Μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την ενεργότητα της PAF-ακετυλοϋδρόλυσης στην λιποπρωτεΐνη (a)
Authors: Τσιρώνης Λουκάς 
Published: August 2021

Το σωματίδιο της λιποπρωτεΐνης (a) [Lp(a)] είναι εμπλουτισμένο σε ενεργότητα ακετυλοϋδρολάσης του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF-AH). Έτσι ένα λειτουργικό χαρακτηριστικό της Lp(a) είναι η υδρόλυση και απενεργοποίηση του PAF αλλά και των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων, μόρια τα οποία ασκούν προφλεγμονώδη και προαθηρογόνο δράση. Στην διατριβή αυτή μελετήθηκανη ενεργότητα αλλά και οι φαινόμενες κινητικές σταθερές Km και Vmax της PAF-AH στην Lp(a) σε σύγκριση με αυτές του ενζύμου που βρίσκεται συνδεδεμένο στην LDL σε στεφανιαίους ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Στην μελέτη πήραν μέρος 20 στεφανιαίοι ασθενείς καθώς και 25 υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα της Lp(a) μετρήθηκαν με μέθοδο ELISA, ενώ οι ισομορφές της apo(a) προσδιορίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1.5% SDS-αγαρόζης και εκφράστηκαν ως αριθμός επαναλαμβανόμενων Kringle 4 (Κ4). Η απομόνωση της Lp(a) από το πλάσμα έγινε με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Lysine-Sepharose 4Β, ενώ αυτή της LDL με υπερφυγοκέντρηση. Η ενεργότητα της PAF-AH προσδιορίστηκε με την μέθοδο καταβύθισης με τριχλωροξικό οξύ. Η ειδική ενεργότητα και οι φαινόμενες κινητικές σταθερές της PAF-AH στην Lp(a) ήταν σημαντικά μικρότερες στους στεφανιαίους ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στους μάρτυρες. Λαμβάνοντας υπόψη ότι όλοι οι στεφανιαίοι ασθενείς της μελέτης ελάμβαναν υπολιπιδαιμική αγωγή θελήσαμε να διερευνήσουμε τη πιθανή επίδραση αυτής στην ενεργότητα της PAF-AH της Lp(a) στα άτομα αυτά. Για το σκοπό αυτό έγινε στην μελέτη πήραν μέρος και 11 ασθενείς με πρωτοπαθή υπεχοληστερολαιμία (δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ) στους οποίους έγινε προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου στις Lp(a), LDL πριν και μετά την 5μηνη χορήγηση ατορβαστατίνης. Η θεραπεία με ατορβαστατίνη σύμφωνα με τα αποτελεσματά μας προκάλεσε σημαντική μείωση της ενεργότητας της PAF-AH στην LDL, ενώ αντίθετα δεν επηρέασε την ενεργότητα της PAF-AH στην Lp(a), εύρημα το οποίο αποκλείει την συμμετοχή τηςυπολιπιδαιμικής θεραπείας στο παραπάνω φαινόμενο. Ωστόσο, η απομάκρυνση της apo(a) με αναγωγική διάσπαση από το υπόλοιπο λιποπρωτεϊνικό σωματίδιο είχε σαν αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση της ενζυμικής ενεργότητας της PAF-AH στην Lp(a) των στεφανιαίων, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στην Lp(a) των μαρτύρων. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα είναι πιθανό η πολυπεπτιδική αλυσίδα της apo(a) να επηρεάζει την ενεργότητα της PAF-AH στην Lp(a) των ασθενών με στεφανιαία νόσο μειώνοντας την ικανότητα αυτής να αποικοδομεί και να απενεργοποιεί φωσφολιπίδια με προφλεγμονώδη και προαθηρογόνο δράση. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο PAF εκτός από υπόστρωμα για την PAF-AH αποτελεί και ισχυρό αγωνιστή για τα αιμοπετάλια μελετήθηκε η επίδραση της Lp(a) στην ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών με PAF. Σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια η Lp(a) ανέστειλε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τόσο την πρωτογενή συσσώρευση που προκαλεί ο PAF όσο και την δευτερογενή η οποία οφείλεται στη δράση αγωνιστών οι οποίοι εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Η παρατηρούμενη αναστολή βρέθηκε να είναι αρκετά μικρότερη παρουσία του συστήματος CP/CPK και ασπιρίνης. Παράλληλα η Lp(a) ανέστειλε πλήρως την έκκριση του ΑΤΡ από τα πυκνά κοκκία αιμοπεταλίων που ενεργοποιήθηκαν με PAF. Το φαινόμενο αυτό δεν ήταν εξειδικευμένο έναντι της δράσης του PAF, αφού παρόμοια αναστολή παρατηρήθηκε και όταν ως αγωνιστές χρησιμοποιήθηκαν ADP και TRAP. Για να διευκρινισθεί ο τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνεται η αναστολή που παρατηρήθηκε στα πειράματα της συσσωρευομετρίας, διερευνήθηκε με χρήση κυτταρομετρίας ροής η επίδραση της Lp(a) στην έκφραση του αιμοπεταλιακού υποδοχέα αι^β3 μετά από ενεργοποίηση με PAF. Είτε παρουσία είτε απουσία του συστήματος CP/CPK και ασπιρίνης παρατηρήθηκε αναστολή της έκφρασης του υποδοχέα αυτού παρουσία της Lp(a). j Στην συνέχεια θελήσαμε να διερευνήσουμε ποια από τα δομικά χαρακτηριστικά της <Lp(a) είναι υπεύθυνα για την εκδήλωση της βιολογικής (ανασταλτικής) της δράσης. > Για τον σκοπό αυτό έγινε παρασκευή πλυμένων αιμοπεταλίων. Βρέθηκε ότι η Lp(a)καθώς και η Lp(a-) ήταν ικανές να αναστείλουν σημαντικά τόσο την συσσώρευση όσο και την έκφραση του απυβ3 μετά από ενεργοποίηση με PAF, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε για την LDL. Προηγούμενη απενεργοποίηση της ενδογενούς PAF-AH δεν διαφοροποίησε την ανασταλτική δράση της Lp(a). Αντίθετα, όταν τα αιμοπετάλια ενεργοποιήθηκαν με TRAP τα σωματίδια Lp(a) και LDL παρουσίασαν παρόμοια σημαντική ανασταλτική δράση τόσο ως προς τησυσσώρευση όσο και ως προς την έκφραση του υποδοχέα am$3. Επιπλέον βρέθηκε ότι το σωματίδιο της Lp(a) ασκεί σημαντική αναστολή της πρόσδεσης του Fg-FITC σε αιμοπετάλια που ενεργοποιήθηκαν με ADP. Συμπερασματικά είναι πιθανό η Lp(a) να αναστέλλει την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ένα μη ειδικό μηχανισμό αναστέλλοντας την έκφραση του υποδοχέα am$3 καθώς και την πρόσδεση του Fg σ’αυτόν. Στην παραπάνω διαδικασία δεν φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο η apo(a) αλλά ούτε το περιεχόμενο της Lp(a) σε PAF-AH. Το παραπάνω εύρημαυποδεικνύει έναν νέο μηχανισμό με τον οποίο πιθανά η Lp(a) να συμμετέχει στην παθοφυσιολογία της θρόμβωσης.