Μελέτη της παθογόνου δράσης των αντιγόνων μεμβράνης του πρωτόζωου L.donovani
Authors: Βογιατζάκη Χρυσάνθη 
Published: September 2021

H λεϊσμανίωση αποτελεί την δεύτερη σε αριθμό κρουσμάτων ασθένεια πρωτοζωικής προέλευσης μετά την ελονοσία και έχει καταταχθεί από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας μεταξύ των έξι σημαντικότερων τροπικών νοσημάτων. Αιτιολογικός παράγοντας του νοσήματος είναι τα είδη των ενδοκυτταρικών πρωτόζωων παρασίτων του γένους Leishmania. Η γνώση των βιοχημικών και αντιγονικών ιδιοτήτων της μεμβράνης της προμαστιγωτής μορφής του παρασίτου Leishmania είναι σημαντική στην μελέτη του τρόπου επιβίωσης του παρασίτου μέσα στα μακροφάγα. Σκοπός της διατριβής αποτελεί η αναζήτηση και ο χαρακτηρισμός των αντιγόνων μεμβράνης του παρασίτου προκειμένου να διαπιστωθεί η συμμετοχή τους στις σχέσεις παρασίτου-ξενιστή, η σημασία τους στην επιβίωση του παρασίτου και η πιθανή χρησιμοποίηση τους στη διάγνωση, στη θεραπεία και την πρόληψη της λεισμανίωσης.Για τον σκοπό αυτό παρασκευάσθηκαν, με τη μέθοδο «κατευθείαν κλωνοποίησης», 30 είδη μονοκλωνικών αντισωμάτων σε ποντίκια BALB/c τα οποία ανοσοποιήθηκαν με κλάσματα της μεμβράνης του παρασίτου L.infantum (μέθοδος χρωματογραφίας ηθμού σε συνθήκες υψηλής πίεσης). Για εκτενέστερη μελέτη επιλέχθηκαν τα μονοκλωνικά αντισώματα Χ2Ι9 (ραδιοανοσολογική δοκιμασία, στερεής φάσης), τα οποία συνδέονται με επίτοπους της επιφάνειας των παρασίτων (έμμεσος ανοφοφθορισμός, ανίχνευση πρωτεϊνών με την μέθοδο ανοσοαποτύπωση σε φύλλα νιτροκυτταρίνης), παρουσιάζουν διασταυρωτή αντίδραση με άλλα είδη λεϊσμανιών και ανήκουν στην τάξη IgG1 (ανοσοενζυμική δοκιμασία, μέθοδος LAB). Mε τη χρησιμοποίηση στήλης ανοσοσυγγένειας, στην οποία συνδέθηκαν τα μονοκλωνικά αντισώματα Χ2Ι9 απομονώθηκε από τη μεμβράνη του παρασίτου μία γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους 78-kDa (πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7-17%, SDS-PAGE ανάλυση) που ταυτίζεται με την τρανσφερρίνη του ανθρώπου (σιδηροπρωτεΐνη, κοινοί αντιγονικοί επίτοκοι). Ο έλεγχος της ανταγωνιστικής πρόσδεσης και ανάλυση κατά Scatchard της τρανφερρίνης σε αμαστιγωτές μορφές (ελήφθησαν από δερματικές αλλοιώσεις ποντικών μολυσμένων με L.mexicana amanzoniensis) και σε προμαστιγωτές μορφές του παρασίτου (L.infantum) ανέδειξε την ύπαρξη ειδικών θέσεων σύνδεσης της τρανσφερρίνης στη μεμβράνη του παρασίτου, υψηλής συγγένειας (Kd=2.2X10-8 M ) ανάλογης με την υψηλή συγγένεια του αντίστοιχου υποδοχέα τρανφερρίνης του ανθρώπου. Ακολούθως απομονώθηκε ο υποδοχέας τρανφερρίνης στη λεϊσμάνια με χρωματογραφία συγγένειας από μεμβράνες προμαστιγωτών L.infantum. Πρόκειται για μία γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους 70kDa η οποία στερείται δισουλφιδικών δεσμών. Η μονομερής δομή του υποδοχέα επιβεβαιώθηκε με χρωματογραφία μοριακού ηθμού υψηλής πίεσης, αποτέλεσμα που υποδεικνύει την δομική διαφορά με το αντίστοιχο διμερές μόριο-υποδοχέα των κυττάρων των θηλαστικών μοριακού βάρους 170-200kDa. Επίσης με τη χρησιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων και πολυκλωνικών αντισωμάτων που παρασκευάσθηκαν στο εργαστήριο κατά του υποδοχέα τρανφερρίνης του ανθρώπου και του αντίστοιχου υποδοχέα στη λεϊσμάνια δεν ανιχνεύθηκε αντιγονική συγγένεια μεταξύ των δύο μορίων (ραδιοανοσολογική δοκιμασία στερεής φάσης, έμμεσος ανοφοφθορισμός, ανοσοαποτύπωση σε φύλλα νιτροκυτταρίνης).Ανάλυση κατά Northern RNA των προμαστιγωτών L.infantum με χρησιμοποίηση του συμπληρωματικού DNA κλώνου TRF-2 του υποδοχέα τρανσφερρίνης του ποντικού, δεν ανέδειξε ομολογία μεταξύ των δύο γονιδίων. Πειράματα παρεμπόδισης της πρόσληψης του σιδήρου (χηλωτές σιδήρου) από τις προμαστιγωτές μορφές L.infantum και L.major έδειξαν αναστολή της ανάπτυξης των παρασίτων, αυξημένη θνησιμότητα αυτών και αυξημένη έκφραση του υποδοχέα τρανφερρίνης.Η διαπίστωση της ύπαρξης υποδοχέων τρανφερρίνης στην μεμβράνη της λεϊσμάνιας, ιδιότητα που χαρακτηρίζει τα εξελιγμένα κύτταρα των θηλαστικών, η απομόνωση του υποδοχέα της τρανσφερρίνης στη λεϊσμάνια, ο βιοχημικός και ανοσολογικός χαρακτηρισμός του μορίου καθώς και η διερεύνηση της λειτουργικής και δομικής ομοιότητάς του με τον αντίστοιχο υποδοχέα στα κύτταρα των θηλαστικών πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά διεθνώς κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής.