Οι ρυθμιστές της αδειοδότησης της αντιγραφής Geminin, McIdas και GemC1 στη γονιδιωματική σταθερότητα και στη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων
Authors: Αρμπή Μαρίνα 
Published: September 2021

Η γονιδιωματική σταθερότητα στα κύτταρα απαιτεί την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος και τον ακριβοδίκαιο διαχωρισμό των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα σε κάθε κυτταρική διαίρεση. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της συντονισμένης λειτουργίας των κύκλων διπλασιασμού και διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων και των κεντροσωματίων. Τα τελευταία χρόνια, ένας αυξανόμενος αριθμός μορίων έχει χαρακτηριστεί να συμμετέχει και στους δύο κύκλους. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο δρουν για το συντονισμό τους παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκαν τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin στον κυτταρικό κύκλο και στην κυτταρική διαφοροποίηση. Τα ευρήματα καθιστούν τις πρωτεΐνες Geminin, McIdas και GemC1 πιθανoύς κοινούς ρυθμιστές της αντιγραφής του DNA και του διπλασιασμού των κεντριολίων. Η πρωτεΐνη Geminin είναι το πρώτο μέλος της οικογένειας που χαρακτηρίστηκε στα μετάζωα και έχει μελετηθεί εκτενώς για το ρόλο της στον κυτταρικό κύκλο. Συνεισφέρει σημαντικά στη διατήρηση της γονιδωματικής σταθερότητας. Μέσω μιας περιοχής σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτει αλληλεπιδρά με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, αναστέλλοντας την πρόωρη πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής. Ακόμα, δρα ανασταλτικά στον υπερδιπλασιασμό των κεντροσωματίων. Τέλος, συμμετέχει και σε αποφάσεις κυτταρικής διαφοροποίησης. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες και σύμπλοκα αναδιάταξης της χρωματίνης, ελέγχοντας τη γονιδιακή έκφραση. Τα τελευταία χρόνια ταυτοποιήθηκαν στα σπονδυλωτά τα δυο νέα μέλη της οικογένειας, GemC1 και McIdas, βάση της ομοιότητας που παρουσίαζαν με τη Geminin στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτουν. Η πρωτεΐνη McIdas αλληλεπιδρά με τη Geminin και εμποδίζει την πρόσδεσή της στον παράγοντα Cdt1, ενώ ο παράγοντας GemC1 συμβάλλει στο σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου της αντιγραφής. Αρχικά πειράματα στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι οι παράγοντες GemC1 και McIdas είναι πιθανό να εμπλέκονται, όπως και η Geminin, σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε το ρόλο τους κατά τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων. Τα πολυκροσσωτά κύτταρα είναι τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα, στα οποία παράγεται ένας μεγάλος αριθμός κεντριολίων που δρουν ως βασικά σωμάτια για το σχηματισμό πολλαπλών κροσσών. Αρχικά, δείχθηκε ότι οι παράγοντες GemC1 και McIdas εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα κατά την ανάπτυξη των μυών σε ιστούς όπου απαντώνται πολυκροσσωτά κύτταρα. Η έκφρασή τους συμπίπτει με αυτή του παράγοντα Foxj1, που αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστή της μετανάστευσης των νεοσυντιθέμενων κεντριολίων στην πλασματική μεμβράνη και της δημιουργίας του αξονήματος των κροσσών. Η έκφρασή τους μελετήθηκε πιο ειδικά στα στάδια της διαφοροποίησης, σε ένα ex vivo σύστημα καλλιέργειας επιθηλιακών κυττάρων τραχείας μυών. Οι GemC1 και McIdas εκφράζονται αμέσως μετά την επαγωγή της διαφοροποίησης και μειώνονται με την ολοκλήρωση της διαδικασίας. Τα υψηλότερα επίπεδα της έκφρασής τους ανιχνεύονται στο στάδιο του πολλαπλασιασμού των κεντριολίων. Αντίθετα, η Geminin εμφανίζει ένα ανεστραμμένο πρότυπο έκφρασης, με υψηλότερα επίπεδα στα διαιρούμενα προγονικά κύτταρα. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η πρωτεΐνη McIdas εκφράζεται ειδικά στα πρώιμα στάδια της διαφοροποίησης, ενώ η έκφρασή της εξαφανίζεται στα ώριμα πολυκροσσωτά κύτταρα. Για το χαρακτηρισμό της λειτουργίας των μελών της υπεροικογένειας της Geminin κατά την εξειδίκευση των πολυκροσσωτών κυττάρων πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης και αποσιώπησης. Υπερέκφραση των GemC1 και McIdas έδειξε ότι είναι ικανοί να επάγουν τα πρώιμα στάδια διαφοροποίησης. Ο ίδιος φαινότυπος παρατηρήθηκε μετά την αποσιώπηση της Geminin, ενισχύοντας την υπόθεση για ανταγωνιστική δράση των μελών της υπεροικογένειας. Οι παράγοντες GemC1 και McIdas προκαλούν τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Foxj1. Επιπλέον, ο παράγοντας GemC1 επάγει τη μεταγραφή του McIdas, ενώ το αντίθετο δεν παρατηρήθηκε. Η λειτουργία τους αυτή ενισχύεται μέσω συνεργασίας με το μεταγραφικό παράγοντα E2F5, ενώ η Geminin αναστέλλει τη μεταγραφική ενεργότητα των GemC1 και McIdas. Τέλος, ο McIdas δρα μέσω ενός μηχανισμού θετικής ανατροφοδότησης, καθώς είναι ικανός να επάγει τη μεταγραφή από τα ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου του. Τα παραπάνω πειράματα συνέβαλαν στο να αποσαφηνιστεί ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin ελέγχoυν το μονοπάτι της διαφοροποίησης. Η κατασκευή διαγονιδιακών μυών ανέδειξε τον in vivo ρόλο του παράγοντα GemC1. Οι ελλειμματικοί για το γονίδιο GemC1 μύες εμφανίζουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη και πεθαίνουν σύντομα μετά τη γέννα. Επίσης, αναδείχθηκε ο καθοριστικός ρόλος του στη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων, αφού αυτά απουσιάζουν εντελώς από την τραχεία των διαγονιδιακών μυών. Τέλος, μελετήθηκε η συμμετοχή της πρωτεΐνης McIdas στον πολλαπλασιασμό των κεντριολίων στα διαιρούμενα κύτταρα. Η πρωτεΐνη McIdas εκφράζεται ειδικά στο μητρικό κεντριόλιο των κεντροσωματίων και προκαταρκτικά πειράματα υπερέκφρασής της προκάλεσαν αύξηση στον αριθμό των κεντριολίων, υποδηλώνοντας την εμπλοκή της στο διπλασιασμό τους. Τα παραπάνω δεδομένα μαρτυρούν ότι τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin αποτελούν κεντρικούς ρυθμιστές του πολλαπλασιασμού των κεντριολίων και της διαφοροποίησης των πολυκροσσωτών κυττάρων. Μέσω θετικών ή αρνητικών αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσουν, τόσο μεταξύ τους όσο και με άλλους παράγοντες είναι πιθανό να συνδέουν την αντιγραφή του DNA με τον πολλαπλασιασμό των κεντριολίων και τη δημιουργία των πολυκροσσωτών κυττάρων.