Μελέτη των μεταβολών στην ομοιοστασία του πρωτεώματος κατά τη γήρανση
Authors: Τσακίρη Ελένη 
Published: September 2021

Η γήρανση είναι μία αναπόφευκτη διαδικασία σχεδόν για όλους τους οργανισμούς. Η εμφάνισή της σχετίζεται με τη σταδιακή συσσώρευση βλαβών κατά τη διάρκεια της ζωής,στις οποίες συμβάλλουν τόσο γενετικοί όσο και στοχαστικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες. Αρκετά μονοπάτια έχουν εμπλακεί στην εξέλιξη της γήρανσης, κάποια από τα οποία είναι τα μεταβολικά μονοπάτια σηματοδότησης, το μονοπάτι των σιρτουϊνών (sirtuins), οι επιγενετικές τροποποιήσεις, η μείωση του μήκους των τελομερών, καθώς και τα μονοπάτια απόκρισης στο στρες. Επίσης, κατά τη γήρανση παρατηρείται αύξηση των μη ενζυματικών τροποποιήσεων των πρωτεϊνών, όπως για παράδειγμα οι οξειδωτικές τροποποιήσεις και οι τροποποιήσεις των πρωτεϊνών με σάκχαρα [τα λεγόμενα τελικά προϊόντα πρωτεϊνικής γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End products)-AGEs]. Αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις οδηγούν στη δυσλειτουργία των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα την αύξηση της πρωτεωμικής αστάθειας που μπορεί να οδηγήσει στην επιτάχυνση της γήρανσης, καθώς και στην εμφάνιση ασθενειών που σχετίζονται με το γήρας.Τα κυριότερα σηματοδοτικά μονοπάτια διατήρησης της πρωτεωμικής σταθερότητας είναι το μονοπάτι ουβικιτίνης-πρωτεασώματος, το μονοπάτι αυτοφαγίας-λυσοσώματος, καθώς και το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι αντι-οξειδωτικής απόκρισης Nrf2/Keap1. To σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεάσωματος συμμετέχει στην αποικοδόμηση ουβικιτινιωμένων φυσιολογικών πρωτεϊνών με μικρό χρόνο ημιζωής, καθώς και μη λειτουργικών πρωτεϊνών τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτοσόλιο, καθώς επίσης και στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο μιτοχόνδριο. Επίσης, φαίνεται πως το σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος «συνομιλεί (αν και ο μοριακός μηχανισμός παραμένει άγνωστος) με το μονοπάτι της αυτοφαγίας, καθώς και με το σηματοδοτικό μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης Nrf2/Keap1. Έχει παρατηρηθεί μείωση της ενεργότητας του πρωτεασώματος κατά την κυτταρική και την in vivo γήρανση. Επομένως, το πρωτεάσωμα συμβάλλει στη μοριακή διαδικασία της εμφάνισης και της εξέλιξης της γήρανσης, χωρίς επίσης, να είναι ξεκάθαρο πως ακριβώς συμβαίνει αυτό. Για το σκοπό αυτό είναι σημαντικό να μελετηθούν οι μεταβολές στην ομοιοστασία του πρωτεώματος, καθώς και να αναλυθεί ο βιολογικός ρόλος των κύριων πρωτεολυτικών συστημάτων κατά τη γήρανση. Επίσης, απαιτείται να πραγματοποιηθεί μια συστηματική ανάλυση των in vivo μοριακών μεταβολών μετά από γονιδιακή αποσιώπηση(RNAi) των διαφόρων πρωτεασωμικών υπομονάδων. Όπως ήδη αναφέρθηκε, τα AGΕs και οιοξειδωμένες πρωτεΐνες συσσωρεύονται κατά το γήρας και καθώς τα AGΕs βρίσκονται σε αρκετά τρόφιμα η μελέτη της in vivo επίδρασής τους στον οργανισμό παρουσιάζει επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον.Σκοπός της παρούσας μελέτης υπήρξε η διερεύνηση όλων των παραπάνω ερωτημάτων invivo, στο πειραματικό μοντέλο Drosophila melanogaster. Η Drosophila είναι ιδανική για τέτοιου είδους μελέτες, καθώς το πρωτεάσωμα της είναι όμοιο με αυτό των θηλαστικών,συνδυάζει τόσο μετα-μιτωτικά όσο και μιτωτικά κύτταρα, ενώ μια σειρά από μεταβολικά μονοπάτια (συμπεριλαμβανομένου του μονοπατιού Nrf2/Keap1) είναι παρόμοια με αυτά των θηλαστικών. Τα ευρήματά μας έδειξαν τη δυσλειτουργία του πρωτεασώματος, τη συσσώρευση ουβικιτινιωμένων, οξειδωμένων πρωτεϊνών, καθώς και πρωτεϊνών που έχουν τροποποιηθεί με AGEs σε όλους τους σωματικούς ιστούς των εντόμων κατά την in vivo γήρανση. Επίσης,βρέθηκε ότι οι ωοθήκες και σπερματοθήκες των εντόμων είναι πιο ανθεκτικές σε σχέση με το σωματικό ιστό τόσο στις βλάβες που υπόκειται ο οργανισμός κατά την in vivo γήρανση όσο και στο εξωγενές οξειδωτικό στρες, αλλά και ενδεχομένως στη μερική αναστολή του πρωτεασώματος. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η καταστολή της έκφρασης βασικών πρωτεασωμικών υπομονάδων διαταράσσει την αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος και δεδομένου ότι (όπως διαπιστώθηκε και στην παρούσα μελέτη) οδηγεί σε θνησιμότητα σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, αναπτύχθηκε ένα φαρμακολογικό μοντέλο όπου οι μοριακές αλλαγές λόγω υπο-λειτουργίας του πρωτεασώματος μελετήθηκαν μετά απόχορήγηση ειδικών πρωτεασωμικών αναστολέων. Παρατηρήθηκε ότι η μείωση της ενεργότητας του πρωτεασώματος στα νεαρά έντομα στα επίπεδα που παρατηρούνται σε γηρασμένα άτομα προκαλεί διαταραχή της πρωτεόστασης, μείωση της μυϊκής δύναμης των εντόμων και τελικά δοσο-εξαρτώμενη μείωση του προσδόκιμου ζωής. Επίσης, η υπολειτουργία της πρωτεασωμικής ενεργότητας σε νεαρά έντομα οδήγησε στη δοσοεξαρτώμενη επαγωγή της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης του πρωτεασώματος, καθώς και των αυτοσυγκροτημένων πρωτεασωμάτων. Η επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος στους σωματικούς ιστούς δεν παρατηρήθηκε, όταν γηρασμένα έντομα εκτέθηκαν στους πρωτεασωμικούς αναστολείς σε αντίθεση με τις ωοθήκες και σπερματοθήκες που διατήρησαν την ικανότητα επαγωγής της έκφρασης του πρωτεασώματος τόσο κατά τη γήρανση όσο και μετά από δυσλειτουργία του πρωτεασώματος. Ακόμα,βρέθηκε ότι η υπολειτουργία του πρωτεασώματος οδηγεί σε αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) και του Η2Ο2 στους νεαρούς αλλά όχι γηρασμένους σωματικούς ιστούς,καθώς και ότι η παραγωγή ROS σηματοδοτεί την επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος. Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική δυσλειτουργία προκαλεί διαταραχή της ομοιοστασίας των μιτοχονδρίων, δυσλειτουργία της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης, καθώς και του μιτοχονδριακού συμπλέγματος ΙΙ/ΙΙΙ, γεγονός που συνάδει με την παρατηρούμενη αύξηση των ROS. Επίσης, με τη χρήση διαγονιδιακών εντόμων διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική δυσλειτουργία επάγει την αντιοξειδωτική άμυνα του κυττάρου στους σωματικούς ιστούς των νεαρών (αλλά όχι των γηρασμένων) εντόμων ενώ στις γονάδες παρατηρήθηκε επαγωγή των αντιοξειδωτικών μονοπατιών ανεξαρτήτως ηλικίας. Καθώς το κύριο μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι το μονοπάτι Nrf2/Keap1, ελέγξαμε αν σχετίζεται με την επαγωγή του πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία. Η μελέτη μας έδειξε ότι η επαγωγή του πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία σε νεαρά έντομα διαμεσολαβείται από τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2 στη Drosophila. Ακόμη, η παροδική υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2 σε νεαρά αλλά και σε γηρασμένα έντομα οδήγησε στην αύξηση της έκφρασης και ενεργότητας του πρωτεασώματος, καθώς και σε αυξημένη ανθεκτικότητα σε σύντομο πρωτεοτοξικό στρες. Βρέθηκε επίσης ότι η μακροχρόνια ενεργοποίηση του Nrf2 οδηγεί σε μείωση του προσδόκιμου ζωής. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση της αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι επιβλαβής για τον οργανισμό. Επομένως,φαίνεται πως μόνο η ήπια παροδική ενεργοποίηση των συστημάτων διατήρησης της πρωτεόστασης είναι ωφέλιμη για τον οργανισμό. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατεσταλμένη την έκφραση των πρωτεασωμικών υπομονάδων β1, β5, α4, α7, Rpn11, Rpn6, Rpn10 και Rpt6. Το εύρημα ότι η μείωση της έκφρασης των υπομονάδων β5, α7, Rpn11 και Rpn6 προκαλεί θνησιμότητα στο στάδιο της λάρβας–προνύμφης, καθώς και επαγωγή της έκφρασης των υπόλοιπων πρωτεασωμικών υπομονάδων επιβεβαίωσε τις φαινοτυπικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν μετά από επίδραση σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια με τον πρωτεασωμικό αναστολέα PS-341. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το εύρημα ότι η καταστολή των υπομονάδων α4, β1, Rpn10 και Rpt6 επιτρέπει μεν τη εκκόλαψη του ενήλικου εντόμου, αλλά όταν τα ενήλικα έντομα μεταφέρθηκαν σε συνθήκες επαγωγής του διαγονιδίου εμφάνισαν μείωση του προσδόκιμου ζωής με εντονότερο φαινότυπο πρώιμης γήρανσης σε συνθήκες καταστολής της πρωτεασωμικής υπομονάδας Rpt6. Το αποτέλεσμα αυτό δεικνύει ότι η απουσία των υπομονάδων αυτών επιτρέπει τη συντήρηση της πρωτεασωμικής λειτουργίας ή ότι η μειωμένη τους έκφραση εξισορροπείται από άλλες υπομονάδες/πρωτεΐνες. Για παράδειγμα,το εύρημα ότι η καταστολή της α4 υπομονάδας δεν προκαλεί ραγδαία αύξηση της θνησιμότητας, πιθανώς να, εξηγείται από την παρατήρηση ότι η α4 και η α3 υπομονάδεςφαίνεται να έχουν παρόμοια λειτουργία. Όπως αναφέρθηκε, οι in vivo επιδράσεις των μη ενζυματικά τροποποιημένων πρωτεϊνώνAGEs ή της λιποφουσκίνης στη φυσιολογία του οργανισμού παρέμεναν άγνωστες. Η διατροφή στις δυτικές χώρες είναι αρκετά πλούσια σε AGEs, τα οποία σε μεγάλες συγκεντρώσεις συμβάλλουν στην αύξηση του οξειδωτικού στρες, καθώς και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Παρομοίως, τόσο η in vivo όσο και η κυτταρική γήρανση συνοδεύονται από την ενδοκυτταρική συσσώρευση της λιποφουσκίνης στα λυσοσώματα. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η κατανάλωση τροφής εμπλουτισμένης σε AGEs ή λιποφουσκίνη οδήγησε σε διαταραχή της πρωτεόστασης και σε δυσλειτουργία του πρωτεασώματος, καθώς και αύξηση του οξειδωτικού στρες. Επιπλέον,παρατηρήθηκε αύξηση της ενεργότητας των λυσοσωμικών καθεψινών, ενώ όταν εκτέθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατασταλμένη (μέσω RNAi) την ενεργότητα των καθεψινών σε τροφή εμπλουτισμένης σε AGEs ή λιποφουσκίνη εμφάνισαν πρώιμη γήρανση. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι οι λυσοσωμικές καθεψίνες έχουν κομβικό ρόλο στην αποικοδόμηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων.Συνοπτικά, οι μελέτες της παρούσας ΔΔ υποστηρίζουν με πειραματικά ευρήματα την(εξελικτική) θεωρία του φθαρτού σώματος (Disposable soma theory), σύμφωνα με την οποία το σώμα είναι απαραίτητο μόνο για να διατηρεί ασφαλές το αναπαραγωγικό σύστημα, το οποίο γηράσκει με σχετικά αργούς ρυθμούς. Επίσης, για πρώτη φορά δείχθηκε σε in vivoσυνθήκες ότι τόσο η διαφορική ρύθμιση του πρωτεασώματος κατά τη γήρανση όσο και η ιστοειδική ρύθμιση του πρωτεασώματος υπό συνθήκες μειωμένης ενζυμικής ενεργότητας εξαρτώνται από το μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2/Keap1. Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει διαφορική βαρύτητα των πρωτεασωμικών υπομονάδων όσον αφορά στην αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος, την πρωτεασωμική λειτουργία και τελικά τη διατήρηση της ομοιοδυναμικής του κυττάρου. Τέλος, μια δίαιτα πλούσια σε AGEs ή λιποφουσκίνη επιταχύνει την εμφάνιση του γήρατος και, έτσι, πιθανολογούμε ότι η περιορισμένη κατανάλωση τροφών πλούσιων σε AGEs ή λιποφουσκίνη μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του προσδόκιμου ζωής και/ή σε επιβράδυνση του ρυθμού των ασθενειών του γήρατος.