Μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση του συνδρόμου Down του εμβρύου στο αίμα της εγκύου με μεθόδους βασιζόμενες στη διαφορική μεθυλίωση DNA του εμβρύου και της μητέρας
Authors: Τσαλίκη Ευδοκία 
Published: September 2021

Το σύνδρομο Down (ή Τρισωμία 21) (OMIM190685) θεωρείται η συχνότερη αιτία διανοητικής καθυστέρησης με συχνότητα εμφάνισης 1 στις 700 γεννήσεις σε όλους τους πληθυσμούς παγκοσμίως. Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος του συνδρόμου Down στις μέρες μας στηρίζεται στη χρήση υπερήχων σε συνδυασμό με τη μέτρηση βιοχημικών δεικτών στο μητρικό ορό, ενώ η προγεννητική διάγνωση στις περιπτώσεις κυήσεων υψηλού κινδύνου πραγματοποιείται με τον καρυότυπο και/ή την DNA ανάλυση εμβρυϊκών κυττάρων που απομονώνονται με τη λήψη χοριονικών λαχνών, την αμνιοπαρακέντηση ή την ομφαλοκέντηση. Οι διαδικασίες αυτές είναι επεμβατικές και σχετίζονται με ~1% κίνδυνο αποβολής. Για το λόγο αυτό, η ανάπτυξη μη επεμβατικών στρατηγικών που να δίνουν ακριβή και ασφαλή αποτελέσματα χωρίς να χρειάζονται περαιτέρω επιβεβαίωση είναι αναγκαία και υψίστης σημασίας. Η ανακάλυψη εξωκυτταρικού εμβρυϊκού DNA (cff-DNA : cell free fetal DNA) στη μητρική κυκλοφορία και η διαπίστωση ότι προέρχεται από κύτταρα πλακούντα (τροφοβλάστης) που υφίστανται απόπτωση έθεσαν τις βάσεις για την ανάπτυξη μη επεμβατικών προγεννητικών διαγνωστικών μεθοδολογιών. Προσφάτως, η ομάδα μας συνδύασε μια καινούρια μεθοδολογία γνωστή ως ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP) με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής ευκρίνειας (high-resolution tiling oligonoucleotide array) και ταυτοποίησε περισσότερες από 2000 διαφορικά μεθυλιωμένες DNA περιοχές (DMRs) κατά μήκος του χρωμοσώματος 21 μεταξύ εμβρύου και μητέρας. 12 DMRs που πληρούσαν κάποια βασικά κριτήρια επιλέχθηκαν για περαιτέρω διερεύνηση και τελικά 8 απ’ αυτές χρησιμοποιήθηκαν για το στήσιμο του πρώτου καθολικού μη επεμβατικού προγεννητικού διαγνωστικού τεστ για την τρισωμία 21 (NIPD21). Το τεστ αυτό στηριζόταν στην εφαρμογή των τεχνικών «MeDIP» και «ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου». Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά εκτιμήσαμε με ακρίβεια την ευαισθησία και την ειδικότητα του NIPD21 διαγνωστικού τεστ (έκδοση 1) προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι πρόκειται για μια πολύ αξιόπιστη και ασφαλή μέθοδο που μπορεί και αξίζει να χρησιμοποιηθεί στην κλινική έρευνα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε 100 κωδικοποιημένα δείγματα αίματος. Τόσο τα 60 φυσιολογικά όσο και τα 40 παθολογικά δείγματα που εξετάσαμε ταξινομήθηκαν σωστά επιδεικνύοντας 100% ευαισθησία και 100% ειδικότητα για το NIPD21 τεστ (έκδοση 1). Έπειτα, μελετήσαμε εκτενώς τα χαρακτηριστικά καθεμιάς από τις 12 διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs) που είχαν επιλεγεί αρχικά για να είμαστε σίγουροι ότι εξετάζουμε τις καλύτερες δυνατές περιοχές. Η διάκριση μεταξύ φυσιολογικών εγκυμοσυνών και εγκυμοσυνών με τρισωμία 21 βασίζεται στην ποσοτικοποίηση του επιπλέον αντιγράφου του χρωμοσώματος 21 και η ύπαρξη CNVs θα μπορούσε να επηρεάσει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και να οδηγήσει σε εσφαλμένη διάγνωση. Συνεπώς, δεν παραλείψαμε να διερευνήσουμε αν οι 8 DMRs του χρωμοσώματος 21 είναι ελεύθερες από πολυμορφισμούς αριθμού αντιγράφων (CNVs) ή όχι. Χρησιμοποιώντας την DGV βάση δεδομένων, διαπιστώσαμε ότι 2 από τις 8 DMRs βρίσκονται εντός χρωμοσωμικών περιοχών με CNVs και έπρεπε να απομακρυνθούν. Στη θέση τους μπήκε μια άλλη DMR ελεύθερη από πολυμορφισμούς (CNVs ή τμηματικούς διπλασιασμούς). Ακολούθησε επαναξιολόγηση της απόδοσης των 7 DMRs που απέμειναν και κατασκευή καινούριας εξίσωσης διάγνωσης (έκδοση 1.1). Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκε η ανάλυση διάκρισης ( discriminant analysis ) σε 75 περιστατικά με γνωστό καρυότυπο (50 φυσιολογικά και 25 παθολογικά). Το κέρδος από αυτή την αλλαγή στη μέθοδο είναι διπλό. Δημιουργήθηκε ένα νέο τεστ απαλλαγμένο από πολυμορφικές περιοχές, όπου συμμετέχουν λιγότερες περιοχές διαφορικής μεθυλίωσης μειώνοντας το κόστος, τον κόπο και το χρόνο εξαγωγής αποτελέσματος, αφού απαιτούνται λιγότερες αντιδράσεις ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. Μετά από την απομάκρυνση των δυο DMRs και την εισαγωγή μιας καινούριας, η ευαισθησία και η ειδικότητα του NIPD21 τεστ (έκδοση 1.1) έπρεπε να υπολογιστεί ξανά ούτως ώστε να εξασφαλίσουμε ότι δε μειώθηκε δραματικά η διακριτική ικανότητα του τεστ μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων. Στην προσπάθεια αυτή, χρησιμοποιηθήκαν 100 επιπλέον δείγματα με κρυφό καρυότυπο για να μην υπάρχει προκατάληψη. Η νέα και εκτενέστερη μελέτη επικύρωσης ( validation blind study ) έδειξε 99.2% ειδικότητα με 95% CI [95.62, 99.98] και 100% ευαισθησία με 95%CI [92.89, 100.00] για την NIPD21 μέθοδό μας. Ειδικότερα, τα 25 δείγματα με τρισωμία 21 και τα 74 από τα 75 φυσιολογικά δείγματα που εξετάστηκαν κατατάχθηκαν σωστά, ενώ ένα από τα 75 φυσιολογικά έδωσε οριακά ψευδώς θετική τιμή. Παράλληλα με την εκτενή μελέτη των 12 διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών που είχαν επιλεγεί στο παρελθόν από την ομάδα μας, εξετάσαμε μία προς μία πάνω τις υπόλοιπες 2000 υποψήφιες DMRs που προέκυψαν από την εφαρμογή των μικροσυστοιχιών ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής ευκρίνειας με σκοπό να δημιουργήσουμε ένα σύνολο διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών που δε θα συμμετέχουν στην εξίσωση πρόγνωσης 1.1, αλλά από το οποίο θα μπορούμε να αντλούμε επιπρόσθετες περιοχές για περαιτέρω διερεύνηση σε περιπτώσεις ασαφών περιστατικών με οριακές τιμές πρόγνωσης. Τα κριτήρια που θέσαμε ήταν πολύ αυστηρά με αποτέλεσμα μόλις το 2.5% να προχωρήσει σε περαιτέρω διερεύνηση.Επίσης, αξιολογήσαμε και βελτιστοποιήσαμε το πρωτόκολλο της μεθόδου. Καταφέραμε να αφαιρέσουμε το στάδιο της ενίσχυσης μέσω LM-PCR με τη χρήση απόλυτης αντί για σχετικής ποσοτικοποίησης και να συμπτύξουμε χρονοβόρα στάδια της MeDIP. Ακόμα, εφαρμόσαμε το NIPD21 σε μητρικό πλάσμα αντί για ολικό περιφερικό αίμα όπου τα ποσοστά cff-DNA είναι υψηλότερα και αντικαταστήσαμε τα EDTA σωληνάκια συλλογής αίματος από εναλλακτικά βελτιώνοντας εντυπωσιακά τα αποτελέσματα. Τέλος, κάναμε κάποιες εποικοδομητικές αλλαγές στο πρωτόκολλο, στον απαιτούμενο εξοπλισμό και στα ένζυμα που χρησιμοποιούνται καταφέρνοντας να μειώσουμε το χρόνο, το κόστος και τον κόπο. Είναι σαφές πλέον ότι η μέθοδός μας θα μπορεί να εφαρμοστεί για όλα τα δείγματα ανεξαρτήτως φύλου ή ύπαρξης συγκεκριμένων πολυμορφισμών (SNPs), σε όλα τα εργαστήρια παγκοσμίως εύκολα, με πολύ χαμηλό κόστος, χωρίς να απαιτείται ιδιαίτερα εξειδικευμένο προσωπικό και ακριβός εξοπλισμός, ενώ η διεξαγωγή του αποτελέσματος θα είναι δυνατή σε λιγότερο από 3 μέρες.