Nanotherapeutic approaches to epithelial cancers
Authors: Ματθαίου Ευθυμία-Ηλιάνα 
Published: September 2021

Ο καρκίνος είναι μια από τις κύριες αιτίες θανάτου ανά τον κόσμο και η επίπτωση του καρκίνου συνεχίζει να αυξάνεται παγκοσμίως, κυρίως εξαιτίας της γήρανσης του παγκόσμιου πληθυσμού. Η ανοχή στον κυτταρικό θάνατο και ο επαναπρογραμματισμός των μεταβολικών οδών είναι δύο από τα χαρακτηριστικά των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, καθώς και δύο κύριοι λόγοι της αναποτελεσματικότητας των χημειοθεραπειών. Κατά τη συμβατική χημειοθεραπεία, υψηλό ποσοστό των ασθενών είναι επιρρεπείς στην υψηλή τοξικότητα των φαρμάκων στα υγιή κύτταρα και ιστούς ενώ επίσης μεγάλο ποσοστό των ασθενών εμφανίζει ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία. Τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί σημαντική εξέλιξη στον τομέα της νανοτεχνολογίας και ιδιαιτέρως στις εφαρμογές της νανοτεχνολογίας στην ιατρική. Νανοσωματίδια, νανοσωλήνες και νανοικτριώματα χρησιμοποιούνται ευρέως στη μεταφορά φαρμάκων, σε εφαρμογές απεικόνισης για τη διάγνωση ασθενειών και στην ανάπτυξη ιστών ex vivo. Η μεταφορά χημειοθεραπευτικών φαρμάκων μπορεί να βελτιωθεί μέσω της χρήσης των νανοσωματιδίων, λόγω του φαινομένου ενισχυμένης διαπέρασης και κατακράτησης των νανοσωματιδίων από τους όγκους. Λόγω του φαινομένου αυτού, νανοσωματίδια μεγέθους < 200 nm κατακρατούνται παθητικά, επί το πλείστον, στην περιοχή των όγκων με συνέπεια την ενίσχυση της αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων και ταυτόχρονα την μείωση της τοξικότητάς τους στους υγιής ιστούς. Είναι γεγονός πως προηγμένα νανοφάρμακα όπως το Doxil (λιποσωματίδια ντοξορουμπισίνης) έχουν αποδειχτεί πιο αποτελεσματικά από τη συμβατική χημειοθεραπεία. Ωστόσο, λόγω της ισχυρής τοξικότητας των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ακόμη και μέσω της παθητικής νανομεταφοράς τους παρατηρούνται σημαντικές παρενέργειες στους ασθενείς. Η μάχη με τον καρκίνο μπορεί να ενισχυθεί συμβατικά, εάν η κυτταροτοξικότητα των φαρμάκων συνδυαστεί με την ανοσολογική απόκριση και μετέπειτα επιτήρηση ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Ανάμεσα στα φάρμακα που δοκιμάστικαν η σικονίνη αναδείχτηκε ως το πλέον υποσχόμενο. Η σικονίνη ως μικρό μόριο φαίνεται να έχει πολλαπλούς στόχους στα καρκινικά κύτταρα, ενώ έχει αποδειχτεί τοξική σε όλες τις καρκινικές σειρές που έχει χορηγηθεί έως τώρα. Επιπλέον, η σικονίνη έχει δειχτέι πως προκαλεί ανοσοαποκρισή και έχει χρησιμοποιηθεί σε εμβόλια ως ανοσοενισχυτικό. Ακόμη, έχει δειχτεί πως η σικονίνη είναι τοξική σε σειρές που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα στα ευρέως χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά, ενώ έως τώρα οι ερευνητές δεν έχουν καταφέρει να δημιουργήσουν κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στο συγκεκριμένο φάρμακο. Στη συγκεκριμένη εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μίας πλατφόρμας για την στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης στο μικροπεριβάλλον του όγκου, στοχεύοντας την ενδοσιαλίνη/καρκινικός ενδοθηλιακός δείκτης 1/ CD248. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν βιοσυμβατά και βιοδιασπόμενα νανοσωματίδια από πολυλάκτο-συν-γλυκολικό οξύ, γεμισμένα με σικονίνη, επικαλυμένα με πολυεθυλενογλυκόλη και με συσκευή στόχευσης έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 (ολικό αντίσωμα, τμήμα Fc του αντισώματος, τμήμα ScFv του αντισώματος έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1). Με βάση την ανάλυση του σωματιδιακού μεγέθους και την ηλεκτονική μικροσκοπία, τα νανοσωματίδια που κατασκευάστηκαν είχαν λείο σφαιρικό σχήμα, εύρος μεγέθους 100-125nm και δυναμικό επιφανείας -30 έως -40mV. Η ικανότητα εγκλωβισμού του φαρμάκου και της βιοσύζευξης έφτασαν στο ~92% και ~90% αντίστοιχα. Η σικονίνη εμφάνισε προφίλ σταδιακής και παρατεταμένης απελευθέρωσης τόσο σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα όσο και σε εμβρυικό ορό. Το προφίλ απελευθέρωσης της σικονίνης φάνηκε πως προσαρμόζεται σε ποικίλα κινητικά μοντέλα, με καλύτερη προσαρμογή στο κινητικό μοντέλο Wagner log-probability. Γεγονός που φανερώνει πως η σικονίνη απελευθερώνεται από τα νανοσωματίδια κυρίως λόγω της βιοδιάσπασής τους και όχι μέσω διάχυσης ή κάποιου άλλου μηχανισμού. Ο μηχανισμός πρόκλησης κυτταρικού θανάτου της σικονίνης μελετήθηκε in vitro και in vivo, όπου και βρέθηκε να επιφέρει απόπτωση και νεκρόπτωση, σε όλες τις κυτταρικές σειρές/μοντέλα που μελετήθηκαν. Η σικονίνη ήταν εμβριθώς τοξική σε επιθηλιακές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (OVCAR-5 και ID8) καθώς και σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (IOSE-398), στις ενδοθηλιακές κυτταρικές σειρές MS1 και TC1 και σε λεμφοκύτταρα. Μετά από χορήγηση σικονίνης σε κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε πως η πλειονότητα του φαρμάκου συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ προκαλεί, μεταξύ άλλων, εκπόλωση των μιτοχονδρίων, παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), αυτοφαγοσώματα, εστίες ετεροχρωματίνης στους πυρήνες των κυττάρων και κατακερματισμό του DNA in vitro. Η δραστική δόση (EC50) της σικονίνης μειώθηκε όταν χορηγληθηκε σε κυτταρικές σειρές υπό τη μορφή νανοσωματιδίων. Ενώ δραματική ήταν η πτώση της EC50 της σικονίνης όταν χορηγήθηκε σε υπό τη μοργή στοχευμένων νανοσωματιδίων σε κυτταρικές σειρές με υψηλή έκφραση του καρκινικού δείκτη 1. Όσον αφορά την ικανότητα στόχευσης in vitro των νανοσωματιδίων που έφεραν αντίσωμα έναντι του καρκινικού δείκτη 1, η ανάλυση των δεδομένων μικροσκοπίας φθορισμού και κυτταρομετρίας ροής έδειξε ενεργή αλληλεπίδραση των νανοσωματιδίων εξοπλισμένων με αντίσωμα και των MS1 κυττάρων με υψηλή έκραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1, αλλά όχι των MS1 κυττάρων χωρίς έκραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1. Επιπλέον, ενώ η χορήγηση της σικονίνης σε ελεύθερη μορφή ήταν τοξική, η χορήγηση νανοσωματιδίων σικονίνης δεν είχε τοξικά αποτελέσματα στα λεμφοκύτταρα. Μελέτη βιοκατανομής των νανοσωματιδίων έγινε προς διερεύνηση της τοξικότητας, της διασποράς και της κάθαρσης τους. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης έδειξαν πως τα συγκεκριμένα νανοσωματίδια δεν κατακρατούνται στο ήπαρ και στο σπλήνα, ενώ κυρίως εκκρίνονται μέσω του ουροποιητικού συστήματος μέσα σε 24 ώρες από τη χορήγησή τους. Ακόμη, τα άδεια νανοσωματίδια δεν είχαν άμεση τοξικότητα in vivo.Η αποτελεσματικότητα όσον αφορα την ικανότητα στόχευσης των νανοσωματιδίων in vivo μελετήθηκε αρχικά στο MS1 μοντέλο ξενομοσχεύματος σε ποντικούς. Τα νανοσωματίδια σικονίνης εξοπλισμένα με Fc έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 είχαν μεγαλύτερη συσσώρευση και τοξικότητα στην πλευρά του όγκου που εξέφραζε καρκινικό ενδοθηλιακό δείκτη 1, σε σύγκριση με τα μη εξοπλισμένα νανοσωματίδια/την ελεύθερη σικονίνη. Το μοντέλο μετάστασης TC1 μελετήθηκε σε nu/nu ποντικούς για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα των νανοσωματιδίων σε ένα επιθετικό μοντέλο καρκίνου. Η ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με νανοσωματίδια σικονίνης στοχευμένα ενάντια στον καρκινικό ενδοθηλιακό δείκτη 1 εμφάνιζαν ελάχιστες ή και καθόλου καρκινικές εστίες στους πνεύμονες σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου όπου όλη η επιφάνεια των πνευμόνων είχε καλυφθεί από καρκινικές εστίες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν πως η στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης σταματά την εισβολή και την εξάπλωση των καρκινικών κυτταρών. Προς απάντηση ερωτημάτων για την κάθαρση των νανοσωματιδίων από το αίμα αλλά και για την αλληλεπίδραση τους με το ανοσοποιητικό σύστημα, επιστρατεύτηκε το μοντέλο TC1 εξωμοσχευματος σε C57BL6 ποντικούς. Το φαινόμενο της ταχέως απομάκρυνσης από το αίμα δεν παρατηρήθηκε και τα νανοσωματίδια είχαν διακριτά καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα στα C57BL6 ποντίκια σε σχέση με τα nu/nu, υποδηλώνοντας εν δυμάμει συνέργεια της νανοθεραπείας με το ανοσοποιητικό σύστημα. Για να ερευνηθεί η ειδική ανοσολική απόκριση στα αντιγόνα Ε6/Ε7 των TC1 κυττάρων, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία ELISPOT. Επιπλέον για τη διερεύνηση ειδικής ανοσολογικής απόκρισης in vivo στα ποντίκια που είχαν εξαληφθεί οι όγκοι μετά τη χορήγηση στοχευμένων νανοσωματιδίων, επανενέθηκαν τα ίδια καρκινικά κύτταρα χωρίς χορήγηση αντισωμάτων. Ο πληθυσμός των καρκινικών αυτών κυττάρων σταδιακά μειώθηκε και τελικά εξαλήφθηκε πλήρως. Το γεγονός αυτό φανερώνει πως η στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης έχει όχι μόνο υψηλή θεραπευτική απόδοση αλλά και διεγείρει παρατεταμένη ανοσολογική απόκριση. Βασιζόμενη στo σύνολο των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης, τα PLGA νανοσωματίδια σικονίνης εξοπλισμένα με Fc έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 μπορούν να προταθούν ως καινοτόμος στοχευμένη θεραπεία για τα καρκινώματα με υψηλή έκφραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1.