Development of advanced cellular and molecular biosensors for the study of neurotransmitter interaction and prospects for applications in Biology and Medicine
Authors: Αποστόλου Θεοφύλακτος 
Published: May 2021

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επίδρασης των νευροδιαβιβαστών σε νευρικά κύτταρα και η ανάπτυξη προηγμένων μεθόδων στον τομέα της Νευροβιολογίας.Οι νευροδιαβιβαστές είναι μια ομάδα χημικών ουσιών που απελευθερώνονται από τις νευρικές απολήξεις και επιτρέπουν τη νευροδιαβίβαση, δηλαδή την ανταλλαγή σημάτων μεταξύ των νευρικών κυττάρων. Επίσης ονομάζονται ως χημικός αγγελιοφόρος ή χημικός πομπός λόγω της ικανότητάς τους να μεταδίδουν τα νευρικά σήματα από ένα νευρικό κύτταρο σε όλο το νευρικό σύστημα. Ο ακριβής αριθμός τους είναι άγνωστος, αλλά περισσότεροι από 200 χημικοί αγγελιοφόροι έχουν αναγνωριστεί.Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε ένα σύστημα μέτρησης της μεταβολής του ηλεκτρικού δυναμικού μιας κυτταρικής μεμβράνης. Η Βιοηλεκτρική Μέθοδος Αναγνώρισης (Bioelectric Recognition Assay - BERA) είναι μια μέθοδος για την ανίχνευση ιών και άλλων βιοδραστικών ουσιών με βάση τη μέτρηση των αλλαγών στις ηλεκτρικές ιδιότητες μιας κυτταρικής ομάδας. Είναι δυνατό να ανιχνευθούν ανθρώπινοι και φυτικοί ιοί με συγκεκριμένο, γρήγορο (λιγότερο από 3 λεπτά) τρόπο, αξιοσημείωτα αναπαραγώγιμο και οικονομικό. Η ευαισθησία της μεθόδου BERA είναι συγκρίσιμη με προηγούμενες ανοσολογικές, κυτταρολογικές και μοριακές τεχνικές.Η παρούσα διδακτορική διατριβή χωρίστηκε σε δυο ενότητες. Η πρώτη ενότητα αφορά την διερεύνηση της επίδρασης της ντοπαμίνης σε νευρικά κύτταρα και πιο συγκεκριμένα την ανάπτυξη μιας λειτουργικής δοκιμής για τη μελέτη της in vitro αλληλεπίδραση του νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη με νευρικά κύτταρα που φέρουν υποδοχείς ντοπαμίνης, με σκοπό την αξιολόγηση διαφόρων φαρμάκων που έχουν σαν στόχους υποδοχείς ντοπαμίνης. Η ιδέα βασίζεται στην εξαιρετικά ταχεία μέτρηση των αλλαγών που παρατηρούνται στις ηλεκτρικές ιδιότητες των καλλιεργημένων κυττάρων νευροβλαστώματος ποντικού (N2a). Αναλύοντας τα πειραματικά δεδομένα, παρατηρήθηκε μια σχετικά στενή σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης ντοπαμίνης και του δυναμικού κυτταρικής μεμβράνης. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε αποπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε υπερπόλωση κυτταρικής μεμβράνης. Η χρήση της ετικλοπρίδης, ενός ανταγωνιστή των D2-υποδοχέων της ντοπαμίνης, οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αποπόλωση της μεμβράνης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική εξασθένιση του φαινομένου της υπερπόλωσης της κυτταρικής μεμβράνης όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με χλωριούχο νάτριο. Όπως προσδιορίζεται από την κυκλική βολταμετρία, η βιοηλεκτρική απόκριση στην ντοπαμίνη συσχετίζεται εξαιρετικά με το πρότυπο "υπερχείλισης" της ντοπαμίνης από τα κύτταρα N2a. Η νέα προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε επιπρόσθετα για την αξιολόγηση της ντοπαμινεργικής δραστικότητας των εκχυλισμάτων του φυτού λυγαριά (Vitex agnus-castus) καθώς και της δραστικότητας δύο γνωστών αντιψυχωτικών, της αλοπεριδόλης και της ολανζαπίνης. Αυτή η νέα ιδέα προσφέρει πολλές ελπιδοφόρες προοπτικές για την ανάπτυξη ενός προηγμένου συστήματος για τον γρήγορο χαρακτηρισμό των αγωνιστών και ανταγωνιστών των νευροδιαβιβαστών,Η δεύτερη ενότητα αφορά τον έλεγχο της ύπαρξης μη χημικών, μακρινών κυτταρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ νευρικών κυττάρων. Ο μηχανισμός της επικοινωνίας μεταξύ κυττάρου προς κύτταρο και οι συντονισμένες κυτταρικές αποκρίσεις που παρουσιάζουν είναι κάτι που έχει απασχολήσει ιδιαίτερα την επιστημονική κοινότητα τα τελευταία χρόνια. Οι περισσότερες εργασίες επικεντρώνονται στις μη χημικές, μακρινές κυτταρικές αλληλεπιδράσεις (NCDCI) που είναι πιθανό να είναι υπεύθυνες για αυτήν την επικοινωνία. Πρόσφατα πειράματα έχουν προτείνει την θεωρία πεδίου της συνειδητής ηλεκτρομαγνητικής πληροφορίας (CEMI) ως πιθανή εξήγηση για αυτή την επικοινωνία κυττάρου προς κύτταρο. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιώντας έναν βιοηλεκτρικό βιοαισθητήρα, παρατηρήσαμε την εμφάνιση μακρινής επικοινωνίας μεταξύ κυττάρων νευροβλαστώματος τα οποία παρέχουν στοιχεία για αυτή τη θεωρία. Αυτή η παρατήρηση έγινε ταυτόχρονα με τις παρατηρήσεις μεταβολών στο δυναμικό μεμβράνης των ανθρώπινων κυττάρων νευροβλαστώματος SK-N-SH που φυσικά διαχωρίστηκαν μεταξύ τους. Τα κύτταρα χωρίστηκαν φυσικά σε δύο ομάδες. Σε μία ομάδα είχαμε τα "επαγωγικά" κύτταρα που διεγέρθηκαν με ντοπαμίνη, και στην άλλη ομάδα, είχαμε τα κύτταρα "ανιχνευτή" που έδειξαν συγχρονισμένη απόκριση στα κύτταρα "επαγωγέα", με το εύρος της απόκρισης να μειώνεται όταν η απόσταση αυξανόταν. Για να διερευνηθεί η φύση των μηχανισμών που προκαλούν τις παρατηρούμενες αλληλεπιδράσεις των κυττάρων, οι κυτταρικές καλλιέργειες διαχωρίστηκαν με φραγμούς που επιτρέπουν διαφορετικά μήκη κύματος να τους διαπερνούν ή υπεβλήθησαν σε επεξεργασία με βινβλαστίνη, ένα αλκαλοειδές, το οποίο δεσμεύει τη τουμπουλίνη, αναστέλλοντας έτσι τη συναρμολόγηση των μικροσωληνίσκων. Ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την επικοινωνία κυττάρου προς κύτταρο συζητείται σύμφωνα με τις παρατηρούμενες επιδράσεις των συντονισμένων αλλαγών στο δυναμικό της μεμβράνης.