Μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου στον καρκίνο του μαστού με αξιοποίηση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών DNA
Authors: Μάρκου Αθηνά 
Published: January 2014

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιήθηκε η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών σφαιριδίων στη μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου στον καρκίνο του μαστού. Η ανάπτυξη και η αξιολόγηση της μεθοδολογίας βασίσθηκε στην μελέτη της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων σε κυκλοφορούντα στο περιφερικό αίμα καρκινικά κύτταρα που με βάση τα πολύ πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συσχετίζονται άμεσα με το μεταστατικό δυναμικό το όγκου. Μέχρι στιγμής δεν έχει δημοσιευθεί καμία εργασία στο συγκεκριμένο θέμα στη διεθνή βιβλιογραφία. Αξιοποιώντας την υπάρχουσα υποδομή και τεχνογνωσία των εργαστηρίων μας, αναπτύχθηκε μία αναλυτική μεθοδολογία για την ταυτόχρονη μελέτη 6 γονιδίων (CK-19, HER-2, MAGE-A3, hMAM, TWIST-1, PBGD) με βάση τις υγρές μικροσυστοιχίες. Η μέθοδος αυτή είναι απλή και αξιόπιστη, κατάλληλη για εφαρμογή σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων ενώ υπάρχει δυνατότητα επέκτασης της μεθόδου για μελέτης της έκφρασης έως και 100 γονιδίων ταυτόχρονα. Για την αναπτυχθείσα μέθοδο πραγματοποιήθηκαν πειράματα βελτιστοποίησης σε όλα τα στάδια του πρωτοκόλλου ώστε να λαμβάνεται το βέλτιστο σήμα και να διασφαλιστεί η εγκυρότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Ακολούθως, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία αυτή για τη μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου μέσω προσδιορισμού κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα σε ειδικά επιλεγμένη ομάδα ασθενών, αξιοποιώντας το ήδη διαθέσιμο και πολύ καλά μελετημένο κλινικό υλικό της ομάδας μας. Η προσέγγιση αυτή θα επιτρέψει την ευρύτερη εφαρμογή των μικροσυστοιχιών στη μελέτη του καρκίνου του μαστού, και θα δώσει τη δυνατότητα εξαγωγής σημαντικών συμπερασμάτων ως προς την πιθανότητα πρόβλεψης της πορείας της νόσου από τα αρχικά της στάδια μέσω της έγκαιρης μοριακής διάγνωσης της μικρομεταστατικής νόσου, με κύρια συνέπεια την ιδιαίτερη αξιολόγηση για κάθε ασθενή επιλογής της θεραπευτικής αντιμετώπισης. Από την εφαρμογή της μεθόδου στα κλινικά δείγματα προέκυψε ότι ανιχνεύτηκε τουλάχιστον ένα γονίδιο στο 57.8% των ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού προ επικουρικής χημειοθεραπείας και παρόλα που τα ποσοστά ανίχνευσης ήταν μειωμένα σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού εντούτοις υπήρχαν και 2 δείγματα στα οποία ανιχνεύτηκαν και τα 6 γονίδια (3.1%). Η ανάπτυξη μεθοδολογίας με βάση το σύστημα των ηλεκτρονικών μικροσυστοιχιών αν και επιχειρήθηκε διεξοδικά και με πολλές διαφορετικές προσεγγίσεις, εντούτοις δεν οδήγησε σε θετικά αποτελέσματα λόγω ανυπέρβλητων τεχνικών δυσκολιών και εξαιρετικά υψηλού κόστους των αναλωσίμων. Επιπλέον το σύστημα αυτό δεν είχε την απαραίτητη ευαισθησία για να εφαρμοστεί σε επίπεδο RNA στα CTCs, έστω και μετά την γραμμική ενίσχυση του mRNA, αλλά ακόμα και έπειτα από την εκθετική ενίσχυση με PCR δεν αντιμετωπίστηκε το πρόβλημα αυτό. Τέλος, μελετήσαμε για πρώτη φορά την έκφραση των ώριμων miRNAs στα CTCs ασθενών με καρκίνο του μαστού. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μεθοδολογία real-time RT-PCR για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ώριμου let-7a, miR-21 και miR-10b χωριστά και εφαρμόστηκε η αναπτυχθείσα μέθοδος σε δείγματα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Με βάση τα πειραματικά μας αποτελέσματα βρέθηκε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-21 ήταν το ίδιο για όλα τα δείγματα στο κλάσμα των CTC και δεν υπήρχε καμία διαφοροποίηση στην τιμή των Cq μεταξύ των φυσιολογικών δειγμάτων και των δειγμάτων που προέρχονται από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Η έκφραση του ώριμου το miR-10b δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα από τα εξεταζόμενα δείγματα παρόλο που το θετικό δείγμα ελέγχου επιβεβαίωνε πάντα την σωστή πορεία της μεθόδου. Αντίθετα, παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του ώριμου let-7a στο κλάσμα των CTCs των υγιών αιμοδοτών ενώ στο αντίστοιχο κλάσμα των δειγμάτων από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού η έκφραση του ανιχνεύτηκε σε 10 από τα 20 δείγματα (50 %)