Ανίχνευση του ογκογονιδίου HPV16 E7 σε επιθηλιακά καρκινώματα. Συσχέτιση με την υπερμεθυλίωση στον προαγωγέα του γονιδίου p16
Authors: Κρικέλης Δημήτριος 
Published: January 2014

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Η επίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα παρουσιάζει ιδιαίτερη αύξηση την τελευταία 20ετία λαμβάνοντας διαστάσεις επιδημίας. Παρά την πρόοδο στους τομείς της πρόληψης και της θεραπείας του καρκίνου, η 5ετής επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει πτωχή, κυρίως λόγω του προχωρημένου σταδίου κατά τη διάγνωση και των μέτρια αποτελεσματικών θεραπειών που είναι διαθέσιμες. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το κάπνισμα είναι η κύρια αιτία που οδηγεί σε καρκίνο του πνεύμονα, όμως δεν μπορεί να εξηγήσει όλες τις περιπτώσεις καθώς υπάρχει σημαντικός αριθμός ασθενών που δεν είναι καπνιστές. Οι πιθανοί επιπρόσθετοι παράγοντες κινδύνου που ενοχοποιούνται είναι τα χημικά καρκινογόνα, η ακτινοβολία και η ατμοσφαιρική ρύπανση. Η πρόοδος της μοριακής βιολογίας έχει οδηγήσει στη διαλεύκανση ορισμένων ενδοκυττάριων διαδικασιών που οδηγούν στην καρκινογένεση. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο, υπάρχει ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών που ενοχοποιούν τη συμμετοχή του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) στην καρκινογένεση του πνεύμονα, οι οποίες συχνά εμφανίζουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Οι μελέτες αυτές συχνά αφορούν στην ανίχνευση διαφόρων τμημάτων του ογκογονιδίου Ε7 το οποίο, μαζί με το γονίδιο Ε6, είναι κυρίως υπεύθυνο για την ογκογόνο δράση του ιού. Η ανάπτυξη εμβολίων έναντι του ιού HPV έχει αναθερμάνει το ενδιαφέρον σχετικά με την πιθανή συμμετοχή του ιού στον καρκίνο του πνεύμονα. Παράλληλα, γίνεται μεγάλη προσπάθεια ώστε να αναγνωριστούν καινούριοι μοριακοί δείκτες πρώιμης διάγνωσης του καρκίνου του πνεύμονα, όπως είναι η υπερμεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16, η οποία υποδηλώνει την επιγενετική αλλοίωση στον πνευμονικό ιστό. H παρούσα μελέτη αφορά στη διερεύνηση της παρουσίας στοιχείων της αλληλουχίας του ιού, που θεωρούνται υπεύθυνα για την ογκογόνο δράση του, καθώς και στη συσχέτιση αυτών με επιγενετικές αλλοιώσεις σε καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, έγινε συστηματικός έλεγχος για την ανίχνευση ενός εκ των δύο κυρίων ογκογονιδίων του ιού, του HPV16 E7, και τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τη μεθυλίωση του γονιδίου p16. Συνολικά αναλύθηκαν 74 δείγματα (58 δείγματα καρκινικού πνευμονικού ιστού και βρογχοκυψελιδικών εκπλυμάτων και 16 δείγματα παρακείμενου μακροσκοπικά φυσιολογικού πνευμονικού ιστού). Για να διαλευκανθούν τα αντικρουόμενα, σε ορισμένες περιπτώσεις, αποτελέσματα αναφορικά με την παρουσία του γονιδίου HPV16 E7, σχεδιάστηκαν τέσσερα διαφορετικά πειραματικά πρωτόκολλα προκειμένου να ανιχνευθούν επικαλυπτόμενα τμήματα του πλαισίου ανάγνωσης του ογκογονιδίου Ε7 (100-69%). Τα πρωτόκολλα αυτά ελέγχθηκαν σε δείγματα DNA από 65 τραχηλικά επιχρίσματα, ορισμένα από τα οποία ήταν θετικά για την παρουσία του ιού. Ανάλυση των δειγμάτων από καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο 1 ανέδειξε καθολική απουσία του πλήρους πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου Ε7. Απεναντίας, όταν για τη μεγέθυνση του ίδιου τμήματος χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές που περιείχαν έναν πολυσυνδέτη στα άκρα τους (πειραματικό πρωτόκολλο 2), τα αποτελέσματα ανίχνευσης ήταν σε μεγάλο βαθμό θετικά για την παρουσία του γονιδίου Ε7 (47/74, 63.5%), όμως τα προϊόντα ανίχνευσης δεν ήταν ειδικά, όπως κατέδειξε η αδυναμία πέψης τους με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και AvaII καθώς και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας τους. Η χρησιμοποίηση αποδιατακτικών παραγόντων (DMSO), πολυμεράσης υψηλής πιστότητας και υψηλότερων θερμοκρασιών μετουσίωσης δε βελτίωσαν το αποτέλεσμα της μεγέθυνσης, γεγονός που πιθανότατα υποδηλώνει την απουσία κάποιων από τις αλληλουχίες-στόχους στα άκρα του γονιδίου Ε7. Ακολούθως σχεδιάστηκαν δύο επιπρόσθετα πειραματικά πρωτόκολλα μεγέθυνσης (πειραματικά πρωτόκολλα 3 και 4) από τα οποία παραλήφθηκαν οι περιοχές στα άκρα της αλληλουχίας του Ε7, οι οποίες θα ήταν δυνατόν να εμφανίζουν ιδιαίτερα σύνθετη δευτεροταγή δομή κατά την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA του ιού. Τα πρωτόκολλα αυτά ανέδειξαν την παρουσία δύο μικρότερων τμημάτων του γονιδίου Ε7, των Ε7595-Ε7822 και Ε7620-Ε7822 (και στις δύο περιπτώσεις 12 θετικά από τα 28 δείγματα που εξετάσθηκαν), τα οποία υποβλήθηκαν επιτυχώς σε πέψη με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και AvaII. Η συμφωνία των αποτελεσμάτων μεταξύ των πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης 3 και 4 ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητική και μόνο στο 12.5% των περιπτώσεων το μικρότερο τμήμα του γονιδίου Ε7 ανιχνεύτηκε μόνο με το ένα πειραματικό πρωτόκολλο μεγέθυνσης. Η ανάλυση της αλληλουχίας των προϊόντων των πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης 3 και 4 απέδειξε ότι οι αναμενόμενες αλληλουχίες ήταν παρούσες και εμφάνιζαν πλήρη ομολογία με αυτές του ιού. Είναι αξιοσημείωτο ότι και τα τέσσερα πειραματικά πρωτόκολλα μπορούσαν να ανιχνεύσουν ειδικά το γονίδιο HPV16 E7 σε επιχρίσματα καρκίνου τραχήλου της μήτρας θετικά για τον ιό HPV16. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Ε7, χρησιμοποιώντας τα πειραματικά πρωτόκολλα 2 και 4, δεν κατέδειξε μεταγραφική ενεργότητα του γονιδίου αυτού στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα που εξετάσθηκαν. Σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου p16 και την πιθανή σχέση με την παρουσία του ιού HPV16 στον καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με τα πειραματικά πρωτόκολλα 3 και 4, η στατιστική ανάλυση δεν ανέδειξε σημαντική συσχέτιση. Η μόνη συσχέτιση που είναι αξιοσημείωτη είναι μεταξύ της παρουσίας του γονιδίου Ε7 σε τραχηλικά επιχρίσματα υγιών καπνιστριών γυναικών και της βαρύτητας του καπνίσματος. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη κατέδειξε την παρουσία του ογκογονιδίου HPV16 E7 στον καρκίνο του πνεύμονα σε σημαντικό βαθμό. Τα φαινομενικά αντικρουόμενα αποτελέσματα των διαφορετικών πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη για την ανίχνευση του γονιδίου Ε7, είναι σύμφωνα με τα αντιφατικά αποτελέσματα προηγούμενων μελετών για τις ίδιες περίπου περιοχές που ελέγχθηκαν στην παρούσα μελέτη. Συγκεκριμένα, μελέτες που αφορούσαν στην ανίχνευση του πλήρους πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου Ε7, παρουσίαζαν την πλήρη έλλειψη ή πολύ χαμηλή συχνότητα του ιού σε καρκίνο του πνεύμονα, σε αντίθεση με μελέτες που στόχευαν στον έλεγχο τμήματος του γονιδίου HPV16 E7 και κατέγραφαν την πολύ συχνή παρουσία ιικών αλληλουχιών σε καρκίνο του πνεύμονα. Παράλληλα, η παρούσα μελέτη παρέχει ένα πιθανό μοντέλο που θα μπορούσε να εξηγήσει τις παραπάνω αντιφάσεις, το οποίο βασίζεται στην ανάλυση της πολυπλοκότητας διαμόρφωσης της αποδιαταγμένης αλληλουχίας στόχου. Από την παρούσα μελέτη, λοιπόν, αλλά και από το σύνολο της βιβλιογραφίας συμπεραίνεται ότι τμήμα του γονιδίου HPV16 E7 περιλαμβάνεται συχνά σε καρκίνο του πνεύμονα και σπανιότερα σε παρακείμενο ιστό, αλλά η παρουσία ολόκληρου του πλαισίου ανάγνωσης του ιού είναι σπάνια ή απουσιάζει στα ίδια δείγματα. Ωστόσο, η παρουσία των τμημάτων αυτών δε συσχετίζεται με την παρουσία του ιού και πιθανώς συνδέεται αρνητικά με τη μεθυλίωση στο γονίδιο p16. Τέλος, από τα προαναφερθέντα αποτελέσματα των μελετών προκύπτει ότι για τον τεκμηριωμένο έλεγχο της παρουσίας του ιού είναι απαραίτητη η χρήση δεύτερης μεθόδου ελέγχου του προϊόντος, όπως η επίδραση με ενδονουκλεάσες περιορισμού ή η ανάλυση της αλληλουχίας των προϊόντων. Tα δεδομένα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν ότι μεταξύ των ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του πνεύμονα είναι συχνή η παρελθούσα λοίμωξη με τον ιό, κατάλοιπο της οποίας είναι πιθανότατα η παρουσία τμήματος του ογκογονιδίου HPV16 Ε7, το οποίο περιέχει έναν δάκτυλο ψευδαργύρου. To γεγονός αυτό θα μπορούσε να επηρεάσει τη δράση άλλων γνωστών μεταγραφικών παραγόντων, που είναι βιβλιογραφικά γνωστό ότι αποτελούν στόχο της ενσωμάτωσης του ιού, όπως το c-Myc. Γίνεται λοιπόν φανερό, ότι απαιτούνται εκτεταμένες μελέτες σχετικά με τη συχνότητα παρουσίας, τη θέση και τον τρόπο ενσωμάτωσης του γονιδίου HPV16 E7 τόσο σε ασθενείς όσο και σε μη επεμβατικό υλικό από υγιή άτομα, ώστε να εκτιμηθεί η σημασία των ευρημάτων της τυχόν εμπλοκής του ιού στην καρκινογένεση του πνεύμονα.