Applications of genetic and genomic modifications (CRISPR / Cas9, ectopic expression) for the analysis of mechanisms of insecticide resistance
Authors: Παντελέρη Ραφαέλα 
Published: October 2024

Τα αρθρόποδα που είναι εχθροί καλλιεργειών και φορείς ασθενειών αποτελούν σημαντικές απειλές για τη γεωργία, τη δημόσια υγεία και τα οικοσυστήματα παγκοσμίως. Παρότι τα παραδοσιακά χρησιμοποιούμενα χημικά εντομοκτόνα εξυπηρετούν ως πρωταρχική μέθοδος ελέγχου, η εκτεταμένη χρήση τους έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Δεδομένης της περιορισμένης ανάπτυξης νέων δραστικών ουσιών, η κατανόηση της γενετικής βάσης του φαινομένου της ανθεκτικότητας είναι κρίσιμη ώστε να μετριαστεί η αποτυχία των μεθόδων ελέγχου που βασίζονται στα εντομοκτόνα. Η έρευνα που πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκειατης παρούσας διατριβής στοχεύει να διαλευκάνει τους μοριακούς μηχανισμούς ανθεκτικότηταςκαι τα συνδυαστικά τους αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας μια πειραματική προσέγγιση που ενσωματώνει τεχνολογίες γονιδιακής τροποποίησης, ειδικότερα CRISPR/Cas9, με εξειδικευμένα εργαλεία γενετικού χειρισμού στον οργανισμό-μοντέλο Drosophila melanogaster. Στο πρώτο υποκεφάλαιο (3.1), ο στόχος ήταν η λειτουργική αξιολόγηση ορισμένων υποψήφιων μεταλλαγών οι οποίες είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στόχου σε σημαντικούς εχθρούς καλλιεργειών. Στην ενότητα 3.1.1, εξετάστηκε η επίπτωση μιας αντικατάστασης που έχει ταυτοποιηθεί στο άκαρι Panonychus citri, στην υπομονάδα PSST του αναπνευστικού συμπλόκου I, το οποίο αποτελεί τον μοριακό στόχο των ακαρεοκτόνων METI-I. Οι βιοδοκιμές τοξικότητας με γονιδιωματικά τροποποιημένες σειρές μυγών που έφεραν τημεταλλαγή A94V δεν αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με μύγες ελέγχου, υποδηλώνοντας την πιθανή εμπλοκή άλλων γενετικών τόπων στον παρατηρούμενο φαινότυπο ανθεκτικότητας. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν οι συνέπειες μιας πρόσφατα ανακαλυφθείσας, σε έναν ανθεκτικό στο etoxazole πληθυσμό του P. citri, μεταλλαγής στο γονίδιο της συνθάσης της χιτίνης Ι. Η μεταλλαγή αυτή θεωρήθηκε ότι δυνητικά εξισορροπεί την επίδραση της καλά χαρακτηρισμένης μεταλλαγής I1017F. Ωστόσο, οι βιοδοκιμές τοξικότητας σε γονιδιωματικά τροποποιημένες μύγες έδειξαν ότι η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο μεταλλαγών δεν μετέβαλε την απόκριση των μυγών στο etoxazole σε σύγκριση με μόνη την I1017F. Στην τελευταία ενότητα του υποκεφαλαίου αυτού, ο στόχος ήταν να διερευνηθεί η δραστικότητα της τοξίνης Bt και η ανθεκτικότητα που συσχετίζεται με μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ενός μεταφορέα ABCC2 της Spodoptera frugiperda. Αρχικά, το γονίδιο SfABCC2 εκφράστηκε σε διαγονιδιακές Drosophila, καθιστώντας τις μύγες ευαίσθητες στις τοξίνες Bt. Ακολούθως, εκτιμήθηκε η συμβολή συγκεκριμένων μεταλλαγών που έχουν βρεθεί στο ECL4 του μεταφορέα SfABCC2 με ενσωμάτωση των μεταλλαγμένων γονιδίων του μεταφορέα στο γονιδίωμα της Drosophila. Μέσω βιοδοκιμών τοξικότητας με ένα μίγμα τοξινών Bt, αξιολογήθηκε η συμβολή κάθε μεταλλαγής στην ανθεκτικότητα. Στο επόμενο υποκεφάλαιο, το επίκεντρο ήταν σε έναν άλλο ζωτικό μηχανισμόανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα: την ενισχυμένη αποτοξικοποίηση, πρωταρχικά διαμεσολαβούμενη μέσω των ενζύμων P450. Ειδικότερα, εξετάστηκε η ικανότητα δύο ενζύμων P450 του δάκου Bactrocera oleae που είχαν προηγουμένως παρατηρηθεί σε ανθεκτικούς φυσικούς πληθυσμούς, να επάγουν ανθεκτικότητα σε πυρευροειδή μέσω ετερόλογης έκφρασης των γονιδίων αυτών στην Drosophila. Παρά την αυξημένη έκφραση των P450s σε διαγονιδιακές μύγες, τα αποτελέσματα δεν έδειξαν σημαντική ανοχή έναντι πυρεθροειδών, κατ’ αρχάς σε αντίθεση με προγενέστερα ευρήματα. Στο τελευταίο υποκεφάλαιο (3.3), διερευνήθηκε ένα μακροχρόνιο ερώτημα που αφορά τις δυνητικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ διακριτών μηχανισμών ανθεκτικότητας. Η εφαρμογή της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 παράλληλα με την ιστοειδική έκφραση γονιδίων ανθεκτικότητας, επέτρεψε την ταυτόχρονη διερεύνηση τόσο της ανθεκτικότητας στόχου όσο και της αποτοξικοποίησης στο πλαίσιο ενός ελεγχόμενου γενετικού υποβάθρου, με επίκεντρο τις δυνητικές αλληλεπιδράσεις τους. Στην ενότητα 3.3.1 οι ενδεχόμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο κύριων μηχανισμών ανθεκτικότητας σε πυρεθροειδή, μεταλλαγών ανθεκτικότητας στόχου και ενισχυμένης αποτοξικοποίησης, διερευνήθηκαν μέσω της κατασκευής διαγονιδιακών μυγών που εκφράζουν την P450 CYP6BQ23 σε γενετικό υπόβαθρο L1014F kdr. Η δουλειά αυτή παρείχε ισχυρές ενδείξεις συνεργιστικών αλληλεπιδράσεων, όπως προκύπτει από τους σχεδόν πολλαπλασιαστικούς λόγους ανθεκτικότητας της σειρά που φέρει και τους δύο μηχανισμούς σε σχέση με τις σειρές ελέγχου. Επεκτείνοντας αυτή την προσέγγιση στην ενότητα 3.3.2, διερευνήθηκε το αποτέλεσμα παρόμοιων αλληλεπιδράσεων σε διαφορετικές τάξεις εντομοκτόνων. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ δύο μηχανισμών ανθεκτικότητας σε αμπαμεκτίνη στο άκαρι Tetranychus urticae. Κατασκευάστηκαν γονιδιωματικά τροποποιημένες σειρές Drosophila που εκφράζουν την P450 CYP392A16 σε γενετικό υπόβαθρο GluCl I321T και χρησιμοποιήθηκαν σε βιοδοκιμές τοξικότητας με αμπαμεκτίνη. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στους λόγους ανθεκτικότητας μεταξύ του στελέχους που φέρει και τους δύο μηχανισμούς και αυτών που φέρουν τον καθένα μόνο του, πράγμα που υποδηλώνει εναλλακτικές ερμηνείες ως προς τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποκείμενων μηχανισμών. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας και τονίζει τη σημασία των ολοκληρωμένων προσεγγίσεων στην ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών διαχείρισης επιβλαβών αρθροπόδων.