Μελέτη της σηματοδοτικής οδού mTOR στα κακοήθη νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων
Authors: Διαμαντή Σμαράγδα 
Published: September 2021

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Τα νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων προσβάλλουν τους μείζονες ή τους ελάσσονες αδένες και αποτελούν το 3.0-6.5% του συνόλου των νεοπλασμάτων της κεφαλής και του τραχήλου. Αποτελούν μια ετερογενή ομάδα νεοπλασμάτων με άγνωστη αιτιοπαθογένεια, ευρύ φάσμα ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών και ποικίλη βιολογική συμπεριφορά.Η οδός σηματοδότησης mTOR ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και άλλες σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου. Η mTOR ενεργοποιείται από ανιόντα μόρια, όπως το Akt, και με τη σειρά της ενεργοποιεί σημαντικά μόρια στόχους, όπως η S6K1 και η 4EBP1. Η φωσφορυλίωση της S6K1 οδηγεί στην φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (συστατικού της ριβοσωμικής υπομονάδας 40S), ενώ η φωσφορυλίωση της 4EBP1 επάγει την απελευθέρωσή του παράγοντα eIF4E, επιτρέποντας την εκκίνηση της μετάφρασης.Η σηματοδοτική οδός mTOR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ποικίλων νεοπλασμάτων, καθιστώντας το μόριο mTOR ελκυστικό αντικαρκινικό θεραπευτικό στόχο. Έχουν εντοπισθεί αρκετές δυσλειτουργίες των μορίων της σηματοδοτικής οδού mTOR σε διάφορα είδη καρκίνου, όπως μαστού, προστάτη, πνεύμονα, ουροδόχου κύστεως, ωοθηκών, παγκρέατος και κεφαλής- τραχήλου. Παρά τον αποδεδειγμένο ογκογενετικό της ρόλο, η ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού mTOR σε νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού mTOR στα νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ανοσοϊστοχημική έκφραση σημαντικών κομβικών ανιόντων και κατιόντων μορίων της οδού mTOR σε καλοήθεις όγκους (πλειόμορφα αδενώματα) και σε διάφορους τύπους κακοηθειών των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (φυσιολογικοί ελάσσονες σιαλογόνοι αδένες). ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 39 περιπτώσεις κακοήθων νεοπλασμάτων των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων ποικίλων ιστοπαθολογικών υποτύπων, οι οποίες συγκρίθηκαν με 13 περιπτώσεις καλοήθων όγκων (πλειομόρφων αδενωμάτων) των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων και 8 περιπτώσεις φυσιολογικών ελασσόνων σιαλογόνων αδένων. Όλες οι παραπάνω περιπτώσεις συλλέχθηκαν από το Αρχείο του Ιστοπαθολογικού Εργαστήριο της Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών.Καταγράφηκαν οι διαθέσιμες πληροφορίες από τα τα παραπεμπτικά και τις ιστοπαθολογικές εκθέσεις, συμπεριλαμβάνοντας τα δημογραφικά (ηλικία, φύλο) και κλινικά στοιχεία όλων των περιπτώσεων και έγινε επιβεβαίωση της ιστοπαθολογικής διάγνωσης με επανεξέταση - επαναξιολόγηση των πλακιδίων αιματοξυλίνης- ηωσίνης, χρησιμοποιώντας τα κριτήρια του WHO 2005 για την ταξινόμηση των όγκων των σιαλογόνων αδένων.Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης συγκεκριμένων μορίων της οδού mTOR σε τομές από τους κύβους παραφίνης όλων των περιπτώσεων, χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο σύστημα ανοσοϊστοχημείας και τα παρακάτω αντισώματα: phospho-AKT (Ser473), 4E-BP1, phospho-4E-BP1 (Thr37/46), S6 RibosomalProtein, phospho-S6 RibosomalProtein (Ser235/236) και eIF4E. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση όλων των αντισωμάτων αξιολογήθηκε με ημιποσοτικό τρόπο, σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: (0) 0%, (1) <20%, (2) 20-50% and (3) >50%, και την ένταση της χρώσης: (0), καθόλου χρώση, (1) ασθενής χρώση, (2) μέτρια χρώση, (3) έντονη χρώση. Επιπλέον υπολογίσθηκε το συνολικό άθροισμα (0, 2-6), ως το άθροισμα των βαθμών του ποσοστού και της έντασης.Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση με αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημικών αποτελεσμάτων (ποσοστό, ένταση, συνολικό άθροισμα) για όλα τα μόρια στο σύνολο των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων και της ομάδας ελέγχου με τις μη παραμετρικές δοκιμασίες Kruskal-Wallis και Mann-Whitney’s. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε η μη παραμετρική στατιστική δοκιμασία Spearman’stest για τη συσχέτιση της έκφρασης των μορίων. Όλα τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά στο επίπεδο p≤0,05.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ανοσοϊστοχημική έκφραση της 4EBP1 και της p4EBP1Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της 4EBP1 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική και σπανίως πυρηνική και παρατηρήθηκε στο 100% των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων και στο 87,5% της ομάδας ελέγχου.Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,67, 2,31 και 4,97 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,77, 1,54 και 3,31 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 1,38, 0,88 και 2,25 στην ομάδα ελέγχου. Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων (p<0,05), κακοήθων νεοπλασμάτων και ομάδας ελέγχου (p<0,05) και καλοήθων νεοπλασμάτων και ομάδας ελέγχου (p<0,05).Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της p4EBP1 ήταν κυτταρο-πλασματική και πυρηνική και παρατηρήθηκε στο 97,4% των κακοήθων νεοπλασμάτων και στο 100% των καλοήθων νεοπλασμάτων, ενώ ήταν αρνητική σε όλες τις περιπτώσεις της ομάδας ελέγχου. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,59, 2,05 και 4,64 στα κακοήθη νεοπλάσματα και 1,69, 1,38 και 3,08 στα καλοήθη νεοπλάσματα. Ο στατιστικός έλεγχος έδειξε υψηλότερες τιμές στα κακοήθη νεοπλάσματα συγκρινόμενα με τα καλοήθη (p<0,05) και τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες(p<0,05), όπως επίσης και στα καλοήθη σε σχέση με τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες (p<0,05).Ανοσοϊστοχημική έκφρασητης S6 και της pS6Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της S6 ήταν κυτταροπλασματική και παρατηρήθηκε σε ποσοστό 100% στα κακοήθη νεοπλάσματα, 92,3% στα καλοήθη και 37,5% στους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες.Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,46, 2,15 και 4,62 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,54, 1,77 και 3,31 στα καλοήθη και 0,63, 0,50 και 1,13 στους φυσιολογικούς αδένες.Παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων (p<0,05) και το συνολικό άθροισμα (p<0,05) μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων. Επίσης, στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν για όλες τις παραμέτρους (ποσοστό, ένταση και συνολικό άθροισμα) μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05) , όπως επίσης και μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της pS6 ήταν κυτταροπλασματική και ανιχνεύθηκε στο 95% των κακοήθων και 76,9% των καλοήθων νεοπλασμάτων. Στους φυσιολογικούς ελάσσονες αδένες, η έκφραση της pS6 υπήρξε αρνητική σε όλες τις μελετώμενες περιπτώσεις. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,31, 2,8 και 4,59 στα κακοήθη και 0,92, 0,85 και 1,77 στα καλοήθη νεοπλάσματα. Στατιστικά σημαντικά διαφορές διαπιστώθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων (p<0,05), όπως επίσης και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05) και μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05).Ανοσοϊστοχημική έκφραση της pAKTΗ ανοσοϊστοχημική έκφραση της pΑΚΤ ήταν κυρίως κυτταροπλασματική και διαπιστώθηκε σε ποσοστό 100% των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων και σε ποσοστό 75% των φυσιολογικών ελασσόνων σιαλογόνων αδένων. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,69, 2,38 και 5,08 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 2,23, 2,00 και 4,23 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 1,10, 1,00 και 2,10 στους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες.Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων όσο αφορά στο ποσοστό θετικών κυττάρων (p<0,05) και στο συνολικό άθροισμα (p<0,05), όπως και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών αδένων(p<0,05) ή καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών αδένων (p<0,05) για όλες τις μελετώμενες περιπτώσεις.Ανοσοϊστοχημική έκφραση της eIF4EΗ ανοσοϊστοχημική έκφραση της eIF4E ήταν κυτταροπλασματική. Διαπιστώθηκε θετική στο 76,9% των κακοήθων νεοπλασμάτων, στο 69,2% των καλοήθων νεοπλασμάτων και σε μία μόνο περίπτωση (12,5%) της ομάδας ελέγχου. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 1,18, 1,23 και 2,41 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,08, 1,15 και 2,23 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 0,13, 0,13 και 0,25 στους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων. Αντίθετα, στατιστικά σημαντικές διαφορές καταγράφηκαν μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05), όπως επίσης και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05). ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Παρά τον αποδεδειγμένο ογκογενετικό ρόλο της mTOR σηματοδότησης, λίγες δημοσιευμένες ερευνητικές εργασίες αναφέρονται στην ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού mTOR σε νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση κομβικής σημασίας συστατικών της οδού mTOR σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα ελασσόνων σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκαν τα επίπεδα τόσο ανιόντων ρυθμιστών (pAKT), όσο και κατιόντων μορίων-στόχων (4EBP1, S6 και eIF4E) και διαπιστώθηκε η έκφραση και ενεργοποίησή τους σε όγκους των σιαλογόνων αδένων. Παρατηρήθηκε ότι τα μελετώμενα μόρια εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα στα νεοπλάσματα (καλοήθη και κακοήθη) των σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες, όπως επίσης και στα κακοήθη νεοπλάσματα σε σύγκριση με τα καλοήθη. Η προοδευτική αυτή αύξηση της έκφρασης και ενεργοποίησης της mTOR σηματοδότησης από τους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες προς τα κακοήθη νεοπλάσματα αποτελεί ισχυρή ένδειξη συμμετοχής στις ογκογόνες διεργασίες του αδενικού επιθηλίου. Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση για τον καθορισμό mTOR-σχετιζόμενων προγνωστικών δεικτών και θεραπευτικών στόχων που ενδεχομένως λαμβάνουν μέρος στην ογκογένεση των νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων