Enhanced RNA interference - 1 - like - 1
Authors: Μέρμηγκα Γλυκερία 
Published: August 2021

Οι ριβονουκλεάσες αποτελούν μια ομάδα ενζύμων που συμμετέχουν σε μια πληθώρα διαδικασιών σε όλους τους οργανισμούς από τους ιούς έως τους ανώτερους ευκαρυώτες. Η λήξη της μεταγραφής, η ωρίμανση και επιδιόρθωση των μεταγράφων αλλά και ο μηχανισμός της RNA σίγησης αποτελούν μερικά από τα μονοπάτια στα οποία προεξέχοντα ρόλο επιτελεί αυτή η ομάδα ενζύμων. Ανάλογα με τη θέση δράσης τους πάνω στο υπόστρωμα αλλά και κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους κατηγοριοποιούνται σε διάφορες οικογένειες μεταξύ των οποίων είναι και η υποοικογένεια Enhancer of RNA interference-1 (ERI-1). Οι πρωτεΐνες τη ομάδας αυτής είναι 3’-5’ εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των DEDDh νουκλεασών, στην οποία μεταξύ άλλων ανήκουν και οι βακτηριακές ολιγοριβονουκλεάση και RNase T. Οι Eri-1 πρωτεΐνες είναι συντηρημένες στους ευκαρυώτες στους οποίους δρα ο μηχανισμός της RNA σίγησης, από το νηματώδη σκώληκα έως το ποντίκι, τον άνθρωπο, τη δροσόφιλα, τον Schizosaccharomyces pombe αλλά και τα φυτά. Συμμετέχουν σε διάφορες διαδικασίες όπως είναι η αποικοδόμηση των μικρών παρεμβαλλόμενων RNA (siRNA), δρώντας κατά αυτόν τον τρόπο στο μονοπάτι της RNA σίγησης, η ωρίμανση και αποικοδόμηση των ιστονικών μεταγράφων αλλά και η ωρίμανση του 5.8S ριβοσωμικού RNA. Το Eri-1 ομόλογο (ERI-1-Like-1, ERIL1) του φυτού Arabidopsis thaliana έχει χλωροπλαστιδιακή στόχευση ενώ φυτά Nicotiana benthamiana που υπερεκφράζουν το διαγονίδιο παρουσιάζουν χλωρωτικούς φαινοτύπους, με χλωροπλάστες που μοιάζουν προπλαστίδια . Από μοριακή ανάλυση των διαγονιδιακών αυτών σειρών προέκυψε ότι τα χλωροπλαστιδιακά μετάγραφα παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη της δράσης του Eri-1 ομολόγου στα φυτά (ERI-1-Like-1, ERIL) και συγκεκριμένα στα φυτά-μοντέλα Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana. Αρχικά, και λόγω της παρουσίας δύο παραλόγων γονιδίων στο είδος N. benthamiana, κλωνοποιήθηκαν τα μετάγραφα όπου και διαπιστώθηκε ότι από το ένα παράλογο γονίδιο προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δύο ισομορφές. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του εναλλακτικού ματίσματος στον ενδοκυττάριο εντοπισμό της παραγόμενης πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης της συγκεκριμένης γονιδιακής θέσης συντηγμένης με την πρωτεΐνη αναφοράς Green Fluorescent Protein, όπου με συνεστιακή μικροσκοπία διαπιστώθηκε ο χλωροπλαστιδιακός εντοπισμός. Η χλωροπλαστιδιακή στόχευση της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε και με ανάλυση τύπου western σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα χλωροπλαστών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός των σειρών που παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης με αναλύσεις τύπου northern και western. Αυτές οι σειρές μαζί με σειρές υπερέκφρασης του διαγονιδίου οι οποίες είχαν χαρακτηριστεί από προηγούμενες μελέτες αποτέλεσαν τα εργαλεία για τη μελέτη της δράσης της υπό μελέτης πρωτεΐνης. Οι σειρές με έντονη καταστολή παρουσίαζαν μειωμένα επίπεδα χλωροφυλλών σε σχέση με φυτά αγρίου τύπου ενώ από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε τομές φύλλων φυτών N.benthamiana με καταστολή των ERIL1 γονιδίων διαπιστώθηκαν ότι οι χλωροπλάστες παρουσίαζαν παρεκκλίνουσα ανατομία. Από μοριακή ανάλυση τύπου northern φυτών με καταστολή και υπερέκφραση του ERIL1 διαπιστώθηκαν παρεκκλίνοντα πρότυπα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών μεταγράφων του χλωροπλάστη υποδεικνύοντας τη συμμετοχή της πρωτεΐνης στην ωρίμανση αυτών των μεταγράφων. Επιπλέον, με ανοσοκατακρήμνιση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη συγκατακρημνίζεται εκτός των ριβοσωμικών μεταγράφων και με ορισμένα άλλα χλωροπλαστιδιακά νουκλεϊκά οξέα υποδεικνύοντας κάποιο πιθανό ρόλο στην ωρίμανση αυτών. Τέλος, με παροδική υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε αναπτυγμένα φύλλα N. benthamiana παρατηρήθηκε επίδραση της στην αποικοδόμηση του ώριμου 4.5S rRNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της υπό μελέτης πρωτεΐνης στο μηχανισμό της RNA σίγησης. Από αυτά δεν διαπιστώθηκε κάποια επίδραση στο μονοπάτια που μελετήθηκαν, ενώ μόνο τα φυτά που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα συγκεκριμένων miRNA. Συνολικά, από τα πειράματα της παρούσας μελέτης συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη ERIL1 δρα στην ωρίμανση των ριβοσωμικών χλωροπλαστιδιακών μεταγράφων και στην αποικοδόμηση του 4.5S rRNA ενώ δεν φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στα μονοπάτια της RNA σίγησης που μελετήθηκαν.