Διερεύνηση της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης του c-myc mRNA από πρωτεΐνες πρόσδεσης RNA
Authors: Λαμπριανίδου Ανδρομάχη 
Published: September 2021

Η έκτοπη έκφραση της πρωτεΐνης c-ΜΥC εμπλέκεται σε πολλά στάδια καρκινογένεσης. Ως εκ τούτου, η έκφρασή της απαιτεί αυστηρό έλεγχο σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης. Το c-myc mRNA φέρει εντός της κωδικής περιοχής μία αλληλουχία 249 νουκλεοτιδίων (Coding Region instability Determinant- CRD) που προσδίδει αστάθεια και καταστέλλει τη μετάφραση. Αυτή η αλληλουχία αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη πρόσδεσης mRNA ΙΜΡ1, η οποία σταθεροποιεί το c-myc mRNA, προστατεύοντάς το από ενδονουκλεάσες. Η ΙΜΡ1 εκφράζεται σε εμβρυϊκούς ιστούς και de novo σε κακοήθειες. Φωσφορυλιώνεται στο κατάλοιπο Tyr 396 από την κινάση Src και στο κατάλοιπο Ser181 από την κινάση mTORC2, αντίστοιχα.Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση αυτών των τροποποιήσεων στην έκφραση της c-ΜΥC. Η μεταφρασιμότητα των χιμαιρικών μετάγραφων που φέρουν την αλληλουχία CRD του c-myc mRNA, εντός πλαισίου ανάγνωσης, μειώθηκε κατά 35% παρουσία του αναστολέα της κινάσης Src (SrcI1) αν και τα αντίστοιχα επίπεδα του mRNA αυξήθηκαν. Τα χιμαιρικά πλασμίδια λουσιφεράσης που φέρουν την αλληλουχία CRD, συνδιαμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν την πρωτεΐνη IMP1 αγρίου τύπου (IMP1wt) ή το μεταλλαγμένο ομόλογό της (ΙΜΡ1Υ396F). Η IMP1wt μείωσε την μεταφρασιμότητα κατά 20% ενώ η υπερεκφράση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης κατά 35%. Η αναστολή της δράσης της Src παρουσία IMP1wt μείωσε περαιτέρω την μεταφρασιμότητα των χιμαιρικών μεταγραφών. Οι ΙΜΡ1Υ396F ή IMP1wt παρουσία του αναστολέα, εντοπίστηκαν σε κυτταροπλασματικά κοκκία. Υπό αυτές τις συνθήκες, το ενδογενές c-myc mRNA σταθεροποιήθηκε, αν και δεν μεταφράστηκε υποδεικνύοντας ότι απουσία σηματοδότησης Src, η ΙΜΡ1 αποθηκεύει αντιστρεπτά το c-myc mRNA σε κυτταροπλασματικές δομές. Η αναστολή της mTORC2 σηματοδότησης είχε ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση των χιμαιρικών μετάγραφων καθώς και του ενδογενούς c-myc mRNA, 20% και 32% αντίστοιχα. Εντούτοις, παρατηρήθηκε αύξηση κατά 80% στα επίπεδα της πρωτεΐνης c-ΜΥC παρουσία του αναστολέα Torin1, ενώ η παρουσία της πρωτεΐνης IMP1S181A διπλασίασε τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-ΜΥC και προκάλεσε απόπτωση στο 23% των κυττάρων.Για να επιτευχτεί περαιτέρω αύξηση της έκφρασης της c-ΜΥC και ενίσχυση της απόπτωσης εφαρμόστηκε διαδοχική αναστολή της φωσφορυλίωσης της ΙΜΡ1 μέσω των δύο οδών. Το συσσωρευμένο c-myc mRNA, λόγω της παρουσίας SrcI1 για 48 ώρες, κατόπιν της επακόλουθης έκθεσης των κυττάρων στον αναστολέα Torin1 απέδωσε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης τόσο των χιμαιρικών μετάγραφων που φέρουν την αλληλουχία CRD όσο και της ενδογενούς c-ΜΥC, 2,5 και 3 φορές, αντίστοιχα. Η αύξηση αυτή των επιπέδων της c-ΜΥC προκάλεσε απόπτωση στο 44% του κυτταρικού πληθυσμού.Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της διαδοχικής δράσης του αναστολέα κινάσης Src AZD0530 και Torin1, σε ξενομοσχεύματα HeLa κυττάρων. Η χορήγηση του αναστολέα AZD0530 δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στον ρυθμό ανάπτυξης των όγκων. Προηγηθείσα όμως έκθεση των καρκινικών κυττάρων στον AZD0530 ενίσχυσε τη δράση του Torin1. Η διαδοχική χρήση των δύο ουσιών οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αναστολή της αύξησης του μεγέθους των ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με εκείνους που εκτέθηκαν μόνο στον Torin1.