Ανίχνευση του ιού της ευλογιάς του προβάτου με τη βοήθεια τεχνικών μοριακής βιολογίας
Authors: Μαγγανά-Βουγιούκα Όλγα 
Published: August 2021

Λόγω της γεωγραφικής θέσης της χώρας μας ανάμεσα στην Ευρώπη στην Ασία και στην Αφρική εμφανίζονται κατά καιρούς διάφορα εξωτικά νοσήματα. Τα τελευταία χρόνια είχαμε αρκετά συχνά κρούσματα ευλογιάς του προβάτου σε διάφορες περιοχές, κυρίως κοντά στα ανατολικά σύνορα. Κάθε φορά που συνέβαινε αυτό η χώρα μας εκαλείτο από την Ευρωπαϊκή Ένωση να απαντήσει γρήγορα και επακριβώς εάν πράγματι τα ύποπτα κρούσματα ήταν ευλογιά και να λάβει τα κατάλληλα μέτρα αφού το νόσημα θεωρείται εξωτικό για τις Ευρωπαϊκές χώρες.Όμως οι διαθέσιμες εργαστηριακές διαγνωστικές μέθοδοι για την ευλογιά είναι ανεπαρκείς κατά το ότι είναι χρονοβόρες και μη ειδικές αφού έχουν μικρή ευαισθησία και δίνουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλους σχετικούς νοσογόνους παράγοντες. Έτσι, προέκυψε η ανάγκη έρευνας για την καθιέρωση ειδικής και ταχείας μεθόδου διαπίστωσης του ιού της ευλογιάς σε δείγματα παθολογικών υλικών. Με την παρούσα διατριβή δημοσιεύονται τα αποτελέσματά της. Ως μέθοδος επιλέχθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR).Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται το νόσημα της ευλογιάς του προβάτου, ο αιτιολογικός παράγοντας και τα επιζωοτιο- λογικά στοιχεία της χώρας μας τα τελευταία 1 7 χρόνια. Στη συνέχεια εκτίθενται οι διαδοχικές ερευνητικές εργασίες που πραγματοποιήθηκαν ώστε να καθιερωθεί η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ως η ειδική δοκιμή για τη διάγνωση της ευλογιάς.Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν τέσσερεις ερευνητικές εργασίες (πειράματα). Στην πρώτη αναπτύχθηκε μία ειδική PCR για την ανίχνευση του ιού της ευλογιάς από καθαρή καλλιέργεια καθιερωμένων στελεχών. Τα εκκινητικά μόρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από περιοχές του γενώματος δύο στελεχών ευλογιάς, του KS- 1 και InS-l. Ελέχθηκαν έξι διαφορετικά στελέχη ευλογιάς. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη λοιμώδους εκθύματος, ένα στέλεχος ιού μυξωμάτωσης, δύο ερπητοϊοί ζώων και κύτταρα μη ενοφθαλμισμένα. Η ευαισθησία της PCR ήταν σχεδόν ίδια με τα δύο ζεύγη εκκινητικών μορίων και για τα έξι στελέχη ευλογιάς. Ό-λοι οι μάρτυρες έδιναν αρνητική αντίδραση στην PCR και διαφοροποιούνταν σαφώς από τα στελέχη της ευλογιάς.Στη δεύτερη εργασία η PCR εφαρμόσθηκε σε ενοφθαλμισμένες με παθολογικά υλικά κυτταροκαλλιέργειες, με στόχο την όσο το δυνατό ταχύτερη ανίχνευση του ιού. Εξετάσθηκαν 17 δείγματα δέρματος προβάτων με αλλοιώσεις ύποπτες ευλογιάς. Τα δείγματα λειοτριβήθηκαν και στη συνέχεια ενοφθαλμίστηκαν και τιτλοποιήθηκαν σε κυτταροκαλλιέργειες όρχεων αμνού. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν πέντε δείγματα δέρματος προβάτων με αλλοιώσεις λοιμώδους εκθύματος και τρία δείγματα δέρματος από υγιή ζώα. Εξετάσθηκαν, επίσης, το ελληνικό στέλεχος 281 της ευλογιάς του προβάτου, ως θετικός μάρτυρας, και το ελληνικό στέλεχος 1 76 του λοιμώδους εκθύματος, ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα ύποπτα ευλογιάς δείγματα ήταν θετικά στην PCR από την πρώτη ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό της πρώτης διόδου, δηλαδή σε 24-48 ώρες. Αντίθετα, το κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα εμφανιζόταν την 2π έως 5^ ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό της πρώτης, δεύτερης ή τρίτης διόδου. Η απομόνωση δηλαδή, του ιού σε κυτταροκαλλιέρ- γειες και η ταυτοποίηση του, διαρκούσαν 1 5 έως 30 ημέρες. Στους αρνητικούς μάρτυρες δεν παρατηρήθηκε θετικό αποτέλεσμα με την PCR. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την γρήγορη και ειδική διάγνωση του νοσήματος από ενοφθαλμισμένα με παθολογικά υλικά κύτταρα όρχεων αμνού.Στην τρίτη εργασία, σαράντα δείγματα δέρματος με αλλοιώσεις ύποπτες ευλογιάς εξετάσθηκαν με τέσσερεις διαγνωστικές μεθόδους, την PCR, την απομόνωση του ιού σε κύτταρα, τον άμεσο ανοσοφθορισμό και την ανοσοδιάχυση. Όλα τα δείγματα ήταν θετικά στην PCR και στην απομόνωση του ιού. Εικοσιεννέα ήταν θετικά στον ανοσοφθορισμό και δεκαέξι στην ανοσοδιάχυση. Δεδομένου ότι η απομόνωση του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες είναι η ασφαλέστερη τεχνική διάγνωσης διαπιστώθηκε ότι η ευαισθησία της PCR ήταν 100%, η του ανοσοφθορισμού 73% και της ανοσοδιά- χυσης 40 %. Τα δείγματα δέρματος με αλλοιώσεις λοιμώδους εκθύματος και εκείνα από τα υγιή ζώα ήταν αρνητικά στην PCR. Διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον ιό του λοιμώδους εκθύματος παρατηρήθηκαν σε τρεις περιπτώσεις, μόνο με την τεχνική της ανο-σοδιάχυσης. Η PCR αποδείχθηκε ότι είναι η μέθοδος εκλογής για την άμεση διάγνωση του νοσήματος από παθολογικά υλικά.Στην τέταρτη εργασία, αναπτύχθηκε η πολλαπλή PCR. Το παθολογικό υλικό εξετάζονταν ταυτόχρονα με τρία ζεύγη εκκινη- τικών μορίων, δύο ειδικών για την ευλογιά και ένα για την α- tubulin. Υευδώς αρνητικά δείγματα, που είναι δυνατόν να εμφανισθούν λόγω κακής εκχύλισης του DNA του δείγματος ή ύπαρξης αναστολέων της επέκτασης του DNA, μπορούν να αποκλεισθούν με την προσθήκη των εκκινητικών μορίων για την α- tubulin. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την εξέταση 42 παθολογικών υλικών ύποπτων ευλογιάς, έδειξαν ότι η πολλαπλή PCR μπορεί να ανιχνεύσει το ιικό DNA από τα παθολογικά υλικά, αποκλείοντας πιθανές περιπτώσεις λάθους.Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι με την εφαρμογή της PCR, και ιδιαίτερα της πολλαπλής PCR, είναι δυνατή η διάγνωση της ευλογιάς και η διάκρισή της από το λοιμώδες έκθυμα μέσα σε 24 ώρες από την παραλαβή του παθολογικού υλικού από το εργαστήριο, σε αντίθεση με τις 1 5-30 ημέρες που χρειαζόταν με τις ως τώρα γνωστές μεθόδους διάγνωσης.