Συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση σε πειραματικό μοντέλο πολυτραυματία
Authors: Πανούσης Κωνσταντίνος 
Published: July 2014

Εισαγωγή. Οι σοβαρές τραυματικές κακώσεις αποτελούν μια από τις κύριες αιτίες του Συνδρόμου Συστηματικής Φλεγμονώδους Αντίδρασης (SIRS) με πιθανή κατάληξη την κλινική επιδείνωση και το θάνατο του ασθενούς. Ο ρόλος του ανοσοποιητικού συστήματος είναι κεντρικός στην παθογένεση του SIRS. Φλεγμονώδεις κυτταροκίνες εκκρίνονται από ποικίλα κύτταρα του ανοσοποιητικού και η διαταραχή της ρύθμισης τους μετά από βαρύ τραύμα μπορεί να καταλήξει σε SIRS και πολυοργανική ανεπάρκεια. O παράγοντας νεκρώσεως των όγκων-α (TNF-α), κατέχει έναν κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσοαντίδραση μετά από βαρύ τραύμα. Εμφανίζεται πρώιμα στον ορό μετά από τον τραυματισμό, επάγει την παραγωγή άλλων φλεγμονωδών κυτταροκινών, προάγει την βλάβη του ενδοθηλίου και επάγει την απόπτωση των λεμφοκυττάρων. Κατά συνέπεια αποτελεί σημαντικό στόχο προσπαθειών τροποποίησης της ανοσοαντίδρασης. Οι μέχρι τώρα κλινικά εφαρμοσμένες στρατηγικές περιλαμβάνουν τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν τον TNFα και τους διαλυτούς υποδοχείς του. Οι παράγοντες όμως αυτοί, σε κλινικές μελέτες με σηπτικούς ασθενείς, έχουν αποδειχτεί αναποτελεσματικοί όσον αφορά στη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών. Αυτό πιθανά υποδεικνύει ότι απαιτείται μια διαφορετική προσέγγιση στις στρατηγικές τροποποίησης της υπερβολικής έκκρισης TNF-α. Η θαλιδομίδη (α-154N-φθαλιμιδογλουταριμίδη) χρησιμοποιήθηκε αρχικά ως ηρεμιστικό και αντιεμετικό φάρμακο κατά την εγκυμοσύνη, αλλά αποσύρθηκε από την αγορά λόγω της τερατογονικής δράσης της. Η θαλιδομίδη δρα ανοσοτροποποιητικά αναστέλλοντας εκλεκτικά τη σύνθεση του TNF-α, μέσω της μείωσης του χρόνου ημιζωής του mRNA του στα ανθρώπινα μονοκύτταρα, ενώ με άλλους μηχανισμούς αναστέλλει την αγγειογένεση. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων της χρησιμοποιείται σήμερα στη θεραπεία διαφόρων νοσημάτων όπως το λεπρικό οζώδες ερύθημα, η νόσος του Crohn, το πολλαπλό μυέλωμα και η αφθώδης στοματίτιδα σε ασθενείς με λοιμώξεις HIV. Η από του στόματος χορήγηση θαλιδομίδης πριν την πρόκληση σήψης σε πειραματικό μοντέλο σε αρουραίους είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση της επιβίωσης των ζώων και την μείωση των επιπέδων TNF-α. Εν τούτοις, η από του στόματος χορήγηση της ουσίας σε ζώα που βρίσκονται σε καταπληξία δεν είναι δυνατή. Έτσι προχωρήσαμε στην παρασκευή ενός διαλύματος θαλιδομίδης κατάλληλου για ενδοφλέβια χορήγηση. Στη συνέχεια το χορηγήσαμε σε κονίκλους σε ένα πειραματικό μοντέλο θανατηφόρου τραύματος με σκοπό τη μελέτη της δράσης της θαλιδομίδης σε αυτό.Υλικά και μέθοδος. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 30 αρσενικοί λευκοί κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας με μέσο (±SD) βάρος 3,37± 0,35 kg. Η θαλιδομίδη είναι δυσδιάλυτη στο νερό και σε φυσιολογικό pH υπόκειται σε ταχεία αυθόρμητη υδρόλυση. Έτσι παρασκευάστηκαν διαλύματα θαλιδομίδης σε 5% Dextrose Water (DW) με συγκεντρώσεις 0,2 mg/mL, 0,5 mg/mL και 1 mg/mL μετά από σύνδεση της θαλιδομίδης με (2-υδροξυπροπυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη.155Πραγματοποιήθηκε μελέτη της φαρμακοκινητικής των παρασκευασθέντων διαλυμάτων θαλιδομίδης με ενδοφλέβια χορήγησή τους σε 6 ζώα. Η συγκέντρωση της θαλιδομίδης στα διαλύματα και στα δείγματα ορού των ζώων προσδιορίστηκε με τη χρήση μιας μεθόδου HPLC. Όλα τα διαλύματα ήταν σταθερά. Τα ζώα στα οποία χορηγήθηκε το διάλυμα θαλιδομίδης με συγκέντρωση 1 mg/mL είχαν μέση (±SD) συγκέντρωση θαλιδομίδης στον ορό 7,30±1,50 μg/mL κατά το τέλος της έγχυσης και 5,82±1,45 μg/mL, 60 min μετά το τέλος της. Με βάση αυτά τα δεδομένα το διάλυμα με συγκέντρωση 1 mg/mL θεωρήθηκε κατάλληλο για χρήση στην πειραματική μελέτη. Μετά από την πρόκληση ανοικτού κατάγματος του δεξιού μηριαίου 24 κόνικλοι χωρίστηκαν στις ομάδες A (ομάδα ελέγχου) και B (θαλιδομίδη). Τα ζώα της ομάδας A (n=14) έλαβαν, με ενδοφλέβια έγχυση διαρκείας 15 min, 30 ml 5% DW με έναρξη 30 min μετά το κάταγμα. Τα ζώα της ομάδας Β (n=10) έλαβαν, με ενδοφλέβια έγχυση διαρκείας 15 min, 30 ml του διαλύματος θαλιδομίδης 1mg/mL σε 5% DW με έναρξη 30 min μετά το κάταγμα. Τα ζωτικά σημεία των ζώων καταγράφονταν για 4 ώρες, ενώ επίσης καταγράφηκε η επιβίωσή τους και μελετήθηκε η βακτηριακή ανάπτυξη στα όργανα των νεκρών ζώων. Αιμοληψίες πραγματοποιήθηκαν κατά την ώρα 0 και στις 2, 4, 24 και 48h μετά το κάταγμα. Μετρήθηκαν τα επίπεδα TNF-α, απομονώθηκαν τα μονοκύτταρα και λεμφοκύτταρα (PBMC) και πραγματοποιήθηκαν αιμοκαλλιέργειες των δειγμάτων. Ο TNF-α μετρήθηκε με μια μέθοδο βιολογικού προσδιορισμού με χρήση της κυτταρικής σειράς ινοσαρκώματος L929 και η απόπτωση των PBMC με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση τους με ανεξίνη-V και ιωδιούχο προπίδιο.156Τα κύτταρα που βρίσκονταν θετικά για ανεξίνη-V και αρνητικά για PI κατά την κυτταρομετρία ροής θεωρούνταν αποπτωτικά. Πραγματοποιήθηκε επίσης ένα ex-vivo πείραμα, όπου επωάστηκαν PBMC από υγιή ζώα και εθελοντές με ορούς των ομάδων A και B που συλλέχθηκαν 2h και 24h μετά το κάταγμα και ακολούθησε η μέτρηση της απόπτωσής τους όπως περιγράφηκε πιο πάνω.Αποτελέσματα. Η επιβίωση των ζώων στην ομάδα B ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σχέση με αυτών της ομάδας A (log rank = 5.543, p = 0.019). Η διασαφήνιση του πιθανού μηχανισμού δράσης της θαλιδομίδης εστιάστηκε στην επίδραση της α) στις αιμοδυναμικές παραμέτρους των ζώων, β) στο βακτηριακό φορτίο των οργάνων των ζώων , γ) στα επίπεδα του TNF-α στον ορό των ζώων και δ) στην απόπτωση των λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων των ζώων. Δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των ομάδων Α και B όσον αφορά στην συστολική, διαστολική και μέση αρτηριακή πίεση και στην καρδιακή συχνότητα. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η θαλιδομίδη δεν επέδρασε στις αιμοδυναμικές παραμέτρους των ζώων. Όλες οι αιμοκαλλιέργειες ήταν αρνητικές και οι ποσοτικές καλλιέργειες των ιστών δεν διέφεραν μεταξύ των δυο ομάδων. Οι απομονωθέντες μικροοργανισμοί ήταν στελέχη εντεροβακτηριοειδών. Οι συγκεντρώσεις του TNF-α στον ορό δεν διάφεραν μεταξύ των δύο ομάδων τόσο κατά την ώρα 0 όσο και 2h και 4h μετά το κάταγμα. Κατά συνέπεια σχηματίστηκε η υπόθεση ότι η θαλιδομίδη δρούσε μέσω ενός ανοσοτροποποιητικού μηχανισμού που δεν περιελάμβανε την αναστολή του TNF-α. Για να εξετάσουμε την υπόθεση αυτή συγκρίθηκε ο ρυθμός απόπτωσης των PBMC μεταξύ των δύο ομάδων. Έγινε εμφανές ότι η απόπτωση των PBMC ήταν αυξημένη στην ομάδα157ελέγχου σε σχάση με την ομάδα της θαλιδομίδης, η διαφορά αυτή δε ήταν στατιστικά σημαντική στις 2h και 24h μετά την κάκωση. Η παρατήρηση μειωμένης απόπτωσης των PBMC στα ζώα που έλαβαν θαλιδομίδη, οδήγησε στο σχηματισμό της υπόθεσης της ύπαρξης ενός άγνωστου παράγοντα στον ορό, διαφορετικού από τον TNF-α. Σύμφωνα με την υπόθεση, ο άγνωστος αυτός παράγοντας είναι υπεύθυνος για την τροποποίηση της απόπτωσης. Για να επιβεβαιώσουμε την υπόθεση αυτή οροί από τις ομάδες ελέγχου και θαλιδομίδης επωάστηκαν με PBMC υγιών κονίκλων. Εφόσον οι διαφορές στην απόπτωση των PBMC εντοπίστηκαν κυρίως στις 2h και 24h, θεωρήθηκε ότι έπρεπε να χρησιμοποιηθούν οροί που συλλέχτηκαν σ’ αυτές τις χρονικές στιγμές. Ο ορός των ζώων που έλαβαν θαλιδομίδη και που συλλέχθηκε 24h μετά την κάκωση, δηλ. πολύ αργότερα από την επίτευξη των κορυφαίων συγκεντρώσεων θαλιδομίδης, προκάλεσε επαγωγή της απόπτωσης των λεμφοκυττάρων. Εξετάστηκε επίσης η πιθανότητα ο άγνωστος αυτός παράγοντας να έχει δραστικότητα μεταξύ-των-ειδών. Ανθρώπεια λεμφοκύτταρα επωάστηκαν με ορούς που συλλέχτηκαν από ζώα των δυο πειραματικών ομάδων 24 ώρες μετά την κάκωση και στη συνέχεια προσδιορίστηκε το ποσοστό απόπτωσης τους. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην απόπτωση μεταξύ των δύο ομάδων.Συμπέρασμα. Σε πειραματικό μοντέλο θανατηφτραύματος του μυοσκελετικού σε κονίκλους η ενδοφλέβια χορήγηση θαλιδομίδης:1. Βελτιώνει την επιβίωση των πειραματοζώων.2. Δεν επηρεάζει τα επίπεδα TNF-α στον ορό των ζώων1583. Δρα ανοσοτροποποιητικά μειώνοντας την απόπτωση των μονοκυττάρων και λεμφοκυττάρων του αίματος των ζώων, μέσω πιθανής αναστολής ενός άγνωστου παράγοντα στον ορό.Με βάση τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα πιστεύουμε ότι χρειάζεται περαιτέρω μελέτη για τη διακρίβωση του ακριβούς μηχανισμού δράσης της θαλιδομίδης και τη δυνητική χρήση της στην αντιμετώπιση ασθενών με βαρύ τραύμα