Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης και χρήση τους στην ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων για τη μυασθένεια
Authors: Τσώνης Αναστάσιος 
Published: August 2021

Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης και χρήση τους στην ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων για τη μυασθένειαΗ βαριά μυασθένεια (MG) αποτελεί μια αυτοάνοση νόσο η οποία χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία. Η παθολογία της νόσου προκαλείται από την παρουσία αυτοαντισωμάτων που στοχεύουν πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης (NMJ). Πιο συγκεκριμένα, αντιγονικούς στόχους αποτελούν ο AChR, σε ποσοστό 80-85% των ασθενών, η MuSK σε ποσοστό 5-7% και η LRP4 σε ποσοστό 2-3%. Παρά την εκτεταμένη έρευνα, το ποσοστό των οροαρνητικών μυασθενών (SN-MG), δηλαδή ασθενών που δεν φέρουν αντισώματα για κανένα από τα ήδη γνωστά αντιγόνα, αποτελεί ένα σοβαρό κενό για την πλήρη κατανόηση της νόσου. Το γεγονός αυτό πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη άγνωστων μέχρι σήμερα αντιγόνων ή/και στη χαμηλή ευαισθησία των τεχνικών ανίχνευσης που είναι διαθέσιμες.Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο την ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών τεχνικών για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι των αντιγόνων LRP4 και MuSK συνεισφέροντας στη μείωση των SN-MG. Η ανίχνευση των αντι-LRP4 αντισωμάτων πραγματοποιείται από την ευαίσθητη αλλά μόνο ποιοτική CBA τεχνική. Η ανάπτυξη μιας τεχνικής (RIPA, ELISA) για την ποσοτικοποίηση αυτών των αντισωμάτων είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της νόσου. Αντιθέτως, σε ότι αφορά στην MuSK-MG, πολύτιμη είναι η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης τεχνικής όπου η MuSK θα βρίσκεται στην φυσική της διαμόρφωση (όπως στο CBA), σε αντίθεση με τις μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (RIPA). Με αυτό τον τρόπο θα είναι δυνατός ο εντοπισμός χαμηλής συγκέντρωσης αντι-MuSK αντισωμάτων ή αντισωμάτων που απαιτούν τη σωστά δομημένη πρωτεΐνη για να ανιχνευθούν. Η ανάπτυξη μιας ποσοτικής και ευαίσθητης διαγνωστικής μεθόδου ανίχνευσης αντισωμάτων προϋποθέτει την παραγωγή, απομόνωση και καθαρισμό ενός πολύ καλά δομημένου και ακέραιου αντιγόνου. Η ανθρώπινη LRP4 είναι μια μεγάλη διαμεμβρανική πρωτεΐνη (212 kDa) με πολύπλοκες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένη πρωτεΐνης καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη την παραγωγή της σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης. Συνεπώς, επιπλέον από την μοριακή κατασκευή για την έκφραση της διαμεμβρανικής LRP4, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες έκφρασης της εξωκυττάριας περιοχής (ΕΚΠ) της, καθώς και λειτουργικών τμημάτων αυτής. Τα συστήματα έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν με γνώμονα τους μεταμεταφραστικούς μηχανισμούς που διαθέτουν, καθώς και με την ικανότητα τους να εκφράσουν μεγάλες ποσότητες των επιθυμητών πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα, για την έκφραση ολόκληρης της LRP4 (1905aa) καθώς και της LRP4-ΕΚΠ (21-1725aa) πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν τα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης των κυττάρων εντόμων (Sf9) επιμολυσμένα με βακιλοϊό και των θηλαστικών κυττάρων (HEK293), αντίστοιχα. Τα παραπάνω συστήματα έκφρασης είναι ικανά να εκφράσουν σωστά δομημένες πρωτεΐνες, με πλήρως λειτουργική δομή, αλλά συνήθως σε μικρές ποσότητες. Για την έκφραση των μικρότερων αλλά λειτουργικών τμημάτων της LRP4 χρησιμοποιήθηκαν τα συστήματα έκφρασης του ζυμομύκητα P. pastoris και των βακτηρίων E.Coli (BL21). Χαρακτηριστικό των συγκεκριμένων συστημάτων έκφρασης είναι οι μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης που μπορούν να παράξουν. Υπολείπονται όμως στο επίπεδο μεταμεταφραστικών μηχανισμών καθιστώντας δυσκολότερη την έκφραση πολύπλοκων πρωτεϊνικών μορίων. Τα τμήματα της LRP4 όπου τα επίπεδα έκφρασης και καθαρότητας επέτρεπαν την ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων, χρησιμοποιήθηκαν με στόχο την ανίχνευση αντι-LRP4 αντισωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το LRP4-ΕΚΠ χρησιμοποιήθηκε ως καθηλωμένο αντιγόνο για την ανάπτυξη έμμεσης ELISA, εφαρμογή της οποίας επιβεβαίωσε μόνο το 14% των θετικών για LRP4 αντισώματα MG ασθενών (προηγουμένως ελεγμένοι με CBA). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μιας ακόμα έμμεσης ELISA με τα τμήματα της LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa και 1004-1306aa) που εκφράστηκαν στο σύστημα έκφρασης των βακτηρίων ως καθηλωμένα αντιγόνα. Με την τεχνική αυτή επιβεβαιώθηκε πάλι περίπου το 10% των LRP4-MG. Ωστόσο, έπειτα από ιωδίωση του τμήματος 21-737aa της LRP4 που εκφράστηκε στον ζυμομύκητα P. pastoris αναπτύχθηκε μια τεχνική RIPA, η εφαρμογή της οποίας ανίχνευσε το 41,2% των θετικών MG για LRP4 αντισώματα. Συνεπώς η RIPA είναι η περισσότερο ευαίσθητη από τις διαγνωστικές τεχνικές που αναπτύχθηκαν. Οι προσπάθειες για την αύξηση της ευαισθησίας των διαγνωστικών εργαλείων που έχουν κατασκευασθεί συνεχίζονται, με στόχο τον ποσοτικό προσδιορισμό των LRP4 αντισωμάτων σε όλους τους LRP4-MG ασθενείς.Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε έλεγχος τριπλά αρνητικών ορών μυασθενών με την MuSK-CBA τεχνική που αναπτύχθηκε. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν 633 SN-MG από 13 χώρες. Από τα αποτελέσματα βρέθηκε πως το 13% των SN-MG φέρει αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης MuSK. Η ειδικότητα της μεθόδου επιβεβαιώθηκε έπειτα από έλεγχο ορών υγιών δοτών και ασθενών με άλλες νευρολογικές νόσους εκ των οποίων βρέθηκαν θετικοί σε ποσοστό 1,9% και 5,1% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη συγκεκριμένη τεχνική ανιχνεύθηκε σημαντικός αριθμός διπλά θετικών ορών (AChR/MuSK και LRP4/MuSK) υποδηλώνοντας πως το συνολικό ποσοστό των πααραπάνω είναι τελικά μεγαλύτερο από αυτό που θεωρείται μέχρι σήμερα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συλλογή και εκτίμηση των κλινικών χαρακτηριστικών των MuSK-CBA θετικών ασθενών. Συνοπτικά, το 27% των SN-MG με οφθαλμική MG (i.e. αποκλειστική εμφάνιση οφθαλμικών συμπτωμάτων) φέρουν αντισώματα έναντι της MuSK. Επιπρόσθετα, το 23% των προσφάτως ανιχνευμένων MuSK-MG εμφανίζει υπερπλασία του θύμου. Τα ποσοστά αυτά είναι πολύ υψηλότερα από εκείνα που έχουν περιγραφεί για τους RIPA θετικούς MuSK-MG ασθενείς.Η φαρμακευτική αγωγή που λαμβάνουν οι μυασθενείς εξαρτάται από το είδος των αντισωμάτων που φέρουν. Επιπρόσθετα, η πορεία της MG φαίνεται να σχετίζεται σε πολλές περιπτώσεις με την συγκέντρωση των αντισωμάτων αυτών. Συνεπώς η ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων όπως αυτών που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή μπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη και γρηγορότερη αντιμετώπιση της νόσου, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των MG ασθενών.