Exploring free-energy landscapes and microscopic interactions of selected small-molecules and proteins wih cell membranes
Authors:   , Lu Huixia 
Published: October 2023

The present Thesis is devoted to the study of the physical-chemical properties of selected small-molecules (such as amino-acids like tryptophan or hormones like melatonin) and proteins (such as KRAS-4B) absorbed in model lipid bilayers located at physiological environments. Since in such conditions biological membranes composed of phospholipids and cholesterol are surrounded by electrolyte solutions, understanding the interactions of the small molecule or protein with the surrounding phospholipids, cholesterol, water and all sorts of ion species is a topic of great fundamental importance. In particular, the present Thesis has advanced into the analysis of the structural and energetic aspects of an oncogenic protein from the RAS family, characterising the physical conditions that allow such protein to remain anchored to the cell. The findings reported in the Thesis may help to shed light in the understanding of a wide variety of cancers, with direct impact on the design of drugs or treatments useful for curation.
The lipids considered in this Thesis include the saturated lipids dimyristoilphosphatidylcholine (DMPC) and dipalmytoilphosphatidylcholine (DPPC), the unsaturated lipids dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) and dioleoylphosphatidylserine(DOPS) and cholesterol. Classical molecular dynamics simulations and well-tempered metadynamics simulations have been applied in this thesis so that all considered systems have been modelled and simulated at the all-atom level, with systems containing up to 200000 atoms.
Using classical molecular dynamics simulations at the microsecond time scale, we studied the microscopic structure and dynamics of the small-molecules and KRAS4B proteins, the latter in the wild-type and mutated (oncogenic) forms. The cell membrane has been always considered in the liquid crystalline phase, what in some cases required to rise the temperature of the system up to 323 K. Structural properties such as the area per lipid and thickness of the membrane, density profiles, deuterium-order parameters, orientational distributions and the extent of water penetration in the membrane have been analysed. Molecular self-diffusion and spectral densities of atomic species reveal a variety of time scales playing a role in membrane dynamics. The physical meaning of all spectral features from lipid atomic sites is analysed and correlated with experimental data. Most relevant have been the location of individual sites of binding of probes at the interface of the membrane. Finally, using reversible work techniques, we estimated the extent of free energy required to form such liaisons.
By applying 1-microsecond well-tempered metadynamics simulations, we have performed systematic free energy calculations of probe binding to the membrane and water for the first time. Free energy landscapes unveil specific binding behaviour of small-molecules and proteins at phospholipid membranes. This Thesis provides a general methodology to explore such free energy landscapes at complex biological interfaces which can be extended to study other interactions of interest between molecules, peptides, proteins or drugs and charged head-groups in colloidal chemistry and biology.
We further applied this methodology to study the case of a prototypical oncogenic protein (KRAS), being able to produce a wide variety of cancers. Our results from resulting free energy landscapes indicate the existence of specific hydrogen-bonding connections between parts of the protein (hypervariable region and farnesylated tail) that might be responsible of the permanent infection of healthy cells through its anchoring at the interface of the membrane.

La presente Tesis doctoral está dedicada al estudio de las propiedades físico-químicas de moléculas pequeñas seleccionadas (por ejemplo aminoácidos como el triptófano u hormonas como la melatonina) y proteínas (como la KRas-4B) absorbidas en membranas celulares formadas por fosfolípidos y ubicadas en entornos fisiológicos. Dado que en estas condiciones, las membranas biológicas compuestas por fosfolípidos y colesterol están rodeadas de soluciones de electrólitos, entender las interacciones de la molécula pequeña o proteína con los fosfolípidos circundantes, el colesterol, el agua y todo tipo de especies iónicas es un tema de gran importancia fundamental. En particular, la presente Tesis se ha avanzado en el análisis de los aspectos estructurales y energéticos de una proteína oncogènica de la familia Ras, caracterizando las condiciones físicas que permiten que esta proteína se mantenga anclada a la célula. Las resultados descritos a la tesis pueden ayudar a dar luz a la comprensión de una gran variedad de cánceres, con un impacto directo en el diseño de medicamentos o tratamientos útiles para su curación.
Los lípidos considerados en esta Tesis incluyen los lípidossaturados dimiristoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidilcolina, los lípidos insaturados dioleoilfosfatidilcolina y dioleoilfosfatidilserina y el colesterol. En esta Tesis se han aplicado simulaciones de dinámica molecular clásica y simulaciones de metadinámica bien temperada, de forma que todos los sistemas considerados han estado modelizados y simulados a nivel puramente atómico, con sistemas de hasta 200000 átomos.
Utilizando simulaciones clásicas de dinámica molecular (a escala 1 microsegundo), hemos estudiado la estructura y la dinámica microscópicas de las moléculas pequeñas y las proteínas KRas4B, estas últimas en formas pura y mutada (oncogénica). La membrana celular siempre se ha considerado en fase cristalina líquida, cosa que en algunos casos ha requerido aumentar la temperatura del sistema hasta 323 K. Se han calculado propiedades estructurales como por ejemplo el área por lípido y el grosor de la membrana, perfiles de densidad, parámetros de orden del deuterio, distribuciones orientacionals y el alcance de la penetración del agua a la membrana. Los coeficientes de difusión moleculares y las densidades espectrales atómicas revelan una gran variedad de escalas de tiempos que tienen un papel en la dinámica de membrana. El significado físico de todas las características espectrales de los lugares atómicos lipídicos se ha analizado y correlacionado con datos experimentales. El más relevante ha sido el hallazgo de la ubicación de lugares individuales de enlace de las varias sondas (pequeñas moléculas y proteínas) a la interfaz de la membrana. Finalmente, utilizando técnicas de trabajo reversible, se ha podido estimar la cantidad de energía libre necesaria para formar estos enlaces.
Mediante la aplicación de simulaciones de metadinámica bien temperada de 1 microsegundo, hemos realizado por primera vez cálculos de energía libre sistemática de la unión de las varias sondas a la membrana y al agua. Las superficies de energía libre muestran un comportamiento específico de los enlaces de moléculas pequeñas y proteínas a las membranas fosfolípidiques. Esta Tesis proporciona una metodología general para explorar superficies de energía libre en interfaces biológicas complejas que se pueden ampliar para estudiar otras interacciones de interés entre moléculas, péptidos, proteínas o fármacos y membranas en Química y Biología coloidal.
También hemos aplicado esta metodología para estudiar el caso de una proteína oncogènica prototípica (KRas), que se considera responsable de una gran variedad de cánceres. Nuestros resultados en superficies de energía libre indican la existencia de conexiones específicas de enlace de hidrógeno entre partes de la proteína (región hipervariabley cola farnesilada) que podrían ser responsables de la infección permanente de células sanas a través de su anclaje a la interfaz de la membrana.