The role of metacaspases and metacaspase-like proteins in Arabidopsis seed and root physiology
Authors: Χατζηανέστης Ιωάννης 
Published: July 2024

Η παραγωγή σπόρου είναι μία διαδικασία η οποία εξελίχθηκε πριν από χιλιάδες χρόνια και αποτελεί μια προσαρμογή που προσδίδει στα φυτά ένα σημαντικό εξελικτικό πλεονέκτημα. Οι σπόροι εισέρχονται σε μια περίοδο ηρεμίας ή λήθαργου που μπορεί να διαρκέσει από μερικές εβδομάδες έως και εκατοντάδες χρόνια, για να αποφευχθεί η φύτρωση σε μη ευνοϊκές συνθήκες για το φυτό. Επιπροσθέτως, οι σπόροι διαθέτουν έναν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών και λιπιδίων, για να μπορέσει το έμβρυο να προμηθευτεί τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά στα πρώτα στάδια της ζωής του αμέσως μετά την φύτρωση, όπου εισέρχεται στο ετερότροφο στάδιο. Ο έλεγχος ποιότητας (π.χ. καταστροφή λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών) αυτού του μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση για την επιβίωση του σπόρου. Για τον λόγο αυτό, η πρωτεόλυση έχει ζωτικό ρόλο στα κύτταρα με σκοπό την διατήρηση της πρωτεϊνικής ομοιόστασης (πρωτεόστασης). Παράλληλα, τα φυτά, ως ακίνητοι οργανισμοί, είναι αναγκασμένα καθημερινά να αποκρίνονται σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών ερεθισμάτων που μπορούν να προκαλέσουν βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις. Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτύξει ενδογενή πεπτιδικά σήματα που συντονίζουν τις ιδιότητες τους μεταξύ ανάπτυξης και επιβίωσης. Πως όμως επιτυγχάνεται αυτός ο έλεγχος ποιότητας πρωτεϊνών καθώς επίσης και η συντονισμένη απόκριση στα περιβαλλοντικά σήματα παραμένει απροσδιόριστο. Ο στόχος της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των παραπάνω δύο ερευνητικών ερωτημάτων με αποτέλεσμα την αποσαφήνιση βασικών βιολογικών διεργασιών που θα αποκαλύψει τους μηχανισμούς ρύθμισής τους. Η παρούσα εργασία αποτελείται από δύο κεφάλαια, οπού το καθένα διερευνά ένα διαφορετικό βιολογικό ερώτημα. Το πρώτο κεφάλαιο επικεντρώνεται στον ρόλο των μετακασπασών (metacaspases), μια οικογένεια πρωτεασών εξαρτώμενων από κυστεΐνη οι οποίες προηγουμένως έχουν συσχετισθεί με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (ΠΚΘ), στην φυσιολογία του σπόρου και στον έλεγχο ποιότητας πρωτεϊνών. Το δεύτερο κεφάλαιο επικεντρώνεται σε ένα ενδογενές πεπτίδιο που ανήκει στην οικογένεια PEP (plant elicitor peptides) και πως οι μετακασπάσες και μια όμοια πρωτεάση γνωστή ως σεπαράση (separase), μπορούν να το επεξεργαστούν πρωτεολυτικά με σκοπό την απελευθέρωση του στον αποπλάστη και την αναγνώριση του από τους σχετικούς υποδοχείς των γειτονικών κυττάρων. Στο φυτό Arabidopsis thaliana, η οικογένεια των μετακασπασών περιλαμβάνει εννέα μέλη, με τρία εξ αυτών να υπάγονται στον τύπο Ι και τις υπόλοιπες έξι στον τύπο ΙΙ, ανάλογα με τις πρωτεϊνικές επικράτειες που φέρουν. Προηγουμένως στο εργαστήριο Φυσιολογίας και Βιοτεχνολογίας Φυτών του καθηγητή Μόσχου, πραγματοποιήθηκε απαλοιφή όλων των μετακασπασών τύπου ΙΙ με την χρήση της τεχνολογίας CRISPR, οδηγώντας στη δημιουργία ενός εξαπλού μεταλλάγματος Arabidopsis. Παραδόξως, παρόλο που σε προηγούμενες έρευνες οι μετακασπάσες έχουν συσχετισθεί με μονοπάτια του ΠΚΘ, στο εξαπλό αυτό μετάλλαγμα δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές προς αυτή την κατεύθυνση. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκαν μόνο ασθενείς αναπτυξιακοί φαινότυποι στο στάδιο του σπορόφυτου (seedling) και στο ενήλικο στάδιο. Αντιθέτως, οι σπόροι του εξαπλού μεταλλάγματος παρουσίασε μειωμένη μακροζωία, υποδεικνύοντας ότι οι μετακασπάσες πιθανώς να έχουν κάποιο ρόλο στη βιωσιμότητα των σπόρων, ρυθμίζοντας τη πρωτεόσταση μέσω της σύνδεσής τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ο στόχος του πρώτου κεφαλαίου είναι η μελέτη του μοριακού μηχανισμού της ρύθμισης της πρωτεόστασης των σπόρων, ακολουθώντας μια προσέγγιση που περιλαμβάνει γενετική, βιοαπεικονιστική καθώς επίσης και πρωτεομικές αναλύσεις. Αυτή η εργασία σε συνδυασμό με την δουλεία της μεταδιδακτορικής ερευνήτριας του εργαστηρίου, Dr Chen Liu, έδειξαν ότι οι σπόροι του εξαπλού μεταλλάγματος εμπλέκονται στον περιορισμό της AAA ATPase CELL DIVISION CYCLE 48 (CDC48) στο ενδοπλασματικό δίκτυο από την απόρριψη των λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, θέτοντας σε κίνδυνο τη μακροζωία των σπόρων. Αυτό εξαρτάται από την πρωτεολυτική κοπή του οδηγού της CDC48, την ubiquitination regulatory X domain–containing 10 (PUX10), από τις μετακασπάσες. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση της μετακίνηση της CDC48 μεταξύ των σωμάτων ελαίων (oil bodies) και του ενδοπλασματικού δικτύου διατηρώντας έτσι την πρωτεόσταση των σπόρων μέσω της ρύθμισης του δυναμικού των σωμάτων ελαίων. Η αφαίρεση της PUX10 στο μετάλλαγμα της μετακασπάσης οδήγησε στην επαναφορά της πρωτεόστασης και της τοπολογίας της CDC48, και αντέστρεψε μερικώς τον φαινότυπο της μειωμένης μακροβιότητας των σπόρων.Όσον αφορά στο κεφάλαιο 2, υπάρχουν 8 PROPEPs στην οικογένεια PEP της Arabidopsis. Πρόκειται για πεπτιδικά σήματα της κατηγορίας damage-associated molecular patterns (DAMPs) χαρακτηρισμένα ως δείκτες κινδύνου για το φυτό, παρόλο που έχουν συσχετισθεί σε προηγούμενες έρευνες και με ρόλους πέρα από την φυτική άμυνα. Προηγουμένως στο εργαστήριο Φυσιολογίας και Βιοτεχνολογίας Φυτών του καθηγητή Μόσχου, η μελέτη ενός μεταλλάγματος σεπαράσης οδήγησε σε στοιχεία που υποδεικνύουν ότι ένα ξεχωριστό μέλος της οικογένειας PEP, όσον αφορά στο μοτίβο έκφρασης και στις συνθήκες ενεργοποίησης, πιθανώς να αποτελεί στόχο της σεπαράσης. Ο στόχος αυτού του κεφαλαίου είναι η διερεύνηση των συνθηκών πρωτεολυτικής επεξεργασίας του PROPEP7 από τις μετακασπάσες και την σεπαράση, το σηματοδοτικό μονοπάτι που ενεργοποιείται από την αντίληψη του πεπτιδίου αυτού καθώς επίσης και τον ρόλο του στην φυσιολογία του φυτού με έμφαση στη ρίζα. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, ακολούθησα προσεγγίσεις μοριακής βιολογίας, απεικόνισης και γενετικής. Η κατανόηση του φαινομένου αυτού πιθανώς να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων μεθόδων για την δημιουργία πιο ανθεκτικών φυτών που θα μπορούν να ξεπεράσουν τις ολοένα και δυσμενέστερες περιβαλλοντικές συνθήκες που απειλούν σήμερα την επισιτιστική ασφάλεια.