A Novel RT-QPCR Based Approach for Detection of Human Hepatitis E Virus in Biological Samples
Authors: Давыдов В.В. , Бабенко А.С. , Жаворонок С.В. , Марчук С.И. , Борисовец Д.С. , Зновец Т.В. 
Published: February 2022

Цель. Разработка новой тест-системы для выявления РНК вируса гепатита Е в различных типах биологического материала. Материалы и методы. В исследовании использовались образцы биологического материала, включающие цельную кровь, плазму и сыворотку крови, мочу, желчь и фекалии, от 97 пациентов, 79 свиней, 28 диких кабанов, 40 оленей, 359 кроликов, из панели положительных и отрицательных образцов, подготовленной в течение 2017-2021 гг. Выбор потенциальных репликонов и анализ нуклеотидных последовательностей ВГЕ (3-й тип), полученных из GenBank, выполняли с помощью программного обеспечения MEGA X. Дизайн и анализ пригодности олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР-РВ осуществляли с помощью on-line сервисов Primer3 и OligoAnalyzer3.1. Результаты. В результате дизайна олигонуклеотидных праймеров и модификации определенных сайтов вырождениями был получен комплект кандидатов, включающий прямой/обратный праймеры и зонд, которые обладали существенно более высокой специфичностью в отношении изучаемых последовательностей ВГЕ. Расчетная специфичность для детекции выбранных для изучения полногеномных последовательностей составила 490/525 (93,3±0,42%, p<0,001). При использовании разработанного нами набора реагентов для ОТ-ПЦР-РВ РНК ВГЕ была выявлена в 66,7%, в то время как применение коммерческого набора RealStar®_HEV_RTPCR_Kit_2.0 позволило обнаружить РНК ВГЕ в 50% образцов, а гнездовой ПЦР - 40%. Из всех положительных образцов, полученных с помощью гнездовой ПЦР, коммерческим набором было подтверждено 75%, тогда как 83% подтверждений было получено с помощью разработанного ОТ-ПЦР-РВ. Заключение. Внесенные изменения в последовательности праймеров и зонда увеличили аналитическую специфичность разработанной нами тест-системы.

Purpose. To develop a new test system for the detection of hepatitis E virus (HEV) RNA in various types of biological samples. Materials and methods. In the study, there were used the whole blood, plasma and serum, urine, bile and feces from 97 patients, 79 domestic pigs, 28 wild boars, 40 deer, 359 rabbits from the panel of positive and negative samples prepared during the period 2017-2021. The selection of potential replicons and analysis of the nucleotide sequences of HEV (genotype 3) obtained from GenBank were performed using the MEGA X software. The design and analysis of the suitability of oligonucleotide primers for RT-PCR were performed using the online services Primer3 and OligoAnalyzer3.1. Results. As a result of the design of oligonucleotide primers and the modification of certain sites by degeneracy, a set of candidates was obtained, including forward / reverse primers and a probe, which had a significantly higher specificity for the studied HEV sequences. The calculated specificity for detection of the whole genome sequences selected for the study was 490/525 (93.3% ± 0.42 p <0.001). When using the test system developed by us, HEV was detected in 66.7%, while the use of the commercial kit "RealStar®_HEV_RT-PCR_Kit_2.0" let to detect HEV RNA in 50% of the samples and nested PCR - in 40%. Of all positive samples obtained by the nested PCR, 75% were confirmed by the commercial kit, and 83% of the confirmations were obtained using the developed test system. Conclusion. Thus, our changes in the sequence of primers and probe increased the analytical specificity of the test system we developed.