Innovative methods for insect control and insecticide resistance management
Authors: Σαμαντσίδης Γεώργιος-Ραφαήλ 
Published: February 2022

Ως έντομα εχθροί ορίζονται τα έντομα που προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στις αγροτικές καλλιέργειες αλλά και στη δημόσια υγεία. Ο έλεγχος αυτών πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο με τη χρήση των εντομοκτόνων. Παρόλα αυτά η αλόγιστη χρήση στο πεδίο έχει οδηγήσει στη φυσική επιλογή πολλών διαφορετικών ανθεκτικών φαινοτύπων. Η λειτουργική ανάλυση των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη διαχείριση και την αντιμετώπιση του φαινομένου, για παράδειγμα μέσω της ανάπτυξη μοριακών διαγνωστικών ή βελτιωμένων σκευασμάτων. Στα πρώτα δύο κεφάλαια χρησιμοποιήσαμε τον οργανισμό μοντέλο Drosophila melanogaster για να μελετήσουμε συγκεκριμένους μηχανισμούς που έχουν συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα σε δύο κλάσεις νευροτοξικών εντομοκτόνων, τα πυρεθροειδή καθώς και τα Sodium Channel Blocker Insecticides (SCBIs). Συγκεκριμένα στο πρώτο κεφάλαιο μελετήθηκαν δύο μεταλλαγές του τασεοευαίσθητου καναλιού νατρίου (F1845Y ή V1848I), οι οποίες έχουν συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα ενάντια στα εντομοκτόνα indoxacarb και metaflumizone, που ανήκουν στην κατηγορία των SCBIs. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάστηκαν αμιγή στελέχη μυγών που φέρουν σε ομόζυγη κατάσταση μία από τις δύο μεταλλαγές, χρησιμοποιώντας την τεχνική γονιδιωματικής τροποποίησης CRISPR/Cas9. Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν βιοδοκιμές τοξικότητας με σκοπό την αξιολόγηση της συνεισφοράς της εκάστοτε μεταλλαγής στην ανθεκτικότητα ενάντια στα δύο εντομοκτόνα, που έδειξαν ότι και οι δύο μεταλλαγές συνεισφέρουν στην ανθεκτικότητα ενάντια στο indoxacarb και στο metaflumizone, με διαφορετική ωστόσο ένταση στο φαινότυπο. Στο επόμενο κεφάλαιο μελετήθηκε η πιθανή συνεργιστική αλληλεπίδραση δύο διαφορετικών μηχανισμών ανθεκτικότητας ενάντια στα πυρεθροειδή, μία κλάση εντομοκτόνων που χρησιμοποιείται ευρέως για την καταπολέμηση εντόμων φορέων ασθενειών όπως είναι τα κουνούπια Aedes aegypti. Ανάμεσα στην πληθώρα γενετικών αλληλομόρφων που έχουν ταυτοποιηθεί στο είδος Aedes aegypti, τα πιο συνήθη φαίνεται να είναι οι μεταλλαγές στο τασεοευαίσθητο κανάλι νατρίου (π.χ. η μεταλλαγή στο σημείο V1016G) καθώς και η υπερέκφραση ενζύμων αποτοξικοποίησης (π.χ. η μονοοξυγενάση του κυτοχρώματος P450 CYP9J28). Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν διαγονιδιακά στελέχη μυγών που φέρουν τη μεταλλαγή V1016G στο γονίδιο para (κανάλι νατρίου) σε συνδυασμό με την ιστοειδική υπερέκφραση του ενζύμου CYP9J28. Βιοδοκιμές τοξικότητας υπέδειξαν τη συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο μηχανισμών που οδηγεί σε μεγαλύτερο συντελεστή ανθεκτικότητας, σε σχέση με το γινόμενο των επιμέρους επιπέδων ανθεκτικότητας (RRcombination: 19.85 >> RRCYP9J28:1.78 X RRV1016G: 3.00). Τα αποτελέσματα των δύο πρώτων κεφαλαίων μας βοηθούν στην κατανόηση νέων μηχανισμών ανθεκτικότητας και στην αξιολόγηση της αξίας επιμέρους μοριακών διαγνωστικών που εφαρμόζονται για την παρακολούθηση του φαινoμένου. Δεδομένης της ανθεκτικότητας, κρίνεται απαραίτητο να αναπτυχθούν και εφαρμοστούν εναλλακτικές μέθοδοι (όπως βιοτεχνολογικές) διαχείρισης των εντόμων και στο πλαίσιο αυτό εντάσσονται τα επόμενα δύο κεφάλαια της διατριβής. Στο κεφάλαιο 3 ταυτοποιήθηκαν υποκινητές εξαρτώμενοι από τις RNA πολυμεράσες II και III του είδους Helicoverpa armigera, με σκοπό την βιοτεχνολογική εφαρμογή τους. Συγκεκριμένα ταυτοποιήθηκαν 4 υποκινητές που εμφανίζουν υψηλή ενεργότητα σε κυτταρική σειρά προερχόμενη από το μεσέντερο λεπιδοπτέρων (RP-HzGUT-AW1(MG)), καθώς και 4 υποκινητές που έχουν την ικανότητα να επάγουν την έκφραση μικρών RNAs (π.χ. shRNAs και sgRNAs), τα οποία αποτελούν βασικό συστατικό τεχνικών γενετικής τροποποίησης (RNAi και CRISPR). Στο κεφάλαιο 4 πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης OATP74D ως πιθανού μεταφορέα εκδυσόνης καθώς και χαρακτηρισμός της ως πιθανού στόχου για εντομοκτόνα. Αρχικά με τη χρήση των πλασμιδίων CRISPR που κατασκευάστηκαν στο κεφάλαιο 3, κατέστη εφικτή η κατασκευή μεταλλαγμένης για το γονίδιο HzOatp74D μονοκλωνικής κυτταρικής σειράς RP-HzGUT-AW1(MG). Η απαλοιφή του γονιδίου οδήγησε σε αδυναμία ενεργοποίησης του μονοπατιού της εκδυσόνης, δεδομένου ότι δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων παρουσία της ορμόνης, συγκριτικά με την κυτταρική σειρά αγρίου τύπου. Επιπλέον η υπερέκφραση των ορθόλογων γονιδίων του Oatp74D από τα λεπιδόπτερα H. armigera και Spodoptera frugiperda, υπέδειξε ότι είναι ικανά να επαναφέρουν την ευαισθησία των κυττάρων στην εκδυσόνη. Εν συνεχεία κατασκευάστηκαν κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν μόνιμα τις πρωτεΐνες HaOATP74D και SfOATP74D με σκοπό τη χρήση τους ως πλατφόρμα για τον έλεγχο πιθανών αναστολέων, όπως η ριφαμπικίνη, που βρέθηκε να είναι ικανή να αναστείλει την είσοδο της εκδυσόνης ενδοκυτταρικά. Μερική απαλοιφή του γονιδίου Oatp74D στο λεπιδόπτερο S. frugiperda (in vivo), υπέδειξε την αναγκαιότητα του γονιδίου αυτού για την ανάπτυξη των εντόμων. Καταλήγοντας, είναι η πρώτη φορά που αποδεικνύεται ότι η μεταφορά εκδυσόνης πραγματοποιείται μέσω του μεταφορέα OATP74D στα λεπιδόπτερα. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη αυτή έχει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη των εντόμων H. armigera και S. frugiperda, και ότι η δράση της μπορεί να ανασταλεί από χημικούς αναστολείς, ευρήματα τα οποία αναδεικνύουν το ρόλο της μελλοντικά ως πιθανό στόχο εντομοκτόνων.