Ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων και μελέτες μετάδοσης σφαλμάτων
Authors: Καλλιγοσφύρη Παναγιώτα 
Published: October 2021

Η συμβολή της παρούσας διδακτορικής διατριβής στην Αναλυτική Χημεία των Νουκλεϊκών Οξέων έγκειται στην ανάπτυξη οπτικών μεθόδων ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων με κύρια μεθοδολογικά χαρακτηριστικά την απλότητα και ταχύτητα στην εκτέλεσή τους καθώς και το χαμηλό κόστος ανάλυσης. Η διατριβή επικεντρώνεται στην αξιοποίηση του κινητού τηλεφώνου και της ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής ως νέων ανιχνευτών για ποσοτικές χημειοφωταυγειομετρικές αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων καθώς και στην αξιοποίηση έγχρωμων νανοσωματιδίων για την ανάπτυξη οπτικών βιοαισθητήρων DNA με εφαρμογές στην ταχεία υγρή βιοψία. Επιπλέον, στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η διάδοση των σφαλμάτων στις αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων.Το Θεωρητικό Μέρος αποτελείται από τα Κεφάλαια 1-4. Στο Κεφάλαιο 1 ανασκοπείται η βιβλιογραφία που αφορά στην αξιοποίηση των ενζύμων ως ιχνηθετών, σε συνδυασμό με χημειοφωταυγειογόνα υποστρώματα, για αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων. Στο Κεφάλαιο 2 παρουσιάζονται διάφορες κατηγορίες οπτικών αισθητήρων νουκλεϊκών οξέων με έμφαση στις αρχές λειτουργίας και τις εφαρμογές τους. Τα νανοσωματίδια έχουν σημαντικό ρόλο ως ιχνηθέτες στους σύγχρονους βιοαισθητήρες. Το Κεφάλαιο 3 αναφέρεται ειδικά στα νανοσωματίδια χρυσού, στις μεθόδους σύνθεσής τους καθώς και στις εξαιρετικές οπτικές τους ιδιότητες.Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι τα διαγράμματα βαθμονόμησης στην αναλυτική χημεία και ιδιαίτερα η γραμμική προσαρμογή με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων και οι προϋποθέσεις που ισχύουν για την εφαρμογή της. Το Πειραματικό Μέρος της διατριβής αποτελείται από τα Κεφάλαια 5-9. Στο Κεφάλαιο 5, το κινητό τηλέφωνο (smartphone) εισάγεται ως νέος ανιχνευτής χημειοφωταύγειας με εφαρμογή στην ανάπτυξη μεθόδων υβριδοποίησης DNA. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη δοκιμασία υβριδοποίησης. Ειδική αλληλουχία ανιχνευτής ακινητοποιείται σε φρεάτια πλακιδίων μικτροτιτλοδότησης και υβριδοποιείται με έναν βιοτινυλιωμένο και αποδιαταγμένο DNA-στόχο. Ο προσδιορισμός των υβριδίων πραγματοποιείται με την προσθήκη συζεύγματος αβιδίνης-υπεροξειδάσης σε συνδυασμό με χημειοφωταυγειογόνο υπόστρωμα. Η εκπεμπόμενη ακτινοβολία ανιχνεύεται με ένα κοινό smartphone. Επιπλέον ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και το λουμινόμετρο για σύγκριση. Πραγματοποιήθηκαν εκτενείς μελέτες για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών λήψης και επεξεργασίας των εικόνων που λήφθηκαν από τους δύο ανιχνευτές. Στο Κεφάλαιο 6 περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Quantitative Competitive PCR, QCPCR) χρησιμοποιώντας το smartphone ως ανιχνευτή χημειοφωταύγειας. Για την QCPCR συντέθηκε κατάλληλος ανταγωνιστής DNA που έχει το ρόλο εσωτερικού προτύπου (Internal Standard, IS). Σε κάθε αντίδραση ενίσχυσης προστίθενται 5000 μόρια του ανταγωνιστή, ο οποίος έχει το ίδιο μέγεθος και τις ίδιες θέσεις πρόσδεσης εκκινητών με το DNA στόχο. Τα προϊόντα ταυτόχρονης ενίσχυσης του ανταγωνιστή και του μορίου στόχου προσδιορίζονται ποσοτικά μέσω υβριδοποίησης. Η αναλογία των σημάτων χημειοφωταύγειας που λαμβάνονται από το smartphone συσχετίζονται με τον αριθμό των αντιγράφων του DNA στόχου στο δείγμα πριν από την ενίσχυση με PCR. Η μέθοδος αξιολογήθηκε ως προς τις αναλυτικές της επιδόσεις σε σύγκριση με το λουμινόμετρο και την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή.Το Κεφάλαιο 7 πραγματεύεται την ανάπτυξη βιοαισθητήρα DNA, τύπου διαγνωστικής ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, βασισμένου σε νανοσωματίδια χρυσού για εφαρμογές στην ταχεία υγρή βιοψία. Η μεθοδολογία εφαρμογής περιλαμβάνει: i) απομόνωση DNA από πρότυπες κυτταρικές σειρές ή απομόνωση ελεύθερου εξωκυττάριου (cell-free) DNA (cfDNA) από πλάσμα αίματος, ii) ενίσχυση μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), iii) αντίδραση επέκτασης εκκινητή για την διάκριση των αλληλίων και iv) ανίχνευση των προϊόντων με τον βιοαισθητήρα DNA. Πραγματοποιήθηκε μελέτη βελτιστοποίησης του αισθητήρα με τη χρήση συνθετικών DNA-στόχων καθώς και πρότυπων καρκινικών σειρών. Τέλος, έγινε εφαρμογή του βιοαισθητήρα σε κλινικά δείγματα ασθενών και υγιών ατόμων για τη διάκριση μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS, που σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, σε κυκλοφορούν καρκινικό DNA (ctDNA).Στο Κεφάλαιο 8 αναπτύχθηκε ένα γρήγορο πολυαναλυτικό μοριακό τεστ για τη γονοτύπηση του γονιδίου KRAS με οπτική ανίχνευση και εφαρμογές σε ταχεία, μη επεμβατική, υγρή βιοψία. Το διαγνωστικό τεστ-βιοαισθητήρας DNA, βασισμένο σε νανοσωματίδια χρυσού για οπτική ανίχνευση, εφαρμόστηκε στην ταυτόχρονη ταυτοποίηση σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS σε ctDNA. Το γρήγορο πολλαπλό τεστ εφαρμόστηκε στη συνέχεια σε δείγματα ιστού από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και τέλος σε cfDNA που προερχόταν από δείγματα αίματος υγιών ατόμων και ασθενών με προχωρημένη νόσο CRC.Η παρούσα διδακτορική διατριβή ολοκληρώνεται με το Κεφάλαιο 9, το οποίο αφορά στις μελέτες μετάδοσης σφαλμάτων σε προσδιορισμούς microRNA. Τα microRNAs είναι μικρές αλληλουχίες RNA, οι οποίες έχουν συνδεθεί με διάφορα είδη καρκίνου τα τελευταία χρόνια και αποτελούν υποσχόμενους βιοδείκτες διάγνωσης και παρακολούθησης του καρκίνου και άλλων ασθενειών. Για τη διεξαγωγή της μελέτες συλλέχθηκαν 100 δημοσιευμένες αναλυτικές μέθοδοι από τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα βαθμονόμησης. Οι μέθοδοι κατηγοριοποιήθηκαν, με βάση την καμπύλη βαθμονόμησης που παρουσίαζαν, σε γραμμική ή λογαριθμική κλίμακα συγκεντρώσεων. Η μελέτη επικεντρώθηκε στη μετάδοση της αβεβαιότητας, στην συγκέντρωση των microRNA αλλά και στην εκτίμηση της ελάχιστης μεταβολής της συγκέντρωσης (MDC), που είναι στατιστικώς διακριτή, με τη βοήθεια των κατάλληλων μαθηματικών μοντέλων.