Μελέτη της λειτουργίας και του επανασυγχρονισμού του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού στο φασόλι (Phaseolus vulgaris)
Authors: Γαλέου Αγγελική 
Published: September 2021

Τα φυτά, ως οργανισμοί που δεν έχουν τη δυνατότητα μετακίνησης, έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς για να αντιδρούν στις διάφορες περιβαλλοντικές αλλαγές. Ένας από αυτούς είναι το ημερήσιο βιολογικό ρολόι (ΗΒΡ), το οποίο παράγει 24-ωρους ρυθμούς στη φυσιολογία και τη συμπεριφορά των οργανισμών, σε συμφωνία με το γεωφυσικό χρόνο. Το ΗΒΡ συντονίζει σημαντικές λειτουργίες των φυτών, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός και η άνθηση. Ως εκ τούτου, φυτά με καλά συγχρονισμένο ΗΒΡ παρουσιάζουν αυξημένη ευρωστία, ανθεκτικότητα και, κατ’ επέκταση, βελτιωμένες αποδόσεις. Το ΗΒΡ συγκροτείται από τρία δομικά συστατικά: τα μονοπάτια σηματοδότησης του κεντρικού ταλαντωτή (μονοπάτια εισόδου), τον ενδογενή κεντρικό ταλαντωτή και τα μονοπάτια εξόδου από αυτόν, δηλαδή τους βιοχημικούς και φυσιολογικούς ρυθμούς υπό τον έλεγχο του ρολογιού. Ο κύριος παράγοντας σηματοδότησης του ΗΒΡ είναι το φως, το οποίο συγχρονίζει το κεντρικό ταλαντωτή, μέσω των φωτοδεκτών. Ο κεντρικός ταλαντωτής αποτελείται από βρόχους επανατροφοδότησης μεταγραφικών παραγόντων με, κυρίως, αρνητική δράση.Για τη μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ επιλέχτηκε ως πειραματόφυτο το φασόλι (Phaseolus vulgaris). Στο φασόλι, πέραν της υψηλής διατροφικής του σημασίας και του καλλιεργητικού του ενδιαφέροντος, υπήρχαν στοιχεία ότι το ΗΒΡ λειτουργεί με διαφορετικό τρόπο από αυτό του ευρέως μελετώμενου Arabidopsis thaliana, γεγονός που ενισχύθηκε και από την παρούσα εργασία. Καθώς οι διαφορές αυτές πιθανά να αντικατοπτρίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς προσαρμογής στο περιβάλλον, έχει σημασία η μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και του μοριακού μηχανισμού που το διέπει. Η in vitro καλλιέργειά του, όμως, παρουσιάζει σημαντικά προβλήματα, καθιστώντας τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών φασολιού ιδιαίτερα δύσκολη. Έτσι, αναπτύχθηκε ένα in vitro κυτταρικό σύστημα πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, το οποίο αφού διαπιστώθηκε ότι διαθέτει άριστα λειτουργικό ΗΒΡ, χρησιμοποιήθηκε για μεγάλο μέρος των πειραμάτων της παρούσας εργασίας.Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζονται πειράματα με στόχο τη μελέτη των ρυθμών της έκφρασης υποψηφίων γονιδίων του ρολογιού. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο επανασυγχρονισμός του ρολογιού. Στο φασόλι, ο επανασυγχρονισμός από το φως είχε μελετηθεί ως προς την απόκριση του PvLHY, ενός πρωινά εκφραζόμενου γονιδίου του ρολογιού. Έτσι, εξετάσθηκε επιπροσθέτως ο επανασυγχρονισμός από το φως των ρυθμών των εσπερινών γονιδίων, PvTOC1 και PvELF4 και δείχτηκε για πρώτη φορά απόκριση εσπερινών γονιδίων στο φως τη νύχτα, η οποία ρυθμίζεται από το ρολόι. Αυτές οι παρατηρήσεις συνδέθηκαν στη συνέχεια με μία φυσιολογική λειτουργία του φυτού, την περιοδική 24-ωρη κίνηση των φύλλων του, ενισχύοντας, έτσι, την άποψη ότι το ρολόι του φασολιού είναι δεκτικό στο φως τη νύχτα.Για τη μελέτη του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ του φασολιού, απομονώθηκε μέρος των υποκινητών τριών εκ των βασικών παραγόντων του, PvTOC1, PvELF4 και PvLHY και μελετήθηκε η λειτουργία cis-ρυθμιστικών στοιχείων τους. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε μία μέθοδος in vivo καταγραφής της ρυθμικής ενεργότητας υποκινητών γονιδίων του ρολογιού με τη χρήση γονιδίου αναφοράς, από το ίδιο δείγμα ζωντανών πρωτοπλαστών, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τέλος, έμφαση δόθηκε στο ρόλο του παράγοντα PvTOC1, κεντρικού στοιχείου του ρολογιού ο οποίος εκτός από την καταστολή του αναμενόμενου στόχου του, PvLHY, παρουσίασε και αυτοκαταστολή, μειώνοντας την ενεργότητα του υποκινητή του ίδιου του γονιδίου του. Επιπλέον, εντοπίστηκε η περιοχή του υποκινητή του PvTOC1 η οποία εμπλέκεται στην καταστολή της μεταγραφικής έκφρασης, καθώς και η λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης PvTOC1 η οποία είναι απαραίτητη για αυτή τη δράση. Προσδόθηκε, έτσι, ένας ρόλος στην πρωτεΐνη PvTOC1, ο οποίος δεν είχε αναφερθεί για ορθόλογές της από άλλα φυτικά είδη.Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε το ΗΒΡ του φασολιού, τόσο ως προς τον επανασυγχρονισμό του (π.χ. φως), όσο και ως προς τη λειτουργία κεντρικών στοιχείων του μοριακού μηχανισμού του. Για την διενέργεια των πειραμάτων, αναπτύχθηκε ένα in vitro σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού για την μελέτη του ΗΒΡ του φυτού, δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα νέο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί γενικότερα για την έρευνα στο φασόλι. Τα πειράματα και τα συμπεράσματα της εργασίας αυτής ανοίγουν καινούριους δρόμους στη μελέτη των μηχανισμών και της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και παρέχουν τις βάσεις για την περαιτέρω διεύρυνση της έρευνας στο πεδίο, η οποία μπορεί να καταλήξει στην κατανόηση του ΗΒΡ και ως εκ τούτου στην ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων ποικιλιών φασολιού, με αυξημένες αποδόσεις και/ή ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις του περιβάλλοντος.