Μηχανιστική ενζυμολογία
Authors: Φούκης Αθανάσιος 
Published: September 2021

Τα βιοκαύσιμα αποτελούν την ευνοϊκότερη επιλογή εναλλακτικής πηγής καυσίμων. Έτσι, σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η μελέτη αντιδράσεων και μηχανισμών ενζυμικής εστεροποίησης με υδρολάσες (ΚΜ-IFO-0288-Α, CALB, LipA), που ως τελικό στόχο είχε την παραγωγή βιοκαυσίμου, μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης λιπαρών οξέων προερχόμενων από οξυγένεση υπολειμμάτων βιομηχανιών ποτοποιίας (Μίγμα Α), με αιθανόλη και 1-βουτανόλη, σε υψηλές % αποδόσεις και συγκεντρώσεις εστέρα ώστε μια τέτοια παραγωγή να καταστεί οικονομικά συμφέρουσα και βιώσιμη με απώτερο σκοπό την σταδιακή απεξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα. Για την επίτευξη των παραπάνω σκοπών και στόχων χρησιμοποιηθήκαν δόκιμες κινητικές μεθοδολογίες, όπως η καταμέτρηση πρωτονίων (P.I.), ο υπολογισμός του ισοτοπικού φαινόμενου διαλύτη (S.I.E.) και του κινητικού ισοτοπικού φαινόμενου (K.I.E.), η μεθοδολογία των αποκριτικών επιφανειών (RSM), καθώς και η ανάλυση πολλαπλών κριτηρίων λήψης αποφάσεων (MCDA).Έτσι, για την πρωτεάση ΚΜ-IFO-0288-Α, πραγματοποιήθηκε ένας πλήρης χαρακτηρισμός βασισμένος σε μία νέα αλληλουχία πειραμάτων (διαγράμματα τιμών P.I., pH και απόλυτης θερμοκρασίας σε συστήματα αυξανόμενης ιονικής ισχύος, καθώς και P.I. σε ένα ικανό εύρος τιμών pH, όπου αυτή η υδρολάση ήταν δραστική) με σκοπό την περεταίρω διερεύνηση του μηχανισμού της αλλά και της καταλληλόλητάς της για χρήση σε μη συμβατικά μέσα αντίδρασης. Ακολούθησε ακινητοποίηση της πρωτεάσης ΚΜ-IFO-0288-Α, καθώς και αντιδράσεις εστεροποίησης με Μίγμα Α και αιθανόλη, σε σύστημα χωρίς διαλύτη (άνυδρες συνθήκες), για παραγωγή βιοκαυσίμου, καταλυόμενες από την πρωτεάση ΚΜ-IFO-0288-Α.Στην συνέχεια με χρήση των ενζύμων ακινητοποιημένη λιπάση Β από Candida antarctica (CALB) και ακινητοποιημένη λιπάση-Α από Β. subtilis (LipA) πραγματοποιήθηκε μια σειρά εστεροποιήσεων του Μίγματος Α με αιθανόλη και 1-βουτανόλη, σε διαλύτη άνυδρο κ-εξάνιο Σε αυτές τις εστεροποιήσεις εφαρμόστηκαν: (α) η μεθοδολογία των αποκριτικών επιφανειών, για την βελτιστοποίηση των αποκρίσεων σε % απόδοση και ολική συγκέντρωση εστέρα στο μίγμα της αντίδρασης εστεροποίησης και (β) ολική λύση κάθε εφαρμοσθέντος πειραματικού σχεδιασμού μέσω της ανάλυσης πολλαπλών κριτηρίων λήψης αποφάσεων (MCDA). Ακολούθησε κινητική μελέτη της ενζυμικής αντίδρασης εστεροποίησης βουτυρικού οξέος με αιθανόλη και δευτεριωμένη αιθανόλη με CALB, σε διαλύτη άνυδρο κ-εξάνιο, καθώς και υπολογισμός του K.I.E. της κάθε παραμέτρου.Ως συμπεράσματα, από τις προηγούμενες πειραματικές διαδικασίες, προέκυψε αρχικά η ανάπτυξη μίας νέας μεθοδολογίας που επιτρέπει την διερεύνηση των μηχανισμών δράσης και της δυναμικής συμπεριφοράς ενζύμων. Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε ότι: (α) οι ισοτοπικοί παράγοντες κλασμάτωσης ΦT αναφέρονται στα μεταφερόμενα πρωτόνια των καταλυτικών καταλοίπων, (β) η pH-εξαρτώμενη μετατροπή των δεσμών υδρογόνου, στους οποίους αναφέρεται ο ΦT, σε LBHB (δεσμοί υδρογόνου χαμηλού φράγματος), έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της πυρηνοφιλίας της καταλυτικής S (γ) η μετατροπή περιοχών της πρωτεάσης σε περιοχές αυξημένης ευπλασίας (IDPRs), που εξαρτώνται τόσο από την τιμή pH όσο και από την ιονική ισχύ του μίγματος της αντίδρασης.Στην συνέχεια αναπτύχθηκε μια ολοκληρωμένη και οικονομικά αποδοτική διεργασία μέσω της οποίας σε αντιδραστήρα μεμβράνης υπερεξάτμισης (διερευνήθηκε η ευεργετική συμβολή της απομάκρυνσης του παραγόμενου Η2Ο από το μίγμα της αντίδρασης) πραγματοποιήθηκε παραγωγή βιοκαυσίμου νέας γενιάς η οποία έφθασε σε απόδοση 97.4 % σε 16 ώρες και σε συγκέντρωση εστέρα 3.35 Μ, γεγονός που συνιστά αύξηση περίπου 500 % σε σχέση με προηγούμενες αναφορές.Ένα ακόμη σημαντικό συμπέρασμα προέκυψε από την προσαρμογή των κινητικών δεδομένων (για πρώτη φορά σε μελέτες ενζυμικής κινητικής) με εξισώσεις επιφάνειας, όπου προσδιορίστηκαν πιο αξιόπιστα οι παράμετροι του ισχύοντος μηχανισμού εστεροποίησης, ανεξάρτητα από τις συγκεντρώσεις των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων. Έτσι, καθώς και με την εφαρμογή της τεχνικής του Κ.Ι.Ε. αποδείχτηκε ότι ακολουθείται κινητική συστήματος τύπου ping-pong bi-bi με αναστολή και από τα δύο υποστρώματα.