Ensayos para la extracción de ADN y estandarización de RAPDs en Moniliophthora roreri
Authors: Quintero-Nuñez Luis Enrique , Suárez-Contreras Liliana Yanet , Chaves-Bedoya Giovanni 
Published: November 2017

Antecedentes: Moniliophthora roreri es el agente causal de la moniliasis del cacao, enfermedad limitante que presentan las regiones productoras de cacao (Theobroma cacao L.), siendo el principal problema fitosanitario para Colombia. Conocer el comportamiento de M. roreri In vitro, es importante para su estudio. Además, continuar con los trabajos que definan la estructura genética de las poblaciones del fitopatógeno es interesante pues refleja su historia evolutiva y su potencial para evolucionar. Objetivo: Observar el crecimiento y desarrollo de 11 aislamientos de M. roreri obtenidos de 6 municipios de Norte de Santander: El Zulia, Cúcuta, Sardinata, El Tarra, Agua Clara, Tibú, para estandarizar ADN polimórfico Amplificado al Azar. Métodos: Se probaron cinco métodos de incubación para el aislamiento del fitopatógeno en PDB, el método donde el hongo permaneció en agitación 1 día a 120 rpm con periodos luz/oscuridad de 12h/1 Universidad Francisco de Paula Santander 2h a temperatura de 25 a 28°C, e incubación a 28°C en completa oscuridad; mostró mejores resultados, al observar crecimiento del micelio de M. roreri durante 8 días razón por la cual se continuó con la extracción del ADN de los aislamientos, y se estandarizó la técnica RAPD (ADN Polimórfico Amplificado al Azar). Resultados: La incubación a 28°C en completa oscuridad, mostró mejores resultados en cuanto al crecimiento del hongo y se logró estandarizar los RAPDs con el Oligo 4, Oligo 8, Oligo10 y OPA 10. En la PCR, con una temperatura de desnaturalización de 94°C por cinco minutos, 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, temperatura de alineamiento de 36°C (para el Oligo 8 y 10) y 32°C (para el Oligo 4 y OPA 10) por un minuto, 72°C por 2 minutos y un ciclo final de 72°C por 7 minutos. Conclusión: se logró determinar la temperatura de incubación de 28°C en oscuridad y estandarizar la técnica RAPDs para Moniliophthora roreri.Palabras claves: ADN, cacao, marcador molecular, patógeno de cacao. Abstract  Background: Moniliophthora roreri is the causal agent of cocoa moniliasis, a limiting disease presented by cocoa producing regions (Theobroma cacao L.), being the main phytosanitary problem for Colombia. Knowing the behavior of M. roreri In vitro, it is important for its study. In addition, continuing the work that defines the genetic structure of phytopathogen populations is interesting because it reflects their evolutionary history and their potential for evolution. Objective: To observe the growth and development of 11 isolates of M. roreri obtained from 6 municipalities of Norte de Santander: El Zulia, Cúcuta, Sardinata, El Tarra, Agua Clara, Tibú, to standardize Random Amplified polymorphic DNA. Methods: Five incubation methods were tested for phytopathogen isolation in PDB, the method where the fungus remained agitated for 1 day at 120 rpm with light / dark periods of 12h / 12h at 25 to 28 ° C, and incubation at 28 ° C in complete darkness; Showed better results, when observing growth of M. roreri mycelium during 8 days reason for which the extraction of DNA from the isolates was continued, and RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technique was standardized. Results: Incubation at 28 ° C in complete darkness showed better results in fungus growth and RAPDs were standardized with Oligo 4, Oligo 8, Oligo 10 and OPA 10. In the PCR, with a denaturation temperature of 94 ° C for five minutes, 35 cycles at 94 ° C for 30 seconds, alignment temperature of 36 ° C (for Oligo 8 and 10) and 32 ° C (for Oligo 4 and OPA 10) for one minute, 72 ° C for 2 minutes and a final cycle of 72 ° C for 7 minutes. Conclusion: it was possible to determine the incubation temperature of 28 ° C in the dark and to standardize the RAPDs technique for Moniliophthora roreri.Keywords: DNA, cocoa, molecular marker, cocoa pathogen. Resumo Antecedentes: Moniliophthora roreri é o agente causal da monilíase do cacau, uma doença limitante apresentada pelas regiões produtoras de cacau (Theobroma cacao L.), sendo o principal problema fitossanitário para a Colômbia. Conhecendo o comportamento de M. roreri In vitro, é importante para o seu estudo. Além disso, prosseguir o trabalho que define a estrutura genética das populações de fitopatógenos é interessante porque reflete sua história evolutiva e seu potencial para evoluir. Objetivo: Observar o crescimento e o desenvolvimento de 11 isolados de M. roreri obtidos de 6 municípios do Norte de Santander: El Zulia, Cúcuta, Sardinata, El Tarra, Agua Clara, Tibú, para padronizar o DNA polimórfico Amplificado Aleatório. Métodos: foram testados cinco métodos de incubação para o isolamento do fitopatogênio no PDB, método em que o fungo permaneceu agitado durante 1 dia a 120 rpm com períodos claros / escuros de 12h / 1 Universidade Francisco de Paula Santander 2h a uma temperatura de 25 a 28 ° C, e incubação a 28 ° C em completa escuridão; apresentaram melhores resultados, observando o crescimento do micelio de M. roreri durante 8 dias, razão pela qual a extração do DNA dos isolados foi continuada, e a técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foi padronizada. Resultados: a incubação a 28 ° C em completa escuridão apresentou melhores resultados no crescimento de fungos e os RAPDs foram padronizados com Oligo 4, Oligo 8, Oligo 10 e OPA 10. No PCR, com uma temperatura de desnaturação de 94 ° C durante cinco minutos, 35 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, temperatura de alinhamento de 36 ° C (para Oligo 8 e 10) e 32 ° C (para Oligo 4 e OPA 10) durante um minuto, 72 ° C durante 2 minutos e um ciclo final de 72 ° C durante 7 minutos. Conclusão: foi possível determinar a temperatura de incubação de 28 ° C no escuro e padronizar a técnica de RAPD para Moniliophthora roreri.Palavras-chave: DNA, cacau, marcador molecular, patógeno do cacau.