Functional importance and molecular characterization of differentially methylated regions in helper T cell subsets
Authors: Νταλλή Άννα 
Published: April 2023

Οι κληρονομήσιμες επιγενετικές τροποποιήσεις παίζουν ουσιαστικό ρόλο στις διαδικασίες διαφοροποίησης των CD4+ T βοηθητικών κυττάρων (Th). Στην παρούσα διατριβή, ξετυλίγεται το μεθυλίωμα των ανθρώπινων αδιαφοροποίητων Τ, Τ βοηθητικών τύπου 1 (Th1), Τ βοηθητικών τύπου 17 (Th17) και μη κλασικών Τ βοηθητικών τύπου 1 (ncTh1) κυττάρων, πραγματοποιώντας αναλύσεις στο μεθυλίωμα όλου του γονιδιώματος τους (WGBS). Πραγματοποιήθηκε επιγενετικός χαρακτηρισμός κάθε υποομάδας κυττάρων και αποκαλύφθηκαν διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs) που παίζουν τον ρόλο ειδικών υπογραφών για τον εκάστοτε κυτταρικό τύπο. Μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές σε Τ βοηθητικά κύτταρα τύπου 17 ανιχνεύθηκαν σε γονίδια όπως τα IL-17A, RORC, HNRNPLL, ZBTB38, GSPT1, PDCD1, FYN, TIGIT, SRSF7 και TNFRSF4, ενώ μοναδικές απομεθυλιώσεις σε περιοχές γονιδίων όπως τα IFNG, TBX21, SLAMF7, SLAMF8, FASLG, NDIFP2, MAPK1, ITPR1, VDAC1P2 και LAG3 ταυτοποιήθηκαν για τα Τ βοηθητικά κύτταρα τύπου 1, αντίστοιχα. Περαιτέρω επιβεβαίωση των ευρημάτων επιτεύχθηκε με την πραγματοποίηση δοκιμών πυροαλληλουχίας (pyrosequencing). Οι αναλύσεις του μεθυλιώματος μη κλασικών Τ βοηθητικών κυττάρων τύπου 1 (ncTh1) επιβεβαίωσαν έναν κοινό με τα Th1- και Th17 βοηθητικά κύτταρα φαινότυπο, με νέες μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές που ανακαλύφθηκαν σε γονιδιακές περιοχές των RUNX2, RPTOR και SLC38A9. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των νέων μοναδικά απομεθυλιωμένων περιοχών (DMR) πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια ενός πλασμιδιακού φορέα ελεύθερου από CpG περιοχές οι οποίες μόνο μπορούν να υποστούν μεθυλίωση. Δοκιμασίες λουσιφεράσης σε πρωτογενή ανθρώπινα CD4+ Τ κύτταρα με τον ανωτέρω πλασμιδιακό φορέα κατόπιν τροποποίησης του, αποκάλυψαν ότι μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές που εντοπίζονται σε υποκινητές γονιδίων όπως GSPT1, SRSF7, SLAMF7, SLAMF8, TIGIT και PDCD1 μπορούν να ρυθμιστούν με τρόπο που εξαρτάται από τη μεθυλίωση τους. Περαιτέρω μελέτες γονιδιακής έκφρασης (RNA-seqL) χρησιμοποιώντας ex vivo απομονωμένα ανθρώπινα αδιαφοροποιήτα Τ, Th1 και Th17 βοηθητικά κύτταρα, αποκάλυψαν μια μοναδική συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης και γονιδιακής έκφρασης σε συγκεκριμένα γονίδια που ανήκουν στις επιγενετικές υπογραφές που ανακαλύφθηκαν και είναι ξεχωριστές για κάθε κυτταρικό τύπο. Προκειμένου να αποκαλυφθεί το δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπεύθυνο για την επιγενετική ρύθμιση των περιοχών αυτών, πραγματοποιήθηκαν in silico αναλύσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (TFBS). Οι αναλύσεις αυτές, βελτιώθηκαν περεταίρω χρησιμοποιώντας τα δεδομένα έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων από τις μελέτες γονιδιακής έκφρασης σε κάθε τύπο κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκε ένα κοινό ρυθμιστικό δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων που μπορεί να ρυθμιστεί από παράγοντες που είναι μοναδικοί σε συγκεκριμένους κυτταρικούς υπότυπους όπως ο EOMES για τα Th1 και ο RORγt για τα Th17 κύτταρα. Τέλος, το γονίδιο SLAMF7 ανακαλύφθηκε ότι είναι μοναδικά απομεθυλιωμένο και ταυτόχρονα υπερεκφράζεται στα Th1 κύτταρα, τόσο σε επίπεδα RNA όσο και σε πρωτεϊνικά επίπεδα. Συνολικά, στην παρούσα διατριβή αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά το μεθυλίωμα ολόκληρου του γονιδιώματος συγκεκριμένων υποτύπων Τ βοηθητικών κυττάρων, το οποίο τα προηγούμενα χρόνια είχε εντελώς παραμεληθεί. Αποδείχθηκε η επίδραση της μεθυλίωσης του DNA στις νεοανακαλυφθέντες μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές, καθώς επίσης αποκαλύφθηκε και το δίκτυο των εμπλεκόμενων μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για τη λειτουργία των περιοχών αυτών. Ταυτόχρονα, το γονίδιο SLAMF7 αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι βρίσκεται υπο επιγενετική ρύθμιση στα Τ κύτταρα βοηθητικού τύπου 1. Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας μπορούν να ρίξουν νέο φως στις διαδικασίες διαφοροποίησης των Τ βοηθητικών κυττάρων, προσεγγίζοντας τες από μια νέα οπτική που θα μπορούσε να εμπνεύσουν την ανάπτυξη νέων ανοσοθεραπειών.