Mechanisms of subcellular membrane trafficking
Authors: Παπαδάκη Γεωργία 
Published: September 2021

Οι μεταφορείς, είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες μέσω των οποίων πραγματοποιείται η διακίνηση θρεπτικών συστατικών, μορίων σηματοδοτών ή άλλων ουσιών εντός και εκτός του κυττάρου. Αυτό τις καθιστά απαραίτητα μόρια για την επικοινωνία του κυττάρου με το περιβάλλον. Τα τελευταία χρόνια, γενετικά, βιοχημικά και βιοφυσικά δεδομένα που προέρχονται από τη μελέτη αρκετών μεταφορέων, συνέβαλλαν στην κατανόηση των σχέσεων δομής λειτουργίας και των μηχανισμών αναγνώρισης και μεταφοράς υποστρώματος. Παρά τις εξελικτικές, δομικές και λειτουργικές διαφορές τους, όλοι οι μεταφορείς χρησιμοποιούν έναν κοινό μηχανισμό εναλλασσόμενης πρόσβασης, όπου μια θέση πρόσδεσης υποστρώματος εναλάσσεται μεταξύ πολλαπλών διαμορφώσεων προκειμένου να μεταφέρει ένα υπόστρωμα από τη μία πλευρά της μεμβράνης στην άλλη. Αυτός ο βασικός μηχανισμός που διεξάγεται από δυναμικές κινήσεις του κύριου διαμεμβρανικού σώματος και υποβοηθείται από την ευελιξία υδρόφιλων βρόχων, συναντάται σε διάφορες παραλλαγές, γνωστές ως rocker-switch, rocking-bundle και μηχανισμός elevator. Μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες δευτερογενών μεταφορέων είναι η υπεροικογένεια amino acid/polyamine/organocation (APC), η οποία περιλαμβάνει μεταφορείς που λειτουργόυν ως συμμεταφορείς διαλυτής ουσίας κατιόντος και αντιμεταφορείς διαλυτών ουσιών με μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων. Η οικογένεια Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) αποτελεί μία από τις πιο καλά μελετημένες υποοικογένειες της APC υπεροικογένειας, και εκπρόσωποί της συναντώνται σε προκαρυωτικούς οργανισμούς, μύκητες και μερικά φυτά. Αυτό οφείλεται στην πληθώρα γενετικών και βιοχημικών δεδομένων που αφορούν μέλη της οικογένειας σε μύκητες, καθώς και σε εκτεταμένες δομικές και βιοφυσικές μελέτες ενός βακτηριακού ομολόγου, του συμμεταφορέα υδαντοΐνης/Na+, Mhp1. Η οικογένεια NCS1 δεν έχει αντιπροσώπους στα θηλαστικά, κάτι που την καθιστά ιδανική για τη στόχευση ειδικών φαρμάκων κατά των μικροβιακών παθογόνων. Οι μεταφορείς της οικογένειας NCS1 αποτελούνται από 12 διαμεμβρανικά τμήματα (ΔΤ) με δομή α έλικας, που συνδέονται με σχετικά μικρές ενδιάμεσες αλληλουχίες και έχουν κυτταροπλασματικά αμινο και καρβοξυτελικά άκρα. Τα ΔΤ1 10 οργανώνονται σε μια δομή ανεστραμμένης επανάληψης ανά 5 (5-helix intertwined inverted repeat; 5HIRT) που ονομάζεται αλλιώς και LeuT-fold, και συναντάται σε μεταφορείς πολλών διαφορετικών οικογενειών που εμπλέκονται στη μεταφορά νευροδιαβιβαστών, σακχάρων, αμινοξέων ή φαρμάκων. Τα δύο τελευταία διαμεμβρανικά τμήματα (11 και 12) μερικών μεταφορέων που έχουν παρόμοια δομή με τον LeuT, φαίνεται να εμπλέκονται στον ολιγομερισμό, παρά στο μηχανισμό λειτουργίας τους αυτό καθαυτό. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για το δομικό ή/και λειτουργικό τους ρόλο. Μεταφορείς που ανήκουν στην οικογένεια NCS1 στους μύκητες, είναι από τους πιο καλά μελετημένους σε γενετικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο. Δομικά μοντέλα μυκητιακών μεταφορέων NCS1 βασίζονται σε πολλές διακριτές κρυσταλλικές δομές του βακτηριακού ομολόγου Mhp1 και υποστηρίζονται από γενετικές μελέτες που προκαθόρισαν τη θέση δέσμευσης του υποστρώματος και τα πιθανά στοιχεία που δρουν σαν πύλες, καθορίζοντας την εξειδίκευση. Πιο συγκεκριμένα, ένα σημαντικό εύρημα που προέρχεται από έρευνα του εργαστηρίου μας πάνω στους μυκητιακούς μεταφορείς της NCS1 οικογένειας (τόσο σε μέλη της Fcy όσο και της Fur υποοικογένειας) είναι ότι η εξειδίκευση δεν καθορίζεται μόνο από κατάλοιπα που βρίσκονται στο σημείο πρόσδεσης του υποστρώματος (ΔΤ1, ΔΤ3, ΔΤ6 ή ΔΤ8) αλλά και από δυναμικές κινήσεις του τμήματος ΔΤ9 ΔΤ10 που δρα σαν εξωκυτταρική πύλη.Σε αυτή τη διατριβή, παρέχουμε πειραματικά και in silico δεδομένα που αποδεικνύουν ότι η ενδοκύτωση, η λειτουργία και περιέργως η εξειδίκευση του FurE, ενός μεταφορέα του Aspergillus nidulans που ανήκει στην NCS1 οικογένεια και μεταφέρει ουρακίλη-αλλαντοΐνη και ουρικό οξύ, εξαρτάται από δυναμικές αλληλεπιδράσεις των άμινο και καρβοξυτελικών άκρων μεταξύ τους και με το βασικό σώμα του μεταφορέα. Πιο συγκεκριμένα, τα καρβοξυτελικά άκρα εμπλέκονται σε ενδομοριακές δυναμικές αλληλεπιδράσεις που είναι απαραίτητες για την εκλεπτυσμένη ρύθμιση των πυλών που ελέγχουν την επιλογή των υποστρωμάτων. Πραγματοποιώντας Μοριακές Δυναμικές (ΜΔ) και αναλύσεις μεταλλαγών στο γονίδιο του μεταφορέα, υποθέσαμε ότι αυτό συμβαίνει μέσω αλληλεπιδράσεων των κυτταροπλασματικών ουρών με ενδοκυττάριες θηλιές, οι οποίες με τη σειρά τους επηρεάζουν τη διαδικασία διαλογής υποστρωμάτων μέσω των πυλών στην εξωκυττάρια πλευρά της πλασματικής μεμβράνης. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται άμεσα από το pH. Στη συνέχεια, αξιοποιώντας τις πληροφορίες από εκτεταμένες αναλύσεις ΜΔ, πραγματοποιήσαμε συστηματική και στοχευμένη λειτουργική ανάλυση μεταλλαγών στο μόριο του μεταφορέα FurΕ, προκειμένου να χαρακτηρίσουμε το μονοπάτι μετατόπισης του υποστρώματος κατά τη διάρκεια της μετάβασής του από τις διακριτές διαμορφώσεις του. Επιπροσθέτως, παρέχουμε πειραματικά στοιχεία που δείχνουν πως η ταυτότητα των αμινοξέων που απαρτίζουν τα δύο τελευταία ΔΤ του FurE, δεν καθορίζει την κατάλυση της μεταφοράς. Ωστόσο, ένα συντηρημένο κατάλοιπο τυροσίνης είναι απολύτως απαραίτητο για τη σωστή στόχευση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη. Στο τελευταίο μέρος αυτής της δουλειάς, συνδυάζουμε βιοφυσικές τεχνικές και υπολογιστικές μεθόδους για να καταλάβουμε σε βάθος το μηχανισμό που διέπει το λειτουργικό ρόλο των κυτταροπλασματικών άκρων στη διαλογή και μεταφορά του υποστρώματος, κάτι που φαίνεται να αντικατοπτρίζει ένα γενικότερο μηχανισμό που χαρακτηρίζει τους μεταφορείς της APC υπεροικογένειας. Το σύνολο της διατριβής αυτής, υποστηρίζει την ευρύτερη ιδέα ότι το μέγεθος των άκρων των ευκαρυωτικών μεταφορέων αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, προσδίδοντας περισσότερους διακριτούς τρόπους ρύθμισης της λειτουργίας τους.