Ρύθμιση του προγράμματος διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού των βλαστικών κυττάρων στα πλαίσια της Ras/Erk οδού μέσω του μεταγραφικού παράγοντα ERF
Authors: Βοργιά Ελένη 
Published: August 2021

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου του γονιδίου erf στην ανάπτυξη, διαφοροποίηση και καρκινογένεση, μέσω διαγονιδιακών ζώων και βλαστικών κυττάρων.Ο Erf είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής στην κύρια μιτωτική RTK/Ras/Erk οδό και ενέχεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Έχει δειχθεί επίσης ότι μπορεί να καταστείλει την ets- και ras- εξαρτώμενη καρκινογένεση σε ινοβλάστες. Αποτελεί στόχο των Erks με τις οποίες αλληλεπιδρά και φωσφορυλιώνεται. Αυτό έχει ως συνέπεια την έξοδό του από τον πυρήνα και την απενεργοποίηση του. Ο πυρηνικός Erf σταματά τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/G1.Έχουν δημιουργηθεί στο εργαστήριό μας ποντίκια με απαλοιφή του γονιδίου του Erf (Erf knock-out) και έχει μελετηθεί η πορεία ανάπτυξης σε όλα τα εμβρυικά στάδια. Οι μελέτες αυτές έχουν δείξει πως τα knock-out στελέχη παρουσιάζουν ανωμαλίες στην ανάπτυξη και συγκεκριμένα δεν παρατηρείται διαφοροποίηση στη χοριονική τροφοβλάστη, απουσία της χοριοαλλαντοϊκής σύντηξης, «έντονη» χοριονική στοιβάδα, ελάττωση της έκτασης της σπογγιοτροφοβλάστης, αποδιοργανωμένες στοιβάδες της σπογγιοτροφοβλάστης και των γιγαντιαίων κυττάρων και τέλος πρόκληση εμβρυικού θανάτου κατά τη δέκατη (Ε10.5) μέρα της κύησης λόγω τροφικής ανεπάρκειας.Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις καθώς και τη μελέτη της έκφρασης του Erf στα διάφορα στάδια της εμβρυογένεσης και πλακουντογένεσης, κρίθηκε σημαντική η διερεύνηση του ρόλου του Erf κατά τη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων σε σπογγιοτροφοβλάστη και συγκυτιοτροφοβλάστη. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαφοροποίησης τροφοβλαστικών κυττάρων in vitro. Έγινε χρήση τεσσάρων (4) κυτταρικών σειρών: τροφοβλαστικά κύτταρα αγρίου τύπου (WT), τροφοβλαστικά κύτταρα με απαλοιφή του Erf (Erf knock-out), τροφοβλαστικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον αγρίου τύπου Erf και τέλος τροφοβλαστικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον Μ1-7 Erf. Στο μετάλλαγμα αυτό, ο Erf, στερείται των 7 θέσεών του φωσφορυλίωσης από τις Erks, με αποτέλεσμα τον πυρηνικό του εντοπισμό και συνεπώς μια συνεχώς ενεργοποιημένη μορφή. Έπειτα από ανάλυση των επιπέδων έκφρασης διαφόρων γονιδίων-μαρτύρων για τα στάδια διαφοροποίησης, προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα:•Τα αγρίου τύπου κύτταρα, ακολουθούν μια πορεία διαφοροποίησης προς σπογγιοτροφοβλαστικά κι γιγαντιαία κύτταρα.•Τα κύτταρα με την απαλοιφή του Erf, παρουσιάζουν καθυστέρηση στο πρόγραμμα διαφοροποίησης, δίνοντας πληθυσμούς γιγαντιαίων κυττάρων.•Τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τον αγρίου τύπου Erf, διαφοροποιούνται προς σπογγιοτροφοβλαστικά κύτταρα.•Τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τη συνεχώς πυρηνική μορφή του Erf (Μ1-7), οδηγούνται προς συγκυτιοτροφοβλάστες και γιγαντιαία κύτταρα.Από τα παραπάνω προκύπτει ένα μοντέλο διαφοροποίησης που προτείνει την εμπλοκή του Erf στον καθορισμό της σπογγιοτροφοβλαστικής και συγκυτιοτροφοβλαστικής γενεαλογίας, προάγοντας τη διαφοροποίηση προς αυτές τις κατευθύνσεις.Πειράματα ChIP-seq έδειξαν ότι ο FGF2, ένας παράγοντας που συμβάλλει στη διατήρηση των TSC, μπορεί να ρυθμίζεται από τον ERF. Ανάλυση της διαφοροποίησης Erf-KO TSCs αποκάλυψαν υψηλά επίπεδα FGF2 σε σύγκριση με τα WT TSCs. Έκφραση ενός μετάλλαγματος του ERF που δεν αποκρίνεται στη σηματοδότηση μέσω RTK / Ras / ERK σε TSCs, καταστέλλει εντελώς την έκφραση του FGF2. Αναλύσεις υποκινητή πρότειναν την άμεση μεταγραφική ρύθμιση του FGF2 από τον ERF. Συλλογικά αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι o ERF συμβάλλει στη διαφοροποίηση των TSC, πέρα από την επίδρασή του στα χοριακά τροφοβλαστικά κύτταρα μέσω της ρύθμισης του Fgf2.Εκτός από τις ανωμαλίες που παρατηρούνται κατά την πλακουντογένεση απουσία του Erf, έχουν επίσης παρατηρηθεί και ανωμαλίες κατά την εμβρυική ανάπτυξη απουσία του Erf. Συγκεκριμένα, τα έμβρυα παρουσιάζουν ανωμαλίες στην περιοχή του κεφαλιού και σε νευρικές δομές, όπως ο νευρικός σωλήνας. Με πειράματα ανάλυσης DNA με microarrays στο εργαστήριό μας, έχει δειχθεί η μεταγραφική κατασταλτική δράση του Erf στο γονίδιο olig1 , που αποτελεί μάρτυρα των ολιγοδενδροκυττάρων που συμμετέχουν στη διαδικασία της μυελινοποίησης. Τέλος, έχει παρατηρηθεί αύξηση των επιπέδων του Erf κατά τη διάρκεια της in vivo μυελινοποίησης, διαδιακασία που είναι RTK-εξαρτώμενη. Κρίθηκε, λοιπόν, σημαντική η μελέτη του πιθανού ρόλου του Erf στη νευρική διαφοροποίηση. Για το σκοπό αυτό έγινε χρήση εμβρυικών βλαστικών κυττάρων αγρίου τύπου και κυττάρων με απαλοιφή του Erf. Με εξέταση της γονιδιακής έκφρασης των Erf+/+ και Erf-/- βλαστικών κυττάρων υπό συνθήκες διαφοροποίησης, αποκαλύφθηκε ένα αυξημένο δυναμικό διαφοροποίησης προς ολιγοδενδροκύτταρα απουσία του Erf.Για τη διαφοροποίηση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων έγινε χρήση ειδικού θρεπτικού μέσου για κατευθυνόμενη νευρική διαφοροποίηση σε μονοστοιβάδα. Τέτοιου είδους πρωτόκολλο έδινε κυρίως πληθυσμούς νευρικών κυττάρων και λιγότερο γλοιακών κυττάρων. Οπότε, κρίθηκε απαραίτητη η αλλαγή στον τρόπο καλλιέργειας. Αποφασίστηκε, λοιπόν, διαφοροποίηση μέσω δημιουργίας εμβρυικών σωματιδίων, πείραμα το οποίο είναι σε εξέλιξη. Με τις μέχρι τώρα παρατηρήσεις, η διαδικασία αυτή εμπλουτίζει την καλλιέργεια με γλοιακά κύτταρα, σύμφωνα με τη μορφολογία των υπό διαφοροποίηση κυττάρων.Παράλληλα, έγινε δημιουργία διαγονιδιακών ζώων στα οποία πραγματοποιείται conditional απαλοιφή του γονιδίου του Erf. Έτσι έχουν προκύψει τα Emx-1-cre και Meox2-cre ποντίκια, με τα δεύτερα να εμφανίζουν εμβρυική θνησιμότητα. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως μειωμένα επίπεδα του μεταγραφικού καταστολέα Erf προκαλεί σύνθετη κρανιοσυνόστωση στους ανθρώπους και τα ποντίκια.Χαρακτηριστικά γνωρίσματα της πρόσφατα αναγνωρισμένης αυτής κλινικής διαταραχής αποτελούν η πολλαπλή συνοστέωση, η κρανιοπροσωπική δυσμορφία, η δυσπλασία Chiari και η γλωσσική καθυστέρηση. Ποντίκια με μειωμένα επίπεδα λειτουργικού Erf στο ~30% των φυσιολογικών επιπέδων εμφανίζουν μεταγεννητική πολλαπλή συνοστέωση. Αντίθετα, η ανάπτυξη των εμβρυικών κρανίων εμφανίζει ήπια καθυστέρηση. Χρησιμοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση της χρωματίνης σε εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού καθώς και high-throughput αλληλούχιση, βρήκαμε ότι ο Erf προσδένεται με μεγάλη συνάφεια σε στοιχεία απομακρυσμένα από τους υποκινητές που περιέχουν τα RUNX και AP-1 μοτίβα. Η εργασία αυτή αναγνωρίζει τον Erf ως νέο ρυθμιστή της οστεογόνου διέγερσης μέσω RAS-ERK σηματοδότησης, πιθανώς ανταγωνιζόμενος με ETS ενεργοποιητές σε πολυπαραγοντικά μεταγραφικά σύμπλοκα.