Μελέτη των μοριακών διαταραχών του επιγενετικού μηχανισμού ρύθμισης των κυττάρων στην παθογένεια των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασιών
Authors: Γιαννόπουλος Ανδρέας 
Published: September 2021

Οι Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες (ΜΥΝ) είναι κλωνικές διαταραχές του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου, που χαρακτηρίζονται από άμετρο και άσκοπο κλωνικό πολλαπλασιασμό ενός ή περισσότερων προγονικών κυττάρων της μυελικής σειράς, τα οποία, ωστόσο, διατηρούν σχετικά φυσιολογική ωρίμανση. Ο πολλαπλασιασμός αυτός οδηγεί σε αυξημένο αριθμό κοκκιοκυττάρων, ερυθροκυττάρων ή αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα.Αντίστοιχα, τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα/Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΜΔΣ/ΜΥΝ), εκτός από αύξηση του αριθμού των κυττάρων μιας ή περισσότερων σειρών, εμφανίζουν ταυτόχρονα και δυσπλασία του μυελού.Μέχρι πρόσφατα, η διάγνωση και πρόγνωση των υποκατηγοριών αυτών των νοσημάτων, βασιζόταν σχεδόν αποκλειστικά σε κυτταρολογικά χαρακτηριστικά και καρυοτυπικές αναλύσεις, με εξαίρεση πολύ συγκεκριμένες μοριακές βλάβες, όπως εκείνες στα γονίδια JAK2 και MPL, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με ΜΥΝ, σπάνια δε στα ΜΔΣ/ΜΥΝ.Η πρόοδος της τεχνολογίας οδήγησε σε καλύτερο χαρακτηρισμό της παθογένειας των μυελικών νεοπλασιών, με την ανάδειξη πληθώρας μεταλλάξεων σε γονιδία με ετερογενείς κυτταρικές λειτουργίες και μάλιστα με διαφορετική συχνότητα σε κάθε περίπτωση.Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι συχνές μεταλλάξεις προσθήκης ή διαγραφής νουκλεοτιδίων στο εξόνιο 9 του γονιδίου CALR, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με Ιδιοπαθή Θρομβοκυτταραιμία (ΙΘ) ή Μυελοΐνωση (ΜΙ), οι οποίοι ελέγχονται αρνητικοί για μεταλλάξεις JAK2 και MPL.Επιπλέον μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του επιγενετικού μηχανισμού του κυττάρου, στον κυτταρικό κύκλο, στην ωρίμανση του mRNA και σε άλλες σημαντικές διεργασίες. Οι μεταλλάξεις αυτές θεωρείται πως συμβάλλουν στην πρόοδο και εξέλιξη των μυελικών νεοπλασιών, καθεμία σε διαφορετικό βαθμό, που εξαρτάται από την επίπτωση στο τελικό πρωτεϊνικό προϊόν, στους κυτταρικούς μηχανισμούς όπου εμπλέκεται κάθε γονίδιο, καθώς και στον κυτταρικό κλώνο που εμφανίζεται.Ορισμένες μεταλλάξεις είναι κοινές στις διάφορες ετερογενείς κατηγορίες αιμοποιητικών διαταραχών και μάλιστα ανιχνεύονται σε υψηλά ποσοστά, όπως εκείνες στα γονίδια ASXL1 και SRSF2, οι οποίες έχουν σχετιστεί με κακή πρόγνωση νόσου.Ωστόσο, άλλες μεταλλάξεις φαίνεται πως είναι αποκλειστικές συγκεκριμένων νοσημάτων, όπως συμβαίνει με τα γονίδια CSF3R και SETBP1, που συμβάλλουν στη διαφορική διάγνωση των ΧΟΛ και αΧΜΛ, αντίστοιχα. Κατά τα άλλα, τα συγκεκριμένα νοσήματα είναι δύσκολο να διακριθούν μεταξύ τους.Η μελέτη των κυτταρικών μηχανισμών που επηρεάζονται στις διαφορετικές υποκατηγορίες νοσημάτων του αίματος, εξαιτίας των παραπάνω, αλλά και επιπρόσθετων μεταλλάξεων, είναι ιδιαίτερα σημαντική, αφού με τον τρόπο αυτό αποκαλύπτονται σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία διατταράσονται και στα οποία είναι δυνατόν να παρέμβουμε θεραπευτικά.Οι σύγχρονες τεχνολογίες προσδιορισμού της πρωτοδιάταξης των νουκλεϊκών οξέων (Next Generation Sequencing, NGS) έχουν ήδη συμβάλλει προς αυτή την κατεύθυνση, μέσω μελέτης του ανθρώπινου μεταγραφώματος (RNA-seq).Ωστόσο, αρχικός στόχος παραμένει, ο όσο το δυνατόν πληρέστερος χαρακτηρισμός του τοπίου των μοριακών βλαβών που φέρει κάθε ασθενής, ξεχωριστά. Η χαρτογράφηση των μεταλλάξεων μπορεί να γίνει είτε σταδιακά με τη μελέτη μεμονωμένων γενωμικών περιοχών με παλαιότερες, ήδη εγκαθιδρυμένες τεχνικές μοριακής βιολογίας, είτε σε μεγαλύτερη κλίμακα, με την ενσωμάτωση σύγχρονων τεχνικών, όπως η μελέτη ολόκληρου του γονιδιώματος (whole genome sequencing, WGS), μόνον των περιοχών που εκφράζονται (whole exome sequencing, WES), ή με την ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών γενωμικών θέσεων (targeted sequencing), με τεχνολογία NGS.Για το λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία, αναπτύξαμε και συγκρίναμε διαφορετικά πρωτόκολλα για τη μοριακή διερεύνηση γονιδίων τα οποία εμφανίζονται συχνά μεταλλαγμένα σε ασθενείς με ΜΥΝ και ΜΔΣ/ΜΥΝ. Στη συνέχεια προχωρήσαμε σε συγκριτική ανάλυση του μεταγραφώματος των ασθενών με ΜΙ, με άτομα του γενικού πληθυσμού, σε μία προσπάθεια να διερευνήσουμε βαθύτερα το τοπίο αυτής της περίπλοκης νόσου. Τέλος, μελέτησαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης των ασθενών με ΜΙ και ΜΔΣ/ΜΥΝ, με στόχο να αποκαλύψουμε τυχόν αλλαγές στο πρότυπο αυτής, της πολύ σημαντικής τροποποίησης, δεδομένου ότι τα νοσήματα αυτά χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια που επηρεάζουν ποικιλοτρόπως την επιγενετική κατάσταση του κυττάρου.Τα αποτελέσματα συνοψίζονται ως εξής:i.Μελετήθηκαν, μέσω διερεύνησης μεμονωμένων γενωμικών περιοχών, 266 ασθενείς με ΜΥΝ τόσο για μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, JAK2 (εξόνια 12 και 14), MPL (εξόνιο 10) και CALR (εξόνιο 9), όσο και για μεταλλάξεις σε γονίδια με τροποποιητική δράση, συγκεκριμένα στα ASXL1 (εξόνιο 12), DNMT3A (εξόνιο 23), IDH1 (εξόνιο 4), IDH2 (εξόνιο 4), SETBP1 (εξόνιο 4), SF3B1 (εξόνια 14 και 15), SRSF2 (εξόνιο 1), U2AF1 (εξόνια 2 και 6), CSF3R (εξόνιο 14) και KIT (εξόνιο 17). Συνολικά, μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 241 ασθενείς (90.60%). Στις επιμέρους κατηγορίες, τα ποσοστά αυτά ανέρχονται σε 98.41% στην Αληθή Πολυκυτταραιμία (ΑΠ, n=62/63), σε 86.73% στη ΙΘ (n=85/98), σε 89.89% στη ΜΙ (n=80/89), σε 100.00% στη Χρόνια Ουδετεροφιλική Λευχαιμία (ΧΟΛ, n=6/6) και σε 80.00% στη Συστηματική Μαστοκυττάρωση (ΣΜ, n=8/10). Στο σύνολο των περιπτώσεων και σε ποσοστό 81.58% (n=217/266), ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό των μεταλλάξεων με τροποποιητική δράση ανέρχεται σε μόλις 9.02% (n=24/266). Σε 16.54% (n=44/266) των ασθενών με ΜΥΝ που μελετήθηκαν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις και στις δύο αυτές κατηγορίες γενετικών βλαβών, με το μοριακό τοπίο της ΜΙ να χαρακτηρίζεται ιδιαίτερα πολύπλοκο, αφού το αντίστοιχο ποσοστό ανέρχεται σε 42.70% (n=38/89) των περιστατικών. Καμία από τις μεταλλάξεις που μελετήθηκαν στην παρούσια εργασία δεν εμφανίστηκαν σε μία μικρή κοορτή ασθενών (n=0/29) με Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία (ΧΜΛ) που μελετήθηκαν.ii.Για τις ίδιες μεταλλάξεις, με όμοιες μεθοδολογίες, μελετήθηκαν 110 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ. Συνολικά, μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 91 ασθενείς (82.73%). Στις επιμέρους κατηγορίες, τα ποσοστά αυτά ανέρχονται σε 70.18% στη Χρόνια Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΜΜΛ, n=40/57), σε 94.87% στην άτυπη Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία (αΧΜΛ, n=37/39) και σε 100.00% στα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα/Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα με παρουσία Δακτυλιωτών Σιδηροβλαστών και Θρομβοκυττάρωση (ΜΔΣ/ΜΥΝ-ΔΣ-Θ, n=14/14). Στο σύνολο των περιπτώσεων και σε ποσοστό 13.64% (n=15/110), ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό των μεταλλάξεων με τροποποιητική δράση ανέρχεται σε 69.09% (n=76/110), φανερώνοντας το διαφορετικό μοριακό υπόβαθρο των ΜΔΣ/ΜΥΝ, σε σύγκριση με τα ΜΥΝ. Σε 11.82% (n=13/110) των ασθενών με ΜΔΣ/ΜΥΝ που μελετήθηκαν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις και στις δύο κατηγορίες μοριακών βλαβών.iii.Σε 25 ασθενείς πραγματοποιήθηκε διερεύνηση για μοριακές βλάβες μέσω targeted sequencing, με τεχνολογία NGS και ανάλυση με βιοπληροφορικό αλγόριθμο που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Με την τεχνική αυτή μελετήθηκαν ταυτόχρονα, σε μία αντίδραση, 26 γονίδια, τα περισσότερα για παραπάνω από ένα εξώνια, ενώ για ορισμένα γονίδια ο έλεγχος αφορούσε ολόκληρη την κωδικοποιούσα αλληλουχία. Σε 13 περιπτώσεις ασθενών δεν είχαν ανιχνευθεί μεταλλάξεις, μέσω άλλων τεχνικών μοριακής βιολογίας οι οποίες διερευνούν μεμονωμένες γενωμικές περιοχές, όπως αντίδραση πολυμεράσης τελικού σημείου (PCR), ανάλυση της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCR πραγματικού χρόνου (HRMA) και κατά Sanger προσδιορισμό της πρωτοδιάταξης νουκλεϊκών οξέων. Σε αυτή την κατηγορία συμπεριλαμβάνονται 1 ασθενής με ΑΠ, 3 με ΙΘ, 4 με ΠΜΙ, 1 με ΧΜΜΛ, 2 με Οξεία Μυλογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ) και 2 με οικογενή διαταραχή αιμοπεταλίων. Σε 12 περιπτώσεις ασθενών είχαν ήδη ανιχνευθεί μεταλλάξεις με τις προαναφερθείσες τεχνικές. Σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνονται 1 περίπτωση με ΑΠ, 1 με ΙΘ, 7 με ΜΙ, 1 με ΣΜ, 1 με ΧΟΛ και 1 με αΧΜΛ. Αυτοί χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου (test group) για προσδιορισμό της ευαισθησίας και της ακρίβειας της μεθόδου. Σε όλες τις περιπτώσεις επιβεβαιώθηκαν οι ήδη γνωστές μεταλλάξεις, που είχαν ανιχνευθεί εκ των προτέρων με άλλες τεχνικές. Μεταλλάξεις επιπρόσθετες αυτών που ήταν ήδη γνωστές ανιχνεύθηκαν σε 5 ασθενείς, ενώ σε 7 περιστατικά τα οποία ήταν χωρίς ευρήματα, φανερώθηκαν μοριακές βλάβες. Τέλος, σε 6 ασθενείς δεν ανιχνεύθηκε καμία γενετική αλλοίωση.iv.Στη συνέχεια μελετήθηκε το πρότυπο της μεθυλίωσης των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1 (Long interspersed nucleotide elements, LINEs) σε ασθενείς με ΜΙ και με ΜΔΣ/ΜΥΝ. Τα στοιχεία αυτά μαζί με τις μικρότερες εκδοχές τους (Short interspersed nucleotide elements, SINEs), απαρτίζουν περίπου 40-50% του γονιδιώματος. Ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των μεταθετών στοιχείων, αποτυπώνει προσεγγιστικά τα επίπεδα αυτής της επιγενετικής τροποποίησης στο σύνολο του γονιδιώματος (estimation of global methylation levels). Με μεθυλοειδική HRMA (MS-HRMA), προσδιορίστηκαν τα επίπεδα μεθυλίωσης των στοιχείων LINE-1 σε 15 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ και σε 15 ασθενείς με ΜΙ. Ως φυσιολογικά θεωρήθηκαν τα αντίστοιχα επίπεδα από 6 άτομα του γενικού πληθυσμού. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό της κατάστασης μεθυλίωσης των στοιχείων LINE-1 μέσω μεθυλοειδικής πυροαλληλούχισης (MSP), σε 8 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ και σε 28 ασθενείς με ΜΙ, σε σύγκριση με 7 άτομα με φυσιολογική αιμοποίηση. Οι δύο τεχνικές αποκάλυψαν στατιστικά σημαντικές (p-value<0.05), ανιχνεύσιμες διαφορές, στο πρότυπο της μεθυλίωσης των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1, στους ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ, όχι όμως και στους ασθενείς με ΜΙ.v.Σε μία προσπάθεια να χαρακτηριστεί καλύτερα η βιολογία της ΜΙ, προχωρήσαμε σε συγκριτική ανάλυση του μεταγραφώματος των ασθενών αυτής της κατηγορίας (n=6), με άτομα του γενικού πληθυσμού (n=2), μέσω τεχνολογίας RNA-Seq και με βιοπληροφορικό αλγόριθμο που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Συνολικά, αναδείχθηκαν 2010 γονίδια, ως στατιστικώς σημαντικά (FDR<0.05), διαφορικά εκφραζόμενα στη ΜΙ, σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό. Από τα παραπάνω γονίδια, τα 695 εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης, ενώ τα 1315 αυξημένα. Υπερ-εκφραζόμενα εμφανίζονται γονίδια που αφορούν σε μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού, συγκεκριμένα σε ενισχυμένη δραστηριότητα των κοκκιοκύτταρων, για την καταπολέμηση βακτηριακών λοιμώξεων. Ωστόσο, υπο-εκφραζόμενα παρατηρούνται γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του λεμφικού ιστού.