Βιοσύνθεση υδρολυτικών ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς
Authors: Σταθοπούλου Παναγιώτα 
Published: August 2021

Η ικανότητα των μικροοργανισμών να επιβιώνουν σε μεγάλη ποικιλία αβιοτικών παραγόντων αντανακλά τα ιδιαίτερα δομικά και μεταβολικά χαρακτηριστικά τους. Η συστηματική καταγραφή και αξιοποίηση της μικροβιακής γενετικής και λειτουργικής ποικιλότητας ακραίων ενδιαιτημάτων ενδέχεται να δώσει λύσεις σε περιβαλλοντικά και βιομηχανικά προβλήματα. Αναφορικά με τις βιοτεχνολογικές εφαρμογές της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εξεύρεσης ποικιλόμορφων, αποδοτικών και σταθερών βιοκαταλυτών για συμμετοχή σε μη συμβατικές συνθήκες διεργασιών, έστρεψε το ενδιαφέρον στη μελέτη του μεταβολικού δυναμικού των θερμόφιλων μικροοργανισμών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή χρησιμοποιήθηκε ως βιολογική πηγή υδρολυτικών ενζύμων ένα σύνολο 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών που είχαν απομονωθεί κατά τη Διδακτορική Διατριβή του Μεΐντάνη Χ. (2005) στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας, του Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών κατά τη διάρκεια μελέτης της συστηματικής καταγραφής και ποικιλότητας επιλεγμένων οικοθέσεων του ηφαιστειακού συμπλέγματος της Σαντορίνης. Τα στελέχη αυτά, στην πλειοψηφία τους εμφάνισαν φυλογενετική συγγένεια με το γένος Geobacillus και ομαδοποιήθηκαν με βάση το αποτύπωμα BOX PCR τους σε 3 ομάδες. Αρχικά, εκτιμήθηκε ποιοτικά το κυτταρινολυτικό και ξυλανολυτικό δυναμικό του συνόλου των θερμόφιλων μικροοργανισμών από το οποίο προέκυψε ένα υψηλό ποσοστό βακτηρίων με ανιχνεύσιμη ενεργότητα ξυλανάσης (80 %) ενώ μόλις το 8 % παρουσίασε ικανότητα ταυτόχρονης υδρόλυσης κυτταρίνης και ξυλάνης. Για την περαιτέρω μελέτη, επιλέχθηκαν 8 στελέχη που εμφάνισαν ταυτόχρονη κυτταρινολυτική και ξυλανολυτική δράση (SP17, SP24, SP37, SP38, SP45, SP46, SP47, SP50) καθώς και επιπλέον 7 με τις υψηλότερες σχετικές ενεργότητες ξυλανάσης (SP8, SP11, SP59, SP68, SP69, SP74, SP87). Ακολούθησε ο φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των επιλεγμένων στελεχών καθώς και ο ποσοτικός προσδιορισμός της υδρολυτικής τους ικανότητας σε καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Το στέλεχος SP24 (κωδικός NCBI-JN692241) εμφάνισε ταυτόχρονη έκκριση ένδο- ξυλανάσης και κυτταρινάσης καθώς και β-ξυλοζιδάσης και β-γλυκοζιδάσης σε ικανοποιητικά επίπεδα, παρουσία πιτύρου σίτου, και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη της βιοσύνθεσης των κυτταρινολυτικών και ξυλανολυτικών του ενζύμων. Αναλυτικότερα, μελετήθηκε η επίδραση μικρής ποσότητας συμπληρωματικών πηγών άνθρακα και αζώτου στην ενζυμική επαγωγή υγρών καλλιέργειών του επιλεγμένου στελέχους SP24, καθώς επίσης και η επίδραση της παροχής οξυγόνου στο ρυθμό μικροβιακής αύξησης και της ενζυμικής βιοσύνθεσης. Επιπλέον μελετήθηκε η κυτταρική τοπολογία των ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων. Αναφορικά με τη βελτιστοποίηση του μέσου αύξησης, η μέγιστη ενζυμική συμπαραγωγή παρατηρήθηκε παρουσία πιτύρου σίτου ως βασική πηγή άνθρακα και συμπληρωματική πηγή την ξυλάνη σημύδας, μειώνοντας το κόστος της διεργασίας. Τα υψηλά επίπεδα αερισμού της καλλιέργειας ήταν καθοριστικός παράγοντας για τον ταχύ μικροβιακό ρυθμό αύξησης και την ενζυμική βιοσύνθεση εκτός από την περίπτωση της β-γλυκοζιδάσης η οποία εμφάνισε αντίθετο πρότυπο παραγωγής. Παράλληλα, οι ξυλανάσες και οι κυτταρινάσες, ένζυμα που δρουν σε μεγαλομοριακά υποστρώματα, εντοπίστηκαν εξ ολοκλήρου εκτός του κυττάρου, ενώ οι β-γλυκοζιδικές ενεργότητες εμφανίστηκαν αρχικά στο κυτταρόπλασμα και μόνο στα τελικά στάδια της ζύμωσης ανιχνεύθηκαν εξωκυτταρικά, γεγονός που σχετίστηκε με την αυτόλυση των κυττάρων κατά τη φάση θανάτου. Συμπερασματικά, οι πληροφορίες από τα ανωτέρω αποτελέσματα επιτρέπουν τη μελλοντική αξιοποίηση του υδρολυτικού δυναμικού του επιλεγμένου μικροοργανισμού σε ευρύτερης κλίμακας ζυμώσεις. Συγχρόνως, ο μοριακός εντοπισμός γονιδίων κυτταρινάσης και ξυλανάσης στο γονιδίωμα του στελέχους SP24 επιτρέπει επίσης την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλα συστήματα. Το δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας αφορούσε στην εκτίμηση του λιπολυτικού δυναμικού των 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών και στην επιλογή ενζύμων (και όχι μικροοργανισμών αυτή τη φορά) με βιοτεχνολογικά αξιοποιήσιμες ιδιότητες για την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλους δέκτες. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των θερμόφιλων βακτηρίων πραγματοποιήθηκε τόσο ποιοτικά (στερεές καλλιέργειες) όσο και ποσοτικά (υγρές καλλιέργειες) και επιλέχθηκαν 9 στελέχη (SP14, SP22, SP29, SP73, SP75, SP76, SP79, SP83 και SP93) για την υψηλή υδρολυτική τους δράση. Χαρακτηριστικό ήταν, ότι κανένα επιλεγμένο στέλεχος για την αυξημένη λιπολυτική του ικανότητα δεν εμφάνισε αντίστοιχη κυτταρινολυτική ή ξυλανολυτική δράση. Ακολούθησε φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των 9 θερμόφιλων βακτηρίων και μελέτη της βιοσύνθεσης λιπασών σε υγρές και στερεές καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Με δεδομένο ότι τα χαμηλά επίπεδα ενζυμικής παραγωγής δεν επέτρεψαν τον πρωτεϊνικό καθαρισμό από καλλιέργεια των στελεχών φυσικού τύπου, η υπερέκφραση των επιθυμητών γονιδίων σε μεσόφιλα συστήματα ήταν ο επόμενος στόχος. Το γονίδιο λιπάσης που επιλέχθηκε για κλωνοποίηση και υπερέκφραση ήταν το προϊόν ενίσχυσης από το γονιδίωμα του στελέχους SP22 (κωδικός NCBI-JQ808133). Η επιλογή βασίστηκε στην αυξημένη σταθερότητα και θερμική αντοχή καθώς και στην αλκαλοφιλία που επέδειξε η αντίστοιχη λιπάση κατά τη μελέτη των χαρακτηριστικών της συγκριτικά με τις υπόλοιπες 8. Η απομόνωση και ανάλυση της αλληλουχίας του επιλεγμένου γονιδίου εμφάνισε ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1251 ζ.β και η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης ανέδειξε το χαρακτηριστικό πενταπεπτίδιο Ala-Χ-Ser-Χ-Gly καθώς και τη σημαντική για το ενεργό κέντρο, τριάδα His - 42, Ser -141 και Asp-345. Τα παραπάνω αποτελούν ιδιαιτερότητες των θερμόφιλων λιπασών (υποοικογένεια I.5) του γένους Bacillus. Αρχικά, η υπερέκφραση του γονιδίου της λιπάσης πραγματοποιήθηκε σε βακτηριακό σύστημα (δεκτικά κύτταρα E.coli) υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή Τ7 (φορέας κλωνοποίησης - pET15b). Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν 3 σειρές ξενιστικών κυττάρων (DH5a, BL21(DE3) και BL21(DE3)pLysS) στις οποίες μελετήθηκε η κινητική έκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης. Η υπερέκφραση της θερμοσταθερής λιπάσης του στελέχους SP22 (Geobacillus sp.) σε προκαρυωτικό σύστημα εμφάνισε προβλήματα, καθότι σε συνθήκες υψηλής παραγωγής οδήγησε στον σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων για τα οποία ενδεχομένως ευθύνονται τα βασικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του μορίου όπως η υδροφοβικότητα, το υψηλό ισοηλεκτρικό του ή κάποια απαιτούμενη μεταμεταφραστική τροποποίηση. Η ανάγκη εύρεσης ενός πιο αποδοτικού συστήματος υπερέκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης οδήγησε στην επιλογή του flashBAC™. Αξίζει να αναφερθεί ότι το σύστημα αυτό ουδέποτε έχει χρησιμοποιηθεί για την υπερέκφραση βακτηριακής λιπάσης παρά μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις ευκαρυωτικών γονιδίων λιπάσης. Επίσης, οι αναφορές έκφρασης θερμοσταθερών πρωτεϊνών μέσω των βακυλοϊών στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες και μάλιστα όχι από βακτήρια. Η υπερέκφραση της λιπάσης με το σύστημα flashBAC™ οδήγησε σε εξαιρετικά υψηλές τιμές ειδικής ενζυμικής ενεργότητας καθώς επίσης και στην ολοκληρωτική εμφάνιση της πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή. Αναλυτικότερα, τα επίπεδα ειδικής ενζυμικής ενεργότητας εμφανίστηκαν έως και 10000 φορές υψηλότερα από το στέλεχος φυσικού τύπου και ενισχυμένα κατά 5000 φορές συγκριτικά με το ετερόλογο προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης. Ακολούθησε η αριστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας μολυσμένων Sf9 κυττάρων και παραγωγής του ενζύμου και ο καθαρισμός της υπερεκφρασμένης λιπάσης από το εξωκυττάριο υγρό με ένα μόνο χρωματογραφικό βήμα. Η θερμοσταθερή λιπάση παρελήφθη σε ηλεκτροφορητικά καθαρή μορφή (46 kDa) και στη συνέχεια χαρακτηρίστηκε φυσικοχημικά και κινητικά. Εμφάνισε αυξημένη θερμοσταθερότητα έως τους 65 oC (άριστη θερμοκρασία δράσης), σχεδόν χωρίς καμία απώλεια ενεργότητας, και η κινητική θερμικής απενεργοποίησης του ενζύμου ήταν 2 τάξεων. Όσον αφορά στο pH, η λιπάση εμφανίστηκε αρκετά σταθερή σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως άριστη τιμή δράσης ήταν το 9. Επίσης, το ένζυμο επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ το ασβέστιο φάνηκε να ενισχύει τη λιπολυτική ενεργότητα. Η εξάρτηση του ενζύμου από το ασβέστιο εμφανίστηκε και στην ολοκληρωτική απώλεια δράσης του παρουσία του χηλικού παράγοντα EDTA (μεταλλοένζυμο). Ολοκληρώνοντας τον χαρακτηρισμό της λιπάσης, μελετήθηκε η δράση της έναντι ψευδοϋποστρωμάτων με λιπαρά οξέα διαφορετικών αλυσίδων. Η λιπάση εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το καπρυλικό οξύ (8 άτομα άνθρακα) και μεγαλύτερη ταχύτητα αντίδρασης στη διάσπαση εστέρων με παλμιτικό οξύ (16 άτομα άνθρακα). Ωστόσο, η μεγαλύτερη αποδοτικότητα του μορίου εντοπίστηκε κατά την υδρόλυση του ψευδοϋποστρώματος με λαυρικό οξύ (12 άτομα άνθρακα). Τέλος, διαπιστώθηκε η ικανότητα της θερμοσταθερής λιπάσης να καταλύει την αντίδραση εστεροποίησης της τυροσόλης παρουσία ιοντικών υγρών. Τα λιπόφιλα παράγωγα της τυροσόλης εμφανίζουν πλήθος εφαρμογών στο πεδίο των φαρμάκων ή των προϊόντων αντιγήρανσης. Η απόδοση της αντίδρασης εστεροποίησης από την υπερεκφρασμένη λιπάση εμφάνισε εξάρτηση τόσο με τη φύση του ιοντικού υγρού όσο και με την κατάσταση του ενζυμικού δείγματος (λυοφιλιωμένο ή ακινητοποιημένη λιπάση σε Celite). Η ακινητοποίηση του ενζύμου σε αδρανή φορέα αύξησε κατά 30 % την απόδοση της βιοκατάλυσης συγκριτικά με το λυοφιλιωμένο ένζυμο και η ικανότητα αυτή είναι ανάλογη με διάφορα εμπορικά σκευάσματα.