In vitro πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων
Authors: Καραγιαννίδου Αγγελική 
Published: August 2021

Τα κύτταρα που προέρχονται από τα πρώιμα στάδια του ανθρώπινου εμβρύου ορίζονται ως Eμβρυονικά Βλαστικά κύτταρα (ΕΒΚ) και χαρακτηρίζονται από τις μοναδικές ιδιότητες της πολυδυναμίας, της αυτοανανέωσης και του υψηλού πολλαπλασιαστικού δυναμικού.Με την επίδραση κατάλληλων αυξητικών παραγόντων τα αΕΒΚ διαφοροποιούνται προς κυτταρικούς τύπους προερχόμενους και από τα τρία βλαστικά δέρματα. Η πλαστικότητα τους αυτή τα καθιστά ένα σημαντικό εργαλείο μελέτης της κυτταρικής διαφοροποίησης, σε ένα πλήθος ιστολογικών τύπων in vitro, με στόχο να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν στην κυτταρική-αναγεννητική θεραπεία πολλών χρόνιων νόσων. Ωστόσο, για την κλινική χρήση των κυττάρων αυτών απαραίτητη είναι η ανάπτυξη ασφαλέστερων και απλούστερων μεθόδων παραγωγής τους. Με δεδομένο το ευρύ φάσμα των εφαρμογών τους στην κλινική πράξη, σκοπός μας ήταν η ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων καλλιέργειας και η μελέτη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησής τους σε ιστούς προερχόμενους από τα τρία βλαστικά δέρματα με τη χρήση αυξητικών-διαφοροποιητικών παραγόντων. Αρχικά, καλλιεργήθηκε η εμβρυονική καρκινική κυτταρική σειρά 2102Ep Cl.2/A6 P48 (GlobalStem Inc.) προκειμένου να πραγματοποιηθεί αξιολόγηση των καλλιεργητικών υλικών και των παραγόντων πολλαπλασιασμού, με σκοπό την τυποποίηση των μεθόδων καλλιέργειας.Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι κυτταρικές σειρές αΕΒΚ HUES-9p18 και HUES-7p15. Αρχικά πραγματοποιήθηκε σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα στις καλλιέργειές μίγμα πρωτεϊνών εξωκυττάριας ουσίας, το matrigel και ανθρώπινα μεσεγχυματικά κύτταρα (ΜΣΚ) και δε παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Εξετάστηκε η διατήρηση της πολυδυναμίας τους κατά την καλλιέργεια με μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων Oct3/4, Nanog, Sox2, Rex-1 με την τεχνική RT-PCR, καθώς και της έκφρασης του επιφανειακού κυτταρικού αντιγόνου SSEA-4 με κυτταρομετρία ροής. Η διαφοροποίηση των κυτταρικών σειρών προς κυτταρικούς τύπους εξωδερμικής (προγονικά νευρικά κύτταρα, ΠΝΚ), μεσοδερμικής (προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, ΠΑΚ και μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα, ΜΣΚ) και ενδοδερμικής (κύτταρα καθορισμέμου ενδοδέρματος) προέλευσης, επιτεύχθηκε υπό την επίδραση κατάλληλων παραγόντων, με μεγαλύτερη απόδοση να εμφανίζει η διαφοροποίηση προς μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα και προγονικά νευρικά κύτταρα. Ο προσδιορισμός της γενετικής σταθερότητα των κυττάρων με τη μέθοδο του μοριακού καρυοτύπου (Agilent 1x244K και 4x180K CGH και SNPs arrays) έδειξε ότι οι δύο κυτταρικές σειρές HUES-9 και HUES-7, έχουν φυσιολογικό καρυότυπο (46ΧΧ και 46 ΧΥ αντίστοιχα) αλλά παρουσιάζουν γενετική αστάθεια (ελλείψεις και διπλασιασμούς) τόσο στην αδιαφοροποίητη όσο και στην διαφοροποιημένη σε ΜΣΚ και ΠΝΚ μορφή τους. Δεν διαπιστώθηκαν in vitro χαρακτηριστικά νεοπλασματικής εξαλλαγής. Συμπερασματικά οι υποχρωμοσωμικές βλάβες προκύπτουν ως προσαρμογή των αΕΒΚ στην καλλιέργεια και δεν επηρεάζουν το πολλαπλασιαστικό και διαφοροποιητικό δυναμικό τους. Ωστόσο, προτείνεται ένας γενετικός έλεγχος (screening) κάθε κυτταρικού πληθυσμού που προέρχεται από διαφοροποίηση ΕΒΚ.Στα πλαίσια της διατριβής αυτής, για πρώτη φορά στην Ελλάδα, αναπτύχθηκε η τεχνολογία για την καλλιέργεια και μελέτη των αΕΒΚ και προτυπώθηκαν κατάλληλοι μεθόδοι παραγωγής διαφοροποιημένων κυττάρων για τη χρησιμοποίησή τους σε προ-κλινικά πρωτόκολλα.