Ιn vitro διερεύνηση της ικανότητας στόχευσης του αιματεγκεφαλικού φραγμού και της αντικαρκινικής δράσης στοχευμένων πολυλειτουργικών μαγνητολιποσωμάτων που εγκλωβίζουν δοξορουβικίνη
Authors: Σκούρας Αθανάσιος 
Published: September 2021

Τα μαγνητικά λιποσώματα μπορούν να αποτελέσουν την κατάλληλη πλατφόρμα για την ταυτόχρονη στοχευμένη μεταφορά/χορήγηση θεραπευτικών και διαγνωστικών ενώσεων. Οι ελεγχόμενες οπτικές ιδιότητες των μαγνητικών νανοσωματιδίων σε συνδυασμό με την ευελιξία των λιποσωμάτων ως φορέων μπορεί δυνητικά να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της αγωγής με την επιλεκτική μεταφορά φαρμάκων μέσω μαγνητικά καθοδηγούμενης εναπόθεσης και ταυτόχρονης στόχευσης με ενεργοποίηση μέσω υποδοχέα (π.χ., πεγκυλίωση και επιφανειακή τροποποίηση : προσδέτες και αντισώματα). Λόγω των οπτικών ιδιοτήτων τους, τα μαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμεύσουν και ως σκιαγραφικές ουσίες κατά την μαγνητική απεικόνιση (MRI), επιτρέποντας την in vivo παρακολούθηση και μεταφορά των φαρμάκων με μη επεμβατικό τρόπο. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν αρχικά η παρασκευή μαγνητολιποσωμάτων, ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός τους καθώς και η μελέτη επίδρασης διαφόρων παραγόντων στις φυσικοχημικές ιδιότητες και την σταθερότητά τους. Κατά την παρασκευή των ΜΛ αρχικός στόχος ήταν ο εγκλωβισμός της μέγιστης δυνατής συγκέντρωσης USPIOs σε μονοστοιβαδιακά λιποσώματα μικρού μεγέθους (<200nm) για να μπορούν να εκμεταλλευθούν το φαινόμενο αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR effect) των καρκινικών κυττάρων. Η μέθοδος DRV(extruded) παρείχε μαγνητολιποσώματα με τον μεγαλύτερο εγκλωβισμό και στο επιθυμητό μέγεθος. Η προσθήκη χοληστερόλης ή φορτίου (PG) στα ΜΛ δεν είχε κάποια σημαντική επίδραση στον εγκλωβισμό, ενώ η προσθήκη λιπιδικού PEG καθώς και η αύξηση της αρχικής αναλογίας USPIOs/λιπίδιο οδήγησε σε αύξηση του εγκλωβισμού. Ο εγκλωβισμός των USPIOs σε λιποσώματα αύξησε κατακόρυφα την μαγνητική τους απόκριση ενώ η αύξηση της αναλογίας Fe/Λιπιδίου, η αύξηση του μεγέθους των ΜΛ και η προσθήκη 4 mol% λιπιδικού-PEG οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση. Αντιθέτως η προσθήκη χοληστερόλης προκάλεσε μείωση. Ο εγκλωβισμός των USPIOs αύξησε επίσης την σκιαγραφική τους ικανότητα ανεξαρτήτου λιπιδικής σύστασης, η προσθήκη λιπιδικού PEG δεν επέφερε κάποια δραστική μεταβολή ενώ η αύξηση της αναλογίας Fe/Λιπιδίου οδήγησε σε αύξηση. Τα ΜΛ που παρασκευάστηκαν παρέμειναν σταθερά για διάστημα αρκετό για την χρήση τους σε in vivo εφαρμογές ενώ επέδειξαν σχεδόν μηδενική κυτταροτοξικότητα. Τέλος τα ΜΛ μελετήθηκαν in vitro ως προς την ικανότητά τους να διαπερνούν τον ΑΕΦ όπου διαπιστώθηκε ότι παρουσία μαγνητικού πεδίου η διαπέραση αυξάνει έως και 10 φορές φανερώνοντας την δυνατότητα που παρέχουν τα ΜΛ για την μεταφορά φαρμάκων στον εγκέφαλο μέσω μαγνητικής στόχευσης. Επόμενος σκοπός της εργασίας αυτής ήταν ο σχηματισμός ΜΛ-Σ για την στόχευση του ΑΕΦ. Έτσι παρασκευάστηκαν ΜΛ που έφεραν στην επιφάνεια τους είτε αντίσωμα ΟΧ-26 (στόχευση του υποδοχέα της τρανσφερίνης), είτε το πεπτίδιο ApoE (στόχευση υποδοχέα λιποπρωτεϊνης) είτε και τα δύο μαζί. Η προσθήκη ενός προσδέτη στην επιφάνεια δεν είχε σημαντική επίδραση στον εγκλωβισμό και το μέγεθος των ΜΛ-Σ ενώ ο συνδυασμός 2 και 3 προσδετών επέφερε μια μικρή μείωση στον εγκλωβισμό. Παρατηρήθηκε επίσης μείωση της μαγνητοφορετικής ικανότητας και της σκιαγραφικής ικανότητας των ΜΛ που παρέμειναν όμως αρκετά υψηλές. Τα ΜΛ-Σ ήταν σταθερά για χρονικό διάστημα αρκετά μεγάλο ενώ επέδειξαν μηδενική κυτταροτοξικότητα. Ως προς την ικανότητα τους να διαπερνούν τον ΑΕΦ invitro, η προσθήκη ενός προσδέτη (ApoE,OX-26) αύξησε την διαπέραση των ΜΛ τουλάχιστον 5 φορές ενώ η προσθήκη και των δύο προσδετών φαίνεται να έχει αθροιστικό αποτέλεσμα, δεκαπλασιάζοντας το ποσοστό διαπέρασης. Τα αποτελέσματα αυτά φανερώνουν την ικανότητα των ΜΛ-Σ να στοχεύσουν τον ΑΕΦ και την πιθανή αξιοποίησή τους ως διαγνωστικό μέσο απεικόνισης του εγκεφάλου.Επόμενο βήμα αποτέλεσε η παρασκευή ΜΛ που θα συνδυάζουν την διαγνωστική ικανότητα με την θεραπευτική. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκε η παρασκευή ΜΛ που συν-εγκλωβίζουν USPIOs και δοξορουβικίνη, ένα μόριο με αντικαρκινική δράση. Για τον συν-εγκλωβισμό δοξορουβικίνης και USPIOs χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός των τεχνικών DRV και ενεργής φόρτωσης. Η παρουσία των USPIOs, η αναλογία ΔΟΞ/Λιπίδιο καθώς και η αναλογία ΔΟΞ/USPIOs δεν είχαν κάποια επίδραση στον εγκλωβισμό της δοξορουβικίνης όπως ούτε η παρουσία αντισώματος. Ο συν-εγκλωβισμός USPIOs-ΔΟΞ δεν είχε κάποια επίδραση στην συγκράτηση της δοξορουβικίνης και στον ρυθμό απελευθέρωσης της αλλά ούτε και στην συγκράτηση των USPIOs ενώ τα ΠΛ-ΜΛ παρέμειναν σταθερά παρουσία πρωτεϊνών ορού για αρκετό χρονικό διάστημα ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε invivo εφαρμογές. Τα ΠΛ-ΜΛ μελετήθηκαν invitro ως προς την αντικαρκινική τους δράσης όπου τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συν-εγκλωβισμός USPIOs δεν επιδρά στην αντικαρκινική δράση της δοξορουβικίνης η οποία είναι δοσο-εξαρτώμενη, ότι η επίδραση του μαγνητικού πεδίου είναι εξαρτώμενη από την συγκέντρωση Fe, καθώς και ότι η αντικαρκινική δράση αυξάνεται μέσω διπλής στόχευσης (παθητική μέσω του μαγνητικού πεδίου και ενεργητική μέσω του αντισώματος).