Μεταβολομική ανάλυση τυροκομικών προϊόντων με την φασματοσκοπία NMR
Authors: Ράλλη Ευαγγελία 
Published: November 2021

H παρούσα διατριβή αφορά τη μελέτη της γραβιέρας Κρήτης ΠΟΠ και κρητικών λευκών όξινων τυριών ΠΟΠ με τη χρήση της Φασματοσκοπίας NMR χαμηλού και υψηλού πεδίου και την μεταβολομική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων με κατάλληλα πολυπαραμετρικά στατιστικά μοντέλα Η διατριβή χωρίζεται σε τρία κύρια μέρη, το πρώτο αφορά τη μελέτη της διαδικασίας ωρίμανσης της γραβιέρας Κρήτης, το δεύτερο τη μελέτη της επίδρασης του γάλακτος τυροκόμησης στα ποιοτικά χαρακτηριστικά της γραβιέρας Κρήτης, και το τρίτο την ανάλυση τεσσάρων διαφορετικών τύπων λευκών όξινων τυριών με ΠΟΠ (πλην ενός) που παράγονται στην Κρήτη. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν τρία (3) δείγματα κρητικής γραβιέρας που παράχθηκαν σε τυροκομεία της ευρύτερης περιοχής της Κρήτης και κατά τη διάρκεια της ωρίμανσής τους έγιναν τακτικές δειγματοληψίες για ανάλυση. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας NMR υψηλής ανάλυσης λήφθηκαν τα φάσματα των υδατικών και άπολων εκχυλισμάτων των δειγμάτων γραβιέρας, και με την ποσοτική ολοκλήρωση των φασμάτων NMR προσδιορίστηκε η χημική σύσταση και οι μεταβολές στη συγκέντρωση των ενώσεων (μεταβολιτών) της γραβιέρας με την αύξηση του χρόνου ωρίμανσης. Με βάση αυτά τα ποσοτικά αναλυτικά δεδομένα υπολογίστηκαν οι ρυθμοί πρωτεόλυσης (παραγωγή μmol αμινοξέων/ημέρα) και λιπόλυσης (αύξηση λόγου 1,2-διγλυκεριδία/τριγλυκερίδια), καθώς και ο ρυθμός παραγωγής της τυραμίνης (παραγωγή μmol τυραμίνης/ημέρα) για κάθε δείγμα. Χρησιμοποιώντας τα ποσοτικά δεδομένα που προέκυψαν από τα φάσματα 1H NMR, αναπτύχθηκαν πολυπαραμετρικά στατιστικά μοντέλα PLS (Partial Least Squares) και προσδιορίστηκαν οι πιο σημαντικοί μεταβολίτες που συσχετίζονται με την εξέλιξη της διαδικασίας ωρίμανσης, καθώς και οι διαφορές και οι ομοιότητες στη διαδικασία ωρίμανσης για κάθε γραβιέρα ανάλογα με το τυροκομείο προέλευσης. Τα αποτελέσματα των μεταβολομικών μοντέλων PLS για την ωρίμανση της γραβιέρας Κρήτης εφαρμόστηκαν στην ανάλυση της σύστασης ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων γραβιέρας του εμπορίου σε μια προσπάθεια να εκτιμηθεί η δυνατότητα της μεταβολομικής ανάλυσης NMR στον χαρακτηρισμό του χρόνου ωρίμανσης αγνώστων δειγμάτων. Ένα από τα δείγματα γραβιέρας Κρήτης, που προερχόταν από το τυροκομείο Καργάκη, χρησιμοποιήθηκε για την πραγματοποίηση πειραμάτων μελέτης της διαδικασίας ωρίμανσης με τεχνικές ανάλυσης NMR χαμηλού πεδίου, στα πλαίσια των οποίων προσδιορίστηκαν οι χρόνοι αποδιέγερσης T1 και T2 και οι συντελεστές διάχυσης των πρωτονίων του νερού και των λιπαρών της γραβιέρας συναρτήσει του χρόνου ωρίμανσης, καθώς και ο ρυθμός αποδιέγερσης των πρωτονίων συναρτήσει της συχνότητας του μαγνητικού πεδίου με τη μέθοδο Fast field cycling (FFC). Βρέθηκε ότι οι χρόνοι Τ1 των πρωτονίων του νερού και των λιπαρών της γραβιέρας έχουν παρόμοιες τιμές με άλλα κίτρινα σκληρά τυριά που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Οι χρόνοι αποδιέγερσης T2w και Τ2f και οι συντελεστές διάχυσης Dw και Df της γραβιέρας επίσης βρέθηκαν να έχουν τιμές αντίστοιχες με άλλα γνωστά ημίσκληρα κίτρινα τυριά διαφορετικής προέλευσης. Βρέθηκε τέλος ότι ο συντελεστής διάχυσης των λιπαρών Df της γραβιέρας αυξάνεται ελαφρά κατά την ωρίμανση, ενώ αυτός του νερού, Dw μειώνεται. Από τα μοντέλα PLS που αναπτύχθηκαν για την ωρίμανση της γραβιέρας βρέθηκε ότι αυτό με τα καλύτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά τη στατιστική σημαντικότητα (παράμετρος p) ήταν αυτό που περιείχε το σύνολο των πειραματικών δεδομένων από μετρήσεις NMR τόσο σε χαμηλό όσο και σε υψηλό πεδίο. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής παρήχθησαν πέντε (5) διαφορετικά δείγματα πρόβειου τυρού στο εργαστήριο ακολουθώντας τη διαδικασία τυροκόμησης της γραβιέρας για να μελετηθεί η επίδραση της ποιότητας του γάλακτος (γάλα πρόβειο - γάλα σκόνη) στη σύσταση και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της γραβιέρας. Το γάλα που χρησιμοποιήθηκε ήταν είτε 100% πρόβειο ή μείγμα αυτού με σκόνη πρόβειου γάλακτος με αυξανόμενο ποσοστό γάλακτος σκόνης (25-100 %). Μετά τη διαδικασία της πρότυπης τυροκόμησης τα δείγματα παρέμειναν προς ωρίμανση για 90 ημέρες, κατά τη διάρκεια των οποίων πραγματοποιήθηκαν τακτικές δειγματοληψίες τις ημέρες 1, 13, 27, 60, 90. Από την ανάλυση των φασμάτων ΝΜR της σειράς αυτής δειγμάτων ταυτοποιήθηκε η παρουσία 1-μονογλυκεριδίων (1-MG) σε όλα τα δείγματα που τυροκομήθηκαν με τη χρήση σκόνης γάλακτος. Η ποσότητα των 1-MG αυξάνονταν με το ποσοστό γάλακτος-σκόνης που είχε χρησιμοποιηθεί, και με το χρόνο ωρίμανσης των δειγμάτων γραβιέρας. Η ανάλυση NMR του πρόβειου γάλακτος σε σκόνη έδειξε ότι τα 1-MG προϋπήρχαν σε αυτό και μεταφέρθηκαν στη γραβιέρα κατά τη διαδικασία της τυροκόμησης. H ρετροανάλυση δειγμάτων γραβιέρας του εμπορίου έδειξε την παρουσία 1-μονογλυκεριδίων σε μερικά εξ αυτών, υποδεικνύοντας είτε την πιθανή χρήση γάλακτος σκόνης κατά την τυροκόμηση, είτε τη χρήση κακών πρακτικών κατά το χειρισμό του γάλακτος.Στο τρίτο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν με Φασματοσκοπία NMR υψηλής ανάλυσης δείγματα κρητικών όξινων τυριών τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά, και συγκεκριμένα ξινομυζήθρα (ΠΟΠ και μη), ξύγαλο (ΠΟΠ και μη), ξινόγαλο και πηχτόγαλο (ΠΟΠ). Στο υδατικό εκχύλισμα των όξινων τυριών προσδιορίστηκαν ποσοτικά σάκχαρα, μικρά οργανικά οξέα, αμινοξέα, αλκοόλες, αζωτούχες και άλλες χημικές ενώσεις. Βρέθηκε ότι τα όξινα κρητικά τυριά διαφοροποιούνται κυρίως ως προς το πολικό μεταβολομικό προφίλ τους, ενώ μικρές διαφορές μόνο παρουσιάστηκαν στο λιπιδικό προφίλ. Με βάση τα ποσοτικά δεδομένα από την ολοκλήρωση φασμάτων 1H NMR αναπτύχθηκαν μεταβολομικά μοντέλα ανάλυσης για τον επιτυχή διαχωρισμό του τύπου και της διαδικασίας παραγωγής των λευκών όξινων τυριών με βάση τη χημική τους σύσταση. Όσον αφορά την ξυνομυζήθρα ΠΟΠ Κρήτης, δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τη γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων.