Κλωνοποίηση και μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου της από το NADP⁺-εξαρτώμενης αφυδρογονάσης του μηλικού του προβάτου
Authors: Στέφος Γεώργιος 
Published: August 2021

Η κυτταροπλασματική NADP⁺-εξαρτώμενη μηλική αφυδρογονάση καταλύει την αντίδραση της μετατροπής του μηλικού σε πυροσταφυλικό με την ταυτόχρονη παραγωγή NADPH το οποίο χρησιμοποιείται στην βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Εκτός της μηλικής αφυδρογονάσης, άλλες τρεις NADP⁺- εξαρτώμενες αφυδρογονάσες συμμετέχουν στην παραγωγή NADPH που είναι απαραίτητα στη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Η δράση των τεσσάρων αφυδρογονασών έχει δειχτεί ότι είναι συγχρονισμένη. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η κλωνοποίηση του cDNA, η κλωνοποίηση της ρυθμιστικής περιοχής και η μελέτη της μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου της NADP⁺εξαρτώμενης μηλικής αφυδρογονάσης του προβάτου. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε για την απομόνωση του cDNA ήταν η ενίσχυση με PCR και η κλωνοποίηση αλληλοεπικαλυπτόμενων τμημάτων. Από την ένωση των παραπάνω τμημάτων προέκυψαν δύο μετάγραφα της μηλικής αφυδρογονάσης. Το μετάγραφο 1 αποτελείται από 2121 νουκλεοτίδια και το μετάγραφο 2 από 3243 νουκλεοτίδια. Τα δύο μετάγραφα φέρουν πανομοιότυπο 5’-UTR αλλά διαφέρουν ως προς το μήκος του 3’-UTR. Διατηρούν το ίδιο ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο και κωδικοποιούν για μία πρωτεΐνη 572 αμινοξέων η οποία παρουσιάζει υψηλό ποσοστό ομολογίας με τις μηλικές αφυδρογονάσες άλλων ζώων. Με RT-PCR ελέγχθηκε η έκφραση της μηλικής αφυδρογονάσης σε ήπαρ, μαστό, μυ, επινεφρίδια, ωοθήκη, σπλήνα, παρεγγεφαλίδα, όρχεις, νεφρό και καρδιά. Το γονίδιο εκφράζεται σε όλους τους παραπάνω ιστούς. Στο λιπώδη ιστό το επίπεδο του mRNA της μηλικής αφυδρογονάσης διπλασιάζεται όταν μετά από περίοδο νηστείας ακολουθήσει διατροφή κατά βούληση. Για την κλωνοποίηση της ρυθμιστικής περιοχής χρησιμοποιήθηκαν 2 κλώνοι μίας BAC βιβλιοθήκης προβάτου, οι οποίοι προέκυψαν μετά από σάρωση της βιβλιοθήκης με PCR. Κλωνοποιήθηκε μία περιοχή που περιέχει 1175 βάσεις άνωθεν του σημείου έναρξης της μετάφρασης. Το τμήμα που περιέχει τις περίπου 200 κατωφερικές βάσεις παρουσιάζει υψηλή ομολογία με τα αντίστοιχα τμήματα του ανθρώπου και του αρουραίου. Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία μέσω των οποίων δρουν οι μεταγραφικοί παράγοντες API, T3R, Sp1 και PPAR, τα οποία έχουν χαρακτηριστεί στη μηλική αφυδρογονάση του ανθρώπου και του αρουραίου, εμφανίζονται συντηρημένα στο πρόβατο. Περαιτέρω in silico ανάλυση έδειξε ότι στην περιοχή εδράζεται ένα πιθανό Antioxidant Response Element και ένα πιθανό Sterol Regulatory Element. Η μεταγραφική ενεργότητα της ρυθμιστικής περιοχής μελετήθηκε με πειράματα διαμόλυνσης ζωικών κυττάρων. Η περιοχή που εκτείνεται στις 139 βάσεις άνωθεν του σημείου έναρξης της μετάφρασης παρουσιάζει μεταγραφική ενεργότητα. Η περιοχή που φέρει το cis-στοιχείο στο οποίο προσδένονται οι υποδοχείς της Τ3 (T3RE), επιδρά αρνητικά στη μεταγραφή σε HepG2 κύτταρα, όχι όμως και σε 3T3-L1. Όταν το T3RE αντικαταστάθηκε με το T3RE της μηλικής αφυδρογονάσης του ανθρώπου, η μεταγραφική ενεργότητα αυξήθηκε σημαντικά σε HepG2 και Η4ΙΙΕ κύτταρα, όχι όμως και σε 3T3-L1. Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη μελέτη του γονιδίου της μηλικής αφυδρογονάσης στα μηρυκαστικά. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής μπορούν να συμβάλουν στην περαιτέρω μελέτη του ρόλου της μηλικής αφυδρογονάσης στο πρόβατο, καθώς επίσης και να χρησιμοποιηθούν σε συγκριτικές μελέτες της λιποσύνθεσης μεταξύ μηρυκαστικών και μονογαστρικών. Τέλος η παρούσα διατριβή μπορεί να συμβάλει στη μελέτη του μοριακού μηχανισμού που είναι υπεύθυνος για τη συγχρονισμένη δράση των τεσσάρων ΝΑDP⁺-εξαρτώμενων αφυδρογονασών.