Μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας των βακτηρίων τεχνητής λίμνης
Authors: Λυμπεροπούλου Δέσποινα 
Published: August 2021

Η παροχή ασφαλούς πόσιμου νερού είναι μία από τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουν οι περισσότερες χώρες, ως αποτέλεσμα του αυξανόμενου πληθυσμού και της βιομηχανοποίησης. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση, το 20% των επιφανειακών υδάτων απειλείται από ρύπανση και υποβάθμιση, ενώ παράλληλα η ζήτηση σε νερό υπερβαίνει τους διαθέσιμους υδάτινους πόρους. Η μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας του περιβάλλοντος του γλυκού νερού αποτελεί προϋπόθεση για τη διαχείρισή του. Η διαχείριση αυτή συνίσταται στον έλεγχο της ποιότητάς του και σχετίζεται με τη δημόσια υγεία, άρα αφορά τελικά άμεσα την ίδια την κοινωνία. Επιπρόσθετα, η υποβάθμιση των περισσότερων υδάτινων συστημάτων, συμπεριλαμβανομένων των λιμνών και των ταμιευτήρων, εξαιτίας κυρίως ανθρωπογενών παρεμβάσεων, αποτελεί τεράστιο οικολογικό ζήτημα που ελκύει έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον, θέτοντας επιπρόσθετες ανησυχίες ως προς την καταλληλότητά του νερού για ανθρώπινη κατανάλωση. Στην παρούσα μελέτη, ο πρωταρχικός στόχος ήταν η καταγραφή της μικροβιακής ποικιλότητας (καλλιεργήσιμοί και μη βακτηρίων) στον ταμιευτήρα πόσιμου νερού της Λίμνης του Μαραθώνα και της εποχιακής διακύμανσης των πληθυσμών των βακτηρίων, με τη μέθοδο της κλωνοποίησης και της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα ακρυλαμίδης παρουσία αποδιατακτικού παράγοντα (DGGE), με στόχο την ανάλυση και την εκτίμηση του πιθανού κινδύνου, σε επίπεδο χρονικό και τοπικό. Η παρακολούθηση του μικροβιακού δυναμικού του ταμιευτήρα αποτελεί προϋπόθεση για την πρόληψη κινδύνων και την ανάπτυξη νέων μεθόδων απομόνωσης μικροοργανισμών. Δεδομένου μάλιστα του περιορισμού, ως προς το εύρος των ελεγχόμενων μικροοργανισμών, που επιτρέπουν οι καθιερωμένες τεχνικές, η αναγκαιότητα αυτή κρίνεται επιτακτική. Η προσέγγιση που ακολουθείται τα τελευταία 100 χρόνια σε ελέγχους ρουτίνας του πόσιμου νερού είναι η ανίχνευση της ομάδας των κολίμορφων βακτηρίων και του βακτηρίου E. coli, τα οποία αποτελούν τους κύριους μικροβιακούς δείκτες. Η παρούσα μελέτη περιέλαβε τόσο τον έλεγχο των κλασσικών τεχνικών καλλιέργειας σε εκλεκτικά και διαγνωστικά θρεπτικά υποστρώματα, όσο και την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδων ανεξάρτητων της καλλιέργειας των μικροοργανισμών, όπως : α) PCR για την ανίχνευση του βακτηρίου E.coli, των ολικών κολίμορφων, του Enterococcus sp., του βακτηρίου Salmonella sp., β) Επιτόπιος Φθορίζων Υβριδισμός (FISH) για το γρήγορο προσδιορισμό διαφόρων μικροβιακών ομάδων και γ) σύγκριση των καθιερωμένων κλασσικών (ζύμωση σε δοκιμαστικούς σωλήνες, τεχνική ηθμομεμβράνης) και βιοχημικών μεθόδων (δραστηριότητα β-D-γαλακτοζιδάσης και β-D- γλουκουρονιδάσης) μεταξύ τους. Από τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας προέκυψε ότι ο ταμιευτήρας του Μαραθώνα έχει ένα σταθερό ως προς την ποικιλότητα μικροβιακό δυναμικό σε κάθε υπό εξέταση θέση - διαφορετικό σε υψηλό βαθμό μεταξύ αυτών των θέσεων τόσο ως προς την ποικιλότητα όσο και ως προς την αφθονία. Η κυριότερη βακτηριακή ομάδα που φάνηκε να επικρατεί, όπως προκύπτει από τα πειράματα κλωνοποίησης, ήταν αυτή των Actinobacteria. Ως προς τα Proteobacteria φαίνεται να υπάρχει μία ομοιόμορφη κατανομή των βακτηρίων της λίμνης στις ομάδες των α- και β-Proteobacteria και λιγότερο σε αυτή των γ- Proteobacteria, αντιπρόσωποι της οποίας ανακύπτουν συνηθέστερα όταν εφαρμόζονται οι κλασσικές μέθοδοι καλλιέργειας. Εξίσου σημαντική ομάδα φαίνεται να είναι και αυτή των Bacteroidetes, ενώ επίσης ανέκυψαν και αντιπρόσωποι των Acidobacteria, των Chloroflexi και της σχετικά πρόσφατα χαρακτηρισμένης ομάδας των Verrucomicrobia. Ένα εξίσου σημαντικό εύρημα ήταν η παρουσία κυανοβακτηριακών κλώνων χρονικά και τοπικά σταθερών, σε όλο το εύρος της λίμνης, μεταξύ των οποίων και κάποιοι δυνητικά τοξικοί κλώνοι του γένους Microcystis. Γενικότερα, το περιεχόμενο της λίμνης σε κυανοβακτήρια φαίνεται να έχει κύρια και άμεση σχέση με το χρόνο παραμονής του νερού στη φραγμαλίμνη (retention time). Ως προς την εφαρμογή της κλασσικής μεθοδολογίας καλλιεργειών σε δείγματα νερού για την εκτίμηση της μικροβιακής επιβάρυνσης του νερού στον ταμιευτήρα, αυτή παρουσίασε μειονεκτήματα, όπως είναι η έλλειψη εξειδίκευσης στην ανάκτηση συγκεκριμένων παθογόνων, ο περιορισμένος αριθμός εκλεκτικών υποστρωμάτων καλλιέργειας και τα σχετικά υψηλά όρια ανίχνευσης μικροοργανισμών. Σημαντικό ωστόσο εύρημα αποτελεί η επιβεβαίωση της υπόθεσης ότι οι εντερόκοκκοι φαίνεται να συσχετίζονται καλύτερα με συμβάντα γαστροεντερικών ασθενειών και πιθανόν να αποτελούν καλύτερους δείκτες της κοπρανώδους μόλυνσης στο νερό από ότι το βακτήριο E. coli και κυρίως από τα κολίμορφα βακτήρια. Ως εκ τούτου, οι εντερόκοκκοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν τουλάχιστον συμπληρωματικά στους ελέγχους ρουτίνας. Ωστόσο, αν και η κλασική μεθοδολογία παρουσιάζει κάποια μειονεκτήματα, οι μοριακές τεχνικές απαιτούν περαιτέρω βελτιστοποίηση. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή PCR απευθείας σε δείγματα νερού είναι δυνατό να οδηγήσει σε ψευδή θετικά αποτελέσματα, είτε λόγω πολύ χαμηλής συγκέντρωσης της υπό ανίχνευσης ομάδας είτε λόγω της διακριτικής ικανότητας της μεθόδου. Επιπρόσθετα, τα ψευδή αυτά αποτελέσματα συχνά αποδίδονται και στη μειωμένη εξειδίκευση των εκκινητικών μορίων που χρησιμοποιούνται και που αποσκοπούν στο να διακρίνουν μεταξύ πολύ στενά συγγενικών βακτηρίων (π.χ. κολίμορφα και E. coli). Τέλος, η τεχνική FISH μπορεί να δώσει αξιόπιστα και επιπρόσθετα της PCR και ποσοτικά αποτελέσματα. Ωστόσο, παρουσιάζει και αυτή προβλήματα που σχετίζονται με τα υψηλά όρια ανίχνευσής της, καθώς και με το χρόνο κατεργασίας των δειγμάτων, ο οποίος δεν είναι λιγότερος από εκείνον που απαιτείται για μία απλή αντίδραση PCR, ειδικά όταν και στην περίπτωση αυτή πρέπει να εφαρμοστούν καλλιέργειες εμπλουτισμού των συνήθως φτωχών σε συγκεκριμένα βακτήρια (π.χ. Salmonella sp.) δειγμάτων νερού.