Comparative analysis of methods for determining the titer of germinated spores of microorganisms
Authors: Посокина Н.Е. , Захарова А.И. , Курбанова М.Н. 
Published: September 2023

Серьезной проблемой для пищевой промышленности является контроль достаточности термической обработки пищевых продуктов длительного хранения, который осуществляется, в том числе, с применением оценки остаточного количества споровых форм микроорганизмов. Это обусловлено тем, что споровая форма микроорганизмов имеет защитные механизмы, способствующие их выживанию при неблагоприятных внешних условиях, в том числе и при нагреве. На сегодняшний день существует широко применяемый в микробиологии метод определения количества спор путем посева на/в питательную среду, который является длительным по времени, трудоемким и трудозатратным. В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных методов контроля количества проросших спор микроорганизмов. Основываясь на том факте, что ядро споры содержит комплекс дипиколиновой кислоты и хелата кальция, которые при прорастании и нарушении оболочки выходят в субстрат, было выдвинуто предположение о взаимозависимости концентрации Ca2+ и титра микроорганизмов. Цель данного исследования – провести сравнительный анализ количественного определения проросших спор, полученных микробиологическим (посев) методом и методом, основанным на корреляции количества проросших спор и выделившихся при этом Ca2+. В качестве объекта исследования был использован штамм Bacillus subtilis ATCC 6633, полученный в ФБУН ГНЦ ПМБ «ГКПМ-Оболенск». Полученную споровую суспензию прогревали при температурах 75, 85, 95 °С в течение 20 мин и определяли титр методом посева в чашки Петри с плотной питательной средой МПА и концентрацию Ca2+методом капиллярного электрофореза. Расчётным путем была найдена функциональная зависимость концентрации Са2+ от количества проросших спор. Анализ данных позволяет сделать вывод о том, что метод определения титра проросших спор по изменению концентрации Ca2+ дает более точные результаты, поскольку выявляет только количество проросших спор, в то время как микробиологический посев дает погрешность результата, так как учитывает и вегетативную микрофлору.

A serious problem for the food industry is the control of the sufficiency of heat treatment of long-term food products, which is carried out, among other things, using the assessment of the residual number of spore forms of microorganisms. This is due to the fact that the spore form of microorganisms has protective mechanisms that contribute to their survival under unfavorable external conditions, including heating. To date, there is a method widely used in microbiology for determining the number of sprouted spores by sowing on / in a nutrient medium, which is time-consuming, time-consuming and labor-intensive. In this regard, there is a need to search for alternative methods of controlling the number of germinated spores of microorganisms. Based on the fact that the spore core contains a complex of dipicolinic acid and calcium chelate, which, when germinating and breaking the shell, exit into the substrate, it was suggested that the concentration of Ca2+ and the titer of microorganisms correlated. The purpose of this study is to conduct a comparative analysis of the quantitative determination of sprouted spores obtained by microbiological (seeding) the method and the method based on the correlation of the number of sprouted spores and the calcium ions released at the same time. The Bacillus subtilis strain ATCC 6633, obtained at the SBU SSC PMB GKPM-Obolensk, was used as the object of the study. The resulting spore suspension was heated at temperatures of 75, 85, 95 °C for 20 minutes and the titer was determined by seeding into Petri dishes with a dense nutrient medium of MPA and the concentration of Ca2+ by capillary electrophoresis. The functional dependence of the Ca2+ concentration on the number of spores sprouted was found by calculation. Analysis of the data obtained allows us to conclude that the method of determining the titer of germinated spores by changing the concentration of Ca2+ allows us to obtain more accurate results, since it only reveals the number of germinated spores, while microbiological sowing gives an error in the result, because it also takes into account the vegetative microflora.