Μελέτη της συγκέντρωσης μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) στη θεμέλια ουσία σκολιωτικών μεσοσπονδύλιων δίσκων με τη χρήση συσκευής ilizarov σε επίμυες
Authors: Βασιλειάδης Ηλίας 
Published: September 2021

Εισαγωγή-Σκοπός: Η εκφύλιση του μεσοσπονδυλίου δίσκου προκύπτει από την διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ σύνθεσης και αποδόμησης των συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Η ασύμμετρη φόρτιση του δίσκου προκαλεί βλάβες σε μοριακό επίπεδο, οι οποίες γίνονται εμφανείς τόσο σε μικροσκοπικό όσο και σε μακροσκοπικό επίπεδο. Σκοπός της παρούσης πειραματικής μελέτης, ήταν η εκτίμηση με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους του ρόλου της MMP-1 και της MMP-12 στην εκφύλιση μεσοσπονδύλιων δίσκων ουράς επίμυων καθώς και η μέτρηση της έκφρασης και της ενεργότητας της MMP-12, έπειτα από την εφαρμογή ασύμμετρων δυνάμεων καθώς και η εκτίμηση της επίδρασης του βαθμού της παραμόρφωσης στην έκφραση των παραπάνω ενζύμων. Υλικό - Μέθοδος: Μεταξύ 9ου και 10ου ιερού σπονδύλου σε ουρές επίμυων (Wistar rats) εφαρμόσθηκε μίνι συσκευή εξωτερικής οστεοσύνθεσης τύπου Ilizarov προκειμένου να δημιουργηθεί σκολιωτική παραμόρφωση. Χρησιμοποιήθηκαν 45 επίμυες, σταθμισμένοι ως προς την ηλικία, το βάρος και το ύψος τους (ηλικία 2 μηνών, βάρος 200±10 γραμμάρια). Οι επίμυες χωρίσθηκαν σε τρεις ομάδες ανάλογα με το βαθμό της παραμόρφωσης. Στην ομάδα Ι η παραμόρφωση ήταν 10o, στην ομάδα ΙΙ 30o και στην ομάδα ΙΙΙ 50o. Την 35η ημέρα έγινε ευθανασία των πειραματοζώων. Δεκαπέντε δίσκοι (πέντε από κάθε ομάδα) αναλύθηκαν με την τεχνική κατά Western και με ζυμογράφημα για την ανίχνευση της pro-MMP12 και της ενεργού MMP12. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν ως προς τη β-ακτίνη. Τριάντα μεσοσπονδύλιοι δίσκοι (δέκα από κάθε ομάδα) αναλύθηκαν ανοσοϊστοχημικά και βαθμονομήθηκαν με ημιποσοτικές μεθόδους για ανοσοθετικότητα στην MMP-1 και MMP-12. Οι παρακείμενοι υγιείς μεσοσπονδύλιοι δίσκοι χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το μη παραμετρικό Mann-Whitney U test και με το unpaired t-test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε ως p< 0.05. Αποτελέσματα: Η pro-MMP-12 ανιχνεύτηκε στην περιοχή των 54 kDa και η έκφρασή της αυξανόταν καθώς μεγάλωνε η παραμόρφωση. Η ενεργός MMP-12 ανιχνεύτηκε στην περιοχή των 22 kDa και η συγκέντρωσή της στην ομάδα Ι και ΙΙ ήταν ελαττωμένη συγκριτικά με τους μάρτυρες, αλλά αυξανόταν σημαντικά στην ομάδα ΙΙΙ. Ανοσοθετικότητα ανιχνεύτηκε για την MMP-1 και MMP-12 σε όλα τα κύτταρα του ινώδους δακτυλίου, αλλά όχι στον πηκτοειδή πυρήνα των μεσοσπονδύλιων δίσκων που εξετάσθηκαν. Στην ομάδα Ι, το ποσοστό των θετικών στην MMP-1 κυττάρων του ινώδους δακτυλίου ήταν 20% (10% των χονδροκυττάρων, 25% των ινοβλαστών), ενώ για την MMP-12 η χρώση ήταν θετική στο 20% των ινοβλαστών (όχι των χονδροκυττάρων) και ήταν ελαφρώς αυξημένη στην κοίλη πλευρά του δίσκου. Στην ομάδα ΙΙ, το 43% των κυττάρων του δίσκου εξέφραζαν την MMP-1 (35% των χονδροκυττάρων, 50% των ινοβλαστών) και 50% των κυττάρων εξέφραζαν την MMP-12 (30% των χονδροκυττάρων, 50% των ινοβλαστών), κυρίως στην περιφέρεια του ινώδους δακτυλίου της κοίλης πλαυράς. Στην μεταβατική ζώνη και στην περιφέρεια του ινώδους δακτυλίου, παρατηρήθηκαν συσσωματώσεις δισκικών κυττάρων, τα οποία παρουσίαζαν μια χόνδρινη διαφοροποίηση και ήταν θετικά ως προς την MMP-12. Στην ομάδα ΙΙΙ, το 75% των δισκικών κυττάρων εξέρφραζαν την MMP-1 (50% των χονδροκυττάρων, 80% των ινοβλαστών) και 80% των δισκικών κυττάρων εξέφραζαν την MMP-12 (50% των χονδροκυττάρων, 90% των ινοβλαστών). Στην ομάδα ΙΙΙ, ο πληθυσμός των κυττάρων ήταν ελαττωμένος, ιδίως στην κοίλη πλευρά του δίσκου, ταυτόχρονα με μια σοβαρή αποδιοργάνωση της μικροαρχιτεκτονικής της θεμέλιας ουσίας. Η ανοσοθετικότητα της MMP-1 και της MMP-12 συσχετιζόταν στατιστικά σημαντικά με το βαθμό της παραμόρφωσης (p<0,001). Από την ανάλυση της διαφοράς της έκφρασης της MMP-1 και MMP-12 μεταξύ κοίλης και κυρτής πλαυράς, προέκυψε πως αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα Ι (p=0,6 για την MMP-1, p=0,48 για την MMP-12), ενώ ήταν στατιστικά σημαντική στις ομάδας ΙΙ και ΙΙΙI (p<0,01 για την MMP-1, p<0,001 για την MMP-12). Συμπέρασμα: Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η πειραματική πρόκληση σκολιωτικής παραμόρφωσης μετά από την εφαρμογή ασύμμετρων δυνάμεων σε μεσοσπονδύλιους δίσκους ουράς επίμυων, προκαλεί αυξημένη έκφραση της MMP-1 και της MMP-12, οι οποίες εξαρτώνται από το βαθμό της παραμόρφωσης και την περιοχή του σφηνοειδώς παραμορφωμένου δίσκου. Η ασύμμετρη φόρτιση οδηγεί σε εκφύλιση του μεσοσπονδυλίου δίσκου με την αποδόμηση των ινιδικών κολλαγόνων και της ελαστίνης από την αυξημένη παραγωγή MMP-1 και MMP-12 καθώς και από την ελάττωση του αριθμού ή τη διαφοροποίηση των δισκικών κυττάρων.