Ανάπτυξη μεθόδου δεσμευτικής αναλύσεως για την ανίχνευση-προσδιορισμό βιομορίων σε βιολογικά δείγματα
Authors: Μαυρογιαννοπούλου Ελισσάβετ 
Published: January 2014

Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη ευαίσθητης, ταχείας και με υψηλή διακριτική ικανότητα μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση των μεταλλάξεων 3099delT, R1751X, 5382insC, G1738R, 5586G>A, R1203X και 3741insA του ογκοκατασταλτικού γονιδίου BRCA1 μέσω υβριδισμού στερεάς φάσης με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων (ΟΝΤ) και βιοαισθητήρα. Η επιλογή των παραπάνω μεταλλάξεων βασίστηκε στο γεγονός ότι οι μεταλλάξεις αυτές καλύπτουν το 67% του συνόλου των σημειακών μεταλλάξεων (αντικαταστάσεις, απαλειφές και ενθέσεις) του γονιδίου BRCA1 σε Ελληνικές οικογένειες με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου μαστού ή/και ωοθηκών. Στα πλαίσια της ερευνητικής εργασίας για την επίτευξη των παραπάνω πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη νέας μεθόδου ακινητοποίησης ΟΝΤ σε στερεές επιφάνειες που περιελάμβανε πρόσδεση συζευγμάτων στρεπταβιδίνης με βιοτινυλιωμένα ΟΝΤ (β-ΟΝΤ) σε επιφάνεια στην οποία είχε προσροφηθεί βιοτινυλιωμένη αλβουμίνη ορού βοός (β-BSA). Με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε κατασκευάστηκαν μικροσυστοιχίες με εναπόθεση μικροκηλίδων οι οποίες παρουσίασαν υψηλότερη επιφανειακή πυκνότητα, ικανότητα υβριδισμού των ακινητοποιημένων ΟΝΤ και ευαισθησία (όριο ανίχνευσης 6 x 10-11 Μ) σε σύγκριση με μικροσυστοιχίες που προέκυψαν βάσει πρωτοκόλλων της βιβλιογραφίας τα οποία περιελάμβαναν είτε πρόσδεση β-ΟΝΤ σε επιφάνεια που φέρει στρεπταβιδίνη ακινητοποιημένη άμεσα στο στερεό (όριο ανίχνευσης 2,31 10-9 Μ) είτε σε στρεπταβιδίνη ακινητοποιημένη μέσω στοιβάδας β-BSA (όριο ανίχνευσης 1,07 10-9 Μ). Επιπλέον, για την ενίσχυση ειδικών αλληλουχιών του γονιδίου BRCA1 στις οποίες εντοπίζονταν οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός κατάλληλων εκκινητών και ανάπτυξη πρωτοκόλλων στο θερμοκυκλοποιητή για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης. Για την ταυτόχρονη ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου, όταν χρησιμοποιήθηκαν συστοιχίες οι οποίες είχαν προκύψει από ακινητοποίηση αναγνωριστικών β-ΟΝΤ κοινού μήκους, όπως προτείνεται στην πλειοψηφία των μεθόδων της βιβλιογραφίας, βρέθηκε ότι δεν ήταν δυνατή η αξιόπιστη διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλουχιών ακόμα και μετά από τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων υβριδισμού και εκπλύσεων. Για το λόγο αυτό βελτιστοποιήθηκε το μήκος των β-ΟΝΤ ακινητοποίησης για κάθε μία μετάλλαξη (3099delT: 24bs, R1751X: 14bs, 5382insC: 16bs, G1738R: 16bs, 5586G>A: 17bs, R1203X: 16bs και 3741insA: 17bs). Με αυτόν τον τρόπο επιτεύχθηκαν λόγοι ειδικού (φυσιολογικό/φυσιολογικό) προς μη ειδικό (φυσιολογικό/μεταλλαγμένο) σήμα υβριδισμού, κατά την ανίχνευση σε μίγμα φθορισμοεπισημασμένων συνθετικών ΟΝΤ, οι οποίοι κυμαίνονταν από 7 έως 47. Οι παραπάνω τιμές των λόγων είναι πολύ υψηλότερες από αυτές που αναφέρονται σε δημοσιευμένη μελέτη στην οποία οι λόγοι διαχωρισμού που ελήφθησαν κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 κυμαίνονταν από 1 έως 8. Χρησιμοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες της δεσμευτικής αντίδρασης πραγματοποιήθηκε ανάλυση για όλες τις μεταλλάξεις σε δείγματα εννέα φυσιολογικών ατόμων και τριών ασθενών. ...............................................................................................................................................