Φαρμακευτική νανοτεχνολογία
Authors: Χρυσοστόμου Βαρβάρα 
Published: November 2024

Η ραγδαία εξέλιξη στην επιστήμη της μοριακής βιολογίας και της γενετικής μηχανικής έχουν καταστήσει τη γονιδιακή θεραπεία ως μια καινοτόμο και ελπιδοφόρα θεραπευτική προσέγγιση, για την αντιμετώπιση διαφόρων νόσων και δυσλειτουργιών που έχουν γενετική βάση, ακόμα και σε επίπεδο εξατομικευμένης θεραπείας. Συνοπτικά, ως γονιδιακή θεραπεία ορίζεται η διαδικασία με την οποία μια νόσος μπορεί να θεραπευτεί με γενετική τροποποίηση των κυττάρων ενός ασθενούς και στηρίζεται στην εισαγωγή εξωγενών γενετικών αλληλουχιών, σε κύτταρα με σκοπό την αποκατάσταση της φυσιολογικής τους λειτουργίας. Η επιτυχής εφαρμογή των θεραπευτικών δυνατοτήτων που προσφέρει η γονιδιακή θεραπεία, απαιτεί την επιλογή του κατάλληλου γενετικού παράγοντα και τη χρήση ενός αποτελεσματικού συστήματος-φορέα που θα τον μεταφέρει στα επιθυμητά κύτταρα-στόχους. Τα συστήματα μεταφοράς που χρησιμοποιούνται σήμερα στη γονιδιακή θεραπεία διαχωρίζονται σε δυο κύριες κατηγορίες, στους ιικούς φορείς (viral vectors) και στους μη ιικούς φορείς (non-viral vectors). Οι ιικοί φορείς (αδενοϊοί, ρετροϊοί, ερπητοϊοί, κ.α.) αποτελούν τη πρώτη μεγάλη κατηγορία γονιδιακών οχημάτων και λόγω του υψηλού θεραπευτικού τους αποτελέσματος, συναντώνται συχνά στην πλειοψηφία των κλινικών δοκιμών γονιδιακής θεραπείας. Ωστόσο, παρά την υψηλή τους αποτελεσματικότητα, η χρήση των ιικών φορέων για γονιδιακή μεταφορά ενέχει ορισμένους περιορισμούς, ιδιαίτερα ως προς την ασφάλειά τους. Η πρόκληση ανοσολογικών αντιδράσεων και κυτταροτοξικότητας, ο κίνδυνος μόλυνσης από παθογόνο ιό, η εισχωρητική μεταλλαξιογένεση και η πιθανή ογκογενετική δραστηριότητα, αποτελούν ορισμένους από αυτούς. Οι παραπάνω περιορισμοί έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη ασφαλέστερων μεθόδων γονιδιακής μεταφοράς, συμπεριλαμβανομένων των μη ιικών συστημάτων μεταφοράς που βασίζονται σε καινοτόμα νανοϋλικά.Τα τελευταία χρόνια η ανάπτυξη της Νανοτεχνολογίας στον τομέα της ιατρικής (Νανοϊατρική) και της φαρμακευτικής (Φαρμακευτική Νανοτεχνολογία) έχει συμβάλει στη δημιουργία καινοτόμων και πολυλειτουργικών τεχνολογικών πλατφορμών σε μοριακό επίπεδο νανοκλίμακας, για μια πληθώρα θεραπευτικών εφαρμογών. Ανάμεσα σε αυτές, αξιοσημείωτη είναι η συμβολή της Νανοτεχνολογίας και στις εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας, μέσω της ανάπτυξης αποτελεσματικών μη ιικών νανοφορέων για τη μεταφορά ποικίλων τύπων νουκλεϊκών οξέων στα κατάλληλα κύτταρα-στόχους. Επίσης, η πολυλειτουργικοτήτα των νανοφορέων αυτών καθιστά δυνατή την ταυτόχρονη συγχορήγηση τόσο νουκλεϊκών οξέων όσο και άλλων θεραπευτικών παραγόντων, παρέχοντας τη δυνατότητα για μια συνδυαστική και στοχευμένη θεραπεία. Οι μη ιικοί φορείς-οχήματα γονιδιακής θεραπείας αποτελούνται από διαφόρου τύπου νανοδομές, όπως κατιοντικά πολυμερή, κατιοντικά λιπίδια, πεπτίδια, ανόργανα νανοσωματίδια, όπως νανοσωματίδια χρυσού, νανοσωματίδια πυριτίου, κβαντικές τελείες και νανοσωλήνες άνθρακα, κ.α. Ιδιαίτερα, νανοδομές αποτελούμενες από κατιοντικά λιπίδια και κατιοντικά πολυμερή έχουν διερευνηθεί περισσότερο και έχουν εξετασθεί σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές, παρουσιάζοντας αξιοσημείωτα θεραπευτικά αποτελέσματα. Ακόμα, μια σύγχρονη προσέγγιση που αναμένεται να αναβαθμίσει τη λειτουργικότητα και να ενισχύσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των μη ιικών νανοφορέων είναι ο συνδυασμός διαφορετικής φύσης υλικών. Ο συνδυασμός μεταξύ των υλικών, όπως για παράδειγμα πολυμερών και λιπιδίων μπορεί να αλλάξει τις επιμέρους ιδιότητές τους και να δημιουργήσει υβριδικές νανοδομές με νέα βελτιωμένα χαρακτηριστικά. Στα πλαίσια αυτά, η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματεύεται τον ορθολογικό σχεδιασμό και την ανάπτυξη καινοτόμων νανοτεχνολογικών πλατφορμών ικανών να μεταφέρουν νουκλεϊκά οξέα, με προοπτική την εφαρμογή τους ως μη ιικούς φορείς για μεθόδους γονιδιακής θεραπείας. Οι νανοτεχνολογικές πλατφόρμες που αναπτύχθηκαν αποτελούνται κυρίως από πολυμερικά βιοϋλικά, καθώς και συμπολυμερή συνδυασμένα με λιπίδια για τη δημιουργία υβριδικών/χιμαιρικών πολυλειτουργικών νανοφορέων. Σε πρώτο στάδιο πραγματοποιήθηκε η σύνθεση καινοτόμων συμπολυμερών με διαφορετικές αρχιτεκτονικές και μοριακά χαρακτηριστικά, με τη χρήση του ελεγχόμενου ριζικού πολυμερισμού αντιστρεπτής προσθήκης-μεταφοράς αλυσίδας με απόσπαση (RAFT polymerization). Οι διάφοροι τύποι συμπολυμερών που έχουν συντεθεί περιλαμβάνουν τα αμφίφιλα δισυσταδικά συμπολυμερή του τύπου πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της διμεθυλοαμινοαιθανόλης)–b–πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της δωδεκανόλης) (PDMAEMA-b-PLMA), τα διυδρόφιλα τυχαία συμπολυμερή του τύπου πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της διμεθυλοαμινοαιθανόλης–co–μεθακρυλικός εστέρας της ολιγοαιθυλενογλυκόλης) P(DMAEMA-co-OEGMA) και τέλος το αμφίφιλο τυχαίο συμπολυμερές του τύπου πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της δεκαοκτανόλης–co–μεθακρυλικός εστέρας της ολιγοαιθυλενογλυκόλης) P(SMA-co-OEGMA). Τα συντιθέμενα συμπολυμερή αποτελούνται από βιοσυμβατά, με απόκριση σε ερεθίσματα (stimuli-responsive) σύμφωνα με τη βιβλιογραφία πολυμερή, πολυμερή που φέρουν λειτουργικές κατιοντικές ομάδες καθώς και πολυμερή ικανά να προσφέρουν ιδιότητες ανοσοαπόκρυψης (stealth properties) και ιδιότητες απόκρυψης φορτίων (shielding effect). Στη συνέχεια, ακολούθησε ο μοριακός τους χαρακτηρισμός με τεχνικές ενόργανης ανάλυσης που περιλαμβάνουν τη χρωματογραφία αποκλεισμού μεγεθών (SEC), τη φασματοσκοπία μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού πρωτονίου (1H-NMR) και τη φασματοσκοπία υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier με αποσβένουσα ολική ανάκλαση (ATR-FTIR). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε η χημική τροποποίηση των συμπολυμερών που απαρτίζονται από τη συστάδα/τμήμα (P)DMAEMA, μέσω της τεταρτοταγοποίησης της τριτοταγούς αμινομάδας του (P)DMAEMA σε τεταρτοταγή άλατα αμμωνίου Q(P)DMAEMA, μετατρέποντας τα συμπολυμερή σε ισχυρούς κατιοντικούς πολυηλεκτρολύτες που φέρουν μόνιμο θετικό φορτίο. Συνεπώς, με αυτό τον τρόπο έχουν συντεθεί τα τεταρτοταγοποιημένα παράγωγα των πρόδρομων συμπολυμερών, τα οποία περιλαμβάνουν τους αμφίφιλους κατιοντικούς πολυηλεκτρολύτες QPDMAEMA-b-PLMA και τους τυχαίας αρχιτεκτονικής διυδρόφιλους κατιοντικούς πολυηλεκτρολύτες P(QDMAEMA-co-OEGMA). Το μόνιμο θετικό φορτίο καθιστά τους κατιοντικούς πολυηλεκτρολύτες ικανούς να συνδέονται ισχυρότερα με τα νουκλεϊκά οξέα. Συνολικά, όλες οι τεχνικές χαρακτηρισμού κατέδειξαν την επιτυχή σύνθεση και τροποποίηση των συμπολυμερών, ενώ προσδιορίστηκαν τα επιθυμητά μοριακά χαρακτηριστικά που βρίσκονται σε συμφωνία με αυτά του πειραματικού σχεδιασμού. Μετά τις διαδικασίες σύνθεσης και χαρακτηρισμού των συμπολυμερών, ακολούθησε η μελέτη της αυτο-οργάνωσής τους σε νανοδομές, όπως μικκύλια ή πολυμερικά συσσωματώματα, όταν βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των πολυμερικών νανοφορέων προσδιορίστηκαν με τη χρήση τεχνικών σκέδασης φωτός, συμπεριλαμβανομένων της δυναμικής (DLS), της στατικής (SLS) και της ηλεκτροφορητικής (ELS). Συγκεκριμένα, μέσω της DLS προσδιορίστηκε το μέγεθος (υδροδυναμική ακτίνα (Rh)), η κατανομή μεγεθών και ο δείκτης πολυδιασποράς μεγέθους (PDI), μέσω της SLS προσδιορίστηκε η γυροσκοπική ακτίνα (Rg) και εκτιμήθηκε ο λόγος Rg/Rh προσφέροντας πληροφορίες για τη μορφολογία των σχηματιζόμενων νανοδομών και τέλος μέσω της ELS προσδιορίστηκε το ζ-δυναμικό τους. Επίσης, οι πολυμερικοί νανοφορείς εξετάστηκαν ως προς την πιθανή κυτταροτοξική τους δράση σε πρότυπα κυτταρικών σειρών, φυσιολογικών (HEK293) και καρκινικών κυττάρων (4T1, MCF-7, MDA-MB-231 και Τ47D) καρκίνου του μαστού. Το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο MTS.Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη καινοτόμων χιμαιρικών/υβριδικών νανοσυστημάτων αποτελούμενων από συμπολυμερή και λιπίδια, ως μια νέα νανοτεχνολογική πλατφόρμα για τη μεταφορά νουκλεϊκών οξέων. Για τη παρασκευή τους, χρησιμοποιήθηκαν το συντιθέμενο μέσω του πολυμερισμού RAFT αμφίφιλο τυχαίο συμπολυμερές P(SMA-co-OEGMA), το κατιονικό λιπίδιο DOTAP (1,2- dioleoyl-3-(trimethylammonium) propane) καθώς και το μη ιονικό φωσφολιπίδιο HSPC (hydrogenated soybean L-α-phosphatidylcholine). Τα χιμαιρικά νανοσυστήματα παρασκευάσθηκαν με τη μέθοδο της ενυδάτωσης του λεπτού λιπιδικού υμενίου, σε διαφορετικές μοριακές αναλογίες λιπιδίων και συμπολυμερούς. Επίσης, με την ίδια μέθοδο παρασκευάσθηκαν και αμιγή/συμβατικά λιποσώματα HSPC:DOTAP, σε διαφορετικές μοριακές αναλογίες λιπιδίων, για τη σύγκρισή τους με τα χιμαιρικά νανοσυστήματα, ως προς την επίδραση του συμπολυμερούς στα χαρακτηριστικά των σχηματιζόμενων νανοδομών. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των χιμαιρικών και αμιγών λιποσωμιακών νανοσυστημάτων προσδιορίστηκαν μέσω των τεχνικών σκέδασης φωτός (DLS, SLS, ELS). Τα πολυμερικά και τα χιμαιρικά/αμιγή λιποσωμιακά νανοσυστήματα που αναπτύχθηκαν, εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν ηλεκτροστατικά και να σχηματίζουν σύμπλοκα με νουκλεϊκά οξέα. Συγκεκριμένα, για τις μελέτες αυτές χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα δίκλωνα γραμμικά μόρια DNA με διαφορετικό αριθμό ζεύγους βάσεων. Η ικανότητα αλληλεπίδρασης των νανοσυστημάτων και ο σχηματισμός συμπλόκων με τα μόρια DNA αξιολογήθηκαν μέσω μιας ποικιλίας τεχνικών ενόργανης ανάλυσης προκειμένου να διερευνηθούν διεξοδικά τα φυσικοχημικά και μορφολογικά τους χαρακτηριστικά. Οι τεχνικές αυτές περιλαμβάνουν τη φασματοσκοπία φθορισμού μελετώντας την απόσβεση του βρωμιούχου αιθιδίου, τη φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού (UV-Vis), τις τεχνικές σκέδασης φωτός (DLS, SLS, ELS) και την κρυογονική ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (Cryo-TEM). Οι τεχνικές κατέδειξαν την επιτυχή αλληλεπίδραση των νανοσυστημάτων με τα μόρια DNA καθώς και τον σχηματισμό νανοσκοπικών και κολλοειδώς σταθερών συμπλόκων με καλά καθορισμένα φυσικοχημικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά. Επιπρόσθετα, μέσω της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) εξετάστηκε η επίδραση της ιοντικής ισχύος στη σταθερότητα και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των συμπλόκων, ως μια προκαταρκτική προσομοίωση των φυσιολογικών συνθηκών των βιολογικών υγρών. Στη πλειοψηφία τους, τα σύμπλοκα επέδειξαν κολλοειδή σταθερότητα υπό φυσιολογική ιοντική ισχύ.Εν κατακλείδι, σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν διαφορετικά είδη νανοτεχνολογικών πλατφορμών, συμπεριλαμβανομένων πολυμερικών (όπως μικκύλια, πολυμερικά συσσωματώματα), λιποσωμιακών και χιμαιρικών/υβριδικών νανοσυστημάτων. Τα νανοσυστήματα αξιολογήθηκαν για την ικανότητα τους να αλληλεπιδρούν με DNA και να σχηματίζουν σύμπλοκα. Τα συστατικά από τα οποία αποτελείται το κάθε σύστημα επιλέχθηκαν με γνώμονα τη βελτίωση των χαρακτηριστικών και της αποτελεσματικότητάς τους για τη χρήση τους ως μη ιικούς νανοφορείς νουκλεϊκών οξέων. Η συνέργεια μεταξύ των διαφορετικών υλικών σε διαστάσεις της νανοκλίμακας αναμένεται να οδηγήσει στη δημιουργία πολυλειτουργικών νανοφορέων, ικανών να μεταφέρουν αποτελεσματικά νουκλεϊκά οξέα και άλλους θεραπευτικούς παράγοντες σε μια ενιαία πλατφόρμα, λειτουργώντας ως ενισχυμένα θεραπευτικά εργαλεία με στόχο την ανάπτυξη προηγμένων φαρμακευτικών προϊόντων γονιδιακής θεραπείας.