Acoustic and optical characterization of soft biological matter and biopolymers
Authors: Χρονάκη Δήμητρα 
Published: September 2021

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή ο ακουστικός βιοαισθητήρας QCM-D χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με διάφορες βιοφυσικές τεχνικές με σκοπό την παρακολούθηση της προσρόφησης διαφόρων βιολογικών «οντοτήτων» στην διεπιφάνεια στερού/υγρού. Οι «οντότητες» που θα μας απασχολήσουν σε αυτή τη διατριβή είναι: μαλακή βιολογική ύλη (κύτταρα) και βιοπολυμερή (πολυμερή και πρωτεΐνες). Ιδιαίτερη προσπάθεια καταβάλλεται για την μελέτη και τον χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ δείγματος και υποστρώματος. Ο ακουστικός βιοαισθητήρας QCM-D χρησιμοποιήθηκε για την διάκριση μεταξύ δυο κυτταρικών σειρών: υγιή και καρκινικά ανθρώπινα κύτταρα θυροειδή αδένα. Τρεις επιφάνειες χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για τις μελέτες κυτταρικής προσκόλλησης: τιτάνιο, χρυσός και χρυσός με επικαλύψη από ινωδογόνο (fibrinogen). Η κυτταρική προσκόλληση στις τρεις επιφάνειες καταγράφηκε σε πραγματικό χρόνο από τον QCM-D και τα ακουστικά σήματα που αποκτήθηκαν είναι: η συχνότητα, η ενεργειακή απώλεια, ο ακουστικός λόγος (ενεργειακή απώλεια ανά μονάδα μάζας που προσδένεται στην επιφάνεια) και ο ρυθμός κυτταρικής πρόσδεσης. Παράλληλα, εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης χρησιμοποιήθηκαν για την παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων που προσκολλήθηκαν στις τρεις επιφάνειες. Ο συνδυασμός των δυο αυτών τεχνικών προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η χρήση δυο επιφανειών για τα πειράματα κυτταρικής προσκόλλησης μπορεί να διακρίνει με ακρίβεια μεταξύ των δυο κυτταρικών τύπων και πιθανώς να μπορεί να αποτελέσει μια πλατφόρμα για την διάκριση μεταξύ υγιών και καρκινικών κυτταρικών τύπων θυροειδή αδένα. Ο QCM-D σε συνδυασμό με ένα φασματοσκοπικό ελλειψόμετρο χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της προσρόφησης του πολυμερούς PLL-g-PEG σε επιφάνεια χρυσού σε πραγματικό χρόνο και την μετέπειτα πρόσδεση μορίων DNA. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προσέφερε πληροφορίες σχετικά με την αρχιτεκτονική του πολυμερούς και των προσδεδεμένων μορίων DNA και πιο συγκεκριμένα σχετικά με το πάχος, την «υγρή» (μόρια + νερό) και «στεγνή» (μόρια) μάζα και τα ποσοστά νερού των σχηματισμένων φιλμ. Χρησιμοποιώντας αυτήν την νέα πληροφορία σε συνδυασμό με τις τιμές ακουστικού λόγου που αποκτήθηκαν για αυτά τα φιλμ, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα μόρια DNA προσδένονται με έναν επίπεδο τρόπο πάνω στο πολυμερές. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε την ιδιότητα του PLL-g-PEG πολυμερούς να έλκει μόρια DNA μέσω του θετικά φορτισμένου σκελετού από PLL και ταυτοχρόνως να απωθεί πρωτεΐνες μέσω των μονάδων PEG. Τέλος, επισημαίνουμε ότι η εξαιρετική αρχιτεκτονική του PLL-g-PEG πολυμερούς κατέστησε ικανή την πρόσδεση μορίων DNA από ολόκληρα κύτταρα Salmonela Thyphimurium μέσα σε πολύπλοκα δείγματα όπως γάλα. Επίσης, ο QCM-D σε συνδυασμό με την φασματοσκοπική ελλειψομετρία χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της προσρόφησης της αβιδίνης, στρεπταβιδίνης και νιουτραβιδίνης σε επιφάνεια χρυσού σε πραγματικό χρόνο. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προσέφερε πληροφορίες σχετικά με ιδιότητες των φιλμ όπως τον δείκτη διάθλασης, την «υγρή» (μόρια + νερό) και «στεγνή» (μόρια) μάζα και τα ποσοστά νερού. Επιπλέον, οι μετρήσεις με υπέρυθρη φασματοσκοπία (FTIR-ATR) χρησιμοποιήθηκαν για την εξιχνίαση της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών στο διάλυμα και μετά την προσρόφησή τους στην επιφάνεια χρυσού. Οι μετρήσεις με φασματοσκοπία Raman χρησιμοποιήθηκαν μόνο για την επιβεβαίωση των ποσοστών δευτεροταγούς δομής στο διάλυμα που αποκτήθηκαν με την χρήση FTIR-ATR. Τα ακουστικά πειραματικά δεδομένα προτείνουν ότι η προσρόφηση της νιουτραβιδίνης στο χρυσό είναι πολύ διαφορετική απ’ αυτή της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης. Η νιουτραβιδίνη πάντα έδινε μεγαλύτερες τιμές σε ενεργειακή απώλεια και ακουστικό λόγο συγκριτικά με την αβιδίνη και στρεπταβιδίνη. Οι χαμηλές τιμές ακουστικού λόγου της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης υποδηλώνουν την σφιχτή αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών αυτών με τον χρυσό που πιθανώς οδηγεί σε υψηλότερη απώλεια β-φύλλων συγκριτικά με την νιουτραβιδίνη. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προτείνει ότι τα φιλμ νιουτραβιδίνης περιέχουν περισσότερο νερό απ’ αυτά της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης. Επιπλέον, τα φιλμ νιουτραβιδίνης περιέχουν περισσότερους τύπους ή/και ποσότητα μορίων νερού συγκριτικά με τα φιλμ αβιδίνης και στρεπταβιδίνης, όπως προκύπτει από τα ακουστικά και φασματοσκοπικά πειραματικά δεδομένα.