Σχέσεις δομής - λειτουργίας και εξέλιξης στους μεταφορείς πουρινών της οικογένειας NAT/NCS2
Authors: Μπότου Μαρία 
Published: September 2021

Στην παρούσα Διατριβή μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας και εξέλιξης στους μεταφορείς πουρινών της οικογένειας NAT/NCS2 και ειδικότερα στόχοι της εργασίας αυτής ήταν α) ο λειτουργικός χαρακτηρισμός νέων ομολόγων της οικογένειας από την Escherichia coli K-12 και το Sinorhizobium meliloti 1021 και β) η μελέτη με στοχευμένη μεταλλαξιγένεση σε ζεύγη κοντινών ομολόγων με διακριτές εξειδικεύσεις του ρόλου των καταλοίπων στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης και η εύρεση καθοριστών εξειδίκευσης στην περιοχή αυτή. Τα ομόλογα NAT/NCS2 που μελετήθηκαν είναι τα RutG (COG2233) και PurP, YicO, YjcD και YgfQ (COG2252) από την Escherichia coli και SmLL9, SmLL8, SmX28 (COG2233), SmVC3 και SmYE1 (COG2252) από το αζωτοδεσμευτικό ριζοβακτήριο Sinorhizobium meliloti. Ιδιαίτερα για το S.meliloti παρουσιάζονται δεδομένα που συνεισφέρουν στην κατανόηση του πιθανού φυσιολογικού ρόλου ενός από τα ομόλογα που μελετήθηκαν (SmLL9) στην συμβιωτική αζωτοδέσμευση. Για τον μεταφορέα ξανθίνης και ουρικού οξέος SmLL9 βρέθηκε ότι είναι υπεύθυνος για την πρόσληψη της ξανθίνης σε εργαστηριακές καλλιέργειες κυττάρων του S.meliloti που αυξάνονται με ξανθίνη ως πηγή αζώτου, μια παρατήρηση που υποδεικνύει ότι μπορεί να έχει ανάλογο σημαντικό ρόλο και στα συμβιωτικά φυμάτια που σχηματίζει ο S.meliloti στις ρίζες των ψυχανθών. Η μελέτη με στοχευμένη μεταλλαξιγένεση έδειξε ότι υπάρχουν θέσεις πολύ σημαντικές για την λειτουργία όλων των μεταφορέων της οικογένειας ανεξάρτητα από την εξειδίκευσή τους και συγκεκριμένα οι θέσεις E241 (TM8) και E290 (TM10) (αρίθμηση σύμφωνα με τον UraA) που συμμετέχουν άμεσα στην πρόσδεση του υποστρώματος (ουρακίλης) με δεσμούς υδρογόνου, είναι αναντικατάστατα σε όλη την οικογένεια NAT/NCS2. Πολύ σημαντικό ρόλο έχει η Asp/His-245 (TM8) για την οποία στους μεταφορείς ξανθίνης ή ξανθίνης/ουρικού όπου συντηρείται ως Asp (D276 στον XanQ, απαραίτητη η καρβοξυλομάδα για υψηλή ενεργότητα) παρουσιάσθηκαν ενδείξεις (από την ανάλυση της εξάρτησης της ενεργότητας από το pH) ότι ίσως επηρεάζει την πρωτονίωση-αποπρωτονίωση της καρβοξυλομάδας Ε241 (ΤΜ8) (Ε272 στον XanQ) επιδρώντας έμμεσα στη δέσμευση και/ή συμμεταφορά του πρωτονίου με το υπόστρωμα. Στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης βρέθηκαν θέσεις που καθορίζουν την εξειδίκευση των μεταφορέων συγκεκριμένων κλάδων και εξειδικεύσεων της οικογένειας. Στους μεταφορείς ξανθίνης ή/και ουρικού οξέος (COG2233) σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση έχει η θέση Ser/Thr/Asn-93 του TM3, η οποία συμμετέχει σε ένα δίκτυο δεσμών υδρογόνου που περιλαμβάνει και τη θέση E262/272 (TM8) που αλληλεπιδρά άμεσα με το υπόστρωμα στην ιμιδαζολική πλευρά και αλλαγές στη θέση του ΤΜ3 επηρεάζουν καταλυτικά αυτήν την αλληλεπίδραση. Στους μεταφορείς πυριμιδινων καθοριστική για την ευρύτερη εξειδίκευση του RutG μπορεί να είναι η Phe-73/Ala-88. Πιθανώς η φαινυλαλανίνη στη θέση F73 εμποδίζει την κατάλληλη διευθέτηση της θυμίνης στο κέντρο δέσμευσης λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης με την μεθυλομάδα στη θέση C5 του πυριμιδινικού δακτυλίου. Από την μεταλλαξιγένεση του rSNBT1, τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι καθοριστική για τη διάκριση ή μη μεταξύ πυριμιδινών και πουρινών στο κέντρο δέσμευσης μπορεί να είναι η θέση E397 (TM10) ενώ στην ομάδα COG2252 καθοριστές εξειδίκευσης στην περιοχή του προβλεπόμενου κέντρου δέσμευσης δεν βρέθηκαν. Από τα αποτελέσματά μας προκύπτουν σημαντικά στοιχεία για την πληρέστερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας στην οικογένεια NAT/NCS2 και για την ερμηνεία των διαφορών εξειδίκευσης. Επίσης, η εργασία για τους μεταφορείς πουρινών του S.meliloti αποτελεί μια αρχική πειραματική βάση για να αναλυθεί περαιτέρω ο φυσιολογικός τους ρόλος στις συμβιωτικές σχέσεις βακτηρίων-φυτών.