Zur Methodik der Bestimmung der Antibiotikumempfindlichkeit von Chlamydien in vitro
Authors: Henning K. , Krauss H. 
Published: May 2010

Methods of Investigation of Antibiotic Resistance of Chlamydiae in Vitro

In this paper first the various methods for testing antibiotic resistance of chlamydiae (estimation of minimum inhibitory concentration = MIC, minimum bactericidal concentration = MBC; “washed and reincubated” method) are discussed. The MIC of the antibiotic doxycyline was determined for 12 strains of Chlamydia psittaci in cell cultures and the influence of a number of factors on the test results investigated.

McCoy and BGM cells were equally suited for determination of the MIC. Various amounts of protein in the medium and addition of cycloheximide did not influence the test results. For the 12 Chlamydia psittaci strains the average MIC value was 0.03μg/ml. Prolongation of incubation of the test‐tubes (90 instead of 40 hours) altered results only insignificantly. The optimal time for the addition of the antibiotic to the infected cells was within the first two hours after infection.

For determination of the MBC, repeated washing of the infected and treated cell cultures was paramount. Cell‐associated doxycycline needed up to 48 hours to be washed out of the cells. A MBC could not be determined for the doxycycline preparation investigated (Vibravenös®, Pfitzer), since 20 μg/ml were not sufficient for the elimination of the agent from the cells, and higher amounts proved to be cytotoxic.

The MBC as determined by a number of authors is questioned, because detection of mature infectious chlamydiae (elementary bodies) may not be substantiated after disintegration of the cells, due to the developmental cycle of chlamydiae.

In der vorliegenden Arbeit werden zunächst die verschiedenen Methoden zur Bestimmung der Antibiotikumempfindlichkeit von Chlamydien — minimale Hemmkonzentration (MHK), minimale bakterizide Konzentration (MBK) und die “washed and reincubated” (W & R)‐Methode — besprochen.

Da die von verschiedenen Autoren verwendeten Untersuchungsmethoden variieren, wurden eigene Untersuchungen zur Bestimmung der MHK und MBK des Antibiotikums Doxycyclin (Vibravenös®, Fa. Pfizer) durchgeführt und dabei der Einfluß verschiedener Faktoren auf das Versuchsergebnis ermittelt.

McCoy‐ und BGM‐Zellen sind gleichermaßen für den MHK‐Test geeignet. Der Eiweißgehalt des Mediums sowie der Zusatz von Actidion hatte keinerlei Einfluß auf die MHK. Die MHK für Doxycyclin betrug für 12 untersuchte Chl. psittaci‐Stämme im Mittel 0,03μg/ml. Eine Verlängerung der Versuchszeit beeinflußte die MHK nur unwesentlich, z.T. erhd̈hten sich die Werte um 0,01 μg/ml. Als optimaler Zeitpunkt für die Zugabe des Doxycyclins zur infizierten Zellkultur wurden die ersten 2 Stunden p. i. ermittelt.

Zur Bestimmung der MBK erwies sich ein mehrmaliges Waschen der infizierten und antibiotisch behandelten Zellkultur als zwingend erforderlich, da zellassoziiertes Doxycyclin eine gewisse Zeit benötigt, um aus den Zellen herausgewaschen zu werden. Erst die in Anschluß daran vorgenommene Reinkubation und Passagierung führt zu gesicherten Aussagen bezüglich der Bakterizidie von Antibiotika gegen Chl. psittaci. Im vorliegenden Fall konnte für das verwendete Doxycyclinpräparat “Vibravenös®” die MBK nicht bestimmt werden, da Mengen von 20 μg/ml für eine Eliminierung des Erregers nicht ausreichten und höhere Konzentrationen zytotoxische Effekte hervorriefen.

Die minimale bakterizide Konzentration, wie sie von vielen Autoren bestimmt wird, wird in Frage gestellt, da den eigenen Untersuchungen zufolge und auch aufgrund von Literaturangaben hier der Nachweis von reifen, infektiösen Chlamydien (Elementarkörperchen) nach Aufschluß der antibiotikumbehandelten infizierten Wirtszellen unzureichend ist.