Μελέτη του ρόλου των επιγενετικών και επιδιορθωτικών μηχανισμών στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης
Authors: Λιάκος Αναστάσιος 
Published: September 2021

Τα κύτταρά μας εκτίθενται καθημερινά σε πληθώρα παραγόντων που απειλούν την γονιδιωματική τους ακεραιότητα. Οι βλάβες που προκαλούνται από την υπεριώδη (UV) ακτινοβολία, επιδιορθώνονται από τον μηχανισμό εκτομής βάσης (Nucleotide Excision Repair, NER), ο οποίος αποτελείται από 2 υπό-μονοπάτια: το Global Genome NER (GG-NER), που δρα σε όλο το γονιδίωμα και το Transcription Coupled NER (TC-NER), το οποίο δρα στις ενεργώς μεταγραφόμενες περιοχές, πυροδοτούμενο από το σταμάτημα της RNA πολυμεράσης ΙΙ (Pol II) στις περιοχές των UV επαγόμενων βλαβών, υποδηλώνοντας πως η μεταγραφή μέσω της Pol II διαδραματίζει κομβικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας. Με την εισαγωγή των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς, βρέθηκε πως τα κύτταρα ανταποκρίνονται στο γενοτοξικό στρες, μέσω μιας πολυεπίπεδης μεταγραφικής αναδιοργάνωσης, η οποία συντελεί στη γρήγορη επιδιόρθωση των UV επαγόμενων βλαβών. Ωστόσο, πολλές λεπτομέρειες του συγκεκριμένου μηχανισμού παρέμειναν αδιευκρίνιστες. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε αρχικά η επίδραση της UV ακτινοβολίας στην προσβασιμότητα της χρωματίνης ανθρώπινων ινοβλαστών δέρματος, μέσω της μεθόδου ATAC-seq. Τα αποτελέσματά έδειξαν πως η έκθεση σε UV οδηγεί σε σημαντική αύξηση της προσβασιμότητας της χρωματίνης στις ρυθμιστικές περιοχές του μεταγραφόμενου γονιδιώματος. Η αύξηση αυτή συνάδει με την UV-επαγόμενη απελευθέρωση των μορίων Pol II-ser2P από τις θέσεις παύσης της μεταγραφής πλησίον του υποκινητή, η οποία λαμβάνει χώρα, σε όλες τις ενεργώς μεταγραφόμενες, κωδικές και μη κωδικές, περιοχές του γονιδιώματος. Επιπλέον, πειράματα αλληλούχισης ανοσοκατακρημνισμένης χρωματίνης, σε συνδυασμό με βιοχημικές τεχνικές, έδειξαν ότι τα επίπεδα και η κατανομή της ιστονικής τροποποίησης H3K27ac παραμένουν σταθερά στις περιοχές των σημείων έναρξης της μεταγραφής (Transcription Start Sites, TSS), μετά την έκθεση σε UV. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι, οι ρυθμιστικές περιοχές των μεταγραφόμενων γονιδιωματικών περιοχών διατηρούν την ενεργότητά τους, μετά από έκθεση σε UV. Ακόμη, βρέθηκε πως η ακτινοβόληση με UV δεν αναστέλλει την πρόσδεση των μορίων Pol II-hypo στις περιοχές TSS των ενεργώς μεταγραφόμενων γενετικών τόπων, αλλά προκαλεί μια γρήγορη μετάβαση των μορίων από το στάδιο μεταγραφικής έναρξης σε αυτό της επιμήκυνσης, οδηγώντας σε μείωση των επιπέδων της Pol II-hypo στους υποκινητές. Διαπιστώθηκε πως η διαδικασία πρόσδεσης-γρήγορης προώθησης λαμβάνει χώρα καθ’ όλη την περιόδο ανάκαμψης των κυττάρων μετά την έκθεση σε UV και επιβεβαιώθηκε πως ταυτόχρονα, τα μόρια Pol II διατηρούν την δυνατότητα να συνθέτουν RNA στις περιοχές πλησίον των TSSs. Επιπλέον, βιοπληροφορική συσχέτιση των δεδομένων μας με δεδομένα αλληλούχισης, τα οποία χαρτογραφούν τα τμήματα του DNA που περιέχουν βλάβες και επιδιορθώνονται μέσω TC-NER, έδειξε πως για την επιτυχή ολοκλήρωση της επιδιόρθωσης και την εξασφάλιση της ακεραιότητας όλου του μεταγραφόμενου γονιδιώματος, απαιτείται συνεχής τροφοδότηση των ενεργών ρυθμιστικών περιοχών, με νέα μόρια Pol II. Συμπερασματικά, η διατήρηση ενεργής κατάστασης της χρωματίνης στα TSS των μεταγραφόμενων κωδικών και μη κωδικών περιοχών μετά την έκθεση σε UV, ευνοεί την πρόσδεση μορίων Pol II και τη γρήγορη προώθησή τους στη φάση επιμήκυνσης, τροφοδοτώντας ένα μεταγραφικό κύμα, το οποίο σαρώνει το ενεργώς μεταγραφόμενο γονιδίωμα, ανιχνεύοντας και επιδιορθώνοντας τις UV επαγόμενες βλάβες. Παράλληλα, μελετήθηκαν οι δυναμικές έναρξης της μεταγραφής μετά από έκθεση σε UV σε ινοβλάστες δέρματος ασθενών CS-B. Βρέθηκε πως η πρόσδεση της Pol II στους υποκινητές των ενεργών γονιδίων δεν αναστέλλεται και πως η τροποποίηση H3K27ac παραμένει σε σταθερά επίπεδα στις περιοχές αυτές. Τα συγκεκριμένα δεδομένα υποδηλώνουν πως η ανικανότητα επανεκκίνησης της μεταγραφής στους ινοβλάστες CS-B, δεν οφείλεται σε μόνιμη αναστολή της μεταγραφικής έναρξης αλλά στην αδυναμία διαχείρισης του σταματήματος της μεταγραφικής επιμήκυνσης στις περιοχές των βλαβών. Τέλος, αρκετά γονίδια σχετιζόμενα με διαδικασίες κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παρουσιάζουν ταυτόχρονα διαφορική έκφραση και στόχευση από την τροποποίηση H3K27me3, συγκρίνοντας μη ακτινοβολημένους φυσιολογικούς και CS-B ινοβλάστες δέρματος. Τα παραπάνω συνδέουν την πρωτεΐνη CSB με τις διαδικασίες της ορθής επιγενετικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.