Βιοχημική και μοριακή διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα τριαζολικά μυκητοκτόνα στην παραγωγή μυκοτοξινών από μύκητες του γένους aspergillus
Authors: Δούκας Ελευθέριος 
Published: August 2021

Στελέχη των μυκοτοξικογόνων μυκήτων Aspergillus parasiticus Speare και Aspergillus westerdijkiae Frisvad and Samson, με μέσο επίπεδο ανθεκτικότητας στα τριαζολικά μυκητοκτόνα, απομονώθηκαν μετά από μεταλλαξιγένεση με UV ακτινοβολία και επιλογή σε υλικό που περιείχε flusilazole και epoxiconazole, αντίστοιχα. Διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στην ικανότητα παραγωγής μυκοτοξινών, έδειξε την ύπαρξη δυο φαινοτυπικών κατηγοριών μεταλλαγμένων στελεχών: μυκοτοξικογόνα (afl+ στον A. parasiticus και och+ στον A. westerdijkiae) και μη μυκοτοξικογόνα στελέχη (afl- στον A. parasiticus και ochστον A. westerdijkiae). Όλα τα αφλατοξικογόνα στελέχη του A. parasiticus που μελετήθηκαν, παρήγαγαν σε τεχνητό θρεπτικό υλικό αφλατοξίνες σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες (115,4 - 189,7 % ως προς τη συνολική παραγωγή αφλατοξινών) σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Χαρακτηριστικό είναι επίσης το γεγονός ότι στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG8, παρουσία flusilazole στο υλικό ανάπτυξης παρατηρήθηκε επιπλέον αύξηση των παραγόμενων ποσοτήτων αφλατοξινών (αύξηση 95,3 %). Στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG11, παρατηρήθηκε αυξημένη παραγωγή αφλατοξινών και μετά από μόλυνση σε σπόρους σιταριού (αύξηση 426,5% ως προς τη συνολική συγκέντρωση των αφλατοξινών), σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Στην περίπτωση των ανθεκτικών στελεχών του A. westerdijkiae, διαπιστώθηκε αρνητική επίδραση των μεταλλαγών για ανθεκτικότητα στην ικανότητα παραγωγής ωχρατοξινών, τόσο σε τεχνητό θρεπτικό υλικό, όσο και σε σπόρους σιταριού. Μελέτη της προσαρμοστικότητας των ανθεκτικών στελεχών του A. parasiticus, έδειξε ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα κατά κανόνα επηρεάζουν αρνητικά τα χαρακτηριστικά προσαρμοστικότητας στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη (afl-), όσον αφορά παραμέτρους όπως η γραμμική ανάπτυξη του μυκηλίου, η παραγωγή κονιδίων και ξηρού βάρους μυκηλίου, σε σχέση τόσο με τα αφλατοξικογόνα στελέχη (afl+), όσο και με το άγριο στέλεχος. Στην περίπτωση των ανθεκτικών στελεχών του Α. westerdijkiae, διαπιστώθηκε ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα μπορεί να επηρεάσουν ή να μην επηρεάσουν τις παραμέτρους προσαρμοστικότητας. Πειράματα διασταυρωτής ανθεκτικότητας με άλλα μυκητοκτοκτόνα, έδειξαν ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα μπορεί να προκαλέσουν μείωση της ευαισθησίας των ανθεκτικών στελεχών του A. parasiticus και σε άλλους παρεμποδιστές της βιοσύνθεσης εργοστερόλης της ομάδας των DMIs, όπως το τριαζολικό μυκητοκτόνο tebuconazole και το ιμιδαζολικό imazalil. Επιπλέον, στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη (afl-) παρατηρήθηκε εκδήλωση του φαινομένου της πολλαπλής ανθεκτικότητας, καθώς διαπιστώθηκε μείωση της ευαισθησίας σε μυκητοκτόνα από άλλες χημικές ομάδες, όπως το βενζιμιδαζολικό benomyl, το ανιλινοπυριμιδινικό cyprodinil, το φαινυλοπυριδιναμινικό fluazinam, καθώς και στα μυκητοκτόνα της ομάδας των αρωματικών υδρογονανθράκων και δικαρβοξιμιδικών (AHDs) iprodione και tolclofos-methyl. Οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα προκάλεσαν επίσης μείωση της ευαισθησίας των μεταλλαγμένων στελεχών του A. westerdijkiae στους DMIs flusilazole, difenoconazole και imazalil, ενώ στην πλειοψηφία των στελεχών διαπιστώθηκε επιπλέον μείωση της ευαισθησίας και σε εξειδικευμένους παρεμποδιστές από άλλες χημικές ομάδες όπως στα μυκητοκτόνα fenpropimorph (μορφολινικό), fludioxonil, iprodione, cyprodinil, fluazinam, boscalid (καρβοξαμιδικό) και pyraclostrobil (Qo παρεμποδιστής). Επιπλέον, σε όλα τα ανθεκτικά στελέχη του A. westerdijkiae, οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα δεν επηρέασαν την ευαισθησία των στελεχών στο βενζιμιδαζολικό carbendazim, ενώ παρατηρήθηκε η ύπαρξη αρνητικής διασταυρωτής ανθεκτικότητας στο μη εξειδικευμένο παρεμποδιστή chlorothalonil. Η διερεύνηση την ανθεκτικότητας των στελεχών των A. parasiticus και Α. westerdijkiae στους DMIs με μοριακές τεχνικές, είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό και την απομόνωση στα άγρια και τα μεταλλαγμένα στελέχη, δυο διαφορετικών ομόλογων γονιδίων {Cyp51A και Cyp51B), που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση του ενζύμου της 14α- απομεθυλάσης, καθώς και ενός γονιδίου (mdr) που κωδικοποιεί ABC πρωτεϊνικούς μεταφορείς. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου Cyp51A στα αφλατοξικογόνα στελέχη ZG8 και ΖΒ1 του A. parasiticus, έδειξε την ύπαρξη αντικατάστασης του αμινοξέος γλυκίνη (GGG) από το αμινοξύ τρυπτοφάνη (TGG) σε θέση (G54W) που σχετίζεται με την ανθεκτικότητα στα τριαζολικά μυκητοκτόνα σε είδη του γένους Aspergillus. Καμία άλλη αμινοξική αλλαγή δεν διαπιστώθηκε στα μεταλλαγμένα στελέχη των parasiticus και A. westerdijkiae, σε θέσεις γνωστές για ανθεκτικότητα στους DMIs. Η μελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στα ανθεκτικά στελέχη του A. parasiticus, με τη χρήση της τεχνικής της PCR πραγματικού χρόνου, έδειξε αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Cyp51A στο αφλατοξικογόνο στέλεχος ZG11, καθώς και του γονιδίου mdr στα στελέχη με πολλαπλή ανθεκτικότητα, σε σύγκριση με το άγριο στέλεχος. Η ύπαρξη διαφορών στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων Cyp51A and mdr, διαπιστώθηκε και σε ανθεκτικά στελέχη του A. westerdijkiae. Για τη διερεύνηση της επίδρασης των μεταλλαγών ανθεκτικότητας στην ικανότητα παραγωγής αφλατοξινών, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και μελέτη της έκφρασης του ρυθμιστικού γονιδίου της βιοσύνθεσης των αφλατοξινών aflR, στο άγριο και τα ανθεκτικά στελέχη του A. parasiticus. Έκφραση του γονιδίου aflR διαπιστώθηκε μόνο στο άγριο και τα αφλατοξικογόνα ανθεκτικά στελέχη, ενώ απώλεια έκφρασης παρατηρήθηκε στα μη αφλατοξικογόνα στελέχη. Στην παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η ύπαρξη δυο διαφορετικών ομόλογων γονιδίων που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση του ενζύμου της 14α- απομεθυλάσης, καθώς και ενός γονιδίου που κωδικοποιεί ABC πρωτεϊνικούς μεταφορείς, στα στελέχη τόσο του A. parasiticus όσο και του A. westerdijkiae. Επίσης διαπιστώθηκε για πρώτη φορά πιθανή συσχέτιση μεταξύ ανθεκτικότητας στους DMIs και παραγωγής αφλατοξινών, μέσω της έκφρασης του ρυθμιστικού γονιδίου aflR. Βάσει των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης, προσδιορίστηκαν τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί για ανθεκτικότητα στα είδη του γένους Aspergillus, η αλλαγή της θέσης δράσης μέσω της πρόκλησης σημειακών μεταλλαγών στο γονίδιο Cyp51A, η υπερέκφραση του γονιδίου Cyp51A καθώς και η λειτουργία του μηχανισμού της αυξημένης απέκκρισης, ενώ διαπιστώθηκε η ύπαρξη αυξημένου κινδύνου για την παρουσία μυκοτοξινών στα γεωργικά προϊόντα, μέσω της εμφάνισης και επικράτησης ανθεκτικών στα τριαζολικά μυκητοκτόνα στελεχών του γένους Aspergillus.