Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени для идентификации продуктов из козьего молока
Authors: Хан А.В. , Лазарева Е.Г. , Коваль Д.Д. , Фоменко О.Ю. 
Published: January 2025

Продукция из нетрадиционных видов молока обладает множеством уникальных и полезных характеристик (высокая пищевая ценность, повышенная антимикробная активность и др.), однако существующие высокие риски возникновения фальсификации такой продукции коровьим молоком в процессе производства вызывают сильную озабоченность. Одними из наиболее перспективных методов идентификации видового состава молочных продуктов являются молекулярно-генетические, в особенности мультиплексная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В связи с этим целью данного исследования была разработка тест-системы для подтверждения видового состава козьего молока и продуктов на его основе с применением мультиплексной ПЦР-РВ. В настоящей статье подробно описаны методические подходы к тестированию образцов промышленных продуктов из козьего молока с одновременным использованием олигонуклеотидных праймеров и гидролизуемых зондов, комплементарных участкам геномов Bos taurus и Capra hircus. Кроме того, были определены ключевые метрологические характеристики тест-системы, позволяющей амплифицировать видоспецифические последовательности ДНК домашнего скота. Динамический диапазон при использовании в качестве матрицы суммарной коровьей и козьей ДНК составлял от 10 нг до 0,001 нг и от 10 нг до 0,0001 нг ДНК на реакцию соответственно. Абсолютные пределы обнаружения составляли 0,0005 нг и 0,00001 нг суммарной коровьей и козьей ДНК на реакцию соответственно. Относительный предел обнаружения коровьей ДНК по отношению к козьей составлял не менее 1 % в мультиплексном варианте. Оценка сходимости и воспроизводимости показала соответствие данных метрологических характеристик требованиям, предъявляемым нормативной документацией к тест-системам на основе ПЦР. Установлено, что разработанная тест-система стабильна при хранении и устойчива к повторным размораживаниям (значение коэффициента вариации при проведении испытаний по ГОСТ Р 70150-2022 не превышает 10 %). Представленные результаты демонстрируют значительные перспективы применения тест-системы для осуществления мониторинга биобезопасности, качества продуктов питания и защиты прав потребителей.

Products from non-traditional milk species have many unique and useful characteristics (high nutritional value, increased antimicrobial activity, etc.), but the existing high risks of adulteration of such products with cow's milk during production are of great concern. One of the most promising methods for identification of species composition of dairy products are molecular genetic methods, especially multiplex real-time PCR (RT-PCR). In this regard, the aim of this work was to develop a test system to confirm the species composition of goat milk and products based on it using multiplex RT-PCR. In this paper, the methodological approaches to testing samples of industrial goat milk products with simultaneous use of oligonucleotide primers and hydrolysable probes complementary to the Bos taurus and Capra hircus genomes were described in detail. In addition, the key metrological characteristics of the test system allowing the amplification of species-specific DNA sequences in livestock were determined. The dynamic range when using total bovine and goat DNA as matrix was 10 ng to 0.001 ng and 10 ng to 0.0001 ng DNA per reaction, respectively. The absolute limits of detection were 0.0005 ng and 0.00001 ng of total cow and goat DNA per reaction, respectively. The relative limit of detection of bovine DNA versus goat DNA was at least 1 % in the multiplex version. The evaluation of convergence and reproducibility showed that these metrological characteristics correspond to the requirements of the normative documentation for PCR-based test systems. It was found that the developed test-system is stable during storage and resistant to repeated thawing (the value of the coefficient of variation in tests according to GOST R 70150-2022 does not exceed 10 %). The presented results demonstrate significant prospects for the application of the test system for monitoring biosafety, food quality and consumer protection.