Επαναπροσδιορισμός της γονεϊκής αποτύπωσης στα πρώτα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης
Authors: Σακάλογλου Πρόδρομος 
Published: September 2021

Ο επιγενετικός μηχανισμός της μεθυλίωσης του DNA διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση του κυττάρου, στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, στον επαναπρογραμματισμό του γενώματος και στην καταστολή των μεταθετών στοιχείων. Στα θηλαστικά, ο επιγενετικός επαναπρογραμματισμός επιτελείται στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. Μετά τη γονιμοποίηση, λαμβάνει χώρα καθολική απομεθυλίωση του πατρικού και μητρικού γενώματος με σκοπό τη διαγραφή της γενωμικής αποτύπωσης που φέρουν οι γονείς. Την απομεθυλίωση ακολουθεί η εκ νέου μεθυλίωση στο στάδιο της βλαστοκύστης η οποία εγκαθιδρύει ένα νέο πρότυπο μεθυλίωσης. Ο επαναπροσδιορισμός του προτύπου μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου αποτελεί ένα “παράθυρο ευκαιρίας” για την έκφραση των κύριων παραγόντων πολυδυναμίας Oct-4, Sox 2 και Nanog, απαραίτητοι για την εγκαθίδρυση και διατήρηση της πολυδυναμίας και της ικανότητας αυτό-αναγέννησης των εμβρυϊκών στελεχιαίων κυττάρων στο προεμφυτευτικό έμβρυο. Επιπροσθέτως, τα έως τώρα ανενεργά ρετρομεταθετά στοιχεία έχουν τη δυνατότητα να επανενεργοποιηθούν και να ρετρομετατεθούν στο γένωμα. Τα LINE-1 είναι ενεργά ρετρομεταθετά στοιχεία τα οποία σχετίζονται με αρκετά νοσήματα στον άνθρωπο, εμπλέκονται σε χρωμοσωματικές ανακατατάξεις και στην αποσιώπηση γονιδίων και έχει διαπιστωθεί ότι είναι ενεργά στα αδιαφοροποίητα ESCs του ανθρώπου. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να μελετήσουμε έκφρασης των παραγόντων Oct-4, Sox2 και Nanog καθώς και να προσδιορίσουμε το πρότυπο μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου στον άνθρωπο καθώς και να ερευνήσουμε την επίδραση της επαγόμενης ρετρομετάθεσης του L1 στον επιγενετικό μηχανισμό της μεθυλίωσης και στη σταθερότητα του γενώματος.Αρχικά, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων για τους παράγοντες Oct-4, Sox2 και Nanog μελετήσαμε την έκφρασή τους στα προεμφυτευτικά έμβρυα. Η έκφραση του παράγοντα Oct-4 ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε έμβρυα στο στάδιο των 8 κυττάρων και ήταν ίδια σε όλα τα βλαστομερίδια μέχρι το στάδιο του μοριδίου. Στη βλαστοκύστη, σήματα φθορισμού ανιχνεύθηκαν μόνο στα κύτταρα της ICM. Η έκφραση του Sox2 ανιχνεύθηκε στο στάδιο του πρώιμου μοριδίου και ακολούθησε η έκφραση του Nanog στο στάδιο του όψιμου μοριδίου. Στη βλαστοκύστη, η έκφραση των Sox2 και Nanog περιορίστηκε στην ICM ακολουθώντας το πρότυπο έκφρασης του Oct-4. Οι παράγοντες Oct-4, Sox2 και Nanog αποτελούν τον πυρήνα του ρυθμιστικού δικτύου που είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της πολυδυναμίας των κυττάρων και της ικανότητάς τους για αυτο-αναγέννηση. Τα πρότυπα έκφρασης των παραγόντων υποδεικνύουν ότι ο Oct-4 αποτελεί τον κύριο μεταγραφικό παράγοντα μεταξύ των τριών, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση του Sox2 και στη συνέχεια οι δύο παράγοντες συνεργατικά ελέγχουν την έκφραση του Nanog.Η δεύτερη φάση της μελέτης αφορούσε τη μελέτη του προτύπου μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της 5-μεθυλοκυτιδίνης καταφέραμε να ανιχνεύσουμε τις μεθυλιωμένες κυτοσίνες στο γένωμα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ισχυρή μεθυλίωση στο ζυγωτό και μέχρι το στάδιο των 4 κυττάρων. Σταδιακή απομεθυλιώση διαπιστώθηκε από το στάδιο των 8 κυττάρων και μέχρι το μοριδίο όπου η μεθυλίωση έφτασε στο κατώτατο επίπεδο. Στο στάδιο της βλαστοκύστης ανιχνεύθηκαν και πάλι σήματα φθορισμού υποδηλώνοντας την εκ νέου μεθυλίωση του γενώματος.Στα πλαίσια μελέτης της επίδρασης της ρετρομετάθεσης στον επαναπροσδιορισμό της μεθυλίωσης και τη σταθερότητα του γενώματος, επαγάγαμε τη ρετρομετάθεση του L1 ρετρομεταθετού στοιχείου μέσω της έγχυσης μικροποσότητας ανασυνδυασμένου L1 σε ανθρώπινα ωάρια κατά τη διαδικασία της μικρογονιμοποίησης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι της 5-μεθυλοκυτιδίνης και της γΗ2ΑΧ είχαμε τη δυνατότητα να ανιχνεύσουμε αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης και θραύσεις του δίκλωνου μορίου DNA. Όσο αφορά τη μεθυλίωση, δεν εντοπίσαμε διαφορές στα ζυγωτά και προεμφυτευτικά έμβρυα στα οποία εισήχθη το L1 σε σύγκριση με τα δείγματα που χρησιμοποιήσαμε ως μάρτυρες (controls). Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να αναφερθεί ότι τα δείγματα αφορούσαν έμβρυα μέχρι το στάδιο των 6 κυττάρων. Μία υπόθεση η οποία θα μπορούσε να ερμηνεύσει την έλλειψη διαφοράς στα επίπεδα μεθυλίωσης είναι ότι τα έμβρυα μέχρι το στάδιο του μοριδίου ακολουθούν μία διαδικασία καθολικής απομεθυλίωσης καθιστώντας αδύνατο να ανιχνεύσουμε την επίδραση της ρετρομετάθεσης στην εκ νέου μεθυλίωση. Τα ρετρομεταθετά στοιχεία αποτελούν στόχους μεθυλίωσης και ως εκ τούτου αναμένεται ότι η αύξηση των αντιγράφων L1 στο γένωμα θα έχουν ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του γενώματος.Τέλος, σε ζυγωτά και προεμφυτευτικά έμβρυα στα οποία επαγάγαμε τη ρετρομετάθεση του L1 ανιχνεύσαμε σήματα ανοσοφθορισμού για τη γΗ2ΑΧ. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η έκφραση του L1 ρετρομεταθετού στοιχείου προκαλεί θραύσεις στο δίκλωνο μόριο του DNA , προκαλώντας ενδεχομένως γενωμική αστάθεια λόγω αδυναμίας επιδιόρθωσης στα κύτταρα του εμβρύου.Στην παρούσα μελέτη προσδιορίσαμε τα πρότυπα έκφρασης των κύριων παραγόντων πολυδυναμίας (Oct4, Sox2, Nanog) και αποτυπώσαμε τις μεταβολές στο πρότυπο μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια εμβρυϊκής ανάπτυξης στον άνθρωπο στα πλαίσια του επιγενετικού επαναρπογραμματισμού. Επιπλέον, αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι πολλαπλά γεγονότα ρετρομετάθεσης στο προεμφυτευτικό έμβρυο στον άνθρωπο, προκαλούν θραύσεις στο δίκλωνο μόριο του DNA.