Mechanisms of muscle function
Authors: Πουλιανίτη Κωνσταντίνα 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Η Χρόνια Νεφρική Νόσος (ΧΝΝ) χαρακτηρίζεται ως μία σιωπηλή επιδημία και αναμφίβολα αποτελεί μία από τις πιο σοβαρές ασθένειες παγκοσμίως. Η ασθένεια συνοδεύεται από παθήσεις, όπως είναι η αναιμία, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, η αθηροσκλήρωση και ο διαβήτης, οι οποίες συμβάλλουν στην μειωμένη ποιότητα ζωής και τη θνησιμότητα των ασθενών. Επιπρόσθετα, η ΧΝΝ συνοδεύεται από διάφορες παθήσεις των σκελετικών μυών που εν μέρει αποδίδονται στην υποκινητικότητα των ασθενών αλλά και στην ουραιμική τοξικότητα. Η αδυναμία του σκελετικού μυός καθώς και οι μεταβολικές διαταραχές του αποτελούν στοιχεία λειτουργικών και μεταβολικών αλλοιώσεων τα οποία συγκεντρωτικά ονομάζονται ουραιμική μυοπάθεια. Έχει προταθεί ότι το οξειδωτικό στρες συμβάλει σε μεγάλο βαθμό σε όλες τις παραπάνω παθολογικές καταστάσεις που εμφανίζονται στη ΧΝΝ. Αν και η εξέλιξη της νόσου σχετίζεται με τις επιβλαβείς επιδράσεις του οξειδωτικού στρες, ο ρόλος του δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί σε προγενέστερα στάδια της νόσου πριν το τελικό στάδιο (αιμοκάθαρση).Σκοπός: Ο σκοπός της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις συστημικές επιδράσεις της ΧΝΝ στο οξειδοαναγωγικό προφίλ του αίματος, χρησιμοποιώντας ένα ζωικό μοντέλο προ-τελικού σταδίου ΧΝΝ (Μελέτη 1). Επίσης, στόχος ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση της ΧΝΝ στο οξειδοαναγωγικό προφίλ του σκελετικού μυός. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν δύο διαφορετικοί τύποι σκελετικού μυός, ο ψοΐτης (ταχείας συστολής) και ο υποκνημίδιος (βραδείας συστολής) (Μελέτη 2). Η μελέτη επίσης αξιολόγησε το βιοχημικό και αιματολογικό προφίλ του ζωικού μοντέλου και εξετάστηκε η πιθανή συσχέτιση τους με το οξειδωτικό στρες (Μελέτη 3). Τέλος, εξετάστηκε κατά πόσο οι δείκτες οξειδωτικού στρες που αξιολογήθηκαν στο αίμα αντικατοπτρίζουν επαρκώς την οξειδοαναγωγική κατάσταση στο μυ και αν η οξειδοαναγωγική κατάσταση που μετρήθηκε στον ψοΐτη μυ αντανακλά την οξειδοαναγωγική κατάσταση του υποκνημιδίου (Μελέτη 4).Μεθοδολογία: Χρησιμοποιήθηκε ένα ζωικό μοντέλο ΧΝΝ και συγκεκριμένα λευκοί θηλυκοί κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας. Τα πρωτόκολλα της εγχείρισης και της ευθανασίας (μετά από 3 μήνες) εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Βιοηθικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Η νεφρική ανεπάρκεια προκλήθηκε με την αφαίρεση του δεξιού νεφρού και την μερική νεφρεκτομή του αριστερού νεφρού (ουραιμική ομάδα Ν=9). Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε εικονική εγχείριση (ομάδα ελέγχου, Ν=6). Και από τις δύο ομάδες ζώων συλλέχθηκαν δείγματα αίματος και σκελετικού μυός (ψοΐτης, υποκνημίδιος) και προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις της Ανηγμένης Γλουταθειόνης (GSH), της Οξειδωμένης Γλουταθειόνης (GSSG), του λόγου GSH/GSSG, της Ολικής Αντιοξειδωτικής Ικανότητας (TAC), των Ουσίων που αντιδρούν με Θειοβαρβιτουρικό Οξύ (TBARS), των Πρωτεϊνικών Καρβονύλίων (PC) καθώς και οι δραστικότητες της Ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης (GR –Reductase) και της Καταλάσης (CAT). Στα δείγματα του αίματος προσδιορίστηκαν επίσης οι συγκεντρώσεις των βιοχημικών δεικτών όπως η Ολική Χοληστερόλη, η Υψηλής-Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνη (HDL), η Χαμηλής-Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνη (LDL), τα Τριγλυκερίδια, ο λόγος Τριγλυκερίδια/HDL, η Γλυκόζη και η Χολερυθρίνη καθώς και τα επίπεδα των αιματολογικών παραμέτρων όπως τα Λευκοκύτταρα, τα Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC), η Αιμοσφαιρίνη (Hb), ο Αιματοκρίτης (Hb), ο Μέσος όγκος ερυθρών (MCV) και η Μέση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης (MCH). Μετρήθηκαν επίσης η Ουρία, η Κρεατινίνη και η Ολική πρωτεΐνη πλάσματος.Αποτελέσματα: (Μελέτη 1) Η συγκέντρωση της GSH βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη στην ουραιμική ομάδα (17.50 ± 1.73 μmol/g protein) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (12.43 ± 1.01 μmol/g protein), p=0.033. Η συγκέντρωση των TBARS παρουσίασε μία τάση για αύξηση στην ουραιμική ομάδα (7.03 ± 0.81 nmol/ml), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (5.12 ± 0.42 nmol/ml), p=0.060. Δεν βρέθηκαν άλλες σημαντικές διαφορές στους υπόλοιπους δείκτες οξειδωτικού στρες που μετρήθηκαν στο αίμα των δύο ομάδων (p>0.05).(Μελέτη 2) Σημαντική επίδραση της ομάδας παρατηρήθηκε για τα PC και στους δύο μύες με την συγκέντρωσή τους να είναι υψηλότερη στην ουραιμική ομάδα (ψοΐτης: 1.086 ± 0.294, υποκνημίδιος: 2.52 ± 0.29 nmol/mg protein) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (ψοΐτης: 0.596 ± 0.372, υποκνημίδιος: 0.929 ± 0.41nmol/mg protein). Σημαντική επίδραση του μυός παρατηρήθηκε για τις συγκεντρώσεις των Total protein, PC, TBARS, GSH, TAC, και της δραστικότητες των CAT και GR-Reductase και στις δύο ομάδες με τα επίπεδά τους να είναι υψηλότερα στην ουραιμική ομάδα (ψοΐτης: 1.086 ± 0.294, υποκνημίδιος: 2.52 ± 0.29 nmol/mg protein) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (ψοΐτης: 0.596 ± 0.372, υποκνημίδιος: 0.929 ± 0.41nmol/mg protein). Η συγκεντρώσεις των Total Protein και TAC ήταν σημαντικά χαμηλότερες στον υποκνημίδιο μυ σε σχέση με τον ψοΐτη και στις δύο ομάδες. Επίσης ο υποκνημίδιος παρουσίασε υψηλότερα επίπεδα TBARS και PC όπως επίσης και υψηλότερα επίπεδα GSH, Catalase και GR-Reductase σε σχέση με τον ψοΐτη τόσο στην ουραιμική όσο και στην ομάδα ελέγχου. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο τύπων μυός και των δύο ομάδων για όλους τους δείκτες οξειδωτικού στρες (p>0.05). (Μελέτη 3) Δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στο λιπιδαιμικό προφίλ της ουραιμικής ομάδας συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (p>0.05). Ωστόσο ο λόγος Τριγλυκερίδια/HDL βρέθηκε 5,67, πολύ υψηλότερος από την τιμή 4 της ομάδας Ελέγχου. Επίσης οι συγκεντρώσεις των RBC, Hematocrit και MCH βρέθηκαν σημαντικά χαμηλότερες στην ουραιμική ομάδα (3.92 ± 0.29 × 106/mm3, 26.06 ± 1.85 %, 19.76 ± 0.67 pg/cell) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (5.10 ± 0.17 × 106/mm3, 35.24 ± 0.79 %, 21.64 ± 0.44 pg/cell), p<0.05, και το MCV παρουσίασε μία τάση για μείωση στην ουραιμική ομάδα (65.40 ± 1.89 mm3 ) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (69.78 ± 1.36 mm3, p=0.087).(Μελέτη 4) Για κάθε έναν από τους δείκτες οξειδωτικού στρες που αξιολογήθηκε, η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του στο αίμα και των επιπέδων του στους δύο τύπους μυός τόσο στο σύνολο των δεδομένων (pool data) όσο και σε κάθε ομάδα ξεχωριστά (p>0.05). Επίσης, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση στα επίπεδα Ουρίας και Κρεατινίνης και των δεικτών του οξειοδαναγωγικού προφίλ στο αίμα και στο σκελετικό μυ, αξίζει να σημειωθεί ότι στο σύνολο των δεδομένων (pool data), τα επίπεδα της Κρεατινίνης παρουσίασαν μία τάση για συσχέτιση με τα επίπεδα της GSH στο αίμα (r=0.655, p=0.078). Αν και στην ομάδα ελέγχου δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση των δεικτών οξειοδαναγωγικού προφίλ μεταξύ των δύο διαφορετικών τύπων μυός (p>0.05), στην ουραιμικη ομάδα παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ ψοΐτη και υποκνημιδίου αναφορικά με τα επίπεδα των PC (r=0.913, p=0.002), της GSSG (r=0.766, p=0.027) και της CAT (r=0.743, p=0.035).Συζήτηση: Στην παρούσα διδακτορική διατριβή παρατηρήθηκε μία αύξηση στα επίπεδα της GSH στο αίμα της ουραιμικής ομάδας κονίκλων, που πιθανότατα αποτελεί έναν προσαρμοστικό μηχανισμό απόκρισης στο οξειδωτικό στρες με σκοπό τη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης. Πράγματι υπήρχε μία τάση για αύξηση του δείκτη λιπιδικής υπεροξείδωσης (TΒΑRS) γεγονός που αποτελεί ένα πρώιμο σημάδι αυξημένου οξειδωτικού στρες στο αίμα του ουραιμικού μοντέλου. Φαίνεται δηλαδή να υπάρχει ή έναρξη της εκδήλωσης ορισμένων αιτιών πρόκλησης καρδιαγγειακών προβλημάτων και αθηρογένεσης στους ασθενείς με ΧΝΝ (Μελέτη 1). Επιπλέον διαπιστώθηκαν αυξημένα επίπεδα των πρωτεϊνικών καρβονυλίων και στους δύο τύπους μυϊκού ιστού στην ομάδα των ουραιμικών κουνελιών. Αυτό μπορεί να θεωρηθεί ως ένα πολύ ενδιαφέρον εύρημα για τη χρονική στιγμή που λαμβάνει χώρα η πρωτεϊνική οξείδωση αφού φανερώνει μία πρώιμη εκδήλωση βλάβης σε επίπεδο πρωτεϊνών. Όσον αφορά τους δύο διαφορετικούς τύπους σκελετικού μυός, στον υποκνημίδιο διαπιστώθηκαν υψηλότερα επίπεδα TBARS, ανεξαρτήτως της ομάδας. Το αποτέλεσμα αυτό οποίο είναι σύμφωνο με το διαφορετικό αριθμό των μιτοχονδρίων ανάμεσα στους δύο μύες, με τον υποκνημίδιο να παρουσιάζει υψηλότερο αριθμό και συνεπώς να είναι περισσότερο εκτεθειμένος σε ROS. Ωστόσο διαπιστώθηκε πως ο υποκνημίδιος μυς ανέπτυξε παράλληλα μία έντονη αντιοξειδωτική δραστηριότητα ώστε να αντιμετωπίσει τα αυξημένα επίπεδα του οξειδωτικού στρες. Παρόλο που τα επίπεδα TAC ήταν μειωμένα στον υποκνημίδιο μυ σε σύγκριση με τον ψοϊτη, τα αυξημένα επίπεδα GSH, CAT and GR-reductase υποδεικνύουν πως σε υγιείς συνθήκες ο υποκνημίδιος δύναται να αναπτύξει αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα σε σύγκριση με τον ψοϊτη και σε συνθήκες ουραιμίας αυτή η ικανότητα αυξάνεται ακόμη περισσότερο (Μελέτη 2). Σχετικά με το λιπιδαιμικό προφίλ, πιθανόν να απαιτούνταν περισσότερος χρόνος για ουραιμικό μοντέλο ώστε να αναπτυχθούν διαταραχές αφού καμία διαφορά δεν βρέθηκε ανάμεσα στις ομάδες. Ωστόσο, η τάση που παρατηρήθηκε για αυξημένη λιπιδική υπεροξείδωση (TBARS) στο πλάσμα και η υψηλότερη τιμή του λόγου Τριγλυκερίδια/HDL στην ουραιμική ομάδα αποτελούν ένα σημάδι εμφάνισης προβλημάτων αθηρογένεσης εξαιτίας της ασθένειας. Αναφορικά με το αιματολογικό προφίλ της ουραιμικής ομάδας, παρατηρήθηκε μια σημαντική διαταραχή σε σχέση με την ομάδα ελέγχου γεγονός που αποτελεί πρώιμο σημάδι εμφάνισης της αναιμίας (Μελέτη 3). Στην παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε επίσης ότι στο μοντέλο της ΧΝΝ δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ των οξειδοαναγωγικών δεικτών που μετρήθηκαν στο αίμα με αυτούς που μετρήθηκαν στους δύο τύπους μυός, αποδεικνύοντας οι οξειδοαναγωγικές αλλαγές που συντελούνται στο μυ, δεν αντανακλώνται στις αντίστοιχες μετρήσεις που διεξάγονται στο αίμα. Παράγοντες όπως, το ζωικό μοντέλο, οι διαφορές μεταξύ των τεχνικών μέτρησης των δεικτών και το στάδιο της ασθένειας είναι πιθανόν να κάλυψαν τη συμβολή του μυός στα επίπεδα οξειδωτικού στρες στο αίμα. Οι σημαντικές συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν μόνο στην ουραιμική ομάδα σχετικά με τα επίπεδα των δεικτών οξειδοαναγωγικού στρες μεταξύ των δύο διαφορετικών τύπων μυός, υποδεικνύουν ότι η πειραματικά προκαλούμενη νεφρική ανεπάρκεια αποτελεί μία αξιόλογη πρόκληση για τη μελέτη του οξειδοαναγωγικού προφίλ του σκελετικού μυός, του οποίου τα δείγματα παρουσιάζουν μία συντονισμένη μεταβλητότητα στα επίπεδα οξειδοαναγωγικής κατάστασης.Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υποδηλώνουν ότι ακόμη και στα μη τελικά στάδια (αιμοδιάλυση) της ΧΝΝ το οξειδωτικό στρες εμφανίζεται στο αίμα και σαν απόκριση προσαρμογής η αντιοξειδωτική άμυνα αυξάνεται με σκοπό να διατηρήσει σταθερή την οξειδοαναγωγική ομοιόσταση. Επίσης, και στους δύο τύπους μυός (ψοϊτη, υποκνημίδιο) ο σχηματισμός πρωτεϊνικών καρβονυλίων υποδεικνύει ένα πρώιμο ερέθισμα αποσύνθεσης των μυϊκών πρωτεϊνών. Ωστόσο, τόσο η οξειδωτική βλάβη όσο και η αντιοξειδωτική απόκριση φαίνεται να εξαρτώνται από τον τύπο του μυός. Επίσης, στο λιπιδαιμικό του προφίλ του μοντέλου ΧΝΝ φάνηκε ότι δεν υπήρξαν σημαντικές διαταραχές σε αυτό το στάδιο της ασθένειας. Δεν μπορεί ωστόσο, να αποκλειστεί εντελώς η πρώιμη εμφάνιση αιτιών αθηρογένεσης η οποία και πρέπει να αντιμετωπιστεί από νωρίς. Ακόμη, βρέθηκε σημαντική διαταραχή στο αιματολογικό προφίλ του μοντέλου, υποδηλώνοντας ότι η έγκαιρη αναγνώριση της αναιμίας σε μη τελικό στάδιο, μπορεί να παίξει πολύ σημαντικό ρόλο στην θεραπεία της και στην πρόοδο της ασθένειας. Τέλος, όπως διαπιστώθηκε, τα επίπεδα των οξειδοαναγωγικών δεικτών στο αίμα δεν αντικατοπτρίζουν την εικόνα της οξειδοαναγωγικής κατάστασης μέσα στο μυ και για το λόγο αυτό χρειάζεται περισσότερη μελέτη στην κατεύθυνση της λιγότερο επεμβατικής παρακολούθησης των οξειδοαναγωγικών ανισορροπιών τους μυός. Συνολικά, τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την ανάγκη για έγκαιρες παρεμβάσεις, στα πρώιμα στάδια της νόσου με σκοπό την προστασία της ακεραιότητας των σκελετικών μυών, τη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας και την διόρθωση της αναιμίας, επιτρέποντας στους ασθενείς να φτάσουν στο τελικό στάδιο της νόσου σε όσο το δυνατόν καλύτερη κατάσταση.