Προσδιορισμός της φυλογενετικής και μεταβολικής ποικιλομορφίας μικροβιακών κοινοτήτων που συμμετέχουν στην αποδόμηση αποβλήτων βιομηχανιών μεταποίησης αγροτικών προϊόντων
Authors: Ζέρβα Ιωάννα 
Published: November 2021

Η πραγματοποίηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής βασίστηκε στη διεξοδική διερεύνηση της φυλογενετικής και μεταβολικής ποικιλομορφίας των μικροβιακών κοινοτήτων που συμμετέχουν στην αποδόμηση αποβλήτων μεταποίησης αγροτικών προϊόντων, τόσο σε ανεπεξέργαστα απόβλητα ή σε απόβλητα που έχουν υποστεί αυθόρμητη ζύμωση, όσο και κατά τη βιολογική επεξεργασία αυτών σε βιοαντιδραστήρες ακινητοποιημένης βιομάζας. Η διερεύνηση αυτή εστιάστηκε σε υγρά απόβλητα και υπολείμματα των κυριότερων διεργασιών μεταποίησης του αγροτοβιομηχανικού τομέα, ήτοι απόβλητα χυμοποίησης πορτοκαλιών, τη μεταποίηση πιπεριάς και απόβλητα που προκύπτουν από την παρασκευή τουρσιού (κάπαρης). Η διερεύνηση των μικροβιακών κοινοτήτων διεξήχθη μέσω σύγχρονων τεχνικών μαζικής αλληλούχισης, αλλά και μέσω απομόνωσης νέων στελεχών μικροοργανισμών βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, για την αξιοποίηση αυτών τόσο στην ενζυμική τεχνολογία και στην βιομηχανία τροφίμων και ποτών, όσο και στην αποδόμηση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Η εκτίμηση της υδρολυτικής ενεργότητας τόσο της μικτής βιομάζας, όσο και των απομονωμένων στελεχών μικροοργανισμών, μέσω προσδιορισμού της ενεργότητας των κυριότερων ενζύμων που εμπλέκονται στην αποδόμηση αγροτοβιομηχανικών υγρών αποβλήτων και υπολειμμάτων, επέτρεψε την αξιολόγηση της διαδικασίας βιοδιάσπασης των σύνθετων βιομορίων που περιλαμβάνονται στα απόβλητα της κατηγορίας αυτής. Για πρώτη φορά, τέθηκαν προς επεξεργασία σε βιολογικό σύστημα υγρά απόβλητα από τη μεταποίηση πιπεριάς, επετεύχθη δε αποτελεσματική αποδόμηση πραγματικού υγρού αποβλήτου που παρήχθη από τη μεταποίηση κάπαρης υπό υπερύαλες συνθήκες, δηλαδή υπό αλατότητα που υπερέβαινε το 10% w/v, και εκτενή πειραματική περίοδο. Επιπλέον, για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε ευρείας κλίμακας προσδιορισμός της υδρολυτικής ενεργότητας, και δη της μεταβολικής δραστηριότητας, αυτόχθονων μικροβιακών κοινοτήτων που εμβιούν σε απόβλητα που προκύπτουν από τη χυμοποίηση πορτοκαλιών. Η διδακτορική αυτή διατριβή εστίασε τόσο στις κοινότητες βακτηρίων, όσο και στις κοινότητες μυκήτων, και στο υδρολυτικό δυναμικό αυτών, για να αξιολογήσει σφαιρικά τις βιολογικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την αποδόμηση των κυριότερων αγροτοβιομηχανικών υπολειμμάτων. Η διδακτορική αυτή διατριβή, εκτός του θεωρητικού μέρους και της αναλυτικής περιγραφής των μεθόδων και τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν, περιλαμβάνει πέντε κεφάλαια αποτελεσμάτων με τη συζήτηση αυτών, ενώ το τελευταίο κεφάλαιο εστιάζει στη συνδυαστική αξιολόγηση και ανάδειξη των ευρημάτων αυτής. Αν και τα υγρά απόβλητα, τα οποία προέρχονται από την επεξεργασία της κάπαρης χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα υψηλή συγκέντρωση άλατος και οργανικών ενώσεων, εντούτοις, δεν υπάρχει στη διεθνή βιβλιογραφία έρευνα σχετικά με την επεξεργασία τους. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε αντιδραστήρας ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος λειτούργησε υπό υπερύαλες συνθήκες (100 g/L NaCl). Το υδρολυτικό δυναμικό της ακινητοποιημένης βιομάζας αξιολογήθηκε με τον προσδιορισμό της ενεργότητας των ενζύμων γλυκανάση, ξυλανάση, γλυκοσιδάση, λιπάση και πρωτεάση, οι οποίες επηρεάστηκαν αρνητικά σε συγκέντρωσεις άλατος μεγαλύτερες των 20 g/L. Οι ενεργότητες των ενζύμων εξω-1,4-β-γλυκανάση και β-1,4-ξυλοσιδάση, ακόμη και υπό αλατότητα 10% w/v, ήταν υψηλότερες από 265 ± 6,4 και 61,7 ± 2,7 U/g πρωτεΐνης, αντίστοιχα, η δε υψηλή συσχέτιση των ενεργοτήτων εξω-ξυλανασών και έξω-γλυκανασών (r=0,821, p<0,01) ανέδειξε την ενεργή συμμετοχή τους στην αποδόμηση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης. Με την αύξηση της αλατότητας, παρατηρήθηκε διαδοχή μη αλοανθεκτικών βακτηρίων από ελαφρώς αλοανθεκτικά στελέχη των γενών Defluviimonas, Amaricoccus, Formosa και Muricauda, και εν συνεχεία από τα μετρίως/εξαιρετικά αλόφιλα γένη Halomonas, Roseovarius και Idiomarina. Στο ίδιο χρονικό διάστημα, παρατηρήθηκε αισθητή μείωση στους προσδιοριζόμενους δείκτες ποικιλότητας. Βάσει συσχετίσεων της αφθονίας των γενών που ανιχνεύτηκαν, σχηματίστηκε ένα διακριτό δίκτυο υπό υπερύαλες συνθήκες, αποτελούμενο από τα αλόφιλα γένη Halomonas, Idiomarina, Saliterribacillus και Gracilibacillus. Στην υψηλότερη αλατότητα και οργανική φόρτιση που εξετάστηκε, εξαιρετικά αλοανθεκτικά/αλόφιλα βακτήρια αποτέλεσαν τους κύριους αποδομητές του οργανικού κλάσματος του υγρού αποβλήτου μεταποίησης κάπαρης. Επιπλέον, διερευνήθηκε η απόδοση βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος επεξεργάστηκε υγρό απόβλητο μεταποίησης πιπεριάς, υπό οργανική φόρτιση 0,31 ± 0,01 και 0,70 ± 0,01 g COD/L.d, επιτυγχάνοντας υψηλές απομακρύνσεις COD που προσέγγιζαν το 90%. Ζύμες του γένους Candida, φυτοπαθογόνοι μικροοργανισμοί της πιπεριάς και γαλακτικά βακτήρια των γενών Lactococcus, Weissella, Limosilactobacillus και Streptococcus κυριάρχησαν στο ανεπεξέργαστο υγρό απόβλητο. Στην ακινητοποιημένη βιομάζα του βιοαντιδραστήρα προσδιορίστηκε η ενεργότητα έξι υδρολυτικών ενζύμων, με τη δραστηριότητα της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης και της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης να αυξάνει στη μεγαλύτερη οργανική φόρτιση, υποδεικνύοντας την ικανότητα του συστήματος για αυξημένη παραγωγή κυτταρινολυτικών και ξυλανολυτικών ενζύμων. Η ενεργότητα της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης υπό οργανική φόρτιση 0,70 ± 0,01 g COD/L.d υπερέβαινε τα 5.600 U/g πρωτεΐνης, η δε ενεργότητα της ενδο-1,4-β-γλυκανάσης προσέγγισε τα 1.400 U/g πρωτεΐνης. Η αύξηση της οργανικής φόρτισης οδήγησε σε μείωση της σχετικής αφθονίας των γενών Pirellula, Nakamurella, Nitrospira και Planctomyces, και σε αντίστοιχη αύξηση της αφθονίας των γενών Gemmata, Nitrosospira και Chitinophaga (p<0,01 ή p<0,05), ευνοώντας κυρίως ομάδες μικροοργανισμών με κυτταρινολυτική δράση. Καταγράφηκε επίσης αύξηση της σχετικής αφθονίας του γένους Nitrosospira έναντι αυτής του γένους Nitrospira. Στην περίπτωση των κοινοτήτων μυκήτων, επικράτησαν στελέχη του γένους Rhizopus, ακολουθούμενα από στελέχη των γενών Paramicrosporidium και Candida. Οι δείκτες ποικιλότητας Shannon και Simpson αυξήθηκαν με την αύξηση του ρυθμού οργανικής φόρτισης (p<0,05), υποδεικνύοντας τη μεγαλύτερη σταθερότητα του συστήματος υπό αυξημένη οργανική φόρτιση. Η εύρεση του δικτύου συσχέτισης ανέδειξε την ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ στελεχών των γενών Pirellula, Plactomyces και Blastopirellula. Επιπλέον, προσδιορίστηκε υψηλή δραστηριότητα ενδο-1,4-β-ξυλανάσης, πλέον των 100 U/mg πρωτεΐνης, από στελέχη των γενών Nocardia και Gordonia που απομονώθηκαν από τον βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας. Επίσης, το στέλεχος βακτηρίου GP5, το οποίο απομονώθηκε από την ακινητοποιημένη βιομάζα του ίδιου συστήματος, παρουσίασε μικρή φυλογενετική συσχέτιση με το είδος Oleiharenicola lentus (96,7%), γεγονός που υποδεικνύει ότι αποτελεί καινούργιο είδος εντός της οικογένειας Opitutaceae.Επίσης, εξετάστηκε υγρό απόβλητο χυμοποίησης πορτοκαλιών, το οποίο υπέστη αυθόρμητη ζύμωση με σκοπό τον προσδιορισμό της διαδοχής των μικροβιακών κοινοτήτων και την απομόνωση νέων αυτόχθονων πηκτινολυτικών μικροβιακών στελεχών. Λόγω προσθήκης Ca(OH)2, το αρχικό υγρό απόβλητο είχε αλκαλικό pH και χαμηλές συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος, αιθανόλης και πτητικών λιπαρών οξέων. Η αυθόρμητη ζύμωση του υγρού αποβλήτου χυμοποίησης πορτοκαλιών προκάλεσε δραστική μείωση της σχετικής αφθονίας του γένους Hanseniaspora και σημαντική ενίσχυση του είδους Ρichia fermentans, η οποία ανήλθε στο υψηλό ποσοστό 75,40 ± 2,34%, ακολουθούμενο από μέλη του γένους Saccharomyces, με σχετική αφθονία 23,38 ± 2,18%. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, παρατηρήθηκε, επίσης σημαντική μείωση στη σχετική αφθονία των ομοζυμωτικών αερόκοκκων, καθώς και ενίσχυση της σχετικής αφθονίας ετεροζυμωτικών στελεχών των γενών Leuconostoc και Lactobacillus, ενώ σημαντική παρουσία εντερόκοκκων καταγράφηκε καθ΄ όλη τη διάρκεια της ζύμωσης. Αναφορικά με τους οικολογικούς δείκτες, σημειώθηκε αντίθετη τάση στην ποικιλότητα του πληθυσμού των βακτηρίων σε σχέση με τη δομή της κοινότητας των μυκήτων. Η εξέταση της β-ποικιλότητας αποκάλυψε τον κυρίαρχο ρόλο των στελεχών του γένους Pichia κατά τη διαδικασία της ζύμωσης. Στελέχη του είδους P. fermentans που ήταν κυρίαρχα στο ζυμωμένο υγρό απόβλητο χυμοποίησης, αναδείχθηκαν ως οι πλέον ικανοί πηκτινολυτικοί μικροοργανισμοί, με την ενεργότητα ορισμένων στελεχών αυτού να υπερβαίνει τα 20 U/mg πρωτεΐνης. Η υδρόλυση της πηκτίνης, η ζύμωση των υδατανθράκων προς παραγωγή αιθανόλης, γαλακτικού οξέος και οξικού, καθώς και η ζύμωση του κιτρικού οξέος, αποτέλεσαν τους κύριους παράγοντες, οι οποίοι επηρέασαν τη δομή της μικροβιακής κοινότητας των υγρών αποβλήτων χυμοποίησης πορτοκαλιών. Διερευνήθηκε, ακόμη, η ποικιλότητα και το ξυλανολυτικό δυναμικό του μικροβιακού πληθυσμού αποβλήτων χυμοποίησης πορτοκαλιών. Η ενεργότητα της ενδο-1,4-β-ξυλανάσης ήταν υψηλότερη στο προϊόν κυτταρικής λύσης, γεγονός που υποδεικνύει ότι συνδεδεμένες περιφερειακά των κυττάρων ξυλανάσες ήταν υπεύθυνες για την υδρόλυση των ημικυτταρινούχων συστατικών. Μέσω εμπλουτισμού κατέστη εφικτή η απομόνωση ξυλανολυτικών στελεχών βακτηρίων που παρουσίαζαν ενεργότητες που προσέγγιζαν ακόμη και τα 280 U/mg πρωτεΐνης, με τα πλέον αποτελεσματικά ξυλανολυτικά στελέχη βακτηρίων να σχετίζονται φυλογενετικά με τα είδη Pseudomonas psychrotolerans και P. oryzihabitans (φυλογενετική ομοιότητα μεγαλύτερη από 99,8%). Ανάλυση του μικροβιακού πληθυσμού ανέδειξε την επικράτηση γαλακτικών και οξικών βακτηρίων, καθώς και ζυμών των γενών Hanseniaspora και Zygosaccharomyces. Ειδικότερα, στελέχη των γενών Lactobacillus και Acetobacter αντιπροσώπευαν το 74,19% και το 25,52% της συνολικής αφθονίας των βακτηρίων, αντίστοιχα, ενώ στην περίπτωση του πληθυσμού των μυκήτων, τα γένη Hanseniaspora και Zygosaccharomyces αντιστοιχούσαν στο 59,66% και το 21,97% των συνολικών αλληλουχιών που αναλύθηκαν. Στη διεθνή βιβλιογραφία αυτή αποτελεί την πρώτη αναφορά αυτόχθονων ξυλανολυτικών μικροοργανισμών απομονωμένων από απόβλητα χυμοποίησης πορτοκαλιών, παρουσιάζοντας το βιοτεχνολογικό δυναμικό που επιτρέπει την αξιοποίηση υπολειμμάτων πορτοκαλιών για παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας.Κυτταρινολυτικά ένζυμα χρησιμοποιούνται κατά την αποφλοίωση των φρούτων στη βιομηχανία επεξεργασίας και παραγωγής χυμών πορτοκαλιού. Συνολικά, απομονώθηκαν 24 μικροβιακά στελέχη από υπολείμματα χυμοποίησης πορτοκαλιών, τα οποία εξετάστηκαν ως προς την κυτταρινολυτική τους δραστηριότητα, μέσω προσδιορισμού των ενεργοτήτων των ενζύμων ενδο-1,4-β-γλυκανάση, εξω-1,4-β-γλυκανάση και β-γλυκοσιδάση. Ειδικότερα, οι ενεργότητες αυτών προσέγγισαν ακόμη και τα 4, 11 και 11 U/mg πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Όλα τα κυτταρινολυτικά στελέχη που ανιχνεύτηκαν ανήκαν στο γένος Paenibacillus. Ως προς την κυτταρινολυτική δραστηριότητα του υπολείμματος χυμοποίησης πορτοκαλιών, προσδιορίστηκε στο εκχύλισμα αυτού ενεργότητα ενδο-1,4-β-γλυκανάσης ίση με 4,00 ± 0,11 U/g, καταγράφηκαν δε ενεργότητες εξω-1,4-β-γλυκανάσης και β-γλυκοσιδάσης, ίσες με 2,60 ± 0,19 U/g και 5,69 ± 0,23 U/g, αντίστοιχα. Συμπερασματικά, όπως προκύπτει από τα παραπάνω πρωτότυπα αποτελέσματα, τα αγροτοβιομηχανικά υγρά απόβλητα και υπολείμματα αποτελούν πηγή καινούργιων μικροοργανισμών με ποικίλες εφαρμογές στην περιβαλλοντική τεχνολογία και στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών. Τέλος, στη διδακτορική αυτή διατριβή αναπτύχθηκαν αποτελεσματικές τεχνολογίες που στόχευσαν στη βιολογική αποδόμηση των κυριότερων αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, που παράγονται τόσο στη χώρα μας όσο και παγκοσμίως.