Electrochemical study of redox enzymes and their utilization on modified electrodes
Authors: Ζουράρης Δημήτριος 
Published: November 2021

Η παρούσα εργασία εστιάζει στην εξαγωγή θερμοδυναμικών και κινητικών δεδομένων οξειδοαναγωγικών ενζύμων καθώς και μορίων που αντιδρούν με αυτά, μέσω ηλεκτροχημικών τεχνικών. Στην εισαγωγή της εργασίας αυτής, πραγματοποιείται μία γενική επισκόπηση για τα οξειδοαναγωγικά ένζυμα και του πως μπορούν να αξιοποιηθούν ηλεκτροχημικά, καθώς και των δυσκολιών που εμφανίζονται. Καθώς ένα από τα κύρια προβλήματα όταν χρησιποιείται η κυκλική βολταμμετρία για την μελέτη οξειδοαναγωγικών ενζύμων είναι τα ρεύματα λόγω χωρητικότητας, ένα μεγάλο μέρος της δουλειάς αυτής επικεντρώνεται στην διερεύνηση της χρήσης της κυκλικής βολταμμετρίας εναλασσόμενου ρεύματος διαταραχής μεγάλου πλάτους με μετασχηματισμό Φουριέ, (large amplitude fast Fourier transform alternating current voltammetry -FTacV), ως εναλλακτική για την άρση του προαναφερθέντος εμποδίου. Η διερεύνησητης FTacV γίνεται και για ελεύθερα στο διάλυμα και για ακινητοποιημένα σε ηλεκτροδιακή επιφάνεια, ηλεκτροενεργά είδη. Παρατίθενται και τα αντίστοιχα αποτελέσματα για την κυκλική βολταμμετρία για σύγκριση. Ξεκινώντας από το ελεύθερο είδος, τα κυρίως παρατηρούμενα μεγέθη, δηλαδή το ύψος,το πλάτος και το δυναμικό των κορυφών, προσδιορίζονται για ελεύθερα στο διάλυμα ηλεκτροενεργά είδη όταν χρησιμοποιείται η FTacV. Οι τιμές των κυρίως παρατηρούμενων μεγεθών προσδιορίζονται από μία ημιαναλυική λύση καθώς και από την ολοκληρωμένη λύση του προβλήματος αρχικών-συνοριακών τιμών. Είσαγεται επίσης μία συνθήκη κατάτης οποία η FTacV καθίσταται ανεξάρτητη της ταχύτητας σάρωσης και εξάγονται οι εξαρτήσεις των κυρίως παρατηρούμενων μεγεθών από το πλάτος της διαταραχής. Κατόπιν εξετάζεται η περίπτωση ημιαντιστρεπτών και αναντίστρεπτων κινητικών, συσχετίζοντας τα κυρίως παρατηρούμενα μεγέθη με την ηλεκτροχημική κινητική. Επίσης, μελετώνται δράσεις δύο σταδίων και γίνεται γραφική αναπαράσταση των βολταμμογραφημάτων που προκύπτουν. Ακόμα δύο μηχανισμοί εξερευνώνται κατά την σύζευξη ενός ηλεκτροχημικού είδους με μία ομογενή χημική δράση. Πραγματοποιείται ακόμα μία εισαγωγή στην βολταμμετρία συνέλιξης, η οποιά θα χρησιμοποιηθεί σε κομμάτι της ανάλυσης πειραματικών αποτελεσμάτων. Η αμέσως επόμενη ανάλυση αφορά σε ακινητοποιημένα είδη. Η ανάλυση ξεκινάει από δράσεις ενός σταδίου για ακινητοποιημένα ηλεκτροενεργά είδη, κάνοντας παρόμοια ανάλυση με αυτήν για το ελεύθερο είδος, φτάνοντας σε δράσεις δύο σταδίων. Σε επόμενη φάση μελετάται η σύζευξη της οξειδοαναγωγικής δράσης ακινητοποιημένου είδους με μία δράση που αφορά σε χημικό είδος που βρίσκεται ελεύθερο στον κύριο όγκο του διαλύματος. Ειδικότερα, οι κινητικές που αναλύονται είναι η κινητική Michaelis-Menten και το σενάριο όπου μία χημική αντίδραση έπεται της ηλεκτροχημικής (μηχανισμός EC). Αναλύονται οι αντίστοιχες μεθοδολογίες που αφορούν στην εξαγωγή κινητικών σταθερών. Συνεχίζοντας στο πειραματικό κομμάτι της εργασίας, εισάγονται οι βασικές έννοιες γύρω από τις λυτικές μονοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (Lytic polysaccharide monooxy-genases - LPMOs) και αναλύεται η διαδιακασία ετερόλογης έκφρασης τριών τέτοιων ενζύμων σε δύο διαφορετια συστήματα. Τα εκφρασμένα ένζυμα κατόπιν ακινητοποιούνται με δύο διαφορετικές μεθοδολογίες και εξάγονται κινητικές πληροφορίες σχετικά με την αλληλεπίδραση τόσο της δράσης του ακινητοποιημενου ενζύμου με το ηλεκτρόδιο καθώς και με διογκωμένη με φωσφορικό οξύ κυτταρίνης (phosphoric acid swollen cellulose - PASC). Η χρησιμοποιούμενη τεχνική για αυτήν την μελέτη είναι η FTacV. Οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται είναι αυτές που έχουν ήδη παρουσιαστεί. Το επόμενο βήμα είναι η ηλεκτροχημική μελέτη πιθανών δοτών ηλεκτρονίων για τις LPMO με τη χρήση κυκλικής βολταμμετρίας, βολταμμετρίας συνέλιξης και FTacV. Διαφορετικές φαινολικές ουσίες και λιγνίνη από άχυρο εξετάζονται ως προς την αποτελεσματικότητά τους ως δότες ηλεκτρονιών χρησιμποιώντας χρωματογραφία ιοντοεναλλαγής υψηλής απόδοσης συζευγμένη με παλμικό αμπερομετρικό ανιχνευτή (high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD). Κατόπιν, βασιζόμενοι στα οξειδωμένα προϊόντα και την ένταση των κορυφών των χρωματογραφημάτων, σε συνδυασμό με βολταμμετρικά δεδομένα, δίνεται ερμηνεία για την αλληλεπίδραση των εξεταζόμενων ουσιών ως δότες ηλεκτρονίων και τις LPMOs. Στο τελευταίο κομμάτι αυτής της δουλειάς το ένζυμο που αναλύεται είναι μία οξειδάση πολλαπλών χαλκών με ενεργότητα λακάσης από το μύκητα Thermothelomyces Thermophila ενώ είναι ακινητοποιημένο στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου και αλληλεπιδρά με επινεφρίνη. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιείται η FTacV. Γίνεται η εφαρμογή της θεωρίας της μελέτης ενός ακινητοποιημένμου οξειδοαναγωγικού ενζύμου που αντιδρά με ένα είδος ελεύθερο στο διάλυμα και ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten.