Φυλογένεση, ταυτοποίηση και έλεγχος της ικανότητας ανάπτυξης αντοχής σε ανθελμινθικά φάρμακα των υποπληθυσμών του νηματώδους παρασίτου Haemonchus spp. στα μηρυκαστικά στην Ελλάδα
Authors: Αρσενόπουλος Κωνσταντίνος 
Published: September 2021

Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η ταυτοποίηση των ειδών των συμπατρικών πληθυσμών του γένους Haemonchus, που προσβάλλουν τα μηρυκαστικά ζώα (πρόβατα, αίγες, βοοειδή, βουβάλια) από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας (ηπειρωτική και νησιωτική) με μοριακές μεθόδους. Παράλληλα, επιχειρήθηκε η αναγνώριση των πιθανών υποπληθυσμών των ειδών Haemonchus στην Ελλάδα, η διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεών τους καθώς και ο καθορισμός της γενετικής ποικιλομορφίας του κάθε είδους. Τέλος, ελέγχθηκε η πιθανή ικανότητα ανάπτυξης ανθελμινθικής αντοχής των υποπληθυσμών του συγκεκριμένου παρασίτου σε μία ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία ανθελμινθικών φαρμάκων, τις βενζιμιδαζόλες. Για τη διεξαγωγή των μοριακών δοκιμών χρησιμοποιήθηκαν 288 νηματώδη παράσιτα Haemonchus spp., εκ των οποίων τα 96 παράσιτα προέρχονταν από πρόβατα, τα 96 από αίγες, τα 48 από βοοειδή και τέλος, τα υπόλοιπα 48 από βουβάλια. Η επιλογή των δειγμάτων αυτών πραγματοποιήθηκε τυχαία με στόχο τη συμμετοχή στις μοριακές δοκιμές παρασίτων τόσο από την ηπειρωτική όσο και από τη νησιωτική Ελλάδα. Η κεφαλή του κάθε παρασίτου, μετά την αποκοπή της στο ύψος των ωτικών πτερυγίων, χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA, η οποία πραγματοποιήθηκε με το κλασικό πρωτόκολλο φαινόλης-χλωροφορμίου. H πυρηνική ITS2 περιοχή χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των ειδών των νηματωδών παρασίτων του γένους Haemonchus. Η ταυτοποίηση των ειδών των νηματωδών παρασίτων Haemonchus βασίστηκε στα αποτελέσματα της έρευνας των Stevenson et al. (1995), σύμφωνα με τους οποίους η παρουσία των βάσεων αδενίνης, γουανίνης και αδενίνης στις θέσεις 24, 205 και 219, αντίστοιχα ταυτοποιούν το είδος H. contortus, ενώ η παρουσία των βάσεων γουανίνης, αδενίνης και γουανίνης στις αντίστοιχες θέσεις ταυτοποιούν το είδος H. placei. Στην παρούσα έρευνα, όλες οι ακολουθίες ανήκαν στο είδος H. contortus. To μιτοχονδριακό NAD4 γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των υποπληθυσμών των νηματωδών παρασίτων H. contortus. Στην παρούσα έρευνα, οι 194 ακολουθίες του μιτοχονδριακού NAD4 γονιδίου των H. contortus ταξινομήθηκαν σε 98 απλότυπους. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε την απουσία σαφούς ομαδοποίησης των απλότυπων ανάλογα με τα είδη των ξενιστών, από τους οποίους συλλέχθηκαν τα παράσιτα. Με άλλα λόγια, το συγκεκριμένο παράσιτο μπορεί να προσβάλει αδιακρίτως όλα τα είδη των μηρυκαστικών όταν δημιουργηθούν οι κατάλληλες προϋποθέσεις. Επίσης, οι τιμές της απλοτυπικής και νουκλεοτιδικής ποικιλότητας στον πληθυσμό των H. contortus ήταν υψηλότερες συγκριτικά με τις αντίστοιχες τιμές των μεγάλων μηρυκαστικών. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία σε επίπεδο μιτοχονδριακού NAD4 γονιδίου στον πληθυσμό των H. contortus από τα μικρά μηρυκαστικά και, συνεπώς, μεγάλη ανταλλαγή γονιδίων μεταξύ των συγκεκριμένων παρασίτων. Τέλος, διερευνήθηκε η παρουσία ανθεκτικών στις βενζιμιδαζόλες γενοτύπων H. contortus με τη μέθοδο της αλληλομορφοειδικής PCR, η οποία ανιχνεύει την παρουσία του πολυμορφισμού του αμινοξέως φαινυλαλανίνη/τυροσίνη στη θέση 200 της πρωτεΐνης της β-σωληνίνης των παρασίτων. Οι συχνότητες των ομόζυγων και ετερόζυγων ανθεκτικών γενοτύπων στη θέση 200 του γονιδίου της β-σωληνίνης των παρασίτων των μηρυκαστικών ήταν 71,2% και 28,8%, αντίστοιχα. Ομόζυγοι ευαίσθητοι γενότυποι δεν ανιχνεύθηκαν σε κανέναν παρασιτικό πληθυσμό. Πιθανολογείται ότι τα ανθεκτικά στις βενζιμιδαζόλες αλληλόμορφα μεταφέρθηκαν στον παρασιτικό πληθυσμό των μεγάλων μηρυκαστικών από τον αντίστοιχο των μικρών μηρυκαστικών εξαιτίας της βόσκησης σε κοινούς λειμώνες.