Μελέτη αλληλεπιδράσεων ακόρεστων λιπαρών οξέων με την αλβουμίνη ορού και την αντι-αποπτωτική πρωτεϊνη Bcl-2 με έμφαση στη χρήση μεθοδολογιών NMR κυτταρικού επιπέδου (in-cell NMR)
Authors: Αλεξανδρή Ελένη 
Published: October 2022

Τα λιπαρά οξέα αποτελούν τις κύριες δομικές μονάδες των σύνθετων λιπιδίων. Η μεταφορά τους στη συστηματική λειτουργία και η κατανομή τους στους ιστούς επιτυγχάνεται με τη μεταφέρουσα πρωτεΐνη αλβουμίνη (BSA/HSA). Με τη χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ και φασματοσκοπίας NMR έχει βρεθεί ότι υπάρχουν επτά θέσεις πρόσδεσης των λιπαρών οξέων στην αλβουμίνη. Η θέση πρόσδεσης 7 (FA7) συμπίπτει με τη θέση Ι των φαρμάκων (βαρφαρίνη), ενώ η θέση πρόσδεσης 3 (FA3) με τη θέση ΙΙ των φαρμάκων (ιβουπροφαίνη). Πρόσφατες μελέτες αντικαρκινικής δράσης των απαραίτητων ω-3 και ω-6 λιπαρών οξέων, απέδειξαν τη μείωση των επιπέδων έκφρασης της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. Το αποτέλεσμα αυτό σε συνδυασμό με τη δομική ομοιότητα των ακόρεστων λιπαρών οξέων με αναστολείς της Bcl-2 υποδεικνύει την προ-αποπτωτική δράση των λιπαρών οξέων ως πιθανό μηχανισμό. Όμως, τα δομικά χαρακτηριστικά αλληλεπίδρασης των λιπαρών οξέων με την Bcl-2 καθώς και ο μηχανισμός της αντικαρκινικής τους δράσης παραμένει άγνωστος. Βασικοί στόχοι της διδακτορικής διατριβής, με τη χρήση σύγχρονων μεθοδολογιών NMR, είναι η διερεύνηση: (α) της μοριακής βάσης αλληλεπίδρασης ακόρεστων FFA με μη επισημασμένη αλβουμίνη ορού, (β) της μη ομοιοπολικής έναντι της ομοιοπολικής πρόσδεσης νιτρο-παραγώγων του ελαϊκού οξέος με HSA, (γ) της μοριακής βάσης αλληλεπίδρασης πολυακόρεστων FFA με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και (δ) δομικών και διαμορφωτικών χαρακτηριστικών αλληλεπιδράσεων πολυακόρεστου λιπαρού οξέος DHA με τη Bcl-2, σε κυτταρικό επίπεδο σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Εφαρμόστηκε, για πρώτη φορά, η συνδυαστική χρήση τεχνικών NMR διαφοράς μεταφοράς κορεσμού (STD), μεταφερόμενου φαινομένου Overhauser (Tr-NOESY), διαμοριακών σημάτων ΝΟΕ για φαρμακοφόρο χαρτογράφηση (INPHARMA) και υπολογισμών docking με στόχο τη μελέτη αλληλεπιδράσεων των λιπαρών οξέων καπρολεϊκού οξέος, ελαϊκού οξέος, λινελαϊκού οξέος, α-λινολενικού οξέος, EPA και DHA με μη επισημασμένη αλβουμίνη ορού. Με τη χρήση ανταγωνιστικών πειραμάτων με τα φάρμακα βαρφαρίνη και ιβουπροφαίνη παρατηρήθηκαν σημαντικά διαμοριακά ΝΟΕ μεταξύ των λιπαρών οξέων και των φαρμάκων, που αντανακλούν τις διαμορφωτικές καταστάσεις των λιπαρών οξέων στις θέσεις πρόσδεσης των φαρμάκων στην HSA. Τα διαμοριακά σήματα ΝΟΕ και οι υπολογισμοί docking ερμηνεύτηκαν σε όρους σημαντικής αναδίπλωσης της δις-αλλυλικής περιοχής και παρουσίας δύο προσανατολισμών των λιπαρών οξέων στη θέση πρόσδεσης της βαρφαρίνης, λόγω ύπαρξης δύο ομάδων πολικών αμινοξέων που έχουν το ρόλο μοριακής άγκυρας. Αυτή η διαμορφωτική ευελιξία των λιπαρών οξέων στη θέση πρόσδεσης της βαρφαρίνης είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο δεν κατέστη δυνατός ο ακριβής προσδιορισμός με ακτίνες-Χ, παρά τις πολυάριθμες βιβλιογραφικές δομικές μελέτες. NMR μελέτες της αλληλεπίδρασης του 9/10-νιτρο-ελαϊκού οξέος (9/10-ΝΟ2-ΟΑ) με την αλβουμίνη ερμηνεύτηκαν σε όρους μη ομοιοπολικής πρόσδεσης του 9/10-ΝΟ2-ΟΑ στην HSA. Με τη χρήση ανταγωνιστικών πειραμάτων του ελαϊκού οξέος και των φαρμάκων ιβουπροφαίνης και βαρφαρίνης διαπιστώθηκε ότι το 9/10-NO2-OA έχει υψηλότερη συγγένεια πρόσδεσης στην HSA σε σχέση με το ελαϊκό οξύ και τη βαρφαρίνη, ενώ με την ιβουπροφαίνη έχει παρόμοια συγγένεια πρόσδεσης. Με τη συνδυαστική χρήση των τεχνικών STD και tr-NOESY NMR διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση των λιπαρών οξέων με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε διάλυμα buffer. Ανταγωνιστικά πειράματα των FFA με τον αναστολέα ABT-263 ερμηνεύτηκαν σε όρους συνεργατικής αλληλεπίδρασης, με εξαίρεση το EPA που έδειξε ανταγωνιστική δράση. Η μεθοδολογία in-cell NMR χρησιμοποιήθηκε, για πρώτη φορά, στη μελέτη αλληλεπίδρασης του DHA με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα Jurkat Bcl-2 που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Αποδείχθηκε ότι το DHA εισέρχεται στα κύτταρα και αλληλεπιδρά σχεδόν αποκλειστικά με τη Bcl-2 και όχι με άλλους πρωτεϊνικούς υποδοχείς. Ανταγωνιστικό πείραμα του DHA με τον αναστολέα ABT-263 έδειξε ανταγωνιστική αλληλεπίδραση, σε αντίθεση με τη συνεργατική αλληλεπίδραση με Bcl-2 σε διάλυμα buffer.