Μελέτη και κλινική αξιολόγηση του γονιδίου NES1 (KLK10) καθώς και των εναλλακτικών μεταγράφων του στον καρκίνο του παχέος εντέρου
Authors: Αλεξοπούλου Δήμητρα 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η πιο συχνή κακοήθης πάθηση του πεπτικού συστήματος σε ΗΠΑ και Ευρώπη. Στη χώρα μας, ο καρκίνος του παχέος εντέρου καταλαμβάνει την τέταρτη θέση των αιτιών θανάτου από νεοπλάσματα. Οι κυριότεροι καρκινικοί δείκτες παχέος εντέρου που χρησιμοποιούνται στη σύγχρονη κλινική πράξη είναι το καρκινοεμβρυικό αντιγόνο CEA (carcinoembryonic antigen), το υδατανθρακικό αντιγόνοCA 19-9 (carbohydrate antigen 19-9), το καρκινικό αντιγόνο CA 72-4 (cancer antigen 72-4)και ο ενεργοποιητής του πλασμινογόνου των ιστών PLAT (tissue plasminogenactivator).‘Έχουν αναγνωριστεί αρκετοί προγνωστικοί δείκτες και δείκτες πρόβλεψης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, αν και πολύ λίγοι από αυτούς χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική πράξη.Η οικογένεια γονιδίων των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών είναι η μεγαλύτερη συνεχόμενη γονιδιακά οικογένεια πρωτεασών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, χωρίς παρέμβαση από άλλα γονίδια. Aποτελεί σημαντικό τομέα μελέτης, καθώς ένα από τα μέλη της, τοPSA/KLK3, είναι ο πλέον αποδεκτός και ευρέως χρησιμοποιημένος καρκινικός δείκτης,μέχρι σήμερα. Συγκεκριμένα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, μελέτες έχουν υποδείξει άλλα μέλη της οικογένειας ως πιθανούς δείκτες πρόγνωσης ή/και πρόβλεψης,συμπεριλαμβανομένων των KLK4 και KLK7, σε επίπεδο mRNA, καθώς και KLK5, KLK7και KLK11,σε επίπεδο πρωτεῒνης. Το γονίδιο της KLK10 είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας των ιστικών καλλικρεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί προκειμένου να αξιολογηθεί ο πιθανός ρόλος της KLK10 ως καρκινικός δείκτης. Λόγω των υψηλότερων επιπέδων της στους καρκινικούς ιστούς και στον ορό ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, η KLK10 έχει προταθεί ως διαγνωστικός και προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών, σε συνδυασμό με τον ήδη χρησιμοποιούμενο δείκτη CA125, για αύξηση της διαγνωστικής ευαισθησίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγινε μελέτη της έκφρασης και κλινική αξιολόγηση του γονιδίου KLK10 για πιθανή εφαρμογή του ως νέο προγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Αναπτύχθηκαν αναλυτικά πρωτόκολλα για τον προσδιορισμό της έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 στον καρκίνο του παχέος εντέρου,βασιζόμενα στην αντίστροφη μεταγραφή (RT), στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης(PCR) και στη μεθοδολογία ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR). Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης KLK10, πραγματοποιήθηκε με ανοσοδοκιμασία ELISA. Δεν υπάρχουν και δεν χρησιμοποιήθηκαν έτοιμα kit για τους παραπάνω προσδιορισμούς αλλά πραγματοποιήθηκε έλεγχος ποιότητας των τεχνικών που αναπτύχθηκαν ώστε να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία των προσδιορισμών. Συλλέχθηκε ένα στατιστικά σημαντικό μέγεθος καρκινικών και μη καρκινικών ιστών παχέος εντέρου (194 ιστολογικά δείγματα) από ασθενείς με πλήρες κλινικό ιστορικό. Για την ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε εκτενής βιοστατιστική ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκαν παραμετρικές και μη παραμετρικές μεθοδολογίες, ανάλυση ROC, ανάλυση Kaplan Meier,καθώς και ανάλυση μονομεταβλητής και πολυμεταβλητής Cox παλινδρόμησης.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι η έκφραση mRNA του γονιδίουKLK10 σχετίζεται σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με διάφορες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων της σταδιοποίησης κατά Dukes (P=0,036), του βαθμού αποδιαφοροποίησης (P=0,025), της μετάστασης στους λεμφαδένες (P=0,046) και της μετάστασης σε απομακρυσμένα όργανα (P=0,027). Η ανάλυση επιβίωσης κατά KaplanMeier έδειξε στατιστικώς σημαντικά μικρότερες πιθανότητες ελεύθερης νόσου (DFS) και ολικής επιβίωσης (OS) των ασθενών με θετική έκφραση mRNA του γονιδίου της KLK10(P=0,014 και P=0,020, αντίστοιχα). Η έκφραση της πρωτεΐνης KLK10 ήταν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (P<0,001) υψηλότερη στα καρκινικά δείγματα απ’ότι στα φυσιολογικά. Συμπερασματικά, στους καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου που εξετάστηκαν παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του γονιδίου της KLK10. Η υπερέκφραση αυτή φαίνεται να σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και μπορεί να συνιστά ένα χρήσιμο νέο μοριακό δείκτη.Στη συνέχεια, έγιναν πειράματα σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου ώστε να διαπιστωθεί εάν το γονίδιο KLK10 εμπλέκεται στην ανταπόκριση των ασθενών σε κυτταροστατικά φάρμακα, γεγονός που θα εξηγούσε αρκετά από τα παραπάνω συμπεράσματα. Πιο συγκεκριμένα, έγινε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων της κυτταρικής σειράς ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος HT-29, για την οποία κατασκευάστηκαν καμπύλες βιωσιμότητας. Στη συνέχεια, έγινε επίδραση με χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη συστηματική θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου(φθοροουρακίλη, οξαλιπλατίνη), καθώς και με άλλα, ευρέως διαδεδομένα αντικαρκινικά φάρμακα (σισπλατίνη, δοσεταξέλη, γεμσιταβίνη). Για πρώτη φορά, μετά το τέλος της επίδρασης με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα, ακολούθησε καλλιέργεια των εναπομείνοντων κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό, προκειμένου να αξιολογήσουμε εάν τα κύτταρα συνεχίζουν να αποπίπτουν ή εάν επανέρχονται σε κανονική κυτταρική διαίρεση,όταν απομακρύνεται πλέον το φάρμακο. Κατόπιν, μελετήθηκαν οι μεταβολές στο προφίλ έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 καθώς και άλλων γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση: BCL2, BCLX, MCL1, BAX, BAK1, BIM, BID, PUMA (BBC3), NΟΧΑ (PMAIP1),BIRC5 (Survivin), και P21 (CDKN1A).Στο γονίδιο KLK10 παρατηρήθηκαν οι σημαντικότερες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA με την επεξεργασία του με φθοροουρακίλη και σισπλατίνη, ενώ μικρότερης έκτασης ήταν οι μεταβολές κατά την επεξεργασία του με τα υπόλοιπα φάρμακα.Τέλος, ενδιαφέρον παρουσίασε και το γεγονός ότι το πρότυπο έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 συνολικά ακολουθούσε το πρότυπο έκφρασης του προ-αποπτωτικού γονιδίου NOXA.Όσον αφορά τα μέλη της οικογένειας BCL2, ανάλογα με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα που χρησιμοποιήθηκε, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στο πρότυπο έκφρασής τους. Η μεταγραφική ενεργοποίηση κάποιων μελών σε κάθε επίδραση με κυτταροτοξικό παράγοντα όμως, υποδεικνύει πως, ανάλογα με το ερέθισμα, τα προαποπτωτικά μέλη ξεκινούν το μονοπάτι της απόπτωσης. Η θέση του κάθε μορίου μπορεί να είναι στρατηγικής σημασίας, προκειμένου να εξασφαλιστεί το μονοπάτι της απόπτωσης. Αυτό θα μπορούσε να αποδώσει έναν ενοποιημένo ρόλο στα αντιαποπτωτικά μέλη της οικογένειας που διαθέτουν μόνο BH3 περιοχή. Και ίσως ένας τέτοιος μηχανισμός να αποδεικνύεται από τη μεταγραφική ενεργοποίηση διαφορετικών μελών της οικογένειας κατά την επίδραση με διαφορετικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αξίζει να αναφερθεί, τέλος, πως τα επίπεδα έκφρασης mRNA του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2 μειώθηκαν σε κάθε επίδραση με κυτταροτοξικό παράγοντα, το οποίο έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες όπου υπερέκφραση του γονιδίου συνδυαζόταν με ανοχή στη χημειοθεραπεία. Ένα δεύτερο σημαντικό σημείο που προκύπτει από την παρούσα μελέτη είναι η χρήση των χημειοθεραπευτικών δοσεταξέλη και σισπλατίνη για την καταπολέμηση του καρκίνου του παχεός εντέρου. Από την εφαρμογή και των δύο παραγόντων, τα κύτταρα συνέχισαν να αποπίπτουν και μετά την αφαίρεσή τους από τη φλάσκα καλλιέργειας.Εν κατακλείδι, η έκφραση του γονιδίου KLK10, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεῒνης, αποτελεί δυσμενή προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς σχετίζεται με μικρότερη πιθανότητα ελευθέρας νόσου και ολικής επιβίωσης, το οποίο και αποτελεί το σημαντικότερο αποτέλεσμα της παρούσας διατριβής. Η μεταγραφική του ενεργοποίηση μετά από επίδραση χημειοθεραπευτικών παραγόντων, του προσδίδει και ένα πιθανό ρόλο ως δείκτη απόκρισης σε χημειοθεραπεία. Η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης και η ανακάλυψη των φυσιολογικών υποστρωμάτων του ενζύμου αυτού, θα βοηθήσουν και σε μετέπειτα αξιολόγησή του ως πιθανό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.