Syntrophic acetate oxidation in the anaerobic digestion of nitrogen-rich wastes : from microbial interactions to process optimization
Authors:   , Ruiz Sánchez Josep 
Published: July 2023

The anaerobic digestion (AD) consists of a cascade of syntrophic interactions between several microbial groups that result in the breakdown of biodegradable organic matter in the absence of oxygen, resulting in the production of biogas, a CH4 and CO2-rich mixture that can be valorised as renewable energy. The anaerobic digestion process has been engineered for a wide range of applications and current technology developments are aimed towards the so-called co-digestion, the treatment of complex mixtures of organic materials (e.g. slaughterhouse wastes) for an increased biogas yield. Nevertheless, the AD process might be hampered by the inhibitory effect of long chain fatty acids, ammonia and sulphate arising from the hydrolysis of proteins.
The main objective of this thesis is to develop innovative techniques and methodologies to degrade protein. As described throughout the following sections, these compounds are potentially inhibitors of AD process, and consequently the production of CH4 and other value-added compounds. These wastes with high concentration of proteins emit high concentrations of NH3 when are degraded. It is reported that in this situation, the main population of methanogenic archaea are inhibited. However, the populations with the ability to carry out the hydrogenotrophic methanogenesis are active in this kind of environments. Therefore, increasing acetate oxidising bacteria populations (SAOB) is possible to achieve a syntrophy relation with some hydrogenotrophic archaea (HMA) populations, in this way is possible to avoid the inhibition caused by the NH3 concentration. Furthermore, sometimes these kind of wastes are associated with rich SO42- compounds that could be easily reduced to sulphide (H2S), molecule that is toxic, corrosive and odorous, producing several problems in the AD process and industrial facilities. The biological reaction that produced these compounds is performed by sulphate-reducing bacteria (SRB). These microbial communities, SRB, have the ability to couple the oxidation of organic matter to the reduction of SO42- outcompeting directly with methane producing archaea (MPA) and homoacetogenic bacteria for common substrates, and inhibiting the CH4 production.
In order to carry out this doctoral thesis, two blocks (engineering and microbiological) have been developed that have been integrated as the work progressed. Firstly, different batch-scale studies were carried out in order to monitor the physical-chemical parameters and also the evolution of the microbial communities. In microbiology field, the main objective was to explore the evidence of acetate oxidation via syntrophic interaction between SAOB-HMA. To this end, the abundances of majorities groups were quantified using qPCR analysis based on the 16S rRNA and mcrA genes combined with isotopic compounds. Furthermore, the rapid advancement of high-throughput molecular techniques, as shotgun metagenomics sequencing and binning of scaffolds, have been allowed the implementation of genome-centric approaches that generate comprehensive databases from complex environmental samples, which includes complete or nearly-complete microbial genomes.
Secondly, it was necessary that the reactors operated with the appropriate parameters to stablish this syntrophic interaction. As well as, it was also to establish protocols and different parameters concerning the configuration of the reactor based on literature and results obtained from the first set of experiments. Within this block, the hydraulic retention time (HRT), temperature ranges, organic loading rate, reactor configuration was treated. Finally, within this block, the most important point was to found the optimal reactor configuration. As it is known, the structure and the various units that make up a reactor, affect directly the efficiency and optimization of the same. Along this thesis different configurations was tested.

La digestió anaeròbia (DA) consisteix en una cascada d’interaccions sintròfiques entre diferents grups de microorganismes que tenen com a principal finalitat la degradació de la matèria orgànica per obtenir biogàs, una barreja de CH4 i CO2 pot ser de gran valor en el camp de les energies renovables. El procés de la DA ha sigut dissenyat per una ampli espectre de residus, (per exemple, restes d’escorxadors) per obtenir un major rendiment de biogàs. No obstant, el procés de la DA es podria veure obstaculitzat per l’efecte inhibitori dels àcids grassos de cadena llarga, la hidròlisi de les proteïnes o els compostos sulfurats. L’objectiu principal d’aquesta tesis es desenvolupar tècniques i mètodes innovadors per la degradació de les proteïnes, principalment. Com es descriu al llarg de les pròximes secciones, aquests compostos son potencialment inhibidores del procés de la DAa, i en conseqüències, de la producció de CH4. Està descrit a la literatura que sota aquestes condicions desfavorables el principal grup de microorganismes productors de CH4 (arquees metanogèniques) es troba total o parcialment inhibit. No obstant, dins d’aquesta gran comunitat de microorganismes existeixen reductes que son capaços de mantenir la activitat metanogènica tot i trobar-se sota aquestes condicions d’inhibició, mitjançant la ruta metanogènica hidrogenotròfica. Aquesta població doncs, ha obert noves possibles vies per la obtenció de biogàs partint d’aquests productes altament inhibitoris. Una d’aquestes opcions, consisteix en incrementar aquelles poblacions que son capaces d’oxidat l’acetat per aconseguir establir una sintròfia amb les poblacions hidrogenotrofiques, evitant així, la inhibició causada per NH3. A més, en moltes ocasions aquest tipus de residus porten associats altes càrregues de compostos sulfurats, el que podria portar posteriorment a una reducció d’aquests compostos a la formació d’àcid sulfhídric (H2S). Aquesta molècula, és tòxica, corrosiva i olorosa, que a més provoca problemes dins del propi procés i és altament perjudicial per les instal·lacions. Aquesta molècula es forma principalment de manera biològica, portada a terme pels bacteris coneguts com sulfato reductors (SRB). Aquestes comunitats, SRB, tenen la capacitat d’acoblar l’oxidació de la matèria orgànica amb la reducció dels compostos sulfurats, competint directament pels substrats comuns amb els arquees hidrogenotrofics i els bacteris homoacetogenics, inhibint així la producció de CH4. Amb la finalitat de desenvolupar aquesta tesis doctoral, s’han portat a terme dos grans blocs experimentals (enginyeria i microbiologia) que a mesura que el treball avançava s’han integrat progressivament l’un amb l’altre. Dins del bloc de la microbiologia, el primer objectiu va ser l’estudi i l’anàlisi de les evidencies de la ruta sintròfica oxidadora d’acetat acoblada a la metanogenesis hidrogenotrofica, estudiant les interaccions entre aquestes dues grans comunitats. Es van quantificar mitjançant anàlisis de qPCR els dos grups majoritaris bastant-nos en els gens de referencia, 16SrRNA per bacteris i mcrA per arquees metanogèniques combinat amb un estudi de marcatge isotòpic. Complementàriament, el ràpid avenç de les tecnologies moleculars d’alt impacte com la seqüenciació shotgun i les eines bioinformàtiques, han permès desenvolupar estudis centrats en el genoma i poder generar bases de dades més accessibles i amplies relacionades amb la complexitat del microbioma ambiental. En segon lloc, un dels principals objectius del segon bloc era mitjançant els correctes paràmetres d’operació dels reactors aconseguir l’aparició i estabilitat de les sintròfies comentades anteriorment. Va ser fonamental també, establir protocols i marcar els paràmetres relacionals amb la configuració dels reactors, per aquest motiu, es va basar el disseny d’aquests digestors en els resultats obtinguts dels experiments discontinus previs. Seguint en aquesta línia, es van analitzar minuciosament paràmetres com el temps de retenció hidràulic, velocitat de càrrega orgànica, rangs de temperatura i configuració del reactor.
Finalment, un dels punts crítics pel bon funcionament del projecte va ser l’elecció i disseny dels reactors. Es coneix, que el disseny i l’operació dels digestors es de vital importància per un desenvolupament òptim dels procés, per això es van provar diferents configuracions.

La digestion anaerobia (DA) consiste en una cascada de interacciones sintróficas entre diferentes grupos de microganismos que tiene como principal finalidad la degradación de la materia orgánica con el fin de obtener biogás, una mezcla de CH4 y CO2 que puede ser de gran valor en el campo de las energíaas renovables. El proceso de DA ha sido diseñado para una amplia gama de aplicaciones y para obtener un mayor rendimiento de biogás. Sin embargo, el proceso de DA podría verse obstaculizado por el efecto inhibidor de los ácidos grasos de cadena larga, el amoníaco de la hidrólisis de proteínas o los compuestos sulfurados.
El objetivo principal de esta tesis es desarrollar técnicas y métodos innovadores para degradar las proteínas. Como se describe a lo largo de las siguientes secciones, estos compuestos son potecialmente inhibidores del proceso de DA y, en consecuencia, de la producción de CH4. Este tipo de residuo con alta carga de proteínas emite altas concentraciones de NH3 cuando éstas son degradadas. Está reportado que bajo estas condiciones desfavorables el principal grupo de microorganismos productores de CH4 (arqueas metanogénicas) se encuentra total o parcialmente inhibido. Sin embargo, dentro de esta gran comunidad de arqueas capaces de producir CH4, existen algunos reductos capaces de mantenerse activas bajo concentraciones de elevado nitrógeno amoniacal mediante la ruta de la metanogenesis hidrogenotrófica. Esta población abre nuevas posibilidades para obtención de biogás de este tipo de residuos. Una de estas opciones consiste en incrementar las poblaciones oxidadoras de acetato para lograr una relación sintrófica estable con estas poblacions hidrogenotrófcas, evitando de este la inhibición causada por NH3. Además, en muchas ocasiones este tipo de residuos con alta carga proteíca van asociados a una elevada concentración de compuestos sulfurados, lo que podría conllevar una reducción de éstos a ácido sulfhídrico (H2S). Esta molécula es tóxica, corrosiva y olorosa, que provoca varios problemas en DA y en las instalaciones asociadas. La reacción biológica que conlleva a la formación de este compuesto está mediada por el grupo de bacterias conocidas como bacterias sulfato reductoras (SRB). Estas comunidades microbianas, SRB, tienen la capacidad de acoplar la oxidación de la materia orgánica a la reducción del SO42- compitiendo directamente por los sustratos comunes con las arqueas productoras de CH4 y bacterias homoacetogénicas inhibiendo de este modo, la producción de biogás.
Se han llevado a cabo dos grandes bloques (ingeniería y microbiología) que a medida que se avanzaba con el trabajo han ido integrándose. En primer lugar, se llevaron a cabo diferentes estudios en régimen discontinuo a escala laboratorio, monitorizando los parámetros físicoquimicos y la evolución de las comunidades microbianas. El primer objetivo fue el estudio y análisis de las evidencias de la ruta sintrófica oxidadora de acetato acoplada a una metanogenesis hidrogenotrófica, estudiando las interacciones entre estas dos comunidades. Para ello, se cuantificaron mediante qPCR los dos grupos mayoritarios basándonos en los genes de referencia, 16SrRNA para la monitorización de las bacterias, y mcrA en el caso de las arqueas metanogénicas combinando esta cuantificación con el marcaje de compuestos isotópicos. Además, se ha podido desarrollar estudios centrados en el estudio del genoma gracias a la secuanciación shotgun y las herramientas bionformáticas.
En segundo lugar, uno de los principales era mediante los correctos parámetros de operación de los reactores conseguir la aparición y estabilidad de las sintrofías comentadas anteriormente. Fue fundamental establecer protocolos y marcar los parámetros relacionados con la configuración de los reactores, y para ello se basó el diseño de estos en los resultados obtenidos de los diferentes ensayos discontinuos previos. Siguiendo en esta línea, se analizaron meticulosamente parámetros como tiempo de retención hidráulico, velocidad de carga orgánica, rangos de temperatura y configuración del reactor. Finalmente, uno de los puntos críticos fue la elección y diseño de los reactores. Es bien sabido, que el diseño y operación del digestor es crucial para un desarrollo óptimo del proceso, por ello se probaron diferentes configuraciones