Μελέτη παθογενετικών μηχανισμών ενός νέου προτύπου υπολειπόμενης αυτοσωμικής νευρομυϊκής νόσου στον ποντικό με φαινοτυπική, γενετική και μοριακή ανάλυση
Authors: Ιωακειμίδης Φώτιος 
Published: August 2021

Οι νευρομυϊκές ασθένειες αποτελούν μια εξαιρετικά ετερογενή ομάδα κλινικών οντοτήτων που παραμένουν ανίατες σε πολύ μεγάλο βαθμό, προκαλώντας πρόωρο θάνατο, ενώ η γενετική βάση πολλών από αυτές τις ασθένειες παραμένει άγνωστη. Τα δεδομένα αυτά τονίζουν την άμεση ανάγκη για την ανακάλυψη γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια αυτών των ασθενειών, ώστε να κατανοηθούν οι παθογενετικοί μηχανισμοί για την εύρεση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Στο Ε.ΚΕ.Β.Ε. «Αλέξανδρος Φλέμιγκ» η ερευνητική ομάδα της Δρ Ελένης Ντούνη εντόπισε ένα καινούργιο νευρομυϊκό φαινότυπο χρησιμοποιώντας τυχαία χημική μεταλλαξογένεση στο ποντίκι. Ο καινούργιος αυτός φαινότυπος κλινικά περιλαμβάνει ανώμαλη στάση των άκρων, ανώμαλη βάδιση, τρόμο, σπαστικότητα, μυϊκή αδυναμία, απώλεια του αντανακλαστικού της έκτασης των οπίσθιων άκρων, καχεξία και πρόωρο θάνατο στην ηλικία του ενός μήνα. Ο φαινότυπος αυτός ονομάστηκε spastic και είναι αυτοσωμικός υπολειπόμενος με πλήρη διεισδυτικότητα επηρεάζοντας εξίσου και τα δύο φύλα.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός αυτού του νέου μοντέλου, η γενετική χαρτογράφηση της υπεύθυνης μετάλλαξης, ο μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός του εν λόγω γονιδίου. Τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής ανάλυσης έδειξαν έντονη και εκτεταμένη κενοτοποίωση των κινητικών νευρώνων στο νωτιαίο μυελό και σε μικρότερη έκταση στον εγκέφαλο. Ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε πως τα κενοτόπια αυτά προέρχονταν κυρίως από μιτοχόνδρια τα οποία έχουν χάσει τις χαρακτηριστικές αναδιπλώσεις των εσωτερικών τους μεμβρανών (cristae). Πέραν του νευρομυϊκού φαινοτύπου ο φαινότυπος spastic περιλαμβάνει λεμφοποιητικές ανωμαλίες με ατροφία του θύμου και του σπλήνα, απώλεια της αρχιτεκτονικής του θύμου, και διαφοροποιήσεις στους υποκυτταρικούς πληθυσμούς του θύμου και του σπλήνα.Μέσω γενετικής χαρτογράφησης και αλληλούχησης η υπεύθυνη σημειακή μετάλλαξη εντοπίστηκε στο γονίδιο DnaJC11 της οικογένειας των συν-συνοδών πρωτεϊνών J. Πρόκειται για ένα καινούργιο γονίδιο, άγνωστης λειτουργίας, το οποίο παρουσιάζει πολύ υψηλή συντήρηση στα σπονδυλωτά ενώ υπάρχει και στα φυτά και τους μύκητες. Η μετάλλαξη είναι εσωνική και επηρεάζει το μάτισμα. Πιο συγκεκριμένα, δημιουργώντας μια νέα θέση δέκτη του ματίσματος προκαλεί την ενσωμάτωση μιας εσωνικής περιοχής μήκους 109 bp στο ώριμο μετάγραφο προκαλώντας μετατόπιση του αναγνωστικού πλαισίου των τελευταίων 51 αμινοξέων. Στο πρωτεϊνικό επίπεδο δείξαμε πως η μετάλλαξη αυτή προκάλεσε την σχεδόν πλήρη απώλεια της πρωτεΐνης στους περισσότερους ιστούς που εξετάστηκαν. Η αιτιότητα της μετάλλαξης αυτής επιβεβαιώθηκε γενετικά σε πειράματα διάσωσης με την έκφραση του αγρίου τύπου ανθρώπινου γονιδίου σε διαγονιδιακά ποντίκια.Η πρωτεΐνη DNAJC11 έχει προταθεί ότι εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο και ότι αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες του προσφάτως χαρακτηρισθέντος συμπλόκου MIB/MICOS το οποίο είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνο για τη διαμόρφωση της δομής της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Με τεχνικές βιοχημείας και μικροσκοπίας φθορισμού επιβεβαιώσαμε πως η DNAJC11 εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο έχοντας τοπολογία περιφερειακή της εξωτερικής μεμβράνης αλλά η απώλεια ή υπερέκφρασή της στα μεταλλαγμένα ή διαγονιδιακά ποντίκια δεν επηρέασε τα επίπεδα δύο κεντρικών πρωτεϊνών του συμπλόκου MIB/MICOS. Δεδομένα ωστόσο που προέκυψαν από συνεργασία με ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου του Würzburg υποστηρίζουν τη φυσική και λειτουργική συσχέτιση της DNAJC11 με το σύμπλοκο MIB/MICOS.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται το πρώτο μετάλλαγμα ποντικού για το γονίδιο DnaJC11 και καταγράφεται η λειτουργική συσχέτισή του με νευρομυϊκό και λεμφοποιητικό φαινότυπο στο ποντίκι με πιθανή ιατρική σημασία. Η περαιτέρω μελέτη του αναμένεται να προσφέρει στην κατανόηση του ρόλου της μιτοχονδριακής δομής στις νευρομυϊκές ασθένειες και στη διαλεύκανση του in vivo φυσιολογικού ρόλου του συμπλόκου MIB/MICOS.