Ετερόλογη υπερέκφραση και ακινητοποίηση ενζύμων διάσπασης αρωματικών ενώσεων σε νανοϋλικά
Authors: Ασημακούλα Σταματία 
Published: July 2024

Η σταθερά αυξανόμενη βιομηχανική δραστηριότητα αλλά και η υπέρμετρη αστικοποίηση, αναπόφευκτα οδηγούν στην παραγωγή μεγάλου όγκου αποβλήτων, καθιστώντας την περιβαλλοντική ρύπανση ως ένα από τα κύρια προβλήματα της σύγχρονης εποχής. Ρύποι όπως η φαινόλη και τα υδροξυβενζοϊκά οξέα, τείνουν να συσσωρεύονται στο περιβάλλον και απειλούν όχι μόνο τα παρακείμενα οικοσυστήματα, αλλά και την ανθρώπινη υγεία. Μια από τις πιο βιώσιμες προσεγγίσεις για την εξυγίανση των προαναφερθέντων οικοσυστημάτων είναι η απομάκρυνση αυτών των ρύπων με την αξιοποίηση του μεταβολικού μηχανισμού μιας πληθώρας μικροοργανισμών, που αναπτύσσονται στα οικοσυστήματα αυτά χρησιμοποιώντας τους εκάστοτε ρύπους ως πηγές άνθρακα και ενέργειας, μια διαδικασία που ονομάζεται βιοαποδόμηση. Τόσο οι μικροοργανισμοί που επιτελούν διαδικασίες βιοαποδόμησης όσο και τα ένζυμα που συμμετέχουν σε αυτές, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αποδοτικοί βιοκαταλύτες για την απομάκρυνση τέτοιων ρύπων. Μια από τις μεθόδους που επιστρατεύεται για την ενίσχυση της απόδοσης ενός βιοκαταλύτη είναι η ακινητοποίησή τους σε διάφορα μέσα - παραδοσιακά και πιο σύγχρονα - που προσφέρει σταθερότητα, δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής του και καλύτερο έλεγχο της αντίδρασης. Το Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3, που απομονώθηκε από μια βαριά ρυπασμένη περιοχή της Ηπείρου, είναι ένας μικροοργανισμός που δυνητικά αποτελεί έναν ευέλικτο βιοκαταλύτη καθώς διαθέτει στο γονιδίωμά του τη γενετική πληροφορία για την έκφραση καταβολικών ενζύμων που αναγνωρίζουν και διασπούν ποικιλία αρωματικών ενώσεων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν, αρχικά, η μελέτη καταβολικών ενζύμων (μονο/διοξυγονασών) του Sphe3, τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στην αποδόμηση αρωματικών ενώσεων με απώτερο στόχο, την ανάπτυξη νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων μέσω της ακινητοποίησης των ενζύμων σε νανοϋλικά. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η πορεία μεταβολισμού της φαινόλης στο Sphe3. Το στέλεχος έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται παρουσία φαινόλης ως η μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας και μπορεί να μεταβολίσει μέχρι και 1500 mg/L φαινόλης, μέσω της ortho-πορείας σχάσης της κατεχόλης, όπως αποδείχθηκε μέσω ταυτοποίησης ενδιάμεσων μεταβολιτών και μεταγραφομικής μελέτης. Τα κύτταρα Sphe3 ακινητοποιήθηκαν σε αλγινικό νάτριο και ήταν ικανά να καταβολίσουν πλήρως 1000 mg/L φαινόλης σε 192 ώρες, διατήρησαν την ικανότητα αποδόμησης της φαινόλης ακόμη και μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης, ενώ κατέστη εφικτό να επαναχρησιμοποιηθούν για τουλάχιστον πέντε κύκλους διατηρώντας περισσότερο από το 75% της αρχικής ικανότητας καταβολισμού. Τα αποτελέσματα αυτά καθιστούν το στέλεχος Sphe3 καλό υποψήφιο για μελλοντικές εφαρμογές βιοαποδόμησης της φαινόλης. Για την ανάπτυξη βιοκαταλυτικών συστημάτων ακινητοποιήθηκαν τα ένζυμα 1,2-διοξυγονάση της κατεχόλης (1,2-CDO), 4-υδροξυλάση του 3-υδροξυβενζοϊκού οξέος (3ΗΒ4Η), και 1,2-διοξυγονάση του γεντισικού οξέος (GDO) του Sphe3 σε μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου σιδήρου (Fe2O4) επικαλυμμένα με πολυντοπαμίνη (PDA) και ενεργοποιημένα με ιόντα νικελίου (Ni2+). Τα ανασυνδυασμένα ένζυμα έφεραν ουρά πολύ-ιστιδίνης, κάτι που επέτρεψε και την απομόνωση του κάθε ενζύμου από το εκάστοτε κυτταρικό εκχύλισμα, ενώ η χρήση των μαγνητικών νανοσωματιδίων ως φορείς ακινητοποίησης επιτρέπει την εύκολη ανάκτηση του νανοβιοκαταλύτη. Η ακινητοποίηση της 1,2-CDO οδήγησε στην ανάπτυξη ενός νανοβιοκαταλύτη με βέλτιστη θερμοκρασία δράσης τους 50 °C και ενισχυμένη ανθεκτικότητα στις θερμοκρασίες 30, 40 και 50 °C. Επιπλέον, μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί μέχρι 7 φορές διατηρώντας τη δραστικότητά του άνω του 50%. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν το νανοβιοκαταλύτη κατάλληλο για εφαρμογές τόσο στην απορρύπανση, όσο και στη βιομηχανία με στόχο την απομάκρυνση αρωματικών ενώσεων και την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως το cis, cis-μουκονικό οξύ (ccMA). Το ccMA ταυτοποιήθηκε ως προϊόν της δράσης της 1,2-CDO με την κατεχόλη ως υπόστρωμα μέσω φασματοσκοπίας NMR. Η συγκεκριμένη ενδιαφέρουσα παρατήρηση οδήγησε στη διερεύνηση της ικανότητας μετασχηματισμένων κυττάρων E. coli BL21(DE3) που εκφράζουν την ανασυνδυασμένη 1,2-CDO, να παράγουν ccMA όταν αναπτύσσονται παρουσία κατεχόλης. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώθηκε, αποδεικνύοντας ότι το ένζυμο μπορεί να αξιοποιηθεί σε ένα βιοκαταλυτικό σύστημα παραγωγής προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ακινητοποίηση της 3ΗΒ4Η, οδήγησε στην αύξηση της συγγένειας του ενζύμου για το υπόστρωμα 3-HBA και επιπλέον, ο νανοβιοκαταλύτης εμφάνισε ελαφρώς αυξημένη θερμοσταθερότητα κατά την επώασή του στους 30, 40 και 50 °C, σε σύγκριση με το ελεύθερο ένζυμο. Η ακινητοποίηση φαίνεται να ευνόησε και τη σταθερότητα του ενζύμου κατά την αποθήκευση, αφού παρουσίασε 10-20% αυξημένη δραστικότητα, σε σχέση με την ελεύθερη μορφή του ενζύμου, στις 10, 20 και 30 ημέρες αποθήκευσης στους −20 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης επαναχρησιμοποιήθηκε 3 φορές διατηρώντας τη δραστικότητα της 3HB4H >40%, ενώ ανιχνεύθηκε δραστικότητα μέχρι και μετά από 5 κύκλους επαναχρησιμοποίησης. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιήθηκε η ακινητοποίηση μιας 3ΗΒ4Η και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του αντίστοιχου νανοβιοκαταλύτη. Είναι ακόμη από τις λίγες φορές που το ελεύθερο ένζυμο χαρακτηρίστηκε βιοχημικά, ενώ για πρώτη φορά ταυτοποιείται το πρωτοκατεχοϊκό οξύ ως προϊόν της αντίδρασης με υπόστρωμα 3-ΗΒΑ, μέσω NMR. Οι πληροφορίες λοιπόν που προκύπτουν σε αυτή την εργασία για τις βέλτιστες συνθήκες δράσης του είναι σαφώς σημαντικές. Ένα ακόμη ενδιαφέρον και καινοτόμο επίτευγμα της παρούσας εργασίας είναι η χρήση κυττάρων E. coli BL21(DE3) που εκφράζουν την ανασυνδυασμένη 3ΗΒ4Η για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της ενζυμικής μετατροπής του 3-ΗΒΑ σε PCA με την in-cell NMR φασματοσκοπία, μέσα στα ζωντανά κύτταρα. Μέσω της διαδικασίας αυτής παρακάμπτονται οι χρονοβόρες και κοστοβόρες διαδικασίες καθαρισμού ενός ενζύμου με σκοπό τη μελέτη των αντιδράσεων που αυτό καταλύει. Επίσης, δίνεται η δυνατότητα μελέτης του εκάστοτε ενζύμου στο φυσιολογικό κυτταρικό περιβάλλον αποκομίζοντας δεδομένα που ανταποκρίνονται περισσότερο στις πραγματικές του ιδιότητες. Τέλος, η ακινητοποίηση της GDO, ενός εξαιρετικά ασταθούς ενζύμου ως προς τη διατήρηση της δραστικότητάς του είχε ως αποτέλεσμα τη διατήρηση της δραστικότητάς της άνω του 60% μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης του νανοβιοκαταλύτη στους −20 °C. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η επιτυχής ακινητοποίηση της GDO δεν έχει αναφερθεί ξανά στη βιβλιογραφία μέχρι τώρα.