Improving the performance of synthetic and biomimetic 3D-printed bone grafts
Authors:   , Mazo Barbara Laura del 
Published: November 2024

(English) Bone is the second most frequent tissue transplantation right after blood transfusion. Although it has natural self-healing abilities, bone grafts are required in critical size defects to provide mechanical support, besides stimulating and guiding new bone formation. A wide range of innovative synthetic materials have been developed for bone tissue regeneration. Among them, calcium phosphate (CaP) cements have gained particular relevance because they are able to self-harden at body temperature through a cementitious reaction and result in biomimetic calcium deficient hydroxyapatite (CDHA), with a composition and microstructure very similar to the inorganic phase of bone. This material is biocompatible and bioactive and it is resorbed progressively during the bone remodelling cycle. Moreover, it is possible to obtain CDHA bone grafts through the 3D printing technology Direct Ink Writing (DIW), by microextrusion of a CaP paste that is able to self-harden after immersion in distilled water at 37 ºC. This allows the creation of personalised bone grafts that perfectly fit the defects of the patients and, at the same time, have precisely controlled internal porosity, an essential factor in inducing new bone ingrowth.
The main goal of this PhD thesis is to improve the mechanical properties of 3D-printed biomimetic CDHA bone grafts obtained by DIW at low temperatures while keeping their excellent biological properties. Moreover, the thesis also addresses the challenge of developing biomorphic CDHA structures with triply periodic minimal surfaces (TPMS) by DIW.
The thesis is divided into three parts: i) the definition of a methodology for assessing the DIW printability of ceramic pastes; ii) the development of a novel calcium phosphate ink for DIW, using a polycaprolactone (PCL) solution binder, to improve the mechanical properties; and iii) design and 3D printing of biomorphic grafts to enhance the biological response.
Chapter 1 presents the main types of ceramic inks for DIW and a detailed description of the more relevant rheological tests for assessing their DIW printability. Moreover, the key rheological parameters are identified and linked to printability aspects. Chapter 2 details the development of a PCL\α-tricalcium phosphate (α-TCP) ink. The presence of PCL did not hinder the hardening reaction and improved the mechanical properties of the 3D-printed bone grafts, especially in terms of toughness. On the other hand, the absence of water in the binder enhanced the stability of the ink and the freshly printed bone grafts, allowing their storage for long periods of time. Chapter 3 characterizes the hardening reaction of the PCL\α-TCP ink, focussing on the evolution of the mechanical and physicochemical properties, as well as the in vitro cell response. The microstructure evolved from a continuous polymeric phase with loose α-TCP particles to a continuous entangled network of CDHA nanocrystals intertwined with the polymer. This resulted in the evolution of the mechanical behaviour from ductile, dominated by the polymer, to stiffer as the ceramic phase reacted. Moreover, the PCL binder provided excellent handleability and elasticity for the as-printed bone grafts. The low PCL content, together with the proven possibility of eliminating the solvent, preserved the favourable in vitro response typical of CDHA. Chapter 4 explores the effect of three different sterilization methods (ethylene oxide gasification, gamma-irradiation and autoclave) on the properties and in vitro degradation of 3D-printed PCL\CDHA bone grafts. PCL underwent hydrolytic bulk degradation without compromising the morphology and integrity of the constructs. Gamma irradiation resulted in the most appropriate option. Chapter 5 investigates the design and 3D printing of three TPMS geometries (Gyroid, Diamond and Schwarz) to generate concave porosity. These structures promoted blood permeability and cell adhesion, proliferation, differentiation and mineralisation.

(Català) L'os és el segon trasplantament de teixit més freqüent després de la sang. Tot i que té capacitats naturals d'autocuració, empelts ossis són necessaris quan la mida del defecte és crítica, per tal de proporcionar suport mecànic, a part d'estimular i guiar la formació d'os nou. S'han desenvolupat una àmplia gamma de materials sintètics innovadors per regenerar l’os. Entre ells, els ciments de fosfat càlcic (CaP) han adquirit una rellevància especial perquè són capaços d'autoendurir-se a temperatura corporal mitjançant una reacció de cimentació i donar lloc a hidroxiapatita deficient en calci (CDHA), amb una composició i microestructura biomimètica molt semblant a la fase inorgànica de l’os. La CDHA és biocompatible i bioactiva i es reabsorbeix progressivament durant el cicle de remodelació ossi. A més, és possible obtenir empelts de CDHA mitjançant la tecnologia d'impressió 3D anomenada direct ink wiriting (DIW), per microextrusió d'una pasta de CaP que s’autoendureix quan es submergeix en aigua a 37 ºC. Això permet crear empelts de CDHA personalitzats que s'adapten perfectament als defectes dels pacients i, alhora, controlar amb precisió la porositat interna, factor essencial per induir la formació d’os nou.
El principal objectiu d’aquesta tesi doctoral és millorar les propietats mecàniques dels empelts de CDHA impresos per DIW a baixa temperatura, mantenint les seves excel·lents propietats biològiques. D’altra banda, s’aborda el repte de desenvolupar empelts de CDHA amb estructures biomòrfiques basades en superfícies mínimes triplement periòdiques (TPMS).
La tesi es divideix en tres parts: i) definició d'una metodologia per avaluar la imprimibilitat de pastes ceràmiques a través de DIW; ii) desenvolupament d'una nova tinta de CaP per DIW, utilitzant una solució de policaprolactona (PCL) com aglutinant, per millorar les propietats mecàniques; i iii) disseny i impressió 3D d'empelts biomòrfics per potenciar la resposta biològica.
El Capítol 1 presenta els principals tipus de tintes ceràmiques usades en DIW i una descripció detallada de les proves reològiques més rellevants per avaluar la seva imprimibilitat. També, s'identifiquen els paràmetres reològics clau i es relacionen amb aspectes d'imprimibilitat. El Capítol 2 detalla el desenvolupament d'una tinta de PCL\ fosfat tricàlcic α (α-TCP). La presència de PCL no va impedir la reacció d'enduriment i va millorar les propietats mecàniques dels empelts impresos per DIW, especialment la duresa. D'altra banda, l'absència d'aigua en la tinta va millorar la seva estabilitat i la dels empelts acabats d’imprimir, permetent-ne l'emmagatzematge durant llargs períodes. El Capítol 3 caracteritza la reacció d'enduriment de la tinta PCL\α-TCP, centrant-se en l'evolució de les propietats mecàniques i fisicoquímiques, així com en la resposta cel·lular in vitro. La microestructura va evolucionar d’una fase polimèrica contínua amb partícules lliures d'α-TCP a una xarxa contínua de nanocristalls de CDHA entrellaçats entre si i amb el PCL. Això va resultar en l’evolució d’un comportament mecànic dúctil, on dominava el polímer, a un de més rígid a mesura que la fase ceràmica reaccionava. A més, l’aglutinant de PCL va permetre manipular els empelts acabats d’imprimir i elàstics. El baix contingut de PCL, juntament amb la possibilitat demostrada d’eliminar el solvent, va preservar la resposta cel·lular favorable. El Capítol 4 explora l'efecte de tres mètodes d'esterilització (gasificació amb òxid d'etilè, irradiació gamma i autoclau) sobre les propietats i la degradació in vitro dels empelts de PCL\CDHA. El PCL va patir una degradació hidrolítica uniforme sense comprometre la morfologia ni la integritat de les construccions. La irradiació gamma va resultar ser l'opció més adequada. El Capítol 5 investiga el disseny i la impressió 3D de tres geometries TPMS (Gyroid, Diamond i Schwarz) per generar porositat còncava. Aquestes estructures van potenciar la permeabilitat sanguínia i la resposta cel·lular.