Ένζυμα σε ιοντικούς διαλύτες τρίτης γενιάς
Authors: Παπαδοπούλου Αθηνά 
Published: September 2021

Στόχο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της επίδρασης νέων μη συμβατικών μέσων όπως είναι τα ιοντικά υγρά 3ης γενιάς και οι βαθείς ευτηκτικοί διαλύτες στην καταλυτική συμπεριφορά οξειδοαναγωγικών και υδρολυτικών ενζύμων με απώτερο σκοπό την ανάπτυξη περιβαλλοντικά φιλικών βιοκαταλυτικών διεργασιών. Το αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον για αυτή την κατηγορία μη συμβατικών μέσων, εντάσσεται στην διαρκώς αυξανόμενη ανάγκη εισαγωγής περιβαλλοντικά φιλικών διεργασιών σε βιομηχανικές διεργασίες. Υδροξυαιθυλαμμωνικά ιοντικά υγρά 3ης γενιάς, χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη της επίδρασης της παρουσίας τους στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά του κυτοχρώματος c. Η παρουσία αυτών των διαλυτών στο μέσο της αντίδρασης αύξησε την καταλυτική δραστικότητα του κυτοχρώματος c (έως 20 φορές), αλλά και την σταθερότητά του απέναντι σε αποδιατακτικούς παράγοντες (Η2Ο2) συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Η θετική επίδραση αυτών των μέσων εξαρτάται σημαντικά από την συγκέντρωσή τους στο μίγμα της αντίδρασης καθώς επίσης και την χαοτροπικότητα του κατιόντος. Φασματοσκοπικές μελέτες ορατού υπεριώδους, κυκλικού διχρωισμού και υπερύθρου υγρών δειγμάτων έδειξαν ότι η επίδραση των ιοντικών υγρών συνδέεται με μικρές αλλαγές στην δομή του πρωτεϊνικού μορίου ή/και αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης. Η εφαρμογή των ιοντικών υγρών ως μέσα για την πραγματοποίση αντιδράσεων αποχρωματισμού οδήγησαν σε αύξηση της δραστικότητας του κυτοχρώματος έως και 4 φορές συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Όλα τα ιοντικά υγρά που μελετήθηκαν επαναχρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς έως και τέσσερις φορές. Η καταλυτική συμπεριφορά του κυτοχρώματος c μελετήθηκε περαιτέρω παρουσία βεθέων ευτηκτικών διαλυτών (DES) με οργανικά άλατα το χλωρίδιο της χολίνης (ChCl) και το χλωρίδιο του αιθυλαμμωνίου (ΕΑC) και δότες δεσμών υδρογόνου την ουρία (U), την γλυκερόλη (Gly) και την αιθυλενική γλυκόλη (EG). Η δραστικότητα του κυτοχρώματος c εξαρτάται σημαντικά, από την φύση του αμμωνιακού άλατος και του δότη δεσμών υδρογόνου του εκάστοτε DES καθώς επίσης και από την συγκέντρωσή του στο μίγμα της αντίδρασης. Η επίδραση των DES στην δραστικότητα του κυτοχρώματος συνδέεται με αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης. Επιπλέον, τα DES με βάση το EAC σταθεροποιούν το πρωτεϊνικό μόριο και αυξάνουν την δραστικότητά αποχρωματισμού του, ενώ παράλληλα μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν έως και τέσσερις φορές. Εν συνεχεία, παρασκευάστηκαν υβριδικά σκευάσματα νανοϋλικών αποτελούμενα από ιόντα χαλκού και λιπάση B από Candida antarctica γνωστά με το όρο «nanoflowers». Η δραστικότητα αυτών των σκευασμάτων μελετήθηκε σε διάφορα υδροξυαιθυλαμμωνικά ιοντικά υγρά 3ης γενιάς και DES. Η φύση των ιοντικών διαλυτών (ιοντικά υγρά και DES) επιδρά σημαντικά στην υδρολυτική και συνθετική δραστικότητα της ακινητοποιημένης λιπάσης καθώς επίσης και στην σταθερότητα και επαναχρησιμοποίηση της. Στα DES με βάση το ChCl η δραστικότητα αλλά κυρίως η σταθερότητα του ενζύμου αυξάνεται σημαντικά, συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Η επαναχρησιμοποίηση των CALBnanoflowers σε DES μπορεί να πραγματοποιηθεί αποτελεσματικά για 7 βιοκαταλυτικούς κύκλους διατηρώντας το 50 % της αρχικής τους δραστικότητας. Τελος, η μελέτη της επίδρασης ιοντικών διαλυτών (ιοντικών υγρών και DES) στην καταλυτική συμπεριφορά της τυροσινάσης από μανιτάρια Agaricus bisporus τόσο σε ελεύθερη μορφή όσο και ακινητοποιημένη (CLEAs) έδειξε ότι το ακινητοποιημένο ένζυμο παρουσίασε αυξημένη δραστικότητα παρουσία των ιοντικών υγρών και DES συγκριτικά με το ελεύθερο σκεύασμα. Η δραστικότητα του ενζύμου εξαρτάται σημαντικά από την φύση του εκάστοτε διαλύτη στο μίγμα της αντίδρασης. Η παρουσία τόσο των ιοντικών υγρών όσο και των DES σταθεροποιεί σημαντικά το ένζυμο μετά από 24 ώρες επώασης στους 40 οC. Οι διαμορφωτικές αλλαγές της πρωτεΐνης παρουσία των ιοντικών διαλυτών μελετήθηκαν μέσω της φασματοσκοπίας φθορισμού. Ο φθορισμός της πρωτεΐνης, και ως εκ τούτου τα δομικά χαρακτηριστικά, φαίνεται να επηρεάζονται σημαντικά από την φύση και την συγκέντρωση του εκάστοτε μέσου στο διάλυμα μέτρησης. Τόσο τα ιοντικά υγρά όσο και τα DES χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς ως μέσα, για την πραγματοποίηση αντιδράσεων σύνθεσης της υδροξυτυροσόλης οδηγώντας σε υψηλές αποδόσεις την αντίδραση (έως 85 %) καθώς επίσης και για την αποδόμηση της φαινόλης από την ακινητοποιημένη τυροσινάση σε συνεχούς λειτουργίας μικρο-βιοαντιδραστήρα φτάνοντας το ποσοστό αποδόμησης 95 %.