Σχεδιασμός και σύνθεση μοντέλων της apoA-I
Authors: Δαρβάρη Μαρία 
Published: August 2021

Η αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) στο πλάσμα και της αθηροσκλήρωσης έχει αποδοθεί στο ρόλο που διαδραματίζει η HDL και το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό της, η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoA-I) στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης καθώς επίσης στις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις της. Η apoA-I είναι μια πρωτεΐνη που αποτελείται από 243 αμινοξέα, έχει μοριακό βάρος 28 kDa και συντίθενται κυρίως στο ήπαρ και στο έντερο. Τα αμινοξέα της apoA-I οργανώνονται σε 10 διαδοχικές αμφιπαθητικές α-έλικες: οκτώ 22-μερείς και δύο 11-μερείς (που αποτελούνται από 22 και 11 αμινοξέα αντίστοιχα) που συχνά διακόπτονται από προλίνες. Κάθε μία από αυτές τις αμφιπαθητικές έλικες έχει ένα συγκεκριμένο ρόλο. Οι λειτουργικά σημαντικές περιοχές της apoA-I είναι σήμερα πολύ καλά τεκμηριωμένες. Έτσι, το καρβοξυ-τελικό άκρο της έλικας 6 θεωρείται υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της LCAT, ενώ το καρβοξυ-τελικό άκρο της έλικας 9 συνδεδεμένο με το αμινο-τελικό άκρο της έλικας 10 αλληλεπιδρά λειτουργικά με το μεταφορέα ABCA1. Επίσης οι έλικες 4 και 6 που περιέχουν τη Met¹¹² και Met¹⁴⁸ αντίστοιχα λειτουργούν πολύ πιθανόν και ως «παγίδες οξείδωσης», συμβάλλοντας στις αντιοξειδωτικές δράσεις της HDL. Οι μεθειονίνες του μορίου της apoA-I φαίνεται να επεμβαίνουν στις αλυσιδωτές αυτοκαταλυόμενες αντιδράσεις των λιποϋπεροξειδίων που οδηγούν στο σχηματισμό των ox- LDL σωματιδίων δεσμεύοντας τις ελεύθερες ρίζες που παράγονται. Συγκεκριμένα η apoA-I ανάγει τα λιποϋπεροξείδια (LOOH) που σχηματίζονται κατά την οξειδωτική τροποποίηση της LDL σε αντίστοιχα υδροξύλια (LOH) με ταυτόχρονη δημιουργία σουλφοξειδίου στη θέση του θείου της μεθειονίνης. Οι αμφιπαθητικές α-έλικες της apoA-I κατατάσσονται σε διάφορες τάξεις όπως είναι η A και η G. Η τάξη A χαρακτηρίζεται από ένα υψηλό μέσο όρο υδροφοβικότητας και μια κατανομή των αμινοξέων με τέτοιο τρόπο ώστε τα θετικά φορτισμένα κατάλοιπα να βρίσκονται ομαδοποιημένα στην διεπιφάνεια πολικής-μη πολικής φάσης και τα αρνητικά να βρίσκονται συγκεντρωμένα στο κέντρο της πολικής επιφάνειας ενώ η πολική πλευρά της G τάξης χαρακτηρίζεται από τυχαία εναλλαγή θετικών και αρνητικών αμινοξέων. Έχοντας υπόψη τα παραπάνω, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν μοντέλα των ελικοειδών τμημάτων της apoA-I ώστε να μελετηθεί διεξοδικά η αντιαθηρογόνος δράσης τους. Ο σχεδιασμός των μοντέλων της apoA-I έγινε με βάση α) τη διατήρηση της αμφιπαθητικότητας της έλικας και την παρουσία θετικών και αρνητικών φορτίων, κατά το δυνατόν, σε θέσεις i, i+3 και i+4, ώστε να σταθεροποιούνται ιοντικές αλληλεπιδράσεις στην υδρόφιλη περιοχή της έλικας, β) την αντικατάσταση της Met με Ala, και γ) τη μεταβολή της τάξης της έλικας. 1. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-FQKKWQEEAELYRQ-NH₂ (1), περιοχή 104-117, έλικα 4, Met¹¹²→ Ala¹¹², τάξη G. 2. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EMRDRARAHVDAL-NH₂ (2), περιοχή 147-159, έλικα 6, τάξη A. 3. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EARDRARAHVDAL-NH₂ (3), περιοχή 147-159, έλικα 6, Met¹⁴⁸→Ala¹⁴⁸, τάξη A. 4. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EMNVaOmRARAAVDAL-NH₂ (4), περιοχή 147-159, έλικα 6, Arg¹⁴⁹·Nva¹⁴⁹, Asp¹⁵⁰·Orn¹⁵⁰, His¹⁵⁵·Ala¹⁵⁵, τάξη G. 5. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-ARAHVDALRTHLA-NH₂ (5), περιοχή 152-164, έλικα 6, τάξη A. 6. Πεπτιδικό μοντέλο AC-ARAHVDALRKHLA-NH₂ (6), περιοχή 152-164, έλικα 6, Thr¹⁶¹→Lys¹⁶¹, τάξη G. 7. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-PALEDLRQGLLPVLESFKVSF-NH₂ (7), περιοχή 209-229 έλικες 9 και 10, τάξη G. 8. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-PALEOmLRQGLLPVLEKFKVSF-NH₂ (8), περιοχή 209-229 έλικες 9 και 10, Asp²¹³·Orn²¹³, Ser²²⁴·Lys²²⁴ τάξη A. Η σύνθεση των πεπτιδικών μοντέλων της apoA-I, έγιναν σύμφωνα με τις αρχές της σύνθεσης των πεπτιδίων σε στερεή φάση κατά Merrifield ακολουθώντας την Fmoc στρατηγική με στερεό υπόστρωμα την ρητίνη RINK Amide AM (υποκατάσταση 0.67 mmol/g ρητίνης) ώστε τα πεπτίδια να απελευθερωθούν ως αμίδια. Πριν από την αποκοπή τους από τη ρητίνη έγινε ακετυλίωση της αμινοτελικής ομάδας των πεπτιδίων. Ο καθαρισμός των πεπτιδικών αναλογών 1-8 έγινε με χρωματογραφία υψηλής διακριτικής ικανότητας HPLC αναλυτικής και ημιπαρασκευαστικής και τα σωστά προϊόντα ελέγχθηκαν με φασματοσκοπία μάζας ESI-MS. Όλα τα πεπτιδικά μοντέλα μελετήθηκαν ως προς τη διαμόρφωση που αποκτούν σε διάφορους διαλύτες με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού. Η συγκέντρωση των πεπτιδίων σε όλα τα πειράματα ήταν 100μΜ. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω διαλύτες: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS buffer pH 7.4, διάλυμα δωδεκυλοθειϊκού νατρίου, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) σε συγκέντρωση 8 mM, μίγμα τριφθοροαιθανόλης/νερού, TFE/H₂0 50/50 (v/v) και διάλυμα δεκατετραφωσφορυλοχολίνης C₁₄PC σε συγκέντρωση 5 mM. Τα βιολογικά πειράματα περιλαμβάνουν την οξειδωτική τροποποίηση της LDL in vitro παρουσία τόσο των πεπτιδικών μοντέλων όσο και των συμπλεγμάτων POPC/MLVs που εμπεριείχαν τα μοντέλα. Η οξείδωση της LDL αρχίζει με την προσθήκη διαλύματος δισθενών ιόντων χαλκού στους 37°C. Η πορεία της οξείδωσης παρακολουθείται φασματομετρικά καταγράφοντας τη σιγμοειδή καμπύλη οξείδωσης στα 234 nm. Τα συμπεράσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται στα εξής: - Παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν, ως προς τις βιολογικές και διαμορφωτικές τους ιδιότητες, πεπτιδικά μοντέλα της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι (apoA-I), η οποία αποτελεί κύριο συστατικό της HDL και ευθύνεται για πολλές από τις αντιαθηρογόνες δράσεις της. - Τα πεπτιδικά μοντέλα που παρασκευάστηκαν είναι μοντέλα των ελίκων 4, 6 και 9-10. Όλα τα πεπτιδικά ανάλογα παρασκευάστηκαν σε καλές αποδόσεις με υψηλή καθαρότητα όπως προκύπτει από τα φάσματα μάζας και τις αναλυτικές HPLC των πεπτιδικών αναλογών 1-8. - Τα χαρακτηριστικά α-έλικας φαίνεται να κυριαρχούν σε όλους τους διαλύτες SDS, TFE/H₂0 και C₁₄PC που μελετήθηκαν εκτός του PBS pH 7.4. - Στο μοντέλο 1 που ανήκει στην περιοχή 104-117 με αντικατάσταση της μεθειονίνης στη θέση 112 με αλανίνη, τάξης G, συμπεραίνουμε πως η αλλαγή αυτή μειώνει τον αντιοξειδωτικό ρόλο του συγκεκριμένου πεπτιδίου και αναδεικνύει τη σημασία της μεθειονίνης ως παγίδα οξείδωσης στην έλικα 4. - Για τα πεπτιδικά μοντέλα της έλικας 6 περιοχή 147-159, παρατηρούμε πως το μοντέλο 4 που ανήκει στην τάξη G παρουσιάζει τις καλύτερες αντιοξειδωτικές δράσεις ενώ τα μοντέλα 2 και 3 έχουν παρόμοια αντιοξειδωτική δράση που είναι καλύτερη σε μεγάλες συγκεντρώσεις π.χ. 424 μΜ πεπτιδίου. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία στα δομικά χαρακτηριστικά της έλικας σε σχέση με τη βιολογική δράση μιας και η τάξη G διαφέρει σημαντικά από την Α. - Το πεπτιδικά μοντέλο 5, περιοχή 152-164, έλικα 6, τάξη A εμφανίζει ένα μικρότερο ποσοστό ελικοειδούς διαμόρφωσης αλλά μια καλύτερη αντιοξειδωτική δράση συγκριτικά με το πεπτιδικά μοντέλο 6 τάξης G. Επιπλέον τα πεπτιδικά μοντέλα 5 και 6 δεν έχουν καμμία δράση στην ενεργοποίηση του ενζύμου LCAT και πιθανόν αυτή η περιοχή της apoA-I να μην είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του ενζύμου. - Το πεπτιδικά μοντέλο 8, περιοχή 209-229 των ελίκων 9 και 10 τάξης A παρουσιάζει καλύτερα βιολογικά και διαμορφωτικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με το μοντέλο 7 που ανήκει στην τάξη G. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη σημασία στα δομικά χαρακτηριστικά της έλικας σε σχέση με τη βιολογική δράση.