Βιοτεχνολογική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης, 2,3-βουτανοδιόλης και αιθανόλης κατά την αύξηση επιλεγμένων προκαρυωτικών στελεχών σε ανανεώσιμες πηγές άνθρακα
Authors: Μετσοβίτη Μαρία 
Published: August 2021

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η ικανότητα 84 βακτηριακών στελεχών να μεταβολίσουντη βιομηχανική γλυκερόλη, κύριο παραπροϊόν της διαδικασίας παραγωγής βιολογικού πετρελαίου(βιοντίζελ), προς παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης (PD), 2,3-βουτανοδιόλης (BD) και αιθανόλης(EtOH), υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Τα εξεταζόμενα στελέχη ανήκουν, πλην ενός(Clοstridium butyricum NRRL B-23495), σε συλλογές του τμήματος Επιστήμης και ΤεχνολογίαςΤροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, είναι φυσικά στελέχη και μελετήθηκαν γιαπρώτη φορά ως προς τη δυνατότητα μεταβολισμού της γλυκερόλης. Στην πλειοψηφία τους έχουναπομονωθεί από τρόφιμα όπως προϊόντα κρέατος, προζύμι και καρπούς σταφυλήςπροσβεβλημένους από τον μύκητα Botrytis sp..Η πειραματική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο στάδια: Αρχικά διενεργήθηκαν ασυνεχείςκαλλιέργειες σε φιάλες, με την καθαρή γλυκερόλη και την γλυκόζη ως συνυποστρώματα σεαναλογία 3:1, είτε υπό αναερόβιες είτε υπό αερόβιες συνθήκες ανάλογα με τις απαιτήσεις σεοξυγόνο του εκάστοτε μικροοργανισμού. Η επιλογή της καθαρής γλυκερόλης έγινε με στόχο τηναποφυγή φαινομένων παρεμπόδισης εξαιτίας προσμίξεων που περιέχονται στην βιομηχανικήγλυκερόλη, ενώ η προσθήκη γλυκόζης στο μέσο της καλλιέργειας κρίθηκε σκόπιμη, καθώς τουπόστρωμα αυτό δύναται να ενισχύσει τη μικροβιακή αύξηση και ως εκ τούτου, ενδεχομένως, ναδιευκολύνει τον μεταβολισμό της γλυκερόλης από τα υπό μελέτη στελέχη. Από τα 84 στελέχη, ανκαι όλα παρουσίασαν κυτταρική αύξηση, μόνο 16 αφομοίωσαν την γλυκερόλη. Σε δεύτερηπροσέγγιση τα 16 αυτά στελέχη αναπτύχθηκαν σε ασυνεχείς καλλιέργειες σε φιάλες με πηγήάνθρακα την βιομηχανική γλυκερόλη. Αφού συνεκτιμήθηκε τόσο η κατανάλωση της γλυκερόληςόσο και η παραγωγή των τριών κύριων μεταβολιτών (1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόλη καιαιθανόλη), επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη τα ακόλουθα τέσσερα στελέχη: Citrobacter freundiiFMCC-B 294 (VK-19), C. freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197 και Enterobacteraerogenes FMCC-10. Σημειώνεται ότι παρά την ικανοποιητική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης απότο στέλεχος Cl. butyricum NRLL B-23495 στο αρχικό στάδιο της πειραματικής διαδικασίας(μέγιστη συγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης 32,2 g/L και συντελεστής απόδοσης παραγόμενης 1,3-προπανοδιόλης ανα καταναλωθείσα γλυκερόλη 0,58 g/g), δεν διενεργήθηκαν περαιτέρω μελέτες μετον εν λόγω μικροοργανισμό, δεδομένου ότι τα αποτελέσματα αυτών των καλλιεργειώναποτέλεσαν τη βάση σύγκρισης για την κατανάλωση γλυκερόλης και παραγωγή 1,3-προπανοδιόληςμε τα υπόλοιπα στελέχη.Στο δεύτερο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας διερευνήθηκαν καλλιέργειες τωντεσσάρων στελεχών, σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Μελετήθηκε ηεπίδραση διαφορετικών τύπων ακατέργαστης γλυκερόλης, η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος, καθώς και των συνθηκών καλλιέργειας (συνθήκες pH,αεροβίωση/αναεροβίωση, τρόπος επίτευξης αναεροβίωσης), στην αύξηση και την παραγωγήμεταβολικών προϊόντων. Και τα τέσσερα στελέχη μεταβόλισαν σημαντικές ποσότητες γλυκερόλης,με μέγιστη συγκέντρωση καταναλωθέντος υποστρώματος ~217,0 g/L, στην ημι-συνεχήκαλλιέργεια του στελέχους E. aerogenes FMCC-10, υπό αερόβιες συνθήκες. Η μέγιστησυγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης (PDmax) 68,1 g/L, σημειώθηκε σε αναερόβια ημι-συνεχήκαλλιέργεια του στελέχους C. freundii FMCC-B 294 (VK-19), με τον αντίστοιχο συντελεστήαπόδοσης παραγόμενης 1,3-προπανοδιόλης ανά καταταλωθείσα γλυκερόλη (YPD/Gly) να λαμβάνειτιμή YPD/Gly=0,40 g/g και η παραγωγικότητα 0,79 g/L/h. Παράλληλα σημαντική ποσότητα τηςδιόλης (50,1 g/L) σχηματίστηκε κατά την ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια του στελέχουςK. oxytoca FMCC-197, υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Και οι δύο τιμέςαποτελούν τις μέγιστες συγκεντρώσεις της διεθνούς βιβλιογραφίας για παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης από φυσικά στελέχη για τα συγκεκριμένα είδη και συγκαταλέγονται στιςυψηλότερες τιμές παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης από βιομηχανική γλυκερόλη. Με βάση τα όσαείμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιείται αύξηση του είδους K.oxytoca σε ακατέργαστη γλυκερόλη.Αναφορικά με την μέγιστη συγκέντρωση 2,3-βουτανοδιόλης (BDmax) σε υπόστρωμαακατέργαστης γλυκερόλης, που ήταν 78,2 g/L, καταγράφηκε κατά την αύξηση του στελέχους E.aerogenes FMCC-10 σε ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια υπό αερόβιες συνθήκες. Στην ενλόγω καλλιέργεια εφαρμόστηκε η τεχνική του διακυμαινόμενου pH, σύμφωνα με την οποία μετάαπό κάθε ανατροφοδότηση, το pH αυξάνονταν στην τιμή 7,0 και στη συνέχεια έμενε μη σταθερό,συνδυάζοντας έτσι δύο παραμέτρους που βρέθηκε ότι επηρεάζουν την παραγωγή της 2,3-βουτανοδιόλης. Αφενός μεν ήταν μη-ελεγχόμενο σε ελαφρώς όξινο εύρος pH, γεγονός απαραίτητογια την σύνθεση της διόλης, αφετέρου δε, δεν ξεπέρασε μια κατώτατη τιμή pH που είναιπαρεμποδιστική για τον μεταβολισμό της γλυκερόλης. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά πουμελετήθηκε η παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης ως το κύριο προϊόν ζύμωσης από ακατέργαστηγλυκερόλη, καθώς το υπόστρωμα αυτό έχει συνδεθεί στενά με την προπανοδιολική ζύμωση, κατάτην οποία η 2,3-βουτανοδιόλη αποτελεί παραπροϊόν της ζύμωσης και παράγεται σε αρκετάμικρότερες ποσότητες. ς εκ τούτου, η τιμή αυτή αποτελεί την μέγιστη της διεθνούς βιβλιογραφίαςπου έχει αναφερθεί τόσο σε υπόστρωμα καθαρής όσο και βιομηχανικής γλυκερόλης. Συγχρόνως,αποτελεί ενδιαφέρο εύρημα η σύνθεση του μεταβολίτη από γλυκερόλη υπό αερόβιες συνθήκες,δεδομένου ότι ο μεταβολισμός της γλυκερόλης τελείται, κατά κύριο λόγο, υπό αναερόβιεςσυνθήκες.Ιδιαίτερα υψηλή ήταν και η μέγιστη παραγόμενη ποσότητα αιθανόλης (EtOHmax) απόβιομηχανική γλυκερόλη, που ήταν 33,4 g/L και σημειώθηκε στην καλλιέργεια του στελέχους C. freundii FMCC-207, κατά την αύξηση του σε αναερόβια ημι-συνεχή τροφοδοτούμενη καλλιέργεια.Η συγκέντρωση αυτή αποτελεί, μέχρι στιγμής, την υψηλότερη τιμή της διεθνούς βιβλιογραφίαςτόσο από φυσικά όσο και από ανασυνδυασμένα στελέχη, κατά την καλλιέργεια τους σευποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Εξίσου υψηλές ποσότητες σχηματίστηκαν καιστις ημι-συνεχείς καλλιέργειες των στελεχών K. oxytoca FMCC-197 και E. aerogenes FMCC-10(25,2 και 20,9 g/L, αντίστοιχα).Τέλος, μια ακόμη παράμετρος που εξετάστηκε ήταν η εφαρμογή των μη-ασηπτικώνσυνθηκών καλλιέργειας στην αφομοίωση της γλυκερόλης και στην σύνθεση μεταβολικώνπροϊόντων, κατά την διενέργεια ασυνεχών και ημι-συνεχών τροφοδοτούμενων καλλιεργειών. Σεόλες τις περιπτώσεις, η απουσία στείρων συνθηκών αποδείχθηκε ότι δεν έχει σημαντική επίδρασηστον μεταβολισμό της γλυκερόλης και από τα τέσσερα εξεταζόμενα στελέχη, ωστόσο σημειώθηκεμικρή μείωση στην τελική συγκέντρωση των παραγόμενων μεταβολικών προϊόντων, συγκριτικά μετις αντίστοιχες καλλιέργειες σε στείρες συνθήκες. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι ηαπουσία ασηπτικών συνθηκών καλλιέργειας μπορεί να αποτελέσει μια ενδιαφέρουσα παράμετρογια την αξιοποίηση της ακάθαρτης γλυκερόλης προς προϊόντα υψηλότερη αξίας σε βιομηχανικόεπίπεδο, καθώς η εφαρμογή των μη-ασηπτικών συνθηκών ελαχιστοποιεί το κόστος ενέργειας γιατην αποστείρωση, αλλά και το συνολικό κόστος για τον εξοπλισμό. Μαζί με την αξιοποίηση τηςχαμηλού κόστους ακατέργαστής γλυκερόλης ως υπόστρωμα, αυτή η εφαρμογή θα βοηθήσει τηνμικροβιακή μετατροπή της ακατέργαστης γλυκερόλης προς 1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόληκαι αιθανόλη ώστε να γίνει μια οικονομικά ανταγωνιστική βιολογική διεργασία.