Εφαρμογή νέων τεχνικών για την ανίχνευση μοριακών διαταραχών σε ασθενείς με δυστροφινοπάθειες χωρίς έλλειψη στο γονίδιο της δυστροφίνης
Authors: Βογιατζάκης Νικόλαος 
Published: September 2021

Εισαγωγή Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα απαιτητική κυρίως λόγω του μεγάλου μεγέθους του γονιδίου (79 εξόνια, 2,4Kb). Παρόλο που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία «θερμές περιοχές» (Hot Spot) όπου συσσωρεύονται ελλείψεις και διπλασιασμοί εξονίων, δεν έχει αναφερθεί ένα ανάλογο σημείο συσσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων οι οποίες απαντώνται διάσπαρτες καθ όλο το μήκος του γονιδίου. Μεθοδολογία. Στην μελέτη αυτή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του ελέγχου 647 ασθενών (608 άρρενα άτομα και 37 θήλεα) που παραπέμφθηκαν στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών τις δυο τελευταίες δεκαετίες για έλεγχο για δυστροφινοπάθειες. Οι ελλείψεις και οι διπλασιασμοί εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το κλασικό πολλαπλό PCR 18 εξονίων αλλά και την τεχνική πολλαπλής ενίσχυσης υβριδοποιημένων ανιχνευτών με το ένζυμο της λιγάσης (Multiplex Ligation –dependant Probe Amplification, MLPA). Οι σημειακές μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σάρωσης ECMA (EnzymaticCleavage Mismatch Analysis protocol (Vogiatzakis et al, 2007; 2010) η οποία τιτλοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής αρχικά για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης. Οι σημειακές μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA (Direct DNA sequencing). Τα όριατων μεταλλάξεων (όπου δεν ήταν προφανή) μελετήθηκαν περαιτέρω με πολλαπλό PCR ή MLPA. Για την σύγκριση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε η τράπεζα μεταλλάξεων για το γονίδιο DMD του πανεπιστημίου του Leiden,Ολλανδία (www.dmd.nl).Αποτελέσματα. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε συνολικά 308 μεταλλάξεις και ειδικότερα 254 ήταν ελλείψεις εξονίων, 24 διπλασιασμοί και 32 σημειακές μεταλλάξεις. Επίσης ταυτοποιήθηκαν αρκετοί πολυμορφισμοί του γονιδίου της δυστροφίνης από τους οποίους 6 χρήζουν περαιτέρω μελέτης λόγω της αμφίβολης παθογένειας τους. Παρόλο που η πλειοψηφία των μεταλλάξεων που βρέθηκαν εντοπίζονται στα γνωστά «θερμά σημεία» του γονιδίου παρατηρήθηκαν διαφορές στα όρια των μεταλλάξεων σε σχέση με τα αναφερόμενα στην διεθνή βιβλιογραφία. Συμπεράσματα. 1. Παρατηρήθηκε μη τυχαία κατανομή μεγάλου αριθμού ελλείψεων στο κεντρομερικό «θερμό σημείο» (εξόνια 45-55) καθώς επίσης και μεγάλου αριθμού διπλασιασμών στο αμινοτελικό «θερμό σημείο» (εξόνια 2-8). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την διεθνή βιβλιογραφία, (Tuffery-GiraudS et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006). Ανάμεσα στις 32 σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν, παρατηρήθηκε συσσώρευση μεταλλάξεων στα εξόνια 21 και 66, όπου με τρείς διαφορετικές μεταλλάξεις στο κάθε ένα.2. Κατά την διάρκεια της μελέτης αποκαλύφθηκαν 31 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου της δυστροφίνης σε ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne Becker. Συγκεκριμένα, 37% των μεταλλάξεων ήταν μεταλλάξεις αλλαγής πλαισίου ανάγνωσης, 17% ήταν μεταλλάξεις σε σημεία ματίσματος και 46% μεταλλάξεις που προκαλούν πρόωρο κωδικόνιο λήξεις. Τα αποτελέσματα της μελέτης συμφωνούν και με την διεθνή βιβλιογραφία παρόλο που ο αριθμός των ασθενών δεν ήταν ικανός για να διευκρινιστεί το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων σε ασθενείς με Duchenne, και Beckerξεχωριστά.3. Απαιτείται η μελέτη των μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης ακόμα και στις περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν απλά υποκλινικά συμπτώματα(όπως αυξημένα CPK) καθώς και σε περιπτώσεις φορέων της νόσου.4. Η δυσκολία μοριακής επιβεβαίωσης πολλών νευρομυικών παθήσεων οδηγεί στην παραπομπή για έλεγχο του γονιδίου DMD περιστατικών όπου ηδυστροφινοπάθεια αποτελεί διαφορική διάγνωση. Ως εκ τούτου πολλοί ασθενείς παραπέμπονται χωρίς να έχουν την τυπική κλινική εικόνα δυστροφινοπάθειας (αρκετές παραπομπές έχουν γίνει με μοναδικό εύρημα αυξημένα CPK στο αίμα) γεγονός που ερμηνεύει το μειωμένο ποσοστό διάγνωσης στην παρούσα μελέτη.