Μελέτη της έκφρασης miRNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, στον καρκίνο του μαστού
Authors: Παπαχριστοπούλου Γεωργία 
Published: September 2021

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνά διαγνωσθείσα κακοήθεια και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον γυναικείο πληθυσμό, αντιπροσωπεύοντας το 25% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 15% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο παγκοσμίως. Εκτιμάται ότι περίπου 1 στις 8 γυναίκες θα αναπτύξει κακοήθη νεοπλασία του μαστικού αδένα κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου είναι η ενδογενής μοριακή ετερογένεια, η οποία εν μέρει ευθύνεται για τους υφιστάμενους περιορισμούς στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών. Η επιλογή του θεραπευτικού σχήματος βασίζεται εξ ολοκλήρου στην ιστοπαθολογική ανάλυση και στο γονιδιακό προφίλ των όγκων. Μάλιστα, η σύνθεση της ανοσοέκφρασης ορισμένων βιοδεικτών συνέβαλε πρόσφατα στην ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού σε διαφορετικούς μοριακούς υποτύπους, οι οποίοι ορίζονται ως Αυλικού τύπου A, Αυλικού τύπου B, HER2-θετικά και Βασικού τύπου/TNBCs. Ο κάθε μοριακός υπότυπος των καρκινωμάτων του μαστού σχετίζεται με συγκεκριμένα μονοπάτια καρκινογένεσης, εκδηλώνοντας διαφοροποιήσεις στη βιολογική συμπεριφορά, στη μεταστατική δυναμική των κυττάρων του και κατ’ επέκτασιν, στην ανταπόκριση των ασθενών έναντι των χορηγούμενων θεραπευτικών σχημάτων. Ως εκ τούτου, η μοριακή και ιστολογική ταξινόμηση των όγκων θεωρούνται ότι είναι καθοριστικής σημασίας για τον προσδιορισμό της κατάλληλης θεραπευτικής προσέγγισης. Συνεπώς, η ταυτοποίηση νέων βιομορίων είναι αναγκαία και ζωτικής σημασίας για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού. Ιδιαίτερα, όταν η έκφρασή τους θα συσχετίζεται με τους μοριακούς υπότυπους και τις κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές, ή θα έχει ρυθμιστικό ρόλο σε παράγοντες που συμβάλλουν στην ογκογένεση και στα περαιτέρω στάδια της νόσου στο μαστό.Ωστόσο, κατά την τελευταία δεκαετία, η εμφάνιση των miRNAs δημιούργησε νέες ευκαιρίες στο ερευνητικό πεδίο για την θεραπεία του καρκίνου. Μάλιστα, έχει προταθεί ότι τα miRNAs μπορεί να είναι πολύτιμα μόρια ως βιοδείκτες στον καρκίνο του μαστού, δεδομένου ότι το πρότυπο έκφρασής τους φαίνεται να συνδέεται με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά αυτής της νόσου. Επομένως, η αναγνώριση των αποκλίσεων στην έκφραση των miRNAs θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην πρόγνωση, τη διάγνωση και την παρακολούθηση των κακοηθειών του μαστού. Επιπλέον, τα miRNAs είναι υποψήφια βιομόρια για στοχευμένη μοριακή θεραπεία στον καρκίνο του μαστού και διάφορες προσεγγίσεις για τον χειρισμό της έκφρασής τους βρίσκονται υπό ανάπτυξη. Ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους τα miRNAs επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου είναι μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αποπτωτική διαδικασία και καλούνται ως apoptomiRs. Η απορύθμιση του μηχανισμού της απόπτωσης συνιστά ένα μεταβατικό στάδιο, επιτρέποντας στα γενετικά ασταθή κύτταρα να επιβιώσουν και να συσσωρεύσουν περαιτέρω μεταλλάξεις που τελικά οδηγούν σε ογκογένεση. Αρκετά μέλη της οικογένειας BCL2 βρέθηκαν να αποτελούν ρυθμιστικούς στόχους των apoptomiRs. H αυξημένη έκφραση των αντιαποπτωτικών γονιδίων ή αντίστοιχα η μειωμένη έκφραση των προαποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, συνδέεται με την παθογένεια και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού, καθώς και με την απόκριση των όγκων στην εκάστοτε θεραπευτική προσέγγιση. Eπιπροσθέτως, αρκετά δεδομένα αναγνωρίζουν τα miRNAs ως ρυθμιστές που στοχεύουν άμεσα ή έμμεσα τα μέλη της οικογένειας BCL2, καθώς και βιομόρια επόμενων σταδίων στον καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνάται, για πρώτη φορά, η έκφραση και η κλινική αξία των miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας BCL2, στον καρκίνο του μαστού. Βασικός στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ευαίσθητων μεθοδολογιών ανάλυσης της έκφρασης των υπό μελέτη miRNAs που μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν αποπτωτικά γονίδια της οικογένειας BCL2, καθώς και η αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής, προβλεπτικής και προγνωστικής τους σημασίας στον καρκίνο του μαστού. Προς επίτευξη των στόχων αυτών αρχικά πραγματοποιήθηκε η συλλογή του βιολογικού υλικού, σύμφωνα με τις ηθικές αρχές που διέπουν την ιατρική και κλινική έρευνα. Συγκεκριμένα, ένας στατιστικά σημαντικός αριθμός 210 ιστολογικών δειγμάτων προήλθε από 140 ασθενείς με καρκίνο στο μαστό και 70 ασθενείς με καλοήθεις όγκους. Η επεξεργασία του συνόλου των ιστοτεμαχίων περιελάμβανε την ομογενοποίηση, την απομόνωση του ολικού RNA, τον ποιοτικό έλεγχο ως προς την καθαρότητα και την ακεραιότητα του RNA, καθώς και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του RNA σε κάθε ιστολογικό δείγμα. Στο επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε η διαδικασία της πολυαδενυλίωσης του ολικού RNA και ακολούθησε η σύνθεση του cDNA μέσω της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής του συνόλου των διαφορετικών miRNAs. Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε η έκφραση των υπό μελέτη miR-29b-3p, miR-128-1-5p, miR-331-3p, miR-365a-3p, miR-195-5p και miR-497-5p, καθώς και του γονιδίου αναφοράς SNORD48, γνωστό και ως RNU48. Για την διαδικασία ανάλυσης της έκφρασης των προαναφερόμενων βιομορίων σχεδιάστηκαν οι ειδικοί εκκινητές, ακολούθησε η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πρωτόκολλου qRT-PCR μεθοδολογίας με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I και τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασής τους μέσω εφαρμογής της μεθόδου σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT . Η παρούσα μελέτη ολοκληρώθηκε με την δημιουργία μίας λεπτομερούς βάσης δεδομένων με πλήρης καταγραφή των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων των ασθενών και της μετεγχειρητικής τους πορείας, και ακολούθως, με την διεξαγωγή εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης για την αξιολόγηση της κλινικής αξίας των υπό μελέτη miRNAs.H μελέτη του miR-29b, το οποίο συμβάλλει στη ρύθμιση των αντιαποπτωτικών γονιδίων BCL2, BCLW και MCL1, ανέδειξε ότι η έκφρασή του θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλες τις ομάδες όγκων του μαστού, χωρίς να υπάρχουν μεταβολές μεταξύ των καρκινικών και των καλοήθων ιστολογικών δειγμάτων του μαστού. Συνεπώς, η έκφραση του miR-29b δεν εμφανίζει σημαντική διαγνωστική αξία για την διάκριση μεταξύ των κακόηθων και καλόηθων όγκων του μαστού. Όμως, η έκφραση του miR-29b διαφοροποιείται μεταξύ λοβιακών και πορογενών καρκινωμάτων του μαστού, εμφανίζοντας σημαντική μείωση (P=0.010) στα πορογενή. Επίσης, ένα ακόμα εύρημα προέκυψε από τη συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την σταδιοποίηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου (P=0.035). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b σταδιακά μειώθηκαν καθώς μεγάλωνε το στάδιο Τ, επιδεικνύοντας παράλληλα την τάση να συσχετίζεται αρνητικά με το μέγεθος του όγκου. Επίσης, η συσχέτιση της έκφρασης του miR-29b με την έκφραση των ΕR στα υπό ανάλυση δείγματα, αποκάλυψαν σημαντική υπερέκφραση του miR-29b σε εκείνα που είχαν χαρακτηριστεί ως ER-θετικά (P=0.021). Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση του miR-29b συσχετίστηκε σημαντικά με μεγαλύτερο χρονικό διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (P=0.010) στην ανάλυση Kaplan-Meier και με τον μικρότερο κίνδυνο υποτροπής στην μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.35, 95% CI: 0.15 – 0.81; P=0.014). Συνεκτιμώντας τα ανωτέρω ευρήματα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-29b αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο βιολογικό δείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης για τους ασθενείς με διηθητικό πορογενές καρκίνωμα του μαστού και υποδηλώνουν ότι η έκφρασή του μπορεί να επηρεαστεί από την ιστολογική προέλευση της κακοήθειας του μαστού.Το miR-128 αποτελεί ένα μετα-μεταγραφικό ρυθμιστή του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, η έκφραση του miR-128 ήταν πιο αυξημένη στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με εκείνη που παρατηρήθηκε στα καλοήθη (P=0.004). Μάλιστα, η διαγνωστική αξία των επιπέδων έκφρασης του miR-128 για τη διάκριση των κακοηθών από τους καλοήθεις όγκους του μαστού, επιβεβαιώθηκε με την ανάλυση της καμπύλης ROC (AUC=0.642; 95%CI=0.552-0.732; P=0.004). Επίσης, δεδομένου του μεγαλύτερου χρόνου επιβίωσης [DFS (P=0.010) και OS (P=0.006)] καθώς και του μικρότερου κινδύνου υποτροπής [DFS-μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 0.43, 95% CI: 0.218 – 0.833; P=0.013), DFS-πολυμεταβλητή (HR=0.39, 95% CI: 0.180 – 0.861; P=0.020)] ή μικρότερου κινδύνου κατάληξης από την νόσο (HR= 0.36, 95% CI: 0.164 – 0.769; P = 0.009) των ασθενών που εκφράζουν αυτό το μόριο, μπορεί να θεωρηθεί ως υποσχόμενος ανεξάρτητος ευμενής προγνωστικός δείκτης στον καρκίνο του μαστού.Ένα άλλο miRNA που σχετίζεται με τη ρύθμιση του προαποπτωτικού γονιδίου ΒΑΧ και η έκφρασή του στον καρκίνο του μαστού μελετήθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα εργασία, είναι το miR-331. Σύμφωνα με την στατιστική αξιολόγηση των δεδομένων μας, το miR-331 αυξάνεται στα καρκινικά δείγματα συγκριτικά με τα καλοήθη. Επίσης, η ανάλυση της καμπύλης ROC έδειξε ότι τα επίπεδα του miR-331 είχαν τη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ των δειγμάτων του μαστού με κακοήθη και καλοήθη φαινότυπο (AUC:0.597±0.044, 95% CI 0.511–0.683, P=0.026). H έκφραση του miR-331 συσχετίζεται μόνο με τον ιστολογικό υπότυπο, αποκαλύπτοντας τη σημαντική μείωση της ρύθμισής του στα λοβιακά καρκινώματα (P=0.026). Λόγω έλλειψης οποιασδήποτε άλλης συσχέτισης, το miR-331 δεν παρουσιάζει προγνωστική αξία για τον καρκίνο του μαστού.Η ανάλυση της έκφρασης του miR-365, το οποίο στοχεύει το αντιαποπτωτικό γονίδιο BCL2, παρουσίασε σημαντική μείωση των επιπέδων του στους καλοήθεις όγκους (P<0.001). Eπιπροσθέτως, η ανάλυσή μας με την καμπύλη ROC πρόσθεσε και τη διαγνωστική αξία στην προαναφερθείσα παρατήρηση, υποδεικνύοντας ότι τα επίπεδα του miR-365 είχαν ισχύ για την διάκριση των καρκινικών από τις καλοήθεις εξεργασίες του μαστού (AUC: 0.704, 95% CI 0.629–0.779, P<0.001). Σχετικά με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, στα πορογενή (P=0.003) και στα τριπλά αρνητικά καρκινώματα (TNBC) (P<0.001) παρατηρήθηκε χαμηλότερη έκφραση του miR-365 συγκριτικά με τα λοβιακά καρκινώματα και τους άλλους μοριακούς υπότυπους. Επίσης, η έκφραση του miR-365 ήταν σημαντικά αυξημένη στα ιστολογικά δείγματα με θετική ανοσοέκφραση των ορμονικών υποδοχέων ER (P<0.001) και PR (P=0.007), υποδηλώνοντας την πιθανή συμβολή του ως ένδειξη καλής προγνώσεως για τους ασθενείς. Ωστόσο, η έλλειψη σημαντικής συσχέτισης των επιπέδων του miR-365 με το DFS και OS δεν ενίσχυσε περισσότερο την κλινική αξία του στον καρκίνο του μαστού. Τέλος, για πρώτη φορά, διερευνήθηκε η έκφραση του συμπλέγματος miR-195/497, όπου και τα δύο miRNAs θεωρούνται άμεσοι ρυθμιστές του γονιδίου BCL2, σε κακοήθη και καλοήθη δείγματα του μαστού. Σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του συμπλέγματος miR-195/497 παρατηρήθηκαν στους καρκινικούς ιστούς συγκριτικά με τους καλοήθεις (miR-195: P=0.015, miR-497: P<0.001). Επιπροσθέτως, επιβεβαιώθηκε και η διαφοροδιαγνωστική αξία τους για τους ασθενείς με όγκους στον μαστό. Συγκεκριμένα, τα επίπεδα miR-195/497 έδειξαν την ικανότητα να διακρίνουν με ακρίβεια τους κακοήθης από τα καλοήθης ιστούς, βάσει της ανάλυσης ROC [(miR-195: AUC:0.605, 95% CI 0.525–0.685, P=0.015), (miR-497: AUC:0.848, 95%CI=0.792-0.905, P<0.001)]. Όσον αφορά τους ιστολογικούς και μοριακούς υπότυπους του μαστού, μόνο το miR-195 ανέδειξε σημαντική συσχέτιση (P<0.001), καταγράφοντας την μικρότερη έκφραση στα πορογενή και στα TNBC καρκινώματα. Επίσης, τα αυξημένα επίπεδα του miR-195 συσχετίζονται με την ομάδα των καρκινικών δειγμάτων που είχαν θετική έκφραση των ER (P=0.002). Στην περίπτωση του miR-497, στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του miR-497 και του ιστολογικού βαθμού διαφοροποίησης (Grade I-III) (P=0.031), της σταδιοποίησης του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου (P=0.013), καθώς και της έκφρασης του μιτωτικού δείκτη Ki67 (P=0.026). Η προγνωστική αξία του miR-497 ενισχύθηκε από τις αναλύσεις επιβίωσης, όπου οι ασθενείς με μειωμένη έκφραση του miR-497 εμφάνισαν μικρότερο χρονικό διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (P=0.028) στην ανάλυση Kaplan-Meier και με τον διπλάσιο κίνδυνο υποτροπής στην μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR= 2.282, 95% CI:1.069 – 4.869; P=0.033). Συνοψίζοντας, στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε η συλλογή 210 ιστοτεμαχίων από κακοήθεις και καλοήθεις όγκους μαστού. Τα ιστολογικά δείγματα επεξεργάστηκαν μέσω ανάπτυξης μεθοδολογιών για τον προσδιορισμό των υπό μελέτη miRNAs που ρυθμίζουν αποπτωτικά γονίδια της οικογένειας BCL2. Έπειτα, τα επίπεδα έκφρασης των εξετασθέντων βιομορίων συσχετίστηκαν με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους των ασθενών και τη μετεγχειρητική τους πορεία μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης. Τα ευρήματα μας ανέδειξαν την ισχυρή κλινική αξία στα περισσότερα υπό μελέτη miRNAs, για την διαφορική διάγνωση και την πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού. Αξίζει να αναφερθεί ότι η συγκριτική μελέτη των ευρημάτων μεταξύ των miRNAs (miR-29b, miR-365 και miR-195) που ρυθμίζουν αντιαποπτωτικά γονίδια, αποκάλυψε ότι η υπερέκφρασή τους συσχετίζεται με τα λοβιακά αδενοκαρκινώματα. Η παρατήρηση αυτή έχει ιδιαίτερη κλινική και ερευνητική αξία, καθώς θα μπορούσε ενδεχομένως να δημιουργήσει ως υπόθεση ότι θα πρέπει να εξεταστεί η επίδραση της ιστολογικής προέλευσης της κακοήθειας του μαστού στην έκφραση των miRNAs που στοχεύουν αντιαποπτωτικά γονίδια και κυρίως το BCL2. Eπιπλέον, η συσχέτιση της έκφρασης των miR-365 και miR-195 με τους μοριακούς υπότυπους, ίσως προσφέρει επιπρόσθετη πληροφορία για την θεραπευτική προσέγγιση των ΤΝBC αδενοκαρκινωμάτων, των οποίων οι ασθενείς στερούνται των επιλογών της ορμονοθεραπείας και της στοχευμένης θεραπείας.