Ανοσιακή απάντηση ασθενών με αιμορραγικό πυρετό με νεφρική προσβολή και ασθενών με αιμορραγικό πυρετό Κριμαίας-Κονγκό
Authors: Τσεργούλη Αικατερίνη 
Published: September 2021

Οι ιογενείς αιμορραγικοί πυρετοί που ενδημούν στην Ελλάδα είναι ο αιμορραγικός πυρετός με νεφρική προσβολή (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) που οφείλεται σε χανταϊούς, και κυρίως στον ιό Dobrava-Belgrade (Dobrava-Belgrade virus, DOBV) και ο αιμορραγικός πυρετός Κριμαίας-Κονγκό (Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF) που οφείλεται στον ομώνυμο ιό (CCHF virus, CCHFV). Οι παθογενετικοί μηχανισμοί των αιμορραγικών πυρετών δεν είναι επαρκώς γνωστοί, ωστόσο η ενεργοποίηση της ανοσιακής απάντησης και η υπερέκκριση κυτταροκινών, γνωστή ως "καταιγίδα κυτταροκινών" φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ανοσιακής απάντησης σε ασθενείς με HFRS και σε ασθενείς με CCHF, κυρίως όσον αφορά την εκτίμηση και την αξιολόγηση των επιπέδων των κυτταροκινών και την συσχέτιση αυτών με το στάδιο, την έκβαση και τη βαρύτητα της νόσου. Υλικό και μέθοδοι: Στη μελέτη περιλήφθηκαν 54 δείγματα αίματος που ελήφθησαν 5-70 μέρες (μέση ημέρα νόσου 13,5) μετά την έναρξη των συμπτωμάτων από 30 ασθενείς με HFRS (26 άνδρες) ηλικίας 17-70 ετών (διάμεση ηλικία 35,5 έτη), καθώς και 29 δείγματα αίματος που ελήφθησαν 1-9 ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων (μέση ημέρα νόσου 4,9) από 29 ασθενείς με CCHF (12 άνδρες) ηλικίας 4-67 ετών (διάμεση ηλικία 44 έτη). Ένα περιστατικό HFRS ήταν θανατηφόρο, και άλλα 17 περιστατικά θεωρήθηκαν σοβαρά. Δύο περιστατικά CCHF ήταν θανατηφόρα, και άλλα 8 θεωρήθηκαν σοβαρά περιστατικά. Tα δείγματα των ασθενών διαχωρίστηκαν σε ομάδες με βάση την έκβαση, τη βαρύτητα και τον αριθμό των ημερών που μεσολάβησαν από την έναρξη των συμπτωμάτων μέχρι τη λήψη του δείγματος. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 16 δείγματα από 16 υγιή άτομα (9 άνδρες) ηλικίας 18-65 ετών (διάμεση ηλικία 45 έτη).Τα δείγματα των ασθενών εξετάστηκαν για την ύπαρξη IgM και IgG αντισωμάτων έναντι των χανταϊών και του CCHFV με μεθόδους ELISA και έμμεσου ανοσοφθορισμού, ενώ η ανίχνευση του ιικού RNA έγινε με RT-nested PCR και real time RT-PCR. Τα επίπεδα 27 κυτταροκινών [ιντερλευκίνη (IL)-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, εοταξίνη, FGFb, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES, TNF-α και VEGF] μετρήθηκαν ταυτόχρονα με τη χρήση της τεχνολογίας BioPlexTM Suspension Array System (Bio-Rad Laboratories, CA).Αποτελέσματα: Σε όλους τους ασθενείς με HFRS ανιχνεύτηκαν IgM και IgG αντισώματα έναντι των χανταϊών. Με RT-nested PCR ανιχνεύθηκε RNA χανταϊού, και συγκεκριμένα του DOBV, σε 22/29 (75,9%) δείγματα ασθενών που είχαν ληφθεί μέχρι την 16η ημέρα της νόσου. Κατά τις πρώτες δύο εβδομάδες της νόσου, και συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, τα σοβαρά περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των παρακάτω κυτταροκινών: IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, GM-CSF, ΙΡ-10, ΜΙΡ-1b, PDGF, TNF-α και VEGF (p<0,05). Τα ήπια περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των IL-13 και TNF-α (p<0,05). Στα δύο δείγματα από το θανατηφόρο περιστατικό HFRS παρατηρήθηκαν χαμηλά επίπεδα των IL-1b, IL-4, IL-7 IL-13, IL-17, MIP-1a και PDGF, ενώ τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 και MIP-1b ήταν υψηλά (p<0,05). Ισχυρή ανοσιακή απάντηση παρατηρήθηκε κατά την 1η εβδομάδα της νόσου, ιδιαίτερα στα σοβαρά περιστατικά, ενώ στα ήπια ήταν ηπιότερη και εμφανιζόταν αργότερα. Μετά το πέρας της 2ης εβδομάδας νόσου, και συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, τα σοβαρά περιστατικά διατήρησαν υψηλά τα επίπεδα των IL-9, IL-10, ΜΙΡ-1b, PDGF και VEGF, ενώ στα δύο δείγματα από το θανατηφόρο περιστατικό διατηρήθηκαν αυξημένα τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 και MIP-1a (p<0,05). Αντίθετα, η πλειοψηφία των κυτταροκινών στα ήπια περιστατικά ήταν σε επίπεδα παρόμοια με αυτά της ομάδας ελέγχου. Σε όλες τις ομάδες ασθενών τα επίπεδα της IP-10 ήταν αυξημένα και της RANTES μειωμένα (p<0,05). Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα των IL-8, IL-10 και VEGF παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με την εμφάνιση σοβαρής νόσου, ενώ η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε τον VEGF ως τον πλέον ισχυρό παράγοντα. Μεταξύ των 29 ασθενών με CCHF, IgM αντισώματα έναντι του ιού ανιχνεύθηκαν σε 14 (48,3%). Σε κανέναν δεν ανιχνεύθηκαν αντισώματα IgG. Η Real-time RT-PCR ήταν θετική σε όλα τα δείγματα, ενώ η RT-nested PCR ήταν θετική σε 23/29 (79,3%) δείγματα. Συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου τα σοβαρά περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των παρακάτω κυτταροκινών: IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ και IP-10 (p<0,05). Τα ήπια περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1 και VEGF (p<0,05). Στα θανατηφόρα περιστατικά τα επίπεδα των IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, εοταξίνης, ΙΡ-10, MCP-1 και TNF-α ήταν αυξημένα (p<0,05). Τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10 και IP-10 ήταν αυξημένα και στις τρεις ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, με υψηλότερα επίπεδα στα θανατηφόρα περιστατικά (p<0,05). Μεταξύ των επιζώντων, τα επίπεδα των IP-10 και MCP-1 ήταν υψηλότερα στα σοβαρά περιστατικά συγκριτικά με τα ήπια. Τα επίπεδα των IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, ΙΡ-10, MCP-1 και TNF-α ήταν υψηλότερα στα θανατηφόρα περιστατικά συγκριτικά με τα μη θανατηφόρα (p<0,05). Το ιικό φορτίο παρουσίασε θετική συσχέτιση με τα επίπεδα των IL-10, ΙΡ-10 και MCP-1 και αρνητική συσχέτιση με τον λόγο IL-12/IL-10. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το ιικό φορτίο και η ΙΡ-10 παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με την εμφάνιση σοβαρής νόσου, ενώ η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε την ΙΡ-10 ως τον πλέον ισχυρό παράγοντα.Συγκρίνοντας τα επίπεδα των κυτταροκινών στους δύο ιογενείς αιμορραγικούς πυρετούς, στα μεν θανατηφόρα περιστατικά δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά, μεταξύ όμως των επιζώντων, οι μέσες τιμές των IL-8, IL-9, IL-10 και εοταξίνης ήταν σημαντικά υψηλότερες στους ασθενείς με HFRS (p<0,05). Συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, η RANTES ήταν ελαττωμένη σε όλους τους ασθενείς (p<0,05). Στα θανατηφόρα περιστατικά HFRS και CCHF η IP-10 ήταν αυξημένη και η IL-4 ελαττωμένη (p<0,05). Τα επίπεδα της IL-10 ήταν αυξημένα μόνο στα θανατηφόρα περιστατικά HFRS, ενώ μόνο στα θανατηφόρα περιστατικά CCHF, τα επίπεδα των MCP-1 και TNF-α ήταν αυξημένα (p<0,05). Η IL-6 και η IL-8 ήταν αυξημένη σε όλους τους ασθενείς με HFRS και στα θανατηφόρα περιστατικά CCHF (p<0,05). Ο VEGF ήταν αυξημένος μόνο στους επιζήσαντες του HFRS. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ανοσιακή απάντηση των ασθενών με HFRS και CCHF εξαρτάται σημαντικά από την χρονική φάση της νόσου, και επηρεάζεται, αλλά και επηρεάζει την κλινική πορεία και την έκβαση της νόσου. Η ανοσολογική απάντηση είναι εντονότερη στα σοβαρά περιστατικά HFRS και CCHF σε σύγκριση με τα ήπια περιστατικά. Γενικά, ο VEGF και η IP-10 είναι δυνατόν να θεωρηθούν ως προγνωστικοί δείκτες βαρύτητας της νόσου στον HFRS και τον CCHF, αντίστοιχα. Οι ομοιότητες της ανοσιακής απάντησης στον HFRS και τον CCHF είναι αποτέλεσμα της κοινής παθοφυσιολογίας των ιογενών αιμορραγικών πυρετών, ενώ οι διαφορές πιθανώς οφείλονται σε παραλλαγές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ιών και των κυττάρων-στόχων του ξενιστή. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να αποτελέσουν βάση για μελλοντικές έρευνες με στόχο τον σχεδιασμό θεραπευτικών σχημάτων και εμβολίων.