Modulation of important non-coding RNAs and proteins in cancer with role in transcription and translation initiation regulation
Authors: Κυριακόπουλος Γεώργιος 
Published: June 2024

Η εξέλιξη του καρκίνου περιλαμβάνει την απορρύθμιση πολλών ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων, πολλά από τα οποία συμμετέχουν άμεσα ή έμμεσα σε σηματοδοτικά γεγονότα που τελικά προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Δύο από τα πιο συχνά επηρεαζόμενα μονοπάτια σηματοδότησης είναι ο καταρράκτης MAPK και το μονοπάτι PI3K/AKT/mTOR. Και τα δύο επηρεάζουν περισσότερους από 200 μεταγενέστερους τελεστές και ρυθμίζουν σχεδόν κάθε διαδικασία του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής και της μετάφρασης. Η μεταγραφή των κωδικών RNAs από την RNA pol II και των μη κωδικών RNAs από τις τρεις RNA πολυμεράσες οδηγεί, μεταξύ άλλων, στην τροποποίηση της πρωτεϊνοσύνθεσης. Προκειμένου ένα κύτταρο να γίνει καρκινικό, ο επαναπρογραμματισμός της μετάφρασης είναι απαραίτητος και διευκολύνεται από πολύπλοκα ρυθμιστικά δίκτυα που ρυθμίζονται κυρίως από σηματοδοτικά μονοπάτια. Δύο από τα πιο κοινά ογκογονίδια που μεταλλάσσονται στον καρκίνο είναι τα KRAS και BRAF, τα οποία ρυθμίζουν τον καταρράκτη MAPK και το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/AKT/mTOR. Οι μεταλλάξεις KRAS είναι διαδεδομένες σε πολυάριθμους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, το οποίο αποτελεί έναν από τους συχνότερα διαγνωσμένους καρκίνους, ο οποίος συχνά συνδέεται με δυσμενή προγνωστικά αποτελέσματα και περιορισμένη αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών παρεμβάσεων. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο BRAF εμφανίζονται κυρίως στο μελάνωμα, αλλά είναι επίσης παρούσες σε διάφορους άλλους τύπους καρκίνου. Παρά τη διαθεσιμότητα στοχευουσών θεραπειών, τα κύτταρα του μελανώματος αναπτύσσουν ταχέως αντίσταση στους αναστολείς του BRAF. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορούν να επηρεάσουν τόσο τις διαδικασίες μεταγραφής όσο και τις διαδικασίες μετάφρασης, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για βαθύτερη κατανόηση της απορρύθμισής τους. Για την αποκρυπτογράφηση των επιδράσεων του KRASG12C στην έναρξη της μεταγραφής και της μετάφρασης στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, πραγματοποιήθηκε η δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών A549 και CL1-5 με επαγώγιμη έκφραση του KRASG12C μέσω TetON συστήματος με τη χρήση TALENs. Περαιτέρω εξέταση των δύο κυτταρικών σειρών αποκάλυψε ότι στα κύτταρα CL1-5, η εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση διαταράχθηκε μέσω της πιθανής εμπλοκής των μονοπατιών mTORC2 και NF-κΒ. Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα A549, η εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση προωθήθηκε μέσω της ενεργοποίησης του mTORC1, του c-MYC και της θετικής ρύθμισης του συμπλόκου eIF4F. Η μείωση των επιπέδων των eIF1, eIF5 και eIF5B στα κύτταρα A549 υποδεικνύει μειωμένη πιστότητα στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η χρώση με πουρομυκίνη και ο έλεγχος του προφίλ πολυσωμάτων επιβεβαίωσαν την αυξημένη μεταφραστική δραστηριότητα στα κύτταρα A549 σε σύγκριση με τη μειωμένη εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση στα κύτταρα CL1-5. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα CL1-5 ήταν σε θέση να ανακτήσουν τη μεταφραστική τους αποτελεσματικότητα μετά από παρατεταμένη ενεργοποίηση του KRASG12C, αλλά η ανάκτηση αυτή πραγματοποιήθηκε μέσω μιας οδού που δεν περιλάμβανε το mTORC1 ή την p70S6K. Τα προφίλ έκφρασης συγκεκριμένων tRNAs και tRFs έδειξαν επίσης διακυμάνσεις στους συνολικούς ρυθμούς πρωτεϊνοσύνθεσης. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι αρκετά μιτοχονδριακά tRFs διαμορφώθηκαν και συσχετίστηκαν με την απορρύθμιση των μιτοχονδριακών λειτουργιών. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, υποδεικνύεται μια αποκλίνουσα απόκριση μεταξύ δύο κυτταρικών σειρών αδενοκαρκινώματος πνεύμονα επιθηλιακής προέλευσης κατά την επαγωγή της ίδιας μετάλλαξης KRAS, η οποία επηρεάζει τη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, την παραγωγή tRFs και ενδεχομένως την ακεραιότητα των μιτοχονδρίων.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές μελανώματος A375 και SKMEL5 ανθεκτικές στη βεμουραφενίμπη (αναφέρονται ως κυτταρικές σειρές VR) και προσδιορίστηκαν οι τιμές IC50 τους. Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στη βεμουραφενίμπη είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική 10πλάσια αύξηση της IC50 των κυτταρικών σειρών A375VR και SKMEL5VR. Αυτές οι ανθεκτικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν συνεχή ενεργοποίηση της οδού MAPK, ακόμη και όταν εκτέθηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις βεμουραφενίμπης. Η κινάση mTOR και τα κατώτερα υποστρώματά της, S6K και 4EBPs, επηρεάστηκαν διαφορετικά στις δύο κυτταρικές σειρές VR, υποδεικνύοντας διαφορετικές επιδράσεις στη σηματοδότηση προς τη μετάφραση. Η αναλογία 60S/40S υποδήλωσε διαταραγμένη βιογένεση των ριβοσωμάτων, η οποία συσχετίστηκε με τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του μεταφραστικού παράγοντα eIF6, υποδηλώνοντας την πιθανή εμπλοκή του στην επίκτητη αντίσταση στη βεμουραφενίμπη. Για την περαιτέρω διερεύνηση αυτού, πέντε κυτταρικές σειρές μελανώματος (A375, SKMEL5, M1, M2 και M3) τροποποιήθηκαν ώστε να υπερεκφράζουν σταθερά τον eIF6. Τα κύτταρα αυτά αναλύθηκαν για αλλαγές στην κυτταρική βιωσιμότητα, τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού και τη μετανάστευση, δείχνοντας διαφορετικές επιδράσεις, που πιθανώς οφείλονται στο διαφορετικό γονιδιωματικό πλαίσιο κάθε κυτταρικής σειράς. Η ανταπόκριση των κυττάρων που υπερεκφράζουν τον eFI6 στη βεμουραφενίμπη επηρεάστηκε, με τα κύτταρα SKMEL5, M1 και M3 να γίνονται πιο ευαίσθητα στην αναστολή του BRAF, τα κύτταρα M2 πιο ανθεκτικά, ενώ η ανταπόκριση των κυττάρων A375 παρέμεινε ανεπηρέαστη. Υψηλότερες αναλογίες 60S/40S παρατηρήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις, ενώ βασικοί σηματοδοτικοί τελεστές επηρεάστηκαν με διαφορετικό τρόπο. Τα ανθεκτικά κύτταρα Μ2 που υπερεκφράζουν τον eIF6 συσχετίστηκαν με χαμηλότερα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK1/2 και υψηλότερα συνολικά επίπεδα mTOR, ενώ τα αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στα ευαίσθητα κύτταρα SKMEL5, Μ1 και Μ3 που υπερεκφράζουν τον eIF6. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσπάθησε να παράσχει μια ολοκληρωμένη εικόνα των γεγονότων απορρύθμισης της μετάφρασης που διέπονται από τις μεταλλάξεις KRAS και BRAF στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και το μελάνωμα, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το KRASG12C μπορεί είτε να προάγει είτε να εξασθενεί την εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Τέλος, η παρούσα διατριβή ενισχύει περαιτέρω τη σημασία της απορρύθμισης της μετάφρασης λόγω της επίκτητης αντοχής στη βεμουραφενίμπη στο μελάνωμα.