Improvement of enzyme systems for the efficient utilization of the hemicellulosic component of lignocellulosic biomass
Authors: Πεντάρη Χριστίνα 
Published: January 2024

Η αξιοποίηση του δυναμικού της φυτικής βιομάζας ως ανανεώσιμη πρώτη ύλη για βιομηχανικές εφαρμογές αποτελεί σημαντικό πυλώνα για την επίτευξη “πράσινων” και βιώσιμων τεχνολογιών. Ωστόσο, η εγγενής ετερογένεια και η πολυπλοκότητα της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας αποτελούν πρόκληση για την ευρεία εκμετάλλευσή της. Η παρούσα έρευνα επισημαίνει τον κομβικό ρόλο της ενζυμικής αποικοδόμησης της φυτικής βιομάζας ως μια βιώσιμη, φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για την υπέρβαση αυτών των εμποδίων, εστιάζοντας στη διαλεύκανση νέων ενζυμικών δραστηριοτήτων και εξειδικεύσεων. Ειδικότερα, διερευνήθηκε ο σημαίνων ρόλος καινοτόμων ενζυμικών δράσεων στη βιοαποικοδόμηση λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, λαμβάνοντας υπόψη τις πρόσφατες γνώσεις σχετικά με τα ανθεκτικά δομικά χαρακτηριστικά της λιγνινοκυτταρίνης. Διανύοντας μια εποχή που απαιτεί βιώσιμες πρακτικές, η παρούσα μελέτη επιχειρεί να βελτιστοποιήσει τα ενζυμικά συστήματα, με σκοπό να συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη βιοαποικοδόμηση της βιομάζας, ενισχύοντας έτσι την αξιοποίηση των ενζυμικών παρασκευασμάτων στο πλαίσιο την βιομηχανικής βιοτεχνολογίας και επιτρέποντας τη μετάβαση προς ένα πιο βιώσιμο μέλλον.Στο πλαίσιο αυτό, η προσοχή εστιάστηκε στη δι-λειτουργική γλυκουρονο-ξυλανάση/ξυλοβιοϋδρολάση TtXyn30A από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila. Η διερεύνηση της νέας αυτής διπλής καταλυτικής ενεργότητας επικεντρώθηκε κυρίως στη διαλεύκανση των δομικών χαρακτηριστικών που αποδίδουν αυτή τη μοναδική καταλυτική δραστηριότητα. Ως εκ τούτου, μέσω σημειακών μεταλλάξεων και βιοχημικών μελετών αναδείχθηκαν βασικά κατάλοιπα αμινοξέων εντός του ενεργού κέντρου ως καθοριστικά για τη δι-λειτουργική φύση του ενζύμου. Συγκεκριμένα, το κατάλοιπο Arg34 προτάθηκε ότι εμπλέκεται στη δέσμευση του υποστρώματος και στη σωστή τοποθέτησή του εντός της καταλυτικής σχισμής. Ωστόσο, σε αντίθεση με την αντίστοιχη συντηρημένη αργινίνη που απαντάται σε άλλες κλασσικές γλυκουρονοξυλανάσες, το συγκεκριμένο κατάλοιπο δεν συμμετείχε στην αναγνώριση της πλευρικής ομάδας γλυκουρονικού οξέος. Επιπλέον, τα αμινοξέα Ser77 και His79 του βρόχου β2-α2 συνεισφέρουν στην ενεργότητα ξυλοβιοϋδρολάσης, αλληλοεπιδρώντας με το κατάλοιπο ξυλοπυρανοζης στην υποπεριοχή -2a του ενεργού κέντρου. Τέλος, το αμινοξύ Glu233 προτείνεται ότι δρα ως εναλλακτικό καταλυτικό αμινοξύ, υπεύθυνο για τη παράπλευρη καταλυτική δραστηριότητα μετά την αντικατάσταση των προτεινόμενων καταλυτικών γλουταμινικών οξέων με αλανίνη, υποδηλώνοντας τη συμβολή του στην αποτελεσματική σύνδεση ενζύμου-υποστρώματος και την κατάλυση. Τα πειραματικά ευρήματα παρείχαν σημαντικές πληροφορίες για τον καταλυτικό μηχανισμό αυτής της σχετικά ανεξερεύνητης ενζυμικής ενεργότητας.Η μελέτη σχετικά με τη δραστικότητα της ξυλανάσης TtXyn30A επικεντρώθηκε στην προκατεργασμένη βιομάζα, σε συνδυασμό με μια λυτική μονοοξυγενάση των πολυσακχαριτών από την οικογένεια AA14. Τα ένζυμα παρουσίασαν συνεργιτική σχέση κατά την υδρόλυση προκατεργασμένων δειγμάτων οξιάς, τα οποία περιείχαν χαμηλά επίπεδα ημικυτταρίνης. Η ημικυτταρίνη σε αυτά τα δείγματα υποτίθεται ότι αντιπροσωπεύει την ανθεκτική ξυλάνη με επίπεδη αναδίπλωση της αλυσίδας. Η μονοοξυγενάση φαίνεται να δημιουργεί ελεύθερες μη αναγωγικές πολυμερικές απολήξεις, στοχεύοντας ειδικά στις άκαμπτες περιοχές της ξυλάνης που βρίσκονται σε επαφή με κρυσταλλικά μικροϊνίδια κυτταρίνης. Αυτά τα εκτεθειμένα άκρα χρησιμεύουν στη συνέχεια ως υποστρώματα για την ενεργότητα ξυλοβιοϋδρολάσης της TtXyn30A. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή η συνεργιτική επίδραση αντικατοπτρίζει εκείνη που παρατηρείται μεταξύ των μονοοξειδασών με εξειδίκευση στην κυτταρίνη και των κελλοβιοϋδρολασών, υποδηλώνοντας μια πιθανή εκμετάλλευση παρόμοιων συνεργιτικών μηχανισμών από τα μικροβιακά συστήματα σε διαφορετικές δομές λιγνινοκυτταρίνης. Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι αυτές οι νέες ειδικότητες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση της ανθεκτικής ξυλάνης.Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η υπόθεση ότι η ξυλανάση TtXyn30A εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της ανθεκτικής ξυλάνης, η έρευνα κατευθύνθηκε στην ενδελεχή εξέταση του προφίλ των προϊόντων της ξυλανάσης όταν δρα σε φυσικά υποστρώματα με ακετυλιωμένη γλυκουρονοξυλάνη. Κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων ελήφθησαν υπόψη πρόσφατα ευρήματα αναφορικά με τη σύνθεση της ακετυλιωμένης ξυλάνης της φυτικής βιομάζα, όπως το μοτίβο ακετυλίωσης σε κάθε δεύτερη ξυλοπυρανόζη. Συγκεκριμένα, η TtXyn30A αποδείχθηκε ότι απελευθερώνει ακετυλιωμένη ξυλοβιόζη από προκατεργασμένη λιγνινοκυτταρινούχα βιομάζα. Οι απελευθερωμένοι δισακχαρίτες δυνητικά φέρουν μονή ή διπλή ακετυλίωση στις θέσεις 2-OH, 3-OH του μη αναγωγικού άκρου της ξυλοβιόζης. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η ακετυλίωση στο αναγωγικό άκρο αυτής. Η συνέργεια μεταξύ της TtXyn30A και εστερασών του οξικού οξέος διαφορετικής εξειδίκευσης υποδεικνύει ότι συγκεκριμένες υποπεριοχές εντός του ενεργού κέντρου της ξυλανάσης δεν μπορούν να ανεχθούν ακετυλιωμένα υπολείμματα ξυλοπυρανοσυλίων. Το προφίλ των προϊόντων της TtXyn30A ευθυγραμμίζεται με το πρότυπο ακετυλίωσης της ανθεκτικής ξυλάνης, ενισχύοντας τον προτεινόμενο ρόλο της ξυλανάσης. Ωστόσο, οι συνεργιτικές αλληλεπιδράσεις με τις εστέρασες του οξικού υποδηλώνουν μερική αναστολή από τις υποκαταστάσεις οξικού, υποδηλώνοντας διακριτά μοτίβα ακετυλίωσης που μπορούν είτε να φιλοξενούνται στο ενεργό κέντρο είτε να παρεμποδίζουν την ενζυμική δραστηριότητα. Στο πλαίσιο της παρεμπόδισης των ξυλανολυτικών ενζύμων από πλευρικές υποκαταστάσεις οξικού, διερευνήθηκε η επίδραση της ενεργότητας εστερασών του οξικού οξέος, εστιάζοντας σε εστεράσες με διαφορετική εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε η ετερόλογη έκφραση και ο χαρακτηρισμός της TtCE16B εστεράσης του οξικού της οικογένειας CE16 από τον μύκητα T. thermophila. Το ένζυμο προσδιορίστηκε ως εξω-αποακετυλάση, στοχεύοντας κυρίως στο μη αναγωγικό άκρο ολιγοσακχαριτών. Η TtCE16B παρουσίασε συμπληρωματική δραστικότητα σε σχέση με μια εστεράση της οικογένειας CE6, η οποία εμφανίζει δράση στην ξυλάνη, επιτυγχάνοντας πλήρη αποεστεροποίηση της ακετυλιωμένης ξυλάνης. Η δραστηριότητά τους διερευνήθηκε στη συνέχεια μαζί με διάφορες ξυλανάσες διαφορετικών οικογενειών (GH10, GH11 και GH30) κατά την υδρόλυση προκατεργασμένου ξύλου οξιάς. Παρόλο που η CE6 εστεράση είχε εξέχουσα επίδραση στις ένδο-ξυλανάσες, η έξω-δράση της TtCE16B ενίσχυσε κυρίως τη δράση ξυλοζιδάσης, η οποία στοχεύει το μη αναγωγικό άκρο ολιγοσακχαριτών. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να προσφέρουν χρήσιμες πληροφορίες για τη δημιουργία μιγμάτων ημικυτταρινολυτικών ενζύμων βέλτιστης απόδοσης. Η δραστικότητα διαφόρων ξυλανασών των οικογενειών GH10, GH11 και GH30 διερευνήθηκε στη συνέχεια σε πιο ετερογενείς και περίπλοκες ξυλάνες, όπως η αραβινοξυλάνη και η γλυκουρονοαραβινοξυλάνη. Οι ξυλανάσες παρεμποδίζονται ισχυρά παρουσία μονο- και δι-υποκαταστάσεων αραβινοφουρανοσυλίων. Λαμβάνοντας υπόψη αυτό, μελετήθηκαν δύο αραβινοφουρανοζιδάσες με συμπληρωματική εξειδίκευση σε προκατεργασμένο πίτουρο σιταριού και καλαμποκιού. Η συνδυασμένη δράση αυτών των αραβινοφουρανοζιδασών οδήγησε σε αύξηση της απελευθέρωσης αραβινόζης από τη λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζα. Κατά την ταυτόχρονη δράση των αραβινοφουρανοζιδασών με ενδοξυλανάσες, παρατηρήθηκε μια αμοιβαία συνεργιτική επίδραση, η οποία χαρακτηρίστηκε από αύξηση τόσο στην απελευθέρωση αραβινόζης όσο και ξυλοολιγοσακχαριτών. Καθεμία από τις αραβινοφουρανοζιδάσες, και ιδίως ο συνδυασμός τους, ήταν σε θέση να απελευθερώσουν τη δραστικότητα ξυλοβιοϋδρολάσης της TtXyn30A στην αραβινοξυλάνη, ενώ η συνεργιτική τους δράση στην γλυκουρονοαραβινοξυλάνη όχι μόνο οδήγησε στην ενίσχυση της ενδο-δραστηριότητας της TtXyn30A, αλλά και στην ενίσχυση της απελευθέρωσης αραβινόζης. Επιπλέον, η συνεργιτική δράση που παρατηρήθηκε μεταξύ των αραβινοφουρανοζιδασών και των εστερασών του οξικού οξέος φανερώνει ακόμα ένα κρίσιμο παράγοντα που χρειάζεται να λαμβάνεται υπόψη για την αποτελεσματικής αποικοδόμησης της βιομάζας.Το τελικό σημείο εστίασης της εργασίας αυτής ήταν η ενζυμική αποικοδόμηση των συμπλεγμάτων λιγνίνης-ημικυτταρίνης. Οι γλυκοζιδικές υδρολάσες εν γένει προτάθηκε ότι παρεμποδίζονται από την εστεροποίηση του γλυκουρονικού οξέος της ημικυτταρίνης με τα αρωματικά μόρια της λιγνίνης, λόγω της περιορισμένης προσβασιμότητας στο υπόστρωμα. Ειδικότερα για τις γλυκουρονοξυλανάσες, η δέσμευση του γλυκουρονικού οξέος στη λιγνίνη παρεμποδίζει την ειδική ενεργότητας τους. Λαμβάνοντας υπόψη αυτό, διερευνήθηκαν δύο μυκητιακές εστεράσες του γλυκουρονικού σε διάφορα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά. Αποδείχθηκε ότι η μέθοδος προκατεργασίας μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα των εστερασών, γεγονός που υποδηλώνει σοβαρή επίδραση της μεθόδου στα συμπλέγματα ημικυτταρίνης-λιγνίνης. Επιπλέον, και οι δύο γλυκουρονικές εστεράσες παρουσίασαν καταλυτική δράση σε ανθεκτικές δομές λιγνίνης-ημικυτταρίνης σε ενζυμικά επεξεργασμένη βιομάζα. Τέλος, οι εστεράσες παρουσίασαν διακριτές συνεργιτικές σχέσεις με διαφορετικές ξυλανάσες, ανάλογα με την προέλευση και τη σύνθεση του υποστρώματος. Η παρατήρηση αυτή υπογραμμίζει περαιτέρω τη σημασία των προσαρμοσμένων ενζυμικών μειγμάτων που στοχεύουν σε λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά σύστασης και δομής. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στη συνεισφορά νέας γνώσης σχετικά με τις δυνατότητες των νέων βιοκαταλυτών, είτε στοχεύουν στην αλυσίδα της ξυλάνης είτε παρουσιάζουν βοηθητικές ενεργότητες, στη βιοαποικοδόμηση περίπλοκων λιγνινοκυτταρινικών δομών. Επιπλέον, η εργασία αυτή στοχεύει να αναδείξει τον καθοριστικό ρόλο της συνεργιτικής δράσης ποικίλων καταλυτικών δραστηριοτήτων για την αποτελεσματική βιομετατροπή της βιομάζας σε ενώσεις προστιθέμενης αξίας, και όλα αυτά στο πλαίσιο του παραδείγματος της κυκλικής βιοοικονομίας.