Development of biocatalytic devices with the use of 3D printing and microfludic technology
Authors: Γκάντζου Ελένη 
Published: January 2022

Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα και μεθοδολογίες με στόχο την προώθηση βιοκαταλυτικών διεργασιών, με τη χρήση των τεχνολογιών της Ακινητοποίησης ενζύμων, της Μικρο-ρευστομηχανικής και της 3D εκτύπωσης. Οι μέθοδοι και τα πρωτόκολλα που ακολουθήθηκαν στόχευσαν στην ανάπτυξη διεργασιών και εργαλείων που ανήκουν στον τομέα της βιοτεχνολογίας, ένα ευρύ ερευνητικό πεδίο που χρησιμοποιεί βιολογικά συστήματα ή μέρη αυτών και τα παράγωγά τους για να αναπτύξει χρήσιμα προϊόντα και διεργασίες για την ανθρώπινη υγεία, τη διατροφή, την ενέργεια και την προστασία του περιβάλλοντος. Η βιοκατάλυση χρησιμοποιεί ένα ή περισσότερα ένζυμα για να μετατρέψει υποστρώματα σε ενώσεις με υψηλότερη αξία. Στις μέρες μας, οι τάσεις στη βιοκατάλυση ακολουθούν τρεις κύριες κατευθύνσεις: την ενσωμάτωση καινοτόμων τεχνολογιών, τα ευφυή συστήματα παραγωγής, και την ενζυμική καθολική σύνθεση περίπλοκων φυσικών προϊόντων και φαρμάκων. Ως υπo-πεδίο της μικρο-ρευστομηχανικής, η βιοκατάλυση υπό ροή, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη γενικότερη ιδέα της αναβάθμισης των ενζυμικών διεργασιών, προσφέροντας εντατικοποίηση των διεργασιών και παραγωγικές ικανότητες που δε θα μπορούσαν να επιτευχθούν με τη συμβατική τεχνολογία. Η έρευνα που έχει διεξαχθεί μέχρι τώρα έχει δείξει ότι, όταν αναπτύσσεται έξω από το δοκιμαστικό σωλήνα, η βιοκατάλυση μπορεί να γίνει υψηλά παραγωγική, ελεγχόμενη και αειφόρα. Θεμελιώδης συμβολή στα χαρακτηριστικά αυτά παρέχει η συνένωση της τεχνολογίας ακινητοποίησης ενζύμων με τα συστήματα μικρο-αντιδραστήρων. Το εξέχων πλεονέκτημα της ακινητοποίησης στους βιοαντιδραστήρες μικροροής είναι ότι ο καταλύτης παραμένει στο εσωτερικό του μικροαντιδραστήρα, ενώ τα αντιδραστήρια και τα προϊόντα αντλούνται συνεχώς μέσα και έξω από το σύστημα αντίδρασης, δίνοντας τη δυνατότητα να αναπτυχθούν συστήματα με υψηλή λειτουργική σταθερότητα. Με εξαιρετικά χαμηλά κόστη και σχεδόν απεριόριστες δυνατότητες σχεδιασμού, η 3D εκτύπωση έχει θεωρηθεί ότι προσφέρει εντελώς νέες συλλογιστικές μεθόδους για τους τομείς της ιατρικής και της βιοτεχνολογίας. Οι δημοσιεύσεις με βιολογικές εφαρμογές 3D εκτυπωμένων πρωτοτύπων αυξάνονται εκθετικά τα τελευταία 5 χρόνια, ενώ έχουν πρόσφατα παρατηρηθεί οι πρώτες προσπάθειες να ενσωματωθεί η τεχνολογία αυτή στον τομέα της βιοκατάλυσης. Ο απώτερος σκοπός των μελετών που έχουν περιγραφεί είναι να χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία της 3D εκτύπωσης για να κατασκευαστούν απλές και χαμηλού κόστους πλατφόρμες αντιδραστήρων που θα φιλοξενήσουν διάφορα ένζυμα και θα φτάσουν ένα βήμα πιο κοντά στη βιομηχανική εφαρμογή των βιοκαταλυτικών διεργασιών. Η παρούσα διατριβή διακρίνεται σε δύο βασικά μέρη. Το πρώτο μέρος περιγράφει την ανάπτυξη ενός μικροαντιδραστήρα με νανοράβδους οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO NWs) που έχουν αναπτυχθεί in situ στα εσωτερικά του τοιχώματα και χρησίμευσαν ως πλατφόρμα ακινητοποίησης για το ένζυμο β-γλυκοσιδάση. Το σύστημα χαρακτηρίστηκε μορφολογικά και φασματοσκοπικά, ενώ τα κινητικά χαρακτηριστικά του και οι δυνατότητες σταθεροποίησής του αξιολογήθηκαν με μία σειρά βιοκαταλυτικών ελέγχων. Επιχειρήθηκαν επίσης αντιδράσεις γλυκοζυλίωσης των φυτικών μεταβολιτών τυροσόλη και περιλύλ- αλκοόλη με σκοπό να συντεθούν πολύτιμες ενώσεις που αφορούν τη φαρμακευτική βιομηχανία, όπως ο περιλύλ γλυκοζίτης και το salidroside. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι, συγκριτικά με μελέτες που έχουν αναφερθεί προηγουμένως με γλυκοσιδάσες σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή, το νανο-ακινητοποιημένο ένζυμο στην περίπτωση του ZnΟ μικροαντιδραστήρα εξέχει για την ικανότητα του να χρησιμοποιείται πολλές φορές, απαιτώντας μικρό χρόνο αντίδρασης και ελάχιστη ποσότητα ενζύμου για να επιτευχθεί επαρκής παραγωγή προϊόντος. Στο δεύτερο μέρος, χρησιμοποιήθηκε το πολυγαλακτικό οξύ (PLA) ως ένα βιοσυμβατό και βιοαποδομήσιμο υλικό 3D εκτύπωσης, ώστε να κατασκευαστούν ικριώματα ακινητοποίησης ενζύμων με διαφορετική τελική δομή ανάλογα με την εφαρμογή. Πλακίδια μικροκελιών, με προσαρμόσιμο αριθμό κελιών, σχεδιάστηκαν και εκτυπώθηκαν με στόχο να αποτελέσουν πλατφόρμες διεξαγωγής διάφορων βιοκαταλυτικών ελέγχων, καθιστώντας δυνατή τη βελτιστοποίηση ενός νέου πρωτοκόλλου τροποποίησης του PLA. Η ευελιξία του συστήματος που σχεδιάστηκε ως βιοτεχνολογικό εργαλείο αναδείχθηκε με την εφαρμογή του για την ακινητοποίηση διαφορετικών ενζύμων, παράλληλα με τη διεξαγωγή μίας σειράς βιοκαταλυτικών ελέγχων για την αξιολόγηση της αποδοτικότητας της ακινιτοποιημένης β-γλυκοσιδάσης. Σε μία διαφορετική προσέγγιση, μικρο-αντιδραστήρες με εσωτερικό σιγμοειδές σχήμα σχεδιάστηκαν και εκτυπώθηκαν ώστε να αποτελέσουν μέρος ενός μικρο-ρευστομηχανικού συστήματος που θα προωθούσε μία ποικιλία αντιδράσεων βιομετασχηματισμού. Η αποδοτικότητα του συστήματος με ακινητοποιημένη λακάση, αξιολογήθηκε με τη χρήση της υδροξυτυροσόλης ως πρότυπη ένωση, καθώς ο βιομετασχηματισμός της είναι υψηλής σημασίας για τις βιομηχανίες τροφίμων, καλλυντικών και φαρμάκων. Παράλληλα, επιτεύχθηκαν υψηλές αποδόσεις μετατροπής για διάφορες βιο-φαινόλες από διατροφικές πηγές, κατά τη διάρκεια του βιομετασχηματισμού τους υπό συνεχή ροή με ακινητοποιημένη λακάση σε 3D εκτυπωμένους PLA μικροαντιδραστήρες. Ως αποτέλεσμα των βιομετασχηματισμών αυτών, ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας ολιγομερή προϊόντα που έχουν δειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι διαθέτουν σημαντικές βιολογικές δράσεις,. Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής αναδεικνύουν ένα πολλά υποσχόμενο σενάριο για το σχεδιασμό φορέων ακινητοποίησης ενζύμων, κάνοντας χρήση φθηνών και βιώσιμων διεργασιών με ενώσεις από φυσικές πηγές. Οι μέθοδοι και τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αποτελούν νέες προσθήκες στην έρευνα για τον σχεδιασμό βιοκαταλυτών και αναμένεται να θέσουν τις βάσεις για την ανάπτυξη πιο προηγμένων βιοκαταλυτικών εργαλείων με αυξημένες δυνατότητες για ποικίλες βιο-σχετιζόμενες εφαρμογές.