Πλαστικότητα των ουδετεροφίλων και ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης
Authors: Αντωνιάδου Χριστίνα 
Published: January 2024

Εισαγωγή: Τα ουδετερόφιλα αποτελούν βασικό συστατικό της έμφυτης/φυσικής ανοσίας (innate immunity) και κύριους επαγωγείς θρομβοφλεγμονής και ιστικής βλάβης. Η πλαστικότητα των ουδετεροφίλων, δηλαδή η ικανότητά των ώριμων μορφών τους να αποκτούν φαινοτυπική ετερογένεια και λειτουργική ευελιξία, όταν εκτίθενται σε διαφορετικά ερεθίσματα του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος, έχει πρόσφατα αναγνωρισθεί ως μια καίρια πτυχή της βιολογίας τους. O σχηματισμός και η απελευθέρωση των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων/παγίδων χρωματίνης (neutrophil extracellular traps – NETs), διακοσμημένων με δραστικές πρωτεΐνες, συνιστά κύρια έκφραση της πλαστικότητας των ουδετεροφίλων. Πολυάριθμες μελέτες καταδεικνύουν την απελευθέρωση των NETs (ΝΕΤωση) ως σημαντικό μηχανισμό άμυνας. Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα συνδέουν την απορρύθμιση της φυσικής ανοσολογικής απόκρισης, που οδηγεί σε εκσεσημασμένη NETωση, με την επαγωγή της φλεγμονής και της θρόμβωσης. Η σοβαρή λοίμωξη από τον ιό SARS-CoV-2 (COVID-19) αποτελεί πρόσφατα αναγνωρισμένο παράδειγμα νόσου, που χαρακτηρίζεται από απορρυθμισμένη ανοσολογική απόκριση και αυξημένη απελευθέρωση NETs. Συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά διασωλήνωσης, ενδονοσοκομειακής θνητότητας και απότοκων επιπλοκών, όπως οι μικρο- και μακρο-θρομβώσεις και η πνευμονική ίνωση, που συχνά αντικατοπτρίζουν την ισχυρή θρομβοφλεγμονώδη και ανοσοϊνωτική υποκείμενη διεργασία. Ο μεταγραφικός παράγοντας Krüppel-like factor 2 (KLF2) έχει συνδεθεί με την ίνωση και την θρομβοφλεγμονή που σχετίζεται με τα ουδετερόφιλα. Ωστόσο, ο ρόλος του στην COVID-19 παραμένει αδιευκρίνιστος. Σκοπός: Λαμβάνοντας υπόψιν την ετερογένεια και πολυπλοκότητα των μηχανισμών που χαρακτηρίζουν την απορρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης στην σοβαρή COVID-19, εφαρμόσθηκε, για πρώτη φορά, επιπλέον της καθιερωμένης θεραπευτικής προσέγγισης (standard-of-care – SOC), συνδυασμένη ανοσοτροποποιητική θεραπεία διάσωσης (COMBI), με στόχο την μείωση της ανάγκης για μηχανικό αερισμό και την αύξηση της επιβίωσης, σε μη διασωληνωμένους ασθενείς με COVID-19-σχετιζόμενη σοβαρή αναπνευστική ανεπάρκεια (PaO2/FiO2 <100 mmHg). Στο πειραματικό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκε η συνομιλία μεταξύ του άξονα ουδετεροφίλων/NETs και των ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών, καθώς και η επίδρασή του πλάσματος στο θρομβωτικό και ινωτικό δυναμικό αυτών, στα πλαίσια της σοβαρής COVID-19. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της ινωτικής δραστηριότητας των πνευμονικών ινοβλαστών με την έκφραση του KLF2 στο περιβάλλον της COVID-19. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη των κλινικών δεδομένων των ασθενών κατά την εφαρμογή διαφορετικών ανοσοτροποποιητικών παρεμβάσεων και συσχέτισή τους με τα ερευνητικά αποτελέσματα. Απώτερος σκοπός ήταν η ανάδειξη πιθανών μελλοντικών στόχων στην πρόγνωση και θεραπεία ανοσοϊνωτικών νοσημάτων με παρόμοιο παθογενετικό υπόστρωμα. Υλικά και μέθοδοι: Στο κλινικό μέρος της μελέτης, αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν 4 ομάδες ασθενών με σοβαρή αναπνευστική ανεπάρκεια (SRF), που υποβλήθηκαν σε διαφορετικές θεραπευτικές παρεμβάσεις. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση του πρωτότυπου θεραπευτικού πρωτοκόλλου διάσωσης COMBI, που περιλάμβανε συνδυασμό εισπνεόμενης DNase I, baricitinib και tocilizumab, για την αναστολή των NETs, της JAK1/2 σηματοδότησης και της IL-6, αντίστοιχα. Τα δεδομένα της συνδυασμένης θεραπείας COMBI συγκρίθηκαν με την SOC θεραπεία ή τις μονοθεραπείες έναντι της IL-1 (anakinra) ή της IL-6 (tocilizumab). Στο μεταφραστικό-ερευνητικό μέρος της μελέτης, απομονώθηκαν ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες (lung fibroblasts – LFs) από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διαγνωστική βιοψία πνεύμονα. Οι in vitro διεγέρσεις στους LFs πραγματοποιήθηκαν είτε με πλάσμα ασθενών, που ελήφθη προτού λάβουν οποιαδήποτε θεραπεία, είτε με δομές NETs, που απομονώθηκαν κατόπιν in vitro επώασης υγιών ουδετεροφίλων με πλάσμα ασθενών (COV NETs). Για την αξιολόγηση της επίδρασης του COVID-19 περιβάλλοντος (πλάσμα ή NETs) στους LFs χρησιμοποιήθηκε RT-qPCR, in-cell ELISA (Cytoblot), μικροσκόπηση ανοσοφθορισμού, μέτρηση παραγωγής κολλαγόνου και λειτουργική δοκιμασία επούλωσης – κυτταρικής μετανάστευσης (wound healing assay). Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες αξιολόγησης αναστολέων, χρησιμοποιώντας τους παράγοντες του πρωτοκόλλου COMBI (DNase I, baricitinib, tocilizumab), ώστε να διερευνηθεί ο ρόλος της σηματοδότησης μέσω των NETs, της οδού JAK1/2 και της IL-6. Αποτελέσματα: Σε κλινικό επίπεδο, η θεραπεία COMBI συσχετίσθηκε με χαμηλότερη ενδονοσοκομειακή θνητότητα, μειωμένο ποσοστό διασωλήνωσης, μικρότερη διάρκεια νοσηλείας και παρατεταμένη συνολική επιβίωση, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Σε πειραματικό επίπεδο, η in vitro διέγερση των LFs με το περιβάλλον της COVID-19 επήγαγε την οδό του ιστικού παράγοντα (TF)/θρομβίνης, ενώ η εφαρμογή των ανοσοτροποποιητικών παραγόντων του COMBI ανέστειλε σημαντικά το φαινόμενο. Επιπλέον, έπειτα από επώαση με πλάσμα COVID-19 ή με COV NETs, οι LFs απέκτησαν προ-ινωτικό φαινότυπο, που χαρακτηρίσθηκε από αυξημένη έκφραση CCN2 (Cellular Communication Network Factor 2), αυξητικού παράγοντα που συσχετίζεται καθοριστικά με την ινωτική αναδιαμόρφωση, και από υψηλή παραγωγή κολλαγόνου. Το παραπάνω φαινόμενο συσχετίστηκε με την προς-τα-κάτω ρύθμιση (down-regulation) του KLF2 στους πνευμονικούς ινοβλάστες. Αντιθέτως, η προ-επώαση των LFs με τους παράγοντες του COMBI πρωτοκόλλου, αποκατέστησε την μειωμένη έκφραση του KLF2, μειώνοντας παράλληλα την ινωτική τους δραστηριότητα. Το πλάσμα των ασθενών 7 ημέρες μετά από θεραπεία με COMBI παρουσίασε σημαντικά μειωμένη ικανότητα επαγωγής του ινωτικού δυναμικού των LFs (δηλαδή μείωση της έκφρασης του CCN2 με σύγχρονη αποκατάσταση της μειωμένης έκφρασης του KLF2), συγκριτικά με το αντίστοιχο πλάσμα ασθενών της ομάδας που έλαβαν μόνο SOC. Συμπεράσματα: Η θεραπεία διάσωσης COMBI συσχετίσθηκε με βελτίωση της κλινικής έκβασης, σε σύγκριση με την SOC θεραπεία ή με τις μη-συνδυασμένες ανοσοτροποποιητικές θεραπείες. Το περιβάλλον της σοβαρής COVID-19 επάγει το θρομβωτικό και ινωτικό δυναμικό των LFs μέσω διαφορετικών μονοπατιών, συμπεριλαμβανομένου του άξονα ουδετερόφιλου/NETs, της σηματοδότησης μέσω JAK1/2 και της IL-6. Η αποδόμηση των NETs μέσω της DNase I, και η επακόλουθη αδρανοποίηση των μεσολαβητών που φέρουν, επισημαίνουν, αφενός, τον κεντρικό ρόλο της NETωσης, μιας διαδικασίας έκφρασης της ουδετεροφιλικής πλαστικότητας, στην θρομβοφλεγμονώδη και ανοσοϊνωτική διαδικασία της COVID-19 και, αφετέρου, την δομική ακεραιότητα των NETs ως απαραίτητη προϋπόθεση για την διατήρηση της λειτουργικότητάς τους. Τα in vitro αποτελέσματα που προκύπτουν από την αναστολή του άξονα TF/θρομβίνης και του ινωτικού μονοπατιού στους LFs συνάδουν με τις παραπάνω κλινικές παρατηρήσεις, προσφέροντας πιθανές μηχανιστικές ερμηνείες. Επιπλέον, η αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του KLF2 και της ινωτικής δραστηριότητας των LFs, προτείνει τον KLF2 ως σημαντικό ρυθμιστή της ινωτικής διεργασίας στην σοβαρή COVID-19. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δύνανται να αξιοποιηθούν μελλοντικά και σε άλλες, συναφείς παθογενετικά με την COVID-19, οξείες ή χρόνιες, φλεγμονώδεις ανοσοϊνωτικές καταστάσεις.