Διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1 από μεταγραφικούς καταστολείς σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα
Authors: Παναγούλιας Ιωάννης 
Published: August 2021

Η IL-2 είναι η πρώτη κυτταροκίνη η οποία εκκρίνεται όταν τα παρθενικά Τ βοηθητικά (Th) λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά Τh0 λεμφοκύτταρα, από τα οποία θα προέλθουν τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα των άλλων γραμμών διαφοροποίησης. Ο ιός HIV-1 είναι μεταγραφικά ενεργός στα ενεργοποιημένα CD4+ T κύτταρα και ανενεργός στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η έκφραση της IL-2 και του HIV-1 εμποδίζεται στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα από την ύπαρξη ενός καταστολέα ο οποίος προσδένεται στην ARRE-2/NFAT περιοχή του υποκινητή της IL-2 και την RATS (Repressor Activator Target Sequence) αλληλουχία (-279 to -250bp) του HIV-1-LTR αντίστοιχα. Οι δύο αυτές περιοχές παρουσιάζουν νουκλεοτιδική ομολογία στην αλληλουχία τους και εμπεριέχουν το νουκλεοτιδικό μοτίβο AAGGAG, που αποτελεί αλληλουχία πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2. Στην παρούσα διατριβή αποδείξαμε ότι ο παράγοντας Ets-2 είναι καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1-LTR στα CD4+CD45RA+CD25-FoxP3- παρθενικά Τh κύτταρα, μέσω της πρόσδεσής του στην κοινή τους αλληλουχία. Η κατασταλτική αυτή δράση του παράγοντα Ets-2 παύει να υπάρχει στα μνημονικά Th κύτταρα ή όταν τα παρθενικά Th κύτταρα ενεργοποιηθούν.Αρχικά μετρήσαμε τα επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mRNA σε υποπληθυσμούς T λεμφοκυττάρων και σε 9 λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, πριν και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με τα μιτογόνα PMA/Ionomicyn (P/I). To ets-2 mRNA ανιχνεύθηκε στα Τ κύτταρα και στις περισσότερες κυτταρικές σειρές όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM), αλλά η σύνθεσή του μειώθηκε σημαντικά μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I). Στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα τα επίπεδα του ets-2 mRNA και της Ets-2 πρωτεΐνης καθώς και η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στις ARRE-2 και RATS αλληλουχίες, μειώνονται μετά την ενεργοποίηση των Th κυττάρων. Η μείωση αυτή ακολουθείται από ταυτόχρονη έκφραση της IL-2. Η προσθήκη κυκλοσπορίνης A στην καλλιέργεια των κυττάρων οδήγησε στην σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 mRNA και πρωτεΐνης όταν τα κύτταρα έχουν πρώτα ενεργοποιηθεί.Στην συνέχεια διαμολύναμε τα κύτταρα Jurkat με (i) τα πλασμίδια IL-2-CAT, 4xARRE-CAT (φέρει 4 αντίγραφα της ARRE-2 αλληλουχίας), 2xmutantARRE-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2) (ii) HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT (2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας), 2xmutantRATS-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2) και CMV-CAT (control), (iii) pCDNA3-ets2 (για την υπερέκφραση της Εts-2 πρωτεΐνης), (iv) ets-2 shRNA (για την αποσιώπηση της έκφρασης του Ets-2 στα κύτταρα). Πειράματα συνδυαμολύνσεων στα Jurkat κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες του pCDNA3-ets2 οδήγησε σε σταδιακή μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας των πλασμιδίων IL-2-CAT, 4xARRE-CAT, HIV1-LTR-CAT και 2xRATS-CAT μετά από μιτογονική διέγερση των κυττάρων με P/I. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην μεταγραφική ενεργότητα των πλασμιδίων αναφοράς CMV-CAT, 2xmutantARRE-CAT και 2xmutantRATS-CAT. Αντίθετα, πειράματα συνδυαμολύνσεων με τα πλασμίδια αναφοράς HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT και τους κλώνους του ets-2 sh-RNA οδήγησε στην αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας και των δύο πλασμιδίων αναφοράς αλλά όχι για τα 2xmutantRATS-CAT και CMV-CAT. Επίσης η διαμόλυνση των Jurkat κυττάρων με τους κλώνους του ets-2 sh-RNA, απουσία σημάτων ενεργοποίησης, οδήγησε και στην έκφραση του ενδογενούς IL-2 mRNA. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει την κατασταλτική δράση του παράγοντα Ets-2 στην έκφραση της IL-2 σε μη επαγώγιμες συνθήκες. Τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης αποκάλυψαν ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2, είναι ισχυρότερη στα παρθενικά Τh κύτταρα σε σχέση με τα ενεργοποιημένα ή μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Με την ίδια πειραματική διαδικασία αυτή την φορά σε Jurkat κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο HIV-1-LTR παρατηρήθηκε ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην RATS αλληλουχία ήταν ισχυρότερη στην CM συνθήκη σε σχέση με το P/I όπου ο παράγοντας Ets-2 εξαφανίζεται από την RATS αλληλουχία.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνουμε ότι η έκφραση του ets-2 και η πρόσδεση της Ets-2 πρωτεΐνης στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που έχει σαν τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερσή τους. Δυσλειτουργία ενός τέτοιου κατασταλτικού μηχανισμού σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να οδηγήσει σε μετέπειτα διαταραχές στην πλαστικότητα των Th κυττάρων με αποτέλεσμα εμφάνιση αυτοάνοσων ή άλλων παθολογικών καταστάσεων. Η μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων στην μνημονική και ενεργοποιημένη κατάσταση των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκφρασης του HIV-1-LTR στα μολυσμένα κύτταρα. Αυτή η καταστολή του ιικού γονιδιώματος που διαμεσολαβείται μέσω της RATS αλληλουχίας μπορεί να ευθύνεται για την χαμηλή μεταγραφική ενεργότητα και πολλαπλασιασμού του ιού HIV-1 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και να συμβάλει στην λανθάνουσα κατάσταση του ιού στα κύτταρα αυτά καθώς και στην διατήρηση των ιικών αποθεμάτων παρά την μακράς διαρκείας θεραπεία.