Molecular analysis of HURP protein’s role in oncogenesis
Authors: Κεσίσοβα Ιλόνα 
Published: September 2021

Η µιτωτική άτρακτος είναι µία µοριακή µηχανή δοµικά βασισµένη σε µικροσωληνίσκους, που παρουσιάζει ιδιαίτερη δυναµικότητα και διενεργεί την ίση κατανοµή των διπλασιασµένων χρωµοσωµάτων στα δύο θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταρική διαίρεση.Ο σχηµατισµός της ατράκτου σε σωµατικά κύτταρα θηλαστικών βασίζεται στις συντονισµένες δραστηριότητες δύο βιοχηµικών µονοπατιών: το µονοπάτι εξαρτώµενο από τα κεντροσώµατα και το µονοπάτι εξαρτώµενο από τη χρωµατίνη, τα οποία ικανοποιούν δύο ευρέως αποδεκτά µοντέλα για τη συναρµολόγηση της ατράκτου, το µοντέλο “search–and-capture” και το µοντέλο του “self-organization”,αντίστοιχα. Γνωρίζουµε ότι η χρωµατίνη παράγει ενδοκυτταρικά σήµατα χωρικής οργάνωσης που ευνοούν την εµπυρήνωση ή/και τη σταθεροποίηση των µικροσωληνίσκων. H κύρια ενδοκυττάρια διαβάθµιση συγκέντρωσης που δηµιουργείται από τα χρωµοσώµατα και συµβάλλει στην αυτο-οργάνωση της µιτωτικής ατράκτου είναι η διαβάθµιση συγκέντρωσης του RanGTP. Η µικρή GTPάσηRan όταν είναι συνδεδεµένη µε GTP, παρουσιάζει µια ενδογενή φθίνουσα διαβάθµιση συγκέντρωσης γύρω από την επιφάνεια των χρωµοσωµάτων λόγω παρουσίας εκεί του παράγοντα ανταλλαγής GTP,RCC1. Το RanGTP που επάγεται από τη χρωµατίνη προωθεί τη συναρµολόγηση της ατράκτου µέσω απελευθέρωσης παραγόντων που ευνοούν την συναρµολόγηση της ατράκτου (Spindle AssemblyFactors, SAFs) και περιέχουν σήµα πυρηνικού εντοπισµού (Nuclear Localization Signal, NLS) από ανασταλτικά σύµπλοκα µε ιµπορτίνες α ή / και β. Το ρυθµιστικό δίκτυο της συναρµολόγησης της ατράκτου ελέγχεται επιπροσθέτως από τη δράση των µιτωτικών κινασών που οδηγούν σε γεγονότα αναστρέψιµης φωσφορυλίωσης, ρυθµίζοντας έτσι τη λειτουργία των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους (Microtubule Associated Proteins, MAPs) και των κινεσινών.Η σωστή διαµόρφωση και λειτουργία της µιτωτικής ατράκτου απαιτούνται για τη διενέργεια της κυτταρική διαίρεση χωρίς σφάλµατα. Παρ 'όλα αυτά, ακόµη και µια µικρή απορρύθµιση αυτών των µιτωτικών πρωτεϊνών, που δεν θέτει σε κίνδυνο τη βιωσιµότητα των κυττάρων, µπορεί να οδηγήσει σε ανώµαλη κυτταρική διαίρεση και τελικά σε ανευπλοειδία, ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα του καρκίνου.Κατά τα τελευταία χρόνια, έχουν αναφερθεί γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις σε έναν σηµαντικόαριθµό µιτωτικών γονιδίων σε ανθρώπινους όγκους. Οι αλλοιώσεις αυτές που παρουσιάζονται σε µιτωτικά γονίδια και σχετίζονται µε τον καρκίνο φαίνεται να επηρεάζουν κυρίως τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Η πλειοψηφία των µιτωτικών γονιδίων που παρουσιάζουν αλλοιώσεις στον καρκίνο περιλαµβάνει κυρίως κινάσες, πρωτεΐνες του σηµείου ελέγχου της ατράκτου και δοµικές πρωτεΐνες της ατράκτου συµπεριλαµβανοµένων των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους και των κινεσινών.Για το σκοπό αυτό κατευθυνθήκαµε προς την µελέτη µίας πρωτεΐνης που προσδένεται σε µικροσωληνίσκους µε ρόλο-κλειδί στον σχηµατισµό ατράκτου, την πρωτεΐνη HURP (Hepatoma UpRegulated Protein) καθώς και προς τη µελέτη του πιθανού της ρόλου στον καρκίνο. Η HURP έχειαρχικά αναγνωριστεί ως µέρος ενός RanGTP εξαρτώµενoυ πολυ-πρωτεϊνικού σύµπλοκου που προάγει την συγκρότηση της διπολικής ατράκτου σε εκχυλίσµατα αυγών του βατράχου Xenopus και αποτελείται από δύο επιπλέον πρωτεΐνες που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους την TPX2 και τηνXMAP215, την κινεσίνη Eg5 και την κινάση Aurora Α. Η HURP ρυθµίζεται αυστηρά κατά τη διάρκειατης µίτωσης ως προς τα επίπεδα έκφρασής της και ως προς τον εντοπισµό της. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης HURP φτάνουν στο µέγιστο κατά τη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου ενώ ο εντοπισµός της πρωτεΐνης περιορίζεται σε ένα υποσύνολο των µικροσωληνίσκων της ατράκτου, τους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου (k-ΜΤs). Στη µεταφασική άτρακτο η HURP εντοπίζεται κυρίως στους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου σε διαβάθµιση συγκέντρωσης κατά µήκος του άξονα των δύο πόλων παρουσιάζοντας υψηλότερη συγκέντρωση σε περιοχές κοντά στην χρωµατίνη, φθίνονταςπρος τους πόλους. Η HURP αποτελεί υπόστρωµα της Aurora Α και η φωσφορυλίωσή της διεγείρει τον ογκογόνο µετασχηµατισµό καλλιεργηµένων κυττάρων.Για να κατανοήσουµε καλύτερα το ρόλο της HURP στη συναρµολόγηση της ατράκτου αναπτύξαµε µικρά-µόρια αναστολείς της κινάσης Aurora Α. Σε αυτή τη µελέτη, από ένα σύνολο 105 πιθανών µικροµοριακών αναστολέων, δύο ενώσεις ο Tripolin Α και ο Tripolin Β, βρέθηκαν να αναστέλλουν την δραστικότητα της Aurora A κινάσης in vitro. Ωστόσο, σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, µόνο ο TripolinΑ δρα ως αναστολέας της Aurora Α. Συνδυάσαµε βιοχηµικά πειράµατα in vitro και µελέτες συνεστιακής µικροσκοπίας µεµονοµένων κυττάρων in vivo, για να εξετάσουµε τη βιολογική δραστικότητα τουTripolin Α. Τα ευρήµατά µας αποδεικνύουν ότι ο Tripolin Α είναι ένας αναστολέας της Aurora Α, µη-ανταγωνιστικός του ΑΤΡ. Ο Tripolin Α µειώνει τον εντοπισµό της Aurora Α στους µικροσωληνίσκουςτης ατράκτου, επηρεάζει την ακεραιότητα των κεντροσωµάτων, επηρεάζει τον σχηµατισµό και το µήκος της ατράκτου, καθώς και τη δυναµική των µικροσωληνίσκων στην µεσόφαση, αποτελέσµατα που συνάδουν µε απαλοιφή της Aurora A. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι ο Tripolin Α επηρεάζει την διαβάθµιση συγκέντρωσης της HURP προς τα χρωµοσώµατα, αλλά όχι την πρόσδεσή της στους µικροσωληνίκους. Πειράµατα ανάκτησης φθορισµού µετά από αποχρωµατισµό FRAP (FluorescenceRecovery After Photobleaching, FRAP) δείχνουν ότι η Aurora A ρυθµίζει την ανταλλαγή της HURP στις θέσεις πρόσδεσής της στους µικροσωληνίκους της ατράκτου. Ως εκ τούτου, καταλήγουµε στο συµπέρασµα ότι η φωσφορυλίωση από την Aurora A διατηρεί την διαβάθµιση συγκέντρωσης του εντοπισµού της HURP στην άτρακτο.Προγενέστερες µελέτες γονιδιακής έκφρασης έχουν εντοπίσει υπερέκφραση της HURP σε ανθρώπινους καρκίνους όπως τον καρκίνο του ήπατος και της ουροδόχου κύστης. Για το σκοπό αυτό εξετάσαµε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης της HURP σε µια οµάδα κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν την πολυσταδιακή χηµική καρκινογένεση της επιδερµίδας του ποντικού,προκειµένου να αναπαραστήσουµε την διαδικασία πολλαπλών βηµάτων για την ανάπτυξη του καρκίνου, σε ένα µοντέλο κυτταρικών σειρών. Οι κυτταρικές σειρές αντιπροσωπεύουν την ανάπτυξη των τριών διαφορετικών στάδιων της καρκινογένεσης, την έναρξης, την προώθηση και την εξέλιξης του όγκου και προέρχονται από όγκους του δέρµατος ποντικού που επάγονται σε δύο στάδια, µε επίδρασηDMBA / ΤΡΑ (πολυκυκλικός αρωµατικός υδρογονάνθρακας / φορβολικός εστέρας). Εφαρµόσαµε λοιπόν, ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χρησιµοποιώντας ποσοτική PCR πραγµατικού χρόνου(Quantitative Real Time PCR, qPCR) και αποτύπωµα κατά Western καi βρήκαµε ότι τα επίπεδα mRNAκαι πρωτεΐνης του γονιδίου της Hurp είναι αυξηµένα στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται απόκαρκινώµατα πλακώδων κυττάρων και από αναπλαστικά ατρακτοειδή καρκίνωµατα σε σύγκριση µε τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καλοήθη θηλώµατα. Συλλογικά, προτείνουµε ότι τα επίπεδα έκφρασης της HURP στον καρκίνο δεν συσχετίζονται µε την καλοήθη υπερπλασία αλλά αυξάνουν µε την κακοήθη εξαλλαγή.Στο σύνολό τους τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης αποκάλυψαν µια νέα ρυθµιστική λειτουργία της κινάσης Aurora A στην πρωτεΐνη HURP πάνω στη µιτωτική άτρακτο. Επιπλέον έχουµε δώσει νέες κατευθύνσεις σχετικά µε το ρόλο της HURP στην εξέλιξη του καρκίνου.