Μελέτη της νευρογένεσης κατά μήκος της οδοντωτής έλικας του ιπποκαμπείου σχηματισμού του ενήλικου εγκεφάλου
Authors: Μπεκιάρη Χρυσάνθη 
Published: September 2021

Δύο περιοχές του ενήλικου εγκεφάλου, η υποκοκκώδης ζώνη της οδοντωτής έλικας του ιπποκάμπειου σχηματισμού και η υποκοιλιακή ζώνη των πλάγιων κοιλιών, διατηρούν την ικανότητα να παράγουν νέα νευρικά κύτταρα καθ’ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής. Τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα της υποκοκκώδους ζώνης, ακολουθώντας μία σύνθετη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, παράγουν νέα κοκκοειδή κύτταρα τα οποία μεταναστεύουν στην κοκκώδη στιβάδα και ενσωματώνονται πλήρως στα υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα.Η δομική, βιοχημική, γονιδιακή, ηλεκτροφυσιολογική και λειτουργική διαμερισματοποίηση της οδοντωτής έλικας κατά το διαμήκη (ή διαφραγματο-κροταφικό) άξονά της επηρεάζει σημαντικά τη συνεχή διαδικασία παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων. Στο διαφραγματικό τμήμα της οδοντωτής έλικας ανιχνεύεται σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων συγκριτικά με το κροταφικό της τμήμα, ενώ παράλληλα αποδεικνύονται και σημαντικές διαφορές στο ρυθμό ωρίμανσης των νεοπαραγόμενων νευρώνων. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες αποδίδουν την ταχύτερη ωρίμανση των νέων νευρώνων του διαφραγματικού τμήματος στα αυξημένα επίπεδα της τοπικής βασικής ηλεκτρικής δραστηριότητας, εικάζοντας ότι το εξαρτώμενο από τη δραστηριότητα φαινόμενο της νευρογένεσης πιθανώς να παρουσιάζει και άλλες διαφορές μεταξύ του δραστήριου διαφραγματικού τμήματος και του λιγότερο ενεργού κροταφικού τμήματος.Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε συγκριτικά ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η ωρίμανση των νέων κυττάρων της οδοντωτής έλικας στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της. Για τη σήμανση των νεοπαραγόμενων κυττάρων της οδοντωτής έλικας, χορηγήθηκαν στους επίμυες (εικοσιτέσσερεις αρσενικοί επίμυες ηλικίας τριών μηνών κατά την έναρξη των πειραματισμών) δύο ενδοπεριτοναϊκές εγχύσεις του διαλύματος της 5-βρωμο-2΄-δεοξυουριδίνης (BrdU, 20mg/ml σε φυσιολογικό ορό 0,9%) στη δόση των 100mg/Kg/έγχυση, με μεσοδιάστημα δώδεκα ωρών. Ακολούθως, οι επίμυες θυσιάστηκαν υπό γενική αναισθησία με ενδοκαρδιακή χορήγηση διαλύματος φυσιολογικού ορού ακολουθούμενο από μονιμοποιητικό διάλυμα 4% παραφορμαλδεϋδης, σε προκαθορισμένες χρονικές στιγμές μετά την έγχυση της BrdU (2, 5, 7, 14, 21 και 30 ημέρες).Από τους μονιμοποιημένους εγκεφάλους λήφθηκαν στεφανιαίες τομές παραφίνης πάχους 10μm, καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματικού (-2,56 έως -4,16 mm αναφορικά με το βρέγμα, σύμφωνα με τον άτλαντα των Paxinos και Watson, 1998) και του κροταφικού τμήματος (-4,80 έως -6,04 mm) της οδοντωτής έλικας. Οι τομές που επιλέχθηκαν σημάνθηκαν είτε με τη χρώση Nissl είτε με απλή ανοσοϊστοχημεία έναντι του αντιγόνου της BrdU, ώστε να είναι εφικτή η καταμέτρηση του συνολικού πληθυσμού των κοκκοειδών κυττάρων και των νεοπαραγόμενων κυττάρων, αντίστοιχα, στα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας.Σε επιλεγμένες τομές καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας εφαρμόστηκε διπλή ανοσοϊστοχημεία φθορισμού έναντι της BrdU και επιλεγμένων αντιγονικών δεικτών που εκφράζονται κατά τα διαδοχικά στάδια ανάπτυξης των νέων νευρώνων. Οι δείκτες αυτοί ήταν η όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας (GFAP), η διπλοκορτίνη (DCX), η πυρηνική πρωτεΐνη των νευρώνων (NeuN), η καλρετινίνη και η καλβινδίνη. Η πρωτεΐνη S100, ειδική των ώριμων αστροκυττάρων, χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της παράλληλης αστρογλοιογένεσης στην οδοντωτή έλικα. Η δημιουργία των γλουταμινεργικών συνάψεων από τους νεοπαραγόμενους νευρώνες επιβεβαιώθηκε μέσω των αντιγόνων της υπομονάδας R1 των NMDA υποδοχέων και της υπομονάδας GluR2 των AMPA υποδοχέων, ενώ μελετήθηκε και η σταδιακή μετανάστευσή τους από την υποκοκκώδη ζώνη στην κοκκώδη στιβάδα. Η απόπτωση μερίδας του πληθυσμού των νέων νευρώνων μελετήθηκε μέσω της έκφρασης των αντιγόνων της κασπάσης-3 και της φρακτίνης. Τουλάχιστον 50 και 30 BrdU+ κύτταρα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος αντίστοιχα, μελετήθηκαν με τη βοήθεια του συνεστιακού μικροσκοπίου (Nikon Eclipse C1, λογισμικό EZ - C1 3.20) για πιθανή συνέκφραση με κάθε δείκτη.Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS 20.0. Η ανάλυση διακύμανσης κατά έναν παράγοντα (one-way ANOVA) και το T–test ανεξάρτητων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για τις συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Η ομοιογένεια των διακυμάνσεων ελεγχόταν με το τεστ του Levene, και όταν αυτή παραβιαζόταν (Levene’s test, P< 0.05), εφαρμοζόταν ο μη παραμετρικός έλεγχος του Kruskal-Wallis για τις πολλαπλές συγκρίσεις, ακολουθούμενος από τον έλεγχο του Mann-Whitney (two-tailed) για τις επιμέρους συγκρίσεις. Όλα τα ποσοτικά αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (mean ± S.E.) και για όλες τις συγκρίσεις το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 5% (P< 0.05). Προκειμένου για τη μελέτη της τοπογραφικής κατανομής των BrdU+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε η ανάλυση προσαρμογής της καμπύλης (curve fit analysis), ακολουθούμενη από την ανάλυση της διακύμανσης κατά έναν παράγοντα.Η ανοσοϊστοχημεία έναντι της BrdU αποκάλυψε ότι μεγαλύτερος πληθυσμός BrdU+ κυττάρων εποικίζει το διαφραγματικό τμήμα της οδοντωτής έλικας, αλλά η παράλληλη στερεολογική ανάλυση των πληθυσμών των νεοπαραγόμενων και των κοκκοειδών κυττάρων απέδειξε ότι τα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας διαθέτουν ισοδύναμη ικανότητα για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων. Παράλληλα, όμοιο εμφανίζεται και το πρότυπο κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων κατά το διαμήκη και τον εγκάρσιο άξονα των δύο τμημάτων.Παρά τον αρχικά όμοιο ρυθμό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των διαιρούμενων κυττάρων καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα, οι δύο πληθυσμοί των νεοπαραγόμενων νευρώνων συμπεριφέρονται διαφορετικά κατά την εξέλιξη της διαφοροποίησης, μετανάστευσης και ωρίμανσης τους. Οι νέοι νευρώνες του διαφραγματικού τμήματος παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού και παρατεταμένη μετανάστευση, επιτυγχάνουν όμως ταχύτερη έκφραση ώριμων νευρωνικών δεικτών και συναπτογένεση. Σημαντικές διαφορές εντοπίζονται και στην επιβίωση των νεοπαραγόμενων νευρώνων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, ενώ αντίθετα, όμοια και ιδιαιτέρως χαμηλά ανιχνεύονται τα ποσοστά αστρογλοιογένεσης και αποπτωτικών νεοπαραγόμενων νευρώνων στα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας.Η ισοδύναμη ικανότητα για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων επαληθεύεται και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της οδοντωτής έλικας. Αποκλίσεις όμως ανιχνεύονται στην επιβίωση των νέων νευρικών κυττάρων, με το υπερ-πυραμιδικό σκέλος να παρουσιάζει αυξημένα ποσοστά επιβίωσης των εκεί παραγόμενων νευρώνων.Οι σημαντικές διαφορές που ανακύπτουν στην αρχικά όμοια εξελισσόμενη νευρογένεση του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, συσχετίζονται προφανώς άμεσα με τις υπάρχουσες διαφοροποιήσεις του τοπικού μικροπεριβάλλοντος και της ειδικότερης λειτουργίας αυτού. Παράλληλα, ενδιαφέρουσες είναι οι ομοιότητες που παρατηρούνται μεταξύ των μορφογενετικά ‘νεότερων’ περιοχών (διαφραγματικό τμήμα και υπο-πυραμιδικό σκέλος), καθώς και μεταξύ των μορφογενετικά ‘παλαιότερων’ περιοχών (κροταφικό τμήμα και υπερ-πυραμιδικό σκέλος) της οδοντωτής έλικας.Επομένως, οι γνωστές δομικές, ηλεκτροφυσιολογικές και λειτουργικές διαφορές κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας, επιδρούν στην εξελισσόμενη νευρογένεση, οδηγώντας το διαφραγματικό τμήμα σε μία συνεχή, ταχεία και λιγότερο πειθαρχημένη παραγωγή νέων νευρώνων, ενώ το ήρεμο μικροπεριβάλλον του κροταφικού τμήματος συντηρεί μία λιγότερο απαιτητική και περισσότερο σταθερή νευρογένεση.