Μελέτη δικτύων πρωτεόστασης που εμπλέκονται στην καρκινογενεση ή/και τη γήρανση
Authors: Γιαννιού Δέσποινα 
Published: January 2024

Οι οργανισμοί εκτίθενται συνεχώς σε στρεσογόνους παράγοντες και, ως εκ τούτου, είναι απαραίτητη η διασφάλιση της ακεραιότητας (μεταξύ άλλων) τόσο του γονιδιώματος όσο και του πρωτεώματος. Ειδικότερα, προκειμένου να διατηρηθεί η λειτουργικότητα του πρωτεώματος, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει το δίκτυο πρωτεόστασης. Βασικά στοιχεία του δικτύου αυτού, μεταξύ άλλων, είναι τα πρωτεολυτικά μονοπάτια του κυττάρου ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (Ubiquitin-Proteasome system, UPS) και αυτοφαγίας-λυσοσώματος (Autophagy-Lysosome system, ALS), το σηματοδοτικό μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης NRF2 (Nuclear factor -erythroid derived 2-like 2, NFE2L2)/ KEAP1(Kelch-like ECH-associated protein 1) καθώς και το δίκτυο μοριακών συνοδών. Παρόλα αυτά, με την πάροδο του χρόνου οι πρωτεϊνικές μηχανές και τα συστήματα ελέγχου του κυττάρου αρχίζουν να απορρυθμίζονται και να δυσλειτουργούν εξαιτίας της συσσώρευσης βλαβών, οδηγώντας έτσι στην εμφάνιση του γήρατος και διαφόρων ηλικιο-εξαρτώμενων ασθενειών όπως είναι ο καρκίνος, ο διαβήτης, οι καρδιαγγειακές διαταραχές και οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις. Δεδομένου ότι, όπως έχουν δείξει μελέτες του εργαστηρίου μας και άλλων, η πρωτεωμική αστάθεια θεωρείται σημαντικό ορόσημο της γήρανσης και της καρκινογένεσης, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανάλυση του λειτουργικού ρόλου βασικών ρυθμιστών του δικτύου πρωτεόστασης και μονοπατιών αντιοξειδωτικής απόκρισης κατά την καρκινογένεση με στόχο την ανάδειξη νέων καινοτόμων αντικαρκινικών προσεγγίσεων και βιοδεικτών με πιθανή διαγνωστική και προγνωστική αξία κατά την έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Αρχικά στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκε ο ρόλος του ενδογενώς παραγόμενου υδρόθειου στο δίκτυο πρωτεόστασης η λειτουργία του οποίου, όπως αναφέρθηκε, διαταράσσεται κατά τη καρκινογένεση. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκαν εμβρυικοί ινοβλάστες από ποντίκια στα οποία έχουν απαλειφθεί τα ένζυμα βιοσύνθεσης του υδρόθειου, γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) ή σουλφοτρανσφεράση του μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-MST), με στόχο τη μελέτη της επίδρασης των δύο ενζύμων στο δίκτυο πρωτεόστασης. Οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν ότι η δυσλειτουργεία βιοσύνθεσης του υδρόθειου οδηγεί σε διατάραξη του πρωτεοστατικού δικτύου καθώς διαπιστώθηκε μείωση της ενεργότητας των πρωτεολυτικών μονοπατιών και της αντιοξειδωτικής απόκρισης. Η προκαλούμενη διαταραχή του πρωτεοστατικού δικτύου (ορόσημο καρκινογένεσης) υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή του δικτύου βιοσύνθεσης του υδρόθειου στην καρκινογένεση η οποία δύναται να μελετηθεί περαιτέρω. Στο δεύτερο τμήμα της παρούσας διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η διαφορική απόκριση του δικτύου πρωτεόστασης μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων σε συνθήκες μειωμένης πρόσληψης θρεπτικών που προηγούνται της χημειοθεραπείας σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού. Σήμερα είναι διαθέσιμες διαφόρων ειδών θεραπείες έναντι των καρκινικών κυττάρων, οι οποίες όμως επιφέρουν αρκετών ειδών παρενέργειες, που οφείλονται στο γεγονός ότι δρουν και σε φυσιολογικά κύτταρα και δεν είναι αρκετά στοχευμένες. Η μειωμένη πρόσληψη αναπτυξιακών παραγόντων (θερμιδική στέρηση) έχει βρεθεί να έχει θετικό αντίκτυπο στη μη εμφάνιση καρκίνου. Επίσης φαίνεται να ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και να μειώνει τις ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός «νηστείας» και χημειοθεραπείας αύξησε τα ενδογενή επίπεδα ενεργών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) και μείωσε την αντιοξειδωτική απόκριση σε συνδυασμό με αύξηση της γενωμικής βλάβης στα καρκινικά κύτταρα ενώ αντίθετα δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στα φυσιολογικά κύτταρα. Ακόμη βρέθηκε ότι η αύξηση των ROS συνοδευόταν από μειωμένη μιτοχονδριακή λειτουργία και αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ ειδικά στα καρκινικά κύτταρα. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων του δικτύου πρωτεόστασης καθώς και miRNAs που εμπλέκονται στο πρωτεοστατικό δίκτυο σε βιοψίες ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Το ουρολογικό καρκίνωμα είναι ένας από τους πιο συχνούς τύπους καρκίνου παγκοσμίως και θεωρείται μία ασθένεια με μεγάλη ετερογένεια, όχι μόνο σε μοριακό επίπεδο εξαιτίας της συσσώρευσης πληθώρας γενετικών μεταλλαγών και επιγενετικών τροποποιήσεων που συμβαίνουν κατά την εξέλιξη της νόσου, αλλά και όσο αναφορά στην πρόγνωση και το αποτέλεσμα της θεραπείας. Όσον αναφορά στο πρώτο κομμάτι μελετήθηκε η διαφορική έκφραση των γονιδίων των μοριακών συνοδών μικρού μοριακού βάρους HSPB2 και HSPB3 ανάμεσα σε καρκινικό και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αρχικά παρατηρήθηκε αυξορρύθμιση σε μυοδιηθητικούς όγκους (T2–T4) έναντι επιφανειακών όγκων (TaT1), καθώς και σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας έναντι χαμηλού βαθμού κακοήθειας. Οι αναλύσεις σχετικά με την πορεία της ασθένειας έδειξαν το σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο για υποτροπή της νόσου μετά τη θεραπεία σε ασθενείς TaT1 που εκφράζουν μειωμένα επίπεδα HSPB2 και HSPB3. Το αποτέλεσμα αυτό αντιστρέφεται σε προχωρημένα στάδια της νόσου (μυοδιηθητοί όγκοι) υποδεικνύοντας τη διφασική επίδραση των γονιδίων HSPB2 και HSPB3 στην εξέλιξη της νόσου. Ο ρόλος των γονιδίων HSPB2 και HSPB3 στην επιβίωση ειδικά των καρκινικών κυττάρων προχωρημένου σταδίου φάνηκε και από πειράματα αποσιώπησή τους (siRNA) σε κύτταρα προχωρημένου σταδίου που οδήγησε σε αύξηση της χημειοευαισθησίας και μείωση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων. Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και από την μελέτη της έκφρασης ενός micro-RNA και ειδικότερα του mir-101 σε βιοψίες από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως όπου φάνηκε η διφασική έκφραση αλλά και επίδραση του στην καρκινογένεση. Χρησιμοποιώντας μοντέλα πολυσταδιακής καρκινογένεσης η οποία έχει προκληθεί είτε με γενετικό είτε με χημικό τρόπο αλλά και καρκινικές σειρές με αποσιωπημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια επιχειρήθηκε η ανάλυση του μηχανισμού δράσης του mir-101 και η σύνδεσή του με τη λειτουργία του πρωτεασώματος. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι πιθανότατα η δράση των ογκογονιδίων ενεργοποιεί το mir-101, του οποίου η έκφραση καταστέλλεται από τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p53/p21. Ακόμη, φάνηκε ότι η υπερέκφραση του mir-101 αυξάνει σημαντικά την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μειώνοντας παράλληλα το μεταναστευτικό τους δυναμικό. Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του δικτύου πρωτεόστασης στην καρκινογένεση. Αρχικά διαπιστώθηκε ότι το δίκτυο πρωτεόστασης διαταράσσεται από την ανεπάρκεια βιοσύνθεσης του αέριου διαβιβαστή υδρόθειου όπως και ότι συμβάλλει στη διαφορική ευαισθησία φυσιολογικών έναντι καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες συνδυαστικής χημειοθεραπείας με μειωμένη παροχή αναπτυξιακών παραγόντων («νηστεία»). Επίσης φάνηκε ότι αν και η ενεργοποίηση των πρωτεοστατικών δικτύων (proteostatic modules) προσφέρει προστατευτικό ρόλο έναντι της νόσου κατά τα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, σε προχωρημένα στάδια της νόσου πιθανόν συμβάλλει σημαντικά στην ενίσχυση των κακοηθών μεταστατικών φαινοτύπων. Τέλος σημαντικό εύρημα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η διαφορική έκφραση του mir-101 κατά τη καρκινογένεση και ο πιθανός μηχανισμός δράσης του.