Μοριακή έρευνα και επιδημιολογική συσχέτιση στελεχών ψευδομονάδων που παράγουν μεταλλο-β-λακταμάσες
Authors: Μπισικλής Αλέξανδρος 
Published: January 2014

Στο γένος των ψευδομονάδων έχουν περιγραφεί 160 διαφορετικά είδη, αλλά λίγα (P. aeruginosa, P. fluorescents, P. putida, P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes και P. pseudoalgaligenes) ενδιαφέρουν την Κλινική Μικροβιολογία ως αποικιστές του ανθρωπίνου σώματος, ως συμπαράγοντες νόσων ή ως καθαρά παθογόνοι παράγοντες. Η P. aeruginosa είναι το είδος που απασχόλησε εκτενώς τους επιστήμονες ως αίτιο σοβαρών λοιμώξεων. Πρόκειται για ένα ευκαιριακά παθογόνο βακτηρίδιο που προκαλεί λοιμώξεις κυρίως σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και συγκαταλέγεται στα πιο συχνά αίτια ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Η ιμιπενέμη και η μεροπενέμη είναι β-λακταμικά αντιβιοτικά που ανήκουν στις καρβαπενέμες και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία λοιμώξεων από P. aeruginosa είτε ως μονοθεραπεία, είτε σε συνδυασμό με άλλα αντιβιοτικά τα οποία έχουν αντιψευδομοναδική δράση. Η ανάπτυξη από τα βακτήρια αντοχής στα αντιμικροβιακά φάρμακα αποτελεί σοβαρό εμπόδιο στην αποτελεσματική θεραπεία των λοιμώξεων. Η μικροβιακή αντοχή είναι αποτέλεσμα της δημιουργίας και διασποράς επίκτητων μηχανισμών αντοχής. Οι μηχανισμοί που υποστηρίζουν την επίκτητη αντοχή της P. aeruginosa που αφορά στα β-λακταμικά αντιβιοτικά, στις αμινοιγλυκοσίδες, στις φθοριοκινολόνες και στις πολυμυξίνες, διακρίνονται σε i) παραγωγή αδρανοποιητικών ενζύμων, ii) μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης, iii) απορρύθμιση των αντλιών ενεργητικής εκροής και iv) τροποποίηση στόχων δράσης των αντιβιοτικών. Στην κατηγορία των αδρανοποιητικών ενζύμων ανήκει η παραγωγή των μεταλλο-β-λακταμασών. Οι μεταλλο-β-λακταμάσες ταξινομούνται σε 5 υποτάξεις που ονομάζονται IMP, VIM, SPM, GIM και SIM. Οι υποτάξεις SPM, GIM και SIM περιλαμβάνουν μόνο έναν τύπο ενζύμου και έχουν περιγραφεί στην Αμερική , τη Γερμανία και την Κορέα, αντίστοιχα. Αντίθετα, οι υποτάξεις VIM και IMP περιλαμβάνουν 22 και 24 ένζυμα, αντίστοιχα και παρουσιάζουν παγκόσμια διασπορά. Τα μεταλλοένζυμα αποτελούν τον νεώτερο μηχανισμό αντοχής στην ιμιπενέμη και στη μεροπενέμη. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν: α) η μοριακή διερεύνηση των μεταλλο-βλακταμασών ως επίκτητου μηχανισμού αντοχής στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη σε στελέχη P. aeruginosa, β) η μοριακή διερεύνηση διασποράς στο νοσοκομειακό χώρο των στελεχών P. aeruginosa με γονίδιο μεταλλο-β-λακταμάσης, και γ) ο προσδιορισμός παραγόντων κινδύνου για την εμφάνιση ανάλογων στελεχών. Για το λόγο αυτό εξετάσθηκαν 361 στελέχη P. aeruginosa, τα οποία απομονώθηκαν από την καλλιέργεια δειγμάτων που λήφθηκαν από ασθενείς, νοσηλευτικό προσωπικό και το χώρο του νοσοκομείου. Τα 106 ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη στελέχη (ποσοστό 29,3%) εξετάσθηκαν φαινοτυπικά για την παραγωγή μεταλλο-β-λακταμάσης. Ποσοστό 35,8% των ανθεκτικών στελεχών παρήγαγαν μεταλλοένζυμο. Όλα τα στελέχη ελέχθησαν επιπλέον για την αντοχή τους σε σειρά αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται εναντίον της P. aeruginosa. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά των ποσοστών αντοχής στα αντιμικροβιακά μεταξύ στελεχών που ήταν ανθεκτικά στις καρβαπενέμες και στελεχών που ήταν ευαίσθητα σ’ αυτές. Πιο αναλυτικά τα ποσοστά αντοχής στα αντιβιοτικά μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων στις καρβαπενέμες στελεχών ήταν: Πιπερακιλλίνη (63,2% vs 9,8%), Πιπερακιλλίνη / Ταζομπακτάμη (34,9% vs 5%), Κεφταζιδίμη (74,5% vs 14,9%), Κεφεπίμη (72,6% vs 9,4%), Αζτρεονάμη (54,7% vs 17,2%), Γενταμυκίνη (54,7% vs 14,5%), Αμικασίνη (59,4% vs 10,1%), Τομπραμυκίνη (66,9% ως 7,8%), Νετιλμικίνη (55,6% vs 9,8%), Σιπροφλοξασίνη (80,1% ως 13,3%), Νορφλοξασίνη (82% vs 17,6%), Κολιστίνη (8,4% vs 3,5%). Τα ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη ήταν κατά κανόνα πολυανθεκτικά. Με τη δοκιμασία της Real-Time PCR και την εφαρμογή ενός νέου πρωτοκόλλου, εμπνευσμένο από τις ανάγκες τις μελέτης, ανιχνεύθηκε blaVIM γονίδιο στα 38 από τα 106 (ποσοστό 35,8%) ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη P. aeruginosa. Το πρωτόκολλο δίνει τη δυνατότητα ελέγχου σε μία αντίδραση 15 από τα 22 blaVIM και 11 από τα 24 blaIMP γονίδια. Με τη μέθοδο της αλληλούχισης ( DNA Sequencing) βρέθηκε ότι στα 33 από τα 38 στελέχη (ποσοστό 86,8%) το blaVIM γονίδιο ήταν τμήμα της μεταβλητής περιοχής του ιντεγκρονίου τάξης 1. Στα 28 από τα 33 στελέχη (ποσοστό 84,8%) το blaVIM-2 γονίδιο συνυπήρχε στην μεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου με γονίδιο αντοχής αμινογλυκοσίδης. Τα ιντεγκρόνια συχνά εντοπίζονται επάνω σε τρανσποζόνια. Τα τρανσποζόνια είναι κομμάτια DNA τα οποία έχουν την ικανότητα να μετακινούνται από πλασμίδιο σε πλασμίδιο, από πλασμίδιο σε βακτηριοφάγο, ή από πλασμίδιο σε χρωμόσωμα, με τη βοήθεια ενός ενζύμου, της τρανσποζάσης, το οποίο κωδικοποιείται από το τρανσποζόνιο. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο έγινε ανάλυση του DNA των στελεχών με blaVIM γονίδιο και από τη σύγκριση των ηλεκτροφορητικών αποτυπωμάτων τους προέκυψε ότι υπήρξαν τέσσερις επιδημικοί κλώνοι με διασπορά σε διάφορα τμήματα και μονάδες εντατικής θεραπείας του νοσοκομείου. Η στατιστική ανάλυση επιδημιολογικών δεδομένων των ασθενών, που έγινε με τη δοκιμασία x² (Chi-square test) ή με την ακριβή δοκιμασία Fisher (Fisher’s exact test) όταν ο αναμενόμενος αριθμός συχνοτήτων ήταν μικρός (<5), έδειξε ότι υπάρχουν παράγοντες κινδύνου, όπως η νοσηλεία με μονάδα εντατικής, η διασωλήνωση, η τοποθέτηση ουροκαθετήρα, ρινογαστρικού καθετήρα και η λήψη κορτικοστεροειδών, η παρουσία των οποίων είναι καταλυτική για την εμφάνιση στελεχών P. aeruginosa με αντοχή στις καρβαπενέμες. Τέλος, η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η θνητότητα των ασθενών έχει στατιστικά σημαντική σχέση με λοιμώξεις από ανθεκτικές στις καρβαπενέμες ψευδομονάδες. Συνοψίζοντας καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα: 1. Σε ποσοστό 29,3% τα στελέχη P. aeruginosa ήταν ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη κατά το χρονικό διάστημα 2003 έως 2005. 2. Σε ποσοστό 35,8% η αντοχή στις καρβαπενέμες οφειλόταν σε παραγωγή VIM-2 μεταλλο-β-λακταμάσης. 3. Σε ποσοστό 86,8% το blaVIM-2 γονίδιο ήταν τμήμα γονιδιακής κασέτας στη μεταβλητή περιοχή ιντεγκρονίου τάξης 1. 4. Σε ποσοστό 84,4% το blaVIM-2 βρέθηκε να συνυπάρχει στη μεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου με άλλη γονιδιακή κασέτα, η οποία έφερε γονίδιο αντοχής για αμινογλυκοσίδες. 5. Το πρωτόκολλο της Real-Time PCR επιτρέπει την κατά ομάδες ανίχνευση σε μία αντίδραση 15 blaVIM και 11 blaIMP αλληλόμορφων γονιδίων. 6. Οι πιθανότητες μόλυνσης από στελέχη P. aeruginosa με αντοχή στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη αυξάνουν όταν συνυπάρχει: α. νοσηλεία σε μονάδα εντατικής θεραπείας β. Διασωλήνωση γ. λήψη κορτικοστεροειδών δ. τοποθέτηση ουροκαθετήρα ε. Τοποθέτηση ρινογαστρικού καθετήρα 7. Η τοποθέτηση ουροκαθετήρα αυξάνει τις πιθανότητες μόλυνσης από στελέχη με γονίδιο μεταλλο-β-λακταμάσης. 8. Τα στελέχη P. aeruginosa με γονίδια μεταλλο-β-λακταμάσης δεν περιορίζονται μόνο σε παθολογικά κλινικά δείγματα, αλλά μπορούν να διασπαρθούν στο χώρο, να αποικίσουν ασθενείς και να προκαλέσουν επιδημίες Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στον έλεγχο και στην αντιμετώπιση της διασποράς των ανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa και στην ορθολογική χρήση των καρβαπενεμών ώστε να διατηρηθεί η αποτελεσματικότητα των φαρμάκων στην θεραπεία ψευδομοναδικών λοιμώξεων.