Χρήση της προσθετικής κατασκευής για την ανάπτυξη μικροβελονών για διαδερμική χρήση πεπτιδίων
Authors: Ξενικάκης Ιάκωβος 
Published: November 2021

Η χρήση μικροβελόνων είναι μία μέθοδος η οποία επιτρέπει τη διάτρηση της κερατίνης στιβάδας και το σχηματισμό πόρων μέσω των οποίων επιτυγχάνεται διαδερμική χορήγηση φαρμάκων. Με αυτή τη μέθοδο μπορούν να χορηγηθούν φάρμακα τα οποία σε άθικτο δέρμα έχουν μηδαμινή απορρόφηση. Τέτοιου είδους φάρμακα είναι και τα μακρομόρια, μεταξύ των οποίων και οι πρωτεΐνες. Η επίτευξη διαδερμικής χορήγησης μακρομορίων θα βελτίωνε την καθημερινότητα και τη συμμόρφωση στη θεραπεία ασθενών που υποχρεώνονται σε τακτική παρεντερική χορήγηση της θεραπείας τους (π.χ. διαβητικοί). Παράλληλα, η χρήση της Προσθετικής Κατασκευής επιτρέπει την κατασκευή των μικροβελόνων με γρήγορο, εύκολο, ευέλικτο και οικονομικό τρόπο χάρη στους ακόλουθους λόγους: α) τα σχέδια των μικροβελόνων σώζονται ως αρχεία .stl και μπορούν να τροποποιηθούν όποτε κριθεί απαραίτητο, β) η διαδικασία κατασκευής συνοψίζεται σε ένα στάδιο στο οποίο στιβάδες του υλικού εκτύπωσης εναποτίθεται διαδοχικά και ελεγχόμενα στην πλατφόρμα εκτύπωσης και γ) οι συσκευές που απαιτούνται για τη διεκπεραίωση της κατασκευής είναι πολύ απλές (ένας υπολογιστής και ένας εκτυπωτής), ενώ δεν γίνεται χρήση περίπλοκων μηχανών και συνηθισμένων εργαλείων. Το γεγονός αυτό επιτρέπει την εγκατάσταση μικρών μονάδων παραγωγής ακόμη και σε απομακρυσμένα μέρη. Επιπρόσθετα, η χρήση της Προσθετικής Κατασκευής για την κατασκευή μικροβελόνων επιτρέπει κατά περιπτώσεις την εξατομικευμένη χορήγηση φαρμάκων.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αξιοποίηση της Προσθετικής Κατασκευής και των πλεονεκτημάτων που προσφέρει με στόχο αφενός την κατασκευή συστοιχιών μικροβελόνων και αφετέρου τη χρήση αυτών για χορήγηση μακρομοριακών φαρμακευτικών ουσιών. Αρχικά η μελέτη επικεντρώθηκε στην κατασκευή των μικροβελόνων. Κατασκευάστηκαν δύο είδη μικροβελόνων: α) συμπαγείς (solid) μικροβελόνες με χρήση στερεολιθογραφίας (stereolithography, SLA) και β) κοίλες μικροβελόνες (HMNs) με εκτύπωση μέσω οθόνης υγρών κρυστάλλων (liquid crystal display, LCD). Σε κάθε περίπτωση οι μικροβελόνες προσδιορίστηκαν ως προς τη μορφολογία και τις διαστάσεις τους με χρήση οπτικής μικροσκοπίας και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (scanning electron microscopy, SEM). Επιπρόσθετα, έγινε μελέτη των μηχανικών τους ιδιοτήτων μέσω δοκιμών μονοαξονικής θλίψης, ενώ ακόμη έγιναν δοκιμές διείσδυσης σε δείγματα δέρματος ανθρώπινης προέλευσης. Παράλληλα, οι δοκιμές μονοαξονικής θλίψης και διείσδυσης προσομοιώθηκαν μέσω ανάλυσης πεπερασμένων στοιχείων (Finite Element Analysis, FEA). Οι συμπαγείς μικροβελόνες (6x6) χρησιμοποιήθηκαν για τη διαδερμική χορήγηση των πρότυπων χρωστικών καλσεΐνη και FITC-Dextran (4000Da). Ακολούθως έγινε επεξεργασία των αποτελεσμάτων διαπερατότητας και υπολογίστηκε η αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος για κάθε χρωστική έπειτα από τη μεσολάβηση των μικροβελόνων. Στα δείγματα δέρματος που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα έγιναν τομές με κρυοστάτη και χρώση αιματοξυλίνης-εοσίνης.Οι HMNs κατασκευάστηκαν αρχικά ως 3x3 συστοιχίες υπό γεωμετρία κυρτής τριγωνικής πυραμίδας. Ακολούθως μελετήθηκε η ικανότητα διάβασης υδατικού μέσου από τα μικροκανάλια και έτσι διαπιστώθηκε η ανάγκη προσθήκης επιφανειοδραστικού παράγοντα στην επιφάνεια των μικροβελόνων. Η επικάλυψη έγινε με 5% Pluronic F-127 και η προσθήκη του επιβεβαιώθηκε με φάσμα FTIR και μελέτη γωνίας επαφής. Για τις ανάγκες της χορήγησης κατασκευάστηκαν δεξαμενές με κατασκευή μέσω μοντελοποίησης απόθεσης τήγματος (fused deposition modeling, FDM). Οι δεξαμενές συναρμολογήθηκαν με τις μικροβελόνες δίνοντας την τελική συσκευή χορήγησης. Στη συνέχεια διεξήχθησαν μελέτες διαπερατότητας μέσω συνθετικών μεμβρανών χρησιμοποιώντας οξική οκτρεοτίδη. Ακόμη, χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα τρισδιάστατα εκτυπωμένου υλικού έγιναν μελέτες τοξικότητας σε HaCaT κυτταρικές σειρές. Σε επόμενο στάδιο σχεδιάστηκε μια παραλλαγή των παραπάνω συστοιχιών και κατασκευάστηκαν 6x6 συστοιχίες μικροβελόνων της ίδιας γεωμετρίας. Επιπρόσθετα, κατασκευάστηκαν 6x6 συστοιχίες μικροβελόνων γεωμετρίας σύριγγας (syringe-like), καθώς και ρεζερβουάρ κατασκευασμένα με LCD μέθοδο. Έπειτα από προσθήκη επιφανειοδραστικού και διεξαγωγή υπολογιστικής μαγνητικής τομογραφίας (μ-OCT) όπου προσδιορίστηκαν οι εσωτερικοί όγκοι των μικροκαναλιών, τα δύο είδη μικροβελόνων χρησιμοποιήθηκαν για in vitro διαδερμική χορήγηση ινσουλίνης.Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι οι μικροβελόνες που κατασκευάστηκαν ήταν κατάλληλες για διάτρηση του δέρματος καθώς και συνθετικών μεμβρανών. Διαστασιολογικά οι μικροβελόνες κυμαίνονται εντός των ορίων που εξασφαλίζουν την ανώδυνη εφαρμογή τους. Η μηχανική αντοχή τους επιτρέπει τη χρήση για την οποία προορίζονται χωρίς να υπάρχει κίνδυνος θραύσης και παραμονής τμήματος των μικροβελόνων εντός των ιστών του δέρματος, με συντελεστή ασφαλείας (safety factor) πολύ μεγαλύτερο της μονάδας και με τα αποτελέσματα FEA να είναι σε συμφωνία με τα πειραματικά δεδομένα. Η προσθήκη του επιφανειοδραστικού παράγοντα στις HMNs ήταν επιτυχής και επέτρεψε την ελεύθερη δίοδο υδατικών διαλυμάτων δραστικών ουσιών. Η κατασκευή των ρεζερβουάρ ήταν επίσης επιτυχής και απέδωσε τις επιθυμητές διαστάσεις, επιτρέποντας έτσι τη συναρμολόγηση των ρεζερβουάρ με τις HMNs χωρίς να σημειώνονται διαρροές. Σε όλες τις περιπτώσεις πειραμάτων διαπερατότητας παρατηρήθηκε αύξηση της ποσότητας δραστικής ουσίας που διαπερνά το δέρμα ή τις συνθετικές μεμβράνες έπειτα από τη μεσολάβηση των μικροβελόνων. Ακόμη, οι τοξικολογικές μελέτες έδειξαν ότι η τρισδιάστατα εκτυπωμένη ρητίνη είναι ασφαλής για ολιγόλεπτη επαφή με το δέρμα. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αποδείχθηκε ότι η Προσθετική Κατασκευή είναι κατάλληλη για κατασκευή μικροβελόνων και συνεπώς δίνεται η δυνατότητα να αξιοποιηθούν τα πλεονεκτήματα που προσφέρει ως μέθοδος. Επίσης, κατόπιν αποτελεσματικής διάτρησης του δέρματος, αποδείχθηκε ότι είναι εφικτή η διαδερμική χορήγηση φαρμάκων μεγάλου μοριακού βάρους (ενδεικτικά εδώ FITC-Dextran 4000Da, οξική οκτρεοτίδη, ινσουλίνη). Εν κατακλείδι, οι τρισδιάστατα εκτυπωμένες μικροβελόνες είναι κατάλληλες για διαδερμική χορήγηση μακρομορίων.