Μελέτη του ρόλου μορίων της κυτταρικής επιφανείας του συμπλέγματος διαφοροποίησης (CD) στην ανάπτυξη του καρκίνου και ρόλος της κανονικής σηματοδοτικής πορείας του NF-κΒ στην ρύθμιση των μορίων CD
Authors: Ντέλλας Παναγιώτης 
Published: June 2024

Η καρκινογένεση είναι μια πολύ-σταδιακή διαδικασία η οποία σε κυτταρικό επίπεδο περιλαμβάνει τη συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων, οι οποίες σε συνδυασμό με επιγενετικές τροποποιήσεις οδηγούν σε καθοριστικές μεταβολές στην γονιδιακή έκφραση και τη κυτταρική φυσιολογία, με αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη διαίρεση του κυττάρου και την απόκτηση μηχανισμών αποφυγής της απόπτωσης. Η ανάπτυξη και η εξέλιξη του καρκίνου ωστόσο αποτελεί μία περισσότερο περίπλοκη διαδικασία στην οποία συμβάλουν κύτταρα και άλλοι παράγοντες που είναι παρόντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου, συμπεριλαμβανόμενου και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή. Στους μοριακούς μηχανισμούς που σχετίζονται με την καρκινογένεση εμπλέκονται και τα μόρια της κυτταρικής επιφάνειας του συμπλέγματος διαφοροποίησης που είναι γνωστά ως τετρασπανίνες. Οι τετρασπανίνες είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που διαπερνούν τη μεμβράνη του κυττάρου με 4 α-έλικες και ρυθμίζουν πολλαπλές βιολογικές διεργασίες μέσω της ικανότητας τους να συγκεντρώνουν και να οργανώνουν συγκεκριμένους υποδοχείς και πρωτεΐνες σηματοδότησης σε μικρο-περιοχές στην επιφάνεια του κυττάρου. Οι πρωτεΐνες αυτές συνδυάζονται μεταξύ τους, καθώς και με μία σειρά άλλων διαμεμβρανικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών για να σχηματίσουν τις μεμβρανικές μικροεπικράτειες (μικροπεριοχές μοριακών συμπλεγμάτων εμπλουτισμένων με τετρασπανίνες -Tetraspanin Enriched Microdomains - TEMs). Αυτά τα πρωτεϊνικά συμπλέγματα αναφέρονται τους στη βιβλιογραφία ως δίκτυα τετρασπανινών (tetraspanin webs). Εξ ορισμού, ένα βασικό χαρακτηριστικό των τετρασπανινών είναι να οργανώνουν συγκεκριμένους υποδοχείς και πρωτεΐνες σηματοδότησης σε μεμβρανικές μικροεπικράτειες (microdomains) στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι τετρασπανίνες έχουν λάβει ιδιαίτερης αναγνώρισης, καθώς ο ξεχωριστός μηχανισμός δράσης τους, τους επιτρέπει να έχουν πολλαπλές διαφορετικές λειτουργίες σε ένα κύτταρο ή/και μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών τύπων. Οι τετρασπανίνες εμπλέκονται σε θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η μετανάστευση των κυττάρων. Επιπλέον, εμπλέκονται στην ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και την στόχευση διάφορων κυττάρων-τελεστών του ανοσοποιητικού συστήματος. Μεταξύ των βιολογικών διεργασιών που εμπλέκονται οι τετρασπανίνες υπάρχουν στοιχεία ότι ενέχονται στην καρκινογένεση καθώς και στην ανοσολογική απάντηση στο μικροπεριβάλλον του όγκου (11,28,70), ωστόσο, λόγω των πλειοτροπικών τους λειτουργιών, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τη λειτουργία των τετρασπανινών και η συμβολή τους στην καρκινογένεση αλλά και στην ανοσολογική απάντηση δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Στην οικογένεια των τετρασπανινών συγκαταλέγονται τα μόρια επιφανείας CD81 και CD82. Η τετρασπανίνη CD82 θεωρείται ότι δρα κατασταλτικά στην εξέλιξη του καρκίνου ενώ η τετρασπανίνη CD81 έχει ενοχοποιηθεί ότι προάγει την ανάπτυξη του όγκου, ωστόσο, δεδομένου των πλειοτροπικών τους λειτουργιών, η συμβολή τους στον καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει άγνωστη. Με την παρούσα πρόταση στοχεύουμε να διερευνήσουμε τον ρόλο τετρασπανινών CD81 και CD82 στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά και στην ανοσολογική απάντηση στο μικροπεριβάλλον του όγκου.Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε, σε ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου, με τη χρήση ανοσοϊστοχημείας την έκφραση των τετρασπανινών CD81 και CD82 και των δεικτών PD1 και PDL1 σε καρκινικά κύτταρα και διηθούντα λεμφοκύτταρα, καθώς επίσης τη διήθηση του όγκου από CD3(+) και CD8(+) λεμφοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μονιμοποιημένοι ιστοί ασθενών σε μορφή TMAs. Τα ανοσοϊστοχημικά δεδομένα των ασθενών συσχετίστηκαν με τα κλινικο-εργαστηριακά τους χαρακτηριστικά. Εκτιμήσαμε επίσης την ολική επιβίωση και την επιβίωση ελεύθερης νόσου των ασθενών βάση των παθολογοανατομικών και κλινικο-εργαστηριακών τους χαρακτηριστικών. Σκοπός μας ήταν να αξιολογήσουμε το ρόλο καθενός από αυτά τα μόρια στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ενεργώντας είτε ως καταστολείς, είτε ως προαγωγείς της καρκινογένεσης, καθώς και να προσδιορίσουμε την προγνωστική ή/και προβλεπτική τους αξία. Επιπλέον, μελετήσαμε τον ρόλο της τετρασπανίνης CD81 στην εξέλιξη (ανάπτυξη, κινητικότητα καρκινικών κυττάρων και δυνατότητα σχηματισμού όγκων) του καρκίνου του παχέος εντέρου in vitro, διερευνήσαμε πιθανούς μηχανισμούς δράσης και εξετάσαμε εάν η κανονική σηματοδοτική πορεία του NF-κΒ εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης της CD81 στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου. Για το λόγο αυτό τροποποιήσαμε την έκφραση της CD81 στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου DLD1, HCT116, CACO2. Χρησιμοποιώντας ρετρο-ιικούς φορείς μπορέσαμε να μειώσουμε την έκφραση της CD81 στα κύτταρα DLD1, HCT116, CACO2 (με τη χρήση shRNA έναντιi της CD81), αλλά και να την αυξήσουμε στα κύτταρα HCT116, CACO2 (με τη χρήση ρετρο-ιικού φορέα που έφερε αντίγραφο του γονιδίου της CD81). Αποτελέσματα: •Παρατηρήσαμε χαμηλότερη έκφραση της τετρασπανίνης CD81 στα καρκινικά κύτταρα σε ασθενείς PS 0, έναντι PS 1 ή 2. •Παρατηρήσαμε χαμηλότερη έκφραση της τετρασπανίνης CD81 στα καρκινικά κύτταρα σε ασθενείς MMR-deficient έναντι MMR-proficient ασθενών.•Παρατηρήσαμε υψηλότερα ποσοστά διηθούντων CD81(+) λεμφοκυττάρων στους μη μεταστατικούς ασθενείς έναντι των μεταστατικών. •Παρατηρήσαμε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση της CD81 στα καρκινικά κύτταρα και τη διήθηση στο μικροπεριβάλλον του όγκου από CD3(+) και CD8(+) λεμφοκύτταρα •Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της τετρασπανίνης CD82 στους καρκινικούς ιστούς χάνεται στα υψηλότερα στάδια νόσου κατά TNM, με τους μεταστατικούς ασθενείς να παρουσιάζουν πολύ χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης της CD82 έναντι των μη-μεταστατικών ασθενών. •Παρατηρήσαμε ότι ασθενείς με R1 ή R2 εκτομή παρουσίαζαν ελαττωμένη έκφραση της CD82 στους καρκινικούς ιστούς συγκριτικά με τους ασθενείς που είχαν R0 εκτομή. •Παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση της CD82 στους καρκινικούς ιστούς σε ασθενείς με αυξημένες τιμές καρκινικών δεικτών CEA και CA 19-9. •Παρατηρήσαμε ότι ασθενείς στους οποίους ο πρωτοπαθής όγκος εντοπίζεται δεξιά εκφράζουν ελαττωμένη CD82 στα καρκινικά κύτταρα, έναντι της αριστερής εντόπισης. •Παρατηρήσαμε μειωμένα ποσοστά CD82(+) λεμφοκυττάρων σε μεταστατικούς ασθενείς, σε ασθενείς με κακή γενική κατάσταση (PS 1 ή 2) και σε ασθενείς με αυξημένες τιμές καρκινικών δεικτών CEA και Ca 19-9. •Παρατηρήσαμε υψηλότερα ποσοστά PD1(+) καρκινικών κυττάρων στους μη-μεταστατικούς ασθενείς έναντι των μεταστατικών. •Παρατηρήσαμε υψηλότερο ποσοστό PD1(+) καρκινικών κύτταρων και λεμφοκυττάρων, σε ασθενείς με χαμηλούς καρκινικούς δείκτες CEA και CA 19-9. •Παρατηρήσαμε συσχέτιση μεταξύ των δεικτών CD82, CD81 και του δείκτη PD1 στα καρκινικά κύτταρα. •Παρατηρήσαμε θετική συσχέτιση μεταξύ των PD1(+) λεμφοκυττάρων και των CD81(+), CD82(+), CD3(+), CD8(+) λεμφοκυττάρων. •Παρατηρήσαμε υψηλότερα ποσοστά διηθούντων CD3(+) και CD8(+) λεμφοκυττάρων στους μη μεταστατικούς ασθενείς έναντι των μεταστατικών ασθενών. •Το ποσοστό των διηθούντων CD3 ή και CD8 Τ-λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερο στους ασθενείς με καλή γενική κατάσταση (PS0 έναντι PS1&2). •Ασθενείς με υψηλές τιμές CEA & Ca 19-9 παρουσίαζαν χαμηλότερα ποσοστά διηθούντων CD8-λεμφοκυττάρων. •Τα ποσοστά διήθησης των CD8 λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερα στους MMR-deficient ασθενείς. •Παρατηρήσαμε ότι η διήθηση από CD81(+) Τ-λεμφοκύτταρα μειώνει τον κίνδυνο θανάτου (OS) ή υποτροπής (PFS).•Παρατηρήσαμε ότι η αυξημένη έκφραση της τετρασπανίνης CD82 στα καρκινικά κύτταρα όσο και το αυξημένο ποσοστό διηθούντων CD82(+) λεμφοκυττάρων σχετίζεται με καλύτερη ολική επιβίωση και επιβίωση ελεύθερης νόσου. •Παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς που παρουσίαζαν υψηλή έκφραση του PD1, είτε στα καρκινικά κύτταρα, είτε στα διηθούντα λεμφοκύτταρα παρουσίαζαν μικρότερο κίνδυνο θανάτου (OS) ή/και υποτροπής (PFS). •Η διήθηση από CD8(+) λεμφοκύτταρα αναδείχθηκε ως θετικός προγνωστικός παράγοντας, προσδίδοντας σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου μειωμένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου. •Επιβεβαιώσαμε την προγνωστική αξία των ήδη γνωστών κλινικο-παθολογοανατομικών παραμέτρων, όπως το στάδιο της νόσου, την πλήρης χειρουργική εκτομή και τις τιμές των καρκινικών δεικτών CEA και CA 19-9. •Διαπιστώσαμε in vitro ότι η τετρασπανίνη CD81 προάγει στον ρυθμό πολλαπλασιασμού ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου. •Διαπιστώσαμε in vitro ότι τετρασπανίνη CD81 αυξάνει την κινητικότητα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου.•Διαπιστώσαμε in vitro ότι τετρασπανίνη CD81 προάγει την σχηματισμό όγκων στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου DLD1. •Διαπιστώσαμε in vitro ότι τετρασπανίνη CD81 προάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου επηρεάζοντας θετικά την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα E2F1 και του CDC6. •Παρατηρήσαμε πιθανή αλληλεπίδραση της τετρασπανίνης CD81 με τα σηματοδοτικά μονοπάτια του NF-κΒ που όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.Συμπερασματικά, διαπιστώσαμε ότι η τετρασπανίνη CD82 έχει προστατευτικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, καθότι η έκφραση της στους καρκινικούς ιστούς συσχετίστηκε με ευνοϊκά κλινικο-παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών και αυξημένη επιβίωση. Παρομοίως, η έκφραση του PD1 αναγνωρίστηκε επίσης ως θετικός προγνωστικός παράγοντας. Παράλληλα, παρατηρήσαμε ότι η τετρασπανίνη CD81 πιθανώς λειτουργεί καταστέλλοντας την ανοσιακή απόκριση στο μικροπεριβάλλον του όγκου στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η τετρασπανίνη CD81 συμβάλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου in vitro, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, ενώ επίσης παρατηρήσαμε ότι ρυθμίζει θετικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.