Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος συστήματος RhD του εμβρύου απο περιφερικό αίμα της εγκύου
Authors: Τούντα Γεωργία 
Published: August 2021

Ανοσοποίηση λόγω ασυμβατότητας του συστήματος Rhesus D (RhD) σε κυήσεις RhD-αρνητικών γυναικών που κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο θεωρείται η συχνότερη αιτία αιμολυτικής νόσου του εμβρύου και του νεογνού. Πρόληψη της ευαισθητοποίησης μπορεί να πραγματοποιηθεί με χορήγηση υπεράνοσης γ-σφαιρίνης (αντί-D) σε όλες τις RhD-αρνητικές εγκύους που πιθανώς κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο. Η αντί-D όμως προέρχεται από ανθρώπινο ορό και θεωρητικά υπάρχει κίνδυνος μετάδοσης λοιμώδους νοσήματος. Επιπλέον τα αποθέματα αντί-D παγκοσμίως δεν είναι απεριόριστα και η οικονομική επιβάρυνση είναι σημαντική. Υπολογίζεται ότι 40% περίπου των RhD-αρνητικών εγκύων λαμβάνουν άσκοπα ανοσοπροφύλαξη αφού κυοφορούν RhD-αρνητικό έμβρυο. Προγεννητικός έλεγχος του συστήματος RhD του εμβρύου είναι εφικτός με μελέτη γενετικού υλικού του εμβρύου που λαμβάνεται με αμνιοπαρακέντηση ή βιοψία τροφοβλάστης Οι τεχνικές αυτές όμως είναι επεμβατικές και έχουν 0,5-1,0% κίνδυνο αποβολής. Επιπλέον, στις RhD-αρνητικές εγκύους, αυξάνουν τον κίνδυνο ευαισθητοποίησης της μητέρας. Η ύπαρξη ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffDNA) στο περιφερικό αίμα της εγκύου έδωσε νέες δυνατότητες ανάπτυξης μη επεμβατικών τεχνικών προγεννητικού ελέγχου. Σκοπός της μελέτης είναι η προτύπωση και κλινική αξιολόγηση μεθόδων για αξιόπιστο μη επεμβατικό προσδιορισμό του συστήματος RhD του εμβρύου με ανίχνευση αλληλουχιών του RHD γονιδίου σε cffDNA που απομονώνεται από το πλάσμα RhD-αρνητικών εγκύων. Μελετήθηκαν 132 δείγματα περιφερικού αίματος RhD-αρνητικών εγκύων (7-24 εβδομάδες κύησης) από τα οποία 84 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των τεχνικών και 48 στη φάση της κλινικής εφαρμογής. Στην 1η φάση, ο προσδιορισμός του συστήματος RhD του εμβρύου έγινε με ανίχνευση του εξονίου 7 του RHD γονιδίου με RTQ-PCR. Για επιβεβαίωση της παρουσίας cffDNA χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία SRY του χρωμοσώματος Υ. Η διάγνωση ήταν ακριβής σε 37/40 δείγματα (92.5%). Διαγνώστηκαν επιτυχώς 30/32 RhD-θετικά και 7/8 RhD-αρνητικά έμβρυα (ευαισθησία 93.8% και ειδικότητα 87.5%). Στη 2η φάση προτυπώθηκε μεθοδολογία που επιβεβαιώνει την παρουσία εμβρυϊκού υλικού στο δείγμα με δείκτη ανεξάρτητο του φύλου ή πολυμορφισμών του εμβρύου. Βασίζεται στο πολλαπλό PCR μετά από ενζυμική πέψη με ευαίσθητη στη μεθυλίωση περιοριστική ενδονουκλεάση (AciI). Το πολλαπλό PCR περιλαμβάνει 5 ζεύγη εκκινητών για τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των εξονίων 7 και 10 του RHD γονιδίου (καθορισμός του συστήματος RhD του εμβρύου), του γονιδίου SRY (δείκτης παρουσίας cffDNA σε κυήσεις με έμβρυο αγόρι), του υποκινητή του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RASSF1A (δείκτης παρουσίας cffDNA) και του υποκινητή του γονιδίου ACTB (εσωτερικός μάρτυρας επιτυχούς ενζυμικής πέψης). Πρέπει να σημειωθεί ότι ο υποκινητής του RASSF1A είναι μεθυλιωμένος στα κύτταρα του πλακούντα και μη μεθυλιωμένες στα κύτταρα της μητρικής κυκλοφορίας οι οποίες και απομακρύνονται μετά από τη ενζυμική πέψη. Στη φάση αξιολόγησης της μεθοδολογίας, σε 1/84 έμβρυα διαπιστώθηκε πιθανή πολυμορφία του RHD και αποκλείστηκε από τη μελέτη. Ο προσδιορισμός του συστήματος RhD ήταν ακριβής σε 82/83 έμβρυα (98.8%) και παρατηρήθηκε 1 ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Διαγνώστηκαν επιτυχώς 53/53 RhD-θετικά και 29/30 RhD-αρνητικά έμβρυα (ευαισθησία 100% και ειδικότητα 96.7%). Κατά την κλινική εφαρμογή της μεθόδου σε 48 δείγματα, με τη χρήση του πολλαπλού PCR η διάγνωση ήταν επιτυχής σε όλα τα έμβρυα (37 RhD-θετικά και 11 RhD-αρνητικά). Η μεθοδολογία πολλαπλού PCR που σχεδιάστηκε στη μελέτη είναι πρωτότυπη διεθνώς και πλεονεκτεί γιατί εκτός από τη διάγνωση του συστήματος RhD του εμβρύου επιβεβαιώνει ταυτόχρονα την παρουσία εμβρυϊκού υλικού στο δείγμα. Με τον τρόπο αυτό διευκολύνεται η διάγνωση και σχεδόν μηδενίζεται η πιθανότητα ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Γνώση του συστήματος RhD του εμβρύου μπορεί να περιορίσει τη χορήγηση αντί-D μόνο σε όσες έγκυες γυναίκες υπάρχει πραγματική ένδειξη. Σε περίπτωση ήδη ευαισθητοποιημένης εγκύου πρώιμη ανίχνευση του συστήματος RhD του εμβρύου μπορεί να συμβάλλει αποφασιστικά στο τρόπο παρακολούθησης κάθε εγκυμοσύνης, δεδομένου ότι οι κυήσεις ευαισθητοποιημένων RhD-αρνητικών γυναικών που κυοφορούν RhD-θετικό έμβρυο είναι υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση αιμολυτικής νόσου του νεογνού ή του εμβρύου.