Investigation of the chronic administration of endogenous and synthetic cannabinoids on the function of cannabinoid receptor type-1 (CB1) in healthy retina and in an experimental model of retinopathy
Authors: Παπαδογκωνάκη Σοφία 
Published: October 2022

Εισαγωγή: Το ενδοκανναβινοειδικό σύστημα αποτελεί σημαντικό θεραπευτικό στόχο στην αντιμετώπιση διάφορων νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας, ως μέρος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) περιλαμβάνει ένα πλήρες και λειτουργικό ενδοκανναβινοειδικό σύστημα, που αποτελείται από τους κανναβινοειδικούς υποδοχείς, CB1 και CB2, τους ενδογενείς αγωνιστές τους (ενδοκανναβινοειδή), καθώς και τα ένζυμα που καταλύουν το μεταβολισμό τους. Τα ενδοκανναβινοειδή Ν-αραχιδονοϋλο-αιθανολαμίνη (ΑΕΑ ή ανανδαμίδη) και 2-αραχιδονοϋλο-γλυκερόλη, καθώς και συνθετικά κανναβινοειδή, όπως η R-(+)-Μεθανανδαμίδη (MethAEA), ασκούν νευροπροστατευτική δράση στους νευρώνες του αμφιβληστροειδούς, όπως έχουν δείξει μελέτες σε διάφορα πειραματικά μοντέλα αμφιβληστροειδοπαθειών. Παρά την νευροπροστατευτική τους δράση, οι θεραπευτικές τους ιδιότητες είναι περιορισμένες καθώς είναι πιθανό να προκληθεί αντοχή στις δράσεις τους έπειτα από παρατεταμένη χορήγησή τους, η οποία σχετίζεται με την ανάπτυξη μειορρύθμισης του CB1 υποδοχέα.Στόχοι: Οι περισσότερες μελέτες που έχουν δείξει απευαισθητοποίηση και μειορρύθμιση του CB1 υποδοχέα, έπειτα από χρόνια χορήγηση κανναβινοειδών έχουν πραγματοποιηθεί σε περιοχές του εγκεφάλου. Η παρούσα μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση της επίδρασης των ενδογενών ή συνθετικών κανναβινοειδών, καθώς και αναστολέων των μεταβολικών ενζύμων των ενδοκανναβινοειδών, στην έκφραση και πιθανή μειορρύθμιση του CB1 υποδοχέα, έπειτα από χρόνια ή υποχρόνια χορήγηση στον υγιή αμφιβληστροειδή αρουραίου, καθώς και στο πειραματικό in vivo μοντέλο της ΑΜΡΑ διεγερτοτοξικότητας, όπου εξετάστηκαν και οι πιθανές νευροπροστατευτικές τους δράσεις, αλλά και στη μελέτη του πιθανού μηχανισμού μειορρύθμισης των CB1 υποδοχέων.Μεθοδολογία: Για τη μελέτη των χρόνιων και υποχρόνιων δράσεων των κανναβινοειδών στον υγιή αμφιβληστροειδή, χρησιμοποιήθηκαν Sprague-Dawley αρουραίοι στους οποίους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά (i.p) AEA, MethAEA, 2-AG ή οι αναστολείς των μεταβολικών ενζύμων της ΑΕΑ, FAAH (ΑΜ5206), και 2-AG, MAGL/ABHD6 (ΑΜ11920) καθημερινά για 4 ή 14 ημέρες (υποχρόνια ή χρόνια χορήγηση, αντίστοιχα). Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε το in vivo μοντέλο της ΑΜΡΑ διεγερτοτοξικότητας, όπου το διεγερτικό αμινοξύ ΑΜΡΑ χορηγήθηκε ενδοϋαλοειδικά κι έπειτα από 24 ώρες οι ουσίες ΑΕΑ, MethAEA, ή 2-AG ή οι αναστολείς ΑΜ5206 και ΑΜ11920 χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p) για 4 ημέρες. Εναλλακτικά, η 2-AG (1%) χορηγήθηκε τοπικά, υπό τη μορφή οφθαλμικών σταγόνων, για 2 ημέρες (δύο φορές/ημέρα) και για 4 ή 8 ημέρες (μία φορά/ημέρα). Για τη μελέτη της έκφρασης του CB1 υποδοχέα αλλά και των νευροπροστατευτικών δράσεων των κανναβινοειδών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ανοσοϊστοχημείας με χρήση αντισωμάτων έναντι του CB1, ή έναντι πρωτεϊνών που εκφράζονται σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, όπως bNOS (brain nitric oxide synthetase, βραχύινα), calbindin (οριζόντια και βραχύινα), Iba-1 (μικρογλοιακά), καθώς και έναντι της cleaved caspase-3, που αποτελεί δείκτη για τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν και μελέτες ανοσοαποτύπωσης κατά western (western blot analysis) με αντισώματα έναντι του CB1 ή έναντι της φωσφορυλιωμένης ή ολικής μορφής των κινασών Akt και ERK1/2. Για την διερεύνηση του πιθανού μηχανισμού της μειορρύθμισης του CB1 υποδοχέα, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση (IP) προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή αλληλεπίδρασή του με δείκτες που σχετίζονται με την ενδοκυτταρική αποικοδόμηση υποδοχέων, όπως η β-αρρεστίνη 2 και οι δείκτες ενδοσωμάτων Rab5 και Rab7. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε ex vivo μοντέλο, όπου μελετήθηκε ο ρόλος της αυτοφαγίας στο μηχανισμό μειορρύθμισης του CB1 μετά από χορήγηση 2-AG, παρουσία ή απουσία του αναστολέα της αυτοφαγίας Bafilomycin A1 (BafA1).Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι τα κανναβινοειδή AEA, MethAEA και 2-AG μειώνουν την έκφραση του CB1 υποδοχέα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, έπειτα από υποχρόνια ή χρόνια i.p χορήγηση, και επηρέασαν με διαφορετικό τρόπο τη σηματοδότηση του υποδοχέα (Akt και ERK1/2 κινασών). Επιπλέον, η υποχρόνια χορήγηση των AEA, MethAEA και 2-AG προκάλεσε μειορρύθμιση του CB1 υποδοχέα η οποία ανέστειλε την νευροπροστασία των βραχύινων κυττάρων στο μοντέλο της AMPA διεγερτοτοξικότητας. Ωστόσο, η υποχρόνια χορήγηση της 2-AG μείωσε την επαγόμενη από AMPA ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων.Η τοπική χορήγηση της 2-AG (1%) στο μοντέλο της ΑΜΡΑ διεγερτοτοξικότητας δεν επηρέασε την έκφραση του CB1 υποδοχέα έπειτα από 2, 4 ή 8 ημέρες χορήγησης, ενώ παράλληλα προστάτευσε τα βραχύινα κύτταρα που εκφράζουν τη bNOS έπειτα από 2 ή 4 ημέρες, αλλά όχι μετά από 8 ημέρες χορήγησης. Ωστόσο μείωσε τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων, έπειτα από 8 ημέρες χορήγησης. Επίσης, η τοπική χορήγηση της 2-AG για 4 ημέρες μείωσε την επαγόμενη από το AMPA αύξηση του αριθμού των ενεργών μικρογλοιακών κυττάρων. Η αύξηση των ενδογενών επιπέδων AEA και 2-AG, έπειτα από υποχρόνια χορήγηση των αναστολέων ΑΜ5206 και ΑΜ11920, αντίστοιχα, δεν προκάλεσε μειορρύθμιση του CB1 υποδοχέα σε καμία από τις δόσεις (i.p.) που μελετήθηκαν (100, 250 ή 500 μg/kg, i.p) στον υγιή αμφιβληστροειδή. Στο μοντέλο της ΑΜΡΑ διεγερτοτοξικότητας, οι αναστολείς παρείχαν νευροπροστασία στα βραχύινα, κύτταρα που εκφράζουν τη bNOS, μετά από υποχρόνια χορήγηση (500μg/kg, i.p) χωρίς να επηρεάζουν την έκφραση του CB1.Τα αποτελέσματά της μελέτης για τον πιθανό μηχανισμό μειορρύθμισης του CB1 in vivo, έδειξαν ότι ο υποδοχέας δεν αλληλεπιδρά με την β-αρρεστίνη 2 ή τους Rab5 και Rab7 (δείκτες πρώιμων και όψιμων ενδοσωμάτων, αντίστοιχα), ωστόσο είναι πιθανό η αλληλεπίδραση τους να μην μπορεί να ανιχνευθεί με ευκολία μέσω της συγκεκριμένης τεχνικής σε δείγματα ιστού. Στο ex vivo μοντέλο, ωστόσο, η 2-AG προκάλεσε μείωση της έκφρασης του CB1 υποδοχέα, η οποία επανέρχεται σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από επώαση με 2-AG σε συνδυασμό με τον αναστολέα της αυτοφαγίας BafA1 (100nM), υποδηλώνοντας ότι η αυτοφαγία μπορεί να εμπλέκεται στον μηχανισμό μειορρύθμισης του υποδοχέα.Συμπεράσματα: Τα ενδογενή και συνθετικά κανναβινοειδή μπορούν να προκαλέσουν μειορρύθμιση του CB1 υποδοχέα μετά από υποχρόνια ή χρόνια i.p χορήγηση στον υγιή αμφιβληστροειδή αρουραίου, καθώς και στο πειραματικό μοντέλο της ΑΜΡΑ διεγερτοτοξικότητας, όπου δεν παρείχαν νευροπροστατευτική δράση. Ωστόσο, η τοπική χορήγηση του ενδοκανναβινοειδούς 2-AG παρέχει νευροπροστασία στον αμφιβληστροειδή έως και 8 ημέρες χορήγησης, χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του CB1. Οι αναστολείς των ενζύμων FAAH και MAGL/ABHD6 δεν επηρέασαν τα επίπεδα έκφρασης του CB1 στον υγιή αμφιβληστροειδή ή στο AMPA μοντέλο διεγερτοτοξικότητας. Επιπλέον, η υποχρόνια i.p χορήγηση αυτών των αναστολέων ασκεί νευροπροστατευτική δράση στον αμφιβληστροειδή, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή του μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών ίσως αποτελεί πιο αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση σε σύγκριση με την εξωγενή συστημική χορήγηση κανναβινοειδών. Με βάση τις ex vivo μελέτες, η αναστολή της αυτοφαγίας αποτρέπει τη μείωση της έκφρασης του CB1 υποδοχέα και ως εκ τούτου η αυτοφαγία μπορεί να εμπλέκεται στον μηχανισμό μειορρύθμισής του.Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη παρέχει νέες πληροφορίες σχετικά με την χρόνια και υποχρόνια χορήγηση ενδογενών και συνθετικών κανναβινοειδών ή αναστολέων του μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών στον αμφιβληστροειδή αρουραίου. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τη μελέτη αυτή θα χρησιμεύσουν στην αξιολόγηση της χρόνιας χρήσης κανναβινοειδών ως νευροπροστατευτικών παραγόντων για τη θεραπεία παθήσεων του αμφιβληστροειδούς.