Μελέτη μηχανισμών αντιγραφής και επιδιόρθωσης του γενετικοί υλικού με τεχνικές λειτουργικής μικροσκοπίας και χρήση αλγορίθμων επεξεργασίας-ανάλυσης εικόνας
Authors: Γιακουμάκης Νικόλαος-Νικηφόρος 
Published: September 2021

Η χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού εξασφαλίζεται διαμέσου της αδειοδότησης. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη αυτής της ισορροπίας στη ρύθμισης της αντιγραφής δύναται να οδηγήσει σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο.Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό μπορεί να προκληθεί από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των διαφόρων βλαβών έχουν εξελικτικά προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Η πρωτεΐνη Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη.Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης είναι άγνωστος, το παρόν επικρατές μοντέλο ρύθμισης του Cdt1 βάση in vitro πειραμάτων σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αυγών Xenopus δείχνει ότι το Cdt1 αρχικά προσδένεται στην περιοχή της βλάβης μέσω αλληλεπίδρασης με το PCNA. Ακολούθως, το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω του Cdt1 και το στοχεύει για πρωτεολυτική ρύθμιση. Στο πρώτο μέρος της μελέτης μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των μερών του συμπλόκου PCNA-Cdt1-Cdt2 οι οποίες συμβαίνουν ύστερα από βλάβη υπεριώδους ακτινοβολίας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση λειτουργικής μικροσκοπίας. Κατόπιν εφαρμογής εντοπισμένης υπεριώδους ακτινοβολίας, το PCNA πηγαίνει γρήγορα και δεσμεύεται ισχυρά με τη χρωματίνη στη περιοχή της βλάβης. Σε αντίθεση με το ότι έδειχνε το παρόν επικρατές μοντέλο, αποδεικνύεται ότι το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης ανεξάρτητα από τα υποστρώματά του και διατηρεί μακροχρόνιες αλληλεπιδράσεις με τη χρωματίνη. Η δέσμευση του Cdt2 στην περιοχή της βλάβης γίνεται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με το PCNA μέσω μοτίβου αλληλεπίδρασης με το PCNA (PiP-box) που ανακαλύφθηκε στην καρβοξυτελική περιοχή του. Το Cdt1 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω PiP-box στο αμινοτελικό άκρο και σταθεροποιείται στην περιοχή της βλάβης διαμέσου άμεσης αλληλεπίδρασης με το Cdt2. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της φωσφορυλίωσης του Cdt2 από την ATR κινάση. Φαίνεται ότι το Cdt2 εφόσον φωσφορυλιωθεί αναστέλλει την σταθεροποίηση του Cdt1 στη περιοχή της βλάβης.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης ερευνάται ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης και η πιθανή εμπλοκή του στην επιλογή κατάλληλου επιδιορθωτικού μηχανισμού διπλών θραύσεων του DNA. Τα πειράματα που περιγράφονται μελετούν διπλές θραύσεις οι οποίες έγιναν είτε με χρήση ακτίνων X είτε με την χρήση παλμικού UVA laser 355nm σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη φαίνεται ότι η απουσία του Cdt1 φαίνεται να αυξάνει τον ρυθμό συγκέντρωσης των TLS πολυμερασών polκ και polη στην περιοχή της βλάβης παίζοντας ρόλο στην χρονική ρύθμιση της επιδιόρθωσης. Επίσης, πειράματα που έγιναν με ημιαυτόματους αλγόριθμους επεξεργασίας και ανάλυσεις εικόνας σε εικόνες συνεστιακού μικροσκοπίου, βρέθηκε ότι η απουσία του Cdt1 επηρεάζει αρνητικά την συγκέντρωση παραγόντων επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων μέσω του μη ομόλογου συνδυασμού άκρων (NHEJ) 53BP1 και Rif1 σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές μαστού (MCF7) και τραχήλου (HeLa kyoto), ενώ δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά η συσσώρευση παραγόντων που εμπλέκονται στην έναρξη του ομόλογου ανασυνδυασμού όπως το BRCA1.Στο τρίτο μέρος της μελέτης παρουσιάζονται αναλυτικές μέθοδοι ποσοτικοποίησης και ποιοτικής ανάλυσης που αναπτύχθηκαν για την μελέτη τόσο της πρωτεϊνικής κινητικής στρατολόγησης σε ζωντανά κύτταρα (recruitment-timelapse) αλλά και για την ημι-αυτοματοποιημένη μέτρηση εστιών σε υποπυρηνικές περιοχές και τη ποσοτικοποίηση πυρηνικών πρωτεΐνών σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τέλος θα περιγραφούν αλγόριθμοι προεπεξεργασίας εικόνας για μετρήσεις αποστάσεων και όγκων.