Διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ ριζοβακτηρίων που προωθούν τη φυτική ανάπτυξη (PGPR) και γεωργικών φαρμάκων
Authors: Μυρεσιώτης Χαράλαμπος 
Published: August 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης συγκεκριμένων ριζοβακτηρίων που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR) του γένους Bacillus (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03) στην αποδόμηση γεωργικών φαρμάκων και η μελέτη των πιθανών επιδράσεων των γεωργικών φαρμάκων στους βακτηριακούς πληθυσμούς. Μελετήθηκαν πέντε γεωργικά φάρμακα διαφορετικών χημικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένων των acibenzolar-S-methyl (ενεργοποιητής SAR), metribuzin και napropamide (ζιζανιοκτόνα), propamocarb hydrochloride (μυκητοκτόνο) και thiamethoxam (εντομοκτόνο). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ελεγχόμενες συνθήκες σε θρεπτικά υποστρώματα και εδάφη αγρού σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισμό των υπολειμμάτων των παραπάνω ουσιών αναπτύχθηκε νέα μέθοδος εκχύλισης και η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας συνδεδεμένο με ανιχνευτή φασματομετρίας μάζας τριπλού τετραπόλου (LC-MS/MS) και σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας με ανιχνευτή με διάταξη φωτοδιόδων (HPLC-DAD). Οι βακτηριακοί πληθυσμοί (CFU) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων και της επιφανειακής επίστρωσης. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η εισαγωγή εμβολίων PGPR σε αποστειρωμένες συνθήκες (υγρές καλλιέργειες και αποστειρωμένο έδαφος) αύξησε σημαντικά την αποδόμηση ορισμένων γεωργικών φαρμάκων. Το acibenzolar-S-methyl σε υγρές καλλιέργειες των ριζοβακτηρίων αποδομήθηκε σε 24 ώρες κατά 58 έως 100% και το στέλεχος B. pumilus SE34 παρουσίασε τη μεγαλύτερη ταχύτητα αποδόμησης. Στα υπόλοιπα γεωργικά φάρμακα, ο εμβολιασμός των υποστρωμάτων με τα στελέχη PGPR προκάλεσε αποδόμηση των metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam που κυμάνθηκε στις διάφορες επεμβάσεις μεταξύ 8-18%, 9-11%, 15-36% και 11-22%, αντίστοιχα, με την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης. Σε αποστειρωμένο έδαφος, το acibenzolar-S-methyl εμφάνισε παρόμοια συμπεριφορά με ταχεία αποδόμηση και τιμές DT50 <16.4 ημέρες στις επεμβάσεις με τα PGPR σε σύγκριση με τιμές DT50>34.2 ημέρες που προσδιορίστηκαν στους μάρτυρες. Ο ρυθμός αποδόμησης των propamocarb hydrochloride και thiamethoxam αυξήθηκε σε εδαφικά δείγματα που ενσωματώθηκαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34, σε σχέση με δείγματα που δεν δέχτηκαν βακτηριακή μεταχείριση. Ωστόσο, ο εμβολιασμός των βακτηρίων PGPR σε φυσικό έδαφος αγρού δεν επηρέασε το ρυθμό αποδόμησης των γεωργικών φαρμάκων που μελετήθηκαν. Η βακτηριακή ανάπτυξη παρουσία των γεωργικών φαρμάκων και στα δύο επίπεδα επιφόρτισης ήταν ικανοποιητική και μάλιστα σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε ακόμη και διεγερτική δράση των ουσιών στην ανάπτυξη των βακτηρίων, αυξάνοντας τους πληθυσμούς των βακτηριακών κυττάρων. Η περαιτέρω έρευνα επικεντρώθηκε στη συμπεριφορά και τύχη του acibenzolar-S-methyl στη ριζόσφαιρα φυτών τομάτας, που αναπτύχθηκαν σε θερμοκηπιακές συνθήκες και μετά από ριζοεμβολιασμό με τα PGPR, καθώς και στην ικανότητα πρόσληψης και διασυστηματικής μετακίνησης των υπολειμμάτων στο υπέργειο μέρος των φυτών. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα αποικισμού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα των φυτών τομάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας και παράλληλα αξιολογήθηκε και η πιθανή επίδραση του acibenzolar-S-methyl στους πληθυσμούς του στελέχους. Η προσθήκη των PGPR δεν επηρέασε το ρυθμό αποδόμησης του acibenzolar-S-methyl στο έδαφος και ο σχηματισμός του κύριου μεταβολίτη του CGA 210007 ήταν γρήγορος. Διαπιστώθηκε ότι σε φυτά που έγινε μεταχείριση με τα στελέχη B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34 η πρόσληψη και διασυστηματική μετακίνηση των acibenzolar-S-methyl και CGA 210007 στο υπέργειο μέρος των φυτών τομάτας ήταν σημαντικά υψηλότερη ως προς το μάρτυρα Για τη μελέτη της ικανότητας αποικισμού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ριζόσφαιρα φυτών τομάτας, δοκιμάστηκε ο μετασχηματισμός του με πλασμιδιακό φορέα (pAD43-25) εισάγοντας γενετικό υλικό που κωδικοποιεί πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Ο βαθμός αποικισμού του στελέχους ήταν μεγαλύτερος στο ριζικό σύστημα των φυτών σε σύγκριση με το έδαφος της ριζόσφαιρας, ενώ παρατηρήθηκε αρνητική επίδραση του acibenzolar-S-methyl στην ανάπτυξη του στελέχους στο έδαφος της ριζόσφαιρας.