Ανάπτυξη μεθόδων πρόβλεψης της οικοτοξικολογικής συμπεριφοράς αναδυόμενων ρυπαντών (emerging pollutants)
Authors: Στεργιόπουλος Χρύσανθος 
Published: December 2023

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη μεθόδων για την πρόβλεψη της τοξικολογικής συμπεριφοράς αναδυόμενων ρυπαντών στο περιβάλλον. Ως αναδυόμενοι ρυπαντές ορίζονται δυνητικά τοξικές ουσίες, οι οποίες δε βρίσκονται φυσικά στο περιβάλλον, αλλά παρ’όλα αυτά έχουν τη δυνατότητα να εισέλθουν σε αυτό (πχ. φυτοφάρμακα, φάρμακα, είδη προσωπικής φροντίδας κ.ά.). Η περιβαλλοντική τοξικότητα που ενδιαφέρει την παρούσα διδακτορική διατριβή αναφέρεται στην περιβαλλοντική ευκινησία των αναδυόμενων ρυπαντών σε ζώντες οργανισμούς (βιοσυσσώρευση), καθώς και στις επιπτώσεις τους (π.χ. θανατηφόρα ή αποτελεσματική συγκέντρωση) σε αυτούς, ενώ η μελέτη επικεντρώνεται σε υδατικά συστήματα, τα οποία αποτελούν και τον τελικό αποδέκτη της δεδομένης ρύπανσης. Στόχος της Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων με βάση την βιομιμητική χρωματογραφία, οι οποίες να μπορούν να προταθούν ως αξιόπιστα εργαλεία πρόβλεψης και εκτίμησης του περιβαλλοντικού κινδύνου αναδυόμενων ρυπαντών. Στη βιομιμητική χρωματογραφία χρησιμοποιούνται στήλες με ακινητοποιημένα βιομόρια σε σκελετό πυριτίας ή προσομοιωτές βιομορίων (μικκύλια) στην κινητή φάση σε χρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως. Η αρχική υπόθεση βασίζεται στο γεγονός ότι τα διάφορα είδη λιποφιλίας που μετρώνται με τη βιομιμητική χρωματογραφία και τα οποία διέπουν τα διάφορα βιολογικά και φαρμακοκινητικά φαινόμενα, μπορούν να περιγράψουν και φαινόμενα που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση ξενοβιοτικών με βιολογικούς οργανισμούς και κατ’επέκταση την εμφάνιση τοξικότητας σε αυτούς. Ο παραδοσιακά χρησιμοποιούμενος δείκτης μερισμού οκτανόλης-νερού που εφαρμόζεται στην πρόβλεψη της οικοτοξικότητας οργανικών ενώσεων έχει πολλά μειονεκτήματα, όπως το δύσκολο, χρονοβόρο και κοπιαστικό πειραματικό προσδιορισμό του, την αδυναμία αυτοματοποίησης της μέτρησής του, καθώς και την αμφισβήτησή του ως μοντέλου προσομοίωσης βιολογικών αλληλεπιδράσεων. Επιπρόσθετα, η υπολογιστική πρόβλεψη του δείκτη οκτανόλης-νερού μέσω λογισμικών παρουσιάζει μεγάλες αποκλίσεις ως προς τις εκτιμώνες τιμές ανάλογα με τον αλγόριθμο στον οποίο βασίζεται η εκάστοτε πρόβλεψη. Αντίθετα, η βιομιμητική χρωματογραφία προσομοιάζει βιολογικά συστήματα με πραγματικά βιομόρια ή υποκατάστατα αυτών, παρέχει μετρήσεις αλληλεπίδρασης μεταξύ βιομορίων και ξενοβιοτικών σε πραγματικό χρόνο, ενώ ταυτόχρονα προσφέρει γρήγορες μετρήσεις, είναι φιλική προς το χρήστη και μπορεί να αυτοματοποιηθεί για μετρήσεις ρουτίνας.Βιομιμητικές χρωματογραφικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής είναι η χρωματογραφία ακινητοποιημένων τεχνητών μεμβρανών (IAM: Immobilized Artificial Membrane), η χρωματογραφία ακινητοποιημένων πρωτεινών (πρωτεΐνη λευκωματίνης ανθρωπίνου ορού – HSA: Human Serum Albumin και α1-όξινης γλυκοπρωτεΐνης – AGP: a1-Acid Glycoprotein), καθώς και η μικκυλιακή υγροχρωματογραφία με χρήση ανιοντικών, κατιοντικών και μη ιοντικών τασιενεργών. Πραγματοποιείται επίσης βιβλιογραφική συλλογή δεδομένων διαφόρων ειδών περιβαλλοντικής τοξικότητας των αναδυόμενων ρυπαντών (συντελεστής βιοσυσσώρευσης– BCF: Bioconcentration Factor, θανατηφόρα/αποτελεσματική συγκέντρωση– LC50: Lethal Concentration 50% /EC50: Effective Concentration 50%) σε υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς χαρακτηριστικούς σε οικοτοξικολογικές μελέτες, όπως ψάρια, δάφνια (daphnia magna) και μαλάκια (crassotrea virginica). Επειδή η περιβαλλοντική τοξικότητα αποτελεί μια πολύπλοκη διεργασία συλλέγονται επιπλέον φυσικοχημικά δεδομένα των υπό μελέτη αναδυόμενων ρυπαντών, όπως η μοριακή τους μάζα, η τοπολογική πολική τους επιφάνεια, τα μοριακά ποσοστά ιοντισμού τους σε υδατικό περιβάλλον, η δημιουργία δεσμών υδρογόνου κ.ά. Τα δεδομένα επεξεργάζονται με χρήση σύγχρονων στατιστικών/χημειομετρικών μεθόδων (πολλαπλή γραμμική παλινδόμηση – MLR: Multiple Linear Regression, ανάλυση κυρίων συνιστωσών – PCA: Principal Component Analysis) και καταστρώνονται μοντέλα πρόβλεψης της οικοτοξικολογικής δράσης των αναδυόμενων ρύπων σε υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς, οι οποίοι χρησιμοποιούνται σε δοκιμές οικοτοξικότητας. Στην παρούσα διατριβή έχει πραγματοποιηθεί συστηματική διερεύνηση της συμπεριφοράς ενός εύρους φαρμακευτικών ενώσεων, φυτοφαρμάκων και ενώσεων UV-φίλτρων που χρησιμοποιούνται σε αντιηλικές κρέμες σε διαφορετικές βιομιμητικές χρωματογραφικές συνθήκες. Μέσω εφαρμογής στατιστικών/χημειομετρικών τεχνικών έχουν συσχετίθεί βιομιμητικοί χρωματογραφικοί δείκτες με οικοτοξικολογικά δεδομένα (θανατηφόρος δόση/συγκέντρωση, τάση βιοσυσσώρευσης) που έχουν συλλεχθεί από έγκριτες βάσεις δεδομένων, όπως η Υπηρεσία Προστασίας Περιβάλλοντος των ΗΠΑ (US EPA: US Environmental Protection Agency) και ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Χημικών Προϊόντων (ECHA: European Chemicals Agency). Τα μοντέλα πρόβλεψης της οικοτοξικότητας έχουν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας κατάλληλα δεδομένα ελέγχου (test set). Η πρωτοτυπία της διδακτορικής διατριβής αφορά τα εξής σημεία: •Λήψη πρωτογενών βιομιμητικών χρωματογραφικών δεδομένων οργανικών ρύπων (φαρμάκων, φυτοφαρμάκων και αντιηλιακών παραγόντων) με τη χρήση χρωματογραφίας ΙΑΜ, AGP και HSA. Ιδίως όσον αφορά τα φυτοφάρμακα και τους αντιηλιακούς παράγοντες, δεν υπάρχει αναφορά σε μετρήσεις αυτών των ενώσεων με τις βιομιμητικές στήλες στη βιβλιογραφία. •Λήψη πρωτογενών βιομιμητικών χρωματογραφικών δεδομένων φυτοφαρμάκων, φαρμάκων και ενώσεων UV-φίλτρων με τη χρήση μικκυλιακής χρωματογραφίας (MLC: Micellar Liquid Chromatography), διερευνώντας ταυτόχρονα την επίδραση διαφορετικών τασιενεργών στην ικανότητα βιολογικής προσομοίωσης και πρόβλεψης της οικοτοξικότητας. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση τριών τασιενεργών, του ουδέτερου Brij-35 (Polyoxyethylene Lauryl Ether), του ανιοντικού SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) και του κατιοντικού CTAB (Cetrimonium Bromide). Λίγες είναι οι αναφορές στη βιβλιογραφία για τη χρήση του συγκεκριμένου είδους χρωματογραφίας στην περιβαλλοντική επιστήμη και αυτές περιορίζονται στην χρήση του ουδέτερου τασιενεργού Brij-35. •Ανάπτυξη πρωτότυπων ποσοτικών σχέσεων κατακράτησης-δράσης (QRAR: Quantitative Retention-Activity Relationships) για την πρόβλεψη της οικοτοξικότητας, βασισμένων στην πληροφορία της εκάστοτε χρωματογραφικής κατακράτησης. Η ανάπτυξη των QRAR προέκυψε από συσχέτιση των χρωματογραφικών δεδομένων με διάφορους δείκτες τοξικότητας, όπως οξείας τοξικότητας (LC50, EC50) και τάσης βιοσυσσώρεσης (BCF), αναφορικά με διάφορους υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς (ψάρια, δάφνια, μαλάκια) που συλλέχθησαν από τη βιβλιογραφία. •Εύρεση του καταλληλότερου δείκτη πρόβλεψης της οικοτοξικότητας σε κάθε περίπτωση και για κάθε οργανισμό. Για το σκοπό αυτό, η προβλεπτική ικανότητα των μοντέλων συγκρίθηκε και με αυτή των μοντέλων που βασίζονται στον παραδοσιακό δείκτη μερισμού οκτανόλης-νερού (logP), καθώς και με τις προβλέψεις του ευρέως αποδεκτού λογισμικού πρόβλεψης περιβαλλοντικού κινδύνου EPI Suite της US EPA. Με την απόδειξη της υπεροχής των προβλέψεων οικοτοξικότητας μέσω της χρήσης των βιομιμητικών χρωματογραφικών δεικτών έναντι των προβλέψεων με βάση το logP και των προβλέψεων του EPI Suite, προτείνονται νέα και πιο ακριβή εργαλεία για την πρόβλεψη της οικοτοξικότητας αναδυόμενων ρύπων.