Microbial production of poly(hydroxyalkanoates) and biorefinery development using by-product streams from sunflower-based biodiesel production processes
Authors: Καχριμανίδου Βασιλική 
Published: September 2021

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής έγκειται στην αξιοποίηση των αποβλήτων της διεργασίας παραγωγής βιοντίζελ με βάση τον ηλίανθο, και ειδικότερα το ηλιάλευρο (ή ηλιόπιτα) και την ακάθαρτη γλυκερόλη, ως ανανεώσιμες πρώτες ύλες για την ανάπτυξη βιο-διυλιστηρίου προς την παραγωγή πολυ-υδροξυαλκανοϊκών εστέρων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η χρησιμοποίηση του ηλιαλεύρου προς την παραγωγή ενός θρεπτικού υποστρώματος για μικροβιακές ζυμώσεις μέσω μιας βιοδιεργασίας δύο σταδίων. Το ηλιάλευρο χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα σε ζύμωση στερεάς κατάστασης για την παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων με το μυκητιακό στέλεχος Aspergillus oryzae. Εν συνεχεία, τα ζυμούμενα στερεά αναμίχθηκαν με ακατέργαστο ηλιάλευρο με απώτερο στόχο την παραγωγή ενός πλούσιου θρεπτικού υποστρώματος για μικροβιακές ζυμώσεις. Η υψηλότερη συγκέντρωση σε άζωτο ελεύθερων αμινομάδων και αμινοξέων (free amino nitrogen, FAN) και ανόργανου φωσφόρου που επετεύχθησαν ήταν 1.5 g/L και 246 mg/L, αντίστοιχα, εφαρμόζοντας αρχική πρωτεολυτική ενεργότητα 6.4 U/mL. Η συγκέντρωση του FAN αυξήθηκε σε 2.3 g/L στην περίπτωση κατά την οποία αυξήθηκε η αρχική πρωτεολυτική ενεργότητα σε 16 U/mL. Τα υδρολύματα του ηλιαλεύρου αναμίχθηκαν με την ακάθαρτη γλυκερόλη ώστε να προκύψει θρεπτικό μέσο ζύμωσης που αξιοποιήθηκε για την παραγωγή πολυ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB) χρησιμοποιώντας το βακτηριακό στέλεχος Cupriavidus necator DSM 7237. Οι ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου σε βιοαντιδραστήρα οδήγησαν στην παραγωγή 27 g/L PHB με ενδοκυτταρικό ποσοστό βιοπολυμερούς 72.9% (w/w), το οποίο βελτιώθηκε όταν εφαρμόστηκαν διαφορετικές στρατηγικές και σχεδιασμός στη βιοδιεργασία (32.6 g/L PHB). Η επίδραση του λεβουλινικού οξέος ως πρόδρομη ένωση για τη σύνθεση πολυ-(3-υδροξυβουτυρικού-co-3-υδροξυβαλερικού), P(3HB-co-3HV), αξιολογήθηκε κατά τη διάρκεια ζυμώσεων σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα. Η συνεχόμενη τροφοδοσία με λεβουλινικό οξύ συνετέλεσε στην παραγωγή έως και 23.4 g/L P(3HB-co-3HV) με ενδοκυτταρικό ποσοστό βιοπολυμερούς 66.4% (w/w) με το ποσοστό του 3HV να ισούται με 22.5 mol%. Εν συνεχεία, υπό το πρίσμα της παραγωγής μιας πληθώρας διαφορετικών τελικών προϊόντων στα πλαίσια του βιο-διυλιστηρίου, το ηλιάλευρο χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ενός κλάσματος πλούσιο σε αντιξειδωτικά, απομονωμένης πρωτεΐνης υψηλής καθαρότητας και θρεπτικών υποστρωμάτων για μικροβιακές ζυμώσεις. Τα αιθανολικά εκχυλίσματα του ηλιαλεύρου παρουσίασαν υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα σύμφωνα με τις μετρήσεις της μεθόδου DPPH•. Η απομονωμένη πρωτεΐνη που παρήχθησε έπειτα απο την επεξεργασία με αλκαλικά διαλύματα ακολοθούμενη απο όξινη κατακρήμνιση, χαρακτηρίστηκε απο καθαρότητα υψηλότερη από 95% (w/w). Τα εναπομείναντα υγρά και στερεά ρεύματα από το διαχωρισμό-κλασμάτωση του ηλιαλεύρου εφαρμόστηκαν σε διεργασία παραγωγής θρεπτικών υποστρωμάτων για μικροβιακές ζυμώσεις, μέσω της παραγωγής ακατέργαστων ενζύμων για την ενζυμική υδρόλυση των υπολοίπων ρευμάτων. Αντίστοιχα, τα πλούσια σε θρεπτικά υδρόλυματα αναμίχθηκαν με την ακατέργαστη γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα και εξιολογήθηκαν σε ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου για την παραγωγή 57 g/L PHB με εσωκυττάριο ποσοστό βιοπολυμερούς 86.2% (w/w), συνεπάγοντας συντελεστή μετατροπής ίσο με 0.47 g/g.Ακολούθως, με απώτερο σκόπο τη διεύρυνση της βιωσιμότητας του προτεινόμενου βιο-διυλιστηρίου, παρήχθησε μέσω ζύμωσης στερεάς κατάστασης με το μύκητα A. oryzae ένα εκχύλισμα ακατέργαστων ενζύμων, το οποίο εφαρμόστηκε στην ενζυμική λύση των κυττάρων του στελέχους C. necator, καθιστώντας δυνατή την ανάκτηση του ενδοκυτταρικού βιοπολυμερούς. Το υψηλότερο ποσοστό ενζυμικής λύσης των βακτηριακών κυττάρων επετεύχθη σε θερμοκρασία 48 °C και μη ελεγχόμενη τιμή pH, συνεπάγοντας ποσοστό ανάκτησης και καθαρότητας ίσο με 98% και 96.7%, αντίστοιχα. Το υδρολυμένο βακτηριακό διάλυμα που προέκυψε μετά το διαχωρισμό των μορίων του P(3HB-co-3HV) αξιολογήθηκε ως θρεπτικό υπόστρωμα σε συνδυασμό με την ακάθαρτη γλυκερόλη για τη συσσώρευση PHB κατά τη διάρκεια ζυμώσεων σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες. Επιπρόσθετα, τα βακτηριακά βιοπολυμερή χαρακτηρίστηκαν αναφορικά με τις θερμικές ιδιότητες και το μοριακό τους βάρος. Μια προκαταρκτική τεχνο-οικονομική μελέτη πραγματώθηκε προκειμένου να αξιολογηθεί το κόστος που σχετίζεται με την παραγωγή των αντιοξειδωτικών, της πρωτεΐνης υψηλής καθαρότητας και του PHB στα πλαίσια του προτεινόμενου βιο-διυλιστηρίου. Εν κατακλείδι, τεκμαίρεται ότι η οικονομική βιωσιμότητα της διεργασίας είναι άμεσα σχετιζόμενη με την τελική τιμή αγοράς και εξαρτάται απο τις τελικές χρήσεις της απομονωμένης πρωτεΐνης και του εκχυλίσματος των αντιοξειδωτικών