Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια χορήγησης της ριφαμπικίνης στην αντιμετώπιση της πειραματικής μόλυνσης του σκύλου με την Ehrlichia Canis
Authors: Θεοδώρου Κωνσταντίνα 
Published: August 2021

Οι τετρακυκλίνες αποτελούν για δεκαετίες τα φάρμακα εκλογής για τη μονοκυτταρική ερλιχίωση του σκύλου (Ehrlichiacanis, ΜΕΣ). Ωστόσο, μόνο η δοξυκυκλίνη έχει μελετηθεί συστηματικά τόσο invitro, όσο και με κλινικές και πειραματικές μελέτες, τα αποτελέσματα των οποίων υποδηλώνουν πως η δοξυκυκλίνη είναι αποτελεσματική ως προς την επίτευξη κλινικής και αιματολογικής ίασης, ενώ αντίθετα, συχνά αποτυγχάνει να εκκριζώσει τη μόλυνση από τηνE.canis. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη σχετικά συχνήεμφάνιση παρενεργειών κατά τη χρήση της, καθιστούν σκόπιμη την αναζήτηση καιαξιολόγηση εναλλακτικών φαρμακευτικών επιλογών.Στο παρελθόν, τα αποτελέσματα της αξιολόγησης άλλων φαρμακευτικών ουσιών όπως η διπροπιονική ιμιδοκάρβη, οι φθοριοκινολόνες και η αζιθρομυκίνη, δεν υπήρξαν ενθαρρυντικά. Πρόσφατες invitroαλλά και κλινικές μελέτες σε περιορισμένο αριθμό σκύλων έδειξαν πως η ριφαμπικίνη,ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ριφαμυκίνης Β,μπορεί ενδεχομένως να αποτελέσει εναλλακτική φαρμακευτική αγωγή της δοξυκυκλίνης στη θεραπεία της ΜΕΣ, τόσο στο σκύλο, όσο και στον άνθρωπο. Οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν 1) η διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της ριφαμπικίνης στην επίτευξη κλινικής και αιματολογικής βελτίωσης και στην εκρίζωση της οξείας μόλυνσης από την E. canis, 2) η διερεύνηση των πιθανών κλινικών παρενεργειών και των αιματολογικών και βιοχημικών διαταραχών που σχετίζονται με τη χορήγηση της ριφαμπικίνης και 3)η σύγκριση της διαγνωστικής ευαισθησίας της PCRσε τρείς διαφορετικούς ιστούς (αίμα, μυελός των οστών και σπλήνας) στην ανίχνευση του DNA της E. canis στην οξεία ΜΕΣ.Στη μελέτη περιλήφθηκαν 16 σκύλοι φυλής Beagle, 7 αρσενικοί και 9 θηλυκοί, ηλικίας από 5-70 μηνών (διάμεση τιμή: 11 μήνες), οι οποίοι χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: Πέντε σκύλοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canisκαι ακολούθως έλαβαν θεραπεία με ριφαμπικίνη (ομάδα Α), 9 σκύλοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canisαλλά δεν έλαβαν θεραπεία (ομάδα Β, μολυσμένοι μάρτυρες), ενώ δύο σκύλοι δεν ενοφθαλμίστηκαν (ομάδα Γ, αρνητικοί μάρτυρες). Για τον ενοφθαλμισμό των σκύλων χρησιμοποιήθηκε το Ισραηλινό στέλεχος "611" της E. canis, το οποίο καλλιεργήθηκε και διατηρήθηκε σε κυτταροκαλλιέργεια DH82, με το οποίο μολύνθηκε ένα υγιές Beagle, το αίμα του οποίουχρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τη μόλυνση των υπόλοιπων 13 σκύλων. Η θεραπεία των σκύλων της ομάδας Α περιελάμβανε τη χορήγηση ριφαμπικίνης στη δόση των 10mg/kg, από το στόμα, κάθε 24 ώρες, για 21 ημέρες. Η έναρξη της θεραπευτικής αγωγής έγινε την 21ηημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ), όταν όλα τα μολυσμένα ζώα πληρούσαν τα κριτήρια της οξείας ΜΕΣ και ολοκληρώθηκε την 42ηΗΜΕ. Επιπλέον, 15 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας με τη ριφαμπικίνη, στα ζώα της ομάδας Α χορηγήθηκε νατριούχος δεξαμεθαζόνη σε δόση 0.5mg/kg, άπαξ, ως εναυσματικός παράγοντας για την πρόκληση υποτροπής πιθανής λανθάνουσας μόλυνσης από την E. canis. Κατά τη διάρκεια της μελέτηςκαι μέχρι την ολοκλήρωσή της (98η ΗΜΕ), τόσο για την επιβεβαίωση της μόλυνσης από την E. canis, όσο και για την μεταθεραπευτική παρακολούθηση, πραγματοποιούνταν τακτική κλινική εξέταση και βαθμονόμηση της κλινικής βαρύτητας της νόσου, γενική εξέταση αίματος, βιοχημικός έλεγχος στον ορό του αίματος, ο οποίος περιελάμβανε τον προσδιορισμό των ολικών πρωτεϊνών, των λευκωματινών, του ουρεϊκούαζώτου, της κρεατινίνης, της ολικής χολερυθρίνης, της αλανινοαμινοτρανφεράσης (ALT), της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), της γλυκόζης, του ολικού ασβεστίου, του φωσφόρου καθώς και μέτρηση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων σε ζεύγη ορών, γενική ανάλυση ούρων, προσδιορισμός των ειδικών έναντι της E. canisIgG αντισωμάτων με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) καιανίχνευση του 16SrDNA της E. canisσε δείγματα ολικού αίματος, μυελού των οστών και σπλήνα με δύο διαφορετικές τεχνικές PCR (nestedPCR και real-timePCR).Μετά την πειραματική μόλυνση και μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοιοι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν συμπτώματα συμβατά με τη ΜΕΣ, ενώ σε όλη τη διάρκεια της μελέτης δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες Α και Β, ως προς την κλινική βαθμολόγησή τους. Μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν θρομβοκυτταροπενία. Ο αριθμός των αιμοπεταλίων των σκύλων της ομάδας Α ήταν σημαντικά υψηλότερος αυτού της ομάδας Β κατά την 42η ΗΜΕ (ημέρα ολοκλήρωσης της θεραπευτικής αγωγής της ομάδας Α) (Wilcoxon-Mann-Whitney, p=0,0233)και την 98η ΗΜΕ (ημέρα ολοκλήρωσης της μελέτης) (Wilcoxon-Mann-Whitney, p=0,0195), ενώ η θρομβοκυτταροπενία αποκαταστάθηκε σημαντικά νωρίτερα στους σκύλους της ομάδας Α σε σχέση με αυτούς της ομάδας Β, κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης (καμπύλη Kaplan-Meier, p=0,048).Μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν θετικό τίτλο IgG αντισωμάτων έναντι της E. canis και παρέμειναν οροθετικοί ως την ολοκλήρωση της μελέτης, χωρίς να διαπιστωθεί σημαντική διαφορά ως προς τα επίπεδα του τίτλου ανάμεσα στις δύο ομάδες σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Μέχρι την 21η ΗΜΕ (έναρξη της θεραπείας με ριφαμπικίνη), όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι ήταν θετικοί στην PCR (τουλάχιστον σε έναν από τους εξεταζόμενους ιστούς και με τουλάχιστον μία από τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους PCR). Κατά την ολοκλήρωση της μελέτης, 3/5 και 6/9 σκύλοι των ομάδων Α και Β, αντίστοιχα, εξακολουθούσαν να είναι θετικοί στην PCR σε έναν από τους ιστούς που εξετάστηκαν.Η διαγνωστική ευαισθησία διέφερε σημαντικά μεταξύ των ιστών που εξετάστηκαν (Cochran’sQtest,p=0,0014),με τον μυελό των οστών να εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με την αντίστοιχη του ολικού αίματος(p=0,0035)ή του σπλήνα(p=0,0067). Σε επίπεδο εξεταζόμενου ιστού (ολικό αίμα, μυελός των οστών, σπλήνας), οι δύο μέθοδοι PCR εμφάνιζαν σημαντική συμφωνία σε ότι αφορά στο μυελό των οστών (Kappa=0,7004, p<0,0001), μέτριου βαθμού συμφωνία ως προς τα δείγματα σπληνικού ιστού(Kappa=0,4214, p=0,0006) και μικρή συμφωνία ως προς το ολικό αίμα(Kappa=0,2029, p=0,0191), ενώ σε επίπεδο σκύλου (ανεξάρτητα από τον εξεταζόμενο ιστό), διαπιστώθηκε μέτριο επίπεδο συμφωνίας μεταξύ τους (Kappa=0,4898, p<0,0001).Κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στους σκύλους της ομάδας Α,η μοναδική κλινική διαταραχή που παρατηρήθηκεαφορούσε στην αλλαγή της χροιάς των ούρων, τα οποία ήταν πορτοκαλόχρωμα από την 1η ημέρα ως και ένα 24ωρο μετά τη διακοπή χορήγησης του αντιμικροβιακού. Η φαρμακευτική αγωγή δεν επηρέασε τη νεφρική λειτουργία, ενώ αντίθετα κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης οι σκύλοι της ομάδας Α παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα της ALP,καθώς και αυξημένη συγκέντρωση των χολικών οξέων, χωρίς ωστόσο να επηρεαστεί η συγκέντρωση της ολικής χολερυθρίνης.Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, 1) η ριφαμπικίνη, στο δοσολογικό σχήμα και στη διάρκεια που χορηγήθηκε, επιτάχυνε σημαντικά την αιματολογική ίαση (θρομβοκυτταροπενία), αλλά απέτυχε να εκριζώσει τη μόλυνση στους περισσότερους από τους σκύλους στους οποίους χορηγήθηκε, 2) Η ριφαμπικίνη, στο δοσολογικό σχήμα και στη διάρκεια που χορηγήθηκε στην παρούσα μελέτη, δεν οδήγησε σε αξιοσημείωτες κλινικές παρενέργειες ή σε αιματολογικές διαταραχές.Ωστόσο, οδήγησε στη σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων και της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης στον ορό του αίματος και 3) Η μοριακή εξέταση του υλικού από το μυελό των οστών φαίνεται να έχει σημαντικά μεγαλύτερη διαγνωστική ευαισθησία έναντι του αίματος και του υλικού από το σπλήνα για την εκτίμηση της εκρίζωσης της μόλυνσης από την E. canis στην οξεία ΜΕΣ. Για τη βελτιστοποίηση της αξιοπιστίας της μεταθεραπευτικής εκκρίζωσης της μόλυνσης, συνιστάται η μοριακή εξέταση συνδυασμού ιστών (μυελός των οστών, αίμα, σπλήνας) τουλάχιστον 1-2 μήνες μετά το πέρας της θεραπείας, ώστε να μειωθεί η πιθανότητα των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων.