Πειραματική μελέτη για την πρόληψη της καμπυλοβακτηρίωσης με τη χορήγηση μίγματος οξέων στα κρεοπαραγωγά ορνίθια
Authors: Μάντζιος Τηλέμαχος 
Published: November 2023

Η μόλυνση του ανθρώπου με βακτήρια του γένους Campylobacter αποτελεί την κύρια αιτία βακτηριακής τροφιμογενούς γαστρεντερίτιδας παγκοσμίως, με την καμπυλοβακτηρίωση να είναι η συχνότερη ζωονόσος που καταγράφεται στην Ευρωπαϊκή Ένωση, με πάνω από 220.000 κρούσματα για το 2019. Το κρέας πουλερικών και κυρίως αυτό των κρεοπαραγωγών ορνιθίων, αποτελεί την κύρια πηγή μόλυνσης του ανθρώπου και το Campylobacter jejuni (C. jejuni) είναι το είδος που εμπλέκεται στη πλειονότητα των περιστατικών. Υπολογίζεται ότι το 60-80% των εμπορικών σμηνών κρεοπαραγωγών ορνιθίων, είναι θετικά στο Campylobacter spp. σε ηλικία σφαγής και ως εκ τούτου, αποτελούν την πιο σημαντική δεξαμενή του μικροοργανισμού στη φύση. Σύμφωνα με τις εκτιμήσεις των Διεθνών Οργανισμών Υγείας (ΠΟΥ, EFSA και CDC), αλλά και από τα αποτελέσματα στατιστικών και επιδημιολογικών μοντέλων, ο έλεγχος του Campylobacter spp. στην αλυσίδα παραγωγής κρεοπαραγωγών ορνιθίων και ειδικότερα κατά τη διάρκεια της πρωτογενούς παραγωγής, αναμένεται να μειώσει σημαντικά τους πληθυσμούς Campylobacter spp. στα τελικά σφάγια και κατ’ επέκταση την πιθανότητα μόλυνσης του ανθρώπου. Πρόσφατα, η EFSA βασιζόμενη σε επιδημιολογική ανάλυση για τον πληθυσμό, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η προσθήκη οργανικών οξέων ή βιοκτόνων συνδυασμών οξέων με βάση το χλώριο ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου στο πόσιμο νερό των πτηνών, θα μπορούσε να μειώσει τον επιπολασμό του Campylobacter spp. στις εκτροφές κρεοπαραγωγών ορνιθίων κατά 55%. Υπάρχουν αρκετά εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα που περιέχουν συγκεκριμένους συνδυασμούς οργανικών ανόργανων οξέων, τα οποία χρησιμοποιούνται στην εξυγίανση του πόσιμου νερού των εκτρεφόμενων πτηνών. Ωστόσο, η δράση αυτών των εμπορικών μιγμάτων οξέων κατά του Campylobacter παραμένει άγνωστη, ενώ ελάχιστα δεδομένα είναι γνωστά σε σχέση με τη δυνατότητα των μικροοργανισμών να αναπτύσσουν ανθεκτικότητα σε αυτά τα προϊόντα. Μέχρι στιγμής, καμία μέθοδος ελέγχου του μικροοργανισμού σε επίπεδο εκτροφής δεν έχει αποδειχθεί πλήρως αποτελεσματική και ταυτόχρονα οικονομικά βιώσιμη για τον έλεγχο του Campylobacter spp. στα κρεοπαραγωγά ορνίθια. Η επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων ελέγχου του επιπολασμού του Campylobacter spp. στα εμπορικά σμήνη πτηνών, καθώς και η συχνή χρήση των εμπορικών προϊόντων-μιγμάτων οξέων στο πόσιμο νερό των εκτροφών, αποτέλεσαν το κίνητρο για την παρούσα μελέτη και διαμόρφωσαν τους βασικούς της στόχους. Ο πρώτος στόχος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε την in vitro αξιολόγηση της αντί-Campylobacter δράσης εννέα (9) εμπορικών προϊόντων, τα οποία έχουν εγκριθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση για χρήση στο πόσιμο νερό των ορνιθίων, και περιέχουν συγκεκριμένους συνδυασμούς οργανικών ή/και ανόργανων οξέων. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά δύο στελέχη C. jejuni και ένα στέλεχος C. coli. H εκτίμηση της δράσης των εμπορικών μιγμάτων οξέων έναντι των στελεχών έγινε με τη μέθοδο της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) σύμφωνα με τα CLSI standards M07-A10 και M100-S28. Η MIC ορίζεται ως η μικρότερη συγκέντρωση μιας χημικής ουσίας η οποία αναστέλλει οπτικά την ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου μικροβίου. Η εξέταση για κάθε σκεύασμα έγινε εις τριπλούν έναντι κάθε στελέχους Campylobacter. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, όλα τα εμπορικά προϊόντα που επιλέχθηκαν ήταν ικανά να αναστείλουν την ανάπτυξη των εξεταζόμενων στελεχών Campylobacter spp. Στη δόση που προτείνεται από τον παρασκευαστή. Δυο προϊόντα, το CID 2000™ και το Aqua-clean® κατέγραψαν την πιο ισχυρή δράση σε αυτή τη μελέτη, έναντι του C. jejuni και του C. coli (0,002%– 0.004%v/v). Με βάση τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, το ισχύον νομοθετικό πλαίσιο, τη συχνότητα χρήσης στη πτηνοτροφία και την απουσία αναφορών από τη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με τη δράση του προϊόντος στον επιπολασμό του C. jejuni στα κρεοπαραγωγά ορνίθια, το εμπορικό μίγμα οξέων που επιλέχθηκε για την in vivo μελέτη ήταν το CID 2000™. Ο δεύτερος στόχος της διδακτορικής διατριβής ήταν η in vivo αξιολόγηση της επίδρασης του CID 2000™ στον έλεγχο του επιπολασμού του C. Jejuni στα κρεοπαραγωγά ορνίθια. Επιπλέον, εκτιμήθηκε για πρώτη φορά η επίδραση της χορήγησης του CID 2000™ στην υγεία και την ευζωία των κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλάμβανε την τυχαία κατανομή 128 νεοσσών (Ross 308®), ηλικίας μιας ημέρας, σε τέσσερις (4) πειραματικές ομάδες των 32 ορνιθίων. Κάθε ομάδα, αποτελούνταν από τέσσερις (4) επιμέρους υποομάδες-επαναλήψεις των οκτώ (8) ορνιθίων. Η συνολική διάρκεια του πειραματισμού ήταν 36 ημέρες. Οι πειραματικοί χειρισμοί που διενεργήθηκαν ήταν η χορήγηση του μίγματος οξέων με το πόσιμο νερό και η μόλυνση των πτηνών με C. jejuni. Συγκεκριμένα, οι πειραματικές ομάδες ήταν οι εξής τέσσερις: 1) Ομάδα Α: τα ορνίθια της ομάδας χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, 2) Ομάδα Β: στα ορνίθια της ομάδας χορηγήθηκε το εμπορικό μίγμα οξέων, 3) Ομάδα Γ: στα ορνίθια της ομάδας διενεργήθηκε μόλυνση με C. jejuni, 4) Ομάδα Δ: στα ορνίθια της ομάδας χορηγήθηκε το εμπορικό μίγμα οξέων και μολύνθηκαν με C. jejuni. Τα ορνίθια μολυνθήκαν τη 18η ημέρα της ζωής τους με 106 CFU C. jejuni. Η κλινική εικόνα των ορνιθίων ελεγχόταν καθημερινά. Την 7η, 13η, 18η, 20η, 23η και 36η ημέρα του πειραματισμού, διενεργήθηκε βαθμονομική εκτίμηση του ποσοστού εμφάνισης και του βαθμού έντασης διαρροϊκών κοπράνων, μέσω της εκτίμησης της παρουσίας ρυπαρού υλικού στο πτέρωμα της περιοχής της αμάρας. Κατά τη διάρκεια του πειραματισμού το ΣΒ των ορνιθίων εκτιμήθηκε την 1η, 7η, 13η, 18η, 23η και 36η ημέρα, ενώ η ΜΗΚΤ, ο ΔΜΤ και η ΜΗΚΝ υπολογίστηκαν για τα χρονικά διαστήματα από την 1η-13η, την 14η-23η, την 24η-36η και την 1η-36η ημέρα πειραματισμού. Τέλος, ο ΕΔΠ υπολογίστηκε για τη συνολική περίοδο του πειραματισμού (1η-36η ημέρα). Συνολικά, στον in vivo πειραματισμό πραγματοποιήθηκαν δύο (2) δειγματοληψίες, την 23η ημέρα (5 ημέρες μετά τη μόλυνση) και την 36η ημέρα (18 ημέρες μετά τη μόλυνση). Οι εξετάσεις που διενεργήθηκαν ήταν: α) η καταμέτρηση των C. jejuni στον πρόλοβο και τα τυφλά, β) η απομόνωση του C. jejuni από το ήπαρ, γ) η ιστομορφομετρική και ιστοπαθολογική εκτίμηση δειγμάτων από το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό, δ) η ιστοπαθολογική διερεύνηση δειγμάτων ήπατος, ε) η μακροσκοπική εκτίμηση των αλλοιώσεων στα πέλματα, στους ταρσούς, στον μυώδη στόμαχο, στο ήπαρ και το έντερο των ορνιθίων, ζ) η μέτρηση του pH του περιεχομένου στον πρόλοβο, στο δωδεκαδάκτυλο, στη νήστιδα, στον ειλεό και τα τυφλά, και η) η μέτρηση του ιξώδους του περιεχομένου στη νήστιδας και τον ειλεό των ορνιθίων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vivo μελέτης, η μόλυνση των κρεοπαραγωγών ορνιθίων με το στέλεχος C. jejuni KC40 οδήγησε στην επιτυχή εγκατάσταση του μικροοργανισμού στο έντερο, σχηματίζοντας μεγάλο πληθυσμό στη περιοχή των τυφλών. Επιπλέον, η μόλυνση αύξησε σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης και τον βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, επηρέασε αρνητικά την ιστομορφολογία του εντέρου και οδήγησε σε υψηλό ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των ορνιθίων. Η χορήγηση του CID 2000™ μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό του C. jejuni στα τυφλά των ορνιθίων (5 ημέρες μετά τη μόλυνση), περιόρισε τη συχνότητα εμφάνισης και το βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, βελτίωσε τις ιστομορφομετρικές μεταβολές που προκάλεσε το C. jejuni στο έντερο και περιόρισε σε σημαντικό βαθμό το ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των μολυσμένων ορνιθίων, χωρίς ωστόσο να περιορίσει τη μετάδοση του C. jejuni μεταξύ των ορνιθίων.