Αποσαφηνίζοντας το ρόλο της ορμόνης του στρες εκλυτική ορμόνη της κορτικοτροπινης (Corticotropin Releasing Hormone, CRH) στην αναγέννηση και τη διατήρηση της ομοιόστασης του εντερικού επιθηλιακού φραγμού
Authors: Αποστόλου Αθανασία 
Published: April 2021

Η διατάραξη της ομοιόστασης του εντερικού επιθηλιακού φραγμού έχει συσχετιστεί με πληθώρα φλεγμονωδών διαταραχών του εντερικού ιστού, συμπεριλαμβανομένης και της Ιδιοπαθούς Φλεγμονώδους Νόσου του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Με τον όρο ΙΦΝΕ αναφερόμαστε σε χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές οι οποίες χαρακτηρίζονται από χρόνια υποτροπιάζουσα ανοσολογική ενεργοποίηση και φλεγμονή του γαστρεντερικού σωλήνα. Η έναρξη της νόσους είναι συχνά συνυφασμένη με την κατάρρευση της ακεραιότητας του επιθηλιακού φραγμού και την εισβολή των βακτηρίων και περιβαλλοντικών αντιγόνων του αυλού στην υποβλεννογόνο περιοχή, με αποτέλεσμα την έναρξη ανοσολογικής απόκρισης. Τα αίτια του φαινομένου αυτού δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί, είναι γνωστό όμως η νόσος έχει τόσο γενετικό όσο και περιβαλλοντικό υπόβαθρο. Η ορμόνη CRH συμμετέχει στη ρύθμιση της ανοσολογικής αντίδρασης σε συστημικό καθώς και σε ιστοειδικό επίπεδο. Στην παρούσα διατριβή στοχεύσαμε στη διαλεύκανση του ρόλου της CRH στην πορεία της ιστικής αναγέννησης κάτω από παθολογικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας το πειραματικό μοντέλο της DSS επαγόμενης κολίτιδας σε μύες. Οι Crh-/-, σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα της ομάδας, εμφανίζουν εκτεταμένη φλεγμονή, αυξημένη θνησιμότητα και αδυναμία επιδιόρθωσης του ιστού. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι πριν την έναρξη της φλεγμονώδους διαδικασίας εμφανίζουν υψηλά επίπεδα IL-6, ενώ η ποιοτική και ποσοτική σύσταση της εντερικής χλωρίδας υποδεικνύει την ύπαρξη δυσβιωτικού περιβάλλοντος. Γνωρίζοντας τη σημασία των μηχανισμών της αυτοφαγίας και του inflammasome στην αλληλεπίδραση του βλεννογόνου με τα εντερικά βακτήρια, εν συνεχεία μελετήσαμε τη ρύθμιση αυτών των μηχανισμών σε συνθήκες γενετικής απαλοιφής της CRH. Χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη LC3 σαν δείκτη ενεργοποίησης του αυτοφαγικού μηχανισμού, διαπιστώσαμε την αυξημένη ενεργότητα της αυτοφαγίας σε συνθήκες ελέγχου καθώς και σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής νόσου. Η φαρμακολογική αναστολή της αυτοφαγίας με τον αναστολές της 3-Methyladenine, οδήγησε σε αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης των Crh -/- μυών μετά την παύση της χορήγησης του DSS, ενώ περιόρισε την ανεξέλεγκτη έκκριση κυτοκινών. Η αρνητική συσχέτιση της σηματοδότησης της CRH με την αυτοφαγία επιβεβαιώθηκε και in vitro σε εμβρυονικούς ινοβλάστες μυός (Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs), έπειτα από στέρηση αμινοξέων, και σε μακροφάγα μυός Raw264.7, έπειτα από χορήγηση LPS. Σε συμφωνία με το αυξημένο μικροβιακό φορτίο των Crh-/- πριν την έναρξη της φλεγμονής, ανιχνεύσαμε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του inflammasome NLRP6, υπεύθυνης για την ανίχνευση μικροβιακών μεταβολιτών, καθώς και των καθοδικών της στόχων σε συνθήκες ελέγχου. Η χορήγηση αντιβιοτικών ευρέως φάσματος για 10 ημέρες πριν αλλά και καθ’ όλη τη διάρκεια της χορήγησης DSS, είχε ως αποτέλεσμα τo θεαματικό περιορισμό της φλεγμονώδους αντίδρασης στους Crh -/- μύες, την αυξημένη επιβίωση τους και την πλήρη ιστική επιδιόρθωση. Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, αποδεικνύουμε πως η CRH ρυθμίζει βασικούς ομοιοστατικούς μηχανισμούς του εντερικού ιστού σε συνθήκες ελέγχου και έπειτα από επαγωγή φλεγμονής. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αυξημένη έκφραση της CRH στο παχύ έντερο ασθενών με ΙΦΝΕ, υπογραμμίζει τη σημασία της απόκρισης στο στρες για την εξέλιξη της ανθρώπινης νόσου και παρέχει στόχους για θεραπευτικές προσεγγίσεις, ανάλογα με το στάδιο και την πορεία της φλεγμονής. Παρ’ όλα αυτά και αξιολογώντας την περιορισμένη μετάφραση των πειραματικών δεδομένων από ζωικά μοντέλα στην κλινική πράξη, επιδιώξαμε την ανάπτυξη μίας πλατφόρμας, που θα επιτρέπει την ex vivo καλλιέργεια και πειραματισμό σε ανθρώπινα κύτταρα παχέος εντέρου. Για το σκοπό αυτό συνδυάσαμε τις τεχνολογίες των οργανοειδών και των Organ-on-Chip, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη του Colon Intestine-Chip, το όποιο προσομοιάζει τις μηχανικές πιέσεις και το περιβάλλον της εξωκυττάριας ουσίας, όπως αυτά απαντώνται στον ανθρώπινο εντερικό ιστό. Ανάλυση του μεταγραφώματος με χρήση RNA sequencing κατέδειξε τη σημασία του ενδοθηλίου στη μορφολογική και λειτουργική ωρίμανση του εντερικού επιθηλιακού φραγμού ex vivo. Το Colon Intestine-Chip επέτρεψε τη διαφοροποίηση των οργανοειδών προς τις δύο εντερικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές. Παράλληλα, η περιοδική έκθεση των επιθηλιακών κυττάρων σε αέρα, ανάλογη της εναλλασσόμενης έκθεσης του βλεννογόνου στον τροφικό χυμό, ενίσχυσε τη διαφοροποίηση των καλυκοειδών κυττάρων. Έκθεση του Colon Intestine-Chip στην προφλεγμονώδη κυτοκίνη IFNγ, γνωστή για τη δράση της στη διάσπαση του επιθηλιακού φραγμού, οδήγησε σε απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων και καταστροφή των στενοσυνδέσμων, προκαλώντας αύξηση της επιθηλιακής παρακυτταρικής διαπερατότητας. Η απελευθέρωση κυτοκινών από τρεις διαφορετικούς δότες, παρουσία του φλεγμονώδους ερεθίσματος, αντικατόπτρισε το εύρος των αποκρίσεων που απαντώνται στην κλινική πράξη. Το γεγονός αυτό υπογραμμίζει τη δυνατότητα εφαρμογής της πλατφόρμας στο πεδίο της εξατομικευμένης ιατρικής. Τέλος, διαπιστώσαμε την κατάρρευση της ακεραιότητας του επιθηλιακού φραγμού έπειτα από χορήγηση της κυτοκίνης IL-22. Συγκρίνοντας τα ευρήματα της παρούσας μελέτης με αυτά πρότερων μελετών που υποστηρίζουν την αντιφλεγμονώδη δράση της IL-22, κατανοούμε τη σημασία των ειδικών χαρακτηριστικών του εκάστοτε πειραματικού μοντέλου στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης των κυτοκινών και υποστηρίζουμε τη δυνατότητα χρήσης του Colon Intestine-Chip στη μελέτη των μηχανισμών που διέπουν τη διάσπαση και αναγέννηση του εντερικού επιθηλιακού φραγμού.