Functional analysis of genes involved in cardiovascular disease
Authors: Γιαρδόγλου Παναγιώτα 
Published: June 2022

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα (ΚΝ) είναι η κύρια αιτία θανάτου σε παγκόσμια κλίμακα. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, εκτιμάται πως 17.9 εκατομμύρια άνθρωποι κάθε χρόνο χάνουν τη ζωή τους από καρδιαγγειακές παθήσεις, ποσοστό που αντιστοιχεί στο 32% της παγκόσμιας θνησιμότητας. Τα ΚΝ αποτελούν την πιο συχνή μορφή μη-μεταδοτικών ασθενειών και περιγράφουν ένα ευρύ φάσμα παθήσεων που αφορούν στη λειτουργία και μορφογένεση της καρδιάς και των αιμοφόρων αγγείων. Η στεφανιαία νόσος (ΣΝ) αποτελεί μια βασική κλινική μορφή των ΚΝ και περιγράφει τη στένωση των στεφανιαίων αρτηριών λόγω συσσώρευσης αθηρωματικού υλικού στον αυλό τους με αποτέλεσμα να μην τροφοδοτείται επαρκώς η καρδιά με τα απαραίτητα συστατικά και οξυγόνο για τη λειτουργία της. Αποτελώντας μείζον ζήτημα δημόσιας υγείας, το ολικό κόστος των καρδιαγγειακών νοσημάτων μαζί με τις υπόλοιπες μη-μεταδοτικές ασθένειες (όπως ο καρκίνος, ο διαβήτης και η χρόνια πνευμονοπάθεια) αναμένεται να αυξηθεί ακόμα περισσότερο εξαιτίας της αύξησης του μέσου όρου ζωής του πληθυσμού καθώς και των κοινωνικών προτύπων. Συνεπώς, είναι τεράστιας σημασίας η προσπάθεια να οριστεί την πρόγνωση, πρόληψη, εξέλιξη και θεραπεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων εντός πλαισίου φάσματος τροποποιήσιμων και μη-τροποποιήσιμων παραγόντων κινδύνου. Είναι γνωστό πως η εκδήλωση της ΣΝ σχετίζεται με παράγοντες κινδύνου τόσο περιβαλλοντικούς όσο και γενετικούς. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν η αρτηριακή υπέρταση, η δισλιπιδαιμία, το αυξημένο σάκχαρο αίματος, η παχυσαρκία και ο τρόπος ζωής (όπως κάπνισμα, έλλειψη φυσικής δραστηριότητας, κακή διατροφή, άγχος και επιβαρυμένη ψυχική υγεία). Ωστόσο, ιδιαιτέρως σημαντικό ρόλο έχουν και οι γενετικοί παράγοντες που επιδρούν στην εμφάνιση της νόσου. Πληθώρα πληθυσμιακών μελετών έχουν στοχεύσει στην ανακάλυψη της γενετικής αρχιτεκτονικής που καθορίζει τη βάση των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Μελέτες συσχέτισης ολόκληρου του γονιδιώματος (Genome-Wide association study - GWAS) έχουν ταυτοποιήσει πάνω από 60 γενετικούς τόπους που σχετίζονται με τη ΣΝ. Τέτοιες γενετικές παραλλαγές έχουν βρεθεί και σε δύο υποψήφια προς μελέτη γονίδια: craniofacial development protein 1 (CFDP1) και coiled-coil domain containing 92 (CCDC92). Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετήσουμε τον λειτουργικό ρόλο των CFDP1 και CCDC92 στην ανάπτυξη της καρδιάς. Στα πλαίσια της έρευνας αυτής, χρησιμοποιήσαμε το zebrafish (Danio rerio) που έχει αναδειχθεί ως ένα πολύτιμο μοντέλο-οργανισμός στην έρευνα για τις καρδιαγγειακές παθήσεις, λόγω της υψηλής γενετικής ομολογίας, της ομοιότητας στη φυσιολογία της καρδιάς και την ευκολία του πειραματικού χειρισμού του. Το CFDP1 ανήκει στη συντηρημένη οικογένεια των Κενταύρων (Bucentaur, BCNT) και έως σήμερα ο μηχανισμός δράσης του στην καρδιακή ανάπτυξη παραμένει άγνωστος. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε μια cfdp1 μεταλλαγμένη zebrafish σειρά μέσω του εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης, CRISPR-Cas9. Ύστερα από ταυτοποίηση του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου διαπιστώσαμε πως διαθέτει ένα πρώιμο κωδικόνιο λήξης στο τρίτο εξόνιο το οποίο παράγει ένα ελαττωματικό πρωτεϊνικό προϊόν. Η έλλειψη του cfdp1 οδηγεί σε έναν θνησιγόνο φαινότυπο, αφού τα πλήρως μεταλλαγμένα άτομα δεν φτάνουν στο ενήλικο στάδιο ζωής. Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε πως τα μεταλλαγμένα cfdp1 έμβρυα αναπτύσσουν καρδιακές αρρυθμίες και ελλιπή καρδιακή λειτουργία όπως αυτή αποτυπώνεται από τα μειωμένα επίπεδα του τελοδιαστολικού όγκου, καρδιακής παροχής, κλάσμα εξώθησης και όγκου παλμού. Περαιτέρω ανάλυση σε κυτταρικό επίπεδο έδειξε πως η κοιλιακή δοκίδωση είναι επίσης μειωμένη στα μεταλλαγμένα cfdp1 έμβρυα, υποδεικνύοντας τον ρυθμιστικό ρόλου του γονιδίου στη μορφογενετική διαδικασία δοκίδωσης κατά την ανάπτυξη της zebrafish εμβρυικής καρδιάς. Τέλος, μετά τη διεξαγωγή knockdown και knockout πειραμάτων δείξαμε πως αποσιώπηση του cfdp1 οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα ενεργοποίησης του Wnt σηματοδοτικού μονοπατιού στις καρδιές εμβρύων κατά τη διάρκεια της δημιουργίας καρδιακών βαλβίδων, χωρίς να επηρεάσει την έκφραση του Notch μονοπατιού στη διαδικασία αυτή. Το CCDC92 ανήκει στην υπεροικογένεια των πρωτεϊνών σπειροειδούς ελίκωσης (coiled-coil proteins) και μολονότι πληθυσμιακές μελέτες έχουν αναδείξει πολυάριθμες παραλλαγές του γονιδίου να σχετίζονται με κλινικές μορφές της ανθρώπινης καρδίας, η λειτουργία του δεν έχει εξακριβωθεί, ούτε μελετηθεί επαρκώς. Στην παρούσα διατριβή, δείξαμε πως το zebrafish ccdc92 εκφράζεται κατά τη διάρκεια την εμβρυικής ανάπτυξης από τα πρώτα στάδια, καταδεικνύοντας το σημαντικό ρόλο του γονιδίου για τη σωστή οργανογένεση και λειτουργία του οργανισμού. Ακολούθως, διεξήγαμε πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του ccdc92 (knockdown) σε έμβρυα zebrafish και μέσω φαινοτυπικού χαρακτηρισμού εντοπίσαμε ανάπτυξη περικαρδιακού οιδήματος και δομική δυσμορφία της καρδιάς. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε πως αναστολή της έκφρασης του γονιδίου αυτού οδηγεί σε ελλαττωματική καρδιακή περιστροφή (cardiac looping), μια απαραίτητη διαδικασία για τη φυσιολογική μορφογένεση της καρδιάς κατά την ανάπτυξή της. Η Protein Kinase D2 (prkd2) ανήκει σε οικογένεια εξελικτικά συντηρημένων ενζύμων που ρυθμίζουν πληθώρα βιολογικών διεργασιών. Προσέγγιση ορθόδρομης μεταλλαξιγέννεσης στο μοντέλο zebrafish ανέδειξε μια μεταλλαγή στο γονίδιο prkd2 (T757A) που προκαλεί στένωση αγωγού καρδιακής εκροής. Στην παρούσα μελέτη, καταγράψαμε την έκτοπη έκφραση του Notch μονοπατιού στην καρδιά μεταλλαγμένων εμβρύων, καθώς επίσης και αυξημένη ευαισθησία στην κυκλοσπορίνη Α (αναστολέας καλσινευρίνης). Ακόμα, αναδείξαμε την πιθανή ρύθμιση του Prkd2 από τον μεταγραφικό παράγοντα Tbx5 στα zebrafish έμβρυα. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής συμμετείχαμε στη συνεργασία GRMIC (Greek Recurrent Myocardial Infarction Cohort), μία προοπτική επιδημιολογική μελέτη με σκοπό τη διαστρωμάτωση των ασθενών ύστερα από εμφάνιση πρώτου επεισοδίου εμφράγματος του μυοκαρδίου, μέσα από τη δημιουργία μοντέλου πρόβλεψης ενσωματώνοντας γενετικούς παράγοντες μαζί με τη δράση βιοδεικτών. Μέχρι την ολοκλήρωση της διατριβής, 66 ασθενείς είχαν επανεξετασθεί μετά το πέρας των έξι μηνών από την εμφάνιση ισχαιμικού επεισοδίου. Ανάλυση επιπέδων γνωστών βιοδεικτών στο πλάσμα ασθενών στις δύο χρονικές περιόδους ανέδειξε πως η ολική χοληστερόλη, η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνική χοληστερόλη, απολιποπρωτεΐνη Β, C-αντιδρώσα πρωτεΐνη και η φωσφατάση της κρεατίνης παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα την περίοδο εμφάνισης επεισοδίου σε σύγκριση με τα επίπεδά τους στο πλάσμα των ασθενών μετά το πέρας των έξι μηνών, επιβεβαιώνοντας τον προγνωστικό τους ρόλο για την πιθανότητα εμφάνισης εμφράγματος του μυοκαρδίου.