Αλληλεπίδραση των ιόντων Ni(ii) και Cu(ii) με πεπτιδικά μοντέλα της ιστόνης H2B
Authors: Ζαβιτσάνος Κίμων 
Published: January 2014

Είναι ευρέως τεκμηριωμένο ότι πολλά μεταλλικά ιόντα των στοιχείων μετάπτωσης, όπως το νικέλιο και ο χαλκός, είναι καρκινογόνα για τον άνθρωπο και άλλα θηλαστικά. Οι μοριακοί μηχανισμοί, με τους οποίους επιτυγχάνεται η καρκινογένεση από μεταλλικά ιόντα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Παρόλα αυτά, πιστεύεται ότι σχετίζεται με καταστροφή του DNA και/ή επιγενετικές μεταβολές που πηγάζουν από την δέσμευση των ιόντων στον πυρήνα του κυττάρου. Είναι γνωστό ότι τα ιόντα Ni(II), δεσμεύονται ασθενώς από τις φωσφορικές ομάδες του DNA και τα φωσφολιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών. Για το λόγο αυτό, οι πυρηνικές πρωτεΐνες και πιο συγκεκριμένα οι ιστόνες, που απαντούν σε υψηλότερη συγκέντρωση εντός του πυρήνα, είναι οι κύριοι υποψήφιοι υποκαταστάτες για δέσμευση του μετάλλου. Αντίθετα, τα ιόντα Cu2+, δεσμέυονται ισχυρά τόσο με τις βάσεις του DNA, όσο και με πεπτιδικά μοντέλα ιστονών. Εντός του πυρήνα του κυττάρου, τα 2 αυτά συστατικά ανταγωνίζονται ως προς τη δέσμευση του μετάλλου. Υπάρχουν αρκετά στοιχεία που συνηγορούν στο γεγονός ότι το νικέλιο μπορεί να εμπλακεί στις χημικές τροποποιήσεις που λαμβάνουν χώρα φυσιολογικά στις ιστόνες και κατ’ αυτόν τον τρόπο να απορρυθμίσει την διαχείριση της γενετικής πληροφορίας. Επιπροσθέτως, η δημιουργία συμπλόκων του μετάλλου με τμήματα ιστονών που παρουσιάζουν αυξημένη οξειδοαναγωγική ικανότητα, μπορεί να προκαλέσει αυξημένη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου που δρούν απευθείας πάνω στο DNA. Ο χαλκός, δεδομένου ότι παρουσιάζει πιο πλούσια οξειδοαναγωγική χημεία από το νικέλιο, μπορεί να οδηγήσει άμεσα σε αυξημένη παραγωγή τέτοιων επιβλαβών προϊόντων, όταν βρίσκεται σε περίσσεια εντός του οργανισμού. Πάντως, όταν συμπλέκεται με ιστόνες ή προταμίνες μπορεί είτε να καταλύσει την δημιουργία τέτοιων ειδών, υποβοηθώντας την καταστροφή του DNA, είτε να δράσει προστατευτικά και να μειώσει την έκταση της οξειδωτικής βλάβης. Στη διεθνή βιβλιογραφία, υπάρχουν πολλές μελέτες αλληλεπίδρασης πεπτιδικών μοντέλων των πυρηνικών ιστονών Η3, Η4 και H2A, με Ni2+ και Cu2+. Αντίθετα, η ιστόνη H2B, δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά, παρόλο που πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι το νικέλιο μπορεί να επιδράσει όχι μόνο στις χημικές τροποποιήσεις που λαμβάνουν χώρα σε αυτή, αλλά και να προκαλέσει οξείδωση σε διάφορα αμινοξικά κατάλοιπα της πρωτεΐνης. Προκειμένου να διερευνήσουμε τον ρόλο της ιστόνης Η2Β, στην τοξικότητα και καρκινογένεση που προκαλείται από Ni(II) και Cu(II), συνθέσαμε τα πεπτίδια Η2Β32-62 (SRKQSYSVYVYKVLKQVHPDTGISSKAMGIM) και Η2Β94-125 Περίληψη 176 (IQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK), τα οποία αποτελούν μοντέλα της ιστονικής πτύχωσης και C-τελικής ουράς της ιστόνης Η2Β, αντίστοιχα, και μελετήσαμε την αλληλεπίδραση τους με Ni(II) και Cu(II). Η πεπτιδική σύνθεση πραγματοποιήθηκε σε στερεή φάση με την Fmoc / tBu μεθοδολογία. Ο καθαρισμός των επιθυμητών πεπτιδικών προϊόντων, επιτεύχθηκε με χρωματογραφικές τεχνικές (gel filtration, RP-HPLC) και η ταυτοποίηση τους έγινε με φασματοσκοπία μάζας (ESI-MS) και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η αλληλεπίδραση των πεπτιδίων με Ni(II) και Cu(II), μελετήθηκε με ποτενσιομετρικές τιτλοδοτήσεις και διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές (UV-Vis, CD, EPR, NMR), ενώ η μελέτη της επίδρασης των συμπλόκων στην διάσπαση της διπλής έλικας του DNA, πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη, χρησιμοποιώντας ως στόχο το πλασμίδιο pUC19. Η αναπάντεχη καταβύθιση του ελεύθερου πεπτιδίου Η2Β32-62, σε pH > 7,8 δεν επέτρεψε τον υπολογισμό των σταθερών ιονισμού των καταλοίπων Lys και Tyr. Η καταβύθιση ήταν εμφανής και στα διαλύματα που περιείχαν Ni(II), υποδηλώνοντας ότι το πεπτίδιο αυτό δεν συμπλέκεται αποτελεσματικά με τα ιόντα Ni(II). Εντούτοις, η μελέτη της οξειδωτικής συμπεριφοράς του συστήματος Η2Β32-62/Ni(II)/H2O2 είναι αρκετά διαφορετική από αυτή του συστήματος Ni(II)/H2O2, όσον αφορά την ικανότητα τους να προάγουν διάσπαση της διπλής έλικας και αποικοδόμηση του πλασμιδίου pUC19. Συγκεκριμένα, παρουσία του πεπτιδίου, παρατηρήθηκε ελάττωση στην αποικοδόμηση του πλασμιδιακού DNA σε μικρά τμήματα, με ταυτόχρονη όμως αύξηση στην συχνότητα διάσπασης της διπλής έλικας. Τα δύο αυτά φαινόμενα, αποδίδονται στην ισχυρή σύμπλεξη του πεπτιδίου με το πλασμιδιακό DNA, η οποία δημιουργεί ένα προστατευτικό στρώμα γύρω από αυτό. Όσον αφορά την αύξηση της συχνότητας εμφάνισης σχάσεων στην διπλή έλικα, αυτή αποδίδεται σε άλκυλο και περόξυ- ρίζες που δημιουργούνται από την περαιτέρω οξείδωση των σουλφοξειδίων μεθειονίνης του πεπτιδίου, δεδομένου ότι από την βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι το Ni(II) προκαλεί διάσπαση μόνο της μιας έλικας...