Μελέτη και κλινική αξιολόγηση των κυκλοφορούντων microRNAs ως νέων βιοδεικτών καρκίνου
Authors: Σουρβίνου Ιωάννα-Όλγα 
Published: September 2021

Τα κυκλοφορούντα miRNAs έχουν ελκύσει ιδιαίτερα το ενδιαφέρον της διεθνούς επιστημονικής κοινότητας ως πολλά υποσχόμενοι βιοδείκτες για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση της θεραπείας ασθενών με καρκίνο.Το αυξανόμενο ενδιαφέρον για τον προσδιορισμό των επιπέδων συγκέντρωσής τους στο πλάσμα απαιτεί τη χρήση αξιόπιστων μεθοδολογιών ποσοτικού προσδιορισμού, όπως η RT-qPCR, αλλά και προσεκτικές θεωρήσεις σε προαναλυτικές και αναλυτικές παραμέτρους που αφορούν στην απομόνωσή τους από το πλάσμα, στη σταθερότητά τους και σε ζητήματα που σχετίζονται με την ποσοτικοποίησή τους. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιολογήθηκε η επίδραση 4 διαφορετικών πρωτοκόλλων απομόνωσης των κυκλοφορούντων miRNAs από το πλάσμα καθώς και η επίδραση των συνθηκών φύλαξης του πλάσματος στον ποσοτικό προσδιορισμό των κυκλοφορούντων miRNAs με τη χρήση της RT-qPCR. Η αξιολόγηση βασίσθηκε στα επίπεδα ανάκτησης εξωγενούς προτύπου γνωστής ποσότητας αλλά και ενδογενών miRNAs.Επιπλέον μελετήθηκε η σταθερότητα των απομονωμένων miRNAs κατά τη φύλαξή τους για μεγάλο χρονικό διάστημα και η επίδραση που έχει η μέθοδος της κανονικοποίησης των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την RT-qPCR στον ποσοτικό προσδιορισμό των κυκλοφορούντων miRNAs.Η απομόνωση των κυκλοφορούντων miRNAs με τη χρήση στηλών μεμβράνης πυριτίου παρέχει μεγαλύτερη απόδοση και αξιοπιστία σε σύγκριση με τη χρήση του Trizol LS. Τα κυκλοφορούντα miRNAs εμφανίζουν μεγαλύτερη σταθερότητα κατά τη μακροχρόνια φύλαξη όταν τα δείγματα πλάσματος φυλάσσονται στους -70°C και σε αυτές τις συνθήκες τα απομονωμένα miRNAs διατηρούνται σταθερά για τουλάχιστον ένα χρόνο.Η κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων που βασίζεται στη συνδυαστική χρήση εξωγενούς προτύπου και ενδογενούς miRNA αναφοράς εξαλείφει με μεγάλη αξιοπιστία σφάλματα που οφείλονται στην ανάκτηση των κυκλοφορούντων miRNAs από το πλάσμα ή στην απόδοση της αντίδρασης σύνθεσης cDNA Ακολούθησε μελέτη και κλινική αξιολόγηση των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα αλλά και στους αντίστοιχους πρωτοπαθείς όγκους σε δυο τύπους καρκίνου: στον καρκίνο του πνεύμονα και στον καρκίνο του μαστού. Οι τύποι αυτοί εμφανίζουν μεγάλη συχνότητα τόσο στον ελλαδικό χώρο όσο και παγκοσμίως με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των miR-21, miR126*,miR-451, miR-30d, miR-10a και miR-30e-5p σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων ασθενών με NSCLCκαθώς και στα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος και ακολούθησε μελέτη της συσχέτισης των αποτελεσμάτων ώστε να διαπιστωθεί σε ποιο βαθμό τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs στον πρωτοπαθή όγκο αντικατοπτρίζονται στα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα. Επιπλέον διεξήχθη και μελέτη της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης των miRNAs στον πρωτοπαθή όγκο και των επιπέδων συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, ενώ αξιολογήθηκε και η προγνωστική τους σημασία αναφορικά με το ελεύθερο νόσου διάστημα και την ολική επιβίωση των ασθενών.Τα επίπεδα έκφρασης των miR-451, miR-126* και miR-30d εμφανίζονται μειωμένα σε καρκινικούς ιστούς ασθενών με NSCLC σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς ιστούς, ενώ το miR-21 εμφανίζει αντιστοίχως αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον, για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία τα επίπεδα έκφρασης των miR-10a και miR-30e-5p και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-30e-5p εμφανίζονται μειωμένα στους καρκινικούς ιστούς ασθενών με NSCLC σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς ιστούς, ενώ τα επίπεδα του miR-10a δεν διαφοροποιούνται.Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-21 στους πρωτοπαθείς όγκους των ασθενών με NSCLC συνδέονται με μικρό DFI και μικρό OS των ασθενών.Τα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-21 είναι αυξημένα στο πλάσμα των ασθενών με NSCLC και συνδέονται με μικρό DFI και μικρό OS των ασθενών, ενώ τα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-10a είναι μειωμένα και συνδέονται με μικρό DFI. Τέλος, το miR-30e-5p εμφανίζει αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης στο πλάσμα των ασθενών με NSCLC τα οποία σχετίζονται με μικρό OS.Σε δείγματα ασθενών με καρκίνο μαστού, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των miR-21, miR146a, miR-210, miR-31 και miR-200c στους πρωτοπαθείς όγκους και στα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος από τους ίδιους ασθενείς. Ακολούθησε μελέτη της συσχέτισης των αποτελεσμάτων: α) μεταξύ των δυο βιολογικών υλικών, β) με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και γ) με την ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (PFS) και την ολική επιβίωση των ασθενών (OS) και δ) με την παρουσία κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs) στο περιφερικό αίμα των ασθενών.Τα επίπεδα έκφρασης των miR-21, miR-146a, miR-210 & miR-200c είναι αυξημένα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι μειωμένα στους πρωτοπαθείς όγκους των ασθενών με καρκίνο μαστού σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς με τα επίπεδα έκφρασης των miR-21, miR-146a, miR-210 να είναι υψηλότερα στους ασθενείς με εγχειρήσιμο καρκίνο μαστού συγκριτικά με τους ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού.Τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι χαμηλότερα στους ασθενείς με επιβεβαιωμένη μετάσταση συγκριτικά με τους ασθενείς με εγχειρήσιμο καρκίνο μαστού.Tα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των miR-21 και miR-146a σχετίζονται με την απουσία ER και PR υποδοχέων στους πρωτοπαθείς όγκους, ενώ τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης του miR-31 σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο της νόσου. Τα επίπεδα συγκέντρωσης των miR-21, miR-146a και miR-210 είναι αυξημένα στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο μαστού σε σύγκριση με τους υγιείς αιμοδότες, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-210 στο πλάσμα των ασθενών σχετίζονται με αυξημένο μέγεθος όγκου, προχωρημένο στάδιο της νόσου και απουσία PR υποδοχέων. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-21 στο πλάσμα συνδέονται για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς τόσο με το PFS όσο και το OS των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-146a στο πλάσμα συνδέονται για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς με μικρό PFS, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-210 με μικρό OS των ασθενών.Αναφορικά με την παρουσία CTCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με καρκίνο μαστού, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 και miR-146a είναι περισσότερο αυξημένα στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 αρνητικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 θετικούς ασθενείς, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι χαμηλότερα στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 θετικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 αρνητικούς ασθενείς. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-21 στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 θετικών ασθενών σχετίζονται με αυξημένο μέγεθος όγκου και με απουσία ER και PR υποδοχέων.Tα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-21 είναι περισσότερο αυξημένα στο πλάσμα των CK-19 θετικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 αρνητικούς ασθενείς, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-210 στο πλάσμα των CK-19 θετικών ασθενών σχετίζονται με το αυξημένο μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (>3cm).Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προκύπτει ότι τα κυκλοφορούνταmiRNAs αποτελούν πολλά υποσχόμενους βιοδείκτες καθώς η συγκέντρωσή τους συνδέεται με την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο. Η ιστοειδικότητα ορισμένων miRNAs μπορεί να αξιοποιηθεί στην αποκάλυψη της προέλευσης του καρκίνου, με τη χρήση ομάδων κυκλοφορούντων miRNAs(panels) ως διαγνωστικών και προγνωστικών εργαλείων. Επιπροσθέτως, το προφίλ έκφρασης τωνmiRNAs μεταξύ πρωτοπαθούς όγκου και πλάσματος δεν είναι απόλυτα ταυτόσημο γεγονός που μπορεί να αξιοποιηθεί στη μελέτη των αλλαγών που πραγματοποιούνται κατά τα στάδια εξέλιξης της νόσου και στην ανάπτυξη μεταστατικής εστίας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs μπορούν να διακρίνουν μεταξύ πρώιμου και μεταστατικού καρκίνου, ενώ τα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs φαίνεται να σχετίζονται με την παρουσία μετάστασης