Αντι-ιικά Τ-λεμφοκύτταρα με ανθεκτικότητα στα γλυκοκορτικοειδή μέσω CRISPR/Cas9 γονιδιακής επεξεργασίας, για τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων μετά από αλλογενή μεταμόσχευση
Authors: Αλβανού Μαρία 
Published: October 2023

Οι ευκαιριακές λοιμώξεις ασθενών μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρωνεπηρεάζουν δυσμενώς την έκβαση των μεταμοσχεύσεων. Η συμβατική φαρμακοθεραπεία συχνά αποτυγχάνει, ενώ συνοδεύεται από τοξικότητα, σημαντικό κόστος και ανάπτυξη αντοχής. Εναλλακτικά, η υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία (ΥΑ) με αντι-ιικά Τ‐λεμφοκύτταρα (virus-specific Tcells- VSTs) προτείνεται ως αποτελεσματική θεραπεία των λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Μολονότι υπάρχουν απλοποιημένα πρωτόκολλα ΥΑ με ταυτόχρονη στόχευση πολλών ιών, η αναστολή της δράσης των VSTs παρουσία υψηλών δόσεων γλυκοκορτικοειδών παραμένει ένας σημαντικός περιορισμός. Η σημασία του συγκεκριμένου περιορισμού είναι προφανής, καθώς οι ασθενείς με νόσο μοσχεύματος κατά ξενιστή (GvHD) που λαμβάνουν υψηλές δόσεις γλυκοκορτικοειδών είναι και οι περισσότερο ευπαθείς σε σοβαρές ευκαιριακές λοιμώξεις.Αρχικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης της δεξαμεθαζόνης (Dex) στα πρωτογενή, ενεργοποιημένα ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα. Ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και ο ανοσοφαινότυπος των ανθρώπινων Τ κυττάρων αξιολογήθηκαν μετά από διέγερση με CD3/CD80 και καλλιέργεια παρουσία ή απουσία Dex. Η τριήμερη έκθεση στη Dex μείωσε τον πολλαπλασιασμό των πρωτογενών Τ κυττάρων και τα οδήγησε σε πρώιμη απόπτωση συγκριτικά με αυτά που καλλιεργήθηκαν απουσία Dex. Ανοσοφαινοτυπικά, η Dex αύξησε τα Τ-ρυθμιστικά κύτταρα (CD4+/CD25 high) και οδήγησε σε υψηλά επίπεδα τους δείκτες εξουθένωσης των Τκυττάρων PD-1 και CTLA-4.Επόμενος στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός συστήματος CRISPR/Cas9 για τη γενετική αδρανοποίηση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR) στα λεμφοκύτταρα, στοχεύοντας τελικά στη δημιουργία αντιγονο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων (pathogen-specific T-cells, pSTs) ανθεκτικών στα στεροειδή. Για να απενεργοποιήσουμε το γονίδιο GR, σχεδιάσαμε 8 RNA-οδηγούς (sgRNA) που στοχεύουν διαφορετικές γονιδιωματικές αλληλουχίες του (θέση έναρξης μεταγραφής και εξόνια 2, 3, 4 και 5) και τα κλωνοποιήσαμε σε πλασμίδια που εκφράζουν το γονίδιο της Cas9. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε λεντι-ϊικούς φορείς που κωδικοποιούν τα sgRNA και τους χρησιμοποιήσαμε για τη διαμόλυνση κυττάρων Τ2. Μετά από επιλογή σε καλλιέργεια με το κατάλληλο αντιβιοτικό, τα τροποποιημένα κύτταρα Τ2 επωάστηκαν παρουσία ή απουσία Dex και αξιολογήθηκαν ο πολλαπλασιασμός τους και η διάσπαση του GR. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε το βέλτιστο sgRNA για περαιτέρω χρήση σε Τ-λεμφοκύτταρα. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε ένα προϊόν Τ‐λεμφοκυττάρων ειδικών έναντι 5 παθογόνων [ιού Epstein‐Barr, κυτταρομεγαλοϊού, αδενοϊού, polyomavirustypeI-BK, και του μύκητα Aspergillusfumigatus] και ταυτόχρονα, ανθεκτικών στα γλυκοκορτικοειδή με γενετική τροποποίηση του γονιδίου του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, με τη χρήση του sgRNA που επιλέχθηκε προηγουμένως. Μετά από αποτελεσματική εντός-στόχου διάσπαση τουGR και ελάχιστη εκτός-στόχου δράση, τα Τ-λεμφοκύτταρα αυτά διατήρησαν τα χαρακτηριστικά των μη επεξεργασμένων ομολόγων τους, όπως πολυκλωνικότητα, δείκτες μνήμης, ειδικότητα και κυτταροτοξικότητα, ενώ παρέμειναν λειτουργικά παρουσίαDex. Κάνοντας ένα βήμα παραπάνω, με στόχο την επιγενετική αποσιώπηση του υποδοχέα GR, προκειμένου να αποφευχθεί η μόνιμη τροποποίηση του γονιδιώματος, στη συνέχεια αναπτύξαμε ένα σύστημα CRISPR/dCas9. Χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα CRISPR/dCas9 για να τροποποιήσουμε αυτήν τη φορά επιγενετικά Τ2 κύτταρα με ένα μίγμα7 sgRNAs και δύο διαφορετικούς καταστολείς, τη μεθυλοτρανσφεράση DNMT3A και τον KRAB. Τα Τ2 κύτταρα που έφεραν την DNMT3A παρουσίασαν σημαντικά μικρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού τους παρουσία Dex σε σύγκριση με τα κύτταρα της ομάδας αναφοράς, υποδηλώνοντας ότι επιτυχή μεταγραφική καταστολή του GR με τον epieditor DNMT3A. Συνολικά, επιβεβαιώνεται η ανασταλτική δράση τηςDex στα πρωτογενή Τ λεμφοκύτταρα και προτείνεται ένα αποτελεσματικό πρωτόκολλο για την αποσιώπηση του GR και την αντίσταση των Τ-κυττάρων στα στεροειδή με γονιδιακή αλλά και επιγενετική επεξεργασία. Με αυτήν την προσέγγιση γίνεται μία προσπάθεια διεύρυνσης της εφαρμογής της ΥΑ και σημαντικής βελτίωσης της έκβασης των μεταμοσχεύσεων, ιδιαίτερα στους ασθενείς που είναι πιο ευάλωτοι σε λοιμώξεις, όπως αυτοί που λαμβάνουν υψηλές δόσεις στεροειδών μετά την allo-HSCT.