In vitro μελέτη του ρόλου των αυξητικών παραγόντων στον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και διήθηση κυττάρων οστεοσαρκώματος
Authors: Δάτσης Γεώργιος-Αλέξανδρος 
Published: September 2021

Υπόβαθρο: Το οστεοσάρκωμα είναι ο πιο συχνός κακοήθης όγκος των οστών σταπαιδιά και τους εφήβους, με συχνότητα 4,4/1000000. Παρά την σημαντική αύξησητου ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με οστεοσάρκωμα τις τελευταίες δεκαετίες,γεγονός που οφείλεται στην έγκαιρη διάγνωση και την χρήση της χημειοθεραπείας, ηκυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και ηπαρουσία μεταστάσεων εξακολουθεί να αποτελεί ένα σημαντικότατο αρνητικόπρογνωστικό παράγοντα.Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων έχουν οι σύνθετεςαλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, του εξωκυτταρίου χώρου (ECM)και των γειτονικών φυσιολογικών κυττάρων. Η σύσταση της ECM επηρεάζεισημαντικές λειτουργίες των φυσιολογικών και των καρκινικών κυττάρων, όπως οπολλαπλασιασμός, η προσκόλληση, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση. Ένα απότα κύρια συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και της κυτταρικής μεμβράνης είναι οιπρωτεογλυκάνες (PGs), οι οποίες μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού ή διαμέσου τωνγλυκοζαμινογλυκανικών (GAGs) τους αλυσίδων, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν μεμακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως το κολλαγόνο, οι αυξητικοί παράγοντες,οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και τα μόρια προσκόλλησης,συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών.Η παραθυρεοειδής ορμόνη είτε ως μια ενδογενώς παραγόμενη ορμόνη είτε ωςένας εξωγενώς χορηγούμενος αντιοστεοπορωτικός παράγοντας διαδραματίζεικομβικό ρόλο στην φυσιολογία του οστού. Ωστόσο παραμένει εν πολλοίς άγνωστη ησημασία της δράσης της σε πρωτογενής όγκους των οστών όπως το οστεοσάρκωμαΣκοπός: η μελέτη της επίδρασης τμημάτων της παραθυρεοειδούς ορμόνης στηνμετανάστευση κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος ανθρώπου καθώς και ο προσδιορισμός των αλλαγών εκείνων του εξωκυτταρίου χώρου που επάγονται απόαυτήν και μεταβάλουν την μεταναστευτική ικανότητα αυτών των κυττάρων. Επίσης ηδιερεύνηση των πιθανών εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων μονοπατιώνσηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση της συγκεκριμένης κυτταρικήςλειτουργίαςΑποτελέσματα: Στα πλαίσια της παρούσας έρευνας μελετήθηκε εάν οι αλλαγές τουμεταβολισμού του υαλουρονικού (ΗΑ) που επάγονται από τα πεπτίδια ΡΤΗ ( 1-34)και ΡΤΗ (7-84) της παραθορμόνης, σε μετρίως (MG63) και καλά διαφοροποιημένες(Saos 2) κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, συσχετίζονται με την μεταναστευτικήικανότητα των κυττάρων αυτών. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι ηδιαλείπουσα χορήγηση ΡΤΗ (1-34) οδήγησε σε σημαντική αύξηση (Ρ ≤0,01 ) τηςμετανάστευσης των κυττάρων MG63, αύξηση της έκφρασης της συνθάσης του ΗΑ,ΗΑS-2 (Ρ ≤0,001) και στην ενισχυμένη εναπόθεση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑστον περικυττάριο χώρο. Τόσο η αύξηση της ενδογενούς παραγωγής ΗΑ (Ρ ≤0,01)όσο και η εξωγενής χορήγηση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ βρέθηκαν νασυσχετίζονται (Ρ ≤0,05) με μία σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότηταςτης κυτταρικής σειράς MG63. Επιμόλυνση με siHAS2 έδειξε ότι η ΡΤΗ (1-34),κυρίως μέσω της HAS2, ενισχύει την παραγωγή του ΗΑ και ρυθμίζει την κυτταρικήκινητικότητα των MG63 κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνεχής χορήγηση ΡΤΗ(1-34) διεγείρει στα Saos 2 κυττάρα την έκφραση της HAS2 (Ρ ≤0,001) και της HAS1(Ρ ≤ 0,001 ) ισομορφής, ενώ αναστέλλει την έκφραση της υαλουρονιδάσης-2(HYAL2) (Ρ ≤0,001) και ενισχύει μέτρια τη μετανάστευσή τους (Ρ ≤ 0,05). Ως εκτούτου, η ΡΤΗ (1-34) κατά τρόπο που εξαρτάται από την μέθοδο χορήγησης τηςφαίνεται να ρυθμίζει σημαντικά την μεταναστευτική ικανότητα των MG63 και Saos2κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος. Συμπερασματικά, τα δεδομένα που προκύπτουν αναδεικνύουν την ύπαρξη μιας ρυθμιστικής επίδρασης της ΡΤΗ (1-34),κατά ένα χρονικά εξαρτώμενο τρόπο χορήγησης, στον μεταβολισμό του ΗΑ γεγονόςπου οδηγεί σε μεταβολές στη μετανάστευση των κυττάρων οστεοσαρκώματος.Κατόπιν θελήσαμε να ερευνήσουμε την συμμετοχή και άλλων πιθανών μονοπατιώνδιαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) ρυθμίζει την μεταναστευτική ικανότητα τωνκυττάρων του οστεοσαρκώματος προξενώντας μεταβολές στην σύνθεση τουεξωκυτταρίου και περικυτταρίου χώρου. Έτσι, ερευνήσαμε την πιθανή συμμετοχήτης σηματοδότησης του FGF2 (αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών 2) στην ΡΤΗ (1-34)-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση του οστεοσαρκώματος. Η χορήγηση FGF2σε κύτταρα οστεοσαρκώματος οδήγησε σε σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01) τηςκυτταρικής μετανάστευσης των MG63, παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από τηνΡΤΗ (1-34). Η mRNA ανάλυση της έκφρασης των κυττάρων στα οποία χορηγήθηκεΡΤΗ (1-34) έδειξε μία έντονη αύξηση του FGF2, σε επίπεδο μεταγραφής (Ρ =0,0015). Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του FGF2 σε κύτταρα MG63 οδήγησε σεσημαντική καταστολή της έκφρασης της διγλυκάνης, μιας μικρής πλούσιας σελευκίνη πρωτεογλυκάνης, τόσο σε επίπεδο mRNA (P ≤ 0,0001) όσο και σε επίπεδοπρωτεΐνης (60%). Προκειμένου να εξεταστεί η σημασία της διγλυκάνης στηνκυτταρική μετανάστευση των MG63 κυττάρων πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση μεsiRNA ειδικών για την διγλυκάνη, με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01)στην ικανότητα μετανάστευσης των κύτταρων αυτών. Σε αντίθεση, η εξωγενήςχορήγηση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης διγλυκάνης ανέστειλε έντονα τηνμετανάστευση αυτών των κυττάρων (P ≤ 0,01). Τέλος, διαπιστώθηκε μια άμεσησυσχέτιση μεταξύ της δράσης της PTH (1-34) και της έκφρασης της διγλυκάνης μεσημαντική μείωση (P ≤ 0,01) σε επίπεδο μεταγραφής της διγλυκάνης στα κύτταραστα οποία χορηγήθηκε PTH (1-34). Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ένα νέο συνεργικό μηχανισμό δράσης της ΡΤΗ (1-34) με τον FGF2 που οδηγεί σεμεταβολές της παρουσίας της διγλυκάνης στον εξωκυττάριο χώρο, οι οποίες με τηνσειρά τους προξενούν μεταβολές στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης τουοστεοσαρκώματος. Λαμβάνοντας υπόψην τη σημασία του TGFβ στα οστά καθώς καιτην ρυθμιστική επίδραση που έχει η διγλυκάνη σε αυτόν και προκειμένου ναδιαπιστωθεί η αναγκαιότητα του TGFβ για τη μετανάστευση των κυττάρων τουοστεοσαρκώματος δημιουργήθηκαν κύτταρα MG63 ελλιπή σε διγλυκάνη στα οποίαπροστέθηκε αντίσωμα έναντι του TGFβ. Διαπιστώθηκε ότι ενώ τα κύτταρα που ήτανελλιπή σε διγλυκάνη παρουσίασαν αύξηση της μεταναστευτικής δραστηριότηταςτους (Ρ<0.01), τα ελλιπή σε διγλυκάνη κύτταρα στα οποία είχε επίσης προστεθεί τοαντίσωμα anti-TGFβ1 δεν κατόρθωσαν να αυξήσουν την μεταναστευτικήδραστηριότητά τους γεγονός που καταδυκνύει την σημασία του TGFβ1 στηνμεταναστευτική ικανότητα τους. Λαμβάνοντας υπόψην την σημασία που έχει ησυνδεκάνη 4 στην βιολογία διαφορετικών καρκινικών κυττάρων καθώς και τηνσημασία του συμπλόκου FGFR/συνδεκάνη 4 στην επίτευξη αυτού του ρόλουθελήσαμε να διαπιστώσουμε την σημασία της συνδεκάνη 4 στην μετανάστευση τωνκυττάρων οστεοσαρκώματος ΜG63. Έτσι προχωρήσαμε στην δημιουργία κυττάρωνMG63 ανεπαρκών σε συνδεκάνη 4 (siSynd4) στα οποία χορηγήσαμε FGF2 καιδιαπιστώσαμε οτι αυτά δεν παρουσίασαν την αναμενόμενη αύξηση στην ικανότητατους να μεταναστεύουν.Κατα αυτόν τον τρόπο δείξαμε οτι η συνδεκάνη 4 αποτελείένα απαραίτητο μόριο στο μηχανισμό με τον οποίο ο FGF-2 επιτυγχάνει την αύξησητης κυτταρικής μετανάστευσης των MG63 κυττάρων.Συμπεράσματα: Mε την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκαν 2 πιθανοί μηχανισμοίδιαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) επιτυγχάνει τη δράση της στη μεταναστευτικήικανότητα των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. 1ος Μηχανισμος: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας τον μεταβολισμό του υαλουρονικούοξέος (ΗΑ) αυξάνει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων τουοστεοσαρκώματος.2ος Μηχανισμός: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας την σύνθεση της διγλυκάνης με τηδιαμεσολάβηση του FGF-2 κατορθώνει να μεταβάλλει τη μεταναστευτική ικανότητατων κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Σε αυτή τη δράση του FGF-2 κρίσιμο ρόλοέχει η συνδεκάνη 4.