Ανάπτυξη μεθόδων LC-MS/MS για την ανάλυση φυσικών προϊόντων
Authors: Στύλος Ευγένιος 
Published: January 2023

Τα φυσικά προϊόντα (NPs) διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη διαδικασία ανακάλυψης φαρμάκων, εξαιτίας της μεγάλης ποικιλομορφίας τους στη φύση, γεγονός που επιτρέπει τον εντοπισμό μορίων ενδιαφέροντος για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων. Επιπλέον, μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για τη συνθετική και φαρμακευτική χημεία στο πλαίσιο της ανάπτυξης νέων παραγώγων με ενισχυμένη βιολογική δράση. Ειδικότερα, τα φλαβονοειδή θεωρούνται από τα σημαντικότερα NPs εξαιτίας των βιολογικών τους ιδιοτήτων και από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες ενώσεις παγκοσμίως. Η συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση για φυσικά προϊόντα με πιθανά οφέλη για την ανθρώπινη υγεία, ενισχύει την ανάγκη για πιο αποτελεσματικές και εξελιγμένες αναλυτικές μεθόδους.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθόδων υγρής χρωματογραφίας συνδυασμένης με φασματομετρία μάζας (LC-MS) για την ανάλυση φυσικών προϊόντων. Πιο συγκεκριμένα, η τεχνική της LC-MS χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση και τον έλεγχο σταθερότητας της ναρινγενίνης σε ανθρώπινο πλάσμα, μιας φλαβανόνης που ανήκει στην ομάδα των φλαβονοειδών καθώς και υβριδικών παραγώγων αυτής, που συντέθηκαν με σκοπό την ενίσχυση της αντιαιμοπεταλιακής της δράσης.Αρχικά, δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στη δομή, την προέλευση, τη βιοσύνθεση και τις βιολογικές ιδιότητες της γενικής κατηγορίας των φλαβονοειδών. Σε αυτή την κατηγορία NPs έχουν εστιάσει πολλές ερευνητικές μελέτες και πιο συγκεκριμένα στην εξεύρεση νέων πηγών με αυξημένη περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες. Το χαρούπι το οποίο είναι ένα φυσικό προϊόν που έχει προσελκύσει την προσοχή της ερευνητικής κοινότητας εξαιτίας των πολυάριθμων οφελών του στην ανθρώπινη υγεία, αποτέλεσε αντικείμενο μιας εκτεταμένης βιβλιογραφικής ανασκόπησης εξαιτίας της περιεκτικότητας του σε φλαβονοειδή αλλά και σε ναρινγενίνη.Η ναρινγενίνη επιλέχθηκε ως πρόδρομη ένωση για την ανάπτυξη νέων αντιαιμοπεταλιακών παραγώγων, όχι μόνο λόγω των βιολογικών και φαρμακολογικών της ιδιοτήτων, αλλά εξαιτίας της ελκυστικής της δομής που προσφέρει τη δυνατότητα τροποποίησης με μεγάλη ποικιλία υποκαταστατών. Πιο συγκεκριμένα συντέθηκαν τα υβρίδια 4'-ακέτυλο-ναρινγενίνη και 4'-DHA-ναρινγενίνη.Για την αξιολόγηση της βιοδραστικότητας των σχεδιασμένων και νεοσυντιθέμενων αναλόγων ναρινγενίνης σε ανθρώπινο πλάσμα, απαραίτητο και σημαντικό βήμα είναι ο προσδιορισμός της σταθερότητα τους σε αυτό. Για να επιτευχθεί αυτό, αναπτύξαμε πρωτόκολλα LC-MS για την ποσοτικοποίηση τόσο της σταθερότητας των υβριδίων ναρινγενίνης, όσο και για την παρακολούθηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της ναρινγενίνης που απελευθερώνεται από την διάσπαση των συζευγμάτων αυτών στο ανθρώπινο πλάσμα, κατά τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο. Τέτοιες μεθοδολογίες έχουν μεγάλη σημασία για την ανάλυση των φυσικών προϊόντων και των κύριων μεταβολιτών τους σε πολύπλοκες μήτρες, όπως είναι τα φυτικά εκχυλίσματα, το πλάσμα, τα ούρα κτλ.Αποδείχθηκε ότι το συζυγές 4'-DHA-ναρινγενίνη έχει επταπλάσια υψηλότερη σταθερότητα σε σχέση με την 4'-ακέτυλο-ναρινγενίνη, η οποία αποικοδομήθηκε ταχέως και επέδειξε σημαντική ανασταλτική δράση και στις τρεις οδούς συσσωμάτωσης αιμοπεταλίων επαγόμενης από τα ADP, ΑΑ και TRAP-6. Αυτό ήταν ιδιαίτερα σημαντικό, διότι επιτύχαμε να προσομοιώσουμε την ταυτόχρονη χορήγηση τριών αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων (φαρμάκων) σε ένα μόνο μόριο. Από την παρούσα μελέτη αναδεικνύεται εκ νέου η σημαντική συμβολή της LC-MS στον ποιοτικό έλεγχο των φυσικών προϊόντων, καθώς και στην ανακάλυψη νέων μεταβολιτών βιοτεχνολογικού και βιομηχανικού ενδιαφέροντος.