Μηχανισμοί νεφρικής βλάβης στην οικογενή αμυλοειδική πολυνευροπάθεια
Authors: Πετράκης Ιωάννης 
Published: September 2021

Εισαγωγή : Η Οικογενής Αμυλοειδική Πολυνευροπάθεια (ΟΑΠ) περιγράφηκε πριν από περίπου 60 έτη. Σήμερα αποτελεί μια από τις πιο συχνές μορφές κληρονομικής αμυλοείδωσης παγκοσμίως. Κληρονομείται με τον αυτοσωμικό επικρατή τρόπο. Η κλινική εικόνα παρουσιάζει ποικιλομορφία με κυριάρχο την προσβολή των λεπτών νευρικών ινών. Μέχρι στιγμής όλοι οι ασθενείς που υποφέρουν από ΟΑΠ είναι φορείς σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου της τρανσθυρετίνης και παρουσιάζουν αμυλοειδές με μόρια τρανσθυρετίνης σε διάφορους ιστούς. Νεφρική εναπόθεση αμυλοειδούς και νεφρική βλάβη έχει περιγραφεί σε ασθενείς με ΟΑΠ. Όσον αφορά την παθογένεση της ΟΑΠ οι ολιγομερείς μη ινιδικές μορφές τρανσθυρετίνης επάγουν απόπτωση, αυξημένη προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών και οξειδωτικής συμφόρησης στους ίστους. Στόχος: Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τους μηχανισμούς νεφρικής βλάβης σε ζωϊκά μοντέλα ΟΑΠ. Ειδικότερα εξέτασε την ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης ούρων σε διαγονιδιακά μοντέλα ΟΑΠ.Επιπρόσθετα εξέτασε μηχανισμούς με τον τρόπο με τον οποίο τα διάφορα συστατικά του σπειραματικού ιθμού διήθησης ( νεφρίνη, ποδοσίνη), ο πληθυσμός των ποδοκυττάρων, τα επίπεδα mRNA του WT-1, το πάχος της ΣΒΜ και των δευτερογενών ποδικών εκβλαστήσεων των ποδοκυττάρων μεταβάλλονται αναλόγως της παρουσίας ή μερικής έλλειψης του Hsf-1. Επίσης εξέτασε υπό την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών την παρουσία σπειραματικών εναποθέσεων ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης, την έκφραση του γονιδίου της μεταλλαγμένης ανθρώπινης τρανσθυρετίνης, την εντόπιση της ανθρώπιου μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης εντός των ποδοκυττάρων καθώς και την ενεργοποίηση της ενδοκυτταρικής ποδοκυτταρικής κασπάσης 3. Επιπρόσθετα διερεύνησε την παρουσία ή την απουσία εναποθέσεων ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης ανάλογα με το φύλο των διαγονιδιακών ζώων, την επίδραση της ραπαμυκίνης στην σπειραματική εναπόθεση ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης, τα επίπεδα έκφρασης των μορίων bax/bcl-2 εντός του σπειράματος σε σχέση με το φύλο των ζώων.Υλικά και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν για την διενέργεια των πειραμάτων, διαγονιδιακά ζώα για το ανθρώπινο μεταλλαγμένο γονίδιο της τρασνθυρετίνης [C57Bl/6-Tg(6.0 TTRMet30)15Imeg –hTTRV30M] προερχόμενα από την μετεμφύτευση ψυγμένων σε βαθιά κατάψυξη εμβρύων (CARD, Kumamoto, Japan) σε ωαγωγούς θετών μητέρων. Νεαρά ζώα (10-16 μηνών) και Γηραιά ζώα (16-21 μηνών) με ή χωρίς το hTTRVal30Met τοποθετήθηκαν σε μεταβολικά κλουβιά (Tecniplast) για συλλογή ούρων 24ώρου. Η ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης κανονικοποιήθηκε σύμφωνα με το σωματικό βάρος των ζώων. Η ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα προσδιορίσηκε με μέθοδο ELISA (Bethyl Laboratories). Τα δεδομένα ημερήσιας απέκκρισης λευκωματίνης μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά. Χρησιμοποιήθηκε δοκιμασία Χ2 κατά την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Η δοκιμασία Pearson’s R χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του βαθμού συσχέτισης. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο ≤ 0,05. Το λογισμικό SPSS 19 χρησιμοποιήθηκε για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Παράλληλα χορηγήθηκε σε ομάδα ζώων ηλικίας 8 μηνών ενδοπεριτοναϊκά ραπαμυκίνη (DMSO&Rapamycin) ή (DMSO) κάθε δεύτερη μέρα σε δόση 0.4 mg/Kg σωματικού βάρους για 2 μήνες. Παράλληλα γινόταν συλλογές ούρων 24ώρου για τον καθορισμό της ημερήσιας απέκκρισης λευκωματίνης. Τα νεφρά ψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο (-196ο C). Κρυοτομές πάχους 5 μm μονιμοποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% και επωάστηκαν με αντισώματα έναντι της ανθρώπινης τρανσθυρετίνης (rabbit anti-human TTR antibody-DAKO), έναντι της ποντικίσιας πρωτεΐνης bax (bax rabbit anti mouse antibody-Abcam) έναντι της ποντικίσιας πρωτεΐνης bcl-2 (bcl-2 rabbit antimouse antibody-Abcam). Ο νεφρικός ιστός περεταίρω υποβλήθηκε σε ιστοχημικές χρώσεις μεθεναμικού αργύρου,ερυθρού του Κονγκό, Τριχρωμικής Masson, καθώς και PAS. Συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για την επισκόπιση των τομών του ανοσοφθορισμού (Leica SP). Η ανάλυση των εικόνων φθορισμού έγινε με την χρήση του λογισμικού Leica Confocal Software.Τα στοιχεία ελέγχθηκαν για την κανονικότητα της κατανομής τους. Σε περίπτωση μη κανονικής κατανομής έγινε λογαριθμικός μετασχηματισμός των στοιχείων. Η στατιστική σημαντικότητα (οριζόμενη στο ≤ 0.05) εξετάστηκε με τις δοκιμασίες Χ2, και T για ανεξάρτητα δείγματα. Η συσχέτιση ελέγχθηκε με την χρήση της δοκιμασίας Pearson’s R . Για την στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPSS19. Επιπρόσθετα διερευνήθηκε ο βαθμός και το κατά πόσο η εναπόθεση ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης (TTRV30M) επηρεάζεται από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (συνθήκες υψηλού φραγμού-SPF και συνθήκες χαμηλού φραγμού-non-SPF). Συγκεκριμένα σπειράματα από διαγονιδιακά για το ανθρώπινο μεταλλαγμένο γονίδιο της τρασνθυρετίνης (hTTRV30M) εξετάστηκαν μέσω της χρήσης άμεσης και έμμεσης συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού για την παρουσία εναποθέσεων ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης, ποντικίσιου αμυλοειδούς P (murine serum amyloid P), ποντικίσιας ενεργοποιημένης κασπάσης 3 και νεφρίνης. Η συσχέτιση του βαθμού συνεντόπισης και το ποσοστό συνεντόπισης εκτιμήθηκε χρησιμοποιόντας το λογισμικό Image J. Η εντόπιση των εναποθέσεων ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης εντός των ποδοκυττάρων έγινε με την χρήση άνοσο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης. Η νεφρική έκφραση της ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης (hTTRV30M) και της νεφρίνης (NPHS-1) έγιναν με την χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-PCR). Παράλληλα μελετήθηκαν με την χρήση άνοσο-ιστοχημείας, στυπώματος κατά Western (Western Blοt) και RT-PCR τα γονίδια της νεφρίνης, της ποδοσίνης και του WT1 σε νεφρικό ιστό hTTRV30M ποντικών ημίζυγων ή ομόζυγων για τον παράγοντα Hsf-1. Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του πάχους των δευτερογενών ποδοκυτταρικών ποδικών εκβλαστήσεων και της σπειραματικής βασικής μεμβράνης σε νεφρικό ιστό ποντικών ημίζυγων για τον Hsf-1 είτε με είτε χωρίς σπειραματική εναπόθεση ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης (hTTRV30M) ή εναπόθεσης αμυλοειδούς.Αποτελέσματα: 78.6% των νεαρών ζώων hTTRV30M είχαν ημερήσια απέκριση λευκωματίνης μεγαλύτερη της διάμεσης τιμής (0.72), ενώ το 21,4% των μη διαγονιδιακών νεαρών ζώων είχαν ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης πάνω από την διάμεση τιμή (Χ2=0.583, p=0.445).Το 100% των γηραιών hTTRVal30Met ζώων είχαν ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης πάνω από την διάμεση τιμή, ενώ 0% των μη διαγονιδιακών ζώων είχαν ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης πάνω από την διάμεση τιμή. (X2 =8.6, p=0.003,R=0.496, p=0.002). Όσον αφορά την ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης (ΗΑΑλβ-ng/24 ώρες/ gr ΣΒ) για τα διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν μέση ΗΑΑλβ 778.9 +/- 6.0 ενώ τα διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν DMSO είχαν ΗΑΑλβ 815.3 +/- 3.3 p=0.97. Σε όλα τα ζώα υπό μελέτη ο νεφρικός ιστός είχε αρνητική χρώση ερυθρού του Κονγκό, υποδεικνύοντας έλλειψη εναπόθεσης αμυλοειδούς. Τα σπειράματα από τα αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία ελάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν μικρότερη έκταση μεσαγγείου όταν συγκρίθηκαν με αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία ελάμβαναν DMSO (X2 =26.56; p<0.001). Τα σπειράματα από τα θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια που λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν μεγαλύτερη έκταση μεσαγγείου όταν συγκρίθηκαν με διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν DMSO(X2 =16.6; p=0.001). Τα αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία ελάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν το 17.6% των σπειραμάτων με ένταση φθορισμού μεγαλύτερη της διάμεσης τιμή. Ενώ τα θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν 89.8% των σπειραμάτων με ένταση φθορισμού μεγαλύτερη της διάμεσης τιμής (X2 =72.4; p<0.001). Δεν υπήρχε διαφορά στην ένταση φθορισμού όσον αφορά τα θηλυκά και αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν DMSO (X2 =2.12; p=0.18) και οι τιμές των εντάσεων φθορισμού ήταν μεταξύ αύτων των θηλυκών διαγονιδιακών ποντικών και των αρσενικών διαγονιδιακών ποντικών που ελάμβαναν ραπαμυκίνη. Τα αρσενικά ποντίκια τα οποία ελάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν 28.6% των σπειραμάτων με λόγο bax/bcl-2 μεγαλύτερο της διάμεσης τιμής (1.52) ενώ τα θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν 88.9% των σπειραμάτων με λόγο bax/bcl-2 μεγαλύτερο της διάμεσης τιμής (X2 =27.71; p<0.001). Οι αντίστοιχες τιμές για τα αρσενικά ποντίκια τα οποία λάμβαναν DMSO ήταν 10% ενώ για τα θηλυκά ποντίκια τα οποία λάμβαναν DMSO ήταν 71.4% (X2 =24.45; p<0.001). Τα διαγονιδιακά ζώα τα οποία στεγαζόταν σε συνθήκες χαμηλού φραγμού (non-SPF) έδειξαν αυξημένη εναπόθεση ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης hTTRV30M στα σπειράματά τους σε σχέση με τα διαγονιδιακά ζώα τα οποία στεγαζόταν σε συνθήκες υψηλού φραγμού (SPF). Επιπρόσθετα αυξημένη ποδοκυτταρική εναπόθεση hTTRV30M παρατηρήθηκε στα non-SPF διαγονιδιακά ποντίκια. Η σπειραματική ενεργοποίηση της κασπάσης-3 ήταν αυξημένη στα non-SPF ποντίκια. Η ποδοκυτταρική ενεργοποίηση της κασπάσης -3 ήταν αυξημένη στα διαγονιδιακά ζώα ανεξαρτήτως συνθηκών σε σύγκριση με τα μη διαγονιδιακά ζώα στις αντίστοιχες συνθήκες. Επιπρόσθετα τα σπειράματα των Hsf-1 ημίζυγων διαγονιδιακών ποντικών για την ανθρώπινη μεταλλαγμένη τρανσθυρετίνη είχαν μικρότερα περιεχόμενο νεφρίνης και ποδοσίνης άλλα μεγαλύτερο αριθμό ποδοκυττάρων όταν συγκρίνονταν με τα αντίστοιχα ομόζυγα για τον Hsf-1 διαγονιδιακά ζώα. H εναπόθεση τρανσθυρετίνης ήταν αυξημένη στα σπειράματα των ζώων τα οποία ήταν ημίζυγα στον Hsf-1.Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων νεφρίνης, ποδοσίνης και WT-1 δεν επηρρεάστηκαν από την ημιζυγία ή ομοζυγωτία του Hsf-1. Η αυξημένη εναπόθεση τρανσθυρετίνης στα Ηsf-1 ημίζυγα ζώα σχετίστηκε με αυξημένο πάχος ποδικών εκβλαστήσεων και σπειραματικής βασικής μεμβράνης.Συμπεράσματα H παρουσία του ανθρώπινου μεταλλαγμένου γονιδίου τρανσθυρετίνης (hTTRVal30Met) επιρρεάζει την ημερήσια απέκκριση αλβουμίνης στο παρόν διαγονιδιακό μοντέλο. Οι φορείς του γονιδίου παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη ημερήσια απέκκριση λευκωματίνης καθώς αυξάνεται η ηλικία τους όταν συγκρίνονται με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Τα αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν μικρότερη έκταση μεσαγγείου όταν συγκρίνονταν με τα θηλυκά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη. Επιπρόσθετα περισσότερα σπειράματα από αρσενικά διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία λάμβαναν ραπαμυκίνη είχαν αυξημένη εναπόθεση hTTRVal30Met σε σύγκριση με τα θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια. Ο λόγος bax/bcl-2 παρατηρούταν πιο συχνά αυξημένος σε σπειράματα από θηλυκά διαγονιδιακά ποντίκια απ’ ότι σε σπειράματα αρσενικών διαγονιδιακών ποντικών. Έτσι η ραπαμυκίνη πιθανόν να επάγει διαφορετικές επιδράσεις είτε καταστροφικές είτε ευεργετικές αναλόγως του φύλου. Αυτή η αλληλεπίδραση δεν συνοδεύεται από αύξημένη απέκκριση λευκωματίνης. Οι διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (συνθήκες υψηλού φραγμού –SPF/συνθήκες χαμηλού φραγμού –non-SPF) επιρρεάζουν την σπειραματική εναπόθεση, και την ενδοποδοκυτταρική εντόπιση της ανθρώπινης μεταλλαγμένης τρανσθυρετίνης (hTTRVal30Met). Σε αυτές τις συνθήκες (non-SPF) παρατηρείται αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Παράλληλα κάτω από την επίδραση της ημιζυγίας στον Hsf-1, η εναπόθεση hTTRV30M έχει καταστροφικά αποτελέσματα στο πάχος της σπειραματικής βασικής μεμβράνης, στο πάχος των ποδοκυτταρικών ποδικών εκβλαστήσεων και στην σύσταση του λεπτού διαφράγματος χωρίς να επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων της νεφρίνης και της ποδοσίνης.Έτσι η νεφρική βλάβη που επάγεται από την εναπόθεση πρό-αμυλοειδικών εναποθέσεων hTTRV30M εξαρτάται από περιβαλλοντικούς καθώς και γονιδιακούς παράγοντες.