Η επίδραση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στις πρώιμες ιστολογικές αλλοιώσεις υπερχοληστερολαιμικών κουνελιών
Authors: Γιάννη Αμαλία 
Published: August 2021

Η αθηροσκλήρυνση προκαλεί το 50% της ετήσιας θνησιμότητας που εμφανίζεται στην Ευρώπη, στις Ηνωμένες Πολιτείες και στο μεγαλύτερο μέρος της Ασίας. Η νόσος αυτή αποτελεί χαρακτηριστικό στοιχείο των πληθυσμών των οποίων το βιοτικό επίπεδο βελτιώθηκε σημαντικά, μετά από τις αντίξοες συνθήκες διαβίωσης των προηγούμενων ετών. Μεγάλος αριθμός μελετών αποδεικνύει ότι η οξειδωτική τροποποίηση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (low density lipoproteins, LDL), του κύριου φορέα της χοληστερόλης του πλάσματος, κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην εμφάνιση και στην πορεία της αθηροσκλήρυνσης. Η ύπαρξη αυτών των τροποποιημένων LDL μορφών οδηγεί στην έκφραση υποδοχέων-καθαριστών από τα μακροφάγα, σαν ένα είδος αμυντικού μηχανισμού. Οι υποδοχείς- καθαριστές δεν υφίστανται ρύθμιση από τα επίπεδα της ενδοκυττάριας χοληστερόλης με αποτέλεσμα να επιτρέπουν την ανεξέλεγκτη συσσώρευση της χοληστερόλης των oxLDL στα μακροφάγα και το συνακόλουθο μετασχηματισμό τους σε αφρώδη κύτταρα. Το κυτταρόπλασμα των αφρωδών κυττάρων είναι πλούσιο σε λιποσταγόνες και η εμφάνισή τους στις αρτηρίες αποτελεί το στοιχείο-σφραγίδα της αθηροσκλήρυνσης. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να ερευνηθεί η επίδραση του L- ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στις πρώιμες αθηρωματικές αλλοιώσεις που προκαλούνται σε λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας μετά από χορήγηση δίαιτας υψηλής περιεκτικότητας σε χοληστερόλη. Στη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν 21 αρσενικά, λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Τα ζωικά πρότυπα μετά την περίοδο του εγκλιματισμού τους στον περιβάλλοντα χώρο η οποία διήρκησε δύο εβδομάδες, μοιράστηκαν σε δύο ομάδες. Στην πρώτη ομάδα (ομάδα Α, n = 11), χορηγήθηκε δίαιτα εμπλουτισμένη με 0.25% χοληστερόλη και 6% αραβοσιτέλαιο για χρονικό διάστημα 4 εβδομάδων. Η δεύτερη ομάδα (ομάδα B, n = 10) διατράφηκε με την ίδια δίαιτα και ταυτόχρονα έλαβε 12.5 mM μονονάτριου άλατος του L-ασπαρτικού οξέος και 12.5 mM μονονάτριου άλατος του L-γλουταμινικού οξέος από το πόσιμο νερό για το ίδιο χρονικό διάστημα. Στη διάρκεια της μελέτης έγιναν τρεις αιμοληψίες, στην έναρξη, στο τέλος της πρώτης εβδομάδας χορήγησης της υπερχοληστερινικής δίαιτας και πριν την ευθανασία. Στον ορό προσδιορίστηκαν η ολική χοληστερόλη, το σάκχαρο και οι ενώσεις που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS). Μετά τη συμπλήρωση του διαστήματος των τεσσάρων εβδομάδων, έγινε ευθανασία των ζώων. Με μέση θωρακοκοιλιακή τομή έγινε προσπέλαση στη θωρακική και κοιλιακή αορτή. Στη δεξιά κοινή καρωτίδα τοποθετήθηκε καθετήρας που συνδέθηκε με συσκευή έγχυσης μονιμοποιητικών διαλυμάτων. Η έγχυση των διαλυμάτων έγινε υπό πίεση 100 ± 10 mmHg, με την ακόλουθη σειρά: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα Hanks (Hanks balanced salts, HBSS) με HEPES pH 7.4, για 5 min, 2. Διάλυμα Karnovsky pH 7.2, για 15-30 min, 3. Διάλυμα σουκρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2, για 10 min. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της έγχυσης η αορτή από την έκφυσή της, μέχρι το διχασμό των λαγονίων παρασκευάστηκε και αφαιρέθηκε. Στη συνέχεια απαλλάχτηκε από τον περιβάλλοντα λιπώδη ιστό, καθηλώθηκε σε ειδικό πλαίσιο στις φυσικές της διαστάσεις και συντηρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2, στους 4 °C για 24 h. Για να γίνουν ορατά τα αφρώδη κύτταρα, τα δείγματα βάφτηκαν με τη χρωστική oil red Ο για 5 min, ξεπλύθηκαν με ισοπροπυλική αλκοόλη για 30 sec και επανυδατώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2. Η θωρακική αορτή διανοίχτηκε κατά τον επιμήκη άξονα, καθηλώθηκε σε ειδικό πλαίσιο και εμβαπτίστηκε σε διάλυμα γλυκερόλης/PBS pH 7.8. Στο διάλυμα αυτό προστέθηκε η φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33342, που εξειδικευμένα βάφει τα μονοπύρηνα κύτταρα που προσκολλώνται στην ενδοθηλιακή επιφάνεια. Τα δείγματα εξετάστηκαν en face με τη μέθοδο ανάλυσης εικόνας σε μικροσκόπιο Zeiss Axiolab. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων έδειξαν ότι τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης του ορού αυξήθηκαν και για τις δύο ομάδες κατά τη διάρκεια της μελέτης χωρίς να υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Παρά την αύξηση των επιπέδων της χοληστερόλης οι τιμές των TBARS εμφανίστηκαν ελαττωμένες στον ορό των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα αμινοξέα. Τα επίπεδα του σακχάρου του ορού ήταν αυξημένα κατά τη διάρκεια της μελέτης και στις δύο ομάδες. Η διαφορά μεταξύ τους έγινε σημαντική την 4η εβδομάδα της δίαιτας όπου τα επίπεδα του σακχάρου εμφανίστηκαν υψηλότερα στην ομάδα που λάμβανε τα αμινοξέα. Ωστόσο κανένα ζωικό πρότυπο δεν παρουσίασε μόνιμο διαβήτη. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι πριν από την αιμοληψία δεν γινόταν διακοπή της χορήγησης των αμινοξέων στα ζωικά πρότυπα της ομάδας Β. Η μικροσκοπική εξέταση έδειξε ότι η χορήγηση του ασπαρτικού και του γλουταμινικού παρεμπόδισε σε μεγάλο βαθμό την προσκόλληση των μονοπύρηνων κυττάρων στο ενδοθήλιο της θωρακικής αορτής. Είναι γνωστό ότι στα πρώιμα στάδια του σχηματισμού των αθηρωματικών αλλοιώσεων σε υπερχοληστερολαιμικά ζωικά πρότυπα, παρατηρείται αυξημένη προσκόλληση των μονοπύρηνων κυττάρων της κυκλοφορίας στο ενδοθήλιο από την 1η κιόλας εβδομάδα χορήγησης της υπερχοληστερινικής δίαιτας. Αυτό το φαινόμενο αποδίδεται στην έκφραση μορίων προσκόλλησης που επάγεται από την υπερχοληστερολαιμία. Τα αποτελέσματα της μελέτης αποδεικνύουν ότι τα δύο αμινοξέα εξασθένησαν το φαινόμενο αυτό, παρεμποδίζοντας το πρώτο στάδιο του σχηματισμού των λιποειδών γραμμώσεων. Ο συνακόλουθος σχηματισμός των αφρωδών κυττάρων που περιέχουν μεγάλα ποσά εστέρων χοληστερόλης αποτελεί το στοιχείο-σφραγίδα τόσο των πρώιμων όσο και των προχωρημένων αθηρωματικών αλλοιώσεων. Το ασπαρτικό και το γλουταμινικό είχαν επίσης πολλή σημαντική επίδραση στο σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων. Η μέθοδος της φωτεινής μικροσκοπίας αποκάλυψε ότι ο αριθμός των αφρωδών κυττάρων στον έσω χιτώνα της θωρακικής αορτής της ομάδας των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα δύο αμινοξέα ήταν πολύ μικρότερος συγκριτικά με τον αντίστοιχο αριθμό της άλλης ομάδας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης τεκμηριώνουν την υπόθεση ότι το L-ασπαρτικό και το L-γλουταμινικό προστατεύουν το αρτηριακό τοίχωμα από τη συσσώρευση αφρωδών κυττάρων και καθυστερούν την εμφάνιση των αθηρωματικών αλλοιώσεων. Οι ελαττωμένες τιμές των TBARS του ορού των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα αμινοξέα αυτά ταυτόχρονα με την υπερχοληστερινική δίαιτα οδηγούν στην υπόθεση ότι η δράση τους μπορεί να είναι αντιοξειδωτικής προέλευσης. Η χρήση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στην εκστρατεία της θεραπευτικής αντιμετώπισης της αθηροσκλήρυνσης, παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι οι ουσίες αυτές δεν είναι προϊόντα οργανικής σύνθεσης και δεν εμφανίζουν τοξικές ιδιότητες. Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι δεν υπάρχει βιβλιογραφία που να αναφέρεται στην επίδραση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στην αθηροσκλήρυνση σε in vivo μελέτες.