Ανάπτυξη προηγμένης τεχνολογίας για την ανίχνευση μεταλλάξεων και πολυμορφισμών σε DNA και RNA
Authors: Πούλου Μυρτώ 
Published: August 2021

Οι εξελίξεις στη γενομική και ο διαρκώς αυξανόμενος όγκος δεδομένων από τα προγράμματα ανάλυσης του γονιδιώματος, δημιουργούν την ανάγκη για την ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την μοριακή μελέτη των γονιδίων που εμπλέκονται στην εμφάνιση νοσημάτων. Ο σκοπός αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη και η προτυποποίηση μεθοδολογίας υψηλής τεχνολογίας για την ανίχνευση μεταλλάξεων και πολυμορφισμών στο επίπεδο του DNA. Επίσης λαμβάνοντας υπ’ όψιν τους γρήγορους ρυθμούς στους οποίους πρέπει να λειτουργεί ένα διαγνωστικό εργαστήριο, σκοπός αυτής της μελέτης ήταν και η ανάδειξη ενός αξιόπιστου αλγόριθμου με τον οποίο θα γίνεται η αξιολόγηση των αλλαγών που ανιχνεύονται για πρώτη φορά και το αντίκτυπο τους στην παραγόμενη πρωτεΐνη. ΜέθοδοιΧρησιμοποιώντας σαν μοντέλα δυο αυτοσωμικά υπολειπόμενα νοσήματα (κυστική ίνωση και Νόσος Wilson) σχεδιάστηκαν τρία διαφορετικά πρωτόκολλα για τις πλατφόρμες NanoChip400TM, Luminex xMAPTM και LightScanner. Η αρχή λειτουργίας της πλατφόρμας ΝanoChip400TM βασίζεται στον ηλεκτρονικό χειρισμό ηλεκτρικού πεδίου και αποτελεί ένα σύστημα ηλεκτρονικών μικροσυστοιχειών. Ο σχεδιασμός έγινε για το γονίδιο ATP7B. H αρχή λειτουργίας της πλατφόρμας Luminex xMAPTM είναι η κυτταρομετρία ροής και αποτελεί ένα σύστημα συστοιχιών με μικροσφαιρίδια. Ο σχεδιασμός έγινε για τα γονίδια CFTR και ATP7B. Η αρχή λειτουργίας της πλατφόρμας LightScanner είναι η αποδιάταξη του DNA με θέρμανση και αποτελεί ένα σύστημα ανάλυσης αποδιάταξης υψηλής ευκρίνειας. Ο σχεδιασμός έγινε για τα γονίδια CFTR και ATP7B.ΑποτελέσματαΜε τη πλατφόρμα NanoChip400TM ελέχθησαν 144 δείγματα νεογνών από την Κάλυμνο και την Κρήτη και ανιχνεύθηκαν 14 ετεροζυγώτες για την μετάλλαξη p.His1069Gln (6 με καταγωγή την Κάλυμνο και 8 με καταγωγή την Κρήτη), 2 ετεροζυγώτες για την μετάλλαξη p.Arg969Gln (με καταγωγή την Κρήτη) και 2 προσυμπτωματικοί ασθενείς με γονότυπο p.[His1069Gln] + [His1069Gln] (ομοζυγώτες για την μετάλλαξη με καταγωγή τη Κάλυμνο). Με τη πλατφόρμα Luminex xMAPΤΜ έγινε προσπάθεια ανίχνευσης των 50 συχνότερων μεταλλάξεων στο γονίδιο CFTR. Παρ’ όλες τις τροποποιήσεις δεν ήταν δυνατό να επιτύχουμε αποδεκτές τιμές για όλες τις μεταλλάξεις. Το ουσιαστικό αποτέλεσμα όμως ήταν πως ο σχεδιασμός που είχε γίνει ήταν σωστός και γι’ αυτό τον λόγο χρησιμοποιήθηκε, εν μέρει από την εταιρία Luminex® για το kit xTAG Cystic Fibrosis 71 kit v2 το οποίο κυκλοφόρησε στην αγορά τον Ιούνιο 2009. Για το γονίδιο ATP7B, ο σχεδιασμός αποδείχθηκε σωστός και επετεύχθη γονοτύπιση των 100 δειγμάτων που αναλύθηκαν για τις 26 συχνότερες μεταλλάξεις. Με τη πλατφόρμα LightScanner στη φάση της πρωτυποποίησης ελέγχθηκαν 100 δείγματα με γνωστούς γονοτύπους και 100 τυφλά δείγματα για κάθε νόσημα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα βάσει των πειραμάτων υπολογίστηκε στο 100%. Επίσης πρωτυποποιήθηκε ένα πρωτόκολλο για προγεννητική και ένα για προεμφυτευτική γενετική διάγνωση. ΣυζήτησηΟ έλεγχος που παρέχει ένα εργαστήριο γενετικής, όταν λειτουργεί ως εργαστήριο αναφοράς για κάποιο νόσημα, θα πρέπει να ανιχνεύει το μεγαλύτερο δυνατό ποσοστό μεταλλάξεων. Αυτή η διαπίστωση αποκτάει ιδιαίτερο νόημα όταν αναφερόμαστε σε ένα γενετικό νόσημα με υψηλό βαθμό μοριακής ετερογένειας στον πληθυσμό ελέγχου. Η καταλληλότερη μέθοδος, από τις τρείς διαφορετικές που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια αυτής της διατριβής, είναι η υψηλής ευκρίνειας ανάλυση αποδιάταξης καθώς μπορεί να εφαρμοστεί χωρίς να χρειάζεται πρότερη γνώση της γενετικής σύστασης του πληθυσμού ελέγχου και με υψηλή αξιοπιστία να επιτύχουμε το υψηλότερο δυνατό ποσοστό ανίχνευσης.