Ανοσοϊστοχημική μελέτη του σηματοδοτικού συστήματος Notch ( Notch signaling) σε περιακρορριζικές κύστεις
Authors: Μέλιου Ελένη 
Published: January 2014

Σκοπός Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της συμμετοχής του σηματοδοτικού συστήματος Notch στους μηχανισμούς ανάπτυξης των περιακρορριζικών κύστεων, μέσω της ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης του συνδέσμου Delta 1, των υποδοχέων Notch 1 και Notch 2 και των μεταγραφικών παραγόντων HES 1 και HES 5 του καταρράχτη του σηματοδοτικού συστήματος Notch στο επιθήλιο των περιακρορριζικών κύστεων. Μεθοδολογία Ανοσοϊστοχημεία Αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσαν περιακρορριζικές κύστεις, οι οποίες αφαιρέθηκαν χειρουργικά, κατά την χρονική περίοδο 1990-1995, μετά από ακρορριζεκτομή δοντιών με αποτυχημένη ενδοδοντική θεραπεία. Τα ιστοτεμάχια της μελέτης είχαν εξετασθεί ιστοπαθολογικά στο Εργαστήριο της Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών. Από το σύνολο των 4121 ιστοτεμαχίων, επιλέχθηκαν 55 παρασκευάσματα που αντιστοιχούσαν σε 55 ασθενείς. Τα ιστοτεμάχια που επιλέχθηκαν εμφάνιζαν αντιπροσωπευτική ιστολογική εικόνα περιακρορριζικής κύστης, σύμφωνα με τα καθιερωμένα ιστολογικά κριτήρια (παθολογική κοιλότητα που επενδύεται από επιθήλιο) και με ελάχιστη έως ήπια φλεγμονώδη διήθηση (μικρός αριθμός φλεγμονωδών κυττάρων ανά οπτικό πεδίο). Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τομές καρκίνου του μαστού και καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου, στους οποίους έχει βρεθεί ερευνητικά ότι εκφράζουν τον υποδοχέα Notch. Ως αρνητικός μάρτυρας και για τα πέντε αντισώματα χρησιμοποιήθηκε υποκατάστατο του αρχικού κάθε φορά αντισώματος με ανοσοορό του ίδιου είδους ζώου. Επιλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: Υποδοχέας Notch 1: rat anti-human Notch 1 monoclonal antibody, catalog No: bTAN 20, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA. Υποδοχέας Notch 2: Rat Anti-Human Notch 2 Monoclonal antibody, catalog No: c651.6dbhn, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA. Σύνδεσμος Delta 1: rabbit anti-Mouse DELTA-1 antibody, catalog No: 600-401-858, Rockland Immunochemicals, USA. Μεταγραφικός παράγοντας HES 1: anti-rat HES 1 monoclononal antibody, catalog No: D134-3, MBL, Int. Inc., Woburn, MA, USA. Μεταγραφικός παράγοντας HES 5: rabbit anti-HES 5 polyclononal antibody, catalog no: AB/HLH54, CeMines, Inc., Biosystems Division, Golden Colorado, USA. Στη συνέχεια ακολούθησε η ανοσοϊστοχημική χρώση των τομών παραφίνης. Μετά από παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο καταγράφηκε η συγκεκριμένη θέση εντόπισης των αντισωμάτων στις ιστολογικές τομές. Στη συνέχεια η κάθε ιστολογική τομή φωτογραφήθηκε και αρχειοθετήθηκε σε ηλεκτρονική μορφή. Η ένταση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης (staining intensity) κάθε οπτικού πεδίου υπολογίσθηκε με την εφαρμογή Ημιαυτόματου Συστήματος Ανάλυσης Εικόνας (Semi automated Ιmage Analysis System) - (Hardware: Mobile Intel Pentium Dual core/ Digital Still Camera SONY CyberShot DSC-P73 (1024X768), Μικροσκόπιο Olympus CX-31. Software (Λογισμικό): Windows XP/Image Pro Plus version 5.1-Media Cybernetics 2000). Το εύρος της έντασης στο συγκεκριμένο σύστημα αντιστοιχεί σε επίπεδα συνεχών τιμών από 0 (απόλυτο μαύρο) έως 255 (απόλυτο λευκό) (μειούμενες τιμές = βαθυχρωματικότητα). Τα περιστατικά κατηγοριοποιήθηκαν ως εξής: ασθενής ένταση χρώσης: τιμές χρώσης ? 151, μέτρια ένταση χρώσης: τιμές χρώσης 121-150, ισχυρή ένταση χρώσης: τιμές χρώσης ?120. ..............................................