Vergleich der pulmonalen Wirkmechanismen partikulärer und faserförmiger Metall‐basierter Nanomaterialien in submersen Studien und über ein air‐liquid interface
Authors: Wall Johanna , Hartwig Andrea 
Published: June 2023

Aufgrund der Weiterentwicklung in der Nanotechnologie wird ein immer breiter werdendes Spektrum an unterschiedlichen Nanomaterialien produziert. Metall‐basierte Nanomaterialien sind dabei von großem Interesse, v. a. wegen ihrer antimikrobiellen Eigenschaften, der hohen Leitfähigkeit und ihrer katalytischen Funktion. Aufgrund ihrer Größe besitzen Nanomaterialien ein vergrößertes Oberflächen‐zu‐Volumen‐Verhältnis, weshalb von ihnen eine erhöhte Reaktivität und damit Toxizität ausgeht. Neben partikulären Materialien werden auch zunehmend faserförmige Materialien, sog. Nanowire, verwendet, die zusätzlich eine faserspezifische Wirkung aufweisen können. Durch die Vielfalt an Nanomaterialien lässt sich häufig kein einzelner Wirkmechanismus eines Materials auf andere Materialien übertragen. Das Ziel des Projekts MetalSafety, in das sich diese Arbeit eingliedert, war daher die Entwicklung von Bewertungskonzepten für Metall‐basierte Nanomaterialien unterschiedlicher Morphologien. Hierzu wurden in der vorliegenden Arbeit zehn partikuläre bzw. faserförmige Metall‐basierte Nanomaterialien im Hinblick auf ihre physikochemischen Eigenschaften und ihr toxikologisches Wirkprofi'l untersucht und verglichen. Als Zellmodelle wurde zum einen eine Monokultur aus der Bronchialepithelzelllinie Beas‐2B verwendet, außerdem fand eine Kokultur aus Beas‐2B‐Zellen und makrophagenähnlichen differenzierten THP‐1‐Zellen Anwendung. Alle Materialien wurden zunächst umfassend charakterisiert, wobei der Fokus auf der Löslichkeit der Materialien in künstlichen physiologischen Medien lag. Die intrazelluläre Freisetzung von Metallionen wurde weiterhin in beiden Zelllinien bestimmt. Dabei zeigte sich eine hohe Verfügbarkeit aller Kupfer‐basierter Materialien, unabhängig von Morphologie und Zellsystem. Silber‐ und Nickel‐basierte Materialien wiesen hingegen nur eine moderate Freisetzung von Metallionen auf, wobei sowohl eine MorphologieAbhängigkeit als auch eine Abhängigkeit von der Zelllinie beobachtet wurde. Hierbei wurde eine vermehrte Aufnahme in makrophagenähnliche Zellen gefunden, wodurch auf einen phagozytotischen Aufnahmemechanismus geschlossen werden kann. Unlösliche Partikel wie TiO2 NP und CeO2 NP zeigten wie erwartet eine vernachlässigbar geringe Freisetzung von Metallionen. Studien zur intrazellulären Ionenverteilung zeigten starke Akkumulationen von Kupfer‐ und Silberionen im Zellkern der Zellen, wohingegen freigesetzte Nickelionen eher im Zytoplasma verblieben. Zur Erfassung des toxikologischen Wirkprofi'ls wurden die Zytotoxizität und die Potenz der Materialien zur Induktion von DNA‐Strangbrüchen bestimmt. Genexpressions‐analysen mittels einer Hochdurchsatz RT‐qPCR‐Methode dienten der Erfassung einer Aktivierung oder Hemmung von Genclustern wie Metallhomöostase, Inflammation, oxidative Stressantwort, DNA‐Schadensantwort und Zellzyklusregulation. Kupfer‐basierte Materialien zeigten Morphologie‐unabhängige, jedoch dosisabhängige zytotoxische und genotoxische Wirkungen sowie Änderungen im Genexpressionsprofil. Letztere deuteten auf einen Mechanismus durch Ionenfreisetzung und dadurch induzierte Inflammation und oxidativen Stress hin, der in der Literatur als trojan horse type Mechanismus beschrieben ist. Für Silber‐basierte Materialien wurden Morphologie‐spezifische Unterschiede beobachtet. Während Ag NP eine starke zytotoxische Wirkung aufwiesen, konnte für Ag NW keine Zytotoxizität festgestellt werden. Beide Materialien verursachten dagegen dosisabhängig DNA‐Strangbrüche. Das Genexpressionsprofil gab für beide Materialien Hinweise auf ein Vorhandensein von freien Silberionen, jedoch wurde ebenfalls eine inflammatorische Wirkung beobachtet. Sowohl für Kupfer‐ als auch für Silber‐basierte Materialien wurde eine schwä‐chere Toxizität in der Kokultur beobachtet, wodurch hier auf einen protekflven Effekt durch Makrophagen geschlossen werden kann. Neben submersen Untersuchungen wurden für Kupfer‐ und Silber‐basierte Materialien zusätzliche Untersuchungen nach Exposiflon über ein air‐liquid interface (ALI) durchgeführt. Hierbei wurden die Zellen an einer Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit kulflviert. Dieses Szenario soll den Bronchioalveolarbereich simulieren, außerdem ist während der ALI‐ Exposiflon eine simultane Erfassung der absolut deponierten Dosis mittels einer QuarzkristallMikrowaage (QCM) möglich. Während das Toxizitätsprofil nach ALI‐Exposiflon die Beobachtungen nach submerser Inkubaflon qualitaflv widerspiegelte, wurden toxikologisch relevante Effekte bereits bei geringeren Dosen verursacht. Dies unterstreicht die Bedeutsamkeit der ALI‐Exposiflon zur genaueren Abschätzung einer Toxizität von Nanomaterialien. Nickel‐basierte Materialien wiesen unab‐hängig von dem verwendeten Kulflvierungssystem und der Morphologie lediglich geringe zytotoxische und keine genotoxischen Effekte auf. Bezüglich der Änderungen im Genex‐pressionsprofil ergaben sich dagegen signifikante Unterschiede zwischen Mono‐ und Kokultur. Während durch beide Materialien in beiden Kulflvierungssystemen inflammatorische Effekte verursacht wurden, wurden vor allem die Gene der oxidaflven Stressantwort deutlich vermehrt in der Kokultur exprimiert. Dies deutet auf einen „oxidaflven Burst” durch in der Kokultur befindliche Makrophagen und eine sekundäre Toxizität hin. TiO2 NP und CeO2 NP, die keine lysosomale Löslichkeit aufwiesen, zeigten unabhängig vom Kulfivierungssystem in keinem der untersuchten Endpunkte toxikologisch relevante Effekte. Um einen möglichen Fasereffekt durch unlösliche Materialien zu untersuchen, wurden als faserförmiges Referenz‐material carbon nanotubes (CNT) ausgewählt. Diese zeigten in Mono‐ und Kokultur eine Abnahme der Viabilität und vor allem in der Kokultur inflammatorische Effekte in der Genexpression, was auf eine sog. „frustrierte Phagozytose” durch Makrophagen hindeutet. Zusammengefasst stellt diese Arbeit erstmals eine systemafische Untersuchung der Toxizität unterschiedlicher Metall‐basierter Nanomaterialien in Abhängigkeit ihrer physikochemischen Eigenschaften vor. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Löslichkeit sowohl für parfikuläre als auch für faserförmige Materialien ausschlaggebend für deren toxische Wirkung ist. Die Verwendung von Kokulturen veränderte die Intensität des Toxizitätsprofils ebenfalls in Abhängigkeit von der intrazellulären Löslichkeit. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine ALI‐Exposifion gegenüber einer herkömmlichen submersen Exposifion zu ausgeprägteren Ergebnissen führt, wodurch die Relevanz von weiterentwickelten in vitro‐Testsystemen in der Parfikel‐ und Fasertoxikologie unterstrichen wird. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse legen gemeinsam mit den von Ronja Neuberger erhobenen Daten einen Grundstein für die Zielsetzung des Gesamtprojekts MetalSafety. Auf dieser Basis können im Projekt auftauende ex vivo‐ und in vivo‐Untersuchungen sta^inden, welche in ihrer Gesamtheit eine Prädikfion auf die Wirkung im Menschen möglich machen sollen.