Μελέτη της τοξικής, κυτταροτοξικής και γενοτοξικής δράσης νεοσυντιθέμενων ενώσεων και νανοϋλικών σε in vitro συνθήκες
Authors: Ευθυμίου Ιωάννα 
Published: November 2021

Η συνεχώς αυξανόμενη παραγωγή προϊόντων της Nανοτεχνολογίας εγείρει στις μέρες μας σημαντικά ερωτήματα σχετικά με τον περιβαλλοντικό αντίκτυπό τους. Συγκεκριμένα, νανοσωματίδια (Nanoparticles, NPs) όπως το οξείδιο του ψευδαργύρου (ZnO) και αργύρου (Ag), παρουσιάζουν ευρεία εξάπλωση και εφαρμογή, γεγονός που αυξάνει τις πιθανότητες να βρεθούν βιοδιαθέσιμα στο περιβάλλον. Παρόλο που υπάρχει εκτεταμένη βιβλιογραφία αναφορικά με τα προαναφερθέντα NPs, συνήθως κάθε μελέτη εστιάζει σε συγκεκριμένο παράγοντα κάθε φορά όπως για παράδειγμα στη σύνθεση των NPs, τα βελτιωμένα χαρακτηριστικά τους, τις πιθανές εφαρμογές τους ή τις τοξικές τους επιδράσεις σε συγκεκριμένο οργανισμό ή κυτταρική σειρά. Αν και κάθε έρευνα ενισχύει το μέχρι τώρα γνωσιακό υπόβαθρο και συμπληρώνει κενά αναφορικά με τη Νανοτεχνολογία, με την παρούσα μελέτη έγινε η προσπάθεια πραγματοποίησης μιας ολοκληρωμένης εργασίας. Συγκεκριμένα, το ερευνητικό πλάνο περιλαμβάνει (α) τη σύνθεση των ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs, (β) το χαρακτηρισμό τους (μεμονωμένα και σε διασπορά μέσα σε υδατικά διαλύματα), (γ) την αξιολόγηση των πιθανών τοξικών, κυτταροτοξικών και γενοτοξικών τους επιδράσεων σε διαφορετικά βιολογικά συστήματα (ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, βακτήρια και αιμοκύτταρα δίθυρου μαλακίου) σε in vitro συνθήκες, (δ) τη μελέτη της αλληλεπίδρασης των εξεταζόμενων NPs παρουσία χουμικών οξέων (Humic Acids, HAs), προσομοιάζοντας έτσι τις πραγματικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Αναλυτικότερα, τα NPs (ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs) παρασκευάστηκαν με την καινοτόμο τεχνική πυρόλυσης ψεκασμού φλόγας (Flame Spray Pyrolysis, FSP) που χρησιμοποιείται για τη σύνθεση μεμονωμένων και σύνθετων NPs με υψηλή καθαρότητα και βελτιωμένα μορφολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά. Ακολούθησε χαρακτηρισμός των NPs με περίθλαση ακτίνων Χ (powder X ray Diffraction, pXRD), με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) και με δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS). Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η ενδεχόμενη γενοτοξική και κυτταροτοξική δράση των NPs παρουσία και απουσία δύο χαρακτηρισμένων HAs (Humic acid-like-polycondensate, HALP; Leonardite Humic Acid, LHA) σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα με την εφαρμογή της τεχνικής των μικροπυρήνων με χρήση της κυτταροχαλασίνης-Β (Cytokinesis Block Micronucleus assay, CBMN assay). Η έκπλυση ιόντων Zn2+ προσδιορίστηκε στα ιζήματα των λεμφοκυττάρων που προέκυψαν από την τεχνική CBMN, μέσω της ανοδικής αναδιαλυτικής βολταμμετρίας (Anodic Stripping Voltammetry, ASV). Έπειτα, οι τοξικές επιδράσεις των NPs παρουσία και απουσία των δύο HAs μελετήθηκαν στο βακτήριο Vibrio fischeri με τη χρήση του συστήματος Microtox. Τέλος, εξετάστηκαν οι κυτταροτοξικές και οξειδωτικές επιδράσεις των NPs σε αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis, μέσω προσδιορισμού (α) της λυσοσωμικής αποσταθεροποίησης (Τεχνική ουδέτερου ερυθρού/Neutral Red Retention Time), (β) της παραγωγής σουπεροξειδικών ανιόντων, (γ) της παραγωγής οξειδίων του αζώτου (υπό μορφή νιτρωδών) και (δ) των επιπέδων λιπιδικής υπεροξείδωσης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, στην περίπτωση της τεχνικής CBMN, δεν υπήρξε εκδήλωση γενοτοξικών φαινομένων σε καμία περίπτωση, για κανένα από τα υπό μελέτη NPs τόσο παρουσία όσο και απουσία των δύο HAs. Από την άλλη πλευρά, όλα τα NPs εκδήλωσαν κυτταροτοξική δράση. Ωστόσο, αν και τα Ag και ZnO-Ag NPs οδήγησαν σε επαγωγή κυτταροτοξικότητας παρουσία και απουσία των δύο HAs, τα μίγματα των ZnO NPs με τα δύο HAs ελάττωσαν την κυτταροτοξικότητα που προκλήθηκε από τα μεμονωμένα ZnO NPs. Αναφορικά με τα ποσοστά έκπλυσης ιόντων Zn2+, παρατηρήθηκε ότι οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις των μιγμάτων (ZnO, ZnO-Ag)NPs-HAs διατήρησαν ένα μικρό ποσοστό ιόντων, ενώ στις υπόλοιπες περιπτώσεις το ποσοστό ήταν αμελητέο. Στην περίπτωση προσδιορισμού της τοξικότητας των NPs έναντι του βακτηρίου Vibrio fischeri, διαπιστώθηκε ενισχυμένη τοξικότητα των ZnO και ZnO-Ag NPs ενώ τα Ag NPs εμφάνισαν τη μικρότερη τοξική δράση. Ο συνδυασμός με τα δύο HAs δεν οδήγησε σε κάποια σημαντική αλλαγή της τοξικότητας σε σύγκριση με τα μεμονωμένα NPs, στην περίπτωση των ZnO και ZnO-Ag NPs. Αντιθέτως, τα μίγματα Ag NPs-HAs ελάττωσαν την τοξικότητα που προκλήθηκε από τα μεμονωμένα Ag NPs. Όσον αφορά τις επιδράσεις των NPs στα αιμοκύτταρα των μυδιών, διαπιστώθηκε ότι κάθε NP διέθετε διαφορετικό μηχανισμό εκδήλωσης τοξικότητας. Συγκεκριμένα, τα ZnO NPs - μέσω του επιφανειακού τους φορτίου και της σωματιδιακής συσσωμάτωσης - ενδέχεται να εισέλθουν στα κύτταρα πριν την εκδήλωση κυτταρικής θνησιμότητας, ενώ η απελευθέρωση των ιόντων Zn2+ μπορούσε να οδηγήσει στην παραγωγή ριζών μέσω διέγερσης της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης. Αντιθέτως, η παρατηρούμενη κυτταρική και οξειδωτική καταπόνηση που προκλήθηκε από τα Ag NPs, πιθανότατα λόγω της απελευθέρωσης ιόντων Ag+, δε φάνηκε να σχετίζεται με την αναπνευστική έκρηξη. Ομοίως, οι κυτταρικές και οξειδωτικές βλάβες που προκλήθηκαν από τα ZnO-Ag NPs, υπέδειξαν την παρουσία ανταγωνιστικής/συνεργιστικής δράσης μεταξύ των μεταλλικών ιόντων (Zn2+, Ag+) που ανάλογα με τις εκάστοτε συνθήκες μπορούν να ρυθμίσουν τη συμπεριφορά και τις βιολογικές επιδράσεις του σύνθετου NP. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν τη δυνατότητα των νεοσυντιθέμενων ZnO, Ag και ZnO-Ag NPs να προκαλούν τοξικές, κυτταροτοξικές και οξειδωτικές επιδράσεις. Παρόλα αυτά, διαπιστώθηκε ότι οι επιδράσεις των NPs ποικίλουν τόσο μεταξύ των ίδιων των NPs, όσο και μεταξύ των τεχνικών και των οργανισμών μοντέλων και/ή κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Κατά συνέπεια, είναι εμφανές ότι είναι αναγκαίο να αξιολογείται το τοξικολογικό προφίλ των NPs με τη χρήση ενός εύρους τεχνικών, βιοδεικτών και περιβαλλοντικών σεναρίων, καθώς και να γίνεται παράλληλα ένας ολοκληρωμένος και αξιόπιστος χαρακτηρισμός αυτών σε κάθε περίπτωση.