Βιοχημική και μοριακή μελέτη των γλυκοζαμινογλυκανών και των ενζύμων μεταβολισμού τους στον καρκίνο
Authors: Καλαθάς Δημήτριος 
Published: January 2014

Οι θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι σημαντικά μόρια του εξωκυττάριου χώρου που επιτελούν σημαντικές διεργασίες. Η βιοσύνθεσή τους επιτυγχάνεται με τη συμμετοχή πολλών ενζύμων που έχουν διάφορους ρόλους. Τα κυριότερα ένζυμα που βιοσυνθέτουν θειική χονδροϊτίνη/ δερματάνη είναι οι συνθάσες χονδροϊτίνης, οι γλυκοσυλοτρανσφεράσες, οι σουλφοτρανσφεράσες και η επιμεράση της θειικής δερματάνης. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης έχουν διττό ρόλο, γιατί έχουν δύο ενεργά κέντρα: Το ένα προσθέτει γλυκουρονικό οξύ και το άλλο Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη στο μη αναγωγικό άκρο μιας νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Παράλληλα, οι σουλφοτρανσφεράσες προσθέτουν θειικά σε συγκεκριμένες θέσεις ενώ η επιμεράση μετατρέπει κατάλοιπα γλυκουρονικού σε ιδουρονικό πριν συμβεί θείωση του δισακχαρίτη. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης είναι οι εξής: CHSY1, CHSY2 (CHPF) και CHSY3. Η γλυκουρονυλοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είναι η CSGlcA-T. Οι κυριότερες σουλφοτρανσφεράσες είναι οι C4ST1, D4ST1 και CHST3. Η μελέτη των ενζύμων αυτών στον καρκίνο είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, γιατί έχει βρεθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες συμμετέχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι οι γλυκοζάμινογλυκάνες υφίστανται ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές στους διάφορους καρκίνους. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να συμβάλλουν τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στον φαινότυπό του. Η κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στις μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πολύ σημαντική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις μεταβολές που υφίστανται τα παραπάνω ένζυμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του λάρυγγα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RT-PCR ανάλυση έπειτα από απομόνωση ολικού RNA, Western blotting ύστερα από διαδοχική εκχύλιση με PBS, υδροχλωρική γουανιδίνη και υδροχλωρική γουανιδίνη Triton-X100 για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων, μεθυλοειδική PCR (MSP) για τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών μετά από απομόνωση DNA και μέτρηση της δραστικότητας C-4 σουλφοτρανσφεράσης με χρήση αποθειωμένης δερματάνης ως υπόστρωμα. Στα δείγματα του παχέος εντέρου, η έκφραση της συνθάσης χονδροϊτίνης Ι ήταν υψηλότερη στα πρώτα στάδια του καρκίνου. Επίσης, ήταν αρκετά υψηλή στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα που είναι παρακείμενα στους καλοήθεις όγκους. Στους τελευταίους και στους υγιείς ιστούς δεν υπήρχε σημαντική έκφραση του ενζύμου. Όσον αφορά τον λάρυγγα η έκφραση ήταν υψηλή στα παθολογικά δείγματα και ελαφρώς χαμηλότερη στα υγιή. Τα φυσιολογικά δείγματα δεν παρουσίαζαν σημαντική έκφραση του ενζύμου. Ο παράγοντας πολυμερισμού της χονδροϊτίνης, είχε υψηλότερη έκφραση στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επίσης, φαίνεται να αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα με το στάδιο του καρκίνου. Η έκφρασή του στους υγιείς ιστούς και στους παρακείμενους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς των αδενωμάτων ήταν περιορισμένη. Αντίθετα, στα λαρυγγικά δείγματα η έκφρασή του ήταν αυξημένη στους υγιείς ιστούς. Η γλυκουρονυλoτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είχε περιορισμένη και σταθερή έκφραση στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά στα ανώτερα στάδια αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη έκφραση των γονιδίων συνθάση χονδροϊτίνης ΙΙΙ και 6-σουλφοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου ή του λάρυγγα. Παρόλο αυτά, στον υγιή λάρυγγα τα δύο αυτά ένζυμα εκφράζονταν περισσότερο από τον καρκίνο. Το αντίθετο ισχύει για το υγιές παχύ έντερο που παρουσίαζε περιορισμένη έκφραση των δύο αυτών γονιδίων σε σχέση με τον καρκίνο. Τα επίπεδα mRNA της C-4 σουλφοτρανσφεράσης της θειικής δερματάνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου φαίνεται να μειώθηκαν με το στάδιο του καρκίνου αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σταθερά. Στην υγιή κατάσταση το ένζυμο υποεκφραζόταν αλλά το αντίθετο ίσχυε για τα λαρυγγικά δείγματα. Επίσης, η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου που εξετάστηκε παρέμενε πλήρως αμεθυλίωτη τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κάτι που σημαίνει ότι πιθανώς δεν υπάρχει ρύθμιση της έκφρασης με μηχανισμό μεθυλίωσης του υποκινητή. Τα επίπεδα mRNA της επιμεράσης της θειικής δερματάνης ήταν αυξημένα στα παθολογικά δείγματα στα ανώτερα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η έκφραση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Στα λαρυγγικά δείγματα δεν έγινε ανίχνευσή της στα φυσιολογικά δείγματα παρά μόνο στα παθολογικά και σε μικρότρο βαθμό στα υγιή. Σε ορισμένα τουλάχιστον παθολογικά λαρυγγικά δείγματα φαίνεται να υπάρχει υπομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. ...