Γενετική και μοριακή μελέτη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και συσχέτιση του με την αφυλετικότητα και την φυτοπαθογένεια στον αστομύκητα Verticillium dahllae
Authors: Βάγγαλης Βασίλειος 
Published: February 2022

Η ετεροκαρυωτική (ή βλαστητική) ασυμβατότητα στους μύκητες είναι ένας από τους πλέον κοινούς τύπους προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και αποτελεί μέρος του μηχανισμού αναγνώρισης ενός έτερου, περιορίζοντας έτσι την εξάπλωση παρασιτικών στοιχείων στους πληθυσμούς. Η ύπαρξη φραγμών ασυμβατότητας φαίνεται πως παρεμποδίζει επίσης την εξέλιξη του παραφυλετικού κύκλου, μια πορεία που ξεκινάει από την αναστόμωση σπορίων ή/και υφών και χαρακτηρίζεται από τον επακόλουθο σχηματισμό βιώσιμων ετεροκαρύων, τη συνύπαρξη γενετικά διακριτών πυρήνων στο ίδιο κυτταρόπλασμα και τελικά την ανταλλαγή γενετικού υλικού μέσω σύντηξης των πυρήνων (καρυογαμία), και τελικά την δημιουργία ενός ασταθούς διπλοειδούς πυρήνα που εισέρχεται στην συνέχεια στην πορεία του απλοειδισμού (τυχαία απώλεια χρωμοσωμάτων). Η ανάπτυξη κατάλληλων δοκιμασιών συμπληρωματικότητας έχει οδηγήσει στην κατάταξη των στελεχών διαφορετικών μυκήτων σε Ομάδες Βλαστητικής Συμβατότητας (Vegetative Compatibility Groups, VCGs), των οποίων τα μέλη μπορούν να αλληλοεπιδράσουν παραφυλετικά μόνο μεταξύ τους. Η ασυμβατότητα έχει μελετηθεί αναλυτικά μόνον σε λίγους μύκητες-πρότυπα και έχει βρεθεί πως ελέγχεται από ένα σύνολο πολυμορφικών γονιδίων het. Ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αναλυτική μελέτη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που επάγεται από την ασυμβατότητα στον αφυλετικό φυτοπαθογόνο ασκομύκητα V. dahliae, καθώς και η συσχέτιση του φαινομένου αυτού με άλλα μονοπάτια κυτταρικού θανάτου και με την πορεία του παραφυλετικού κύκλου.Αρχικά πραγματοποιήθηκε η λειτουργική μελέτη του φαινομένου της αναστόμωσης των κονιδίων (Conidial Anastomosis Tubes, CATs) και διαπιστώθηκε πως στο V. dahliae κάτω από συνθήκες έλλειψης θρεπτικών οι CATs μπορούν να οδηγήσουν στην μεταφορά γενετικού υλικού μεταξύ ‘συμβατών’ ατόμων του μύκητα. Γενετικές αναλύσεις κατέδειξαν πως ο σχηματισμός τους ελέγχεται από τα συντηρημένα σηματοδοτικά μονοπάτια των ΜAP κινασών Fus3 και Slt2, καθώς και από την NADPH οξειδάση Α. Εκτεταμένες κυτταροβιολογικές αναλύσεις απέδειξαν πως γενετικά διακριτά άτομα, που ανήκουν σε διαφορετικές VCGs, μπορούν επίσης να αναγνωρίζονται και να συντήκονται αποτελεσματικά, ξεπερνώντας έτσι το πρώτο επίπεδο ασυμβατότητας που έχει περιγραφεί σε άλλους ασκομύκητες.Η πλειονότητα των ‘ασύμβατων’ αναστομώσεων γρήγορα εισέρχονταν σε ένα μονοπάτι προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που χαρακτηριζόταν από την αποικοδόμηση των πυρήνων, την κατάρρευση των συντηγμένων κυττάρων, και τη διαμερισματοποίηση τους μέσω της έντονης εναπόθεσης χιτίνης στα σέπτα που περιβάλλουν την αντίδραση. Απροσδόκητα, κάτω από αυτές τις συνθήκες ένα σημαντικό ποσοστό των θεωρητικά ασύμβατων αναστομώσεων ξέφευγαν από τους φραγμούς ασυμβατότητας, επιτρέποντας έτσι την δημιουργία βιώσιμων ετεροκαρυωτικών κυττάρων και την πιθανή ανταλλαγή γενετικού υλικού.Η ανάπτυξη μιας νέας δοκιμασίας συμπληρωματικότητας που βασίζεται στην δημιουργία των CATs πριν τη μεταφορά των κυττάρων σε μέσα επιλογής, απέδειξε πως μέσω της διαδικασίας αυτής μπορούν να δημιουργηθούν ετεροκαρυωτικές αποικίες τόσο in vitro όσο και in planta, ενώ κάτω από κατάλληλες επιλεκτικές συνθήκες ανιχνεύθηκε η δημιουργία διπλοειδών κονιδίων, τόσο έμμεσα με γενετικές προσεγγίσεις όσο και άμεσα με ανάλυση μέσω κυτταρομετρία ροής. Παρακολουθήθηκε στη συνέχεια, μέσω αντίστοιχων προσεγγίσεων, και η πορεία του απλοειδισμού επιβεβαιώνοντας έτσι την έναρξη και λειτουργία του πλήρους παραφυλετικού κύκλου στο V. dahliae ακόμη και μεταξύ θεωρητικά ασύμβατων στελεχών. Επιπλέον, διαπιστώθηκε πως η πορεία αυτή μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή εκτεταμένης γενετικής ποικιλομορφίας, καθώς η μελέτη επιλεγμένων παραφυλετικών απογόνων φανέρωσε πως αυτοί εμφάνιζαν πληθώρα μορφολογικών, φυσιολογικών και φυτοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Καρυοτυπικές και γονιδιωματικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν πως οι παραφυλετικοί απόγονοι διέθεταν χρωμοσωμικό υλικό και από τους δυο γονείς, ενώ συχνά μιτωτικοί γενετικοί ανασυνδυασμοί φαίνεται πως οδηγήσαν στη δημιουργία νέων χρωμοσωμάτων.Ακολούθησε στη συνέχεια η αναζήτηση για πιθανούς γενετικούς ρυθμιστές του φαινομένου της ασυμβατότητας και η έρευνα αυτή φανέρωσε τον καθοριστικό ρόλο της αυτοφαγίας στις διαδικασίες της ετεροκαρύωσης και της ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας. Πιο συγκεκριμένα, η αυτοφαγία αποδείχθηκε πως ήλεγχε την αποικοδόμηση των πυρήνων μέσω επιλεκτικής νουκλεοφαγίας, διασφαλίζοντας έτσι την ύπαρξη ενός πυρήνα ανά κυτταρικό διαμέρισμα, αμέσως μετά τη δημιουργία των CATs, ενώ φάνηκε πως προστατεύει τα συντηγμένα κύτταρα από την αντίδραση της ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας. Παρ’ ότι στο γονιδίωμα του V. dahliae υπάρχουν πολλά από τα ομόλογα γονίδια που ελέγχουν την ασυμβατότητα σε άλλους ασκομύκητες, λειτουργική τους ανάλυση απέδειξε πως μόνο το γονίδιο vic2 που κωδικοποιεί για έναν υποδοχέα τύπου Nod επηρεάζει το φαινόμενο και στο V. dahliae, επιβεβαιώνοντας έτσι την υπόθεση πως κάθε οργανισμός έχει αναπτύξει τους δικούς του μηχανισμούς ελέγχου της ασυμβατότητας και λίγα μόνο συστατικά του έιναι συντηρημένα.Τέλος, πραγματοποιήθηκαν λειτουργικές αναλύσεις γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (mca2, endoG), με την προστασία των υφών από τραυματισμό (hex1, κύριο συστατικό των Woronin bodies), καθώς και με την διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας του κυττάρου (noxA, yap1). Η διαγραφή αυτών των γονιδίων απέδειξε πως κανένα από αυτά δε συμμετείχε άμεσα στο φαινόμενο της ασυμβατότητας, αλλά φάνηκε πως επηρέαζαν σημαντικά την μορφολογία, φυσιολογία, φυτοπαθογένεια και την αντίσταση σε κυτταρικό στρες του V. dahliae.Συνολικά, τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής υποδεικνύουν πως στον αφυλετικό μύκητα V. dahliae, οι φραγμοί ασυμβατότητας δεν είναι τόσο απόλυτοι και κάτω από κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες φαίνεται ότι μπορούν να ξεπεραστούν. Αυτό επιτρέπει την ανταλλαγή γενετικού υλικού και τη δημιουργία γενετικής ποικιλομορφίας μέσω του παραφυλετικού κύκλου, χωρίς την ανάγκη φυλετικής αναπαραγωγής, ακόμη και μεταξύ στελεχών από διαφορετικές VCG αναθεωρώντας έτσι τη σημασία που έχει ο παραφυλετικός κύκλος στην εξέλιξη αυτού του αφυλετικού φυτοπαθογόνου μύκητα.