Μελέτες πάνω στην παθολογία και ανοσολογία στο κοινό χταπόδι (Octopus vulgaris Cuvier, 1797)
Authors: Γουάιτ Ντανιέλλα-Μαρί 
Published: December 2023

Το κοινό χταπόδι, Οctopus vulgaris G., λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών που το διακρίνουν, και σε συνδυασμό με την ανάγκη διαφοροποίησης της υδατοκαλλιέργειας για την επίτευξη βιώσιμης ανάπτυξής της στο μέλλον, θεωρείται καλός υποψήφιος για τη βιομηχανία της. Μία από τις προϋποθέσεις για την επιτυχή ένταξη νέων ειδών σε παραγωγή βιομηχανικής κλίμακας, είναι η γνώση των παθολογικών καταστάσεων που μπορεί να προκύψουν, με έμφαση στις λοιμώδεις νόσους που προκαλούνται από μικροοργανισμούς και παράσιτα μεταδιδόμενα μέσω άγριων πληθυσμών, και ειδικά για τους εκτρεφόμενους οργανισμούς που καλλιεργούνται σε κλουβιά κοντά σε αυτά των ιχθύων. Οι μολυσματικές ασθένειες στην υδατοκαλλιέργεια θα μπορούσαν να σχετιστούν με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας και νοσηρότητας, με αποτέλεσμα αρνητικές επιπτώσεις στη βιομηχανία της ιχθυοκαλλιέργειας, στους καταναλωτές και στο περιβάλλον. Τα χταπόδια εκτρέφονται κοντά σε περιοχές εκτροφής θαλάσσιων ιχθύων, και αυτό μπορεί να αποτελεί σημαντικό κίνδυνο, καθώς τα παθογόνα των ιχθύων πιθανόν να προκαλέσουν παθολογίες στα χταπόδια. Μέχρι σήμερα, η ανοσολογία και οι παθολογίες που μπορεί να προκύψουν στο χταπόδι δεν είναι πλήρως μελετημένες κατά συνέπεια να υπάρχουν πολλά κενά. Ως εκ τούτου, η κεντρική ιδέα της διδακτορικής διατριβής, στηρίζεται στη διερεύνηση της ευαισθησίας του κοινού χταποδιού σε παθογόνα βακτήρια (Photobacterium damselae subsp. piscicida - Phdp ή Photobacterium damselae subsp. damselae - Phdd ή Vibrio alginolyticus - VA ή Vibrio anguillarum O1 - VAO1) των ιχθύων μετά από πειραματικές μολύνσεις, ενδομυϊκά ή ενδοφλέβια. Για τον σκοπό αυτό αξιολογήθηκε η κυτταρομεσολαβούμενη άμυνα και η απόκριση μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου του Octopus vulgaris διά της μελέτης ενεργοποίησης των αιμοκυττάρων και της ικανότητας φαγοκυττάρωσής τους μετά από προκαλούμενη μόλυνση. Ακολούθησε η μελέτη των διαλυτών συστατικών της αιμολέμφου και της δράσης τους απέναντι στα παθογόνα. Παράλληλα, διερευνήθηκε η συσχέτιση της ευαισθησίας με αλλαγές της θερμοκρασίας, την οδό μόλυνσης, και τον χρόνο μετά από αυτήν. Προσδιορίστηκαν επίσης οι συσχετίσεις μεταξύ αιμοκυττάρων και σωματικού βάρους και μεταξύ αιμοκυττάρων και της ικανότητας φαγοκυττάρωσης. Με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους διερευνήθηκε ο εντοπισμός αντιγόνου στους ιστούς από πλοκάμι, βραγχιακές καρδιές, πεπτικό αδένα-συκώτι, νεφρό και λευκό σώμα, και με ιστολογική μέθοδο μελετήθηκε η τυχόν μεταβολή στη δομή τους. Οι πειραματισμοί πραγματοποιήθηκαν σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (21 ± 0,5 ◦C και 24 ± 0,5 ◦C) σε μια προσπάθεια να συσχετιστούν αυτές οι πτυχές με την κλιματική αλλαγή. Η αιμολέμφος λήφθηκε σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία, την ημέρα 0, 3 κα 7 μετά την μόλυνση και αυθημερόν προσδιορίστηκε ο αριθμός των κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων και η φαγοκυτταρική δραστηριότητά τους. Το υπόλοιπο της αιμολέμφου διαχωρίστηκε από τα αιμοκύτταρα και φυλάχθηκε στους -85℃ μέχρι τη χρήση της για τη μελέτη της άμυνας μέσω των διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου, με τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της ελεύθερης αιμοκυττάρων αιμολέμφου, όσον αφορά τη λυσοζύμη, τις πρωτεΐνες, την αιμόλυση, την πρωτεόλυση, την αντιβακτηριαδιακή δράση και την αιμοσυγκόλληση. Την ημέρα 7, συλλέχθηκαν επίσης και οι ιστοί από τα όργανα μελέτης, και μετά από τουλάχιστον 24ωρη μονιμοποίησή τους μελετήθηκαν με ανοσοϊστοχημικές και ιστολογικές αναλύσεις. Δεν καταγράφηκαν θνησιμότητες σχετιζόμενες με το παθογόνο, την οδό μόλυνσης και τη θερμοκρασία. Οι συγκεντρώσεις των κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων παρουσίασαν ατομική μεταβλητότητα στις ομάδες ελέγχου και πρόκλησης σχετιζόμενη με εξωγενείς και ενδογενείς παράγοντες σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του βάρους των χταποδιών και της συγκέντρωσης κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων δεν έδειξε συσχέτιση. Πιθανόν φυσικές διακυμάνσεις όπως για παράδειγμα η ηλικία, το στάδιο αναπαραγωγής και η θερμοκρασία μπορεί να επηρεάζουν αυτή τη σχέση, όπως αναφέρεται βιβλιογραφικά. Επιπλέον, τα αποτελέσματά έδειξαν ότι ο χρόνος μετά την πρόκληση, η οδός πρόκλησης και το παθογόνο μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα φαγοκυττάρωσης. Η επίδραση που σχετίζεται με το παθογόνο στην ικανότητα φαγοκυττάρωσης μπορεί να συσχετιστεί με συγκεκριμένους παράγοντες λοιμογόνου δράσης/στρατηγικές μόλυνσης που χρησιμοποιεί κάθε παθογόνο για να επιτύχει μια μόλυνση. Τα αποτελέσματα ώθησαν προς το να υπολογιστεί ο δείκτης ενεργοποίησης. Αυτός ο δείκτης έδειξε ότι η θερμοκρασία είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την ενεργοποίηση των αιμοκυττάρων αφού οι ομάδες πρόκλησης με τα βακτήρια Phdp, Phdd και VAO1 ενεργοποιήθηκαν περισσότερο στη χαμηλότερη θερμοκρασία 21 ±0,5℃ αντί στους 24 ± 0,5℃. Το αντίθετο παρατηρήθηκε στις ομάδες πρόκλησης με VA, και μόνο αργότερα μετά τη μόλυνση. Ο προτεινόμενος δείκτης AI μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο υπολογισμού ενεργοποίησης των αιμοκυττάρων και πιθανόν στο μέλλον να εφαρμοστεί ως βιοδείκτης υγείας του κοινού χταποδιού ή άλλων κεφαλόποδων. Η εποχικότητα δεν βρέθηκε να συσχετίζεται με καμία δραστηριότητα απόκρισης μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου εντούτοις, εξωγενείς και ενδογενείς παράμετροι την επηρεάζουν. Η άμυνα μέσω των διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου του κοινού χταποδιού, μελετώμενη μέσω της δράσης της λυσοζύμης στην αιμολέμφο, στο πλείστο των περιπτώσεων, στην ομάδα ενδομυϊκής πρόκλησης ΙM, παρουσίασε μεγαλύτερη ή σταθερή αποτελεσματικότητα έναντι της ομάδας ενδοφλέβιας πρόκλησης IV. Η συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης στην αιμολέμφο φαίνεται να καθορίζεται από το ίδιο το παθογόνο, καθώς παρόμοια μοτίβα παρατηρήθηκαν όταν μελετήθηκαν παθογόνα του ίδιου γένους. Η αναφορά της παρούσας διατριβής στην αιμολυτική δραστηριότητα ελεύθερης αιμολέμφου του O. vulgaris πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά και βρέθηκε να κυμαίνεται σε χαμηλά επίπεδα σε σχέση με τους ιχθύες. Η αιμολυτική δραστηριότητα της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος μπορεί να επηρεαστεί από την οδό, το χρόνο μετά την πρόκληση και τη θερμοκρασία. Η μέγιστη δραστηριότητα παρατηρήθηκε σε δείγματα IM πρόκλησης, αποδεικνύοντας ότι η οδός μόλυνσης μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο. Η πρωτεολυτική δράση της αιμολέμφου εξαρτάται από τον χρόνο μετά την έκθεση στο παράγοντα πρόκλησης του ανοσοποιητικού συστήματος του κοινού χταποδιού. Η μέτρηση της πρωτεολυτικής και αντιπρωτεολυτικής δράσης της αιμολέμφου πρέπει να πραγματοποιείται τις πρώτες 48 ώρες μετά την πρόκληση και όχι αργότερα. Οι μέθοδοι διερεύνησης της αντιβακτηριδιακής δράσης της αιμολέμφου δεν έδωσαν μετρήσιμη αντίδραση. Διερεύνηση της δραστηριότητας σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα αντί άγαρ θα πρέπει εξίσου να δοκιμαστεί. Κατά τον προσδιορισμό της αιμοσυγκόλλησης μέσω λεκτίνων στην ελεύθερη αιμοκυττάρων αιμολέμφο παρατηρήθηκε μετρήσιμη αιμοσυγκολλητική δράση μόνο κατά τη χρήση φρέσκιας αιμολέμφου παρουσίας αιμοκυττάρων. Μελλοντικά θα πρέπει να πραγματοποιηθεί περαιτέρω διερεύνηση. Αποικίες βακτηρίων δεν εντοπίστηκαν σε κανένα ιστό μελέτης. Φαίνεται ότι γίνεται απομάκρυνση των βακτηριακών κυττάρων νωρίτερα των 7 ημερών μετά την πρόκληση, που έγινε η λήψη των δειγμάτων, καθώς αντιγόνα εντοπίστηκαν σε αρκετές περιπτώσεις. Η ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση του ιστού από πλοκάμι οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα βακτήρια VA και VAO1 μπορούν να αναφερθούν ως παθογόνα με τοξική δράση προς το χταπόδι σε οποιαδήποτε θερμοκρασία. Στις βραγχιακές καρδιές η απομάκρυνση των παθογόνων και των τοξικών ουσιών τους γίνεται νωρίτερα του χρόνου των 7 ημερών. Στο νεφρό φαίνεται ότι η οδός εισόδου ενός παθογόνου παίζει καθοριστικό ρόλο όπως και το ίδιο το παθογόνο και η θερμοκρασία. Στο λευκό σώμα οι περιπτώσεις εντοπισμού αντιγόνων παρουσιάστηκαν μόνο σε αγγεία, δείχνοντας ότι τα αντιγόνα βρίσκονται στην κυκλοφορία και όχι στο όργανο. Προφανώς τα αιμοκύτταρα δρουν άμεσα, καθαρίζοντας από τον εισβολέα το αιμοποιητικό όργανο. Τα παθογόνα δημιούργησαν αλλαγές στη δομή του φυσιολογικού ιστού των βραγχίων. Αντιγόνα εντοπίστηκαν σε αρκετές περιπτώσεις επιβεβαιώνοντας τις αναφορές ότι τα βράγχια είναι πρωταρχικός σταθμός καθαρισμού ξένων σωματιδίων από την κυκλοφορία. Ο πεπτικός αδένας-συκώτι, εμπλέκεται στην κάθαρση λοιμογόνων παραγόντων. Εντοπισμός αντιγόνων αλλά και έντονης εναπόθεσης λιποφουσκίνης στα κύτταρα παρατηρήθηκε σε σχεδόν όλες τις περιπτώσεις. Λιποφουσκίνη εντοπίστηκε και στους φυσιολογικούς ιστούς όπου ερμηνεύεται ως σημάδι γήρανσης των οργανισμών.Η παρούσα μελέτη παρέχει τιμές αναφοράς για ορισμένους ανοσολογικούς δείκτες της αιμολέμφου του Octopus vulgaris, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως χρήσιμο εργαλείο για την καθιέρωση του είδους στην υδατοκαλλιέργεια και την καλύτερη κατανόηση της ανοσοποιητικής κατάστασης των κεφαλόποδων στη φύση, παράλληλα με την κλιματική αλλαγή και συνεπώς την άνοδο της θερμοκρασίας. Ας ελπίσουμε ότι τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούν να συμβάλουν σε περαιτέρω έρευνα σχετικά με την άμυνα μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου, στα κεφαλόποδα και συγκεκριμένα στο Octopus vulgaris, όπως απαιτείται για την καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ των περιβαλλοντικών παραλλαγών και τη βελτίωση της γνώσης μας σχετικά με την απόκριση των κεφαλόποδων στην αύξηση της θερμοκρασίας στον απόηχο μιας παγκόσμιας θέρμανση.