Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο FGFR 1, στο γονίδιο GPR54, και στο γονίδιο της prokineticin 2 και του υποδεχέα της prokineticin receptor 2 σε ασθενείς με ανεπάρκεια GnRH (ιδιοπαθή υπογοναδοτροφικό υπογοναδισμό και σύνδρομο kallmann) και διερεύνηση της παρουσίας μεταλλαγών στο γονίδιο KaL1 σε ασθενείς με αγενεσία/δυσγενεσία νεφρού
Authors: Βαρνάβας Πέτρος 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Το σύνδρομο της μεμονωμένης ανεπάρκειας της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών (IGD) χαρακτηρίζεται από μεμονωμένη λειτουργική ανεπάρκεια της υποθαλαμικής παραγωγής ή/και έκκρισης της GnRH οδηγώντας σε μεμονωμένη ανεπάρκεια των γοναδοτροπινών με φυσιολογική λειτουργικότητα των υπολοίπων υποφυσιακών ορμονών. Η συνύπαρξη IGD και ανοσμίας αναφέρεται ως σύνδρομο Kallmann (ΣΚ), ενώ η απουσία οσφρητικής διαταραχής αναφέρεται ως ιδιοπαθής υπογοναδοτροφικός υπογοναδισμός (ΙΥΥ). Σκοπός: Σκοπός της μελέτης είναι η περιγραφή των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών ασθενών με μεμονωμένη ανεπάρκεια GnRH (ΙΥΥ και ΣΚ), η διερεύνηση της ύπαρξης μεταλλάξεων στα γονίδια KAL1, FGFR1 (υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών 1), PROK2 (προκινετισίνη 2), PROKR2 (υποδοχέας της προκινετισίνης 2) και GPR54 (KISS1R: υποδοχέας της κισσπεπτίνης) στους ασθενείς αυτούς, καθώς και η συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου των ασθενών και ειδικών κλινικών φαινοτύπων. Επίσης διερευνείται η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο KAL1 σε ομάδα φαινομενικά υγιών παιδιών με ετερόπλευρη αγενεσία/δυσγενεσία νεφρού (ΕΝΑ), σε μια προσπάθεια καθορισμού της συχνότητας των μεταλλάξεων του γονιδίου KAL1 στην ΕΝΑ. Τέλος πραγματοποιείται in-vitro λειτουργικός έλεγχος δύο σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου FGFR1 που επηρεάζουν το ίδιο αμινοξύ της πρωτεΐνης (R254W και R254Q), με στόχο τη συσχέτιση των in-vitro ευρημάτων με τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Ασθενείς: Μελετήθηκαν συνολικά εξήντα έξι (66) ασθενείς με μεμονωμένη ανεπάρκεια GnRH (26 με ΣΚ και 40 με ΙΥΥ), στους οποίους πραγματοποιήθηκε μοριακός έλεγχος των γονιδίων KAL1, FGFR1, PROK2, PROKR2 και GPR54. Επίσης μελετήθηκαν 13 παιδιά (ηλικίας κάτω των 15 ετών) στα οποία υπήρχε απεικονιστικά επιβεβαιωμένη συγγενής ετερόπλευρη νεφρική αγενεσία/δυσγενεσία, η οποία δεν παρατηρήθηκε στα πλαίσια γνωστού συνδρόμου και τα οποία ελέχθησαν για την παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο KAL1. Μέθοδοι: Η μεθοδολογία του μοριακού γονιδιακού ελέγχου περιλάμβανε την απομόνωση DNA γονιδιώματος από δείγμα ολικού αίματος, τον εκλεκτικό πολλαπλασιασμό των εξονίων των υπό μελέτη γονιδίων με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR amplification) και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA στα προϊόντα της PCR (DNA sequencing). Ο in-vitro λειτουργικός έλεγχος των δύο μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα FGFR1 (R254W και R254Q) περιλάμβανε την μελέτη της σηματοδοτικής δραστηριότητας του υποδοχέα κατόπιν διέγερσής του από τον προσδέτη FGF2, καθώς και τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα FGFR1, τα οποία συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα του φυσιολογικού υποδοχέα (WT=wild type). Η μετάδοση σήματος του υποδοχέα FGFR1 αξιολογήθηκε με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. Η μέτρηση των επιπέδων της ολικής έκφρασης του FGFR1 πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ανάλυσης πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου, ακολουθούμενη από την τεχνική της ανάλυσης κατά Western. Η εκτίμηση της ενδοκυττάριας ωρίμανσης του πρωτεϊνικού μορίου του υποδοχέα FGFR1 έγινε μέσω ενζυμικής πέψης της γλυκοπρωτεΐνης με ενδογλυκοσιδάσες, ενώ ο υπολογισμός των επιπέδων έκφρασης του FGFR1 στην κυτταροπλασματική μεμβράνη έγινε με την πρόσδεση ραδιοσημασμένου αντισώματος (radiolabelled antibody binding assay). Αποτελέσματα: Εκ του μοριακού γονιδιακού ελέγχου που πραγματοποιήθηκε στους ασθενείς με IGD εντοπίσθηκαν πέντε διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο KAL1 σε τρεις άρρενες ασθενείς με σύνδρομο Kallmann (Ε514Κ, Α660Τ, Ε37Κ, T235S, έλλειψη εξονίων 5-10), καθώς και μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο FGFR1 (R254W) σε έναν άρρενα ασθενή με ιδιοπαθή υπογοναδοτροφικό υπογοναδισμό. Εκ του in-vitro λειτουργικού ελέγχου των δύο σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου FGFR1 (R254W και R254Q) που μελετήθηκαν, προέκυψε ότι η μέγιστη σηματοδοτική δραστηριότητα για τη μεταλλαγμένη μορφή του υποδοχέα R254W παρουσιάζει μείωση κατά 45% σε σύγκριση με τον wild-type υποδοχέα (p<0.01), ενώ η μέγιστη απάντηση της μεταλλαγμένης μορφής R254Q μειώνεται κατά 15% σε σχέση με το wild-type υποδοχέα, διαφορά που δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική. Ωστόσο και οι δυο μεταλλαγμένες μορφές R254W και R254Q εμφανίζουν ελαττωμένα επίπεδα ολικής έκφρασης (40% και 30% μείωση σε σχέση με τον wild-type, αντίστοιχα), ενώ η πρωτεϊνική ωρίμανση δεν φαίνεται να επηρεάζεται. Τέλος η έκφραση των μεταλλαγμένων μορφών R254W και R254Q επί της κυτταρικής επιφάνειας παρουσιάζεται σημαντικά ελαττωμένη (35%, p<0.01 και 15%, p<0.05, αντιστοίχως). Εκ του μοριακού γονιδιακού ελέγχου που πραγματοποιήθηκε στους ασθενείς με ΕΝΑ βρέθηκε μετάλλαξη του KAL1 σε έναν ασθενή 12 ετών, ο οποίος εμφάνιζε συνοδό ανοσμία, συγκινησία άνω άκρων και κρυψορχία. Στον ασθενή αυτόν τέθηκε η γενετική διάγνωση του ΣΚ και αργότερα υποβλήθηκε σε έγκαιρη έναρξη θεραπευτικής αγωγής. Συμπεράσματα: Το ποσοστό των γνωστών μεταλλάξεων που έχουν εντοπισθεί στους ασθενείς με IGD του Ελλαδικού χώρου είναι πολύ μικρό και επομένως παραμένει πρόσφορο το πεδίο για περαιτέρω έρευνα προς την κατεύθυνση της διευκρίνησης της μοριακής αιτιοπαθογένειας της νόσου. Η σύγκριση φαινότυπου-γονότυπου των ασθενών με σύνδρομο Kallmann υποδεικνύει ότι η παρουσία συνοδού ετερόπλευρης αγενεσίας νεφρού αποτελεί ισχυρή ένδειξη για την ύπαρξη μεταλλαγών στο γονίδιο KAL1. Η ανεύρεση μεταλλάξεων του γονιδίου KAL1 σε παιδιά με ΕΝΑ έχει διττή σημασία· αφενός επιβεβαιώνει την εμπλοκή της ανοσμίνης-1 (του προϊόντος του γονιδίου KAL1) στην οργανογένεση του νεφρού και αφετέρου οδηγεί στην πρώιμη διάγνωση του ΣΚ. Ο μοριακός έλεγχος του γονιδίου KAL1 σε παιδιά με ΕΝΑ συστήνεται επί συνύπαρξης και άλλων κλινικών σημείων του ΣΚ (ανοσμία, κινήσεις καθρέπτη, κρυψορχία, μικροφαλλία) ή ανάδειξης οικογενειακού ιστορικού υπογοναδισμού και ανοσμίας. Ο συγκριτικός λειτουργικός έλεγχος δύο μεταλλάξεων του FGFR1 που επηρεάζουν το ίδιο αμινοξύ (R254W, R254Q) αναδεικνύει την απώλεια της λειτουργικότητας των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα in-vitro. Αν και από τον in-vitro λειτουργικό έλεγχο προκύπτει ότι η μετάλλαξη R254W είναι πιο σοβαρή από τη μετάλλαξη R254Q, ωστόσο δεν παρατηρείται συσχέτιση του βαθμού της απώλειας της in-vitro λειτουργικότητας των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα με τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις.