Ανάλυση της λειτουργικής συμμετοχής ρυθμιστών της ομοιοστασίας των μιτοχονδρίων στη γήρανση και τις νόσους του γήρατος
Authors: Ευαγγελάκου Ζωή 
Published: October 2022

Η επιβίωση των οργανισμών εξαρτάται από την ικανότητα ρύθμισης του μεταβολισμού τους προκειμένου να παράγουν ενέργεια, καθώς και από τη δυνατότητα ρύθμισης των κυτταρικών αποκρίσεων έναντι στρεσογόνων παραγόντων για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργικότητας των βιομορίων τους (π.χ. γονιδίωμα, πρωτέωμα). Σε επίπεδο οργανισμού, αυτές οι αποκρίσεις απαιτούν εξαιρετικά περίπλοκες, σε μεγάλο βαθμό άγνωστες ακόμα, διασυνδέσεις και αλλήλο-ρυθμίσεις των αυτόνομων και μη αυτόνομων μηχανισμών των κυττάρων. Σε αυτή τη ρύθμιση, τα μιτοχόνδρια έχουν κρίσιμες αναβολικές και καταβολικές λειτουργίες για τον μεταβολισμό των θρεπτικών συστατικών και την προσαρμογή της κυτταρικής φυσιολογίας μέσω της λειτουργίας των πρωτεϊνικών μηχανών της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS) με σκοπό την παραγωγή ενέργειας. Ως εκ τούτου, ο αριθμός των μιτοχονδρίων αλλά και η συσχέτιση της ενεργότητας τους με τους κυτταρικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την ανάπτυξη, τη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών και την ομοιοδυναμική του κυττάρου βρίσκονται υπό στενή ρύθμιση. Ωστόσο οι μηχανιστικές λεπτομέρειες των διαδικασιών αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.Τα μιτοχόνδρια αποτελούνται από δύο μεμβράνες, την Εξωτερική Μιτοχονδριακή Μεμβράνη (ΕξΜΜ) και την Εσωτερική Μιτοχονδριακή Μεμβράνη (ΕσΜΜ). Όντας δυναμικές κυτταρικές δομές τα μιτοχόνδρια αναδιαμορφώνουν ταχέως το σχήμα τους και το μέγεθος τους μέσω των διαδικασιών σύντηξης και σχάσης. Στα θηλαστικά, οι διαδικασία της σύντηξης ρυθμίζεται από τις πρωτεΐνες Mfn1, Mfn2 και Opa1. Οι πρωτεΐνες Mfn εμπλέκονται στη σύντηξη της ΕξΜΜ, ενώ η Opa1 εμπλέκεται στη σύντηξη της ΕσΜΜ και στην αναδιαμόρφωση των ακρολοφιών. Η μιτοχονδριακή σύντηξη είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία η οποία επιτρέπει την αλλαγή της μιτοχονδριακής δομής καθώς και την ανταλλαγή μιτοχονδριακού υλικού. Για την ολοκλήρωση της σύντηξης απαραίτητη είναι η πρωτεΐνη Opa1, η οποία επιτρέπει την σύντηξη της ΕσΜΜ, την ρύθμιση της βιογένεσης και αναδιαμόρφωσης των ακρολοφιών του μιτοχονδρίου και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Η σχάση είναι το άλλο δυναμικό γεγονός των μιτοχονδρίων, μέσω του οποίου δημιουργούνται δύο ή περισσότερα μιτοχόνδρια – κύριος τελεστής της σχάσης είναι η πρωτεΐνη Drp1. Όπως αναφέρθηκε η μιτοχονδριακή μάζα και ενεργότητα πρέπει να αναπροσαρμόζονται ως αποτέλεσμα της ρύθμισης της λειτουργίας των ιστών, του ρυθμού κυτταρικής ανάπτυξης και της διαθεσιμότητας θρεπτικών συστατικών. Στα θηλαστικά, ο μεταγραφικός συν-ενεργοποιητής PGC-1α (PPARγ coactivator 1), καθώς και τα ομόλογά του PGC-1β και PRC, ρυθμίζουν πολλαπλές μεταβολικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μιτοχονδριακής βιογένεσης. Τα μέλη της οικογένειας PGC-1 ρυθμίζουν τη μιτοχονδριακή βιογένεση μέσω της συν-ενεργοποίησης των πυρηνικών μεταγραφικών παραγόντων Nrf2, του σχετιζόμενου με οιστρογόνα υποδοχέα-α (ERRα) και του YY1, για την ενίσχυση της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες. Στην Drosophila melanogaster εκφράζεται ένα μοναδικό ομόλογο των γονιδίων της οικογένειας PGC, το spargel (srl). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η έλλειψη γονιδιακού πλεονασμού (πολλαπλές ισομορφές του ίδιου γονιδίου) στη D. melanogaster τη καθιστά ιδανικό σύστημα μοντέλο για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων των μειωμένων ή αυξανόμενων επιπέδων έκφρασης του srl σε ολόκληρο τον οργανισμό.Η σταθερότητα του πρωτεώματος διασφαλίζεται από το δίκτυο της πρωτεόστασης (PN), ένα ολοκληρωμένο αρθρωτό σύστημα που διασφαλίζει τον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες αυξημένου πρωτεοτοξικού στρες. Βασικά συστατικά του δικτύου πρωτεόστασης είναι οι μοριακές μηχανές πρωτεϊνικής σύνθεσης και διαλογής/διακίνησης πεπτιδίων, το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), το σύστημα απόκρισης στις μη σωστά διπλωμένες πρωτεΐνες του ενδοπλασματικού δικτύου (ERAD), οι μοριακές συνοδοί και οι δύο κύριες μηχανές αποικοδόμησης, δηλαδή τα μονοπάτια αυτοφαγίας-λυσοσώματος (ALP) και ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (UPP). Η λειτουργία του πρωτεασώματος στους ιστούς της D. melanogaster, όπως και στους περισσοτέρους οργανισμούς, ρυθμίζεται από τον μεταγραφικό παράγοντα cncC, που είναι λειτουργικά παρόμοιος με τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2 των θηλαστικών. Ο Nrf2, μαζί με τους Foxo και Hsf-1 παίζουν κεντρικό ρόλο στην προστασία του κυττάρου από οξειδωτική βλάβη. Ο Nrf2 εμπλέκεται επίσης στην διατήρηση της δομής και της λειτουργικότητας των μιτοχονδρίων καθώς ελέγχει τα επίπεδα των ROS, επηρεάζει την οξειδωτική φωσφορυλίωση και την παραγωγή ATP, καθώς και την οξείδωση των λιπαρών οξέων και την βιογένεση των μιτοχονδρίων. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες τόσο από το εργαστήριο μας όσο και από άλλες ερευνητικές ομάδες, δεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο του UPP στον ποιοτικό έλεγχο της λειτουργίας των μιτοχονδρίων καθώς το πρωτεάσωμα όχι μόνο απομακρύνει τις κατεστραμμένες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες, αλλά εμπλέκεται και στον ποιοτικό έλεγχο της σύνθεσης αυτών.Παρόλο λοιπόν που η μιτόσταση φαίνεται να ρυθμίζεται εν μέρει από το δίκτυο της πρωτεόστασης, η αντίστροφή λειτουργική συσχέτιση δεν έχει μελετηθεί. Συγκεκριμένα, η ανταπόκριση των κύριων πρωτεολυτικών μηχανισμών σε συνθήκες διαταραχής της μιτόστασης παραμένει άγνωστη. Στο πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής μελετάται και αποδεικνύεται η ύπαρξη αλληλο- ρύθμισης του δικτύου της πρωτεόστασης με τα μιτοχονδριακά δυναμικά (κομμάτι της μιτόστασης) στη Drosophila melanogaster καθώς και η συμμετοχή του μεταγραφικού συν-παράγοντα srl/Pgc-1α στην ρύθμιση του δικτύου της πρωτεόστασης.Ειδικότερα το πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής δείχθηκε ότι η γενετική διαταραχή των μιτοχονδριακών δυναμικών (καταστολή έκφρασης των Opa1, Marf, Drp1) στην Drosophila επάγει αναπτυξιακή θνησιμότητα όταν προκαλείται στα πρώτα στάδια της ζωής ή επιταχύνει σημαντικά την γήρανση όταν επάγεται μετά το στάδιο της μεταμόρφωσης. Η διαταραχή των μιτοχονδριακών δυναμικών είναι ανεκτή για μια μικρή περίοδο στα νεαρά ενήλικα έντομα, η οποία όμως συνοδεύεται από αύξηση του οξειδωτικού στρες και της πρωτεωμικής αστάθειας. Η παροδική αυτή ανοχή φαίνεται να προέρχεται από την κινητοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων Nrf2/cncC και foxo και του μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή srl για την αυξο-ρύθμιση κυτταρο-προστατευτικών αντιοξειδωτικών και πρωτεοστατικών μηχανισμών. Επίσης η καταστολή της μιτοχονδριακής σύντηξης και σχάσης φαίνεται να ενεργοποιεί άμεσα το UPP και ALP ως απόκριση στη μιτοχονδριακή βλάβη, ενώ το αντίθετο παρατηρείται ύστερα από επαγωγή των μιτοχονδριακών δυναμικών. Παράλληλα βρέθηκε ότι η αναστολή της λειτουργικότητας του πρωτεασώματος ή η αποσιώπηση των Nrf2 και foxo μεταγραφικών παραγόντων σε νεαρά έντομα με διαταραγμένα μιτοχονδριακά δυναμικά προκαλεί σημαντική αύξηση της τοξικότητας. Παρόλα αυτά τόσο η υπερέκφραση του Nrf2 (με ταυτόχρονη ενεργοποίηση του πρωτεασώματος) όσο και η αυξο-ρύθμιση του αυτοφαγικού γονιδίου Atg8a δεν είναι σε θέση να βελτιώσουν τη βιωσιμότητα των εντόμων, η οποία φαίνεται να βελτιώνεται ελαφρά ύστερα από χορήγηση αντιοξειδωτικών.Επιπρόσθετα, δείχνουμε τις εντυπωσιακές διαφοροποιήσεις μεταξύ των φύλων που παρατηρούνται ύστερα από αποσιώπηση της Opa1. Τα μιτοχόνδρια παρουσιάζουν μια έντονη διαφοροποίηση ανάλογα με το φύλο, καθώς κληρονομούνται αποκλειστικά από τη μητέρα και ασκούν διαφορετικές επιδράσεις σε αρσενικά-θηλυκά, πιθανότητα λόγω των διαφορετικών ενεργειακών απαιτήσεων αλλά και της σύνθεσης των ορμονών. Βρέθηκε ότι τα αρσενικά έντομα με καταστολή σύντηξης της ΕσΜΜ παρουσιάζουν πιο σοβαρή διαταραχή των μιτοχονδρίων, της μυϊκής δομής, μειωμένα επίπεδα κυτταρικής αναπνοής και μειωμένη μακροζωία. Επιπρόσθετα, βρέθηκε ότι η αποσιώπηση της Opa1 μεταβάλλει με φυλο-εξαρτώμενο τρόπο τον μεταβολισμό της γλυκόζης, το μέγεθος των λιπιδίων και το μεταβολικό προφίλ των εντόμων.Ένα ακόμη εύρημα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η συμμετοχή του μεταγραφικού συν- ενεργοποιητή srl/Pgc-1α στην ρύθμιση του UPP. Δεδομένης της αλληλεπίδρασης του srl/Pgc-1α με τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2/cncC για την επαγωγή της μιτοχονδριακής βιογένεσης, στην παρούσα εργασία δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση του UPP υπό συνθήκες υπερέκφρασης του srl δεν τελείται από τον cncC/Nrf2. Εντούτοις ο cncC/Nrf2 φαίνεται να είναι καθοριστικός για την ρύθμιση της έκφρασης των μιτοχονδριακών γονιδίων, του μεταβολισμού, της μιτοχονδριακής αναπνοής και του οξειδωτικού φορτίου. Επιπρόσθετα, αποδεικνύεται ότι το srl δρα συμπληρωματικά αλλά και αναπληρωματικά με τον cncC/Nrf2 για να καλύψει την γενετική του έλλειψη του στη διατήρηση της μιτόστασης και να βελτιώσει την μακροβιότητα των εντόμων. Τέλος, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή βιογένεση δεν προτιμάται υπό συνθήκες καταστολής σύντηξης της ΕξΜΜ, αντιθέτως όμως ύστερα από καταστολή σύντηξης της ΕσΜΜ η ενεργοποίηση του srl προκαλεί περαιτέρω ενεργοποίηση του UPP, βελτίωση της ομοιοδυναμικής των μιτοχονδρίων και αύξηση της μακροβιότητας.Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχει σημαντικές επιπτώσεις στη φυσιολογία του οργανισμού. Παρά την ενεργοποίηση άμεσων κυτταρο-προστατευτικών μονοπατιών, το σύστημα δεν καταφέρνει να ισορροπήσει, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική επιτάχυνση της γήρανσης. Η ενεργοποίηση των πρωτεοστατικών μηχανισμών είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ζωής και φαίνεται να μεσολαβείται από τους μεταγραφικούς παράγοντες cncC, foxo αλλά και από τον μεταγραφικό συμπαράγοντα Pgc-1α/srl. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η τοξικότητα που προκαλείται από τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μπορεί εν μέρει να μειωθεί από μόρια με αντιγηραντικές ή αντιοξειδωτικές δράσεις ή μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα srl.