DNA replication dyregulation and response pathways following induced genotoxic stress in Schizosaccharomyces pombe
Authors: Κασελίμη Ειρήνη 
Published: June 2022

Τα ευμεγέθη ευκαρυωτικά γονιδιώματα εκκινούν την αντιγραφή τους από πολλές διαφορετικές, διάσπαρτες σε αυτά αφετηρίες, που ενεργοποιούνται με στοχαστικότητα κατά τη διάρκεια της φάσης S. Η διαδικασία εκκίνησης της αντιγραφής από κάθε αφετηρία είναι μία διαδικασία δύο σταδίων. Αρχικά, λαμβάνει χώρα αδειοδότηση της αφετηρίας κατά την οποία η ελικάση της αντιγραφής MCM2-7 φορτώνεται στην αφετηρία από τους αδειοδοτικούς παράγοντες CDC6/Cdc18 και Cdt1 σε αδρανή κατάσταση. Στο δεύτερο στάδιο, η ελικάση ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση λόγω της αύξησης της CDK δραστηριότητας κατά τη G1/S μετάβαση, η οποία σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση και άλλων βοηθητικών παραγόντων και τη στρατολόγηση της αντιγραφικής μηχανής πυροδοτεί το τοπικό ξετύλιγμα του DNA και τη σύνθεση του νέο-αντιγραφόμενου DNA. Απορρύθμιση του μηχανισμού αδειοδότησης της αντιγραφής σχετίζεται με γονιδιωματική αστάθεια και με την επαγωγή μονοπατιών κυτταρικού θανάτου. Στο σχιζοσακχαρομύκητα υπερέκφραση του αδειοδοτικού παράγοντα Cdc18 αρκεί για την κατάργηση του κανόνα για εκκίνηση της αντιγραφής μία και μόνο μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, προκαλώντας επαναντιγραφή του DNA κατά την οποία αντιγραφικές φυσαλίδες γεννώνται μέσα σε ήδη υπάρχουσες φυσαλίδες. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής υπήρξε η διερεύνηση κυτταρικών «αισθητήρων» ειδικά για φαινόμενα απορρύθμισης του αδειοδοτικού μηχανισμού. Για το σκοπό αυτό διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος του ριβοσωματικού DNA (ribosomal DNA, rDNA) ως αισθητήρα βλαβών ειδικά κατά την επαγωγή του φαινομένου της επαναντιγραφής. Το ριβοσωματικό DNA αποτελείται από εκατοντάδες-χιλιάδες επαναλήψεις rRNA γονιδίων, η μεταγραφή των οποίων δίνει γένεση στον πυρηνίσκο. Σε κάθε επανάληψη εδράζεται μία αφετηρία της αντιγραφής με αποτέλεσμα τη συσσώρευση πολλών θέσεων έναρξης της αντιγραφής που βρίσκονται σε πυκνή διάταξη στο rDNA. Δεδομένης της ιδιαιτερότητας του rDNA ως προς τη συσσώρευση αφετηριών αλλά και άλλων εγγενών χαρακτηριστικών (συνεχής και έντονη μεταγραφή των γονιδίων του, περιοχές φραγμού της αντιγραφικής διχάλας, τεταρτογενείς δομές του DNA G4 κ.ά.) υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο σε συνθήκες επαναδειοδότησης και επαναντιγραφής, δρώντας ως σηματοδότης της ύπαρξης ανισορροπίας στο σύστημα αδειοδότησης. Αξιοποιήσαμε το σχιζοσακχαρομύκητα ως πειραματικό σύστημα προκειμένου να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το rDNA εμφανίζει αύξηση του αριθμού αντιγράφων του πολύ νωρίς κατά την πρόκληση ήπιας επαναντιγραφής. Ακόμη, εστίες συσσώρευσης των δεικτών DNA βλάβης της φωσφορυλιωμένης ιστόνης 2Α και του Rad22 συγκεντρώνονται κυρίως στην περιοχή του πυρηνίσκου, που οργανώνεται γύρω από το rDNA, κατά την επαγωγή ήπιας επαναντιγραφής. Στο δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής πραγματοποιήσαμε συνδυαστικά πειράματα με υπερέκφραση Cdc18 αγρίου τύπου ή μεταλλάγματος από το οποίο απουσιάζει το αμινοτελικό άκρο παρουσία ή απουσία της πρωτεΐνης Rad3, δείχνοντας ότι κατά την υπερέκφραση του Cdc18 τα επαγόμενα Rad3-εξαρτώμενα και μη μονοπάτια είναι αναγκαίο να δρουν σε συνέργεια για την πλήρη παρεμπόδιση της εισόδου σε μίτωση όταν το DNA των κυττάρων έχει υποστεί επαναντιγραφή. Έτσι, το Cdc18 αναδεικνύεται ως κομβικό μόριο για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.