Αξιοποίηση βακτηριακών γονιδίων hrp/hrc για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αβιοτικές καταπονήσεις
Authors: Μητσοπούλου Νικολέττα 
Published: August 2023

Η έκθεση των φυτών σε δυσμενή περιβάλλοντα αποβαίνει εξαιρετικά επισφαλής για την παραγωγικότητα και ικανότητα επιβίωσής τους, επιφέροντας παράλληλα ανάλογες προσαρμογές στα προγράμματα βελτίωσης που στοχεύουν στην ανάπτυξη ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων ως την πλέον βιώσιμη προσέγγιση για την εξασφάλιση της οικονομικής βιωσιμότητας των καλλιεργειών σε παγκόσμιο επίπεδο. Η επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων προσεγγίζεται παραδοσιακά μέσω της επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων ή/και της μεταφοράς γνωρισμάτων ανθεκτικότητας σε ευαίσθητους γονοτύπους μέσω διασταυρώσεων. Παρά τα αδιαμφισβήτητα επιτεύγματα των κλασικών βελτιωτικών διαδικασιών, η αποτελεσματικότητά τους περιορίζεται από τον πολυγονιδιακό έλεγχο των γνωρισμάτων ανθεκτικότητας, την ύπαρξη σημαντικής αλληλεπίδρασης γονοτύπου-περιβάλλοντος, την αναγκαιότητα αξιολόγησης ενός μεγάλου αριθμού γονοτύπων, την εφαρμογή πολλαπλών κύκλων επιλογής, καθώς και τη δυσκολία επίτευξης ομοιόμορφων συνθηκών καταπόνησης σε συνθήκες αγρού. Στις ανωτέρω προκλήσεις τίθενται πρόσθετοι περιορισμοί που σχετίζονται με τη στενή γενετική βάση των καλλιεργούμενων ειδών καθώς την περιορισμένη διαθεσιμότητα αλλά και υπερκέραση των χρησιμοποιούμενων πηγών ανθεκτικότητας που αναπόφευκτα πλήττει τη σταθερότητα της ανθεκτικότητας. Ενόψει της αναγκαιότητας διεύρυνσης της γονιδιακής δεξαμενής με στόχο την επίτευξη ευρείας και σταθερής ανθεκτικότητας, το ερευνητικό ενδιαφέρον στρέφεται δικαιολογημένα προς την αξιοποίηση των τεχνολογιών της γενετικής μηχανικής που δίνουν τη δυνατότητα στοχευμένης ένθεσης ενός μοναδικού επιθυμητού γονιδίου, ανεξαρτήτως προέλευσης και ταξινομικών εμποδίων, προσφέροντας δυνατότητες επίτευξης υψηλού επιπέδου ανθεκτικότητας ή/και ανοσίας χωρίς περαιτέρω αλλοίωση του οργανισμού -στόχου. Με δεδομένη την περιορισμένη διαθεσιμότητα φυσικών πηγών ανθεκτικότητας φυτικής προέλευσης, η έρευνα ενσωματώνει ολοένα και περισσότερο την αξιοποίηση γονιδίων μη φυτικής προέλευσης που δυνητικά προδίδουν ευρέος φάσματος ανθεκτικότητα. H παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη διερεύνηση των δυνατοτήτων αξιοποίησης βακτηριακών γονιδίων hrp/hrc, που κωδικοποιούν το εκκριτικό σύστημα τύπου III (Τ3SS), για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αβιοτικές καταπονήσεις. Αρχικά, η έρευνα εστίασε στη μελέτη της επίδρασης των γονιδίων hrpZPsph, hpaA και hpaB, που ανήκουν στη συστάδα hrp/hrc, ως προς τη δυνατότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Έπειτα από τη διαπίστωση ότι οι hrpZPsph-σειρές εμφανίζουν προηγμένη ανθεκτικότητα έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, ως ερευνητικός στόχος τέθηκε η αποσαφήνιση των μηχανισμών που κυβερνούν την ανθεκτικότητά τους, μέσω προσδιορισμού του μεταβολικού τους προφίλ υπό συνθήκες καταπόνησης, και η εύρεση πιθανών μεταβολικών βιοδεικτών που σηματοδοτούν τις μεταβολικές προσαρμογές στις εν λόγω καταπονήσεις. Στο εισαγωγικό κεφάλαιο περιγράφονται οι επιπτώσεις που επιφέρουν οι καταπονήσεις στα φυτά καθώς και οι αποκρίσεις άμυνας των φυτών σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις. Ακολούθως, γίνεται περιγραφή των βελτιωτικών προσεγγίσεων για την επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών και βιοτικών καταπονήσεων, με έμφαση στις τεχνολογίες της γενετικής μηχανικής και στη φύση των χρησιμοποιούμενων πηγών ανθεκτικότητας. Τέλος, γίνεται αναφορά στις δυνατότητες και προοπτικές που επιφέρει η αξιοποίηση φυτών-μοντέλων στα επιστημονικά πεδία της Βελτίωσης των Φυτών. Με δεδομένες τις πολυδιάστατες λειτουργικές επιδράσεις των χαρπινών στα φυτά, στο Κεφάλαιο 2 διερευνήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του γονιδίου hrpZPsph, από το βακτήριο Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola, για την επίτευξη ανθεκτικότητας στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας. Τα ευρήματα από την αξιολόγηση κατέδειξαν την υπεροχή συγκεκριμένων hrpZPsph-σειρών έναντι των φυτών wt, η οποία στα νεαρά στάδια εκφράστηκε μέσω του υψηλότερου δυναμικού βλάστησης και ανάπτυξης των σποροφύτων, ενώ στο στάδιο των ώριμων φυτών αποτυπώθηκε στην καθυστερημένη ανάπτυξη και στην εκδήλωση ηπιότερων συμπτωμάτων, στη βελτιωμένη ευρωστία, στο υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης αλλά και στην ικανότητα ανάκαμψης, μετά το πέρας της περιόδου καταπόνησης. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα υποδεικνύουν τη θετική επίδραση του γονιδίου hrpZPsph στην επαγωγή ανθεκτικότητας έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας.Ακολούθως, αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η απόκριση των hrpZPsph-σειρών στην καταπόνηση καδμίου (Κεφάλαιο 3) στη φάση της βλάστησης και σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια. Τα ευρήματα συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι οι hrpZPsph-σειρές, και ιδιαίτερα οι σειρές #6 και #9, εμφανίζουν προηγμένη ανθεκτικότητα έναντι της καταπόνησης καδμίου, όπως προκύπτει τόσο από το δυναμικό βλάστησης των σπόρων και ανάπτυξης των σποροφύτων υπό συνθήκες καταπόνησης όσο και από τη φαινοτυπική και φυσιολογική απόκριση στο στάδιο των ώριμων φυτών. Είναι ενδιαφέρον ότι οι hrpZPsph-σειρές εμφάνισαν διαφορετικό προφίλ συσσώρευσης καδμίου, συγκριτικά με τα φυτά wt. Ειδικότερα, τα φυτά wt εμφάνισαν μεγαλύτερη ποσότητα Cd στα φύλλα, ενώ οι hrpZPsph-σειρές παρουσίασαν αντίθετο μοτίβο, γεγονός που πιθανά υποδηλώνει την ύπαρξη ενός μηχανισμού συγκράτησης του Cd στις ρίζες. Με δεδομένο τον πολυδιάστατο ρόλο του hrpZPsph in planta, που αναδείχθηκε μέσω της παρατηρούμενης ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων, ερευνητικό στόχο αποτέλεσε η κατανόηση της μεταβολικής απόκρισης των hrpZPsph-σειρών στις ανωτέρω καταπονήσεις και ο εντοπισμός των μεταβολικών συστατικών με καίριο ρόλο στην επαγωγή ανθεκτικότητας. Στο Κεφάλαιο 4 έγινε προσδιορισμός του μεταβολικού προφίλ και συγκριτική αξιολόγηση των hrpZPsph-σειρών και των φυτών wt υπό συνθήκες καταπόνησης ξηρασίας. Τα συνολικά αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη διαφορική απόκριση των υπό μελέτη γονοτύπων στην υδατική καταπόνηση, η οποία σημαίνεται πρωτίστως από τις διαφορές στο μεταβολικό περιεχόμενο της σειράς #6 που αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική στην ξηρασία κατά τη φάση της βλάστησης αλλά, κυρίως στο στάδιο των ώριμων φυτών. Επιπλέον, η έρευνα ανέδειξε ως βασικούς ρυθμιστές του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης τα συστατικά L-σερίνη, L- θρεονίνη, μουκικό οξύ και πιπεκολικό οξύ. Με δεδομένο ότι οι διαφορές στο προφίλ συσσώρευσης των ανωτέρω συστατικών σχετίστηκαν με το επίπεδο αντοχής των υπό μελέτη γονοτύπων, προσφέρονται σημαντικές προοπτικές αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για την αναγνώριση των ανθεκτικών γονοτύπων. Αντίστοιχα, στο Κεφάλαιο 5 προσεγγίστηκε η μελέτη της μεταβολικής απόκρισης των hrpZPsph-σειρών υπό συνθήκες καταπόνησης υψηλής αλατότητας με στόχο αφενός μεν την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ανθεκτικότητα των hrpZPsph-σειρών και αφετέρου τον εντοπισμό των συστατικών που σηματοδοτούν τις μεταβολικές ρυθμίσεις υπό συνθήκες καταπόνησης. Τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν το διακριτό μεταβολικό περιεχόμενο των hrpZPsph-σειρών, συγκριτικά με τα φυτά wt, τόσο απουσία όσο και παρουσία καταπόνησης αλατότητας, παρέχοντας ενδείξεις σχετικά με την επίδραση του hrpZPsph στο μεταβολισμό των φυτών του είδους N. benthamiana. Μεταξύ των hrpZPsph-σειρών, σημαντική διαφοροποίηση ως προς το μεταβολικό περιεχόμενο εμφάνισε η σειρά #1, η οποία βάσει των ευρημάτων του Κεφαλαίου 2 αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική, στη φάση της βλάστησης και στο στάδιο των ώριμων φυτών, έναντι των υπολοίπων hrpZPsph-σειρών και των φυτών wt. Ως προς τα συστατικά που σηματοδοτούν τη ρύθμιση του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης, υπογραμμίζεται η σημαντική συνεισφορά των μεταβολιτών D-γαλακτόζη, L-προλίνη, D-σορβιτόλη, κιτρικό οξύ και μαλονικό οξύ, προσφέροντας δυνατότητες αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες ανθεκτικότητας έναντι της καταπόνησης υψηλής αλατότητας. Η παρούσα μελέτη προσδίδει καίρια γνώση σχετικά με την επίδραση της χαρπίνης ΗrpZPsph στη μεταβολική απόκριση αντοχής στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, συμβάλλοντας παράλληλα στον εντοπισμό των μεταβολικών συστατικών με πρωτεύοντα ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης. Στο πλαίσιο αξιοποίησης πρωτεϊνών-τελεστών για την επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων, αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης του γονιδίου hpaA από το βακτήριο Xanthomonas campestris pv. campestris, το οποίο βάσει της δράσης του έχει προταθεί ως τελεστής, ως προς την ικανότητα επαγωγής ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η απόκριση hpaA-διαγονιδιακών φυτών του είδους Nicotiana benthamiana στην καταπόνηση ξηρασίας και υψηλής αλατότητας στη φάση της βλάστησης και στο στάδιο των ώριμων φυτών. Τα συνολικά ευρήματα υποδεικνύουν τη διαφορική απόκριση των hpaA-σειρών και των φυτών wt στις καταπονήσεις της ξηρασίας και της υψηλής αλατότητας και υπογραμμίζουν την υπερέχουσα επίδοση των σειρών #1 και #5 έναντι των υπολοίπων. Η παρούσα μελέτη συνιστά την πρώτη αναφορά σχετικά με την επίδραση της έκφρασης του hpaA in planta, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις σχετικά με τη θετική επίδραση της έκφρασης τελεστών στην άμυνα των φυτών έναντι καταπονήσεων. Παρά την αδυναμία σύνδεσης με συγκεκριμένες μοριακές ή/και βιοχημικές οδούς άμυνας, η παρατηρηθείσα προηγμένη ανθεκτικότητα πιθανά αποδίδεται στην ενεργοποίηση της γενικής άμυνας των φυτών λόγω της ενδογενούς έκφρασης του γονιδίου hpaA και, παράλληλα, θέτει τη βάση για την περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης που φέρει η έκφραση του γονιδίου hpaA in planta.Με δεδομένο το ρόλο της πρωτεΐνης HpaB στην παθογένεια του βακτηριακού φορέα της, καθώς και τη δράση της ως δομικό συστατικό της εκκριτικής συσκευής T3SS, ερευνητικό στόχο του Κεφαλαίου 7 αποτέλεσε η μελέτη των λειτουργικών επιδράσεων του γονιδίου hpaB in planta, ως προς την ικανότητα επαγωγής ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Ειδικότερα, μελετήθηκε η απόκριση hpaB-σειρών του είδους N. benthamiana, από το βακτήριο Xanthomonas vesicatoria, στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας στη φάση της βλάστησης και σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν σαφώς την υπεροχή της σειράς #4, η οποία εκφράστηκε σε όλες τις υπό μελέτη παραμέτρους που αφορούν στο δυναμικό βλάστησης και ανάπτυξης των σποροφύτων, στο ποσοστό επιβίωσης των φυτών, στο χρόνο εκδήλωσης και στην ένταση των συμπτωμάτων, στην ικανότητα ανάκαμψης έπειτα από άρδευση, σε αναπτυξιακά γνωρίσματα, στην ικανότητα συγκράτησης νερού στα φύλλα και στην περιεκτικότητα χλωροφύλλης και προλίνης. Αν και δεν παρέχεται επαρκής αιτιολόγηση σχετικά με τους μηχανισμούς που διέπουν την παρατηρηθείσα ανθεκτικότητα, καθώς η παρούσα μελέτη συνιστά την πρώτη αναφορά σχετικά με τη λειτουργική επίδραση του hpaB in planta, τα ευρήματα προσφέρουν προοπτικές αξιοποίησης του γονιδίου hpaΒ για την αναβάθμιση της ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Τέλος, η Γενική Συζήτηση (Κεφάλαιο 8) επικεντρώνεται σε μία ανασκόπηση των βελτιωτικών προσεγγίσεων για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων, δίδοντας έμφαση στις τεχνολογίες της γενετικής μηχανικής. Τα αποτελέσματα της μελέτης συζητώνται υπό το πρίσμα της συνεισφοράς τους στην απόκτηση βασικής γνώσης αλλά και των προοπτικών αξιοποίησής τους στην έρευνα για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Η Γενική Συζήτηση ολοκληρώνεται με μία κριτική ανασκόπηση των νέων τεχνολογιών βελτίωσης, οι οποίες εμπλουτίζουν δραματικά τη φαρέτρα των βελτιωτών, σύμφωνα με το ρυθμό ανάπτυξής τους και τεκμηρίωσης της αποτελεσματικότητάς τους αλλά και του ρυθμιστικού πλαισίου που αναμένεται να καθορίσει το πλαίσιο εφαρμογής τους για ανάπτυξη και χρήση ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων.