Patent ES-2861477-T3 (ES)
Title: Método para determinar la clonalidad celular
Inventor: LA NEVE FABIO
IPC: C12Q1/68
Filed: 2016-12-01
Granted: 2021-10-06
Abstract: Un método para determinar la clonalidad de un Banco Maestro de Células (MCB), siendo dicho MCB el resultado de la inserción predecible o no predecible de un transgén de secuencia conocida en el genoma de una célula progenitora anfitriona (HPC) de secuencia conocida, comprendiendo dicho método las etapas de: a) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una célula subclonal de referencia (RSC), en donde la RSC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad y en donde dicha identificación se logra mediante i. secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de RSC para obtener una secuencia del genoma de RSC o secuencias de genoma de RSC; y ii. alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de RSC con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR); b) Determinar una o más TIR identificadas en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia, en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación mediante lecturas parcialmente solapantes; en donde dichas una o más TIR con el grado más alto de cobertura de secuencia se asignan como TIR de referencia (RTIR); c) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en los genomas respectivos de los uno o más subclones (SC); en donde cada una de las SC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad pero es independiente de dicha RSC, en donde dicha identificación se logra mediante i. secuenciación de extremos emparejados de cada genoma de SC respectivo para obtener una secuencia del genoma de SC o secuencias del genoma de SC; y ii. alineamiento de cada secuencia o secuencias del genoma de SC respectivo con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes comparativas (CTIR); d) Comparar dichas una o más RTIR determinadas en la etapa (b) con las CTIR respectivas determinadas en la etapa (c); e) Evaluar la correspondencia entre cada una de dichas una o más CTIR presentes en una SC respectiva y las RTIR correspondientes presentes en dicha RSC, donde la relación entre dicha RSC y cada una de dichas una o más SC se evalúa mediante el cálculo de una matriz de distancia; y f) Determinar la clonalidad de dicho MCB basándose en dicha correspondencia evaluada en la parte (e), en donde dicho MCB se considera monoclonal, si dicha RSC y dichas una o más SC están agrupadas en la misma agrupación, y en donde la matriz de distancia se calcula basándose en la siguiente fórmula (I), **(Ver fórmula)** en donde DD (RSC, SCm) representa la función de distancia entre dicho genoma de RSC y un genoma de SCm respectivo, en donde N(total) es el número de regiones de inserción presentes tanto en dicho genoma de RSC como en dicho genoma de SCm; N(CTIR) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de SCm; y N(RTIR) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de RSC; en donde DD (RSC, SCm) representa la distancia, en una escala de 0 a 1, en donde una distancia de 0 representa identidad clonal entre dicha RSC y una SCm respectiva y 1 representa diferencia clonal.