Patent SU-1626682-A1 (SU)
Title: ФРАГМЕНТ ДНК AMYAMYLLICH I, КОДИРУЮЩИЙ ГИБРИДНУЮ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ α-АМИЛАЗУ, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ, РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PRTLICH, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНУЮ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ α-АМИЛАЗУ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ α-АМИЛАЗЫ
IPC: C12N15/52
Filed: 1989-01-03
Granted: 1999-05-27
Abstract: 1. Фрагмент ДНК amyamyllich I, кодирующий гибридную термостабильную α-амилазу, полученный в результате замены нуклеотидных остатков с 562 по 690 на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis без регулярной области, со следующей нуклеотидной последовательностью фрагмента amyamyllich I:2. Способ конструирования фрагмента ДНК amyamyllich I, заключающийся в том, что однонитевую ДНК рекомбинантного фага M13mWBamy, содержащего часть фрагмента ДНК, кодирующего α-амилазу B.amyloliquefaciens, выращенного на клетках Escherichia coli TGl, смешивают с фрагментом ДНК, кодирующим часть гена α-амилазы B.licheniformis, ограниченную последовательностями узнавания рестрикционных эндонуклеаз KpnI и HindII, полученную смесь нагревают до 100C, медленно охлаждают до 20C, затем достраивают однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым фрагментом ДНК полимеразы I E.coli, затем обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансфецируют клетки E.coli TGl, после трансфекции анализируют полученные рекомбинантные фаги на наличие в их ДНК нуклеотидных замен, отличающих фрагмент ДНК, кодирующий α-амилазу B.amyloliquefaciens, от фрагментов ДНК amyamyllichi, затем выделяют двунитевую ДНК фагов, содержащих указанные замены, смешивают с ДНК плазмиды pNS15BamHI, полученную смесь гидролизуют эндонуклеазами рестрикции PstI и HindIII, продукты гидролиза обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4, трансформируют клетки E. coli TGl, отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу и соответственно содержащие плазмиду pTG29lich 1 с фрагментом ДНК amyamyllichi.3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pRTlich 1, кодирующая термостабильную α-амилазу размером 7740 п.о., содержащая:Pst1-BamH1 - фрагмент плазмиды pRT5 размером 2430 п.о. с геном, необходимым для репликации в клетках Bacillus subtilis;BamHI-HindIII - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1804 п.о. с геном устойчивости клеток Bacillus sibtilis к эритромицину;PstI-EcoRI - фрагмент плазмиды pBR322 размером 309 п.о. с частью гена устойчивости к тетрациклину;PstI-EcoRI - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1377 п.о. с регулярной областью, необходимой для экспрессии гибридного гена α-амилазы и Isl - элемента Escherichia coli, и частью фрагмента ДНК amyamyllich 1;EcoRI-HindIII - фрагмент фага M13mWBamyразмером 635 п.о. с частью гена гибридной термостабильной α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, в котором нуклеотидные остатки с 562 по 690 заменены на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis;HindIII-HindIII - фрагмент ДНК плазмиды pRT5 размером 1184 п.о. с частью гена α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens;уникальные сайты рестрикции: PstI, EcoRI, 3HindIII, BamHI;гены: Ori - ген, кодирующий белок и область начала репликации плазмиды pRT5;E- ген, обеспечивающий синтез метилазы, определяющей устойчивость клеток B.subtilis к эритромицину;amyamyllichi - структурный ген гибридной термостабильной α-амилазы.4. Способ конструирования плазмиды pRT lich 1, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pTG29lich 1 смешивают с плазмидой ДНК pRT, содержащей фрагмент ДНК amyamyllichi, подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI, полученные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки B. subtilis 2lrecE4any4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу.5. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ B-4632 - продуцент термостабильной α-амилазы.