Ανάπτυξη νέων αναλυτικών τεχνικών για τις βιοδραστικές φαινόλες της ελιάς και μελέτη της δραστικότητας τους σε ανθρώπους και σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινης προέλευσης
Authors: Παπακωνσταντίνου Αικατερίνη 
Published: October 2024

Το ελαιόδεντρο (Olea europaea) έχει ιδιαίτερη πολιτιστική σημασία τόσο για την Ελλάδα, όσο και για την ευρύτερη περιοχή της Μεσογείου, όπου η καλλιέργεια του έχει χιλιάδες χρόνια ιστορία. Η καλλιέργεια της ελιάς παραμένει σήμερα ζωντανή αντιπροσωπεύοντας έναν οικονομικό και πολιτιστικό πυλώνα της σύγχρονης γεωργίας παγκοσμίως. Το ελαιόλαδο, που είναι το προϊόν επεξεργασίας του καρπού της ελιάς με μηχανικά μέσα, αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα βρώσιμα έλαια και βασικό συστατικό της Μεσογειακής διατροφής. Το διατροφικό αυτό μοντέλο διατροφής, με χιλιετίες ιστορίας, έχει συνδεθεί με πολύ ευεργετικά αποτελέσματα για την υγεία, πολλά από τα οποία συσχετίζονται με το ελαιόλαδο. Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια, πληθώρα μελετών αποδεικνύουν ότι υπεύθυνο για τις σημαντικές υγειοπροστατευτικές ιδιότητες του ελαιολάδου είναι περισσότερο το φαινολικό του κλάσμα, παρά η λιπιδική του σύσταση. Οι φαινολικές ενώσεις του ελαιολάδου έχουν βρεθεί ότι διαθέτουν σημαντικές χημειοπροστατευτικές και αντικαρκινικές ιδιότητες έναντι πολλών ειδών καρκίνου, δρουν ευεργετικά σε πολλές καρδιαγγειακές και νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ενώ πολλές μελέτες υποστηρίζουν επίσης την ευεργετική τους δράση και σε άλλες ασθένειες όπως ο διαβήτης και η οστεοπόρωση. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, ασχοληθήκαμε με τις φαινόλες της ελιάς - ελαιοκανθάλη, ελαιασίνη, άγλυκο ελευρωπαΐνης, άγλυκο λιγκστροσίδη, ελαιομισσιονάλη και ελαιοκανθαλικό οξύ – εστιάζοντας σε δύο σημαντικούς τομείς μελέτης τους: τις μεθόδους ποσοτικής ανάλυσης και τις αντικαρκινικές ιδιότητές τους τόσο σε ex vivo όσο και σε in vivo συστήματα. Στο πρώτο μέρος (Κεφάλαιο 1), παρατίθενται κάποια εισαγωγικά στοιχεία σχετικά με το ελαιόδεντρο τον καρπό της ελιάς και το ελαιόλαδο, που συμπεριλαμβάνουν κάποια ιστορικά στοιχεία, τη βοτανική κατάταξη, την καλλιέργεια, τις ποικιλίες, τη χημική σύσταση του ελαιολάδου κ.ά. Περιγράφεται αναλυτικά η βιολογική σημασία του ελαιολάδου τόσο μέσα από την Μεσογειακή Διατροφή όσο και λόγω των φαινολικών συστατικών του. Τέλος, γίνεται εκτενής αναφορά των κυριότερων επιστημονικών ευρημάτων σχετικά με τις ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες καθεμιάς από τις σημαντικότερες φαινόλες του ελαιολάδου. Το δεύτερο μέρος χωρίζεται σε 6 κεφάλαια, όπου παρουσιάζονται οι μέθοδοι, τα υλικά, τα πειραματικά αποτελέσματα και συμπεράσματα, καθώς και κάποια εισαγωγικά στοιχεία απαραίτητα για την διεξαγωγή της συζήτησης των αποτελεσμάτων. Στην πρώτη πειραματική ενότητα (Κεφάλαια 2-3), αρχικά παρουσιάζονται τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση και ταυτοποίηση των καθαρών φαινολών τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην υπόλοιπη εργασία. Στην συνέχεια, παρουσιάζεται η ανάπτυξη και εφαρμογή κάποιων μεθόδων ανάλυσης για τον ποσοτικό προσδιορισμό των φαινολών της ελιάς σε δείγματα ελαιολάδου ή βιολογικά υγρά. Πιο συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 2 περιγράφεται η ανάπτυξη δύο αναλυτικών μεθόδων με τις οποίες μπορεί να γίνει εύκολα και γρήγορα μια ποσοτική εκτίμηση των υπό μελέτη φαινολών είτε σε δείγματα ελαιολάδου είτε σε διαλύματα απομονωμένων φαινολών. Η πρώτη μέθοδος ανάλυσης αφορά τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνολικού αλδεϋδικού περιεχομένου δειγμάτων ελαιολάδου ή διαλυμάτων απομονωμένων ουσιών με την χρήση μεθόδου ογκομέτρησης. Μάλιστα, όσον αφορά στη μέθοδο αυτή έγινε ανάπτυξη δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων. Στο ένα ο προσδιορισμός του τελικού σημείου της ογκομέτρησης γίνεται με τη χρήση δείκτη, με μικρότερη ακρίβεια στις μετρήσεις, ενώ στο άλλο, ο προσδιορισμός του τελικού σημείου πραγματοποιείται με μέτρηση του pH του διαλύματος με ηλεκτρονικό πεχάμετρο ακριβείας, με αποτέλεσμα οι τελικές μετρήσεις να είναι πιο ακριβείς. Η δεύτερη αναλυτική μέθοδος που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο αυτό, αφορά μια μέθοδο εκλεκτικού ποσοτικού προσδιορισμού των διφαινολών (δηλαδή ουσιών που διαθέτουν δύο υδροξυλομάδες στον αρωματικό δακτύλιο (ελαιασίνη, άγλυκο ελευρωπαΐνης και ελαιομισσιονάλη), με τη χρήση φασματοσκοπίας UV-Vis, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό περιεκτικότητας διαλυμάτων απομονωμένων διφαινολών. Το Κεφάλαιο 3 περιλαμβάνει την ανάλυση ανθρώπινων βιολογικών δειγμάτων ούρων, με τη χρήση αέριας χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματογράφο μάζας (GC-MS), για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητάς τους σε τυροσόλη και υδροξυτυροσόλη - ουσίες που αποτελούν βασικούς μεταβολίτες των φαινολών του ελαιολάδου στα ούρα – εφαρμόζοντας ένα ήδη ανεπτυγμένο πρωτόκολλο. Απώτερος στόχος της μελέτης αυτής ήταν να διαπιστωθεί αν οι μεταβολίτες αυτοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες αξιολόγησης της συμμόρφωσης στην Μεσογειακή Διατροφή ατόμων που συμμετέχουν σε μελέτες με διατροφικές παρεμβάσεις. Αυτή η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια μιας ευρύτερης μελέτης γνωστής ως «Feeding America’s Bravest». Στην δεύτερη πειραματική ενότητα (Κεφάλαια 4-7), παρουσιάζεται μια συστηματική ex vivo μελέτη των αντικαρκινικών ιδιοτήτων των φαινολών της ελιάς και ολικών φαινολικών εκχυλισμάτων ελαιολάδου, καθώς επίσης παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από πιλοτικά in vivo πειράματα σχετικά με την επίδραση κάποιων φαινολών στον καρκίνο του μαστού. Πιο συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 4 παρουσιάζεται για πρώτη φορά μια συστηματική μελέτη της επίδρασης των 6 βιοδραστικών φαινολών της ελιάς στην βιωσιμότητα μεγάλου αριθμού καρκινικών κυτταρικών σειρών προερχόμενων από 8 διαφορετικούς ιστούς, τόσο σε βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, όσο και σε συνθήκες που προσομοιάζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου (δηλ. υποξίας και περιορισμένων θρεπτικών συστατικών). Παράλληλα, παρουσιάζονται αποτελέσματα πειραμάτων ελέγχου κυτταροτοξικότητας των φαινολών σε μη ογκογόνες κυτταρικές σειρές. Στο Κεφάλαιο 5, μελετάται η συνεργιστική δράση των φαινολών της ελιάς είτε σε διπλούς συνδυασμούς απομονωμένων φαινολών είτε ως φαινολικά εκχυλίσματα ελαιολάδου, έναντι καρκινικών και μη καρκινικών κυτταρικών σειρών. Στο Κεφάλαιο 6 διερευνώνται οι πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η αναστολή της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων που παρατηρήθηκε στα προηγούμενα κεφάλαια. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά αξιολογήθηκε η ικανότητα των φαινολών να παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων προερχόμενων από διαφορετικούς τύπους καρκίνου, ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε κατά πόσο η επώαση των κυττάρων με τις ουσίες αυτές μπορεί να οδηγήσει τα κύτταρα σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Επίσης, με τη βοήθεια της μικροσκοπίας φθορισμού ελέγχθηκε η επίδραση των φαινολών της ελιάς στη μορφολογία των κυττάρων. Τέλος, στο Κεφάλαιο 7, παρουσιάζονται δύο πιλοτικά in vivo πειράματα σε ζωïκά καρκινικά μοντέλα ξενομοσχευμάτων καρκίνου μαστού, όπου ελέγχθηκε η ικανότητα των πιο δραστικών από τις υπό μελέτη φαινόλες αλλά και ενός εκχυλίσματος ελαιολάδου πλούσιο σε ελαιοκανθάλη και ελαιασίνη να παρεμποδίζουν την ογκογένεση/καρκινογένεση, μετά από ενδοπεριτοναϊκή και per os χορήγησή τους.