In vitro probiotic attributes of lactic acid bacteria and their spoilage potential in meat products
Authors: Παυλή Φωτεινή 
Published: September 2021

Τη σημερινή εποχή το καταναλωτικό ενδιαφέρον και οι τάσεις στην αγορά των τροφίμων έχουν μεταβληθεί σημαντικά. Τρόφιμα που μπορεί να είναι ωφέλιμα για την υγεία και βοηθούν στην ευζωία εμφανίζουν αυξημένη ζήτηση και για το λόγο αυτό οι βιομηχανίες τροφίμων καθώς και η έρευνα επικεντρώνονται προς αυτή την κατεύθυνση. Μεγάλη μερίδα της αγοράς των λειτουργικών προϊόντων, κατέχουν τα προβιοτικά προϊόντα και ο συγκεκριμένος τομέας φαίνεται να επεκτείνεται. Τα γαλακτοκομικά προϊόντα έχουν εκτενώς μελετηθεί ως πηγές προβιοτικών καλλιεργειών και ως προϊόντα-φορείς των προβιοτικών, όμως άλλες πηγές πέρα των γαλακτοκομικών, θεωρούνται πολύ σημαντικές έτσι ώστε να αυξηθούν οι κατηγορίες των τροφίμων στις οποίες τα προβιοτικά είναι διαθέσιμα σε όλους τους καταναλωτές. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα μελέτη εστιάζει στο: α) να μελετηθεί το προβιοτικό δυναμικό οξυγαλακτικών βακτηρίων που έχουν απομονωθεί από παραδοσιακά ζυμούμενα ελληνικά προϊόντα, β) να χρησιμοποιηθούν επιλεγμένα οξυγαλακτικά βακτήρια σαν εκκινητήριες συγκαλλιέργειες ή πρόσθετες καλλιέργειες σε ζυμούμενα προϊόντα κρέατος, γ) να ερευνηθεί η δυνατότητα χρήσης εναλλακτικών μεθόδων όπως αυτή των εδώδιμων μεμβρανών, για τη μεταφορά των προβιοτικών καλλιεργειών σε προϊόντα κρέατος θερμικής επεξεργασίας και δ) να αξιολογηθεί η τεχνική της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier σαν εργαλείο για την πρόβλεψη της ποιότητας των ανωτέρω προϊόντων κρέατος. Σε πρώτο στάδιο οξυγαλακτικά βακτήρια, απομονωμένα απο παραδοσιακά ζυμούμενα ελληνικά γαλακτοκομικά και ζωϊκά προϊόντα, ταυτοποιήθηκαν μοριακά και μελετήθηκε το προβιοτικό τους δυναμικό in vitro. Δεκαεννέα (19) απο τα 47 στελέχη οξυγαλακτικών επιλέχθηκαν ως τα καλύτερα με τη βοήθεια μιας σειράς δοκιμών. Επιπρόσθετα, άλλα στελέχη οξυγαλακτικών, που απομονώθηκαν από ελιές, μελετήθηκαν επίσης ως προς τα προβιοτικά τους χαρακτηριστικά, με 17 απο αυτά να εμφανίζουν τις καλύτερες ιδιότητες. Τα ίδια στελέχη μελετήθηκαν στη συνέχεια ως προς την ικανότητα παραγωγής γ-αμινοβουτυρικού οξέος καθώς και αυτεπαγωγέων-2 (μορίων-σημάτων επικοινωνίας), οπού κανένα απο τα στελέχη δεν εμφανίστηκε θετικό ως προς την παραγωγή των συγκεκριμένων μορίων. Τέσσερα (4) απο αυτά τα στελέχη εξετάστηκαν περαιτέρω για την ικανότητα τους να παράγουν αυτεπαγωγείς-2, υπό συνθήκες καταπόνησης, παρόμοιες με αυτές που απαντώνται σε ζυμούμενα τρόφιμα και στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης του γονιδίου luxS (υπεύθυνου για την παραγωγή αυτεπαγωγέων τύπου-2) υπο αυτές τις συνθήκες καταπόνησης με τη χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο. Παρατηρήθηκε σημαντική διακύμανση στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών καταπονήσεων και μεταξύ των διαφορετικών στελεχών, αν και γενικά τα επίπεδα θεωρήθηκαν χαμηλά. Σε δεύτερο στάδιο, επιλεγμένα στελέχη οξυγαλακτικών που εμφάνισαν προβιοτικό δυναμικό χρησιμοποιήθηκαν σαν πρόσθετες καλλιέργειες για την παραγωγή ζυμούμενων αλλαντικών (σαλάμι αέρος). Μικροβιολογικές, φυσικοχημικές (pH και aw) και οργανοληπτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, ωρίμανσης και συντήρησης των σαλαμιών στους 4 και 12 °C. Η παρουσία του προβιοτικού στελέχους μέχρι και το τέλος της διάρκειας ζωής του προιόντος επιβεβαιώθηκε με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Τα αποτελέσματα ήταν πολύ ικανοποιητικά, αφού τo προβιοτικό στέλεχος διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα (>6 log CFU/g), η καλλιέργεια φάνηκε να προσδίδει τα επιθυμητά τεχνολογικά χαρακτηριστικά και τα νέα προϊόντα είχαν αποδεκτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Σε επόμενο στάδιο ερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της εφαρμογής των εδώδιμων μεμβρανών αλγινικού νατρίου ως φορείς των προβιοτικών καλλιεργειών σε συνδυασμό με την τεχνική της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (ΥΥΠ) σε φέτες ζαμπόν. Τα προβιοτικά οξυγαλακτικά βακτήρια ενσωματώθηκαν στο διάλυμα αλγινικού νατρίου. Οι φέτες ζαμπόν (με ή χωρίς προηγούμενη μεταχείριση με ΥΥΠ:500MPa για 2 min) συσκευάστηκαν σε κενό, σε επαφή με τις εδώδιμες μεμβράνες και στη συνέχεια συντηρήθηκαν στους 4, 8 και 12 °C, για 66, 47 και 40 ημέρες αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκαν μικροβιολογικές και φυσικοχημικές (pH, aw) αναλύσεις καθώς επίσης και μέτρηση του χρώματος. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε οργανοληπτική αξιολόγηση, ενώ η παρουσία και το ποσοστό επιβίωσης του κάθε προβιοτικού στελέχους κατά τη συντήρηση επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Σε φέτες ζαμπόν χωρίς τη μεταχείριση με ΥΥΠ, τα επίπεδα των προβιοτικών βακτηρίων ήταν της ταξης των 6 log CFU/g κατά τη συντήρηση σε όλες τις θερμοκρασίες. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσαν οι φέτες ζαμπόν που υποβλήθηκαν σε μεταχείριση με ΥΥΠ, αλλά με διαφορετικές τιμές pH μεταξύ των δυο περιπτώσεων. Τα ζαμπόν στα οποία είχαν προστεθεί προβιοτικές καλλιέργειες παρουσίασαν μια πιο όξινη γεύση και άρωμα σε σύγκριση με το μάρτυρα, παρόλο που αυτά τα χαρακτηριστικά μειώθηκαν αρκετά στην περίπτωση του ζαμπόν με ΥΥΠ. Γενικά τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ενθαρρυντικά, αφού τα προβιοτικά βακτήρια κατάφεραν να περάσουν επιτυχώς απο την εδώδιμη μεμβράνη στο ζαμπόν, ανεξάρτητα απο τη μεταχείριση με ΥΥΠ. Συγχρόνως, παρόμοια μελέτη πραγματοποιήθηκε εστιάζοντας στην αντιμικροβιακή δράση των εδώδιμων μεμβρανών αλγινικού νατρίου εμπλουτισμένων με αιθέριο έλαιο ρίγανης, ενάντια στο παθογόνο Listeria monocytogenes κατά την παρουσία του στο ίδιο προϊόν με ή χωρίς μεταχείριση με ΥΥΠ. Πραγματοποιήθηκαν οι ίδιες αναλύσεις με αυτές που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη μελέτη, ενω η απουσία/παρουσία και το ποσοστό επιβίωσης του κάθε στελέχους Listeria monocytogenes κατά τη διάρκεια της συντήρησης πραγματοποιήθηκε με την ηλεκτροφόρηση αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η ΥΥΠ είχε επίδραση στη Listeria, ανεξάρτητα απο τη θερμοκρασία συντήρησης. Η προσθήκη αιθερίου ελαίου ρίγανης στις εδώδιμες μεμβράνες προκάλεσε μείωση ~1.5 log στον πληθυσμό της Listeria στους 8 και 12 °C, στο τέλος της συντήρησης και περίπου 2.5 log μείωση στους 4 °C. Ο συνδυασμός ΥΥΠ και εδώδιμων μεμβρανών εμπλουτισμένων με αιθέριο έλαιο ρίγανης στο ζαμπόν θεωρήθηκε η πιο αποτελεσματική μεταχείριση προκαλώντας σημαντική μείωση ή ακόμη και απουσία του παθογόνου, επηρεάζοντας ταυτόχρονα τους υπόλοιπους βακτηριακούς πληθυσμούς. Σε τελικό στάδιο, αξιολογήθηκε το δυναμικό της φασματοσκοπίας Υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR) σαν εργαλείο για τον προσδιορισμό των ποιοτικών χαρακτηριστικών των προϊόντων κρέατος εμπλουτισμένων με προβιοτικές καλλιέργειες. Τα προϊόντα που μελετήθηκαν ήταν αυτά που προέκυψαν από τις προηγούμενες μελέτες όπως τα ζυμούμενα αλλαντικά, οι φέτες ζαμπόν (χωρίς περαιτέρω μεταχείριση-μάρτυρας), οι φέτες ζαμπόν με εδώδιμες μεμβράνες προβιοτικών και εδώδιμες μεμβράνες με αιθέριο έλαιο ρίγανης, με ή χωρίς μεταχείριση με ΥΥΠ. Μοντέλα Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS) αναπτύχθηκαν με στόχο τη συσχέτιση των φασματικών δεδομένων απο την ανάλυση με FTIR με την αλλοίωση κατά τη συντήρηση στις διάφορες θερμοκρασίες ανάλογα με το εξεταζόμενο προϊόν. Ο σκοπός της μοντελοποίησης ήταν ο διαχωρισμός των δειγμάτων με βάση την αντίστοιχη ποιοτική τους κατηγορία, καθώς επίσης και να προβλεφθεί ο μικροβιακός πληθυσμός απευθείας από τα φασματικά δεδομένα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επεξεργασία των προϊόντων επηρέασε την ακρίβεια της κατηγοριοποίησης των δειγμάτων σε ποιοτικές κλάσεις. Η αξιολόγηση της ακρίβειας των μοντέλων PLS ως προς τον υπολογισμό των μικροβιακών πληθυσμών βασίστηκε σε γραφήματα και στατιστικούς δείκτες (Βf, Af, RMSE, % PE). Τα δεδομένα που καταγράφηκαν για πρώτη φορά έδειξαν ότι ενω η τεχνική της φασματοσκοπίας υπερύθρου έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία αξιολόγηση των προϊόντων, πρόσθετες επεξεργασίες όπως η ζύμωση, τα πρόσθετα και η ΥΥΠ, μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της τεχνικής.