Estudio de las características bio-ecológicas de un aislamiento autóctono del entomonemátodo <i>Heterorhabditis bacteriophora</i> (Nematoda: Heterorhabditidae) y su potencialidad como agente bioregulador de insectos
Authors:   , Eliceche Daiana Pamela 
Published: October 2019

Algunos nematodos parásitos de insectos tienen relaciones simbióticas con bacterias que son responsables de matar rápidamente a los insectos parasitados. A causa de esta muerte rápida, el termino entomopatógenos es utilizado para describir a estos nematodos. Los nematodos entomopatógenos de las familias Heterorhabditidae forman una simbiosis mutualista con bacterias patógenas de insectos de la familia Enterobacteriaceae, específicamente del genero Photorhabdus. Los juveniles infectivos (JIs) permanecen en el suelo en busca de un insecto hospedador adecuado. Tras la entrada a través de la cutícula o las aberturas naturales del hospedador, los JIs liberan las bacterias simbióticas en el hemocele de los insectos, provocando la muerte del mismo dentro de las 24-48 hs. Los nematodos se alimentan de las bacterias simbióticas, completan 1-3 generaciones en el cadáver del hospedador y, a medida que se agotan los recursos alimenticios, se producen nuevos JIs que se dispersan en busca de nuevos hospedadores. La variabilidad del complejo nematodo-bacteria, condiciona su virulencia, la cual a su vez se relaciona con el área de procedencia. Las especies nativas son consideradas en programas de control biológico de plagas respecto a especies introducidas, ya que se espera estén adaptadas a las condiciones locales, incluyendo a la propia plaga. El relevamiento de muestras de suelo provenientes de una huerta orgánica del cinturón hortícola platense, reveló la presencia de un nuevo aislado de Heterorhabditis bacteriophora, estudios morfológicos y moleculares, mostraron que las características morfológicas fueron cualitativamente similares a la de otras poblaciones de Heterorhabditis citadas y los análisis bioinformáticos permitieron determinar que este nematodo fuera un nuevo aislamiento de H. bacteriophora, el cual fue designado como Heterorhabditis bacteriophora SUP. Esta población representa un nuevo registro para el cinturón hortícola platense. A su vez, mediante estudios de morfología de las colonias, pruebas bioquímicas, biotipificación y análisis moleculares se caracterizó la bacteria endosimbionte asociada a este aislamiento como Photorhabdus luminescens. El uso excesivo de agroquímicos y la carencia de productos para control de plagas constituye uno de los principales problemas en el cinturón hortícola bonaerense por lo cual los enemigos naturales (parásitos, patógenos y depredadores) constituyen una alternativa de control de plagas de importancia agroeconómica. La caracterización de los diferentes aislados es necesaria para la búsqueda de nuevas alternativas al uso de agroquímicos para el control de plagas en la región. El uso y éxito de estos organismos a campo como agentes de biocontrol exige una metodología eficiente de producción que proporcione altas densidades de JIs sin alterar su virulencia. Cuando se aísla un agente de control biológico a partir de un ambiente natural y es criado en el laboratorio, o producido en masa con fines comerciales, sus atributos biológicos pueden alterarse dando lugar a la disminución y pérdida de la patogenia y la longevidad durante los procesos de producción, desarrollo y formulación, afectando laviabilidad de los productos comerciales. Varios factores podrían afectar su eficacia, entre ellos, la selección del hospedador para la cría in vivo. Tenebrio molitor se mostró susceptible a H. bacteriophora SUP cuya infectividad resultó ser mayor conforme al aumento de concentración de JIs, obteniéndose menores tiempos letales, sin embargo, la mayor producción de JIs se obtuvo con las menores concentraciones de exposición evaluadas. Dada la susceptibilidad de las larvas de T. molitor a la cepa en estudio, el uso de estos insectos como insectos de cría para la producción in vivo de H. bacteriophora representa una alternativa viable respecto al uso de Galleria melonella, debido a la facilidad para criarlos en el laboratorio y a los bajos costos económicos asociados. En este sentido, para maximizar la producción de este aislamiento deberían utilizarse las concentraciones más bajas. La viabilidad es otro factor a considerar, durante sus condiciones de almacenamiento, la temperatura y la densidad afectaron la supervivencia media de los JIs almacenados, resultando esta menor conforme aumenta la temperatura y a su vez por incremento de la densidad; resultando más adecuadas para su almacenamiento las temperaturas de 4 y 16°C y bajas concentraciones de JIs. A pesar de garantizar una amplia supervivencia, la temperatura de 4°C redujo significativamente la virulencia de los nematodos almacenados sin pasar por un hospedador. En cuanto a la eficacia de los JIs, la infectividad de la cepa en estudio fue mayor a superficies intermedias de exposición, obteniéndose mayores porcentajes de mortalidad con una concentración de 1000 JIs en capsulas de 10 cm respecto a 5 y 25 cm. En concordancia con la zona de origen de este aislamiento, caracterizada por un clima templado a cálido con un promedio anual de temperatura de 17°C, la viabilidad de la cepa, reproducción, actividad, infectividad y supervivencia resultaron óptimas en un rango de temperatura de 16 a 25°C, siendo 16°C la temperatura más adecuada para su mantenimiento en el laboratorio en pos de asegurar una alta longevidad, supervivencia y virulencia sostenida en el tiempo. La infectividad de los JIs podría estar relacionada con la viabilidad de su bacteria endosimbionte, en este sentido, las pruebas de viabilidad en medio líquido para P. luminescens, permitieron establecer un rango de temperatura de 16 a 25°C en el cual las bacterias sobrevivieron por más de 20 semanas. La utilización de enemigos naturales constituye uno de los pilares del manejo integrado de plagas, cuyo objetivo es reducir por debajo del nivel de daño económico la población de una plaga por medio de la utilización de diferentes estrategias de control, entre las que se encuentran el control biológico. En la Provincia de Buenos Aires la horticultura es una de las actividades agrícolas más importantes. Los reportes de plagas emergentes en huertas de producción orgánica, como el coleóptero Lobiopa insularis en cultivos de frutilla y Phyrdenus muriceus en cultivos de berenjena hace necesaria la búsqueda y evaluación de enemigos naturales para su uso en control biológico. La susceptibilidad de estos coleópteros al aislamiento caracterizado en este estudio fue probada. El aislamiento nativo H. bacteriophora SUP resultó ser infectivo sobre L. insularis, registrándose una susceptibilidad decreciente de 77,10; 56,67 y 25,00%, para larvas, pupas y adultos, respectivamente. La mayor susceptibilidad de larvas y pupas, sumado al comportamiento de estos insectos de dirigirse al suelo para empupar, los convierte en un blanco adecuado para el control con nematodos entomopatógenos. H. bacteriophora SUP pudo completar el ciclo en todos los estados de desarrollo de L. insularis, lo cual mejoraría el establecimiento y la propagación de este aislamiento tras una aplicación en el campo. Dada la susceptibilidad registrada y la factibilidad de su empleo en el control de los estados del coleóptero, se realizó una evaluación a campo, la cual incluyó la liberación de los JIs en la estación experimental Julio Hirschhorn ubicada en Los Hornos, Provincia de Buenos Aires para evaluar el efecto de control sobre L. insularis en cultivos de frutilla. Previo a la liberación se realizó un monitoreo en el cual se registró el número de frutillas presentes en el cultivo, se contabilizaron y clasificaron las frutillas por estado de maduración (verde, roja y fermentada) y se contabilizó el número de coleópteros por fruta examinada. La aplicación se realizó por medio de suspensiones acuosas de JIs. Se trataron un total de 6 parcelas, utilizando una concentración de 10.000 JIs por planta, y se marcaron otras 6 como controles. Los registros post-aplicación no arrojaron diferencias significativas entre parcelas tratadas y controles. Sin embargo, al comparar los registros pre-aplicación y post-aplicación, se detectaron diferencias significativas en el porcentaje de frutillas atacadas, 32% para los registros pre-aplicación y 28 y 17% para parcelas control y tratadas post-aplicación, respectivamente. Estas diferencias podrían ser atribuidas a una reducción del número de frutas disponibles como fuentes de alimento, y/o a la dispersión de los JIs desde las parcelas aplicadas hacia los controles. Los resultados indicaron que el 93,14% de los coleópteros se encontraron en las frutillas fermentadas, y que la proporción de frutillas fermentadas atacadas fue mayor a los otros estados. Por otro lado, la infectividad en trampas cebo colocadas en el campo demostró la persistencia de los nematodos durante el periodo evaluado (8 meses) y su dispersión a lo largo del cultivo. A los tres meses de ser aplicado se lo encontró en el 92% de las muestras de suelo colectadas, encontrándolos a lo largo de todos los camellones, incluidos los no tratados. H. bacteriophora SUP demostró varios atributos como potencial agente de control de L. insularis: se trata de una población adaptada a las condiciones ambientales y climáticas locales, provocó la muerte de los tres estados de la plaga, demostró un amplio poder de dispersión por medio de movimientos activos y/o pasivos, y a su vez pudo persistir en el ambiente. Las pruebas de laboratorio demostraron la susceptibilidad del coleóptero Phyrdenus muriceus a H. bacteriophora SUP, demostrando mayor virulencia frente a larvas y pupas, probablemente debido a la baja movilidad de estos estados respecto a los adultos. El nematodo pudo completar su ciclo en todos los estados evaluados. Dada la susceptibilidad de la plaga al aislamiento estudiado, la escasez de enemigos naturales y el nivel de daño ocasionado por los coleópteros en el momento de la plantación de los cultivos, pruebas de campo fueron realizadas con el objetivo de evaluar el control sobre P. muriceus. La liberación de H. bacteriophora SUP se realizó empleando dos metodologías de aplicación. El monitoreo de la plaga se estimó a partir del daño producido en las hojas, contabilizando el número de agujeros (daño) por hoja producidos por los gorgojos al alimentarse de la planta. Las evaluaciones realizadas luego de la primera aplicación, no mostraron un efecto positivo sobre la reducción de las poblaciones de P. muriceus. Los registros de daño en hojas no mostraron diferencias significativas entre tratamientos y controles, el rango de daño fue de 5,4- 6,1 agujeros/hoja; mientras que luego de una segunda aplicación de JIs, se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, cuyo rango de daño promedio fue de 26,4 -42 agujeros/hoja. Estas diferencias detectadas sumadas a la colecta de adultos de P. muriceus infectados con H. bacteriophora, permitieron determinar la eficacia de este nematodo sobre el control de esta plaga. A su vez, muestras de suelo fueron evaluadas mensualmente con el fin de conocer la persistencia y dispersión de los JIs aplicados en este cultivo. A partir de los datos obtenidos, se observó que dos meses después de la aplicación, los JIs se dispersaron a las parcelas asignadas como controles, ubicadas a 3 metros de los puntos de aplicación. Esto pudo deberse en parte al movimiento activo de los NEPs, y a su vez, a los movimientos pasivos, a través de hospedadores infectados, foresis y el agua. A partir de las muestras de suelo procesadas se pudo comprobar que durante siete meses el nematodo pudo persistir en el ambiente, lo cual podría deberse a la tolerancia de la larva dauer a la desecación y/o a la infección de nuevos hospedadores. Sin embargo, la dispersión fue menor a la registrada en el cultivo de frutilla. Esto podría deberse a una distribución insuficiente de la humedad a lo largo del cultivo dado el tipo de riego utilizado, el cual se realiza por surcos de inundación, cuya eficiencia puede ser tan baja que puede llegar a menos del 40% del cultivo. Los resultados obtenidos indicarían que H. bacteriophora SUP, podría ser un potencial agente de control de P. muriceus, dada la susceptibilidad demostrada en condiciones de laboratorio, la reducción del daño foliar registrado en el campo en los tratamientos realizados, y la recuperación de ejemplares infectados con el nematodo aplicado. Heterorhabditis bacteriophora SUP representa el primer registro de un nematodo entomopatógeno asociado a cultivos de tomate en el cinturón hortícola platense, sumándose a la lista de los enemigos naturales presentes en este cultivo, considerándose como un potencial agente de control de coleópteros plaga. Los resultados demostraron su potencialidad como biocontrolador de diferentes plagas agrícolas, debido a la factibilidad de producción en el laboratorio a la capacidad de infección, establecimiento y dispersión en condiciones naturales en dos agroecosistemas distintos.