Identificación del gen CEBPα en pacientes con leucemia mieloide aguda y su potencial uso clínico
Authors:   , Aguayo Tapia Claudio , Chandía Mauricio 
Published: August 2023

La leucemia mieloblástica aguda (LMA) se produce por acumulación de mutaciones en células pluripotentes hematopoyéticas, provocando un bloqueo en la diferenciación, apoptosis y un aumento en la proliferación. Entre sus alteraciones moleculares se registran mutaciones puntuales en el gen CEBPα doble mutación, estas ultimas se asocia con un pronóstico favorable de sobrevida global y sobrevida libre de eventos teniendo una mejor respuesta al tratamiento, en comparación con pacientes sin mutaciones en CEBP . El estudio molecular del gen CEBP en adultos se menciona en la guía clínica del paciente leucémico del ministerio de salud, sin embargo, no se estudia en este grupo etario, ni tampoco en pacientes pediátricos debido a que no se encuentra disponible en ningún laboratorio clínico público de biología molecular. La técnica de reacción en cadena de la polimeraza (PCR) para amplificar el gen CEBP no se ha estandarizado en los laboratorios antes señalados, debido a que la región codificante del gen presenta un alto contenido de guanina (G) citocina (C) ( 65%), y una secuencia de repetición de trinucleótidos, lo que dificulta su amplificación. Para obtener la secuencia amplificada del gen CEBP se requiere comparar y elegir una técnica de extracción de ADN (Columna, Columna más Perlas y Sales) y estandarizar la PCR por las características del gen, sugiriendo el uso de PCR gradiente con DMSO. El desarrollo de un protocolo de amplificación y secuenciación permite caracterizar el gen CEBP en pacientes con LMA. Desarrollar de un protocolo de amplificación y secuenciación del gen CEBPα para el estudio molecular de pacientes con Leucemia Mieloide Aguda. Se realizó un estudio observacional de cohorte transversal, con muestreo no probabilístico por conveniencia para una muestra de 3 personas voluntarias sin LMA durante el I semestre de 2021. Luego se realiza la extracción de ADN de 10 pacientes con LMA desde muestras de matriz sangre periférica y médula ósea. Se evalúan las técnicas de extracción en cuanto a concentración y pureza del ADN, costos y tiempo. Luego se realizó PCR para amplificar el gen CEBP desde el ADN de los pacientes sanos y con LMA considerando partidores publicados, y otros de elaboración propia, se evalúo el protocolo de amplificación, ajustando temperaturas de alineamiento y adyuvantes, como DMSO en distintas concentraciones. Se realizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar integridad del ADN extraído y también del ADN amplificado. Luego se secuencian las regiones amplificadas por método de sanger, llegando a establecer el protocolo completo del estudio del gen CEBP . La técnica de extracción por sales en muestras de concentrado de leucocitos fue la más óptima en cuanto a rendimiento, al observarse diferencias estadísticamente significativas (p 0,005) en cuanto a concentración de ADN con respecto a la técnica de columna. La estandarización de la PCR y la amplificación de la región codificante del gen CEBP completa con un solo juego de partidores, y por fragmentos con dos juegos de partidores, se logró con todos los pares de partidores estudiados a una temperatura de alineamiento de 62 y 64°C, siendo posible mediante el uso de DMSO a un 3 y 8% obteniendo bandas únicas en gel de agarosa. La secuenciación utilizada fue tipo sanger, la que mostró que, en el caso de la región amino terminal, hubo un producto secuenciado optimo con la elaboración de una secuencia consenso. La estandarización de la técnica de extracción de ADN, PCR y secuenciación para el estudio del gen CEBPα permitirá obtener información útil en el diagnóstico de pacientes con LMA otorgándole al clínico mejores herramientas para decidir una adecuada terapia en este contexto.