Το φάσμα των μεταλλάξεων του γονιδίου CYP21A2 σε ασθενείς με συγγενή υπερπλασία επινεφριδίων... ες γην εναλίαν Κυπρον
Authors: Σκορδής Νικόλαος 
Published: January 2014

Η Συγγενής Υπερπλασία Επινεφριδίων (ΣΥΕ) αποτελεί μία ομάδα διαταραχών, οι οποίες κληρονομούνται με αυτόσωμο υπολειπόμενο χαρακτήρα και χαρακτηρίζονται από ελλειμματική βιοσύνθεση της Κορτιζόλης, λόγω ένδειας ενός εκ των ενζύμων, τα οποία απαιτούνται για την βιοσύνθεση της στον φλοιό των επινεφριδίων. Η συχνότερη μορφή της ΣΥΕ (95% των περιπτώσεων) οφείλεται σε έλλειψη της 21-υδροξυλάσης, ως αποτέλεσμα γενετικών λαθών στο γονίδιο CYP21Α2, το οποίο αποτελεί ένα από τα πλέον πολυμορφικά γονίδια.Τα γενετικά λάθη του γονιδίου CYP21Α2 προέρχονται από δύο τύπους ανασυνδυασμών ανάμεσα στο CYP21Α2 και στο ψευδογονίδιο CYP21Α1P: άνισες διασταυρώσεις κατά τη διάρκεια της μείωσης, οι οποίες οδηγούν σε απαλείψεις CYP21Α2 και μετατροπές, με αποτέλεσμα την μεταφορά αλλοιωμένων αλληλουχιών από το CYP21A1P στο CYP21Α2, όπου καθίστανται επιζήμιες. Τα γενετικά λάθη του γονιδίου CYP21Α2 ταξινομούνται σε τρείς κατηγορίες ανάλογα με τον βαθμό της ενζυματικής λειτουργίας και τυπικά ανταποκρίνονται στις τρεις κλινικά μορφές της έλλειψης της 21- Υδροξυλάσης: με απώλεια άλατος - salt-wasting (SW), απλή αρρενοποιητική - simple virilizing (SV), και όψιμης εκδήλωσης- nonclassical (NC) ΣΥΕ. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων παρατηρείται συμφωνία μεταξύ γονοτύπου και φαινοτύπου, αν και δεν είναι πάντα εφικτό να γίνει επακριβώς η πρόβλεψη της κλινικής έκφρασης βάσει της υποκείμενης γενετικής διαταραχής. Οι περισσότεροι ασθενείς ανευρίσκονται να είναι σύνθετοι ετεροζυγώτες, όπου η σοβαρότητα της νόσου καθορίζεται από την δραστηριότητα του λιγότερο επηρεαζόμενου αλληλίου. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη του φάσματος των μεταλλάξεων που αναγνωρίστηκαν σε Ελληνοκύπριους ασθενείς με ΣΥΕ και η εξακρίβωση της επίδρασης του υποκείμενου γονότυπου στη κλινική έκφραση της πάθησης. Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 218 ασθενείς και 300 υγιείς μάρτυρες, στους οποίους έγινε μοριακή ανάλυση του γονιδίου CYP21Α2 με προσδιορισμό της αλληλουχίας προϊόντων της PCR σε αυτόματο αναλυτή (ABI Sequencer) και με τη μέθοδο MLPA για ανίχνευση διπλασιασμών και μεγάλων απαλείψεων. Συνοπτικά τα αποτελέσματα έχουν ως εξής. 1. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις συνολικά, που αναγνωρίστηκαν στους 47 μη συσχετιζόμενους ασθενείς, των οποίων μελετηθήκανε 94 αλλήλια είναι οι p.Val281Leu (54.8 %) και IVS2-13A/C>G (14.9%). 2. Στην ομάδα των 10 ασθενών, οι οποίοι είχαν την κλασσική μορφή της ΣΥΕ η πιο συχνή σημειακή μετάλλαξη ήτανε η IVS2-13A/C>G (52.4%).3. Τα πιο συχνά μοριακά λάθη, που αναγνωρίστηκαν στην ομάδα των 37 ασθενών με την μη κλασσική μορφή ΣΥΕ, είναι η μετάλλαξη p.Val281Leu σε ποσοστό 68.9%, η p.Pro453Ser (6.75%) και οι μεταλλάξεις IVS2-13A/C (4.05%), p.Qln318stop (4.05%) και p.Val304Met (4.05%). 4.Οι ασθενείς με τη μη κλασσική μορφή, που έφεραν συνδυασμό ήπιας/σοβαρής μετάλλαξης σε μεγαλύτερο ποσοστό εκδήλωσαν τη νόσο πριν από την εφηβεία και είχαν υψηλότερα επίπεδα επινεφριδιακών ανδρογόνων. 5. Η συνολική συσχέτιση γονότυπου – φαινότυπου στην παρούσα φάση της μελέτης ήτανε 100%. Όλοι οι ασθενείς των ομάδων null, Α και Β είχαν την κλασσική (απώλεια άλατος ή απλή αρρενοποιητική) μορφή ΣΥΕ. Όλοι οι ασθενείς της ομάδας C εκδήλωσαν την μη κλασσική μορφή, όπως ήταν αναμενόμενο. 6.Ανάλυση του γονότυπου CYP21A2 σε 171 θήλεις με κλινική εικόνα υπερανδρογοναιμίας εδειξε τα ακολουθα: Α. 66 θήλεις βρέθηκαν να έχουν μία μετάλλαξη του γονιδίου CYP21A2 με την p.Val281Leu να είναι η πιο συχνή, οι οποίες είχαν και τις υψηλότερες τιμές 17-OH Προγεστερόνης.Β. Οι υπόλοιπες 105 θήλεις με κλινικά σημεία υπερανδρογοναιμίας, στις οποίες δεν αναγνωρίστηκε καμία μετάλλαξη στο γονίδιο CYP21A2 είχαν σε ασυνήθιστα υψηλή συχνότητα 56.1% τον πολυμορφισμό p.Asn493Ser, ο οποίος βρέθηκε να είναι 19.7% στην ομάδα των 66 CYP21A2 ετεροζυγωτών θηλέων. Επιπρόσθετα σε δείγμα 300 υγιών Κυπρίων μαρτύρων η συχνότητα των φορέων της παραλλαγής p.Asn493Ser εκτιμάται να είναι 37%. Γ. Η αλληλούχιση της μη μεταφραζόμενης περιοχής 3’UTR του γονιδίου CYP21A2 στις 66 θήλεις με ένα επηρεασμένο αλλήλιο CYP21A2 έδειξε ότι όσες έφεραν σε ετεροζυγωτία την παρανοηματική μετάλλαξη p.Val281Leu έφεραν επίσης στην περιοχή 3’UTR in cis τους πολυμορφισμούς *52 T>C, *440 C>T και *443 T>C και όσες έφεραν την σοβαρή μετάλλαξη p.Qln318stop είχαν επίσης in cis τους πολυμορφισμούς *12 T>C και *52 C>T στην ίδια περιοχή του 3’UTR. Αντιθέτως η κατανομή και των δύο ανωτέρω πολυμορφισμών δεν παρατηρήθηκε σε καμία από τις υπόλοιπες CYP21A2 ετερόζυγες θήλεις. 7.Οι σπάνιες γενετικές βλάβες που αναγνωρίστηκαν ήταν οι σημειακές μεταλλάξεις p.Val304Met, p.Met283Va, p.Ala391Thr καθώς και ο ασυνήθης συνδυασμός p.Phe306insT+ p.Val281Leu/ p.Phe306insT+ p.Val281Leu. 8.Σε δείγμα 300 κλινικά ασυμπτωματικών ατόμων (150 άνδρες και 150 γυναικών) η συχνότητα φορέων μεταλλάξεων του γονιδίου CYP21A2 στον Κυπριακό πληθυσμό είναι 9.83%. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις που αναγνωρίστηκαν ήταν η ήπια p.Val281Leu (4.3%), ακολουθούμενη από τις p.Qln318stop (2.5%), p.Pro453Ser (1.33%), p.Val304Met (0.83%), p.Pro482Ser (0.67%) και p.Met283Val (0.17%). Οι σοβαρές πέντε μεταλλάξεις, οι οποίες αναγνωρίστηκαν στους ασθενείς της παρούσας μελέτης δεν ανιχνεύτηκαν σε κανένα από τους υγιείς μάρτυρες, έτσι που να ερμηνεύεται η σπανιότητα της κλασσικής μορφής στον πληθυσμό μας. Από τα προκαταρτικά αυτά αποτελέσματα φαίνεται ότι το φάσμα και η συχνότητα των μεταλλάξεων του γονιδίου CYP21A2 στους Ελληνοκύπριους ασθενείς με ΣΥΕ προσομοιάζει με τις πλέον συχνά ανευρεθείσες γενετικές βλάβες. Παρατηρείται μία εξαιρετική συσχέτιση του γονότυπου με τον κλινικό φαινότυπο, άνκαι μερική διαφωνία είναι λογικά αναμενόμενη, λόγω διαφοράς στην έκφραση του γονιδίου της 21 – Υδροξυλάσης. Μέχρι τώρα η πραγματική εικόνα της συχνότητας των μεταλλάγμένων αλλήλίων και συνεπώς φορέων ΣΥΕ λόγω έλλειψης της 21 – Υδροξυλάσης δεν έχει μελετηθεί με εμπεριστατωμένη μοριακή ανάλυση του γονιδίου CYP21A2 σε συγκεκριμένο Ευρωπαϊκό πληθυσμό. Στην παρούσα μελέτη έγινε ανίχνευση για μεταλλάξεις του γονιδίου CYP21A2 σε στατιστικά αξιόπιστο για τον πληθυσμό της χώρας με αλληλούχιση DNA και ανάλυση MLPA για μεταλλάξεις στο γονίδιο CYP21A2 και στον προμότορά του. Η γνώση της υποκείμενης γενετικής βλάβης είναι αναγκαίο εργαλείο τόσο για την ακριβή διάγνωση και ταυτοποίηση των ασθενών όσο και για την παροχή ορθολογιστικής γενετικής συμβουλής, όταν καθίσταται αναγκαία.