Laboratory Diagnostic Technology for Simultaneous Determination in a Sample of the Analyzed Material (Tissue, Biological Fluid) of Homocysteine and Other Physiologically Active Aminothiols Using Highly Efficient Liquid Chromatography
Authors: Дорошенко Е.М. , Новогродская Я.И. 
Published: April 2022

Введение. Существующие методы определения гомоцистеина в плазме (сыворотке) крови не могут быть использованы для определения в тканях из-за их недостаточной разрешающей способности. Цель. Разработать способ одновременного определения гомоцистеина и других биологически важных аминотиолов в тканях, пригодный также для биологических жидкостей. Материалы и методы. Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография с предколоночной дериватизацией, градиентным элюированием и детектированием по флуоресценции. Пробоподготовка: восстановление аминотиолов в гомогенатах тканей трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридом и дериватизация аммоний-7-фторбензол-2-оксо-1,3-диазола-4-сульфонатом. Результаты и обсуждение. Предложен новый способ параллельного определения в пробах анализируемого биологического материала основных представителей низкомолекулярных аминотиолов гомоцистеина (Hcy), цистеина (Cys), цистеинилглицина (CysGly), гамма-глутамилцистеина (GluCys) и глутатиона (GSH), пригодный для их определения в тканях. Оптимизированная селективность системы (рН и ионная сила буфера в подвижной фазе, температураи профиль градиента) позволила уверенно детектировать Hcy и основные аминотиолы тканей крыс. Метод может быть использован при проведении исследований в области экспериментальной медицины и биохимии. Заключение. Разработанный способ определения низкомолекулярных тиолсодержащих соединений в тканях методом ВЭЖХ c детектированием по флуоресценции после предколоночной дериватизации является воспроизводимым, чувствительным и пригодным для использования в экспериментальных и клинико-биохимических исследованиях.

Introduction. The existing methods of determination of blood plasma homocysteine cannot be applied for tissue samples due to insufficient resolution. Purpose. To develop a method for simultaneous determination of homocysteine and other biologically important aminothiols in tissues, which would be also suitable for biological fluids. Materials and methods. Reversed-phase high performance liquid chromatography with pre- column derivatization followed by gradient elution and fluorescence detection. Sample preparation: reduction of aminothiols in the homogenates of tissues with tris(2-carboxyethyl)phosphine and derivatization with 7-fluorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt. Results and discussion. We developed a new method for quantitative measurement of low- molecular weight aminothiols homocysteine (Hcy), cysteine (Cys), cysteinylglycine (CysGly), gamma-glutamylcysteine (GluCys), and glutathione (GSH) with resolution high enough for their determination in tissues. The optimized selectivity of the chromatographic system (рН and ionic strength of the buffer in mobile phase, temperature and profile of the gradient) let to detect the main aminothiols of rat tissues. The described method can be used in studies in the field of experimental medicine and biochemistry. Conclusion. The proposed method for determination of low molecular weight thiol-containing compoundsintissueswith HPLCmethodwithfluorescencedetectionafterpre-columnderivatization is reproducible, sensitive and suitable for use in experimental and clinical biochemical studies.