Μελέτη της ρύθμισης της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης
Authors: Χαλατσά Ιωάννα 
Published: August 2021

Η L-3,4 διυδροξυ-φαινυλ-αλανίνη αποκαρβοξυλάση (L-Dopa αποκαρβοξυλάση, L-Dopa decarboxylase ή DDC, EC 4.1.1.26) είναι το ένζυμο το οποίο καταλύει την αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Έως πρόσφατα το ένζυμο αυτό εθεωρείτο ένα μάλλον μη ρυθμιζόμενο μόριο το οποίο ανιχνεύεται σε σεροτονεργικούς και μη σεροτονεργικούς νευρώνες, καθώς επίσης σε περιφερικά όργανα, όπου η λειτουργία του ενζύμου δεν είναι ακόμα γνωστή. Αν και η ρύθμιση του γονιδίου της DDC έχει μελετηθεί εκτενώς σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την έκφραση και τη ρύθμιση παραμένουν υπό διερεύνηση. Η DDC εμπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις και είναι αποδεκτό πως οι μηχανισμοί ρύθμισης του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο στη νόσο του Parkinson, τον καρκίνο και τη σχιζοφρένεια. Για τους παραπάνω λόγους η DDC αποτελεί αντικείμενο εκτεταμένης μελέτης τόσο σε βιοχημικό επίπεδο, όσο και σε επίπεδο μοριακής και αναπτυξιακής βιολογίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ρύθμισης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC). Ο πρώτος άξονας των πειραματικών προσεγγίσεων αφορούσε στη μελέτη της ρύθμισης έκφρασης της της DDC σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές νευρικής και μη νευρικής προέλευσης. Στα κύτταρα SH-SY5Y (ανθρώπινο νευροβλάστωμα), HeLa (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τραχήλου μήτρας) και ΗΤΒ-14 (ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα-αστροκύτωμα) ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά έκφραση του νευρικού και μη νευρικού τύπου μεταγράφου της πλήρους μήκους DDC, καθώς και έκφραση της εναλλακτικής πρωτεϊνικής ισομορφής της, Alt-DDC. Στα πλαίσια της μελέτης της ρύθμισης της έκφρασης της DDC, διερευνήθηκε η κυτταρική τοπολογία της πλήρους μήκους DDC, της εναλλακτικής ισομορφής Αlt-DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V σε κυτταρικές σειρές νευρικής και μη νευρικής προέλευσης. Πειράματα θερμοεπαγώμενου διαχωρισμού των πρωτεϊνών με χρήση του μη ανιονικού απορρυπαντικού Triton X-114 στις κυτταρικές σειρές SH-SY5Y (ανθρώπινο νευροβλάστωμα), HTB-14 (ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα-αστροκύτωμα) και ΗΕK-293 (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά κύτταρα) έδειξαν εντοπισμό της DDC, της Alt-DDC και της Αννεξίνης V σε όλες τις φάσεις διαχωρισμού. Η ετερογένεια στην κυτταρική τοπολογία των μορίων, υποδηλώνει την πολυπλοκότητα στη ρύθμιση της έκφρασης της πλήρους μήκους και της εναλλακτικής ισομορφής της DDC. Λόγω του εντοπισμού της DDC και της Alt-DDC σε όλες τις φάσεις διαχωρισμού στις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές ακολούθησε περαιτέρω διερεύνηση του φαινομένου αυτού, μελετώντας της πιθανότητα απελευθέρωσης της DDC από το μεμβρανικό κλάσμα στα κύτταρα ΗΕΚ-293. Η διαλυτοποίηση των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων της DDC βρέθηκε ότι εξαρτάται από τη επίδραση του pH, το χρόνο επώασης και τις συγκεντρώσεις δισθενών κατιόντων και αναστολέων πρωτεασών κυστεΐνης και σερίνης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ένα μέρος των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων απελευθερώνεται στο διαλυτό κλάσμα, υποδεικνύοντας έναν πιθανό μηχανισμό για τη ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας του μορίου. Στα πλαίσια της ρύθμισης της έκφρασης και της ενζυμικής ενεργότητας της DDC, διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του ενζύμου με άλλα μόρια, καθώς με τον τρόπο αυτό μπορούν να προκύψουν σημαντικά συμπεράσματα ως προς τον τρόπο δράσης του, αλλά και τους παράγοντες που αναστέλλουν την ενεργότητά του. Με τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης σε μη αποδιατακτικές συνθήκες βρέθηκε πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V σε διαλυτό κλάσμα ανθρώπινου πλακούντα, στην κυτταρική σειρά νευρικής προέλευσης SH-SY5Y, αλλά και στην κυτταρική σειρά επιθηλιακής προέλευσης HeLa. Επίσης, πιθανή αλληλεπίδραση εντοπίστηκε μεταξύ της εναλλακτικής ισομορφής Alt-DDC και της Aννεξίνης V σε διαλυτό κλάσμα ανθρώπινου πλακούντα. Πειράματα κατακρήμνισης της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στα κύτταρα SH-SY5Y και PC12 (φαιοχρωμοκύτωμα αρουραίου) από την Aννεξίνη V ενισχύουν την πιθανότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο μορίων.Η μελέτη του τρόπου δράσης των ενδογενών και χημικών αναστολέων της DDC θεωρείται πολύ σημαντική για τη κατανόηση της ρύθμισης του ενζύμου. Για το λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε επίδραση χημικών αναστολέων της ενζυμικής ενεργότητας της DDC και του ενδογενούς αναστολέα της που έχει απομονωθεί από ανθρώπινο ορό, σε κυτταρικές σειρές μη νευρικής προέλευσης. Για πρώτη φορά, βρέθηκε ότι η καρβιντόπα παρουσίασε κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα HeLa (αδενοκαρκίνωμα τραχήλου μήτρας) και στα κύτταρα MCF7 (αδενοκαρκίνωμα μαστού ανθρώπου). Αντίθετα, ο χημικός αναστολέας NSD-1015 και ο ενδογενής αναστολέας που απομονώνεται από τον ορό ανθρώπινου αίματος δεν προκάλεσαν φαινόμενα κυτταροτοξικότητας απέναντι στις συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές. Το γεγονός ότι η DDC έχει προταθεί ως διαγνωστικός δείκτης καρκινικών κυττάρων νευροενδοκρινούς προέλευσης, καθώς και ως δείκτης της εμβρυονικής προέλευσης, του βαθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης του όγκου, υποδεικνύουν τη σημασία των ρυθμιστικών μορίων της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην ανάπτυξη μελλοντικών χημειοθεραπευτικών προσεγγίσεων.Για την περαιτέρω μελέτη του φαινομένου, σχεδιάστηκε η μελέτη της αλληλεπίδρασης της DDC και της Αlt-DDC με την Aννεξίνη V σε ευκαρυωτικό σύστημα CHO κυττάρων (Chinese Hamster Ovary cells), τα οποία δεν εκφράζουν τους μεταφορείς ντοπαμίνης DAT και VMAT-2 και τα επιμολυσμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν τη DDC χρησιμοποιούνται ως μοντέλο ντοπαμινεργικών νευρώνων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση της κωδικοποιούσας περιοχής γονιδίου της Aννεξίνης V και εισαγωγή του cDNA στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcDNA 3,1+. Στη συνέχεια, επιμολύνθηκαν ευκαρυωτικά κύτταρα CHO, μέσω ηλεκτροδιάτρησης, με τις κωδικοποιούσες περιοχές των γονιδίων των ανασυνδυασμένων μορίων της πλήρους μήκους DDC, της εναλλακτικής ισομορφής Αlt-DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V. Πειράματα προσδιορισμού της ενζυμικής ενεργότητας της DDC, πιστοποίησαν τη συμμετοχή της Αννεξίνης V στη ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας της DDC και επιβεβαίωσαν παλαιότερα δεδομένα του εργαστηρίου μας που υποστήριζαν την ανασταλτική δράση της. Διερεύνηση της επίδρασης των ανασταλτικών μορίων Αννεξίνη V και καρβιντόπα στην ενζυμική ενεργότητα της DDC σε αποπτωτικά κύτταρα, έδειξε πιθανή συμμετοχή της DDC στην επαγωγή αποπτωτικών φαινομένων.Η DDC εμπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στη νόσο του Parkinson, τον καρκίνο και τη σχιζοφρένεια. Η L-Dopa αποκαρβοξυλάση δεν φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με την αιτιολογία της ασθένειας του Parkinson, είναι όμως αποδεκτό πως οι μηχανισμοί ρύθμισης του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο για τη θεραπεία της συγκεκριμένης ασθένειας. Για τους παραπάνω λόγους, η μελέτη της ρύθμισης της DDC παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι θα μπορούσε να συμβάλλει σε νέες πειραματικές προσεγγίσεις, οι οποίες θα έχουν ως τελικό στόχο την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών και θεραπευτικών μέσων για την καταπολέμηση νευροεκφυλιστικών και νεοπλασματικών νόσων.