Εγκλεισμός του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 και εφαρμογή του σε τρόφιμο
Authors: Φρακολάκη Γεωργία 
Published: April 2022

Ο εγκλεισμός των προβιοτικών κυττάρων ορίζεται ως η διεργασία κατά την οποία προβιοτικά κύτταρα εγκλείονται μέσα σε υλικά κατάλληλα για τρόφιμα, προκειμένου να παραχθούν σωματίδια με λεπτή, ημιπερατή μεμβράνη, διαμέτρου από μερικά nm έως μερικά mm. Τα παραγόμενα σφαιρίδια (προϊόντα εγκλεισμού) μπορούν να ενσωματωθούν σε προϊόντα τροφίμων για την παραγωγή προβιοτικών προϊόντων. Ο σκοπός της τεχνολογίας του εγκλεισμού είναι ο περιορισμός της φθοράς ή απώλειας των προβιοτικών κυττάρων κατά την έκθεσή τους σε αντίξοες συνθήκες κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης ή/και της κατανάλωσης. Ακόμη, ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων παρέχει στη βιομηχανία τροφίμων ευελιξία κατά την παραγωγή προϊόντων που περιέχουν τα συγκεκριμένα είδη βακτηρίων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο εγκλεισμός προβιοτικών βακτηρίων με σκοπό την επακόλουθη ενσωμάτωση των προϊόντων εγκλεισμού σε προϊόν τροφίμου. Το προβιοτικό στέλεχος που επιλέχθηκε προς εγκλεισμό ήταν το στέλεχος Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, ενώ οι μέθοδοι εγκλεισμού που εφαρμόστηκαν ήταν η τεχνική της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης, καθώς επίσης και μία καινοτόμος μέθοδος η οποία συνδυάζει διπλό νερό-σε-λάδι-σε-νερό γαλάκτωμα με την τεχνική της εξώθησης, με στόχο την αύξηση της παρεχόμενης προστασίας στα προβιοτικά κύτταρα. Η τεχνική της εξώθησης στηρίζεται στην στάγδην προσθήκη του διαλύματος του εγκλειστικού μέσου που εμπεριέχει τα προς εγκλεισμό προβιοτικά κύτταρα σε διάλυμα CaCl2 με σκοπό την παραγωγή σφαιριδίων μέσω δημιουργίας σταυροειδών δεσμών μεταξύ του εγκλειστικού μέσου και των ιόντων Ca2+. Αντίστοιχα, η τεχνική της γαλακτωματοποίησης στηρίζεται στη διασπορά μίας υδατικής φάσης που εμπεριέχει το εγκλειστικό μέσο και τα προβιοτικά βακτήρια εντός μίας λιπαρής φάσης και τον σχηματισμό γαλακτώματος. Όταν το γαλάκτωμα έρχεται σε επαφή με διάλυμα CaCl2, πραγματοποιείται σχηματισμός σταυροειδών δεσμών όπως και στην περίπτωση της εξώθησης, με αποτέλεσμα τα σταγονίδια εντός της λιπαρής φάσης να μετατρέπονται σε στερεά σωματίδια. Τα εγκλειστικά μίγματα που εξετάστηκαν κατά την εφαρμογή των δύο πρώτων μεθόδων εγκλεισμού (εξώθηση και γαλακτωματοποίηση) περιελάμβαναν τα εξής: αλγινικό νάτριο μόνο του ως εγκλειστικό μέσο, καθώς και σε μίγμα με άλλα υλικά είτε συμβατικά, όπως ξανθάνη, γλυκερόλη, κ-καραγενάνη και σκόνη ορού γάλακτος μαζί με πηκτίνη, είτε καινοτόμα όπως νανοκρυσταλλική κυτταρίνη (CNC). Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η χρήση γάλακτος αντί νερού για την παρασκευή του διαλύματος του εγκλειστικού μέσου αλγινικού νατρίου. Ακόμη, σε κάθε εγκλειστικό μίγμα εξετάστηκε η προσθήκη ινουλίνης, γλυκόζης ή L-κυστεΐνης-HCl, προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή επίδραση αυτών στη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων. Κατά την εφαρμογή της καινοτόμου μεθόδου που συνδυάζει διπλό ν1/ε/ν2 γαλάκτωμα με την τεχνική της εξώθησης έγινε μελέτη διαφόρων εγκλειστικών μέσων (αλγινικό, αλγινικό-πηκτίνη, αλγινικό-ζελατίνη, αλγινικό-καζεΐνη, αλγινικό-αραβικό κόμμι) για το σχηματισμό του διπλού γαλακτώματος και επιλέχθηκε προς εφαρμογή το σταθερότερο γαλάκτωμα με βάση τις τιμές του ζ-δυναμικού και του ιξώδους του διπλού ν1/ε/ν2 γαλακτώματος. Σε κάθε περίπτωση, στην εσωτερική φάση του διπλού γαλακτώματος έγινε ενσωμάτωση του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 μαζί με ινουλίνη. Ακόμη, μετά το πέρας του εγκλεισμού εξετάστηκε και η πιθανότητα επικάλυψης των προκυπτόντων σφαιριδίων με χιτοζάνη. Στόχος όλων των ανωτέρω ήταν η αξιολόγηση της ικανότητας των συγκεκριμένων μέσων να ενθυλακώσουν τα προβιοτικά βακτήρια και να τους παρέχουν επαρκή προστασία τόσο κατά τη διατήρηση των προκυπτόντων προϊόντων εγκλεισμού υπό ψύξη ή κατάψυξη, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος. Η αποτελεσματικότητα κάθε μεθόδου ως προς τον εγκλεισμό του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 εξετάστηκε μέσω της απόδοσης εγκλεισμού (ΕΥ%), ενώ η παρεχόμενη προστασία αξιολογήθηκε μέσω εκτίμησης του ποσοστού επιβίωσης (SR%) των προβιοτικών κυττάρων. Όλα τα παραπάνω προσδιορίστηκαν μέσω μικροβιολογικών αναλύσεων. Έγινε, επίσης, χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) με σκοπό τη μελέτη της δομής και της μορφολογίας των προϊόντων εγκλεισμού. Από τα πειράματα προέκυψε ότι και οι δύο πρώτες μέθοδοι εγκλεισμού (εξώθηση, γαλακτωματοποίηση) παρείχαν υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού, με τα καλύτερα αποτελέσματα να επιτυγχάνονται εν γένει μέσω της τεχνικής της γαλακτωματοποίησης (84.2-99.7%) έναντι της τεχνικής της εξώθησης (58.6-100%). Από τα εγκλειστικά μέσα που μελετήθηκαν, καλύτερο αποδείχθηκε το μίγμα γάλακτος-αλγινικού-γλυκόζης, με αποδόσεις εγκλεισμού 100.0% και 99.2% μέσω των τεχνικών της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης, αντίστοιχα. Σημαντικά υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού επιτεύχθηκαν και μέσω συνδυασμού του αλγινικού με άλλα υλικά, την κ-καραγενάνη και το CNC, φτάνοντας μέχρι και 91.3% μέσω εξώθησης και 98.8% μέσω γαλακτωματοποίησης. Τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μίγματα δημιουργούν ένα αρκετά σταθερό και πυκνό πλέγμα, εγκλείοντας με επιτυχία μεγάλο ποσοστό προβιοτικών κυττάρων, και ως εκ τούτου προτείνονται ως αποτελεσματικοί φορείς εγκλεισμού των προβιοτικών βακτηρίων. Αντίθετα, η χρήση μόνο αλγινικού νατρίου ως εγκλειστικού μέσου οδήγησε στις χαμηλότερες αποδόσεις εγκλεισμού (60.5% μέσω εξώθησης και 86.9% μέσω γαλακτωματοποίησης), ενώ η προσθήκη ξανθάνης, γλυκερόλης ή μίγματος σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης αύξησε αρκετά τις τιμές αυτές, είτε στην περίπτωση της εξώθησης (73.2, 78.0, 86.9% αντίστοιχα), είτε στην περίπτωση της γαλακτωματοποίησης (87.1, 92.6 και 87.4%). Ακόμη, η προσθήκη γλυκόζης φάνηκε να ευνοεί τη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων κατά τη διάρκεια του εγκλεισμού, αυξάνοντας ελαφρώς την απόδοση εγκλεισμού. Τα ίδια εγκλειστικά μίγματα (μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC ή γάλα) που έδωσαν υψηλές τιμές απόδοσης εγκλεισμού παρείχαν, επίσης, ικανοποιητική προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά κύτταρα τόσο κατά τη διατήρηση των προϊόντων εγκλεισμού υπό ψύξη ή κατάψυξη, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης. Τα υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης κατά την αποθήκευση των προϊόντων εγκλεισμού στους 4οC επιτεύχθηκαν μέσω της τεχνικής της εξώθησης, ξεπερνώντας το 72%, σε αντίθεση με τα ποσοστά επιβίωσης που επιτεύχθηκαν με τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μίγματα μέσω γαλακτωματοποίησης (>51.1%). Η χρήση, μόνο, αλγινικού ως εγκλειστικό μέσο δεν είχε ικανοποιητικά αποτελέσματα, και έτσι μελετήθηκε ο συνδυασμός του με άλλα υλικά. Τα βέλτιστα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν, όπως και στην περίπτωση της απόδοσης εγκλεισμού, μέσω συνδυασμού γάλακτος με αλγινικό, με ποσοστά επιβίωσης, μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης στους 4οC, που ανέρχονταν στο 72.0% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω εξώθησης και στο 52.7% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης. Στην περίπτωση του εγκλεισμού μέσω εξώθησης, ο συνδυασμός αλγινικού με ξανθάνη, γλυκερόλη, μίγμα σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης, κ-καραγενάνη ή CNC βοήθησε στη διατήρηση ενός μέρους της βιωσιμότητας των προβιοτικών κυττάρων (28.6-37.8%) μέχρι το τέλος των 30 ημερών αποθήκευσης στους 4οC. Ακόμη, αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλα τα εγκλειστικά μίγματα πέραν του μίγματος γάλακτος-αλγινικού, η προσθήκη γλυκόζης οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση (12.9-42.2%) της βιωσιμότητας κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης υπό ψύξη. Η προσθήκη, επίσης, ινουλίνης σε κάθε εγκλειστικό μίγμα αύξησε μερικώς στις περισσότερες περιπτώσεις τη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων. Αντίστοιχη τάση, όσον αφορά τη συμπεριφορά των εγκλειστικών μιγμάτων, παρατηρήθηκε και κατά την αποθήκευση των προϊόντων εγκλεισμού στους -18οC, καθώς με τα συγκεκριμένα εγκλειστικά μέσα (μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC ή γάλα) επιτεύχθηκαν ποσοστά επιβίωσης 69.9-82.4% μέσω εξώθησης και 49.6-55.2% μέσω γαλακτωματοποίησης. Όσον αφορά το βακτηριακό φορτίο των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης, αυτό διατηρήθηκε σε επίπεδα άνω των 6 log cfu g-1 μέχρι και για 30 ημέρες αποθήκευση στους 4οC ή στους -18οC στην περίπτωση των μιγμάτων κ-καραγενάνης, CNC ή γάλακτος με αλγινικό και γλυκόζη. Επιπρόσθετα, στην περίπτωση αποθήκευσης σε τόσο χαμηλές θερμοκρασίες η προσθήκη γλυκερόλης στο εγκλειστικό μίγμα είχε σημαντική συμβολή, με αποτέλεσμα τα ποσοστά επιβίωσης του προβιοτικού στελέχους μετά από διατήρηση στους -18οC για 30 ημέρες να φτάνουν στο 82.5% στην περίπτωση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης και στο 57.1% στην περίπτωση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης.Εξίσου ενθαρρυντικά ήταν τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη δοκιμή προσομοίωσης πέψης, με τα βέλτιστα ποσοστά επιβίωσης του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 (78.4%) να επιτυγχάνονται στα προϊόντα εγκλεισμού που παρήχθησαν μέσω εξώθησης με εγκλειστικό μέσο το μίγμα γάλακτος-αλγινικού. Τα αντίστοιχα προϊόντα εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης διατήρησαν τη βιωσιμότητα του προβιοτικού στελέχους ΒΒ-12 μέχρι και 45.7%. Επιπρόσθετα, καθώς το αλγινικό μόνο του δεν παρείχε επαρκή προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά κύτταρα, δοκιμάστηκαν συνδυασμοί αλγινικού με κ-καραγενάνη, ξανθάνη, σκόνη ορού γάλακτος-πηκτίνη ή CNC, οι οποίοι αύξησαν τα ποσοστά επιβίωσης κατά 7.9-44.6% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω εξώθησης και μέχρι 28.1% στην περίπτωση εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης. Η προσθήκη της πρεβιοτικής ουσίας, της ινουλίνης, είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των προβιοτικών κυττάρων κατά την έκθεσή τους σε σύστημα προσομοίωσης πέψης, αυξάνοντας σε κάθε περίπτωση τα ποσοστά επιβίωσης, ενώ η προσθήκη γλυκόζης ή L-κυστεΐνης-HCl δεν είχε κάποια σημαντική συνεισφορά στη βιωσιμότητα των εγκλεισμένων προβιοτικών βακτηρίων μέσω των δύο μεθόδων εγκλεισμού.Από την παρατήρηση των προϊόντων εγκλεισμού μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) προέκυψε ότι η προσθήκη γλυκόζης, κ-καραγενάνης, CNC ή γάλακτος στο εγκλειστικό μίγμα βελτίωσε τη δομή των προϊόντων εγκλεισμού μέσω εξώθησης, στα οποία επιβεβαιώθηκε η απουσία ρωγμών ή διακριτών πόρων, επαληθεύοντας την παρεχόμενη προστασία στα εγκλεισμένα προβιοτικά βακτήρια. Τα προϊόντα εγκλεισμού που παρήχθησαν μέσω γαλακτωματοποίησης χαρακτηρίζονταν από μικρότερο μέγεθος, περισσότερο ανομοιόμορφη μορφολογία και είχαν τάση σχηματισμού συσσωματωμάτων. Κατά την εφαρμογή της καινοτόμου μεθόδου εγκλεισμού μέσω συνδυασμού διπλού ν1/ε/ν2 γαλακτώματος με την τεχνική της εξώθησης, με βάση τις μετρήσεις του ζ-δυναμικού και του ιξώδους των διαλυμάτων που εξετάστηκαν για χρήση ως εξωτερική φάση του διπλού γαλακτώματος, προέκυψε ως καταλληλότερο μέσο εγκλεισμού το αλγινικό καθώς οδήγησε στο σχηματισμό του πιο σταθερού γαλακτώματος. Συγκεκριμένα, το διάλυμα αλγινικού εμφάνισε την υψηλότερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (-65.1 mV). Αντίθετα, το διάλυμα μίγματος αραβικού κόμμεος και αλγινικού οξέος είχε τη χαμηλότερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (-18.8 mV). Το διπλό γαλάκτωμα που σχηματίστηκε με εξωτερική φάση μόνο αλγινικό εμφάνισε τη μεγαλύτερη απόλυτη τιμή ζ-δυναμικού (3.4 mV) και τη χαμηλότερη τιμή ιξώδους (34.3 cP) σε σύγκριση με τα υπόλοιπα εξεταζόμενα ν1/ε/ν2 γαλακτώματα που εμφάνισαν απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού μεταξύ 0.1-1.6 mV και τιμές ιξώδους μεταξύ 56.7-283.4 cP. Η εφαρμογή του μέσου αυτού ως εγκλειστικού με τους συνδυασμούς που αναφέρθηκαν παραπάνω οδήγησε σε τιμές απόδοσης εγκλεισμού που κυμάνθηκαν μεταξύ 72.5% και 81.6%. Η ενσωμάτωση του προβιοτικού στελέχους Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 εντός της εσωτερικής φάσης του διπλού ν1/ε/ν2 ¬¬είχε ως αποτέλεσμα τη διατήρηση της βιωσιμότητάς του πάνω από το ελάχιστο όριο των 6 log cfu g-1 σε κάθε περίπτωση κατά τη διάρκεια αποθήκευσης στους 4οC ή στους -18οC. Η επικάλυψη των προϊόντων εγκλεισμού με χιτοζάνη οδήγησε στα βέλτιστα ποσοστά επιβίωσης (82-86.1%) κατά την έκθεση των προϊόντων εγκλεισμού σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης.Με βάση τα συνολικά αποτελέσματα έγινε επιλογή των κατάλληλων προϊόντων εγκλεισμού, τα οποία παρήχθησαν μέσω των πιο βιώσιμων βιομηχανικά μεθόδων εγκλεισμού, για ενσωμάτωσή τους σε γάλα μαζί με συμβατική καλλιέργεια εκκίνησης με σκοπό την παραγωγή προβιοτικού γιαουρτιού. Έτσι, στο τελευταίο μέρος της διδακτορικής διατριβής τα προϊόντα που παρήχθησαν μέσω των τεχνικών της εξώθησης και της γαλακτωματοποίησης (τεχνικές που θεωρούνται άμεσα εφαρμόσιμες σε βιομηχανική κλίμακα) με βάση τα εγκλειστικά μίγματα αλγινικού με γλυκόζη και κ-καραγενάνη, CNC, γάλα, ή συνδυασμό σκόνης ορού γάλακτος-πηκτίνης ενσωματώθηκαν σε γάλα για παραγωγή προβιοτικού γιαουρτιού. Έγινε μελέτη της επίδρασης εγκλεισμένων ή ελεύθερων προβιοτικών βακτηρίων στη διεργασία της ζύμωσης κατά την προσθήκη τους στο γάλα σε συνδυασμό με συμβατική καλλιέργεια εκκίνησης. Η χρήση τόσο εγκλεισμένων όσο και ελεύθερων προβιοτικών βακτηρίων επηρέασε την εξέλιξη της ζύμωσης του γάλακτος (λανθάνουσα φάση, φάση μέγιστου ρυθμού μείωσης pH, συνολικός χρόνος ζύμωσης) επιταχύνοντας τη συνολική διεργασία παραγωγής του γιαουρτιού. Ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων περιόρισε τη συνεισφορά τους στη ζύμωση, ενώ μικρότερη λανθάνουσα φάση (176-186 min) και συνολικό χρόνο ζύμωσης (205-210 min) και μεγαλύτερη απόλυτη τιμή μέγιστου ρυθμού μείωσης pH (0.032-0.036 min-1) εμφάνισαν τα γιαούρτια με προϊόντα εγκλεισμού μέσω γαλακτωματοποίησης, ανεξάρτητα από το χρησιμοποιούμενο εγκλειστικό μέσο. Η χρήση εγκλεισμένων προβιοτικών βακτηρίων αύξησε τόσο τις τιμές του ιξώδους του γιαουρτιού (έως και 45483 cP έναντι 18594 cP γιαουρτιού μόνο με συμβατική καλλιέργεια μετά από 24 h αποθήκευση στους 4οC) όσο και τις τιμές της σταθερότητας του πήγματος (έως 0.82 Ν έναντι 0.62 Ν στην περίπτωση γιαουρτιού μόνο με συμβατική καλλιέργεια), της προσκολλησιμότητας (έως 0.65 N·s έναντι 0.31 N·s στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια) και της ελαστικότητας (3.01 έως έναντι 2.15 στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια). Ο εγκλεισμός των προβιοτικών βακτηρίων, ειδικά μέσω της τεχνικής της εξώθησης, αύξησε το ποσοστό επιβίωσής τους τόσο κατά την αποθήκευση των γιαουρτιών, όσο και κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος. Τα μέγιστα ποσοστά επιβίωσης επιτεύχθηκαν κατά τον εγκλεισμό των προβιοτικών κυττάρων σε μίγμα αλγινικού-γάλακτος μέσω εξώθησης, πλησιάζοντας το 81.6% μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης του γιαουρτιού υπό ψύξη (έναντι 35.0% στην περίπτωση του γιαουρτιού με μόνο συμβατική καλλιέργεια) και το 85.3% κατά την έκθεση σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρεντερικού συστήματος.