές του DNA δεν σχετίζονται με την νόσο.ΣΥΖΗΤΗΣΗΣτην μελέτη μας βρέθηκαν μεταλλάξεις (νέες και ήδη γνωστές) που βρίσκονται στα εξόνια 1 έως 11, τα οποία κωδικοποιούν το εξωκυττάριο τμήμα της πρωτεΐνης. Οι μεταλλάξεις αυτές - όπως και το 80% των μεταλλάξεων του ENG γονιδίου - οδηγούν σε πρόωρα κωδικόνια λήξης και εκτρωτικά πολυπεπτίδια. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες σπάνια ανιχνεύονται ενώ ακόμη και, όταν εκφράζονται δεν φτάνουν στην κυτταρική μεμβράνη. Οι μεταλλάξεις, που οδηγούν σε αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης και κατακερματισμό πιθανώς καταλήγουν σε ελαττωμένα επίπεδα mRNA και πολύ ασταθείς μεταλλαγμένες πρωτεΐνες. Σε πρωτεϊνικό επίπεδο δεν μπορούν να εντοπιστούν οι πρωτεΐνες αλλά μόνο με DNA ανάλυση.