Μελέτη της δυναμικής μεταγραφικών συμπλόκων in vivo
Authors: Αποστόλου Ευτυχία 
Published: January 2014

Η πρώτη γραμμή αντι-ικής άμυνάς μας βασίζεται στην παραγωγή κι έκκριση ειδικών πρωτεϊνών που ονομάζονται ιντερφερόνες τύπου Ι, οι οποίες στη συνέχεια, προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια τόσο υγειών όσο και μολυσμένων κυττάρων ενεργοποιώντας έναν μεγάλο αριθμό γονιδίων με αντιική δράση. Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών (μεταγραφικοί παράγοντες, κυτοκίνες, ένζυμα υδρόλυσης νουκλεικών οξέων κ.α) δρουν προλαμβάνοντας την εισβολή ή/και τον πολλαπλασιασμό των ιών μέσα στα κύτταρα. Η μόλυνση των ανθρώπινων κυττάρων με διάφορους τύπους ιών προκαλεί την άμεση μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της ιντερφερόνης β (IFN-β). Αυτό επιτυγχάνεται με τη συντονισμένη ενεργοποίηση τριών ομάδων μεταγραφικών παραγόντων (NF-kB, ATF-2/cJUN, IRFs), οι οποίοι μαζί με την αρχιτεκτονική πρωτείνη HMGI(Y) προσδένονται στον ενισχυτή του γονιδίου της IFN-β και δημιουργούν ένα αρχιτεκτονικά πολύπλοκο νουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, γνωστό ως ενισχυόσωμα (enhanceosome). Το ενισχυόσωμα, αφού συγκροτηθεί στον ελεύθερο από νουκλεοσώματα ενισχυτή, καθοδηγεί τη στρατολόγηση μιας σειράς πρωτεϊνών που τροποποιούν τη χρωματίνη, συνενεργοποιητών και βασικών μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή. Το πρόγραμμα στρατολόγησης ολοκληρώνεται με την ολίσθηση του νουκλεοσώματος που κάλυπτε τον υποκινητή, επιτρέποντας έτσι, την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης ΙΙ και την έναρξη της μεταγραφής. Η συνεργατικότητα (cooperativity) με την οποία προσδένονται οι μεταγραφικοί παράγοντες στον ενισχυτή του γονιδίου, και η συνέργεια (synergy) που χαρακτηρίζει τον τρόπο στρατολόγησης των παραγόντων στο ενισχυόσωμα, υποδηλώνουν έναν εξαιρετικά πολύπλοκο κι ακριβή μηχανισμό συνδυαστικού ελέγχου της μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της IFN-β. Ένα επιπρόσθετο ιδιαίτερο γνώρισμα της έκφρασης της IFN-β (Zawatzky et al., 1985), όπως και πολλών άλλων κυτοκινών, είναι ότι ακόμη και υπό ιδανικές συνθήκες μόνο ένα περιορισμένο ποσοστό κυττάρων (~22% για την IFN-β) σε έναν πληθυσμό εκφράζει το γονίδιο της κυτοκίνης κάθε δεδομένη στιγμή. Αυτή η ετερογένεια χαρακτηρίζεται ως στοχαστικότητα ή πιθανοκρατία και εμφανίζεται, συνήθως, σε βιολογικά συστήματα ή διεργασίες, που χαρακτηρίζονται από πολυπλοκότητα και χαμηλές συγκεντρώσεις των εμπλεκόμενων μορίων. Ένα ελκυστικό μοντέλο υποστηρίζει ότι η ίδια η μεταγραφική διαδικασία είναι υπεύθυνη για τη στοχαστική έκφραση κι αυτό, πιθανόν, να συνδέεται με την εγγενή πολυπλοκότητα της συγκρότησης του ενισχυοσώματος στον ενισχυτή/υποκινητή του γονιδίου της IFN-β. Δεδομένου ότι η οργάνωση του ενισχυοσώματος είναι μια συνεργατική διαδικασία, αναρωτηθήκαμε αν η πιθανώς περιορισμένη συγκέντρωση ενός ή περισσοτέρων ενεργοποιητών της IFN-β συμβάλλει στην στοχαστική συγκρότηση ενισχυοσωμάτων οδηγώντας έτσι σε διπλούς μεταγραφικούς διακόπτες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δύο τουλάχιστον από τους μεταγραφικούς παράγοντες που συνδέονται στον ενισχυτή της IFN-β, ο NF-κΒ κι ο IRF-7, διαδραματίζουν περιοριστικό ρόλο στην πιθανότητα έκφρασης του γονιδίου, καθώς, όταν αυξήσουμε εξωγενώς της συγκέντρωσή τους, αυξάνουμε σημαντικά και το ποσοστό των κυττάρων, που τελικά αποκρίνονται στη μόλυνση με ιό. Η χαμηλή συγκέντρωση των παραγόντων αυτών, γεννά εύλογα ερωτήματα για τον τρόπο με τον οποίο, οι παράγοντες αυτοί, εντοπίζουν μέσα στο σχεδόν απέραντο «χάος» του γονιδιώματος και του τρισδιάστατου πυρήνα τις ειδικές θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους τους. Επικεντρωθήκαμε, κυρίως στην αποσαφήνιση του μηχανισμού που κατευθύνει αποτελεσματικά τον περιοριστικό παράγοντα NF-κΒ στα γονίδια στόχους, και κυρίως στην IFN-β, επειδή αφενός ο NF-κB αποτελεί τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα που πυροδοτεί τη δημιουργία του ενισχυοσώματος κι αφετέρου, επειδή έχουν βρεθεί εκατομμύρια πιθανές θέσεις πρόσδεσής του στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Διατυπώσαμε, λοιπόν, ως υπόθεση εργασίας ότι κάποιες από αυτές τις θέσεις πρόσδεσης έχουν ειδικό ρόλο στο να προσλαμβάνουν άμεσα τον NF-κB μετά την είσοδό του στον πυρήνα και να τον μεταφέρουν στα γονίδια- στόχους μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Εφαρμόζοντας μια σειρά, εξαιρετικά σύγχρονων κι εξειδικευμένων μοριακών τεχνικών, όπως 4C-ChIP και DNA FISH, ανακαλύψαμε και χαρακτηρίσαμε τρεις γενωμικές περιοχές σε διαφορετικά χρωμοσώματα, που αλληλεπιδρούν ειδικά με το γονίδιο της IFN-β μέσω NFκΒ. Όλες αυτές οι περιοχές, εντοπίζονται μακριά από γνωστά γονίδια, περιέχουν μια εξειδικευμένη θέση πρόσδεσης του NF-κΒ ως τμήμα επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας Alu κι είχαν άγνωστη μέχρι τώρα δράση. Τα πειράματά μας απέδειξαν ότι οι διαχρωμοσωμικές αυτές αλληλεπιδράσεις (στις οποίες λαμβάνει μέρος μόνο ένα αλληλόμορφο από κάθε γενωμική περιοχή) συμβαίνουν παροδικά, μόνο μετά τη μόλυνση με ιό, και κατά τη διάρκεια συγκρότησης του ενισχυοσώματος, ενώ μειώνονται κατά την έναρξη ή την επιμήκυνση της μεταγραφής. Προκειμένου, να μελετήσουμε άμεσα το ρόλο αυτών των αλληλεπιδράσεων στη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IFN-β, εφαρμόσαμε την τεχνική RNA/DNA FISH, κατά την οποία αποκαλύψαμε ότι το γονίδιο της IFN-β, εκφράζεται όχι μόνο στοχαστικά, αλλά και μονο-αλληλικά, δηλαδή από ένα μόνο αλληλόμορφό της. Το εκπληκτικό αυτό αποτέλεσμα, αποκτά επιπρόσθετη βιολογική αξία από το γεγονός, ότι το μοναδικό μεταγραφικά ενεργό αλληλόμορφο της IFNβ είναι αυτό που βρίσκεται σε αλληλεπίδραση με -τουλάχιστον- μία από τις 3 προαναφερθείσες γενωμικές περιοχές. Είναι λογικό, λοιπόν, να υποθέσουμε ότι αύξηση της συχνότητας των διαχρωμοσωμικών αυτών αλληλεπιδράσεων συνεπάγεται κι αύξηση της πιθανότητας έκφρασης της IFN-β. Η υπόθεση αυτή, επαληθεύτηκε όταν διαμολύνοντας τα κύτταρα με πολλαπλά αντίγραφα καθεμιάς από τις τρεις γενωμικές περιοχές, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν IFN-β, αλλά και των συνολικών επιπέδων του mRNA της IFN-β. Μάλιστα, διαπιστώθηκε ότι η δράση αυτή των πολλαπλών αντιγράφων στα επίπεδα έκφρασης της IFN-β, εξαρτάται άμεσα από την ειδική αλληλουχία πρόσδεσης του NF-κΒ. Το φαινόμενο αυτό ερμηνεύεται από το γεγονός ότι ο περιοριστικός παράγοντας NF-κΒ προσδένεται πρώτα στις γενωμικές περιοχές κι έπειτα μεταφέρεται στον ενισχυτή της IFN-β, όπως διαπιστώθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε χρωματίνη που απομονώθηκε από κύτταρα μολυσμένα με ιό για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Δεδομένου ότι οι εν λόγω γενωμικές περιοχές βρίσκονται σε φυσική εγγύτητα, ακόμη και πριν την είσοδο του NF-κΒ στον πυρήνα, ενδέχεται να αποτελούν ένα «κέντρο πρόσληψης του NF-κΒ», που είναι ικανό να προσελκύει άμεσα τον NF-κB και τον διανέμει στους υποκινητές επιλεγμένων γονιδίων μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Όμως, δεν είναι γνωστός ο μηχανισμός που εξασφαλίζει την άμεση πρόσδεση του NF-κΒ στο «κέντρο πρόσληψης του NF-κΒ», ούτε την εξειδίκευση των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων, καθώς δεν στρατολογούνται όλα τα γονίδια που ρυθμίζονται από τον NF-κB (π.χ το IL-8) στο «κέντρο πρόσληψης». Μπορούμε να υποθέσουμε ότι το «κέντρο» εντοπίζεται σε εξειδικευμένες υποπυρηνικές περιοχές, στις οποίες ο NF-κB μπορεί να έχει άμεση πρόσβαση. Το μοντέλο αυτό ενισχύεται εν μέρει από το γεγονός ότι η συγγένεια του NF-κB για αυτές τις περιοχές είναι 2-3 φορές ασθενέστερη από αυτήν για το γονίδιο της IFN-β, υποδηλώνοντας ότι η προτίμησή του για το κέντρο «πρόσληψης» μπορεί να οφείλεται στην τοπική αρχιτεκτονική του πυρήνα, σε αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις ή και σε άλλες πρωτεΐνες που εντοπίζονται σε αυτό το μικροπεριβάλλον. Επιπλέον, δεν γνωρίζουμε πλήρως τους μηχανισμούς που καθοδηγούν τις διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις κι εξασφαλίζουν την εξεδίκευσή τους. Τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας, αποκαλύπτουν ότι οι μετακινήσεις των γενωμικών περιοχών, προϋποθέτουν κατανάλωση ενέργειας με τη μορφή υδρόλυσης ATP κι επιπλέον, απαιτούν την παρουσία ορισμένων τροποποιητών της χρωματίνης, όπως της ακετυλ-τρανσφεράσης CBP/p300 και του συμπλόκου αναδόμηση της χρωματίνης SWI/SNF. Φυσικά, για την πλήρη διαλέυκανση του προβλήματος είναι αναγκαία επισταμένη έρευνα με χρήση μοριακών, βιοχημικών και κυτταρολογικών μεθόδων. Τα προηγούμενα πειράματα αποδεικνύουν ότι η στοχαστική μονοαλληλική έκφραση του γονιδίου της IFN-β ως απόκριση στη μόλυνση με ιό εξαρτάται από διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις του γονιδίου με τρεις διαγονιδιακές περιοχές. Οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ ενός αλληλομόρφου της IFN-β, το οποίο επιλέγεται τυχαία (πιθανολογικά), κι ενός αλληλομόρφου οποιασδήποτε από τις γενωμικές περιοχές. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επιτρέπουν την πρόσδεση του περιοριστικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στον ενισχυτή του γονιδίου. O NF-κΒ με τη σειρά του ενορχηστρώνει τη συγκρότηση του ενισχυοσώματος σε αυτό το αλληλόμορφο κι οδηγεί στη μεταγραφική ενεργοποίησή του. Μελετώντας την έκφραση του γονιδίου της IFN-β σε μετέπειτα στάδια της ιικής μόλυνσης (8-10 ώρες μετά τον ιό), διαπιστώσαμε ότι η παραγωγή της IFN-β ενισχύεται σημαντικά, γεγονός που οφείλεται αφενός στην αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν το εν λόγω γονίδιο, κι αφετέρου στη αύξηση των μεταγραφικά ενεργών αλληλομόρφων ανά κύτταρο. Η σταδιακή μετατροπή της μονο-αλληλικής έκφρασης σε πολυ-αλληλική είναι ανεξάρτητη από διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις. Για να διερευνήσουμε τον υπεύθυνο μηχανισμό, εξετάσαμε πρώτα από όλα το ενδεχόμενο θετικής αυτοτροφοδότησης από την εκκρινόμενη πρωτεϊνη IFN-β. Τα πειράματά μας, επιβεβαίωσαν αυτή την υπόθεση, καθώς απέδειξαν ότι η αρχικά μονο-αλληλικά παραγόμενη IFN-β, μέσω του μονοπατιού μεταγωγής σήματος, και ειδικά μέσω επαγωγής του γονιδίου του παράγοντα IRF-7 προάγει την ενεργοποίηση επιπρόσθετων αλληλομόρφων και σε περισσότερα κύτταρα. Υπενθυμίζεται ότι ο IRF-7, αποτελεί έναν ακόμη περιοριστικό μεταγραφικό παράγοντα του γονιδίου της IFN-β. Επομένως, η άυξηση της ενδοκυτταρικής του συγκέντρωσης, πιθανότατα, εξασφαλίζει την σύνδεσή του στον υποκινητή των αλληλομόρφων, που δεν εξέφραζαν αρχικώς την IFN-β, όπου οργανώνει τη συγκρότηση του ενισχυοσώματος σε αυτά, προκαλώντας έτσι ένα δεύτερο κύμα παραγωγής IFN-β από περισσότερα κύτταρα και περισσότερα αλληλόμορφα ανά κύτταρο. Συνοψίζοντας, στην παρούσα μελέτη, παρουσιάζουμε ισχυρές ενδείξεις για ένα μοντέλο διφασικής έκφρασης του γονιδίου της IFN-β. Σύμφωνα με αυτό, η μόλυνση με ιό προκαλεί αρχικά τη στοχαστική έκφραση του γονιδίου της IFN-β σε ένα αλληλόμορφο και σε ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων. Η επιλογή του αλληλομόρφου της IFN-β, που πρόκειται να εκφραστεί, εξαρτάται από δια-χρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις με τις τρεις διακριτέ γενωμικές περιοχές που ταυτοποιήσαμε. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές διαμεσολαβούν για την πρόσδεση του περιοριστικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στον ενισχυτή της IFN-β προάγοντας την συγκρότηση του ενισχυοσώματος και την ενεργοποίηση της μεταγραφής από το συγκεκριμένο αλληλόμορφο. Η εκκρινόμενη IFN-β προκαλεί υψηλά επίπεδα έκφρασης του παράγοντα IRF-7, ο οποίος με τη σειρά του επάγει την συγκρότηση του ενισχυοσώματος και τη μεταγραφή της IFN-β από τα υπόλοιπα αλληλόμορφα και σε κύτταρα που δεν εξέφραζαν αρχικά. Επομένως, ο ενισχυτής της IFN-β λειτουργεί με έναν μη-γραμμικό τρόπο κι ενισχύοντας εξωκυτταρικά σήματα. Στην παρούσα μελέτη γίνεται σαφές ότι η πιθανότητα έκφρασης του γονιδίου της IFN-β είναι δυνατόν να αυξηθεί τεχνητά με δύο διαφορετικούς τρόπους. Ο πρώτος βασίζεται στην άμεση αύξηση της συγκέντρωσης ενός από τους περιοριστικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Στην περίπτωση αυτή, ο άφθονος πλέον παράγοντας έχει πολύ μεγάλη πιθανότητα να προσεγγίσει τον ενισχυτή οποιουδήποτε αλληλομόρφου σχεδόν σε όλα τα κύτταρα. Η πρόσδεσή του θα προσελκύσει συνεργατικά και τους υπόλοιπους παράγοντες, προκειμένου να συγκροτηθεί ένα λειτουργικό ενισχυόσωμα που θα εξασφαλίσει τη μεταγραφή του γονιδίου από πολλάπλά αλληλόμορφα σε πολλά κύτταρα. Ο δεύτερος τρόπος έγκειται στο ρόλο των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Είναι η πρώτη φορά που αποκαλύπτεται ότι αυξάνοντας τα αντίγραφα μιας γενωμικής περιοχής (και μάλιστα μη κωδικής) που έχει τη δυνατότητα άμεσης πρόσληψης και διανομής ενός μεταγραφικού παράγοντα χαμηλής συγκέντρωσης, αυξάνεται η πιθανότητα έκφρασης του γονιδίουστόχου του. Αξιοσημείωτο, είναι ότι με την κατασκευή σταθερών κυτταρικών σειρών με πολλαπλά αντίγραφα μιας τέτοιας γενωμικής περιοχής επιτύχαμε: 1. αυξημένα επίπεδα έκφρασης της IFN-β, 2. πρόωρη και πιο άμεση απόκριση στην ιική μόλυνση και τέλος, 3. υψηλή ευαισθητοποίηση των κυττάρων, τα οποία καθίστανται ικανά να αποκρίνονται ακόμη και σε πολύ χαμηλούς τίτλους ιού.