Συγκριτική επιδημιολογική μελέτη του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου, στα παραγωγικά ζώα, στο κρέας τους, στο περιβάλλον και το προσωπικό σφαγείων και εγκαταστάσεων επεξεργασίας κρέατος της Βόρειας Ελλάδας
Authors: Κομοδρόμος Δημήτριος 
Published: November 2021

Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) είναι ένας ευπροσάρμοστος ευκαιριακός παθογόνος μικροοργανισμός, αποτελεί μέρος της φυσιολογικής μικροχλωρίδας των ανθρώπων και των ζώων, αλλά κάτω από συγκεκριμένες προϋποθέσεις είναι σε θέση να προκαλεί λοιμώξεις με ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις, που κυμαίνονται από απλή δερματίτιδα ή γαστρεντερίτιδα μέχρι πνευμονία ή σηψαιμία. Είναι ευρέως διαδεδομένος στο περιβάλλον, διαθέτει την ικανότητά να επιβιώνει και να αναπτύσσεται σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες και παράγει πληθώρα τοξινών, κατατάσσοντάς τον μεταξύ των κύριων παθογόνων μικροοργανισμών που είναι ικανοί να προκαλούν τροφοτοξινώσεις, παγκοσμίως. Ιδιαίτερα σοβαρό πρόβλημα για τη Δημόσια Υγεία και την Κτηνιατρική πράξη αποτελούν τα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη του (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA), τα οποία αποικίζουν τόσο τους ανθρώπους, όσο και τα ζώα, με ενδεχόμενο πρόκλησης σοβαρών λοιμώξεων που αντιμετωπίζονται δύσκολα λόγω της αντιμικροβιακής αντοχής. Τις τελευταίες δεκαετίες, στελέχη του MRSA απομονώνονται όλο και πιο συχνά από τα παραγωγικά ζώα και τα τρόφιμα ζωικής προέλευσης. Υπό το παραπάνω πρίσμα, εγείρεται ανησυχία ως προς τη δυνατότητα μετάδοσης του παθογόνου από τα παραγωγικά ζώα και τα ζωικά τρόφιμα στους ανθρώπους, γεγονός που φαίνεται να σχετίζεται τόσο με την άμεση και στενή επαφή των ανθρώπων με τα ζώα, όσο και με το χειρισμό και την κατανάλωση τροφίμων ζωικής προέλευσης, επιμολυσμένων με τα στελέχη αυτά.Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της επιδημιολογίας του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου (MRSA) στα προς σφαγή ζώα και στα σφάγια αυτών, στους εργαζόμενους και στις επιφάνειες του περιβάλλοντος τριών σφαγείων, καθώς επίσης στο κρέας, τα νωπά κρεατοσκευάσματα, τους εργαζόμενους και το περιβάλλον δύο εγκαταστάσεων επεξεργασίας κρέατος της Βόρειας Ελλάδας. Η μελέτη περιλάμβανε δύο σκέλη. Το πρώτο σκέλος αφορούσε στην έρευνα στα σφαγεία και το δεύτερο στις μονάδες επεξεργασίας κρέατος.Τα δείγματα εξετάστηκαν για την παρουσία του S. aureus σύμφωνα με τη μέθοδο ISO 6888:1-1999 και τεχνικές της κλασσικής μικροβιολογίας (χρώση Gram, παραγωγή καταλάσης, ζύμωση μανιτόλης, ανίχνευση της συνδεδεμένης πηκτάσης και της πρωτεΐνης Α). Όλα τα απομονωθέντα στελέχη που πληρούσαν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του S. aureus υποβλήθηκαν σε μοριακές εξετάσεις για την ανίχνευση των γονιδίων nuc και coa για την επιβεβαίωση της ταυτότητάς τους. Η αντιμικροβιακή αντοχή των στελεχών S. aureus έναντι 14 αντιμικροβιακών παραγόντων ελέγχθηκε με τη μέθοδο διάχυσης δισκίων αντιβιοτικών σε άγαρ. Για την ταυτοποίηση των MRSA στελεχών πραγματοποιήθηκε μοριακός έλεγχος για την ανίχνευση της παρουσίας των γονιδίων mecA και mecC. Επιπλέον, όλα τα απομονωθέντα στελέχη του S. aureus και του MRSA εξετάσθηκαν για τη φορεία γονιδίων παραγωγής σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei και sej), της τοξίνης του συνδρόμου της τοξικής καταπληξίας (Toxic Shock Syndrome-1, TSST-1) και της λευκοκτονίνης Panton Valentine (PVL), καθώς και για την ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίων. Τέλος, εξετάστηκε η γενετική ποικιλομορφία και η φυλογενετική συγγένεια των απομονωθέντων στελεχών μέσω της τυποποίησής τους βάσει του γονιδίου της σταφυλοκοκκικής πρωτεΐνης Α (spa) και των ηλεκτροφορητικών προτύπων τους (pulsotypes), μετά την εφαρμογή ηλεκτροφόρησης σε παλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE). Για το πρώτο ερευνητικό σκέλος της διδακτορικής διατριβής, το οποίο διεξήχθη σε τρία σφαγεία της Β. Ελλάδας, εξετάστηκαν συνολικά 547 δείγματα, στα 55 (10,1%) εκ των οποίων ανιχνεύθηκε ο S. aureus. Η μεγαλύτερη συχνότητα απομόνωσης παρατηρήθηκε στα δείγματα που λήφθηκαν από τη ρινική κοιλότητα των εργαζομένων (17,2%), ακολουθούμενη από τα δείγματα που λήφθηκαν από τις επιφάνειες των εργαλείων σφαγής (16,1%), τα σφάγια των χοίρων (15,5%), τις ρινικές κοιλότητες μικρών μηρυκαστικών (15,0%), βοοειδών (7,5%) και χοίρων (6,9%), τις επιφάνειες των εγκαταστάσεων (6,8%), τα σφάγια βοοειδών (5,7%) και τέλος, τα σφάγια μικρών μηρυκαστικών (5,0%). Ο επιπολασμός του MRSA στις εγκαταστάσεις σφαγής ήταν 1,3%, αφού 7 από τα απομονωθέντα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως MRSA εμφανίζοντας ανθεκτικότητα έναντι της κεφοξιτίνης και φορεία του γονίδιου mecA, ενώ κανένα δεν έφερε το γονίδιο mecC. Δύο από τα παραπάνω στελέχη ανακτήθηκαν από τα σφάγια χοίρων κι ένα από τις ρινικές κοιλότητες χοίρου και τέσσερα από τις περιβαλλοντικές επιφάνειες των σφαγείων. Σε επίπεδο διαφορετικών εγκαταστάσεων, το ποσοστό απομόνωσης στελεχών του S. aureus ανήλθε σε 4,2%, 14,2% και 31,7%, ενώ του MRSA σε 1,2%, 2,0% και 0,0%, για το σφαγείο Β, το σφαγείο Κ και το σφαγείο Λ, αντίστοιχα.Ποσοστό 96,4% των απομονωθέντων στελεχών του S. aureus εμφάνισε ανθεκτικότητα έναντι τουλάχιστον μίας από τις 14 αντιμικροβιακές ουσίες που επιλέχθηκαν. Όλα τα MRSA στελέχη εμφάνισαν αντοχή έναντι της κεφοξιτίνης, ενώ διαπιστώθηκε ο πολυανθεκτικός τους χαρακτήρας με παρατηρούμενη αντοχή σε τέσσερις έως επτά κλάσεις αντιμικροβιακών ουσιών. Τα υψηλότερα ποσοστά αντοχής των στελεχών S. aureus και MRSA αντίστοιχα, παρατηρήθηκαν έναντι της πενικιλλίνης (89,1% & 100,0%), της αμπικιλλίνης (74,5% & 100,0%), της τετρακυκλίνης (40,0% & 100,0%), της κλινδαμυκίνης (29,1% & 100,0%), του συνδυασμού αμοξυκιλλίνης – κλαβουλανικού οξέος (25,5% & 100,0%), της ερυθρομυκίνης (23,6% & 71,4%) και της τομπραμυκίνης (23,6% & 14,3%), ενώ όλα τα στελέχη εμφάνισαν ευαισθησία έναντι του συνδυασμού τριμεθοπρίμης – σουλφαμεθοξαζόλης. Η παρουσία ενός τουλάχιστον γονιδίου παραγωγής σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών, μόνου του ή σε συνδυασμό με άλλα, βρέθηκε στο 60,0% και στο 50,0% των στελεχών του S. aureus και του MRSA, αντίστοιχα. Μεγαλύτερο ποσοστό φορείας διαπιστώθηκε για το γονίδιο sei (75,8%), ακολουθούμενο από τα γονίδια seg (42,4%), see (21,2%), sed (15,2%), seb (12,1%), sej (6,1%) και sec (3,0%). Τα γονίδια sea και seh δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα από τα απομονωθέντα στελέχη του S. aureus, ενώ τα στελέχη MRSA έφεραν τα γονίδια see (42,9%) και sei (42,9%), κατά μόνας ή σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα των μοριακών ελέγχων για την ανίχνευση των γονιδίων tsst και lukF-PV, απέβησαν αρνητικά για όλα τα στελέχη που εξετάστηκαν. Όλα τα απομονωθέντα στελέχη βρέθηκαν ικανά να παράγουν βιοϋμένια. Συγκεκριμένα, το 43,6% από αυτά διέθεταν ισχυρή ικανότητα παραγωγής βιοϋμενίων, το 54,5% μέτρια ικανότητα και μόνο ένα στέλεχος (1,8%) παρουσίασε μικρή ικανότητα παραγωγής βιοϋμενίων. Στο σύνολό τους, τα MRSA στελέχη διέθεταν μέτρια ικανότητα παραγωγής βιοϋμενίων.Η τυποποίηση βάσει του γονιδίου που κωδικοποιεί τη σύνθεση της πρωτεΐνης Α (spa typing) των επτά MRSA που απομονώθηκαν στην παρούσα διατριβή κατέταξε τέσσερα στελέχη στον τύπο t011 και τρία στον t034, οι οποίοι ανήκουν στο κλωνικό σύμπλεγμα ST398/ CC398, που περιλαμβάνει τα στελέχη LΑ-MRSA που απομονώνονται συχνότερα στην Ευρώπη. Από την άλλη μεριά, οι ευαίσθητοι στη μεθικιλλίνη S. aureus (MSSA) επέδειξαν ευρεία γενετική ποικιλομορφία, όντας κατανεμημένοι σε 19 τύπους spa. Στους πιο συχνά εμφανιζόμενους τύπους spa συγκαταλλέονταν, κατά φθίνουσα σειρά, οι t034, t7947, t337, ένας νέος, που ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά και οι t084, t2891, t012, t024, t4038, t005, t011, t120, t209, t306, t542, t564, t589, t620, t11205. Απ’ όσο γνωρίζουμε κάποιοι από τους παραπάνω τύπους ανιχνεύθηκαν για πρώτη φορά στην Ελλάδα, ενώ ένα στέλεχος δεν τυποποιήθηκε με βάση την παραπάνω μέθοδο.Η πλειοψηφία (41/55) των στελεχών S. aureus κατέστη εφικτό να τυποποιηθεί με τη μέθοδο PFGE, μετά από την επίδραση της ενδονουκλεάσης περιορισμού SmaI, αναδεικνύοντας μεγάλη γενετική ποικιλομορφία, που χαρακτηρίζονταν από 7 κύρια διακριτά συμπλέγματα, τα οποία περιλάμβαναν 30 διαφορετικά ηλεκτροφορητικά πρότυπα. Παρά ταύτα, η γονοτυπική ανάλυση με τη μέθοδο PFGE αποκάλυψε τη διασπορά όμοιων ή γενετικά πολύ συγγενικών στελεχών S. aureus, που απομονώθηκαν από το σύνολο των εξετασθέντων σφαγείων, στην ευρύτερη περιοχή της Βόρειας Ελλάδας, αλλά και σε ορισμένες περιπτώσεις και την ύπαρξη επιδημιολογικών κλώνων εντός των εγκαταστάσεων σφαγής ζώων, υποδηλώνοντας την πιθανότητα πρόκλησης διασταυρούμενων επιμολύνσεων. Τα MRSA στελέχη δεν κατέστη εφικτό να τυποποιηθούν με την παραπάνω μέθοδο, λόγω της προκληθείσας μεθυλίωσης στις θέσεις πρόσδεσης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης, γεγονός που αναφέρεται συχνά για τα MRSA στελέχη που ανήκουν στο κλωνικό σύμπλεγμα CC398.Κατά το δεύτερο σκέλος της έρευνα, συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν 160 δείγματα από δύο εγκαταστάσεις επεξεργασίας κρέατος της Β. Ελλάδας. Ο επιπολασμός του S. aureus και του MRSA ήταν 13,8% και 0,6%. Ο S. aureus ανιχνεύθηκε κατά φθίνουσα σειρά στο 25,0% των παρασκευασμάτων κρέατος, στο 25,0% των εργαζομένων, στο 10,1% των περιβαλλοντικών δειγμάτων και στο 8,1% των δειγμάτων από τεμάχια τυποποιημένου κρέατος (αποστεωμένου ή μη). Το μοναδικό στέλεχος MRSA που απομονώθηκε έφερε το γονίδιο mecA και εντοπίστηκε σε δείγμα που προήλθε από ένα παρασκεύασμα από σύγκοπτο κρέας και συγκεκριμένα από νωπό χοιρινό λουκάνικο.Τα υψηλότερα ποσοστά αντιμικροβιακής αντοχής των απομονωθέντων στελεχών S. aureus από εγκαταστάσεις επεξεργασίας κρέατος, παρατηρήθηκαν έναντι της πενικιλλίνης (68,2%) και της αμπικιλλίνης (68,2%), ακολουθούμενα από αυτά της τετρακυκλίνης (18,2%) και της τομπραμυκίνης (13,6%), με το 68,2% των στελεχών να εμφανίζει αντοχή έναντι τουλάχιστον μίας από τις 14 αντιμικροβιακές ουσίες που εξετάστηκαν. Το στέλεχος MRSA βρέθηκε πολυανθεκτικό, εκδηλώνοντας αντοχή έναντι έξι κλάσεων αντιμικροβιακών παραγόντων, ενώ ήταν το μοναδικό, που εμφάνισε αντοχή στην κεφοξιτίνη. Όλα τα στελέχη βρέθηκαν ευαίσθητα έναντι της γενταμυκίνης, της αμικασίνης, της ερυθρομυκίνης, της κλινδαμυκίνης, της σιπροφλοξασίνης και του φουσιδικού οξέος.Η πλειοψηφία (54,5%) των στελεχών S. aureus που απομονώθηκαν από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας κρέατος έφεραν από ένα έως τρία γονίδια παραγωγής εντεροτοξινών, ενώ στο μοναδικό MRSA στέλεχος δεν ανιχνεύτηκε κανένα γονίδιο παραγωγής τοξινών. Το γονίδιο με τη μεγαλύτερη συχνότητα ανίχνευσης ήταν το seb (40,9%), ακολουθούμενο από το sed (18,2%) και το sei (13,6%). Τα υπόλοιπα γονίδια παραγωγής εντεροτοξινών, όπως και το γονίδιο lukF-PV, δεν ανιχνεύτηκαν σε κανένα από τα απομονωθέντα στελέχη S. aureus. Δύο MSSA στελέχη, ένα από κάθε εγκατάσταση επεξεργασίας κρέατος, έφεραν το γονίδιο παραγωγής της TSST-1.Σημασία για τη δυνητική παθογένεια των απομονωθέντων στελεχών εμφάνισε η ικανότητά τους να παράγουν βιοϋμένια. Όλα τα στελέχη διέθεταν μέτρια ικανότητα παραγωγής βιοϋμενίων, εκτός από ένα που εμφάνισε ισχυρή.Η τυποποίηση με τη μέθοδο spa οδήγησε στην ανίχνευση δέκα διαφορετικών spa τύπων, αποκαλύπτοντας την ύπαρξη μέτριας γενετικής ποικιλομορφίας στον πληθυσμό των απομονωθέντων στελεχών από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας κρέατος. O τύπος t084, ένας νέος τύπος (NEW Z), που ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στην εγκατάσταση επεξεργασίας κρέατος Ζ και ο τύπος t091 εμφάνισαν τη μεγαλύτερη συχνότητα ανίχνευσης, κατά φθίνουσα σειρά ανίχνευσης. Όλοι οι υπόλοιποι τύποι spa (t012, t197, t499, t774, t891, t899, t1510) που ανιχνεύθηκαν αντιπροσωπεύονταν από ένα μόνο στέλεχος. Το μοναδικό MRSA στέλεχος που απομονώθηκε από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας κρέατος κατά την παρούσα μελέτη προέρχονταν από δείγμα νωπού παρασκευάσματος από χοιρινό σύγκοπτο κρέας και ανήκε στο spa τύπο t899. Απ’ όσο γνωρίζουμε κάποιοι από τους παραπάνω τύπους, συμπεριλαμβανομένου του MRSA t899, ανιχνεύθηκαν για πρώτη φορά στην Ελλάδα.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν μέτρια συχνότητα απομόνωσης του S. aureus και χαμηλή συχνότητα απομόνωσης του MRSA από την αλυσίδα παραγωγής κρεατος και προϊόντων κρέατος στην Ελλάδα. Παρά ταύτα, η ύπαρξη όμοιων ή πολύ συγγενικών επιδημιολογικών κλώνων μεταξύ απομακρυσμένων περιοχών, στο πλαίσιο της παρούσας έρευνας, αλλά και εντός των εγκαταστάσεων σφαγής υποδηλώνουν τη δυναμική μετάδοσης των στελεχών αυτών, καθιστώντας ορατό και τον κίνδυνο μετάδοσης αυτών στην κοινότητα. Η φορεία μάλιστα πληθώρας παραγόντων λοιμογονικότητας τόσο από τα στελέχη S. aureus, αλλά ιδιαίτερα από τα στελέχη MRSA, συνιστά πηγή προβληματισμού. Με γνώμονα τον περιορισμό, στο ελάχιστο δυνατό, του κινδύνου διασποράς του MRSA στην κοινότητα, φαίνεται ότι είναι επιτακτική τόσο η ανάγκη τήρησης των κανόνων Ορθής Υγιεινής και Βιομηχανικής Πρακτικής στον τομέα της παραγωγής κρέατος, ξεκινώντας ακόμη από τον επανασχεδιασμό των πρωτοκόλλων καθαρισμού και απολύμανσης στις εγκαταστάσεις παραγωγής, όσο και η λήψη επιπρόσθετων προληπτικών μέτρων, λαμβάνοντας υπόψη τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του παθογόνου. Η πολυανθεκτικότητα των στελεχών MRSA έναντι των αντιβιοτικών, αλλά και η δυνητική μετάδοση πολυανθεκτικών στελεχών μεταξύ των ζώων και των ανθρώπων, επιβεβαιώνει την αναγκαιότητα της εφαρμογής το δόγματος της Ενιαίας Υγείας (One Health Initiative), με έμφαση στην ύπαρξη ολοκληρωμένων προγραμμάτων συνεχούς παρακολούθησης του επιπολασμού και της αντιμικροβιακής αντοχής του MRSA, ώστε να είναι εφικτή η λήψη έκτακτων μέτρων, εφόσον κρίνεται αναγκαίο.