Ο ρόλος των μεταλλοπρωτεϊνασών-2 και -9 στην αθηροσκλήρωση των ασθενών με χρόνια νεφρική νόσο
Authors: Δήμας Γρηγόριος 
Published: September 2021

Τα καρδιαγγειακά επεισόδια αποτελούν σήμερα κύρια αιτία θνητότητας και θνησιμότητας σε ασθενείς με ΧΝΝ. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών αυτών δεν προλαβαίνει να οδηγηθεί σε τελικό στάδιο και ένταξη σε πρόγραμμα υποστήριξης της νεφρικής λειτουργίας. Η παρουσία εμμένουσας λευκωματουρίας χαρακτηρίζει τη ΧΝΝ και τη νεφρική δυσλειτουργία, ενώ τελευταία δεδομένα την αναφέρουν και ως αίτιο νεφρικής  βλάβης μεταξύ των ασθενών με ΧΝΝ. Τελευταία, συγκαταλέγεται και μεταξύ των νεότερων παραγόντων καρδιαγγειακού κινδύνου. Παρότι οι παραπάνω παρατηρήσεις υποδεικνύουν κάποια σχέση μεταξύ λευκωματουρίας, ΧΝΝ και ΚΑΝ, δεν έχουν διαλευκανθεί οι υποκείμενοι μηχανισμοί, με τους οποίους η λευκωματουρία συνδέει νεφρική και αγγειακή βλάβη σε ασθενείς με ΧΝΝ. Η οικογένεια των MMPs αποτελεί το κύριο σύστημα, που αποδομεί στον άνθρωπο, τόσο τις φυσιολογικές, όσο και τις παθολογικές πρωτεΐνες της ECM στο νεφρό και στα αγγεία. Τελευταία δεδομένα αναφέρονται στις ΜΜΡs -2 και -9 να εμπλέκονται στη ΧΝΝ και στην ΚΑΝ, πρωτίστως μέσω της αποδόμησης του col-IV, βασικού συστατικού της ECM και της ΒΜ των αγγείων και της GBM στο νεφρό, που άπτεται άμεσα του ενδοθηλίου. Η δράση των MMPs αυτών στην έναρξη και εξέλιξη της ΧΝΝ και της ΚΑΝ επιτυγχάνεται στις περιοχές του σπειράματος και του σωληναρίου στο νεφρό, αλλά και ευρύτερα των αγγείων, μέσω της αναδιάρθρωσης και δομικών αλλαγών των ιστών.Έως το σχεδιασμό του πρωτοκόλλου της παρούσας διδακτορικής  διατριβής υπήρχαν ελάχιστα δεδομένα με αντιφατικά αποτελέσματα από κλινικές μελέτες που συσχέτιζαν τις δύο ΜΜΡs, ΜΜΡs -2 και -9, με αθηροσκλήρωση και ιδίως στη ΧΝΝ, ενώ αυτές αφορούσαν ασθενείς σε προχωρημένα και τελικό στάδια υπό αιμοκάθαρση. Δεν υπήρχαν μελέτες που να αξιολογούν τη συσχέτιση των πιο πάνω MMPs με τη λευκωματουρία. Η μόνη μελέτη συσχέτισης της ΜΜΡ-2 με τη λευκωματουρία, σύγχρονης μάλιστα εμφάνισης με την έναρξη της παρούσας μελέτης, περιελάμβανε ασθενείς σε προχωρημένα στάδια ΧΝΝ, με διάφορες αιτίες της νόσου, ενώ πολλοί από αυτούς δεν εμφάνιζαν λευκωματουρία.Κάτω απ΄ αυτό το πρίσμα, κύριος σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η εμπλοκή των MMPs -2 και -9 στους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν τη λευκωματουρία με την αθηροσκλήρωση (καρωτίδων και μηριαίων αρτηριών) στη ΧΝΝ. Έτσι, η αθηροσκλήρωση ελέγχθηκε με τον πρώιμο δείκτη ΙΜΤ, την ύπαρξη αθηρωματικής πλάκας, καθώς και το αθηρωματικό αποτέλεσμα ATHUS για τα τέσσερα αγγεία των δύο καρωτίδων και των δύο μηριαίων αρτηριών (0-8 με ΙΜΤ≥0.8mm=1, IMT<0.8mm=0, παρουσία αθηρωματικής πλάκας με στένωση >25%=1, απουσία αθηρωματικής πλάκας=0), με έναν υψηλής ευκρίνειας υπερηχοτομογράφο. Δευτερεύοντες στόχοι της διατριβής ήταν να συσχετισθούν οι δύο ζελατινάσες, MMPs-2 και -9 με ΑΥ, ΒΜΙ, υπερουριχαιμία, δείκτες υποθρεψίας, φλεγμονής και οξειδωτικού στρες, καθώς και με τους αυξητικούς παράγοντες TGF-β1 και VEGF-A, με σκοπό την ανάδειξη και άλλων μηχανισμών αιτιοπαθογένειας και εξέλιξης ΧΝΝ, που μπορούν να επηρεάζουν και την ποιότητα ζωής των ασθενών αυτών.Στην παρούσα μελέτη έλαβαν μέρος 160 ασθενείς σε πρώιμα και προχωρημένα στάδια (Ι έως IV) ΧΝΝ, καθώς και 66 ασθενείς σε προτελικό και τελικό στάδια ΧΝΝ, χωρίς να έχει ενταχθεί κάποιος σε πρόγραμμα αιμοκάθαρσης (GFR: 12-25 ml/min). Οι ασθενείς ήταν χωρισμένοι σε δύο υποομάδες ανάλογα με το αίτιο της ΧΝΝ, δηλ. 80 με διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ) από σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ) (20 σε κάθε στάδιο) και 80 με πρωτοπαθή χρόνια σπειραματονεφρίτιδα (ΣΜΝ), συμπεριλαμβανομένων της ΣΜΝ με ελάχιστες αλλοιώσεις (ΣΜΝΜΕΑ), της μεσαγγειοϋπερπλαστικής ΣΜΝ (ΜΥΣΜΝ), της IgAN, της μεμβρανώδους ΣΜΝ (ΜΣΜΝ) και της εστιακής τμηματικής ΣΜΝ (ΕΤΣΜΝ), επίσης 20 σε κάθε στάδιο ΧΝΝ. Το ίδιο ακριβώς συνέβη και με τους 66 ασθενείς προτελικού-τελικού σταδίου, δηλ. 33 εμφάνιζαν ΔΝ από ΣΔ2 και 33 προερχόταν από α΄ παθή ΣΜΝ. Έτσι, ελέγξαμε το πρόβλημα της λευκωματουρίας από δύο διαφορετικές οδούς (ΣΔ2-ΣΜΝ) και από τα αρχικά στάδια ΧΝΝ, με εξέλιξη προς την προχωρημένη νόσο. Ως υγιείς μάρτυρες επιλέγησαν 112 συμμετέχοντες. Δηλαδή, 56 υγιείς εθελοντές, οι οποίοι δεν ελάμβαναν καμία φαρμακευτική αγωγή και 56 ασθενείς με ΣΔ τ.2 με ιστορικό ΣΔ πάνω από 15 χρόνια χωρίς ΧΝΝ. Για τους πολυμορφισμούς ως μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν 106 εθελοντές, από τον ίδιο κορμό υγιών, 45 με ΣΔ τ.2 χωρίς  ΧΝΝ και 61 υγιείς μάρτυρες που δεν ελάμβαναν καμία φαρμακευτική αγωγή. Για την ανοσοϊστοχημεία ως υγιείς μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν 44 εθελοντές, νοσηλευόμενοι για διερεύνηση κροταφικής αρτηρίτιδας (βιοψία κροταφικής αρτηρίας) και βρέθηκαν αρνητικοί για τη νόσο. Στις πιο πάνω ομάδες ασθενών και υγιών μαρτύρων διενεργήθηκαν τρεις διαφορετικές εργαστηριακές μέθοδοι, προκειμένου να αποσαφηνισθεί ο ρόλος των δύο ΜΜΡs (-2 και -9) στην αθηροσκλήρωση και λευκωματουρία.Στην πρώτη περίπτωση προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα ορού των MMΡs -2 και -9 με τους αναστολείς τους ΤΙΜΡs -1 και -2, με ενζυμοανασολογική μέθοδο (ELISA), για τους 160 ασθενείς. Για τους ίδιους ασθενείς στη συνέχεια διενεργήθηκε γονοτυπική ανάλυση πέντε πολυμορφισμών μονών νουκλεοτιδίων (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), τρεις για την ΜΜΡ-2 (C735T, C1306T, G1575A) και δύο για την ΜΜΡ-9 (R279Q και C1562Τ) με την μέθοδο της ανταγωνιστικής ειδικής-αλληλόμορφης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Τέλος, για τους 66 ασθενείς προτελικού-τελικού σταδίου, κατά την προετοιμασία ένταξης σε πρόγραμμα υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας για την διενέργεια αρτηριοφλεβικής αναστόμωσης (arteriovenous fistula, AVF) ελήφθη τμήμα αγγείου κερκιδικής αρτηρίας, στο οποίο με ιστολογική-ανοσοϊστοχημική μελέτη φάνηκε η έκφραση των δύο ΜΜΡs (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9) και των αναστολέων τους (ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2) σε όλες τις κυτταρικές σειρές των στοιβάδων των αγγείων, δηλ. στο ενδοθήλιο, στα λεία μυϊκά κύτταρα και στους ινοβλάστες. Όλες οι μετρήσεις και εξετάσεις υλοποιήθηκαν στα Εργαστήρια Βιοχημικό και Υπερήχων Νευροαγγειακών παθήσεων του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ (ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ), καθώς και στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής  του ΑΠΘ ενώ οι ασθενείς προέρχονταν από το Διαβητολογικό και Νεφρολογικό Τμήμα της Α΄ Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής (Α΄ΠΡΠ) του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ.Η παρούσα διατριβή εμφάνιζε μια σειρά σημαντικών αποτελεσμάτων. Η μέση τιμή των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παρουσιάζει  στατιστικά σημαντική διαφορά, τόσο μεταξύ ασθενών-μαρτύρων (ΜΜΡ-2: 365.5±59ng/ml έναντι 100±27 και ΜΜΡ-9: 1465±445ng/ml έναντι 117±44, p<0.001), όσο και σε κάθε ομάδα χωριστά (ΜΜΡ-2: 378ng/ml στην ΔΝ ομάδα, 353 στη ΣΜΝ, 106 στη ΣΔ και 94 στους υγιείς, ενώ η ΜΜΡ-9: 1591ng/ml στη ΔΝ, 1338 στη ΣΜΝ, 133 στη ΣΔ και 101 στους υγιείς). Αντίστοιχα ελαττωμένα εμφανίζονταν τα επίπεδα ορού των ιστικών αναστολέων των ΜΜΡs, ΤΙΜΡs. Ο ΤΙΜΡ-1, αναστολέας της ΜΜΡ-9, εμφάνιζε 493ng/ml στην ενιαία ομάδα ασθενών και 772ng/ml στην ομάδα μαρτύρων (375ng/ml στην ομάδα ΔΝ, 612 στη ΣΜΝ, 625 στη ΣΔ και 919 στους υγιείς). Ο ΤΙΜΡ-2, αναστολέας της ΜΜΡ-2, εμφάνιζε 119ng/ml στην ομάδα ασθενών και 242 στην ομάδα μαρτύρων (95ng/ml στην ομάδα ΔΝ, 143 στη ΣΜΝ, 205 στη ΣΔ και 279 στους υγιείς). Η ανάλυση παλινδρόμησης,  η συσχέτιση του Pearson και το t-test έδειξαν σημαντική συσχέτιση της ΜΜΡ-2 και της ΜΜΡ-9 με τη νεφρική λειτουργία, τους δείκτες ΙΜΤ καρωτίδων και αθηρωματικής πλάκας, καθώς και με τη λευκωματουρία.Αναφορικά με τους πέντε πολυμορφισμούς, τρεις για την ΜΜΡ-2 και δύο για την ΜΜΡ-9, βρέθηκαν επίσης κάποια αξιοσημείωτα αποτελέσματα. Η συσχέτιση των γονοτύπων των ΜΜΡs -2 και -9 μεταξύ των ομάδων έγινε με τη μέθοδο του Pearson chi-square, η προσαρμογή στο φύλο και την ηλικία με τη λογιστική παλινδρόμηση, ενώ η συσχέτιση των πέντε SNPs με ΑΥ και ATHUS στις δύο ομάδες ασθενών-υγιών διενεργήθηκε με τον ακριβή έλεγχο του Fisher (Fisher exact test). Υπήρχε μεγάλη στατιστική σημαντικότητα για τον ΜΜΡ9-R279Q σε όλες τις ομάδες. Οι ομόζυγοι QQ φαίνονται να διατρέχουν από 4 μέχρι και 20 φορές περισσότερο κίνδυνο για ΑΥ σε σχέση με τους RR και RQ. Διαφαίνεται επίσης κάποια υποκείμενη συσχέτισή του με ΔΝ και ΣΜΝ, καθώς και στην ΑΥ της IgAN, τείνοντας να εμφανίσει στατιστική σημαντικότητα. Ο πολυμορφισμός ΜΜΡ2C735T φαίνεται γενικά να σχετίζεται με τη ΧΝΝ, με τη ΔΝ, καθώς και με αθηροσκλήρωση, ενώ ο ΜΜΡ2-G1575A έδειξε τάση συσχέτισης, στατιστικά οριακά σημαντική, στην ομάδα ασθενών.Από την ανοσοϊστοχημεία, η έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, διέφερε στατιστικά πολύ σημαντικά και στους τρεις τύπους κυττάρων στις στιβάδες των αγγείων για όλες τις ομάδες, σύμφωνα με τον μη-παραμετρικό έλεγχο του Friedman.Για τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων η στατιστικά σημαντική διαφορά παραμένει και αυξάνει κατά την ομαδοποίηση των μεταβλητών με το τεστ του Mann Whitney, για κατηγορικές μεταβλητές. Η στατιστικά μεγάλη σημαντικότητα υπάρχει και στη σύγκριση των ΜΜΡs -2 και -9 με αθηροσκλήρωση (p<0,000). Προκειμένου να καταδειχτεί η διαφαινόμενη έντονη έκφραση των ΜΜΡs -2 και -9 και η ελαττωμένη έκφραση έως εξαλείψεως των ΤΙΜΡs -1 και -2 στην ομάδα ασθενών διενεργήθηκε η συσχέτιση του Spearman. Στην ενιαία ομάδα ασθενών η ΜΜΡ-2 σχετιζόταν με τον ΤΙΜΡ-2 αρνητικά στατιστικά σημαντικά (r: -0.427, p<0.01) και η ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 εμφάνιζε πολύ ισχυρή αρνητική συσχέτιση στατιστικά επίσης σημαντική (r: -0.771, p<0.01). H ισχυρή αρνητική συσχέτιση παραμένει στην ομάδα ΔΝ για την ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 (r: -0.738, p<0.01), ενώ στην ομάδα ΣΜΝ ισχυροποιείται περαιτέρω (ΜΜΡ-2 με ΤΙΜΡ-2, r: -0.587, p<0.01) και για την ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 φθάνει να τείνει στη μονάδα, r: -0.842, p<0.01.Όταν στη συσχέτιση αυτή προστίθεται και ο παράγοντας της αθηροσκλήρωσης, οι συσχετίσεις παραμένουν σημαντικές για ΜΜΡ-2/ΤΙΜΡ-2 vs ATHUS (r: -0.496, p<0.01) και για ΜΜΡ-9/ΤΙΜΡ-1 vs ATHUS (r: -0.697, p<0.01). Ακολουθώντας το ζωικό μοντέλο υπερπλασίας του έσω χιτώνα, της στένωσης και απόφραξης της AVF, όπου φάνηκε αυξημένη έκφραση των ΜΜΡs -2 και -9 στο σημείο της στένωσης, ενώ ο ΤΙΜΡ-1 έχει μειωμένη έκφραση (δρα προστατευτικά στην αθηροσκλήρωση), ανάλογο μοντέλο προτάσσεται και στον άνθρωπο, σύμφωνα και με την παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματα της παρούσας ανοσοϊστοχημικής μελέτης σε 66 ασθενείς εμφανίζουν την έκφραση των ΜΜΡs -2 και –9 στην κερκιδική αρτηρία χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-ΜΜΡ-2 και αντι-ΜΜΡ-9 αντισώματα. Έτσι αποδείχθηκε σε ασθενείς με τύπου 2 ΔΝ η πάνω από 3 φορές υπερέκφραση της ΜΜΡ-2 με κυτταροπλασματική θετικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων, των λείων μυικών κυττάρων και των ινοβλαστών. Η έκφραση ήταν έως τρεις φορές πιο έντονη από την ΜΜΡ-2 όσον αφορά την ΜΜΡ-9. Η ενεργότητα και η έκφραση των ΜΜΡs -2 και –9 στα αρτηριακά τοιχώματα και στα τοιχώματα των αρτηριοποιημένων φλεβών μπορεί να οδηγήσει σε δομικές αλλαγές της σύνθεσης της ECM (κολλαγόνες ίνες), η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση της διαμέτρου των αρτηριοποιημένων φλεβών, με απώτερο αποτέλεσμα την θρόμβωση της AVF ή την αδυναμία ωρίμανσής της.Στους 33 ασθενείς της παρούσας μελέτης με ΔΝ, 21 εμφάνιζαν έντονη απόπτωση της ενδοθηλιακής στιβάδας και διάσπαρτα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα ενδοθηλιακά αυτά κύτταρα εμφάνιζαν πιο έντονη έκφραση των MMPs και ιδίως της ΜΜΡ-9, ενώ δεν φάνηκε έκφραση του ΤΙΜΡ-1. Οι υπόλοιποι 12 ασθενείς με ΔΝ εμφάνιζαν μέτρια απόπτωση με διαστήματα απογύμνωσης της ενδοθηλιακής στοιβάδας. Σε 7 από τους 33 ασθενείς με ΔΝ, των οποίων η φίστουλα θρομβώθηκε εντός εξαμήνου, καθώς και σε άλλους 3, των οποίων η φίστουλα δεν ωρίμασε ποτέ, η εξαιρετικά έντονη έκφραση της ΜΜΡ-9 στα εναπομείναντα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα λεία μυϊκά κύτταρα και στους ινοβλάστες συνοδευόταν από παντελή έλλειψη έκφρασης του ΤΙΜΡ-1 και στους τρεις τύπους αγγειακών κυττάρων.Από τους 33 ασθενείς με ΣΜΝ, 13 εμφάνιζαν έντονη απόπτωση της ενδοθηλιακής στιβάδας, ενώ 5 εμφάνιζαν τμηματική απογύμνωσή της.Από όλα τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι:Τα αυξημένα επίπεδα των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον ορό συνδέονται με την αιτιοπαθογένεια της λευκωματουρίας και η αύξησή τους έχει επίσης σχέση με την εξέλιξη της πρωτεϊνουρικής νόσου.Οι ΜΜPs που αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη αποτελούν παράγοντες κινδύνου για την αθηροσκλήρωση, δηλαδή για την αύξηση του ΙΜΤ και της αθηρωματικής πλάκας των καρωτίδων και των μηριαίων αρτηριών, καθώς και για την διαβάθμιση του αθηρωματικού υπερηχογραφικού δείκτη (ATHUS).Οι ΜΜΡs -2 και ΜΜΡ-9 δρουν ευωδοτικά στην παραγωγή των βιομορίων VEGF και TGF-β και ως εκ τούτου συμβάλλουν στην εμφάνιση σκλήρυνσης και ίνωσης που  ακολουθεί τις χρόνιες σπειραματοπάθειες.Οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 συνδέονται με την παθογένεια της διαβητικής νεφροπάθειας, δηλαδή την μεσαγγειακή υπερπλασία, μέσω της αποδόμησης της ECM, της εκφύλισης της ΒΜ των αγγείων και της GBM στο νεφρό, της ενεργοποίησης και απόπτωσης του ενδοθηλίου, την ποδοκυττοπενία και την χρόνια βλάβη του σπειράματος.