Μελέτη της ανάπτυξης ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου αντισωμάτων σε BALB/c ποντικούς μετά από ανοσοποίηση με πεπτίδια Β και Τ επιτόπων του αυτοαντιγόνου La/SSB
Authors: Παπαματθαίου Μαρία 
Published: August 2021

Σε πειραματικά μοντέλα αυτοάνοσων ασθενειών έχει διαπιστωθεί πως η ανάπτυξη ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου μπορεί να ρυθμίσει την εξέλιξη της νόσου. Η La/SSB πρωτεΐνη είναι ένα αυτοαντιγόνο, το οποίο φαίνεται να εμπλέκεται σε αυτοάνοσες ασθένειες όπως ο SLE και το SS. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου που αναπτύσσεται σε BALB/c ποντίκια, μετά από ανοσοποίηση με τους επιτόπους της La/SSB πρωτεΐνης pep289-308 και pep349-364 καθώς και τις συμπληρωματικές τους μορφές (cpep289- 308 και cpep349-364 αντίστοιχα). Σε πρώτο στάδιο μελετήθηκε η ανοσογονικότητα των τεσσάρων προαναφερθέντων πεπτιδίων σε μη αυτοάνοσα ποντίκια της φυλής BALB/c και CBA. Επίσης προσδιορίστηκαν η άριστη δόση ανοσοποίησης για κάθε πεπτίδιο, ο βέλτιστος τρόπος χορήγησης των αντιγόνων και ο αριθμός των αναμνηστικών δόσεων. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η δημιουργία του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου και μελετήθηκαν οι ιδιότητες των παραγόμενων αντισωμάτων. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων διαπιστώθηκε πως ο επίτοπος 289-308, όταν χορηγήθηκε στα πειραματόζωα, προκάλεσε την παραγωγή ιδιοτυπικών αντι-pep289- 308 αλλά και αντι-ιδιοτυπικών αντι-cpep289-308 αντισωμάτων. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσε και η ανοσοποίηση με το συμπληρωματικό πεπτίδιο cpep289- 308, κατά την οποία παράχθηκαν αντι-cpep289-308 (ιδιοτυπικά) αντισώματα, αλλά και αντι-pep289-308 (αντι-ιδιοτυπικά) αντισώματα. Η ειδικότητα των συγκεκριμένων αντισωμάτων επιβεβαιώθηκε με ειδικές δοκιμασίες ανταγωνιστικής ELISA. Ανάλογες μελέτες πραγματοποιήθηκαν και για το ζευγάρι των πεπτιδίων pep349-364 και cpep349-364. Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε πως η ανοσοποίηση των BALB/c ποντικών με τους συγκεκριμένους επιτόπους δεν οδηγεί στην παραγωγή αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων. Η περαιτέρω μελέτη της κινητικής των παραγόμενων αντισωμάτων, έδωσε επιπλέον πληροφορίες για τη σχέση τους και βοήθησε στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δημιουργίας του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου. Σύμφωνα με το μηχανισμό τα ιδιοτυπικά αντισώματα αποτελούν εκ νέου αντιγόνα για το ανοσοποιητικό σύστημα, με αποτέλεσμα την παραγωγή των αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων. Η χρονική υστέρηση που παρατηρήθηκε στην εμφάνιση των αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων σε σχέση με την παραγωγή των ιδιοτυπικών, συμφωνεί με την πιο πάνω θεωρία. Με στόχο την καλύτερη μελέτη της δημιουργίας και διατήρησης του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου παράχθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για το συμπληρωματικό πεπτίδιο cpep289-308. Στα πειράματα μας με τη χρήση του συγκεκριμένου αντι-cpep289-308 μονοκλωνικού αντισώματος επιβεβαιώθηκε η ιδιοτυπική/αντι-ιδιοτυπική σχέση των αντι-pep289-308 με τα αντι-cpep ειδικά αντισώματα. Οι οροί των ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με τα πεπτίδια pep289-308 ή pep349-364, ελέγχθηκαν και έναντι ολόκληρου του μορίου της La/SSB και διαπιστώθηκε πως μπορούν να αναγνωρίζουν το ακινητοποιημένο μόριο της ανθρώπινης πρωτεΐνης σε ειδική δοκιμασία ELISA. Πολύ πιθανόν τα αντισώματα του ορού να αναγνώρισαν τους αντίστοιχους επίτοπους (pep289-308 και pep349-364) ως τμήμα ολόκληρου του μορίου. Παράλληλα θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί και το φαινόμενο της ενδομοριακής εξάπλωσης, το οποίο παρατηρείται πολύ συχνά σε περιπτώσεις αυτοάνοσων καταστάσεων και ασθενειών. Η μελέτη έδειξε πως η ανοσοποίηση των BALB/c ποντικών με τα πεπτίδια pep289-308 και cpep289-308 οδηγεί σε ενδομοριακή εξάπλωση και στον άλλο επίτοπο της La/SSB, τον 349-364. Με δεδομένο πως η ανάπτυξη και η διατήρηση του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου βασίζεται στη συνεργασία Β και Τ κυττάρων, ελέγχθηκε η δημιουργία ειδικών Τ κυτταρικών κλώνων για τα εν λόγω πεπτίδια. Παρατηρήθηκε πως τα ευαισθητοποιημένα από τα pep289-308 και cpep289-308 Τ λεμφοκύτταρα αποκρίνονται θετικά in vitro και στα δύο πεπτίδια. Αυτό το αποτέλεσμα πιθανόν δείχνει την in vivo ανάπτυξη πληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων ειδικών για το κάθε πεπτίδιο ξεχωριστά. Θεωρήθηκε επίσης αναγκαίος ο προσδιορισμός του τύπου απόκρισης μέσω ανίχνευσης δύο αντιπροσωπευτικών κυτοκινών, της IL-4 και της IFN-γ. Βρέθηκε πως η ιδιοτυπική απόκριση για όλα τα πεπτίδια ήταν μικτή TH1/TH2, ενώ η αντι-ιδιοτυπική απόκριση μόνο TH2.