Επίδραση του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού-β1 (TGF-β1) στην παραγωγή ιντερλευκίνης-6 (IL-6), προσταγλανδίνης (PGE2) και του ενδογενούς αναστολέα των μεταλλοπρωτεϊνασών-1 (ΤΙΜP-1) από ινοβλάστες αρθρικού υμένα και χονδροκύτταρα αρθρικού χόνδρου ασθενών με οστεοαρθρίτιδα
Authors: Γούρα Σοφία 
Published: August 2021

Στη παρούσα διατριβή μελετάται η επίδραση του TGF-β1 στην έκφραση και παραγωγή της IL-6, της PGE2 και του ΤΙΜΡ-1 από ινοβλάστες αρθρικού υμένα και χονδροκύτταρα αρθρικού χόνδρου, και γίνεται διερεύνηση των σηματοδοτικών μονοπατιών που διαμεσολαβούν στην επίδραση αυτή, με σκοπό τη διελεύκανση και αξιολόγηση του ρόλου που παίζει τελικά ο TGF-β1 στη παθογένεια της ΟΑ, γεγονός που θα συμβάλλει στη πιθανή επιλογή του ή όχι ως στόχου για την θεραπευτική αντιμετώπιση της ασθένειας. Υλικά και ΜέθοδοιΌλα τα πειράματα της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκαν με κύτταρα τύπου ινοβλάστης και χονδροκύτταρα που απομονώθηκαν από τον Αρθρικό Υμένα (ΑΥ) και τον Αρθρικό Χόνδρο (ΑΧ), αντίστοιχα, ασθενών που έπασχαν από Ρευματοειδή Αρθρίτιδα ή Οστεοαρθρίτιδα και είχαν υποβληθεί σε ολική αρθροπλαστική. Τα επίπεδα της IL-6, της PGE2 και του ΤΙΜΡ-1 στο μέσο καλλιέργειας των ινοβλαστών και των χονδοκυττάρων προσδιορίστηκαν με ELISA. Η διαπίστωση της έκφρασης στο επίπεδο του mRNA των, IL-6, COX-1, COX-2, MKP-1 και PAI-1, των υπομονάδων Χ, Υ, Ζ του πρωτεασώματος, και των υποδοχέων του TGF-β1, TβRI και TβRII, έγινε με RT-PCR με τη χρήση ειδικών εκκινητών.H διαπίστωση της ενεργοποίησης των ERK1/2 έγινε με ανοσοαποτύπωση western, και προσδιορισμός των ενδοκυττάριων αλλά και των παραγόμενων και ελευθερούμενων ROS πραγματοποιήθηκε με φθορισμομετρία Αποτελέσματα1. Επίδραση του TGF-β1 στην παραγωγή PGE2 από ινοβλάστες και χονδροκύτταρα σε καλλιέργεια Ο TGF-β1 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στη παραγωγή της PGE2 τόσο από τις ινοβλάστες όσο και από τα χονδροκύτταρα, κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία παρέμεινε σταθερή μετά από καλλιέργεια για 24 μέχρι 48 ώρες. Η επαγόμενη από τον TGF-β1 παραγωγή της PGE2 κατεστάλλει πλήρως τόσο από την ινδομεθακίνη όσο και από τους ειδικούς αναστολείς SC-560 για τη COX-1 και NS-398 για τη COX-2. Ο TGF-β1 ήταν ικανός να επάγει την έκφραση και των δύο κυκλοοξυγονασών κατά χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, μέχρι τις 2 ώρες, και στα δύο είδη κυττάρων, η οποία καταστέλονταν σημαντικά παρουσία είτε του αναστολέα της COX-1, SC-560, είτε του αναστολέα της COX-2, NS-398. Με τη χρήση των αναστολέων των πρωτεϊνικών κινασών, ΡΚΑ, PKC και κινασών τυροσίνης, Η-89, Calphostin C και Genestein, αντίστοιχα, και των αναστολέων των ΜΑΡ κινασών JNK1-3, SP600125, και ΜΕΚ1/2, U0126, δείχτηκε ότι στην επαγόμενη από τον TGF-β1 παραγωγή της PGE2 και στα δύο είδη κυττάρων, εμπλέκονται η PKC και κινάσες τυροσίνης αλλά και οι ΜΑΡ κινάσες JNK και Erk1/2 πιθανόν μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1. 2. Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες και χονδροκύτταρα σε καλλιέργεια Ο TGF-β1 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στην έκφραση της IL-6 τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA κατά δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενο τρόπο, και στα δύο είδη κυττάρων. Με τη χρήση των αναστολέων των πρωτεϊνικών κινασών, ΡΚΑ, PKC και κινασών τυροσίνης, Η-89, Calphostin C και Genestein, αντίστοιχα, και των αναστολέων των ΜΑΡ κινασών JNK, ΜΕΚ1/2 και p38, U0126, SP600125 και SB203580, αντίστοιχα, δείχτηκε ότι στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6 και στα δύο είδη κυττάρων, εμπλέκονται κυρίως οι κινάσες τυροσίνης και οι ΜΑΡ κινάσες, πιθανόν μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1, και σε μικρότερο βαθμό η ΡΚΑ και PKC. Με πειράματα χρονοεπίδρασης και ανοσοαποτύπωση western δείχτηκε ότι ο TGF-β1 προκάλεσε τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των Erk1/2, φτάνοντας σε μέγιστο στα 5-15 min και στη συνέχεια ακολουθόντας πτωτική πορεία μέχρι τα 120min, υποδηλωτικό ότι οι Erk1/2 αποφωσφορυλιώνονται με τη δράση κάποιας φωσφατάσης, πιθανόν της MKP-1, της οποίας την έκφραση δείχτηκε ότι επάγει ο TGF-β1. Η επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες κατεστάλλει μερικώς παρουσία των αναστολέων του πρωτεασώματος (MG-132 και Εpoxomicin) ή του αναστολέα ενεργοποίησης του NF-κB, Bay 11-7085, υποδηλωτικό ότι ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB μέσω μάλλον της ενεργοποίησής του από το μονοπάτι ουβικιτίνης/πρωτεασώματος εμπλέκεται στην έκφραση της IL-6, αφού δείχτηκε ότι ο TGF-β1 μπορούσε να διεγείρει την έκφραση και των τριών υπομονάδων του πρωτεασώματος στις ινοβλάστες ΑΥ. Ο TGF-β1 είχε επίσης την ικανότητα να προκαλεί τόσο άμεση και παροδική, όσο και αργή και παρατεταμένη παραγωγή ROS από τις ινοβλάστες ΑΥ και χονδροκύτταρα ΑΧ, μέσω της διέγερσης της έκφρασης κάποιας NADPH οξειδάσης (Nox), τα οποία φαίνεται να εμπλέκονται στην έκφραση της IL-6, αφού αυτή κατεστάλλει σημαντικά παρουσία του αναστολέα των Nox, DPI, και των αντιοξειδωτικών γλουταθειόνης (GSH) και Ν-ακέτυλο-κυστεΐνης (NAC), και ενός ειδικού συλλέκτη ενδοκυτταρικών ROS του WR-1065. Στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες ΑΥ και χονδροκύτταρα ΑΧ φαίνεται ότι εμπλέκεται και η PGE2, τη παραγωγή της οποίας διέγειρε ο TGF-β1, αφού η ινδομεθακίνη προκάλεσε μερική καταστολή της έκφρασης της IL-6 από τον TGF-β1. Από όλους τους παραπάνω παράγοντες, που εμπλέκονται στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες ΑΥ, μόνο οι πρωτεϊνικές κινάσες ΡΚΑ και PKC, και οι JNK ΜΑΡ κινάσες φαίνεται να συμμετέχουν στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση του αναστολέα-1 των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου (ΡΑΙ-1), ενός παράγοντα του οποίου η έκφραση είναι κατ΄εξοχήν εξαρτώμενη από το μονοπάτι TGF-β1 / SMADs, ενδεικτικό ότι η επαγωγή της έκφρασης της IL-6 και του ΡΑΙ-1 από τον TGF-β1 διαμεσολαβείται από διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Πράγματι, ο ειδικός αναστολέας φωσφορυλίωσης των SMADs, SB431542, προκάλεσε πολύ μικρή καταστολή στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6. Αντίθετα οι αναστολείς AG 1478 (αναστολέας ενεργοποίησης των υποδοχέων του EGF) και Gleevec (αναστολέας ενεργοποίησης των υποδοχέων του PDGF) προκάλεσαν σημαντική καταστολή της επαγόμενης από TGF-β1 παραγωγής της IL-6, ενδεικτικό της εμπλοκής των EGFR και PDGFR στην έκφραση της IL-6. Με τη χρήση αντισωματων έναντι του εξωκυττάριου τμήματος του EGFR δείχτηκε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού του EGFR δεν πραγματοποιείται αυτοκρινώς μέσω δέσμευσης του EGF στον υποδοχέα του, η παραγωγή του οποίου επάγεται από τον TGF-β1, αλλά ενδοκυτταρικά με κάποιο άλλο τρόπο, χωρίς τη μεσολάβηση των SMADs, πιθανόν με άμεση ενδοεπικοινωνία των δύο υποδοχέων ή μέσω κάποιου άλλου διαμεσολαβητή.3. Επίδραση του TGF-β1 στην έκφραση των υποδοχέων του TβRI και TβRII σε ινοβλάστες και χονδροκύτταραΔείχτηκε ότι ο TGF-β1 ήταν ικανός, μέσω των ROS των οποίων προκαλεί τη παραγωγή, να διεγείρει την έκφραση του υποδοχέα TβRII, όχι όμως και του υποδοχέα TβRI και στα δύο είδη κυττάρων. Δεδομένου ότι ο TβRII παίζει το ρόλο του αισθητήρα, η διέγερση της έκφρασής του από το TGF-β1 ενισχύει τη σηματοδότηση του αυξητικού παράγοντα.4. Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή ΤΙΜΡ-1 από ινοβλάστες σε καλλιέργεια Ο TGF-β1 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στη παραγωγή του ΤΙΜΡ-1 από ινοβλάστες ΑΥ κατά δόσο- και χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Με τη χρήση των αναστολέων των πρωτεϊνικών κινασών, ΡΚΑ, PKC και κινασών τυροσίνης, Η-89, Calphostin C και Genestein, αντίστοιχα, και των ειδικών αναστολέων των MAP κινασών, MEK1/2 και JNK1-3, U0126, και SP600125, αντίστοιχα, διαπιστώθηκε ότι μόνο τα σηματοδοτικά μονοπάτια της PKC και των ΜΑΡ κινασών Εrk1/2 και JNK εμπλέκονται στην επαγόμενη από τον TGF-β1 παραγωγή του ΤΙΜΡ-1 από τις ινοβλάστες ΑΥ. Δείχτηκε επίσης ότι τα ROS εμπλέκονται και στην επαγόμενη από τον TGF-β1 παραγωγή του ΤΙΜΡ-1. Η IL-6, άν και είχε την ικανότητα από μόνη της, σε μεγάλη όμως συγκέντρωση, να διεγείρι την έκφραση του ΤΙΜΡ-1, η επαγόμενη από τον TGF-β1 δεν φάνηκε να διαμεσολαβεί στην έκφραση του ΤΙΜΡ-1. ΣυμπεράσματαO TGF-β1 είναι ικανός να διεγείρει τη παραγωγή της PGE2 από ινοβλάστες ΑΥ και χονδροκύτταρα ΑΧ. Η διέγερση πραγματοποιείται μέσω της επαγωγής της έκφρασης τόσο της COX1 όσο και της COX-2, οι οποίες φαίνεται να δρουν συνεργειακά. Η επαγωγή της έκφρασης των COX, από τον TGF-β1, και επομένως η παραγωγή PGE2 πραγματοποιείται με τη διαμεσολάβηση των σηματοδοτικών μονοπατιών της PKC και των κινασών τυροσίνης όπως επίσης και των μονοπατιών των ΜΑΡΚ (ERK & JNK) πιθανόν μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1. Ο TGF-β1 είναι ικανός να διεγείρει την παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ΑΥ και χονδροκύτταρα ΑΧ. Ο TGF-β1 προκαλεί τόσο άμεση παροδική όσο και αργή και παρατεταμένη παραγωγή ROS, μέσω της επαγωγής της έκφρασης κάποιας NADPH-οξειδάση (Nox) ανεξάρτητα από SMADs, τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν: α) άμεσα ή έμεσα τον EGFR και μέσω αυτού τα μονοπάτια της PKC και ΜΑΡΚ/ΑΡ-1, β) το μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ, μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης /πρωτεασώματος, γ) τη παραγωγή PGE2, τα οποία με τη σειρά τους συμβάλλουν στην διέγερση της έκφρασης της IL-6.O TGF-β1 αυτορυθμίζει τη δράση του, μέσω διέγερσης της έκφρασης του υποδοχέα του TβRII και της ικανότητάς του να διεγείρει την έκφραση της ΜΚΡ-1. Ο TGF-β1 είναι επίσης ικανός να διεγείρει την παραγωγή του ΤΙΜΡ-1. Η διέγερση της έκφρασης του ΤΙΜΡ-1 από τον TGF-β1 φαίνεται να πραγματοποιείται μέσω μονοπατιού διαφορετικού από αυτό που οδηγεί στη διέγερση της έκφρασης της IL-6. Ο TGF-β1 φαίνεται ότι είναι ένας πολυδύναμος αυξητικός παράγοντας ο οποίος μπορεί στα ίδια κύτταρα να σηματοδοτεί ταυτόχρονα διαφορετικά μονοπάτια τα οποία, συνεργαζόμενα μεταξύ τους, να οδηγούν στην έκφραση διαφορετικών μορίων, της PGE2, της IL-6, του ΡΑΙ-1 και του ΤΙΜΡ-1, σε ινοβλάστες ΑΥ. Ανάλογα με το είδος των κυττάρων και τη προέλευση αυτών ο TGF-β1 μπορεί να διεγείρει ταυτόχρονα πολλαπλά σηματοδοτικά μονοπάτια και να ενεργοποιήσει μία ποικιλία μεταγραφικών παραγόντων (SMADs, AP-1, NF-κΒ κλπ) οδηγώντας με διαφορετικό τρόπο στη γονιδιακή έκφραση διαφόρων μορίων, όπως π.χ. της IL-6, με το τελικό αποτέλεσμα κάθε φορά να είναι προϊόν συνέργειας πολλών παραγόντων. Για τα μόρια, την έκφραση των οποίων επάγει ο TGF-β1, έχει διαπιστωθεί τόσο ένας αντιφλεγμονώδης όσο και ένας προφλεγμονώδης ρόλος του. Όμως, δεδομένου του θεμελιώδη ανασταλτικού ρόλου του TGF-β1 στα κύτταρα της έμφυτης και της επίκτητης ανοσίας, η δράση του συγκεκριμένου αυξητικού παράγοντα στη ΡΑ αλλά και την ΟΑ ίσως δεν θα πρέπει να θεωρείτε αποκλειστικά επιβλαβής. Επομένως κρίνεται σκόπιμο να αναφερθεί ότι ο πιθανός φαρμακευτικός αποκλεισμός του μορίου ως θεραπευτική επιλογή, ίσως δεν θα πρέπει να επιχειρηθεί στους ασθενείς με ΡΑ και ΟΑ.