Patent ES-2577929-T3 (ES)
Title: Recombinasa elaborada a medida para recombinar unos sitios diana asimétricos en una pluralidad de cepas de retrovirus
Inventor: HAUBER JOACHIM
IPC: C12N15/867
Filed: 2011-05-27
Granted: 2016-07-19
Abstract: Procedimiento para preparar un vector de expresión que codifica una recombinasa elaborada a medida, pudiendo dicha recombinasa elaborada a medida recombinar unas secuencias diana asimétricas dentro de la LTR del ADN provírico de una pluralidad de cepas de retrovirus que son cepas del VIH-1, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar unas secuencias con una homología de por lo menos 30% respecto a la secuencia de hemisitio izquierdo y secuencia de hemisitio derecho de por lo menos un sitio diana de recombinasa conocido en la secuencia de la LTR del ADN provírico de una pluralidad de cepas de retrovirus, en el que las secuencias homólogas se encuentran separadas por un espaciador de 5 a 12 nucleótidos y en el que la secuencia diana asimétrica se encuentra en una pluralidad de cepas de retrovirus, en el que la secuencia diana asimétrica presenta la secuencia expuesta como SEC ID nº 1, (b) identificar dos secuencias, en el que la primera secuencia corresponde a la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio izquierdo de dicho sitio diana conocido y a la que se hace referencia como "secuencia 1 de hemisitio" y en el que la segunda secuencia corresponde a la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio derecho y a la que se hace referencia como "secuencia 2 de hemisitio"; (c) determinar los nucleótidos dentro de las secuencias de la etapa (b) que se diferencian de las secuencias de hemisitio izquierdo y de hemisitio derecho homólogas correspondientes de dicho por lo menos un sitio diana homólogo conocido de la etapa (a); (d) generar un primer subconjunto de dos ácidos nucleicos diana que comprende unas secuencias diana, en el que la primera secuencia diana se denomina subsitio 1 y comprende, adyacentes entre sí y en orden 5' a 3', la secuencia 1 de hemisitio de la etapa (b), la secuencia espaciadora de la secuencia diana asimétrica y una repetición invertida de la secuencia 1 de hemisitio, y en el que la segunda secuencia diana se denomina subsitio 2 y comprende, adyacentes entre sí y en orden 5' a 3', una repetición invertida de la secuencia 2 de hemisitio, la secuencia espaciadora de la secuencia diana asimétrica y la secuencia 2 de hemisitio de la 30 etapa (b), (e) generar un segundo subconjunto de ácidos nucleicos diana que comprende unas secuencias diana modificadas sobre la base de las secuencias diana del primer subconjunto de la etapa (d), en el que, en las secuencias basadas en el subsitio 1, en la secuencia de hemisitio izquierdo, una parte de los nucleótidos que se diferencian de la secuencia de hemisitio homóloga correspondiente de por lo menos un sitio diana conocido de la etapa (a) se sustituye por los nucleótidos naturales hallados en dicho sitio diana conocido, hasta que dicha secuencia de hemisitio contenga uno, dos o tres nucleótidos que se diferencian de dicho sitio diana conocido, en el que el hemisitio derecho de dicha secuencia diana modificada está formado por una repetición invertida de dicha secuencia modificada de hemisitio izquierdo, que se encuentra separada de dicha secuencia modificada de hemisitio izquierdo por la secuencia espaciadora de la secuencia diana asimétrica, y en el que, en las secuencias basadas en el subsitio 2, en la secuencia de hemisitio derecho, una parte de los nucleótidos que se diferencian de la secuencia de hemisitio homóloga correspondiente de dicho por lo menos un sitio diana conocido de la etapa (a) se sustituye por los nucleótidos naturales hallados en dicho sitio diana conocido, hasta que dicha secuencia de hemisitio contenga uno, dos o tres nucleótidos que se diferencian de dicho sitio diana conocido, en el que el hemisitio izquierdo de dicha secuencia diana modificada está formado por una repetición invertida de dicha secuencia modificada de hemisitio derecho, que se encuentra separada de dicha secuencia modificada de hemisitio derecho por la secuencia espaciadora de la secuencia diana asimétrica, de manera que en todas las secuencias modificadas de hemisitio originadas a partir de una secuencia diana del primer subconjunto de la etapa (d) tomadas conjuntamente, pueden encontrarse todos los nucleótidos que se diferencian, mientras que ninguna de dichas secuencias modificadas de hemisitio sola comprende todos los nucleótidos que se diferencian, (f) aplicar por separado la evolución molecular dirigida a por lo menos una recombinasa que reconoce un sitio diana homólogo conocido según la etapa (a) utilizando cada ácido nucleico del segundo subconjunto obtenido en la etapa (e) como sustrato, (g) mezclar las colecciones de recombinasas evolucionadas en la etapa (f), en el que todas las colecciones de recombinasas evolucionadas sobre las secuencias basadas en el subsitio 1 se combinan y mezclan, y en el que todas las colecciones de recombinasas evolucionadas sobre las secuencias basadas en el subsitio 2 se combinan y mezclan; (h) aplicar la evolución molecular dirigida a las colecciones mezcladas obtenidas en la etapa (g) utilizando cada ácido nucleico del subconjunto según la etapa (d) como un sustrato; (i) mezclar las colecciones de recombinasas evolucionadas en la etapa (h); (j) aplicar la evolución de proteína ligada a sustrato de la colección mezclada obtenida en la etapa (g) utilizando un ácido nucleico que comprende la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) como un sustrato, hasta que se obtiene por lo menos una recombinasa que resulta activa sobre la secuencia diana asimétrica dentro de la LTR del ADN retrovírico de la etapa (a); (k) aislar el ácido nucleico que codifica dicha por lo menos una recombinasa obtenida en la etapa (j) a partir de la colección; y (l) clonar el ácido nucleico obtenido en la etapa (k) en un vector de expresión adecuado.