**리프로그래밍**은 포유류의 발생 과정이나 세포 배양 과정에서 DNA 메틸화 (DNA methylation)와 같은 후성유전학적 표시(epigenetic marks)가 변화되는 과정을 의미한다. 이러한 조절은 종종 히스톤 (histone)의 공유 결합 수정 및 대체와도 관련이 있다.

후성유전학적 표시의 상당 부분 (10%에서 100%)이 빠르게 (수 시간에서 수일) 리프로그래밍되는 현상은 포유류의 세 가지 생애 단계에서 발생한다. 정자 (sperm)와 난자 (oocytes)가 수정된 후 초기 발생 단계에서 거의 100%에 달하는 후성유전학적 표시들은 두 번의 짧은 기간 동안 리프로그래밍된다.

포유류의 수정 후, DNA 메틸화 패턴은 대부분 지워졌다가 초기 배아 발생 과정에서 다시 확립된다. 부모로부터 전달된 대부분의 메틸화는 초기 배아 발생 과정에서 지워지고, 또 배우자 형성 (gametogenesis) 과정에서 다시 지워지며 그때마다 탈메틸화 (demethylation)와 재메틸화 (remethylation)가 일어난다 (유전체 각인이 되어있는 유전자의 DMR (Differentially methylated region)은 여기서 제외된다). 초기 발생 과정에서 일어나는 탈메틸화는 착상 전 기간에 일어난다. 정자와 난자가 수정하여 접합체를 형성한 후, 부계 DNA는 신속하게 탈메틸화되고, 모계 DNA는 더 느리게 탈메틸화되어 거의 메틸화되지 않은 상태의 상실배 (morula)가 형성된다. 배반포 (blastocyst)가 형성된 후 메틸화가 시작될 수 있으며, 배아가 착상 단계에 이르기까지 메틸화가 진행된다. 이 리프로그래밍은 새롭게 형성된 배아가 전분화능 (totipotency)을 갖게 되고, 기존의 후성유전학적 특징을 지우는 과정을 말한다. 착상 후 체세포의 메틸화 패턴은 각 개별 세포 유형을 정의하는 것으로, 단계 및 조직에 따라 다르며 오랜 시간 동안 안정적으로 지속된다.

또한, 생식세포전구체  내에서는 생식세포 형성 중에 탈메틸화가 발생한다. 수정 후 새롭게 형성된 배아를 구성하는 몇몇 세포들은 배융선 (germinal ridge)을 따라 이동하게 되고, 마침내 정자, 난자와 같은 생식세포 (germ cell)가 된다. 유전체 각인 (genomic imprinting)에 의해 양친의 유전체는 각각 다르게 표시 (mark)되지만, 생식세포가 되는 과정 동안에는 모두 새롭게 리프로그래밍된다. 그러므로 배우자형성 (gametogenesis)과정 동안에 생식세포전구체는 원래 양친이 가지고 있던 DNA 메틸화 패턴을 지운 후, 배아의 성별에 따라 재확립되게 된다.

체세포 핵치환과 같이 착상 전 배아를 생체 외에서 조작하는 경우, 각인된 유전체자리의 메틸화 패턴에 이상이 생기는 것이 확인되었으며,

리프로그래밍은 체세포 핵 치환 뿐만 아니라 줄기세포 관련 유전자를 외인성 (exogenous)으로 과발현 시킴으로써 인위적으로 유도할 수도 있다. 즉, 성인의 섬유아세포 (fibroblast)와 같은 성숙한 세포로부터 유도만능줄기세포 를 만들어 낼 수 있다는 것인데, 그 결과 세포 치료와 같은 의생명과학연구 (biomedical research)를 위한 줄기세포를 배아의 이용 없이 생산할 수 있게 되었다.

## 발생
생쥐의 정자 유전체는 DNA의 CpG 부위에서 80~90%가 메틸화되어 있으며, 이는 대략 2천만 개의 메틸화 부위에 해당한다. 수정 후, 부 염색체는 DNA 복제가 시작되기 전의 활성 과정 (active process)에 의해 6시간 내에 거의 완전히 탈메틸화된다 (그림의 파란색 선). 성숙한 난모세포에서는 약 40%의 CpG 부위가 메틸화된다. 모 염색체의 탈메틸화는 주로 메틸화 효소가 모체 유래 DNA에 작용하는 것을 차단하고, 복제 중에 메틸화된 모체 DNA가 희석됨으로써 발생한다 (그림의 빨간색 선). 상실배 (16세포 단계)에는 소량의 DNA 메틸화만 존재한다 (그림의 검은색 선). 수정 후 배반포 단계에서는 3.5일째부터 메틸화가 증가하기 시작해, 4.5일에서 5.5일 사이에 메틸화 수준이 12%에서 62%로 급격히 높아지며, 이후 자궁 착상을 거쳐 최대 수준에 도달한다. 수정 7일 후에는 착상된 배아에서 새롭게 형성된 생식세포전구체가 나머지 체세포로부터 분리되며, 이 때 생식세포전구체는 체세포와 거의 유사한 메틸화 수준을 가지게 된다.

착상된 배아에서 새롭게 형성된 생식세포전구체는 체세포에서 유래한다. 이 시점에서 생식세포전구체는 높은 메틸화 수준을 가진다. 이 세포들은 배반포 상태에서 배융선으로 향해 이동하며, 이 과정에서 빠르게 증식하고 두 단계에 걸쳐 탈메틸화가 진행된다. 첫 번째 단계에서는 복제 희석에 의한 탈메틸화가 일어나지만, 두 번째 단계에서는 활성 과정에 의한 탈메틸화가 일어난다. 특히 두 번째 단계에서는 특정 유전자자리 (loci)의 탈메틸화로 이어진다. 이 시점에서 생식세포전구체의 유전체는 전체 생애 주기에서 모든 세포 중 가장 낮은 DNA 메틸화 수준을 나타낸다. 이 과정은 배아 발달 13.5일(E13.5)에 해당하며, 관련 내용은 이 섹션의 두 번째 그림 참조.
수정 후, 부계와 모계의 유전체는 후성유전학적 흔적을 지우고 전분화능을 획득하기 위해 탈메틸화된다. 이 과정에서 비대칭성이 나타난다: 수컷의 핵은 빠르고 능동적으로 탈메틸화된다. 반면 암컷의 핵은 연속적인 세포 분열 동안 수동적으로 탈메틸화된다. DNA 탈메틸화 과정은 염기 절제 복구 및 기타 DNA 수선 기반 메커니즘이 포함된다.

## 학습 및 기억
학습과 기억은 일시적인 사고, 언어, 의식과 같은 다른 정신적 과정과는 달리 영속성을 지닌다. 학습과 기억은 구구단처럼 천천히 축적될 수도 있고 뜨거운 난로를 만지는 것처럼 빠르게 축적될 수도 있지만, 한 번 습득하면 의식적으로 오랫동안 기억하여 사용할 수 있다. 공포 조건화 (contexual fear conditioning)를 한 번 경험한 쥐는 특히 강력한 장기 기억을 형성한다. 훈련 후 24시간이 지난 시점에서 해마 뉴런의 쥐 게놈에서 9.17%의 유전자가 차등적으로 메틸화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 여기에는 훈련 후 24시간이 지난 시점에서 2,000개 이상의 차등 메틸화된 유전자가 포함되었으며, 그 중 500개 이상의 유전자가 탈메틸화되었다.

## 리프로그래밍의 역사 및 종류
리프로그래밍을 처음으로 체외에서 성공시킨 사람은 **존 거든**(John Gurdon)이다. 그는 1962년에 분화된 장상피세포 (intestinal epithelial cell)를 핵이 제거된 개구리의 난자 (oocytes)에 삽입하여 성숙한 체세포를 배아상태로 되돌릴 수 있음을 증명해냈다. 야마나카는 자신이 발견한 4개의 유전자를 이용하면 거든이 발견한 핵치환에 의한 리프로그래밍과 마찬가지로 성숙한 체세포로부터 유도만능줄기세포를 만들어 낼 수 있다는 것을 2006년에 입증하였으며,{{저널 인용

### 체세포 핵 치환
난자는 성체의 핵과의 치환을 통해 배아상태로 리프로그래밍 될 수 있다. 리프로그래밍 된 세포는 어떤 세포타입이든 상관없이 새로운 유기체 (organism)로 발달할 수 있는 능력을 가지게 된다. 하지만 체세포 핵 치환의 경우 세포의 유전체가 바뀌어 다른 세포타입으로 전환되는 것이기 때문에 체세포 에피타입과는 구분된다. 체세포 핵 치환은 매우 정교한 기술으로 오랜 훈련이 필요한 작업이며, 이를 사람에 적용함에 있어서 사람의 난자를 채취해야 하기 때문에 그 수가 제한적이라는 단점을 가진다.

### 유도만능줄기세포 리프로그래밍
일반적으로 유도만능줄기세포 리프로그래밍은 이미 성숙한 체세포에 리프로그래밍에 필요한 인자 (factor) 4가지를 인위적으로 과발현시켜 만능줄기세포를 유도해내는 기술을 의미한다. 선택된 인자들은 전사인자 (transcription factor)로 이들의 과발현에 의해 하위 유전자들의 발현이 조절되어 리프로그래밍이 이루어지게 된다. 4가지 유전자를 과발현시키는 방법으로는 바이러스, 플라스미드 벡터, mRNA, 단백질 등이 있다. 이 경우, 모든 종류의 체세포를 이용해 만능줄기세포를 유도할 수 있으며, 과발현 시키는 방법 역시 일반적으로 많은 연구에 쓰이는 기술이기 때문에 체세포 핵치환에 비해 많은 사람들이 쉽게 이용할 수 있는 기술이다.

#### 확률론적 관점에서 OSKM 방법 이해
몇 주간의 리프로그래밍 유도 기간와 상대적으로 낮은 효율성이 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자 발현을 충분히 제어한 후에도 지속되었기 때문에, 이러한 연구들은 기본적인 후성유전학적 재프로그래밍 메커니즘에 관련된 중요한 질문들을 해결하지 못했었다. 그 질문들에는 리프로그래밍 과정은 시간이 지남에 따라 어떻게 진행되며, 리프로그래밍 인자의 지속적인 발현에도 불구하고 다수의 세포가 리프로그래밍되지 않는 이유는 무엇인지, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc에 의해 유도된 노화 또는 세포 자멸사를 회피한 일부 체세포가 다른 세포보다 더 일찍 iPS 세포로 전환되는 이유, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 리프로그래밍 인자를 발현하는 모든 성체 기증 세포가 결국 iPS 세포를 생성하는가에 대한 아니면 추가적인 유전적 또는 소분자 화합물의 조작이 필요성과 높은 리프로그래밍 효율성은 비계통 세포(non-lineage) 또는 성체 줄기 세포에만 국한되어 있는 가에 대한 것이 포함되어 있다.

Hanna 등의 연구자들은 이 현상을 연구하기 위해, 특정 전사 인자의 통합 패턴이 같은 체세포(이 경우 B 세포)를 사용하는 시스템을 사용하여 그림에서 처럼 가설을 세우고 실험을 진행하였다. 리프로그래밍은 2주 동안 배양 후 세포 내에서 녹색 형광 단백질로 표지된 NANOG의 발현을 통해 평가되었으며, 이 과정에서 3~5%의 세포에서 관찰되었고 18주 후에는 >92%로 증가하였다. 이는 모든 세포가 유도만능줄기 세포가 될 수 있는 확률적 과정임을 나타냈고. 또한 p53나 그 효과자 p21의 억제는 세포 분열 속도를 증가시켜 리프로그래밍을 가속화할 수 있음을 밝혔다.

### 세포융합 (Cell Fusion)
세포융합은 두 개 이상의 세포질이 융합하여 단일의 세포막으로 싸여진 상태로 되는 것을 말한다. 세포분열 저해제를 이용하여 두 개의 체세포를 하나의 세포로 융합할 수 있으며, 이 때 두 개의 핵은 여전히 분리되어 존재한다. 이렇게 만들어진 이핵체 (heterokaryon)는 두 개의 핵 중 우위 (dominant)의 핵이 자신의 유전자 발현 패턴을 다른 핵에 강요하여 하위 (recessive)의 핵의 유전자 발현 패턴에 변화가 생기게 된다. 이처럼 세표융합의 결과 두 개의 핵이 공존하는 이핵체의 경우, DNA 복제와 세포분열이 일어나지 않는다는 문제를 가진다.{{저널 인용

### 직접교차분화(Direct Conversion)
성숙한 체세포를 다른 유형의 성숙한 체세포로 직접 변환하는 과정으로, 중간 단계인 유도만능줄기세포(iPSC) 상태로 되돌리지 않고 수행된다. 이 방법은 특정 세포 유형을 보다 효율적이고 안전하게 생성할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 직접 전환의 핵심은 특정 전사 인자를 도입하여 세포의 정체성을 리프로그래밍하는 것이다. 과정이 비교적 빠르고 효율적이며, 중간 단계 없이 목표 세포로 직접 변환할 수 있어 잠재적으로 안전성이 높다. 하지만 세포 유형에 따라 전환 효율이 다를 수 있다.

### 화학적 리프로그래밍(chemically induced reprogramming)
유도만능줄기세포 제작 방법에 앞서 언급했던 4가지을 인위적으로 유전자를 과발현 시켜 제작한 방법과는 달리 구조가 알려진 화합물을 활용한 세포의 리프로그래밍이 개발되었다. 본 연구에서 사용한 성인 지방 유래 간질 세포(human adipose stem cell)을 이용해서 먼저, 체세포에서 발견되는 특이적인 유전자 발현을 감소 혹은 억제시키는 화합물질을 처리해서 이들의 특성을 8일 동안 억제시킨다. 이후 후성유전학적인 세포의 특성을 지우기 위해 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제 등 탈메틸화 유도 화합물 혼합물을 8~12일간 처리한다. 세번째 단계 전분화능줄기세포의 생존에 도움을 주는 녹아웃 혈청 대체제와 ERK와 GSK3를 억제하는 화합물을 처리함으로써 세포 리프로그래밍이 될 수 있다. 이 방법을 사용한 리프로그래밍은 저렴하고 농도 및 시간 의존 방식으로 세포를 제어하기에 쉬우며 대량 생산이 용이하다는 장점이 있다.

## 리프로그래밍의 단계
세포 운명이 변경될 수 있다는 발견과 함께, 세포가 재프로그래밍되는 동안 어떤 사건들이 발생하는지에 대한 질문이 중요해졌다. iPSC 리프로그래밍의 최종 산물은 형태(morphology), 증식(proliferation), 유전자 발현, 다능성(pluripotency), 텔로머라제(telomerase) 활성에서 유사하기 때문에, 유전적 및 형태학적 표지자가 재프로그래밍의 어느 단계가 진행 중인지 확인하는 방법으로 사용되었다.

### 개시(initiation)
시작 단계는 세포 유형 특정 유전자의 하향 조절과 다능성 유전자의 상향 조절과 관련이 있다.

만약 세포가 하나의 체세포에서 다른 체세포로 직접 리프로그래밍된다면, 각 세포 유형과 관련된 유전자들이 상향 조절되거나 하향 조절된다. 이는 직접적인 세포 리프로그래밍을 통해 발생하거나 iPSC와 같은 중간 단계를 거쳐 원하는 세포 유형으로 분화시킬 수 있다.

시작 단계는 세 가지 경로 중 하나를 통해 완료된다: 핵 치환, 세포 융합, 또는 정해진 인자.

#### 체세포 핵 치환(Somatic cell transfer)
난자가 체세포 핵 치환 후 성체 핵을 배아 상태로 재프로그래밍할 수 있어, 이러한 세포로부터 새로운 유기체를 개발할 수 있다.

리프로그래밍은 체세포 에피타입의 발달과는 구별되며, 체세포 에피타입(epitype)은 유기체가 발달 단계를 벗어난 후에도 잠재적으로 변화할 수 있다을 통해 입증되었다. 특히 이러한 사건들은 세포 운명이 되돌릴 수 있는 과정임을 보여주었다.

#### 세포 융합(Cell fusion)
세포 융합은 이핵 세포(heterokaryon)라고 불리는 다핵 세포를 생성하는 데 사용된다.

#### 정해진 인자
체세포 핵 치환과 세포 융합과는 달리, 정의된 인자는 전체 유전체가 아닌 리프로그래밍 인자만 필요하다. 이러한 재프로그래밍 인자에는 마이크로RNA, 전사 인자, 후성 유전적 표지, 기타 소분자가 포함된다.

### 성숙(maturation)
성숙 단계는 첫 번째 다능성 유전자가 발현되는 시작 단계의 끝에서 시작된다. 이 단계에서 세포는 리프로그래밍 과정을 시작한 요인들로부터 독립할 준비를 한다. iPSC에서 처음으로 감지되는 유전자는 Oct4, Homeobox 단백질 NANOG, Esrrb이며, 이후에 Sox2가 뒤따라 발현된다. 성숙 단계의 후반에서는 트랜스젠 유전자 침묵이 발생하여 세포가 유도된 전사 인자로부터 독립하기 시작함을 나타낸다. 세포가 독립하게 되면 성숙 단계가 끝나고 안정화 단계가 시작된다.

리프로그래밍 효율성이 가변적이고 낮은 효율성으로 입증되었기 때문에, 모든 세포가 성숙 단계를 완료하고 다능성에 도달하지는 않는다. 리프로그래밍을 겪는 일부 세포는 유전자 발현 변화의 스트레스로 인한 산화 스트레스로 인해 성숙 단계의 시작 부분에서 여전히 세포 자살 상태에 있다. 마이크로RNA, 단백질 및 OSKM 인자의 다양한 조합을 사용하면 리프로그래밍의 효율성을 높이는 방향으로 나아가고 있다.

### 안정화(stabilization)
안정화 단계는 세포가 다능성에 도달한 후에 발생하는 과정들을 의미한다. 한 가지 유전적 표지자는 Sox2의 발현과 X 염색체의 재활성화이며, 후성유전학적 변화로는 텔로머라제가 텔로미어를 연장하고 세포의 후성유전학적 기억을 상실하는 것이 포함된다. 세포의 후성유전학적 기억은 DNA 메틸화의 변화에 의해 재설정되며, 활성화 유도 시티딘 탈아미노효소(activation-induced cytidine deaminase), TET 효소(TET enzymes), 그리고 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNA methyltransferase)를 사용하여 성숙 단계부터 안정화 단계까지 진행된다. 세포의 후성유전학적 기억이 상실되면 세 가지 배엽으로 분화할 가능성이 생긴다. 이는 세포가 완전히 재프로그래밍된 것으로 간주되며, 원래의 체세포 유형으로 되돌아가지 않고도 계대 배양이 가능하다는 특징을 가진다.

화학적 리프로그래밍 단계를 통해 인간 체세포가 리프로그래밍 되는 단계는 앞서 서술한 단계와 상이하다.

## 세포 배양 시스템에서의 리프로그래밍
리프로그래밍은 전사 인자 같은 외부 요소를 도입함으로써 인공적으로 유도될 수 있다. 리프로그래밍은 주로 성인 섬유아세포와 같은 성숙세포로부터 유도만능한 줄기세포를 생성하는 것을 의미한다. 이를 통해 배아를 사용하지 않고도 생체 의학 연구를 위한 줄기세포를 생산할 수 있다. 이는 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 줄기세포 관련 유전자를 성숙 세포에 전달하는 과정이다. 이러한 벡터는 세포 내에 필요한 유전자 물질을 전달하여 리프로그래밍 과정을 시작하고, 성숙 세포를 배아 줄기 세포와 유사한 다능한 상태로 변환시킨다. 리프로그래밍 기술의 이러한 발달은 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 연구를 위한 새로운 길을 열었으며, 생체 의학 연구와 질병 치료를 발전시킬 수 있는 기회를 제공한다.

### 전사 인자(Transcription Factors)
세포 변화를 야기하는 첫번째 발견된 전사 인자 중 하나는 근육모세포(Myoblast)에서 발견되었다. 마이오디(MyoD)의 cDNA를 발현하여 섬유아세포를 근육모세포(Myoblast)로 변환했다. 또 다른 인자인 C/EBPα는 림프구 세포를 골수세포로 직접 변환했다. MyoD와 C/EBPα는 세포를 변환시킬 수 있는 단일 인자 중 대표적인 예이다. 더 흔하게는, 여러인자의 조합이 함께 작용하여 세포를 리프로그래밍한다.

#### OSKM
OSKM 인자는 2006년 야마나카가 쥐 섬유아세포를 유도만능줄기세포(iPSCs)로 유도하면서 처음 발견되었다. 다음 해에는 이러한 인자를 사용하여 인간 섬유아세포를 유도만능줄기세포로 유도하는 데 성공했다.

Oct4는 배아 줄기 세포와 종양에서 모두 발견되는 다능성에 필요한 핵심 조절 유전자 중 하나이다. Oct4의 발현이 약간 증가하는 것만으로도 다능성으로 분화를 시작할 수 있다. Oct4는 Sox2와 함께 FGF4의 발현을 조절하여 분화를 돕는다.

Sox2는 줄기세포에서 다능성을 유지하는 데 사용되는 유전자이다. Oct4와 Sox2는 함께 다능성에 필요한 수백 개의 유전자를 조절한다. 그러나 Sox2는 Oct4와 함께 유전자 조절에 참여하는 유일한 Sox 계열 구성원이 아니다. Sox4, Sox11, Sox15도 참여하며, Sox 단백질은 줄기 세포 게놈 전체에 걸쳐 중복되어 있다.

Klf4는 증식, 분화, 세포 자살, 체세포 리프로그래밍에 사용되는 전사 인자이다. 세포 리프로그래밍에 사용될 때, Klf4는 손상된 세포의 분열을 막고 세포 자살을 유도하는 능력을 통해 세포 주기를 조절하며, 히스톤 아세틸전달효소의 활동을 돕는다.

#### NANOG
NANOG는 다능성을 유지하고 세포 결정 인자를 억제함으로써 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 효율성을 높이는 전사 인자이다. NANOG는 H3K27me3와 같은 히스톤 표지를 억제하여 염색질 접근성을 촉진하는 방식으로 작동한다. NANOG는 Oct4, Sox2, Esrrb를 전사에 사용하기 위해 모이고, 염색질 접근성을 위해 Brahma-related gene-1(BRG1)을 모집하는 역할도 한다.

#### C/EBPα
CEBPA는 세포를 유도만능줄기세포 뿐만 아니라 다른 세포로 리프로그래밍할 때 자주 사용되는 인자이다. C/EBPα는 림프구 세포를 골수구 세포로 직접 리프로그래밍할 때 단일 트랜스액팅 인자로 작용한다. C/EBPα는 세포가 OSKM 인자와 특정 전사 이벤트를 받아들일 수 있도록 준비하는 역할을 한다. 또한 C/EBPα는 리프로그래밍 이벤트의 효율성을 높이는 것으로도 알려져 있다.

## 가변성
리프로그래밍 후 얻어진 세포의 특성은 특히 유도만능줄기세포 사이에서 크게 다양할 수 있다. 리프로그래밍 성능 및 최종 산물의 기능적 특성에 변동을 일으키는 요인으로는 유전적 배경, 조직 출처, 리프로그래밍 인자의 비율 및 세포 배양과 관련된 스트레스 요인 등이 있다.