Establishment of the optimal administration schedule for cryptic telomerase peptides (hTERT) as cancer immunotherapy
Authors: Παπαδημητράκη Ελισάβετ 
Published: September 2021

Εισαγωγή. Η ενεργοποίηση της τελομεράσης συνδέεται με τον απεριόριστο κυτταρικό πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Blasco, 2005; Shay & Wright, 2000). Διασφαλίζοντας τη διατήρηση του μήκους των τελομερών πάνω από ένα κρίσιμο σημείο, η τελομεράση εμποδίζει την κυτταρική γήρανση ή απόπτωση των καρκινικών κύτταρων, επιτρέποντας έτσι την εξέλιξη του όγκου. Η τελομεράση, και ειδικότερα η καταλυτική υπομονάδα της, hTERT υπερεκφράζεται σε 85-90% των καρκίνων, γεγονός που την καθιστά δημοφιλή στόχο για αντικαρκινικές θεραπείες.Σχεδόν όλα τα καρκινικά αντιγόνα συμπεριλαμβανομένης της τελομεράσης, προέρχονται από αυτό-αντιγόνα, και επομένως είναι υποκείμενα ανοσολογικής ανοχής. Τα μόρια HLA-I μπορούν να δεσμεύσουν τόσο κυρίαρχα όσο και κρυπτικά πεπτίδια. Τα κυρίαρχα πεπτίδια έχουν ισχυρή συγγένεια με τα μόρια HLA-I, βρίσκονται συχνά στην κυτταρική επιφάνεια και είναι ανοσογονικά, ενώ τα κρυπτικά πεπτίδια δεν είναι τόσο συχνά, έχουν ασθενή συγγένεια με τα μόρια HLA-I, επιδεικνύοντας ασθενή ανοσογονικότητα ή πλήρη έλλειψη ανοσογονικότητας. Σε αντίθεση με τα κυρίαρχα πεπτίδια, τα κρυπτικά πεπτίδια εκφράζονται ελάχιστα και δεν προκαλούν ανοσολογική ανοχή. Αυτά τα χαρακτηριστικά των κρυπτικών πεπτιδίων τα καθιστούν ιδανικό στόχο για την ανοσοθεραπεία με πεπτιδικά εμβόλια. Επιπλέον, η χρήση μη- ειδικών αντιγόνων όγκων αποτελεί καλύτερη επιλογή για αντικαρκινικά εμβόλια, αφού η αποτελεσματικότητα τους δεν εξαρτάται από την χρήση ανοσορυθμιστικών μορίων (adjuvants) (Mavroudis et al., 2006; Menez-Jamet & Kosmatopoulos, 2009; Ruden & Puri, 2013).Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να υπερνικήσουμε την ανοσολογική ανοχή χρησιμοποιώντας κρυπτικά πεπτίδια. Εντούτοις, η σύνδεση των κρυπτικών πεπτιδίων με τα μόρια HLA είναι συνήθως ασταθής, με ασθενή ανοσογονικότητα παρεμποδίζοντας την ανταπόκριση και ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Πιο πρόσφατες έρευνες επικεντρώνονται στην ανάπτυξη βελτιστοποιημένων κρυπτικών πεπτιδίων με υψηλότερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA.Με βάση αυτή την προσέγγιση, το εμβόλιο μας, γνωστό ως Vx-001 (Vaxon Biotech,), αποτελείται από ένα κρυπτικό πεπτίδιο hTERT572 (RLFFYRKSV) χαμηλής χημικής συγγένειας και τη βελτιστοποιημένη του έκδοση, το hTERT572Y (YLFFYRKSV), στο οποίο έχει γίνει αντικατάσταση ενός αμινοξέος Αυτή η αλληλουχία στοχεύει στην ενίσχυση της συγγένειας του πεπτιδίου με τα μόρια HLA-I και μπορεί να παρακάμψει το ζήτημα της ανοχής. Έτσι αυξάνεται η ανοσογονικότητα του κρυπτικού πεπτιδίου όταν παρουσιάζεται από τα μόρια HLA-A* 0201 (το πιο συχνά εκφραζόμενο αλληλόμορφο, που υπάρχει στο 40-45% του πληθυσμού) χωρίς αλλοίωση της ειδικότητας του αντιγόνου (Mavroudis et al., 2006) .Στόχος της μελέτηςΟ σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός του αποτελεσματικότερου τρόπου χορήγησης ενός βελτιστοποιημένου και ενός φυσικού πεπτιδίου που προέρχονται από ένα κρυπτικό επίτοπο της τελομεράσης με βάση την ανοσιακή απάντηση που αυτά επάγουν όταν χορηγηθούν σε ασθενείς με ανθεκτικά νεοπλάσματα.Πρωταρχικός στόχος της μελέτης είναι να διευκρινισθεί ο βέλτιστος συνδυασμός ενεργητικής ανοσοποίησης με το τροποποιημένο πεπτίδιο TERT572Y και το φυσικό πεπτίδιο TERT572 με βάση την ισχύ της χημικής συγγένειας (avidity) και την συχνότητα (frequency) της διέγερσης των ειδικών για το φυσικό πεπτίδιο TERT572 Τ λεμφοκυττάρων ( CTL) που ενεργοποιούνται στους ασθενείς που έχουν εμβολιασθεί. Στη συνέχεια, ο βέλτιστος τρόπος χορήγησης χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό ασθενών με διάφορα νεοπλάσματα. Οι δευτερογενείς στόχοι της παρούσας μελέτης είναι α) η μελέτη της τοξικότητας του εμβολίου της τελομεράσης, β) η συσχέτιση της in vivo ανοσολογικής ανταπόκρισης με την κλινική έκβαση των ασθενών. Ασθενείς. Στην πρώτη φάση της μελέτης, για τον καθορισμό του πρωτοκόλλου εμβολιασμού, εντάχθηκαν 48 ασθενείς, ενώ συνολικά εντάχθηκαν 142 ασθενείς με διάφορα νεοπλάσματα. Όλοι πληρούσαν τα βασικά κριτήρια ένταξης, ήταν μεταξύ 18 και 80 ετών και σε γενική κατάσταση που δηλωνόταν βάσει του ECOG performance status (PS) 0 – 2. Παρουσίαζαν όλοι έκφραση του HLA-A*0201. Είχαν επάρκεια αιμοποιητικού συστήματος ,φυσιολογική ηπατική και νεφρική λειτουργία και είχαν λάβει αποτελεσματικές θεραπείες εκλογής για το νεόπλασμά τους πριν την ένταξη στη μελέτη αυτή.Κατά τη διάρκεια της μελέτης και τέσσερις εβδομάδες πριν και μετά από αυτή δεν έλαβαν καμία άλλη αντινεοπλασματική θεραπεία για τη νόσο τους είτε συστηματική (χημειοθεραπεία) είτε τοπική (ακτινοβολία). Επίσης κατά την ίδια περίοδο δεν ελάμβαναν κορτικοστεροειδή ή άλλη ανοσοκατασταλτική αγωγή. Πεπτίδια. Και τα δύο πεπτίδια, το 9-μερές κρυπτικό φυσικό πεπτίδιο TERT572 (RLFFYRKSV) και το τροποποιημένο TERT572Y (YLFFYRKSV), παράχθηκαν από την εταιρία Epytop ( Nimes, France) και αργότερα από την Pepscan (Lelystad, The Netherlands). Η ποιότητά τους πιστοποιήθηκε με ειδικές μεθόδους και δεν αλλοιώθηκε ακόμα και μετά από δύο έτη βαθιάς κατάψυξης στους -80°C.Δείγματα ασθενών. Η ανάλυση έγινε σε περιφερικό αίμα το οποίο ελήφθη από τους ασθενείς πριν την πρώτη χορήγηση, μετά την δεύτερη και την έκτη χορήγηση του πεπτιδίου, καθώς και πριν από κάθε αναμνηστική χορήγηση. Τα μονοπύρινα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν με φικόλη (Ficoll-Hypaque ,Sigma, UK), φυγοκεντρήθηκαν και διατηρήθηκαν στην κατάψυξη (Gibco/Invitrogen, Paisley, Scotland, UK) στους -80οC μέχρι τη μέτρηση της ανοσολογικής απάντησης.Πρωτόκολλα εμβολιασμών (Σχήμα Α,Β). Ολοι οι ασθενείς (no= 48) έλαβαν αρχικά δύο υποδόριες (s.c) ενέσεις του τροποποιημένου κρυπτικού πεπτιδίου TERT572Y στη δόση των 2mg κάθε τρεις εβδομάδες. Στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν (1:1 ) σε δύο ομάδες. Η μία ομάδα έλαβε 2mg του φυσικού πεπτιδίου TERT572, (σχήμα Α) ενώ η άλλη ομάδα συνέχισε τον εμβολιασμό με 2mg του τροποποιημένου πεπτιδίου TERT572Y (σχήμα Β). Ολοι οι ασθενείς έλαβαν έξι χορηγήσεις εκτός εάν παρουσίαζαν υποτροπή της νόσου, οπότε αποκλείονταν από τη μελέτη. Οι ασθενείς που δεν παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου συνέχισαν με τις αναμνηστικές χορηγήσεις με το φυσικό πεπτίδιο TERT572 και τις αιμοληψίες ανά 3 μήνες. Μέθοδοι. Η μέτρηση της ανοσολογικής ανταπόκρισης στη χορήγηση του φυσικού πεπτιδίου TERT572 έγινε με την μέτρηση της IFN-γ κυρίως με την μέθοδο Enzyme-Linked Immunosorbent Spot (ELISpot). Για την εξασφάλιση της μεγαλύτερης δυνατής αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων, η μέθοδος επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε ομάδα ασθενών σε ανεξάρτητες χρονικές στιγμές. Αποτελέσματα. Ο βέλτιστος τρόπος εμβολιασμού αποδείχτηκε η διαδοχική χορήγηση του τροποποιημένου πεπτιδίου ΤΕΡΤ572Υ ακολουθούμενου από το φυσικό πεπτίδιο ΤΕΡΤ572. Συγκεκριμένα, μετά την έκτη χορήγηση στους ασθενείς που έλαβαν 4 χορηγήσεις με το φυσικό πεπτίδιο TERT572, σε σχέση με τους ασθενείς που έλαβαν μόνο το τροποποιημένο πεπτίδιο TERT572Y, παρατηρήθηκαν τα εξής:Α) συχνότερα ανοσολογική ανταπόκριση (44% vs 17%) και με υψηλότερη χημική συγγένεια , και Β) υψηλότερη συγκέντρωση Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο (60 T cells/2x105 PBMC vs 10 T cells/2x105 PBMC, p=0.04). Επιπροσθέτως αναλύθηκαν τα κλινικά δεδομένα των ασθενών που εντάχθηκαν στην πρώτη φάση της μελέτης, ώστε να συσχετισθεί η ανοσολογική ανταπόκριση με την κλινική πορεία των ασθενών. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές τόσο στην συνολική επιβίωση (overall survival) όσο και στο διάστημα ελεύθερο υποτροπής (progression free survival) ανάμεσα στους ασθενείς που ανέπτυξαν ανοσολογική απάντηση στις ομάδες Α και Β. Ωστόσο όσοι ασθενείς από την ομάδα Α εμφάνισαν ανοσολογική απάντηση είχαν σημαντικά μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής σε σχέση με όσους δεν ανέπτυξαν ανοσολογική απάντηση ((13.5 vs. 3.5 mo; log-rank test p=0.01). Στην επόμενη φάση της μελέτης ο βέλτιστος τρόπος εμβολιασμού χρησιμοποιήθηκε σε ασθενείς με διάφορα νεοπλάσματα και σε πληθυσμό με Μη-μικροκυττταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Το εμβόλιο αποδείχτηκε καλά ανεκτό με ήπιο προφίλ τοξικότητας, κυρίως δερματική αντίδραση στο σημείο της χορήγησης. Δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες αυτοάνοσου τύπου κατά την διάρκεια της χορήγησης ή κατά την διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών μετά το τέλος της μελέτης και για τουλάχιστον 2 έτη.Οι ασθενείς που ανέπτυξαν ανοσιακή απάντηση είχαν καλύτερη κλινική έκβαση με μεγαλύτερο διάστημα μέχρι την υπότροπή (PFS 5.2 months; range, 0.9–51.8), σε σχέση με όσους δεν ανέπτυξαν ( PFS 2.2 months, range, 1.4–6.5; P = 0.0001). Σε πολύπαραγοντική ανάλυση η ανάπτυξη ανοσιακής απάντησης στους ασθενείς που εμβολιάσθηκαν αποδείχτηκε ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για καλύτερο PFS (HR = 3.35, 95% CI 1.7–6.7; P = 0.001), ενώ όσοι απέτυχαν να αναπτύξουν ανοσιακή απάντηση στον εμβολιασμό παρουσίασαν τάση για χειρότερη επιβίωση (HR = 2.0, 95% CI 1.0–4.0; P = 0.057).