Υπολογιστικές μελέτες δομής και λειτουργίας μεμβρανικών πρωτεϊνών και του ρόλου τους σε ασθένειες
Authors: Νάστου Αικατερίνη-Δέσποινα 
Published: September 2021

Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες είναι μία από τις πιο πολυπληθείς ομάδες κυτταρικών πρωτεϊνών και επιτελούν μια σειρά από πολύ σημαντικές λειτουργίες, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται η κυτταρική αναγνώριση, η λειτουργία τους ως μοριακών υποδοχέων, η παθητική ή ενεργητική μεταφορά ουσιών διαμέσου της μεμβράνης και η εξειδικευμένη ενζυμική δραστηριότητα. Όπως γίνεται εύκολα αντιληπτό, οποιαδήποτε πιθανή αλλοίωση των μεμβρανικών πρωτεϊνών μπορεί δυνητικά να οδηγήσει σε διαφόρων ειδών ασθένειες. Ως εκ τούτου, οι πρωτεΐνες αυτές είναι δυνατόν να αποτελέσουν και οι ίδιες στόχους φαρμάκων, με σκοπό την αναστολή ή την ενίσχυση της λειτουργίας τους, κατά περίπτωση. Γενικά, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες ταξινομούνται, ανάλογα με τον τρόπο αλληλεπίδρασής τους με τη μεμβράνη, σε τρεις μεγάλες ομάδες· α) τις περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με ασθενείς αλληλεπιδράσεις είτε με τα λιπίδια της μεμβράνης ή με πρωτεΐνες αυτής, β) τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες διαπερνούν με την πολυπεπτιδική τους αλυσίδα τη λιπιδική διπλοστιβάδα και γ) τις αγκυροβολημένες πρωτεΐνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν ομοιοπολικά με λιπίδια της μεμβράνης. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε:•ανάλυση δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών των μεμβρανικών πρωτεϊνών, η οποία επέτρεψε •τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων για την ταυτοποίηση μεμβρανικών πρωτεϊνών σε πρωτεώματα και •την κατασκευή μίας βάσης δεδομένων για τη συλλογή και καταγραφή πληροφοριών για ένα υποσύνολο των μεμβρανικών πρωτεϊνών.Επιπλέον, μελετήθηκαν •οι αλληλεπιδράσεις των μεμβρανικών πρωτεϊνών με άλλα βιομόρια, με στόχο την εξακρίβωση της συμμετοχής τους και του ρόλου τους σε ανθρώπινες ασθένειες.Οι περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες είναι η λιγότερο μελετημένη ομάδα μεμβρανικών πρωτεϊνών, δίχως αυτό το γεγονός να τις καθιστά μη σημαντικές. Οι πρωτεΐνες αυτές αλληλεπιδρούν με την επιφάνεια της μεμβράνης μη ομοιοπολικά και η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να γίνεται τόσο με τα λιπίδια της μεμβράνης (άμεση αλληλεπίδραση), όσο και με πρωτεΐνες της (έμμεση αλληλεπίδραση). Στην άμεση μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση με τη μεμβράνη μπορούν να συμμετέχουν ειδικές αυτοτελείς δομικές περιοχές που αλληλεπιδρούν με λιπίδια της μεμβράνης (Membrane Binding Domains – MBDs). Οι περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες βοηθούν στην αλληλεπίδραση με τον κυτταροσκελετό, παρέχοντας στήριξη σε διάφορες μεμβράνες του κυττάρου. Επίσης, παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην επικοινωνία μεταξύ του εσωτερικού και του εξωτερικού του κυττάρου και πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες εντοπίζονται σε χαρακτηριστικές μεμβρανικές δομές, οι οποίες είναι γνωστές ως λιπιδικές σχεδίες, όπου και εμπλέκονται ενεργά στη κυτταρική σηματοδότηση.Στη παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκε η μέθοδος MBPpred, η οποία έχει τη δυνατότητα να εντοπίζει πρωτεΐνες οι οποίες αλληλεπιδρούν άμεσα με τη μεμβράνη και να τις διαχωρίζει με βάση τον τρόπο αλληλεπίδρασης τους σε περιφερειακές ή διαμεμβρανικές. Μία διαδικτυακή έκδοση της μεθόδου βρίσκεται διαθέσιμη στην ιστοσελίδα http://bioinformatics.biol.uoa.gr/MBPpred/. Για την κατασκευή της μεθόδου MBPpred αρχικά έγινε εκτεταμένη έρευνα στη βιβλιογραφία για την εύρεση αυτοτελών δομικών και λειτουργικών περιοχών που αρκούν για να διαχωριστούν οι μεμβρανικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με λιπίδια της μεμβράνης από άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών. Από αυτή την έρευνα προέκυψε ότι υπάρχουν 18 αυτοτελείς δομικές περιοχές, οι οποίες σχετίζονται με τη μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση πρωτεϊνών με συγκεκριμένα λιπίδια της μεμβράνης σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Για τις συγκεκριμένες αυτοτελείς δομικές περιοχές έγινε αναζήτηση στη βάση δεδομένων πρωτεϊνικών οικογενειών Pfam και απομονώθηκε τουλάχιστον ένα pHMM για κάθε μία από αυτές. Τα pHMMs που απομονώθηκαν χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί μία βιβλιοθήκη η οποία περιέχει 40 προφίλ. Εν συνεχεία, έγινε χρήση του πακέτου λογισμικού HMMER, για τον εντοπισμό πρωτεϊνών οι οποίες περιέχουν κάποια από αυτές τις αυτοτελείς δομικές περιοχές στην ακολουθία τους. Τέλος, για πρωτεΐνες που φέρουν τις συγκεκριμένες αυτοτελείς περιοχές έγινε διαχωρισμός με χρήση του αλγορίθμου PredClass, ανάλογα με τον τρόπο με τον οποίο αλληλεπιδρούν με τη μεμβράνη σε περιφερειακές ή διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Η συγκεκριμένη μέθοδος εφαρμόστηκε σε 407 καλά σχολιασμένα ευκαρυωτικά πρωτεώματα, τα οποία απομονώθηκαν από τη UniProt και παρατηρήθηκε η κατανομή των πρωτεϊνών αυτών στα διάφορα βασίλεια των ευκαρυωτικών οργανισμών. Επίσης, πραγματοποιήθηκε, μέσω της εφαρμογής της μεθόδου, αναζήτηση ομολόγων των ευκαρυωτικών πρωτεϊνών, σε 2760 προκαρυωτικά πρωτεώματα (Βακτηρίων και Αρχαίων). Στη συνέχεια, σε μία προσπάθεια να συλλεχθεί το σύνολο της πληροφορίας που αφορά στις περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες ευκαρυωτικών οργανισμών, σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε η βάση δεδομένων PerMemDB. Επί του παρόντος, η PerMemDB αποτελεί το πιο ολοκληρωμένο αποθετήριο δεδομένων για περιφερειακές μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες είτε βρίσκονται κατατεθειμένες στη βάση δεδομένων πρωτεϊνικών ακολουθιών UniProt ή έχουν ταυτοποιηθεί με τη μέθοδο MBPpred. Η πρώτη έκδοση της βάσης δεδομένων περιέχει 231770 εγγραφές περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών από 1009 ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Όλες οι εγγραφές της βάσης έχουν υπερσυνδέσμους προς άλλες βάσεις δεδομένων, βιβλιογραφικές αναφορές και πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλες πρωτεΐνες. Επιπλέον, παρέχεται περαιτέρω σχολιασμός της πρωτεϊνικής ακολουθίας σε ότι αφορά τις χαρακτηριστικές αυτοτελείς δομικές και λειτουργικές περιοχές των περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών. Μέσω της διαδικτυακής διεπαφής της βάσης, οι χρήστες μπορούν να πλοηγηθούν στα περιεχόμενά της, να υποβάλουν αναζητήσεις και να εκτελέσουν επερωτήσεις για την εύρεση ομόλογων ακολουθιών μέσω του εργαλείου BLAST. Η βάση δεδομένων είναι δημόσια διαθέσιμη μέσω του συνδέσμου http://bioinformatics.biol.uoa.gr/db=permemdb Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες είναι η περισσότερο μελετημένη κατηγορία μεμβρανικών πρωτεϊνών και έχει βρεθεί ότι αποτελούν περίπου το 20-30% των πρωτεϊνών των γνωστών πρωτεωμάτων. Οι πρωτεΐνες αυτές επιτελούν πολύ σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η μεταφορά ουσιών και η μεταγωγή σήματος, ενώ ταυτόχρονα συμμετέχουν στη ρύθμιση της λιπιδικής σύστασης των μεμβρανών και τη συγκρότηση και διατήρηση του σχήματος των μεμβρανών και του κυττάρου. Τα κανάλια ιόντων είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν πόρους που επιτρέπουν τη διέλευση ιόντων και συνεπώς τη μετακίνηση τους εντός και εκτός του κυττάρου. Οι πρωτεΐνες αυτές ελέγχουν τις ηλεκτρικές ιδιότητες των μεμβρανών διεγέρσιμων κυττάρων και είναι εξαιρετικά σημαντικές για πολλές λειτουργίες, όπως η αναπαραγωγή και η μετάδοση ηλεκτρικών σημάτων στα μυϊκά και νευρικά κύτταρα και η έκκριση ορμονών. Στη παρούσα διατριβή επικεντρωθήκαμε στις δύο σημαντικότερες οικογένειες καναλιών ιόντων, τα τασεοελεγχόμενα κανάλια ιόντων και τα κανάλια ιόντων που ελέγχονται από προσδέτες. Τα τασεοελεγχόμενα κανάλια ιόντων είναι μία από τις μεγαλύτερες ομάδες διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Λόγω του κεντρικού ρόλου τους στην παραγωγή και τη μετάδοση ηλεκτρικών σημάτων, πιθανή αλλοίωση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών έχει ως συνέπεια την πρόκληση σημαντικών ασθενειών, οι οποίες είναι γνωστές ως καναλοπάθειες. Στην παρούσα μελέτη ταυτοποιήθηκαν απλοί και παθογόνοι πολυμορφισμοί των ανθρώπινων τασεοελεγχόμενων καναλιών ιόντων από τις βάσεις δεδομένων UniProt και ClinVar και αποτυπώθηκαν στις αμινοξικές ακολουθίες των πρωτεϊνών αυτών, λαμβάνοντας υπόψη τα ιδιαίτερα δομικά και λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Ακολούθησε στατιστική ανάλυση η οποία έδειξε ότι οι παρερμηνεύσιμοι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί με τη μεγαλύτερη σημαντικότητα εντοπίζονται στον αισθητήρα τάσης και στον βρόχο του πόρου, δύο περιοχές με εξαιρετική σημασία για την ενεργοποίηση και τη ροή ιόντων διαμέσου των συγκεκριμένων καναλιών. Επιπρόσθετα, μεταξύ των πιο συχνά παρατηρούμενων μεταλλαγών ανήκουν αυτές από αργινίνη σε γλουταμίνη, ιστιδίνη ή κυστεΐνη, υπερτονίζοντας τον εξαιρετικά σημαντικό ρόλο των καταλοίπων αργινίνης στη ρύθμιση του δυναμικού της μεμβράνης, που επιτελείται από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι ο συνδυασμός των ιδιαίτερων τοπολογικών χαρακτηριστικών των τασεοελεγχόμενων καναλιών ιόντων με τα δεδομένα των γενετικών αλλαγών μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην εκτίμηση της κλινικής ταυτότητας των μέχρι σήμερα αταξινόμητων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Επιπλέον, μπορεί δυνητικά να επιτρέψει τη συσχέτιση με συγκεκριμένους φαινοτύπους καναλοπαθειών.Τα κανάλια ιόντων που ελέγχονται από προσδέτες είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που περιέχουν έναν πόρο που επιτρέπει τη ρυθμιζόμενη από τη διαφορά δυναμικού παθητική ροή επιλεγμένων ιόντων, μέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Η δέσμευση ενός προσδέτη, σε μία ή περισσότερες ορθοστερικές θέσεις, οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιάταξής τους και ως εκ τούτου στο άνοιγμα τους. Παρότι μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί αρκετές μέθοδοι οι οποίες επιτρέπουν την ταυτοποίηση και την πρόγνωση τασεοελεγχόμενων καναλιών ιόντων, δεν ισχύει το ίδιο για τα κανάλια ιόντων που ελέγχονται από προσδέτες, όπου παρά τη σημαντικότητα τους καμία μέθοδος που να αφορά στην κατηγοριοποίηση τους στις διάφορες υπο-οικογένειες δεν είναι δημόσια διαθέσιμη. Για τον λόγο αυτό αναπτύχθηκε η προγνωστική μέθοδος LiGioNs, η οποία επιτρέπει τον εντοπισμό καναλιών ιόντων που ελέγχονται από προσδέτες και την κατηγοριοποίησή τους σε υπο-οικογένειες. Η μέθοδος βρίσκει εφαρμογή σε ολόκληρα πρωτεώματα και αποτελείται από δύο διακριτά τμήματα, το τμήμα της πρόγνωσης και το τμήμα του σχολιασμού. Για το προγνωστικό τμήμα κατασκευάστηκε μία βιβλιοθήκη με 35 pHMMs από στοιχίσεις των διαμεμβρανικών τμημάτων των καναλιών ιόντων που ελέγχονται από προσδέτες, τα οποία ανήκουν στις 10 γνωστές υπο-οικογένειες αυτών των πρωτεϊνών. Για το τμήμα σχολιασμού δημιουργήθηκε μία βιβλιοθήκη με 14 pHMMs τα οποία εντοπίζονται στα κανάλια αυτά και έχουν καταγραφεί στη βάση δεδομένων Pfam. Η μέθοδος LiGioNs εφαρμόστηκε σε 30 πρωτεώματα αναφοράς και είναι δημόσια διαθέσιμη μέσω της διαδικτυακής διεπαφής http://bioinformatics.biol.uoa.gr/ligions. Ένας άλλος εξαιρετικά σημαντικός στόχος που προέκυψε στην πορεία της διατριβής, έπειτα από την εις βάθος ενασχόληση και τη μελέτη της σχέσης των περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών με ασθένειες, ήταν η μελέτη της άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης των μεμβρανικών πρωτεϊνών με μία ιδιαίτερη ομάδα πρωτεϊνών, τις αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες αυτές, κάτω από μη φυσιολογικές συνθήκες, αδυνατούν να αποκτήσουν ή να διατηρήσουν τη φυσιολογική τους στερεοδιάταξη και οδηγούνται σε ένα εναλλακτικό, μη κανονικό δίπλωμα της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας στο χώρο. Αυτά τα «λάθος» διπλωμένα πρωτεϊνικά μόρια αυτοσυγκροτούνται σε οργανωμένα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, που ονομάζονται αμυλοειδή ινίδια. Στον άνθρωπο, τα αμυλοειδή ινίδια μπορούν να προσβάλουν διάφορα όργανα ή ιστούς και να οδηγήσουν σε στερεοδιαταξικές ασθένειες, γνωστές ως αμυλοειδώσεις, πιθανόν λόγω της τοξικότητας που προκαλούν στην περιοχή συσσώρευσής τους. Πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα υποδεικνύουν την εμπλοκή συνήθως δύο ή και περισσότερων πρωτεϊνών, στην εξέλιξη τέτοιων παθολογικών καταστάσεων.Σε μία προσπάθεια μελέτης της αλληλεπίδρασης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών με μεμβρανικές πρωτεΐνες κατασκευάστηκε το δίκτυο των πρώτων (Amyloid Interactome). Το Amyloid Interactome κατάφερε να συσχετίσει το σύνολο των φαινομενικά ασυσχέτιστων αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, μέσω της αποκάλυψης σημαντικών διασυνδέσεων τόσο μεταξύ των ίδιων των αμυλοειδογόνων, όσο και άλλων πρωτεϊνών του δικτύου και κατόρθωσε να αναδείξει σημαντικές πρωτεΐνες με καίριο ρόλο στο σύνολο των αμυλοειδώσεων. Ειδικότερα, η κατηγοριοποίηση των στοιχείων του δικτύου με βάση την υποκυτταρική τους θέση κατέδειξε τη σημαντικότητα των μεμβρανικών πρωτεϊνών, και ιδιαίτερα όσων εντοπίζονται σε λιπιδικές σχεδίες, τόσο στην επαγωγή όσο και στον έλεγχο της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από την εναπόθεση αμυλοειδών ινιδίων, ιδιαίτερα στη νόσο του Alzheimer. Στη προσπάθεια μας να μελετήσουμε σε βάθος όλες τις ασθένειες που σχετίζονται με την εναπόθεση αμυλοειδών ινιδίων, προβήκαμε σε εκτεταμένο βιβλιογραφικό έλεγχο, ο οποίος οδήγησε στην κατασκευή μίας βάσης δεδομένων, η οποία συγκεντρώνει και κατηγοριοποιεί την ετερογενή ομάδα των ασθενειών που σχετίζονται με την εναπόθεση αμυλοειδών ινιδίων και περιέχει πληροφορίες για το σύνολο των πρωτεϊνών που εντοπίζονται σε αμυλοειδείς εναποθέσεις. Η βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε ονομάζεται AmyCo, είναι δημόσια διαθέσιμη και περιέχει πληροφορία για 75 ασθένειες και 83 πρωτεΐνες (http://bioinformatics.biol.uoa.gr/amyco/). Σε δεύτερο στάδιο πραγματοποιήθηκε μελέτη δικτύων ασθενειών για τις σπάνιες αμυλοειδώσεις που καταγράφηκαν στην AmyCo, χρησιμοποιώντας δεδομένα για πρωτεΐνες που προέκυψαν τόσο από τη βιβλιογραφική μας μελέτη, όσο και από την εξόρυξη κειμένου. Όπως και στη περίπτωση του Amyloid Interactome, έτσι και στα δίκτυα που δημιουργήθηκαν για το σύνολο των διαφορετικών αμυλοειδώσεων κατεδείχθησαν πιθανές ομοιότητες στον υποκείμενο μηχανισμό της αμυλοειδογένεσης, μεταξύ των διαφόρων ασθενειών. Επιπρόσθετα, τονίστηκε για ακόμη μία φορά η σημαντικότητα του ρόλου των λιπιδικών σχεδιών, της κυτταρικής μεμβράνης και των μεμβρανικών πρωτεϊνών, τόσο στην πρόληψη όσο και στην αναστολή της δημιουργίας αμυλοειδών ινιδίων και αναδείχθηκε πληθώρα σημαντικών πρωτεϊνικών στόχων με πιθανές προεκτάσεις στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών τακτικών για το σύνολο των αμυλοειδώσεων. Συνολικά, η συγκεκριμένη υπολογιστική προσέγγιση θέτει πλήθος ερωτημάτων που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για το μελλοντικό σχεδιασμό στοχευμένων πειραματικών προσεγγίσεων κατά τη μελέτη της αμυλοειδογόνικότητας.