Investigation of molecular parameters on cartilage regeneration in experimental models of cartilage defects and osteoarthritis
Authors: Μακρής Ελευθέριος 
Published: August 2021

Ο αρθρικός και ο ινώδης χόνδρος έχουν περιορισμένη ικανότητα αναγέννησης μετά από τραυματικές κακώσεις και παθήσεις των αρθρώσεων. Δεδομένου του κριτικού ρόλου των ιστών αυτών στην προστασία των αρθρικών οστικών δομών και στην εξασφάλιση σταθερών λειτουργικών αρθρώσεων, η ανάπτυξη μεθόδων που προάγουν την αναγέννηση ή / και την επιδιορθώση των ιστών αυτών ειναι εξαιρετικά σημαντική. Η επιστήμη της ανάπτυξης μηχανικών ιστών παρέχει σήμερα εξαιρετικές προοπτικές στη θεραπεία των εκφυλισμένων και παθολογικών χόνδρινων ιστών. Και ενώ μεγάλη πρόοδος έχει επιτευχθεί πρόσφατα ως προς την ανάπτυξη νεοχόνδρινων ιστών με θλιπτικές μηχανικές ιδιότητες ανάλογες των φυσικών ιστών, ωστόσο οι ιδιότητες εφελκυσμού των νεοϊστών ειναι συγκριτικά υποδιαίστερες. Ως εκ τούτου, η ανάγκη ανάπτυξης νέων βελτιωμένων μεθόδων για να δημιουργία λειτουργικών νεοϊστών και την αποτελεσματική αντιμετώπιση των περίπου 46.4 εκατομμυρίων ασθένών που υποφέρουν σήμερα από αρθρίτιδα μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, καθίσταται ιδιαίτερα επιτακτική.Δεδομένης της προόδου που έχει επιτευχθεί την τελευταία δεκαετία στην ανάπτυξη μηχανικών χόνδρινων ιστών, η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει τρεις γενικούς στόχους: 1) τη διερεύνηση νέων μοριακών/βιολογικών μεθόδων αναγέννησης του αρθρικού χόνδρου σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα χόνδρινων βλαβών και οστεοαρθρίτιδας, 2) την ανάπτυξη ή/και βελτίωση μεθόδων αναγέννησης νεοχόνδρινών ιστών με ευρεία κλινική εφαρμογή, και 3) την ανάπτυξη μεθόδων βιολογικής και μηχανικής ωρίμανσης των νεοϊστών και μεθόδων ενσωμάτωσης τους με το φυσικό ιστό μετά απο μεταμόσχευση. Για την επίτευξη των στόχων αυτών, η παρούσα διατριβή περιγράφει την διερεύνηση νέων εξωγενών βιολογικών παραγόντων για την ανάπτυξη μηχανικών νεοϊστών με δομική οργάνωση ανάλογης των αντίστοιχων φυσικών ιστών. Αρχικά, μελετήθηκε η χρήση του χαλκού και της υδροξυλυσίνης, δύο σημαντικών μεσολαβητών της φυσιολογικής διαδικασίας ανάπτυξης διασταυρώμενων δέσμών κολλαγόνου, για την ενίσχυση της περιεκτικότητας των διασταυρώμενων δεσμών κολλαγόνου στους μηχανικούς ιστούς. Αναλόγως, σε μια διαφορετική μελέτη διερευνήθηκε η in vitro καλλιέργεια φυσικών μυοσκελετικών ιστών και μηχανικών νεοϊστών σε υποξικό περιβάλλον, με στόχο την ενίσχυση της περιεκτικότητάς τους σε διασταυρώμενους δεσμούς κολλαγόνου, και ως εκ τούτου, τη βελτίωση των λειτουργικών τους ιδιοτήτων. Λαμβάνοντας υπόψη την εκταινώς περιγεγραμένη στη βιβλιογραφία θετική συσχέτιση μεταξύ της περιεκτικότητας διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου και εφελκυστικών μηχανικών ιδιοτήτων των νεοϊστών, μελετήθηκε μία νέα μέθοδος για την αύξηση αυτών των διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου βασιζόμενη στην εξωγενή χορήγηση του ενζύμου λυσυλική οξειδάση (LOX) κατά τη καλλιέργεια των νεοϊστών, με απώτερο στόχο την περαιτέρω ενισχυση των λειτουργικών τους ιδιοτήτων.Άλλες μελέτες της παρούσας διατριβής επικεντρώνονται στην ανάπτυξη μεθόδων ενίσχυσης της περιεκτικότητας των μηχανικών ιστών σε κολλαγόνο, που όταν συνδυάζονται με τις τεχνικές ενίσχυσης των διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου θα μπορούσαν να βελτιώσουν περαιτερώ την μηχανική ωρίμανση των νεοϊστών για την αποτελεσματική αποκατάσταση χόνδρινών ελλειμάτων σε πειραματικά μοντέλα αρθρικών παθήσεων. Ειδικότερα, δύο παράγοντες που είναι γνωστοί ρυθμιστές της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης του Ca2+ (η διγοξίνη και η τριφωσφορική αδενοσίνη), εξετάστηκαν ως εναλλακτικές μέθοδοι για τη μηχανική βελτίωση των ιστών μέσω αύξησης της περιεκτικότητάς τους σε κολλαγόνο και σε διασταυρούμενους δεσμούς κολλαγόνου. Επιπλέον, ανάλογες μελέτες επικεντρώθηκαν στην βελτίωση μιας θεραπευτικής αγωγής που περιλαμβάνει το βιοφυσικό παράγοντα χονδροϊτινάση-ABC (C-ABC) και τον βιοχημικό παράγοντα αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού -β1 (ΤGF-β1) με στόχο πάλι την ενισχύση τών λειτουργικών ιδιοτήτων των νεοχόνδρινων ιστών. Μια διαφορετική μελέτη εξέτασε την ικανότητα της εμβιομηχανικής διέγερσης με τη μορφή παθητικής αξονικής θλιπτικής φόρτισης να συμβάλλει σε in vitro ανάπτυξη νεοχόνδρινών ιστών με προδιαγεγραμμένο σχήμα/αρχιτεκτονική. Τέλος, μια πρόσθετη μελέτη διερεύνησε την χρήση χονδροκυττάρων απο την ποδοκνημική άρθρωση για την κατασκευή νεοχόνδρινων μοσχευμάτων προοριζόμενων για την βλάβες της ποδοκνημικής άρθρωσης.Καταλεικτικά, η παρούσα διατριβή διερεύνησε τη δυνατότητα ενσωμάτωσης του νεοχόνδρινου με τον φυσικό ιστό μέσω της εξωγενούς χορήγησης του ενζύμου LOX. Μια αρχική μελέτη διερεύνησε τη δυνατότητα του LOX να προώθηση της ενσωμάτωσης μεταξύ του νεοχόνδρου και του φυσικού αρθρικού χόνδρου σε in vitro περιβάλλον καλλιέργειας των ιστών. Ελπιδοφόρα αποτελέσματα αυτής της μέλετης οδήγησαν σε συνδυασμό του ενζύμου LOX με τους παράγοντες C-ABC και ΤGF-β1 με στόχο την ταυτόχρονη ενίσχυση της ωρίμανσης του νεοχόνδρου και τη ενσωμάτωση του με τον φυσικό αρθρικό χόνδρο. Ειδικότερα, ο συνδυασμός των παραγόντων αυτών εφαρμόστηκε πρώτα σε ένα in vitro μοντέλο ενσωμάτωσης των δύο ιστών, και στη συνέχεια σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο για τη διερεύνηση της ικανότητας του in νίνο περιβάλλοντος να ενισχύσει περαιτέρω της βιολογική αυτή διεργασία.Σε γενικές γραμμές, η σειρά των μελετών που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αντιπροσωπεύουν πρωτοπόρες και δυνητικώς κλινικά εφαρμόσιμες μοριακές μεθόδους για την ενίσχυση των λειτουργικών ιδιοτήτων ενός μεγάλου φάσματος κολλαγόνων ιστών και νεοϊστών. Συγκεκριμένα, ο χαλκός, η ενδογενής παραγώγη του ενζύμου LOX μέσω της καλλιεργειας των ιστών σε υποξίκό περιβάλλον, και η εξωγενή χορήγηση του LOX βελτιώνουν τις μηχανικές ιδιότητες των μηχανικών ιστών αναδεικνύοντας την ικανότητα στόχευσης της αύξησης των διαστραυρούμενων δεσμών κολλαγόνου για την ανάπτυξη βιομιμητικών και μηχανικά ισχυρών νεοχονδρινών ιστών. Εναλλακτικά, η διγοξίνη, η τριφωσφορική αδενοσίνη, ο C-ABC, ο ΤGF -β1, και η στατική εφαρμογή βάρους αποτελουν αποτελεσματικές μεθόδους για την ενίσχυση του κολλαγόνου και την αυξηση των διαστραυρούμενων δεσμών κολλαγόνου στους νεοϊστούς. Τέλος, η εξωγενής χορήγηση του LOX, μονομερώς ή σε συνδυασμό με τους παράγοντες C-ABC και ΤGF -β1, βρέθηκε να προάγει την in vitro και in vivo ωρίμανση των νεοϊστών και την ενσωμάτωση τους με το φυσικό ιστό, αντανακλώντας την πολλά υπόσχόμενη συνδιαστική χρήση των παραγόντων αυτών για την θεραπευτική αντιμετώπιση χόνδρινων βλαβών in νίνο. Συνολικά, οι μελέτες που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αποτελούν μια επισκόπηση διαφορετικών και πολλά υποσχόμενων νέων τεχνολογιών με στόχο 1) την ενίσχυση των μηχανικών ιδιοτήτων των φυσικών ιστών και νεοϊστών, και 2) την ενίσχυση των δυνατοτήτων τους να ενσωματώνονται in vitro, υπογραμμίζοντας τη δυνατότητα για εφαρμογή των τεχνολογιών αυτών στη ανάπτυξη κλινικά λειτουργικών νεοϊστών για την επιδιόρθωση και / ή αντικατάσταση των ιστών που έχουν καταστραφεί από τραυματισμό ή ασθένεια.