Ανάπτυξη εμπεδησιομετρικών βιοαισθητήρων σε επιφάνειες τιτανίου και χρυσού για την άμεση παρακολούθηση της σύζευξης βιομορίων και την ανίχνευση salmonella typhimurium σε πραγματικά δείγματα
Authors: Μαντζίλα Αικατερίνη 
Published: January 2014

1ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφονται τα πλεονεκτήματα και οι περιορισμοί στη χρήση εμπεδησιομετρικών αισθητήρων που βασίζονται σε ανοδιωμένα ηλεκτρόδια του τύπου Ti/TiΟₓΗᵧ. Οι στιβάδες οξειδίου του τιτανίου (Ti/TiΟₓΗᵧ) αναπτύχθηκαν ποτενσιοστατικά σε ηλεκτρόδια τιτανίου διαμέτρου 2 mm σε 1 Μ H₂SO₄ με εφαρμογή ηλεκτρικής τάσης (στη συνέχεια αναφέρεται ως δυναμικό σχηματισμού, forming potential) 10,0 και 30,0 V. Το πάχος των στιβάδων του οξειδίου μετρήθηκε με ελλειψομετρία και βρέθηκε περίπου 30 και 86 nm αντίστοιχα. Σύμφωνα, με μετρήσεις φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης, κάτω από συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες, οι στιβάδες παρουσίασαν διηλεκτρική συμπεριφορά με αντιστάσεις μεταφοράς φορτίου στην κλίμακα των ΜΩ. Σε χαμηλές τιμές δυναμικού σχηματισμού (<10 V ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl/3 M KCl), η ανοδίωση οδήγησε στην ανάπτυξη άμορφου TiO₂, ενώ σε υψηλότερες τιμές δυναμικών (>25 V ως προς αντισταθμιστικό ηλεκτρόδιο Pt) αναπτύχθηκαν κυρίως κρυσταλλικές μορφές ανατάση. Οι εικόνες μικροσκοπίας σάρωσης ηλεκτρονίων (SEM) έδειξαν ότι οι στιβάδες του οξειδίου είναι σχετικά λείες, συμπαγείς, χωρίς σοβαρές ρωγμές. Στη συνέχεια έγινε περαιτέρω κατεργασία των οξειδίων με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (χημική εγχάραξη) με σκοπό την αύξηση του πληθυσμού των ελεύθερων ομάδων υδροξυλίου στην εξωτερική τους επιφάνεια. Η τροποποίηση της επιφάνειας των ηλεκτροδίων Ti/TiΟₓΗᵧ με άμινο ομάδες έγινε με σιλανοποίηση υγρής και αέριας φάσης χρησιμοποιώντας γ-αμινοπροπυλοτριμεαιθοξυσιλάνιο, ενώ η ακινητοποίηση της πρωτεΐνης αβιδίνης έγινε μέσω διασταυρούμενης σύνδεσης με γλουταραλδεΰδη. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένη δεξτράνη ως αναλύτη. Η αρχική αγωγιμότητα των ηλεκτροδίων τιτανίου/οξειδίου τιτανίου (η οποία εξαρτάται από το μέσο και τη διάρκεια της χημικής εγχάραξης) καθώς και η ποιότητα των στιβάδων του σιλανίου βρέθηκαν ότι επηρεάζουν καθοριστικά τη λειτουργία των βιοαισθητήρων. Με την παρούσα μελέτη και μετρήσεις φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης προέκυψαν σημαντικές πληροφορίες για το μηχανισμό ανάπτυξης του μετρούμενου σήματος και τους φυσικούς παράγοντες που ελέγχουν τη φύση και το μέγεθος αυτού. 2ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφεται η ανάπτυξη ενός ανοσοαισθητήρα για την άμεση ανίχνευση της σύζευξης μεταξύ ενός συνθετικού πεπτιδίου και του ειδικού του αντισώματος. Το πεπτίδιο τροποποιήθηκε με κυστεΐνη (εισαγωγή -SH για την πρόσδεσή του σε επιφάνεια χρυσού) και αντιστοιχεί στον επίτοπο cTnC-89-98 της τροπονίνης C. Η ακινητοποίηση του συνθετικού πεπτιδίου πάνω στα ηλεκτρόδια χρυσού έγινε μέσω του σχηματισμού μιας αυτοδιατασσόμενης μονοστιβάδας. Η μεταβολή της εμπέδησης των ηλεκτροδίων (Au-πεπτιδίου) λόγω της αλληλεπίδρασης πεπτιδίου-αντισώματος ανιχνεύθηκε με φαρανταϊκή φασματοσκοπία ηλεκτροχημικής εμπέδησης, χρησιμοποιώντας ως οξειδοαναγωγικό «ανιχνευτή» το πυριτοβολφραμικό ετεροπολυοξύ H₄SiO₄·12WO₃. Η ηλεκτροχημική συμπεριφορά του οξειδοαναγωγικού «ανιχνευτή» μελετήθηκε με κυκλική βολταμμετρία και φασματοσκοπία εμπέδησης. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση στη συμπεριφορά του ανοσοαισθητήρα των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων και συγκεκριμένα της πρωτεΐνης γάλακτος και της 4-μερκαπτοφαινόλης. Η κατεργασία των ηλεκτροδίων με 4-μερκαπτοφαινόλη οδήγησε σε βιοαισθητήρες, οι οποίοι δοκιμάστηκαν με επιτυχία σε δείγματα αντί-ορών. Επίσης, καθορίστηκε ένα βέλτιστος λόγος αραίωσης των δειγμάτων, στον οποίο είναι αμελητέα η επίδραση της μήτρας στο μετρούμενο σήμα. 3ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Σε αυτό το κεφάλαιο, περιγράφεται για πρώτη φορά η ανάπτυξη φαρανταϊκών εμπεδησιομετρικών ανοσοαισθητήρων για την ανίχνευση Salmonella Typhimurium σε δείγματα γάλακτος. Οι προτεινόμενοι βιοαισθητήρες αναπτύχθηκαν με την ακινητοποίηση πολυκλωνικών αντισωμάτων Salmonella Typhimurium πάνω σε ηλεκτρόδια χρυσού, τα οποία είχαν τροποποιηθεί με αυτοδιατασσόμενες μονοστιβάδες θειολών. Η αρχή λειτουργίας των προτεινόμενων βιοαισθητήρων βασίζεται στη μεταβολή της εμπέδησης των τροποποιημένων ηλεκτροδίων (χρυσός/θειόλη/αντίσωμα) λόγω της εκλεκτικής αλληλεπίδρασης συγκεκριμένων επιτόπων της κυτταρικής επιφάνειας των βακτηρίων Salmonella με τα ακινητοποιημένα αντισώματα στην επιφάνεια των βιοαισθητήρων. Σημαντικό πλεονέκτημα της προτεινόμενης μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι οι αναλύσεις πραγματοποιούνται με την άμεση εμβάπτιση των βιοαισθητήρων σε καλλιέργειες των υπό εξέταση δειγμάτων, δηλαδή, χωρίς να απαιτείται η όποια προκατεργασία του δείγματος. Έτσι αποφεύγεται μια σειρά χρονοβόρων σταδίων, τα οποία απαιτούνται για την απομόνωση και τον καθαρισμό των κυττάρων και προηγούνται κάθε ανάλυσης με τις έως τώρα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (ELISA ή PCR). Οι προτεινόμενοι ανοσοαισθητήρες παρουσιάζουν άριστα αναλυτικά χαρακτηριστικά, όπως υψηλή ευαισθησία, αξιοπιστία (δεν ανταποκρίνονται στην παρουσία νεκρών κυττάρων) και απλότητα στη χρήση. Η δυνατότητα απευθείας εμβάπτισης των βιοαισθητήρων σε πραγματικά δείγματα καθιστά επίσης δυνατή τη χρησιμοποίησή τους σε επιτόπιες μετρήσεις, δημιουργώντας πρόσφορο έδαφος για μελλοντική εμπορική χρήση αυτών, όπως για παράδειγμα στη βιομηχανία γάλακτος.