Αξιοποίηση της κινναμωμικής ομάδας στον σχεδιασμό, σύνθεση και φαρμακοχημική μελέτη νέων παραγώγων με δράση σε πολλαπλούς βιολογικούς στόχους
Authors: Πεπερίδου Αικατερίνη 
Published: September 2021

Τα παράγωγα των κινναμωμικών οξέων αποτελούν μια ομάδα χημικών ενώσεων με τεράστια ποικιλία βιολογικών δράσεων. Μεταξύ των δράσεων αυτών συγκαταλέγονται η αντιφλεγμονώδης, η οποία εκδηλώνεται μέσω της αναστολής διαφόρων ενζύμων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της φλεγμονής, η αντιοξειδωτική, μέσω της παγίδευσης ελευθέρων ριζών, η αντιμικροβιακή, η αντικαρκινική και η αναλγητική. Επιπλέον, τα παράγωγα του κινναμωμικού οξέος απαντώνται σε διάφορα φυτά και αποτελούν πρόδρομες ενώσεις κουμαρινικών παραγώγων. Για τους παραπάνω λόγους, οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν ιδιαίτερο συνθετικό και βιολογικό ενδιαφέρον τόσο ως τελικά, αλλά και ως ενδιάμεσα προϊόντα.Η θεραπεία πολυπαραγοντικών ασθενειών, στην οποία εμπλέκονται περισσότεροι από ένα βιολογικοί στόχοι (ένζυμα ή πρωτεϊνική υποδοχείς), κεντρίζει το ενδιαφέρον ερευνητών, καθώς ένα μόνο φάρμακο συχνά καθίσταται ανεπαρκές και απαιτείται θεραπευτική προσέγγιση μέσω συνδυασμού φαρμάκων με διαφορετικά θεραπευτικά προφίλ. Σε τέτοιου είδους πολυπαραγοντικά φαινόμενα, όπως η ανάπτυξη φλεγμονής, η πήξη του αίματος και η ανάπτυξη καρκίνου, εμπλέκονται διάφορα ένζυμα όπως η κυκλοξυγονάση (COX), η λιποξυγονάση (LOX), πρωτεολυτικά ένζυμα αλλά και η καρβονική ανυδράση η hCA IX που αποτελούν μοριακούς στόχους για την ανάπτυξη πολυδύναμων μορίων. Για την αντιμετώπιση πολυπαραγοντικών καταστάσεων έχει προταθεί η χρήση υβριδικών φαρμάκων, τα οποία συνδυάζουν δύο ή περισσότερες φαρμακοφόρες ομάδες σε ένα ενιαίο μόριο, σηματοδοτώντας την εκδήλωση έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος αναφορικά με τον σχεδιασμό και τη σύνθεση πολυλειτουργικών υβριδικών μορίων. Έχοντας ως βάση πρότερες ερευνητικές προσπάθειες όπου κατάλληλα υποκατεστημένα κινναμωμικά οξέα εμφάνισαν ικανοποιητική αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής και με στόχο τον σχεδιασμό δραστικότερων αναστολέων LOX, πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσδεσης (virtual screening), χρησιμοποιώντας μοντέλα λιποξυγονάσης S-LOX-1, και 2D-QSAR αναλύσεις, όπου επιλέχθηκαν υβριδικά παράγωγα του κινναμωμικού οξέος με δράση σε πολλαπλούς στόχους. Για τον σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων πλειοτροπικών ενώσεων, συνδυάστηκαν παραγώγα του κινναμωμικού οξέος με γνωστά φαρμακομόρια (π.χ. παρακεταμόλη, προπρανολόλη, ατενολόλη, υμεχρωμόνη, 1-αδαμαντιλαμίνη, 1-αδαμαντανόλη, βενζοκαϊνη, σουλφοναμίδια) ή «φαρμακομιμητικά» μόρια (π.χ. 4-, 7-, κουμαρίνες, μ-ακετάμιδοφαινόλη, π-/ μ-αμινοφαινόλη, βενζυλαμινο-αιθανόλη). Τα νέα υβριδικά παράγωγα διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: α) εστέρες του κινναμωμικού οξέος και β) αμίδια του κινναμωμικού οξέος. Η επιλογή επίσης του κουμαρινικού συστήματος ως δομικού σκελετού των ενώσεων που σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν, βασίστηκε στο γεγονός ότι τα κουμαρινικά παράγωγα εμφανίζουν ανάλογες προς τα κινναμωμικά παράγωγα δράσεις, μεταξύ των οποίων αναφέρονται η αντιφλεγμονώδης, η αντιοξειδωτική και η αντικαρκινική. Παράλληλα, το γεγονός ότι ο κουμαρινικός δακτύλιος αποτελεί εσωτερικό εστέρα του ο-υδροξυ κινναμωμικού οξέος, σηματοδοτώντας τη χημική συγγένεια μεταξύ των κινναμωμικών και κουμαρινικών παραγώγων, συμπεριελήφθησαν και κουμαρινικά παράγωγα στη μελέτη. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι τα 6- και 7- ή 6,7-δισυποκατεστημένα κουμαρινικά παράγωγα εμφανίζουν αποτελεσματική ανασταλτική δράση έναντι των σχετιζόμενων με καρκίνο ισομορφών καρβονικής ανυδράσης IX και XII. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν μη σουλφοναμιδικοί αναστολείς καρβονικής ανυδράσης, 6/7-κουμαρινυλοξυ-ακεταμίδια, συνδυάζοντας παράγωγα 6/7 υδροξυ υποκατεστημένης κουμαρίνης με την ομάδα του οξικού οξέος (μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη παράγωγα του οξικού οξέος είναι γνωστά στη βιβλιογραφία), η οποία συζευγνύεται με ομάδες που εμφανίζουν φαρμακο-ομοιότητα (φαιναιθυλαμίνη, βενζυλαμίνη, ανιλίνη, ο-αμινοβενζοϊκός μεθυλεστέρας, ομάδες πυριδίνης, μορφολίνης και πιπεριδίνης κ.α.), στοχεύοντας σε πιθανή εμφάνιση πλειοτρόπου δράσης.Για τη σύνθεση των πρόδρομων κινναμωμικών οξέων έλαβε χώρο η αντίδραση Knoevenagel-Doebner μεταξύ της κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης και του μηλονικού οξέος παρουσία βάσεων. Η σύνθεση των 6,/7- κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων πραγματοποιήθηκε βάση γνωστής κατάλληλα τροποποιημένης αντίδρασης αιθεροποίησης μεταξύ της εμπορικά διαθέσιμης 6- ή 7- κουμαρίνης και του ιωδοοξικό αιθυλεστέρα και ακολούθως υδρόλυση προς παρασκευή κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων. Οι ενώσεις λήφθηκαν με ιδιαίτερα ικανοποιητικές αποδόσεις, ενώ τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα ταυτίζονται με τα αναφερόμενα στη σχετική βιβλιογραφία. Για τη σύνθεση των νέων υβριδικών ενώσεων του κινναμωμικού οξέος, εφαρμόστηκαν γνωστές αλλά και τροποποιημένες αντιδράσεις και τεχνικές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, με βασικό στόχο την εξεύρεση μεθόδων απλών στην εφαρμογή και αποτελεσματικών ως προς την αποδόση. Η σύνθεση των κουμαρινυλ-οξυ ακεταμιδίων βασίστηκε στην αντίδραση σύζευξης μεταξύ των 6/7- κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων και των αρωματικών ή αλειφατικών αμινών. Για την ταυτοποίηση των δομών, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι ενόργανης ανάλυσης, φασματοσκοπία IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS(ΕSI), στοιχειακή ανάλυση και χρωματογραφικές μέθοδοι. Η λιποφιλικότητα είναι μια φυσικοχημική ιδιότητα που καθορίζει την απορρόφηση, κατανομή, δράση και απέκκριση των μορίων. Οι τιμές λιποφιλικότητας των ενώσεων υπολογίστηκαν θεωρητικά ως τιμές ClogP (C-QSAR, Bioloom Biobyte) και πειραματικά ως τιμές RM με τη μέθοδο χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης.Υπολογίστηκαν οι φυσικοχημικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες των νεοσυντιθέμενων ενώσεων με τη βοήθεια του προγράμματος C-QSAR και με την εκτέλεση του ελεύθερης πρόσβασης προγράμματος Molinspiration. Όλες οι ενώσεις εμφανίζουν μοριακό βάρος μικρότερο από 500, με εξαίρεση το μικτό υβρίδιο του φαινοξυκινναμωμικού οξέος με την μ-αμινοφαινόλη (ένωση 26), το οποίο παραβιάζει δύο κανόνες του Lipinski. Τα περισσότερα μόρια αποδεικνύεται ότι είναι δυνατόν να μεταφερθούν και να διαχυθούν διαμέσου βιολογικών μεμβρανών. Δέκα ενώσεις παραβιάζουν τον κανόνα του Lipiski ως προς την λιποφιλικότητα.Οι υβριδικές ενώσεις μελετήθηκαν με τη βοήθεια πειραμάτων in vitro και in vivo για τη δράση τους ως πιθανοί αναστολείς λιποξυγονάσης, ως προς την αντιοξειδωτική τους ικανότητα, ως πιθανοί αναστολείς του ενζύμου της θρυψίνης και ως πιθανοί αναστολείς των ισομορφών της καρβονικής ανυδράσης Ι, ΙΙ, ΙV, IX. Ειδικότερα, οι ενώσεις δοκιμάστηκαν στα παρακάτω πειράματα: Βιολογικές δοκιμασίες in vitro: 1. Αναστολή της υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το ΑΑΡΗ. 2. Αναστολή του ενζύμου της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης (από σόγια). 3. Αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης4.Αναστολή της δράσης διαφορετικών ισομορφών της καρβονικής ανυδράσης I, II, IV, IX. Βιολογικά πειράματα in vivo: Εκτέλεση αισθητικοκινητικών δοκιμασιών για την αξιολόγηση και πιθανή αποκατάσταση βλάβης ισχιακού περιφερικού νεύρου έπειτα από χορήγηση εφάπαξ δόσης του υβριδικού παραγώγου ναφθυλο-υποκατεστημένου κινναμωμικού οξέος με την παρακεταμόλη.Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν διαπιστώθηκε ότι οι περισσότερες ενώσεις παρουσίασαν ικανοποιητική ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το AAPH.Τα βιολογικά αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η πλειοψηφία των ενώσεων (2, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 22, 23, 24, 27, 28-33) αποτελούν πλειοτρόπα υβριδικά παράγωγα με εκδήλωση δράσης έναντι της λιποξυγονάσης και της θρυψίνης. Ειδικότερα η ένωση του ναφθυλο-υποκατεστημένου κινναμωμικού οξέος με την παρακεταμόλη (ένωση 3) αποτελεί δραστικό αναστολέα των ενζύμων LOX και θρυψίνης.Την ισχυρότερη δράση έναντι της S-LOX έδειξε η εστερική ένωση του φαινοξυ-κινναμωμικού οξέος με την 3-ακεταμιδοφαινόλη (ένωση 10) με ΙC50= 0.34 μM, ακολουθούμενη από την αμιδική ένωση 32 (φαινοκινναμωμικό οξύ με την προπρανολόλη) με ΙC50= 6 μM, συγκριτικά με την ένωση αναφοράς NDGA. Παράλληλα, η ένωση 32 συνδυάζει ισχυρή δράση σε δύο μοριακούς στόχους, την λιποξυγονάση και την θρυψίνη.Η ένωση με την ισχυρότερη δράση έναντι της θρυψίνης είναι ο εστέρας του διμεθοξυκινναμωμικού οξέος με την υμεχρωμόνη (ένωση 15: ΙC50 = 0.1 μM) ακολουθούμενη από τα υβρίδια της ατενολόλης που αποδείχθηκαν δραστικότερα των αντίστοιχων της προπρανολόλης. Μεταξύ των υβριδίων της παρακεταμόλης αξιοσημείωτη δράση εμφάνισαν τα παράγωγα 3, 5 και 8. Σημαντική δράση απέδειξε το παράγωγο του βρωμοβενζυλοξυκινναμωμικού οξέος με την υμεχρωμόνη (ένωση 14: ΙC50= 5 μM).Τα 6/7- παράγωγα του κουμαρινυλοξυ-οξικού οξέος εκλεκτικά αναστέλλουν την καρβονική ανυδράση ΙΧ, με ισχυρότερη την ένωση 39, που αποτελεί 6-υποκατεστημένο κουμαρινινυλοξυ-ακεταμίδιο που φέρει την ομάδα της βενζυλαμίνης.Οι ενώσεις 36, 37 συνδυάζουν ισχυρή δράση σε δύο μοριακούς στόχους στην καρβονική ανυδράση ΙΧ και στη λιποξυγονάση.Τέλος, τα αποτελέσματά από την in vivo μελέτη αποδεικνύουν ότι το υβριδικό παράγωγο της παρακεταμόλης (ένωση 3) βελτιώνει την λειτουργική αποκατάσταση του ισχιακού νεύρου σε επίμυες και φαίνεται να αποτελεί έναν υποσχόμενο παράγοντα για την θεραπεία τραυματισμών του περιφερικού νεύρου σε συνδυασμό με τις άλλες του δράσεις.