Συμμετοχή του αποπτωτικού μονοπατιού TRAIL στην καρκινογένεση
Authors: Τσικαλάκης Σπυρίδων 
Published: September 2021

Εισαγωγή: Το αποπτωτικό μονοπάτι TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand, pathway) σχετίζεται με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) και συμμετέχει σε φυσιολογικές διαδικασίες του κυττάρου όπως την ανοσοεπιτήρηση του καρκίνου και των μεταστάσεων. Λόγω της ιδιότητας του TRAIL να προκαλεί επιλεκτικά το θάνατο σε καρκινικά κύτταρα, το μονοπάτι αυτό αποτελεί πολλά υποσχόμενο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου. Έχει όμως παρατηρηθεί αντίσταση στη θεραπεία μέσω TRAIL εξαιτίας ποικιλίας παραγόντων, κάποιες από τις οποίες είναι η διαφορετική έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται με το εξωγενές (DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2 και c-FLIP) αλλά και με το ενδογενές αποπτωτικό μονοπάτι (Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1 και XIAP), επιγενετικές αλλοιώσεις, καθώς και μεταλλαγές γνωστών γονιδίων που εμπλέκονται με την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά την καρκινογένεση όπως τα - στοχευόμενα στην κλινική θεραπευτική πρακτική -γονίδια KRAS, BRAF και NRAS του σηματοδοτικού μονοπατιού των MAP κινασών (MAPK/ERK). Επομένως είναι απαραίτητος ο προσδιορισμός βιοδεικτών, βάσει των οποίων θα επιλέγονται οι ασθενείς που μπορεί να έχουν πιθανό όφελος από την χορήγηση της θεραπείας.Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 106 καρκινώματα παχέος εντέρου, εκ των οποίων τα 76 ήταν φρέσκα συντηρημένα στους -20οC και τα 30 μονιμοποιημένα σε RCL2 και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης. Στην συνέχεια αναλύθηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA των γονιδίων DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2, Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1, c-FLIP και XIAP με εφαρμογή ημιποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου, και ανάλυση των αποτελεσμάτων με την μέθοδο ΔΔCt. Σε 44 από αυτά τα δείγματα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της μεθυλίωσης του υποκινητή των γονιδίων DcR1 και DcR2, με σκοπό την διερεύνηση της ως πιθανού μηχανισμού αποσιώπησης της έκφρασης στα δείγματα με μειωμένα επίπεδα σχετικής έκφρασης mRNA. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ενδεικτικά σε 10 δείγματα, η ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου DR4/5, με σκοπό την ενδεικτική επιβεβαίωση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA σε επίπεδο πρωτεΐνης. Σε 53 δείγματα παχέος εντέρου, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των μεταλλαγών των γονιδίων KRAS, BRAF και NRAS του σηματοδοτικού μονοπατιού MAPK/ERK, αρχικά με την μέθοδο της HRM-PCR και με την μέθοδο της πυροαλληλούχισης για τον τελικό προσδιορισμό της αλληλουχίας τους.Αποτελέσματα: Ανιχνεύθηκε για τα γονίδια DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2, Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1 και XIAP: α) υπερέκφραση σε ποσοστό αντίστοιχα για κάθε γονίδιο σε ποσοστά 12% (12 από τα 101), 13% (14 από τα 105), 10% (8 από τα 77), 15% (16 από τα 105), και 25% (24 από τα 97), 33% (28 από τα 92), 50% (38 από τα 76), και 45% (42 από τα 96), 66% (65 από τα 96) και 29% (28 από τα 97) αντίστοιχα β) υποέκφραση σε ποσοστά 60% (61 από τα 101), 65% (68 από τα 105), 77% (59 από τα 77), 64% (67 από τα 105), 37% (36 από τα 97), 33% (32 από τα 92), 21% (16 από τα 76), 26% (24 από τα 96), 20% (20 από τα 96) και 20%(20 από τα 97) αντίστοιχα γ) σταθερή έκφραση σε ποσοστά 28%(28 από 101), 22% (23 από τα 105), 13% (10 από 77), 21% (22 από 105), 38% (23 από τα 105), 34% (32 από 92), 29% (22 από 76), 29% (30 από τα 96), 14% (11 από 96) και 20% (20 από τα 97) αντίστοιχα. Παρατηρήθηκαν θετικές γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων σε στατιστικά σημαντικό βαθμό, αρκετές από τις οποίες ισχυρές (Spearmann’s rho συντελεστής συσχέτισης Rs>0,6 και p<0,001). Ακόμα, 55% των δειγμάτων που αναλύθηκαν (24 από τα 44) παρουσίασε μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου DcR1 και 16% των δειγμάτων (7 από τα 44 δείγματα) μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου DcR1. Επίσης στο 57% των δειγμάτων που αναλύθηκαν, ανιχνεύτηκαν μεταλλαγές των γονιδίων του μονοπατιού MAPK/ERK εκ των οποίων: το 45% ανιχνεύτηκαν στο γονίδιο KRAS, το 6% στο γονίδιο BRAF και τo 6% στο γονίδιο NRAS. Επίσης. εντοπίστηκαν συσχετίσεις των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα μεταξύ: της έκφρασης των γονιδίων DR4 και DR5 και του σταδίου κατά ΤΝΜ (p=0,036 και p=0,048 αντίστοιχα), της έκφρασης του γονιδίου DcR2 και του βλεννώδους ιστολογικού τύπου (p=0,015), της έκφρασης του γονιδίου Bcl2 και του βαθμού κακοήθειας G (p=0,049), της έκφρασης των γονιδίων Mcl-1 και XIAP και του μεγέθους πρωτοπαθούς εστίας Τ (p=0,059 και p=0,052 αντίστοιχα), της έκφρασης των γονιδίων DR5 και c-FLIP του φύλου (p=0,036 και p=0,078 αντίστοιχα) και μεταξύ των μεταλλαγών του γονιδίου KRAS και του βαθμού εξάπλωσης στους λεμφαδένες (p=0,026), του σταδίου TNM (p=0,029) και του βαθμού κακοήθειας G (p=0,015). Τέλος παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ: των μεταλλαγών των γονιδίων KRAS και των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων TRAIL και XIAP (p=0,041 και p=0,085 αντίστοιχα) και μεταξύ των μεταλλαγών του γονιδίου NRAS και των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου XIAP (p=0,026).Συμπεράσματα: Για την επιλογή των κατάλληλων ασθενών η οποίοι θα έχουν όφελος από τη χορήγηση θεραπειών που στοχεύουν στο αποπτωτικό σηματοδοτικό μονοπάτι TRAIL είναι σημαντική η ανεύρεση προβλεπτικών βιοδεικτών. Τα διαφορετικά μοτίβα έκφρασης των αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών γονιδίων του μονοπατιού TRAIL που αναδείχτηκαν στη μελέτη αυτή μπορούν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν ως προβλεπτικοί βιοδείκτες στην κλινική πράξη για την αποτελεσματική θεραπευτική στόχευση του μονοπατιού TRAIL σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Για το λόγο αυτό απαιτείται η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων σε μεγαλύτερες ομάδες ασθενών, καθώς η περεταίρω διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων με άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια.