Βιολογική και βιοηλεκτροχημική επεξεργασία για την απομάκρυνση μελανοϊδίνης από υδατικά συστήματα και απόβλητα και μελέτη της βιολογικής δραστικότητας της μελανοϊδίνης
Authors: Τσιακίρη Ελένη 
Published: September 2021

Στην παρούσα ερευνητική διαδικασία αρχικά παρασκευάστηκαν συνθετικά διαλύματα μελανοϊδίνης, μέσω της συμπύκνωσης της γλυκόζης με τα αμινοξέα γλυκίνη, λυσίνη, γλουταμινικό και ασπαραγινικό οξύ. Οι μελανοϊδίνες που προέκυψαν διαχωρίστηκαν σε μοριακά κλάσματα χαμηλής (<10 kDa) και υψηλής (>30 kDa) μοριακού βάρους, μέσω στηλών μοριακής διήθησης τύπου Αmicon, προκειμένου να ακολουθήσει ο χαρακτηρισμός των διάφορων προϊόντων μελανοϊδίνης ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση (δοκιμή πυρογαλλόλης και ABTS). Παρόμοια διαδικασία πραγματοποιήθηκε και στο φυσικό απόβλητο μελανοϊδίνης της βιομηχανίας ζυμών ΖΑΝΑΕ. Στην συνέχεια της μελέτης αυτής, διερευνήθηκε η βιολογική βιοαποικοδόμηση της μελανοϊδίνης (συνθετικής και πραγματικής), από διαλύματα της εύρους συγκεντρώσεων 1%- 50% v/v, με χρήση των βιοκαταλυτών της λακκάσης (οξειδάση), των βακτηριακών στελεχών Β. subtilis, T. thermophilus, E. coli και της ζύμης S. cerevisiae. Ο αποχρωματισμός της μελανοϊδίνης διαπιστώθηκε από όλα τα παραπάνω βιολογικά συστήματα μέσω της ελάττωσης της απορρόφησής της στα 475 nm και με μονάδες ADMI, ώστε να αποδοθεί στα ένζυμα της λακκάσης και της υπεροξειδάσης με ενζυμικές δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν με υπόστρωμα το ΑΒΤS. Ακολούθως με πειράματα μη αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης σε πηκτή ακρυλαμιδίου (native-PAGE), που πραγματοποιήθηκαν σε εξωκυττάρια εκχυλίσματα των μικροοργανισμών S. cerevisiae και Τ. thermophilus, αποδείχθηκε η έκκριση αυτών των δύο ενζύμων κατόπιν χρώσης τους με in situ βαφή με guaicol. Η βέλτιστη διαχείριση συνθετικών και πραγματικών αποβλήτων μελανοϊδίνης εκδηλώθηκε από τους μικροοργανισμούς Τ. thermophilus και S. cerevisiae με ποσοστά αποχρωματισμού πάνω από 90% και μέχρι 80%, αντίστοιχα. Εν συνεχεία, προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες αποχρωματισμού των φυσικών και συνθετικών αποβλήτων που περιεγράφηκαν, κύτταρα της ζύμης καθηλώθηκαν σε σωματίδια αλουμίνας και σφαιρίδια silica για να επιτευχθεί υψηλός έως πλήρης αποχρωματισμός των διαλυμάτων μελανοϊδίνης σε διάρκεια 48 ωρών, αντίστοιχα. Το ένζυμο της λακκάσης καθηλώθηκε επίσης σε σωματίδια αλουμίνας και σφαιρίδια γυαλιού για την διεξαγωγή της ίδιας βιοδιεργασίας, με σαφώς μικρότερα ποσοστά αποχρωματισμού. Εν κατακλείδι η μελέτη του βιοαποχρωματισμού των συνθετικών αποβλήτων μελανοϊδίνης γλυκόζης-γλυκίνης (10% v/v) ολοκληρώθηκε με τη διερεύνηση της βιο-ηλεκτρολυτικής οξείδωσης της μελανοϊδίνης, καταλυόμενης είτε από το ένζυμο της λακκάσης είτε από τον S. cerevisiae. Εν συνεχεία εκτιμήθηκε η ηλεκτροχημική συμπεριφορά και ο μηχανισμός στον οποίο συμμετέχουν όλα τα συστατικά τα οποία απαρτίζουν την ηλεκτρολυτική κυψέλη που κατασκευάστηκε, με πειράματα κυκλικής βολταμμετρίας. Ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιμοποιήθηκε αρχικά ένα ηλεκτρόδιο γραφίτη (GR) και μεταγενέστερα ένα που κατασκευάστηκε από ίνες άνθρακα, με διαμεσολαβητή φορτίου το ABTS (0.35 mM) ενώ ως φέροντας ηλεκτρολύτης επιλέχθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (100 mM KH2PO4-K2HPO4, pH=5). Σε σταθερή τιμή δυναμικού, ίση με +1,1 V, όπως εκτιμήθηκε με καμπύλες κυκλικής βολταμετρίας των συστημάτων των βιοκαταλυτών ABTS+Lac+MD και ABTS+Sac+MD, πραγματοποιήθηκαν πειράματα χρονο-αμπερομετρίας παρουσία του ηλετροδίου του γραφίτη. H τελική τιμή ρεύματος που καταγράφηκε και στις δύο περιπτώσεις ήταν 12 μΑ και το ποσοστό αποχρωματισμού που επιτεύχθηκε υπολογίστηκε περίπου 70% και στις δύο περιπτώσεις, μετά από την 6ωρη βιο-ηλεκτρολυτική διεργασία διαλύματος όγκου 40 mL. Όταν το ηλεκτρόδιο εργασίας αντικαταστάθηκε από αυτό που κατασκευάστηκε από ίνες άνθρακα η τελική τιμή του ρεύματος ήταν 1,76 mA ενώ το ποσοστό αποχρωματισμού ήταν το ίδιο. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κινητικά δεδομένα της ετερογενούς κατάλυσης για τα καθηλωμένα συστήματα του σακχαρομύκητα στα δύο μέσα (silica και αλουμίνα), εκτιμήθηκαν και συγκρίθηκαν με αυτά του ηλεκτροδίου (GR), με σταθερά ταχύτητας k ίση με 5,81*10-5 m/s, που είναι δύο τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη από αυτές των άλλων διεργασιών. Τα πειράματα αξιολόγησης του ποσοτικού προσδιορισμού της in vitro αντιοξειδωτικής δράσης της μελανοϊδίνης και των συστατικών της απέδειξαν ότι η συγκέντρωση αντιοξειδωτικών συστατικών κυμάνθηκε μεταξύ 0,89 και 1,6 mg/μL, αποτελώντας το εφαλτήριο για την μελέτη της βιοδραστικότητας των ουσιών αυτών έναντι των καρκινικών σειρών Τ24 και Α549. Οι δύο παραπάνω καρκινικές σειρές εκτέθηκαν στα συνθετικά προϊόντα μελανοϊδίνης της γλυκίνης, της λυσίνης, του γλουταμινικού και του ασπαραγινικού οξέος, και αποδείχθηκε ότι τη μέγιστη κυτταροτοξική δράση επέδειξαν τα AGEs της λυσίνης (IC50=2,5 μg/mL) και τη μικρότερη αυτά της γλυκίνης (IC50>20 μg/mL), με χρήση της μεθόδου SRB. Προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός μηχανισμός της τοξικής δράσης των ΑGEs πραγματοποιήθηκαν πειράματα που αφορούν την πρόκληση οξειδωτικού stress και τη λιπιδική υπεροξείδωση σε εξωκυττάρια εκχυλίσματα της κυτταρικής σειράς Α549 και σε ηπατικό εκχύλισμα μόσχου με τις μεθόδους NBT και ΜDA, παρουσία και απουσία ενός προοξειδωτικού παράγοντα (H2O2). Τα συνθετικά προϊόντα μελανοϊδίνης που προέκυψαν από τη γλυκόζη με τα αμινοξέα δεν επέδειξαν καμία χημειοπροστασία σε κύτταρα και σε καθαρά μιτοχόδρια in vitro, έναντι των ελεύθερων ριζών που σχηματίστηκαν από το H2O2, αλλά αντίθετα εκδηλώθηκε μάλλον έντονα ο προοξειδωτικός τους χαρακτήρας με την παρουσία των προϊόντων ROS και MDA να αυξάνεται παρουσία των AGEs παρά απουσία αυτών. Η ενζυμική δράση της SOD, όταν αυτή εκτιμήθηκε με υπόστρωμα την πυρρογαλόλη, πυροδοτήθηκε παρουσία των AGEs (35- 40 U/mL) παρά απουσία αυτών (5 U/mL). Οσον αφορά την πρόκληση φλεγμονής από τα AGEs, αυτή ελέγχθηκε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών της COX-1 και του ΤNF-α, παράγοντες που σχετίζονται με τη φλεγμονή του κυττάρου, σε εκχυλίσματα της κυτταρικής σειράς Α549, τα οποία έδωσαν θετικό σήμα.