Σχεδιασμός, σύνθεση και αποτίμηση βιολογικής δραστικότητας νέων στεροειδών εστέρων με τροποποιημένους αλκυλιωτικούς παράγοντες
Authors: Παπακωνσταντίνου Ιωάννα 
Published: August 2021

Εξήντα έξη χρόνια μετά την εμφάνιση της πρώτης δημοσίευσης που αφορούσε στη θεραπεία με τη χρήση μουσταρδών αζώτου και ενώσεις που ανήκουν στη θεραπευτική αυτή κατηγορία, όπως το κυκλοφωσφαμίδιο και η μελφαλάνη εξακολουθούν να αποτελούν πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικούς παράγοντες τόσο κατά της λευχαιμίας όσο και έναντι άλλων συμπαγών όγκων. Οι διλειτουργικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες, κατηγορία στην οποία ανήκουν και οι μουστάρδες αζώτου, επάγουν το θάνατο των καρκινικών κυττάρων και κατά συνέπεια και την κυτταροτοξική τους δράση μέσω της δημιουργίας διαμοριακών χιαστί τύπου δεσμών μεταξύ των κλώνων του DNA. Οι φαρμακολογικές τους δράσεις σχετίζονται κυρίως με την σύνθεση του DNA των διαιρούμενων κυττάρων, προκαλώντας ουσιαστικά μια γενική αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης. Ωστόσο, εκτός από την αναμενόμενη και επιθυμητή θεραπευτική δράση, προκαλούν τοξικές παρενέργειες, οι οποίες σχετίζονται με μεταλλαγή των κυττάρων της αρχέγονης σειράς, εμφάνιση καρκινογένεσης και τερατογένεσης. Το εύρος των μειονεκτημάτων που παρουσιάζουν και ειδικά η συστηματική τοξικότητα σε συνδυασμό με την υψηλή χημική in vivo δραστικότητα τους και την μειωμένη εκλεκτικότητα τους, είχαν ως αποτέλεσμα τον περιορισμό της χρήσης τους. Παρόλα αυτά κατέχουν εξέχουσα θέση στη θεραπευτική έναντι μιας μεγάλης ποικιλίας τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και των αιματολογικών νεοπλασμάτων. Στην προσπάθεια επίλυσης του προβλήματος της αυξημένης τοξικότητας και της απουσίας εκλεκτικότητας των ενώσεων της κατηγορίας αυτής, διάφορες μουστάρδες αζώτου συζεύχθηκαν μέσω εστερικού δεσμού με ποικίλους στεροειδικούς σκελετούς, στρατηγική που αποδείχθηκε ουσιαστικά ιδιαιτέρως αποτελεσματική. Αποτελέσματα μελετών τόσο της ερευνητικής μας ομάδας όσο και άλλων, υποστηρίζουν πως ο στεροειδικός σκελετός δεν μπορεί πλέον να θεωρηθεί μόνο ως απλός φορέας για την αποτελεσματική μεταφορά της αλκυλιωτικής ομάδας στις θέσεις στόχους του DNA, εφόσον μικρές δομικές τροποποιήσεις του επιφέρουν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην αντιλευχαιμική δράση των τελικών στεροειδών εστέρων. Επιπρόσθετα, οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η παρουσία της –NHCO- ομάδας είτε ως ενδοκυκλικής λακταμικής είτε ως εξωκυκλικής αμιδικής στον Δ-δακτύλιο του στεροειδικού τμήματος είναι καθοριστικός παράγοντας για την εμφάνιση κυτταροτοξικής ή αντινεοπλασματικής δράσης στεροειδών εστέρων της χλωραμβουκίλης και αναλόγων αυτής. Μέχρι σήμερα έχει προκύψει ένας εκτεταμένος αριθμός στεροειδών εστέρων, από την σύζευξη απλών και τροποποιημένων στεροειδών με αρκετές διαφορετικές μουστάρδες αζώτου. Η πλειονότητα αυτών των παραγώγων έχουν υποβληθεί σε in vitro και in vivo βιολογικές δοκιμές έναντι των λευχαιμίων Ρ388 και L1210 και αρκετά από αυτά έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικοί αντινεοπλασματικοί παράγοντες. Σε μια πρόσφατη 3D-QSAR μελέτη τριάντα οκτώ στεροειδών εστέρων τριών διαφορετικών μουσταρδών αζώτου με απλούς και τροποποιημένους στεροειδικούς σκελετούς, έγινε προσπάθεια διερεύνησης των 3D σχέσεων χημικής δομής-βιολογικής δραστικότητας, με σκοπό την εύρεση των απαραίτητων στερεοηλεκτρονικών χαρακτηριστικών των ενώσεων που συμβάλλουν στην εκδήλωση της αντιλευχαιμικής δράσης των. Η ανάλυση στηρίχθηκε στην χρήση των μεθοδολογιών CoMSIA και CoMFA. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από τις 3D-QSAR αναλύσεις αξιοποιήθηκαν στη συνέχεια από ένα υπολογιστικό πρόγραμμα de novo σχεδιασμού και ανακάλυψης νέων βιοδραστικών μορίων, την εφαρμογή LeapFrog. Με βάση τα είκοσι βελτιωμένα στεροειδικά εστερικά παράγωγα που προτάθηκαν από το LeapFrog, επιλέχθηκαν να σχεδιαστούν και να συντεθούν οι ακόλουθες αρωματικές μουστάρδες αζώτου: α) 2-[π-Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμινοφαινυλο]βουτυρικό οξύ (7), β) 2-ακεταμιδο-2-[π-Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμινοφαινυλο]οξικό οξύ (30), γ) 2-ακεταμιδο-2-[ο-Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμινοφαινυλο]οξικό οξύ (31) και δ) το 3-ακεταμιδο-3-[π-Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμινοφαινυλο] προπανοϊκό οξύ (42), καθώς και τα εστεροποιημένα παράγωγα αυτών, με επιλεγμένους απλούς και τροποποιημένους στεροειδικούς σκελετούς. Η σύζευξη των νεων μουσταρδών με επιλεγμένες στεροειδικές αλκοόλες απέδωσε δεκαεπτά νέα εστερικά ανάλογα, η σύνθεση των οποίων είχε ως απώτερο σκοπό τη βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη των μουσταρδών αζώτου καθώς και τον εμπλουτισμό της βιβλιοθήκης των αποτελεσμάτων που αφορούν στη σχέση χημικής δομής-βιολογικής δραστικότητας των ενώσεων της κατηγορίας αυτής. Συγκεκριμένα, για τη σύνθεση των παραπάνω μουσταρδών αζώτου, εφαρμόστηκε η κλασσική μεθοδολογία σύνθεσης. Ωστόσο, αυτή αποδείχθηκε αποδοτική μονό κατά τη σύνθεση της μουστάρδας 7, παρέχοντας το τελευταίο σε συνολική απόδοση 45%. Για τις υπόλοιπες μουστάρδες ακολουθήθηκαν εναλλακτικές πορείες σύνθεσης λόγω προβλημάτων που παρουσιάστηκαν κατά την εφαρμογή της κλασσικής μεθοδολογίας. Κρίσιμο στάδιο κατά τη σύνθεση των μουσταρδών αζώτου 30 και 31, αποτέλεσε η αρχική προστασία της ελεύθερης αμινομάδας της DL-α-φαινυλγλυκίνης (16) που χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη της συνθετικής πορείας. Η διερεύνηση και η βελτιστοποίηση των πειραματικών συνθηκών ήταν απαραίτητη και κατά το στάδιο της χλωρίωσης των Ν,Ν-δις(2-υδροξυαιθυλ)-παραγώγων 26 και 27 για τον σχηματισμό της χαρακτηριστικής Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλαμινο)-ομάδας των παραγώγων 30 και 31. Κατά τη σύνθεση του 3-ακεταμιδο-3-[π-Ν,Ν-δις(2-χλωροαιθυλ)αμινοφαινυλο]προπανοϊκού οξέος (42) ήταν απαραίτητη η βελτιστοποίηση παρασκευής των ενδιαμέσων 33 και 37. Μετά από διερευνητικές προσπάθειες κατέστη εφικτή η βελτίωση της απόδοσης σύνθεσης του παραγώγου 33 από 54% σύμφωνα με τη βιβλιογραφία σε 98%, καθώς και η σύνθεση του ακετάμιδο παραγώγου 37 τόσο σε λιγότερα συνθετικά στάδια και σε καλύτερη απόδοση σε σχέση με τα δημοσιευμένα βιβλιογραφικά δεδομένα. Σε επόμενο στάδιο της μελέτης σχεδιάσθηκε η εστεροποίηση των μουστάρδων 7, 30 και 42 με επιλεγμένους στεροειδικούς σκελετούς. Για τη σύνθεση των τελικών εστερικών στεροειδικών παραγώγων εφαρμόστηκε η μέθοδος των μικτών ανυδριτών, η οποία περιλαμβάνει την αντίδραση της αρωματικής μουστάρδας αζώτου με ελαφρά περίσσεια 2,4,6-τριχλωροβενζοϋλοχλωρίδιου παρουσία τριαιθυλαμίνης, το σχηματισμό του αντίστοιχου μικτού ανυδρίτη και στη συνέχεια in situ αντίδρασή του με τη στεροειδική αλκοόλη παρουσία 4-διμεθυλαμινοπυριδίνης. Τελικώς κατέστη εφικτή η σύνθεση δεκαεπτά τελικών στεροειδών εστέρων από τη σύζευξη των μουσταρδών αζώτου, 7 και 42 με επιλεγμένες στεροειδείς αλκοόλες. Παρά τις διερευνητικές προσπάθειες που καταβλήθησαν δεν κατέστη εφικτή η εστεροποίηση της μουστάρδας 30. Το σύνολο των τελικών στεροειδών εστέρων προωθήθηκαν σε βιολογικές μελέτες για την αποτίμηση της αντινεοπλασματικής τους δράσης. Τα διαθέσιμα αποτελέσματα αυτών των μελετών σχετίζονται με τα έντεκα στεροειδικά εστερικά παράγωγα της μουστάρδας 7 (2-PHE-BU). Τα μελετηθέντα αυτά παράγωγα επέδειξαν μειωμένη τοξικότητα και μια οριακή αντινεοπλασματική δραστικότητα έναντι της λευχαιμίας Ρ388, στην οποία είχαν μελετηθεί, συγκριτικά με την ελέυθερη αρωματική μουστάρδα (2-PHE-Bu). Ωστόσο, τα ληφθέντα βιολογικά αποτελέσματα ήταν υποδεέστερα των αντίστοιχων δεδομένων που είχαν συλλεχθεί κατά τη μελέτη του PHE και των στεροειδικών εστέρων αυτού έναντι και πάλι της λευχαιμίας Ρ388. Το γεγονός αυτό πιθανόν να οφείλεται στη μειωμένη ενζυμική υδρόλυση που υφίστανται in vivo τα παράγωγα αυτά, λόγω της στερεοχημικής παρεμπόδισης που προκαλεί η αιθυλική αλυσίδα γύρω από τον εστερικό δεσμό σύνδεσης μουστάρδας-στεροειδούς, γεγονός που συνεπάγεται μειωμένη απελευθέρωση της μουστάρδας αζώτου. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί πως αν και, τόσο οι νέες αρωματικές μουστάρδες αζώτου, όσο και τα στεροειδικά τους παράγωγα είχαν προταθεί ως υποψήφια παράγωγα με βελτιωμένη βιοδραστικότητα κατά την πραγματοποίηση de novo σχεδιασμού από το υπολογιστικό πρόγραμμα LeapFrog, τα αποτελέσματα των βιολογικών δοκιμών δεν επιβεβαιώσαν τις συγκεκριμένες ποτάσεις. Πιθανότατα, παράμετροι που δεν ελήφθησαν υπόψη κατά τον de novo σχεδιασμό από το LeapFrog, όπως η μεταβολική τροποποίηση των ενώσεων να εμπλέκονται και να καθορίζουν την βιοδραστικότητα του τελικών στεροειδικών εστέρων. Θεωρείται ότι μια αναθεώρηση κρίσιμων παραμέτρων όπως η χημική ποικιλομορφία και ο αριθμός των ενώσεων που εισέρχονται ως δεδομένα στις μελέτες 3D-QSAR μπορεί να αποδώσει μεγαλύτερης αξιοπίστιας μοντέλα CoMFA και CoMSIA. Τα νέα αυτά μοντέλα κατά την εισαγωγή τους σε υπολογιαστικά προγράμματα de novo σχεδιασμού μπορούν να συμβάλλουν στο σχεδιασμό νεών ενώσεων με πιθανά υπέρτερη βιοδραστικότητα.