Patent ES-2603062-T3 (ES)
Title: Métodos de ensamblaje dinámico de vectores para la clonación de ADN de vectores plasmídicos
Inventor: REED THOMAS D
IPC: C12P19/34
Filed: 2005-05-18
Granted: 2017-02-23
Abstract: Un método para sintetizar simultáneamente una matriz de transgenes, que comprende las etapas de: a. proporcionar un vector plasmídico de clonación primario que comprende un armazón, comprendiendo el armazón (i) al menos un primer punto de acoplamiento y un segundo punto de acoplamiento estando cada punto de acoplamiento fijado en el armazón y que comprenden al menos un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una enzima de restricción rara no variable y (ii) un único sitio para HE en orientación directa localizado secuencia arriba desde el extremo 5' del primer punto de acoplamiento y un único sitio para HE en orientación inversa localizado secuencia abajo desde el extremo 3' del segundo punto de acoplamiento; b. escindir el primer punto de acoplamiento con una primera enzima de restricción rara no variable que se corresponde con uno de los sitios de restricción raros de más de 6 nucleótidos del primer punto de acoplamiento; c. escindir el segundo punto de acoplamiento con una segunda enzima de restricción rara no variable que se corresponde con uno de los sitios de restricción del segundo punto de acoplamiento; d. proporcionar al menos una inserción de Promotor que comprende una secuencia de Promotor de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' del primer punto de acoplamiento; e. proporcionar al menos una inserción de Expresión que comprende una secuencia de Expresión de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' de la al menos una inserción de Promotor para formar un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una tercera enzima de restricción rara no variable; f. proporcionar al menos una inserción Reguladora que comprende una secuencia Reguladora de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' de la al menos una inserción de Expresión para formar un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una cuarta enzima de restricción rara no variable, y un extremo 3' que es compatible con el extremo 5' del segundo punto de acoplamiento que se escindió en la etapa `c', en donde la primera, la segunda, la tercera y la cuarta enzimas de restricción raras no variables son diferentes; g. colocar al menos dos tipos diferentes de al menos una de las inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladora, al menos una de cada una de las inserciones restantes y el vector plasmídico de clonación escindido en una mezcla de reacción apropiada para producir la unión simultánea, la auto-orientación y la colocación secuencial de cada una de las inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladora entre el primer y el segundo puntos de acoplamiento del armazón, creando de esta manera una matriz de plásmidos que tienen diferentes combinaciones de inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladoras en su armazón; m. escindir el armazón en cada uno de los sitios para HE únicos con una enzima de restricción HE única; n. purificar la parte escindida que contiene las inserciones; y o. insertar la parte escindida en un genoma huésped de interés.