Λειτουργικές γονιδιωματικές προσεγγίσεις για τη μελέτη της μορφογένεσης στη Drosophila melanogaster
Authors: Μουρατίδου Μαρία 
Published: August 2021

Τα τελευταία χρόνια πολλές ερευνητικές ομάδες εστίασαν στην ταυτοποίησηγονιδίων που ενέχονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες και η Δροσόφιλααποτέλεσε τον ιδανικό οργανισμό-μοντέλο λόγω της διαθεσιμότητας πολλώνγενετικών εργαλείων. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής ευνόησειδιαίτερα την ευρείας κλίμακας γενετική ανάλυση στη Δροσόφιλα. Εκμεταλλευόμενοιτα διαθέσιμα εργαλεία πραγματοποιήσαμε μία μελέτη σάρωσης βασισμένη σε RNAiγια γονίδια που εμπλέκονται στη μορφογένεση του συστήματος των σωματικών μυώνκαι του επιθηλίου του φτερού της Drosophila melanogaster. Συνολικά, εξετάσαμε321 γονίδια με συστημική ή ιστοειδική RNAi σιώπηση στο μεσόδερμα ή μεσυνδυασμό και των δύο και ταυτοποιήσαμε 58 γονίδια άγνωστης λειτουργίας ταοποία χρειάζονται για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του εμβρυϊκού/προνυμφικούμυϊκού συστήματος. Περιέργως, στις μισές σχεδόν περιπτώσεις δεν παρατηρήσαμεφαινότυπο θνησιμότητας πλήρους διεισδυτικότητας, γεγονός που υποδεικνύει ότι οαριθμός των γονιδίων που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη διεργασία είναιμεγαλύτερος από αυτόν που έχει προβλεφθεί με βάσει τα αποτελέσματα μίας ευρείαςκλίμακας μελέτης σάρωσης με RNAi στο μυϊκό σύστημα που ολοκληρώθηκεπρόσφατα. Επιπλέον, μελετήσαμε 242 γονίδια με ιστοειδική σιώπηση στα επιθήλιακαι ταυτοποιήσαμε 32, τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα, και 24, ταοποία είναι αναγκαία για τη μορφοποίηση του ενήλικου φτερού. Από τα γονίδια πουέδωσαν θετικό αποτέλεσμα επιλέξαμε ένα το οποίο είναι απαραίτητο και για τις δύοδιεργασίες, το chd64.Το chd64 κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που αποτελείται από μία δομική περιοχήμε ομολογία στις καλπονίνες (CH) και ένα μοτίβο CLIK23 και παρουσιάζει 42% και43% ταυτότητα με τις τρανσγελίνες 2 και 3 των θηλαστικών αντιστοίχως. Οιτρανσγελίνες συνιστούν μία οικογένεια πρωτεϊνών που εμφανίζουν υψηλό βαθμόσυντήρησης και συμμετέχουν στο σχηματισμό δεσμίδων και στη σταθεροποίηση τωνινιδίων ακτίνης. Το γονιδίωμα της Δροσόφιλας εμπεριέχει τρεις διαφορετικούςγενετικούς τόπους: CG4694 ή Mp20, CG14996 ή Chd64 and CG5023, σε πλήρηαναλογία με τα γονιδιώματα των θηλαστικών. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μαςέδειξαν ότι από τα γονίδια που κωδικοποιούν τις τρεις τρανσγελίνες της Δροσόφιλαςμόνο το Chd64 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα και τη σωστή ανάπτυξη τωνμυϊκών και επιθηλιακών ιστών. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του γονιδίου ήταν απαραίτητο: α) να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης του και β) να αξιολογήσουμετα αποτελέσματα της απώλειας λειτουργίας του σε διαφορετικούς ιστούς. Έτσι,δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν τυχαίες ενθέσεις ενός γενωμικούτμήματος του γονιδίου συζευγμένου με GFP που επέτρεπε την παρατήρηση τουενδογενούς προτύπου έκφρασης του γονιδίου σε ζωντανό οργανισμό κατά τηδιάρκεια της ανάπτυξης. Ταυτόχρονα, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα έναντιολόκληρης της πρωτεΐνης Chd64. Επιπλέον, προμηθευτήκαμε δύο UAS:chd64IRστελέχη και πολλά διαφορετικά GAL4 στελέχη με σκοπό να μελετήσουμε τηνεπίδραση της μειορρύθμισης του chd64 σε διαφορετικούς ιστούς. Τέλος,δημιουργήσαμε δύο ελλείψεις που απομακρύνουν το chd64. Τα δεδομένα που έχουμεως τώρα δείχνουν ότι το chd64 εκφράζεται έντονα στον εμβρυϊκό/προνυμφικόπεπτικό σωλήνα, στα αιμοκύτταρα, στην τραχεία, στο νευρικό σύστημα, σταπεριτραχειακά κύτταρα Inka, στους εμβρυϊκούς δίσκους, στους σιελογόνους αδένες,στην επιδερμίδα και στα τενόντια κύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώσαμε έκφραση τουγονιδίου στα θυλακοκύτταρα και μισχοειδή κύτταρα των ωοθυλακίων. Σε όλους τουςπαραπάνω κυτταρικούς τύπους η πρωτεΐνη συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα καιστην περιφέρεια του κυττάρου. Λεπτομερέστερη ανάλυση των μεγάλων κυττάρωντων σιελογόνων αδένων έδειξε ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται σε μεβρανικές δομές πουαντιστοιχούν στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο φλοιό του κυττάρου, όπουσυνεντοπίζεται με την ακτίνη. Οι μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι έκφρασητου chd64 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία ή/καιλειτουργικότητα των μαλπιγγιανών σωληναρίων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι ηαναστολή της ζυγωτικής έκφρασης του γονιδίου οδηγεί σε διόγκωση τωνμαλπιγγιανών σωληναρίων και σχετίζεται με τη μη φυσιολογική υποκυτταρικήκατανομή της DE-καδερίνης. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης του γονιδίου στηνπροαναφερθείσα διαδικασία παραμένει άγνωστος. Η απομάκρυνση της μητρικήςπροέλευσης Chd64 πρωτεΐνης και η εκτενέστερη εξέταση της διαδικασίαςκαθορισμού και της πολικότητας των κυττάρων που συγκροτούν τα μαλπιγγιανάσωληνάρια σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο γενετικό υπόβαθρο με τη χρήσηκατάλληλων μαρτύρων θα μας δώσουν νέες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργίατου γονίδιου σε ολόκληρο τον οργανισμό.