Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός ουσιών που μεταβάλλουν τα επίπεδα H2S
Authors: Ασημακοπούλου Αντωνία 
Published: September 2021

Το υδρόθειο (H2S), είτε ενδογενώς παραγόμενο είτε εξωγενώς χορηγούμενο (μέσω«δοτών»), αποτελεί ένα σηματοδοτικό μόριο, με πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές βιολογικές δράσεις. Το H2S επηρεάζει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως τη ρύθμιση του αγγειακού τόνου, την αγγειογένεση και τη νευροδιαβίβαση, αλλά απορρύθμιση της παραγωγής του μπορεί να οδηγήσει και σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, καρκίνο, κυκλοφορικές καιενδοκρινικές διαταραχές. Η βιοσύνθεσή του γίνεται από ένζυμα του μεταβολισμούτης L-κυστεΐνης, τη β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β synthase, CBS)και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ lyase, CSE) καθώς και από το ένζυμο σουλφοτρανσφεράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-mercaptopyruvatesulphurtransferase, 3MST). Τα δύο πρώτα ένζυμα χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα τοαμινοξύ L-κυστεΐνη ή/και την ομοκυστεΐνη και η δράση τους εξαρτάται από το συνένζυμο φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal-5’-phosphate, PLP). Το ένζυμο 3MSTκαταλύει την αντίδραση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό και H2S.Η επαρκής τεκμηρίωση του ρόλου του υδροθείου στη φυσιολογία και παθολογία,αλλά και η εξακρίβωση των μηχανισμών δράσης του, δυσχεραίνεται από την έλλειψη των απαραίτητων φαρμακολογικών εργαλείων, όπως πχ εκλεκτικών αναστολέων καθενός από τα τρία ένζυμα της βιοσύνθεσής του ή ενεργοποιητών της ενδογενούς παραγωγής, δηλ. διακριτών απο τους δότες H2S.Για να καλύψουμε αυτό το σημαντικό κενό, στην παρούσα διατριβή αρχικά μελετήσαμε in vitro σε απομονωμένα ένζυμα, νέες ενώσεις που συντέθηκαν βάσει σχεδιασμού ως πιθανοί αναστολείς για τα ένζυμα CBS και CSE, αλλά και εμπορικά διαθέσιμες ουσίες από τη βιβλιοθήκη 1280 ενώσεων LOPAC (Library ofPharmacologically Active Compounds), ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουντα ένζυμα βιοσύνθεσης του υδροθείου. Στη συνέχεια έγινε πιο εκτεταμένος φαρμακολογικός χαρακτηρισμός επιλεγμένων ενώσεων για τυχόν εκλεκτική ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS, CSE και 3MST.Από τη μελέτη μας βρέθηκε πως οι νεοσυντεθείσες ενώσεις Hydrazino-glycine καιHydrazino-L-alanine, αν και με περιορισμένη εκλεκτικότητα, αναστέλλουν τα ένζυμαCBS και CSE, και θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως αρχικές ενώσεις για τον σχεδιασμό ακόμη πιο εκλεκτικών φαρμακολογικών αναστολέων των ενζύμων αυτών.Στις in vitro δοκιμές μας παρατηρήθηκε επίσης, ότι η ένωση Aminoethoxyvinylglycine(AVG) αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυμο CSE έναντι του CBS με IC50: 1,0 ±0,1μΜ, γεγονός που την καθιστά ως τον πιο δραστικό και εκλεκτικό ταυτοχρόνως αναστολέα του ενζύμου CSE που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα. Επίσης, από τα αποτελέσματα της σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC, προέκυψαν μερικές ενώσεις(hits) ως εν δυνάμει αναστολείς, οι οποίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως βάση για τη σύνθεση αναλόγων ή νέων ουσιών που να έχουν εκλεκτικά ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS ή 3ΜSΤ. Βάσει των ευρημάτων μας, η δοξυκυκλίνη και ηδεμεκλοκυκλίνη μπορεί να θεωρηθούν ως χρήσιμοι, σε μικρές συγκεντρώσεις εκλεκτικοί, αναστολείς του ενζύμου 3ΜSΤ, για το οποίο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επαρκώς χαρακτηρισμένοι εκλεκτικοί αναστολείς. Από εκτενή μελέτη άλλων τετρακυκλινών δεν προέκυψαν άλλα μόρια με παρόμοια δραστικότητα.Θέλοντας να ερευνήσουμε την επίδραση σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες της τροποποίησης των επιπέδων του ενδογενώς παραγόμενου υδροθείου,χρησιμοποιήσαμε την S-αδενόσυλο-L-μεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM),έναν αλλοστερικό ενεργοποιητή του ενζύμου CBS, και την εξετάσαμε σε σχέση μετον έλεγχο του πολλαπλασιασμού σε φυσιολογικά και καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου. Διαπιστώσαμε πως, σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0,1-1mM), σε έκθεση 12 ωρών, η SAM επάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων HCT116, τα οποία υπερεκφράζουν το CBS, ενώ σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS, όπως τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου NCM356, και σε HCT116 κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσω shRNA) το ένζυμο CBS, η SAM δεν επάγει τον πολλαπλασιασμό. Αντιθέτως, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (3mM) και μεγαλύτερης διάρκειας έκθεση (12-24h), η SAM παρουσιάζει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό, η οποία μάλιστα διατηρείται και στα NCM356 κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS και σε κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσωshRNA) το CBS. Επομένως, συμπεραίνουμε πως η αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τη SAM (χαμηλές συγκεντρώσεις) εξαρτάται από την αυξημένη παρουσία και ενεργότητα του CBS, ενώ οι ανασταλτικές δράσεις της πιθανόν οφείλονται σε μηχανισμούς ανεξάρτητους από το μονοπάτι CBS/H2S.Συνολικά, η παρούσα εργασία κατέληξε α) στην αναγνώριση και χαρακτηρισμό συγκεκριμένων μοριακών δομών, μεταξύ αυτών και γνωστών φαρμάκων, των τετρακυκλινών, ως υπό συγκεκριμένες συνθήκες εκλεκτικών αναστολέων των ενζύμων παραγωγής του υδροθείου, με δυνατότητα βελτιστοποίησης της δράσης και εκλεκτικότητάς τους στο μέλλον, και β) στον εκτενή χαρακτηρισμό του ρόλου του ενζύμου CBS, μέσω της χρήσης του αλλοστερικού ενεργοποιητή SAM, στην αύξηση των καρκινικών κυττάρων του κόλου που υπερεκφράζουν το ένζυμο αυτό.