Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real time-PCR), sekansa özgüllüğü sebebiyle yaygın olarak kullanılan hızlı ve hassas bir gen niceleme yöntemidir. Real Time-PCR yönteminde, tüp içerisinde hızlı şekilde başlangıç deoksiribonükleik asit (DNA) miktarının milyon kat artırılması hedeflenmektedir . Klasik PCR yönteminde, amplifiye edilen DNA ürünü, bir uç nokta analizinde saptanmaktadır. Buna karşılık Real Time-PCR’de amplifikasyon ürününün birikimi, reaksiyon ilerledikçe gerçek zamanlı olarak her döngüden sonra ölçülebilmektedir. Günümüzde spesifik DNA'yı ölçmek için hassas yöntemlerden olan Real Time-PCR, tek bir molekülü de belirleyebilmektedir. Bu doğrultuda, Real Time-PCR yöntemi klasik yöntemlere kıyasla daha düşük miktarlarda karmaşık biyolojik materyaller aracılığıyla çeşitli hastalıkların teşhisinde kullanılmaktadır .

"RT-PCR" kısaltması, genel olarak ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonunu belirtir ve gerçek zamanlı PCR'yi değil, ancak tüm yazarlar bu sözleşmeye uymaz

Real Time-PCR Aşamaları 
Real Time-PCR, ribonükleik asidin (RNA) tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters transkriptaz bağımlı dönüşümü, cDNA'nın PCR kullanılarak amplifikasyonu ve gerçek zamanlı amplifikasyon ürünlerinin tespiti olmak üzere üç aşamadan oluşmaktadır .

Denatürasyon Evresi 
Denatürasyon evresi, yüksek sıcaklıkta inkübasyon ile çift sarmallı DNA'yı tek sarmallar halinde yıkarak tek sarmallı DNA'daki ikincil yapıyı gevşetmeyi hedeflemektedir. Bu evrede kullanılan bir enzim olan DNA polimerazın dayanabileceği en yüksek sıcaklık genellikle 95 °C’dir .

Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing) Evresi 
Bu evre, primerlerin ortamda bulunan hedef DNA komponenti ile birleşmesini ve tekrar ayrıştırma olayını kapsamaktadır. Annealing evresi sırasında, tamamlayıcı dizilerin hibritleşme olasılığından kaynaklı primerlerin hesaplanan erime sıcaklığına (Tm) (primerin Tm'sinin 5 °C altında) dayalı uygun bir sıcaklık kullanılmaktadır.

Primer Uzaması Evresi 
70-72 °C'de, DNA polimeraz uyarımı optimal seyrederek primer uzaması saniyede 100 baza kadar ulaşabilen hızda gerçekleşmektedir .

Real Time-PCR Prosedürleri 
RNA önce miktar ve bütünlük açısından izole edilmektedir. Tek adımlı bir reaksiyon gerçekleştiriliyorsa RNA, Real Time-PCR testi için bir şablon olarak kullanılarak test sırasında ters transkripsiyon işlemi gerçekleştirilmektedir. İki aşamalı bir reaksiyon sırasında, cDNA önce sentezlenerek bir PCR şablonu olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, Real Time-PCR cihazında gerçekleştirilen bu adımlar, analiz için kullanılan çıktı verilerini oluşturmak için ham floresan verilerinin toplandığı ve düzenlendiği süre boyunca mavi olarak gösterilir. Floresan verilerinin normalleştirme faktörüne bölünmesi ile normalleştirilmiş veriler üretilerek bu verilerin istatistiksel analizi gerçekleştirmektedir .

Real Time-PCR Yönteminin Avantajları ve Dezavantajları 
Gerçek zamanlı PCR, hemen hemen aynı dizilere sahip haberci RNA'lar (mRNA'lar) arasında ayrım yaparak diğer gen ifade analizi yöntemlerinden daha az RNA şablonu gerektirmektedir. Ek olarak, bu yöntemde uygun ekipman sağlandığında nispeten yüksek verim elde edilmektedir. Buna karşılık, Real Time-PCR’nin en büyük dezavantajı ise pahalı ekipman ve reaktifler gerektirmesidir . Bu yöntemle çok az miktarda RNA ile oluşan mesajlar saptanarak ifadeleri belirlenebilmektedir. Ek olarak, oluşan Real Time-PCR ürünleri klonlamada vektör olarak kullanılabilir. Bu bağlamda, bu ürünlerden cDNA kütüphaneleri oluşturularak gen kütüphanelerinde değerlendirilmektedir. Real Time-PCR, diğer RNA analiz yöntemlerinden olan RNA hibridizasyonu ile kıyaslandığında daha hassas, hızlı, güvenilir ve kolay bir yöntemdir .

RT-PCR Yönteminin Uygulama Alanları

Kanser 
Kanser, hücre döngüsü, DNA onarımı ve büyüme sinyali genlerinde kalıtsal polimorfizm, mutasyon ve/veya germ hattı olmayan polimorfizm birikiminden kaynaklanabilmektedir . Bu bağlamda, Real Time-PCR yöntemi, kanser araştırmalarında tercih edilebilmektedir . İnsidansı yüksek olan kanserlerin çoğunluğu, Real Time-PCR yönteminde işaretleyici gen ifadeleri ölçülerek veya problar kullanılarak gözlemlenmektedir .

Tıbbi Bilim 
Kişiselleştirilmiş tıp yolunda, hastalar benzer ilaç etkilerine sahip insan ırkları veya belirli bir seti taşıyan herhangi bir popülasyon grubu, genetik sınıflandırma ile tanımlanabilmektedir. Bu bağlamda sınıflandırma, hastayı kategorize ederek bir hasta için doğru ilaç oranını artırabilmektedir . Bu doğrultuda, advers ilaç reaksiyonları önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. Bu vakaların çoğu, çevresel değişkenlerden güçlü bir şekilde etkilenen klinik fenotip ifadelerdeki değişikliklerle ilişkili görülmektedir . Bu bağlamda, Real Time-PCR yönteminin diğer moleküler tekniklerle birlikte uygulanması, terapötik müdahalenin ve ilaçlara verilen bireysel tepkilerin izlenmesini sağlayabilmektedir .

Viroloji 
Real Time-PCR yöntemini kullanan araştırmalar, viral enfekte olan insan örneklerinden virüsleri tespit etmek veya ölçmek için bu yöntemden yararlanmaktadır. İnsan hastalıkları ile ilgili virüsleri tespit etmek ve ölçmek için Real Time-PCR protokollerinin kritik öneme sahip olduğu ifade edilmiştir . Literatürde viral bir hastalık olan herpeks simpleks virüsü 1 (HSV1) ve herpeks simpleks virüsü 2'nin (HSV2) tespiti, kantitatif PCR'nin özgüllüğünü artırmak için tasarlanmış hidroliz probları olan TaqMan probları aracılığıyla RT-PCR yönteminde sağlanabilmektedir . Ek olarak, HSV DNA polimeraz genini hedefleyen primerler ve problar aracılığıyla HSV1 ve HSV2 genotipleri arasında tespit, kantifikasyon ve farklılaşma elde edilebilmektedir. Bu bağlamda, Real Time-PCR multipleks testleri, viral genotip farklılaşması için gelişmiş bir rol oynamaktadır .

COVID-19 
Nükleik asit amplifikasyon testleri, şüpheli hastadan elde edilen numunedeki varlığı tanımlamak için patojenin spesifik nükleik asit dizilerini hedefleyen moleküler testlerdir. Literatürde, enfekte vakaların rutin olarak doğrulanması ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) saptanması için nükleik asit amplifikasyon testlerinden Real Time-PCR yöntemi önerilmektedir. SARS-CoV-2 patolojisinde, Real Time-PCR gibi nükleik asit amplifikasyon testleri, şüpheli hastanın solunum yolundan nükleokapsid (N) geni, zarf (E) geni, S geni ve RNA'ya bağımlı RNA polimeraz geni gibi spesifik viral genleri hedef almaktadır .

Kaynakça 

Laboratuvar teknikleri
Moleküler biyoloji
Polimeraz zincir tepkimesi
Biyoteknoloji