Γεωγραφική διαφοροποίηση και γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων
Authors: Καμηλάρη Μαρία 
Published: September 2021

Τα χερσόβια ισόποδα (Oniscidea) αντιπροσωπεύουν έναν μονοφυλετικό κλάδο της τάξης ισοπόδων (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). Είναι η μόνη ομάδα καρκινοειδών που έχουν πλήρως προσαρμοστεί να ζουν στη στεριά, με εξάπλωση σε όλα τα ενδιαιτήματα. Εμφανίζονται από το επίπεδο της θάλασσας έως και σε ψηλά υψόμετρα, από τα δάση μέχρι και στις ερήμους, με εξαίρεση τις πολικές περιοχές. Η πλειοψηφία των χερσόβιων ισοπόδων χρειάζεται ένα υψηλό βαθμό υγρασίας του αέρα για την επιβίωσή της, εξαιτίας της περιορισμένης δυνατότητάς τους να διατηρήσουν το νερό. Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει σχετικά στενόοικους οργανισμούς οι οποίοι διαβιούν σε οικοτόπους που υπόκεινται σε απειλή λόγω των ανθρώπινων δραστηριοτήτων, όπως τα υγρά δάση και οι παρόχθιες διαπλάσεις. Περιλαμβάνει περί τα 50 είδη που εξαπλώνονται σε όλη την Παλαιαρκτική, με 8 είδη να έχουν καταγραφεί στην Ελλάδα, 4 εκ των οποίων είναι ενδημικά στη χώρα (ελληνικά ενδημικά: Τ. palustris, Τ. aegaeus, Τ. cavaticus, Τ. n. sp., ευρωπαϊκά είδη: Τ. camerani Τ, Τ. squamuliger, Τ. razzauti, Τ. arcuatus). Η κατανομή των ειδών είναι ασυνεχής λόγω του αυξανόμενου κατακερματισμού των ενδιαιτημάτων τους και της επέκτασης της γεωργικής γης και της αποψίλωσης των δασών. Η επίδραση της προϊούσας κλιματικής αλλαγής ενδέχεται να περιορίσει περαιτέρω τη ροή γονιδίων μεταξύ των πληθυσμών Trachelipus, καθώς τα ξηρά ενδιαιτήματα αναμένεται να αυξηθούν στην Ελλάδα. Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ αυτών των οργανισμών είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες καθώς πιο συστηματικές αναλύσεις έχουν αρχίσει να διενεργούνται σχετικά πρόσφατα. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού δευτερευόντων φυλετικών μορφολογικών χαρακτήρων των αρσενικών ατόμων, ωστόσο οι πρόσφατες αναλύσεις με μοριακούς δείκτες καταδεικνύουν ότι η ταξινόμηση των ειδών με βάση τη μορφολογία μπορεί να υποτιμά τα πραγματικά επίπεδα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών. Επιπλέον, μέσα σε διάφορα γένη ή ομάδες ειδών, οι χρησιμοποιούμενοι μορφολογικοί χαρακτήρες δεν παρέχουν σαφή ταξινομική ανάλυση, κι έτσι έχουν παρουσιαστεί πολλές αλλαγές στην ονοματολογία των περιγεγραμμένων ειδών στη βιβλιογραφία. Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών, η διαπίστωση κάποιου ενδεχόμενου γεωγραφικού ή/και παλαιογεωγραφικού προτύπου και η αποσαφήνιση της κατανομής κάθε είδους εντός της ελληνικής επικράτειας, προκειμένου να εκτιμηθεί καλύτερα μια πιθανή γεωγραφική δομή στα πρότυπα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών, και να επανεξεταστεί η συστηματική τους. Μετά την απομόνωση ολικού DNA, χρησιμοποίησα τρεις μοριακούς δείκτες: τους μιτοχονδριακούς δείκτες 16S rRNA και την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρέως για τις φυλογενετικές μελέτες στο διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο, και τον πυρηνικό γενετικό τόπο της α-υπομονάδας της αντλίας NaK (NaK ATPase a-subunit), η οποία είναι μία Ρ-τύπου αντλία, συμμεταφορέας ιόντων για τη διατήρηση της διαφοράς του ηλεκτροχημικού δυναμικού μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών, και είναι απαραίτητη για την κυτταρική σηματοδότηση και τη δευτερογενή μεταφορά. Λόγω της κακής συντήρησης αρκετών δειγμάτων, προτείνω ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο απομόνωσης DNA, το οποίο έδωσε πολύ θετικά αποτελέσματα αναφορικά με την ποιότητα του απομονωμένου DNA. Μετά τον πολλαπλασιασμό των τριών γενετικών δεικτών με τη μέθοδο της PCR, υπολόγισα τις γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών και ειδών, καθώς και τις μεταξύ τους φυλογενετικές σχέσεις. Για τη φυλογενετική ανασύσταση χρησιμοποίησα τις μεθόδους της Μέγιστης Φειδωλότητας (MP), της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (BI) για κάθε γενετικό τόπο και για τις συνδυασμένες αναλύσεις. Προκειμένου να αξιολογηθεί η βιογεωγραφική ιστορία και να εκτιμηθεί η χρονολόγηση των γεγονότων διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών και των πληθυσμών, εφάρμοσα ένα βαθμονομημένο μοριακό ρολόι εξετάζοντας 12 εναλλακτικές υποθέσεις με το πρόγραμμα BEAST [α: παλαιογεωγραφικά γεγονότα (όπως η διαμόρφωση της Μεσαιγαιακής Τάφρου 12-9 εκ. χρόνια πριν και η κρίση αλατότητας κατά το Μεσσήνιο 5,971 - 5,33 εκ. χρόνια πριν), β: διαφορετικές παραμέτρους δέντρων (tree priors: διαδικασία της γέννησης-θανάτου, διαδικασία Yule), γ: διαφορετικά ρολόγια (σταθερό μοριακό ρολόι, μη συσχετιζόμενο λογαριθμικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης, μη συσχετιζόμενο εκθετικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης) και δ: διαφορετικούς ρυθμούς υποκατάστασης για τoυς μιτοχονδριακούς δείκτες COI και 16S rRNA (COI = 1,56% -1,72% Poulakakis & Sfenthourakis 2008, 16Sr RNA = 0,14% Held 2001). Οι διαφορετικές υποθέσεις που δοκιμάστηκαν κατατάχθηκαν με βάση τους οριακούς εκτιμητές πιθανοφάνειας που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone. Όλες οι φυλογενετικές μέθοδοι (MP, ML, BI) - κατέληξαν σε δέντρα με κοινές τοπολογίες κλάδων και καταδεικνύουν ασυμφωνία με την ισχύουσα ταξινόμηση. Ορισμένοι πληθυσμοί που θεωρούνται πως ανήκουν στο ίδιο είδος παρουσιάζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις και ομαδοποιούνται σε διακριτούς κλάδους. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι αυτό των πληθυσμών του είδους Τ. palustris που ομαδοποιούνται σε τρεις διαφορετικούς κλάδους με πολύ μεγάλη γενετική απόσταση (Kimura 2-P) και στους τρεις γενετικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν (COI = 27,2%, 16S rRNA = 15,2%, NaK ΑΤΡ = 4,3%). Σε γενικές γραμμές, οι γενετικές αποστάσεις που καταγράφονται στην παρούσα μελέτη είναι αρκετά μεγάλες σε σύγκριση με εκείνες που έχουν αναφερθεί για τα διάφορα είδη και γένη, ακόμη και σε άλλες μελέτες χερσόβιων ισοπόδων. Από την άλλη πλευρά, διαφορετικοί πληθυσμοί από την Κρήτη που ανήκουν στα είδη Τ. cavaticus και Τ. aegaeus, ομαδοποιούνται μαζί και παρουσιάζουν μικρές γενετικές αποστάσεις (COI: 12,3%, 16S rRNA: 6,4%, NaK: 2,9%). Υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, κρίνεται απαραίτητη η αναθεώρηση της ταξινόμησης των ειδών Trachelipus που απαντώνται στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα της διατριβής μου προτείνουν την ύπαρξη δύο ενδεχομένων κρυπτικών ειδών αφενός για τους πληθυσμούς “T. palustris” που ομαδοποιούνται στον κλάδο της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας και της βόρειας-βορειοδυτικής Πελοποννήσου και αφετέρου για του πληθυσμούς που ομαδοποιούνται στον κλάδο της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας Αντίθετα, με βάση τα αποτελέσματα της διατριβής προτείνω τη συγχώνευση των κρητικών πληθυσμών Τ. cavaticus και Τ. aegaeus σε ένα μόνο είδος (αυτό θα ήταν Τ. aegaeus δεδομένου ότι έχει προτεραιότητα). Τα φυλογενετικά δέντρα με την ισχυρή στατιστική υποστήριξη συμφωνούν με την παλαιογεωγραφική ιστορία της ελληνικής περιοχής από την εποχή του Μειόκαινου (23,03 εκ. χρόνια πριν). Οι γεωγραφικές κατανομές των ειδών φαίνεται να ακολουθούν την τεκτονική και κινηματική ανασυγκρότηση της περιοχής της ηπειρωτικής Ελλάδας, του Αιγαίου και της δυτικής Τουρκίας απεικονίζοντας τη σχέση μεταξύ των ορογενετικών διεργασιών, της ηπειρωτικής επέκτασης και της ανύψωσης των μεταμορφωμένων πετρωμάτων στις κινήσεις των τεκτονικών πλακών στην περιοχή. Τα αποτελέσματα της χρονολόγησης των κλάδων επιβεβαιώνουν τόσο τα γεωλογικά γεγονότα όσο και την ανασυγκρότηση του ελλαδικού χώρου που ευθύνονται για την σημερινή γεωγραφία και γεωλογία της περιοχής. Η Διατριβή μου αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε πληθυσμούς χερσόβιων καρκινοειδών στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα κατέληξαν στην οριοθέτηση της γεωγραφικής εξάπλωσης των ειδών και την ανασύσταση των φυλογενετικών τους σχέσεων υπό το πρίσμα της παλαιογεωγραφικής ιστορίας και της σύγχρονης γεωγραφίας της νησιωτικής και ηπειρωτικής περιοχής. Τόσο οι φυλογενετικές σχέσεις όσο και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών φαίνεται να συνηγορούν στην περαιτέρω διερεύνηση της συστηματικής των ειδών του γένους. Η Διατριβή μου καταδεικνύει ότι η μορφολογία περιγράφει ανεπαρκώς την πραγματική ποικιλότητα μεταξύ των ειδών. Ως εκ τούτου, η ταξινόμηση των ειδών με βάση τους διαγνωστικούς χαρακτήρες και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα για τα είδη Trachelipus θα πρέπει να επανεξεταστεί υπό το φως των νέων αυτών μοριακών φυλογενετικών αναλύσεων.