Μελέτη του ρόλου των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων (EPCs) στην αθηρωματική νόσο
Authors: Χαντζηχρήστος Βασίλειος 
Published: August 2021

Είναι γνωστό ότι, τα αιμοπετάλια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αιμόσταση, στη φλεγμονή και στην αγγειογένεση. Τα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα (EPCs) είναι ένας πληθυσμός πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων τα οποία έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs). Τα EPCs συνεισφέρουν σε σημαντικό βαθμό στην αναγέννηση του αγγειακού ενδοθηλίου και στην επανενδοθηλιοποίηση. Επιπρόσθετα, εκφράζουν στην επιφάνειά τους τα αντιγόνα CD34, CD133 και KDR. Τα CD34 και CD133 είναι δείκτες πρόδρομων κυττάρων, ενώ το KDR ταυτοποιεί τα κύτταρα με ενδοθηλιακό φαινότυπο. Συνεπώς, ο ορισμός των EPCs είναι σύνθετος εξαιτίας της απουσίας ενός μοναδικού εξειδικευμένου δείκτη. Επιπλέον, πρέπει να τονιστεί ότι, στη διεθνή επιστημονική κοινότητα δεν έχει αναπτυχθεί ακόμη μια εξειδικευμένη και ευαίσθητη μεθοδολογία για το χαρακτηρισμό και την ταυτοποίηση των EPCs. Εντούτοις, διάφορες κατηγορίες των κυκλοφορούντων EPCs έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία οι οποίες βασίζονται σε διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης και καλλιέργειας. Τα EPCs ταξινομούνται στα colony forming unit-Hill (CFU-Hill) κύτταρα και τα κυκλοφορούντα αγγειογενετικά κύτταρα (CACs), τα οποία ονομάζονται early EPCs, όπως επίσης και στα προχωρημένης ωρίμανσης EPCs (OECs) ή late EPCs. Στην παρούσα μελέτη, θελήσαμε να αναπτύξουμε μεθόδους απομόνωσης και καλλιέργειας των διαφόρων τύπων EPCs για πρώτη φορά στο εργαστήριο μας. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση των EPCs στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, in vitro.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καλλιέργεια των μονοπύρηνων κυττάρων από περιφερικό αίμα κάτω από διαφορετικές συνθήκες έτσι ώστε να οδηγηθούμε στη δημιουργία των CFU-Hill και CACs κυττάρων. CD34+ κύτταρα απομονώθηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα αίματος από ομφάλιο λώρο και καλλιεργήθηκαν κατάλληλα για 30 μέρες ώστε να οδηγηθούμε στο σχηματισμό των OECs κυττάρων. Στη συνέχεια, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των τριών κατηγοριών των EPCs χρησιμοποιώντας το οπτικό ανάστροφο μικροσκόπιο, την τεχνική της κυτταρομετρίας ροής, καθώς και τη μικροσκοπία συνεστιασμού. Βρέθηκε ότι, τα CFU-Hill κύτταρα είχαν την ικανότητα σχηματισμού αποικιών που αποτελούνταν από ένα κεντρικό σύμπλεγμα σφαιρικών κυττάρων με επιμήκη κύτταρα στην περιφέρεια. Τα CACs ήταν σφαιρικά κύτταρα ενώ μερικά από αυτά ήταν ατρακτοειδή. Τα OECs μοιάζουν ως προς τη μορφολογία με τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιου λώρου (HUVECs) αφού αυτά εμφανίζουν μια τυπική ελλειψοειδή μορφή και παρουσιάζουν υψηλή ικανότητα πολλαπλασιασμού και εξάπλωσης. Τέλος, τα CD34+ κύτταρα ήταν μικρά με σφαιρικό σχήμα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε το χαρακτηρισμό των τριών κατηγοριών των EPCs ως προς την έκφραση διαφόρων επιφανειακών αντιγόνων. Τα CFU-Hill κύτταρα παρουσίασαν έκφραση των CD34, KDR και CD133. Επιπλέον, εμφάνισαν έκφραση του γενικού δείκτη των λευκοκυττάρων CD45 και του μονοκυτταρικού δείκτη CD14, υποδεικνύοντας την αιμοποιητική τους φύση. Τέλος, βρέθηκε ότι εκφράζουν CD31, ένα εξειδικευμένο ενδοθηλιακό αντιγόνο. Παρομοίως, τα CACs παρουσίασαν έκφραση των CD34, KDR, CD133, CD31, όπως επίσης των CD45 και CD14, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά εμφανίζουν αιμοποιητικά χαρακτηριστικά. Γενικά, βρέθηκε ότι τα OECs εκφράζουν CD34, KDR, CD31 και μόνο ένα μικρό ποσοστό τον πρόδρομο δείκτη CD133. Από την άλλη πλευρά, τα OECs δεν παρουσίασαν καθόλου έκφραση των αιμοποιητικών δεικτών CD14 και CD45, δείχνοντας ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα εμφανίζουν ισχυρό ενδοθηλιακό φαινότυπο. Ένα σημαντικό εύρημα είναι ότι, ο ενδοθηλιακός φαινότυπος των OECs φαίνεται να είναι ισχυρότερος καθώς αυξάνεται η γενιά των κυττάρων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση των EPCs με μικροσκοπία συνεστιασμού. Τα CFU-Hill είχαν την ικανότητα πρόσληψης της DiI-ακετυλιωμένης LDL (DiI-ac-LDL) και δέσμευσης της FITC-λεκτίνης. Επίσης, έγινε χρώση των CACs με τον παράγοντα von Willebrand (vWF). Ακολούθησε χρώση των OECs με την ac-LDL, τη λεκτίνη και τον vWF.Αφού πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός και η ταυτοποίηση των EPCs, η επίδραση των κυττάρων και του υπερκειμένου τους στη συσσώρευση των πλυμένων αιμοπεταλίων μελετήθηκε με τη συσσωρευομετρία οπτικής διαπερατότητας. Μελετήθηκαν επίσης τα CD34+ και τα HUVECs κύτταρα, καθώς και το υπερκείμενό τους. Ως αγωνιστές των αιμοπεταλίων χρησιμοποιήθηκαν το κολλαγόνο, η θρομβίνη και το Trap14. Τόσο τα CFU-Hill κύτταρα όσο και το υπερκείμενό τους δεν ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων παρουσία του κολλαγόνου ή της θρομβίνης. Παρομοίως, τα CACs κύτταρα και το υπερκείμενό τους δεν εμφάνισαν ανασταλτική δράση στη συσσώρευση η οποία προκλήθηκε από το κολλαγόνο ή το Trap14. Από την άλλη πλευρά, τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων από το κολλαγόνο ή το Trap14. Η ανασταλτική δράση των OECs στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων ήταν παρόμοια με αυτή των HUVECs, αφού τα OECs εκφράζουν ισχυρό ενδοθηλιακό φαινότυπο. Η ανασταλτική δράση που εμφανίζει το υπερκείμενο των OECs πιθανώς οφείλεται στο γεγονός ότι τα OECs κύτταρα, σε αντίθεση με τα early EPCs παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση της ενδοθηλιακής συνθάσης του νιτρικού οξειδίου (eNOS) και εκκρίνουν διάφορες αντιαιμοπεταλιακοί παράγοντες, όπως μονοξείδιο του αζώτου (NO) και προσταγλανδίνη Ι2 (PGI2). Ο αυξανόμενος βαθμός του ενδοθηλιακού φαινοτύπου βρέθηκε να συσχετίζεται με υψηλότερο ποσοστό αντιαιμοπεταλιακής δράσης. Επιπλέον, διαπιστώθηκε δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη ανασταλτική δράση της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων από τα OECs κύτταρα. Τέλος, ένα πολύ σημαντικό πρωτότυπο εύρημα αυτής της μελέτης είναι ότι τα OECs κύτταρα, καθώς και το υπερκείμενό τους παρουσίασαν αυξημένη αναστολή από το Trap14 παρά από το κολλαγόνο. Ο λόγος για τον οποίο ενδεχομένως μπορεί να ισχύει αυτό είναι γιατί τα EPCs και ιδιαίτερα τα late EPCs εκφράζουν τον PAR-1. Τόσο τα CD34+ κύτταρα όσο και το υπερκείμενό τους δεν ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων από τη θρομβίνη. Συμπερασματικά, μόνο τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους ανέστειλαν τη συσσώρευση εμφανίζοντας ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Για αυτό το λόγο, θελήσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω την επίδραση των συγκεκριμένων κυττάρων και του υπερκειμένου τους στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων χρησιμοποιώντας την κυτταρομετρία ροής.Στη συνέχεια, ερευνήθηκε η επίδραση των OECs και του υπερκειμένου τους στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από τον αγωνιστή ADP. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων εκτιμήθηκε προσδιορίζοντας τη μεμβρανική έκφραση του υποδοχέα-ιντεγκρίνης αIIbβ3 (πρόσδεση PAC-1-FITC) και τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης (CD62P-PE). Έγινε χρώση των αιμοπεταλίων με τον αιμοπεταλιακό δείκτη CD61-PerCP και των OECs με τον ενδοθηλιακό δείκτη CD31-PE. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των HUVECs κυττάρων και του υπερκειμένου τους, καθώς επίσης και των CD34+ κυττάρων στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Βρέθηκε ότι, τα ελεύθερα αιμοπετάλια τα οποία δεν είναι προσκολλημένα στα CD34+, OECs και HUVECs κύτταρα ενεργοποιούνται. Τα OECs, καθώς και τα HUVECs κύτταρα και τα υπερκείμενά τους ανέστειλαν την ενεργοποίηση των ελεύθερων αιμοπεταλίων. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε αναστολή στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από τα CD34+ κύτταρα και το υπερκείμενό τους. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ADP επάγει την προσκόλλησή τους στα OECs, στα CD34+ και στα HUVECs κύτταρα. Διαπιστώθηκε ότι, τα προσκολλημένα αιμοπετάλια είτε στα OECs είτε στα HUVECs κύτταρα δεν ενεργοποιούνται. Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε στα CD34+ κύτταρα.Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη δείχνει για πρώτη φορά ότι τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους εμφανίζουν ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Η σπουδαιότητα των παραπάνω ευρημάτων στους μηχανισμούς της αθηρωμάτωσης παραμένουν υπό διερεύνηση.