Ανάπτυξη πρότυπων βιοαισθητήτων για τον προσδιορισμό βιοτοξικών ουσιών στο γάλα και στο νερό
Authors: Καραπέτης Στέφανος 
Published: September 2021

Οι βιοαισθητήρες έχουν ένα σημαντικό ρόλο στην επιστήμη της χημικής ανάλυσης κυρίως στο πεδίο των ηλεκτροχημικών μεθόδων. Τα κύρια χαρακτηριστικά των βιοαισθητήρων, που τους τοποθετούν στις πλέον σύγχρονες τεχνικές της χημικής ανάλυσης, είναι η υψηλή ευαισθησία, η μεγάλη εκλεκτικότητα, η γρήγορη απόκριση και η επαναχρησιμότητα. Σε αναλύσεις πραγματικών δειγμάτων κρίνεται επιπλέον ως απαραίτητη μέθοδος αξιολόγησης το ποσοστό της ανάκτησης, δηλαδή η κλασματική διαφορά του σήματος μεταξύ των πραγματικών και των πρότυπων δειγμάτων. Στα πλεονεκτήματα της ανάπτυξης και χρήσης των βιοαισθητήρων για εμπορικούς σκοπούς, εντάσσονται η εύκολη κατασκευή, η φορητότητά τους και το χαμηλό κόστος. Η αναλυτική αξιοπιστία των βιοαισθητήρων είναι παρόμοια με αυτή άλλων πολύ πιο ακριβών μεθόδων της ενόργανης χημικής ανάλυσης. Η εφαρμογή τους στην γρήγορη ανίχνευση τοξινών σε είδη, που καταναλώνουμε στην καθημερινή μας ζωή, είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την δημόσια υγεία. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ’ αρχήν ένας πρότυπος βιοαισθητήρας ροής (flow injection με ταχύτητα 2 ml/min) για προσδιορισμό της τοξίνης της χολέρας σε υδατικά μικρο-δείγματα (10 μL ή 20 μL). Ο βιοαισθητήρας αυτός κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανοστιβάδων γραφενίου σε φύλλα χαλκού με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες (BLMs), που τροποποιήθηκαν με φυσικούς υποδοχείς GM1 (receptors). Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος της αναγεννησιμότητας ανά 6 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις (διατήρηση της αρχικής δραστικότητάς του). Ο έλεγχος του βιοαισθητήρα σε πρότυπα δείγματα νερών λίμνης ήταν επιτυχής και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές υπό την επίδραση 7 συνηθισμένων παρεμποδιστών που εισήχθησαν σε πρότυπα δείγματα. Το πλέον κατάλληλο περιβάλλον για να γίνουν οι μετρήσεις βρέθηκε να είναι pH=7. Ο βιοαισθητήρας ελέγχθηκε σε ένα δυναμικό εύρος της τοξίνης (10nM-10μΜ) και το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε σε (LOD=1nM). Στην συνέχεια έγινε μελέτη αυτού του βιοαισθητήρα σε 10 δείγματα πραγματικού νερού λίμνης και υπολογίστηκε το ποσοστό της ανάκτηση σε δύο συγκεντρώσεις της Τοξίνης (Χαμηλή 50 nM και υψηλή 7 μM). Τα ποσοστά της ανάκτησης που βρέθηκαν είναι αποδεκτά σύμφωνα με τα κριτήρια του ICH2005 για τη καταλληλόλητα του βιοαισθητήρα για χρήση σε επαναλαμβανόμενη παρακολούθηση των υδάτων.Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν τρεις πρότυποι απτοαισθητήρες για την ανίχνευση της Αφλατοξίνης (AFM1) στο γάλα. Ο πρώτος απτοαισθητήρας χωρίς δείκτη (Label-free) κατασκευάστηκε με επιφανειακή εναπόθεση δενδριμερούς (PAMAM-4G) σε ηλεκτρόδιο χρυσού όπου ακινητοποιήθηκε ένα αμινοτροποποιημένο DNA απταμερές (aptamer 1-receptor). Ο απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της διηλεκτρικής φασματοσκοπίας (EIS). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (15-120 ng/l) και προσδιορίστηκε το όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=8.47 ng/l). Επίσης έγινε έλεγχος σε πραγματικά δείγματα στο ίδιο δυναμικό εύρος με παρόμοιο όριο ανίχνευσης και ανάκτηση (recovery) σήματος μεγαλύτερη από 78%. Στη συνέχεια κατασκευάστηκε ο δεύτερος απτοαισθητήρας με επιφανειακή εναπόθεση Neutravidin/Fe-COOH και ακινητοποίηση τροποποιημένων απταμερών (aptamer 2-receptor) με βιοτίνη. O απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της Διαφορικής παλμικής βολταμετρίας (DPV). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (15-120 ng/l) και προσδιορίστηκε το όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=8,52 ng/l). Ο απτοαισθητήρας αυτός έχει επιπλέον το καινοτόμο στοιχείο του μικρού εργαστηριακού χρόνου κατασκευής (περίπου 3 ώρες).Τέλος κατασκευάστηκε ο τρίτος απτοαισθητήρας με ακινητοποίηση τροποποιημένου απταμερούς με κυανό του μεθυλίου (receptor) αναμεμιγμένο με μερκαπτοεξανόλη. O απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της Διαφορικής παλμικής βολταμετρίας (DPV). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (31.45-3145 ng/l) και βρέθηκε όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=37.7 ng/l). Ο συγκεκριμένος απτοαισθητήρας παρουσίασε μεγάλες τυπικές αποκλίσεις στις καμπύλες βαθμονόμησης και για αυτό χαρακτηρίστηκε ως αντικείμενο περαιτέρω μελέτης. Όμως το όριο ανίχνευσης είναι συγκρίσιμο με βιβλιογραφικά δεδομένα.Τα όρια ανίχνευσης (LOD) και των τριών ανωτέρω πρότυπων απτοαισθητήρων, που αναπτύχθηκαν, είναι κάτω από το επιτρεπόμενο όριο τιμών που έχουν ορίσει τόσο η ΕΕ (47 ng/l) όσο και οι ΗΠΑ (471 ng/l) και δύνανται να χαρακτηριστούν κατάλληλοι για την ανίχνευση της Αφλατοξίνης Μ1 στο γάλα.