Ραδιοεπισημασμένοι αναστολείς κινάσης τυροσίνης για την ανάπτυξη μορίων με φαρμακολογικό ενδιαφέρον
Authors: Μακρυπίδη Κωνσταντίνα 
Published: November 2023

Στην παρούσα διατριβή σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και αξιολογήθηκαν νέα σύμπλοκα του τεχνητίου – 99m και του ρηνίου, του χαλκού – 64, του φθορίου – 18, του γαλλίου – 68 και του λανθανίου – 133 που φέρουν παράγωγα της 4-ανιλινοκιναζολίνης με στόχο την ανάπτυξη ραδιοφαρμάκων για την διάγνωση και θεραπεία καρκινικών όγκων που υπερεκφράζουν τον EGFR. Αρχικά, συντέθηκαν μια σειρά κατάλληλων κιναζολινικών υποκαταστατών που φέρουν την ομάδα του ισοκυανιδίου αποτελώντας τους μονοδραστικούς υποκαταστάτες. Για την ανάπτυξη των συμπλόκων του ρηνίου και του τεχνητίου στην οξειδωτική βαθμίδα ΙΙΙ χρησιμοποιήθηκε ως τετραδαστικός υποκαταστάτης ο NS3, ενώ για τα σύμπλοκα της οξειδωτικής βαθμίδας Ι και την σταθεροποίηση του τρικαρβόνυλο πυρήνα χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά διθειοκαρβαμίδικά παράγωγα και οι χηλικοί υποκαταστάτες PAMA, κυστεΐνη και τριαζολικό ανάλογο της ιστιδίνης που συνδέθηκαν με τη φαρμακοφόρο δομή μέσω μιας ανθρακικής αλυσίδας 6 ατόμων ή 4 ατόμων C και ένα δακτύλιο τριαζολίου. Η συναρμογή των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La πραγματοποιήθηκε με την επιλογή τριών χηλικών συστημάτων που συζεύχθηκαν με τον κιναζολινικό δακτύλιο μέσω αλειφατικών αλυσίδων και τριαζολικών δακτυλίων. Τα χηλικά που επιλέχθηκαν ήταν το NODAGA (για το 64Cu), το αλκινικό ανάλογο του RESCA (για το 18F και το 68Ga) και το αλκινικό ανάλογο του macropa (για το 133La). Τα κιναζολινικά παράγωγα του RESCA και του macropa είναι τέσσερα και εκτός από το χηλικό που φέρουν διαφέρουν και ανά δύο στον αριθμό ατόμων ανθράκων που συνδέουν τα χηλικά με το φαρμακοφόρο της 4-ανιλινοκιναζολίνης. Οι τελικοί υποκαταστάτες συντέθηκαν σε ικανοποιητικές αποδόσεις και χαρακτηρίστηκαν με IR, NMR και MS. Τα σύμπλοκα του ρηνίου (ΙΙΙ) και (Ι) παρασκευάστηκαν σε καλές αποδόσεις χρησιμοποιώντας τα πρόδρομα σύμπλοκα [ReNS3(PMe2Ph)] και [NEt4]2[Re(CO)3Br3], αντιστοίχως, και χαρακτηρίστηκαν με IR και NMR. Η μεταφορά των πειραμάτων σε επίπεδο ιχνηθετών έδωσε τα ραδιενεργά ανάλογα σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Τα [4+1] σύμπλοκα του 99mTc παρασκευάστηκαν, αφού συντέθηκε πρώτα το σύμπλοκο του [99mTc]TcEDTA και ύστερα προστέθηκαν ο τετραδραστικός NS3 και το εκάστοτε κιναζολινικό ισοκυανίδιο. Τα σύμπλοκα του 99mTc (Ι) σχηματίστηκαν με καθαρότητα έως και 98 % σε αντίδραση ενός σταδίου από το πρόδρομο σύμπλοκο [99mTc] fac-[Tc(CO)3(H2O)3]+. Η ταυτοποιήση των 99mTc συμπλόκων πραγματοποιήθηκε με συγκριτική χρωματογραφία HPLC χρησιμοποιώντας τα χαρακτηρισμένα ανάλογα σύμπλοκα του Re, ως αναφορά. Η επισήμανση του NODAGA – κιναζολινικού υποκαταστάτη με το 64Cu έδωσε το επιθυμητό σύμπλοκο με RY και RCP 100 % όταν χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις υποκαταστάτη από 10-3 έως 10-5 Μ. Για την επισήμανση με 18F έγινε χρήση της τεχνικής του [18F][AlF], καθώς το χηλικό RESCA που φέρει ο κιναζολινικός υποκαταστάτης συναρμόζεται με το αργίλιο μέσω των δύο ατόμων Ν και των τριών ατόμων Ο του καρβοξυλικού οξέος. Τα αρνητικά φορτισμένα σύμπλοκα σχηματίστηκαν με απόδοση ~ 98 %, όταν η αντίδραση θερμάνθηκε στους 95 ⁰C για μισή ώρα. Το ίδιο είδος συναρμογής συναντάται και κατά την συμπλοκοποίηση του 68Ga, όπου η επισήμασνη των δύο RESCA – κιναζολινικών υποκαταστατών μελετήθηκε σε έξι διαφορετικές συγκεντρώσεις στους 40 ⁰C για 15 λεπτά. Αντιθέτως, τα σύμπλοκα των 133La – macropa κιναζολινικών υποκαταστατών παρασκευάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητες έως και 100 %, όταν χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις υποκαταστατών 10-3 – 10-5Μ. Όλα τα ραδιενεργά σύμπλοκα παρουσίασαν υψηλή σταθερότητα σε μελέτες που περιλάμβαναν επώαση με ανταγωνιστές, όπως κυστεΐνη και ιστιδίνη, ή σε ανθρώπινο ορό αίματος. Ο προσδιορισμός του logD σε σύστημα οκτανόλης / PBS pH 7.4 έδειξε πως τα σύμπλοκα του 99mTc είναι λιπόφιλα ενώ τα ραδιο – σύμπλοκα των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La είναι υδρόφιλα με αρνητικές τιμές logD.Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η κυτταροτοξικότητα των υποκαταστατών και των σμπλόκων τους με το ρήνιο με τη μέθοδο MTT. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα παράγωγα είναι δραστικά έναντι της κυτταρικής αύξησης με τιμές IC50 συγκρίσιμες με ανάλογα σύμπλοκα της βιβλιογραφίας. Ο προσδιορισμός της αναστολής της φωσφορυλίωσης του EGFR παρουσίασε πως τα νέα σύμπλοκα του Re, 25b και 29, αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα με τιμές IC50 σημαντικά χαμηλότερες από ότι αναφέρεται στη βιβλιογραφία για ανάλογο σύμπλοκο. Μεταξύ των κιναζολινικών παραγώγων του NODAGA, RESCA και macropa, ο υποκαταστάτης που φέρει το NODAGA εμφάνισε αυξημένη κυτταροτοξική δράση έναντι των καρκινικών σειρών A431 και FaDu. Οι μελέτες κυτταρικής πρόσληψης σε κύτταρα A431, FaDu και MDA – MB 435S για τα ραδιενεργά σύμπλοκα των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La έδειξαν πως γενικά η μεγαλύτερη πρόσληψη φαίνεται να υπάρχει στα Α431 κύτταρα. Επίσης, τα θετικά φορτισμένα σύμπλοκα του 133La εμφάνισαν τη μεγαλύτερη πρόσληψη στα κύτταρα. Η περαιτέρω αξιολόγηση του τρόπου δέσμευσης των συμπλόκων με τον EGFR οδήγησαν στην πραγματοποίηση πειραμάτων ανοσοκατακρίμνησης όπου το αρνητικά φορτισμένο σύμπλοκο του 64Cu φαίνεται να εμφανίζει ειδικό τρόπο δέσμευσης με τον υποδοχέα. Οι βιοκατανομές των συμπλόκων του 99mTc σε υγιή ποντικούς και σε ποντίκια που φέρουν όγκο παρουσίασαν γρήγορη αιματική κάθαρση, απέκκριση από το ηπατοχολικό σύστημα και παρατηρήθηκε πρόσληψη στον όγκο.