Μελέτη της έκφρασης της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ και πιθανών ισομορφών της σε διάφορους ιστούς
Authors: Καρούσης Ευάγγελος 
Published: September 2021

Μετά τον κεντρικό βιολογικό ρόλο που έχει αποδωθεί στα μόρια RNA ως ρυθμιστέςτης γονιδιακής έκφρασης, ο ενδοκυττάριος μεταβολισμός τους αποτελεί περισσότερο απόποτέ αντικείμενο συστηματικής έρευνας. Έτσι, η ιστο-και χρονο-ειδική αποικοδόμηση τωνμορίων RNA θεωρείται ότι εμπλέκεται σε ένα μεγάλο πλήθος βιολογικών μηχανισμών πουμέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ασύνδετοι με τη ρύθμιστη της γονιδιακής έκφρασης.Οι ριβονουκλεάσες, που αποτελούν τους βιολογικούς καταλύτες για τονκαταβολισμό του RNA εμπλέκονται επίσης και σε ένα μεγάλο αριθμό βιολογικώνδιεργασιών ως παράγοντες ωρίμανσης και "ποιοτικού ελέγχου", ως αμυντικοί μηχανισμοίέναντι ιικών μορίων RNA αλλά και ως παράγοντες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.Παρά τη μεγάλη ετερογένειά τους χαρακτηρίζονται στο σύνολό τους σχεδόν από υψηλήαποδοτικότητα, πλειοτροπική δράση – όπου το ίδιο μόριο RNA μπορεί να αποτελεί στόχογια περισσότερες από μία ριβονουκλεάσες – και τη δυνατότητα πολλαπλών λειτουργιών –όπου μία ριβονουκλεάση μπορεί να διασπά έναν μεγάλο αριθμό RNA-στόχων.Στο σύνολό τους, οι ριβονουκλεάσες δρουν στα πλαίσια ενός πολύπλοκου δικτύουαποικοδόμησης RNA μορίων που κατευθύνεται από μηχανισμούς λεπτομερούς ρύθμισης.Κατά τη δράση τους αλληλεπιδρούν με ένα σύνολο κυτταρικών παραγόντων που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες (RNA πολυμεράσες, ελικάσες, πρωτεΐνες συνοδούς καιαναστολείς), ρυθμιστικά RNA μόρια (όπως τα miRNAs) και άλλα μικρά μόρια πουεξασφαλίζουν έναν δυναμικό μηχανισμό ρύθμιστης των ενδογενών επιπέδων RNA πουβρίσκεται σε συνεχή συντονισμό με το κυτταρικό περιβάλλον προκειμένου ναικανοποιούνται οι ιστοειδικές, αναπτυξιακές και μεταβολικές απαιτήσεις πουεξασφαλίζουν την κυτταρική αύξηση, διαφοροποίηση και λειτουργία.Η πρωτεϊνική οικογένεια της ριβονουκλεάσης κ αποτελεί αντικείμενοσυστηματικής έρευνας του εργαστηρίου μας. Πρόκειται για μια ορθόλογη πρωτεϊνικήοικογένεια με αντιπροσώπους σε όλα τα Μετάζωα από το φύλο των Κνιδοζώων μέχρι τονάνθρωπο. Οι πρωτεϊνικοί αντιπρόσωποί της παρουσιάζουν υψηλό βαθμόσυντηρητικότητας, γεγονός που υποδηλώνει υψηλή εξελικτική πίεση που οδήγησε στηδιατήρηση των αντίστοιχων μορίων. Η ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ εκφράζεται σε όλουςτους ιστούς και αναπτυξιακά στάδια σε επίπεδο mRNA. Το γονίδιο της ανθρώπινηςριβονουκλεάσης κ εδράζεται στο χρωμόσωμα 17 και ακολουθεί το αυστηρό πρότυπογονιδιακής οργάνωσης της οικογένειας που χαρακτηρίζεται από τρία εξώνια και δύο εσώνια. Κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης 98 αμινοξικών καταλοίπων και μοριακούβάρους 10,98 kDa. Δεν αναστέλλεται από τον αναστολέα RI της υπεροικογένειας Αριβονουκλεασών ενώ διασπά κυρίως ApG και ApU φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Τέλος,απαραίτητη προϋπόθεση για την καταλυτική ενεργότητα του μορίου είναι ο σχηματισμόςενός δισουλφιδικού δεσμού μεταξύ των καταλοίπων κυστεΐνης 6 και 69.Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης της ανθρώπινηςριβονουκλεάσης κ και πιθανών ισομορφών της σε διάφορους ιστούς. Στα πλαίσια τηςέρευνας αυτής απομονώθηκε και μελετήθηκε μια νέα εναλλακτική ισομορφή, η ανθρώπινηριβονουκλεάση κ-02.Σύμφωνα με EST δεδομένα, η ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ εκφράζεται σε έναπλήθος ιστών, σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Προκειμένου να επαληθεύσουμεπειραματικά την έκφραση αυτή σε επίπεδο RNA, προχωρήσαμε στην καλλιέργεια 6κυτταρικών σειρών που αντιστοιχούν σε ιστούς διαφορετικής προέλευσης, από όλες τιςκυτταρικές σειρές απομονώθηκε RNA υψηλής ποιότητας και ακολούθησε ανάλυση κατάNorthern. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν την παρουσία ενός κύριου μεταγράφουμήκους 800 περίπου βάσεων σε όλες τις κυτταρικές σειρές γεγονός που επαληθεύει καιπειραματικά την ευρεία έκφραση του mRNA της ανθρώπινης RNάσης κ σε ένα μεγάλοεύρος κυτταρικών τύπων.H έρευνα σε βάσεις EST δεδομένων οδήγησε επίσης στην αποκάλυψη ενόςυποσυνόλου EST αλληλουχιών που παρουσιάζει μία μικρή διαφορά σε σχέση με τηνκλωνοποιημένη ισομορφή της ανθρώπινης RNάσης κ. Έπειτα από στοίχιση τωναλληλουχιών αυτών, που εντοπίστηκαν σε έναν μεγάλο αριθμό κυτταρικών τύπων, με τογονίδιο της RNάσης κ βρέθηκε ότι υπολείπονται σε μία αλληλουχία 4 συνεχόμενωννουκλεοτιδικών βάσεων, γεγονός που προκύπτει από εναλλακτική συρραφή μικρήςέκτασης (subtle alternative splicing). Για την απομόνωση και κλωνοποίηση της ισομορφήςαυτής εφαρμόστηκε με τροποποιήσεις η μέθοδος επιλογής μέσω υβριδισμού, η οποία είχεεφαρμοστεί στο παρελθόν με επιτυχία για την απομόνωση του εναλλακτικού μεταγράφουτης RNάσης κ του εντόμου Ceratitis capitata. Ο κλώνος cDNA που απομονώθηκε έχει μήκος540 ζευγών βάσεων και περιέχει ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που κωδικοποιεί τησύνθεση μιας πρωτεΐνης μήκους 134 αμινοξικών καταλοίπων με υπολογιζόμενο μοριακόβάρος 14.900 Da. Η πρωτεΐνη αυτή κωδικοποιείται με χρήση ενός αναρροϊκού κωδικονίουέναρξης σε σχέση με την κλωνοποιημένη κ-01 ισομορφή το οποίο εμφανίζει μεγάληπιθανότητα σύνθεσης εναρκτήριας μεθειονίνης (68%). Η αμινοξική στοίχιση των πρωτεϊνικών αλληλουχιών των δύο ισομορφών της RNάσης κ δεν αποκάλυψε καμίαομοιότητα στο αμινοτελικό τμήμα. Αντίθετα, το τμήμα της αμινοξικής αλληλουχίας 63-134της RNάσης κ-02 είναι πανομοιότυπο με την αμινοξική αλληλουχία 27-98 της RNάσης κ-01.Σε ένα πρώτο στάδιο προχωρήσαμε στη διαλεύκανση των βιοχημικών ιδιοτήτωντης εναλλακτικής πρωτεΐνικής ισομορφής. Για το λόγο αυτό προχωρήσαμε στηνετερόλογη έκφραση της ανασυνδυασμένης RNάσης κ-02 στο σύστημα του ζυμομύκηταPichia pastoris και στον μερικό χρωματογραφικό της καθαρισμό. To ανασυνδυασμένοένζυμο που απομονώθηκε χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ενεργότητας καιτης υποστρωματικής εξειδίκευσης της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ-02 έναντι ενόςσυνόλου συνθετικών RNA και RNA-DNA ραδιενεργά σημασμένων υποστρωμάτων. Τααποτελέσματα ανάλυσης των προϊόντων ενζυμικής δράσης του ενζύμου έναντι ενόςμονόκλωνου τριανταμερούς RNA υποστρώματος που περιλαμβάνει όλους τους πιθανούςσυνδυασμούς φωσφοδιεστερικών δεσμών έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη RNάση κ-02καταλύει τη διάσπαση κυρίως ApG και ApU φωσφοδιεστερικών δεσμών. Για την περαιτέρω μελέτη εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα ακολούθησε ηχρήση μιας σειράς οκτανουκλεοτιδίων του τύπου 5΄-dΝdΝdΝrAdGdNdNdN-3΄ και 5΄-dΤdΤdΤrAdNdΤdΤdΤ-3΄, όπου περιέχουν μία μόνο θέση υδρόλυσης από την ανθρώπινηRNάση κ-02. Η ανάλυση των προϊόντων δράσης του ενζύμου έναντι των υποστρωμάτωνέδειξε ότι η ενεργότητα της RNάσης κ-02 επηρεάζεται από την αλληλουχία βάσεωνεκατέρωθεν του φωσφοδιεστερικού δεσμού που υδρολύεται. Το ανθρώπινο ένζυμο δρααποδοτικότερα έναντι του υποστρώματος που φέρει κατάλοιπα θυμίνης εκατέρωθεν τουApG δεσμού. Επίσης η ενεργότητα επηρεάζεται και από το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο πουέπεται της αδενίνης στην θέση διάσπασης διασπώντας κυρίως ApG και ApTφωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Επίσης με την χρήση κατάλληλων υποστρωμάτωνπροσδιορίστηκε το βέλτιστο pH δράσης του ενζύμου στην τιμή 6,0 ενώ η ενεργότητά τουεπηρεάζεται από την ιονική ισχύ του διαλύματος.Προκειμένου να διερευνήσουμε κατά πόσο εμφανίζει παρόμοια συγγένεια ως προςτο βέλτιστο συνθετικό υπόστρωμα η εναλλακτική πρωτεϊνική ισομορφή RNάση κ-02 με τημελετημένη ισομορφή RNάση κ-01 προχωρήσαμε σε μία πρώτη προσέγγιση κινητικήςμελέτης της RNάσης κ-02. Συγκεκριμένα, αναπτύξαμε μία συνεχή ενζυμική δοκιμασίαέναντι του φθορίζοντος μορίου subΒ με αλληλουχία: 5΄-FAM –dTdTdTdTdTrAdGdTdTdTdTdT-BHQ1-3΄. Η δοκιμασία αυτή επιτρέπει την παρακολούθηση της ενζυμικής αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο μέσω της απόσβεσης τουφθορισμού του μορίου FAM στο ακέραιο υπόστρωμα λόγω φαινομένου FRET και τηςεκπομπής φθορίζουσας ακτινοβολίας μόνο μετά την υδρόλυση του ApG δεσμού από τηριβονουκλεάση. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης που πραγματοποιήθηκε για τις RNάσες κ-01 και κ-02 έδειξαν ότι εμφανίζουν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης του συγκεκριμένουυποστρώματος παρά τη σημαντική αμινοξική διαφορά τους στο αμινοτελικό τους άκρο.Σε ένα επόμενο επίπεδο θεωρήθηκε σκόπιμη η διερεύνηση των συγκριτικώνεπιπέδων έκφρασης των δύο ισομορφών σε επίπεδο mRNA σε ένα σύνολο ανθρώπινωνκυτταρικών σειρών διαφορετικής προέλευσης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι δύοισομορφές διαφέρουν μεταξύ τους σε πολύ μικρό βαθμό συνεπώς ο συγκριτικόςπροσδιορισμός των επιπέδων έκφρασής τους δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί με χρήσηειδικών εκκινητών και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Για τολόγο αυτό, αναπτύξαμε μια νέα μοριακή δοκιμασία που επιτρέπει τη σχετικήποσοτικοποίηση των δύο μεταγράφων προσδιορίζοντας την αναλογία έκφρασής τους(RNάση κ-01/RNάση κ-02) σε ένα μεγάλο εύρος ανθρώπινων κυτταρικών σειρών. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης ανάλυσης έδειξαν ότι η RNάση κ-02 εκφράζεται σε όλεςτις περιπτώσεις ενώ η αναλογία RNάση κ-01/RNάση κ-02 κυμαίνεται από 1,45 (κυτταρικήσειρά HEK-293) έως 9,06 (κυτταρική σειρά AGS).Όπως είναι γνωστό, ένας μεγάλος αριθμός μεταγράφων δεν κωδικοποιεί τησύνθεση πρωτεϊνών. Συνεπώς, ένα κρίσιμο ερώτημα στα πλαίσια του χαρακτηρισμού τουμεταγράφου της RNάσης κ-02 ήταν κατά πόσο κωδικοποιεί τη σύνθεση πρωτεΐνης σεανθρώπινα κύτταρα. Για το λόγο αυτό, στα πλαίσια της παρούσας διατριβήςπροχωρήσαμε στην ανάπτυξη, τον ανοσοκαθαρισμό και το βιοχημικό χαρακτηρισμό ενόςειδικού για την RNάση κ-02 πολυκλωνικού αντισώματος. Λαμβάνοντας υπόψη την υψηλάυδρόφοβη φύση της RNάσης κ-02 προχωρήσαμε στην εφαρμογή μιας μεθοδολογίας πουεπιτρέπει τον εμπλουτισμό υψηλά υδρόφοβων μορίων σε κυτταρικά εκχυλίσματα από ένασύνολο πέντε κυτταρικών διαφορετικής προέλευσης. Έπειτα από κατάλληλη κατεργασίατων πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων και διαχωρισμό των φάσεων, τα κλάσματα πουπροέκυψαν υποβλήθηκαν σε ανοσοεντοπισμό κατά Western χρησιμοποιώντας τοανοσοκαθαρισμένο αντίσωμα. Η RNάση κ-02 εντοπίζεται ως μοναδική ζώνη στηναδιάλυτη φάση ενώ η ειδικότητα της ανίχνευσης επαληθεύθηκε με την επανάληψη τουπειράματος έπειτα από καταστολή της έκφρασης της RNάσης κ-02 μέσω RNAi σεανθρώπινα κύτταρα νεφρού. Στα πλαίσια της μελέτης της έκφρασης της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ-02 σεανθρώπινες κυτταρικές σειρές προχωρήσαμε στη διερεύνηση του υποκυτταρικού τηςεντοπισμού μέσω ανοσοφθορισμού. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας το ειδικό για τηνRNάση κ-02 πολυκλωνικό αντίσωμα προχωρήσαμε στον ανοσολογικό της εντοπισμό σεανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον δευτερογενές αντίσωμα καισυνεστιακή μικροσκοπία. Από τη συγκεκριμένη προσέγγιση προέκυψε ότι η ανθρώπινηριβονουκλεάση κ-02 κατανέμεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων ενώ τοφθορίζον σήμα σχεδόν εκμηδενίστηκε έπειτα από καταστολή της έκφρασης της RNάσης κ-02 μέσω RNAi. Συνολικά, η εργασία που επιτεύχθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβήςαναδεικνύει τη δυναμική πλαστικότητα του ανθρώπινου γονιδιώματος, καθώς μία μικρήδιαφοροποίηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε επίπεδο mRNA μπορεί ναεκδηλώνεται σαν σημαντική αλλαγή σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η διαφορά στην αμινοξικήαλληλουχία του αμινοτελικού άκρου των δύο ισομορφών της ανθρώπινης ριβονουκλεάσηςκ υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή των ενζύμων σε διαφορετικές κυτταρικές διαδικασίες ήσε μηχανισμούς λεπτής ρύθμισης, ένδειξη που καθιστά τη μελλοντική διαλεύκανση τουβιολογικού τους ρόλου ακόμα πιο επιτακτική.