Δομικές και λειτουργικές μελέτες των ριβοσωμικών πρωτεϊνών THX, S20 και L4 του θερμόφιλου οργανισμού Thermus thermophilus
Authors: Λεοντιάδου Φωτεινή 
Published: August 2021

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τρεις ριβοσωμικές πρωτεΐνες του Τ. thermophilus, η Thx, η S20 και η L4, με ιδιαίτερη σημασία για τη δομή και τη λειτουργία του ριβοσώματος. Το γεγονός ότι η Thx είναι μία πολύ μικρή (2G αμινοξέα) και πολύ βασική πρωτεΐνη (pI=12,1) η οποία βρίσκεται στους θερμόφιλους οργανισμούς Τ. thermophilus, Τ. aquaticus και Τ. flavus ενώ απουσιάζει από άλλα βακτήρια σε συνδυασμό με την εντόπισή της μετά από κρυσταλλογραφικές μελέτες στην κορυφή της κεφαλής της 30S υπομονάδας του οργανισμού Τ. thermophilus, σε μία κοιλότητα αποτελούμενη από rRNA, την καθιστά ιδιαιτέρως ενδιαφέρουσα. Στην συγκεκριμένη εργασία ταυτοποιήθηκε το γονίδιο της Thx ξεκινώντας από την ήδη γνωστή αμινοξική της ακολουθία. Χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της PCR, της αντίστροφης PCR και του υβριδισμού κατά Southern. Στην πορεία ανεύρεσης του γονιδίου της διαπιστώθηκε ότι 9 νουκλεοτίδια ανοδικά ως προς το Ν-τελικό άκρο της βρίσκεται το γονίδιο της S20 ριβοσωμικής πρωτεΐνης και ότι τα δύο αυτά γονίδια αποτελούν ένα οπερόνιο με κοινό προαγωγέα σε απόσταση 29 νουκλεοτιδίων ανοδικά ως προς το Ν- τελικό άκρο της S20. Πριν από κάθε γονίδιο ταυτοποιήθηκε η χαρακτηριστική Shine-Dalgarno περιοχή. Η λειτουργία του προαγωγέα πιστοποιήθηκε πειραματικά, ελέγχοντας την ικανότητά του να μεταγράφει το γονίδιο της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραμφαινικόλης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το γονίδιο της S20 είναι μονοκιστρονικό σε άλλα βακτήρια. Επιπρόσθετα έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας μιας περιοχής 1,4 kb από το γονιδίωμα του Τ. thermophilus η οποία περιλαμβάνει τα γονίδια των δύο πρωτεϊνών S20 και Thx. Η L4 είναι πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος η οποία συμμετέχει στην διαμόρφωση του στενότερου τμήματος του καναλιού από το οποίο διέρχονται οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες κατά την έξοδό τους από το ριβόσωμα. Μελετήθηκε η λειτουργία της Τ. thermophilus L4 και συγκεκριμένα του πιθανού ρόλου ενός συντηρημένου αμινοξέος, του Glu-56, στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού και στη διέλευση της πεπτιδικής αλυσίδας από το κανάλι. Έγιναν μεταλλάξεις στο αμινοξύ αυτό όπως και στη γειτονική Gly-55 (Glu56Ala, Glu56Gln, Glu56Asp, Gly55Ala, Gly55Ser, Gly55Glu, Gly55Glu/Glu56Gly) κι ενσωμάτωση τόσο της αγρίου-τύπου L4 όσο και των μεταλλάξεων αυτής σε ριβοσώματα από κύτταρα E. coli. Τα ριβοσώματα αυτά ελέγχθηκαν ως προς την ενεργότητά τους στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού με την αντίδραση της πουρομυκίνης. Από τα πειραματικά αποτελέσματα προέκυψε ότι η γ-καρβοξυλομάδα του γλουταμινικού οξέος-56 δεν εμπλέκεται άμεσα στην κατάλυση της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού αλλά πιθανότατα έμμεσα μέσω διατάραξης της διαμόρφωσης του 23S rRNA η οποία έχει ως αποτέλεσμα "πιθανή απομάκρυνση" της αδενίνης A2451Ec (E. coli) από το κέντρο της πεπτιδυλικής τρανσφεράσης. Επίσης διαπιστώθηκε ότι το μέγεθος της ανθρακικής αλυσίδας του αμινοξέος στη θέση 56 παίζει σημαντικό ρόλο στις καταλυτικές ιδιότητες της πεπτιδυλικής τρανσφεράσης. Αναφορικά με το ρόλο της Gly-55 φαίνεται πως κι αυτός είναι έμμεσος και διαπιστώθηκε πώς είναι απαραίτητη η ύπαρξη αλανίνης στη θέση 55 για την εκδήλωση υψηλής καταλυτικής δραστικότητας στα E. coli κύτταρα. Η διερεύνηση της επίδρασης της L4 στην βιοσύνθεση των πεπτιδυλο-tRNA πεπτιδίων και στην διέλευσή τους από το κανάλι έγινε με πειράματα συζευγμένης μεταγραφής-μετάφρασης σε συστήματα ελεύθερα κυττάρων (S30 εκχυλίσματα). Τα συστήματα ελεύθερα κυττάρων περιείχαν ριβοσωμάτια με ενσωματωμένες τις διαφορετικές μορφές της L4 (αγρίου τύπου ή μεταλλάξεις αυτής) και χρησιμοποιήθηκαν για in vitro μεταγραφή-μετάφραση των πρωτεϊνών IF-1, IF-2, EF-G, Co και 5&6 απουσία και παρουσία του αντιβιοτικού ερυθρομυκίνη. Παρατηρήθηκε ότι ο ρυθμός και ο "τρόπος" βιοσύνθεσής των πρωτεϊνών μεταβάλλεται, όταν χρησιμοποιούνται διαφορετικές μεταλλάξεις της L4. Το γεγονός αυτό εισηγείται την ύπαρξη αλληλοεπιδράσεων μεταξύ των νεοσυντιθέμενων πεπτιδικών αλυσίδων και της L4, για την οποία είναι γνωστό ότι βρίσκεται πολύ κοντά στην είσοδο του καναλιού.