Σχεδιασμός και σύνθεση νέων κουμαρινικών παραγώγων και νανοτεχνολογική προσέγγιση για την πιθανή αξιοποίησή τους σε φαρμακευτικές εφαρμογές
Authors: Κατωπόδη Αννίτα 
Published: September 2023

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων κουμαρινικών αναλόγων με αξιόλογη βιολογική δράση. Για το σκοπό αυτό, συντέθηκαν επτά Σειρές δομικά τροποποιημένων κουμαρινικών παραγώγων (Σειρά Α-Σειρά Ζ), οδηγώντας συνολικά στη σύνθεση περίπου 100 μορίων, τα περισσότερα από τα οποία παρουσιάζονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Ο δομικός χαρακτηρισμός των νέων παραγώγων πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Πρωτονίου (1H NMR) και Άνθρακα (13C NMR), καθώς και Φασματομετρίας Μάζας Υψηλής Ανάλυσης (HR-MS). Σειρές Α και Β: Η σύνθεση των νέων 3-αρυλο-κουμαρινικών παραγώγων των Σειρών Α και Β πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια: αρχικά μέσω μιας τροποποιημένης αντίδρασης Perkin-Oglialoro συντέθηκαν τα ακετυλοξυ ανάλογα (3a-3o & 9a-9j), ενώ στη συνέχεια μέσω αντίδρασης απομάκρυνσης της ακετυλο ομάδας προέκυψαν τα αντίστοιχα υδροξυ κουμαρινικά ανάλογα (4a-4k & 10a-10j). Τα νέα 3-αρυλο-κουμαρινικά παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση μέσω των δοκιμών δέσμευσης των ελευθέρων ριζών DPPH, ABTS·+, ·ΟΗ και αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης, υποκινούμενη από τον εκκινητή ελευθέρων ριζών, AAPH. Ακόμη, μελετήθηκε η ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση της λιποξυγονάσης (LOX) από σόγια ως ένδειξη αντιφλεγμονώδους δράσης, καθώς και η κυτταροτοξική τους δράση έναντι διαφορετικών καρκινικών σειρών. Η 3-(4-ακετυλοξυφαινυλο)-6,8-διβρωμο-4-μεθυλο-κουμαρίνη (3k) και η 4-μεθυλο-5-υδροξυ-3-(3-φθοροφαινυλο)-κουμαρίνη (4e) που παρουσίασαν την ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι της LOX (IC50 8.7 και 4.1 μM, αντίστοιχα), εξετάστηκαν μέσω in silico δοκιμών μοριακής πρόσδεσης στη LOX από σόγια, οι οποίες υπέδειξαν αλλοστερική δέσμευση. Επιλεγμένα παράγωγα της Σειράς Β αξιολογήθηκαν επιπλέον ως προς την ικανότητα αλληλεπίδρασής τους με το DNA θύμου αδένα (ctDNA), ενώ για τα παράγωγα της Σειράς Α πραγματοποιήθηκε εκτίμηση βασικών φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων (απορρόφηση από το στόμα και σύνδεση με τις πρωτεΐνες του πλάσματος) μέσω βιομιμητικής χρωματογραφίας. Σειρές Γ και Δ: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση πέντε νέων κουμαρινικών καρβοξαμιδίων (17a-17e, Σειρά Γ) και τριών νέα αμινοαιθοξυ-κουμαρινικών παραγώγων (22a-22c, Σειρά Δ), τα οποία στη συνέχεια αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση των ενζύμων ακετυλοχολινεστεράση (AChE) και βουτυρυλοχολινεστεράση (BuChE) ως ένδειξη νευροπροστατευτικής δράσης. Τα εξεταζόμενα κουμαρινικά ανάλογα παρουσίασαν αξιόλογη δράση έναντι των δύο ενζύμων με τιμές IC50 34.9-94.2 μΜ και 10-100 μΜ, αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε μελέτη μοριακής πρόσδεσης των κουμαρινικών αναλόγων που παρουσίασαν την ισχυρότερη δράση, στο ενεργό κέντρο της ακετυλοχολινεστεράσης, η οποία υπέδειξε σημαντικές αλληλεπιδράσεις με κρίσιμα για την πρόσδεση, αμινοξέα του ενζύμου.Σειρά Ε: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση τεσσάρων νέων υβριδικών μορίων κουμαρινών-χαλκονών (26a-26d), τα οποία αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης (16-94%) και της δράσης της λιποξυγονάσης από σόγια (IC50 32.5-100 μΜ), καθώς και την κυτταροτοξικότητά τους έναντι της καρκινικής σειράς προστάτη LNCaP (IC50 59-130 μΜ). Επιπλέον, μελετήθηκαν οι φωτοφυσικές τους ιδιότητες καθώς και η ικανότητά τους να παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου in vitro, αλλά και η φωτοτοξική τους δράση έναντι της ανθρώπινης σειράς επιδερμικού καρκινώματος A431, με το παράγωγο 26b να μειώνει, έπειτα από ακτινοβόληση, τη βιωσιμότητα στο 26%.Σειρά ΣΤ: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση δέκα νέων δικουμαρινικών αναλόγων (32a-32j) και τριών βενζοπυρανοκουμαρινών (33a-33c), μέσω αντίδρασης Domino Michael-Knoevenagel, καθώς και δύο νέων κινολινονών (34a, 34b) χρησιμοποιώντας το φυσικό βαθέως ευτηκτικό διαλύτη L-προλίνη/γαλακτικό οξύ = 1:2. Είναι αξιοσημείωτο ότι η σύνθεση των κινολινονικών αναλόγων, μέσω της συγκεκριμένης μεθόδου, αναφέρεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Η ταυτοποίηση της δομής της κινολινόνης 34a και της βενζοπυρανοκουμαρίνης 33b πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR δύο διαστάσεων (2D NMR). Τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση μέσω της δοκιμής δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH και της ικανότητάς τους να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση (LP). Τα δικουμαρινικά ανάλογα παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, με ισχυρότερο αντιοξειδωτικό παράγοντα την 32c.Σειρά Ζ: Η σύνθεση των δέκα νέων 3,6-διυποκατεστημένων κουμαρινικών αναλόγων (35a-35j) της Σειράς Ζ πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης Suzuki-Miyaura με τη χρήση του φυσικού βαθέως ευτηκτικού διαλύτη χλωριούχος χολίνη/γλυκερόλη = 1:2, ενώ σημαντική παρατήρηση αποτέλεσε το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της αντίδρασης φαίνεται να σχηματίζονται νανοσωματίδια παλλαδίου τα οποία συμβάλλουν στην αντίδραση. Τα νέα κουμαρινικά ανάλογα εξετάστηκαν ως προς την κυτταροτοξικότητά τους έναντι της καρκινικής σειράς Α431, με την πλειοψηφία των νέων κουμαρινικών αναλόγων να παρουσιάζει αξιόλογη δράση (40-60% κυτταροτοξικότητα στη συγκέντρωση των 100 μΜ).Τελικό σκοπό της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη εγκλεισμού επιλεγμένων κουμαρινικών αναλόγων σε λιπιδικά νανοσυστήματα νεότερης γενιάς. Σε αυτό το πλαίσιο, πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη της διεργασίας εγκλεισμού τoυ φυσικού προϊόντος, δαφνετίνη (7,8-διυδροξυ-κουμαρίνη), και του συνθετικού αναλόγου της, 7,8-διυδροξυ-3-(4-υδροξυφαινυλο)-4-μεθυλο-κουμαρίνη, σε νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων (SLNs). Τα νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων που παρασκευάστηκαν, χαρακτηρίστηκαν κατάλληλα, ενώ μελετήθηκαν ως προς το προφίλ απελευθέρωσής τους σε διαφορετικές συνθήκες. Ακολούθησε η μελέτη της αντιοξειδωτικής τους δράσης, με τα νανοσυστήματα των κουμαρινικών αναλόγων να παρουσιάζουν βελτιωμένη δράση σε σχέση με τις καθαρές ενώσεις. Οι μελέτες χωρικού εντοπισμού σε κύτταρα A431 υπέδειξαν βελτιωμένη κυτταρική διαπερατότητα στην περίπτωση των SLNs σε σχέση με τις καθαρές ενώσεις. Ακόμη, μελετήθηκε η ικανότητά τους να δρουν ως φωτοευαισθητοποιητές έναντι της καρκινικής σειράς επιδερμικών κυττάρων A431, με την 7,8-διυδροξυ-3-(4-υδροξυφαινυλο)-4-μεθυλο-κουμαρίνη να επιδεικνύει αξιόλογη φωτοτοξική δράση τόσο σε ελεύθερη όσο και σε εγκλεισμένη μορφή (11% βιωσιμότητα έπειτα από ακτινοβόληση με 12 mW/cm2 για 3 min).Τέλος, πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός της 7,8-διυδροξυ-4-φαινυλο-κουμαρίνης σε τρεις διαφορετικούς λιπιδικούς φορείς: νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων (SLNs), νανοδομημένους λιπιδικούς φορείς (NLCs) και νιοσώματα. Ακολούθησε χαρακτηρισμός των λιπιδικών νανοσυστημάτων μέσω φασματοσκοπίας FT-IR και θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA), καθώς και μελέτη αποδέσμευσης της κουμαρίνης από τα διαφορετικά νανοσυστήματα, ενώ πραγματοποιήθηκε και μελέτη της αντιοξειδωτικής τους δράσης μέσω της ικανότητάς τους να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH. Τα NLCs φαίνεται να διατήρησαν καλύτερα την αντιοξειδωτική δράση του κουμαρινικού αναλόγου, ενώ παρουσίασαν και την υψηλότερη απόδοση εγκλεισμού (84%).