Αναστολή της έκφρασης γονιδίων που ενέχονται στην οστεοαρθρίτιδα
Authors: Ορφανίδου Τιμόκλεια 
Published: August 2021

Η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί την πιο κοινή νόσο των αρθρώσεων με μεγαλύτερη επίπτωση σε ηλικίες άνω των 60 ετών. Είναι μία πάθηση που επηρεάζει όλα τα στοιχεία της άρθρωσης κυριότερα όμως τον αρθρικό χόνδρο και που μπορεί να εμφανιστεί σε όλες τις αρθρώσεις με πλέον συχνή εμφάνιση στο χέρι, το πόδι, το γόνατο, τη σπονδυλική στήλη και το ισχίο. Θεωρείται μια πολυπαραγοντική νόσος, στην εμφάνιση και εξέλιξη της οποίας έχει βρεθεί ότι είναι σημαντική η συνεισφορά γενετικών παραγόντων. Η φυσιολογική πορεία της διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων στην αναπτυξιακή πλάκα περιλαμβάνει τα στάδια του πολλαπλασιασμού, της υπερτροφίας και τελικά τον κυτταρικό θάνατο. Το προϊόν της διαφοροποίησης και ωρίμανσης των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας, είναι ο ανθεκτικός, μόνιμος χόνδρος ενήλικα ατόμου. Τα χονδροκύτταρα του μόνιμου χόνδρου, φυσιολογικά, δεν υφίστανται πολλαπλασιασμό ή υπερτροφική διαφοροποίηση και δεν αποπίπτουν σε αντίθεση με τα χονδροκύτταρα της αναπτυξιακής πλάκας. Παρόλα αυτά, στην οστεοαρθρίτιδα, παρατηρούνται αλλαγές στο προφίλ των χονδροκυττάρων που προσομοιάζουν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας. Συγκεκριμένα, παρατηρείται επανεκκίνηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και υπερτροφική διαφοροποίηση, στα πλαίσια της οποίας πρωταγωνιστούν ποικίλοι μεταγραφικοί και αυξητικοί παράγοντες, ένζυμα, ορμόνες και κυττοκίνες. Η υπερτροφία στην ΟΑ συνδέεται και με άλλες φαινοτυπικές μεταβολές, όπως την επασβέστωση του χόνδρου και έχει βρεθεί ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της επασβέστωσης του χόνδρου, της κλινικής διαβάθμισης της νόσου και της έκφρασης του κολλαγόνου τύπου X, δείκτη χαρακτηριστικού της υπερτροφίας.Σημαντικό ρόλο στην υπερτροφία των χονδροκυττάρων διαδραματίζει η 1,25(ΟΗ)2D3, η οποία αποτελεί τον ενεργό μεταβολίτη της βιταμίνης D. Η 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω σύνδεσής της με τον ειδικό υποδοχέα VDR συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην υπερτροφία και την επασβέστωση του ΟΑ χόνδρου. Επιπλέον, η 1,25(ΟΗ)2D3 συμβάλει στη δημιουργία υπερτροφικών χονδροκυττάρων, κυρίως κοντά στις περιοχές του χόνδρου που έχουν επασβεστωθεί, και στο σχηματισμό μεμβρανικών κυστιδίων, πλούσια σε Pi και Ca2+, στην εξωκυττάρια ουσία (ECM). Τα τελευταία οδηγούν στο σχηματισμό κρυστάλλων ασβεστίου (CPPD, BCP) οι οποίοι διαβρώνουν το χόνδρο και σχετίζονται με την εξέλιξη της ΟΑ. Στη διαδικασία της υπερτροφίας και της επασβέστωσης του χόνδρου συμμετέχει επιπλέον ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (FGF23), ο οποίος αποτελεί έναν φωσφατουρικό παράγοντα που επάγει την πρόωρη μετατροπή των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας σε υπερτροφικά. Ο FGF23 προσδένεται σε ειδικούς υποδοχείς FGFRs και ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια στα κύτταρα στόχους. Ιδιαίτερα, η πρόσδεση του FGF23 στον υποδοχέα FGFR1c προκαλεί την ενεργοποίηση του μονοπατιού των MAP-κινασών στα χονδροκύτταρα. Όσον αφορά στη λειτουργία του, συμμετέχει στη διατήρηση της ομοιοστασίας των ιόντων Ca2+/Pi και στη ρύθμιση του μεταβολισμού της 1,25(ΟΗ)2D3, μέσω καταστολής της δραστηριότητα της 1α-υδροξυλάσης στους νεφρούς. Ο FGF23 εμφανίζει αυξημένη έκφραση σε κύτταρα τα οποία επασβεστώνουν την ECM, όπως οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα, και η έκφρασή του διαφοροποιείται πριν και μετά την επασβέστωση. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της υπερτροφίας και της επασβέστωσης διαδραματίζουν επιπλέον τα αυξημένα επίπεδα Pi. Τα αυξημένα εξωκυττάρια επίπεδα του Pi εισέρχονται στα χονδροκύτταρα μέσω του συμμεταφορέα Na+/Pi, Pit-1 και επάγουν την έκφραση γονιδίων της υπερτροφίας όπως RUNX2, OPN και OC. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η διερεύνηση του ρόλου μορίων που επάγουν την υπερτροφία και την επασβέστωση στα ΟΑ χονδροκύτταρα, όπως η 1,25(OH)2D3 και το Pi, οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί, καθώς και η αναστολή της έκφρασής τους. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα που είχαν υποβληθεί σε ολική αρθροπλαστική γόνατος και δεν είχαν άλλες ρευματικές παθήσεις, χονδροδυσπλασίες ή αυτοάνοσα. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν άτομα που νοσηλεύτηκαν για λόγους τραυματισμού ή κατάγματος. Αναλυτικότερα, στο πειραματικό μέρος της διατριβής διερευνήθηκαν τα ακόλουθα:ο υπερτροφικός φαινότυπος των χονδροκυττάρων από δείγματα αρθρικού χόνδρου ασθενών με οστεοαρθρίτιδα γόνατος, με τη μελέτη γονιδίων χαρακτηριστικών της υπερτροφίας, όπως τα COL10A1, OPN και OC, η δράση της 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω της έκφρασης του υποδοχέα της VDR σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, η δράση του Pi μέσω της έκφρασης των συμμεταφορέων Na+/Pi, Pit-1 και Pit-2 σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, ο ρόλος του αυξητικού παράγοντα FGF23 και του μεταγραφικού παράγοντα RUNX2 σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, καθώς και η μεταξύ τους αλληλεπίδραση,η έκφραση του FGFR1c, ενός ειδικού υποδοχέα του FGF23 και η ενεργοποίηση της σηματοδότησης που επάγεται από την σύνδεσή τους στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα συγκριτικά με τα φυσιολογικάο ρόλος της 1,25(ΟΗ)2D3 ή του Pi στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης του FGF23 και η συμβολή τους στην επαγωγή της υπερτροφίας σε φυσιολογικά χονδροκύτταρα,ο ρόλος της αναστολής του VDR ή των αντλιών Pit-1, Pit-2 στην αναστροφή του υπερτροφικού φαινότυπου σε οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα, το συνδυαστικό αποτέλεσμα της επίδρασης με 1,25(ΟΗ)2D3 και Pi στην επαγωγή της υπερτροφίας σε φυσιολογικά χονδροκύτταρα.Η ύπαρξη υπερτροφίας επιβεβαιώθηκε σε όλα τα δείγματα ΟΑ χόνδρου που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη με την παρουσία οστεοφύτων και με την ανίχνευση αυξημένης έκφρασης του δείκτη COL10A1. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του υποδοχέα VDR και των Pit-1, Pit-2 στα ΟΑ χονδροκύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά, προτείνοντας αφενός την αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα της 1,25(ΟΗ)2D3 στα ΟΑ χονδροκύτταρα, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα της, και αφετέρου την συσσώρευση του Pi στο εξωκυττάριο στρώμα των ΟΑ χονδροκυττάρων, το οποίο προκαλεί υπερέκφραση των αντλιών Pit-1, Pit-2, προκειμένου να εισέλθει στο κυτταρόπλασμά τους. Επίσης παρατηρήθηκε ότι τόσο ο φωσφατουρικός αυξητικός παράγοντας FGF23 όσο και ο μεταγραφικός παράγοντας της υπερτροφίας RUNX2 υπερεκφράζονται στα ΟΑ χονδροκύτταρα και μάλιστα ο FGF23 επάγει την έκφραση του RUNX2. Έτσι προτείνεται ότι η υπρέκφρασή τους αλλά και η αλληλεπίδρασή τους, σχετίζεται με την υπερτροφία στα ΟΑ χονδροκύτταρα, συμβάλλοντας στην εξέλιξη της νόσου. Η επίδραση με 1,25(ΟΗ)2D3 ή Pi στα φυσιολογικά χονδροκύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του FGF23 και του υποδοχέα του FGFR1c και ως ακολούθως την ενεργοποίηση του μονοπατιού των ΜΑP-κινασών και τη φωσφορυλίωση της ERK1/2. Η ενεργοποίηση του ανωτέρου σηματοδοτικού μονοπατιού είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της έκφρασης γονιδίων χαρακτηριστικών της υπερτροφίας, όπως τα RUNX2, COL10A1, οστεοποντίνη (OPN), οστεοκαλσίνη (OC), την επαγωγή καταβολικών μορίων όπως μεταλλοπρωτεϊνάση-13 (MMP-13) αλλά και την απόπτωση των χονδροκυττάρων. Ανάλυση του υποκινητή του FGF23, έδειξε για πρώτη φορά, ότι διαθέτει περιοχές δέσμευσης του συμπλόκου 1,25(ΟΗ)2D3-VDR, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαγωγή της έκφρασής του FGF23 από τη 1,25(ΟΗ)2D3 πραγματοποιείται άμεσα με την πρόσδεση του συμπλόκου στον υποκινητή του. Στη συνέχεια, ακολούθησε αναστολή του VDR ή των Pit-1, Pit-2 στα ΟΑ χονδροκύτταρα, η οποία προκάλεσε την αναστολή της έκφρασης των FGF23 και FGFR1c, απενεργοποίηση του μονοπατιού MAP-κινασών και μείωση της έκφρασης όλων των δεικτών, RUNX2, COL10A1, OPN, OC, MMP-13 και της απόπτωσης. Το αποτέλεσμα της αναστολής του VDR ή των Pit-1, Pit-2, επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από επίδραση με 1,25(ΟΗ)2D3 ή με Pi στα φυσιολογικά χονδροκύτταρα και επιπρόσθετα αναδεικνύει τον μηχανισμό μέσω του οποίου διενεργούνται οι δράσεις της 1,25(ΟΗ)2D3 και του Pi στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Ταυτόχρονη αναστολή του VDR και των Pit-1, Pit-2, οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης των FGF23 και FGFR1c συγκριτικά με τη μεμονωμένη αναστολή του VDR ή των Pit-1, Pit-2. Επίσης διαπιστώθηκε μεγαλύτερη απώλεια στη φωσφορυλίωση της ERK1/2 και στατιστικά σημαντική μείωση όλων των γονιδίων-δεικτών (COL10A1, OPN, OC, MMP-13) στα ΟΑ χονδροκύτταρα.Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν την εμπλοκή της 1,25(ΟΗ)2D3 και του Pi στην υπερτροφία και την επασβέστωση των ΟΑ χονδροκυττάρων. Συγκεκριμένα η 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω σύνδεσης της στον υποδοχέα VDR, εμφανίζει αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα στα ΟΑ χονδροκύτταρα, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από τη είσοδο αυξημένων επιπέδων Pi στα χονδροκύτταρα μέσω των Pit-1, Pit-2. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο 1,25(ΟΗ)2D3 -VDR προσδένεται σε ειδικές περιοχές στον υποκινητή του FGF23 και προκαλεί την ενίσχυση της έκφρασής του. Με τη σειρά του, ο FGF23 προσδένεται στον υποδοχέα FGFR1c και ενεργοποιεί το μονοπάτι των MAP-κινασών, με στόχο την αύξηση της έκφρασης δεικτών της υπερτροφίας και της επασβέστωσης του ECM με τελικό αποτέλεσμα τον εκφυλισμό του χόνδρου. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τη μελέτη αναδεικνύουν νέα μόρια, όπως η 1,25(ΟΗ)2D3, που θα μπορούσαν να συνεισφέρουν στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στόχων.