Αλληλεπιδράσεις Zn2+, Cd2+, Cu2+, με 2-(α-ύδροξυ-αίθυλ) πυροφωσφορική θειαμίνη (ΗΕΤΡΡ) και πυροφωσφορική θειαμίνη (ΤΡΡ)
Authors: Μαλανδρίνος Γεράσιμος 
Published: August 2021

Η μελέτη αυτή αναφέρεται στην αλληλεπίδραση μεταλλικών ιόντων (Cu(II), Zn(II), Cd(II)) με το πραγματικό ενδιάμεσο της ενζυμικής αποκαρβοξυλίωσης του πυροσταφυλικού οξέος, την 2-(α-ύδροξυ-αίθυλ) πυροφωσφορική θειαμίνη (ΗΕΤΡΡ). Επιπλέον αναφέρεται στην αλληλεπίδραση των παραπάνω ιόντων με την πρόδρομη ένωση της ΗΕΤΡΡ την πυροφωσφορική θεαμίνη (ΤΡΡ), καθώς και με την αλληλεπίδραση αυτών και της ΗΕΤΡΡ παρουσία του πεπτιδίου Asp-Asp-Lys-Ile (μικτά σύμπλοκα). Το τελευταίο αποτελεί την περιοχή 185-189 του ενεργού κέντρου του ενζύμου τρανσκετολάση (yTK). Η διατριβή αποτελείται από πέντε τμήματα (εισαγωγή (Α), σκοπός (Β), αποτελέσματα συζήτηση (Γ), τελικά συμπεράσματα (Δ) και πειραματικό μέρος (Ε)). Στο πρώτο τμήμα (Α) επιχειρείται μια όσο το δυνατόν ευρύτερη ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας τόσο όσον αφορά την θειαμίνη και τα παράγωγά της, όσο και τα ενζυμικά συστήματα στα οποία αποτελεί συνένζυμο δίνοντας έμφαση στην πυροσταφυλική αποκαρβοξυλάση (yPDC) και στην τρανσκετολάση (yTK). Αναφέρονται επίσης οι προτεινόμενοι μηχανισμοί μη ενζυμικής και ενζυμικής κατάλυσης, ο ρόλος των διάφορων τμημάτων του μορίου της θειαμίνης κατά την κατάλυση, καθώς και οι μελέτες συμπλοκοποίησης τόσο της απλής θειαμίνης όσο και των παραγώγων “ενεργού αλδεύδης”. Περνώντας στο τμήμα της ενζυμικής κατάλυσης, περιγράφονται αναλυτικά οι δομές τωνενζύμων yPDC και yTK δίνοντας έμφαση στο ενεργό κέντρο και στο ρόλο των αμινοξικώνκαταλοίπων που το απαρτίζουν και συμμετέχουν έμμεσα ή άμεσα στην καταλυτική διεργασία. Σε όλο το εισαγωγικό τμήμα συζητείται ο πιθανός ρόλος των διαμορφώσεων F, S ή V της θειαμίνης κατά τη διάρκεια της κατάλυσης. Στο δεύτερο τμήμα (Β) αναφερόμαστε στο σκοπό αυτής της μελέτης, στους λόγους επιλογής των συγκεκριμένων μεταλλικών ιόντων και υποκαταστατών και τέλος στοπροσδοκώμενα αποτελέσματα. Στο τρίτο μέρος (Γ) παραθέτονται και αναλύονται τα πειραματικά δεδομένα. Η αλληλεπίδραση των ιόντων Cu(II), Zn(II) και Cd(II) με την 2-(α-ύδροξυ-αίθυλ)πυροφωσφορική θειαμίνη σε μη υδατικά διαλύματα οδηγεί στην απομόνωση στερεών μεταλλικών συμπλοκών του τύπου K2{[M(LH)Cl2]2} (Μ= Zn,Cd, L= ΗΕΤΡΡ) και [Cu(LH)C1)2 στα οποία τα ιόντα εντάσσονται μέσω του Ν( 1') της πυριμιδίνης ενός μορίου ΗΕΤΡΡ και της * πυροφωσφορικής ομάδας ενός άλλου μορίου (σχήμα 90, σελίδα 145). Σε υδατικά διαλύματα σχηματίζονται σύμπλοκα του ίδιου τύπου με τη διαφορά ότι αναλόγως του pH του διαλύματος η δεύτερη ομάδα Ρρ-ΟΗ και των δυο υποκαταστατών των διμερών είναι πρωτονιωμένη ή μη. Η σειρά σταθερότητας των παραπάνω συμπλοκών όπως αποδεικνύεται από σύγκριση των τιμών τους logp (ολικές σταθερές σχηματισμού) είναι Cu(II)>Cd(II)>Zn(II). Η εύκολη απομάκρυνση της πλευρικής ομάδας CH3CH(OH)- απ’ τον C(2) του θειαζολίου υποδεικνύει ότι τα σύμπλοκα αυτά αποτελούν καλά μοντέλα συνενζυμικής δράσης. Επιπλέον βρέθηκε ότι τόσο ο υποκαταστάτης όσο και τα σύμπλοκα και στη στερεά φάση και σε διάλυμα, υιοθετούν την Sδιαμόρφωση, γεγονός που τονίζει για μια ακόμη φορά τη σπουδαιότητα αυτής κατά την καταλυτική διεργασία. Η αλληλεπίδραση των ιόντων Zn(II), Cd(U) με την πυροφωσφορική θειαμίνη (ΤΡΡ) σε μη υδατικά διαλύματα οδηγεί στην απομόνωση στερεών μεταλλικών συμπλοκών του τύπου [M(L'H)C1]2 (Μ= Zn,Cd, L'= ΤΡΡ). Ο τύπος ένταξης που προτάθηκε για τα αντίστοιχα σύμπλοκα της ΗΕΤΡΡ ισχύει και σ’ αυτή την περίπτωση, τόσο για τα στερεά σύμπλοκα (σχήμα 112, σελίδα 180) όσο και για τα σωματίδια που σχηματίζονται σε υδατικά διαλύματα. Σύγκριση των τιμών \ogfi μεταξύ των αντίστοιχων σωματιδίων της ΗΕΤΡΡ και της ΤΡΡ αποδεικνύει ότι τα πρώτα είναι σταθερότερα, γεγονός που ενισχύει την άποψη της ερευνητικής μας ομάδας ότι τα σύμπλοκα παραγώγων “ενεργού αλδευδης” είναι σταθερότερα και σχηματίζονταιευκολότερα απ’ ότι τα αντίστοιχα σύμπλοκα απλής θειαμίνης [58]. Ο έλεγχος της συνενζυμικής δραστικότητας των συμπλοκών ΗΕΤΡΡ και ΤΡΡ όσον αφορά την ενζυμική αποκαρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού οξέος, αποδεικνύει ότι τα σύμπλοκα της ΤΡΡ είναι καταλυτικά ανενεργό ενώ τα αντίστοιχα της ΗΕΤΡΡ (σύμπλοκο με Ζη) δείχνουν υψηλή δραστικότητα. Στο τελευταίο μέρος αυτού του τμήματος μελετάμε την αλληλεπίδραση των συμπλοκών Ζη(Π) και Cd(II) της ΗΕΤΡΡ με το πεπτίδιο Asp-Asp-Asn-Lys-Ile, καθώς και την αλληλεπίδραση (Ιιι(ΙΙ)-ΗΕΤΡΡ-πεπτιδίου σε υδατικά διαλύματα. Το πεπτίδιο αυτό αποτελεί τμήμα (185-189) του ενεργού κέντρου της yTK και εντοπίζεται γύρω απ’ την πυροφωσφορικη ομάδα της ΗΕΤΡΡ [194], Αρχικά μελετάμε την αλληλεπίδραση μόνο του πεπτιδίου με τα παραπάνω ιόντα, οπότε βρέθηκε ότι σχηματίζονται σωματίδια με ένταξη των ιόντων μέσω της Ν-τελικής αμινομάδας, καρβονυλικών και καρβοξυλικών ατόμων οξυγόνου (σύμπλοκα Zn(II),Cd(II), σχήμα 122, σελίδα 198) και επιπλέον αποπρωτονιωμένων ατόμων αζώτου πεπτιδικών δεσμών (σύμπλοκα Cu(II), σχήμα 135, σελίδα 225). Περνώντας στα μικτά συστήματα παρατηρήθηκε ο σχηματισμός μικτών σωματιδίων στα οποία σε φυσιολογικό pH η σφαίρα ένταξης των ιόντων Ζη(ΙΙ) και Cd(II) αποτελείται από καρβονυλικά και καρβοξυλικά άτομα οξυγόνου προερχόμενα απ’ το πεπτίδιο, το Ν(Γ) και την πυροφωσφορική ομάδα της ΗΕΤΡΡ, ενώ η Ν-τελική αμινομάδα είναι πρωτονιωμένη (σχήμα 131, σελίδα 217). Τα σύμπλοκα αυτά αποτελούν πολύ καλά μοντέλα του ενεργού κέντρου της yTK αφού και στο φυσικό ένζυμο το ιόν Ca(II) εντάσσεται με παρόμοιο τρόπο [194] (αν εξαιρέσουμε την επιπλέον συμμετοχή και του Ν(Γ) στα σύμπλοκά μας). Όσον αφορά το μικτό σύστημα Cu(II)-HETPPπεπτιδίου, σχηματίζονται μικτά σύμπλοκα στα οποία το ιόν Cu(II) εντάσσεται μέσω της τελικής αμινομάδας καρβοξυλικών οξυγόνων και ενός αποπρωτονιωμένου ατόμου αζώτου πεπτιδικού δεσμού, ενώ η σφαίρα ένταξης συμπληρώνεται απ’ το Ν(Γ) και την πυροφωσφορική ομάδα της ΗΕΤΡΡ (σχήμα 141, σελίδα 234). Η S-διαμόρφωση διατηρείται και στα μικτά σωματίδια ενισχύοντας ακόμη περισσότερο το ρόλο της κατά την καταλυτική δράση. Στο τέταρτο μέρος (Δ) αναφέρονται επιγραμματικά τα κυριότερα συμπεράσματα που προκύπτουν απ’ αυτή τη μελέτη, ενώ στο πέμπτο μέρος (Ε) δίνονται λεπτομέρειες σχετικά με τις μεθόδους σύνθεσης και μελέτης όλων των ουσιών που αναφέρονται στη διατριβή.