Τρόπος δράσης και θεραπευτικό όφελος της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης μεσεγχυματικών κυττάρων λιπώδους ιστού και νανοφορέων anti-VEGF σε επαγόμενο ζωικό μοντέλο φλεβικής απόφραξης του αμφιβληστροειδούς
Authors: Γούναρη Ελένη 
Published: June 2021

Τα τελευταία χρόνια, η χρήση αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (anti-VEGF) έχει συμβάλλει ενεργά στη θεραπεία της απόφραξης φλέβας του αμφιβληστροειδούς (RVO) την ίδια στιγμή που πολυμερικοί νανοφορείς για ελεγχόμενη και διαρκή αποδέσμευση του φαρμάκου αναδύονται ταχύτατα. Παράλληλα τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) και οι εκκρινόμενοι από αυτά παράγοντες έχουν συσχετιστεί με την προστασία των γαγγλιακών κυττάρων, περιορίζοντας τηνν εκφύλιση. Ο αναστολέας κινάσης ΜΕΚ, PD0325901, έχει εφαρμοστεί για επαγόμενη ανάπτυξη RVO μετά από ενδοϋαλοειδική χορήγηση σε κονίκλους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της συνδυαστικής επίδρασης MSCs προερχόμενων από το λιπώδη ιστό (ASCs) και νανοφορέων anti-VEGF με βελτιωμένες ιδιότητες σε ένα PD0325901 φαρμακευτικά επαγόμενο μοντέλο RVO. Στην in vitro προσέγγιση της μελέτης, ο αναστολέας PD0325901 χρησιμοποιήθηκε για να επάγει την έκφραση EPCR (Endothelial Protein C Receptor), ενός κοινού για την RVO δείκτη, σε πρωτογενή σειρά ενδοθηλίου HUVEC (Human Umbilical Cord Endothelial Cell). Αντίσωμα anti-VEGF ενθυλακώθηκε σε νανοσωματίδια τροποποιημένης θειολωμένης χιτοζάνης (ThioCHI) και συνδυαστικά με MSCs εφαρμόστηκαν σε καλλιέργειες προσομοίωσης RVO προς έλεγχο της απόκρισής τους στον συνδυασμό. Σκέτα νανοσωματίδια CHI και ThioCHI κατασκευάστηκαν με την τεχνική της ιονικής πηκτωματοποίησης και τα ThioCHI επιλέχτηκαν ως πολυμερική μήτρα βελτιωμένων ιδιοτήτων βιοπροσκόλλησης για την ενθυλάκωση του anti-VEGF. Πλήρης χαρακτηρισμός των παρακευασθέντων NPs έγινε με φασματοσκοπία υπερύθρου, περίθλαση ακτίνων Χ και SEM. Τα MSCs λήφθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης ανθρώπινου λιπώδους ιστού που λήφθηκε κατόπιν λιπεκτομής και καλλιεργήθηκε μέχρι και το στάδιο των 5 ανακαλλιεργειών το πολύ. Μετά από έκθεση 24 ωρών της σειράς HUVEC στον αναστολέα PD0325901, η επίδραση των NPs με ενθυλακωμένο anti-VEGF(nanoThioCHI-anti-VEGF), MSCs και συνδυασμού τους αξιολογήθηκε με ποσοτικοποίηση των εκκρινόμενων ποσοτήτων EPCR και anti-VEGF σε βάθος χρόνου με δοκιμασίες ELISA.Για τις in vivo πειραματικές δοκιμές, ASCs απομονώθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης λιπώδους ιστού που λήφθηκε από τη βουβωνική χώρα κονίκλου. Τα κύτταρα εκπτύχθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και τροποποιήθηκαν γενετικά προκειμένου να εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP. Εικοσι-τέσσερις κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν στις ακόλουθες τέσσερις ομάδες: Ομάδα Ι ASCs (n = 6), ομάδα ΙΙ ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF (n = 6), ομάδα III RVO (n = 6) και ομάδα IV ελέγχου (n = 6). Για την επαγωγή RVO οι ομάδες Ι-ΙΙΙ έλαβαν ενδοϋαλοεδικά PD0325901 στη δόση των 0.1m ml ανά οφθαλμό ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε με τον ίδιο τρόπο BSS μόνο. Δώδεκα ημέρες αργότερα τα προτεινόμενα θεραπευτικά σχήματα χορηγήθηκαν στις ομάδες I-II ενώ οι ομάδες ΙΙΙ-IV έλαβαν BSS. Δύο εβδομάδες αργότερα έγινε ευθανασία των πειραματοζώων για να προσδιοριστεί η επίδραση όσων χορηγήθηκαν. Πριν την ευθανασία έγινε κλινική και οφθαλμολογική αξιολόγηση ενώ ακολούθησε ιστολογική ανάλυση μονιμοποιημένων τομών αμφιβληστροειδούς, ELISA για ποσοτικοποίηση εκκρινόμενων παραγόντων στο περιφερικό αίμα των ζώων και το υαλοειδές υγρό και Q-PCR για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης σχετιζόμενων με την απόφραξη ή τη φλεγμονή γονιδίων. Μικρού μεγέθους παρόμοια των εμβρυϊκών βλαστοκύτταρων (VSELs) απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα των πειραματοζώων, ως σημάδι απόκρισης στη βλάβη 12 και 36 ημέρες μετά την επαγωγή ενώ χαρακτηρίστηκαν με χρώση αλκαλικής φωσφατάσης και Q-PCR για την έκφραση γονιδίων εμβρυϊκής φύσης.Τα νανοσωματίδια τροποποιημένης χιτοζάνης (nanoThioCHI) δεν παρουσίασαν κυτταροτοξική εικόνα στις κυτταροκαλλιέργειες ενώ η απελευθέρωση anti-VEGF εμφανίστηκε συνεχής για περίπου 8 ημέρες. Τα μη φυσιολογικά επαυξημένα επίπεδα EPCR που μετρήθηκαν στο in vitro μοντέλο προσομοίωσης RVO μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά 24 και 48 ώρες μετά την έκθεση του πάσχοντος ενδοθηλίου στα nanoThioCHI-anti-VEGF και τα MSCs. Ωστόσο ο συνδυασμός τους φάνηκε να είναι περισσότερο αποδοτικός από την μεμονωμένη παρουσία του καθενός και μάλιστα σε χρονικό διάστημα 24 ωρών, συνοδευόμενος από παράλληλη μείωση των μεταγραφικών επιπέδων VEGF από τα κύτταρα. Περιορισμένο οίδημα, αιμορραγίες και αποκόλλησεις αμφιβληστροειδούς και βελτιωμένη κυτταρική οργάνωση παρατηρήθηκε στις ομάδες Ι και ΙΙ σε σύγκριση με τα παθολογικά συμπτώματα της ομάδας ΙΙΙ που παρουσίαζε εικόνα πλήρους ιστολογικής αποδιοργάνωσης συνδυασμένη με θετική χρώση ανοσοϊστοχημείας για δείκτες νεοαγγείωσης (FVIII) ή σχετιζόμενους με την απόφραξη. Σημαντική μείωση των υψηλών επιπέδων εκκρινόμενων φλεγμονωδών κυτοκινών μετρήθηκαν στο υαλοειδές υγρό των ομάδων Ι και ΙΙ, ενώ η έκφραση RVO-σχετιζόμενων γονιδίων και γονιδίων φλεγμονής μειώθηκε επίσης σημαντικά και ειδικότερα στην ομάδα ΙΙ. Θετικές χρώσεις ανοσοϊστοχημείας για δείκτες κυτταρικής αναγέννησης (ki-67, GFAP) παρατηρήθηκαν στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία. GFP+ ASCs, ικανά για διαφοροποίηση προς προγενήτορες νευρικών κυττάρων, ανιχνεύτηκαν στα κυτταρικά εναιωρήματα των ιστών της ομάδας ΙΙ, υποδεικνύοντας την πιθανή προσκόλλησή τους στην περιοχή που έχει υποστεί βλάβη. Η χρώση H&E στα κυτταρικά επιχρίσματα του περιφερικού αίματος αποκάλυψε την παρουσία κυττάρων πολύ μικρού μεγέθους με υψηλή αναλογία πυρήνα-κυτταροπλάσματος στην ομάδα RVO. Η θετική χρώση αλκαλικής φωσφατάσης σε συνδυασμό με την υπερέκφραση των γονιδίων Oct3/4, Nanog και Sox-2 επιβεβαίωσε την ύπαρξη αδιαφοροποίητων κυττάρων με εμβρυϊκά χαρακτηριστικά ως απόκριση στην επαγόμενη βλάβη. Συμπερασματικά η παρούσα διατριβή προτείνει μία θεραπεία βασισμένη στη χρήση βλαστοκυττάρων λιπώδους ιστού και συνοδευόμενη από τη διαρκή και χρονοελεγχόμενη απελευθέρωση anti-VEGF από βελτιωμένους νανοφορείς με στόχο το συνδυασμό της παρακρινούς δράσης των βλαστοκυττάρων με τον σταδιακό περιορισμό της παθολογικής νεοαγγείωσης για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της RVO.