Σπειροκαρβοκυκλικά και αρυλοϋποκατεστημένα 2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικά και σπειροκαρβοκυκλικά Ν-[(2,6-δικετοπιπεραζιν-1-υλ)ακετυλο] γλυκινοϋδροξαμικά οξέα
Authors: Τσατσαρώνη Αλεξάνδρα 
Published: September 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφονται ο σχεδιασμός, η σύνθεση και η αξιολόγηση της in vitro αντιτρυπανοσωμιακής δράσης νέων σπειροκαρβοκυκλικών (αδαμαντανικών, κυκλοοκτανικών και κυκλοεπτανικών) 2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικών οξέων (ενώσεις 1-6), 3-αλκυλο-3-αρυλο-2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικών οξέων (ενώσεις 7-18) και σπειροκαρβοκυκλικών Ν-[(2,6-δικετοπιπεραζιν-1-υλ)ακετυλο]γλυκινοϋδροξαμικών οξέων (ενώσεις 19-29).Ο σχεδιασμός των ενώσεων 1-18 βασίστηκε σε προηγούμενα δεδομένα, σύμφωνα με τα οποία η εισαγωγή ακετοϋδροξαμικού υπολοίπου (CH2CONHOH) στο ιμιδικό άζωτο λιπόφιλων σπειροκαρβοκυκλικών 2,6-δικετοπιπεραζινικών σκελετικών δομών παρέχει ανάλογα με πολύ ισχυρή δράση κατά του Αφρικανικού Τρυπανοσώματος με τιμές IC50 6,8-1870 nΜ (ενώσεις VIIIa-e, IX, Xa-d, XΙa και XIb, Πίνακας 1).Η σύνθεση των ενώσεων 1-4 πραγματοποιήθηκε για να διερευνηθεί η επίδραση επί της αντιτρυπανοσωμιακής δράσης των δομικών χαρακτηριστικών του υποκαταστάτη στον μεθυλενικό άνθρακα, πλησίον του βασικού ατόμου αζώτου του 2,6- δικετοπιπεραζινικού δακτυλίου.Εξάλλου, τα Ν-μεθυλοακετοϋδροξαμικά οξέα (δευτεροταγή υδροξαμικά οξέα) 5 και 6 συντέθηκαν με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση της μεθυλοϋποκατάστασης στη διαμόρφωση της καρβοϋδροξαμικής ομάδας και, κατ’επέκταση, στην αντιτρυπανοσωμιακή δράση των σπειροκαρβοκυκλικών 2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικών οξέων.Η δομική τροποποίηση που οδήγησε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση των ενώσεων 7-18, είχε ως σκοπό να μελετηθεί κατά πόσον επηρεάζεται η αντιτρυπανοσωμιακή δράση από την αντικατάσταση του σπειρανικώς ενωμένου καρβοκυκλικού δακτυλίου από ένα βενζολικό δακτύλιο (υποκατεστημένο ή μη) και έναν αλκυλοϋποκαταστάτη (CH3, (CH2)2CH3, (CH2)3CH3).Σε προηγούμενη εργασία μας είχαμε δείξει ότι η ακετοϋδροξαμική ομάδα είναι απαραίτητη για τη δράση των ενώσεων VIIIa-e, IX, Xa-d, XΙa και XIb. Ως εκ τούτου, είχαμε υποθέσει ότι οι ενώσεις αυτές δρούν με αναστολή ενός μεταλλοενζύμου μέσω δέσμευσης του μεταλλικού ιόντος στο ενεργό του κέντρο. Έτσι, προκειμένου να υποβοηθηθεί ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ της καρβοϋδροξαμικής ομάδας και του μεταλλοϊόντος στην καταλυτική θέση του ενζύμου, διερευνήθηκε η αντικατάσταση του ακετοϋδροξαμικού υπολοίπου (CH2CONHOH) με υπόλοιπο μιας Ν-ακετυλογλυκινοϋδροξαμικής ομάδας (CH2CON(R)CH2CONHOH, R= H, CH3). Η εισαγωγή της συγκεκριμένης ομάδας θα μπορούσε να οδηγήσει σε περαιτέρω σταθεροποίηση του παραπάνω συμπλόκου μέσω επιπρόσθετων αλληλεπιδράσεων του ακεταμιδικού τμήματος (CH2CONR) με το βιολογικό στόχο σε γειτονικές θέσεις του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Με βάση το σκεπτικό αυτό και με στόχο τη βελτίωση της δράσης σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν οι ένωσεις 19-29.Τα καρβοξυλικά οξέα 43-45 (Σχήμα 4), 59, 60 (Σχήμα 5), 83-86 (Σχήμα 8), 107-110 (Σχήμα 9), 124 και 125 (Σχήμα 10), αποτελούν τις δομικές μονάδες για την παρασκευή των τελικών ενώσεων 1, 3-6, 7, 8, 10-13, 15-18 και συντίθενται σύμφωνα με μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί προηγουμένως από την ερευνητική μας ομάδα και έχουν δημοσιευθεί. Έτσι, η σύζευξη των καρβοξυλικών οξέων αυτών με Ο-βενζυλοϋδροξυλαμίνη ή Ο-βενζυλο-Ν-μεθυλοϋδροξυλαμίνη παρουσία 1,1’-καρβονυλοδιιμιδαζολίου (CDI), οδηγεί στα Ο-βενζυλοκαρβοϋδροξαμικά παράγωγα 46, 48, 49, 61, 62, 87, 88, 90, 91, 111, 112, 114, 115, 126 και 127. Η υδρογονόλυση της βενζυλομάδας των τελευταίων περέχει τα ακετοϋδροξαμικά οξέα 1, 3-6, 7, 8, 10-13, 15-18. Εξάλλου, για τη σύνθεση των ακετοϋδροξαμικών 2, 9 και 14, οι αντίστοιχοι 4-μεθοξυβενζυλεστέρες 40, 80 και 104 κατεργάζονται με TFA σε CH2Cl2 και τα ενδιαμέσως σχηματιζόμενα καρβοξυλικά οξέα αμιδοποιούνται με τα Ο-(4-μεθυξυβενζυλο)υδροξυλαμίνη για να δώσουν τα αντίστοιχα Ο-(4-μεθοξυβενζυλο)καρβοϋδροξαμικά παράγωγα 47, 89 και 113. Η κατεργασία των ενώσεων 47, 89 και 113 με TFA παρουσία Et3SiH σε άνυδρο CH2Cl2 οδηγεί στα επιθυμητά ακετοϋδροξαμικά οξέα 2, 9 και 14, αντίστοιχα.Για τη σύνθεση των σπειροκαρβοκυκλικών Ν-[(2,6-δικετοπιπεραζιν-1-υλ)ακετυλο]γλυκινοϋδροξαμικών οξέων 19-29, τα καρβοξυλικά οξέα 43, 44, 59, 60, 128, 147 και 148 μετατρέπονται προς τους αντίστοιχους σπειροκαρβοκυκλικούς Ν-[(2,6-διοξοπιπεραζιν-1-υλ)ακετυλο]γλυκινικούς βενζυλεστέρες 129-134 (Σχήμα 11) και 149-153 (Σχήμα 12), υπό συνθήκες πεπτιδικής σύνθεσης. Συγκεκριμένα, οι γλυκινικοί βενζυλεστέρες 129-131 και 149-152 λαμβάνονται με αντίδραση των αντίστοιχων καρβοξυλικών οξέων με γλυκινικό βενζυλεστέρα (υπό μορφή τοζυλικού άλατος), παρουσία ΕDCI.HCl, HOBt, και DIEA σε άνυδρο CH2Cl2-άνυδρο DMF 3:5 v/v. Η παρασκευή των γλυκινικών βενζυλεστέρων 132-134 και 153 πραγματοποιήθηκε με σύζευξη των αντίστοιχων καρβοξυλικών οξέων με σαρκοσινικό βενζυλεστέρα (υπό μορφή υδροχλωρικού άλατος), παρουσία CDI και Εt3N σε άνυδρο THF. Στη συνέχεια, η καταλυτική υδρογόνωση των βενζυλεστέρων 129-134 και 149-153 οδηγεί στα αντίστοιχα Ν-υποκατεστημένα παράγωγα της γλυκίνης 135-140 και 154-158. Ακολούθως, η επίδραση στα τελευταία υδροχλωρικής Ο-βενζυλοϋδροξυλαμίνης παρουσία είτε ΕDCI.HCl, HOBt, και Εt3N ή DIEA είτε CDI και Εt3N οδηγεί στα Ο-βενζυλοκαρβοϋδροξαμικά παράγωγα 141-146 και 159-163. Τελικώς, με καταλυτική υδρογονόλυση της βενζυλομάδας στις ενώσεις 141-146 και 159-163 λαμβάνονται τα επιθυμητά γλυκινοϋδροξαμικά οξέα 19-29.Προκειμένου να ερμηνευτεί το γεγονός ότι τα μεθυλιωμένα επί του αζώτου της καρβοϋδροξαμικής ομάδας ακετοϋδροξαμικά οξέα 5 και 6 (δευτεροταγή υδροξαμικά οξέα) είναι βιολογικώς αδρανή (Πίνακας 2), σε σχέση με τα αντίστοιχα μη μεθυλιωμένα ανάλογά τους VIIIa και IX (Πίνακας 1), πραγματοποιήθηκε μελέτη Ε/Ζ διαμόρφωσης για τις προηγούμενες τέσσερις ενώσεις με φασματοσκοπία NMR σε συνδυασμό με θεωρητικούς υπολογισμούς. Τα πειράματα ΝΜR πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, χρησιμοποιώντας DMSO-d6 ως διαλύτη. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν ότι τα πρωτοταγή υδροξαμικά οξέα VIIIa και IX προσλαμβάνουν κατά προτίμηση την Ε-διαμόρφωση (Ε/Ζ=75/25), ενώ στα αντίστοιχα δευτεροταγή Ν-μεθυλιωμένα ανάλογά τους 5 και 6, το Ε-διαμορφομερές είναι το μόνο παρόν στο διάλυμα.Τα αποτελέσματα της in vitro αντιτρυπανοσωμιακής δράσης των ενώσεων 1-6, 7-18 και 19-29 αποκαλύπτουν τα ακόλουθα:1.Τα σπειροκαρβοκυκλικά 2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικά οξέα 1-4 επιδεικνύουν ισχυρή δράση έναντι του Αφρικανικού Τρυπανοσώματος (Τ. brucei), είτε υπό τη μορφή βάσης, είτε υπό τη μορφή του υδροχλωρικού άλατος, με τιμές IC50 σε ικανοποιητικά έως αρκετά ικανοποιητικά νανομοριακά επίπεδα (ΙC50= 32-283 nM, υπό τη μορφή βάσης και ΙC50= 31-253 nM, υπό τη μορφή του υδροχλωρικού άλατος).2.Οι ενώσεις 5 και 6 (δευτεροταγή υδροξαμικά οξέα) απεδείχθησαν ότι είναι ουσιαστικά αδρανείς έναντι του Τ. brucei, τόσο υπό τη μορφή βάσης, όσο και υπό τη μορφή του υδροχλωρικού άλατος. Μάλιστα, για τις ενώσεις αυτές παρατηρήθηκε μία δραματική ελάττωση της δράσης σε σύγκριση με τα μη μεθυλιωμένα ανάλογά τους VIIIa και IX (~2000 φορές). Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στην απουσία του αντίστοιχου Ζ-διαμορφομερούς στη θέση σύνδεσης του μεταλλοενζύμου.3.Η αντικατάσταση του σπειροκαρβοκυκλικού δακτυλίου (αδαμαντανικού, κυκλοοκτανικού και κυκλοεπτανικού) στις ενώσεις VIIIa, Xa και XΙa (Πίνακας 1) από ένα βενζολικό πυρήνα (υποκατατεστημένο ή μη) και έναν αλκυλοϋποκαταστάτη (μεθύλιο, n-προπύλιο ή n-βουτύλιο), που οδηγεί στις ενώσεις 7-11, προκαλεί γενικά ελάττωση της αντιτρυπανοσωμιακής δράσης (IC50 = 1,72-19,1 μΜ, υπό τη μορφή βάσης και IC50 = 1,85-12,9 μΜ, υπό τη μορφή υδροχλωρικού άλατος). Ωστόσο, για ορισμένες από τις ενώσεις αυτές η αντιτρυπανοσωμιακή δράση μπορεί να θεωρηθεί ικανοποιητική (IC50= 1,72-7,25 μΜ).4.Η εισαγωγή αλκυλίου (μεθυλίου, n-προπυλίου ή n-βουτυλίου) στο βασικό άζωτο του δικετοπιπεραζινικού δακτυλίου των ενώσεων 7-11, που οδηγεί στα Ν-αλκυλοπαράγωγα 12-18, επιφέρει σημαντική βελτίωση της δράσης (ΙC50= 0,47 – 8,16 μΜ). Μάλιστα, τα παράγωγα 12 και 14-18 εμφανίζουν δράση σε χαμηλά μικρομοριακά έως υπομικρομοριακά επίπεδα (ΙC50= 0,47 – 2,97 μΜ).5.Η εισαγωγή Ν-ακετυλογλυκινοϋδροξαμικού υπολοίπου (CH2CON(R)CH2CONHOH, R=H, CH3) στο ιμιδικό άζωτο των σπειροκαρβοκυκλικών 2,6-δικετοπιπεραζινικών σκελετικών δομών (scaffolds) οδηγεί γενικώς σε Ν-υποκατεστημένα γλυκινοϋδροξαμικά οξέα (βλ. Πίνακα 4) με σαφώς ελαττωμένη αντιτρυπανοσωμιακή δράση σε σχέση με τα ανάλογά τους που φέρουν ακετοϋδροξαμικό υπόλοιπο (CH2CONHOH) στην ίδια θέση. Εντούτοις, είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι ο συνδυασμός (S)-ισοβουτυλοϋποκατάστασης ή (S)-βενζυλοϋποκατάστασης στον μεθυλενικό άνθρακα μεταξύ του αμινικού αζώτου και του καρβονυλίου του 2,6-δικετοπιπεραζινικού δακτυλίου της μητρικής αδαμαντανικής ένωσης 19 (ΙC50= 24,8 μΜ) και της εισαγωγής μεθυλίου στο γλυκινικό άζωτο της πλευρικής αλυσίδας βελτιώνει εντυπωσιακά τη δράση. Τα παράγωγα 23 (IC50= 34 nΜ) και 24 (IC50= 53 nΜ), που προκύπτουν είναι δραστικά κατά του Αφρικανικού Τρυπανοσώματος σε ικανοποιητικά νανομοριακά επίπεδα. Ιδιαίτερα είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι το παράγωγο 23 που βασίζεται στην σπειροαδαμαντανική (S)-ισοβουτυλο-2,6-δικετοπιπεραζινική σκελετική δομή βρέθηκε δραστικότερο από το αντίστοιχο ακετοϋδροξαμικό παράγωγο 1 (IC50= 283 nM, βλ. Πίνακα 2) κατά 8,3 φορές.6. Η κυτταροτοξικότητα των δραστικών σπειροκαρβοκυκλικών 2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικών οξέων 1-4 (Πίνακας 2) και των περισσότερο δραστικών από τα 3-αλκυλο-3-αρυλο-2,6-δικετοπιπεραζινο-1-ακετοϋδροξαμικά οξέα 7-18 (Πίνακας 3) για τα κύτταρα θηλαστικών (L6-κύτταρα αρουραίου) βρέθηκε ότι είναι χαμηλή έως αμελητέα (SI=110-2830). Στην περίπτωση των Ν-υποκατεστημένων γλυκινοϋδροξαμικών οξέων 19-29, η κυτταροτοξικότητα των δραστικών ενώσεων για τα κύτταρα θηλαστικών διαπιστώθηκε ότι είναι μέτρια έως χαμηλή (SI=16-940).