Συστημικές αποκρίσεις μυών Mus musculus σε ηλεκτομαγνητικά πεδία ραδιοσυχνοτήτων
Authors: Φραγκοπούλου Αδαμαντία 
Published: August 2021

Όπως εκτιμάται από ειδικούς επιστήμονες, η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που «έλουζε» τη γη μετά τη δημιουργία της 4,6 δισεκατομμύρια χρόνια πριν, περιελάμβανε κυρίως το φάσμα από τον ήλιο (υπέρυθρο, ορατό και υπεριώδες), καθώς και την κοσμική ακτινοβολία υψηλής ενέργειας. Σε αυτές τις συνθήκες φυσικής ακτινοβολίας αναπτύχθηκαν οι πρώτοι οργανισμοί πριν από 3,8 δισεκατομμύρια χρόνια και συνέχισαν να υπάρχουν μέχρι σήμερα με διάφορες παραλλαγές (εξάρσεις ηλιακών κηλίδων, κλπ.). Μερικές δεκαετίες μετά την ανακάλυψη του ηλεκτρονίου από τον Thomson (1897) ξεκίνησε σταδιακά η ανάπτυξη της ασύρματης τεχνολογίας, η οποία είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία τεχνητών πηγών μη ιονιζουσών ακτινοβολιών που διαδιδόμενες στο χώρο παράγουν τα λεγόμενα ηλεκτρομαγνητικά πεδία (ΗΜΠ). Ιδιαίτερα σημαντικές είναι οι ακτινοβολίες που εντάσσονται στο φάσμα των ραδιοσυχνοτήτων, που έχουν κατακλύσει όλες τις περιοχές του πλανήτη και κυμαίνονται από τη συχνότητα των 3 χιλιοκύκλων/sec (kHz) (τα υπερμακρά κύματα της ναυσιπλοΐας), μέχρι τη συχνότητα των 300 γιγακύκλων/sec (GHz) (τα κύματα των ραντάρ). Στο φάσμα αυτό, και συγκεκριμένα στην περιοχή των μικροκυμάτων (300 MHz - 300 GHz) ανήκουν και οι συχνότητες της κινητής τηλεφωνίας και του ασύρματου τηλεφώνου (900 - 1900 MHz) που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Τα ΗΜΠ ραδιοσυχνοτήτων έχουν αποτελέσει αντικείμενο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας λόγω της συσχέτισής τους με πληθώρα συμπτωμάτων στην υγεία, όπως πονοκέφαλοι, κόπωση, ίλιγγοι, αϋπνίες, αλλεργίες, ταχυκαρδία, νευρικότητα, έλλειψη συγκέντρωσης, απώλεια μνήμης, υπογονιμότητα και καρκινογένεση, γι’ αυτό και ο αριθμός δημοσιεύσεων όσον αφορά στις βιολογικές επιπτώσεις παρουσιάζει εκθετική αύξηση από το 1985 έως και σήμερα. Εντούτοις, τα αποτελέσματα των μελετών παραμένουν μέχρι στιγμής αντικρουόμενα και οι μηχανισμοί δράσης δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Η ανακοίνωση της 31ης Μαΐου 2011 της Διεθνούς Επιτροπής της Έρευνας για τον Καρκίνο (International Agency for Research on Cancer - IARC) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organization - WHO), που κατέταξε τα κινητά τηλέφωνα και παρόμοιες ασύρματες συσκευές ως πιθανά καρκινογόνα (κατηγορία 2Β), τάραξε τα νερά της επιστημονικής κοινότητας και της κοινωνίας, καθώς αναγνώρισε για πρώτη φορά επίσημα την πιθανή επικινδυνότητα της ακτινοβολίας αυτής για την υγεία. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως αντικείμενο τη μελέτη των επιπτώσεων της μη ιονίζουσας ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (ΗΜΑ) εκπεμπόμενης από δύο ευρείας καθημερινής χρήσης συσκευές ασύρματης τεχνολογίας, το κινητό τηλέφωνο και το ασύρματο τηλέφωνο. Επειδή η κατανόηση των βιολογικών διεργασιών κάτω από φυσιολογικές ή μη φυσιολογικές συνθήκες σχετίζεται με την επιλογή του κατάλληλου πρότυπου συστήματος, στη δική μας μελέτη χρησιμοποιήσαμε το θηλαστικό Mus musculus και συγκεκριμένα τα στελέχη Balb/c και C57BL/6J. Την περίοδο που ξεκίνησε η εν λόγω διατριβή υπήρχαν αρκετές αναφορές για εμπλοκή της μικροκυματικής ακτινοβολίας σε γνωστικές δυσλειτουργίες, τρωκτικών, στη διαταραχή του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, σε θραύσεις DNA, σε εμβρυογεννητικές αλλοιώσεις, στην επαγωγή απόπτωσης, στις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και στην πιθανότητα εμφάνισης εγκεφαλικών όγκων, αλλά με αντικρουόμενα και διάσπαρτα αποτελέσματα. Ελάχιστες ήταν δε οι μελέτες με προσέγγιση πρωτεωμικής που καταδείκνυαν επίδραση στην πρωτεϊνική έκφραση και κυρίως σε κυτταροκαλλιέργειες. Να σημειωθεί επιπλέον, ότι όλες οι έρευνες μέχρι το 2008 περιελάμβαναν χρήση γεννητριών ή ανάλογων συστημάτων και όχι τυπικές συσκευές ασύρματης τηλεφωνίας ανθρώπινης χρήσης. Επιπλέον, καμία άλλη μελέτη δεν έχει μέχρι σήμερα δημοσιευθεί με ακτινοβολία βάσης ασύρματου τηλεφώνου. Στόχοι της Διατριβής: Στη διατριβή αυτή προσομοιάστηκαν διάρκειες έκθεσης ανθρώπινης χρήσης των ανωτέρω συσκευών ώστε να εφαρμοστούν σε μυς και ο πειραματικός σχεδιασμός βασίστηκε σε τέσσερις προσεγγίσεις: α) ανίχνευση διαταραχών οστεογένεσης κατά την κύηση – ιστοχημική/ιστολογική ανάλυση σκελετού νεογέννητων και ενήλικων ατόμων που εκτέθηκαν σε ΗΜΠ κατά τη διάρκεια της κύησης, β) ανίχνευση διαταραχών μάθησης - μνήμης με συμπεριφορικές δοκιμασίες, γ) απόκριση στο στρες με ανάλυση των επιπέδων κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος και ανίχνευση οξείδωσης σε πρωτεΐνες της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης (μέτρηση του δείκτη καρβονυλίωσης με το αντιδραστήριο Oxyblot), καθώς επίσης και με δοκιμασίες συμπεριφοράς και δ) ανάλυση πρωτεϊνικής έκφρασης περιοχών του εγκεφάλου (μετωπιαίου φλοιού, ιππόκαμπου και παρεγκεφαλίδας) ενήλικων μυών με πρωτεωμική τεχνολογία. α) Διαταραχές οστεογένεσης κατά την κύηση. Δεδομένου ότι η περίοδος της κύησης είναι μια περίοδος ευαίσθητη στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων, ενήλικοι θηλυκοί μύες Balb/c εκτέθηκαν σε ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου για 6 ή 30 λεπτά ημερησίως για 21 ημέρες και ακολούθως μελετήθηκαν ιστοχημικά-ιστολογικά το βασικρανίο, το νευροκρανίο και οι πλευρές του θωρακικού κλωβού. Οι επιπτώσεις της ακτινοβολίας εκτιμήθηκαν αμέσως μετά τη γέννηση με μακροσκοπική παρατήρηση των νεογέννητων μυών για έλεγχο εμφάνισης πιθανών δυσπλασιών, καθώς και ύστερα από διπλή ιστοχημική χρώση των σκελετών τους με Alcian blue (χρωματίζει βλεννοπολυσακχαρίτες - χόνδρο) και Alizarin red S (χρωματίζει οστίτη ιστό). Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στο βασικρανίο, ενώ αντίθετα διαπιστώθηκαν σε μεγάλο ποσοστό των εκτεθειμένων ζώων (60-100% ανάλογα με το χρόνο έκθεσης) μικρού βαθμού οστεογεννητικές αλλοιώσεις στο νευροκρανίο και μετακίνηση του χόνδρου του Meckel στην κάτω γνάθο. Στις θωρακικές πλευρές παρατηρήθηκε μειωμένη οστεοποίηση (σε ποσοστό 100% των εκτεθειμένων ζώων) και η 8η θωρακική πλευρά να προσκολλάται στο στέρνο (σε ποσοστό έως 30% των εκτεθειμένων ζώων). Οι αλλοιώσεις αυτές ήταν παροδικές και δεν ανιχνεύτηκαν στα άτομα που αφέθηκαν να μεγαλώσουν στη συνέχεια μέχρι τον απογαλακτισμό. Φαίνεται πως δεν επηρεάστηκε η μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας και η ικανότητά τους να ευρίσκουν επακριβώς την περιοχή εποίκισης, ενώ πιθανολογείται τροποποίηση του μεταβολισμού στη σύνθεση βλεννοπολυσακχαριτών ή διαταραχή στην εναπόθεση του ασβεστίου (Fragopoulou AF, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). β) Συμπεριφορικές διαταραχές μάθησης-μνήμης . Χρησιμοποιήσαμε ειδικές δοκιμασίες χωρικής και μη χωρικής μνήμης, όπως είναι ο υδάτινος λαβύρινθος κατά Morris (Morris water maze, MWM) και η δοκιμασία αναγνώρισης καινοφανούς αντικειμένου (Novel Object Recognition task, NOR) αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια των 4 ημερών της πρώτης δοκιμασίας αρσενικοί μύες Balb/c που εκτέθηκαν σε ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου για 2 ώρες ημερησίως, εκπαιδεύτηκαν να βρίσκουν μια πλατφόρμα λίγο κάτω από την επιφάνεια του νερού εντός μιας δεξαμενής βάσει σημαδιών στο χώρο. Μετά τη «φάση εκπαίδευσης» και αφού αφαιρέθηκε η πλατφόρμα από το νερό, οι μύες αφέθηκαν να θυμηθούν τη θέση αυτής. Τα ακτινοβολημένα ζώα παρουσίασαν δυσκολία στη μεταφορά της χωρικής προσκτηθείσας πληροφορίας από ημέρα σε μέρα, καθώς και αδυναμία παγίωσης/ανάκλησης της ήδη αποθηκευμένης πληροφορίας, ενοχοποιώντας τον ιππόκαμπο ως πιθανό στόχο της ακτινοβολίας άμεσα ή έμμεσα (Fragopoulou AF, Miltiadous P, Stamatakis A, Stylianopoulou F, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). Για τον έλεγχο της μη χωρικής μνήμης (και συγκεκριμένα της μνήμης αναγνώρισης), αρσενικοί ενήλικοι μύες C57BL6/J, υποβλήθηκαν, έπειτα από 5μηνη έκθεση σε ακτινοβολία βάσης ασύρματου τηλεφώνου, στην εν λόγω δοκιμασία (NOR), κατά την οποία αρχικά αφέθηκαν να εξερευνήσουν δύο πανομοιότυπα αντικείμενα και ακολούθως καλέστηκαν να «διακρίνουν» το γνώριμο από ένα καινούργιο. Διαπιστώθηκε πως η ακτινοβόληση διατάραξε την ικανότητα αναγνώρισης του νέου αντικειμένου και συνεπώς την ικανότητα απομνημόνευσης των πληροφοριών από τα αισθητήρια στον ενδορρινικό φλοιό και τον ιππόκαμπο, που ελέγχουν τη συγκεκριμένη δοκιμασία. γ) Επαγωγή στρες. Επειδή η λειτουργία της μνήμης σχετίζεται με την κατάσταση άγχους των ανώτερων οργανισμών, αναλύθηκαν τα επίπεδα κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος των ίδιων μυών σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα κατά την πορεία της ακτινοβόλησης και διαπιστώθηκε αύξηση ως άμεση απόκριση στην ακτινοβολία, με επακόλουθη εξομάλυνση, που ενδεχόμενα οφείλεται στην επιστράτευση ομοιοστατικών μηχανισμών. Η μη πρόκληση χρόνιας κατάστασης «άγχους» στα ζώα, εξαιτίας της ακτινοβόλησης, επιβεβαιώθηκε και με δοκιμασίες συμπεριφοράς, τον υπερυψωμένο λαβύρινθο σχήματος σταυρού και το ανοιχτό πεδίο. Επιπλέον, επειδή τα ερυθροκύτταρα θεωρούνται ως δείκτες στρες ενός οργανισμού, μελετήθηκε το ποσοστό των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών των μεμβρανών τους στις αντίστοιχες ημέρες που μελετήθηκαν και τα επίπεδα της κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών στο σύνολο των ζώων, παρόλο που σε μεμονωμένα ζώα διαπιστώθηκε μια μικρή αύξηση του βαθμού οξείδωσης σε κάποιες πρωτεΐνες κατά την 1η ημέρα της έκθεσης. Τα αποτελέσματά μας πιθανά υποδηλώνουν πως η όποια αύξηση στρες επήλθε στον οργανισμό εξαιτίας της ακτινοβολίας, εξουδετερώθηκε επιτυχώς από την αντιοξειδωτική ικανότητα των ερυθροκυττάρων στα περισσότερα ζώα, η οποία, σε αντίθεση με εκείνη του πλάσματος, είναι πολύ πιο ισχυρή. Όμως, επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δηλώνουν πως η απάντηση στο στρες πιθανά είναι άτομο-εξαρτώμενη διαδικασία και ο κάθε οργανισμός μπορεί να το καταστείλει σε διαφορετικό βαθμό. δ) Διαταραχή στην έκφραση πρωτεϊνών του εγκεφάλου. Για να διαπιστωθεί εάν οι παραπάνω αλλαγές συμπεριφοράς σχετίζονται με τροποποιήσεις στην έκφραση των πρωτεϊνών στο εγκέφαλο των μυών, πραγματοποιήθηκε, έπειτα από 8μηνη έκθεση σε ακτινοβολία κινητού ή ασύρματου τηλεφώνου, πρωτεωμική ανάλυση σε τρεις περιοχές του εγκεφάλου μυών (για πρώτη φορά διεθνώς), του ιππόκαμπου, της παρεγκεφαλίδας και του μετωπιαίου λοβού, περιοχές που εμπλέκονται σε γνωστικές λειτουργίες. Η προσέγγιση αυτή έδειξε πως μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών (143) παρουσιάζει τροποποίηση στα προφίλ έκφρασης αυτών (υπερέκφραση ή μειορύθμιση) σε απόκριση στην ακτινοβολία, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με το νευρικό σύστημα και τον μεταβολισμό, καθώς και κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (HSPs) (Fragopoulou AF, Samara A, Antonelou MH, Xanthopoulou A, Papadopoulou A, Vougas K, Koutsogiannopoulou E, Anastasiadou E, Stravopodis DJ, Tsangaris GTh, Margaritis LH, 2012). Συγκεκριμένα: • στον ιππόκαμπο, υπερεκφράζονται 11 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 37 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 11 και 33 αντίστοιχα • στην παρεγκεφαλίδα, υπερεκφράζονται 12 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 19 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 11 και 18 αντίστοιχα • στον μετωπιαίο φλοιό, υπερεκφράζονται 8 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 36 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 10 και 18 αντίστοιχα. Διαπιστώθηκε πως τη μεγαλύτερη επίδραση ακτινοβολίας την υφίσταται ο ιππόκαμπος πιθανά λόγω ύπαρξης «θερμών εστιών» (hot spots) και μάλιστα έπειτα από έκθεση από κινητό τηλέφωνο, ίσως επειδή η εκπεμπόμενη ισχύς είναι μεγαλύτερη (12 V/m έναντι 2.7 V/m). Από όλες τις πρωτεΐνες που άλλαξε η έκφρασή τους μετά από έκθεση μυών στην ακτινοβολία σημειώνουμε τις νευροειδικές: συναψίνη, συνταξίνη, συναπτοταγμίνη, δυναμίνη, δυνακτίνη, δρεβρίνη, νευροϊνίδια, άλφα συνουκλεΐνη, απολιποπρωτεΐνη E (apoE), καθώς και την όξινη ινιδιακή πρωτεΐνη της γλοίας (GFAP) και τον παράγοντα ωρίμανσης της γλοίας (GMF), που θα μπορούσαν πιθανά να εξηγήσουν τις διαταραχές μνήμης και την επαγωγή στρες που παρατηρήσαμε στα πειράματά μας, αλλά και την ανάπτυξη όγκων (γλοιώματος) που έχει συσχετιστεί, στις επιδημιολογικές μελέτες, με τη μακροχρόνια (τουλάχιστον δεκαετή) «βαριά» χρήση κινητών και ασύρματων τηλεφώνων. Οι πρωτεΐνες apoE, GFAP και GMF επελέγησαν για περαιτέρω ανάλυση ανοσοστυπώματος κατά western και επιβεβαιώθηκε η αλλαγή στην έκφρασή τους. Να σημειωθεί ότι πρωτεωμική ανάλυση του ιππόκαμπου μυών έπειτα από μικρής διάρκειας έκθεσή τους σε ΗΜΑ βάσης ασύρματου τηλεφώνου, έδειξε επίσης αλλαγή στην έκφραση αρκετών πρωτεϊνών, όχι όμως στατιστικά σημαντική αλλαγή στην έκφραση της GFAP (βιοδείκτης για νευροτοξικότητα και γλοίωμα) και της GMF (ενδοκυττάριος ρυθμιστής μεταγωγής σήματος στα αστροκύτταρα και ρυθμιστής παύσης πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων), γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι η πιθανή εμπλοκή της ΗΜΑ στην έναρξη ή επιδείνωση καρκινογένεσης μπορεί να προέλθει πιθανά μόνο έπειτα από χρόνια έκθεση. Αν και δεν είναι ακόμα γνωστό μέσω ποιών μονοπατιών αλλάζουν τα επίπεδα των πρωτεϊνών αυτών στις συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, πιθανολογείται πως η αρχική βλάβη ενδεχόμενα εστιάζεται στο οξειδωτικό στρες συμπαρασύροντας έμμεση δράση πρωτεϊνών θερμικού πλήγματος, απόπτωση και διαταραχή της λειτουργίας των συνάψεων. Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή αποκαλύπτει σημαντικές επιδράσεις των ηλεκτρομαγνητικών πεδίων (ΗΜΠ) ραδιοσυχνοτήτων στο θηλαστικό Mus musculus όπως διαταραχές μνήμης, επαγωγή στρες και αλλαγές στην έκφραση πρωτεϊνών του εγκεφάλου. Οι διαταραχές αυτές πιθανά να σχετίζονται με συχνά αναφερόμενα συμπτώματα (επιθετικότητα, νευρικότητα, απώλεια μνήμης, πονοκέφαλος, αϋπνία, κόπωση, ανάπτυξη εγκεφαλικών όγκων έπειτα από μακρόχρονη έκθεση). Περαιτέρω έρευνα πρέπει να πραγματοποιηθεί για τη διαλεύκανση του μηχανισμού αρχικής επίδρασης της ΗΜΑ, καθώς και για την επίδραση της διάρκειας έκθεσης, της διαμόρφωσης, της συχνότητας και έντασης της ακτινοβολίας στο ίδιο ζωικό πρότυπο, αλλά και σε άλλα πειραματικά μοντέλα.