Μελέτη της έκφρασης γονιδίων κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου του ποντικού
Authors: Στυλιανοπούλου Ηλέκτρα 
Published: September 2021

Τα τελευταία χρόνια καταβάλλονται μεγάλες προσπάθειες, με πληθώρα μεθοδολογικών προσεγγίσεων προκειμένου να γίνουν κατανοητοί οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί που ενέχονται στην ανάπτυξη, στη λειτουργία και στη γήρανση του νευρικού συστήματος. Πέρα από το επιστημονικό ενδιαφέρον, η αποκάλυψη των συγκεκριμένων μηχανισμών έχει τεράστια σημασία για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των ασθενειών του νευρικού συστήματος και για τον σχεδιασμό λελογισμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Σκοπός του παρόντος διδακτορικού ήταν ο χαρακτηρισμός νέων γονιδίων τα οποία εκφράζονται στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο του ποντικού καθώς και η μελέτη του προτύπου έκφρασής τους κατά την ανάπτυξη. Προκειμένου να χαρακτηρίσουμε νέα γονίδια τα οποία εκφράζονται στην ανάπτυξη του εγκεφάλου του ποντικού, ακολουθήσαμε τη στρατηγική της ανάλυσης των δεδομένων που υπάρχουν σε δύο βάσεις δεδομένων αδρής έκφρασης και συγκεκριμένα στην Genepaint και στην Allen Brain. Η πρώτη από τις δύο βιβλιοθήκες παρέχει πληροφορίες που αφορούν στο στάδιο Ε14.5 ενώ η δεύτερη δεδομένα που αφορούν εκτός από τον αναπυσσόμενο και στον εγκέφαλο του ενηλίκου ατόμου. Χρησιμοποιήσαμε αναλύσεις συσχέτισης που παρέχονται από τις βάσεις, και ακολούθως εξετάσαμε ανεξάρτητα τα παρεχόμενα αδρά πρότυπα έκφρασης 1274 γονιδίων και στη συνέχεια εστιαστήκαμε στον τελεγκέφαλο, που αποτελεί το πλέον περίπλοκο τμήμα του νευρικού συστήματος και το λιγότερο μελετημένο. Καταλήξαμε να ταυτοποιήσουμε 4 νέα γονίδια, τα ncapg , Elfn1, Elfn2 και HSPC280.Το γονίδιο ncapg κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη του συμπλέγματος της κοντενσίνης Ι. Οι κοντεσίνες είναι δύο μεγάλα πρωτεϊνικά ετεροπενταμερή σύμπλοκα (κοντενσίνη Ι και ΙΙ) τα οποία θεωρείται ότι έχουν κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας, της ακεραιότητας και του σχήματος των συμπαγών μιτωτικών χρωμοσωμάτων. Η μελέτη της κατανομής του mRNA του ncapg έδειξε ότι το συγκεκριμένο γονίδιο εκφράζεται αποκλειστικά στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα και ειδικότερα σε περιοχές του εγκεφάλου στις οποίες υπάρχει έντονη νευρογένεση. Το mRNA του ncapg ανιχνεύθηκε από την Ε11.5 στην κοιλιακή ζώνη του τελεγκεφάλου, και σε χαμηλά επίπεδα, στην κοιλιακή ζώνη του μεσεγκεφάλου. Μία μέρα αργότερα, η κατανομή του mRNA του ncapg παραμένει στις προαναφερθείσες περιοχές ενώ εμφανίστηκε και στην κοιλιακή ζώνη του διαφράγματος. Από την Ε13.5 έως και την Ε15.5 το πρότυπο έκφρασης του ncapg παρέμεινε ίδιο με την Ε12.5, με τη διαφορά ότι παρατηρήθηκε έκφρασή του και στην κοιλιακή ζώνη του ιπποκάμπου, της ηνίας και της προοπτικής περιοχής, ενώ από την Ε15.5 άρχισε να εμφανίζεται σε χαμηλά επίπεδα έκφραση στον αμφιβληστροειδή. Από την Ε16.5 μέχρι και το ενήλικο άτομο η έκφραση του γονιδίου περιορίζεται σταδιακά στον αμφιβληστροειδή και σε πολύ χαμηλά επίπεδα στο νευροεπιθήλιο του φλοιού και του κερκοφόρου κελύφους. Στο πλαίσιο της μελέτης της έκφρασης του ncapg χρειάστηκε να αναπτύξουμε μια νέα ταχύτερη και πιο ευαίσθητη μέθοδο υβριδοποίησης in situ προκειμένου να αναλύσουμε την κατανομή του συγκεκριμένου mRNA το οποίο εκφράζεται σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα. Θεωρώντας ότι η βελτίωση της ευαισθησίας θα μπορούσε να επιτευχθεί βελτιώνοντας τις συνθήκες μονιμοποίησης δοκιμάστηκε ένα μονιμοποιητικό που βασίζεται στον ψευδάργυρο. Η τροποποίηση αυτή βελτίωσε σημαντικά την ευαισθησία της υβριδοποίησης in situ χωρίς ενίσχυση της μη ειδικής χρώσης, μείωσε στο 50% τον χρόνο που απαιτείται για την μέθοδο διατηρώντας παράλληλα άριστη τη μορφολογία των ιστών.Ακολούθησε η μελέτη του χωροχρονικού προτύπου των γονιδίων Εlfn1 και Elfn2 τα οποία κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των eLRR. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει ένα σύνολο διαμεμβρανικών πρωτεϊνών οι οποίες αποτελούνται από ένα μεγάλο εξωκυττάριο τμήμα στο οποίο συναντώνται επαναλαμβανόμενα μοτίβα πλούσια σε κατάλοιπα λευκίνης (LRR) και μια επικράτεια ανοσοσφαιρίνης ή φιμπρονεκτίνης. Αρκετά μέλη της οικογένειας αυτής έχουν πολύ σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση, στη μετανάστευση των νευρώνων και την ανάπτυξη των νευριτών. Η μελέτη της κατανομής του mRNA των Εlfn1 και Elfn2 έδειξε ότι αυτά τα γονίδια εκφράζονται στον εμπρόσθιο εγκέφαλο και μάλιστα τα πρότυπα έκφρασής τους είναι επικαλυπτόμενα αλλά σαφώς διακριτά. Πιο συγκεκριμένα, το mRNA του Εlfn1 ανιχνεύθηκε από την Ε12.5 στο μανδύα της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής και στο πλευρικό τμήμα του υποθαλάμου. Μια μέρα μετά εκτός από τις παραπάνω περιοχές η έκφρασή του εντοπίστηκε στο μανδύα της πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής και στην ηνία του υποθαλάμου, σε χαμηλά επίπεδα. Από την Ε14.5 ασθενής έκφραση του Εlfn1 ανιχνεύθηκε σε μεμονωμένα κύτταρα του εγκεφαλικού φλοιού, στον ιππόκαμπο και στο διάφραγμα. Η έκφραση στον φλοιό και στον ιππόκαμπο ενισχύθηκε στα όψιμα στάδια της εμβρυογένεσης, ενώ παρέμεινε σταθερή στην ηνία και στις γαγγλιονικές προεξοχές. Στο ενήλικο άτομο η έκφραση του Εlfn1 ανιχνεύθηκε στον φλοιό, στον ιππόκαμπο, στο διάφραγμα, στην ηνία και στην ωχρή σφαίρα, παράγωγο της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής.Η έκφραση του Elfn2 ανιχνεύθηκε αρχικά κατά την Ε13.5. Στο στάδιο αυτό υψηλά επίπεδα του mRNA του ανιχνεύθηκαν στη φλοιϊκή πλάκα, στον ιππόκαμπο, στον μανδύα της μέσης και πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής, στην περιοχή της αμυγδαλής και στον υποθάλαμο. Κατά Ε14.5 εκτός από τις παραπάνω περιοχές το mRNA του Elfn2 ανιχνεύθηκε επίσης στην υποφλοιϊκή πλάκα, και, από την Ε15.5, και στο διάφραγμα. Το πρότυπο αυτό παρέμεινε αναλλοίωτο μέχρι την ολοκλήρωση της εμβρυογένεσης. Τέλος, στο ενήλικο άτομο η έκφραση του Elfn2 ανιχνεύθηκε στη φλοιϊκή πλάκα, στο διάφραγμα, στην αμυγδαλή, στον ιππόκαμπο, στην προοπτική περιοχή, στην ωχρή σφαίρα, στο κερκοφόρο κέλυφος και στην ανώνυμη ουσία.Το επόμενο γονίδιο που μελετήθηκε ήταν το HSPC280 που κωδικοποιεί μια ιδιαίτερα συντηρημένη πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών οργανισμών η οποία ανήκει στις πρωτεΐνες με δομή φτερωτής έλικας, ωστόσο θεωρείται ότι δεν αποτελεί πρωτεΐνη που προσδένεται στο DNA. Η έκφραση του HSPC280 ανιχνεύθηκε αρχικά σε πολύ χαμηλά επίπεδα κατά την Ε11.5 στη μέση γαγγλιονική προεξοχή. Από την Ε12.5 η έκφρασή του mRNA του HSPC280 ανιχνεύθηκε στην υποκοιλιακή ζώνη της μέσης και της πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής, στην υποκοιλιακή ζώνη του φλοιού και στον θάλαμο. Κατά την Ε13.5 το mRNA του HSPC280 ανιχνεύθηκε εκτός από τις γαγγλιονικές περιοχές, στον φλοιό, σε έναν πληθυσμό κυττάρων που αρχικά εντοπίζεται στο κοιλιακό τμήμα του φλοιού και σταδιακά επεκτείνεται ραχιαία μέχρι και στον ιππόκαμπο. Το πρότυπο αυτό παραμένει μέχρι και την Ε15.5 με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου να μειώνονται σταδιακά. Από την Ε16.5 έως και την P0, χαμηλά επίπεδα έκφρασης του HSPC280 εντοπίστηκαν στο κερκοφόρο κέλυφος, στην υποκοιλιακή ζώνη του φλοιού, στη φλοιϊκή πλάκα και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου. Τέλος, στο ενήλικο άτομο, η έκφραση του γονιδίου ανιχνεύθηκε στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου σε πολύ χαμηλά επίπεδα.Η συγκριτική ανάλυση της έκφρασης του HSPC280 με τρία πολύ καλά μελετημένα γονίδια, τα Lhx6, Dlx2 και cyclinD2, με πειράματα υβριδοποίησης in situ σε στεφανιαίες διαδοχικές τομές των γαγγλιονικών προεξοχών κατά την Ε13.5, έδειξε πως το HSPC280 εκφράζεται αποκλειστικά στην υποκοιλιακή ζώνη, σε έναν πληθυσμό κυττάρων ο οποίος εκφράζει επισης το cyclinD2, και στην περίπτωση της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής και το Lhx6. Επιπλέον, με πειράματα ανοσοφθορισμού και ανοσοϊστοχημείας σε κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας από τις γαγγλιονικές προεξοχές εμβρύων ποντικού Ε13.5, δείχθηκε ότι όλα τα κύτταρα που εκφράζουν cyclinD2 εκφράζουν και την HSPC280. Τέλος, πειράματα υπερέκφρασης της HSPC280 σε ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα της σειράς Neuro2a, τα οποία στη συνέχεια κατευθύνθηκαν προς διαφοροποίηση, έδειξαν πως η υπερέκφραση της HSPC280 έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των διαφοροποιημένων κυττάρων, γεγονός που οδηγεί στο πιθανό συμπέρασμα πως η εν λόγω πρωτεΐνη μπορεί να εμποδίζει τα κύτταρα να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο.