Έρευνα των μη θερμικών διεργασιών παλμικών ηλεκτρικών πεδίων και υπερυψηλής πίεσης στην επεξεργασία βιομάζας ζυμομυκήτων για την αξιοποίηση βιολειτουργικών συστατικών με εφαρμογή στα τρόφιμα
Authors: Δημόπουλος Γεώργιος 
Published: November 2021

Η κυτταρική σύσταση του S. cerevisiae τον τοποθετεί στο επίκεντρο της έρευνας για την παραλαβή βιοδραστικών συστατικών. Η παραγωγή βιομάζας του μικροοργανισμού σε μεγάλες ποσότητες και χαμηλό κόστος τόσο πρωτογενώς όσο και ως παραπροϊόν άλλων διεργασιών, όπως η ζυθοποιία, τον καθιστά ελκυστική πηγή τέτοιων συστατικών. Η διεργασία της αυτόλυσης στηρίζεται στην δράση των ενδογενών λυτικών ενζύμων του μικροοργανισμού υπό ελεγχόμενες συνθήκες pH και θερμοκρασίας για την παραγωγή εκχυλισμάτων μαγιάς, συστατικά που χρησιμοποιούνται ως φυσικά πρόσθετα τροφίμων για την ενίσχυση της γεύσης, χάρη στα ελεύθερα αμινοξέα και πεπτίδια που περιέχουν. Η αυτόλυση προτιμάται σε σχέση με άλλες διεργασίες παραγωγής εκχυλίσματος (ενζυμική υδρόλυση, πλασμόλυση με άλας, υδρόλυση με ανόργανα οξέα), λόγω του χαμηλού κόστους και του απλού εξοπλισμού που απαιτεί. Κύριο εμπόδιο στη διεργασία αποτελεί η χαμηλή διαπερατότητα του κυττάρου, η οποία οδηγεί σε επιβράδυνση της διεργασίας, με διάρκεια που ξεπερνά τις 24 h. Παράλληλα, η διεργασία οδηγεί στην παραγωγή μεγάλης ποσότητας στερεών υπολειμμάτων πλούσιων σε β-γλυκάνες, τα οποία όμως απορρίπτονται ή οδηγούνται στην παραγωγή ζωοτροφών. Διεργασίες που προκαλούν αύξηση της κυτταρικής διαπερατότητας μπορούν να συνεισφέρουν στην επιτάχυνση της αυτόλυσης και ταυτόχρονα να συνεισφέρουν στην αξιοποίηση του στερεού υπολείμματος. Ακόμη, αυξημένη κυτταρική διαπερατότητα μπορεί να βελτιώσει την παραλαβή των ενδογενών πρωτεασών του κυττάρου αλλά και να τα καταστήσει κατάλληλους φορείς για την ενθυλάκωση βιοδραστικών συστατικών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της εφαρμογής των καινοτόμων, μη θερμικών διεργασιών των Παλμικών Ηλεκτρικών Πεδίων (ΠΗΠ), της Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) και της Ομογενοποίησης Υψηλής Πίεσης (ΟΥΠ) στην αξιοποίηση βιομάζας κυττάρων του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Οι διεργασίες αυτές αυξάνουν την κυτταρική διαπερατότητα, διατηρώντας ή και ενισχύοντας την ενδογενή ενζυμική ενεργότητα των κυττάρων. Η έρευνα επικεντρώθηκε στη μελέτη της επίδραση των διεργασιών αυτών στην βελτίωση της διεργασίας της αυτόλυσης ως προς τον ρυθμό και την απόδοση εκχυλίσματος μαγιάς με τον ταυτόχρονο εμπλουτισμό του στερεού κυτταρικού υπολείμματος της διεργασίας σε β-γλυκάνες. Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση της ΥΠ στα ενδογενή πρωτεολυτικά ένζυμα του μικροοργανισμού αλλά και η εφαρμογή των διεργασιών ως κυτταρικές προεπεξεργασίες για την βελτίωση της κυτταρικής ενθυλάκωσης αιθερίου ελαίου ρίγανης. Η επίδραση των διεργασιών στην αυτόλυση (52°C, pH=5.5) των κυτταρικών αιωρημάτων μελετήθηκε ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του παραγόμενου εκχυλίσματος (συγκέντρωση α-αμινικού αζώτου και πρωτεϊνών, απελευθέρωση ολικών στερεών, δείκτης αμαύρωσης, θολότητα) και του στερεού υπολείμματος της αυτόλυσης ως προς την περιεκτικότητα β-γλυκανών και αδιάλυτων πρωτεϊνών. Όπου κατέστη δυνατό, η εξάρτηση των χαρακτηριστικών από τον χρόνο αυτόλυσης περιγράφηκε μαθηματικά με τη χρήση εκθετικού μοντέλου πρώτης τάξης και η επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στην αυτόλυση εκτιμήθηκε με βάση την επίδρασή τους στις παραμέτρους της εξίσωσης. Ο βαθμός κυτταρικής διάρρηξης που προκαλείται από κάθε διεργασία εκτιμήθηκε με βάση τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης Z ο οποίος προσδιορίζεται με βάση την ηλεκτρική αγωγιμότητα του κυτταρικού αιωρήματος και εκφράζει το ποσοστό των κυττάρων που υφίστανται διάρρηξη. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση των ΠΗΠ στην κυτταρική διάρρηξη αιωρημάτων S. cerevisiae με στόχο την εύρεση των συνθηκών επεξεργασίας που οδηγούν σε αποτελεσματική διάρρηξη. Αρχικά πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων της διεργασίας (ένταση ηλεκτρικού πεδίου 2-22 kV/cm, αριθμός εφαρμοζόμενων παλμών 0-2000) και της κυτταρικής περιεκτικότητας του αιωρήματος (1%-10% κ.β.) στον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των ΠΗΠ στην κινητική της αυτόλυσης αιωρημάτων S. cerevisiae. Οι συνθήκες επεξεργασίας ΠΗΠ που εφαρμόστηκαν (ένταση ηλεκτρικού πεδίου 5-20 kV/cm, 0-2000 παλμοί) επιλέχθηκαν με βάση τη μελέτη της εξάρτησης του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης από τις παραμέτρους της διεργασίας, ώστε να μελετηθεί η επίδραση εύρους τιμών του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0-1) στην αυτόλυση. Η εξεργασία με ΠΗΠ επιτάχυνε σημαντικά την απελευθέρωση α-αμινικού αζώτου, πρωτεϊνών και ολικών στερεών κατά 54%, 69% και 60% αντίστοιχα σε σχέση με το ανεπεξέργαστο αιώρημα. Η μέγιστη επιτάχυνση της απελευθέρωσης επιτεύχθηκε για τιμές δείκτη κυτταρικής διάρρηξης μεγαλύτερες από 0.5, ενώ βρέθηκε ότι η επιτάχυνση της αυτόλυσης εξαρτάται από τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης ανεξάρτητα από τον συνδυασμό έντασης ηλεκτρικού πεδίου και αριθμού παλμών με τον οποίο επιτυγχάνεται. Στην επόμενη ενότητα της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της επεξεργασίας ΠΗΠ (6 kV/cm, 0-1000 παλμοί) στην αυτόλυση κυτταρικών αιωρημάτων S. cerevisiae σε συνδυασμό με την χρήση παπαΐνης, μιας φυτικής πρωτεάσης που έχει χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της απόδοσης εκχυλίσματος κατά την αυτόλυση. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν οδήγησαν στην επίτευξη τιμών δείκτη κυτταρικής διάρρηξης στο εύρος Ζ=0 έως και Ζ=0.74). Οι συνθήκες επεξεργασίας συνδυάστηκαν με την χρήση παπαΐνης σε περιεκτικότητα 0.25% κ.β.. Η αύξηση της έντασης των συνθηκών επεξεργασίας ΠΗΠ οδήγησε στην επιτάχυνση της αυτόλυσης ως προς όλα τα μελετούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του εκχυλίσματος. Η συνολική επιτάχυνση της αυτόλυσης εκτιμήθηκε με βάση την κινητική απελευθέρωσης του α-αμινικού αζώτου που αποτελεί το σημαντικότερο φυσικοχημικό χαρακτηριστικό του εκχυλίσματος. Σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, η επεξεργασία με ΠΗΠ για 1000 παλμούς οδήγησε σε συνολική επιτάχυνση της αυτόλυσης κατά 62% ως προς το α-αμινικό άζωτο, οδηγώντας στην παραγωγή εκχυλίσματος με 51% κ.β. περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες (52% για το ανεπεξέργαστο δείγμα), 6.1% κ.β. περιεκτικότητα σε α-αμινικό άζωτο (7.5% για το ανεπεξέργαστο δείγμα) και δείκτη αμαύρωσης 19.1 (16.5 για το ανεπεξέργαστο δείγμα). Στις συνθήκες αυτές, το στερεό υπόλειμμα της αυτόλυσης βρέθηκε να έχει αυξημένη περιεκτικότητα σε β-γλυκάνες (κατά 25% σε σχέση με το ανεπεξέργαστο) και μειωμένη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες (κατά 21% σε σχέση με το ανεπεξέργαστο). Η αυτόλυση παρουσία παπαΐνης επιτάχυνε την αυτόλυση σε συνδυασμό με αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (55%-61%) σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, οδηγώντας στην παραγωγή εκχυλισμάτων με παρόμοια χαρακτηριστικά. Η παρουσία παπαΐνης σε συνδυασμό με επεξεργασία ΠΗΠ για 1000 παλμούς οδήγησε σε περαιτέρω εμπλουτισμό του στερεού υπολείμματος σε β-γλυκάνες με παράλληλη μείωση της περιεκτικότητάς του σε πρωτεΐνες (51% και 31% αντίστοιχα σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα). Εντούτοις, η παρουσία παπαΐνης αύξησε σημαντικά τη θολότητα του εκχυλίσματος από 3 έως και 9 φορές σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Στην επόμενη ενότητα της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της διεργασίας της Ομογενοποίησης Υψηλής Πίεσης (ΟΥΠ) (200-800 bar, 1-4 διελεύσεις) στην αυτόλυση κυτταρικών αιωρημάτων S. cerevisiae. Η επεξεργασία με ΟΥΠ οδήγησε στην επιτάχυνση της αυτόλυσης ως προς όλα τα μελετούμενα χαρακτηριστικά, καθώς αύξηση της πίεσης και του αριθμού διελεύσεων οδήγησαν σε αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0.97 στα 800 bar/3 διελεύσεις). Με βάση την κινητική απελευθέρωσης α-αμινικού αζώτου, η επεξεργασία στις εντονότερες συνθήκες (800 bar, 3 διελεύσεις) βρέθηκε ότι επιταχύνει την αυτόλυση κατά 86%, με τα παραγόμενα εκχυλίσματα να εμφανίζουν περιεκτικότητα 8.2% κ.β. σε α-αμινικό άζωτο (6.5% για το ανεπεξέργαστο δείγμα) και 57.0% κ.β. σε πρωτεΐνες (48.3% για το ανεπεξέργαστο δείγμα). Εντούτοις, τα εκχυλίσματα που παράγονται με ΟΥΠ εμφάνισαν υψηλές τιμές θολότητας, έως και 4 φορές αυξημένες σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Η επίδραση της ΟΥΠ στην περιεκτικότητα του στερεού υπολείμματος της αυτόλυσης σε β-γλυκάνες και πρωτεΐνες επίσης βρέθηκε να είναι σημαντική. Η περιεκτικότητα β-γλυκανών του στερεού αυξήθηκε με αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης αλλά μόνο σε συνδυασμό με την αυτόλυση, επιτυγχάνοντας περιεκτικότητα έως και 78% αυξημένη σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, για χρόνο αυτόλυσης 8 και 24 h στον μέγιστο δείκτη κυτταρικής διάρρηξης (Ζ=0.97), με παράλληλη μείωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες κατά 64%. Στην συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της διεργασίας της Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) (200-750 MPa, 0-120 min) στα κυτταρικά αιωρήματα S. cerevisiae, ως προς τον δείκτη κυτταρικής διάρρηξης, την ολική πρωτεολυτική ενεργότητα και την αυτόλυση. Αύξηση της πίεσης και του χρόνου επεξεργασίας οδήγησαν σε αύξηση του δείκτη κυτταρικής διάρρηξης. Η πρωτεολυτική ενεργότητα των κυττάρων αυξήθηκε σε πιέσεις 200 και 400 MPa (έως και 1.7 φορές σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα), ενώ σε πιέσεις άνω των 600 MPa παρατηρήθηκε απενεργοποίηση της πρωτεολυτικής ενεργότητας. Η ΥΠ επηρέασε σημαντικά την αυτόλυση ως προς τα μετρούμενα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, στις συνθήκες επεξεργασίας που επιλέχθηκαν (200, 400, 600 MPa, 0-60 min). Για πιέσεις επεξεργασίας 200 και 400 MPa, η επεξεργασία με ΥΠ επιτάχυνε την αυτόλυση ενώ σε πίεση επεξεργασίας 600 MPa η αυτόλυση παρεμποδίστηκε, παρά τις υψηλές τιμές δείκτη κυτταρικής διάρρηξης, εξαιτίας της απώλειας της πρωτεολυτικής ενεργότητας. Με βάση την απελευθέρωση α-αμινικού αζώτου, βρέθηκε ότι για επεξεργασία 400 MPa για 16 min, η αυτόλυση επιταχύνθηκε κατά 61%. Παράλληλα στις συνθήκες αυτές, η περιεκτικότητα του στερεού υπολείμματος σε β-γλυκάνες ήταν κατά 37% αυξημένη σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα, ενώ η περιεκτικότητά του σε πρωτεΐνες κατά 26% μειωμένη. Στην ενότητα αυτή μελετήθηκε επίσης η επίδραση της ΥΠ σε συνδυασμό με διαφορετικές θερμοκρασίες αυτόλυσης (32°C, 42°C και 52°C) στην ενεργότητα των κενοτοπικών πρωτεασών Α και Β κατά την αυτόλυση μηχανικά διαρρηγμένων κυττάρων (διάρρηξη με ΟΥΠ). Οι δύο αυτές πρωτεάσες παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην αυτόλυση του κυττάρου. Σε θερμοκρασία αυτόλυσης 52°C πιέσεις 200 και 400 MPa, η ενεργότητα των πρωτεασών αυξήθηκε έως και 100% στις πρώτες 2-6 h της αυτόλυσης σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Ωστόσο, αυτόλυση στους 32 και 42°C οδήγησε σε απώλεια της πρωτεάσης Α στις πρώτες 6 h της αυτόλυσης η οποία ανακάμπτει μετά τις 16 h. Η μέγιστη πρωτεολυτική ενεργότητα και για τα δύο ένζυμα παραλαμβάνεται για αυτόλυση στους 32°C μετά τις 16 h, όπου η ενεργότητα της πρωτεάσης Β πενταπλασιάζεται σε σχέση με την αρχική ενεργότητα, ενώ η πρωτεάση Α ανακάμπτει σε επίπεδα συγκρίσιμα με τα αρχικά. Η εξάρτηση του χρόνου πήξης του γάλακτος από την ενζυμική ενεργότητα των δύο πρωτεασών μελετήθηκε με εφαρμογή της ΥΠ ως διεργασία για την επίτευξη διαφορετικών τιμών ενεργότητας για τις δύο πρωτεάσες. Η ικανότητα των ενζυμικών εκχυλισμάτων στην πήξη του γάλακτος βρέθηκε ότι εξαρτάται έντονα από την ενεργότητα των δύο πρωτεασών, με την ενεργότητα της πρωτεάσης Α να την επηρεάζει εντονότερα από την πρωτεάση Β. Ο χαμηλότερος χρόνος πήξης στους 50°C που επετεύχθη ήταν ίσος με 136 s για το ανεπεξέργαστο ενζυμικό εκχύλισμα (σε σύγκριση με την πυτιά σε περιεκτικότητα 2 mg/mL με χρόνο πήξης 148 s στην ίδια θερμοκρασία). Στην τελευταία πειραματική ενότητα της διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση των διεργασιών των ΠΗΠ και της ΟΥΠ αλλά και της αυτόλυσης των κυττάρων S. cerevisiae στην ενθυλάκωση αιθερίου ελαίου ρίγανης. Ως φορείς ενθυλάκωσης μελετήθηκαν κυτταρικά αιωρήματα που υπέστησαν επεξεργασία με ΠΗΠ (8.5-17 kV/cm, ειδική ενέργεια 3.2-107 kJ/kg), ΟΥΠ (800 bar, 4 διελεύσεις) και αυτόλυση (52°C, pH=5.5 για 8 και 24 h). Η ενθυλάκωση πραγματοποιήθηκε με ανάμειξη των ξηρών κυτταρικών υλικών παρουσία του ελαίου, νερού και αιθανόλης (63.8% νερό, 14.5% έλαιο, 14.5% κυτταρικό υλικό, 7.2% αιθανόλη) σε διαφορετικές θερμοκρασίες (30°C, 37°C, 45°C, 65°C). Η κινητική της ενθυλάκωσης μελετήθηκε ως προς το φορτίο ενθυλάκωσης και περιγράφηκε μαθηματικά μέσω του 2ου νόμου του Fick. Στις κυτταρικές κάψουλες που παρήχθησαν μελετήθηκε η απελευθέρωση ελαίου σε συνάρτηση με την ενεργότητα νερού σε τιμές ενεργότητας νερού 0.53-0.97 και η σύσταση του ενθυλακωμένου ελαίου με αέρια χρωματογραφία (GC-MS). Τέλος, δείγματα από κάθε κυτταρική προκατεργασία μελετήθηκαν με ηλεκτρονιακή μικροσκοπία σάρωσης ώστε να εκτιμηθεί η επίδραση της κάθε προκατεργασίας στις κυτταρικές δομές. Τόσο οι κυτταρικές προκατεργασίες που μελετήθηκαν όσο και η θερμοκρασία της ενθυλάκωσης βρέθηκε ότι επιδρούν σημαντικά στην κινητική της ενθυλάκωσης οδηγώντας σε αύξηση του φαινόμενου συντελεστή διάχυσης έως και κατά 260% σε σχέση με το ανεπεξέργαστο δείγμα. Το φορτίο ενθυλάκωσης δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις κυτταρικές προκατεργασίες ή τη θερμοκρασία ενθυλάκωσης, φθάνοντας σε τιμή 38%. Εξαίρεση αποτέλεσε η προεπεξεργασία με ΟΥΠ η οποία οδήγησε στην επίτευξη φορτίου ενθυλάκωσης μόλις 24.1%. Η απελευθέρωση του ελαίου από τα κύτταρα ως συνάρτηση της ενεργότητας νερού βρέθηκε ότι γίνεται σημαντική σε ενεργότητα νερού άνω του 0.7, οδηγώντας σε απελευθέρωση έως και 90% του ολικού ελαίου. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν την καταλληλότητα των μη θερμικών διεργασιών στην αξιοποίηση κυτταρικής βιομάζας S. cerevisiae. Πέραν από τη σημαντική επιτάχυνση της παραγωγής εκχυλίσματος μαγιάς, οι διεργασίες που μελετήθηκαν συμβάλλουν στην αύξηση της περιεκτικότητας του στερεού υπολείμματος της αυτόλυσης σε β-γλυκάνες. Παράλληλα, η αύξηση της κυτταρικής διαπερατότητας καθιστά τα κύτταρα κατάλληλους φορείς για την ενθυλάκωση βιοδραστικών συστατικών, παρέχοντας μία ακόμη δυνατότητα για την εκμετάλλευσή τους.