Μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός βακτηριακών πεπτιδυλ-προλυλ-ισομερασών
Authors: Ζωγράφου Χρυσούλα 
Published: August 2021

Οι πεπτίδυλ-πρόλυλ cis/trans ισομεράσες (PPIάσες, EC: 5.2.1.8) αποτελούν μια υπεροικογένεια συντηρημένων πρωτεϊνών, οι οποίες απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς, ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς. Καταλύουν την cis/trans ισομερίωση πεπτίδυλ-πρόλυλ δεσμών τόσο νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών όσο και ώριμων πρωτεϊνών στόχων, τροποποιώντας τη δομή τους ή τις ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις τους και ως εκ τούτου επηρεάζουν τη λειτουργία τους. Τα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών διακρίνονται στις εξής οικογένειες: τις κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το FK506 (FKBPs) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι PPIάσες, εκτός από την ενεργότητα PPIάσης, εμφανίζουν και ενεργότητα τσαπερόνης μέσω της οποίας επιτελείται η αναδίπλωση πρωτεϊνών και παρεμποδίζεται η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μελών της FKBP οικογένειας των μικροοργανισμών Azotobacter vinelandii και Escherichia coli. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση του πλήρως αλληλουχημένου γονιδιώματος των δυο βακτηρίων μέσω της οποίας εντοπίστηκαν έξι και πέντε γονίδια αντίστοιχα, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ανήκουν στην FKBP οικογένεια. Κατά τον in vitro υπολογισμό της ενζυμικής ενεργότητας διαπιστώθηκε ότι οι AvfkbX, AvfkbB, AvfkbA1, AvfkbA2 του A. vinelandii και οι EcfkpA, EcfkpB, EcfklB, EcslyD, Ectig του E. coli είναι ενεργές PPIάσες, ενώ οι περισσότερες με βάση τη μέθοδο παρεμπόδισης της δημιουργίας συσσωματωμάτων της συνθάσης του κιτρικού οξέος εμφάνισαν ενεργότητα τσαπερόνης. Στη συνέχεια κατασκευάστηκαν κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων τα οποία μετέχουν στον ενεργό κέντρο PPIάσης κάθε FKBP πρωτεΐνης. Διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της ενεργότητας PPIάσης στις AvfkbA1Y194A, AvfkbA2Y84A και EcfkpAY225A ενώ δεν ανιχνεύθηκε ενεργότητα PPIάσης στις EcfklBY181A, EcslyDF132A, EctigF198A και EcfkpBD119A. Ο φυσιολογικός ρόλος των FKBP πρωτεϊνών μελετήθηκε μέσω της ανάπτυξης, σε διαφορετικές συνθήκες, των E. coli στελεχών ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig στα οποία έχει απενεργοποιηθεί το συγκεκριμένο FKBP γονίδιο. Η απουσία των FKBP πρωτεϊνών είχε ως αποτέλεσμα πλειοτροπικούς φαινοτύπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αυξημένη ικανότητα κολυμβητικής και επιφανειακής ομαδικής κίνησης, καθώς και αυξημένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου, συγκριτικά με το στέλεχος αγρίου τύπου. Η έκφραση των αγρίου τύπου γονιδίων EcfkpA, EcfkpB, EcfklB, EcslyD και Ectig στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig επανέφερε τους φυσιολογικούς προαναφερθέντες φαινοτύπους, ενώ η έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων EcfkpAY225A, EcfkpBD119A, EcfklBY181A, EcslyDF132A και EctigF198A στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη δεν επανέφερε, στις περισσότερες περιπτώσεις, το φαινότυπο του σχηματισμού βιοϋμενίου, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή των FKBP πρωτεϊνών σε αυτό το οργανωμένο σύστημα ζωής. Εξετάζοντας την κυτταρική μορφολογία των στελεχών που υπερεκφράζουν κάθε FKBP γονίδιο παρατηρήθηκε μια σημαντική κυτταρική επιμήκυνση, αντίθετα με τα στελέχη τα οποία υπερεκφράζουν κάθε μεταλλαγμένο FKBP γονίδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργότητα PPIάσης επηρεάζει το μήκος των κυττάρων του E. coli. Επίσης, ο φαινότυπος των στελεχών ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig επανήλθε στα φυσιολογικά επίπεδα μέσω υπερέκφρασης της πλειοψηφίας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις PPIάσες του E. coli, υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατή μια λειτουργική υποκατάσταση ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών. Η αυξημένη ικανότητα ομαδικής, κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου του στελέχους ΔfkpB επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από την υπερέκφραση πρωτεϊνών που αποτελούν πιθανούς στόχους της EcfkpB, υποδηλώνοντας ότι ο παρατηρούμενος φαινότυπος προκύπτει από την λανθασμένη αναδίπλωση των πρωτεϊνών στόχων, λόγω της απουσίας του EcfkpB γονιδίου. Η παρουσία αυτών των πιθανών στόχων είχε ως συνέπεια τη μείωση της in vitro ενεργότητας PPIάσης της EcfkpB. Η υπερέκφραση των πιθανών πρωτεΐνών στόχων της EcfkpB στο στέλεχος ΔslyD σε συνθήκες κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου έδειξε ότι οι πρωτεΐνες EcdnaK, EcmreB, EccheA, EcfliC και EcrpoB είναι πιθανοί κοινοί στόχοι της EcfkpB και της EcslyD ενώ μόνο οι EcdnaK και EccheA είναι πιθανοί κοινοί στόχοι της EcfkpB και της EcfkpA. Τέλος, ανιχνεύθηκε η αλληλεπίδραση της EccarA, η οποία αποτελεί πιθανή πρωτεΐνη στόχο της EcfkpB, με την EcfkpB και η αλληλεπίδραση της AvcarA, με τις AvfkbA1 και AvfkbA2 μέσω συνέκφρασης και απομόνωσης των σταθερών συμπλεγμάτων. Η χρήση του διασυνδετή DTBP συνέβαλλε στη σταθεροποίηση του συμπλέγματος της EcfkpB με την EcispH, η οποία αποτελεί πιθανή πρωτεΐνη στόχο της EcfkpB. Η EcispH εδράζεται στο ίδιο οπερόνιο με την EcfkpB και διαθέτει δύο κατάλοιπα προλίνης με cis διάταξη, τα P8 και P32. Η εξέταση της αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμένων ως προς την προλίνη EcispHP8A και EcispHP32A με την EcfkpB κατέδειξε ότι μόνο η προλίνη P8 είναι υπεύθυνη για το σύμπλεγμα αυτό.