Παραγωγή και λειτουργικός ρόλος του υδρόθειου (H2S) στη κυτταρική σηματοδότηση με έμφαση στο καρκίνο και την αγγειογένεση
Authors: Παυλίδου Αθανασία 
Published: July 2022

Το υδρόθειο (H2S), είτε ενδογενώς παραγόμενο είτε εξωγενώς χορηγούμενο (μέσω «δοτών»), αποτελεί ένα σηματοδοτικό μόριο, με πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές βιολογικές δράσεις. Το H2S επηρεάζει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως τη ρύθμιση του αγγειακού τόνου, την αγγειογένεση και τη νευροδιαβίβαση. Aπορρύθμιση της παραγωγής του μπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές νόσους, καρκίνο, κυκλοφορικές και ενδοκρινικές διαταραχές. Η βιοσύνθεσή του γίνεται από ένζυμα του μεταβολισμού της L-κυστεΐνης, τη β-συνθάση της κυσταθειονίνης (CBS) και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) καθώς και από το ένζυμο σουλφοτρανσφεράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3MST). Παρόλο που και τα τρία ένζυμα παραγωγής H2S εκφράζονται στο ενδοθήλιο, η πλειονότητα των αγγειακών μελετών έχει επικεντρωθεί στο CSE λόγω της ύπαρξης εκλεκτικών φαρμακολογικών αναστολέων και ποντικιών στα οποία το γονίδιο CSE έχει απαλοιφθεί. Σημειώνεται ότι τα ποντίκια που δεν εκφράζουν CBS υπάρχουν μόνο ως ετερόζυγα διότι η ομοζυγία οφηγεί στο θάνατο τις πρώτες πέντε βδομάδες. Αν και η παρουσία του 3MST στο ενδοθήλιο, έχει αποδειχθεί εδώ και χρόνια, ο ρόλος και η επίδραση του στις αγγειογενετικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Έχοντας στη διάθεση μας τόσο τα 3MST KO ποντίκια όσο και τους εκλεκτικούς φαρμακολογικούς αναστολείς του 3MST, θελήσαμε να αξιολογήσουμε την αγγειογενετική επίδραση του 3ΜSΤ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, χαρακτηρίσαμε τέσσερις νέους φαρμακολογικούς αναστολείς του 3ΜSΤ στην αγγειογενετική απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα των 3MST KO ποντικών παρατηρήσαμε ομοίως μειωμένες αγγειογενετικές ιδιότητες. Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις δείξαμε ότι η σίγαση ή η απαλοιφή του CSE μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την δυνατότητα εκβλάστησης από σφαιροειδή ενδοθηλιακών κυττάρων και την εκβλάστηση από αορτικούς δακτυλίους. Η αποσιώπηση ή η απαλοιφή του 3MST ομοίως είχε ανασταλτικές δράσεις σε αυτές τις δοκιμασίες αλλά σε μικρότερο βαθμό από αυτήν του CSE. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα είναι γεγονός ότι η εξασθένιση τόσο του CSE όσο και του 3MST οδηγούν σε μειωμένη αγγειογένεση. Επιπλέον για πρώτη φορά, αποδεικνύουμε την μείωση της αγγειογένεσης in vivo σε απόκριση στο VEGF σε ποντίκια 3MST ΚΟ. Δεδομένου ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα βασίζονται κυρίως στη γλυκόλυση για να καλύψουν την ανάγκη τους για ΑΤΡ, θελήσαμε να εξετάσουμε την επίδραση την αναστολής του 3MST στο μεταβολισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα μεταβολομικά μας δεδομένα έδειξαν ότι ορισμένα γλυκολυτικά ενδιάμεσα συσσωρεύονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα με μειωμένη έκφραση 3MST, ενώ τα επίπεδα πυροσταφυλικού οξέος μειώνονταιν. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γλυκόλυση έχει μπλοκαριστεί μερικώς στο επίπεδο της 3-φωσφορικής δεϋδρογενάσης γλυκεραλδεΰδης, της αλδολάσης ή πιθανώς της πυροσταφυλικής κινάσης. Μερικοί μεταβολίτες στην οδό των φωσφορικών πεντοζών (ΡΡΡ) βρέθηκαν αυξημένοι υποδηλώνοντας ότι αυτή η οδός διαταράσσεται επίσης σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση 3MST. Συνολικά, αυτές οι μεταβολομικές αλλαγές θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι η μειωμένη έκφραση 3MST στα ECs (1) διαταράσσει τη γλυκολυτική δραστηριότητα και (2) ανακατευθύνει τη γλυκόζη προς την οδό των φωσφορικών πεντοζών.Για την περαιτέρω διερεύνηση της παραγωγής ενέργειας που ρυθμίζεται από το 3MST στα ECs, αξιολογήθηκε η μιτοχονδριακή αναπνοή σε άθικτα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν μειωμένη ικανότητα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων με μειωμένη έκφραση του 3MST, όπως αξιολογήθηκε από τον αναλυτή εξωκυτταρικής ροής Seahorse XF24. Επίσης, παρήγαγαν λιγότερο μιτοχονδριακό ΑΤΡ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.Συνολικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει τον ρυθμιστικό ρόλο του μονοπατιού 3MST/H2S στις αγγειογενετικές ιδιότητες των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων (π.χ. πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και σχηματισμός δικτύου τύπου σωλήνα) και στην μιτοχονδριακή αναπνοή σε συνδυασμό με αυξημένη παραγωγή μιτοχονδριακού ΑΤΡ. Η μελέτη χαρακτήρισε επίσης τις μεταβολικές αλλοιώσεις κυττάρων με μειωμένη έκφραση 3MST και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η καταστολή της 3MST, διαταράσσει σημαντικά τον μεταβολισμό του θείου, των νουκλεοτιδίων, των πρωτεϊνών, των λιπαρών οξέων και των υδατανθράκων. Το 3MST στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποστηρίζει τις βιοενεργητικές/μεταβολομικές και αγγειογενετικές λειτουργίες τους, ενώ η αναστολή του 3MST εμποδίζει τη λειτουργεία του «αγγειογενετικού/μεταβολικού διακόπτη». Στο τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής επεκτείναμε την μελέτη μας σε καρκινικά κύτταρα. Μελετήσαμε το ρόλο του υδροθείου σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου ανθεκτικά στην 5-FU (5 φθοριοουρακίλη). Συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε στο ρόλο του CBS, χρησιμοποιώντας τον αναστολέα του AOAA (αμινοξυοξικό οξύ), ο οποίος είναι γνωστό ότι αναστέλλει το πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων κόλον. Τα κύρια ευρήματα είναι ότι 1) τα επίπεδα των πρωτεϊνών που παράγουν H2S, CBS και 3MST, αυξάνονται στα ανθεκτικά σε 5-FU HCT116 κύτταρα και 2)τα ανθεκτικά σε 5-FU HCT116 είναι λιγοτερο ευαίσθητα στην αντιπολλαπλασιαστική δράση του αναστολέα του CBS AOAA.