Biotechnological treatment of olive mill wastewaters-based media
Authors: Σαρρής Δημήτριος 
Published: September 2021

Στην παρούσα μελέτη, η οποία αποτελείται από τέσσερα μέρη, διερευνήθηκε η ικανότηταδύο ειδών ζυμομυκήτων, του Yarrowia lipolytica [στελέχη ACA-YC 5028, ACA-YC 5033 καιW29 (ATCC 20460)] και του Saccharomyces cerevisiae (στέλεχος MAK-1) να αυξηθούν σευποστρώματα με βάση τα υγρά απόβλητα ελαιουργίας (ΥΑΕ) ώστε να παραχθούν πολύτιμοιμεταβολίτες (βιομάζα, αιθανόλη, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια) χρήσιμοι στη ΒιομηχανικήΒιοτεχνολογία και την Τεχνολογία Τροφίμων και ταυτοχρόνως να μειωθεί η ρυπογόνος δύναμη τουαποβλήτου μέσω της μείωσης της συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων αλλά και του χρώματόςτου.Στο πρώτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα τριών στελεχών της ζύμης Y. lipolytica νααυξηθούν σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ υπό ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες,ώστε να παραχθεί βιομάζα, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια υπό συνθήκες περιοριστικές σεάζωτο [αρχική συγκέντρωσης γλυκόζης (Glc0) ~35.0 g L−1, αρχικός λόγος άνθρακα/αζώτου (C/N)~85] και υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα (Glc0~28.0 g L−1, C/N~13). Έγινε προσθήκηΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε η αρχική συγκέντρωση φαινολικώνενώσεων (Ph0) να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο), ~1.15 και ~1.55. Σημειώθηκε αποχρωματισμός (εύρος μέγιστων τιμών 45-63%) και μείωσητων φαινολικών ενώσεων (εύρος μέγιστων τιμών 13-34% w/w) στο μέσο τόσο στις ζυμώσεις υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όσο και στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα.Το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου έδειξε νααυξάνεται με την προσθήκη ΥΑΕ (εξαιρώντας το στέλεχος ACA-YC 5033). Στις καλλιέργειες υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο παράχθηκε σε ικανοποιητικές ποσότητες συνολικό κιτρικό οξύ[π.χ. μέγιστη συγκέντρωση κιτρικού οξέος (Citmax) ~18.1 g L−1, με αντίστοιχο συντελεστήαπόδοσης κιτρικού οξέος προς αναλωθείσα γλυκόζη (YCit/Glc) ~0.51 g g−1.για το στέλεχος Y.lipolytica ACA-YC 5033 σε υποστρώματα εμπλουτισμένα με ΥΑΕ]. Το ισοκιτρικό οξύπαρουσίασε μια ποσότητα της τάξης του 5 – 8% w/w του συνολικού κιτρικού οξέος πουπαράχθηκε, ανεξαρτήτα από το στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε. Η προσθήκη ΥΑΕ οδήγησε σεσοβαρή μείωση της παραγωγής του κιτρικου οξέος (τόσο σε απόλυτες τιμές συγκέντρωσης όσο καισε τιμές του συντελεστή απόδοσης) ειδικά για το στέλεχος W29. Αντίθετα, η παραγωγή τωνκυτταρικών λιπιδιών ευνοήθηκε με την προσθήκηΥΑΕ συγκρίνοντας με το πείραμα αναφοράς(χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) κυρίως για το στέλεχος W29 [μέγιστη συγκέντρωση ολικού λίπους (Lmax)~1.9 g L−1, λίπος επί ξηρής μάζας (YL/X) ~0.28 g g−1], υποδεικνύοντας πως η προσθήκη ΥΑΕ ευνόησε τη διαδικασία συσσώρευσης λίπους. Αξίζει να σημειωθεί πως στις περισσότερες ζυμώσειςυπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, παρουσιάστηκε μερική μείωση της συγκέντρωσης του παραγόμενου λίπους (υπό την έννοια τόσο των τιμών Lmax όσο και των τιμών YL/X) στην αρχή τηςστατικής φάσης αύξησης του μικροοργανισμού, ακριβώς πριν ξεκινήσει σε αυξημένεςσυγκεντρώσεις η έκκριση κιτρικού οξέος στο μέσο. Στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σεάνθρακα δεν παράχθηκε κιτρικό οξύ (όπως άλλωστε αναμενόταν) και παρά την ύπαρξηπαρεμποδιστικών παραγόντων (π.χ. φαινολικών συστατικών), η παραγωγή της βιομάζας [μέγιστησυγκέντρωση βιομάζας (Xmax) ~13.0 g L−1, συντελεστής απόδοσης βιομάζας (YX/Glc) ∼0.45 g g−1]ενισχύθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο. Υπήρξε σημαντικά υψηλότερη παραγωγήβιομάζας στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα από ότι στις ζυμώσεις υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όπως επίσης και ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήτανμεγαλύτερος στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα. Αναφορικά με την παραγωγήολικού λίπους, στις περισσότερες ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα το λίπος επίξηρής μάζας μετρήθηκε στο εύρος 5-12% w/w επί ξηρής ουσίας, υποδεικνύοντας πως δεν υπήρξεαξιοσημείωτη συσσώρευση κυτταρικων λιπιδίων υπό αυτές τις συνθήκες. Η ανάλυση των λιπαρώνοξέων των κυτταρικών λιπιδίων που παράχθηκαν, έδειξε ότι η προσαρμογή όλων των στελεχών τηςζύμης στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ έστρεψε το μεταβολισμό προς τη σύνθεση κυτταρικώνλιπιδίων που περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις κυτταρικού ελαϊκού οξέος.Δεδομένης της δυναμικής του στελέχους ACA-YC 5033 να παράγει σε υψηλές ποσότητεςκιτρικό οξύ ανεξάρτητα από την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο, στο δεύτερο μέρος τηςδιατριβής, μελετήθηκε η ικανότητα του στελέχους αυτού να αυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ (επιπλέον σε ανακινούμενες φιάλες υπό συνθήκες παστερίωσης και σε βιοαντιδραστήρα υπόσυνθήκες ασηπτικές αλλά και υπό συνθήκες παστερίωσης) σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις ΥΑΕ(και συνεπώς φαινολικών συστατικών) στο μέσο της καλλιέργειας. Σημειώθηκε αποχρωματισμός(~58%) και αξιοσημείωτη μείωση των φαινολικών ενώσεων [~51% w/w, τιμή που σημειώθηκεανέλπιστα στο πείραμα με αρχική συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων (Ph0) ~5.50 g L−1]. Η τόσουψηλή τιμή μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου ζύμωσης που σημειώθηκε, ανήκει στιςυψηλότερες τιμές που έχουν αναφερθεί ως τώρα στη διεθνή βιβλιογραφία αναφορικά με τηναύξηση ζυμών σε υπολείμματα που περιέχουν φαινολικές ενώσεις.Στις καλλιέργειες υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο (στις οποίες Citmax~19.0 g L−1,YCit/Glc~0.74 g g−1), η συγκέντρωση της Xmax μειώθηκε αναλογικά με την περιεκτικότητα σεφαινόλες, με την προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο. Αξιοσημείωτο είναι πως η προσθήκη ΥΑΕενεργοποίησε τη διαδικασία συσσώρευσης λιπιδίων (Lmax~1.0 g L−1, YL/X~0.27 g g−1) εν συγκρίσειμε το πείραμα αναφοράς, υποδεικνύοντας πως τα ΥΑΕ δείχνουν να αποτελούν ένα«ελαιοσυσσωρευτικό» υπόστρωμα. Η υψηλότερη συγκέντρωση κιτρικού οξέος που σημειώθηκε σεόλη τη μελέτη (Citmax~47.0 g L−1, YCit/Glc~0.67 g g−1), προέκυψε στη ζύμωση με την υψηλότερη προσθήκη εμπορικής γλυκόζης (Glc0~80.0 g L−1). Στα πειράματα με την υψηλότερη συγκέντρωσηφαινολικών ενώσεων (Ph0~4.50 and ~5.50 g L−1) παρουσιάστηκε σημαντική αναστολή τηςαύξησης του μικροοργανισμού αλλά η παραγωγή των κυτταρικών λιπιδίων ενεργοποιήθηκε με τηνπροσθήκη ΥΑΕ σε αυτές τις αναλογίες. Σε συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα, η παραγωγήβιομάζας ενισχύθηκε από την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις καλλιέργειες σε ανακινούμενεςφιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες και συνθήκες παστερίωσης σημειώθηκαν μη αξιοσημείωτεςαλλαγές όσον αφορά στην κινητική του μικροοργανισμού (τόσο στην παραγωγή βιομάζας οσο καιστην παραγωγή ολικού λίπους) ενώ ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν γραμμικός και στιςδύο περιπτώσεις με υψηλότερο αυτόν στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες από ότι στις ζυμώσειςυπό συνθήκες παστερίωσης. Αντίθετα, παρατηρήθηκε μείωση της παραγωγής κιτρικού οξέος στιςζυμώσεις υπό συνθήκες παστερίωσης υπό την έννοια τόσο των απόλυτων τιμών Citmax όσο και τωνσχετικών τιμών YCit/Glc. Συγκρίνοντας τα πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικέςσυνθήκες με τα αντίστοιχα πειράματα σε βιοαντιδραστήρα (που παρουσίασαν παρόμοιεςσυγκεντρώσεις Glc0 και Ph0), παρατηρήθηκε μη-αξιοσημείωτη βελτίωση στην παραγωγή βιομάζαςκαι λιπιδιών ενώ το στέλεχος παρουσίασε νωρίτερα τη στατική του φάση στις φιάλες από ότι στοβιοαντιδραστήρα. Ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν υψηλότερος στις ζυμώσεις σε φιάλες.Η παραγωγή κιτρικού οξέος μειώθηκε στις ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα (υπό την έννοια τόσο τωντιμών Citmax όσο και των τιμών YCit/Glc).Στο τρίτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 νααυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ ώστε να παραχθεί βιομάζα, αιθανόλη και κυτταρικάλιπίδια σε ανακινούμενες φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικέςσυνθήκες (σε όλες τις περιπτώσεις η σύγκριση ασηπτικών και μη ασηπτικών συνθηκώνπαρουσίασε παρόμοια κινητική). Στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικές συνθήκες, έγινε προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε ηPh0 να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο),~1.20, ~2.00 και~2.90. Για κάθε Ph0 προστέθηκε στο μέσο ποσότητα γλυκόζης ώστε η αρχικήσυγκέντρωσή αυτής να είναι (σε g L−1): ~40.0, ~55.0 και ~75.0 . Τόσο η μέγιστη συγκέντρωσηαρχικής γλυκόζης που επιλέχθηκε, όσο και οι αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων,αναφέρονται στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις που μπορεί να βρεθούν σε τυπικά ΥΑΕ παραγόμενααπό διάφορες μεθόδους πίεσης του ελαιοκάρπου. Στις καλλιέργειες με ανακινούμενες φιάλες υπόασηπτικές συνθήκες, η προσθήκη ΥΑΕ αύξησε θεαματικά την παραγωγή βιομάζας παρά τογεγονός ότι, όπως αναφέρθηκε, τα ΥΑΕ περιέχουν ανασταλτικούς παράγοντες. Η υψηλότερη τιμήΧmax που σημειώθηκε ήταν ~19.0 g L−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 (ενώΧmax~11.0 g L−1 σημειώθηκε στο αντίστοιχο πείραμα αναφοράς). Επίσης, όπως αναμενόταν, με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης στο μέσο, παρατηρήθηκε και αύξηση της παραγωγήςτης βιομάζας. Σημαντικό σημείο αποτελεί το γεγονός ότι μετά την ολική κατανάλωση της γλυκόζηςτου μέσου, η αιθανόλη που είχε παραχθεί άρχισε να καταναλώνεται προς νέα παραγωγή βιομάζαςκαι σε αρκετές περιπτώσεις δε, παρατηρούταν η ανακατανάλωση όλης της ποσότητας τηςπροηγούμενης συντιθέμενης αιθανόλης. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης (EtOHmax) πουπαράχθηκε στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες ήταν ~26.0 g L−1 με συντελεστή απόδοσηςαιθανόλης (YEtOH/Glc) ~0.36 g g−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 ενώ ουψηλότερος συντελεστής απόδοσης αιθανόλης ήταν ~0.47 g g−1 (με αντίστοιχη μέγιστησυγκέντρωση αιθανόλης ~17.0 g L−1) στο πείραμα με Glc0~40.0 g L−1 και Ph0~2.00 g L−1. Ηπροσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο έως μία συγκεκριμένη αναλογία ευνόησε την παραγωγή τηςαιθανόλης. Λαμβάνοντας υπ’όψιν το συντελεστή απόδοσης αιθανόλης, σημειώνεται πωςσημαντικά υψηλότερη τιμή αυτού παρατηρήθηκε στη ζύμωση με Ph0~2.0 g L−1, συνθήκες οι οποίεςεπιλέχθηκαν για προσαρμογή της πειραματικής διαδικασίας σε ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα.Συγκρίνοντας τις ζυμώσεις σε φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες (Glc0~40.0 g L−1, Ph0~0.00 g L−1 καιGlc0~75.0 g L−1, Ph0~2.90 g L−1) με τις αντίστοιχες υπό μη ασηπτικές συνθήκες, σημειώνεται πως δεν παρατηρήθηκε διαφορά τόσο στην παραγωγή βιομάζας όσο και στην παραγωγή αιθανόλης.Αναφορικά με τις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα έγινε σύγκρισηπειράματος αναφοράς (ζύμωση χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) υπό ασηπτικές και υπό μη ασηπτικέςσυνθήκες χωρίς να παρατηρηθεί αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική του μικροοργανισμού.Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση του αερισμού (0.0, 0.5, 1.0 και 1.5 vvm) της καλλιέργειας καιδεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική. Λόγω των παραπάνω παρατηρήσεωνεπιλέχθηκαν (για λόγους μείωσης κόστους) οι μη-ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό για τησυνέχεια των πειραμάτων με την προσθήκη στο μέσο ΥΑΕ, γεγονός το οποίο οδήγησε σεαξιοσημείωτη αύξηση της βιομάζας χωρίς όμως να επηρεάσει τη βιοσύνθεση της αιθανόλης.Σημειώνεται επίσης πως, οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα παρουσίασανυψηλότερες ποσότητες αιθανόλης και χαμηλότερες βιομάζας εν συγκρίσει με τα αντίστοιχαπειράματα των ανακινούμενων φιαλών. Τέλος, προκειμένου να αυξηθεί η συγκέντρωση τηςπαραγόμενης αιθανόλης πραγματοποιήθηκε ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικέςσυνθήκες χωρίς αερισμό με αρχική συγκέντρωση γλυκόζης ~115.0 g L-1 και αρχική συγκέντρωσηφαινολικών ενώσεων ~2.90 g L-1 με EtOHmax~52.0 g L-1 (YEtOH/Glc~0.46 g g−1). Σημειώθηκε αξιοσημείωτος αποχρωματισμός (~63%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (~34% w/w) στομέσο. Για μια δεδομένη αρχική συγκέντρωση γλυκόζης, αναφορικά με τις ζυμώσεις σεανακινούμενες φιάλες, το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεωντου μέσου αυξήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις τιμές αποχρωματισμού και μείωσης φαινολικών ενώσεων στα πειράματα σε φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με αυτές τωναντίστοιχων ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες, συμπεραίνεται ότι ήτανπαρόμοιες. Η ανάλυση των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων (παράχθηκαν σε ποσότηταμικρότερη του 10% w/w επί ξηρής ουσίας), έδειξε ότι στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ τακυτταρικά λιπίδια περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος, κάτι πουβρίσκεται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα πειράματα του πρώτου μέρους αυτής της μελέτης όπουμελετήθηκαν τα κυτταρικά λιπίδια του μικροοργανισμού Y. lipolytica.Στο τέταρτο μέρος, ερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 νααυξηθεί σε μίγματα ΥΑΕ και μελάσας, ώστε να παραχθεί βιομάζα και αιθανόλη σε ανακινούμενεςφιάλες και βιοαντιδραστήρα υπό αερόβιες και αναερόβιες, μη ασηπτικές συνθήκες. Τα ΥΑΕχρησιμοποιήθηκαν ταυτοχρόνως τόσο ως υπόστρωμα της ζύμωσης όσο και ως νερό της διεργασίαςκαι η μελάσα ως χαμηλού κόστους υπόστρωμα για τον εμπλουτισμό των ήδη υπαρχόντωνσακχάρων των ΥΑΕ προς την ενίσχυση της παραγωγής προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Η λογικήτης χρήσης μιγμάτων ΥΑΕ και μελάσας ήταν η μελέτη της επίδρασης των μιγμάτων αυτών στηφυσιολογία και την συμπεριφορά της κινητικής του στελέχους, καθώς σε ενδεχόμενη κλιμάκωσημεγέθους των ζυμώσεων, τα ΥΑΕ θα μπορούσαν να αντικαταστήσουν το νερό που χρησιμοποιείται για την αραίωση της μελάσας στη διαδικασία βιοτεχνολογικής επεξεργασίας και αξιοποίησής της.Πραγματοποιήθηκαν προκαταρτικά πειράματα σε υποστρώματα μελάσας αραιωμένα με νερό[αρχική συγκέντρωση ολικών σακχάρων (TS0) ~100.0 g L-1, χωρίς την προσθήκη ΥΑΕ] υπόαερόβιες ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες για να αξιολογηθεί η προσθήκη διαλύματοςμεταλλικών αλάτων (η σύσταση της μελάσας περιλαμβάνει μη αμελητέα ποσότητα μεταλλικώνστοιχείων). Η προσθήκη μεταλλικών αλάτων στο μέσο επηρέασε αρνητικά την παραγωγή τηςβιομάζας και της αιθανόλης, επομένως η πρακτική αυτή εξαιρέθηκε από τη συνέχεια τωνπειραμάτων. Κατόπιν, ζυμώσεις με μίγματα μελάσας και ΥΑΕ (προσθήκη 10% v/v) σεανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες συγκρίθηκαν με αντίστοιχες καλλιέργειες υπό μηασηπτικές συνθήκες. Η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης ήταν ελαφρώς υψηλότερη και ησυγκέντρωση της βιομάζας χαμηλότερη στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες. Ταπροαναφερθέντα πειράματα υπό μη ασηπτικές συνθήκες θεωρήθηκαν ικανοποιητικά γεγονός τοοποίο οδήγησε στην εφαρμογή μη ασηπτικών συνθηκών στις υπόλοιπες ζυμώσεις. Στη συνέχειαεκτελέστηκαν πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με μίγματα