Prostate cancer, radiotherapy and immune response
Authors: Ξανθοπούλου Ερασμία 
Published: July 2023

Θεωρητικό Υπόβαθρο: Ο καρκίνος του προστάτη συνιστά τη δεύτερη συχνότερη κακοήθεια στους άνδρες, με τις κλασσικές θεραπευτικές προσεγγίσεις που εφαρμόζονται για τη θεραπεία να περιλαμβάνουν τη ριζική προστατεκτομή και την Aκτινοθεραπεία, οι οποίες προσφέρουν υψηλά ποσοστά ίασης στα αρχικά στάδια της νόσου. Εντούτοις, παρά την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών, δεν υπάρχει σημαντική πρόοδος στον καρκίνο του προστάτη που να υπόσχεται καλύτερα αποτελέσματα και βελτιωμένη πρόγνωση. Ο ρόλος της ανοσοθεραπείας στον καρκίνο του προστάτη βρίσκεται υπό διερεύνηση. Ένα από τα πιο καλά μελετημένα μονοπάτια ανοσολογικής διαφυγής των καρκινικών κυττάρων αποτελεί το μονοπάτι PD-L1/PD-1, το οποίο και αποτέλεσε και ένα κύριο στόχο μελέτης στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Ταυτόχρονα, στοχεύσαμε στη μελέτη της επίδρασης διαφορετικών σχημάτων ακτινοθεραπείας στο ανοσολογικό μονοπάτι Τύπου Ι Ιντερφερόνης (ΙFN), ένα μονοπάτι με εξέχοντα ρόλο στην ενεργοποίηση ανοσολογικών αποκρίσεων που στοχεύουν στον όγκο. Τέλος, στόχο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η ανάλυση του συνόλου των ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της ακτινοθεραπείας και του ρόλου στη συστηματική ανοσοαπόκριση που διαδραματίζει η ακτινοθεραπεία, σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που υποβάλλονται σε ακτινοθεραπεία και πώς διαφορετικά πεδία σχημάτων ακτινοθεραπείας επιδρούν στην ανοσία κατά του όγκου.Μεθοδολογία: Για τον σκοπό αυτό συσχετίσαμε το σύνολο των παραγόντων του μικροπεριβάλλοντος του όγκου που οδηγούν στην ενεργοποίηση του μορίου PD-L1 στον καρκίνο του προστάτη, με τη μελέτη της έκφραση του μορίου σε 66 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, ταυτόχρονα με τη παρουσία δεικτών σχετιζόμενων με την υποξία ή/ και την οξέωση (επαγώγιμος παράγοντας υποξίας HIF1α, και γαλακτική αφυδρογονάση LDHA), με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Ταυτόχρονα, εκτιμήθηκε η παρουσία και η πυκνότητα διηθούντων τον όγκο λεμφοκυττάρων και μακροφάγων. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες σε τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, τις 22Rv1, DU145 και PC3, για να αναδειχθεί η συσχέτιση με την υποξία, την οξέωση, την ακτινοβολία και τις αλληλεπιδράσεις των καρκινικών κυττάρων με τα λεμφοκύτταρα, στην επαγωγή του μορίου PD-L1. Στην μελέτη της επίδρασης ακτινοβολίας στην επαγωγή του μονοπατιού Τύπου Ι Ιντερφερόνης (ΙFN), επιδράσαμε με δύο διαφορετικές κλασματοποιήσεις ακτινοβολίας; 3 ημερήσια κλάσματα των 8Gy έναντι ενός εφάπαξ κλάσματος των 20Gy, στις τρεις κυτταρικές σειρές του καρκίνου του προστάτη. Τέλος, για τη μελέτη της επαγώμενης από την ακτινοβολία συστηματικής ανοσοαπόκρισης σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, εστιάσαμε σε τρεις ομάδες ασθενών, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε διαφορετικά σχήματα ακτινοθεραπείας; i. τους ασθενείς που υπεβλήθησαν σε εντοπισμένο πεδίο ακτινοθεραπείας στην περιοχή του προστάτη, ii. τους ασθενείς που υπεβλήθησαν σε εκτεταμένο πεδίο ακτινοβολίας στην περιοχή του προστάτη, των σπερματοδόχων κύστεων και των πυελικών λεμφαδένων, και iii. σε ασθενείς που υπεβλήθησαν σε μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εξαιτίας βιοχημικής υποτροπής οι οποίοι υποβλήθηκαν επίσης σε εκτεταμένα πεδία ακτινοθεραπείας. Οι αιμοληψίες των ασθενών πραγματοποιήθηκαν στην αρχή και στο τέλος της Ακτινοθεραπείας, ενώ από το ολικό περιφερικό αίμα των ασθενών απομονώθηκαν τα περιφερικά μονοκύτταρα, τα οποία εν συνεχεία χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των επιπέδων ανοσολογικών βιοδεικτών με την τεχνική της Κυτταρομετρίας ροής.Αποτελέσματα: Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση ιστών καρκίνου προστάτη από 56 ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε προστατεκτομή έδειξε την ύπαρξη μεμβρανικής έκφρασης της PD-L1 σε τουλάχιστον 1% των καρκινικών κυττάρων σε 13/56 (23.2%) περιπτώσεις οι οποίες θεωρήθηκαν και θετικές. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εξέφραζαν PD-L1 κυμαινόταν από 1-60% (διάμεση τιμή 5%). 8/56 (14.3%) περιπτώσεις εξέφραζαν PD-L1 σε 1-9% και 5/56 (8.9%) σε 10-60% των καρκινικών κυττάρων. PD-L1 εξέφραζαν επίσης και τα λεμφοκύτταρα και μακροφάγα που διηθούσαν τους όγκους (TILMs) σε 17/56 (30.3%) δείγματα, τα οποία και θεωρήθηκαν θετικά. Σε 8/56 (14.3%) περιπτώσεις, PD-L1+ TILMs παρατηρήθηκαν σε <10% των οπτικών πεδίων, και σε 9/56 (16.1%) PD-L1 >10% των οπτικών πεδίων που εξετάσθηκαν. Η έκφραση του PD-L1 στα καρκινικά κύτταρα ήταν συνδεδεμένη με την έκφραση στα TILMs σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0.05). Δεν παρατηρήσαμε συσχέτηση μεταξύ της έκφρασης του PD-L1 στα καρκινικά κύτταρα και TILMs με το Gleason score ή το T-stage. Επιπλέον, κατά την ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση των ιστικών δειγμάτων, τόσο η κυτταροπλασματική όσο και η πυρηνική έκφραση του HIF1α ήταν εμφανής σε 36 περιπτώσεις (64,3%), η έκφραση των οποίων παρουσίασε διακύμανση από 0 έως 100% (διάμεση τιμή 30%), ενώ ιδιαίτερα υψηλή έκφραση παρατηρήθηκε σε 21 περιπτώσεις. Η κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση του μορίου LDH5 ανιχνεύθηκε σε 45 περιπτώσεις, οι οποίες και πάλι παρουσίασαν διακύμανση από 0 έως 100% (διάμεση τιμή 70%), ενώ ιδιαίτερα υψηλή έκφραση παρατηρήθηκε σε 32 περιπτώσεις. Η υψηλή έκφραση στα καρκινικά κύτταρα των μορίων HIF1α και LDH5 σχετίζεται άμεσα με την έκφραση του PD-L1. Στις περιπτώσεις όπου η έκφραση του PD-L1 ήταν υψηλή, το μέσο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που ήταν θετικά για τον HIF1α ήταν 60%, ενώ ήταν μόλις 20% στις περιπτώσεις όπου ανιχνεύθηκε χαμηλή έκφραση (p<0,01. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για το LDH5, όπου ήταν 90% στις περιπτώσεις όγκων με υψηλά επίπεδα έκφρασης του PD-L1, έναντι 30% στις περιπτώσεις με χαμηλή έκφραση (p<0,05). Παρ' όλα αυτά, δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των μορίων HIF1α και LDH5, με την έκφραση του PD-L1 στα ΤΙLMs. Η πυκνότητα των λεμφοκυττάρων που διηθούνται από τον όγκο παρουσίασε μια διακύμανση από 6-520 λεμφοκύτταρα ανά οπτικό πεδίο x200, με τη διάμεση τιμή να εκτιμάται σε 96, καθορίζοντας έτσι τις δύο ομάδες ασθενών με καρκίνο του προστάτη, εκείνες με υψηλή και χαμηλή πυκνότητα TILMs. Στις 21 περιπτώσεις με υψηλά επίπεδα έκφρασης του HIF1α, 6 (28,5%) παρουσίασαν υψηλή πυκνότητα λεμφοκυττάρων που διηθούν τον όγκο, ενώ από τις 45 περιπτώσεις με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του HIF1α, 22 (48,9%) παρουσίασαν υψηλή πυκνότητα λεμφοκυττάρων που διηθούν τον όγκο (p<0,05), ενώ δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της LDH5 και της αντίστοιχης πυκνότητας λεμφοκυττάρων που διηθούν τον όγκο. Η δημιουργία κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη sh22Rv1, shDU145, shPC3 με μόνιμη καταστολή της έκφρασης του HIF1α (σταθερά διαμολυσμένες) επιβεβαιώθηκε με την τεχνική Real-Time PCR, όπου παρατηρήθηκε σημαντικά μειωμένη γονιδιακή έκφραση και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (στην κυτταρική σειρά 22Rv1 παρατηρήθηκε 3,3 φορές μείωση σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου, p<0. 001- η DU145 παρουσίασε μείωση των επιπέδων έκφρασης κατά 4,76 φορές σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου, p<0,001- η PC3 παρουσίασε τη μέγιστη μείωση κατά 7,14 φορές σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου, p<0,001), ενώ, η διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη με μη κωδικοποιούσα αλληλουχία δεν έδειξε καμία επίδραση στα επίπεδα έκφρασης του HIF1α σε καμία περίπτωση (nc22Rv1, ncDU145, ncPC3).Στην ανάλυση Ανοσοαποτυπώματος κατά Western, η έκθεση των καρκινικών κυτταρικών σειρών του προστάτη σε υποξία είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1 και στις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές άγριου τύπου, αλλά και στις nc-κυτταρικές σειρές (η καρκινική κυτταρική σειρά άγριου τύπου 22Rv1 έδειξε 2.75-πλάσια αύξηση των επιπέδων, p<0,001- nc22Rv1 2,34-πλάσια αύξηση των επιπέδων έκφρασης p<0,01- ομοίως η γραμμή άγριου τύπου DU145 παρουσίασε 2,84-πλάσια αύξηση p<0,001- και ncDU145 2,63-πλάσια αύξηση p<0. 01- η σειρά PC3 παρουσίασε 3,69-πλάσια αύξηση των επιπέδων έκφρασης p<0,001- και η σειρά ncPC3 3,25-πλάσια αύξηση p<0,001), ενώ αντίθετα μειωμένα ή σταθερά επίπεδα βρέθηκαν στις σειρές με μόνιμη καταστολή της έκφρασης του HIF1α shHIF1α (η sh22Rv1 παρουσίασε 1. 1-πλάσια μεταβολή p=NS- η σειρά shDU145 παρουσίασε μείωση των επιπέδων έκφρασης κατά 2,24 φορές p<0,001- η κυτταρική σειρά shPC3 παρουσίασε μείωση κατά 2,43 φορές p<0,001).Η έκθεση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη άγριου τύπου DU145 και PC3 σε χρυσίνη σε συγκέντρωση 5 μmol/L για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης HIF1α, όπου παρατηρήθηκε με ανάλυση Ανοσοαποτυπώματος κατά Western (παρατηρήθηκε μείωση στο DU145 κατά 1,96 φορές σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου p<0,01- αντίστοιχη μείωση εντοπίστηκε στο PC3 κατά 2,08 φορές σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου p<0,01). Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές (μείωση ανιχνεύθηκε στο DU145 κατά 2,32 φορές p<0,001- μείωση ανιχνεύθηκε στο PC3 κατά 2 φορές σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου p<0,001).Και οι τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές αγρίου τύπου, οι nc και οι shHIF1a κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε: α. ακτινοβόληση με ακτινοβολία 20Gy, β. καλλιέργεια σε θρεπτικό μέσο που ελήφθη από τις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές δύο ημέρες μετά την ακτινοβόληση και γ. καλλιέργεια σε θρεπτικό μέσο DMEM επωασμένο με περιφερικά μονοκύτταρα αίματος που καλλιεργήθηκαν εξίσου για 2 ημέρες. Στη συνέχεια, μετά από δύο ημέρες, πραγματοποιήθηκε ανάλυση Ανοσοαποτυπώματος κατά Western για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1. Τόσο η ακτινοβόληση όσο και η επώαση των καρκινικών κυτταρικών σειρών με θρεπτικό μέσο DMEM από προ-ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα δεν είχαν καμία επίδραση στα επίπεδα του PD-L1. Ωστόσο, το μέσο που προέκυψε από την καλλιέργεια περιφερικών μονοκυττάρων αίματος οδήγησε σε ισχυρή επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (στην κυτταρική σειρά 22Rv1 2,98 φορές, p<0,001- στην κυτταρική σειρά nc22Rv1 1,95 φορές, p<0,001- στην κυτταρική σειρά sh22Rv1 1,95 φορές, p<0,001- στην κυτταρική σειρά sh22Rv1 3,84 φορές, p<0. 001- στην κυτταρική σειρά DU145 παρατηρήθηκε αύξηση 2,29 φορές, p<0,001- όπως και στην ncDU145 αύξηση 3 φορές, p<0,001- και ομοίως, στην shDU145 2,84 φορές, p<0,001- στη σειρά PC3 αύξηση 3,4 φορές, p<0,001- με τη σειρά ncPC3 να παρουσιάζει επίσης αύξηση 3,83 φορές, p<0,001- όπως τέλος, στη σειρά shPC3 αύξηση 3,28 φορές p<0,01).Η έκθεση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη για 48 ώρες σε 25 ng/ml IFNγ είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1 και στις τρεις καρκινικές σειρές άγριου τύπου και τις nc (στην κυτταρική σειρά 22Rv1 άγριου τύπου ανιχνεύθηκε αύξηση κατά 3,27 φορές, p<0. 001- στην αντίστοιχη κυτταρική σειρά nc 2,84 φορές, p<0,01- στην κυτταρική σειρά DU145 άγριου τύπου 2,8 φορές αύξηση, p<0,001- και στην αντίστοιχη κυτταρική σειρά nc 2,38 φορές, p<0,001- στην καρκινική σειρά PC3 άγριου τύπου 2,02 φορές, p<0,01- και στην κυτταρική σειρά nc 2 φορές, p<0,01). Το ίδιο φαινόμενο, παρατηρήθηκε και στις τρεις κυτταρικές σειρές shHIF1α (στην sh22Rv1 2,36-πλάσια αύξηση, p<0,001- στην shDU145 2,89-πλάσια αύξηση, p<0,001- και στην shPC3 2,86-πλάσια αύξηση, p<0,001). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν επίσης με την τεχνική PCR πραγματικού χρόνου, όπου τα επίπεδα έκφρασης mRNA του PD-L1 αυξήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές άγριου τύπου, nc και shHIF1a (στην 22Rv1 ανιχνεύθηκε αύξηση 2,9 φορές, p<0,001- στην nc22Rv1 αύξηση 2,6 φορές, p<0. 01- στην κυτταρική σειρά sh22Rv1 αύξηση 2,19 φορές, p<0. 001. Ομοίως, στην κυτταρική σειρά DU145 παρατηρήθηκε αύξηση 3,5 φορές, p<0,001. Στην κυτταρική σειρά ncDU145 αύξηση 2,7 φορές, p<0,001. Στην shDU145 αύξηση 2,8 φορές, p<0,001. Και τέλος, στην PC3 αύξηση 2 φορές, p<0,01. Όπως και στην ncPC3 αύξηση 2,7 φορές, p<0,001 και στην shPC3 αύξηση 2,5 φορές, p<0,001).Στα πειράματα μελέτης επαγωγής του Μονοπατιού Τύπου Ι Ιντερφερόνης, η έκφραση της πρωτεΐνης IFNβ δεν φάνηκε να επάγεται σε κανένα από τα δύο σχήματα ακτινοβόλησης και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη 22Rv1, DU145 και PC3, γεγονός που υποστηρίζεται από το γεγονός της μειωμένης έκφρασης της πρωτεΐνης cGAS στις κυτταρικές σειρές 22Rv1 και DU145. Παρ' όλα αυτά, παρατηρήθηκε μια μικρή αύξηση της έκφρασης της cGAS στην ορμονοευαίσθητη κυτταρική σειρά PC3 (p<0,05). Η ανάλυση Ανοσοαποτυπώματος κατά Western για την πρωτεΐνη TREX1 δεν έδειξε καμία επίδραση της ακτινοβολίας στην ορμονοεξαρτώμενη κυτταρική σειρά 22Rv1. Ωστόσο, ιδιαίτερη έκπληξη προκαλεί η διαπίστωση ότι τα βασικά επίπεδα της πρωτεΐνης TREX1 ήταν σημαντικά υψηλότερα στην κυτταρική σειρά 22Rv1 σε σύγκριση με την DU145 και, ειδικότερα, με την PC3, η οποία παρουσίαζε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα TREX1 (στην κυτταρική σειρά 22Rv1 παρατηρήθηκε αύξηση κατά 2,63 φορές και 3,42 φορές, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την DU145 και την PC3). Η πρωτεΐνη TREX1 παρουσίασε αύξηση των βασικών επιπέδων της στην κυτταρική σειρά DU145 μόνο μετά από κλάσμα ακτινοβόλησης 20Gy (p<0,01), ενώ στην PC3, η πρωτεΐνη TREX αυξήθηκε και από τα δύο προγράμματα ακτινοβόλησης (1,28-πλάσια αύξηση για τη συνθήκη ακτινοβόλησης 3x8Gy και 1,3-πλάσια αύξηση για τη συνθήκη ακτινοβόλησης 20Gy, σε σύγκριση με την αντίστοιχη κυτταρική σειρά ελέγχου). Ωστόσο, ακόμη και το μέγιστο παρατηρούμενο επίπεδο έκφρασης που επιτεύχθηκε ήταν σημαντικά χαμηλότερο από τα αντίστοιχα βασικά επίπεδα που παρατηρήθηκαν στις κυτταρικές σειρές 22RV1 και DU145, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα της PCR πραγματικού χρόνου των επιπέδων έκφρασης mRNA των γονιδίων IFNβ, cGAS και TREX1 δεν έδειξαν καμία επίδραση των δύο συστημάτων ακτινοβολίας σε καμία από τις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (Εικόνες 23A,B,C). Ωστόσο, υπήρξε σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που διεγείρονται από την IFNβ, η οποία παρατηρήθηκε και στις τρεις κυτταρικές σειρές και μετά από τα δύο σχήματα ακτινοβολίας (p<0,05). Το πιο εντυπωσιακό εύρημα παρατηρήθηκε για τα γονίδια IFI62V και IFI44, όπου εντοπίστηκε έντονη αύξηση και στις τρεις κυτταρικές σειρές, με την κυτταρική σειρά 22Rv1 να παρουσιάζει 2,98 φορές αύξηση για τη συνθήκη 3x8Gy και 3,41 φορές για τη συνθήκη 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου για την έκφραση του γονιδίου IFI62V και 2,7 φορές αύξηση για τη συνθήκη 3x8Gy και 3,4 φορές για τη συνθήκη 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου για την έκφραση του γονιδίου IFI44. Παρομοίως, στην κυτταρική σειρά DU145, παρατηρήθηκε 2,24-πλάσια αύξηση των βασικών επιπέδων για τη συνθήκη 3x8Gy για την έκφραση IFI62V και 2,95-πλάσια αύξηση για 3x8Gy και 2,11-πλάσια αύξηση για 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου για την έκφραση IFI44 (p<0,001). Παράλληλα, παρατηρήθηκε μια εντυπωσιακά σημαντική αύξηση των βασικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων MX1 και MX2 στην κυτταρική σειρά PC3. Συγκεκριμένα, υπήρξε αύξηση κατά 1,86 φορές στα 3x8Gy και κατά 2,61 φορές στα 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου για την έκφραση MX1 και αύξηση κατά 3,23 φορές στα 3x8Gy και κατά 3,86 φορές στα 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου για την έκφραση MX2. Όσον αφορά την έκφραση του γονιδίου IFI62V, παρατηρήθηκε 2,87-πλάσια αύξηση στα 3x8Gy και 3,27-πλάσια αύξηση στα 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου και, τέλος, για το γονίδιο IFI44, ανιχνεύθηκε 2,67-πλάσια αύξηση στα 3x8Gy και 2,61-πλάσια αύξηση στα 20Gy σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά ελέγχου (p<0,001).Η ανάλυση ανοσολογικών βιοδεικτών στα περιφερικά μονοκύτταρα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη που υπεβλήθησαν σε ακτινοθεραπεία έδειξε μια άμεση συσχέτιση του πλάνου δόσης ακτινοβολίας στη διέγερση των δεικτών. Τα ποσοστιαία επίπεδα των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε σε τέσσερις από τους πέντε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη ακτινοθεραπεία. Αντίθετα, παρατηρήθηκε αύξηση στους τρεις από τους τέσσερις και στους πέντε από τους πέντε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ριζική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου και μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου, αντίστοιχα. Ταυτόχρονα, σημειώθηκε σημαντική μείωση του ποσοστιαίου επιπέδου των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων μετά την ακτινοθεραπεία, σε σύγκριση με τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου (p=0,02). Το ποσοστιαίο επίπεδο των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων αυξήθηκε σε τέσσερα από τα πέντε περιστατικά που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη ακτινοθεραπεία. Αντίθετα, αυτό αυξήθηκε σε δύο από τα τέσσερα και μειώθηκε σε δύο από τα τέσσερα περιστατικά που έλαβαν θεραπεία με ριζική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου. Στους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου μείωση παρατηρήθηκε σε τέσσερις από τις πέντε περιπτώσεις. Η αύξηση του ποσοστιαίου επιπέδου των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων μετά την ακτινοθεραπεία δεν έφθασε σε στατιστικά σημαντικά επίπεδα.Η αναλογία CD4/CD8 Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε και στους πέντε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη ακτινοθεραπεία. Αντίθετα, αυτή αυξήθηκε και στις τέσσερις περιπτώσεις και μειώθηκε στις τέσσερις από τις πέντε σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ριζική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου και μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου, αντίστοιχα. Μετά την εντοπισμένη ακτινοθεραπεία παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του λόγου CD4/CD8 σε σύγκριση με τους ασθενείς που έλαβαν ριζική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου (p=0,01) ή μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου (p=0,05).Το ποσοστό των ρυθμιστικών CD4/CD25/Foxp3+ Τ-κυττάρων παρέμεινε σταθερό και στους πέντε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη ακτινοθεραπεία. Αντίθετα, αυτό αυξήθηκε στα τρία από τα τέσσερα και μειώθηκε στα δύο από τα πέντε περιστατικά των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με ριζική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου ή μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία εκτεταμένου πεδίου, αντίστοιχα. Αναφορικά με τη διαφορά μεταξύ του ποσοστιαίου επιπέδου των CD4/CD25/Foxp3+ Τ-λεμφοκυττάρων μετά από την ακτινοθεραπεία συγκριτικά με πριν την έναρξή της, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές μεταξύ των τριών ομάδων ασθενών.Συζήτηση: Στην παρούσα μελέτη, εκτιμήθηκε η έκφραση του PD-L1 στα καρκινικά κύτταρα του όγκου σε περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη, όπου εντοπίστηκε έκφραση στο 25% των περιπτώσεων, ενώ στα διηθούντα του όγκου λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα η έκφραση ήταν στο 30% των καρκινωμάτων του προστάτη που εξετάστηκαν (Xanthopoulou et al., 2023). Για να συμβάλουμε στη διαλεύκανση των ενδεχόμενων αλληλεπιδράσεων μεταξύ του μικροπεριβάλλοντος του όγκου και της έκφρασης του PD-L1 στον καρκίνο του προστάτη, διερευνήσαμε την έκφραση των γονιδίων HIF1α και LDHA που σχετίζονται με συνθήκες υποξίας/οξέωσης. Παρατηρήθηκε άμεση και ισχυρή συσχέτιση της έκφρασης του PD-L1 με την υπερέκφραση και των δύο δεικτών. Στη συνέχεια, μια σειρά από πειράματα in vitro σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη επιβεβαίωσαν το παραπάνω εύρημα. Η υποξία, κυρίως και όχι η οξέωση, οδήγησε στην επαγωγή της έκφρασης του μορίου PD-L1, σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, τόσο στις ορμονοανεξάρτητες κυτταρικές σειρές DU145, PC3 όσο και στην ορμονοεξαρτώμενη σειρά 22Rv1. Είναι προφανές λοιπόν, ότι η υποξία στο μικροπεριβάλλον του όγκου οδηγεί σε υπερέκφραση του PD-L1 από τα καρκινικά κύτταρα και, ταυτόχρονα, καταστέλλει την πυκνότητα των λεμφοκυττάρων που διηθούνται από τον όγκο, ένα εύρημα που υπερτονίζει το φαινόμενη της ενδοογκικής ανοσοκαταστολής. Δεδομένων των πειραματικών αποτελεσμάτων που έχουν δημοσιευτεί στη βιβλιογραφία και υποδηλώνουν ότι η PD-L1 βρίσκεται υπό άμεσο μεταγραφικό έλεγχο από τον HIF1α, επιδιώξαμε περαιτέρω να διερευνήσουμε τον ρόλο του HIF1α στην μεσολαβούμενη από την υποξία επαγωγή της PD-L1. Για τον σκοπό αυτό, δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές προστάτη με μόνιμη αποσιώπηση του γονιδίου HIF1α χρησιμοποιώντας συστήματα λεντοϊικών συστημάτων 2ης γενιάς. Σε αντίθεση με τις αντίστοιχες του άγριου τύπου, το PD-L1, τόσο το mRNA, όσο και η πρωτεΐνη δεν επάγονται στα κύτταρα shHIF1α όταν εκτίθενται σε υποξικές συνθήκες, επιβεβαιώνοντας τον άμεσο έλεγχο της έκφρασης του PD-L1 από τον παράγοντα HIF1α (Xanthopoulou et al., 2023). Επιπλέον, εκθέσαμε τα αρχικά κύτταρα και τα κύτταρα με την καταστολή σε 50 μmol/L του αναστολέα σταθερότητας του HIF1α, Chrysin, ο οποίος οδήγησε στην καθοδική ρύθμιση όχι μόνο του HIF1α, αλλά και του μορίου PD-L1, υποστηρίζοντας το σενάριο της άμεσης συσχέτισης μεταξύ αυτών των δύο μορίων στον καρκίνο του προστάτη (Xanthopoulou et al., 2023). Μια άλλη υπόθεση που εξετάσαμε στη μελέτη μας ήταν ότι ο ανοσογόνος θάνατος από ακτινοβολία και αν οι αλληλεπιδράσεις με τα λεμφοκύτταρα μπορεί επίσης να εμπλέκονται στην έκφραση του PD-L1 στον καρκίνο του προστάτη. Παρόλο που η άμεση ακτινοβόληση των καρκινικών κυττάρων δεν οδήγησε σε ενεργοποίηση της έκφρασης του μορίου PD-L1, η καλλιέργεια καρκινικών κυτταρικών σειρών με μη επεξεργασμένες καλλιέργειες μονοκυττάρων περιφερικού αίματος που προέρχονται από υγιή δότη προκάλεσε την επαγωγή του PD-L1 τόσο στις γονικές όσο και στις shHIF1α κυτταρικές σειρές. Επομένως, επιβεβαιώσαμε ότι εκεί εντοπίζονται διαλυτοί παράγοντες που απελευθερώνονται από τα λεμφοκύτταρα και μπορούν να επάγουν την έκφραση του PD-L1 σε καρκινικά κύτταρα μέσω μονοπατιών ανεξάρτητων από την υποξία και τη λειτουργικότητα του HIF1α (Xanthopoulou et al., 2023).Για να ελέγξουμε περαιτέρω την υπόθεσή μας, επωάσαμε τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με την κυτταροκίνη IFNγ. Στα πειράματά μας, παρατηρήσαμε ισχυρή επαγωγή της PD-L1, από την IFNγ, τόσο σε κυτταρικές σειρές άγριου τύπου όσο και σε αποσιωπημένες κυτταρικές σειρές με HIF1α. Παρόλο που δεν συσχετίσαμε άμεσα τη δράση της ακτινοβολίας με την έκφραση του μορίου PD-L1, η επαγόμενη από την ακτινοβολία φλεγμονώδης απόκριση μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στην επαγωγή του PD-L1 σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που έλαβαν ακτινοθεραπεία. Παράλληλα, η υποξία οδηγεί στην αύξηση της έκφρασης του PD-L1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη μέσω του εξαρτώμενου από τον HIF1α μηχανισμού, ενώ η IFNγ και μια ποικιλία άλλων παραγόντων που απελευθερώνονται από τα περιφερικά μονοκύτταρα του αίματος ενισχύουν τον παραπάνω φαινότυπο, ανεξάρτητα από τη λειτουργία του HIF1α. Εάν το φαινόμενο αυτό ενταθεί κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας των ασθενών με καρκίνο του προστάτη, τότε η ανοσοθεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν στην οδό PD-L1/PD-1 θα αποδειχθούν κρίσιμα για την ανοσολογική απόρριψη του ακτινοβολημένου καρκίνου του προστάτη (Xanthopoulou et al., 2023). Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματά μας, προτείνουμε ότι η έκφραση του μορίου PD-L1 καθοδηγείται από δύο ανεξάρτητα μοριακά μονοπάτια- το πρώτο εξαρτάται άμεσα από το υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου και το δεύτερο συσχετίζεται άμεσα με την απελευθέρωση κυτταροκινών, όπου καθοδηγούμενη από τα διηθούντα του όγκου λεμφοκύτταρα και τα μονοκύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τον εντοπισμό συγκεκριμένων κυτταρικών συστατικών των περιφερικών μονοκυττάρων του αίματος που επάγουν την έκφραση του PD-L1 (Xanthopoulou et al., 2023). Σε ένα ιδιαίτερα υποξικό μικροπεριβάλλον, το οποίο αναστέλλει τη λειτουργία και το πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων στην περιοχή του όγκου, απαιτείται η στόχευση των υποξικών συνθηκών με παράγοντες αποκλεισμού του HIF1α για την ενίσχυση της ανοσοθεραπείας κατά του PD-L1. Αυτό θα μπορούσε να επιτρέψει την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος και να προωθήσει τη διήθηση του όγκου από τα κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα (Xanthopoulou et al., 2023). Οι μη-υποξικοί όγκοι που διηθούνται πυκνά από λεμφοκύτταρα θα μπορούσαν να επωφεληθούν από την ανοσοθεραπεία με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν το μόριο PD-L1, καθιστώντας τα ευάλωτα στα κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα που εκφράζουν το PD-1.Η μελέτη του ρόλου της ακτινοθεραπείας στην πρόκληση της απόκρισης της ιντερφερόνης τύπου Ι, αποτέλεσε μια πρόκληση, για τη διαλεύκανση των επιδράσεων της ακτινοθεραπείας ως προς τον ραδιοεμβολιασμό. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την αντίληψη ότι η ακτινοθεραπεία επάγει άμεσα την οδό της ιντερφερόνης τύπου Ι στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, ρυθμίζοντας ανοδικά τα γονίδια που διεγείρονται από την Ιντερφερόνη, ανεξάρτητα από την επαγωγή των μορίων IFNβ και cGAS. Τόσο το πλάνο ακτινοβόλησης 3x8Gy όσο και τα μεμονωμένα κλάσματα των 20Gy είχαν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των IFI62V και IFI44, μορίων που διεγείρονται από την IFN και στις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές του προστάτη, και ειδικά στην κυτταρική σειρά PC3, παρατηρήθηκε επίσης εντυπωσιακή ρύθμιση των γονιδίων MX1 και MX2. Στην παρούσα μελέτη, δεν εντοπίσαμε άμεση ρύθμιση των μορίων TREX1 και cGAS σε κανένα από τα δύο σχήματα ακτινοβόλησης. Ωστόσο, παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων που προκαλούνται από την IFN και στα δύο σχήματα. Αξίζει να σημειωθεί εδώ, ότι ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά στα βασικά επίπεδα του TREX1 μεταξύ των καρκινικών σειρών, με την κυτταρική σειρά PC3 που είχε τα χαμηλότερα βασικά επίπεδα να παρουσιάζει αύξηση των επιπέδων του TREX μετά την ακτινοβόληση. Αυτά τα επαγόμενα επίπεδα TREX στη σειρά PC3 ήταν, ωστόσο, πολύ χαμηλότερα από τα αντίστοιχα βασικά επίπεδα που παρατηρήθηκαν στις άλλες δύο κυτταρικές σειρές. Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή αναστολή της απόκρισης της IFN τύπου Ι λόγω μιας συνισταμένης ανοδικής ρύθμισης της TREX1 σε ορισμένες κυτταρικές σειρές, η οποία επιβεβαιώθηκε με πειράματα RT-PCR. Επιπρόσθετα, από τα αποτελέσματά μας φάνηκε ότι η επαγωγή των γονιδίων που διεγείρονται από την IFN δεν εξαρτάται από τη ρύθμιση των μορίων IFNβ και cGAS.Είναι, επομένως, προφανές ότι η χρήση υποκλασματοποιημένης ακτινοθεραπείας 8Gy ή μεμονωμένων κλασμάτων 20Gy, παρόμοιων με αυτά που χρησιμοποιούνται στην αφαιρετική στερεοτακτική ακτινοθεραπεία (SBRT), οδηγεί σε σημαντική επαγωγή της οδού IFN τύπου I, ανεξάρτητα από την ίδια την IFN και τα ανοδικά της γονίδια. Κατά συνέπεια, τα ανοσοδιεγερτικά μονοπάτια φαίνεται να επάγονται είτε μέσω συμβατικών κλασματοποιημένων σχημάτων ακτινοθεραπείας είτε μέσω υπερ-υποκλασματοποιημένης ακτινοθεραπείας, γεγονός που δημιουργεί νέες προκλήσεις για την ανάπτυξη πρακτικών ανοσο-ακτινοθεραπείας για τη θεραπεία ασθενών με εντοπισμένο και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη.Τα αποτελέσματα της μελέτης μας στις επιδράσεις της ακτινοβολίας στη συστηματική ανοσολογική απόκριση στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του προστάτη μέσω κυτταρομετρίας ροής ανέδειξαν έναν πιθανό ρόλο των T-βοηθητικών/ρυθμιστικών και T-κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων στην κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε μείωση των CD4+ T-βοηθητικών/ρυθμιστικών κυττάρων στους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη χαμηλού κινδύνου που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη ακτινοθεραπεία κατευθυνόμενη στον προστάτη και τις σπερματοδόχες κύστεις. Αντίθετα, τα CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν στους ασθενείς αυτούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μειωμένη αναλογία CD4/CD8 που παρατηρήθηκε σε αυτούς τους ασθενείς αντανακλά την ενίσχυση της ανοσολογικής απάντησης κατά του όγκου. Οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ακτινοβολία εκτεταμένου πεδίου στην περιοχή του προστάτη και των πυελικών λεμφαδένων παρουσίασαν αύξηση του υποπληθυσμού CD4+. Ταυτόχρονα, τα CD8+ κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα παρέμειναν σταθερά ή μειώθηκαν στους μισούς από τους ασθενείς που εξετάστηκαν. Ο λόγος CD4/CD8 αυξήθηκε στους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με στους λεμφαδένες, γεγονός που υποδηλώνει ανοσοκαταστολή πιθανώς λόγω της ακτινοβόλησης των λεμφαδένων ή της εκτεταμένης συμμετοχής του μυελού των οστών και του αίματος στο πλάνο της θεραπείας. Ωστόσο, και στις τρεις ομάδες που μελετήθηκαν, ανιχνεύθηκαν σταθερά επίπεδα CD4/CD25/Foxp3+ Τ-κυττάρων πριν και μετά από διαφορετικά σχήματα θεραπείας με ακτινοβολία. Λαμβάνοντας υπόψη τα προαναφερθέντα δεδομένα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι σχετικές μεταβολές των ανοσολογικών βιοδεικτών μετά από ακτινοθεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη είναι σημαντικές και προβλέπουν μονοπάτια ανοσοκαταστολής που θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για την ανάπτυξη στρατηγικών ανοσοθεραπείας σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία. Η ακτινοβολία καθαυτή προκαλεί την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι και προάγει τη διήθηση λεμφοκυττάρων που καθιστά τους όγκους του προστάτη ευαίσθητους στην ανοσοθεραπεία. Η διαστρωμάτωση των ασθενών ανάλογα με τα επίπεδα υποξίας και ανοσολογονικότητας του μικροπεριβάλλοντος του όγκου παράλληλα με την κατάσταση έκφρασης του PD-L1 από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αποτελέσει σημαντική βάση για τη διεξαγωγή κλινικών δοκιμών με στόχο τον εντοπισμό ομάδων ασθενών όπου η ανοσοθεραπείας με μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν στην οδό PD-L1/PD-1 θα μπορούσε να βελτιώσει την επιβίωση ασθενών με καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, η χρησιμότητα των παραγόντων στόχευσης της υποξίας σε συνδυασμό με την ανοσοθεραπεία προκύπτει ως σημαντική πρόταση για την θεραπεία συγκεκριμένων ομάδων ασθενών.