Φυσιολογική και μοριακή διερεύνηση της σωματικής εμβρυογένεσης στην Ελιά
Authors: Αλεξάκη Αλεξία 
Published: November 2021

Η ελιά αποτελεί ένα φυτικό είδος μεγάλου οικονομικού ενδιαφέροντος για την οικονομία πολλών χωρών, οι οποίες στην πλειοψηφία τους, εξαπλώνονται γύρω από την λεκάνη της Μεσογείου. Πρόκειται για ένα μακρόβιο, αειθαλές φυτό το οποίο προσαρμόζεται και καρποφορεί σε αντίξοες συνθήκες, ακόμα και με ελλιπή καλλιεργητική φροντίδα. Οι καλλιέργειές της αξιοποιούν ακατάλληλες για άλλες καλλιέργειες εκτάσεις, συμβάλλουν καθοριστικά στην αποφυγή της διάβρωσης του εδάφους και προσφέρουν εποχική εργασία και ικανοποιητικό εισόδημα σε χιλιάδες μικροκαλλιεργητές. Παράλληλα είναι δυνατή η εκμετάλλευση, εκτός των κύριων προϊόντων της (ελαιόλαδο και βρώσιμες ελιές) και των υποπροϊόντων της (φύλλα, ξύλο, πυρήνας, πυρηνέλαιο κ.ά.) για φαρμακευτικούς και άλλους σκοπούς. Αντίθετα με την πλειοψηφία των καρποφόρων φυτών και την τεράστια οικονομική και θρεπτική της αξία, η καλλιέργεια της ελιάς εξακολουθεί να απαιτεί επίπονες και όχι πάντα αποδοτικές διαδικασίες. Η μη ανταγωνιστικότητα των προϊόντων της οφείλεται, κυρίως, στην μικρή παραγωγικότητα, στην περιορισμένη φωτοσυνθετική ικανότητα των καλλιεργούμενων ποικιλιών και στις παραδοσιακές μεθόδους καλλιέργειας. Αδήριτη είναι λοιπόν η ανάγκη για εφαρμογή εναλλακτικών αναγεννητικών προσεγγίσεων. Η σωματική εμβρυογένεση αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη in vitro αναγεννητική μέθοδο φυτικών ειδών. Η επαγωγή και η επίτευξη υψηλών ποσοστών σωματικής εμβρυογένεσης σε έκφυτα ελιάς θα ήταν καθοριστική για την εφαρμογή γρήγορων, εύκολων και αποδοτικών μεθόδων πολλαπλασιασμού της ελιάς με μειωμένο κόστος παραγωγής.Καθώς οι ερευνητικές προσπάθειες για την επαγωγή σωματικών εμβρύων στην ελιά ήταν περιορισμένες και τα ποσοστά επαγωγής χαμηλά, θεωρήσαμε καθοριστικής σημασίας τη διεξαγωγή έρευνας με δύο βασικούς στόχους:1.Τον προσδιορισμό των παραγόντων (θρεπτικών συστατικών και φυτοαυξητικών παραγόντων) που απαιτούνται για την επαγωγή, ανάπτυξη και επιβίωση των σωματικών εμβρύων σε υψηλά ποσοστά.2.Τον εντοπισμό, μέσω μοριακής ανάλυσης, δύο γονιδίων του Dc8 και του Dc59 και το πρότυπο έκφρασή τους κατά τη διάρκεια της σωματικής εμβρυογένεσης. Στο πλαίσιο της πραγμάτωσης των παραπάνω στόχων χρησιμοποιήθηκαν σαν έκφυτα ριζίδια, βάσεις και κορυφές ώριμων ζυγωτικών εμβρύων ποικιλίας Κορωνέικης. Η Κορωνέικη επιλέχτηκε σαν το καταλληλότερο πειραματικό υλικό, καθώς προκαταρκτικά πειράματα με άλλες ελληνικές ποικιλίες (Τζονάτη, Καλαμάτα, Αγγουρομάνα και Άμφισσα) έδειξαν ότι εμφανίζει το υψηλότερο εμβρυογενετικό δυναμικό.Δοκιμάστηκε η μορφογενετική ικανότητα τεσσάρων διαφορετικών θρεπτικών υποστρωμάτων καλλογένεσης, που περιείχαν σαν φυτοαυξητικούς ρυθμιστές 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP: ΟΜc (Cañas et al. 1988).ΟΜc χωρίς υδρολυμένη καζεΐνη.MS (Murashige et al. 1962).MS με 1,0 g/L υδρολυμένη καζεΐνη. Τα έκφυτα, μετά από παραμονή 21 ημερών στα παραπάνω θρεπτικά υποστρώματα, μεταφέρονταν σε ίδιο θρεπτικό υπόστρωμα από το οποίο απουσίαζαν οι φυτοαυξητικοί παράγοντες (θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης). Το θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc αποδείχτηκε το καταλληλότερο για την επαγωγή σωματικών εμβρύων σε ιστοκαλλιέργειες ελιάς. Παράλληλα η παρουσία υδρολυμένης καζεΐνης ήταν καθοριστική για την επαγωγή και την έκφραση της εμβρυογενετικής δυναμικότητας των εκφύτων.Σε όλα τα πειράματα που ακολουθούν το θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης ήταν το ίδιο με το αρχικό χωρίς φυτοαυξητικούς παράγοντες.Η εξάρτηση της εμβρυογένεσης από την ηλικία του εκφύτου, μελετήθηκε με τον εμβολιασμό ανώριμων ζυγωτικών εμβρύων ελιάς τα οποία συλλέγονταν από Ιούλιο μέχρι Αύγουστο, σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP, για 21 ημέρες και μεταφορά τους σε θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης. Μεγαλύτερη μορφογενετική δυναμικότητα εμφάνιζαν τα ριζίδια η οποία αυξανόταν αναλογικά με την ηλικία τους. Η εμβρυογενετική ικανότητα των βάσεων και των κορυφών των ανώριμων ζυγωτικών εμβρύων ήταν κατά πολύ μικρότερη από εκείνη των βάσεων και των κορυφών των ώριμων ζυγωτικών εμβρύων. Σε καμία περίπτωση δεν καταγράφηκαν υψηλότερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης από τα ποσοστά που καταγράφονταν σε ιστοκαλλιέργειες εκφύτων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων.Διερευνήθηκε η μεταβολή της εμβρυογενετικής δυναμικότητας κατά μήκος του ριζιδίου το οποίο και τεμαχίστηκε σε δύο μέρη:α) Στο ακραίο τμήμα του ριζιδίου, δηλαδή στο τμήμα του ριζιδίου προς το άκρο του ζυγωτικού εμβρύου. β) Στο υποακραίο τμήμα του ριζιδίου, δηλαδή στο τμήμα του ριζιδίου προς τις κοτυληδόνες, το οποίο γειτνίαζε και με το μερίστωμα του βλαστού.Τα έκφυτα εμβολιάζονταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP. Το υποακραίο τμήμα του ριζιδίου υπερείχε εμβρυογενετικά έναντι του ακέραιου ριζιδίου (πείραμα-μάρτυρας), ενώ στο ακραίο τμήμα του ριζιδίου παρατηρήθηκε μερική αναστολή της σωματικής εμβρυογένεσης, υποδηλώνοντας την ύπαρξη διαβάθμισης της εμβρυογενετικής δυναμικότητας κατά μήκος του ριζιδίου.Η ανακαλλιέργεια ριζιδίων, βάσεων και κορυφών κοτυληδόνων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP, κάθε 21 ημέρες, κατέληγε σε σταδιακή μείωση και τελικά μηδενισμό της εμβρυογενετικής δυναμικότητας των μεν ριζιδίων στην 4η ανακαλλιέργεια, των δε βάσεων και κορυφών από τη 2η ανακαλλιέργεια.Σε επόμενη πειραματική δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε φυτοαυξητικούς παράγοντες 25,0 μΜ IBA και 2,5 μΜ 2iP και μία από τις εξής συγκεντρώσεις σακχαρόζης: •5,0 g/L σακχαρόζης (0,015 Μ).•20,0 g/L σακχαρόζης [0,058 Μ (πείραμα-μάρτυρας)].•40,0 g/L σακχαρόζης (0,12 Μ).•80,0 g/L σακχαρόζης (0,23 Μ).•160,0 g/L σακχαρόζης (0,46 Μ). Η μορφογενετική υπεροχή (55,0% επαγωγή σωματικών εμβρύων) των 160,0 g/L σακχαρόζης καταγράφηκε από το θρεπτικό υπόστρωμα καλλογένεσης (14 μόλις ημέρες μετά τον εμβολιασμό). Η σακχαρόζη αντικαταστάθηκε από μαννιτόλη σε τρεις συγκεντρώσεις:•10,0 g/L μαννιτόλης (0,05 Μ).•42,0 g/L μαννιτόλης (0,23Μ).•85,0 g/L μαννιτόλης (0,46Μ). Η παραπάνω αντικατάσταση δεν υπέδειξε συσχέτιση του υψηλού ποσοστού σωματικής εμβρυογένεσης στο θρεπτικό υπόστρωμα με υψηλή συγκέντρωση σακχαρόζης, με το αυξημένο oσμωτικό δυναμικό του θρεπτικού υποστρώματος.Στο πλαίσιο της διερεύνησης της επίδρασης των αυξινών συνδυάστηκε σταθερή συγκέντρωση κυτοκινίνης (2,5 μΜ 2iP) με μια από τις εξής αυξίνες σε θρεπτικό μέσο ΟΜc :i)ΙΒΑ: 0,39 / 1,56 / 6,25 / 12,5 / 25,0 / 50,0 / 100,0 ή 200,0 μΜ.ii)ΝΑΑ: 0,1 / 0,39 / 1,56 / 6,25 / 12,5 / 25,0 ή 50,0 μΜ.iii)2,4-D: 0,01 / 0,05 / 0,1 / 0,39 ή 1,56 μΜ.Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τόσο το ΝΑΑ όσο και το 2,4-D, ανεξαρτήτως συγκέντρωσης και είδους εκφύτου, δεν προκαλούσαν υψηλότερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης από εκείνα του πειράματος-μάρτυρα (4,0-15,0%). Αντίθετα στο ΙΒΑ καταγράφηκαν πολύ υψηλότερα ποσοστά διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων από όλα τα υπόλοιπα πειράματα τόσο στα έκφυτα ριζιδίων (23,0-31,0%) όσο και κοτυληδόνων ιδιαίτερα στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (17,0%).Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση του θρεπτικού υποστρώματος ΟΜc που περιείχε 2,5 μΜ 2iP και έναν από τους εξής τέσσερις συνδυασμούς αυξινών:0,195 μΜ ΝΑΑ / 0,78 μΜ ΙΒΑ.0,39 μΜ ΝΑΑ / 1,56 μΜ ΙΒΑ.6,25 μΜ ΝΑΑ / 12,5 μΜ ΙΒΑ.12,5 μΜ ΝΑΑ / 25,0 μΜ ΙΒΑ. Η συνδυασμένη παροχή αυξινών μείωνε την επαγωγική δράση της μεμονωμένης παροχής του ΙΒΑ, πιθανώς εξαιτίας της ανασταλτικής δράσης του ΝΑΑ, καθηλώνοντας την επαγωγή τόσο της άμεσης όσο και της έμμεσης σωματικής εμβρυογένεσης (15,0%) έναντι της μεμονωμένης παροχής ΙΒΑ (23,0% άμεση σωματική εμβρυογένεση και 31,0% έμμεση σωματική εμβρυογένεση). Τα παραπάνω δεδομένα δεν υποδηλώνουν αθροιστική δράση των δύο αυξινών, αλλά ούτε ύπαρξη διαφορετικών θέσεων-στόχων των αυξινών στα κύτταρα της ελιάς. Δοκιμάστηκε η μορφογενετική δράση τριών συνθετικών κυτοκινινών (ΤDZ, 2iP και BA) σε διάφορες συγκεντρώσεις (0,625 / 2,5 / 10,0 ή 40,0 μΜ), όταν παρέχονταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ. Σε έκφυτα ριζιδίων τα 0,625 μΜ 2iP κατέληγαν σε 9,0% άμεση σωματική εμβρυογένεση, ενώ οι υπόλοιπες συγκεντρώσεις σε υψηλότερα ποσοστά έμμεσης σωματικής εμβρυογένεσης, με μικρή υπεροχή των 2,5 μΜ 2iP (15,0%). Σε έκφυτα κοτυληδόνων τα ποσοστά επαγωγής σωματικών εμβρύων κυμαίνονταν από 0,0-10,0% (20,0 μΜ 2iP). Η παροχή ΒΑ σε έκφυτα ριζιδίων ανέστελλε μερικώς τη σωματική εμβρυογένεση (2,0-5,0%) και του TDZ πλήρως.Η χρήση τεσσάρων συνδυασμών κυτοκινινών σε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ δεν προωθούσε την έμμεση σωματική εμβρυογένεση. Η συνδυασμένη παροχή 2iΡ και ΒΑ (2,5 μΜ / 10,0 μΜ και 1,25 μΜ / 5,0 μΜ) υστερούσε σε εμβρυογενετική επαγωγική δράση έναντι της μεμονωμένης παροχής του 2iΡ, ενώ κυμαινόταν σε αντίστοιχα επίπεδα με εκείνα της μεμονωμένης παροχής του ΒΑ. Η συνδυασμένη παροχή 2iΡ και TDZ (2,5 μΜ / 10,0 μΜ και 1,25 μΜ / 5,0 μΜ) μείωνε την επαγωγική δράση της μεμονωμένης παροχής του 2iP. Η επίδραση της πηγής ανόργανου αζώτου στην επαγωγή σωματικών εμβρύων ήταν μια ακόμα παράμετρος που μελετήθηκε. Ριζίδια ώριμων ζυγωτικών εμβρύων εμβολιάζονταν σε θρεπτικό μέσο ΟΜc που περιείχε 25,0 μΜ ΙΒΑ, 2,5 μΜ 2iΡ και σαν πηγή αζώτου ΝΗ4ΝΟ3 ή ΚΝΟ3 ή ΝΗ4Cl στις εξής συγκεντρώσεις: 5,0 / 20,0 / 80,0 ή 160,0 mM. H προσθήκη ΝΗ4ΝΟ3, σαν αποκλειστική πηγή ανόργανου αζώτου ανεξαρτήτως συγκέντρωσης, δεν επηρέαζε το ποσοστό διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων (32,0-36,0%) συγκριτικά με το πείραμα-μάρτυρα, εκτός από τα 160,0 mM που την ανέστελλαν σημαντικά, όπως και την καλλογένεση (19,0%). Η παροχή ΚΝΟ3 μείωνε την παραγωγή σωματικών εμβρύων δραστικά (18,0%) σε μικρές συγκεντρώσεις και ακόμα εντονότερα στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (4,0%), ενώ δεν παρατηρήθηκε ταυτόχρονη μείωση της καλλογένεσης. Η παροχή ΝΗ4Cl σε συγκεντρώσεις 5,0 / 20,0 ή 80,0 mM έδωσε υψηλά ποσοστά (52,0-58,0%) και πολύ υψηλότερο (62,0%) στα 160,0 mM. Η καλλογένεση παρουσίαζε μείωση στη συγκέντρωση 80,0 mM (60%) και στη συγκέντρωση 160,0 mM (40,0%).Μελετήθηκε και η δράση δύο συνδυασμών πηγών ανόργανου αζώτου ΚΝΟ3:ΝΗ4ΝΟ3 και ΚΝΟ3:ΝΗ4Cl στις εξής αναλογίες: 1:9, 3:7, 5:5, 7:3 και 9:1. Ο εμβολιασμός γινόταν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΟΜc με τον εκάστοτε συνδυασμό πηγών ανόργανου αζώτου και φυτοαυξητικούς παράγοντες 25,0 μΜ ΙΒΑ και 2,5 μΜ 2iP. Τα αποτελέσματα από όλους τους συνδυασμούς υποδείκνυαν την ανασταλτική δράση στην επαγωγή σωματικών εμβρύων του ΚΝΟ3 και τη διεγερτική του ΝΗ4ΝΟ3 και του ΝΗ4Cl. Παράλληλα, επαλήθευαν την ανασταλτική δράση στην επαγωγή κάλλου του ΝΗ4Cl στις υψηλές συγκεντρώσεις. Στους συνδυασμούς ΚΝΟ3:ΝΗ4ΝΟ3 καταγράφονταν ποσοστά που κυμαίνονταν από 3,0-16,0%. Ανάλογα αποτελέσματα προέκυπταν και στις αναλογίες ΚΝΟ3:ΝΗ4Cl. Στην αναλογία 1:9 καταγραφόταν υψηλό ποσοστό σωματικής εμβρυογένεσης (38,0%) και στις υπόλοιπες αναλογίες τα ποσοστά έβαιναν μειούμενα μέχρι που σχεδόν μηδενίζονταν (27,0-1,0%).Σαν κατακλείδα όλων των πειραματικών μας δοκιμασιών παρασκευάστηκε το θρεπτικό υπόστρωμα “KM” το οποίο συνδύαζε όλα εκείνα τα θρεπτικά στοιχεία και τους φυτοαυξητικούς παράγοντες που η παρούσα εργασία κατέδειξε σαν καταλληλότερα για την επαγωγή σωματικών εμβρύων στην ελιά in vitro. Πιο συγκεκριμένα συνίστατο από τη βασική χημική σύσταση του θρεπτικού υποστρώματος ΟΜc και τις εξής τροποποιήσεις:25,0 μΜ ΙΒΑ.2,5 μΜ 2iP.20,0 mM ΝΗ4Cl. 160,0 g/L σακχαρόζης.Στο “KM” θρεπτικό μέσο προέκυψαν εντυπωσιακά ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης (62,0%) συγκριτικά με το OMc (24,0%) που προτάθηκε από τους Cañas et al. (1988) σαν καταλληλότερο θρεπτικό μέσο για ιστοκαλλιέργειες στην ελιά. Αξιομνημόνευτη είναι η εμφάνιση των πρώτων σωματικών εμβρύων στο θρεπτικό μέσο καλλογένεσης, πριν ακόμα μεταφερθούν οι κάλλοι στο θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης.Στο πλαίσιο της μοριακής προσέγγισης της σωματικής εμβρυογένεσης στην ελιά χρησιμοποιήθηκαν κάλλοι από ριζίδια ζυγωτικών εμβρύων ποικιλίας Κορωνέικης και έγινε προσπάθεια εντοπισμού στο γονιδίωμα της ελιάς των γονιδίων Dc8 και Dc59. Από τη μελέτη των φιλμ των αυτοραδιογραφημάτων έγινε φανερή η ύπαρξη και των δύο γονιδίων. Ειδικότερα για το Dc8 δεν προέκυψε πολυμορφισμός στο γονιδίωμα της ελιάς, όπως έχει βρεθεί και στο καρότο, γεγονός που υποδεικνύεται από την εμφάνιση μιας μόνο ζώνης (περίπου 3 Κb). Όσο αφορά το γονίδιο Dc59, εντοπίστηκε πλήθος ζωνών (4,4-6,6 Kb) που υβρίδιζαν, υποδηλώνοντας την ύπαρξη πολυμορφισμού για το συγκεκριμένο γονίδιο και στην ελιά, όπως ισχύει στο καρότο, αλλά και σε πολλά άλλα φυτικά είδη.Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση του Dc8 σε διαφορετικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου στο ακέραιο ζυγωτικό έμβρυο και στο ενδοσπέρμιο της ελιάς, στο ακέραιο ζυγωτικό έμβρυο του καρότου, όχι όμως και στο ενδοσπέρμιό του, γεγονός που δεν συνάδει με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα. Πιθανώς αυτό οφείλεται στη χαμηλότερη έκφρασή του στα ενδοσπέρμια.(περίπου 2 φορές χαμηλότερο από ότι στα ζυγωτικά έμβρυα) και στη χαμηλή συγκέντρωση (8,0-10,0 μg/L) του απομονωθέντος ολικού RNA που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του μεταγραφήματος του Dc8.Τέλος, διερευνήθηκε η έκφραση του Dc8 σε οκτώ είδη κάλλων ώριμων ζυγωτικών εμβρύων ελιάς, οι οποίοι βρίσκονταν σε διαφορετικά μορφογενετικά-εμβρυογενετικά στάδια, λόγω της διαφορετικής τους ηλικίας. Η έκφραση του Dc8 ήταν αισθητή από τις πρώτες ημέρες του εμβολιασμού και σε όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας των ριζιδίων στο θρεπτικό μέσο καλλογένεσης (21 ημέρες), αλλά και μετά την μεταφορά τους στο θρεπτικό υπόστρωμα διαφοροποίησης σωματικών εμβρύων στο οποίο παρέμεναν για 60 ημέρες τουλάχιστον. Η ποσότητα των μεταγραφημάτων ήταν σχετικά σταθερή στους κάλλους ηλικίας 7-31 ημερών και αυξανόταν στα δύο τελευταία δείγματα RNA που αντιστοιχούσαν σε κάλλους ηλικίας 36 και 42 ημερών. Η αύξηση της συσσώρευσης των μεταγραφημάτων του Dc8 συμπίπτει με το χρονικό διάστημα κατά το οποίο το ποσοστό επαγωγής σωματικών εμβρύων στην ιστοκαλλιέργεια είχε πλέον σταθεροποιηθεί στο μέγιστο επίπεδο και τα περισσότερα σωματικά έμβρυα βρίσκονταν είτε στο καρδιόσχημο και στο στάδιο της τορπίλης είτε άρχιζαν να ωριμάζουν και να εξελίσσονται περαιτέρω σε φυτάρια.