Φαρμακολογική μελέτη των υποδοχέων του εκλυτικού παράγοντα κορτικοτροπίνης ως θεραπευτικών στόχων σε περιφερικά συστήματα και στον καρκίνο
Authors: Κουρέτα Μαρία 
Published: September 2021

Το σύστημα του Εκλυτικού Παράγοντα Κορτικοτροπίνης είναι ο κύριος ρυθμιστής των ενδοκρινικών, συμπεριφορικών και αυτόνομων αντιδράσεων του οργανισμού έναντι στο στρες, διατηρώντας την ομοιόσταση σε αυτά τα επίπεδα. Το σύστημα του CRF, εκτός από το υποθαλαμικό νευροπεπτίδιο CRF, αποτελείται από τα ομόλογα πεπτίδια των Ουροκορτινών (Ucn) Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, δύο διακριτούς υποδοχείς, τους CRF-R1 και CRF-R2 καθώς και μια πρωτεΐνη δέσμευσης CRF-BP. Οι δυο υποδοχείς (CRF-Rs) που παρουσιάζουν διαφορετική κατανομή και λειτουργία, ανήκουν στην κατηγορία Β των υποδοχέων συζευγμένων με πρωτεΐνη G (GPCRs). Το σύστημα CRF εντοπίζεται σε πολλές περιοχές του ΚΝΣ που εμπλέκονται σε δράσεις απάντησης στο στρες. Σε κάθε κυτταρικό τύπο, η ενεργοποίηση των συζευγμένων G -πρωτεϊνών οδηγεί στην ενεργοποίηση πολλών και διαφορετικών μονοπατιών σηματοδότησης (για παράδειγμα έχουν αναφερθεί τα μονοπάτια cAMP-ΡΚΑ, PKC, ERK-MAPK, Akt/ Protein Kinase B-PI-3, NF-κΒ, Nur1 / Nur77 και άλλα). Έτσι, η επιλεκτική σύνδεση των νευροπεπτιδίων του συστήματος CRF με τον υποδοχέα και η δημιουργία του ενεργοποιημένου συμπλόκου προσδέτης- υποδοχέας οδηγεί σε ιστο-ειδική σηματοδότηση. Το σύστημα πεπτιδίων-υποδοχέων του CRF επεκτείνεται και στην περιφέρεια όπου δρουν ανεξάρτητα και επηρεάζουν ποικίλα οργανικά συστήματα ασκώντας κάποιο φυσιολογικό ρυθμιστικό ρόλο, ενώ πιθανολογείται η συμμετοχή του σε παθογενετικούς μηχανισμούς που σχετίζονται με το στρες. Ακόμη, το σύστημα CRF στην περιφέρεια φαίνεται να εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, καθώς και σε φαινόμενα φλεγμονής. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν αποδείξει την σχέση του συστήματος CRF με διάφορους τύπους καρκίνου. Με βάση μελέτες που χρησιμοποιούν in vitro πειραματικά μοντέλα, η οικογένεια των νευροπεπτιδίων του CRF και των υποδοχέων τους έχει προταθεί ότι συμμετέχουν στην καρκινογένεση, τη μετάσταση, την αγγειογένεση και την ανοσοδιαφυγή διαφόρων κακοηθειών. Αρκετές μελέτες καταδεικνύουν την έκφραση στοιχείων του συστήματος CRF σε ένα ευρύ φάσμα των ανθρώπινων κακοηθειών, ενώ αποσαφήνιση του βιολογικού του ρόλου είναι αναγκαία για τη στήριξη της παθοφυσιολογικής σημασίας των ευρημάτων αυτών. Δημοσιευμένα δεδομένα από τη δική μας και άλλες ερευνητικές ομάδες παρείχαν στοιχεία ότι και οι δύο υποδοχείς του συστήματος CRF εκφράζονται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού - προερχόμενα είτε από βιοψίες όγκου ή από πειραματικά μοντέλα in vitro καρκινικών κυττάρων μαστού- παρουσιάζοντας διαφορετική κατανομή, υποδηλώνοντας κάποιο βιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη, ομοιόσταση και μεταναστευτική ικανότητα αυτών των καρκινικών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης και των βιολογικών δράσεων των υποδοχέων του CRF στον καρκίνο του μαστού με στόχο την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην δράση του συστήματος στην περιφέρεια και την καρκινογένεση και προσεγγίζοντας τους ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Πρόκειται για μια in vitro μελέτη, που ξεκίνησε με το χαρακτηρισμό της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς μαστού MCF-7 ως μοντέλου για τη μελέτη του συστήματος CRF στον καρκίνο του μαστού. Συγκεκριμένα, περιγράφηκε η έκφραση των υποδοχέων CRF σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο μέσω της τεχνικής ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT qPCR) και ανοσοφθορισμού (IF) αντίστοιχα, υπό βασικές συνθήκες καλλιέργειας και υπό ορμονική επαγωγή. Εντοπίστηκε η έκφραση του CRF-R2 στην κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων MCF-7 μέσω ανοσοφθορισμού, ενώ η ποσοτική RT-PCR έδειξε γονιδιακή έκφραση και των δύο τύπων υποδοχέων, με τον υποδοχέα CRF-R2a να εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα. Η ρύθμιση της μεταγραφής των CRF-Rs σε κύτταρα MCF-7 υπό την επίδραση οιστρογόνων (Ε2) ήταν αντίθετη για τους δύο υποδοχείς: παρατηρήθηκε αύξηση στα μετάγραφα των υποδοχέων CRF-R1 ενώ το mRNA του CRF-R2 μειώθηκε. Επίσης, προκειμένου για την κατανόηση του μηχανισμού και επιπέδου ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων CRF-R1 και CRF-R2, έγινε μελέτη της κατάστασης μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων. Αξιοσημείωτο εύρημα είναι ότι ο υποκινητής του CRF-R1 βρέθηκε να απομεθυλιώνεται από τον γνωστό απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-αζακυτιδίνη, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην κατάσταση μεθυλίωσης του υποδοχέα CRF-R2, υποδηλώνοντας διαφορετικά επίπεδα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Μετά από επίδραση με Ε2 δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην κατάσταση μεθυλίωσης αμφοτέρων των υποδοχέων. Τα αποτελέσματα από την καρκινική σειρά εκτιμήθηκαν παράλληλα με μετρήσεις σε δείγμα βιοψιών καρκίνου μαστού, όπου η μεθυλίωση του υποδοχέα CRF-R1 ήταν επίσης αυξημένη σε δείγματα που ήταν θετικά για την έκφραση ορμονικών υποδοχέων. Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η κυτταρική σηματοδότηση των υποδοχέων σε σχέση με τις παραμέτρους ανάπτυξης (κυτταρικός πολλαπλασιασμός, μεταναστευτικό δυναμικό) της καρκινικής κυτταρικής σειράς MCF-7, και η αλληλεπίδραση με την ορμονική επαγωγή τους. Για τα πειράματα αυτά, χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα παρακολούθησης της κυτταρικής συμπεριφοράς σε πραγματικό χρόνο. Αξιολογήθηκε χρόνο- και δόσο-εξαρτώμενα η δράση ουσιών που δρουν ως αγωνιστές ή ανταγωνιστές στους υποδοχείς του συστήματος CRF. Πιο συγκεκριμένα, για την ενεργοποίηση των υποδοχέων CRF-R2 in vitro, επιλέχθηκε ο ειδικός και εκλεκτικός αγωνιστής UcnII. Στις αναλύσεις κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF-7 δεν ανιχνεύθηκε καμία επίδραση της Ucn II, είτε σε βασικές συνθήκες ανάπτυξης είτε υπό επαγωγή με Ε2. Στα πειράματα παρακολούθησης της μεταναστευτικής ικανότητας των MCF-7, παρατηρήθηκε αύξηση του δυναμικού μετανάστευσης των MCF-7 κυττάρων υπό την επίδραση UcnII. H δράση αυτή καταργήθηκε από τον επιλεκτικό ανταγωνιστή του υποδοχέα CRF-R2, Astressin- 2B, καταδεικνύοντας ειδική ενεργοποίηση μέσω CRF-R2. Τέλος, η UcnII ενίσχυσε την επαγωγική δράση της Ε2 στη μεταναστευτική ικανότητα των MCF-7. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι στον καρκίνο του μαστού υπάρχει ένας ενεργός «διάλογος» μεταξύ του CRF συστήματος και των στεροειδών ορμονών, ο οποίος πιθανόν να συμβάλλει στην ορμόνο- εξαρτώμενη καρκινογένεση και να έχει προεκτάσεις στην ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων.