Ανοσογενετικές ενδείξεις για την οντογένεση της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας
Authors: Βαρδή Άννα 
Published: September 2021

Η CLL είναι η συχνότερη λευχαιμία των ενηλίκων στη Δύση. Πρόκειται για ανίατη πάθηση, ωστόσο πολύ ετερογενή ως προς την κλινική πορεία και την απάντηση στη θεραπεία. Αυτή η κλινική ετερογένεια φαίνεται να συνδέεται με ετερογένεια σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Η έρευνα των τελευταίων ετών αποκάλυψε ότι η CLL διακρίνεται σε υποκατηγορίες με ξεχωριστά βιολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν στο γενωμικό και επιγενωμικό προφίλ (χωρίς ωστόσο να υπάρχουν συγκεκριμένες βλάβες που χαρακτηρίζουν μεγάλο ποσοστό ασθενών), αλλά και σε δομικές/σηματοδοτικές ιδιαιτερότητες του κλωνοτυπικού Β-κυτταρικού υποδοχέα (B-cell receptor, BcR)247.Η ανοσογενετική ανάλυση των κλωνοτυπικών BcR στη CLL υπήρξε αποκαλυπτική για την παθογένεια της νόσου. Η έντονη επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών62, η διαφορετική πρόγνωση των ασθενών ανάλογα με την κατάσταση μεταλλάξεων των γονιδίων της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IGHV)63,64 και, κυρίως, η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με παρόμοιους, στερεότυπους BcR (30% του συνόλου των ασθενών με CLL)74,76,100, αποτελούν ισχυρές ενδείξεις επιλογής του κλώνου από αντιγόνο(-α), χωρίς ωστόσο να έχει διευκρινιστεί η φύση αυτών των αντιγόνων, ούτε το πού, πότε και για πόσο διάστημα επιδρούν. Αυτές οι παρατηρήσεις αποτέλεσαν τη βάση για την πρόσφατη ανάπτυξη και εφαρμογή στην κλινική πράξη βιολογικών θεραπειών που στοχεύουν το σηματοδοτικό μονοπάτι του ΒcR, με θεαματικά αποτελέσματα214,216.Εκτός από τη σηματοδότηση μέσω του BcR, ο λευχαιμικός κλώνος της CLL φαίνεται να αλληλεπιδρά ποικιλοτρόπως με το μικροπεριβάλλον του προκειμένου να εκμεταλλευτεί σήματα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού και ταυτόχρονα να αποφύγει την ανοσοεπιτήρηση217,219. Ανοσοτροποποιητικά φάρμακα που δρουν στο επίπεδο της άνοσης σύναψης μεταξύ Β και Τ λεμφοκυττάρων δοκιμάζονται σήμερα σε κλινικές μελέτες, με υποσχόμενα αποτελέσματα218,231.H ανοσολογική προσέγγιση της CLL πρέπει να μπορεί να ερμηνεύσει και την ύπαρξη της CLL-like μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης (CLL-like monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL). Ο όρος περιγράφει την παρουσία κλωνικού Β λεμφοκυτταρικού πληθυσμού με τυπικό ανοσοφαινότυπο CLL στο περιφερικό αίμα, με μέγεθος μικρότερο από το απαιτούμενο για τη διάγνωση της CLL, δηλαδή <5000 κλωνικά Β λεμφοκύτταρα/μL. Η CLL-like MBL είναι οντότητα συχνή στο γενικό πληθυσμό, με επίπτωση ~10% η οποία αυξάνει με την ηλικία και με την ευαισθησία της μεθόδου ανίχνευσης και θεωρείται προκαρκινική κατάσταση της CLL, επειδή μεταπίπτει σε CLL που απαιτεί θεραπεία με ρυθμό 1-2% ανά έτος154. Αν όμως τα κλωνικά κύτταρα της MBL αντιστοιχούν σε πρόγονους κυττάρων CLL, γιατί δε μεταπίπτουν όλες οι περιπτώσεις MBL σε CLL;Διερευνήσαμε την οντογένεση της CLL από ανοσογενετική σκοπιά, κινούμενοι σε τρεις άξονες: (i) ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στην MBL, προκειμένου να διαπιστωθούν ανοσογενετικές ομοιότητες ή διαφορές με τη CLL και μάλιστα τη CLL πρώιμου σταδίου (CLL-0), (ii) ανάλυση της CLL με εναλλαγή ισοτύπου, μια ειδική υποκατηγορία CLL, προκειμένου να διερευνηθεί αν η εναλλαγή ισοτύπου συνοδεύεται κι από άλλα ειδικά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά που μπορεί να προσανατολίσουν ως προς το είδος αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο(-α), και (iii) μελέτη του ρεπερτορίου των Τ κυτταρικών υποδοχέων (TR) στα Τ λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ, προκειμένου να διερευνηθεί η αλληλεπίδρασή τους με (αλλο-, αυτο-, ογκο-)αντιγόνα. Μελετήθηκαν 333 περιπτώσεις CLL-like MBL από συνεργαζόμενα κέντρα Ελλάδας, Ευρώπης και Η.Π.Α (60 με LC-MBL και 273 με HC-MBL). To ρεπερτόριo των γονιδίων IG διέφερε μεταξύ LC-MBL και HC-MBL. Ωστόσο, το ρεπερτόριο των γονιδίων IG της HC-MBL προσομοίαζε εκείνο της CLL πρώιμου κλινικού σταδίου (Rai 0). Επιπλέον, αναζητήσαμε έκφραση στερεότυπων BcR IGs εφαρμόζοντας ανάλυση ομαδοποίησης στο σύνολο των αλληλουχιών MBL, CLL, καθώς και των αλληλουχιών που ανασύρθηκαν από τη δημόσια βάση δεδομένων IMGT/LIGM-DB. Μόλις 5.5% των αναδιατάξεων LC-MBL ομαδοποιήθηκαν με άλλες αλληλουχίες, που προέρχονταν από ασθενείς με CLL, άλλα λεμφοϋπερπλαστικά ή αυτοάνοσα νοσήματα και συνεπώς χαρακτηρίστηκαν ως "κοινές" (public) στερεότυπες BcR IG. Αντίθετα, στη HC-MBL ανιχνεύθηκε σαφώς μεγαλύτερη συχνότητα ειδικών για τη CLL στερεοτύπων BcR IGs, με 23.3% των περιπτώσεων να φέρουν ταυτόσημες BcR IGs είτε με άλλες περιπτώσεις HC-MBL είτε με περιπτώσεις CLL. Μάλιστα, αυτή η συχνότητα ήταν παρόμοια με την αντίστοιχη για τη CLL Rai-0 (20.2%). Συνολικά, παρατηρήθηκε βαθμιαία αύξηση της συχνότητας στερεοτυπίας που ακολουθεί την αύξηση του απόλυτου αριθμού των κλωνικών Β κυττάρων, ξεκινώντας με 5.5% στη LC-MBL, αυξανόμενη σε 23.3-20.2% στη HC-MBL/CLL Rai-0 και τελικά κορυφούμενη σε 30.4% στη CLL όλων των σταδίων. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πως η LC-MBL δεν αντιστοιχεί σε πραγματική προκαρκινική κατάσταση, αντίθετα μπορεί να αποτελεί επιφαινόμενο χρόνιου αντιγονικού ερεθισμού ή ανοσολογικής γήρανσης. Από την άλλη μεριά, η HC-MBL παρουσιάζει μεγάλες ανοσογενετικές ομοιότητες με τη CLL-, και πιθανώς αντιστοιχεί σ' ένα πρωιμότερο στάδιο που χρειάζεται είτε επιπρόσθετες γενετικές βλάβες είτε απλά περισσότερο χρόνο για να ξεπεράσει το αριθμητικό -και όχι βιολογικό- κατώφλι των 5000 κλωνικών Β κυττάρων/μL αίματος. H αναγνώριση μοριακών δεικτών ικανών να προβλέψουν την εξέλιξη της HC-MBL/CLL Rai-0 σε CLL που απαιτεί θεραπεία θα είχε ιδιαίτερη κλινική σημασία.Στη συνέχεια, μελετήσαμε το ανοσογενετικό προφίλ 169 ασθενών με CLL γάμμα ισοτύπου (G-CLL) σε σχέση με 1087 ασθενείς με κλασική CLL χωρίς εναλλαγή ισοτύπου (ΜD-CLL). Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV διέφερε σημαντικά μεταξύ G-CLL και MD-CLL, με υπερεκπροσώπηση των γoνιδίων IGHV4-34 και IGHV4-39, και υποεκπροσώπηση των γονιδίων IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48, αντιστοίχως. Η G-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό περιπτώσεων με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV σε σχέση με την MD-CLL. Αντίθετα, η MD-CLL περιλάμβανε σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό περιπτώσεων με πλήρως αμετάλλακτα γονίδια IGHV (100% ταυτότητα με τη βλαστική σειρά) σε σχέση με τη G-CLL. Η αναζήτηση ειδικών για τη CLL στερεότυπων BcR IGs αποκάλυψε πως η ακραία επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου της G-CLL οφείλεται στο γεγονός ότι σχεδόν το 1/3 των περιπτώσεων αφορά σε ασθενείς που κατατάσσονται σε τρία συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα: #4 και #16, που χρησιμοποιούν το γονίδιο IGHV4-34 με SHMs, και #8, που χρησιμοποιεί το γονίδιο IGHV4-39 σε πλήρως αμετάλλακτη μορφή (18.3%, 4%, και 7.3% της G-CLL, αντιστοίχως). Αυτά τα υποσύνολα, ιδίως το υποσύνολο #4 και το υποσύνολο #8, έχουν πολύ διαφορετική πρόγνωση, με τους ασθενείς του υποσυνόλου #4 να ακολουθούν εξαιρετικά ήπια κλινική πορεία και τους ασθενείς του υποσυνόλου #8 να εμφανίζουν ιδιαίτερα επιθετική νόσο που συχνά επιπλέκεται με εκτροπή σε λέμφωμα υψηλής κακοήθειας (σύνδρομο Richter). Σε σαφή αντίθεση με τα στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV4-34 και IGHV4-39, όλα τα πολυπληθή στερεότυπα υποσύνολα που χρησιμοποιούν τα γονίδια IGHV1-69, IGHV3-21, IGHV1-2 και IGHV3-48 παρατηρήθηκαν αποκλειστικά στην MD-CLL. H G-CLL χαρακτηρίζεται από ειδική ανοσογενετική υπογραφή σε σχέση με την MD-CLL, ακόμη και όταν η σύγκριση περιοριστεί σε περιπτώσεις με μεταλλαγμένες BcR IGs. Αυτό το γεγονός υπαινίσσεται διαφορετική οντογενετική προέλευση ή/και άνοση διέγερση της G-CLL συγκριτικά με την κοινή ΙgM/D ποικιλία και υποκινεί ερωτήματα σχετικά με τη χρονική ακολουθία εναλλαγής ισοτύπου και κακοήθους εξαλλαγής.21 Σε κάθε περίπτωση, η υποδειγματική περίπτωση του στερεότυπου υποσυνόλου #8 δείχνει πως οι διεργασίες CSR και SHM μπορεί να συμβαίνουν ανεξάρτητα στη CLL.Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη τον κρίσιμο ρόλο που φαίνεται να παίζει το αντιγόνο(-α) στη φυσική ιστορία του CLL κλώνου, διερευνήσαμε τις άνοσες επιδράσεις που διαμορφώνουν το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Η αρχική, προκαταρκτική προσέγγιση αφορούσε χαρακτηρισμό του Τ ρεπερτορίου με μεθόδους κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger. Aναλύθηκαν 58 ασθενείς με CLL που επιλέχθηκαν κυρίως με βάση την κατάταξή τους σε γνωστά, καλά χαρακτηρισμένα στερεότυπα υποσύνολα της CLL (υποσύνολα #1, #2 και#4), με το σκεπτικό ότι η στερεοτυπία αποτελεί την πιο ισχυρή ένδειξη επιλογής του CLL κλώνου από αντιγόνο. Η μελέτη ανέδειξε επιλεκτικότητα και ολιγοκλωνικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, καθώς και κοινούς Τ κλωνοτύπους μεταξύ διαφορετικών ασθενών, ένδειξη επιλογής από κοινό αντιγόνο. Ωστόσο, οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν, παρότι καθιερωμένες, αποδίδουν χαμηλής κλίμακας ανάλυση ρεπερτορίων που δεν είναι αμιγώς μονοκλωνικά, γεγονός που εμπόδιζε την εξαγωγή οριστικών συμπερασμάτων. Έτσι, επιχειρήσαμε να εμβαθύνουμε την ανάλυσή μας αξιοποιώντας τεχνικές μαζικής αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing) προκειμένου να χαρτογραφήσουμε ενδελεχώς το ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων στη CLL. Επειδή η αλληλούχηση προϊόντων PCR με NGS αποτελεί καινοτόμο τεχνική στον τομέα της ανοσογενετικής με συγκεκριμένους περιορισμούς και εγγενείς αδυναμίες, επιλέξαμε μια συστηματική, αυστηρή προσέγγιση συμπεριλαμβάνοντας πολλών ειδών εσωτερικά και εξωτερικά controls, και αναπτύξαμε εξειδικευμένα βιοπληροφορικά εργαλεία για τη διαχείριση, τον ποιοτικό έλεγχο και την ερμηνεία των παραγόμενων δεδομένων. Συνολικά αναλύθηκαν 32 ασθενείς με CLL. Συμπεριλήφθηκαν ασθενείς που κατατάσσονταν σε στερεότυπα υποσύνολα (υποσύνολα #1, #2 και#4), αλλά και ασθενείς με ετερογενείς BcR IG (μεταλλαγμένες ή αμετάλλακτες), ώστε να διαπιστώσουμε ανοσογενετικά χαρακτηριστικά του Τ ρεπερτορίου που είναι κοινά για όλη τη CLL. Η μελέτη επιβεβαιώνει την επιλεκτικότητα του Τ ρεπερτορίου στη CLL, με ευρήματα ολιγοκλωνικότητας που έρχονται σε αντίθεση με το πολυκλωνικό προφίλ υγιών μαρτύρων αντίστοιχης ηλικίας και παραπέμπουν σε επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων από αντιγόνο(-α). Η ανάλυση διαχρονικών δειγμάτων έδειξε ότι ο αντιγονικός ερεθισμός παραμένει στο χρόνο, οδηγώντας τους αντίστοιχους Τ-κυτταρικούς κλώνους σε περαιτέρω έκπτυξη. Εξάλλου, η διαπίστωση κοινών Τ κλωνοτύπων μεταξύ ασθενών, ιδίως αυτών που κατατάσσονται στο ίδιο στερεότυπο υποσύνολο, αναδεικνύει μοριακές υπογραφές ειδικές για τη CLL, με προεκτάσεις για τη διερεύνηση μηχανισμών άρσης της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Πώς συνοψίζονται όλα τα παραπάνω σ' ένα κοινό παθογενετικό σενάριο για τη CLL; Σίγουρα υπάρχουν πολλά σημεία της οντογένεσης της νόσου που παραμένουν σκοτεινά ή αμφιλεγόμενα. Θα μπορούσαμε όμως να υποθέσουμε ότι σε μια προνεοπλασματική φάση, Β κύτταρα με ή χωρίς γενετική προδιάθεση για ανεξέλεγκτο κλωνικό πολλαπλασιασμό δέχονται εμμένοντα αντιγονικό ερεθισμό, είτε από εξωγενή είτε από ενδογενή αντιγόνα, και οδηγούνται σε ολιγο- ή πολυκλωνική έκπτυξη. Στα πλαίσια αυτά, μπορεί να υποβάλλονται σε SHM/CSR ανάλογα με την προέλευσή τους (κλασικά Β2 κύτταρα, Β1 κύτταρα, Β κύτταρα οριακής ζώνης;) ή/και ανάλογα με τη φύση της αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο, ενώ κατά τον κλωνικό πολλαπλασιασμό τους ίσως αποκτούν γενετικές βλάβες που σχετίζονται με το φαινότυπο της CLL. Έτσι, μπορεί να προκύψει η LC-MBL, που παραμένει σταθερή στο χρόνο, εκτός αν επιπρόσθετες γενετικές/επιγενετικές αλλαγές ή οι ίδιες οι λειτουργικές ιδιότητες της BcR IG (π.χ. πολυαντιδραστικότητα ή/και ικανότητα ομότυπων αλληλεπιδράσεων για αυτόνομη σηματοδότηση μέσω του BcR) οδηγήσουν γρήγορα στη φάση της HC-MBL, η οποία εμφανίζει κακόηθες δυναμικό και, με το πέρασμα του χρόνου και εφόσον επιδράσουν κατάλληλα σήματα μέσω του BcR ή/και από το μικροπεριβάλλον, θα μεταπέσει σε CLL που απαιτεί θεραπεία.