Ρύθμιση βιοσύνθεσης υαλουρονικού οξέος σε κυτταρικά μοντέλα καρκίνου του μαστού
Authors: Καραλής Θεόδωρος 
Published: November 2021

Ο καρκίνος του μαστού, ένας από τους πιο συχνά εμφανιζόμενους καρκίνους στις γυναίκες, εμφανίζει μεγάλη φαινοτυπική και γονοτυπική ετερογένεια. Ένας από τους σημαντικούς κλινικούς δείκτες που χρησιμοποιούνται για την κατηγοριοποίηση του καρκίνου του μαστού είναι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα (Estrogen Receptor α). Το 70% των καρκίνων του μαστού διαγιγνώσκονται ως ERα+ όγκοι και εμφανίζουν καλή πρόγνωση, ενώ στους ERα- όγκους παρατηρείται υψηλό ποσοστό μεταστάσεων και κακή πρόγνωση των ασθενών. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι ο καρκίνος, παρατηρείται έντονη αναδιοργάνωση του εξωκυτταρικού δικτύου μακρομορίων που περιβάλλει τα κύτταρα στους ιστούς. Ένα σημαντικό συστατικό του εξωκυττάριου χώρου είναι το υαλουρονικό, ένας γραμμικός ετεροπολυσακχαρίτης, ο οποίος συντίθεται από διαμεμβρανικά ένζυμα, τις συνθάσες του υαλουρονικού (Hyaluronan Synthases, HASes). Η αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στους καρκινικούς ιστούς του μαστού συσχετίζονται με υψηλή πιθανότητα δημιουργίας μεταταστάσεων, αντίσταση στις εφαρμοζόμενες χημειο- και ραδιο-θεραπείες και κακή πρόγνωση των ασθενών. Το υαλουρονικό αλληλεπιδρώντας τόσο με μόρια του εξωκυττάριου χώρου όσο και με τους εξειδικευμένους κυτταρικούς υποδοχείς του, όπως ο CD44, ρυθμίζει σχεδόν όλες τις πτυχές της κυτταρικής συμπεριφοράς, όπως η κυτταρική μετανάστευση, η διήθηση, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Με δεδομένο τον σημαντικό ρόλο του υαλουρονικού στη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην ανάδειξη και μελέτη αναστολέων της βιοσύνθεσής του. Το 4-methyl-umbelliferone (4-MU) είναι ένα μη τοξικό διαιτητικό συμπλήρωμα που προέρχεται από φυτά, όπως το χαμομήλι, με επιβεβαιωμένη ανασταλτική δράση έναντι της βιοσύνθεσης υαλουρονικού σε διάφορους τύπους κυττάρων. Υποθέσαμε ότι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα -ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης στην κλινική διαχείριση και θεραπεία του καρκίνου του μαστού- ρυθμίζει διαφορετικά τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού μετά από την επώασή τους με 4-MU. Πράγματι, το 4-MU ανέστειλε τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού στα ERα+ και ERα- καρκινικά κύτταρα μαστού, με την ισχυρότερη δράση να παρατηρείται στα κύτταρα που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα ERα. Η μείωση του νεο-συντιθέμενου υαλουρονικού συνοδεύτηκε από μεταβολές στα ένζυμα μεταβολισμού του και συγκεκριμένα ελάττωση της συνθάσης HAS2 και επαγωγή των υαλουρονιδασών HYAL-1 και HYAL-2. Επιπλέον, το 4-MU προκάλεσε σημαντικές μορφολογικές αλλαγές, οι οποίες συνοδεύονταν από απώλεια του υποδοχέα του υαλουρονικού CD44 από τις κυτταρικές προεκβολές. Σε λειτουργικό επίπεδο, η επώαση των κυττάρων με 4-MU προκάλεσε σημαντική μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρήθηκαν διαφορετικές επιδράσεις του 4-MU σε καρκινικά κύτταρα μαστού με διαφορετικό προφίλ έκφρασης του ERα. Στα ERα+ κύτταρα, το 4-MU προκάλεσε την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης ή/και anoikis, ενώ στα ERα- κύτταρα πιθανώς οδήγησε σε στάση του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, το 4-MU ανέστειλε τη μετανάστευση και διήθηση των μεταστατικών ERα- καρκινικών κυττάρων μαστού, ενώ προκάλεσε αύξηση της προσκόλλησής τους σε εξωκυττάριο υπόστρωμα, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από σημαντικές μεταβολές στην έκφραση ενζύμων αποικοδόμησης του εξωκυττάριου χώρου και προ-φλεγμονωδών διαμεσολαβητών. Το σαλικυλικό και το ακετυλο-σαλικυλικό (ασπιρίνη) χρησιμοποιούνται εδώ και πολλά χρόνια ως αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Παράλληλα, σύμφωνα με πρόσφατες επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες, εμφανίζουν σημαντικές αντικαρκινικές ιδιότητες. Παρότι ο ρόλος τους και η δράση τους στη φλεγμονή έχει αποσαφηνιστεί, ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής τους δράσης δεν είναι πλήρως γνωστός. Στην παρούσα διατριβή, εξετάσθηκε η δράση του σαλικυλικού -το οποίο παράγεται ταχέως in vivo μετά από την ενζυμική αποακετυλίωση της χορηγούμενης ασπιρίνης από εστεράσες- ως αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σαλικυλικό είναι ικανό να επάγει την άμεση ενεργοποίηση της κινάσης AMPK, η οποία είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την HAS2, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στα καρκινικά κύτταρα μαστού. Η παρατηρούμενη αναστολή φαίνεται να ρυθμίζεται από την επάρκεια θρεπτικών συστατικών στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων και από τις ενεργειακές τους ανάγκες. Επιπλέον, το σαλικυλικό επηρέασε την έκφραση μορίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και τις δράσεις του υαλουρονικού καθώς προκάλεσε μείωση της HAS2 και αύξηση των HYAL-2 και CD44 σε γονιδιακό επίπεδο. Επιπροσθέτως, η επώση των κυττάρων με σαλικυλικό προκάλεσε έντονη υποκυτταρική ανακατανομή του CD44 και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από μείωση της μετανάστευσης των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Τέλος, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το σαλικυλικό προκαλεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης πιθανότατα μέσω στάσης του κυτταρικού κύκλου.Με δεδομένη την ανάγκη ανάπτυξης νέων εκλεκτικών και περισσότερο αποτελεσματικών αναστολέων των συνθασών του υαλουρονικού, εξετάσθηκε η ικανότητα μιας ομάδας νέων συνθετικών χημικών ενώσεων να αναστέλλουν τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού. Η παρούσα διατριβή ανέδειξε έναν νέο αναστολέα, τον SMD1736, ο οποίος είναι ένα ανάλογο θυμιδίνης. Ο SMD1736 φαίνεται να είναι κατά περίπου 12.5-φορές δραστικότερος από τον ήδη γνωστό αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού 4-MU. Η επώαση καρκινικών κυττάρων μαστού με τον SMD1736 προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση γονιδίων του συστήματος του υαλουρονικού (HASes, HYALs, CD44 και RHAMM). Περαιτέρω, η μείωση της βιοσύνθεσης του υαλουρονικού από τον SMD1736 συνοδεύτηκε από αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Συγκεκριμένα, ο SMD1736 προκάλεσε σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, πιθανώς επάγοντας στάση του κυτταρικού κύκλου, ενώ σημαντική μείωση παρατηρήθηκε επίσης στο μεταναστευτικό και διηθητικό δυναμικό των κυττάρων. Οι μεταβολές αυτές συνοδεύτηκαν από έντονη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και απενεργοποίηση της RhoA GTPάσης. Τέλος, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων μαστού, η οποία συνοδεύτηκε και από αλλαγές της μορφολογίας των κυττάρων που αναπτύσσονταν σε συνθήκες 3D, μετά από επώαση με τον SMD1736. Συνοψίζοντας, η διδακτορική αυτή διατριβή ανέδειξε και χαρακτήρισε τρεις αναστολείς βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε καρκινικά κυτταρικά μοντέλα μαστού: το 4-MU (υπό το πρίσμα του διαφορετικού προφίλ έκφρασης οιστρογονοϋποδοχέων), το σαλικυλικό (δραστικό συστατικό ενός κλασσικού και ευρέως χρησιμοποιούμενου αντιφλεγμονώδους φαρμάκου, της ασπιρίνης) και μία νέα χημική ένωση, τον αναστολέα SMD1736. Η μείωση των επιπέδων του παραγόμενου υαλουρονικού και της συσσώρευσής του τόσο εξωκυττάρια όσο και ενδοκυττάρια και από τις τρεις χημικές ενώσεις, συνοδεύτηκε από αξιοσημείωτη αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων μαστού (ιδιαίτερα των μεταστατικών), αναδεικνύοντας τη σημασία της στόχευσης του συστήματος του υαλουρονικού στον καρκίνο του μαστού. Και οι τρεις αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή εμφανίζουν σημαντική αντικαρκινική δράση, καθιστώντας τους χρήσιμα «εργαλεία» για την ανάπτυξη νέων εκλεκτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι ασθενειών οι οποίες χαρακτηρίζονται από αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού, όπως είναι ο καρκίνος του μαστού.