Μελέτη με κυτταρομετρία ροής των νεότερων προγνωστικών δεικτών στα χρόνια Β-λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα
Authors: Τσιώνη Κωνσταντίνα 
Published: August 2021

Εισαγωγή: Τα χρόνια Β Λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα (Β-ΛΥΝ) είναι κλωνικές παθήσεις των Β λεμφοκυττάρων. Η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο συχνή μορφή λευχαιμίας στο Δυτικό κόσμο. Η κλινική της πορεία και η πρόγνωση εμφανίζουν μεγάλη ετερογένεια. Ορισμένοι ασθενείς ζουν για δεκαετίες χωρίς να χρειάζονται θεραπεία, ενώ άλλοι έχουν γρήγορη εξέλιξη και επιθετική νόσο. Αν και τα συστήματα σταδιοποίησης παραμένουν η βάση για την εκτίμηση της πρόγνωσης στη ΧΛΛ, νεότεροι προγνωστικοί δείκτες είναι απαραίτητοι για την πρόγνωση, ειδικά, για τους ασθενείς σε αρχικό στάδιο νόσου. Η κατάσταση των μεταλλάξεων των IgVH και οι κυτταρογενετικές ανωμαλίες έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία, αλλά οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό τους είναι διαθέσιμες σε μικρό αριθμό κέντρων διότι είναι ακριβές, χρονοβόρες και τεχνικά δύσκολες. Πιθανοί νεότεροι προγνωστικοί δείκτες, όπως το CD38 και οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53 που είναι σχετικά εύκολο να προσδιοριστούν με Κυτταρομετρία ροής (ΚΡ) είναι υπό μελέτη. Η ΚΡ είναι σχετικά εύκολη και γρήγορη και διαθέσιμη στα περισσότερα κλινικά εργαστήρια για τη διάγνωση των Β-ΛΥΝ, αλλά για την πρόγνωση των νοσημάτων αυτών χρειάζεται αξιολόγηση και προτυποποίηση. Σκοπός: Μελέτη της μεθόδου της ΚΡ και βελτιστοποίησή της, όσον αφορά στον προσδιορισμό CD38, ΖΑΡ-70 και p53. Μελέτη της δυνατότητας υποκατάστασης της ανοσοϊστοχημείας με την ΚΡ, στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και της del17p που προσδιορίζεται με FISH με τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης p53 με ΚΡ, σε ασθενείς με Β-ΛΥΝ. Εκτίμηση της προγνωστικής αξίας της έκφρασης των CD38, ZAP-70 και p53 σε ασθενείς με ΧΛΛ. Ανακάλυψη νεότερων προγνωστικών δεικτών με ανεξάρτητη προγνωστική αξία με σκοπό να προσδιοριστεί η ανάγκη έναρξης θεραπείας των ασθενών με ΧΛΛ και ειδικά ασθενών χαμηλού κινδύνου. Αυτό θα βοηθήσει στον εντοπισμό των ασθενών χαμηλού κινδύνου που θα εμφανίσουν πρόοδο νόσου και θα ωφεληθούν από την εφαρμογή πρώιμης και/ή πιο επιθετικής θεραπείας, θα βοηθήσει, δηλαδή, στην εξατομίκευση της θεραπείας με βάση τη διαστρωμάτωση κινδύνου. Υλικό και μέθοδος: 100 συνεχόμενοι ασθενείς από ένα κέντρο αναφοράς συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη και παρακολουθήθηκαν για 1-216 μήνες (διάμεση τιμή 35 μήνες), 60 (60%) άνδρες ηλικίας 40-88 ετών (διάμεση ηλικία 68 έτη). Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Ομάδα Α: 80 ασθενείς πάσχοντες από ΧΛΛ, 52 (65%) άνδρες με μέση ηλικία διάγνωσης τα 67 έτη και διάμεσο χρόνο παρακολούθησης τους 37 μήνες. 54 (67,5%) από τους ασθενείς της Ομάδας Α, που είναι και η πλειοψηφία των ασθενών με ΧΛΛ ήταν σταδίου 0 κατά Rai (ασθενείς χαμηλού κινδύνου). Ομάδα Β: 20 ασθενείς με Β-ΛΥΝ, 8 (40%) άνδρες, με διάμεση ηλικία διάγνωσης τα 74 έτη και διάμεσο χρόνο παρακολούθησης τους 25,5 μήνες. Υψηλού κινδύνου γενετικές διαταραχές, όπως η έλλειψη στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 17 (del17p) προσδιορίστηκαν με Fluorescence in situ Hybridization (FISH), η πρωτεΐνη ΖΑΡ-70 προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία και ΚΡ, η έκφραση του CD38 και της πρωτεΐνης p53 προσδιορίστηκε με ΚΡ και πρωτόκολλο τριών χρωμάτων τόσο στο περιφερικό αίμα, όσο και στο μυελό των οστών. Δύο διαφορετικά πρωτόκολλα εργασίας αξιολογήθηκαν, όσον αφορά στον προσδιορισμό ενδοκυττάριων αντιγόνων, όπως οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53. Προσδιορίστηκαν επίσης, η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και η β2-μικροσφαιρίνη. Αποτελέσματα: Βρέθηκαν 56 (56%) ασθενείς με θετικό CD38, 62 (62%) με θετική ΖΑΡ-70 και 28 (29,9%) με θετική p53 στο περιφερικό αίμα. Με το συντελεστή συσχέτισης Spearmann βρέθηκε θετική συσχέτιση ανάμεσα στο περιφερικό αίμα και στο μυελό των οστών και για τους τρεις δείκτες (p<0,0001). Με το συντελεστή συμφωνίας k και με έλεγχο με Mc Nemars και Bowkers test βρέθηκε θετική συσχέτιση ανάμεσα στην ανοσοϊστοχημεία και στην ΚΡ όσον αφορά στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και ανάμεσα στην del17p που προσδιορίζεται με FISH και την πρωτεΐνη p53 που προσδιορίζεται με ΚΡ (p=1). Το βέλτιστο όριο θετικότητας για την ΚΡ προσδιορίστηκε με καμπύλες ROC και βρέθηκε να είναι 10%, 20% και 12,5% για το CD38, την ΖΑΡ-70 και την p53, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας MANOVA fit για το CD38 και το Wilcoxon-Sing Rank test για την ΖΑΡ-70 βρήκαμε ότι και οι δύο δείκτες δεν είχαν σταθερή έκφραση στην πορεία της νόσου (p=0,017 και p=0,003, αντίστοιχα). Η υπόλοιπη μελέτη αφορά στους ασθενείς με ΧΛΛ (Ομάδα Α). Δεν έγιναν συσχετίσεις στην Ομάδα Β εξαιτίας του μικρού αριθμού των ασθενών της. Με το κριτήριο χ² βρέθηκε ότι θετική έκφραση CD38, ΖΑΡ-70 ή p53 συσχετίζεται με την ανάγκη έναρξης θεραπείας (p=0,025, p=0,013 p<0,001, αντίστοιχα), με τις καμπύλες ROC, όμως, μόνο το CD38 και η p53 βρέθηκαν να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση μόνο η p53 βρέθηκε να έχει ανεξάρτητη προγνωστική αξία, δείχνοντας ότι η p53 μόνη της μπορεί να προβλέψει την ανάγκη έναρξης θεραπείας στη ΧΛΛ. Ανεξάρτητη προγνωστική αξία βρέθηκαν να έχουν και οι παλαιότεροι προγνωστικοί δείκτες, το κλινικό στάδιο της νόσου, η LDH και η β2-μικροσφαιρίνη (χ², p=0,002, p=0,025 και p<0,001, αντίστοιχα). Δε βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στους τρεις δείκτες και στο χρόνο έναρξης της θεραπείας (Time To First Treatment, TTT) (Log-rank test, p=0,545, p=0,102 and p=0,646) και στην υποτροπή της νόσου (χ², p=0,930, p=0,360 and p=0,475). Τέλος, με το κριτήριο χ² βρέθηκε ότι το CD38 και η p53 προβλέπουν την ανάγκη έναρξης θεραπείας στην ευαίσθητη και πολυπληθή ομάδα των ασθενών χαμηλού κινδύνου (p=0,02, p=0,02 and p=0,005). Συμπεράσματα: Η ΚΡ αποτελεί ένα πολύ καλό εργαλείο για τον προσδιορισμό του CD38 και των πρωτεϊνών ΖΑΡ-70 και p53 τόσο στο περιφερικό αίμα, όσο και στο μυελό των οστών. Το βελτιωμένο πρωτόκολλο εργασίας που χρησιμοποιήσαμε στη μελέτη μπορεί να ενσωματωθεί στο διαγνωστικό πρωτόκολλο των Β-ΛΥΝ. Η ΚΡ μπορεί να υποκαταστήσει την ανοσοϊστοχημεία στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και τον προσδιορισμό της del17p που προσδιορίζεται με FISH με τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης p53 στους ασθενείς με Β-ΛΥΝ. Η έκφραση του CD38 και της ΖΑΡ-70 δεν ήταν σταθερή στην πορεία της ΧΛΛ, οπότε προτείνουμε τον προσδιορισμό τους περισσότερες από μία φορές και κυρίως στους ασθενείς που ήταν αρνητικοί για τους δείκτες αυτούς και εμφάνισαν πρόοδο νόσου. Τα βέλτιστα όρια θετικότητας που βρήκαμε για το CD38 και τη ΖΑΡ-70 συμφωνούν με αυτά που δίνουν διεθνείς μελέτες και η ERIC (European Research Initiative on CLL). Το βέλτιστο όριο θετικότητας για την πρωτεΐνη p53 διαφέρει από αυτό που χρησιμοποιείται διεθνώς και πρέπει να επιβεβαιωθεί σε μεγαλύτερες σειρές ασθενών. Το CD38 και οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53 που προσδιορίζονται με ΚΡ έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία όσον αφορά στον προσδιορισμό της ανάγκης έναρξης θεραπείας και βοηθούν στην αξιολόγηση της πορείας των ασθενών με ΧΛΛ που γίνεται με τους κλασικούς προγνωστικούς δείκτες που είναι το κλινικό στάδιο της νόσου, η LDH και η β2-μικροσφαιρίνη, αμέσως μετά τη διάγνωση. Από την πολυπαραγοντική ανάλυση φαίνεται ότι η πρωτεΐνη p53 μόνη της μπορεί να προβλέψει την ανάγκη έναρξης θεραπείας στη ΧΛΛ. Το CD38, η p53 και ο συνδυασμός τους μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς σε αρχικό στάδιο νόσου που θα χρειαστούν θεραπεία από αυτούς που η νόσος τους θα παραμείνει σταθερή και δε θα ωφεληθούν από πρώιμη έναρξη θεραπείας. Εξαιτίας του μικρού αριθμού των ασθενών δεν εδραιώθηκε συσχέτιση ανάμεσα στους τρεις δείκτες και το χρόνο έναρξης θεραπείας. Εξαιτίας του μικρού χρονικού διαστήματος παρακολούθησης των ασθενών δεν εδραιώθηκε συσχέτιση ανάμεσα στο CD38, τη ΖΑΡ-70 και την p53 και την υποτροπή της νόσου ή την επιβίωση των ασθενών.