Μελέτη των λοιμώξεων από Brucella spp.
Authors: Πριάβαλη Ευθαλία 
Published: January 2014

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αφενός μεν η αξιολόγηση της εφαρμογής δύο (2) μοριακών τεχνικών στη διάγνωση της οξείας βρουκέλλωσης, της PCR-ενζυμοσυνδετικής-ανοσολογικής μεθοδολογίας (PCR-ELISA) και της Real Time PCR (RT-PCR), αφετέρου δε η παρακολούθηση με τη μέθοδο της RT-PCR του βακτηριακού DNA, πριν και μετά τη θεραπεία και η πιθανή συσχέτιση του με την έκβαση και πορεία της νόσου. Όσον αφορά την εφαρμογή της PCR-ELISA, εξετάσθηκαν δείγματα ολικού αίματος και ορού από 243 ασθενείς. Μετά την αντίδραση πολλαπλασιασμού ενός τμήματος με 223 ζεύγη βάσεων του γονιδίου που κωδικοποιεί για τη σύνθεση μιας ανοσογόνου μεμβρανικής πρωτεΐνης μεγέθους 31 kDa (BCSP31), ειδικής για το γένος της Brucella με τη χρήση ειδικών εκκινητών, ακολουθούσε το στάδιο ανίχνευσης. Κατά το στάδιο αυτό το προϊόν πολλαπλασιαμού ανιχνευόταν μετά από υβριδισμό σε μικροπλάκα με τη βοήθεια ειδικού ιχνηθέτη σημασμένου με βιοτίνη (biotinylated probe). Για την αξιολόγηση της ποσοτικής RT PCR μεθοδολογίας στη διάγνωση της βρουκέλλωσης, εξετάσθηκαν δείγματα ολικού αίματος και ορού από 126 ασθενείς με διάγνωση οξείας νόσου. Από αυτούς για την παρακολούθηση του βακτηριακού DNA, εξετάσθηκαν από έναν υποπληθυσμό 78 ασθενών τουλάχιστον 3 δείγματα ολικού αίματος. Η αντίδραση πολλαπλασιασμού ενός τμήματος με 207 ζεύγη βάσεων του γονιδίου που κωδικοποιεί για τη σύνθεση της ίδιας μεμβρανικής πρωτεΐνης (BCSP31) και η ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού με την χρησιμοποίηση της φθορίζουσας τεχνικής των hybridization probes γινόταν ταυτόχρονα στο ίδιο τριχοειδές σωληνάριο ειδικού θερμικού κυκλοποιητή (LightCycler). To στάδιο πολλαπλασιασμού ακολουθούνταν από μελέτη της καμπύλης τήξης του προϊόντος (melting curve analysis) που επέτρεπε και ποιοτική ανάλυση για τον έλεγχο της ειδικότητας του πολλαπλασιασμένου γενετικού υλικού. Διακόσιοι σαράντα ένας από τους 243 ασθενείς που μελετήθηκαν με την PCR-ELISA είχαν ανιχνεύσιμο DNA Brucella, είτε στα δείγματα ολικού αίματος, είτε στα δείγματα ορού : σε 149 (61,3%) ασθενείς ανιχνεύθηκε DNA και στα δύο είδη δειγμάτων, σε 43 (17,7%) μόνο στα δείγματα ορού και σε 49 (20,2%) μόνο στα δείγματα ολικού αίματος. Η διαγνωστική ειδικότητα της μεθόδου και για τα δύο είδη δειγμάτων ήταν 100%, ενώ η ευαισθησία ήταν 81,5% για τα δείγματα ολικού αίματος, 79% για τα δείγματα ορού και 99,2% για το συνδυασμό των δειγμάτων. Στους 123 από τους 126 ασθενείς που μελετήθηκαν με την RT-PCR, ανιχνεύτηκε DNA Brucella είτε στο ολικό αίμα, είτε στον ορό είτε και στα δύο είδη δειγμάτων : σε 108 (85,7%) ασθενείς και στα δύο είδη δειγμάτων, σε 6 (4,8%) μόνο στα δείγματα ορού και σε 9 (7,1%) μόνο στα δείγματα ολικού αίματος. Η διαγνωστική ειδικότητα της μεθόδου και για τα δύο είδη κλινικών δειγμάτων ήταν 100%, ενώ η ευαισθησία ήταν 92,8% για τα δείγματα ολικού αίματος, 90,5% για τα δείγματα ορού και 97,6% για το συνδυασμό των δύο ειδών κλινικών δειγμάτων. Από τον υποπληθυσμό των 78 ασθενών, η πλειοψηφία (87% στο τέλος της θεραπείας, 77% στους 6 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας και 70% μετά το δεύτερο έτος από το τέλος της θεραπείας) είχαν επίμονα ανιχνεύσιμο βακτηριακό φορτίο, αν και ήταν ασυμπτωματικοί. Οι 6 ασθενείς που υποτροπίασαν, δεν είχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο βακτηριακό τους φορτίο σε σχέση μ’ αυτούς που δεν υποτροπίασαν. Συμπερασματικά, η εφαρμογή των δύο μεθοδολογιών για την ανίχνευση του DNA της Brucella έδειξε ότι πρόκειται για ευαίσθητες και ειδικές μέθοδοι που μπορούν να βοηθήσουν στην έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση της οξείας βρουκέλλωσης. Επιπλέον, η RT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση του βακτηριακού φορτίου και επομένως της πορείας της νόσου του ασθενή καθώς και την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων για τη βελτίωση της θεραπευτικής προσέγγισης.