Μοριακή πληθυσμιακή ανάλυση στρεπτομυκήτων εδάφους μεσογειακού τύπου
Authors: Κοράκη Θεοδώρα 
Published: August 2021

Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να ερευνηθεί : • αν και σε ποιο βαθμό η ποικιλομορφία και η ομαδοποίηση των στρεπτομυκήτων σε συγκεκριμένες ταξινομικές ομάδες αντικατοπτρίζεται στο γενετικό επίπεδο, • αν υπάρχει ροή γενετικής πληροφορία ανάμεσα σε διαφορετικά είδη ενδογενών πληθυσμών; • και αν αυτή συσχετίζεται με τις ιδιαιτερότητες κάθε περιβάλλοντος ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Το πρώτο μέρος της διατριβής αφορά στη μοριακή τυποποίηση ενδογενών στελεχών στρεπτομυκήτων. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η ποικιλομορφία 138 ενδογενών στελεχών στρεπτομυκήτων που βάση φυσιολογικών και βιοχημικών κριτηρίων είχαν ενταχθεί στην ίδια ταξινομική ομάδα. Τα στελέχη αυτά προέρχονταν από τη συλλογή του εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Τομέα Βοτανικής, και είχαν απομονωθεί από δείγματα εδάφους δύο περιοχών της Αττικής: α) Περιοχή Μαραθώνα (καλλιεργούμενη περιοχή), β) Περιογή Καισαριανής (δασώδης προστατευόμενη περιοχή). Επίσης, στα δείγματα εδάφους που μελετήθηκαν, καταγράφηκε η ποικιλότητα, σε μοριακό επίπεδο, του ευρύτερου πληθυσμού των Ακτινοβακτηρίων. Η πληθυσμιακή ανάλυση και η μοριακή τυποποίηση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης με αποδιατακτικό παράγοντα υπό κλίση (DGGE). Χρησιμοποιήθηκαν 3 διαφορετικά ζεύγη μορίων εκκινητών που ενισχύουν τμήματα της 16S rDNA αλληλουχίας. Το δεύτερο μέρος της διατριβής σχετίζεται με το ερώτημα ύπαρξης ροής γενετικής πληροφορία ανάμεσα στα διαφορετικά είδη των δύο πληθυσμών στρεπτομυκήτων. 138 ενδογενή στελέχη στρεπτομυκήτων που απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας ελέγχθηκαν για την παρουσία αυτόνομων κυκλικών υπερελικωμένων πλασμιδίων. Συνολικά βρέθηκαν έξι απομονοθέντα στελέχη φορείς πλασμιδίων. Πρόκειται για τα S. rochei AGAI (pMARl), S. griseoruber AGA43 (pMAR2), S. anulatus AGA27 (pMAR3), S. exfoliatus AGA37 (pMAR 4), 5. diastaticus AGA50 (pMAR5) και S. anulatus CAG17 (pMAR6). Από τα πρότυπα των πέψεων προέκυψε ότι το μέγεθος των πλασμιδίων pMARl, pMAR3 pMAR5 και pMAR6 κυμαίνεται μεταξύ 70 και 80 kb. Το αντίστοιχο μέγεθος για τα πλασμίδια pMAR2 και pMAR4 είναι από 40 έως 50 kb. Πειράματα υβριδισμού αποκάλυψαν ότι τα τέσσερα πλασμίδια, pMARl, pMAR3, pMAR5 και pMAR6, εμφάνισαν πολύ υψηλό ποσοστό ομολογίας. Αντίθετα τα πλασμίδια pMAR2 και pMAR4, δεν έδειξαν καμία ομολογία με τα προηγούμενα πλασμίδια αλλά επίσης δεν εμφάνισαν και καμία ομολογία μεταξύ τους. Επίσης δεν ανιχνεύθηκαν ομολογίες των φυσικών πλασμιδίων με γνωστά πλασμίδια στρεπτομυκήτων όπως το piJ101 και toSCP2* ενώ από πειράματα υβριδισμού αποικιών έδειξαν απουσία ομολογίας των φυσικών πλασμιδίων με το ολικό DNA των 138 στελεχών. Στην προσπάθεια εύρεσης φαινοτυπικών χαρακτηριστικών-μαρτύρων των πλασμιδίων αλλά και ερμηνείας της παρουσίας τους στους ενδογενείς πληθυσμούς πραγματοποιήθηκαν πειράματα υβριδισμού με τη βιβλιοθήκη των 200 κοσμιδίων στην οποία κλωνοποιήθηκε το γενετικό υλικό του στελέχους S. coelicor Α3(2) (8 Mb), δεν παρατηρήθηκαν όμως σημαντικές ομολογίες. Στα πλαίσια πειραμάτων για τον χαρακτηρισμό των πλασμιδίων μελετήθηκε η σταθερότητα, η κινητικότητα και η γραμμικότητά τους. Τα νέα φυσικά πλασμίδια εμφάνισαν ιδιαίτερη σταθερότητα ακόμα και μετά από επίδραση θερμικού σοκ, αντιμικροβιακών και χημικών παραγόντων. Πειράματα ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου πεδίου αποκάλυψαν ότι τα τέσσερα στελέχη ξενιστές των φυσικών πλασμιδίων pMARl, pMAR3, pMAR5 και pMARó , ήταν επίσης ξενιστές γραμμικών πλασμιδίων. Η γραμμική και κυκλική μορφή των πλασμιδίων εμφάνισε πολύ υψηλή ομολογία. Τα νέα φυσικά πλασμίδια εμφάνισαν επίσης συζευκτική ικανότητα σε πειράματα σύζευξης με το στέλεχος S. lividans ΤΚ23, ενώ επιπλέον το στέλεχος 5. rochei AGAI εμφάνισε ικανότητα κινητοποίησης του μη συζευκτικού πλασμιδίου pIJ702. Η μελέτη της διασποράς των νέων φυσικών πλασμιδίων σε πληθυσμούς στρεπτομυκήτων, απομονωμένους από διαφορετικά και απομακρυσμένα περιβάλλοντα, θα παρείχε επιπλέον πληροφορίες για την εκτίμηση του πραγματικού εύρους των ξενιστών και του ρόλου τους στη ροή γενετικής πληροφορίας ανάμεσα στις διαφορετικές ταξινομικές ομάδες αυτών των πληθυσμών. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης εξετάστηκαν συνολικά 257 στελέχη της συλλογής στρεπτομυκήτων του εργαστηρίου μας, προερχόμενα από 7 διαφορετικά ενδιαιτήματα του ελλαδικού χώρου. Από τη συλλογή στρεπτομυκήτων που εξετάστηκε, 6 στελέχη παρουσίαζαν σε όλες τις επαναλήψεις θετικό αποτέλεσμα. Πρόκειται για τα στελέχη S. rochei AM 16, S. rochei AM35, S. rochei AK21, S. viridosporus AM29, S. viridosporus AM37 και S. venezuelae AM32. Τρία από τα στελέχη αυτά ανήκαν στην ταξινομική υποομάδα S. rochei στην οποία ανήκει και το στέλεχος AGA1 ξενιστής του πλασμιδίου pMARl. Δύο ανήκαν στην ταξινομική υποομάδα S. viridosporus και ένα στην υποομάδα S. venezuelae. Όσον αφορά τη γεωγραφική τους κατανομή, πέντε στελέχη ανήκαν στον πληθυσμό της περιοχής Μαραθώνα (όπου ανήκε και στέλεχος AGA1), ενώ το στέλεχος S. rochei AK 21 προερχόταν από την περιοχή της Καισαρισανής. Τέλος μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις των ενδογενών στελεχών - ξενιστών στρεπτομυκήτων μέσω σύγκρισης αλληλουχιών 16S rDNA, καθώς και τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά των στελεχών, όπως η ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά, που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν παράλληλα και ως μάρτυρες σε πειράματα συζεύξεων. Επιπλέον εξετάστηκε ο κύκλος ζωής των έξι στελεχών, S. rochei AGA1 (pMARl), S. griseoruber AGA43 (pMAR2), S. anulatus AGA27 (pMAR3), S. exfoliatus AGA37 (pMAR 4), S. diasiaticus AGA50 (pMAR5) και S. anulatus CAG17 (pMAR6), καθώς και του στελέχους S. lividans TK24+pIJ673 t, σε συστήματα μικροκόσμων εδάφους.