Ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης DNA / RNA
Authors: Κυριακού Ηρακλής 
Published: September 2021

Σύμφωνα με τη Διεθνή Έκθεση για τις καρκινικές νόσους που παρουσιάστηκε από τον IARC (International Agency for Research on Cancer), ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των γυναικών, με περίπου ένα εκατομμύριο νέα κρούσματα παγκοσμίως, ενώ ο καρκίνος του προστάτη έρχεται δεύτερος σε συχνότητα διάγνωσης στους άνδρες και είναι η πέμπτη συχνότερη μορφή καρκίνου συνολικά. Αυτά τα δεδομένα καθιστούν αναγκαία την έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Για το σκοπό αυτό απαιτείται η ανάπτυξη υπερευαίσθητων μοριακών μεθόδων, που στόχο έχουν την ταυτοποίηση ή/και ποσοτικοποίηση νέων μοριακών δεικτών. Αντικείμενο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού των mRNAs σειράς γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο μαστού και προστάτη. Η μέθοδος περιλαμβάνει: (i) ταυτόχρονη ενίσχυση (μέσω πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, PCR) των cDNAs των mRNAs επιλεχθέντων γονιδίων και (ii) τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων ενίσχυσης με πολλαπλή δοκιμασία υβριδισμού που λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια φασματικά κωδικοποιημένων μικροσφαιριδίων. Τα μικροσφαιρίδια αυτά περιέχουν στο εσωτερικό τους δυο φθορίζουσες χρωστικές σε διάφορες αναλογίες, από όπου προκύπτουν έως και 100 διαφορετικές ομάδες σφαιριδίων. Για την αντιστάθμιση των διακυμάνσεων στην απόδοση της PCR, χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά εσωτερικά πρότυπα (IS) DNA, τα οποία διαθέτουν τις ίδιες περιοχές σύνδεσης των εκκινητών με τους αντίστοιχους DNA-στόχους. Τα προϊόντα της PCR (DNA-στόχος και IS) έχουν το ίδιο μέγεθος και διαφέρουν μόνο ως προς μια κεντρική αλληλουχία 24 bp, η οποία καθιστά εφικτή τη διάκρισή τους και τον προσδιορισμό τους μετά την PCR. Τα προϊόντα ενίσχυσης των DNA-στόχων και των εσωτερικών προτύπων είναι βιοτινυλιωμένα και υβριδοποιούνται με συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές, τα οποία με τη σειρά τους υβριδοποιούνται με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες που φέρουν τα φθορίζοντα μικροσφαιρίδια. Τα προϊόντα υβριδοποίησης ανιχνεύονται με σύζευγμα στρεπταβιδίνης – φυκοερυθρίνης μέσω της αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Στη συνέχεια, τα μικροσφαιρίδια αναλύονται με κυτταρομετρία ροής με τη χρήση δύο ακτίνων λέιζερ. Μια ακτίνα λέιζερ χρησιμοποιείται για την κατάταξη των μικροσφαιριδίων σε ομάδες, ταυτοποιώντας έτσι το επιλεγμένο γονίδιο, ενώ μία δεύτερη ακτίνα λέιζερ διεγείρει τα μόρια της φυκοερυθρίνης, της οποίας ο φθορισμός σχετίζεται άμεσα με την συγκέντρωση του προς προσδιορισμό DNA-στόχου.Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν εκτενείς μελέτες όσον αφορά στον τρόπο λήψης και επεξεργασίας αποτελεσμάτων από τον κυτταρομετρητή ροής. Συγκεκριμένα, σχεδιάστηκαν και εκτελέστηκαν πειράματα σύγκρισης των αποτελεσμάτων που εξάγονται από το λογισμικό του οργάνου, σε σχέση με τα αντίστοιχα ανεπεξέργαστα δεδομένα που προκύπτουν από τις μετρήσεις φθορισμού των μικροσφαιριδίων και της φυκοερυθρίνης. Ειδικότερα, αναπτύχθηκε αλγόριθμος που περιλαμβάνει τα απαραίτητα βήματα στατιστικής ανάλυσης των ακατέργαστων τιμών φθορισμού και παρακάμπτοντας το λογισμικό του κυτταρομετρητή, που οδηγεί στην κατάταξη των μικροσφαιριδίων σε ομάδες – ανάλογα με το DNA-στόχο – ενώ παράλληλα δίνει πληροφορία για τη συγκέντρωση κάθε αναλύτη από την αντίστοιχη τιμή έντασης φθορισμού φυκοερυθρίνης.Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή ολοκληρώνεται με την παρουσίαση μίας σειράς μελετώνμε στόχο την ανάπτυξη φωταυγειομετρικής μεθόδου για αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων με χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής ως ανιχνευτή. Αναλυτικότερα, περιγράφονται οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν για την ακινητοποίηση των αλληλουχιών DNA σε διάφορα στερεά υποστρώματα, την υβριδοποίησή τους με βιοτυνιλιωμένες συμπληρωματικές αλληλουχίες, καθώς και την αλληλεπίδραση των υβριδίων με συζεύγματα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης ή στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης χρένου. Η ανίχνευση της εκπεμπόμενης φωταύγειας των παραπάνω ενζύμων, πραγματοποιήθηκε τόσο με χρήση συμβατικών οργάνων, όπως το φωταυγειόμετρο, όσο και με τη χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής και ακολούθησε σύγκριση των αποτελεσμάτων που λήφθηκαν με τους δύο τρόπους ανίχνευσης. Στη συνέχεια, περιγράφονται οι μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της παρεμπόδισης στη μέτρηση χημειοφωταύγειας μεταξύ γειτονικών φρεατίων του πλακιδίου μικροτιτλοδότησης. Τέλος, παρουσιάζεται η εφαρμογή της αναπτυχθείσας μεθόδου στην ανίχνευση προϊόντων PCR, ο ποσοτικός προσδιορισμός των οποίων επετεύχθη με το λογισμικό επεξεργασίας ψηφιακής εικόνας Image J.