GC‐IMS and machine learning for the rapid differentiation of complex isomeric mixtures of terpenes
Authors: Brendel Rebecca , Rohn Sascha , Weller Philipp , Mannheim Hochschule 
Published: June 2023

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Prototyp einer Kopplung eines Headspace Gaschromatographen an die Massen‐ und Ionenmobilitätsspektrometrie (HS‐GC‐MS‐IMS) zur parallelen Detektion entwickelt, um die qualitative und quantitative Analytik von isomeren Terpenen in komplexen Matrices von Lebensmittel und Kosmetika zu verbessern. Zusätzlich wurden Methoden des maschinellen Lernens für unterschiedliche analytische Fragestellungen in eigenen MATLAB Routinen angewendet, um die in den IMS‐ und MS‐Spektren enthaltende Information zu extrahieren und zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten zunächst, dass HS‐GC‐ MS‐IMS die Identifizierung von Monoterpenen aus dem volatilen Profil von Hopfenpellets und Zitrussäften, zwei terpenreichen Lebensmitteln, verbesserte. Die Co‐Elution mit anderen Matrixkomponenten führte zu veränderten Massenspektren und damit zu reduzierten Match Quality Werten, was keine spezifische Aussage über die Identität der Substanzen zuließ. In der IMS konnten die Ionensignale der untersuchten Monoterpene hingegen klar von den Ionensignalen anderer Matrixkomponenten differenziert werden. Jedoch wiesen die Ionensignale der Monomere einiger Isomere große Ähnlichkeiten auf. Unterschiede waren nur im Signalbereich der Dimere zu beobachten, welche bei höheren Analytkonzentrationen gebildet werden. Es wurde angenommen, dass eine durch Protonentransfer initiierte komplexe Ionenchemie, wie Eliminierungs‐, Substitutions‐ und Umlagerungsreaktionen, zur Bildung der sehr ähnlichen Monomerionencluster führte. Wohingegen Dimerionencluster durch die Anlagerung eines intakten Analytmoleküls an einen Monomerionencluster gebildet wurden und diese damit charakteristischer für die Molekülstruktur der Isomere sind. Um dennoch die Selektivität der IMS zu steigern, wurde Stickstoffmonoxid (NO) als Dopant dem Driftgasstrom zugemischt. Dies führte zu erhöhten Mengen an NO+ Reaktantionen und zur Bildung zusätzlicher, charakteristischer Ionen in der Region der Monomerionen, was damit die klare Differenzierung auch bei geringeren Analytkonzentrationen der untersuchten Monoterpene ermöglichte. Des Weiteren war bekannt, dass es im Fall von Co‐Elutionen zur Bildung von Multikomponentenclusterionen oder zur Ionenunterdrückung durch kompetitive Ionisierungssituationen kommen kann und dadurch univariate Methoden zur Quantifizierung nicht anwendbar sind. Ebenso war bekannt, dass das nicht lineare Signalverhalten in der IMS die quantitative Analyse zusätzlich erschwert. Als ein neuer analytischer Ansatz wurden in dieser Arbeit multivariate Regressionsmethoden angewendet und miteinander verglichen, wie der multivariate curve resolution alternating least squares (MCR‐ALS) Algorithmus, die partial least square regression (PLS) und die kernel PLS, als nicht lineare multivariate Regressionsmethode. Da die Konzentration von potenziell allergenen Terpenen in kosmetischen Produkten von besonderem Interesse ist, wurden Mischungen von häufig verwendeten Duftstoffen als Anwendungsbeispiel in zwei Experimenten verwendet. Die geringsten Vorhersagefehler zwischen 2,57 und 3.60 % wurden mittels kernel PLS im Fall der Bildung von Multikomponentenclusterionen erhalten, während im Fall von Ionenunterdrückung der Vorhersagefehler höher war. Werte zwischen 3,20 und 13,72 % zeigten, dass in diesem Fall eine Quantifizierung schwierig bleibt.

Anschließend wurde die Anwendung der HS‐GC‐MS‐IMS Kopplung als Profilingtechnik für die Analytik von Terpenen in komplexen Lebensmittelmatrices untersucht. In einer ersten Studie wurde der Aufbau zur Analyse von Hopfenpellets unterschiedlicher Hopfenkultivare verwendet. Die erhaltenen Daten wurden mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der hierarchischen Clusteranalyse (HCA) ausgewertet, um Ähnlichkeiten zwischen den Kultivaren zu visualisieren. Die Proben lagen in den erhaltenen Dendrogrammen der IMS‐ und MS‐Daten unterschiedlich verteilt vor, was auf Unterschiede in den erhaltenen volatilen Profilen der beiden Techniken hinwies. Jedoch waren einige Kultivare ähnlichen Clustern in der ersten hierarchischen Ebene beider Datensätze zugeordnet. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass die Information hinsichtlich der Ähnlichkeit im volatilen Profil sowohl aus den IMS‐, als auch aus den MS‐Daten extrahierbar war, obwohl sich die Information im Detail zwischen den beiden Techniken unterschied. Zusätzlich konnte ein genereller Trend entlang der ersten Hauptkomponente in den Score Plots beider Datensätzen beobachtet werden. Proben mit hohen Alphasäuregehalten lagen bei höheren Scorewerten und Proben mit geringen Alphasäuregehalten bei niedrigen Scorewerten. Um eine mögliche Korrelation zwischen dem volatilen Profil und dem Alphasäuregehalt der Hopfenproben zu untersuchen, wurde eine PLS mit beiden Datensätzen durchgeführt. Mit den IMS‐Daten konnte der Alphasäuregehalt mit einem Fehler von durchschnittlich 0,99 % Alphasäure vorhergesagt werden, mit den MS‐Daten mit einem Fehler von 2,12 % Alphasäure. Damit konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche chemische Informationen aus den IMS‐ und MS‐Daten extrahiert wurden. In einer zweiten Studie wurde der Aufbau für die Klassifizierung von Zitrussäften aus unterschiedlichen

Fruchtsorten und von unterschiedlichen Saftarten verwendet. Der allgemeine Klassifizierungsfehler der Kreuzvalidierung der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) lag für die IMS‐Daten bei 10,6 % und für die MS‐Daten bei 12,8 %. Grapefruit‐ und Orangesaft konnten mit beiden Datensätzen differenziert werden, währenddessen die Saftarten deutlicher mit den IMS‐Daten und die Sorten Blutorange und süße Orange mit den MS‐Daten unterschieden werden konnten. Die Vorhersagefähigkeit des Klassifizierungsmodels konnte jedoch mittels Datenfusion nicht verbessert werden, da möglicherweise die enthaltene Information der IMSund MS‐Daten nicht vollständig komplementär zueinander war. Schließlich wurde der entwickelte Aufbau der HS‐GC‐MS‐IMS mit paralleler Detektion zur Analytik von Terpenen in komplexen Matrices umfassend in dieser Arbeit getestet. Die mittels IMS zusätzlich erhaltene Information verbesserte die Identifizierung von Terpenen neben anderen Matrixkomponenten. Zukünftige Anwendungsgebiete in der Lebensmittelanalytik wurden gezeigt. Dazu zählen die Vorhersage des Alphasäuregehalts von Hopfenpellets, wie auch die Klassifizierung von Zitrussäften unter Zuhilfenahme von intelligenten Methoden des maschinellen Lernens. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Selektivität für Terpene in der IMS durch Zugabe von NO als Dopant gesteigert werden kann und dass die generellen Schwierigkeiten bei der Quantifizierung im Fall von Co‐Elutionen in der IMS durch den Einsatz von multivariaten Regressionsmethoden überwunden werden können.

aufwies. Mit letzterer sollte untersucht werden, ob altersbedingten Veränderungen entgegengewirkt werden kann, indem eine erhöhte Versorgung mit den SpE erfolgt, deren Gehalt im Serum mit zunehmendem Alter abnimmt. Als ein zentrales Organ der Zink‐Homöostase wurde die Leber untersucht. Dafür wurde ein Fluoreszenzsonden‐basierter Assay zur Bestimmung der freien Zinkkonzentration in homogenisierten murinen Lebergewebeproben etabliert. Die damit ermittelten Daten zeigen, dass die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe tendenziell die Zink‐Versorgung der Mäuse widerspiegelt und die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe weiblicher Mäuse signifikant höher ist als die im Lebergewebe männlicher. Beim Gesamtzinkgehalt des Lebergewebes traten keine derartigen Effekte der Zink‐Versorgung oder des Geschlechts auf. Das Alter der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe. Die Funktionsfähigkeit des Immunsystems ist von Zink abhängig und unterliegt zudem altersbedingten Veränderungen. Als Bestandteil des Immunsystems wurden daher isolierte Splenozyten untersucht. Es wurde der prozentuale Anteil an B‐Zellen, T‐Helferzellen, zytotoxischen T‐Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen an den isolierten Splenozyten bestimmt, die zelluläre freie Zinkkonzentration der verschiedenen Zelltypen, sowie der relative Gehalt der pro‐ bzw. antiinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)‐2, IL‐10, IL‐17, Interferon‐γ und Tumornekrosefaktor‐α im Überstand nach Stimulation mit Phytohämaglutinin (PHA). Es zeigte sich altersbedingt eine Abnahme des Anteils an T‐Helferzellen, ein Anstieg des Anteils an dendritischen Zellen, eine Abnahme der zellulären freien Zinkkonzentration von B‐Zellen und dendritischen Zellen sowie eine Zunahme des relativen IL‐10 Gehaltes im Überstand nach Stimulation der isolierten Splenozyten mit PHA. Die altersadaptierte SpE‐Versorgung, mit einem erhöhten Zink‐ und Selengehalt, hat diesen beobachteten altersbedingten Veränderungen des Immunsystems nicht entgegengewirkt. Dies deutet darauf hin, dass die zugrunde liegenden Mechanismen nicht durch eine erhöhte ernährungsbedingte Zink‐ und Selenzufuhr moduliert werden können.