Μηχανισμοί αντοχής πολυανθεκτικών στελεχών klebsiella pneumoniae σε τριτοβάθμιο ελληνικό νοσοκομείο
Authors: Ζάρρας Χαράλαμπος 
Published: August 2023

Εισαγωγή: Η παρατηρούμενη εξάπλωση πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένης της Klebsiella pneumoniae, αποτελεί παγκόσμια απειλή για τη Δημόσια Υγεία. Το πρόβλημα είναι μεγαλύτερο στους νοσηλευόμενους ασθενείς, ιδιαίτερα σε αυτούς που βρίσκονται στις μονάδες εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ). Σύμφωνα με την τελευταία έκθεση του Ευρωπαϊκού Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (European Center for Disease Control and Prevention-ECDC) για το 2021, η Ελλάδα ήταν η χώρα με το υψηλότερο ποσοστό (73,7%) ανθεκτικών στην καρβαπενέμη στελεχών K. pneumoniae (CRKP). Ο πιο συχνός μηχανισμός επίκτητης αντοχής στις καρβαπενέμες είναι μέσω της παραγωγής καρβαπεμενασών, ιδιαίτερα της καρβαπενεμάσης K. pneumoniae (KPC), της μεταλλο-β-λακταμάσης Νέου Δελχί (NDM), μεταλλο-β-λακταμάσης Verona Integron-Borne (VIM), ιμιπενεμάσης (IMP) και οξακιλλινάσης-48 (OXA-48). Η παθογονικότητηα αυτών των στελεχών καθορίζεται από διάφορους λοιμογόνους παράγοντες, όπως τον λιποπολυσακχαρίτη της κάψας, τις φίμπριες, τις πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης και τα συστήματα απόκτησης σιδήρου. Η εφαρμογή της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing-NGS) αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για τη λήψη αλληλουχιών ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole-Genome Sequencing-WGS) των βακτηρίων, δίνοντας τη δυνατότητα για τον πλήρη γενετικό χαρακτηρισμό των στελεχών και την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ αυτών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο γενετικός χαρακτηρισμός πολυανθεκτικών στελεχών K. pneumoniae απομονωθέντων από ασθενείς των ΜΕΘ τριτοβάθμιου νοσοκομείου και η ταυτοποίηση των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά, και κυρίως στις καρβαπενέμες.Υλικό και μέθοδοι: Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 150 στελέχη CRKP που συλλέχθηκαν από τον Ιούνιο του 2018 έως τον Ιούλιο του 2021 από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ ενηλίκων (116 στελέχη, 77,4%), την παιδιατρική ΜΕΘ (17 στελέχη, 11,3%) και τις δύο ΜΕΘ νεογνών (17 στελέχη, 11,3%) του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Η διάμεση ηλικία των παιδιατρικών ασθενών ήταν 2 έτη (εύρος 14 ημερών–18 ετών) και εκείνη των ενηλίκων ασθενών 66 έτη (εύρος 19–92 ετών). Εκτός των φαινοτυπικών μεθόδων, εφαρμόστηκε μία πολυπλεκτική PCR για την ανίχνευση των γονιδίων αντοχής στις καρβαπενέμες blaKPC, blaNDM, blaIMP και τύπου blaOXA-48. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε με την προσθήκη εκκινητών για την ανίχνευση και του γονιδίου blaVIM-1. Πραγματοποιήθηκε περιγραφική και συμπερασματική στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο SPSS v. 22.0. Σε 24 αντιπροσωπευτικά στελέχη CRKP εφαρμόστηκε η μέθοδος NGS για τη λήψη αλληλουχιών ολόκληρου του γονιδιώματος των στελεχών και τον πλήρη γενετικό χαρακτηρισμό τους. Από αυτά, τα 18 επιλέχθηκαν από τα 150 στελέχη της συνολικής μελέτης (ώστε να περιλαμβάνονται στελέχη από όλα τα έτη και από όλους τους τύπους καρβαπενεμάσης), ενώ περιελήφθησαν 6 επιπλέον στελέχη που συλλέχτηκαν από τον Δεκέμβριο 2021 μέχρι τον Ιούνιο του 2022, διότι τα στελέχη αυτά απομονώθηκαν από ασθενείς με σηψαιμία και παρουσίαζαν κλινικό ενδιαφέρον. Η διάμεση ηλικία των ενηλίκων ασθενών ήταν 57,5 έτη (εύρος 30–88), ενώ η διάμεση ηλικία των παιδιών ήταν 6,2 έτη (εύρος 0,25–17). Οι τύποι αλληλουχίας (ST), τα πλασμίδια, τα γονίδια που σχετίζονται με τα ρυθμιστικά συστήματα και αντλιών εκροής, καθώς και τα γονίδια μικροβιακής αντοχής ταυτοποιήθηκαν με διάφορα λογισμικά πακέτα. Για τη φυλογενετική ανάλυση βασισμένη σε σημειακούς πολυμορφισμούς του γονιδιώματος του πυρήνα (core genome single nucleotide polymorphism, cgSNP) των στελεχών, και για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου εφαρμόστηκαν προγράμματα βιοπληροφορικής (BRIG και REALPHY).Αποτελέσματα: Με την εφαρμογή της πολυπλεκτικής PCR βρέθηκε ότι οι συχνότερες καρβαπενεμάσες ήταν οι KPC και NDM (37,3 και 36,0%, αντίστοιχα) με αποτελέσματα ταυτόσημα με αυτά της ανοσοδοκιμασίας. Το γονίδιο blaNDM ανιχνεύθηκε κυρίως σε ενήλικες (54/116, 46,9%), ενώ σε νεογνά και παιδιά το πιο συχνό γονίδιο ήταν το blaKPC (24/34, 70,6%). Ο κύριος μηχανισμός αντοχής στις καρβαπενέμες κατά την περίοδο 2018-2019 ήταν η παραγωγή KPC μόνη της ή σε συνδυασμό με VIM, ενώ σημαντική επικράτηση της παραγωγής NDM παρατηρήθηκε κατά την περίοδο 2020-2021 (p <0,001). Ο επιπολασμός των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στις β-λακτάμες ήταν 100%, στις αμινογλυκοσίδες 79,2%, στις κινολόνες 95,8%, στη φωσφομυκίνη και την τιγεκυκλίνη 33,3% και στην κοτριμοξαζόλη 87,5%. Το πιο διαδεδομένο πλασμίδιο ήταν το IncF, το οποίο σχετίζεται με την εξάπλωση αρκετών γονιδίων β-λακταμάσης εκτεταμένου φάσματος (ESBL) ή καρβαπενεμασών, και ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη CRKP. Επιπλέον πλασμίδια (όπως Col και IncC), βρέθηκαν σε δεκαπέντε στελέχη. Οι παράγοντες λοιμογόνου δράσης που ανιχνεύθηκαν περιλάμβαναν γονίδια που κωδικοποιούν φίμπριες (του συμπλέγματος mrk για φίμπριες τύπου 3), γονίδια για την yersiniabactin (ybt, irp και fyuA), γονίδια που κωδικοποιούν το σιδεροφόρο αεροβακτίνη (iut) και γονίδιο kfu που είναι ρυθμιστής του συστήματος μεταφοράς σιδήρου. Γονίδια που κωδικοποιούν την αντλία εκροής AcrAB (acr, mar, sox, rob, ram, sdiA, fis και envR) ή την αντλία εκροής OqxAB (oqx και rar) ανιχνεύτηκαν σε όλα τα στελέχη. Τα 24 στελέχη CRKP ανήκαν σε οκτώ διαφορετικούς τύπους αλληλουχιών (ST): ST11 (7, 29.1%), ST39 (7, 29.1%), ST323 (3, 12.5%), ST15 (7, 29.1%), ST307 (1, 4.2%), ST30 (1, 4.2%), ST512 (1, 4.2%) και ST35 (1, 4.2%). Δημιουργήθηκαν κυκλικοί χάρτες γονιδιώματος του πυρήνα για τους τέσσερις πιο συχνούς τύπους ST (ST11, ST39, ST323 και ST15). Κατόπιν κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση τους πολυμορφισμούς του γονιδίωματος του πυρήνα των στελεχών της μελέτης σε σχέση με το στέλεχος αναφοράς. Να σημειωθεί ότι με την εφαρμογή NGS αναγνωρίστηκε η πρώτη περίπτωση νεογνικής σήψης οφειλόμενης σε στέλεχος K. pneumoniae ανθεκτικού στο CAZ/AVI που παρήγαγε KPC-2 και VEB-25, γεγονός που οδήγησε σε εφαρμογή προσαρμοσμένου προγράμματος ενεργούς επιτήρησης σε συνδυασμό με μέτρα ελέγχου λοιμώξεων στο Νοσοκομείο.Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη παρέχει πληροφορίες για τον γενετικό χαρακτηρισμό στελεχών CRKP που κυκλοφόρησαν στις ΜΕΘ ενός ελληνικού τριτοβάθμιου νοσοκομείου κατά τη διάρκεια του διδακτορικού, συμπεριλαμβανομένων των μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά, και ιδιαίτερα στις καρβαπενέμες. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι ορισμένα στελέχη παρουσίαζαν επιδημιολογική συσχέτιση. Δεδομένου ότι η τεχνική NGS έχει γίνει πλέον αρκετά προσιτή, η εφαρμογή της σε νοσοκομειακό περιβάλλον είναι εξαιρετικά χρήσιμη, καθώς τα γενετικά δεδομένα που λαμβάνονται, σε συνδυασμό με τη χρονική και χωρική κλωνική κατανομή των στελεχών, μπορούν να καθοδηγήσουν τον σχεδιασμό έγκαιρων και δραστικών μέτρων ελέγχου των λοιμώξεων για την καταπολέμηση της εξάπλωσης πολυανθεκτικών βακτηρίων.