Mechanisms of muscle function
Authors: Μήτρου Γεωργία 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Στην Χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ), οι ασθενείς παρουσιάζονται με αυξημένη συγκέντρωση παραπροϊόντων του μεταβολισμού (ουραιμία) τα οποία φαίνεται να επηρεάζουν αρνητικά τον σκελετικό μυ προκαλώντας «ουραιμική μυοπάθεια» (συμπερ. διαταραχές όπως ατροφία κυρίως σε μυϊκό ιστό ταχείας συστολής, αδυναμία, λιπώδης διήθηση, περιφερική νευροπάθεια, αυξημένη οξέωση και πρόωρη κόπωση). Μια σειρά παρεμβάσεων που έχουν εφαρμοστεί στην συγκεκριμένη κλινική ομάδα ενώ έχουν φανεί ευεργετικές, δεν έχουν καταφέρει να διορθώσουν επαρκώς το λειτουργικό έλλειμμα των ασθενών. Δεδομένης της συννοσηρότητας που παρουσιάζεται στην νόσο, η ερμηνεία αυτών των αποτελεσμάτων γίνεται πολύπλοκη ενώ οι περισσότερες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε ασθενείς τελικού σταδίου. Ως εκ τούτου δεν είναι γνωστό το αν και με ποιό τρόπο επηρεάζονται οι σκελετικοί μύες σε προγενέστερα στάδια της εξέλιξης της νόσου.Σκοπός της συγκεκριμένης έρευνας ήταν να εξεταστεί η επίδραση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας στον σκελετικό μυ ως προς την ικανότητα παραγωγής δύναμης, χρησιμοποιώντας ένα ζωικό μοντέλο προ-τελικού σταδίου ΧΝΝ. Με σκοπό λοιπόν να διαπιστωθεί εάν η καθαυτή σαρκομερική λειτουργία μπορεί να επηρεάζεται από την χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, εξετάστηκε η ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες ηρεμίας αλλά και στην ανταπόκριση σε συνθήκες οξέωσης, στην ευαισθησία στο ασβέστιο αλλά και στην ικανότητα λειτουργικής ανταπόκρισης σε οξειδοαναγωγικές μεταβολές, εξετάζοντας:1. την ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 1). 2. την ικανότητα απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες οξέωσης (Μελέτη 1). 3. την σχέση δύναμης-pCa απομονωμένων μυϊκών ινών σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 2). 4. την σχέση δύναμης-pCa απομονωμένων μυϊκών ινών σε συνθήκες οξέωσης (Μελέτη 2). 5. την ανταπόκριση απομονωμένων μυϊκών ινών σε αιφνίδιες αλλαγές του μήκους τους σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 3). 6. την μορφολογία απομονωμένων μυϊκών ινών (Μελέτες 1 και 3).7. την ικανότητα λειτουργικής ανταπόκρισης απομονωμένων μυϊκών ινών στην παραγωγή δύναμης σε συνθήκες οξείας πρόκλησης οξειδοαναγωγικών μεταβολών (Μελέτη 4). Μεθοδολογία: Η νεφρική ανεπάρκεια προκλήθηκε χειρουργικά σε κονίκλους Νέας Ζηλανδίας (UREM) ενώ πραγματοποιήθηκε εικονική χειρουργική επέμβαση για τους κονίκλους της ομάδας ελέγχου (CON). Τρεις μήνες μετά την χειρουργική παρέμβαση και ύστερα από την ευθανασία των ζώων, πραγματοποιήθηκε συλλογή ψοΐτη μυϊκού ιστού. Ακολούθησε χημική απομεμβράνωση του ιστού και στην συνέχεια τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε διάλυμα 50% γλυκερόλης στους -20οC, μέχρι την μηχανική τους αξιολόγηση με την χρήση εξειδικευμένου μικροδυναμομέτρου (SI Heidelberg/WPI). Οι διάμετροι των ινών αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσοφθάλμιο φακό ενός στερεοσκοπίου. H επεξεργασία των δειγμάτων, ο διαχωρισμός και όλες οι αξιολογήσεις διεξήχθησαν σε έναν τυφλό σχεδιασμό. Μελέτη 1. Πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της μέγιστης ισομετρικής δύναμης (Po) (Ν=142 CON, N=240 UREM) σε ‘standard’ συνθήκες (pH7, 10oC), και σε θερμοκρασίες πλησίον των φυσιολογικών (pH7, 30oC) σε μια υποομάδα ινών• αξιολογήθηκε επίσης η επίδραση της οξέωσης (pH 6.2).Μελέτη 2. Η ισομετρική δύναμη απομονωμένων μυϊκών ινών ψοΐτη (N=128 CON, N=195 UREM) αξιολογήθηκε σε ένα εύρος συγκεντρώσεων ασβεστίου στους 10oC, 30oC αλλά και σε pH 7 και pH 6.2. Για να διευκολυνθεί η σύγκριση, τα δεδομένα της δύναμης εκφράστηκαν ως ποσοστό (%) των τιμών Po στους 10oC και pΗ 7 και το ελεύθερο ασβέστιο εκφράστηκε σε τιμές pCa. Αυτές οι τιμές κατόπιν προσαρμόστηκαν στην εξίσωση Hill. Η τιμή pCa στην οποία επιτεύχθηκε το 50% της σχετικής δύναμη (pCa50) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της ευαισθησίας στο ασβέστιο. Η συνεργατικότητα αντανακλάται στις τιμές nΗ. Μελέτη 3: Οι απομονωμένες ίνες ψοΐτη (Ν=21 CON, Ν=42 UREM) ενεργοποιήθηκαν μέγιστα υπό ισομετρικές συνθήκες στους 22°C, pΗ 7. Όταν η δύναμη σταθεροποιήθηκε, προκλήθηκε αιφνίδια επιμήκυνση των ινών κατά 0,3% του αρχικού τους μήκους ώστε να προκληθούν αλλαγές στην παραγόμενη δύναμη. Ο χρόνος που χρειάστηκε από την έναρξη της επιμήκυνσης μέχρι την κορύφωση της καθυστερημένης αύξησης της δύναμης (t₃), αξιολογήθηκε ως δείκτης της κινητικής των εγκάρσιων γεφυρών. Τα σαρκομερικά μήκη ηρεμίας των ινών προσδιορίστηκαν επίσης σε θέση που οι ίνες βρίσκονταν σε χάλαση, με περίθλαση λέιζερ.Μελέτη 4. Η λειτουργική ανταπόκριση απομονωμένων ινών ψoΐτη (Ν=18 CON, Ν=19 UREM) σε οξειδοαναγωγικές μεταβολές [υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και/ή Διθειοθρεϊτόλη (DTT)] αξιολογήθηκε σε 2 πειραματικές ομάδες: Α) Οξεία έκθεση σε 10mM Η2Ο2 κατά τη διάρκεια πλήρους ενεργοποίησης που ακολουθείται από επώαση σε 10mM DTT κατά την διάρκεια χάλασης και την επακόλουθη ενεργοποίηση σε “standard” διαλύματα (Ν=9 CON, Ν=9 UREM) Β) Έκθεση σε 10mM Η2Ο2 κατά τη διάρκεια της χάλασης, πριν και μετά από υπομέγιστες (pCa50) και μέγιστες ενεργοποιήσεις σε “standard” διαλύματα (Ν=9 CON, Ν=10 UREM).Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής εργασίας συνοψίζονται παρακάτω:Μελέτη 1. Η νεφρική ανεπάρκεια οδήγησε σε σημαντικά μικρότερη εγκάρσια διατομή (CSA) τις UREM μυϊκές ίνες συγκριτικά με τις CON (κατά ~ 11%, Ρ<0.01). Σε “standard” συνθήκες οι UREM ίνες παρήγαγαν χαμηλότερες απόλυτες και ειδικές δυνάμεις (διορθωμένες ως προς CSA) σε σύγκριση με τις CON (P<0.01). Αυτή η διαφορά στην δύναμη παρέμεινε, επίσης, όταν οι μετρήσεις έγιναν στους 30°C (P<0.01). Και για τις δύο ομάδες, η οξέωση μείωσε σημαντικά την παραγωγή δύναμης (vs pH7, 10oC P<0.01), με ένα παρόμοιο ποσοστό μείωσης (UREM -48% vs CON -43%, P>0.05).Mελέτη 2. Σε “standard” συνθήκες, οι UREM ίνες παρουσιάστηκαν με παρόμοια ευαισθησία στο ασβέστιο (pCa50 UREM 6.12±0.02 vs CON 6.20±0.03) και συνεργατικότητα (nΗ UREM 2.11±0.14 vs CON 2.36±0.3). H oξέωση (pH6.2), στους 10°C προκάλεσε απώλεια της ευαισθησίας του ασβεστίου και για τις δύο ομάδες, κυρίως όμως για τις UREM (pCa50 UREM 5.32±0.06 έναντι CON 5.58±0.02). Στους 30oC, pΗ7, οι UREM ίνες παρουσιάστηκαν με χαμηλότερη ευαισθησία από ό,τι οι CON (pCa50 UREM 6.00±0.25 έναντι CON 6.42±0.19). Στους 30oC, η οξέωση μείωσε την ευαισθησία στο ασβέστιο, παρόμοια και για τις δύο ομάδες (pCa50 UREM 5.71±0.13 έναντι CON 5.80±0.05).Μελέτη 3. Οι UREM ίνες παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές t₃ (UREM 67±18 ms έναντι CON 57±16 ms, P<0.05). Επιπλέον, οι UREM ίνες εμφάνισαν μεγαλύτερα σαρκομερικά μήκη ηρεμίας (UREM 2.25±0.33 μm έναντι CON 2.05±0.17 μm, Ρ<0.01) και μικρότερες διαμέτρους (UREM 70 ± 19 μm έναντι CON 79 ± 13 μm, Ρ<0.05).Μελέτη 4. Α) Η οξεία έκθεση σε Η2Ο2 κατά την ενεργοποίηση δεν επηρέασε την παραγωγή δύναμης (P>0.05). Ωστόσο, το DTT προκάλεσε σημαντική μείωση της δύναμης κατά 12% (P<0.05) μόνο στις UREM ίνες. Β) Η επώαση με Η2Ο2 κατά τη διάρκεια της χάλασης μείωσε την μέγιστη ισομετρική δύναμη στο σύνολο των ινών (CON και UREM) κατά 3.5% (P<0.05), αλλά όχι στις 2 ομάδες ινών ξεχωριστά (UREM P>0.05; CON P>0.05). Συζήτηση: Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια προκάλεσε σημαντικές διαταραχές στην δύναμη απομονωμένων μυϊκών ινών ψοΐτη που μόνο εν μέρει μπορούν να εξηγηθούν από την μυϊκή ατροφία. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να εντοπίσει την συμβολή πιθανών μεταβολών στις σαρκομερικές πρωτεΐνες στο εμφανές λειτουργικό έλλειμμα (Μελέτη 1). Φαίνεται ότι η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια μπορεί να μειώσει σημαντικά την ευαισθησία στο ασβέστιο, και το μέγεθος αυτής της μείωσης εξαρτάται από τις πειραματικές συνθήκες. Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη η σημασία της θερμοκρασίας και της οξέωσης κατά την αξιολόγηση της ευαισθησίας του ασβεστίου σε χρόνιες ασθένειες (Μελέτη 2). Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια μπορεί επίσης να προκαλέσει επιβράδυνση στην κινητική των εγκάρσιων γεφυρών των κεφαλών της μυοσίνης καθώς και μεταβολές όσον αφορά την διάμετρο των ινών (ατροφία) και την δομή του σαρκομερίου. Τα μεγαλύτερα σαρκομερικά μήκη στις ίνες των UREM ζώων θα μπορούσαν να οφείλονται σε μείωση των δυνάμεων αποκατάστασης του σαρκομερικού μήκους σε συνθήκες ηρεμίας (Μελέτη 3). Η ικανότητα παραγωγής δύναμης των CON και UREM ινών επηρεάστηκε από την οξείδωση παρόμοια. Ωστόσο, η παρατήρηση ότι οι UREM ίνες μπορεί να βρίσκονταν σε μια πιο αναγωγική κατάσταση κατά την έναρξη των πειραμάτων χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση, καθώς αυτό θα μπορούσε να συνδέεται με την επίδραση της ασθένειας (Μελέτη 4).Συμπεράσματα: Για πρώτη φορά, αξιολογήθηκαν οι συσταλτικές ιδιότητες του ουραιμικού μυός σε επίπεδο απομονωμένων μυϊκών ινών. Η αξιολόγηση της μέγιστης ισομετρικής δύναμης, της σχέσης δύναμης-pCa και της ανταπόκρισης των ινών σε αιφνίδια επιμήκυνση, αποκάλυψε σημαντικούς λειτουργικούς περιορισμούς στις UREM ίνες που εν μέρει εξηγούνται από την ατροφία. Τα ελαστικά στοιχεία του σαρκομερίου θα μπορούσαν επίσης να επηρεαστούν και να εξηγήσουν κάποια αποτελέσματα. Μεταφέροντας τα αποτελέσματα στην ανθρώπινη κατάσταση, υποδεικνύουμε ότι ακόμη και σε ένα προ-τελικό στάδιο, η ΧΝΝ μπορεί να διαταράξει σοβαρά την ικανότητα παραγωγής δύναμης ενός μυός σε επίπεδο μυϊκής ίνας. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες πληροφορίες για την ερμηνεία της μυϊκή αδυναμίας και πρόωρης μυϊκής κόπωσης στη ΧΝΝ.