Patent ES-2861353-T3 (ES)
Title: Amplificación específica de alelo utilizando una composición de oligonucleótidos cebadores no específicos de alelo y bloqueantes específicos de alelo solapantes
Inventor: ZHANG DAVID YU
IPC: C12Q1/6858
Filed: 2015-05-19
Granted: 2021-10-06
Abstract: Un método para la amplificación de una secuencia diana que comprende las etapas de: a. proporcionar una muestra que contiene una o más copias de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia variante y que posiblemente contiene al menos una copia de un segundo ácido nucleico que comprende la secuencia diana, en donde la secuencia diana y la secuencia variante comprenden cada una, una subsecuencia homóloga y una subsecuencia variable, en donde la subsecuencia variable comprende al menos un nucleótido, y en donde la subsecuencia variable de la secuencia diana es una subsecuencia específica de diana y la subsecuencia variable de la secuencia variante es una subsecuencia no específica de diana; b. diseñar un oligonucleótido bloqueante de ADN, en donde el oligonucleótido bloqueante de ADN comprende una primera secuencia que comprende una subsecuencia diana neutra y una subsecuencia variable bloqueante, en donde la subsecuencia diana neutra es complementaria a una porción de la subsecuencia homóloga y la subsecuencia variable bloqueante es complementaria de la subsecuencia no específica de diana, en donde la subsecuencia variable bloqueante está flanqueada en sus extremos 3' y 5' por la subsecuencia diana neutra y es continua con la subsecuencia diana neutra, y en donde el oligonucleótido bloqueante de ADN comprende una región de secuencia no complementaria en el extremo 3', que evita la extensión enzimática; y c. diseñar un primer oligonucleótido cebador de ADN en donde el primer oligonucleótido cebador de ADN comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia es complementaria a una segunda porción de la subsecuencia homóloga, en donde la segunda secuencia se solapa a la subsecuencia diana neutra del oligonucleótido bloqueante en al menos 5 nucleótidos de manera que la segunda secuencia comprende una subsecuencia solapante y una subsecuencia no solapante, y en donde la segunda secuencia no incluye ninguna secuencia complementaria a la subsecuencia variable; en donde la segunda secuencia del primer oligonucleótido cebador de ADN está diseñada para producir una energía libre de hibridación estándar (ΔG°PT) a la secuencia diana, y la primera secuencia del oligonucleótido bloqueante de ADN está diseñada para producir una energía libre de hibridación estándar (ΔG°BT) a la secuencia diana, que cumple la siguiente condición: +2 kcal/mol >= ΔG°PT - ΔG°BT >= -8 kcal/mol; y en donde la subsecuencia no solapante está diseñada para producir una energía libre de hibridación estándar (ΔG°3) a la secuencia diana, que cumple la siguiente condición: -4 kcal/mol >= ΔG°3 >= -12 kcal/mol; y d. proporcionar el oligonucleótido bloqueante de ADN y el primer oligonucleótido cebador de ADN como se ha diseñado en las etapas (b) y (c); y e. introducir el oligonucleótido bloqueante de ADN y el primer oligonucleótido cebador de ADN en la muestra, en donde el primer oligonucleótido cebador de ADN es suficiente para inducir la extensión enzimática; y f. introducir en la muestra una ADN polimerasa, nucleósidos trifosfato y uno o más reactivos necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos basada en polimerasa; y g. hacer reaccionar la muestra en condiciones suficientes para lograr la amplificación de ácidos nucleicos.