Μοριακός χαρακτηρισμός δυνητικώς τοξικών στελεχών βακτηρίων και πρωτίστων από υδάτινα οικοσυστήματα
Authors: Μαυρογιώργου Μαρία-Χριστίνα 
Published: September 2021

Η ραγδαία αύξηση πληθυσμού φυκών σε υδάτινα οικοσυστήματα με ταυτόχρονη παραγωγή βιοτοξινών είναι ένα φαινόμενο γνωστό ως επιβλαβής άνθιση φυκών (HAB – Harmful Algal Bloom). Οι βιοτοξίνες αυτές παράγονται από πλαγκτονικούς οργανισμούς (κυανοβακτήρια και πρώτιστα) και συσσωρεύονται στα οστρακοειδή. Κατανάλωση οστρακοειδών που περιέχουν βιοτοξίνες απειλεί την ανθρώπινη υγεία μέσω δηλητηριάσεων. Αναλόγως των συμπτωμάτων που προκαλούν, οι δηλητηριάσεις αυτές διακρίνονται σε: Αμνησιακή δηλητηρίαση (ASP) (τοξίνη: δομοϊκό οξύ), Παραλυτική δηλητηρίαση (PSP) (σαξιτοξίνες), Ηπατική δηλητηρίαση (HSP) (μικροκυστίνες), Διαρροϊκή δηλητηρίαση (DSP) (οκαδαϊκό οξύ και δινοφυσιοτοξίνες) και Νευροτοξική δηλητηρίαση (NSP) (μπρεβετοξίνες). Από προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα, έχει αναφερθεί η ύπαρξη τοξινών αμνησιακής, παραλυτικής, ηπατικής, διαρροϊκής και νευροτοξικής δηλητηρίασης στον Αμβρακικό Κόλπο. Οι οργανισμοί που έχουν ενοχοποιηθεί για την παραγωγή των τοξινών αυτών έχουν προσδιοριστεί μόνο με μικροσκοπική παρατήρηση. Στη παρούσα εργασία μελετήσαμε την ύπαρξη θαλασσίων βιοτοξινών σε ιστούς μυδιών που συλλέχθηκαν εποχικά από έξι θέσεις δειγματοληψίας περιμετρικά του Αμβρακικού Κόλπου. Ο προσδιορισμός των βιοτοξινών έγινε με εξειδικευμένη για κάθε τοξίνη δοκιμασία, με την μέθοδο της ELISA. Επιβεβαιώσαμε την ύπαρξη τεσσάρων από τις πέντε τοξίνες που μελετήσαμε: μπρεβετοξίνες (1,65 – 68,25ng/g ww), μικροκυστίνες (18,6 – 117,5ng/g), οκαδαϊκό οξύ 19,6 – 494,1ng/g) και δομοϊκό οξύ). Οι σαξιτοξίνες ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες τοξίνες που αναφέρθηκαν, η παρουσία της μικροκυστίνης στα μύδια από τον Αμβρακικό Κόλπο είναι έντονη σε όλη τη διάρκεια του έτους. Από δείγματα επιφανειακού νερού, προσπαθήσαμε να ταυτοποιήσουμε τους μικροοργανισμούς που πιθανά παράγουν τις τοξίνες αυτές, χρησιμοποιώντας μοριακές τεχνικές. Πιο συγκεκριμένα κατασκευάσαμε μια γονιδιακή βιβλιοθήκη για την περιοχή 16S-ITS-23S rDNA των κυανοβακτηρίων. Τα περισσότερα κυανοβακτήρια ανήκουν στο γένος Synechococcus και συγκεκριμένα στην ομάδα 5.3. Κυανοβακτήρια της ομάδας αυτής εμφανίζονται κυρίως στην Μεσόγειο, στη Θάλασσα των Σαργασσών και στην Ανατολική Θάλασσα. Για λεπτομερέστερη ανάλυση της βιοποικιλότητας των κυανοβακτηρίων και των πρωτίστων, συνεχίσαμε με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS). Τα αποτελέσματα της NGS ανάλυσης δείχνουν την ύπαρξη 7 κοινών OTU κυανοβακτηρίων σε όλα τα δείγματα μας, ενώ 4 από αυτές καλύπτουν >90% του πληθυσμού των κυανοβακτηρίων. Όλες ανήκουν στο γένος Synechococcus. Δεν βρέθηκε κάποιο κυανοβακτήριο να ανήκει σε γένος που ξέρουμε πως παράγει μικροκυστίνη. Τα περισσότερα πρώτιστα ανήκουν στην υπερσυνομοταξία των Κυψελιδωτών (Alveolata) και στην συνομοταξία των Δινομαστιγωτών (Dinoflagellata). Μεταξύ των δειγμάτων, υπάρχουν 23 OTU πρωτίστων, παρούσες σε όλα τα δείγματά μας, με 11 από αυτές να είναι άφθονες (>1% του δείγματος). Στο σύνολο των OTU των πρωτίστων από τα γνωστά δυνητικά τοξικά γένη υπάρχουν τα Alexandrium και Gymnodinium – υπεύθυνα για την παραγωγή τοξινών παραλυτικής δηλητηρίασης - και Prorocentrum και Dinophysis – υπεύθυνα για την παραγωγή τοξινών διαρροϊκής δηλητηρίασης. Στο τρίτο και τελευταίο μέρος της εργασίας μας, προσπαθήσαμε να καλλιεργήσουμε κυανοβακτήρια που παράγουν μικροκυστίνη. Μια καλλιέργεια βρέθηκε να παράγει μικροκυστίνη μετά από διαδοχικές ανακαλλιέργειες. Μοριακός χαρακτηρισμός της συγκεκριμένης καλλιέργειας έδειξε την ύπαρξη OTU που αντιστοιχούν σε κυανοβακτήρια του γένους Microcystis. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την ύπαρξη δύο γονιδίων του οπερονίου παραγωγής μικροκυστίνης (mcyA-NMT και mcyA-Cd) και πήραμε θετικό αποτέλεσμα μόνο για το γονίδιο mcyA-NMT. Η παρούσα διατριβή αποκαλύπτει ότι ο Αμβρακικός Κόλπος είναι ένα οικοσύστημα, με μεγάλη βιοποικιλότητα και ετερογένεια ακόμη κυρίως στα πρώτιστα. Από τις τοξίνες που μελετήθηκαν, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μικροκυστίνη. Επόμενες μελέτες μπορούν να επικεντρωθούν στην απομόνωση εκείνων των κυανοβακτηρίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή μικροκυστίνης.