Διερεύνηση αντοχής των σταφυλοκόκκων σε οξαζολιδόνες και στρεπτογραμμίνες με φαινοτυπικές και μοριακές μεθόδους
Authors: Τατσιόπουλος Απόστολος 
Published: August 2021

Οι σταφυλόκοκκοι αποτελούν ένα από τα συχνότερα αίτια λοιμώξεων σε όλο τον κόσμο. Η εμφάνιση και εξάπλωση των μεθικιλλίνη ανθεκτικών στελεχών (MRSA & MRCoNS) ανάμεσα στους ενδονοσοκομειακούς ασθενείς αλλά και στην κοινότητα, δημιούργησε μεγάλο προβληματισμό ως προς την αντιμετώπιση τους, αφού έχουν την τάση να εμφανίζουν αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά. Οι οξαζολιδόνες και οι στρεπτογραμμίνες με κύριους αντιπροσώπους την λινεζολίδη και την κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη αποτελούν δύο καινούργιες τάξεις αντιμικροβιακών φαρμάκων που εισήλθαν στην κλινική θεραπευτική τα τελευταία χρόνια για την αντιμετώπιση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Τόσο οι μελέτες που προηγήθηκαν της εισαγωγής των δύο φαρμάκων όσο και οι επιδημιολογικές μελέτες που ακολούθησαν, ήταν πολύ ικανοποιητικές και για τα δύο φάρμακα. Τα ποσοστά αντοχής που αναφέρθηκαν στην διεθνή βιβλιογραφία ήταν πολύ χαμηλά. Δεδομένου ότι η εισαγωγή των φαρμάκων αυτών στον ελληνικό χώρο έγινε το 2002, η παρούσα διατριβή σχεδιάστηκε με σκοπό την καταγραφή της αντοχής των σταφυλόκοκκων και στα δύο φάρμακα καθώς και τη διερεύνηση του μηχανισμού αντοχής στα ανθεκτικά στελέχη. Αποτελεί μια πρώτη καταγραφή της συμπεριφοράς των δύο φαρμάκων στο χώρο του νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ και φιλοδοξεί να χρησιμεύσει ως βάση για επιτήρηση της αντοχής του σταφυλόκοκκου στα συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Για το σκοπό αυτό εξετάσθηκαν 475 στελέχη σταφυλόκοκκων, τα οποία απομονώθηκαν από υλικά ασθενών που νοσηλεύτηκαν στο Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ κατά την χρονική περίοδο 2005-2007. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με τις κλασικές μεθόδους (χρώση Gram-δοκιμασία καταλάσης - δοκιμασία παραγωγής πηκτάσης) και τον αναλυτή Vitek 2. Από τα 475 στελέχη 140 ήταν S. aureus και 335 πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι. Η αντοχή στη μεθικιλλίνη πραγματοποιήθηκε με έλεγχο παραγωγής της πρωτεΐνης PBP2a. Η αντοχή στα αντιβιοτικά ελέγχθηκε με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων με τον αναλυτή Vitek 2. Ο προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) στη λινεζολίδη (LZ) και στην κινοπριστίνη-νταλφοπριστίνη(Q/D) έγινε με τη μέθοδο του Etest και τα όρια ευαισθησίας καθορίστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια του CLSI. Το ποσοστό των MRSA ήταν 36% και των CoNS ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη 76%, ποσοστά που συμβαδίζουν με προηγούμενες μελέτες στο Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ. Η αντοχή των σταφυλόκοκκων στα αντιβιοτικά κυμάνθηκε από 20% στην τριμεθοπρίμη-σουλφομεθοξαζόλη έως 64,4% στο φουσιδικό οξύ. Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας της λινεζολίδης δεν βρέθηκαν στελέχη σταφυλόκοκκου με MIC>4mg/L που αποτελεί το όριο αντοχής στο αντιβιοτικό, σύμφωνα με το CLSI. Τα MRSA στελέχη εμφάνισαν χαμηλότερες τιμές MIC στη λινεζολίδη σε σχέση με τα MSSA. Η μέση τιμή της MIC ήταν 1.18 mg/L για τον S.aureus και 0.87 mg/L για τους CoNS. Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη βρέθηκαν 12 στελέχη S.aureus και 12 στελέχη CoNS με ενδιάμεση ευαισθησία (MIC=1-4 mg/L) και 3 στελέχη με αντοχή (1 S. epidermidis, 2 S..cohnii). Όλα τα στελέχη που είχαν MIC≥1 mg/L στην Q/D μελετήθηκαν με PCR για την ανίχνευση των γονιδίων που ευθύνονται για την αντοχή των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραμμίνες [vat(A,B,C), vga(A,B), vgb(A,B), erm(A,B,C) και msr(A,B) ]. Σε 11 στελέχη των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων ανιχνεύτηκε το γονίδιο vgaA(7 S. epidermidis, 4 S. haemolyticus). Σε 12 από τα 13 στελέχη των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων ανιχνεύτηκε το γονίδιο ermA. Τα 12 στελέχη S. aureus με τιμές MIC από 1 έως 2 mg/L ήταν αρνητικά για την ύπαρξη γονιδίων που κωδικοποιούν αντοχή στην νταλφοπριστίνη (vga και vat). Σε 7 στελέχη S.aureus ανιχνεύτηκε το γονίδιο erm(C), σε 2 στελέχη S. aureus το γονίδιο erm(A) και 3 στελέχη ήταν αρνητικά. Στα vga θετικά στελέχη έγινε μοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους βάσει του γονιδίου tuf. Η μοριακή ταυτοποίηση έδωσε τα ίδια αποτελέσματα για τα 10 από τα 11 στελέχη, ενώ ένα στέλεχος το οποίο αρχικά είχε ταυτοποιηθεί ως S. epidermidis με το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek2, με τον μοριακό έλεγχο βρέθηκε S. haemolyticus. Η γενετική συγγένεια των στελεχών σταφυλόκοκκου που παρουσίαζαν αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE). Μελετήθηκαν 7 στελέχη S. epidermidis, 4 στελέχη S. haemolyticus και 2 στελέχη S. cohnii. Από την ανάλυση των ζωνών της PFGE σύμφωνα με τα κριτήρια του Tenover βρέθηκε ότι τα στελέχη S. epidermidis ανήκαν σε έναν κλώνο, ενώ τα στελέχη S. haemolyticus και S. cohnii ήταν πολυκλωνικά. Στην παρούσα μελέτη η in vitro δραστικότητα της λινεζολίδης ήταν 100% έναντι των στελεχών σταφυλόκοκκου, γεγονός ιδιαίτερα ενθαρρυντικό. Το γεγονός αυτό δεν πρέπει να δημιουργήσει εφησυχασμό καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περιπτώσεις εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών αυξάνονται. Η εμφάνιση στελεχών CoNS με αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη προβληματίζει. Η μελέτη έδειξε ότι είναι απαραίτητη η τεκμηρίωση της φαινοτυπικής αντοχής με μοριακές μεθόδους για την αναζήτηση των υπεύθυνων γονίδιων, ειδικά στις περιπτώσεις με χαμηλού επιπέδου αντοχή (ΜΙC=1-4 mg/L). Η προσεκτική χρήση των νεότερων αντιμικροβιακών φαρμάκων όπως η λινεζολίδη και η κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη είναι θεμελιώδους σημασίας και η επαγρύπνηση του μικροβιολογικού εργαστηρίου για την ανίχνευση της αντοχής με τις κατάλληλες μεθόδους είναι απαραίτητη.