Fractionation of Human Plasma with Polyphosphate*
Authors: Nitschmann Hs. , Rickli E. , Kistler P. 
Published: March 2009

On the basis of previously published experiments dealing with the solubility of plasma proteins in the presence of polyphosphate, a fractionation method for human plasma has been developed. This procedure is simple and especially designed for the production of the fractions of clinical interest.

A first fraction containing predominantly fibrinogen is precepitated with 0.4% polyphosphoric acid at a pH between 5.0 and 5.3. A second fraction containing virtually all the albumin is then precipitated from the supernatant with 0.8 % polyphosphoric acid at a pH of 4.3. The γ‐globulin remains in the supernatant. The purification of the last two fractions is described in detail.

The raw albumin fraction is dissolved at neutral pH. Then the polyphosphate is eliminated by passage over a low crosslinked anion‐exchanger. By subsequent desalting on a mixed bed ion exchange column a plasma protein solution is obtained which can be pasteurized at 60° C. It contains 60 % of the plasma proteins of which 80 % are albumin and 20% globulins. It is free of any risk of hepatitis transmission and seems therefore very well suited as a plasma expander.

From the supernatant of the albumin precipitate the polyphosphate is removed by ion exchange. The γ‐globulin is then precipitated at a pH of 7 with 25% ethanol. The yield is excellent. This γ‐globulin has a purity of at least 90% and contains the antibodies in full potency.

The composition of the fractions is recorded and it is also shown that the amount of polyphosphate eventually remaining in the final product is so small that there is no danger of toxicity. There are no indications of denaturation of the plasma proteins by polyphosphate within the pH range employed (7.0–4.3).

The average degree of polymerization of the polyphosphoric acid used has virtually no effect on its precipitating action, at least as long as the lower oligophosphates are excluded.

Finally the method is compared to that proposed byRane and Newhouser, in which cyclic tetrametaphosphate is used for fractionation.

The polyphosphate method, as described here, may prove of practical value in preparing from human plasma the two fractions for which there is today the greatest demand from the clinicians: a stable pasteurized plasma protein solution, and an antibody‐globulin preparation.

Sur la base de recherches precedemment publiées concernant la solubilité des protéines plasmatiques en présence de polyphosphate, les auteurs ont mis au point une méthode de fractionnement de plasma humain; cette méthode est simple et est plus particulihrement adaptée à la préparation de fractions utilisables en clinique.

Une premiere fraction, composée principalement de fibrinogène, est précipité à pH 5‐5,3 avec de l'acide polyphosphorique à 0,4 %. Du surnageant on précipite, à pH 4,3, au moyen d'acide polyphosphorique à 0,8%, une fraction qui contient pratiquement toute l'albumine. La γ‐globuline reste dans le surnageant. Le traitement subséquent de ces deux dernières fractions est décrit. La fraction brute d'albumine est mise en solution par neutralisation et est liberée du polyphosphate et des sels au moyen échangeurs d'ions et l'on obtient une solution de protéines plasmatiques que l'on peut pasteuriser, et qui semble indiquée comme solution de transfusion ne comportant pas de risque de transmission d'hépatite. Elle contient environ 60% des protéines plasmatiques totales, dont 80% d'albumine.

Après précipitation de l'albumine et élimination du polyphosphate au moyen d'échangeurs d'ions, le surnageant est porté à pH 7 et est additionné de 25% d'éthanol. On obtient ainsi avec un très bon rendement une γ‐globuline d'une pureté de plus de 90 % qui contient les anticorps entièrement actifs. La composition des fractions est indiquée et il est aussi démontré que les quantités de polyphosphate éventuellement encore contenues dans les préparations terminées sont extrèmement faibles de sorte qu'aucun effet toxique n'est à craindre. II n'y a pas non plus d'indices permettant de supposer que les protéines sont dénaturées par le polyphosphate aux pH utilisés (entre 7 et 4,3), même pas à température ordinaire.

Le degré moyen de polymérisation de l'acide polyphosphorique utilisé n'a pratiquement pas d'influence sur l'action précipitante tant qu'il ne s'agit pas des acids oligophosphoriques inférieurs. Pour terminer, la méthode proposée est comparée avec celle deRane et Newhouser;ces auteurs ont procédè à une précipitation fractionnée au moyen de tétramétaphosphate cyclique pur.

La méthode rapportée ici représente un procédé rationnel, permettant de transformer le plasma en un produit de transfusion ne présentant pas de risque de transmission d'hépatite, et qui est susceptible d'être conservé comme solution sous forme stérile; la γ globuline, dont l'importance devient toujours plus considérable en clinique, peut être préparée comme sous‐produit avec un excellent rendement.

Auf Grund früher publizierter Untersuchungen über die Loslichkeit von Plasmaproteinen in Gegenwart von Polyphosphat wurde eine Fraktionierungsmethode für humanes Plasma ausgearbeitet, die einfach und speziell für die Gewinnung der klinisch wichtigsten Fraktionen zugeschnitten ist.

Mit 0,4% Polyphosphorsaure wird bei pH 5‐5,3 eine erste, vor‐wiegend Fibrinogen enthaltende Fraktion ausgefallt. Aus dem Über‐stehenden fällt bei pH 4,3 mit 0,8 % Polyphosphorsäure eine Fraktion, die praktisch alles Albumin enthält. Das γ‐Globulin verbleibt im Überstehenden. Die Aufarbeitung der beiden letztgenannten Fraktionen wird beschrieben.

Die rohe Alhuminfraktion wird unter Neutralisation gelöst und mit Hilfe eines schwachvernetzten Anionenaustauschers von Polyphosphat befreit. Durch anschlieoende Totalentsalzung mittels Ionenaustausch wird eine bei 60° C pasteurisierbare Plasmaproteinlösung erhalten, die als hepatitissicheres Transfusionsmittel sehr geeignet scheint. Sie enthält ca. 60% des gesamten Plasmaproteins, und davon sind 80% Albumin. Das Überstehende von der Albuminfällung kann nach Eliminierung des Polyphosphates durch Ionenaustausch bei pH 7 mit 25 % Aethanol gefällt werden. Dabei wird in hervorragender Ausbeute ein γ‐Globulin von über 90prozentiger Reinheit erhalten, welches die Antikörper in voller Wirksamkeit enthält.

Die Zusammensetzung der Fraktionen wird angegeben und es wird auch gezeigt, daβ die in den fertigen Präparaten eventuell noch vorhandenen Mengen Polyphosphat außerordentlich gering sind, so daß keinerlei toxische Wirkungen zu befürchten sind. Es liegen auch keine Anzeichen dafür vor, daβ die Plasmaproteine durch Polyphosphat im angewendeten pH‐Bereich (zwischen 7 und 4,3) denaturiert werden, auch nicht bei Zimmertemperatur.

Der Durchschnittspolymerisationsgrad der verwendeten Polyphosphorsäure hat auf die Fällwirkung praktisch keinen Einfluß, solange nicht zu den niederen Oligophosphaten übergegangen wird. Am Schluß wird die Methode mit der vonRane und Newhouserverglichen, bei der mit reinem cyclischem Tetrametaphosphat fraktioniert gefällt wird.

Die hier niitgeteilte Methode stellt ein rationelles Verfahren dar, um Plasma in ein hepatitissicheres, als sterile Lösung haltbares Transfusionsmittel überzuführen und dabei als Nebenprodukt das immer wichtiger werdende γ‐Globulin in ausgezeichneter Ausbeute zu gewinnen.