The long non-coding RNA SMANTIS interacts with RUNX1 in monocytic cells
Authors:   , Weiß Lisa 
Published: February 2025

In den letzten 20 Jahren verschob sich die Perspektive von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) von „Schrott“-Transkripten zu essentiellen transkriptions-beeinflussenden Elementen. lncRNAs sind wichtige Moleküle, die mit RNA, DNA und Proteinen interagieren, um chromosomale Umstrukturierung zu ermöglichen und somit die Expression von Genen zu beeinflussen. lncRNAs sind in der Lage, Proteine an bestimmte Genregionen zu rekrutieren oder sie daran zu hindern, an die DNA zu binden. lncRNAs sind unterschiedlich stark in verschiedenen Spezies konserviert und deren Expression ist stark zell- sowie gewebespezifisch. Einige dieser lncRNAs besitzen repetitive Elemente, sogenannte Alu Elemente. Forschungen hierzu zeigen eine zunehmende Relevanz in der Funktion von lncRNAs. lncRNAs beeinflussen die molekularen- und zellulären Prozesse in vielen physiologischen Bereichen wie Hämatopoese und Herz-Kreislauf allerdings auch in Krankheiten wie Krebs und Atherosklerose.
In dieser vorliegenden Doktorarbeit wurde die zuvor in Endothelzellen entdeckte lncRNA SMANTIS (SMARCA4 interacting SWI/SNF chromatin remodelling complex scaffold lncRNA) weiter in ihrer Funktion in Monozyten untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass SMANTIS Adhesionsmoleküle in Monozyten reguliert und spezifisch über das integrierte Alu Element mit der funktionellen Einheit RUNT des Transkriptionsfaktors RUNX1 interagiert.
SMANTIS zeigte eine signifikante erhöhte Expression in monozytischen Zellen. Eine mögliche klinische Relevanz vertiefte sich aufgrund unterschiedlicher Expressionslevel in Patienten mit verschiedenen Typen von akuter myeloischer Leukämie. Eine mögliche spezifische Relevanz für Monozyten ergab sich daraus, dass die Expression von SMANTIS in Stammzellen sowie in Makrophagen, die sich aus Monozyten differenzieren, reduziert war. Durch die Deletion von SMANTIS in der monozytischen Zelllinie THP-1 konnte der hämatopoetische relevante Transkriptionsfactor RUNX1 als Interaktionspartner von SMANTIS identifiziert werden. Die Bindung zwischen lncRNA und RUNX1 wurde durch das Alu Element in SMANTIS und der funktionellen Einheit RUNT in RUNX1 ermöglicht. Eine spezifische DNA-Protein-Interaktionsmethode zeigte, dass RUNX1 aufgrund der Abwesenheit von SMANTIS eine geringe Bindungsaffinität zur DNA seiner Zielgene hatte.
Daraufhin wurde ebenfalls eine RUNX1-eliminierte monozytische Zelllinie erstellt, die zusätzlich mit der SMANTIS Knockout-Zelle weitere Aufschlüsse auf den genregulatorischen Einfluss in Monozyten ergeben sollte. Die aufgrund der Deletion differenziell regulierten Gene zeigten eine Assoziation mit Signalwegen der Zelladhäsion. Daraufhin bestätigte eine Co-Kultur beider Knockoutzelllinien mit Endothelzellen eine erhöhte Interaktion zwischen Monozyten und Endothelzellen und damit eine Regulation von SMANTIS und RUNX1 auf Zelladhäsions-spezifische Gene. Mit einem Rescue-Modell, bei der SMANTIS und das Alu-Element überexpremiert wurden, konnte die zuvor erhöhte Interaktion zwischen Monozyten und Endothelzellen nicht revidiert werden, allerdings zeigten die Gene ITGAL und ITGAM (auch bekannt als CD11a und CD11b) eine signifikante Normalisierung.
Der Oberflächenmarker ITGAM ist ein bekannter Marker für die Differenzierung in Osteoklasten. Aufgrund der veränderten Genexpression in SMANTIS Knockout-Zellen, wurde diese Zelllinie, sowie die RUNX1 Knockout-Zellen mit Osteoklast-spezifischen Signalmolekülen zu Osteoklasten differenziert. Osteoklast-spezifische Markergene waren zum Teil signifikant in ihrer Genexpression im Vergleich zur Kontrolle verändert. Allerdings ergaben sich hieraus keine synergistischen Effekte von RUNX1 und SMANTIS auf die Differenzierung von Osteoklasten, woraufhin der Fokus weiterhin auf die Regulation von SMANTIS und RUNX1 in Monozyten lag.
Um den molekularen Mechanismus von SMANTIS und dessen Interaktion mit RUNX1 weiter zu verstehen, wurden die Interaktionspartner von RUNX1 (CBFB (wichtig für die DNA-Bindung), SIN3A (Repressor), und EP300 (Aktivator)) mit der Abwesenheit von SMANTIS untersucht. Ebenfalls zeigten die AML-Patienten mit hoch exprimierten SMANTIS eine signifikante erhöhte Expression dieser Bindeproteine von RUNX1. Eine Proteininteraktionsmethode zeigte keine Veränderung der Interaktionen zwischen RUNX1 und seiner Interaktionspartner im Nukleus. Allerdings zeigte sich in den SMANTIS Knockout-Zellen eine räumliche ringähnliche Änderung in Richtung der Nukleus-Zytoplasma Membran. Die Quantifizierung spiegelte die erhöhte signifikante Änderung der Interaktion im Zytoplasma von CBFB und EP300 wieder. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass mit der Abwesenheit von SMANTIS die Lokalisation der Bindung von RUNX1 zu EP300 und CBFB verändert ist.
Zusammenfassend kann aus der vorliegen Arbeit geschlussfolgert werden, dass SMANTIS die Interaktion von Monozyten mit Endothelzellen reguliert und die Genexpression von AML-relevanten Genen beeinflusst. SMANTIS interagiert mit seinem Alu-Element spezifisch die RUNT Sequenz des hämatopoetisch relevanten Transkriptionsfaktor RUNX1. SMANTIS beeinflusst ebenfalls die Interaktion zu RUNX1-Interaktionspartnern. Wenn weitere Experimente bestätigen können, dass SMANTIS eine essentielle physiologische Rolle in Monozyten und Endothelzellen spielt, kann SMANTIS unteranderem als potentiellen Marker für klinische Therapien berücksichtig werden.