Μοριακή ανάλυση του μικροβιακού φορτίου ριζικών σωλήνων δοντιών με ασυμπτωματικές και συμπτωματικές περιακρορριζικές βλάβες ενδοδοντικής αιτιολογίας με τη μέθοδο Pyrosequencing
Authors: Τζανετάκης Γεώργιος 
Published: August 2021

Εισαγωγή: Η παθογένεση των λοιμώξεων ενδοδοντικής αιτιολογίας συνδέεται με τους μικροοργανισμούς της στοματικής κοιλότητας, που αποικίζουν την πολφική κοιλότητα ως αποτέλεσμα της νέκρωσης του πολφού από τερηδόνα, οδοντικό τραύμα, χαίνουσες αποκαταστάσεις ή που πολλαπλασιάζονται εκ νέου λόγω αποτυχίας της ενδοδοντικής θεραπείας. Η λεπτομερής κατανόηση της μικροβιακής αιτιολογίας και των χαρακτηριστικών των ενδοδοντικών λοιμώξεων είναι αναγκαία για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών πρωτοκόλλων. Η διερεύνηση και ταυτοποίηση της μικροβιακής χλωρίδας που αποικίζει την πολφική κοιλότητα παραμένει ένα από τα πιο επίκαιρα θέματα στη Μικροβιολογία της Ενδοδοντολογίας με την πλειοψηφία των βακτηρίων, όπως υποστηρίζεται, να παραμένουν μη ταυτοποιήσιμα ή μη καλλιεργήσιμα. Μέχρι σήμερα, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ευρέος φάσματος καθώς και διάφορες μοριακές τεχνικές αποτύπωσης (DGGE, T-RFLP) έχουν ανιχνεύσει και προσδιορίσει μεγάλο τμήμα της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων. Ωστόσο και παρά την υψηλή ευαισθησία τους, οι παραπάνω μέθοδοι μπορούν να ανιχνεύσουν μόνο τους μικροοργανισμούς που ανευρίσκονται με υψηλή συγκέντρωση μέσα στην πολφική κοιλότητα. Ο απευθείας προσδιορισμός των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών 2ης γενεάς του τμήματος 16S του βακτηριακού DNA εισήχθη με σκοπό να δώσει λύση στο παραπάνω πρόβλημα. Η συγκεκριμένη τεχνολογία επιτρέπει την ανάγνωση ενός μεγάλου αριθμού αλληλουχιών σε μία και μόνη φορά, παρέχοντας ταυτόχρονα αυξημένο βάθος δειγματοληψίας σε σύγκριση με άλλες τεχνικές με αποτέλεσμα να επιτρέπει την ανίχνευση μικροοργανισμών που ανευρίσκονται με ιδιαίτερα χαμηλή συγκέντρωση μέσα στην πολφική κοιλότητα. Μέχρι σήμερα, οκτώ μόνο μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τη συγκεκριμένη τεχνολογία με σκοπό τη διερεύνηση της ενδορριζικής αλλά και εξωρριζικής μικροβιακής χλωρίδας. Από αυτές, μόνο δύο έχουν εξετάσει τη σύνθεση και την ποικιλότητα της μικροβιακής χλωρίδας σε ενδοδοντικά θεραπευμένα δόντια με περιακρορριζική αλλοίωση. Στις περιπτώσεις αυτές, παρατηρείται ένα σημαντικό κενό στη διεθνή βιβλιογραφία που έχει σχέση κυρίως με τους μικροοργανισμούς που ανευρίσκονται πιθανά σε χαμηλές συγκεντρώσεις μέσα στους ριζικούς σωλήνες. Παράλληλα, ένας σημαντικός αριθμός στοιχείων καταδεικνύουν μια σημαντική ετερογένεια όσον αφορά τη μικροβιακή χλωρίδα των ριζικών σωλήνων ανάμεσα σε γεωγραφικά απομακρυσμένους πληθυσμούς. Δεν είναι ακόμη σαφές αν αυτή η ετερογένεια είναι ένα τυχαίο εύρημα ή είναι πράγματι αποτέλεσμα γενετικών ή περιβαλλοντικών διαφορών μεταξύ των πληθυσμών αυτών. Όλα τα παραπάνω ωστόσο, ενισχύουν τη σημασία της περαιτέρω διερεύνησης της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε πιθανή βελτιστοποίηση των αντιμικροβιακών πρωτοκόλλων της χημικής επεξεργασίας. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της σύνθεσης και της ποικιλότητας του συνόλου της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων σε συμπτωματικές και ασυμπτωματικές πρωτογενείς και δευτερογενείς λοιμώξεις ενδοδοντικής αιτιολογίας σε Ελληνικό πληθυσμό, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Pyrosequencing. Υλικό και Μέθοδος: Ο προσδιορισμός μέσω πυροφωσφορικού των αλληλουχιών των παραγόμενων αμπλικονίων του τμήματος 16S του βακτηριακού DNA από τα 48 κλινικά μικροβιολογικά δείγματα έλαβε χώρα χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων HOMD και μια πιο ευρεία βάση, τη βάση Greengenes. Η σύγκριση της αφθονίας (ποσοστό επί του συνόλου ανά δείγμα) και παρουσίας (ποσοστό ανίχνευσης μεταξύ των δειγμάτων) βακτηριακών φύλων και γενών συνολικά και ανά κατηγορία έγινε με τη χρήση μη-παραμετρικών δοκιμασιών Wilcoxon και Fisher’s Exact και με οριακή τιμή P<0,05. Η σύγκριση των τιμών της βακτηριακής ποικιλότητας (δείκτες PD, S, Chao1, και Shannon) μεταξύ των 4 πειραματικών κατηγοριών έγινε μέσω ενός γραμμικού στατιστικού μοντέλου μικτών επιδράσεων (mixed-effects), λαμβάνοντας υπόψη την αλληλεξάρτηση δειγμάτων/δοντιών και συμμετεχόντων και εφαρμόζοντας τη διόρθωση Bonferroni της οριακής τιμής P λόγω πολλαπλών δυαδικών συγκρίσεων. Αποτελέσματα: Μετά τον έλεγχο της ποιότητας των αλληλουχιών, ανιχνεύθηκαν και εξασφαλίστηκαν συνολικά (και από τα 48 δείγματα) 406,070 αλληλουχίες με μέσο όρο 8,460 αλληλουχίες ανά δείγμα. Συμφωνα με τη βάση δεδομένων HOMD, στο επίπεδο των OTUs και σε επίπεδο ομοιομορφίας 97%, έλαβαν χώρα 339 παρατηρήσεις, οι οποίες ταξινομήθηκαν συνολικά σε 11 φύλα (phyla), 60 οικογένειες (families) και 109 γένη (genera). Τα φύλα με τις περισσότερες αλληλουχίες βρέθηκαν να είναι οι Bacteroidetes (36.2%), Firmicutes (32.9%), Actinobacteria (8.1%), Synergistetes (7.4%), Fusobacteria (7.4%), Proteobacteria (5.2%), Spirochaetes (1.9%), και Tenericutes (0.5%). Σημαντικά υψηλότερος αριθμός αλληλουχιών ανιχνεύθηκε για τα Proteobacteria (6.4% vs. 4.0%; P=0.02) και τις Tenericutes (0.1% vs. <0.05%; P=0.03) στις δευτερογενείς σε σχέση με τις πρωτογενείς λοιμώξεις. Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Greengenes, ανιχνεύθηκαν επιπρόσθετα 18 φύλα με ποσοστό ατομικά επι του συνολικού αριθμού αλληλουχιών κάτω του 0.2%. Μεταξύ αυτών, τα Cyanobacteria (0.018%) και τα Acidobacteria (0.007%) ανιχνεύθηκαν με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών. Τα Cyanobacteria ανιχνεύθηκαν στο 67% επί του συνόλου των δειγμάτων με ποσοστό αριθμού αλληλουχιών 0.3% ενώ τα Acidobacteria στο 42% επί του συνόλου των δειγμάτων με ποσοστό αριθμού αλληλουχιών 0.1%. Στο επίπεδο του γένους και σύμφωνα με τη βάση HOMD, γένη της οικογένειας Bacteroidaceae, το γένος Pyramidobacter και το γένος Parvimonas ανιχνεύθηκαν με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών στις πρωτογενείς λοιμώξεις ενώ το γένος Fusobacterium, γένη επίσης της οικογένειας Bacteroidaceae καθώς και το γένος Prevotella ανιχνεύθηκαν αντίστοιχα με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών στις δευτερογενείς λοιμώξεις. Στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά τον αριθμό των αλληλουχιών που ανιχνεύθηκαν μεταξύ δευτερογενών και πρωτογενών λοιμώξεων παρατηρήθηκαν για 14 γένη με περισσότερο αξιοσημείωτη την αυξημένη παρουσία στις δευτερογενείς λοιμώξεις των γενών Lactobacillus, Streptococcus, Sphingomonas, Mycoplasma και Ralstonia. Η αντίστροφη συσχέτιση, με αυξημένη παρουσία στις πρωτογενείς λοιμώξεις βρέθηκε για τα γένη Moryella και Alloprevotella. Οι δευτερογενείς λοιμώξεις κατέγραψαν υψηλότερη βακτηριακή φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις πρωτογενείς λοιμώξεις. Επίσης, οι συμπτωματικές πρωτογενείς λοιμώξεις κατέγραψαν υψηλότερη φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις αντίστοιχες ασυμπτωματικές. Αντίθετα, οι συμπτωματικές δευτερογενείς λοιμώξεις βρέθηκε να καταγράφουν χαμηλότερη φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις αντίστοιχες ασυμπτωματικές. Η στατιστική ανάλυση των ομοιοτήτων με βάση τις φυλογενετικές αποστάσεις UniFrac αποκάλυψε σημαντικές, παρά ταύτα, ασθενείς διαφορές όσον αφορά τη σύνθεση της μικροβιακής χλωρίδας που σχετίζονται τόσο με το είδος της λοίμωξης (R=0.087, P=0.005), με την ύπαρξη ή όχι συμπτωμάτων (R=0.055, P=0.047) όσο και συνδυαστικά των δύο παραπάνω καταστάσεων (R=0.093, P=0.007). Σύμφωνα επίσης, με τη βάση δεδομένων Greengenes, στις περιπτώσεις δοντιών με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση ανιχνεύθηκαν 24 βακτηριακά φύλα και 280 βακτηριακά γένη. Αντίθετα, στις περιπτώσεις ενδοδοντικά θεραπευμένων δοντιών ανιχνεύθηκαν 28 βακτηριακά φύλα και 347 βακτηριακά γένη. Τα φύλα Elusimicrobia, OP3, OP8, Planctomycetes και WS5 δεν ανιχνεύθηκαν στα δόντια με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση ενώ στα ενδοδοντικά θεραπευμένα δόντια δεν ανιχνεύθηκε το φύλο Gemmatimonadetes. Με τη βάση Greengenes ανιχνεύθηκαν επιπλέον βακτηριακά γένη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν τα γένη Candidatus solibacter (Acidobacteria), Sharpea (Firmicutes), Methylobacterium (Proteobacteria), Novosphingobium (Proteobacteria) και Jathinobacterium (Proteobacteria). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη προσφέρει μια νέα και ιδιαίτερα λεπτομερή χαρτογράφηση της μικροβιακής χλωρίδας που ευθύνεται τόσο για πρωτογενείς όσο και για εμμένουσες λοιμώξεις ενδοδοντικής αιτιολογίας. Με βάση τον αριθμό των φύλων και γενών που ανιχνεύθηκαν, η βακτηριακή ποικιλότητα της χλωρίδας των ριζικών σωλήνων σε ασθενείς στην Ελληνική Επικράτεια είναι εξίσου μεγάλη με αυτή που έχει ήδη περιγραφεί. Παράλληλα, η μικροβιακή χλωρίδα των ριζικών σωλήνων ενδοδοντικά θεραπευμένων δοντιών με περιακρορριζική αλλοίωση είναι σε σημαντικό βαθμό περισσότερο περίπλοκη και πολυποίκιλη από την αντίστοιχη των δοντιών με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση. Σύμφωνα επίσης με τη βάση δεδομένων Greengenes, μεγάλος αριθμός μικροοργανισμών δεν κατέστη δυνατό να ταυτοποιηθεί και που πιθανά να σχετίζεται με την ανάπτυξη περιακρορριζικής παθολογίας. Περαιτέρω μικροβιολογικές μελέτες απαιτείται να λάβουν χώρα στο μέλλον στη βάση αυτή για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών αυτών.