Εκτίμηση της in vivo δραστικότητας των κυματοχρωμάτων P4501A2, P4502A6 και των ενζύμων ν-ακετυλο-τρασφεράση-2 και οξειδάση της ξανθίνης μετά από προσδιορισμό με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης των μεταβολιτών της καφεΐνης στα ούρα ασθενών με χρόνια ηπατική νόσο
Authors: Μπέγας Ηλίας 
Published: January 2014

Η καφεΐνη (1,3,7-τριμεθυλοξανθίνη) μεταβολίζεται μέσω των ενζύμων CYP1A2, CYP2A6, οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ) και Ν-ακετυλοτρανσφεράση-2 (ΝΑΤ-2). Οι κυριώτεροι μεταβολίτες στα ούρα είναι το 1-μεθυλουρικό οξύ, η 5-ακετυλάμινο-6-φορμυλάμινο-3-μεθυλουρακίλη (ΑFMU), η 1-μεθυλοξανθίνη (1Χ), το 1,7-διμεθυλουρικό οξύ (17U) και η 1,7 διμεθυλο ξανθίνη (17Χ). Η δραστικότητα των ανωτέρω ενζύμων προσδιορίζεται με τους μεταβολικούς λόγους (AFMU+1U+1X)/17U, 17U/(17U+17X), 1U/(1U+1X) και AFMU/(AFMU+1U+1X). Σκοπός της εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθόδου Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για την ανάλυση των μεταβολιτών της καφεΐνης στα ούρα και ο προσδιορισμός των ανωτέρω μεταβολικών λόγων σε 125 υγιείς και 342 ηπατοπαθείς. Μετά από αποχή από μεθυλοξανθίνες και φάρμακα οι εθελοντές έλαβαν 200mg καφεΐνης και 6 ώρες αργότερα συλλέχτηκε δείγμα ούρων. Οι μεταβολίτες και το εσωτερικό πρότυπο απομονώθηκαν με χλωροφόρμιο/ισοπροπανόλη (85/15, v/v), διαχωρίστηκαν σε στήλη C18 σε δύο στάδια, μεταβαίνοντας από τον διαλύτη Α (0,1% οξικό οξύ/μεθανόλη/ακετονιτρίλιο, 92/4/5, v/v) στον διαλύτη Β (0,1% οξικό οξύ/μεθανόλη, 60/40, v/v) και ανιχνεύτηκαν στα 280nm. Ο διαχωρισμός ήταν επαρκής, η ακρίβεια 94,1–106,3%, η εντός σειράς και μεταξύ σειρών επαναληψιμότητα μικρότερη του 8,02% και του 8,78%, αντίστοιχα. Φύλο και ηλικία δεν είχαν επίδραση στα ένζυμα ενώ το κάπνισμα είχε επαγωγική δράση στο CYP1A2 και ανασταλτική στο CYP2A6. Η δραστικότητα της ΝΑΤ-2 παρουσίασε δικόρυφη κατανομή και 59,2% των υγιών και 57,0% των ασθενών χαρακτηρίστηκαν ως βραδείς ακετυλιωτές. Η δραστικότητα των CYP1A2 και CYP2A6 ανεστάλη κατά την ηπατοπάθεια και εμφανέστερα κατά την κίρρωση. Το CYP1A2 ανεστάλη στην αυτοάνοση ηπατίτιδα, στην μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα, στην ιογενή ηπατίτιδα, στην αλκοολική ηπατοπάθεια και στα αυτοάνοσα χολοστατικά νοσήματα. Το κάπνισμα επικάλυψε την αναστολή του CYP1A2 στις περισσότερες περιπτώσεις, με εξαίρεση την αλκοολική νόσο και την μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα. Το κάπνισμα δεν επικάλυψε την αναστολή του CYP1A2 στους κιρρωτικούς, λόγω σοβαρής ανεπάρκειας του ενζύμου στην μή αντιρροπούμενη κίρρωση, ενώ στην αντιρροπούμενη το κάπνισμα επισκίασε την αναστολή του ενζύμου. Δείχθηκε ότι η ΧΟ επάγεται κατά την ηπατοπάθεια και ιδιαίτερα στην ιογενή ηπατίτιδα. Δείχθηκε, τέλος, ότι μόνον η ταχεία ακετυλίωση υποχωρεί στους ηπατοπαθείς. Ο λογάριθμος του λόγου (AFMU+1U+1X)/17U παρουσίασε εξειδίκευση 70,7-85,4% και ευαισθησία 60,1-91,7% στην διάγνωση διαφόρων σταδίων της ηπατικής νόσου, στους μη καπνιστές, ενώ στους καπνιστές είχε εξειδίκευση 72,1-86,0% και ευαισθησία 31,5-83,3%. Στις περισσότερες περιπτώσεις ο ανωτέρω λογάριθμος είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από τις συνήθεις δοκιμασίες, ενώ ο συνδυασμός του με αυτές βελτίωσε την ευαισθησία της διάγνωσης με ποσοστά από 69,6-100,0% και 51,7-83,3% στους μη καπνιστές και καπνιστές, αντίστοιχα. Η μέθοδος των μεταβολικών λόγων της καφεΐνης στα ούρα είναι μη επεμβατική, αβλαβής, ανώδυνη και αξιόπιστη διαδικασία για την εκτίμηση της δραστικότητας των CYP1A2, CYP2A6, XO και ΝΑΤ-2. Ο λογάριθμος του λόγου (AFMU+1U+1X)/17U, σε συνδυασμό με τις συνήθεις δοκιμασίες του ήπατος, βελτιώνει σημαντικά την διάγνωση της ηπατικής νόσου.