Μέθοδοι συστημικής βιοπληροφορικής για την μελέτη των αλληλεπιδράσεων μικροβιώματος και βλεννογονίου ανοσολογικής απόκρισης ως στόχος νέων θεραπευτικών στρατηγικών
Authors: Δόβρολης Νικόλαος 
Published: September 2021

Εισαγωγικά. Η ανοσολογία του βλεννογόνου είναι ένα κρίσιμο μέρος της άμυνας μας έναντι παθογόνων οργανισμών και του εξωτερικού περιβάλλοντος. Ο βλεννογόνος λειτουργεί επιλεκτικά έναντι των βλαβερών μικροοργανισμών και επιτρέπει την ειρηνική συμβίωση του ξενιστή με την μικροχλωρίδα. Ο γαστρεντερικός σωλήνας φιλοξενεί τη μεγαλύτερη βλεννογονική επιφάνεια στο ανθρώπινο σώμα και παρέχει το τέλειο έδαφος αναπαραγωγής για την μικροχλωρίδα λόγω του μεγάλου μεγέθους και της σύνθετης αρχιτεκτονικής του. Κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης, ο ρόλος της μικροχλωρίδας ποικίλει περιλαμβάνοντας τη σηματοδότηση και την άμυνα έναντι παθογόνων οργανισμών και της φλεγμονής (αλληλεπιδρώντας με τον βλεννογόνο), την παραγωγή βιταμινών, την επικουρική πεπτική λειτουργία και τον μεταβολισμό σημαντικών θρεπτικών ουσιών. Η γενετική σύνθεση όλων των μικροβίων σε έναν περιβάλλον ονομάζεται μικροβίωμα και έχει εμπλακεί ως θετικός και αρνητικός παράγοντας σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων, από νευρολογικές έως καρδιαγγειακές και γαστρεντερικές. Η σύσταση και ποικιλομορφία της μικροχλωρίδας του εντέρου είναι μοναδική για κάθε άτομο και επηρεάζεται από τον τόπο διαμονής, τον τρόπο ζωής και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Ίσως οι ισχυρότερες συσχετίσεις μεταξύ ασθένειας και μικροβιακής δυσβίωσης (παθολογικής ανισορροπίας των μικροβιακών κοινοτήτων) έχουν μελετηθεί και παρατηρηθεί στις Ιδιοπαθείς Φλεγμονώδεις Νόσους του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Οι ΙΦΝΕ και οι δύο κύριες εκδηλώσεις τους, η Νόσος του Crohn (NC) και η Ελκώδης Κολίτιδα (ΕΚ), είναι ιδανικές για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του βλεννογόνου και του μικροβιώματος λόγω του φλεγμονώδους υποβάθρου τους, της εμφάνισής τους στον γαστρεντερικό σωλήνα και της άγνωστης αιτιολογίας τους που περιλαμβάνει τόσο την φυσική όσο και την επίκτητη ανοσία. Η NC, ειδικότερα, προσθέτει ακόμα μία σύνθετη παθοφυσιολογική παράμετρο με τις ινωτικές επιπλοκές της.Λόγω του σύνθετου υποβάθρου τους, η μελέτη των ΙΦΝΕ απαιτεί πολύπλευρες προσεγγίσεις για τη διευκρίνιση του μοριακού τους προφίλ. Οι προσεγγίσεις πολλαπλών -omics, οι οποίες περιλαμβάνουν τη γονιδιωματική, την επιγονιδιωματική, την μεταγραφομική, την πρωτεωμική, την μεταβολομική και την μελέτη του μικροβιώματος, παρέχουν μια μοναδική ευκαιρία για την μελέτη εις βάθος της παθοφυσιολογίας και της αιτιολογίας των ΙΦΝΕ (IBD-omics). Κάθε μία από αυτές τις μεθοδολογίες βασίζεται στην παραγωγή και ανάλυση ενός μεγάλου όγκου βιολογικών δεδομένων, υπερβαίνοντας κατά πολύ τις δυνατότητες επεξεργασίας τους από τον άνθρωπο. Ως εκ τούτου, ανακύπτει η ανάγκη για υπολογιστική βοήθεια και μαζί της το επιστημονικό πεδίο της βιοπληροφορικής και ιδιαίτερα της συστημικής βιοπληροφορικής που επικεντρώνεται στις αλληλεπιδράσεις αυτών των προσεγγίσεων. Σκοπός. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η χρήση μεθόδων συστημικής βιοπληροφορικής για την αναζήτηση και ανάλυση αλληλεπιδράσεων μεταξύ της βλεννογονίου ανοσολογικής απόκρισης και του μικροβιώματος χρησιμοποιώντας σαν κύριο μοντέλο την εμπλοκή της μικροχλωρίδας του εντέρου στην ομοιόσταση και φλεγμονώδη εξεργασία του εντερικού βλεννογόνου. Η μελέτη αυτή θα γίνει στοχεύοντας στην αναζήτηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών και μοριακών στόχων στην αντιμετώπιση της εντερικής φλεγμονής. Υλικά και μέθοδοι. Ανάλογως την μοριακή λειτουργία υπό μελέτη, στα πλαίσια αυτής της διατριβής, έχουν εφαρμοστεί οι κατάλληλες μεθοδολογίες σε δείγματα ασθενών και δεδομένα διαθέσιμα στο κοινό. Οι φαινότυποι και οι υπο-φαινοτύποι της NC και της ΕΚ αποτέλεσαν τους κύριους στόχους προς μελέτη, προκειμένου να ταξινομηθούν καλύτερα αυτές οι παθήσεις και να χαρακτηριστούν τα μοναδικά μοριακά τους προφίλ. Προκειμένου να μελετηθεί το γενετικό και πρωτεϊνικό υπόβαθρο των ΙΦΝΕ, σημειακοί πολυμορφισμοί (SNPs), που σχετίζονται με την NC και την ΕΚ και τους υπο-φαινότυπους τους (όπως αυτοί χαρακτηρίζονται στο σύστημα ταξινόμησης κατά Μόντρεαλ), ανιχνεύθηκαν μέσω μιας προσαρμοσμένης μικροσυστοιχίας δεδομένων GWAS κινδύνου των ΙΦΝΕ πάνω σε δείγματα Ελλήνων ασθενών . Αυτά τα SNPs σχετίστηκαν στατιστικά με κάθε φαινότυπο μέσω του υπολογιστικού εργαλείου PLINK. Στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για 2 διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης μοριακών μονοπατιών, βασισμένες σε δεδομένα της βάσης KEGG, για την ανίχνευση λειτουργικών αλληλεπιδράσεων. Η πρώτη μέθοδος μέσω του εργαλείου βιοπληροφορικής PathwayConnector δημιουργεί συμπληρωματικά δίκτυα μοριακών μονοπατιών με σκοπό την επίτευξη ενός πλήρως συνδεδεμένου δικτύου. Η δεύτερη, μέσω της πλατφόρμας STRING παρήγαγε δίκτυα συσχετίσεως πρωτεϊνών και ενέπλεξε συγκεκριμένα μοριακά μονοπάτια. Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που εμφανίζουν σημαντική συμμετοχή στις ΙΦΝΕ και την μετέπειτα βαθμολογική ταξινόμηση των μοριακών μονοπατιών στα οποία αυτές συμμετέχουν, πραγματοποιήθηκαν τοπολογικές μετρήσεις δικτύου, και συγκεκριμένα centrality analyses. Επιπλέον, οι αναλύσεις αυτές επέτρεψαν την κατασκευή ενός δικτύου παθολογικών καταστάσεων οι οποίες μοιράζονται μοριακούς μηχανισμούς με τις ΙΦΝΕ. Για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ βλεννογόνου και μικροβίων εφαρμόστηκε μία υπολογιστική μεθοδολογία ανάλυσης μικροβιώματος. Αναλύθηκαν η μικροβιακή ποικιλότητα, η ταξινομική αφθονία, οι συσχετίσεις μικροβίων-πάθησης καθώς και ο μικροβιακός μεταβολισμός, ανάμεσα στους υπο-φαινοτύπους συμπεριφοράς της NC (Β1 μη στενωτική – μη διατιτραίνουσα, Β2 στενωτική, Β3 διατιτραίνουσα). Για τις αναλύσεις αυτές, εξετάστηκαν αλληλουχίες 16s rRNA από δύο σύνολα δεδομένων ασθενών με ΝC και υγιών μαρτύρων (διαθέσιμα στο κοινό μέσω της πλατφόρμας μικροβιακής μελέτης QIITA), από δύο γεωγραφικά διακεκριμένους πληθυσμούς. Οι αναλύσεις έγιναν με τις εφαρμογές και πλατφόρμες βιοπληροφορικής QIIME, Calypso, LEfSe, PICRUSt και STAMP.Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των γονιδίων κατά τη ΝC και τους μηχανισμούς πίσω από την ίνωση, ελήφθησαν δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών, διαθέσιμα στο κοινό μέσω του Gene Expression Omnibus. Αυτά τα σύνολα περιείχαν δεδομένα από ασθενείς με NC, Ιδιοπαθή Πνευμονική Ίνωση (IPF), Συστηματικό Σκληρόδερμα (SSc), χρόνια νεφρική νόσο (CKD) και Κίρρωση Ήπατος (LC) καθώς και φυσιολογικούς μάρτυρες. Κάθε ομάδα δεδομένων μελετήθηκε ανεξάρτητα, για να αποφευχθεί η μεροληψία λόγω διαφορετικών πειραματικών συνθηκών, χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης μέσω του εργαλείου GEO2R. Αυτές οι ομάδες περιείχαν τα στατιστικά σημαντικά (ρ <0,05) διαφορικά εκφρασμένα γονίδια έναντι υγιών μαρτύρων από τα σύνολα δεδομένων NC και τις υπόλοιπες ινωτικές διαταραχές, αντίστοιχα . Η τομή αυτών των δύο ομάδων ανέδειξε μια «ινωτική γονιδιακή υπογραφή» 241 γονιδίων που. Η υπογραφή αυτή βοήθησε στην ανάλυση μοριακών μονοπατιών μέσω της βάσης δεδομένων Reactome. Επιπλέον, αναλύσεις δικτύου έγιναν σε δύο ιστοειδικά δίκτυα γονιδιακής συν-έκφρασης που σχηματίστηκαν, από όλα τα γονίδια που συν-εκφράστηκαν στον ανθρώπινο τελικό ειλεό και το σιγμοειδές, για να αναγνωρίσουν τη μοριακή αιτιολογία πίσω από την τοπολογική προτίμηση της ίνωσης κατά τη διάρκεια της NC .Τέλος, για τον εντοπισμό φαρμάκων και χημικών ενώσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπευτικά σχήματα των ΙΦΝΕ, χρησιμοποιήθηκε υπολογιστική επανατοποθέτηση φαρμάκου στα δεδομένα διαφορικής γονιδιακής έκφρασης NC που ελήφθησαν προηγουμένως. Τα στατιστικά σημαντικά γονίδια (p <0,05) κάθε ομάδας δεδομένων χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες που περιείχαν γονίδια υπερεκφραζόμενα ή υποεκφραζόμενα έναντι υγιών μαρτύρων. Η τομή όλων των συνόλων δεδομένων NC ανέδειξε μια de novo «υπογραφή γονιδιακής έκφρασης» της NC. Αυτή η υπογραφή χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των αιτιοπαθογενετικών μηχανισμών της ΝC μέσω της REACTOME καθώς και για την ταυτοποίηση χημικών ενώσεων που την αντιστρέφουν ή την ενισχύουν μέσω του CLUE.IO. Αποτελέσματα. Συνολικά, συχετίστηκαν 41 σημειακοί πολυμορφισμοι με τους φαινοτύπους των ΙΦΝΕ, έναντι των υγιών μαρτύρων, μέσω της ανάλυσης PLINK. Τέσσερις βρέθηκαν κοινοί μεταξύ NC και EK, τρεις μεταξύ των υπο-φαινοτύπων Β1 και Β2 της NC και κανένας μεταξύ των υπο-φαινοτύπων Ε1 και Ε3 της ΕΚ. Τα συμπληρωματικά μοριακά μονοπάτια και τα εμπλουτισμένα δίκτυα συσχέτισης πρωτεϊνών αποκάλυψαν νέα αλλά και γνωστά μόρια και μηχανισμούς κινδύνου των ΙΦΝΕ. Μηχανισμοί σχετιζόμενοι με την απόπτωση, τον υποδοχέα της Jak-STAT, την PI3K-Akt, τον TNF, τα Τ- και Β- λεμφοκύτταρα, την MAPK και τον TLR συσχετίστηκαν ισχυρά. Επίσης, βρέθηκαν 44 παθήσεις μοριακούς μηχανισμούς κοινούς με τους φαινοτύπους και τους υπο-φαινότυπους των ΙΦΝΕ. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι οι υπο- φαινότυποι των ΙΦΝΕ έχουν ξεχωριστά γενετικά και μοριακά προφίλ που μπορούν να συμβάλουν στην ακριβή τους ταυτοποίηση και ταξινόμηση. Η ανάλυση του εντερικού μικροβιώματος σε συνδυασμό με τoυς υπο-φαινοτύπους συμπεριφοράς της ΝC έδειξε μειωμένη βιοποικιλότητα εντός όλων των 3 υπο-φαινοτύπων έναντι υγιών μαρτύρων, με τις πιο έντονες μειώσεις στους Β2 και Β3 σε σύγκριση με τον Β1. Οι περιπεπλεγμένοι υπο-φαινότυποι Β2 και Β3 εμφάνισαν παρόμοιους εντερότυπους μεταξυ τους και διαφορετικούς από αυτούς του Β1 και των φυσιολογικών μαρτύρων. Το ίδιο μοτίβο επισημάνθηκε από τη διαφορική μικροβιακή αφθονία μεταξύ των υπο-φαινοτύπων, την ανάλυση συσχέτισης φαινοτύπου-μικροβιακών ομάδων και τις μικροβιακές μεταβολικές διεργασίες όπου ο Β1 συμπεριφερόταν διαφορετικά από τους Β2 και Β3. Τέλος, πλήθος μικροβίων αναδείχτηκαν ως δυνητικοί βιοδείκτες για την ταξινόμηση όλων των υπο-φαινοτύπων και της προόδου της NC. Αυτά τα ευρήματα αποδεικνύουν ότι υπάρχουν διακριτές διαφορές ανάμεσα στην στενωτική και διαιτιτραίνουσα μορφή της NC έναντι της φλεγμονώδους και των φυσιολογικών μαρτύρων. Η μελέτη σχετικά με το μοριακό υπόβαθρο της ίνωσης αποκάλυψε 7 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια έναντι υγιών μαρτύρων ανάμεσα σε όλα τα σύνολα δεδομένων ΝC (CXCL1, ICAM1, PHLPP2, ZKSCAN1, ATP9A, NCF4, CACNA2D1). Η τομή όλων των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε όλες τις παθήσεις που χαρακτηρίζονται από ίνωση, ανέδειξε 241 κοινά γονίδια που συμμετέχουν σε 12 μονοπάτια που σχετίζονται με ίνωση και 17 σχετιζόμενα με φλεγμονή / ανοσοαπόκριση. Τα ιστοειδικά δίκτυα συνεκφράσεως αποκάλυψαν 122/241 γονίδια που συνεκφράζονται στον τελικό ειλεό και μόνο 32/241 στο σιγμοειδές. Όσον αφορά τα μοριακά μονοπάτια στους ιστούς αυτούς, 9 ινωτικά και 6 φλεγμονώδη εμφανίστηκαν στον τελικό ειλεό και μόνο 1 ινωτικό και 5 φλεγμονώδη στο σιγμοειδές.Τέλος, εντοπίστηκαν φάρμακα και χημικές ενώσεις που έχουν πιθανό θεραπευτικό ή επιβλαβή χαρακτήρα στην NC μέσα από διαφορικά εκφραζόμενα γονιδία έναντι φυσιολογικών μαρτύρων. Η τομή των γονιδίων σε όλα μας τα σύνολα δεδομένων υπογράμμισε 39 υπερεκφραζόμενα και 12 υποεκφραζόμενα γονίδια. Αυτά εμπλέκονται σε 26 και 52, αντιστοίχως, φλεγμονώδεις και ανοσολογικόυς μοριακούς μηχανισμούς. Συνολικά, βρέθηκαν 22 χημικές ενώσεις που αντιστρέφουν την έκφραση αυτών των γονιδίων και θα μπορούσαν να εξεταστούν για επανατοποθέτηση φαρμάκων, ενώ, 33 που την ενισχύουν και μπορεί να εμπλέκονται στην επιδείνωση της NC. Έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ότι καμία σημαντική συσχέτιση δεν βρέθηκε μεταξύ των φαρμάκων της καθημερινής κλινικής πράξης και των γονιδίων αυτών, υποδηλώνοντας έλλειψη αλληλεπιδράσεων. Συμπεράσματα. Η διατριβή αυτή χαρακτηρίζει το ξεχωριστό μοριακό και μικροβιακό υπόβαθρο των φαινοτύπων και υπο-φαινóτυπων των ΙΦΝΕ μέσω μεθόδων συστημικής βιοπληροφορικής και παραδοσιακών εφαρμογών βιοπληροφορικής. Παρουσιάζονται οι τρόποι με τους οποίους η γενετική διαφοροποίηση, η γονιδιακή έκφραση και οι μεταβολικές και μικροβιακές διαφορές μπορούν να ερμηνευθούν και να συσχετιστούν με φυσικούς και επίκτητους μηχανισμούς ανοσίας μέσω του βλεννογόνου επιτρέποντας την αναγνώριση μοναδικών μοριακών και μικροβιακών θεραπευτικών στόχων. Τέλος, επιδεικνύεται η ανάγκη για περισσότερες συνδυαστικές προσεγγίσεις σε μελλοντικές μελέτες.