Διερεύνηση και μελέτες απαδενυλασών που σχετίζονται με τον ημερονύκτιο ρυθμό
Authors: Μπέτα Ραφαηλία 
Published: March 2023

Ο κιρκάδιος ρυθμός είναι κάθε εγγενής διαδικασία που ρυθμίζει τον κύκλο εγρήγορσης-ύπνου και επαναλαμβάνεται κάθε 24 ώρες περίπου. Μπορεί να είναι ενδογενής, αλλά και να προσαρμόζονται σε αλλαγές στο περιβάλλον, με κυριότερη από αυτές την εναλλαγή φωτός/σκότους λόγω της περιστροφής της Γης περί τον άξονά της. Σε αυτή την περίπτωση οι κιρκάδιοι ρυθμοί ονομάζονται και ημερονύκτιοι ρυθμοί. Οι κιρκάδιοι ρυθμοί κατευθύνονται από το κιρκάδιο ρολόι, ένα βιοχημικό ταλαντωτή που μεταβάλλεται με σταθερή φάση και συγχρονίζεται με την ημέρα 24ωρών. Τα κιρκάδια ρολόγια επιτρέπουν στον οργανισμό να αποκρίνονται στις αναμενόμενες περιβαλλοντικές αλλαγές από την εναλλαγή φωτός/σκότους και να προσαρμόζονται ανάλογα. Έτσι, οι ρυθμοί επηρεάζουν διάφορες πτυχές της φυσιολογίας και της συμπεριφοράς των οργανισμών, όπως ο κύκλος ύπνου, οι κινήσεις των φύλλων στα φυτά, κ.α.. Ο μοριακός μηχανισμός του ρολογιού βασίζεται στη μεταγραφική ρύθμιση, οδηγώντας σε ρυθμικές αλλαγές που βασίζονται σε αλληλένδετους βρόχους ανατροφοδότησης μεταξύ μεταγραφής και μετάφρασης ελέγχοντας την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται με τον ρυθμό. Έτσι, οι διαδικασίες και οι παράγοντες που καθορίζουν τη ρυθμική γονιδιακή έκφραση είναι σημαντικοί για την κατανόηση των κιρκάδιων ρυθμών. Μεταξύ αυτών, οι ουρές πολυ(Α) των RNA παίζουν βασικό ρόλο στη σταθερότητα, τη μεταφραστική ικανότητα, αλλά και την αποδόμησή. Ειδικότερα, η βράχυνση και αφαίρεση της ουράς πολυ(Α) από ένζυμα που ονομάζονται απαδενυλάσες, είναι το πρώτο και καθοριστικό βήμα της αποικοδόμησης των ευκαρυωτικών mRNA, καθορίζοντας έτσι τη διάρκεια ζωής τους. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος δυο απαδενυλασών που εμπλέκονται στον κιρκάδιο ρυθμό, της AtHESPERIN και της πολυ(Α) εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης (PARN). Από μελέτες του εργαστηρίου ταυτοποιήθηκε η HESPERIN ως μια απαδενυλάση με κιρκάδια έκφραση στο φυτό Arabidopsis thaliana. Στην διατριβή περιγράφεται ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του ενζύμου μέσω των διαδικασιών βελτιστοποίησης των συνθηκών παραγωγής και απομόνωσης αλλά και της εξέτασης του ενεργού του κέντρου και του καταλυτικού μηχανισμού. Συνδυάζοντας τα βιοχημικά αποτελέσματα με ανάλυση in silico, αξιολογήσαμε τη σημασία των απαραίτητων για την κατάλυση αμινοξέων, οδηγώντας στην κατηγοριοποίηση της HESPERIN στην οικογένεια απαδενυλασών EEP (exonuclease-endonuclease-phosphatase). Παράλληλα, έχει περιγραφεί πως η PARN εκδηλώνει ρυθμικά επίπεδα mRNA σε ήπαρ μυός, χωρίς να είναι κάτι γνωστό για τα πρωτεϊνικά της επίπεδα ή το γενικότερο ρόλο που μπορεί να διαδραματίζει στο κιρκάδιο ρολόι. Στο πλαίσιο της διατριβής, εξετάσαμε τα επίπεδά της PARN σε ανθρώπινα κύτταρα HEK293T μετά από εναρμόνιση με τον κιρκάδιο ρυθμό αλλά και σε ήπαρ μυός. Επιπλέον, εξετάσαμε την αλληλεπίδρασή της PARN με το miR-29a, καθώς από μελέτες του εργαστηρίου έχει προκύψει πως σε κύτταρα πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα αλληλεπιδρά η PARN εμπλέκεται στην ωρίμανση του, ενώ παράλληλα έχει περιγραφεί πως το miR-29a διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της περιόδου του ρολογιού σε ήπαρ ποντικών. Ανοσοκατακρήμνιση της PARN και ανάλυση των προσδεδεμένων σε αυτή μορίων RNA έδειξε πως αλληλεπιδρά με το miR-29a και ακολούθησε κατακρήμνιση του miR-29a σε διάφορα χρονικά σημεία του 24ώρου ώστε να ταυτοποιηθούν οι πρωτεϊνικές του αλληλεπιδράσεις. Τέλος, ο ρόλος της PARN στον κιρκάδιο ρυθμό μελετήθηκε πραγματοποιώντας μεγάλης κλίμακας πρωτεομική μελέτη μετά από ανοσοκατακρήμνιση της PARN από ήπαρ ποντικών στη διάρκεια του 24ωρου. Η μελέτη αυτή αποκάλυψε νέους παράγοντες που αλληλεπιδρούν με την PARN σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές του 24ώρου αλλά και παράγοντες που υποδεικνύουν πως η PARN ίσως διαδραματίζει πολύ εξειδικευμένους ρόλους στο πλαίσιο του κιρκάδιου ρυθμού, θέτοντας τα θεμέλια για τη μελέτη της σε διεργασίες που δεν έχει κάποιο γνωστό ρόλο.