Patent WO-2009141121-A1 (WO)
Title: Procédé de génération rapide de profils de phosphorylation, détection de sites de phosphorylation in vivo de kinases et de phosphatases et leur utilisation en tant que marqueurs de diagnostic dans des cellules, des tissus et des liquides corporels
Inventor: AEBERSOLD RUEDI
IPC: G01N33/50
Filed: 2009-05-19
Abstract: L'invention porte sur un nouveau procédé pour la détection et l'identification de sites de phosphorylation/déphosphorylation directe et/ou indirecte de protéines kinases et phosphatases ainsi que pour générer des profils de phosphorylation de cellules, de tissus et de liquides corporels à différents états physiologiques. Ces sites de phosphorylation/déphosphorylation identifiés et profils de phosphorylation et leurs marqueurs de diagnostic peuvent être utilisés pour surveiller une activité kinase et/ou phosphatase, pour venir à l'appui d'une découverte de cible de médicament (par exemple, par identification des kinases/voies qui sont dérégulées dans un état de maladie donné), pour classer les tissus atteints de maladies pour un traitement optimal et pour un développement de médicament (par exemple, cribles d'inhibiteur de kinase, évaluation d'effet hors cible, pharmacocinétique,…). L'invention comprend de plus la génération d'essais par spectrométrie de masse spécifiques correspondants pour la détection et la quantification d'une liste ou d'une bibliothèque de cibles de kinase et/ou phosphatase spécifiques identifiées. De plus, l'invention porte sur l'utilisation d'un tel marqueur de diagnostic sélectif et/ou d'un tel essai par spectrométrie de masse respectivement pour la mesure et/ou l'analyse d'une activité kinase et/ou phosphatase, de préférence dans les conditions influencées de façon différentielle par comparaison à des échantillons de protéome soumis et non soumis à des composés physiologiquement/biologiquement/chimiquement actifs. Le procédé comprend notamment : (1a) l'isolement sélectif de phosphopeptides à partir d'un produit de digestion d'un (sous)protéome de référence pour former au moins un isolat de phosphopeptide de référence; (1b) l'isolement sélectif de phosphopeptides à partir d'un état de cellule qui produit le (sous)protéome d'intérêt (POI). Les états de cellule et, par conséquent, le POI peuvent comprendre tout d'abord un protéome dans lequel un gène de kinase ou de phosphatase défini a été inactivé, désactivé, surexprimé, ou la kinase ou phosphatase a été inhibée ou activée ou était sensible à la température ou était dépourvue de son activité (kinase morte) ou en second lieu, un protéome dans lequel une kinase et/ou phosphatase ou voie de signalisation a été dérégulée (par exemple, cellules cancéreuses/tissu cancéreux) ou, en troisième lieu, un protéome provenant d'un tissu atteint de maladie dans lequel une ou plusieurs kinases ou phosphatases ou voies de signalisation ont été dérégulées pour former au moins un isolat de phosphopeptide d'intérêt; (2) la génération de cartes LC-MS(/MS) individuelles (motifs de phosphoprotéome) pour chaque isolat de phosphopeptide à l'aide d'une spectrométrie de masse quantitative (sans marqueur); (3) la corrélation et la comparaison du ou des motifs de phosphoprotéome de l'isolat de phosphopeptide de référence avec le ou les motifs de phosphoprotéome de l'isolat de phosphopeptide de POI et la détermination de caractéristique de phosphopeptide présentant un comportement différentiel entre le type sauvage et l'isolat de phosphopeptide de POI; (4) la collecte de données et la détermination des caractéristiques de phosphopeptide régulées en correspondance selon les étapes (1b) à (3) pour au moins une autre ou plusieurs ou la totalité des POI possibles (tel que défini sous 1b) (5) la détermination d'au moins une caractéristique de phosphopeptide régulée ou d'une liste de ces caractéristiques, qui ont été régulées de manière unique par une kinase ou phosphatase spécifique, entre des états de cellule (POI) produisant son marqueur ou ses marqueurs de diagnostic sélectifs.