Μελέτη ενδοφυτικών βακτηρίων από την Calendula officinalis και ριζοσφαιρικών βακτηρίων από το Phaseolus vulgaris που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών
Authors: Τσαλγατίδου Πωλίνα 
Published: October 2022

Η εκτεταμένη χρήση στην εντατική γεωργία χημικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων, φυτοφαρμάκων όσο και λιπασμάτων έχει ως αποτέλεσμα δυσμενείς επιπτώσεις στο περιβάλλον και τους ζωντανούς οργανισμούς, που οδήγησαν στην ανάγκη εύρεσης νέων, εναλλακτικών και ασφαλέστερων εφαρμογών που στόχο έχουν μια φιλική προς το περιβάλλον και εξίσου αποτελεσματική αειφόρο γεωργία. Η εφαρμογή ωφέλιμων ριζοσφαιρικών ή ενδοφυτικών βακτηρίων μπορεί να αποτελέσει μια ανταγωνιστική και ασφαλή πρακτική διαχείρισης των καλλιεργειών, καθώς ενισχύουν την ανάπτυξη και την αντοχή των φυτών σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Στην παρούσα μελέτη απομονώθηκαν και μελετήθηκαν 119 ενδοφυτικά βακτηριακά στελέχη από φύλλα, ρίζα και άνθη του φαρμακευτικού φυτού Calendula officinalis, καθώς και το βακτηριακό στέλεχος P. carnis X απομονωμένο από τη ριζόσφαιρα του Phaseolus vulgaris. Η μορφολογική και φυλογενετική ανάλυση σε 37 αντιπροσωπευτικά ενδοφυτικά στελέχη απέδειξε ότι ανήκουν στα γένη Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Stenotrophomonas και Pantoea. Τα επιλεγμένα ενδοφυτικά βακτήρια του φαρμακευτικού φυτού C. officinalis μελετήθηκαν εκτενέστερα ως προς το πλήθος των άμεσων και έμμεσων μηχανισμών δράσης τους, καθώς και για την ικανότητα επιβίωσής τους σε ακραίες συνθήκες ανάπτυξης. Η in vitro εφαρμογή αντιπροσωπευτικών στελεχών σε φυτά Arabidopsis thaliana Col-0 και ο εμβολιασμός τους με βιο- κάλυψη σε σπόρους Solanum lycopersicum var. Chondrokatsari Messinias, επηρέασε σημαντικά την ανάπτυξη και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των φυτών, με τη σύνθεση και παραγωγή φυτοορμονών, την παραγωγή βακτηριακών πτητικών ενώσεων (ΒVCs), τον καλό αποικισμό των βακτηρίων και την αφομοίωση των απαραίτητων θρεπτικών στοιχείων, να αποτελούν πιθανούς μηχανισμούς δράσης. Επιπλέον, μελετήθηκε η ανταγωνιστικότητα των μελετώμενων βακτηρίων εναντίον των φυτοπαθογόνων μυκήτων Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici και Botrytis cinerea in vitro, με τα είδη B. velezensis, B. subtilis και B. halotolerans να ξεχωρίζουν συγκριτικά με τα υπόλοιπα είδη βακτηρίων. Η αποτελεσματική παρεμπόδιση των φυτοπαθογόνων μυκήτων συνδυάστηκε με την άμεση επίδραση των παραγόμενων και διαχεόμενων αντιμικροβιακών ενώσεων των βακτηριακών στελεχών στο μέσο ανάπτυξης, όπως επιβεβαιώθηκε και μικροσκοπικά εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Τα ενδοφυτικά βακτήρια B. halotolerans Cal.l.30, B. velezensis Cal.r.29 και B. halotolerans Cal.f.4, καθώς και το ριζοσφαιρικό βακτήριο P. carnis X που ξεχώρισαν για την in vitro ανταγωνιστικότητά τους, παρεμπόδισαν σημαντικά τους φυτοπαθογόνους μύκητες B. cinerea και Colletotrichumacutatum σε μετασυλλεκτικές εφαρμογές in vivo, σε καρπούς τομάτας και σταφυλιού, αλλά και ελιάς αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, τα επιλεγμένα ανταγωνιστικά στελέχη μείωσαν εξίσου σημαντικά το δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας (DSI %) σε καρπούς τομάτας με ποσοστό μεταξύ 11-18% και σε καρπούς ελιάς με ποσοστό μεταξύ 24-27%, ενώ στους καρπούς σταφυλιού ξεχώρισε η εφαρμογή του βακτηρίου Cal.r.29 με ποσοστό 13%. Η μεταβολομική ανάλυση με UHPLC-ESI HRMS των στελεχών Cal.l.30 και Cal.r.29 σε συνδυασμό με την in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των στελεχών Cal.l.30, Cal.f.4 και X, ανέδειξαν ένα πλήθος ισχυρών αντιμικροβιακών ενώσεων και δευτερογενών μεταβολιτών που εμπλέκονται στον ανταγωνισμό των βακτηρίων. Συγκεκριμένα, τα βακτήρια του γένους Bacillusξεχώρισαν για την παραγωγή των ισχυρών κυκλικών λιποπεπτιδίων των οικογενειών surfactin, fengycin και iturin, της πρόδρομης ένωσης του αντιβιοτικού διπεπτιδίου bacilysin(L-dihydroanticapsin), το πολυκετίδιο bacillaene, την αντιβακτηριακή ένωση oxydifficidin, τη σιδηροφόρο ένωση bacillibactin και τη δραστική ουσία azelaic acid. Αντίστοιχα η in silicoανάλυση του γονιδιώματος του βακτηρίου P. carnis X ανέδειξε τις συστάδες γονιδίων για τη βιοσύνθεση του κυκλικού λιποπεπτιδίου viscosinamide, της σιδηροφόρου ένωσης pyoverdinκαι επιβεβαίωσε την ύπαρξη του εκκριτικού συστήματος τύπου VI (T6SS). Οι ενώσεις αυτές, εκτός από την άμεση ανταγωνιστική τους δράση, λειτουργούν παράλληλα ως διεγέρτες της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (ISR), για την ενεργοποίηση των αμυντικών μηχανισμών των φυτών, είτε στον ιστό επαφής, είτε διασυστηματικά. Έτσι, μελετήθηκε επιπλέον η επίδραση των βακτηριακών στελεχών Cal.l.30, Cal.r.29, Cal.f.4 και Χ σε συνθήκες θερμοκηπίου στην ανάπτυξη και την ενεργοποίηση της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (ISR) καθώς τελικά και την προστασία των φυτών τομάτας από το φυτοπαθογόνο μύκητα B. cinerea, μετά από την εφαρμογή των βακτηρίων είτε ως μεμονωμένα στελέχη είτε ως ζεύγη σε μίγματα. Συγκεκριμένα, μετά από την εφαρμογή των βακτηρίων παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας (DSI %)με ποσοστό μεταξύ 20- 27%, σε σύγκριση με τα φυτά του μάρτυρα με ποσοστό 78%. Hεφαρμογή των βακτηρίων στις ρίζες των φυτών τομάτας ενεργοποίησε τα μονοπάτια του σαλικυλικού οξέος και του γιασμονικού οξέος/ αιθυλενίου. Συγκεκριμένα αυξήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR1, PR2, PR3 που εμπλέκονται στο μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος και των ERF1, ACO1 και TomLoxA που εμπλέκονται στο μονοπάτι του γιασμονικού οξέος/ αιθυλενίου. Ακολούθως μελετήθηκε η δράση των στελεχών αυτών ως μίγματα και η πιθανή συμβατότητά τους. Ο συνδυασμός των κατάλληλων στελεχών μεταξύ τους μπορεί να δημιουργήσει ισχυρά μίγματα βακτηρίων, με αποτέλεσμα να ενισχύσουν αθροιστικά την αποτελεσματικότητά τους στην ανάπτυξη και προστασία των φυτών, σε σύγκριση με τα μεμονωμένα στελέχη. Στην παρούσα μελέτη τα μίγματα βακτηρίων που εμφάνισαν τη βέλτιστη συμβατότητα in vitro, παρουσίασαν παράλληλα και καλύτερα αποτελέσματα στις in vivo και in planta εφαρμογές. Έτσι, τα μίγματα βακτηρίων Cal.l.30-Cal.f.4 και Cal.r.29- X, διακρίθηκαν για τη συνδυαστική τους δράση και τη βελτίωση τόσο των μορφολογικών και αναπτυξιακών χαρακτηριστικών των φυτών τομάτας, όσο και για την προστασία τους από το φυτοπαθογόνο μύκητα B. cinerea λόγω της ενεργοποίησης του μηχανισμού ISR. Επομένως, η ολοκληρωμένη μελέτη των ενδοφυτικών βακτηρίων του φαρμακευτικού φυτού C. officinalis και του ριζοσφαιρικού βακτηρίου P. carnis X από το φυτό P. vulgaris ανέδειξε σημαντικό αριθμό ανταγωνιστικών BCAs και PGP στελεχών, τα οποία μετά από κατάλληλο συνδυασμό μεταξύ τους μπορούν να αποτελέσουν ισχυρά και αποτελεσματικά μίγματα βακτηρίων.