Χαρακτηρισμός των απο-ακετυλασών και ακετυλασών που συμμετέχουν στην μεταγραφή του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β
Authors: Κουτρούμπας Γεώργιος 
Published: August 2021

Η δυνατότητα των κυττάρων να αντιλαμβάνονται τις μεταβολές στο περιβάλλον τους και να προσαρμόζονται σε αυτές, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη βιοσύνθεση των κατάλληλων μακρομορίων. Ένας τέτοιος μηχανισμός με εξαιρετικό, θεωρητικό και πρακτικό, επιστημονικό ενδιαφέρον, είναι η βιοσύνθεση του RNA και ιδιαίτερα εκείνου του τύπου που, μετά τη διαδικασία της μετάφρασης, θα δώσει γένεση στις πρωτεΐνες του κυττάρου. Ακριβώς λόγο της σπουδαιότητας του φαινομένου, τα κύτταρα επενδύουν σε αυτό μεγάλο μέρος των ρυθμιστικών και ελεγκτικών τους μηχανισμών. Εξασκούν, δηλαδή, έλεγχο στο πότε θα εκφραστεί η γενετική πληροφορία, σε τι έκταση θα λάβει χώρα το φαινόμενο, καθώς επίσης και στην πιστότητα με την οποία δραστηριοποιούνται οι σχετικοί ενζυμικοί μηχανισμοί. Προκειμένου να χαρακτηρίσουμε το σύνολο των εμπλεκόμενων βιοχημικών μονοπατιών, λέμε ότι η γονιδιακή έκφραση υπόκειται σε ρύθμιση. Ρόλο-κλειδί στους μηχανισμούς ρύθμισης, παίζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες, πρωτεΐνες με εξειδικευμένο μοριακό σχεδίασμά που τους επιτρέπει, αφ' ενός να αλληλεπιδρούν με ειδικό τρόπο με το DNA σε θέσεις που ονομάζονται ρυθμιστικά στοιχεία και αφ' ετέρου να στρατολογούν στο εκμαγείο όλα τα απαραίτητα συστατικά -άλλες πρωτεΐνες- οι οποίες είναι απαραίτητες για τη σύνθεση του σωστού γονιδιακού προϊόντος. Η αναγνώριση συγκεκριμένων αζωτούχων βάσεων του DNA από την υπεύθυνη περιοχή ενός μεταγραφικού παράγοντα, συμβάλλει, κατά ένα μέρος μόνο, στην ειδικότητα που χαρακτηρίζει το όλο φαινόμενο. Η ενεργοποίηση της μεταγραφής ενός γονιδίου, ιδιαίτερα στην περίπτωση κυττάρων ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά υψηλό βαθμό συνεργατικότητας. Αυτό σημαίνει, με απλά λόγια, ότι η έκφραση ενός γονιδίου δεν εξαρτάται από την πρόσδεση ενός μόνο, ή έστω και λίγων μεταγραφικών παραγόντων στη σχετική ρυθμιστική περιοχή. Αντίθετα, ογκώδη πολύ-πρωτεΐνικά σύμπλοκα σχηματίζονται στους υποκινητές των γονιδίων, σα συνέπεια εκτεταμένων διαμοριακών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στους μεταγραφικούς παράγοντες-ενεργοποιητές και διάφορες άλλες πρωτεΐνες, επιφορτισμένες με την εκτέλεση επίσης κρίσιμων βημάτων της διαδικασίας ενεργοποίησης της μεταγραφής. Έτσι, με τον εκτεταμένο επιμερισμό των ρόλων για τη μεταγραφή ενός γονιδίου, περιορίζονται και οι πιθανότητες «ανεπιθύμητης» (μη ελεγχόμενης) έκφρασής του. Επιπλέον, το άθροισμα των ασθενών, πλην όμως πολυάριθμων, συνεργατικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα συστατικά του ανεγειρόμενου συμπλόκου, εξασφαλίζει και τη σταθερότητά του. Μία από τις ριζικές διαφορές ανάμεσα στα βακτήρια και τα ευκαρυωτικά κύτταρα, είναι η ύπαρξη της χρωματίνης. Είναι η δομή στην οποία προσαρτάται το DNA, προκειμένου να συμπυκνωθεί επαρκώς, μέσα στα όρια που καθορίζονται από τον ευκαρυωτικά πυρήνα. Θεμελιώδης δομική μονάδα της χρωματίνης είναι το νουκλεόσωμα, ένα οκταμερές πρωτεϊνών που ονομάζονται ιστόνες, γύρω από το οποίο περιελίσσονται 147 ζεύγη βάσεων DNA. Ο σχηματισμός νουκλεοσωμάτων και η περαιτέρω οργάνωση της χρωματίνης σε δομές υψηλότερου βαθμού πολυπλοκότητας, έχει μια αναπόφευκτη συνέπεια: τον «εγκλεισμό» κρίσιμων ρυθμιστικών αλληλουχιών του DNA σε περιοχές που παρουσιάζουν τοπική διαμόρφωση αρνητική για τη γονιδιακή έκφραση. Οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές μπορούν να αντιπαρέρχονται τέτοιων ανασταλτικών δομών της χρωματίνης, χάρη στην ικανότητά τους να στρατολογούν, εκτός από τη μοριακή μηχανή σύνθεσης του RNA και πολύ-πρωτεϊνικά σύμπλοκα με δυνατότητες «επέμβασης» στη χρωματίνη και τροποποίησης της διαμόρφωσης και/ή του περιεχομένου της. Δύο από τους καλύτερα μελετημένους μηχανισμούς αναδόμησης της χρωματίνης, είναι η ομοιοπολική, μετά-μεταφραστική τροποποίηση των ιστονών και η αλλαγή της δομής των νουκλεοσωμάτων με κατανάλωση ΑΤΡ. Ενζυμικά σύμπλοκα επιφορτισμένα με τον ένα ή τον άλλο ρόλο, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά, την προηγούμενη δεκαετία. Το πρωτότυπο σύμπλοκο με δυνατότητα αναδόμησης του νουκλεοσώματος στηριζόμενης στην κατανάλωση ενέργειας, ταυτοποιήθηκε στο σακχαρομήκυτα και ονομάστηκε SWI/SNF. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστός ο ακριβής μηχανισμός δράσης του. Συνολικά όμως, μπορούμε να πούμε ότι εκείνο που επιτυγχάνεται είναι μια «χαλάρωση» της νουκλεοσωμικής δομής, μέσω ανακατανομής των μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων που καθοδηγούν την περιέλιξη του DNA γύρω από το οκταμερές των ιστονών του νουκλεοσώματος. Περισσότερο μελετημένη ανάμεσα στα διάφορα είδη μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων των ιστονών, είναι η περίπτωση της ακετυλίωσης εξαιτίας, κατά ένα βαθμό τουλάχιστον, της πολύ πρώιμης παρατήρησης (από τη δεκαετία του ’60) ότι συσχετίζεται θετικά με τη μεταγραφή. Παραμένει όμως ανοιχτό μέχρι και σήμερα το ερώτημα για τον τρόπο με τον οποίο η ακετυλίωση επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση. Εναλλακτικές προτάσεις που έχουν διατυπωθεί, μπορούν να διακριθούν σε δύο γενικές κατηγορίες. Η πρώτη περιλαμβάνει τα διάφορα μοντέλα που έχουν ως σημείο αναφοράς τη μεταβολή (απώλεια) φορτίου στα αμινοτελικά άκρα των ιστονών, κατά την προσθήκη ακετυλο-ομάδων. Σχετικές εργασίες αναφέρουν τις συνέπειες που προκύπτουν στην οργάνωση των ινιδίων της χρωματίνης, οι οποίες είναι μάλλον ευρείας κλίμακας, παρά τοπικού χαρακτήρα. Ένας δεύτερος τρόπος με τον οποίο η ακετυλίωση μπορεί να συσχετιστεί με αλλαγές στη δομή της χρωματίνης, προσδιορίστηκε με την ανακάλυψη ενός πρωτεϊνικού μοτίβου το οποίο έχει δυνατότητα να αναγνωρίζει με ειδικό τρόπο κατάλοιπα λυσινών που έχουν ακετυλιωθεί. Το μοτίβο αυτό ονομάστηκε επικράτεια bromo (bromodomain). Τα ~100 αμινοξικά κατάλοιπα που το αποτελούν, διατάσσονται σε μία δέσμη από τέσσερις έλικες, στο ένα άκρο της οποίας σχηματίζεται η υδρόφοβη «θήκη» εισδοχής της ακετυλιωμένης λυσίνης. Η ανακάλυψη και άλλων πρωτεϊνικών μοτίβων που αναγνωρίζουν άλλα είδη τροποποιήσεων των ιστονών, οδήγησε στην ανάπτυξη της υπόθεσης του «κώδικα των ιστονών». Σύμφωνα με αυτόν, πρωτεϊνικά σύμπλοκα εξοπλισμένα με τα κατάλληλα μοτίβα, είναι πιθανό να «διαβάζουν» τις αντίστοιχες τροποποιήσεις με ένα συνεργατικό τρόπο. Η ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων αυτού του τύπου, ερμήνευσε ικανοποιητικά, σε «μηχανιστικό» επίπεδο, τη διασύνδεση των συμπλοκών που στρατολογούνται σε υποκινητές και εμπλέκονται σε αλλαγές της δομής της χρωματίνης. Το ανθρώπινο γονίδιο της ιντερφερόνης β (IFNβ) ήταν το πρώτο στο οποίο μελετήθηκε συστηματικά το πλήρες βιοχημικό μονοπάτι που περιλαμβάνει τις απαραίτητες αλλαγές στη δομή της χρωματίνης και οδηγεί, τελικά, σε μεταγραφική ενεργοποίηση. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, ο σχηματισμός ενός νουκλεοσώματος στην περιοχή του κεντρικού υποκινητή, αποτρέπει την πρόσδεση του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου και τελικά την έναρξη της μεταγραφής, εκτός και αν, κατόπιν επίδρασης του κατάλληλου ερεθίσματος, αναπτυχθεί το αντίστοιχο πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης. Αυτό ξεκινάει με τη συγκρότηση ενός νουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου υψηλού βαθμού οργάνωσης στη ρυθμιστική περιοχή (ενισχυτή) του γονιδίου. Το σύμπλοκο αυτό, που ονομάζεται ενισχυόσωμα, αποτελείται από τους μεταγραφικούς ενεργοποιητές ATF-2/c-Jun, IRF, NF-κΒ και τον «αρχιτεκτονικό» μεταγραφικό παράγοντα HMGI(Y). Συγκροτείται χάρη στην ανάπτυξη πολλαπλών συνεργατικών αλληλεπιδράσεων, που φέρνουν σε επαφή τα συστατικά του ενισχυοσώματος μεταξύ τους, αλλά και με τον υποκείμενο ενισχυτή. Η ενεργοποιητική επιφάνεια του ενισχυοσώματος, διαμεσολαβεί τη στρατολόγηση συγκεκριμένων συμπλοκών τροποποίησης της δομής της χρωματίνης, σύμφωνα με μία απολύτως ιεραρχημένη χρονικά ακολουθία γεγονότων. Πρώτα στρατολογείται η ακετυλο-τρανσφεράση GCN5, η οποία ακετυλιώνει επιλεκτικά ορισμένα κατάλοιπα λυσίνης του ανασταλτικού νουκλεοσώματος. Η διενεργούμενη ακετυλίωση χαρακτηρίζεται από ένα επίσης καλά καθορισμένο χρονικό πρότυπο και συσχετίζεται με την προσέλκυση στον υποκινητή, κατά σειρά, του συμπλόκου SWI/SNF και έπειτα του βασικού μεταγραφικού παράγοντα TFIID. Κανένα από τα δύο γεγονότα στρατολόγησης δεν είναι εφικτό, χωρίς την ειδική αναγνώριση ακετυλο-ομάδων που προστίθενται από την GCN5 σε συγκεκριμένα κατάλοιπα λυσίνης των ιστονών H3 και Η4. Την αναγνώριση αναλαμβάνουν επικράτειες bromo που εμπεριέχονται σε υπομονάδες των δύο συμπλοκών, SWI/SNF και TFIID. Στην εργασία αυτή, επιδιώξαμε να μελετήσουμε περαιτέρω τη σημασία της ακετυλίωσης και απο-ακετυλίωσης στη γονιδιακή έκφραση. Ένα από τα σπουδαιότερα ερωτήματα που θέσαμε ήταν το εξής: η ακετυλίωση είναι πάντα απαραίτητη για την αντιμετώπιση της ίδιας αποτρεπτικής, τοπικής δομής της χρωματίνης; Είναι δυνατό, με άλλα λόγια, να μεταβληθεί η ανασταλτική δομή της χρωματίνης που χαρακτηρίζει τον κεντρικό υποκινητή της IFNβ μέσω ενός άλλου βιοχημικού μονοπατιού, ή θα πρέπει η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου να συνοδεύεται πάντα από το ίδιο πρότυπο μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων; Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι η παρουσία συμπλοκών αναδόμησης της χρωματίνης στους υποκινητές γονιδίων που υπόκεινται σε ρύθμιση, δεν είναι απαραίτητη εφόσον αυξηθεί η ενεργοποιητική ισχύς του αντίστοιχου ενισχυτή. Ένας τρόπος για να συμβεί αυτό, είναι η αύξηση της χημικής συγγένειας με τον οποία οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με τις θέσεις που αναγνωρίζουν επάνω στη χρωματίνη. Ένας δεύτερος τρόπος, είναι η αύξηση της ισχύος αυτής καθ’ αυτής της ενεργοποιητικής επιφάνειας, της αύξησης, επομένως, των περιοχών μεταγραφικής ενεργοποίησης που παρατάσσονται στον υπεύθυνο ενισχυτή. Πιο συγκεκριμένα, είχε διατυπωθεί η πρόβλεψη ότι ένας αρκετά ισχυρός ενισχυτής, είναι πιθανό να προάγει αλλαγές στη δομή της χρωματίνης, χωρίς να είναι απαραίτητη η προηγούμενη ακετυλίωσή της. Η λεπτομερής διερεύνηση αυτής της υπόθεσης, και μάλιστα στα πλαίσια ρύθμισης της έκφρασης ενός γονιδίου ανώτερου ευκαρυωτικού οργανισμού, επιχειρήθηκε για πρώτη φορά μέσα από τα πειράματα της παρούσας εργασίας. Κατασκευάσαμε τεχνητούς ενισχυτές αυξανόμενης ισχύος, μέσω επάλληλης διάταξης αντιγράφων του θετικού ρυθμιστικού στοιχείου PRDII, του στοιχείου που, στον ενισχυτή της ιντερφερόνης β, αναγνωρίζεται από το μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ. Βρήκαμε ότι, όπως και στην περίπτωση του φυσιολογικού γονιδίου, ένας τεχνητός ενισχυτής με μία μόνο θέση πρόσδεσης για τον NF-κΒ, εξαρτάται απόλυτα από την ακετυλίωση των ιστονών, προκειμένου να επιτύχει μετατόπιση in cis του ανασταλτικού νουκλεοσώματος που παρεμποδίζει την έναρξη της μεταγραφής. Ο ενισχυτής με δύο αντίγραφα του στοιχείου PRDII, εξαρτάται μερικώς από την ακετυλίωση, ενώ ένας ισχυρός ενισχυτής με τέσσερις θέσεις πρόσδεσης για τον NF-κΒ, κατευθύνει το πλήρες πρόγραμμα αναδόμησης της χρωματίνης και ενεργοποίησης της μεταγραφής, εντελώς ανεξάρτητα από την ακετυλίωση. Στην τελευταία αυτή περίπτωση, στρατολογούνται οι ίδιοι ακριβώς παράγοντες που ελέγχουν το πρόγραμμα έκφρασης και του φυσιολογικού γονιδίου, αλλά χωρίς να υπάρχει πλέον συγκεκριμένη χρονική σειρά στη σύνδεσή τους με την περιοχή του υποκινητή. Ερμηνεύσαμε το φαινόμενο στη βάση της δημιουργίας μιας εκτεταμένης ενεργοποιητικής επιφάνειας, που επιτρέπει στα τέσσερα μόρια του NF-κΒ να αλληλεπιδρούν ουσιαστικά ταυτόχρονα με όλα τα απαραίτητα συστατικά για την αναδόμηση της χρωματίνης (π.χ. SWI/SNF) και την ενεργοποίηση της μεταγραφής (π.χ. TFIID). Επιπλέον, παρά το γεγονός ότι η ακετυλίωση δεν είναι απαραίτητη για την εκπόνηση του προγράμματος γονιδιακής έκφρασης, πειραματική διερεύνηση που σχεδιάστηκε όπως στην περίπτωση του φυσιολογικού ενισχυτή, έδειξε ότι ο συνθετικός, ισχυρός ενισχυτής PRDIU κατευθύνει την εκτεταμένη ακετυλίωση πολλών, διαφορετικών καταλοίπων λυσίνης, μέσω της ακετυλο-τρανσφεράσης CBP. Επομένως, η επίλυση του ίδιου βιοχημικού προβλήματος, η στόχευση, δηλαδή και αναδόμηση του ίδιου ανασταλτικού νουκλεοσώματος, προωθείται μέσα από ένα διαφορετικό μονοπάτι, στα πλαίσια του οποίου δεν αξιοποιούνται τα στοιχεία του «κώδικα ακετυλίωσης των ιστονών», όπως αυτά προσδιορίστηκαν στο πρωτότυπο γονίδιο της ιντερφερόνης β. Τέλος, η αντικατάσταση του NF-κΒ φυσικού τύπου με ελλείψεις που αδυνατούν να προσελκύσουν αποτελεσματικά την ακετυλο-τρανσφεράση CBP ή το βασικό μεταγραφικό παράγοντα TFIID, αποκάλυψε ότι σε περιβάλλον χρωματίνης με την ίδια τοπική, ανασταλτική δομή, η αποκατάσταση αλληλεπιδράσεων με τον κρίσιμο αυτό παράγοντα του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου, έχει ξεκάθαρη προτεραιότητα έναντι της δυνατότητας για ακετυλίωση των ιστονών.