Mελέτη παθοφυσιολογικών μηχανισμών σε μοντέλο SLC25A46-επαγόμενης νευρολογικής ασθένειας στο ποντίκι μέσω προσεγγίσεων μοριακής γενετικής και πρωτεομικής
Authors: Περιβολίδη Βασιλική-Ίρις 
Published: November 2023

Η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη SLC25A46, μέλος της οικογένειας SLC25 των μιτοχονδριακών μεταφορέων, συσχετίστηκε πρόσφατα με ένα ευρύ φάσμα αυτοσωμικών υπολειπόμενων νευρολογικών παθήσεων, όπως οπτική ατροφία, περιφερική νευροπάθεια Charcot-Marie-Tooth τύπου 2, σύνδρομο Leigh, προοδευτική μυοκλωνική αταξία, παρεγκεφαλιδική αταξία και θανατηφόρα συγγενή παρεγκεφαλιδική υποπλασία. Ερευνητικά δεδομένα προτείνουν την συμμετοχή της SLC25A46 στη δυναμική κατάσταση των μιτοχονδρίων, στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των cristae της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και στην επικοινωνία του μιτοχονδρίου με το ενδοπλασματικό δίκτυο. Ωστόσο, ο παθοφυσιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης SLC25A46 παραμένει ακόμα ασαφής δυσχεραίνοντας την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών. Η ερευνητική ομάδα της Δρ. Ελένης Ντούνη χρησιμοποιώντας την προσέγγιση της Πρόσθιας Γενετικής στο ποντίκι, αναγνώρισε μία μη νοηματική μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο που προκαλεί ένα αυτοσωμικό υπολειπόμενο νευρολογικό φαινότυπο στο ποντίκι (Slc25a46atc/atc) που προσομοιάζει τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών όπως αταξία, σπασμοί, ασταθή βάδιση, μυϊκή αδυναμία, οπτική ατροφία, υποπλασία της παρεγκεφαλίδας και καθυστερημένη ανάπτυξη με πρόωρη θνησιμότητα. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, με σκοπό την περαιτέρω κατανόηση του παθοφυσιολογικού ρόλου της SLC25A46 πραγματοποιήθηκε: α) χαρακτηρισμός του σκελετικού συστήματος των Slc25a46atc/atc ποντικιών, β) ανάλυση της ενεργότητας των μιτοχονδρίων σε παρεγκεφαλίδα, εγκέφαλο, θύμο και σπλήνα Slc25a46atc/atc ποντικιών προκειμένου να ανιχνευθεί η επίδραση της έλλειψης της SLC25A46 πρωτεΐνης στη μιτοχονδριακή λειτουργία, γ) ανίχνευση απορυθμισμένων πρωτεϊνικών δικτύων και μονοπατιών τόσο στην παρεγκεφαλίδα Slc25a46atc/atc ποντικιών, όσο και σε κυτταρικό σύστημα επαγόμενης αποσιώπησης της SLC25A46 με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS) για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών, δ) δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακών ποντικιών που εκφράζουν την SLC25A46-FLAG πρωτεΐνη (TgSLC25A46-FLAG), ε) ταυτοποίηση των in vivo αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 σε ιστούς TgSLC25A46-FLAG ποντικιών, μέσω ανοσοκατακρήμνισης με a-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων που περιέχουν την SLC25A46-FLAG με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS), στ) προσδιορισμός της επίδρασης μεταλλάξεων στο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 μέσω δημιουργίας ανασυνδυασμένων πλασμιδίων για μεταλλάξεις της SLC25A46, παροδική έκφρασής τους σε κύτταρα N2A, ανοσοκατακρήμνιση με a-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS). Αρχικά, ιστολογική και ποσοτική ανάλυση με microCT του μηριαίου οστού σε Slc25a46atc/atc ποντίκια, έδειξε έντονη οστική απώλεια τόσο στο σπογγώδες οστό της μετάφυσης όσο και στο φλοιώδες οστό της διάφυσης. Επιπλέον, συγκριτική ανάλυση mRNA έκφρασης, σε μηριαία οστά Slc25a46atc/atc και WT ποντικιών, έδειξε αυξημένη έκφραση του γονιδίου RANKL που επάγει την οστεοκλαστογένεση και μειωμένη έκφραση του ALP που αποτελεί δείκτη της οστεοβλαστικής ενεργότητας, υποδεικνύοντας ότι πιθανώς υπάρχει αύξηση της οστεοκλαστογένεσης με μειωμένη οστική σύνθεση που θα μπορούσαν να προκαλέσουν οστική απώλεια. Ταυτόχρονα παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης γονιδίων που ανήκουν στο σύμπλοκο Ι της αναπνευστικής αλυσίδας, υποδεικνύοντας πιθανή σύνδεση του οστεοπορωτικού φαινοτύπου με τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία των Slc25a46atc/atc ποντικιών. Στη συνέχεια, μιτοχονδριακή ανάλυση στην παρεγκεφαλίδα των Slc25a46atc/atc ποντικιών έδειξε μειωμένα επίπεδα δραστικών μορφών οξυγόνου και υπερπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης, ενώ η συγκέντρωση του ATP δεν παρουσίασε διαφορές. Έπειτα, συγκριτική πρωτεομική ανάλυση σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρεγκεφαλίδας Slc25a46atc/atc και WT ποντικιών, φανέρωσε σημαντική μείωση των πρωτεϊνών της αναπνευστικής αλυσίδας, κυρίως των συμπλόκων Ι, ΙΙΙ και ΙV, καθώς και αύξηση των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής δυναμικής και της οργάνωσης των cristae, υποδηλώνοντας αλλαγές στη δομή και τη βασική λειτουργία των μιτοχονδρίων. Επιπλέον, βρέθηκαν απορυθμισμένες διαδικασίες του κυτταρικού μεταβολισμού, της ομοιόστασης των λιπιδίων και του ασβεστίου, όπως επίσης και διαδικασίες νευρογένεσης και λειτουργίας των συνάψεων. Παράλληλα συγκριτική πρωτεομική ανάλυση σε κυτταρική σειρά επαγόμενης αποσιώπησης της SLC24A46, έδειξε ότι η απουσία της SLC25A46 επηρεάζει κυρίως την έκφραση πρωτεϊνών του πυρήνα, που σχετίζονται με διαδικασίες επεξεργασίας των νουκλεϊκών οξέων και της χρωματίνης, πρωτεϊνών της οργάνωσης του μιτοχονδρίου και της μιτοχονδριακής σύντηξης και πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και την παραγωγή ενέργειας στο μιτοχόνδριο. Για τη καλύτερη κατανόηση του φυσιολογικού ρόλου της SLC25A46 πρωτεΐνης, δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν την πρωτεΐνη SLC25A46-FLAG (ΤgSLC25A46-FLAG) και ανιχνεύθηκε το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της SLC25A46 σε παρεγκεφαλίδα, εγκέφαλο, καρδιά και θύμο, χρησιμοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση και πρωτεομική ανάλυση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν ήδη γνωστές αλληλεπιδράσεις της SLC25A46 με μέλη του συμπλόκου ΜICOS, ενώ έδειξαν για πρώτη φορά ότι αλληλεπιδρά με ένα μεγάλο δίκτυο πρωτεϊνών, όπως μέλη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της F1F0-ATP συνθάσης, πρωτεΐνες των σημείων επαφής των μιτοχονδρίων και ενδοπλασματικού δικτύου και πρωτεΐνες των συναπτικών κυστιδίων. Τέλος, δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένα πλασμίδια για παρανοηματικές μεταλλάξεις του SLC25A46 γονιδίου που ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς. Η χιμαιρική SLC25A46R257Q-FLAG πρωτεΐνη που παρουσίασε σταθερότητα στην έκφραση επιλέχθηκε για την εύρεση των αλληλεπιδράσεών της. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μετάλλαξη p.R257Q διατηρεί την πλειοψηφία (81%) των αλληλεπιδράσεων της SLC25A46, συμπεριλαμβανομένων γνωστών αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 όπως η IMMT. Ωστόσο, σε σχέση με την αγρίου τύπου SLC25A46 η μετάλλαξη p.R257Q προκαλεί απώλεια του 17% των αλληλεπιδράσεών της, συμπεριλαμβάνοντας πρωτεΐνες που σχετίζονται με την ομοιόσταση του ασβεστίου στο ενδοπλασματικό δίκτυο.Συμπερασματικά, η απορρύθμιση βασικών λειτουργιών του κυττάρου απουσία της SLC25A46, όπως η οξειδωτική φωσφορυλίωση, η αρχιτεκτονική και δυναμική του μιτοχονδρίου και η ομοιόσταση του ασβεστίου, σε συνδυασμό με το πλούσιο δίκτυο αλληλεπιδράσεων της SLC25A46, αναδεικνύουν την εμπλοκή της σε βασικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν το μιτοχόνδριο με την παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της SLC25A46 στη φυσιολογική λειτουργία, τη δομή και την επικοινωνία των μιτοχονδρίων με άλλα κυτταρικά οργανίδια, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση των SLC25A46-επαγόμενων νευρολογικών παθήσεων.