Αξιοποίηση υγρών απορροών μονάδων παραγωγής βιοαερίου μέσω καλλιέργειας φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών με σκοπό την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας
Authors: Μαστροπέτρος Σάββας-Γιάννης 
Published: December 2023

Η επεξεργασία των λυμάτων της σύγχρονης παραγωγικής διαδικασίας σε τομείς της οικονομίας, όπως η γεωργία, η κτηνοτροφία και η βιομηχανία τροφίμων, αποτελεί παγκόσμια πρόκληση. Οι μεγάλοι όγκοι αποβλήτων, που προκύπτουν λόγω των αυξημένων αναγκών της αγοράς, απαιτούν νέες ιδέες και βιώσιμες τεχνολογίες για την άμβλυνση των περιβαλλοντικών προβλημάτων. Οι πρόσφατες εξελίξεις στη βιοτεχνολογία προσφέρουν τη δυνατότητα να συνδυαστούν οι διεργασίες επεξεργασίας αστικών και βιομηχανικών απορροών με την καλλιέργεια φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών για την ανάκτηση θρεπτικών και την ταυτόχρονη παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, ελαχιστοποιώντας το κόστος της διεργασίας. Η βιομάζα μικροφυκών και κυανοβακτηρίων είναι πλούσια σε πρωτεΐνες, σάκχαρα και λιπίδια, ενώ ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού και τις συνθήκες καλλιέργειας παράγονται πολύτιμες χρωστικές ουσίες, αντιοξειδωτικά φαινολικά συστατικά και άλλα βιοπολυμερή, όπως πολυεστέρες, που εν δυνάμει αντικαθιστούν τα συμβατικά πολυμερή πετροχημικής προέλευσης. Η αναερόβια χώνευση είναι μια ευρέως διαδεδομένη μέθοδος επεξεργασίας αποβλήτων για την παραγωγή βιοαερίου, που έχει χαρακτηριστεί ως φιλική προς το περιβάλλον και μπορεί να εφαρμοστεί σε μεγάλη κλίμακα είτε τοπικά σε μικρότερες εγκαταστάσεις. Παρά την ικανοποιητική κατανάλωση θρεπτικών από το εκάστοτε υπόστρωμα, κατά την αναερόβια χώνευση παράγονται σημαντικές ποσότητες χωνευμένων υπολειμμάτων, που χρήζουν περαιτέρω επεξεργασίας πριν τη διάθεση τους σε φυσικά ενδιαιτήματα. Εκτός από τις φυσικοχημικές μεθόδους επεξεργασίας των αναερόβιων απορροών, αξιολογούνται και βιολογικές διεργασίες με στόχο την ανάκτηση θρεπτικών προς παραγωγή βιομαζας και τη βιοσταθεροποίηση αυτού του τύπου αποβλήτων. Η απόδοση και η βιωσιμότητα των βιολογικών συστημάτων διαχείρισης απορροών αναερόβιας χώνευσης εξαρτάται τόσο από τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του αποβλήτου όσο και από τις δυνατότητες του εκμεταλλευόμενου μικροοργανισμού. Η παρούσα διατριβή αποσκοπούσε στην αξιολόγηση ειδών μικροφυκών και κυανοβακτηρίων, για τα οποία η έως τώρα βιβλιογραφία δεν παρείχε επαρκή δεδομένα σχετικά με τη συμπεριφορά τους σε υποστρώματα που περιείχαν απορροές αναερόβιας χώνευσης. Ιδιαίτερη σημασία δόθηκε σε είδη, απομονωμένα από το φυσικό τους περιβάλλον και στη σύγκρισή τους με ευρέως γνωστούς και χρησιμοποιημένους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς στην επεξεργασία αποβλήτων ή/και την παραγωγή μεταβολικών προϊόντων. Τα τοπικά απομονωμένα μικροφύκη και κυανοβακτήρια παρουσιάζουν εύκολη προσαρμογή σε μεγάλο εύρος περιβαλλοντικών συνθηκών και οι ανθεκτικές καλλιέργειές τους έχουν χαρακτηριστεί ως πολλά υποσχόμενες για βιομηχανική εφαρμογή. Η μελέτη των τοπικών ειδών συμπληρώνει συνεχώς με στοιχεία την ήδη υπάρχουσα γνώση γύρω από τους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς στα πλαίσια της προσπάθειας για την εύρεση κατάλληλων στρατηγικών αξιοποίησης των υγρών απορροών ως μέσο ανάπτυξης. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν τα είδη Chlorella vulgaris 211-11b (SAG, University of Göttingen), Chlorella sp. (απομονωμένο από το φυσικό του περιβάλλον στην Αλγερία), Phormidium sp. (απομονωμένο από λιμνοθάλασσα της Δ. Ελλάδας) και Chlorogloeopsis fritschii 1411-1a (SAG, University of Göttingen) για την επεξεργασία δύο τύπων αναερόβιων απορροών σε φωτοβιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου. Οι καλλιέργειες των δύο ειδών Chlorella πραγματοποιήθηκαν με σκοπό τη μελέτη αφομοίωσης ρύπων, οργανικού άνθρακα, αζώτου και φωσφόρου, από υγρό χωνευμένο υπόλειμμα διαφορετικών αρχικών περιεκτικοτήτων σε αμμωνιακό άζωτο. Οι διαφορετικές συγκεντρώσεις αμμωνιακού αζώτου προέκυψαν ύστερα από τη φυσικοχημική αφαίρεση της αέριας αμμωνίας και φάνηκε να επηρεάζουν την παραγωγή βιομάζας και τη σύστασή της σε λιπαρά οξέα. Η καλλιέργεια του Phormidium sp. σε συνθετικό μέσο και σε υπόστρωμα αραιωμένης απορροής είχε ως στόχο τη μελέτη της επίδρασης του παρεχόμενου φωτός και της συγκέντρωσης του οργανικού άνθρακα στην κατανάλωση των θρεπτικών με την παράλληλη παραγωγή της χρωστικής φυκοκυανίνης. Τέλος, το κυανοβακτήριο C. fritschii αξιολογήθηκε σχετικά με την ενδοκυτταρική συσσώρευση πολύ-υδροξυβουτυρικών εστέρων μέσω της κατανάλωσης οξικού οξέος σε αποστειρωμένο τεχνητό μέσο και κατά τη λειτουργία των φωτοβιοαντιδραστήρων με τροφοδοσία αναερόβια χωνευμένου υγρού από την επεξεργασία αγροτοκτηνοτροφικών αποβλήτων. Τα ευκαρυωτικά μικροφύκη έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση για την αποτελεσματική επεξεργασία του υγρού υπολείμματος της αναερόβιας χώνευσης. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, μια ευρέως εφαρμοσμένη διαδικασία με βάση τα μικροφύκη εξακολουθεί να απουσιάζει, λόγω αρκετών περιορισμών από τις υψηλές συγκεντρώσεις αμμωνίας και τη θολερότητα του υγρού αποβλήτου, που εμποδίζουν την παραγωγή βιομάζας. Στο πλαίσιο αυτό, ο σκοπός της πρώτης ενότητας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η απόδοση δύο στελεχών Chlorella, του στελέχους SAG 211-11b και ενός απομονωμένου από φυσικό περιβάλλον στην Αλγερία. Τα δύο μικροφύκη καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά επίπεδα αζώτου μετά τη φυσικοχημική απομάκρυνση αμμωνίας. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κυλινδρικούς φωτοβιοαντιδραστήρες υπό ελεγχόμενο pH (7.8 ± 0.2) και θερμοκρασία (25 ± 2 °C). Οι καλλιέργειες παρακολουθήθηκαν ως προς την παραγωγή βιομάζας και την αφαίρεση θρεπτικών από την αναερόβια απορροή. Στην αρχή της στάσιμης φάσης της καλλιέργειας (12η ημέρα) και μετά την ωρίμανση των κυττάρων (24η ημέρα), αναλύθηκε η παραγόμενη βιομάζα στα βιοχημικά συστατικά της. Το Chlorella sp. έδειξε καλύτερη προσαρμογή και ανάπτυξη στην αναερόβια απορροή σε σχέση με το C. vulgaris 211-11b, με αποτέλεσμα 1.43 mg βιομάζας L−1 έναντι 1.02 mg L−1 υπό 25 mg N-NH4+ L−1. Η κατανάλωση οργανικού άνθρακα και θρεπτικών συστατικών διέφερε μεταξύ των δύο στελεχών και φάνηκε να επηρεάστηκε από τις διαφορετικές αρχικές συνθήκες. Όσον αφορά στην ποιότητα της βιομάζας, η υψηλή αρχική συγκέντρωση N-NH4+οδήγησε σε υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες, ενώ τα χαμηλά επίπεδα αζώτου ευνόησαν τη συσσώρευση λιπαρών οξέων και ανέστειλαν την παραγωγή χρωστικών ουσιών. Συγκεκριμένα, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε στο 45 % του ξηρού βάρους σε όλα τα πειραματικά σενάρια με επαρκές άζωτο, ενώ τα λιπαρά οξέα πλησίασαν το 20 % στην περίπτωση της ανάπτυξης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση N-NH4+. Η σύγκριση των δύο ειδών και η μελέτη του συνδυασμού της φυσικοχημικής απογύμνωσης αμμωνίας με τη βιολογική επεξεργασία των απορροών αναερόβιας χώνευσης εμπλούτισαν την έως τώρα σχετική βιβλιογραφία. Από αυτήν την ερευνητική εργασία αναδείχθηκε ένα τοπικά απομονωμένο είδος του γένους Chorella, του οποίου οι εφαρμογές μπορούν να αποδειχθούν ακόμη πιο εύρωστες και κερδοφόρες. Καθώς η βιοτεχνολογική παραγωγή υψηλής προστιθέμενης αξίας προϊόντων συνεχίζει να προκαλεί το ερευνητικό ενδιαφέρον, ακόμα περισσότεροι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί αξιοποιούνται για τη σύνθεση αμινοξέων, λιπαρών οξέων, χρωστικών και άλλων βιοπολυμερών. Στη συνέχεια της ερευνητικής μελέτης, αξιολογήθηκε το απομονωμένο από λιμνοθάλασσα της Δ. Ελλάδας κυανοβακτήριο Phormidium sp. για την παραγωγή της υδατοδιαλυτής χρωστικής φυκοκυανίνης. Η συσσώρευση της φυκοκυανίνης ευνοήθηκε από υποστρώματα με χαμηλό οργανικό φορτίο. Αποσκοπώντας στην ελαχιστοποίηση του κόστους του υποστρώματος, χρησιμοποιήθηκε το υγρό κλάσμα απορροής αναερόβια χωνευμένων αγροτοκτηνοτροφικών αποβλήτων. Η χρήση της αραιωμένης αναερόβιας απορροής όχι μόνο επέτρεψε στο Phormidium sp. να αναπτυχθεί, αλλά ενίσχυσε τη σύνθεση της φυκοκυανίνης. Οι φωτοβιοαντιδραστήρες με τη χαμηλότερη παροχή φωτός, που έδειξαν αυξημένη συσσώρευση χρωστικής (έως 2.5 % w/w) οδήγησαν σε συγκέντρωση βιομάζας 0.7 g L-1 ανεξαρτήτως του τύπου του υποστρώματος. Όταν το Phormidium sp. εμβολιάστηκε σε καθαρό συνθετικό μέσο με 1 g γλυκόζης L-1, η συγκέντρωση φυκοκυανίνης πλησίασε τα 10 mg L-1, ενώ μετρήθηκε κατά 1,75 φορές υψηλότερη στην καλλιέργεια που περιείχε αναερόβια χωνευμένο υγρό, λόγω μεγαλύτερης παραγωγής βιομάζας. Τέλος, η παροχή υψηλότερης έντασης φωτός στις καλλιέργειες βοήθησε στην αύξηση της συσσώρευσης βιομάζας και την παραγωγή φυκοκυανίνης, χωρίς ωστόσο να βελτιώσει την περιεκτικότητα των κυττάρων σε προϊόν. Η μελέτη του τοπικά απομονωμένου κυανοβακτηρίου απέδειξε τη δυνατότητα βιοαποκατάστασης του αναερόβια χωνευμένου αποβλήτου με την ταυτόχρονη παραγωγή χρωστικών ουσιών υψηλής προστιθέμενης αξίας. Τα οπτικά χαρακτηριστικά σκουρόχρωμων υποστρωμάτων μπορούν να ενισχύσουν την παραγωγή φυκοκυανίνης, βελτιώνοντας την ποιότητα του αξιοποιήσιμου φωτός από τους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς. Δεδομένης της περιβαλλοντικής επιβάρυνσης από τα συμβατικά πετροχημικά πλαστικά υλικά, η τρίτη ενότητα αποτελεσμάτων ασχολήθηκε με τη συσσώρευση πολύ-υδροξυβουτυρικών εστέρων (PHB) στους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς. Εξετάστηκαν 10 είδη μικροοργανισμών σε μιξότροφες καλλιέργειες σε συνθετικό μέσο παρουσία οξικού οξέος, ωστόσο μόνο 4 από αυτά κατάφεραν να παρουσιάσουν περιεχόμενο στο προϊόν ενδιαφέροντος. Ανάμεσα σε 9 ευκαρυωτικά μικροφύκη ξεχώρισε το κυανοβακτήριο C. fritschii 1411-1a, το οποίο σε ανεπιθύμητες για την ανάπτυξή του συνθήκες συσσώρευσε PHB έως και 4 % του ξηρού βάρους της βιομάζας. Μετά τη διαδικασία αξιολόγησης και επιλογής, το C. fritschii καλλιεργήθηκε σε φωτοβιοαντιδραστήρες με συνθετικό υπόστρωμα και μέσο που αποτελούνταν κατά 10 % από αναερόβια απορροή. Αξιολογήθηκε σχετικά με την παραγωγή βιομάζας και βιοπολυμερούς παρουσία και απουσία οξικού οξέος. Το συγκεκριμένο κυανοβακτήριο ήταν ικανό να πολλαπλασιάζεται σε τεχνητό υπόστρωμα και ταυτόχρονα να συνθέτει PHB παρουσία πηγής οργανικού άνθρακα, φτάνοντας η βιομάζα του να αποτελείται από PHB κατά 8.3 %. Εκμεταλλευόμενο μόνο την αναερόβια απορροή το C. fritschii συσσώρευσε PHB, που αντιστοιχήθηκε σε 5.1 % της ξηρής κυτταρικής μάζας. Επιπλέον, η μείωση της θερμοκρασίας των καλλιεργειών, από την κατάλληλη για ανάπτυξη (35 οC) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (25 oC), οδήγησε στη σύνθεση ενδοκυτταρικού PHB (7.2 % w/w), αναστέλλοντας την παραγωγή βιομάζας. Ο εκμηδενισμός του κόστους του υποστρώματος σε συνδυασμό με τη βελτιστοποίηση της σύνθεσης PHB από το συγκεκριμένο κυανοβακτήριο θα μπορούσαν να συνεισφέρουν στη βιώσιμη παραγωγή βιοπλαστικών. Για την κατανόηση των αποτελεσμάτων από τις παραπάνω ενότητες πειραμάτων και τον πλήρη σχολιασμό τους πραγματοποιήθηκε η μαθηματική μοντελοποίηση της συμπεριφοράς των φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών. Έγινε προσπάθεια να περιγραφούν οι αναπτύξεις των προς μελέτη ειδών σε συνδυασμό με την παραγωγή των εκάστοτε επιθυμητών προϊόντων. Πιο συγκεκριμένα, για τα είδη του γένους Chlorella προέκυψαν εξισώσεις από μοντέλα μη γραμμικής παλινδρόμησης, οι οποίες συσχέτισαν την αρχική ποιότητα του υποστρώματος με την τελική παραγωγή βιομάζας και τη συσσώρευση λιπαρών οξέων. Όσον αφορά στα κυανοβακτήρια Phormidium sp. και C. fritschii τα μαθηματικά μοντέλα, που αναπτύχθηκαν, βοήθησαν στην εξήγηση των μεταβολικών οδών προς την παραγωγή φυκοκυανίνης και PHB αντίστοιχα. Συνοψίζοντας, οι καλλιέργειες φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών αποτελούν σημαντικό παράγοντα στην επεξεργασία απορροών και την ανάκτηση θρεπτικών για την παραγωγή βιομάζας και μεταβολικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η παραγωγή βιοκαυσίμων, φαρμακευτικών ενώσεων και άλλων βιοπολυμερών προσφέρει νέες προοπτικές για τη βιοσταθεροποίηση υγρών αποβλήτων με την ταυτόχρονη βιολογική παραγωγή πόρων. Η μελέτη εφαρμογών φωτοσυνθετικών ειδών μπορεί να συμβάλει στη μείωση του ανθρώπινου αποτυπώματος άνθρακα στο περιβάλλον και στην προώθηση μίας βιώσιμης και φιλικής προς το περιβάλλον οικονομίας.