Εφαρμογή νέων βιοτεχνολογικών μεθόδων στην παραγωγή οίνου
Authors: Νικολάου Αναστάσιος 
Published: September 2021

Η διεξαγωγή μηλογαλακτικής ζύμωσης συνηθίζεται για την παραγωγή οίνων υψηλής και σταθερής ποιότητας και στοχεύει στη μείωση της οξύτητας του τελικού προϊόντος, σε μικροβιακή σταθεροποίηση και σε βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Επειδή, όμως, η επιτυχία της δεν είναι πάντα διασφαλισμένη, τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον για τη χρήση μικτών μικροβιακών καλλιεργειών (αποτελούμενες κυρίως από κατάλληλα στελέχη ζυμομυκήτων και μηλογαλακτικών βακτηρίων) στην οινοποίηση, ικανών να διεξάγουν αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση, αν είναι δυνατόν ταυτόχρονα, είναι έντονο. Επιπλέον, είναι γνωστό πως η χρήση συστημάτων ακινητοποιημένων κυττάρων προσφέρει πολλαπλά τεχνικά και οικονομικά πλεονεκτήματα, όπως κυτταρική προστασία, αύξηση της κυτταρικής βιωσιμότητας και παραγωγικότητας, μείωση του κόστους παραγωγής, βελτίωση της ποιότητας, δυνατότητα χρήσης πολλών τύπων βιοαντιδραστήρων, κλπ, ενώ παράλληλα, οι βιομηχανικές και εμπορικές ανάγκες απαιτούν τη χρήση λυοφιλιωμένων κυττάρων, εξαιτίας κυρίως των ιδιαίτερων τεχνικών πλεονεκτημάτων που εμφανίζουν σε σχέση με τα υγρά κύτταρα (π.χ. υψηλότεροι χρόνοι διατήρησης, προστασία έναντι επιμολύνσεων, ευκολία στη χρήση, κλπ). Συνεπώς, στόχος της Διδακτορικής Διατριβής ήταν η αξιολόγηση υγρών και λυοφιλιωμένων, ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων της καλλιέργειας kefir στην διεξαγωγή αλκοολικής και μηλογαλακτικής ζύμωσης ταυτόχρονα κατά την οινοποίηση και την παραγωγή μηλίτη οίνου.Αρχικά, μελετήθηκε η ακινητοποίηση της καλλιέργειας kefir σε φυσικούς φορείς [κομμάτια μήλου, απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά (DCM), στέμφυλα και κόκκους ζεόλιθου] και προσδιορίστηκαν οι πληθυσμοί των κυττάρων. Σημειώνεται πως οι κόκκοι φυσικού ζεόλιθου χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως φορείς ακινητοποίησης μικτής μικροβιακής καλλιέργειας στην οινοποίηση, λόγω των αυξημένων πλεονεκτημάτων που διαθέτουν (όπως υψηλή διαθεσιμότητα, ευκολία χρήσης, αυξημένη μηχανική αντοχή, απουσία προπαρασκευαστικού σταδίου, κλπ). Επιπλέον, η ακινητοποίηση στην επιφάνεια και στις φυσικές κοιλότητες των κόκκων φυσικού ζεόλιθου μελετήθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM). Για την εκτίμηση της λειτουργικής σταθερότητας, τα κύτταρα δοκιμάστηκαν σε επαναλαμβανόμενες παρτίδες ζύμωσης γλεύκους σταφυλής ή χυμού μήλου σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (5-45 oC). Όλα τα συστήματα έδειξαν αξιοσημείωτη σταθερότητα, αφού οι ζυμώσεις συνεχίστηκαν για διάστημα 29 μηνών και >7 μηνών κατά την παραγωγή οίνου και μηλίτη οίνου, αντίστοιχα. Η μετατροπή του μηλικού οξέος ανήλθε έως 71.5 % και παρατηρήθηκαν τιμές παραγωγικότητας [έως 56.9 g/(Ld)] που είναι ίσες ή/και μεγαλύτερες από αυτές που συνηθίζονται κατά τη βιομηχανική πρακτική, ενώ η παραγωγή μηλίτη οίνου με ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά στους 37 oC, ολοκληρώθηκε σε <24 h. Από τα κύρια πτητικά παραπροϊόντα που προσδιορίστηκαν, η συγκέντρωση του οξικού αιθυλεστέρα παρουσίασε κατά κύριο λόγο αύξηση στις χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης, ενώ αντίστοιχα η συγκέντρωση των ανώτερων αλκοολών μείωση, γεγονός που σχετίζεται με τη βελτίωση της ποιότητας των προϊόντων που παράχθηκαν. Η εφαρμογή του αλγόριθμου των κυρίων συνιστωσών (PCA) στα πτητικά παραπροϊόντα που ανιχνεύθηκαν μέσω HS-SPME GC/MS ανάλυσης έδειξε ότι, κατά την οινοποίηση, η σύστασή τους επηρεάστηκε περισσότερο από τη θερμοκρασία της ζύμωσης, ενώ αντίθετα κατά την παραγωγή μηλίτη οίνου τόσο η θερμοκρασία της ζύμωσης όσο και η φύση της καλλιέργειας kefir (ελεύθερα ή ακινητοποιημένα κύτταρα) επηρέασαν σημαντικά το προφίλ των υπεύθυνων για το άρωμα ενώσεων. Όλα τα προϊόντα που παράχθηκαν από τις επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις με υγρά κύτταρα καλλιέργειας kefir έγιναν αποδεκτά κατά τον προκαταρκτικό οργανοληπτικό έλεγχο επιβεβαιώνοντας την υψηλή τους ποιότητα.Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λυοφιλίωση και εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων κρυοπροστατευτικών μέσων (σακχάρων και γλυκερόλης σε διάφορες συγκεντρώσεις και χυμού μήλου) στη ζυμωτική ικανότητα των ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων της καλλιέργειας kefir με ζυμώσεις χυμού μήλου στους 30 oC. Η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων δεν αποδείχθηκε ικανή να βελτιώσει σημαντικά τις κινητικές παραμέτρους των ζυμώσεων, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε μεταφορά υπολειμμάτων στο τελικό προϊόν. Επομένως, σε επόμενο στάδιο αξιολογήθηκε η λειτουργική σταθερότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων που παράχθηκαν χωρίς κρυοπροστατευτικά μέσα, μέσω επαναλαμβανόμενων ζυμώσεων μηλίτη οίνου σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (5-45 oC). Οι κινητικές παράμετροι κυμάνθηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές των ζυμώσεων με υγρά κύτταρα, αλλά η ακινητοποίηση οδήγησε σε σημαντική βελτίωση στην πλειοψηφία των ζυμώσεων, ενώ κυμάνθηκαν σε επίπεδα αποδεκτά από τη βιομηχανία. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε βελτίωση κατά το πέρας των επαναλαμβανόμενων παρτίδων ζύμωσης, υποδεικνύοντας τη λειτουργική σταθερότητα των συστημάτων για διάστημα >5 μηνών. Στις ζυμώσεις στους 5 oC παράχθηκε μηλίτης οίνος με συγκέντρωση αλκοόλης όμοια με τις ζυμώσεις υγρών κυττάρων (έως 6.6 % vol), ενώ στις ζυμώσεις στους 20, 30 και 37 oC η συγκέντρωση της αλκοόλης κυμάνθηκε σε εύρος 1.4-5.1 % vol, υποδηλώνοντας την καταλληλότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων για την παραγωγή μηλίτη οίνου χαμηλότερου αλκοολικού βαθμού. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης και της θερμοκρασίας ζύμωσης στα πτητικά παραπροϊόντα. Η συγκέντρωση εστέρων και συνολικών πτητικών παραπροϊόντων ήταν σημαντικά αυξημένη στις ζυμώσεις με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε DCM στους 20 oC, ενώ παρατηρήθηκε προοδευτική μείωση της συγκέντρωσης των ανώτερων αλκοολών παράλληλα με τη μείωση της θερμοκρασίας ζύμωσης, γεγονός σημαντικό για την ποιότητα του μηλίτη οίνου. Ο αλγόριθμος των κυρίων συνιστωσών (PCA) που εφαρμόστηκε στα πτητικά παραπροϊόντα που ανιχνεύθηκαν μέσω HS-SPME GC/MS έδειξε ότι τόσο η θερμοκρασία της ζύμωσης όσο και η φύση της καλλιέργειας kefir (ελεύθερα ή ακινητοποιημένα κύτταρα) επηρέασαν σημαντικά τη σύσταση των πτητικών παραπροϊόντων. Όλα τα προϊόντα που παράχθηκαν από επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις με λυοφιλιωμένα κύτταρα καλλιέργειας kefir έγιναν αποδεκτά κατά τον προκαταρκτικό οργανοληπτικό έλεγχο.Έπειτα, μελετήθηκε η επίδραση των κρυοπροστατευτικών μέσων, της ακινητοποίησης και της θερμοκρασίας κατά την αποθήκευση για μεγάλο χρονικό διάστημα στη ζυμωτική ικανότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων. Μετά τη λυοφιλίωση, τα κύτταρα αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασίες δωματίου (25 oC), ψυγείου (4 oC) ή κατάψυξης (-18 oC) για διάστημα 1, 3 ή 6 μηνών και αξιολογήθηκαν σε ζυμώσεις χυμού μήλου στους 30 oC. Σε γενικές γραμμές, η ακινητοποίηση και η αποθήκευση σε θερμοκρασίες ψυγείου και κατάψυξης είχαν κατά μέσο όρο σημαντικά θετική επίδραση στις κινητικές παραμέτρους. Αξίζει, ωστόσο, να σημειωθεί πως όλες οι ζυμώσεις ολοκληρώθηκαν σε διάστημα μικρότερο από αυτό που απαιτείται στην περίπτωση μιας παραδοσιακής ζύμωσης. Επιπλέον, η συγκέντρωση της αιθανόλης και η μετατροπή του μηλικού οξέος κυμάνθηκαν σε αποδεκτές τιμές και δεν επηρεάστηκαν από το διάστημα της αποθήκευσης. Η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων, αντίθετα, δεν επηρέασε σημαντικά τους χρόνους ζύμωσης, παρά μόνο μεμονωμένες κινητικές παραμέτρους, χωρίς η διαφορά να είναι πάντα στατιστικά σημαντική. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης και των επαναλαμβανόμενων ζυμώσεων στην μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας kefir και οι πιθανές αλλαγές προσδιορίστηκαν με PCR-DGGE. Οι κυρίαρχοι βακτηριακοί πληθυσμοί που ανιχνεύθηκαν ήταν μέλη του γένους Lactobacillus (L. helveticus/L. dextrinicus/L. buchneri/L. kefiri/L. sunkii), ενώ οι Klyveromyces marxianus/Klyveromyces lactis και Saccharomyces cerevisiae αποτέλεσαν τα κύρια μέλη της χλωρίδας των ζυμομυκήτων. Αξίζει να σημειωθεί πως δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στη μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας κατά τις επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις σε διάφορες θερμοκρασίες. Επιπλέον, η σύσταση της καλλιέργειας kefir και των ακινητοποιημένων κυττάρων σε κόκκους φυσικού ζεόλιθου μελετήθηκε μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το 96 % των αλληλουχιών που ανιχνεύθηκαν ανήκε στο γένος Lactobacillus και το κυρίαρχο είδος ήταν o Lactobacillus kefiri (95 %), ενώ ένα μικρό ποσοστό αντιστοιχούσε σε βακτήρια του γένους Lactobacillus και Lactococcus (<1 %). Όσο αφορά τον πληθυσμό των ευκαρυωτών, κατά κύριο λόγο αποτελούνταν από Kluyveromyces lactis (97 %) και Saccharomyces cerevisiae (2 %). Όμως, εντοπίστηκαν πληθυσμοί άλλων βακτηρίων και ζυμομυκήτων σε πολύ μικρό ποσοστό (<1 %), ενώ δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στη μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας.Συμπερασματικά, η καλλιέργεια kefir αποδείχθηκε κατάλληλη για διεξαγωγή αλκοολικής και μηλογαλακτικής ζύμωσης ταυτόχρονα, τόσο στην υγρή όσο και στη λυοφιλιωμένη της μορφή, σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, χωρίς να παρατηρηθούν μεταβολές στη σύστασή της. Η ακινητοποίηση ενίσχυσε τη ζυμωτική δραστηριότητα των κυττάρων και έδρασε προστατευτικά κατά τη λυοφιλίωση. Η χρήση φθηνών υλικών με υψηλή καθαρότητα και διαθεσιμότητα ως φορείς ακινητοποίησης συνεπάγεται χαμηλό λειτουργικό κόστος της προτεινόμενης τεχνολογίας. Επιπλέον, η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων κατά τη λυοφιλίωση κρίθηκε μη απαραίτητη, γεγονός που οδηγεί σε περαιτέρω μείωση του λειτουργικού κόστους. Τέλος, η διατήρηση της ζυμωτικής ικανότητας των λυοφιλιωμένων κυττάρων μετά από αποθήκευση για διάστημα έως 6 μηνών σε διάφορες θερμοκρασίες φαίνεται να αποτελεί λύση συντήρησης των καλλιεργειών στο μεσοδιάστημα μεταξύ των οινοπαραγωγικών περιόδων.