Patent ES-2433667-T3 (ES)
Title: Método de amplificación de ácidos nucleicos, y reactivo y kit de reactivos para la utilización en el método
Inventor: YONEKAWA TOSHIHIRO
IPC: C12Q1/68
Filed: 2008-10-17
Granted: 2013-12-12
Abstract: Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, quecomprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en unamisma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antes de laamplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del molde de ácido nucleico diana,evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción deamplificación del ácido nucleico diana, en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleicodiana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñadopara hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleicodiana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado parahibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno,en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que seha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácidonucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes: (a) la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentracióndel cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferioral de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de unmaterial de estándar interno y un ácido nucleico diana, y (b) la concentración de un nucleótido de sustrato se fija en un valor superior al de la solución de reacción deamplificaciónutilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material deestándar interno y, en el que, como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizadopara la amplificación del ácido nucleico diana se utilizan el cebador (1) y/o el cebador (2), en el que, al seleccionarsesucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de lasecuencia diana de un ácido nucleico molde hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico de molde, el cebador (1)comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5'hacia el lado 3', y en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuartasecuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal delácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.