Λιποσώματα που ενσωματώνουν αρσονολιπίδια
Authors: Ζαγανά Παρασκευή 
Published: August 2021

Στη παρούσα εργασία, μελετήθηκαν διάφοροι τύποι αρσονολιποσωμάτων, ως προς την επίδραση της λιπιδικής τους σύστασης στην σταθερότητα τους, την αλληλεπίδραση τους με φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και την βιοκατανομή τους. Παρασκευάστηκαν sonicated αρσονολιποσώματα με 1,2-rac-διάκυλοοξυπροπυλ-αρσονικό οξύ με παλμιτόυλ- παράπλευρες αλυσίδες (αρσονολιπίδιο, Ars), χοληστερόλη (Chol) και φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [PC-based αρσονολιποσώματα] ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη (DSPC) [DSPC-based αρσονολιποσώματα], με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 12:8:10 mol:mol:mol. Επίσης παρασκευάστηκαν παρόμοια αρσονολιποσώματα με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 17:3:10 mol:mol:mol. Παρασκευάστηκαν επίσης αρσονολιποσώματα που, εκτός από αρσονολιπίδιο, χοληστερόλη, φωσφατιδυλοχολίνη ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη περιείχαν στην σύσταση τους και PEG2000-λιπίδιο (πολυαιθυλενογλυκόλη, Μ.Β. 2000, συζευγμένη με 1,2-διστεαρόυλ-φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, DSPE-PEG2000) [PEGylated PC- και DSPC-based αρσονολιποσώματα]. Εκτός από τα παραπάνω αρσονολιποσώματα, παρασκευάστηκαν και sonicated λιποσώματα με χοληστερόλη και PC ή DSPC σε αναλογίες PC:Chol και DSPC:Chol 2:1 mol:mol («συμβατικά» λιποσώματα, χωρίς αρσονολιπίδιο). Μελετήθηκε αρχικά η τοξικότητα όλων των παραπάνω λιποσωμάτων έναντι διάφορων τύπων καρκινικών κυττάρων: ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων (ΝΒ4), κυττάρων από καρκίνο του προστάτη (PC3), ανθρώπινων κυττάρων από καρκίνο του μαστού (MDA-MB-468) και Τ-λεμφοκυττάρων από ασθενείς με λευχαιμία (ΜΤ-4), καθώς και έναντι φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβες ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC). Η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων υπολογίσθηκε με μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από αλληλεπίδραση τους με τα λιποσώματα με την μέθοδο MTT. Από τις καμπύλες βιωσιμότητας υπολογίσθηκαν και οι IC50 τιμές, οι συγκεντρώσεις δηλαδή στις οποίες κάθε λιπόσωμα προκαλεί 50% μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα όλοι οι τύπο αρσονολιποσωμάτων είναι τοξικοί έναντι των καρκινικών κυττάρων (PC3, NB4 και MT-4), με εξαίρεση τα MDA-MB-468 κύτταρα, ενώ αντιθέτως δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητα των φυσιολογικών HUVEC κυττάρων. Ωστόσο, για τον ίδιο τύπο κυττάρων, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών τύπων αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες δεν είναι ανάλογες με τις διαφορές της σταθερότητας των αρσονολιποσωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακεραιότητα της μεμβράνης των αρσονολιποσωμάτων δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την εμφάνιση τοξικότητας. Είναι φανερό επομένως πως η σύσταση των αρσονολιποσωμάτων πρέπει να προσαρμόζεται κατάλληλα, ανάλογα με την in vivo κινητική τους και την επιθυμητή βιοκατανομή τους. Μελετήθηκε επίσης ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης των λιποσωμάτων με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, καθώς αυτές οι δυο κυτταρικές σειρές ήταν οι σειρές που επέδειξαν την περισσότερη και την λιγότερη ευαισθησία αντίστοιχα έναντι των αρσονολιποσωμάτων στις μελέτες βιωσιμότητας, με χρήση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου. Η μέθοδος επιτρέπει την παρακολούθηση της ενδοκυττάρωσης, της δέσμευσης και διαφυγής των λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Το HPTS, μια υδατοδιαλυτή, έντονα φθορίζουσα ουσία, της οποίας ο φθορισμός εξαρτάται από το pH, εγκλωβίστηκε στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Η τιμή του φθορισμού του HPTS στα 413 nm εξαρτάται από το pH, ενώ είναι ανεξάρτητη από το pH στα 454 nm, με μήκος κύματος διέγερσης 512 nm. Η ύπαρξη ισοασβεστικού σημείου στα 413 nm επιτρέπει την «μετάφραση» του φθορισμού σε ποσότητα της ουσίας. Τα NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα επωάστηκαν με λιποσώματα που είχαν εγκλωβίσει φθορίζουσα στο εσωτερικό τους (HPTS-λιποσώματα) στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα και υπολογίστηκε ο λόγος των τιμών φθορισμού στα 413 nm και τα 454 nm (Ι454/Ι413), που λειτουργεί ως ένδειξη της ενδοκυττάριας εντόπισης των λιποσωμάτων. Με σκοπό να διευκρινιστεί ο εντοπισμός των λιποσωμάτων στα κύτταρα μετά την επώαση τους, τα κύτταρα επωάστηκαν με NH4Cl, που αλκαλοποιεί το όξινο περιβάλλον των υποκυτταρικών διαμερισμάτων, με αποτέλεσμα αύξηση της τιμής φθορισμού στα 454 nm, εφόσον η φθορίζουσα βρίσκεται στα ενδοσώματα (π.χ. λυσοσώματα). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αναστραφεί με απομάκρυνση του NH4Cl. Υπολογίσθηκαν οι λόγοι Ι454/Ι413 πριν και μετά την επώαση τους με NH4Cl, καθώς και μετά από την απομάκρυνση του. Προσδιορίστηκε επίσης το % ποσοστό πρόσληψης αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα. Η τιμή του φθορισμού στα 413 nm αποτελεί μέτρο της συγκέντρωσης αρσονολιποσωμάτων στα κύτταρα, ανεξάρτητα από το σημείο εντόπισης τους (ανεξάρτητα από το pH). Με σύγκριση των τιμών φθορισμού με πρότυπες καμπύλες αναφοράς προσδιορίστηκε η συγκέντρωση φθορίζουσας σε NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, μετά από επώαση τους με HPTS-λιποσώματα στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα. Οι ίδιες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και μετά από επώαση NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με τα ίδια HPTS-αρσονολιποσώματα στους 4 oC, με σκοπό να διευκρινιστεί αν ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης τους εξαρτάται από την θερμοκρασία, αν είναι δηλαδή ενεργειακά εξαρτώμενη διαδικασία. Για τις μορφολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, προστέθηκε στα λιποσώματα επισημασμένο με φθορίζουσα λιπίδιο στην μεμβράνη τους (ροδαμίνη συζευγμένη με φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, Rho-PE) και η κατανομή των λιποσωμάτων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά μετά από επώαση τους στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα. Η επίδραση αναστολέων της ενδοκυττάρωσης μελετήθηκε με επώαση των NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με χλωροπρομαζίνη (CPZ, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης) και με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (ΜeβCD, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω caveolae) πριν την επώαση τους με HPTS-λιποσώματα. Προσδιορίστηκαν στην συνέχεια οι λόγοι Ι454/Ι413 και τα % ποσοστά πρόσληψης των αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα, με σκοπό να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ενδοκυττάρωσης. Όλα τα αρσονολιποσώματα επέδειξαν σχεδόν την ίδια συμπεριφορά σε σχέση με τον τρόπο που αλληλεπιδρούν με τα MDA-MB-468 κύτταρα. Ο κύριος μηχανισμός ενδοκυττάρωσης τους φαίνεται να περιλαμβάνει συμμετοχή υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των μελετών βιωσιμότητας προκύπτει ότι η έλλειψη τοξικότητας αυτών των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση τους στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων ως φυσικό επακόλουθο της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης, γεγονός που συμφωνεί και με τον προσδιορισμό αρσενικού που έγινε στα MDA-MB-468 κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης και ανιχνεύτηκαν ποσοστά αρσενικού μόνο στην περίπτωση των πιο σταθερών DSPC-based λιποσωμάτων (PEGylated και μη). Στην περίπτωση των NB4 κυττάρων, προκύπτει πως η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να συνδέεται επίσης με το ποσοστό συμμετοχής υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Λιποσώματα όπως τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα (που είναι τα πιο τοξικά), δεν αλληλεπιδρούν καθόλου με τα NB4 κύτταρα μέσω υποδοχέων, ενώ αντίθετα τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα, που αποδείχθηκαν τα λιγότερο τοξικά έναντι των NB4 κυττάρων, φαίνεται να εισέρχονται στα κύτταρα αποκλειστικά μέσω κλαθρίνης ή/και caveolae. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης, δεν ανιχνεύτηκαν παρ’ όλα αυτά ποσοστά αρσενικού στα κύτταρα, γεγονός που θέτει πολλά ερωτηματικά για την ενδοκυττάρια τύχη των αρσονολιποσωμάτων και συγκεκριμένα των αρσονολιπιδίων, δεδομένου ότι γίνεται ενδοκυττάρωση ολόκληρων των λιποσωμάτων αφού «control» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα δεν αποδείχθηκαν τοξικά για τα κύτταρα. Τέλος, με σκοπό να μελετηθεί η βιοκατανομή των αρσονολιποσωμάτων, πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα. Σε ένα πρώτο σετ πειραμάτων, ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα 1, 2, 5, 12 και 24 ώρες μετά την χορήγηση μετρήθηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS). Ένα υψηλό ποσοστό της δόσης που χορηγήθηκε αποβλήθηκε ταχέως, καθώς στην πρώτη ώρα μετά την χορήγηση σχεδόν 30-40% της δόσης ανιχνεύθηκε στις ιστούς των ζώων. Από το χρονικό σημείο αυτό και μετά, η απομάκρυνση του αρσενικού ήταν βραδεία με χρόνους ημιζωής 27.6 h για τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα και 83 h για τα DSPC-based. Και για τους δύο τύπους αρσονολιποσωμάτων, η κατανομή αρσενικού ήταν υψηλότερη στα έντερα, μετά στο ήπαρ και μειωνόταν κατά την ακόλουθη σειρά: δέρμα + τρίχωμα, στομάχι, σπλήνα, νεφρά, πνεύμονες και καρδιά. Από τα αποτελέσματα αυτά, αν συγκριθούν με τα αποτελέσματα από παρόμοιες μελέτες που έχουν γίνει με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα, φαίνεται πως τα DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα χαρακτηρίζονται από καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα. Από το γεγονός αυτό γίνεται φανερό πως η λιπιδική σύσταση (και κατ’ επέκταση η σταθερότητα) των λιποσωμάτων επηρεάζει το φαρμακοκινητικό τους προφίλ και συνεπώς, η σωστή επιλογή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων είναι πολύ σημαντική ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται τα λιποσώματα. Παρόμοιες in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν τόσο με DSPC-based και PEGylated DSPC-based, όσο και με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα. Τα λιποσώματα χορηγήθηκαν ενδοφλέβια (i.v.) σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα προσδιορίστηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS) 1, 3 και 24 ώρες μετά την χορήγηση. Στην περίπτωση των DSPC-based, τα επίπεδα αρσενικού στους ιστούς των ζώων ήταν γενικά υψηλότερα συγκριτικά με τα επίπεδα μετά από χορήγηση PC-based αρσονολιποσωμάτων. Η επικάλυψη των λιποσωμάτων με PEG επηρέασε περισσότερο την συμπεριφορά των DSPC-based. Τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα επέδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με τα PEGylated «συμβατικά» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα. Μετά από σύγκριση με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με i.p. χορήγηση, προκύπτει πως ο ρόλος της οδού χορήγησης είναι σημαντικός στην κινητική των αρσονολιποσωμάτων, όπως και στην περίπτωση των «συμβατικών» λιποσωμάτων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι, μετά από την i.v. χορήγηση, βρέθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες αρσενικού στον εγκέφαλο, που αποτελεί ένδειξη πως τα αρσονολιποσώματα μπορούν να περάσουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμό σε κάποιο ποσοστό, όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα.