Πρωτεϊνική μηχανική και μελέτη λυτικών ενζύμων για την καταπολέμηση των ανθεκτικών βακτηρίων
Authors: Πρεμέτης Γεώργιος 
Published: October 2024

Το φαινόμενο της γενικευμένης πολλαπλής βακτηριακής ανθεκτικότητας, που πλέον παρατηρείται από την εκτεταμένη και ανορθολογική χρήση των αντιβιοτικών θέτουν σε κίνδυνο τα μέχρι τώρα οφέλη τους στο πεδίο της υγείας καθώς το φαινόμενο λαμβάνει διαστάσεις παγκόσμιας κρίσης. Η ανακάλυψη πολλών γνωστών αντιβιοτικών, σχεδόν πάντα συνοδεύτηκε από εκτεταμένη και ανορθολογική χρήση και έπειτα την εμφάνιση βακτηρίων που ανθίστανται στην δράση τους. Το γεγονός ότι πλέον οι μεταδοτικές ασθένειες που οφείλονται σε παθογόνους μικροοργανισμούς δεν μπορούν να θεραπευτούν από τη χρήση των αντιβιοτικών, το καθιστά παγκόσμια απειλή και αποτελεί μείζον ζήτημα της δημόσιας υγείας. Στην συγκεκριμένη μελέτη, επιλέχθηκαν περιπτώσεις εμφάνισης του φιανομένου της πολλαπλής ανθεκτικότητας στα πολυανθεκτικά βακτήρια, τα οποία δύναται να προκαλέσουν επικίνδυνες λοιμώξεις στον άνθρωπο, σε όλο τον κόσμο, λόγω φαινομένων ανθεκτικότητας έναντι των αντιβιοτικών. Η άμεση απειλή για την ανθρώπινη υγεία καθοδηγεί την έρευνα στην ανάπτυξη νέων και καινοτόμων αντιβακτηριακών ενώσεων. Τα λυτικά ένζυμα που προέρχονται από βακτηριοφάγους (ενδολυσίνες ή «ένζυμα-αντιβιοτικά» - «Enzybiotics») και έχουν ως πρωταρχικό ρόλο την υδρόλυση του κυτταρικού τοιχώματος του ξενιστή, παρουσιάζουν εξειδίκευση για το βακτήριο ξενιστή σε επίπεδο γένους, και σε ορισμένες περιπτώσεις έως και το επίπεδο του στελέχους εντός του ίδιου είδους, χαρακτηριστικό που καθιστά τις ενδολυσίνες ως την πιθανή εναλλακτική ή ενισχυτική/πρόσθετη ένωση στα σύγχρονα αντιβιοτικά.Έχοντας σαν απώτερο σκοπό την εύρεση καινοτόμων τρόπων αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας επιχειρήθηκε, αρχικά, η έρευνα με έμφαση στα βακτήρια Acinetobacter baumannii και Enterococcus faecium. Το ζητούμενο ήταν η μελέτη της δυνατότητας αντιμετώπισης μέσω των υδρολυτικών ενζύμων Enzybiotics. Αν και η χρήση των συγκεκριμένων ενζύμων είναι ευρέως διαδεδομένη, η διαφοροποίηση έγκειται στην ανακάλυψη νέων ενζυύων με ιδιαίτερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, επιλέγοντας ωε πηγές για αναζήτηση λειτουργική γονιδιωματική αλλά και μεταγονιδωματικές βιβλιοθήκες προερχόμενες από ιδιαίτερα περιβάλλοντα βιοποικιλότητας. Ο πρώτος άξονας της μελέτης περιλάμβανε συγκριτική μελέτη δύο υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης, της AbLys1 από τον βακτηριοφάγο Acinetobacter phage TZA1 που προσβάλει το Acinetobacter baumannii και της EfAmi1 από ενσωματωμένη μορφή φάγου (προφάγος) στο γονιδίωμα του βακτηρίου Enterococcus faecium. Η AbLys1 εμφάνισε εξειδίκευση ως προς τα βακτήρια του είδους Acinetobacter baumannii ενώ η EfAmi1 παρουσίασε μεγαλύτερο εύρος εκλεκτικότητας. Τα δυο ένζυμα χαρακτηρίστηκαν κινητικά, φυσικοχημικά και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή τους δράση έναντι μεγάλου εύρους Gram+ και Gram- βακτηρίων. Τέλος, επιλύθηκε η τρισδιάστατή τους δομή με κρυσταλλογραφία ακτίνων X.Ο δεύτερος άξονας περιλάμβανε απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA από θαλάσσιο βιοϋμένιο που απομονώθηκε από τη βιομηχανική περιοχή της Κορίνθου, αλληλούχιση Illumina NextSeq500 και αναζήτηση γονιδίων υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης. Η αναζήτηση οδήγησε στην ανακάλυψη μιας γλυκοσιδάσης της πεπτιδογλυκάνης AbLys2, η οποία παρουσιάζει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά έκφρασης και εμφανίζει εξειδίκευση ως προς το Acinetobacter baumannii. Το ένζυμο χαρακτηρίστηκεν κινητικά, φυσικοχημικά και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή του δράση έναντι μεγάλου εύρους Gram+ και Gram- βακτηρίων.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, πραγματοποιήθηκε σύντηξη του αντιμικροβιακού πεπτιδίου CLLKKLLKKC (C(LLKK)2C) με το N-τελικό άκρο της γλυκοσιδάσης AbLys1, για την δημιουργία ενός τεχνιτού λυτικού ενζύμου μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής. Η νέα γλυκοσιδάση, (art-AbLys1) παρουσίασε διευρυμένη εκλεκτικότητα και σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα, συγκριτικά με τον άγριο τύπο AbLys1, κυρίως όσον αφορά τα στελέχη Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecium με ανθεκτικότητα στην αμπικιλλίνη, Staphylococcus epidermidis (MRSE), Escherichia coli DH5a έχοντας ικανότητα να αναστέλλει και την ανάπτυξη τους. Ικανότητα αναστολής της ανάπτυξης επιδεικνύει και έναντι των άλλων δύο βακτηρίων, της Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 και Klebsiella oxytoca. Τελικό εγχείρημα της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός ενζυμικού συστήματος για την ενθυλάκωση του ενζύμου art-AbLys1 σε σφαιρίδια πολυμερούς αλγινικού ασβεστίου ως ένα σύστημα σταθεροποίησης ή/και ελεγχόμενης ελευθέρωσης. Το σύστημα που κατασκευάστηκε (art-AbLys1-Alg-Ps) αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητα του να αναστέλει επιτυχημένα τον σχηματισμό βιοϋμενίων βακτηρίων A. baumanni, P. aeruginosa ATCC 27853 και του στελέχους S. pyogenes. Επίσης, η ενθυλάκωση ταυτόχρονα αύξησε σημαντικά την σταθερότητα του ενζύμου.