Μελέτη των σηματοδοτικών οδών BRAF/MEK/ERK και AKT/mTOR στη λευχαιμία εκ τριχωτών κυττάρων
Authors: Λακιωτάκη Ελευθερία 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Η μετάλλαξη BRAFV600E αποτελεί το προέχον γενετικό γεγονός στη λεμφωματογένεση της ΛΤΚ. Η οδός ΑΚΤ/mTOR κατέχει ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και μετανάστευσης και εμφανίζει σε αρκετά σημεία διασυνδέσεις με την οδό ΜΑΡΚ. Η συμμετοχή της οδού ΑΚΤ/mTOR στη ΛΤΚ και η σύνδεσή της με την οδό ΜΑΡΚ διερευνάται για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, ενώ τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και τα μικροαγγειακά ευρήματα του ΜΟ των ασθενών. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με τη μέθοδο Western blot σε μικρό αριθμό περιστατικών. Ακόμη, η παρουσία της μετάλλαξης BRAFV600E ανιχνεύθηκε με μοριακές τεχνικές σε υλικό ΟΜΒ των ασθενών, ενώ έγινε σύγκριση της ενεργοποίησης της οδού ΑΚΤ/mTOR στην κυτταρική σειρά ΒΟΝΝΑ-12 πριν και μετά τη διαμόλυνση με το μεταλλαγμένο γονίδιο BRAFV600E.Υλικό και Μέθοδοι: Το μόριο BRAFV600E καθώς και τα φωσφορυλιωμένα (p-) ERK1/2, mTOR, p70S6K, 4E-BP1 και ΑΚΤ μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά σε 77 περιστατικά ΛΤΚ και με Western blot σε 7 εξ αυτών. Επίσης, τα παραπάνω μόρια μελετήθηκαν σε 16 περιστατικά άλλων Β λεμφωμάτων χαμηλής κακοήθειας για σύγκριση των αποτελεσμάτων. Τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, και τα μικροαγγειακά ευρήματα του ΜΟ των ασθενών σε 36 εξ αυτών. Έγινε έλεγχος για την μετάλλαξη BRAFV600E με αλληλούχιση, πυροαλληλούχιση και ανάλυση τήξης υψηλής ευκρίνειας σε 35 περιστατικά. Η κυτταρική σειρά ΛΤΚ ΒΟΝΝΑ-12 διαμολύνθηκε με πλασμίδιο το οποίο έφερε τη μετάλλαξη BRAFV600E και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των πρωτεϊνών BRAFV600E, p-ERK1/2, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 και p-ΑΚΤ με Western blot σε φυσικού τύπου και BRAFV600E μεταλλαγμένα κύτταρα πριν και μετά τη χορήγηση ραπαμυκίνης, ενώ έγινε και μελέτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤS.Αποτελέσματα: Όλα τα περιστατικά ήταν θετικά για BRAFV600E και p-ERK1/2 και τα περισσότερα για p-p70S6K, p-4E-BP1 και p-ΑΚΤ (93,5%, 97,4% και 96,1% αντίστοιχα), ενώ έκφραση του p-mTOR παρατηρήθηκε μόνο στο 12,99% των περιπτώσεων. Τα λοιπά Β λεμφώματα χαμηλής κακοήθειας ήταν αρνητικά για τις πρωτεΐνες BRAFV600E και p-ERK1/2. Τα αποτελέσματα του Western blot είχαν αντίστοιχη εικόνα, ενώ οι μοριακές τεχνικές ανέδειξαν την παρουσία της μετάλλαξης BRAFV600E σε 30/35 περιστατικά. Η πρωτεΐνη BRAFV600E εμφάνισε θετική συσχέτιση με την πυρηνική έκφραση του p-p70S6K, την κυτταροπλασματική έκφραση του p-4E-BP1 και την πυρηνική/κυτταροπλασματική έκφραση του p-ERK1/2. Η κυτταροπλασματική έκφραση του p-ERK1/2 συσχετίσθηκε με την έκφραση του p-mTOR, την κυτταροπλασματική έκφραση του p-p70S6K και την κυτταροπλασματική έκφραση του p-4E-BP1, ενώ η έκφραση του p-mTOR εμφάνισε συσχετίσεις με όλα τα υπόλοιπα μόρια της οδού AKT/mTOR. Η έκφραση του p-AKT συσχετίσθηκε με την πυρηνική (αλλά όχι την κυτταροπλασματική) έκφραση του p-p70S6K. Όσον αφορά τα κλινικοπαθολογοανατομικά και μικροαγγειακά χαρακτηριστικά, το p-ERK1/2 έδειξε αντίστροφη συσχέτιση με τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης και τον απόλυτο αριθμό αιμοπεταλίων (κυτταροπλασματική έκφραση) και θετική συσχέτιση με τον παράγοντα καμπυλότητας (πυρηνική έκφραση), ενώ το BRAFV600E συσχετίσθηκε αρνητικά με τον απόλυτο αριθμό των αιμοπεταλίων και τον απόλυτο αριθμό των ουδετεροφίλων. Στη μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης η αυξημένη διήθηση του ΜΟ από ΛΤΚ, τα μειωμένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης, η νεότερη ηλικία, η αυξημένη έκφραση του p-AKT, του κυτταροπλασματικού p-ERK1/2, του κυτταροπλασματικού p-4E-BP1, του p-mTOR και του BRAFV600E όπως και η παρουσία ταυτόχρονης αυξημένης έκφρασης των πρωτεϊνών p-AKT/ κυτταροπλασματικού p-mTOR/ κυτταροπλασματικού p-4E-BP1 συσχετίσθηκαν με βραχύτερο διάστημα TNT. Η συνέκφραση αυτών των τριών μορίων παραμένει σημαντική στην πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, όπως και ο βαθμός διήθησης του ΜΟ από ΤΚ. Όταν τα p-AKT, p-mTOR και p-4E-BP1 εισήχθησαν χωριστά στο μοντέλο Cox, μόνο το τελευταίο αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγων δυσμενούς πρόγνωσης. Τέλος, τα κύτταρα ΒΟΝΝΑ-12 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα p-ΕRΚ1/2, p-mTOR, p-p70S6K και p-4E-BP1 και αυξημένο πολλαπλασιασμό μετά την εισαγωγή της μετάλλαξης BRAFV600E, ο οποίος ήταν σχετικά ανθεκτικός στη χορήγηση ραπαμυκίνης. Συμπεράσματα: .Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν για πρώτη φορά την ενεργοποίηση της οδού ΑΚΤ/mTOR στη ΛΤΚ και, μέσω των ισχυρών συσχετίσεων των μορίων που ενεργοποιούν ή ενεργοποιούνται από το mTOR με τα μόρια της οδού Raf-MEK-ERK, την υπάρχουσα αλληλεπίδραση των δύο οδών. Αξιοσημείωτη είναι η ανάδειξη της έκφρασης του μορίου p-4E-BP1, μόνη της ή σε συνδυασμό με την έκφραση των p-AKT και p-mTOR ως ανεξάρτητου προγνωστικού παράγοντα βραχύτερης υποτροπής στη ΛΤΚ.