Φαρμακολογική μελέτη της αντινεοπλασματικής δράσης νέων παραγώγων τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων
Authors: Σαγρέδου Σοφία 
Published: April 2022

Η σύντηξη του 1,2,4-τριαζολικού δακτυλίου με τον 1,3,4-θειαδιαζολικό δακτύλιο αποτελεί μια κατηγορία θεραπευτικών παραγόντων με ευρύ φάσμα φαρμακολογικών ιδιοτήτων συμπεριλαμβανομένου της αντικαρκινικής. Οι σημαντικές δυνατότητες χημικής σύνθεσης των 1,2,4-τριαζολίων και 1,3,4-θειαδιαζολίων οδήγησαν στο σχεδιασμό και σύνθεση νέων παραγώγων 3,6 διϋποκατεστημένων 1,2,4-τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων εκ των οποίων κάποια ξεχώρισαν για την in vitro και in vivo αντικαρκινική τους δράση.Σκοπός είναι η in vitro εκτίμηση της φαρμακολογικής αντικαρκινικής δράσης νέων πρωτότυπων ενώσεων και η διαλογή των αποτελεσματικότερων εξ’ αυτών, η διερεύνηση των πρωτεϊνών που αποτελούν στόχους των υπό μελέτη παραγώγων και τέλος η in vitro αξιολόγηση των επιδράσεών τους στους προβλεπτικούς βιοδείκτες MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) και TMB (tumor mutation burden). Επίσης, μελετήθηκε η αποπτωτική δράση και η επίδραση των υπό μελέτη μορίων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.Για τις ανάγκες της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: πέντε παχέος εντέρου (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) και δύο προστάτη (DU-145, PC-3) με διαφορετικούς MSI φαινοτύπους. Η in vitro αντινεοπλασματική δράση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26, ΚΑ39, SF29 και SF30 μελετήθηκε με τη μέθοδο MTT ενώ με τις μεθόδους χρώσης με αννεξίνη V/7-AAD και ιωδιούχο προπίδιο εκτιμήθηκε η επίδραση του μορίου ΚΑ39 στην απόπτωση και στον κυτταρικό κύκλο, αντίστοιχα. Σχετικά με την αντινεοπλασματική δράση των υπό μελέτη μορίων, διεξήχθησαν in silico υπολογιστικές μελέτες οι οποίες ανέδειξαν τις πρωτεΐνες TopIIα και Akt1/2 ως πιθανούς στόχους. Στην περίπτωση της TopIIα, η ανασταλτική επίδραση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26 και ΚΑ39 διερευνήθηκε τόσο στην καταλυτική της δραστηριότητα (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) όσο και στη φωσφορυλίωσή της (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). Σχετικά με τις κινάσες Akt1/2, εξετάσθηκαν τα παράγωγα ΚΑ25 και ΚΑ39 ως πιθανοί αναστολείς με τη μέθοδο της ενδοκυττάριας κυτταρομετρίας ροής. Η επίδραση του πλέον δραστικού παραγώγου ΚΑ39 στους ανοσογόνους προβλεπτικούς δείκτες, PD-L1, MSI και TMB, μελετήθηκε σε MSI-H και MSS καρκινικά κύτταρα με τη μέθοδο της εξωκυττάριας κυτταρομετρίας ροής, με PCR ανάλυση για τα πέντε συστήματα μικροδορυφόρων του πάνελ Bethesda και της στοχευμένης αλληλούχισης (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των MTT πειραμάτων, από τα υπό μελέτη παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, ως πιο δραστικό ανεδείχθη το χημικό μόριο ΚΑ39 λόγω της αξιοσημείωτης κυτταροστατικής και κυτταροτοξικής δράσης που προκάλεσε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (P<0.001). Η χορήγηση του παραγώγου ΚΑ39 οδήγησε τα καρκινικά κύτταρα σε πρώιμη και όψιμη απόπτωση και προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S (P<0.001). Ο επαγόμενος από το παράγωγο ΚΑ39 σχηματισμός του υπερελικωμένου DNA κατά την αντίδραση χαλάρωσης του πλασμιδιακού DNA σε συνδυασμό με τη στατιστικά σημαντική μείωση στη φωσφορυλίωση της TopIIα υποδεικνύουν πώς η ΚΑ39 ανήκει στους αναστολείς TopIIα. Ακόμη, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αναστολή στη φωσφορυλίωση των Akt1/2 ύστερα από την επίδραση των παραγώγων ΚΑ25 και ΚΑ39 (P<0.01). Επιπλέον, η επίδραση του χημικού μορίου ΚΑ39 οδήγησε σε υπερέκφραση του ανοσορρυθμιστικού μορίου PD-L1 στα MSI-H και MSS κύτταρα. Ακόμη, προκάλεσε αποσταθεροποίηση του μηχανισμού MMR κυρίως στις MSI-H και σε μικρότερη έκταση στις MSS κυτταρικές σειρές. Τέλος, συγκρίνοντας τις ομάδες ελέγχου με τα κύτταρα που έλαβαν το παράγωγο ΚΑ39, ουδεμία μεταβολή παρατηρήθηκε στο TMB.Συμπερασματικά, από τα νέα παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, η χημική ένωση ΚΑ39 απεδείχθη η πιο δραστική σύμφωνα με την in vitro κυτταροστατική και κυτταροτοξική δράση που επήγαγε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα παρόντα επιστημονικά ευρήματα δείχνουν πώς πρόκειται για ένα πιθανό φάρμακο με πολλαπλούς στόχους και σημαντική αντινεοπλασματική δράση καθώς και την ικανότητα να πυροδοτήσει την έκφραση του ανοσοσυνδέτη PD-L1 και συγχρόνως να προκαλέσει διαταραχές στη λειτουργικότητα του μηχανισμού MMR οι οποίες αποτυπώνονται στο φαινότυπο MSI. Συμπερασματικά, το παράγωγο ΚΑ39 φαίνεται να είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντικαρκινικός παράγοντας με δυνατότητες περαιτέρω ανάπτυξης στην κλινική εφαρμογή και στην αντικαρκινική χημειο-ανοσοθεραπεία.