Μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων μέσω του 3΄-tRF-CysGCA και του γονιδίου BCL2L12 μέσω νέων κυκλικών μορίων RNA, σε ανθρώπινα κύτταρα
Authors: Καρούση Παρασκευή 
Published: April 2024

Tα μη κωδικά μόρια RNA (non-coding RNAs, ncRNAs), συγκεκριμένα τα θραύσματα tRNA (tRNA derivatives, tDRs) και κυκλικά RNA (circular RNAs, circRNAs), έχουν αναδειχθεί ως μόρια-ρυθμιστές σε διάφορες βιολογικές διεργασίες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, εμβαθύνει στον πολύπλευρο πεδίο της γονιδιακής ρύθμισης, εστιάζοντας στο 3′-tRF-CysGCA, ένα θραύσμα που προέρχεται από το tRNACysGCA και σε νέα circRNA του γονιδίου BCL2-like 12 (BCL2L12), αποκαλύπτοντας τους ρόλους τους στη γονιδιακή έκφραση. Τα tDRs έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον για τις πιθανές ρυθμιστικές τους λειτουργίες. Μεταξύ αυτών, τα 3′-tRFs έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της συσχέτισής τους με τη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε ο ρυθμιστικός ρόλος του 3′-tRF-CysGCA στα κύτταρα HEK-293. Αυτό το tRF, που προέρχεται από τμήση στον βρόχο Τ του tRNACysGCA, έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Argonaute, υποδηλώνοντας το ρόλο του στη γονιδιακή έκφραση. Ωστόσο, η ευρύτερη επίδρασή του στα ανθρώπινα κύτταρα παρέμεινε ανεξερεύνητη. Για να γεφυρωθεί αυτό το χάσμα, διεξήχθη σταθερή υπερέκφραση του 3′-tRF-CysGCA σε κύτταρα HEK-293, ακολουθούμενη από πειράματα μεταγραφομικής και πρωτεομικής. Τα ευρήματα των προαναφερθέντων πειραμάτων αποκαλύπτουν σημαντικές αλλαγές στο προφίλ κυτταρικής έκφρασης, ενώ η εκτενής βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε πολυάριθμες διεργασίες που επηρεάζονται από την υπερέκφραση του 3′-tRF-CysGCA. Επιπλέον, η δοκιμασία λουσιφεράσης επιβεβαίωσε την άμεση αλληλεπίδραση αυτού του tRF με το TMPO v.1 και το ERGIC1, οδηγώντας σε αλλαγές στα επίπεδα έκφρασής τους. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία προσδιορισμού κυτταρικής πυκνότητας αποκάλυψε το μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κλώνων ΗΕΚ-293 σε σύγκριση με τη μητρική κυτταρική σειρά. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν τον ουσιαστικό ρυθμιστικό ρόλο του 3′-tRF-CysGCA στη διαμόρφωση της γονιδιακής έκφρασης και τη δυνητική σημασία του στις κυτταρικές διεργασίες.Τα circRNAs αναδείχθηκαν πρόσφατα ως μια κατηγορία μη κωδικών RNA με ενεργό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, αναπτύχθηκε μια προσέγγιση υψηλής απόδοσης, χρησιμοποιώντας αλληλούχηση μεγάλων διαβασμάτων, για να ταυτοποιηθούν νέα circRNA που προέρχονται από το γονίδιο BCL2L12, ένα μέλος της οικογένειας BCL2 που εμπλέκεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλές επάλληλες αντιδράσεις PCR με αποκλίνοντες εκκινητές που υβριδοποιούνταν σε κάθε εξώνιο του BCL2L12, ακολουθούμενο από αλληλούχηση με τεχνολογία νανοπόρων των προϊόντων PCR. Η εκτενής ανάλυση δεδομένων, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης προσαρμοσμένων αλγορίθμων σε γλώσσα Perl, επέτρεψε τον εντοπισμό 46 νέων BCL2L12 circRNA. Αυτά τα circRNAs φάνηκε να σχηματίζονται μέσω μη κανονικών θέσεων οπίσθιας συρραφής, που βρίσκονται σε εξωνιακές ή εσωνιακές περιοχές των πρόδρομων μεταγραφών που παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα στην αλληλουχία τους. Επιπλέον, η μελέτη αποκάλυψε δύο circRNAs που περιείχαν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αδενινών, που επιβεβαιώθηκαν μέσω της αλληλούχησης κατά Sanger και αλληλούχησης επόμενης γενιάς. Το circ-BCL2L12-92, ένα νέο circRNA που ταυτοποιήθηκε, έχει κοινές θέσεις δέσμευσης microRNA με την 3′-αμετάφραστη περιοχή του BCL2L12 mRNA. Η μείωση των επιπέδων του circ-BCL2L12-92 μέσω διαμόλυνσης των κυττάρων HCT 116 με siRNA, είχε ως αποτέλεσμα την έμμεση μείωση του mRNA του BCL2L12, αναδεικνύοντας την εμπλοκή των circRNAs στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτή η παρατήρηση αναδεικνύει τον πιθανό ρόλο του circ-BCL2L12-92 ως ρυθμιστή της έκφρασης του γονιδίου BCL2L12.Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή παρέχει νέες γνώσεις για το ρυθμιστικό ρόλο του 3′-tRF-CysGCA και του circ-BCL2L12-92 στη γονιδιακή έκφραση και αποκαλύπτει μια πληθώρα νέων circRNAs προερχόμενων από το BCL2L12. Αυτά τα ευρήματα ανοίγουν νέους δρόμους για περαιτέρω έρευνα, υπογραμμίζοντας τη σημασία αυτών των μη-κωδικών μορίων RNA στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.