Ανάπτυξη νέων βιο-λειτουργικών τροφίμων και βελτίωση της ολικής ποιότητας παραδοσιακών προϊόντων με κατάλληλη διαχείριση της μικροβιακής τους οικολογίας
Authors: Καμαρινού Χριστίνα 
Published: June 2024

Τα οξυγαλακτικά βακτήρια αποτελούν την κυρίαρχη μικροχλωρίδα, η οποία έχει βρεθεί ότι συμβάλλει θετικά στα τεχνολογικά, οργανοληπτικά (εμφάνιση, άρωμα, γεύση και υφή) και ευεργετικά χαρακτηριστικά των ζυμούμενων τροφίμων. Στην παραγωγή ζυμούμενων τροφίμων εκτός από τις εναρκτήριες οξυγαλακτικές καλλιέργειες, υπάρχει και η μη εναρκτήρια καλλιέργεια οξυγαλακτικών βακτηρίων (NSLAB). Τα NSLAB προέρχονται συνήθως από την πρώτη ύλη, το περιβάλλον παραγωγής και επεξεργασίας, και ονομάζονται αυτόχθονοι μικροοργανισμοί. Στα NSLAB ανήκουν συνήθως μικροοργανισμοί που ανήκουν στα είδη Lacticaseibacillus paracasei, Lacticaseibacillus casei και Lacticaseibacillus rhamnosus. Η χρήση τους στη παραγωγή ζυμούμενων τροφίμων, μπορεί να συμβάλλει θετικά στη ζύμωση, βελτιώνοντας την ποιότητα και την ασφάλεια του τελικού προϊόντος. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η απομόνωση αυτόχθονων οξυγαλακτικών βακτηρίων από παραδοσιακά φρέσκα ελληνικά τυριά και η αξιολόγηση των βιοχημικών, τεχνολογικών και προβιοτικών χαρακτηριστικών τους. Η αξιολόγηση αυτή, είχε ως στόχο την ανάπτυξη νέων ασφαλών πολυλειτουργικών καλλιεργειών που θα χρησιμοποιηθούν στη παραγωγή ζυμούμενων γαλακτοκομικών προϊόντων ως επιπρόσθετες καλλιέργειες, με στόχο τη βελτίωση της ποιότητας, της ασφάλειας και την ενίσχυση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Ως εκ τούτου, 109 απομονωμένα οξυγαλακτικά βακτήρια ανακτήθηκαν από παραδοσιακά φρέσκα τυριά και αξιολογήθηκαν in vitro ως προς την ικανότητα παραγωγής αερίου, την πρωτεολυτική, λιπολυτική και αιμολυτική δραστηριότητα τους, την ικανότητα παραγωγής εξωπολυσακχαριτών, την ενζυμική δραστηριότητα τους, την ικανότητα ανάπτυξης σε 6,5% NaCl και σε διαφορετικές συνθήκες pH και θερμοκρασίας. Στην συνέχεια, 48 επιλεγμένα στελέχη αξιολογήθηκαν περαιτέρω ως προς την επιβίωσή τους σε προσομοιωμένες συνθήκες γαστρεντερικού σωλήνα, την ικανότητα υδρόλυσης των χολικών αλάτων, την αντοχή τους παρουσία αντιβιοτικών και την αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Απομονώσεις που παρουσίασαν ευνοϊκά τεχνολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά (καλά ποσοστά επιβίωσης σε χαμηλό pH και χολικά άλατα, ικανότητα παραγωγής β-γαλακτοσιδάσης, και EPS) ήταν τα στελέχη Lactococcus lactis SRX2, SRX3, SRX5 και SMX16, Lacticaseibacillus paracasei SRX10 και Lactiplantibacillus plantarum FRX7, FB1, ενώ τα στελέχη Leuconostoc mesenteroides FMX3 και Lc. lactis SMX2 έδειξαν αντιμικροβιακή δράση in vitro έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes. Στην συνέχεια, οι 48 απομονώσεις ελέγχθηκαν in situ, προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση που μπορεί να έχουν στην ποιότητα και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των ζυμούμενων γαλακτοκομικών προϊόντων, καθώς και η ικανότητα επιβίωσης του σε αυτά. Οι 48 απομονώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως επιπρόσθετες καλλιέργειες με τη μορφή μονοκαλλιεργειών και συγκαλλιεργειών στην παραγωγή γιαουρτιού. Τα δείγματα γιαουρτιού υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές, φυσικοχημικές και μοριακές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της συντήρησης των δειγμάτων στους 4 °C. Οι απομονώσεις που βαθμολογήθηκαν με επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στο γιαούρτι ως μονοκαλλιέργειες αλλά και ως συγκαλλιέργειες επιλέχθηκαν για την προσθήκη τους ως επιπρόσθετες καλλιέργειες στην παραγωγή Φέτας. Τα τυριά Φέτα παρήχθησαν με την εμπορική εναρκτήρια καλλιέργεια και την προσθήκη 9 στελεχών LAB (Lactococcus lactis SMX2 και SMX16, Levilactobacillus brevis SRX20, Lacticaseibacillus paracasei SRX10, Lactiplantibacillus plantarum FRX20 και FB1, Leuconostoc mesenteroides FMX3, FMX11 και FRX4, που απομονώθηκαν από χειροποίητα ελληνικά τυριά) σε διαφορετικούς συνδυασμούς για την παραγωγή 13 δειγμάτων Φέτας (12 δείγματα Φέτας με τις πρόσθετες απομονώσεις LAB και ένα δείγμα μάρτυρας). Τα δείγματα τυριού Φέτας υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης και με μικροβιολογικές, φυσικοχημικές, μοριακές και οργανοληπτικές αναλύσεις κατά την αποθήκευση στους 4 °C. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά την παρασκευή, ο πληθυσμός των LAB ήταν περίπου 9,0 log CFU/g σε όλα τα δείγματα, ενώ κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, ο πληθυσμός τους μειώθηκε σε 6,5 - 7,0 log CFU/g. Επιπλέον, η προσθήκη επιλεγμένων στελεχών, ιδίως του στελέχους Lc. paracasei SRX10, οδήγησε σε τυριά με επιθυμητά και διακριτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον, η μοριακή ανάλυση RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic PCR) επιβεβαίωσε ότι τα πολυλειτουργικά στελέχη LAB ήταν βιώσιμα μέχρι το τέλος της συντήρησης. Προκειμένου να εξεταστεί in situ η αντιμικροβιακή δράση που εμφάνισαν τα στελέχη FMX3 και SMX2 έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού L. monocytogenes, παρασκευάστηκε γιαούρτι και τυρί Φέτα με τη χρήση αυτών των στελεχών ως επιπρόσθετες καλλιέργειες. Παρασκευάστηκε γιαούρτι με την επιπρόσθετη καλλιέργεια Ln. mesenteroides FMX3 (YF), γιαούρτι με την επιπρόσθετη καλλιέργεια Lc. lactis SMX2 (YS), γιαούρτι με μείγμα των επιπρόσθετων οξυγαλακτικών καλλιεργειών Ln. mesenteroides FMX3 και Lc. lactis SMX2 (YFS) και γιαούρτι-μάρτυρας (YC). Ακολούθησε τεχνητή επιμόλυνση του γάλακτος με το παθογόνο L. monocytogenes σε πληθυσμό 4,0 log CFU/g. Μετά το πέρας της ζύμωσης, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη συντήρηση τους στους 4°C. Το δείγμα γιαουρτιού YFS εμφάνισε τη μεγαλύτερη μείωση στο πληθυσμό του παθογόνου κατά 2,4 log CFU/g. Ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων, στο χρόνο 0, ήταν 8,5 log CFU/g και 9,0 log CFU/g για τους μεσόφιλους γαλακτόκοκκους και γαλακτοβακίλλους αντίστοιχα, ενώ στο τέλος της συντήρησης ο πληθυσμός ήταν 8,2 log CFU/g και 8,6 log CFU/g για τους μεσόφιλους γαλακτόκοκκους και γαλακτοβακίλλους αντίστοιχα. Οι τιμές pH διακυμάνθηκαν μεταξύ 4,7 με 4,4 καθόλα τη διάρκεια της συντήρησης. Στην περίπτωση του τυριού Φέτας, παρασκευάσθηκε Φέτα με την επιπρόσθετη συγκαλλιέργεια των στελεχών FMX3 και SMX2 (Φέτα L12), και ακολούθησε η τεχνητή επιμόλυνση των δειγμάτων (4,0 log CFU/g) με το παθογόνο L. monocytogenes (κοκτέιλ από 4 προσαρμοσμένα σε οξύ ή μη οξύ στελέχη). Τα δείγματα τυριού Φέτας υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης και με μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά την αποθήκευση τους στους 4 °C. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι ο πληθυσμός του παθογόνου L. monocytogenes απουσίαζε μετά από 60 ημέρες (τέλος της ωρίμανσης) και μετά από 90 ημέρες στη συμπληρωματική καλλιέργεια και στη Φέτα μάρτυρα, αντίστοιχα. Ο αρχικός πληθυσμός μεσόφιλων γαλακτοβακίλλων και γαλακτόκοκκων στη Φέτα L12 και στο δείγμα μάρτυρας (ημέρα 1) ήταν 8,5 - 9,2 log CFU/g, ενώ ο πληθυσμός των μεσόφιλων γαλακτοβακίλλων μειώθηκε κατά 1,2 - 1,5 log CFU/g μέχρι το τέλος της συντήρησης (60 ημέρες), ενώ ο πληθυσμός των γαλακτόκοκκων μειώθηκε κατά 1,0 - 1,9 log CFU/g σε όλες τις περιπτώσεις.Το στέλεχος Lc. paracasei SRX10, έδειξε ανοχή σε προσομοιωμένες γαστρεντερικές συνθήκες, βιοσυνθετική ικανότητα εξωπολυσακχαριτών, έλλειψη αιμολυτικής δραστηριότητας και κατά την παραγωγή γιαουρτιού και τυριού Φέτας προσέδωσε ξεχωριστά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Για τους λόγους αυτούς δερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά του σε επίπεδο γονιδιώματος μέσω της αλληλούχισης ολόκληρου γονιδιώματος και της συγκριτικής γονιδιωματικής. Η γονιδιωματική ανάλυση έδειξε ότι, το γονιδίωμα του στελέχους αποτελείται από ένα χρωμόσωμα μήκους 2,81 Mb και περιεκτικότητα GC 46,40%. Tο στέλεχος Lc. paracasei SRX10 εμφανίζει υψηλή ομοιότητα σε επίπεδο αλληλουχίας (> 99%) με άλλα στελέχη του είδους Lc. paracasei που έχουν απομονωθεί από γαλακτοκομικά προϊόντα. Η παρουσία γονιδίων που εμπλέκονται στα τεχνολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του Lc. paracasei SRX10 διερευνήθηκε με τη χρήση των εργαλείων EggNOG, BlastKOALA και BLAST+. Ταυτοποιήθηκαν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τεχνολογικά χαρακτηριστικά, όπως αυτά της ανοχή σε όξινες συνθήκες (π.χ. atpA, atpB, atpC, atpD), πρωτεολυτικά ένζυμα (π.χ. pepN, pepX και pepC), πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση λιπαρών οξέων (π.χ., fabD, fabH, fabZ), τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών (π.χ. epsA, epsB και epsC), την επιβίωση στον ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα και την παραγωγή Βιταμίνης Β1. Αξίζει να σημειωθεί ότι το στέλεχος Lc. paracasei SRX10 δεν περιέχει γονίδια επίκτητης ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά και δεν κωδικοποιεί λοιμογόνους παράγοντες. Η πλήρης γονιδιωματική ανάλυση του Lc. paracasei SRX10 επιβεβαιώνει την ασφαλή χρήση του ως επιπρόσθετη καλλιέργεια στην παραγωγή διαφόρων γαλακτοκομικών προϊόντων, συμβάλλοντας στη βελτίωση της συνολικής ποιότητας και των διατροφικών χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος.