Evaluation of novel methodologies for the analysis of colistimethate sodium against Gram-negative bacteria
Authors: Δάγλα Ιωάννα-Βαλεντίνη 
Published: December 2021

Η κολιστίνη (πολυμυξίνη Ε) είναι ένα αντιβιοτικό που αποτελείται κυρίως από τις μορφές Α και Β και παράγεται από το βακτήριο Bacillus polymyxa var. colistinus. Απομονώθηκε για πρώτη από το βακτήριο το 1949 και αργότερα χορηγήθηκε ως μεθανοσουλφονική κολιστίνη (colistimethate sodium - CMS) για την αντιμετώπιση των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η χρήση της, όμως, περιορίστηκε τη δεκαετία του ’80 λόγω της νευροτοξικότητας και της νεφροτοξικότητας που προκαλούσε. Λόγω της εμφάνισης πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηριών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η κολιστίνη άρχισε να χρησιμοποιείται ξανά ως αντιβιοτικό τελευταίας εκλογής, όταν όλες οι θεραπείες με άλλα αντιβιοτικά έχουν αποτύχει, καθώς αντιμετωπίζει αποτελεσματικά τις λοιμώξεις που οφείλονται σε αυτά τα βακτήρια. Η κολιστίνη χορηγείται παρεντερικά ως CMS που αποτελεί το ανενεργό και λιγότερο τοξικό προφάρμακο της κολιστίνης, το οποίο υδρολύεται στον οργανισμό (in vivo) δίνοντας την ενεργή μορφή (κολιστίνη). Η CMS παράγεται κατόπιν σουλφομεθυλίωσης των ελεύθερων αμινομάδων που υπάρχουν στο μόριο της κολιστίνης. Ωστόσο, η δομή της παραμένει μέχρι σήμερα ασαφής, καθώς δεν έχει εξακριβωθεί ο βαθμός της σουλφομεθυλίωσης των αμινομάδων. Είναι όμως γενικά αποδεκτό πως η CMS αποτελεί ένα πολύπλοκο μίγμα πολλών μορίων με διαφορετικό βαθμό υποκατάστασης. Η κολιστίνη αν και έχει ανακαλυφθεί εδώ και αρκετά χρόνια, δεν έχει υποβληθεί στις διαδικασίες ανάπτυξης φαρμάκων και έγκρισης που εφαρμόζονται σήμερα. Μέχρι σήμερα, οι έλεγχοι ποιότητας που εφαρμόζονται στα σκευάσματα της CMS βασίζονται σε μικροβιολογικές δοκιμασίες.Έχει παρατηρηθεί όμως πως, αν και τα φαρμακευτικά σκευάσματα της CMS ελέγχονται με μικροβιολογικές δοκιμασίες (in vitro), οδηγούν σε διαφορετικά επίπεδα ενεργής κολιστίνης στον οργανισμό (in vivo), τονίζοντας την ανάγκη για ανάπτυξη άλλων μεθόδων ποιοτικού ελέγχου των σκευασμάτων της CMS, ώστε να ελέγχεται με μεγαλύτερη ακρίβεια η σύσταση των φαρμακευτικών σκευασμάτων και κατ’ επέκταση η βιοδιαθεσιμότητά τους. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου που είναι βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης (ultra-high performance liquid chromatography – UPLC) συζευγμένη με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (high resolution mass spectrometry – HRMS), για την μέτρηση της CMS σε σκευάσματα. Η μέθοδος αυτή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου των φαρμακευτικών σκευασμάτων της CMS. Αρχικά, λόγω της πολυπλοκότητας της CMS, κρίθηκε αναγκαίος ο πειραματικός σχεδιασμός για την βελτιστοποίηση των παραμέτρων τόσο της υγροχρωματογραφίας όσο και της φασματομετρίας μάζας. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει δύο στάδια στοχεύοντας τον διαχωρισμό των συστατικών της CMS. Τελικά, το χρωματογράφημα που προέκυψε αποκάλυψε 20 συστατικά. Ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από A) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,005 Μ, pH=6) και Β) μίγμα μεθανόλης και ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Πειραματικός σχεδιασμός πραγματοποιήθηκε και για τις παραμέτρους της φασματομετρίας μάζας, ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη ευαισθησία. Για την ανάλυση, επιλέχθηκαν τα μονοφορτισμένα ιόντα των μορίων της CMS που προέκυψαν κατόπιν θετικού ιονισμού. Οι καμπύλες αναφοράς είχαν εύρος 50-110 μg/mL, που αντιστοιχεί στο 80-120% της ονομαστικής ποσότητας της CMS στα εμπορικά σκευάσματα. Λόγω της πολυπλοκότητας των χρωματογραφημάτων της CMS, αλλά και του φάσματος κάθε χρωματογραφικής κορυφής, εφαρμόστηκαν τεχνικές στοχευμένης (targeted) και μη στοχευμένης (untargeted) ανάλυσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό MZmine. Εκτός από την κλασική μονοπαραμετρική στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε ακόμα το μοντέλο της παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (partial least squares regression – PLSR), καθώς οι μεταβλητές ήταν περισσότερες από τις παρατηρήσεις. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS και βρέθηκαν διαφορές στη σύστασή τους. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μεθοδολογία βασισμένη στην υγρoχρωματογραφία συζευγμένη με ανιχνευτή υπεριώδους (ultraviolet – UV) για την μέτρηση της CMS σε ενέσιμα σκευάσματα. Στην μεθοδολογία αυτή χρησιμοποιήθηκαν λογισμικά τα οποία είναι διαθέσιμα δωρεάν προκειμένου με ευκολία θα υιοθετηθεί από τις φαρμακευτικές εταιρείες αλλά και από την ερευνητική κοινότητα γενικότερα, ως μέθοδος ποιοτικού ελέγχου. Για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της χρωματογραφίας χρησιμοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των συστατικών της CMS επιτεύχθηκε με τη στήλη Waters Acquity BEH C8 και βαθμιδωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α) υδατικό διάλυμα φορμικού αμμωνίου (0,001 Μ) και Β) μίγμα μεθανόλης/ακετονιτριλίου (79/21 v/v). Τα μόρια της CMS ανιχνεύθηκαν στο μήκος κύματος 214 nm. Κατασκευάστηκαν 23 μονοπαραμετρικά μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης για την μέτρηση του κάθε συστατικού της CMS χωριστά και ένα μοντέλο PLSR για την εκτίμηση της συνολικής ποσότητας της CMS στα ενέσιμα σκευάσματα. Η μέθοδος επικυρώθηκε για το εύρος συγκεντρώσεων 110-220 μg/mL. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση παρτίδων της CMS. Οι παρτίδες συγκρίθηκαν ως προς μια παρτίδα αναφοράς με επιπλέον στατιστικές αναλύσεις, όπως ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis – PCA), μέτρα ομοιότητας, χάρτες θερμότητας (heatmaps) και τον δείκτη δομικής ομοιότητας (structural similarity index).Η μέτρηση των επιπέδων της CMS στα βιολογικά υλικά των ασθενών είναι πολύ σημαντική προκειμένου να βρεθεί το κατάλληλο δοσολογικό σχήμα που θα περιορίζει την τοξικότητά της. Μέχρι σήμερα, η μέτρηση της CMS γίνεται με έμμεσο τρόπο, δηλαδή μετά από την όξινη υδρόλυσή της σε κολιστίνη. Στην παρούσα διατριβή, σκοπός είναι να βρεθούν οι συνθήκες που οδηγούν σε πλήρη υδρόλυση της CMS. Η αντίδραση μελετήθηκε σε επιταχυνόμενες συνθήκες: 40°C, 50°C και 60°C και τα αποτελέσματα εκτιμήθηκαν με τη χρήση της εξίσωσης του Arrhenius και το λογισμικό Tenua. Για τη μέτρηση της CMS και της κολιστίνης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος βασισμένη στην υγροχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματόμετρο μάζας με υβριδικό αναλυτή τετραπόλου – χρόνου πτήσης ιόντων (hybrid quadrupole time-of-flight – QqTOF). Με την παρούσα μεθοδολογία επιτεύχθηκε πλήρης υδρόλυση της CMS, σε αντίθεση με τις μεθοδολογίες που αναφέρονται στην βιβλιογραφία που, όπως αποδείχθηκε, οδηγούσαν σε μερική υδρόλυση. Αν και η χορήγηση της CMS αυξάνεται ραγδαία, η δομή της παραμένει ασαφής. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγιναν προσπάθειες αποσαφήνισης της δομής της CMS με τη χρήση της φασμοτομετρίας μάζας. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις αναλυτές μάζας: 1) QqTOF, 2) LTQ Orbitrap Discovery XL, 3) Q-Exactive Orbitrap and 4) Omnitrap. Η έγχυση (infusion) της CMS στον αναλυτή μάζας πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας διαφορετικές συνθήκες ως προς τον διαλύτη αραίωσης, το pH και τη θερμοκρασία αποδιαλύτωσης. Στους αναλυτές μάζας QqTOF και Omnitrap πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα θραυσματοποίησης (MS/MS) και για την ερμηνεία τους χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Cyclobranch. Τελικά, βρέθηκαν οι δομές τριών συστατικών της CMS.