Study on biofilm-related microorganisms implicated in table olive fermentation
Authors: Γρούντα Αθηνά 
Published: September 2021

Η ζύμωση είναι μία από τις παλαιότερες και πλέον διαδεδομένες μεθόδους για την επεξεργασία και συντήρηση των τροφίμων η οποία εμφανίστηκε από τις απαρχές της ανθρωπότητας. Οι επιτραπέζιες ελιές αποτελούν ένα από τα πιο σημαντικά τρόφιμα φυτικής προέλευσης στο Δυτικό κόσμο που καταναλώνονται ως ζυμωμένο προϊόν. Η διαδικασία της ζύμωσης έχει ως βασικό στόχο την μερική ή ολική απομάκρυνση της φαινολικής ουσίας ελευρωπαΐνη, η οποία ευθύνεται για την πικρή γεύση του νωπού ελαιοκάρπου καθιστώντας το μη εδώδιμο, και την ανάπτυξη ενός τελικού προϊόντος με βελτιωμένα οργανοληπτικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά που θα εξασφαλίζουν την μικροβιολογική σταθερότητα του προϊόντος ακόμη και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, αλλά και την αποδοχή του από τον καταναλωτή. Η ζύμωση της επιτραπέζιας ελιάς οφείλεται στην επιλεκτική δράση της αυτόχθονης μικροχλωρίδας του καρπού, με την τελική επικράτηση των οξυγαλακτικών βακτηρίων και των ζυμών. Μέχρι πρόσφατα, η μελέτη της δυναμικής της μικροχλωρίδας κατά τη ζύμωση πραγματοποιείτο αποκλειστικά στην άλμη, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η δυνατότητα των μικροοργανισμών να προσκοληθούν στην επιφάνεια του καρπού και να σχηματίσουν μεικτές βιοκοινότητες γνωστές ως βιοϋμένια. Τα τελευταία χρόνια όμως το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει μετατοπιστεί από την άλμη στον καρπό της ελιάς, δεδομένου ότι το προϊόν που τελικά καταναλώνεται είναι ο καρπός ενώ η μητρική άλμη απορρίπτεται. Ως εκ τούτου, το αντικείμενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της δημιουργίας βιοϋμενίων στην επιφάνεια του ελαιοκάρπου κατά τη ζύμωση με την εφαρμογή επιλεγμένων μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης, καθώς επίσης και ο προσδιορισμός της επιβίωσής τους κατά την επεξεργασία του καρπού. Στο πλαίσιο αυτό, επιλεγμένοι μικροοργανισμοί οι οποίοι είχαν προηγουμένως απομονωθεί από άλμες ζύμωσης ελιάς σε βιομηχανική κλίμακα και μελετηθεί για τις προβιοτικές και τεχνολογικές τους ιδιότητες (Argyri et al. 2013; Bonatsou et al. 2015), εξετάστηκαν αρχικά για την in situ ικανότητά τους να προσκολλώνται στον ελαιόκαρπο και να δημιουργούν βιοϋμένιο (Κεφάλαιο 2). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν θερμικά επεξεργασμένες (αποστειρωμένες) ελιές χωρίς την παρουσία αυτόχθονης μικροχλωρίδας και αποστειρωμένα διαλύματα άλμης με φυσικοχημικές συνθήκες (αλατότητα, pH, οξύτητα, ζυμώσιμα συστατικά) ανάλογες με αυτές που χρησιμοποιεί η μεταποιητική βιομηχανία της επιτραπέζιας ελιάς στη χώρα μας. Οι μικροοργανισμοί που επιλέχθηκαν ως καλλιέργειες εκκίνησης ήταν το οξυγαλακτικό βακτήριο Lactobacillus pentosus B281 και η ζύμη Pichia membranifaciens M3A. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αυξημένη συγκέντρωση άλατος στην άλμη (10%) επηρέασε σε μεγάλο βαθμό την ικανότητα αύξησης του οξυγαλακτικού βακτηρίου, σε αντίθεση με τη ζύμη της οποίας ο πληθυσμός παρουσίασε μικρές διακυμάνσεις. Στις περισσότερες συνθήκες που μελετήθηκαν οι δύο μικροοργανισμοί μπόρεσαν να αποικίσουν τον καρπό σε μεγάλους πληθυσμούς που κυμαίνονταν μεταξύ 6,0–7,0 log CFU/g και 5,0–5,5 log CFU/g για το βακτήριο L. pentosus B281 και τη ζύμη P. membranifaciens M3A, αντίστοιχα. Η παρουσία βιοϋμενίου επάνω στον καρπό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, με τους μικροοργανισμούς να συγκεντρώνονται κυρίως στα στομάτια του καρπού και σε σημεία όπου υπήρχε ασυνέχεια της επιδερμίδας. Από τα εν λόγω αποτελέσματα προέκυψε ότι οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν έχουν την προδιάθεση προσκόλλησης και σχηματισμού βιοϋμενίου στην επιφάνεια του ελαιόκαρπου. Παράλληλα, οδήγησαν στην ανάγκη περαιτέρω μελέτης για τη χρήση τους ως καλλιέργειες εκκίνησης σε συνθήκες ζύμωσης διαφορετικών εμπορικών τύπων επιτραπέζιας ελιάς (πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου, φυσικές μαύρες ελιές) όπου θα έπρεπε να ανταγωνιστούν την υπάρχουσα αυτόχθονη μικροχλωρίδα κατά την επεξεργασία. Σε αυτή τη λογική, τα οξυγαλακτικά βακτήρια L. pentosus B281 και L. plantarum B282 χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως εναρκτήριες καλλιέργειες κατά τη ζύμωση πράσινων ελιών ποικιλίας «Χαλκιδικής» σύμφωνα με την Ισπανική μέθοδο σε αρχική άλμη χαμηλής (8%) και υψηλής (10%) αλατοπεριεκτικότητας, ενώ το βακτήριο L. pentosus B281 και η ζύμη P. membranifaciens M3A χρησιμοποιήθηκαν ως εναρκτήριες καλλιέργειες κατά τη ζύμωση φυσικής μαύρης ελιάς ποικιλίας «Κονσερβολιά» σε αρχική άλμη 8%, σύμφωνα με την πρακτική που εφαρμόζεται από τη βιομηχανία στη χώρα μας (Κεφάλαια 3 και 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρήση του βακτηρίου L. pentosus B281 οδήγησε στη δημιουργία τελικού προϊόντος με επιθυμητά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και καλές οργανοληπτικές ιδιότητες τόσο στην επεξεργασία ισπανικού τύπου όσο και στη ζύμωση της φυσικής μαύρης ελιάς. Στην περίπτωση της ζύμωσης ισπανικού τύπου (Κεφάλαιο 3), το βακτήριο L. pentosus Β281 επικράτησε του L. plantarum Β282 όταν ενοφθαλμίστηκαν στην άλμη ως συγκαλλιέργεια ανεξάρτητα από την αρχική αλατότητα της άλμης, ενώ το δεύτερο στέλεχος, όταν εμβολιάστηκε ως μονοκαλλιέργεια σε άλμη υψηλής αλατότητας (10%) επέδειξε χαμηλή ικανότητα επικράτησης έναντι της αυτόχθονης μικροχλωρίδας των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Στην περίπτωση της ζύμωσης φυσικής μαύρης ελιάς, το επιλεγμένο στέλεχος της ζύμης, παρά το υψηλό ποσοστό προσκόλλησης στον καρπό στο αρχικό στάδιο της επεξεργασίας (100%), δεν κατάφερε να επικρατήσει και να ανακτηθεί στο τέλος της ζύμωσης. Ωστόσο, η χρήση οδήγησε σε φυσιολογική ζύμωση με το τελικό προϊόν να χαρακτηρίζεται από καλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και ήπια αίσθηση της οξύτητας. Αντίθετα, το βακτήριο L. pentosus B282, είτε ως μονοκαλλιέργεια είτε ως συγκαλλιέργεια με τη ζύμη, επικράτησε κατά την επεξεργασία και ανακτήθησε σε ποσοστό 100% στο τέλος της ζύμωσης. Επομένως, η εφαρμογή μικτής καλλιέργειας εκκίνησης (οξυγαλακτικού βακτηρίου/ζύμης) κατά τη ζύμωση του φυσικού μαύρου ελαιόκαρπου θα μπορούσε να συμβάλλει στη δημιουργία ενός τελικού προϊόντος με ήπια γεύση που απευθύνεται σε καταναλωτές που δεν εκτιμούν ιδιαίτερα την όξινη γεύση στην επιτραπέζια ελιά.Στη συνέχεια, μελετήθηκε η δυνατότητα προσκόλλησης της αυτόχθονης μικροχλωρίδας και η δημιουργία βιοϋμενίου στην επιφάνεια της δεξαμενής ζύμωσης, καθώς επίσης και ο ποσοτικός και ποιοτικός χαρακτηρισμός των μικροοργανισμών του βιοϋμενίου σε διαφορετικές συνθήκες εξυγίανσης της δεξαμενής (Κεφάλαιο 5). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μικροοργανισμοί που αποτελούν την επικρατούσα μικροχλωρίδα κατά τη ζύμωση, οξυγαλακτικά βακτήρια και ζύμες, έχουν την ικανότητα προσκόλλησης στην εσωτερική επιφάνεια του περιέκτη και δημιουργία βιοϋμενίων τα οποία επιβιώνουν έναντι των συνθηκών απολύμανσης. Κατά το χαρακτηρισμό του πληθυσμού των ζυμών βρέθηκε ότι τα πιο συχνά απαντώμενα είδη ήταν Candida spp. ακολουθούμενα από τα είδη Wickerhamomyces anomalus, Debaryomyces hansenii και Pichia guilliermondii, ενώ όσον αφορά στο χαρακτηρισμό των οξυγαλακτικών βακτηρίων, το βακτήριο L. pentosus ήταν το πιο συχνά ευρισκόμενο είδος. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δημιουργία βιοϋμενίων στην επιφάνεια των δεξαμενών ζύμωσης μπορεί να λειτουργήσει ως ένας φυσικός τρόπος ενοφθαλμισμού της άλμης με μικροοργανισμούς που διαθέτουν τα κατάλληλα τεχνολογικά χαρακτηριστικά για να υποστηρίξουν τη ζύμωση.