Επιδράσεις ηλεκτρομαγνητικών πεδίων σε βιολογικά συστήματα
Authors: Χαβδούλα Ευαγγελία 
Published: August 2021

Στη σύγχρονη εποχή της τεχνολογίας, ο άνθρωπος ζει μέσα σε ένα περιβάλλονβεβαρημένο από ποικίλες πηγές τεχνητών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων (ΗΜΠ) ενόςευρέος φάσματος συχνοτήτων, 300MHz-3GHz. Ορισμένα παραδείγματα αποτελούν: οιφούρνοι μικροκυμάτων, οι κεραίες δορυφορικών επικοινωνιών και ραδιοτηλεόρασης, ταασύρματα συστήματα δικτύου Wi-Fi, οι πομποί και δέκτες της κυψελωτής κινητήςτηλεφωνίας, τα ασύρματα τηλέφωνα DECT κ.ά. Ειδικά η εκτεταμένη χρήση τωνκυψελωτών κινητών τηλεφώνων, τις δύο τελευταίες δεκαετίες, έχει προκαλέσει τοιδιαίτερο ενδιαφέρον, αλλά και την ανησυχία της επιστημονικής κοινότητας σχετικά μετους πιθανούς κινδύνους που μπορεί να κρύβει αυτή η παγιωμένη πλέον συνήθεια τηςκαθημερινότητας του σύγχρονου ανθρώπου. Η μη ιονίζουσα ακτινοβολία τωνραδιοσυχνοτήτων (RF), που χρησιμοποιεί η τεχνολογία των κινητών τηλεπικοινωνιών[συστήματα GSM-900 MHz (Global System for Mobile Telecommunications) καιGSM/DCS-1800MHz (Digital Cellular System) με διαφορά στη φέρουσα συχνότητα]μεταδίδεται με παλμούς πολύ χαμηλών συχνοτήτων 217 Hz (ELF), ή περιλαμβάνεισήματα διαμόρφωσης σε συχνότητες ELF, για τη μεταφορά και μετάδοση τηςπληροφορίας. Ερευνητικές μελέτες, σε πλήθος βιολογικών συστημάτων και συνθηκώνέκθεσης, διερευνούν τον τρόπο απόκρισης των κυττάρων/οργανισμών στα διάφορα είδηηλεκτρομαγνητικών (H/M) πεδίων. Η βιβλιογραφία περιλαμβάνει αντικρουόμενααποτελέσματα σχετικά με τις μη-θερμικές και μη-γραμμικές επιδράσεις της RFακτινοβολίας των κινητών τηλεφώνων στα μιτοχόνδρια, το αποπτωτικό μονοπάτι, τιςπρωτεϊνες θερμικού σοκ, το μεταβολισμό των ελευθέρων ριζών, τη γονιδιακή έκφραση,την κυτταρική διαφοροποίηση, το γενετικό υλικό, και τις πλασματικές μεμβράνες, ενώδεδομένα έχουν προκύψει τόσο από επιδημιολογικές μελέτες όσο και από κλινικέςδοκιμές. Ένας μεγάλος όγκος δεδομένων, όπως θα περίμενε κανείς, έχει συσσωρευθείκαι αφορά στις ενδεχόμενες αλλοιώσεις της εγκεφαλικής λειτουργίας,συμπεριλαμβανομένων της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, τηςνευρωνικής ηλεκτρικής δραστηριότητας και της αυξημένης εκροής ιόντων ασβεστίου,της ισορροπίας των νευροδιαβιβαστών, της γνωστικής λειτουργίας, και των αυξημένωνκρουσμάτων εγκεφαλικών όγκων. Πρόσφατες επίσης έρευνες κάνουν λόγο για τηναυξημένη πιθανότητα υπογονιμότητας στον ανθρώπινο πληθυσμό εξαιτίας της βλάβηςστο DNA και του επαγομένου από την ακτινοβολία οξειδωτικού στρες. Σε παρόμοιασυμπεράσματα έχουν καταλήξει αντίστοιχες μελέτες σε άλλους οργανισμούς.Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι, η ασυμφωνία πολλές φορές ανάμεσα σταευρήματα των πειραματικών μελετών, στο συγκεριμένο ερευνητικό πεδίο, είναιαναμενόμενη και αναπόφευκτη, καθώς το παρατηρούμενο βιολογικό αποτέλεσμα μπορείνα επηρεαστεί από ένα πλήθος παραγόντων. Η βιολογική επίδραση εξαρτάται από τοποσό της ενέργειας που απορροφάται από τον κάθε οργανισμό, καθώς και από τον τρόποπου αυτή κατανέμεται στο χώρο και το χρόνο. Η συχνότητα, η ένταση, η διάρκειαέκθεσης και ο αριθμός δόσεων της ακτινοβολίας μπορούν να επηρεάσουν την κυτταρικήαπόκριση, ενώ ο συνδυασμός και η αλληλεπίδραση των παραπάνω παραγόντωνδιαμορφώνει το τελικό βιολογικό αποτέλεσμα.Τα πειράματα της παρούσας διατριβής διεξήχθησαν σε νεοεκδυθέντα δίπτερα έντομαDrosophila melanogaster. Ο κύκλος ζωής του εντόμου είναι σύντομος και περιλαμβάνειτέσσερα διακριτά στάδια: το αυγό, την προνύμφη, τη χρυσαλίδα και το ενήλικο άτομο. Σύμφωνα με τα ευρήματα προηγουμένων μελετών του εργαστηρίου μας, η συνεχήςημερήσια έκθεση διάρκειας 6 λεπτών του εντόμου στη διαμορφωμένη, από τηνανθρώπινη ομιλία, ακτινοβολία του συστήματος GSM-900MHz, κατά τη διάρκεια τωνπρώτων 5 ημερών της ενήλικης ζωής του, προκαλεί σημαντική μη-θερμική μείωση τηςαναπαραγωγικής του ικανότητας/μέσης ωοτοκίας, όπως αυτή προσδιορίζεται από τοναριθμό χρυσαλίδων της πρώτης θυγατρικής γενιάς.Η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στη διερεύνηση, σε κυτταρικό επίπεδο, τηςαιτίας, που ευθύνεται για την παρατηρούμενη μείωση της αναπαραγωγικής ικανότηταςτων εντόμων. Για το σκοπό αυτό, εξετάστηκαν: 1) ωοθυλάκια όλων των αναπτυξιακώνσταδίων προερχόμενα από ωοθήκες εκτεθειμένων εντόμων (in vivo έκθεση) και 2)ωοθυλάκια εκτεθειμένα κατά την in vitro ανάπτυξή τους, στα GSM πεδία κοινώνκινητών τηλεφώνων. Η έκθεση των εντόμων πραγματοποιήθηκε σε τιμές έντασης εντόςτων θεσπισμένων ορίων από τη διεθνή επιτροπή για την προστασία από τη μη-ιονίζουσαακτινοβολία (ICNIRP, 1998), Παράλληλα, μελετήθηκαν ορισμένες παράμετροι τηςακτινοβολίας (αριθμός δόσεων, διάρκεια και ένταση) ως προς τον τρόπο που αυτέςκαθορίζουν το τελικό βιολογικό αποτέλεσμα.Η κάθε ωοθήκη του εντόμου αποτελείται από 18-20 ωοθηκάρια, παράλληλες δηλαδήσειρές ωοθυλακίων διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων. Τα ωοθυλάκια είναιγενετικές/βλαστικές κύστεις, 16 κυττάρων που περιβάλλονται από περίπου 1000σωματικής προέλευσης θυλακοκύτταρα. Στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης τουωοθυλακίου, που διεξάγονται στην περιοχή του γερμαρίου (την πλέον πρόσθια περιοχήτου ωοθηκαρίου), ένα από τα βλαστικά κύτταρα διαφοροποιείται σε ωοκύτταρο, ενώ ταυπόλοιπα 15 αναπτύσσονται και συνιστούν τα πολυπλοειδικά τροφοκύτταρα. Τατελευταία τροφοδοτούν το ωοκύτταρο με θρεπτικά συστατικά, οργανίδια, mRNAs,πρωτεϊνες, που απαιτούνται για τη διεξαγωγή της ωογένεσης, αλλά και την ανάπτυξη τουεμβρύου. Ο πληθυσμός των σωματικών θυλακοκυττάρων, που υπόκειται σε μιτωτικέςδιαιρέσεις μέχρι και το αναπτυξιακό στάδιο 6, απαιτείται για την εγκαθίδρυση τωναξόνων πολικότητας στο ωοκύτταρο, για τη σύνθεση της λεκίθου, της βιτελλινήςμεμβράνης και του χορίου. Τα ωοθυλάκια καθώς εξέρχονται από το γερμάριο, καιεισέρχονται στο βιτελλάριο, αναπτύσσονται μέσα από μία σειρά 14 διακριτών σταδίων(πρώιμης ωογένεσης στ. 1-7, μέσης στ.8-10, όψιμης στ. 11-14), με το ωοκύτταρο τουσταδίου 14 να είναι ώριμο για γονιμοποίηση και απόθεση.Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (ΠΚΘ) είναι ιδιαίτερα μελετημένος καιπαρατηρείται ως απόκριση τόσο σε ενδογενή (αναπτυξιακά) όσο και σε εξωγενή (από τοπεριβάλλον) ερεθίσματα ακολουθώντας δύο διαφορετικά πρότυπα με καθοριστικό ρόλοστη φυσιολογική ανάπτυξη των ωοθυλακίων.Σύμφωνα με το αναπτυξιακά ρυθμιζόμενο και ασύγχρονο πρότυπο, ο φυσιολογικός,με ορισμένα χαρακτηριστικά απόπτωσης, θάνατος, αρχίζει στο στάδιο 11 στατροφοκύτταρα του κάθε αναπτυσσομένου ωοθυλακίου με την χαρακτηριστικήαναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης πέριξ των πυρήνων και τοσχηματισμό των δεσμών ακτίνης, που απαιτούνται για τη διεξαγωγή της διαδικασίαςαδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικού στο ωοκύτταρο. Στο στάδιο 12, η πυρηνικήχρωματίνη συμπυκνώνεται, ενώ ακολουθεί ο θρυμματισμός του DNA κατά το στάδιο 13.Τα υπολείμματα των τροφοκυττάρων εγκολπώνονται και απομακρύνονται από ταγειτονικά θυλακοκύτταρα, τα οποία επίσης υφίστανται κυτταρικό θάνατο στο στάδιο 14.Το δεύτερο πρότυπο παρατηρείται σποραδικά στα στάδια 7-8 (πριν την βιτελλογένεσητης μέσης ωογένεσης) και στο στάδιο του γερμαρίου και συνιστά απόκριση απέναντι σεδιάφορα στρεσογόνα ερεθίσματα, ενώ χαρακτηρίζεται από την ταυτόχρονη ανίχνευσητων συμπυκνωμένων και θρυμματισμένων πυρήνων των τροφοκυττάρων και των θυλακοκυττάρων, όπως και από το αποδιοργανωμένο δίκτυο ακτίνης στα ανώμαλαωοθυλάκια. Το γερμάριο και τα στάδια 7-8 θεωρούνται τα δύο σημεία ελέγχου τηςωογένεσης και δρουν ως ένα είδος προστατευτικού μηχανισμού της αναπτυξιακήςδιαδικασίας για τον περιορισμό της απώλειας ενέργειας και θρεπτικών υλικών σεωοθυλάκια ανίκανα να αναπτυχθούν σε φυσιολογικά ώριμα αυγά.Σύμφωνα με τα πειραματικά μας πρωτόκολλα, νεοεκδυθέντα έντομα πουσυλλέχθησαν εντός 4 ωρών, τοποθετούνται σε σωλήνες με τροφή, χωριστά τα αρσενικάαπό τα θηλυκά, όπου και παραμένουν για τις επόμενες 2 μέρες. Με την ολοκλήρωση του2ου 24ωρου τα έντομα είναι σεξουαλικά ώριμα και τοποθετούνται σε νέους κοινούςσωλήνες έτοιμα για διασταύρωση. Σε αυτούς παραμένουν για 3 ακόμη 24ωρα κατά τηδιάρκεια των οποίων τα θηλυκά παρουσιάζουν το μέγιστο της ωοτοκίας τους.Η έκθεση των εντόμων έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια των παραπάνω 5 24ώρωνσύμφωνα με τα πρωτόκολλα έκθεσης της κάθε πειραματικής ενότητας. Το 6ο 24ωροπραγματοποιείται μία επιπλέον έκθεση και 2-3 ώρες αργότερα τα πατρικά έντομααπομακρύνονται από τους σωλήνες, οι οποίοι φυλάσσονται σε θάλαμο σταθερώνσυνθηκών για τα επόμενα 6-8 24ωρα, μέχρι δηλαδή την ανάπτυξη των θυγατρικώνχρυσαλίδων. Στις ωοθήκες των θηλυκών εντόμων, που απομακρύνθηκαν από τουςσωλήνες, κάνουμε ανατομία σε ισότονο με την αιμολέμφο των εντόμων διάλυμαRinger’s προκειμένου να λάβουμε τα ωοθυλάκιά τους. Τα διαχωρισμένα ωοθυλάκιαεπωάζονται στη συνέχεια με την κατάλληλη χρώση για την ανίχνευση των ακόλουθωνχαρακτηριστικών κυτταρικού θανάτου: αποδόμηση DNA, αποδιοργάνωση τουκυτταροσκελετού της ακτίνης, συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης καιενεργοποίησης κασπασών. Η εξέταση των δειγμάτων γίνεται σε μικροσκόπιο φθορισμούή συνεστιακό μικροσκόπιο laser (CLSM). Ορισμένα δείγματα εξετάστηκαν και μετά από έγκλειση, τομές και χρώση στο φωτονικό μικροσκόπιο και ηλεκτρονικό μικροσκόπιοδιέλευσης.Στην περίπτωση της in vitro μελέτης, εξετάστηκε η οργάνωση και κατανομή τουκυτταροσκελετού της ακτίνης σε απομονωμένα ωοθυλάκια, που προήλθαν από την invitro ανάπτυξή τους για 3h σε θρεπτικό μέσο Schneider's και την ταυτόχρονη έκθεσήτους στην GSM ακτινοβολία.Οι πειραματικές ενότητες που εξετάστηκαν είναι οι ακόλουθες:1) Επίδραση της GSM ακτινοβολίας στο DNA και τον κυτταροσκελετό της ακτίνης-σύγκριση βιολογικής επίδρασης συνεχούς και διακοπτόμενης έκθεσης,2) Επαγωγή χαρακτηριστικών αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου στα ωοθυλάκια τηςπρώιμης και μέσης ωογένεσης από την GSM ακτινοβολία3) Επίδραση της GSM-ακτινοβολίας στα ωοθυλάκια της όψιμης ωογένεσης4) Επίδραση της GSM-ακτινοβολίας στην in vitro ανάπτυξη των ωοθυλακίωνκαταδεικνύοντας τα εξής:1) Τα αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης αποδομημένου DNA και τις αλλοιώσεις στονκυτταροσκελετό της ακτίνης (έως 46% και 44% αντιστοίχως) από όλους τους τύπουςέκθεσης στα κύτταρα ωοθυλακίων της πρώιμης και μέσης ωογένεσης (στ. 1-10) λόγω τηςέκθεσης στην GSM ακτινοβολία (6min/day). Και τα δύο χαρακτηριστικά κυτταρικούθανάτου βρέθηκαν να συμπίπτουν στα ίδια κύτταρα των εκφυλισμένων ωοθυλακίων.Παράλληλα, διαπιστώθηκε η σημαντική μείωση της μέσης ωοτοκίας μέχρι το ποσοστότου 43%. Οι διακοπτόμενοι τύποι με τα σύντομα διαλείμματα (10 λεπτών) μεταξύ των δόσεων της ακτινοβολίας αποδείχθηκαν στον ίδιο σχεδόν βαθμό δραστικοί με τον συνεχή τρόπο έκθεσης ίδιας συνολικής διάρκειας, παρέχοντας μία ένδειξη αθροιστικήςεπίδρασης της συγκεκριμένης ακτινοβολίας. Αντιθέτως, τα μεγαλύτερα διαστήματαδιακοπής (6 ωρών) επέτρεψαν στα έντομα να ανακάμψουν από το στρες της έκθεσηςενδεχομένως λόγω ενεργοποίησης κάποιου μηχανισμού κυτταρικής επιβίωσης αντίθανάτου.2) Την ανίχνευση επιπροσθέτων χαρακτηριστικών κυτταρικού θανάτου, όπως ηενεργοποίηση των κασπασών στο κυτταρόπλασμα των τροφοκυττάρων και ησυμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης, στα κύτταρα ωοθυλακίων της πρώιμης καιμέσης ωογένεσης (στ. 1-10), σε ποσοστά της τάξεως του 30%. Σημειώνεται ότι, ησυμπυκνωμένη πυρηνική χρωματίνη βρέθηκε να συνυπάρχει με το θρυμματισμένο DNAστους ίδιους τροφοκυτταρικούς πυρήνες. Η διαφορά που καταγράφηκε στα ποσοστά τηςπαρούσας σε σύγκριση με τα ποσοστά της προηγούμενης ενότητας μπορεί να αποδοθείστη χαμηλότερη τιμή έντασης της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας από το κινητό τηλέφωνοστην οποία έλαβε χώρα η έκθεση των εντόμων.3) Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής, η έκθεση των εντόμων στηνGSM ακτινοβολία (6min/day) δεν προκάλεσε μεταβολές: 1) στον ΠΚΘ τωντροφοκυττάρων (στ. 12-13) και τη διαδικασία αδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικούστο ωοκύτταρο (στ. 11) και 2) στην ενδογενή ενεργότητα της υπεροξειδάσης τουκελύφους (στ. 14). Ωστόσο, δύο τύπου αλλοιώσεις διαπιστώθηκαν μετά την έκθεση τωνεντόμων μεγαλύτερης ημερήσιας διάρκειας (30min/day). Στην περίπτωση αυτή υπήρξανενδείξεις ότι η GSM έκθεση επηρεάζει την ακεραιότητα του επιθηλίου τωνθυλακοκυττάρων (στ. 12-13) με την παρουσία ασυνεχειών σε αυτό, ενώ μεταβολές διαπιστώθηκαν και στο σχήμα του ωοκυττάρου (συρρίκνωση) (στ. 14).4) Τέλος, η GSM έκθεση [3h (45min on/15min off)] απομονωμένων ωοθυλακίωνσταδίου 11 σε in vitro συνθήκες, επιφέρει μεταβολές στην οργάνωση και την κατανομήτου δικτύου ακτίνης στα τροφοκύτταρα και τα θυλακοκύτταρα και κατ’επέκταση στηδιαδικασία αδειάσματος του τροφοκυτταρικού υλικού στο ωοκύτταρο (dumping).Σύμφωνα με τα παραπάνω ευρήματα, η απόπτωση είναι ένα τουλάχιστον είδοςκυτταρικού θανάτου που επάγεται, από την έκθεση των εντόμων στην GSM ακτινοβολία(6min/day) των κινητών τηλεφώνων, στα κύτταρα των ωοθυλακίων όλων των σταδίωντης πρώιμης και μέσης ωογένεσης. Ωστόσο, η πιθανότητα η ακτινοβολία να επηρεάζεικαι μηχανισμούς άλλων τύπων κυτταρικού θανάτου, όπως της νέκρωσης, δεν θαμπορούσε να αποκλειστεί. Μεγαλύτερη ευαισθησία όπως ήταν αναμενόμενο, επέδειξαντα ωοθυλάκια στα δύο σημεία ελέγχου της ωογένεσης, στο γερμάριο και τα στάδια 7-8με τα τροφοκύτταρα να είναι αυτά στα οποία κυρίως ανιχνεύονται τα χαρακτηριστικάτου επαγομένου κυτταρικού θανάτου. Επιπλέον, σημαντική υπήρξε η διαπίστωση ότι ταποσοστά που προήλθαν από την εφαρμογή και των δύο πειραματικών πρωτοκόλλων(αναπαραγωγικής ικανότητας και ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου) στις ίδιες ομάδεςεντόμων σχεδόν ταυτίζονται, και άρα συνάγεται το συμπέρασμα ότι, ο επαγόμενοςκυτταρικός θάνατος των τροφοκυττάρων/θυλακοκυττάρων, που καταλήγει στονεκφυλισμό των ωοθυλακίων, είναι ο κυρίως υπεύθυνος για την παρατηρούμενη μείωσητης μέσης ωοτοκίας του εντόμου. Άλλωστε, στο συμπέρασμα αυτό μπορούμε νακαταλήξουμε και από το γεγονός ότι, τα ωοθυλάκια των σταδίων 11-13 παρουσίασανφυσιολογική ανάπτυξη (6min/day). Αντιθέτως, οι ασυνέχειες στο επιθήλιο τωνθυλακοκυττάρων, που διαπιστώθηκαν στην περίπτωση της έκθεσης μεγαλύτερηςχρονικής διάρκειας (30min/day), θα μπορούσαν να αποδοθούν στον επαγόμενο θάνατο των θυλακοκυττάρων, σε μεταβολές κατά τις διαδικασίες των μιτωτικών τους διαιρέσεων(στάδια 1-6), είτε τέλος σε μεταβολές των συνιστωσών κυτταρικής πρόσφυσης. Τέλος,τα δεδομένα αλλοίωσης του δικτύου ακτίνης in vitro είναι δυνατόν να οφείλονται στην οξείδωση της ακτίνης ή την αλλαγή ενεργότητας πρωτεϊνικών μορίων που σχετίζονται μεαυτή, λόγω οξείδωσης ή μεταβολών στις ιοντικές συγκεντρώσεις ασβεστίου. Αντίστοιχηερμηνεία μπορεί να δοθεί και στην περίπτωση συρρίκνωσης του ωοκυττάρου.Σε επίπεδο κυττάρου, οι παρατηρούμενες βιολογικές επιδράσεις μπορούν νααποδοθούν στην αλληλεπίδραση των Η/Μ πεδίων με τις κυτταρικές μεμβράνες,σύμφωνα με τον προταθέντα βιοφυσικό μηχανισμό του εργαστηρίου μας. Πιοσυγκεκριμένα, το αντικανονικό άνοιγμα/κλείσιμο των ηλεκτροευαίσθητωνδιαμεμβρανικών ιοντικών καναλιών (π.χ. κανάλια Ca+2), λόγω της εξαναγκασμένηςταλάντωσης, που υφίστανται τα ελεύθερα ιόντα που βρίσκονται σε μεγάλεςσυγκεντρώσεις εκατέρωθεν των μεμβρανών, από τις ELF συνιστώσες των σημάτων τωνκινητών τηλεφώνων, μπορεί να ανατρέψει την ηλεκτροχημική ισορροπία του κυττάρουκαι κατ’επέκταση να προκαλέσει δυσλειτουργία στα μιτοχόνδρια ή τα λυσοσώματα,καθώς και υπερπαραγωγή ενεργών ενώσεων οξυγόνου (ROS), μεταβολές ικανές ναεπηρεάσουν τους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου των τροφοκυττάρων και τωνθυλακοκυττάρων των ωοθυλακίων.Ωστόσο, η σύνδεση ανάμεσα στη δράση των RF H/M πεδίων και τις επερχόμενεςαλλαγές των ενδοκυτταρικών ιοντικών συγκεντρώσεων, το οξειδωτικό στρες και τιςμεταβολές της κυτταρικής λειτουργίας χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.