Μελέτη του μεταβολισμού και της δράσης του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων σε ανθρώπινο νεφρικό ιστό και νεφρικά κύτταρα
Authors: Φραγκοπούλου Ελισσάβετ 
Published: January 2014

Ο Παράγοντας Ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF) είναι ένας ισχυρός φλεγμονώδης παράγοντας λιποειδικής φύσης που παράγεται από πληθώρα διεγερμένων κυττάρων μέσω δυο πορειών. Η εξ’ υπαρχής πορεία (de novo) είναι υπεύθυνη για τα βασικά επίπεδα του PAF ενώ η πορεία ανασχηματισμού (remodeling) ενεργοποιείται σε καταστάσεις φλεγμονής. Η μελέτη των ενζύμων μεταβολισμού του PAF είναι σημαντική αφού αυτά καθορίζουν τα επίπεδα του σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Πολλές μελέτες, συμπεριλαμβανομένου μελέτες σε πειραματόζωα, καλλιέργειες νεφρικών κυττάρων και κλινικές μελέτες, επισημαίνουν τον κύριο ρόλο του PAF στις νεφρικές παθήσεις. Η σπειραματοσκλήρυνση (GS) είναι το κοινό χαρακτηριστικό των περισσότερων νεφρικών παθήσεων και σχετίζεται άμεσα με τη εξέλιξη αυτών σε νεφρική ανεπάρκεια. Παρόλο τον μεγάλο αριθμό μελετών δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός πρόκλησης της GS. Τα τελευταία χρόνια μια σειρά μελετών επισημαίνουν ότι η αθηροσκλήρυνση και η σπειραματοσκλήρυνση παρουσιάζουν κοινά ιστολογικά χαρακτηριστικά και έχει προταθεί ο όρος «σπειραματική αθηροσκλήρυνση». Από το εργαστήριο μας έχει προταθεί μηχανισμός εμπλοκής του PAF στην πρόκληση της αθηροσκλήρυνσης και δεδομένου της ομοιότητας ανάμεσα στις δυο νόσους ο μηχανισμός αυτός φαίνεται ότι βρίσκει εφαρμογή και στην GS. Η ανεξέλεγκτη ενδοκυτταρική συσσώρευση λιποειδών στο εσωτερικό των κυττάρων οδηγεί στον σχηματισμό αφρωδών και πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των δυο ασθενειών. Η συσσώρευση μπορεί να γίνει τόσο μέσω των εκκαθαριστών υποδοχέων για την τροποποιημένη LDL όσο και μέσω δυσλειτουργίας των υποδοχέων για την μη τροποποιημένη LDL. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετήσει: 1. Το ένζυμο ακετυλο-CoA:λυσο-PAF ακετυλοτρανσφεράση (λυσο-PAF AT), της remodeling πορείας βιοσύνθεσης του PAF, το οποίο ενεργοποιείται σε καταστάσεις φλεγμονής σε ανθρώπινο νεφρικό ιστό και καλλιέργειες μεσαγγειακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκαν οι ολικές μεμβράνες από νεφρικό ιστό που προέρχεται από νεφρεκτομηθέντες ασθενείς και από καλλιέργειες κυτταρικής σειράς ανθρώπινων μεσαγγειακών κυττάρων (HMC) και μετρήθηκε η δραστικότητα της λυσο-PAF-AT με τη μέθοδο του τριχλωροξικού οξέος. Στην περίπτωση των HMC καθορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για τη δράση του ενζύμου συγκεκριμένα : βέλτιστη θερμοκρασία επώασης 37οC, βέλτιστο pH 7.2-7.4, βέλτιστη 187 συγκέντρωση λυσο-PAF και ακετυλο-CoA 20 μΜ και 200 μΜ αντίστοιχα. Στις βέλτιστες συνθήκες υπολογίστηκε το φαινόμενο Κm (μΜ) και Vmax (nmol/min/mg) 45.2 ± 9.37, 9.37 ± 3.1 ως προς τον λυσο-PAF και 71.2 ± 15.1, 2.83 ± 0.252 ως προς το ακετυλο-CoA,, αντίστοιχα. Τα ιόντα Μg 2+ , Ca 2+ σε μεγάλη συγκέντρωση προκαλούν μερική αναστολή του ενζύμου ενώ το EDTA προκαλεί αναστολή που μειώνεται με προσθήκη εξωγενούς Ca 2+. Η BSA, το NaF και το pefabloc δε επηρεάζουν σημαντικά τη δραστικότητα του ενζύμου, ενώ το DTT και η μερκαπτοαιθανόλη το αναστέλλουν. Για τη διαλυτοποίηση του ενζύμου από τις ολικές μεμβράνες τόσο από νεφρικό ιστό όσο και από HMC δοκιμάστηκαν διάφορα απορρυπαντικά. Μόνο η γλυκερόλη κατάφερε να διαλυτοποιήση το ένζυμο χωρίς να το απενεργοποιήσει με απόδοση περίπου 35 %. Το διαλυτοποιημένο κλάσμα καθαρίστηκε περαιτέρω σε στήλη ανιοανταλλαγής (HPLC). Στα κλάσματα της HPLC εντοπίστηκε ενζυμική δραστικότητα. Επίσης πραγματοποιήθηκε μη αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση στο διαλυτοποιημένο κλάσμα από το νεφρικό ιστό και στα δραστικά κλάσματα από την HPLC στα HMC και βρέθηκαν δυο περιοχές με δραστικότητα λυσο-PAF AT σε περιοχές μοριακών βαρών 25-30 kDa και 65-80 kDa. 2. Η διερεύνηση της εμπλοκής του PAF στο μηχανισμό πρόκλησης και εξέλιξης της νεφρικής βλάβης και συγκεκριμένα στις λειτουργίες των μεσαγγειακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά ανθρώπινων μεσαγγειακών κυττάρων. Ανιχνεύτηκε ένα είδος PAF υποδοχέα με Kd = 17.5 nM και Βmax = 4.01 pmol/mg πρωτεΐνης. Μορφολογικά παρατηρήθηκε ότι η LDL παρουσία αντιοξειδωτικών και PAF 10-6 M μπορεί να σχηματίσει αφρώδη κύτταρα. Η δημιουργία των αφρωδών κυττάρων οφείλεται στις συγκεκριμένες συνθήκες σε δράση των υποδοχέων της LDL αφού αναστέλλεται από την ηπαρίνη, που μπλοκάρει τους LDL υποδοχείς, και από το BN52021 που είναι αναστολέας του PAF, ενώ δεν επηρεάζεται από το πολυϊνοσικό οξύ που μπλοκάρει τους εκκαθαριστές υποδοχείς. Τα παραπάνω ενισχύονται αφού PAF 10-6 Μ προκαλεί αύξηση στα επίπεδα mRNA του υποδοχέα LDL στις 6-12 ώρες επώασης ενώ επιπλέον ο PAF φαίνεται ότι υπερκαλύπτει την επαγόμενη καταστολή στα επίπεδα του mRNA του υποδοχέα LDL από τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης. Επιπλέον ο PAF αυξάνει τα επίπεδα του εκκαθαριστή υποδοχέα SRAI με μέγιστη αύξηση να παρατηρείται σε συγκέντρωση 10-9-10-10 Μ PAF και στις 6-24 ώρες επώασης. Ο ίδιος ο PAF σε συγκέντρωση 10-6-10-11 Μ προκαλεί θετική ρύθμιση του υποδοχέα του σε 6 ώρες επώασης, ενώ και τα δύο είδη υποκινητών, που ελέγχουν τη μεταγραφή του υποδοχέα του PAF, ανιχνεύτηκαν στα μεσαγγειακά κύτταρα. Επιπλέον ο PAF (10-6 και 10-9 Μ) ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ μέσα σε 30 λεπτά. Αφού ο υποκινητής 1 περιέχει αλληλουχία δέσμευσής του NF-κΒ είναι πιθανό η θετική ρύθμισή στον υποδοχέα του να γίνεται μέσω του NF-κΒ. Τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι ο PAF παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση και εξέλιξη της νεφρικής βλάβης μέσω του σχηματισμού μεσαγγειακών αφρωδών κυττάρων και την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ.