Il museo occupa gran parte di un antico convento dei Vallombrosani intitolato a San Salvi e prende il nome dal Cenacolo;un grande affresco raffigurante l'Ultima Cena;posto nel refettorio;opera di Andrea del Sarto;uno dei capolavori della pittura rinascimentale.Nei vasti locali del convento sono collocati importanti dipinti della prima metà del Cinquecento;che documentano lo sviluppo della pittura fiorentina di quel periodo.Tra questi opere di Pontormo;Andrea del Sarto;Franciabigio;Raffaellino del Garbo;Giuliano Bugiardini;Bachiacca.Si segnala inoltre il Monumento funebre a San Giovanni Gualberto;fondatore dei vallombrosani;ordinato nel 1505 a Benedetto da Rovezzano e rimasto incompiuto.Nel piano superiore;è ordinato un vasto deposito di opere delle Gallerie Fiorentine.