Biochemical and biophysical study of two putative polysaccharide deacetylases
Authors: Αρναουτέλη Σοφία 
Published: August 2021

Οι απακετυλάσες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης των πολυσακχαριτών ανήκουν στην οικογένεια των εστερασών CE4, η οποία περιλαμβάνει ένζυμα που χαρακτηρίζονται απο σημαντική ομολογία και λειτουργικές ομοιότητες. Αποτελεί εξαιρετικό ενδιαφέρον το γεγονός οτι τα γονιδιώματα του Bacillus cereus και του συγγενικού παθογόνου Bacillus anthracis περιέχουν 10 και 11 γονίδια αντίστοιχα με υψηλή ομολογία μεταξύ τους που κωδικοποιούν για πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών. Πρόσφατα μελετήθηκε ο βιολογικός ρόλος για 5 απο αυτές. Οι αιτίες ύπαρξης τόσο μεγάλου αριθμού γονιδίων που κωδικοποιούν για πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών στο γονιδίωμα του B. anthracis, σε αντίθεση με άλλα παθογόνα βακτήρια που διαθέτουν μικρότερο αριθμό αντίστοιχων γονιδίων αποτελεί βασική αναζήτηση της παρούσας μελέτης.Tα γονίδια ba0330 και ba0331 αποτελούν τα δυο μοναδικά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης απο τα 11 που περιέχει ο B. anthracis που εκτός απο πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών κωδικοποιούν και για πιθανές λιποπρωτείνες και μοιράζονται 55% ομολογία μεταξύ τους. Οι λιπορωτείνες των βακτηρίων αποτελούν μια οικογένεια μεμβρανικών πρωτεινών με ποικίλους ρόλους στα κατά Gram θετικά βακτήρια. Για την διαλεύκανση του βιολογικού ρόλου των παραπάνω ενζύμων ακολουθήθηκε συνδυασμός βιοχημικών και μοριακών τεχνικών καθώς και ο κυτταρικός εντοπισμός τους στο βακτήριο B. anthracis.Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι παρόλο που στις δύο πρωτείνες δεν ανιχνεύθηκε ενεργότητα Ν- απακετυλάσης σε ενζυμικές δοκιμές με συνήθη υποστρώματα απακετυλασών, η κατασκευή των μεταλλαγμάτων Δba0330, Δba0331 και Δba0330Δba0331 έδειξε ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της ακεραιότητας του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου. Συγκεκριμένα η διαγραφή του γονιδίου ba0330 απο το γονιδίωμα του B. anthracis έδειξε ότι οδηγεί στην εμφάνιση μερικής αποκόλλησης μεταξύ μεμβράνης και πεπτιδογλυκάνης, πιθανά λόγω αποδυνάμωσης της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο στρωμάτων. Επίσης τα κύτταρα του στελέχους Δba0330 είχαν πολύ χαμηλό ρυθμό ανάπτυξης συγκρινόμενα με κύτταρα αγρίου τύπου σε θρεπτικό μέσο με αυξημένη συγκέντρωση NaCl, συσχετίζοντας έτσι την BA0330 με την προσαρμογή του βακτηρίου σε συνθήκες υψηλής αλατότητας. Κατά την διαγραφή του γονιδίου ba0331 παρατηρήθηκε αδυναμία του στελέχους να διατηρήσει το χαρακτηριστικό σχήμα του βακίλου, με αποτέλεσμα την εμφάνιση άτυπων κυτταρικών σχημάτων. Προκειμένου να διαπιστωθεί κατα πόσο οι φαινότυποι των μεταλλαγμάτων μπορούν να αποδωθούν σε πιθανή ενεργότητα Ν-απακετυλάσης, σημιακές μεταλλαγές εισήχθησαν στα δυο γονίδια σε καθοριστικά κατάλοιπα για την διατήρηση της πιθανής ενεργότητας. Τα μεταλλλαγματα Δba0330 και Δba0331 στα οποία εκφράστηκαν οι αντίστοιχες πρωτείνες που έφεραν την σημιακή μετάλλαξη ανέκτησαν πλήρως τα χαρακτηριστικά του στελέχους αγρίου τύπου.Επίσης οι δύο πρωτείνες εντοπίζονται σε διαφορετικά σημεία του κυτταρικού φακέλου: η ΒΑ0330 εντοπίζεται στην περιφέρεια του κυττάρου, ενώ η ΒΑ0331 εντοπίζεται σε διακριτά σημεία. Παράλληλα και οι δύο πρωτείνες αλληλεπιδρούν με την πεπτιδογλυκάνη του βακτηρίου.Παρόλο που η ΒΑ0330 και η ΒΑ0331 διαθέτουν τα περισσότερα απο τα κατάλοιπα των μελών της CE4 οικογένειας που έιναι απαραίτητα και συντηρημένα για την κατάλυση, η πρόσφατη επίλυση της δομής της ΒΑ0330 έδειξε κάποιες διαφοροποιήσεις στον καταλυτικό μηχανισμό, στις οποίες θα μπορούσε να αποδωθεί η πιθανή έλλειψη ενεργότητας.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής παρέχουν καινοτόμες και θεμελιώδεις πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο των λιποπρωτεινών στα κατά Gram θετικά βακτήρια, καθώς για πρώτη φορά καταδεικνύεται ο ρόλος που παίζουν στην διατήρηση της ακεραιότητας των κυτταρικών τοιχωμάτων.