Functional investigation of NAT genes in bacteria and fungi of biotechnological interest
Authors: Κοντομηνά Ευανθία 
Published: September 2021

Οι αρωματικές αμίνες είναι ξενοβιοτικές ενώσεις που αποτελούν σημαντική κατηγορία περιβαλλοντικών ρύπων, λόγω της εντατικής χρήσης τους στη χημική βιομηχανία και τη γεωργία. Δεδομένης της υψηλής τοξικότητάς τους για τους οργανισμούς, οι μεγάλες ποσότητες αρωματικών αμινών που απελευθερώνονται στο περιβάλλον έχουν εγείρει προβληματισμό σε παγκόσμιο επίπεδο, ενώ καταβάλλονται προσπάθειες προκειμένου να αναπτυχθούν περισσότερο αποδοτικές μέθοδοι βιοαποικοδόμησής τους. Είναι γνωστό ότι οι μικροοργανισμοί έχουν αναπτύξει μεταβολικούς μηχανισμούς που τους επιτρέπουν να επιβιώνουν παρουσία ξενοβιοτικών ουσιών, ή ακόμα και να αξιοποιούν τις ενώσεις αυτές ως πηγή θρεπτικών συστατικών και ενέργειας. Μία από αυτές τις βιοχημικές οδούς περιλαμβάνει τη Ν-ακετυλίωση των αρωματικών αμινών μέσω της δράσης των Ν-ακετυλοτρανσφερασών της ενζυμικής οικογένειας ΝΑΤ. Ευρύτερος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των γονιδίων ΝΑΤ στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό διαφόρων προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών μικροοργανισμών, καθώς επίσης να μελετηθούν άλλες πιθανές λειτουργίες ορισμένων λιγότερο συντηρημένων ομολόγων ΝΑΤ. Ένας βασικός στόχος της διατριβής ήταν η φαινοτύπηση διαφόρων βακτηρίων ως προς την ικανότητά τους να ανέχονται και να μεταβολίζουν την αρωματική αμίνη 3,4-διχλωροανιλίνη (3,4-DCA), ειδικά μέσω Ν-ακετυλίωσης από τα ένζυμα ΝΑΤ. Η συγκεκριμένη αρωματική αμίνη απαντά ως περιβαλλοντικός ρύπος προερχόμενος από τη διάσπαση φυτοφαρμάκων και άλλων ανθρωπογενών χημικών. Στη διάρκεια της μελέτης αξιοποιήθηκαν δύο ευρείες ταξινομικά συλλογές βακτηριακών στελεχών που ήταν διαθέσιμες στο εργαστήριο από συνεργάτες. Συνεχίζοντας προηγούμενες μελέτες του Εργαστηρίου, εξετάστηκαν 20 βακτηριακά στελέχη από την αποκαλούμενη "συλλογή ELTE" και 26 στελέχη από την αποκαλούμενη "συλλογή MED-DUTH", τα οποία είχαν αντιστοίχως απομονωθεί είτε από περιβαλλοντικά δείγματα είτε από την ανθρώπινη εντερική μικροχλωρίδα. Τα στελέχη αυτά φαινοτυπήθηκαν ως προς την ευαισθησία τους έναντι της 3,4-DCA. Στη συνέχεια, τα συνολικά 107 στελέχη (85 βακτηριακά είδη) και των δύο συλλογών φαινοτυπήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να μεταβολίζουν τη συγκεκριμένη αρωματική αμίνη, χρησιμοποιώντας χρωματογραφία λεπτής στιβάδας προκειμένου να ανιχνευθούν τυχόν μεταβολίτες της 3,4-DCA στο θρεπτικό μέσο των καλλιεργειών. Η πλειοψηφία (93%) των στελεχών, η οποία κάλυπτε ολόκληρο το μελετούμενο ταξινομικό εύρος μικροοργανισμών, εμφάνισε βιωσιμότητα σε συγκεντρώσεις 3,4-DCA μέχρι 200 μg/mL (1.2 mM). Ωστόσο, οι δύο εξεταζόμενοι φαινότυποι, δηλ. η βιωσιμότητα σε 3,4-DCA και η ικανότητα κάθε βακτηριακού στελέχους να μεταβολίζει την αρωματική αμίνη, δεν φάνηκαν να συσχετίζονται. Σχετικά μικρός (19%) ήταν ο αριθμός των στελεχών που βρέθηκαν να είναι μεταβολικά ενεργά ως προς την υπό μελέτη διχλωροανιλίνη. Η δε ικανότητα παραγωγής Ν-ακετυλιωμένης 3,4-DCA παρατηρήθηκε μόνο στο 14% των βακτηριακών ειδών (κυρίως βάκιλλοι και στρεπτομύκητες), ενώ ο φαινότυπος αυτός βρέθηκε να συνδέεται άμεσα με την παρουσία γονιδίων ΝΑΤ στο γονιδίωμα των συγκεκριμένων μικροβίων. Πέραν της Ν-ακετυλίωσης, ένα μικρό ποσοστό (5%) των βακτηριακών ειδών που εξετάστηκαν διαπιστώθηκε ότι είναι ικανό να πραγματοποιεί άλλων τύπων βιομετατροπές της αρωματικής αμίνης, χωρίς να είναι εμφανές αν τα γονίδια ΝΑΤ μπορεί να παίζουν κάποιο ρόλο.Ανάμεσα στα βακτήρια που παρουσίασαν υψηλή ανεκτικότητα (> 1000 μg/mL, > 6.2 mM) ως προς την 3,4-DCA, το κορυνοβακτηρίδιο Tsukamurella paurometabola παρουσίασε ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς προηγούμενες μελέτες του Εργαστηρίου είχαν δείξει ότι το ένζυμο ΝΑΤ, με επίσημο σύμβολο (TSUPD)NAT1, του συγκεκριμένου βακτηρίου εμφανίζει δραστικότητα Ν-μαλονυλοτρανσφεράσης παρά Ν-ακετυλοτρανσφεράσης. Η ευαισθησία σε ξενοβιοτικά του βακτηρίου αυτού μελετήθηκε επομένως περισσότερο διεξοδικά, χρησιμοποιώντας συνολικά εννέα διαφορετικές αρωματικές αμίνες και υδραζίνες, οι οποίες ήταν ήδη γνωστό ότι αποτελούν υποστρώματα του ανασυνδυασμένου ενζύμου (TSUPD)NAT1 in vitro. Παρά το γεγονός ότι το βακτήριο παρουσίασε υψηλή ανεκτικότητα έναντι αρκετών από τις ξενοβιοτικές ουσίες που μελετήθηκαν, δεν φάνηκε να είναι ικανό να μεταβολίζει καμία από αυτές. Επιπλέον, δεδομένου ότι ξενοβιοτικές ενώσεις είναι δυνατό να απελευθερώνονται και ως αποτέλεσμα ανταγωνιστικής αλληλεπίδρασης μεταξύ μικροοργανισμών, το βακτήριο T. paurometabola υποβλήθηκε σε πειράματα συγκαλλιέργειας με εννέα διαφορετικά στελέχη του γένους Streptomyces (συλλογή ELTE) που είναι γνωστό ότι διαθέτουν πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ανάπτυξη του βακτηρίου T. paurometabola (το οποίο είναι δυνητικά παθογόνο του ανθρώπου) φάνηκε να αναστέλλεται από την παρουσία στρεπτομυκήτων, πιθανότατα λόγω απελευθέρωσης από αυτούς ουσιών με ενδεχομένως χρήσιμη αντιμικροβιακή δράση. Άλλος βασικός στόχος της διατριβής ήταν να μελετηθεί η επίδραση της απαλοιφής των γονιδίων NAT στην ανάπτυξη, την ευαισθησία, αλλά και την ικανότητα μεταβολισμού ξενοβιοτικών ουσιών, στον ασκομύκητα Fusarium verticillioides. Ο συγκεκριμένος φυτοπαθογόνος μύκητας κατορθώνει να αποτοξικοποιεί την φυτοαντισιπίνη 2-βενζοξαζολινόνη (ΒΟΑ) που παράγεται ως άμυνα από το φυτό-ξενιστή (καλαμπόκι), όπως επίσης και το βασικό μεταβολίτη του ΒΟΑ που είναι η 2-αμινοφαινόλη (2AP), μέσω δράσης ενζύμων ΝΑΤ. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης αξιοποιήθηκε μια συλλογή 37 στελεχών του F. verticillioides (αποκαλούμενη "συλλογή USDA-ARS", διαθέσιμη από συνεργάτη), η οποία περιλαμβάνει στελέχη αγρίου τύπου, καθώς και στελέχη στα οποία έχει πραγματοποιηθεί απαλοιφή ενός (ΔNAT1, ΔNAT2, ΔNAT3), δύο (ΔNAT1/ΔNAT2, ΔNAT1/ΔNAT3, ΔNAT2/ΔNAT3) ή και των τριών γονιδίων ΝΑΤ (ΔNAT1/ΔNAT2/ΔNAT3) του μύκητα. Τα στελέχη αυτά αρχικά καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά θρεπτικά μέσα (π.χ. παρουσία οξικού, προπιονικού, μηλονικού ή ηλεκτρικού ως πρόσθετης πηγής άνθρακα), ωστόσο η απώλεια των γονιδίων ΝΑΤ δεν διαπιστώθηκε να έχει κάποια επίπτωση στην ικανότητα του μύκητα να αναπτύσσεται σε διαφορετικές συνθήκες. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα του αγρίου τύπου μύκητα να αναπτύσσεται παρουσία 14 διαφορετικών ξενοβιοτικών ενώσεων. Τρεις από τις ενώσεις αυτές (BOA, 2AP και 3,4-DCA) χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω προκειμένου να διερευνηθεί η επίπτωση της απαλοιφής των γονιδίων ΝΑΤ στη βιωσιμότητα και τον ξενοβιοτικό μεταβολισμό του μύκητα. Σε συμφωνία με την προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κυρίως η ΝΑΤ1 μαλονυλοτρασφεραση και λιγότερο η ΝΑΤ3 ακετυλοτρασφεράση του μύκητα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποτοξικοποίηση των ξενοβιοτικών ουσιών, ενώ ο ρόλος του ισοενζύμου ΝΑΤ2 παραμένει άγνωστος. Ακόμη, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των γονιδίων ΝΑΤ στην ευρύτερη ικανότητα του F. verticillioides να ανταπεξέρχεται του ανταγωνισμού άλλων μικροοργανισμών (βακτηριακά στελέχη των συλλογών ELTE και MED-DUTH), παρουσία ή απουσία ξενοβιοτικών ενώσεων (BOA ή 3,4-DCA). Για το σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε η ευαισθησία των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα, έναντι του BOA και του μεταβολικού παραγώγου του 2AP. Παρά το γεγονός ότι η απουσία του γονιδίου ΝΑΤ1 φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα του μύκητα να επιβιώνει παρουσία των ξενοβιοτικών ενώσεων, ωστόσο τα γονίδια ΝΑΤ δεν φάνηκε να έχουν κάποιο εμφανή ρόλο στην αλληλεπίδραση μεταξύ των συγκαλλιεργούμενων μικροοργανισμών. Τέλος, η παρούσα διατριβή επιχείρησε να μελετήσει άλλους πιθανούς ρόλους των γονιδίων ΝΑΤ των μικροοργανισμών, πέραν του ξενοβιοτικού μεταβολισμού. Για το σκοπό αυτό, αρχικά, πραγματοποιήθηκε μια εκτεταμένη υπολογιστική ανασκόπηση βάσεων δεδομένων για τον εντοπισμό γονιδίων ΝΑΤ σε ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς (πρώτιστα και μύκητες) που έχουν αλληλουχηθεί πρόσφατα. Οι αλληλουχίες αυτές αποτέλεσαν τη βάση για περαιτέρω βιοπληροφορική μελέτη που είχε στόχο να διερευνήσει την πιθανή συσχέτιση των γονιδίων ΝΑΤ με βιοσυνθετικά μονοπάτια του δευτερογενούς μεταβολισμού. Πράγματι, η μελέτη προσδιόρισε 103 συστοιχίες γονιδίων στο γονιδίωμα 69 ασκομυκήτων και βασιδιομυκήτων, οι οποίες βρέθηκε να περιλαμβάνουν γονίδια ΝΑΤ. Καθώς, η αρωματική αμίνη 3-αμινο-5-υδροξυβενζοϊκό οξύ (3,5-AHBA) είναι γνωστό ότι χρησιμοποιείται από τους μικροοργανισμούς για τη βιοσύνθεση πολυκετιδικών δευτερογενών μεταβολιτών, ακολούθως διερευνήθηκε η ικανότητα των ανασυνδυασμένων ενζύμων ΝΑΤ δύο φυτοπαθογόνων μυκήτων του γένους Fusarium (F. verticillioides and F. graminearum) να χρησιμοποιούν την ένωση αυτή ως υπόστρωμα δέκτη. Επιπλέον, διερευνήθηκε η ικανότητα των ενζύμων αυτών να υδρολύουν υπόστρωμα ακυλο-συνένζυμο Α απουσία υποστρώματος δέκτη. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μια πιο διεξοδική λειτουργική μελέτη για το ανασυνδυασμένο ισοένζυμο ΝΑΤ1 του F. verticillioides, το οποίο φέρει επίσημο σύμβολο (GIBMO)NAT1, μέσω κινητικής ανάλυσης με το επιλεκτικό υπόστρωμα δότη μαλόνυλο-συνένζυμο Α, ενώ η μελέτη ολοκληρώθηκε με κρυσταλλογραφική ανάλυση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Η παρούσα διατριβή παρέχει πρωτότυπη επιστημονική γνώση πάνω στο ρόλο των μικροβιακών γονιδίων ΝΑΤ στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό, επεκτείνοντας επιπλέον την κατανόησή μας σχετικά με τη λειτουργική διαφοροποίηση της συγκεκριμένης ενζυμικής οικογένειας που πιστεύεται ότι έχει πολύ ενδιαφέρουσα εξελικτική ιστορία. Με βάση τις παρατηρήσεις της μελέτης προτείνονται επίσης ορισμένες πιθανές εφαρμογές προς διερεύνηση, π.χ. μέσω της χρήσης σε πρωτόκολλα βιοαποκατάστασης μικροοργανισμών που βρέθηκε ότι ανέχονται και μεταβολίζουν τοξικές αρωματικές αμίνες μέσω των ενζύμων ΝΑΤ που διαθέτουν. Επίσης, η αναστολή είτε της έκφρασης των γονιδίων ΝΑΤ είτε της ενζυμικής ενεργότητας των αντίστοιχων πρωτεϊνικών προϊόντων τους θα μπορούσε να διερευνηθεί ως μέσο βιολογικού ελέγχου του φυτοπαθογόνου μύκητα F. verticillioides που προσβάλλει το καλαμπόκι.