Identification & characterization of a rice spikelet-specific germin-like protein
Authors: Τσακιρπάλογλου Νικόλαος 
Published: April 2024

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) όπως το υπεροξείδιο, το υπεροξείδιο, το ιόν υδροξυλίου και οι ρίζες οξυγόνου είναι υποπροϊόντα συγκεκριμένων μεταβολικών αντιδράσεων στα φυτά. Οι ROS βλάπτουν τα κυτταρικά βιομόρια και έτσι σαρώνονται ενεργά. Ωστόσο, οι ROS λειτουργούν επίσης ως μορφοτροπείς σήματος κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και των αντιδράσεων στο στρες. Τα οξειδοαναγωγικά ένζυμα όπως η δισμουτάση υπεροξειδίου (SOD) συμβάλλουν στην επίτευξη ισορροπίας μεταξύ των ROS που σαρώνονται και είναι διαθέσιμα ως μετατροπείς σήματος. Η χωροχρονικά διαφορική έκφραση των SOD σε διάφορους ιστούς παίζει κρίσιμο ρόλο στην απομάκρυνση της ρίζας υπεροξειδίου. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία SOD με βάση το νιτρομπλε-τετραζόλιο-ριβοφλαβίνη, παρατηρήθηκε ρύθμιση δύο υποθετικών SOD χαμηλής κινητικότητας (~96 kDa και ~92 kDa) σε αιχμές ρυζιού. Οι δύο πρωτεΐνες καθαρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής και οι δύο αναγνωρίστηκαν μέσω φασματομετρίας μάζας ως ομοτετραμερείς εκδόσεις μιας μοναδικής πρωτεΐνης που μοιάζει με βλαστίνη (GLP), κωδικοποιημένη από το γονίδιο LOC_Os08g08960 (Rice Genome Annotation Project). Η χρώση με χρώση πηκτής γλυκοπρωτεΐνης και ενζυματική απογλυκοζυλίωση έδειξε ότι η πρωτεΐνη τροποποιείται μετα-μεταφραστικά με Ν-γλυκοζυλίωση. Η διαφορική τροποποίηση πιθανώς εξηγεί τη διαφορά μεταξύ των δύο μορφών. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός αυτού του αναπτυξιακά ρυθμιζόμενου ειδικού GLP spikelet (ssGLP) έδειξε ότι η δραστικότητά του SOD είναι τύπου Mn-SOD και είναι εξαιρετικά σταθερή σε παράγοντες μετουσίωσης και σε υψηλές θερμοκρασίες. Το τετραμερές ssGLP στερείται δραστικότητας οξειδάσης οξαλικού. Οι βιολογικές λειτουργίες των ΟΕΠ δεν έχουν καθοριστεί πλήρως. Μεταξύ των διαφόρων λειτουργιών που τους αποδίδονται, ο ρόλος τους στην ανοχή στο βιοτικό στρες είναι σχετικά καλά μελετημένος. Τα μικρόβια ρυζιού, ειδικά μερικά από εκείνα με γονίδια στο χρωμόσωμα 8 στο ίδιο σύμπλεγμα με το γονίδιο LOC_Os08g08960, αν και όχι αυτό το συγκεκριμένο γονίδιο, έχουν βρεθεί προηγουμένως ότι συμβάλλουν στον βασικό μηχανισμό αντοχής σε παθογόνα που προκαλούν έκρηξη ρυζιού και ασθένεια θήκης. Το ssGLP εκτιμάται ότι συνεισφέρει σχεδόν το 11% της συνολικής δραστηριότητας SOD στις αιχμές ρυζιού, υποδεικνύοντας έναν κρίσιμο αναπτυξιακό ρόλο. Η ανάλυση έκφρασης με τη δοκιμασία in-gel SOD σε χωροχρονικό επίπεδο, καθώς και η θεραπεία με διάφορες ορμόνες, χημικές ουσίες και αβιοτικές μεταβλητές όπως ο τραυματισμός και το φως, έδειξαν ότι η έκφραση του ssGLP επηρεάζεται από αναπτυξιακά και όχι από ερεθίσματα στρες. Περαιτέρω, η ανάλυση έκφρασης σε χωροχρονικό επίπεδο μέσω RT-PCR επιβεβαίωσε τα αναπτυξιακά πρότυπα που παρατηρήθηκαν προηγουμένως σε επίπεδο πρωτεΐνης. In situ μελέτες υβριδισμού mRNA παρείχαν στοιχεία για την έκφραση γονιδίων ssGLP στη γύρη και το ενδοσπέρμιο και σε εντοπισμένες περιοχές των φύλλων και για την παραγωγή αντινοηματικού RNA. Σύμφωνα με την αύξηση της ρύθμισης των ακίδων, η σύγκριση in silico των υποστηρικτών της ΟΕΠ ρυζιού αποκάλυψε περισσότερα μοτίβα σπόρων και γύρης σε LOC_Os08g08960 από ό, τι σε άλλα γονίδια ΟΕΠ. Επιπλέον, η παρουσία ενός τομέα πρωτεΐνης GAF χαρακτηριστικού των κυκλικών νουκλεοτιδικών φωσφοδιεστερασών είναι μοναδική για το ssGLP. Προκαταρκτικές δοκιμασίες ενζύμων και αποτελέσματα in silico έδειξαν ότι το ssGLP μπορεί να δράσει ως πυροφωσφατάση/φωσφοδιεστεράση νουκλεοτιδίου-σακχάρου (NSPPase) παρόμοιο με ένα GLP κριθαριού που περιγράφηκε προηγουμένως. Ως πρώτο βήμα για έναν πληρέστερο ορισμό της ενζυμικής δραστικότητας του ssGLP και ειδικότερα για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι μια διαφορετική ολιγομερής διαμόρφωση δρα ως NSPPase, ένα γονίδιο για την ανασυνδυασμένη ssGLP κατασκευάστηκε, κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε στο Pichia pastoris.