The role of small leucine rich proteoglycans (SLRPs) in regulating the biological functions of mesenchymal origin tumors
Authors: Γιαταγάνα Ειρήνη-Μαρία 
Published: October 2022

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο τρόπος με τον οποίο οι μικρές, πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRPs) αλληλεπιδρούν με τους μοριακούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν τις βιολογικές λειτουργίες των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης. Τα σαρκώματα είναι τύποι καρκίνου που αναπτύσσονται από διαφοροποιημένα κύτταρα του συνδετικού ιστού και μπορούν να ξεκινήσουν να αναπτύσσονται από τα οστά, το χόνδρο, το αίμα ή τα αγγεία και κατηγοριοποιούνται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα τον ιστό και τον τύπο κυττάρων από τα οποία προέρχονται. Επομένως, υπάρχουν τα σαρκώματα των οστών, όπως το οστεοσάρκωμα ή το χονδροσάρκωμα και τα σαρκώματα μαλακών ιστών, όπως το ινοσάρκωμα. Στη μελέτη αυτή σκοπός ήταν να διερευνήσουμε τις αλληλπιδράσεις της λουμικάνης και της διγλυκάνης με σηματοδοτικά μονοπάτια που συμμετέχουν στην πρόοδο των σαρκωμάτων των οστών σε τέσσερεις διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, την κυτταρική σειρά ανθρώπινου χονδροσαρκώματος HTB94, και τις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου οστεοσαρκώματος MG63, U-2OS και Saos-2.Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο πρωτεογλυκανών, ινιδικών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος. Ο ρόλος της για τους ιστούς είναι στηρικτικός, αλλά τα μόριά της συμμετέχουν επίσης στη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία δημιουργεί και μεταφέρει πολλά διαφορετικά σήματα στους ιστούς και τα κύτταρα, επηρεάζοντας τα χαρακτηριστικά και τις λειτουργίες τους. Επίσης, λειτουργεί σαν αποθήκη αποθήκευσης αυξητικών παραγόντων, όπως ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας I (IGF-I) και άλλα βιολογικά μακρομόρια που μπορούν να αλλάξουν την κυτταρική συμπεριφορά. Τα καρκινικά κύτταρα των οστών παράγουν άφθονη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, το οστεοειδές, με διαφορετική σύσταση από αυτή των φυσιολογικών ιστών. Τα συστατικά της συμμετέχουν σε σηματοδοτικά μονοπάτια που συνδέονται με παθολογικούς φαινότυπους των οστών. Η απορρυθμισμένη έκφραση των μορίων της εξωκυττάριας μήτρας επηρεάζει τις βιολογικές λειτουργίες των σαρκωμάτων.Οι πρωτεογλυκάνες (PGs) είναι μόρια που αποτελούνται από αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs) ομοιοπολικά προσδεδεμένων σε ένα πρωτεϊνικό πυρήνα. Αυτές οι πρωτεΐνες υφίστανται πολλές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και μπορούν να επηρεάσουν τις κυτταρικές λειτουργίες και την εξέλιξη του όγκου μέσω μια πληθώρας σηματοδοτικών μονοπατιών. Πολλές μελέτες δείχνουν ότι οι εκκρινόμενες στην εξωκυττάρια μήτρα πρωτεογλυκάνες, οι μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRPs) αλληλεπιδρούν άμεσα με το μικροπεριβάλλον του όγκου και μεταφέρουν ερεθίσματα στα κύτταρα, δρώντας τελικά σα σηματοδοτικά μόρια που ελέγχουν τις κυτταρικές λειτουργίες, όπως τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, τη διαφοροποίηση και την περαιτέρω σύνθεση της εξωκυττάριας μήτρας του κάθε ιστού. Επιπλέον, αυτές οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με υποδοχείς κινάσης τυροσίνης επηρεάζοντας την κατάντη σηματοδότησή τους και τελικά την κυτταρική συμπεριφορά. Πιο ειδικά, κάποιες SLRPs, όπως η λουμικάμη και η διγλυκάνη, συμμετέχουν σε μηχανισμούς σχηματισμού και ομοιόστασης των οστών με διαφορετικούς ρόλους σε κάθε στάδιο αυτών των διαδικασιών. Για το λόγο αυτό θεωρούνται ρυθμιστές των σηματοδοτικών μονοπατιών και μπορούν να μελετηθούν είτε ως θεραπευτικοί στόχοι, είτε ως διαγνωστικά μόρια σε παθολογικές καταστάσεις.Ο IGF-I είναι ένας αυξητικός παράγοντας με αποδεδειγμένες ογκογόνες ιδιότητες. Οι περισσότερες από τις δράσεις του μεσολαβούνται από δύο σηματοδοτικά μονοπάτια, αυτό του PI3K/Akt (phosphoinositide 3-kinase/ serine/threonine kinase Akt) και του MAPK (mitogen-activated protein kinase). Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η λουμικάνη είναι ένας ενδογενής ρυθμιστής της ανάπτυξης των κυττάρων ανθρώπινου χονδροσαρκώματος HTB94. Πιο συγκεκριμένα αποδείχθηκε ότι η λουμικάνη είναι η κύρια εκφραζόμενη και εκκρινόμενη SLRP στα κύτταρα HTB94, ενώ η ντεκορίνη και η διγλυκάνη εκφράζονται ελάχιστα. Η λουμικάνη επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό θετικά, αφού HTB94 κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη εμφανίζουν μειωμένους βασικούς και εξαρτώμενους από IGF-I πολλαπλασιαστικούς ρυθμούς. Η ογκογόνος δράση του IGF-I μεσολαβείται από τον υποδοχέα του IGF-IR, ο οποίος εμφανίζει μειωμένη ενεργοποίηση σε κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη. Επιπλέον, τα επίπεδα της λουμικάνης επηρεάζουν την ενεργοποίηση του ERK1/2, που φαίνεται να είναι απαραίτητος μεσολαβητής της εξαρτώμενης από IGF-I ανάπτυξης των κυττάρων HTB94. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνονται και εξετάζοντας την έκφραση γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, αφού κύτταρα ελλιπή σε λουμικάνη έχουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53. Επομένως, η λουμικάνη ευνοεί τον πολλαπλασιασμό των HTB94 κυττάρων χονδροσαρκώματος μέσω του σηματοδοτικού άξονα IGF-IR/ ERK1/2/p53.Η διγλυκάνη είναι μια ταξής I SLRP με ενεργό ρόλο στο σχηματισμό, την ανάπτυξη και την ομοιόσταση των οστών. Η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή αποκαλύπτει μηχανισμούς μέσω των οποίων η διγλυκάνη ευνοεί την κυτταρική ανάπτυξη και το χημειοανθεκτικό φαινότυπο στο οστεοσάρκωμα. Η έκφραση της διγλυκάνης είναι συνυφασμένη με επιθετικό φαινότυπο του όγκου και ανοχή στη χημειοθεραπεία. Η συνεχώς ενεργοποιημένη σηματοδότηση του υποδοχέα IGF-IR είναι γνωστή στη βιολογία των σαρκωμάτων και, επίσης, συνδέεται με χημειοανθεκτικούς φαινοτύπους. Στη συγκεκριμένη εργασία αποδεικνύεται ότι η διγλυκάνη, σχηματίζοντας σύμπλοκο με τον IGF-IR, ενεργοποιεί τη σηματοδότηση του υποδοχέα για να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων οστεοσαρκώματος MG63, που εκφράζουν ενδογενώς αυτή την SLRP. Υπολογιστικά μοντέλα σύνδεσης του IGF-IR και της διγλυκάνης υποδηλώνουν ότι η διγλυκάνη δεσμεύεται στο διμερές σύμπλοκο του IGF-IR μέσω της κοίλης επιφάνειάς της. Οι υπολογισμοί της ελεύθερης ενέργειας δέσμευσης δείχνουν τον σχηματισμό ενός σταθερού συμπλόκου. Η δέσμευση της διγλυκάνης οδηγεί σε παρατεταμένη ενεργοποίηση του IGF-IR που έχει ως αποτέλεσμα τη συνεχή απόκριση ανάπτυξης των ελάχιστα διαφοροποιημένων κυττάρων MG63 στην ενεργοποιημένη σηματοδότηση του υποδοχέα IGF-IR. Επιπλέον, η διγλυκάνη διευκολύνει την ενδοκυττάρωση και σουμοϋλύωση του IGF-IR που οδηγεί στην πυρηνική μετατόπισή του και τη δέσμευσή του στο DNA των MG63. Η δραστηριότητα κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα μεσολαβεί τη δράση του παραπάνω μηχανισμού. Επιπροσθέτως, η διγλυκάνη αυξάνει την έκφραση των δεικτών επιθετικότητας, της βιμεντίνης και της φιμπρονεκτίνης, στα κύτταρα MG63. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο μηχανισμός δεν ακολουθείται από τα μετρίως και καλά διαφοροποιημένα κύτταρα οστεοσαρκώματος, U-2OS και Saos-2, αντίστοιχα, που δεν εκφράζουν ενδογενώς διγλυκάνη. Επιπλέον, δείξαμε ότι η διγλυκάνη ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου, Phosphatase and tensin homolog (PTEN), ενώ η ανεπάρκεια διγλυκάνης αυξάνει την ανταπόκριση των κυττάρων στο χημειοθεραπευτικό φάρμακο, την δοξορουβικίνη.Η αυτοφαγία είναι ένας καλά μελετημένος καταβολικός μηχανισμός που παρέχει στα κύτταρα ενέργεια και πρόδρομα βιολογικά μακρομόρια. Ωστόσο, είναι απορυθμισμένη σε πολλές παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου, ενώ ο ρόλος της στη βιολογία του καρκίνου είναι διττός και εξαρτάται από το στάδιο και τον τύπο του όγκου. Η ραπαμυκίνη αναστέλλει το σηματοδοτικό μονοπάτι mammalian target of therapamycin (mTOR), ενεργοποιώντας το μηχανισμό αυτοφαγίας. Στο οστεοσάρκωμα η απορυθμισμένη αυτοφαγία επηρεάζει την απάντηση στη χημειοθεραπεία ενώ η απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως το PTEN, φαίνεται να σχετίζεται με την ενεργοποίηση της αυτοφαγίας. Όπως αναφέρθηκε, η διγλυκάνη ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του PTEN, οπότε σε επόμενο βήμα μελετήθηκε ο ρόλος της διγλυκάνης στον αυτοφαγικό μηχανισμό των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διγλυκάνη αναστέλλει την αυτοφαγία σε δύο κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, ενώ η εξαρτώμενη από ραπαμυκίνη ενεργοποίηση της αυτοφαγίας μειώνει την έκφραση της συγκεκριμένης SLRP στα κύτταρα ανθρώπινου οστεοσαρκώματος MG63 και εμποδίζει την εξαρτώμενη από τη διγλυκάνη κυτταρική ανάπτυξη.Η σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνης είναι ένα ακόμα ενεργοποιημένο αναπτυξιακό μονοπάτι στο οστεοσάρκωμα. Αλληλεπίδραση μεταξύ των μονοπατιών Wnt/β-κατενίνης και της αυτοφαγίας έχει προηγουμένως εντοπιστεί σε πολλά καρκινικά μοντέλα. Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου εντοπίστηκε αλληλεπίδραση μεταξύ του μονοπατιού της β-κατενίνης και του υποδοχέα IGF-IR, ενώ μέσω της μη κανονικής σηματοδότησης της β-κατενίνης, ο ενεργοποιημένος IGF-IR οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης της διγλυκάνης. Στα πειράματα για τη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή αποδείχθηκε ότι η ραπαμυκίνη αναστέλλει τη μετατόπιση της β-κατενίνης στον πυρήνα, καταστέλλοντας την κανονική σηματοδότηση Wnt και μειώνοντας το συν-εντοπισμό της διγλυκάνης με τον συν-υποδοχέα του Wntμονοπατιού, low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6). Η αυξημένη εναπόθεση της β-κατενίνης αναστέλλει το μηχανισμό της αυτοφαγίας και προστατεύει τα κύτταρα MG63 από την απόπτωση μέσω ενός μηχανισμού που εμπλέκει τη διγλυκάνη. Επιπροσθέτως, η διγλυκάνη παρέχει προστασία στα κύτταρα MG63 από τη δράση της δοξορουβικίνης, μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από το μηχανισμό αυτοφαγίας των κυττάρων αυτών. Συνδυαστική θεραπεία των κυττάρων με τη δοξορουβικίνη και τη ραπαμυκίνη ενισχύει την απάντηση των κυττάρων στη δοξορουβικίνη μειώνοντας την έκφραση της διγλυκάνης και της β-κατενίνης. Κύτταρα ελλιπή σε διγλυκάνη εμφανίζουν αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έλλειψη διγλυκάνης σχετίζεται με αυξημένη απόπτωση ύστερα από θεραπεία των κυττάρων με δοξορουβικίνη.Τα υπολογιστικά μοντέλα για το σύμπλοκο του LRP6 με τη διγλυκάνη υποδηλώνουν ότι η διγλυκάνη αλλάζει την ικανότητα του υποδοχέα να αλληλεπιδρά με άλλα σηματοδοτικά μόρια, επηρεάζοντας τη διαμόρφωση του υποδοχέα. Η δέσμευση της διγλυκάνης στον LRP6 ενεργοποιεί το μονοπάτι Wnt και την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης εμποδίζοντας το σχηματισμό συμπλόκου αποικοδόμησης της β-κατενίνης. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο μηχανισμός δεν ακολουθείται στα μετρίως διαφοροποιημένα κύτταρα οστεοσαρκώματος U-2OS, που δεν εκφράζουν ενδογενών διγλυκάνη.Συνοψίζοντας, η διγλυκάνη επιδεικνύει προστατευτικά αποτελέσματα έναντι της δοξορουβικίνης στα κύτταρα οστεοσαρκώματος MG63, προάγοντας την παρατεταμένη ενεργοποίηση του IGF-IR και την πυρηνική του μετατόπιση, ενεργοποιώντας την οδό σηματοδότησης Wnt/β-κατενίνης και αναστέλλοντας την αυτοφαγία. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν νέες πτυχές του μοριακού δικτύου αλληλεπίδρασης της διγλυκάνης και του ρόλου της στη σηματοδότηση μέσω διάφορων υποδοχέων και υποδεικνύουν αυτή την πρωτεϊνη ως ένασημαντικό ρυθμιστή της ανάπτυξης του οστεοσαρκώματος και της απόκρισης αυτού του όγκου στη χημειοθεραπεία.Συμπερασματικά, οι μηχανισμοί που περιγράφηκαν παραπάνω αποδεικνύουν τη συμμετοχή των SLRPs στην ανάπτυξη των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης και η αλληλεπίδρασή τους με διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης τις καθιστούν πιθανά διαγνωστικά μόρια ή μόρια με θεραπευτική σημασία στη βιολογία των σαρκωμάτων.