Ανάπτυξη ανοσοαναλυτικού προσδιορισμού της φερομόνης του δάκου της ελιάς με τη χρήση σειράς πολυκλωνικών αντισωμάτων
Authors: Νεοκοσμίδη Αφροδίτη 
Published: January 2014

Ο δάκος (Bactrocera oleae Gmelin) είναι το πιο επιβλαβές έντομο της καλλιέργειας της ελιάς στη Μεσόγειο. Η υπερβολική χρήση χημικών εντομοκτόνων για τον έλεγχο του εντόμου και η επακόλουθη ζημιά που προκαλείται στο περιβάλλον και τη δημόσια υγεία είναι ένα σοβαρό πρόβλημα. Πρόσφατα, έχουν γίνει και συνεχίζουν να γίνονται αξιοσημείωτες προσπάθειες σε όλον τον κόσμο, για την ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων ελέγχου, οι οποίες εκμεταλλεύονται βιολογικούς παράγοντες (φυσικούς εχθρούς, αρπακτικά, βακτήρια, ιούς κ.λπ.) ή βιοχημικούς παράγοντες (ορμόνες, φερομόνες κ.λπ.), με στόχο τον έλεγχο του πληθυσμού του εντόμου. Από όλες αυτές τις μεθόδους τα πιο ενθαρρυντικά αποτελέσματα έχουν ληφθεί με τη χρήση της φερομόνης του ίδιου του εντόμου, είτε με την μέθοδο της μαζικής παγίδευσης (mass trapping), χρησιμοποιώντας παγίδες φερομόνης, είτε διαχέοντας στο περιβάλλον μέσω εξατμιστήρων την απαιτούμενη ποσότητα φερομόνης προκαλώντας παρεμπόδιση των συζεύξεων, μέθοδος που έχει γίνει γνωστή ως μέθοδος αποπροσανατολισμού (matting disruption). Για την αποτελεσματική εφαρμογή των τελευταίων αυτών μεθόδων, απαιτείται μια γρήγορη, εύκολη και αξιόπιστη μέθοδος προσδιορισμού της συγκέντρωσης της φερομόνης που είναι παρούσα στους εξατμιστήρες, στο περιβάλλον ή στα ίδια τα έντομα. Οι ιδιαίτερα μικρές συγκεντρώσεις, στις οποίες εφαρμόζεται η φερομόνη, απαιτούν μια αναλυτική μέθοδο υψηλής ευαισθησίας για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσής της σε περιβαλλοντικά δείγματα. Μέχρι σήμερα, τα επίπεδα της φερομόνης του δάκου προσδιορίζονται με αέρια χρωματογραφία (GC) καθώς, όπως όλες οι φερομόνες, είναι μια πολύ πτητική ένωση. Ο προσδιορισμός της ωστόσο, με μια τέτοια μέθοδο ενόργανης ανάλυσης, είναι χρονοβόρος και δύσκολος στην εφαρμογή του, διότι: (α) η συλλογή του δείγματος και η επεξεργασία του είναι δύσκολες, καθώς τα δείγματα πρέπει να είναι ελεύθερα από όλες τις ενώσεις μεγάλης σχετικής μοριακής μάζας που συνυπάρχουν με τη φερομόνη και μπορεί να επιμολύνουν τις στήλες της χρωματογραφίας, (β) κάθε δείγμα μετράται ξεχωριστά και με διαφορετικό πρωτόκολλο, το οποίο εξαρτάται από την προέλευσή του (περιβαλλοντικό ή βιολογικό δείγμα), και (γ) κάθε μέτρηση διαρκεί τουλάχιστον 30 min, ενώ είναι απαραίτητες πολλές επαναλήψεις, ώστε να αποφευχθούν τυχαία σφάλματα. Οι ανοσοαναλυτικές μέθοδοι, οι οποίες βασίζονται στη χρήση εξειδικευμένων αντισωμάτων, είναι οι καταλληλότερες τεχνικές για την ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων σε ελάχιστο χρόνο, με μεγάλη ευαισθησία, επαναληψιμότητα και ακρίβεια. Μέχρι σήμερα, ωστόσο, δεν έχει αναπτυχθεί καμία ανοσοανάλυση για φερομόνη εντόμου, επειδή είναι εξαιρετικά δύσκολο να αναπτυχθούν εξειδικευμένα αντισώματα εναντίον αυτών των ενώσεων, λόγω της μικρής μοριακής μάζας και της ιδιάζουσας, πολλές φορές, δομής τους. Αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη μιας ανοσοανάλυσης, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της φερομόνης του δάκου της ελιάς σε βιολογικά και περιβαλλοντικά δείγματα. Η ανάπτυξη μιας ανοσοανάλυσης για τη φερομόνη του δάκου, που να χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια και να είναι ικανή να αναλύει μεγάλο αριθμό δειγμάτων σε μικρό χρονικό διάστημα, θα αποτελούσε πολύτιμο εργαλείο για την επιτυχή εφαρμογή της εναλλακτικής μεθόδου καταπολέμησης του εντόμου. Δύο συνθετικά παράγωγα της φερομόνης του δάκου, το καρβοξυ- παράγωγο (+)-β-[3-(1,7-διοξασπιρο[5.5]ενδεκάνιο προπιονικό οξύ (απτένιο Ι) και το αμινο- παράγωγο (+)-δ-[3-(1,7-διοξασπιρο[5.5]ενδεκάνιο βουτυλαμίνη (απτένιο ΙΙ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της ανοσοανάλυσης της φερομόνης. Το απτένιο Ι συζεύχθηκε στην πρωτεΐνη φορέα keyhole limpet hemocyanin, με τη μέθοδο του καρβοδιιμιδίου, ώστε να παρασκευασθεί κατάλληλο ανοσογόνο, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για την ανοσοποίηση κουνελιών καθώς και ορνίθων ωοτοκίας. Η ανοσοποίηση ορνίθων θεωρείται ότι προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι της ανοσοποίησης θηλαστικών. Στην περίπτωση των ανοσοποιημένων ορνίθων, οι αντίστοιχες ανοσοσφαιρίνες Υ απομονώθηκαν σε μεγάλες ποσότητες από τον κρόκο των αυγών. .....................