Ανάπτυξη ζωικών προτύπων ανθρώπινων ασθενειών μέσω ιστο-ειδικής μειορρύθμισης γονιδίων ελέγχου ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών δικτύων στο δίπτερο έντομο Drosophila melanogaster
Authors: Καταραχιά Σταματία 
Published: December 2023

Οι μηχανισμοί που ελέγχουν την «οργανισμική» αύξηση, και το συντονισμό αυτής, με τη διαθεσιμότητα θρεπτικών στοιχείων στα κυτταρικά μικρο-περιβάλλοντα παρέμεναν άγνωστοι μέχρι πριν λίγες δεκαετίες. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό, ότι ο «μηχανιστικός στόχος της ραπαμυκίνης», mTOR, λειτουργεί ως κύριος αισθητήρας «τροφής» και ρυθμιστής της ζωικής ανάπτυξης, ενώ παίζει κεντρικό ρόλο στη φυσιολογία, το μεταβολισμό, τη γήρανση και τις ασθένειες. Η απορρύθμισή του έχει συσχετιστεί έντονα με μία σειρά ανθρώπινων διαταραχών, όπως ο διαβήτης, οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες και ο καρκίνος. Η mTOR είναι μία πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης, η οποία αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα δύο διακριτών πολυ-πρωτεϊνικών συμπλόκων, αποκαλούμενα mTORC1 και mTORC2. Η λειτουργία τους, η εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, τα ανωρροϊκά ερεθίσματα, η σηματοδότηση κατωρροϊκά αυτών και η ευαισθησία τους στη ραπαμυκίνη διαφέρουν σημαντικά, καθώς τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες. Από τα δύο αυτά σύμπλοκα, το mTORC1 είναι το καλύτερα χαρακτηρισμένο. Ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη και τον μεταβολισμό, ρυθμίζοντας αναβολικές και καταβολικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και των νουκλεοτιδίων, καθώς επίσης αναστέλλει την αυτοφαγία, ως απόκριση σε κρίσιμα περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως οι αυξητικοί παράγοντες, η ενεργειακή κατάσταση, το οξυγόνο, το στρες και κυρίως τα αμινοξέα. Ένας από τους καθοριστικούς ρυθμιστές του mTORC1 είναι το ετεροτριμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο TSC (Tuberous Sclerosis Complex). Οι πρωτεΐνες TSC1 και TSC2 συνδέονται με την πρωτεΐνη TBC1D7 και σχηματίζουν το λειτουργικό σύμπλοκο TSC, το οποίον είναι και βασικός καταστολέας του συμπλέγματος mTORC1. Μεταλλαγές στα γονίδια TSC1 ή/και TSC2 που κωδικοποιούν τις εν λόγω πρωτεΐνες ευθύνονται για την εμφάνιση της Οζώδους Σκλήρυνσης στον άνθρωπο. Η Οζώδης Σκλήρυνση αποτελεί μία αυτοσωμική, επικρατή, γενετική διαταραχή, με κύριο γνώρισμα την ύπαρξη καλοηθών όγκων (αμαρτώματα) σε πολλαπλά οργανικά συστήματα. Είναι εντυπωσιακό, ότι μεταλλαγές στα TSC1 ή/και TSC2 γονίδια ευθύνονται για το ~85% των ασθενών, ενώ το ~15% αυτών με διαγνωσμένη Οζώδη Σκλήρυνση δεν φέρει εμφανή μεταλλαγή σε κανένα εκ των δύο γονιδίων.Στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη μίας καινοτόμου βιολογικής πλατφόρμας που θα αναπαράγει αξιόπιστα και αποτελεσματικά, και θα «μοντελοποιεί», την Οζώδη Σκλήρυνση, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο ζωικό μοντέλο την Drosophila melanogaster. Η D. melanogaster αντιπροσωπεύει έναν από τους πιο ισχυρούς πρότυπους οργανισμούς-μοντέλα και χρησιμοποιείται παγκοσμίως από πολυάριθμα εργαστήρια στη βιολογική έρευνα για την αποσαφήνιση σημαντικών ερωτημάτων που αφορούν στους μοριακούς μηχανισμούς της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και της γήρανσης, λόγω των πλεονεκτημάτων που φέρει ως πειραματικό σύστημα-μοντέλο. Με την χρήση προηγμένων βιοπληροφορικών εργαλείων και βάσεων δεδομένων που προσφέρονται ελεύθερα, όπως η "FlyBase" (flybase.org), το "Ensembl Genome Browser 91" (ensembl.org) και το "BLAST-NCBI-NIH" (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), εντοπίσαμε in silico τα ομόλογα TSC1, TSC2 και TBC1D7 γονίδια στην Drosophila (dTSC1, dTSC2 και dTBC1D7), και πραγματοποιήσαμε αποσιώπηση της (μετα-)μεταγραφικής/μεταφραστικής τους έκφρασης, μέσω της χρήσης του γενετικού εργαλείου GAL4/UAS και της RNAi τεχνολογίας, σε πληθώρα διαφορετικούς ιστούς. Οι αποκτηθέντες φαινότυποι -φυσικού και γενετικά στοχευμένου τύπου- απομονωμένων οργάνων αξιολογήθηκαν μέσω φωτονικής (στερεο-)μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM). Η νευρολογική/νευρωνική/νευρομυική επάρκεια του οργανισμού εκτιμήθηκε μελετώντας το προφίλ επιβίωσης και τα μοτίβα του αρνητικού γεωτακτισμού, τόσο σε έντομα διασταύρωσης ελέγχου όσο και σε γενετικά στοχευμένα έντομα, κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Σε έντομα με μειορρυθμισμένα τα γονίδια dTSC1 και dTSC2 στο νευρικό σύστημα, λόγω της ισχυρής παθολογίας που παρουσίασαν, πραγματοποιήθηκε μικρο-ανατομία εγκεφάλου και απομόνωση πρωτεϊνών, οι οποίες, εν συνεχεία, μελετήθηκαν μέσω στυπώματος Western για τυχόν ενεργοποίηση, μέσω φωσφορυλίωσης, κρίσιμων dTOR κατωρροϊκών τελεστών, όπως οι πρωτεΐνη dS6K(1). Επιπλέον, υγιή έντομα (αναφοράς/μάρτυρες) και διαγονιδιακά έντομα με αποσιώπηση των γονίδιων dTSC1 ή dTSC2 (εκλεκτικά) στο νευρικό σύστημα, χαρτογραφήθηκαν ενδελεχώς ως προς το περιεχόμενο των πρωτεωμάτων (μέσω της προηγμένης τεχνολογίας nano-LC-MS/MS), των μεταγραφωμάτων (μέσω της τεχνολογίας αιχμής RNA-Seq.), και των μεταβολωμάτων (μέσω της νέας γενεάς τεχνολογίας LC-MS/MS) τους, καθώς, επίσης, υπεβλήθησαν σε πλήρη χαρτογράφηση του ενεργού τους κινώματος, μέσω της σύγχρονης τεχνολογίας PamGene. Τα βακτήρια του εντέρου συνδέονται με διάφορες λειτουργίες και συγκεκριμένες ασθένειες, και το εντερικό μικροβίωμα φαίνεται να επηρεάζει καθοριστικά τη φυσιολογία και το μεταβολισμό του ξενιστή. Ως εκ τούτου, απομονώθηκε βακτηριακό DNA από τον ιστό του εντέρου εντόμων με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 ή dTSC2 (ειδικά) στο (μέσο) έντερο, και πραγματοποιήθηκε ενδελεχής και συστημική ανάλυση του μικροβιώματος, σε σχέση με τις συνθήκες αναφοράς (υγιή έντομα). Τέλος, σε έντομα με την ισχυρότερη, ανιχνεύσιμη, παθολογία χορηγήθηκαν είτε αναστολείς της ενεργότητας της mTOR κινάσης, είτε επαγωγείς της αυτοφαγίας (καταστέλλεται από την σηματοδοτική δράση του mTORC1 συμπλόκου), με σκοπό την αναστροφή της εγκεφαλικής παθολογίας, και την ανάπτυξη μίας νέας χημειοθεραπευτικής in vivo πλατφόρμας για την Οζώδη Σκλήρυνση. Η μειορρύθμιση τόσο του dTSC1 γονιδίου όσο και του dTSC2 στους οφθαλμούς του εντόμου είχε ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της μορφολογίας του οφθαλμού από νεαρή ηλικία (10 ημερών), με προοδευτική απώλεια βλεφαρίδων, η οποία εντάθηκε κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Από την άλλη πλευρά, η μειορρύθμιση της πρωτεΐνης dTBC1D7 στους οφθαλμούς δεν προκάλεσε κάποιον παθολογικό φαινότυπο. Η δομή και η αρχιτεκτονική οργάνωση των φτερών αλλοιώθηκε εντόνως κατόπιν γονιδιακής αποσιώπησης τόσο του dTSC1 γονιδίου όσο και του γονιδίου dTSC2, με τους παρατηρηθέντες φαινοτύπους να ποικίλουν. Η μειορρύθμιση της πρωτεΐνης dTBC1D7 δεν επηρέασε τη μορφολογία των φτερών, ωστόσο παρατηρήθηκε σε αρσενικά έντομα μια τάση αύξησης του μεγέθους των φτερών, συγκριτικά με τα έντομα διασταύρωσης ελέγχου. Το προφίλ επιβίωσης των θηλυκών αλλά και των αρσενικών εντόμων με αποσιώπηση του dTSC1 γονιδίου παρουσιάστηκε δραματικά μειωμένο συγκριτικά με τις συνθήκες control σε όλα τα οργανικά συστήματα που μελετήθηκαν (νευρικό σύστημα, σύστημα γιγαντιαίου νευρώνα, χολινεργικοί/ντοπαμινεργικοί/γλουταμινεργικοί/σεροτονεργικοί/γ-αμινο-βουτυρικοί νευρώνες, ενδιάμεσος νευρώνας, κινητικοί νευρώνες, μυς, έντερο) εκτός από τα κύτταρα της γλοίας όπου δεν υπήρξε κάποια αξιοσημείωτη μεταβολή. Η μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου επηρέασε και την αναρριχητική ικανότητα των εντόμων η οποία εμφανίζεται μειωμένη, και στα δύο φύλα, (εξαιρούνται οι ντοπαμινεργικοί και γ-αμινο-βουτυρικοί νευρώνες), με τον ισχυρότερο και παθολογικότερο φαινότυπο να παρατηρείται ύστερα από μειορρύθμιση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα και στον ενδιάμεσο νευρώνα, γεγονός που επιβεβαιώθηκε και μέσω ηλεκτροφυσιολογίας. Η χορήγηση του αναστολέα της dTOR κινάσης, Ridaforolimus, σε έντομα με μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου στο νευρικό σύστημα λόγω της ισχυρής παθολογίας που εμφάνισαν, προκάλεσε τη σημαντική αύξηση του προσδόκιμου ζωής των θηλυκών εντόμων.Η μειορρύθμιση του dTSC2 γονιδίου επηρέασε τη βιωσιμότητα και την αναρριχητική ικαντότητα των εντόμων με φυλο- και ιστο- εξαρτώμενο τρόπο. Η επιβίωση των θηλυκών εντόμων εμφανίστηκε στατιστικά σημαντικά μειωμένη ύστερα αποσιώπηση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα, στο σύστημα του γιγαντιαίου νευρώνα, στους χολινεργικούς /ντοπαμινεργικούς/γλουταμινεργικούς και γ-αμινο-βουτυρικούς νευρώνες, στον ενδιάμεσο νευρώνα, τους κινητικούς νευρώνες, και στο έντερο. Στα αρσενικά έντομα η βιωσιμότητα διαταράχτηκε, συγκριτικά με τις συνθήκες control, μετά από γονιδιακή αποσιώπηση του dTSC2, στους χολινεργικούς /ντοπαμινεργικούς/γλουταμινεργικούς, γ-αμινο-βουτυρικούς νευρώνες καθώς επίσης και στα κύτταρα της γλοίας. Τα θηλυκά παρουσίασαν κινητική δυσλειτουργία ύστερα από μειορρύθμιση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα, στο σύστημα του γιγαντιαίου νευρώνα, στους γλουταμινεργικούς και κινητικούς νευρώνες καθώς επίσης και στα κύτταρα της γλοίας. Στα αρσενικά άτομα, η ικανότητα αναρρίχησης εμφανίστηκε μειωμένη στην πλειοψηφία των μελετηθέντων ιστών. Η χορήγηση των αναστολέων της dTOR κινάσης, Ridaforolimus και Εverolimus, καθώς επίσης και του επαγωγέα της αυτοφαγίας Σπερμιδίνη, σε έντομα με μειορρύθμιση του dTSC2 γονιδίου στο νευρικό σύστημα λόγω της ισχυρής κινητικής δυσχέρειας που εμφάνισαν, προκάλεσε τη σημαντική αύξηση της αναρριχητικής ικανότητας των αρσενικών εντόμων. Η χαρτογράφηση του μεταβολώματος, του πρωτεώματος και του ενεργού κινώματος σε έντομα με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 και dTSC2 στο νευρικό σύστημα αποκάλυψε μια σειρά νέων βιο-δεικτών. Από τη μελέτη της δράσης των ενεργών κινασών σε εγκεφάλους εντόμων με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 ή dTSC2 προέκυψε σημαντική αύξηση της ενεργότητας διαφόρων κινασών, συμπεριλαμβανομένων υποστρωμάτων του dTORC1 συμπλόκου, όπως είναι η dp70S6K. Ως προς τη μεταβολωμική ανάλυση, η αποσιώπηση του γονιδίου dTSC1, που οδηγεί σε απορρύθμιση του dTOR σηματοδοτικού δικτύου, είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του μεταβολίτη της βεταίνης, ενός σακχάρου που συμμετέχει στο μεταβολισμό της μεθεϊονίνης, ενώ η αποσιώπηση του γονιδίου dTSC2 οδήγησε σε αύξηση του δισακχαρίτη τριαλόζη. H χαρτογράφηση του μεταγραφώματος εντόμων με μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου ανέδειξε την ενεργοποίηση της μεταγραφής πληθώρας γονιδίων που σχετίζονται με τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος της D. melanogaster. Τέλος, από την ανάλυση του μικροβιώματος τόσο σε έντομα με αποσιώπηση του dTSC1 γονιδίου, όσο και με αποσιώπηση του dTSC2 γονιδίου στον ιστό σου εντέρου, παρατηρήθηκαν μεγάλες διαφοροποιήσεις στο μικροβιακό φορτίο μεταξύ διαγονιδιακών εντόμων και εντόμων διασταύρωσης ελέγχου.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την αποσιώπηση του γονιδίου dTBC1D7 δείχνουν πως η απουσία της πρωτεΐνης έχει αντίστροφη επίδραση από την απώλεια των πρωτεϊνών dTSC1 και dTSC2. Αναλυτικότερα, η επιβίωση των θηλυκών διαγονιδιακών εντόμων ήταν σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με τα υγιή έντομα, στο νευρικό σύστημα, στους γλουταμινεργικούς και κινητικούς νευρώνες, στους μυς και στο έντερο, ενώ στα αρσενικά υπήρξε αυξημένο προσδόκιμο ζωής σε όλους τους μελετηθέντες ιστούς, εκτός του νευρικού συστήματος. Η ικανότητα αναρρίχησης των θηλυκών εντόμων με μειορρύθμιση του γονιδίου dTBC1D7 δεν εμφάνισε αξιοσημείωτες μεταβολές συγκριτικά με τα έντομα control, ενώ στα αρσενικά διαπιστώθηκε μια τάση μείωσης της κινητικής δραστηριότητας στους χολινεργικούς, σεροτονεργικούς και κινητικούς νευρώνες, στα κύτταρα της γλοίας, στους μυς και στο έντερο.Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης SAMTOR, μιας πρωτεΐνης που σηματοδοτεί έμμεσα τα επίπεδα της μεθειονίνης στο mTORC1 σύμπλοκο. Υψηλά επίπεδα μειορρύθμισης της dSAMTOR πρωτεΐνης σε μια πληθώρα ιστών (ολόκληρο το σώμα, νευρικό σύστημα, κινητικοί νευρώνες, μυς, κύτταρα γλοίας) οδήγησε σε μη βιώσιμα έντομα, ενώ η μειορρύθμιση στους οφθαλμούς και στα φτερά προκάλεσε έντονη απώλεια βλεφαρίδων και δυσμορφικά φτερά, αντίστοιχα. Η επιβίωση των εντόμων και των δύο φύλων, ύστερα από υψηλά ποσοστά μειορρύθμισης του γονιδίου στον ιστό που εντέρου, παρατηρήθηκε σημαντικά μειωμένη, συγκριτικά με τα υγιή έντομα. Μέτρια επίπεδα μειορρύθμισης του γονιδίου dSAMTOR δεν επηρέασαν την εξωτερική μορφολογία ούτε των φτερών ούτε των οφθαλμών. Το προφίλ επιβίωσης επηρεάστηκε ιστο- και φυλο-ειδικά ενώ η αναρριχητική ικανότητα εμφανίστηκε μειωμένη μόνο κατόπιν αποσιώπησης του γονιδίου στους κινητικούς νευρώνες. Η εξωγενής χορήγηση της μεθειονίνης, σε έντομα με μειορρύθμιση του dSAMTOR γονιδίου, μείωσε το προσδόκιμο ζωής των εντόμων και των δύο φύλων, ενώ η χορήγηση της βεταινης βελτίωσε την βιωσιμότητα των αρσενικών εντόμων.Για πρώτη φορά αποδεικνύεται: •Η επιτυχής «μοντελοποίηση» της ανθρώπινης Οζώδου Σκλήρυνσης σε έναν πρότυπο ασπόνδυλο οργανισμό, την Drosophila•Η κρίσιμη συμμετοχή, με αυτόνομο και αυτοδύναμο τρόπο, πολλών και διαφορετικών οργανικών συστημάτων του εντόμου στην αποκτώμενη παθολογία της TSC-γονιδιο-ειδικής και ηλικιο-εξαρτώμενης έκπτωσης τόσο στο προσδόκιμο ζωής, όσο και στη νευρομυϊκή λειτουργία και ακεραιότητα •Η διαφορική συμβολή των dTSC1 και dTSC2 γονιδίων στην παρατηρούμενη παθολογία της Οζώδου Σκλήρυνσης σε περιβάλλοντα διαγονιδιακών εντόμων •Η ικανότητα των dTSC1 και dTSC2 πρωτεϊνών να σηματοδοτούν αντίθετα από το dTBC1D7 συστατικό, ως προς την λειτουργική τους επίδραση, επί της dTOR κινάσης, τόσο σε συστημικό όσο και σε ιστο-ειδικό επίπεδο •Η μηχανιστική αξία πλήθους μεταγραφωμικών, πρωτεωμικών, μεταβολωμικών και κινωμικών βιο-δεικτών, ταυτοποίησης της «μοντελοποιημένης» παθολογίας, με έμφαση σε αυτούς που σχετίζονται με ανοσολογικές αποκρίσεις, αλλά και μεταβολισμό υδατανθράκων •Ο σημαντικός ρόλος του (μεσο-)εντερικού μικροβιώματος, ως απόκριση στην δυσλειτουργία του dTORC1 συμπλόκου, και την εμφάνιση «μοντελοποιημένης» Οζώδου Σκλήρυνσης, σε in vivo συνθήκες διαγονιδιακών εντόμων, υπό φάση γήρανσης •Η δυνατότητα in vivo ανάπτυξης νέων χημειοθεραπευτικών σχημάτων, βασισμένων στην «μοντελοποιημένη» νόσο, με προοπτική και δυνατότητα επιτυχούς και ασφαλούς εφαρμογής τους, στην κλινική πράξη, για τους πάσχοντες από Οζώδη Σκλήρυνση ασθενείς.