Development of computational methods for the study of cellular responses to genotoxic stress
Authors: Κωνσταντόπουλος Δημήτριος 
Published: November 2021

Ο σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης, αποτέλεσε την δημιουργία ενός υπολογιστικού πλαισίου ανάλυσης για την μελέτη των δυναμικών αλλαγών της ενεργής μεταγραφής, καθώς και της αλληλεπίδρασής τους με την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, κατά την απόκριση στο γενοτοξικό στρες. Για τον σκοπό αυτό, η υπεριώδης ακτινοβολία C (UVC) χρησιμοποιήθηκε σαν στρεσογόνος παράγοντας για την δημιουργία βλαβών σε δερματικά κύτταρα, και συγκεκριμένα κυτταρικές σειρές ινοβλαστών δέρματος (VH10, CSB and 1BR.3), ενώ ο μηχανισμός εκτομής νουκλεοτιδίων (NER), και συγκεκριμένα τα επιδιορθωτικά παράγωγα των υπό-μονοπατιών Global Genome NER (GG-NER) και Transcription Coupled NER (TC-NER) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των υπό μελέτη μηχανισμών.Για την μελέτη των σταδίων του μεταγραφικού κύκλου σε κανονικές συνθήκες, καθώς και σε συνθήκες έκθεσης στην UVC ακτινοβολία, χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές αλληλούχισης νέας γενιάς (Next Generation Sequencing - NGS). Συγκεκριμένα, για την μελέτη της κινητικής των μορίων της RNA πολυμεράσης 2 (RNAPII), από το στάδιο έναρξης της μεταγραφής, στο στάδιο παύσης (promoter proximal pausing - PPP), μέχρι και την μετάβαση στο στην παραγωγική επιμήκυνση, παράχθηκαν και αναλύθηκαν δεδομένα NGS ανοσοκατακρίμνησης της χρωματίνης (Chromatin immunoprecipitation sequencing - ChIP-seq) της υποφωσφορυλιωμένης RNAPII (RNAPII-hypo), της φωσφορυλιωμένης στην σερίνη 2 RNAPII (RNAPII-ser2P), και της φωσφορυλιωμένης στην σερίνη 5 RNAPII (RNAPII-ser5P).Για την μελέτη της παραγωγικότητας των μορίων της RNAPII στα παραπάνω στάδια της μεταγραφής, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα CAGE-seq (Capped Analysis of Gene expression sequencing), καθώς και δεδομένα NGS αρτιγενούς έκφρασης RNA (nascent RNA synthesis sequencing - nRNA-seq).Για την μελέτη της αλληλεπίδρασης της χρωματίνης και των αναδιαμορφώσεων της κατά το φαινόμενο της ενεργής μεταγραφής, ενεργοποιήθηκαν και αναλύθηκαν NGS δεδομένα καταγραφής της προσβασιμότητας της χρωματίνης ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin), καθώς και δεδομένα ChIP-seq των επιγενετικών τροποποιήσεων της χρωματίνης H3K27ac και H3K27me3.Για την αποσαφήνιση της αποτελεσματικότητας του μηχανισμού NER και των υπο-μονοπατιών GG-NER και TC-NER, αναπτύχθηκε μια νέα NGS τεχνολογία, το aniFOUND-seq, η οποία συνδυάστηκε με δεδομένα XR-seq (μεθοδολογία εντοπισμού εκτομής DNA κατά την δράση του μηχανισμού NER), καθώς και με NGS δεδομένα εντοπισμού βλαβών του DNA που προκαλούνται από την UVC ακτινοβολία (damage-seq). Η λειτουργική αποτίμηση του μηχανισμού TC-NER σε ενεργά μεταγραφικές μονάδες πραγματοποιήθηκε με την ανάλυση δεδομένων μεταλλαγών γονιδιώματων με καρκίνο του δέρματος (melanoma) καθώς και καρκίνο του πνεύμονα (lung adenocarcinoma), σε συνδυασμό με μετα-ανάλυση δεδομένων XR-seq.Τα αποτελέσματα των παραπάνω συνοψίζονται σε 4 τμήματα:(1) Ανάπτυξη και εφαρμογή αλγορίθμων για την ανάλυση δεδομένων NGS που σχετίζονται με την ανθρώπινη παθογένεια: (α) Ανάπτυξη ενός αυτόνομου πλαισίου ανάλυσης δεδομένων ChIP-seq, nRNA-seq, και ATAC-seq που περιέχει την ποιοτική αποτίμηση των δεδομένων (Quality Control - QC), την προ-επεξεργασία των μικρών διαβασμάτων (reads), την αντιστοίχιση των διαβασμάτων στο γονιδίωμα/ μεταγράφωμα αναφοράς, την επεξεργασία των αντιστοιχίσεων, την σύνοψη των αντιστοιχίσεων σε γονιδιακές περιοχές αναφοράς και την οπτικοποίηση τους, την δημιουργία εγγραφών για πλοήγηση σε γονιδιακούς φυλλομετρητές (IGV, UCSC), την ομαδοποίηση του NGS σήματος σε λειτουργικά μετάγραφα, τις συσχετίσεις μεταξύ βιολογικών και τεχνικών επαναλήψεων των δεδομένων, την εφαρμογή μεθόδων μείωσης διαστάσεων για την αναγνώριση τεχνικών/βιολογικών ομοιοτήτων/διαφορών των δεδομένων, την ανάλυση διαφορικής έκφρασης, την ανάλυση εύρεσης περιοχών με ενισχυμένο ChIP-seq σήμα (peak calling), την ανάλυση διαφορικής πρόσδεσης, την ανάλυση διαφορικής προσβασιμότητας της χρωματίνης, και άλλες στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των υπο-μελέτη βιολογικών συνθηκών. (β) Ανάπτυξη ενός αλγορίθμου για τον εντοπισμό του “de novo” μεταγραφικού κύματος της RNAPII, χρησιμοποιώντας Κρυφά Μαρκοβιανά Μοντέλα (Hidden Markov Models - HMMs) και δεδομένα DRB-nRNA-seq.(2) Κυτταρική απόκριση σε συνθήκες γενοτοξικού στρες: (α) Ανάπτυξη ενός πλαισίου ανάλυσης για την μελέτη της αναδιοργάνωσης της μεταγραφής και της χρωματίνης έπειτα από έκθεση σε UV-C. Στο συγκεκριμένο πλαίσιο ανάλυσης περιέχονται: Κατάλληλη προσαρμογή των μεταγράφων αναφοράς (υποκινητές, γονίδια, ενισχυτές, PROMoter uPstream Transcripts - asPROMPs) και χαρακτηρισμός της ενεργότητάς τους, ποσοτικοποίηση της εξόδου της RNAPII από το σημεία PPP και αποτίμηση της κινητικής της κατά την παραγωγική επιμήκυνση.(b) Ένα προτεινόμενο μοντέλο που περιγράφει τον μηχανισμό “safe mode” της παραγωγικής επιμήκυνσης. Συγκεκριμένα, κατά την απόκριση στο γενοτοξικό στρες που προκαλείται από την UVC ακτινοβολία, παρατηρείται η γρήγορη και ομοιόμορφη απελευθέρωση της RNAPII από τα PPP σημεία των ενεργών μεταγράφων, προκαλώντας το ξέσπασμα ενός μεταγραφικού κύματος το οποίο με την σειρά του ανιχνεύει το μεταγραφώμενο γονιδίωμα για βλάβες.Ο συγκεκριμένος μηχανισμός μεγιστοποιεί την ταχύτητα εντοπισμού DNA βλαβών, την πιθανότητα αναγνώρισης από τα επιμηκούμενα μόρια RNAPII, και αφαίρεσης τους από το TC-NER στις μεταγραφικές μονάδες των ενεργών γονιδίων. Σαν αποτέλεσμα, γονιδιώματα εκτεθημένα σε περιβαλλοντικούς παράγοντες χαρακτηρίζονται από περιορισμένο και ομοιόμορφο βαθμό μεταλλαγών, σε περιοχές ενεργών μεταγράφων, και στις 2 DNA αλυσίδες, σε αντίθεση με τις περιοχές που δεν μεταγράφονται από την RNAPII όπου παρατηρείται αυξημένος βαθμός μεταλλαγών. Σε περίπτωση που το NER είναι ανεπιτυχές, η δεν στρατολογηθεί επιτυχώς κατά την διαδικασία της ανάκαμψης από την έκθεση στις στρεσογόνες συνθήκες, μη διορθωμένες DNA βλάβες μπορούν να προκαλέσουν εσφαλμένη DNA σύνθεση η οποία θα έχει σαν αποτέλεσμα την μεταλλαξιγένεση.(3) Επεκτείνοντας την περιγραφή του μηχανισμού “safe mode” της παραγωγικής επιμήκυνσης, τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης διατριβής υποστηρίζουν ένα μοντέλο διαρκούς έναρξης της μεταγραφής, το οποίο τροφοδοτεί την εκτενή έξοδο των RNAPII μορίων από το PPP έπειτα από έκθεση στην UVC, διαφυλάσσοντας έτσι την ακεραιότητα του ενεργά μεταγραφώμενου γονιδιώματος. Ο μηχανισμός αυτός πλαισιώνεται από την καθολική αύξηση της προσβασιμότητας της χρωματίνης, σε όλες τις ενεργές μεταγραφικές μονάδες, παίζοντας τον ρόλο μιας πλατφόρμας η οποία ευνοεί την αδιάκοπη έναρξη της μεταγραφής, ενώ παράλληλα διατηρούνται οι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών H3K27ac και H3K27me3 κατά την διάρκεια των πρώτων σταδίων κυτταρικής ανάκαμψης έπειτα από την έκθεση στην UVC ακτινοβολια. (4) Ανάπτυξη ενός πλαισίου ανάλυσης του ολόκληρου του γονιδιώματος για την αποτίμηση της aniFOUND-seq μεθόδου. Το aniFOUND, αποτελεί την πρώτη μέθοδο (κατά την διάρκεια τηςσυγγραφής της συγκεκριμένης μελέτης) που επιτρέπει τον αποκλειστικό χαρακτηρισμό και την ανάκτηση των νεοσυντιθέμενων τμημάτων της επιδιορθωμένη χρωματίνης, έπειτα από την απομάκρυνση των DNA βλαβών από τον μηχανισμό NER. O συνδυασμός της μεθόδου aniFOUND με την τεχνολογία NGS, επιτρέπει τον εντοπισμό και τον χαρακτηρισμό της αποτελεσματικότητας του μηχανισμού NER στο σε ολόκληρο το ανθρώπινο γονιδίωμα.To aniFOUND-seq εφαρμόστηκε επιτυχώς για την ανίχνευση επιδιορθωμένων περιοχών σε ινοβλάστες δέρματος (1BR.3 κυτταρική σειρά), με έμφαση στις περιοχές των υποκινητών και ενισχυτών. Επιπλέον, το aniFOUND-seq αξιοποιήθηκε για την αποτίμηση της δραστηριότητας του NER-UDS, σε διάφορες περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος, όπως οι περιοχές επαναλήψεων DNA (DNA repeats). Συγκεκριμένα, αποσαφηνίστηκε η αποτελεσματικότητα της επιδιόρθωσης του DNA κατά τις 4 πρώτες ώρες έπειτα από την δημιουργία βλαβών, για τις περιοχές ριβοσωμικού DNA και των τελομερών, για τις οποίες μέχρι τώρα υπήρχαν αντικρουόμενα μοντέλα περιγραφής. Κατά συνέπεια, ο σωρευτικός χαρακτήρας του aniFOUND-seq (σε όρους τύπων βλαβών, καθώς και περιόδου επιδιόρθωσης) το καθιστά κατάλληλο για μελέτες που απαιτούν την ολική αξιολόγηση της διαδικασίας επιδιόρθωσης του DNA κατά την διάρκεια σχετικά μεγάλων χρονικών διαστημάτων.