Ο ρόλος της Tip60 στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων κυτταροκινών των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων
Authors: Αγγελετοπούλου Ιωάννα 
Published: September 2021

H ιντερλευκίνη-2 (IL-2) είναι η πρώτη κυτταροκίνη που εκφράζεται στα παρθενικά Τ βοηθητικά (Τh) λεμφοκύτταρα όταν αυτά ενεργοποιηθούν και είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των παρθενικών Th κυττάρων σε επαγώγιμα Τh0 κύτταρα. Η μεταγραφή της IL-2 παραμένει ανενεργή προεπαγωγικά μέσω ρύθμισης που πραγματοποιείται σε μια μικρή περιοχή του υποκινητή της, που εκτείνεται από το -292 έως το -273bp. Η περιοχή αυτή ονομάζεται ARRE-2 και αποτελεί περιοχή πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα NFAT. Μια εκτεταμένη in silico ανάλυση μορίων στην περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 αποκάλυψε τουλάχιστον 25 διαφορετικούς παράγοντες που μπορούν να στρατολογούνται στην παραπάνω περιοχή, ανάμεσα στους οποίους ήταν ο παράγοντας Ets-2 και η οικογένεια των ακετυλοτρανσφερασών MYST. Σε πρόσφατη δημοσίευση του εργαστηρίου μας δείξαμε ότι ο Ets-2 δεσμεύεται στην περιοχή ARRE-2 και ενέχει δράση προεπαγωγικού καταστολέα καθώς υπερέκφρασή του και ταυτόχρονη πρόσδεσή του στην ARRE-2 DNA ακολουθία μειώνει την έκφραση της IL-2. Η δε έκφρασή του σε ενεργοποιημένα παρθενικά Τh κύτταρα μειώνεται, με παράλληλη αύξηση της έκφρασης της IL-2. Παράλληλα, πρόσφατη δημοσίευση του εργαστηρίου μας έδειξε ότι ο Εts-2 συμμετέχει στη καταστολή της μεταγραφής του HIV-1. Η ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1 στα ανθρώπινα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα είναι παρόμοια αφού σε ομόλογες περιοχές του LTR του ιού και του υποκινητή της IL-2 προσδένονται ένα ή περισσότερα κοινά μόρια. Από την άλλη έχει δειχτεί ότι η Tip60 συμμετέχει στην μεταγραφική ρύθμιση του HIV-1 καθώς απομονώθηκε σαν αλληλεπιδρώσα με την πρωτεΐνη Tat του ιού. Τα μέλη της οικογένειας MYST, μεταξύ αυτών και η Tip60, δρουν ως ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών υποδηλώνοντας πιθανούς ρόλους στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην γονιδιακή ρύθμιση. Η ικανότητα της Tip60 να ακετυλιώνει τις ιστόνες, κάνει ελκυστική την εμπλοκή της δομής της χρωματίνης στην υπό μελέτη διαδικασία της μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου της IL-2. Ο συνδυασμός των παραπάνω παρατηρήσεων μας ώθησε να ασχοληθούμε με τη μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης Tip60 στην έκφραση γονιδίων των κυτταροκινών και ειδικότερα της IL-2. Συγκεκριμένα η παρούσα διατριβή στοχεύει στην διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της IL-2 μέσω της Tip60 και πιθανών αλληλεπιδράσεών της με παράγοντες κλειδιά που συμμετέχουν στην ρύθμιση του γονιδίου, όπως τον παράγοντα NFAT2 και τον Ets-2.Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποστηρίζουν ότι η Tip60 δρα επαγωγικά στην μεταγραφική ενεργότητα της IL-2. Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση της Tip60 οδήγησε σε σταδιακή αύξηση της γονιδιακής έκφρασης της IL-2 στα ενεργοποιημένα κύτταρα Jurkat ενώ δεν είχε αντίκτυπο στα εν ηρεμία κύτταρα. Αντίστοιχα η αποσιώπηση της έκφρασης της Tip60, οδήγησε σε μείωση της έκφρασης της IL-2 παρουσία σημάτων ενεργοποίησης. Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν ο επαγωγικός ρόλος της Tip60 προέρχεται αμιγώς από την ίδια ή ενδεχομένως η δράση της ασκείται μέσω ενός συμπλόκου, ελέγχθηκε η ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των Tip60 και άλλων σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 όπως του NFAT2 και του Εts-2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρξε αλληλεπίδραση μεταξύ των NFAT2 και Tip60 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε επίσης και μεταξύ των Tip60 και Εts-2 τόσο όταν τα κύτταρα ήταν εν ηρεμία αλλά και μετά την ενεργοποίησή τους. Δεν ανιχνεύθηκε αλληλεπίδραση μεταξύ των NFAT2 και Εts-2 σε καμία συνθήκη. Εφόσον ανιχνεύσαμε τις αλληλεπιδράσεις της Tip60 με τον παράγοντα Ets-2 και με τον NFAT2, ελέγξαμε το εάν η ρύθμιση της μεταγραφής της IL-2 επηρεάζεται από την στρατολόγηση των Tip60 και Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Tip60 και ο παράγοντας Ets-2 στρατολογούνται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 σε συνθήκες ηρεμίας. Η ενεργοποίηση των κυττάρων οδήγησε σε μειωμένη ικανότητα δέσμευσης των Tip60 και Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία και στη μεταφορά και στρατολόγηση των δυο αυτών πρωτεϊνών στην ARRE-1/TATA box αλληλουχία, περιοχή απαραίτητη για την ενεργοποίηση της IL-2. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας δείχνουν ότι η Tip60 δρα ως συνενεργοποιητής της μεταγραφής της IL-2. Παράλληλα, η Tip60 και ο παράγοντας Εts-2 φαίνεται να δρουν μέσω ενός κοινού συμπλόκου, στο οποίο προσαρτάται και ο παράγοντας NFAT2 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Η στρατολόγηση των Tip60 και Εts-2 στην θέση ARRE-2 σε συνθήκες ηρεμίας όπου η IL-2 είναι σε καταστολή και η μετακίνηση των πρωτεϊνών αυτών στην περιοχή ARRE-1 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων, η οποία συμπίπτει με την επαγωγή της μεταγραφικής δραστηριότητας του γονιδίου, καταμαρτυρούν την σπουδαιότητα της Tip60 στη διαδικασία αυτή. Η συμμετοχή των Tip60 και Ets-2 στην μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της IL-2 μας ώθησε να εξετάσουμε το εάν ενδεχόμενη απορρύθμιση του παραπάνω μηχανισμού σχετίζεται με την παθογένεια αυτοάνοσων νοσημάτων. Αυξημένα επίπεδα της IL-2 έχουν βρεθεί στον ορό ασθενών που βρίσκονται στην ενεργή φάση της νόσου της Σκλήρυνσης κατά Πλάκας (ΣΚΠ). Παράλληλα, πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας, έδειξε ότι η έκφραση του παράγοντα Εts-2 είναι μειωμένη στα παρθενικά Th λεμφοκύτταρα ασθενών που πάσχουν από το τύπου Th1 αυτοάνοσο νόσημα ΣΚΠ, ενώ βρέθηκε ανικανότητα πρόσδεσης του Εts-2 στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 στα κύτταρα αυτά. Έτσι, στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκε η έκφραση της Tip60 σε απομονωμένους πληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων που απομονώθηκαν από ασθενείς με ΣΚΠ σε σύγκριση με υγιείς δότες. Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη γονιδιακή έκφραση της Tip60 στα κύτταρα των ασθενών η οποία συμπίπτει με την αυξημένη έκφραση της IL-2. Ο παράγοντας NFAT2 παρουσίασε παρόμοια επίπεδα έκφρασης τόσο στα παρθενικά όσο και στα μνημονικά Th κύτταρα μεταξύ υγιών και ΣΚΠ ασθενών. Συνεπώς συμπεραίνουμε ότι για την αύξηση των επιπέδων της IL-2 σε ασθενείς με ΣΚΠ πιθανόν να οφείλεται η παρουσία «βλάβης» στο κατασταλτικό μηχανισμό δράσης της έκφρασής της μέσω της μειωμένης σύνθεσης και πρόσδεσης στην αλληλουχία ARRE-2 του παράγοντα Ets-2. Παράλληλα, τα αυξημένα επίπεδα της ΙL-2 στα μνημονικά Th κύτταρα πιθανόν να οφείλονται στα αυξημένα επίπεδα της Tip60 η οποία φαίνεται να ασκεί την επαγωγική της δράση και σε παθολογικές καταστάσεις.