Η συμβολή της Μεσογειακής χλωρίδας στην προστασία των μικρών μηρυκαστικών έναντι των γαστρεντερικών παρασίτων
Authors: Σαράτση Αικατερίνη 
Published: October 2021

Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα τόσο στη χώρα μας, όσο και παγκοσμίως, είναι η μόλυνση των μικρών μηρυκαστικών από γαστρεντερικά νηματώδη παράσιτα της οικογένειας Trichostrongylidae. Αυτό γιατί η συχνότητα εμφάνισης αυτών, σε συνδυασμό με την εκτεταμένη εξάπλωση τους απειλούν την υγεία και την ευζωία των ζώων και μειώνουν την ποσότητα και την ποιότητα των παραγόμενων ζωικών προϊόντων, με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του αγροτικού εισοδήματος των κτηνοτρόφων. Σε συστήματα εκτροφής που βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στη βόσκηση, όπως τα ημιεκτατικά και τα ημιεντατικά που επικρατούν στη χώρα μας, η μόλυνση των ζώων από γαστρεντερικά νηματώδη παράσιτα θεωρείται δεδομένη. Μέχρι σήμερα, η αντιμετώπιση των γαστρεντερικών νηματωδών γίνονταν τόσο προληπτικά, όσο και θεραπευτικά με τη χρήση ανθελμινθικών φαρμάκων ευρέως φάσματος, πρακτική που αποδείχθηκε αποτελεσματική, ασφαλής και οικονομικά αποδοτική. Όμως η εμφάνιση και η συχνότητα ανάπτυξης στελεχών των παρασίτων ανθεκτικών στα φάρμακα, φαινόμενο γνωστό με τον όρο «ανθελμινθικοαντοχή», σε συνδυασμό με την ανησυχία των καταναλωτών για υπολείμματα φαρμάκων στα παραγόμενα προϊόντα και το περιβάλλον, οδήγησε στην αναζήτηση εναλλακτικών/συμπληρωματικών τρόπων αντιμετώπισης των παρασιτώσεων. Σήμερα η χρήση βιοενεργών φυτών, δηλαδή φυτών πλούσιων σε δευτερογενείς μεταβολίτες με ανθελμινθική δράση αποτελεί αντικείμενο ερευνητικής δραστηριότητας, που συνάδει και με την πολιτική της ΕΕ για πράσινη ανάπτυξη. Από τα φυτά αυτά, ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν αυτά που όχι μόνο εμφανίζουν ανθελμινθική δράση, αλλά συνεισφέρουν και σαν συστατικά της διατροφής των μικρών μηρυκαστικών, γνωστά με τον αγγλικό όρο «nutraceuticals». Σε ότι αφορά τους δευτερογενείς μεταβολίτες, η μελέτη της ομάδας των συμπυκνωμένων ταννινών των φυτών (CT) με πιθανή δράση έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών, συνιστά μέχρι σήμερα ελκυστική προσέγγιση επίλυσης του προβλήματος. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση και αξιολόγηση της πιθανής ανθελμινθικής δράσης φυτικών ειδών της χώρας μας, που είναι πλούσια σε δευτερογενείς μεταβολίτες, έναντι των γαστρεντερικών παρασίτων των προβάτων και αποτελούν συγχρόνως και συστατικά διατροφής των μικρών μηρυκαστικών. Για το σκοπό αυτό, αρχικά διερευνήθηκε και αξιολογήθηκε η ανθελμινθική δράση 31 φυτικών εκχυλισμάτων σε in vitro δοκιμές. Αλκοολούχα εκχυλίσματα των ειδών αυτών ελέγχθηκαν με τη Δοκιμή της Έκδυσης των Προνυμφών (Larval Exsheathment Inhibition Assay/LEIA) σε 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις (150-1.200μg/mL), για την ανθελμινθική τους δράση έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών Haemonchus contortus και Trichostrongylus colubriformis. Στη συνέχεια, με βάση τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής, υπολογίσθηκε η μέση αποτελεσματική δόση (EC50), ενάντια στα δύο είδη παρασίτων. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι εκχυλίσματα της νωπής πούλπας Olea europaea και του υπέργειου τμήματος του φυτού Aremonia agrimonoides, εμφάνισαν ανθελμινθική δράση, αλλά μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση των εκχυλίσματος (1.200μg/mL). Τα εκχυλίσματα από τα υπέργεια τμήματα των φυτικών ειδών Pyrus spinosa και Potentilla haynaldiana παρουσίασαν αντίστοιχη δράση τόσο στη συγκέντρωση των 1.200μg/mL, αλλά και σε αυτή των 600μg/mL εκχυλίσματος. Η ονοβρυχίδα Onobrychis peloponnesiaca παρουσίασε δοσοεξαρτώμενη ανθελμινθική δράση ενάντια και στα δύο είδη παρασίτων, ενώ η On. alba laconica μόνο έναντι του H. contortus. Το μοναδικό φυτικό είδος που εμφάνισε ανθελμινθική δράση έναντι του H. contortus, αλλά όχι έναντι του Tr. colubriformis, ήταν αυτό του υπέργειου τμήματος του είδους Alchemilla bulgarica. Στα εκχυλίσματα όλων των υπό μελέτη φυτών έγινε χημική ανάλυση με έμφαση τον προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων (μέτρηση των ολικών πολυφαινολών (TPC), των ολικών φλαβονοειδών (TFC) και των επιμέρους πολυφαινολών), όπου και περιεγράφηκε το προφίλ των δευτερογενών αυτών μεταβολιτών. Επειδή αρκετά από τα υπό δοκιμή φυτά παρουσίασαν ανθελμινθική δράση, ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η στερεοχημική ανάλυση των δευτερογενών μεταβολιτών, σχετικά με το είδος και τη στερεοδομή τους και η συσχέτισή τους με τη δράση ενάντια στα παράσιτα. Για την περαιτέρω αξιολόγηση της ανθελμινθικής δράσης των βιοενεργών φυτών σε συνθήκες εκτροφής, διενεργήθηκαν πειραματισμοί σε in vivo συνθήκες. Για το σκοπό, αυτό επιλέχθηκαν 2 φυτά, οι καρποί της χαρουπιάς (Ceratonia siliqua) και η ονοβρυχίδα (Onobrychis viciifolia). Σχεδιάστηκαν και πραγματοποιήθηκαν 3 in vivo πειραματισμοί, όπου τα παραπάνω φυτά ενσωματώθηκαν στα σιτηρέσια αρνιών 6 μηνών, πειραματικά μολυσμένων με τα νηματώδη H. contortus και Tr. colubriformis. Στόχος των πειραματισμών αυτών ήταν να διερευνηθεί το αν και κατά πόσο η συμμετοχή των φυτικών αυτών ειδών στα σιτηρέσια των προβάτων, μπορεί να αντιμετωπίσει τις μολύνσεις από γαστρεντερικά νηματώδη και να επιλεγεί ο πιο αποτελεσματικότερος τρόπος χορήγησης τους π.χ. μεμονωμένα ή σε συνδυασμό και σε επιθυμητή συγκέντρωση. Συγκεκριμένα, στο Πείραμα 1 διερευνήθηκε η ανθελμινθική δράση των καρπών της χαρουπιάς σε διάφορες συγκεντρώσεις, έτσι ώστε να επιλεγεί η πιο αποτελεσματική. Στον πειραματισμό αυτό συμμετείχαν 35 ζώα (5 ομάδες των 7), στα οποία χορηγήθηκε σιτηρέσιο με προσθήκη χαρουπάλευρου (CaBP) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0%, 3%, 6% και 12% g CaBP/100g συνολικού σιτηρεσίου). Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση στις μέσες τιμές FEC (αυγά / g κοπράνων) και των AWC (ενήλικα παράσιτα), μόνο για τα ζώα της ομάδας όπου χορηγήθηκε η μεγαλύτερη συγκέντρωση CaBP, που όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Όμως ήταν θετικό, που βρέθηκε αρνητική συσχέτιση της μείωσης του ποσοστού ωοτοκίας των θηλυκών παρασίτων, σε σχέση με τη συγκέντρωση CaBP στο σιτηρέσιο, υποδηλώνοντας δοσοεξαρτώμενη δράση. Δεδομένου ότι τα παράσιτα του είδους H. contortus σημειώνουν ιδιαίτερα υψηλή ημερήσια παραγωγή αυγών σε σύγκριση με του Tr. colubriformis, η μείωση των FEC οφείλεται κυρίως στην επίδραση του χαρουπιού στα παράσιτα του είδους H. contortus. Στη συνέχεια με στόχο να διερευνηθεί το αν η ανθελμινθική δράση του χαρουπιού (όπως αποδείχτηκε στο Πείραμα 1), οφείλεται στις περιεχόμενες ταννίνες του, σχεδιάστηκε το Πείραμα 2. Στην περίπτωση αυτή, τα ζώα διατρέφονταν με σιτηρέσιο πλούσιο ή μη σε χαρουπάλευρο και η δράση των ταννινών αξιολογήθηκε μετά από την προσθήκη ενός αναστολέα της δράσης των ταννινών και συγκεκριμένα της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Συγκεκριμένα, στον πειραματισμό συμμετείχαν 24 αρνιά χωρισμένα σε 4 ομάδες, σε δύο από τις οποίες χορηγήθηκε CaBP ως συμπλήρωμα στην μέγιστη συγκέντρωση 12% του συνολικού σιτηρεσίου με PEG (CaBP και CaBP+PEG), ενώ στις υπόλοιπες 2 χορηγήθηκε τυπική διατροφή φτωχή σε ταννίνες επίσης με, ή χωρίς την προσθήκη PEG (Control/C και C+PEG). Τα αποτελέσματα, επιβεβαίωσαν τη δράση του χαρουπιού στα FEC, τα οποία εμφάνισαν μειώσεις 20% έως 45%, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Οι εν λόγω μειώσεις παρατηρήθηκαν στο είδος H. contortus (μείωση αριθμού παραγωγής αυγών για ένα πολύ παραγωγικό είδος), αλλά όχι στο Tr. colubriformis. Η ανθελμινθική δράση του CaBP αποδόθηκε στις CT, καθότι η επίδραση του χαρουπιού στα FEC και τα ενήλικα H. contortus αναστέλλονταν στις ομάδες ελέγχου (C, C+PEG, CaBP+PEG). Καμία επίδραση του CaBP δεν υπήρξε στην ωοτοκία των θηλυκών παρασίτων. Τέλος, στο Πείραμα 3, εξετάστηκαν οι υποθέσεις εάν α) οι CT του CaBP παρουσιάζουν ισχυρότερη ανθελμινθική δράση από αυτές της ονοβρυχίδας (O. viciifolia) και β) είναι πιθανή η συνεργιστική δράση μεταξύ των παραπάνω φυτικών ειδών. Συγκεκριμένα, στον πειραματισμό συμμετείχαν 24 αρνιά χωρισμένα σε 4 ομάδες, στις οποίες χορηγήθηκε α) χαρουπάλευρο (CaBP), β) pellets ονοβρυχίδας (S) γ) συνδυασμός χαρουπάλευρου και pellets ονοβρυχίδας (CaBP+S) και δ) διατροφή με βάση τη μηδική / μάρτυρας (C). Το χαρουπάλευρο χορηγήθηκε ως συμπλήρωμα, σε ποσοστό 12% του συνολικού σιτηρεσίου, ενώ η ονοβρυχίδα ως pellet, που αντιπροσώπευε το 35% του συνολικού σιτηρεσίου. Τα αποτελέσματα του εν λόγω πειραματισμού, έδειξαν ότι υπήρχε τάση μείωσης των FEC στις ομάδες S και CaBP+S, σε σύγκριση με τις ομάδες C και CaBP, ενώ ο αριθμός των ενηλίκων παρασίτων (AWC) του H. contortus εμφανίστηκε μειωμένος στις ομάδες CaBP, S, και CaBP+S, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με αντίστοιχα ποσοστά μείωσης 35,5%, 62,1% και 53,5%, χωρίς όμως οι διαφορές να είναι στατιστικά σημαντικές. Η ωοτοκία και των δύο ειδών παρασίτων, στις ομάδες CaBP, S και CaBP+S εμφανίστηκε σημαντικά μειωμένη σε σχέση με αυτή των μαρτύρων, γεγονός που εξηγεί ως ένα σημείο και τη μείωση των FEC που παρατηρήθηκε, δεδομένου ότι οι πληθυσμοί των ενήλικων παρασίτων δεν επηρεάστηκαν σε μεγάλο βαθμό. Αν και τα αποτελέσματα του πειραματισμού επιβεβαίωσαν την υπόθεση ότι οι ταννίνες του χαρουπιού παρουσιάζουν ανθελμινθική δράση, δεν υπάρχουν σαφείς ενδείξεις συνεργιστικής επίδρασης με την ονοβρυχίδα. Τέλος, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση και η σύσταση των ταννινών, του χαρουπιού και της ονοβρυχίδας, με δυο διαφορετικούς τρόπους ανάλυσης α) με τη χρήση acetone-butanol-HCl assay και β) πραγματοποιώντας θειολυτική αποικοδόμηση (thiolytic degradation with benzylmercaptan). Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι οι CT του χαρουπιού που έχουν υψηλό λόγο προδελφινιδίνες / προκυανιδίνες (96,7% προδελφινιδίνες / 3,3% προκυανιδίνες), και ταυτόχρονα υψηλό βαθμό εστεροποίησης με γαλλικό οξύ (π.χ. 41,1% των υπομονάδων της φλαβαν-3όλης είναι εστεροποιημένες), δεν παρουσίασαν ισχυρότερη ανθελμινθική δράση από την ονοβρυχίδα, της οποίας οι συμπυκνωμένες ταννίνες έχουν λιγότερες προδελφινιδίνες (74,8%), που μάλιστα δεν είναι και εστεροποιημένες. Σε όλη τη διάρκεια και των 3 πειραματισμών πραγματοποιούνταν ανά τακτά διαστήματα παθοφυσιολογικές εξετάσεις (μετρήσεις αιματοκρίτη και σωματικού βάρους), τα αποτελέσματα των οποίων δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες πειραματισμού. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή επιβεβαιώνεται ότι διάφορα φυτικά είδη παρουσιάζουν ανθελμινθική δράση και μάλιστα φαίνεται ότι οι συμπυκνωμένες ταννίνες ευθύνονται σε μεγάλο βαθμό για αυτήν την δράση, έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών των μικρών μηρυκαστικών. Σε διερεύνηση που έγινε σε φυτικά είδη που απαντώνται συχνά στη Μεσόγειο, φάνηκε ότι υπάρχουν αρκετά φυτά που παρουσιάζουν τέτοιες ιδιότητες και χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Οι μελέτες χορήγησης καρπών χαρουπιάς και ονοβρυχίδας σε αρνιά έδειξαν ότι υπάρχει δυνατότητα μείωσης του αριθμού των αυγών των παρασίτων που εκκρίνονται με τα κόπρανα και κατά συνέπεια μείωση της έντασης της μόλυνσης των λιβαδιών. Σε ότι αφορά τον μηχανισμό δράσης των ταννινών ενάντια στα γαστρεντερικά νηματώδη, η φύση αλλά και η στερεοδομή των ταννινών πιθανά να συσχετίζονται με την ανθελμινθική δράση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής θα ήταν επιθυμητό να επιβεβαιωθούν και σε πειραματισμούς σε συνθήκες εκτροφής και σε ζώα φυσικώς μολυσμένα από γαστρεντερικά νηματώδη.