Ο ρόλος του παράγοντα νέκρωσης όγκων (tumor necrosis factor, TNF) και του ινοβλάστη στις πνευμονικές παθήσεις
Authors: Οικονόμου Νικόλαος 
Published: August 2021

Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (ΙΠΙ) με το ιστοπαθολογικό πρότυπο της συνήθους διάμεσης πνευμονίας (UIP), είναι μια προοδευτική και θανατηφόρος πάθηση των πνευμόνων, αγνώστου αιτιολογίας. Παρά το αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την ανάπτυξη της ίνωσης, παραμένουν εν πολλοίς άγνωστοι. Το γεγονός αυτό αντανακλάται και στην έλλειψη αποτελεσματικής αντιμετώπισης της νόσου από τις τρέχουσες κλινικές πρακτικές, τόσο σε επίπεδο πρόγνωσης όσο και σε επίπεδο θεραπείας. Η προσεκτικότερη παρατήρηση του ινωτικού πνεύμονα σε συνδυασμό με την αποτυχία των αντι-φλεγμονωδών και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων να θεραπεύσουν τη νόσο, απομάκρυναν την ερευνητική προσπάθεια από τη μελέτη των ανοσολογικών παραμέτρων της νόσου και την κατεύθυναν στην αναζήτηση εναλλακτικών μοριακών μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες. Οι πρόσφατες θεωρίες που προσπαθούν να εξηγήσουν την παθογένεια της ΙΠΙ, προτείνουν ότι υπεύθυνοι μηχανισμοί για την ανάπτυξη της ίνωσης αποτελούν οι απορυθμισμένοι μηχανισμοί επούλωσης τραύματος που ενεργοποιούνται μετά από επαναλαμβανόμενες βλάβες του πνευμονικού επιθηλίου. Ο Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων (Tumor Necrosis Factor, TNF) είναι μια πλειοτροπική κυτταροκίνη που παράγεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους ως απόκριση σε μολύνσεις και βλάβες. Πέρα από τη διεξοδικά μελετημένη προφλεγμονώδη ιδιότητα του, ο TNF σηματοδοτεί για μια πλειάδα, πολλές φορές αντικρουόμενων λειτουργιών, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και ο θάνατος του κυττάρου. Παρά την εμφανή συμμετοχή του TNF στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΙΠΙ, οι έρευνες των περασμένων χρόνων δεν κατάφεραν να αποσαφηνίσουν τον ακριβή ρόλο του μορίου στις παθογενετικές διαδικασίες ενώ μόνο μεμονωμένες περιπτώσεις χρήσης αντι-TNF προσεγγίσεων για τη θεραπεία της νόσου έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Για να εξακριβωθεί η βιολογική δράση του TNF στους μηχανισμούς ανάπτυξης της ίνωσης και να εξεταστεί η διαφορική συμμετοχή των διαφόρων μορφών του καθώς και των υποδοχέων του, χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό πρότυπο της ΙΠΙ επαγόμενο από Μπλεομυκίνη και μια σειρά διαγενετικών ποντικών που δεν διαθέτουν σημαντικά μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού του TNF. Έκφραση μόνο της μεμβρανικής μορφής του TNF ενώ είναι αρκετή για την ανάπτυξη φλεγμονωδών αντιδράσεων, δεν επαρκεί για τη μετάβαση στην ινωτική φάση της νόσου. Αντιθέτως, η διαλυτή μορφή του TNF, η οποία παράγεται από τα αποπίπτοντα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα, αποδείχτηκε αναγκαία για την ανάπτυξη ινωτικού ιστού, μέσω της αυξημένης συνάθροισης λεμφοκυττάρων στον πνεύμονα που προκάλεσε και την επακόλουθη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του κύριου προ-ινωτικού παράγοντα, TGF-bl. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη ενισχύουν την ανάγκη αξιολόγησης της χρήσης αντι-TNF παραγόντων για τη θεραπεία της ΙΠΙ. Επιπλέον, ειδική απενεργοποίηση της διαλυτής μορφής του TNF θα έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της προ-ινωτικής δράσης του TNF διατηρώντας παράλληλα την ικανότητα επαγωγής ανοσίας έναντι σε μολύνσεις, μέσω της δράσης της μεμβρανικής μορφής του. Αν και μια τέτοια θεραπευτική προσέγγιση έναντι του TNF δεν αναμένεται να θεραπεύσει τη νόσο (όπως και με την περίπτωση της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας και της νόσου Crohn), θα μπορούσε να προσφέρει ανακούφιση και βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Η ΙΠΙ αποτελεί μια πολυπαραγοντική νόσο με τη συμμετοχή πολλών γονιδίων και μοριακών μονοπατιών στους παθογενετικούς μηχανισμούς. Σε μια προσπάθεια για την ανακάλυψη νέων σημαντικών γονιδίων που τροποποιούν την ινωτική διαδικασία και την ανάδειξη νέων θεραπευτικών στόχων, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική των DNA μικροσυστοιχιών (DNA microarrays) για την ανάλυση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων κατά την ανάπτυξη ίνωσης στο πειραματικό μοντέλο της νόσου. Ακολουθώντας εκτενή στατιστική ανάλυση, μια σειρά από γονίδια με διαφοροποιημένη έκφραση συγκρίθηκαν με λίστες γονιδίων της ήδη υπάρχουσας βιβλιογραφίας, προερχόμενες από μελέτες με μικροσυστοιχίες γενετικού υλικού τόσο σε ανθρώπους με ΙΠΙ όσο και στο πειραματικό μοντέλο, δημιουργώντας έτσι μια μοναδική λίστα με πιθανούς τροποποιητές της νόσου. Δύο από αυτά τα γονίδια ο HIF-la και η gelsolin (GSN) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μοριακή μελέτη της δράσης τους στα πλαίσια της ΙΠΙ. Η υποξία, η έλλειψη δηλαδή οξυγόνου, μπορεί να τροποποιήσει την κυτταρική ομοιόσταση του κυψελιδικού επιθηλίου με την επαγωγή σημαντικών προστατευτικών αλλά και ανεπιθύμητων-βλαβερών λειτουργιών της επιθηλιακής λειτουργίας όπως η έκφραση του VEGF και η παραγωγή επιφανειοδραστικού παράγοντα (surfactant factor), η καταστροφή της ακεραιότητας του κυτταροσκελετού και η πυροδότηση της απόπτωσης, ενώ μπορεί να επάγει και διαδικασίες φλεγμονής. Ο HIF-la αναγνωρίζεται ως ο κυρίαρχος ρυθμιστικός παράγοντας της κυτταρικής υποξικής σήμανσης επάγοντας τη μεταγραφή γονιδίων στόχων τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που καθορίζουν την κυτταρική απάντηση στην υποξία. Χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοϊστοχημείας επιβεβαιώθηκε η αυξημένη έκφραση του HIF-la καθώς και σημαντικών γονιδίων στόχων του όπως το γονίδιο VEGF τους πνεύμονες ποντικών με ίνωση. Επιπλέον με τη χρήση ιστικών μικροσυστοιχιών ερευνήθηκε ο ρόλος του HIF-la και του γονιδίου-στόχου του p53 στους πνεύμονες ασθενών με ΙΠΙ, στους οποίους αυξημένη έκφραση του παράγοντα παρατηρήθηκε σε αποπτωτικά επιθηλιακά κύτταρα και όχι στις ινοβλαστικές εστίες, οι οποίες εμφανίστηκαν ανθεκτικές στην απόπτωση εν μέρει λόγω της αυξημένης έκφρασης του αντιαποπτωτικού παράγοντα bcl-2. Το παραπάνω πρότυπο έκφρασης του HIF-la δεν παρατηρήθηκε στην περίπτωση μιας άλλης ιδιοπαθούς διάμεσης πνευμονοπάθειας της COP, όπου αυξημένη έκφραση του παράγοντα βρέθηκε τόσο σε επιθηλιακά κύτταρα αλλά και σε περιοχές ενεργού ίνωσης (Masson bodies), γεγονός που μπορεί να εξηγήσει εν μέρει και τις διαφορές που εμφανίζουν τα δυο αυτά πρότυπα πνευμονικής ίνωσης τόσο όσον αφορά στην παθογένεια της νόσου όσο και στη διαφορετική κλινική πορεία, πρόγνωση και ανταπόκριση στη θεραπεία. Η GSN είναι μια πρωτεΐνη που ανήκει στην κατηγορία των δεσμευτικών πρωτεϊνών της ακτίνης και ρυθμίζει τη δομή του κυτταρικού σκελετού ενώ η δράση της έχει εμπλακεί στους μηχανισμούς της απόπτωσης που συμμετέχουν οι κασπάσες. Η έκφραση της έχει βρεθεί απορυθμισμένη σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό και την ικανότητα κίνησης των κυττάρων. Αυξημένη έκφραση της GSN βρέθηκε σε δείγματα πνευμονικού ιστού από ποντικούς με ίνωση στο ζωικό πειραματικό πρότυπο της ΙΠΙ. Γενετικά τροποποιημένοι ποντικοί ώστε να μη διαθέτουν το γονίδιο της GSN, παρουσιάστηκαν ανθεκτικοί έναντι στην ανάπτυξη πνευμονικής φλεγμονής και ίνωσης, γεγονός που αποδόθηκε στην ελαττωματική διήθηση του πνεύμονα από ουδετερόφιλα και στο μειωμένο ρυθμό απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων. Γενετική και κυτταρική ανάλυση των παθογενετικών μηχανισμών της νόσου, ανέδειξε την πρωτεολυτική διάσπαση της GSN από την κασπάση-3 ως δείκτη της απόπτωσης των κυψελιδικών κυττάρων και ως κύριο μηχανισμό υπεύθυνο για την ανάπτυξη πνευμονικής φλεγμονής και ίνωσης. Επιπλέον, η έκφραση της GSN μελετήθηκε και στους πνεύμονες ασθενών με διάφορες διάμεσες πνευμονοπάθειες όπως IPF, f-, c-NSIP, και COP, με τη χρήση ιστικών μικροσυστοιχιών. Η επιλεκτική έκφραση του μορίου από το κυψελιδικό επιθήλιο της IPF και της f-NSIP αλλά όχι και από αυτό της c-NSIP και COP, μπορεί να εξηγήσει ή ακόμα να προβλέψει τις διαφορές στην εξέλιξη της παθολογίας και την ανταπόκριση σε θεραπεία, που παρατηρούνται μεταξύ της IPF και της f-NSIP και της COP. Συγκεντρωτικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αποκαλύπτουν νέες πτυχές της βιολογίας του TNF στα πλαίσια της ΙΠΙ, διαχωρίζοντας τις ευεργετικές δράσεις της μεμβρανικής του μορφής από τις καταστρεπτικές συνέπειες της διαλυτής του μορφής, προτείνοντας την επιλεκτική στόχευση της τελευταίας σαν θεραπευτική προσέγγιση της ΙΠΙ, ενώ επιβεβαιώνουν ξεκάθαρα και για πρώτη φορά τη συμμετοχή της υποξίας και του HIF-la από τη μια μεριά και του κυτταρικού σκελετού και της GSN από την άλλη στην παθογένεια της ΙΠΙ, αναδεικνύοντας νέες προοπτικές για το σχεδίασμά καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών.