Einsatz kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) zur Differenzierung von Muskelfleisch verschiedener Tierarten
Authors: Decker Christina , Bunzel Mirko , Kuballa Thomas 
Published: June 2023

Die 1H‐NMR‐Spektroskopie ist eine geeignete Analysetechnik, um Lebensmittelverfälschungen (Food Fraud) aufzudecken. Besonders in Verbindung mit Metabolomics‐basierten Ansätzen ist es möglich, die Authentizität von Lebensmitteln zu prüfen. Durch die Betrachtung der Gesamtheit der Metaboliten wird ein charakteristisches Muster, ein sogenannter chemischer Fingerprint, erhalten. Hierdurch lassen sich Unterschiede oder Veränderungen zwischen verschiedenen Proben feststellen. So können komplexe Fragestellungen, wie solche nach der Unterscheidung von konventionell oder biologisch erzeugten Eiern, der geografische Herkunft von Saft, Wein und Fleisch oder der botanischen Herkunft von Honig beantwortet werden. Außerdem können mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie zielgerichtet einzelne Markerverbindungen identifiziert und quantifiziert werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Metabolomics‐basierte Ansätze zur Authentizitätsprüfung von Muskelfleisch zu entwickeln. Durch die Kombination von 1H‐NMR‐Spektroskopie und multivariaten statistischen Verfahren sollten Analysemethoden entwickelt werden, die eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Tierarten ermöglichen. Die Metaboliten von Muskelfleisch verschiedener Tierarten sollten auf der Basis verschiedener NMR‐Methoden charakterisiert und auf Unterschiede untersucht werden. Mögliche identifizierte Markerverbindungen, mittels derer sich die Tierarten voneinander unterscheiden lassen, sollten mittels quantitativer NMR bestimmt werden.

Zunächst wurden geeignete Extraktionsmethoden für die Analyse von unpolaren und polaren Metaboliten aus Muskelfleisch entwickelt. Zur Extraktion der unpolaren Metaboliten wurde eine modifizierte FOLCH‐Methode (Chloroform, Methanol, Wasser (10:5:1; v/v/v)) gewählt. Sie zeichnet sich bei maximaler Analyterfassung durch einen geringeren Lösungsmittelverbrauch und Arbeitsaufwand als die ursprüngliche Methode nach Folch aus. Für die wässrigen Extrakte wurden verschiedene Proteinentfernungsmethoden getestet, da Proteine die Basislinie der 1H‐NMR‐Spektren negativ beeinflussen. Die Ultrafiltration an einer 3 kDa‐Filtermembran zeigte die besten Ergebnisse bei der Entfernung der Fleischproteine.

Beide Extrakte wurden mittels verschiedener NMR‐Experimente untersucht, um möglichst viele Metaboliten zu identifizieren. Für das polare Extrakt konnten 32 Metaboliten aus verschiedenen Stoffklassen (Aminosäuren, Kohlenhydrate, organische Säuren, Purinderivate, Imidazol‐Dipeptide und quartäre Ammoniumverbindungen) identifiziert werden. Ebenso war es möglich, die verschiedenen Lipidklassen im unpolaren Extrakt zu charakterisieren. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit Hilfe von Standardsubstanzen sowie durch den Vergleich der chemischen Verschiebungen und Kopplungskonstanten mit gängigen Datenbanken und Literaturquellen verifiziert.

Für den Aufbau und die Validierung von Klassifizierungsmodellen zur Differenzierung der Tierarten wurden insgesamt 437 authentische Muskelfleischproben mit Hilfe der nontargeted Methoden für polare (n=418) sowie unpolare (n=437) Metaboliten analysiert. Die Messung der Proben erfolgte an einem 400 MHz Spektrometer, und nach der Prozessierung der 1H‐NMR‐Spektren wurden die Daten für eine multivariate Datenanalyse vorbehandelt. Mittels Hauptkomponentenanalyse wurde eine Reduzierung und Vereinfachung der Dimensionalität der Daten erreicht. Auf die erhaltenen relevanten Scores der Hauptkomponentenanalyse wurde anschließend eine lineare Diskriminanzanalyse angewendet. Durch eine parallel ablaufende eingebettete Monte‐Carlo‐Kreuzvalidierung konnten die Muskelfleischproben klassifiziert werden. Die Klassifizierungsgenauigkeiten lagen bei Anwendung beider Modelle über 96 %.

Mithilfe einer mid‐level‐Datenfusionierung wurden die erhaltenen spektralen Informationen der non‐targeted Ansätze für die polaren und unpolaren Metaboliten kombiniert, um ein Klassifizierungsmodell zu erstellen, das die Gesamtheit der chemischen Information enthält. Das Hauptziel der Datenfusionierung sollte die Erhöhung der Vorhersagegenauigkeit des erstellten Modells sein. Da bereits durch die Einzelmodelle die Vorhersagegenauigkeiten in einem sehr guten Bereich lagen, war die Erhöhung der Genauigkeit jedoch nur nebensächlich. Vielmehr konnte die Streuung der Muskelfleischproben innerhalb der jeweiligen Probencluster reduziert werden, wodurch die Grenzen des 95 %igen Konfidenzintervalls minimiert wurden. Durch die Kombination der Datensätze konnte somit eine verbesserte Trennung der Einzelcluster im Raum erreicht werden, da die absoluten Abstände zwischen den Probenclustern größer wurden.

Es war ebenfalls möglich für verarbeitete Fleischprodukte über die Analyse der polaren bzw. unpolaren Metaboliten die Tierarten zu differenzieren. Die durchschnittlichen Klassifizierungsgenauigkeiten der Einzelmodelle lagen bei 97 % für das unpolare Modell und bei 94 % für das polare Modell. Mittels m/d‐/eve/ Datenfusionierung konnte die Klassifizierungsgenauigkeit nicht verbessert werden. Die Streuung innerhalb einzelner Probencluster konnte durch die Kombination der verschiedenen Informationsquellen minimiert werden. Damit verbunden wurde ebenfalls das 95 %igen Konfidenzintervall reduziert.

Im zweiten Teil der Arbeit konnten mithilfe der Load/ngs Schlüsselmetaboliten, die zu der Differenzierung der Tierarten beitragen, identifiziert werden. Die Differenzierung ist nicht an der Abwesenheit oder dem Vorhandensein einzelner Signale oder bestimmter Verbindungen festzumachen. Vielmehr ist es ein Zusammenspiel aus unterschiedlichen Metaboliten, die in unterschiedlichen Konzentrationen in den Tierarten enthalten sind. Für die unpolaren Metaboliten stand vor allem der Anteil der ungesättigten Fettsäuren und der trans‐Fettsäuren in Vordergrund. Bei den polaren Metaboliten waren Imidazol‐Dipeptide, Verbindungen aus dem Purinstoffwechsel und quartäre Ammoniumverbindungen einflussreiche Faktoren. Die Imidazol‐Dipeptide L‐Carnosin und L‐Anserin konnten direkt mit der zuvor entwickelten 1H‐ NMR‐Spektroskopie‐basierten targeted Methode quantifiziert werden. Über die Verteilung der Imidazol‐Dipeptide und besonders über ihre Verhältnisse (CAR/ANS) ist es bereits bedingt möglich, verschiedene Tierarten voneinander zu differenzieren. Es war jedoch nicht möglich, alle untersuchten Tierarten lediglich über das CAR/ANS‐Verhältnis zu unterscheiden. So konnten Rind‐ und Schaffleisch aufgrund ähnlicher CAR/ANS‐Verhältnisse nicht differenziert werden. Ebenso konnten Puten‐ und Hühnerfleisch nicht über das Verhältnis unterschieden werden.

Abschließend wurde auf Grundlage der erhaltenen Ergebnisse versucht, mit den entwickelten methodischen Ansätzen Muskelfleischproben derselben Tierart zu differenzieren. Authentische Proben von Schwäbisch‐Hällischem Qualitätsschweinefleisch (n=100) mit geschützter geografischer Angabe konnten von Nicht‐Schwäbisch‐Hällischem Schweinefleischproben (n=175) differenziert werden. Dabei wurde nach mid‐level Datenfusionierung eine Vorhersagegüte von über 95 % erreicht. Die entwickelten non‐targeted Methoden bieten somit Möglichkeiten für weitere Fragestellungen im Bereich Authentizität von Fleisch. Mögliche Anwendungsbeispiele sind die Differenzierung von Fleisch aus konventioneller und ökologischer Tierhaltung und Untersuchungen zur Unterscheidung der geografischen Herkunft. Schließlich wäre auch eine Unterscheidung von Kalb‐ und Rindfleisch bzw. Schweine‐ und Wildschweinfleisch ein möglicher Untersuchungsansatz.