Ανίχνευση Β- και Τ-επιτόπων της θυρεοσφαιρίνης
Authors: Κάνιστρας Ιωάννης 
Published: August 2021

Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκαν νέοι Β- και Τ- επίτοποι της θυρεοσφαιρίνης(Tg), του κύριου αυτοαντιγόνου στην αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα. Η Tg, λόγω τουμεγάλου μεγέθους της, προσφέρεται για εκτενείς μελέτες εντοπισμού επιτόπων πουαναγνωρίζονται από Β- και Τ-κύτταρα, αλλά αυτός είναι και ο κύριος λόγος πουδυσχεραίνεται ο προσδιορισμός ανοσο-επικρατουσών περιοχών.Β-επίτοποι: Κοινός παρονομαστής στις δύο κύριες αυτοάνοσες παθήσεις τουθυρεοειδή αδένα [θυρεοειδίτιδα Hashimoto (Hashimoto’s thyroiditis-HT) και νόσοςGraves’ (Graves’ disease-GD)] είναι κυκλοφορούντα αντι-Tg αυτοαντισώματα,αξιόλογα στη διάγνωση, δίχως όμως κυρίαρχο παθογονικό ρόλο. Η συσχέτιση Β-επιτόπων της Tg και αυτοάνοσων θυρεοειδικών ασθενειών δεν έχει αποτελέσεισυχνά αντικείμενο έρευνας. Σε παλαιότερη μελέτη του Εργαστηρίου Ανοσολογίαςτου Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, με βάση ένα πάνελ 48 αλληλεπικαλυπτόμενωνσυνθετικών πεπτιδίων (επικάλυψη 8 αμινοξέων) της καρβοξυ-τελικής περιοχής τηςTg, είχαν χαρακτηριστεί 17 που αποτελούσαν στόχο αυτοαντισωμάτων απόασθενείς με GD. Τα τρία που αναγνωρίστηκαν πιο ισχυρά, μελετήθηκαν στησυνέχεια, αναμεμειγμένα ή μη, ως πιθανοί στόχοι και των αυτοαντισωμάτων απόασθενείς με HT, πράγμα που δεν επιβεβαιώθηκε.Στο πρώτο μέρος της διατριβής διερευνήθηκαν νέα πεπτίδια-δείκτες τηςανθρώπινης Tg, με σκοπό τον ορολογικό διαχωρισμό των δύο αυτοάνοσωνθυρεοειδικών ασθενειών, και κυρίως για την επιλεκτική ορολογική διάγνωση της HT.Από το διαθέσιμο πάνελ των αντιγονικών πεπτιδίων του Εργαστηρίου επιλέχθηκανπρος μελέτη τρία νέα, το p2208(2208-2227), το p2352(2352-2371) και τοp2472(2472-2491). Σε επίπεδο ολικού ορού βρέθηκε πως τα πεπτίδια της μελέτηςαναγνωρίζονταν εξίσου από τους ορούς και των δύο ομάδων ασθενών. Μόνο ότανχρησιμοποιήθηκαν απομονωμένες ολικές IgG των ορών παρατηρήθηκε στατιστικάσημαντική ορολογική διαφοροποίηση των δύο κλινικών οντοτήτων, κυρίως όταν ταπεπτίδια χρησιμοποιούνται αναμεμειγμένα (71% HT και 100% GD, p<0.05).Συμπερασματικά, η μελέτη καταδεικνύει την ακαταλληλότητα των εν λόγω πεπτιδίωνστη διαγνωστική πρακτική της HT, όμως θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότιενδεχομένως τα αποτελέσματα έχουν επηρεαστεί από τον αρχικό τρόπο επιλογήςτους, που βασίστηκε στην αναγνώρισή τους από τις IgG ασθενών με GD.Τ-επίτοποι: Για την κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που διέπουν τιςαυτοάνοσες θυρεοειδικές ασθένειες, απαιτείται η δημιουργία κατάλληλωνπειραματικών ζωικών προτύπων. Ειδικότερα για τη ΗΤ, το πρότυπο μελέτης είναι ηπειραματική αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα (ΕΑΤ), η οποία επάγεται στον ποντικό είτεάμεσα (ανοσοποίηση με Tg ή πεπτίδια αυτής παρουσία ανοσοενισχυτικού), είτεέμμεσα (παθητική μεταφορά in vivo και in vitro ενεργοποιημένων με Tg κυττάρωναπό λεμφαδένες ποντικών). Η βαρύτητα εκδήλωσης της νόσου (διήθηση θυρεοειδήαδένα από μονοπύρηνα κύτταρα, παραγωγή ειδικών αντι-Tg αντισωμάτων)κατατάσσει τα ζώα σε ευαίσθητα (high responder-HR) και ανθεκτικά (low responder-LR), μία ιδιότητα που συνδέεται με τον απλότυπο των μορίων MHC τάξης II πουφέρουν: Η2k, H2q, H2s για τα HR και H2b, H2d, H2v για τα LR. Τα τελευταία 20χρόνια, οι μελέτες γύρω από τους παθογενετικούς μηχανισμούς της ΕΑΤπροέρχονται σχεδόν αποκλειστικά από τη χρήση στελεχών HR αγρίου τύπουποντικών. Από τα 34 πεπτίδια που έχουν δοκιμαστεί στις φυλές αυτές, τα 17 είναιπαθογονικά, ενώ από τα 10 πεπτίδια που έχουν δοκιμαστεί σε στελέχη LR αγρίουτύπου, μόνο ένα επάγει ΕΑΤ, το 20μερές p2340 (2340-2359). Το πεπτίδιο αυτόχαρακτηρίστηκε, σε προηγούμενη μελέτη του Εργαστηρίου Ανοσολογίας τουΕλληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, ως παθογονικό στις φυλές LR ποντικών C57BL/6(H-2b) και BALB/c (H-2d) μόνο μετά από παθητική μεταφορά in vivo και in vitroενεργοποιημένων με το πεπτίδιο λεμφοκυττάρων ποντικών, ενώ στις φυλές HRSJL/J (H-2s) και CBA/J (H-2k) με άμεση ανοσοποίηση. Είναι λοιπόν προφανές, ότι ηέλλειψη επαρκούς γνώσης σχετικά με παθογονικά πεπτίδια στις φυλές LR ποντικώνδεν επιτρέπει τη σύγκριση και κατανόηση των μηχανισμών παθογένειας των δύοτύπων ποντικών.Σκοπός του δεύτερου μέρους της διατριβής ήταν ο εντοπισμός νέων παθογονικών20μερών πεπτιδίων της Tg με ικανότητα επαγωγής ΕΑΤ σε LR φυλές. Με τη χρήσητου διαθέσιμου πάνελ των 48 πεπτιδίων του Εργαστηρίου, εντοπίστηκαν δύο νέαπεπτίδια, το p2208 (2208-2227) και το p2352 (2352-2371), τα οποία περιείχαναλληλεπικαλυπτόμενα μοτίβα πρόσδεσης σε μόρια MHC HR ποντικών. Το p2208παρουσίασε ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς έφερε επιπλέον μοτίβα πρόσδεσης σεμόρια MHC LR ποντικών. Μετά από την άμεση χορήγησή του σε δύο HR και δύο LRφυλές, το p2208 βρέθηκε ανοσογονικό και παθογονικό σε μία HR (SJL/J) και σε μίαLR (C57BL/6) φυλή ποντικών. Επιπλέον, έφερε κρυπτικό/ούς επίτοπο/ους στηναλληλουχία του. Είναι η πρώτη φορά που ένα πεπτίδιο αναφέρεται να επάγει άμεσηΕΑΤ με εκτενή διήθηση του αδένα τόσο στη φυλή HR και όσο και στη φυλή LR.Επιπρόσθετα, η ανοσοποίηση των ποντικών με το p2208 είχε ως αποτέλεσμα τηνπαραγωγή ειδικών αντισωμάτων, όχι μόνο έναντι του πεπτιδίου, αλλά καιολόκληρης της Tg. Η ιδιότητά τους αυτή, υποδηλώνει ότι το πεπτίδιο είτε φέρει ένανεπιφανειακό, προσβάσιμο επίτοπο στην τεταρτοταγή δομή της Tg, είτε επάγειενδομοριακή επέκταση επιτόπων. Η απομάκρυνση των ειδικών αντισωμάτων απότους αντι-ορούς ποντικών που είχε ως αποτέλεσμα τη δραματική μείωση τηςδραστικότητας έναντι της Tg, υποστηρίζει την πρώτη ερμηνεία.Τέλος, το δεύτερο πεπτίδιο που ανέδειξε η in silico ανάλυση, το p2352, δεν βρέθηκεανοσογονικό ή παθογονικό σε καμία από τις φυλές ποντικών όπου ελέγχθηκε.Συνολικά, από την προσπάθεια εντοπισμού νέων αντιγονικών καθοριστών της Tgσε επίπεδο Β- και Τ-κυττάρων εξάγονται τα εξής συμπεράσματα:α) η χρήση μικρών (20μερών) πεπτιδίων ενδεχομένως να μην ενδείκνυται για τονεντοπισμό ειδικών πληθυσμών αντισωμάτων με διαγνωστική αξία στον ολικό ορόασθενών με αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα.β) το πεπτίδιο p2208 φέρει μοναδική ικανότητα να επάγει άμεση ΕΑΤ σε LR στελέχηποντικών. Ένα τέτοιο πειραματικό μοντέλο της ΕΑΤ προσφέρεται για τη διερεύνησητων μηχανισμών που προσδίδουν ανθεκτικότητα στην εκδήλωσή της.γ) ο εντοπισμός Β- αλλά και Τ-επιτόπων στο πεπτίδιο p2208, καθώς και η ικανότητάτου να επάγει άμεση ΕΑΤ σε HR και LR φυλές ποντικών, καθιστά αναγκαίο τονπροσδιορισμό της ελάχιστης αμινοξικής αλληλουχίας/θέσης των διαφορετικώνεπιτόπων στο πεπτίδιο.