Μελέτη της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων με τη μέθοδο PFA (Platelet Function Assay) σε νεογνά με ενδομήτρια υπολειπόμενη αύξηση
Authors: Κόλλια Μαρία 
Published: March 2023

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η λειτουργία της αιμόστασης στον ανθρώπινο οργανισμό στηρίζεται στη λεπτή ισορροπία ανάμεσα στην αναχαίτιση της αιμορραγίας και την αποφυγή της θρόμβωσης. Aποτελείται από 3 βασικά στάδια: την πρωτογενή αιμόσταση, τη δευτερογενή αιμόσταση και την ινωδόλυση. Η πρωτογενής αιμόσταση στηρίζεται στην αγγειοσύσπαση και τη δημιουργία αιμοπεταλιακού θρόμβου. Τα αιμοπετάλια, ως βασικοί πρωταγωνιστές, συμμετέχουν μέσω μιας σειράς αλληλένδετων διαδικασιών που περιλαμβάνουν την προσκόλληση στο τραυματισμένο ενδοθήλιο, την ενεργοποίηση τους (αλλαγή σχήματος και αποκοκκίωση) και τη συσσώρευση τους στον αρχικό ασταθή θρόμβο. Οι διαδικασίες αυτές στηρίζονται στη σύνδεση μακρομορίων πχ VWF, κολλαγόνο με γλυκοπρωτεΐνες της επιφάνειας τους, που οδηγούν κάθε φορά μέσω ποικίλων σηματοδοτικών μονοπατιών στην ενεργοποίηση και αποκοκκίωση τους. Το μικροπεριβάλλον που σχηματίζεται σε συνδυασμό με τις συνθήκες της διατμητικής τάσης στο αγγείο καθορίζουν τις συνδέσεις που θα οδηγήσουν σε συσσώρευση των αιμοπεταλίων.Η μελέτη της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων και της πρωτογενούς αιμόστασης στηρίζεται τα τελευταία χρόνια σε μια σειρά εξετάσεων που βασίζονται στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων (π.χ. LTA), στην προσκόλληση σε υψηλό στρες διάτμησης (π.χ. PFA-100), στις μεταβολές των ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων, σε κυτταρομετρία ροής και έλεγχο αποκοκκίωσης. Κάθε μια έχει ξεχωριστά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα ενώ γίνεται προσπάθεια εφαρμογής point -of-care tests (POCTs) τα τελευταία χρόνια με σκοπό την ευρεία χρήση τους στην κλινική πράξη.Η μέθοδος PFA-100 αποτελεί μια γρήγορη, απλή και αναπαραγώγιμη εξέταση αξιολόγησης της πρωτογενούς αιμόστασης. Βασίζεται στην προσκόλληση, ενεργοποίηση και συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων σε συνθήκες υψηλού στρες διάτμησης αποτυπώνοντας με τον καλύτερο δυνατό τρόπο in vitro τις διαδικασίες της πρωτογενούς αιμόστασης. H αξιολόγηση της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων στηρίζεται στο χρόνο που απαιτείται για να κλείσει η οπή μιας μεμβράνης με συσσωματώματα αιμοπεταλίων. Ο χρόνος αυτός εκφράζεται ως χρόνος κλεισίματος – closure time (CT). Η μεμβράνη, ανάλογα με το φυσίγγιο, καλύπτεται είτε από κολλαγόνο και επινεφρίνη (COL/EPI) είτε από κολλαγόνο και ΑDP(COL/ADP). Προκύπτουν έτσι δύο CTs η τιμή και ο συνδυασμός των οποίων προσανατολίζει σε διάφορες διαταραχές της πρωτογενούς αιμόστασης.Η αιμοστατική ισορροπία στο νεογνικό πληθυσμό είναι διαφορετική από τους ενήλικες και είναι μια εξελισσόμενη διαδικασία. Όσο αφορά στην πρωτογενή αιμόσταση η in vitro υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων αντισταθμίζεται στα υγιή τελειόμηνα νεογνά αποτελεσματικά από άλλους μηχανισμούς όπως τα υψηλά επίπεδα VWF, ο υψηλός αιματοκρίτης και MCV και θα πρέπει να εκλαμβάνεται ως μέρος ενός προσεκτικά ισορροπημένου νεογνικού αιμοστατικού συστήματος, αντί για αναπτυξιακή ανεπάρκεια. Όσο αφορά στη δευτερογενή αιμόσταση και την ινωδόλυση φαίνεται πως τα μειωμένα επίπεδα παραγόντων πήξης αντιρροπούνται από τα μειωμένα επίπεδα φυσικών ανασταλτών και τη μειωμένη ινωδολυτική ικανότητα. Οι μεταβολές αυτές προσαρμοστικότητας είναι γνωστές με τον όρο «Αναπτυξιακή Αιμόσταση»- «Developmental Hemostasis». Ενδιαφέρον και πεδίο έρευνας παρουσιάζει το αν και πώς η προωρότητα και οι διάφορες ασθένειες της μητέρας και του νεογνού διαταράσσουν αυτό το ευαίσθητο σύστημα.Ως ενδομήτρια υπολειπόμενη αύξηση (ΕΥΑ) ορίζεται ο ρυθμός εμβρυϊκής ανάπτυξης που είναι μικρότερος από τον κανονικό για το δυναμικό ανάπτυξης ενός συγκεκριμένου βρέφους ανάλογα με τη φυλή και το φύλο του εμβρύου. Είναι σημαντικό να διαχωρίζεται από τον όρο SGA που αναφέρεται σε νεογνά με βάρος γέννησης μικρότερο από το 10ο εκατοστημόριο για τη συγκεκριμένη ηλικία κύησης. Νεογνά με ΕΥΑ αντιπροσωπεύουν το 25% των γεννήσεων, δηλαδή περίπου 30 εκατομμύρια νεογέννητα ετησίως. Οφείλεται σε μητρικούς, πλακουντιακούς ή εμβρυϊκούς παράγοντες και διακρίνεται σε δυο μεγάλες κατηγορίες, το συμμετρικό και τον ασύμμετρο τύπο. Η ΕΥΑ σχετίζεται τόσο με άμεσες μεταγεννητικές επιπλοκές όσο και με σοβαρές μακροχρόνιες επιπτώσεις. Το αιματολογικό προφίλ των νεογνών με ΕΥΑ χαρακτηρίζεται από αύξηση του αιματοκρίτη, μείωση των λευκοκυττάρων και των αιμοπεταλίων χωρίς όμως να έχει μελετηθεί εκτενώς και σε βάθος το αιμοστατικό προφίλ τους.Τα τελευταία χρόνια φαίνεται να κερδίζει ενδιαφέρον η μελέτη της επίπτωσης της ΕΥΑ στη νεογνική αιμόσταση. Η θρομβοπενία αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό των νεογνών με ΕΥΑ μέσω ποικίλων προτεινόμενων παθοφυσιολογικών μηχανισμών. Οι μελέτες που αφορούν στον έλεγχο της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων νεογνών με ΕΥΑ είναι λίγες και δεν καταλήγουν σε σαφή συμπεράσματα, με άλλες να παρουσιάζουν υπεραντιδραστικότητα και άλλες υπολειτουργικότητα των αιμοπεταλίων σε αυτή την ομάδα των νεογνών.ΣΚΟΠΟΣ: Η παρούσα μελέτη είχε σκοπό αρχικά να καθοριστεί το εύρος τιμών αναφοράς των CTs σε δείγματα ομφάλιου αίματος από υγιή AGA πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά. Βασικός στόχος ήταν να προσδιοριστούν οι CTs σε δείγματα ομφάλιου αίματος πρόωρων και τελειόμηνων νεογνών με ΕΥΑ, να συγκριθούν με τους αντίστοιχους των AGA νεογνών και να συσχετιστούν με διάφορες περιγεννητικές παραμέτρους.ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Το υλικό της διδακτορικής διατριβής αποτελούν 192 νεογνά τα οποία γεννήθηκαν στο Αρεταίειο Νοσοκομείο το διάστημα από τον Ιανουάριο 2017 έως και το Δεκέμβριο 2018. Στην ομάδα των 118 υγιών AGA νεογνών (control) συμπεριελήφθησαν 104 τελειόμηνα νεογνά (με ηλικία κύησης μεγαλύτερη από 37 εβδομάδες και κανονικό βάρος γέννησης για την ηλικία κύησης) και 14 πρόωρα νεογνά (με ηλικία κύησης μικρότερη από 37 εβδομάδες και κανονικό βάρος γέννησης για την ηλικία κύησης). Στην ομάδα των 74 νεογνών με ΕΥΑ συμπεριελήφθησαν 48 τελειόμηνα νεογνά (με ηλικία κύησης μεγαλύτερη ή ίση από 37 εβδομάδες τα οποία πληρούσαν τα κριτήρια χαρακτηρισμού για ΕΥΑ) και 26 πρόωρα νεογνά ( με ηλικία κύησης μικρότερη από 37 εβδομάδες τα οποία πληρούσαν τα κριτήρια χαρακτηρισμού για ΕΥΑ). Σε όλα τα νεογνά της μελέτης ελήφθη λεπτομερές οικογενειακό, μαιευτικό, περιγεννητικό και νεογνικό ιστορικό. Σε κάθε κύηση καταγράφηκε η αιτία της ΕΥΑ. Και στις 2 ομάδες (AGA και EYA) εφαρμόστηκαν αυστηρά κριτήρια αποκλεισμού. Όλα τα δείγματα αίματος ελήφθησαν από την ομφαλική φλέβα διπλά απολινωμένου ομφάλιου λώρου από εκπαιδευμένο προσωπικό και εξετάστηκαν χωρίς πρόσθετη επεξεργασία με τον αναλυτή PFA-100® - Platelet Function Analyzer (DADE BEHRING) μέσα σε 4 ώρες από την αιμοληψία. Για κάθε δείγμα αίματος έγινε καταγραφή δυο CTs σε δευτερόλεπτα, COL/EPI CT και COL/ADP CT.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:AGA νεογνά: Οι τιμές αναφοράς του εργαστηρίου μας σε δείγματα ομφάλιου αίματος είναι στα τελειόμηνα AGA νεογνά COL/EPI CT 76s - 164s και COL/ADP CT 59s - 85s. Για τα πρόωρα AGA νεογνά είναι COL/EPI CT 101s - 178s και COL/ADP CT 64s - 86s. Ο χρόνος COL/EPI CT είναι παρατεταμένος στα πρόωρα AGA νεογνά (149s) συγκριτικά με τα τελειόμηνα AGA νεογνά (111s) σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (0.0236). Το εύρημα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις εργασίες που υποστηρίζουν τη μεγαλύτερη υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων που συνοδεύει την προωρότητα. Υπάρχει αρνητική συσχέτιση μεταξύ του COL/ADP CT και της ηλικίας κύησης (Spearman’s r = -0,184, p= 0.0475) και του COL/ADP CT και του απόλυτου αριθμού αιμοπεταλίων (Spearman’s r = -0,188, p= 0.0437).Νεογνά με ΕΥΑ: Από τη μελέτη μας προκύπτει πως τα νεογνά με ΕΥΑ παρουσιάζουν παρατεταμένους χρόνους COL/EPI CTs (132s) σε σχέση με τα AGA νεογνά (112,5s) (p=0.04), ενώ δε διαπιστώνεται η αντίστοιχη διαφορά για τους COL/ADP CTs. Ο χρόνος COL/ADP CT είναι συντομότερος σε νεογνά με ΕΥΑ που γεννιούνται με φυσιολογικό τοκετό (p=0.007), σε νεογνά με ΕΥΑ που οι μητέρες τους έλαβαν αμπικιλλίνη περί τον τοκετό (p=0.005) και παρατεταμένος σε νεογνά με ΕΥΑ που οι μητέρες τους έλαβαν επισκληρίδιο αναισθησία (p=0.032). Τόσο ο χρόνος COL/EPI CT όσο και ο COL/ADP CT δε φαίνεται να διαφέρουν ανάλογα με την αιτία που προκαλεί την ΕΥΑ. Ο COL/EPI CT είναι παρατεταμένος στα πρόωρα νεογνά με ΕΥΑ (137s) σε σύγκριση με τα τελειόμηνα νεογνά με ΕΥΑ (126s) (p=0.001), ενώ δεν παρατηρείται αντίστοιχη διαφορά για τον COL/ADP CT.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ο χρόνος COL/EPI CT είναι παρατεταμένος τόσο στα πρόωρα AGA νεογνά όσο και στα πρόωρα νεογνά με ΕΥΑ, αντανακλώντας την υπολειτουργικότητα των αιμοπεταλίων που συνοδεύει την προωρότητα. Όσο αφορά στο σύνολο των νεογνών με ΕΥΑ φαίνεται η υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων να εκφράζεται μέσα από τους παρατεταμένους χρόνους COL/EPI CTs. Η αύξηση του αιματοκρίτη θα μπορούσε να δρα αντισταθμιστικά στην απουσία εκδήλωσης σοβαρών αιμορραγικών διαταραχών. Στην ομάδα των νεογνών με ΕΥΑ πέρα από την προωρότητα, θα πρέπει να λαμβάνουμε υπόψιν και άλλες περιγεννητικές παραμέτρους στην αξιολόγηση των χρόνων CTs. Η μέθοδος PFA-100 προσφέρει τη δυνατότητα γρήγορης και απλής αρχικής αξιολόγησης της πρωτογενούς αιμόστασης και αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο στην καθημερινή κλινική πράξη. Τα δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου μπορούν να έχουν έναν προγνωστικό χαρακτήρα θέτοντας σε αυξημένη επιτήρηση νεογνά υψηλού κινδύνου. Η μελέτη μας θα μπορούσε να βοηθήσει στην ευρύτερη χρήση της μεθόδου PFA-100 στην κλινική νεογνολογία συμβάλλοντας στην καλύτερη εκτίμηση της αιμόστασης στα νεογνά με ΕΥΑ.