Επιλογή και χαρακτηρισμός θερμοανθεκτικών υδρολυτικών ενζύμων από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες οργανισμών από ακραία περιβάλλοντα
Authors: Ζαραφέτα Δήμητρα 
Published: September 2021

Oι υδρολάσες είναι μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την υδρόλυση ενόςμεγάλου εύρους υποστρωμάτων και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βιομηχανικέςβιομετατροπές προς την παραγωγή πληθώρας προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η χρήση τους δύναται να αντικαταστήσει τις καθαρά χημικές μεθόδους επεξεργασίαςτων υλικών καθώς απαιτεί ηπιότερες συνθήκες, και είναι αποδοτικότερη καιακριβέστερη λόγω της υψηλής εξειδίκευση των ενζύμων, οδηγώντας έτσι σε μια πιο «πράσινη» βιομηχανία. αρότι τα πλεονεκτήματα χρήσης των υδρολασών στη βιομηχανία είναι πολλά, η χρήση τους περιορίζεται από το γεγονός ότι οι συμβατικοί βιοκαταλύτες καθίστανται ανενεργοί στις υψηλές θερμοκρασίες και σε άλλες «αντίξοες» σύνηθες που συχνά επικρατούν στις βιομηχανικές διεργασίες. Το κόστος ψύξης και απομάκρυνσης των αποδιατακτικών παραγόντων πριν την προσθήκη των ενζύμων προς αποφυγή της αποδιάταξής τους, είναι τις περισσότερες φορές απαγορευτικό και αυτός είναι ο λόγος που περιορίζει την αντικατάσταση των κλασσικών χημικών κατεργασιών από ενζυμικές μετατροπές. ια λύση σε αυτό το πρόβλημα, που καθιστά τις ενζυμικές διεργασίες οικονομικά βιώσιμες, αποτελεί η χρήση θερμοσταθερών και εν γένει σταθερών υδρολασών. Για το λόγο αυτό, το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων έχει στραφεί τα τελευταία χρόνια στην ανακάλυψη θερμοσταθερών βιοκαταλυτών. Στη φύση, τα ένζυμα αυτά απαντώνται στην πρωτεϊνική φαρέτρα των ακραιόφιλων οργανισμών, των οργανισμών δηλαδή που έχουν προσαρμοστεί σε ακραία περιβάλλοντα μέσω της εξελικτικής πίεσης. Επειδή όμως το 99% της μικροβιακής βιοποικιλότητας δεν μπορεί να καλλιεργηθεί στο εργαστήριο, για χρόνια, η συντριπτική πλειοψηφία των οργανισμών αυτών και των πρωτεϊνών τους παρέμεινε ανεξερεύνητη. Τα τελευταία χρόνια, μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης που απαλείφει την ανάγκη της μικροβιολογικής καλλιέργειας, οι βιοτεχνολόγοι απέκτησαν πρόσβαση στον τεράστιο πρωτεϊνοχώρο των ακραιόφιλων οργανισμών. Σε αυτή τη διατριβή, η οποία εκπονήθηκε στο πλαίσιο της διεθνούς κοινοπραξίας “Hotzyme”, η βιοπληροφορικής και η in vivo λειτουργικής σάρωσης μεταγονιδιωματικών βιβλιοθηκών που προέκυψαν από δειγματοληψίες ακραίων ενδιαιτημάτων, οδήγησε στην ανακάλυψη τριών νέων θερμοσταθερών υδρολασών. Τα αντίστοιχα γονίδια που κωδικοποιούν για αυτές τις υδρολάσες εντοπίστηκαν και ανακτήθηκαν από τις μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες, και μετά από ετερόλογη έκφραση τους σε βακτηριακά κύτταρα E. coli, τα ανασυνδυασμένη ένζυμααπμονώθηκαν και μελετήθηκαν βιοχημικά. Συνοπτικά, το πρώτο ένζυμο που απομονώθηκε είναι η θερμοανθεκτική κυτταρινάση CelDZ1. Η CelDZ1 προέκυψε από τη βιοπληροφορική σάρωση δείγματος εμπλουτισμού σλανδικής θερμοπηγής και ανήκει στη οικογένεια GH5. Η CelDZ1 είναι μια θερμοανθεκτική, οξεόφιλη κυτταρινάση με βέλτιστες συνθήκες δράσης το pH 5 και τους 70 oC. αράλληλα, η νέα κυτταρινάση παρουσιάζει εντυπωσιακή αλοανθεκτικότητα και αλοσταθερότητα αφού διατηρεί την ενεργότητα της σε συγκεντρώσεις αλάτων που τείνουν στον κορεσμό. Σε συνεργασία με τους εταίρους μας μελετήθηκε η κρυσταλλική της δομή η οποία αποκάλυψε ότι η CelDZ1 διαφέρει από τις ομόλογες πρωτεΐνες καθώς υπολείπεται της υποπεριοχής-2 πρόσδεσης των σακχαριτών. Το δεύτερο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβή είναι η εστεράση EstDZ2, η οποία προέκυψε μέσω βιοπληροφορικής σάρωσης του μεταγονιδιωματικού υλικού ωσικής θερμοπηγής. Η νέα εστεράση είναι θερμοσταθερή, με χρόνο ημιζωής πάνω από έξι ώρες στους 60 οC και παρουσιάζει εξαιρετική σταθερότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Η φυλογενετική μελέτη της νέας εστεράσης έδειξε ότι η EstDZ2 εγκαινιάζει μια νέα οικογένεια λιπολυτικών ενζύμων που φέρει το χαρακτηριστικό καταλυτικό αμινοξικό μοτίβο GHSAG, την οποία και ονομάσαμε ικογένεια XV. αράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της τρισδιάστατης δομής της EstDZ2 έδειξε ότι πιθανότατα το νέο ένζυμο να υπολείπεται μεγάλο μέρος της χαρακτηριστικής δομής του «πρωτεϊνικού καπακιού» που συναντάται στις δομές των μελών της κοντινότερης οικογένειας V των λιπολυτικών ενζύμων.Τέλος, το τρίτο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβήείναι η εστεράση EstDZ3, ένα υπερ-θερμοσταθερό ένζυμο που διατηρεί τηνκαταλυτική του δράση ακόμα και μετά από πολύωρη επώαση σε θερμοκρασίες κοντά στο βρασμό. H νέα εστεράση εντοπίστηκε μετά από in vivo λειτουργική σάρωση του γενετικού υλικού βακτηριακού στελέχους που απομονώθηκε από δείγμα εμπλουτισμού κινεζικής θερμοπηγής. έρα από την εξαιρετική θερμοσταθερότητα της, η ΕstDZ3 παρουσιάζει σταθερότητα και σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Παράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της δομής της, έδειξε ότι πρόκειται για ένα ένζυμο που φέρει ένα πρωτεϊνικό ένθετο της δομής α/β, παρόμοιο με αυτό της πλησιέστερης δομικά πρωτεΐνης, που προβλέπεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην εκλεκτικότητα του ενζύμου. Και τα τρία νέα ένζυμα παρουσιάζουν χαμηλή ομολογία με ήδη γνωστές και χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες κάτι που σε συνδυασμό με τα ενδιαφέροντα βιοχημικά και δομικά τους χαρακτηριστικά τα καθιστά τόσο υποψήφιους βιοκαταλύτες γιαβιοτεχνολογικές εφαρμογές όσο και μοριακά μοντέλα για τη μελέτη της θερμοσταθερότητας των πρωτεϊνών και όχι μόνο.