MRD Monitoring in AML with KMT2A Gene Rearrangements: Comparison of Multiplex and Monoplex Real-Time RT-PCR Methods
Authors: Лебедева С.А. , Борковская А.Н. , Дадаханова Э.Р. , Вьюшков В.C. , Солдаткина О.И. , Тимофеева Н.М. , Калинина И.И. , Масчан А.А. , Новичкова Г.А. , Ольшанская Ю.В. , Зеркаленкова Е.А. 
Published: March 2023

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) занимает 15–20% в структуре детских острых лейкозов. Несмотря на успехи, достигнутые за последние годы, терапия ОМЛ остается трудной задачей. Важную роль в определении оптимальной тактики терапии играет определение уровня минимальной остаточной болезни (МОБ). Для ОМЛ с перестройками гена KMT2A одним из наиболее чувствительных методов детекции МОБ является количественная ПЦР. Перестройки гена KMT2A представляют собой крайне гетерогенную группу, в связи с чем для их первичной детекции применяют различные молекулярно-биологические методы, включая длинную инвертированную ПЦР, мультиплексную ПЦР и таргетное высокопроизводительное секвенирование, что позволяет не только подтвердить наличие перестройки гена KMT2A, но и уточнить характер этой перестройки. В дальнейшем для мониторинга МОБ может применяться как мультиплексная, так и моноплексная количественная ПЦР. Целью работы являлось сравнение методов мультиплексной и моноплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени в контексте мониторинга МОБ у пациентов с KMT2A-позитивными ОМЛ. В исследование было включено 20 пациентов с KMT2A-позитивным ОМЛ, проходивших диагностику в лаборатории цитогенетики и молекулярной генетики НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева. Определение экспрессии химерного транскрипта выполнено суммарно в 37 точках, из них 14 – исследование на инициальном материале, 23 – исследование на материале в контрольных точках, предусмотренных протоколом лечения. В 33 случаях химерный транскрипт детектировался обоими методами, в 4 случаях – только при использовании моноплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. При использовании моноплексной ОТ-ПЦР отношение копийности химерного транскрипта к копийности контрольного гена было достоверно выше, нежели при использовании мультиплексной ОТ-ПЦР (n=33, p<0,001). Проведенное сравнение демонстрирует, что моноплексная ОТ-ПЦР в режиме реального времени является не только более специфичным, но и более чувствительным методом детекции МОБ.

Acute myeloid leukemia (AML) occupies 15–20% in the structure of childhood acute leukemia. Despite the advances made in recent years, the treatment of AML remains a challenge. The level of minimal residual disease (MRD) plays an important role in determining of the optimal therapy tactics. For AML with KMT2A gene rearrangements, quantitative PCR is one of the most sensitive methods for MRD detection. KMT2A rearrangements are extremely heterogeneous, and therefore, for their primary detection, various molecular methods are used, including long-distance inverse PCR, multiplex PCR, and targeted high-throughput sequencing, which enables not only to confirm KMT2A rearrangement presence, but also to clarify its structure. Subsequently, both multiplex and monoplex quantitative PCR can be used for MRD monitoring. The purpose of the work was to compare methods of multiplex and monoplex real-time RT-PCR in the context of MRD monitoring in patients with KMT2A-positive AML. The study included 20 patients with KMT2A-positive AML who underwent diagnostics in the laboratory of cytogenetics and molecular genetics in Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology. The chimeric transcript expression analysis was performed at 37 points, including 14 initial and 23 MRD samples as determined by the treatment protocol. In 33 cases, the chimeric transcript was detected by both methods, and in 4 cases, only by real-time monoplex RT-PCR. When using monoplex RT-PCR, the copy ratio of the chimeric transcript to the copy number of the control gene was significantly higher than when using multiplex RT-PCR (n=33, p<0.001). This comparison demonstrates that real-time monoplex RT-PCR is not only more specific, but also more sensitive for PCR- based MRD detection.