Λειτουργικές και γονιδιωματικές μελέτες επί της αποαδενυλίωσης
Authors: Αναστασάκης Δημήτριος 
Published: August 2021

Η γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ελέγχεται σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετάφρασης και την αποικοδόμησης του mRNA. Τόσο η μετάφραση όσο και η σταθερότητα του mRNA ρυθμίζονται από μεταβολές του μήκους της poly(A) ουράς τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η αποικοδόμηση των mRNAs ξεκινάει με την μείωση του μήκους της poly(A) ουράς και ακολουθεί αποικοδόμηση από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα με 3'-5', ή με απομάκρυνση του 5΄καλύμματος από το ένζυμο αφαίρεσης του καλύμματος. Η σταδιακή αποικοδόμηση της poly(A) ουράς που αναφέρεται ως αποαδενυλίωση πραγματοποιείται από μία πληθώρα 3'-5' εξωνουκλεασών που αποκαλούνται αποαδενυλάσες. Οι αποαδενυλάσες είναι μαγνησιο-εξαρτώμενες 3'-5' εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν σε μία από τις υπερ-οικογένειες αποαδενυλασών, την DEDD ή την EEP. Οι αποαδενυλάσες τύπου DEDD περιέχουν τρία συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα Asp και ένα κατάλοιπο Glu που σχηματίζουν το ενεργό κέντρο και καθορίζουν την διευθέτηση των ιόντων μαγνησίου τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στο καταλυτικό μηχανισμό. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει την POP2, την CAF1Z, την PAN2 και την poly(A)-specific ribonuclease (PARN). Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το γονίδιο PNLDC1 που βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια νέα DEDD αποαδενυλάση και βρίσκεται σε όλους του ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Ο προαγωγέας του γονιδίου PNLDC1 βρέθηκε μεθυλιωμένος και απομεθυλίωση του DNA οδήγησε στην ανίχνευση της έκφρασής του σε κυτταρική σειρά HEK293. H PNLDC1 βρίσκεται σε δύο ισομορφές οι οποίες προκύπτουν πιθανότατα από εναλλακτικό μάτισμα οι οποίες και μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Τα αποτελέσματα του βιοχημικού χαρακτηρισμού έδειξαν δραστικότητα και εξειδίκευση συγκρίσιμη με αυτή της PARN, ενώ οι δύο ισομορφές εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Μελέτες έκφρασης του γονιδίου σε διάφορους ιστούς και κυτταρικές σειρές έδειξε υψηλά εξειδικευμένη έκφραση σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, καθώς και σε γαμετικά κύτταρα υποδεικνύοντας έναν πιθανό ρόλο στη ανάπτυξη. Αποσιώπηση του γονιδίου σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού έδειξε να επηρεάζει σημαντικούς δείκτες πολυδυναμίας καθώς και σημαντικούς παράγοντες της διαφοροποίησης. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι η PNLDC1 πρέπει να κατέχει κεντρικό ρόλο στα αρχικά βήματα της κυτταρικής ανάπτυξης. Ιn silico ανάλυση και σχεδιασμός της δομής βάση ομολογίας και προσομοίωσης μοριακής δυναμική έδειξε ότι η PNLDC1 έχει παρόμοιο ενεργό κέντρο με DEDD αποδενυλάσες και αποτελεί ένα νέο μέλος στο ρεπερτόριο των ενζύμων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του mRNA. Ταυτόχρονα αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι υπόκειται σε αυστηρό επιγενετικό έλεγχο και ειδικό υποκυττάριο εντοπισμό με άγνωστη βιολογική λειτουργία που είναι όμως υπό διερεύνηση. Η ρύθμιση των mRNAs μέσω αποαδενυλίωσης είναι καθοριστική για πολλά βιολογικά φαινόμενα συμπεριλαμβανομένου των κυτταρικό κύκλο, την απόκριση σε εξωκυττάρια σήματα, ωογένεση και σπερματογένεση, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Επιπλέον τα miRNAs προκαλούν μεταφραστική αποσιώπηση και αποσταθεροποίηση του mRNA μέσω αποαδενυλίωσης, δίνοντας βαρύτητα στη διαδικασία αυτή στην μετα-μεταγραφική γονιδιακή αποσιώπηση.