Investigation of the role of Nadph oxidase inhibitors in experimental animal models of retinopathies
Authors: Διονυσοπούλου Σταυρούλα 
Published: October 2023

Ο αμφιβληστροειδής είναι ένας ιδιαίτερα σύνθετος ιστός στον οποίο, η άμεση αλληλεπίδραση και λειτουργική σύζευξη νευρώνων, κυττάρων γλοίας (μακρο/μικρογλοία) και αγγείων διαμορφώνει την Νευροαγγειακή Μονάδα, απαραίτητη για τη διατήρηση της φυσιολογικής δομής και λειτουργίας του. Επιμέρους παθολογικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν κάποιο ή και όλα τα συστατικά της Νευροαγγειακής Μονάδας, διαταράσσοντας την ομαλή λειτουργία της και προκαλώντας την εκδήλωση αμφιβληστροειδοπαθειών. Η Διαβητική Αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ), κύρια επιπλοκή του διαβήτη, επηρεάζει σημαντικό ποσοστό ασθενών με διαβήτη παγκοσμίως. Η νευροεκφύλιση, η φλεγμονή και η αγγειοπάθεια έχουν αναγνωριστεί ως οι κύριες συνιστώσες που ενέχονται στην εκδήλωση και ανάπτυξη ΔΑς, διαταράσσοντας τη λειτουργία της Νευροαγγειακής Μονάδας. Από την άλλη πλευρά, το οξειδωτικό στρες και η διεργετοξικότητα γλουταμικού εμπλέκονται άμεσα στην εκδήλωση διαταραχών στον αμφιβληστροειδή, συμπεριλαμβανομένης της ΔΑς και μάλιστα, αποτελούν μηχανισμούς αλληλένδετους. Οι NAPDH οξειδάσες είναι ενζυμικά σύμπλοκα (οικογένεια ΝΟΧ, επτά αναγωρισμένες ισομορφές: ΝΟΧ1-5, DUOX1/DUOX2) υπεύθυνα για την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου και αποτελούν μία από τις κύριες πηγές οξειδωτικού στρες σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις του αμφιβληστροειδή. Σε επιμέρους αμφιβληστροειδικούς κυτταρικούς τύπους εκφράζονται οι κύριες ισομορφές ΝΟΧ1,2 και 4, οι οποίες, σε παθολογικές συνθήκες έχουν συσχετιστεί με φαινόμενα νευροτοξικότητας στον ιστό. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να αξιολογηθεί ο ρόλος των NADPH οξειδασών στην εκδήλωση διαταραχών στον αμφιβληστροειδή που σχετίζονται με τη διεγερτοτοξικότητα γλουταμικού και το διαβήτη, καθώς και η αποτελεσματικότητα ειδικών αναστολέων των NADPH οξειδασών έναντι στη νευροεκφύλιση, τη φλεγμονή και την αγγειοπάθεια που εκδηλώνονται στη ΔΑ, περιορίζοντας ουσιαστικά τη διαταραχή της Νευροαγγειακής Μονάδας κι επομένως αποτελώντας ολική θεραπευτική προσέγγιση αντιμετώπισης της ΔΑς. Για το σκοπό αυτό, αξιοποιήθηκαν συνολικά δύο in vivo μοντέλα σε επίμυες (Sprague-Dawley): 1) το μοντέλο της επαγόμενης μέσω AMPA διεγερτοτοξικότητας και 2) το μοντέλο της επαγόμενης μέσω στρεπτοζοτοκίνης (ΣΤΖ) ΔΑς, σε δύο παραλλαγές, των δύο και των πέντε εβδομάδων. In vivo μοντέλο AMPA διεγερτοτοξικότητας: ο ειδικός ΝΟΧ2 αναστολέας, GLX7013170, ή ο ειδικός NOX4 αναστολέας, GLΧ7013114, συγχορηθήκαν μαζί με το AMPA(8.4mM) ενδοϋαλοειδικά, στη δόση των 10-4Μ. Εικοσιτέσσερις ώρες (24 ώρες) μετά τις χορηγήσεις απομονώθηκαν οι οφθαλμοί και συλλέχθηκαν οι ιστοί για ανοσοϊστοχημικές μελέτες. In vivoμοντέλο επαγόμενης μέσω ΣΤΖ ΔΑς: ο διαβήτης προκλήθηκε μέσω ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης ΣΤΖ (70mg/ml) και η θεραπεία περιελάμβανε την τοπική χορήγηση υπό μορφή οφθαλμικών σταγόνων (20μl/σταγόνα) της εκάστοτε εξεταζόμενης ουσίας (pan-NOX αναστολέας: VAS2870, NOX4 αναστολέας: GLX7013114, NOX2 αναστολέας: GLX7013170), στη συγκέντρωση των 10mg/ml, είτε 1) μία φορά καθημερινά, για 14 μέρες συνολικά, ξεκινώντας 48 ώρες μετά τη χορήγηση της ΣΤΖ (παραλλαγή των δύο εβδομάδων) ή 2) μία φορά καθημερινά, για 7 συνολικά μέρες, ξεκινώντας 4 εβδομάδες μετά τη χορήγηση της ΣΤΖ (παραλλαγή των πέντε εβδομάδων). Σε κάθε περίπτωση, 24 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση της θεραπείας, οι ιστοί συλλέχθηκαν προκειμένου να αξιοποιηθούν σε επιμέρους τεχνικές, που περιελάμβαναν: ανοσοϊστοχημεία, αναλύσεις western blot, Real Time PCR, ELISA και Evans-Blue, καθώς και ηλεκτροαμφιβληστροειδογράφημα προκαλούμενο από οπτικό ερέθισμα (Pattern Electroretinogram, PERG). Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε φαρμακοκινητική μελέτη του NOX4 αναστολέα, GLX7013114, με προσδιορισμό των επιπέδων του στον αμφιβληστροειδή υγιών αρουραίων μέσω LC-MS/MS ανάλυσης. Στο μοντέλο της AMPA διεγερτοτοξικότητας, η χορήγηση του AMPA συσχετίστηκε με την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στον ιστό, φαινόμενο το οποίο περιορίστηκε σημαντικά μέσω του NOX4 αναστολέα. Παράλληλα, και οι δύο εξεταζόμενοι αναστολείς, ΝΟΧ2/ΝΟΧ4, GLX7013170 και GLX7013114, αντίστοιχα, περιόρισαν σημαντικά την ενεργοποίηση της μακρο/μικρογλοίας, ενώ μόνο ο ΝΟΧ2 αναστολέας παρείχε προστασία των NOS θετικών αμακρυνικών κυττάρων του ιστού έναντι της AMPA επαγόμενης διεγερτοτοξικότητας. Στο μοντέλο της επαγόμενης μέσω ΣΤΖ ΔΑς, ο διαβήτης προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του mRNA της ΝΟΧ2 και ΝΟΧ4 ισομορφής στον αμφιβληστροειδή, στην παραλλαγή των δύο εβδομάδων, ενώ στην παραλλαγή των πέντε εβδομάδων αυξημένη ήταν η έκφραση της ΝΟΧ2 ισομορφής, με την ΝΟΧ1 να παρουσιάζει στατιστικώς σημαντική μείωση. Στην ίδια παραλλαγή, η γενική ΝΟΧ αναστολή (VAS2870) συσχετίστηκε με προστασία των αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων, καθώς και με μειωμένη ενεργοποίηση της μικρο/μακρογλοίας, αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε και κατά τη χορήγηση του ΝΟΧ2 αναστολέα, GLX7013170. Ωστόσο, ο ΝΟΧ2 αναστολέας δεν παρείχε καμία προστασία σε επίπεδο αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων, αν και βρέθηκε να ρυθμίζει την έκφραση της Bcl-2 πρωτεΐνης στον αμφιβληστροειδή των διαβητικών επίμυων. Ο NOX4 αναστολέας, GLX7013114, οδήγησε σε: 1) μείωση της οξειδωτικής βλάβης, της έκφρασης της κασπάσης-3, της απώλειας των NOS θετικών αμακρυνικών κυττάρων και των αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων και της ενεργοποίησης μικρο/μακρογλοίας και στις δύο εξεταζόμενες παραλλαγές. Συγχρόνως, περιόρισε σημαντικά την έκφραση του παράγοντα TNF-α στην παραλλαγή των δύο εβδομάδων, ενώ στην παραλλαγή των πέντε εβδομάδων περιόρισε την έκφραση του παράγοντα VEGF και των κυτοκικών IL-1β/IL-6 (mRNA), την αγγειακή διαρροή και προστάτευσε και τη λειτουργία των γαγγλιακών κυττάρων, όπως φανερώνει η ανάλυση του εύρους των καταγραφών της μελέτης PERG. Επιπρόσθετα, η φαρμακοκινητική μελέτη του ΝΟΧ4 αναστολέα, GLX7013114, επιβεβαίωσε ότι ο συγκεκριμένος αναστολέας, χορηγούμενος τοπικά υπό μορφή οφθαλμικών σταγόνων, φτάνει στον αμφιβληστροειδή και παραμένει σε ανιχνεύσιμα επίπεδα μέχρι και για 8 ώρες, ενισχύοντας τα προηγούμενα θεραπευτικά του αποτελέσματα. Συμπερασματικά, οι NADPH οξειδάσες εμπλέκονται στην εκδήλωση φαινομένων διεγερτοτοξικότητας στον αμφιβληστροειδή, ενώ παράλληλα η έκφρασή τους στον ιστό επηρεάζεται διαφορετικά από το διαβήτη (ΝΟΧ1,2 και 4). Η AMPA διεγερτοτοξικότητα σχετίζεται με την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στον ιστό και οι ΝΟΧ αναστολείς μπορούν να δράσουν ως νευροπροστατευτικοί (ΝΟΧ2 αναστολέας) και αντιφλεγμονώδεις παράγοντες (ΝΟΧ2 και ΝΟΧ4 αναστολέας) έναντι αυτής. Οι NOX2 και NOX4 ισομορφές εμπλέκονται αμφότερες στις επιπλοκές που εκδηλώνονται στον αμφιβληστροειδή στα πρώιμα στάδια ΔΑς, γεγονός που καθιστά τους αναστολείς τους υποσχόμενα μόρια αντιμετώπισής της. Ειδικότερα για τον ΝΟΧ4 αναστολέα, GLX7013114, η εκτενής μελέτη του και στις δύο παραλλαγές της ΔΑς, σε συνδυασμό με την φαρμακοκινητική ανάλυση, υποστηρίζουν την ικανότητά του να δράσει συγχρόνως έναντι στη νευροεκφύλιση, τη φλεγμονή κα την αγγειοπάθεια, αποτελώντας ολική θεραπευτική προσέγγιση αντιμετώπισης των πρώιμων σταδίων ΔΑς.