Targeted high throughput RNA sequencing for detection of gene fusions and gene expression markers in thyroid cancer
Authors: Якушина В.Д. , Стрельников В.В. , Авдеева Т.Ф. , Казубская Т.П. , Кондратьева Т.Т. , Лернер Л.В. , Лавров А.В. 
Published: February 2024

Введение. Определение химерных онкогенов имеет важное значение в дооперационной дифференциальной диагностике рака щитовидной железы, а также для назначения ингибиторов тирозинкиназ. Предполагается, что оценка 5’/3’ дисбаланса экспрессии, косвенно отражающая наличие перестроек и уровня экспрессии ряда генов, позволит расширить спектр маркеров и тем самым повысить чувствительность диагностики злокачественных новообразований щитовидной железы. Высокопроизводительное секвенирование РНК, позволяющее определять полный спектр перестроек в сочетании с экспрессионными маркерами, рассматривается в качестве перспективного подхода, активно внедряемого в клиническую практику. Цель: оценить точность определения генных перестроек и экспрессионных маркеров методом таргетного высокопроизводительного секвенирования РНК при раке щитовидной железы. Методы. Исследованы 64 образца рака щитовидной железы и 16 образцов доброкачественных образований щитовидной железы с цитологическим диагнозом Бетезда III-V. Наличие траснкриптов перестроек генов RET, ALK, NTRK1, NTRK3, PPARG, THADA, LTK, MET, BRAF, C15orf55, ERBB4, OFD1, ROS1, 5’/3’ дисбаланс экспрессии данных генов и уровень экспрессионных маркеров определяли методом высокопроизводительного секвенирования с использованием технологи AmpliSeq на собственной панели праймеров. Результаты. Перестройки найдены в 12% образцов рака, список найденных перестроек включил CCDC6-RET, ETV6-NTRK3, TPM3- NTRK1, STRN-ALK, PAX8-PPARG. Доля образцов с выявленными перестройками соответствует ожидаемой по данным литературы. В образцах доброкачественных образований перестройки не выявлены. 5’/3’ дисбаланс в образцах рака был выражен для генов RET, NTRK1, NTRK3, MET и THADA, при этом отсутствовал в доброкачественных образованиях. Среди исследованных экспрессионных маркеров, гены KRT7, KRT20, CHGA, CITED1 имели выраженную гиперэкспрессию в отдельных образцах рака при отсутствии абберантной экспрессии в доброкачественных новообразованиях. Заключение. Таргетное высокопроизводительное секвенирование РНК на основе технологии AmpliSeq с помощью разработанной панели праймеров позволяет определять химерные гены, 5’/3’ дисбаланс экспрессии генов и экспрессионные маркеры с высокой специфичностью относительно статуса злокачественности новообразования. Включение 5’/3’ дисбаланса экспрессии и экспрессионных маркеров в тестирование может повысить точность дифференциальной диагностики злокачественных новообразований.

Background. Detection of fusion genes is important in the preoperative differential diagnostics of thyroid cancer, as well as for tyrosine kinase inhibitors prescription. It is assumed that the assessment of the 5’/3’ expression imbalance, which indirectly reflects the presence of gene rearrangements, and gene expression markers, might widen the range of markers and would thereby improve the sensitivity of the malignant thyroid tumors diagnostics. High throughput RNA sequencing, which allows determining the full range of rearrangements in combination with expression markers, is supposed to be promising application and is under active implementation into clinical practice. Aim. To assess the detection of rearrangements and expression markers by targeted high throughput RNA sequencing in thyroid cancer. Methods. 64 samples of thyroid cancer and 16 samples of benign thyroid lesions with a cytological diagnosis of Bethesda III-V were examined. Presence of RET, ALK, NTRK1, NTRK3, PPARG, THADA, LTK, MET, BRAF, C15orf55, ERBB4, OFD1, ROS1 gene rearrangement transcripts, 5’/3’ gene expression imbalance and expression marker levels were evaluated by high throughput sequencing using AmpliSeq technology on the custom primer panel. Results. Fusion genes were found in 12% of cancer samples. Their list includes CCDC6-RET, ETV6-NTRK3, TPM3-NTRK1, STRN-ALK, and PAX8-PPARG. The proportion of samples with identified rearrangements meets the values expected according to the literature. No rearrangements were found in the benign samples. 5’/3’ imbalance in cancer samples was detected for the RET, NTRK1, NTRK3, MET, and THADA genes, while it was absent in benign lesions. Among the studied expression markers, the KRT7, KRT20, CHGA, CITED1 genes had significant overexpression in cancer samples, with no aberrant expression in benign neoplasms. Conclusions. Targeted high throughput RNA sequencing based on AmpliSeq technology using the developed primer panel allows to determine gene fusions, 5’/3’ expression imbalance and expression markers with high specificity regarding the malignancy of the neoplasm. Inclusion of 5’/3’ expression imbalance and gene expression markers can improve the accuracy of differential diagnostics of malignant neoplasms.