Black Aspergilli on grapes
Authors: Τεστέμπασης Στέφανος-Γαβριήλ 
Published: February 2023

H ασθένεια της σήψης των βότρεων (ΑΣΒ) από τα είδη του γένους Aspergillus, θεωρείται μία από τις σημαντικότερες προ- και μετά-συλλεκτικές ασθένειες των σταφυλιών. Η ασθένεια προκαλείται από διάφορα είδη του γένους Aspergillus άθροισμα Nigri (μαύροι ασπέργιλλοι), ενώ η σπουδαιότητα της, έγκειται στις σοβαρές ποσοτικές αλλά και ποιοτικές απώλειες, εξαιτίας της επιμόλυνσης των σταφυλιών και των προϊόντων-σταφυλής με τις μυκοτοξίνες του μύκητα. Διανύοντας τη νέα μεταβατική περίοδο της Ευρωπαϊκής πράσινης συμφωνίας, η διερεύνηση εναλλακτικών, βιολογικών, μη χημικών μεθόδων αντιμετώπισης των ασθενειών, κρίνεται αναγκαία. Μέχρι και σήμερα, το μεγαλύτερο μέρος τής έρευνας που αφορούσε στην ΑΣΒ από είδη μαύρων ασπέργιλλων, επικεντρωνόταν στην επιδημιολογία, οικολογία, παραλλακτικότητα και τον μοριακό και μυκοτοξικογόνο χαρακτηρισμό των μυκήτων που προκαλούν την ασθένεια. Παρόλα αυτά, δεν είναι γνωστή η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας (συμβατική και βιολογική καλλιέργεια) στην ανάπτυξη της ασθένειας. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας: α) στη πλυθησμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων, ii) στο μυκοτοξικογόνο χαρακτηρισμών των απομονώσεων του μύκητα που προέρχονται από τα δύο συστήματα καλλιέργειας, iii) στο επίπεδο επιμόλυνσης εμπορικών κρασιών συμβατική και βιολογικής καλλιέργειας με μυκοτοξίνες του μύκητα, iv) στα επίπεδα ευαισθησίας των απομονώσεων των μαύρων ασπέργιλλων σε μυκητοκτόνα των ομάδων SDHI, QoI, DMI και στα φαινυλοπυρόλια, και v) στη μελέτη της επίδρασης διαφόρων αμπελουργικών καλλιεργητικών πρακτικών στην συχνότητα εμφάνισης των μαύρων ασπεργίλλων και στη σύσταση του μικροβιώματος της καρπόσφαιρας. Κατά τη διάρκεια διετούς έρευνας που πραγματοποιήθηκε, ελέγχθηκε η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας στην πληθυσμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων. Συνολικά, 300 απομονώσεις του μύκητα συλλέχθηκαν και ταυτοποιήθηκαν μοριακά με αλληλούχιση κατά Sanger. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν τέσσερα κυρίαρχα είδη του μύκητα Aspergillus άθροισμα Nigri (A. tubingensis, A. uvarum, A. carbonarius και A. niger). Τα είδη A. uvarum και το A. tubingensis ταυτοποιήθηκαν ως κυρίαρχα είδη και για τα δύο έτη δειγματοληψιών, ενώ τα είδη A. tubingensis και A. uvarum ανιχνεύθηκαν σε υψηλότερες συχνότητες στους βιολογικούς και συμβατικούς αμπελώνες, αντίστοιχα. Ο in vitro μυκοτοξικογόνος χαρακτηρισμός αποκάλυψε χαμηλή συχνότητα μυκοτοξινογόνων απομονώσεων, που προέρχονταν κυρίως από συμβατικούς αμπελώνες. Επιπλέον, ο μύκητας A. carbonarius αναδείχθηκε ως η κύρια πηγή ΟΤΑ, ενώ το είδος A. niger ευθύνεται κυρίως για την παραγωγή FBs. Επιπλέον, 74 εμπορικά κρασιά βιολογικής και συμβατικής παραγωγής ελέγχθηκαν για την παρουσία διαφόρων μυκοτοξινών (OTA, FB1, FB2 FB3, AOH, AME, και CIT), με μία νέα αναλυτική μεθοδο (Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer) ταυτόχρονης ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης διάφορων μυκοτοξινών που παράγονται από τα είδη του μύκητα. Η συχνότητα των επιμολυσμένων κρασιών με μυκοτοξίνες ήταν ιδιαίτερα χαμηλή, ενώ οι Φουμονισίνες αναδείχθηκαν ως κυρίαρχες μυκοτοξίνες στα Ελληνικά κρασιά. Σύμφωνα με τα δεδομένα των προηγούμενων ενοτήτων, διαπιστώσαμε ότι το σύστημα καλλιέργειας επηρέασε τη πληθυσμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων στους ελληνικούς αμπελώνες, και προχωρήσαμε στον έλεγχο της υπόθεσης, ότι οι διαφορές στη δομή του πληθυσμού μπορεί να σχετίζονται με την επιλογή ανθεκτικών σε μυκητοκτόνα στελεχών του μύκητα. Ο έλεγχος της υπόθεσης πραγματοποιήθηκε με τον προσδιορισμό των επιπέδων ευαισθησίας των απομονώσεων του μύκητα (A. uvarum, A. tubingensis, A. niger, και A. carbonarius) στα μυκητοκτόνα fluxapyroxad (SDHIs), pyraclostrobin (QoIs), tebuconazole- (DMIs), και fludioxonil (φαινυλοπυρρόλια). Οι απομονώσεις του μύκητα A. uvarum, που προέρχονταν κυρίως από συμβατικούς αμπελώνες, παρουσίασαν υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας και στις τέσσερις (4) ομάδες μυκητοκτόνων που ελέγχθηκαν. Αντιθέτως, οι απομονώσεις του μύκητα A. tubingensis, βρέθηκαν να είναι είναι ευαίσθητες στο pyraclostrobin, ενώ καταγράφηκαν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στα μυκητοκτόνα tebuconazole, fludioxonil, και fluxapyroxad. Η αλληλούχιση των γονιδίων, που κωδικοποιούν τον βιοχημικό στόχο της κάθε ομάδας μυκητοκτόνων, αποκάλυψε την παρουσία των μεταλλάξεων H270Y, H65Q/S66P και G143A στα γονίδια sdhB, sdhD και cytb στις ανθεκτικές απομονώσεων του A. uvarum, αντίστοιχα. Αντίθετα, δεν ανιχνεύθηκε καμία μετάλλαξη στα γονίδια CYP51A και CYP51B, σε καμία από τις απομονώσεις του A. uvarum και A. tubingensis. Τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής ενισχύουν την αρχική μας υπόθεση για την συμβολή της ανθεκτικότητας σε μυκητοκτόνα στην δομή του πληθυσμού των μαύρων ασπεργίλλων, ενώ η καταγραφή των μεταλλαγών H270Y, H65Q/S66P, και G143A στα γονίδια sdhB, sdhD, και cytb, αποτελούν πρώτη παγκόσμια αναφορά για το είδος A. uvarum. Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση διάφορων καλλιεργητικών πρακτικών (άρδευση, αποφύλλωση και αραιοραγία/πυκνοραγία) στη συχνότητα προσβολής από μύκητες γένους Aspergillus spp., στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των σταφυλιών (TA, pH, και TSS), και στην διαμόρφωση του μικροβιώματος της καρπόσφαιρας, σε τρία βλαστικά στάδια (σχηματισμός βότρεων, περκασμός και ωρίμανση). Η συχνότητα προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus spp., βρέθηκε να είναι υψηλότερη κατά το στάδιο της πλήρους ωρίμανσης, ενώ παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των επεμβάσεων. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε υψηλή συχνότητα προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus στις επεμβάσεις άρδευσης (IR), χωρίς αποφύλλωση (NDF), και πυκνοραγίας (HBD), συγκριτικά με τις επεμβάσεις αραιοραγία (LBD), αποφύλλωση (DF) και χωρίς άρδευση (NIR). Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης νέας γενιάς των μικροβιακών κοινοτήτων της καρπόσφαιρας, παρουσίασε σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των βλαστικών σταδίων ανάπτυξης και των επεμβάσεων, ενώ παρατηρήθηκαν σημαντικές διακυμάνσεις στην α- και β- ποικιλότητα των μικροβιακών κοινοτήτων στο στάδιο της ωρίμανσης. Τέλος, η ανάλυση δικτύου μεταξύ των μικροβιακών κοινοτήτων της καρπόσφαιρας, επέδειξε την παρουσία μοτίβων αρνητικής συσχέτισης μεταξύ του Aspergillus και διάφορων βακτηριακών γενών (Streptococcus, Rhodococcus, Melitangium, Roseomnonas, και Belnapia), στις επεμβάσεις όπου ο Aspergillus βρέθηκε να μειώνεται σημαντικά (NIR, DF, LBD). Τα προαναφερθέντα βακτηριακά γένη είναι γνωστά για τις μυκοστατικές τους ιδιότητες, υποδηλώνοντας την συμβολή φυσικών μηχανισμών ελέγχου προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus spp.