Διερεύνηση του τρόπου παραγωγής και δράσης πεπτιδικών θραυσμάτων της προθυμοσίνης α: νέα ανοσοενισχυτικά μόρια των λεμφοκυτταρικών αποκρίσεων
Authors: Ιωάννου Κυριακή 
Published: September 2021

Η προθυμοσίνη α (προΤα) απομονώθηκε πρώτη φορά το 1984 από θύμο αδένα αρουραίου. Είναι μία πυρηνική, κυρίως, πρωτεΐνη με διπλό διακριτό ρόλο. Ενδοκυτταρικά συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού θανάτου, ενώ εξωκυτταρικά δρα πλειοτροπικά, επάγοντας και ενισχύοντας τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Στα πλαίσια του ανοσορυθμιστικού της ρόλου, τόσο η ακέραια πρωτεΐνη όσο και το καρβοξυτελικό ανοσοδραστικό της τμήμα προΤα(100-109), επάγουν τη φαινοτυπική ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων, που συνιστούν τα επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της ικανότητας της προΤα και του προΤα(100-109) να δρουν ως ανοσοενισχυτικά μόρια ενεργοποιώντας δενδριτικά κύτταρα, εστιάζοντας: I. Στην αναγνώριση της επιφανειακής θέσης πρόσδεσης/υποδοχέα, αλλά και των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που ενεργοποιούνται καταρροϊκά αυτής και μεσολαβούν τη δράση της προΤα και του δεκαπεπτιδίου της προΤα(100-109) σε ανθρώπινα δενδριτικά κύτταρα, II. Στην αναλυτικότερη μελέτη του φαινοτύπου, αλλά κυρίως της λειτουργικότητας των δενδριτικών κυττάρων που ωριμάζουν παρουσία προΤα ή προΤα(100-109)και του τύπου των T κυτταρικών ανοσοαπαντήσεων που επάγουν in vitro,III. Στη διερεύνηση της αντικαρκινικής δράσης της προΤα και του προΤα(100-109)σε ένα in vivo μοντέλο μελανώματος σε ποντίκια και στον ex vivo έλεγχο των επαγόμενων από τα δύο πεπτίδια ανοσολογικών απαντήσεων, καιIV. Στην προσπάθεια συσχέτισης των δύο διακριτών ρόλων (ενδοκυτταρικού και εξωκυτταρικού) της προΤα και τη μελέτη της πιθανότητας το ακέραιο μόριο ή/και το ανοσοδραστικό δεκαπεπτίδιο προΤα(100-109) να δρουν εξωκυτταρικάως «σήματα κινδύνου».Αρχικά, λαμβάνοντας υπόψη πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα που υποστηρίζουν ότι η προΤα σηματοδοτεί μέσω υποδοχέων τύπου Toll (TLR) σε ανθρώπινα μονοκύτταρα και προσδένεται στον ΤLR-4 σε μακροφάγα ποντικού,θελήσαμε να εξετάσουμε αν ο ίδιος υποδοχέας ενεργοποιείται και στα ανθρώπινα δενδριτικά κύτταρα. Με κυτταρομετρία ροής, μελετήσαμε την επιφανειακή έκφραση του ΤLR-4 σε δενδριτικά κύτταρα διαφοροποιημένα από μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ανθρώπου, μετά από ωρίμανσή τους με LPS, προΤα ή προΤα(100-109) για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Παρατηρήσαμε ότι και οι τρεις παράγοντες ωρίμανσης οδήγησαν σε συγκρίσιμη παροδική αύξηση της έκφρασης του ΤLR-4 στην επιφάνεια των δενδριτικών κυττάρων. Με τη βοήθεια ανάλυσης κατά Western,παρατηρήθηκε ότι η αυξημένη έκφραση του TLR-4 συνοδεύτηκε και από αντίστοιχη ενδοκυτταρική ενεργοποίηση, καθώς τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών προσαρμογέων του TLR-4, MyD88, TIRAP και TRIF, βρέθηκαν αυξημένα ύστερα από επίδραση με LPS, προΤα και προΤα(100-109). Τα δεδομένα αυτά αποτελούν μία πρώτη ένδειξη ότι η ικανότητα της προΤα και του προΤα(100-109), όπως του LPS, να ωριμάζουν ανθρώπινα δενδριτικά κύτταρα μεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από τον TLR-4, επάγοντας την ενεργοποίηση των MyD88- και TRIF-εξαρτώμενων μονοπατιών σηματοδότησης καταρροϊκά αυτού. Στη συνέχεια, ελέγξαμε αν τα δενδριτικά κύτταρα που ωριμάζουν παρουσία προΤα ή προΤα(100-109) εκφράζουν χαρακτηριστικά μόρια-δείκτες των δενδριτικών κυττάρων και παράγουν επαγωγικές, για τα Τ λεμφοκύτταρα, κυτταροκίνες. Σε συμφωνία με ήδη δημοσιευμένα αποτελέσματα, η προΤα και το προΤα(100-109)αύξησαν την έκφραση των μορίων HLA-DR, CD11b, CD80, CD83, CD86 και CD40 στην επιφάνεια των δενδριτικών κυττάρων, σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά που επάγονται από τον LPS. Τα επίπεδα αυτά ήταν συγκρίσιμα και με αυτά που επάγονται παρουσίαTNF-α, ενός παράγοντα ωρίμανσης ευρέως χρησιμοποιούμενου σε κλινικές δοκιμές που βασίζονται στα δενδριτικά κύτταρα. Επιπλέον, ανάλυση των υπερκειμένων καλλιέργειας έδειξε ότι τα δενδριτικά κύτταρα που ωρίμασαν παρουσία των δύο πεπτιδίων, σε αντιστοιχία με τα πρότυπα (LPS- ή TNF-α-ωριμασμένα) δενδριτικά κύτταρα, παρήγαγαν κυρίως την προφλεγμονώδη κυτταροκίνη IL-12, υποδεικνύοντας την ικανότητά τους να προάγουν ανοσοαπαντήσεις τύπου ΤH1. Η ικανότητά τους αυτή, επιβεβαιώθηκε με έλεγχο της λειτουργικότητάς τους invitro. Αναλυτικότερα, προΤα- και προΤα(100-109)-ωριμασμένα δενδριτικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να διεγείρουν αυτόλογα Τ κύτταρα, τόσο μνήμης όσο και παρθένα, παρουσία ιικών και ογκοειδικών πεπτιδίων-αντιγόνων, αντίστοιχα. Ο έλεγχος των παραγόμενων από τα βοηθητικά Τ κύτταρα κυτταροκινών με πολυχρωματική κυτταρομετρία ροής, και στα δύο συστήματα μελέτης, αποκάλυψε την αυξημένη παραγωγή προφλεγμονωδών (TNF-α, IFN-γ, IL-2) και τη μειωμένη παραγωγή αντιφλεγμονωδών (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) κυτταροκινών, επιβεβαιώνοντας την επαγωγή απαντήσεων τύπου ΤΗ1. Αντίστοιχο ήταν και το προφίλ των παραγόμενων από τα CD8+ Τ κύτταρα κυτταροκινών, υποδηλώνοντας τη διαφοροποίησή τους σε TC1-τύπου κύτταρα. Επιπλέον, τα ογκοειδικά κυτταροτοξικά Τ κύτταρα πουεκπτύχθηκαν στις καλλιέργειες ενεργοποίησης των παρθένων Τ κυττάρων, ήταν πολυλειτουργικά και επέδειξαν αυξημένη αντιγονοειδική MHC τάξης I-περιοριζόμενη κυτταροτοξικότητα. Αντίστοιχα, οι εκπτυχθείσες ογκοειδικές Τ κυτταρικές σειρές παρουσίασαν αντιγονοειδική MHC τάξης IΙ-περιοριζόμενη ικανότητα πολλαπλασιασμού. Σε συνέχεια των in vitro αποτελεσμάτων, μελετήσαμε την in vivo ικανότητα του προΤα(100-109) και της προΤα να εγείρουν ογκοειδικές ανοσοαπαντήσεις σε ένα πειραματικό μοντέλο μελανώματος. Για την ανάπτυξη μελανωματικών όγκων στα ζώα χρησιμοποιήσαμε τα κύτταρα Β16.F1, γνωρίζοντας ότι τα κύτταρα αυτά είναι αντιγονικά, ανοσογονικά και μπορούν να σχηματίσουν συμπαγείς όγκους όταν χορηγηθούν υποδόρια σε συγγενικά ποντίκια της φυλής C57BL/6. Η προΤα και το ανοσοδραστικό της πεπτίδιο χορηγήθηκαν στα ζώα, σε συνδυασμό με ογκοειδικά πεπτιδικά αντιγόνα που εκχυλίστηκαν από την ίδια κυτταρική σειρά, με σκοπό την ενεργοποίηση ειδικών απαντήσεων έναντι του όγκου. Αναπτύξαμε δύο πρωτόκολλα,ένα ετερόχρονης και ένα σύγχρονης χορήγησης ανοσοενισχυτικών παραγόντων και καρκινικών κυττάρων. Καταγράφοντας την πορεία ανάπτυξης των όγκων,παρατηρήσαμε ότι η προΤα και το πεπτίδιο προΤα(100-109) επέδειξαν ιδιαίτερα ευεργετική δράση, μειώνοντας το ρυθμό αύξησης του καρκινικού φορτίου και παρατείνοντας την επιβίωση των πειραματόζωων και στα δύο ανοσοθεραπευτικά πρωτόκολλα. Μάλιστα, ο ex vivo έλεγχος των σπληνοκυττάρων που απομονώθηκαν από συγκεκριμένα ζώα όλων των ομάδων επιβεβαίωσε ότι η παρατηρούμενη ανάσχεση της ανάπτυξης των μελανωματικών κυττάρων οφειλόταν στην in vivo επαγωγή αντιγονοειδικών, αλλά και μη ειδικών κυτταροτοξικών απαντήσεων, μεσολαβούμενων από ενεργοποιημένα Τ και ΝΚ/LAK λεμφοκύτταρα, αντίστοιχα.Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η προΤα ενδοκυτταρικά ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και δρα αντιαποπτωτικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, εξωκυτταρικά, το ίδιο πολυπεπτίδιο και το ανοσοδραστικό της δεκαπεπτίδιο ενισχύουν τις κυτταρομεσολαβητικές απαντήσεις τόσο in vitro όσο και invivo. Σε μια προσπάθεια να συνδέσουμε τους δύο αυτούς ρόλους, μελετήσαμε τις συνθήκες παραγωγής και εξωκυττάρωσης του προΤα(100-109) προκειμένου να ασκήσει τον εξωκυτταρικό του ρόλο. Είναι γνωστό, ότι σε πρώιμα στάδια της απόπτωσης η προΤα μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα όπου και υπόκειται πέψη από τις ενεργοποιημένες κασπάσες 3 και 7 στο αμινοξύ (D) 99. Το τμήμα 1-99 της προΤα έχει εντοπιστεί στο κυτταρόπλασμα, ενώ το προΤα(100-109) δεν έχει ανιχνευθεί μέχρι στιγμής ενδοκυτταρικά. Υποθέτοντας ότι είναι πιθανό τα δκεκαπεπτίδιο να εξωκυτταρώνεται και αφού δείξαμε ότι το προΤα(100-109) παραμένει ακέραιο και δεν θραυσματοποιείται περαιτέρω από ενεργοποιημένες κατά την απόπτωση πρωτεάσες, εξωκυττάριο υλικό αποπτωτικών κυττάρων HeLa αναλύθηκε με HPLC και φασματομετρία μάζας. Στα αποκτηθέντα φάσματα μάζας ανιχνεύθηκε κορυφήμοριακής μάζας αντίστοιχης της θεωρητικής μοριακής μάζας του προΤα(100-109),υποδεικνύοντας ότι το δεκαπεπτίδιο εξωκυτταρώνεται υπό συνθήκες απόπτωσης μέσω ενός αγνώστου, προς το παρόν, μηχανισμού. Μάλιστα, όπως επίσης δείξαμε, η εξωκυττάρωση αυτή σχετίζεται με την απόπτωση και όχι με άλλους τύπους κυτταρικού θανάτου, όπως η νέκρωση και η όγκωση. Συνοψίζοντας, στην παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζονται σημαντικά δεδομένα για την ανοσοενισχυτική δράση της προΤα και του προΤα(100-109).Μελετώντας την έκφραση του TLR-4, καθώς επίσης και ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε μονοπάτια σηματοδότησης καταρροϊκά αυτού, διαπιστώσαμε ότι ο υποδοχέας αυτός μεσολαβεί, τουλάχιστον εν μέρει, την επαγόμενη από τα δύο πεπτίδια ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων. Τα δενδριτικά κύτταρα που ωριμάζουν παρουσία προΤα ή προΤα(100-109) εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα MHC μόρια τάξης ΙΙ και συνδιεγερτικά μόρια, και παράγουν προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες. Από τη μελέτητης λειτουργικότητάς τους, αποδείχθηκε ότι εκτός από φαινοτυπικά ώριμα, τα συγκεκριμένα δενδριτικά κύτταρα είναι και ανοσοϊκανά, και μπορούν in vitro να ενεργοποιούν αντιγονοειδικά Τ κύτταρα, ανεξαρτήτως του τύπου τους (Τ κύτταρα μνήμης και παρθένα), αλλά και της φύσεως του αντιγόνου (ιικά και ογκοειδικά). Οι ανοσοαπαντήσεις που επάγουν μεσολαβούνται από TH1- και TC1-τύπου Τ κύτταρα.Παράλληλα, τόσο η ακέραια πρωτεΐνη όσο και το ανοσοδραστικό της τμήμα ενίσχυσαν τις ογκοειδικές, κυρίως, απαντήσεις σε ένα in vivo μοντέλο μελανώματος, με αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού αύξησης του καρκινικού φορτίου και την παράταση της επιβίωσης των πειραματόζωων. Συνδυάζοντας τα παραπάνω δεδομένα με τις πρώτες ενδείξεις για ειδική εξωκυττάρωση του πεπτιδίου προΤα(100-109) υπό αποπτωτικές συνθήκες, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποστηρίζουν την ικανότητα της προΤα και του προΤα(100-109) να δρουν ως «σήματα κινδύνου», ενισχύοντας και προάγοντας τις ανοσολογικές απαντήσεις in vivο. Αν η υπόθεση αυτή επιβεβαιωθεί περαιτέρω, ανοίγονται νέες προοπτικές για την πιθανή χρήση των δύο πεπτιδίων ως ανοσοενισχυτικών μορίων για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας αντικαρκινικών, κυρίως, εμβολίων που βασίζονται στη χρήση καρκινικών αντιγόνων σε συνδυασμό με δενδριτικά κύτταρα.