Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός ενζύμων δραστικών σε πολυσακχαρίτες από θαλάσσιο μικροβίωμα με ακραίες συνθήκες περιβάλλοντος
Authors: Τσοπανάκης Βασίλειος 
Published: October 2024

Στο Κεφάλαιο 1 της παρούσας διδακτορικής διατριβής γίνεται μία σύντομη ιστορική αναδρομή για τις πρώτες εφαρμογές των ενζύμων στη βιομηχανία. Στη συνέχεια αναφέρονται οι προκλήσεις που υπάρχουν στη βιομηχανία για τους βιοκαταλύτες και αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την προσαρμογή τους σε βιομηχανικές διεργασίες. Εστιάζοντας στη (μετα)γονιδιωματική προσέγγιση, γίνεται αναφορά στη βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθείται για την ανακάλυψη νέων γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Έπειτα, γίνεται μία γενική εισαγωγή για το προς μελέτη πεδίο έρευνας, την επεξεργασία της θαλάσσιας βιομάζας των φυκών, όπου δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση των φυκών και των εφαρμογών τους στη βιομηχανία. Στη συνέχεια, αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον εξευγενισμό της βιομάζας φυκών και δίνονται πληροφορίες για τα ένζυμα τροποποίησης πολυσακχαριτών. Κλείνοντας το κεφάλαιο παρατίθεται ο στόχος της διατριβής, η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός ενζύμων δραστικών σε πολυσακχαρίτες από θαλάσσιο μικροβίωμα με ακραίες συνθήκες περιβάλλοντος. Στο Κεφάλαιο 2 αναφέρονται τα πρωτόκολλα για τη βιοπληροφορική ανάλυση και τις πειραματικές τεχνικές μοριακής βιολογίας, μικροβιολογίας και ενζυμολογίας που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Στο Κεφάλαιο 3 περιγράφεται η βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθήθηκε για την ταυτοποίηση μιας νέας λυάσης αλγινικού από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τις υδρόθερμες πηγές του ηφαιστείου Kolumbo στο Αιγαίο Πέλαγος, που ονομάστηκε από την ερευνητική μας ομάδα Kolumbo Alginate Lyase (KΑlLy). Η ανάλυση της αλληλουχίας και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της KΑlLy έδειξαν ότι είναι μια λυάση πολυσακχαριτών με μόνο 58% ταυτότητα με γνωστές αλληλουχίες, ανήκει στην οικογένεια λυασών πολυσακχαριτών 7 (PL7) με ενδο- και εξω- δράση σε αλγινικό και πολυ-μαννουρονικό οξύ, με υψηλή δραστικότητα στους 60°C (56 ± 8 U/mg) και υψηλή θερμοσταθερότητα (χρόνος ημίσειας ζωής 30 h στους 50°C). Η ανάλυση της μεθοδολογίας απόκρισης επιφάνειας (RSM) έδειξε ότι οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης με υπόστρωμα το πολυ-μαννουρονικό οξύ είναι 44°C, pH 5.5, σε 440 mM NaCl. Αυτή η νέα λυάση αλγινικού είναι μια πολύτιμη προσθήκη στην εργαλειοθήκη των ενζύμων τροποποίησης αλγινικού, λόγω της διαφορετικής αλληλουχίας και της καλής θερμικής σταθερότητάς της, ενώ λόγω της διαφοράς αλληλουχίας της από τα ήδη χαρακτηρισμένα ένζυμα της κατηγορίας, επιτρέπει την ανακάλυψη νέων PL7 ενζύμων. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφεται η βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθήθηκε για την ταυτοποίηση νέων β-γλουκανασών από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τις υδρόθερμες πηγές του ηφαιστείου Kolumbo στο Αιγαίο Πέλαγος, που ονομάστηκαν από την ερευνητική μας ομάδα Kolumbo β-glucanases (KolG). Η ανάλυση αλληλουχίας των KolGs έδειξε ότι αυτές οι νέες β-γλουκανάσες παρουσιάζουν χαμηλή ταυτότητα με γνωστές αλληλουχίες (28-56%) και ανήκουν στην οικογένεια γλυκοζιδικών υδρολασών 16 (GH16). Η έκφραση αυτών των γονιδίων για την παραγωγή διαλυτών πρωτεϊνών απαιτούσε τη σύντηξή τους με την πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (MBP) και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των συντηγμένων πρωτεϊνών έδειξε πως τα ένζυμα έχουν ενδο- και εξω- δράση σε πολυσακχαρίτες γλυκόζης, όπως β-γλουκάνη από κριθάρι, λαμιναρίνη και λειχενάνη, με δραστικότητα σε pH 5.0-9.0, στους 40-50°C (0.4-4.0 U/mg) και σε υψηλές συγκεντρώσεις NaCl (1-4 M). Αυτές οι νέες β-γλουκανάσες λόγω της σημαντικά διαφορετικής αλληλουχίας τους από τις ήδη χαρακτηρισμένες, της σταθερότητάς τους σε υψηλές συγκεντρώσεις NaCl και του εύρους των υποστρωμάτων πολυσακχαριτών που αποικοδομούν, θα μπορούσαν να αποτελέσουν πολύτιμα εργαλεία για την τροποποίηση β-γλουκανών από χερσαίους και θαλάσσιους οργανισμούς.