Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών
Authors: Καραβασίλη Φωτεινή 
Published: September 2021

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αφορά στην ανάπτυξη και εφαρμογή καινοτόμων μεθοδολογιών για τον δομικό χαρακτηρισμό υλικών εστιάζοντας σε πρωτεΐνες φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ινσουλίνης και επίλυση της δομής πολυμόρφων της μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα κρυστάλλωσης της ινσουλίνης υπό διαφορετικές συνθήκες (pH, οργανικοί προσδέτες). Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης (Κεφάλαια 2 και 7), για τη μελέτη της οποίας καταστευάσθηκε εκ νέου σύστημα ελεγχόμενης παραγωγής ελεύθερων ριζών. Η τελευταία μελέτη πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την ομάδα Βιοχημείας του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης, του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Οι κρύσταλλοι ινσουλίνης που προέκυψαν είτε μεταβάλλοντας τις συνθήκες κρυστάλλωσης είτε λόγω του οξειδωτικού στρες, μελετήθηκαν μέσω της περίθλασης ακτίνων-Χ αρχικά με τη χρήση εργαστηριακού περιθλασίμετρου και στη συνέχεια στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, της Γαλλίας. Η βασική τεχνική που ακολουθήθηκε για τα πειράματα κρυσταλλογραφίας ήταν η περίθλαση ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-Ray Powder Diffraction-XRPD), η οποία τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί σε ένα σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού των πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών ιζημάτων. Παράλληλα διεξήχθησαν και κάποια πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ από μονοκρυσταλλικά δείγματα (Single crystal diffraction) ώστε να εξαχθούν περαιτέρω πληροφορίες χρησιμοποιώντας συνδυαστικά τις δυο τεχνικές.Από τη μελέτη συγκρυστάλλωσης της ινσουλίνης με τους οργανικούς προσδέτες, προσδιορίστηκαν εκτενώς τα κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά των πολυμόρφων που προέκυψαν, ενώ εξήχθησαν σημαντικά συμπεράσματα για τις διαμορφώσεις που λαμβάνει η ινσουλίνη παρουσία αυτών, καθώς και η φαρμακευτική σημασία τους. Ανάμεσα στα πολύμορφα που εντοπίσθηκαν, ταυτοποιήθηκαν δυο νέα πολύμορφα ινσουλίνης που χαρακτηρίζονται κρυσταλλογραφικά από πλεγματικές σταθερές που δεν έχουν καταχωρηθεί στην παγκόσμια τράπεζα πρωτεϊνικών δομών (Protein Data Bank) όπου και καταθέσαμε τις ακριβείς συντεταγμένες των πρωτεϊνικών δομών όπως προέκυψαν πειραματικά.Για την εκπόνηση της μελέτης της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στην δομή της ινσουλίνης, πραγματοποιήθηκε μελέτη και κατασκευή ενός καινοτόμου συστήματος επιτυχούς παραγωγής ελεύθερων ριζών με ελεγχόμενο ρυθμό, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της επίδρασης συγκεκριμένων ριζών σε ποικίλα πρωτεϊνικά συστήματα. Η ανάγκη αυτή προέκυψε καθώς το μοναδικό τεχνητό διαθέσιμο σύστημα παραγωγής ριζών (σύστημα Fenton) περιέχει παρεμβάλλοντα οξειδωτικά ή αντιοξειδωτικά συστατικά με αποτέλεσμα να μην επιτρέπει εξειδικευμένα την παραγωγή ελευθέρων ριζών και τη μελέτη της επίδρασής τους. Συγκεκριμένα από τη μελέτη στην ινσουλίνη, εντοπίσθηκαν κάποια από τα αμινοξέα που επηρεάζονται από τη ρίζα υδροξυλίου και ο βαθμός οξείδωσής τους συναρτήσει του χρόνου έκθεσης μέσω τεχνικών φωτομετρίας, ενώ επιπλέον η ινσουλίνη εξετάσθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ για τον εντοπισμό ενδεχόμενων αλλοιώσεων που προκαλούνται στη στερεοδιαμόρφωσή της. Ο εντοπισμός των αμινοξέων που επηρεάζονται μέγιστα από τη ρίζα υδροξυλίου αποτελεί σημαντικό εύρημα καθώς αντικατάσταση (μέσω μετάλλαξης ή χημικής σύνθεσης) των ευπρόσβλητων αμινοξέων, θα μπορούσε να προστατεύσει την ινσουλίνη, καθιστώντας τη λειτουργική ακόμα και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τέλος, στα πλαίσια του δομικού χαρακτηρισμού υλικών, πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα περίθλασης ηλεκτρονίων με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διελεύσεως και την τεχνική της ηλεκτρονικής τομογραφίας (Manual Diffraction Tomography, MDT) σε υλικά υψηλού ερευνητικού ενδιαφέροντος λόγω των υπεραγώγιμων ιδιοτήτων τους, σε ορυκτά λιθίου τα οποία παρουσιάζουν ιδιαίτερο γεωχημικό ενδιαφέρον καθώς και σε δείγματα αρχαιολογικής σημασίας. Η τεχνική της μετάπτωσης ηλεκτρονικής δέσμης (Precession Electron Diffraction, PED) η οποία χρησιμοποιήθηκε συνδυαστικά με την ηλεκτρονική τομογραφία, μείωσε δραστικά το φαινόμενο της δυναμικής σκέδασης (ιδιαίτερα έντονο κατά την περίθλαση ηλεκτρονίων) επιτρέποντας τη σαφή καταγραφή ανακλάσεων στον τρισδιάστατο αντίστροφο χώρο και την εξαγωγή δομικής πληροφορίας με μεγάλη ακρίβεια.