Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη λειτουργία αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση
Authors: Πετρόπουλος Αλέξανδρος 
Published: January 2014

Τα ριβοσώματα, οι μακρομοριακές μεταφραστικές μηχανές που είναι υπεύθυνες για την πρωτεϊνική σύνθεση, αποτελούν έναν από τους κυριότερους κυτταρικούς στόχους των αντιβιοτικών, που χορηγούνται για αντιμικροβιακή θεραπεία. Μελέτες για περισσότερο από 40 χρόνια δείχνουν ότι το κατάλληλο ιοντικό περιβάλλον (μονοσθενή, δισθενή κατιόντα και πολυαμίνες) είναι απαραίτητο για τη σωστή ριβοσωματική λειτουργία, ενώ παράλληλα επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις του με διάφορους προσδέτες. Παρόλα αυτά η μοριακή βάση της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στο μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών δεν έχει ενδελεχώς μελετηθεί. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση σε συνθήκες που προσομοιάζουν με τις φυσιολογικές του κυττάρου και η μελέτη της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση αυτών. Τα αντιβιοτικά που μελετήθηκαν ήταν: α) η βλαστισιδίνη, ως κλασικός αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (ΡΤάσης), β) το μακρολίδιο τυλοσίνη που αναστέλλει την ΡΤάση, αλλά παράλληλα προσδένεται στην αρχή του τούνελ εξόδου και παρεμποδίζει την πολυπεπτιδική αλυσίδα να εξέλθει από το ριβόσωμα, και γ) τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη (πρώτης γενεάς), αζιθρομυκίνη (δεύτερης γενεάς) και τελιθρομυκίνη (μακρολίδιο τρίτης γενεάς ή κετολίδιο), η δράση των οποίων έγκειται στην παρεμπόδιση του τούνελ εξόδου. Εξίσου σημαντική φαίνεται να είναι η επίδραση των μακρολιδίων στη συγκρότηση της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας. Ο μηχανισμός δράσης των αντιβιοτικών και η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση τους έγινε αρχικά με κινητικές μελέτες. Το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε ήταν η αντίδραση πουρομυκίνης, η οποία μας έδωσε τη δυνατότητα τιτλοδότησης των ενεργών ριβοσωμάτων. Βάσει αυτού μελετήθηκαν τα αντιβιοτικά βλαστισιδίνη και τυλοσίνη που αναστέλλουν άμεσα την ΡΤάση, ενώ για τη μελέτη των υπολοίπων μακρολιδίων διεξήχθησαν πειράματα συναγωνιστικής αναστολής. Ως γνωστό, τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη μοιράζονται κοινές θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα με την τυλοσίνη. Έτσι, για την εύρεση των σταθερών πρόσδεσης αυτών στο ριβόσωμα έγινε συναγωνισμός με τυλοσίνη. Τα πειράματα συναγωνισμού πραγματοποιήθηκαν, επωάζοντας το ριβόσωμα με μείγμα μακρολιδίου καιτυλοσίνης, και τιτλοδοτώντας την απομένουσα δραστικότητα του ριβοσώματος με την αντίδραση πουρομυκίνης απομακρύνοντας την περίσσεια αντιβιοτικών. Σε παράλληλα πειράματα, το ριβόσωμα προεπωάστηκε αρχικά με το μακρολίδιο και στη συνέχεια προστέθηκε τυλοσίνη, η οποία ανιχνεύει το εναπομείναν ριβοσωματικό σύμπλοκο. Επειδή η σταθερά συγγένειας στη δεύτερη περίπτωση βρέθηκε μικρότερη (ισχυρότερη πρόσδεση αντιβιοτικού) συμπεράναμε, ότι ο μηχανισμός πρόσδεσης του αντιβιοτικού είναι βραδύς και ακολουθεί δυο στάδια. Βασιζόμενοι στις τιμές των σταθερών συγγένειας σε πειράματα αναγέννησης του ριβοσωματικού συμπλόκου από την απενεργοποιημένη μορφή του, προσδιορίστηκαν ξεχωριστά όλες οι κινητικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την πρόσδεση του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα. Συγκρίναμε τις παραμέτρους αυτές και γενικότερα την ισχύ πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα σε πέντε ιοντικές συνθήκες: (α) 4,5 mM Mg²⁺, 150 mM NH₄⁺, (β) 4,5 mM Mg²⁺, 150 Mm NH₄⁺, 100 μΜ σπερμίνη, (γ) 4,5 mM Mg²⁺, 150 mM NH₄⁺, 50 μΜ σπερμίνη και 2 mM σπερμιδίνη, (δ) 4,5 mM Mg²⁺, 150 mM NH₄⁺ ριβοσωματικό σύμπλοκο φωτοσημασμένο με 100 μΜ ΑΒΑ-σπερμίνη, και (ε) 10 mM Mg²⁺, 100 mM NH₄⁺. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πολυαμίνες βελτιώνουν την πρόσδεση της βλαστισιδίνης, αλλά μειώνουν την πρόσδεση των μακρολιδίων. Η επίδραση των ιόντων Mg²⁺ προσομοιάζει εκείνης των πολυαμινών, αλλά είναι λιγότερο αποτελεσματική, αφού 100 μΜ σπερμίνης επιφέρουν μεγαλύτερη αναστολή πρόσδεσης, από ότι 10 mM Mg²⁺. Για να ερμηνευτεί σε μοριακό επίπεδο η επίδραση της σπερμίνης στη συγγένεια των αντιβιοτικών έναντι του ριβοσώματος, οι θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο ριβόσωμα προσδιορίστηκαν με φωτοσήμανση συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Οι θέσεις αυτές αποκάλυψαν ότι οι πολυαμίνες προσδένονται σε γειτονικές θέσεις προς τα αντιβιοτικά, επηρεάζοντας την τοπική διαμόρφωση και το φορτίο. Επιβεβαίωση του μηχανισμού δράσης και της επίδρασης των πολυαμινών έγινε με ανάλυση αποτυπώματος. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, τα μακρολίδια προσδενόμενα στο ριβόσωμα προστατεύουν ορισμένα νουκλεοτίδια από την επίδραση χημικών τροποποιητών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αντιβιοτικά διέρχονται μια ενδιάμεση κατάσταση πρόσδεσης στο ριβόσωμα δεσμευόμενα αρχικά στην είσοδο του τούνελ εξόδου και στη συνέχεια εισχωρώντας βαθύτερα σε αυτό. Η φύση της ενδιάμεσης κατάστασης εξαρτάται από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε μακρολιδίου. Η επίδραση των πολυαμινών στο μηχανισμό πρόσδεσης ελέγχθηκε επαναλαμβάνοντας τα πειράματα χημικής προστασίας παρουσία αυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μείωση της πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα επιτελείται κυρίως μέσω της επίδρασης των πολυαμινών στη δέσμευση του υδρόφοβου λακτονικού δακτυλίου. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε αντιβιοτικού επηρεάζουν ποικιλοτρόπως το μέγεθος της επίδρασης αυτής. Στο τελευταίο κομμάτι της διατριβής μελετήθηκε η ισχύς των μακρολιδίων, υπολογίζοντας την αναστολή που προκαλούν στο συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης του γονιδίου της GFP πρωτεΐνης, και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα κινητικά δεδομένα πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα-στόχο. Σε υψηλή συγκέντρωση ιόντων Mg²⁺ η τυλοσίνη έχει μεγαλύτερη ισχύ, ενώ σε χαμηλή συγκέντρωση ιόντων απουσία ή παρουσία πολυαμινών η αζιθρομυκίνη. Η τελιθρομυκίνη παρουσίασε τη χαμηλότερη ισχύ πρόσδεσης στο ριβόσωμα και αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπρόσθετα, ελέγχθηκε πιθανή επίδραση των μακρολιδίων στην πρόσδεση των υποστρωμάτων (tRNAs) στην Α-, Ρ- και Ε- θέση του ριβοσώματος, στη μετατόπιση αυτών από την Α- στην Ρ- θέση και στη μεταφραστική πιστότητα του ριβοσώματος. Βρήκαμε ότι τα μακρολίδια δεν μπορούν να επηρεάσουν αυτά τα στάδια της ριβοσωματικής λειτουργίας.