Επίπεδα νευροτενσίνης (NT), εκλυτικής ορμόνης της κορτικοτροπίνης (CRH) και ιντερλευκίνης-33 (IL-33) στον ορό ασθενών με δερματική μαστοκυττάρωση (ΔΜ) και η επίδρασή τους στην ενεργοποίηση των ανθρωπίνων καλλιεργούμενων μαστοκυττάρων
Authors: Πετρά Αναστασία 
Published: September 2021

Σκοπός. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε με σκοπό τη διερεύνηση: α) της επίδρασης της νευροτενσίνης (ΝΤ), της εκλυτικής ορμόνης της κορτικοτροπίνης (CRH) και της ιντερλευκίνης-33 (IL-33) στον τρόπο με τον οποίο τα ανθρώπινα καλλιεργούμενα μαστοκυττάρα απελευθερώνουν ουσίες, όταν καλλιεργηθούν σε υλικό εμπλουτισμένο ή όχι με ιντερλευκίνη-4 (IL-4). Επίσης, β) την επίδραση των παραπάνω ουσιών και των συνδυασμών τους στη γονιδιακή έκφραση, ενδοκυττάρια σύνθεση και εξωκυττάρια απελευθέρωση της ιντερλευκίνης-31 (IL-31) από τα διεγερμένα μαστοκύτταρα όταν καλλιεργούνται σε υλικό εμπλουτισμένο ή όχι με ΙL-4 και ευαισθητοποιηθούν ή όχι με IgE/anti-IgE. Τελευταίος στόχος της παρούσας μελέτης αποτέλεσε γ) η μέτρηση των επιπέδων της NT, της CRH και της IL-33 στον ορό ασθενών με δερματική μαστοκυττάρωση (ΔΜ).Χαρακτηριστικά κυττάρων και ατόμων τα οποία μελετήθηκαν και μέθοδοι. Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά ανθρώπινων λευχαιμικών μαστοκυττάρων (human LAD2 cells), η οποία χορηγήθηκε δωρεάν από το Δρ Kirshenbaum του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (National Institute of Health,ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA), από ασθενή ο οποίος έπασχε από λευχαιμία της σειράς των μαστοκυττάρων. Τα LAD2 καλλιεργήθηκαν σε ειδικές καλλιεργητικές φλάσκες, όπου τοποθετούνταν σε συγκέντρωση 105/ml θρεπτικού υλικού (StemPro-34 serum-free medium, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Στην καλλιέργεια προστίθεντο 100 ng/ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου παράγοντα βλαστικών κυττάρων (recombinant human stem cell factor, rhSCF, Biovitrum, Sweden), 1% πενικιλλίνη, 1% στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη. Στις συνθήκες στις οποίες μελετήθηκε η συμπεριφορά των LAD2 όταν αυτά ευαισθητοποιήθηκαν με recombinant human IL-4, (rhIL-4, R&D systems, Mineapolis, MN) ή/και IgE, το καλλιεργούμενο θρεπτικό τους υλικού εμπλουτίστηκε με 100 ng/ml IL-4 για 2 εβδομάδες ή/και με 1 μg/ml IgE (human IgE, EMD Millipore, San Diego, CA) για 12 ώρες αντίστοιχα, προτού ξεπλυθούν με το αντίστοιχο ανά κατάσταση καλλιεργούμενο θρεπτικό υλικό και διεγερθούν για 24 ώρες με την ανάλογη ανά συνθήκη ουσία. Οι ουσίες, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για την 24ωρη διέγερση των LAD2, ήταν η CRH 10 μΜ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), η ΝΤ 1 μM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), η IL-33 10 ng/ml, (R&D Sytsems, Minneapolis, MN), το anti-IgE 1 μg/ml, (Life Technologies, Carlsbad, CA) και η SP 2μΜ, (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) καθώς και συνδυασμός αυτών. Οι τελικές συγκεντρώσεις στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν οι τελευταίες ουσίες έγιναν στο αντίστοιχο για κάθε συνθήκη καλλιεργούμενο θρεπτικό υλικό, προτού χρησιμοποιηθούν, ενώ τα LAD2 αναπτύχθηκαν σε επωαστικό θάλαμο συγκέντρωσης 5% CO2 στους 37οC και χρησιμοποιήθηκαν κατά τη λογαριθμική φάση ανάπτυξής τους. Τα διεγερμένα ή μη με τις προαναφερόμενες ουσίες και ευαισθητοποίημένα ή όχι με IgE/anti-IgE μαστοκύτταρα μελετήθηκαν σε εμπλουτισμένο ή όχι με IL-4 καλλιεργητικό υλικό ως προς την ικανότητά τους να εκφράζουν γονιδιακά, να συνθέτουν ενδοκυττάρια και να απελευθερώνουν εξωκυττάρια τη νεοπεριγραφείσα ιντερλευκίνη-31 (IL-31), αφού πρώτα αποδείχθηκε αν οι μελετούμενες ουσίες αποκοκκιώνουν προσχηματισμένες ουσίες των μαστοκυττάρων ή απελευθερώνουν νεοσυντιθέμενες ουσίες από αυτά.Επίσης, για τη μέτρηση των επιπέδων της NT, της CRH και της IL-33 στον ορό ασθενών με ΔΜ, συμμετείχαν 20 παιδιά, Καυκάσιας φυλής, μέσης ηλικίας 5 + 4 έτη με κηλιδοβλατιδώδη (n=5), διάχυτη ΔΜ (n=4) ή μονήρες δερματικό μαστοκυττάρωμα (n=11), τα οποία παρουσιάστηκαν στο Παιδοδερματολογικό Ιατρείο της Α’ Πανεπιστημιακής Δερματολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το νοσοκομείο Ανδρέας Συγγρός καθώς και στη Β’ Μονάδα Αλλεργιολογίας και Κλινικής Ανοσολογίας του νοσοκομείου Παίδων Παναγιώτη και Αγλαίας Κυριακού του Πανεπιστημίου Αθηνών. Οι υγιείς μάρτυρες ήταν 10 παιδιά, Καυκάσιας φυλής, μέσης ηλικίας 4.5 + 3 ετών (n= 10), τα οποία προέρχονταν από το Παιδοδερματολογικό Ιατρείο της Α’ Πανεπιστημιακής Δερματολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το νοσοκομείο Ανδρέας Συγγρός και τα οποία προσήλθαν για άλλες δερματολογικές παθήσεις. Στους κηδεμόνες τόσο των υγιών όσο και των πασχόντων από ΔΜ παιδιών έγινε εκτενής αναφορά σχετικά με το σκοπό και τα σημεία της μελέτης και στο τέλος όλοι οι κηδεμόνες υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης σύμφωνα με τη Διακήρυξη των Αρχών του Helsinki, όπως επίσης, ο κάθε κηδεμόνας συμπλήρωσε ένα ερωτηματολόγιο, το οποίο αφορούσε στο ατομικό ιστορικό των πασχόντων από ΔΜ παιδιών. Για τους παραπάνω σκοπούς, ακολουθήθηκαν οι παρακάτω μέθοδοι: α) απελευθέρωση της β-εξοζαμινιδάσης (β-hex), ώστε να μελετηθεί ο τρόπος με τον οποίο τα μαστοκύτταρα απελευθερώνουν τις ουσίες τους υπό την επίδραση των μελετούμενων ουσιών, έχοντας ως μάρτυρα τη SP, β) η λύση των LAD2 μαστοκυττάρων μετά από τις παραπάνω διαφορετικές συνθήκες, με φωτοευαίσθητο διάλυμα, το οποίο αποτελούνταν από ρυθμιστικό διάλυμα (Buffer 10x, Cell Signaling Technology), PBS και PMSF (Cell Signaling Technology). Με αυτήν την τεχνική συλλέχθηκε, σε συνθήκες φωτοπροστασίας, το ενδοκυττάριο υλικό των μαστοκυττάρων, προκειμένου να μετρηθεί η ενδοκυττάρια σύνθεση και αποθήκευση της IL-31, γ) η μέθοδος της αντίστροφης μεταγραφής ακολουθούμενης από την ποσοτική αλυσιδωτή αντιδραση της πολυμεράσης (quantitave PCR, qPCR), ώστε να μελετηθεί η δυνατότητα των καλλιεργούμενων μαστοκυττάρων αν εκφράζουν την IL-31 γονιδιακά, υπό την επίδραση των παραπάνω ουσιών και στις προαναφερόμενες συνθήκες και δ) η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέθοδος (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), προκειμένου να μελετηθεί η ενδoκυττάρια σύνθεση και η εξωκυττάρια απελευθέρωση της IL-31 (human IL-31, R&D Systems, Minneapolis, MN) από τα μαστοκύτταρα κάτω από όλες τις προαναφερόμενες συνθήκες. Επίσης, η ELISA χρησιμοποιήθηκε και για τη μέτρηση των επιπέδων της NT (human Neurotensin, NT ELISA kit, CSB-E09144h, Cusabio), της CRH (human corticotropin releasing hormone, CRH ELISA Kit, CSB-E06872h, Cusabio) και της IL-33 (human IL-33 ELISA Kit, EA 100585, Origene) στον ορό τόσο πασχόντων από ΔΜ όσο και ανάλογων χαρακτηριστικών μαρτύρων.Αποτελέσματα. Τα μαστοκύτταρα εκφράζουν γονιδιακά, συνθέτουν ενδοκυττάρια και απελευθερώνουν τη νεοσυντιθέμενη IL-31 όταν σε αυτά επιδράσει η IL-33 μεμονωμένα, αλλά όχι η NT, η CRH και η SP. Ωστόσο, σε συνδιέγερση της NT ή της CRH ή της SP με την IL-33, και ιδιαίτερα όταν συνδιεγερθεί η SP με την IL-33, οι παραπάνω δραστηριότητες των μαστοκυττάρων σχετικά με την IL-31 παρατηρούνατι αυξημένες. Η γονιδιακή έκφραση, η ενδοκυττάρια σύνθεση και η εξωκυττάρια απελευθέρωση της IL-31 από τα μαστοκύτταρα ευνοείται εξαιρετικά όταν το καλλιεργητικό υλικό εμπλουτιστεί με την IL-4 ή όταν τα μαστοκύτταρα ευαισθητοποιηθούν με IgE και έπειτα διεγερθούν με anti-IgE. Αυτά τα αποτελέσματα υπεραυξάνονται, όταν τα ευαισθητοποιημένα με IgE και συνδιεγερμένα με anti-IgE μαστοκύτταρα καλλιεργηθούν, ταυτόχρονα, και σε καλλιεργητικό υλικό εμπλουτισμένο με IL-4, ξανά με ιδιαίτερα αυξημένα αποτελέσματα στη συνθήκη κατά την οποία η IL-33 αλληλεπιδράσει με την SP. Υποστηρίξαμε ότι τα μαστοκύτταρα δεν αποκοκκιώνουν την IL-31, λόγω του ότι στα πειράματα αποδείχθηκε ότι η NT, η CRH και η IL-33 δεν προκαλούν την αποκοκκίωση της γνωστής προσχηματισμένης ουσίας των μαστοκυττάρων, της β-εξοζαμινιδάσης, ενώ αντίθετα η SP προκαλεί την αποκοκκίωσή της τελευταίας. Στον ορό των πασχόντων από ΔΜ δεν παρατηρήθηκαν αυξημένα τα επίπεδα της NT, της CRH και της IL-33, συγκριτικά με τους μάρτυρες.Συμπεράσματα. Η επιδείνωση τόσο ως προς τη συμπτωματολογία φλεγμονωδών, αλλεργικών και αυτοανόσων νοσημάτων, με κυριότερο το σύμπτωμα του κνησμού, όσο και ως προς την πρόγνωσή τους, και κυρίως κάτω από καταστάσεις συναισθηματικού και σωματικού στρες, μπορεί να εξηγηθεί με την αύξηση των επιπέδων της IL-31 κάτω από την επίδραση την οποία δέχονται τα μαστοκύτταρα από το περιβάλλον τους, στο οποίο η IL-33, η CRH, η NT και η SP είναι αυξημένα στα παραπάνω νοσήματα, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Τα μαστοκύτταρα διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στις προαναφερόμενες καταστάσεις, καθώς μπορούν να επάγουν και να ενισχύουν τόσο την ενδογενή όσο και την επίκτητη ανοσία, μέσω των πολλαπλών και ποικίλλων υποδοχέων που διαθέτουν και τα καθιστούν ικανά ως κύτταρα να συμμετέχουν, μεταξύ άλλων, και στη στρατολόγηση άλλων κυττάρων. Με τη στρατολόγηση, επιπλέον, κυττάρων απελευθερώνονται περισσότεροι μεσολαβητές και επομένως, συμβαίνουν περαιτέρω αλληλεπιδράσεις με τα μαστοκύτταρα, ανοσολογικά ή μη μεσολαβούμενες. Η μελέτη μας είναι μοναδική, γιατί είναι η πρώτη φορά που αποδεικνύεται ότι η IL-31, νεοπεριγραφείσα βασική κυτταροκίνη σε φλεγμονώδεις, αλλεργικές και αυτοάνοσες καταστάσεις, όπως προκύπτει από τη βιβλιογραφία, εκφράζεται γονιδιακά, συντίθεται ενδοκυττάρια και απελευθερώνεται εξωκυττάρια από τα μαστοκύτταρα όταν σε αυτά επιδράσουν ουσίες, όπως η IL-33, η CRH και η NT. Οι παραπάνω δράσεις των μαστοκυττάρων ως προς την IL-31 ενισχύονται όταν τα μαστοκύτταρα απαντήσουν με IgE-μεσολαβούμενους μηχανισμούς ή στην παρουσία της IL-4, αλλά μεγιστοποιούνται όταν τα μαστοκύτταρα απαντήσουν με IgE-μεσολαβούμενο μηχανισμό σε περιβάλλον στο οποίο, την ίδια στιγμή, υπάρχει η IL-4 και το άτομο φορτίζεται συναισθηματικά ή σωματικά. Η IL-4, η οποία μπορεί να απελευθερωθεί από τα μαστοκύτταρα, διεγείρει την επιπλέον παραγωγή των λευκοτριενιών από αυτά, με θετική ανατροφοδότηση και επομένως την περαιτέρω αντιδραστική υπερπλασία των μαστοκυττάρων. αλλά, επίσης, προωθεί τη μεγαλύτερη παραγωγή της IgE, πολλαπλασιάζοντας τα όποια αποτελέσματα των μαστοκυττάρων. H IL-4, όμως, απελευθερώνεται και από τα στρατολογημένα λευκά κύτταρα, μιας και τα Th2 κύτταρα θεωρούνται η βασική πηγή παραγωγής της IL-4 βιβλιογραφικά. Επίσης, στη μελέτη μας αποδείχθηκε, για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ότι τα επίπεδα της NT, της CRH και της IL-33 στον ορό πασχόντων από ΔΜ δεν παρουσιάζονται αυξημένα συγκριτικά με αυτά των μαρτύρων. Ωστόσο, από τη βιβλιογραφία προκύπτει ότι και τα επίπεδα της IL-31 στον ορό ατόμων με ΔΜ δε μετρώνται αυξημένα, αποδεικνύοντας επιπρόσθετα τη στενή συσχέτιση μεταξύ των μελετούμενων ουσιών, NT, CRH, IL-33 με την IL-31, σε καταστάσεις στις οποίες τα μαστοκύτταρα κατέχουν κεντρικό ρόλο, όπως στη ΔΜ. Παρόλα αυτά τα επίπεδα των μελετούμενων ουσιών σε άτομα με συστηματική μαστοκυττάρωση θα μπορούσαν να είναι διαφορετικά, εφόσον, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τα επίπεδα της IL-31 είναι αυξημένα στον ορό αυτών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα μαστοκύτταρα είναι πολυδύναμα και ενεργοποιούνται μέγιστα από συνδυασμό ερεθισμάτων. Είναι, επομένως, απαραίτητο να βρεθεί αποτελεσματικός τρόπος για να ανασταλλούν η σύνθεση και έκκριση προφλεγμονωδών διαβιβαστών. Πρόσφατο παράδειγμα αποτελεί η πολλά υποσχόμενη θεραπεία αναστολέων της IL-4 (ντουπιλουμάμπη), σε νοσήματα, όπως η ατοπική δερματίτιδα, τα οποία αφενός χαρακτήριζονται από μεγάλο αριθμό μαστοκυττάρων και αφετέρου η IL-31 αποτελεί σε αυτά τόσο προγνωστικό δείκτη τους, όσο και δείκτη έντασης του κνησμού που τα χαρακτηρίζει.