Patent DE-102019001425-A1 (DE)
Title: CoLi - zylisch-exponentielle de novo Synthese doppelsträngiger Polynukleotide
Inventor: BERNAUER HUBERT S
IPC: C40B40/06
Filed: 2019-02-28
Abstract: Die Verfahren zur chemischen Synthese von einzel-strängigen ssNukleinsäuren, ssDNA und ssRNA-OLIGO-Nukleotiden (OLIGOS) haben einen entscheidenden Beitrag geleistet auch doppel-strängige DNA und RNA Moleküle jeder beliebigen Basenabfolge bereitzustellen. Mit diesen kann man eine große Vielfalt von verschiedenen Anwendungen entwickeln, die in den Bereichen der molekularen Biologie, in der Nukleinsäureanalytik und-diagnostik, sowie im konstruktiven Bereichen der Synthetischen Biologie in vielerlei Varianten eingesetzt werden.In der molekularen Analytik hat sich der Bedarf an OLIGO-Nukleotiden in die Richtung von parallel prozessierenden Multiplex-Verfahren entwickelt. Diese verwenden in der Regel multiple, physikochemisch kompatible ssDNA-OLIGO-PCR-Primerpaare, einhergehend mit der quantitativen PCR oder neueren isothermalen DNA-Vermehrungsverfahren. ssDNA-OLIGOS als Bausteine für die aufbauende de novo Gensynthese und die Synthetische Biologie haben wegen des immensen OLIGO-Bedarfs eine überaus große Dynamik in die Bereitstellung artifizieller DNA-Synthesen für synthetische Gene gebracht. Bislang verwendete man neben anderen publizierten und praktizierten chemischen Verfahren aber fast ausschließlich die für die industrielle Massenfertigung ausgelegte Amidit-Nukleotidchemie. Syntheseautomaten, die für diese Chemie ausgelegt sind haben in den letzten Jahrzehnten eine große Verbreitung gefunden. Die zyklische Synthese von OLIGOS benötigt chemische Schutzgruppen, um ungewünschte Nebenreaktionen zu unterdrücken. Diese müssen nach der Synthese chemisch abgespalten werden. Außerdem müssen z-1 Produkte im gegebenen Synthesezyklus z geblockt werden. Diese sind um ein Nukleotid gegenüber dem OLIGO mit der gewünschten Sequenzidentität verkürzt. Eine chemische Formylierung des 5'OH-Endes nach der Additionsreaktion in z verhindert dass im nächsten Synthesezyklus z+1 keine weiteren Bausteine zu addieren und so die Synthese von unerwünschten verkürzten Sequenzen zu unterdrücken.Mit großem Erfolg wird auch die Mikrosystemtechnik kombiniert mit chemischen Verfahren auf MikroArrayoberflächen zur ortsaufgelösten de novo Synthese von vielen sequenz-vorbestimmten, komplementären Oligonukleotiden eingesetzt, die in ihrer Summe doppel-strängige DNAs ergeben. Diese können enzymatisch wiederum zu DNA bzw. Geneinheiten noch höherer Ordnung verknüpft werden. Damit ist es möglich Vorstufen für biologisch funktionale Einheiten weiter aufzubauen (TWIST).Erst in letzter Zeit sind vermehrt neuartige enzymatische de novo DNA-Synthese-Verfahren bekannt geworden, mit denen die Synthese von einzel-strängigen Oligonukleotiden mittels Reaktionsfolgen bewerkstelligt werden, die die template-unabhängige Polynukleotidpolymerase verwenden (Palluk S. et al. (2018), DNAScript). Die Problematik dieses Verfahrens liegt darin, dass an Verwendung findenden desoxy-Triphosphaten chemische Schutzgruppen angebracht sein müssen. Diese blockieren die z - Reaktion so lange, bis die Nukleotidlösung, für die nächste, lineare Additionsreaktion ausgetauscht ist. Direkt auf die de novo Synthese und lineare Assemblierung doppelsträngiger DNA ausgelegte Verfahren (z.B. „molecular beacons“) sind in den letzten Dekaden bekannt geworden (Sloaning). Molekulare Bausteine werden hier ebenso aus der Amidit-Nukleotidchemie gewonnen. Es sind einzelsträngige Oligonukleotide mit einer sequenzinvertierten, intrinsischen, komplementären Rückfaltungsdynamik, die hier zur Verfügung gestellt werden. Diese sehr kurzen dsDNAs werden zunächst nicht mit molekularen Verfahren vermehrt. Sie werden als Bausteine in jedem linearen Additionszyklus zur Verfügung gestellt. Verfahren dieser Art zeigen sich aber relativ gesehen ineffizient und basieren auf der herkömmlichen Chemie unter Verwendung von nicht nachhaltig einsetzbaren Lösungsmitteln.Das CoLi-Verfahren, das bei der de novo - Synthese nicht-linear doppelsträngige DNA bereitstellt und exponentiell ansteigende Anzahlen von de novo synthetisierten Basenpaaren generiert, ist derart bislang nicht beschrieben worden. Diese Neuheit wird in der vorliegenden Patentschrift dargestellt. CoLi beruht auf einer Bibliothek von vorgefertigten biologisch und chemo-enzymatisch vermehrbaren Bausteinen (BB), die in Amplimeren eingebettet in vivo, wie auch in vitro vermehrt werden können. Durch die Vermehrung einer sequenzgebenden Teilbibliothek und der Kreuzligation asymmetrisch gespaltener Amplimere kann eine vorbestimmte Sequenzidentität in einer zyklischen Reaktionsfolge bereitgestellt werden.Bei dem hier beispielhaften dsDNA-Syntheseverfahren wird der direkte Aufbau doppel-strängiger DNA-Moleküle im Lösungsmittel Wasser rein biochemischenzymatisch durchgeführt. Dies hat zur Folge, dass das Verfahren in bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen ganz ohne schädliche Lösungsmittel auskommt und demnach als nachhaltig bezeichnet werden kann. Zudem stören bei der direkten Synthese von z.B. dsDNAs (CoLi) intrinsische, sequenzabhängige Sekundärstrukturen wenig und das Verfahren ist in verschiedenen erfindungskonformen Ausführungsformen tolerant gegenüber der Synthese von extremen Sequenzzusammensetzungen, wie GC- bzw. AT-reiche Sequenzen. Im Gegensatz zur herkömmlichen dsDNA-Synthese sind repetitive Sequenzen und Homo-polymersequenzen präzise reproduzierbar. Verglichen mit anderen enzymatischen Verfahren e.g. der Template-unabhängigen Polynukleotid-Polymerasereaktion bei der de novo dsDNA-Synthese Palluk S.