Η προγνωστική και προβλεπτική σημασία του ενζύμου ercc - 1 στους επιθηλιακούς όγκους ωοθηκών
Authors: Αβραάμ Κωνσταντίνος 
Published: July 2014

Εισαγωγή: Το ERCC1 (excision repair cross complementation –group 1) συνιστά ένα γονίδιο που εδράζει στο χρωμόσωμα 19 (19q13.3) και κωδικοποιεί μια ενδονουκλεάση η οποία διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην επιδιόρθωση βλαβών στους δεσμούς μεταξύ των ελίκων του διπλού μορίου DNA.Το ERCC1 ανευρίσκεται στα κύτταρα σχεδόν όλων των θηλαστικών και θεωρείται ότι αποτρέπει μεταλλάξεις στο μόριο DNA ακολουθώντας μια «οδό» αποκοπής και επιδιόρθωσης νουκλεοτιδίων. Αυτό επιτυγχάνεται με την απομάκρυνση του νουκλεοτιδίου που έχει υποστεί βλάβη από την προσβεβλημένη περιοχή (αποκοπή) και με τη συμπλήρωση του κενού που δημιουργείται με τη δράση της DNA-πολυμεράσης (ERCC1) που επιδιορθώνει τη βλάβη ανάμεσα στους δεσμούς μεταξύ των νουκλεοτιδίων των ελίκων του μορίου DNA (επιδιόρθωση). Πιο αναλυτικά, το ERCC1 ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια ενζύμων γνωστή ως NER (Nucleotide Excission Repair) enzymes.Τα ένζυμα αυτά δρουν ως ακολούθως: •αναγνώριση της προσβεβλημένης DNA περιοχής (recognition of a DNA lesion)•διαχωρισμός της διπλής ελικας του DNA στη συγκεκριμένη περιοχή (separation of the double helix at the DNA lesion site)•απλή αποκοπή και στις 2 πλευρές της περιοχής (single strand incision at both sides of the lesion)•εκτομή της περιοχής (excision of the lesion-containing single stranded DNA fragment)•σύνθεση DNA για να συμπληρωθεί καταλληλα το κενό DNA (repair synthesis to replace the gap) και •σύνδεση του εναπομειναντος άκρου αλυσίδας( ligation of the remaining single stranded nick.)Η ικανότητα επιδιορθώσεως του DNA πιστεύεται ότι αφενός εμποδίζει την καρκινογένεση, αφετέρου αποτελεί ένα σημαντικό μοριακό μηχανισμό που ενοχοποιείται για την ανάπτυξη αντίστασης έναντι της πλατίνας. Είναι γνωστό, ότι η κυτταροτοξικότητα της πλατίνας έχει συσχετισθεί με την επαγωγική της δράση στους δεσμούς μεταξύ των ελίκων του DNA. Η καταστροφή καρκινικών κυττάρων από φάρμακα με κύριο συστατικό την πλατίνα, προϋποθέτει τη συνένωση του φαρμάκου με το μόριο DNA και τη δημιουργία παραγώγων (παράγωγα DNA-πλατίνας).Τα νεοσχηματιζόμενα αυτά συμπλέγματα δημιουργούν ομοιοπολικής φύσεως δεσμούς μεταξύ των DNA ελίκων προκαλώντας κατ’αυτόν τον τρόπο αναστολή της αντιγραφής του DNA.Το ERCC1 φαίνεται ότι μπορεί να αναγνωρίζει και να απομακρύνει αυτά τα παράγωγα DNA-πλατίνας και να μην επιτρέπει στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα (πλατίνα) να δράσουν αποτελεσματικά ώστε να έχουν το επιθυμητό όφελος για τον ασθενή.Σκοπός της διατριβής: Α) Μελέτη της υποθέσεως να συσχετίζεται η ανοσοϊστοχημική έκφραση του ενζύμου ERCC1 με την ανταπόκριση ασθενών με επιθηλιακού τύπου όγκο ωοθηκών σε χημειοθεραπεία με φάρμακα που έχουν ως κύριο συστατικό την πλατίνα. Β) Αξιολόγηση της ανοσοέκφρασης του ενζύμου ERCC1 με την ανοσοέκφραση των άλλων μοριακών δεικτών που σχετίζονται με αντίσταση στα φάρμακα και Γ) Συσχέτιση της έκφρασης του ERCC1 με τα υπόλοιπα κλινικοεργαστηριακά στοιχεία των ασθενών (ηλικία ασθενούς, εντόπιση όγκου, είδος επέμβασης, ιστολογικός τύπος καρκινώματος, στάδιο της νόσου).Υλικό και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν κύβοι παραφίνης από το εγχειρητικό υλικό 60 ασθενών με επιθηλιακού τύπου όγκο ωοθηκών που νοσηλεύτηκαν στην ογκολογική κλινική του «ΙΑΣΩ» από 1/1/1999 έως 31/12/2007. Καμία από τις ασθενείς δεν είχε υποβληθεί σε χημειοθεραπεία πριν να χειρουργηθεί. Η ηλικία των ασθενών κυμαινόταν από 33-76 έτη. Η χειρουργική αντιμετώπιση που επιλέχτηκε ήταν (κατά περίπτωση): ολική υστερεκτομή με αμφoτερόπλευρη ή μονόπλευρη σαλπιγγο-ωοθηκεκτομή, επιπλεκτομή ή/και λεμφαδενικός καθαρισμός (πυελικοί κ παραορτικοί λεμφαδενες).Οι παραπάνω 60 περιπτώσεις ταξινομούνται στους εξης ιστολογικούς υπότυπους: 25 ορώδη, 3 βλεννώδη, 17 ενδομητριοειδή ,8 διαυγοκυτταρικά, 5 σύνθετου τύπου, 2 καρκινοσαρκώματα (μεικτοί μυλλεριανοί όγκοι). Το κλινικό στάδιο ορίστηκε ανά περίπτωση με βάση την ταξινόμηση κατά FIGO. Τα κλινικοεργαστηριακά στοιχεία που αφορούν στις 60 ασθενείς της παρούσας μελέτης (ιστολογικός τύπος όγκου, διαφοροποίηση, ημερομηνία επέμβασης, είδος χειρουργικής επέμβασης , στάδιο όγκου (FIGO), ημερομηνίες λήψης χημειοθεραπευτικού σχήματος, τύπος χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία,ημερομηνία λήψης 2ης γραμμής χημειοθεραπείας, κατάσταση υγείας ασθενούς (παρόν), ανοσοϊστοχημική έκφραση των αντισωμάτων ) συμπληρώθηκαν σε ειδικές φόρμες (ovarian cancer study forms) και εν συνεχεία χρησιμοποιήθηκαν ως δεδομένα προς στατιστική ανάλυση.Στατιστική ανάλυση Η ανάλυση συσχετισμού (correlation analysis) πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας τη δοκιμασία Spearman και εκτιμώντας τον παράγοντα gamma co-efficient. Οι διαφορές στη βαθμολόγηση (scoring) της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία Mann-Whitney. Στην παρούσα μελέτη η εκτίμηση της έκφρασης των αντισωμάτων p53, bcl-2 , ERCC-1 και bax αναλύθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Οι διαφορές ανάμεσα στους ιστολογικούς υπότυπους εκτιμήθηκαν με την εφαρμογή της δοκιμασίας Long-Rank.Η μέση επιβίωση αναφέρθηκε ως μέση τιμή± τυπική απόκλιση σε μήνες. Αποτελέσματα :Α) Συσχετίσεις ανάμεσα σε ανοσοϊστοχημική έκφραση αντισωμάτων και στο στάδιο και τη διαφοροποίηση του όγκου. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του ERCC-1 και της πρωτεϊνης bcl-2 με το στάδιο της νόσου. Ειδικότερα, το υψηλό στάδιο της νόσου συσχετίστηκε με χαμηλή ανοσοέκφραση του ERCC-1 (αρνητική συσχέτιση) και με υψηλή ανοσοέκφραση του bcl-2 (θετική συσχέτιση). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του p53 και της πρωτεϊνης bax με το στάδιο της νόσου. Αναφορικά με τη διαφοροποίηση του όγκου (grade) μόνο η ανοσοϊστοχημική έκφραση του bax βρέθηκε να σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά και συγκεκριμένα βρέθηκε ότι η θετική ανοσοέκφραση του bax ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τη διαφοροποίηση του όγκου.Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των μορίων της μελέτης. Β) Σημαντικές διαφορες μεταξύ ανοσοέκφρασης αντισωμάτων και ιστολογικών υποτύπων .Η ανοσοέκφραση της πρωτεινης ERCC-1 ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη στα ορώδη και τα ενδομητριοειδούς τύπου καρκινώματα σε σύγκριση με τα διαυγοκυτταρικά. (IHC score 2.80±0.41 and 2.88±0.56 vs 5.00±0.46 αντίστοιχα, p=0.007 and p=0.031). Παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση της ανοσοέκφρασης του p53 στα ορώδη καρκινώματα (IHC score 5.28±0.26 vs 3.87±0.58 αντίστοιχα, p=0.032), στατιστικώς σημαντική αύξηση της ανοσοέκφρασης του bax στα ορώδη καρκινώματα συγκριτικά με τα καρκινοσαρκώματα (MMTs) (IHC score 3.64±0.24 vs 1.00±1.00 αντίστοιχα, p=0.041). Περαιτέρω σύγκριση ανά ζεύγος των υπολοίπων ιστολογικών υποτύπων όσον αφορά το ανοσοϊστοχημικό score δεν ανέδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορέςΓ) Η ανοσοέκφραση του ERCC-1 σχετίζεται με το διάστημα ελεύθερου νόσουΔεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στο χρονικό διάστημα ελεύθερου νόσου ( disease free interval (DFI) ) μεταξύ των ιστολογικών υποτύπων είτε με θετική είτε με αρνητική ανοσοέκφραση των i) p53 (48.07 ± 30.09 vs 54.33 ± 23.95 μήνες αντίστοιχα, p=0.58), ii) Bcl-2 (41.65 ± 27.75 vs 53.68 ± 26.29 μήνες αντίστοιχα, p=0.22) iii) Bax (51.59 ± 30.30 vs 46.39 ± 27.70 μήνες αντίστοιχα, p=0.82). Αντιθέτως , ανεξάρτητα από τον ιστολογικό υπότυπο, καρκινώματα με θετική ανοσοέκφραση του ERCC-1 παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικά υψηλό DFI εν συγκρίσει με τα καρκινώματα με αρνητική ανοσοέκφραση του ERCC-1 (54.02 ± 29.75 vs 37.93 ± 24.32 μήνες αντίστοιχα, p=0.022)Συμπεράσματα : Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης μας, ασθενείς με ERCC-1 (+) ωοθηκικά καρκινώματα παρουσίασαν μεγαλύτερο διάστημα ελευθέρο νόσου (disease free interval-DFI) σε σύγκριση με ασθενείς με ERCC-1 (-) ωοθηκικά καρκινώματα (ανεξάρτητα από ιστολογικό υπότυπο). Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες στις οποίες η υψηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση του ERCC-1 φαίνεται να συσχετίζεται με την κακή πρόγνωση ασθενών.Όσον αφορά στις στατιστικές παρατηρήσεις για τα υπόλοιπα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας (p53 , bcl-2 , bax) υπήρχαν συμπεράσματα με διαφορετικά αποτελέσματα από αντίστοιχα άλλων μελετών. Ενδεικτικά αναφέρουμε ότι στη μελέτη μας το ογκογονίδιο p53 δε φαίνεται να συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών , η έκφραση της πρωτείνης bcl2 δεν συσχετίζεται με τον ιστολογικό υπότυπο, με την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και τη διαφοροποίηση του όγκου και η ανοσοέκφραση του bax δεν επηρεάζεται από τον ιστολογικό υπότυπο του όγκου. Όλες οι προαναφερθείσες παρατηρήσεις συνιστούν ενδείξεις ότι υπάρχουν διαφορές στη βιολογική συμπεριφορά των ωοθηκικών όγκων και αυτό φαίνεται να αντικατοπτρίζεται και στην ανοσοϊστοχημική έκφραση ποικίλων αντισωμάτων. Προσπαθώντας να εξηγήσει κανείς τη διαφορετική αυτή βιολογική συμπεριφορά των ωοθηκικών καρκινωμάτων είναι ενδιαφέρον να μελετήσει το μηχανισμό καρκινογένεσης που οδηγεί στην ανάπτυξη αυτών. Είναι γνωστό ότι οι επιθηλιακοί όγκοι ωοθηκών , αν και προέρχονται από το ίδιο επιθήλιο , παρουσιάζουν μια μορφολογική και βιολογική ετερογένεια και έτσι διακρίνουμε διαφόρους ιστολογικούς υποτύπους (ορώδη , βλεννώδη , ενδομητριοειδή , διαυγοκυτταρικά νεοπλάσματα κ.α.). Η ποικιλομορφία αυτή ερμηνεύεται από πολλούς μελετητές ως αποτέλεσμα της ξεχωριστής γενετικής ταυτότητας που έχει το καθένα από αυτά. Φαίνεται ότι υπάρχουν διαφορετικά μονοπάτια καρκινογένεσης και ανάλογα με τις μεταλλάξεις που συμβαίνουν σε αυτά προκύπτουν συγκεκριμένοι τύποι όγκων. Ωστόσο μεμονωμένες γενετικές αλλαγές (single-genes alterations) δε φαίνεται να καθορίζουν τη γενετική ταυτότητα και εν τέλει τη βιολογική συμπεριφορά ενός όγκου. Πιθανότατα, τα μοριακά φαινόμενα που συμβαίνουν κατά την πορεία του μονοπατιού είναι πολυσύνθετα και ακόμη μη πλήρως κατανοητά, είναι δε υπεύθυνα για το χαρακτηρισμό κάθε ωοθηκικού καρκινώματος ως ειδική νοσολογική οντότητα (distinct disease).Συμπερασματικά , τα αποτελέσματα της μελέτης μας δεν κατέδειξαν συσχέτιση της έκφρασης των πρωτεινών που σχετίζονται με την απόπτωση ( p53, bcl2 και Bax) και της πορείας των ωοθηκικών καρκινωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν. Αναφορικά με το ERCC-1 καταδείχτηκε οτι αυτό εκφράζεται διαφορετικά σε κάθε κακοήθη επιθηλιακό όγκο των ωοθηκών. Το γεγονός αυτό μπορεί να είναι αποτέλεσμα της ξεχωριστής μοριακής οδού που ακολουθεί η ιστογέννεση των νεοπλασμάτων αυτών. Παρ όλα αυτά, όπως φάνηκε από τη μελέτη μας και ανεξάρτητα από ιστολογικό υπότυπο, ασθενείς με ERCC-1 (+) ωοθηκικά καρκινώματα παρουσίασαν μεγαλύτερο διάστημα ελευθέρο νόσου (disease free interval-DFI) σε σύγκριση με ασθενείς με ERCC-1 (-) ωοθηκικά καρκινώματα. Το γεγονός αυτό πιθανόν να έχει προγνωστική σημασία και περαιτέρω μελέτες πάνω στον τον τομέα αυτό ενδεχομένως να οδηγήσουν σε χρήσιμα συμπεράσματα προς όφελος των ασθενών.