Qualitative und quantitative Untersuchungen zur Autofluoreszenz bei Pilzen
Authors: Graf Barbara , Göbel U. B. , Adam T. 
Published: April 2009

Zusammenfassung. Die Fluoreszenzmikroskopie wird als Standard‐Nachweisverfahren für immunhistologische Techniken sowie im Rahmen moderner molekularbiologischer Methoden wie in‐situ Hybridisierung eingesetzt. Da verschiedene Faden‐ und Sproßpilze Autofluoreszenzeigenschaften aufweisen, besteht die Möglichkeit, daß fluoreszenzoptische Verfahren durch Autofluoreszenz beeinträchtigt werden. Ziel unserer Studie war daher, die Autofluoreszenz bei Pilzen näher zu charakterisieren und die Abhängigkeit dieses Phänomens von Parametern wie Wachstumsbedingungen, Fixierungsmethoden und Eindeckmedien zu analysieren.

Unsere Untersuchungen ergaben, daß in Flübsigkultur angezüchtete Fadenpilze eine ausgeprägte Autofluoreszenz zeigen, die aber durch mehrfaches Waschen der Pilze verringert werden konnte. Bei Fadenpilzen war kein deutlicher Unterschied der Fluoreszenzintensität hinsichtlich der verwendeten Fixierungsmethoden zu beobachten. Offensichtlich ist aber der Einfluß der Fixierungsmethode auf die Autofluoreszenz abhängig von der jeweiligen Pilzart. So konnten wir zeigen, daß bei Candida albicans unter Grünlichtanregung nach Aceton‐Fixierung nur Einzelzellen innerhalb einer Zellpopulation starke Autofluoreszenz aufwiesen. Die Verwendung eines Eindeckmediums kann die Autofluoreszenz fast vollständig unterdrücken. Dabei fanden wir erhebliche Unterschiede zwischen den untersuchten Medien, die wir durch quantitative Erfassung der Fluoreszenzsignale mittels gekühlter CCD‐Kamera an Aspergillus fumigatus objektivierten. Diagnostische Methoden, die auf fluoreszenzoptischen Nachweisverfahren beruhen, müssen daher sorgfältig evaluiert werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.

Summary. Fluorescence microscopy is an important method in mycology. It is a common procedure used in immunology or histology and more recently in modern techniques of molecular biology like in‐situ hybridization. Since several molds and yeasts show autofluorescence, an interference of this phenomenon with the detection method cannot be excluded. Therefore, we studied autofluorescence in fungi in more detail, in particular with respect to the dependence of this phenomenon from growth conditions, fixing method or mounting medium used. Here we show that moulds cultivated in a liquid medium are strongly autofluorescent which could be considerably reduced by repetitive washing. In moulds, we did not find important differences in autofluorescence levels with the three fixing methods under study. However, this finding cannot be generalized. Thus, in the yeast Candida albicans we found the autofluorescence pattern being largely dependent from the fixing method and the excitation wave length, respectively. In particular, with green excitation we could show that aceton fixation resulted in strong fluorescence of individual cells within a vast population of cells showing little or no autofluorescence. In addition, we could demonstrate that mounting media are able to strongly modify autofluorescence in fungi. Using digital image acquisition with a cooled CCD camera we were able to quantify the influence of different mounting media on fluorescence intensities of Aspergillus fumigatus.