Λειτουργική ανάλυση και ισοδυναμία μονομερών και διμερικών 14-3-3 κατά τη γήρανση και εκφυλισμό του νευρικού συστήματος
Authors: Λεπτουργίδου Φλώρα 
Published: January 2014

Οι 14-3-3 αποτελούν μια οικογένεια ευκαρυωτικών, μικρών σε μοριακό βάρος πρωτεϊνών, με όξινες ιδιότητες, που διαδραματίζουν ρόλο στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών διαδικασιών. Η μύγα Drosophila melanogaster περιέχει δύο γονίδια που κωδικοποιούν για ισομορφές 14-3-3 πρωτεϊνών, τα ε και ζ (Leonardo) που κωδικοποιούν για μία και τρεις ισομορφές αντίστοιχα, ενώ στο μαστιγοφόρο παράσιτο Giardia duodenalis εντοπίζεται μόνο ένα γονίδιο. Στην παρούσα εργασία αναφέρουμε την ύπαρξη μιας καινούριας, τρίτης λειτουργικής ισομορφής της πρωτεΐνης LEO, που κωδικοποιείται από το γονίδιο leo και η οποία διαφέρει από τις άλλες δύο σε δομικά και λειτουργικά σημαντικές περιοχές. Έτσι, αυξάνεται η ποικιλομορφία των 14-3-3 στη Drosophila. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μια νέα προσέγγιση μείωσης της έκφρασης του leo σε συγκεκριμένες περιοχές με την τεχνική του παρεμβαλλόμενου RNA και δείξαμε διαφορές στην κατανομή της LEO σε κεφάλια ενήλικων μυγών, με την LEOIII να εμφανίζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης στους νευρώνες που είναι υπεύθυνοι για τη μνήμη και τη μάθηση στη Drosophila. Μέρος της διατριβής επίσης αποτελεί μια μελέτη επί της εξέλιξης της οικογένειας των 14-3-3. Οι διάφορες ισομορφές των 14-3-3 πρωτεϊνών εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των διαφόρων ειδών και διακρίνονται σε δύο ομάδες: α) την τυπική και την β) άτυπη ομάδα. Οι ισομορφές της 14-3-3ζ της Drosophila, ανήκουν στην τυπική ομάδα και η 14-3-3ε στην άτυπη. Η 14-3-3 της Giardia (g14-3-3), εμφανίζει μεγάλη ομολογία σε επίπεδο αλληλουχίας με την 14-3-3ε. Η διαπίστωση των ομοιοτήτων των 14-3-3 σε επίπεδο δομής και αλληλουχίας, μας οδήγησε να διερευνήσουμε την πιθανή λειτουργική συντήρηση των 14-3-3 μεταξύ της Drosophila και της Giardia. Δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν το cDNA της g14-3-3 και παράλληλα διαμολύναμε κύτταρα της Giardia με 14-3-3 cDNA της Drosophila. Από τις τρεις διαφορετικές ισομορφές της 14-3-3ζ της Drosophila επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε το cDNA της LeoI που θεωρείται ως η ευρύτερα εκφραζόμενη στους ιστούς της. Στην εργασία αυτή παρουσιάζονται αποτελέσματα της έκφρασης και της μετα-μεταφραστικής τροποποίησης των πρωτεϊνών στους διαφορετικούς οργανισμούς που εισήχθησαν. Παρά την ικανότητα της Giardia να πραγματοποιεί ορισμένες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στις 14-3-3 της Drosophila η αμοιβαία ανάλυση υποδεικνύει πως δεν υφίσταται λειτουργική συντήρηση μεταξύ της δροσοφιλικής 14-3-3ε και της g14-3-3. Το τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής αφορά στη δράση της 14-3-3ζ στις λειτουργίες μάθησης και μνήμης στη μύγα Drosophila melanogaster. Ο σημαντικός ρόλος της 14-3-3ζ στις συγκεκριμένες διαδικασίας έχει αποδοθεί εξαιτίας του υψηλού βαθμού συσσώρευσης στα μανιταροειδή σωμάτια και λόγω του ότι μεταλλαγές που επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασής της εμφανίζουν ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης. Θέλοντας να χαρτογραφήσουμε τις ακριβείς περιοχές δράσης της LEO για τη λειτουργία της συνειρμικής εξαρτημένης μάθησης, πραγματοποιήσαμε ιστοειδική σίγηση του γονιδίου με την τεχνική του παρεμβαλόμενου RNA (RNAi). Προς έκπληξή μας, παρατηρήσαμε πως η έλλειψη της LEO από τα μανιταροειδή σωμάτια δεν προκαλούσε ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης, αλλά είχε σημαντικές συνέπειες στη διαδικασία μακροπρόθεσμης μνήμης. Αντιθέτως, η έλλειψη της από τους νευρώνες που παράγουν ντοπαμίνη προκαλούσε ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης. Περαιτέρω ανάλυση, έδειξε πως ο τελευταίος φαινότυπος συνδεόταν με τη μη φυσιολογική απόκριση των μυγών σε διαδικασίες μη εξαρτημένης μάθησης. Επειδή, η ντοπαμίνη έχει σχετιστεί με ανάλογες συμπεριφορές, προτείνουμε πως ο ελλειμματικός φαινότυπος των μεταλλαγμένων στελεχών, οφείλεται σε διαδικασίες μη εξαρτημένης μάθησης μέσω του βιοχημικού μονοπατιού σύνθεσης ή μεταφοράς της ντοπαμίνης. Πρέπει επίσης να σημειωθεί πως, αν και μέρος της διατριβής, η αρχική υπόθεση της μελέτης της ισοδυναμίας μονομερών και διμερών 14-3-3 πρωτεΐνών στο ΚΝΣ δεν διερευνήθηκε περεταίρω μιας και αρχικά πιλοτικά πειράματα έδειξαν την αδυναμία των μονομερών 14-3-3ζ της Drosophila να αποκαταστήσει τον φαινότυπο θνησιμότητας που προκαλεί η απουσία της αντίστοιχης πρωτεΐνης στη μύγα. Επιπλέον, δείχθηκε πως in vivo και σε συνθήκες ομοιόστασης μεταξύ των διαφορετικών 14-3-3 πρωτεΐνών στη μύγα ο διμερισμός είναι απαραίτητος για τη σταθερότητα και τη λειτουργικότητα της 14-3-3ζ και πως η μονομερής μορφή της είναι ασταθής in vivo και προκαλέι φαινοτύπους αρνητικά επικρατών μεταλλαγών (Messaritou et al., submitted).