Κλινική σημασία της έκφρασης των ενζύμων αποακετυλίωσης ιστονών σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων
Authors: Μάνου Μαρία 
Published: May 2024

Σκοπός: Οι ΟΣΑ εμφανίζουν μεγάλο κλινικό και ερευνητικό ενδιαφέρον, λόγω της σπανιότητας τους, της ετερογένειας, της εν δυνάμει επιθετικής συμπεριφοράς, των αλληλεπικαλυμμένων ιστοπαθολογικών τους χαρακτηριστικών αλλά και του πολύπλοκου γενετικού και επιγενετικού τους προφίλ. Σκοπός της μελέτης είναι α) η ανάλυση για πρώτη φορά και η αξιολόγηση της έκφρασης, των τάξεως-Ι και τάξεως-ΙΙ ενζύμων απακετυλίωσης ιστονών HDAC (-1, -2, -4, -6) σε ένα σημαντικό αντιπροσωπευτικό δείγμα διαφορετικών υποτύπων ΟΣΑ (καλοηθών και κακοήθων), β) η συγκριτική διερεύνηση μεταξύ της επαγόμενης έκφρασης και της κατεσταλμένης έκφρασης των HDAC στους ΟΣΑ γ) να διερευνηθούν οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις αναφορικά με την έκφραση των HDAC και τα χαρακτηριστικά των ασθενών (ηλικία, φύλο), δ) η διερεύνηση συσχέτισης της διαφοροποιημένης έκφρασης των HDAC σε κακοήθη ΟΣΑ με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά, και η χρησιμότητα τους ως πιθανούς βιοδείκτες, ε) οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ υπερέκφασμένων HDAC και τα χαρακτηριστικά διαφοροποίησης του όγκου. Επίσης, μέσω συστηματικής ανάλυσης στόχος είναι α) να διερευνηθούν για πρώτη φορά μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης μεταγραφικά δεδομένα ώστε να εντοπίσουμε σημαντικά αλληλοεπιδρώντα ΔΕΓ στο ΑΚΚ, β) να γίνει έλεγχος επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων της βιοπληροφορικής ανάλυσης μέσω πρωτεϊνικής έκφρασης των ΔΕΓ και κατασταλτικών τροποποιήσεων ιστονών σε ΟΣΑ και γ) να πραγματοποιηθεί βιβλιογραφική ανασκόπηση με στόχο την εύρεση σχετικών επιστημονικών ευρημάτων αναφορικά με το δίκτυο των ΔΕΓ που ανιχνεύθηκε από την βιοπληροφορική ανάλυση. Μέθοδοι: Στο πρώτο στάδιο της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ιατρικά αρχεία και αρχειακό ιστοπαθολογικό υλικό συνολικά 58 δειγμάτων ΟΣΑ από ισάριθμους ασθενείς, αντιστοιχώντας σε 36 περιπτώσεις καλοηθών νεοπλασμάτων σιαλογόνων αδένων και 22 περιπτώσεις κακοήθων νεοπλασμάτων σιαλογόνων αδένων. Ακολούθησε ανεξάρτητη, εκ νέου αξιολόγηση αντιπροσωπευτικών τομών κάθε περίπτωσης, με χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης από 2 διαφορετικούς ερευνητές προς επιβεβαίωση της αρχικής ιστολογικής διάγνωσης σύμφωνα με την νεότερη ταξινόμηση των όγκων κεφαλής και τραχήλου του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (2017). Για την ανοσοϊστοχημική χρώση των HDAC-1 και HDAC-2 έγινε χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων με προέλευση από λαγό, ενώ για τις χρώσεις των HDAC-4 και HDAC-6 έγινε χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων με προέλευση από μύες, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Στη συνέχεια έγινε αξιολόγηση της χρώσης και υπολογίσθηκε το H-score κάθε περίπτωσης (H-score=score έκτασης χρώσης + score έντασης χρώσης), πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση (SPSS V25.0.0) και κατασκευάσθηκαν καμπύλες επιβίωσης με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας για όλες τις στατιστικές δοκιμασίες ορίσθηκε το p<0.05. Στο δεύτερο στάδιο της ανάλυσης αντλήσαμε δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα RNA-Seq (Bioproject PRJNA287156) συνολικά από 98 δείγματα FFPE, 94 ΑΚΚ και 4 φυσιολογικούς ιστούς ΣΑ. Η αλληλούχιση των αναγνώσεων πραγματοποιήθηκε σε συστήματα αλληλούχισης Ion Proton και Ion S5/XL (Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ). Η ποιότητα ανάγνωσης των ακατέργαστων αρχείων FASTQ «ενός άκρου» (single-end FASTQ) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το FastQC (έκδοση 0.11.7). Η περικοπή προσαρμογής, η ποιότητα και το polyX πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας fastp (έκδοση 0.20.0). Οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν σε decoy-aware transcriptome (gencode41/GRh38) και η μέτρηση γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Salmon (έκδοση 1.1.0). Οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις <2 εκατομμυρίων απορριφθήκαν από το δείγμα. Η ανίχνευση των ΔΕΓ πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο DESeq2, χρησιμοποιώντας τα εξής όρια στατιστικής σημαντικότητας: α) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value <0,05, β)|log2Fold-Change (FC)|>1ή<-1, γ) μέση τιμή των DESeq2’s normalized counts>2 εκ. Εφαρμόστηκαν 3ης γενιάς αναλύσεις εμπλουτισμού προκειμένου να γίνει ανίχνευση των γονιδιακών οντολογιών και των μονοπατιών KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) τα οποία ήταν υπερεκπροσωπημένα μεταξύ των επαγόμενων και κατεσταλμένων γονιδίων χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης συνόλου γονιδίων WebGestalt. Η ανάλυση του δικτύου των ΔΕΓ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Cytoscape (έκδοση 3.9.1) και το StringApp Plugin (έκδοση 2.0.1), μια προσθήκη Cytoscape που επιτρέπει την εισαγωγή δικτύων STRING PPI. Μέσω ερωτήματος: «τροποποίηση ιστονών» στο stringApp, προέκυψε το δίκτυο των αλληλοεπιδρώντων και σχετικών με τροποποιήσεις ιστόνης ΔΕΓ. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επικύρωση της βιοπληροφορικής ανάλυσης για την οποία χρησιμοποιήθηκαν ιατρικά αρχεία και αρχειακό ιστοπαθολογικό υλικό (FFPE) συνολικά από 10 ασθενείς με ΟΣΑ: 2 καλοήθεις (ΠΑ) και 8 κακοήθεις όγκους (5 AKK, και 3 ΠΑΚ) και προχωρήσαμε σε ανοσοϊστοχημική διερεύνηση των εξής πρωτεϊνών: Ki-67, p53, SUV39h1, EΖΗ2, HDAC8, H3K27me3 και H3K9me3. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από δυο ανεξάρτητους ερευνητές ως προς τη θετικότητα, το ποσοστό, και την ένταση της χρώσης, και τέλος έγινε ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας. Αποτελέσματα: Επαγόμενη έκφραση των HDAC ανιχνεύθηκε στο 25%-89% των θετικών σε έκφραση HDAC ΟΣΑ. Η πρωτεϊνική έκφραση έχει ως εξής: α) η HDAC-1 εκφράστηκε πυρηνικά στο 31% των καλοηθών, και 14% των κακοήθων ΟΣΑ, β) η HDAC-2 ανιχνεύθηκε (κυρίως πυρηνικά) στο 86% των καλοηθών και 82% των κακοήθων περιπτώσεων, γ) η HDAC-4 εκφράστηκε στο 44% των καλοήθων και 36% των κακοήθων όγκων, κυρίως με πυρηνικό μοτίβο, δ) Η HDAC-6 εκφράστηκε στο 11% των καλοηθών και στο 18% κακοήθων ΟΣΑ, κυρίως κυτταροπλασματικά. Προς μείωση της ετερογένειας του δείγματος, τα καλοήθη νεοπλάσματα ομαδοποιήθηκαν με τα χαμηλού βαθμού κακοήθειας νεοπλάσματα και συγκρίθηκαν με τα υψηλού βαθμού κακοήθειας νεοπλάσματα. Η σύγκριση ανέδειξε στατιστικά σημαντικές ομάδες. Συγκεκριμένα, η έκφραση της HDAC-2 αποτελεί προγνωστικό παράγοντα θετικής έκβασης, και σχετίστηκε με παρατεταμένη συνολική επιβίωση σε κακοήθειες ΚΑΙ υψηλού βαθμού ΟΣΑ. Η υπερέκφραση της HDAC-6 συνδέθηκε με αρνητικό αντίκτυπο στην συνολική επιβίωση των κακοήθων και υψηλού βαθμού ΟΣΑ, καθώς η μη έκφραση της HDAC-6 συσχετίστηκε με παρατεταμένη συνολική επιβίωση. Συνεπώς, η αναστολή του HDAC-6 προτάθηκε για τη βελτίωση της επιβίωσης αυτών των ασθενών. Η έκφραση των επιμέρους HDAC δεν συσχετίστηκε με την ηλικία και το φύλο των ασθενών. Αναδείχθηκε για πρώτη φορά μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης στο ΑΚΚ ένα δίκτυο σημαντικών αλληλοεπιδρώντων πρωτεϊνών, σχετικών με τις τροποποιήσεις των ιστονών. Το δίκτυο των ΔΕΓ ανέδειξε σημαντικά επαγόμενη έκφραση α) στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο TP53, β) τις μεθυλτρανσφεράσες: SUV39H1, EZH2 και PRMT1, γ) την αποακετυλάση ιστόνης HDAC8, δ) τα ένζυμα μεθυλίωσης του DNA: DNMT3A, UHRF1 και KDM5B. Σημαντικά κατεσταλμένη έκφραση ανιχνεύθηκε στην ακετυλοτρανσφεράση λυσίνης KAT2B/PCAF. Η ανάλυση επικυρώθηκε περαιτέρω μέσω πρωτεϊνικής έκφρασης των P53, SUV39H1, EZH2, HDAC8 και των κατασταλτικών τροποποιήσεων ιστόνης: H3K9me3, H3K27me3. Η έκφραση της p53 ήταν χαμηλή στις περιπτώσεις των ΠΑ, και επαγόμενη σε ΠΑΚ και ΑΚΚ, επιβεβαιώνοντας τη σχετική βιβλιογραφία. Η χρώση της EΖΗ2 ήταν ασθενής σε περιπτώσεις ιστών ΠΑ και ΠΑΚ, ενώ σε συμφωνία με βιβλιογραφικά δεδομένα ανιχνεύσαμε επαγόμενη έκφραση στα ΑΚΚ, ενώ η έκφραση της H3K27me3 παρατηρήθηκε σε όλους τους ΟΣΑ. Η μελέτη είναι η πρώτη που ανιχνεύει επαγόμενα επίπεδα mRNA αλλά και πρωτεϊνικής έκφρασης της SUV39H1 σε ΑΚΚ, σε σύγκριση με ιστούς ΠΑ και ΠΑΚ. Ενώ, η επαγωγή της H3K9me3 στα κακοήθη ΠΑΚ και ΑΚΚ, σε σύγκριση με τα καλοήθη ΠΑ, υποδεικνύει ενδεχόμενο λειτουργικό ρόλο της SUV39H1, μεσολαβούμενο από την επαγωγή της H3K9me3, στους ΟΣΑ. Επίσης για πρώτη φορά ανιχνεύσαμε σημαντικά επαγόμενη έκφραση (μεταγραφικά και πρωτεϊνικά) της HDAC8 σε κακοήθη ΟΣΑ (ΑΚΚ,ΠΑΚ) συγκριτικά με καλοήθη (ΠΑ), τονίζοντας την επιστημονική υπόθεση για περαιτέρω ερευνά. Συμπεράσματα: Οι αποακετυλάσες ιστόνης και οι τροποιήσεις ιστόνης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στους ΟΣΑ. Αναφορικά με τις αποακετυλάσες ιστόνης, στη μελέτη μας η έκφραση της HDAC-2 αναδεικνύεται ως σημαντικός θετικός προγνωστικός παράγοντας για τους ΟΣΑ (καλή πρόγνωση), ενώ η έκφραση της HDAC-6 ως αρνητική (κακή πρόγνωση). Καθώς η υπερέκφραση της HDAC-6 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση, η αναστολή της HDAC-6 θα μπορούσε να συμβάλλει στη βελτίωση της επιβίωσης αυτών των ασθενών. Παρά το γεγονός πως η μελέτη μας υποστηρίζει στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα κλινικής σημασίας, η κύρια μομφή τέτοιων μελετών παραμένει ο μικρός αριθμός ασθενών με σπάνια νεοπλάσματα που ενσωματώνονται στη μελέτη, και η ετερογένεια των ιστολογικών ομάδων εντός των μελετών. Περαιτέρω ανάλυση, σε μεγαλύτερες εργασίες επί συγκεκριμένων ιστολογικών υποτύπων ΟΣΑ, κρίνεται απαραίτητη τόσο για την επαλήθευση του ουσιαστικού προγνωστικού ρόλου των HDAC στους ΟΣΑ αλλά και να αναδειχθούν οι δυνατότητές τους ως θεραπευτικοί στόχοι, μέσω των αναστολέων HDAC, στους ασθενείς με ΟΣΑ. Επιπλέον, η μελέτη μας ανέδειξε ένα δίκτυο αλληλoεπιδρώντων παραγόντων τροποποίησης ιστονών που εμπλέκονται στη γονιδιακή ρύθμιση των ΟΣΑ, υπογραμμίζοντας τον κρίσιμο ρόλο των επιγενετικών μηχανισμών στην ογκογένεση των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Μεταξύ των διαφορικώς εκφρασμένων γονιδίων που εντοπίστηκαν στα ΑΚΚ, οι κρίσιμες μεθυλοτρανσφεράσες SUV39H1 και EZH2, καθώς και η αποακετυλάση ιστόνης HDAC8 ανιχνεύθηκαν περαιτέρω υπερεκφρασμένες σε δείγματα ιστών, επιβεβαιώνοντας το δίκτυο ΔΕΓ καθώς και ορισμένες προηγούμενες μελέτες [244, 245]. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση των τροποποιήσεων καταστολής ιστονών H3K9me3 και H3K27me3 στους ΟΣΑ, υποδηλώνει έναν πιθανό λειτουργικό ρόλο των SUV39H1 και EZH2, αντίστοιχα, με αρνητικό αντίκτυπο στη γονιδιακή ρύθμιση. Τέλος, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιβεβαιωθούν οι πιθανές φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανιχνευόμενων παραγόντων τροποποίησης των ιστονών καθώς και να αναδειχθούν οι μοριακοί μηχανισμοί και ο λειτουργικός ρόλος των παραπάνω ΔΕΓ σε όγκους σιελογόνων αδένων.