Μελέτη των μυκοβακτηριδίων στην Κρήτη. Ανίχνευση, ταυτοποίηση, φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος ευαισθησίας
Authors: Γκίτη Ζωή 
Published: January 2014

Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση της φυματίωσης με βάση νέες μεθοδολογίες άμεσης ανίχνευσης του μυκοβακτηριδίου σε κλινικό δείγματα που αφορούν την ταυτοποίηση στελεχών και την ανίχνευση της αντοχής σε αντιμικροβιακούς παράγοντες. Η παρούσα μελέτη ανέλυσε όλα τα δείγματα που εστάλησαν στο Εργαστήριο Μυκοβακτηριολογίας του Πανεπιστημικού Νοσοκομείου Ηρακλείου για καλλιέργειες από τον Ιανουάριο 2000 έως το Δεκέμβριο 2007, χωρισμένες σε δύο επιμέρους τετραετείς περιόδους (α 2000-2003 και β 2004-2007,) και οι ασθενείς διαχωρίστηκαν σε δύο ομάδες, Έλληνες και μετανάστες για λόγους αναλυτικότερης επεξεργασίας και σύγκρισης δεδομένων. Με στόχο την γρήγορη και αξιόπιστη διάγνωση των μυκοβακτηριώσεων εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό κλασσικές και σύγχρονες μοριακές τεχνικές, οι οποίες και αξιολογήθηκαν. Εξετάσθηκαν 9542 διαδοχικά δείγματα στα οποία πραγματοποιήθηκε οξεάντοχη χρώση, καλλιέργειες σε υλικό Lowenstein-Jensen και ενοφθαλμίστηκαν στο αυτοματοποιημένο σύστημα υγρών καλλιεργειών BacT/Alert 3D. Επιπλέον, διενεργήθηκαν και αξιολογήθηκαν στα ύποπτα και θετικά με οξεάντοχη χρώση δείγματα οι τρεις πιο σύγχρονες εμπορικές τεχνικές για άμεση ανίχνευσης μυκοβακτηριδίων σε δείγμα GenProbe (bioMerieux), GenoType MycobacteriumDirect και GenoType MTBDRplus (Hain-Lifescience). Για την ταυτοποίηση του M. tuberculosis και των άτυπων μυκοβακτηριδίων εφαρμόσθηκαν οι μέθοδοι υβριδισμού: Accuprobe (bioMerieux) και Genotype Mycobacterium CM και AS, και Genotype MTBC (Hain-Lifescience). Για την επιβεβαίωση των σπανίων και καινούργιων στελεχών χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι αναφοράς: η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου και η ανάλυση του γονιδίου heat shock 65kD με τη μεθοδολογία ανάλυσης πολυμορφισμού μήκους με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Από τα ανωτέρω δείγματα απομονώθηκαν, τυποποιήθηκαν και ελέγχτηκαν για αντοχή 320 στελέχη που περιελάμβαναν 179 Mycobacterium tuberculosis complex και 141 άτυπα που ανήκαν σε 19 είδη μυκοβακτηριδίων (51 ταχέως και 90 βραδέως αναπτυσσόμενα). Από τα 179 Μ. tb.complex, το ένα τυποποιήθηκε ως Μ. bovis. Ο έλεγχος ευαισθησίας για τα στελέχη M. tuberculosis προσδιορίσθηκε με τη κλασική μέθοδο αναλογιών σε υλικό Lowenstein-Jensen και στο αυτοματοποιημένο σύστημα BacT/AlerT 3D. Εφαρμόσθηκαν και οι καινούργιες εξετάσεις ανίχνευσης γόνου αντοχής έναντι των αντιφυματικών φαρμάκων ριφαμπικήνη (RMP) και ισονιαζίδη (INH) (Genotype MTBDRplus) και της εθαμβουτόλης (ΕΜΒ), τις φλουοροκινολόνες και αμυνογλυκοσίδες (Genotype MTBDRsl). Οι δημογραφικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι ασθενείς με φυματίωση που εξετάσθηκαν ήταν το 73,7% από την Κρήτη και οι υπόλοιποι από 11 χώρες. Εκατό σαράντα έξη στελέχη (81,%) ήταν ευαίσθητα σε όλα τα αντί-φυματικά φάρμακα ενώ 33 (18,4%) ήταν ανθεκτικά σε ?1 φάρμακο. Μόνο σε μία περίπτωση βρέθηκε πολυανθεκτικό στέλεχος (0,56%). Η αντοχή στην Ισονιαζίδη και σε ?2 αντιφυματικά φάρμακα αυξήθηκε σημαντικά από 2,9% στο 16% (p=0,002)και από 2,9% στο 12% (p=0,03) κατά τις δύο περιόδους. Βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ Ελλήνων και μεταναστών όσον αφορά τις αντοχές έναντι ΙΝΗ, στρεπτομυκίνης και πάρα-αμινο-σαλικυλικού οξύ. Η αντιστοιχία των αποτελεσμάτων της μοριακής τεχνικής ανίχνευσης γόνων αντοχής MTBDRplus και την κλασική μέθοδο αναλογιών ήταν 93,3% και 100% για την ΙΝΗ και για τα πολυανθεκτικά στελέχη (MDR), αντίστοιχα. Παρότι η πολυανθεκτική φυματίωση βρέθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα στην Κρήτη, η αυξανόμενη συχνότητα της γενικής αντοχής υπογραμμίζει την ανάγκη για βελτίωση της επιτήρησης της νόσου. Για τα άτυπα μυκοβακτηρίδια η αντοχή ελέγχτηκε με τη μέθοδο του Ε-test. Η ανάλυση των 51 ταχέως αναπτυσσόμενων μυκοβακτηριδίων έδειξε: 26 Μ. fortuitum, 9 M. peregrinum, 7 M. chelonae, 5 M. abscessus, 1 M. thermoresistible, 2 M. mucogenicum και 1 M. europaeum. Το στέλεχος Μ.thermoresistible είναι το πρώτο που έχει απομονωθεί στην Ευρώπη και το έβδομο παγκοσμίως. Το στέλεχος Μ.GN-10643, μαζί με άλλα δύο στελέχη, συνιστά καινούργιο είδος άτυπου μυκοβακτηρίδιου το οποίο ονομάσθηκε M.europaeum. Τα 90 βραδέως αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδια περιελάμβαναν: 24 M. avium, 4 M. intracellulare, 1 M. scrofullaceum, 4 M. kansasii, 1 M. marinum,1 M. malmons, 1 M. xenopi, 10 M. lentiflavum, 29 M. gordonae, 2 M. arupense, 12 M. GN01 και M. GN-9680. Κατά τη διάρκεια της μελέτης ανακαλύφτηκαν στο εργαστήριο καινούργια στελέχη άτυπων μυκοβακτηριδίων και για το λόγο αυτό προτάθηκε η ονομασία τους σε:1) Mycobacterium herakleense (M.GN01), 2) Mycobacterium hellenicum, M.GN-9680, 3) Mycobacterium create (M.GΝ-11124). Επίσης, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τα δύο πολύ σπάνια άτυπα μυκοβακτηρίδια Μ. arupense (Μ.GN-9722 και M.GN-10546). Ta καινούργια στελέχη, όπως και τα πολύ σπάνια κατοχυρώθηκαν στη GenBank. Τα τρία καινούργια στελέχη κατατέθηκαν και σε δύο διαφορετικά, διεθνή κέντρα φύλαξης βακτηριδίων προς ερευνητική χρήση. Σε όλα τα άτυπα μυκοβακτηρίδια πραγματοποιήθηκε έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκοβακτηριακά φάρμακα με τη μέθοδο του Ε-test