Proteomic study of ovine mastitis associated with Mannheimia haemolytica
Authors: Κατσαφάδου Αγγελική 
Published: September 2021

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στην πρωτεωμική μελέτη της πειραματικής μαστίτιδας από Mannheimia haemolytica σε πρόβατα, χρησιμοποιώντας καθιερωμένα πρότυπα πειραματικής μόλυνσης, και αποσκοπεί ειδικότερα: (α) στη μελέτη της διαφορικής έκφρασης πρωτεϊνών επακόλουθα της πρόκλησης μαστίτιδας από M. haemolytica σε προβατίνες και (β) στην αξιολόγηση της σημασίας της καθελισιδίνης-1 στο γάλα των προβατίνων ως διαγνωστικό μέσο για την ανίχνευση της υποκλινικής μαστίτιδας.Η διατριβή χωρίζεται σε τρία κεφάλαια και ακολουθεί η Γενική Συζήτηση.Στο Κεφάλαιο Ι, ανασκοπείται η σχετική βιβλιογραφία. Το Κεφάλαιο υποδιαιρείται σε δύο τμήματα. Στο τμήμα Α, ανασκοπείται συνοπτικά η βιβλιογραφία σχετικά με την πρωτεωμική τεχνολογία και τις μεθοδολογίες που ακολουθούνται. Στο τμήμα Β ανασκοπείται η βιβλιογραφία η σχετική με την εφαρμογή της πρωτεωμικής στην κτηνιατρική επιστήμη.Στο Κεφάλαιο II, μετά από σύντομη ανασκόπηση για το βακτήριο M. haemolytica και το ρόλο του στη μαστίτιδα (τμήμα Α), περιγράφεται ένας πειραματισμός, στον οποίο πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση του αίματος και του γάλακτος προβατίνων έπειτα από ενοφθαλμισμό του μαστού με M. haemolytica (τμήματα Β και Γ).Προκλήθηκε μαστίτιδα σε προβατίνες (n=5) στη γαλακτική περίοδο με ενοφθαλμισμό ενός στελέχους M. haemolytica με γνωστή παθογόνο δράση εντός του θηλαίου πόρου του μαστού, η δε ετερόπλευρη πλευρά του μαστού χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για επιβεβαίωση της εκδήλωσης μαστίτιδας και για παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιήθηκαν καθιερωμένες κλινικές, μικροβιολογικές, κυτταρολογικές και ιστοπαθολογικές τεχνικές. Δείγματα αίματος (για εξαγωγή πλάσματος) και γάλακτος (για εξαγωγή ορού γάλακτος) συλλέχθηκαν διαδοχικά πριν από και μετά τον ενοφθαλμισμό, συνολικά σε 6 ή 7 χρονικά σημεία ανά προβατίνα μέχρι την 4η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό. Για την πρωτεωμική ανάλυση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακριλαμιδίου σε όλα τα δείγματα και στα πηκτώματα ανιχνεύτηκαν οι διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες. Επιλέχθηκαν οι κηλίδες πρωτεϊνών στα πηκτώματα και οι πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας, χρησιμοποιώντας ιοντισμό-εκρόφηση από μήτρα μέσω laser σε συνδυασμό με αναλυτή μαζών χρόνου πτήσης (MALDI-TOF MS). Όλα τα ζώα στον πειραματισμό εκδήλωσαν μαστίτιδα, η οποία επιβεβαιώθηκε με βάση την απομόνωση του ενοφθαλμισμένου στελέχους και την αύξηση των σωματικών κυττάρων (κυρίως ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) στο γάλα, καθώς και με τα ιστοπαθολογικά ευρήματα της παρουσίας λευκοκυτταρικής (ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) διήθησης, με καταστροφή του μαστικού επιθηλίου και διακυψελιδική αιμορραγία. Σε πρωτεωμικό χάρτη αναφοράς που παράχθηκε από δείγμα αίματος, που είχε συλλεχθεί πριν από τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν 19 πρωτεΐνες (σε 155 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η απολιποτρωτεΐνη Α-Ι, η β-αλυσίδα ινοδωγόνου και η απτογλοβίνη - οι περισσότερες (13/20) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες, σχετίζονταν δε με φυσιολογικές λειτουργίες στα ζώα (π.χ., μεταφορά οξυγόνου). Σε πρωτεωμικούς χάρτες αναφοράς που παράχθηκαν από δύο δείγματα γάλακτος, που είχαν συλλεχθεί πριν από τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 40 πρωτεΐνες (σε συνολικά 280 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η α-λακταλβουμίνη, η α-S2-καζεΐνη, η β-λακτογλοβουλίνη και η λακτοτρανφερίνη - οι περισσότερες (17/39) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες, σχετίζονταν δε με φυσιολογικές λειτουργίες στα ζώα. Μετά τον ενοφθαλμισμό, στα δείγματα αίματος, ταυτοποιήθηκαν 33 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες, από τις οποίες 6 υποεκφράστηκαν, 13 εκφράστηκαν εξαρχής (π.χ., αντιθρομβίνη-ΙΙΙ, συμπλήρωμα C3, παράγοντας συμπληρώματος Β) και 14 παρουσίασαν διακυμάνσεις στην έκφραση (π.χ., άλφα-1-αντιπρωτεϊνάση, απολιποπρωτεΐνη Α-1, απολιποπρωτεΐνη Α-IV, σεροτρανσφερίνη). Σε πρωτεωμικό χάρτη αναφοράς που παράχθηκε από δείγμα γάλακτος, που είχε συλλεχθεί από την ενοφθαλμισμένη μεριά του μαστού 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν 65 πρωτεΐνες (σε 215 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η κυτταροπλασματική ακτίνη-1, η β-λακτογλοβουλίνη-1/Β και η καθελισιδίνη-1 - οι περισσότερες (19/65) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και λιγότερες (18/65) ήταν πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος, οι οποίες, σχετίζονταν με φυσιολογικές λειτουργίες σε ζώα ή με την αμυντική ανταπόκριση μετά από μόλυνση. Μετά τον ενοφθαλμισμό, στα δείγματα γάλακτος, ταυτοποιήθηκαν 89 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες, από τις οποίες 18 υποεκφράστηκαν, 53 εκφράστηκαν εξαρχής - 3 υπερεκφράστηκαν (π.χ., άλφα-ενολάση, απολιποπρωτεΐνη Α-1, καθελισιδίνη-1, απτογλοβίνη, heat-shock proteins, πρωτεΐνη S100-A9, phakinin) και 15 παρουσίασαν διακυμάνσεις στην έκφραση (π.χ., λακτοτρανσφερίνη, σεροτρανσφερίνη, τρανσθυρετίνη, tuftelin-interacting protein 11). Σε 79 πρωτεΐνες, ταυτοποιήθηκαν διαφορές στη διαφορική έκφρασή τους μεταξύ ενοφθαλμισμένης και μη ενοφθαλμισμένης πλευράς του μαστού (74 σε δείγματα από την ενοφθαλμισμένη πλευρά και 5 σε δείγματα από τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού), ενώ σε 15 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν διαφορές στη διαφορική έκφρασή τους και στις δύο πλευρές του μαστού. Επίσης, 15 πρωτεΐνες (π.χ., απτογλοβίνη) εμφάνισαν διαφορική έκφραση ταυτόχρονα σε αίμα και γάλα μετά τον ενοφθαλμισμό. Σχετικά με την βιολογική διεργασία στην οποία συμμετείχαν οι πρωτεΐνες που παρουσίασαν διαφορική έκφραση, στο μεν αίμα οι περισσότερες πρωτεΐνες συμμετείχαν στη μεταφορά ιόντων και μορίων (n=8) ή στην αμυντική απάντηση (n=7), στο δε γάλα οι περισσότερες πρωτεΐνες συμμετείχαν στην κυτταρική οργάνωση (n=17) ή στην αμυντική απάντηση (n=13).Στο Κεφάλαιο III, μετά από σύντομη ανασκόπηση για τις καθελισιδίνες (τμήμα Α), παρουσιάζεται λεπτομερής αξιολόγηση των ευρημάτων που σχετίζονται ειδικά με την καθελισιδίνη-1 από τον πειραματισμό για την πρωτεωμική ανάλυση του αίματος και του γάλακτος προβατίνων σε περιπτώσεις μαστίτιδας από M. haemolytica, που έχει περιγραφεί στο Κεφάλαιο ΙΙ (τμήμα Β). Στη συνέχεια, περιγράφεται επιπλέον πειραματισμός για τον προσδιορισμό της καθελισιδίνης-1 σε γάλα προβατίνων μετά από ενδομαστικό ενοφθαλμισμό και πρόκληση μαστίτιδας (τμήμα Γ). Τέλος, υπολογίζονται συσχετίσεις μεταξύ των αποτελεσμάτων των κυτταρολογικών εξετάσεων και της ταυτοποίησης της καθελισιδίνης-1 στο γάλα των προβατίνων (τμήμα Δ).Στο Τμήμα Β, έγινε λεπτομερής αξιολόγηση των στοιχείων σχετικά με την ταυτοποίηση της καθελισιδίνης-1 στα δείγματα γάλακτος στον πειραματισμό που παρουσιάζεται στο Κεφάλαιο ΙΙ. Στο πλαίσιο αυτό, υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων της καθελισιδίνης-1 στα πηκτώματα, για κάθε ζώο και κάθε χρονικό σημείο δειγματοληψίας. Κηλίδες αντιπροσωπευτικές της καθελισιδίνης-1 αντιστοιχήθηκαν στα πηκτώματα από τα δείγματα από κάθε ζώο για όλα τα συλλεχθέντα δείγματα. Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές οπτικής πυκνότητας σε κάθε πήκτωμα. Δεν εντοπίστηκε καθελισιδίνη-1 στο γάλα πριν από τον ενοφθαλισμό. Μετά τον ενοφθαλμισμό, καθελισιδίνη-1 ταυτοποιήθηκε σε δείγματα γάλακτος από την ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού από τις 5/5 προβατίνες (συνολικά σε 19/22 δείγματα) για πρώτη φορά 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, καθώς και σε δείγματα από τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά από 3/5 προβατίνες (συνολικά σε 5/22 δείγματα) για πρώτη φορά την 1η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό. Στα δείγματα γάλακτος από την ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού, η οπτική πυκνότητα των κηλίδων της καθελισιδίνης-1 αυξήθηκε δραματικά ήδη στην πρώτη δειγματοληψία μετά τη μόλυνση (D0+12 ώρες) και στη συνέχεια μειώθηκε προοδευτικά (P=0,001 σε σχέση με την τιμή πριν από τον ενοφθαλμισμό), επιπλέον δε οι διαφορές στα ευρήματα από την ενοφθαλμισμένη και τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού ήταν σημαντικές (P=0,05).Στο Τμήμα Γ, παρουσιάζεται ένας πειραματισμός, στον οποίο πραγματοποιήθηκε ενδομαστικός ενοφθαλμισμός M. haemolytica ή Staphylococcus chromogenes σε προβατίνες (n=3), ο δε ετερόπλευρος μαστικός αδένας χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για επιβεβαίωση της ανάπτυξης μαστίτιδας και για παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιήθηκαν κλινικές, μικροβιολογικές και κυτταρολογικές μέθοδοι. Δείγματα γάλακτος (για παραγωγή ορού γάλακτος) συλλέχθηκαν διαδοχικά πριν από και μετά τον ενοφθαλμισμό, συνολικά σε 5 χρονικά σημεία ανά προβατίνα μέχρι 24 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Για την πρωτεωμική ανάλυση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακριλαμιδίου σε όλα τα δείγματα. Στα πηκτώματα, ανιχνεύτηκε και ταυτοποιήθηκε η καθελισιδίνη-1. Επιλέχθηκαν στα πηκτώματα οι αντιπροσωπευτικές της καθελισιδίνης-1 κηλίδες και η πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας, χρησιμοποιώντας τον φασματογράφο MALDI-TOF MS. Όλα τα ζώα στον πειραματισμό εκδήλωσαν μαστίτιδα, η οποία επιβεβαιώθηκε με βάση την απομόνωση του ενοφθαλμισμένου στελέχους και την αύξηση των σωματικών κυττάρων (κυρίως ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) στο γάλα. Δεν ταυτοποιήθηκε καθελισιδίνη-1 στο γάλα πριν από τον ενοφθαλισμό των προβατίνων. Μετά τον ενοφθαλμισμό, η πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε στο γάλα και των τριών προβατίνων (συνολικά σε 14/15 δείγματα) από τον ενοφθαλμισμένο μαστικό αδένα για πρώτη φορά 3 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, αλλά δεν ταυτοποιήθηκε σε κανένα δείγμα από τον ετερόπλευρο μαστικό αδένα. Η μέση τιμή της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων της πρωτεΐνης αυξήθηκε, ήδη στο πρώτο μετά τον ενοφθαλμισμό δείγμα (3 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό), και έφτασε στη μέγιστη τιμή 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό (P=0,002 σε σχέση με τις τιμές πριν από τον ενοφθαλμισμό), επιπλέον δε οι διαφορές στα ευρήματα από την ενοφθαλμισμένη και τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού ήταν σημαντικές (P=0,05).Στο Τμήμα Δ, πραγματοποιήθηκαν υπολογισμοί και ανάλυση για διερεύνηση ενδεχόμενης συσχέτισης των τιμών της δοκιμής California Mastitis Test (CMT) ή του αριθμού των σωματικών κυττάρων με τις τιμές οπτικής πυκνότητας της καθελισιδίνης-1. Για την ανάλυση, οι διάφοροι υπολογισμοί έγιναν θεωρώντας κάθε δείγμα από κάποιο ζώο ως μία παρατήρηση και έλαβε χώρα συσχέτιση αριθμητικών τιμών. Πραγματοποιήθηκε επιπλέον ανάλυση, στην οποία τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ως ‘αρνητικά’ ή ‘θετικά’ και έγινε η κατάλληλη συσχέτιση. Τα αποτελέσματα των δύο πειραματισμών συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν συνολικά. Παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του κυτταρικού περιεχομένου και της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων καθελισιδίνης-1 στα δείγματα γάλακτος (P<0.001). Η ευασθησία / ειδικότητα της χρήσης καθελισιδίνης-1 για τη διάγνωση της μαστίτιδας ήταν 0,965 / 0,815, αντίστοιχα, ο δε θετικός προγνωστικός δείκτης / αρνητικός προγνωστικός δείκτης αυτής ήταν 0,685 / 0,980, αντίστοιχα.Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής, είναι τα παρακάτω.(α) Μελετήθηκε το πρωτέωμα του αίματος και του γάλακτος σε προβατίνες με μαστίτιδα από Mannheimia haemolytica, για ταυτοποίηση και αξιολόγηση των μεταβολών στην έκφραση των πρωτεϊνών, των αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους και των διαφοροποιήσεών τους ως αποτέλεσμα της μαστίτιδας. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την πολυπλοκότητα μεταξύ μεσολαβητών, λευκοκυττάρων, μαστικών επιθηλιακών κυττάρων και των εκκρίσεων του μαστικού αδένα κατά την οξεία φάση της λοίμωξης. Το σύνολο των πρωτεωμικών ευρημάτων έδειξε ότι η ανοσολογική ανταπόκριση στις προσβεβλημένες προβατίνες εξαρτάτο από πολλές πρωτεΐνες και εκδηλωνόταν μέσω διαφόρων μονοπατιών, παρατηρήθηκαν δε πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ήδη 12 ώρες μετά την εναπόθεση βακτηρίων στο θηλαίο πόρο, υπήρξε εξαρχής έκφραση ή υπερέκφραση πολλών πρωτεϊνών, κυρίως στο γάλα και σε μικρότερο βαθμό στο αίμα. Από τις πρωτεΐνες στις οποίες παρατηρήθηκε εξαρχής έκφραση ή/και υπερέκφραση, ορισμένες προέρχονταν από το αίμα, ορισμένες απελευθερώθηκαν από συστατικά του αίματος που εισήλθαν στο μαστικό αδένα (π.χ., από ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) και ορισμένες συνετέθησαν τοπικά στο μαστικό ιστό. Θεωρήθηκε ότι οι προβατίνες προσπαθούσαν να διατηρούσαν την σύνθεση και παραγωγή γάλακτος, ταυτοχρόνως δε να εξυπηρετούσαν τις ανάγκες για ανοσολογική ανταπόκριση και λευκοκυτταρική δραστηριότητα. Υπήρχαν ενδείξεις ότι αρκετές πρωτεΐνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιούνταν ως βιοδείκτες για τη μαστίτιδα στις προβατίνες.(β) Η ανίχνευση καθελισιδίνης-1 στο γάλα συσχετίστηκε με αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση της μαστίτιδας. Υπήρχε αυξημένη συσχέτιση της παρουσίας της καθεσιδίνης-1 με τα αποτελέσματα της κυτταρολογικής εξέτασης, τα αποτελέσματα δε ήταν παρόμοια όταν τα ευρήματά της ελήφθησαν υπόψη ως ποσοτικά (αριθμητικές τιμές) ή ποιοτικά (‘θετικά’/‘αρνητικά’) αποτελέσματα. Η καθελισιδίνη-1 ανιχνεύτηκε στο γάλα πιο νωρίς από την αύξηση του αριθμού των σωματικών κυττάρων. Η ανίχνευση της καθελισιδίνης-1 για την διάγνωση της μαστίτιδας έχει το πλεονέκτημα ότι, καθώς δεν ανιχνεύεται στο γάλα των υγιών προβατίνων, δεν υπάρχει ανάγκη να καθιερωθεί ουδός για την τιμή της, αλλά θα αρκούσε μία αξιολόγηση ‘θετικό’/‘αρνητικό’.