The effect of Porhyromonas gingivalis, the keystogen pathogen, on stimulation of human mast cells in periodontal disease
Authors: Παλάσκα Κασσιανή-Ηρώ 
Published: November 2021

Ανασκόπηση: Ως Περιοδοντική νόσος χαρακτηρίζεται η φλεγμονώδης αντίδραση των στηρικτικών περιοδοντικών ιστών, λόγω της συσσώρευσης μικροβιακής πλάκας, που έχει ως αποτέλεσμα την προοδευτική απώλεια πρόσφυσης και απώλεια φατνιακού οστού. Η βακτηριακή συσσώρευση και ο σχηματισμός πλάκας είναι απαραίτητες για την έναρξη της νόσου. Ένα απο τα σημαντικότερα περιοπαθογόνα, που εμπλέκονται στην εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου, είναι ο Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)του οποίου συστατικά του κυτταρικού του τοιχώματος, όπως οι λιπο-πολυσακχαρίτες (LPS), μπορεί να προκαλέσουν ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού μηχανισμού μέσω συγκεκριμένων υποδοχέων στα αμυντικά κυταρρα, τους Toll-like receptors(TLR). Η διασταυρούμενη ομιλία μεταξύ μικροβιακής προσβολής και ανοσο-ανταπόκρισης προκαλείται από κυτοκίνες/χημειοκίνες που εκκρίνονται τοπικά από τα κύτταρα-ξενιστές. Στους σημαντικότερους μεσολαβητές που υπαγορεύουν το ρυθμό και την εξέλιξη της περιοδοντικής καταστροφής μέσω της ενεργοποίησης φλεγμονώδουςς αντίδρασης ανήκει ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α), o αυξητικός αγγειακός ενδοθηλιακός παράγοντας (VEGF) και η χημειοτακτική πρωτείνη των μονοκυττάρων (MCP-1). Πολλές αναφορές, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ετών, έχουν ρίξει φως στo ρόλο συγκεκριμένων κυττάρων που διαμένουν στον συνδετικό ιστό των ούλων και εμφανίζουν σημαντική συνεισφορά στην φλεγμονώδη απόκριση κατά την περιοδοντική νόσο, τα μαστοκύτταρα (MCs). Τα μαστοκύτταρα εμπλέκονται σε πολλές δραστηριότητες, από τον έλεγχο του αγγειακού συστήματος σε βλάβη ή επιδιόρθωση των ιστών, στην αλλεργική φλεγμονή μέχρι και στην άμυνα του ξενιστή. Η σημαντική συμβολή των μεσολαβητών των κυττάρων αυτών, στην διάδοση της φλεγμονώδους απόκρισης καθιστούν τον έλεγχο της δραστικότητας τους,ζωτικής σημασίας για τη διαχείριση πολλών φλεγμονωδών ασθενειών. H αύξηση των μαστοκυττάρων in vivo στις περιοδοντικές βλάβες, ενισχύει την άποψη της συμμετοχής τους, στους πιθανούς μηχανισμούς άμυνας ή/και καταστροφής κατά την διάρκεια της περιοδοντικής φλεγμονής. Ακόμη και εάν πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με τον ποιοτικό και ποσοτικό καθορισμό των μαστοκυττάρων σε υγιείς ή περιοδοντικά προσβεβλημένους ιστούς, ελάχιστες μελέτες έχουν γίνει με σκοπό την μελετή της επίδρασης των περιοπαθογόνων βακτηρίων (όπως Ρ. gingivalis) στην διέγερση και δράση των ανθρωπίνων μαστοκυττάρων.14Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε ως σκοπό να μελετήσει την επίδραση του P. gingivalis LPS, στην διέγερση ανθρωπίνων μαστοκυττάρων, (κυτταρικής σειράς LAD2) και την παραγωγή μεσολαβητών της φλεγμονής. Συγκεκριμένα μελετήθηκε, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε πρωτεινικό επίπεδο, η έκφραση και απελευθέρωση του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF-α), του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και της χημειοτακτικής πρωτεΐνης των μονοκυττάρων (MCP-1) από τα ανθρώπινα διεγειρμένα μαστοκύτταρα. Οι συγκεκριμένοι μεσολαβητές επιλέχθηκαν, καθώς έχουν ενοχοποιηθεί για τον ρόλο τους στην έναρξη και επιδείνωση της περιοδοντικής νόσου. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η ύπαρξη ή όχι, διαφοροποιημένης διέγερσης των κυττάρων και κατ’επέκταση παραγωγή των μεσολαβητών, υπό την επίδραση ιδίων συγκεντρώσεων λιποπολυσακχαριτών προερχόμενοι απο P. gingivalis και E. Coli βακτήρια. Επιπλέον, μελετήκε εάν και μέσω ποιού TLR υποδοχέα, έγινε η διέγερση των ανθρωπίνων μαστοκυττάρων απο το κάθε λιποπολυσακχαρίτη και συγκεκριμένα διερευνήθηκε ο λειτουργικός ρόλος των TLR4 και TLR2. Υλικά και Μέθοδοι: Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ηταν της κυτταρικής σειράς LAD2 (ευγενική χορηγία του Δρ. Kirshenbaum, National Institutes of Health, Bethesda) και προήλθαν από ανθρώπινα μαστοκύτταρα ασθενούς με λευχαιμική μαστοκυττάρωση. Η καλλιέργειά τους έγινε σε μέσο StemPro34 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 100 U/mLπενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης και 100 ng/mL rhSCF (Swedish Orphan Biovitrum AB). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία 37°C σε επωαστήριο με σύστημα ύγρανσης με 5% CO2 . Όλα τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν στο στάδιο λογαριθμικής ανάπτυξής τους. Χρησιμοποιήθηκε εμπορικά διαθέσιμο παρασκεύασμα λιποπολυσακχαρίτη από P. gingivalis (Invivogen) και από E. coli 0111: B4 (Sigma-Aldrich). Τα κιτ μεθόδου sandwichELISA για TNF-α, VEGF και MCP-1 προήλθαν από την R&D Systems. Τα ανθρώπινα μονόκλωνικά αντισώματα TLR4 και TLR2 (100μg Mab-hTLR4, Mab-hTLR2) προήλθαν από την Invivogen και οι ιχνηθέτες Taqman για TNF-α, VEGF, και MCP-1 και το Taqman MasterMix απο την Applied Biosystems. Η δοκιμή έκκρισης β-εξοζαμινιδάσης (β-hex) πραγματοποιήθηκε, χρησιμοποιώντας φθοριομετρική δοκιμή ως δείκτη της απώλειας κοκκίων απο τα μαστοκύτταρα. Τα LAD2 (0,5 × 105) διεγέρθηκαν με LPS η ουσία P (SP) για 30 λεπτά. Η SP (2 μmol/L) χρησιμοποιήθηκε ως ουσία θετικού ελέγχου. Με σκοπό να μετρηθεί η έκκριση de novo των μεσολαβητών υπό εξέταση, τα κύτταρα LAD2 (0.5 × 105) 15διεγέρθηκαν με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις LPS (1 ng/ml και 1 μg/ml) για 24 ώρες. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν επίσης με την ουσία P (SP) (2 μM) η οποία χρησίμευσε ως ουσία θετικού ελέγχου και μή διεγερμένα κύτταρα ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. Τα υπερκείμενα υγρά συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 150 x g), αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία 20° C και υποβλήθηκαν σε δοκιμή για TNF-α, VEGF και MCP-1, χρησιμοποιώντας κιτ ενζυμικής δοκιμής ανοσοπροσρόφησης ELISA. Για την έκφραση σε επίπεδο mRNA, τα LAD2 διεγέρθηκαν είτε με SP (2 μM) ή με LPS από P. gingivalis και E. coli (1 ng/mL) για 6 ώρες. Το συνολικό mRNA εξάχθηκε με κιτ RNeasy Mini. Χρησιμοποιήθηκε κιτ σύνθεσης cDNA iScriptγια την αντίστροφη μεταγραφή κάθε δείγματος. Η ποσοτική qPCR πραγματικού χρόνου ανιχνεύθηκε με δοκιμές γονιδιακής έκφρασης TaqMan για TNF-α (Hs99999043_m1), MCP1 (Hs00234140_m1) και VEGF (Hs00900055_m1). Η γονιδιακή έκφραση mRNAκανονικοποιήθηκε σε ενδογενή έλεγχο του ανθρώπινου γονιδίου GAPDH. Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος των TLR2 και TLR4 στην έκκριση διαμεσολαβητών, τα LAD2 επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα anti-TLR2 ή anti-TLR4 (2 μg/ml) για 1 ώρα πριν από τη διέγερση με LPS από P. gingivalis και E. coli (1 μg/ml). Τα υπερκείμενα υγρά συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμή για διαμεσολαβητές με τη μέθοδο ELISA μετά από 24 ώρες. Οι ουσίες θετικού ελέγχου ήταν κύτταρα επωασμένα με LPS, αλλά χωρίς antiTLR, ενώ οι ουσίες αρνητικού ελέγχου ήταν κύτταρα μή διεγερμένα. Αποτελέσματα: Και τα δύο LPS που χρησιμοποιήθηκαν, δεν προκάλεσαν αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων σε αντίθεση με την ουσία P, η οποία οδήγησε σε σταστιστικά σημαντική αποκκοκίωση των κυττάρων (p < 0.05). Η διέγερση των LAD2 κυττάρων με P. gingivalis LPS είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση, στην γονιδιακή έκφραση και για τους τρεις υπό μελετη μεσολαβητές της φλεγμονής (p <0.05). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και για τον Ε. Coli LPS σχετικά με την έκφραση του γονιδίου TNF-α και VEGF (p < 0.05). Αντιθέτως, η γονιδιακή έκφραση για την MCP-1, ακόμη και αν υπήρχε μικρή αύξηση, δεν ήταν στατιστικά σημαντική από την ομάδα ελέγχου (p > 0.05).Όσον αφορά στα δύο διαφορετικά LPS που χρησιμοποιήθηκαν, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση γονιδίων. Η διέγερση των κυττάρων LAD2 με την ουσία P προκάλεσε την πιο ισχυρή αύξηση της γονιδιακής έκφρασης για όλους τους μεσολαβητές, στατιστικά σημαντική τόσο σε σχέση με την ομάδα ελέγχου όσο και με τις ομάδες LPSs. Όσον αφορά στην απελευθέρωση σε επίπεδο πρωτεΐνης, και οι δύο 16συγκεντρώσεις LPS που ελέγχθηκαν (1 ng / ml και 1 μg / ml) οδήγησαν σε de novoαπελευθέρωση και των τριών μεσολαβητών που μελετήθηκαν, σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (p < 0.05). Τα επίπεδα απελευθέρωσης για TNF-α, VEGF και MCP-1κινήθηκαν στα ίδια επίπεδα για τον P. gingivalis και για E. coli LPS, στην ίδια συγκέντρωση, καθώς δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά (p > 0.05). Ωστόσο, υπήρχε η τάση υψηλότερων επιπέδων απελευθέρωσης για το P. gingivalis LPS και στις δύο υπό εξέταση συγκεντρώσεις σε σύγκριση με το Ε. Coli LPS. H ύπαρξη μιας εξαρτούμενης σχέσης συγκέντρωσης - απόκρισης δεν παρατηρήθηκε και για τα δύο LPS στη μελέτη μας. Η ουσία P οδήγησε σε απελευθέρωση των TNF-α, VEGF και MCP-1 στις υψηλότερες συγκεντρώσεις, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με την ομάδα ελέγχου και τις ομάδες LPS (p < 0.05). Τα επίπεδα των τριών μεσολαβητών που μελετήθηκαν, μειώθηκαν μετά την προ-θεραπεία με αντι-TLR4 και αντι-TLR2 αντισώματα και στις δύο ομάδες LPSs. Τα επίπεδα ΤΝF-α μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα Ρ. Gingivalis, μετά από επώαση με αντίσωμα αντι-TLR2 ενώ στην ομάδα Ε. coli, η μείωση ήταν πιο εμφανής μετά την επώαση με το αντίσωμα αντιΤLR4. Τόσο τα αντι-TLR4 όσο και τα αντι-TLR2 αντισώματα μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα του VEGF μετά από διέγερση είτε με P. gingivalis είτε με Ε. Coli LPS (p < 0.05). Είναι ενδιαφέρον ότι η προ-επώαση κυττάρων LAD2 με αντισώματα αντι-TLR4 ή αντι-TLR2 δεν μείωσε, στατιστικά σημαντικά, τα επίπεδα MCP-1 σε καμία από τις ομάδες LPSs (p > 0. 05).Συμπεράσματα: Η παρούσα ερευνητική προσπάθεια δείχνει για πρώτη φορά ότι ο LPS από το κυριότερο περιοπαθογόνο βακτήριο, P. gingivalis, επιλεκτικά, χωρίς αποκοκκίωση, διεγείρει τα μαστοκύττρα της σειράς LAD2, τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεινικό εππίπεδο για την απελευθέρωση TNF-α, VEGF και MCP-1, μεσολαβητές που έχουν τεκμηριωθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου. Επιπρόσθετα, στην παρούσα μελέτη, δεν παρατηρήθηκε διαφορά του P. gingivalisLPS σε σύγκριση με το E. coli LPS στην ικανότητα διέγερσης και παραγωγής κυτοκινών.Επιπλέον, τεκμηριώσαμε ότι ο P. gingivalis LPS μπορεί να λειτουργεί τόσο μέσω του TLR2 όσο και του TLR4 στην συγκεκριμένη κυτταρική σειρά. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε την ουσία P ως ουσία θετικού ελέγχου για όλα τα πειράματα. Η ουσία P είναι ένα νευροπεπτίδιο που εμπλέκεται στη νευρογενή φλεγμονή και είναι ένας σημαντικός νευροδιαμεσολαβητής. Πρόσφατα, το νευρικό σύστημα έχει αναγνωριστεί ως κρίσιμος ρυθμιστής της φλεγμονής και στις περιοδοντικές νόσους. Τα μαστοκύτταρα είναι παρόντα 17στο ανθρώπινο σώμα και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στις αλλεργικές αντιδράσεις όσο και σε φλεγμονώδεις διεργασίες, ιδιαίτερα εκείνες που επιδεινώνονται λόγω άγχους, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η ατοπική δερματίτιδα, η πολλαπλή σκλήρυνση, η ψωρίαση και η περιοδοντική φλεγμονή. Η αναστολή της ενεργοποίησης των μαστοκυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε νέους θεραπευτικούς στόχους για τον έλεγχο της φλεγμονώδους αντίδρασης στους περιοδοντικούς ιστούς.