Αυτοφαγία και κυτταρική γήρανση ως μηχανισμοί απόκρισης στο οξειδωτικό στρες
Authors: Γούτας Ανδρέας 
Published: December 2022

Το οξειδωτικό στρες (ΟΣ) έχει συνδεθεί με την κυτταρική γήρανση καθώς και με την αιτιοπαθολογία πολλών ασθενειών συμπεριλαμβανομένων των ηλικιοεξαρτώμενων ασθενειών, όπως η οστεοαρθρίτιδα. Tόσο το ΟΣ όσο και η κυτταρική γήρανση έχουν συσχετιστεί με την αυτοφαγία, ωστόσο μελέτες καταδεικνύουν τη διττή φύση της αυτοφαγίας, με δεδομένα να υποστηρίζουν το ρόλο της τόσο στην αναστολή όσο και στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Επιπλέον μελέτες του εργαστηρίου μας αλλά και άλλες έχουν δείξει ότι η εγκαθίδρυση της κυτταρικής γήρανσης συνοδεύεται από γενωμική αστάθεια, που είναι εμφανής μέσω διαφόρων χαρακτηριστικών όπως η ανευπλοειδία ή τα μιτωτικά λάθη. Στο πρώτο μέρος της συγκεκριμένης διατριβής χρησιμοποιήθηκαν χονδροκύτταρα από φυσιολογικούς και οστεοαρθριτικούς δότες. Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος και σύγκριση των οστεοαρθριτικών με φυσιολογικά χονδροκύτταρα αναφορικά με δείκτες γήρανσης. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα επίπεδα της πρωτεΐνης p16, γνωστού αναστολέα του κυτταρικού κύκλου και χαρακτηριστικού βιοδείκτη της γήρανσης, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Αναλύθηκε επιπλέον το συνολικό φορτίο ελευθέρων ριζών ή δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species-ROS) και τα επίπεδα του υπεροξειδίου (ρίζα του σουπεροξειδίου) καθώς και τα μεταγραφικά επίπεδα του iNOS, ενζύμου κύρια υπεύθυνου για τη δημιουργία δραστικών μορφών αζώτου (Reactive Nitrogen Species-RNS). Υπολογίστηκαν επιπλέον οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA με την χρήση αντισωμάτων εναντίον της οξειδωμένης παραλλαγής της δεοξυγουανοσίνης (8-οξο-δεοξυγουανοσίνης-8-oxo-dG). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε επιδράσεις επί φυσιολογικών και οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα και ανάλυση των επιπέδων των βλαβών στο DNA μέσω μικροσκοπικής ανάλυσης ανοσοφθορισμού με αντίσωμα εναντίον της φωσφορυλιωμένης στην σερίνη 139 ιστόνης H2AX (γH2AX) και του 53BP1, δύο χαρακτηριστικών δεικτών των θραύσεων της διπλής αλυσίδας. Η ανάλυση σκόπευε στο αναδείξει αν το ήδη αυξημένο οξειδωτικό φορτίο των οστεοαρθριτικών χονδροκυττάρων οδηγεί σε αδυναμία επιδιόρθωσής των βλαβών που δημιουργούνται στο DNA εξαιτίας της εξωγενούς οξειδωτικής προσβολής. Στη συνέχεια, κάτω από τις ίδιες συνθήκες και μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας αναλύθηκε επιπλέον η μορφολογία των μιτοχονδρίων, προκειμένου να αναδειχθεί πιθανή συσχέτιση της αδυναμίας απόκρισης στο οξειδωτικό στρες με την ανισορροπία μεταξύ σχάσης και σύντηξης, που αντικατοπτρίζεται με αλλαγές στη μορφολογία του μιτοχονδριακού δικτύου. Τέλος, αναλύθηκε και ένα χαρακτηριστικό των γηρασμένων κυττάρων, ο σχηματισμός μικροπυρήνων, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και έπειτα από ανάκαμψη 1 ώρας και 24 ωρών από την επίδραση εξωγενούς οξειδωτικού στρες. Ακολούθησε μελέτη της ικανότητας επαγωγής της αυτοφαγίας στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα μεταγραφικά επίπεδα βασικών γονιδίων της αυτοφαγίας (ATG5, Beclin-1, LC3) μέσω qRT-PCR α) υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και β) έπειτα από επιδράσεις με H2O2 και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Στις ίδιες συνθήκες ελέγχθηκαν και τα πρωτεϊνικά επίπεδα δεικτών της αυτοφαγίας και πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός εναντίον της βασικής πρωτεΐνης δείκτη της αυτοφαγικής απόκρισης, LC3, προκειμένου να παρατηρήσουμε το σχηματισμό των αυτοφαγοσωμάτων. Τέλος, στην προσπάθεια ανίχνευσης ενός πιθανού μορίου-κλειδί για τη ρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης απέναντι στο οξειδωτικό στρες οδηγηθήκαμε στη μελέτη ενός γνωστού ρυθμιστή της αυτοφαγίας αλλά και, σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, εκλεκτικού υποστρώματος της αυτοφαγίας κατά τη γήρανση, τη SIRT1. Πραγματοποιήσαμε επιδράσεις σε χονδροκύτταρα με υδροξυχλωροκίνη (HCQ) (παράγοντα που εμποδίζει την σύντηξη των αυτοφαγοσωμάτων με τα λυσοσώματα) και συν-κατακρήμνιση με το LC3 προκειμένου να ελέγξουμε την αποικοδόμηση της SIRT1 μέσω αυτοφαγίας. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων έδειξαν ότι τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα εμφανίζουν χαρακτηριστικά γηρασμένων κυττάρων όπως αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα του p16, αυξημένα επίπεδα ROS ενώ ταυτόχρονα εμφανίζουν και αλλαγές στο μιτοχονδριακό δίκτυο το οποίο οδηγεί σε επιπλέον παραγωγή οξειδωτικού στρες που πιθανά ευθύνεται για τις αυξημένες βλάβες στο γενετικό υλικό που παρατηρήθηκαν. Επιπρόσθετα βρέθηκε ότι τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα αδυνατούν να αποκριθούν στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή και να επιδιορθώσουν τις βλάβες στο γενετικό υλικό. Επιπλέον τα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα εμφάνισαν μειωμένα μεταγραφικά επίπεδα βασικών μορίων της αυτοφαγίας αλλά και χρονική απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Τέλος βρέθηκε ότι η SIRT1 αποικοδομείται επιλεκτικά από την αυτοφαγία στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα, όπως έχει δειχθεί για γηρασμένα κύτταρα. Βάση όλων των ανωτέρων και των αποτελεσμάτων που προέκυψαν οδηγηθήκαμε στη διατύπωση της ακόλουθης πρότασης αναφορικά με τη σχέση οξειδωτικού στρες-γήρανσης-αυτοφαγίας στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής χρησιμοποιηθήκαν μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από τη γέλη του Wharton (WJ-MSCs) από 3-6 δότες μέχρι τη γήρανση τους, η οποία επήλθε είτε φυσικά εξαιτίας των διαδοχικών διαιρέσεων (αναδιπλασιαστική γήρανση) είτε με πρόωρη επαγωγή της ως απόκριση στο εξωγενές οξειδωτικό στρες (stress induced premature senescence – SIPS). Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος και σύγκριση των νεαρών (early passage) με τα μεσαίας ηλικίας (middle passage) και τα γηρασμένα (late passage) βλαστοκύτταρα αναφορικά με δείκτες γήρανσης. Ελέγχθηκε η ενεργότητα της β-γαλακτοσιδάσης, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου p16 και του p21 υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, ενώ πραγματοποιήθηκε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού προκειμένου να αναλύσουμε το συνολικό φορτίο των ελευθέρων ριζών (ROS) καθώς και τα επίπεδα του υπεροξειδίου υπό κανονικές συνθήκες. Επιπλέον υπολογίστηκαν οι βλάβες στο DNA σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας αλλά και έπειτα από επιδράσεις με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και ανάκαμψη για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1h και 24h) με τη χρήση αντισωμάτων εναντίον του 53BP1 και της γH2AX. Στις ίδιες συνθήκες αναλύθηκε και η μορφολογία του μιτοχονδριακού δικτύου. Μια παλιότερη μελέτη της ομάδας μας, καθώς και άλλων, έχει συσχετίσει το οξειδωτικό στρες με δυσλειτουργία του σημείου ελέγχου διαμόρφωσης της μιτωτικής ατράκτου (Spindle Assembly Checkpoint - SAC)-βασικού μηχανισμού διατήρησης της χρωμοσωμικής σταθερότητας-και την επακόλουθη γενωμική αστάθεια, και προκειμένου να αναλυθεί περαιτέρω αυτή η σχέση πραγματοποιηθήκαν μια σειρά πειραμάτων: Υπολογίστηκαν τα ποσοστά μιτωτικών βλαβών, καθώς και έλεγχος των κεντροσωμάτων και σχετιζόμενες με τα κεντροσώματα δυσλειτουργίες νεαρών και γηρασμένων κυττάρων, καθώς και νεαρών κυττάρων στα οποία έγινε επίδραση με H2O2 και ανάκαμψη για 48 ώρες. Επίσης υπολογίστηκε η εμφάνιση καθυστερημένων (lagging) χρωμοσωμάτων και η δημιουργία γεφυρών χρωματίνης. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε επιδράσεις με ταξόλη, γνωστού δηλητηρίου των μικροσωληνίσκων που οδηγεί σε παύση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μίτωση αν το SAC είναι λειτουργικό, σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα και σε νεαρά κύτταρα τα οποία είχαμε προηγουμένως επιδράσει με H2O2 και υπολογίστηκε το ποσοστό των κυττάρων που παρέμεινε στη μίτωση μετά από 16 ώρες. Έπειτα πραγματοποιήθηκε έλεγχος των πρωτεϊνικών και μεταγραφικών επιπέδων των βασικών μορίων του SAC καθώς και έλεγχος συγκεκριμένα των πρωτεϊνικών και μεταγραφικών επιπέδων του Bub1b/BubR1, βασικού μορίου του συμπλόκου του μιτωτικού σημείου ελέγχου (Mitotic checkpoint complex-MCC) κατά τη γήρανση των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων αλλά και σε ιστούς νεαρών, μέσης ηλικίας και γηρασμένων ποντικών. Ελέγχθηκε επιπλέον η ποσότητα του Mad2 και του Bub1b/BubR1 που συν-ανοσοκατακρημνίζεται με το CDC20 (κεντρικά μόρια στο MCC) σε νεαρά βλαστοκύτταρα και νεαρά βλαστοκύτταρα στα οποία έχει προηγηθεί επίδραση με Η2Ο2. Πραγματοποιήθηκε και ανοσοκατακρήμνιση με το CDC20 στο μιτωτικό κλάσμα από νεαρά και γηρασμένα βλαστοκύτταρα έπειτα από 16 ώρες στην ταξόλη. Καθώς η προηγούμενη ενότητα της διατριβής έδειξε την απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης σε ΟΑ χονδροκύτταρα (κύτταρα όπως είδαμε με γηρασμένο φαινότυπο), αλλά και επειδή υπάρχουν πρόσφατες ενδείξεις συσχέτισης της σχετιζόμενης με τη γήρανση γενωμικής αστάθειας με την απορρύθμιση της αυτοφαγίας, περάσαμε στην ενδελεχή μελέτη της αυτοφαγίας και στα WJ-MSCs. Σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs έγινε μελέτη της απόκριση τους μέσω αυτοφαγίας στην εξωγενή οξειδωτική προσβολή. Ελέγχθηκαν καταρχάς τα πρωτεϊνικά επίπεδα βασικών μορίων της αυτοφαγίας σε νεαρά (early passage) μεσαίας ηλικίας (middle passage), γηρασμένα (late passage) βλαστοκύτταρα αλλά και σε κύτταρα με πρόωρη επαγωγή της γήρανσης μέσω οξειδωτικής προσβολής (SIPS). Στη συνέχεια αναλύθηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα των βασικών μορίων της αυτοφαγίας σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs τα οποία υποβλήθηκαν σε εξωγενές οξειδωτικό στρες και αφέθηκαν να ανακάμψουν για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Επιπλέον πραγματοποιήσαμε αποσιώπηση του βασικού μορίου της αυτοφαγίας ATG5 και πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την επαγωγή κυτταρικής γήρανσης, τη δημιουργία μιτωτικών βλαβών (mitotic defects) καθώς και για την ύπαρξη κυττάρων με υπεράριθμα κεντροσώματα. Επιπλέον απομονώσαμε το μιτωτικό κλάσμα και υπολογίσαμε τα επίπεδα των αυτοφαγικών πρωτεϊνών σε νεαρά και γηρασμένα WJ-MSCs. Δεδομένου ότι η αυτοφαγία έχει δειχθεί ότι καταστέλεται σε φυσιολογικά κύτταρα προκειμένου να προφυλαχθεί το γενετικό υλικό από τυχόν λανθασμένη αποικοδόμηση, θελήσαμε να ελέγξουμε τη δραστικότητα της αυτοφαγίας κατά τη μίτωση γηρασμένων WJ-MSC, αναλύοντας την αλληλεπίδραση ATG13/ULK1, καθώς και την αλληλεπίδραση Beclin-1/PI3K-CIII, βασικών αλληλεπιδράσεων των μορίων-κλειδιά του αυτοφαγικού μονοπατιού, πραγματοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση του ATG13 και του Beclin-1 σε νεαρά και γηρασμένα ασύγχρονα κύτταρα και σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα που βρισκόντουσαν στη μίτωση. Τέλος, θελήσαμε να μελετήσουμε αν τυχόν αλλαγές στα επίπεδα του Bub1b/BubR1 κατά τη γήρανση μπορεί να ελέγχονται από την αυτοφαγία. Για να αναλύσουμε αυτό το ενδεχόμενο, επιδράσαμε σε νεαρά και γηρασμένα βλαστοκύτταρα με δύο αναστολείς της αυτοφαγίας που δρουν σε διαφορετικό σημείο της διαδικασίας, την HCQ και την 3-Μεθυλαδενινη (3-Methyladenine /3MA) καθώς και με έναν γνωστό επαγωγέα της αυτοφαγίας, το everolimus. Προκειμένου να αναλύσουμε αν το Bub1b/BubR1 θα μπορούσε να αποτελεί υπόστρωμα της αυτοφαγίας ελέγξαμε μέσω υπολογιστικών προγραμμάτων την ύπαρξη στο μόριο χαρακτηριστικού μοτίβου που εξυπηρετεί την αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες ATG8 και βρίσκεται στα περισσότερα γνωστά υποστρώματα της αυτοφαγίας. Επιπλέον ελέγχθηκε αν αποτελεί εκλεκτικό υπόστρωμα της αυτοφαγίας άμεσα α) μέσω ανοσοκατακρήμνισης του με το LC3 σε νεαρά και γηρασμένα μεσεγχυματικά και σε ιστούς νεαρών και μέσης ηλικίας ποντικών και β) μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού προκειμένου να ελεγχθεί ο συνεντοπισμός του Bub1b/BubR1 με το LC3. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων κατέδειξαν αλλαγές στα πρωτεϊνικά και μεταγραφικά επίπεδα των μορίων του SAC και κυρίως του Bub1b/BubR1, που εμφανίζει ένα χαρακτηριστικό πρότυπο με μια αρχική αύξηση που ακολουθείται από μείωση όταν τα κύτταρα ή τα ζώα αρχίζουν να γερνούν. Επιπλέον παρατηρήθηκε απορρύθμιση της αυτοφαγικής απόκρισης έναντι της οξειδωτικής προσβολής αλλά και αδυναμία καταστολής της αυτοφαγίας κατά τη μίτωση στα γηρασμένα WJ-MSC, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την απορρύθμιση της αυτοφαγίας κατά τη γήρανση. Παρατηρήθηκαν επίσης αλλαγές στο σχηματισμό του MCC, που οδηγούν σε ένα αποδυναμωμένο SAC στα γηρασμένα βλαστοκύτταρα αλλά και σε νεαρά κύτταρα είχαν δεχθεί την επίδραση εξωγενούς οξειδωτικού στρες, όπως υποδεικνύει η αύξηση στα μιτωτικά λάθη, τα υπεράριθμα κεντροσώματα και τα σχετιζόμενα με δυσλειτουργικό SAC χαρακτηριστικά (μικροπυρήνες, ανώμαλες άτρακτοι, αδυναμία παύσης του κυτταρικού κύκλου). Τέλος, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι για τη μείωση των επιπέδων του κεντρικού μορίου του SAC, Bub1b/BubR1, κατά τη γήρανση είναι η υπεύθυνη η αυτοφαγία. Όλα τα παραπάνω συνέβαλαν στη διαμόρφωση της πρότασης μας για τον υποκείμενο μηχανισμό, η οποία περιγράφεται σχηματικά στην εικόνα 2: Για πρώτη φορά, από όσο γνωρίζουμε, υποστηρίζεται ότι το Bub1b/BubR1 είναι εκλεκτικό υπόστρωμα της αυτοφαγίας κατά την έναρξη της γήρανσης. Το Bub1b/BubR1 έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι μειώνεται φυσικά με τη γήρανση. Εδώ, δείχνουμε ότι υπάρχει μια αρχική αύξηση στα επίπεδα του, πιθανώς ως μέρος της απόκρισης των κυττάρων έναντι της γενωμικής αστάθειας που προκύπτει ως αποτέλεσμα της δυσλειτουργίας του SAC λόγω ΟΣ. Η αρχική αυτή αύξηση ακολουθείται από την αποικοδόμησή του που εξαρτάται από την αυτοφαγία. Αυτό παρέχει μια εξήγηση για τη μείωση του κατά τη γήρανση, κυρίως επειδή είναι καλά αποδεδειγμένο ότι η λειτουργία του πρωτεασώματος μειώνεται καθώς τα κύτταρα γερνούν. Αυτά τα αποτελέσματα, όχι μόνο υποστηρίζουν την προηγουμένως αναφερθείσα άποψη της μετατόπισης της αποικοδόμησης που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα προς την αυτοφαγία κατά τη γήρανση, αλλά, προτείνουν επίσης μια μηχανιστική επεξήγηση για τη γήρανση που προκαλείται από τα μιτωτικά λάθη. Πιστεύουμε επιπλέον ότι τα συμπεράσματά μας εμβαθύνουν την κατανόησή μας σχετικά με την ομοιοστατική λειτουργία της αυτοφαγίας που εξυπηρετεί την εγκαθίδρυση της κυτταρικής γήρανσης ως εμπόδιο ενάντια στον κυτταρικό μετασχηματισμό.