Treatment effect on the expression of podocyte proteins in systemic lupus erythematosus nephritis
Authors: Μωυσιάδης Δημήτριος 
Published: January 2014

Τα επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σπειραμάτων (ποδοκύτταρα) και οι λεπτές μεμβράνες των σχισμών διήθησης (ΛΜ) που γεφυρώνουν τους πόρους μεταξύ των γειτονικών ποδοειδών προσεκβολών (ΠΠ) των ποδοκυττάρων αποτελούν σημαντικά στοιχεία του φραγμού της υπερδιήθησης του πλάσματος στα νεφρικά σπειράματα. Διασφαλίζουν έτσι την ακεραιότητα της βασικής μεμβράνης και εμποδίζουν την απώλεια πρωτεϊνών στα ούρα. Βλάβη των ΛΜ και κυρίως των σημαντικότερων συστατικών τους, νεφρίνη και ποδοσίνη, εμπλέκεται σε σπειραματονεφρίτιδες ανοσολογικής αρχής. Έχουμε πρόσφατα αναφέρει ότι ελάττωση αυτών των πρωτεϊνών των ΛΜ αποτελεί πρώιμο γεγονός στην «ποδοκυττοπάθεια» της νεφρίτιδας του λύκου (ΝΛ). Η τελευταία αποτελεί πρότυπο αυτοάνοσου νοσήματος με ποικίλη ιστολογική και κλινική εικόνα με την πρωτεϊνουρία να αποτελεί την κυριότερη κλινική εκδήλωση. Διενεργήσαμε μία μελέτη με πειραματόζωα προκειμένου να εξετάσουμε κατά πόσο η ανοσοκατασταλτική θεραπεία με κορτικοειδή και κυκλοφωσφαμίδη, μπορεί να έχει άμεση επίδραση στις πρωτεϊνες των ΛΜ και κατ’επέκταση στα ποδοκύτταρα. Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια NZB/W F1. Τα NZB/W αναφέρθηκε προηγούμενα ότι θεωρούνται το πιο αντιπροσωπευτικό μοντέλο αυθόρμητης εκδήλωσης της ΝΛ. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε ομάδες ηλικίας έξι και εννέα μηνών και επίσης σε ομάδες ανάλογα με το αν έλαβαν ή όχι κορτικοειδή p.o ή ώσεις κυκλοφωσφαμίδη i.p. για 3 ή 6 μήνες αντίστοιχα. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια C57Bl/6 ως φυσιλογικοί μάρτυρες. Τέλος συγκρίσεις έγιναν και με τους προγόνους των NZB/W , δηλ. τα ποντίκια NZB και NZW. Η πρωτεϊνουρία 24ώρου προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο Bradford. Μετά την ευθανασία των πειραματόζωων απομονώθηκε ο αριστερός νεφρός για ιστολογική μελέτη: φωτονικό μικροσκόπιο, ανοσοφθορισμός IgG και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Αντίθετα ο δεξιός νεφρός απομονώθηκε για μοριακή και βιοχημική μελέτη: η σπειραματική έκφραση της νεφρίνης και ποδοσίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο μελετήθηκε με western blot, ενώ η έκφραση της νεφρίνης εξετάστηκε επίσης με ανοσοφθορισμό στα παρασκευάσματα νεφρικού ιστού. Για να προσδιοριστεί αν οι μεταβολές της νεφρίνης και ποδοσίνης οφείλονται σε μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων προσδιορίσαμε το mRNA τους με ποσοτική αντίστροφη real time PCR στα ίδια δείγματα. Τέλος με ELISA μετρήθηκαν και τα επίπεδα anti-DNA του ορού των ποντικών. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Για τις συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι Mann-Whitney U-test (αριθμητικές μεταβλητές) και το Fischer’s exact test (κατηγορικές μεταβλητές).Το Spearman’s rho (ρ) test χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση συσχετίσεων. Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη εμπόδισε την ανάπτυξη πρωτεϊνουρίας στα NZB/W ποντίκια, ενώ τα αντίστοιχα μη θεραπευμένα εμφάνισαν από την ηλικία των 6 μηνών νεφρωσικού επιπέδου πρωτεϊνουρία. Στο επίπεδο του φωτονικού μικροσκοπίου τα ζώα μάρτυρες 3 μηνών είχαν φυσιολογική ιστολογική εικόνα ή ήπια μεσαγγειακή υπερπλασία (ΗΜΝΛ), ενώ τα 6-9 μηνών εμφάνισαν όλα εστιακή ή διάχυτη υπερπλαστική ΝΛ (ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ αντίστοιχα) με άφθονες IgG εναποθέσεις. Τα θεραπευμένα είχαν ηπιότερη εικόνα από τους 3 μήνες θεραπείας (ηλικίας 6 μηνών), ενώ στους 6 μήνες θεραπείας (9μηνών) 7/8 είχαν φυσιολογική ιστολογική εικόνα. Οι εναποθέσεις IgG μειώθηκαν από τους 3 μήνες θεραπείας μέχρις μη ανίχνευσή τους στους 6 μήνες θεραπείας. Η εξέταση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο των ποντικών-μαρτύρων με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ κατέδειξε εκτεταμένες μεσαγγειακές, υπενδοθηλιακές και υποεπιθηλιακές εναποθέσεις με συνοδό ποδοκυττοπάθεια (επιπέδωση των ποδοκυττάρων και εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων). Αντίθετα τα πειραματόζωα που έλαβαν θεραπεία είχαν ελάχιστες υπενδοθηλιακές εναποθέσεις, ενώ τα ποδοκύτταρα και οι ΛΜ διατηρούνταν φυσιολογικές. Η μελέτη της σπειραματικής έκφρασης των κύριων πρωτεϊνών των ΛΜ με western blot έδειξε αύξηση των επιπέδων νεφρίνης στα ζώα με θεραπεία σε σχέση με τους μάρτυρες χωρίς θεραπεία (p<0,05) και για την ομάδα με κορτικοειδή και για αυτή με κυκλοφωσφαμίδη. Επίσης η έκφραση της νεφρίνης είχε αρνητική συσχέτιση με την ιστολογική τάξη της ΝΛ (ρ= -0,69, p<0,001) και θετική συσχέτιση με τα επίπεδα της ποδοσίνης (ρ= 0,53, p=0,007). Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη για 3-6 μήνες εμφάνισε επίσης υψηλότερα επίπεδα σπειραματικής έκφρασης ποδοσίνης σε σχέση με ζώα ίδιας ηλικίας με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ που δεν έλαβαν θεραπεία. Αντίστοιχα με τη νεφρίνη τα επίπεδα της ποδοσίνης συσχετίστηκαν αντίστροφα με την ιστολογική κατάταξη της ΝΛ (ρ= -0,62, p<0,001). Η νεφρίνη περαιτέρω εκτιμήθηκε με ανοσοφθορισμό νεφρικών ιστών των NZB/W ποντικών. Σύμφωνα και με τα αποτελέσματα των western blot η ένταση της χρώσης της νεφρίνης αυξήθηκε στα ζώα με θεραπεία, ενώ στα μη θεραπευμένα ζώα με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ 6 μηνών ήταν μειωμένη και εντελώς απούσα στα ζώα ηλικίας 9 μηνών. Επιπλέον η ένταση της χρώσης της νεφρίνης συσχετίστηκε με την ιστολογική τάξη (ρ=0,55, p=0,008) και με την western blot (ρ= 0,71, p=0,004). Για να καταδειχθεί αν η έκφραση των πρωτεϊνών σχετίζεται με μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων προσδιορίσθηκε το mRNA νεφρίνης των θεραπευμένων ποντικών για 3-6 μήνες και ήταν σημαντικά αυξημένο σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0,05 για την ομάδα των κορτικοειδών και p<0,01 για την ομάδα της κυκλοφωσφαμίδης). Το mRNA της ποδοσίνης ήταν αυξημένο ήδη από τους 3 μήνες θεραπείας αλλά στατιστικά σημαντικά μόνο μετά από 6 μήνες θεραπείας. Παρατηρήθηκε επίσης συσχέτιση μεταξύ του mRNA της νεφρίνης και της ποδοσίνης και στους μάρτυρες (ρ=0.67, p=0.005, n = 16) αλλά και στα θεραπευμένα ζώα (ρ=0.72, p=0.002, n = 16). Έπειτα προσδιορίσθηκαν πιθανές συσχετίσεις των ευρημάτων του ηλεκτρονικού με την έκφραση των πρωτεϊνών. Πράγματι, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση των εναποθέσεων με τη νεφρίνη (ρ από -0.75 ως -0.85, p<0,013) και την ποδοσίνη (ρ από -0.88 ως -0.93, p<0,013). Ομοίως η εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων συσχετίστηκε αρνητικά και με τη νεφρίνη (ρ = -0.77, p = 0.009) και με την ποδοσίνη (ρ= -0.93, p<0,001). Σχετικά με τα επίπεδα mRNA οι εναποθέσεις κάθε τύπου και η εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων είχαν αρνητική συσχέτιση με τη νεφρίνη, αλλά όχι με την ποδοσίνη. Επίσης εξετάστηκε η έκφραση των πρωτεϊνών των ΛΜ καθώς και τα επίπεδα mRNA στα θεραπευμένα ζώα σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες, αλλά και με τα προγονικά στελέχη τους. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την επίδραση της πρώιμης θεραπείας της ΝΛ στις κύριες πρωτεϊνες των ΛΜ των ποδοκυττάρων. Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη εμπόδισε την ανάπτυξη πρωτεϊνουρίας, αλλά και τις ιστολογικές αλλοιώσεις τόσο με το φωτονικό, όσο και με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όπου μειώθηκαν οι κάθε τύπου ανοσοεναποθέσεις και διατηρήθηκε η δομή των ποδοκυττάρων. Η σπειραματική έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης αυξήθηκαν σημαντικά στα ζώα με θεραπεία ως το επίπεδο των φυσιολογικών μαρτύρων, ενώ το ίδιο επιβεβαίωσε για τη νεφρίνη η μελέτη με ανοσοφθορισμό. Τα παραπάνω ευρήματα σε συνδυασμό με την αύξηση των επιπέδων mRNA των πρωτεϊνών κυρίως στη μεγαλύτερη διάρκεια θεραπείας πιθανά υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στις ΛΜ συμβαίνουν πρώτα σε επίπεδο πρωτεϊνης και ακολούθως σε επίπεδο μεταγραφής της. Τα παραπάνω επιβεβαιώνονται και από την συσχέτιση των πρωτεϊνών με τα ιστολογικά ευρήματα. Η ποδοκυττοπάθεια πιθανά οφείλεται σε ανοσολογικούς μηχανισμούς όπου εμπλέκονται στοιχεία της φυσικής, αλλά και της επίκτητης ανοσίας (CD8+ T-κύτταρα, αντι-DNA αντισώματα, συνδιεγερτικά μόρια όπως το Β7-1 και οι υποδοχείς TLR). Η ανοσοκατασταλτική θεραπεία που χρησιμοποιήθηκε πέρα από την επίδραση στο ανοσολογικό σύστημα πιθανά επιδρά άμεσα στη δομή και λειτουργία των ποδοκυττάρων. Τα αποτελέσματά μας τονίζουν περαιτέρω το ρόλο των ποδοκυττάρων και των πρωτεϊνών των ΛΜ σε ανοσολογικής αρχής σπειραματονεφρίτιδες και αναδεικνύουν τα πιθανά οφέλη της ανάπτυξης εκλεκτικών, προστατευτικών για τα ποδοκύτταρα θεραπειών.