Μελέτη των cis και trans παραγόντων που συμμετέχουν στην κοινή μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων κυτταροκινών και του ιού HIV-1
Authors: Αναστασοπούλου Σπυριδούλα 
Published: February 2024

Η λοίμωξη από τον ίο HIV-1 χαρακτηρίζεται από χρόνια ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και ανεξέλεγκτο ιϊκό πολλαπλασιασμό που οδηγεί σταδιακά σε μείωση των CD4+ T helper (Th) βοηθητικών κυττάρων. Παρά την αντιρετροϊκή θεραπεία που λαμβάνουν οι ασθενείς, μελέτες δείχνουν πως δεν υπάρχει πλήρης εξάλειψη του ιού, δημιουργώντας έτσι ένα «ιϊκό απόθεμα», εκεί όπου ο ιός παραμένει σε καταστολή ώσπου να δοθεί το κατάλληλο σήμα για την μεταγραφική ενεργοποίησή του. Αμέσως μετά την ένθεση του ιού στο γονιδίωμα μια σειρά cis στοιχείων και trans παραγόντων ρυθμίζουν την μεταγραφή του. Μελέτες δείχνουν πως τόσο κυτταρικοί όσο και ιϊκοί μεταγραφικοί παράγοντες, DNA μεθυλιώσεις, η κατάσταση στην οποία βρίσκεται η χρωματίνη αλλά και μετά -μεταφραστικές τροποποιήσεις διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παραμονή του ιού σε μεταγραφική καταστολή η οποία σχετίζεται με χρόνια ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και τη φλεγμονή. Μια από τις σημαντικότερες επιδράσεις της χρόνιας λοίμωξης από τον ιό είναι η διαταραχή στην έκφραση πολλών κυτταροκινών όπως είναι η IL-2, κυτταροκίνη που εκφράζεται από τα παρθενικά Τ κύτταρα αμέσως μετά την έκθεση στον ιό. Η έκφραση της IL-2 έχει βρεθεί να μειώνεται σε ασθενείς που φέρουν τον ιό, ενώ έχει επιβεβαιωθεί και σε Τ λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Jurkat που φέρουν ένα τμήμα ή ολόκληρο το γονιδίωμα του ιού. Η παραγωγή της IL-2 είναι ένας δείκτης ενεργοποίησης των Τ κυττάρων μέσω του TCR μονοπατιού και έτσι η διαφορική έκφραση της σχετίζεται μη επαρκή ανάπτυξη και διαφοροποίηση λεμφοκυττάρων, μονοκυττάρων και μακροφάγων, καθώς και ανεπαρκή ιϊκή αναπαραγωγή. Για τον λόγο αυτό η ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 είναι απαραίτητη για την έκφραση του ιού όσο και για την εδραίωση της κατάστασης σίγασης του ιού.Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της πιθανής αλληλεπίδρασης του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1 LTR και κατά πόσο αυτή είναι υπεύθυνη για μια στοχαστική διαδικασία στην έκφραση του ιού και της IL-2, αλλά και κατά πόσο ο παράγοντας Ets-2 εμπλέκεται σε αυτό. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν Τ λευχαιμικές κυτταρικές σειρές που φέρουν είτε ένα αντίγραφο του ιικού γονιδιώματος (Jurkat-Lat), είτε το HIV-1 LTR (Jurkat-LTRG), είτε τίποτα από τα παραπάνω (Jurkat). Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε παρουσία ή απουσία μιτογόνων για 6h και ακολούθως καθορίστηκαν τα επίπεδα mRNA των IL-2, Ets-2, HIV1-Tat και LTR-GFP με qPCR. Επιβεβαιώσαμε την αυξημένη έκφραση της IL-2 σε κύτταρα παρουσία μιτογόνων αλλά και την μείωση στην έκφραση του παράγοντα Ets-2 κυτταρικές σειρές Jurkat and Jurkat-Lat. Στη συνέχεια ελέγχθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης η πρόσδεση άμεσα ή έμμεσα των παραγόντων αυτών στα ρυθμιστικά στοιχεία της IL-2 και του HIV-1. Παρατηρήσαμε πρόσδεση του Ets-2 στις αλληλουχίες ARRE-1/TATA, ARRE-2 και RATS σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Παράλληλα, παρατηρήθηκε διαφοροποίηση στην πρόσδεση της RNA Pol II στα ίδια ρυθμιστικά στοιχεία. Επιπλέον, η παρουσία του HIV-1 Tat στις ίδιες λειτουργικές περιοχές, μας οδήγησε στον έλεγχο για πιθανή αλληλεπίδραση των παραγόντων Ets-2 και HIV-1 Tat, καθώς ο HIV-1 Tat δεν έχει την ικανότητα πρόσδεσης σε περιοχές DNA. Η αλληλεπίδραση των δύο παραγόντων επιβεβαιώθηκε με πειράματα συγκατακρήμνισης πρωτεΐνης, ενώ αντίστοιχα ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση του παράγοντα HIV-1 Tat με τον NFAT2, χωρίς ωστόσο να υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Τέλος, επιβεβαιώθηκε η αρχική μας υπόθεση για γειτνίαση στον πυρήνα του κυττάρου του υποκινητή της IL-2 με το HIV-1 LTR στα J-Lat κύτταρα και σε συνθήκες ηρεμίας μόνο, πραγματοποιώντας πειράματα 3C (Chromosome conformation capture). Οι δύο ρυθμιστικές περιοχές βρίσκονται σε κοντινή απόσταση, όταν αυτά βρίσκονται σε ηρεμία αλλά όχι στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Αντίστοιχη αλληλεπίδραση δεν φάνηκε να υπάρχει στα J-LTRG κύτταρα σε καμία συνθήκη, στα οποία δεν εκφράζεται ο παράγοντας HIV-1 Tat. Πιθανόν οι δύο περιοχές να βρίσκονται σε εγγύτητα λόγω της αλληλεπίδρασης των παραγόντων Ets-2 και HIV-1 Tat, όπως προκύπτει από τα πειράματα 3C σε κύτταρα J-LTRG που εκφράζουν παροδικά τον Tat. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας έδειξαν ότι ο Tat παρεμποδίζει την RNA Pol II να προσεγγίσει τον υποκινητή της IL-2 και να ξεκινήσει τη μεταγραφή του γονιδίου με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκφραση της IL-2. Σε συνθήκες ηρεμίας των κυττάρων υπάρχει κοινή ρύθμιση της IL-2 και του HIV-1 μέσω 3D αλληλεπιδράσεων σε επίπεδο χρωματίνης ανάμεσα στον υποκινητή της IL-2 και το HIV-1-LTR, που διαταράσσεται μετά την επαγωγή των κυττάρων. Η χρωμοσωμική αυτή αλληλεπίδραση παύει να υφίσταται όταν μειώνεται η έκφραση του Ets-2, δηλαδή όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται. H τρισδιάστατη αυτή δομή μεταξύ του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1-LTR με την συμμετοχή των Tat και Ets-2 μπορεί να εξηγήσει την συνρύθμιση των IL-2 και HIV-1.