Immune response in head and neck cancer
Authors: Γκέγκα Αναστασία 
Published: February 2024

Ο καρκίνος της τραχηλοπροσωπικής χώρας, και ειδικότερα το καρκίνωμα από το πλακώδες επιθήλιο, το οποίο αποτελεί την πλειονότητα των περιπτώσεων, είναι η έκτη αιτία καρκίνου παγκοσμίως, με σημαντικά ποσοστά θνησιμότητας. Η χειρουργική αντιμετώπιση του όγκου σε αυτήν την περιοχή μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλη νοσηρότητα ή αισθητικές παραμορφώσεις. Από την άλλη πλευρά, πολλοί ασθενείς τείνουν να διαγιγνώσκονται όταν η νόσος έχει ήδη προχωρήσει, με αποτέλεσμα η χειρουργική επέμβαση να είναι αδύνατη και να απαιτούνται εναλλακτικές θεραπείες. Η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία είναι, φυσικά, δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες επιλογές και, τις τελευταίες δεκαετίες, η ανοσοθεραπεία είναι μια πολλά υποσχόμενη μορφή αντιμετώπισης, όσον αφορά τα θεραπευτικά αποτελέσματα, μόνη της ή σε συνδυασμό με χειρουργείο ή/και χημειο- και ακτινοθεραπεία. Το ανοσολογικό σύστημα κάθε ασθενούς ανταποκρίνεται διαφορετικά στον καρκίνο, επομένως η εφαρμογή της ανοσοθεραπείας θα πρέπει να εξατομικεύεται, προκειμένου οι ασθενείς να ωφεληθούν τα μέγιστα. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τις συνθήκες που κυριαρχούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου σε μια σειρά 106 περιπτώσεις καρκινώματος από το πλακώδες επιθήλιο της τραχηλοπροσωπικής χώρας (HNSCC), και πώς αυτές επηρεάζουν την ανοσολογική απόκριση έναντι των καρκινικών κυττάρων, μαζί με μια σειρά από χαρακτηριστικά όγκου. Ειδικότερα, εξετάσαμε τα χειρουργικά παρασκευάσματα από 33 ασθενείς με SCC του λάρυγγα, 13 ασθενείς με SCC της γλώσσας και 60 ασθενείς με SCC στο χείλος. Ελήφθησαν αντιπροσωπευτικές τομές από κάθε δείγμα και δημιουργήθηκαν μπλοκ ιστού σε παραφίνη. Κατά την εξέταση των περιπτώσεων SCC του λάρυγγα, οι ιστοπαθολογικές παράμετροι που ελήφθησαν υπόψη στην τρέχουσα ανάλυση ήταν το μέγεθος του όγκου (σε cm), η διήθηση των μαλακών μορίων έναντι του χόνδρου, η διήθηση λεμφαδένων και ο αριθμός των εκβλαστήσεων του όγκου στο μέτωπο διήθησης (tumor-budding - ΤΒ). Στην ανασκόπηση των δειγμάτων SCC των χειλέων, οι ιστολογικές παράμετροι που εξετάστηκαν ήταν το μέγεθος του όγκου (σε cm), το βάθος διήθησης (DOI) του όγκου (σε mm) και το TB. Ο περιορισμένος αριθμός περιστατικών με SCC της γλώσσας (δεκατρία) κατέστησε αδύνατη την εξαγωγή στατιστικά σημαντικών αποτελεσμάτων. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ανοσολογική απόκριση έναντι του όγκου, εκτιμήσαμε τα λεμφοκύτταρα που διηθούν τον όγκο (TILs) και τις τριτογενείς λεμφοειδείς δομές (TLSs) (με ή χωρίς βλαστικό κέντρο), ξεχωριστά στο διηθητικό όριο και εντός του στρώματος του όγκου. Εφαρμόσαμε τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας για το MIB1 για να αξιολογήσουμε την παρουσία μιτωτικής δραστηριότητας, SMA για την εντόπιση ινοβλαστών που σχετίζονται με τον όγκο (CAFs) στο στρώμα του όγκου, οι οποίες έχει βρεθεί να συν-δέονται με κακή πρόγνωση, και p16 για να αναγνωρίσουμε τυχόν προέλευση του όγκου λόγω ιογενούς HPV λοίμωξης. Η αγγειογενετική ικανότητα αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημεία για το CD31, το οποίο ανέδειξε τα τοιχώματα των μικρών αγγείων στο μέτωπο διήθησης με την υψηλότερη αγγειακή πυκνότητα και σε δύο διαδοχικά πεδία x200 προς τον κέντρο του όγκου (t1, t2, t3). Για να εκτιμήσουμε πιθανές συνθήκες υποξίας στο μικροπεριβάλλον του όγκου, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία για LDH5 και HIF1α. Τελος, χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο, κατηγοριοποιήσαμε τα TILs, της περιφέρειας του όγκου και του στρώματος, σε λεμφοκύτταρα CD4+, CD8+ και FOXP3+, τα οποία συσχετίστηκαν με όλες τις παραπάνω παραμέτρους. Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση και θεωρήσαμε στατιστικά σημαντικά τα αποτελέσματα με τιμή p <0,05.Οι πυκνότητες των TILs και TLSs αναλύθηκαν χωριστά και συγκρίθηκαν μεταξύ τους ανάλογα με τη θέση του όγκου. Η πυκνότητα των TILs και TLSs στην περιφέρεια του όγκου δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των καρκινωμάτων του λάρυγγα, της γλώσσας και των χειλέων (p=0,21 και p=0,44, αντίστοιχα). Στο εσωτερικό του όγκου, ωστόσο, η πυκνότητα των TILs και TLSs ήταν σημαντικά υψηλότερη στα καρκινώματα των χειλέων σε σύγκριση με τους όγκους στις άλλες θέσεις κεφαλής-τραχήλου (p=0,0004 και p=0,02, αντίστοιχα). Στον λάρυγγα, η πυκνότητα των TILs και TLSs ήταν σημαντικά υψηλότερη στο διηθητικό μέτωπο παρά στο στρώμα του όγκου (p<0,0001, αμφότερα). Η ανάλυση της πυκνότητας των TILs και της πυκνότητας των TLSs, στο διηθητικό όριο και στο εσωτερικό του όγκου, δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το μέγεθος του όγκου (p > 0,35). Η χαμηλή πυκνότητα των TILs εντός του στρώματος του όγκου συνδέθηκε οριακά με διήθηση του χόνδρου, αλλά όχι των μαλακών μορίων (p = 0,05). Η ανάλυση των TILs και TLSs, όσον αφορά την παρουσία μεταστατικής διήθησης των λεμφαδένων, έδειξε ότι η χαμηλή πυκνότητα TILs στην περιφέρεια του όγκου συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλότερο μεταστατικό δυναμικό στους επιχώριους λεμφαδένες (p = 0,03). Ο αυξημένος αριθμός TB συνδέθηκε με χαμηλή πυκνότητα TILs στο στρώμα του όγκου (p = 0,005), χαμηλή πυκνότητα TLS στο μέτωπο διήθησης (p = 0,02) και χαμηλή πυκνότητα TLSs στο εσωτερικό του όγκου (p = 0,002). Η έκφραση SMA δεν σχετιζόταν με την πυκνότητα των TILs και TLSs (p > 0,19). Όσον αφορά το p16, μόνο 10/33 όγκους έδειξαν αντιδραστικότητα σε πολύ χαμηλό ποσοστό καρκινικών κυττάρων (0–4%), επομένως περαιτέρω ανάλυση δεν ήταν εφικτή. Ο υψηλός δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού MIB1 συσχετίστηκε με χαμηλή πυκνότητα TILs στο μέτωπο διήθησης (p = 0,006, r = 0,47) και στο εσωτερικό του όγκου (p = 0,02, r = 0,40). Υψηλή έκφραση του HIF1α σημειώθηκε σε 18/33 όγκους του λάρυγγα και συνδέθηκε με χαμηλή πυκνότητα TILs και TLSs στο όριο διήθησης όγκου και εντός του στρώματος (p = 0,008, p = 0,02 και p = 0,003, p = 0,01 , αντίστοιχα). Υψηλή έκφραση της LDH5 σημειώθηκε σε 18/33 όγκους του λάρυγγα και συνδέθηκε με χαμηλή πυκνότητα TLS στην περιφέρεια και στις εσωτερικές περιοχές του όγκου (p = 0,048 και p = 0,007, αντίστοιχα). Η αγγειακή πυκνότητα (VD) ήταν υψηλότερη στο μέτωπο διήθησης σε σύγκριση με το στρώμα του όγκου (p < 0,0001). Η VD στο όριο διήθησης του όγκου σχετιζόταν άμεσα με την πυκνότητα των TILs (p = 0,02, r = 0,39) και την πυκνότητα των TLSs (p = 0,04, r = 0,36) στο μέτωπο διήθησης. Τα CD8+ και CD4+ TILs μειώθηκαν στο στρώμα του όγκου (p=0,01). Οι αναλογίες CD4+/CD8+ και FOXP3+/CD8+ (ρυθμιστικά/εκτελεστικά) δεν έδειξαν σημαντική διαφορά μεταξύ της περιφέρειας του όγκου και των έσω περιοχών (p > 0,07). Η ανάλυση του ποσοστού των υποτύπων CD8+, CD4+, FOXP3+ TILs και των αναλογιών CD4+/CD8+, FOXP3+/CD8+ (όπως αξιολογήθηκαν στο μέτωπο διήθησης του όγκου), μεταξύ των όγκων με και χωρίς διήθηση στον χόνδρο του λάρυγγα, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές. Παρατηρήθηκαν οριακά λιγότερα CD8+ TILs σε όγκους με διήθηση του χόνδρου (p = 0,07). Παρόμοια ανάλυση των υποτύπων των TILs εντός του στρώματος του όγκου δεν έδειξε καμία συσχέτιση με διήθηση του χόνδρου του λάρυγγα. Μια παραπλήσια ανάλυση δεν απέδειξε συσχέτιση με το μέγεθος του όγκου, την έκφραση SMA και το TB. Χρησιμοποιώντας την αναλογία VD t2/t1 και t3/t1 υπολογίσαμε την ικανότητα αγγειακής επιβίωσης (VSA) για κάθε όγκο. Αυτός ο δείκτης δείχνει την ικανότητα των αγγείων να επιβιώνουν εντός του στρώματος του όγκου. Χρησιμοποιώντας ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης, εκτιμήσαμε τη συσχέτιση των υποτύπων των TILs με την έκφραση των HIF1a, LDH5, VD (t1, t2 και t3) και VSA (t2 και t3) στο μέτωπο διήθησης του όγκου, όπου παρατηρήθηκε άμεση συσχέτιση των FOXP3+ TILs με το VSA t2 (οριακή σημαντικότητα p = 0,05). Στις εσωτερικές περιοχές όγκου σημειώθηκε άμεση συσχέτιση των CD4+ και FOXP3+ TILs και της FOXP3+/CD8+ αναλογίας με το VSA t2 (p = 0,008, 0,02 και 0,05, αντίστοιχα). Στο χείλος, η ανάλυση της πυκνότητας των TILs και της πυκνότητας των TLSs στο μέτωπο διήθησης και στο στρώμα του όγκου, έδειξε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερο αριθμό TILs σε μεγαλύτερους όγκους, τόσο στην περιφέρεια όσο και εντός του στρώματος του όγκου (p=0,05 και 0,008, αντίστοιχα). Δεν καταγράφηκε διαφορά μεταξύ των πυκνοτήτων των TLSs. Η πυκνότητα των TILs στο διηθητικό μέτωπο ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους με μεγαλύτερο DOI (p=0,01), αλλά δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των TLSs. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των TB με τη πυκνότητα των TILs ή TLSs. Υψηλή έκφραση SMA συνδέθηκε με χαμηλή πυκνότητα σε TILs στην περιφέρεια του όγκου (p=0,01). Υψηλή έκφραση HIF1α σημειώθηκε σε 30/60 καρκινώματα χειλέων και συνδέθηκε σημαντικά με χαμηλή πυκνότητα TILs στο διηθητικό όριο του όγκου (p=0,02). Υψηλή έκφραση LDH5 σημειώθηκε σε 40/60 καρκινώματα χειλέων και σχετίστηκε σημαντικά με χαμηλή πυκνότητα TILs στο μέτωπο διήθησης του όγκου (p=0,04). Η αγγειακή πυκνότητα VD μειώθηκε από την περιφέρεια του όγκου προς το κέντρο (p<0,0001). Σχετικά με την αγγειογένεση, η ανάλυση έδειξε σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της πυκνότητας των TILs στο μέτωπο διήθησης του όγκου και του VSA t2/t1 (p=0,009, r=0,33). Το κλάσμα των CD8+ TILs και FOXP3+ TILs ήταν μεγαλύτερο στο εσωτερικό του όγκου (p = 0,001 και 0,0006, αντίστοιχα). Η αναλογία FOXP3+/CD8+ αυξήθηκε σημαντικά εντός του στρώματος του όγκου (p = 0,002). Η ανάλυση των υποτύπων των TILs, CD8+, CD4+ και FOXP3+, και των αναλογιών CD4+/CD8+ και FOXP3+/CD8+ (όπως αξιολογήθηκαν στο όριο διήθησης του όγκου) δεν εμφάνισε σημαντική συσχέτιση με το μέγεθος του όγκου. Η ανάλυση στο στρώμα του όγκου έδειξε σημαντική μείωση των CD8+ TILs και αύξηση της αναλογίας FOXP3+/CD8+ σε μεγαλύτερους όγκους. Η ανάλυση στο μέτωπο διήθησης του όγκου μεταξύ όγκων των χειλέων, με και χωρίς διήθηση του μυός, έδειξε σημαντική μείωση του FOXP3+ και της αναλογίας FOXP3+/CD8+ σε όγκους με διήθηση του μυός, ενώ δε βρέθηκε συσχέτιση σε αντίστοιχη ανάλυση για το στρώμα του όγκου. Υπάρχει σημαντική μείωση της αναλογίας FOXP3+/CD8+ στην περιφέρεια του όγκου, σε όγκους με μεγάλο βάθος διήθησης, αλλά δεν υπάρχει ανάλογη συσχέτιση στις εσωτερικές περιοχές του όγκου. Η ανάλυση έδειξε σημαντική αύξηση των CD4+ TILs στο όριο διήθησης σε όγκους με υψηλό αριθμό TB, αλλά δεν βρέθηκε συσχέτιση των ΤΒ με τους υποτύπους CD στο εσωτερικό του όγκου. Σε όγκους με υψηλή έκφραση SMA υπάρχει σημαντική μείωση των CD8+ TILs στο μέτωπο διήθησης και σημαντική μείωση των CD8+ TILs και αύξηση της αναλογίας FOXP3+/CD8+ στις εσωτερικές περιοχές όγκου. Παρατηρήθηκε άμεση συσχέτιση του VD t1 με τα CD4+ και FOXP3+ TILs στην περιφέρεια του όγκου (p = 0,05 και 0,01, αντίστοιχα). Επιπλέον, το VD t1 συσχετίστηκε αντιστρόφως με τα CD8+ TILs στο διηθητικό όριο του όγκου (p = 0,01, r = 0,31). Η LDH5 σχετιζόταν άμεσα με υψηλά CD4+ TIL στην περιφέρεια του όγκου (p = 0,05, r = 0,26), ενώ ειδικά η πυρηνική έκφραση LDH5 συνδέθηκε άμεσα με τα FOXP3+ TILs (p = 0,01, r = 0,31) και την αναλογία FOXP3+/CD8+ (p = 0,03, r = 0,27). Στην παρούσα διατριβή, δίνουμε έμφαση στις συνθήκες που επικρατούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου και στον τρόπο με τον οποίο επηρεάζουν την ανοσολογική απόκριση. Τα SCC των χειλέων αναδείχθηκαν ως πιο “ανοσογόνα” σε σύγκριση με άλλα HNC. Στο SCC του λάρυγγα, η αραιή λεμφοκυτταρική διήθηση και η χαμηλή πυκνότητα σε TLSs σχετίζονταν με υποξικό περιβάλλον (υψηλότερη έκφραση HIF1α και LDH5), μετάσταση σε επιχώριους λεμφαδένες, μεγαλύτερο αριθμό TB στο διηθητικό όριο και ενισχυμένη αγγειογενετική ικανότητα του όγκου. Μεταξύ των διαφορετικών υποτύπων TILs, τα CD4+ και FOXP3+ TILs και η αναλογία FOXP3+/CD8+ συσχετίστηκαν άμεσα με την ικανότητα αγγειακής επιβίωσης (VSA). Στο SCC των χειλέων, η πτωχή λεμφοκυτταρική διήθηση σχετιζόταν με μεγαλύτερο μέγεθος όγκων, ικανότητα των όγκων να διηθούν σε βάθος τους ιστούς, πυκνή παρουσία ενεργοποιημένων ινοβλαστών του στρώματος και συνθήκες υποξίας. Η χαμηλή πυκνότητα CD8+ TILs και η υψηλή αναλογία FOXP3+/CD8+ χαρακτηρίζουν μεγαλύτερους όγκους και όγκους με έντονη μιτωτική και αγγειογενετική δραστηριότητα. Η μελέτη παρέχει πληροφορίες για την αλληλεπίδραση μεταξύ των συνθηκών που επικρατούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου και της ανοσολογικής απόκρισης, οι ο-ποίες μπορεί να φανούν χρήσιμες στην ανάπτυξη στρατηγικών ανοσοθεραπείας που στοχεύουν συστατικά του μικροπεριβάλλοντος.