Μελέτη της επίδρασης της θερμικής καταπόνησης στην εξωσωματική παραγωγή εμβρύων και στο περιβάλλον του ωαγωγού των αγελάδων
Authors: Σταμπέρνα Κωνσταντίνα 
Published: March 2023

Για την ολοκλήρωση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής διενεργήθηκαν πέντε διακριτοί πειραματισμοί που είχαν ως στόχο τη μελέτη της επίδρασης της θερμικής καταπόνησης (ΘΚ) στο περιβάλλον του ωοθυλακίου και στον ωαγωγό των αγελάδων. Ειδικότερα, σε in vitro συνθήκες, μελετήθηκαν οι επιπτώσεις της ΘΚ στην ωρίμανση του συμπλέγματος ωαρίου – κυττάρων ωοφόρου δίσκου, στη γονιμοποιητική ικανότητα του ωαρίου, στην ποιότητα των παραγόμενων εμβρύων, ενώ σε in vivo συνθήκες μελετήθηκαν οι επαγόμενες από τη ΘΚ αλλαγές στο περιβάλλον του ωαγωγού. Οι πειραματισμοί εστίασαν: α) στην επίδραση της ΘΚ κατά τη διάρκεια της in vitro ωρίμανσης ωαρίων βοοειδών στα ποσοστά παραγωγής βλαστοκύστεων και στην ποιότητα τους, β) στη διερεύνηση της επίδρασης της εξωγενούς προσθήκης heat shock protein 70 (Hsp70) στο υπόστρωμα ωρίμανσης ωαρίων που εκτέθηκαν σε ΘΚ, γ) στη συγκριτική μελέτη της ικανότητας ανάπτυξης ωαρίων αγελάδων των φυλών Holstein και Limousine, μετά από έκθεση σε ΘΚ κατά τη διάρκεια της in vitro ωρίμανσης, δ) στη μελέτη της επίδρασης της προσθήκης Hsp70 στο υπόστρωμα της in vitro καλλιέργειας στην ανάπτυξη και την ποιότητα εμβρύων βοοειδών που εκτέθηκαν σε ΘΚ, ε) στη συγκριτική μελέτη του μεταγραφώματος των επιθηλιακών κυττάρων του ωαγωγού και των εξωκυτταρικών κυστιδίων σε θερμοουδέτερες συνθήκες και σε συνθήκες ΘΚ σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής.Η Διατριβή χωρίζεται σε έξι κεφάλαια.Το Κεφάλαιο Ι αποτελεί ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας των επιστημονικών πεδίων στα οποία εκτείνονται οι πειραματισμοί της Διατριβής. Στο Κεφάλαιο II, αξιολογήθηκαν οι επιδράσεις της μικρής διάρκειας, ήπιας αύξησης της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της IVM, στην παραγωγή εμβρύων και στην έκφραση διαφόρων γονιδίων. Σε 8 επαναλήψεις, τα συμπλέγματα ωαρίων-κυττάρων ωοφόρου δίσκου (COCs) ωρίμασαν για 24 ώρες στους 39°C (μάρτυρες, C, n=520) ή στους 41°C από την ώρα 2 έως την ώρα 8 της IVM (ομάδα έκθεσης σε αυξημένη θερμοκρασία, T, n=802), γονιμοποιήθηκαν, και τα πιθανά ζυγωτά καλλιεργήθηκαν για 9 ημέρες στους 39°C. Η εκτίμηση του ποσοστού αυλάκωσης στα πρώιμα έμβρυα και του ποσοστού παραγωγής βλαστοκύστεων πραγματοποιούνταν 48 ώρες και 7, 8, και 9 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (post insemination, pi), αντίστοιχα. Κύτταρα του ωοφόρου δίσκου, απογυμνωμένα ωάρια και βλαστοκύστεις από 5 επαναλήψεις καταψύχθηκαν για την ανάλυση της σχετικής έκφρασης γονιδίων, που σχετίζονται με το μεταβολισμό, την απόκριση στο θερμικό και οξειδωτικό στρες, την απόπτωση και τη δυνατότητα ανάπτυξης πλακούντα. Στην ομάδα T, τα ποσοστά αυλάκωσης και παραγωγής βλαστοκύστεων ήταν σημαντικά (p<0.05) χαμηλότερα σε σύγκριση με την ομάδα C (αυλάκωση 86.7% έναντι 74.2%, βλαστοκύστεις: ημέρα 7, 29.9% έναντι 19.7%, ημέρα 8, 34.2% έναντι 22.9% και ημέρα 9, 35.9% έναντι 24.5%). Η έκφραση τριών γονιδίων στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου (HSP90AA1, CPT1B, G6PD) και τριών γονιδίων στις βλαστοκύστεις (DNMT3A, PLAC8, GPX1) εμφάνισε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (p<0.05). Η έκφραση των G6PD, SOD2, GXP1 στα ωάρια και του PTGS2 στις βλαστοκύστεις έτεινε να διαφέρει μεταξύ των ομάδων (0.05<p<0.08). Η ΘΚ μετέβαλε (p<0.05) τη συσχέτιση της έκφρασης μεταξύ των HSPs και άλλων γονιδίων στα ωάρια (G6PD, GPX1, CCNB1), στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου (LDH, CCNB1) και στις βλαστοκύστεις (AKR1B1, PLAC8).Στο Κεφάλαιο III, μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης Hsp70 στο υπόστρωμα της in vitro ωρίμανσης ωαρίων βοοειδών που εκτέθηκαν σε συνθήκες ΘΚ και αξιολογήθηκε η ικανότητα της in vitro παραγωγής εμβρύων, καθώς και η ποιότητα των παραγόμενων εμβρύων, με βάση την έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Ωάρια βοοειδών ωρίμασαν για 24 ώρες στους 39°C χωρίς (ομάδα C39, n=471) ή με Hsp70 (ομάδα H39, n=353) και στους 41°C για τις πρώτες 6 ώρες, και στη συνέχεια για 16 ώρες στους 39°C με (ομάδα H41, n=704) ή χωρίς Hsp70 (ομάδα C41, n=405). Μετά τη γονιμοποίηση, τα ζυγωτά καλλιεργήθηκαν για 9 ημέρες στους 39°C. Τα ποσοστά αυλάκωσης και παραγωγής εμβρύων εκτιμήθηκαν 48 ώρες pi και τις ημέρες 7, 8, 9, αντίστοιχα. Η γονιδιακή έκφραση εκτιμήθηκε με RT-PCR σε ωάρια, κύτταρα του ωοφόρου δίσκου και βλαστοκύστεις. Στην ομάδα C41, ο ρυθμός σχηματισμού βλαστοκύστεων ήταν χαμηλότερος σε σχέση με την C39 και την ημέρα 9 ήταν χαμηλότερος από την H41. Στα ωάρια, η Hsp70 ενίσχυσε την έκφραση τριών γονιδίων HSP ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ωρίμανσης. Η Hsp70 στους 39°C οδήγησε σε ισχυρό συντονισμό της γονιδιακής έκφρασης στα ωάρια και στις βλαστοκύστεις, αλλά όχι στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου.Στο Κεφάλαιο IV, διερευνήθηκαν οι επιπτώσεις της ΘΚ κατά τη διάρκεια της in vitro ωρίμανσης στην ικανότητα ανάπτυξης ωαρίων που προήλθαν από αγελάδες Limousine και Holstein και η επίδραση στη διαφορική γονιδιακή έκφραση σημαντικών γονιδίων σε ωάρια, κύτταρα του ωοφόρου δίσκου και βλαστοκύστεις, μεταξύ των φυλών. Σε επτά επαναλήψεις, COCs από αγελάδες Holstein (H) και Limousine (L) ωρίμασαν για 24 ώρες στους 39°C (μάρτυρες C, HC, n= 405, LC, n=370) ή στους 41°C από την ώρα 2 έως την ώρα 8 της IVM (ομάδες που υποβλήθηκαν σε αύξηση της θερμοκρασίας T, HT, n=652, LT, n=488), γονιμοποιήθηκαν και τα πιθανά ζυγωτά καλλιεργήθηκαν για 9 ημέρες στους 39°C. Οι ρυθμοί αυλάκωσης και σχηματισμού εμβρύων αξιολογήθηκαν 48h pi και τις ημέρες 7, 8 και 9, αντίστοιχα. Σε υποομάδες κυττάρων του ωοφόρου δίσκου, ωαρίων και βλαστοκύστεων από όλες τις ομάδες αναλύθηκε η σχετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό, το στρες, την απόπτωση και την ικανότητα ανάπτυξης πλακούντα. Δεν εντοπίστηκαν διαφορές στο ρυθμό αυλάκωσης ή στο ρυθμό σχηματισμού βλαστοκύστεων μεταξύ των ομάδων των μαρτύρων. Και στις δύο φυλές, η ΘΚ μείωσε την παραγωγή βλαστοκύστεων, αλλά όλες τις ημέρες η καταστολή ήταν μεγαλύτερη στα Limousine. Στα Holstein, μεταβλήθηκε η γονιδιακή έκφραση στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου (G6PD, GLUT1) και στις βλαστοκύστεις (PLAC8), ενώ στα Limousine, διαφορές εντοπίστηκαν στα ωάρια (G6PD, HSP90AA1), στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου (CPT1B, HSP90AA1, SOD2) και στις βλαστοκύστεις (DNMT, HSP90AA1, SOD2).Ο σκοπός του Κεφαλαίου V ήταν να εξεταστεί η επίδραση της προσθήκης Hsp70 στο υπόστρωμα της in vitro καλλιέργειας στην ικανότητα ανάπτυξης και την ποιότητα εμβρύων ημέρας 3. Ωάρια βοοειδών (n=1442) ωρίμασαν in vitro, γονιμοποιήθηκαν και καλλιεργήθηκαν για τις δύο πρώτες ημέρες σύμφωνα με τις καθιερωμένες μεθόδους. Τα πιθανά ζυγωτά κατανεμήθηκαν τυχαία σε τρεις πειραματικές ομάδες: μάρτυρες, C (έμβρυα που καλλιεργήθηκαν στους 39°C καθ' όλη την περίοδο καλλιέργειας, n=396), ομάδα C41 (η θερμοκρασία αυξήθηκε στους 41°C από την 48η έως την 72η ώρα pi και στη συνέχεια επανήλθε στους 39°C για την υπόλοιπη περίοδο καλλιέργειας, n=514) και την ομάδα Η41 (η τροποποίηση της θερμοκρασίας ήταν η ίδια όπως στην C41 και κατά τη διάρκεια της έκθεσης στη ΘΚ, προστέθηκε Hsp70 στο υπόστρωμα καλλιέργειας, n=532). Η αυλάκωση και η παραγωγή εμβρύων αξιολογήθηκαν 48 ώρες pi και τις ημέρες 7, 8, 9, αντίστοιχα. Η γονιδιακή έκφραση στις βλαστοκύστεις ημέρας 7 αξιολογήθηκε με RT-PCR. Η απόδοση σε βλαστοκύστεις ήταν υψηλότερη στην ομάδα C39 και υψηλότερη στην ομάδα H41 σε σύγκριση με την ομάδα C41. Από την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, εντοπίστηκε τροποποίηση της έκφρασης 11 γονιδίων μεταξύ των ομάδων. Η ανάλυση των ενορχηστρωμένων προτύπων γονιδιακής έκφρασης διέφερε μεταξύ των ομάδων.Στο Κεφάλαιο VI, περιγράφονται το μεταγράφωμα των επιθηλιακών κυττάρων του ωαγωγού και συγκεκριμένα χαρακτηριστικά των εξωκυτταρικών κυστιδίων (Extracellular Vesicles, EVs) γαλακτοπαραγωγών αγελάδων σε θερμοουδέτερη περίοδο και περίοδο ΘΚ. Ωαγωγοί από είκοσι αγελάδες συγκρίθηκαν την άνοιξη με THI=65,6±0,90 και το καλοκαίρι με THI=78,36±2,73. Κατά τη διάρκεια κάθε εποχής, οι οιστρικοί κύκλοι των αγελάδων συγχρονίστηκαν και την 3η ημέρα του επακόλουθου κύκλου, συλλέχθηκε ένα δείγμα αίματος για προσδιορισμό της προγεστερόνης, ενώ οι ωαγωγοί τους συλλέχθηκαν μετά τη σφαγή. Τα επιθηλιακά κύτταρα και το υγρό του ωαγωγού συλλέχθηκαν από τους ομόπλευρους και ετερόπλευρους ως προς το ωχρό, ωαγωγούς, αντίστοιχα. Για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική προσέγγιση του μεταγραφώματος, χρησιμοποιώντας RNA Sequencing (RNASeq), σε κύτταρα που συλλέχθηκαν από τους ομόπλευρους και τους ετερόπλευρους ωαγωγούς. Το μέγεθος και η συγκέντρωση των EVs και στις δύο εποχές μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Μετάδοσης και Ανάλυση Εντοπισμού Νανοσωματιδίων και η ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με Western blotting. Η συγκέντρωση της προγεστερόνης ήταν υψηλότερη κατά τη διάρκεια της θερμοουδέτερης περιόδου. Μεταξύ των εποχών, διαπιστώθηκε αποκλίνουσα έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα, τη συσπαστικότητα, την προστασία των γαμετών και τα μακρά μη κωδικοποιημένα RNA (long non-coding RNAs, lncRNAs). Το μέγεθος και η συγκέντρωση των EVs δεν διέφεραν μεταξύ των εποχών, ωστόσο, η συγκέντρωση στον ομόπλευρο ωαγωγό έτεινε να είναι χαμηλότερη (p=0.09) από τον ετερόπλευρο το καλοκαίρι, αλλά όχι την άνοιξη.Τα κυριότερα ευρήματα της παρούσας Διατριβής συνοψίζονται ως εξής:1.Η αυξημένη θερμοκρασία κατά την ωρίμανση των ωαρίων διαταράσσει την ικανότητα ανάπτυξης των ωαρίων, καταστέλλει την παραγωγή βλαστοκύστεων και μεταβάλλει σημαντικά το συντονισμένο μοτίβο των γονιδιακών εκφράσεων.2.Η προσθήκη της Hsp70 προστατεύει τα υπό ωρίμανση ωάρια σε συνθήκες ΘΚ και διατηρεί την ικανότητα ανάπτυξης τους, αποτρέποντας την απόπτωση, ενισχύοντας την ανταλλαγή σημάτων και αυξάνοντας την αντιοξειδωτική προστασία των εμβρύων.3.Τα COCs των Holstein είναι πιο ανθεκτικά από τα COCs των Limousine, πιθανώς λόγω της υποχρεωτικής επιλογής που έχουν υποστεί, με γνώμονα την παραγωγή.4.Η αύξηση της θερμοκρασίας είναι επιβλαβής για την ικανότητα ανάπτυξης των πρώιμων εμβρύων και η Hsp70 μπορεί εν μέρει, μόνο, να μετριάσει τις δυσμενείς επιπτώσεις της ΘΚ, βελτιώνοντας την παραγωγή εμβρύων και μειώνοντας τις αρνητικές επιπτώσεις της ΘΚ σε ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά των εμβρύων.5.Η τροποποίηση του περιβάλλοντος του ωαγωγού κατά τη διάρκεια της ΘΚ θα μπορούσε να σχετίζεται με την παρατηρούμενη υπογονιμότητα κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού στις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής.