Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων των μικρών Rho GTPασών RhoA και RhoB σε βλαστικά κύτταρα
Authors: Νομικού Ειρήνη 
Published: September 2021

Σκοπός της διατριβής ήταν να μελετηθούν οι μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης των μικρών Rho GTPασών RhoA και RhoB καθώς και ο πιθανός ρόλος του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στα βλαστικά κύτταρα. Οι μικρές Rho GTPάσες εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες σε διάφορους κυτταρικούς τύπους μεταξύ των οποίων και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Η διαταραχή στη ρύθμισή τους μπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες όπως ο καρκίνος. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε μία λειτουργική ανάλυση των υποκινητών των γονιδίων RhoA και RhoB προκειμένου να εντοπιστούν ρυθμιστικά στοιχεία που είναι σημαντικά για την μεταγραφική τους ρύθμιση σε φυσιολογικά (CGR8) και καρκινικά (P-19) βλαστικά κύτταρα. Αρχικά παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης της RhoΑ είναι σημαντικά υψηλότερα από αυτά της RhoB και στις δύο εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές όπως επίσης και σε διάφορες καρκινικές σειρές. Η διαφορά αυτή οφείλεται, έστω εν μέρει, στη διαφορά που υπάρχει στις ενεργότητες των αντίστοιχων υποκινητών. Λειτουργική ανάλυση των υποκινητών έδειξε ότι οι εγγύς περιοχές και των δύο περιέχουν ρυθμιστικά στοιχεία που είναι σημαντικά για την ενεργότητα τους. Συγκεκριμένα, και οι δύο υποκινητές περιέχουν CCAAT boxes, η μετάλλαξη των οποίων μείωσε σημαντικά την ενεργότητα τους υποδεικνύοντας μία κοινή ρύθμιση των δύο γονιδίων από παράγοντες που προσδένονται στο CCAAT box. Τέλος, βρέθηκε ότι και τα δύο γονίδια υπόκεινται σε μεταγραφική αυτορρύθμιση στα βλαστικά κύτταρα και ότι αυτή η αυτορρύθμιση απαιτεί την ενεργότητα GTPάσης των Rho πρωτεϊνών στην περίπτωση της RhoB. Ο TGFβ αποτελεί μέλος της οικογένειας των μετασχηματιστικών αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκουν οι Ινχιμπίνες, η Ακτιβίνη, η ΑΜΗ, οι ΒΜΡs , οι GDFs και ο παράγοντας Nodal. Γενικά, οι TGFs δρουν ως μορφογόνοι παράγοντες κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης παρέχοντας πληροφορίες για τον καθορισμό των αξόνων και τη διαφοροποίηση των κυττάρων προς εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Αρχικά μελετήθηκε η πιθανότητα ενεργοποίησης του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ στα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και παρατηρήθηκε ότι αυτή δεν ήταν δυνατή υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, δηλαδή παρουσία του παράγοντα LIF ο οποίος διατηρεί τα κύτταρα πολυδύναμα. Συγχρόνως, υπό αυτές τις συνθήκες δεν ήταν δυνατή η διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων από τον TGFβ. Αντίθετα, η ελάττωση του παράγοντα LIF επέτρεψε την ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ υποδηλώνοντας ότι το μονοπάτι του παράγοντα LIF ανταγωνίζεται αυτό του TGFβ. Ακόμα, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του TGFβ στη διαδικασία της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων επιχειρήθηκε η καταστολή του, σε συνδυασμό με την πλήρη απουσία του LIF. Οι παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η καταστολή του TGFβ επέτρεψε τη διατήρηση της πολυδύναμης κατάστασης των βλαστικών κυττάρων παρά την απουσία του LIF έναντι των καλλιεργειών ελέγχου που παρουσίασαν μεσοδερμική διαφοροποίηση. Ωστόσο, υπό αυτές τις συνθήκες δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στην έκφραση των γονιδίων της RhoA και της RhoB. Συμπερασματικά, παρά τις διαφορές στην έκφραση των γονιδίων της RhoA και της RhoB στα βλαστικά κύτταρα διαπιστώθηκε ότι οι υποκινητές τους ρυθμίζονται από κοινούς μηχανισμούς. Παρόλα αυτά, κάποιες πτυχές της ρύθμισης τους, όπως η αυτορρύθμιση, διαφέρουν ανάμεσα στα φυσιολογικά και τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Είναι σημαντικό, επίσης, ότι η ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ είναι δυνατή μόνο σε συνθήκες που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση. Ωστόσο, ενώ η καταστολή του TGFβ επέτρεψε τη διατήρηση της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων, δεν είχε καμία επίδραση στη ρύθμιση των Rho γονιδίων. Η κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση των Rho GTPασών στα βλαστικά κύτταρα είναι απαραίτητη προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των πρωτεϊνών αυτών στις λειτουργίες των βλαστικών αλλά και των καρκινικών κυττάρων με τα οποία μοιράζονται πολλές ομοιότητες.