Análisis bioquímico y transcriptómico de eritrocitos expuestos in vitro a metilmercurio en la tortuga marina Caretta caretta
Authors:   , Hernández Fernández Javier Adolfo 
Published: July 2022

El metilmercurio (MeHg) es la forma más tóxica y abundante del mercurio en la red alimentaria marina, produciendo daños sobre la salud a diferentes niveles en los organismos vivos y humanos. Las tortugas cabezonas (Caretta caretta) son consideradas especies centinelas de contaminación ambiental debido a su susceptibilidad, a la acumulación de xenobióticos como consecuencia de su longevidad, baja tasa metabólica y su conversión eficiente de presas en biomasa. En un esfuerzo por entender los cambios en las actividades de las enzimas y la expresión de genes como biomarcadores de exposición a MeHg, nosotros expusimos eritrocitos de tortugas cabezonas a diferentes concentraciones de MeHg bajo condiciones controladas de laboratorio. Se determinó la CL50 de eritrocitos (eritrocitos) a MeHg y se evaluó el estrés oxidativo producido por MeHg en eritrocitos de cinco tortugas cabezonas pre-juveniles sometidas a concentraciones agudas de 0, 1 y 5 mg L-1, incubados in vitro a 30ºC por 12 h de exposición. Se evaluó la viabilidad de los eritrocitos a las 12 h y se analizó la actividad de las enzimas superóxido dismutasa (SOD), glutatión S-transferasa (GST) y la peroxidación lipídica por malondialdehído (MDA) a las 6 y 12 h de exposición. La concentración de Hg-T en agua fue de 1,96 µg L-1 y en eritrocitos de tortugas en cautiverio fue en promedio 31,14 µg L-1. Los eritrocitos expuestos en todas las concentraciones de MeHg mostraron aproximadamente 100% de viabilidad celular. Los niveles de MDA a las 6 y 12 h de exposición fueron más altos en los eritrocitos tratados con 1 y 5 mg L-1 de MeHg respecto al control. La actividad GST se inhibió a las 12 h de exposición al aumentar la concentración de Hg. La actividad SOD presentó variaciones en cada uno de los tratamientos, a las 6 h fue mayor a 1 mg L-1 y a las 12 h, fue ligeramente mayor a 5 mg L-1. No se observaron diferencias significativas en las actividades SOD, GST y MDA entre los tratamientos a las 6 y 12 h (Kruskal Wallis, p - 0,05). Sin embargo, se observó una correlación positiva entre la concentración de MeHg y los niveles de MDA (r = 0,56, p- 0,05) a las 12 h de exposición (Sperman). Esta fase de la investigación mostró a los eritrocitos como un buen modelo para estudios ecotoxicológicos. Preliminarmente, el transcriptoma sanguíneo de la tortuga cabezona fue secuenciado por RNA-seq. Este estudio proporciona el primer transcriptoma sanguíneo de alta calidad y el primer análisis estructural y funcional de tioredoxinas (Tnxs) y peroxiredoxinas (Prdxs) de la tortuga cabezona. El transcriptoma estuvo compuesto por 515.597 contigs con un N50 de 2631 pb. Se obtuvieron 374.545 unigenes, de los cuales 165.676 tenían ORF que codifican proteínas putativas. Un total de 52.147 (31,5%) de estas transcripciones tenían coincidencias de homología significativas en al menos una de las cinco bases de datos utilizadas. El estudio resultó en la identificación de 180 proteínas con actividad antioxidante, incluidas 28 Prdxs y 50 Tnxs. En general, los sitios activos y los motivos estructurales de las Prdxs y Tnxs estaban conservados. La investigación de Prdxs y Txns es de suma importancia debido a su abundancia y alta eficiencia catalítica en la reducción de peróxidos.

Para profundizar en la expresión diferencial de genes y estudiar vías metabólicas afectadas por MeHg, se aisló el RNA total de cada una de las muestras de eritrocitos sometidos a MeHg (5 x 1 mg L-1 y 5 x 5 mg L-1) y los controles (5 x 0 mg L-1). Se obtuvo por RNA-seq el transcriptoma de los eritrocitos de la tortuga cabezona utilizando BGISEQ (lecturas pareadas de 100 pb). Nosotros generamos, entre todos los tratamientos 130.98 Gb en total (1333 millones de lecturas), y con estas, se ensambló un transcriptoma de novo. Las lecturas de secuencia de cada uno de los tratamientos (0, 1 y 5 mg L-1) se utilizaron para realizar análisis de expresión diferencial de genes y metabolismo de selenocompuestos, cisteína y metionina, glutatión y peroxiredoxinas. El análisis de expresión por RNA-seq identificó 83 genes desregulados, 39 sobreexpresados y 44 reprimidos. Los resultados indican claramente que el MeHg alteró los patrones de expresión génica como respuesta al estrés celular producido, reflejado en la desregulación del ciclo celular, la actividad lisosomal, la autofagia, la regulación del calcio, regulación mitocondrial, apoptosis y regulación de la transcripción y traducción. De acuerdo con el análisis de DEGs realizados se reporta una respuesta baja de la maquinaria antioxidante de reacción temprana ante la toxicidad del MeHg, evidenciado porque estos genes no se desregularon. Al parecer, los eritrocitos de la tortuga cabezona mantienen una expresión constitutiva de genes que representan buena parte de la defensa contra las especies reactivas de oxígeno (EROS) inducidas por el MeHg. Esta investigación representa el primer estudio realizado sobre la respuesta de eritrocitos a concentraciones agudas de MeHg en tortugas cabezonas utilizando RNA-seq. Los genes expresados diferencialmente identificados en este estudio proporcionan una línea base para estudios posteriores sobre los impactos del estrés oxidativo del MeHg en eritrocitos de la tortuga cabezona.