Χρήση μοριακών εργαλείων για τη μελέτη της καταλυτικής εξειδίκευσης των εστερασών του φερουλικού οξέος
Authors: Μουκούλη Μαρία 
Published: January 2014

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τόσο σε μοριακό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο δύο εστεράσες του φερουλικού οξέος των ημικυτταρινών από δύο ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς, το μεσόφιλο μύκητα Fusarium oxysporum και το θερμόφιλο μύκητα Sporotrichum thermophile.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των παραπάνω μικροοργανισμών και στη συνέχεια των αλληλουχιών των εστερασών του φερουλικού οξέος που συναντώνται σε αυτούς. Οι αλληλουχίες δύο γονιδίων που κωδικοποιούν για εστεράσες του φερουλικού οξέος απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν με τη βοήθεια αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και έπειτα κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν λειτουργικά μέσω του συστήματος έκφρασης του μεθυλότροφου ζυμομύκητα Pichia pastoris Χ33. Επιπλέον, μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ανασυνδυασμένων ενζύμων που παρήχθησαν, FoFaeC και StFaeB. H ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για μια τρίτη ημικυτταρινάση, την ξυλανάση FoXyn11 της οικογένειας 11 των γλυκοζυλ-υδρολασών από το F. oxysporum και επιχειρήθηκε επιτυχώς η ενίσχυση της παραγωγής των ενζύμων FoFaeC και FoXyn11 μέσω βελτιστοποίησης των συνθηκών ζύμωσης του μύκητα P. pastoris.Σε επόμενο στάδιο της διατριβής, κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των καταλυτικών κέντρων των ενζύμων FoFaeC και StFaeB, οδήγησαν στον εντοπισμό της καταλυτικής σερίνης η οποία μετέχει στο μηχανισμό υδρόλυσης των εστερικών δεσμών, επαληθεύοντας την κατηγοριοποίησή τους στην οικογένεια των εστερασών σερίνης και συγκεκριμένα στην ομάδα των εστερασών του φερουλικού οξέος. Περαιτέρω ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της StFaeB, με τη βοήθεια εργαλείων της Bιοπληροφορικής, συνέβαλλε στην πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής της.Ο πλήρης χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης υποστρώματος των υπό μελέτη εστερασών του φερουλικού οξέος διενεργήθηκε με τη χρήση διαφόρων συνθετικών και φυσικών υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των κινναμικών μεθυλεστέρων, των αλκυλ-εστέρων του φερουλικού οξέος και των π-νιτροφαινυλ-αραβινοφουρανοζιτών. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών οδήγησαν στην κατηγοριοποίηση των εστερασών FoFaeC και StFaeB στις ομάδες C και Β, αντίστοιχα, σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, ενώ η σύγκριση των αμινοξικών τους αλληλουχιών με αλληλουχίες γνωστών από τη βιβλιογραφία εστερασών του φερουλικού οξέος, επέτρεψαν την κατηγοριοποίηση τους στις υποοικογένειες (Subfamilies) SF1 και SF6 αντίστοιχα. Παράλληλα, τα εν λόγω πρωτεϊνικά μόρια εξετάστηκαν ως προς τις βέλτιστες συνθήκες δράσης τους και τη σταθερότητα που εμφανίζουν σε ένα εύρος τιμών pH και θερμοκρασιών.Στη συνέχεια μελετήθηκε εκτενώς η συνεργιστική δράση μεταξύ των εστερασών του φερουλικού οξέος και των ξυλανασών. Και οι δύο εξεταζόμενες ανασυνδυασμένες εστεράσες, αποδείχθηκε ότι έχουν την ικανότητα να απελευθερώνουν φερουλικό οξύ από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά, μόνο με τη βοήθεια ξυλανασών. Η μέγιστη τιμή παραγόμενου - από τα ζεύγη των ενζύμων - φερουλικού οξέος μετρήθηκε κατά τη συνεργιστική δράση της εστεράσης FoFaeC και της εμπορικής ξυλανάσης TlXyn11 από το μύκητα Trichoderma longibrachiatum. Ο συγκεκριμένος συνδυασμός ενζύμων χρησιμοποιήθηκε και σε αντιδράσεις υδρόλυσης του στερεού υπολείμματος βύνης, ενώ περαιτέρω ενίσχυση της απελευθέρωσης φερουλικού οξέος παρατηρήθηκε κατόπιν προσθήκης πολυενζυμικού εκχυλίσματος από το μύκητα F. oxysporum.Τέλος, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανενεργών μορφών των υπό μελέτη εστερασών, οι οποίες δημιουργήθηκαν κατόπιν σημειακής μεταλλαξιγένεσης, και των ολιγοσακχαριτών από αραβινοξυλάνη σίτου, διερευνήθηκαν μέσω Θερμιδομετρίας Ισόθερμης Τιτλοδότησης, με σκοπό την κατανόηση της ποικιλομορφίας των ενζύμων αυτών και του ρόλου τους στην αποικοδόμηση των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων. Ο φερουλοποιημένος αραβινο-ξυλοτρισακχαρίτης εμφάνισε ισχυρότερη δέσμευση στην εστεράση FoFaeC S217A, ενώ η 1,5-α-L-αραβινοτετραόζη φάνηκε να μην αλληλεπιδρά με τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες.Για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε μια επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης και ερμηνείας των μηχανισμών κατάλυσης των εστερασών του φερουλικού οξέος από τους μύκητες F. oxysporum και S. thermophile, με χρήση μοριακών τεχνικών και εργαλείων Bιοπληροφορικής, σηματοδοτώντας έτσι την απαρχή μιας νέας πορείας στην εκμετάλλευση των ενζύμων αυτών στους διάφορους τομείς της βιομηχανίας