Τοξικολογικοί δείκτες μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης
Authors: Βελιβάση Γλυκερία 
Published: November 2022

Η αιθανόλη είναι το βασικό δραστικό συστατικό των αλκοολούχων ποτών και αποτελεί την ευρύτερη νομίμως χρησιμοποιούμενη «ευφοριστική» τοξική ουσία, που χαρακτηρίζεται μάλιστα και από εξαρτησιογόνο δράση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αιθανόλης στο αίμα από νεκροτομικό υλικό αποτελεί μέρος της διαδικασίας διερεύνησης των αιτίων θανάτου, δεδομένου ότι η αιθανόλη μπορεί να αποτελεί αιτιώδη παράγοντα που συνέβαλε στον μηχανισμό του θανάτου ενός συγκεκριμένου περιστατικού. Καθίσταται προφανές ότι αν υπάρχει υποψία μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης ή αν η προέλευση της προσδιορισθείσας αιθανόλης σε νεκροτομικό υλικό τίθεται υπό αμφισβήτηση (κατάποση «εν ζωή» ή μεταθανάτια μικροβιακή παραγωγή), η ακριβής επιστημονική ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης αιθανόλης αποτελεί πρόβλημα κεφαλαιώδους σπουδαιότητας στην Δικαστική Τοξικολογία. Η αιθανόλη μπορεί να βιοσυντεθεί μεταθανάτια από πολλούς μικροοργανισμούς, από όλα τα διαθέσιμα υποστρώματα. Ταυτόχρονα με την αιθανόλη βιοσυντίθενται και άλλες πτητικές ενώσεις, οι λεγόμενες ανώτερες αλκοόλες (1-προπανόλη, 1-βουτανόλη, ισοβουτανόλη, 2-μεθυλο-1-βουτανόλη (d-αμυλική αλκοόλη) και 3-μεθυλο-1-βουτανόλη (ισοαμυλική αλκοόλη)). Σε προηγούμενες μελέτες της επιβλέπουσας της παρούσας διδακτορικής διατριβής, προτάθηκε η διαμόρφωση μαθηματικών μοντέλων για τον υπολογισμό της μικροβιακά παραγόμενης αιθανόλης σε καλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών Εscherichia coli, Clostridium perfringens, και Clostridium sporogenes στους 25°C σε συνάρτηση με τις συγκεντρώσεις των αλκοολών 1-προπανόλη, 1-βουτανόλη, ισοβουτανόλη και μεθυλο-βουτανόλη (άθροισμα d-αμυλικής και ισοαμυλικής αλκοόλης). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκαν υγρές αερόβιες/αναερόβιες και αυστηρά αναερόβιες καλλιέργειες, χωριστά, επιλεγμένων μικροβιακών στελεχών (των βακτηρίων Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis και του μύκητα Candida albicans) σε διάφορες θερμοκρασίες (37°C, 25°C και 4°C), με διαφορετικά καλλιεργητικά υλικά (Brain Heart Infusion, BHI (με ή χωρίς προσθήκη επιπλέον γλυκόζης) και Sabouraud Dextrose Broth, SDB), καθώς και αερόβιες/αναερόβιες και αυστηρά αναερόβιες μικροβιακές καλλιέργειες σε μετουσιωμένο ανθρώπινο φυσιολογικό αίμα στους 25°C, σε όξινες ή ουδέτερες συνθήκες pH, με ή χωρίς προσθήκη επιπλέον γλυκόζης. Οι συγκεντρώσεις της αιθανόλης, των ανώτερων αλκοολών και άλλων πτητικών συστατικών που υπάρχουν φυσιολογικά στο ανθρώπινο αίμα ή παράγονται μικροβιακά προσδιορίστηκαν, σε ημερήσια βάση, με αέρια χρωματογραφία υπερκείμενης φάσης και ανιχνευτή ιονισμού φλογός (head space-gas chromatography-flame ionization detector, HS-GC-FID). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μεθόδους πολυπαραμετρικής ανάλυσης (multiple linear regression) και η συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων των παραγόμενων αλκοολών στις μικροβιακές καλλιέργειες στους 25°C περιγράφηκαν από μαθηματικά μοντέλα. Η εφαρμοσιμότητα των εξαχθέντων μοντέλων ελέγχθηκε στις μικροβιακές καλλιέργειες στους 37°C, στις μικροβιακές καλλιέργειες μετουσιωμένου ανθρώπινου φυσιολογικού αίματος και σε βιολογικά υλικά από πραγματικά περιστατικά νεκροτομών. Η C. albicans παρήγαγε τις υψηλότερες συγκεντρώσεις αιθανόλης στους 25°C και στους 37°C, ακολουθούμενη από την K. pneumoniae, τον S. aureus και τον E. faecalis. Επίσης, παράχθηκαν ανώτερες αλκοόλες και άλλες πτητικές ενώσεις σε συγκεντρώσεις που ποίκιλαν ανάλογα με τις διαφορετικές μικροβιακές καλλιέργειες, τη θερμοκρασία και τη σύσταση των θρεπτικών υλικών. Στις βακτηριακές καλλιέργειες σε ανθρώπινο μετουσιωμένο αίμα, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις αιθανόλης παράχθηκαν από την K. pneumoniae μαζί με τον S. aureus και ακολούθως, τον E. faecalis. Οι συγκεντρώσεις αιθανόλης που παρήχθησαν από την C. albicans ήταν ανάλογες της συγκέντρωσης της προστιθέμενης γλυκόζης. Οι ανώτερες αλκοόλες δεν παράχθηκαν από όλες τις μικροβιακές καλλιέργειες σε μετουσιωμένο αίμα. Η 1-προπανόλη, η 1-βουτανόλη, η ισοβουτανόλη και η μεθυλο-βουτανόλη αποτελούν τόσο ποιοτικούς όσο και ποσοτικούς δείκτες της μικροβιακής παραγωγής αιθανόλης. Η 1-προπανόλη ήταν η πιο σημαντική αλκοόλη στη μοντελοποίηση της βακτηριακής παραγωγής αιθανόλης, ενώ η μεθυλο-βουτανόλη η πιο σημαντική αλκοόλη στη μοντελοποίηση της μυκητιακής παραγωγής αιθανόλης. Τα βακτηριακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε δείγματα βακτηριακών καλλιεργειών σε σχέση με τις μυκητιακές καλλιέργειες στους 37°C. Αντιστοίχως, τα μυκητιακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε δείγματα από καλλιέργειες της C. albicans. Τα μοντέλα των βακτηρίων εφαρμόστηκαν με μεγαλύτερη επιτυχία από τα μοντέλα των μυκήτων σε μικροβιακά δείγματα μετουσιωμένου φυσιολογικού αίματος. Αντιθέτως, τα μοντέλα της C. albicans εφαρμόστηκαν κυρίως σε δείγματα από καλλιέργειες μυκήτων σε ανθρώπινο μετουσιωμένο αίμα. Γενικά, τα μοντέλα της K. pneumoniae είχαν την καλύτερη εφαρμογή από όλα τα μικροβιακά μοντέλα, σε δείγματα αίματος από πραγματικά περιστατικά νεκροτομών. Ακολούθησε το μοντέλο του E. faecalis και εκείνα του S. aureus. Τα λιγότερα επιτυχημένα μοντέλα ήταν της C. albicans. Παρατηρήθηκε ότι τα βακτηριακά μοντέλα είχαν καλύτερη εφαρμογή σε μεταθανάτια δείγματα με συγκέντρωση αιθανόλης στο αίμα μεγαλύτερη από 0,50 g/L, σε περιστατικά απροσδιόριστου τρόπου θανάτου παρουσία σήψης. Συνολικά, τα βακτηριακά μοντέλα θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μεταθανάτια δείγματα ανεξάρτητα από τα μικρόβια που πιθανώς δραστηριοποιούνται στο δείγμα.