Χωροχρονική οργάνωση και μηχανισμοί επικοινωνίας μεταξύ ενδοκυττάρωσης και ρυθμιζόμενης έκκρισης κατά τη σηματοδότηση του VEGFR2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα
Authors: Γούλα Ευαγγελή 
Published: September 2021

Μέχρι στιγμής, η επαγόμενη από την ενδοκυττάρωση σηματοδότηση καθώς και η σηματοδοτούμενη εξωκυττάρωση έχουν μελετηθεί ξεχωριστά. Έτσι, δεν γνωρίζουμε αν η ενδοκυττάρωση και η εξωκυττάρωση είναι αλληλοεξαρτώμενες διαδικασίες και ποιοι είναι οι βασικοί μοριακοί μηχανισμοί αυτής της σχέσης. Στην παρούσα μελέτη, οι χημικοί αναστολείς dyngo-4a (για το εξαρτώμενο από την κλαθρίνη μονοπάτι ενδοκυττάρωσης) και ΕΙΡΑ (για την μακροπινοκυττάρωση) χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή των διαφορετικών ενδοκυτταρικών οδών του VEGFR2 και μελετήθηκε η επίδραση αυτής της αναστολής στην εξωκυττάρωση των WPBs. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το εξαρτώμενο από κλαθρίνη μονοπάτι ενδοκυττάρωσης του VEGFR2 έχει μικρή ανασταλτική δράση στο ποσοστό του εκκρινόμενου vWF, σε αντίθεση με την μακροπινοκυττάρωση, η οποία φαίνεται να έχει σημαντικό ανασταλτικό ρόλο. Ο ανασταλτικός ρόλος της μακροπινοκυττάρωσης στην VEGF επαγόμενη εξωκυττάρωση των WPBs ελέγχθηκε και με πειράματα αποσιώπησης πρωτεϊνών-τελεστών της μακροπινοκυττάρωσης (Rabankyrin-5, CDC42), με χρήση siRNAs και ακόλουθη μέτρηση του εκκρινόμενου vWF με δοκιμασία ELISA. Πράγματι, η αποσιώπηση των δύο αυτών πρωτεϊνών, ξεχωριστά ή συνδυαστικά, οδήγησε σε αύξηση της επαγόμενης εξωκυττάρωσης των WPBs. Επιπλέον, συνεστιακή μικροσκοπία πραγματικού χρόνου σε ζωντανά κύτταρα HUVE υποδεικνύει ότι μετά από ενεργοποίηση με VEGF, ο εντοπισμένος σε ενδοσωματικά κυστίδια VEGFR2 βρίσκεται σε περιορισμένες επαφές με τα WPBs. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τους μοριακούς μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την μεταγωγή του σήματος του VEGF και σχετίζονται με την εξωκυττάρωση των WPBs, πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση των εκκρινόμενων πρωτεϊνών σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μεταξύ των εκκρινόμενων πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (nLC-MS/MS) συμπεριλαμβάνεται και η πρωτεΐνη galectin-1 (Gal-1). Στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι η galectin-1 εντοπίζεται στα WPBs των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού συνεστιακή μικροσκοπία (LSCM/CLSM) με ή χωρίς την χρήση υπερδιακριτικής ικανότητας (STED) απέδειξε τον πλήρη συνεντοπισμό της galectin-1 με τον vWF, το κύριο πρωτεϊνικό φορτίο των WPBs. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε από τον συνεντοπισμό της και με άλλες γνωστές πρωτεΐνες-δείκτες των WPBs (P-selectin, Rab27a, Rab3a, Rab3d). Προς έκπληξή μας, η galectin-1 βρέθηκε να εντοπίζεται σε ένα υποσύνολο των WPBs και σε ένα περιορισμένο αριθμό κυττάρων HUVE. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μετά από ενεργοποίηση της έκκρισης με VEGF/bFGF/ATP η galectin-1 εντοπίζεται στα WPBs που προσέλαβαν τα αντισώματα έναντι του vWF, και επομένως υπέστησαν “kiss-and-run” εξωκυττάρωση. Παράλληλα, πειράματα πρόσληψης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών galectin-1 που προστέθηκαν εξωγενώς στο θρεπτικό καλλιέργειας, σε φυσιολογικά αλλά και σε κύτταρα όπου η ενδογενής galectin-1 αποσιωποιήθηκε με siRNAs, έδειξαν την παρουσία της ανασυνδυασμένης galectin-1 σε περιορισμένο αριθμό WPBs. Επιπλέον, η απομάκρυνση της εξωκυττάριας galectin-1 από το θρεπτικό καλλιέργειας των κυττάρων μείωσε αισθητά τον αριθμό των θετικών για την galectin-1 WPBs. Τα παραπάνω δεδομένα παρέχουν νέες πληροφορίες για τον μηχανισμό της μη συμβατικής έκκρισης της galectin-1, υποδηλώνοντας ότι η έκκρισή της, εν μέρει, οφείλεται στην “kiss-and-run” εξωκυττάρωση των WPBs.