Διερεύνηση της επίδρασης υποανασταλτικών συγκεντρώσεων τριαζολών στην παθογονικότητα ζυγομηκύτων
Authors: Λάμαρης Γρηγόριος 
Published: September 2021

Οι διηθητικές μηκυτιακές λοιμώξεις αποτελούν μείζονα αιτία θνησιμότητας και θνητότητας σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και λήπτες μοσχεύματος μυελού των οστών (1). Η αυξανόμενη επίπτωσή τους, έχει οδηγήσει στην χρήση της βορικοναζόλης(VRC) σαν προφυλακτική αγωγή σε ασθενείς υψηλού κινδύνου για την εκδήλωση μηκυτιακών λοιμώξεων (2). Παρά το ευρύ φάσμα δράσης, η VRC είναι ανενεργή απέναντι στους ζυγομήκυτες (3), οι οποίοι ευθύνονται για έναν αυξανόμενο αριθμό λοιμώξεων στους συγκεκριμένους ασθενείς (1, 4). Πρόσφατες μελέτες συσχετίζουν την αύξηση της επίπτωσης της ζυγομηκυτίασης με τη χρήση της VRC ως προφυλακτικής αγωγής (1,2, 5-9). Δεδομένου του σύνθετου μηχανισμού παθογονικότητας των ζυγομυκήτων, δεν είναι σαφές αν η αγωγή με VRC ευνοεί την ανάπτυξη των ζυγομυκήτων ως πίεση φυσικής επιλογής ή ευθέως επιδρώντας στην παθογονικότητά τους. Για τη διερεύνηση της επίδρασης της έκθεσης σε VRC στην παθογονικότητα των ζυγομυκήτων, χρησιμοποιήσαμε ως μοντέλο ξενιστή την μύγα Drosophila melanogaster(10-12). Προκειμένου να επαληθεύσουμε τα αρχικά μας ευρήματα σε έναν οργανισμό φυλογενετικά συγγενέστερο προς τον άνθρωπο, χρησιμοποιήσαμε ένα ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε θηλαστικά, με ποντικούς Balb/C. Yλικά και μέθοδοι. Xρησιμοποιήθηκαν 3 στελέχη ζυγομυκήτων (Rhizopus oryzae 557969, Rhizopusoryzae 518749 και Mucor circinelloides 48812) και ως μάρτυρα ένα στέλεχος Ασπεργίλλου(Aspergillus fumigatus 293), κονίδια των οποίων εκτέθηκαν σε VRC, ιτρακοναζόλη, κασποφουγκίνη ή αμφοτερικίνη Β με διαδοχικές καλλιέργειες σε μέσο που περιείχε μια υποανασταλτική συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου (13). Ώς μάρτυρες, τα ίδια στελέχη επωάστηκαν διαδοχικές φορές σε μέσο χωρίς αντιμηκυτιακό. Για το ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε μύγες D.melanogaster, χρησιμοποιήσαμε μύγες αγρίου τύπου OregonR (Wt) καθώς και γενετικά τροποποιημένες μύγες απο τις οποίες απουσιάζει το μονοπάτι Τοll (Tl), το οποίο προστατεύει τις μύγες Wt απο την πλειοψηφία των μηκυτιακών παθογόνων, αλλά όχι τους ζυγομήκυτες (12,13). Η μόλυνση πραγματοποιήθηκε με τρώση του θώρακα των μυγών με βελόνη πρότινοςεμβυθισμένη σε διάλυμα κονιδίων (106 κονίδια/ml)(12, 13). Η επιβίωση κατεγράφη για χρονικό διάστημα 8 ημερών μετά τη μόλυνση. Για το ζωικό μοντέλο ζυγομηκυτίασης σε θηλαστικά, χρησιμοποιήσαμε ποντικούς Balb/C, ανοσοκατεσταλμένους με τη χρήση κορτιζόνης (14). Η μόλυνση πραγματοποιήθηκε με ενδορινική ενστάλλαξη διαλύματος κονιδίων του στελέχους R.οryzae 557969 δύο διαφορετικών συγκεντρώσεων (5x104 κονίδια/ml και 106 κονίδια/ml) και η επιβίωση παρατηρήθηκε για 10 ημέρες.Για την ιστοπαθολογική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν πνεύμονες ποντικών απο κάθε πειραματική ομάδα που παρασκευάστηκαν διαδοχικές ημέρες μετά απο τη μόλυνση, ενώ η χρώση των δειγμάτων έγινε με η ωσίνη-αιματοξυλίνη, χρώση αργύρου Grocott-Gomori methenamine silver nitrate) και χρώση ιώδους της κρεσύλης (cresylviolet). Για την ανάλυση του μηκυτιακού φορτίου, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) με δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) R.οryzaeπου απομονώθηκε απο πνεύμονες μολυσμένων ποντικών. Για την μελέτη της μεταβολής στην έκφραση γονιδίων των ποντικών που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής αντίδρασης μετά τη μόλυνση, απομονώθηκε ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) απο τους πνεύμονες υγιών ποντικών καθώς και ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια R.οryzae(με ή χωρίς προηγούμενη έκθεση σε VRC) το οποίο και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (micro-arrays).Οι καμπύλες επιβίωσης για τις μύγες και τα ποντίκια επεξεργάστηκαν με ανάλυση Kaplan Meier και log rank test, προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη διαφορών μεταξύ των μαρτύρων (μύγες ή ποντίκια που μολύνθηκαν με μύκητες που δεν είχαν εκτεθεί σε αντιμηκυτιασικά) και των μυγών ή ποντικών αντίστοιχα που μολύνθηκαν με μήκυτες πρότινος εκτεθειμένους σε αντιμηκυτιακά. Η σύγκριση του μηκυτιακού φορτίου στους πνεύμονες διαφορετικών ομάδων ποντικών πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Mann-Whitney U test. Η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στις διαφορετικές ομάδες ποντικών πραγματοποιήθηκε με ανάλυση unpairedstudent t test και τη μέθοδο Benjamini-Hochberg. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όπου P < 0,05. Αποτελέσματα. Η μόλυνση μυγών Wt με R.oryzae 557969 οδήγησε στην εκδήλωση οξείας λοίμωξης με 39% θνητότητα, ενώ προηγούμενη έκθεση των κονιδίων σε VRC αύξησε τη θνητότητα σε 65% (P<0,001). Μόλυνση μυγών Tl με το ίδιο στέλεχος είχε ως αποτέλεσμα θνητότητα 54% (82% με προηγούμενη έκθεση σε VRC, P<0,001). Μόλυνση μυγών Wt με το στέλεχος R.oryzae 518749, είχε 64% θνητότητα, που αυξήθηκε σε 80% αν το κονίδια είχαν προηγουμένως εκτεθεί σε VRC (P=0,03). Μόλυνση μυγών Tl με το ίδιο στέλεχος είχε 81% θνητότητα (95% με προηγούμενη έκθεση σε VRC, P<0,001). Παρομοίως, οι μύγες Wt και Tl ήταν ευαίσθητες στην μόλυνση με το στέλεχος M.circinelloides 488128 ενώ έκθεση των κονιδίων σε VRC αύξησε τη θνητότητα (απο 47% σε 75% στις Wt,P<0,001, απο 54% σε 90,8% στις Tl, P<0,001). Η έκθεση κονιδίων R.oryzae 557969 σε ιτρακοναζόλη, κασποφουγκίνη ή αμφοτερικίνη Β δεν επηρέασε στατιστικώς σημαντικάτην παθογονικότητά του ούτε στις μύγες Wt αλλά ούτε και στις μύγες Tl. Εξάλλου, η έκθεση A. fumigatus 293 σε VRC δεν φάνηκε να έχει επίδραση στην παθογονικότητά του. Συγκεκριμένα, μόλυνση μυγών Tl με κονίδια A. fumigatus 293 είχε ως αποτέλεσμα θνητότητα 57% (56% με προηγούμενη έκθεση του στελέχους σε VRC, P=0,88).Οι ποντικοί Balb-C ήταν ευαίσθητοι στη μόλυνση με διάλυμα κονιδίων R. oryzae557969. Η παρατηρούμενη θνητότητα και στις δύο συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση ήταν μεγαλύτερη αν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σεVRC. ΢την ομάδα που μολύνθηκε με το διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης κονιδίων, η θνητότητα ήταν 67%, ενώ προηγούμενη έκθεση των κονιδίων σε VRC είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της θνητότητας σε 93% (P< 0,009). Παρομοίως, μόλυνση με την μικρότερη συγκέντρωση είχε 43% θνητότητα, που αυξήθηκε σε 86%, αν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σε VRC (P< 0,001).Η ιστοπαθολογική εξέταση πνευμόνων ποντικών τέσσερις ημέρες μετά την μόλυνση αποκάλυψε την εμφάνιση εντονότερης φλεγμονώδους αντίδρασης, με εκτεταμένη διήθηση του πνευμονικού παρεγχύματος απο ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και διήθηση των αγγείων απο μηκυτιακές υφές όταν τα κονίδια είχαν πρότινος εκτεθεί σε VRC. Σο μέσο μηκυτιακό φορτίο ήταν αυξημένο στους πνεύμονες ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια τα οποία είχαν εκτεθεί σε VRC σεσχέση με τους πνεύμονες ποντικών που είχαν μολυνθεί με κονίδια τα οποία δεν είχαν εκτεθεί σε VRC (διαφορά ενός λογαρίθμου με χρήση διαλύματος χαμηλής συγκέντρωσης κονιδίων, P=0,006, διαφορά δύο λογαρίθμων με χρήση διαλύματος υψηλής συγκέντρωσης, P=0,002). H ανάλυση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής απάντησης στους ποντικούς με χρήση μικροσυστοιχειών εντόπισε 71 γονίδια που η έκφρασή τους αυξήθηκε επιπλέον όταν τα κονίδια είχαν εκτεθεί σε VRC πριν τη μόλυνση. ΣυζήτησηΗ ζυγομηκυτίαση έχει εξελιχθεί στην δεύτερη σε συχνότητα μηκυτιακή λοίμωξη από υφομήκυτες σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (6). Πρόσφατες μελέτες αποδίδουν την αύξηση της επίπτωσης της νόσου στην προφυλακτική χρήση δραστικών απέναντι στον Ασπέργιλλο αντιμηκυτιακών, τα οποία δημιουργούν μια πίεση επιλογής που ευνοεί την ανάπτυξη ανθεκτικών οργανισμών όπως οι ζυγομήκυτες (2, 5, 6).΢την παρούσα μελέτη, η έκθεση τριών διαφορετικών στελεχών ζυγομηκύτων σε υποανασταλτικές συγκεντρώσεις VRC αύξησε την παθογονικότητά τους στις μύγεςD.melanogaster. Η παρατήρησή μας ήταν ειδική για τους ζυγομήκυτες (έκθεσηΑσπεργίλλου σε VRC δεν μετέβαλε την παθογονικότητά του) αλλά και για την VRC(έκθεση R.oryzae σε άλλα αντιμηκυτιασικά δεν είχε επίδραση στην παθογονικότητά του). Σα ευρήματά μας επαληθεύτηκαν και σε ένα ζωικό μοντέλο πνευμονικής ζυγομηκυτίασης, όπου μόλυνση με κονίδια που είχαν πρότινος εκτεθεί σε VRC είχε ως αποτέλεσμα την εκδήλωση λοίμωξης με αυξημένη θνητότητα, αυξημένο μηκυτιακόφορτίο στους πνεύμονες καθώς και αύξηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής αντίδρασης. Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας σε δύο ζωικά μοντέλα ζυγομηκυτίασης επιβεβαιώνουν την αρχική μας υπόθεση πως η έκθεση ζυγομηκύτων σε υποανασταλτικές συγκεντρώσεις VRC αυξάνει την παθογονικότητά τους. Σε αυτό το πλαίσιο, η ανά χείρας μελέτη προτείνει μια εναλλακτική εξήγηση για την αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης ζυγομηκυτίασης σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς υπό προφυλακτική αγωγή με VRC, όπως αυτή έχει παρατηρηθεί τα τελευταία χρόνια.Δεδομένης της υψηλής θνησιμότητας και θνητότητας που χαρακτηρίζει την διηθητική ζυγομηκυτίαση, ο μηχανισμός μέσω του οποίου η έκθεση σε VRC αυξάνει την παθογονικότητα των ζυγομηκύτων αποτελεί σημαντική κατεύθυνση για μελλοντικές ερευνητικές προσπάθειες