Ο ρόλος του μονοπατιού Notch και των bHLH-Orange πρωτεϊνών στην αυτο-ανανέωση των νευροβλαστών στα μετεμβρυικά στάδια της D.melanogaster
Authors: Ζαχαριουδάκη Ευανθία 
Published: August 2021

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εκτενώς ο ρόλος των πρωτεïνών bHLH-Orange (bHLH-O) και του μονοπατιού Notch στην αυτο-ανανέωση των μετεμβρυικών νευροβλαστών της D.melanogaster. Οι πρωτεΐνες bHLH-O είναι μια υποκατηγορία των μεταγραφικών παραγόντων basic-helix-loop-helix που χαρακτηρίζεται από το μοτίβο ‘Orange’ για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεïνών. Οι πρωτεΐνες αυτές δρούν ως καταστολείς της μεταγραφής και χαρακτηριστικά μέλη της οικογένειας είναι οι πρωτεΐνες Hairy/E(spl), ή Hes. Συνήθως αποτελούν στόχους της σηματοδότησης Notch και είναι γνωστοί για την ικανότητά τους μεταξύ άλλων να καταστέλλουν τη νευρική διαφοροποίηση σε σπονδυλωτά και ασπόνδυλα. Η νευρογένεση της προνύμφης στη Δροσόφιλα είναι ένα πολύ καλό μοντέλο για τη μελέτη της ισορροπίας ανάμεσα στην αυτοανανέωση και τη διαφοροποίηση ενός σωματικού βλαστικού κυττάρου (νευροβλάστη). Οι μετεμβρυικοί νευροβλάστες (NBs) είναι νευρικά βλαστικά κύτταρα που παραμένουν σε φάση ηρεμίας μετά το πέρας της εμβρυογένεσης και έπειτα από τη λήψη κατάλληλων θρεπτικών σημάτων στα πρώτα στάδια της προνύμφης, αρχίζουν εκ νέου να πραγματοποιούν ασύμμετρες διαιρέσεις. Οι νευροβλάστες παράγουν διαφοροποιημένους νευρώνες και γλοιακά κύτταρα από ενδιάμεσα πρόδρομα κύτταρα που ονομάζονται GMCs ή INPs. Αρχικά δείξαμε ότι οι bHLH-O πρωτεΐνες E(spl)mγ, E(spl)mβ, E(spl)m8 και Deadpan (Dpn) εκφράζονται στους νευροβλάστες και όχι στα διαφοροποιημένα κύτταρα στο ΚΝΣ της προνύμφης. Μωσαïκές γενεαλογίες οι οποίες είναι διπλά μεταλλαγμένες για τον γενετικό τόπο των γονιδίων E(spl) και για το γονίδιο dpn παρουσιάζουν δραματική μείωση στην ικανότητα αυτοανανέωσης των νευροβλαστών τους με αποτέλεσμα την πρόωρη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση των γονιδίων E(spl)mγ και m8, αλλά όχι του γονιδίου dpn, ρυθμίζεται από τη σηματοδότηση Notch που αποστέλλεται από το θυγατρικό κύτταρο GMC/INP προς τον θυγατρικό NB. Τέλος, είναι γνωστό ότι η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού Notch στους νευροβλάστες οδηγεί στην δημιουργία υπερπλασιών. Βρήκαμε ότι αυτός ο φαινότυπος της υπερπλασίας οφείλεται στην εκτοπική επαγωγή των γονιδίων E(spl) και μάλιστα η υπερέκφραση των γονιδίων E(spl) μπορεί να μιμηθεί μερικώς αυτόν τον φαινότυπο της επαγόμενης από το Notch υπερπλασίας. Επομένως, από τα παραπάνω πειράματα βρέθηκε ότι οι πρωτεΐνες E(spl) και Dpn δρούν συνεργατικά για τη διατήρηση των νευροβλαστών στην κατάσταση της αυτοανανέωσης και σε αυτή τη διαδικασία συνδράμει το μονοπάτι Notch το οποίο επάγει την έκφραση μονάχα των γονιδίων E(spl).Εν συνεχεία καταφύγαμε σε μια γονιδιωματική ανάλυση για να αναγνωρίσουμε το σύνολο των στόχων του μονοπατιού Notch που επηρεάζουν την ικανότητα αυτοανανέωσης στους μετεμβρυικούς νευροβλάστες. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση του συνολικού μεταγραφώματος (μικροσυστοιχίες Affymetrix) σε προνυμφικά ΚΝΣ όπου ο υποδοχέας Notch είναι υπερενεργός για 24 ώρες και προκαλεί υπερπλασία των νευροβλαστών. Από αυτές τις μικροσυστοιχίες 1289 ιχνηθέτες γονιδίων σημείωσαν αύξηση στα επίπεδα έκφρασής τους. Για την εύρεση των άμεσων στόχων της σηματοδότησης Notch, προχωρήσαμε σε ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (Ch-IP) με σκοπό την αναγνώριση θέσεων που καταλαμβάνει το συμπλόκο Nicd/Su(H) στο γονιδίωμα στο ΚΝΣ προνυμφών με υπερενεργοποίηση του μονοπατιού Notch για 24 ώρες. Οι αλληλουχίες στις οποίες προσδέθηκε το σύμπλοκο αυτό υβριδοποιήθηκαν σε μικροσυστοιχίες που φέρουν ολιγονουκλεοτίδια που καλύπτουν το σύνολο του γονιδιώματος της Δροσόφιλας (tiling arrays). Προέκυψαν 169 γονίδια ως άμεσοι στόχοι του Notch. Μεταξύ αυτών υπήρχαν πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες και παράγοντες που εμπλέκονται στο μηχανισμό της ασύμμετρης διαίρεσης. Επιλέξαμε 10 απο την πρώτη κατηγορία [τα γονίδια E(splmγ και dpn που μελετήθηκαν σε βάθος στο πρώτο μέρος της διατριβής και τα γονίδια, svp, cas, grh, wor, Antp, hth, lola, seq ] και 2 από τη δεύτερη (Mira και numb) για περαιτέρω μελέτη. Βρήκαμε ότι 5 από τα 12 γονίδια [E(spl)mγ, grh, wor, Mira, numb) αποκρίνονται σε απώλεια της λειτουργίας του Notch σε ποικίλο βαθμό ενώ 10 από τα 12 εμφανίζουν συσσώρευση μετά την υπερενεργοποίηση του Notch [E(spl)mγ, dpn, grh, wor, Mira, numb, svp, cas, hth και Antp]. Τέλος, πέρα από τα γονίδια E(spl), βρέθηκε ότι τα γονίδια lola και svp ήταν αναγκαία για την παθολογική Notch επαγόμενη υπερπλασία. Το γονίδιο svp που κωδικοποιεί έναν ορφανό πυρηνικό υποδοχέα στεροειδών (ομόλογο του COUP-TF στα θηλαστικά) ήταν ακόμα επαρκές για την επαγωγή υπερπλασιών στους νευροβλάστες. Τέσσερα ακόμα γονίδια (cas, dpn, grh και hth) βρέθηκαν να διαδραματίζουν ένα μικρότερο ρόλο σε αυτές τις υπερπλασίες.