The effect of cfDNA on the expression of TLR receptors in human mesenchymal stem cells
Authors: Е.С. Ершова, , Н.Н. Вейко, , Н.А. Салимова, , Л.В. Каменева, , О.А. Долгих, , С.В. Костюк, 
Published: January 2023

Введение. Опосредованная толл-подобными рецепторами (TLR) активация врожденного иммунного ответа варьирует в зависимости от типа клеток. TLR могут узнавать не только экзогенныe патогенные молекулы (PAMP - pathogen-associated molecular patterns), но и молекулы эндогенной природы, появляющиеся при повреждении тканей, асептическом воспалении и дегенерации - DAMP. При определенных обстоятельствах эта реакция может быть неконтролируемой, что приводит к развитию тяжелого системного воспаления и сепсиса. TLR9 - единственный из TLR, который способен обнаруживать патогенные CpG-ДНК в эндолизосомных структурах. В составе внеклеточной ДНК (вкДНК) при патологии, при беременности и при действии повреждающих факторов накапливаются ГЦ-богатые фрагменты рибосомной ДНК (рДНК), являющиеся лигандами TLR9. Цель исследования: исследовать влияние разных по составу фрагментов вкДНК на экспрессию TLR9 и других TLR человека в клеточных культурах in vitro. Методы. Исследование проводилось на гистологически различающихся культурах с разным пролиферативным потенциалом: мезенхимные стволовые клетки (N=13), HUVEC (N=7) и клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF7. Исследование экспрессии клетками поверхностных белков проводили методом проточной цитометрии. Для моделирования воздействия вкДНК на разные типы клеток были приготовлены модельные формы ДНК: геномная ДНК (гДНК) гидролизованная нуклеазой, окисленные формы гДНК и модельный ГЦ-обогащенный фрагмент ДНК - CpG-богатый фрагмент транскрибируемой области рДНК. Уровень экспрессии генов TLR 1-10 оценивали методом ПЦР в реальном времени. Результаты. Установлено повышение экспрессии генов внутриклеточных эндоплазматических рецепторов TLR3, TLR7 и TLR8 в ответ на воздействие как ГЦ-богатых, так и окисленных фрагментов вкДНК в разных типах клеток. Кроме того, в присутствии вкДНК возрастает экспрессия генов рецепторов клеточной поверхности TLR6 и, в меньшей степени, TLR1 и TLR5. При действии окисленных фрагментов возрастает экспрессия гена TLR4. Однако, повышение экспрессии генов семейства TLR возникает вторично после активации TLR9. Блокирование TLR9 ингибирует проведение сигнала и через остальные TLR. Заключение. Наблюдаемое при воздействии вкДНК увеличение экспрессии рецепторов семейства TLR, помимо TLR9, может быть связано с вовлечением сети рецепторов TLR в регуляцию проведения сигнала через TLR9, как через взаимодействия между рецепторами TLR, так через другие сигнальные пути, связанные с распознаванием вкДНК ДНК-сенсорами.

Background. TLR-mediated activation of the innate immune response varies with cell type. TLRs can recognize not only exogenous pathogenic molecules (PAMP - pathogen-associated molecular patterns), but also endogenous molecules that appear during tissue damage, aseptic inflammation, and degeneration - DAMP. Under certain circumstances, this reaction may be uncontrollable, which leads to the development of severe systemic inflammation and sepsis. TLR9 is the only TLR that is capable of detecting pathogenic CpG DNA in endolysosomal structures. GC-rich rDNA fragments, which are TLR9 ligands, are accumulated in eDNA during pathology, pregnancy, or under the action of damaging factors. Aim: to investigate the influence of cfDNA fragments of different composition on the expression of TLR9 and on the expression of other human TLRs in in vitro cultures. Methods. The study was carried out on histologically different cultures with different proliferative potentials: mesenchymal stem cells (N = 13), HUVEC (N = 7), and MCF7 human breast adenocarcinoma cells. The expression of surface proteins by cells was studied by flow cytometry. To simulate the effect of eDNA on different types of cells, there were prepared model forms of DNA: genomic DNA (hydrolyzed by nuclease), oxidized forms of gDNA, and a model GC-enriched DNA fragment - CpG - a rich fragment of the transcribed region of rDNA. The expression level of TLR 1-10 genes was assessed by real-time PCR. Results. We noticed an increase in the expression of intracellular endoplasmic receptors TLR3, TLR7 and TLR8 genes in response to the action of both GC-rich and oxidized cfDNA fragments in different types of cells. In addition, the presence of cfDNA increases the expression of cell surface receptors TLR6 genes, and, to a lesser extent, TLR1 and TLR5. Under the action of oxidized fragments, the expression of the TLR4 gene increases. However, an increase in the expression of TLR family genes occurs secondarily after TLR9 activation. Blocking TLR9 inhibits signal transduction through other TLRs. Conclusions. Binding of An increase in the expression of receptors of the TLR family, except for TLR9, observed upon exposure to cfDNA, may be associated with the involvement of the TLR network in the regulation of signal transduction through TLR9, both through interactions between TLR receptors and through other signaling pathways associated with cfDNA recognition by DNA sensors.