Αξιοποίηση της ακάθαρτης γλυκερόλης ως μέσο στρατηγικής της κυκλικής οικονομίας για τη βιοτεχνολογική παραγωγή μικροβιακών προϊόντων
Authors: Σαράντου Σοφία 
Published: December 2024

Η αειφόρος διαχείριση των ανανεώσιμων πόρων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάβαση από μία γραμμική οικονομία σε μία κυκλική και βιολογική οικονομία με αποδοτική χρήση πόρων. Η ακάθαρτη γλυκερόλη, ως κύριο παραπροϊόν των διεργασιών παραγωγής βιοντήζελ 1ης γενιάς μέσω της αντίδρασης μεθυλεστεροποίησης, αποτελεί υποσχόμενο υλικό για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας με τη χρήση της Χημικής ή της Μικροβιακής Τεχνολογίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η χρήση της ακάθαρτης γλυκερόλης ως υπόστρωμα καλλιεργειών ζυμών (σε κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου) με σκοπό τη μελέτη της μικροβιακής αύξησης και της σύνθεσης πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολικών προϊόντων. Η ανάπτυξη νέων τεχνολογιών για τη μετατροπή της ακάθαρτης γλυκερόλης σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως πολυολών (Pol) (ερυθριτόλης-Er, μαννιτόλης-Ml, αραβιτόλης-Ara) και κιτρικού οξέος-CA στον τομέα των βιομηχανιών τροφίμων καθώς και την παραγωγή μικροβιακού λίπους ως υλικό εκκίνησης βιολογικού καυσίμου 2ης γενιάς, με τη βοήθεια της εφαρμοσμένης βιομηχανικής μικροβιολογίας, αποτελούν υποσχόμενες οδούς της έννοιας ολοκληρωμένης ανάπτυξης και παραγωγής προϊόντων βιο-οικονομίας. Αρχικά 4 στελέχη που ανήκουν στα είδη/γένη Yarrowia lipolytica και Rhodosporidium sp. καλλιεργήθηκαν σε ακάθαρτη γλυκερόλη, υποπροϊόν της παραγωγής βιοντήζελ αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης (Gly)≈50 g/L, και αρχικού λόγου C/N≈65 moles/moles, προκειμένου να αξιολογηθούν οι δυνατότητές τους ως προς την αφομοίωσή της και την παραγωγή Pol, CA, κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών και κυτταρικού λίπους. Δύο στελέχη μεταξύ αυτών, το Y. lipolytica ACA DC 5033 και το R. toruloides DSM 4444 μελετήθηκαν περαιτέρω δεδομένου ότι στην πρώτη σειρά των πειραμάτων, παρουσίασαν καλύτερα αποτελέσματα από πλευράς παραγωγής μεταβολικών προϊόντων. Μελετήθηκε αρχικά η διεργασία εκχύλισης των λιπιδίων από την κυτταρική μάζα των μικροοργανισμών. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι εκχύλισης, η «κλασσική» με διαλύτη Folch που αποτελείται από μίγμα διαλυτών χλωροφορμίου (CHCl3)-μεθανόλης (CH3OH) σε αναλογία 2:1 και η μέθοδος της «πέψης» με HCl. Για το στέλεχος R. toruloides DSM 4444 δεν παρατηρήθηκαν διαφορές με τη χρήση και των δύο μεθόδων, παρουσιάζοντας ποσοστό ολικού κυτταρικού λίπους ανά ξηρή κυτταρική μάζα (YL/DCW)≈40%, w/w. Από την άλλη πλευρά, για το στέλεχος Y. lipolytica ACA DC 5033 τα αποτελέσματα ήταν διαφορετικά με τη χρήση της μεθόδου Folch παρουσιάζοντας πολύ καλύτερη ανάκτηση, αφού με τη μέθοδο αυτή το ποσοστό απόδοσης ολικού κυτταρικού λίπους ανά ξηρή κυτταρική μάζα YL/DCW ήταν ≈50% w/w εν αντιθέσει με την χρήση της μεθόδου ΗCl όπου επετεύχθη μέγιστο ποσοστό YL/DCW≈7%, w/w. Επίσης, οι φάσεις της κύριας ισορροπημένης ανάπτυξης (τροφόφαση) και της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών (ιδιόφαση) για τις ζύμες Y. lipolytica ACA DC 5033 και R. toruloides DSM 4444 καλλιεργούμενες στη γλυκερόλη (Gly≈90 g/L), προσομοιώθηκαν επιτυχώς με τη βοήθεια αριθμητικών μοντέλων. Σύγκριση των αριστοποιημένων τιμών των παραμέτρων μmax (μέγιστος ειδικός ρυθμός παραγωγής βιομάζας), Xmax (μέγιστη παραγωγή βιομάζας), YX/Gly (απόδοση σύνθεσης βιομάζας ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη), YL/Gly (απόδοση σύνθεσης μικροβιακού λίπους ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη) και YPol,CA/Gly (απόδοση σύνθεσης πολυολών και κιτρικού οξέος ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη) με τα πειραματικά μας δεδομένα οδήγησε επίσης στο συμπέρασμα ότι οι βελτιστοποιημένες τιμές των παραμέτρων που προήλθαν από τα μοντέλα παρουσίασαν σύγκλιση με τις πειραματικές, παρέχοντας εχέγγυα για την ακρίβεια των χρησιμοποιούμενων μοντέλων στην προτυποποίηση των βιοδιεργασιών που έλαβε χώρα. Κατόπιν πραγματοποιήθηκε μια ενδελεχής μελέτη της φυσιολογίας του άγριου στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033. Αυτό το άγριου τύπου στέλεχος καλλιεργήθηκε υπό συνθήκες περιορισμού αζώτου σε πειράματα ανακινούμενων φιαλών με ακάθαρτη γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ως μοναδικό μικροβιακό υπόστρωμα θρεπτικού μέσου στο οποίο προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωριούχου νατρίου (NaCl). Η αύξηση των αρχικών συγκεντρώσεων Gly (≈50, 90, 120 και 150 g/L) καθώς και η αύξηση των αρχικών συγκεντρώσεων NaCl (0, 20, 40 και 60 g/L) ορίστηκαν στο μέσο στο οποίο η αρχική συγκέντρωση αζώτου (χρήση εκχυλίσματος ζύμης 1,0 g/L και πεπτόνη 2,0 g/L ως πηγές αζώτου) παρέμεινε σταθερή και παρόμοια με το πρώτο πείραμα επιλογής («screening»). Ως εκ τούτου, η επίδραση τόσο των αυξανόμενων συγκεντρώσεων γλυκερόλης και NaCl, όσο και της αυξανόμενης αρχικής μοριακής αναλογίας C/N μελετήθηκαν στη φυσιολογική συμπεριφορά του στελέχους. Όσο περισσότερο αυξανόταν η Gly, τόσο περισσότερο εμφανιζόταν η παραγωγή πολυολών. Συγκεκριμένα, με Gly≈50 g/L, παρήχθησαν Pol≈20 g/L, ενώ με Gly≈150 g/L, παρήχθησαν Pol≈92 g/L. Η συγκέντρωση της Er επίσης αυξήθηκε αξιοσημείωτα καθώς αυξάνονταν η Gly όπως και η συγκέντρωση του NaCl. Έτσι, για Gly≈120 g/L και για αρχική συγκέντρωση NaCl=0 g/L (απουσία άλατος), η Ermax ήταν =36,2 g/L και ταυτόχρονα η συγκέντρωση Pol ήταν =57,3 g/L ενώ για Gly≈120 g/L και με αρχική παρουσία NaCl=60 g/L, η Ermax ήταν =62,0 g/L και ταυτόχρονα η συγκέντρωση Pol ήταν ≈64 g/L. Για Gly≈190 g/L, και χωρίς προσθήκη NaCl, η πολύ υψηλή συγκέντρωση ερυθριτόλης =105,0 g/L (με ταυτόχρονη παραγωγή Pol≈136 g/L) καταγράφηκε ως μια από τις υψηλότερες τιμές που έχει αναφερθεί ποτέ στη διεθνή βιβλιογραφία για στελέχη άγριου τύπου. Επιπλέον, για Gly≈120 g/L και για την αρχική συγκέντρωση NaCl=60 g/L, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε μη αποστειρωμένα μέσα (με προηγούμενη υψηλή παστερίωση συνδυασμού T=85°C για 15 λεπτά), και παρήχθη σημαντική συγκέντρωση Er, συγκρίσιμη με τα προηγουμένως αποστειρωμένα θρεπτικά μέσα (Er=61,7 g/L έναντι 62,0 g/L για το ασηπτικό πείραμα). Επιπλέον, για την περαιτέρω μείωση κόστους της διαδικασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε μέσα με Gly≈100 g/L, με προσθήκη NaCl=80 g/L, και υπό εντελώς μη ασηπτικές συνθήκες (επομένως, δεν υπήρξε καμία προηγούμενη θερμική επεξεργασία) όπου καταγράφηκε συγκέντρωση Ermax=57,5 g/L. Ακολούθησαν δύο ζυμώσεις του στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033 σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου με Gly≈100 g/L χωρίς παρουσία άλατος υπό ασηπτικές συνθήκες. Παρατηρήθηκε ότι η μείωση της ταχύτητας ανάδευσης κατά 200 rpm (από 500 rpm σε 300 rpm) εμπόδισε την ταχεία αφομοίωση της γλυκερόλης από τη ζύμη μετατοπίζοντας το μεταβολισμό της προς τη συσσώρευση Pol και κυρίως Er και Ml με μια ταυτόχρονη αύξηση του ολικού κυτταρικού λίπους σε βάρος της παραγωγής CA. Ταυτόχρονα παρατηρήθηκε διαφοροποίηση της μορφολογίας των κυττάρων της ζύμης. Ενδεικτικά σε χαμηλές στροφές ανάδευσης με κατανάλωση 91,2 g/L γλυκερόλης εντός 380 ωρών, παρήχθησαν 4,5 g/L ολικού κυτταρικού λίπους (ΥL/DCW≈40%, w/w), ενώ ταυτόχρονα ως επί το πλείστον συντέθηκαν πολυόλες (ήτοι Ml=24,7 g/L, Er=38,0 g/L, Ara=4,0 g/L και Pol=66,7 g/L) και παρήχθη μόνο 9,0 g/L CA. Εν αντιθέσει, σε υψηλές ταχύτητες ανάδευσης (επομένως, σε υψηλή συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο) με πλήρη κατανάλωση γλυκερόλης (≈100 g/L) όπου συνέβη πολύ πιο γρήγορα (εντός 100 ωρών), περίπου 2,9 g/L ολικού κυτταρικού λίπους παράχθησαν (ΥL/DCW≈30%, w/w), ενώ συντέθηκαν χαμηλότερες ποσότητες Pol (ήτοι Ml=8,0 g/L και Er=15,1 g/L), με τον μεταβολισμό να μετατοπίζεται προς τη σύνθεση κιτρικού οξέος (CA=57 g/L).Σε επόμενο στάδιο, ακολούθησε καλλιέργεια του μικροοργανισμού R. toruloides DSM 4444 σε υποστρώματα υψηλής συγκέντρωσης Gly (≈50 έως ≈150 g/L) και NaCl (0 έως 60 g/L), προκειμένου να αξιολογηθεί η βιοχημική του απόκριση στα ανωτέρω υποστρώματα. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η αφομοίωση Gly χρησιμοποιούμενης σε Gly≈50 g/L, 90 g/L, 120 g/L και 150 g/L προς περαιτέρω εμβάθυνση των κινητικών παραγωγής κυτταρικής μάζας, ολικού κυτταρικού λίπους και κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών. Το στέλεχος στα ανωτέρω πειράματα παρουσίασε ενδιαφέρουσες τιμές απόδοσης κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών ανά ξηρή κυτταρική μάζα (YIPS/DCW %, w/w), σε σχετικά πρώιμες φάσεις ανάπτυξης όπου οι τιμές μειώνονταν καθώς προχωρούσε η ζύμωση, ενώ ταυτόχρονα αυξάνονταν οι τιμές ολικού κυτταρικού λίπους L (g/L) και το ποσοστό YL/DCW (%, w/w). Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν και πειράματα με προσθήκη αυξημένων ποσοτήτων NaCl (σε συγκεντρώσεις 20, 40 και 60 g/L) στο υπόστρωμα και παρατηρήθηκαν φαινόμενα ανάσχεσης της μικροβιακής αύξησης καθώς οι μετρήσεις έδειξαν ότι το στέλεχος δεν μπορεί να προσαρμοστεί σε όλους τους ανωτέρω συνδυασμούς συγκέντρωσης γλυκερόλης και άλατος. Συγκεκριμένα, κατέστη δυνατή η ανάπτυξη του εν λόγω στελέχους για Gly≈50 g/L και NaCl σε συγκεντρώσεις 20, 40 και 60 g/L με μέγιστη παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους (Lmax)=7,4 g/L στην περίπτωση NaCl=20 g/L. Για Gly≈90 g/L και NaCl 20 g/L και 40 g/L παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αύξηση. Η Lmax ήταν =11,2 g/L στην περίπτωση NaCl 20 g/L, ενώ απουσία NaCl και Gly≈90 g/L, η μέγιστη συγκέντρωση των λιπιδίων ήταν στα 14,9 g/L. Σε Gly≈120 g/L και παρουσία NaCl σε συγκέντρωση 20 g/L εμφανίστηκε μέγιστη παραγωγή λιπιδίων Lmax=11,1 g/L εν αντιθέσει με την καλλιέργεια συγκέντρωσης Gly≈120 g/L και απουσία NaCl όπου η παραγωγή λιπιδίων ήταν 19,1 g/L. Σε αρχικές συγκεντρώσεις άλατος >20 g/L, και για την αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 120 g/L, η κυτταρική αύξηση η οποία έλαβε χώρα ήταν πολύ μικρή ή αμελητέα. Τέλος, σε συγκέντρωση Gly≈150 g/L μόνο απουσία NaCl επετεύχθη ανάπτυξη του στελέχους, αφού στην αναφερόμενη αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης, οποιαδήποτε παρουσία NaCl (ακόμη και αυτή των 20 g/L) δεν επέτρεψε τη μικροβιακή αύξηση. Πάντως στο πείραμα με Gly≈150 g/L και χωρίς παρουσία άλατος, παρουσιάστηκε υψηλή κυτταρική αύξηση και μέγιστη παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους (Lmax=20,3 g/L, με ταυτόχρονη τιμή YL/DCW=66,1%, w/w).Ακολούθησαν πειράματα με παστεριωμένο θρεπτικό μέσο γλυκερόλης Gly≈50 g/L και παρουσία NaCl 60 g/L όπου τα αποτελέσματα ήταν σχεδόν ταυτόσημα όσον αφορά στην παραγωγή της ξηρής κυτταρικής μάζας, του ολικού κυτταρικού λίπους και των κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών με αυτά του αντίστοιχου πειράματος του εν λόγω στελέχους με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης Gly≈50 g/L και παρουσία ΝaCl συγκέντρωσης 60 g/L όπου είχε προηγηθεί αποστείρωση του θρεπτικού μέσου. Για όλα τα ανωτέρω πειράματα τόσο για τη ζύμη Y. lipolytica ACA DC 5033 όσο και για τη ζύμη R. toruloides DSM 4444 πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων κατά την πρώιμη, όψιμη και την πολύ όψιμη φάση αύξησης της εκάστοτε καλλιέργειας σε ακάθαρτη γλυκερόλη με απουσία και παρουσία άλατος και δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές ως προς το προφίλ των κύριων λιπαρών οξέων, με το ελαϊκό οξύ να είναι το κυρίαρχο λιπαρό οξύ, καθιστώντας τους μικροοργανισμούς ως πολύ ανταγωνιστικούς σχετικά με την παραγωγή 2ης γενιάς βιοντήζελ, χρησιμοποιώντας τη γλυκερόλη ως υλικό εκκίνησης των διεργασιών. Συμπερασματικώς, τα στελέχη ζυμών των ειδών Y. lipolytica και R. toruloides δύνανται να χρησιμοποιηθούν ως κυτταρικά εργοστάσια ικανά να μετατρέπουν τη γλυκερόλη σε μια πληθώρα χρήσιμων μικροβιακών μεταβολιτών. Έτσι, η ακάθαρτη γλυκερόλη, το κύριο «απόβλητο» της διεργασίας παραγωγής βιοντήζελ, αποτελεί σημαντικό υπόστρωμα προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας χρησιμοποιουμένων στη βιομηχανία τροφίμων ήτοι πολυολών και κιτρικού οξέος για την περίπτωση του οσμώφιλου στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033 συνδυαστικά με υψηλή συγκέντρωση άλατος (με πιθανή μελλοντική χρήση θαλασσινού νερού ή άλμης ως προϊόν αφαλάτωσης). Για την περίπτωση του στελέχους R. toruloides DSM 4444 η γλυκερόλη χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς ως υπόστρωμα προς παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους, το οποίο δύναται να χρησιμοποιηθεί ως υλικό εκκινήσεως βιοντήζελ 2ης γενιάς.