Νουκλεοσωμική οργάνωση και ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του χορίου μέσω ειδικών αρχιτεκτονικών παραγόντων στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori.
Authors: Παπαντώνης Αργύρης 
Published: January 2014

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι ο χαρακτηρισμός πρωτεϊνικών παραγόντων που σχετίζονται με τη ρύθμιση των ενδιάμεσων γονιδίων του χορίου. Η ομάδα αυτή των γονιδίων μπορεί να διαιρεθεί σε δυο υποομάδες, με πιο εξειδικευμένο πρότυπο έκφρασης: στα πρώιμα-ενδιάμεσα (επιλέχθηκε το ζεύγος Α/B.L9) και τα ενδιάμεσα-όψιμα (A/B.L1). Η αρχιτεκτονική των υποκινητών τους βασίζεται στα ίδια δομικά στοιχεία (αλληλουχίες αναγνώρισης μεταγραφικών ρυθμιστών) διαφοροποιείται όμως η διάταξή τους κατά μήκος των 200 bp που περιλαμβάνονται ανάμεσα στις δυο αλληλουχίες ΤΑΤΑ. Στο επίκεντρο της μελέτης τοποθετήθηκαν οι νέοι cDNA κλώνοι BmCHD1 και BmHMGA (GenBank acc. nos. DQ402511, DQ402512) και ο χαρακτηρισμένος BmC/EBP. Οι δύο πρώτοι χαρακτηρίζονται ‘αρχιτεκτονικοί’ μεταγραφικοί παράγοντες εξαιτίας της δομικής σχέσης που δυνητικά αναπτύσσουν με τη χρωματίνη. Ο τελευταίος αποτελεί ένα γνωστό μεταγραφικό ρυθμιστή της υπεροικογένειας των πρωτεϊνών με φερμουάρ λευκίνης. Το πρότυπο έκφρασής τους εμφανίζει σαφή συσχέτιση με τη φάση της χοριογένεσης, όπως και με το πρότυπο έκφρασης του παράγοντα C/EBP. Παρατηρήθηκε (μέσω qRT-PCR) ότι τα γονίδια HMGA, CHD1 μεταγράφονται με υψηλούς ρυθμούς κατά τη βιτελλογένεση, την ενδιάμεση και την όψιμη χοριογένεση· μικρότερα επίπεδα εντοπίστηκαν κατά τα υπόλοιπα στάδια. Η παραγωγή των αντίστοιχων πρωτεϊνών φαίνεται, μέσω ανοσοστύπωσης (Western blot) να διατηρείται σταθερά σε υψηλά επίπεδα. Ακολούθησε μελέτη των βασικών λειτουργικών χαρακτηριστικών των δύο παραγόντων. Δοκιμές κάμψης του DNA έδειξαν ότι ο HMGA επάγει το σχηματισμό γωνιών στους ενδιάμεσους υποκινητές (90ο κατά μέση τιμή), αποτέλεσμα της συνεργιστικής δράσης δύο ‘AT-hook’ μοτίβων και της όξινης καρβοξυλικής ‘ουράς’ του μορίου. Η ανάπτυξη διαπρωτεϊνικών σχέσεων εξετάστηκε μέσω πειραματικών διατάξεων στο σύστημα ‘Δύο Υβριδίων’ (Yeast-two-hybrid), μέσω συν-ανοσοκατακρημνίσεων και μεθόδων in vitro ομοιοπολικης διασύνδεσης πρωτεϊνών. Το σύνολο των αναλύσεων αποκάλυψε μια αλληλουχία μοριακών γεγονότων: ο παράγοντας HMGA αποτελεί τον ‘κόμβο’ που ρυθμίζει και εναλλάσσει σχέσεις αλληλεπίδρασης με τους CHD1, C/EBP όπως και με τον ειδικό ενεργοποιητή των όψιμων γονιδίων, BmGATAβ. Οι CHD1, C/EBP δεν βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν και η δράση τους φαίνεται πως συντονίζεται μέσω της σχέσης τους με τον HMGA, όπως προσδιορίστηκε από πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP) στους υποκινητές των γονιδιακών ζευγών A/B.L1, A/B.L9. H παρουσία του CHD1 συσχετίζεται με τη τροποποίηση (δι-/τριμεθυλίωση) της θέσης της λυσίνης 4 στην ιστόνη Η3 και με την αναδιοργάνωση της νουκλεοσωμικής διαρύθμισης. Βρέθηκε, δηλαδή, ότι μετακινεί ένα ιστονικό οκταμερές κατά 25 bp αριστερότερα, αποκαλύπτοντας σημαντικά cis-στοιχεία στο α-ήμισυ του υποκινητή L9. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των HMGA, CHD1, C/EBP συμπληρώθηκε από πειράματα παροδικής καταστολής της γονιδιακής έκφρασης μέσω παρεμβολής με τροποποιημένα μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια DNA (antisense DNA interference). Συνοπτικά, η εκκίνηση (και πιθανότατα η ολοκλήρωση) της μεταγραφής κατά τη χοριογένεση πραγματοποιείται μέσω διαφορικών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και αλληλεπιδράσεων DNA-πρωτεϊνών. Ο παράγοντας CHD1 οριοθετεί τις μετακινήσεις των νουκλεοσωμάτων, ενώ ο C/EBP δρα τόσο ενεργοποιητικά όσο και κατασταλτικά. Ο HMGA διαμεσολαβεί στην ανάπτυξη των διαπρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, συντονίζοντας και οργανώνοντας τη διαδοχή των μοριακών γεγονότων και παρεμβαίνει στο λειτουργικό ισοζύγιο C/EBP-GATA το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει τη μετάβαση από την ενδιάμεση στην όψιμη χοριογένεση. Οι σχέσεις HMGA-C/EBP-GATA φαίνεται να συμμετέχουν σε ένα κλειστό μεταγραφικό κύκλωμα το οποίο ελέγχει τόσο τη ρύθμιση των γονιδίων του χορίου, όσο και του γονιδίου C/EBP.