Lipopolysaccharides increase the ire1-mediated unfolded protein response signaling induced by homocysteine in endotheliocytes
Authors: Московцев А.А. , Иванов А.В. , Зайченко Д.М. , Микрюкова А.А. , Суханова И.Ф. , Соколовская А.А. , Кожевникова Л.М. , Кубатиев А.А. 
Published: October 2022

Введение. Гипергомоцистеинемия (Ггц) - повышение уровня гомоцистеина в плазме крови выше 12 мкмоль/л - независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. Гипергомоцистеинемия, являясь сравнительно распространенным состоянием, ассоциирована также с рядом других патологий, таких как болезнь Альцгеймера, шизофрения, заболевания почек, остеопороз, инсулиннезависимый диабет. Повышенные концентрации гомоцистеина (Гц) способны вызывать клеточный стресс (окислительный, стресс эндоплазматического ретикулума), что может приводить к эндотелиальной дисфункции и клеточной гибели. Ггц может отягощать течение инфекционных заболеваний, но механизмы такой модуляции изучены недостаточно. Предполагается, что Ггц является одним из факторов неблагоприятного прогноза SARSCoV-2 инфекции. Цель исследования - изучение в эндотелиальных клетках механизмов действия гомоцистеина, липополисаридов, их комбинации, а также модулирующего действия фолиевой кислоты и витамина В12. Методика. Эндотелиоцитоподобные клетки EA.hy926 подвергали действию дитиотрейтола, гомоцистеина, липополисаридов, гомоцистеина в комбинации с липополисахаридами, с дополнительной инкубацией с витамином В12 и фолиевой кислотой или только фолиевой кислотой. Использовали ДНК-цитометрию для подсчета процента гиподиплоидных клеток, а также МТТ-тест для оценки цитотоксических эффектов. Методом ПЦР-РВ оценивали уровни экспрессии мРНК генов, вовлеченных в ответ клетки на стресс эндоплазматического ретикулума: BiP, XBP1 (общего и сплайсированной формы), IRE1, ATF6 в двух временных точках после воздействия - 6 ч и 24 ч. Результаты. Впервые показано, что совместное действие липополисахаридов и гомоцистеина приводит к увеличению активности пути IRE1-XBP1 - сигнальной ветви ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. Являясь слабыми индукторами стресса ЭПР, липополисариды значимо потенцируют активированный гомоцистеином сигнальный путь IRE1-XBP1, что мы связываем с взаимодействием сигнальных путей врожденного иммунитета и ответа на стресс. Обнаруженное потенцирование может объяснять небольшое увеличение цитотоксичности при сочетанном действии Гц и ЛПС в связи с тем, что пролонгированная активность IRE1 обладает проапоптотическим действием. Впервые показано, что фолиевая кислота и витамин В12 снижают активность пути IRE1-XBP1 при действии гомоцистеина и ЛПС, а также дитиотрейтола. Заключение. В ходе исследования установлено значимое стимулирование сигнального пути IRE1-XBP1 комбинацией ЛПС и Гц, а также атеннюация этого пути фолиевой кислотой и витамином В12. Однако, потенцирование гомоцистеином цитотоксического эффекта ЛПС невелико. Хотя полученные в ходе данного in vitro исследования результаты не позволяют в полной мере рассматривать Ггц как фактор, усложняющий течение инфекционных заболеваний, состояние сосудистой системы и возрастающий риск ее дисфункции должны приниматься во внимание при выборе методов профилактики, терапии и прогноза течения инфекционных заболеваний на фоне гипергомоцистеинемии.

Introduction. Hyperhomocysteinemia (HHcy) is a pathological condition described with high levels in plasma of homocysteine (Hcy), a nonprotein α-amino acid homologue of cysteine. It might cause oxidative and endoplasmic reticulum stress with resultant endothelial dysfunction and cell death. HHcy, that is a widespread condition, is associated with a number of other pathologies, such as Alzheimer’s disease, schizophrenia, kidney disease, osteoporosis, and diabetes. Early studies emphasize HHcy as one of the crucial and independent risk factors for development of cardiovascular disorders. Moreover, hyperhomocysteinemia can escalate the severity of infectious diseases and even appears as a potential marker for forecasting the course of SARSCoV-2 infection, as many patients are currently at risk for major clotting events once the infection is established. However, the mechanisms of these processes were poorly studied previously. Therefore, the major focus of this work is to study the mechanisms of actions of homocysteine and lipopolysaccharides (LPS) separately and combined together, and modulating actions of them by folic acid and vitamin B12 in endothelial cells. Methods. Endotheliocyte-like EA.hy926 cells were exposed to dithiothreitol, homocysteine, LPS, and Hcy in combination with LPS, with additional incubation with vitamin B12 and folic acid or folic acid alone.The DNA cytometry was performed to calculate the percentage of hypodiploid cells, and the MTT test was conducted to assess cytotoxic effects. RT-qPCR was done in order to evaluate the mRNA expression of the genes involved in the cell response to endoplasmic reticulum stress: BiP, XBP1 (common and spliced form), IRE1, ATF6 at two time points after exposure, 6 h and 24 h. Results. During our research, it was discovered that the coaction of LPS and Hcy increased the activity of the IRE1-XBP1 pathway, a signaling branch of ER stress. LPS, as weak inducers of ER stress, significantly potentiates the Hcy-activated IRE1-XBP1 signaling pathway. We interpret this event as the interaction of signaling pathways of innate immunity and stress response. The observed potentiation may explain the elevated cytotoxicity under the coaction of Hcy and LPS due to the proapoptotic effect of IRE1prolonged activity. In this paper, our research demonstrated that folic acid and vitamin B12 restrict the activity of the IRE1-XBP1 pathway under the action of Hcy and LPS as well as of dithiothreitol. Conclusion. A significant stimulation of the IRE1-XBP1 signaling pathway by a combination of LPS and Hcy, as well as attenuation of this pathway by folic acid and vitamin B12 have been shown. However, the potentiation of the cytotoxic effect of LPS by homocysteine is relatively small. Although the results obtained during this in vitro study do not let us to fully consider HHcy as a factor aggravating the course of infectious diseases, the state of the vascular system and the increasing risk of its dysfunction should be taken into account while choosing methods for the prevention, treatment and forecasting of the infectious diseases course against the background of hyperhomocysteinemia.