Ανάπτυξη τεχνικών και βιοαντιδραστηρίων ανίχνευσης της τροπονίνης για τη διάγνωση καρδιαγγειακών παθήσεων
Authors: Φώτου Ευγενία 
Published: May 2022

Η τροπονίνη είναι ένα σύμπλεγμα τριών πρωτεϊνικών υπομονάδων (I, T, C), που εδράζεται στους σκελετικούς (ταχείας και βραδείας σύσπασης) και καρδιακούς μύες και φυσιολογικά ρυθμίζει τη σύσπασή τους. Από τις τρεις υπομονάδες η καρδιακή τροπονίνη Ι (cTnI) έχει τη μικρότερη ομολογία με τις αντίστοιχες σκελετικές ισομορφές και αυτό συνεπάγεται υψηλότερη εξειδίκευση για το μυοκάρδιο. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι η cTnI είναι περισσότερο εξειδικευμένη για την καρδιά συγκριτικά με ένα πλήθος άλλων εδραιωμένων βιοδεικτών, όπως η CK-MB.Όταν δημιουργηθεί κάποια βλάβη στο μυοκάρδιο, η τροπονίνη απελευθερώνεται από το κυτοσόλιο των μυοκυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος μέσα σε δύο ώρες από την εμφάνιση των συμπτωμάτων (στηθάγχη) και διατηρείται στο αίμα για περίπου δύο εβδομάδες. Η κινητική της cTnI, συγκριτικά με των άλλων βιοδεικτών, επιτρέπει την ταχεία ανίχνευσή της στο αίμα των ασθενών και την καλύτερη παρακολούθηση της τιμής της ως ένδειξη της αρχικής ή πιθανής επόμενης βλάβης. Συνεπώς, η cTnI δικαίως αποτελεί τον σημαντικότερο βιοδείκτη στη διάγνωση του οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου, καθώς μπορεί να ανιχνεύει μικρές βλάβες που πιθανά υπάρχουν σε έναν ασθενή υψηλού κινδύνου με ευάλωτη αθηρωματική πλάκα, απουσία μυοκαρδιακής νέκρωσης.Δεδομένων αυτών, οι ερευνητές επικεντρώθηκαν στην ανίχνευση της τροπονίνης και την αξιοποίησή της ως ένα εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση μίας μυοκαρδιακής βλάβης, με σκοπό την πρόληψη και την καλύτερη αντιμετώπιση του ασθενούς.Στις κλινικές αναλύσεις, το τεστ τροπονίνης βασίζεται στην τεχνική της E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) τύπου Sandwich. Αν και η ELISA παρέχει μεγάλη ευαισθησία, υπάρχουν πολλοί παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την ανίχνευση της τροπονίνης, όπως: 1) η διαφορά στην εξειδίκευση και την ευαισθησία των εμπορικώς διαθέσιμων αντισωμάτων σύλληψης και ανίχνευσης της τροπονίνης, 2) η φωσφορυλίωση της σερίνης και η συμπλοκοποίηση της cTnI με άλλα μόρια, 3) η ύπαρξη ειδικών anti-cTnI αυτο-αντισωμάτων στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών, που παράγονται σε απόκριση της απελευθέρωσης της τροπονίνης στο αίμα και 4) η ύπαρξη αντισωμάτων παρεμβολής, δηλαδή ετερόφιλων αντιζωϊκών αντισωμάτων (HAA). Έτσι λαμβάνονται θετικά ή αρνητικά ψευδή αποτελέσματα, τα οποία δυσχεραίνουν την κατάταξη των ατόμων σε υποψήφιους ή μη για οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου.Τα πολλά διαφορετικά διαθέσιμα βιο-αντιδραστήρια οδήγησαν στην ανάγκη για τον ορισμό του ορίου ανίχνευσης cutoff με συντελεστή διακύμανσης μικρότερο από 10% σε ορισμένη συγκέντρωση της τροπονίνης. Αυτό σταδιακά οδήγησε στην ανάπτυξη δοκιμασιών υψηλότερης αναλυτικής ευαισθησίας, δίνοντας τη δυνατότητα καλύτερης παρακολούθησης της τιμής της τροπονίνης για την έγκαιρη διάγνωση μίας πιθανής βλάβης. Ωστόσο η μεγάλη ευαισθησία των σύγχρονων δοκιμασιών συνδέθηκε με μειωμένη ειδικότητα, καθώς εκτός από τους ασθενείς τα χαμηλά επίπεδα της cTnI μπορούν να εντοπιστούν και σε άλλες ομάδες του πληθυσμού, οι οποίοι δεν έχουν κάποια βλάβη (π.χ. αθλητές), δημιουργώντας έτσι μια πρόσθετη διαγνωστική πρόκληση.Οι σύγχρονες κλινικές πρακτικές ανίχνευσης της τροπονίνης είναι κυρίως ενζυμικοί ανοσοπροσδιορισμοί που ανιχνεύουν την cTnI με υψηλή ευαισθησία, όμως με σχετικά μεγάλο χρόνο και κόστος. Ωστόσο, οι εξελίξεις στην τεχνολογία επέτρεψαν την ανάπτυξη μη ενζυμικών προσδιορισμών, όπως είναι οι ηλεκτροχημικοί, παραμαγνητικοί και συντονισμού επιφανειακού πλασμονίου. Αν και οι νέες τεχνολογίες δύνανται να μειώσουν τις παρεμβολές στο σήμα, εντούτοις απαιτούν ογκώδη και ακριβό εξοπλισμό, καθώς και ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό. Όλα αυτά συνηγορούν στην αύξηση του τελικού κόστους της δοκιμασίας της τροπονίνης.Παρά τις συνεχείς εξελίξεις, υπάρχουν σημαντικά περιθώρια βελτίωσης στις δοκιμασίες της τροπονίνης, ιδιαίτερα στον τομέα της τυποποίησης των ποσοτικών προσδιορισμών και της εξάλειψης των παρεμβολών. Νέες προοπτικές περιλαμβάνουν επίσης την ανάπτυξη μικρών, φορητών και ευαίσθητων βιο-αισθητήρων (Point of care tests, POCTs), που να επιτρέπουν την άμεση ανίχνευση της τροπονίνης από μη εξειδικευμένο προσωπικό, το σύντομο χρόνο ανάλυσης και το χαμηλό κόστος.Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη βιο-αντιδραστηρίων και έξυπνων υλικών για τη χρήση τους σε ενζυμικές και μη ενζυμικές τεχνικές, ανίχνευσης της καρδιακής τροπονίνης I.Για το σκοπό αυτό συντέθηκαν ορισμένοι πιθανοί αντιγονικοί επίτοποι της cTnI, επιλεγμένοι βάσει δεδομένων ομολογίας, αντιγονικότητας, υδροφιλικότητας, επιφανειακής προσβασιμότητας, ευελιξίας, δευτεροταγούς δομής, θέσης και συχνότητας εμφάνισης επίτοπων. Επίσης, συντέθηκε o πεπτιδικός φορέας αντιγονικών πεπτιδίων CPSOC(3,9-Acm) βάσει προηγούμενων μελετών του φορέα SOC, που έδειξαν ότι το μόριο αυτό είναι ικανό 1) να προβάλλει τους προσδεμένους αντιγονικούς επίτοπους και να προκαλεί την παραγωγή υψηλού τίτλου αντισωμάτων και 2) να χρησιμοποιείται ως υλικό προσρόφησης σε ELISA plate κατά τους ανοσοπροσδιορισμούς. Επιπλέον, συντέθηκαν πεπτιδικά ανοσογονικά συμπλέγματα που προέκυψαν από την πρόσδεση των απτενίων (αντιγονικών πεπτιδίων) στον πεπτιδικό φορέα CPSOC(3,9-Acm) με θειοαιθερικό δεσμό.Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν ανοσοποιήσεις σε πειραματόζωα (ωοτόκες όρνιθες) με τα ανοσογονικά συμπλέγματα, ακολουθώντας δύο πρωτόκολλα που διέφεραν ως προς τη συγκέντρωση του ανοσογόνου και τα διαστήματα μεταξύ των ανοσοποιήσεων. Τα αυγά των ανοσοποιημένων ζώων συλλέχθηκαν και από αυτά απομονώθηκαν τα IgY αντισώματα (ακολουθώντας δύο διαφορετικές τεχνικές), τα οποία στη συνέχεια καθαρίστηκαν με διαπίδυση.Ακολούθησε μία σειρά ενζυμικών προσδιορισμών των αντισωμάτων, με την τεχνική της έμμεσης ELISA, για τον έλεγχο της εξειδίκευσή τους τόσο για τα ανοσογονικά συμπλέγματα όσο και για ολόκληρη την cTnI. Στο πλαίσιο αυτών των μελετών έγινε σύγκριση των επιμέρους παραχθέντων αντισωμάτων, ελέγχθηκε το χρονικό διάστημα που οι όρνιθες είναι ικανές να παράγουν εξειδικευμένα αντισώματα, αλλά και η σταθερότητα των αντισωμάτων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους.Στη συνέχεια τα αντισώματα καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας, όπου ταυτόχρονα ελέγχθηκε και η εξειδικευμένη πρόσδεση των αντισωμάτων στον επίτοπο cTnI19-31. Για τη χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιήθηκε το ειδικό υλικό προσρόφησης Seph@Ahx-cTnI19-31, το οποίο προέκυψε από τη σύζευξη επιφανειακά τροποποιημένων (με θειοπροπυλ-ομάδα) σφαιριδίων σεφαρόζης με το IAc-Ahx-cTnI19-31.Επίσης, πραγματοποιήθηκαν δύο ενζυμικές δοκιμασίες ELISA τύπου sandwich για την ανίχνευση της cTnI. Στη μία εξ’ αυτών χρησιμοποιήθηκε το Ac-12peptide για τη σύλληψη της τροπονίνης και στην άλλη για τον ίδιο σκοπό χρησιμοποιήθηκαν anti-cTnI IgG εμπορικά αντισώματα, ενώ και στις δύο περιπτώσεις ως αντισώματα ανίχνευσης χρησιμοποιήθηκαν τα παραχθέντα αντισώματα έναντι του μίγματος των τεσσάρων ανοσογονικών συμπλεγμάτων.Αναπτύχθηκαν έξυπνα υλικά (Smart materials and structure, SmMaS) με σκοπό την ανίχνευση της cTnI με μη ενζυμικές τεχνικές. Με βάση το 12peptide (FYSHSFHENWPS), που προτάθηκε ότι αναγνωρίζει την cTnI, συντέθηκε 1) το SiO2@12peptide, το οποίο αποτελείται από επιφανειακά τροποποιημένα νανοσωματίδια σίλικας συζευγμένα με το 12peptide και 2) το TCDA@12peptide, το οποίο αποτελείται από το πολυμερισμένο σύμπλεγμα 10,12-τρικοσαδιινοϊκού οξέος συζευγμένο με το 12peptide.Ακολούθησε η ανάπτυξη δύο μη ενζυμικών τεχνικών ανίχνευσης της cTnI σε ορούς ασθενών και σε υγιείς. Στην πρώτη χρησιμοποιήθηκε το υλικό SiO2@12peptide και μελετήθηκε με θερμοβαρυμετρία και φασματοσκοπία FTIR, ενώ στη δεύτερη χρησιμοποιήθηκε το TCDA@12peptide και μελετήθηκε η αλλαγή του χρώματός του.Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι τα ανοσοποιημένα πειραματόζωα παρήγαγαν υψηλού τίτλου και εξειδικευμένα αντισώματα έναντι των ανοσογονικών συμπλεγμάτων, και ανιχνεύουν την cTnI. Επίσης τα παραχθέντα αντισώματα που καθαρίστηκαν μόνο με διαπίδυση μπορούν να χρησιμοποιηθούν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό για την ανίχνευση της cTnI. Τα απτένια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υλικά για τον καθαρισμό των αντισωμάτων με χρωματογραφία συγγένειας. Ο φορέας CPSOC(3,9Acm) αποτελεί χρήσιμο εργαλείο στην παραγωγή αντισωμάτων. Τα απομονωμένα IgY αντισώματα από αυγά όρνιθας είναι κατάλληλα για την ανάπτυξη διαγνωστικών δοκιμασιών και είναι σταθερά για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τα υλικά SiO2@12peptide και TCDA@12peptide μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανάπτυξη δοκιμασιών ανίχνευσης της cTnI.