Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος
Authors: Κωστοπούλου Ουρανία 
Published: August 2021

Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Η χλωραμφαινικόλη (CAM) δεσμεύεται επί της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας των βακτηρίων και παρεμποδίζει θεμελιώδεις λειτουργίες, όπως είναι η σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού, η πρόσδεση των tRNA-υποστρωμάτων στην Α-θέση και ο τερματισμός της πεπτιδικής αλυσίδας. Η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων για πολυαμίνες στα κύτταρα και κρυσταλλογραφικά δεδομένα που παρουσιάζουν δύο θέσεις πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα μας έδωσαν το έναυσμα για τη δημιουργία δύο κατηγοριών παραγώγων των πολυαμινικών και των διμερών, αντίστοιχα. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η επανεξέταση της πολύπλοκης συμπεριφοράς της χλωραμφαινικόλης, χρησιμοποιώντας την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης, καθώς και τη σύνθεση και εκτίμηση της αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής δράσης μιας σειράς πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης, με αναμενόμενη ισχυρότερη συγγένεια προς το ριβόσωμα και βελτιωμένη ικανότητα εισόδου στα κύτταρα, συγκριτικά με τη μητρική ένωση. Τα πειράματα κινητικής ανάλυσης, έγιναν σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E. coli, όπου η σύνθεση ακετυλο-φαινυλαλανυλο-πουρομυκίνης πραγματοποιείται μέσω μιας αντίδρασης ψευδοπρώτης τάξεως μεταξύ του συμπλέγματος C, δηλαδή ακετυλο-φαινυλαλανυλο-tRNA•poly(U) •ριβοσωμάτων (δρα ως ανάλογο του εναρκτήριου μεταφραστικού συμπλόκου) και περίσσειας πουρομυκίνης (δρα ως υπόστρωμα της Α-θέσης). Τα πολυαμινικά όσο και τα διμερή παράγωγα μελετήθηκαν ως αναστολείς της αντίδρασης πουρομυκίνης και η κινητική τους συμπεριφορά συγκρίθηκε με εκείνη της μητρικής ένωσης. Αρχικά, παρατηρήσαμε ότι απουσία αναστολέα, οι αντιδράσεις ακολουθούσαν κλασσική κινητική πρώτης τάξης (μονοφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ωστόσο, η παρουσία των παραγώγων είχε ως αποτέλεσμα τα δεδομένα να υποστηρίζουν κινητική χρονοεξαρτώμενης αναστολής (διφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ακολούθησε ενδελεχής κινητική ανάλυση, η οποία αποκάλυψε ότι τα παράγωγα συμπεριφέρονται ως αναστολείς βραδείας δέσμευσης. Με βάση την ολική σταθερά αναστολής, Κi*, κατατάξαμε τα πολυαμινικά παράγωγα ως εξής: το ΚΑ240 (Κi*= 0,28 μΜ) και το F5 (Κi*= 0,75 μΜ) που φέρουν μία σπερμιδίνη προσκολλημένη στο μόριο της CAM, και το CLB3 (Κi*= 0,6 μΜ) που φέρει μια σπερμίνη, προσδένονται πιο ισχυρά από τη μητρική ένωση (Κi*= 0,88 μΜ) στο ριβόσωμα. Από τα διμερή ισχυρότερα είναι το mag240 (Κi*= 0,3 μΜ) που φέρει συνδέτη με περιορισμένη διαμορφωτική ελευθερία και έξι άτομα άνθρακα και τα mag261 (Κi*= 0,6 μΜ) και mag266 (Κi*= 0,75 μΜ) τα οποία φέρουν βραχύτερο συνδέτη. Μελέτες ανάλυσης αποτυπώματος επιβεβαίωσαν ότι τα παράγωγα της CAM ακολουθούν μηχανισμό πρόσδεσης δύο σταδίων, αφού το αποτύπωμα του αρχικού και τελικού συμπλόκου διέφερε, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα παρακολούθησης της πορείας πρόσδεσης. Η χημική προστασία που παρέχει η πρόσδεση στα νουκλεοτίδια Α2451 και U2506, που βρίσκονται στο καταλυτικό κέντρο, δικαιολογεί το συναγωνιστικό χαρακτήρα αναστολής των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM στην αντίδραση πουρομυκίνης. Το πολυαμινικό παράγωγο ΚΑ240 και η μητρική ένωση φαίνεται να προστατεύουν τα Α2059 και Α2062 μέσω αλλοστερικού φαινομένου αφού το μήκος των μορίων τους δεν τους επιτρέπει να φτάσουν στο κανάλι εξόδου. Από την άλλη πλευρά, τα διμερή παράγωγα (mag240 και mag234) προστατεύουν τα νουκλεοτίδια του καναλιού εξόδου Α2058, Α2059, Α2062, με το mag240 να δείχνει ισχυρότερη προστασία, πιθανότατα λόγω μικρότερης δυνατότητας περιστροφής του μορίου γύρω από το βραχίονα που συνδέει τις δύο πολυαμινικές ομάδες. Εκτός από τα in vitro πειράματα πραγματοποιήσαμε και μια σειρά πειραμάτων σε βακτήρια και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η μελέτη της επίδρασης των παραγώγων σε καλλιέργειες στελεχών Ε. coli και S. aureus κατέδειξε ότι τα παράγωγα της CAM εισέρχονται πιο εύκολα στα θετικά κατά Gram σε σχέση με τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Όμως, κανένα από τα παράγωγα δεν επέδειξε ισχυρότερη αντιβακτηριακή δράση από τη μητρική ένωση. Με βάση την υπόθεση ότι η χλωραμφαινικόλη δρα στα μιτοχόνδρια και συγκεκριμένα αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεσή τους, διερευνήθηκε αν η μητρική ένωση και το δραστικότερο in vitro παράγωγο της κάθε σειράς είναι τοξικό σε ανθρώπινες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (Jurkat, HS-Sultan, U937) και σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Αρχικές μετρήσεις με τον αναλυτή αίματος έδειξαν ότι: κανένα εκ των τριών αντιβιοτικών δεν είναι τοξικό σε ώριμα κύτταρα του αίματος σε συγκέντρωση 6 μΜ και για έκθεση 120 h. Επίσης, έδειξαν ότι η CAM αναστέλλει την ανάπτυξη κυττάρων Jurkat (Τ-λευχαιμική σειρά) κατά 13%, το ΚΑ240 κατά 26% και το mag240 κατά 31%. Σε καλλιέργεια κυττάρων HS-Sultan (Β-λευχαιμική σειρά), η συμπεριφορά των αντιβιοτικών ήταν διαφορετική: η CAM ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 30%, το ΚΑ240 κατά 15% και το mag240 κατά 10%. Σε καλλιέργεια κυττάρων U937 (μονοκυτταρική σειρά) τα αντιβιοτικά μας δεν έδειξαν κάποια τοξική δράση. Περαιτέρω μελέτη των κυτταρικών σειρών με ιωδιούχο προπίδιο (υπολογισμός νέκρωσης) και CFSE (υπολογισμός πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έδειξε ότι η μείωση των κυττάρων δεν οφείλεται σε νέκρωση, αλλά σε ανάσχεση των κυτταρικών διαιρέσεων. Τέλος, η CAM και το mag240 δεν έδειξαν τοξική δράση στις κυτταρικές σειρές Μet5Α (επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα) και Zl34 (κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος), σε αντίθεση με το ΚΑ240, το οποίο ήταν δραστικό έναντι της καρκινικής σειράς. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης και προσδιορίσαμε την αντιβακτηριακή ισχύ μιας σειράς παραγώγων της CAM σε καλλιέργειες θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Αν και κανένα από τα παράγωγα δεν έδειξε ισχυρότερη in vivo δράση από εκείνη της μητρικής ένωσης, η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης τους in vitro οδήγησε σε σπουδαία συμπεράσματα για τις ιδιότητες του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος. Τα σπουδαιότερα εξ’ αυτών αφορούν στην ικανότητα του καταλυτικού κέντρου να διαμορφώνει τη στερεοδομή του, ώστε να υποδέχεται επιτυχώς ένα προσδέτη (induced fitting) και να μεταφέρει αλλοστερικά μηνύματα σε απομακρυσμένες χωροταξικά περιοχές. Επίσης, σημαντικό συμπέρασμα ήταν η ταυτοποίηση μιας δεύτερης θέσης πρόσδεσης της CAM στην είσοδο του καναλιού εξόδου, μικρής συγγένειας, η οποία μπορεί να αποκαλυφθεί μόνο με τη χρήση προσδετών με περιορισμένη στερεοδιαμόρφωση. Τέλος, από τη μελέτη της τοξικότητας των εν λόγω ουσιών σε ευκαρυωτικά κύτταρα διαπιστώθηκε ότι μερικά εξ αυτών, παρότι ανενεργά έναντι φυσιολογικών ανθρωπίνων κυττάρων, προκαλούν ανάσχεση στην πολλαπλασιαστική ικανότητα καρκινικών κυττάρων. Αυτό το γεγονός δίνει το έναυσμα για περαιτέρω μελέτη αξιοποίησης των εν λόγω ουσιών ως αντικαρκινικών.