Ανοσογενετική ανάλυση του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με αλληλούχηση υψηλής απόδοσης
Authors: Σταλίκα Ευαγγελία 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Οι λεμφοϋπερπλασίες CD3+CD8+CD57+ μεγάλων Τ λεμφοκυττάρων με κοκκία (T-LGL) αναπτύσσονται σε ευρύ νοσολογικό ετερογενές φάσμα διαφόρων κλινικών οντοτήτων και χαρακτηρίζονται από επικάλυψη κλινικών συμπτωμάτων αλλά και εργαστηριακών ευρημάτων. Η ανοσογενετική ανάλυση των γονιδίων της β αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων των οντοτήτων αυτών αναδεικνύει ενδείξεις περί αντιγονικής εμπλοκής στην οντογένεση και πιθανώς εξέλιξη της νόσου. Σκοπός: Οι εγγενείς αδυναμίες της αλληλούχησης χαμηλής κλίμακας δεν μας επέτρεπαν την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων σχετικά με την παθογένεια των οντοτήτων. Η εφαρμογή μεθόδων αλληλούχησης υψηλής απόδοσης προσφέρει μία πληρέστερη εικόνα του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα που θα ανασκευάσει τις απόψεις περί της σύστασης των άνοσων αποκρίσεων. Παρόλα αυτά, η έλλειψη προτυποιημένης πειραματικής διαδικασίας αλλά και βιοπληροφορικής ανάλυσης ειδικής για ανοσογενετικά δεδομένα δεν εξασφαλίζουν την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων μας και την οριστική εξαγωγή συμπερασμάτων. Υλικά και μέθοδοι: Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η προτυποποίηση της πειραματικής προσέγγισης αλλά και της βιοπληροφορικής ανάλυσης ανοσογενετικών δεδομένων τα οποία προκύπτουν με μεθόδους αλληλούχησης επόμενης γενιάς. Το προτυποποιημένο πειραματικό πρωτόκολλο εφαρμόσθηκε στη συνέχεια σε δείγματα (i) πατέρα και υιού με οικογενή T-LGL λευχαιμία (ii) ενός ασθενή με Ph+ALL που ανέπτυξε T-LGL λευχαιμία από τα κύτταρα του δότη μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (allo-HCT) και σε (iii) σε ασθενείς με Χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία (CIN), προκειμένου να αναζητηθούν περαιτέρω ανοσογενετικές μοριακές ενδείξεις για το ρόλο της επιλογής από αντιγόνο στις T-LGL λεμφοϋπερπλασίες. Αναδιατάξεις TRBV-TRBD-TRDJ ενισχύθηκαν από γενωμικό DNA ή/και cDNA με το πρωτόκολλο Biomed-2. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε paired-end πρωτόκολλο NGS (MiSeq Illumina). Η επεξεργασία των αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε με εξειδικευμένο αλγόριθμο βιοπληροφορικής που περιλάμβανε: (i) ποιοτικά φίλτρα, (ii) σύνθεση των paired-end αλληλουχιών, (iii) προετοιμασία των συντεθειμένων αλληλουχιών για το εργαλείο IMGT/HighV-QUEST, και (iv) ομαδοποίηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων.Αποτελέσματα: Η ανάλυση των δεδομένων και στις τρεις περιπτώσεις κλινικών οντοτήτων επιβεβαιώνει : (i.) την επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου, (ii.) την παρουσία δημόσιων κλωνότυπων και (iii.) τη διαχρονική παραμονή των εκπτυγμένων κλωνότυπων, δεδομένα που υπαινίσσονται ισχυρά επιλογή από περιορισμένο αριθμό αντιγόνων στην ανάπτυξη και πιθανώς εξέλιξη της T-LGL ανά περίπτωση. Συμπεράσματα: Τα όρια μεταξύ πολύ-, όλιγο-, μονο-, κλωνικότητας δεν είναι σαφώς οριοθετημένα. Η μετάβαση από μία πολυκλωνική κατάσταση σε μονοκλωνική εξαλλαγή των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων είναι μία δυναμική, πολυπαραγοντική διαδικασία, με το μικροπεριβάλλον να διαδραματίζει βασικό ρόλο. Η ανοσογενετική μελέτη των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με μεθόδους αλληλούχησης υψηλής απόδοσης θα οδηγήσει στην αναθεώρηση των απόψεων περί σύστασης των άνοσων αποκρίσεων και θα προσφέρει ισχυρές ενδείξεις για την εμπλοκή αντιγόνου στη λεμφωματογένεση. Η φύση των αντιγόνων αυτών παραμένει να διευκρινιστεί.