Υποκυτταρικός προορισμός και μηχανισμοί μιτοχονδριακής στόχευσης των ανθρώπινων μορφών της γλουταμικής αφυδρογονάσης
Authors: Κοτζαμάνη Δήμητρα 
Published: August 2021

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) είναι ένα κεντρικό ένζυμο του κυτταρικού μεταβολισμού, το οποίο βρίσκεται σε όλους τους ζώντες οργανισμούς. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, η GDH απέκτησε σύνθετη αλλοστερική ρύθμιση και ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης. Στα θηλαστικά, η GDH είναι ένα από τα πιο άφθονα μιτοχονδριακά ένζυμα, αποτελώντας σε ορισμένες περιπτώσεις πάνω από το 10% των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής μήτρας. Ωστόσο, εξωμιτοχονδριακές θέσεις εντόπισης του ενζύμου έχουν επίσης προταθεί. Στον άνθρωπο, η GDH εμφανίζεται στις ισομορφές hGDH1 και hGDH2, οι οποίες κωδικοποιούνται από τα γονίδια GLUD1 και GLUD2 αντίστοιχα, και εμφανίζουν ετερογένεια ως προς το ιστο-ειδικό και κυτταρικό πρότυπο έκφρασης. Οι δύο πρωτεΐνες προβλέπεται να έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο Ν-τελικό σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS), αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53), το οποίο αποκόπτεται μετά την είσοδο των πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια. Παρόλο που στην ώριμη τους μορφή, οι hGDH1 και hGDH2 εμφανίζουν μεγάλη ομολογία, τα MTS τους παρουσιάζουν μεγαλύτερη απόκλιση ως προς την αμινοξική αλληλουχία. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση των δύο ισομορφών της hGDH, σε κυτταρικές σειρές. Για το σκοπό αυτό κατασκευάσαμε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης των hGDH1 και hGDH2 σε σύζευξη με τη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP και διαμολύναμε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και θηλαστικών. Πειράματα συνδιαμόλυνσης των hGDH1-EGFP ή hGDH2-EGFP σε συνδυασμό με κατάλληλους υποκυτταρικούς δείκτες και συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού έδειξαν ότι οι hGDHs συν-εντοπίζονται με το μιτοχονδριακό δείκτη DsRed2-Mito, και σε μικρότερο βαθμό με το δείκτη του ενδοπλασματικού δίκτυου DsRed2-ER. Πειράματα υποκυτταρικής κλασμάτωσης και ανοσοαποτύπωσης έδειξαν ότι οι hGDHs-EGFP εντοπίζονται στο μιτοχονδριακό κλάσμα, όπου ανίχνευεται κυρίως η ώριμη τους μορφή (~90 kDa), από την οποία έχει αποκοπεί το Ν53. Αντίθετα στο κυτταροπλασματικό κλάσμα ανιχνεύεται η πρόδρομος μορφή (~95 kDa), η οποία αντιστοιχεί πιθανά στη GDH που σχετίζεται με το ενδοπλασματικό δίκτυο. Η απαλοιφή του Ν53 από το μόριο των hGDHs έχει ως αποτέλεσμα την κατάργηση της μιτοχονδριακής τους στόχευσης, επιβεβαιώνοντας το ρόλο του N53 ως μιτοχονδριακό σινιάλο στόχευσης. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, προσπαθήσαμε να χαρακτηρίσουμε το Ν53 των hGDHs, να κατανοήσουμε τη δομή του και τις ιδιότητες που είναι σημαντικές στη μιτοχονδριακή στόχευση. Τα κύρια χαρακτηριστικά του Ν53 είναι το θετικό φορτίο και η τάση να σχηματίζει δύο α-έλικες (α1: N1-10 και α2: N16-32), από τις οποίες η α1 είναι περισσότερο αμφιπαθής. Η πρώτη έλικα, α1, είναι απολύτως απαραίτητη για τη μιτοχονδριακή στόχευση, καθώς πειράματα απαλοιφής της α1 έλικας της hGDH2, οδηγούν σε απώλεια της μιτοχονδριακής της στόχευσης. Επιπλέον η α1, αλλά όχι η α2, αποτελεί ένα αυτόνομο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης που μπορεί να οδηγήσει μη μιτοχονδριακές πρωτεΐνες στα μιτοχόνδρια. Ωστόσο, για την αποτελεσματική είσοδο των hGDHs στα μιτοχόνδρια είναι απαραίτητη η συνεργασία μεταξύ των δύο ελίκων, α1 και α2, αν και η α1 έχει τον πρωταγωνιστικό ρόλο. Τα πειράματά μας επιβεβαιώθηκαν από παράλληλα πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα από συνεργάτες του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας, που επιπλέον διαπιστώσανε ότι η hGDH2 εισέρχεται και/ ή ωριμάζει ταχύτερα στα μιτοχόνδρια του σακχαρομύκητα σε σχέση με τη hGDH1. Επιπρόσθετα, τα πειράματα στο σακχαρομύκητα έδειξαν ότι η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53 δεν είναι απαραίτητη για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs. Το τελευταίο τμήμα της εργασίας ρίχνει φως στην εξέλιξη του μιτοχονδριακού σινιάλου στόχευσης της GDH, από τους κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς προς τα θηλαστικά και τον άνθρωπο. Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό προγραμμάτων βιοπληροφορικής και in silico προβλέψεων μιτοχονδριακής στόχευσης, προτείνουμε ότι η εμφάνιση αποκοπτόμενου MTS για τη GDH πιθανώς ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα. Στη GDH των θηλαστικών, το MTS εξελίχθηκε σε ένα μεγαλύτερο, δομικά πολυπλοκότερο και ισχυρότερο σινιάλο στόχευσης. Επιπρόσθετα, διαπιστώσαμε ότι η α1 έλικα στα θηλαστικά είναι περισσότερο συντηρημένη σε σχέση με την α2 έλικα. Για να ελέγξουμε πειραματικά μερικές από τις in silico προβλέψεις, μελετήσαμε την ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης των MTS των GDH διαφορετικών ευκαρυωτικών οργανισμών-μοντέλων. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila (βλεφαριδοφόρο), C. elegans (νηματώδης), D. melanogaster (μύγα) and X. laevis (αμφίβιο) είναι ικανά να στοχεύσουν τις μη μιτοχονδριακές πρωτεΐνες EGFP και DHFR στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την hGDH2 στα μιτοχόνδρια.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη παρέχει σημαντικές γνώσεις ως προς την υποκυτταρική στόχευση και τους μηχανισμούς εισόδου στα μιτοχόνδρια μίας από τις κυριότερες πρωτεΐνες της μιτοχονδριακής μήτρας και βοηθάει στην καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας και της εξέλιξης των σινιάλων στόχευσης των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών.