Studies of the membrane influenza A/M2 protein with aminoadamantane drugs using experimental and computational biophysics
Authors: Κωνσταντινίδη Αθηνά 
Published: February 2025

Στο Κεφάλαιο 1 περιγράφονται τα βασικά χαρακτηριστικά του μηχανισμού αντιγραφής του ιού της γρίπης Α, με έμφαση στη λειτουργία της πρωτεΐνης Μ2 του ιού της γρίπης Α. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφεται η δομή του πρωτεϊνικού διαύλου πρωτονίων Μ2 (M2 WT) του ιού της γρίπης Α, ο οποίος αποτελεί αρχέτυπο ιοντικό κανάλι. Ο δίαυλος αυτός αποτελεί στόχο των αντι-ιικών φαρμάκων αμανταδίνη (amantadine) και ριμανταδίνη (rimantadine). Διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για την κατανόηση των δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών αυτού του διαύλου, συμπεριλαμβανομένων της περίθλασης νετρονίων, της ηλεκτροφυσιολογίας, της φασματοσκοπίας NMR διαλύματος, της φασματοσκοπίας στερεάς κατάστασης NMR (ssNMR) και της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, σε μία ερευνητική πορεία τριών δεκαετιών γεμάτη αντιπαραθέσεις. Η πειραματική δομή του διαμεμβρανικού τομέα Μ2(22-46) (M2TM), ο οποίος αποτελεί τον πόρο του διαύλου Μ2, επιλύθηκε το 2000, ενώ οι κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων του με την αμανταδίνη, τη ριμανταδίνη και άλλα μόρια δημοσιεύθηκαν έως το 2018. Μέχρι σήμερα, έχουν επίσης επιλυθεί βασικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης του αγώγιμου τομέα του M2 (M2CD ή M2AH), που περιλαμβάνει το M2TM και τις αμφιπαθείς έλικες (46-62), χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία ssNMR. Στο Κεφάλαιο 3 παρουσιάζονται οι βασικές αρχές των πειραματικών βιοφυσικών μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, δηλαδή η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC), η σκέδαση ακτίνων Χ σε μικρές και μεγάλες γωνίες (SAXS/WAXS) και η φασματοσκοπία ssNMR. Στο Κεφάλαιο 4 διερευνώνται οι συγκριτικές επιδράσεις που ασκούν στην κυτταρική μεμβράνη οι αναστολείς του πρωτεϊνικού διαύλου M2 WT, αμανταδίνη και η παράγωγός της AK13 (spiro[pyrrolidine-2,2'-adamantane]), χρησιμοποιώντας βιοφυσικές μεθόδους και προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD). Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Καθηγητών Thomas Mavromoustakos και Costas Demetzos, καθώς και της Dr. Barbara Sartori και του Καθηγητή Heinz Amenitsch. Οι πειραματικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν DSC, σκέδαση ακτίνων Χ και φασματοσκοπία ssNMR. Και οι τρεις μέθοδοι έδειξαν ότι τα δύο ανάλογα μόρια προκαλούν έντονες διαταραχές στις διπλοστιβάδες DMPC, με την AK13 να είναι πιο αποτελεσματική σε υψηλές συγκεντρώσεις. Οι προσομοιώσεις MD αποκάλυψαν λεπτομέρειες για τις αλληλεπιδράσεις των φαρμάκων με την κυτταρική μεμβράνη, καθώς και τον σχηματισμό δεσμών υδρογόνου με το νερό και τις φωσφορικές ομάδες των λιπιδίων. Στο Κεφάλαιο 5 περιγράφεται η μελέτη των αλληλεπιδράσεων του M2TM WT με τις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Καθηγητών Thomas Mavromoustakos και Costas Demetzos, καθώς και της Dr. Barbara Sartori και του Καθηγητή Heinz Amenitsch. Το πεπτίδιο M2TM συντέθηκε από την ερευνητική ομάδα του Καθηγητή Thedoros Tselios. Χρησιμοποιήθηκαν διάφορες βιοφυσικές μέθοδοι (DSC, SAXS/WAXS, MD προσομοιώσεις, φασματοσκοπία ssNMR), οι οποίες έδειξαν ότι το M2TM αλληλεπιδρά έντονα με τις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Στο Κεφάλαιο 6 παρουσιάζεται η μελέτη της σύνδεσης των μικρών μορίων αμανταδίνης και ριμανταδίνης με το κανάλι Μ2 WT του ιού της γρίπης Α, το οποίο αποτελεί στόχο των αντι-ιικών φαρμάκων. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Καθηγητών William DeGrado και Jun Wang. Χρησιμοποιήθηκαν κρυσταλλογραφικές μέθοδοι, που επέτρεψαν την επίλυση κρυσταλλικών δομών των συμπλόκων των φαρμάκων με το M2. Στο Κεφάλαιο 7 περιγράφεται η μελέτη της μετάλλαξης V27A στο κανάλι M2, η οποία προσδίδει ανθεκτικότητα στην αμανταδίνη. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Καθηγητών DeGrado και Wang. Χρησιμοποιήθηκαν κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και προσομοιώσεις MD, που αποκάλυψαν τις δομικές αλλαγές του διαύλου λόγω της μετάλλαξης V27A, καθώς και την αλλαγή στη θέση σύνδεσης των φαρμάκων. Στο Κεφάλαιο 8 παρουσιάζεται η μελέτη της σύνδεσης των δύο εναντιομερών της ριμανταδίνης [(R)- και (S)-rimantadine] στο κανάλι Μ2. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Καθηγητών DeGrado, Jun Wang και Jon Essex. Χρησιμοποιήθηκαν κρυσταλλογραφικές μέθοδοι, ηλεκτροφυσιολογικές μετρήσεις και προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής, που αποκάλυψαν ότι τα δύο εναντιομερή δεσμεύονται με παρόμοιο τρόπο στον δίαυλο Μ2, χωρίς να εμφανίζουν σημαντικές διαφορές στην αποτελεσματικότητά τους.