Αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων με καρκινικά κύτταρα
Authors: Πεχλιβάνη Λουίζα 
Published: April 2024

Εισαγωγή: Η αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων-καρκινικών κυττάρων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην καρκινογένεση όσο και στις θρομβωτικές επιπλοκές ασθενών με καρκίνο. Ο στόχος της της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να εμβαθύνει περισσότερο στους μηχανισμούς αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων-καρκινικών κυττάρων, να αναδείξει αυτούς που διαδραματίζουν το σημαντικότερο ρόλο στην αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών και τέλος να αναδείξει νέα συνθετικά ανάλογα του Nilotinib που να εκφράζουν ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή και αντικαρκινική δράση. Μέθοδοι: Στο πλαίσιο αυτό έχουν σχεδιαστεί και συντεθεί, από το εργαστήριο Οργανικής Χημείας, δώδεκα νέα ανάλογα του Nilotinib, ενός αναστολέα της BCR-ABL κινάσης, που χρησιμοποιείται στη θεραπεία της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας και μελετήθηκαν για πρώτη φορά οι αντιαιμοπεταλιακές και αντικαρκινικές τους ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκαν το Nilotinib και όλα τα ανάλογα, ως προς την ικανότητά τους να αναστείλουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, in vitro, μετά από ενεργοποίηση με ΑΑ, ADP, TRAP-6 και U-46619, με τη μέθοδο της συσσωρευομετρίας οπτικής διαπερατότητας. Παράλληλα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των αναλόγων με αντιαιμοπεταλιακούς παράγοντες, όπως Ticagrelor και Vorapaxar. Στη συνέχεια, τα ανάλογα μελετήθηκαν με τη μέθοδο συσσωρευομετρίας εμπέδησης σε ολικό αίμα, ώστε να αξιολογηθεί η αντιαιμοπεταλιακή δραστικότητά τους σε συνθήκες όσο το δυνατόν πιο κοντινές στις in vivo συνθήκες που επικρατούν στο ανθρώπινο αίμα, καθώς και με κυτταρομετρία ροής, ώστε να διερευνηθεί η δράση τους ως προς τη μεμβρανική έκφραση της P-selectin και του PAC-1, μετά από ενεργοποίηση με ΑΑ. Τέλος, για να εμβαθύνουμε περισσότερο στο μηχανισμό δράσης των αναλόγων, διερευνήθηκε με τη μέθοδο της ELISA, η επίδρασή τους στο μονοπάτι σύνθεσης του θρομβοξανίου, μετά από ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ΑΑ. Συνεχίσαμε τη μελέτη μας για να αξιολογήσουμε τα ανάλογα ως προς τις κυτταροστατικές και αντιμεταστατικές τους ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση του Nilotinib και των δώδεκα αναλόγων στον κυτταρικό κύκλο των HepG2 κυττάρων, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Παράλληλα, η ίδια μελέτη πραγματοποιήθηκε και μετά από επώαση των HepG2 κυττάρων με ακετυλοσαλικυλική λυσίνη ή αιμοπετάλια. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν τα ανάλογα, αλλά και η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη, ως προς την αποπτωτική τους δραστικότητα, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Η μελέτη της αποπτωτικής δράσης των αναλόγων πραγματοποιήθηκε και σε υγιή ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs, ώστε να αξιολογηθεί η ασφάλεια χρήσης τους. Για να εμβαθύνουμε στη μελέτη των αναλόγων, διερευνήθηκε η επίδραση του Nilotinib και των αναλόγων στην έκφραση δύο πρωτεϊνών προσκόλλησης, της E-cadherin και της N-cadherin, με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western Blot. Συνεχίσαμε μελετώντας την επίδραση των αναλόγων, αλλά και των αιμοπεταλίων, στη μετανάστευση των HepG2 κυττάρων με τη μέθοδο του θαλάμου Boyden. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση των αναλόγων στη φωσφορυλίωση της Src κινάσης σε κυτταρολύματα HepG2 κυττάρων, με τη μέθοδο της ELISA. Αποτελέσματα: Τα ανάλογα-1, -2 και -3 εμφάνισαν σημαντικά ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι της επαγόμενης από ΑΑ συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, σε σύγκριση με το Nilotinib, ενώ κανένα από τα ανάλογα δεν ανέστειλε ικανοποιητικά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, όταν χρησιμοποιήθηκαν ως αγωνιστές το ADP, το TRAP-6 ή το U-46619. Κανένα από τα ανάλογα σε συνδυασμό με Ticagrelor δεν εμφάνισε κάποια αλληλεπίδραση, ενώ αντίθετα, και τα τρία ανάλογα σε συνδυασμό με Vorapaxar εμφάνισαν συνεργατική δράση, προκαλώντας σημαντική αύξηση του ποσοστού αναστολής της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Σε ολικό αίμα, μόνο το ανάλογο-3 μπόρεσε να προκαλέσει ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση σε χαμηλή συγκέντρωση. Τα ανάλογα-1, -2 και -3 ανέστειλαν ισχυρά τη μεμβρανική έκφραση της P-selectin και του PAC-1, ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις και παράλληλα εμφάνισαν σημαντική αναστολή στη σύνθεση του TxB2, σε σύγκριση με το Nilotinib.Όσον αφορά στα HepG2 κύτταρα, το Nilotinib προκάλεσε μία μικρή αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων της φάσης M1, ενώ αντίθετα τα ανάλογα-1, -2 και -3 προκάλεσαν μείωση των κυττάρων της φάσης M1 και σημαντική αύξηση των κυττάρων της φάσης M3. Τα υπόλοιπα ανάλογα, η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη, καθώς και τα αιμοπετάλια, δεν επηρέασαν σημαντικά την κατανομή των καρκινικών κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Το Nilotinib και τα ανάλογα-1 και -3 εμφάνισαν σημαντική μείωση των ζωντανών κυττάρων, αλλά μόνο το ανάλογο-3 εμφάνισε ισχυρή αποπτωτική δράση, ενώ η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη δεν επηρέασε καθόλου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. Κανένα από τα ανάλογα δεν προκάλεσε απόπτωση σε υγιή ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs. Επίσης, παρατηρήθηκε μεγάλη μείωση της έκφρασης της E-cadherin, από τα ανάλογα-1 και -3, ενώ παράλληλα τα ανάλογα-2 και -3 προκάλεσαν μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης της N-cadherin, σε σύγκριση με το Nilotinib. Και τα τρία ανάλογα προκάλεσαν σημαντική μείωση των μεταστατικών κυττάρων, ενώ τα αιμοπετάλια δεν κατάφεραν να διαφοροποιήσουν τη μετανάστευση των HepG2 κυττάρων. Κανένα από τα τρία ανάλογα δεν επηρέασε τη λειτουργία της Src κινάσης, αφού δεν προκάλεσαν κάποια σημαντική διαφορά στη φωσφορυλίωσή της. Συμπεράσματα: Τα ανάλογα-1, -2 και -3, παρουσίασαν παρόμοια ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Όσον αφορά στις αντικαρκινικές τους ιδιότητες, τα ανάλογα-1 και -3 φάνηκε να έχουν παρόμοια δραστικότητα στις περισσότερες μελέτες, με το ανάλογο-3 να εμφανίζει την ισχυρότερη αποπτωτική δράση στα HepG2 κύτταρα. Παρατηρήσαμε επομένως, ότι οι αλλαγές που πραγματοποιήθηκαν στην πρότυπη δομή του Nilotinib ενίσχυσαν και τις αντιαιμοπεταλιακές, αλλά και τις κυτταροστατικές ιδιότητές του. Τα μέχρι στιγμής αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι υπάρχει σημαντική δυνατότητα ανάπτυξης νέων συνθετικών TKIs, με ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δραστικότητα και ενισχυμένες κυτταροστατικές ιδιότητες, για τη θεραπεία του καρκίνου και παράλληλα την αποτελεσματική πρόληψη της CAT.