Patent ES-2641871-T3 (ES)
Title: Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos
Inventor: JU JINGYUE
IPC: C12Q1/68
Filed: 2011-12-16
Granted: 2017-11-14
Abstract: Método para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario que comprende: (a) poner en contacto la molécula de ácido nucleico monocatenario, en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario está en una disolución de electrolito en contacto con un nanoporo en una membrana y en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario tiene un cebador hibridado con una parte de la misma, con una ácido nucleico polimerasa y al menos cuatro análogos de polifosfato de nucleótido (NPP) marcados con etiqueta de fosfato en condiciones que permiten que la ácido nucleico polimerasa catalice la incorporación de uno de los análogos de NPP en el cebador si es complementario al residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está inmediatamente en 5' con respecto a un residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3'- terminal del cebador, para formar un producto de extensión de ácido nucleico y con la condición de que (i) el tipo de base en cada análogo de NPP es diferente del tipo de base en cada uno de los otros tres análogos de NPP, y (ii) o bien el número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada análogo de NPP es diferente del número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada uno de los otros tres análogos de NPP, o bien el número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada uno de los cuatro análogos de NPP es el mismo y el tipo de etiqueta en cada análogo de NPP es diferente del tipo de etiqueta en cada uno de los otros tres análogos de NPP, en el que la incorporación del análogo de NPP da como resultado la liberación de un polifosfato que tiene la etiqueta unida al mismo; y (b) determinar qué análogo de NPP se ha incorporado en el cebador para formar un producto de extensión de ácido nucleico en la etapa (a) aplicando una tensión a través de la membrana y midiendo un cambio electrónico a través del nanoporo que resulta de que el polifosfato que tiene la etiqueta unida al mismo generado en la etapa (a) se transloca a través del nanoporo, en el que el cambio electrónico es diferente para cada número de fosfatos en la parte de polifosfato, o para cada tipo de etiqueta diferente, según sea apropiado, identificando de ese modo el residuo de nucleótido en el ácido nucleico monocatenario complementario al análogo de NPP incorporado; y (c) realizar de manera iterativa las etapas (a) y (b) para cada residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está secuenciándose, en el que en cada iteración de la etapa (a) se incorpora el análogo de NPP en el producto de extensión de ácido nucleico resultante de la iteración anterior de la etapa (a) si es complementario al residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está inmediatamente en 5' con respecto a un residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3'-terminal del producto de extensión de ácido nucleico, determinando así la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico monocatenario.