Διερεύνηση των μοριακών συστατικών που καθορίζουν την εξειδίκευση της GABAA-εργικής αναστολής σε νευρικά κύτταρα, καθώς και των μηχανισμών ενίσχυσής της από ενδογενή νευροστεροειδή
Authors: Ξυλούρη Μαρία 
Published: August 2021

Στον ώριμο εγκέφαλο των θηλαστικών, η διατήρηση της δυναμικής ισορροπίας μεταξύ διέγερσης και αναστολής είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική νευρωνική λειτουργία. Η μείωση της συναπτικής αναστολής οδηγεί σε υπερδιεγερσιμότητα, κυρίως λόγω αυξημένης ενεργοποίησης των υποδοχέων NMDA και αν παραταθεί, σε υπερβολική είσοδο ασβεστίου (διεγερσιμοτοξικότητα) και κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα, η ενίσχυση της συναπτικής αναστολής, μπορεί να αποτρέψει την εκδήλωση των παραπάνω φαινομένων. Στον υποδοχέα GABAₐ έχουν αναγνωριστεί ξεχωριστές και ευδιάκριτες θέσεις δέσμευσης για το GABA, τα βαρβιτουρικά, τις βενζοδιαζεπίνες, την αιθανόλη και τα ενδογενή νευροστεροειδή, όπως η αλλοπρεγνανολόνη (allo), η δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) και ο θειικός εστέρας της τελευταίας (DHEAS). Τα νευροστεροειδή παράγονται στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) de novo από χοληστερόλη, εκκρίνονται κύρια από νευρογλοιακά αλλά και νευρικά κύτταρα και συγκεντρώνονται στον εγκέφαλο, ανεξάρτητα από την έκκριση των περιφερικών στεροειδογενών αδένων. Αποτελούν μια ειδική κατηγορία ρυθμιστών που επηρεάζουν τη νευρωνική λειτουργία μέσω της άμεσης και ταχείας αλληλεπίδρασής τους με ιονοτροπικούς υποδοχείς, όπως είναι οι υποδοχείς GABAₐ και NMDA. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των κυτταρικών λειτουργιών που επάγονται από τα νευροστεροειδή σε ειδικά κυτταρικά συστήματα έκφρασης υποδοχέων GABAₐ και NMDA. Χρησιμοποιήθηκαν δυο πολυδύναμες εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές, τα ΝΤ2 (ανθρώπου) και Ρ19 (ποντικού) κύτταρα, τα οποία παρουσία ρετινοϊκού οξέος μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ώριμους μετα-μιτωτικούς νευρώνες ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν αντίστοιχα, οι οποίοι εκφράζουν νευρωνικούς δείκτες και λειτουργικούς υποδοχείς GABAₐ και NMDA. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα πρόδρομα κύτταρα ΝΤ2 και Ρ19 διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς σε νευρικά κύτταρα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν αντίστοιχα, καθώς διαπιστώθηκε ότι εκφράζουν τις νευρο-ειδικές πρωτεΐνες συναπτοφυσίνη και β-ΙΙΙ τουμπουλίνη. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της μεταβολής της ομοιόστασης των ιόντων ασβεστίου στη βιωσιμότητα και την απόπτωση των ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν νευρώνων, καθώς και η πιθανή προστατευτική δράση των νευροστεροειδών allo, DHEA και DHEAS. Επειδή η διαταραχή της ομοιόστασης του Ca²⁺ αφορά στο σύνολο των κυτταρικών λειτουργιών, πραγματοποιήθηκαν μεταβολές στην ενδοκυττάρια συγκέντρωση των ιόντων Ca²⁺ από διαφορετικές οδούς: εξάντληση των αποθεμάτων στις ενδοκυττάριες αποθήκες με έμφαση στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ), μη ειδική συσσώρευση Ca²⁺ στα κύτταρα, δέσμευση του Ca²⁺ από ειδικούς παράγοντες και αυξημένη είσοδος Ca²⁺ από μεμβρανικούς διαύλους. Από τα αποτελέσματά μας φάνηκε ότι μόνο οι παράγοντες που επάγουν εκκένωση των ενδοκυττάριων αποθηκών Ca²⁺ του ΕΔ και αύξηση του ενδοκυττάριου pH και/ή απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού, προκάλεσαν εκτεταμένο νευρωνικό αποπτωτικό θάνατο στα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν κύτταρα. Η δράση αυτών των παραγόντων ήταν μη-αντιστρέψιμη, αφού τόσο η παρουσία των τριών νευροστεροειδών, όσο και ειδικών αναστολέων με γνωστή προστατευτική δράση έναντι της Ca²⁺-εξαρτώμενης τοξικότητας, όπως το Ruthenium Red (αναστολέας του μονομεταφορέα Ca²⁺ της μεμβράνης των μιτοχονδρίων) και το dantrolene (αναστολέας των υποδοχέων ρυανοδίνης του ΕΔ), δεν ανέστειλε το νευρωνικό θάνατο. Φαίνεται λοιπόν ότι τα νευροστεροειδή παρουσιάζουν εξειδίκευση στην εκδήλωση νευροπροστατευτικής δράσης, η οποία δε φαίνεται να σχετίζεται με τη συνολική τροποποίηση της συγκέντρωσης του κυτταροπλασματικού Ca²⁺, αλλά πιθανόν με σημειακά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στην πλασματική μεμβράνη. Σε ένα επόμενο στάδιο μελετήθηκαν οι επιπτώσεις των μεταβολών της συγκέντρωσης Ca²⁺ που προκαλούνται από την αυξημένη ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA (παρουσία L-γλουταμινικού οξέος και NMDA), στα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν κύτταρα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα ΝΤ2-Ν κύτταρα βρέθηκαν ιδιαίτερα ανθεκτικά στην πρόκληση διεγερσιμοτοξικότητας, κάτι το οποίο πιθανόν να οφείλεται στην παρουσία μεγάλου αριθμού αστροκυττάρων στο συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα, που μπορεί να δρουν προστατευτικά. Αντίθετα, στα Ρ19-Ν κύτταρα, η παρουσία γλουταμινικού οξέος ή NMDA ήταν ιδιαίτερα κυτταροτοξική. Ειδικότερα, παρουσία του NMDA (1 mM, 60 λεπτά), παρατηρήθηκε αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος, όπως επιβεβαιώθηκε από τη θραύση του γενετικού υλικού (DNA laddering) και τη συμπύκνωση της χρωματίνης, φαινόμενα τα οποία παρουσία των νευροστεροειδών allo και DHEA (10 μΜ), μειώθηκαν σημαντικά. Ανάλογα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν παράλληλα και σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων υποθαλάμου αρουραίου, έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα. Η NMDA-επαγόμενη τοξικότητα στους Ρ19-Ν νευρώνες, φάνηκε ότι οφείλεται στην αναστολή της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΡΙ3Κ→Akt κινάσης, που αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης. Παρουσία του NMDA παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων της ενεργού φωσφορυλιωμένης Akt κινάσης, ενώ η παρουσία των νευροστεροειδών allo και DHEA, οδήγησε σε σημαντική αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Akt παρουσία του NMDA. Η παρουσία του ειδικού αναστολέα wortmannin, ανέστειλε την ενεργοποίηση της Akt και την ικανότητα των νευροστεροειδών να αποτρέψουν τη μείωση της φωσφορυλίωσης της Akt κινάσης, καθώς και τον κυτταρικό θάνατο που προκαλεί το NMDA, υποδηλώνοντας εξειδίκευση της προστατευτικής δράσης των δύο νευροστεροειδών. Ακόμα, αυτές οι δράσεις των νευροστεροειδών φάνηκε να σχετίζονται άμεσα με την ύπαρξη λειτουργικών υποδοχέων GABAₐ, αφού ανεστάλησαν παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή του υποδοχέα μπικουκουλίνη. Επιπρόσθετα, η επίδραση γλουταμινικού ή NMDA στους Ρ19-Ν νευρώνες, προκάλεσε αύξηση της εισόδου Ca²⁺, η οποία μειώθηκε σημαντικά παρουσία των νευροστεροειδών allo ή DHEA. Ο ρόλος του Ca²⁺ στην NMDA-επαγόμενη διεγερσιμοτοξικότητα, φάνηκε και από το γεγονός ότι η χρήση δυο χηλικών παραγόντων δέσμευσης του Ca²⁺, δηλαδή του Bapta-AM και του EGTA προκάλεσε αύξηση της βιωσιμότητας των Ρ19-Ν κυττάρων και αναστολή της μείωσης των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης Akt. Η αυξημένη εισροή ιόντων Ca²⁺ παρουσία του NMDA, πιθανόν να ευθύνεται και για την ενεργοποίηση του ενδογενούς αποπτωτικού μονοπατιού, αφού σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας το συγκεκριμένο μονοπάτι εμπλέκεται άμεσα στην NMDA-επαγόμενη απόπτωση των Ρ19-Ν κυττάρων. Πράγματι, παρουσία NMDA παρατηρήθηκε μετατόπιση της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bax από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια, με ταυτόχρονη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, χωρίς αντίστοιχες μεταβολές στα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL. Συνεπώς, η αμοιβαία μετατόπιση κυτοχρώματος c / Bax, αποτελεί μια ικανή συνθήκη, για την πυροδότηση της αποπτωτικής διαδικασίας στους Ρ19-Ν νευρώνες Τα νευροστεροειδή allo και DHEA ανέστειλαν την NMDA-επαγόμενη απόπτωση, επάγοντας την ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ→Akt μονοπατιού και διατηρώντας το κυτόχρωμα c στα μιτοχόνδρια και την πρωτεΐνη Bax στο κυτταρόπλασμα. Παρόμοια προστατευτική δράση εκδήλωσαν τρία νέα συνθετικά νευροστεροειδή (ανάλογα της allo και του DHEA), γεγονός που υποστηρίζει μια πιθανή χρησιμοποίησή τους σε καταστάσεις διεγερσιμοτοξικότητας. Τέλος, μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης υπομονάδων των υποδοχέων GABAₐ και NMDA κατά τη διαφοροποίηση των Ρ19 κυττάρων, καθώς και οι πιθανές επιδράσεις των νευροστεροειδών. Παρατηρήσαμε ότι τα διαφοροποιημένα Ρ19-Ν κύτταρα, σε αντίθεση με τα αδιαφοροποίητα, εξέφραζαν τα μετάγραφα των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ, καθώς και της λειτουργικής υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA. Η έκφραση των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ αυξανόταν σημαντικά μετά από μικρής διάρκειας επίδραση (10 μΜ, 24 ώρες) με τα νευροστεροειδή allo ή DHEA και αυτή η επίδραση ακολουθούσε ένα δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο πρότυπο. Αντίθετα, τα επίπεδα των μεταγράφων της υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA, δε μεταβάλλονταν σημαντικά. Παράλληλα, η παρουσία της allo προκάλεσε σημαντική αύξηση και στα επίπεδα των πρωτεϊνών των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ, κάτι το οποίο πιθανόν να σημαίνει και αύξηση του αριθμού των λειτουργικών υποδοχέων στην κυτταρική μεμβράνη και επομένως αυξημένη συναπτική αναστολή. Συμπερασματικά, τα νευροστεροειδή φαίνεται ότι αποτελούν μια ειδική κατηγορία ρυθμιστών του ΚΝΣ με πιθανή νευροπροστατευτική δράση, που μπορούν να επηρεάζουν τη νευρωνική λειτουργία, μέσω ταυτόχρονης αλληλεπίδρασης στη νευρική διεγερσιμότητα και τη γονιδιακή έκφραση.