Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορμονών με αυξητική δράση σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών
Authors: Κακλαμάνος Γεώργιος 
Published: January 2014

Το ζήτημα της χρήσης των στεροειδών αναβολικών ως αυξητικών παραγόντων στην κτηνοτροφία άρχισε να απασχολεί την επιστημονική κοινότητα και την κοινή γνώμη πριν από 30 περίπου χρόνια. Έκτοτε και μέχρι σήμερα υπήρξαν διάφορες προσεγγίσεις, αλλά το θέμα εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά μέχρι σήμερα τόσο τους επιστήμονες όσο και τους πολίτες ως καταναλωτές. Ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών στεροειδών αναβολικών έχει χρησιμοποιηθεί στην κτηνοτροφία ως μέσο αύξησης της μυϊκής μάζας των ζωών, τα οποία καταλήγουν σε διάφορα προϊόντα ζωικής προέλευσης, με αποτέλεσμα να τίθεται σε κίνδυνο η δημόσια υγεία. Λόγω των παραπάνω, η χρήση των στεροειδών και άλλων αυξητικών παραγόντων απαγορεύτηκε στην Ε.Ε. από το 1986. Σύμφωνα με την Κοινοτική Οδηγία 98/179/EC, όλα τα κράτη-μέλη της Ε.Ε. θα πρέπει να αναπτύξουν Εθνικά Εργαστήρια Αναφοράς που να έχουν στην αρμοδιότητά τους την ανάπτυξη ενός Προγράμματος Ελέγχου Καταλοίπων, στο οποίο να αναλύεται ένα ευρύ φάσμα στεροειδών αναβολικών. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων, με την απαιτούμενη ευαισθησία για την αναμφισβήτητη ανίχνευση και επιβεβαίωση των ουσιών αυτών. Στην ερευνητική αυτή εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 20 ορμονών (diethylstilbestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α/β-nortestosterone, methyltestosterone, β-trenbolone, triamcinolone acetonide, dexamethasone, flumethasone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, melengestrol acetate, megestrol acetate, medroxyprogesterone acetate) από διάφορες ομάδες καταλοίπων (Stilbenes, Steroids, Corticosteroids, Resorcyclic acid lactones, Gestagens) σε μυϊκό ιστό με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). H προκατεργασία περιλάμβανε υδρόλυση, εκχύλιση με TBME, απομάκρυνση λίπους και τελικό καθαρισμό με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλες Oasis και Αmino. Τα στεροειδή αναβολικά αναλύθηκαν, για πρώτη φορά, με χημικό ιοντισμό (APCI) σε τύπο MRM, παρακολουθώντας 2 θυγατρικά ιόντα για την αναμφίβολη επιβεβαίωσή τους. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 0,5 ng/g με βάση την Κοινοτική Απόφαση 2002/657/EC. Η ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητικές. Υπολογίστηκαν οι παράμετροι CCα και CCβ, οι οποίες κυμάνθηκαν από 0,03 ng/g έως 0,14 ng/g και από 0,05 ng/g έως 0,24 ng/g, αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθηκαν ήταν αρκετά καλές και κυμάνθηκαν μεταξύ 78,7% και 119,4% με το CV (%) να κυμαίνεται μεταξύ 1,9% και 14,1%. Η μέθοδος αποδεικνύεται ευαίσθητη και αξιόπιστη και είναι κατάλληλη για εφαρμογή σε προγράμματα ελέγχου καταλοίπων. Επίσης, αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού προγεσταγόνων (medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, melengestrol acetate) σε λίπος με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Ο προσδιορισμός έγινε με θετικό ιοντισμό APCI. H προκατεργασία περιλάμβανε αυτόματο καθαρισμό, για πρώτη φορά, με GPC (gel permeation chromatography) για το διαχωρισμό των προγεσταγόνων από το λίπος. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 1 ng/g με βάση την Κοινοτική Απόφαση 2002/657/EC. H ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητικές. Το CCα κυμάνθηκε μεταξύ 0,20 ng/g και 0,22 ng/g και το CCβ από 0,33 ng/g έως 0,38 ng/g. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθηκαν ήταν ικανοποιητικές και κυμάνθηκαν μεταξύ 72% και 89,2% με το CV (%) να κυμαίνεται μεταξύ 2,5% και 16,2%. Η μέθοδος κρίνεται ειδική, απλή, ευαίσθητη, πλήρως αυτοματοποιημένη και κατάλληλη για εργαστήρια που ασχολούνται με επίσημους ελέγχους των ενώσεων αυτών. Η μέθοδος προσδιορισμού προγεσταγόνων σε λίπος ελέγχθηκε, ως προς την απόδοσή της, με συμμετοχή σε Διεργαστηριακή Δοκιμή (Δ.Δ.) που διοργάνωσε το Κοινοτικό Εργαστήριο Αναφοράς (Εθνικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας και Περιβάλλοντος, RIVM, Bilthoven, Ολλανδία). Αντικείμενο της Δ.Δ. ήταν η ανίχνευση, ο ποσοτικός προσδιορισμός και η επιβεβαίωση της οξικής μεδρόξυπρογεστερόνης (MPA) σε περινεφρικό λίπος χοίρου. Τα αποτελέσματα προσδιορισμού της οξικής μεδρόξυπρογεστερόνης κρίθηκαν ικανοποιητικά, τόσο σε χαμηλές συγκεντρώσεις της (1,03 ng/g, z-score= 0,11, CV =2%), όσο και σε υψηλές συγκεντρώσεις της (4,95 ng/g, z-score= 0,91, CV =2%). Η συνολική βαθμολογία απόδοσης των εργαστηρίων κυμάνθηκε από 6 έως 9, με το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Σερρών να παίρνει το βαθμό 9. Αναπτύχθηκε επίσης μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 15 στεροειδών αναβολικών (diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α-nortestosterone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, stanozolol και 16β-OH-stanozolol), οι οποίες έχουν ευρύ ενδιαφέρον σε προγράμματα ελέγχου προϊόντων ζωικής προέλευσης, σε oύρα βοοειδών με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS)...