Μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας και των εξελικτικών σχέσεων ρετροϊών που προσβάλλουν τα πρόβατα και ανάπτυξη μοριακών δοκιμών για την ανίχνευσή τους
Authors: Χασαλεύρης Ταξιάρχης 
Published: June 2021

H οικογένεια Retroviridae αποτελείται από ιούς οι οποίοι ενσωματώνουν το γενετικό τους υλικό στο γονιδίωμα του ξενιστή. Προκαλούν κυρίως σύνδρομα ανοσοανεπάρκειας και/ή ογκογένεση, καθώς και χρόνια, βραδέως εξελισσόμενη νόσο του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος. Ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον στα πρόβατα παρουσιάζουν οι lenti-ιοί των μικρών μηρυκαστικών (small ruminant lentiviruses, SRLVs) και ο ιός του ενζωοτικού ενδορρινικού νεοπλάσματος των προβάτων (Εnzootic nasal tumor virus, ENTV-1). Η διατριβή που εκπονήθηκε είχε 2 κύριους στόχους: α) τον προσδιορισμό τμήματος των γονιδιών env και pol του ENTV-1 και των SRLVs αντιστοίχως για τη μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας και των εξελικτικών σχέσεων των στελεχών που κυκλοφορούν στην Ελλάδα, και β) Την ανάπτυξη μοριακών δοκιμών για την αξιόπιστη ανίχνευση των προαναφερθέντων ιών σε παθολογικά υλικά. Σε ό,τι αφορά τον ENTV-1, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη δυνατότητα διαχωρισμού του ιού αυτού από συγγενείς εξωγενείς β-ρετροϊούς καθώς και απο ενδογενείς β-ρετροϊούς οι οποίοι απαντώνται φυσιολογικά στο γονιδίωμα των μικρών μηρυκαστικών. Αντίστοιχα, στην περίπτωση των SRLVs δόθηκε έμφαση στην ανάπτυξη δοκιμής με μεγάλο εύρος ανίχνευσης διαφορετικών ιικών στελεχών όλων των διεθνώς χαρακτηρισμένων γενότυπων (γενότυποι Α-Ε). Οι SRLVs είναι ιοί που χαρακτηρίζονται από μεγάλη γενετική ποικιλομορφία και προσβάλουν τα μικρά μηρυκαστικά. Προκαλούν επίμονη και ισόβια λοίμωξη, η οπoία χαρακτηρίζεται από μεγάλο χρόνο επώασης (μήνες η και χρόνια) ενώ προσβάλλονται πολλά όργανα και κυρίως οι πνεύμονες, οι μαστικοί αδένες, οι αρθρώσεις καθώς και το κεντρικό νευρικό σύστημα. Ο έλεγχος των λοιμώξεων των μικρών μηρυκαστικών που προκαλούνται από τους lenti-ιούς στηρίζεται στην έγκυρη και έγκαιρη εργαστηριακή διάγνωση με στόχο την απομάκρυνση των μολυσμένων ζώων από τις εκτροφές, καθώς η χρήση εμβολίων, θεωρείται αναποτελεσματική και θεραπεία δεν υπάρχει. Η εργαστηριακή μοριακή διάγνωση των λοιμώξεων από SRLVs δυσχεραίνεται κυρίως από τη μεγάλη γενετική παραλλακτικότητά τους και τον χαμηλό αριθμό των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος τα οποία προσβάλλονται κατά την λοίμωξη. Για τον λόγο αυτό, αναπτύχθηκε πρωτόκολλο ημι-ένθετης PCR πραγματικού χρόνου για την ανίχνευση του DNA προϊού των SRLVs σε ζωντανά ζώα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε χαρακτηρίζεται από μεγάλη διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα, ενώ παράλληλα διαθέτει τις εξής καινοτομίες: α) Ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν, στηρίχθηκε στην επιλογή τους με βάση τον υπολογισμό της συχνότητας χρήσης των κωδικωνίων (codon usage) στις γονιδιωματικές περιοχές-στόχους και β) χρησιμοποιήθηκαν «εκφυλισμένοι» εκκινητές, στους οποίους ενσωματώθηκαν 5 μονάδες κατιονικής σπερμίνης (zip nucleic acids, ZNAs) με στόχο την αύξηση της θερμοκρασίας τήξης (melting temperature, Tm). Οι παραπάνω τροποποιήσεις, επέτρεψαν τον υβριδισμό των εκκινητών στο εκμαγείο-στόχο ακόμα και σε περιπτώσεις που αυτό εμφάνιζε σποραδικούς νουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς, με αποτέλεσμα την δυνατότητα ανίχνευσης στελεχών SRLVs με μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα. Η μείωση της αναλυτικής ευαισθησίας και ειδικότητας της δοκιμής λόγω των προαναφερθέντων τροποποιήσεων των εκκινητών, αντιμετωπίστηκε με την εισαγωγή ενός δεύτερου γύρου ενίσχυσης στην αντίδραση και την συνδυαστική χρήση ανιχνευτών TaqMan με ενσωματωμένα κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα (locked nucleic acids, LNAs). Η in silico αξιολόγηση και ο προσδιορισμός του προφίλ υβριδισμού των εκκινητών και των ανιχνευτών TaqMan κατέδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των διαθέσιμων στη GenBank αλληλουχιών pol των SRLVs θα ενισχυθεί επιτυχώς κατά την διενέργεια ημι-ένθετης PCR πραγματικού χρόνου. Η δοκιμή παρουσίασε γραμμικό εύρος ποσοτικοποίησης 3 log10 (3 – 3000) αντίγραφα DNA προϊού ανά αντίδραση και όριο ανίχνευσης τα 3,9 αντίγραφα DNA προϊού ανά αντίδραση. Η διαγνωστική απόδοση της δοκιμής αξιολογήθηκε σε σύνολο 72 οροθετικών και οροαρνητικών δειγμάτων από 12 ποίμνια προβάτων και αιγών. Το γονιδίωμα του προϊού των SRLVs ανιχνεύθηκε σε 31 από τα 36 οροθετικά (ELISA) δείγματα (86%), ενώ 10 από τα 36 (28%) οροαρνητικά εξεταζόμενα ζώα ήταν επίσης θετικά στην PCR. Παράλληλα, και με στόχο την περεταίρω αύξηση της διαγνωστικής ευαισθησίας της δοκιμής, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε πρωτόκολλο εκχύλισης DNA από τα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος με υψηλή απόδοση. Η αξιολόγηση κατέδειξε ότι για την ανίχνευση των SRLVs με PCR, ενδείκνυται η χρήση εκχυλισμάτων με συγκέντρωση DNA τουλάχιστον 500 ng, εξαιτίας του χαμηλού ποσοστού των μολυσμένων μονοκυττάρων. Η φυλογενετική ανάλυση που διενεργήθηκε σε 24 στελέχη SRLVs, κατέδειξε ότι οι ιοί αυτοί χαρακτηρίζονται από μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα στην Ελλάδα, με 9 στελέχη να προσδιορίζονται ως πιθανοί νέοι υπότυποι του γενότυπου Α, και 1 του γενότυπου Β. Οι ιοί του ενζωοτικού ενδορρινικού νεοπλάσματος των προβάτων (ΕΝΤV-1) και των αιγών (ENTV-2) ανήκουν στο γένος Betaretrovirus. Προκαλούν αδενοκαρκίνωμα (EEN) στις ηθμοειδείς ρινικές κόγχες των μικρών μηρυκαστικών, εξαιτίας της προσβολής των επιθηλιακών κυττάρων του ρινικού βλεννογόνου. Η διάγνωση του νοσήματος στηρίζεται πρωτίστως στα νεκροτομικά και ιστοπαθολογικά ευρήματα. H μη επαρκώς διερευνημένη γενετική παραλλακτικότητα των ιικών στελεχών του ENTV, καθώς και η ύπαρξη ενδογενών β-ρετροϊών στα ζώα, δυσχεραίνουν σημαντικά την ανίχνευση και το μοριακό χαρακτηρισμό τους. Ως αποτέλεσμα οι εξελικτικές τους σχέσεις είναι ανεπαρκώς μελετημένες διεθνώς, ενώ δεν έχουν αναφερθεί αξιόπιστες μοριακές δοκιμές που βασίζονται στη PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) για τη διάγνωση του ΕΕΝ στα πρόβατα. Στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων τεχνικών μοριακής ανίχνευσης του ΕΝΤV-1. Αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος 3΄-RACE για το μοριακό χαρακτηρισμό των β-ρετροϊών, ικανή να ανιχνεύει τον ENTV-1 και τον ENTV-2 και να τους διαχωρίζει από τους ενδογενείς β-ρετροϊούς. Η μέθοδος επέτρεψε τον εύκολο προσδιορισμό τμήματος της αλληλουχίας της περιοχής U3R η οποία παρουσιάζει ικανή γενετική παραλλακτικότητα έτσι ώστε να εξασφαλίσει τον διαχωρισμό του ENTV-1 από τους ενδογενείς β-ρετροϊούς καθώς και από τους εξωγενείς ENTV-2 και JSRV και είναι χρήσιμη για τον σχεδιασμό ειδικών εκκινητών. Με βάση τον αρχικό μοριακό χαρακτηρισμό τριών κυπριακών στελεχών του ENTV-1, σχεδιάστηκε ειδική PCR για την ενίσχυση και αλληλούχιση τμήματος του γονιδίου env (περιοχή ΤΜ) και της περιοχής U3 του ENTV-1 σε 14 στελέχη από διαφορετικές εκτροφές της Κύπρου. Η φυλογενετική ανάλυση κατέδειξε ότι τα κυπριακά στελέχη ομαδοποιούνται σε διακριτό κλάδο και παρουσιάζουν πολύ μικρές εξελικτικές αποστάσεις μεταξύ τους, γεγονός που υποδηλώνει μοναδικό γεγονός εισόδου ενός στελέχους ENTV-1 στην Κύπρο και κατόπιν μετάδοση του σε εκτροφές του νησιού. Επιπλέον στην παρούσα μελέτη για πρώτη φορά εντοπίσθηκε και χαρακτηρίσθηκε ελληνικό στέλεχος ENTV-1 σε αρχειακό εκχύλισμα DNA από νεοπλασματικές αλλοιώσεις, το οποίο ομαδοποιήθηκε σε κλάδο που περιλαμβάνει καναδικά και ισπανικά στελέχη. Οι αλληλουχίες του γονιδίου env (ΤΜ) του ENTV-1 που προσδιορίσθηκαν, έκαναν εφικτή την εύρεση ειδικών συντηρημένων περιοχών και την ανάπτυξη ευαίσθητης και αξιόπιστης ποσοτικής δοκιμής αντιστροφής μεταγραφής PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Η qRT-PCR επιτρέπει την ειδική και ευαίσθητη ανίχνευση του ENTV-1 σε ζωντανά ζώα αποτελώντας ένα αποτελεσματικό, χαμηλού κόστους διαγνωστικό εργαλείο, χρήσιμο σε προγράμματα επιτήρησης ή/και εκρίζωσης του ΕΕΑ. H αξιολόγηση της qRT-PCR σε ποίμνιο προβάτων της Κύπρου, κατέδειξε την υψηλή ευαισθησία της, καθώς η δοκιμή ανίχνευσε τον ιό ακόμα και σε ασυμπτωματικά ζώα-φορείς. Ο βέλτιστος τρόπος δειγματοληψίας και συντήρησης των δειγμάτων κατά την μεταφορά τους, για την ευαίσθητη μοριακή ανίχνευση του ENTV-1 σε ζωντανά ζώα είναι η εμβάπτιση των άκρων των στειλεών από την αριστερή και τη δεξιά ρινική κοιλότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα υδροχλωρικής γουανιδίνης εντός ενός σωληναρίου μικροφυγοκέντρου.