Phytochemical investigation and metabolomic study of Cannabis sativa L.
Authors: Τζίμας Πέτρος 
Published: May 2023

Το φυτό της κάνναβης (Cannabis sativa L.) χρησιμοποιείται εδώ και χιλιάδες χρόνια από την ανθρωπότητα για ποικίλους σκοπούς, συμπεριλαμβανομένων πολλών θεραπευτικών εφαρμογών. Ο τύπος κλωστικών ινών, γνωστός και ως βιομηχανική κάνναβη, έχει αναδειχθεί ως πηγή πολύτιμων ενώσεων, κυρίως μη ψυχοδραστικών κανναβινοειδών, όπως η κανναβιδιόλη (CBD). Η καλλιέργεια βιομηχανικής κάνναβης επετράπη μόλις πρόσφατα σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ελλάδας, οδηγώντας στην ανάπτυξη νέων αγορών. Παράλληλα, η χρήση της φαρμακευτικής κάνναβης, που αποτελεί τον χημειότυπο με υψηλή περιεκτικότητα στην ψυχοδραστική ουσία Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC), επεκτείνεται με σταθερό ρυθμό σε όλο τον κόσμο για την αντιμετώπιση ορισμένων παθολογικών καταστάσεων. Με βάση τα παραπάνω, ζητήματα που αφορούν την αξιολόγηση ποιότητας και τον χαρακτηρισμό της C. sativa με βάση το φυτοχημικό περιεχόμενο έχουν προφανή σημασία. Η εκχύλιση του φυτικού υλικού είναι το πρωταρχικό βήμα για την ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών, όπως τα κανναβινοειδή. Σε αυτή τη διατριβή, τεχνικές εκχύλισης που προορίζονται τόσο για ποσοτική ανάλυση όσο και για παρασκευαστικούς σκοπούς διερευνήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν με τη χρήση μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισης (RSM). Επίσης, η πλειονότητα των διαλυτών εκχύλισης που αναφέρονται στη βιβλιογραφία συγκρίθηκαν διεξοδικά τόσο όσον αφορά την ανάκτηση κανναβινοειδών όσο και το συνολικό φυτοχημικό προφίλ των εκχυλισμάτων. Για τον προσδιορισμό των κανναβινοειδών, αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν αναλυτικές μέθοδοι που βασίζονται κυρίως στην υγρή χρωματογραφία με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (LC-PDA), αποδίδοντας γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα. Με σκοπό την περαιτέρω φυτοχημική διερεύνηση, επιτεύχθηκε λεπτομερής χαρακτηρισμός δειγμάτων, κυρίως μέσω τεχνικών φασματομετρίας μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMS) σε συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία, επιτρέποντας την ταχεία αναγνώριση δευτερευόντων κανναβινοειδών από διάφορες κατηγορίες, καθώς και άλλων συστατικών. Με αυτό τον τρόπο χαρακτηρίστηκαν ολικά εκχυλίσματα καθώς και κλάσματα που προέκυψαν από αποτελεσματικές τεχνικές απλοποίησης της χημικής πολυπλοκότητας, όπως η εκχύλιση κατανομής με φυγοκέντρηση (CPE). Στη συνέχεια, προκειμένου να κατανοηθούν οι αιτίες της υποκείμενης μεταβλητότητας μεταξύ διαφόρων δειγμάτων C. sativa, ακολουθήθηκαν μεταβολομικές προσεγγίσεις, τόσο στην βιομηχανική όσο και στην φαρμακευτική κάνναβη. Όσον αφορά τη βιομηχανική κάνναβη, χαρτογραφήθηκε ένα πλήθος δειγμάτων από την ελληνική επικράτεια και διερευνήθηκε η σημασία του έτους συγκομιδής, της γεωγραφικής προέλευσης και της ποικιλίας χρησιμοποιώντας συνδυασμό πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και τεχνικών βασισμένων στην υγρή χρωματογραφία για την καταγραφή του προφίλ μεταβολιτών. Η πολυπαραμετρική ανάλυση δεδομένων (MVDA) για την αναγνώριση προτύπων επέτρεψε την ταξινόμηση σύμφωνα με σημαντικές παραμέτρους και αποκάλυψε πιθανά μόρια-βιοδείκτες, αποτελώντας την πρώτη μελέτη του είδους της για ελληνικά δείγματα κάνναβης. Όσον αφορά τον άλλο σημαντικό χημειότυπο, δηλαδή την φαρμακευτική κάνναβη, η αυξημένη παγκόσμια χρήση της για θεραπευτικούς σκοπούς εντείνει την ανάγκη για ελεγχόμενη παραγωγή με χρήση βιοτεχνολογικών εργαλείων, όπως in vitro καλλιέργεια. Χρησιμοποιώντας ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο ιστοκαλλιέργειας, διερευνήθηκε η χημική ποικιλομορφία ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια του μικροπολλαπλασιασμού για να κατανοηθεί η επίδραση της οντογένεσης στον δευτερογενή αλλά και στον πρωτογενή μεταβολισμό. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές για γρήγορη και ολοκληρωμένη ανίχνευση μεταβολιτών, κυρίως NMR. Για τις περισσότερες από τις παραπάνω μελέτες, απαιτήθηκαν ποσότητες πρότυπων κανναβινοειδών, οι οποίες παραλήφθηκαν στο πλαίσιο αυτής της διατριβής. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε απομόνωση από το φυτικό υλικό, που οδήγησε στην παραλαβή αναλυτικών προτύπων υψηλής καθαρότητας για χρήση στην ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων. Κυρίως όσον αφορά τα πρωταρχικά κανναβινοειδή, αναπτύχθηκαν διάφορες διεργασίες για αποδοτικό διαχωρισμό και καθαρισμό, περιλαμβάνοντας χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντρηση (CPC) και άλλες παρασκευαστικές τεχνικές. Με βάση τις διαδικασίες αυτές, ανακτήθηκε CBD υψηλής καθαρότητας σε διάφορες κλίμακες, επιτρέποντας την περαιτέρω διερεύνηση των φαρμακολογικών της ιδιοτήτων, και συγκεκριμένα της πιθανής αντιψυχωσικής της δράσης.