Μελέτη της επίδρασης της γκρελίνης στην αναπαραγωγή των αγελάδων
Authors: Χουζούρης Θωμάς-Μάρκος 
Published: September 2021

Για την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής διενεργήθηκαν τέσσερις διακριτοί πειραματισμοί που είχαν στόχο να διευκρινίσουν τη δράση της γκρελίνης ως δείκτη μεταβολισμού σε διάφορες λειτουργίες του αναπαραγωγικού συστήματος των αγελάδων. Οι πειραματισμοί εστίασαν: α) στη μελέτη των επιδράσεων της χορήγησης της γκρελίνης σε καθοριστικές αναπαραγωγικές παραμέτρους, β) στον έλεγχο της αντίδρασης στο στρες της στέρησης τροφής, σε έγκυες και μη-έγκυες μοσχίδες γαλακτοπαραγωγής, γ) στη μελέτη της γκρελίνης, κατά την περιοιστρική περίοδο, σε αγελάδες και μοσχίδες και δ) στη μελέτη των πιθανών μοριακών μονοπατιών, μέσω των οποίων η γκρελίνη επιταχύνει την in vitro ωρίμανση των ωαρίων. Ακόμη, μελετήθηκε το πρότυπο έκκρισης της γκρελίνης, κατά τη διάρκεια της κυοφορίας, σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής και μοσχίδες. Η διατριβή χωρίζεται σε πέντε κεφάλαια και ακολουθούν τα συμπεράσματα.Το κεφάλαιο Ι περιλαμβάνει τη γενική εισαγωγή που διακρίνεται σε 5 μέρη. Στο πρώτο μέρος γίνεται λόγος για την αναπαραγωγή σε αγελάδες υψηλών αποδόσεων. Στο δεύτερο μέρος γίνεται ανασκόπηση του ωοθηκικού κύκλου των αγελάδων, όπου περιλαμβάνονται τα στάδια ανάπτυξης του ωαρίου, το πρότυπο ανάπτυξης των ωοθυλακίων και η ρύθμιση του ωοθηκικού κύκλου των αγελάδων. Στο τρίτο μέρος αναφέρεται πώς διάφορα νευροπεπτίδια και ρυθμιστικά μόρια, όπως η λεπτίνη, οι κισπεπτίνες, το νευροπεπτίδιο Υ, οι μελανοκορτίνες και τα Agouti-related πεπτίδια, συμμετέχουν στη ρύθμιση λειτουργιών της αναπαραγωγής. Στο τέταρτο μέρος, γίνεται εκτενής αναφορά στη γκρελίνη, από την ανακάλυψη της ορμόνης έως τα όργανα έκφρασης και τις βιολογικές δράσεις της, με έμφαση στο ρόλο της ορμόνης στην αναπαραγωγή. Τέλος, στο πέμπτο μέρος του κεφαλαίου περιγράφεται ο σκοπός της διατριβής.Στο κεφάλαιο ΙΙ αναλύεται ο πρώτος πειραματισμός, ο στόχος του οποίου ήταν η μελέτη των επιδράσεων της χορήγησης της γκρελίνης, στην έκκριση της αυξητικής ορμόνης (GH), της ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) και της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH), καθώς και των επιπτώσεων της στην ωχρινική λειτουργία του επερχόμενου ωοθηκικού κύκλου. Για το σκοπό αυτό, οι ωοθηκικοί κύκλοι οκτώ μοσχίδων, συγχρονίστηκαν με τη χρήση ενδοκολπικών εμφυτευμάτων προγεστερόνης και η ωοθυλακιορρηξία προκλήθηκε με έγχυση απελευθερωτικής ορμόνης της έκκρισης των γοναδοτρόπων ορμονών (GnRH). Στη συνέχεια, τα ζώα χωρίστηκαν σε δύο ισάριθμες ομάδες (n=4). Στα ζώα της πρώτης ομάδας (ομάδα Ghr) χορηγήθηκε 1,5 μg kg-1 βόεια ακυλιωμένη γκρελίνη, ενώ στα ζώα της δεύτερης ομάδας (ομάδα C) χορηγήθηκε η ίδια δόση φυσιολογικού ορού. Οι δειγματοληψίες ξεκίνησαν αμέσως μετά την πρώτη έγχυση της γκρελίνης· στις επόμενες 4 ώρες συλλέχτηκαν 13 δείγματα αίματος για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της γκρελίνης, της GH, της FSH και της LH. Οι δειγματοληψίες για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της προγεστερόνης ξεκίνησαν αμέσως μετά την εμφάνιση του οίστρου και συνεχίστηκαν κάθε δεύτερη ημέρα, έως και την εμφάνιση του επόμενου οίστρου. Στην ομάδα Ghr, η συγκέντρωση της γκρελίνης αυξήθηκε σημαντικά 15 λεπτά μετά την πρώτη έγχυση και παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα έως και 90 λεπτά μετά την τελευταία. Κατά τη χρονική στιγμή της τρίτης στη σειρά έγχυσης γκρελίνης, η συγκέντρωση της GH ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα Ghr σε σύγκριση με την αντίστοιχη της ομάδας των μαρτύρων. Παρόμοιες διαφορές παρατηρήθηκαν και στις τρεις επόμενες δειγματοληψίες, οι οποίες διενεργήθηκαν 15, 30 και 60 λεπτά αργότερα, αλλά όχι στα 90 λεπτά. Στην ομάδα Ghr, οι υπό την καμπύλη περιοχές για την LH και για την FSH ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με τις αντίστοιχες της ομάδας των μαρτύρων. Σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία, οι συγκεντρώσεις των LH και FSH ήταν σημαντικά χαμηλότερες στην ομάδα Ghr σε σύγκριση με την ομάδα των μαρτύρων (15, 30, 45, 75 και 90, καθώς και 60, 75, 90, 120 και 150 λεπτά μετά τη χορήγηση GnRH για τον έλεγχο LH και FSH, αντίστοιχα). Ο ωοθηκικός κύκλος που επακολούθησε της έγχυσης, ήταν σημαντικά βραχύτερος στην ομάδα Ghr συγκρινόμενος με τον αντίστοιχο της ομάδας των μαρτύρων. Επιπροσθέτως, τις ημέρες 4, 6, 8, 10 και 14, η συγκέντρωση της προγεστερόνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα Ghr συγκρινόμενη με την αντίστοιχη της ομάδας των μαρτύρων. Ομοίως, η υπό την καμπύλη περιοχή της προγεστερόνης για την ομάδα Ghr, ήταν σημαντικά μικρότερη από την αντίστοιχη της ομάδας των μαρτύρων. Τα παραπάνω αποτελέσματα παρέχουν ασφαλείς ενδείξεις ότι η γκρελίνη δρα στην υπόφυση, αμβλύνοντας το εύρος της απάντησης στο ερέθισμα της GnRH, ενώ είναι πιθανόν να επιδρά και στην ωχρινοποίηση του κυτταρικού τμήματος του προ-ωοθυλακιορρηκτικού ωοθυλακίου, ή/και να καταστέλλει τη στεροειδογενετική ικανότητα των ωχρινικών κυττάρων.Στο κεφάλαιο ΙΙΙ περιγράφονται δύο επιμέρους πειράματα, τα οποία απέβλεπαν στη μελέτη: α) των αλλαγών στο πρότυπο έκκρισης της LH σε μοσχίδες που ακολουθούσαν διαφορετικά προγράμματα διατροφής και β) της συγκέντρωσης της ολικής γκρελίνης, κατά τη διάρκεια του οίστρου, σε αγελάδες και μοσχίδες. Στο πρώτο πείραμα, 12 μοσχίδες, στις οποίες είχε προηγηθεί συγχρονισμός των ωοθηκικών κύκλων, χωρίστηκαν σε 3 ομάδες (R- μάρτυρες με κανονική χορήγηση τροφής, F- ζώα σε νηστεία και F-F ζώα σε νηστεία, τα οποία στη συνέχεια ταΐστηκαν). Την ημέρα 8, τα ζώα των ομάδων F και F-F δεν ταΐστηκαν για 24 ώρες, ενώ στη συνέχεια ακολούθησε παράθεση τροφής στα ζώα της ομάδας F-F και ταυτόχρονη έγχυση GnRH στα ζώα όλων των ομάδων. Διενεργήθηκε συστηματική αιματοληψία για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της γκρελίνης, της LH και της κορτιζόλης. Η νηστεία προκάλεσε σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων της γκρελίνης στα ζώα των ομάδων F και F-F σε σύγκριση με τα ζώα της ομάδας R. Στο δεύτερο πείραμα, χρησιμοποιήθηκαν αγελάδες και μοσχίδες γαλακτοπαραγωγής. Κατά την ημέρα 9 του κύκλου, χορηγήθηκε σε όλα τα ζώα προσταγλανδίνη F2α (PGF2α) για την πρόκληση οίστρου. Δείγματα αίματος συλλέγονταν δύο φορές την ημέρα, με εκκίνηση 24 ώρες πριν τη χορήγηση PGF2α, έως και την τρίτη ημέρα μετά την εκδήλωση οίστρου, για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της προγεστερόνης, της οιστραδιόλης-17β, της γκρελίνης, της γλυκόζης και του β-υδροξυβουτυρικού οξέος (ΒΗΒΑ). Οι συγκεντρώσεις στεροειδών ορμονών και ΒΗΒΑ, δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων. Στις αγελάδες, οι συγκεντρώσεις της γκρελίνης, κατά την περιοιστρική περίοδο, αυξήθηκαν σημαντικά για 36 ώρες σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τιμές κατά το μέσο στάδιο της ωχρινικής φάσης, γεγονός το οποίο δεν διαπιστώθηκε στις μοσχίδες. Τα αποτελέσματα των πειραματισμών του παρόντος κεφαλαίου δείχνουν ότι η αύξηση των συγκεντρώσεων της γκρελίνης μπορεί να ασκήσει κατασταλτική επίδραση στην έκκριση της LH, ακόμη και ύστερα από την επαναφορά των συγκεντρώσεών της στα βασικά επίπεδα. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια του οίστρου, η έκκριση της γκρελίνης ρυθμίζεται με διαφορετικό τρόπο στις αγελάδες από ότι στις μοσχίδες και είναι πιθανόν ανεξάρτητη από τις συγκεντρώσεις της οιστραδιόλης-17β. Από τα αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι απαιτείται διενέργεια περαιτέρω έρευνας, ώστε να ταυτοποιηθούν οι παράγοντες, οι οποίοι οδηγούν σε διαφορετικό τρόπο ρύθμισης της έκκρισης της γκρελίνης σε αγελάδες και μοσχίδες.Στο κεφάλαιο IV παρουσιάζεται ο τρίτος πειραματισμός (που αποτελείται από δύο μέρη), ο οποίος είχε ως στόχο αρχικά να εκτιμηθούν οι συγκεντρώσεις της γκρελίνης κατά τη διάρκεια της κυοφορίας, τόσο σε αγελάδες όσο και σε μοσχίδες και εν συνεχεία να συγκριθεί η αντίδραση στο στρες της στέρησης τροφής, σε έγκυες και μη-έγκυες μοσχίδες. Στο πρώτο μέρος, δείγματα αίματος συλλέγονταν (1 στην αρχή κάθε μήνα της κυοφορίας) από τις αγελάδες (n=5) και τις μοσχίδες (n=5), ώστε να ελεγχθεί η συγκέντρωση της ολικής γκρελίνης. Εν συγκρίσει με τις τιμές πριν από τη γονιμοποίηση, οι συγκεντρώσεις της γκρελίνης έδειχναν την τάση να είναι υψηλότερες κατά τον 3ο μήνα της κυοφορίας στις μοσχίδες και κατά τον 7ο, 8ο και 9ο μήνα της κυοφορίας στις αγελάδες. Ωστόσο, δεν εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις αγελάδες και στις μοσχίδες. Στο δεύτερο μέρος, έγκυες (n=4) και μη-έγκυες (n=4) μοσχίδες υποβλήθηκαν σε πλήρη νηστεία για 24 ώρες. Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν τις ώρες 0, 4, 8, 12, 16 και 24 μετά την απομάκρυνση της τροφής και αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της ινσουλίνης, της γλυκόζης, της κορτιζόλης, του ΒΗΒΑ και των μη-εστεροποιημένων λιπαρών οξέων (NEFA) και τις ώρες 0, 8, 16 και 24, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της ολικής γκρελίνης. Η σύγκριση των συγκεντρώσεων της γκρελίνης μεταξύ των ομάδων πριν και μετά τη νηστεία, έδειξε σημαντική αύξηση στις 8, 16 και 24 ώρες μετά την απομάκρυνση της τροφής στις έγκυες και στις 8 ώρες στις μη-έγκυες μοσχίδες. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα έγκυα και στα μη-έγκυα ζώα. Οι συγκεντρώσεις της γλυκόζης στις έγκυες μοσχίδες ήταν σημαντικά χαμηλότερες από τις αντίστοιχες των μη-έγκυων. Οι συγκεντρώσεις της ινσουλίνης εμφάνισαν σημαντική πτώση στις 4 και 8 ώρες της νηστείας στις έγκυες μοσχίδες, αλλά παρέμειναν ανεπηρέαστες στις μη-έγκυες. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις της κορτιζόλης αυξήθηκαν σημαντικά μετά την 4η ώρα και παρέμειναν σε αυξημένα επίπεδα καθ’ όλη τη διάρκεια των δειγματοληψιών στα έγκυα ζώα, ενώ στα μη-έγκυα κορυφώθηκαν την 24η ώρα της νηστείας. Στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώνεται ότι οι συγκεντρώσεις της ολικής γκρελίνης αυξάνουν ως ανταπόκριση στον περιορισμό της τροφής. Τα αποτελέσματα δείχνουν, επίσης, ότι: α) κατά τη διάρκεια του τελευταίου τριμήνου της κυοφορίας, η έκκριση της ολικής γκρελίνης λαμβάνει χώρα με διαφορετικό πρότυπο στις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής σε σύγκριση με τις μοσχίδες και β) τα έγκυα ζώα είναι πιο ευαίσθητα στο στρες της στέρησης τροφής σε σύγκριση με τα μη-έγκυα ζώα.Στο κεφάλαιο V παρατίθεται ο τέταρτος πειραματισμός, στον οποίο μελετήθηκαν τα πιθανά μοριακά μονοπάτια, μέσω των οποίων η γκρελίνη επιταχύνει την in vitro ωρίμανση των ωαρίων. Συμπλέγματα ωαρίων-ωοφόρου δίσκου (COCs) αγελάδων, ύστερα από ωρίμανση 18 ή 24 ωρών, με ή χωρίς την προσθήκη 800 pg ml-1 βόειας ακυλιωμένης γκρελίνης, αξιολογούνταν ως προς την ωρίμανση του πυρήνα και υποβάλλονταν σε in vitro γονιμοποίηση σε καλλιεργητικά υποστρώματα (standard media). τα ζυγωτά που προέκυπταν, καλλιεργούνταν εν συνεχεία in vitro για 8 ημέρες. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των Akt1 και ERK1/2 (ΜΑΡΚ1/3) αξιολογήθηκαν σε υποομάδες COCs, κατά τις ώρες 0, 6, 10, 18 και 24 της in vitro ωρίμανσης (IVM). Στην ομάδα, όπου είχε γίνει προσθήκη γκρελίνης, δεν παρουσιάστηκε καμιά σημαντική διαφορά στο ποσοστό των ώριμων ωαρίων μεταξύ των ωρών 18 και 24. Σε αντίθεση, στις 24 ώρες ωρίμανσης, στην ομάδα των μαρτύρων, παρατηρήθηκε σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός ώριμων ωαρίων από ότι στις 18. Η ωρίμανση των ωαρίων για 24 ώρες, υπό την παρουσία γκρελίνης, οδήγησε σε σημαντική μείωση του ποσοστού παραγωγής βλαστοκύστεων συγκριτικά τόσο με την ομάδα ωαρίων που ωρίμασε για 18 ώρες παρουσία γκρελίνης, όσο και με τις δύο ομάδες των μαρτύρων. Στα ωάρια, στα οποία είχε γίνει προσθήκη γκρελίνης, το ποσοστό φωσφορυλίωσης της Akt1 ήταν σημαντικά χαμηλότερο την 10η ώρα της in vitro ωρίμανσης, ενώ το αντίθετο παρατηρήθηκε στο ποσοστό φωσφορυλίωσης της ERK1/2 την 6η και τη 10η ώρα της IVM σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ποσοστά των μαρτύρων. Στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου, το ποσοστό φωσφορυλίωσης της Akt1 ήταν σημαντικά υψηλότερο την 18η και την 24η ώρα της in vitro ωρίμανσης, στην ομάδα που είχε γίνει προσθήκη γκρελίνης σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ποσοστά της ομάδας των μαρτύρων. Το συμπέρασμα της συγκεκριμένης μελέτης, είναι ότι η γκρελίνη δρα με διαφορετικό χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο στα ωάρια και στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου των βοοειδών, τροποποιώντας τη φωσφορυλίωση των Akt1 και ERK1/2, γεγονός που επιταχύνει τη διαδικασία της ωρίμανσης των ωαρίων.Τα κυριότερα ευρήματα της παρούσας διατριβής συνοψίζονται ως ακολούθως: 1. Η γκρελίνη επιδρά στην υπόφυση, αμβλύνοντας την απόκρισή της στο ερέθισμα της GnRH και διαταράσσοντας τη διαδικασία ωχρινοποίησης των κυττάρων του ωοθυλακίου ή/και της στεροειδογενετικής ικανότητας των ωχρινικών κυττάρων. 2. Σε σύγκριση με τα μη έγκυα, τα έγκυα βοοειδή αντιδρούν εντονότερα στο στρες της στέρησης τροφής απελευθερώνοντας ταχύτερα μεγαλύτερες συγκεντρώσεις γκρελίνης. 3. Η στέρηση της τροφής προκαλεί αύξηση των συγκεντρώσεων της γκρελίνης, οι οποίες αμβλύνουν την επαγόμενη έκκριση των γοναδοτρόπων ορμονών, ακόμα και μετά την αποκατάσταση της συγκέντρωσης της γκρελίνης στα βασικά επίπεδα. 4. Κατά τη διάρκεια της κυοφορίας οι συγκεντρώσεις της γκρελίνης διακυμαίνονται με καθορισμένο πρότυπο στις αγελάδες, αλλά όχι στις μοσχίδες. 5. Η περιοιστρική περίοδος των αγελάδων, αλλά όχι των μοσχίδων, χαρακτηρίζεται από υπεργκρελιναιμία. 6. Η γκρελίνη επιδρά διαφορετικά στα ωάρια και στα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου, επιφέροντας επιτάχυνση στη διαδικασία ωρίμανσης των ωαρίων, μέσω της τροποποίησης της φωσφορυλίωσης των Akt1 και ERK1/2.