Λειτουργικός χαρακτηρισμός γονιδίων τα οποία ρυθμίζονται από τον VEGF (Vascula Endothelial Growth Factor)
Authors: Καραλή Ευδοξία 
Published: August 2021

O VEGF είναι ο κύριος ρυθμιστής της δημιουργίας φυσιολογικών αγγείων, αλλά επίσης εμπλέκεται στην παθογένεση των αγγειογενετικών νόσων, όπως ο καρκίνος. Έτσι, η διερεύνηση της μεταγωγής του σήματος του αναμένεται να εντοπίσει νέους μοριακούς στόχους για την ανάπτυξη αντι-αγγειογενετικών θεραπειών. Η παρούσα διατριβή βασίστηκε στην παρατήρηση, με μικροσυστοιχίες cDNA, ότι ο VEGF ενεργοποιεί μεταγραφικά τα γονίδια HERPUD1 και DNAJB9, τα οποία συμμετέχουν στην απόκριση του ΕΔ στην παρουσία μη αναδιπλωμένων πρωτεϊνών στον αυλό του (Unfolded protein Response, UPR). Η υπερέκφραση των δύο αυτών γονιδίων από τον VEGF ήταν ειδική και δεν παρατηρήθηκε μετά από χορήγηση FGF2, ενός άλλου ισχυρού αγγειογενετικού παράγοντα. Παραπέρα μελέτη αποκάλυψε ότι ο VEGF δεν επάγει μόνο τα γονίδια HERPUD1 και DNAJB9, αλλά επίσης την πλειοψηφία των γονιδίων που ρυθμίζονται και από τους τρεις βραχίονες της UPR (IRE1, ATF6 και PERK). Η γενικευμένη αυτή ενεργοποίηση των γονιδίων της UPR δεν προκλήθηκε από αυξημένα φορτία πρωτεϊνών στον αυλό του ΕΔ εξαιτίας της ενεργοποίησης του εκκριτικού μονοπατιού από τον VEGF. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στα εξής δεδομένα. Πρώτον, παρά την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης με κυκλοεξιμίδιο, η προσθήκη VEGF συνέχισε να επάγει μεταγραφικά, αν και σε μικρότερο βαθμό, τα γονίδια HERPUD1 και DNAJB. Δεύτερον, η ενεργοποίηση και των τριών μονοπατιών της UPR (IRE1, ATF6 και PERK) από τον VEGF ήταν ταχύτατη (εντός 15-30 λεπτών) και εξασθένησε γρήγορα. Αντίθετα, η προσθήκη του αναστολέα της N-γλυκοσυλίωσης Tunicamycin (Tm), η οποία υπερφορτώνει το ΕΔ με πρωτεΐνες λανθασμένης διαμόρφωσης, προκάλεσε την ενεργοποίηση των τριών μονοπατιών της UPR σε αργότερο χρονικό διάστημα (μερικές ώρες) και για μακρό χρονικό διάστημα. Τέλος, με τη χρήση ειδικών αναστολέων κινασών και αποσιώπηση γονιδίων με siRNA, δείξαμε πως o VEGF επάγει την UPR διαμέσου του μονοπατιού της PLCγ. Αν και ο μηχανισμός ενεργοποίησης των βραχιόνων της UPR από το μονοπάτι της PLCγ παραμένει άγνωστος, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι δεν εξαρτάται από τη διακύμανση της συγκέντρωσης του ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα και το ΕΔ.Η ενεργοποίηση των τριών βραχιόνων της UPR φαίνεται να παίζει κρίσιμο ρόλο στην επαγωγή της επιβίωσης που προκαλεί ο VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, η αποσιώπηση των ATF6 και eIF2a γονιδίων μείωσε κατά 50% την επαγωγή της επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων από τον VEGF. Ουσιαστικά, η ενεργοποίηση αμφοτέρων των μονοπατιών που διαμεσολαβούνται από το ΕΔ είναι κομβικής σημασίας για την αντι-αποπτωτική δράση του VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Πράγματι, η φωσφορυλίωση της Akt από το μονοπάτι της PI3K εξαρτάται από την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των PLCγ-ER-ATF6/PERK και PLCγ-IP3-ER-Ca2+-calmodulin-CaMKII μονοπατιών. Παράλληλα, η χορήγηση VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα οδηγεί σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης CHOP, παρά το γεγονός ότι γονίδιο της CHOP ενεργοποιείται μεταγραφικά, κυρίως από το μονοπάτι PERK/ATF4. Η παρατήρηση αυτή είναι συμβατή με προηγούμενη μελέτη όπου το mRNA και η πρωτεΐνη της CHOP είναι ασταθή και αποικοδομούνται ταχύτατα κατά τη διάρκεια ήπιας UPR. Φαίνεται, λοιπόν, ότι η ενσωμάτωση των μονοπατιών του ΕΔ στους μηχανισμούς μεταγωγής του σήματος του VEGF μεγιστοποιεί την αντι-αποπτωτική δράση του στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η παρούσα μελέτη προσθέτει νέα γνώση όσον αφορά τη μεταγωγή του σήματος από τον VEGF και φωτίζει άγνωστες πτυχές του ρόλου του ΕΔ στην ομοιοστασία του κυττάρου. Τα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο VEGF, διαμέσου της PLCγ, ενεργοποιεί διαδικασίες του ΕΔ, όπως η UPR, οι οποίες εντάσσονται στο μηχανισμό της μεταγωγής σήματος του VEGF συμμετέχοντας στις δράσεις του τελευταίου στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Έτσι, ονομάσαμε την ενεργοποίηση των IRE1, ATF6 και PERK του ΕΔ (και της επακόλουθης μεταγραφικής επαγωγής) από τα μονοπάτια σηματοδότησης εξωκυτταρικών προσδεμάτων ως «Extracellular Signaling Response (ESR)», για να τη διαφοροποιήσουμε από την ενεργοποίηση διαμέσου υπερφόρτωσης του ΕΔ με μη αναδιπλωμένες πρωτεΐνες (Unfolded Protein Response, UPR).