Μελέτη σε κυτταρικές καλλιέργειες της παρουσίασης του αντιγόνου από τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος ασθενών που βρίσκονται σε χρόνια περιοδική αιμοκάθαρση
Authors: Ελευθεριάδης Θεόδωρος 
Published: January 2014

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί σε καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος (PBMC), αν η παρου-σίαση του αντιγόνου από τα μονοκύτταρα στα λεμφοκύτταρα των ασθενών που υποβάλλονται σε χρόνια περιοδική αιμοκάθαρση είναι διαταραγμένη, συμβάλλοντας έτσι στην γνωστή από πολλά έτη ανε-πάρκεια της επίκτητης ανοσίας των ασθενών αυτών. Ως ερέθισμα για την διέγερση των Τ-λεμφοκυττάρων χρησιμοποιή-θηκε η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB), διότι η δράση της εξαρτάται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και επιπλέον επειδή από το σύνολο των περιφερικών μονοπύρηνων του αίματος διεγείρει εκλεκτικά τα Τ-λεμφοκύτταρα. Επιπρόσθετα η αλληλεπίδραση που προ-καλεί μεταξύ του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου και του Τ-λεμφοκυττάρου μιμείται αυτήν που προκαλείται από την παρουσίαση των συμβατικών αντιγόνων από τα πρώτα κύτταρα στα δεύτερα. Τέλος, σε αντίθεση με τα συμβατικά αντιγόνα, η SEB διεγείρει μεγάλο ποσοστό των Τ-λεμφοκυττάρων. Εκτιμήθηκαν ο πολλαπλασιασμός των Τ-λεμφοκυττάρων σε καλ-λιέργεια PBMC πριν και μετά από διέγερση με SEB σε συγκεντρώσεις 1 ng/ml και 10 ng/ml για 48 ώρες. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός υπολογίστηκε με ανοσοενζυμική μέτρηση της ενσωμάτωσης βρωμοδε-οξυουριδίνης (BrdU) στο DNA των Τ-λεμφοκυττάρων. Επίσης εκτιμήθηκε η φωσφορυλίωση των υπολειμμάτων τυροσίνης των ITAMs (immunoreceptor tyrosine based activation motifs) της ζ-αλύσου του συμπλέγματος του υποδοχέα του αντιγόνου του Τ-λεμφοκυττάρου πριν και μετά από διέγερση με SEB σε συγκέντρωση 10μg/ml για 2 λεπτά. Η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου είναι το πρώτο γεγονός που ακολουθεί την επιτυχή παρουσίαση του αντιγόνου. Έτσι οποιαδήποτε διαταραχή στην παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγο-νοπαρουσιαστικά κύτταρα στα Τ-λεμφοκύτταρα αποτυπώνεται άμεσα στον βαθμό μεταβολής της φωσφορυλίωσης της ζ-αλύσου. Η εκτίμηση της φωσφορυλίωσης της ζ-αλύσου έγινε με ανοσοκαθήλωση της ζ-αλύσου και κατόπιν με SDS-ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτύπωση με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης τυροσίνης. Ετέθησαν αυστηρά κριτήρια για την ένταξη των ασθενών στην μελέτη με σκοπό τον περιορισμό πολλών παραγόντων που επηρεάζουν την επίκτητη ανοσία στον πληθυσμό αυτό. Όλοι οι ασθενείς αιμοκαθαί-ρονταν επαρκώς, με μεμβράνη διοξεικής κυτταρίνης και δια αρτηριο-φλεβικής αναστόμωσης. Είχαν τις επιθυμητές τιμές παραθορμόνης, φερριτίνης και κορεσμού τρανσφερρίνης. Ελάμβαναν ερυθροποιητίνη, αλλά όχι βιταμίνη D. Δεν είχαν μεταγγιστεί πρόσφατα, βρίσκονταν σε καλή κατάσταση θρέψης και ήταν μικρότεροι από 65 ετών. Φυσικά δεν έπασχαν από άλλα νοσήματα, ούτε ελάμβαναν φάρμακα που επη-ρεάζουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Έτσι εξετάστηκε κυρίως η επίδρασης της ουραιμίας ή/και της αιμοκάθαρσης. Στην μελέτη συμμετείχε μία κατά το δυνατό ομοιογενής ομάδα 30 αιμοκαθαιρόμενων ασθενών. Επίσης συμμετείχαν 20 υγιείς μάρτυρες. Αποτελέσματα: 1. Στην ομάδα των ασθενών η μέση πρόσληψη BrdU βρέθηκε 2,1 φορές υψηλότερη μετά από διέγερση με SEB σε συγκέντρωση 1ng/ml. Στην ομάδα των μαρτύρων η διέγερση με SEB αύξησε ακό-μα περισσότερο την πρόσληψη BrdU, κατά 3,6 φορές. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα μετά από διέγερση με SEB σε συγκέ-ντρωση 10ng/ml. 2. Στην ομάδα των υγιών μαρτύρων η μέση αύξηση της φωσφο-ρυλίωσης της ζ-αλύσου βρέθηκε 2,65 φορές υψηλότερη μετά από διέγερση με SEB. Αντίθετα τα Τ-λεμφοκύτταρα των αμοκαθαιρό-μενων ασθενών απέτυχαν να αυξήσουν την φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου. Μετά από διέγερση με SEB η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου ελαττώθηκε κατά 24% σε σχέση με τη φωσφορυλίωση χωρίς διέγερση με SEB. 3. Παρατηρήθηκε σημαντικού βαθμού φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου στα λεμφοκύτταρα των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών που δεν είχαν διεγερθεί με SEB. Το εύρημα αυτό αποτυπώθηκε σε κάθε film, αλλά η στατιστική επεξεργασία του δεν ήταν δυνατή λόγω του περιορισμένου αριθμού των δειγμάτων που μπορούν να ηλεκτροφο-ρηθούν ταυτόχρονα στην ίδια γέλη. 4. Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή της μεταβολής της φωσφορυ-λίωσης της ζ-αλύσου μετά από διέγερση με SEB και πολλών από τους παράγοντες που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την επίκτητη ανοσία στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στα αυστηρά κριτήρια που εφαρμόστηκαν για την ένταξη των ασθενών στη μελέτη. Συμπεράσματα: 1. Ο ελαττωμένος πολλαπλασιασμός των Τ-λεμφοκυττάρων στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς μετά από διέγερση με ένα απόλυτα εξαρτώμενο από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ερέθισμα, καταδεικνύει αφενός ότι η επίκτητη ανοσία είναι ανεπαρκής στον πληθυσμό αυτό και αφετέρου ότι μια διαταραχή στην παρουσίαση του αντιγόνου είναι πιθανόν υπεύθυνη. 2. Αυτή η ελαττωμένη απάντηση των Τ-λεμφοκυττάρων στους αιμοκα-θαιρόμενους ασθενείς φαίνεται ότι οφείλεται στην ελαττωμένη φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου. Η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου είναι το πρώτο γεγονός που ακολουθεί την επιτυχή παρουσίαση του αντιγόνου. Έτσι η ελαττωμένη φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου κατά-δεικνύει ότι η παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπα-ρουσιαστικά κύτταρα στα Τ-λεμφοκύτταρα είναι ανεπαρκής στον πληθυσμό αυτό. 3. Η σημαντικού βαθμού φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου στα λεμφο-κύτταρα των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών που δεν είχαν διεγερθεί με SEB καταδεικνύει ότι τα Τ-λεμφοκύτταρα των ασθενών αυτών είναι προενεργοποιημένα. Γεγονός που διαπιστώθηκε και σε άλλες μελέτες. Η προενεργοποίηση αυτή πιθανό να οδηγεί τα κύτταρα αυτά σε πρόωρη απόπτωση την στιγμή ακριβώς που πρέπει να δρά-σουν, δηλαδή κατά την επαφή με τους λοιμογόνους παράγοντες.