Time-Resolved Step-Scan FTIR μελέτη του κυτοχρώματος ba3 από το Thermus thermophilus και φασματοσκοπική μελέτη του συστήματος Fe/Bleomycin/DNA
Authors: Κουτσουπάκης Κωνσταντίνος 
Published: August 2021

Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η φασματοσκοπική μελέτη της τύπου ba3 κυτοχρωμικής c οξειδάσης από το βακτήριο Thermus thermophilus και του αντικαρκινικού συμπλόκου των bleomycins. Η ba3 κυτοχρωμική οξειδάση καταλύει την αναγωγή του μοριακού οξυγόνου Ο2 σε νερό Η2Ο και του μονοξειδίου του αζώτου ΝΟ σε μονοξείδιο του διαζώτου N2O. Το ενεργό κέντρο του μορίου περιλαμβάνει ένα διπυρηνικό κέντρο αίμης α3- CuB, ενώ επιπλέον δομική μονάδα αποτελεί και μία αίμη b. Χρησιμοποιώντας ως βασική φασματοσκοπική τεχνική την time-resolved step-scan FTIR και ως μοντέλο των βιολογικά ενεργών συμπλόκων τη δεσμευμένη με CO μορφή του ενζύμου, ανιχνεύσαμε και ταυτοποιήσαμε σημαντικές ιδιότητες του διπυρηνικού κέντρου οι οποίες παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε τέτοιου μεγέθους σύστημα. Η πλήρης μελέτη της δυναμικής του ενεργού κέντρου επιβεβαίωσε τον χαρακτηρισμό που είχε αποδωθεί παλαιότερα στο κυτόχρωμα ba3, ως ενζύμου με ιδιόμορφα χαρακτηριστικά, κατά την αλληλεπίδραση του με εξωγενείς υποκαταστάτες, ταυτόχρονα όμως άνοιξε τον δρόμο σε επόμενες μελέτες οι οποίες θα έχουν ως τελική κατάληξη την καλύτερη κατανόηση των φαινομένων δυναμικής, αλλά και των διαφορών στην δραστικότητα που επιδεικνύουν δομικά όμοιες ενώσεις, κατά την φυσιολογική καταλυτική τους λειτουργία. Οι bleomycins ανήκουν σε μία τάξη γλυκοπεπτιδικών, αντικαρκινικών, αντιβιοτικών παραγόντων και ως φυσικό προϊόν απομονώνονται από το βακτήριο Streptomyces verticillus. H ενδοκυτταρική τοξική τους δράση είναι αποτέλεσμα της ικανότητας δέσμευσης του σιδήρου Fe και της οξειδοαναγωγικής ενεργοποίησης του μοριακού οξυγόνου. Οι bleomycins πιστεύεται ότι ασκούν την βιολογική τους δράση μέσω της δέσμευσης και αποικοδόμησης του DNA, μία διαδικασία η οποία είναι εξαρτώμενη από το μεταλλικό ιόν και το οξυγόνο και οδηγεί στη διάσπαση τόσο του μονόκλωνου, όσο και του δίκλωνου DNA, με το τελευταίο να είναι το πιο σημαντικό βιολογικά γεγονός και να συμβαίνει επιλεκτικά στις θέσεις 5΄-GC ή 5΄-GT. Το ενεργό κέντρο του συμπλόκου περιλαμβάνει το μεταλλικό ιόν του σιδήρου το οποίο είναι συναρμοσμένο με πέντε άτομα αζώτου του μορίου των bleomycins. Με την χρήση της φασματοσκοπικής τεχνικής FTIR μελετήσαμε το δεσμευμένο με CO σύμπλοκο, μοντέλο του βιολογικά ενεργού μορίου, CO-Fe2+-BLM, παρουσία και απουσία DNA. Τα time-resolved step-scan FTIR πειράματα με 5 μs χρονική διακριτική ικανότητα δεν στάθηκαν ικανά να μας δώσουν πληροφορίες για το σύστημα μας, καθιστώντας αναγκαία την απόκτηση πειραματικής διάταξης με ns (10-9 s) χρονική ανάλυση. Με την χρήση της φασματοσκοπίας UV/Vis μελετήθηκε η αντίδραση του συμπλόκου Fe-BLM με το οξυγόνο Ο2, αλλά και το υπεροξείδιο του υδρογόνου Η2Ο2, παρουσία και απουσία του DNA, αλλά και παρουσία ολιγονουκλεοτιδίων συγκεκριμένης αλληλουχίας. Το επόμενο βήμα σε αυτή τη μελέτη αποτελούσε η time-resolved resonance Raman δονητική ανίχνευση των ενδιαμέσων των παραπάνω αντιδράσεων. Σημαντικά προβλήματα που είχαν να κάνουν με τη φύση του όλου συστήματος (ασθενής σκεδαστής και ανάγκη για εύρεση πηγής διέγερσης συγκεκριμένου μήκους κύματος στα 385 nm) κατέστησαν ανέφικτη την ουσιαστική πραγματοποίηση των time-resolved resonance Raman πειραμάτων με το αυτή την στιγμή διαθέσιμο laser διόδου (416 nm). Παράλληλα εμφανίστηκαν στην βιβλιογραφία resonance Raman εργασίες με βάση το σύμπλοκο Co-BLM, το οποίο όντας μη δραστικό απλά δεσμεύει το μόριο του οξυγόνου, χωρίς όμως να προχωράει στην κατάλυση του και στην παραγωγή των μικρού χρόνου ζωής ενδιαμέσων. Αυτό το γεγονός φυσικά διευκόλυνε την ανίχνευση των σχετιζόμενων με το Ο2 δονήσεων και έθεσε την πρώτη βάση δονητικού χαρακτηρισμού του συστήματος. Παρά ταύτα, σημαντικά ζητήματα πάνω στην βιολογικά ενεργή πορεία του συμπλόκου Fe-BLM (ανίχνευση ενδιαμέσων οξυγόνου, αλληλεπίδραση με το DNA, RNA) παραμένουν ανοικτά και προγραμματίζονται για το μέλλον, όταν η πρόσβαση σε laser μήκους κύματος εκπομπής 365-385 nm γίνει ευκολότερη (laser μίγματος αερίων Kr/Ar ή laser διόδου).