Μελέτη επίδρασης της θερμικής καταπόνησης στην αναπαραγωγή των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής-διαφορές μεταξύ φαινοτυπικά θερμοαντοχών και θερμοευαίσθητων ατόμων
Authors: Νανάς Ιωάννης 
Published: November 2021

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στην Κλινική Μαιευτικής και Αναπαραγωγής του Τμήματος Κτηνιατρικής, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Γενετικής, Συγκριτικής και Εξελικτικής Βιολογίας (ΒΙΟΖ) του Τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Οι πειραματισμοί της διδακτορικής διατριβής αποτελούσαν μέρος των μελετών που ολοκληρώθηκαν στo πλαίσιo του ερευνητικού έργου με τίτλο «Βελτίωση της γονιμότητας των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής μέσω εντοπισμού και αξιοποίησης ατόμων με γενετικά καθοριζόμενη θερμοαντοχή –The summer cow» με κωδικό ΕΕ 5719, που χρηματοδοτήθηκε από την δράση ΕΡΕΥΝΩ – ΔΗΜΙΟΥΡΓΩ – ΚΑΙΝΟΤΟΜΩ. Ο υποψήφιος διδάκτορας χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ), στα πλαίσια του επιχειρησιακού προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Ενίσχυση του ανθρώπινου ερευνητικού δυναμικού μέσω της υλοποίησης διδακτορικής έρευνας» (MIS-5000432), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ). Για την ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής διενεργήθηκαν πέντε πειραματισμοί, που στόχο είχαν τη μελέτη της επίδρασης της θερμικής καταπόνησης (ΘΚ) του θέρους σε λειτουργίες της αναπαραγωγής σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής και τον εντοπισμό πιθανών διαφοροποιήσεων μεταξύ φαινοτυπικά θερμοάντοχων και θερμοευαίσθητων ατόμων. Οι πειραματισμοί εστιάστηκαν: α) στη μελέτη των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών και της ανταπόκρισης στη ΘΚ των φαινοτυπικά θερμοάντοχων και θερμοευαίσθητων ατόμων, β) στη μελέτη των πρώιμων εμβρυικών θανάτων, της προγεστερόνης και των ειδικών γλυκοπρωτεϊνών της εγκυμοσύνης σε αγελάδες που εκτίθενται σε ΘΚ, γ) στη μελέτη της επίδρασης της ΘΚ και της εγκυμοσύνης στην έκκριση της γκρελίνης σε αγελάδες και μοσχίδες, δ) στη μελέτη των υπερηχογραφικών χαρακτηριστικών της κυοφορούσας μήτρας και των ωοθηκών κατά τη διάρκεια ΘΚ και ε) στη διερεύνηση της δυνατότητας πρώιμης ανίχνευσης της γενετικά καθοριζόμενης θερμοαντοχής, με χρήση μοριακών δεικτών. Η διδακτορική διατριβή χωρίζεται σε έξι κεφάλαια.Το Κεφάλαιο Ι αποτελεί τη γενική εισαγωγή, στην οποία γίνεται ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας των πεδίων στα οποία εκτείνονται οι βασικοί πειραματισμοί της διατριβής. Στο κεφάλαιο ΙΙ, περιγράφονται διαφορές μεταξύ φαινοτυπικά θερμοάντοχων και θερμοευαίσθητων ζώων. Οι πειραματισμοί που πραγματοποιήθηκαν στηρίχθηκαν στην κλινική παρατήρηση ετών, σύμφωνα με την οποία, παρά την γενικευμένη μείωση της γονιμότητας των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής κατά τους καλοκαιρινούς μήνες, υπάρχουν συγκεκριμένα άτομα, τα οποία παραμένουν ιδιαιτέρως γόνιμα στις αντίξοες συνθήκες που επικρατούν τους θερινούς μήνες. Στηριζόμενοι σε αυτή την παρατήρηση μελετήθηκαν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά αυτών των αγελάδων. Από τα αρχεία τριών εκτροφών επιλέχθηκαν, με βάση του αναπαραγωγικό τους ιστορικό, 57 αγελάδες που συνέλαβαν σε συνθήκες ΘΚ, με την 1η τεχνητή σπερματέγχυση (ΤΣ) (Θερμοάντοχες, ομάδα ΤΤ) και 110 αγελάδες που συνέλαβαν μετά από τουλάχιστον 2 ΤΣ (θερμοευαίσθητες, ομάδα TS). Tα ζώα που επιλέχθηκαν είχαν γεννήσει κατά την άνοιξη του προηγούμενου έτους και η έναρξη των σπερματεγχύσεων έγινε κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Στα ζώα της μελέτης πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες υπό συνθήκες έντονης ΘΚ (ΤΗΙ≥81) για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της κορτιζόλης και της HSP70. Σε 28 ζώα της ομάδας ΤΤ και σε 39 ζώα της ομάδας TS, επιβεβαιώθηκε η επαναληψιμότητα των δεδομένων γονιμότητας του προηγούμενου έτους με τον υπολογισμό του ποσοστού των ζώων που γονιμοποιήθηκαν με την 1η ΤΣ κατά τη διάρκεια του νέου καλοκαιριού. Σε 6 ζώα της κάθε ομάδας (ΤΤ και TS) πραγματοποιήθηκε συγχρονισμός οίστρου σε συνθήκες ΘΚ (ΤΗΙ=80) με τη χρήση ενδοκολπικής συσκευής απελευθέρωσης προγεστερόνης (PRID) και τη χορήγηση προσταγλαδίνης (PGF2α), ενώ η ωοθυλακιορρηξία προκλήθηκε με έγχυση απελευθερωτικής ορμόνης των γοναδοτρόπων ορμονών (GnRH). Ξεκινώντας από τη χρονική στιγμή 30 λεπτών πριν και τελειώνοντας 120 λεπτά μετά την έγχυση της GnRH , συλλέχθηκαν διαδοχικά 9 δείγματα αίματος με σκοπό τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της LH. Η ΤΣ πραγματοποιήθηκε 16 ώρες μετά την έγχυση της GnRH, και για τις επόμενες 21 ημέρες γινόταν προσδιορισμός της προγεστερόνης σε δείγματα που συλλέγονταν κάθε δεύτερη ημέρα. Η ανάλυση των δειγμάτων έδειξε ότι η συγκέντρωση της κορτιζόλης ήταν χαμηλότερη (p<0.05) στην ομάδα ΤΤ σε σύγκριση με την ομάδα ΤS. Ομοίως, η συγκέντρωση της HSP70 ήταν χαμηλότερη (p<0.001) στην ομάδα ΤΤ σε σύγκριση με τη ομάδα ΤS. Περισσότερα ζώα της ομάδας ΤΤ (p<0.05) γονιμοποιήθηκαν με την 1η ΤΣ σε σχέση με τα ζώα της ομάδας ΤS. Η προωθυλακιορρηκτική κορύφωση της συγκέντρωσης της LH ήταν υψηλότερη (p<0.002) στην ομάδα ΤΤ σε σύγκριση με την ομάδα TS, ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη συγκέντρωση της προγεστερόνης μεταξύ των δύο ομάδων. Στο κεφάλαιο ΙΙΙ, μελετήθηκαν α) η επίδραση της ΘΚ στη συγκέντρωση των ειδικών γλυκοπρωτεϊνών της εγκυμοσύνης (PAGs) και της προγεστερόνης και β) η συσχέτισή τους με την επιβίωση του εμβρύου. Η μελέτη περιλάμβανε τρεις πειραματισμούς. Στον 1ο πειραματισμό αναλύθηκαν δείγματα αίματος, που είχαν συλλεχθεί τις ημέρες 29 έως 36 μετά την ΤΣ, στα οποία έγινε σύγκριση της συγκέντρωσης των PAGs μεταξύ χειμώνα (n=3721) και καλοκαιριού (n=2388). Στον 2ο πειραματισμό εκτιμήθηκε το ποσοστό των πρώιμων εμβρυικών θανάτων σε 144 αγελάδες το χειμώνα και σε 133 αγελάδες το καλοκαίρι. Για τη μελέτη αυτή, η διάγνωση της εγκυμοσύνης πραγματοποιήθηκε με υπερηχογραφία την ημέρα 24 ή 25 μετά την ΤΣ και επαναλήφθηκε μια εβδομάδα αργότερα. Κατά την ημέρα της δεύτερης εξέτασης, προσδιορίσθηκε και η συγκέντρωση των PAGs. Στον 3ο πειραματισμό συγκρίθηκαν οι συγκεντρώσεις των PAGs και της προγεστερόνης μεταξύ χειμώνα και θέρους, τις ημέρες 33 έως 36. Στον 1ο πειραματισμό δεν βρέθηκαν διαφορές στην συγκέντρωση των PAGs μεταξύ χειμώνα και καλοκαιριού, ενώ ο ρυθμός γονιμοποίησης και το ποσοστό των εγκυμοσυνών που, με βάση την συγκέντρωση των PAGs, χαρακτηρίστηκαν ως αμφίβολες, ήταν υψηλότερο το χειμώνα σε σύγκριση με αυτό του θέρους (p˂0.001). Στον 2ο πειραματισμό το ποσοστό των εμβρυικών θανάτων ήταν υψηλότερο (p<0.001) κατά τους καλοκαιρινούς μήνες σε σύγκριση με τον χειμώνα. Στα περιστατικά των εμβρυικών θανάτων του θέρους, η συγκέντρωση των PAGs ήταν υψηλότερη των αντιστοίχων του χειμώνα (p<0.02). Η πιθανότητα εμβρυικού θανάτου κατά το καλοκαίρι ήταν πέντε φορές μεγαλύτερη σε σύγκριση με αυτήν του χειμώνα. Στον 3ο πειραματισμό κατά τις ημέρες 33 έως 36 της εγκυμοσύνης βρέθηκε ότι κατά το καλοκαίρι η συγκέντρωση των PAGs ήταν αυξημένη (p=0.044) σε σύγκριση με την αντίστοιχη του χειμώνα, ενώ , αντιθέτως, η προγεστερόνη ήταν μειωμένη (p=0.041).Στο Κεφάλαιο IV μελετήθηκε η επίδραση της ΘΚ στην έκκριση της γκρελίνης, και η συσχέτισή της με την κατανάλωση ξηράς ουσίας σε αγελάδες και μοσχίδες, σε συγκεκριμένα στάδια της εγκυμοσύνης. Οι πειραματισμοί πραγματοποιήθηκαν κατά την διάρκεια του χειμώνα και του καλοκαιριού, σε μια εκτροφή της Θεσσαλίας, στην οποία δεν υπήρχε εγκατεστημένο σύστημα ψύξης των ζώων. Η παροχή τροφής γινόταν δύο φορές την ημέρα, και κάθε πρωί ζυγίζονταν τα υπολείμματα τροφής της προηγούμενης ημέρας. Σε κάθε εποχή τα ζώα κατανεμήθηκαν σε 4 ομάδες, ως εξής: μη έγκυες αγελάδες (n=10) και μη έγκυες μοσχίδες (n=10), και έγκυες αγελάδες και μοσχίδες (σε κάθε ομάδα, αγελάδες n=8, και μοσχίδες, n=10). Τα έγκυα ζώα βρίσκονταν στο 1ο (65-90 ημέρες), στο 2ο (114-144 ημέρες) και στο 3ο τρίμηνο εγκυμοσύνης (198-220 ημέρες και 192-230 ημέρες, για τις αγελάδες και τις μοσχίδες αντίστοιχα). Σε κάθε εποχή, πραγματοποιήθηκε αιμοληψία την ίδια ημέρα από όλα τα ζώα των ομάδων, μία ώρα πριν την προγραμματισμένη παράθεση της τροφής, σε συνθήκες ΤΗΙ=58 και ΤΗΙ=73 το χειμώνα και το καλοκαίρι, αντίστοιχα. Μετά την κατάλληλη επεξεργασία, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν μέχρι τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της ολικής και της ακυλιωμένης γκρελίνης. Το ποσοστό της τροφής που δεν καταναλωνόταν το καλοκαίρι ήταν αυξημένο σε σύγκριση με αυτό του χειμώνα (P<0.01). Στις αγελάδες, η συγκέντρωση της ολικής γκρελίνης διέφερε μεταξύ των σταδίων εγκυμοσύνης το χειμώνα και το καλοκαίρι (p<0.04), ενώ η ακυλιωμένη γκρελίνη διέφερε μεταξύ των σταδίων εγκυμοσύνης τον χειμώνα (p<0.001), αλλά όχι το καλοκαίρι. Οι συγκεντρώσεις της ακυλιωμένης γκρελίνης στα διάφορα στάδια της εγκυμοσύνης έδειξε να επηρεάζονται από την εποχή (p<0.001), κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε για την ολική γκρελίνη. Στις μοσχίδες, οι συγκεντρώσεις της ολικής και της ακυλιωμένης γκρελίνης δεν επηρεάστηκαν από την εποχή ή το στάδιο εγκυμοσύνης (p>0.05). Γενικώς, η συγκέντρωση της ακυλιωμένης γκρελίνης στις αγελάδες και στις μοσχίδες ήταν χαμηλότερη το καλοκαίρι σε σχέση με τον χειμώνα (p<0,002).Στο Κεφάλαιο V με την χρήση υπερηχοτομογραφίας B-mode και Doppler εξετάσθηκαν, η ηχογένεια, το μέγεθος και η αιματική ροή στο ωχρό σωμάτιο (ΩΣ) και στα πλακούντια, και επιπλέον, η ροή στην ομφαλική και στη μητριαία αρτηρία σε έγκυες αγελάδες γαλακτοπαραγωγής (στις 90 και 110 ημέρες εγκυμοσύνης) κατά τη διάρκεια θερμοουδέτερων περιόδων (ομάδα W, n=9) και περιόδων ΘΚ (ομάδα S, n=10). Οι ωοθήκες και τα πλακούντια εξετάστηκαν με υπερηχοτομογραφία B-mode, ενώ η μητριαία και η ομφαλική αρτηρία με υπερηχοτομογραφία Spectral-Doppler. Στα πλακούντια και τα ΩΣ όλων των ζώων προσδιορίσθηκαν, το μήκος τους, η ένταση της φωτεινότητας του γκρι (gray-scale) και η έγχρωμη φασματική απεικόνιση (color flow imaging), ενώ στην ομφαλική και τη μητριαία φλέβα υπολογίστηκαν η διάμετρος και οι αιμοδυναμικές παράμετροι της ροής του αίματος. Την στιγμή της υπερηχοτομογραφικής εξέτασης από όλα τα ζώα πραγματοποιήθηκε αιμοληψία για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της κορτιζόλης και της προγεστερόνης. Στην ομάδα S η συγκέντρωση της κορτιζόλης ήταν υψηλότερη (p=0.016) ενώ η συγκέντρωση της προγεστερόνης έτεινε να είναι χαμηλότερη (p=0.065) σε σύγκριση με την ομάδα W. Το gray-scale των πλακουντίων και των ΩΣ ήταν χαμηλότερο (p<0.005 και p<0.001 αντίστοιχα) στην ομάδα S σε σύγκριση με την ομάδα W. Η διάμετρος της ομφαλικής αρτηρίας όπως επίσης και ο συνολικός όγκος παροχής αίματος στην ομάδα S υπολείπονταν (p=0.001 και p=0.042 αντίστοιχα) σε σχέση με αυτά της ομάδας W. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη διάμετρο και τον όγκο παροχής αίματος της μητριαίας αρτηρίας.Στο κεφάλαιο VI χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση ανάμεσα σε 40 θερμοάντοχα και 40 θερμοευαίσθητα ζώα. Από την ανάλυση, προέκυψαν γονιδιακοί πολυμορφισμοί, από τους οποίους επιλέχθηκαν πολυμορφισμοί που χαρτογραφούνται σε ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες θερμικού σοκ (3’ αμετάφραστες περιοχές HSPs γονιδίων) για να ελεγχθεί η καταλληλότητά τους ως μοριακοί δείκτες για τον χαρακτηρισμό των ζώων ως γενετικά θερμοάντοχα. Από τις τρείς συνεργαζόμενες εκτροφές, συλλέχθηκαν δείγματα από 275 χαρακτηρισμένα ζώα με βάση τον φαινότυπο τους. Συνολικά, επιλέχθηκαν 21 πολυμορφισμοί που χαρτογραφούνται σε εννέα διαφορετικά γονίδια (CCT6A, DNAJA4, DNAJB1, DNAJB6, DNAJC21, DNAJC27, DNAJC6, HSPA1A, HSPA1L) και έγινε γονοτύπησή τους με το σύστημα iPlex Mass Array. Για τη διερεύνηση της καταλληλότητάς τους ως μοριακοί δείκτες, πραγματοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης για κάθε πολυμορφισμό, ώστε να ελεγχθεί εάν οι συχνότητες τους διαφέρουν στατιστικά σημαντικά ανάμεσα στις δύο ομάδες. Από την ανάλυση αυτή, προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε πολυμορφισμούς που χαρτογραφούνται σε 5 γονίδια (DNAJC27, DNAJA4, DNACJ21,DNAJB1, HSPA1A).Τα κυριότερα ευρήματα της παρούσας διατριβής συνοψίζονται ως ακολούθως:1.Η θερμοαντοχή στις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής φαίνεται ότι αποτελεί εγγενές χαρακτηριστικό που συσχετίζεται με αυξημένο ουδό της θερμοουδέτερης ζώνης.2.Η διατήρηση της προγεστερόνης και των PAGs σε υψηλά επίπεδα κατά τη διάρκεια της ΘΚ, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την διατήρηση της εγκυμοσύνης. Τα νεαρά έμβρυα που επιβιώνουν υπό συνθήκες ΘΚ έχουν ιδιαίτερα λειτουργικό πλακούντα.3.Οι συγκεντρώσεις της γκρελίνης μειώνονται από τη ΘΚ, γεγονός που ερμηνεύει την περιορισμένη κατανάλωση τροφής το καλοκαίρι. Επιπλέον, στα βοοειδή, οι συγκεντρώσεις της ορμόνης επηρεάζονται σημαντικά από το στάδιο της εγκυμοσύνης, την ηλικία και την υφιστάμενη ή όχι γαλακτοπαραγωγή.4.Η ΘΚ επιδρά στη δομή και λειτουργία του ΩΣ και των πλακουντίων των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής. Επιπλέον, οι παρατηρήσεις που αφορούν αλλαγές στη διάμετρο και την αιματική ροή στην ομφαλική αρτηρία κατά τη διάρκεια της ΘΚ, δείχνουν κάποιου βαθμού διαταραχή στην εμβρυική κυκλοφορία του αίματος.5.Μεταξύ φαινοτυπικά χαρακτηρισμένων θερμοάντοχων ή θερμοευαίσθητων αγελάδων γαλακτοπαραγωγής, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε πολυμορφισμούς που χαρτογραφούνται σε περιοχές που αφορούν τις πρωτεΐνες θερμικού σοκ, καθιστώντας εφικτή τη μελλοντική γενετική ταυτοποίηση των ζώων.