Development of methodologies for the identification of biomarkers in clinical/biological samples by high resolution mass spectrometry techniques
Authors: Μπάρλα Ιωάννα 
Published: December 2023

Σημαντικός στόχος της σύγχρονης τοξικολογίας είναι η εκτίμηση της αποτελεσματικότητας και των παρενεργειών (όπως η τοξικότητα) των φαρμακευτικών ενώσεων, πριν από το στάδιο των κλινικών δοκιμών. Για αυτό εστιάζει στην ανάπτυξη γρήγορων, πολύμορφων και φθηνών μεθόδων, που θα επιτρέπουν την πρόβλεψη της τοξικότητας κατά την διάρκεια των in-vivo δοκιμασιών. Οι νέες αναλυτικές τεχνικές και τα αναδυόμενα υπολογιστικά εργαλεία διευκολύνουν την παραπάνω προσπάθεια. Οι μεταβολομικές μελέτες που βασίζονται σε φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMS) παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τις εφαρμογές της σύγχρονης τοξικολογίας. Οι μεταβολίτες είναι ενώσεις που έχουν καθολικές δομές και επιτρέπουν την μετάφραση της βιολογικής απόκρισης από το επίπεδο του πειραματόζωου στο επίπεδο του ανθρώπινου οργανισμού. Επίσης, το μεταβόλωμα περιγράφει με ακρίβεια έναν φαινότυπο ενδιαφέροντος και επομένως η μεταβολομική μελέτη επιτρέπει την βαθύτερη κατανόηση της βιοχημείας των εκφράσεων τοξικότητας, καθώς και την δημιουργία προβλεπτικών μοντέλων τοξικότητας. Βάσει των παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη μεθοδολογιών μεταβολομικής ανάλυσης για την εύρεση βιοδεικτών που σχετίζονται με την έκφραση τοξικότητας. Το πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής (Κεφάλαια 4 και 5) παρουσιάζει την διερεύνηση της νεφροτοξικότητας που επάγεται από την χορήγηση του αντικαρκινικού παράγοντα καρφιλζομίμπης (Cfz). Κατά το in-vivo πείραμα, σε 6 ποντίκια χορηγήθηκαν 8 mg/kg/μέρα Cfz (Cfz-group) και σε 6 ποντίκια χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός (Control-group). Το πλάσμα, οι νεφροί και τα ούρα των ποντικών αναλύθηκαν με UPLC-HRMS-DIA μεθοδολογία. Για την ταξινόμηση των ομάδων και την επιλογή μεταβλητών χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός πολυπαραμετρικών και μονοπαραμετρικών μεθοδολογιών. Για την ταυτοποίηση των μεταβολητών χρησιμοποιήθηκαν μεθοδολογίες μη στοχευμένης σάρωσης και σάρωσης ύποπτων ενώσεων. Επίσης, αναπτύχθηκαν post-hoc μεθοδολογίες για την διερεύνηση συσχετίσεων και αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στους μεταβολίτες και τους διαφορετικούς τύπους βιοδειγμάτων. Η μελέτη απέδειξε την σοβαρή επίπτωση του φαρμάκου στους νεφρούς, μέσω της διατάραξης του νεφρικού μεταβολισμού που οδηγεί σε νεφρική δυσλειτουργία. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν μεταβολίτες που σχετίζονται με την ουρεμία, το οξειδωτικό στρες, την φλεγμονή και την νεφρική ανεπάρκεια. Το δεύτερο μέρος της μελέτης (Κεφάλαιο 6) εστίασε στον προσδιορισμό πρώιμων αλλαγών στο μεταβολικό προφίλ παιδιών με καρκίνο, οι οποίες θα μπορούσαν να εξηγούν/ προβλέπουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιοτοξικότητας, όταν οι ασθενείς υποβληθούν σε θεραπεία. Σε συνεργασία με την Ογκολογική – Αιματολογική Κλινική του Νοσοκομείου Παίδων «Αγία Σοφία» πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες αίματος από ασθενείς, πριν την υποβολή τους σε χημειοθεραπεία. Οι ασθενείς ακολούθησαν το κατάλληλο θεραπευτικό πρωτόκολλο και κάποιοι (26) εμφάνισαν καρδιοτοξικότητα. Δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν με UPLC-HRMS-DIA μεταβολομική ανάλυση και, η γνώση εμφάνισης τοξικότητας χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των ασθενών σε Ομάδα Ρίσκου (CT-Risk) και ομάδα ελέγχου (No-Risk). Η μελέτη εστίασε στην διαδικασία επιλογής μεταβλητών συνδυάζοντας 4 συμπληρωματικές στατιστικές δοκιμασίες (KODAMA, OPLS-DA, BORUTA, t-test). Η βασική ιδέα ήταν πως μεταβλητές με καλή απόδοση σε παραπάνω από 3 δοκιμασίες έχουν αυξημένη πιθανότητα να σχετίζονται με το ρίσκο εμφάνισης καρδιοτοξικότητας, σύμφωνα με την θεωρεία του Bayes. Επιπλέον, η μελέτη έθεσε συγκεκριμένα κριτήρια εμπιστοσύνης για την ταυτοποίηση μεταβολιτών που προκύπτουν από DIA μεθοδολογίες λήψης φασμάτων. Η μελέτη ανέπτυξε μοντέλα ταυτοποίησης των CT-Risk ασθενών, με επιβεβαιωμένη προβλεπτική ικανότητα. Επιπλέον, οι ταυτοποιημένοι μεταβολίτες έδειξαν πρώιμη μεταβολή σε μεταβολικά μονοπάτια που συνδέονται με το γενικό μονοπάτι του καρδιακού μεταβολισμού για παραγωγή ενέργειας. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν πως η χημειοθεραπεία επιδεινώνει ήδη υπάρχουσες ανωμαλίες της καρδιακής λειτουργίας και οδηγεί στην εκδήλωση καρδιοτοξικότητας. Τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής (Κεφάλαιο 7) αποτέλεσε η διερεύνηση της χορήγησης ανθρώπινης δόσης κολιστίνης σε ποντίκια. Στόχος ήταν η κατανόηση των βιοχημικών αιτιών που οδηγούν σε τοξικότητα λόγο του συγκεκριμένου φαρμάκου. Η κολιστίνη (CMS) είναι αντιβιοτικό τελευταίας επιλογής, και συνδέεται με σοβαρή νεύρο- και νέφροτοξικότητα. Θέλοντας να δούμε την επίπτωση του φαρμάκου στον οργανισμό σε συνθήκες που δεν υπάρχουν κλινικές ενδείξεις τοξικότητας, πραγματοποιήθηκε ένα in-vivo πείραμα: σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκε 1 mg/kg/ ημέρα (LD-Group), σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκαν 1.5 mg/kg/ ημέρα (HD-Group), και σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός (Control). Το πλάσμα, οι νεφροί και το ήπαρ, χρησιμοποιήθηκαν για μεταβολομική ανάλυση με τη χρήση UPLC-HRMS-DIA μεθοδολογίας. Τα αποτελέσματα ταυτοποίησαν μεταβολίτες που ανταποκρίνονται στην αύξηση της δόσης. Επίσης εντοπίστηκε απορρύθμιση του μεταβολισμού της ντοπαμίνης και του μεταβολισμού των πουρινών στους νεφρούς. Ιδιαίτερη σημασία είχε η αύξηση της ξανθίνης στο επίπεδο των νεφρών, που επάγει τη δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση, οδηγώντας σε ταχεία αποικοδόμηση της ακετυλοχολίνης, διαδικασία που θα μπορούσε να αποτελέσει συνδετικό κρίκο ανάμεσα στην νευροτοξικότητα και την νεφροτοξικότητα λόγω της χορήγησης κολιστίνης.