Μελέτη βιοδραστικών ενώσεων φυσικών προϊόντων με υψηλής ευαισθησίας φασματοσκοπία NMR κρυογενικής τεχνολογίας και έλεγχος της αντινεοπλασματικής και αντιαγγειογενετικής τους δράσης
Authors: Πριμηκύρη Αλεξάνδρα 
Published: August 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η μελέτη πρότυπων φλαβονοειδών που φέρουν συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά και υποκαταστάσεις ώστε να διαθέτουν βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά και οι φυσικοχημικές ιδιότητες επιλεγμένων φλαβονοειδών με χρήση φασματοσκοπίας NMR 1D και 2D. Στη συνέχεια με χρήση φασματοσκοπίας διάχυσης DOSY NMR αναπτύχθηκε μια νέα μεθοδολογία για τον ποιοτικό διαχωρισμό και την ταυτοποίηση φλαβονοειδών σε μίγματα. Έπειτα, μελετήθηκε ο μηχανισμός της αντιοξειδωτικής δραστικότητας των φλαβονοειδών και η ικανότητά τους να συμπλοκοποιούνται με δύο σημαντικά μεταλλικά ιόντα, τον Zn2+ και τον Fe2+. Μελέτες φασματοσκοπίας 1D NMR και θεωρητικοί υπολογισμοί σε επίπεδο DFT υπέδειξαν ως θέσεις συμπλοκοποίησης του Zn2+ τις 3-4 και 4-5 για την κερσετίνη και την λουτεολίνη, αντίστοιχα, με αποπρωτονίωση των ΟΗ-3 για την πρώτη περίπτωση και του ΟΗ-5 για την δεύτερη. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι η συμπλοκοποίηση της κερσετίνης με Zn2+ υποβοηθά τη σύμπλεξη με τον Fe2+ λόγω αποπρωτονίωσης. Η διαπίστωση αυτή μπορεί να αποτελέσει μια ικανή επεξήγηση του φαινομένου της βελτιωμένης αντιοξειδωτικής ικανότητας των φλαβονοειδών όταν είναι ήδη σε συμπλοκοποιημένη μορφή που έχει παρατηρηθεί σε προηγούμενες in vitro μελέτες.Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η μελέτη της αντιπολλαπλασιαστικής τους δράσης ενάντια σε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και η συσχέτιση των δομικών χαρακτηριστικών με τη δραστικότητα. Διαπιστώθηκε ότι τα φλαβονοειδή με τον ισχυρότερο ενδομοριακό δεσμό έχουν βελτιωμένη δραστικότητα, ενώ η παρουσία μεθόξυ υποκαταστατών στις θέσεις 3 και 4’ και υδροξυλομάδων στις 5,7 και 3’ είναι απαραίτητη για ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική δράση.Για την αντιαγγειογενετική δραστικότητα επιλέχθηκε να μελετηθεί το φλαβονοειδές 5,7,3’-τριυδροξυ-3,4’-διμεθοξυφλαβόνη, το οποίο παρουσίασε και τη σημαντικότερη αντικαρκινική δράση in vitro. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε ότι το φλαβονοειδές αυτό αναστέλλει την επαγώμενη από τον VEGF αγγειογένεση στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs και αποτελεί ένα προτεινόμενο μηχανισμό. Η διμεθοξυφλαβόνη, συνεπώς, μπορεί να αποτελέσει ένωση «οδηγό» και να προωθηθεί για μελλοντικές μελέτες αντικαρκινικών και αντιαγγειογενετικών ιδιοτήτων τόσο της ίδιας όσο και πιο δραστικών αναλόγων της. Το φλαβονοειδές κερσετίνη επιλέχθηκε για την μελέτη της ικανότητάς του να επιφέρει απόπτωση σε Τ λευχαιμικά κύτταρα. Mε τη χρήση in vitro πειραμάτων αλλά και βιοχημικών και φυσικοχημικών μελετών και υπολογισμών πρόσδεσης, διαπιστώθηκε ότι η κερσετίνη αλληλεπιδρά άμεσα με τις αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες Bcl-2 και Bcl-xL στον τομέα ΒΗ3 επάγωντας απόπτωση. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας in-cell NMR επιτεύχθηκε η μελέτη της αλληλεπίδρασης ενός συνθετικού υδατοδιαλυτού αναλόγου της κερσετίνης με την Bcl-2 πρωτεΐνη μέσα σε ζωντανά κύτταρα Jurkat που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη αυτή. Η μελέτη αλληλεπίδρασης της Bcl-2 με μικρά μόρια αποτελεί την πρώτη σε διεθνές επίπεδο μελέτη μιτοχονδριακής μεμβρανικής πρωτεΐνης σε κυτταρικό επίπεδο. Συνεπώς, η φασματοσκοπία in-cell NMR αποτελεί ένα δυναμικό εργαλείο σάρωσης αλληλεπιδράσεων φαρμάκων και πρωτεϊνικών στόχων με δυνατότητα εξέλιξης και ιδιαίτερα υποσχόμενες μελλοντικές εφαρμογές.