Investigation of genetic and epigenetic factors in pediatric astrocytomas
Authors: Κλώνου Παρασκευή-Αλεξία 
Published: September 2022

Οι τροποποιήσεις ιστονών αποτελούν ένα κύριο επιγενετικό μηχανισμό γονιδιακής ρύθμισης, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη και την εξέλιξη νεοπλασιών. Το προφίλ μεθυλίωσης της ιστονών στα παιδιατρικά αστροκυτώματα και η συμμετοχή των ιστονικών τροποποιήσεων στην ανάπτυξη των όγκων δεν είχε μέχρι σήμερα μελετηθεί. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήσαμε τα ολικά επίπεδα έκφρασης των σημαντικότερων κατασταλτικών H3K9me3, H3K27me3, H4K20me3 και ενεργοποιητικών H3K4me3, H3K36me3 ιστονικών τροποποιήσεων, μαζί με τα αντίστοιχα ένζυμα που τις καταλύουν, SUV39H1, SETDB1, EZH2, MLL2, SETD2 σε παιδιατρικά αστροκυτώματα διαφορετικού βαθμού κακοήθειας και σε φυσιολογικούς εγκεφαλικούς ιστούς. Αρχικά πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση βάσεων δεδομένων και στη συνέχεια επιβεβαίωση των ευρημάτων με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση κατά Western. Επιπλέον, εξετάσαμε τον λειτουργικό ρόλο των μεθυλοτρανσφερασών στη βιωσιμότητα και μεταναστευτικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων με αναστολείς μεθυλίωσης καθώς και γονιδιακή σίγαση των SETDB1 και SUV39H1 με siRNA σε δύο παιδιατρικές κυτταρικές σειρές γλοιβλαστώματος (CHLA-200, SJ-GBM2). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η διαφορική έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση και την απόπτωση.Εντοπίσθηκε υπερέκφραση των γονιδίων των ιστονικών μεθυλοτρανσφερασών και απορρύθμιση του κώδικα των ιστονών στα παιδιατρικά αστροκυτώματα, με υψηλότερα επίπεδα των H4K20me3, H3K4me3, SUV39H1, SETDB1 και SETD2 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς εγκεφαλικούς ιστούς. Τα πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα (βαθμός κακοήθειας Ι) εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα του ενζύμου MLL2 σε σύγκριση με τους διάχυτους όγκους, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μοτίβο επιγενετικής ρύθμισης μεταξύ των δύο τύπων αστροκυτταρικών νεοπλασμάτων. Υψηλότερη έκφραση των H3K9me3, H3K36me3 και SETDB1 ανιχνεύθηκε στα αστροκυτώματα βαθμού κακοήθειας IIΙ / IV σε σύγκριση με τα αστροκυτώματα βαθμού II. Στη μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, η υψηλή έκφραση της τροποποίησης H3K9me3 και του ενζύμου MLL2 καθώς και η χαμηλή έκφραση της SUV39H1 συσχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση των ασθενών. Κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, μόνο η έκφραση της μεθυλοτρανσφεράσης SUV39H1 βρέθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας αρνητικής συσχέτισης. Οι αναστολείς μεθυλίωσης ιστονών, έδειξαν μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και της κυτταρικής μεταναστευτικότητας μετά από αναστολή της SUV39H1 σε παιδιατρικές κυτταρικές σειρές.Ο διαφορικός βιολογικός ρόλος των μεθυλοτρανσφερασών SUV39H1 και SETDB1 διερευνήθηκε περαιτέρω στα υψηλόβαθμα αστροκυτώματα όπου παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση της SETDB1, θετική συσχέτιση της έκφρασης των δυο μεθυλοτρανσφερασών με προνευρικά γονίδια και αρνητική συσχέτιση με μεσεγχυματικά γονίδια στη βιοπληροφορική ανάλυση. Η γονιδιακή σίγαση των SETDB1 και SUV39H1 στις κυτταρικές σειρές υψηλόβαθμων αστροκυτωμάτων έδειξε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων. Η σίγαση της SETDB1 ανέστρεψε την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMΜ) μειώνοντας την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα SNAI1 και αυξάνοντας την έκφραση της Ε-cadherin. Παράλληλα, μείωσε τα επίπεδα έκφρασης της Ν-cadherin και του γονιδίου MARCKS. Η καταστολή της SUV39H1 απέτυχε να αναστρέψει την EMΜ αλλά μείωσε σημαντικά την έκφραση των παραπάνω ΕΜΜ γονιδίων. Επιπλέον, η αποσιώπηση της SETDB1 αύξησε σημαντικά τα επίπεδα του αντι-αποπτωτικού γονιδίου BCL-2 και του δισθενούς ογκοκατασταλτικού γονιδίου SLC17A7. Συμπερασματικά, τα ευρήματα μας εμπλέκουν τα υψηλά επίπεδα της ιστονικής τροποποίησης H3K9me3 στην παθοβιολογία των παιδιατρικών αστροκυτωμάτων, την υψηλή έκφραση της SUV39H1 να αποτελεί θετικό προγνωστικό παράγοντα στα χαμηλόβαθμα, ενώ την υψηλή έκφραση της SETDB1 αρνητικό προγνωστικό παράγοντα στα υψηλόβαθμα αστροκυττώματα. Επιπλέον, η SETDB1 έχει ρόλο ογκογονιδίου καθώς σχετίζεται με την εξέλιξη των υψηλόβαθμων όγκων και την μειωμένη πρόγνωση των ασθενών, ενώ η SUV39H1 επηρεάζει κυρίως την κυτταρική προσκόλληση και την απόπτωση.