Αναλυτικές, κινητικές μέθοδοι και δομικές μελέτες για την διερεύνηση εξειδικευμένων βιοτεχνολογικών εφαρμογών πρωτεολυτικών ενζύμων σε ελεύθερη και ακινητοποιημένη μορφή
Authors: Στεργίου Παναγιώτα 
Published: September 2021

Οι πρωτεάσες έχουν ευρεία εφαρμογή σε διάφορους τομείς, όπως η βιοτεχνολογία, η παραγωγή τροφίμων, οι ζωωτροφές, τα φάρμακα και τα καλλυντικά κ.α., αποτελώντας σημαντικά εργαλεία έρευνας με σκοπό την ανάπτυξη. Έτσι, η αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης τους και η συσχέτισή της με την δομή τους, δηλαδή οι τρόποι αλληλεπίδρασης τους με τα μόρια των υποκαταστατών τους (υποστρώματα, αναστολείς, κ.λ.π.), εκτός από το ερευνητικό τους ενδιαφέρον, είναι προαπαιτούμενα για την χρήση των ενζύμων αυτών σε εξειδικευμένες βιοτεχνολογικές και άλλες εφαρμογές. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν αναλυτικές, κινητικές και δομικές/υπολογιστικές μεθοδολογίες για την διερεύνηση εξειδικευμένων βιοτεχνολογικών εφαρμογών δύο πρωτεολυτικών ενζύμων, της παγκρεατικής ελαστάσης χοίρου (PPE) και της ρεννίνης από τον μικροοργανισμό Rhizomucor pusillus (MPR).Διερευνήθηκε για πρώτη φορά ο μηχανισμός της αντιστρεπτής αναστολής της PPE από Τριφθορο-ακετυλ-διπεπτιδικά-π-τριφθορο-ανιλίδια, που εκτός τον πιθανό μελλοντικό σχεδιασμό παραγώγων κατά της παθογένεσης του εμφυσήματος, συνέτεινε αποφασιστικά στην διερεύνηση αλληλεπιδράσεων τύπου ενζύμου-υποστρώματος και από αυτές στον σχεδιασμό και την σύνθεση σημαντικών υποστρωμάτων άλλων πρωτεασών, χρήσιμων σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Αναλύθηκε διεξοδικά, με εφαρμογή κινητικών μεθοδολογιών, η υδρόλυση του υποστρώματος Suc-AAA-pNA από την PPE παρουσία και απουσία αντιστρεπτών ενζυμικών αναστολέων του τύπου CF3C(O)-ΧA-NHPh-p-CF3 (όπου Χ={K,V,D}) και πραγματοποιήθηκαν, επίσης, υπολογιστικές προσομοιώσεις για μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ PPE και των αντιστρεπτών αυτών αναστολέων.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ η υδρόλυση του Suc-ΑΑΑ-pΝΑ από την ΡΡΕ, απουσία αντιστρεπτών αναστολέων, προχωρά μέσω μίας εικονικής μεταβατικής κατάστασης που περιλαμβάνει ένα ελάσσον φυσικό κι ένα κυρίαρχο χημικό στάδιο με δύο σταθεροποιημένες καταστάσεις αντιδρώντων να προηγούνται του κυρίαρχου ακυλο-ενζύμου, ωστόσο η ίδια υδρολυτική αντίδραση, παρουσία των αντιστρεπτών αναστολέων, αποδείχθηκε ότι προχωρά με απουσία εικονικής μεταβατικής κατάστασης, υποδεικνύοντας έτσι έναν διαφορετικό τρόπο κατάλυσης, η οποία πραγματοποιείται μέσω ενός τροποποιημένου δομικά ενζυμικού μορίου. Ως τελικό συμπέρασμα προτείνεται ένας νέος και λεπτομερής μηχανισμός αντιστρεπτής αναστολής της PPE.Η MPR είναι ένα πολλά υποσχόμενο υποκατάστατο της βοοειδούς χυμοσίνης, με αυξανόμενη χρήση, παγκοσμίως. Έτσι, η ανάπτυξη μιας αυτοματοποιημένης και ευαίσθητης μεθόδου προσδιορισμού δραστικότητας της MPR, σε ελεύθερη και ακινητοποιημενη μορφή και η αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης της αποτελούν πρόκληση για την ευρεία χρήση της στην βιομηχανική παραγωγή τυριού. Η απουσία ευαίσθητου και αναλυτικά αξιόπιστου υποστρώματος για ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικότητας της MPR αποτελούσε πρόβλημα. Τα υπάρχοντα υποστρώματα δεν προσέφεραν αξιόπιστους ποσοτικούς προσδιορισμούς της δραστικότητας της MPR, ούτε δυνατότητα διερεύνησης του μηχανισμού δράσης της, λόγω σφαλμάτων των εμμέσων, μη αυτοματοποιημένων μετρήσεων, που αυτά επέτρεπαν.Έτσι επιλέχθηκε ο σχεδιασμός φθορισμομετρικών πεπτιδικών υποστρωμάτων, όπου κατά την υδρόλυσή τους λαμβάνει χώρα μεταφορά ενέργειας λόγω συντονισμού κατά Förster (FRET-πεπτίδια). Με χρήση υπολογιστικών τεχνικών προσομοίωσης προσδιορίστηκαν οι αλληλεπιδράσεις κατά την πρόσδεση μιας σειράς πιθανών FRET-πεπτιδικών υποστρωμάτων στην ενεργό περιοχή της MPR και εξετάστηκε η σταθερότητα των σχηματιζόμενων συμπλόκων MPR/FRET-πεπτιδίων. Από αυτά επιλέχθηκαν υποστρώματα που δίεθεταν τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά και ακολούθησε σταδιακή σύνθεση των FRET-πεπτιδικών υποστρωμάτων σε υγρή φάση (Fmoc/Butyl) με την μεθοδολογία των μεικτών ανυδριτών. Από τα φάσματα εκπομπής φθορισμού για την αντίδραση της υδρόλυσης τεσσάρων συντεθέντων FRET-πεπτιδίων από την ΜPR, προέκυψε ότι μόνο τρία από αυτά, τα Abz-GFY-pNA, Abz-SFY-pNA και Abz-GFI-pNA, παρουσίασαν φθορισμό με μέγιστο λem = 415 nm και επομένως συνιστούν υποστρώματα της MPR. Οι κινητικές μελέτες με τα τρία προαναφερθέντα FRET-πεπτιδικά υποστρώματα έδειξαν ότι το Abz-GFY-pNA διαθέτει τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά δηλαδή υψηλή εξειδίκευση κι ευαισθησία. Έτσι, αναπτύχθηκε μια νέα αυτοματοποιημένη και στατιστικά ισχυρή μέθοδος προσδιορισμού δραστικότητας της MPR σε ελεύθερη και ακινητοποιημένη μορφή, βασισμένη στην μεταβολή της έντασης του φθορισμού (λem = 415 nm, λex = 340 nm) κατά την υδρόλυση του υποστρώματος Abz-GFY-pNA, αλλά και πρoτάθηκε ένας νέος μηχανισμός, που διαφωτίζει αρκετά σημεία-κλειδιά της δράσης της MPR και που ενδεχομένως να μπορεί να αντιστοιχηθεί και σε άλλες ασπαρτικοπρωτεϊνάσες.