Μελέτη των παραγόντων που επιδρούν στο σχηματισμό των βιο-υμενίων από μικροοργανισμούς των τροφίμων
Authors: Γκιαούρης Ευστάθιος 
Published: August 2021

Στη βιομηχανία τροφίμων, τα βιο-υμένια αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών που σχηματίζονται πάνω στις επιφάνειες που έρχονται σε επαφή με τρόφιμα, εμπλέκονται σε προβλήματα μίανσης των τροφίμων που οδηγούν στη μείωση της διάρκειας ζωής των προϊόντων και στη μετάδοση λοιμώξεων. Εν τούτοις, τα βιο-υμένια δεν προκαλούν πάντα προβλήματα, ενώ μερικές φορές ο σχηματισμός τους θεωρείται χρήσιμος. Έτσι, στη βιομηχανία ζυμούμενων τροφίμων, η εγκατάσταση και διατήρηση μιας «προστατευτικής» μικροχλωρίδας (ή ενός «προστατευτικού» βιο-υμενίου) πάνω σε επιφάνειες του βιομηχανικού εξοπλισμού, συνιστά μια νέα υγειονομική προσέγγιση προκειμένου να αποτραπεί η προσκόλληση και ο πολλαπλασιασμός ανεπιθύμητων μικροοργανισμών. Ο Lactococcus lactis αποτελεί έναν καλό υποψήφιο μικροοργανισμό για το σχηματισμό προστατευτικών βιο-υμενίων. Η μικροβιακή προσκόλληση σε επιφάνειες είναι το πρώτο βήμα στο σχηματισμό ενός βιο-υμενίου και συνιστά μια σύνθετη διαδικασία που επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων κυρίαρχο ρόλο πιστεύεται πως διαδραματίζουν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των τριών αλληλοεμπλεκόμενων φάσεων (βακτήρια, στερεή επιφάνεια, και υγρό μέσο). Στην παρούσα διατριβή αρχικά μελετήθηκε η ποικιλομορφία των επιφανειακών φυσικοχημικών ιδιοτήτων ανάμεσα σε 50 φυσικά στελέχη L. lactis, τα οποία είχαν απομονωθεί από διάφορες πηγές (γαλακτοκομικά προϊόντα, φυτά και ζώα), προκειμένου να ερευνηθεί ο τρόπος με τον οποίο αυτή θα μπορούσε να επηρεάζει την ικανότητα προσκόλλησης αυτών σε αβιοτικές επιφάνειες. Η εκτίμηση της επιφανειακής υδροφοβίας έγινε μέσω μετρήσεων της συγγένειας των κυττάρων προς το μη πολικό διαλύτη δεκαεξάνιο, ενώ το σφαιρικό ηλεκτρικό φορτίο των κυττάρων μετρήθηκε μέσω μικροηλεκτροφόρησης. Τα αποκτηθέντα αποτελέσματα φανέρωσαν μια εκπληκτική ποικιλομορφία των ιδιοτήτων της κυτταρικής επιφάνειας του L. lactis. Σφαιρική ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών επέτρεψε τον καθορισμό τριών ευδιάκριτων ομάδων στελεχών: υδρόφιλα στελέχη υψηλού ηλεκτραρνητισμού (48%), υδρόφοβα στελέχη (12%), στελέχη με μειωμένο ηλεκτρικό φορτίο (18%) και στελέχη με ενδιάμεσες φυσικοχημικές ιδιότητες (22%). Δοκιμές προσκόλλησης, υπό συνθήκες χαμηλής ιοντικής ισχύς, φανέρωσαν την ύπαρξη μιας σημαντικής συσχέτισης ανάμεσα στην προσκόλληση, την επιφανειακή υδροφοβία και το ηλεκτρικό φορτίο. Η έμμεση ποσοτικοποίηση των τειχοϊκών οξέων τοιχώματος των στελεχών εκείνων που είχαν βρεθεί να παρουσιάζουν μειωμένο επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο, έδειξε πως περιέχουν λιγότερη ποσότητα των πολυμερών αυτών, σε σχέση με το ηλεκτραρνητικό στέλεχος μάρτυρα MG1363. Η πλειοψηφία των στελεχών L. lactis έχουν υψηλά αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια. Η μείωση του καθαρού αρνητικού φορτίου του κυτταρικού τοιχώματος του L. lactis θα μπορούσε να αυξήσει την προσκόλληση του σε αρνητικά φορτισμένες επιφάνειες (π.χ. ανοξείδωτος χάλυβας, γυαλί, πολυστυρένιο κ.τ.λ.). Στη παρούσα διατριβή το καθαρό αρνητικό φορτίο της κυτταρικής επιφάνειας του L. lactis επιχειρήθηκε να μειωθεί μέσω: (α) της αύξησης της εστεροποίησης των τειχοϊκών οξέων με D-αλανίνη, δεδομένου πως η προσθήκη D-αλανίνης εισάγει θετικά φορτισμένες αμινομάδες στα ειδάλλως αρνητικά φορτισμένα τειχοϊκα οξέα (λόγω των φωσφορικών τους ομάδων), και (β) της εξάλειψη των τειχοϊκών οξέων από το κυτταρικό τοίχωμα. Έτσι, για την πρώτη προσπάθεια, δημιουργήθηκαν δύο μεταλλαγμένα στελέχη του εργαστηριακού στελέχους L. lactis MG1363, που υπερέκφραζαν το οπερόνιο που είναι υπεύθυνο για τη D-αλανυλοποίηση των τειχοϊκών οξέων (dit). Στο ένα στέλεχος τα τέσσερα γονίδια του οπερονίου κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδιο πολλαπλών αντιγράφων μαζί με το δικό τους φυσικό προαγωγέα, ενώ στο δεύτερο τα γονίδια κλωνοποιήθηκαν υπό το μεταγραφικό έλεγχο προαγωγέα υποκινούμενο από τη νισίνη. Και τα δύο μεταλλαγμένα στελέχη βρέθηκαν να παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα D-αλανίνης στα τειχοϊκά οξέα τους, χωρίς όμως να παρατηρηθούν διαφορές στο ηλεκτρικό φορτίο ανάμεσα στα μεταλλαγμένα και τα στελέχη μάρτυρες. Επιπλέον, πειράματα προσκόλλησης σε μικροπλακίδια πολυστυρενίου και σε γυαλί έδειξαν πως ο βαθμός D-αλανυλοποίησης των τειχοϊκών οξέων δεν επηρεάζει την αρχική προσκόλληση του βακτηρίου σε αυτές τις επιφάνειες, μεταβάλει όμως την επακόλουθη ικανότητα σχηματισμού βιο-υμενίου. Για την εξάλειψη των τειχοϊκών οξέων από το κυτταρικό τοίχωμα επιχειρήθηκε η διαγραφή ενός γονιδίου, που βρέθηκε να είναι ομόλογο με το γονίδιο tagO του Bacillus subtilis, το οποίο έχει ήδη δειχτεί πως κωδικοποιεί το ένζυμο εκείνο που καταλύει την πρώτη αντίδραση στη σύνθεση της μονάδας σύνδεσης των τειχοϊκών στην πεπτιδογλυκάνη. Προσπάθειες αδρανοποίησης του γονιδίου αυτού με τεχνικές μονού αλλά και διπλού ανασυνδυασμού ήταν ανεπιτυχείς. Αντιθέτως, η αδρανοποίηση αυτού του γονιδίου κατέστη εφικτή όταν το ομόλογο γονίδιο tagO του Staphylococcus aureus εισήχθη επίσης στο L. lactis, μέσω κλωνοποίησης σε θερμοευαίσθητο πλασμίδιο. Το μεταλλαγμένο στέλεχος βρέθηκε να αναπτύσσεται κανονικά σε θερμοκρασία 30°C, ενώ η αύξηση του σταματούσε μετά από λίγες γενιές σε θερμοκρασία 37°C. Παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης των κυττάρων του μεταλλαγμένου στελέχους σε θερμοκρασία 37°C φανέρωσε πως η αναστολή της πορείας σύνθεσης των τειχοϊκών οξέων τοιχώματος στο L. lactis, φαίνεται πως προκαλεί πρόβλημα στη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης. Έτσι, η προσπάθεια μείωσης της επιφανειακής ηλεκτραρνητικότητας του L. lactis μέσω δημιουργίας στελέχους απαλλαγμένου τειχοϊκών οξέων τοιχώματος στάθηκε αδύνατη, αφού τα πολυμερή αυτά φαίνεται να είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα αυτού του βακτηρίου. Εκτός από τα προστατευτικά βιο-υμένια, αλλοιογόνοι και παθογόνοι μικροοργανισμοί μπορούν να σχηματιστούν βιο-υμένια σε οποιαδήποτε επιφάνεια στη βιομηχανία τροφίμων, αν δεν υπάρχει το κατάλληλο πρόγραμμα καθαρισμού και εξυγίανσης. Ειδικής σημασίας είναι η ικανότητα της Salmonella Enteritidis να προσδένεται και να αυξάνεται πάνω στις επιφάνειες που έρχονται σε επαφή με τρόφιμα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων στο σχηματισμό βιο-υμενίου από τη S. Enteritidis πάνω σε επιφάνεια ανοξείδωτου χάλυβα. Το σχηματισμένο βιο-υμένιο ποσοτικοποιήθηκε, μέσω αποκόλλησης των κυττάρων από τις επιφάνειες και καλλιέργειας αυτών σε τρυβλία, παράλληλα με μετρήσεις αγωγιμότητας. Αρχικά, φανερώθηκε η μεγάλη σημασία της ύπαρξης μεσεπιφάνειας αέρα - υγρού γι’ αυτό το φαινόμενο. Η περιοδική ανανέωση του θρεπτικού μέσου ευνόησε σταδιακά το σχηματισμό βιο-υμενίου όταν οι μεταλλικές επιφάνειες ήταν πλήρως εμβαπτισμένες. Ακολούθως και οι δύο μέθοδοι έδειξαν πως ο σχηματισμός βιο-υμενίου από τη S. Enteritidis ευνοείται σε θερμοκρασία 20°C, στις πιο ουδέτερες τιμές pH του θρεπτικού ζωμού και σε χαμηλές τιμές ωσμωτικής πυκνότητας. Στο τελευταίο Κεφάλαιο της διατριβής μελετήθηκε η απολυμαντική δράση μερικών χημικών ουσιών ενάντια σε βακτηριακά βιο-υμένια που αποτελούνταν από χρήσιμα, αλλοιογόνα και παθογόνα βακτήρια των τροφίμων. Τρεις πρότυπες χημικές ενώσεις (υδροχλωρικό οξύ, γαλακτικό οξύ, και υδροξείδιο του νατρίου) και τρεις φυσικές ουσίες (αιθέριο έλαιο, αφέψημα και υδροκολλοειδής φάση από Satureja thymbra) δοκιμάστηκαν ενάντια σε βιο-υμένια που είχαν προηγουμένως σχηματιστεί, είτε σε μονοκαλλιέργεια, είτε σε μικτή καλλιέργεια, από Staphylococcus simulans, Lactobacillus fermentum, Pseudomonas putida, Salmonella enterica και Listeria monocytogenes. Τα βιο-υμένια αφέθηκαν να αναπτυχθούν πάνω σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα, σε θερμοκρασία 16°C για 5 ημέρες, πριν την εφαρμογή των απολυμαντικών μεταχειρίσεων, για 60 και 180 λεπτά. Η ικανότητα απολύμανσης αυτών εκτιμήθηκε μέσω απαρίθμησης των κυττάρων που παρέμειναν ζωντανά μετά την κάθε μεταχείριση, παράλληλα με μετρήσεις αγωγιμότητας. Και οι δύο αυτές μέθοδοι έδειξαν πως το αιθέριο έλαιο και η υδροκολλοειδής του φάση παρουσίαζαν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση ενάντια τόσο στα μονής, όσο και στα μικτής καλλιέργειας βιο-υμένια. Η χρησιμοποίηση φυσικών αντιμικροβιακών ουσιών θα μπορούσε να παράσχει εναλλακτικούς ή συμπληρωματικούς τρόπους απολύμανσης των μικροβιακά μιασμένων βιομηχανικών επιφανειών.