Η συμβολή των καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων στη μελέτη της αναιμίας της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας
Authors: Καρακολιός Απόστολος 
Published: January 2014

Η αναιμία αποτελεί συχνή εκδήλωση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρ-κειας (ΧΝΑ) και στην παθογένειά της συμμετέχουν πολλοί παράγοντες. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συνηγορούν ότι στην ανάπτυξη της αναιμίας της ΧΝΑ ενδεχομένως συμβάλλει και η παρουσία στον ορό των ασθενών ευοδωτικών της φλεγμονής κυτταροκινών. Σκοπός της μελέτης μας ήταν να ερευνήσουμε με τη μέθοδο της in vitro καλλιέργειας προγο-νικών αιμοποιητικών προβαθμίδων τον πιθανό ρόλο των κυτταροκινών στο μηχανισμό ανάπτυξης της αναιμίας της ΧΝΑ. Η πειραματική μελέτη αφορούσε την επίδραση των υπερκείμενων από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (ΜΚΠΑ) 111 ασθενών με ΧΝΑ (41 ασθενείς με ΧΝΑ χωρίς υποκατάσταση, 42 ασθενείς με ΧΝΑ σε αιμοκάθαρση και 28 ασθενείς με ΧΝΑ σε συνεχή φορητή περιτοναϊκή κάθαρση) και 33 υγιών εθελοντών (ομάδα ελέγχου) στην ανάπτυξη αποι-κιών από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της ερυθράς σειράς (BFU-E) του αίματος φυσιολογικών ατόμων. Οι αιμοληψίες περιφερικού αίματος γίνονταν μετά από πλήρη ενη-μέρωση και συγκατάθεση του ασθενούς. Τα μονοπύρηνα κύτταρα διαχω-ρίζονταν με φυγοκέντρηση στο διαχωριστικό μέσο Ficoll-Hypaque, εκπλύνονταν τρεις φορές με Iscove's Modified Dulbeccos Medium (IMDM), εμπλουτισμένο κατά 2% με ορό εμβρύου μόσχου (fetal calf serum, FCS) και τοποθετούνταν σε φλάσκες με IMDM και 10% FCS σε συγκέντρωση 2x106/mL με ή χωρίς την προσθήκη φυτοαιμοσυγκολλη-τίνης (PHA). Ακολουθούσε η επώασή τους στους 37o C σε περιβάλλον με 5% CO2 για 48 ώρες. Η συλλογή των υπερκείμενων ΜΚΠΑ γίνονταν μετά από φυγοκέντρηση (300g/min) και αποθηκεύονταν στους - 70o C. Οι αιμοληψίες για τις καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών προβαθμίδων γίνονταν από υγιείς εθελοντές. Τα ΜΚΠΑ διαχωρίζονταν όπως ήδη περιγράψαμε και ένα εναιώρημα 2x105/mL κυττάρων τοποθε-τούνταν εις διπλούν σε τρυβλία Petri-35 mm σε καλλιεργητικό υλικό MethoCult H4330 μαζί με ποσότητα 10% υπερκείμενου (από ασθενείς με ΧΝΑ ή υγιείς δότες). Τα τρυβλία επωάζονταν σε κλίβανο με 95% υγρασία, 37o C και 5% CO2. Η ανάπτυξη φυσιολογικών BFU-E αποικιών καταμετρούνταν τη 14η ημέρα σε ανάστροφο μικροσκόπιο. Τα επίπεδα των TNF-α, IFN-γ και της IL-3 στα υπερκείμενα ΜΚΠΑ μετρήθηκαν με τη μέθοδο ELISA. Παράλληλα με τις απλές καλλιέργειες που περιγράψα-με παραπάνω γίνονταν και καλλιέργειες με τη χρήση υπερκείμενων ΜΚΠΑ τα οποία παρασκευάζονταν με την προσθήκη είτε 4-5 μg/mL αντι-TNF-α ή 12-16 μg/mL αντι-IFN-γ ή και των δύο ή μη ειδικού IgG αντισώματος σε 300 μl υπερκείμενου και επώαση στον κλίβανο για 30 λεπτά. Διαπιστώσαμε ότι τα υπερκείμενα ΜΚΠΑ του συνόλου των ασθε-νών με ΧΝΑ προκαλούσαν καταστολή των BFU-E σε σημαντικό βαθμό (BFU-E με υπερκείμενο φυσιολογικών ατόμων= 90±67,35/2x105 κύτ./mL, BFU-E με υπερκείμενο ασθενών= 50,64±36,25/2x105 κυτ./mL, ανάπτυξη 66% του φυσιολογικού, p=0,0006). Ο βαθμός καταστολής δε διέφερε στις υποομάδες των ασθενών που μελετήθηκαν (BFU-E ασθενών χωρίς υποκατάσταση 68% του φυσιολογικού, ασθενείς σε αιμοκάθαρση 63% του φυσιολογικού, ασθενείς σε περιτοναϊκή κάθαρση 66% του φυσιολογικού). Η προσθήκη πολυκλωνικού αντισώματος έναντι του TNF-α ανέστειλε σχεδόν πλήρως την κατασταλτική ικανότητα του υπερκεί-μενου στην ανάπτυξη των BFU-E (BFU-E με υπερκείμενο ασθενών ανά-πτυξη 68% του φυσιολογικού και BFU-E με υπερκείμενο ασθενών + αντι-TNF-α ανάπτυξη 93% του φυσιολογικού, p<0,001). Τα αντισώματα έναντι της IFN-γ δεν είχαν στατιστικά σημαντική επίδραση (p= 0,948). Tα επίπεδα του TNF-α στα υπερκείμενα των ασθενών ήταν στατιστικώς ση-μαντικά αυξημένα (TNF-α ασθενών= 2,23±1,29 ng/mL vs TNF-α ομάδας ελέγχου= 1,55±1,20 ng/mL, p=0,006). Συμπερασματικά, από τα ευρήματα της μελέτης μας προκύπτει ότι: α. τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών με ΧΝΑ τελικού σταδίου παράγουν αυξημένα ποσά TNF-α και καταστέλ-λουν in vitro την ερυθροποίηση β. η καταστολή της ερυθροποίησης είναι ανεξάρτητη της υποβολής ή μη των ασθενών σε υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας και της μεθόδου υποκατάστασης γ. επιβεβαιώνονται τα ευρήματα της μελέτης των Allen και συν. (1999), οι οποίοι χρησιμοποίησαν στα πειράματα πλάσμα ουραιμικών ασθενών και ανέδειξαν το ρόλο των κυτταροκινών TNF-α και IFN-γ στην καταστολή της ερυθροποίησης των ασθενών με ουραιμία δ. στην παθογένεια της αναιμίας της ΧΝΑ συμμετέχει μερικώς του-λάχιστον ένας εκ των γνωστών μηχανισμών ανάπτυξης της αναιμίας χρόνιας νόσου ε. η καταστολή της ερυθροποίησης πιθανόν να επιτείνεται όταν συνυπάρχει λοίμωξη ή φλεγμονή στ. τα ευρήματά μας ερμηνεύουν εν μέρει το φαινόμενο της αντί-στασης στη χορήγηση rh- ΕΠΟ που εμφανίζουν μερικοί ασθενείς με ΧΝΑ ζ. η θεραπευτική επιλογή της χορήγησης πεντοξυφυλλίνης, που ανα-στέλλει τη δράση των κυτταροκινών, σε ασθενείς με πτωχή ανταπόκριση στη rh-ΕΠΟ, φαίνεται ρεαλιστική.