Μελέτη της αλληλεπίδρασης ελεύθερων και συνδεδεμένων στην κυτταρική μεμβράνη μορίων HLA-A2.1 με ακινητοποιημένο αντίσωμα μέσω ακουστικού βιοαισθητήρα
Authors: Δελλαπόρτα Αναστασία 
Published: January 2014

Οι βιοαισθητήρες παρέχουν μία ελκυστική εναλλακτική λύση στις κλασσικές μεθόδους ανάλυσης καθώς δίνουν τη δυνατότητα συνεχούς παρακολούθησης βιολογικών αλληλεπιδράσεων και μάλιστα χωρίς σήμανση των μορίων που συμμετέχουν. Οι ακουστικοί αισθητήρες Love ανιχνεύουν μεταβολές μάζας και ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων στη μεσεπιφάνεια στερεού-υγρού με υψηλή ευαισθησία και έχουν χρησιμοποιηθεί τα τελευταία χρόνια σε αρκετές βιολογικές εφαρμογές. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η πρώτη εφαρμογή τους στην ανίχνευση κυττάρων καθώς και στη μελέτη της κινητικής κυτταρικών αλληλεπιδράσεων. Επίσης παρουσιάζεται η εφαρμογή τους στη μελέτη της κινητικής της αλληλεπίδρασης μορίων HLA-A2.1 με ακινητοποιημένο αντίσωμα. Αρχικά αναπτύχθηκε επιφάνεια κατάλληλη για τη μελέτη ελεύθερων αλλά και συνδεδεμένων στην κυτταρική μεμβράνη μορίων HLA-A2.1. Αυτό έγινε με βελτιστοποίηση της διάταξης του βιοαισθητήρα, μέσω επιλογής κατάλληλου συνδυασμού υλικών για τον κυματοδηγό, ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερη σταθερότητα στη μεταβολή αγωγιμότητας και χαμηλότερη ολίσθηση του σήματος. Ο συνδυασμός που επελέγη ήταν Novolac/Au χωρίς γείωση. Ακολούθησε η ακινητοποίηση κατάλληλων βιομορίων στην επιφάνεια. Αρχικά επελέγη πεπτίδιο που παρουσιάζεται από τα μόρια HLA-A2.1 (ΗER2/neu 9369) και χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι για την ακινητοποίησή του, αλλά δεν κατέστη δυνατή η δημιουργία επιφάνειας που να αλληλεπιδρά με τα κύτταρα με επαναλήψιμο τρόπο. Έτσι, ακολούθησε ακινητοποίηση μονοκλωνικού αντισώματος ειδικού για τα HLA-A2.1 (BB7.2), ώστε να έχουμε ένα καλύτερα καθορισμένο σύστημα. Η ακινητοποίηση έγινε μέσω προσρόφησης σε πρωτεΐνη Α ή G και η μέθοδος βελτιστοποιήθηκε όσον αφορά το ρυθμιστικό διάλυμα και τη συγκέντρωση πρωτεΐνης Α. H εξειδικευμένη βιολογική μεσεπιφάνεια που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρόσδεσης κυττάρων που εκφράζουν τα μόρια HLA-A2.1. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν αναγνωριστικά πειράματα που επέτρεψαν την επιλογή κατάλληλων πειραματικών συνθηκών όσον αφορά την ταχύτητα ροής, τη διάρκεια αλληλεπίδρασης των κυττάρων με την επιφάνεια και την παράμετρο που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της αλληλεπίδρασης, η οποία πρέπει να είναι το πλάτος και όχι η φάση του κύματος (αντίθετα απ’ ό,τι συμβαίνει στην περίπτωση πρόσδεσης πρωτεϊνών). Ακολούθησε η μελέτη της σύνδεσης στην επιφάνεια τριών κυτταρικών σειρών σε διάφορες συγκεντρώσεις. Οι σειρές αυτές (LG2, JY και T2) είναι ομόζυγες ως προς τα μόρια HLA-A2.1, αλλά διαφέρουν σε κάποιες ιδιότητες (μέγεθος κυττάρων και αριθμός HLA-A2.1 στην επιφάνεια του κυττάρου). Από τη μελέτη αυτή προέκυψε το συμπέρασμα ότι ο βιοαισθητήρας που χρησιμοποιήθηκε ανιχνεύει με επιτυχία όχι μόνο τη σύνδεση των κυττάρων αλλά και τις διαφορές που αναφέρθηκαν. Η ανίχνευση βασίζεται στη μεταβολή του πλάτους του κύματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι η βασική μεταβολή παρατηρείται στις ιξωδοελαστικές ιδιότητες και όχι στη μάζα της επιφάνειας. Άρα η στιβάδα των κυττάρων συμπεριφέρεται ως ιξωδοελαστικό στρώμα και όχι ως άκαμπτη μάζα. Με βάση την παρατήρηση αυτή υπολογίστηκε ένα φαινόμενο ιξώδες για το στρώμα αυτό. Ο υπολογισμός βασίστηκε στη χρήση διαφόρων συγκεντρώσεων γλυκερόλης γνωστού ιξώδους και σύγκριση της μεταβολής του σήματος που προκαλείται από αυτές με τη μεταβολή που προκύπτει κατά τη σύνδεση των κυττάρων. Το φαινόμενο ιξώδες που μετρήθηκε ήταν 1,2-1,8 mPa?s, ανάλογα με την σειρά. .......................................................