Πυρηνικοί πολυεδρικοί ιοί λεπιδοπτέρων εντόμων
Authors: Ιωαννίδης Κωνσταντίνος 
Published: September 2021

Οι πυρηνικοί πολυεδρικοί ιοί των λεπιδοπτέρων εντόμων ανήκουν στην οικογένεια των βακτροϊών (baculoviruses), οι οποίοι αποτελούν παθογόνους παράγοντες με γονιδίωμα κλειστού κυκλικού δίκλωνου DNA μεγέθους 80-180 kb και προσβάλλουν αποκλειστικά αρθρόποδα και κυρίως λεπιδόπτερα έντομα. Οι βακτροϊοί που προσβάλλουν τα λεπιδόπτερα Bombyx mori και Autographa californica έχουν μελετηθεί σε βάθος και αποτελούν μοντέλα για τη βιολογία της πλειονότητας των βακτροϊών, τις λεπτομέρειες του ιικού κύκλου ζωής και τις επιπτώσεις της μόλυνσης των ξενιστών τους. Επιπλέον, γενετικά τροποποιημένοι βακτροϊοί χρησιμοποιούνται ως βιοτεχνολογικά εργαλεία, κυρίως για παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Η χρησιμοποίησή τους για την εφαρμογή αυτή έχει εδραιωθεί εδώ και δεκαετίες, επειδή τα βακτροϊικά συστήματα έκφρασης μπορούν να παράγουν πληθώρα πρωτεϊνών με υψηλή απόδοση. Σημειώνεται όμως ότι οι βακτροϊοί, που διατηρούν μία λυτική φάση στον κύκλο ζωής τους, παρεμποδίζουν τους κυτταρικούς μηχανισμούς μετα-μεταφραστικής τροποποίησης και έκκρισης των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τα αντίστοιχα συστήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών να παρουσιάζουν μειωμένη απόδοση για συγκεκριμένες κατηγορίες πρωτεϊνών. Επιπλέον, η παθογονικότητα των λυτικών συστημάτων περιορίζει τη χρονική διάρκεια ωφέλιμης λειτουργίας τους λόγω του αναπόφευκτου κυτταρικού θανάτου. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η γενετική τροποποίηση του βακτροϊού BmNPV (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus), που προσβάλει αποκλειστικά το μεταξοσκώληκα (Bombyx mori), με στόχο τη δημιουργία ιού που θα μολύνει κύτταρα-ξενιστές χωρίς να προκαλεί ενεργή παθολογία και θάνατο και θα διατηρεί παράλληλα ακέραια την ικανότητα του να αναπαράγεται. Τα παραπάνω χαρακτηριστικά θα μπορούσαν να αποτελέσουν τη βάση για ένα νέο βακτροϊικό σύστημα έκφρασης που θα πλεονεκτεί έναντι άλλων βακτροϊικών συστημάτων παραγωγής, διότι θα επιτρέπει τη διατήρηση των μηχανισμών σύνθεσης, τροποποίησης και έκκρισης πρωτεϊνών του ξενιστή, ενώ ο ιός θα αντιγράφεται, παρέχοντας υψηλά επίπεδα γονιδιωμάτων, συνεπώς και ανασυνδυασμένων γονιδίων, για αποδοτική έκφραση της επιλεγμένης πρωτεΐνης. Ο τροποποιημένος ιός κατασκευάστηκε με την τεχνολογία βακμιδίου, η οποία επιτρέπει τη διατήρηση, αναπαραγωγή και τροποποίηση του ιικού γονιδιώματος σε βακτήρια. Βασίστηκε στην απομάκρυνση της κωδικής περιοχής ενός σημαντικού γονιδίου, του lef8, που κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της ιικής RNA πολυμεράσης. Στα πλαίσια της δημιουργίας του ελλειμματικού βακμιδίου (βακμίδιο Δlef8) κατασκευάστηκαν πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης της φυσικής και αμινοτελικά σημασμένης πρωτεΐνης LEF8 με επίτοπο Myc, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη διάσωση του ελλειμματικού βακμιδίου μέσω εξωγενούς/ εξωιικής παροχής LEF8. Προηγούμενες εργασίες και επιπλέον δοκιμές στα πλαίσια της παρούσας μελέτης είχαν δείξει ότι για την εξασφάλιση της σταθερότητας του Δlef8 ήταν αναγκαία η αφαίρεση ολόκληρης της κωδικής περιοχής του lef8, καθώς και η χρησιμοποίηση ετερόλογων αλληλουχιών υποκινητή και αλληλουχίας πολυαδενυλίωσης στους φορείς διάσωσης: η διατήρηση ομόλογων περιοχών, ανάμεσα στο γονιδίωμα του ελλειμματικού ιού/βακμιδίου και στους φορείς έκφρασης του γονιδίου lef8 στα κύτταρα-ξενιστές, οδηγούσε σταθερά στην απώλεια της μετάλλαξης με επιστροφή ενός λειτουργικού γονιδίου lef8 στον ιό μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού.Ο φαινότυπος του ελλειμματικού βακμιδίου, που δεν μπορούσε να παράγει την πρωτεΐνη LEF8, εμφάνισε τα επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως η διακοπή του κύκλου ζωής του ιού μετά τη φάση αντιγραφής του DNA του και η απουσία εμφανών επιπτώσεων σε διαμολυσμένα κύτταρα-ξενιστές σε ό,τι αφορούσε στη γενικότερη λειτουργικότητα και βιωσιμότητά τους. Όμως, η διάσωση του ελλειμματικού ιού μόνο με εξωγενή χορήγηση της πρωτεΐνης LEF8 δεν ήταν εφικτή. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η αφαίρεση της κωδικής περιοχής του lef8 επηρέαζε τη λειτουργία του γειτονικού και επίσης σημαντικού γονιδίου orf40. Κωδικές περιοχές από γονίδια ομόλογα του lef8, καθώς και χιμαιρικά γονίδια lef8, που περιείχαν ετερόλογες αλληλουχίες υποκινητή και αλληλουχίες πολυαδενυλίωσης, εισήχθησαν στο γενετικό τόπο lef8 ως αντικαταστάτες της κωδικής περιοχής του lef8 για τη διερεύνηση των προϋποθέσεων διάσωσης του ελλειμματικού βακμιδίου. Τα ενθέματα δοκιμάστηκαν στη φυσική ή αντίστροφη φορά ενσωμάτωσης σε σχέση με την κατεύθυνση της κωδικής περιοχής του lef8 αγρίου τύπου. Επιπλέον, τα χιμαιρικά γονίδια lef8 δοκιμάστηκαν και σε άλλες, εκτοπικές θέσεις στο βακμιδιακό γονιδίωμα. Συνολικά, διαπιστώθηκε ότι η παροχή αλληλουχιών υποκινητή για το γονίδιο orf40 είναι απαραίτητη για τη διάσωση του ελλειμματικού βακμιδίου, γεγονός που αποδεικνύει ότι σημαντικές αλληλουχίες ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου orf40 βρίσκονται στην κωδική περιοχή του γονιδίου lef8. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η έκφραση και των δύο πρωτεϊνών – LEF8 και ORF40 – μπορεί να γίνει αποτελεσματικά από ετερόλογους υποκινητές και ετερόλογες αλληλουχίες πολυαδενυλίωσης και μάλιστα και με τα δύο χιμαιρικά γονίδια σε διαφορετικές, μη συνδεδεμένες θέσεις του ιικού γονιδιώματος. Με βάση τα παραπάνω στοιχεία, κατασκευάστηκε ένα νέο ελλειμματικό βακμίδιο lef8 που χρησιμοποιεί τον υποκινητή του γονιδίου της κυτταροπλασματικής ακτίνης του μεταξοσκώληκα για να ρυθμίζει την ενεργότητα του γονιδίου orf40 και την παραγωγή της πρωτεΐνης ORF40. Το νέο βακμίδιο διασώζεται με εξωγενή χορήγηση της πρωτεΐνης LEF8 σε κύτταρα διάσωσης, που εκφράζουν παροδικά ένα χιμαιρικό γονίδιο lef8. Με αυτό τον τρόπο, δεν παρέχεται στον ελλειμματικό βακτροϊό η δυνατότητα να μεταλλάσσεται στα κύτταρα διάσωσης σε ιό φυσικού τύπου μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Σε κύτταρα που δεν εκφράζουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη LEF8, ο ελλειμματικός βακτροϊός εμφανίζει τον επιθυμητό μη παθογόνο φαινότυπο για τα κύτταρα-ξενιστές. Έχουν επιπλέον σχεδιαστεί βελτιωμένα συστήματα διάσωσης των ελλειμματικών βακμιδίων, που θα αυξήσουν την απόδοση παραγωγής των ελλειμματικών ιοσωμάτων. Η παρούσα διατριβή έδειξε ότι είναι εφικτή η παραγωγή ενός βακτροϊού μη παθογόνου για κύτταρα-ξενιστές, που διατηρεί την ικανότητα αντιγραφής του γενετικού του υλικού. Επιπλέον, μέσω αυτής της μελέτης επιτεύχθηκε η παραγωγή ελλειμματικών ιοσωμάτων, που διατηρούν τον μεταλλαγμένο φαινότυπο κατά τη διάσωση. Ο νέος βακτροϊικός φορέας έχει τη δυνατότητα να αποτελέσει τη βάση για ένα καλύτερο σύστημα, σε σχέση με τα προϋπάρχοντα βακτροϊικά συστήματα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.