Bioprocess development and transcriptomic analysis for succinic acid production via fermentation using waste streams for the pulp and paper industry
Authors: Πατεράκη Χρυσάνθη 
Published: February 2022

Ο σκοπός της διατριβής αυτής έγκειται στην αξιολόγηση του παράπλευρου ρεύματος που παράγεται από βιομηχανίες χαρτοπολτού (SSL) για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω μικροβιακών ζυμώσεων. Η μελέτη επικεντρώθηκε αρχικά στην ποσοτικοποίηση των κυριοτέρων συστατικών. Ακολούθως μελετήθηκε η παρεμπόδιση συγκεκριμένων συστατικών του SSL στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος και στην μικροβιακή ανάπτυξη. Οι συγκεντρώσεις του οξικού οξέος, της φουρφουράλης και της μεθανόλης που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη του Actinobacillus succinogenes είναι 12, 1 and 4 g/L αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις για τον Basfia succiniciproducens είναι 12, 3 and 8 g/L, αντίστοιχα. Τα λιγνοσουλφονικά άλατα αποτελούν παρεμποδιστικά συστατικά σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 50 g/L. Το γεγονός ότι το SSL που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη περιέχει υψηλή συγκέντρωση λιγνοσουλφονικών αλάτων οδήγησε στην απόφαση να προεπεξεργαστούμε το αρχικό SSL μέσω υπερδιήθησης ή νανοδιήθησης. Οι συγκεντρώσεις του ηλεκτρικού οξέος, του γαλακτικού οξέος, του μυρμηγκικού οξέος και του οξικού οξέος που παρεμποδίζουν την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι 55, 60, 18 και 38 g/L τόσο για τον A. succinogenes όσο και για τον B. succiniciproducens. Η επεξεργασία του SSL μέσω υπερδιήθησης ή νανοδιήθησης αξιολογήθηκε προκειμένου να εκτιμήσουμε τη δυνατότητα διαχωρισμού λιγνοσουλφονικών αλάτων και σακχάρων τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ακολούθως για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος με χρήση των στελεχών A. succinogenes και B. succiniciproducens. Η χρήση υπερδιήθησης με μεμβράνες με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 10, 5 και 3 kDa είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια σημαντικών ποσοτήτων λιγνοσουλφονικών αλάτων (26 - 50%) στο διήθημα. Η χρήση νανοδιήθησης με μεμβράνες με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 500 Da οδήγησε σε υψηλό βαθμό διαχωρισμού λιγνοσουλφονικών αλάτων (95.6%). Η πραγματοποίηση ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου με χρήση διηθήματος από επεξεργασμένο SSL μέσω υπερδιήθησης οδήγησε στην παραγωγή 27.5 g/L ηλεκτρικού οξέος με παραγωγικότητα 0.4 g/L/h όταν χρησιμοποιήθηκαν και οι δύο μικροοργανισμοί. Η υψηλότερη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος (33.8 g/L), παραγωγικότητα (0.48 g/L/h) και βαθμός μετατροπής σακχάρων σε ηλεκτρικό οξύ (0.58 g/g) επετεύχθησαν με το στέλεχος B. succiniciproducens όταν αναπτύχθηκε σε διήθημα που παρήχθη μέσω νανοδιήθησης του SSL. Η νανοδιήθηση 1 τόνου SSL δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή 306.3 kg λιγνοσουλφονικών αλάτων και 52.7 kg ηλεκτρικού οξέος όταν χρησιμοποιηθεί ο μικροοργανισμός B. succiniciproducens. Η υπερδιήθηση 1 τόνου SSL με χρήση μεμβράνης με μοριακό βάρος αποκοπής της τάξης των 3 kDa δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή 237 kg λιγνοσουλφονικών αλάτων και 71.8 kg ηλεκτρικού οξέος όταν χρησιμοποιηθεί ο μικροοργανισμός B. succiniproducens.Η δυναμική του μεταβολισμού του A. succinogenes αξιολογήθηκε μέσω της έφρασης του RNA των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τα ένζυμα που συμμετέχουν στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος, σε υποστρώματα που περιέχουν γλυκόζη, ξυλόζη και στο παραπροϊόν της βιομηχανίας χαρτοπολτού. Επιλέχθηκε η μέθοδος της υπερδιήθησης για την προεπεξεργασία του SSL που χρησιμοποιήθηκε σαν υπόστρωμα για την μελέτη της έκφρασης του RNA. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αποτελεσμάτων από τη ζύμωση σε SSL με ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε γλυκόζη ή ξυλόζη. Η ξυλόζη και η γλυκόζη επιλέχθηκαν διότι αποτελούν τα κύρια σάκχαρα που περιέχονται στο SSL με περιεκτικότητα 73% και 10%, αντίστοιχα. Η μεταγραφομική ανάλυση των σημαντικότερων ενζύμων που συμμετέχουν στον καταβολισμό της γλυκόζης και της ξυλόζης, στον κύκλο των τρικαρβοξυλικών οξέων και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, οδήγησαν στην καλύτερη κατανόηση των μεταβολικών διαδικασιών. Η μεταγραφομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου σε εργαστηριακό βιοαντιδραστήρα. Σε διαφορετικές φάσεις της ζύμωσης, όπου παρατηρήθηκαν αλλαγές στους εξωκυτταρικούς μεταβολίτες, κατασκευάστηκαν cDNA βιβλιοθήκες. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων «στόχων», σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, αναλύθηκαν με τη χρήση της RT-qPCR. Τα καθοριστικά σημεία του μεταβολισμού του A. succinogenes αναγνωρίστηκαν. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασαν τα μεταβολικά μονοπάτια που συμμετέχουν στην κατανάλωση ATP και στην οξείδωση του NADH σε συνδυασμό με τον καταβολισμό της γλυκόζης και της ξυλόζης. Όλες οι υπομονάδες της ATP συνθάσης υπερεκφράστηκαν στο SSL. Συγκεκριμένα, η F0 περιοχή της ATP συνθάσης υπερεκφράστηκε στο SSL. H έκφραση της φωσφοενολοπυροσταφυλικής καρβοξυκινάσης (PEPCK) ήταν χαμηλότερη όταν το θρεπτικό μέσο περιείχε ξυλόζη. Παρά το γεγονός ότι δεν ανιχνεύθηκε εξωκυτταρικό γαλακτικό οξύ, ανιχνεύθηκε η έκφραση της γαλακτικής δεϋδρογονάσης (LDH) σε όλα τα υποστρώματα.Τέλος, μία καινοτόμος τεχνολογία εφαρμόσθηκε σε καλλιέργεις ημι-διαλείποντος έργου με τον B. succiniciproducens, η οποία συνδυάζει την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω ζύμωσης με ταυτόχρονο διαχωρισμό του ηλεκτρικού οξέος μέσω μίας ηλεκτροχημικής κυψέλης στην οποία χρησιμοποιείται μία ανιονική μεμβράνη. Το ηλεκτρικό ρεύμα οδηγεί τα καρβοξυλικά οξέα από το υγρό της ζύμωσης, διαμέσου της ανιονικής μεμβράνης, σε ένα μικρότερου όγκου διάλυμα το οποίο περιέχει υψηλή συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος. Οι μεμβράνες αυτές είναι διαπερατές σε πολλά καρβοξυλικά οξέα (π.χ. οξικό οξύ, ηλεκτρικό οξύ), αλλά δεν είναι διαπερατές από μικροβιακά κύτταρα και στερεά συστατικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται διαχωρισμός του ηλεκτρικού οξέος από το υγρό της ζύμωσης σε συνδυασμένο με την ταυτόχρονη μετατροπή του άλατος των καρβοξυλικών οξέων στην όξινη μορφή γεγονός το οποίο οδηγεί στη μείωση των σταδίων καθαρισμού του ηλεκτρικού οξέος (π.χ. απομάκρυνση μικροβιακών κυττάρων και προσμίξεων που περιέχονται στο υγρό της ζύμωσης).