Ανάπτυξη ενός κλινικά αξιοποιήσιμου πρωτοκόλλου διαφοροποίησης επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων σε μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα
Authors: Σφουγκατάκη Ειρήνη 
Published: April 2021

Τα μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα (ΜΣΚ) έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον των ερευνητών αφού, λόγω των ανοσορυθμιστικών και αναγεννητικών τους ιδιοτήτων, εξετάζονται ως θεραπευτικό εργαλείο διαφόρων νοσημάτων. Η πιο συχνή πηγή παραγωγής ΜΣΚ είναι ο μυελός των οστών, από τον οποίο, όμως, μπορεί να παραχθεί ένας περιορισμένος αριθμός ΜΣΚ, που πολλές φορές δεν επαρκεί για κλινική χρήση. Μια εναλλακτική πηγή ΜΣΚ που παρακάμπτει τα προβλήματα χρήσης ΜΣΚ από ενήλικους ιστούς είναι τα επαγόμενα πολυδύναμα στελεχιαία κύτταρα (ΕΠΣΚ). Λόγω της πολυδυναμίας τους, τα ΕΠΣΚ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μεγάλης κλίμακας παραγωγή διαφοροποιημένων κυττάρων με σκοπό τη χρησιμοποίησή τους στην αναγεννητική ιατρική. Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να αναπτύξουμε κλινικής κλίμακας πρωτόκολλο παραγωγής ΜΣΚ από ΕΠΣΚ σειρές που δημιουργήθηκαν με ασφαλή μέθοδο επαναπρογραμματισμού χωρίς δεν ενσωμάτωση ξένου γενετικού υλικού και στη συνέχεια να διερευνήσουμε τα χαρακτηριστικά των παραχθέντων ΜΣΚ. Δύο σειρές ΕΠΣΚ που δε φέρουν ξένο DNA, πολλαπλασιάστηκαν χωρίς υποστηρικτικά κύτταρα σε κατάλληλες καλλιέργειες, ώστε να προκύψουν επαρκείς αριθμοί κυττάρων. Ακολούθως, οι σειρές ΕΠΣΚ καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία χαμηλής προσκόλλησης απουσία του παράγοντα FGF-2, προς σχηματισμό εμβρυικών σωματιδίων, τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ζελατίνη και υλικό διαφοροποίησης σε ΜΣΚ. Τα παραχθέντα ΜΣΚ (ΕΠΣΚ-ΜΣΚ) ελέγχθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την έκφραση των τυπικών επιφανειακών αντιγόνων των ΜΣΚ. Κάτω από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας ελέγχθηκε η διαφοροποίησή τους σε χονδροκύτταρα, οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Επιπλέον, η ικανότητα χονδρογένεσής τους συγκρίθηκε με αυτήν των ΜΣΚ του μυελού των οστών (ΜΟ-ΜΣΚ) ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά. Το πολλαπλασιαστικό δυναμικό τους συγκρίθηκε με αυτό των ΜΟ-ΜΣΚ, μέσω παράλληλων, συνεχών ανακαλλιεργειών μέχρι να επέλθει το κυτταρικό γήρας. Η πιθανή in vivo ογκογενετική τους ικανότητα εξετάστηκε με υποδόρια χορήγησή τους σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια και ελέγχθηκε η έκφραση σε αυτά, των δεικτών πολυδυναμίας Nanog, Oct3/4. Η γενετική τους σταθερότητα ελέγχθηκε με μικροσυστοιχίες συκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού (aCGH). Τα ΕΠΣΚ διαφοροποιήθηκαν με μεγάλη αποδοτικότητα σε ΜΣΚ, μετά από καλλιέργεια 3 εβδομάδων. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ μοιάζουν με τα ΜΟ-ΜΣΚ και εκφράζουν τους επιφανειακούς δείκτες CD105, CD73, CD44, CD90 ενώ απουσιάζουν από αυτά οι δείκτες CD34, CD45. In vivo δε δημιουργούν όγκους σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια έως και 10 εβδομάδες μετά την έγχυση, ενώ έχουν ελαττώσει την έκφραση των δεικτών πολυδυναμίας. Η διαφοροποίηση δεν προκάλεσε χρωμοσωμικές αλλαγές στα κύτταρα και αυτά διατηρούν το χρωμοσωμικό προφίλ των ΕΠΣΚ από όπου προήλθαν, συμπεριλαμβανομένων 2 ελλειμμάτων μεγέθους 3Mb, τα οποία προέκυψαν κατά τις συνεχείς ανακαλλιέργειες των ΕΠΣΚ, αλλά δε σχετίζονται με ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Παρουσιάζουν πολλαπλασιαστικό δυναμικό πολύ μεγαλύτερο από αυτό των MO-ΜΣΚ, με συνολικούς αριθμούς διπλασιασμών 35.7 και 28.3, έναντι 16.9 και 17.8 των ΜΟ-ΜΣΚ, ενώ μπορούν να αποδώσουν τον αρχικό αριθμό τους έως και 5.88x1010 φορές έναντι 2.3x105 στα ΜΟ-ΜΣΚ. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ in vitro διαφοροποιούνται σε χονδροκύτταρα, οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Παρόλα αυτά, ο χόνδρος που σχηματίστηκε από τη διαφοροποίησή τους, ιστολογικά δεν είχε την τυπική οργάνωση και περιεκτικότητα σε πρωτεογλυκάνες του υαλώδους χόνδρου, ενώ παρουσίαζε ελάχιστη έκφραση των δεικτών Sox9, Collagen II, σε αντίθεση με τα ΜΟ-ΜΣΚ.Για πρώτη φορά στην Ελλάδα δημιουργούνται σειρές ΜΣΚ από ΕΠΣΚ που δε φέρουν διαγονίδια, κάτω από ασφαλή και αποδοτικά πρωτόκολλα και διερευνώνται οι ιδιότητές τους σε σχέση με τα ΜΟ-ΜΣΚ. Τα ΕΠΣΚ μπορούν να αποτελέσουν ασφαλή πηγή παραγωγής ΜΣΚ, με φύλαξη σε κυτταρική τράπεζα και συνεχή διαφοροποίηση, ενώ μελλοντικά μπορούν να αξιοποιηθούν σε πρωτόκολλα κυτταρικής θεραπείας. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ παρουσιάζουν μεγάλες ομοιότητες με τα ΜΟ-ΜΣΚ, αλλά χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης, κυρίως σε προκλινικά μοντέλα ποικίλων ασθενειών, ώστε να αποσαφηνιστεί η θεραπευτική τους δράση.