Επίδραση λειτουργικών τροφίμων στην εντερική μικροβιακή χλωρίδα πληθυσμών με μεταβολικά νοσήματα
Authors: Πράπα Ιωάννα 
Published: February 2024

Η διατροφή, αποτελεί σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει τη σύσταση της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την διατήρηση της εντερικής μικροβιακής ισορροπίας σε πλήθος μεταβολικών νοσημάτων και κατ’ επέκταση και σε καταστάσεις Σακχαρώδους Διαβήτη τύπου 1 (ΣΔτ1). Σήμερα, παρατηρείται έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων τροφίμων εμπλουτισμένων με προ- και πρεβιοτικά συστατικά, όπως βακτήρια του γαλακτικού οξέος (LAB) και διαιτητικές ίνες, τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν για την ομοιόσταση του εντερικού μικροβιώματος (ΕΜ) με ευεργετικά αποτελέσματα σε ορισμένες ασθένειες. Οι ωφέλιμες επιδράσεις των προβιοτικών είναι συγκεκριμένες για κάθε στέλεχος και όχι χαρακτηριστικές για συγκεκριμένα είδη, ενώ πλήθος αγρίου-τύπου στελεχών απομονωμένα από διάφορες πηγές (π. χ. ζυμωμένα τρόφιμα, φυτικές πηγές ή ανθρώπινα δείγματα μικροβιώματος) αξιολογούνται ως προς τις πιθανές τους ευεργετικές δράσεις στην υγειά με στόχο την βιομηχανική και εμπορική αξιοποίησή τους. Ένα χαρακτηριστικό που πρέπει να παρουσιάζουν οι λειτουργικές καλλιέργειες είναι ανθεκτικότητα στις συνθήκες που επικρατούν κατά μήκος του γαστρεντερικού σωλήνα (ΓΣ), έτσι ώστε να μπορούν να επιβιώσουν κατά την πέψη και να έχουν ικανότητα αποικισμού στον εντερικό σωλήνα. Η στρατηγική που θα εφαρμοστεί για την ενσωμάτωση των λειτουργικών καλλιεργειών στα τρόφιμα αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για να επιτευχθεί η αναγκαία υψηλή συγκέντρωση, ειδικά κατά τη στιγμή της κατανάλωσης. Είναι, επίσης, γνωστό πως η ακινητοποίηση των κυττάρων, π. χ. σε διατροφικά συστατικά τροφίμων και η χρήση τους στην παραγωγή (τελικών) προϊόντων τροφίμων, αποτελεί σήμερα επιστημονική και τεχνολογική πρόκληση για τη βιομηχανία και παράλληλα βελτιώνει σημαντικά τη ζωτικότητα των καλλιεργειών. Ο βασικός σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη λειτουργικών συστατικών τροφίμων και τελικών προϊόντων με θετικές στην υγεία δράσεις μέσω της δυνατότητας ρύθμισης της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, εστιάζοντας στον ΣΔτ1. Προκειμένου να υλοποιηθεί ο παραπάνω σκοπός: α) διερευνήθηκαν, in vivo, οι πιθανές επιδράσεις στο ΕΜ της κατανάλωσης κελυφωτού φιστικιού σε υγιή ζωικά πρότυπα και σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1, στοχεύοντας στη χρήση του ως λειτουργικού φορέα ακινητοποίησης, β) μελετήθηκε η ακινητοποίηση αγρίου-τύπου στελεχών LAB σε φυσικούς φορείς (νιφάδες ζέας, κελυφωτό φιστίκι και σταφίδα), γ) μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλίωσης και της θερμοκρασίας αποθήκευσης στη βιωσιμότητα των καλλιεργειών, με σκοπό την ικανοποίηση των απαιτήσεων της βιομηχανίας, δ) προσδιορίστηκε το ποσοστό επιβίωσης των καλλιεργειών σε στατικό in vitro μοντέλο γαστρεντερικής πέψης, ε) αξιολογήθηκε η καταλληλόλητα ξηρών ακινητοποιημένων κυττάρων Pediococcus acidilactici SK σε φυσικούς φορείς στην παραγωγή δημητριακών πρωινού τύπου muesli και στ) διερευνήθηκαν, in vivo, οι πιθανές επιδράσεις στο ΕΜ της κατανάλωσης ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων σε κελυφωτό φιστίκι σε υγιή ζωικά πρότυπα και σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1.Αρχικά διερευνήθηκε η επίδραση της διατροφικής παρέμβασης με κελυφωτό φιστίκι (Pistacia vera L.) στους προσκολλημένους στο εντερικό επιθήλιο μικροβιακούς πληθυσμούς στα εντερικά τμήματα της νήστιδας, του ειλεού, του κόλου και του τυφλού, αλλά και των μικροβιακών πληθυσμών σε δείγματα κοπράνων επίμυων με ΣΔτ1. Στα δείγματα προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, καθώς και των εντερόκοκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, σταφυλόκοκκων, Ε. coli, ζυμών / μυκήτων, γαλακτικών βακτηρίων και bifidobacteria. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η σχετική αφθονία των βακτηριακών πληθυσμών με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) και του γονιδίου 16S rRNA και του προφίλ λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFAs) και του γαλακτικού οξέος σε δείγματα κοπράνων. Τα ζωικά μοντέλα, αφού κατέστησαν διαβητικά μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση στρεπτοζοτοκίνης, χωρίστηκαν σε 4 ομάδες των 6 ζώων / ομάδα: α) υγιή ζώα που έλαβαν συμβατική τροφή, β) υγιή ζώα στα οποία εφαρμόστηκε διατροφική παρέμβαση με κελυφωτό φιστίκι, γ) ζώα με ΣΔτ1 που έλαβαν συμβατική τροφή και δ) ζώα με ΣΔτ1 που τράφηκαν με κελυφωτό φιστίκι. Η διάρκεια της παρέμβασης ήταν 4 εβδομάδες και στο τέλος πραγματοποιήθηκε ευθανασία, έτσι ώστε να συλλεχθούν τα εντερικά τμήματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διατροφή των διαβητικών ζώων με κελυφωτό φιστίκι οδήγησε σε αύξηση των bifidobacteria και των γαλακτικών βακτηρίων στη νήστιδα, στον ειλεό και στο κόλον και οδήγησε σε εξισορρόπηση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας σε όλα τα υπό εξέταση εντερικά τμήματα. Τα γαλακτικά βακτήρια και τα bifidobacteria εμφάνισαν στατιστικά σημαντική αύξηση τόσο στα διαβητικά όσο και στα υγιή ζωικά πρότυπα, ενώ οι εντερόκοκκοι φαίνεται να μειώθηκαν μετά τη διατροφή με κελυφωτό φιστίκι και στις 2 παραπάνω ομάδες στα δείγματα κοπράνων. Επιπλέον, μετά την ανάλυση NGS τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διατροφή με κελυφωτό φιστίκι οδήγησε σε αύξηση του γένους Bifidobacterium στους επίμυες που κατέστησαν διαβητικοί μετά από χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης και του γένους Lactobacillus στα υγιή ζωικά πρότυπα. Ακόμη, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των Firmicutes και μείωση των Bacteroidetes στα υγιή ζώα που τράφηκαν με φιστίκι, αλλά και αύξηση των Actinobacteria στα διαβητικά ζωικά πρότυπα. Επίσης, η κατανάλωση κελυφωτού φιστικιού οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα ισοβαλερικού οξέος τόσο σε υγιείς όσο και σε διαβητικούς επίμυες σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου που έλαβαν συμβατική δίαιτα. Το γαλακτικό οξύ βρέθηκε αυξημένο στις διαβητικές ομάδες ζώων συγκριτικά με τις υγιείς (1.429-1.508 και 0.760-0.798 μmol / g, αντίστοιχα), ενώ η συγκέντρωσή του στα υγιή ζωικά πρότυπα μετά από 4 εβδομάδες κατανάλωσης κελυφωτού φιστικιού αυξήθηκε (1.345 μmol / g) συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης (0.760 μmol / g).Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός και ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών συστατικών τροφίμων, αλλά και τελικών προϊόντων, με στόχο τη διατήρηση υψηλής συγκέντρωσης ζωντανών λειτουργικών καλλιεργειών LAB. Η παραγωγή τροφίμων με προβιοτικές καλλιέργειες που θα έχουν αυξημένη διάρκεια ζωής και ταυτόχρονα υψηλή συγκέντρωση τη στιγμή της κατανάλωσης, αποτελεί προϋπόθεση για τη βιομηχανία. Η ξήρανση με ψύξη και υπό κενό (λυοφιλίωση) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική για την αφυδάτωση λειτουργικών καλλιεργειών. Ως δυνητικά προβιοτικά στελέχη χρησιμοποιήθηκαν τα P. acidilactici SK και Lactiplantibacillus plantarum F4, απομονωμένα από κόπρανα εθελοντών και από ξηρά σύκα, αντίστοιχα, τα οποία επιλέχθηκαν μετά από in vitro αξιολόγηση των προβιοτικών τους ιδιοτήτων, στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Καινοτόμα Λειτουργικά Τρόφιμα: Ανάπτυξη, Παραγωγή, Χαρακτηρισμός, Ιδιότητες‐iFUNFoods», και ως στέλεχος αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το L. plantarum Β282, απομονωμένο από επιτραπέζιες ελιές, το οποίο ήταν ευγενική παραχώρηση του Ινστιτούτου Τεχνολογίας Αγροτικών Προϊόντων, ΕΛΓΟ-ΔΗΜΗΤΡΑ (Λυκόβρυση, Ελλάδα). Αρχικά, εξετάστηκε η δυνατότητα ακινητοποίησης των προβιοτικών κυττάρων σε φυσικούς φορείς (νιφάδες ζέας, κελυφωτό φιστίκι και σταφίδα) και μελετήθηκε η βελτιστοποίηση των παραμέτρων ακινητοποίησης, με στόχο την επίτευξη των μεγίστων επιπέδων ακινητοποιημένων κυττάρων. Παράλληλα, μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλίωσης ως μεθόδου ξήρανσης στη βιωσιμότητα ακινητοποιημένων κυττάρων. Η ακινητοποίηση οδήγησε σε υψηλή κυτταρική συγκέντρωση (≥ 8.20 logcfu / g για υγρές και ≥ 7.35 logcfu / g για λυοφιλιωμένες καλλιέργειες). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (18-20°C) ή ψυγείου (4°C) στη βιωσιμότητα υγρών ή λυοφιλιωμένων ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων. Τα επίπεδα των λυοφιλιωμένων καλλιεργειών διατηρήθηκαν έως 7.17 logcfu / g μετά από αποθήκευση 6 μηνών σε θερμοκρασία δωματίου και έως 8.47 logcfu / g σε θερμοκρασία ψυγείου, σε αντίθεση με τα επίπεδα των ελευθέρων κυττάρων που κυμάνθηκαν 3.13 και 8.05 logcfu / mL, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας τα πλεονεκτήματα που προσέφερε η ακινητοποίηση και η λυοφιλίωση στην κυτταρική βιωσιμότητα.Τα λειτουργικά συστατικά τροφίμων των 3 υπό μελέτη στελεχών σε όλες τις μορφές (λυοφιλιωμένα ή υγρά και ακινητοποιημένα ή ελεύθερα) υποβλήθηκαν σε στατικό in vitro μοντέλο γαστρεντερικής πέψης προκειμένου να αξιολογηθεί η ικανότητα επιβίωσής τους κατά την δίοδο από το ΓΣ που αποτελεί ένα σημαντικό κριτήριο επιλογής των λειτουργικών καλλιεργειών. Η επώαση στο διάλυμα προσομοίωσης στοματικής κοιλότητας δεν επηρέασε σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης ανεξάρτητα από την κατάσταση (υγρές ή λυοφιλιωμένες) ή την φύση (ελεύθερες ή ακινητοποιημένες) των κυττάρων. Όμως, μετά την ολοκλήρωση της in vitro προσομοίωσης πέψης και την επώαση στα διαλύματα προσομοίωσης στομάχου και εντέρου, παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης στα ακινητοποιημένα σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, ενώ μεταξύ υγρών και λυοφιλιωμένων κυττάρων εμφανίστηκαν διαφορές σε συγκεκριμένες περιπτώσεις. Αξίζει να αναφερθεί πως καταγράφηκαν σημαντικές διαφορές ανάλογα με τον φορέα ακινητοποίησης, όπου τα υψηλότερα ποσοστά εμφανίστηκαν στα ακινητοποιημένα κύτταρα σε νιφάδες ζέας ή σε κελυφωτό φιστίκι. Tα υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης για κάθε στέλεχος ήταν: 95.91% για τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. plantarum F4 σε νιφάδες ζέας, 91.97% για τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα P. acidilactici SK σε νιφάδες ζέας και 90.17-93.47% για τα λυοφιλιωμένα κύτταρα L. plantarum Β282 σε νιφάδες ζέας / κελυφωτό φιστίκι. Τα συστατικά τροφίμων με τις ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες P. acidilactici SK στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή δημητριακών τύπου muesli και μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας αποθήκευσης στην κυτταρική βιωσιμότητα, ενώ παράλληλα τα νέα προϊόντα υποβλήθηκαν σε οργανοληπτική αξιολόγηση από κοινούς καταναλωτές. Την ημέρα παραγωγής επιτεύχθηκε υψηλή συγκέντρωση κυττάρων (8.73 logcfu / g), η οποία μειώθηκε σημαντικά μετά από 30 και 90 ημέρες αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (8.57 logcfu / g) και ψυγείου (8.48 logcfu / g), αντίστοιχα. Μετά από 6 μήνες αποθήκευσης, τα ποσοστά επιβίωσης κυμάνθηκαν 92.33% σε θερμοκρασία δωματίου και 94.96% σε θερμοκρασία ψυγείου και οι αντίστοιχες τιμές ενεργότητας νερού ήταν 0.125 και 0.098. Τα δημητριακά πρωινού απέσπασαν θετικές βαθμολογίες κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση και δεν διαφοροποιήθηκαν σε σχέση με τα δημητριακά που δεν περιείχαν ακινητοποιημένες καλλιέργειες. Ακολούθησε in vivo διατροφική παρέμβαση με ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες P. acidilactici SK σε κελυφωτό φιστίκι ή ελεύθερα κύτταρα σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1. Οι επίμυες κατανάλωναν καθημερινά 2*10^9 cfu κυττάρων και η διάρκεια του πειραματικού πρωτοκόλλου ήταν 30 ημέρες. Στο τέλος, πραγματοποιήθηκε ευθανασία και συλλογή εντερικού ιστού και ολικού αίματος και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των προσκολλημένων στα διάφορα εντερικά τμήματα (νήστιδα, ειλεός, κόλον, τυφλό) και σε δείγματα κοπράνων μικροβιακών πληθυσμών. Ακολούθησε ανάλυση NGS σε δείγματα κοπράνων και ποσοτικοποίηση των SCFAs και γαλακτικού οξέος, ενώ επίσης εξετάστηκαν οι βιοχημικές παράμετροι και τα επίπεδα ινσουλίνης και παραγόντων φλεγμονής στο αίμα των ζώων. Τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων στα εντερικά τμήματα του ειλεού και στο κόλον των διαβητικών ζωικών προτύπων φανερώνουν μειωμένα επίπεδα εντεροβακτηρίων μετά την κατανάλωση ακινητοποιημένων κυττάρων P. acidilactici SK σε κελυφωτό φιστίκι, συγκριτικά με τις ομάδες που κατανάλωσαν τα ελεύθερα κύτταρα (3.30 και 3.87 logcfu / g, συγκριτικά με 4.09 και 4.76 logcfu / g, για ειλεό και κόλον, αντίστοιχα). Μετά από 4 εβδομάδες, οι πληθυσμοί των γαλακτικών βακτηρίων στα κόπρανα αυξήθηκαν σε όλες τις ομάδες, υποδεικνύοντας την επιβίωση του χορηγούμενου στελέχους που ανήκει στα LAB, ενώ τα bifidobacteria αυξήθηκαν σε υγιή ζωικά πρότυπα που έλαβαν τα ακινητοποιημένα κύτταρα σε κελυφωτό φιστίκι. Παράλληλα, στα ζωικά πρότυπα ΣΔτ1, οι πληθυσμοί δυνητικά παθογόνων μικροβίων μειώθηκαν (συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης) ή επανήλθαν στα επίπεδα των υγιών ζώων μετά την χορήγηση ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων P. acidilactici SK. Μετά την NGS ανάλυση, εντοπίστηκε αυξημένη παρουσία του φύλου Actinobacteria στα διαβητικά ζωικά πρότυπα και περαιτέρω αύξηση στα ζώα που έλαβαν ακινητοποιημένα κύτταρα P. acidilactici SK. Σε επίπεδο γένους, το Pediococcus spp. αυξήθηκε σε όλες τις ομάδες ζωικών προτύπων, ενώ το γένος Lactobacillus αυξήθηκε στις ομάδες που έλαβαν τα ακινητοποιημένα κύτταρα. Η διατροφική παρέμβαση δεν επηρέασε τα επίπεδα των SCFAs και του γαλακτικού οξέος. Επιπρόσθετα, η κατανάλωση (ελεύθερων ή ακινητοποιημένων) κυττάρων P. acidilactici SK οδήγησε σε σημαντικά αυξημένα επίπεδα HDL-c στο πλάσμα των διαβητικών ζωικών προτύπων, συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης και σε παρόμοια επίπεδα με των υγιών ζώων, χωρίς, όμως, να επιδρά στα επίπεδα γλυκόζης ή ινσουλίνης. Τελικά, με την χρήση multiplex PCR ειδικής για τo είδος P. acidilactici επιβεβαιώθηκε η παρουσία του σε συγκεντρώσεις > 6 logcfu / g στα δείγματα του εντερικού ιστού και κοπράνων.Λαμβάνοντας υπόψιν τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υπογραμμίζεται η θετική επίδραση της διατροφής ή / και των λειτουργικών τροφίμων που περιέχουν δυνητικά προβιοτικούς μικροοργανισμούς στην υγεία και στον ΣΔτ1. Το κελυφωτό φιστίκι που αποτελεί έναν ξηρό καρπό που εντάσσεται στη μεσογειακή διατροφή μπορεί να επιδρά θετικά στο ΕΜ ζωικών προτύπων ΣΔτ1. Παράλληλα, η ακινητοποίηση λειτουργικών καλλιεργειών σε κελυφωτό φιστίκι και νιφάδες ζέας είχε θετική επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα, τόσο κατά την αποθήκευση, αλλά και κατά την επώαση σε συνθήκες προσομοίωσης γαστρεντερικής πέψης. Τα ξηρά ακινητοποιημένα κύτταρα σε φυσικούς φορείς παρουσιάζουν προοπτικές εφαρμογής σε συστήματα τροφίμων ως λειτουργικά συστατικά τροφίμων και αναμένεται να προσελκύσουν το καταναλωτικό κοινό. Τέλος, η διατροφική παρέμβαση με λειτουργικές καλλιέργειες P. acidilactici SK σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή επιδρά θετικά στο ΕΜ ζωικών προτύπων ΣΔτ1, αλλά και στο προφίλ των λιπιδίων του αίματος.