Μελέτη του βιολογικού ρόλου της ιστόνης Η1 και της κινάσης της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK-3) της Leishmania
Authors: Ξύγγη Ευαγγελία 
Published: January 2014

Η συνδετική ιστόνη LeishH1 της Leishmania έχει μελετηθεί διεξοδικά στο εργαστήριο Μοριακής Παρασιτολογίας του ΕΙΠ. Έχει δειχτεί ότι η επισωμική έκφραση της LeishH1 σε L. major προμαστιγωτά οδηγεί σε υπερέκφραση του μορίου και μειώνει την μολυσματικότητα του παρασίτου in vitro και in vivo (Papageorgiou and Soteriadou, 2002; Smirlis et al., 2006). Στα παράσιτα που υπερεκφράζουν την LeishH1 παρατηρήθηκε in vitro καθυστέρηση στη διαφοροποίηση από προμαστιγωτά σε αμαστιγωτά (Smirlis et al., 2006). Στα πλαίσια της διατριβής αυτής μελετήθηκε εάν οι διαφορές αυτές στη μολυσματικότητα και στην διαφοροποίηση των παρασίτων που υπερεκφράζουν την LeishH1 οφείλονται σε διαφορές στον κυτταρικό τους κύκλο. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση της LeishH1 καθυστερεί την μετάβαση από την G1 στην S φάση και αυξάνει τη διάρκεια της S φάσης του κυτταρικού κύκλου στα διάφορα είδη της Leishmania (L. donovani, L. infantum και L. major). Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκοντα σε συμφωνία με δεδομένα για τις συνδετικές ιστόνες στα μετάζωα, καθώς η υπερέκφραση τους καθυστερεί την αντιγραφή του DNA και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, που στηρίζουν την ιδέα ότι σημαντικές λειτουργίες της ιστόνης Η1 είναι συντηρημένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Εφόσον τα επίπεδα έκφρασης της LeishΗ1 επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο της Leishmania, το ενδιαφέρον στρέφεται σε μόρια-κλειδιά, που ρυθμίζουν τη λειτουργία της LeishΗ1, κυρίως μέσω μετα-μεταφραστικών τροποιήσεων (π.χ. φωσφορυλίωσης). Η LeishΗ1 περιέχει πιθανά μοτίβα φωσφορυλίωσης από σύμπλοκα κινασών/κυκλινών, τα οποία μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Papageorgiou and Soteriadou, 2002). Επίσης, στο πρωτόζωο T. cruzi έχει δειχτεί ότι δύο CDK ομόλογες κινάσες του παρασίτου, οι TzCRK3 και TzCRK1 φωσφορυλιώνουν την Η1 in vitro (da Cunha et al., 2005). Στη Leishmania έχουν μελετηθεί οι CDK ομόλογες πρωτεΐνες CRK1 και CRK3, αλλά δεν έχει δειχτεί ότι φωσφορυλιώνουν την LeishΗ1. Συνεπώς αντικείμενο ενδιαφέροντος αποτελεί η μελέτη κινασών του παρασίτου που πιθανόν φωσφορυλιώνουν τη LeishΗ1. Στα πλαίσια αυτά, μελέτηθηκε η κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK-3) της Leishmania, σαν ένα πιθανό μόριο που φωσφορυλιώνει την LeishΗ1. Τα τελευταία χρόνια, οι πρωτεϊνικές κινάσες θεωρούνται πιθανά μόρια-στόχοι του παρασίτου και οι ερευνητικές προσπάθειες επικεντρώνονται στη διερεύνηση των υπάρχοντων βιβλιοθηκών αναστολέων κινασών και στη δημιουργία νέων βιβλιοθηκών αναστολέων, που θα στοχεύουν Περίληψη 231 επιλεκτικά τις κινάσες του παρασίτου, χωρίς να προκαλούν βλάβη στον τελικό ξενιστή (Hammarton et al., 2003; Naula et al., 2005). Για το σκοπό αυτό, ταυτοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε η μία από τις δύο ομόλογες ισομορφές της GSK-3 στη L. donovani, που ονομάστηκε LdGSK-3short. Η LdGSK-3short αποτελεί ένα υψηλά συντηρημένο μόριο της Leishmania και εμφανίζει 49% ταυτότητα και 68% ομοιότητα με την ανθρώπινη GSK-3β. Η LdGSK-3short ανιχνεύεται και στις δύο μορφές της Leishmania (προμαστιγωτά και αμαστιγωτά). Τα επίπεδα έκφρασης της δεν διαφέρουν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των προμαστιγωτών από τη λογαριθμική στη στατική φάση, αλλά μειώνονται περίπου τρεις φορές στα αμαστιγωτά, ένα αποτέλεσμα που βρίσκεται σε συμφωνία με πρόσφατα ευρήματα σχετικά με την έκφραση της LdGSK-3short σε L. donovani αξενικά αμαστιγωτά (Rosenzweig et al., 2008). Επιπλέον, η LdGSK-3short εμφανίζει κυτταροπλασματική εντόπιση σε προμαστιγωτά λογαριθμικής φάσης και πυρηνική εντόπιση σε προμαστιγωτά στατικής φάσης. Σημαντικά είναι επίσης τα ευρήματα ότι: α) η LeishΗ1 είναι υπόστρωμα της LdGSK-3short in vitro και η φωσφορυλίωση της αναστέλλεται από την 5-Me-6-BIO (που όπως αναφέρεται στη συνέχεια αναστέλλει επιλεκτικά την LdGSK-3short) και β) η LeishΗ1 συνεντοπίζεται με την LdGSK-3short στον πυρήνα προμαστιγωτών στατικής φάσης. Περισσότερα πειραματικά δεδομένα χρειάζονται για να αποδειχτεί η in vivo αλληλεπίδραση της LdGSK-3short με την LeishH1. Η διερεύνηση του ρόλου της GSK-3short του παρασίτου, έγινε με τη χρήση χημικών αναστολέων της και γενετικών μελετών (ανασυνδυασμένων παρασίτων που υπερεκφράζουν την κινάση ή την ανενεργή μορφή της). Οι χημικοί αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν, οι ιντιρουμπίνες είναι γνωστό ότι στοχεύουν τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs) και την κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK-3) ελέγθηκαν για την αντιλεϊσμανιακή δράση τους. Η 3’ οξίμη της 6-βρώμο-ιντιρουμπίνης (6-BIO), η 3’ ακετοξίμη της 6-βρώμο- ιντιρουμπίνης (6-BIA) και η 3’ οξίμη της 6-βρώμο-5-μέθυλο-ιντιρουμπίνης (5-Me-6-BIO) ήταν οι πιο ισχυροί αναστολείς της ανάπτυξης των L. donovani προμαστιγωτών και αμαστιγωτών (τιμές IC50 ? 1,2 μM). ...