Improvement and Clinical Testing of the Method for Determining the Normalized Expression Levels of Bone Homeostasis Gene (COL1A1) and Vitamin D Receptor Gene (VDR) in Biological Material of Patients with Inflammatory Periodontal Diseases
Authors: Полуян О.С. , Костюк С.А. , Мельникова Т.Ю. , Юдина Н.А. 
Published: November 2023

Цель. Усовершенствование и клиническая апробация молекулярно-генетического метода определения уровней нормализованной экспрессии генов COL1A1 и VDR в биологическом материале пациентов с воспалительными заболеваниями периодонта. Материалы и методы. В исследование включено 123 образца биологического материала (соскоб клеток эпителия ротовой полости), в которых с использованием усовершенствованного метода ПЦР в реальном времени проводили определение уровней нормализованной экспрессии генов COL1A1 и VDR. Статистическая обработка данных проводилась с помощью SPSS 16 (SPSS Inc.). Все количественные данные имели непараметрическое распределение и представлены в виде значений медиан (Ме) с указанием 25/75 процентилей – Ме (25/75), сравнение независимых групп количественных переменных проводили с использованием критерия Манна – Уитни. Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принят уровень р<0,05. Результаты. В ходе исследования подобраны нуклеотидные последовательности пар праймеров и молекулярных зондов, меченных флуоресцентными красителями, оптимизированы состав амплификационной смеси и температурные профили реакции амплификации. Для нормализации использовали ген человека HPRT1. Усовершенствованный метод, основанный на использовании мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, специфических пар праймеров и зондов, можно использовать для одновременной амплификации таргетного гена (COL1A1 и VDR) и референсного гена HPRT1 при определении уровней нормализованной экспрессии указанных генов в биологическом материале пациентов с заболеваниями периодонта. Заключение. Проведенные молекулярно-генетические исследования с использованием усовершенствованного метода позволили получить количественные данные уровней нормализованной экспрессии генов COL1A1 и VDR в образцах биологического материала пациентов с воспалительными заболеваниями периодонта. С использованием непараметрических методов статистического анализа установлено отсутствие (p>0,05) статистически значимых достоверных различий в уровнях нормализованной экспрессии гена VDR, тогда как для гена COL1A1 такие различия установлены (p<0,05), за исключением групп 1-4, 2-3, 2-4 и 3-4.

Purpose. Improvement of the molecular genetic method for determining the normalized expression levels of the COL1A1 and VDR genes and its clinical approbation in the biological material of patients with inflammatory periodontal diseases. Materials and methods. The study included 123 samples of biological material (scraping of the epithelial cells of the oral cavity), in which, using an improved real-time PCR method, the levels of normalized expression of the COL1A1 and VDR genes were determined. Statistical data processing was carried out using SPSS 16 (SPSS Inc.). All quantitative data had a non-parametric distribution and are presented as median values (Me) indicating 25/75 percentiles: Me (25/75), comparison of independent groups of quantitative variables was performed using the Mann-Whitney test. The critical level of significance in testing statistical hypotheses was the level p<0.05. Results. In the course of the study, the nucleotide sequences of pairs of primers and molecular probes labeled with fluorescent dyes were selected, the composition of the amplification mixture and the temperature profiles of the amplification reaction were optimized. The human HPRT1 gene was used for normalization. An improved method based on the use of multiplex real-time PCR, specific pairs of primers and probes, can be used for simultaneous amplification of the target gene (COL1A1 and VDR) and the reference gene HPRT1 in determining the levels of normalized expression of these genes in the biological material of patients with periodontal diseases. Conclusion. Conducted molecular genetic studies using an improved method made it possible to obtain quantitative data on the levels of normalized expression of the COL1A1 and VDR genes in samples of biological material from patients with inflammatory periodontal diseases. Using non-parametric methods of statistical analysis, it was found that there were no (p>0.05) statistically significant differences in the levels of normalized expression of the VDR gene, then for the COL1A1 gene such differences were established (p<0.05), except for groups 1-4, 2-3, 2-4 and 3-4.