Σχεδιασμός και ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων με ακινητοποιημένες καλλιέργειες ευεργετικών μικροοργανισμών
Authors: Νέλιος Γρηγόριος 
Published: June 2024

Στην Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΕ) παρατηρείται σήμερα αυξημένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων τροφίμων που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς ή/και πρεβιοτικές διαιτητικές ίνες με πιθανές επιδράσεις στην προαγωγή της υγείας. Προκειμένου να μεγιστοποιηθούν τα οφέλη των προβιοτικών, είναι σημαντικό i) να επιτευχθεί αυξημένη βιωσιμότητα των καλλιεργειών, ii) να αναπτυχθούν προσεγγίσεις συμβατές με τη χρήση αποξηραμένων καλλιεργειών, έτσι ώστε να υιοθετηθούν εύκολα από τον βιομηχανικό τομέα, και iii) να χρησιμοποιηθούν μικροβιακά στελέχη κατάλληλα για νέα προϊόντα με ειδικά χαρακτηριστικά. Ταυτόχρονα, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η εντερική μικροβιακή χλωρίδα εμπλέκεται στην ανάπτυξη του Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 1 (ΣΔτ1), μιας αυτοάνοσης νόσου που προκαλείται από την καταστροφή των παγκρεατικών ινσουλινοπαραγωγών β-κυττάρων μετά από μεσολάβηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Η εντερική μικροβιακή χλωρίδα των ασθενών που βρίσκονται σε προ-κλινικό στάδιο χαρακτηρίζεται από μειωμένη και ασταθή βακτηριακή και λειτουργική ποικιλομορφία, και φαίνεται ότι συμβάλει στην εξέλιξη από την β-κυτταρική αυτοανοσία στην κλινική εμφάνιση της νόσου. Συνεπώς, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η παραγωγή ακινητοποιημένων ευεργετικών αρχικών μικροβιακών καλλιεργειών με πιθανές ευεργετικές ιδιότητες στην υγεία, ιδίως όσον αφορά το ΣΔτ1, και η χρήση τους ως συστατικά για νέα λειτουργικά τρόφιμα.Aρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και ταυτοποίηση 20 βακτηριακών στελεχών από ελληνικά παραδοσιακά προϊόντα, τα οποία εξετάστηκαν μέσω κατάλληλων in vitro δοκιμών για τις εν δυνάμει λειτουργικές τους ιδιότητες. Από τα 20 αγρίου τύπου στελέχη, 14 ταυτοποιήθηκαν ως Lacticaseibacillus rhamnosus, 4 ως Lactiplantibacillus pentosus, 1 ως Lacticaseibacillus paracasei και 1 ως Leuconostoc mesenteroides. Με στόχο τη διερεύνηση των λειτουργικών ιδιοτήτων των νέων αγρίου τύπου στελεχών, εφαρμόστηκε σειρά in vitro πειραματικών δοκιμών συμπεριλαμβανομένων: (α) μελέτη ικανότητας αναστολής της δράσης του ενζύμου α-γλυκοσιδάσης, (β) προσδιορισμός ανασταλτικής δράσης ανάπτυξης υπερκειμένων των αγρίου τύπου στελεχών έναντι τροφιμογενών παθογόνων και αλλοιογόνων μικροοργανισμών, (γ) μελέτη έκκρισης υδρολάσης χολικών αλάτων, (δ) επιβίωσης των εν δυνάμει προβιοτικών κυττάρων σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης, και (ε) προσδιορισμός της ανθεκτικότητας των απομονωμένων καλλιεργειών έναντι κοινών αντιβιοτικών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, όλα τα αγρίου τύπου στελέχη εμφάνισαν ικανότητα αναστολής του ενζύμου α-γλυκοσιδάση σε εύρος 14.31 - 44.87%, με το υψηλότερο ποσοστό αναστολής να παρατηρείται στο στέλεχος L. rhamnosus OLXAL-1. Επίσης, παρατηρήθηκε ισχυρή ανασταλτική δράση των μη-ουδετεροποιημένων υπερκειμένων διαλυμάτων των αγρίου τύπου στελεχών έναντι κοινών αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών και ικανότητα έκκρισης υδρολάσης χολικών αλάτων για τα στελέχη L. pentosus OLTH-1, L. pentosus OLTH-2, L. pentosus OLTH-3, L. pentosus OLTH-4, και L. paracasei ALTH-2. Τα επίπεδα επιβίωσης των αγρίου τύπου στελεχών σε συνθήκες που προσομοιάζουν τη διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα κυμάνθηκαν σε εύρος 0 - 58.98% και στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα επιβίωσης των κυττάρων καλλιέργειας Lacticaseibacillus rhamnosus GG, στέλεχος αναφοράς με γνωστές προβιοτικές ιδιότητες. Όσον αφορά τον προσδιορισμό ανθεκτικότητας των αγρίου τύπου καλλιεργειών έναντι κοινών αντιβιοτικών, στο στέλεχος L. rhamnosus OLXAL-1 δεν παρατηρήθηκε ανθεκτικότητα σε κανένα από τα αντιβιοτικά που εξετάστηκαν, σύμφωνα με τις συστάσεις της EFSA, και με βάση το σύνολο των in vitro δοκιμών επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραμάτων της παρούσας μελέτης.Στη συνέχεια, αγρο-βιομηχανικά απόβλητα (μελάσα και τυρόγαλα) και υπολείμματα τροφίμων (γάλα και χυμός ανανά μετά το πέρας της ημερομηνίας λήξεως) αξιολογήθηκαν ως πιθανά υποστρώματα ανάπτυξης καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 συγκριτικά με συνθετικά μέσα καθαρότητας τροφίμου (food grade). Ανάμεσα στα αγρο-βιομηχανικά απόβλητα και υπολείμματα τροφίμων, τα υψηλότερα μέγιστα επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης παρατηρήθηκαν στο μίγμα χυμού ανανά + γάλακτος (1:1) (9.54 log CFU/mL), ενώ ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης (> 9 log CFU/mL) προσδιορίστηκαν και στις περιπτώσεις του τυρογάλακτος + χυμού ανανά (1:1) (9.34 log CFU/mL) και χυμού ανανά (9.05 log CFU/mL. Για τη συνέχεια των πειραμάτων, ωστόσο, επιλέχθηκε συνθετικό μέσο καθαρότητας τροφίμου, το οποίο αναπτύχθηκε στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, επιλογή η οποία βασίστηκε στην περιεκτικότητα σε συστατικά καθαρότητας τροφίμου, αλλά και στο γεγονός ότι στο συγκεκριμένο θρεπτικό μέσο καταγράφηκαν τα υψηλότερα επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης του στελέχους L. rhamnosus OLXAL-1 (9.68 log CFU/mL), συγκριτικά με το σύνολο των υπό μελέτη θρεπτικών μέσων, συμπεριλαμβανομένου και του θρεπτικού μέσου αναφοράς MRS Broth.Έπειτα, μελετήθηκε η ακινητοποίηση κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε διάφορους φυσικούς φορείς και αγρο-βιομηχανικά απόβλητα [βρώμη, σιτάρι, αραχίδα, σταφίδα κορινθιακή, πρωτεΐνη τυρογάλακτος, και γάλακτος (καζεΐνη), brewer’s spent grain (BSG), κόκκινο και πράσινο μήλο, μπανάνα, και πράσο]. Με στόχο τη βελτιστοποίηση των συνθηκών ακινητοποίησης, προσδιορίστηκε ο βέλτιστος χρόνος παραμονής του φορέα ακινητοποίησης στη μικροβιακή καλλιέργεια, η επίδραση μεγέθους φορέα ακινητοποίησης, και η βέλτιστη αναλογία μικροβιακής καλλιέργειας/ φορέα ακινητοποίησης. Με δεδομένο ότι είναι απαραίτητη η παραγωγή ξηρών καλλιεργειών για τις βιομηχανικές εφαρμογές, μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση διεργασιών ξήρανσης (λυοφιλίωση και θερμική ξήρανση) στην επιβίωση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο στα ελεύθερα κύτταρα, αλλά και στην πλειοψηφία των ακινητοποιημένων καλλιεργειών παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κυτταρικών συγκεντρώσεων στις λυοφιλιωμένες συγκριτικά με τις θερμικά αποξηραμένες καλλιέργειες. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C) και ψυγείου (4 °C) στην επιβίωση των λειτουργικών καλλιεργειών, για διάστημα έως 360 ημέρες. Κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C), στην πλειοψηφία των ξηρών (θερμικά αποξηραμένων ή λυοφιλιωμένων) ακινητοποιημένων καλλιεργειών καταγράφηκαν ποσοστά κυτταρικής επιβίωσης υψηλότερα από τις αντίστοιχες ξηρές ελεύθερες καλλιέργειες, ενώ κατά την αποθήκευση για 360 ημέρες σε συνθήκες δωματίου και ψυγείου, δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη αλλοιογόνων ή παθογόνων μικροοργανισμών στις ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες.Επιπλέον, μελετήθηκε η επιβίωση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε φυσικούς φορείς διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα in vitro. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι υγρές και λυοφιλιωμένες ακινητοποιημένες καλλιέργειες που μελετήθηκαν παρουσίασαν υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, ενώ στα ακινητοποιημένα κύτταρα σε βρώμη παρατηρήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης (> 81.22%). Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε in vivo πειραματικό πρωτόκολλο αρσενικών μυών φυλής BALB/c, προκειμένου να μελετηθεί η προστατευτική δράση της ακινητοποίησης των κυττάρων L. rhamnosus σε νιφάδες βρώμης στην επιβίωση των χορηγούμενων καλλιεργειών μετά από διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα. Η ημερήσια χορήγηση (διάρκειας 10 ημερών) των λυοφιλιωμένων ελεύθερων ή ακινητοποιημένων L. rhamnosus κυττάρων σε νιφάδες βρώμης οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων των λακτοβακίλλων στα κόπρανα, στα δείγματα εντερικού περιεχομένου, και στα τμήματα εντερικού ιστού αρσενικών ποντικών BALB/c. Επίσης, η ακινητοποίηση των κυττάρων L. rhamnosus σε νιφάδες βρώμης φαίνεται να επηρέασε θετικά την ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων κατά τη διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς στις ομάδες ποντικών που έλαβαν ακινητοποιημένα κύτταρα παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα λακτοβακίλλων σε σχέση με τις ομάδες ποντικών που έλαβαν ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus. Επιπλέον, η παρουσία κυττάρων L. rhamnosus σε επίπεδα > 6 log CFU/g επιβεβαιώθηκε στα κόπρανα των ποντικών μέσω Multiplex PCR. Σε επόμενο στάδιο, μελετήθηκε in vivo η πιθανή ρύθμιση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας σε υγιή και διαβητικά (επαγόμενος μετά από χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης ΣΔτ1) ζωικά πρότυπα (επίμυες του είδους «RCCHan:Wistar»), μετά από χορήγηση καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1. Η καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 χορηγήθηκε με τη μορφή λυοφιλιωμένων ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων σε νιφάδες βρώμης, ενώ παράλληλα στο πειραματικό πρωτόκολλο διατροφικής παρέμβασης, διάρκειας 4 εβδομάδων, συμπεριλήφθηκαν και ομάδες ζωικών προτύπων που έλαβαν αποκλειστικά τυπική δίαιτα ή τυπική δίαιτα με την προσθήκη νιφάδων βρώμης (ομάδες ελέγχου). Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος, κοπράνων, εντερικού ιστού, και εντερικού περιεχομένου, προκειμένου να μελετηθεί εκτενώς η επίδραση της διατροφικής παρέμβασης στη σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, και του εντερικού μικροβιώματος, αλλά και στη γενική υγεία των διαβητικών ζωικών προτύπων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η μικροβιολογική ανάλυση στα δείγματα κοπράνων έδειξε σημαντικά αυξημένα επίπεδα των βακτηριακών πληθυσμών Escherichia coli, εντεροβακτηριοειδών, κολοβακτηριδίων, εντεροκόκκων, σταφυλόκοκκων, και κλωστριδίων των διαβητικών ζωικών προτύπων. Παράλληλα, τα επίπεδα των πληθυσμών E. coli, εντεροβακτηριοειδών, κολοβακτηριδίων, και σταφυλόκοκκων των διαβητικών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης και συμβατική δίαιτα + ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης κατά τη δειγματοληψία της 4ης εβδομάδας, αν και υψηλότερα από τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα (εβδομάδα 0), ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τους αντίστοιχους πληθυσμούς των διαβητικών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα και συμβατική δίαιτα + λυοφιλιωμένη ελεύθερη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι η προσθήκη βρώμης ενδέχεται να καθυστερεί την εξέλιξη της εντερικής δυσβίωσης, ρυθμίζοντας την εντερική μικροβιακή χλωρίδα. Επιπλέον, εξίσου σημαντικό αποτέλεσμα αποτέλεσε η αύξηση των πληθυσμών των βακτηρίων γαλακτικού οξέος (LAB) στα δείγματα κοπράνων που συλλέχθηκαν στο τέλος της διατροφικής παρέμβασης στις υγιείς ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης και στις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα, αλλά και με τις ομάδες που δεν έλαβαν την καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 (ζωικά πρότυπα που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης). Αναφορικά με τα αποτελέσματα των μικροβιακών πληθυσμών σε δείγματα εντερικού περιεχομένου και εντερικού ιστού, σε γενικές γραμμές, οι μεταβολές που προσδιορίστηκαν ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των δειγμάτων κοπράνων. Ωστόσο, σημαντικό εύρημα αποτέλεσε η αύξηση των επιπέδων του γένους Bifidobacterium σε όλες τις ομάδες ζώων που έλαβαν καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 και ιδιαίτερα στην περίπτωση της ομάδας διαβητικών επίμυων που ακολούθησαν συμβατική δίαιτα + ακινητοποιημένη καλλιέργεια Lacticaseibacillus rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης. Κατά τη μελέτη του εντερικού μικροβιώματος των ζωικών προτύπων με Αλληλούχιση Νέας Γενιάς (Next Generation Sequencing – NGS), τα φύλα Firmicutes και Bacteroidetes αναγνωρίστηκαν ως κυρίαρχα, με τα ποσοστά των σχετικών αφθονιών να κυμαίνονται σε τιμές 60.00% - 90.00 %, και 4.10 % - 39.21 % αντίστοιχα, ενώ σε επίπεδο γένους, σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν στα ποσοστά σχετικών αφθονιών των γενών Lactobacillus και Bifidobacterium. Αναλυτικότερα, στα δείγματα κοπράνων των υγιών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά σχετικών αφθονιών του γένους Lactobacillus, σε σύγκριση με τις υγιείς ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης μετά το τέλος του πειραματικού πρωτοκόλλου. Αντίστοιχα, αυξημένα ποσοστά του ίδιου γένους καταγράφηκαν στις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης, σε σύγκριση με τις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης, χωρίς όμως αυτή η αύξηση να είναι σημαντική. Επιπλέον, αυξημένα ποσοστά του γένους Bifidobacterium ανιχνεύτηκαν στα δείγματα κοπράνων της διαβητικής ομάδας που έλαβε ελεύθερη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1, τα οποία συλλέχτηκαν στο τέλος του πειραματικού πρωτοκόλλου (εβδομάδα 4), σε σύγκριση με τα αντίστοιχα αρχικά ποσοστά (εβδομάδα 0), αλλά και με τις υπόλοιπες ομάδες ζωικών προτύπων στο ίδιο χρονικό σημείο (εβδομάδα 4). Κατά τον προσδιορισμό των λιπαρών οξέων μικρής αλύσου (SCFAs) και του γαλακτικού οξέος σε δείγματα κοπράνων των ζωικών προτύπων παρατηρήθηκαν: (α) σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων γαλακτικού οξέος στα δείγματα κοπράνων των υγιών και διαβητικών ομάδων που έλαβαν ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1, σε σχέση με τα ζώα, στα οποία δεν χορηγήθηκε καλλιέργεια, (β) αυξημένα επίπεδα οξικού οξέος στα δείγματα κοπράνων των διαβητικών ζωικών προτύπων κατά την έναρξη του πρωτοκόλλου (εβδομάδα 0), (γ) αύξηση των επιπέδων οξικού οξέος μετά από χορήγηση ελεύθερης ή ακινητοποιημένης καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 στα διαβητικά ζωικά πρότυπα (εβδομάδα 4), και (δ) αυξημένα επίπεδα βουτυρικού οξέος στα δείγματα κοπράνων της υγιούς ομάδας που έλαβε ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης που συλλέχθηκαν την 4η εβδομάδα της διατροφικής παρέμβασης.Το τελευταίο μέρος της διατριβής αφορούσε την παρασκευή 3 νέων πρότυπων προϊόντων (δημητριακά πρωινού, χυμός σταφύλι και αλλαντικά αέρος) εμπλουτισμένα με ακινητοποιημένα κύτταρα καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 σε συστατικά τροφίμων. Στα νέα προϊόντα, προσδιορίστηκαν τα αρχικά κυτταρικά επίπεδα των καλλιεργειών, αλλά και μια σειρά από φυσικοχημικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τα αρχικά επίπεδα των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στα δημητριακά πρωϊνού ήταν > 8 log CFU/g (8.49 log CFU/g), ενώ κατά την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, το προϊόν δημητριακών πρωϊνού με λυοφιλιωμένες ακινητοποιημένες καλλιέργειες L. rhamnosus OLXAL-1 παρουσίασε σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία ως προς το άρωμα, τη γεύση, και τη συνολική εκτίμηση, σε σύγκριση με αντίστοιχο εμπορικά διαθέσιμο προϊόν. Τα αρχικά επίπεδα των κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στον χυμό σταφύλι ήταν ~7.5 log CFU/g σε όλες τις περιπτώσεις (προϊόντα με λυοφιλιωμένα ελεύθερα και ή ακινητοποιημένα κύτταρα), ενώ κατά τον οργανοληπτικό έλεγχο, τα προϊόντα με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου ξεχώρισαν στην προτίμηση των δοκιμαστών, εξαιτίας της πρωτοτυπίας τους. Στα νέα προϊόντα αλλαντικών αέρος, κατά την περίοδο ωρίμανσης 15 ημερών, επιτεύχθηκε απώλεια βάρους > 30% του αρχικού βάρους και μείωση των τιμών pH < 5.30, τιμές συνιστώμενες για την ασφαλή κατανάλωση και τη σταθερότητα των ζυμωμένων προϊόντων κρέατος. Κατά την πρόοδο της ωρίμανσης, τα επίπεδα των LAB αυξήθηκαν σημαντικά, ακόμα και από την 5η ημέρα της ωρίμανσης και παρέμειναν σταθερά > 8.5 log CFU/g έως και το τέλος της. Η προσθήκη πρωτεΐνης τυρογάλακτος οδήγησε σε υψηλότερη συνολική βαθμολογία των προϊόντων κατά τον οργανοληπτικό έλεγχο, ενώ η προσθήκη καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 δεν επηρέασε σημαντικά τη συνολική εκτίμηση των τελικών προϊόντων.Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η επιβίωση των κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στα πρότυπα προϊόντα (δημητριακά πρωινού, χυμός σταφύλι και ζυμωμένα προϊόντα κρέατος), προσδιορίστηκε ο χρόνος ζωής, και διερευνήθηκε η πιθανή αναστολή ανάπτυξης τροφιμογενών αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση. Αναλυτικότερα, στα προϊόντα δημητριακών πρωϊνού με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου για 90 ημέρες όσο και σε θερμοκρασία ψυγείου για 360 ημέρες, τα κυτταρικά επίπεδα παρέμειναν > 7 log CFU/g, ενώ σημαντικό στοιχείο αποτέλεσε το γεγονός ότι σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Όσον αφορά τα προϊόντα χυμού, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C), τα επίπεδα των ελεύθερων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 παρέμειναν ~7 log CFU/g προϊόντος έως τις πρώτες 2 ημέρες αποθήκευσης, ενώ ήδη μετά από 4 ημέρες, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση. Για το ίδιο διάστημα αποθήκευσης, τα επίπεδα των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου παρέμειναν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα (> 7 log CFU/g), αλλά εξαιτίας της εμφάνισης μούχλας την 4η ημέρα (επίπεδα ζυμών/μυκήτων > 3 log CFU/g), τα προϊόντα απορρίφθηκαν. Αντίθετα, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία ψυγείου (4 οC), τα κυτταρικά επίπεδα στα προϊόντα χυμών που εμπλουτίστηκαν τόσο με ελεύθερα όσο και με ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 παρέμειναν σταθερά > 7 log CFU/g για διάστημα έως 2 εβδομάδες. Στο πείραμα εσκεμμένης επιμόλυνσης των προϊόντων χυμού με S. cerevisiae και A. niger (104 log CFU/mL και 104 spores/mL, αντίστοιχα), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου, τα κυτταρικά επίπεδα των παραπάνω μικροοργανισμών ήταν σημαντικά χαμηλότερα στον χυμό με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου έναντι των δειγμάτων με τα ελεύθερα κύτταρα και των δειγμάτων ελέγχου. Στα προϊόντα ζυμωμένου κρέατος (αλλαντικά αέρος), τα επίπεδα των LAB κυμάνθηκαν > 8.5 log CFU/g έως τις 90 ημέρες σε όλα τα προϊόντα κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία ψυγείου, με μοναδική εξαίρεση τα προϊόντα της ομάδας ελέγχου που παρασκευάστηκαν με προσθήκη αποκλειστικά εμπορικής καλλιέργειας (BessaSTART) και στα οποία τα κυτταρικά επίπεδα των LAB μειώθηκαν σημαντικά ήδη από τις 30 ημέρες αποθήκευσης, μείωση που συνεχίστηκε έως 90 ημέρες (τελική συγκέντρωση LAB 7.67 log CFU/g. Μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση των αλλαντικών αέρος με Salmonella spp., τα κυτταρικά επίπεδα του παθογόνου μειώθηκαν σημαντικά, σε σχέση με τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα (> 4 log CFU/g), ήδη από την 2η ημέρα ωρίμανσης σε όλες τις ομάδες προϊόντων και κυμάνθηκαν μεταξύ 3.24 – 3.74 log CFU/g. Η μείωση των επιπέδων του παθογόνου παρατηρήθηκε και στις επόμενες δειγματοληψίες κατά την περίοδο της ωρίμανσης (ημέρες 5, 10 & 15) και στις ομάδες προϊόντων που παρασκευάστηκαν με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 και με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 + σκόνη πρωτεΐνης τυρογάλακτος παρατηρήθηκαν επίπεδα χαμηλότερα από το όριο ανίχνευσης κατά το τέλος της ωρίμανσης (ημέρα 15). Αντίθετα, στα προϊόντα των ομάδων με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART και με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + σκόνη πρωτεΐνης τυρογάλακτος, όπου δεν υπήρξε προσθήκη του δυνητικά προβιοτικού στελέχους L. rhamnosus OLXAL-1, αλλά και στην περίπτωση της ομάδας προϊόντων που παρασκευάστηκαν με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος, τα κυτταρικά επίπεδα Salmonella spp. προσδιορίστηκαν > 2.72 log CFU/g. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της NGS ανάλυσης, τo φύλο Firmicutes προσδιορίστηκε ως το επικρατέστερο σε όλες τις ομάδες προϊόντων, με ποσοστά > 95.48%, ενώ ανιχνεύτηκαν μικρότερες σχετικές αφθονίες του φύλου Proteobacteria, σε ποσοστά < 4.52%. Σε επίπεδο γένους, προσδιορίστηκαν 13 διαφορετικά βακτηριακά γένη, εκ των οποίων τα επικρατέστερα ήταν Lactobacillus (49.53% – 80.47%), Leuconostoc (11.84 % - 16.53%) και Staphylococcus (1.27% - 32.65%), στα οποία συμπεριλαμβάνονται και οι εναρκτήριες καλλιέργειες που χρησιμοποιήθηκαν για την ωρίμανση των αλλαντικών αέρος, ενώ παράλληλα επιβεβαιώθηκε και η παρουσία του γένους Salmonella spp. σε όλες τις ομάδες προϊόντων σε σχετικές αφθονίες < 4%. Συνοψίζοντας, κυριότερα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσαν: (α) η απομόνωση, ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός του μοναδικού αγρίου τύπου στελέχους Lacticaseibacillus rhamnosus OLXAL-1 με πιθανές λειτουργικές ιδιότητες στη διαχείριση του ΣΔτ1, (β) η μελέτη αξιοποίησης αγρο-βιομηχανικών αποβλήτων και υπολειμμάτων τροφίμων για την παραγωγή κυτταρικής βιομάζας λειτουργικών καλλιεργειών, (γ) η παραγωγή εμπορικών "έτοιμων προς χρήση" ξηρών ακινητοποιημένων ευεργετικών καλλιεργειών σε φυσικούς φορείς για χρήση ως λειτουργικά συστατικά τροφίμων με δυνητικά ευεργετικά οφέλη στη ρύθμιση της εντερικής δυσβίωσης που παρατηρείται τον ΣΔτ1 και (δ) η παραγωγή νέων προϊόντων διατροφής με λειτουργικές καλλιέργειες, παρατεταμένη διάρκεια ζωής και αυξημένη μικροβιακή ασφάλεια.