Ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης αμινοξέων και αυτοματοποιημένων διαδικασιών κατεργασίας σε μεθόδους LC-MS / MS
Authors: Κολοκούρη Φιλομήλα 
Published: January 2014

Στην παρούσα εργασία, αναπτύχθηκαν νέες και αυτοματοποιημένες μέθοδοι για τον προσδιορισμό φαρμάκων και ενώσεων βιολογικής σημασίας παρουσία βιολογικών υγρών ή μη με την τεχνική LC-MS/MS. Ως γνωστόν, η ανάπτυξη μεθόδων με την τεχνική LC-MS/MS χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα. Στόχος, σε κάθε περίπτωση, πέρα από τη φασματομετρική και χρωματογραφική βελτιστοποίηση, ήταν η εύρεση όλων εκείνων των συνθηκών και παραμέτρων που οδηγούσαν στη βελτιστοποίηση της απόκρισης του εκάστοτε υπό εξέταση σύστηματος. Στο πρώτο μέρος, στόχος ήταν η βελτιστοποίηση του σήματος ορισμένων βασικών και συνθετικών αμινοξέων σε καθαρά διαλύματα. Τα αμινοξέα, ως ελεύθεροι αναλύτες, δεν έχουν μεγάλη ικανότητα ιοντισμού με αποτέλεσμα η ανίχνευσή τους με τη φασματομετρία μαζών να είναι συχνά προβληματική. Η παραγωγοποίηση ως τεχνική ενίσχυσης του σήματος των συγκεκριμένων αναλυτών είναι συνήθης και ευρέως διαδεδομένη πρακτική. Μελετώντας τις χημικές ιδιότητες που πρέπει να διαθέτει ένα παράγωγο ως προuπόθεση για τον προσδιορισμό του με την τεχνική LC-MS/MS, συνετέθησαν νέοι παράγοντες παραγωγοποίησης C1-DAPS και C4-DAPS οι οποίοι θα προσέδιδαν στα παραγωγοποιημένα αμινοξέα τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, οι παράγοντες αυτοί σχεδιάστηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε τα παράγωγα (i) να φέρουν σταθερό θετικό φορτίο υπό τη μορφή του άλατος του τεταρτοταγούς αμμωνίου, (ii) να διαθέτουν σημαντικό υδρόφοβο τμήμα και (iii) να δίνουν όλα το ίδιο θυγατρικό ιόν έπειτα από θραυσματοποίηση των μητρικών τους ιόντων, για μεγαλύτερη εκλεκτικότητα. Ακολούθως, αναπτύχθηκε χρωματογραφική μέθοδος προσδιορισμού των παραγώγων, ενώ βελτιστοποιήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού, και συγκεκριμένα με κεντρικό σύνθετο σχεδιασμό, οι παράμετροι εκείνες οι οποίες επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης. Επόμενο στάδιο ήταν η σύγκριση των αποκρίσεων των παραγώγων των αμινοξέων με τους νέους παράγοντες C1-DAPS και C4-DAPS με αυτές των μη παραγωγοποιημένων αμινοξέων. Επίσης, έγινε σύγκριση μεταξύ των νέων αυτών παραγώγων και των βουτυλεστέρων των αμινοξέων που προκύπτουν έπειτα από παραγωγοποίηση αυτών με 1-βουτανόλη σε υδροχλωρικό οξύ 3Μ. Ο παράγοντας αυτός παραγωγοποίησης χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο σύγκρισης, καθώς είναι βιβλιογραφικά αποδεδειγμένο πως ενισχύει το σήμα ανίχνευσης των αμινοξέων συνδεόμενος με αυτά. Η αξιολόγηση των αποκρίσεων πραγματοποιήθηκε τόσο με χρήση χρωματογραφικής στήλης όσο με απευθείας έγχυση δείγματος. Συμπερασματικά, οι παράγοντες C1-DAPS και C4-DAPS ενισχύουν σημαντικά το σήμα ανίχνευσης των αμινοξέων (έως και 52 φορές για τον παράγοντα C1-DAPS και έως 23 για τον C4-DAPS) και ιδιαίτερα εκείνο της γλυκίνης (περί τις 4500 και 2800 φορές αντίστοιχα). Όσον αφορά, δε, στην αύξηση σήματος που επιτυγχάνεται έναντι των βουτυλεστέρων, η υπεροχή των C1-DAPS παραγώγων ήταν ξεκάθαρη με την ένταση του σήματος σαφώς σημαντικά ενισχυμένη για όλα τα αμινοξέα. Ο παράγοντας C4-DAPS εμφάνισε στην πλειοψηφία των αμινοξέων βελτιωμένη ή παραπλήσια ένταση σήματος με αυτή των βουτυλεστέρων...