Αλγόριθμοι για την υπολογιστική ανάλυση της λειτουργίας των μη κωδικών μεταγράφων
Authors: Παρασκευοπούλου Μαρία 
Published: September 2021

Η επανάσταση του RNA μετέφερε τα μη κωδικά μετάγραφα (non-coding RNAs) στο επίκεντρο της βιολογικής έρευνας. Τα τελευταία χρόνια, στοιχεία από πολυάριθμα πειράματα αποκαλύπτουν πολλαπλούς ρυθμιστικούς ρόλους των μη κωδικών μεταγράφων στο γονιδίωμα σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών διεργασιών. H εργασία αυτή εστιάζει στην ανάπτυξη αλγορίθμων για την κατανόηση της λειτουργίας μη κωδικών μορίων και διερευνά εκτενώς τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ ομάδων κωδικών και μη κωδικών μεταγράφων. Οι μεθοδολογίες που αναπτύχθηκαν κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής συνδύασαν προηγμένες αναλύσεις δεδομένων αλληλούχησης επόμενης γενεάς και συμπεριέλαβαν αλγορίθμους αιχμής Μηχανικής Μάθησης, για την πραγματοποίηση αυτόματων αναλύσεων καθώς και εποπτείας των αντίστοιχων αποτελεσμάτων. H εργασία εστιάζει στη μελέτη ειδικών κατηγοριών μορίων: τα microRNAs (miRNAs) και τα long non-coding RNAs (lncRNAs). Τα miRNAs είναι μονόκλωνα μόρια RNA μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων. Θεωρούνται βασικοί μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων και διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο σε πληθώρα βιολογικών διαδικασιών. Αποτελούν αντικείμενο έντονης μελέτης τα τελευταία χρόνια για τη δυναμική τους ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι καθώς πέρα από το ρόλο τους σε φυσιολογικές διεργασίες, εμφανίζονται να εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα παθολογικών καταστάσεων. Βάσει τελευταίων ερευνών, τα miRNAs στοχεύουν και άλλα μη κωδικά RNAs, τα lncRNAs. Τα lncRNAs είναι μακρά μη κωδικά μετάγραφα και μέρος αυτών σχετίζεται με την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.Προκειμένου να χαρακτηριστεί ολόκληρο το φάσμα των αλληλεπιδράσεων των miRNAs με lncRNAs, σχεδιάστηκε η βάση δεδομένων DIANA-LncBase που υποστηρίζει τον μεγαλύτερο κατάλογο πειραματικά επιβεβαιωμένων miRNA-lncRNA αλληλεπιδράσεων. Περιέχει πάνω από 70.000 αλληλεπιδράσεις από πληθώρα πειραμάτων αλληλούχησης επόμενης γενεάς και ειδικές τεχνικές μικρής διεκπεραιωτικής ικανότητας σε 66 διαφορετικούς τύπους κυττάρων, που εκτείνονται σε 36 ιστούς του ανθρώπου και του μυός. Στη παρούσα διατριβή ανανεώθηκε και η βάση δεδομένων DIANA-TarBase, η βάση με τον εκτενέστερο κατάλογο πειραματικά επιβεβαιωμένων αλληλεπιδράσεων μεταξύ μικρών RNA και κωδικών γονιδίων στόχων παγκοσμίως. Περιέχει περισσότερες από 500.000 αλληλεπιδράσεις από 28 διάφορες πειραματικές μεθοδολογίες, καλύπτοντας 356 κυτταρικούς τύπους και 59 διαφορετικούς ιστούς. Κατά τη λεπτομερή καταγραφή του χάρτη των αλληλεπιδράσεων των μορίων στο επίπεδο του RNA σημειώθηκαν για πρώτη φορά και αλληλεπιδράσεις των μικρών RNAs που παράγονται από ιούς με τα μακρά μη κωδικά μετάγραφα του ανθρώπου. Η αναγνώριση τέτοιων αλληλεπιδράσεων έγινε σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που έχουν προσβληθεί από κάποιο στέλεχος ιού. Αυτά τα δεδομένα βάζουν ένα ακόμη επίπεδο πολυπλοκότητας στις αλληλεπιδράσεις των μη κωδικών μορίων, καθώς χρειάζεται να μελετηθούν και αυτές μεταξύ των μεταγράφων του ιού και του ανθρώπου. Τα δεδομένα NGS που αναλύθηκαν, για την ανεύρεση στόχων των microRNAs με τα (μη)κωδικά μετάγραφα για το σχηματισμό των βάσεων LncBase και TarΒase, περιλαμβάνουν πάνω από 150 βιβλιοθήκες CLIP-Seq. Παράλληλα, συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν δεδομένα αλληλούχησης για την έκφραση των microRNA και των μεταγράφων στα κύτταρα όπου πραγματοποιήθηκαν τα CLIP-Seq πειράματα. Αναπτύχθηκαν αλγόριθμοι για την ανάλυση των δεδομένων αλληλούχησης, ενώ ο εντοπισμός των αναγνωριστικών θέσεων πρόσδεσης των microRNAs στα μετάγραφα έγινε με μηχανική μάθηση. Η μεθοδολογία που υιοθετήθηκε συγκρίθηκε με αντίστοιχους αλγορίθμους αιχμής, ενώ εμφάνισε πληθώρα πλεονεκτημάτων σε κάθε σύγκριση.Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής, η συνεχής αρχειοθέτηση και ανάλυση πειραματικών δεδομένων από χαμηλής και υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας μεθοδολογίες, μαζί με την εκτενή αξιολόγηση των διαθέσιμων CLIP-Seq προγραμμάτων, αποκάλυψε ότι υπήρχε περιθώριο για περαιτέρω βελτίωση. Οι διαθέσιμοι αλγόριθμοι αιχμής που εντοπίζουν στόχους των miRNAs μέσα από την ανάλυση CLIP-Seq δεδομένων επιτυγχάνουν την ορθή αναγνώριση σε περίπου μισές πειραματικά επικυρωμένες αλληλεπιδράσεις. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε ένας καινοτόμος αλγόριθμος για την ανάλυση AGO-CLIP-Seq δεδομένων. Ο αλγόριθμος εκπαιδεύτηκε και δοκιμάστηκε εκτενώς σε μια υψηλής ποιότητας, ολοκληρωμένη συλλογή θετικών και αρνητικών αλληλεπιδράσεων των miRNAs με γονίδια βάσει πολυάριθμων πειραματικών δεδομένων. Επιπλέον αξιολογήθηκε έναντι παρόμοιων εφαρμογών αιχμής, συμπεριλαμβανομένου και του αλγορίθμου ανάλυσης CLIP-Seq δεδομένων των TarBase / LncBase. Τα αποτελέσματα παρουσίασαν ότι η νέα αλγοριθμική προσέγγιση ξεπερνά σημαντικά τις άλλες εφαρμογές όχι μόνο όσον αφορά την ακρίβεια, αλλά παράλληλα καταφέρνει να αυξήσει την ευαισθησία μέσω της πρόβλεψης περιοχών πρόσδεσης των μικρών RNA που δεν είχαν εντοπιστεί από οποιοδήποτε άλλο αλγόριθμο.Παράλληλα, η λειτουργική σημασία των αλληλεπιδράσεων των miRNAs με τις διάφορες κατηγορίες μεταγράφων μελετήθηκε μέσω της διερεύνησης της εξελικτικής συντήρησης των περιοχών πρόσδεσης σε κωδικές και μη κωδικές ακολουθίες. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει και τη μελέτη του χάρτη των αλληλεπιδράσεων των μορίων στο επίπεδο του RNA σε σχέση με ασθένειες και μοριακά μονοπάτια, γεγονός που θα βοηθήσει να προσδιοριστούν άγνωστες μέχρι τώρα πτυχές της δράσης των μικρών RNAs. Παράλληλα, αναβαθμίστηκαν και σχηματίστηκαν νέες λειτουργικότητες για τον εξυπηρετητή του DIANA-microT και πραγματοποιήθηκε η δημιουργία αυτόματων ροών ανάλυσης (workflows), δεδομένων που προκύπτουν από πειράματα NGS. Οι έτοιμες αναλύσεις διασυνδέουν εργαλεία του DIANA που αφορούν αλληλεπιδράσεις των μικρών RNAs με γονίδια και την εμπλοκή τους σε μοριακά μονοπάτια. Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής, η υποψήφια έλαβε μέρος σε 8 επιστημονικές μελέτες που περιλαμβάνουν υπολογιστικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της δράσης των μη κωδικών μεταγράφων, και σε τέσσερις από αυτές είναι πρώτη συγγραφέας. Οι μελέτες δημοσιεύτηκαν σε διεθνή έγκριτα περιοδικά και οι συνολικές αναφορές που έχουν λάβει έως τώρα είναι 310.