Μελέτη mecA - θετικών κλινικών στελεχών staphylococcus aureus με διαφορετικά επίπεδα αντοχής στη μεθικιλλίνη
Authors: Λάμπρου Μαρία 
Published: January 2014

Ανάλογα με το γενετικό υπόβαθρο κάθε στελέχους που φέρει το γονίδιο mecA, τα επίπεδα αντοχής μπορεί να κυμαίνονται από φαινοτυπική ευαισθησία έως υψηλή αντοχή. Χαρακτηριστικό πολλών στελεχών MRSA αποτελεί η ετερογενής έκφραση της αντοχής, η οποία οφείλεται στον διαχωρισμό ενός ισχυρά ανθεκτικού υποπληθυσμού μετά από έκθεση σε μεθικιλλίνη. Η μέγιστη έκφραση αντοχής από την μεταλλαγμένη πενικιλλινο-δεσμευτική πρωτεΐνη PBP2΄ απαιτεί την ορθή και αποτελεσματική σύνθεση των προδρόμων μορίων της πεπτιδογλυκάνης. Τα γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση και αποικοδόμηση των πρόδρομων του κυτταρικού τοιχώματος, τη ρύθμιση, τη μεταφορά και μεταγωγή σήματος μπορεί να καθορίσουν το επίπεδο αντοχής που εκφράζεται. Σε αυτό το στάδιο, ωστόσο, δεν υπάρχουν πληροφορίες διαθέσιμες σχετικά με τη λειτουργία ή την αποτελεσματικότητα αυτών των παραγόντων στα κλινικά στελέχη, σε σχέση με τα επίπεδα αντοχής στη μεθικιλλίνη.Στελέχη S. aureus της κοινότητας που φέρουν το mecA γονίδιο και την PBP2’ αλλά εμφανίζουν φαινοτυπικά ευαισθησία στην οξακιλλίνη (OS-MRSA, oxacillin MIC ≤ 2 mg/L) αναφέρονται όλο και περισσότερο παγκοσμίως, με μία σαφή αναφορά να υπάρχει και από το ΠΓΝ Λάρισας. Για το λόγο αυτό, αρχικά μελετήσαμε τέσσερα κλινικά στελέχη S. aureus που φέρουν το mecA γονίδιο με MIC στην οξακιλλίνη <2mg/L και ακολούθησε μελέτη της απόκρισης αυτών στην οξακιλλίνη με πληθυσμιακές αναλύσεις και πειραματικές λοιμώξεις σε επίμυες. Τα στελέχη αυτά έχουν SCCmec τύπου IV και ανήκουν σε δύο γονότυπους. Δύο από τα τέσσερα στελέχη βρέθηκαν, από την πληθυσμιακή ανάλυση, να είναι πραγματικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη. Και τα τέσσερα στελέχη εμφάνισαν σημαντικές μειώσεις στον αριθμό των αποικιών που αναπτύχθηκαν μετά από θεραπεία με δικλοξακιλλίνη κατά τη διαδικασία των πειραματικών λοιμώξεων σε μηρό, κάτι που έγινε επίσης για ένα στέλεχος ελέγχου (control) S. aureus που είναι mecA αρνητικό. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ορισμένα από τα φαινοτυπικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη mecA-θετικά στελέχη S. aureus μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να ανταποκρίνονται στην οξακιλλίνη.Παράλληλα, εστιάσαμε σε επιπρόσθετους παράγοντες που μπορεί να συμβάλουν στην φαινοτυπική ευαισθησία με στόχο να αποκτήσουμε γνώσεις σε μοριακό και λειτουργικό επίπεδο. Διερευνήσαμε το νουκλεοτιδικό περιεχόμενο των femA, femB και femX γονιδίων, τα οποία θεωρούνται απαραίτητα για την αντοχή στη μεθικιλλίνη, σε τέσσερα κλινικά στελέχη OS-MRSA του SCCmec-IV τύπου. Πραγματοποιήσαμε ποσοτική Real-Time PCR, η οποία έδειξε ότι τα γονίδια mecA, femA, femB και femX εκφράστηκαν στα ίδια επίπεδα σε όλα τα στελέχη. Επιπροσθέτως, εντοπίσαμε και στα τρία fem γονίδια αρκετές μεταλλάξεις που οδηγούν σε ουσιαστικές αντικαταστάσεις αμινοξέων σε θέσεις που ενδεχομένως να επηρεάζουν τη δραστηριότητα των Fem ενζύμων. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο femX ήταν περισσότερο συντηρημένες στα δύο OS-MRSA στελέχη που αναπτύχθηκαν και ήταν πλήρως λειτουργικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη με όλες τις δυνατές δοκιμασίες (χαρακτηριστικά αναπτύχθηκαν μόνο μέχρι 1 mg/L οξακιλλίνης στην πληθυσμιακή ανάλυση). Θεωρούμε ότι η συσσώρευση αυτών των αμινοξικών αλλαγών μπορεί να επηρεάσει την ανέπαφη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, συμβάλλοντας στην μη αναμενόμενη ανταπόκριση αυτών των στελεχών στην οξακιλλίνη.Τέλος, συγκρίναμε in vitro την δραστικότητα της δικλοξακιλλίνης με εκείνη της βανκομυκίνης σε 15 κλινικά στελέχη OS-MRSA. Με πληθυσμιακές αναλύσεις, διαπιστώσαμε ότι 6 OS-MRSA στελέχη ήταν σε θέση να αναπτυχθούν παρουσία μέχρι και 8 mg/L δικλοξακιλλίνης, ενώ 9 στελέχη ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε 12 έως >32 mg/L δικλοξακιλλίνης. Όλα τα στελέχη ήταν πλήρως ευαίσθητα και αναπτύχθηκαν μέχρι 2 mg/L βανκομυκίνης. Και τα δύο φάρμακα όμως παρουσίασαν παρόμοιες βακτηριοκτόνες δραστηριότητες. Στις πειραματικές λοιμώξεις, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της δικλοξακιλλίνης (το εμπορικά διαθέσιμο σκεύασμα της οξακιλλίνης) σε 10 OS-MRSA στελέχη ήταν σημαντική [P<0.05 σε σχέση με μάρτυρες (control) χωρίς θεραπεία] ενώ η βανκομυκίνη ήταν αποτελεσματική (P<0.05) έναντι σε 12 OS-MRSA στελέχη. Παράλληλα, η δικλοξακιλλίνη είχε αποτελεσματικότητα η οποία ήταν συγκρίσιμη με εκείνη της βανκομυκίνης (P>0.05) σε 8 OS-MRSA στελέχη. Η ευνοϊκή ανταπόκριση στη θεραπεία με δικλοξακιλλίνη μπορεί να υποδηλώνει ότι αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες θα μπορούσαν πιθανώς να χρησιμοποιηθούν σε OS-MRSA λοιμώξεις.