Ο ρόλος των μεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών στον καρκίνο των ωοθηκών
Authors: Ντάνγκαη Ντενάρντα 
Published: August 2021

Καθώς η θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με τις συμβατικές χημειοθεραπείες δεν είναι αποτελεσματική, αναζητούνται προσεγγίσεις που στοχεύουν συγκεκριμένους καρκινικούς στόχους ή ειδικά σηματοδοτικά μονοπάτια.Ένας από τους στόχους αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη και CA125 στην εξέλιξη και μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών αλλά και η διερεύνηση εφαρμογών, που βασίζονται σε αντισώματα, με σκοπό τον περιορισμό των περιτοναϊκών μεταστάσεων. Έτσι, υποθέσαμε ότι η ταυτόχρονη στόχευση των δύο αυτών γλυκοπρωτεϊνών θα μπορούσε να περιορίσει πιο αποτελεσματικά τη μετάσταση. Για να ελέγξουμε την παραπάνω υπόθεση αναπτύξαμε ένα μοντέλο μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών στον ποντικό. Σύμφωνα με την in vivo απεικόνιση, η τοπική χορήγηση του συνδυασμού των δύο αντισωμάτων που στοχεύουν την μεσοθηλίνη και το CA125 περιόρισε τις μικρομεταστάσεις σε σύγκριση με τις ομάδες ποντικών στα οποία χορηγήθηκαν μεμονωμένα αντισώματα. Η ανάλυση των ανοσοποιητικών κυττάρων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος της περιτοναϊκής κοιλότητας έδειξε πως η συνδυασμένη θεραπεία περιόρισε α) τις μικρομεταστάσεις, β) το καρκινικό φορτίο και γ) τα δραστικά προερχόμενα από το μυελό ανοσοκατασταλτικά κύτταρα (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs). Η σημασία της παρατήρησής μας είναι προφανής, αφού ένα καρκινικό μικροπεριβάλλον με λιγότερα ανοσοκατασταλτικά στοιχεία ευνοεί την ανοσολογική απόρριψη του όγκου.Η μεσοθηλίνη, εκτός από μια γλυκοπρωτεΐνη προσδεδεμένη στην κυτταρική επιφάνεια μέσω «άγκυρας» γλυκοσυλο-φωσφατιδυλο-ϊνοσιτόλης (GPI), υπάρχει και σε εκκρινόμενη μορφή και συνιστά έναν καρκινικό δείκτη στον ορό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Διατυπώσαμε την υπόθεση ότι τα καρκινικά αντιγόνα με άγκυρα GPI όπως η μεσοθηλίνη, μπορούν να δεσμεύονται στον υποδοχέα της μαννόζης (MR) που εκφράζεται από τα μακροφάγα τα οποία διηθούν τους καρκίνους, μέσω των τελικών καταλοίπων μαννόζης. Επίσης η πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης στον MR, θα μπορούσε να συνεισφέρει στην ενεργοποίηση των μακροφάγων προς έναν εναλλακτικό, σχετιζόμενο με τον καρκίνο φαινότυπο (TAM). Για να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση ελέγξαμε την ύπαρξη προσδεδεμένης μεσοθηλίνης στην επιφάνεια μακροφάγων από ασκίτες ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Με κυτταρομετρία ροής βρήκαμε ότι τα μακροφάγα τα οποία εξέφραζαν τον υποδοχέα της μαννόζης είχαν στην επιφάνειά τους προσδεδεμένη μεσοθηλίνη. Σε in vitro πειράματα που περιελάμβαναν καλλιέργεια ώριμων μακροφάγων και καρκινικών σειρών ωοθήκης σε συστήματα transwell, επιβεβαιώσαμε την πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης σε μακροφάγα που στο τεχνητό καρκινικό περιβάλλον υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της μαννόζης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε πως η εκκρινόμενη μεσοθηλίνη που δεν διαθέτει άγκυρα GPI δεν προσδένεται σε μακροφάγα. Για να αποδείξουμε πως η πρόσδεση οφειλόταν στον υποδοχέα της μαννόζης απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα κατά της υπομονάδας που αναγνωρίζει με ειδικότητα κατάλοιπα μαννόζης (anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) μετά από σάρρωση βιβλιοθήκης ζύμης που εκφράζει στην επιφάνειά της ανασυνδυασμένα αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά παρεμπόδισαν την πρόσδεση της μεσοθηλίνης. Επιπλέον, ο κλώνος #G11, απέτρεψε την πόλωση των μακροφάγων σε φαινότυπο TAM. Αυτό αποδεικνύει πως παράγοντες ικανοί να ρυθμίζουν την πόλωση των μακροφάγων στο καρκινικό μικροπεριβάλλον είναι δυνατόν να πυροδοτήσουν την απόρριψη του όγκου από τοανοσοποιητικό σύστημα.Για να διευρύνουμε τη στόχευση των σχετιζόμενων με τον καρκίνο μακροφάγων (ΤΑΜ), μελετήσαμε επίσης την γλυκοπρωτείνη Β7-Η4 που 1) αντιπροσωπεύει έναν από τους σημαντικούς καταστολείς των Τ λεμφοκυττάρων, 2) υπερεκφράζεταιι στα ΤΑΜ και 3) συσχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα και κακή πρόγνωση για την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Μετά από ανάλυση πρωτογενών καρκινικών κυττάρων από ασκίτες ή συμπαγείς όγκους ή από ποντικούς στους οποίους είχαν δημιουργηθεί όγκοι ωοθήκης, εντοπίσαμε αυξημένη έκφραση του Β7-Η4 στην κυτταρική επιφάνεια. Επίσης, βρήκαμε πως τα διηθούμενα στον όγκο μακροφάγα παρουσίαζαν αυξημένη επιφανειακή έκφραση του Β7-Η4. Για τη στόχευση του Β7-Η4 των καρκινικών κυττάρων και των ανοσοκατασταλτικών ΤΑΜ, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα. Επιλεγμένοι κλώνοι αντισωμάτων κατά του Β7-Η4 μελετήθηκαν λεπτομερώς για την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την ανοσοκατασταλτική δράση του Β7-Η4. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κλώνος 3#54 μπορούσε να αντιστρέψει την καταστολή της ενεργότητας Τ λεμφοκυττάρων μετά από ομοιοπολική ενεργοποίηση μέσω του CD3 μορίου παρουσία της ανασυνδυασμένης Β7-Η4 πρωτεΐνης. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το B7-H4 που εκφράζεται in cis από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα ή in trans από ΤΑΜs μειώνει την ενεργοποίηση Τ κυττάρων με ειδικότητα για καρκινικά αντίγονα κατόπιν αναγνώρισης των κυττάρων-στόχων τους. Τo ανασυνδυασμένο αντίσωμα κατά του B7-H4 3#54 από την άλλη, εξουδετερώνει την αρνητική επίδραση του Β7-Η4 προάγοντας την ανοσολογική απόκριση των Τ λεμφοκυττάρων κατά των καρκινικών στόχων ή κυττάρων που παρουσιάζουν τον αντιγονικό επίτοπο. Ανακεφαλαιώνοντας, στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τον ρόλο της υπερέκφρασης των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη, CA125, MR και B7-H4. Οι συγκεκριμένες αποτελούν σημαντικούς διαγνωστικούς και προγνωστικούς δείκτες στον καρκίνο των ωοθηκών. Μελετήσαμε την πρόσδεση αυτών των αντιγόνων σε μακροφάγα ή σε Τ λεμφοκύτταρα και αποκαλύψαμε σημαντικές συνέπειες των αλληλεπιδράσεων αυτών για την ανοσολογική απόκριση έναντι καρκινικών κυττάρων. Τέλος, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα έναντι των παραπάνω γλυκοπρωτεϊνών και διερευνήσαμε την εφαρμογή τους σε πειραματικές μελέτες για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων στον καρκίνο των ωοθηκών.