Microbial production and applications of carotenoids
Authors: Σερέτη Φανή 
Published: December 2024

Η παρούσα διατριβή εστιάζει στην παραγωγή μικροβιακών καροτενοειδών με τη χρήση νέων στελεχών ζυμών, σε συνδυασμό με αποτελεσματικές και φιλικές προς το περιβάλλον μεθόδους ανάκτησης, στοχεύοντας σε εφαρμογές υψηλής προστιθέμενης αξίας σε τρόφιμα αλλά και σε φαρμακευτικά προϊόντα. Τα καροτενοειδή είναι βιοδραστικές ενώσεις γνωστές για το ευρύ φάσμα χρωμάτων αλλά και για τις ευεργετικές βιολογικές τους ιδιότητες, γεγονός που τα καθιστά ιδιαίτερα πολύτιμα για την ταχέως εξελισσόμενη βιομηχανία των τροφίμων. Η μικροβιακή παραγωγή καροτενοειδών παρουσιάζει μια αποτελεσματική και φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για τη σύνθεσή τους, δίνοντας προτεραιότητα στην ανθρώπινη υγεία και την περιβαλλοντική βιωσιμότητα. Επιπλέον, η μικροβιακή παραγωγή καροτενοειδών, αναλόγως της σύστασης, δύναται να προσφέρει ένα ευρύ φάσμα επιλογών χρωμάτων. Για το σκοπό αυτό, τέσσερα ελάχιστα μελετημένα στελέχη του γένους Rhodosporidium αξιολογήθηκαν αρχικά για την ικανότητά τους να αναπτύσσονται και να συνθέτουν καροτενοειδή αφομοιώνοντας διάφορες πηγές άνθρακα. Αρχικά, η έρευνα επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της ικανότητας δύο στελεχών Rhodosporidium kratochvilovae (Y-42 και Y-43) να παράγουν καροτενοειδή υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας, όπως σε διαφορετικές πηγές άνθρακα και σε διαφορετικούς λόγους άνθρακα/αζώτου (C/N). Η γλυκόζη και το μείγμα γλυκόζης-γαλακτόζης αποδείχθηκαν τα πιο υποσχόμενα υποστρώματα για την παραγωγή καροτενοειδών αλλά και μικροβιακού λίπους. Η σύνθεση των καροτενοειδών επηρεάστηκε σε μεγάλο βαθμό από την αναλογία άνθρακα/αζώτου και στα δύο υπό μελέτη στελέχη, ενώ παρατηρήθηκε επίσης μια ανταγωνιστική τάση με τη συσσώρευση μικροβιακού ελαίου. Η ανάλυση των εκχυλισμάτων των καροτενοειδών έδειξε ότι κυρίαρχο ήταν το β-καροτένιο (55-85%), ανεξαρτήτως των συνθηκών ζύμωσης ή του στελέχους που χρησιμοποιήθηκε. Η αποτελεσματικότητα των ζυμώσεων στο μίγμα γλυκόζης: γαλακτόζης οδήγησε στην μελέτη υδρολυμένου (και αποπρωτεϊνομένου) τυρογάλακτος ως εναλλακτική πηγή άνθρακα. Πριν από τη ζύμωση, το τυρόγαλα υπέστη υδρόλυση είτε με τη χρήση εμπορικής β-γαλακτοσιδάσης είτε με τη χρήση ακατέργαστων ενζύμων. Στην περίπτωση που για την υδρόλυση χρησιμοποιήθηκε η εμπορική β-γαλακτοσιδάση, τα στελέχη Rhodosporidium kratochvilovae Y-42 και Y-43 παρήγαγαν 1,87 και 1,64 mg/L συνολικών καροτενοειδών, αντίστοιχα, με την ταυτόχρονη συσσώρευση 19,7% και 23,9% (w/w) μικροβιακού λίπους. Η ανάλυση του προφίλ των παραγόμενων καροτενοειδών έδειξε ότι το β-καροτένιο ήταν το κύριο καροτενοειδές. Αντιθέτως, όταν η υδρόλυση του τυρογάλακτος έγινε με ακατέργαστα ένζυμα από ζυμούμενο πίτουρο σιταριού, το οποίο επίσης λειτούργησε ως πηγή αζώτου (FAN), και τα δύο στελέχη παρήγαγαν σχεδόν αποκλειστικά λυκοπένιο, ενώ μειώθηκε σημαντικά η σύνθεση μικροβιακών λιπιδίων. Η παραγωγή λυκοπενίου διερευνήθηκε περαιτέρω υπό διαφορετικές αναλογίες άνθρακα/αζώτου και θερμοκρασίες επώασης. Υπό τις βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας (λόγος άνθρακα/αζώτου 40 και 33°C), το στέλεχος Y-42 παρήγαγε 36,4 mg/L καροτενοειδών, με το 97% να είναι λυκοπένιο, αναδεικνύοντας τον καθοριστικό ρόλο του υποστρώματος στη σύνθεση και σύσταση των καροτενοειδών. Επιπλέον, το εκχύλισμα καροτενοειδών παρουσίαζε υψηλή αντιοξειδωτική δράση, υποδεικνύοντας τη δυνατότητα περαιτέρω χρήσης του ως πρόσθετου σε καινοτόμα τρόφιμα. Επιπρόσθετα, δύο νέα στελέχη ζυμομυκήτων, τα Rhodosporidium paludigenum 2663 και 2664, μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα (γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη, μείγμα γλυκόζης-γαλακτόζης). Το στέλεχος 2663 παρήγαγε τη μεγαλύτερη συγκέντρωση καροτενοειδών (2,21 mg/L) όταν αναπτύχθηκε σε σακχαρόζη, ενώ παράλληλα παρήγαγε και 4 g/L μικροβιακού ελαίου (30%, w/w). Μάλιστα, το ίδιο στέλεχος ήταν ικανό να παράγει και εξωπολυσακχαρίτες, όταν χρησιμοποιήθηκε η σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα. Στην περίπτωση του στελέχους 2664, η γλυκόζη ευνόησε την παραγωγή καροτενοειδών επιτυγχάνοντας συγκεντρώσεις της τάξεως των 2,93 mg/L μαζί με 1,57 g/L μικροβιακού ελαίου (31,8%, w/w). Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα χρησιμοποιώντας είτε σακχαρόζη είτε μελάσα με το στέλεχος 2663, για την περαιτέρω διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής των εν λόγω μεταβολιτών. Η στρατηγική καλλιέργειας ημι-συνεχούς λειτουργίας με μελάσα ως υπόστρωμα οδήγησε στην παραγωγή των υψηλότερων συγκεντρώσεων όλων των μεταβολιτών, με τα καροτενοειδή να ανέρχονται στα 3,3 mg/L, ενώ η περιεκτικότητα σε μικροβιακό έλαιο έφθασε στο 50,7% (w/w), και η συγκέντρωση των εξωπολυσακχαριτών στα 3 g/L. Η ανάλυση του προφίλ των καροτενοειδών έδειξε ότι το β-καροτένιο ήταν το κύριο καροτενοειδές, ενώ το ελαϊκό οξύ ήταν το κύριο λιπαρό οξύ του παραγόμενου μικροβιακού ελαίου. Τα εκχυλίσματα καροτενοειδών που προέκυψαν έδειξαν υψηλή αντιοξειδωτική δράση, καθώς επίσης και αντιμικροβιακή δράση έναντι κοινών βακτηριακών και μυκητιακών παθογόνων στελεχών. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η ανάκτηση του μικροβιακού ελαίου και των καροτενοειδών από το στέλεχος Rhodosporidium paludigenum 2663 χρησιμοποιώντας εκχύλιση με υπερκρίσιμο CO2 (SFE-CO2), μια μέθοδο φιλική προς το περιβάλλον. Πριν από την εκχύλιση, η βιομάζα υποβλήθηκε αρχικά σε έξι διαφορετικές μεθόδους διάρρηξης των κυττάρων, με την ομογενοποίηση υψηλών ταχυτήτων να αναδεικνύεται ως η βέλτιστη μέθοδος προ-επεξεργασίας, η οποία σε συνδυασμό με τη μέθοδο (SFE-CO2), οδήγησε σε αποδόσεις ανάκτησης των καροτενοειδών της τάξεως του 80% και σε ανάκτηση 83% του μικροβιακού ελαίου. Η χρήση αιθανόλης ως συν-διαλύτη ήταν καθοριστικής σημασίας για την αποδοτική ανάκτηση και των δύο μεταβολικών προϊόντων. Στο τελευταίο στάδιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής εξετάστηκαν πιθανές εφαρμογές του πλούσιου σε καροτενοειδή μικροβιακού ελαίου, μέσω της αξιολόγησης δύο μεθόδων ενθυλάκωσης: της ηλεκτρονηματοποίησης και των ελαιοπηκτών. Όσον αφορά τη διαδικασία ηλεκτρονηματοποίησης, η επιλογή των συστατικών της μήτρας ενθυλάκωσης επηρέασε σημαντικά την αποδοτικότητά της ενθυλάκωσης. Οι μεγαλύτερες αποδόσεις ενθυλάκωσης για το μικροβιακό έλαιο και τα καροτενοειδή ήταν 71,15% και 42,20%, αντίστοιχα, όταν χρησιμοποιήθηκαν οι εξωπολυσακχαρίτες στη μήτρα ενθυλάκωσης. Όσον αφορά την ελαιοπηκτή που αναπτύχθηκε με το μικροβιακό έλαιο, παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση της περιεκτικότητας σε καροτενοειδή κατά τη διαδικασία της παραγωγής της ελαιοπηκτής, η οποία τελικά διατήρησε το 45% της αρχικής συγκέντρωσης των καροτενοειδών. Η μελέτη της θερμικής σταθερότητας του μικροβιακού ελαίου και των καροτενοειδών διερευνήθηκε στην περιοχή 50-90 °C, με στόχο την αξιολόγηση της σταθερότητάς τους. Η εφαρμογή κινητικών μοντέλων έδειξε ότι οι ρυθμοί οξείδωσης του ελαίου και αποικοδόμησης των καροτενοειδών ήταν σημαντικά χαμηλότεροι στην ελαιοπηκτή σε σύγκριση με το μη ενθυλακωμένο μικροβιακό έλαιο. Ως εκ τούτου, η ελαιοπηκτή λειτούργησε ως προστατευτικός φορέας τόσο του μικροβιακού ελαίου όσο και των καροτενοειδών υπό συνθήκες θερμικής επεξεργασίας. Επιπλέον, η ανάλυση των φυσικών ιδιοτήτων ανέδειξε την υψηλή ικανότητα επάλειψης και την υψηλή μηχανική αντοχή της ελαιοπηκτής, υποστηρίζοντας περαιτέρω την δυνατότητα εφαρμογής της για την ανάπτυξη καινοτόμων προϊόντων τροφίμων.