Abnormal demethylation and ectopic expression of leukotriene receptors genes LTB4R/LTB4R2 in breast cancer
Authors: Калинкин А.И. , Сигин В.О. , Немцова М.В. , Кузнецова Е.Б. , Кекеева Т.В. , Виноградов И.Ю. , Виноградов М.И. , Виноградов И.И. , Залетаев Д.В. , Стрельников В.В. , Танас А.С. 
Published: December 2021

Введение. Выявление и всесторонняя характеристика новых молекулярных маркеров злокачественных опухолей остаётся актуальной задачей онкологии. Ранее по результатам проведенного авторами широкогеномного скрининга дифференциального метилирования ДНК нормальных и опухолевых тканей молочной железы (МЖ) было выявлено аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 в опухолях относительно нормы. Цель. Настоящее исследование посвящено молекулярной и клинической характеристике аномального деметилирования этого CpG-островка и экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 при раке молочной железы (РМЖ). Методы. Для разведочного анализа использовали полученные авторами ранее результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования Xmal-RRBS 110 образцов РМЖ и 6 образцов нормальной МЖ. В этой выборке был проведен сравнительный анализ уровней метилирования CpG-динуклеотидов в нормальной и опухолевой ткани 10 образцов трижды негативного (ТН) РМЖ с аномальным деметилированием LTB4R/LTB4R2 и 6 образцов нормальной МЖ с использованием критерия Манна-Уитни. Для подтверждения аномального деметилирования в образцах ТН РМЖ было использовано бисульфитное секвенирование по Сэнгеру. Для изучения корреляции между уровнями метилирования и экспрессии и для оценки прогностической значимости экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 использовали данные 3 уровня по измерению метилирования с чипов Illumina HumanMethylation 450K, экспрессии RNA-seq, а также клинические характеристики 731 образцов из проекта TCGA-BRCA. Отличия между кривыми Каплана-Мейера сравнивали с использованием логранкового критерия. Результаты. Определено, что аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 характерно для эпигеномного подтипа умеренно метилированных образцов ТН РМЖ. Определены дифференциально метилированные CpG-динуклеотиды CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2; их дифференциальное метилирование подтверждено бисульфитным секвенированием по Сэнгеру. Установлена отрицательная корреляция между уровнем их метилирования и экспрессией генов LTB4R и LTB4R2. Показано, что общая выживаемость достоверно снижена в группе ТН РМЖ с высокой экспрессией LTB4R, а также в группе нормально-подобных опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R и в группе LumB опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R2. Различия показателей выживаемости позволяют рассматривать уровни экспрессии LTB4R/LTB4R2 как прогностический маркер при РМЖ, однако следует учитывать, что прогноз зависит от молекулярного подтипа опухоли. Это относится также к использованию уровней экспрессии LTB4R/LTB4R2 в качестве потенциального предиктивного маркера чувствительности таких опухолей к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов при проведении клинических испытаний.

Background. The identification and comprehensive characterization of new molecular markers of malignant tumors remains an urgent task of oncology. Earlier, according to the results of a genome-wide screening of differential DNA methylation of normal and tumor breast tissues, abnormal demethylation of the CpG island of LTB4R/LTB4R2 genes in tumors relative to norm was revealed. Aim. The present study focuses on the molecular and clinical characterization of abnormal demethylation of this CpG island and expression of the LTB4R/LTB4R2 genes in breast cancer (BC). Methods. For exploratory analysis, we used the previously obtained results of genome wide bisulfite sequencing of breast cancer (BC) and normal mammary gland samples. From this set, 10 samples of triple-negative (TN) breast cancer with abnormal LTB4R/LTB4R2 demethylation and 6 normal breast samples were selected, for which a comparative analysis of CpG methylation levels in cancer vs norm using the Mann-Whitney test was performed. Sanger bisulfite sequencing was used to confirm abnormal demethylation in TN BC samples. The analysis of the obtained electrophoregrams was carried out using the SeqBase software developed by the authors. To validate and assess the level of predictive significance of LTB4R/LTB4R2 gene expression, level 3 data were used to measure methylation from Illumina HumanMethylation 450K arrays, RNA-seq expression, as well as clinical characteristics for 731 samples from the TCGA-BRCA project. Kaplan-Meier curves were compared using a logrank test. Results. Abnormal demethylation of LTB4R/LTB4R2 genes in breast tumors was confirmed by Sanger sequencing. Among samples from the TCGA-BRCA project, a group of TN BC samples with low methylation of LTB4R/LTB4R2 genes was identified. Overall survival was significantly reduced in the TN breast cancer group with high LTB4R expression, as well as in the group of normal-like breast tumors with low LTB4R expression, and in the LumB group overall survival was significantly reduced when tumors demonstrated low LTB4R2 expression. Conclusions. Fine mapping of abnormal demethylation in individual CpG dinucleotides of the LTB4R/LTB4R2 genes will make it possible to design an effective PCR system that may potentially be used to define patients with TN breast cancer that would benefit from leukotriene receptor therapeutic inhibition. Different expression levels of LTB4R/LTB4R2 allow their use as a prognostic marker for breast cancer, but the prognosis directly depends on the molecular subtype of a tumor. This also applies to the use of different levels of LTB4R/LTB4R2 expression as a predictive marker of the sensitivity of such tumors to leukotriene receptor inhibitors in case they enter clinical trials.