Εφαρμογές στοχαστικών υβριδικών μοντέλων σε βιολογικά συστήματα
Authors: Ραψομανίκη Μαρία-Άννα 
Published: September 2021

Τα βιολογικά συστήματα είναι εγγενώς πολύπλοκα συστήματα, που αποτελούνται από ένα μεγάλο αριθμό βιολογικών οντοτήτων που αλληλεπιδρούν και συνεργάζονται με συντονισμένο τρόπο έτσι ώστε να οδηγήσουν σε σταθερές και προσαρμοστικές συμπεριφορές. Ταυτόχρονα, τα βιολογικά συστήματα χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό τυχαιότητας και αβεβαιότητας, καθώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν με πιθανοτικό τρόπο. Η συστημική ανάλυση των βιολογικών διεργασιών απαιτεί εξελιγμένες πειραματικές μεθόδους και προηγμένα υπολογιστικά μοντέλα έτσι ώστε να περιγράψει πλήρως τη φύση των βιολογικών φαινομένων. Σε αυτό το πλαίσιο, τα στοχαστικά υβριδικά συστήματα, ικανά να περιγράψουν αποδοτικά πολύπλοκες διεργασίες που εμπεριέχουν συνεχή εξέλιξη και διακριτή ενεργοποίηση των τμημάτων τους με πιθανοτικό τρόπο, έχουν ήδη βρει σημαντικές εφαρμογές στη μοντελοποίηση βιολογικών συστημάτων και έχουν θέσει τη βάση για περαιτέρω διερεύνηση. Η παρούσα διατριβή αφορά στις εφαρμογές των στοχαστικών υβριδικών συστημάτων στη μοντελοποίηση βιολογικών διεργασιών, με έμφαση σε δύο βασικές εφαρμογές: την ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας πειράματα επαναφοράς φθορισμού μετά απο φωτολεύκανση (Fluorescence Recovery After Photoblaching - FRAP) και την ανάλυση της επαναντιγραφής του DNA. Στο πρώτο μέρος της διατριβής προτείνεται μια πλήρης ροή εργασίας για την ανάλυση των πειραμάτων FRAP. Αρχικά δόθηκε έμφαση στα πρώτα βήματα της ανάλυσης και για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε το λογισμικό easyFRAP, που επιτρέπει την εξαγωγή ποσοτικών παραμέτρων από πειραματικές καμπύλες FRAP. Στη συνέχεια παρουσιάζεται ένα στοχαστικό υβριδικό μοντέλο πειραμάτων FRAP, βασισμένο στη στοχαστική περιγραφή της διάχυσης και της πρόσδεσης των πρωτεϊνών σε επίπεδο μορίου μέσα σε μια καθορισμένη τρισδιάστατη περιοχή που αναπαριστά τον πυρήνα του κυττάρου. Τέλος, παρουσιάζεται μια νέα μέθοδος εξαγωγής των παραμέτρων της κινητικής από πειραματικά δεδομένα FRAP. Η βασική ιδέα πίσω από την προτεινόμενη μέθοδο είναι η εκ των προτέρων κατασκευή μιας χαρτογράφησης από το χώρο των παραμέτρων που σχετίζονται με τις καμπύλες επανάκτησης φθορισμού στο χώρο των παραμέτρων της κινητικής. Με αυτόν τον τρόπο η μέθοδος παρακάμπτει την επαναλαμβανόμενη προσομοίωση του μοντέλου κατά την αναζήτηση νέων προβλέψεων. Μετά την επικύρωση της μεθόδου χρησιμοποιώντας δεδομένα από προσομοίωση, η εξαγωγή παραμέτρων χρησιμοποιώντας πειραματικά δεδομένα από τις πρωτεΐνες Cdt1, PCNA και GFPnls επιβεβαίωσε την υπάρχουσα γνώση για την κινητική συμπεριφορά τους και παρείχε επιπρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την ετερογένεια της κινητικής από κύτταρο σε κύτταρο και τη δυνατότητα πρόβλεψης και ακρίβεια των κινητικών παραμέτρων τους.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, τα στοχαστικά υβριδικά μοντέλα χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της επαναντιγραφής του DNA, επεκτείνοντας υπάρχουσα δουλειά για την περίπτωση της φυσιολογικής αντιγραφής. Το μοντέλο που αναπτύχθηκε αποτυπώνει με ακρίβεια την αλληλεπίδραση ανάμεσα στη διακριτή δυναμική, που σχετίζεται με διαφορετικές καταστάσεις των αφετηριών αντιγραφής, τη συνεχή δυναμική, που σχετίζεται με την κίνηση των διχάλων αντιγραφής, και την αβεβαιότητα, που σχετίζεται με τα τυχαία γεγονότα πυροδότησης και επαναπυροδότησης των αφετηριών. Χρησιμοποιώντας ως είσοδο πειραματικά δεδομένα από τον οργανισμό S.pombe, που περιέχουν θέσεις αφετηριών πάνω στο γονιδίωμα και τις αντίστοιχες αποδοτικότητές τους, το μοντέλο επιτρέπει την προσομοίωση της επαναντιγραφής και συνεπώς τη διερεύνηση της κινητικής της επαναντιγραφής κατά μήκος ολόκληρου το γονιδιώματος. Συγκρίνοντας δεδομένα από προσομοιώσεις για διαφορετικές υλοποιήσεις του μοντέλου και αναλύοντας την ευαισθησία του μοντέλου σε διαφορετικές τιμές των μεταβλητών εισόδου, εξάγουμε συμπεράσματα σχετικά με τις παραμέτρους που επηρεάζουν περισσότερο τη δυναμική της επαναντιγραφής. Συγκρίνοντας τα προφίλ επαναντιγραφής σε επίπεδο πληθυσμού με αντίστοιχα πειραματικά δεδομένα, παρατηρούμε ότι συνολικά οι προβλέψεις του μοντέλου αναπαράγουν τις πειραματικές παρατηρήσεις σε μεγάλο βαθμό κατά το μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος, γεγονός που επιβεβαιώνει την προσέγγισή μας. Κάποιες σημαντικές αποκλίσεις παρατηρούνται σε μεμονωμένες περιοχές και πιθανώς οφείλονται σε ειδικούς τοπικούς κυτταρικούς μηχανισμούς. Η ανάλυση των δεδομένων σε επίπεδο κυττάρου επιτρέπει μια πιο λεπτομερή ματιά στη διαδικασία της επαναντιγραφής. Τα επίπεδα επαναντιγραφής μεμονωμένων περιοχών πάνω στο γονιδίωμα βρέθηκαν να επηρεάζονται από τις εγγενείς τους ιδιότητες, όπως η αποδοτικότητα της πυροδότησης, από in cis αλληλεπιδράσεις με γειτονικές περιοχές και από in trans αλληλεπιδράσεις με απομακρυσμένες περιοχές. Συνολικά η ανάλυσή μας έδειξε ότι, παρά το γεγονός ότι τα προφίλ επαναντιγραφής σε επίπεδο πληθυσμού είναι σταθερά, σε επίπεδο κυττάρου χαρακτηρίζονται από μεγάλο βαθμό ετερογένειας και αποκλίνουν σημαντικά από το μέσο όρο. Η επαναντιγραφή μπορεί, με διαφορετική πιθανότητα, να συμβεί οπουδήποτε πάνω στο γονιδίωμα και να οδηγήσει σε πολλούς διαφορετικούς γονότυπους σε έναν πληθυσμό. Βασισμένοι σε αυτές τις παρατηρήσεις, συμπεραίνουμε πως η ετερογένεια σε επίπεδο κυττάρου είναι εγγενές χαρακτηριστικό της επαναντιγραφής και οδηγεί σε μεγάλο βαθμό πλαστικότητας του γονιδιώματος.