Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα υποδοχέων έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία
Authors: Ντούφα Σταυρούλα 
Published: September 2021

Ο  ρόλος  του  αντιγόνου  στη  ΧΛΛ  υποδεικνύεται  από  τη  χρήση  συγκεκριμένων   γονιδίων  IGHV  για  τη  δημιουργία  των  Β  κυτταρικών  υποδοχέων  (B  cell  Receptors,   BcRs)  που  εκφράζουν  τα  νεοπλασματικά  κύτταρα,  την  προγνωστική  αξία  της  δομής   των  BcR  καθώς  και  την  ύπαρξη  υποσυνόλων  ασθενών  με  σχεδόν  πανομοιότυπους,   στερεότυπους,   BcR.  Η  δομική  ομολογία  υποδεικνύει  το  σημαντικό  ρόλο  ενός   περιορισμένου  εύρους  παθογόνων  ή  δομικά  σχετιζόμενων  επιτόπων,  στη   λευχαιμογένεση.  Η  άμυνα  έναντι  παθογόνων  μικροοργανισμών  στηρίζεται  στη   συνεργική  δράση  πολλών  μηχανισμών,  ώστε  να  επιτευχθεί  μία  αποτελεσματική   άνοση  απάντηση.  Σε  αυτούς  τους  μηχανισμούς  συμπεριλαμβάνεται  και  η  μη  ειδική   διέγερση  των  Β  λεμφοκυττάρων  μέσω  των  υποδοχέων  έμφυτης  ανοσίας,  κύριοι   αντιπρόσωποι  των  οποίων  οι  τύπου  Toll  και  NOD  (Toll  Like  Receptors,  TLRs,  Nod  Like   Receptors,   NLRs).  Τα  δεδομένα  που   υπάρχουν  σχετικά  με  την  έκφραση  των   υποδοχέων  TLR  και  NLR  στη  ΧΛΛ  είναι  περιορισμένα  και  προέρχονται  από  μικρές   σειρές  ασθενών.     Στην  παρούσα  μελέτη  πραγματοποιήσαμε  μια  συστηματική  ανάλυση  του  προτύπου   έκφρασης  του  σηματοδοτικού  μονοπατιού  των  υποδοχέων   TLR   καθώς  και  των   υποδοχέων   NLR,  σε  μία  μεγάλη  σειρά  191  ασθενών  με  ΧΛΛ.  Η  ανάλυση   περιελάμβανε  όλους  τους  TLR  και  τους  NOD1/2,  προσαρμοστές,  τελεστές,  μόρια   που  εμπλέκονται  σε  άλλα  σηματοδοτικά  μονοπάτια  που  αλληλεπιδρούν  με  το   μονοπάτι  των  TLR,  καθώς  και  τελικά  μόρια-­‐στόχους.  Παρατηρήθηκαν  διαφορετικά   πρότυπα  γονιδιακής  έκφρασης  μεταξύ  υποομάδων  ασθενών  με  ΧΛΛ  που  ορίστηκαν   με  βάση  τα  μοριακά  χαρακτηριστικά  του  BcR,  όπως  το  ρεπερτόριο  και  το  status   μεταλλάξεων  των  γονιδίων   IGHV   και  η  έκφραση  στερεότυπων   BcR.  Η  μελέτη   πραγματοποιήθηκε  σε  CD19+  Β  λεμφοκύτταρα  που  επιλέχθηκαν  αρνητικά  από  ολικό   αίμα.  Το  γονιδιακό  πρότυπο  έκφρασης  του  σηματοδοτικού  μονοπατιού  των  TLR  πραγματοποιήθηκε  με  τη  χρήση  του  RT²  Profiler™  PCR  Array  kit  (PAHS-­‐018A  array,   SABiosciences),  ενώ  τα  επίπεδα  των  mRNA  μεταγράφων  των  υποδοχέων  NOD1/2   μετρήθηκαν  με  τη  χρήση  ειδικών  εκκινητών.  Στο  σύνολο  των  ασθενών,  μεταξύ  των   υποδοχέων  υψηλά  επίπεδα  έκφρασης  παρουσίαζαν  οι  TLR7  και  CD180,  ενδιάμεσα   οι  TLR1,  TLR6  και  TLR10  και  χαμηλά  οι  TLR2  και  TLR9.  Τα  επίπεδα  έκφρασης  των   TLR4  και  TLR8  ήταν  πολύ  χαμηλά  και  σε  πολλές  περιπτώσεις  μη  ανιχνεύσιμα.  Η   έκφραση  των  TLR3  και  TLR5  ήταν  αρνητική  στην  πλειονότητα  των  περιπτώσεων.  Οι   NOD1/2  παρουσίαζαν  υψηλά  επίπεδα  έκφρασης.  Οι  περισσότεροι  προσαρμοστές   (MyD88,  TICAM1,  TRAF6),  οι  τελεστές  που  ρυθμίζουν  τη  λειτουργία  του  μονοπατιού   (UBE2N)  καθώς  και  τα  μόρια  που  εμπλέκονται  στα  άλλα  σηματοδοτικά  μονοπάτια   των  NFKB,  JNK/p38,  NF/IL6  και  IRF  καθοδικά  του  μονοπάτιου  των  TLR  εμφάνιζαν   υψηλά  ή  ενδιάμεσα  επίπεδα  έκφρασης,  ενώ  οι  αναστολείς  του  μονοπατιού   εκφραζόταν  σε  χαμηλά  έως  μηδενικά  επίπεδα  (TOLLIP,  SIGIRR/TIR8).  Η  σύγκριση   των  περιπτώσεων  που  φέρουν  μεταλλαγμένες  αλληλουχίες  IGHV  (M-­‐ΧΛΛ)  έναντι   εκείνων  που  φέρουν  αμετάλλακτες  αλληλουχίες   IGHV   (Α-­‐ΧΛΛ)  (124  και  67   περιπτώσεις,  αντιστοίχως)  αποκάλυψε  ότι  τα  μόρια  CD80,  CD86,  IL6,  IFNG  και  TLR4   υπερεκφράζονταν,  ενώ  τα  μόρια  TLR8  και  NFKBIL1  υποεκφράζονταν  στην  M-­‐ΧΛΛ   έναντι  της   Α-­‐ΧΛΛ.   Σημαντικές  διαφορές  παρατηρήθηκαν  και   κατά  τη   σύγκριση   ασθενών  που  ανήκαν  σε  διαφορετικά  στερεότυπα  υποσύνολα   (στερεότυπο   υποσύνολο  #4,  IGHV4-­‐34/1GKV2-­‐30  BcR,  στερεότυπο  υποσύνολο  #1,  IGHV1/5/7-­‐ IGKV1(D)-­‐39   BcR,  στερεότυπο  υποσύνολο  #8,   IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39   BcR):  (i)   υπερέκφραση  των  μορίων  TLR7  και  NFKBIA  και  υποέκφραση  των  μορίων  CD86  και   TLR4  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1  έναντι  του  στερεότυπου   υποσυνόλου  #4,  (ii)  υπερέκφραση  ων  μορίων  TLR4  και  MAP4K4  και  υποέκφραση   των  μορίων  NFKBIA  και  RIPK2  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #8   έναντι  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1  και  (iii)  υπερέκφραση  του  μορίου  LY96  και   υποέκφραση   των  μορίων   RIPK2  και   CD86  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου   υποσυνόλου  #8  έναντι  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #4.  Συμπερασματικά,  το   πρότυπο   έκφρασης  των  υποδοχέων   TLR   είναι   παρόμοιο  με  το  αντίστοιχο  των   ενεργοποιημένων  Β  λεμφοκυττάρων,  ενισχύοντας  την  άποψη  ότι  τα  κύτταρα  της   ΧΛΛ  έχουν  εμπειρία  αντιγόνου.  Επιπλέον,  υπο-­‐ομάδες  ασθενών  με  ΧΛΛ  που   ορίζονται  με  βάση  τα  ιδιαίτερα  μοριακά  χαρακτηριστικά  των   BcR   -­‐ιδίως  οι  περιπτώσεις  που  φέρουν  στερεότυπους   BcR-­‐   εμφανίζουν  διαφορετικά  πρότυπα   έκφρασης  των  υποδοχέων   TLR,  γεγονός  που  υποδεικνύει  ότι  διαφορετικά  (και   ταυτόχρονα)  σήματα  εκτός  από  τα  σήματα  που  προέρχονται  από  τον  BcR  μπορεί  να   επηρεάζουν  τη  συμπεριφορά  του  νεοπλασματικού  κλώνου.    Τα  ώριμα  Β  λεμφοκύτταρα  αναγνωρίζουν  αντιγόνα  ειδικά  μέσω  του  Β  κυτταρικού   υποδοχέα  (B  cell  Receptor,  BcR)  αλλά  και  μέσω  των  υποδοχέων  έμφυτης  ανοσίας,   όπως  οι  υποδοχείς  τύπου  Toll  (Toll  Like  Receptors,  TLRs)  και  υποδοχείς  τύπου  NOD   (NOD  Like  Receptors,  NLRs),  οι  οποίοι  ασκούν    συν-­‐διεγερτική  δράση  στον  BcR.   Φαίνεται  ότι  η  σηματοδότηση  μέσω   BcR   διαδραματίζει  σημαντικό  ρόλο  στην   ανάπτυξη  και  ίσως  στην  εξέλιξη  της  Χρόνιας  Λεμφοκυτταρικής  Λευχαιμίας  (ΧΛΛ).   Ωστόσο,  η  ακριβής  χρονική  στιγμή,  η  διάρκεια  και  κυρίως  η  φύση  της  αντιγονικής   διέγερσης  είναι  μέχρι  και  σήμερα  αδιευκρίνιστα.  Παρόλο  που  σημαντικά  δεδομένα   υποδεικνύουν  ότι  οι  υποδοχείς  έμφυτης  ανοσίας  σχετίζονται  με  την  παθογένεια  της   ΧΛΛ,  η  λειτουργικότητα  των  υποδοχέων  TLR  και  NLR  δεν  έχει  μελετηθεί  εκτενώς  στη   ΧΛΛ.  Μελετήσαμε  τη  λειτουργικότητα  των  υποδοχέων  TLR  και  NLR  σε  υποομάδες   ασθενών  με  ΧΛΛ  οι  οποίες  διαχωρίστηκαν  με  βάση  το  ρεπερτόριο,  το   status   μεταλλάξεων  των  γονιδίων  IGHV  και  την  έκφραση  στερεότυπων  BcR.  Για  το  λόγο   αυτό  μελετήσαμε  67  ασθενείς,  με  σκόπιμη  υπερ-­‐αντιπροσώπευση  περιπτώσεων   που   εκφράζουν   στερεότυπους  υποδοχείς  χαρακτηριστικούς   των  στερεότυπων   υποσυνόλων  #1  (IGHV1/5/7-­‐IGKV1(D)-­‐39)  και  #4  (IGHV4-­‐34/IGKV2-­‐30),  τα  οποία   θεωρούνται  υποδείγματα  κακής  και  καλής  πρόγνωσης,  αντίστοιχα.  Έγινε  διέγερση   CD19+  κυττάρων,  που  είχαν  επιλεγεί  αρνητικά  από  ολικό  αίμα,  με  προσδέτες   ειδικούς  για  όλους  τους   TLR/NLR   που  εκφράζονται  στα  Β  λεμφοκύτταρα.  Τα   αποτελέσματα  της  διέγερσης  εκτιμήθηκαν  μετά  από  12  ώρες  με  μέτρηση  της   έκφρασης  των  μορίων   CD25  και   CD86   (δείκτες  ενεργοποιημένων  Β  λεμφοκυττάρων),  με  κυτταρομετρία  ροής.  Επίσης,  μετρήθηκε  η  βιωσιμότητα  των   κυττάρων  σε  συγκεκριμένα  χρονικά  στιγμιότυπα  (Ημέρα  3,  6,  9).  Οι  TLR1/2,  TLR2/6,   TLR9  και   NOD2  απάντησαν  στη  διέγερση  με  τους  ειδικούς  προσδέτες  στις   περισσότερες  περιπτώσεις  που  μελετήθηκαν,  αν  και   με   μεγάλη  ετερογένεια.  Η   διέγερση  του  TLR7  με  Imiquimod,  ένα  μικρό  συνθετικό  αντι-­‐ιικό  μόριο,  οδήγησε  σε   αύξηση  της  έκφρασης  του  CD25  και/ή  CD86  σε  ~50%  των  περιπτώσεων.  Αντίθετα,  η   loxoribine  που  είναι  ο  φυσικός  προσδέτης  του  TLR7  δεν  είχε  καμία  επίδραση  στα  Β   λεμφοκύτταρα  της  ΧΛΛ.  Παρατηρήθηκαν  σημαντικές  διαφορές  στην  απάντηση  μετά   από  διέγερση   επιλεγμένων   TLR   όταν   μεταξύ  περιπτώσεων   που  έφεραν   μεταλλαγμένες  έναντι  αμετάλλακτων   αλληλουχιών   IGHV   (M-­‐ΧΛΛ   vs   Α-­‐ΧΛΛ).   Συγκεκριμένα,  το  ποσοστό  των  CD25  θετικών  κυττάρων  αυξήθηκε  περισσότερο  στην   Α-­‐ΧΛΛ  μετά  από  διέγερση  του  TLR7  με  Im.  Αντίθετα,  μετά  από  διέγερση  του  TLR9  με   CpG,  το  ποσοστό  των   CD86  θετικών  κυττάρων  ήταν  μεγαλύτερο  στην   M-­‐ΧΛΛ.   Ιδιαίτερα  λειτουργικά  πρότυπα  των   TLR   και   NOD2  παρατηρήθηκαν  και  στα   διαφορετικά  στερεότυπα  υποσύνολα  ασθενών.  Συγκεκριμένα,  μετά  από  διέγερση   των  υποδοχέων  TLR9,  TLR1/2,  TLR2/6,  και  NOD2  με  τους  κατάλληλους  προσδέτες,  η   έκφραση  του   CD86  επαγόταν  ισχυρά  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου   υποσύνολου  #4,  ενώ  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσύνολου  #1  η  επαγωγή   της  έκφρασης  ήταν  χαμηλή  έως  μηδενική.  Η  διέγερση  του  TLR7  με  Im  δεν  είχε  καμία   επίδραση  στην  έκφραση  του  CD86,  αλλά  οδηγούσε  σε  αυξημένη  έκφραση  του  CD25   μόνο  στις  περιπτώσεις  του  στερεότυπου  υποσυνόλου  #1.  Η  μελέτη  μας   περιλάμβανε  επίσης  περιπτώσεις  που  ανήκαν  στα  στερεότυπα  υποσύνολα  #8   (IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39,   UM)  και  #16  (IGHV4-­‐34/IGKV3-­‐20,   M).  Παρατηρήσαμε   ιδιαίτερα  λειτουργικά  πρότυπα  ακόμα  και  όταν  συγκρίναμε  περιπτώσεις  που   ανήκαν  σε  στερεότυπα  υποσύνολα  με  ίδιο  status  μεταλλάξεων  των  γονιδίων  IGHV   (στερεότυπο  υποσύνολο  #1  έναντι  #8  και  στερεότυπο  υποσύνολο  #4  έναντι  #16),   γεγονός  που  υποδεικνύει  ότι  τα  ιδιαίτερα  πρότυπα  έκφρασης  των  υποδοχέων  TLR   είναι  χαρακτηριστικά  των  στερεότυπων  υποσυνόλων,  ανεξάρτητα  από  τη  χρήση   συγκεκριμένου  γονιδίου  IGHV  ή  status  μεταλλάξεων.  Για  να  επιβεβαιώσουμε  το   παραπάνω    συμπέρασμα,   επικεντρωθήκαμε  στις  περιπτώσεις  που   χρησιμοποιούσαν  το  γονίδιο    IGHV4-­‐34  σε  στερεότυπες  (#4  και  #16)  και  μη  (non   #4/16)  αναδιατάξεις.  Με  αυτή  την  προσέγγιση  παρατηρήθηκαν  στατιστικά σημαντικές  διαφορές  (p<0.05)  ανάμεσα  στις  τρεις  ομάδες  ασθενών  αναφορικά  με   την  έκφραση  των  συνδιεγερτικών  μορίων  μετά  από  διέγερση  των  TLR1/2,  TLR2/6,   NOD2  και   TLR9.  Σε  όλες  τις  παραπάνω  συγκρίσεις  παρατηρήθηκαν  επίσης   διαφορετικά  ποσοστά  βιωσιμότητας  μετά  από  διέγερση  συγκεκριμένων  TLR  και/ή   NLR  με  τους  κατάλληλους  προσδέτες.  Συμπερασματικά,  η  ανάπτυξη  και  εξέλιξη  της   ΧΛΛ  πιθανόν  επηρεάζεται  και  από  σήματα  που  λαμβάνονται  μέσω  των  υποδοχέων   έμφυτης  ανοσίας.  Υποομάδες  ασθενών  με  ΧΛΛ  που  ορίζονται  με  βάση  τα  ιδιαίτερα   μοριακά  χαρακτηριστικά  των   BcR   εμφανίζουν  διαφορετικά  πρότυπα   λειτουργικότητας  των  υποδοχέων   TLR   και/ή   NLR.  Με  βάση  τα  παραπάνω,  η   βιολογική  συμπεριφορά  του  λευχαιμικού  κλώνου,  που  αντικατοπτρίζεται  στην   κλινική  πορεία  της  νόσου,  είναι  αποτέλεσμα  της  συνεργασίας  των  κλωνοτυπικών   BcR   με  συγκεκριμένους  υποδοχείς  έμφυτης  ανοσίας  που  διαφέρουν  κατά   περίπτωση.  Επιπλέον,  τα  αποτελέσματα  της  παρούσας  μελέτης  θα  μπορούσε  να   χρησιμεύσουν  για  τη  διάκριση  ομάδων  ασθενών  που  θα  ωφελούνταν  από  τη   θεραπεία  με  συγκεκριμένους  προσδέτες.