Φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος στελεχών Pasteurella multocida και Mannheimia haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών (προβάτων, αιγών, βοοειδών) και χοίρων
Authors: Βουγίδου Χριστίνα 
Published: August 2021

Η παρούσα έρευνα είχε ως στόχο το φαινοτυπικό και γονοτυπικό έλεγχο στελεχών της P. multocida και της M. haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών και χοίρων. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με βασικές βιοχημικές δοκιμές, καθώς και με τη μέθοδο της PCR. Η μέθοδος της PCR χρησιμοποιήθηκε και για τη διάκριση των τύπων (A, B, D, E και F) των στελεχών της P. multocida, ενώ η οροτυποποίηση των στελεχών της M. haemolytica έγινε με τη μέθοδο της έμμεσης αιμοσυγκόλλησης. Επιπλέον, τα στελέχη εξετάσθηκαν για την παρουσία γονιδίων λοιμοτοξικότητας. Συγκεκριμένα, με τη μέθοδο της PCR, ανιχνεύθηκαν τα γονίδια toxA και ompA της P. multocida και τα γονίδια lktA και ompA της M. haemolytica. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ompA της P. multocida με τη μέθοδο PCR-RFLP και την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA του γονιδίου. Στα στελέχη της M. haemolytica, έγινε ανάλυση της αλληλουχίας του DNA των γονιδίων lktA και ompA, ενώ για τη μελέτη των πολυμορφισμών στο γονίδιο ompA χρησιμοποιήθηκε και η μέθοδος DGGE.Σκοπός της έρευνας ήταν η διερεύνηση του επιπολασμού των δύο ειδών βακτηρίων, ο συσχετισμός των επικρατέστερων τύπων και οροτύπων τους με τα διαφορετικά είδη ζώων και την ηλικία τους, καθώς και η σύγκρισή τους με τους ορότυπους που χρησιμοποιούνται στα εμβόλια. Επιπλέον, στόχος της παρούσας έρευνας ήταν η μελέτη της λοιμογόνου ικανότητας των στελεχών με τη μοριακή ανάλυση σημαντικών γονιδίων λοιμοτοξικότητας, καθώς και η αξιοποίηση των αποτελεσμάτων για τη δημιουργία πρωτοκόλλου ταχείας και αξιόπιστης ταυτοποίησης των στελεχών, με τη χρήση μεθόδων μοριακής βιολογίας. Πνεύμονες με μακροσκοπικές αλλοιώσεις πνευμονίας (ηπάτωση) συλλέχθηκαν από 21 συνολικά σφαγεία όλης της χώρας. Εξετάσθηκαν συνολικά 491 δείγματα, από τα οποία τα 247 προήλθαν από πρόβατα, 66 από βοοειδή, 47 από αίγες και 131 από χοίρους. Παράλληλα εξετάσθηκαν και οκτώ δείγματα πνευμονικού ιστού ζώων από εκτροφές, τα οποία παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα πνευμονίας.Απομονώθηκαν συνολικά 144 στελέχη P. multocida και 103 στελέχη M. haemolytica. Ο επιπολασμός των δύο βακτηριακών ειδών βρέθηκε να διαφέρει ανάμεσα στα είδη των ζώων που μελετήθηκαν. Συγκεκριμένα, ο επιπολασμός της P. multocida στα βοοειδή ήταν 28,8% και της M. haemolytica 1,5%, ενώ, αντίθετα, στα μικρά μηρυκαστικά, τα ποσοστά κυμαίνονταν μεταξύ 14,9-17,8% και 31,9-35,2% αντίστοιχα. Στους χοίρους, απομονώθηκε, όπως αναμενόταν, μόνο η P. multocida (σε ποσοστό 56,5%).Μεταξύ των στελεχών της P. multocida, βρέθηκαν οι τύποι Α (86,1%), D (13,2%) και F (0,7%). Στα βοοειδή, το σύνολο σχεδόν των στελεχών ήταν τύπου Α (94,7%), ενώ μόνο ένα στέλεχος ήταν τύπου D. Στα πρόβατα, βρέθηκαν επίσης οι τύποι Α και D, σε ποσοστό 61,4% και 38,6% αντίστοιχα. Στις αίγες, εκτός από τον κυρίαρχο τύπο Α (71,4%), βρέθηκαν οι τύποι D και F (ο τύπος F αναφέρεται για πρώτη φορά στις αίγες). Τέλος, στους χοίρους, βρέθηκε μόνο ο τύπος Α.Το γονίδιο toxA ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 43% στο σύνολο των στελεχών της P. multocida. Στους χοίρους και στα βοοειδή, το ποσοστό ήταν αρκετά χαμηλό (2,3% και 5,3% αντίστοιχα). Αντίθετα, στα στελέχη των μικρών μηρυκαστικών, το ποσοστό ανίχνευσης του γονιδίου ήταν απρόσμενα υψηλό (85,7% στις αίγες και 93,2% στα πρόβατα), γεγονός που εγείρει ερωτήματα, που χρήζουν περαιτέρω έρευνας, σχετικά με τη σημασία της τοξίνης στην παθογένεια και επιδημιολογία των πνευμονικών λοιμώξεων από P. multocida στα συγκεκριμένα είδη ζώων.Η ανάλυση του γονιδίου ompA της P. multocida έδειξε πολύ μεγάλη ετερογένεια των στελεχών, τα οποία κατατάχθηκαν σε 11 συνολικά γονοτυπικές ομάδες. Τόσο με την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA, όσο και με την εφαρμογή πρωτοκόλλου PCR-RFLP, ήταν δυνατή η διάκριση των στελεχών των μηρυκαστικών από τα στελέχη των χοίρων.Μεταξύ των στελεχών της M. haemolytica, ο επικρατέστερος ορότυπος ήταν ο Α2 (47,8% στο σύνολο των στελεχών). Το σύνολο των στελεχών των αιγών και το 36,8% των στελεχών των προβάτων ήταν Α2, ενώ οι λοιποί ορότυποι (Α1-14,5%, Α7-13,2%, Α9-9,2%, Α12-9,2%, Α6-3,9% και Α5-2,6%) βρέθηκαν μόνο μεταξύ των πρόβειων στελεχών. Μάλιστα, στα πρόβατα, σε ποσοστό 11,8% βρέθηκαν ορότυποι που δεν περιλαμβάνονται στα εμβόλια του εμπορίου.Η μελέτη του γονιδίου ompA ανέδειξε εννέα συνολικά γονοτυπικές ομάδες μεταξύ των στελεχών της M. haemolytica. Τα στελέχη των προβάτων έδειξαν μεγαλύτερη ετερογένεια και κατατάχθηκαν σε οκτώ ομάδες, δύο από τις οποίες ήταν οι πολυπληθέστερες. Αντίθετα, η πλειονότητα των στελεχών των αιγών αποτέλεσε μία ξεχωριστή ομάδα, ενώ τα υπόλοιπα στελέχη των αιγών κατατάχθηκαν στις δύο κύριες ομάδες των πρόβειων στελεχών. Η διάκριση της πλειονότητας των στελεχών των αιγών από αυτά των προβάτων ήταν δυνατή και με τη μέθοδο της DGGE.Το γονίδιο lktA ανιχνεύθηκε στο σύνολο των στελεχών της M. haemolytica που εξετάσθηκαν. Τα στελέχη των αιγών κατατάχθηκαν σε δύο γονότυπους, ενώ πέντε διαφορετικοί γονότυποι βρέθηκαν μεταξύ των στελεχών των προβάτων. Η παρουσία πολλών πολυμορφισμών σε συντηρημένες, υδρόφοβες περιοχές του γονιδίου και η μεγαλύτερη πιθανότητα ορισμένες από αλληλουχίες των ελληνικών στελεχών να έχουν το ρόλο MTS (mitochondrial targeting signal) αποτελούν σημαντικά ευρήματα της παρούσας έρευνας που χρήζουν μελλοντικής διερεύνησης.Κατά τη μελέτη των στελεχών, δεν παρατηρήθηκε συγκεκριμένη γεωγραφική κατανομή για κανένα από τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Αντίθετα, παρατηρήθηκε ετερογένεια ακόμη και μεταξύ στελεχών της ίδιας εκτροφής, η οποία είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη στην επιλογή των στελεχών για την παρασκευή εμβολίων.Η μελέτη του γονιδίου ompA της P. multocida και της M. haemolytica έδειξε ότι συγκεκριμένα αλληλόμορφα φαίνεται να εμφανίζουν ειδικότητα ξενιστή και, επομένως, το γονίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη πρωτοκόλλου ταυτοποίησης στελεχών των δύο ειδών βακτηρίων. Τα ευρήματα της παρούσας έρευνας αποτελούν την πρώτη αναφορά μέχρι σήμερα στη γενετική ποικιλότητα του γονιδίου ompA της P. multocida.