Μοριακή και λειτουργική ανάλυση αναπτυξιακών γονιδίων στο Arobidopsis thaliana
Authors: Μπερή Δέσποινα 
Published: September 2021

Το WD40 πρωτεϊνικό μοτίβο αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα μοτίβα του πρωτεώματος των ευκαρυωτικών οργανισμών. Η ικανότητα των πρωτεϊνών που περιέχουν WD40 επαναλήψεις (WDR πρωτεΐνες) να αναδιπλώνονται σε τριτοταγή δομή β-προπέλας, τις καθιστά ιδανικά ικριώματα για πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Στα φυτά, οι WDR φαίνεται να αποτελούν κεντρικοί ρυθμιστές μίας πληθώρας κυτταρικών και αναπτυξιακών διεργασιών. Το πρωτέωμα του Arabidopsis thaliana περιέχει μία πολυπληθή υπεροικογένεια WDR πρωτεϊνών, η οποία σύμφωνα με τελευταίες εκτιμήσεις αριθμοί περισσότερα από 400 μέλη (Sharma and Pandey, 2016). Ωστόσο, ένας μικρός αριθμός αυτών των πρωτεϊνών έχει χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα σε μοριακό και γενετικό επίπεδο.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο χαρακτηρισμός του γονιδίου AtULCS1 (Ubiquitin Ligase Complex Subunit 1) του Arabidopsis thaliana και η ανάδειξη του ρόλου που αυτό διαδραματίζει στην ανάπτυξη των φυτών. Το γονίδιο εδράζεται στο πέμπτο χρωμόσωμα του Arabidopsis, στο γενετικό τόπο 66240 και η πρωτεΐνη που παράγει αποτελείται από 331 αμινοξέα. Σύμφωνα με τη συγκριτική μελέτη των Lee και συνεργατών του (2008) αποτελεί πιθανή υπομονάδα ενός Ε3 Cullin-RING συμπλόκου λιγάσης, ενώ εμφανίζει μεγάλο ποσοστό αμινοξικής ταυτότητας με μία ομόλογη πρωτεΐνη στο πρωτέωμα του Arabidospsis, την AtAPRF1. Παρά τη μεγάλη ομοιότητάς τους, δεδομένα από τη λειτουργική ανάλυση των δύο πρωτεϊνών (παρούσα μελέτη και αδημοσίευτα αποτελέσματα) υποδεικνύουν ότι συμμετέχουν σε δύο διακριτά σύμπλοκα. Η AtULCS1, όπως αποκαλύπτουν τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης εργασίας, αλληλεπιδρά in planta με την DDB1a υπομονάδα, δημιουργώντας ένα λειτουργικό σύμπλοκο CUL4-DDB1aAtULCS1 του πρωτεολυτικού μονοπατιού, ρυθμίζοντας βασικές κυτταρικές διεργασίες. Αντίθετα, η ομόλογη AtAPRF1, εμπλέκεται στη ρύθμιση του χρόνου άνθησης στο Arabidopsis, πιθανά μέσω μεθυλίωσης του γενετικού τόπου FLC.Κατά την πειραματική προσέγγιση της λειτουργικής ανάλυσης του γονιδίου, πραγματοποιήθηκε η in silico ανάλυση του AtULCS1 όσο και της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί, ενώ ταυτόχρονα μελετήθηκε και η φυλογένεση της. Από την ανάλυση αυτή, διαπιστώθηκε η ύπαρξη δύο ομόλογων αλληλουχιών σε όλους τους φυτικούς οργανισμούς που ελέγχθηκαν. Αυτές οργανώνονται σε δύο διακριτούς κλάδους, διαφορετικούς από αυτόν των μυκήτων και των ζώων. Η πρωτεΐνη AtULCS1 εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, όπως αποκαλύπτουν τα αποτελέσματα του υποκυτταρικού εντοπισμού της, ενώ αλληλεπιδρά in planta ειδικά με την DDB1a υπομονάδα του συμπλόκου Ε3 λιγάσης. Η μελέτη του ιστοειδικού προτύπου του γονιδίου, μέσω της δημιουργίας διαγονιδιακών σειρών μεταγραφικής σύντηξης του υποκινητή με το γονίδιο αναφοράς της β-γλυκουρονιδάσης (GUS), υπέδειξε την έκφραση του σε πολλά αναπτυξιακά στάδια, με μέγιστη έκφραση στους ιστούς του άνθους. Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκαν και αναλύθηκαν σε μοριακό και φαινοτυπικό επίπεδο διαγονιδιακές σειρές RNAi αποσιώπησης, καθώς και υπερέκφρασης του γονιδίου, οι οποίες αποκάλυψαν την εμπλοκή του AtULCS1 γονιδίου σε μία πληθώρα αναπτυξιακών διεργασιών, με σημαντικότερη την εναπόθεση δευτερογενών τοιχωμάτων στους ιστούς του ενδοθηκίου και του αγωγού ιστού του βλαστού. Τέλος, όσον αφορά το μοριακό μονοπάτι στο οποίο συμμετέχει, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση βασικών ΜΥΒ μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι ελέγχουν την ενεργοποίηση ή καταστολή γονιδίων των βιοσυνθετικών μονοπατιών της λιγνίνης και κυτταρίνης.