Επανεργοποίηση της έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης με χημικές ουσίες σε in vitro και in vivo πειραματικά συστήματα
Authors: Σπύρου Παντελής 
Published: July 2014

Η θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο συχνές κληρονομικές ασθένειες του αίματος κατά την οποία παρατηρείται μειωμένη ή καθόλου παραγωγή μίας ή περισσότερων αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης. Μια ερευνητική προσέγγιση για την θεραπεία της θαλασσαιμίας είναι η επανεργοποίηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης. Με αυτή την θεραπευτική προσέγγιση καταπιάνεται η παρούσα διατριβή.O βασικός σκοπός της εργασίας είναι η εύρεση ουσιών που επάγουν την έκφραση του γ-γονιδίου υπεύθυνου για την παραγωγή της γ-σφαιρίνης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης. Η επιλογή των ουσιών που μελετήθηκαν βασίστηκε είτε στον μηχανισμό δράσης τους είτε στη χημική τους δομή. Όλες οι ουσίες μελετήθηκαν αρχικά in vitro στο κυτταρικό σύστημα GM979. Οι ουσίες που ήταν θετικές στα κύτταρα GM979 μελετήθηκαν ακολούθως ex vivo σε καλλιέργειες ερυθροβλαστικών κυττάρων από υγιή άτομα και θαλασσαιμικούς δότες. Ουσίες με ιδιαίτερο ενδιαφέρον μελετήθηκαν στη συνέχεια in vivo σε διαγονιδιακά ποντίκια. Για τη στοχευόμενη σύνθεση παραγώγων με βελτιωμένη δράση αναπτύχθηκε ένα λογισμικό μοντέλο QSAR που κάνει προβλέψεις για τις αλλαγές στη δομή για τις οποίες μπορεί να βελτιωθεί η δράση τους. Για την μελέτη του μοριακού μηχανισμού των δραστικών ουσιών έγιναν πειράματα με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης. Οι ουσίες κατατάσσονται σε 6 κατηγορίες ανάλογα με το κύριο μοριακό μηχανισμό δράσης τους. Στην μελέτη συμπεριλαμβάνονται ουσίες που προκαλούν υπομεθυλίωση και παράγωγα τους, καταστολείς της αποκετυλάσης των ιστονών, ουσίες που συνδέονται στο DNA, ανθρακυκλίνες, καταστολείς της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης και ουσίες που είναι είτε αντιοξειδωτικές ή μεταβολίτες ή ουσίες που επηρεάζουν μεταβολικά μονοπάτια. Από τις 65 ουσίες που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία, έχουν βρεθεί 13 θετικές ουσίες. Από τις 13 θετικές ουσίες που μελετούνται για πρώτη φορά, 8 είχαν θετική δράση σε κύτταρα ερυθροβλαστών από υγιή άτομα. Οι 6 από τις 8 αυτές ουσίες ήταν δραστικές και σε κύτταρα ερυθροβλαστών από θαλασσαιμικούς δότες και μάλιστα σε κάποια δείγματα η αύξηση που προκάλεσαν ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη που προκάλεσε η υδροξυουρία. Οι ουσίες αυτές ήταν οι: Oxamflatin (καταστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών), 5-Fluoro2’deoxyuridine (ουσίες που προκαλούν υπομεθυλίωση και παράγωγα), Diammine-dinitritoplatinum (ουσίες που συνδέονται στο DNA), Daunorubicin, Idarubicin (Ανθρακυκλίνες), 3,3’5-Triodo-L-Thryonine (ουσίες που επηρεάζουν μεταβολικά μονοπάτια).Μελέτη του μηχανισμού δράσης της Mithramycin (ουσίες που συνδέονται στο DNA) και του Oxamflatin έδειξε ότι η Mithramycin προκαλεί μείωση στη σύνδεση του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 σε επιλεγμένες ρυθμιστικές περιοχές του LCR ενώ το Oxamflatin προκαλεί αύξηση στην ακετυλίωση ρυθμιστικών περιοχών στο γ-γονίδιο και το LCR. Έγινε επίσης χημική τροποποίηση και σύνθεση παραγώγων της θετικής ουσίας MS-275 σε συνδυασμό με τον εικονικό έλεγχο των συνθετικών παραγώγων με το μοντέλο ποσοτικής συσχέτισης δομής-λειτουργίας QSAR (quantitative structure-activity relationships) με στόχο την βελτίωση της δράσης τους και μείωση της κυτταροτοξικότητας τους. Έγινε σύνθεση 26 παραγώγων. Το CRC 144 ήταν το μόνο παράγωγο που είχε παραπλήσια δράση στην ίδια συγκέντρωση με το MS275 και χωρίς να είναι τοξικό.