Δομικές μελέτες ενζύμων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος με έμφαση στις β-υδρολάσες αποικοδόμησης της φυτικής βιομάζας
Authors: Σωτηροπούλου Αναστασία 
Published: February 2025

Η αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρίνης ως πηγή ανηγμένου άνθρακα για την παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών, αποτελεί μια από τις πλέον σύγχρονες ερευνητικές κατευθύνσεις της βιομηχανικής βιοτεχνολογίας. Για τον σκοπό αυτό η εύρεση τρόπων βελτίωσης των ρυθμών υδρόλυσης των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, με τη βοήθεια σταθερών βιοκαταλυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, έχει καταστεί αναγκαία. Η αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρίνης, στην περίπτωση των αναερόβιων κυτταρινολυτικών βακτηρίων, πραγματοποιείται μέσω της έκκρισης πολυπρωτεϊνικών συμπλεγμάτων τα οποία ονομάζονται κυτταρινοσώματα. Τα κυτταρινοσώματα συγκροτούνται από την κύρια πρωτεϊνική υπομονάδα στήριξης (scaffoldin), η οποία συντίθεται από τις επί μέρους μονάδες σύνδεσης (cohesins) και η οποία φέρει μία μόνο θέση πρόσδεσης στην κυτταρίνη (Cellulose Binding Module, CBM) σε αντίθεση με τα ελεύθερα υδρολυτικά ένζυμα που φέρουν μια CBM έκαστο. Πάνω στην υπομονάδα στήριξης μπορεί να προσδεθούν, μέσω ισχυρών δια-πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, μια σειρά από υδρολυτικά ένζυμα που διαθέτουν επικράτειες αγκίστρωσης (dockerins) συμπληρωματικές ως προς τις αντίστοιχες μονάδες σύνδεσης. Οι δομικές μελέτες των επί μέρους ενζύμων που συνθέτουν το τεχνητό κυτταρινόσωμα είναι απαραίτητες για την ανάδειξη των σχέσεων δομής-δράσης/λειτουργίας των τεχνητών κυτταρινοσωμάτων, αλλά και για τη διεξαγωγή των κατάλληλων τροποποιήσεων προκειμένου να γίνουν ιδανικοί βιοκαταλύτες (tailor-made biocatalysts). Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν οι εξής στόχοι: β-γλυκοζιδάση (βGl) από τον μικροοργανισμό Caldicellulosiruptor sacchrolyticus, το χιμερικό ένζυμο βGl:doct που φέρει επικράτεια αγκίστρωσης t από το Clostridium thermocellum (βGl-doct), κυτταρινάση Cel5 από το θερμόφιλο βακτήριο Geobacillus sp50 (Cel5) και χιμερικό ένζυμο Cel5:doct. Για την έκφραση των μακρομοριακών στόχων χρησιμοποιήθηκαν πλασμίδια τύπου pET, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και μοριακής διήθησης και υποβλήθηκαν σε δοκιμές κρυστάλλωσης με χρήση συμβατικών και ρομποτικών διατάξεων. Εξ’ αυτών για όσες πρωτεΐνες αναπτύχθηκαν κρύσταλλοι ακολούθησε έκθεση σε ακτίνες Χ συγχροτρονικής ακτινοβολίας στο PETRA III / EMBL-Hamburg Unit, c/o DESY, Hamburg, Germany και o δομικός χαρακτηρισμός αυτών, ενώ για τις υπόλοιπες που μελετήθηκαν πραγματοποιήθηκαν in silicο μελέτες για τον προσδιορισμό, υπολογιστικά, της τριδιάστατης δομής τους. Ειδικότερα, προσδιορίστηκε η τριδιάστατη δομή της β-Gl, με χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, σε διακριτική ικανότητα 1.47 Å καθώς και ενός συμπλόκου αυτής με ένα μόριο β-D-γλυκόζης, προϊόν της καταλυτικής δράσης του ενζύμου όταν χρησιμοποιήθηκε η λακτόζη ως υπόστρωμα, σε διακριτική ικανότητα 1.95 Å. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τριδιάστατη δομή της βGl από Caldicellulosiruptor sacchrolyticus ακολουθεί το τυπικό δίπλωμα της οικογενείας GH1 και στο καταλυτικό κέντρο του ενζύμου, αμινοξέα Glu163 και Glu361, ο υπολογισμός του χάρτη διαφοράς ηλεκτρονιακής πυκνότητας 2Fo-Fc και Fo-Fc έδειξε ότι για το μεν ένζυμο χωρίς υπόστρωμα, στο καταλυτικό κέντρο είχε προσδεθεί ένα μόριο γλυκερόλης το οποίο αλληλεπιδρά με τα καταλυτικά αμινοξέα, ενώ όταν είχε χρησιμοποιηθεί η λακτόζη ως υπόστρωμα στο καταλυτικό κέντρο υπήρχε ικανή πυκνότητα να φιλοξενήσει ένα μόριο β-D-γλυκόζης το οποίο προέκυψε ως προϊόν της κατάλυσης που πραγματοποιήθηκε στον κρύσταλλο. Σύγκριση της δομής της βGl με άλλες ομόλογες β-γλυκοζιδάσες είτε ως προς την αμινοξική ακολουθία είτε ως προς τη δομή, έδειξε ότι η βGl είναι αρκετά όμοια εκτός από την υποπεριοχή (226-241) όπου αποτελείται από έναν εύκαμπτο βρόχο που λαμβάνει αρκετά διαφορετική διαμόρφωση έναντι των άλλων ενζύμων και μπορεί να αποτελέσει στόχο για περαιτέρω μελέτες πρωτεϊνικής μηχανικής για την περαιτέρω διερεύνηση και τον πλήρη χαρακτηρισμό της λειτουργικής ιδιότητας αυτής της περιοχής. Επίσης, αναπτύχθηκαν κρύσταλλοι για το χιμαιρικό ένζυμο βGl:doct, σε περισσότερες από μια συνθήκες, συλλέχθηκαν δεδομένα περίθλασης σε χαμηλή διακριτική ικανότητα περί τα 4.2 Å με έκθεση περισσοτέρων από έναν κρυστάλλων και ο υπολογισμός του χάρτη διαφοράς ηλεκτρονιακής πυκνότητας 2Fo-Fc και Fo-Fc έδειξε ότι δεν υπάρχει πρόσθετη ηλεκτρονιακή πυκνότητα για το τμήμα της doct παρά μόνο για την βGl. Για τον σκοπό αυτό έγιναν υπολογιστικές μελέτες για το χιμερικό ένζυμο βGl:doct με τη χρήση του εξυπηρετητή iTASSER-MTD κατάλληλο για ακριβέστερες προβλέψεις για τριδιάστατες δομές πρωτεϊνών με περισσότερες από μια περιοχές καθώς και με το AlphaFold. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο βρόχος που συνδέει τη βGl με την doct είναι αρκετά εύκαμπτος και αποτέλεσε ιδιαίτερη πρόκληση για τον προσδιορισμό της σχετικής τους θέσης υπολογιστικά. Η δομή της doct όταν αυτή είναι μόνη της είναι αρκετά σταθερή πλούσια σε δευτεροταγή στοιχεία που σχηματίζουν ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου. Στο χιμαιρικό ένζυμο βGl:doct μόνον ο εξυπηρετητής iTASSER-MTD, ο οποίος έχει τη δυνατότητα να λαμβάνει υπ΄όψιν επί μέρους υποπεριοχές, έδωσε τα βέλτιστα αποτελέσματα τα οποία φέρουν τις δύο υποπεριοχές να συνδέονται με έναν βρόχο που λειτουργεί ως «φουρκέτα» (hairpin), η διαμόρφωση του οποίου υπαγορεύει και την τεταρτοταγή δομή του χιμαιρικού ενζύμου. Περαιτέρω μελέτες με σημειακές ή/και πολλαπλές μεταλλάξεις που θα διερευνήσουν την ευκαμψία του εν λόγω βρόχου ως προς τη λειτουργία του ενζύμου, θα συνεισφέρουν στην καλύτερη κατανόηση του ρόλου αυτής της περιοχής. Στην περίπτωση της κυτταρινάσης και του χιμερικού ενζύμου Cel5:doct, πραγματοποιήθηκαν, κατ΄ αναλογία των προηγούμενων ενζύμων, δοκιμές κρυστάλλωσης οι οποίες όμως δεν έδωσαν κρυστάλλους κατάλληλης ποιότητας για τη συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Για αυτόν τον λόγο ακολουθήθηκε η υπολογιστική προσέγγιση με χρήση του εξυπηρετητή iTasser-MTD και σε αυτήν την περίπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο μέρος των δευτεροταγών στοιχείων της cel5 ακολουθούν το δίπλωμα της οικογενείας GH5 στην οποία ανήκουν ενώ και σε αυτήν την περίπτωση ο εύκαμπτος βρόχος που συνδέει τις δύο υποπεριοχές cel5 και doct λειτουργεί ξανά ως φουρκέτα παρεμποδίζοντας τον ακριβή προσδιορισμό της τριδιάστατης δομής. Συμπερασματικά, η μελέτη τόσο των διακριτών όσο και των χιμαιρικών ενζύμων αφορά στη εξαγωγή των δομικών αυτών χαρακτηριστικών που υποδεικνύουν τις δέουσες τροποποιήσεις για τον ορθολογικό σχεδιασμό τεχνητών κυτταρινοσωμάτων ως ιδανικών βιοκαταλυτών, η «σύσταση» των οποίων θα δύναται να προσαρμόζεται κατά περίπτωση. Η χρήση των οργανισμών Caldicellulosiruptor και Geobacillus τα οποία έχουν απομονωθεί από "θερμά" ενδιαιτήματα του Ελλαδικού χώρου παρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον γιατί προσδίδουν στα παραγόμενα ένζυμα επιθυμητές ιδιότητες για την αξιοποίησή τους σε βιομηχανικές διεργασίες.