The role of apolipoprotein A-I in the atheroprotective functions of high-density lipoprotein (HDL)
Authors: Τηνιακού Ιωάννα 
Published: August 2021

Επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει μια αντιστρόφως ανάλογη συσχέτιση μεταξύ των επίπεδων της HDL χοληστερόλης και του κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου στον άνθρωπο. Κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) αποτελεί η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (αποΑ-Ι), η οποία και κατέχει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση, τη δομή, καθώς και τις λειτουργίες της HDL. Η αποΑ-Ι αλληλεπιδρά με πλήθος υποδοχέων και ενζύμων (ABCA1, ABCG1, SR-BI, LCAT) που συμμετέχουν ενεργά στην βιογένεση, τον καταβολισμό και τις λειτουργίες της HDL. Αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η ενεργοποίηση μηχανισμών, όπως η εκροή χοηστερόλης, η διατήρηση της ακεραιότητας του ενδοθηλίου καθώς και αντι-οξειδωτικοί, αντι-φλεγμονώδεις και αντι-αποπτωτικοί μηχανισμοί, οι οποίοι συμβάλλουν στην προστασία από την αθηρωμάτωση. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου της αποΑ-Ι στις αντιφλεγμονώδεις και τις αθηροπροστατευτικές δράσεις της HDL in vivo.H ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) είναι μια χρόνια αυτοάνοση νόσος με αυξημένη θνητότητα, η οποία οφείλεται μερικώς σε καρδιαγγειακά αίτια. Επιπλέον, τα χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης αποτελούν δείκτη για διάφορες φλεγμονώδεις νόσους, ενώ τα επίπεδα προφλεγμονώδους HDL βρίσκονται αυξημένα σε ασθενείς με ΡΑ. Στόχος της πρώτης ενότητας της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου της HDL στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Για το σκοπό αυτό εφαρμόσθηκε ένα μοντέλο της ασθένειας σε αγρίου τύπου ποντικούς και ποντικούς με έλλειψη σε αποΑ-Ι (apoA-I-/-) και μελετήθηκε σε αυτό η επίδραση της έλλειψης της HDL στην παθογένεση της ΡΑ, η επίδραση της χρόνιας φλεγμονής στα επίπεδα και τις αθηροπροστατευτικές δράσεις της HDL, καθώς και κατά πόσο η HDL μπορεί να δράσει στο ανοσοποιητικό σύστημα οδηγώντας σε μείωση της φλεγμονής. Έπειτα από την επαγωγή της αρθρίτιδας οι ποντικοί αγρίου τύπου εμφάνισαν κατά κύριο λόγο μέτρια έως σοβαρή φλεγμονή, ενώ η πλειοψηφία των apoA-I-/- ποντικών εμφάνισαν το βαρύτερο φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό πάννου. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της HDL στις Τh1 και Th17 ανοσοαπόκρισεις, οι οποίες εμπλέκονται στην ανάπτυξη της ΡΑ, πραγματοποιήθηκε ανοσοποίηση αγρίου τύπου ποντικών με οβαλβουμίνη και προσδιορίστηκε ο αντιγονο-ειδικός πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των Τh λεμφοκυττάρων παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων συνθετικής HDL (rHDL). Η επαγωγή και ο πολλαπλασιασμός των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων προσδιορίστηκε με βάση τα εκκρινόμενα επίπεδα κυτταροκινών (IFN-γ, IL-17, IL-2) στα θρεπτικά μέσα των καλλιεργειών. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων κατέδειξαν μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή στη σύνθεση των κυτταροκινών σαν αποτέλεσμα της χορήγησης αυξανόμενων συγκεντρώσεων rHDL στα κύτταρα. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της rΗDL σε καλλιέργεια δενδριτικών κυττάρων, στα οποία η επώαση με rHDL οδήγησε σε μείωση της έκκρισης προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-6, IL-12, IL-23, IL-8, TNF-α) και της έκφρασης συν-διεγερτικών μορίων (CD40, CD80, CD86, MHC-II). Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της rΗDL σε καλλιέργεια δενδριτικών κυττάρων με έλλειψη σε καθέναν από τους υποδοχείς της HDL (ABCG1, ABCA1, SR-BI). Στην περίπτωση των δενδριτκών κυττάρων με έλλειψη στον ABCA1 ή τον SR-BI, η rHDL δε μπόρεσε να καταστείλλει την ενεργοποίηση τους καταδεικνύοντας τη συμμετοχή των δύο αυτών υποδοχέων στον μηχανισμό δράσης της.Το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής αφορά στη μελέτη της επίδρασης δύο φυσικά απαντώμενων μεταλλάξεων της αποΑ-Ι, των αποA-I(L141R)Pisa και αποA-I(L159R)FIN στη βιογένεση της HDL και την ανάπττυξη αθηροσκλήρωσης in vivo. Ετεροζυγώτες για οποιαδήποτε από τις δύο παραπάνω μεταλλάξεις παρουσιάζουν πολύ χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης στο πλάσμα και ορισμένοι από αυτούς εμφανίζουν πρόωρη αθηροσκλήρωση. Για τη μελέτη των ιδιοτήτων των συγκεκριμένων μεταλλάξεων in vivo δημιούργηθηκαν διαγονιδιακοί ποντικοί οι οποίοι εκφράζουν την ανθρώπινη αποΑ-Ι στο ήπαρ. Για το σκοπό αυτό, η αγρίου τύπου (WT) και τα παραπάνω μεταλλάγματα της ανθρώπινης αποΑ-Ι κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα καθοδικά του υποκινητή του γονιδίου της τρανσθυρετίνης (TTR1). Από την ανάλυση αυτή προέκυψαν τα ζώα «ιδρυτές», τα οποία διασταυρώθηκαν με apoA-I-/- ποντικούς για τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν μόνο την αντίστοιχη, είτε αγρίου τύπου είτε μεταλλαγμένη, ανθρώπινη αποΑ-Ι. Τα ζώα που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν ως προς το λιπιδικό και λιποπρωτεϊνικό τους προφίλ, τη δομή και τη λειτουργικότητα της HDL και την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης. Οι διαγονιδιακοί ποντικοί που εξέφραζαν οποιοδήποτε εκ των δύο μεταλλαγμάτων της αποΑ-Ι εμφάνισαν πολύ χαμηλά επίπεδα ολικής και HDL χοληστερόλης, καθώς και αποΑ-Ι στον ορό. Επιπλέον, στον ορό αυτών των ποντικών ανιχνεύθηκαν λίγα μικρού μεγέθους HDL σωματίδια με preβ2 και α3, α4 ηλεκτροφοριτική κινητικότητα. Επιπλέον, τα HDL σωματιδία που έφεραν τις μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι εμφάνισαν μειωμένες αντι-οξειδωτικές ιδιότητες αλλά αυξημένη ικανότητα ABCA1-εξαρτώμενης εκροής χοληστερόλης από τα μακροφάγα, καθώς και αυξημένη ικανότητα να προωθούν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τέλος, έπειτα από 14 εβδομάδες σε δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λίπη, η ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών στην αορτή ήταν σημαντικά υψηλότερη στους διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν τις μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι σε σχέση με αυτούς που είτε εξέφραζαν την αγρίου τύπου αποΑ-Ι είτε εμφάνιζαν παντελή έλλειψη της αποΑ-Ι (apoA-I-/-).Πρόσφατες έρευνες υποστηρίζουν πως η φυσιολογικά αθηροπροστατευτική HDL μπορεί να μετατραπεί σε αθηροματωγόνο ως αποτέλεσμα των οξειδωτικών τροποποιήσεων που υφίσταται η αποΑ-Ι από το ένζυμο μυελοπεροξειδάση (MPO). Συγκεκριμένα, έχει προταθεί πως ο συνδυασμός χλωρίωσης της τυροσίνης-192 και οξείδωσης της μεθειονίνης-148 μειώνει την ικανότητα της αποΑ-Ι να επάγει έξοδο χοληστερόλης μέσω του μεταφορέα ABCA1. Επιπλέον, in vitro πειράματα έχουν δείξει πως η οξείδωση της μεθειονίνης-148 από την MPO οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας της αποΑ-Ι να ενεργοποιήσει το ένζυμο LCAT. Τα αίτια, καθώς και οι μηχανισμοί δημιουργίας δυσλειτουργικών μορίων HDL παραμένουν αδιευκρίνιστα.Στόχος του τρίτου μέρους της διατριβής ήταν η μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους η μυελοπεροξειδάση επιδρά στην αποΑ-Ι και παράγει δυσλειτουργικά HDL σωματίδια in vivo. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εκφράζουν την αγρίου τύπου αποΑ-Ι (apoA-I WT), τις μεταλλαγμένες μορφές apoΑ-Ι(Met148Ala) και apoΑ-Ι(Tyr192Ala), καθώς και την ανθρώπινη μυελοπεροξειδάση. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης για τη δημιουργία των παραπάνω μεταλλάξεων στο γονίδιο της ανθρώπινης αποΑ-Ι. Παράλληλα, ουδετερόφιλα κύτταρα απομονώθηκαν από ανθρώπινο ολικό αίμα και το RNA που απομονώθηκε από αυτά χρησιμοπoιήθηκε για την κλωνοποίηση του cDNA της MPO. Οι αλληλουχίες που προέκυψαν κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pAdTrack-CMV και οι αντίστοιχοι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί παρήχθησαν σε μεγάλη κλίμακα με τη μέθοδο AdEasy, απομονώθηκαν με υπερφυγοκέντρηση σε διαβάθμιση χλωριούχου καισίου και τιτλοδοτήθηκαν με τη δοκιμασία σχηματισμού μολυσματικών πλακών. Οι τιτλοδοτημένοι αδενοϊοί ελέγχθηκαν ως προς τη μολυσματικότητά τους και την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Οι παραπάνω αδενοϊοί που εκφράζουν τις διάφορες μορφές αποΑ-Ι μπορούν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με τον αδενοϊό που εκφράζει MPO για την επιμόλυνση apoA-I-/- ποντικών. Με τον τρόπο αυτό θα μπορέσει να προσδιοριστεί in vivo η επίδραση του ενζύμου αυτού στα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος, το σχήμα, το μέγεθος και τη λειτουργικότητα της HDL. Πρόσφατες γονιδιωματικές μελέτες μεγάλης κλίμακας έχουν αναδείξει νέους γενετικούς τόπους, μεταξύ των οποίων το γονίδιο GALNT2 (GalNAc Transferase 2), που σχετίζονται με χαμηλά επίπεδα HDL. Η GALNT2 είναι ένα ένζυμο που συμμετέχει στην O-γλυκοζυλίωση και καταλύει τη μεταφορά σακχάρων σε κατάλοιπα σερίνης ή θρεονίνης πρωτεϊνών. Δεδομένου ότι η O-γλυκοζυλίωση κατέχει ρυθμιστικό ρόλο για πληθώρα πρωτεϊνών, είναι πιθανό η GALNT2 να επηρεάζει τις συγκεντρώσεις των λιπιδίων τροποποιώντας διάφορες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μεταβολισμό της HDL.Η τελευταία ενότητα αφορά τη μελέτη του ρόλου της GALNT2 στο μεταβολισμό της HDL in vivo με χρήση της γονιδιακής μεταφοράς μέσω αδενοϊών σε apoA-I διαγονιδιακούς ποντικούς. Για το σκοπό αυτό αρχικά απομονώθηκε από κύτταρα HepG2 το cDNA της ανθρώπινης GALNT2 το οποίο κλωνοποιήθηκε σε κατάλληλο φορέα, και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του αδενοϊού Ad-GALNT2 σύμφωνα με το πρωτόκολλο AdEasy. Ο αδενοϊός παρήχθη σε μεγάλη κλίμακα, απομονώθηκε και τιτλοδοτήθηκε όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Ο τιτλοδοτημένος αδενοϊός πρόκειται μελλοντικά να χορηγηθεί σε ποντικούς από τους οποίους έχει απαλειφεί το γονίδιο της αποΑ-Ι, ενώ ταυτόχρονα φέρουν το ανθρώπινο γονίδιο της αποΑ-Ι υπό τον έλεγχο του φυσικού υποκινητή και ενισχυτή του. Στους μολυσμένους ποντικούς θα πραγματοποιηθεί μια σειρά αναλύσεων προκειμένου να προσδιοριστούν τα επίπεδα λιπιδίων στο πλάσμα, η δραστικότητα συγκεκριμένων ενζύμων (LPL, LCAT), καθώς και η δομή και η λειτουργικότητα των HDL σωματιδίων που θα προκύψουν. Με τον τρόπο αυτό θα μπορέσει να εκτιμηθεί η επίδραση της GALNT2 τόσο στη δομή όσο και το μεταβολισμό της HDL in vivo.