Development of a zinc-based fixative for DNA, RNA and protein molecular studies
Authors: Λυκίδης Δημήτριος 
Published: August 2023

Η μονιμοποίηση είναι μια πολύπλοκη βιοχημική διαδικασία με την οποία τμήματα ιστού και κυττάρων σταθεροποιούνται στο χώρο, συντηρώντας τη μορφολογία, τα νουκλεϊνικά οξέα, τις πρωτεΐνες και άλλα συστατικά κυττάρων. Υπάρχει ένα ευρύ φάσμα μονιμοποιητικών, ανάλογα με την βιοχημική τους λειτουργία, αλλά κανένα από αυτά δεν είναι “ιδανικό”, δηλαδή ικανό να προσφέρει διατήρηση της μορφολογίας των ιστών η των κυττάρων, της ακεραιότητας του DNA, του RNA καθώς και των πρωτεϊνών των ιστών η των κυττάρων. Αυτή η διατριβή στόχευσε να αναπτύξει ένα αξιόπιστο, οικονομικώς αποδοτικό και μη τοξικό μονιμοποιητικό για να ικανοποιήσει τις ανάγκες της σύγχρονης μοριακής παθοβιολογικής έρευνας, ιδιαίτερα για την ακεραιότητα του DNA και RNA. Τα αποτελέσματα 35 διαφορετικών μονιμοποιητικών στη ποιότητα των ιστών από 5 διαφορετικά όργανα ποντικιών C57Bl6 ερευνήθηκαν. Τα αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση των τεχνικών ανοσοϊστοχημείας, αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), RT-PCR, RNA Agilent Bioanalyser και Real-time PCR έδειξαν ότι ένα νέο μονιμοποιητικό με βάση τον ψευδάργυρο (Z7) που περιέχει τριφθοροοξικό ψευδάργυρο, χλωριούχο ψευδάργυρο και οξικό άλας ασβεστίου ήταν σημαντικά καλύτερο από το τυποποιημένο βασισμένο στον ψευδάργυρο μονιμοποιητικό (Z2) και την neutral buffered formalin (NBF) για το DNA, το RNA και την πρωτεϊνική διατήρηση. Ακολουθίες DNA μήκους μέχρι 2.4 Kb και RNA μήκους 361 bp ενισχύθηκαν επιτυχώς από Z7 μονιμοποιημένους ιστούς, σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με τις τεχνικές PCR, RT-PCR και Real-time PCR. Η ανάλυση ολικής πρωτεΐνης από δείγματα ιστών επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τη 2D-PAGE ηλεκτροφόρηση. Επιπλέον, τα νουκλεϊνικά οξέα και οι πρωτεΐνες διατηρήθηκαν εξίσου καλά σε Ζ7 μονιμοποιημένους ιστούς ακόμη και μετά την πάροδο χρονικής περιόδου 18 μηνών. “Φρέσκα- παγωμένα” δείγματα περιλήφθηκαν επίσης σε αυτό το πειραματικό πρότυπο ως μάρτυρες (controls) για την ακεραιότητα DNA, RNA και πρωτεϊνών. Η χρησιμοποίηση της τεχνικής Affymetrix exon microarrays έδειξε ότι τα Ζ7 μονιμοποιημένα δείγματα από ιστούς ποντικιών, δεν είχαν καμία στατιστική σημαντική διαφορά σε όλο το γονιδίωμα όσων αφορά την έκφραση των γονιδίων όσο και το εναλλακτικό μάτισμα των εξωνίων έναντι των “φρέσκων-παγωμένων” δειγμάτων. Συνεπώς, το Ζ7 μονιμοποιητικό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτες χρησιμοποιώντας ανθρώπινους ιστούς φυσιολογικούς και καρκινικούς. Μελέτες φασματομετρίας μάζας (ΜALDI-TOF MS/MS), όπου χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια και μελετήθηκε η αλληλεπίδραση τους με το άλας τριφθοροoξικού ψευδαργύρου έδειξαν ότι ο ψευδάργυρος δεσμεύεται τουλάχιστον από ένα αμινοξύ, και συγκεκριμένα μια κυστεΐνη ή μια ιστιδίνη, με πιθανή επίσης την ύπαρξη ενός συμπλόκου κυστεΐνης-ψευδαραργύρου-ιστιδίνης. Περαιτέρω ερευνητική εργασία απαιτείται για να διευκρινιστεί ο ακριβής χημικός μηχανισμός της μονιμοποίησης με ψευδάργυρο. Τελικά, αυτό το νέο, μη τοξικό και οικονομικό μονιμοποιητικό ιστών και κυττάρων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε τακτική βάση τόσο σε ερευνητικά όσο και σε διαγνωστικά εργαστήρια και επιπλέον να επιτρέψει γενομικές και πρωτεομικές μελέτες.