Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και έλεγχος δράσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στην έκφραση κυτταροκινών σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα
Authors: Δάβουλου Παναγιώτα 
Published: February 2024

Η ενεργοποίηση και η διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών (Th) κυττάρων είναι διαδικασίες καθοριστικής σημασίας για τη διατήρηση επαρκούς άμυνας και τη ρύθμιση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ενεργοποίηση των Τh κυττάρων επάγει σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση σημαντικών λεμφοτροπικών παραγόντων όπως των NFAT, NF-κΒ και AP-1, οι οποίοι εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της μεταγραφής της ΙL-2. Η IL-2 είναι η πρώτη κυτταροκίνη που παράγεται όταν τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε επαγώγιμα Th0 λεμφοκύτταρα. Σύμφωνα με μελέτη του εργαστηρίου μας, ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2 προσδένεται στην περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 σε παρθενικά Τh κύτταρα και καταστέλλει την έκφρασή της. Κατά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τh κυττάρων, ο Εts-2 μετακινείται στην ARRE-1 περιοχή του υποκινητή της ΙL-2 και χάνει την κατασταλτική του δράση ενώ παράλληλα τα επίπεδα έκφρασής του μειώνονται. Μετά την ενεργοποίησή τους ως αποτέλεσμα της αντιγονοπαρουσίασης τα παρθενικά Τh κύτταρα ανάλογα με το είδος και τη συγκέντρωση του αντιγόνου, την ισχύ του σήματος TCR, το κυτταροκινικό περιβάλλον στο οποίο επιτελέστηκε η ενεργοποίηση και τη διαφορική έκφραση μεταγραφικών παραγόντων διαφοροποιούνται στους διαφορετικούς υποληθυσμούς Τh κυττάρων.Η παρούσα διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση των μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης του Εts-2, καθώς και του ρόλου του στη ρύθμιση της έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι εμπλέκονται στις διαδικασίες της ενεργοποίησης και διαφοροποίησης των Τh κυττάρων. Η συγκεκριμένη μελέτη θα εξετάσει επίσης την πιθανή εμπλοκή του Εts-2 στην παθογένεια αυτοάνοσων νοσημάτων λόγω δυσλειτουργίας των μηχανισμών ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων. Αρχικά διερευνήσαμε το ρόλο του Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των λεμφοτροπικών παραγόντων NFAT2, NF-κΒ p65, c-Jun και c-Fos. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων που διεξήχθησαν στην κυτταρική σειρά Jurkat, προκύπτει ότι ο Εts-2 είχε επαγωγικό ρόλο στην έκφραση του NFAT2 και του c-Jun. Θετική ρύθμιση ασκεί στην έκφραση της πρωτεΐνης του NF-κB p65, ωστόσο δεν επέφερε κάποια αλλαγή στα επίπεδα του NF-κΒ p65 mRNA. Εξετάζοντας τη δράση του Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης του c-Fos παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του Εts-2 είχε ως αποτέλεσμα αύξηση των επιπέδων του c-Fos mRNA τόσο στα μη ενεργοποιημένα όσο και στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Ωστόσο οδήγησε σε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων του c-Fos μόνα στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Επομένως ο Εts-2 έχει επαγωγικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης λεμφοτροπικών παραγόντων οι οποίοι εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των Τh λεμφοκυττάρων, είτε μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασής του με τους εξεταζόμενους λεμφικούς παράγοντες, είτε μέσω της συμμετοχής του σε σηματοδοτικά μονοπάτια που επηρεάζουν άμεσα την έκφρασή τους. Στη συνέχεια προχωρήσαμε στη μελέτης της γονιδιακής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Εts-2 καθώς και των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων και συγκεκριμένα των: GATA-3, RORγt και Foxp3, σε παρθενικά και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Ακολούθως εξετάσαμε το ρόλο του Εts-2 στην έκφραση των GATA-3, RORγt και Foxp3 και το αντίστροφο με σκοπό να αποσαφηνισθεί η δράση του Εts-2 στη διαδικασία διαφοροποίησης των Τh κυττάρων. Ενδιαφέρον παρουσίασαν τα αποτελέσματα των πειραμάτων που εξέτασαν τη δράση του Εts-2 στην έκφραση του RORγt, καθώς η υπερέκφραση του Εts-2 επέφερε μείωση των επιπέδων του RORγt μόνο στα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Τα πειράματα διερεύνησης της δράσης του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3 καθώς και τα πειράματα μελέτης του ρόλου του Foxp3 στην έκφραση του Εts-2 παρουσίασαν επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν η υπερέκφραση του Εts-2 οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης του Foxp3, αλλά και η υπερέκφραση του Foxp3 μείωσε τα επίπεδα του Εts-2. Για να επιβεβαιώσουμε την αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης των ανωτέρω μεταγραφικών παραγόντων προχωρήσαμε σε πειράματα αποσιώπησης του Εts-2 τα οποία είχαν ως αποτέλεσμα αύξηση των επιπέδων έκφρασης του Foxp3, επιβεβαιώνοντας τον κατασταλτικό ρόλο του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3. Στη συνέχεια, γνωρίζοντας την ύπαρξη θέσεων πρόσδεσης του Εts-2 στον υποκινητή του Foxp3, αποδείξαμε ότι ο Εts-2 προσδένεται στον υποκινητή του Foxp3.Καθώς η δυσλειτουργία των μηχανισμών ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία παθολογικών Τh κλώνων και την επακόλουθη εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων, επόμενο βήμα ήταν να διερευνήσουμε την πιθανή εμπλοκή του Εts-2 στο αυτοάνοσο νόσημα της σκλήρυνσης κατά πλάκας (ΣΚΠ). Για αυτό το λόγο εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασής του Εts-2 και του Foxp3 σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) ασθενών με ΣΚΠ και προχωρήσαμε στη σύγκρισή τους με τα αντίστοιχα των υγιών δοτών. Οι ασθενείς με ΣΚΠ παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Εts-2 συγκριτικά με τους υγιείς δότες, ενώ παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα Foxp3 συγκριτικά με τα υψηλότερα επίπεδα των υγιών δοτών. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με αυτά των προηγούμενων πειραμάτων διερεύνησης του ρόλου του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3, μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2, ο οποίος υπερεκφράζεται στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών με ΣΚΠ, μπορεί να ασκεί αρνητική ρύθμιση στην έκφραση του Foxp3. Τα χαμηλά επίπεδα του Foxp3 που παρατηρήθηκαν στους ασθενείς μπορεί να υποδηλώνουν δυσλειτουργία στο μηχανισμό καταστολής της έκφρασης της ΙL-2 με αποτέλεσμα την επακόλουθη αύξηση των επιπέδων της. Επομένως, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ένα κατασταλτικό ρόλο του Εts-2 στην ανάπτυξη και τη λειτουργία των Tregs και την επακόλουθη εμπλοκή του στην παθογένεια της ΣΚΠ.