Διερεύνηση των επιγενετικών μεταβολών του DNA μετά τη χορήγηση ηρωίνης ή κοκαΐνης
Authors: Φράγκου Δομνίκη 
Published: August 2021

Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν η μελέτη της καθολικής μεθυλίωσης του DNA στον εγκέφαλο και στο ήπαρ επίμυων μετά από χορήγηση κοκαΐνης ή ηρωίνης. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με υπεριώδη ανίχνευση. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η σταθερότητα των δειγμάτων κάτω από διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης και χειρισμούς και τελικά, η μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε στην ανάλυση των δειγμάτων.Αφορμή για την πραγματοποίηση της εν λόγω διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διαπίστωση ότι οι επιγενετικές δράσεις της κοκαΐνης και της ηρωίνης δεν έχουν μελετηθεί, παρ’ όλο που ο επιστημονικός κλάδος της επιγενετικής γνωρίζει συνεχώς αυξανόμενο επιστημονικό ενδιαφέρον. Για το σκοπό της διατριβής, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες των εννέα επίμυων, από τις οποίες οι δύο έλαβαν κοκαΐνη ή ηρωίνη βάσει πρωτοκόλλων που μιμούνται τον εθισμό στους ανθρώπους και οι άλλες δύο χρησιμοποιήθηκαν ως οι αντίστοιχοι μάρτυρες. Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση τα ζώα θανατώθηκαν και αφαιρέθηκαν τα όργανά τους, τα οποία κατόπιν εμβάπτισης σε υγρό άζωτο αποθηκεύτηκαν στους -80°C. Με κατάλληλα πρωτόκολλα απομόνωσης του DNA ελήφθη υψηλής καθαρότητας γενετικό υλικό, το οποίο στη συνέχεια υδρολύθηκε ενζυματικά για να διασπαστεί στα επιμέρους νουκλεοτίδια. 10 μg υδρολυμένου DNA αναλύθηκαν με HPLC-UV. Η συγκεκριμένη μέθοδος αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για τον ποιοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων βάσεων του DNA και της πέμπτης βάσης, της 5-mdC και για την ποσοτικοποίηση δύο εξ αυτών, της 5-mdC και της dC. Η μέθοδος παρουσίασε γραμμικότητα, πολύ καλό διαχωρισμό και υψηλή επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό της 5-mdC έναντι της συνολικής κυτοσίνης. Μετά από επεξεργασία και ανάλυση 72 δειγμάτων ιστών, συγκρίθηκε η καθολική μεθυλίωση στο ήπαρ και στον εγκέφαλο μεταξύ των πειραματοζώων που έλαβαν ηρωίνη ή κοκαΐνη και των αντίστοιχων υγιών μαρτύρων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στην καθολική μεθυλίωση μεταξύ πειραματοζώων και μαρτύρων και για τους δύο ιστούς που μελετήθηκαν. Επιπρόσθετα, η % 5-mdC βρέθηκε πάντα να είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στον εγκέφαλο από ότι στο ήπαρ και στις τέσσερις ομάδες επίμυων. Η απουσία μεταβολών στην καθολική μεθυλίωση του DNA μετά τη χορήγηση ηρωίνης και κοκαΐνης ενδεχομένως οφείλεται σε αντισταθμιζόμενες επιδράσεις αυτών των ουσιών σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος. Είναι πιθανό κάποιες περιοχές του DNA να υπο-μεθυλιώνονται, ενώ κάποιες άλλες να υπερ-μεθυλιώνονται διατηρώντας έτσι τα συνολικά επίπεδα μεθυλίωσης αμετάβλητα. Εκτός αυτού, είναι εξίσου πιθανό να υπάρχουν διαφορετικές επιγενετικές επιδράσεις σε διαφορετικές ανατομικές περιοχές του ήπατος και του εγκεφάλου. Τέλος, μία άλλη αιτία μπορεί να είναι η ενεργοποίηση των φυσικών προστατευτικών μηχανισμών του γονιδιώματος, όπως είναι η de novo μεθυλίωση (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπομεθυλίωση) ή η απομεθυλίωση του DNA, με πρώτο στάδιο το σχηματισμό της 5-hmdC (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπερμεθυλίωση). Περαιτέρω διερεύνηση σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος, στις διάφορες ανατομικές περιοχές των οργάνων, καθώς και σε άλλους παράγοντες, όπως η 5-hmdC και οι DNMTs, θα μπορέσουν να απαντήσουν στα παραπάνω ερωτήματα.