Διευρεύνηση της σημαντικότητας της σαλμονέλλωσης του χοίρου από τον στάβλο στο τραπέζι
Authors: Ευαγγελοπούλου Γραμμάτω 
Published: August 2021

Το γένος Salmonella περιλαμβάνει παθογόνα βακτηρίδια με παγκόσμια σημασία στη Δημόσια Υγεία και την οικονομία, λόγω του άμεσου οικονομικού κόστους που προκύπτει από τα ποσοστά θνησιμότητας και θνητότητας, καθώς και των ανυπολόγιστων απωλειών σε ζωοκομικά προϊόντα. Στο είδος Salmonella enterica ανήκουν πάνω από 2.500 ορότυποι με σημασία στη Δημόσια Υγεία και τη ζωική παραγωγή. Οι ορότυποι αυτοί διαφέρουν σημαντικά ως προς το εύρος των ξενιστών τους, καθώς και ως προς τη φύση της νόσου που είναι ικανοί να προκαλέσουν. Ο χοίρος και τα προϊόντα του αποτελούν σημαντική δεξαμενή διασποράς του παθογόνου στην τροφική αλυσίδα, λόγω του ότι τα είδη του γένους Salmonella είναι ευρέως διαδεδομένα στα συστήματα παραγωγής χοίρων παγκοσμίως. Οι υποκλινικές λοιμώξεις του χοίρου με Salmonella spp. έχουν ζωονοτικό χαρακτήρα με μεγάλη σημασία στην ασφάλεια των τροφίμων, συνεπώς και στη χοιροτροφία, καθιστώντας την επιτήρηση των σαλμονελλώσεων απαραίτητη. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επιδημιολογίας των Salmonella spp. σε ελληνικές εκτροφές χοίρου, ώστε να διερευνηθεί η σημαντικότητα του χοιρινού κρέατος για τη Δημόσια Υγεία.Μετά από εκτενή μελέτη της κείμενης διεθνούς βιβλιογραφίας, αποφασίστηκε η διαδικασία της ερευνητικής μελέτης της σαλμονέλλωσης του χοίρου σε επίπεδο σφαγείου, ώστε να καθοριστεί η σημασία της μόλυνσης στη Δημόσια Υγεία.Αρχικά η μόλυνση διερευνήθηκε ορολογικά με δείγματα αίματος 314 συών και 374 χοίρων τελικής πάχυνσης από 39 εκτροφές, αγνώστου επιπέδου μόλυνσης με Salmonella spp., σε πέντε γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας (Θεσσαλία, Στερεά Ελλάδα, Β. Ελλάδα, Ήπειρος, Κρήτη). Η ορολογική διερεύνηση έγινε με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμης έμμεσης mix-ΕLISA (Herd-Check Swine Salmonella Antibody Test Kit, Idexx Laboratories, Inc., Maine, USA).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οροθετικότητα ήταν:•Μεταξύ των χοιρομητέρων 81,53% με cut off OD≥10% και 20,38% με cut off OD≥40%•Μεταξύ των χοίρων τελικής πάχυνσης 70,32% με cut off OD≥10% και 15,5% με cut off OD≥40% •Μεταξύ των εκτροφών από 0-100% με cut off OD≥10% και από 0-63,33% με cut off OD≥40%.Η οροθετικότητα των 39 εκτροφών ήταν εξαρτημένη από την επιλεγείσα τιμή cut off της ELISA. Αυτή η διερεύνηση έδειξε ότι η καλύτερη συσχέτιση μεταξύ ορολογικών μεθόδων και απομονώσεων παρατηρήθηκε για τιμή OD cut off 40%. Συγκεκριμένα το Odds Ratio για την τιμη του cut off 40% ήταν OR 2,456 (1,004 – 6,007) (95% CI), δηλαδή ένα ζώο είχε 2,456 φορές πιθανότητες να βρεθεί Salmonella spp. θετικό. Επιπλέον, η στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε τον σημαντικό επιδημιολογικό ρόλο των χοιρομήτερων στη διατήρηση και διασπορά της μόλυνσης με Salmonella, δηλαδή τον ρόλο τους στη μετάδοση του παθογόνου σε χοίρους τελικής πάχυνσης. Με βάση αυτά τα δεδομένα για cut off της OD 40% η συχνότητα εμφάνισης (επιπολασμός) της Salmonella στις χοιρομητέρες σε σχέση με τους χοίρους τελικής πάχυνσης ήταν 20,38% και 15,5% αντίστοιχα.Με δεδομένα τα ευρήματα της προκαταρκτικής οροδιερεύνησης ο σχεδιασμός της απομόνωσης του παθογόνου και της συσχέτισής του με τα ποσοστά οροθετικότητας περιορίστηκε στη Θεσσαλία, όπου τα ποσοστά των οροθετικών εκτροφών ήταν μεταξύ 0-92,6% με cut off OD≥10% και μεταξύ 0-20% (cut off OD≥40%).Για την απομόνωση και ταυτοποίηση των οροτύπων τα επιλεγμένα δείγματα εξετάστηκαν με βάση το ISO 6579:2002, Annex D για τρόφιμα και ζωοτροφές (ISO 2002). Τα δείγματα ήταν αίμα, ιστοί και κοπράνα από 123 σφάγια χοίρων τελικής πάχυνσης, που προήλθαν από 15 εκτροφές με 2.500 περίπου ζώα τελικής πάχυνσης. Δηλαδή ελέγχθηκε ορολογικά και μικροβιολογικά περίπου το 5% αυτών των ζώων. Για τον μικροβιολογικό έλεγχο των εκτροφών διερευνήθηκαν 615 δείγματα ιστών και κοπράνων. Η οροθετικότητα των εξετασθέντων ζώων συνολικά ήταν 59,35% με cut off OD≥10% και 20,33% με cut off OD≥40%, ενώ το ποσοστό των οροθετικών ζώων με βακτηριολογική επιβεβαίωση ήταν 65,11% με cut-off OD≥ 10% και 30,23% με cut-off OD≥ 40%. Διαφαίνεται ότι η ευαισθησία και η ειδικότητα της mix-ELISA είναι στατιστικά σημαντική (95% CI) με cut-off OD≥ 10%.Επιπλέον των δειγμάτων από σφάγια χοίρων, εξετάστηκαν μικροβιολογικά 378 δείγματα επιφανειών (swab samples) του σφαγείου, ώστε να διερευνηθεί ο ρόλος τους στην επιμόλυνση των σφάγιων.Από τη μικροβιολογική διερεύνηση με το ISO 6579:2002 απομονώθηκαν 265 στελέχη. Τα στελέχη αυτά ήταν Gram και οξειδάση αρνητικά, άρα ανήκαν στην οικογένεια των Εντεροβακτηριοειδών και ταυτοποιήθηκαν βιοχημικά με το API 20E (Biomerieux, France) και το MicrogenTM GnA+B-ID (Microgen Bioproducts Ltd, UK). Χαρακτηρίστηκαν ως Salmonella spp. 101 στελέχη, τα οποία ελέγχθηκαν με πολυδύναμους αντι-Ο, αντι-H και αντι-Vi ορούς και στάλθηκαν στο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Σαλμονελλών (Χαλκίδα) για πλήρη οροταυτοποίηση. Τελικά οροταυτοποιήθηκαν πλήρως 82 στελέχη (55 προερχόμενοι από ζώα και 27 από τις επιφάνειες του σφαγείου), 4 χαρακτηρίστηκαν ως ατυποποίητα, 14 αναγνωρίστηκαν βιοχημικά ως S. enterica subsp. arizonae και ένα ως S. enterica subsp. indica. Μεταξύ των αναγνωρισμένων οροτύπων ήταν οι νεοαναδυόμενοι μοναφασκοί τύποι του οροτύπου Typhimurium, S. enterica subsp. enterica ser. 4,5, 12:i:- (16 στελέχη) και S. enterica subsp. enterica ser. 4,12:i:- (9 στελέχη), οι μονοφασικοί S. enterica subsp. enterica ser. 6,7:k:- (7 στελέχη) και S. enterica subsp. enterica ser. 6,14,25:-:1,2 (ένα στέλεχος) και οι πιο σπάνιοι ορότυποι των υποειδών enterica subsp. diarizonae 61:k:1,5, S. enterica subsp. salamae 38:b:1,2 και S. enterica subsp. houtenae 40:g,t:- (ένα στέλεχος ο καθένας). Από τα λοιπά στελέχη, 38 ανήκαν στον ορότυπο Typhimurium και 12 σε άλλους οροτύπους (S. Bredeney (3 στελέχη), S. Agona, S. Derby, S. Infantis, S. Meleagridis, S. Cerro). Παρόλο που ο ορότυπος Typhimurium ήταν ο επικρατέστερος (38), η πλειοψηφία του συνόλου των λοιπών οροτύπων ανήκαν σε εκείνους που θεωρούνται αναδυόμενοι ή «εξωτικοί» όσον αφορά τη σαλμονέλλωση του ανθρώπου. Για τη διερεύνηση της σημασίας της αντιβιοαντοχής στη Δημόσια Υγεία, τα 101 στελέχη αναγνωρισμένα με τα API 20E, MicrogenTM GnA+B-ID και την οροταυτοποίηση ως Salmonella spp. διερευνήθηκαν με τη μέθοδο διάχυσης των δίσκων σε 24 αντιμικροβιακές ουσίες. Οι ουσίες ήταν: amoxicillin (30 μg), amoxicillin/clavulanic acid (20/10μg), ampicillin (10 μg), ampicillin/sulbactam (10/10 μg), aztreonam (30 μg), cefotaxime (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftazidime (30 μg), ceftiofur (30 μg), ceftriaxone (30 μg), cefuroxime (30 μg), chloramphenicol (30 μg), colistin (50 μg), doripenem (10 μg), enrofloxacin (5 μg), erythromycin (15μg), gentamycin (10 μg), kanamycin (30 μg), nalidixic acid (30 μg), penicillin G (10 μg), rifampin (30 μg), sulfamethoxazole/trimethoprim (23.75/1.25 μg), tetracycline (30 μg) και tigecycline (15 μg). Τα ευρήματα έδειξαν υψηλά ποσοστά ανθεκτικότητας σε: penicillin G (10 μg) (93%), rifampin (30 μg) (75,24%), tetracycline (30 μg) (68,31%), sulfamethoxazole/trimethoprim (23.75/1.25 μg) (61,38%), ampicillin (10 μg) (54,45%), amoxicillin (30 μg) (53,46%) και μικρότερα σε chloramphenicol (30 μg) (22,77%), kanamycin (30 μg) (14,85%) και colistin (50 μg) (11,88%).Λόγω της παρατηρούμενης υψηλής ανθεκτικότητας και της επιβολής περιορισμών στη χρήση των αντιμικροβιακών ουσιών, διερευνήθηκε η ευαισθησία 59 στελεχών με πολλαπλή ανθεκτικότητα εκ των οροταυτοποιηθέντων Salmonella spp. που απομονώθηκαν από σφάγια χοίρων, σε τρεις αναραίωτες ποσότητες (5, 15 και 30 μl) αιθέριων ελαίων από ρίγανη, δενδρολίβανο και θυμάρι. Τόσο το ριγανέλαιο όσο και το θυμαρέλαιο είχαν ισχυρή ανασταλτική επίδραση, ακόμη και για την ποσότητα των 5 μl, χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους, ενώ το έλαιο δενδρολίβανου δεν είχε καμία ή παρουσίασε μικρότερη αντιμικροβιακή δράση σε σχέση με το ριγανέλαιο και το θυμαρέλαιο. Η σύγκριση των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων αυτών των αιθέριων ελαίων με τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά για το ίδιο στέλεχος (tetracycline, amoxicillin, ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim) αποκάλυψε ότι τα αιθέρια έλαια έχουν καλύτερη αντιμικροβιακή δράση από τα χρησιμοποιηθέντα αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στην Κεντρική Ελλάδα οι χοίροι μολύνονται από τουλάχιστον 14 διαφορετικούς οροτύπους. Ο μεγάλος αριθμός διαφορετικών οροτύπων και η παρουσία σημαντικών νεοαναδυόμενων παγκοσμίως είναι η πρώτη φορά που παρατηρείται στην Ελλάδα.Συμπεραίνεται από τα αποτελέσματα αυτής της διερεύνησης ότι το κρέας του χοίρου είναι μια σημαντική πηγή σαλμονέλλωσης του ανθρώπου, όχι μόνο από συνηθισμένους οροτύπους, αλλά και από νεοαναδυόμενους, οι οποίοι εμφανίζουν υψηλή ανθεκτικότητα σε ευρέως χρησιμοποιούμενες αντιμικροβιακές ουσίες. Επιπλέον, η μελέτη έδειξε ότι ο κίνδυνος για τον άνθρωπο προέρχεται από το συγκεκριμένο ζώο που φέρει το παθογόνο στους ιστούς του και όχι λόγω διασταυρούμενης επιμόλυνσης του σφάγιου που μπορεί να συμβεί κατά τη σφαγή. Κατά τη μελέτη των ανωτέρω προέκυψαν δυσκολίες στην απομόνωση και τον βιοχημικό χαρακτηρισμό των Εντεροβακτηρίων, που χρήζουν αναφοράς, αφού επηρεάζουν τα ποσοστά θετικότητας και τον τελικό προσδιορισμό των οροτύπων που μολύνουν τον χοίρο. Μεταξύ αυτών ήταν η παρουσία λακτόζη θετικών salmonellae, τα προβλήματα ευαισθησίας των χρησιμοποιηθέντων υποστρωμάτων, καθώς και ο ρόλος του H2S στην απομόνωση Salmonella spp. από τα ζώα. Αυτά τα προβλήματα επηρεάζουν αρνητικά τον ακριβή καθορισμό του ποσοστού μόλυνσης των σφάγιων, άρα και τον καθορισμό του μεγέθους της επικινδυνότητας του κρέατος χοίρου για τον καταναλωτή.Η παρούσα μελέτη υποδεικνύει την ανάγκη συνεχούς επιτήρησης της συχνότητας εμφάνισης του παθογόνου στις ελληνικές χοιροτροφικές μονάδες, καθώς και της προσπάθειας απομόνωσής του με δειγματοληψίες κυρίως ιστών και κοπράνων, αφού το παθογόνο δείχνει τροπισμό και εγκατάσταση στον λεμφικό ιστό κυρίως. Επιπλέον, διαφάνηκε ότι η συστηματική αξιόπιστη μελέτη των σαλμονελλώσεων απαιτεί άριστα εκπαιδευμένο στη βακτηριολογία επιστημονικό προσωπικό, ώστε να εντοπίζονται και τα άτυπα στελέχη, που δεν εμπίπτουν στους κανόνες των προτεινόμενων διεθνών μεθόδων.