Διερεύνηση της εμπλοκής του πρωτεοσώματος στην παθογένεση του πτερυγίου
Authors: Τριλίβας Ιωάννης 
Published: July 2022

Εισαγωγή: Το πτερύγιο είναι μια οφθαλμική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από υπερπλασία του επιθηλίου του κερατοειδούς, συνήθως αμφοτερόπλευρη, υπερανάπτυξη ινοβλαστών του στρώματος και αιμοφόρων αγγείων, σημαντική νεοαγγείωση, κυτταρική φλεγμονώδη διήθηση και μη φυσιολογική συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, όπου η ελαστίνη και το κολλαγόνο είναι τα κύρια συστατικά. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι το πτερύγιο είναι μάλλον μια διαταραχή των επιθηλιακών βλαστοκυττάρων του σκληροκερατοειδούς, και ο σχηματισμός και η ανάπτυξή του μπορεί να προκληθεί από βλάβη ή ενεργοποίηση αυτών των βλαστοκυττάρων. Οι ακριβείς λόγοι της παθογένειας του πτερυγίου παραμένουν ασαφείς, ωστόσο η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία θεωρείται η πιο αποδεκτή αιτία για την έναρξη αυτής της διαταραχής.Tο 26S πρωτεάσωμα είναι ένα ενδοκυτταρικό πρωτεολυτικό σύμπλεγμα δύο συστατικών: ενός πρωτεολυτικού πυρήνα 20S, o οποίος περιέχει τη καταλυτική δραστικότητα, και μιας ρυθμιστικής υπομονάδας 19S. O πρωτεολυτικός πυρήνας 20S συγκροτείται από 28 υπομονάδες, 14α και 14β, κατανεμημένες σε τέσσερεις επταμερείς δακτυλίους στοιβαγμένους ο ένας πάνω στον άλλο, για να σχηματίσουν μία δομή που μοιάζει με βαρέλι. Το πρωτεάσωμα διαθέτει πολλαπλές δραστικότητες πρωτεάσης, όπως κασπάσης, θρυψίνης και χυμοθρυψίνης, εντοπισμένες στις υπομονάδες β1, β2 και β5 αντίστοιχα, και είναι σε θέση να αποικοδομίσει σχεδόν όλες τις ενδοκυτταρικές μή φυσιολογικές και μετουσιωμένες πρωτεΐνες, καθώς και λειτουργικές πρωτεΐνες που ολοκλήρωσαν το χρόνο ζωής τους και πρέπει να ανακυκλωθούν. Η φυσιολογική λειτουργία του πρωτεασώματος και η επακόλουθη επιλεκτική αποικοδόμηση οξειδωμένων πρωτεϊνών που ασκεί, συμβάλει ιδιαίτερα στην κυτταρική άμυνα κατά του οξειδωτικού στρές. Αντίθετα, η μειωμένη λειτουργία του πρωτεασώματος, οδηγεί σε συσσώρευση οξειδωμένων/μή φυσιολογικών πρωτεϊνών εντός του κυττάρου και μπορεί να είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση αρκετών εκφυλιστικών ασθενειών. Η υπομονάδα β5 του πρωτεασώματος (PSMB5), που φέρει δραστικότητα χυμοθρυψίνης, θεωρείται ως η κύρια υπομονάδα του και η έκφρασή της διαμεσολαβείται από το Nrf2/ARE μονοπάτι σε πολλούς τύπους κυττάρων. Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) είναι ένας κυρίως προ-φλεγμονώδης μεσολαβητής που εμπλέκεται σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων. Πολλές από τις λειτουργίες του, όπως η “in vitro” αναστροφή της αντιφλεγμονώδους δράσης των γλυκοκορτικοειδών, η χημειοτακτική στρατολόγηση των μονοκυττάρων, η επαγωγή της παραγωγής IL-8 και TNF-α από μακροφάγα, η παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου από τα ουδετερόφιλα και η αυξορύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών του εξωκυττάριου χώρου MMP-1 και MMP-3 σε ινοβλάστες αρθρικού υμένα, έχουν συνδεθεί με τις ασυνήθιστες ενζυμικές ιδιότητές του, τις δραστικότητες της ταυτομεράσης και οξειδοαναγωγάσης που διαθέτει. Σκοπός: Στη παρούσα μελέτη διερευνάται η έκφραση των υπομονάδων του πρωτεασώματος στο πτερύγιο και η επίδραση της UV ακτινοβολίας στην έκφρασή τους σε ινοβλάστες πτερυγίου. Ιδιαίτερα δε, διερευνώνται η επίδραση της UVB ακτινοβολίας στην έκφραση και δραστικότητα της PSMB5 στις ινοβλάστες πτερυγίου και ο μηχανισμός μέσω του οποίου αυτή πραγματοποιείται. Επιπλέον, διερευνάται η παρουσία του MIF στο πτερύγιο, όπως επίσης, η έκφρασή του σε ινοβλάστες πτερυγίου καθώς και η εμπλοκή του στην έκφραση της PSMB5 στις ινοβλάστες αυτές υπό την επίδραση της UVB ακτινοβολίαςΜέθοδοιΦυσιολογικά δείγματα επιπεφυκότα και πτερυγίου ελήφθησαν από τον άνω-κροταφικό βολβικό επιπεφυκότα υγιών ατόμων που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση καταρράκτη και από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς ιστού πτερυγίου, αντίστοιχα. Οι ινοβλάστες απομονώθηκαν ύστερα από επεξεργασία των δειγμάτων με βακτηριακή κολλαγονάση. Η έκφραση των PSMB5, Nrf2 και MIF στους ιστούς και τα κύτταρα διαπιστώθηκε με ανάλυση RT-PCR και qPCR, και ανασοαποτύπωση western. Η κυτταρική επιβίωση μετρήθηκε με τη μέθοδο MTT και η δραστικότητα χυμοθρυψίνης του πρωτεασώματος προσδιορίστηκε με φθορισμομετρία. Τα επίπεδα του MIF στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων προσδιορίσθηκαν με τη μέθοδο ELISA και η ταυτοποίησή του σ’ αυτά πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ανασοαποτύπωσης western.ΑποτελέσματαAνάλυση RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση όλων των υπομονάδων του πρωτεασώματος ήταν σημαντικά χαμηλότερη στο πτερύγιο συγκριτικά με το φυσιολογικό επιπεφυκότα. Μετά την έκθεση σε UV (UVA και UVB) ακτινοβολία ινοβλαστών πτερυγίου παρατηρήθηκε καταστολή της έκφρασής τους. Με τη χρήση του ενεργοποιητή του Νrf2, Oltipraz, δείχτηκε ότι η έκφραση της PSMB5 διαμεσολαβείται από το μονοπάτι Nrf2/ARE. Η έκφραση των PSMB5 και Nrf2 σε ινοβλάστες πτερυγίου κατεστάλλει κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο μετά από έκθεση σε UVB ακτινοβολία με δόσεις 0–50 mJ/cm2. Η έκφραση της PSMB5, αλλά όχι του Nrf2, παρέμεινε σχεδόν στα επίπεδα ελέγχου, όταν η έκθεση σε UVB πραγματοποιήθηκε μετά από την προ-επώαση των κυττάρων με τον αναστολέα των src κινασών PP2, που υποδεικνύει ότι κάποια src κινάση εμπλέκεται στη καταστολή της PSMB5 που προκαλείται από τη UVB ακτινοβολία. Η UVB ακτινοβολία είχε το ίδιο αποτέλεσμα, αλλά σε μικρότερο βαθμό, στην έκφραση της PSMB5 σε φυσιολογικούς ινοβλάστες του επιπεφυκότα, υποδεικνύοντας ότι η παρατηρούμενη επίδραση της UVB ακτινοβολίας στις ινοβλάστες πτερυγίου δεν ήταν αποτέλεσμα εκφυλισμού των κυττάρων αυτών λόγω της ακτινοβολίας. Η UVB ακτινοβολία είχε πολύ μικρή επιβλαβή επίδραση στην επιβίωση των ινοβλαστών, ενώ δεν επηρέασε τη δραστικότητα χυμοθρυψίνης του πρωτεασώματος. Aνάλυση RT-PCR έδειξε επίσης ότι η έκφραση του MIF ήταν υψηλότερη στο πτερύγιο συγκριτικά με το φυσιολογικό επιπεφυκότα. Μετά την έκθεση ινοβλαστών πτερυγίου σε δόσεις UVB ακτινοβολίας 0-50 mJ/cm2, παρατηρήθηκε μια δοσοεξαρτώμενη από την ακτινοβολία επαγωγή της έκφρασης και της απελευθέρωσης του MIF στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων. Αντίθετα, η ακτινοβολία UVB δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του MIF σε φυσιολογικές ινοβλάστες του επιπεφυκότα. Η έκφραση της PSMB5 παρέμεινε σχεδόν στα επίπεδα ελέγχου, όταν η έκθεση στην UVB ακτινοβολία πραγματοποιήθηκε μετά την προ-επώαση των κυττάρων με τον αναστολέα του MIF ISO- 1, υποδεικνύοντας ότι ο MIF μπορεί να εμπλέκεται στην καταστολή της PSMB5 που προκλήθηκε από την ακτινοβολία. Συμπεράσματα: Φαίνεται ότι η UVB ακτινοβολία διεγείρει την έκφραση του MIF σε ινοβλάστες πτερυγίου, που με τη σειρά του, δρώντας αυτοκρινώς, οδηγεί σε μειορύθμιση της διαμεσολαβούμενης από το μονοπάτι Νrf2/ARE έκφρασης της PSMB5, μέσω κάποιας (ων) src κινάσης (ών), της οποίας διεγείρει την έκφραση ή την ενεργοποίηση. Είναι γνωστό ότι ο MIF μπορεί να επάγει την έκφραση διαφόρων παραγόντων, όπως κυτταροκινών και ενζύμων, καθώς και ότι το πρωτεάσωμα εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων παραγόντων, όπως μεταλοπρωτεϊνασών και των ενδογενών αναστολέων τους, κυτταροκινών και κολλαγόνων, τα οποία μπορούν να συμβάλουν στο σχηματισμό και την ανάπτυξη του πτερυγίου. Κατά συνέπεια, είναι εύλογο να διατυπωθεί η άποψη ότι η επίπτωση της UVB ακτινοβολίας στην παθογένεια του πτερυγίου διαμεσολαβείται εν μέρει από την αυξορύθμιση της έκφρασης του MIF και την επακόλουθη καταστολή της έκφρασης του πρωτεασώματος.