Μελέτη βιοϋλικών με απεικονιστική μικροσκοπία ατομικής δύναμης
Authors: Κοντομάρης Στυλιανός-Βασίλειος 
Published: August 2021

Αντικείμενο της Διδακτορικής Διατριβής αποτελεί η μελέτη ινών κολλαγόνου υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας και ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε μέσω της ανάπτυξης τεχνικών Απεικονιστικής Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης και καινοτόμων τεχνικών για την ασφαλέστερη εξαγωγή αποτελεσμάτων τόσο κατά τη διαδικασία απεικόνισης των δειγμάτων όσο και κατά τη μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων.Επιμέρους αντικείμενα της έρευνας αποτέλεσαν: α) η ανάπτυξη τεχνικών χαρακτηρισμού και απεικόνισης λεπτών υμενίων κολλαγόνου σε νανοκλίμακα με Απεικονιστική Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης, β) η ανάπτυξη τεχνικών επαναπροσδιορισμού της ίδιας νανοπεριοχής ενός δείγματος πριν και μετά την επίδραση ενός ελεγχόμενου εξωτερικού παράγοντα,γ) η εφαρμογή τεχνικών υπολογισμού του μέτρου ελαστικότητας σε νανοπεριοχές του εξεταζόμενου δείγματος,δ) η κατασκευή χαρτών μέτρου ελαστικότητας για την μελέτη εκτεταμένων περιοχών σε νανοκλίμακα ως προς τις μηχανικές ιδιότητες,ε) η ανάπτυξη τεχνικών μελέτης των ποσοστιαίων μεταβολών του μέτρου ελαστικότητας υπό την επίδραση ελεγχόμενων εξωτερικών παραγόντων χωρίς τα σφάλματα που προέρχονται από τη σταθερά ελατηρίου του χρησιμοποιούμενου προβολού και το ακριβές σχήμα και μέγεθος της ακίδας, στ) η μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων κολλαγόνου σε νανοκλίμακα,ζ) η μελέτη της επίδρασης της υπεριώδους ακτινοβολίας σε μεμονωμένες ίνες κολλαγόνου με εστίαση στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα (τόσο ως προς τις δομικές όσο και ως προς τις μηχανικές τους ιδιότητες),η) η μελέτη της επίδρασης της ακτινοβολίας laser χαμηλής ισχύος στην περιοχή του ερυθρού σε μεμονωμένες ίνες κολλαγόνου (τόσο ως προς τις δομικές όσο και ως προς τις μηχανικές τους ιδιότητες).Όσον αφορά την επίδραση της ακτινοβολίας επιλέχθηκαν οι συγκεκριμένες περιοχές του Η/Μ φάσματος διότι παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για μια πληθώρα από ιατρικές και βιοϊατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα, αντικείμενο της έρευνας αποτέλεσε η ακτινοβόληση στην υπεριώδη περιοχή (UV-C, 254 nm) και στην ερυθρή περιοχή (με laser χαμηλής ισχύος, 661 nm). Η υπεριώδης ακτινοβολία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς χρησιμοποιείται για αποστείρωση και επεξεργασία βιοϋλικών με βάση το κολλαγόνο ενώ παράλληλα αποτελεί έναν από τους κύριους παράγοντες φωτο-γήρανσης του δέρματος και πρόκλησης δερματικού καρκίνου. Η χαμηλής ισχύος ακτινοβολία στην περιοχή του ερυθρού εφαρμόζεται για την ονομαζόμενη Low-Level Laser Therapy, η οποία έχει ένα ευρύ φάσμα από εφαρμογές, μεταξύ των οποίων η επούλωση πληγών. Για τη μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων κολλαγόνου μελετήθηκαν οι μηχανικές ιδιότητες (ποσοτικός προσδιορισμός μέτρου ελαστικότητας) σε σημεία των ινών με απότομη αλλαγή κατεύθυνσης και συγκρίθηκαν με τις τιμές των του μέτρου ελαστικότητας στα υπόλοιπα σημεία των ινών. Η ποιοτική μελέτη της μηχανικής ανομοιογένειας των λεπτών υμενίων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο απεικόνισης φάσης. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σημαντική διαφοροποίηση του μέτρου ελαστικότητας στις συγκεκριμένες περιοχές και οδηγούν στην επικύρωση του μοντέλου της σωληνοειδούς δομής της ίνας του κολλαγόνου. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η μηχανική ανομοιογένεια των ινών λόγω της D – περιοδικότητας. Η μέθοδος απεικόνισης φάσης επικύρωσε τα παραπάνω αποτελέσματα.Για τη μελέτη της επίδρασης της UV ακτινοβολίας στα νανοχαρακτηριστικά του κολλαγόνου, λεπτά υμένια κολλαγόνου ακτινοβολήθηκαν, με ελεγχόμενες δόσεις υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη βοήθεια της μικροσκοπίας ατομικής δύναμης κατεγράφησαν οι δομικές αλλαγές στις διαστάσεις και τη χαρακτηριστική περιοδικότητα των ινών, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και η ποσοστιαία μεταβολή του μέτρου ελαστικότητας λόγω της ακτινοβόλησης. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί σημαντικές δομικές αλλοιώσεις στις ίνες κολλαγόνου (μείωση της υψομετρικής διαφοράς ‘ορέων’ και κοιλάδων’ και των διαμέτρων των ινών). Επίσης επηρεάζει σημαντικά τις μηχανικές ιδιότητες των ινών κολλαγόνου. Συγκεκριμένα, το ποσοστό μείωσης του μέτρου ελαστικότητας στις περιοχές ‘ορέων’ προσδιορίστηκε 68%, ενώ των ‘κοιλάδων’ 61%. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι μεγάλοι χρόνοι έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία οδηγούν στην αλλοίωση της μηχανικής ανομοιογένειας των ινών κολλαγόνου.Η μελέτη της επίδρασης της ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού στα νανοχαρακτηριστικά του κολλαγόνου πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο χρησιμοποιήθηκε διάλυμα κολλαγόνου μικρής διάρκειας ζωής για την παρασκευή των λεπτών υμενίων με αποτέλεσμα οι ίνες που σχηματίστηκαν να παρουσιάζουν ατέλειες στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα. Η παραπάνω διαδικασία αποτελεί προσομοίωση κολλαγόνου με ατέλειες λόγω γήρατος ή ασθενειών. Η ακτινοβόληση στην περίπτωση αυτή πραγματοποιήθηκε σε 20 δόσεις των 45 δευτερολέπτων με ένα λεπτό ηρεμίας μεταξύ δύο διαδοχικών δόσεων. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ερυθρή ακτινοβολία laser χαμηλής ισχύος οδηγεί στον πλήρη σχηματισμό της D – περιοδικότητας, αλλά και στη μείωση κατά ~25% του πάχους των ινών. Στο δεύτερο στάδιο ίνες κολλαγόνου με πλήρως σχηματισμένη δομή ακτινοβολήθηκαν αρχικά με διακοπτόμενες δόσεις ακτινοβόλησης και στη συνέχεια με συνεχή ακτινοβόληση για μεγάλα χρονικά διαστήματα (15 λεπτά και 60 λεπτά). Στην περίπτωση της διακοπτόμενης ακτινοβόλησης δεν κατεγράφησαν δομικές διαφοροποιήσεις στα επιφανειακά χαρακτηριστικά του υμενίου, παρουσιάστηκε όμως αλλοίωση της μηχανικής ετερογένειας των ινών. Επίσης τα αποτελέσματα μετά τη συνεχή ακτινοβόληση των 15 λεπτών ήταν ταυτόσημα με τα αποτελέσματα των 20 δόσεων με το πρωτόκολλο της διακοπτόμενης ακτινοβόλησης. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι το πρωτόκολλο ακτινοβόλησης δεν επηρεάζει το κολλαγόνο, με προϋπόθεση η συνολική πυκνότητα ενέργειας να είναι η ίδια. Στην περίπτωση της συνεχούς ακτινοβόλησης των 60 λεπτών, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σημαντικές αλλαγές στις διαστάσεις των ινών (~14% μείωση του πάχους και ~5% αύξηση του ύψους). Στην περίπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφοροποιήσεις στη χαρακτηριστική D – περιοδικότητα. Οι χάρτες μέτρου ελαστικότητας κατασκευάστηκαν για μία επιλεγμένη περιοχή ίνας κολλαγόνου πριν και μετά την ακτινοβόληση. Η επίδραση της ακτινοβολίας στις μηχανικές ιδιότητες του κολλαγόνου υπήρξε καταλυτική καθώς κατεγράφη αύξηση κατά 24.5% της μέσης τιμής του μέτρου ελαστικότητας της επιλεγμένης περιοχής μετά την ακτινοβόληση. Τέλος αξίζει να σημειωθεί ότι σε κάθε διαδικασία ακτινοβόλησης (τόσο με UV όσο και με ερυθρή ακτινοβολία) η μελέτη πραγματοποιήθηκε στην ίδια ίνα, σε κάθε περίπτωση, για την απόκτηση πραγματικά αξιόπιστων αποτελεσμάτων χωρίς ενδεχόμενα σφάλματα λόγω διαφορών που παρουσιάζονται μεταξύ των ινών του υμενίου (π.χ. σε κάθε υμένιο κολλαγόνου παρουσιάζονται ίνες διαφορετικών πάχους που κυμαίνονται στο εύρος 300nm – 700nm).Τέλος, αναδείχθηκε η σημασία της ποσοστιαίας μεταβολής του μέτρου ελαστικότητας (στην γενικότερη περίπτωση, υπό την επίδραση οποιουδήποτε ελεγχόμενου εξωτερικού παράγοντα) καθώς ο υπολογισμός της ποσοστιαίας μεταβολής του μέτρου ελαστικότητας είναι ανεξάρτητος από τυπικά σφάλματα του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης που οφείλονται κυρίως στην άγνοια της ακριβούς τιμής της σταθεράς του προβόλου (η τιμή της οποίας εισάγει σφάλματα έως και 20% στην τιμή του μέτρου ελαστικότητας) αλλά και στην άγνοια του ακριβούς σχήματος και μεγέθους της ακίδας (η τιμή της οποία επίσης επίσης εισάγει σφάλματα ~20%). Αξίζει να σημειωθεί ότι η νέα μέθοδος χαρακτηρισμού μηχανικών ιδιοτήτων μπορεί να εφαρμοστεί σε κάθε βιοϋλικό ακόμα και σε περιπτώσεις μελέτης μηχανικών ανομοιογενειών στο ίδιο δείγμα.