Μελέτη δομής και λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα
Authors: Μαστοροδήμος Βασίλειος 
Published: January 2014

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) ένα ένζυμο με σημαίνοντα ρόλο στο μεταβολισμό τουγλουταμικού θεωρείται πως εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, μολονότι νεότερες μελέτες έδειξαν εντόπισή της και εξωμιτοχονδριακά. Στον άνθρωπο υπάρχει σε δυο ισόμορφες. Η πρώτη (hGDH1) κωδικοποιείται από το γονίδιο GLUD1 το οποίο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (house-keeping), ενώ η δεύτερη (hGDH2) κωδικοποιείται από ένα φυλοσύνδετο μη περιέχων ιντρόνια γονίδιο (GLUD2), το οποίο εκφράζεται ειδικώς στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις. Η wild type hGDH1 είναι θερμοανθεκτική, έχει βασική δραστηριότητα 40 45% της μέγιστης και αναστέλλεται ισχυρά από το GTP σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις. Η wild type hGDH2 είναι θερμοασταθής, εμφανίζει χαμηλή βασική δραστηριότητα (5-10 % της μέγιστης) και δεν αναστέλλεται από το GTP. Ενεργοποιείται πλήρως σε αυξημένες συγκεντρώσεις ADP. Η λευκίνη δρα ως αλλοστερικός ενεργοποιητής σε μεγαλύτερο ποσοστό της hGDH2 απ’ ότι της hGDH1 και ενεργεί συνεργικά με το ADP σε μικρές συγκεντρώσεις. Με μεταλλαξιογένεση σε θέσεις στις οποίες διαφέρουν τα δυο ισοένζυμα βρέθηκε πως η αντικατάσταση της Gly 456 από Ala προσδίδει την ανθεκτικότητα στο GTP. Μια δεύτερη αντικατάσταση (Arg443 από Ser) ελαχιστοποιεί την βασική δραστικότητα (~3% της μέγιστης) και αποτρέπει την ενεργοποίηση από τη λευκίνη. Μικρές όμως ποσότητες ADP επιτρέπουν στη λευκίνη να το ενεργοποιήσει έως και >2,000%. Τέλος η Arg443 φαίνεται πως είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία στη θερμική αδρανοποίηση της wild type hGDH2. Η Arg443 βρίσκεται στην μικρή έλικα της κατερχόμενης αλυσίδας της antenna και συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου με τη Ser 409 της ανερχομένης α-έλικας της antenna γειτονικής υπομονάδας. Με σκοπό να εμβαθύνουμε περαιτέρω στον τρόπο ρύθμισης της wild type hGDH2 δημιουργήσαμε με μεταλλαξιογένεση θέσης 2 μεταλλαγμένες ισομορφές με αντικατάσταση της Ser409 με Arg ή Asp. Η Ser409Arg μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνισε πολύ χαμηλή βασική δραστηριότητα ανθεκτικότητα στη δράση του ADP και της λευκίνης και ευαισθησία στη συνεργική δράση ADP λευκίνης στη θερμική αδρανοποίηση. Η Ser409Asp μεταλλαγμένη hGDH1 εμφάνιζε χαμηλή βασική δραστηριότητα (3-5% της μέγιστης) και σημαντικά μικρότερη ανθεκτικότητα στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ διαπιστώθηκε συνεργεία μεταξύ ADP και L-λευκίνης μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ADP. Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πως η βασική αίτια της χαμηλής βασικής δραστηριότητας της wild type hGDH2 οφείλεται στην αλληλεπίδραση της Arg443 μιας υπομονάδος με την Ser409 γειτονικής υπομονάδας μέσω δεσμών Η, που αποτελεί το κριτικό γεγονός για το άνοιγμα/κλείσιμο της καταλυτικής σχισμής. Επιπλέον επιβεβαιώνεται πως η λευκίνη συνδέεται εντός του ενεργού κέντρου και συνεπώς απαραίτητη συνθήκη για τη δράση της αποτελεί η διάνοιξη της καταλυτικής σχισμής, γεγονός που επιτελείται με την αλληλεπίδραση Arg443 και Ser409. Η διπλά μεταλλαγμένη R443S/G456A hGDH1 που κατασκευάσαμε αναπαρήγαγε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ hGDH1 και hGDH2. Συγκεκριμένα εμφάνισε χαμηλή βασική δραστηριότητα (0.25% της μέγιστης), ήταν ευαίσθητη στη θερμότητα ήταν ~3 φορές πιο ανθεκτική στην ενεργοποίηση από το ADP σε σχέση με την wild type hGDH2 και επέδειξε παρόμοια με την wild type hGDH2 συμπεριφορά στην ανθεκτικότητα αναστολής από το GTP παρουσία ADP. Συνοπτικά υιοθετούσε συμπεριφορά ενδιάμεση της Arg443Ser μεταλλαγμένης hGDH1 και της hGDH2. Τέλος μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση της γλουταμικής αφυδρογονάσης με παροδική συν-διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών COS 7, HeLa, CHO HEK 293 και SH-SY5Y (κυττάρων νευροβλαστώματος) με το χιμαιρικό πλασμίδιο pEGFP-Ν3 GLUD1 (ή GLUD2) και με 3 πλασμιδιακούς φορείς τους pDsRed2-Mito, pDsRed2-Nuc και pDsRed2-ER-δείκτες υποκυτταρικής εντόπισης για συγκεκριμένα κυτταρικά οργανύλλια (μιτοχόνδρια, πυρήνας και ενδοπλασματικό δίκτυο αντιστοίχως). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και οι δυο ισομορφές hGDH1 και hGDH2 εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια. Σε μικρότερο ποσοστό εντοπιζόταν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ανθρωπίνων σωματικών και νευρικών κυττάρων, ενώ δεν υφίσταται πυρηνική μορφή GDH.