Genotypic, physiological and technological attributes of lactic acid bacteria and yeasts isolated from spontaneously fermented greek wheat sourdoughs
Authors: Συρόκου Μαρία 
Published: October 2022

Στόχος της παρούσας διπλωματικής μελέτης ήταν να διερευνηθεί η σύσταση του μικρο-οικοσυστήματος 13 προζυμιών σίτου αυθόρμητης ζύμωσης, τα οποία έχουν συλλεχθεί από περιοχές της Ελλάδας, που δεν έχουν μελετηθεί έως τώρα. Για το λόγο αυτόν, επιλέχθηκαν τόσο κλασικές μέθοδοι όσο και ανεξάρτητες της καλλιέργειας προσεγγίσεις. Στη συνέχεια, διεξήχθη περαιτέρω διερεύνηση των μεταβολικών δράσεων των απομονωθέντων μικροοργανισμών, που σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων, με στόχο την πιθανή εφαρμογή τους ως εναρκτήριες ή συμπληρωματικές καλλιέργειες σε ζυμώσεις τροφίμων. Στην πρώτη μελέτη, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση της μικροβιακής οικολογίας των 13 ελληνικών προζυμιών σίτου, συνδυάζοντας κλασικές τεχνικές καθώς και προσεγγίσεις που δεν στηρίζονται στην καλλιέργεια. Όσον αφορά στην κλασική μέθοδο, εφαρμόστηκε η συμβατική καλλιέργεια σε τρυβλία, ομαδοποίηση με πολυμορφισμούς τυχαίως πολλαπλασιασμένου DNA που βασίζεται σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR-RAPD), ταυτοποίηση μέσω εξειδικευμένης PCR για το είδος Lactiplantibacillus plantarum, καθώς και αλληλούχιση του 16S και 26S rRNA γονιδίου για οξυγαλακτικά βακτήρια και ζύμες, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, η μη κλασική προσέγγιση περιλάμβανε ανάλυση με ηλεκτροφόρηση βαθμιδωτής αποδιάταξης βασισμένη σε PCR (PCR-DGGE), με άμεση εκχύλιση τόσο του DNA όσο και του RNA των δειγμάτων προζυμιού. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι ο πληθυσμός των οξυγαλακτικών βακτηρίων κυμάνθηκε μεταξύ 6.28-9.20 log CFU/ g, με τους Lp. plantarum και Levilactobacillus brevis να επικρατούν ή να συνεπικρατούν στην πλειονότητα των περιπτώσεων. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν και τα είδη Companilactobacillus paralimentarius, Fructilactobacillus sanfranciscensis, Latilactobacillus sakei, Lt. curvatus, Lv. zymae, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum και Leu. mesenteroides. Στην περίπτωση των ζυμών, ο πληθυσμός τους κυμάνθηκε μεταξύ 4.60-6.32 log CFU/ g και αποτελούνταν κυρίως από Saccharomyces cerevisiae, ενώ καταγράφθηκε και η παρουσία των Pichia membranifaciens, Pi. fermentans, Wickerhamomyces anomalus και Kazachstania humilis. Παρά το γεγονός ότι η PCR-DGGE ανάλυση με βάση το DNA ή το RNA απέδωσε παρόμοια μικροβιακά προφίλ, η συνολική PCR-DGGE ανάλυση επαλήθευσε μόνο εν μέρει τη σύσταση του μικρο-οικοσυστήματος του προζυμιού, όπως αποτυπώθηκε με την κλασική μέθοδο.Σε επόμενη μελέτη, τα οξυγαλακτικά βακτήρια και οι ζύμες που απομονώθηκαν από ελληνικά προζύμια, αξιολογήθηκαν ως προς μία σειρά ιδιοτήτων, οι οποίες σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων. Οι υπό μελέτη ιδιότητες περιλάμβαναν την πρωτεόλυση, λιπόλυση, αμυλόλυση, παρουσία αποκαρβοξυλάσης αμινοξέων, δραστηριότητα φυτάσης, αντιμικροβιακή ικανότητα και παραγωγή EPS τόσο από οξυγαλακτικά όσο και από ζύμες. Τα στελέχη εμφάνισαν πρωτεολυτικές, λιπολυτικές και αντιμικροβιακές δράσεις, οι οποίες αρχικά εξετάστηκαν με τη μέθοδο διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (WDA). Επτά οξυγαλακτικά βακτήρια και 8 ζύμες ήταν ικανά να υδρολύσουν τη γλουτένη, ενώ 11 οξυγαλακτικά βακτήρια χαρακτηρίστηκαν από παρουσία λιπολυτικής δράσης. Στην πρώτη περίπτωση, εφαρμόστηκε περαιτέρω ανάλυση με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με δωδέκυλο-θειικό νάτριο (SDS-PAGE) των κλασμάτων της γλουτένης, η οποία έδειξε μερική και εξαρτώμενη από το στέλεχος υδρόλυση της γλουτένης. Στην περίπτωση της λιπόλυσης, μια επακόλουθη κινητική λιπόλυσης σε διάστημα 21 ημερών αποκάλυψε αυξημένη διακύμανση της ενζυμικής δραστηριότητας, μεταξύ των υπό μελέτη στελεχών. Όσον αφορά στην αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δραστηριότητας, 13 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων και 12 στελέχη ζυμών παρουσίασαν παρεμποδιστική δράση ως προς την ανάπτυξη διαφορετικών μυκήτων, η οποία αποδόθηκε σε μη πρωτεϊνικούς μεταβολίτες. Επιπλέον, 21 στελέχη Lp. plantarum εμφάνισαν αντιβακτηριακή δράση εναντίον ενός μίγματος 5 στελεχών Listeria monocytogenes, που ανήκουν στον ορότυπο 4b, ενώ επαληθεύτηκε και η πρωτεϊνική φύση των παρεμποδιστικών ενώσεων. Μεταξύ των παραπάνω, 3 στελέχη W. anomalus (LQC 10346, 10353, 10360) και 6 στελέχη Lp. plantarum (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516, 2520), τα οποία εμφάνισαν περισσότερες από μία ιδιότητες, αξίζουν περαιτέρω έρευνας.Τα τρία στελέχη W. anomalus, συγκεκριμένα τα LQC 10346, 10353 και 10360, για τα οποία η παραγωγή αντιμυκητιακών ενώσεων μη πρωτεϊνικής φύσης καταγράφθηκε σε προηγούμενη μελέτη, υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αξιολόγηση της παρεμποδιστικής τους δράσης τόσο in vitro όσο και in situ. Για το σκοπό αυτό, τα στελέχη ζυμών αναπτύχθηκαν στους 30 oC για 24 ώρες σε δύο υποστρώματα. Το πρώτο ήταν υγρό θρεπτικό υπόστρωμα BHI προσαρμοσμένο σε 6 αρχικές τιμές pH (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0) και 6 συγκεντρώσεις NaCl (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5%), ενώ το δεύτερο ήταν ένα υγρό ζυμάρι ενισχυμένο με τις προαναφερθείσες συγκεντρώσεις NaCl. Τα αποτελέσματα της διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα έδειξαν ότι η μέγιστη ανασταλτική δράση ποσοτικοποιήθηκε σε 5120 AU/ mL, η οποία παρουσιάστηκε και από τα τρία στελέχη μετά από ανάπτυξη και στα δύο υποστρώματα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση των πτητικών ενώσεων με SPME-GC-MS, μεταξύ των οποίων ανιχνεύθηκε αιθανόλη, οξικός αιθυλεστέρας, ισοαμυλική αλκοόλη και οξικός ισοαμυλεστέρας, σε όλα τα δείγματα που αξιολογήθηκαν. Στην περίπτωση της αξιολόγησης της παρεμποδιστικής δράστης των καθαρών πτητικών ενώσεων εναντίον της ανάπτυξης του μύκητα, οι χαμηλότερες τιμές ελάχιστης παρεμποδιστικής δράσης καταγράφηκαν για τις 2,4-δι-τριτ-βουτυλ-φαινόλη και βενζαλδεΰδη (0,04 και 0,06 µL/ mL ελεύθερου χώρου, αντίστοιχα). Τέλος, οι άρτοι που παρήχθησαν είτε με μονοκαλλιέργειες στελεχών W. anomalus είτε με τη συγκαλλιέργειά τους με μαγιά αρτοποιίας απέκτησαν πρόσθετη διάρκεια ζωής, που κυμάνθηκε από 9 έως 30 ημέρες, σε σύγκριση με το μάρτυρα.Σε επόμενη μελέτη, 6 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων απομονωθέντων από προζύμια, συγκεκριμένα τα LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520, τα οποία αρχικά ταυτοποιήθηκαν ως Lp. plantarum μέσω αλληλούχισης του 16S rRNA γονιδίου, επιλέχθηκαν για περαιτέρω αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματός τους, λόγω ιδιοτήτων, που σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων. Τα ακατέργαστα τμήματα των αλληλουχιών ελέγχθηκαν ποιοτικά, στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε de novo (χωρίς τη χρήση γονιδιώματος αναφοράς) συναρμολόγησή τους σε μια συνεχόμενη γονιδιωματική αλληλουχία (contigs), στην οποία η σειρά των βάσεων είναι γνωστή με υψηλό επίπεδο εμπιστοσύνης. Τέλος, οι συναρμολογηθείσες αλληλουχίες οργανώθηκαν σε ακόμη μεγαλύτερα τμήματα (scaffolds), χρησιμοποιώντας μία γνωστή και ολοκληρωμένη αλληλουχία (completed genome) ως γονιδίωμα αναφοράς (reference-based scaffolding). Μετά την οργάνωση των αλληλουχιών, πραγματοποιήθηκε ο εντοπισμός των γονιδίων μέσα στις αλληλουχίες DNA (genome annotation). Η ταξινόμηση των προαναφερθέντων στελεχών αποκάλυψε ότι ανήκαν στο υποείδος Lp. plantarum subsp. argentoratensis. Η ποιοτική ανάλυση των συναρμολογημένων μη ολοκληρωμένων γονιδιωμάτων (draft genomes) και του εντοπισμού των γονιδίων έδειξε ότι ήταν υψηλής ποιότητας. Το συνολικό μέγεθος των γονιδιωμάτων κυμάνθηκε μεταξύ 3,13-3,49 Mb, ενώ ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και των αντίστοιχων που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυμάνθηκε μεταξύ 3091-3492 και 160-231, αντίστοιχα.Δεδομένου ότι δεν έχει υπάρξει προηγούμενη αναφορά σε βιοπληροφορική ανάλυση γονιδιώματος του στελέχους Lp. plantarum subsp. argentoratensis απομονωθέντος από προζύμι, σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η βιοπληροφορική ανάλυση και σύγκριση των γονιδιωμάτων 6 βακτηριακών στελεχών (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520), τα οποία ανήκουν στο συγκεκριμένο υποείδος. Η ανάλυση που σχετίζεται με το βιοτεχνολογικό τους δυναμικό αποκάλυψε ότι στα 6 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων καταγράφθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό των υδατανθράκων, το σύστημα μεταφοράς διαφόρων ουσιών μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, το μεταβολισμό συγκεκριμένων οργανικών οξέων, όπως για παράδειγμα τη μετατροπή του κιτρικού σε οξαλοξικό, τη βιοσύνθεση ακετοΐνης καθώς και την παραγωγή ριβοφλαβίνης και φολικού οξέος. Όσον αφορά στις γονιδιωματικές πτυχές που σχετίζονται με την ασφάλεια των τροφίμων, η βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε δεν αποκάλυψε παθογόνους παράγοντες, ωστόσο ανιχνεύθηκε η παρουσία γονιδίων με ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Επιπλέον, τα 6 στελέχη Lp. plantarum subsp. argentoratensis αξιολογήθηκαν αρνητικά ως προς τη δυνατότητα παραγωγής της πλειονότητας των βιογενών αμινών. Παρόλα αυτά, η ανίχνευση του γονιδίου cadA που κωδικοποιεί την παραγωγή καδαβερίνης, αξίζει περαιτέρω έρευνα σε φαινοτυπικό επίπεδο. Σχετικά με τη σταθερότητα των γονιδιωμάτων, σημειώθηκε η παρουσία διαφόρων κινητών/ μετακινούμενων γενετικών στοιχείων (Mobile Genetic Elements - MGEs), όπως είναι για παράδειγμα τα πλασμίδια, μικρές αλληλουχίες DNA (instertion sequences - IS) που κινούνται εντός ή μεταξύ των γονιδιωμάτων χρησιμοποιώντας τα δικά τους εξιδεικευμένα συστήματα ανασυνδυασμού (recombination systems), οι προφάγοι (γονιδίωμα βακτηριοφάγου ενσωματωμένο στο βακτηριακό γονιδίωμα) και συστημάτων CRISPRcas (αλληλουχίες DNA που παίζουν ρόλο στην άμυνα του μικροοργανισμού). Τέλος, και τα 6 βακτηριακά στελέχη αξιολογήθηκαν θετικά ως προς την παραγωγή πλανταρισινών.Σε προηγούμενες μελέτες, τα 6 στελέχη Lp. plantarum (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520) χαρακτηρίστηκαν από αντιβακτηριακή δράση, λόγω της παραγωγής μεταβολιτών πρωτεϊνικής φύσης, ενώ καταγράφηκε και η παρουσία ενός συνόλου γονιδίων στο γονιδίωμά τους που κωδικοποιούν πλανταρισίνες. Επομένως, στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση των παραμέτρων που σχετίζονται με την παρασκευή προζυμιού στην ενεργότητα των πλανταρισινών και στη μεταγραφική απόκριση των γονιδίων που τις κωδικοποιούν, στα 6 στελέχη Lp. plantarum. Οι παράμετροι που σχετίζονται με την παρασκευή προζυμιού περιλάμβαναν 3 υποστρώματα: υγρό θρεπτικό υπόστρωμα MRS, υγρό θρεπτικό υπόστρωμα MRS που περιέχει τον τύπο και την ποσότητα υδατανθράκων που απαντώνται στο αλεύρι σίτου, εκχύλισμα αλεύρου-νερού ενισχυμένο με υδατάνθρακες στην αρχική συγκέντρωση του αλεύρου˙ 3 θερμοκρασίες (20, 30, 37 oC)˙ 2 αρχικές τιμές pH (5.0, 6.0)˙ 2 συγκεντρώσεις NaCl (0.0, 1.8%)˙ 12 χρονικά σημεία (από 0 έως 33 ώρες)˙ 6 Lp. plantarum στελέχη. Τα αποτελέσματα έδειξαν διαφορετικό τρόπο δράσης των πλανταρισινών ανάλογα με το στέλεχος. Πιο αναλυτικά, τα 6 στελέχη διακρίθηκαν σε δύο ομάδες όσον αφορά στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και στην οργάνωση του pln γενετικού τόπου. Η ανάλυση διακύμανσης αποκάλυψε ότι το μέσο ανάπτυξης, η θερμοκρασία, η αρχική τιμή pH και το στέλεχος είχαν σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα των πλανταρισινών, ενώ το NaCl είχε μόνο οριακή επίδραση. Αναφορικά με τη μεταγραφική απόκριση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πλανταρισίνες, τόσο η θερμοκρασία όσο και το υπόστρωμα είχαν πιο σημαντική επίδραση στη σχετική γονιδιακή μεταγραφή, σε σύγκριση με την αντίστοιχη της αρχικής τιμής pH. Ασθενής συσχέτιση καταγράφηκε μεταξύ της φαινοτυπικής αξιολόγησης και της σχετικής γονιδιακής μεταγραφής.