Μελέτη της ανοσολογικής απόκρισης ποντικών ανοσοποιημένων με εμβόλια γενετικού υλικού που στοχεύουν επιλεγμένα καρκινικά αντιγόνα
Authors: Τιπτιρή-Κουρπέτη Αγγελική 
Published: August 2021

Τα DNA εμβόλια αποτελούν σημαντικό εργαλείο για την καταπολέμηση του καρκίνου με ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις παρέχοντας μεγάλη ευελιξία και ασφάλεια. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο τον σχεδιασμό, την ανάπτυξη και αξιολόγηση ενός νέου DNA γενετικού εμβολίου με σκοπό την αντιμετώπιση του αδενοκαρκινώματος μαστού σε συνγονικό πειραματικό μοντέλο καρκίνου σε BALB/c ποντικούς. Ανάμεσα στην πληθώρα των ογκοσχετιζόμενων καρκινικών αντιγόνων, αρχικά επιλέχθηκαν τα αντιγόνα BIRC5, EpCAM και NPTN. Στην παρούσα μελέτη επιτεύχθηκε η δημιουργία DNA εμβολίων ικανών να εκφράζονται σε κυτταρικές σειρές in vitro και σε ιστούς in vivo. Τα αρχικά πειραματικά δεδομένα και η εκτεταμένη βιβλιογραφική αναζήτηση οδήγησαν στο προσκολλητικό μόριο NPTN –νευροπλαστίνη- ως ένα νέο πολλά υποσχόμενο αντιγόνο των όγκων. Η νευροπλαστίνη είναι μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, που απαντάται σε δύο ισομορφές. Ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών των προσκολλητικών μορίων CAMs. Σε ενήλικα άτομα, η νευροπλαστίνη εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στην ανοσολογικά «προνομιούχα» περιοχή του εγκεφάλου. Η νευροπλαστίνη ταυτοποιήθηκε πρόσφατα ως καρκινικό αντιγόνο του καρκίνου του μαστού. Μάλιστα η έκφρασή της εντοπίστηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και βιοψίες καρκινωμάτων μαστού προχωρημένου σταδίου. Κατά τη διάρκεια της μελέτης του DNA εμβολίου της νευροπλαστίνης ανιχνεύθηκε αντιγονο-ειδική ανοσολογική απόκριση σε BALB/c ποντικούς. Τα NPTN-ειδικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού και ELISA μετά από ανοσοποίηση των ποντικών τόσο πριν, όσο και μετά την πρόκληση συνγονικού αδενοκαρκινώματος του μαστού. Ο εμβολιασμός (50μg) πραγματοποιήθηκε 3 φορές ανά διάστημα 7 περίπου ημερών intra ear. Η πλειονότητα των NPTN-ανοσοποιημένων ποντικών δεν εμφάνισαν όγκο ή το μέγεθος του όγκου ήταν στατιστικά μικρότερο από αυτό των ποντικών που δεν εμβολιάστηκαν ή εμβολιάστηκαν με τον φορέα κλωνοποίησης μόνο. Τα δεδομένα της έρευνάς μας υποστηρίζουν την ανάπτυξη κυτταροτοξικής ανοσολογικής απόκρισης. Τα σπληνοκύτταρα από ανοσοποιημένους ποντικούς καλλιεργήθηκαν και διεγέρθηκαν με 4 διαφορετικά αντιγονικά πεπτίδια και το συνδυασμό τους. Τα πεπτίδια αυτά επιλέχθηκαν με σκοπό την βέλτιστη παρουσίασή τους από MHCI μόρια στα CD8+ κύτταρα. Γι΄ αυτό επιλέχθηκαν 9μερή πεπτίδια (παρουσίαση στον TCR των κυτταροτοξικών κυττάρων) μετά από αναζήτηση στις βάσεις δεδομένων SYFPEITHI και IEDB για τα MHC μόρια των BALB/c ποντικών H2-Kd και H2-Ld. Το υπερκείμενο της καλλιέργειας των διεγερμένων σπληνοκυττάρων υποβλήθηκε σε δοκιμή ELISPOT και έδειξε παραγωγή υψηλών επιπέδων IFN-γ από πολλούς διαφορετικούς CD8 κλώνους κυττάρων. Η ανάλυση των ισοτύπων των αντισωμάτων στον ορό ανοσοποιημένων και μη BALB/c ποντικών έδειξε αύξηση των IgG2b και IgG3 αντισωμάτων και μείωση των IgG1b αντισωμάτων. Η μεταστροφή αυτή των ισοτύπων σχετίζεται με Th1 ανοσολογική απόκριση. Επιπροσθέτως, τα επίπεδα της IL-12 /IL-23 p40 και του TNFa σχεδόν διπλασιάστηκαν στους ανοσοποιημένους ποντικούς, όπως επιβεβαιώθηκε με ELISA. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής αποκάλυψαν υψηλή συγκέντρωση CD8+ T λεμφοκυττάρων στους όγκους και τους σπλήνες των ανοσοποιημένων ποντικών, γεγονός που συνάδει με την παραγωγή IFN-γ και το συνολικό πρότυπο έκφρασης των κυτταροκινών. Η περαιτέρω διερεύνηση της δράσης της νευροπλαστίνης και του μοριακού μονοπατιού σηματοδότησής της μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη σημαντικών μορίων στόχων που ενέχονται στην καρκινογένεση. Πρώιμα πειράματα έδειξαν ότι η in vitro υπερέκφραση της νευροπλαστίνης οδηγεί στην μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση και την μετάσταση. Επίσης in vitro δοκιμή μετάστασης έδειξε ότι η υπερέκφραση της νευροπλαστίνης στην καρκινική κυτταρική σειρά HeLa αυξάνει το μεταναστευτικό δυναμικό των κυττάρων. Απώτερος στόχος είναι η μετάφραση των ευρημάτων μας στην κλινική πράξη με σκοπό την ανάπτυξη αποτελεσματικής προστατευτικής ανοσίας σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού.