Μελέτη των γονιδίων και ρυθμιστικών στοιχείων που εμπλέκονται στην αντιγραφή και μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στους εντομοπαθογόνους μύκητες Beauveria bassiana και Metarhizium brunneum
Authors: Βαρασσάς Στυλιανός 
Published: August 2023

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες και πιο συγκεκριμένα τα γένη Beauveria και Metarhizium έχουν αξιοποιηθεί παγκοσμίως για τη βιολογική καταπολέμηση των εντόμων παρασίτων στις αγροτικές καλλιέργειες ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου (BCAs). Οι γονιδιωματικές αναλύσεις είναι σημαντικές για την καλύτερη κατανόηση του τρόπου δράσης των παραπάνω μυκήτων, και επομένως για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητάς τους έναντι των εντόμων - ξενιστών. Μέχρι στιγμής έχουν μελετηθεί οι αλληλουχίες των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων τους, αλλά όχι σε επίπεδο μεταγραφής. Εκτός από τους ζυμομύκητες και τον υφομύκητα Neurospora crassa, των οποίων η μεταγραφή των μιτοχονδριακών γονιδίων έχει περιγραφεί σε ικανοποιητικό βαθμό, στους υπόλοιπους Ασκομυκητες, και συγκεκριμένα στο Υπόφυλο Pezizomycotina, οι σχετικές πληροφορίες είναι λιγοστές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στους υπό εξέταση εντομοπαθογόνους μύκητες, καθώς και τα βασικά ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτήν τη βασική μιτοχονδριακή λειτουργία. Μέσω πειραμάτων RT-PCR και υβριδισμών κατά Northern αποκαλύφθηκε ο δομικός μεταγραφικός χάρτης των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στα είδη B. bassiana και M. brunneum. Τα mt-γονίδια και στους δύο υπό μελέτη μύκητες μεταγράφονται σε έξι κύριες πολυσιστρονικές μεταγραφικές μονάδες και έπειτα κάθε μία υφίσταται μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις για τη δημιουργία των μονοσιστρονικών μεταγράφων. Οι μιτοχονδριακοί υποκινητές προσδιορίστηκαν και στα δύο mt-γονιδιώματα μέσω συγκριτικής in silico ανάλυσης, η οποία διενεργήθηκε σε μεγάλο πλήθος μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων από την τάξη Hypocreales, λαμβάνοντας υπόψη και όλες τις ήδη γνωστές πληροφορίες που υπήρχαν βιβλιογραφικά και από άλλα μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων. Η συναινετική αλληλουχία των mt υποκινητών είναι 5'-ATAGTTATTAT-3', και είναι σύμφωνη με τον ορισμό των πολυσιστρονικών μεταγραφικών μοναδων, που προσδιορίστηκαν μέσω της πειραματικής διαδικασίας που περιγράφηκε παραπάνω. Επιπλέον, πείραμα 5'-RACE PCR, στην περίπτωση της 5ης πολυσιστρονικής μεταγραφικής μονάδας (nad1-nad4-atp8-atp6), αποκάλυψε το 5'-άκρο του RNA μεταγράφου, αμέσως μετά τον in silico καθορισμένο mt-υποκινητή, όπως έχει ήδη περιγραφεί και στη N. crassa και τις ζύμες, ανοδικά του πρώτου γονιδίου του εκάστοτε πολυσιστρονικού μεταγράφου. Παράλληλα με την ανάλυση των 5'-άκρων των πρωτογενών πολυσιστρονικών μεταγράφων στους εντομοπαθογόνους μύκητες, οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι τα tRNA γονίδια ενδέχεται να λειτουργούν ως σημεία λήξης της mt-μεταγραφής σύμφωνα με το «λειτουργικό μοντέλο» (functional model). Ισχυρή ένδειξη αποτελεί η in vitro ανάλυση των πολυσιστρονικών μονάδων 4 και 5 (cox1-trnR2 και nad1-nad4-atp8-atp6, αντίστοιχα), τόσο στο μύκητα B. bassiana όσο και στο M. brunneum, με το συντηρημένο μοτίβο της αλληλουχίας λήξης να διαμορφώνεται ως εξής: 5'-TAAATT-3', καθοδικά του τελευταίου γονιδίου του εκάστοτε πολυσιστρονικού μεταγράφου. Δεδομένου ότι από τις παραπάνω μελέτες ανακτήθηκαν αρκετά συντηρημένα στοιχεία σε σύγκριση με τα ήδη γνωστά δεδομένα, πραγματοποιήθηκαν εξελικτικές - φυλογενετικές αναλύσεις για την mt-RNA πολυμεράση (Rpo41) και τον μεταγραφικό παράγοντά της (Mtf1), προκειμένου να καθοριστεί η πορεία εξέλιξης τους. Έπειτα από βιοπληροφορική έρευνα βρέθηκε ότι η Rpo41 των μυκήτων προέρχεται από την αντίστοιχη πολυμεράση των βακτηριοφάγων Τ7/Τ3, και για λόγους που χρήζουν περαιτέρω εξέτασης, η συγκεκριμένη φαγική προγονική RNA πολυμεράση παρέμεινε στο αρχέγονο μιτοχόνδριο ως πλήρως λειτουργική, ενώ ο πρόγονος του Mtf1 εξελίχθηκε από το μεταγραφικό παράγοντα σίγμα ενός α πρωτεοβακτηρίου. Επομένως, αυτή η μελέτη παρουσιάζει πληροφορίες σχετικά με την πιστότητα της μοναδικής υπομονάδας της mt-RNA πολυμεράσης κατά τη μεταγραφή, καθώς η σωστή αναγνώριση των μιτοχονδριακών υποκινητών από την Rpo41 απαιτεί ένα παράγοντα παρόμοιο με τον βακτηριακό παράγοντα σίγμα (σ), δηλαδή τον Mtf1. Έτσι, η υπόθεση ενός μολυσμένου με φάγου α-πρωτεοβακτηρίου, ως ενδοσυμβιωτικού προγόνου του μιτοχονδρίου επιβεβαιώνεται σε αυτήν τη διδακτορική διατριβή και αναβαθμίζεται περαιτέρω από την ύπαρξη συνεξέλιξης μεταξύ των λειτουργικών συστατικών του ολοενζύμου της μιτοχονδριακής μεταγραφής, τα οποία προέρχονται τόσο από βακτήρια (Mtf1) όσο και από ιούς (Rpo41). Στο δεύτερο σκέλος της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός της μιτοχονδριακής DNA πολυμεράσης γ (Mip1) του M. brunneum. Οι πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή (π.χ. DNA πολυμεράση γ) και για τη μεταγραφή (π.χ. μιτοχονδριακή RNA πολυμεράση) του mtDNA, και γενικά αυτές που εμπλέκονται στη διατήρηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, είναι γνωστό ότι κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια. Όπως προαναφέρθηκε και παραπάνω, αρκετές από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή και έκφραση του mtDNA έχουν ομολογία με τα αντίστοιχα γονίδια των βακτηριοφάγων. Στην παρούσα διατριβή, μία in silicο συνδυαστική δομή του ολοενζύμου Mip1 – Rpo41 – Mtf1 για την έναρξη της αντιγραφής του mtDNA προτάθηκε με βάση την υπόθεση ότι η Rpo41 συνθέτει εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την έναρξη του πολυμερισμού από την Mip1 στην περιοχή έναρξης της αντιγραφής (ori/rep). Πιο αναλυτικά, παράλληλα με την in silico ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, εντοπίστηκε, με βάση ειδικά κριτήρια που επιλέχθηκαν, μία περιοχή έναρξης της αντιγραφής (ori/rep), τόσο στο είδος B. bassiana όσο και στο M. brunneum, στην περιοχή ενδιάμεσα του trnP γονιδίου και της rnl – μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας. Παράλληλα με τη μελέτη της δομικής μεταγραφικής οργάνωσης των mt γονιδιωμάτων και των εντοπισμό υποκινητών και αλληλουχιών τερματισμού της μεταγραφής, σημαντικό στοιχείο της μελέτης του μύκητα M. brunneum αποτελούσε και η αναγνώριση – εξέταση in vivo του κύριου εμπλεκόμενου πυρηνικού γονιδίου στην μιτοχονδριακή αντιγραφή (mip1 – μιτοχονδριακή DNA πολυμεράση γ), το οποίο ενδέχεται να συνεισφέρει και στην εντομοπαθογονική συμπεριφορά του μύκητα, πέρα της βασικής τους λειτουργίας στον κυτταρικό κύκλο και κατ’ επέκταση στην φυσιολογία του. Όσον αφορά τις μεταλλαγές διαγραφής – αποσιώπησης στο γονίδιο mip1, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Mip1 είναι απαραίτητη για την κυτταρική ανάπτυξη, τη μορφολογία, την εκβλάστηση των κονιδίων καθώς και την αντοχή σε συνθήκες στρες στο στέλεχος M. brunneum ARSEF 3297. Η υποέκφραση της πρωτεΐνης Mip1 δεν προκαλεί μείωση της μεταγραφής των μιτοχονδριακών γονιδίων σε σχέση με τα επίπεδα στο στέλεχος φυσικού τύπου, υποδηλώνοντας ότι η Mip1 δεν απαιτείται για την επιτυχή διεκπεραίωση της μιτοχονδριακής μεταγραφής. Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν λειτουργικές διαφορές μεταξύ του Μ. brunneum (Δmip1) με τα αντίστοιχα στελέχη στο μύκητα Saccharomyces cerevisiae και στους ανώτερους οργανισμούς. Σε αντίθεση με το S. cerevisiae, ο μηχανισμός της αντιγραφής του μιτοχονδριακού DNA στο M. brunneum, ομοιάζει με αυτόν που παρατηρείται στους ανώτερους οργανισμούς, οι οποίοι δεν μπορούν να επιβιώσουν από την απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας, καθώς υπήρξε αδυναμία απομόνωσης knock-out στελέχους. Ακόμα, τα μιτοχονδρικά γονιδιώματα στο στέλεχος ARSEF 3297 και στον άνθρωπο είναι παρόμοια σε μέγεθος και πολύ μικρότερα από αυτό του S. cerevisiae. Συμπερασματικά, η παραπάνω έρευνα (Δmip1) αποτελεί την πρώτη συστηματική μελέτη της κυτταρικής λειτουργίας της πρωτεΐνης DNA πολυμεράσης γ στον εντομοπαθογόνο μύκητα M. brunneum.