Identification and control of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices by Ultra High Pressure processing
Authors: Σουρρή Πάτρα-Πέγκυ 
Published: October 2022

Οι χυμοί φρούτων κατέχουν σημαντική θέση στην υγιεινή διατροφή του ανθρώπου. Θεωρούνται ασφαλή προϊόντα ραφιού λόγω της χαμηλής τιμής του pH που αποτρέπει την ανάπτυξη των περισσοτέρων βακτηρίων. Παρόλα αυτά θερμοανθεκτικά και οξυανθεκτικά σπορογόνα βακτήρια του γένους Alicyclobacillus είναι πιθανόν να προκαλέσουν την αλλοίωση των παστεριωμένων χυμών φρούτων. Η αλλοίωση χωρίς την εμφανή διόγκωση της συσκευασίας λόγω παραγωγής αερίων αλλά η παρουσία χημικών ενώσεων αλλοίωσης (κυρίως γουαϊακόλης) και η ικανότητα των σπορίων του βακτηρίου Alicyclobacillus να επιβιώνουν μετά την παστερίωση και να εκβλαστάνουν κάτω από ευνοϊκές συνθήκες, τα καθιστούν μείζων πρόβλημα για την βιομηχανία χυμών φρούτων παγκοσμίως. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους και η παρουσία τους στη βιομηχανία φρουτοχυμών, καθιστά την έγκαιρη ανίχνευση τους μεγάλη πρόκληση για την ελαχιστοποίηση οικονομικών απωλειών. Επιπρόσθετα πρωταρχικής σημασίας είναι η ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου με στόχο την αδρανοποίηση των σπορίων και των βλαστικών μορφών του βακτηρίου Alicyclobacillus. Η υπερυψηλή υδροστατική πίεση έχει χαρακτηριστεί ως η σημαντικότερη τεχνολογία μη θερμικής επεξεργασίας , η οποία μπορεί να διασφαλίσει τη μικροβιακή ασφάλεια και τη θρεπτική αξία των χυμών φρούτων. Επιπλέον, σε συνδυασμό με μέτριες έως υψηλές θερμοκρασίες η υπερυψηλή πίεση έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στην αδρανοποίηση βακτηριακών σπορίων. Συνεπώς, ο σκοπός της εν λόγω διδακτορικής διατριβής ήταν αρχικά η διερεύνηση της παρουσίας του βακτηρίου Alicyclobacillus σε χυμούς φρούτων, η απομόνωση των αποικιών, η ταυτοποίηση τους με RFLP PCR και ο έλεγχος της δυνατότητας τους να παράγουν γουαϊακόλη. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση της υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης στην αδρανοποίηση των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων του βακτηρίου Alicyclobacillus acidoterrestris σε εμπορικό δείγμα χυμού πορτοκαλιού και ροδάκινου αμέσως μετά την επεξεργασία και κατά τη διάρκεια της συντήρησης σε διαφορετικές θερμοκρασίες.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε έλεγχος σε εμπορικά δείγματα χυμών πορτοκαλιού και ροδάκινου από την ελληνική αγορά (Κεφάλαιο 2). Για το σκοπό αυτό, χυμοί ψυγείου και ραφιού από πορτοκάλι και ροδάκινο αναλύθηκαν φυσικοχημικά και μικροβιολογικά. Ο μικροβιολογικός έλεγχος είχε ως σκοπό την απαρίθμηση της ολικής αερόβιας μικροβιακής χλωρίδας, του πληθυσμού των οξυγαλακτικών βακτηρίων, των ζυμών και μυκήτων καθώς επίσης και του βακτηρίου Alicyclobacillus spp., ενώ ο φυσικοχημικός έλεγχος περιλάμβανε την μέτρηση της τιμής του pH και τη συγκέντρωση των ολικών διαλυτών στερεών. Τα αποτελέσματα έδειξαν χαμηλούς πληθυσμούς από τους εξεταζόμενους μικροοργανισμούς, αλλά επιβεβαίωσαν την παρουσία του βακτηρίου Alicyclobacillus spp. στους χυμούς.Στο Κεφάλαιο 3, απομονώσεις του βακτηρίου Alicyclobacillus spp. από χυμό πορτοκάλι που επιβεβαιώθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο IFU που αναπτύχθηκε από την Ομάδα Εργασίας για την Μικροβιολογία της Διεθνούς Ομοσπονδίας Παραγωγών Χυμών Φρούτων, αναλύθηκαν με την χρήση της μοριακής τεχνικής 16S rDNA PCR RFLP με 3 ένζυμα περιορισμού (HhaI, RSa I and HiNFI), για ταχεία ταυτοποίηση. Επιπροσθέτως, όλες οι απομονώσεις του βακτηρίου Alicyclobacillus ελέγχθηκαν για τη δυνατότητα παραγωγής γουαϊακόλης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τεχνική PCR RFLP ομαδοποίησε τις απομονώσεις σε 8 ομάδες, εκ των οποίων 7 ήταν διαφορετικές από το χρησιμοποιούμενο στέλεχος αναφοράς. Επίσης, όλες οι απομονώσεις είχαν τη δυνατότητα παραγωγής γουαϊακόλης. Για την ταυτοποίηση των απομόνωσεων σε επίπεδο είδους χρησιμοποιήθηκε μονοενζυματική PCR RFLP. Για τον σκοπό αυτό, 78 απομονώσεις Alicyclobacillus υποβλήθηκαν σε ανάλυση PCR RFLP με τη χρήση εκκινητών για την ενίσχυση της V1-V3 μεταβλητής περιοχής του 16S rDNA γονιδίου και του περιοριστικού ενζύμου HhaI. Με την εφαρμογή της τεχνικής PCR RFLP οι απομονώσεις των A. acidoterrestris διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς από εκείνες των A. acidocaldarius και A. hesperidum.Η παρουσία του βακτηρίου A. acidoterrestris στους χυμούς φρούτων μπορεί να επιφέρει σοβαρά προβλήματα αλλοίωσης. Για τον λόγο αυτό, διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης στην αδρανοποίηση των σπορίων του βακτηρίου A. acidoterrestris (Κεφάλαιο 4). Συγκεκριμένα, σπόρια από δύο στελέχη του εν λόγω βακτηρίου (ένα άγριο στέλεχος απομονωμένο από χυμό μήλου και ένα στέλεχος αναφοράς) εμβολιάστηκαν σε χυμό πορτοκάλι και υποβλήθηκαν σε υπερυψηλή υδροστατική πίεση σε 500 και 600 MPa σε συνδυασμό με ταυτόχρονη θέρμανση σε διαφορετικές θερμοκρασίες (25, 45, 60, and 70 °C) και διάρκεια έως 30 min (1, 3, 5, 15 και 30 min). Στη συνέχεια το πρωτογενές μοντέλο Weibull προσαρμόστηκε στα πειραματικά δεδομένα της αδρανοποίησης των δύο στελεχών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αδρανοποίηση των σπορίων αυξάνονταν με την αύξηση των επιπέδων πίεσης και θερμοκρασίας. Πλήρης αδρανοποίηση των σπορίων και για τα δύο στελέχη επιτεύχθηκε στην υψηλότερη πίεση (600 MPa) και την υψηλότερη θερμοκρασία (70 °C). Επίσης παρατηρήθηκε ότι το μοντέλο Weibull μπόρεσε να περιγράψει ικανοποιητικά την αδρανοποίηση των σπορίων του βακτηρίου A. acidoterrestris για τα διαφορετικά επίπεδα πίεσης και θερμοκρασίας. Παρότι η αδρανοποίηση του βακτηρίου A. acidoterrestris έχει μελετηθεί εκτενώς, η επιβίωση των σπορίων και των βλαστικών μορφών του μικροοργανισμού κατά τη διάρκεια της συντήρησης των χυμών φρούτων μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ, δεν έχει τεκμηριωθεί επαρκώς. Για τον σκοπό αυτό, στο Κεφάλαιο 5 δείγματα πορτοκαλοχυμού εμβολιάστηκαν με τα σπόρια δύο στελεχών του βακτηρίου A. acidoterrestris -που χρησιμοποιήθηκαν και στην μελέτη του Κεφαλαίου 4- και υποβλήθηκαν σε ΥΥΠ σε 600 MPa/60 °C για 5 και 10 min αντίστοιχα. Τόσο τα επεξεργασμένα όσο και τα μη επεξεργασμένα δείγματα (μάρτυρας) συντηρήθηκαν σε θερμοκρασίες 4, 12 και 25 °C για 60 ημέρες. Στα δείγματα πραγματοποιούνταν μικροβιολογικές αναλύσεις κάθε εβδομάδα ώστε να καταγραφεί η μεταβολή του πληθυσμού των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της συντήρησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση της εκβλάστησης των σπορίων που επιβίωσαν από την επεξεργασία, το μέγεθος της οποίας καθορίστηκε από το στέλεχος του βακτηρίου, την πίεση, τον χρόνο επεξεργασίας και την θερμοκρασία συντήρησης, ενώ τα εναπομείναντα βλαστικά κύτταρα δεν ανιχνεύθηκαν κατά την συντήρηση του χυμού σε χαμηλές θερμοκρασίες. Επίσης, με σκοπό την μελέτη της δυναμικής των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων κατά την συντήρηση των χυμών σε υψηλότερες θερμοκρασίες, σπόρια του στελέχους αναφοράς A. acidoterrestris ATCC 49025 εμβολιάστηκαν σε δείγματα χυμού ροδάκινου. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ΥΥΠ σε 500 και 600 MPa σε συνδυασμό με ταυτόχρονη θέρμανση (25, 45 και 60 °C) για 10 min. Επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα (μάρτυρας) δείγματα χυμού ροδάκινου συντηρήθηκαν σε θερμοκρασίες 25, 35 και 45 °C και αναλύθηκαν μικροβιολογικά για χρονικό διάστημα έως 240 h. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επεξεργασία με ΥΥΠ σε 600 MPa/60 °C/10 min μπόρεσε να εξουδετερώσει τα σπόρια του βακτηρίου κατά την συντήρηση του χυμού σε θερμοκρασία 25 °C, ενώ o πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων μπόρεσε να εξαλειφθεί με την ίδια επεξεργασία σε όλες τις εξεταζόμενες θερμοκρασίες συντήρησης του χυμού.