Βιοχημική και μοριακή προσέγγιση του ρόλου του υαλουρονικού οξέος και του κολλαγόνου τύπου VI σε κυτταρικές σειρές από σύνδρομο Down
Authors: Σταχτέα Ξανθή 
Published: August 2021

Το σύνδρομο Down ή τρισωμία 21 αντιπροσωπεύει μία κατάσταση εγγενών μορφογενετικών διαταραχών, τα οποία οφείλονται σε ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 21 λόγω γενετικής διαταραχής κατά τη μείωση και την κυτταρική διαίρεση. Το μικρό ανάστημα, τα τυπικά χαρακτηριστικά του προσώπου, οι καρδιακές δυσμορφίες, η πρόωρη γήρανση και τη νόσος Alzheimer είναι μεταξύ των βασικών χαρακτηριστικών της ασθένειας. Παρατηρούνται επίσης μυοσκελετικές και ενδοκρινικές ανωμαλίες, ανωμαλίες στο αιμοποιητικό σύστημα με πιθανότητα εμφάνισης οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Ένα από τα πιο αξιοσημείωτα χαρακτηριστικά του συνδρόμου Down είναι το εύρος των χαρακτηριστικών γνωρισμάτων των ανθρώπων με τρισωμία 21. Η πιθανότητα εμφάνισης καθώς και η έκταση της σοβαρότητας των διάφορων συμπτωμάτων διαφέρει από άτομο σε άτομο, ανάλογα με το φαινότυπο και δεν παρατηρούνται όλα σε όλα τα έμβρυα και όλους τους ανθρώπους. Όσoν αφορά τη βιοχημική σύσταση, διάφορες μελέτες έδειξαν ότι ορισμένες διαφοροποιήσεις στον εξωκυττάριο χώρο, όπου παρατηρείται σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση του υαλουρονικού (HA), μπορεί να είναι η αιτία για την αυξημένη αυχενική διαφάνεια που παρατηρείται στα έμβρυα με τρισωμία 21 στα αρχικά στάδια κύησης. Επίσης, η σύνθεση του εξωκυττάριου χώρου φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρδιακών δυσλειτουργιών που αφορούν τη διαφοροποίηση στο λεγόμενο ‘ενδοκαρδιακό μαξιλάρι’ (endocardial cushion), και συγκεκριμένα στην κολποκοιλιακή βαλβίδα, τα οποία εξηγούν περίπου τις μισές από τις περιπτώσεις των εκ-γενετής καρδιοπαθειών, που συναντώνται στα άτομα με σύνδρομο Down. Γενικά το ΗΑ είναι ένα συστατικό του συνδετικού ιστού απαντάται στον εξωκυττάριο χώρο (ECM) των περισσότερων ιστών των σπονδυλωτών και βρίσκεται σε ιδιαίτερα υψηλή συγκέντρωση στους εμβρυϊκούς ιστούς και πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο επιτρέποντας την κυτταρική μετανάστευση κατά τη μορφογένεση και την επούλωση τραύματος. Ο πολυμερισμός του ΗΑ πραγματοποιείται στην εσωτερική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων και το προϊόν πολυμερισμού ‘εκβάλλει’ ή μετατοπίζεται μέσω της μεμβράνης στην εξωκυττάρια πλευρά του κυττάρου. Η σύνθεση του ΗΑ πραγματοποιείται από τις 3 συνθάσες του ΗΑ (ΗΑS), που είναι οι ΗΑS1, HAS2 και HAS3, οι οποίες έχουν διαφορετικές ενζυμικές ιδιότητες και πιθανώς διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες. Η ΗΑS2 εκφράζεται ευρέως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, είναι πολύ πιο ενεργή από την HAS1 και συνθέτει επίσης ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους. Η παραγωγή μεγάλων ποσών ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους μπoρεί να έχει σημαντικές επιδράσεις στη δομή και τον όγκο ενός ιστού. Συνεπώς, η βιοσύνθεση του ΗΑ εξαρτώμενη από την HAS2 πιθανώς να παίζει σημαντικό ρόλο σε αναπτυξιακές διαδικασίες που συμπεριλαμβάνουν την αύξηση και επέκταση των ιστών. Ο καταβολισμός του ΗΑ στον ECM οφείλεται κυρίως στην οικογένεια ενζύμων των υαλουρονιδασών και η αποικοδόμηση γίνεται κυρίως ενζυμικά, βηματικά, με τμηματική μείωση του μεγέθους του πολυμερούς. Εφόσον όπως προαναφέρθηκε, το ΗΑ ανάλογα με το μέγεθός του έχει και διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες, υποδηλώνοντας υψηλά ελεγχόμενο μονοπάτι διάσπασης. Το κολλαγόνο τύπου VI (COLVI) είναι συστατικό του ECM με καθολική παρουσία σε όλο το συνδετικό ιστό. Αποτελεί κύριο συστατικό των μικροϊνιδίων με σφαιρικούς σχηματισμούς (beaded filements) και απαντάται σε πληθώρα ιστών. Διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ακεραιότητας των ιστών παρέχοντας δομική σύνδεση μεταξύ διαφορετικών συστατικών στο συνδετικό ιστό, στη βασική μεμβράνη και στα κύτταρα. Είναι ένα ετεροτριμερές, αποτελούμενο από γενετικά διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες, την α1(VI), α2(VI) και την α3(VI). Έχει πολύπλοκη δομή με πολλά διαφορετικά τμήματα, και με το τμήμα της τριπλής έλικας να αποτελεί το 20% περίπου της συνολικής μάζας. Τα μονομερή του COLVI αποτελούνται από τριπλή έλικα μήκους 105nm που πλαισιώνεται σε κάθε άκρο από δύο σφαιρικές δομές. Oι αλυσίδες α1(VI) και α2(VI) είναι παρόμοιες σε δομή και μέγεθος (130-140 kDa), ενώ η α3(VI) αλυσίδα είναι πολύ μεγαλύτερη (250-350 kDa). Τα μόρια του κολλαγόνου συνδέονται γραμμικά με αντι-παράλληλο τρόπο προς διμερή, τα οποία σταθεροποιούνται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Τα διμερή συσωμματώνονται προς σχηματισμό τετραμερών, τα οποία εκκρίνονται στον ΕCM, όπου ενώνονται μέσω των τελικών τους άκρων (end-to-end) προς σχηματισμό μικροϊνιδίων με σφαιρικούς σχηματισμούς (beaded microfibrils). Τα μικροϊνίδια συχνά συσσωματώνονται πλευρικά σχηματίζοντας διασταυρούμενες δέσμες, οι οποίες αναφέρονται με διάφορα ονόματα στη βιβλιογραφία (Luse bodies, fusifοrm bodies or zebra collagen). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις αλυσίδες α1(VI) και α2(VI), COL6A1 και COL6A2, βρίσκονται στο χρωμόσωμα 21, ενώ το γονίδιο της αλυσίδας α3(VI), COL6A3, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2. Έχει βρεθεί ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ γενετικής ποικιλομορφίας στην περιοχή COL6A1 του χρωμοσώματος 21 και των εκ-γενετής καρδιοπαθειών στην τρισωμία 21. Επίσης η κατανομή του COLVI σε έμβρυα με τρισωμία 21 διαφέρει από αυτή στα φυσιολογικά έμβρυα, τόσο στα πόδια όσο και στο δέρμα από τον αυχένα. Yπερέκφραση των COL6A1 και COL6A2 και μεγαλύτερα ποσά κολλαγόνου τύπου VI έχει βρεθεί στο δέρμα ατόμων με τρισωμία 21. Το COLVI είναι κατανεμημένο με πιο ανώμαλο τρόπο, πιο πυκνά πακτωμένο, σε ανυψώσεις του δέρματος (elevations of skin) από ραχιαίες και πλευρικές περιοχές των μη-φυσιολογικών εμβρύων. Το COL6A1 εκφράζεται επίσης και σε ευρύτερη περιοχή δέρματος εμβρύων με τρισωμία 21 σε σχέση με το COL6A3. Συνεπώς διαφοροποιήσεις στην έκφραση και κατανομή του COLVI συμμετέχουν στο δερματικό οίδημα στα τρισωμικά έμβρυα. Συνεπώς, ανωμαλίες που αφορούν το COLVI μπορούν να ευθύνονται για ένα ευρύ φάσμα κλινικών φαινότυπων. Τέλος το COLVI έχει βρεθεί ότι δεσμεύεται στο υαλουρονικό και θέσεις δέσμευσης για το HA και την ηπαρίνη εντοπίζονται εντός του Ν-τελικού σφαιρικού άκρου των α3(VI) αλυσίδων.Ο μηχανισμός με τον οποίο η περίσσεια γενετικού υλικού του χρωμοσώματος 21 προκαλεί τα δυσμορφολογικά χαρακτηριστικά του συνδρόμου Down είναι άγνωστος. Ένας λόγος για τους ειδικούς φαινότυπους των ατόμων με σύνδρομο Down μπορεί να πηγάζει από την διαταραχή του ECM. Σκοπός αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη και αξιολόγηση του ρόλου του HA και του COLVI σε φυσιολογικούς και τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος. Αρχικά έγινε ανάπτυξη μεθόδου εκχύλισης του COLVI από ινοβλάστες δέρματος και το πρωτόκολλο περιλάμβανε εκχύλιση των κυττάρων με ρυθμιστικό διάλυμα ουρίας 8Μ (pH 7.5) για 16h στους 4 oC και ανάλυση Western σε αναγωγικές συνθήκες. Στη συνέχεια έγινε προσδιορισμός των συνθηκών καλλιέργειας των ινοβλαστών δέρματος για την ανάλυση, σε πρωτεϊνικό και γονιδιακό επίπεδο, COLVI και HA και επιλέχθηκε επώαση των κυττάρων παρουσία 10% ορού, χωρίς ασκορβικό. Επόμενος στόχος της διατριβής ήταν η σύγκριση φυσιολογικών και τρισωμικών ινοβλαστών δέρματος ως προς την έκφραση σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο, και στον εντοπισμό του COLVI και του HA. Αρχικά συγκρίθηκε η γονιδιακή έκφραση των τριών αλυσίδων του κολλαγόνου VI, της HAS2 και της HYAL2 σε φυσιολογικούς και τρισωμικούς ινοβλάστες και βρέθηκαν να είναι υψηλότερα τα επίπεδα των α1(VI), α2(VI) και HAS2 στα τρισωμικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν σε συμφωνία με τα αντίστοιχα από ιστούς ομφάλιου λώρου, όπου ο λόγος του αθροίσματος των α1(VI) και α2(VI) αλυσίδων προς την α3(VI) (α1 + α2 / α3), καθώς επίσης και ο λόγος της ΗΑS2 προς την HYAL2 (HAS2 / HYAL2) ήταν μεγαλύτερος στα κύτταρα με σύνδρομο Down από ότι στα φυσιολογικά. Στη συνέχεια συγκρίθηκε η πρωτεϊνική έκφραση των α1(VI) / α2(VI) αλυσίδων του COLVI από φυσιολογικούς και τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος και βρέθηκε ότι η έκφραση του COLVI είναι αυξημένη στα τρισωμικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά και η διαφορά αυτή του COLVI οφείλεται σε αυξημένη ενδογενή πρωτεϊνική έκφραση. Ακολούθησε σύγκριση των επιπέδων ΗΑ από τρισωμικούς και φυσιολογικούς ινοβλάστες δέρματος και βρέθηκε ότι τα τρισωμικά κύτταρα εμφανίζουν εμφανώς αυξημένα επίπεδα ΗΑ σε σύγκριση με τα φυσιολογικά. Με ανοσοκυτταροχημεία συγκρίθηκε ο εντοπισμός του COLVI και του ΗΑ σε φυσιολογικούς και τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι τα τρισωμικά κύτταρα παράγουν περισσότερο ΗΑ ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην χρώση του COLVI ενδοκυτταρικά. Επίσης πραγματοποιήθηκε μικροεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (confocal microscopy) για τον εντοπισμό των μορίων του ΗΑ και του COLVI σε φυσιολογικούς και τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος. Στους τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος βρέθηκε περισσότερο ΗΑ, με μεγαλύτερη διάχυση, κυρίως στο χώρο ανάμεσα από τα κύτταρα, σε σχέση με τους φυσιολoγικούς ινοβλάστες, στους οποίους το περίγραμμα των κυττάρων ήταν πιο καλά καθορισμένο. Στα τρισωμικά κύτταρα παρατηρήθηκαν επίσης σχηματισμοί του ΗΑ σε μορφή λεπτών ινών (cables) που ενώνουν τα κύτταρα μεταξύ τους. Το ενδοκυττάριο COLVI έδωσε εντονότερη χρώση στα τρισωμικά κύτταρα, τα οποία ήταν μεγαλύτερα σε μέγεθος. Επίσης δεν παρατηρήθηκε συνεντοπισμός των δύο μορίων, τόσο στους φυσιολογικούς όσο και στους τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος. Τέλος στους φυσιολογικούς ινοβλάστες δέρματος τα μικροϊνίδια του COLVI είναι πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα περικυτταρικά, ενώ στα τρισωμικά κύτταρα τα είναι πιο ανώμαλα κατανεμημένα και πακτωμένα προς σχηματισμό πιο παχέων μικροϊνιδίων. Τέλος και το ΗΑ φαίνεται να είναι αφθονότερο στα τρισωμικά κύτταρα με πολλά ενδοκυτταρικά κυστίδια, τα οποία αποδίδουν πιο έντονη χρώση. Επόμενος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί η σχέση μεταξύ του COLVI και του ΗΑ, σε προ- και μετα-μεταγραφικό στάδιο. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε σιώπηση της α2(VI) αλυσίδας, και αυτή βρέθηκε να έχει διαφορετική επίδραση σε φυσιολογικούς και σε τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος. Αναλυτικότερα, η σιώπηση της α2(VI) δεν προκαλεί στατιστικώς σημαντικές αλλαγές στην α1 αλυσίδα στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, ενώ στους τρισωμικούς εμφανίζει μικρή τάση αύξησης. Η α3(VI), μετά τη σιώπηση της α2, φαίνεται να μένει ανεπηρέαστη στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, ενώ παρουσιάζεται στατιστικώς σημαντικά αυξημένη στους τρισωμικούς. Η HAS2, η οποία μετά τη σιώπηση της α2(VI) στους φυσιολογικούς ινοβλάστες φαίνεται να έχει μια μικρή πτώση, στους τρισωμικούς εμφανίζεται στατιστικώς σημαντικά μειωμένη. Τέλος η HYAL2 παραμένει σταθερή μετά τη σιώπηση της α2(VI) τόσο στους φυσιολογικούς όσο και στους τρισωμικούς ινοβλάστες δέρματος.Επόμενος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης του COLVI και ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους στη γονιδιακή έκφραση του COLVI, της HAS2 και της HYAL, στην πρωτεϊνική έκφραση του COLVI, στην έκκριση του HA και στον εντοπισμό των δύο μορίων, σε φυσιολογικούς ινοβλάστες δέρματος. Αρχικά βρέθηκε ότι η παρουσία COLVI στο υπερκείμενο φυσιολογικών ινοβλαστών δεν επιφέρει στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση κανενός από τα μόρια που μελετήθηκαν. Το ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους στο υπερκείμενο προκάλεσε αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης των α1/α2 αλυσίδων του κολλαγόνου VI. Ως προς τον εντοπισμό των μορίων, η προσθήκη ΗΑ μεγάλου μοριακού βάρους στο υπερκείμενο των κυττάρων, επέφερε εντονότερη χρώση για το ΗΑ ενώ δεν επέφερε σημαντικές διαφορές στο COLVI. Η προσθήκη COLVI επιφέρει αξιοσημείωτη αύξηση της χρώσης του ΗΑ, και αύξηση της χρώσης του COLVI. Η επώαση φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος παρουσία υπερκείμενου καλλιέργειας τρισωμικών ινοβλαστών προκάλεσε αύξηση του ρυθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού των φυσιολογικών κυττάρων και αύξηση στη χρώση του HA μεταξύ των κυττάρων. Τέλος, μελετήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία η επίδραση του ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους στο σχηματισμό μικροϊνιδίων COLVI σε φυσιολογικούς ινοβλάστες δέρματος και βρέθηκε ότι όταν τα κύτταρα επωάστηκαν παρουσία ΗΑ, δεν σχηματίστηκαν μικροϊνίδια COLVI και μειώθηκε δραματικά η χρώση του COLVI ενδο- και εξω-κυτταρικά.Συνοπτικά από τη διδακτορική διατριβή προκύπτει ότι οι ινοβλάστες δέρματος από τρισωμικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα COLVI και ΗΑ σε συμφωνία με τα αντίστοιχα ευρήματα για τα δυο αυτά μόρια στους ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι ινοβλάστες δέρματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αξιόπιστο μοντέλο για τη μελέτη του σύνδρομου Down in vitro. Με βάση αυτό, οι ινοβλάστες δέρματος χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του ρόλου του COLVI και του ΗΑ στην παθολογία του σύνδρομου Down καθώς και τον τρόπο αλληλεπίδρασης των δυο μορίων σε προ-και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Βρέθηκε ότι είναι δυνατόν να υπάρχει μια συντονισμένη ρύθμιση στη γονιδιακή έκφραση της α2(VI) αλυσίδας και της ΗAS2 σε γονιδιακό/μεταγραφικό επίπεδο στα τρισωμικά κύτταρα. Σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, η προσθήκη COLVI στο υπερκείμενο φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος βρέθηκε να επιφέρει αύξηση στη χρώση του ΗΑ ενώ η προσθήκη ΗΑ υψηλού μοριακού βάρους βρέθηκε να αναστέλλει το σχηματισμό μικροϊνιδίων COLVI. Συνοπτικά από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι η αλληλεπίδραση του ΗΑ με το COLVI και η διαταραχή του COLVI στον ECM μπορεί να εξηγεί και την αύξηση των επιπέδων του ΗΑ στο σύνδρομο Down.