Ανάπτυξη μεθόδων μεταφοράς βιομορίων με τη χρήση νανοσωματιδίων
Authors: Κατσικάρη Αθανασία 
Published: September 2021

Πολυάριθμα προβλήματα που σχετίζονται με τα ελεύθερα φάρμακα και τα εμβόλια, όπως η μικρή διαλυτότητα, η φτωχή σταθερότητα και οι ανεπιθύμητες παρενέργειες, έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων. Μολονότι έχουν παρουσιαστεί αρκετά καινοτόμα συστήματα μεταφοράς εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη βελτίωσης των θεμάτων αυτών. Τις τελευταίες δεκαετίες, τα συστήματα μεταφοράς που βασίζονται σε σωματίδια έχουν διερευνηθεί εκτεταμένα για την επίλυση των προβλημάτων. Συγκεκριμένα, η χρησιμοποίηση βιοαποικοδομήσιμων πολυμερικών νανοσωματιδίων με ενσωματωμένα φάρμακα ή εμβόλια αντιπροσωπεύουν μία συναρπαστική προσέγγιση όσον αφορά τον έλεγχο της αποδέσμευσης των ουσιών. Μεταξύ των πολυμερικών σωματιδίων, τα νανοσωματίδια που στηρίζονται στο πολυ(γαλακτικό-γλυκολικό)οξύ (PLGA) αποτελούν έναν από τους πιο συχνά μελετημένους φορείς μεταφοράς φαρμάκων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών, εμβολίων και νουκλεοτιδίων. Το PLGA είναι ένα συμπολυμερές αποτελούμενο από γαλακτικό οξύ και γλυκολικό οξύ και είναι ένα από τα λίγα πολυμερή που έχει εγκριθεί για φαρμακευτικούς σκοπούς χάρη στη βιοαποικοδομησιμότητα και την έλλειψη τοξικότητας. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων PLGA NPs για αποτελεσματική μεταφορά πρωτεϊνών και DNA, σε κύτταρα και ιστούς. Τα νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και εξάτμισης του διαλύτη, αφού προηγήθηκε ο προσδιορισμός της επίδρασης ποικίλλων παραγόντων στις φυσικοχημικές ιδιότητες των παραγόμενων νανοσωματιδίων. Τα νανοσωματίδια που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν πλήρως ως προς το μέγεθος, το επιφανειακό τους φορτίο και τη μορφολογία τους ενώ ακολούθησε μελέτη της δομικής και λειτουργικής ακεραιότητας του ενσωματωμένου DNA και της αποδέσμευσης του από τα νανοσωματίδια. Αξιολόγηση της πιθανής τοξικότητας των νανοσωματιδίων in vitro έδειξε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται μόνο σε συγκεντρώσεις νανοσωματιδίων ανώτερες των 1 mg/ml. Διερεύνηση της πρόσληψης αποκάλυψε ότι τα νανοσωματίδια εισέρχονται στο εσωτερικό των κυττάρων από τα πρώτα 30 λεπτά της επώασης και διανέμονται ομοιόμορφα στο κυτταρόπλασμα και τον περι-πυρηνικό χώρο. Επιπρόσθετα, διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν την in vitro πρόσληψη των νανοσωματιδίων αποκάλυψε ότι πρόκειται για μία διεργασία που παρουσιάζει δοσο- και χρονο- εξαρτώμενο χαρακτήρα και ότι αναστέλλεται σε σημαντικό βαθμό μειώνοντας τη θερμοκρασία επώασης στους 4οC και από την παρουσία αναστολέων όπως το NaN3 και η κυτοχαλαζίνη D. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν ότι η πρόσληψη είναι μία ενεργητική διαδικασία και ότι είναι πιθανό να στηρίζεται σε κάποιο μηχανισμό ενδοκύττωσης. Μετά από τις δοκιμές πρώτης γραμμής in vitro, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των κυτταρικών επιδράσεων με το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα. Με το μοντέλο αυτό έγινε δυνατός ο αξιόπιστος και ταχύς χαρακτηρισμός της ανοσοτροποποιητικής δράσης των νανοσωματιδίων που προκαλούν ενεργοποίηση των μηχανισμών της έμφυτης ανοσίας στον αεροθύλακα. Ιδιαιτέρως ικανοποιητικά ήταν τα αποτελέσματα της in vivo πρόσληψης των νανοσωματιδίων και αποτελεσματικής μεταφοράς του φορτίου τους, μέσω δύο διαφορετικών οδών χορήγησης. Ενδομυϊκή χορήγηση pMAX-GFP NPs είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση της πρωτεΐνης GFP στους τετρακέφαλους μύες των ποντικών. Από την άλλη, 30 μόλις λεπτά μετά τη στοματική χορήγηση νανοσωματιδίων φορτωμένων με FITC σε ποντίκια της φυλής Balb/c, τα νανοσωματίδια εντοπίστηκαν στο έντερο. Ανιχνεύτηκαν επίσης σημαντικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης όταν τα ποντίκια ταΐστηκαν με PLGA NPs που περιείχαν το πλασμίδιο pMAX-GFP, 12 ημέρες μετά την πρώτη ανοσοποίηση, τη στιγμή που κάτι τέτοιο κατέστη αδύνατο με γυμνό πλασμιδιακό DNA.Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής θέσης υπογραμμίζουν τη δυνατότητα χρησιμοποίησης των PLGA NPs που παρασκευάστηκαν ως φορέων πρωτεϊνών και DNA. Τα νανοσωματίδια που είναι φορτωμένα με πλασμίδιο μπορούν να παρέχουν τοπική και συνεχή απελευθέρωση στον ιστό στόχο, και συνεπώς παρουσιάζουν τη δυνατότητα ενίσχυσης της δραστικότητας του γυμνού DNA προς έκφραση. Η κατανόηση των ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων θα μπορούσε να διευκολύνει την εφαρμογή τους σε πεδία όπως ο DNA εμβολιασμός, μέσω ποικίλλων οδών χορήγησης.