Ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και παραγώγων τους με αγγειογενετικές ιδιότητες
Authors: Δημητρακούδη Σαπφώ-Μαρία 
Published: July 2022

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και συνθετικών αναλόγων τους με αγγειογενετικές ιδιότητες. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν το γεγονός ότι ένας μεγάλος αριθμός φυσικών προϊόντων έχουν χαρακτηριστεί ως ικανοί προ-αγγειογενετικοί και αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες στο παρελθόν, πραγματοποιήθηκε in vitro αξιολόγηση ενός σημαντικού αριθμού ενώσεων της χημειοθήκης του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων (ΕΦΧΦΠ), ως προς την ικανότητά τους να ρυθμίζουν τη διαδικασία της αγγειογένεσης σε κυτταρική σειρά ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων EA.hy926. Πραγματοποιήθηκε επιλογή 202 μικρομοριακών ενώσεων με γνώμονα τη δομική ποικιλότητα, και τα αποτελέσματα του in vitro ελέγχου της αγγειογενετικής δράσης, ανέδειξε τους περισσότερο υποσχόμενους δομικούς σκελετούς (scaffolds) βάση των οποίων i) αναζητήθηκαν φυτικές πηγές πλούσιες στους εν λόγω δευτερογενείς μεταβολίτες και ii) σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν συνθετικές ενώσεις με βελτιωμένες ιδιότητες.Με βάση τα αποτελέσματα του πρωταρχικού ελέγχου, κυρίως απλά φαινολικά παράγωγα όπως και φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στις κατηγορίες των φλαβονοειδών, αλκαλοειδών, τερπενίων, κουμαρινών, ξανθονών και ανθρακινονών, χαρακτηρίστηκαν από αντι-αγγειογενετική επίδραση, ενώ παράγωγα φλαβονοειδών, αλκαλοειδών, φαινολικών και θειούχων ενώσεων επέδειξαν πιθανή προ-αγγειογενετική δράση. Τελικά επιλέχθηκαν 191 φυτικά είδη από την ελληνική χλωρίδα λαμβάνοντας υπ’ όψιν τους περισσότερο υποσχόμενους δομικούς σκελετούς, αλλά και βιβλιογραφικές αναφορές σχετικές με τη δράση τους στην αγγειογένεση. Με τη χρήση πράσινων τεχνικών εκχύλισης (κυρίως της τεχνικής της επιταχυνόμενης εκχύλισης ASE) παρασκευάσθηκαν 275 εκχυλίσματα, τα οποία μελετήθηκαν με τη μέθοδο της Χρωματογραφίας Λεπτής Στιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC) ώστε να αξιολογηθεί το χημικό τους φορτίο και να καθοριστεί το φυτοχημικό τους προφίλ. Στη συνέχεια, τα προαναφερόμενα παρασκευάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επιδρούν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων EAhy926, εκτιμώντας την (αντι-) ή (προ-) αγγειογενετική τους ικανότητα. Συνυπολογίζοντας τα αποτελέσματα της αξιολόγησης του φυτοχημικού περιεχομένου και των βιολογικών ιδιοτήτων, επιλέχθηκαν 65 εκχυλίσματα για περαιτέρω φυτοχημική μελέτη, τα οποία κλασματώθηκαν με χρήση της φυγόκεντρου χρωματογραφίας κατανομής (FCPC). Τα προκύπτοντα κλάσματα ελέγχθηκαν ως προς το χημικό τους προφίλ με την τεχνική της HPTLC, με σκοπό την επιλογή των κλασμάτων για την περαιτέρω αξιολόγησή τους ως προς την ικανότητά τους να επιδρούν στην αγγειογένεση. Από το σύνολο λοιπόν των συνενωμένων κλασμάτων που προέκυψαν, 492 κλάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων EAhy926 με τη μέθοδο MTT σε συγεντρώσεις ελέγχου 2 μg/ml και 20 μg/ml. Συνδυάζοντας λοιπόν τα αποτελέσματα του χημικού και βιολογικού ελέγχου, επιλέχθηκαν τελικά 14 εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα των φυτικών ειδών: Asphodeline lutea, Nepeta orphanidea, Daphne sericea και Morus alba, Drypis spinosa, Glycyrrhiza glabra, Inula pseudolimonella, Cotinus coggygria, Dittrichia viscosa, Bupleurum fruticosum, Laserpitium pseudomeum, Origanum dictamnus, Tamus communis και Ruta graveolens με σκοπό να λάβει χώρα η βιοκατευθυνόμενη απομόνωση των δευτερογενών μεταβολιτών τους. Τα επιλεγμένα φυτικά εκχυλίσματα κλασματώθηκαν εκ νέου με χρήση της φυγόκεντρου χρωματογραφίας κατανομής (FCPC) για την παραλαβή κλασμάτων σε μεγαλύτερη ποσότητα και εν συνεχεία, με χρήση διαφόρων χρωματογραφικών τεχνικών (CPC, Sephadex LC, Prep-TLC) απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 55 μεταβολίτες, οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, στερολών, φαινολικών παραγώγων, φλαβονοειδών, κουμαρινών, φουρανοκουμαρινών, στιλβενίων, διυδροστιλβενίων, βενζοφουρανονών, φουρανολιγνανίων ανθρακινονών, ανθρακενίων, φαινανθρενίων, σεσκιτερπενικών λακτονών και γλυκοσιδικών παραγώγων τους. Αναφορικά με την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων των επιλεγμένων φυσικών προϊόντων, έλαβε χώρα ο σχεδιασμός και η παρασκευή συνολικά 10 συνθετικών ενώσεων οι οποίες ανήκουν στις κατηγορίες των χαλκονών και των διαρυλοπροπανίων. Οι απομονωμένοι φυσικοί μεταβολίτες και τα συνθετικά ανάλογα ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1D και 2D NMR). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση των 55 απομονωμένων μεταβολιτών και των 10 συνθετικών ενώσεων, ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν ή να επάγουν την αγγειογένεση. Η συντριπτική πλειοψηφία των δευτερογενών μεταβολιτών χαρακτηρίστηκε από αντι-αγγειογενετική επίδραση ενώ ξεχώρισαν δευτερογενείς μεταβολίτες που ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, των σεσκιτερπενικών λακτονών, των κουμαρινών, των φλαβονοειδών αλλά και των χαλκονοειδών.Συμπερασματικά θα μπορούσαμε να αναφέρουμε ότι η ανάδειξη ελπιδοφόρων δομικών σκελετών, με βάση τα αποτελέσματα της αρχικής in vitro αξιολόγησης σε επιλεγμένες ενώσεις της χημειοθήκης φυσικών προϊόντων, είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση φυσικών προϊόντων και την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων με ρυθμιστικές ιδιότητες στην αγγειογένεση.