Cortisol dynamics in European sea bass, Dicentrarchus labrax L
Authors: Σαμαράς Αθανάσιος 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη περιβαλλοντικών, διαχειριστικών και γενετικών παραγόντων που μπορούν να επηρεάσουν τη ρύθμιση και τη μεταβλητότητα της κορτιζόλης, καθώς επίσης και την απόκριση αυτής στην καταπόνηση σε ένα είδος της Μεσογειακής ιχθυοκαλλιέργειας, το λαβράκι, Dicentrarchus labrax.Για το σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της περιβαλλοντικής θερμοκρασίας νερού στα επίπεδα κορτιζόλης, τόσο πριν όσο και μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Ελέγχθηκαν τρεις περιβαλλοντικές θερμοκρασίες, συγκεκριμένα 15, 20, και 25°C, οι οποίες αντικατοπτρίζουν το εύρος θερμοκρασιών που συνήθως συναντάται στην Μεσογειακή ιχθυοκαλλιέργεια. Τα ψάρια εγκλιματίστηκαν σε αυτές τις θερμοκρασίες για δύο εβδομάδες πριν τη δειγματοληψία. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος και νερού για τον προσδιορισμό της κορτιζόλης τόσο πριν όσο και 0.5, 1, 2, 4 και 8 ώρες μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θερμοκρασία του νερού επιδρά στις συγκεντρώσεις κορτιζόλης, τόσο σε συνθήκες ηρεμίας όσο και μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Συγκεκριμένα, υψηλότερες συγκεντρώσεις κορτιζόλης σε συνθήκες ηρεμίας παρατηρήθηκαν στους 20°C και 25°C συγκριτικά με τους 15°C. Όσον αφορά στην απόκριση στην καταπόνηση, παρατηρήθηκε απόκριση με αύξηση των συγκεντρώσεων κορτιζόλης σε όλες τις θερμοκρασίες που ελέγχθηκαν. Παρ’ όλα αυτά, η ταχύτητα της απόκρισης, εκφρασμένη ως ο χρόνος που χρειάζεται για να επιτευχθούν τόσο οι μέγιστες συγκεντρώσεις όσο και η επαναφορά σε φυσιολογικά επίπεδα, ήταν μεγαλύτερη στις υψηλότερες θερμοκρασίες, ενώ αντίθετα η απόκριση στη χαμηλότερη θερμοκρασία ήταν πιο αργή και παρατεταμένη. Επιπλέον, η συνολική απόκριση, όπως αποτυπώθηκε από την Περιοχή Κάτω από την Καμπύλη (AUC), ήταν μεγαλύτερη στους 15°C. Ο ρυθμός απελευθέρωσης κορτιζόλης στο νερό επίσης επηρεάστηκε από τη θερμοκρασία και συγκεκριμένα ήταν πιο αργός και χαμηλότερης έντασης στη χαμηλή θερμοκρασία. Συμπερασματικά, οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στο πρότυπο της απόκρισης μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιών που ελέγχθηκαν θα μπορούσαν να έχουν προκύψει από διαφορές στους ρυθμούς σύνθεσης ή καταβολισμού της κορτιζόλης, αλλά και από διαφορές στους ρυθμούς απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό.Για τη διερεύνηση του κατά πόσο και με ποιο τρόπο οι διαχειριστικές πρακτικές που προξενούν καταπόνηση μπορούν να προκαλέσουν διαφορετικά αλλοστατικά φορτία στα ψάρια και πως αυτό εν συνεχεία μπορεί να επηρεάσει τη ρύθμιση της κορτιζόλης, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε ένα πρωτόκολλο επαναλαμβανόμενης προβλέψιμης καταπόνησης διαφορετικής έντασης. Συγκεκριμένα, χωρίστηκαν τέσσερεις ομάδες ψαριών, μία εκ των οποίων δεν υπέστη κανένα χειρισμό (ομάδα ελέγχου), ενώ οι άλλες τρεις εκτέθηκαν σε επαναλαμβανόμενη προβλέψιμη καταπόνηση διαφορετικής έντασης για τρεις εβδομάδες. Το πρωτόκολλο καταπόνησης που αναπτύχθηκε προσομοίαζε συχνές διαχειριστικές πρακτικές όπως κυνηγητό με την απόχη, περιορισμός του διαθέσιμου χώρου και έκθεση στον αέρα και κατηγοριοποιήθηκε ως χαμηλής, μέτριας και υψηλής έντασης. Συγκεκριμένα, η χαμηλής έντασης καταπόνηση περιελάμβανε τη μείωση του διαθέσιμου χώρου της δεξαμενής στο 50 % για 30 λεπτά κάθε δεύτερη μέρα, ενώ η μέτριας έντασης στον περιορισμό των ψαριών με τον ίδιο τρόπο, συνοδευόμενη επιπλέον από 5 λεπτά κυνηγητού με την απόχη. Τέλος, η υψηλής έντασης καταπόνηση αφορούσε στον περιορισμό των ψαριών στο 25 % της δεξαμενής για 30 λεπτά και κυνηγητό με την απόχη για 5 λεπτά κάθε δύο μέρες, ενώ επιπλέον γινόταν και έκθεση των ψαριών στον αέρα για 1 λεπτό, κάθε 7 μέρες. Μετά το πέρας της εφαρμογής του πρωτοκόλλου για το αλλοστατικό φορτίο συλλέχθηκε αίμα από 10 ψάρια από κάθε δεξαμενή χωρίς να τους γίνει οποιοσδήποτε άλλος χειρισμός (Τ0), ενώ στο υπόλοιπα 10 ψάρια έλαβε χώρα ένα επιπλέον συμβάν οξείας καταπόνησης, κυνηγώντας τα για 5 λεπτά με την απόχη και εκθέτοντάς τα στον αέρα για 1 λεπτό (Τ1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σωματικό βάρος μετά την έκθεση στο πρωτόκολλο καταπόνησης ήταν αντιστρόφως ανάλογο της ένταση του πρωτοκόλλου, οδηγώντας ακόμα και σε μείωση βάρους, σε σχέση με το αρχικό, στα ψάρια που εκτέθηκαν στην υψηλή καταπόνηση. Επιπλέον, τα ψάρια που εκτέθηκαν στο πρωτόκολλο υψηλής έντασης εμφάνισαν υψηλά επίπεδα κορτιζόλης στο πλάσμα και αδυναμία περαιτέρω απόκρισης μετά την έκθεση σε ένα επιπλέον συμβάν οξείας καταπόνησης. Σε μοριακό επίπεδο, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του υποδοχέα της αδρενοκορτικοτρόπου ορμόνης ACTH, mc2r, και του ενζύμου 11β-υδροξυλάση, που συμμετέχει στη βιοσύνθεση της κορτιζόλης, στο πρόσθιο τμήμα του νεφρού ψαριών που εκτέθηκαν σε καταπόνηση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, στην ομάδα υψηλής καταπόνησης παρατηρήθηκε απορρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ της έκφρασης των γλυκοκορτικοειδών (gr) και του αλατοκορτικοειδούς υποδοχέων στον υποθάλαμο του εγκεφάλου, καθώς επίσης και μειωμένη ηπατική έκφραση του ενζύμου 11β-υδροξυστεροειδής δεϋδρογονάση τύπου 2 (11β-hsd2), που δρα αδρανοποιώντας την κορτιζόλη, υποδεικνύοντας έτσι πιθανούς λόγους που οδήγησαν στα αυξημένα επίπεδα κορτιζόλης στα ψαριών αυτά. Είναι ευρέως γνωστό ότι το γενετικό υπόβαθρο μαζί με το περιβάλλον διαμορφώνουν το φαινότυπο ενός ατόμου. Για το σκοπό αυτό επιχειρήθηκε να εκτιμηθεί κατά πόσο το γενετικό υπόβαθρο μπορεί να επηρεάσει την παρατηρούμενη μεταβλητότητα στα επίπεδα κορτιζόλης του λαβρακιού, τόσο σε επίπεδο οικογενειών όσο και ατόμων. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση του ηπατικού μεταγραφικού προτύπου σε άτομα που δείχνουν σταθερά χαμηλή (LR) ή υψηλή (HR) απόκριση κορτιζόλης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι απόγονοι 6 οικογενειών λαβρακιού, οι οποίοι εκτίθονταν σε οξεία καταπόνηση μία φορά το μήνα και για τέσσερεις συνεχόμενους μήνες με σκοπό να εκτιμηθούν τα επίπεδα κορτιζόλης στο αίμα τους μετά την καταπόνηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απόκριση της κορτιζόλης επηρεάζεται σημαντικά από το γενετικό υπόβαθρο, όπως αποτυπώθηκε από τις διαφορές μεταξύ των οικογενειών, καθώς επίσης ότι η ατομική απόκριση είναι ένα χαρακτηριστικό με έντονη επαναληψιμότητα και σταθερότητα. Εν συνεχεία, άτομα χαμηλής (LR) και υψηλής (HR) απόκρισης αναγνωρίστηκαν, τα οποία διέφεραν, εκτός από τις συγκεντρώσεις μετά την καταπόνηση, τόσο στα επίπεδα ηρεμίας, δηλαδή απουσίας καταπόνησης, όσο και στα επίπεδα της ελεύθερης, μη δεσμευμένης σε πρωτεΐνες, κορτιζόλης. Οι διαφορές αυτές δεν μπορούσαν να αποδοθούν σε διαφορές στις συγκεντρώσεις της ACTH στο πλάσμα. Τέλος, παρατηρήθηκαν διαφορές στα πρότυπα της ηπατικής γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των LR και HR ατόμων οι οποίες υποδεικνύουν διαφορετική ηπατική ρύθμιση μεταξύ των δύο αυτών φαινοτύπων. Οι μεταγραφικές διαφορές σχετίζονταν με διάφορες μεταβολικές και ανοσολογικές διεργασίες, με 169 μετάγραφα να εκφράζονται μόνο στο LR και 161 μόνο στα HR άτομα.Οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη διαφορετική απόκριση της κορτιζόλης στην καταπόνηση μεταξύ LR και HR ατόμων δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Στο πλαίσιο αυτό, επιχειρήθηκε να μελετηθεί ο μηχανισμός ρύθμισης των αποκλινόντων αποκρίσεων κορτιζόλης μεταξύ LR και HR ατόμων στο επίπεδο του πρόσθιου τμήματος του νεφρού. Για το λόγο αυτό, αρχικά εκτιμήθηκαν οι συγκεντρώσεις κορτιζόλης και ACTH σε συνθήκες ηρεμίας σε LR και HR άτομα, 1.5 χρόνο μετά τον χαρακτηρισμό τους ώστε να φανεί αν αυτό το χαρακτηριστικό διατηρείται στο χρόνο. Εν συνεχεία, δείγματα από το πρόσθιο τμήμα του νεφρού αυτών των ατόμων διεγέρθηκαν με ACTH σε ένα σύστημα in vitro επώασης και έγχυσης (superfusion) ώστε να ποσοτικοποιηθεί η βιοσυνθετική τους ικανότητα για παραγωγή κορτιζόλης. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στη ρύθμιση της σύνθεσης κορτιζόλης από το πρόσθιο τμήμα του νεφρού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα LR και HR άτομα διέφεραν στις συγκεντρώσεις κορτιζόλης ηρεμίας ακόμα και 1.5 μετά τον χαρακτηρισμό τους, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα της ACTH στο πλάσμα. Επιπλέον, η βιοσυνθετική ικανότητα των HR ήταν υψηλότερη από αυτή των LR ατόμων κατά την in vitro διέγερσή τους με την ίδια συγκέντρωση ACTH. Στο μοριακό επίπεδο, οι διαφορές στην κορτιζόλη ηρεμίας μεταξύ LR και HR ατόμων θα μπορούσαν να αποδοθούν στην υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα της ACTH, mc2r, και την 2,3-φορές υψηλότερη, αν και όχι στατιστικά σημαντική, έκφραση της 11β-υδροξυλάσης που συμμετέχει στη βιοσύνθεση της κορτιζόλης στα HR άτομα. Τέλος, παρατηρήθηκε μία σημαντική υπό-έκφραση της 11β-υδροξυστεροειδούς δεΰδρογονάσης στα LR άτομα, υποδεικνύοντας έτσι για πρώτη φορά ότι τα επίπεδα της κορτιζόλης μπορεί να ρυθμίζονται στο πρόσθιο τμήμα του νεφρού ακόμα και αμέσως μετά την παραγωγή της ορμόνης εξηγώντας έτσι μέρος της διαφοράς στα επίπεδα της ορμόνης μεταξύ των αποκλινόντων αυτών φαινοτύπων.