Monitoring blood flow velocity in rat mesenteric venules
Authors: Гришачёва Т.Г. , Михайлова И.А. , Петрищев Н.Н. , Кривченко А.И. , Струй А.В. 
Published: November 2020

Разработка систем для регистрации и автоматической обработки информации о непосредственной реакции микрососудов на различные факторы является важной задачей для доклинического испытания новых препаратов, воздействующих на систему микроциркуляции. Цель исследования - модификация метода on-line-регистрации и обработки интравитальных изображений микрососудов для изучения динамики скорости кровотока при возмущающих воздействиях. Методика. Представлена усовершенствованная методика регистрации скоростей линейного кровотока в микрососудах и обработки интравитальных изображений. Для визуальной фиксации изменения скорости кровотока использовали макроскоп (Wild M420, Швейцария), объектив (Makrozoom 6.3-32х), быстродействующую цифровую камеру (Basler acA2000-165uc USB3.0, Германия) c матрицей CMOSIS CMV2000. Камера позволяет получать полнокадровые изображения 2000×1000 пикселей с частотой 165 кадров/с, а линейные изображения с частотой 8000 кадров/с, что позволяет фиксировать достаточно широкий диапазон линейных скоростей кровотока. Масштаб полученного с помощью системы «микроскоп - камера изображения» составляет 0,7 микрона на пиксел, что дает возможность измерения скоростей от 0,1 до 150 мм/с. В работе был использован метод оцифровки и анализа изображений на основе пакета программ «МультиМедиа Каталог» версии 2.3 («MMCatalog», Россия). Анализ скорости кровотока основан на непосредственном измерении скорости движения потока клеток крови. При измерении скорости определяется смещение потока клеток крови между двумя измерениями через заданный промежуток времени. Для этого на изображение кровотока в выбранном участке микрососуда наносится линейный маркер, ориентированный вдоль русла сосуда. После запуска процесса измерений камера каждую секунду переводится в режим линейной съемки вдоль маркера. Производится съемка серии из 5-6 измерений линейных изображений с заданным интервалом времени, по ним строятся оптические срезы и измеряется относительное смещение кривой. Смещение кривой определяется методом оценки суммы разностей одного массива яркостей графика от другого при сканировании от -20 до +20% от текущей позиции. Позиция, соответствующая минимальной сумме разностей, считается величиной смещения графиков. Эта процедура проводится для всех 5-6 пар измерений. Из полученных значений смещения графиков выбирается медиана, которая и используется как результат измерения скорости. Затем камера опять переводится в режим съемки полнокадровых изображений, что позволяет контролировать положение маркера в реальном времени. Во время эксперимента могут происходить перемещения объекта из-за движения или дыхания животного. Для корректировки положения маркера на изображении сосуда есть возможность изменения его позиции во время измерений. Программа фиксирует полученные значения смещения графиков и, как следствие, скорость кровотока. В зависимости от скорости кровотока программа позволяет регулировать число измерений в единицу времени, что дает возможность поддерживать стабильность измерения скорости. Для снижения влияния высокочастотного шума проводится сглаживание графиков с помощью скользящего усреднения. Интенсивность усреднения регулируется в процессе измерений. Регистрация скорости кровотока в выбранном участке проводится непрерывно в течение всего эксперимента. Схема проведения эксперимента: - запись исходного кровотока в течение 180 с; - регистрация кровотока во время лазерного облучения - 300 с; - регистрация кровотока после воздействия - 300 с. Результаты. Данный способ регистрации скорости кровотока позволяет фиксировать повышение скорости кровотока в венулах как во время воздействия лазерным излучением (662 нм), так и после завершения облучения. Заключение. Предложенная методика обработки интравитальных изображений кровотока дает возможность регистрации в режиме реального времени быстрых изменений скорости кровотока в микрососудах при возмущающих воздействиях.

Development of systems for recording and automatic processing of information about direct microvascular responses is an important task for a preclinical study of drugs influencing the microcirculation. The aim was to modify the method for on-line recording and processing of intravital images of microvessels to study changes in the blood flow velocity under disturbing impacts. Method. This article presents an improved technique for recording linear blood flow velocity in microvessels and for processing intravital images. Macroscope (Wild M420, Switzerland), lens (Makrozoom 6.3-32x), and high-speed digital camera (Basler acA2000-165uc USB3.0, Germany) with a CMOSIS CMV2000 matrix were used for visual tracking of changes in blood flow velocity. The camera allows obtaining full-frame, 2000x1000 pixel images with a frequency of 165 fps, and linear images with a frequency of 8000 fps to capture a wide range of linear blood flow velocities. The scale of an image obtained with the microscope-camera system is 0.7 microns per pixel, which makes it possible to measure velocities of 0.1 to 150 mm/s. Digitizing and analyzing images were performed with a MultiMedia Catalog software, Version 2.3 (MMCatalog, Russia). The analysis of blood flow velocity is based on direct measurement of the blood cell flow velocity. The velocity is measured by estimation of the shift of blood cell flow for a predetermined time period between two measurements. To this purpose, a linear marker oriented along the vessel is applied to the blood flow image in a selected section of the microvessel. Following the measurement onset, the camera switches to a linear mode along the marker every second. A series of 5-6 measurements of linear images is taken at definite time intervals. Then measurements are used for construction of optical slices and measurement of the relative shift of the curve. The curve shift is determined by estimating the sum of differences between two arrays of curve brightness in scanning from -20 to +20% of the current position. The position corresponding to the minimum sum of differences is considered the value of curve shift. This procedure is performed for all 5-6 pairs of measurements. From the obtained values of curve shifts a median is selected, which is used as a result of measuring the velocity. Then the camera is again switched to the full-frame shooting mode, which allows you to control the position of the marker in real time. During the experiment, the object may move due to movements or breathing of the animal. To adjust the marker position on the image, it is possible to change its position during the measurements. The program captures the obtained values of curve shits and, thereby, the blood flow velocity. Based on the blood flow velocity, the program allows adjusting the number of measurements per unit time, which makes it possible to maintain stability of velocity measurements. To reduce the effect of high-frequency noise the curves are smoothed using moving averages. The averaging intensity can be adjusted in the process of measurement. Recording of blood flow velocity in a selected area is performed continuously during the entire experiment. Experimental protocol: - recording of the initial blood flow for 180 s; - recording of blood flow during laser irradiation for 300 s; - recording of blood flow after the exposure for 300 s. Results. This method of recording blood flow velocity allows recording increases in venular blood flow velocity both during and after an exposure to laser irradiation (662 nm). Conclusion. The proposed technique for processing intravital images of blood flow makes it possible to record fast changes in blood flow velocity in microvessels under disturbing impacts in real time.