Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση της δραστικής ουσίας ποσακοναζόλης σε εναιωρήματα
Authors: Λυκούρας Μιχαήλ 
Published: November 2022

Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των πολυμόρφων των δραστικών ουσιών σε φαρμακοτεχνικές μορφές, όπως τα εναιωρήματα, είναι ιδιαίτερα επίπονες και απαιτητικές διαδικασίες εξαιτίας της υδατικής φύσης τους και της χαμηλής συγκέντρωσης των δραστικών ουσιών σε αυτά. Επίσης, ο χαρακτηρισμός του πολυμορφισμού δραστικών ουσιών είναι αδύνατος με τη χρήση χρωματογραφικών τεχνικών, οι οποίες θα μπορούσαν να εξασφαλίσουν πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης. Ένα ακόμα πρόβλημα, κατά την ταυτοποίηση του πολυμορφισμού των δραστικών ουσιών σε εναιωρήματα, αποτελεί η ταχύτατη μετατροπή των πολυμόρφων των δραστικών ουσιών που περιέχονται σε αυτές τις φαρμακοτεχνικές μορφές.Μία δραστική ουσία, η οποία χορηγείται συχνά στους ασθενείς υπό τη μορφή εναιωρήματος, είναι η ποσακοναζόλη. Η ποσακοναζόλη κυκλοφορεί υπό τη μορφή πόσιμου εναιωρήματος συγκέντρωσης 40 mg/mL, ως ενέσιμο διάλυμα για ενδοφλέβια χορήγηση σε συγκέντρωση 18 mg/mL και ως γαστροανθεκτικά δισκία παρατεταμένης αποδέσμευσης των 100 mg. Αποτελεί μέλος των αντιμυκητιασικών φαρμάκων της κατηγορίας των τριαζολών και ανήκει στη δεύτερη γενιά τους, διαθέτοντας το πιο ευρύ αντιμυκητιασικό φάσμα. Μέχρι σήμερα, έχουν καταγραφεί 14 διαφορετικές μορφές της ποσακοναζόλης: τα πολύμορφα I, II, III, IV, V, II-S, Y, A, S, N, οι επιδιαλυτωμένες μορφές της με ισοπροπανόλη, με μεθανόλη και με μίγμα διοξανίου με νερό και η άμορφη κατάστασή της. Από τις μορφές αυτές, το πολύμορφο I είναι το σταθερότερο και χρησιμοποιείται για την παρασκευή των εναιωρημάτων ποσακοναζόλης.Η απευθείας ανάλυση των εναιωρημάτων ποσακοναζόλης με Περιθλασιμετρία Ακτίνων-Χ Κόνεως (X-Ray Powder Diffraction, XRPD) και Φασματοσκοπία Raman οδήγησε σε περιθλασιογράμματα και φάσματα Raman, αντίστοιχα, χαμηλής ποιότητας, με αποτέλεσμα να είναι αδύνατος ο χαρακτηρισμός του πολυμορφισμού της δραστικής ουσίας. Για το λόγο αυτό, αναπτύχθηκε μέθοδος για την αύξηση του λόγου σήματος προς θόρυβο στις αναλύσεις με τις δύο τεχνικές. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, τα εναιωρήματα ποσακοναζόλης φυγοκεντρήθηκαν και απομονώθηκε το ίζημα, το οποίο στη συνέχεια, αναλύθηκε με XRPD και Φασματοσκοπία Raman, αφού πρώτα καλύφθηκε με μεμβράνη τροφίμων πολυαιθυλενίου χαμηλής πυκνότητας. Με τον τρόπο αυτό, η δραστική ουσία στα εναιωρήματα ποσακοναζόλης ανιχνεύθηκε υπό τη μορφή S.Η διερεύνηση της αιτίας της μετατροπής του αρχικού πολυμόρφου I της ποσακοναζόλης στο πολύμορφο S οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το νερό είναι υπεύθυνο για την πολυμορφική μετάπτωση. Επίσης, βρέθηκε ότι η απλή επαφή του πολυμόρφου I της ποσακοναζόλης με το νερό οδηγεί σε μετατροπή προς το πολύμορφο S μεγάλου ποσοστού της αρχικής μορφής. Η επίτευξη καλής διαβροχής με ομογενοποίηση της υδατικής διασποράς του πολυμόρφου I σε λουτρό υπερήχων για τουλάχιστον 10 λεπτά είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη μετατροπή στο πολύμορφο S. Μετά από διήθηση της υδατικής διασποράς, απομονώθηκε το καθαρό πολύμορφο S, το οποίο χαρακτηρίστηκε με XRPD, Φασματοσκοπία Raman, Φασματοσκοπία Εξασθενισμένης Ολικής Ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance, ATR), Οπτική Μικροσκοπία, Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και Θερμοσταθμική Ανάλυση (Thermogravimetric Analysis, TGA).Από τα περιθλασιογράμματα XRPD των καθαρών πολυμόρφων S και I της ποσακοναζόλης και εφαρμόζοντας τη μέθοδο της διχοτόμησης μέσω του λογισμικού PreDICT, βρέθηκε ότι και τα δύο πολύμορφα υιοθετούν το μονοκλινές κρυσταλλικό πλέγμα. Οι διαστάσεις της μοναδιαίας κυψελίδας για το πολύμορφο S προσδιορίστηκαν a = 12.3799 Å, b = 6.3053 Å και c = 23.1258 Å, η γωνία β = 93.140ο και ο όγκος της V = 1802.47 Å3, ενώ οι πλευρές της μοναδιαίας κυψελίδας του πολυμόρφου I είχαν διαστάσεις a = 12.5355 Å, b = 6.3481 Å και c = 22.7796 Å, γωνία β = 96.387ο και όγκο ίσο με V = 1801.48 Å3. Με την οπτική μικροσκοπία παρατηρήθηκε ότι το πολύμορφο S σχηματίζει ένα δίκτυο κρυστάλλων που συνδέονται χαλαρά μεταξύ τους, ενώ περιβάλλονται από μόρια νερού. Από την ανάλυση του πολυμόρφου S με τις θερμικές τεχνικές, βρέθηκε ότι αποτελεί ένυδρη μορφή, ενώ από την παρασκευή στοιχειομετρικών μιγμάτων του πολυμόρφου I με το νερό, προσδιορίστηκε ότι απαιτούνται τουλάχιστον 2 mol νερού ανά 1 mol πολυμόρφου I για τη μετατροπή προς το πολύμορφο S.Ακολούθησε ο ποσοτικός προσδιορισμός των πολυμόρφων S και I με XRPD. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάστηκαν πρότυπα εναιωρήματα ποσακοναζόλης από αραίωση αρχικού εναιωρήματος συγκέντρωσης 40 mg/mL με Placebo, τα οποία ακολούθως φυγοκεντρήθηκαν και απομονώθηκε το ίζημα. Για την κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης του πολυμόρφου S τα ιζήματα που απομονώθηκαν, καλύφθηκαν με τη μεμβράνη πολυαιθυλενίου χαμηλής πυκνότητας, ενώ για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης του πολυμόρφου I, τα ιζήματα ξηράνθηκαν για μία ημέρα, ώστε να ολοκληρωθεί πλήρως η μετατροπή στο αρχικό πολύμορφο I και ακολούθησε η ανάλυσή τους χωρίς τη χρήση μεμβράνης. Για την κατασκευή των καμπυλών βαθμονόμησης, πραγματοποιήθηκε ολοκλήρωση των χαρακτηριστικών κορυφών του πολυμόρφου S στις 10.2ο 2θ, του πολυμόρφου I στις 9.9ο 2θ και του εκδόχου διοξειδίου του τιτανίου (TiO2), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο, στις 25.3ο 2θ και υπολογίστηκαν οι λόγοι των εντάσεων των κορυφών κάθε πολυμόρφου προς την ένταση της κορυφής του TiO2, δηλαδή Ι10.2/Ι25.3 για το πολύμορφο S και I9.9/I25.3 για το πολύμορφο I. Με τη μέθοδο της οπτικής αξιολόγησης στα περιθλασιογράμματα XRPD, το όριο ανίχνευσης (Detection Limit, DL) του πολυμόρφου S βρέθηκε 2.0 mg/mL και το όριο ποσοτικοποίησης (Quantitation Limit, QL) 6.0 mg/mL, ενώ για το πολύμορφο I υπολογίστηκαν DL = 3.0 mg/mL και QL = 9.0 mg/mL. Σε εναιώρημα ποσακοναζόλης συγκέντρωσης 25 mg/mL, η συγκέντρωση του πολυμόρφου S προσδιορίστηκε ίση με (23.3 ± 1.7) mg/mL, ενώ του πολυμόρφου I βρέθηκε ίση με (21.6 ± 1.0) mg/mL. Σε εναιώρημα ποσακοναζόλης συγκέντρωσης 40 mg/mL, που αποτελούσε μίγμα των δύο πολυμόρφων, η συγκέντρωση του πολυμόρφου S υπολογίστηκε ίση με (22.1 ± 1.7) mg/mL και του πολυμόρφου I (19.6 ± 1.0) mg/mL. Διαπιστώθηκε, όμως, ότι οι μέθοδοι προσδιορισμού των δύο πολυμόρφων με XRPD υστερούν ως προς την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα και την ενδιάμεση πιστότητα λόγω του προτιμώμενου προσανατολισμού των κρυστάλλων των δύο πολυμόρφων της δραστικής ουσίας και του TiO2.Με τη Φασματοσκοπία Raman, το πρόβλημα του προτιμώμενου προσανατολισμού υπερνικήθηκε. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ειδική συσκευή για την περιστροφή του δείγματος. Ολοκληρώθηκαν οι κορυφές των πολυμόρφων S και I στους 738 cm-1 και 745 cm-1, αντίστοιχα, και του TiO2 στους 393 cm-1 και υπολογίστηκαν οι λόγοι των εντάσεων των κορυφών κάθε πολυμόρφου προς την ένταση της κορυφής του TiO2, δηλαδή I738/I393 για το πολύμορφο S και I745/I393 για το πολύμορφο I. Από τις καμπύλες βαθμονόμησης, τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης υπολογίστηκαν για το πολύμορφο S, DL = 1.9 mg/mL και QL = 5.9 mg/mL και για το πολύμορφο I, DL = 2.2 mg/mL και QL = 6.6 mg/mL. Οι συγκεντρώσεις των πολυμόρφων S και I, σε εναιώρημα ποσακοναζόλης 25 mg/mL, προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο αυτή ίσες με (24.1 ± 0.5) mg/mL και (25.6 ± 0.6) mg/mL, αντίστοιχα, ενώ οι συγκεντρώσεις τους στο εναιώρημα ποσακοναζόλης 40 mg/mL, που ήταν μίγμα των δύο πολυμόρφων υπολογίστηκαν ίσες με (25.4 ± 0.5) mg/mL και (14.7 ± 0.6) mg/mL, αντίστοιχα. Οι μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού των πολυμόρφων S και I με Φασματοσκοπία Raman επικυρώθηκαν και βρέθηκε ότι χαρακτηρίζονται από άριστη ακρίβεια, πιστότητα (επαναληψιμότητα και ενδιάμεση πιστότητα), ευαισθησία, ειδικότητα και ευρωστία.