Characterization of spoilage microbiota through next-generation sequencing and application of spectroscopy-based technologies for assessing the microbiological quality of fresh-cut produce
Authors: Μάνθου Ευανθία 
Published: November 2021

Τα φρέσκα κομμένα προϊόντα ικανοποιούν την συνεχώς αυξανόμενη ανάγκη των καταναλωτών για υγιεινά και ταυτόχρονα γρήγορα και εύκολα στην προετοιμασία τρόφιμα. Βέβαια, οι φυσικά απαντώμενοι μικροβιακοί πληθυσμοί σε συνδυασμό με την επιπρόσθετη επιμόλυνση κατα την διάρκεια της επεξεργασίας τείνουν να περιορίζουν τον χρόνο ζωής αυτών των προϊόντων. Δεδομένης της περιορισμένης γνώσης για τις μικροβιακές κοινότητες που σχετίζονται με την αλλοίωση των φρέσκων κομμένων προϊόντων, ο ευρύτερος χαρακτηρισμός των κοινοτήτων αυτών και η μελέτη των σημαντικών περιβαλλοντικών παραγόντων που επηρεάζουν τη σύστασή τους κατά την διάρκεια της αποθήκευσης των εν λόγω προϊόντων, απαιτείται. Από την άλλη πλευρά, η εφαρμογή ταχέων και αποτελεσματικών μεθόδων για την ανίχνευση της μικροβιολογικής αλλοίωσής τους είναι επίσης σημαντική για την αντίστοιχη βιομηχανία. Οι δύο κύριοι στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν: i) ο χαρακτηρισμός των μικροβιακών κοινοτήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση διαφορετικών φρέσκων κομμένων προϊόντων κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές θερμοκρασίες, με τη χρήση μεταγενετικής προσέγγισης (Ενότητα Α: Κεφάλαια 2 και 3), και ii) η αξιολόγηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των παραπάνω προϊόντων μέσω της χρήσης γρήγορων αισθητήρων με βάση την φασματοσκοπία (Ενότητα Β : Κεφάλαια 4, 5 και 6). Όσον αφορά στο Κεφάλαιο 2, οι κοινότητες των ζυμών-μυκήτων και των βακτηρίων που σχετίζονται με την αλλοίωση του έτοιμου-προς-κατανάλωση (ready-to-eat, RTE) ανανά κατά την αποθήκευσή του σε διαφορετικές θερμοκρασίες ταυτοποιήθηκαν μέσω της μεταγενετικής αλληλούχισης των γενετικών περιοχών ITS2 και gyrB, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε υψηλή παραλλακτικότητα στη σύνθεση των ειδών ζυμών-μυκήτων μεταξύ των διαφόρων παρτίδων ανανά. Η αρχική μικροβιακή σύνθεση ήταν ο κύριος παράγοντας που καθόρισε την πρόοδο της αλλοίωσης. Δεδομένων των αρχικών επικρατέστερων ειδών, η επίδραση της θερμοκρασίας και του χρόνου αποθήκευσης ήταν ποικίλη. Σχετικά με τη μη κυρίαρχη βακτηριακή κοινότητα, η θερμοκρασία αλλά και η παρτίδα του προϊόντος δεν επηρέασαν σημαντικά την βακτηριακή ποικιλότητα και σύνθεση.Στο Κεφάλαιο 3, μια μεταγενετική προσέγγιση, βασισμένη στην αλληλούχιση του γενετικού δείκτη gyrB, εφαρμόστηκε επίσης για τον χαρακτηρισμό των βακτηριακών κοινοτήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση RTE ρόκας και τρυφερών φύλλων σπανακιού, κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας. Οι βακτηριακές κοινότητες των δυο λαχανικών διέφεραν στην κυριαρχία συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών. Συγκεκριμένα, το Pseudomonas viridiflava ήταν κυρίαρχο στα περισσότερα δείγματα ρόκας, ενώ ένα νέο είδος Pseudomonas, καθώς και το P. fluorescens ή / και P. fragi ήταν ιδιαίτερα άφθονα ή ακόμα και κυρίαρχα στο σπανάκι. Παρατηρήθηκε επίσης σημαντική παραλλακτικότητα στη σύνθεση των βακτηριακών ειδών μεταξύ των διαφόρων παρτίδων κάθε είδους λαχανικού. Σε επίπεδο παρτίδας, η επίδραση της θερμοκρασίας ή /και του χρόνου αποθήκευσης στις βακτηριακές κοινότητες του σπανακιού δεν ήταν εμφανής. Σχετικά με την ρόκα, ο χρόνος αποθήκευσης ήταν ο πιο σημαντικός παράγοντας που είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της αφθονίας κάποιων ειδών Pseudomonas και την παράλληλη αύξηση της αφθονίας γαλακτικών βακτηρίων. Συμπερασματικά για τα Κεφάλαια 2 και 3, η διεξαγωγή μεγάλης κλίμακας πειραμάτων σε φρέσκα κομμένα προϊόντα φυτικής προέλευσης είναι απαραίτητη για την πλήρη αξιολόγηση της βιοποικιλότητας των μικροβιακών κοινοτήτων που συμμετέχουν στη διαδικασία αλλοίωσης και για την ανάδειξη της επίδρασης σημαντικών περιβαλλοντικών παραγόντων στην μικροβιακή σύνθεση.Στο Κεφάλαιο 4, η καταλληλότητα τεσσάρων αισθητήρων σε συνδυασμό με διαφορετικούς αλγόριθμους μηχανικής μάθησης αξιολογήθηκε για την εκτίμηση της ποιότητας RTE ανανά, ενώ διερευνήθηκαν επίσης οι δυνατότητες επιλεγμένων αναλυτικών «εργαλείων», του λογισμικού The Unscrambler και της διαδικτυακής πλατφόρμας SorfML. Τα δείγματα ανανά αποθηκεύτηκαν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας και υποβλήθηκαν σε μικροβιολογική (ολική μεσόφιλη χλωρίδα, ΟΜΧ) και οργανοληπτική ανάλυση με παράλληλη συλλογή φασματικών δεδομένων φασματοσκοπίας υπέρυθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), εγγύς υπέρυθρου (NIR), φθορισμού (FLUO), ορατού (VIS), καθώς και πολυφασματικών εικόνων (MSI). Παρόμοιες τάσεις σχετικά με τη δυνατότητα εφαρμογής των διαφορετικών αισθητήρων και αλγορίθμων παρατηρήθηκαν για τα δυο λογισμικά. Για την ΟΜΧ, τα μοντέλα από σχεδόν όλους τους συνδυασμούς αισθητήρων με τον αλγόριθμο παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLSR) παρουσίασαν σχετικά ικανοποιητικές επιδόσεις. Επιπλέον, η γραμμική μηχανή διανυσμάτων υποστήριξης (SVM Linear) σε συνδυασμό με την πλειοψηφία των αισθητήρων παρουσίασε παρόμοιες επιδόσεις. Συνολικά, όλοι οι αισθητήρες εκτός του NIR αποτελούν υποσχόμενα «εργαλεία» για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης φρέσκων κομμένων προϊόντων φυτικής προέλευσης. Σχετικά με τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, τα FLUO φασματικά δεδομένα και o MSI αισθητήρας φαίνεται να είναι επίσης κατάλληλοι για την αξιολόγηση της οσμής του ανανά. Το Κεφάλαιο 5 παρείχε μια συγκριτική αξιολόγηση διαφορετικών αισθητήρων και προσεγγίσεων μηχανικής μάθησης για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης RTE ρόκας και τρυφερών φύλλων (baby) σπανακιού κατά την αποθήκευσή τους σε διαφορετικές θερμοκρασίες και υπό συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας (MAP). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές αναλύσεις (TVC και Pseudomonas spp.), με παράλληλη συλλογή φασματικών δεδομένων FTIR, NIR, VIS και MSI. Πραγματοποιήθηκε συγκριτική αξιολόγηση (i) δύο προσεγγίσεων κατανομής των δεδομένων σε σύνολα εκπαίδευσης και επαλήθευσης (τυχαία κατανομή και δυναμικά δεδομένα για επαλήθευση), και (ii) δύο αλγoρίθμων μηχανικής μάθησης [PLSR και παλινδρόμηση διανυσμάτων υποστήριξης (SVR) βασισμένησε πυρήνα ακτινικής βάσης (radial basis function, RBF)]. Όσον αφορά στο σπανάκι σε παθητικό MAP, οι δύο αλγόριθμοι παρουσίασαν παρόμοιες επιδόσεις για την πλειονότητα των ανεπτυγμένων μοντέλων. Η τυχαία κατανομή δεδομένων είχε ως αποτέλεσμα καλύτερες (για MSI και NIR) ή παρόμοιες (για FTIR και VIS) επιδόσεις συγκριτικά με τη χρήση των δυναμικών δεδομένων για επαλήθευση. Στην περίπτωση της ρόκας, ο αλγόριθμος SVR οδήγησε σε καλύτερη πρόβλεψη για σχεδόν όλους τους αισθητήρες, ενώ η τυχαία κατανομή δεδομένων έδωσε επίσης σημαντικά ή ελαφρώς καλύτερα αποτελέσματα. Η μικροβιολογική αλλοίωση του σπανακιού σε παθητικό MAP εκτιμήθηκε καλύτερα με μοντέλα που βασίστηκαν κυρίως σε φασματικά δεδομένα VIS, ενώ τα μοντέλα τα οποία αναπτύχθηκαν με βάση δεδομένα FTIR και MSI ήταν πιο κατάλληλα στην ρόκα, όλα με ικανοποιητικές επιδόσεις. Αντίθετα, οι αισθητήρες FTIR και MSI ήταν καταλληλότεροι για την πρόβλεψη της ΟΜΧ του σπανακιού σε ενεργό MAP, με υψηλότερη ικανότητα πρόβλεψης. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι απαιτείται εξατομικευμένη (για κάθε προϊόν) χρήση ασθητήρων και ανάλυση δεδομένων, ενώ οι συνθήκες αποθήκευσης των προϊόντων θα πρέπει επίσης, να λαμβάνονται υπόψη.Στο Κεφάλαιο 6, αξιολογήθηκε η εφαρμοσιμότητα των τεχνολογιών FTIR και MSI για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των μανιταριών στρειδιών (Pleurotus ostreatus). Τα φρέσκα μανιτάρια αποθηκεύτηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες και υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές αναλύσεις (TVC), με παράλληλη συλλογή δεδομένων φασματοσκοπίας FTIR και MSI και για τις δυο πλευρές (του καπέλου και των ελασμάτων) των μανιταριών. Τα PLSR μοντέλα και για τις δύο πλευρές μανιταριών παρουσίασαν κακή επίδοση πρόβλεψης, ανεξάρτητα από τον εφαρμοζόμενο τρόπο διαχωρισμού των δεδομένων, την προσπάθεια μείωσης της παρατηρούμενης υψηλής φασματικής παραλλακτικότητας που παρατηρήθηκε και την επιλογή των πιο σημαντικών ανεξάρτητων μεταβλητών. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι, κάτω από τις συνθήκες της παρούσας μελέτης και της εφαρμοζόμενης υπολογιστικής ανάλυσης, η εφαρμογή των FTIR και MSI δεν είναι υποσχόμενη για την αξιολόγηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των συγκεκριμένων προϊόντων (μανιτάρια στρείδια).