Interacción de Fusarium circinatum y Pinus pinaster: mecanismos de defensa en planta y evolución espacio-temporal del patógeno en España
Authors:   , Fariña Flores David 
Published: February 2025

Pine Pitch Canker (PPC), caused by the fungus Fusarium circinatum Nirenberg and oDonnell, is a disease that causes significant economic and ecological losses in nurseries and forest plantations worldwide. PCC affects at least 60 species of the Pinus genus and is considered one of the most important diseases in conifers. Pinus radiata and P. pinaster are the two species most affected by the disease in Spain. P. radiata is one of the most susceptible species, while P. pinaster is moderately resistant.

An analysis of the genetic structure of the pathogen population in Spain, carried out shortly after it was established in the Peninsula, showed that the population was structured in two clusters, each one with a predominant haplotype, a situation compatible with two independent pathogen introductions in Spain. Moreover, this analysis showed that the population was mainly clonal and that there was no evidence that sexual reproduction was producing. In the time since its introduction, the change that may have occurred in the genetic structure is unknown.

Typically, resin is part of the constitutive defensive system of conifers . Pines synthesize de novo induced resin which accumulates and produces in the constitutive and induced resin canals. This resin s mainly composed of terpenes and it acts as a chemical defense. Nevertheless, F. circinatum colonizes the plant using constitutive and traumatic resin ducts, suggesting that it is resin tolerant. There is also evidence that the most susceptible species produces more resin. The work presented here is structured into three distinct sections.

The objective of the first of them is to quantify the genetic diversity of Spanish F. circinatum populations infecting pine stands and to determine how this variation is distributed in a temporal and spatial scale. For this purpose, we analyzed the population structure using six polymorphic SRR markers, and identified 15 MLGs in 66 isolates. In general, genotypic diversity was low and decreased over time in tGalicia and Asturias while maintained at País Vasco, where only one haplotype was detected. This region also includes a single mating group with two VCGs, while the isolates from the northwest area were from one of the two possible mating groups and from one of the 11 VGCs. Results are explained by the asexual reproduction, but also selfing, at least to a lesser extent, that leads to identification of two new haplotypes.

The second objective was to evaluate the growth of F. circinatum in the presence of constitutive and induced resin of P. pinaster and P. radiata using spectrophotometric techniques. The results showed that resin from P. pinaster and P. radiata stimulated fungal growth. Besides, F. circinatum grew 40% more in the hexane extract of the induced resin than in the constitutive resin of P. radiata.

Finally, we compared the anatomical resin system and terpene profiles in both species infected with F. circinatum. We used a previous transcriptomic study of the P. pinaster-F. circinatum to study the expression of genes related to terpene biosynthesis. The formation of induced ducts occurred in the cortex and xylem of P. radiata, these ducts having a greater diameter, density and conductive area than in P. pinaster. In this last species, the expression of genes related to the mevalonate pathway responsible for the synthesis of terpene precursors increased, as well as the expression of sesquiterpene synthases. In P. radiata the amount of total resin increased, as well as monoterpenes and diterpenes. Our results confirm that the species most susceptible to the pathogen induced larger resin ducts and produced more resin than P. pinaster, which occurs in a similar way in pathogens that use resin ducts for host colonization By comparing terpene profiles, we identified a group of terpenes potentially involved in plant defense. The greater resistance of P. pinaster may also be due to a faster response in terpene abundance to infection.

RESUMEN

El chancro resinoso del pino (PPC), causado por el hongo Fusarium circinatum Nirenberg and oDonnell, es una enfermedad que provoca importantes pérdidas económicas y ecológicas en viveros y plantaciones. PPC afecta al menos a 60 especies del género Pinus y es una de las enfermedades más importantes en coníferas. En España F. circinatum es un hongo patógeno introducido. En el país P. radiata y P. pinaster son las dos especies mayormente afectadas por la enfermedad. P. radiata es una de las especies más susceptibles, mientras que P. pinaster es moderadamente resistente.

Un análisis previo de la estructura genética de la población del patógeno en España mostraba que la población se estructuraba en dos grupos, cada uno con un haplotipo dominante, una situación compatible con dos introducciones independientes del patógeno en el país. Además la población era principalmente clonal y no había evidencias de reproducción sexual. La resina forma parte del sistema defensivo constitutivo de las coníferas y los pinos sintetizan de novo resina inducida la cual se acumula y produce en los canales resiníferos constitutivos e inducidos. Esta resina está compuesta por terpenos y actúa como defensa química debido a que contiene compuestos tóxicos o inhibitorios para crecimiento del patógeno. Sin embargo, F. circinatum coloniza la planta usando los canales resiníferos lo que sugiere que es tolerante a la resina. Además, hay evidencia de que las especies más susceptibles producen más cantidad de resina.

Este trabajo se estructura en tres apartados diferenciados. El objetivo del primero de ellos es cuantificar la diversidad genética de la población española de F. circinatum y determinar cómo se ha distribuido la variación en una escala temporal y espacial. Para ello hemos analizado la estructura de la población usando seis marcadores polimórficos SRR y hemos identificado 15 MLGs en 66 aislados. La diversidad genotípica fue baja y disminuyó con el tiempo en las regiones de Galicia y Asturias, mientras que se mantuvo en el País Vasco, donde solo se ha detectado un haplotipo. En esta región solo esta presente un grupo de apareamiento con dos VCGs, mientras que los aislados del área noroeste eran de uno de los dos grupos posibles de apareamiento y de alguno de los 11 VGCs. Los resultados se explican por la reproducción asexual, pero también por el autocruzamiento, al menos en menor medida, que conduce a la identificación de dos nuevos haplotipos.

El segundo objetivo consistió en evaluar el crecimiento de F. circinatum en presencia de la resina constitutiva e inducida de P. pinaster y P. radiata utilizando técnicas espectrofotométricas. El patógeno fue cultivado en medio mínimo suplementado con resina en los pocillos de una microplaca durante 6 días, y se midió la absorbancia a 597 nm como indicador de biomasa fúngica. Los resultados mostraron que la resina de P. pinaster y P. radiata estimulaban el crecimiento fúngico. Además, F. circinatum creció un 40% más en el extracto de hexano de la resina inducida que en la resina constitutiva de P. radiata.

Por último, comparamos los canales resiníferos y el perfil terpénico de ambas especies infectadas por el hongo. También utilizamos un estudio transcriptómico previo con el fin de estudiar la expresión de los genes relacionados con la biosíntesis de terpenos. La formación de canales inducidos se produjo en el córtex y xilema de P. radiata, teniendo estos un diámetro, densidad y área conductora mayor que en P. pinaster. En este último aumentó la expresión de los genes relacionados con la vía del mevalonato así como la expresión de las sesquiterpenos sintasas. En P. radiata aumento la cantidad de resina total, así como los monoterpenos y diterpenos. Nuestros resultados confirman que la especie más indujo canales resiníferos más grandes y produjo más resina. La mayor resistencia de P. pinaster también puede ser debida a una respuesta más rápida en el contenido de terpenos frente a la infección.