Συστημική αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου uniquome
Authors: Κοντοπόδης Ευάγγελος 
Published: July 2023

Η Πρωτεωμική είναι ένα σύνολο πολύπλοκων μεθόδων και τεχνολογιών που αποσκοπεί στην ταυτοποίηση, καταγραφή και μελέτη του ολικού πρωτεϊνικού περιεχομένου ενός βιολογικού υλικού. Περιλαμβάνει το διαχωρισμό των πρωτεϊνών ενός βιολογικού δείγματος, την ανάλυση τους με φασματομετρία μάζας, την ταυτοποίησή τους με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, τη συστηματική εισαγωγή των αποτελεσμάτων σε βάσεις δεδομένων και, τέλος την επεξεργασία τους. Οι πλέον εύχρηστες μέθοδοι για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών είναι αυτές που αξιοποιούν το πεπτιδικό αποτύπωμά τους (peptide finger-print) και αναλύουν την αμινοξική αλληλουχία των πεπτιδίων τους. Τα σημαντικότερα μειονεκτήματα αυτών των μεθόδων είναι πως για την ασφαλή ταυτοποίηση μίας πρωτεΐνης, απαιτείται η ανάλυση τουλάχιστον δύο πεπτιδίων ανά πρωτεΐνη καθώς και ότι πολλά από τα πεπτίδια που ταυτοποιούνται από το φασματογράφο μάζας δεν οδηγούν τελικά σε ασφαλή χαρακτηρισμό μίας πρωτεΐνης και απορρίπτονται κατά τη βιοπληροφορική επεξεργασία. Οι παραπάνω αδυναμίες των ήδη υπαρχόντων μεθόδων, οδήγησαν στην ανάγκη ανάπτυξης μιας νέας προσέγγισης για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών ενός οργανισμού. Η προσέγγιση αυτή βασίστηκε στην υπόθεση ότι η αμινοξική αλληλουχία κάθε πρωτεΐνης θα πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα πεπτίδιο που η αμινοξική του αλληλουχία είναι απόλυτα μοναδική (Unique) ως προς το πρωτέωμα του οργανισμού που ανήκει, με αποτέλεσμα να χαρακτηρίζει την πρωτεΐνη διαφορικά και μονοσήμαντα. Έτσι, σαν αποτέλεσμα αυτής της προσέγγισης, στην παρούσα διατριβή καταγράφηκαν τα μοναδικά πεπτίδια του συνόλου των θεωρημένων (reviewed) πρωτεϊνών του ανθρώπου και εντός αυτών αναδείχθηκαν δύο νέες οντότητες μοναδικών πεπτιδίων, τα μοναδικά πεπτίδια ελαχίστου μήκους (core unique peptide - CrUP) και τα σύνθετα μοναδικά πεπτίδια (composite unique peptide - CmUP). Τέλος, εισήχθη για πρώτη φορά ο όρος του Uniquome που περιλαμβάνει το σύνολο των μοναδικών πεπτιδίων (CrUPs και CmUPs) ενός οργανισμού. Τα αντικείμενα της παρούσας διατριβής περιλαμβάνουν: α) Την ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ανάλυση μεγάλων δεδομένων (big data analysis) με σκοπό την δημιουργία του ανθρώπινου Uniquome, β) την κατάρτιση και πλήρη καταγραφή του ανθρώπινου Uniquome που περιλαμβάνει τόσο τα CrUPs όσο και τα CmUPs, γ) την ανάλυση και την διερεύνηση των χαρακτηριστικών των μοναδικών πεπτιδίων σε ένα υψηλά συστημικό και συνθετικό επίπεδο και δ) την διερεύνηση εφαρμογών του ανθρώπινου Uniquome σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Για την δημιουργία του ανθρώπινου Uniquome αναπτύχθηκε ένα νέο λογισμικό ανάλυσης που έχει την δυνατότητα να επεξεργαστεί μεγάλο όγκο δεδομένων (big data analysis) χρησιμοποιώντας κυρίως ως γλώσσα προγραμματισμού τη C#, με παράλληλη χρήση μεθόδων που βασίζονται τόσο σε παράλληλα όσο και σε κατανεμημένα συστήματα.Στο ανθρώπινο πρωτέωμα έως σήμερα έχουν περιληφθεί 20.430 θεωρημένες πρωτεΐνες, που περιλαμβάνουν 7.263.888 CrUPs και 77.697 CmUPs και απαρτίζουν το ανθρώπινο Uniquome, ενώ διαπιστώθηκε ότι 148 πρωτεΐνες (0,7%) δεν περιλαμβάνουν μοναδικά πεπτίδια καθώς φαίνεται να είναι ισομορφές με ομολογία μεγαλύτερη του 99%. Περαιτέρω ανάλυση των μοναδικών πεπτιδίων ως προς το μήκος τους, έδειξε ότι η πλειοψηφία των CrUPs και των CmUPs αποτελείται από πεπτίδια 6 και 11 αμινοξέων αντίστοιχα, ενώ η ανάλυση τους ως προς την σχετική θέση εμφάνισής τους μέσα στην πρωτεΐνη έδειξε πως τα CrUPs εντοπίζονται με το ίδιο ποσοστό σε όλες τις πιθανές θέσεις μέσα στις πρωτεΐνες, εν αντιθέσει με τα CmUPs που εντοπίζονται κυρίως στις αρχικές θέσεις των πρωτεϊνών. Η συνολική πυκνότητα από μοναδικά πεπτίδια για το ανθρώπινο πρωτέωμα υπολογίστηκε στο 64% για τα CrUPs, και στο 0,68% για τα CmUPs, ενώ η συνολική κάλυψη στο 93%. Αναφορικά με τον αριθμό από CrUPs που συνθέτουν ένα CmUP, η ομάδα των σύνθετων μοναδικών πεπτιδίων (6.103 πεπτίδια) που συνθέτονται από 5 μοναδικά πεπτίδια ελαχίστου μήκους είναι αυτή που εντοπίζεται με το μεγαλύτερο ποσοστό (7,85%). Η ανάλυση των χρωμοσωμάτων ως προς τα μοναδικά πεπτίδια που εμπεριέχονται σε αυτά, ανέδειξε πως χρωμοσώματα που εντοπίζονται με χαμηλά χαρακτηριστικά μοναδικότητας ενοχοποιούνται για χρωμοσωμικές ανωμαλίες που έχουν καταγραφεί στον άνθρωπο. Για την καλύτερη κατανόηση του ανθρώπινου Uniquome και των χαρακτηριστικών του, η μελέτη επεκτάθηκε στην κατάρτιση του Uniquome άλλων 19 πρότυπων οργανισμών που χρησιμοποιούνται σαν βιολογικά μοντέλα. Περεταίρω, αναφορικά με την εφαρμογή του Uniquome για την κατανόηση της βιολογικής δράσης του, αναλύθηκαν διάφορες οικογένειες πρωτεϊνών όπως η οικογένεια RAS, η οικογένεια Major histocompatibility complex class I (MHC I), η οικογένεια Peptidase C19 και η οικογένεια Peptidase S1. Τέλος, δύο ομάδες πεπτιδίων με ιδιαίτερη βιολογική σημασία σε ανθρώπινες παθήσεις είναι τα ανοσοπεπτίδια και τα αντιγονικά καρκινικά πεπτίδια. Διαπιστώθηκε ότι από τα υπάρχοντα ανοσοπεπτίδια το 87% είναι unique πεπτίδια, ενώ το 89% των υπαρχόντων αντιγονικών πεπτιδίων είναι επίσης unique.Η κατάρτιση και η ανάλυση του ανθρώπινου Uniquome οδήγησε για πρώτη φορά στην αποκάλυψη δύο νέων οντοτήτων πεπτιδίων στο ανθρώπινο πρωτέωμα τα οποία όπως διαπιστώθηκε έχουν τεράστια βιολογική σημασία. Η ένταξη των μοναδικών πεπτιδίων στις ήδη υπάρχουσες εφαρμογές της φασματομετρίας μάζας μπορεί να αυξήσει σημαντικά τα ποσοστά ταυτοποίησης πρωτεϊνών στα υπό μελέτη δείγματα και να αποκαλύψει νέες πρωτεΐνες, καθόσον μια πρωτεΐνη δύναται να ταυτοποιηθεί από ένα και μόνο πεπτίδιο. Έτσι η χρήση των CrUPs και CmUPs θα οδηγήσει στην αποτελεσματική, ασφαλή και ταχεία ταυτοποίηση πρωτεϊνικών βιοδεικτών παθολογικών καταστάσεων. Επιπλέον, από τα ευρήματα της παρούσας διατριβής διαπιστώνεται ότι η χρήση του Uniquome στην αντιμετώπιση παθολογικών καταστάσεων είναι δυνατόν να οδηγήσει στον σχεδιασμό νέων και πιο εξατομικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων τόσο σε επίπεδο φαρμάκων όσο και σε επίπεδο εμβολίων.