Μελέτη του ιού του ποικιλοχλωρωτικού νανισμού της μελιτζάνας (Eggplant mottled dwarf virus, EMDV)
Authors: Παππή Πολυξένη 
Published: August 2021

Ο ιός του ποικιλοχλωρωτικού νανισμού της μελιτζάνας (Eggplant mottled dwarf virus, EMDV) ανήκει στο γένος Nucleorhabdovirus της οικογένειας Rhabdoviridae. Παρόλο που απαντάται σποραδικά εδώ και πολλά χρόνια στη Μεσογειακή λεκάνη σε καλλιεργούμενα, καλλωπιστικά φυτά και αυτοφυή ζιζάνια, μέχρι σήμερα δεν είχε προσδιοριστεί η νουκλεοτιδική αλληλουχία και η οργάνωση του γονιδιώματος του. Στην παρούσα διατριβή, προσδιορίστηκε για πρώτη φορά το γονιδίωμα μιας απομόνωσης του EMDV, με μία νέα στρατηγική που χρησιμοποιεί τις εξαιρετικά συντηρημένες, μεταξύ των γονιδίων, περιοχές του ιού. Το αρνητικής πολικότητας, μονόκλωνο RNA γονιδίωμα του EMDV είναι μήκους 13.093 νουκλεοτιδίων και περιέχει 7 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ΑΠΑ) τα οποία οργανώνονται σε κατεύθυνση 3' προς 5' και δυνητικά κωδικοποιούν επτά πρωτεΐνες, την Νουκλεοπρωτεΐνη Ν, την Χ άγνωστης λειτουργίας πρωτεΐνη, την Φωσφοπρωτεΐνη Ρ, την υποθετική πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης Υ, την Βασική πρωτεΐνη περιβλήματος Μ, την Γλυκοπρωτεΐνη G και την Πολυμεράση L. Στο 3' άκρο της αλληλουχίας αυτής, η αλληλουχία οδηγός, προηγείται του γονιδίου της Νουκλεοπρωτεΐνης Ν, ενώ στο 5' άκρο του γονιδιωματικού RNA, η μετατερματική αλληλουχία, έπεται του γονιδίου της Πολυμεράσης L. Μεταξύ των γονιδίων, το μέγεθος των αμετάφραστων περιοχών παραλλάσει σημαντικά, με σταθερή την παρουσία μιας ελαχίστων νουκλεοτιδίων συντηρημένης αλληλουχίας που το μοναδικό της μοτίβο χαρακτηρίζει τον ιό EMDV. Η φυλογενετική ανάλυση μεγάλου τμήματος της πρωτεΐνης L επιβεβαίωσε την κατάταξη του EMDV στο γένος Nucleorhabdovirus και απέδειξε την στενή εξελικτική σχέση του με τον PYDV. Περαιτέρω, αναπτύχθηκε μοριακή δοκιμή, ποσοτικής, πραγματικού χρόνου RT-PCR για τον ακριβή προσδιορισμό του ιικού φορτίου σε φυτά-ξενιστές του EMDV, καθώς και την ελαχιστοποίηση του χρόνου διάγνωσης. Κατόπιν, αξιολογήθηκαν τέσσερα διαφορετικά πρωτόκολλα εκχύλισης ολικού RNA με σκοπό την ανάδειξη αυτού με την υψηλότερη ανάκτηση ιικού φορτίου. Για την αξιολόγηση αυτή, επιλέχθηκε ιστός από επτά διαφορετικά φυτικά είδη, στους οποίους και προστέθηκαν συνθετικά αντίγραφα RNA του EMDV γνωστής συγκέντρωσης. Τα ποσοστά ανάκτησης των συνθετικών αντιγράφων και ο έλεγχος της επίδρασης της παρουσίας συνεκχυλισθέντων αναστολέων στην απόδοση της δοκιμής, ανέδειξαν ως επικρατέστερα δύο πρωτόκολλα. Η εφαρμογή των πρωτοκόλλων αυτών έδωσε μη στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών Ct (ο κύκλος κατά τον οποίο οι τιμές φθορισμού της PCR υπερβαίνουν την ουδό ανίχνευσης του προϊόντος) των ανακτώμενων αντιγράφων του μάρτυρα και των υπολοίπων φυτικών εκχυλισμάτων. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η διαγνωστική εξειδίκευση και ευαισθησία της δοκιμής σε σχέση με την ορολογική δοκιμή DAS-ELISA. Ακολούθως, μελετήθηκε η γενετική παραλλακτικότητα και εξέλιξη του ιού. Για το σκοπό αυτό προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες των γονιδίων Ν, Χ, Ρ, Υ, Μ και G, οχτώ απομονώσεων του ιού από διάφορους ξενιστές που συλλέχθηκαν από την Ελλάδα και την Κύπρο. Μελετήθηκαν οι εξελικτικές τους σχέσεις με τη βοήθεια αναλύσεων γενετικής παραλλακτικότητας των προσδιορισθέντων αλληλουχιών, προσδιορισμού ανασυνδυασμών, θετικής επιλογής και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων με τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML). Η φυλογενετική ανάλυση των περιοχών αυτών κατέταξε τις απομονώσεις σε τρεις διακριτούς κλάδους με κοινή τοπολογία σε όλα τα γονίδια, που φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από την γεωγραφική προέλευση των απομονώσεων. Παράλληλα, η ομαδοποίηση των απομονώσεων που πρόκυψε, ανέδειξε τη σημασία της παρουσίας του εντόμου-φορέα και των αγενώς πολλαπλασιαζόμενων πολυετών φυτών-ξενιστών στη διασπορά τους.