Development of acoustic wave biosensors for application in molecular diagnostics
Authors: Γραμμουστιάνου Αριστέα 
Published: September 2021

Από την ανάπτυξη του πρώτου βιοαισθητήρα από τον Leland C. Clark το 1962, η πρόοδος στον τομέα των βιοαισθητήρων είναι πρωτοφανής. Η αγορά των βιοαισθητήρων εκτιμάται ότι θα κοστίζει 27.06 δισεκατομμύρια δολάρια μέχρι το 2022. Επί του παρόντος, η επιστημονική έρευνα είναι επικεντρωμένη στην ανάπτυξη οικονομικών, μη επεμβατικών, ενσωματωμένων και φορητών βιοαισθητήρων που θα βρουν εφαρμογή στους τομείς της ταχείας διαγνωστικής, της ανάλυσης ποιότητας τροφίμων, του περιβαλλοντικού ελέγχου, της βιοάμυνας και της εγκληματολογίας. Η παρούσα διδακτορική έρευνα επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ακουστικών βιοαισθητήρων που μπορούν να βρουν εφαρμογή στη μοριακή διαγνωστική. Οι ακουστικοί βιοαισθητήρες επιτρέπουν την βιολογική ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο και χωρίς την ανάγκη σήμανσης. Η έρευνα χρησιμοποίησε τα μοναδικά χαρακτηριστικά των ακουστικών βιοαισθητήρων για την ανάπτυξη βιοδοκιμών με εφαρμογή στους τομείς της ασφάλειας τροφίμων και της διαγνωστικής καρκίνου.Ο πρώτος στόχος της διατριβής ήταν η ακουστική ανίχνευση του τροφιμογενούς παθογόνου Salmonella Typhimurium. Δύο προσεγγίσεις ακολουθήθηκαν: η πρώτη χρησιμοποίησε έναν ακουστικό ανοσοαισθητήρα για την ανίχνευση ολόκληρων κυττάρων Salmonella Typhimurium. Ο βιοαισθητήρας πέτυχε την ανίχνευση των κυττάρων μέσα σε 30 λεπτά και με όριο ανίχνευσης τις 106 μονάδες σχηματισμού αποικίας/mL (106 cfu/mL). Η δεύτερη προσέγγιση χρησιμοποίησε έναν ακουστικό βιοαισθητήρα για την ενίσχυση και ανίχνευση της ενίσχυσης του γονιδίου invA της Salmonella Typhimurium επάνω στην ακουστική επιφάνεια. Για την ενίσχυση του γονιδίου χρησιμοποιήθηκε η ισόθερμη τεχνική recombinase polymerase amplification (RPA). Η ταυτόχρονη ανίχνευση των γονιδιακών αμπλικονίων πάνω στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα έγινε με τη χρήση λιποσωμάτων που έδρασαν ως ενισχυτικοί ανιχνευτές. Η μεθοδολογία που παρουσιάστηκε για πρώτη φορά σε αυτή την έρευνα ήταν γρήγορη (ανίχνευση των γονιδιακών αμπλικονίων σε 5 μόνο λεπτά) και απλή (δε χρειάστηκαν μετα-ενισχυτικά βήματα επεξεργασίας των αμπλικονίων).Το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής ασχολήθηκε με την ανάπτυξη ακουστικών βιοαισθητήρων για τη μοριακή διαγνωστική καρκίνου. Ένας DNA-βιοαισθητήρας σχεδιάστηκε για την ανίχνευση 4 microRNAs (miRNAS: miR-21, miR-155, miR-150, miR-107) που θεωρούνται δυναμικοί βιοδείκτες του καρκίνου του μαστού. Η ακουστική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός μοναδικού ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη. Μάλιστα, ο βιοαισθητήρας επέτρεψε τη γρήγορη, απλή και ταυτόχρονη ανίχνευση δύο miRNAs σε πραγματικό χρόνο και χωρίς τη χρήση μορίων επισήμανσης.Ο τελικός σκοπός της παρούσας δουλειάς ήταν η ανάπτυξη ενός ακουστικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση KRAS μεταλλάξεων, χαρακτηριστικών του ορθοκολικού καρκίνου, παρόντων σε circulating tumor DNA (ctDNA) μόρια. Η ανίχνευση των KRAS μεταλλάξεων έγινε μέσω της υβριδοποίησης των ctDNA μορίων σε έναν peptide nucleic acid (PNA) ανιχνευτή πάνω στην επιφάνεια του αισθητήρα. Χρησιμοποιήθηκαν ακουστικοί αισθητήρες υψηλούς θεμελιώδους συχνότητας και μία πατενταρισμένη τεχνολογία που συνδυάζει νουκλεοβάσεις με τροποιημένη αλδεΰδη (SMART nucleobases) και μοναδικούς PNA ιχνηθέτες που φέρουν μία «κενή» θέση στον σκελετό τους (DGL probes). Η τεχνολογία που αναπτύχθηκε πέτυχε την ακουστική ανίχνευση KRAS μεταλλάξεων παρόντων σε μόρια ctDNA εισάγοντας μία νέα εναλλακτική στις τρέχουσες μεθόδους διάγνωσης του ορθοκολικού καρκίνου.