Μελέτη της φαρμακοκινητικής και της ενδεχόμενης αμφιβληστροειδικής τοξικότητας πρωτότυπων συνθετικών νευροστεροειδών μορίων με νευροπροστατευτική δράση
Authors: Τσίκα Χρυσάνθη 
Published: March 2024

Το ΒΝΝ27 είναι ένα πρωτόλειο συνθετικό 17-spiroepoxy παράγωγο του νευροστεροειδούς Δεϋδροεπιανδροστερόνης (Dehydroepiandrosterone, DΗΕΑ). Αποτελεί το ένα από μια ολόκληρη σειρά νεοσυντεθιμένων συνθετικών παραγώγων της DΗΕΑ, τα οποία ονομάστηκαν ΒΝΝ και είναι μικρά λιπόφιλα μόρια, με αντιαποπτωτικές ιδιότητες, χωρίς την ανεπιθύμητη οιστρογονική δράση της DHEA. Πιο συγκεκριμένα, είναι ένα από τα τρία ΒΝΝ (ΒΝΝ20, 23 και 27), τα οποία βρέθηκαν να έχουν την πιο ισχυρή νευροπροστατευτική και αντιαποπτωτική δράση. Στην παρούσα διατριβή, επιλέχθηκε το ΒΝΝ27, γιατί είναι το ΒΝΝ που έχει μελετηθεί σε πειραματικά ζωικά μοντέλα αμφιβληστροειδικών παθήσεων, ενώ είναι και το πιο πολυχρησιμοποιημένο ΒΝΝ, στις μέχρι τώρα προκλινικές μελέτες, συνολικά.Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η μελέτη των φαρμακοκινητικών χαρακτηριστικών του BNN27, τόσο μετά από συστηματική όσο και μετά από τοπική χορήγηση, τόσο στο αίμα όσο και στο όργανο στόχο, το οπίσθιο ημιμόριο του οφθαλμού (υαλοειδές και αμφιβληστροειδής), καθώς και η διερεύνηση πιθανής τοξικότητας του μορίου στον αμφιβληστροειδή, μετά από τοπική χορήγηση.Αρχικά, περιεγράφηκαν φασματοσκοπικά τα τρία βασικά ΒΝΝ, ΒΝΝ20, 23 και 27. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η φαρμακοκινητική του ΒΝΝ27 τόσο μετά από συστηματική- ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση, στον ορό του αίματος και στο όργανο στόχο, τον αμφιβληστροειδή, όσο και μετά από τοπική- ενδοϋαλοειδική χορήγηση, στο υαλοειδές σώμα. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η ύπαρξη ενδεχόμενης αμφιβληστροειδικής τοξικότητας έπειτα από ενδοϋαλοειδική χορήγηση του ΒΝΝ27. Για την κινητική στο αίμα, χρησιμοποιήθηκαν 42 C57BL/6 μύς. Χορηγήθηκε μία ενδοπεριτοναϊκή ένεση 100mg/kg β.σ. ΒΝΝ27. Το αίμα συλλέχθηκε οπισθοβολβικά στις χρονικές στιγμές 0, 30 λεπτά, 1ώρα, 2, 4, 6 και 24ώρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Το μόριο βρέθηκε να έχει σταθερά απομάκρυνσης (elimination constant) kel=0.465h^(-1) και χρόνο μέσης παραμονής (Mean Residence Time) MRT=2.154 ώρες στον ορό του αίματος του μυός. Για την κινητική στον αμφιβληστροειδή, έγινε μία ενδοπεριτοναϊκή έγχυση 30mg/kg β.σ. σε 48 Sprague-Dawley επίμυες. Ο αμφιβληστροειδής απομονώθηκε με κατάλληλη τεχνική, μετά από εξόρυξη των οφθαλμών στις χρονικές στιγμές 0, 15, 30λεπτά, 1ώρα, 2, 4, 6 και 24 ώρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Η πρώτη χρονική στιγμή ανίχνευσης του ΒΝΝ27 στον αμφιβληστροειδή ήταν τα 30 λεπτά. Η χρονική στιγμή της μέγιστης μετρούμενης συγκέντρωσης (tcmax) ήταν οι δύο ώρες και η μέγιστη συγκέντρωση βρέθηκε ίσης με Cmax=1100ng/g. Το ΒΝΝ27 ανιχνεύτηκε στον αμφιβληστροειδή ακόμα και μετά από απομάκρυνση του αίματος από τη συστηματική κυκλοφορία, με τροποποιημένη διακαρδιακή έγχυση με ισοτονικό διάλυμα Ringer’s Lactate (RL) με μετρούμενη συγκέντρωση στις 2 ώρες τα 320(70) ng/g. Για τη μελέτη της κινητικής στο υαλοειδές, έγινε μία ενδοϋαλοειδική ένεση 6mg/ml ΒΝΝ27 σε αμφότερους τους οφθαλμούς 21 αλφικών κονίκλων. Το υαλοειδές απομονώθηκε με κατάλληλη τεχνική, μετά από εξόρυξη των οφθαλμών στις χρονικές στιγμές 0 (ευθανασία αμέσως μετά την έγχυση), 12 ώρες, 1, 2, 7, 14 και 30 ημέρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Η απομάκρυνση του ΒΝΝ27 από το υαλοειδές βρέθηκε να ακολουθεί κινητική 1ης τάξης, με σταθερά απομάκρυνσης kel= 0.15h^(-1) και χρόνο ημίσειας ζωής τις 4.49 ημέρες. Για τη διερεύνηση της αμφιβληστροειδικής τοξικότητας, ελέγχθηκαν δύο ενδοϋαλοειδικές συγκεντρώσεις ΒΝΝ27: 6mg/ml (ομάδα Α) και 0.6mg/ml (ομάδα Β). Σε αμφότερες τις ομάδες, εγχύθηκε ενδοϋαλοειδικά 0.1ml μίγματος ΒΝΝ27 της αντίστοιχης συγκέντρωσης, στον δεξιό οφθαλμό (οφθαλμός μελέτης) 12 κονίκλων με φυσιολογική χρωστική και 0.1 ml διαλύματος 6% αιθυλικής αλκοόλης στον αριστερό οφθαλμό και των δύο ομάδων (οφθαλμός ελέγχου-θετικός μάρτυρας). Ελέγχθηκαν οι χρονικές στιγμές 0 (πριν την έγχυση), 1 μέρα, 1 εβδομάδα, 2 εβδομάδες και 1 μήνας μετά την έγχυση. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, χρησιμοποιήθηκαν μακροσκοπικές τεχνικές παρακολούθησης (σχισμοειδής λυχνία, βυθοσκόπηση, τονομέτρηση). Μετά το τέλος του πειράματος, οι οφθαλμοί μελετήθηκαν ιστολογικά, με φωτονικό μικροσκόπιο, μετά από εξόρυξη και κατάλληλη προετοιμασία. Η λειτουργική ακεραιότητα του αμφιβληστροειδή μελετήθηκε με αμφιβληστροειδογράφημα (ΗΑΓ), πριν την έγχυση και ένα μήνα μετά την έγχυση, πριν την ευθανασία. Στην ομάδα Α παρατηρήθηκαν ανατομικά και λειτουργικά ευρήματα ενδοϋαλοειδικής φλεγμονής σε 2 οφθαλμούς μελέτης, τα οποία πιθανά να σχετίζονται με το υπό μελέτη κολλοειδές του ΒΝΝ27. Στην ομάδα Β, δεν παρατηρήθηκαν ευρήματα τοξικότητας του ΒΝΝ27. Σε αμφότερες τις ομάδες, παρατηρήθηκαν μικροσκοπικές αλλοιώσεις, μη σχετιζόμενες με το υπό μελέτη μόριο, που δεν επιβεβαιώθηκαν ηλεκτροφυσιολογικά. Οι οφθαλμοί μάρτυρες αμφότερων των ομάδων δεν εμφάνισαν σημεία τοξικότητας. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι το ΒΝΝ27 μετακινείται ταχέως από τον ενδοπεριτοναϊκό χώρο στο αίμα και από κει στον αμφιβληστροειδή. Δεδομένου του μεγέθους και της λιποφιλικότητας του μορίου, κάτι τέτοιο ήταν αναμενόμενο. Το ΒΝΝ27 αποδείχθηκε ότι διέρχεται τον αιματοαμφιβληστροειδικό φραγμό με την ανίχνευσή του στον ιστό, μετά τη διακαρδιακή έγχυση RL. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η συγκεκριμένη φαρμακοκινητική μορφή του ΒΝΝ27 μπορεί να λειτουργήσει ως δεξαμενή για την βραδεία απόδοση του μορίου στον αμφιβληστροειδή, σε πιθανή κλινική του χρήση. Τέλος, η χαμηλή δόση φαίνεται να είναι σχετικά ασφαλής για ενδοϋαλοειδική χρήση και η αιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια για την αραίωση του BNN27 στη συγκέντρωση 6% v/v.