Μοριακή ανάλυση μηχανισμών ανθεκτικότητας εντόμων υγειονομικής σημασίας και εχθρών καλλιεργειών στα εντομοκτόνα
Authors: Καμπουράκη Αναστασία 
Published: April 2022

Ένας μεγάλος αριθμός εντόμων απειλεί τους τομείς της αγροτικής παραγωγής, προκαλώντας σημαντικές απώλειες των γεωργικών προϊόντων ετησίως, και της δημόσιας υγείας, μέσω ασθενειών που μεταδίδονται από φορείς. Η καταπολέμησή τους βασίζεται κυρίως στη χρήση χημικών εντομοκτόνων, όμως η πίεση επιλογής που υφίστανται, συχνά οδηγεί στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας.Ένας πολύ σημαντικός γεωργικός εχθρός είναι ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, ο οποίος προκαλεί πολύ σοβαρές ποιοτικές και ποσοτικές ζημιές στην ελαιοπαραγωγή, εάν δεν τεθεί υπό έλεγχο. Τα κουνούπια αποτελούν μία ομάδα εντόμων υγειονομικής σημασίας, η οποία ευθύνεται για τη μετάδοση πολύ σοβαρών ασθενειών όπως η ελονοσία, ο δάγκειος πυρετός, ο ιός του Δυτικού Νείλου κ.α.. Ο έλεγχος των ασθενειών που μεταδίδονται από κουνούπια στηρίζεται κυρίως στον έλεγχο του φορέα. Η καταπολέμηση του δάκου της ελιάς και των κουνουπιών στηρίζεται κυρίως στη χρήση εντομοκτόνων. Εν τούτοις, η συχνή και εκτεταμένη χρήση περιορισμένου αριθμού διαθέσιμων εντομοκτόνων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, και στις δύο περιπτώσεις, υπονομεύοντας την αποτελεσματικότητα των επεμβάσεων καταπολέμησης. Η μελέτη των μηχανισμών ανθεκτικότητας και η παρακολούθηση της εξέλιξής της στους πληθυσμούς, αποτελούν πολύ σημαντικά στοιχεία της διαχείρισής της και κατ’ επέκταση της διαφύλαξης της αποτελεσματικότητας των εντομοκτόνων. Σε αυτή την κατεύθυνση, στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε παρακολούθηση της κατάστασης και της εξέλιξης της ανθεκτικότητας ελληνικών πληθυσμών του δάκου της ελιάς στις κύριες ομάδες εντομοκτόνων που χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια για την καταπολέμησή του (οργανοφωσφορικά, πυρεθροειδή, σπινοσίνες). Με κλασσικές εργαστηριακές βιοδοκιμές τοξικότητας ελέγχθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα alpha-cypermethrin και spinosad, τα οποία βρέθηκαν αρκετά αυξημένα στην περίπτωση του alpha-cypermethrin. Με βιοδοκιμές που έλαβαν χώρα στον αγρό, επιβεβαιώθηκε η μειωμένη αποτελεσματικότητα στο alpha-cypermethrin και σε πραγματικές συνθήκες πεδίου, η οποία είχε προηγουμένως παρατηρηθεί με κλασικές εργαστηριακές βιοδοκιμές. Τέλος, η εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για τον έλεγχο της συχνότητας γνωστών μεταλλαγών ανθεκτικότητας του δάκου στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα, έδειξε ότι οι μεταλλαγές G488S και I214V στο γονίδιο της ακετυλοχολινεστεράσης είναι εγκαθιδρυμένες στους περισσότερους πληθυσμούς, ενώ η Δ3Q έλλειψη βρέθηκε σε πολύ χαμηλές συχνότητες. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας του δάκου στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα. Βιοδοκιμές τοξικότητας με το εντομοκτόνο alpha-cypermethrin και τον αναστολέα δράσης P450 μονοξυγενασών (PBO) έδειξαν την εμπλοκή των P450 μονοοξυγενασών στην ανθεκτικότητα στο alpha-cypermethrin. Έπειτα, από ανάλυση μεταγραφώματος, προέκυψε ένας αριθμός γονιδίων αποτοξικοποίησης που υπερεκφράζονται σε ανθεκτικούς πληθυσμούς σε σχέση με ευαίσθητους, εκ των οποίων το μεγαλύτερο ποσοστό ήταν μέλη της ομάδας των P450 μονοοξυγενασών. Για δύο από αυτές (CYP6A23, CYP6G2), έγινε διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου με χρήση της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής. Η μείωση της έκφρασής της CYP6A23 απέδωσε περισσότερη ευαισθησία στο εντομοκτόνο alpha-cypermethrin, ενώ στην περίπτωση της CYP6G2 δεν υπήρξε κάποια αλλαγή.Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε ο μηχανισμός της ανθεκτικότητας διείσδυσης στο κουνούπι Anopheles gambiae, το οποίο αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους φορείς της ελονοσίας παγκοσμίως. Υπολογίστηκε ο ρυθμός διείσδυσης του πυρεθροειδούς εντομοκτόνου deltamethrin σε ανθεκτικά κουνούπια, όπου βρέθηκε μειωμένος, σε σχέση με ευαίσθητα. Ποσοτική ανάλυση των υδρογονανθράκων του επιδερμιδίου σε ολόκληρα σώματα και σε πόδια ανθεκτικών κουνουπιών σε σχέση με ευαίσθητα, υπέδειξε διαφορές στη σύνθεση του επιδερμιδίου, φανερώνοντας συσχέτιση με την ανθεκτικότητα διείσδυσης των εντομοκτόνων στο Anopheles gambiae. Επιπλέον, εκτίμηση της πληθυσμιακής σύστασης και ανθεκτικότητας σε πληθυσμούς κουνουπιών-φορέων ασθενειών, πραγματοποιήθηκε στο νησί της Κρήτης. Με βάση μορφολογική αναγνώριση και μοριακή ταυτοποίηση, βρέθηκε ότι η πληθυσμιακή κοινότητα των κουνουπιών της Κρήτης περιλαμβάνει σημαντικούς φορείς ασθενειών, με το είδος Culex pipiens (κύριος φορέας του ιού του Δυτικού Νείλου) να κυριαρχεί. Η εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για τoν έλεγχο της παρουσίας μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα και στο ρυθμιστή ανάπτυξης diflubenzuron, έδειξαν ότι οι γνωστές μεταλλαγές ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα βρίσκονται σε υψηλές συχνότητες στους πληθυσμούς Cx. pipiens, και σε χαμηλές έως μέτριες συχνότητες στους πληθυσμούς Aedes albopictus. Η μεταλλαγή Ι1043Μ ανθεκτικότητας στο diflubenzuron, αν και σε μικρό ποσοστό, ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε άτομα του είδους Cx. pipiens από το Λασίθι.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι η ανθεκτικότητα στους πληθυσμούς του δάκου στο πυρεθροειδές εντομοκτόνο alpha-cypermethrin και στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα έχει εξελιχθεί στην Ελλάδα. Η ανθεκτικότητα του δάκου στο alpha-cypermethrin έχει αρνητικό αντίκτυπο στις εφαρμογές στο πεδίο, ενώ στο μηχανισμό ανθεκτικότητας εμπλέκονται οι P450 μονοοξυγενάσες. O μηχανισμός της επιδερμικής ανθεκτικότητας (μειωμένης διείσδυσης εντομοκτόνων) είναι υπαρκτός στον φορέα της ελονοσίας An. gambiae, και βασίζεται σε αλλαγές στη σύσταση του επιδερμιδίου, όπως την αυξημένη εναπόθεση υδρογονανθράκων. Τέλος, η πληθυσμιακή σύνθεση των κουνουπιών της Κρήτης περιλαμβάνει σημαντικούς φορείς ασθενειών, οι οποίοι σε ένα μεγάλο ποσοστό φέρουν μεταλλαγές ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα, και επιπλέον ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε άτομα Culex pipiens μία από τις μεταλλαγές ανθεκτικότητας στο diflubenzuron.