Μελέτη της έκφρασης ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών στη μεμβρανώδη σπειραματονεφρίτιδα
Authors: Στρατάκης Σταύρος 
Published: August 2021

Μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 90 η ιδιοπαθής μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια (ΙΜΝ) ήταν η συχνότερη νεφροπάθεια σε ενήλικες άνδρες. Σταδιακά με την επέκταση των διαγνωστικών νεφρικών βιοψιών σε ισπανόφωνους και μαύρους το ποσοστό της έπεσε από το 30% στο 15-23% αλλά παραμένει η συχνότερη σπειραματοπάθεια σε ενήλικες άνδρες της καυκάσιας φυλής. Ιστολογικά χαρακτηρίζεται από πάχυνση της βασικής μεμβράνης, με παρουσία υποεπιθηλιακών εναποθέσεων, εξάλειψη των ποδοειδών εκβλαστήσεων και σταδιακή παραγωγή νέας βασικής μεμβράνης πέριξ των εναποθέσεων (spikes) που σταδιακά οδηγεί στον εγκλωβισμό και αργότερα στην αποδόμηση αυτών. Παράλληλα παρατηρείται ελάχιστη έως ήπια αύξηση της κυτταροβρίθειας του σπειράματος και κοκκιώδεις εναποθέσεις IgG και C3 στον ανοσοφθορισμό. Παθογενετικά στην ιδιοπαθή μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια παρατηρείται in situ εναπόθεση αντισωμάτων υποεπιθηλιακά με ακόλουθη ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Τελευταίες μελέτες έχουν δείξει ότι στην πλειοψηφία των περιπτώσεων κυκλοφορούντα αντισώματα είτε έναντι του υποδοχέα της φωσφολιπάσης Α2 των ποδοκυττάρων (70% των περιπτώσεων ΙΜΝ) είτε έναντι της θρομβοσπονδίνης τύπου-1 τμήματος περιέχουσα 7 Α (10% των περιπτώσεων ΙΜΝ), τα οποία έχουν αντίστοιχο ρόλο με τα αντισώματα έναντι μεγκαλίνης στο πειραματικό μοντέλο μεμβρανώδους σπειραματονεφρίτιδας των αρουραίων. Επίσης, έχει περιγραφεί ότι οι ουδέτερες ενδοπεπτιδάσες των ποδοκυττάρων σε νεογέννητα μωρά αποτελούν αντιγονικό επίτοπο στην αλλοάνοσο βρεφική μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια, όπως και η θετικά φορτισμένη βόεια πρωτεΐνη του ορού στην παιδική ηλικία. Τα αποτιθέμενα ανοσοσυμπλέγματα ενεργοποιούν το συμπλήρωμα και οδηγούν σε ανακατασκευή του κυτταροσκελετού, διαταραχή στην παραγωγή των πρωτεϊνών των σχισμών διήθησης και συνοδό λευκωματουρία. Ακολούθως παρατηρείται παθολογική παρουσία στην ποδοκυτταρική μεμβράνη ενδοκυττάριων πρωτεϊνών που λειτουργούν ως νέοι αντιγονικοί επίτοποι, εκλύοντας ένα δεύτερο κύμα ανοσολογικής απάντησης με παραγωγή IgG4 αντισωμάτων.Σε πειραματικό επίπεδο το μοντέλο της νεφρίτιδας του Heymann αποτελεί ένα πιστό πρότυπο της ΙΜΝ στον άνθρωπο. Στο ενεργητικό μοντέλο η ανοσοποίηση των Lewis αρουραίων γίνεται με εκχύλισμα επιθηλιακών πρωτεϊνών των ποδοκυττάρων (Fx1A). Στο παθητικό μοντέλο χορηγείται ενδοφλεβίως ο ετερόλογος αντιορός έναντι των επιθηλιακών κυττάρων (antiFx1A), o οποίος εντός ωρών προκαλεί εναπόθεσεις υποεπιθηλιακά. Μετά από 5 μέρες, εμφανίζεται πρωτεϊνουρία στο 100% των αρουραίων. Η ετερόλογη φάση ακολουθείται μετά 15 μέρες από μια αυτόλογη φάση, όπου IgG αντισώματα παράγονται έναντι των ετερόλογων IgG. Τα αυτόλογα IgG αλλοαντισώματα, εναποτίθενται και αυτά υποεπιθηλιακά, επιδεινώνοντας την πρωτεϊνουρία μιμούμενα την ιδιοπαθή μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια στον άνθρωπο. Σε αυτή την περίοδο παράγονται αυτοαντισώματα έναντι ενός εξωγενούς αντιγόνου, καθώς και νεοαντιγόνων που εμφανίζονται υποεπιθηλιακά, κατά τη διάρκεια της αρχικής βλάβης. Συνεπώς, η αυτόλογη (2η) φάση της παθητικής νεφρίτιδας του Heymann είναι αυτή που μιμείται τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που περιγράφονται στη σύγχρονη βιβλιογραφία για την ιδιοπαθή μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια του ανθρώπου.Κλινικά η νόσος εκδηλώνεται συνήθως με οιδήματα, λευκωματουρία νεφρωσικού επιπέδου, υποαλβουμιναιμία, δυσλιπιδαιμία και παθολογικό ίζημα ούρων (λιπιδουρία, σπειραματικά ερυθρά και επιθηλιακά κύτταρα). Σε αρχικά στάδια η σπειραματική διήθηση μπορεί να είναι φυσιολογική.Η θεραπεία της ΙΜΝ είναι συνάρτηση βαρύτητας της πρωτεϊνουρίας, της νεφρικής λειτουργίας και των βιοπτικών ευρημάτων κατά τη διάγνωση. Συνήθως σε περιπτώσεις ασθενών με λευκωματουρία έως και 8 gr/24ωρό και φυσιολογική κρεατινίνη η θεραπεία είναι συντηρητική και περιλαμβάνει αναστολείς του άξονα ρενίνης αγγειοτασίνης αλδοστερόνης, στατίνες και ενίοτε αντιθρομβωτική αγωγή. Αν ο ασθενής μετά από 6 μήνες συντηρητικής αντιμετώπισης δεν βελτιωθεί ή επιδεινωθεί τότε προκύπτει ανάγκη για χορήγηση ανοσοκαταστολής. Μέχρι και σήμερα η ανοσοκατασταλτική θεραπεία πρώτης γραμμής στηρίζεται στο κλασσικό ή τροποποιημένο 6μηνο σχήμα μηνιαίας εναλλαγής κορτιζόνης και χλωραμβουκίλης ή κυκλοφωσφαμίδης (κλασσικό ή τροποποιημένο σχήμα Ponticelli αντίστοιχα). Την τελευταία 5ετία η είσοδος της ριτουξιμάμπης στη θεραπευτική φαρέτρα και οι ανακαλύψεις για την παθογένεια της νόσου, προσέδωσαν μεγαλύτερη προσοχή στο ρόλο των Β λεμφοκυττάρων και των IgG ανοσοσφαιρινών που παράγουν. Η ανοσοκατασταλτική δράση της ραπαμυκίνης αποδώθηκε αρχικά στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων. Πρόσφατα όμως περιγράφηκε και ο πρόσθετος ρόλος της στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των Β λεμφοκυττάρων και στον περιορισμό της ικανότητας τους να παράγουν ανοσοσφαιρίνες. Oι Βοnegio και συνεργάτες το 2005 έδειξαν ότι μικρή δόση ραπαμυκίνης υποστρέφει την πρωτεϊνουρία σε πειραματικό μοντέλο μεμβρανώδους σπειρματοπάθειας και παράλληλα μειώνει τη διαμεσοσωληναριακή ίνωση και φλεγμονή μέσω μείωσης της έκφρασης προφλεγμονωδών και προϊνωτικών παραγόντων. Η ευεργετική επίδραση της ραπαμυκίνης έχει αναδειχθεί και σε μοντέλο ενεργητικής νεφρίτιδας του Heymann. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να εξεταστεί η επίδραση της ραπαμυκίνης στην πρωτεϊνουρία και στην ιστοπαθολογική βλάβη σε πειραματικό μοντέλο μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας. Η καινοτομία της εργασίας αυτής έγκειται στη μελέτη της επίδρασης της ραπαμυκίνης στην έκφραση των ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών του διαφράγματος της σχισμής διήθησης, νεφρίνη και ποδοσίνη, αλλά και στο σχεδιασμό της καθώς αφορά μόνο στη 2η φάση της παθητικής νεφρίτιδας του Heymann όταν έχει ήδη εγκατασταθεί η αρχική βλάβη, όπως ακριβώς συμβαίνει και στην κλινική πράξη.Υλικά και Μέθοδοι: Η αναπαραγωγή του μοντέλου της Μ.Ν. αναπτύχθηκε με την ενδοφλέβια χορήγηση 0,5ml antiFx1/100gr σωματικού βάρους σε 12 αρουραίους Sprague Dolley. Ο ορός antiFx1 ήταν ευγενική χορηγία του Dr Kerjaschki. Μετά από 7 μέρες σε 6 από αυτούς χορηγήθηκε υποδορίως ραπαμυκίνη 0.5mg/kg σωματικού βάρους (ΡHN-RAPA) ενώ οι υπόλοιποι χρησίμευσαν ως συγκριτική ομάδα μελέτης πασχόντων από Μ.Ν (PHN). Επίσης υπήρχε και μια τρίτη ομάδα με 6 φυσιολογικούς αρουραίους οι οποίου δεν έλαβαν καμία θεραπεία (Control). Ακολούθησαν συλλογές ούρων μια φορά την εβδομάδα για 7 εβδομάδες και στη πέρας της 7ης εβδομάδας όλα τα ζώα θυσιάστηκαν. Ένα μέρος νεφρικού ιστού χρησιμοποιήθηκε για φωτονικό, ανοσοφθορισμό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ενώ το υπόλοιπο διαμοιράστηκε για τη μελέτη των ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών νεφρίνης και ποδοσίνης μέ PCR και Western Βlot. Παράλληλα μετρηθήκαν μεταβολικοί δείκτες θρέψης, η κρεατινίνη καθώς και τα επίπεδα ραπαμυκίνης ορού. Για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ANOVA με διόρθωση κατά Βonferroni. Στατιστικά σημαντικές ήταν η διαφορές με p μικρότερο από 0,05 ενώ για την ανάλυση χρησιμοποιηθηκε το στατιστικό προγραμμα SPSS17.Aποτελέσματα: Στις συλλογές ούρων 24ωρου επιβεβαιώθηκε ότι η ομάδα ΡHN-RAPA καθώς και η ομάδα PHN είχαν πρωτεϊνουρία νεφρωσικού επιπέδου την 7η μέρα (οπότε χορηγήθηκε η ραπαμυκίνη) και η οποία παρέμεινε σταθερά υψηλή μέχρι την 14η μέρα. Μετά τη 14η μέρα παρατηρήθηκε βελτίωση της πρωτεϊνουρίας στην ομάδα ΡHN-RAPA, ενώ στο πέρας των 7 εβδομάδων η πρωτεϊνουρία μειώθηκε στο 1/3 στην ομάδα ΡHΝ-RAPA σε σύγκριση με την ομάδα PHN (p=0.007 στην post hoc ανάλυση) ποτέ όμως δεν έφτασε τα επίπεδα της ομάδας Control (p<0.001). Όσον αφορά στους δείκτες θρέψης οι ολικές πρωτεΐνες και η αλβουμίνη ήταν υψηλότερες στην ομάδα ΡHΝ-RAPA έναντι της ΡHΝ ενώ το σωματικό βάρος ήταν μικρότερο. Τα επίπεδα ραπαμυκινης την ημέρα θανάτωσης των αρουραίων ήταν 12,5± 0.76ng/ml στην ομάδα ΡHΝ-RAPA.Η ιστολογική χρώση αργύρου έδειξε βελτίωση του πάχους της σπειραματικής βασικής μεμβράνης στην ομάδα ΡHΝ-RAPA έναντι της ομάδας ΡHΝ. Στον ανοσοφθορισμο οι IgG εναποθέσεις μειώθηκαν κατά 1 με 2 τάξεις μεγέθους (από 3+ σε 1+ με 2+) ενώ στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρατηρήθηκε περιορισμός των εναποθέσεων και στατιστικά σημαντική (p<0.001) μείωση του πάχους την βασική μεμβράνης στην ομάδα της ραπαμυκίνης. Όσον αφόρα στην έκφραση των ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών με Western Blot, τα επίπεδα νεφρίνης και ποδοσίνης μειώθηκαν στην ομάδα ΡHΝ ενώ διατηρήθηκαν σε φυσιολογικά επίπεδα στην ομάδα ΡHΝ-RAPA . Αντίστοιχα και στον ανοσοφθορισμό η έκφραση νεφρίνης και ποδοσίνης αποκαταστάθηκε στην ομάδα της ραπαμυκίνης. Στην PCR η έκφραση του mRNA της νεφρίνης ακολούθησε την πρωτεϊνική έκφραση κάτι που δεν παρατηρήθηκε στην περίπτωση της ποδοσίνης. Συμπέρασμα : Η ραπαμυκίνη φαίνεται να περιορίζει την πρωτεϊνουρία και να αποκαθιστά τη βλάβη στα ποδοκύτταρα σε μοντέλα ανοσολογικής τοξικότητας. Στην μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια ιδιαίτερο ρόλο έχουν τα ΙgG αυτοαντισώματα, οπότε παρεμβάσεις έναντι παθολογικών Β λεμφοκυτταρικών κλώνων μπορεί να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα. Η Ραπαμυκίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των Β και Τ λεμφοκυττάρων καθώς και την παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Επιπλέον προάγει την παραγωγή ρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων που περιορίζουν αυτοδραστικούς Β-λεμφοκυτταρικούς κλώνους.Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο η ραπαμυκίνη χορηγήθηκε αφού είχε εγκατασταθεί η βλάβη και φάνηκε να περιορίζει την πρωτεϊνουρία, να υποστρέφει τις ιστολογικές αλλοιώσεις και να επαναφέρει την έκφραση των ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών στη ομάδα ΡHΝ-RAPA κατά την αυτόλογη φάση του πειράματος. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει ότι η μείωση των ανοσοσυμπλεγματικών εναποθέσεων συνέβη κατά την αυτόλογη φάση του πειράματος, γεγονός που δείχνει ότι η δράση της ραπαμυκίνης επιτελείται τόσο μέσω καταστολής της παραγωγής παθολογικών ανοσοσφαιρινών από τα Β λεμφοκύτταρα όσο και λόγω αποκατάστασης των πρωτεϊνών της σχισμής διηθήσεως. Συνεπώς η ραπαμυκίνη θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτική επιλογή για τη μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες.