Μελέτη αντιγόνων mage για την ανάπτυξη αντικαρκινικών εμβολίων
Authors: Δημτσούδη Δήμητρα 
Published: August 2021

Η χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων με σκοπό την επαγωγή αντικαρκινικής Τ-κυτταρικής απόκρισης πλεονεκτεί ως προς το ότι είναι δυνατόν να επιτευχθεί η καταστροφή των καρκινικών κυττάρων χωρίς να επηρεαστούν οι φυσιολογικοί ιστοί. Επίσης, η παρασκευή και ο χαρακτηρισμός τους είναι σχετικά εύκολος και όπως φαίνεται από κλινικές μελέτες που έγιναν τα εμβόλια αυτά είναι ασφαλή. Η συνύπαρξη τάξης I και τάξης II επιτόπων που προέρχονται από το ίδιο καρκινικό αντιγόνο έχει βρεθεί ότι ενισχύει την ποιότητα της ανοσολογικής απόκρισης, προκαλεί μακράς διάρκειας ανοσία και ενδυναμώνει την αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι τα CD4 Τ κύτταρα ενεργοποιούν τα αντιγονοπαρουσιαστικά (δενδριτικά) κύτταρα μέσω αλληλεπίδρασης των CD40 και των προσδετών τους και με τη σειρά τους τα ενεργοποιημένα δενδριτικά κύτταρα μπορούν να παρουσιάσουν το αντιγόνο στα CD8 Τ κύτταρα. Το MAGE 3 καρκινικό αντιγόνο αποτελεί ένα από τα περισσότερο μελετημένα καρκινικά αντιγόνα. Το αντιγόνο αυτό ανήκει στην κατηγορία των εξειδικευμένων αντιγόνων και εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στο μελάνωμα. Επίσης, εκφράζεται και σε άλλα είδη καρκίνου όπως είναι ο καρκίνος του στήθους, των πνευμόνων, του θυρεοειδούς αδένα και του εντέρου. Τα μόνα φυσιολογικά κύτταρα στα οποία εκφράζεται το MAGE 3 είναι οι πλακούντιοι τροφοβλάστες και τα ορχικά γενετικά κύτταρα, στα οποία δεν εκφράζονται τα μόρια MHC. Για την παρασκευή ισχυρών ανοσογόνων/αντιγόνων χρησιμοποιείται η τεχνική της πρόσδεσης των επιτόπων σε πρωτεϊνικούς φορείς. Στο εργαστήριο Πεπτιδοχημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων σχεδιάστηκε και παρασκευάστηκε ένα συνθετικό υπόστρωμα με δομική σταθερότητα και κανονικότητα, έτσι ώστε οι πεπτιδικοί επίτοποι να προσδένονται χωρίς διαμορφωτικούς περιορισμούς ή στερικές παρεμποδίσεις. Το παρασκεύασμα αυτό είναι ο Επαναλαμβανόμενος Ολιγοπεπτιδικός Φορέας τύπου I ή τύπου II (Sequential Oligopeptide Carrier -I, ΙΙ, SOCn I, II). O SOCn I αποτελείται από την επαναλαμβανόμενη ακολουθία αμινοξέων Lys-Aib-Gly, ενώ ο SOCn II αποτελείται από την επαναλαμβανόμενη ακολουθία αμινοξέων Aib-Lys-Aib-Gly. Η παρούσα εργασία αναφέρεται στη σύνθεση, τη διαμορφωτική μελέτη με την τεχνική του κυκλικού διχρωϊσμού και τη μελέτη της διαμεμβρανικής μεταφοράς πεπτιδικών φορέων πολλαπλών αντιγονικών ή/και ανοσογονικών επιτόπων με τη συνεστιακή μικροσκοπία. Η εργασία περιλαμβάνει επίσης βιολογικά πειράματα (FACS ανάλυση και ELISA) για τη μελέτη της ενεργοποίησης Τ κυττάρων με αυτόλογα δενδριτικά κύτταρα που έχουν προεπωασθεί με τα SOCn-παράγωγα. Η εργασία περιλαμβάνει δύο τμήματα: το πρώτο (Κεφάλαια 1-9) είναι το θεωρητικό, ενώ το δεύτερο (Κεφάλαιο 10-19) είναι το πειραματικό μέρος, στο οποίο παρατίθενται η σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων και μακρομορίων, τα αποτελέσματα της μελέτης της διαμόρφωσης, τα αποτελέσματα της διαμεμβρανικής μεταφοράς των πεπτιδίων και τα αποτελέσματα των βιολογικών αποτελεσμάτων. Στο Κεφάλαιο 1 γίνεται αναφορά στη μοριακή βάση της ανοσίας, δηλαδή στην ικανότητα του οργανισμού να αμύνεται στην επίδραση διαφόρων αντιγόνων. Το κεφάλαιο αυτό αναφέρεται στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και στην ανοσολογική απόκριση που επάγεται από την ενεργοποίησή τους. Επισημαίνεται η σημαντικότητα του καθορισμού πολλών αντιγόνων καρκινικών κυττάρων που αναγνωρίζονται από Τ κύτταρα και συγκεκριμένα του καρκινικού αντιγόνου MAGE 3. Επίσης, γίνεται αναφορά στην ασθένεια του καρκίνου και στην καταπολέμηση αυτού μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς επίσης και στα αντικαρκινικά πεπτιδικά εμβόλια. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται οι μέθοδοι ενίσχυσης της αντιγονικότητας/ανοσογονικότητας των πεπτιδίων. Ιδιαίτερη αναφορά γίνεται στη χρήση συνθετικών φορέων και πιο συγκεκριμένα στους Επαναλαμβανόμενους Ολιγοπεπτιδικούς Φορείς SOCn, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η ενίσχυση της αντιγονικότητας/ανοσογονικότητας των επιτόπων. Το Κεφάλαιο 3 αναφέρεται στην πεπτιδική σύνθεση και πιο συγκεκριμένα δίνεται λεπτομερής ιστορική αναδρομή στα αντιδραστήρια σύζευξης που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδοχημεία. Επίσης, υπάρχει αναλυτική παρουσίαση των πολυμερικών υποστρωμάτων και των αμινοπροστατευτικών ομάδων που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφονται οι μέθοδοι ταυτοποίησης και καθαρισμού πεπτιδίων. Συγκεκριμένα, περιγράφονται η αρχή μεθόδου της διαπίδυσης, της υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της φασματοσκοπίας μάζας ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό. Το Κεφάλαιο 5 αφορά την τεχνική που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία για τη διαμορφωτική ανάλυση των πεπτιδίων/μακρομορίων. Συγκεκριμένα, παρουσιάζονται αναλυτικά οι βασικές αρχές της φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού και ο τρόπος μελέτης της δευτεροταγούς διαμόρφωσης των πεπτιδίων σε διάλυμα. Στο Κεφάλαιο 6 περιγράφονται συνοπτικά οι βασικές αρχές της συνεστιακής μικροσκοπίας (Confocal Microscopy), η οργανολογία που χρησιμοποιείται και τα πλεονεκτήματα της μεθόδου που την καθιστούν ως την πλέον διαδεδομένη τεχνική μελέτης τόσο «ζωντανών» αλλά και μονιμοποιημένων «fixed» συστημάτων. Το Κεφάλαιο 7 αναφέρεται στην κυτταρομετρία ροής. Συγκεκριμένα περιγράφονται συνοπτικά οι βασικές αρχές της κυτταρομετρίας ροής και η οργανολογία που χρησιμοποιείται, καθώς επίσης και οι συνηθέστεροι τρόποι παρουσίασης των αποτελεσμάτων που προκύπτουν. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφονται οι βασικές αρχές της ανοσοενζυμικής τεχνικής για την ανίχνευση αντισώματος ή αντιγόνου, η γνωστή τεχνική ELISA. Στο Κεφάλαιο 9 αναφέρεται ο σκοπός της παρούσας εργασίας. Στο Κεφάλαιο 10 περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία που ακολουθήθηκε κατά τη σύνθεση των πεπτιδίων της παρούσας εργασίας με την τεχνική της πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση κατά Merrifield καθώς και ο τρόπος που έγινε η ομοιοπολική σύνδεση της φλουορεσκεΐνης στα πεπτίδια σε υγρή φάση. Ακόμη, παρατίθενται τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν. Τέλος περιγράφεται ο καθαρισμός και η ταυτοποίηση των πεπτιδίων με υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσης και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της φασματοσκοπίας μάζας ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό. Στη συνέχεια δίνονται οι αναλυτικές HPLC και τα φάσματα μάζας των καθαρών πεπτιδίων που παρασκευάσθηκαν. Στο Κεφάλαιο 11 περιγράφεται η CD ανάλυση και η διαμορφωτική μελέτη των πεπτιδίων που συντέθηκαν, σε διάφορους διαλύτες. Τέλος, γίνεται επεξεργασία των φασμάτων κυκλικού διχρωισμού των πεπτιδίων με το πρόγραμμα CDNN. Στο Κεφάλαιο 12 δίνεται η πορεία διεξαγωγής των πειραμάτων της διαμεμβρανικής μεταφοράς των πεπτιδίων με τη συνεστιακή μικροσκοπία και παράλληλα παρουσιάζονται οι φωτογραφίες των κυττάρων σε διάφορες τομές του. Στο Κεφάλαιο 13 περιγράφεται το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για τη διεξαγωγή των βιολογικών πειραμάτων. Συγκεκριμένα περιγράφεται ο τρόπος με τον οποίο έγιναν οι καλλιέργειες δενδριτικών κυττάρων και παρατίθενται τα αποτελέσματα των πειραμάτων κυτταρομετρίας ροής και ELISA. Στο Κεφάλαιο 14 πραγματοποιείται μια σύντομη ανασκόπηση των βασικών αρχών και θεωριών στις οποίες βασίζεται η παρούσα εργασία με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία και παράλληλα σχολιάζεται το σύνολο των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής. Στο Κεφάλαιο 15 αναφέρονται τα γενικά συμπεράσματα της παρούσας εργασίας, τα οποία είναι τα εξής: ♦ Παρασκευάσθηκαν CD8 επίτοποι του καρκινικού αντιγόνου MAGE 3 που ταυτοποιήθηκαν από ασθενείς στην ελεύθερη μορφή τους καθώς και προσδεδεμένοι στον φορέα SOCn, ώστε να βελτιωθεί η αντιγονική/ανοσολογική τους δράση. ♦ Μελετήθηκαν τα διαμορφωτικά τους χαρακτηριστικά με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού και επιβεβαιώθηκε ότι προσλαμβάνουν συγκεκριμένες διαμορφώσεις σε υδατικό και μικκυλιακό περιβάλλον. ♦ Έγινε ιχνηθέτηση των SOCn-παραγώγων με φλουορεσκεΐνη, και βρέθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία ότι διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη. ♦ Βιολογικά πειράματα σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος υγιών εθελοντών και σε δενδριτικά κύτταρα έδειξαν σημαντική ενεργοποίηση των CD8 κυττάρων, παραγωγή IFN-γ, ενώ δεν παρήχθη IL-4. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη δυνατότητα ανάπτυξης κυτταροτοξικής ανοσολογικής απόκρισης Thl. Στο Κεφάλαιο 16 παρουσιάζονται περιληπτικά το αντικείμενο και τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στο Κεφάλαιο 17 παρουσιάζονται περιληπτικά το αντικείμενο και τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής στην Αγγλική γλώσσα. Στο Κεφάλαιο 18 δίνεται λεπτομερείς βιβλιογραφία σχετικά με τα θέματα που αναλύονται στην παρούσα διατριβή. Στο Κεφάλαιο 19 παρατίθενται τα 20 φυσικά αμινοξέα με τους συντακτικούς τους τύπους, οι συντομογραφίες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, καθώς και δημοσιεύσεις σε πρακτικά συνεδρίων και ομιλίες.