Διερεύνηση της παρουσίας της Salmonella spp. στη διαδικασία προετοιμασίας των σφάγιων: κρίσιμα σημεία και έλεγχος των επιμολύνσεων του χοιρείου κρέατος
Authors: Λιμπιτάκης Νικόλαος 
Published: August 2021

Στην παρούσα διατριβή γίνεται πρώτα μια βιβλιογραφική ανασκόπηση θεμάτων που αφορούν την σαλμονέλλα (Γενικό μέρος). Στην συνέχεια ακολουθεί το ερευνητικό μέρος που καλύπτει: 1. Την παρουσία της Salmonella enterica στο περιβάλλον, στα χοίρεια σφάγια και σε υποπροϊόντα σφαγής σε δύο βιομηχανικά σφαγεία της Β. Ελλάδας κατά την περίοδο 1996 έως 1998. (Κεφάλαιο Α'). 2. Την ευαισθησία στα αντιβιοτικά των στελεχών της Salmonella spp. που απομονώθηκαν στα δυο σφαγεία κατά την ίδια περίοδο (Κεφάλαιο Β'). 3. Την μικροβιολογική χλωρίδα του αέρα του περιβάλλοντος των δύο σφαγειοτεχνικών εγκαταστάσεων με έμφαση την Salmonella spp. (Κεφάλαιο Γ). 4. Την αντιμετώπιση του προβλήματος των διασταυρούμενων αντιδράσεων που προέκυπτε κατά την εφαρμογή της ανοσολογικής διαγνωστικής μεθόδου της Elisa με εμπορικά kit για την ανίχνευση της Salmonella spp. (Κεφάλαιο Δ'). Από τα αποτελέσματα των πειραματικών μελετών, στα αντίστοιχα κεφάλαια , διαπιστώθηκαν τα εξής: 1. Από τα 1874 δείγματα που εξετάστηκαν με την κλασσική μικροβιολογική μέθοδο απομόνωσης βρέθηκαν θετικά για Salmonella spp. τα 178 (9.5%). Ο μέσος όρος της παρουσίας της Salmonella spp. (mean prevalence) στα δάπεδα των σφαγείων, στα χέρια των εργατών, στα μαχαίρια των εργατών, στα σφάγια αλλά και στα υποπροϊόντα σφαγής ήταν 19.6% (εύρος: 0%-100%), 5.2% (0%-50%), 3.1% (0%-37.5%), 7.3% (0%-88.9), και 6.6% (0%-90%), αντίστοιχα. Η μέση παρουσία της μόλυνσης με Salmonella spp. στους χοίρους ήταν 20.7% στα μεσεντέρια λεμφογάγγλια και 15.2% στο περιεχόμενο του τυφλού εντέρου τους. Σημαντική ήταν και η παρατήρηση στο ότι πριν την έναρξη της σφαγής το 37.5%, 6.3% και 8.7% των δειγμάτων που συλλέχθηκαν από τα δάπεδα, τα χέρια και τα μαχαίρια των εργατών αντίστοιχα βρέθηκαν θετικά για Salmonella spp. γεγονός που πιθανά να αντικατοπτρίζει την ανεπαρκή υγιεινή των σφαγειοτεχνικών εγκαταστάσεων. Στη δίχρονη συλλογή των στοιχείων η Salmonella spp. βρέθηκε σε ποσοστό 7.3% των σφάγιων. Πιο αναλυτικά για τα δύο σφαγεία που συμμετείχαν στη μελέτη μας το ποσοστό θετικότητας των σφάγιων για Salmonella spp. ήραν 1.1% και 0% κατά την διάρκεια των δειγματοληψιών των ψυχρών μηνών του έτους (1/10-30/4), και 11.1 % και 20.6% αντίστοιχα κατά την διάρκεια των δειγματοληψιών των θερμών μηνών του έτους (1/5-30/9). Γενικότερα την θερμή περίοδο τα θετικά με Salmonella spp. προϊόντα σφαγής ήταν περισσότερα σε αριθμό συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα θετικά με Salmonella spp. δείγματα της ψυχρής περιόδου. Τα στελέχη των σαλμονελλών πού απομονώθηκαν ανήκαν σε 22 διαφορετικούς οροτύπους. Ανάμεσα σε αυτούς οι S. derby και S. london ήταν οι πλέον συχνά απομονωθέντες ορότυποι αντιπροσωπεύοντας το 25.8% και 15.2% των οροτύπων αντίστοιχα. Τρίτος κατά σειρά απομόνωσης ήταν ορότυπος S. typhimurium. Το 37% των στελεχών της S. typhimurium που απομονώθηκαν ήταν του βακτηριοφαγικού τύπου DT 104, ενός τύπου ανθεκτικού σε πολλά αντιβιοτικά. Η μελέτη του αντιβιογράμματος των στελεχών αυτού του τύπου έδειξε μεγάλη συγγένεια με τα αντιβιογράμματα του αντίστοιχων στελεχών S. typhimurium DT 104 που απομονώθηκαν στη Β. Ευρώπη και Β. Αμερική. Η S.enteritìdis δεν απομονώθηκε σε κανένα δείγμα στην παρούσα μελέτη. 2. Από τα αντιβιογράμματα των 178 σαλμονελλών που απομονώθηκαν ποσοστό 62.4 % και 34.2 % ήταν ανθεκτικό στην Tetracyclin, και Streptomycin αντίστοιχα ενώ ποσοστό 5.6% και 9.5% των σαλμονελλών εμφάνισαν ενδιάμεση ευαισθησία στα ίδια αντιβιοτικά. Ποσοστά 26.4%, 29.8%, 5.1%, 1.7% 1.1%, 2.2%, 0, 0, 0, και 0, βρέθηκαν αντίστοιχα ανθεκτικά στα αντιβιοτικά Ampicillin, Sulfamethoxazole / Trimethoprim, Chloramphenicole, Gentamicin, Tobramycin, Nalidixic acid, Amikacin, Cefotaxime, Cefriaxone και Ciprofloxacin. Από τα 19 στελέχη της S. typhimurium τα 7 ήταν S. typhimurium DT 104, ορότυπος που απομονώσαμε για πρώτη φορά στην Ελλάδα. Ποσοστό 100, 100, 100, 85.7 και 28.6% των S. typhimurium DT 104 ήταν ανθεκτικά στην Ampicilin, Chloramphenicole, Tetracyclin, Streptomycin και Sulfamethoxazole / Trimethoprim αντίστοιχα. Η αντίσταση στα ίδια αντιβιοτικά των μη DT 104 στελεχών ήταν αντιστοίχως 0, 0, 25, 8.3 και 75%. Το αντιμικροβιακό προφίλ των στελεχών της S. typhimurium DT104 που απομονώθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι σχεδόν ταυτόσημο με το προφίλ των αντίστοιχων στελεχών της S. typhimurium DT104 που απομονώθηκαν από ανθρώπους στην Βόρεια Αμερική, Γαλλία και Ηνωμένο Βασίλειο. Υποψιαζόμαστε ότι τα Ελληνικά στελέχη της S. typhimutium DT 104 ήταν μάλλον προϊόν εισαγωγής στη χώρα μας είτε μέσω τροφίμου ζωικής προέλευσης και ζωοτροφής, η ζωντανού ζώου. Η τελευταία παραδοχή ενισχύεται από το γεγονός ότι τα μη DT104 Ελληνικά στελέχη παρουσίασαν σημαντικά διαφορετικό προφίλ χαμηλής αντίστασης στα αντιβιοτικά από τα στελέχη του τύπου DT104. Πολύ σημαντικό ήταν και το γεγονός ότι το 5.1% των απομονωθέντων στελεχών σαλμονέλλας ήταν ανθεκτικό στην Chloramphenicole, αντιβιοτικό του οποίου η χρήση απαγορεύεται στην κτηνιατρική συνταγογράφηση. Βρήκαμε ακόμα ότι οι σαλμονέλλες του ίδιου ορότυπου εμφάνισαν διαφορετικό αντιμικροβιακό προφίλ, ένδειξη της παρουσίας διαφορετικών κλώνων στον ίδιο ορότυπο. 3. Για τον έλεγχο της μικροβιολογικής ποιότητας του αέρα του περιβάλλοντος των χώρων σφαγής των δύο σφαγείων πήραμε δείγματα αέρα πριν την έναρξη της διαδικασίας σφαγής (1ος κύκλος), μετά την σφαγή 50-80 χοίρων (2ος κύκλος) και μετά το πέρας της όλης διαδικασίας σφαγής (3ος κύκλος). Η δειγματοληψία του αέρα έγινε με ειδικό πιστόλι δειγματοληψίας, μέθοδος πρόσκρουσης σε σταθερή επιφάνεια. Όλοι οι μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν, πλην ενός, ήταν θετικοί κατά Gram και Catalase θετικοί κόκκοι. Από αυτούς ποσοστό 15% ήταν Staphylococcus hominis, 15% S. haemolyticus/S. simulons, 15% S. aericularis ενώ 55% δεν ταυτοποιήθηκαν. Ο μοναδικός αρνητικός κατά Gram μικροοργανισμός που απομονώθηκε ήταν η E.coli ο οποίος και απομονώθηκε στον αέρα του περιβάλλοντος του ψυγείου του σφαγείου Α. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρξε μια σαφώς χρονοεξαρτώμενη επιβάρυνση του αέρα του περιβάλλοντος από θετικά κατά Gram μικρόβια κατά τη διάρκεια των κύκλων σφαγής. Ο αέρας δεν φάνηκε ωστόσο να αποτελεί πηγή διασποράς αρνητικών κατά Gram παθογόνων μικροοργανισμών όπως η σαλμονέλλα και συνεπώς δεν φάνηκε να συμβάλει στην επιμόλυνση των σφαγίων με αυτά. 4. Από τα 1878 περιβαλλοντολογικά δείγματα και προϊόντα σφαγής που συλλέξαμε από τα δύο σφαγεία και εξετάστηκαν με την κλασσική μικροβιολογική μέθοδο βρέθηκαν θετικά για σαλμονέλλα τα 178 (9.5%). Όταν όμως τα ίδια δείγματα εξετάστηκαν με ακόμη δύο διαγνωστικές εμπορικές μεθόδους που βασίζονταν στην ανοσολογική μέθοδο της ELISA, και χαρακτηρίσαμε θετικό για Salmonella κάθε δείγμα που βρίσκονταν θετικό με μία η περισσότερες από τις παραπάνω τρεις μεθόδους απομόνωσης, τότε τα θετικά δείγματα για Salmonella spp. αυξήθηκαν σε 463 (24,7%). Αυτό φανέρωνε την ύπαρξη προβλήματος διασταυρούμενης αντίδρασης γεγονός το οποίο επιβεβαιώσαμε και διορθώσαμε στη συνέχεια. Στο κομμάτι της εργασίας αυτής αποσαφηνίσαμε τα αίτια του προβλήματος και βελτιώσαμε την αξιοπιστία των εμπορικών kit Elisa. Η αυξημένη ευαισθησία και συνεπώς ο αυξημένος αριθμός ψευδώς θετικών δειγμάτων της Salmonella-Tek Elisa αποδόθηκε σε άλλα μη επιθυμητά (προβληματικά) βακτήρια τα οποία αντιδρούσαν με τα μονοκλωνικά αντισώματα της μεθόδου, κατά μη ειδικό τρόπο. Το 70% των προβληματικών βακτηρίων ήταν Providencea stuartii, το 20% Entrobacter cloacae, και το 10% Escherichia coli. Βρήκαμε ότι για την μείωση του πληθυσμού της Ρ. stuartii θα πρέπει να χρησιμοποιείται το Nalidixic acid σε συγκέντρωση 15mg/L στον προεμπλουτιστικό ζωμό Buffered Peptone Water ενώ για την αναστολή της ανάπτυξης της E.coli και Ε.cloacae κρίνεται απαραίτητη η παράλληλη χρησιμοποίηση 5mg/L Gentamycin. Με την χρησιμοποίηση των παραπάνω αντιβιοτικών κατορθώσαμε να έχομε στο στάδιο του προεμπλουτισμού 5 λογαριθμικές μειώσεις για τη Ρ. stuartii και 7 για την E.coli και Ε.cloacae αντίστοιχα. Η μελέτη αυτή απέδειξε την αδυναμία των συνιστώμενων από τον κατασκευαστή των εμπορικών kit Elisa εκλεκτικών εμπλουτιστικών ζωμών Rappaport-Vasiliadis (RV) και Selenite Cystine (SC) να καταστείλουν τα προβληματικά βακτήρια εις τρόπον ώστε αυτά να μην μεγαλώνουν πάνω από ≥ 106 κύτταρα/ml στον τελικό εμπλουτιστικό ζωμό M-Broth. Ο εκλεκτικός όμως εμπλουτιστικός ζωμός Tetrathionate Brilliant Green Bile (TBG) όταν δοκιμάστηκε μόνος του ήταν ικανός να αναστείλει την ανάπτυξη των προβληματικών βακτηρίων. Όταν ωστόσο δοκιμάστηκε σε συνδυασμό με τους ζωμούς (RV) η (SC) τότε τα προβληματικά βακτήρια ξεπέρασαν το όριο των 106 κυττάρων/ml στο M-Broth δημιουργώντας την ανάγκη χρήσης αντιμικροβιακών ουσιών στο προ-εμπλουτιστικό στάδιο. Ο καινούργιος σχεδιασμός της παραπάνω μεθοδολογίας, επιπλέον της εξάλειψης του προβλήματος των διασταυρούμενων αντιδράσεων, και συνεπώς της παραγωγής ψευδώς θετικών δειγμάτων για Salmonella spp. από την Elisa, αποτελεί και εξέλιξη της ίδιας της καλλιεργητικής μεθόδου στην απομόνωση της σαλμονέλλας.