Whole genome sequencing and characterization of the lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Authors: Αλεξανδράκη Σταυρούλα 
Published: September 2021

Τα οξυγαλακτικά βακτήρια εφαρμόζονται στην παραγωγή τροφίμων ζύμωσης και ζωοτροφών και γενικά θεωρούνται ωφέλιμοι μικροοργανισμοί, με αρκετά στελέχη να παρουσιάζουν προβιοτικές ιδιότητες. Ωστόσο, ορισμένα γένη των οξυγαλακτικών βακτηρίων,όπως τα γένη Streptococcus και Enterococcus, περιλαμβάνουν παθογόνα είδη τόσο για τον άνθρωπο όσο και για τα ζώα. Επομένως η κατανόηση της ταξινόμησης, του μεταβολισμού και της μοριακής βιολογίας των οξυγαλακτικών βακτηρίων είναι μείζονος σημασίας για την μέγιστη αξιοποίηση των τεχνολογικών, διατροφικών και προβιοτικών ιδιοτήτων τους, αποφεύγοντας ταυτόχρονα πιθανούς κινδύνους. Σήμερα, αυτό είναι εφικτό λόγω της βελτίωσης των τεχνικών αλληλούχησης, οι οποίες επιτρέπουν την παραγωγή γονιδιωμάτων υψηλής ποιότητας. Επιπλέον, η συνεχής ανάπτυξη εργαλείων βιοπληροφορικής επιτρέπει την ανεύρεση βιολογικών δεδομένων μέσω της in silico ανάλυσης των αλληλουχιών. Η πληροφοριακή δύναμη μιας τέτοιας γονιδιωματικής ανάλυσης είναι αξιοσημείωτη, καθώς παρέχει γνώσεις για τα τεχνολογικά και προβιοτικά χαρακτηριστικά, καθώς και για την βακτηριακή ποικιλομορφία και την οικολογική προσαρμογή των βακτηριακών στελεχών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το τεχνολογικό δυναμικό τριών οξυγαλακτικών βακτηρίων της συλλογής μικροοργανισμών ACA-DC του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνικές αλληλούχησης και προηγμένα εργαλεία βιοπληροφορικής. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα στελέχη Streptococcus thermophilus ACA-DC 2 και Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87, οι οποίοι απομονώθηκαν από παραδοσιακό γιαούρτι, καθώς και το στέλεχος Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis 178, το οποίο απομονώθηκε από παραδοσιακό Κασέρι. Με χρωμόσωμα περίπου 1.73 Mbp, ο S. thermophilus ACA-DC 2 είναι το στέλεχος με το μικρότερο γονιδίωμα μεταξύ των στελεχών του είδους, για τα οποία υπάρχουν ολοκληρωμένες αλληλουχίες. Σε αυτό βρέθηκαν 1,850 γονίδια, εκ των οποίων τα 1,556 κωδικοποιούν πρωτεΐνες, καθώς και 224 πιθανά ψευδογονίδια. Η απουσία χαρακτηριστικών παθογένειας καθώς και ο μεγάλος αριθμός ψευδογονιδίων υποδεικνύουν εκφυλισμό του γονιδιώματος και υποστηρίζουν την προσαρμογή του στελέχους στο περιβάλλον του γάλακτος. Μελέτη της λειτουργίας των πρωτεϊνών με τη βάση δεδομένων Clusters of Orthologous Groups (COG) έδειξε ότι 1,327 πρωτεΐνες (περίπου 85%) ανήκουν σε μία τουλάχιστον λειτουργική κατηγορία COG, με επικρατέστερη την κατηγορία για την μεταφορά και τον μεταβολισμό αμινοξέων (E: 10%), ενώ περίπου 28.5% των πρωτεϊνών δεν έχουν κάποια χαρακτηρισμένη λειτουργία. Στο στέλεχος ACA-DC 2 ταυτοποιήθηκαν γενωμικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με σημαντικές τεχνολογικές ιδιότητες και περιλαμβάνουν τα οπερόνια για τον καταβολισμό της λακτόζης και της γαλακτόζης, το οπερόνιο για τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών, τα πρωτεολυτικά ένζυμα, τους μηχανισμούς απόκρισης σε συνθήκες στρες καθώς και γονίδια για την παραγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων. Το στέλεχος δεν κωδικοποιεί την πρωτεάση PrtS. Επίσης, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη ενός πιθανού Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associated (Cas) συστήματος. Ωστόσο η ενεργότητα των Cas πρωτεϊνών πιθανόν να είναι χαμηλή, αφού το στέλεχος διαθέτει μόνο έναν spacer στη συστοιχία CRISPR. Τέλος, η ύπαρξη τεσσάρων πιθανών restriction-modification (R-M) συστημάτων, ενδεχομένως να εξισορροπεί την ανεπάρκεια του συστήματος CRISPR-Cas. Προκειμένου να αξιολογήσουμε τα εξελικτικά, βιολογικά και τεχνολογικά χαρακτηριστικά του S. thermophilus, πραγματοποιήθηκε συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ 23 στελεχών του είδους με ολοκληρωμένα γονιδιώματα. Το πανγονιδίωμα του είδους περιλαμβάνει 2,516 γονίδια, εκ των οποίων τα 1,082 ανήκουν στο συντηρημένο γονιδίωμα ενώ 997 ανήκουν στο συμπληρωματικό γονιδίωμα. Επίσης προσδιορίστηκαν μοναδικά γονίδια σε αρκετά από τα στελέχη που μελετήθηκαν. Η ανάλυση έδειξε ότι το πανγονιδίωμα του είδους είναι ακόμα ανοιχτό, σύντομα όμως θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως κλειστό. Η φυλογενετική ανάλυση των στελεχών του S. thermophilus βάσει του συντηρημένου γονιδιώματος καθώς και του ποσοστού ταυτόσημων νουκλεοτιδίων (average nucleotide identity, ANI), έδειξε την ύπαρξη δύο διακριτών Clusters, το Cluster A που περιλαμβάνει 15 στελέχη με μέγεθος γονιδιωμάτων μεγαλύτερο από 1.83 Mbp, και το Cluster Β που περιλαμβάνει 7 στελέχη με μικρότερο μέγεθος γονιδιωμάτων. Το στέλεχος NCTC12958Τ δεν ανήκει σε κανένα από τα δύο Clusters. Αυτή η διαφοροποίηση πιθανόν να οφείλεται σε διακριτά γεγονότα απόκτησης ή απώλειας γονιδίων κατά την εξελικτική πορεία του είδους. Σε αυτά τα δύο Clusters εντοπίστηκαν υποομάδες στελεχών. Πιο συγκεκριμένα το Cluster A περιλαμβάνει τέσσερις υποομάδες στελεχών, τις I (ASCC 1275, DGCC 7710, KLDS SM, MN-BM-A02, and ND07), II (MN-BM-A01 and MN-ZLW-002), III (LMD-9 and SMQ-301), and IV (APC151 and ND03), ενώ το Cluster Β περιλαμβάνει μόνο μία υποομάδα στελεχών (CNRZ1066, CS8, EPS, and S9). Η ύπαρξη Clusters και υποομάδων για τα στελέχη του S. thermophilus υποδεικνύει την ύπαρξη γενεαλογικών γραμμών του είδους. Διεξοδική μελέτη της κατανομής και/ή της αρχιτεκτονικής ποικίλλων γενωμικών χαρακτηριστικών, όπως η πρωτεάση PrtS, τα γονίδια για τη βιοσύνθεση της ιστιδίνης, οι γενετικές περιοχές για τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών, τα συστήματα CRISPR-Cas και R-M και οι γονιδιωματικές νήσοι, επιβεβαιώνουν ως ένα βαθμό την παραπάνω παρατήρηση. Επιπλέον, πολλά γονίδια που σχετίζονται με βασικές μεταβολικές λειτουργίες, όπως τον μεταβολισμό της λακτόζης και της ουρίας, τη βιοσύνθεση των αμινοξέων και το πρωτεολυτικό σύστημα, βρέθηκαν συντηρημένα σε μεγάλο βαθμό σε όλα τα στελέχη του είδους. Ο Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87 έχει χρωμόσωμα με μέγεθος περίπου 1.86 Mbp. Σε αυτό βρέθηκαν 1,993 γονίδια εκ των οποίων τα 1,644 κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επίσης ταυτοποιήθηκαν 229 πιθανά ψευδογονίδια. Περίπου 87% των πρωτεϊνών (1,284 πρωτεΐνες) ανήκουν σε μία τουλάχιστον λειτουργική κατηγορία COG, με την πλειοψηφία των πρωτεϊνών να εντοπίζονται κυρίως στις κατηγορίες της μετάφρασης, της ριβοσωμικής δομής και της βιογένεσης (J: 8.5%), της μεταφοράς και του μεταβολισμού αμινοξέων (E: 7.8%) και της αναπαραγωγής, του ανασυνδυασμού και της επιδιόρθωσης (L: 7.4%). Επίσης, ταυτοποιήθηκε μία συστοιχία CRISPR με μέγεθος 761 bp και 11 spacers καθώς και δύο διακριτές γενετικές περιοχές για τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών. Τέλος, βρέθηκαν 12 γονιδιωματικές νήσοι, οι οποίες περιλαμβάνουν συνολικά 196 γονίδια, πολλά από τα οποία κωδικοποιούν Cas πρωτεΐνες, πρωτεΐνες των συστημάτων R-M καθώς και πρωτεΐνες για την παραγωγή εξωπολυσακχαριτών. Ο Lb. delbrueckii subsp. lactis ACA-DC 178 έχει χρωμόσωμα με μέγεθος περίπου 2.05 Mbp. Σε αυτό βρέθηκαν 2,112 γονίδια, εκ των οποίων τα 1,752 κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επίσης ταυτοποιήθηκαν 239 πιθανά ψευδογονίδια. Λειτουργική ανάλυση των πρωτεϊνών με τη βάση δεδομένων COG αποκάλυψε ότι περίπου το 80% των πρωτεϊνών (1,417 πρωτεΐνες) ανήκουν σε μία τουλάχιστον λειτουργική κατηγορία COG, με την πλειοψηφία αυτών να εντοπίζονται στις κατηγορίες της αναπαραγωγής, του ανασυνδυασμού και της επιδιόρθωσης (L: 10.6%), της μετάφρασης, της ριβοσωμικής δομής και της βιογένεσης (J: 7.5%) και της μεταφοράς και του μεταβολισμού αμινοξέων (E: 7.2%). Επίσης ταυτοποιήθηκε μία μεγάλη συστοιχία CRISPR με μέγεθος 3,197 bp και 52 spacers, πολλοί από τους οποίους αντιστοιχούν σε φάγους του γένους Lactobacillus. Επιπλέον, βρέθηκαν δύο διακριτές περιοχές για τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών καθώς και 14 γονιδιωματικές νήσοι, οι οποίες περιλαμβάνουν συνολικά 159 γονίδια. Κάποια από αυτά τα γονίδια σχετίζονται με τη μεταφορά αμινοξέων, τα συστήματα R-M καθώς και την παραγωγή εξωπολυσακχαριτών. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν σαφώς ότι η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμάτων καθώς και η συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση διευκόλυναν την ταυτοποίηση πολλών γενετικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται με σημαντικές τεχνολογικές ιδιότητες, τονίζοντας τη σημασία της εφαρμογής της γονιδιωματικής ανάλυσης σε μικροοργανισμούς που σχετίζονται με τα τρόφιμα.