Ο µοριακός µηχανισµός της στόχευσης των προ-πρωτεϊνών στα βακτήρια
Authors: Χατζή Αικατερίνη 
Published: September 2021

Περίπου 500 πρωτεΐνες του Escherichia coli εκκρίνονται µετα-µεταφραστικά από τηνµεταθετάση του κυττάρου (SecY-SecA). Οι εκκριτικές πρωτεΐνες αποτελούνται απότο πεπτίδιο σήµα και το ώριµο µέρος. Τα δύο µέρη προσδένονται σε διακριτές θέσειςστη µεταθετάση. Στόχος της διατριβής είναι να βρούµε τα σήµατα στόχευσης τουώριµου τµήµατος για την µεταθετάση. Χρησιµοποιώντας διαφορετικές εκκριτικέςπρωτεΐνες καταλήξαµε ότι ~100 αµινοξέα είναι ικανά προκειµένου να στοχευθεί µιαπρωτεΐνη στη µεταθετάση. Στη συνέχεια χρησιµοποιώντας την αλκαλική φωσφατάσηως πρωτεΐνη µοντέλο, δηµιουργήσαµε πρωτεΐνες-παράγωγά της- µικρότερες από 100αµινοξέα. Η συγγένειά τους για τη µεταθετάση µειώνεται καθώς µειώνεται το µήκοςτους. Εποµένως ~100 αµινοξέα είναι αναγκαία για τη στόχευση. Οι µεγαλύτερεςµειώσεις της συγγένειας συµπίπτουν µε την αφαίρεση 2 υδρόφοβων νησίδων.Προκειµένου να εξετάσουµε αν οι νησίδες είναι σηµαντικές για τη στόχευση,µεταλλάξαµε τα υδρόφοβα αµινοξέα δηµιουργώντας αλληλουχίες ουδέτερηςυδροφοβικότητας. Όταν 1. µεταλλάχθηκαν και οι δύο νησίδες και 2. το υπόστρωµαδεν έχει πεπτίδιο σήµα τότε χάνεται η συγγένεια της πρωτεΐνης για την µεταθετάση.Εποµένως το ώριµο τµήµα πρέπει να έχει τουλάχιστον µια υδρόφοβη νησίδαπροκειµένου να στοχευθεί. Οι πρωτεΐνες προκειµένου να είναι σταθερές στοκυτταρικό περιβάλλον και να µην κατακρηµνίζονται, πρέπει να σχηµατίσουνυδρόφοβο πυρήνα, να κρύψουν τα υδρόφοβα µέρη τους και εποµένως νααναδιπλώσουν. Γνωρίζουµε οστώσο ότι µόνο οι αποδιπλωµένες πρωτεΐνεςστοχεύονται και εκκρίνονται. Δηµιουργείτε η απορία πώς οι εκκρινόµενες πρωτεΐνεςκαταφέρνουν να χρησιµοποιούν τις υδρόφοβες νησίδες τους και να στοχεύονται.Δοκιµάσαµε τη σταθερότητα των εκκριτικών πρωτεϊνών σε υδατικό διάλυµα. Το 50%παραµένει σταθερό και ικανό για στόχευση και έκκριση. Οι πρωτεΐνες προκειµένουνα στοχευθούν πρέπει να είναι αποδιπλωµένες, εποµένως καταλήγουµε στοσυµπέρασµα ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες παραµένουν εγγενώς αποδιπλωµένες. Toυπόλοιπο 50% κατακρηµνίζεται. Οστώσο το κύτταρο έχει πολλαπλές επιλογές για τιςεκκρινόµενες πρωτεΐνες που κατακρηµνίζονται. Τουλάχιστον 3 πρωτεΐνες (SecA,SecB, Trigger Factor) µπορούν να «σώσουν» τις εκρινόµενες πρωτεΐνες από τηνκατακρήµνιση αλλά και να τις διατηρήσουν ικανές για µετατόπιση. Οικυτταροπλασµατικές, έχουν υδρόφοβες νησίδες παρόµοιες µε αυτές τωνεκκρινόµενων και προσδένονται στην µεταθετάση. Η διαφορά τους έγγειται στο ότι το χρονικό περιθώριο που παραµένουν ικανές για στόχευση είναι µικρότερο από τωνεκκρινόµενων. Καταλήγοντας τα σήµατα στόχευσης είναι 1. Οι υδρόφοβες νησίδεςκαι 2. Η τάση των εκκρινόµενων να παραµένουν αποδιπλωµένες.Εξετάζοντας τα σήµατα στόχευσης από την πλευρά της SecA, παρατηρήσαµε ότιυπάρχουν υδρόφοβες νησίδες στην κυτταροπλασµατική πλευρά της SecA. Ότανακινητοποιήσαµε την καρβοξυτελική ουρά της SecA σε µια από τις νησίδες, ησυγγένεια στόχευσης των υποστρωµάτων έγινε 10 φορές µικρότερη . Εποµένως ησυγκεκριµένη περιοχή αν και φαίνεται να µην είναι µοναδική, είναι σηµαντική γιατην πρόσδεση υποστρωµάτων.Όταν ελέγξαµε αν το πεπτίδιο σήµα επηρεάζει τη στόχευση αντικαθιστώντας τοπεπτίδιο σήµα της αλκαλικής φωσφατάσης µε 30 άλλα πεπτίδια σήµαταπαρατηρήσαµε ότι οι διαφορές στη συγγένεια ήταν µικρές. Αντίθετα το πεπτίδιοσήµα είναι καθοριστικό για την αποτελεσµατικότητα της έκκρισης και για τη µείωσητης ενέργειας ενεργοποίησης του ολοενζύµου (SecY-SecA).