Δείκτες χρόνιας έκθεσης στους οργανοφωσφορικούς εστέρες
Authors: Μαραυγάκης Γεώργιος 
Published: September 2021

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στην εκτίμηση της χρόνιας υπό-τοξικής έκθεσης πειραματόζωων στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Diazinon {O,O-diethyl-O-[4-methyl-6-propan-2-yl)]pyrimidin-2-yl phosphorothioate} και Chlorpyrifos-ethyl {O,O-diethyl-O-[3,5,6-trichloro-pyridin-2-yl]phosphorothioate} μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων των μη ειδικών μεταβολιτών τους στην τρίχα. Διερευνήθηκε η σχέση του επιπέδου των δόσεων και της διάρκειας της έκθεσης με την συσσώρευση των μη ειδικών μεταβολιτών DEP και DETP στην τρίχα και αξιολογήθηκε ο ρόλος τους ως βίο-δεικτών (biomarkers) της χρόνιας και παρελθοντικής έκθεσης. Μετρήθηκαν τα επίπεδα των Diazinon, Chlorpyrifos-ethyl και Propoxur σε καρδιακούς ιστούς εκτεθειμένων κουνελιών και διερευνήθηκε η καρδιοτοξική τους δράση. Τέλος, εκτιμήθηκε η επίδραση τους στο φορτίο του οξειδωτικού στρες στο μυοκαρδιακό ιστό και η ικανότητα πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών στο DNA των μυοκυττάρων. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει πέντε ενότητες.Η πρώτη ενότητα αναφέρεται στον σχεδιασμό του ερευνητικού πρωτοκόλλου της μελέτης έκθεσης στα Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl. Για τη διεξαγωγή του πειράματος επιλέχτηκαν δώδεκα κουνέλια τα οποία οργανώθηκαν σε τέσσερις ομάδες (treatment groups) των τριών ζώων. Η διάρκεια έκθεσης στο Diazinon ήταν τέσσερις μήνες και στο Chlorpyrifos-ethyl τρεις μήνες. Επιλέχτηκαν χαμηλές δόσεις με σκοπό να προσομοιαστεί η διαδικασία με την χρόνια υπότοξική έκθεση επαγγελματικού και γενικού πληθυσμού. Οι δόσεις του Diazinon διαμορφώθηκαν στα 3.0 mg/day/kg και 6.0 mg/day/kg και χορηγήθηκε μια σταθερή δόση του οργανοφωσφορικού φυτοφαρμάκου Clorpyrifos –ethyl (18.0 mg /day /kg).Η δεύτερη ενότητα περιλαμβάνει τη διαδικασία συλλογής και επεξεργασίας των υπό ανάλυση δειγμάτων τρίχας. Κατά τη διάρκεια της in vivo πειραματικής διαδικασίας, συλλέχτηκαν δείγματα τριχών από τα πειραματόζωα στα οποία μετρήθηκαν τα επίπεδα των μεταβολιτών των χορηγούμενων φυτοφαρμάκων με σκοπό την εκτίμηση της χρόνιας συσσωρευτικής έκθεσης. Δείγματα συλλέχτηκαν στο τέλος κάθε μήνα καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στις ομάδες που εκτέθηκαν στο Diazinon συλλέχτηκαν επίσης δείγματα επτά μήνες μετά το πέρας της τελευταίας δόσης.Στην επόμενη ενότητα, διερευνώνται οι συνθήκες ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισμού των μη ειδικών (non-specific) μεταβολιτών των εντομοκτόνων Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl στο στέλεχος της τρίχας. Συγκεκριμένα, μετρήθηκαν τα επίπεδα των diethyl-thiophosphate (DETP) και diethyl-lphosphate (DEP), στο σύνολο των πειραματόζωων, ανά μήνα έκθεσης, με αναλυτικές τεχνικές όπως η αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (Gas Chromatography-Μass Spectrometry) μετά από στερεά–υγρή επεξεργασία (solid-liquid extraction) των δειγμάτων.Κατά την εκχύλιση των μεταβολιτών από την τρίχα διερευνήθηκαν παράμετροι όπως ο χρόνος εκχύλισης των αναλυτών από την ομογενοποιημένη τρίχα στους υπερήχους (sonication), η θερμοκρασία και ο βέλτιστος διαλύτης εκχύλισης συναρτήσει της πολικότητας των αναλυτών DEP και DETP. Οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν στο 85% και στο 108% για το DEP και DETP αντίστοιχα.Για την ανάλυση απαιτήθηκε παραγωγοποίηση (derivatization) των αναλυτών με 2,3,4,5,6 πεντα-φθορο-βενζυλο-βρωμίδιο και διερευνήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες αυτής. Το όριο ποσοτικοποίησης της ανάλυσης (LOQ) υπολογίστηκε στα 15 pg/mg για το DEP και στα 37 pg/mg για το DETP. Οι χρόνοι κατακράτησης (Rt) των προς ανάλυση μεταβολιτών DEP και DETP ήταν 18.66 min και 22.08 min αντίστοιχα.Η επόμενη ενότητα αναφέρεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης τριχών των πειραματόζωων που εκτέθηκαν στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl. Η ανάλυση των τριχών που συλλέχτηκαν από τα group των πειραματόζωων έδειξε ότι τα προϊόντα μεταβολισμού των Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl ανιχνεύονται στο συγκεκριμένο βιολογικό υλικό. Αποδεικνύεται ότι η τρίχα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν αξιόπιστο βιολογικό υπόστρωμα για την εκτίμηση της επιβάρυνσης σε φυτοφάρμακα. Η ανίχνευση επιπέδων των DEP και DETP επτά μήνες μετά την τελευταία χορήγηση δόσης καθιστά την ανάλυση τρίχας χρήσιμο εργαλείο για την εκτίμηση της παρελθοντικής έκθεσης μέσω της μέτρησης των επιπέδων των συσσωρευμένων μεταβολιτών. Η πειραματική μελέτη έδειξε ακόμα ότι το επίπεδο της δόσης του φυτοφαρμάκου επηρεάζει τα ανιχνευόμενα επίπεδα των μεταβολιτών. Στην περίπτωση του DEP η σχέση ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.047) ενώ για το DETP υπήρχε σχετική τάση (p=0.095). Διαπιστώθηκε ότι το DETP ανιχνεύεται στην τρίχα σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με το DEP γεγονός που αποδίδεται στο μοτίβο του μεταβολισμού των μητρικών ουσιών αλλά και στις διαφορές στη λιποφιλικότητα και στη βασικότητα μεταξύ των μεταβολιτών που επηρεάζουν τον βαθμό ενσωμάτωσης στη τρίχα.Στην τελευταία ενόητητα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μελέτης που είχε σκοπό να εκτιμήσει την επίδραση των Diazinon, Chlorpyrifos-ethyl και Propoxur στην καρδιακή λειτουργία μετά από μακροχρόνια έκθεση σε υποτοξικές δόσεις. Μελετήθηκαν οι ιστολογικές αλλοιώσεις του μυοκαρδίου, οι παράμετροι του οξειδωτικού στρες και οι τροποποιήσεις στο DNA του καρδιακού ιστού. Στο πειραματικό πρωτόκολλο, τα πειραματόζωα χωριστήκαν σε ομάδες των δύο μελών και σχηματίστηκαν τέσσερα group. Στο πρώτο χορηγήθηκαν δύο δόσεις του οργανοφωσφορικού εστέρα Diazinon, οι οποίες ήταν 2.6 και 5.2 mg/kg/day. Στο δεύτερο group χορηγήθηκαν δύο δόσεις του οργανοφωσφορικού εστέρα Chlorpyrifos-ethyl οι οποίες ήταν 8.7 και 18 mg/ kg/ day. Το τρίτο group εκτέθηκε στο καρβαμιδικό φυτοφάρμακο Propoxur σε δόσεις 8.8 και 17.5 mg/kg/day. Ο σχεδιασμός του in vivo πειραματικού σχήματος περιελάμβανε δύο περιόδους χορήγησης των φυτοφαρμάκων διάρκειας 90 και 30 ημερών ανάμεσα στις οποίες μεσολάβησαν επτά μήνες κατά τους οποίους δεν χορηγήθηκαν ουσίες στα πειραματόζωα. Μετά τη θανάτωση των ζώων, συλλέχτηκαν καρδιακοί ιστοί και ολικό αίμα.Η μελέτη ανέδειξε την καρδιοτοξική επίδραση των υπό μελέτη φυτοφαρμάκων. Παρατηρήθηκε τάση για αύξηση του καρδιακού ρυθμού, εξασθένηση της συστολικής και διαστολικής λειτουργίας καθώς και μείωση της μάζας του μυοκαρδίου. Στα ιστό-παθολογικά ευρήματα περιλαμβάνονταν επιπτώσεις όπως η ίνωση και η αιμορραγική διήθηση. Η αξιολόγηση δεικτών όπως η ενεργότητα της τελομεράσης, η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα, η ενεργότητα της καταλάσης και τα επίπεδα των TBARS κατέδειξε ότι όλα τα παρασιτοκτόνα που μελετήθηκαν προκαλούν οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον ενώ ταυτόχρονα επιφέρουν οξειδωτικές αλλοιώσεις στο DNA των εκτεθειμένων κουνελιών.