Ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για την εκτίμηση της ποιότητας των οστών
Authors: Καραμπάς Ιωάννης 
Published: August 2021

Το οστό αποτελεί ένα σύνθετο υλικό, χαρακτηριζόμενο από μια πολύπλοκη ιεραρχική δομή. Συνίσταται από τρεις φάσεις, μια ανόργανη, μια οργανική και μια υδατική. Το ανόργανο μέρος του, το οποίο αντιστοιχεί περίπου σε 60-65% της κατά βάρος περιεκτικότητάς του, αποτελείται από ένα χημικό και δομικό ανάλογο του φωσφορικού άλατος υδροξυαπατίτης [Ca10(PO4)6(OH)2], το οποίο γι’ αυτό το λόγο καλείται βιοαπατίτης ή βιολογικός απατίτης. Το οργανικό μέρος αποτελεί περίπου το 30% της κ.β. περιεκτικότητάς του και κυριαρχείται από την παρουσία της πρωτεΐνης κολλαγόνο (τύπου Ι), το ποσοστό της οποίας ανέρχεται σε 90% περίπου της οργανικής φάσης. Το υπόλοιπο τμήμα αυτής καταλαμβάνεται από ένα πλήθος άλλων πρωτεϊνών, οργανικών ενώσεων και κυττάρων. Το εναπομένον 5-10% της μάζας του οστού αποτελείται από νερό. Η σύσταση του οστού και πιο συγκεκριμένα η περιεκτικότητά του σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο (των οποίων η συνολική % κ.β. περιεκτικότητα ανέρχεται σε πάνω από 95% επί ξηρού οστού) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις μηχανικές ιδιότητές του, όπως είναι η αντοχή σε θραύση, η ακαμψία και η ελαστικότητα. Οι μεταβολές των μηχανικών ιδιοτήτων σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις των οστών κατά τις οποίες είναι πολύ πιθανή η εμφάνιση κατάγματος, όπως είναι η οστεοπόρωση –από την οποία πάσχει ένα σημαντικό μέρος του πληθυσμού– αλλά και άλλες λιγότερο συνηθισμένες παθήσεις όπως η οστεομαλακία και η ατελής οστεογένεση. Οι παραπάνω ασθένειες και κυρίως η οστεοπόρωση, διαγιγνώσκονται μέχρι σήμερα με μέτρηση της οστικής πυκνότητας (Bone Mineral Density, BMD). Η συγκεκριμένη όμως παράμετρος υστερεί στην αξιόπιστη πρόβλεψη του κινδύνου εμφάνισης καταγμάτων. Για το λόγο αυτό, η νέα προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα απαιτεί ως διαγνωστικό εργαλείο τη γνώση παραμέτρων που σχετίζονται άμεσα με τις μηχανικές ιδιότητες, ανάγοντας έτσι και τη σύσταση των οστών ως ένα πιθανό αξιόπιστο παράγοντα εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης κατάγματος. Αν και η σύσταση του οστού μπορεί να υπολογιστεί με διάφορες αναλυτικές τεχνικές, η χρήση της φασματοσκοπίας Raman (RS) αποτελεί μια προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα η οποία παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως είναι η δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο, η ελάχιστη επεξεργασία του προς ανάλυση δείγματος ενώ ήδη έχουν αρχίσει να γίνονται προσπάθειες και για την ανάπτυξη μεθόδου για την in vivo ανάλυση των οστών. Λαμβάνοντας επομένως υπόψη τα σημαντικά πλεονεκτήματά της φασματοσκοπίας Raman και τη σπουδαιότητα της σύστασης στον καθορισμό της ποιότητας του οστού, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτική ανάλυση της περιεκτικότητας των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας Raman. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα βόειων οστών (από το συμπαγές και το σπογγώδες τμήμα) και αφού πραγματοποιήθηκε χημικός καθαρισμός τους από ξένες οργανικές ενώσεις (λιπίδια, μυελός, κύτταρα), ορισμένα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του κολλαγόνου –κατόπιν διάλυσης του βιοαπατίτη με EDTA– ενώ κάποια άλλα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του βιοαπατίτη –με διάλυση του κολλαγόνου σε υδραζίνη. Στα πλαίσια χαρακτηρισμού των δοκιμίων, μελετήθηκαν οι επιδράσεις που επάγουν η διαδικασία του χημικού καθαρισμού και το πρωτόκολλο απομόνωσης κολλαγόνου στην κρυσταλλική δομή του βιοαπατίτη. Μετρήσεις με τη βοήθεια της περίθλασης ακτίνων Χ (XRD), αποκάλυψαν ότι ενώ ο χημικός καθαρισμός δεν επηρεάζει τη δομή των δοκιμίων ωστόσο, το πρωτόκολλο απομάκρυνσης του κολλαγόνου με υδραζίνη έχει ως συνέπεια την αύξηση της κρυσταλλικότητας και του μεγέθους των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη σε σημαντικό βαθμό. Επιπλέον, από μελέτες με φασματοσκοπία υπερύθρου και XRD προέκυψε ότι η μεταβολή των παραπάνω παραμέτρων οφείλεται στην απομάκρυνση των ιόντων CO32- και HPO42- από τους κρυσταλλίτες του βιοαπατίτη, η οποία προκαλείται από χρήση της υδραζίνης. Μάλιστα προέκυψε ότι όσο μεγαλύτερη είναι η θερμοκρασία της χρησιμοποιούμενης υδραζίνης τόσο μεγαλύτερη είναι η κινητική των μεταβολών που επάγονται στις κρυσταλλογραφικές παραμέτρους του βιοαπατίτη. Αναμιγνύοντας καθορισμένες ποσότητες βιοαπατίτη και κολλαγόνου, παρασκευάστηκαν πρότυπα μίγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ευθειών αναφοράς, για τον προσδιορισμό της σύστασης του οστού ως προς αυτά τα συστατικά. Από τα φάσματα Raman του οστού επιλέχθηκε η ν1 δόνηση των ΡΟ43- του βιοαπατίτη που εμφανίζεται ως μια κορυφή στα 960 cm-1 ως δείκτης της ποσότητάς του ενώ για το κολλαγόνο δοκιμάστηκαν δύο κορυφές, μια στα 1667 cm-1 που ανήκει στη δόνηση του αμιδίου Ι και άλλη μια στα 2941 cm-1 που αποδίδεται στην C-H2 δόνηση. Κατά την ανάλυση που ακολούθησε, χρησιμοποιήθηκαν τόσο τα ύψη όσο και τα εμβαδά κάτω από τις αντίστοιχες κορυφές. Οι λόγοι εντάσεων (εκφραζόμενές από τα ύψη ή τα εμβαδά των κορυφών) των δονήσεων 960 cm-1/1667 cm-1 και 960 cm-1/2941 cm-1 είναι ανάλογοι του λόγου περιεκτικοτήτων σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο. Προέκυψαν επομένως τέσσερεις ευθείες αναφοράς. Από αξιολόγηση των συγκεκριμένων ευθειών αναφοράς προέκυψε ότι μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό του λόγου περιεκτικοτήτων βιοαπατίτη και κολλαγόνου παρουσιάζει αυτή που χρησιμοποιεί το λόγο υψών των κορυφών 960 cm-1/1667 cm-1. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός νέου μοντέλου βαθμονόμησης με τη χρήση χημειομετρικών μεθόδων και πιο συγκεκριμένα εφαρμόζοντας τον αλγόριθμο PLS, ο οποίος έχει εφαρμοστεί με σημαντική επιτυχία τα τελευταία χρόνια στην ανάλυση φασματοσκοπικών δεδομένων. Επειδή για την ανάπτυξη του νέου μοντέλου χρησιμοποιήθηκε μια μεγάλη περιοχή του φάσματος (από 366 cm-1 ως 1800 cm-1) και όχι μεμονωμένες δονήσεις, αναμένετο μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό της σύστασης των αγνώστων δειγμάτων. Από τους διάφορους τρόπους κατασκευής μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης βιοαπατίτη και κολλαγόνου που αναπτύχθηκαν, αυτό που επέδειξε τα καλύτερα χαρακτηριστικά ήταν εκείνο που τα πειραματικά δεδομένα, πριν την επεξεργασία τους με τον αλγόριθμο PLS, υποβλήθηκαν στον SNV (Standard Normal Variate) μετασχηματισμό. Μετά την επιλογή των βέλτιστων για κάθε μέθοδο μοντέλων, ακολούθησε η αξιολόγησή τους με άλλες τεχνικές. Αρχικά, ποσοτικοποιήθηκε η περιεκτικότητά σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο μεγάλου αριθμού δοκιμίων οστών, με τις παραπάνω μεθόδους που βασίζονται στη φασματοσκοπία Raman. Ακολούθως, τα ίδια οστά αναλύθηκαν με τις τεχνικές της φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης (AAS) και της θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) ως προς την περιεκτικότητά τους σε ανόργανη και οργανική φάση. Σύγκριση των αποτελεσμάτων από αυτές τις τεχνικές με τα αντίστοιχα που προέκυψαν από την ανάλυση με φασματοσκοπία Raman, κατέδειξαν μειωμένη ικανότητα πρόβλεψης της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο και για τα δύο μοντέλα που είχαν αναπτυχθεί με βάση τη φασματοσκοπία Raman. Θεωρώντας ως ένα από τους λόγους αποτυχίας των παραπάνω μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης την επιλογή της δόνησης του αμιδίου Ι στα 1667 cm-1 ως δείκτη της ποσότητας του κολλαγόνου, επιχειρήθηκε η κατασκευή ενός νέου μοντέλου ποσοτικής ανάλυσης, με την επιλογή διαφορετικών δονήσεων για την ποσοτικοποίηση του κολλαγόνου. Οι κορυφές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αυτές στα 855 και 878 cm-1 οι οποίες ανήκουν σε δονήσεις των αμινοξέων προλίνη και υδροξυπρολίνη αντίστοιχα ενώ, για το βιοαπατίτη χρησιμοποιήθηκε και η κορυφή στα 960 cm-1. Και πάλι αναπτύχθηκαν μοντέλα λαμβάνοντας υπόψη τα ύψη και τα εμβαδά των παραπάνω κορυφών. Τελικά, προέκυψε ότι το βέλτιστο μοντέλο ήταν αυτό στο οποίο ως δείκτης της ποσότητας του κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκε το άθροισμα των υψών των κορυφών στα 855 και 878 cm-1. Αξιολόγηση του συγκεκριμένου μοντέλου μέσω της σύγκρισης με τα αποτελέσματα που εξήχθησαν από τις ποσοτικές αναλύσεις με την ατομική απορρόφηση και τη θερμοσταθμική ανάλυση, κατέδειξε ιδιαίτερα ικανοποιητική σύγκλιση των τιμών περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο από τις τρεις τεχνικές. Ως εκ’ τούτου, κατέστη δυνατή η δημιουργία ενός μοντέλου ακριβούς πρόβλεψης της σύστασης των οστών ως προς την ανόργανη και την οργανική φάση. Η εξίσωση της καμπύλης αναφοράς που προτείνεται για το σκοπό αυτό είναι η: όπου: Ηi είναι το ύψος της κορυφής του φάσματος Raman στον κυματάριθμο i και ΧΒ, ΧC οι % κ.β. περιεκτικότητες των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο αντίστοιχα.