Σχεδιασμός και ανάπτυξη βιοϋλικών από υβριδικά σύνθετα με βάση το πολυ(γαλακτικό) οξύ
Authors: Αθανασούλια Ιωάννα-Γεωργία 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο σχεδιασμός, η παρασκευή και ο χαρακτηρισμός υβριδικών συστημάτων με βάση το πολυ(L-γαλακτικό οξύ) για βιοϊατρικές εφαρμογές, με έμφαση στην κατασκευή τρισδιάστατης διασυνδεόμενης πορώδους δομής, για χρήση ως ικριώματα στη μηχανική ιστών. Πραγματοποιήθηκε τροποποίηση σε δύο τύπους πολυ(γαλακτικού οξέος) μικρότερης (PLA) και μεγαλύτερης κρυσταλλικότητας (PLLA), μέσω παρασκευής μιγμάτων τους με πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PEG), με στόχο τη βελτίωση της ικανότητας διαβροχής και της υδροφιλικότητας, καθώς και την αύξηση στο ρυθμό αποδόμησης του μίγματος που προκύπτει. Με βάση τα παραπάνω πολυμερή, παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν νανοσύνθετα με νανοσωματίδια υδροξυαπατίτη (ΗΑ) και διοξειδίου του τιτανίου (TiO2), καθώς και οξειδίου του γραφενίου (GO), με σκοπό τη βελτίωση λειτουργικών ιδιοτήτων σε βιοϊατρικές εφαρμογές όπως η βιοδραστικότητα και οι αντιμικροβιακές ιδιότητές τους. Η παρασκευή των μιγμάτων και των νανοσυνθέτων πραγματοποιήθηκε σε δικόχλιο σύστημα εκβολής εργαστηριακής κλίμακας. Μελετήθηκαν οι συνθήκες παρασκευής, η δομή και οι θερμομηχανικές ιδιότητες των συνθέτων που προέκυψαν, καθώς και o μηχανισμός και η κινητική κρυστάλλωσης του τροποποιημένου πολυ(γαλακτικού οξέος). Επιπλέον, έγινε μελέτη της γήρανσης του PLLA και των συνθέτων TiO2/PLLA, σε περιβάλλον υπεριώδους (UV) ακτινοβολίας. Σε επιλεγμένα νανοσύνθετα του PLLA έγινε μελέτη της αντιμικροβιακής τους δράσης σε βακτήρια Escherichia coli (Ε. coli) στο σκοτάδι και σε περιβάλλον προσομοίωσης του ηλιακού φωτός, με και χωρίς προεπεξεργασία των δοκιμίων με UV-ακτινοβολία για τη φωτο-ενεργοποίησή τους. Ακολούθησε μελέτη της παρασκευής ικριωμάτων PLA με τη χρήση της τεχνικής έκπλυσης χλωριούχου νατρίου (NaCl) και έγινε συνδυασμός με τη χρήση PEG, ως υδατοδιαλυτό πορογενές μέσο. Εξετάστηκαν διάφορες κοκκομετρίες NaCl και διαφορετικά μοριακά βάρη της PEG, καθώς και αναλογίες τους, και συσχετίστηκαν με τη λαμβανόμενη πορώδη δομή. Eπίσης, για τη δημιουργία πορώδους δομής στα διάφορα συστήματα του PLA, έγινε χρήση της τεχνικής υπερκρίσιμου CO2 (sc-CO2), όπου εξετάστηκαν διαφορετικές συνθήκες πίεσης κορεσμού του sc-CO2 και ταχύτητας εκτόνωσης. Από τη μελέτη του μηχανισμού κρυστάλλωσης των συστημάτων PEG (10-40 % κ.β.), χαμηλής κρυσταλλικότητας πολυ(γαλακτικού οξέος), (PLA), με Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC), βρέθηκε ότι η ενσωμάτωση της PEG διευκόλυνε την κρυστάλλωσή του με την εμφάνιση κρυστάλλωσης κατά την ψύξη, κάτι που δεν εμφανίζεται στο καθαρό πολυμερές, με τη μετατόπιση της ψυχρής κρυστάλλωσης σε χαμηλότερες θερμοκρασίες κατά ~40 °C, έως εξαφάνισής της και με αύξηση του ποσοστού κρυσταλλικότητάς του έως ~20 %.Η ενσωμάτωση της PEG (10-40 % κ.β.) στο υψηλότερης κρυσταλλικότητας πολυ(γαλακτικό οξύ), (PLLA), οδήγησε στην καταγραφή της κορυφής στα κρυσταλλογραφήματα XRD, που αποδίδεται στην αριστερόστροφη ελικοειδή διαμόρφωση τύπου 103 της ορθορομβικής (ή ψευδοορθορομβικής) μοναδιαίας κυψελίδας του πολυ(γαλακτικού οξέος). Αντίστοιχα, στα θερμογραφήματα DSC εμφανίστηκε κορυφή κρυστάλλωσης, η οποία και ολοκληρώθηκε κατά τον κύκλο ψύξης και δεν εντοπίστηκε κορυφή ψυχρής κρυστάλλωσης, σε αντίθεση με το καθαρό PLLA. Επιπλέον, το ποσοστό κρυσταλλικότητάς του αυξήθηκε έως ~45 %. Κατά τη μελέτη της μη-ισοθερμοκρασιακής κρυστάλλωσης του PLLA για διαφορετικούς ρυθμούς ψύξης, το μίγμα 20/80 w/w PEG/PLLA επέδειξε τις υψηλότερες θερμοκρασίες κρυστάλλωσης σε κάθε εξεταζόμενο ρυθμό ψύξης, τις μεγαλύτερες τιμές της παραμέτρου πυρήνωσης n και τις μικρότερες του ρυθμού ανάπτυξης κρυστάλλων Κ, της εξίσωσης Avrami. Κατά τη μελέτη ισοθερμοκρασιακής του κρυστάλλωσης με DSC, το μίγμα αυτό επέδειξε τους μικρότερους χρόνους ημικρυστάλλωσης. Οι μετρήσεις της γωνίας επαφής των εξεταζομένων μιγμάτων επιβεβαίωσαν σημαντική βελτίωση της ικανότητας διαβροχής, με την αύξηση της παρουσίας της PEG, ενώ η αντοχή και το μέτρο ελαστικότητας σε εφελκυσμό μειώθηκαν. Η ενσωμάτωση 0.1-0.8 % κ.β. GO στο PLLA αποδείχθηκε ευεργετική για την αύξηση της θερμικής σταθερότητας του PLLA, όπως διαπιστώθηκε κατά τη θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA), πιθανότατα λόγω της δράσης των νανοφυλλιδίων GO ως ‘φράγματα’ στη μεταφορά θερμότητας και των πτητικών παραγώγων της καύσης, ενώ παράλληλα, αναβάθμισε έως και κατά ~25 % την αντοχή του σε εφελκυσμό. Η συμπεριφορά αυτή συνδέεται με την ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου και χημικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ GO και PLLA, όπως επιβεβαιώθηκε με την φασματοκοπία FTIR/ATR. Από τη μελέτη της ισοθερμοκρασιακής κρυστάλλωσης των συνθέτων με DSC, διαπιστώθηκε η δράση του GO ως παράγοντα πυρήνωσης, αυξάνοντας το άνω θερμοκρασιακό όριο που μπορεί να πραγματοποιηθεί η μελέτη της κρυστάλλωσης του PLLA από τους 120 °C, για το καθαρό PLLA, στους 130 °C. Τη σημαντικότερη βακτηριοστατική συμπεριφορά εμφάνισαν τα σύνθετα υπό συνεχή έκθεση του GO στη UV ακτινοβολία, πιθανότατα ως αποτέλεσμα μίας φωτοχημικής αντίδρασης που λαμβάνει χώρα στους ενεργούς φωτοκαταλύτες και οδηγεί στην απελευθέρωση αντιδρώντων οξυγονούχων ειδών (ROS, Reactive oxygen species) στην επιφάνεια των νανοφυλλιδίων άνθρακα, που προκαλούν λύση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων. Η βακτηριοστατική συμπεριφορά των επιφανειών των νανοσυνθέτων που επετεύχθη στο σκοτάδι έχει αποδοθεί βιβλιογραφικά στην παγίδευση των βακτηρίων μεταξύ των φυλλιδίων του GO και την καταστροφή του τοιχώματός τους από τα αιχμηρά άκρα στην επιφάνεια των εξαιρετικά λεπτών φυλλιδίων του. Αποσκοπώντας στη βέλτιστη διασπορά των νανοφυλλιδίων του GO στη μήτρα PLLA και αποφεύγοντας τη χρήση οργανικών διαλυτών, των οποίων το υπόλειμμα θα ήταν επιβλαβές για τα κύτταρα σε βιοϊατρικές εφαρμογές, επιλέχθηκε η παρασκευή μητρικών μιγμάτων (masterbatches) GO/PEG με τεχνική υδατικού διαλύματος και η εν συνεχεία ενσωμάτωσή τους στο πολυμερές. Από τη μελέτη με φασματοσκοποία Raman των νανοσυνθέτων 0.5-2 % κ.β. GO/PEG διαπιστώθηκε ότι η κατεργασία αυτή επιφέρει αύξηση της αταξίας στη δομή του γραφενίου, καθώς αυξάνει ο λόγος των εντάσεων των χαρακτηριστικών ζωνών D (1350 cm-1) και G (1600 cm-1) στα φάσματα Raman (ID/IG). Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν νανοσύνθετα GO (0.1-0.4 % κ.β.) του μίγματος 20/80 w/w PEG/PLLA και με την τεχνική DSC διαπιστώθηκε η συνεργιστική δράση των GO και PEG στην κρυστάλλωση του PLLA. Συγκεκριμένα η κρυστάλλωση του PLLA λάμβανε χώρα σε κατά ~15 °C υψηλότερη θερμοκρασία, συγκριτικά με το μη ενισχυμένο μίγμα, και συνοδεύτηκε από αύξηση της θερμοκρασίας τήξης κατά ~5 °C και του ποσοστού κρυσταλλικότητας κατά ~5 %. Η συμπεριφορά αυτή επιβεβαιώνεται και με τη φασματοσκοπία FTIR/ATR, όπου στα φάσματα των νανοσυνθέτων εμφανίστηκε κορυφή στην περιοχή 921 cm-1, η οποία συνδέεται με την παρουσία α-κρυσταλλικής δομής του PLLA. Από τη μελέτη της ισοθερμοκρασιακής κρυστάλλωσης με DSC παρατηρήθηκε ότι μειώθηκε στο ~1/7 ο χρόνος ημικρυστάλλωσης του PLLA, σε σύγκριση με του μίγματος PEG/PLLA, και αυξήθηκε το άνω όριο της θερμοκρασίας που είναι εφικτό να μελετηθεί η κρυστάλλωση του PLLA από τους 130 °C, για τα σύνθετα GO/PLLA και για τα μίγματα PEG/PLLA, στους 140 °C για το σύστημα GO/PEG/PLLA.Από τη μελέτη με DSC των συνθέτων TiO2/PLLA διαπιστώθηκε ότι η κρυστάλλωση του PLLA, μεταβλήθηκε σταδιακά αυξανομένης της περιεκτικότητας σε νανοσωματίδια TiO2, από 5 σε 20 % κ.β., με τη θερμοκρασία ψυχρής του κρυστάλλωσής να μειώνεται, τη θερμοκρασία τήξης και το ποσοστό κρυσταλλικότητας του PLLA να αυξάνονται. Η θερμική σταθερότητα του συνθέτου με 20 % κ.β. TiO2 βελτιώθηκε, πιθανότατα λόγω της δράσης των νανοσωματιδίων TiO2 ως ‘φράγματα’ στη μεταφορά θερμότητας και των πτητικών παραγώγων της καύσης. Το νανοσύνθετο με 5 % κ.β. TiO2 εμφάνισε τις βέλτιστες μηχανικές ιδιότητες κατά τη δοκιμή σε εφελκυσμό. Την καλύτερη βακτηριοκτόνο δράση εμφάνισαν τα σύνθετα με 20 % κ.β. ΤiO2 όταν είχε προηγηθεί ενεργοποίηση των νανοσωματιδίων TiO2 στο σκοτάδι και σε περιβάλλον UV-ακτινοβολίας. Εξετάσθηκε επίσης η γήρανση συνθέτων 10 % κ.β. TiO2/PLLA σε περιβάλλον UV-ακτινοβολίας, ώστε να προβλεφθεί η επίδραση που έχει στις ιδιότητές τους η έκθεση στην ακτινοβολία αυτή κατά τη φωτοενεργοποίηση του TiO2. Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι το μοριακό βάρος του PLLA μειώθηκε κατά ~15 %, κάτι που συνοδεύτηκε από μείωση της περιοχής της καρβονυλομάδας και αύξηση της καρβοξυλομάδας, στα φάσματα FTIR/ATR. Πιθανότατα, η δράση του μηχανισμού Norrish ΙΙ για τη φωτοαποδόμηση του PLLA οδήγησε σε θραύση του εστερικού δεσμού στο PLLA και το σύνθετο, σε ποσοστό 33 %, έως τις 210 ώρες έκθεσης στη UV- ακτινοβολία. Η αύξηση του δείκτη κρυσταλλικότητας (CI) στα φάσματα αυτά συνοδεύτηκε από εμφάνιση κρυστάλλωσης και κατά την ψύξη σε όλα τα εξεταζόμενα δείγματα και ιδιαίτερα στην περίπτωση των νανοσυνθέτων. Επίσης, τα νανοσύνθετα εμφάνισαν μεγαλύτερη θερμική σταθερότητα σε σχέση με το μη ενισχυμένο PLLA. Σε αντίθεση με το καθαρό PLLA, και η προσθήκη των νανοσωματιδίων ΗΑ οδήγησε στην εμφάνιση κρυστάλλωσης κατά τον κύκλο ψύξης. Η θερμοκρασία ψυχρής κρυστάλλωσης του PLLA μειώθηκε και αυξήθηκε η θερμοκρασία τήξης του. Το μέτρο ελαστικότητας των νανοσυνθέτων αυξήθηκε έως και κατά ~26 % με 20 % κ.β. ΗΑ. Η μείωση της αντοχής σε εφελκυσμό των νανοσυνθέτων με περισσότερο από 5 % κ.β. ΗΑ, μπορεί να γίνει αποδεκτή σε εφαρμογές όπως τα βιοαπορροφήσιμα εμφυτεύματα σε περιοχές που δεν υφίστανται υψηλές φορτίσεις, αξιοποιώντας τη βελτιωμένη βιοσυμβατότητα που προσδίδει το έγκλεισμα αυτό. Το PLA που δεν έχει υψηλή κρυσταλλικότητα χρησιμοποιήθηκε στην παρασκευή ικριωμάτων καθώς διευκολύνει την εισχώρηση του νερού, κατά την έκπλυση των πορογενών μέσων και του υπερκρίσιμου CO2, κατά τη διόγκωση. Επίσης, ο ρυθμός αποδόμησής του δεν είναι τόσο αργός, ακολουθώντας το ρυθμό ανάπτυξης των ιστών στο ικρίωμα. Λόγω της αυξημένης υδροφιλικότητας, της διατήρησης των χαμηλών επιπέδων κρυσταλλικότητας, της μικρότερης υποβάθμισης της θερμικής σταθερότητας και της αντοχής σε εφελκυσμό, τα μίγματα PEG/PLA με 10 % κ.β. PEG κρίθηκαν κατάλληλα για τη χρήση τους στην παρασκευή ικριωμάτων με την τεχνική της έκπλυσης άλατος (NaCl). Με την αύξηση της κοκκομετρίας άλατος από 200-300 μm σε 400-500 μm επετεύχθη διασύνδεση των πόρων στα σύνθετα NaCl/PLA. Σε αυτό συνέβαλε και η αύξηση της περιεκτικότητας σε NaCl χαμηλής κοκκομετρίας, που οδήγησε και σε αύξηση της διαμέτρου των πόρων. Με την προσθήκη της PEG επιταχύνθηκε η έκπλυση των πορογενών συνοδευόμενη από μείωση της διαμέτρου των πόρων αυξανομένης της περιεκτικότητας σε NaCl. Η βέλτιστη πορώδης δομή ελήφθη με το συνδυασμό του μεγαλύτερης κοκκομετρίας NaCl, περιεκτικότητας σε άλας 60 % κ.β. (εξεταζόμενες περιεκτικότητες 40, 60 και 80 % κ.β.) και της PEG με μοριακό βάρος 6,000 g/mol (εξεταζόμενα μοριακά βάρη 3,000, 6,000 και 10,000 g/mol). Για την παρασκευή ικριωμάτων PLA, εξετάστηκε επίσης η τεχνική διάλυσης στο πολυμερές διοξειδίου του άνθρακα σε κατάσταση υπερκρίσιμου ρευστού (sc-CO2), το οποίο κατά την εφαρμογή συνθηκών αεριοποίησής του, οδηγεί στη δημιουργία κενών χώρων - πόρων στην πολυμερική μάζα. Όταν εφαρμόστηκε ακαριαία εκτόνωση του sc-CO2 (100 bar/min), δημιουργήθηκαν πόροι με λεπτά τοιχώματα κατά το στάδιο της διάχυσης του CO2, οι οποίοι έτειναν να σπάσουν και να συνενωθούν, δημιουργώντας κανάλια επικοινωνίας με τους γειτονικούς πόρους. Η ανισοτροπία και ανομοιογένεια στις πορώδεις αυτές δομές, που είναι παρεμφερής με αυτή των σπογγωδών οστών, λόγω της επίδρασης της πίεσης, επιβεβαιώθηκε και από πειράματα με μικροϋπολογιστική τομογραφία (μ-CT). Με πίεση κορεσμού CO2 στα 200 bar και ακαριαία εκτόνωση, το μέτρο συμπιεστότητας των πορωδών δομών κυμαινόταν στο εύρος τιμών του φυσικού χόνδρου στις αρθρώσεις. Όταν επιβλήθηκε αργός ρυθμός εκτόνωσης του sc-CO2 (10 bar/min), η σταθεροποίηση της πορώδους δομής γινόταν μετά το κρίσιμο σημείο του CO2 όπου η θερμοκρασία του είχε μειωθεί και η περισσότερη ποσότητά του είχε απομακρυνθεί από την πολυμερική μάζα και το θάλαμο υψηλής πίεσης. Οι πορώδεις δομές που προέκυψαν εμφάνισαν μεγάλο βαθμό οργάνωσης και πόρους με τοιχώματα μεγαλύτερου πάχους και με στενό εύρος κατανομής της διαμέτρου τους, κατάλληλο για ικριώματα σε in vitro εφαρμογές της ιστομηχανικής, όπως στην ανάπλαση δέρματος. Συνοψίζοντας, από τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής βρέθηκε ότι η αναλογία 20% κ.β. σε PEG πλαστικοποιεί, βελτιώνει την υδροφιλικότητα και την ικανότητα κρυστάλλωσης του PLLA και χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για την ενσωμάτωση οξειδίου του γραφενίου σε αυτό. H ενσωμάτωση 10 % κ.β. σε PEG ενυδατώνει, βελτιώνει τη βιοσυμβατότητα και την επεξεργασιμότητα του PLA και εφαρμόστηκε στην παρασκευή ικριωμάτων με την τεχνική έκπλυσης σε συνδυασμό με άλας NaCl. Αυξημένη και ελεγχόμενη ικανότητα κρυστάλλωσης παρουσίασε το PLA στα νανοσύνθετά του με γραφένιο, ΤiO2 και ΗΑ. Τα νανοσύνθετα με τα βιοδραστικά αυτά μέσα θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν σε διάφορες βιοϊατρικές εφαρμογές, όπως στην κατασκευή ικριωμάτων του πολυ(γαλακτικού οξέος) με τις τεχνικές έκπλυσης άλατος ή με χρήση sc-CO2 που μελετήθηκαν και αριστοποιήθηκαν στη διατριβή αυτή.