Εφαρμογές σύγχρονων ενόργανων αναλυτικών τεχνικών στην κλινική και δικαστική τοξικολογία
Authors: Κρόκος Αδαμάντιος 
Published: November 2023

Η παρούσα διδακτορική διατριβή χωρίζεται σε τρεις ενότητες. Στην πρώτη έγινε μελέτη των ΜΣΑΦ, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως χωρίς ιατρική συνταγή και γι’ αυτό το λόγο ετησίως καταγράφονται αρκετά περιστατικά δηλητηρίασης, κυρίως σε μικρά παιδιά. Σε αυτή την εργασία αναπτύχθηκε μια μέθοδος στην οποία μελετήθηκε ο βαθμός εκχύλισης των ΜΣΑΦ στον ορό του αίματος και στη συνέχεια ο ακριβής προσδιορισμός τους. Αρχικά, εξετάστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης (pH) και ακολούθως οι διαφορετικές συνθήκες παραγωγοποίησης για τον προσδιορισμό των ΜΣΑΦ. Το BSTFA με 1% TMCS επιλέχθηκε ως το βέλτιστο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης για την πλειοψηφία των ΜΣΑΦ, ενώ το pH που επιλέχθηκε ως καταλληλότερο για την εκχύλιση των ΜΣΑΦ από τον ορό αίματος ήταν το 3,7. Επίσης, μελετήθηκε εκτενώς ο σχηματισμός της DCF-lactam, η οποία σχηματίζεται στον ορό του αίματος, αλλά και στον θάλαμο εισαγωγής του δείγματος λόγω υψηλής θερμοκρασίας. Στην επόμενη ενότητα εξετάστηκε η in vitro τοξικότητα της κοκαΐνης με μεταβολομική προσέγγιση, τόσο σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά κύτταρα, όσο και σε φυσιολογικά νευρικά προγονικά κύτταρα μύων. Αρχικά, εξετάστηκε η επίδραση της κοκαΐνης σε κύτταρα HepG2 και υπολογίστηκε πειραματικά η IC50 με XTT στα 2,428 mM. Στη συνέχεια, μελετήθηκε το μεταβολομικό προφίλ των κυττάρων HepG2 μετά από επίδραση με κοκαΐνη σε συγκέντρωση 2 mM σε τρία χρονικά σημεία (3h, 24h και 48h). Τα δείγματα του ενδοκυττάριου και του εξωκυττάριου υγρού ακολούθως αναλύθηκαν με επικυρωμένη μέθοδο HILIC-MS/MS για στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση χρησιμοποιώντας στήλη αμιδίου (ACQUITY) και βαθμωτή έκλουση με το τριπλό τετράπολο να λειτουργεί σε μέθοδο MRM. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη ανάλυση με αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μαζών ακολουθώντας την μέθοδο του Fiehn. Η στοχευμένη και η μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση κατάφερε να αποκαλύψει μεταβολομικές αλλαγές μετά από επίδραση με κοκαΐνη, αλλά η αποκωδικοποίηση του ακριβούς κυτταροτοξικού μηχανισμού της κοκαΐνης εξακολουθεί να είναι μια πρόκληση. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε το ίδιο πείραμα σε νευρικά προγονικά κύτταρα μύων και υπολογίστηκε αρχικά η IC50 στα 5,48 mM κοκαΐνης. Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που εφαρμόστηκε και για τα HepG2 κύτταρα και προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι μεταβολίτες που επηρεάστηκαν από την κοκαΐνη ήταν οι ίδιοι με αυτούς που βρέθηκαν στα κύτταρα HepG2 εκτός από την αδενίνη, αδενοσίνη, λευκίνη, ισολευκίνη και πουτρεσκίνη, οι οποίες βρέθηκαν να διαφοροποιούνται μόνο στα NPCs.Στην τρίτη ενότητα της διδακτορικής διατριβής έγινε ανάπτυξη μεθόδου αλκαλικών ναρκωτικών σε DBS με SPE-LC-MS/MS. Αρχικά μελετήθηκε ο χρόνος ξήρανσης της ξηρής κηλίδας. Στη συνέχεια έγινε ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα. Για την δημιουργία των DBS χρειάστηκαν μόνο 10 μL και ο απαραίτητος χρόνος ξήρανσης υπολογίστηκε κάτω από μία ώρα. Η μέθοδος επικυρώθηκε για ανάκτηση στο στάδιο της εκχύλισης, γραμμική περιοχή, όρια ανίχνευσης, ακρίβεια, επαναληψιμότητα και σταθερότητα. Μετά από την επικύρωση της μεθόδου αναλύθηκαν πραγματικά δείγματα ολικού αίματος, τα οποία είχαν αναλυθεί πριν από ένα έτος και τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα εκτός από την ουσία 6-ΜΑΜ. Απαραίτητη είναι η υψηλή ευαισθησία και η υψηλή ανάκτηση στο στάδιο της εκχύλισης και για αυτόν το λόγο είναι αναγκαία η περαιτέρω βελτιστοποίηση της μεθόδου, ώστε να αυξηθεί η ανάκτηση των οπιούχων.