Δομικές μελέτες DNA μεθυλτρανσφερασών
Authors: Κουγιανού Καλλιόπη 
Published: July 2024

Η μεθυλίωση του DNA επιτελεί αποτελεί σημαντικό παράγοντα επιγενετικής ρύθμισης, σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, από τα βακτήρια έως τα φυτά και τους ανώτερους ευκαρυώτες. αποκαλύπτοντας πολυδιάστατους ρόλους για τα ένζυμα που την πραγματοποιούν, τις DNA μεθυλτρανσφεράσες. Οι DNA ΜΤασες εμπλέκονται στην γονιδιακή έκφραση, την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την προσαρμογή των βακτηρίων σε διαφορετικά περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Οι DNA ΜΤασες μεταφέρουν μεθυλομάδες στην αζωτούχο βάση του DNA από τον συμπαράγοντα τους AdoMet, προς σχηματισμό AdoHcy και μεθυλιωμένου DNA.Η M.BseCI αποτελεί μια N6-adenine ΜΤαση που μεθυλιώνει το Ν6 άτομο της 3’ αδενίνης στην αλληλουχία 5’-ATCGAT-3’και αποτελεί μέρος ενός τύπου ΙΙ συστήματος περιορισμού-τροποποίησης του gram-θετικού θερμόφιλου βακτηρίου Geobacillus stearothermophilus, που συνήθως συναντάται στο έδαφος και σε θερμές πηγές. Η M.BseCI DNA ΜΤαση είναι μια τύπου ΙΙ N6mA-ΜΤαση 579 αμινοξέων, που εμφανίζεται ως μονομερές μοριακού βάρους 66.7 kDa, με ιδανική θερμοκρασία για την δραστικότητα του ενζύμου τους 323-328 οΚ και pH 7.4.Στην παρούσα διδακτορική έρευνα, πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η δομική μελέτη της M.BseCI σε σύμπλοκο με το DNA στόχο της σε διαφορετικές μορφές μεθυλίωσης , ως βάση για την κατανόηση των δομών και του μηχανισμού δράσης των DNA ΜΤασων Ν6-μεθυλαδενίνης. Σε αντίθεση με τις C5-cytosine ΜΤασες, ελάχιστες κρυσταλλικές δομές N6 adenine ΜΤασων έχουν λυθεί σε σύμπλοκο με DNA και συνεπώς λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον καταλυτικό τους μηχανισμό και τα δομικά τους χαρακτηριστικά που εμπλέκονται στην πρόσδεση του DNA, στο base flipping και στην πρόσδεση του συμπαράγοντα AdoMet. Συγκεκριμένα, έλαβε χώρα έκφραση και απομόνωση της M.BseCI, καθώς και ο σχηματισμός και βιοχημικός χαρακτηρισμός συμπλόκων της πρωτεΐνης με τον συμπαράγοντα της AdoHcy και το DNA- στόχο της σε διαφορετικές μορφές μεθυλίωσης (μη μεθυλιωμένο (UM), ημιμεθυλιωμένο (HM) και μεθυλιωμένο (FM)). Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κρυστάλλωσης των πρωτεϊνικών αυτών συμπλόκων και ακολούθησε ο προσδιορισμός των τρισδιάστατων δομών με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Η δομές προσδιορίστηκαν με την μέθοδο της μοριακής αντικατάστασης και βελτιστοποιήθηκαν μέχρι τη διακριτικότητα των 2.4 Å για το σύμπλοκο με το ήμιμεθυλιωμένο DNA και 2.6 Å για αυτό με το μεθυλιωμένοDNA. Η πρωτεΐνη εμφανίζεται χωρισμένη σε 2 επικράτειες, συνδεόμενες μέσω 1 βρόχου, σχηματίζοντας μια κοιλότητα, στο εσωτερικό της οποίας βρίσκεται το ολιγονουκλεοτίδιο DNA – στόχος.Η Ν-τερματική επικράτεια (κατάλοιπα 1-301) είναι μια μικτή α/β δομή αποτελούμενη από ένα συστραμμένο β-πτυχωτό φύλλο 10 κλώνων, που περιβάλλονται από α έλικες περίπου παράλληλα προς τους β-κλώνους. Αυτή η διαμόρφωση είναι γνωστή ως αναδίπλωση ΜΤασης και βρίσκεται συντηρημένη σε πολλές άλλες ΜΤασες. Η αναδίπλωση ΜΤασης ξεκινάει με την αΑ α έλικα και συνεχίζει με εναλλασσόμενους παράλληλους β-κλώνους και α-έλικες, με την εξαίρεση ενός αντιπαράλληλου β-κλώνου (β7) που ακολουθεί αμέσως μετά τον β6. Στην περίπτωση της M.BseCI, η Ν-τερματική της επικράτεια συγκροτείται από 2 επιπλέον α-έλικες και ένα επιπλέον β-πτυχωτό φύλλο 3 αντιπαράλληλων κλώνων, συνοδευόμενο από μία α-έλικα. Τα υπόλοιπα κατάλοιπα της M.BseCI συγκροτούν την C-τερματική επικράτεια της πρωτεΐνης (αα 302-579), και δεν διαθέτουν μια τόσο εκτενή δευτεροταγή δομή.Η δομική ανάλυση της M.BseCI επιβεβαιώνει ότι κάποια χαρακτηριστικά των γ-N6-DNA ΜΤασων αδενίνης είναι εμφανώς συντηρημένα σε όλα τα μέλη τους . Η M.BseCI όπως η M.TaqI στρέφουν την προς μεθυλίωση αδενίνη κατά 180ο εκτός της διπλής έλικας του DNA και εντός μιας κοιλότητας που σχηματίζει το ενεργό τους κέντρο, στην Ν-τερματική επικράτεια τους. Ενώ η Ν-τερματική επικράτεια εμφανίζει αμινοξική, δομική και λειτουργική συντήρηση, υπάρχουν μεγάλες διαφορές στην C-τερματική που είναι υπεύθυνη για μεγάλο μέρος της αναγνώρισης της αλληλουχίας-στόχου. Παρά τις αναμενόμενες αυτές διαφορές όμως καθώς διαφοροποιείται η αλληλουχία αναγνώρισης της κάθε πρωτεΐνης, εμφανίζεται μια γενικότερη δομική ομολογία και αντιστοιχίες καταλοίπων που εμπλέκονται στην αναγνώριση του DNA στόχου των ενζύμων στις δύο C-τερματικές επικράτειες, γεγονός που δεν διαφαίνεται σε επίπεδο πρωτοταγούς δομής, Ακόμα και αν υποτεθεί ότι οι αλληλουχίες που μεθυλιώνουν οι M.BseCI και M.TaqI είναι παρεμφερείς, καθώς εμπεριέχουν τον κοινό πυρήνα 5΄-TCGA-3, και δικαιολογούν τις ομοιότητες στην C-τερματική περιοχή τους, στην περίπτωση της ορφανής γ-N6-adenine DNA ΜΤασης CamA , με αλληλουχία αναγνώρισης 5’-CAAAAA-3’ κάτι τέτοιο δεν ισχύει και παρόλα αυτά, η συντήρηση δομικών στοιχείων και ειδικών αλληλεπιδράσεων είναι ακόμη μεγαλύτερη.Οι τρεις αυτές ΜΤασες, επίσης εμφανίζουν παρόμοια παραμόρφωση του σκελετού του DNA κατά την στρέψη της αδενίνης στόχου εκτός της διπλής έλικας. Η έντονη συμπίεση του σκελετού γύρω από την αδενίνη, η απουσία αμινοξέων στην κενή θέση που βρισκόταν και η απουσία αλλαγών στο ζευγάρωμα των υπολοίπων βάσεων, είναι φαινόμενα που προς στιγμήν παρατηρούνται μόνο στις γ-N6-adenine DNA ΜΤασες. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η στρέψη της αδενίνης δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, όπως και ο μηχανισμός ώθησης της αδενίνης να επιστρέψει εντός της διπλής έλικας μετά το πέρας της μεθυλίωσης. Ένα επίσης σημαντικό χαρακτηριστικό της μεθυλίωσης του DNA αποτελεί η ικανότητα των DNA ΜΤασων να διακρίνουν την κατάσταση μεθυλίωσης των υποστρωμάτων του DNA που αναγνωρίζουν, μεταξύ αυτών που διαθέτουν μεθυλομάδες στον ένα κλώνο τους (ήμι-μεθυλιωμένο DNA) και αυτών που δεν έχουν υποστεί μεθυλίωση. Στη δομή και των δύο συμπλόκων της M.BseCI φαίνεται να πραγματοποιείται base flipping, ανεξάρτητα από την κατάσταση μεθυλίωσης της αδενίνης, κατ’ αντιστοιχία με προηγούμενες μελέτες στην C5 ΜΤαση κυτοσίνης M.HhaI με προσδεδεμένο ένα αβασικό νουκλεοτίδιο στην θέση στόχο, που έδειξαν ότι το ένζυμο στρέφει τον φωσφοσακχαρικό σκελετό εκτός της έλικας του DNA (O’Gara et al. 1998). Είναι πιθανόν συνεπώς, να μην προωθεί το base flipping η ίδια η προς μεθυλίωση βάση, αλλά ο σκελετός του DNA. (X Cheng and Roberts 2001). Μια ακόμη παράμετρος της μεθυλίωσης η οποία στους προκαρυωτικούς οργανισμούς δεν έχει αποκωδικοποιηθεί πλήρως, είναι η επιλογή του σωστού προσανατολισμού του DNA από την ΜΤαση σε συμμετρικές αλληλουχίες αναγνώρισης, έτσι ώστε να μεθυλιωθεί ο θυγατρικός κλώνος του νέο-συντιθέμενου DNA που παραμένει μη μεθυλιωμένος μετά την αντιγραφή. Στην περίπτωση της M.BseCI, φαίνεται να υπάρχει μια μικρή υδρόφοβη πλατφόρμα γύρω από την ήδη μεθυλιωμένη αδενίνη Α17 στον άλλο κλώνο του DNA, υποδηλώνοντας ότι η ήδη μεθυλιωμένη αδενίνη καθοδηγεί την πρόσδεση του ενζύμου με σωστό προσανατολισμό σε ήμι-μεθυλιωμένες αλληλουχίες DNA που φέρουν την αλληλουχία αναγνώρισης του. Αν και ένας τέτοιος μηχανισμός φαίνεται πιθανός και αποτελεσματικός, δεν φαίνεται να παρουσιάζεται στο σύμπλοκο με την M.TaqI, και χρειάζονται επιπλέον δομικές και βιοχημικές μελέτες προκειμένου να τεκμηριωθεί πλήρως.Συμπερασματικά, η δομική μελέτη της M.BseCI και απουσία DNA, και με ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν την αλληλουχία αναγνώρισης του ενζύμου σε κάθε μορφή μεθυλίωσης, αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για την περαιτέρω διασαφήνιση του μηχανισμού της Ν6-adenine μεθυλίωσης του DNA, μιας διεργασίας που καταλύεται από μια μεγάλη οικογένεια ενζύμων, με πολυδιάστατους ρόλους σε όλο το φάσμα των οργανισμών.