Δομική μελέτη βιολογικών μακρομορίων για τη δημιουργία φαρμακευτικών στόχων
Authors: Σπηλιοπούλου Μαρία 
Published: July 2023

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση βιοχημικών μεθόδων και τεχνικών ακτίνων Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος προς την κατεύθυνση του σχεδιασμού και της ανάπτυξης φαρμακευτικών στόχων. Τα μόρια που μελετήθηκαν παρουσιάζουν ένα εύρος μεγεθών, από πεπτίδια έως πρωτεΐνες. Αναφορικά με τα πεπτίδια, τα συνθετικά ανάλογα ορμονών και η εφαρμογή τους ως πιθανά φάρμακα μελετώνται εκτενώς λόγω της κλινικής τους χρήσης. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε το οκταπεπτίδιο οκτρεοτίδη (octreotide), που αποτελεί ένα πεπτιδικό ανάλογο της σωματοστατίνης. Παρόλο που το octreotide διατίθεται ήδη στο εμπόριο ως άμορφο εναιώρημα για υποδόρια ή ενδοφλέβια έγχυση, ένα προϊόν σε μικροκρυσταλλική μορφή που παρουσιάζει αυξημένη ενζυμική σταθερότητα και παρατεταμένο χρόνο δράσης θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Προς αυτή την κατεύθυνση, η διερεύνηση των κρυσταλλικών πολυμόρφων του πεπτιδίου από πλευράς ταυτοποίησης και δομικού χαρακτηρισμού είναι εξαιρετικά σημαντική. Τα επιτυχή πειράματα κρυστάλλωσής του ακολούθησε ο πλήρης δομικός του χαρακτηρισμός από δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-ray powder diffraction, XRPD), οδηγώντας σε ένα υψηλής ευκρίνειας (1.87 Å) δομικό μοντέλο (PDB ID: 6vc1), αποκαλύπτοντας τις δομικές ιδιότητες του μορίου το οποίο συμφωνεί στερεογεωμετρικά με τις δομές του octreotide που είχαν προσδιοριστεί σε προηγούμενες μελέτες, ενώ επισημαίνονται κάποιες διαφορές, λόγω της βελτιωμένης ευκρίνειας του χάρτη ηλεκτρονικής πυκνότητας. Επίσης, μελετήθηκε το φαρμακευτικό πεπτίδιο λιραγλουτίδη (liraglutide) που αποτελεί ανάλογο του παρόμοιου με τη γλυκαγόνη πεπτιδίου 1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), χημικά τροποποιημένο με την προσθήκη του παλμιτικού οξέος, το οποίο συνδέεται αντιστρεπτά με την αλβουμίνη του πλάσματος έχοντας παρατεταμένο χρόνο δράσης. Οι in silico μελέτες μοντελοποίησης και τα πειράματα ελέγχου της μεταβολής της θερμοφορητικής κίνησης και του διαφορικού φθορισμού επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση της αλβουμίνης με το liraglutide. Ωστόσο, η αδυναμία δημιουργίας κρυστάλλων για το σύμπλοκο αυτό, κατευθύνει τις επόμενες μελέτες στη διερεύνηση της διαδικασίας δημιουργίας του συμπλόκου και των συνθηκών κρυστάλλωσης. Σχετικά με τις πρωτεΐνες που εξετάζονται δομικά στη συγκεκριμένη εργασία, πραγματοποιήθηκε εκτενής μελέτη του πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης, παρουσία δύο οργανικών μορίων-προσδετών (4-chlororecorcinol, 4-bromorecorcinol) σε ένα εύρος τιμών pH. Η πρόσδεση των μορίων στην ινσουλίνη ταυτοποιήθηκε με πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού διαφορικής μεταφοράς κορεσμού (STD-NMR). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων XRPD, για την ανίχνευση των διαφορετικών πολυμόρφων, όσο και με πειράματα περίθλασης ακτίνων Χ από μονοκρυστάλλους (single crystal X-ray diffraction, SCXRD), για τον ακριβή προσδιορισμό των θέσεων και αλληλεπιδράσεων των προσδετών. Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, ένα εκ των οποίων δεν έχει καταγραφεί έως τώρα βιβλιογραφικά για την ανθρώπινη ινσουλίνη, αποδεικνύοντας το πιο πυκνά πακεταρισμένο πολύμορφο για την πρωτεΐνη συγκρυσταλλωμένη με τους δύο αυτούς προσδέτες, κάτι ιδιαίτερα σημαντικό προς την κατεύθυνση της δημιουργίας πολυκρυσταλλικών φαρμάκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν την αποτελεσματικότητα μιας νέας προσέγγισης που συνδυάζει τεχνικές φασματοσκοπίας και περίθλασης και παρέχει μια καινοτόμο εναλλακτική λύση για την υψηλής απόδοσης μελέτη της ινσουλίνης. Το επόμενο κεφάλαιο αφορά στη μελέτη πρωτεϊνικών μορίων με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια ιϊκών κύκλων ζωής, καθώς χαρακτηρίζονται ως κατάλληλοι στόχοι για την ανάπτυξη αντιϊκών φαρμάκων. Οι μελέτες εστίασαν σε δύο οικογένειες ιών, τους Arenaviridae και τους Picornaviridae. Στην πρώτη περίπτωση, περιγράφεται ο μηχανισμός δράσης και πολυμερισμού της νουκλεοπρωτεΐνης, με χρήση βιοπληροφορικών μέσων και δεδομένων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Επίσης, αναλύεται η παραγωγή, ο έλεγχος σταθερότητας και ενεργότητας και ο δομικός χαρακτηρισμός της περιοχής εξωνουκλεάσης της, απουσία και παρουσία της «βασικής θηλιάς», με απώτερο στόχο τη μελέτη της ποικιλίας των επεκτάσεων των δομικών μοτίβων που εμπλέκονται στον τρόπο πρόσδεσης μεταξύ μορίων νουκλεοπρωτεΐνης και την αξιολόγηση των κύριων λειτουργικών επιπτώσεων των αλληλεπιδράσεων, καθώς και του ρόλου της εξωνουκλεασικής περιοχής, καθιστώντας τη νουκλεοπρωτεΐνη στόχο επιλογής για μελλοντικά εμβόλια και αντιϊκές θεραπείες. Η δεύτερη περίπτωση ιϊκής πρωτεΐνης αφορά στην πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie. Συγκεκριμένα, περιγράφεται η πορεία των πειραμάτων έκφρασης, απομόνωσης και κρυστάλλωσης της εν λόγω πρωτεΐνης, ενώ πραγματοποιήθηκε μια εκτενής μελέτη διαλογής δομικών θραυσμάτων, στοχεύοντας στην ανίχνευση αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με μικρά μόρια. Η εύρεση μορίων που είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με την πρωτεΐνη με τρόπο που να επηρεάζεται η λειτουργία της είναι ένα από τα πρώτα βήματα στο σχεδιασμό ενώσεων που προορίζονται για τη θεραπεία της παθολογίας που προκαλεί ο ιός. Μέσω διαδικασιών βελτιστοποίησης, τα μόρια αυτά μπορούν να αποτελέσουν συστατικό υποψήφιων φαρμάκων για τη θεραπεία αυτής της νόσου. Οι δομικές πληροφορίες που εξάγονται για χημικά μόρια που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό ενώσεων που παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα δράσης έναντι μοριακών στόχων. Το τελευταίο κεφάλαιο σχετίζεται με την ανάπτυξη μεθοδολογιών για τη δομική βιοχημεία, εστιάζοντας στη δομική μελέτη της παγκρεατικής ελαστάσης του χοίρου. Πρόκειται για την αξιοποίηση των πλεονεκτημάτων που προσφέρει η μέθοδος Rietveld για τη βελτιστοποίηση της δομής, εκμεταλλευόμενοι την ανισοτροπική αλλαγή που προκαλούν στο κρυσταλλικό πλέγμα οι μεταβολές θερμοκρασίας. Πολυκρυσταλλικά δείγματα της ελαστάσης μετρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και κρυογονικές θερμοκρασίες και τα δεδομένα περίθλασης αξιοποιήθηκαν με απώτερο στόχο τον πλήρη δομικό χαρακτηρισμό του μορίου. Τα αποτελέσματα δείχνουν την επέκταση των ορίων της μεθόδου XRPD, για τη βελτιστοποίηση δομών μακρομορίων μεγάλου αριθμού αμινοξέων. Για τη συλλογή δεδομένων XRPD χρησιμοποιήθηκε μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων, ενώ παρουσιάζεται σύγκριση των συλλεχθέντων δεδομένων ανά περιπτώσεις. Ο πρωταρχικός έλεγχος των πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εργαστηριακών περιθλασιμέτρων και ακολούθησε συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού σύγχροτρον ESRF, ενώ μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό MS-X04SA του Ελβετικού σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του καινοτόμου ανιχνευτή MYTHEN II, που ανά περιπτώσεις βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης. Τέλος, τα πειράματα SCXRD πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1, 14.2 & P13, P14) του σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα. Εν κατακλείδι, η συνδυαστική χρήση διαφόρων τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ για τη συστηματική διερεύνηση της δομικής συμπεριφοράς των μακρομορίων σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας κρίσιμες πληροφορίες για τη λειτουργία και τις ιδιότητές τους, είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική, κάτι που αποδεικνύεται από τα ευρήματα και τις παρατηρήσεις της παρούσας διατριβής.