Microbial synthesis of platform chemicals via crude glycerol valorization
Authors: Καραγιάννης Δημήτριος 
Published: October 2024

Η ανθρωπότητα βρίσκεται στα πρόθυρα της μετάβασης από την βασισμένη στα ορυκτά καύσιμα οικονομία σε αυτή της βιοοικονομίας. Η ανάπτυξη πετροχημικών υποκατάστατων στο πλαίσιο βιώσιμων βιοδιεργασιών έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον τόσο από την ακαδημία όσο και από τη βιομηχανία. Το βιολογικό πετρέλαιο (βιοντίζελ), το οποίο είναι ένα υποκατάστατο πετροχημικών καυσίμων, παρουσίαση ραγδαία ανάπτυξη τις 3 τελευταίες δεκαετίες. Η παραγωγή του βιοντίζελ συνεπάγεται την ταυτόχρονη παραγωγή γλεκερόλης (Γλυκ), ως το κύριο παραπροϊόν της διεργασίας, καθώς ~1 kg αυτής παράγεται για κάθε ~9 kg βιοντίζελ. Εκτιμάται ότι το ~65% της παγκόσμια παραγωγής γλυκερόλης προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ, με αποτέλεσμα την υπεραφθονία αυτής στην παγκόσμια αγορά. Η αξιοποίηση της γλυκερόλης μέσω μικροβιακών ή/και χημικών μετατροπών παρουσιάζει έντονο οικονομικό και περιβαλλοντικό ενδιαφέρον. Η χρήση της γλυκερόλης, προερχόμενης από το βιοντίζελ, ως υλικό εκκίνησης για μικροβιακές καλλιέργειες με σκοπό την παραγωγή υψηλής αξίας βιοχημικών μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα από τα σημαντικότερα θέματα στον τομέα της λευκής/βιομηχανικής βιοτεχνολογίας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει την πρωτότυπη μελέτη της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοχημικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας, μέσω της αξιοποίησης ακάθαρτης γλυκερόλης, η οποία προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ. Για τη διερεύνηση και την αριστοποίηση παραγωγής πολύτιμων μεταβολιτών, όπως η 2,3-βουτανοδιόλης (ΒΔΟ), η ακετοΐνη και η 1,3-προπανοδιόλη (ΠΔΟ), μελετήθηκε ένα εύρος βακτηριακών στελεχών, συνθηκών καλλιέργειας, στρατηγικών αερισμού και τροφοδοσίας, τύπων καλλιέργειας και μεθόδων ανάκτησης προϊόντος από το μέσο καλλιέργειας. Η παραγωγή ΒΔΟ από το βακτήριο Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 αρχικά αριστοποιήθηκε σε ημι-συνεχές εργαστηριακή κλίμακα, και στη συνέχεια αναπτύχθηκε σε συνεχές σύστημα και σε πιλοτική κλίμακα. Μετά το πέρας της καλλιέργειας, η παραχθείσα ΒΔΟ ανακτήθηκε από το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. Στο αρχικό στάδιο της μελέτης διερευνήθηκαν βακτήρια άγριου τύπου με μεταβολικούς μηχανισμού αφομοίωσης ακατέργαστης γλυκερόλης (καθαρότητας 75% w/w), η οποία προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ, προς παραγωγή εξωκυτταρικών βιοχημικών ενώσεων μείζονος ενδιαφέροντος. Η μελέτη 12 βακτηρίων υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (π.χ. pH, διαθεσιμότητα Ο2, καθαρότητα γλυκερίνης) οδήγησε στην εύρεση αρκετών μικροβιακών στελεχών με υψηλή ικανότητα ως προς την παραγωγή ΒΔΟ, ΠΔΟ, αιθανόλης, και ακετοΐνης. Υπό αερόβιες συνθήκες, το πρώτη φορά μελετηθέν στέλεχος K. oxytoca ACA-DC 1581 παρουσίασε υψηλή δυναμική παραγωγής ΒΔΟ. Ο συντελεστής της παραχθείσας ΒΔΟ ως προς την καταναλωθείσα γλυκερόλη (YΒΔΟ/Γλυκ) ήταν 0,46 g/g, ήτοι το 94% της μέγιστης θεωρητικής απόδοσης (Yμθ). Υπό αναερόβιες συνθήκες, το στέλεχος Citrobacter freundii NRRL-B 2645 παρήγαγε ΠΔΟ (YΠΔΟ/Γλυκ = 0,56 g/g, 93% του Ymt) σε περιβάλλον ρυθμιζόμενου pH, λόγω της παραγωγής γαλακτικού οξέος. Ο μικροοργανισμός Enterobacter ludwigii FMCC-204, ο οποίος δεν έχει μελετηθεί εκτενώς σε σχέση με την αφομοίωση της γλυκερόλης, παρήγαγε αιθανόλη με υψηλή εκλεκτικότητα και ο YΑΙΘΑΝ/Γλυκ ήταν 0.44 g/g, δηλαδή 88% του Yμθ. Οι αερόβιες καλλιέργειες του Bacillus subtilis ACA-DC 1176, υποδεικνύουν τη δυναμική του για παραγωγή ακετοΐνης και ΒΔΟ. Παράλληλα, για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ένα στέλεχος από το είδος Hafnia alvei (Hafnia alvei ACA-DC 1196) αναφέρεται για την ικανότητά του να παράξει ΒΔΟ. Η ημι-συνεχής καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα του K. oxytoca οδήγησε στην παραγωγή ΒΔΟ ίση με 70 g/L, με YΒΔΟ/ΓΛΥΚ 0,47 g/g και μέση τιμή παραγωγικότητας (PrBDO) 0,40 g/L/h, χωρίς να έχει πραγματοποιηθεί καμία τεχνική/μέθοδος βελτιστοποίησης. Ως εκ τούτου, η παρούσα βιοδιεργασία παρουσίασε ενδιαφέρον για βελτιστοποίηση της παραγωγικότητας και μείωση του κόστους. Η τελική συγκέντρωση ΒΔΟ που επιτυγχάνεται από αυτό το άγριο στέλεχος (K. oxytoca) είναι από τις υψηλότερες στη βιβλιογραφία.Κατά το δεύτερο και τέταρτο μέρος της μελέτης, διερευνήθηκε η παραγωγή και ανάκτηση της ΒΔΟ, μέσω της αξιοποίησης ακάθαρτης γλυκερόλης, προερχόμενης από την παραγωγή του βιοντίζελ, από τον μικροοργανισμό K. oxytoca ACA-DC 1581. Η παραγωγή της ΒΔΟ βελτιστοποιήθηκε ολιστικά όσον αφορά την παραγωγικότητα και το κόστος της βιοδιεργασίας. Αναπτύχθηκε ένα νέο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας για την αξιοποίηση πάρα-προϊόντων και εναλλακτικών πηγών αζώτου, συμπεριλαμβανομένων του παραπροϊόντος της υγρής άλεσης καλαμποκιού, του υγρού χωνεμένου παραπροϊόντος της παραγωγής βιοαερίου και άλλων ανόργανων ενώσεων αζώτου χαμηλού κόστους. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η σύσταση του θρεπτικού μέσου της προ-καλλιέργειας, η στρατηγική αερισμού (π.χ. αερισμός δύο σταδίων) και ρύθμισης του pH της καλλιέργειας. Κατόπιν της βελτιστοποίησης των παραπάνω, πραγματοποιήθηκαν τέσσερις νέες ημισυνεχείς καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα. Το παρόν στάδιο βελτιστοποίησης της βιοδιεργασίας υπέδειξε ότι η απουσία θερμικής επεξεργασίας του θρεπτικού μέσου δεν είχε αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού K. oxytoca και στη βιομετατροπή της ακατέργαστης γλυκερόλης σε ΒΔΟ. Επομένως, κρίνεται εφικτή η ανάπτυξη μιας μη ασηπτικής διεργασίας χαμηλότερου κόστους. Τόσο το υγρό χωνεμένο παραπροϊόν της παραγωγής βιοαερίου όσο και το παραπροϊόν της υγρής άλεσης καλαμποκιού, ήτοι τα κύρια παραπροϊόντα των βιομηχανιών καλαμποκιού και βιοαερίου αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία ως μοναδική πηγή αζώτου, επιτρέποντας έτσι την πλήρη αντικατάσταση ακριβότερων πηγών (π.χ. εκχύλισμα ζύμης). Το βιοχημικό μονοπάτι σχετιζόμενο με τον καταβολισμό της γλυκερόλης εξετάστηκε υπό ποικίλες συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου, με στόχο τη βελτιστοποίηση της παραγωγής ΒΔΟ σε πλήρως αερόβιο περιβάλλον (ογκομετρικός συντελεστής μεταφοράς μάζας- kLa =70,5 1/h.). Μετά τη βελτιστοποίηση και κατά τη διάρκεια των πρώτων 48 ωρών της πιο επιτυχημένης ημι-συνεχούς καλλιέργειας, η παραγωγικότητα της ΒΔΟ αυξήθηκε κατά 2,5 φορές (1,12 g/L/h) και ο ρυθμός κατανάλωσης γλυκερόλης έφθασε τα 2,80 g/L/h. Ο YΒΔΟ/Γλυκ ήταν 0,46 g/g, ενώ ο λόγος της ΒΔΟ προς το σύνολο των μεταβολικών προϊόντων ήταν 0,96 g/g, υποδεικνύοντας την υψηλή εκλεκτικότητα της βιοδιεργασίας προς την παραγωγή ΒΔΟ. Οι τιμές αυτές είναι από τις υψηλότερες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για στελέχη άγριου τύπου καλλιεργούμενα σε ακατέργαστη γλυκερόλη. Σε όλες τις ημι-συνεχείς καλλιέργειες, οι τελικές συγκεντρώσεις του αθροίσματος ΒΔΟ και ακετοΐνης έφτασαν τα ~80 g/L, ενώ παρατηρήθηκε ένα πλατώ περίπου στα 68 g/L BDO. Το επόμενο βήμα εστίασε στην αναβάθμιση της ήδη βελτιστοποιημένης βιοδιεργασίας, η οποία πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε αντιδραστήρα πιλοτικής κλίμακας (250-L) στο εργοστάσιο παραγωγής βιοτνίζελ της Verd S.A. στη Μαγνησία.Ταυτόχρονα, αναπτύχθηκε η διεργασία ανάκτησης της παραχθείσας ΒΔΟ από το μέσο της καλλιέργειας. Εφαρμόστηκε η μέθοδος “salting-out extraction”, στην οποία χρησιμοποιήθηκε αιθανόλη (24%) και K2HPO4 (25%) και η ανάκτηση της ΒΔΟ ήταν 91,7%. Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση του συντελεστή κατανομής της μη καταναλισκόμενης γλυκερόλης, δεδομένου ότι ήταν ισοκατανεμημένη στις δύο φάσεις, καθώς για πρώτη φορά μελετάται σε θρεπτικό μέσο με βάση τη γλυκερόλη. Η παρεμπόδιση εκ του προϊόντος που παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις ΒΔΟ ~65 g/L υποδηλώνει την ανάγκη ανάπτυξης ενός εναλλακτικού τύπου καλλιέργειας προκειμένου να αυξηθεί η απόδοση της βιοδιεργασίας. Ως αποτέλεσμα, αναπτύχθηκε μια συνεχής καλλιέργεια, στην οποία χρησιμοποιήθηκαν διάφοροι ρυθμοί αραίωσης και συγκεντρώσεις γλυκερόλης στο θρεπτικού μέσο τροφοδοσίας. Μεταξύ αυτών που δοκιμάστηκαν, ο ρυθμός αραίωσης 0,04 1/h επέδειξε τις υψηλότερες τιμές. Η παραγωγικότητα της ΒΔΟ έφθασε τα 2,17 g/L/h, ο ρυθμός κατανάλωσης γλυκερόλης ήταν 4,71 g/L/h και ο YΒΔΟ/Γλυκ ήταν 0,46 g/g, ενώ η συγκέντρωση της ΒΔΟ έφθασε τα 52,0 g/L. Πρόκειται για την πρώτη φορά που αναφέρεται η συνεχής παραγωγή ΒΔΟ από γλυκερόλη, επίσης οι τιμές που ελήφθησαν είναι οι υψηλότερες που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα για την παραγωγή ΒΔΟ από αφομοίωση γλυκερόλης. Η μικροσκοπική παρατήρηση του μικροοργανισμού κατά τη διάρκεια της συνεχούς καλλιέργειας αποκάλυψε μια αλλαγή στη μορφολογία του κυττάρου. Μετά από 80 ημέρες καλλιέργειας, τα ραβδόμορφα βακτήρια του K. oxytoca απέκτησαν νηματοειδ ήμορφή, το οποίο μπορεί να ερμηνευτεί ως μηχανισμός προσαρμογής στα υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης ΒΔΟ. Κατά το τελικό στάδιο της παρούσας μελέτης διερευνήθηκαν οι συνθήκες που ευνοούν την παραγωγή ακετοΐνης από το στελέχη του είδους Bacillus subtilis. Μεταξύ των δύο στελεχών αυτού του είδους που δοκιμάστηκαν, το B. subtilis ACA-DC 1176 επέδειξε το μεγαλύτερο δυναμικό παραγωγής ακετοΐνης. Διαπιστώθηκε ότι οι αναερόβιες καλλιέργειες αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων, με το ξηρό βάρος αυτών να είναι χαμηλότερο από 2 g/L. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ο σχηματισμός βιοϋμενίου ως απόκριση σε μη ευνοϊκές και στρεσογόνες συνθήκες, όπως η χαμηλή συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου. Ο αντίκτυπος της στρατηγικής αερισμού και τροφοδοσίας προς παραγωγή ακετοΐνης, έδειξε ότι μόνο μετά την εξάντληση της γλυκερόλης η ακετοΐνη και η ΒΔΟ μετατράπηκαν σε οξικό οξύ. Είναι πιθανό ότι ένα μέρος της ΒΔΟ μετατράπηκε αρχικά σε ακετοΐνη για την παραγωγή NADH. Στη συνέχεια, ελλείψει διαθέσιμης πηγής άνθρακα, η ΒΔΟ και η ακετοΐνη (σε ορισμένες περιπτώσεις) μετατράπηκαν σε οξικό οξύ, προφανώς για την παραγωγή ΑΤΡ, ικανοποιώντας τις ενεργειακές απαιτήσεις του κυττάρου. Η μέγιστη τιμής της συγκέντρωσης ακετοΐνης και του YAΚΕΤ/Γλυκ ήταν 25,5 g/L και 0,27 g/g, αντίστοιχα. Εξ όσων γνωρίζουμε, αυτή είναι μία από τις ελάχιστες μελέτες που διερευνούν την παραγωγή ακετοΐνης με χρήση ακατέργαστης γλυκερόλης, ως πηγή άνθρακα.Τα στελέχη και η μεθοδολογία που προτείνονται στην παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στην ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου που συμπληρώνει τη βιομηχανία βιοκαυσίμων και καλαμποκιού με υψηλής αξίας βιοχημικά μικροβιολογικής προέλευσης. Η μελέτη παρουσιάζει νέα ευρήματα σχετικά με τον μηχανισμό που επηρεάζει την παραγωγή της ΒΔΟ και της ΑΚΕΤ. Το μέρος που επικεντρώνεται στην παραγωγή της ΒΔΟ, υποδεικνύει τη δυνατότητα βιομηχανοποίησης της βιοδιεργασίας μέσω της βιώσιμης, συνεχούς και χαμηλού κόστους βιομετατροπής της ακατέργαστης γλυκερόλης που προέρχεται από βιοντίζελ με την ταυτόχρονη αξιοποίηση του παραπροϊόντος της υγρής άλεσης καλαμποκιού και του υγρού παραπροϊόντος του βιοαερίου προς ΒΔΟ. Οι τιμές της παραγωγικότητας και του YΒΔΟ/Γλκυκ είναι οι υψηλότερες στη βιβλιογραφία σχετικά με την ανάπτυξη βακτηριακών στελεχών άγριου τύπου σε ακατέργαστη γλυκερόλη.