Η συμβολή της προεμφυτευτικής διάγνωσης αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή
Authors: Χριστοπίκου Δήμητρα 
Published: September 2021

Oι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ανευπλοειδίες) εντοπίζονται στο 50 % των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου στον άνθρωπο, οι περισσότερες από τις οποίες (70%) αφορούν στα χρωμοσώματα Χ, Υ, 13, 22, 16, 18, 21 και 15 (Hassold and Hunt, 2001;) (Spandorfer, Davis et al. 2004). Στην εξωσωματική γονιμοποίηση (Ιn vitro fertilization-IVF), το ποσοστό των ανευπλοειδιών στα έμβρυα, την τρίτη μέρα της in vitro ανάπτυξης τους, είναι συχνότερο (70%) από ότι στις αυτόματες αποβολές. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι έμβρυα που προκύπτουν με εξωσωματική γονιμοποίηση και παρουσιάζουν αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες απορρίπτονται αυτόματα λίγο πριν ή μετά την μεταφορά τους στη μήτρα, μειώνοντας τα ποσοστά εμφύτευσης (Verlinsky et al., 1996; Munne et al., 2002). Για το λόγο αυτό, η έγκαιρη διάγνωση και ο αποκλεισμός των ανευπλοειδικών εμβρύων από τη μεταφορά τους στη μήτρα της γυναίκας, που υποβάλλεται σε κύκλο τεχνητής γονιμοποίησης, μπορούν να βελτιώσουν τα ποσοστά κύησης. Επιπρόσθετα, η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση σε έμβρυα φορέων ισοζυγισμένων μεταθέσεων συντελεί στην αποφυγή μιας παθολογικής κυήσεως.Αρχικά, ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η τυποποίηση της μεθοδολογίας μονιμοποίησης πυρήνα στο επίπεδο του ενός κυττάρου έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τους σκοπούς της προεμφυτευτικής διάγνωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Για την ανάπτυξη της μεθοδολογίας χρησιμοποιήθηκαν 50 προέμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης τα οποία παραχωρήθηκαν στην έρευνα ύστερα από ενυπόγραφη συγκατάθεση ζευγαριών που υποβάλλονται σε κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης. Το τροποποιημένο πρωτόκολλο του Tarkowski (Tarkowski and Wronska-Nofer 1966) με τη χρήση Carnoy’s (3:1 μεθανόλη:οξικό οξύ) επιλέχθηκε για να εφαρμοστεί κλινικά ως αρτιότερο, επειδή οι πυρήνες που μονιμοποιήθηκαν είχαν μεγαλύτερη διάμετρο και μικρότερο ποσοστό επικαλυπτόμενων σημάτων FISH, σε σχέση με το πρωτόκολλο κατά Coonen (Coonen, Dumoulin et al. 1994) με Tween-20 HCl. Μετά τον καθορισμό των πειραματικών παραμέτρων για τη μονιμοποίηση του ενός κυττάρου εφαρμόστηκε η τεχνική του φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) για τη χρωμοσωμική ανάλυση επειδή μπορεί να εφαρμοστεί σε μεσοφασικούς πυρήνες. Η αναλυτική ευαισθησία και η ειδικότητα της τεχνικής του φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) εξετάστηκε σε 34 προέμβρυα και ανήλθε στο 83.3% και 91%, αντίστοιχα. Το ποσοστό λανθασμένης διάγνωσης λόγω τεχνικού προβλήματος ήταν 3%. Ο μωσαϊκισμός στο στάδιο της αυλάκωσης υπολογίσθηκε στο 8.37% με αποτέλεσμα να υπάρχει κίνδυνος να χαρακτηριστεί ένα παθολογικό έμβρυο ως φυσιολογικό ή το αντίστροφο.Στη δεύτερη φάση μελετήθηκαν 4442 έμβρυα και αντίστοιχα βλαστομερίδια, χρησιμοποιώντας την τεχνική του FISH. Από τα 4442 έμβρυα που αναλύθηκαν τα 496 κρίθηκαν ακατάλληλα για εμβρυομεταφορά ύστερα από τον έλεγχο στο στάδιο της τρίτης ημέρας μετά τη γονιμοποίηση και επανεξετάσθηκαν την πέμπτη ημέρα προκειμένου να υπολογισθεί η αποδοτικότητα της μεθοδολογίας. Η επανεξέταση, στο στάδιο της βλαστοκύστης, έδειξε ότι 14.6% και 3.7% των εμβρύων διαγνώστηκαν ψευδώς ως ευπλοειδικά και ανευπλοειδικά αντίστοιχα ύστερα από την ανάλυση του ενός κυττάρου. Παράλληλα, οι συγκεκριμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν στο στάδιο της αυλάκωσης επιβεβαιώθηκαν μόλις στο 34% των εμβρύων στο στάδιο της βλαστοκύστης. Ο μωσαϊκισμός αποτέλεσε τη σημαντικότερη δυσκολία στην εξαγωγή έγκυρων αποτελεσμάτων κατά την ανάλυση του ενός κυττάρου. Για το λόγο αυτό τα έμβρυα με ‘’καρυότυπο’’ ταυτόσημο με αυτόν που ανιχνεύθηκε στον προεμφυτευτικό έλεγχο στο επίπεδο του ενός κυττάρου, ήταν λίγα. Στη τρίτη φάση της μελέτης εξετάστηκαν 347 έμβρυα τρίτης ημέρας εκ των οποίων τα 121 προήλθαν από άτομα με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στον καρυότυπο με την τεχνική των μικροσυστοιχιών DNA (arrayCGH) για την ανάλυση του συνόλου των χρωμοσωμάτων (Gutierrez-Mateo, Colls et al. 2011). Από τη σύγκριση των δυο μεθοδολογιών χρωμοσωμικής ανάλυσης (FISH και arrayCGH), το περιθώριο λάθους λόγω τεχνικού σφάλματος ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στην περίπτωση της εφαρμογής του FISH (11.4%) σε σχέση με το arrayCGH (4.5%). Η συχνότητα των φυσιολογικών εμβρύων στους φορείς ισοζυγισμένων μεταθέσεων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική ανάμεσα στα δυο φύλα, αν και τα ποσοστά κλινικών κυήσεων ήταν μεγαλύτερα στην περίπτωση που οι φορείς ήταν γυναίκες (♀ 12/26, 46%, ♂ 9/22, 41%), πιθανώς λόγω της επίδρασης των ισοζυγισμένων μεταθέσεων στην ανδρική γονιμότητα. Συνολικά, ο 2:2 εναλλασσόμενος και ο παρακείμενος-1 ήταν οι κυρίαρχοι τύποι κατά το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στην πρώτη μειωτική διαίρεση. Ο διαχωρισμός 3:0 ήταν ο σπανιότερος. Η συχνότητα του 2:2 εναλλασσόμενου διαχωρισμού που οδηγεί σε φυσιολογικούς γαμέτες ήταν μικρότερη όταν στις αμοιβαίες και ισοζυγισμένες μεταθέσεις εμπλέκονταν ακροκεντρικά χρωμοσώματα, γεγονός που οφείλεται στο ότι τα ακροκεντικά είναι λιγότερο σταθερά από τα μετα- και υπομετακεντρικά χρωμοσώματα κατά τη διάρκεια διαχωρισμού τους στη μείωση. Παράλληλα, προς αποφυγή της λανθασμένης διάγνωσης λόγω του μωσαϊκισμού εξετάστηκε η ακρίβεια της χρωμοσωμικής ανάλυσης σε 104 πολικά σωμάτια ως προς το επίπεδο της αντιπροσώπευσης της ευπλοειδίας/ανευπλοειδίας του εμβρύου. Η χρωμοσωμική ανάλυση των πολικών σωματίων έδειξε ότι είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος ανίχνευσης ανευπλοειδιών μητρικής προέλευσης που προκύπτουν στη μείωση. Η επανεξέταση των 30 εκ των 52 αναλυθέντων ωαρίων έδειξε ότι αξιολογήθηκαν αληθώς ως ανευπλοειδικά βάσει της χρωμοσωμικής ανάλυσης των πολικών σωματίων. Συγκεκριμένα ανιχνεύθηκαν 74 συνολικά ανευπλοειδίες εκ των οποίων οι 29 ήταν τρισωμίες και οι 45 μονοσωμίες. Οι 69 από αυτές (69/74, 93%) σχετίστηκαν με χρωμοσωμικές αλλαγές στα πολικά σωμάτια και θεωρήθηκαν μητρικής προέλευσης ενώ οι 5 (7%) που δεν ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια θεωρήθηκαν πατρικής ή μιτωτικής προέλευσης. Οι 68 από τις 69 (98.5%) ανευπλοειδίες μητρικής προέλευσης για συγκεκριμένα χρωμοσώματα επιβεβαιώθηκαν στα 30 επανεξεταζόμενα έμβρυα.Εντούτοις, οι ανευπλοειδίες συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων που δεν ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια αποτέλεσαν το 17% των επανεξεταζόμενων εμβρύων, γεγονός που αποδόθηκε κυρίως σε λάθη κατά τον πολλαπλασιασμό ολόκληρου του γονιδιώματος. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την αναγκαιότητα βελτίωσης της τεχνικής arrayCGH για την αρτιότερη εφαρμογή της σε κλινικό επίπεδο.Ο πρώιμος διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων ήταν ο συχνότερος τύπος (37/38, 97%) που οδήγησε σε ανευπλοειδία στη πρώτη μειωτική διαίρεση, γεγονός που πιθανά να οφείλεται στην αδυναμία ενεργοποίησης και τον σταδιακό εκφυλισμό των συγκολλητίνων-cohesins- σύμπλεγμα πρωτεϊνών που συνδέει τα ομόλογα χρωμοσώματα των ωαρίων κατά το στάδιο της πρόφασης στην εμβρυϊκή ωοθήκη πριν τη γέννηση. Η επανεξέταση των εμβρύων έδειξε ότι το 50% του πρώιμου διαχωρισμού των αδελφών χρωματίδων στην πρώτη μειωτική διαίρεση (MI) ισοζυγίσθηκαν στη δεύτερη (MII) (19/37,51%) οδηγώντας σε ευπλοειδικά έμβρυα. Στη συγκεκριμένη μελέτη το ποσοστό των διπλασιασμών ήταν διπλάσιο σε σύγκριση με τα ελλείμματα των χρωματίδων στο δεύτερο πολικό σωμάτιο (PB2) οδηγώντας σε αύξηση των μονοσωμιών στα αντίστοιχα έμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης.Αναλύοντας τα δυο πολικά σωμάτια στα γονιμοποιημένα ωάρια γυναίκας που έφερε ισοζυγισμένη και αμοιβαία μετάθεση στον καρυότυπο φάνηκε ότι το πρώτο (PB1) και το δεύτερο πολικό σωμάτιο (PB2) ήταν μη ισοζυγισμένα και αντίστροφα ως προς τη μετάθεση στο 55% των αναλυθέντων ωαρίων. Το εύρημα αυτό δεν έχει βιβλιογραφική παραπομπή και είναι αποτέλεσμα μονού αριθμού χιασμάτων σε κοντινό στη μετάθεση τμήμα του ενός χρωμοσώματος κατά τον εναλλασσόμενο ή τον παρακείμενο-1 διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στην πρώτη μειωτική διαίρεση MI. Από το συγκεκριμένο περιστατικό φάνηκε ότι η ανάλυση της μετάθεσης είναι εφικτή μόνο μέσω της ανάλυσης και των δυο πολικών σωματίων. Στη παρούσα μελέτη φάνηκε ότι:Α) Η χρωμοσωμική ανάλυση του ενός κυττάρου με την τεχνική του FISH στο στάδιο της αυλάκωσης σε ένα κύτταρο μπορεί να διακρίνει το παθολογικό, αλλά όχι τον ακριβή γονότυπο. Β) Από τη σύγκριση των δυο μεθοδολογιών χρωμοσωμικής ανάλυσης, το περιθώριο λάθους λόγω τεχνικού σφάλματος ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στην περίπτωση της εφαρμογής του FISH σε σχέση με το arrayCGH.Γ) Η συχνότητα των φυσιολογικών εμβρύων στους φορείς ισοζυγισμένων μεταθέσεων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική ανάμεσα στα δυο φύλα, αν και τα ποσοστά κλινικών κυήσεων ήταν πολύ υψηλότερα στην περίπτωση που οι φορείς ήταν γυναίκες. Ο εναλλασσόμενος είχε μικρότερη συχνότητα στις γυναίκες ως τύπος διαχωρισμού. Η συχνότητα φυσιολογικών γαμετών ήταν μικρότερη όταν στις αμοιβαίες μεταθέσεις συμμετείχαν ακροκεντρικά χρωμοσώματα, γεγονός που μπορεί να οφείλεται στο ότι τα ακροκεντικά είναι λιγότερο σταθερά από τα μετα- και τα υπομετακεντρικά χρωμοσώματα στη διάρκεια του διαχωρισμού τους στη μείωση. Δεν παρατηρήθηκε μείωση στη συχνότητα των ισοζυγισμένων εμβρύων στην περίπτωση που τα σημεία θραύσης των μεταθέσεων ήταν κοντά στα τελομερίδια. Δ) Η ανάλυση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών στο ωάριο είναι αξιόπιστη όταν αναλύονται και τα δυο πολικά σωμάτια. Από την επανεξέταση των εμβρύων στο στάδιο της αυλάκωσης φάνηκε ότι τα έμβρυα αληθώς κρίθηκαν ως ανευπλοειδικά βάσει της χρωμοσωμικής ανάλυσης των πολικών σωματίων. Οι ανευπλοειδίες μητρικής προέλευσης, που ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια, αποτέλεσαν το 93% των ανευπλοειδιών στα έμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης. Το 98.5% των ανευπλοειδιών μητρικής προέλευσης για συγκεκριμένα χρωμοσώματα που ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια επιβεβαιώθηκαν στα 30 επανεξεταζόμενα έμβρυα. Ωστόσο, 17 (17%) αριθμητικές αλλαγές χρωμοσωμάτων στα πολικά σωμάτια δεν επιβεβαιώθηκαν στα αντίστοιχα έμβρυα, γεγονός που θα πρέπει να αναφέρεται στη συμβουλευτική των γυναικών που υπεισέρχονται σε κύκλο εξωσωματικής γονιμοποίησης σε συνδυασμό με την ανάλυση των πολικών σωματίων των ωαρίων τους. Το ψευδώς θετικό αποτέλεσμα σε ένα ή και στα δυο πολικά σωμάτια αποδόθηκε κυρίως σε σημαντικά μικρότερο ποσοστό λογαριθμικών μετατοπίσεων σε σχέση με αυτό που αναμένεται για ολόκληρα χρωμοσώματα ή χρωματίδες σε γραφήματα μικροσυστοιχιών DNA. Γι’αυτό αν και η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών DNA έχει βελτιωθεί τελευταία τα τεχνικά λάθη εξακολουθούν να προκύπτουν από τον πολλαπλασιασμό όλου του γονιδιώματος. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την αναγκαιότητα της βελτίωσης της τεχνικής για την αρτιότερη εφαρμογή της σε κλινικό επίπεδο.Ε) Ο πρώιμος διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων ήταν ο κυρίαρχος μηχανισμός που οδήγησε σε ανευπλοειδίες στη διάρκεια των δυο μειωτικών διαιρέσεων και επικρατεί στα ωάρια γυναικών προχωρημένης ηλικίας. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να είναι αποτέλεσμα της παρατεταμένης έκθεσης των χρωμοσωμάτων στο στάδιο της δικτυοταινίας στην πρώτη μειωτική διαίρεση.Η) Η χρωμοσωμική ανάλυση των πολικών σωματίων με την τεχνική arrayCGH συμβάλει στην αναγνώριση των ωαρίων που δίνουν είτε μη βιώσιμα έμβρυα λόγω σύνθετων χρωμοσωμικών ανωμαλιών είτε έμβρυα με ανευπλοειδίες που μπορεί να οδηγήσουν σε αποβολή, γεγονός σημαντικό για την συμβουλευτική των γυναικών όσον αφορά τη πιθανότητα βιώσιμης κύησης σε επόμενους κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης (ΙVF) χρησιμοποιώντας τα δικά τους ωάρια. Συνεπώς, η βιοψία στο στάδιο των ωαρίων με τη λήψη των πολικών σωματίων, αντί του σταδίου της αυλάκωσης, σε συνδυασμό με την ανάλυση του συνόλου των χρωμοσωμάτων μπορεί να αποτελέσουν στο μέλλον τον εναλλακτικό τρόπο της ανίχνευσης ανευπλοειδιών στα έμβρυα. Για τον σκοπό αυτό απαιτείται βέβαια και η προοπτική μελέτη μεγάλου αριθμού κύκλων με ή χωρίς προεμφυτευτικό έλεγχο με την μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στην παρούσα εργασία, έτσι ώστε να καταδειχθεί η συνεισφορά της στα ποσοστά κυήσεων.