Η εμπλοκή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L4 και L22 στη διέλευση των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδικών αλυσίδων μέσω της κύριας διόδου εξόδου από το ριβόσωμα
Authors: Τσαγκάλια Αικατερίνη 
Published: January 2014

Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L4 και L22 στην διέλευση των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδικών αλυσίδων από κύριο κανάλι εξόδου από το ριβόσωμα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν E. coli στελέχη στα ριβοσώματα των οποίων η διάμετρος του καναλιού εξόδου των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδίων ήταν μικρότερη (Ν282) ή μεγαλύτερη (Ν281) σε σχέση με την διάμετρο των άγριου τύπου στελεχών (ΑΒ301). Η στένωση η διεύρυνση του καναλιού που αποκαλύφθηκε από μελέτες κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας στην οποία αποδίδεται και η αυξημένη αντίσταση έναντι του μακρολιδίου ερυθρομυκίνη, οφείλεται σε συγκεκριμένες μεταλλάξεις που φέρουν οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες wtL4 (Lys63Glu) και wtL22 (Met82-Lys83-Arg84) στα στελέχη Ν282 και Ν281 αντίστοιχα. Για μελέτες της in vivo λειτουργικότητας αυτών των στελεχών χρησιμοποιήθηκε η SRPK1 κινάση. Ο προσδιορισμός δράσης του καθαρού ένζυμου που προέκυψε και από τα τρία στελέχη ΑΒ301 Ν282 και Ν281 έδειξε ότι τα στελέχη Ν281 που έφεραν την L22-Δery (απαλοιφή Met82-Lys83-Arg84) εμφάνισαν αυξημένη βιοσυνθετική ικανότητα σε σχέση με εκείνα άγριου τύπου. Τα Ν282 στελέχη με την μεταλλαγμένη L4 Lys63Glu είχαν μειωμένη βιοσυνθετική ικανότητα όπως αναμενόταν. Αντίθετα αναφορικά με τις in vitro μελέτες ο ρυθμός βιοσύνθεσης της GFPem στα πρώτα 15 min βρέθηκε τέσσερις φορές μικρότερος για τα ριβοσώματα προερχόμενα από τα Ν282 στελέχη και μειωμένος κατά το ήμισυ για τα ριβοσώματα των Ν281 στελεχών σε σχέση με τον ρυθμό βιοσύνθεσης των άγριου τύπου ριβοσωμάτων από τα ΑΒ301 στελέχη E coli BL21DE3 κύτταρα μετασχηματισμένα με τον ανασυνδυασμένο φορέα pET-29c με την EcL4Glu51Ala ανέπτυξαν αυξημένη ευαισθησία έναντι της ερυθρομυκίνης σε αντίθεση με την αυξημένη αντίσταση που είχε παρατηρηθεί για τα Ν282 στελέχη. Το αποτέλεσμα αυτό παραπέμπει σε μια πιθανή εμπλοκή του συγκεκριμένου αμινοξέος και κατ’ επέκταση του βρόγχου στην σταθεροποίηση της γεωμετρίας του καναλιού εξόδου των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων. Ριβοσώματα ανασυγκροτημένα in vitro στα οποία είχαν αντικατασταθεί η η wtL4 ή η wtL22 με μεταλλάγματα των πρωτεϊνών αυτών (απάλειψη σταδιακά αυξανομένου μεγέθους τμημάτων των βρόγχων) υπεβλήθησαν σε δοκιμή poly(phe) σύνθεση. Βρέθηκε ότι τα «mutL4 - ανασυγκροτημένα» ριβοσώματα ήταν λιγότερο δραστικά σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL4. Παρόμοια χαμηλή δραστικότητα εμφάνισαν και τα ριβοσωματα που είχαν ενσωματωμένη την L4Glu51Ala. Τα ανασυγκροτημένα ριβοσωματα με τα αντίστοιχα μεταλλάγματα της L22, έκτος εκείνου της L22-Δloop1 (απαλοιφή 11 αμινοξέων 85-95 από το σύνολο των 110 αμινοξέων της πρωτεΐνης) εμφάνισαν επίσης χαμηλή δραστικότητα Αντίθετα η σύνθεση της poly(phe) σύνθεση. Βρέθηκε ότι τα «mutL4 - ανασυγκροτημένα» ριβοσώματα ήταν λιγότερο δραστικά σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL4. Παρόμοια χαμηλή δραστικότητα εμφάνισαν και τα ριβοσώματα που είχαν ενσωματωμένη την L4Glu51Ala. Τα ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με τα αντίστοιχα μεταλλάγματα της L22, έκτος εκείνου της L22-Δloop1 (απαλοιφή 11 αμινοξέων 85-95 από το σύνολο των 110 αμινοξέων της πρωτεΐνης) εμφάνισαν επίσης χαμηλή δραστικότητα. Αντίθετα η σύνθεση της poly(phe) βρέθηκε αυξημένη κατά 50% σε ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με ενσωματωμένη την L22-Δloop1 σε σχέση με εκείνα που έφεραν την wtL22. Η αυξημένη αυτή λειτουργικότητα των L22-Δloop1- ανασυγκροτημένων ριβοσωμάτων μελετήθηκε περαιτέρω με απομόνωση ριβοσωμάτων τα οποία είχαν ενσωματώσει in vivo την L22-Δloop1 και πειράματα αντίδρασης της πουρομυκίνης. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η δράση της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης ήταν παρόμοια με εκείνη που εμφάνισαν τα άγριου τύπου ριβοσώματα η ικανότητα όμως πρόσδεσης των υποστρωμάτων στην Α-θέση ήταν διπλάσια. Η εμπλοκή επομένως κάποιων συγκεκριμένων αμινοξέων του βρόγχου των L4 και L22 τόσο στην γεωμετρία του καναλιού εξόδου όσο και στην ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, είναι πιθανή και χρειάζεται να μελετηθεί περαιτέρω.