Μελέτη του παθοφυσιολογικού ρόλου της πρωτεΐνης RANKL στον μαστικό αδένα διαγονιδιακών ποντικών
Authors: Κολοκοτρώνη Ανθή 
Published: November 2023

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τον δεύτερο συχνότερο καρκίνο παγκοσμίως και την κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες. Ο RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand) έχει χαρακτηριστεί ως ο κύριος μεσολαβητής της ανάπτυξης του μαστικού αδένα από την προγεστερόνη κατά την εγκυμοσύνη, ενώ τελευταία δεδομένα τον εμπλέκουν στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση του μαστού. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη μελέτη του ρόλου του RANKL στη φυσιολογική ανάπτυξη του μαστικού αδένα αλλά και στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του μαστού μέσω της χρήσης μοναδικών γενετικών μοντέλων υπερέκφρασης (ΤgRANKL) ή αδρανοποίησης (RANKLtles/tles) του RANKL στο ποντίκι. Πιο συγκεκριμένα, οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) η ανάπτυξη μεθόδου τρισδιάστατης απεικόνισης και ποσοτικοποίησης του μαστικού αδένα ποντικιών, β) η μελέτη της υπερέκφρασης του RANKL στην διαμόρφωση του μαστικού επιθηλίου σε διάφορα αναπτυξιακά και αναπαραγωγικά στάδια του ποντικιού όπως εφηβεία, ώριμο στάδιο, κύηση και γαλουχία, γ) η μελέτη των μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αυξημένη πυκνότητα του μαστικού αδένα των TgRANKL ποντικιών, δ) η μελέτη της έλλειψης ή αναστολής του RANKL στην διαμόρφωση του μαστικού επιθηλίου στα πρώιμα στάδια ανάπτυξής του, ε) η κατανόηση της δράσης του RANKL στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση του μαστικού αδένα, ζ) η δημιουργία ενός ανθρωποποιημένου humTgRANKL διαγονιδιακού μοντέλου για τη μελέτη της ορμονο-επαγόμενης καρκινογένεσης αποκλειστικά μέσω του huRANKL και την εφαρμογή προκλινικών δοκιμών με τον αναστολέα του huRANKL Denosumab και η) η εύρεση του δικτύου των γονιδίων που απορρυθμίζονται κατά την ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση στο humTgRANKL μοντέλο και η επίδραση του Denosumab στην έκφρασή τους.Αρχικά, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο για την τρισδιάστατη απεικόνιση και ποσοτικοποίηση του μαστικού αδένα με υψηλή ευκρίνεια μέσω χρώσης του με φωσφοβολφραμικό οξύ (PTA) και ανάλυση με αξονική μικροτομογραφία (microCT). Στην συνέχεια, μελετήθηκε ο μαστικός αδένας των διαγονιδιακών TgRANKL ποντικιών κατά το ώριμο στάδιο μέσω ανάλυσης της δομής του με χρώση καρμίνης, microCT και ιστολογική ανάλυση, όπου παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένη πυκνότητα του δικτύου των γαλακτοφόρων πόρων και κυρίως των δευτερογενών και τριτογενών διακλαδώσεων συγκριτικά με τα αγρίου τύπου (WT) ποντίκια. Ανάλυση της έκφρασης έδειξε υπερέκφραση του διαγονιδίου huRANKL στον μαστό των TgRANKL ποντικιών με εντοπισμό στα επιθηλιακά κύτταρα του αυλού αλλά και αύξηση της έκφρασης δεικτών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και των βλαστοκυττάρων. Ανάλυση των μαστικών αδένων με κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε αύξηση των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού και των βλαστοκυττάρων στα TgRANKL ποντίκια. Η μείωση της πυκνότητας του μαστικού επιθηλίου και των δεικτών πολλαπλασιασμού στα TgRANKL ποντίκια έπειτα από τη χορήγηση του μονοκλωνικού αντισώματος Denosumab, που αποτελεί αναστολέα του huRANKL, επιβεβαίωσε τη δράση του διαγονιδίου στο φαινότυπο αυτό. Η συγκριτική ανάλυση έκφρασης σε ώριμους μαστικούς αδένες μεταξύ TgRANKL και WT ποντικιών με αλληλούχηση RNA (RNA-Seq) έδειξε ότι η υπερέκφραση του huRANKL οδηγεί σε επαγωγή σηματοδοτικών μονοπατιών και γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, το πολλαπλασιασμό, το μεταβολισμό, τη διέγερση των ορμονών και τον καρκίνο, ενώ επιβεβαιώθηκε η έκφραση επιλεγμένων γονιδίων με qPCR.Στην εγκυμοσύνη και τη γαλουχία, επίσης, τα TgRANKL ποντίκια εμφανίζουν πιο εκτεταμένη ανάπτυξη των κυψελίδων, ενώ στην εφηβεία παρουσιάζουν ταχύτερη ανάπτυξη του μαστικού επιθηλίου και αύξηση των τελικών λοβιακών μονάδων (TEBs) σε σχέση με τα WT. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η απουσία του RANKL παρεμποδίζει την ανάπτυξη του μαστικού αδένα κατά την εφηβεία, τόσο σε γενετικό μοντέλο όσο και με φαρμακευτική αναστολή του RANKL. Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση του huRANKL στα TgRANKL ποντίκια δεν επηρέασε την ανάπτυξη και τα χαρακτηριστικά των ορμονο-επαγόμενων (MPA/DMBA) όγκων σε σχέση με τα WT ποντίκια, αν και η αναστολή του RANKL με OPG-Fc μείωσε τη συχνότητα εμφάνισης όγκων αλλά και τον αριθμό των όγκων ανά ποντίκι. Στην συνέχεια, δημιουργήσαμε ένα ανθρωποποιημένο διαγονιδιακό μοντέλο (humTgRANKL) για την μελέτη της ορμονο-επαγόμενης καρκινογένεσης αποκλειστικά μέσω του huRANKL. Τα humTgRANKL ποντίκια ανέπτυξαν όγκους στον ίδιο βαθμό με τα TgRANKL και WT ποντίκια. Η προφυλακτική θεραπεία των humTgRANKL ποντικιών με Denosumab ανέστειλε την εμφάνιση όγκων στο μαστό καθώς και τα πρώιμα στάδια καρκινογένεσης, ενώ η θεραπευτική αγωγή δεν ήταν εξίσου αποτελεσματική στην παρεμπόδιση εμφάνισης των όγκων, υποδηλώνοντας τη σημασία του RANKL κυρίως στα αρχικά στάδια της ογκογένεσης. Τέλος, ανιχνεύθηκε το δίκτυο των γονιδίων που απορυθμίζονται κατά την ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση στα humTgRANKL ποντίκια αλλά και η επίδραση της προφυλακτικής θεραπείας με Denosumab στην έκφρασή τους, μέσω RNA-Seq ανάλυσης σε παρακείμενους μαστικούς αδένες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πληθώρα γονιδίων που εμπλέκονται σε διεργασίες και μονοπάτια καρκινογένεσης του μαστού και επάγονται από την RANKL σηματοδότηση. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν τον RANKL ως ένα σημαντικό παράγοντα για την φυσιολογική ανάπτυξη του μαστικού επιθηλίου σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, αλλά και στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση. Η εύρεση γονιδίων που απορυθμίζονται κατά την καρκινογένεση και η αξιολόγηση νέων φαρμάκων έναντι του ορμονο-επαγόμενου καρκίνου του μαστού στα humTgRANKL ποντίκια, θα μπορούσε να συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών καρκινογένεσης και στην ανάπτυξη στοχευμένων προκλινικών δοκιμών στον καρκίνο του μαστού.