Exploring new metabolic traits of the model acetogenic bacterium Acetobacterium woodii by genetic engineering
Authors:   , Moon Jimyung 
Published: November 2024

Das Modell-Acetogen Acetobacterium woodii ist bisher das Acetogen, das physiologisch, biochemisch und bioenergetisch am besten studiert ist. Während A. woodii als Homoacetogen bekannt ist, das Acetat als einziges Endprodukt produziert, hat seine genetische Information das Potenzial für die natürliche Produktion anderer reduzierter Produkte wie Ethanol oder Laktat angedeutet. Darüber hinaus wurde die Umsetzung bestimmter Substrate in A. woodii nur begrenzt untersucht, und ihre Physiologie, Biochemie und Bioenergetik sind noch nicht ausreichend erforscht. Das Ziel dieser Arbeit war es, unentdeckte Stoffwechselwege bestimmter Substrate in A. woodii zu untersuchen und neue metabolische Eigenschaften durch gentechnisches Engineering zu entdecken. Das erste Kapitel dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Untersuchung der formatotrophen Acetogenese von A. woodii. Formiat, eine der vielversprechenden C1-Verbindungen, kann in A. woodii verstoffwechselt werden. Es wurde festgestellt, dass ein Gencluster von A. woodii für eine zweite Formyl-Tetrahydrofolat-Synthetase zusammen mit einem potenziellen Formiat-Transporter kodiert. Um die Rolle dieser Gene zu verstehen, wurden sie in A. woodii deletiert. Die Charakterisierung der daraus resultierenden Mutanten zeigte, dass dieses Gencluster eine wichtige Rolle beim Formiat-Stoffwechsel spielt. Im zweiten Kapitel wurde die Ethanologenese von A. woodii untersucht. Die Wachstums- und Zellsuspensionsversuche zeigten, dass höhere Fruktosekonzentrationen, Na+-Limitierung und niedriger Bikarbonatgehalt die Ethanolbildung in A. woodii stimulierten. Anschließend wurden Expressionsanalysen und Mutationsstudien durchgeführt, um die Ethanol-bildende Alkohol-Dehydrogenase zu identifizieren. Das dritte Kapitel konzentrierte sich auf die Charakterisierung der formatogenen Lebensweise von A. woodii während des methylotrophen Stoffwechsels mittels der hdcr-Deletionsmutante. In der ∆hdcr-Mutante wurden die Methylgruppen in Formiat und Acetat umgewandelt, und die Zugabe eines alternativen Elektronenakzeptors, Kaffeat, ermöglichte die Umrichtung des Stoffwechsels auf Homoformatogenese. Im vierten Kapitel wurde eine Mutante hergestellt und charakterisiert, die Methylene-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) nicht mehr vorhanden ist. In der ∆metVF-Mutante, bei der zwei Untereinheiten von MTHFR genetisch deletiert wurden, wurde ein bisher unbekannter fermentativer Stoffwechsel von A. woodii, gemischte Säuregärung, während des Wachstums auf Fruktose beobachtet. Darüber hinaus wurden durch Transkriptomanalysen die mit diesem neuen fermentativen Stoffwechsel assoziierten Enzyme aufgedeckt. Im letzten Kapitel wurde die Laktogenese in A. woodii unter Verwendung eines genetisch veränderten Stammes untersucht. A. woodii hat das Potenzial, Laktat durch die bifurkierende Laktatdehydrogenase, LDH/ETF-Komplex, zu produzieren. Die ∆metVF-Mutante war zwar in der Lage, Laktat zu produzieren, aber es wurde eine erhebliche Menge an Elektronen für die H2-Produktion verbraucht. Um die Laktatproduktion zu verbessern, wurde eine Doppeldeletionsmutante, ∆hydBA/hdcr, ausgewählt und die Laktogenese aus C1-Verbindungen in ruhenden Zellen der ∆hydBA/hdcr-Mutante untersucht.