Radiolabeled compounds in molecular imaging of pancreatic adenocarcinoma
Authors: Κανελλόπουλος Παναγιώτης 
Published: October 2022

Ο παγκρεατικός καρκίνος (PC) καταγράφηκε ως ο 10ος σε συχνότητα καρκίνος στον άνθρωπο και ως 4η αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ το 2018. Ο ασυμπτωματικός χαρακτήρας του PC σε συνδυασμό με την έλλειψη επαρκών διαγνωστικών μεθόδων για την έγκαιρη διάγνωση συμβάλλουν σε αυτήν την κατάσταση. Η πρόσφατη τεχνολογική πρόοδος στις απεικονιστικές διατάξεις της πυρηνικής ιατρικής (τομογραφία ποζιτρονίου (PET), ή υπολογιστική τομογραφία μονοφωτονιακής εκπομπής (SPECT)), παράλληλα με την πρόσφατη έλευση των νέων μοριακών ραδιοφαρμάκων, αναμένεται να προσφέρουν στους κλινικούς γιατρούς εξελιγμένα διαγνωστικά εργαλεία στο άμεσο μέλλον. Έτσι, αναμένεται να καταστεί δυνατή η απεικόνιση πρωτογενών και μεταστατικών εστιών PC μη παρεμβατικά, γρήγορα και με ευκολία, με την αλληλεπίδραση ραδιοσημασμένων μορίων (π.χ. ραδιοσημασμένων πεπτιδίων) με ειδικά βιομόρια – “στόχους” (π.χ. υποδοχείς πεπτιδίων), χαρακτηριστικών για τον καρκίνο. Σήμερα υπάρχει επείγουσα ανάγκη για νέα ραδιοφάρμακα για εφαρμογή στην ακριβή και αξιόπιστη διάγνωση του PC, και ιδιαίτερα του εξωκρινούς ποροειδούς αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος (PDAC) που αποτελεί το 95% των περιστατικών PC.Αξίζει να σημειωθεί ότι ο υποδοχέας 1 της νευροτενσίνης (ή νευροτανσίνης) (NTS1R) αντιπροσωπεύει υποψήφιο βιομοριακό στόχο στη διάγνωση του PDAC, δεδομένου ότι υπερεκφράζεται επιλεκτικά στο 95% των περιστατικών PDAC αλλά όχι στο υγιές πάγκρεας ή σε χρόνια παγκρεατίτιδα. Η ύπαρξη του ενδογενούς πεπτιδικού NTS1R-προσδέτη νευροτενσίνης (NT) και πληθώρας συνθετικών NT-αναλόγων δίνουν το έναυσμα για την ανάπτυξη NT-σχετικών ραδιοφαρμάκων. Όπως όλα τα πεπτίδια, η NT και τα ανάλογα της υφίστανται ταχεία πρωτεολυτική αποικοδόμηση. Δύο κυρίως πεπτιδάσες, η νεπριλυσίνη (NEP) και το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ή αγγειοτασίνης) (ACE) εμπλέκονται στην ταχεία αποικοδόμηση των αναλόγων NT στον οργανισμό. Παρόμοια, ραδιοπεπτίδια στόχευσης του NTS1R αποικοδομούνται κατά την πορεία τους στις καρκινικές εστίες με αρνητικά αποτελέσματα στην ικανότητα πρόσληψης τους εκεί.Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη νέων στρατηγικών ή/και πεπτιδικών ραδιοπροσδετών με βάση το C-τελικό εξαπεπτίδιο NT(8-13), ώστε να βελτιωθεί η in vivo σταθερότητα, η στόχευση των όγκων και η ολική φαρμακοκινητική, ώστε να αποβούν κατάλληλα και επιτυχή στην διάγνωση του PC/PDAC με SPECT. Για την επιτυχία αυτού του σκοπού εφαρμόστηκαν δύο μέθοδοι: (1) Επαναξιολόγηση γνωστών [99mTc]Tc-σημασμένων NT(8-13)-αναλόγων χωρίς ή με in situ αναστολή των NEP ή/και ACE. (2) Σχεδιασμός νέων NT-ραδιοπεπτιδίων με δομικές παρεμβάσεις-κλειδιά στο NT(8-13). Η διαγνωστική αξία των αναλόγων αυτών μελετήθηκε και πάλι χωρίς ή με in situ αναστολή των NEP ή/και ACE.Για την επίτευξη του πρώτου στόχου, τα ήδη γνωστά DT1, DT5 και DT6 επισημάνθηκαν με Tc-99m. Έγινε σύγκριση της πρόσληψης τους σε κύτταρα WiDr, της σταθερότητας τους στο αίμα υγιών ποντικιών και της βιοκατανομής τους σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια με όγκους WiDr, καταλήγοντας στα ακόλουθα συμπεράσματα: i) Η αντικατάσταση Dab9/Arg9 οδήγησε σε χαμηλότερη κυτταρική πρόσληψη in vitro, μη μετρήσιμη βελτίωση της μεταβολικής σταθερότητας, χαμηλότερη πρόσληψη σε όγκους WiDr και αυξημένη νεφρική εντόπιση. ii) Η αντικατάσταση Tle12/Ile12 αύξησε δραστικά την in vivo σταθερότητα, αλλά μείωσε την κυτταρική πρόσληψη in vitro και την πρόσληψη στον όγκο in vivo. Το [99mTc]Tc-DT1 εμφάνισε τις καλύτερες in vitro ιδιότητες, και συνδύασε άριστη στόχευση των όγκων WiDr με ταχεία φαρμακοκινητική in vivo με παράλληλη αναστολή των NEP και ACE. Ως εκ τούτου, [99mTc]Tc-DT1 επιλέχθηκε ως ένωση αναφοράς για την αξιολόγηση των νέων δομικά τροποποιημένων αναλόγων.Για την αξιολόγηση όλων των αναλόγων σε αξιόπιστο και πρακτικά εύχρηστο NTS1R-θετικό πρότυπο PC, έγινε σύγκριση της καταλληλότητας τεσσάρων διαφορετικών κυτταρικών σειρών PC: AsPC-1, PANC-1, MiaPaca-2 και Capan-1. Με επώαση του [99mTc]Tc-DT1 σε αυτά τα κύτταρα προέκυψε η ακόλουθη σειρά μειούμενης κυτταρικής πρόσληψης: κύτταρα AsPC-1 >> PANC-1 >>MiaPaca-2 > CAPAN-1. Επιπλέον, η ανάπτυξη όγκων μετά την εμφύτευση κυττάρων AsPC-1 σε ποντίκια SCID βρέθηκε παρόμοια με των κυττάρων WiDr, με τις δύο κυτταρικές σειρές να χρειάζονται χρονικό διάστημα 3 – 4 εβδομάδων για την ανάπτυξη όγκων στα σημεία της εμφύτευσης. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα AsPC-1 επιλέχθηκαν ως η κατάλληλη κυτταρική σειρά PC για την παρούσα διατριβή. Συνολικά, το [99mTc]Tc-DT1 έδειξε παρόμοια συμπεριφορά in vitro και in vivo πειραματικά πρότυπα των κυττάρων WiDr και AsPC-1. Παρότι η φωσφοραμιδόνη (PA) έχει μέχρι τώρα χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για αναστολή της NEP, αποφασίστηκε αλλαγή προς το εγκεκριμένο αντιϋπερτασικό φάρμακο Entresto® για τον σκοπό αυτό, προσβλέποντας σε μελλοντική «μετάφραση» της μεθοδολογίας από τα ποντίκια σε ασθενείς. Πράγματι, το Entresto® αποδείχθηκε εξίσου αποτελεσματικό με το PA, με τις όποιες παρατηρούμενες μικροδιαφορές στην σταθεροποιητική δράση των δύο αυτών αναστολέων να αποδίδονται: i) στον τρόπο χορήγησης (PA – iv, Entresto® - per os), ii) διαφορές μεταξύ των ζώων και iii) τη μικρή ικανότητα αναστολής του ACE από PA σε υψηλές δόσεις.Στη δεύτερη ενότητα της διατριβής, επιχειρήθηκαν δομικές παρεμβάσεις στο DT1 σύμφωνα με δύο βασικές στρατηγικές. Επιμήκυνση / αντικατάσταση στο C-τελικό άκρο, ή εισαγωγή πλευρικών ομάδων στην αρχική DT1 αλληλουχία. Η πρώτη ομάδα αναλόγων περιέλαβε τα DT7 και DT13, που διατήρησαν υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον NTS1R. Οι αντίστοιχοι [99mTc]Tc-ραδιοπροσδέτες επέδειξαν αυξημένη in vivo σταθερότητα στην κυκλοφορία του αίματος σε υγιή ποντίκια, αλλά έφθασαν σε μέγιστη σταθερότητα μόνο μετά τη χορήγηση του συνδυασμού Entresto®+Lis στα ποντίκια. Τα [99mTc]Tc-DT7 και [99mTc]Tc-DT13 έδειξαν πολύ χαμηλή πρόσληψη σε κύτταρα AsPC-1 in vitro, οπότε δεν επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη της βιοκατανομής τους σε ποντίκια με όγκους AsPC-1.Στη δεύτερη ομάδα πλευρικά-τροποποιημένων αναλόγων, αρχικά προσδέθηκε ομάδα λιπαρού οξέος – DT8. Το DT8 έδειξε υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον NTS1R και το [99mTc]Tc-DT8 υψηλή πρόσληψη σε κύτταρα AsPC-1 και υψηλή σταθερότητα στην κυκλοφορία του αίματος υγιών ποντικιών. Οι ιδιότητες αυτέςμεταφράστηκαν σε πολύ ικανοποιητική πρόσληψη του [99mTc]Tc-DT8 σε ετερομοσχεύματα AsPC-1 σε ποντίκια SCID, όμως συνδυάστηκε με ανεπιθύμητη και επίμονα υψηλή ακτινοβολία υποστρώματος. Συμπεραίνεται, ότι η ισχυρή δέσμευση της ομάδας λιπαρού οξέος του [99mTc]Tc-DT8 στην αλβουμίνη και η υψηλή της λιποφιλικότητα οδήγησαν σε μη επιθυμητή φαρμακοκινητική.Στη 2η γενιά αναλόγων 3 διαφορετικές πλευρικές ομάδες προσδέθηκαν στα: DT9, DT10 και DT11. Οι δομικές αυτές τροποποιήσεις δε μείωσαν την αλληλεπίδραση των αναλόγων με τον NTS1R, και τα DT9, DT10 και DT11 επέδειξαν υψηλή συγγένεια δέσμευσης στον υποδοχέα. Τα [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT10 προσλήφθηκαν σε κύτταρα AsPC-1 εξίσου ικανοποιητικά με το [99mTc]Tc-DT1, ενώ το [99mTc]Tc-DT11 έδειξε μειωμένη πρόσληψη. Οι ραδιοπροσδέτες [99mTc]Tc-DT1 και [99mTc]Tc-DT11 είχαν χαμηλή δέσμευση στην αλβουμίνη. Σε αντίθεση, τα [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT10 δεσμεύτηκαν σε ικανοποιητικό ποσοστό στην αλβουμίνη, με το ποσοστό αυτό να μειώνεται με προσθήκη του παυσίπονου ιμπουπροφένη (ibuprofen), που δεσμεύεται στην αλβουμίνη. Το [99mTc]Tc-DT9 έδειξε παρόμοια χαμηλή in vivo σταθερότητα με το [99mTc]Tc-DT1 στην κυκλοφορία του αίματος υγιών ποντικιών, με τα [99mTc]Tc-DT10 και [99mTc]Tc-DT11 να είναι σημαντικότερα πιο σταθερά, αναδεικνύοντας την επίδραση στερεοχημικών παραγόντων. Όλοι οι ραδιοπροσδέτες έφθασαν στο υψηλότερο ποσοστό σταθερότητας μετά τη χορήγηση του συνδυασμού Entresto®+Lis στα ποντίκια. Είναι αξιοσημείωτο το ότι το [99mTc]Tc-DT10 μετά τη χορήγηση του Entresto® μόνο επέτυχε παρόμοια ποσοστά σταθερότητας με αυτά των [99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT11 μετά την συνδυαστική χορήγηση Entresto®+Lis. Σε ποντίκια SCID με ετερομοσχεύματα AsPC-1 οι τρεις ραδιοπροσδέτες επέδειξαν πολύ ταχύτερη κάθαρση υποστρώματος σε σύγκριση με το [99mTc]Tc-DT8. Η πρόσληψη των τριών ραδιοπροσδετών στους όγκους AsPC-1 στην ομάδα των μαρτύρων βρέθηκε σημαντικά αυξημένη σε σχέση με το [99mTc]Tc-DT1, και αυξήθηκε περαιτέρω με εφαρμογή του συνδυασμού Entresto®+Lis ([99mTc]Tc-DT9 και [99mTc]Tc-DT11) ή μόνο του Entresto® ([99mTc]Tc-DT10). Συμπερασματικά, το [99mTc]Tc-DT10, ξεπέρασε όλα τα ανάλογα της παρούσας διατριβής με κριτήρια τη σταθερότητα, τη στόχευση των όγκων και της ταχείας κάθαρσης υποστρώματος, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση ενός μόνον αναστολέα στα ποντίκια, του εγκεκριμένου φαρμάκου Entresto®.Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν την αποτελεσματικότητα και σημασία της στρατηγικής της in situ σταθεροποίησης ραδιοπεπτιδίων, δεδομένου ότι οδήγησαν σε σημαντικές βελτιώσεις στη συμπεριφορά μεταβολικά ασταθών NTS1R-ραδιοπροσδετών. Επίσης ανέδειξαν ότι η προσθήκη πλευρικών ομάδων σε τροποποιημένες αλυσίδες NT(7-13), ήταν ανεκτή από τον NTS1R. Η συμπεριφορά των αντίστοιχων ραδιοπροσδετών δείχτηκε ότι εξαρτάται από τις ιδιότητες της πλευρικής ομάδας, όπως η λιποφιλικότητα, η ικανότητα δέσμευσης στην αλβουμίνη και στερεοχημικούς παράγοντες. Η συμπεριφορά του [99mTc]Tc-DT10 ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητική σε προκλινικό επίπεδο, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με Entresto®, ώστε να ανταγωνίζεται άλλους NTS1R-ραδιοπροσδέτες ήδη σε κλινική αξιολόγηση με SPECT. Ως εκ τούτου, περαιτέρω μελέτη απαιτείται για τη διερεύνηση της προοπτικής αυτής σε ασθενείς PC.