Egy DNS-metiltranszferáz specifitásának megváltoztatása tervezett enzimátalakítással és irányított enzimevolúcióval
Authors: Albert Pál 
Published: February 2025

Emlős genomokban a CG dinukleotidokban elhelyezkedő citozinok egy része metilált formában (C5-metilcitozin) van jelen. A CG-metiláció mint epigenetikai jel fontos szerepet játszik többek között a génexpresszió szabályozásában, az embrionális fejlődésben, az X-kromoszóma inaktivációban, valamint az imprinting jelenségében. Feltételezik, hogy az abnormális genomi metiláció hozzájárulhat különféle betegségek (pl. a rák) kialakulásához. A közelmúltban felfedezték, hogy bizonyos sejttípusokban a CA, CT és CC (röviden: CH) dinukleotidokban található citozinok is metilálódhatnak. Ennek a nem-kanonikus metilációnak jelenleg nem ismert a biológiai szerepe. A CG és a CH-metilációért is ugyanazok ez enzimek (Dnmt3a és Dnmt3b) a felelősek. A nem-CG metiláció kutatását nagyban elősegítené, ha elérhetőek lennének olyan enzimek, melyekkel célzottan metilálni lehetne a CH helyeket, anélkül hogy befolyásolnánk a CG-metilációs mintázatot. Jelenleg ilyen specifitású C5-MTázok nem ismertek. Munkánk során célul tűztük ki a bakteriális M.MpeI DNS-metiltranszferáz olyan mutánsainak előállítását, melyek szekvenciaspecifitása CG-ről CH-ra (CA, CT, CC, vagy ezek kombinációja) változott. A projekt első szakaszában arra törekedtünk, hogy a CG specifitást CN-re rontsuk, melyet helyspecifikus mutagenezissel kívántunk elérni. A mutagenizálandó aminosavak kiválasztásánál felhasználtuk az M.MpeI DNS-sel alkotott specifikus komplexének rtg. diffrakciós szerkezetéből nyerhető információt. Elsősorban olyan aminosavakat változtattunk helyspecifikus mutagenezissel, amelyek a felismerőhely nem szubsztrátbázispárjával (5’-CG/5’-CG-3’) létesítenek specifikus kölcsönhatásokat. Létrehoztunk olyan enzimváltozatokat is, amelyekben az aromás oldalláncával a nem-szubsztrát szálban lévő C és G közé ékelődő, jellegzetes torzulást okozó és ezáltal a szekvenciaspecifitásban valószínűleg szerepet játszó 302-es fenilalanint cseréltük más aminosavra. Az elkészült mutánsok között voltak egyszerű aminosavcserék, mikrodeléciók, illetve ezek kombinációi. A mutáns enzimek fenotípusának vizsgálatához a MTáz-változatokat kódoló plazmidokat E. coli sejtekből izoláltuk, majd olyan restrikciós enzimekkel emésztettük, amelyekről tudtuk, hogy működésüket a keresett relaxált specifitású metiláció megakadályozná. A védett fragmentumok megjelenéséből, méretéből következtettünk a mutáns enzimek megváltozott specifitására. A relaxált specifitású M.MpeI változat előállításához a nem-szubsztrát bázispár mindkét tagjának felismerését meg kellett szüntetnünk. A 2. felismerőhurokban található A323 főlánca és a metilálandó citozint követő guanin közötti hidrogénhíd megzavarásának leghatékonyabb módjának az A323 deléciója bizonyult. A megfelelő aktivitású enzim létrehozásához szükség volt az N324G mutáció beépítésére, amely valószínűleg megszüntetett egy, az A323 deléció által okozott, szerkezeti torzulást. A legjobb aktivitással rendelkező relaxált specifitású mutáns (ΔA323 + N324G +E305A) az in vitro mérések alapján a CG helyek mellett a CA és CC dinukleotidokat is elfogadta szubsztrátnak, a CT dinukleotidokat nem metilálta. A munka második szakaszában az volt a célunk, hogy növeljük az enzim CH specifikus aktivitását, lehetőség szerint a kanonikus CG-metilációs aktivitás rovására. Az egyik munka során telítési mutagenezist végeztünk, mely azokat az aminosavakat érintette, melyek feltételezéseink szerint szerepet játszhatnak a nem-szubsztrát szálban elhelyezkedő citozin felismeréséban(CG/CG). A sejtekből izolált plazmidok emésztési képe alapján azonosítottunk egy mutánst (ΔA323+N324G+E305N), amely kissé hatékonyabban metilálta a CC helyeket, mint a ΔA323+N324G+E305A. Sajnos ez a változat továbbra is nagymértékben metilálta a kanonikus CG helyeket is. Egy párhuzamos munka során a ΔA323+N324G+E305A mutánst kódoló gén egy nagyobb szakaszát (~500 bp) random mutagenezisnek vetettük alá. Ennek eredményeként egy megközelítőleg 60 000 klónból álló plazmidkönyvtárat kaptunk. A könyvtárból Eco47I (felismerőhely: GGWCC, a belső és az 5’ végi citozin C5 metilációja véd az emésztéssel szemben) emésztéssel igyekeztünk olyan plazmidokat szelektálni, amely CA és/vagy CC specifitású metiltranszferáz enzimeket kódolnak. Az emésztést túlélt és transzformálással visszanyert plazmidok közül az egyik a ΔA323+N324G+R326G+E305A négyes mutánst kódolta, amely a védési tesztek alapján megnövekedett CC specifikus metiltranszferáz aktivitást mutatott. Az R326G mutációnak további előnyös következménye volt, hogy a CG dinukleotidok metilációja csaknem teljesen megszűnt. A két mutagenezis kísérletből származó előnyös mutációk (E305N és R326G) kombinálásával létrehoztunk egy újabb négyes mutánst (ΔA323+N324G+R326G+E305N), amely továbbra is minimális mértékben metilálta a CG helyeket, a CC specifikus metilációs aktivitás viszont tovább fokozódott. A ΔA323+N324G+R326G+E305N négyes mutáns oldható formában termelődik és nagy mennyiségben tisztítható