Μοριακή μελέτη σηματοδοτικών μονοπατιών στην καρκινογένεση
Authors: Μιχελλή Μαρία 
Published: September 2022

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt παίζει σημαντικό ρόλο τόσο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης όσο και στην μεταγεννητική ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ενήλικων ιστών καθώς ρυθμίζει μια ποικιλία κυτταρικών διαδικασιών όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση, τη μορφολογία και τον σχηματισμό του άξονα. Το μονοπάτι Wnt συμμετέχει στην ανάπτυξη του μαστικού αδένα και στη διαφοροποίηση του κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Επίσης, έχει παρατηρηθεί η επικοινωνία του μονοπατιού Wnt με άλλα σημαντικά μονοπάτια όπως το PI3K/AKT. Η απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt σχετίζεται με την καρκινογένεση, η οποία μπορεί να προκληθεί από μεταβολές των επιπέδων έκφρασης συστατικών του μονοπατιού. Έχει παρατηρηθεί απορρύθμιση του συγκεκριμένου σηματοδοτικού μονοπατιού σε πολλούς τύπους καρκίνου μεταξύ των οποίων και στον καρκίνο μαστού. Επομένως, η μελέτη του στον καρκίνο μαστού μπορεί να το καταστήσει ως ένα πολλά υποσχόμενο δείκτη πρόγνωσης της νόσου αλλά και μελλοντικό στόχο νέων θεραπευτικών στρατηγικών.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ:Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 100 δείγματα καρκίνου μαστού εκ των οποίων 68 ήταν φρέσκοι συντηρημένοι ιστοί στους -20 0C και 32 δείγματα μονιμοποιημένα σε RCL2 και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν 10 δείγματα φυσιολογικού ιστού παρακείμενα του όγκου. Αρχικά από τα δείγματα απομονώθηκε RNA και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αντίστροφη μεταγραφή του σε cDNA. Έπειτα ακολούθησε η ημιποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για την ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του μονοπατιού Wnt στα οποία συμπεριλαμβάνονται οι προσδέτες WNT2, WNT3, WNT5A, οι υποδοχείς FRIZZLED 4 (FZD4), FRIZZLED 6 (FZD6) και FRIZZLED 7 (FZD7), η β-κατενίνη, η κινάση GSK3-β και οι μεταγραφικοί παράγοντες TCF4 και LEF1. Η ανάλυση των επιπέδων έκφρασης έγινε με τη μέθοδο ΔΔCt, χρησιμοποιώντας ως ενδογενές γονίδιο το PPIa. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε σε 31 δείγματα καρκίνου μαστού η ανοσοϊστοχημική μελέτη της β-κατενίνης και σε 28 δείγματα η μελέτη έκφραση της πρωτεΐνης GSK3-β με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Επίσης σε 81 δείγματα DNA μελετήθηκαν μεταλλαγές στο γονίδιο PIK3CA το οποίο εμπλέκεται στο μονοπάτι PI3K/AKT με τη μέθοδο της HRM-PCR και η επιβεβαίωση έγινε με την αλληλούχιση κατά Sanger. Τέλος, πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών και αναζήτηση γραμμικών συσχετίσεων της έκφρασης mRNA των υπό μελέτη γονιδίων.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από την ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA των γονιδίων WNT2, WNT3, WNT5A, FRIZZLED 4, FRIZZLED 6, FRIZZLED 7, CTNNB1, GSK3-B, TCF4 και LEF1, παρατηρήθηκαν: αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 6%, 47%, 10%, 0%, 13%, 5%, 21%, 7%, 5%, 31%, αντίστοιχα, μειωμένα επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 54%, 36%, 57%, 83%, 47%, 73%, 29%, 40%, 80%, 39%, αντίστοιχα, ενώ σταθερά επίπεδα έκφρασης σε ποσοστό 40%, 17%, 33%, 17%, 40%, 22%, 50%, 53%, 15%, 30% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA των υπό μελέτη γονιδίων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και με τον μοριακό υπότυπο των ασθενών με καρκίνου μαστού. Πιο αναλυτικά παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των μειωμένων επιπέδων έκφρασης του προσδέτη WNT2 με την απουσία του οιστρογονικού υποδοχέα (p=0,033). Για τον προσδέτη WNT3 καταγράφηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων έκφρασης με τους όγκους καλής-μέτριας διαφοροποίησης (p=0,026) και των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τη παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (p=0,02). Για τον υποδοχέα FZD4 παρατηρήθηκε ότι τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης σχετίζονται σημαντικά με τους ασθενείς ηλικία άνω των 65 ετών (p=0,026). Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των μειωμένων επιπέδων έκφρασης του υποδοχέα FZD7 με την απουσία του προγεστερονικού υποδοχέα (p=0,02). Στατιστικά σημαντική συσχέτιση καταγράφηκε μεταξύ των αυξημένων επιπέδων έκφρασης της β-κατενίνης και των ασθενών ηλικίας κάτω των 65 ετών (p=0,007) και των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τους όγκους χαμηλής διαφοροποίησης (p=0,028). Επιπρόσθετα, στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα TCF4 με τα δείγματα με μοριακό υπότυπο Luminal A (p=0,011). Για τον μεταγραφικό παράγοντα LEF1 παρατηρήθηκε οριακή στατιστική συσχέτιση μεταξύ των μειωμένων επιπέδων έκφρασης με τον μοριακό υπότυπο HER2 (HER2 enriched). Στη συνέχεια ακολούθησε συσχέτιση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA μεταξύ των υπό μελέτη γονιδίων από την οποία προέκυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις: WNT3/WNT5 p<0,01, WNT5A/FDZ6 p<0,01, WNT3/FZD6 p<0,01, WNT3/β-κατενίνη p<0,01, WNT5A/β-κατενίνη p<0,01, WNT3/GSK3-B p<0,01, WNT5A p<0,01, FZD6/GSK3-B p=0,020, FZD4/GSK3-B p=0,047, β-κατενίνη/GSK3-B p<0,01, FZD4/TCF4 p<0,01, TCF4/LEF1 p=0,017, WNT5A/LEF1 p<0,01, WNT2/LEF1 p=0,017, FZD7/LEF1 p,0,01, FZD6/LEF1 p<0,01, LEF1/GSK3-B p<0,01, LEF1/β-κατενίνη p=0,046. Σε παλαιότερη μελέτη του εργαστηρίου παρατηρήθηκε μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου APC σε ποσοστό 55%, η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί εμπλέκεται στο σύμπλοκο αποικοδόμησης της β-κατενίνης. Από την ανάλυση της παρουσίας ή απουσίας μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου APC σε σχέση με τα υπό μελέτη μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt της παρούσας διατριβής δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση. Από την μελέτη έκφρασης των γονιδίων GSK3-B και CTNNB1 σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωμα κατά Western και ανοσοϊστοχημείας αντίστοιχα παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης της κινάσης GSK3-β σε ποσοστό 78%. Από την ανοσοϊστοχημική μελέτη της β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε 65% χαμηλή μεμβρανική έκφραση και σε 31% υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση, ενώ δεν παρατηρήθηκε έκφραση της β-κατενίνης στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, ανιχνεύθηκαν μεταλλαγές στο γονίδιο PIK3CA σε ποσοστό 35%, και συγκεκριμένα 20% στο εξώνιο 9 του γονιδίου και 15% στο εξώνιο 20. Από τη συσχέτιση των μεταλλαγών με τα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων του μονοπατιού Wnt με σκοπό να δειχθεί εάν υπάρχει σχέση μεταξύ των δύο μονοπατιών στα δείγματα μαστού δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Από τα παραπάνω δεδομένα παρατηρείται απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt, ταυτόχρονη έκφραση μορίων και συσχετίσεις με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, επισημαίνοντας την πολυπλοκότητα του στον καρκίνο μαστού και την ανάδειξη πιθανών προβλεπτικών βιοδεικτών με σκοπό την επιλογή κατάλληλων ασθενών οι οποίοι θα έχουν όφελος από τη χορήγηση θεραπείας, η οποία στοχεύει το μονοπάτι Wnt.