Συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού σε σκύλους με ιδιοπαθή και με επίκτητη επιληψία
Authors: Μπάκα Ουρανία 
Published: December 2023

Οι επιληπτικές κρίσεις αποτελούν την κύρια κλινική εκδήλωση των μεταβολικών, των οργανικών καθώς και των γενετικών εγκεφαλοπαθειών (ιδιοπαθής επιληψία). Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), λόγω της άμεσης επαφής του με το κεντρικό νευρικό σύστημα, είναι το ιδανικό βιολογικό υλικό για τον προσδιορισμό ειδικών βιοδεικτών και τη διαγνωστική προσέγγιση των διαφόρων νευρολογικών παθήσεων μέσω της πρωτεωμικής ανάλυσης. Ο στόχος της μελέτης ήταν η συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση του ΕΝΥ των σκύλων που εκδήλωναν επιληπτικές κρίσεις (ιδιοπαθής και επίκτητη επιληψία) και των κλινικά υγιών σκύλων, χωρίς ιστορικό επιληπτικών κρίσεων. Μελετήθηκαν 34 σκύλοι με ιδιοπαθή, επίκτητη επίληψια και κλινικά υγιείς σκύλοι, οι οποίοι κατανεμήθηκαν σε 4 ομάδες (Ομάδα Α: κλινικά υγιείς σκύλοι, Ομάδα Β: σκύλοι με ιδιοπαθή επιληψία υπό αντιεπιληπτική αγωγή, Ομάδα Γ: σκύλοι με ιδιοπαθή επιληψία χωρίς αντιεπιληπτική αγωγή, Ομάδα Δ: σκύλοι με επίκτητη επιληψία που άλλοι λάμβαναν ΑΕΦ και άλλοι δεν λάμβαναν ΑΕΦ). Η συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση των δειγμάτων έγινε με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης Tandem Mass Tag χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία νάνο-ροής υψηλής αποδόσεως συζευμένη σε σειρά με φασματόμετρο μάζας Q Exactive Mass με δυνατότητα διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS). Η ανίχνευση και η σχετική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών έγινε με τη χρήση του προγράμματος Proteome Discoverer και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη γλώσσα προγραμματισμού R. Η ανάλυση των γονιδίων έγινε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων για το Canis lupus familiaris. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα μέσω του ProteomeXchange με κωδικό εύρεσης PXD018893. Από την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψαν 18 πρωτεΐνες με στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των 4 ομάδων (P<0.05). Στις ομάδες Β και Δ οι πρωτεΐνες: μεταλλοπεπτιδάση 2 της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMP2-Matrix metalloproteinase 2) και EGF- που περιέχει το ινώδες της εξωκυτταρικής πρωτεΐνης 2 του υποστρώματος (EFEMP2- epidermal growth factor (EGF-) containing fibulin-like extracellular matrix protein 2) ήταν ρυθμισμένες προς τα κάτω, ενώ οι πρωτεΐνες απτοσφαιρίνη (HP) και APO-A1 ήταν ρυθμισμένες προς τα πάνω. Οι πρωτεΐνες τετρανεκτίνη (CLEC3B) και δεσμευτική πρωτεΐνη της φωσφατιδιλεθανολαμίνης (PEBP4) βρέθηκαν ρυθμισμένες προς τα πάνω ενώ η πρωτεΐνη απολιποπρωτεϊνη Α1 (APO-A1) ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω (Ομάδα Γ). Η πρωτεΐνη ανοσοσφαιρίνη L1 (IGLL1) ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω στις ομάδες Β και Γ και ρυθμισμένη προς τα πάνω στην ομάδα Δ. Η πρωτεΐνη EFEMP2 ήταν η μοναδική κοινή πρωτεΐνη που ανιχνεύθηκε ανάμεσα στις 4 ομάδες των σκύλων ενώ η PEBP4 ήταν η μόνη κοινή πρωτεΐνη ανάμεσα στις ομάδες των σκύλων με επιληπτικές κρίσεις. Για να αξιολογηθούν οι μεταβολές της πρωτεΐνης απτοσφαιρίνης (HP) που προέκυψαν από την πρωτεωμική ανάλυση, έγιναν επιπλέον η δοκιμή ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών κατά Western (Western Blot) και η ανοσολογική δοκιμή SPARCL. Τόσο η δοκιμή Western Blot όσο και η δοκιμή SPARCL, έδειξαν ικανοποιητική συσχέτιση με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την πρωτεωμική ανάλυση (r = 0.712 και r = 0.703, αντίστοιχα). Η πρωτεωμική ανάλυση του ΕΝΥ των σκύλων που εκδηλώνουν επιληπτικές κρίσεις έδειξε ότι η βιολογική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MMP2, HP και APO-A1 υποδεικνύει τη διαταραχή της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού μέσω της φλεγμονής που προκαλείται στον εγκέφαλο από τα επαναλαμβανόμενα επιληπτικά επεισόδια. Οι μεταβολές της πρωτεΐνης MMP2 συνάδουν με την ενεργοποίηση προστατευτικών μηχανισμών στον εγκέφαλο. Η αντιεπιληπτική αγωγή επιδρά σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες που υποδηλώνεται από τις διαφορές στη βιολογική συμπεριφορά των πρωτεϊνών του ΕΝΥ, όπως φαίνεται μέσω της πρωτεωμικής ανάλυσηςτων δειγμάτων ΕΝΥ των σκύλων που λάμβαναν και που δεν λάμβαναν αντιεπιληπτική αγωγή.