Μεταγονιδιωματική ανάλυση λιγνινοκυτταρινολυτικών μικροοργανισμών από επιλεγμένα εδαφικά δείγματα
Authors: Καλντρεμτζίου Μαρία 
Published: August 2023

Τα δάση καλύπτουν μεγάλες εκτάσεις της επιφάνειας της Γης και αποτελούν τις πιο σημαντικές πηγές ανανεώσιμης ενέργειας με βάση τον άνθρακα στη μορφή της ξυλώδους βιομάζας. Πολύπλοκες μικροβιακές κοινότητες στο έδαφος αποικοδομούν τα ξυλώδη συστατικά και ανακυκλώνουν τον άνθρακα, παρέχοντας πολύτιμα θρεπτικά συστατικά και διατηρώντας τη ζωή στα δάση. Παρόλα αυτά η εξερεύνηση των εδαφικών μικροβιωμάτων αποτελεί “πρόκληση’’ καθώς η πλειονότητα των εδαφικών μικροοργανισμών και η ακριβής λειτουργία τους σε αυτά τα ενδιαιτήματα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστα. Στην συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή (ΔΔ), αναλύθηκαν δείγματα από ένα δάσος κωνοφόρων (Abies cephalonica, στην ηπειρωτική Πάρνηθα) και ένα δάσος αγγειοσπέρμων (Quercus ilex, στο νησί της Άνδρου) της Ελλάδας. Τα δείγματα ελήφθησαν σε δύο περιόδους διαφορετικής ενεργότητας των μικροοργανισμών (χειμώνας-καλοκαίρι), από τέσσερις θέσεις (ανοιχτά/κλειστά διάκενα στην κόμη) του κάθε δάσους και τρία βάθη (επιφάνεια 0-2 cm, 2-7 cm και 7-15 cm). Οι μικροβιακές κοινότητες, προσδιορίστηκαν με μεταγονιδιωματική ανάλυση υψηλής απόδοσης των φυλογενετικών δεικτών της ριβοσωμικής επανάληψης rDNA (ITS περιοχή για τους μύκητες και 16S για τα Βακτήρια και Αρχαία). Με ανάλυση βασιζόμενη στη SILVA και στη UNITE βάση δεδομένων, οι καταγραφές (reads) που προέκυψαν αντιστοιχήθηκαν σε 334.639 OTUs (Operational Taxοnomic Units, λειτουργικές ταξινομικές μονάδες) για τα βακτήρια και σε 185.717 OTUs για του μύκητες αντίστοιχα, με τη χρήση του λογισμικού QIIME.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στα δύο δάση τα Ευβακτήρια (Bacteria) απαντώνται σε >95% αφθονία ενώ τα Αρχαιοβακτήρια (Archaea) σε Αντιστοίχως για τους μύκητες βρέθηκε ότι οι πλέον άφθονοι σε αυτά τα εδάφη ήταν οι Βασιδιομύκητες (~67%) και οι Ασκομύκητες (25%). Οι πολυπληθέστερες τάξεις Βασιδιομυκήτων ήταν οι Agaricales και (σε μικρότερο βαθμό) Russulales, Sebacinales, Gomphales, Geastrales, Hysterangiales και Trechisporales. Από τους Ασκομύκητες οι πιο άφθονες τάξεις ήταν των Pezizales, Sordariales, Xylariales και Eurotiales (κυρίως στην επιφάνεια του εδάφους, με δραστική μείωση στα βαθύτερα εδαφικά δείγματα). Όπως και στα βακτήρια, παρατηρήθηκε άμεση συσχέτιση αφθονίας των μυκήτων με την εποχή και το τύπο βλάστησης (π.χ. αύξηση των Agaricomycetes το καλοκαίρι στο δάσος της Άνδρου), το βάθος (αύξηση των Βασιδιομυκήτων σε βαθύτερα στρώματα και στα δύο δάση), καθώς και είδη/γένη εμφανιζόμενα στο ένα δάσος σε υψηλή αφθονία αλλά όχι στο άλλο, όπως και παρουσία τους σε μοναδικές θέσεις. Εντοπίσθηκαν ομοιότητες και διαφορές με άλλες Μεσογειακές εδαφικές κοινότητες μυκήτων, οι οποίες και συζητούνται.Για τον εντοπισμό μελών της ενζυμικής οικογένειας των υπεροξειδασών-καταλασών, εφαρμόσθηκε στοχευμένη μεταγονιδιωματική και μεταγραφωματική ανάλυση, κάνοντας χρήση «γενικευμένων» εκκινητών PCR οι οποίοι στοχεύουν στις υπεροξειδάσες Τάξης ΙΙ (λιγνινάσες ή υπεροξειδάσες λιγνίνης, lignin peroxidases LiP, μαγγανίου, manganese peroxidases MnP, και πολυλειτουργικές, versatile peroxidases, VP). Από τις ενισχυθείσες αλληλουχίες, 4.423.453 καταγραφές αντιστοιχήθηκαν σε 338.271 OTUs, τα οποία μετά από επεξεργασία (συγκρίσεις με το dbCAN) βρέθηκαν να ανήκουν σε 44.119 CAZymes OTUs. Για συγκριτικούς λόγους κατασκευάστηκε βάση δεδομένων με όλες τις δημοσίως διαθέσιμες αλληλουχίες υπεροξειδασών Τάξης ΙΙ, συμπεριλαμβανομένων και αυτών οι οποίες εντοπίσθηκαν σε ολοκληρωμένα γονιδιώματα Βασιδιομυκήτων (από NCBI και JGI Mycocosm) και βάσει αυτής έγινε η ένταξη των ενισχυόμενων αλληλουχιών σε συγκεκριμένα γονίδια (κριτήριο 0,97 ταυτότητας). Εκτός των γνωστών αλληλουχιών των γονιδίων αυτών των ενζύμων ανακαλύφθηκαν δεκάδες νέες –άγνωστες μέχρι σήμερα– υπεροξειδάσες μαγγανίου, καθώς και διττές υπεροξειδάσες. Στοίχιση και σύγκριση των αλληλουχιών που ενισχύθηκαν με γνωστές λειτουργικές υπεροξειδάσες Τάξης ΙΙ από Agaricomycetes, εκτός της ταυτοποίησης πολλών εξ αυτών, οδήγησαν και στον εντοπισμό της φυλογενετικής συγγένειας των νέων αλληλουχιών υπεροξειδασών. Οι στοιχίσεις τους έδειξαν εκτενείς πολυμορφισμούς, εντοπίστηκαν δε νέα ένζυμα και μελετήθηκαν τα σχετικά αμινοξικά κατάλοιπα σε ευρύ φυλογενετικό επίπεδο. Οι αλληλουχίες των ενζύμων που προέκυψαν από τα δύο δάση ήταν έξι φορές περισσότερες στην Πάρνηθα από ότι στην Άνδρο, και η πλειονότητά τους ήταν MnPs, ενώ οι VPs και LiPs εντοπίσθηκαν σε πολύ μικρότερο ποσοστό. Η μεγάλη αύξηση των αλληλουχιών υπεροξειδασών Τάξης ΙΙ παρατηρήθηκε στα βαθύτερα εδαφικά στρώματα και στα δύο δάση, ειδικότερα όταν εφαρμόζονταν nested PCR.Ο συχνός εντοπισμός μελών του γένους Ganoderma στα εδαφικά δείγματα και η δυσχέρεια ορθής ταυτοποίησης στελεχών του βάσει ευρέως χρησιμοποιούμενων μοριακών δεικτών οδήγησε σε εκτενέστερη φυλογενετική μελέτη και ανάλυση των υπεροξειδασών διάσπασης λιγνίνης του Ganoderma. Αυτό έγινε σε φυλογενετικό και λειτουργικό επίπεδο μέσω των προβλέψεων στερεοδιατάξεών τους, των χαρακτηριστικών αμινοξικών καταλοίπων, των επαναλήψεών τους και των εσωνίων τους. Προέκυψαν σημαντικά ευρήματα ως προς την ταξινόμηση αυτού του γένους, το οποίο έχει πολλές φαρμακευτικές και γενικότερα βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Η χρήση εξειδικευμένων εκκινητών που αναπτύχθηκαν στη διάρκεια της μελέτης επιτρέπει την ασφαλή ταυτοποίηση ειδών και διαφοροποίηση στελεχών αυτών.Η παρούσα διδακτορική διατριβή (ΔΔ) επιβεβαίωσε ότι τα ενεργά είδη μικροοργανισμών για λιγνινοκυτταρινόλυση στα εδάφη των δύο δασών ήταν περισσότερα στα τέλη της Άνοιξης, και ότι αύξαναν την παρουσία τους με το βάθος. Ο επιπρόσθετος εντοπισμός πλήθους αλληλουχιών βακτηρίων με μακρινή ομοιότητα με υπεροξειδάσες ενισχύει την υπόθεση της συνεργιστικής δράσης τους στην αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας. Αναδείχθηκε η σημασία της στοχευμένης «μετα-ωμικής» ανάλυσης για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό διαφορετικών μικροβιακών κοινοτήτων, ώστε να ανακτώνται νέα ένζυμα και να καθορίζονται δυνητικοί στόχοι για γενετικές τροποποιήσεις. Οι υπεροξειδάσες μελών των τάξεων Hysterangiales, Gomphales, Trechisporales και Gaestrales εντοπίζονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Η μεταγραφωματική ανάλυση επιλεγμένων δειγμάτων επέτρεψε την καλύτερη κατανόηση της σχετικής λειτουργικής σημασίας των διαφορετικών taxa μικροοργανισμών και ενζύμων που σχετίζονται με διαδικασίες λιγνινοκυτταρινόλυσης σε δασικά εδάφη.