Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων HPLC-DAD για τον προσδιορισμό διαφόρων ενδοκρινικών διαταρακτών σε βιολογικά δείγματα με καινοτόμα υλικά και σύγχρονες τεχνικές προκατεργασίας
Authors: Αλαμπάνος Βασίλειος 
Published: April 2023

Η παρούσα διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη τεσσάρων νέων μεθόδων προκατεργασίας δείγματος με χρήση σύγχρονων τεχνικών και καινοτόμων υλικών σε συνδυασμό με νέες μεθόδους υγρής χρωματογραφίας και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό εστέρων του π-υδροξυβενζοϊκού οξέος (parabens), δισφαινολών και διαιθυλοστιλβεστρόλης, σε βιολογικά υποστρώματα και πιο συγκεκριμένα σε ιστούς μαστού, σε ούρα και σε μητρικό γάλα. Οι ενώσεις αυτές είναι ενδοκρινικοί διαταράκτες και συνδέονται με πολλές ασθένειες και μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού. Εντοπίζονται σε πλήθος βιομηχανικών προϊόντων, με αποτέλεσμα η πρόσληψη τους να συμβαίνει καθημερινά από πολλές πηγές. Επομένως, ο προσδιορισμός τους σε βιολογικά υποστρώματα παρουσιάζει ενδιαφέρον για επιδημιολογικούς και τοξικολογικούς σκοπούς. Αρχικά, η εκχύλιση με υφασμάτινο μέσο (FPSE) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκχύλιση επτά parabens (MPB, EPB, iPPB, PPB, iBPB, BPB, BzPB) από ιστούς μαστού πριν τον προσδιορισμό τους με μία νέα μέθοδο HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός των επτά ενώσεων πραγματοποιήθηκε με την αναλυτική στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 4,6 × 150 mm) με ισοκρατική έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Η ταχύτητα ροής ήταν 1,4 mL/min και ο χρόνος ανάλυσης ήταν 13,6 min. Πριν την εφαρμογή της μεθόδου FPSE, αναπτύχθηκε μία αποτελεσματική διαδικασία τεμαχισμού και ομογενοποίησης του δείγματος για την παραλαβή των στερεών υπολειμμάτων του ιστού με SLE. Η μέθοδος FPSE βελτιστοποιήθηκε ως προς τις κρίσιμες παραμέτρους. Πιο αποδοτική μεμβράνη ήταν η sol-gel PTHF (πολυ-τραϋδροφουράνιο) σε υφασμάτινο υπόστρωμα κυτταρίνης. Η μέθοδος επικυρώθηκε εφαρμόζοντας μια προσέγγιση που έλαβε υπόψη διεθνείς οδηγίες και συμπεράσματα προηγούμενων ερευνών. Επιπροσθέτως, αξιολογήθηκε ο «πράσινος» χαρακτήρας της με χρήση κατάλληλου λογισμικού. Μέσω της εφαρμογής της FPSE, επιτεύχθηκε η εναρμόνιση της μεθόδου με τις αρχές τις Πράσινης Αναλυτικής Χημείας (GAC). Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανάλυση δειγμάτων καρκινικών και μη καρκινικών ιστών. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν βιοσυσσώρευση των parabens στους ιστούς του μαστού, με τα επίπεδα συγκέντρωσης να είναι υψηλότερα στα καρκινικά δείγματα. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μία νέα μέθοδος FPSE-HPLC-DAD για την εκχύλιση και τον προσδιορισμό έξι δισφαινολών (δισφαινόλες Α, Β, C, E, F, S) και της διαιθυλοστιλβεστρόλης σε ούρα. H FPSE εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκχύλιση δισφαινολών από ούρα. Ο διαχωρισμός των επτά ενώσεων πραγματοποιήθηκε με αναλυτική στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 4,6 × 150 mm) με βαθμωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Η ταχύτητα ροής ήταν 1 mL/min και ο χρόνος ανάλυσης ήταν 17,4 min. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε μία νέα μέθοδος FPSE. Η μεμβράνη sol-gel PEG (πολυ-αιθυλενογλυκόλη) σε υφασμάτινο υπόστρωμα κυτταρίνης έδωσε την πιο αποτελεσματική εκχύλιση. Η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα, την ευαισθησία, την επιλεκτικότητα, την ακρίβεια, την πιστότητα, τη σταθερότητα και την ανθεκτικότητα. Επιπλέον, ελέγχθηκε η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης του μέσου εκχύλισης. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές. Οι τιμές LOD και LOQ ήταν 0,60-0,87 ng/mL και 1,8-2,6 ng/mL, αντίστοιχα. Η μέθοδος εμφάνισε ικανοποιητική ακρίβεια, επαναληψιμότητα και ενδιάμεση πιστότητα, καθώς οι τιμές RSD ήταν χαμηλότερες από 10%. Επιπλέον, αξιολογήθηκε ως ικανοποιητικά «πράσινη» και εφαρμόστηκε στην ανάλυση δειγμάτων ούρων. Η BPA ήταν η πιο συχνά μετρούμενη ένωση, γεγονός που αντικατοπτρίζει την ευρεία βιομηχανική χρήση της. Έπειτα, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά η εκχύλιση με υφασμάτινο μέσο ενσωματωμένου μηχανισμού ανάδευσης (MI-FPSE) και εφαρμόστηκε για την ανάπτυξη μίας νέας μεθόδου για τον προσδιορισμό πολύ κοινών διαταρακτών (MPB, EPB, PPB, BPB, BzPB) σε ούρα με HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός έγινε σε στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 150×4,6 mm) και πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης εντός 14 min. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. To μέσο sol-gel CW 20 M (Carbowax 20 M) ήταν το πιο αποτελεσματικό. Το πρωτόκολλο MI-FPSE βελτιστοποιήθηκε και η μέθοδος επικυρώθηκε. Οι τιμές των LOD και LOQ ήταν 1,17-2,0 και 3,5-6,0 ng/mL, ενώ οι τιμές RSD βρέθηκαν χαμηλότερες από 9,0% σε όλες τις περιπτώσεις. Επίσης, η μέθοδος κρίθηκε ικανοποιητικά «πράσινη». Εφαρμόστηκε αποτελεσματικά στην ανάλυση δειγμάτων ούρων. Όλα τα εξεταζόμενα EDCs μετρήθηκαν σε υψηλά ποσοστά ανίχνευσης. Τέλος, η CPME εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκλεκτική εκχύλιση έξι δισφαινολών (BPA, BPB, BPC, BPE, BPF, BPS) από μητρικό γάλα και τον προσδιορισμό τους με μία νέα μέθοδο HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη Pathfinder C18 (3,5 μm, 150×4,6 mm) με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης εντός 11,8 min. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Αναφορικά με τη μέθοδο προκατεργασίας, αρχικά αναπτύχθηκε μία μέθοδος απομάκρυνσης των λιπιδίων και των πρωτεϊνικών δομών από το δείγμα, η οποία περιλάμβανε εφαρμογή παρατεταμένης φυγοκέντρησης και προσθήκη ακετονιτριλίου. Έπειτα, βελτιστοποιήθηκαν οι κρίσιμοι παράγοντες της απόδοσης της CPME. Η κάψουλα sol-gel PEG ήταν η πιο αποδοτική. Η μέθοδος επικυρώθηκε. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης ήταν 8,33 ng/mL και 25 ng/mL, αντίστοιχα. Οι τιμές RSD ήταν μικρότερες από 11%. Οι κάψουλες μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν έως και 6 φορές, ενώ η μέθοδος αξιολογήθηκε ως επαρκώς «πράσινη». Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τέσσερις νέες HPLC-DAD μέθοδοι για τον προσδιορισμό πολύ κοινών ενδοκρινικών διαταρακτών σε τρία βιολογικά υποστρώματα. Στις μεθόδους αυτές, εφαρμόζονται σύγχρονες τεχνικές μικροεκχύλισης, όπως είναι FPSE, CPME και MI-FPSE. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η MI-FPSE, η οποία αποτελεί μια ενδιαφέρουσα εξέλιξη της FPSE λαμβάνοντας υπόψη τους κινητικούς παράγοντες που επιδρούν στην εκχύλιση ισορροπίας, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά. Όλες οι μέθοδοι αποδείχθηκαν αποτελεσματικές, σύμφωνες με τις αρχές της GAC, ικανοποιητικά ευαίσθητες, ακριβείς, επαναλήψιμες, ανθεκτικές, πρακτικές και οικονομικές.