Elucidating the functional organisation of the microbiome residing in anaerobic digesters for biogas production
Authors: Γάσπαρη Μαρία 
Published: November 2023

Η αναερόβια χώνευση είναι μια καθιερωμένη τεχνολογία που βασίζεται στη φυσική διαδικασία αποσύνθεσης της οργανικής ύλης από μικροοργανισμούς απουσία οξυγόνου. Στο επίκεντρο αυτής της διαδικασίας βρίσκεται η περίπλοκη μικροβιολογία που κρύβεται πίσω από αυτήν, όπου μια ποικιλόμορφη κοινοπραξία μικροοργανισμών, κυρίως βακτηρίων και αρχαίων, αλλά και μυκήτων σε μικρότερο βαθμό, συνεργάζονται για να μετατρέψουν πολύπλοκες οργανικές ενώσεις σε απλούστερα μόρια. Η διαδικασία αυτή διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αντιμετώπιση των περιβαλλοντικών προκλήσεων καθώς επιτυγχάνεται αποτελεσματική διαχείριση των οργανικών αποβλήτων και παραγωγή βιοαερίου, που αποτελεί βιώσιμη πηγή ενέργειας. Ως εκ τούτου, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι η χρήση αυτής της τεχνολογίας έχει σημειώσει αξιοσημείωτη αύξηση, τόσο στην Ευρώπη όσο και παγκοσμίως. Ωστόσο, η παρουσία τοξικών ουσιών στην πρώτη ύλη μπορεί να παρεμποδίσει τη μικροβιακή δραστηριότητα και να θέσει σε κίνδυνο την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας. Οι βλαβερές συνέπειες αυτών των τοξικών παραγόντων εκδηλώνονται με τη διακοπή βασικών μεταβολικών οδών και την αναστολή της μικροβιακής ανάπτυξης και δραστηριότητας, οδηγώντας σε μειωμένους ρυθμούς αποικοδόμησης, τροποποιημένη σύνθεση αερίου και μειωμένη συνολική απόδοση της διεργασίας. Τα σύγχρονα μοριακά εργαλεία, όπως η αλληλουχία υψηλής απόδοσης, η μεταγονιδιωματική ανάλυση και η μεταμεταγραφωματική ανάλυση, προσφέρουν τη δυνατότητα για τη μελέτη των επιπτώσεων των ανασταλτικών ουσιών στις μικροβιακές κοινότητες σε αντιδραστήρες βιοαερίου. Παρά την πολυπλοκότητα της διαδικασίας, αυτές οι μοριακές προσεγγίσεις παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για την καλύτερη κατανόηση και τη βελτιστοποίηση των συστημάτων αναερόβιας χώνευσης. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διεξοδική διερεύνηση της επίδρασης διαφόρων παραγόντων καταπόνησης, και πιο συγκεκριμένα των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου και της αμμωνίας, στις μικροβιακές κοινότητες αντιδραστήρων βιοαερίου. Για την επίτευξη αυτού του στόχου χρησιμοποιήθηκαν μοριακές τεχνολογίες αιχμής για την αποκάλυψη της συμπεριφοράς των μικροβιακών μελών. Συγκεκριμένα, μέσω μεταγονιδιωματικών αναλύσεων, διερευνήθηκαν η γενετική ποικιλομορφία και οι λειτουργικές δυνατότητες των μικροβιακών κοινοτήτων, επιτρέποντας την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό των διαφόρων μικροβιακών ειδών, καθώς και των μεταβολικών οδών και των πιθανών αλληλεπιδράσεών τους. Οι μεταμεταγραφωματικές αναλύσεις παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τα μεταβολικά μονοπάτια και τις κυτταρικές διεργασίες που ενεργοποιούνται ή αναστέλλονται από την παρουσία λιπαρών οξέων μακράς αλύσου και αμμωνίας. Η παρούσα διατριβή είναι διαρθρωμένη σε τέσσερις επιμέρους μελέτες, καθεμία από τις οποίες αποτελούν ξεχωριστά κεφάλαια που παρέχουν ολοκληρωμένες περιγραφές των αντίστοιχων ερευνών. Η πρώτη μελέτη είχε ως στόχο να εξετάσει τις αλλαγές στο μικροβιακό προφίλ αντιδραστήρων βιοαερίου, όταν μεταβάλλεται η σύνθεση της εισερχόμενης τροφοδοσίας. Η έρευνα περιλάμβανε την αλλαγή του υποστρώματος από λύματα βουστασίου, σε λύματα βουστασίου στα οποία είχαν προστεθεί ακόρεστα λιπαρά οξέα μακράς ανθρακικής αλυσίδας και στη συνέχεια επαναφορά του υποστρώματος στην αρχική του σύνθεση. Με τη χρήση μεταγονιδιωματικής ανάλυσης και την παρακολούθηση βασικών βιοχημικών παραμέτρων, η μελέτη διαλεύκανε στις προσαρμοστικές αποκρίσεις των μικροοργανισμών στη σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης των λιπαρών οξέων. Συγκεκριμένα, σε κάθε περίοδο λήφθηκε γενετικό υλικό με στόχο την κατηγοριοποίηση των μικροοργανισμών ανάλογα με τη συμπεριφορά τους και τον εντοπισμό εκείνων που προσαρμόστηκαν λόγω των αλλαγών της τροφοδοσίας. Η αύξηση του ρυθμού οργανικής φόρτωσης στην Περίοδο ΙΙ άσκησε επιλεκτική πίεση στη μικροβιακή κοινότητα και διαμόρφωσε τη σύνθεσή της. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε τη διαμόρφωση τριών διακριτών ομάδων συμπεριφοράς: Ο "τύπος Ι" μείωσε τους πληθυσμούς στις περιόδους ΙΙ και ΙΙΙ, ο "τύπος ΙΙ" αύξησε τους πληθυσμούς στην περίοδο ΙΙ και ο "τύπος ΙΙΙ" αύξησε τους πληθυσμούς στην περίοδο ΙΙΙ. Η επικράτηση του Candidatus Methanoculleus thermohydrogenotrophicum στους αντιδραστήρες βιοαερίου που τροφοδοτήθηκαν αποκλειστικά με λύματα βουστασίου υπέδειξε την κυριαρχία της υδρογονοτροφικής οδού για την επίτευξη της μεθανογένεσης. Μια κυριαρχία που ενισχύθηκε περαιτέρω από την αύξηση των συντροφικών βακτηρίων με ικανότητα μεταβολισμού λιπαρών οξέων κατά τη Περίοδο ΙΙ. Ωστόσο, κατά την επιστροφή στην αρχική τροφοδοσία (αποκλειστικά με λύματα βουστασίου), η μικροβιακή δυναμική παρουσίασε σημαντικές αλλαγές, που χαρακτηρίζονται από αξιοσημείωτη αύξηση της αφθονίας ενός μικροοργανισμού που έχει την ικανότητα να αποικοδομεί προπιονικό οξύ και που ανήκε στην τάξη Bacteroidales.Στη δεύτερη μελέτη διερευνήθηκε περαιτέρω η απόκριση του μικροβιώματος αναερόβιων χωνευτών υπό την παρουσία λιπαρών οξέων μακράς ανθρακικής αλυσίδας. Για το λόγο αυτό, υιοθετήθηκε μια ολοκληρωμένη στρατηγική, με τη συσχέτιση βιοχημικών παραμέτρων με μεταγονιδιωματικά και μεταμεταγραφωματικά δεδομένα. Για την εκπλήρωση αυτού του στόχου και προκειμένου να συμπεριληφθεί η μεταγραφική δραστηριότητα των μικροβίων παρουσία λιπαρών οξέων, εφαρμόστηκε μια διαφορετική μεθοδολογική προσέγγιση. Οι μικροοργανισμοί υποβλήθηκαν σε εφάπαξ έκθεση λιπαρών οξέων σε μεγάλη συγκέντρωση, σε σύγκριση με την προηγούμενη στρατηγική της σταδιακής έκθεσης. Η μελέτη αυτή οδήγησε στην αποκάλυψη για πρώτη φορά του Nigerium sp. σε περιβάλλον αντιδραστήρα βιοαερίου. Επιπλέον, έγινε μια ενδιαφέρουσα διαπίστωση σχετικά με την ικανότητα του Candidatus Hydrogenedentes sp. για β-οξείδωση. Η μεταγραφωματική ανάλυση αποκάλυψε μια κυρίαρχη ανοδική ρύθμιση γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό των λιπιδίων, όπως υποδεικνύεται από το Cluster of Orthologous Group. Επιπλέον, παρατηρήθηκε η ενεργοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυτταρικής κινητικότητας, όπως εκείνες που εμπλέκονται στη σύνθεση των βακτηριακών μαστιγίων και τη βακτηριακή χημειοταξία, αποκαλύπτοντας μια ενδιαφέρουσα πτυχή της μικροβιακής δυναμικής σε αυτό το πλαίσιο.Η τρίτη μελέτη επικεντρώθηκε στην απόκριση του μικροβιώματος αντιδραστήρων βιοαερίου σε δύο μεμονωμένες εγχύσεις αμμωνίας σε τοξικές για τη διεργασία συγκεντρώσεις. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, διεξήχθη μια ολοκληρωμένη ανάλυση με τη χρήση ενός συνδυασμού βιοχημικών μετρήσεων και μεταγονιδιωματικών και μεταμεταγραφωματικών δεδομένων. Η ανάλυση των δεδομένων ανέδειξε την κυριαρχία της υδρογονοτροφικής μεθανογένεσης ακόμη και στην πιο υψηλή συγκέντρωση αμμωνίας. Η μεταμεταγραφωματική ανάλυση αποκάλυψη τη μεταβολική μετατόπιση των μεθανογόνων Methanothrix sp. MA6 και Methanosarcina flavescens MX5 (που χρησιμοποιούν πολλαπλά μεταβολικά μονοπάτια για την παραγωγή μεθανίου) από την οξικοτροφική προς την υδρογονοτροφική οδό κατά τη διάρκεια της δεύτερης καταπόνηση, αποτελώντας ένα μηχανισμό επιβίωσης που χρησιμοποιούν αυτοί οι μικροοργανισμοί. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η έκφραση ενός ευρέος φάσματος γονιδίων που σχετίζονται με την οσμωτική ρύθμιση και τη διατήρηση της κυτταρικής οσμωτικής ισορροπίας, αναδεικνύοντας το σημαντικό ρόλο της οσμωπροστασίας παρουσία αμμωνίας. Συνολικά, η μελέτη παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την άμεση απόκριση σε επίπεδο mRNA της μικροβιακής κοινότητας, δίνοντας ιδιαίτερη έμφαση στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάκαμψη από το στρες που προκαλείται από την αμμωνία.Στην τέταρτη και τελευταία μελέτη, χρησιμοποιήθηκε το μαθηματικό μοντέλο Bioconversion Model για την προσομοίωση σεναρίων τροφοδοσίας που δύναται να συναντηθούν σε αντιδραστήρες βιοαερίου, κατά τα οποία η βιοδιεργασία διαταράσσεται λόγω της παρουσίας λιπαρών οξέων ή αμμωνίας. Ο πρωταρχικός στόχος ήταν να αξιολογηθεί η αξιοπιστία και η απόδοση του μοντέλου. Για το λόγο αυτό, διερευνήθηκαν τρεις μελέτες που αφορούσαν διαφορετικές στρατηγικές τροφοδοσίας στους αντιδραστήρες. Οι προσομοιώσεις έδειξαν καλή προσαρμογή των προσομοιωμένων με τα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά την παραγωγή του μεθανίου και την εξέλιξη του pH. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν ορισμένες αποκλίσεις στην πρόβλεψη των συγκεντρώσεων πτητικών λιπαρών οξέων. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν ορισμένες αποκλίσεις στην πρόβλεψη των συγκεντρώσεων των πτητικών λιπαρών οξέων. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε ότι για την επίτευξη αξιόπιστων προβλέψεων είναι απαραίτητη η προσαρμογή σε προεπιλεγμένες κινητικές παραμέτρους του μοντέλου, ιδίως σε εκείνες που σχετίζονται με την αποικοδόμηση του οξικού οξέος (Ki,Ac).Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλε σημαντικά στην επίτευξη βαθύτερης κατανόησης της απόκρισης των μικροβιακών κοινοτήτων σε αντιδραστήρες βιοαερίου μέσω της εφαρμογής προηγμένων μοριακών εργαλείων. Η μελέτη στο σύνολό της προσέφερε λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με το μικροβιακό μεταβολισμό και οικολογία, διευρύνοντας τις τρέχουσες γνώσεις για την αναερόβια χώνευση. Η αποκτηθείσα γνώση μπορεί να αξιοποιηθεί ως βάση για μελλοντικές εξελίξεις στον έλεγχο και τη βελτιστοποίηση της διεργασίας, οδηγώντας σε ενίσχυση της αποτελεσματικότητας και βιωσιμότητα στον τομέα της παραγωγής βιοαερίου.