Έκφραση πρωτεϊνών θερμικής καταπληξίας και πρωτεϊνικών κινασών στην παθολογική καρδιά
Authors: Καραμανώλη Ευαγγελία 
Published: August 2021

Εισαγωγή: Οι θυρεοειδ ικές ορμόνες ασκούν πολλαπλές επιδράσεις στο μυοκάρδιο που δυνητικά θα μπορούσαν να το καταστήσουν λιγότερο ανθεκτικό στο ισχαιμικό στρες σε σχέση με το φυσιολογικό μυοκάρδιο. Εντούτοις καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες παρουσιάζουν διαφορετική απάντηση, όταν υποβάλλονται σε ισχαιμία σε σχέση με τις καρδιές φυσιολογικών επιμύων, εμφανίζοντας εντονότερη και γρηγορότερη ισχαιμική σύσπαση και αυξημένη αντοχή στην ισχαιμία. Είναι πιθανόν είτε η θυρεοειδική ορμόνη per se μέσω πρόσδεσής της στους πυρηνικούς θυρεοειδικούς υποδοχείς είτε οι παρατηρούμενες λειτουργικές και μεταβολικές μεταβολές κατά τον υπερθυρεοειδισμό να επάγουν αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μορίων που μπορούν να δράσουν προστατευτικά κατά την ισχαιμία. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της προσαρμοστικής απάντησης της υπερθυρεοειδικής καρδιάς στην ισχαιμία. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η βασική έκφραση των πρωτεϊνών PKCô και ε και HSP70, η επαγωγή του mRNA HSP70 και η ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ μετά από εφαρμογή ολικής ισχαιμίας μηδενικής ροής-επαναιμάτωσης και η κινητική της ενεργοποίησης των ρ38 ΜΑΡΚ και JNKs κατά τη διάρκεια ισχαιμίας και ισχαιμίας- επαναιμάτωσης.Μέθοδοι: Υπερθυρεοειδισμός προκλήθηκε σε άρρενες επίμυες Wistar με χορήγηση θυροξίνης (250pg/kg) για 14 ημέρες. Σε μια πρδιτη ομάδα πειραμάτων καρδιές από φυσιολογικούς και υπερθυρεοειδικούς επίμυες που δεν υποβλήθηκαν σε κανένα πειραματικό πρωτόκολλο (Φ και Θ) μελετήθηκαν για την ανίχνευση της βασικής έκφρασης των πρωτεϊνών PKCÔ και ε και HSP70 με τη μέθοδο του Western blotting και ανοσοανίχνευσης. Μια δεύτερη ομάδα πειραμάτων περιελάμβανε τη χορήγηση θυροξίνης (250pg/kg) σε επίμυες για 14 ημέρες (Θι4ημ) και για 2 ημέρες (Θτημ), ενώ επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός για τα αντίστοιχα χρονικά διαστήματα (Φΐ4ημ και Φ2ημ) χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Υπερτροφία από περίδεση αορτής προκλήθηκε σε επίμυες (Υπέρ) και εικονικώς χειρουργημένοι επίμυες (EX) χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Οι θυρεοειδικές ορμόνες (Τλ και Τ4) μετρήθηκαν στο πλάσμα με RIA. Καρδιές από τις ανωτέρο) ομάδες υποβλήθηκαν σε πρωτόκολλο 20 min ολικής ισχαιμίας μηδενικής ροής-45 min επαναιμάτωσης. Για την εκτίμηση της καρδιακής λειτουργίας και της απάντησης στην ισχαιμία χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος μελέτης απομονωμένης καρδιάς κατά Langendorff. Η καρδιακή λειτουργία εκτιμήθηκε από την αναπτυσσόμενη πίεση της αριστερής κοιλίας (LVDP) και η λειτουργική ανάκαμψη μετά από την ισχαιμία εκτιμήθηκε από την LVDP στο τέλος της επαναιμάτωσης (LVDP45) εκφρασμένη ως % της αρχικής τιμής LVDP0 (LVDP%). Η ανάπτυξη καρδιακής υπερτροφίας εκτιμήθηκε με το δείκτη βάρος αριστερής κοιλίας/βάρος ζώου (ΒΑΚ/ΒΖ). Η μελέτη της έκφρασης του mRNA HSP70 και της ενεργοποίησης της ρ38 ΜΑΡΚ μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση έγινε με τις μεθόδους Northern blotting-υβριδισμού και Western blotting-ανοσοανίχνευσης αντίστοιχα. Σε μια τρίτη ομάδα πειραμάτων με σκοπό τη μελέτη της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης χορηγήθηκε θυροξίνη για 14 ημέρες σε άρρενες επίμυες Wisrar, ενώ επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός για το ίδιο χρονικό διάστημα χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Απομονωμένες καρδιές από φυσιολογικούς και υπερθυρεοειδικούς επίμυες αναρτήθηκαν στη συσκευή Langendorff και υποβλήθηκαν α) σε σταθεροποίηση 20 min μόνο (Φσταθ και Θσταθ), β) σε σταθεροποίηση 20 min και σε 10 ή 20 min ισχαιμίας (Φ101, Θ101, Φ20Ι και Θ20Ι) και γ) σε σταθεροποίηση 20 min και σε 20 min ισχαιμίας ακολουθούμενα από 10, 20. ή 43 min επαναιμάτωσης (Φ20Ι/10Ε, Θ20Ι/10Ε, Φ20Ι/20Ε, Θ20Ι/20Ε, Φ20Ι/45Ε και Θ20Ι/45Ε). Η μελέτη της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs στις παραπάνιο πειραματικές ομάδες έγινε με τη μέθοδο του Western blotting-ανοσοανίχνευσης. Αποτελέσματα: Η βασική έκφραση των ΡΚΟδ και ε και της HSP70 μεταβλήθηκε μετά από χορήγηση θυροξίνης στους επίμυες για 14 ημέρες. Η έκφραση της ΡΚΟδ ήταν 1.7 φορές μεγαλύτερη στις καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες από ότι στις καρδιές από φυσιολογικούς επίμυες (ρ<0.01 ). Αντίθετα, η έκφραση της ΡΚΟε ήταν 1.6 φορές μεγαλύτερη στις φυσιολογικές από ότι στις υπερθυρεοειδικές καρδιές (ρ<0.01). Η έκφραση της HSP70 βρέθηκε 2.1 φορές μεγαλύτερη στις υπερθυρεοειδικές σε σχέση με τις φυσιολογικές καρδιές (ρ<0.05). Οι θυρεοειδικές ορμόνες βρέθηκαν αυξημένες στο αίμα ζώων μετά από χορήγηση θυροξίνης για 2 και για 14 ημέρες (Θ2ημ και ©ΐ4ημ) σε σχέση με φυσιολογικά ζώα. Οι καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες 14 ημερών (Θ]4ημ) παρουσίασαν καρδιακή υπερτροφία (ΒΑΚ/ΒΖ=3.1 έναντι 2.5 στους Φι4ημ, ρ<0.05), ενώ η χορήγηση θυροξίνης για 2 ημέρες δεν οδήγησε σε ανάπτυξη καρδιακής υπερτροφίας. Καρδιακή υπερτροφία αναπτύχθηκε, επίσης, σε επίμυες μετά από περίδεση αορτής (Υπέρ), (ΒΑΚ/ΒΖ=2.8 έναντι 2.5 στους EX. ρ<0.05). Στις Θι4ημ καρδιές παρατηρήθηκε αυξημένη συσταλτικότητα (LVDP0=127.6 mmHg έναντι 1 10.7 mmHg στις Φΐ4ημ, ρ<0.05), ενά) δεν παρατηρήθηκε το ίδιο στους Θ2ημ επίμυες σε σχέση με τους Φ2ημ. Επίσης, αυξημένη συσταλτικότητα παρατηρήθηκε στις υπερτροφικές καρδιές επιμύων (Υπέρ) μετά από περίδεση αορτής (LVDP0= 132.6 mmHg έναντι 97.6 mmHg στις EX. ρ<0.05). Οι Θ|4ημ καρδιές παρουσίασαν αυξημένη μεθισχαιμική ανάκαμψη (LVDP%=54.9 έναντι 37.2 των Φι4ημ. ρ<0.05), ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο LVDP% ούτε μεταξύ Θ2ημ και Φ2ημ επιμύων ούτε μεταξύ Υπέρ και EX επιμύων. Βασική έκφραση του mRNA HSP70 δεν ανιχνεύτηκε σε καμία από τις πειραματικές ομάδες. Η έκφραση του mRNA HSP70 μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση ήταν 2.3 φορές μεγαλύτερη στις Θ|4ιιμ καρδιές σε σύγκριση με τις Φι4ημ (ρ<0.05) και 1.8 φορές μεγαλύτερη στις Υπέρ καρδιές σε σχέση με τις EX καρδιές (ρ<0.05). Δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην έκφραση του mRNA HSP70 στις 02ημ καρδιές σε σχέση με τις Φ2ημ. Η ρ38 ΜΑΡΚ βρέθηκε να ενεργοποιείται μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση 2.2 φορές περισσότερο στις Φ|4ημ καρδιές σε σχέση με τις Θι4ημ (ρ<0.05), ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ μεταξύ καρδιών 02 ημ και Φ2ημκαι μεταξύ Υπέρ και EX καρδιών. Τα αποτελέσματα της κινητικής της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs έχουν ως εξής: η φωσφορυλιωμένη ρ38 ΜΑΡΚ βρέθηκε μειωμένη στις υπερθυρεοειδικές καρδιές σε σχέση με τις φυσιολογικές τόσο κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας όσο και κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Οι JNKs βρέθηκαν να ενεργοποιούνται μόνο κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων ρ46 και ρ54 JNKs βρέθηκαν μειωμένα στις υπερθυρεοειδικές σε σχέση με τις φυσιολογικές καρδιές κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης, η μείωση, όμως, αυτή ήταν στατιστικούς σημαντική μόνο στα 10 min της επαναιμάτωσης.Συμπεράσματα: Η μακροχρόνια χορήγηση θυροξίνης σε ενήλικες επίμυες οδηγεί σε έναν καρδιοπροστατευτικό φαινότυπο χαρακτηριστικά του οποίου είναι: 1 ) η μεταβολή στη βασική έκφραση των ισομορφών των PKCs (αύξηση της δ και μείωση της ε ισομορφής), 2) η αυξημένη βασική έκφραση της HSP70, 3) η αυξημένη παραγωγή mRNA HSP70 στο τέλος της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και 4) η μειωμένη ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης.