A complex of biochemical properties of recombinant reindeer (Rangifer tarandus) chymosin with point amino acid substitution K53E
Authors: Пушкарев В.А. , Мусина О.Н. , Беленькая С.В. , Щербаков Д.Н. , Коваль А.Д. , Белов А.Н. , Ельчанинов В.В. 
Published: April 2023

Традиционно наилучшим коагулянтом молока для сыроделия считался коровий сычужный фермент – препарат, получаемый из слизистой оболочки желудков телят-молокопоек. Основным компонентом сычужного фермента является аспартатная молокосвертывающая протеиназа химозин. Мировой дефицит натурального сычужного фермента, возникший в середине XX века, инициировал поиск его заменителей. Одним из вариантов решения данной проблемы стала разработка технологий получения генно-инженерных аналогов химозина. В настоящее время для промышленного получения сыров уже используются рекомбинантные химозины коровы и одногорбого верблюда. Однако работы, направленные на получение и исследование новых молокосвертывающих протеиназ, по-прежнему актуальны, что связано с перспективой нахождения ферментов с улучшенными технологическими свойствами. Российской междисциплинарной научной группой впервые получен инженерный вариант рекомбинантного химозина северного оленя (Rangifer tarandus) с точечной аминокислотной заменой K53E, экспрессированный в системе продукции Escherichia coli (штамм SHuffle Express). Для оценки производственных перспектив нового фермента изучены его биохимические свойства, важные с точки зрения сыроделия. В качестве препаратов сравнения использованы коммерческие рекомбинантные химозины коровы и одногорбого верблюда производства компании Chr. Hansen (Дания). Показано, что инженерный вариант оленьего химозина способен эффективно коагулировать молоко коровы. Удельная молокосвертывающая активность инженерного варианта оленьего химозина оказалась приблизительно в 4–6 раз ниже, чем у коровы и одногорбого верблюда. Для использования нового препарата в сыроделии рекомендовано увеличить удельную молокосвертывающую активность целевого фермента, что может быть достигнуто, например, путем замены прокариотической системы экспрессии на эукариотическую. По термостабильности инженерный вариант рекомбинантного химозина R. tarandus сопоставим с коммерческими препаратами. По показателям общей протеолитической активности олений фермент занимает промежуточное положение между рекомбинантными химозинами коровы и верблюда. По зависимости молокосвертывающей активности от рН и концентрации хлорида кальция в молочном субстрате инженерный вариант химозина северного оленя не уступает коммерческим рекомбинантным коагулянтам молока и полностью соответствует требованиям сыроделия.

Traditionally, the best coagulant of milk for cheese-making was considered cow rennet – a preparation obtained from the mucous membrane of the stomachs of milk-feeding calves. The main component of rennet is aspartate milk-converting proteinase chymosin. The global shortage of natural rennet, which arose in the middle of the XX century, initiated the search for its substitutes. One of the solutions to this problem was the development of technologies for obtaining genetically engineered analogues of chymosin. Currently, recombinant cow and single-humped camel chymosins are already being used for the industrial production of cheeses. However, the work aimed at obtaining and researching new milk-clotting proteinases is still relevant, which is associated with the prospect of finding enzymes with improved technological properties. For the first time, an engineered variant of recombinant reindeer (Rangifer tarandus) chymosin with a point amino acid substitution K53E expressed in the Escherichia coli production system (SHuffle Express strain), was obtained by a Russian interdisciplinary scientific group. To assess the production prospects of the new enzyme, its biochemical properties, important from the point of view of cheese-making, have been studied. As a comparison specimens the commercial recombinant chymosins of cow and single-humped camel, produced by the company Chr. Hansen (Denmark), were used. It is shown that the engineered version of deer chymosin is able to effectively coagulate cow's milk. The specific milk-clotting activity of the engineered variant of deer chymosin turned out to be approximately 4–6 times lower than that of a cow and a single-humped camel. To use the new drug in cheese making, it is recommended to increase the specific milk-clotting activity of the target enzyme, which can be achieved, for example, by replacing the prokaryotic expression system with a eukaryotic one. In terms of thermal stability, the engineered version of recombinant chymosin R. tarandus is comparable to commercial enzymes. In terms of overall proteolytic activity, the deer enzyme occupies an intermediate position between recombinant cow and camel chymosins. According to the dependence of milk-clotting activity on pH and the concentration of calcium chloride in the milk substrate, the engineered version of reindeer chymosin is not inferior to commercial recombinant milk coagulants and fully meets the requirements of cheese-making.