Patent BR-112014015155-A2 (BR)
Title: produção biotecnológica de álcoois e seus derivados
Inventor: CHRISTIAN GEHRING
IPC: C12P13/00
Filed: 2012-12-14
Abstract: relatório descritivo da patente de invenção para "produção biotecnológica de álcoois e seus derivados". [001] a presente invenção refere-se a um micro-organismo tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo e expressando uma alcano oxidase recombinante, um processo para oxidação de um alquila, compreendendo contato de alquila com uma solução aquosa compreendendo a célula inventiva. [002] produção industrial de compostos químicos finos e em volume baseada em fontes renováveis como biomassa tem uma faixa de desvantagens. uma delas é a necessidade de extrair a partir de um grande volume de meio aquoso o produto de interesse, um procedimento necessário não somente para concentrar o produto para ainda processamento a jusante, mas também para limitar sua concentração em um meio aquoso tipicamente compreendendo células vivas. tais células são extremamente potentes, mas não obstante catalisadores delicados que não podem ser submetidos a condições severas, por exemplo, altas temperaturas, valores extremos de ph, a presença de solventes, produtos perigosos e semelhantes, ou também existe a chance de que eles podem lisar para o efeito de que sua atividade catalítica é perdida e fragmentos de células, metabólitos e macromoléculas são liberadas que podem contaminar ou mesmo degradar o produto visado após. [003] de modo a extrair o produto de interesse, o meio aquoso é tipicamente contatado com um volume comparavelmente pequeno de solvente orgânico imiscível em água. o produto pode ser subsequentemente ainda submetido a etapas sintéticas compatíveis com o solvente imiscível em água ou pode ser purificado, por exemplo, por meio de destilação ou cristalização. [004] se um composto pode ou não ser extraído de uma fase aquosa usando um solvente orgânico imiscível em água depende de suas propriedades físico-químicas. enquanto compostos ricos em, ou consistindo inteiramente em cadeias de carbono não substituídas são prováveis de entrar no solvente, compostos tendo grupos funcionais compreendendo heteroátomos ou mesmo cargas são esperados prevalecerem na fase aquosa. [005] uma distribuição relativa de composto em um sistema bifásico líquido que tenha atingido o estado de equilíbrio pode ser descrito usando a lei de distribuição de nernst: a = c phase 1 / c phase 2, [006] em que c1 e c2 são as concentrações de equilíbrio molar do composto na primeira e segunda fase , respectivamente, e a constante k é um coeficiente de distribuição dependente de temperatura. as propriedades de distribuição de um composto também podem ser descritas usando o valor kow ou p, em caso de sistema bifásico compreender uma fase aquosa e uma fase compreendendo octanol: kow = p = c octanol / c água. [007] estas equações descrevem a distribuição de um composto em um dado sistema bifásico líquido, entretanto, elas se aplicam somente quando o equilíbrio de distribuição foi atingido. se água pura e um solvente orgânico imiscível em água pura, por exemplo, água e hexano, são misturados, duas fases distintas emergirão quase instantaneamente. entretanto, a situação é muito diferente se um meio de cultura aquoso compreendendo uma célula viva e um solvente imiscível em água são contatados. devido às numerosas interações moleculares possíveis, separação do solvente imiscível em água pode levar várias horas se não dias; enquanto isso as células são submetidas a contato com solvente potencialmente tóxico. portanto, o tempo gasto para o estado bifásico ser atingido é um parâmetro que deve ser otimizado se um processo eficiente para a produção biotecnológica de compostos químicos é para ser criado. [008] alcanos substituídos, por exemplo, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos e aminas, representam uma classe de compostos visados - após tradicionalmente preparados através de conversão de compostos fabricados a partir de fontes de carbono fóssil. em uma era de suprimentos crescentemente limitantes de combustíveis fósseis não renováveis, há considerável interesse em processos biotecnológicos para produção de alcanos e seus derivados partindo com fontes renováveis, isto é, materiais que são facilmente e, em termos de escalas de tempo geológico, rapidamente reabastecíveis. [009] numerosos processos para conversão de um alcano em um correspondente alcano substituído, em particular alcanos oxidados, foram reportados na técnica anterior. metano mono-oxigenases catalisam a inserção dependente de nadh de um átomo de oxigênio na ligação c-h de metano para formar metanol, na primeira etapa de degradação de metano por metanotrofos como methylosinus trichosporium e methylococcus capsulatus. as metano mono-oxigenases solúveis tipicamente têm um amplo espectro de substrato incluindo hidrocarbonetos saturados e insaturados, lineares, ramificados, e cíclicos de até cerca de c8, assim como compostos aromáticos, heterocíclicos e clorados (merkx m, kopp da, sazinsky mh, blazyk jl, muller j, lippard sj (2001), angew chem int ed engl 40:2782-2807; higgins ij, best dj, hammond rc. 1980. new findings in methane-utilizing bacteria highlight their importance in the biosphere and their commercial potential. nature 286:561-564.). oxigenases contendo heme, mais notavelmente aquelas da classe de sistemas citocromo p450 incluindo citocromo p450 bm-3 de bacillus megaterium, também usa oxigênio molecular de modo a hidroxilar alcanos de vários comprimentos de cadeia de carbono e foram submetidas a abordagens de evolução de proteína (koch dj, chen, mm, van beilen, j.b. and arnold f.h. (2009, appl. and environm. microbiol. 75(2), 337-344). alcano mono-oxigenases dependentes de rubredoxina tal como a alcano mono-oxigenase de pseudomonas putida gpo1 catalisam a oxidação de alcanos de comprimentos de cadeia médios, rendendo uma mistura de álcoois e ácidos carboxílicos (grant c., woodley, j. m, and baganz, f (2011) enzyme and microbial technology 48, 480-486). xileno mono-oxigenases hidroxilam alcanos que podem ser subsequentemente convertidos a vários outros alcanos substituídos incluindo aminas, ácidos carboxílicos, amidas, haletos de alquila, ésteres, alquenos, usando abordagens biotecnológicas ou sintéticas (bruce, p. y. (1998), organic chemistry, sec. ed., prentic hall inc.). [0010] alcanos consistem somente em átomos de hidrogênio e carbono ligados por ligações simples e como tal carecem de grupos funcionais compreendendo heteroátomos. consequentemente, mesmo alcanos curtos substituídos com um grupo funcional polar, separando aqueles compreendendo longas cadeias de carbono não substituídas, são solúveis em solventes orgânicos imiscíveis em água. por último, mas não menos, muitos deles, por exemplo, metanol e etanol, são reativos e são conhecidos terem efeitos adversos sobre o crescimento, viabilidade e metabolismo de micro-organismos biotecnologicamente relevantes. por isso, muitos processos biotecnológicos para a produção de tais compostos compreendem uma etapa de extração usando solventes imiscíveis em água. [0011] por isso, o problema subjacente da presente invenção é prover um processo biotecnológico para conversão de um alcano em um alcano substituído em um sistema bifásico compreendendo um meio aquoso e um solvente imiscível em água, onde a separação do solvente imiscível em água a partir do meio aquoso é rápida. mais especificamente, o problema subjacente da presente invenção é aperfeiçoar a separação de um solvente imiscível em água e um alcano substituído ali dissolvido em termos do tempo gasto para separar as duas fases, o grau de separação do solvente em um dado tempo, rendimento e pureza do produto ali dissolvido ou obtido seguindo ainda processamento assim como viabilidade e/ou capacidade de reciclagem de quaisquer células contatadas com o solvente imiscível em água. [0012] um outro problema subjacente da presente invenção é prover uma célula que possa ser usada para um tal processo, preferivelmente uma que seja mais resistente na direção de tensão causada pela presença de solventes orgânicos imiscíveis em água, por exemplo, em termos de consumo de oxigênio, consumo de oxigênio por quantidade de produto, taxas de crescimento, atividade metabólica e viabilidade em geral. [0013] um outro problema subjacente da presente invenção é montar um processo para produção de produtos de oxidação de alcanos e seus derivados baseado em fontes sustentáveis. [0014] um outro problema subjacente da presente invenção é prover um processo biotecnológico para oxidação de alcanos, onde o consumo de oxigênio é reduzido. [0015] o problema subjacente da presente invenção é resolvido pela matéria objeto das reivindicações apostas. [0016] o problema subjacente da presente invenção é resolvido, em um primeiro aspecto, por um micro-organismo tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo e expressando uma alcano oxidase recombinante. [0017] em uma primeira modalidade do primeiro aspecto, a alcano oxidase é selecionada do grupo compreendendo alcano oxidases dependentes de rubredoxina, alcano oxidases citocromo p450, xileno mono-oxigenases, metano mono-oxigenases e suas variantes. [0018] em uma segunda modalidade, que é também uma modalidade da primeira modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, a capacidade de degradação de ácido graxo é reduzida através de supressão de um gene codificando uma enzima do grupo compreendendo importador de ácido graxo, ácido graxo-coa ligase, acil-coa desidrogenase, 2,4-dienoil-coa reductase, enoil-coa hidratase e 3-ceto acil-coa tiolase. [0019] em uma terceira modalidade, que é também uma modalidade da primeira e a segunda modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, o micro-organismo é uma célula procariótica ou eucariótica inferior, preferivelmente uma célula bacteriana, mais preferivelmente e. coli. [0020] em uma quarta modalidade, que é também uma modalidade das primeira a terceira modalidades do primeiro aspecto da presente invenção, o micro-organismo ainda expressa uma álcool desidrogenase recombinante. [0021] em uma quinta modalidade, que também é uma modalidade das primeira à quarta modalidades do primeiro aspecto da presente invenção, o micro-organismo ainda expressa uma transaminase recombinante. [0022] em uma sexta modalidade, que também é uma modalidade das primeira à quinta modalidades do primeiro aspecto da presente invenção, o micro-organismo expressa uma aminoácido desidrogenase recombinante, preferivelmente uma alanina desidrogenase. [0023] o problema subjacente da presente invenção é resolvido, em um segundo aspecto, através de um processo para oxidação de uma alquila, compreendendo a) contato de alquila com uma solução aquosa compreendendo a célula de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção e qualquer uma de suas modalidades. [0024] em uma primeira modalidade do segundo aspecto da presente invenção, o problema é resolvido através de um processo ainda compreendendo b) contato de solução aquosa de etapa a) com um solvente orgânico imiscível em água. [0025] em uma segunda modalidade do segundo aspecto da presente invenção que é também uma modalidade da primeira modalidade, a extração é realizada seguindo término da oxidação de alquila e preferivelmente remoção da célula inventiva da solução aquosa. [0026] o problema subjacente da presente invenção é resolvido, em um terceiro aspecto, através de uso do micro-organismo de acordo com o primeiro aspecto e qualquer uma de suas modalidades para oxidação de um alquila. [0027] ainda em uma modalidade do segundo ou terceiro aspecto ou qualquer uma de suas modalidades, a alquila é um composto representado pela fórmula h-(ch2)x-r, onde x é 1 a 30, e r é qualquer grupo químico, preferivelmente um selecionado do grupo consistindo em -oh, -coh, -cooh, -coor1, -nh2, -no2, -cn, -opo3h, -so3h e -h, e é preferivelmente h, e onde r1 é um alquila linear não-substituído, preferivelmente metila e etila. [0028] ainda em uma modalidade do segundo ou terceiro aspectos ou qualquer uma de suas modalidades, o alquila é um alcano linear, preferivelmente um que é gasoso em temperatura ambiente. [0029] ainda em uma modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção e qualquer uma de suas modalidades, o solvente orgânico imiscível em água é um éster de ácido graxo ou ácido graxo imiscível em água. [0030] os inventores da presente invenção surpreendentemente verificaram que a separação de um solvente orgânico imiscível em água de um meio de cultura aquoso compreendendo um micro-organismo capaz de catalisar oxidação de alcano ou alquila é mais rápida e completa se um micro-organismo tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo antes que um correspondente micro-organismo de tipo selvagem é usado. [0031] além disso, os presentes inventores verificaram que micro-organismos tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo consomem menos oxigênio em relação aos respectivos micro-organismos tipo selvagem enquanto o rendimento do produto é igual ou mesmo aperfeiçoado. [0032] sem desejar ser preso por qualquer teoria, os inventores da presente invenção teorizam que redução de capacidade de degradação de ácido graxo de uma célula conduz a diminuídos níveis de pelo menos um como um metabólito ainda não identificado atuando como um detergente e contrabalançando separação de um solvente orgânico imiscível em água, localizado tanto intracelularmente como na superfície da célula de interesse. [0033] a presente invenção contempla um processo para oxidação de um alquila. o alquila pode ser oxidado a um ou mais compostos selecionados do grupo compreendendo um álcool, um aldeído, uma cetona, e um ácido carboxílico. um tal composto pode ser o produto principal de um processo inventivo, mas ele também pode ser ainda processado. por exemplo, o processo pode não somente compreender a oxidação de um alquila a um ácido carboxílico, mas também a conversão de um tal ácido carboxílico a uma amida. [0034] a presente invenção centra ao redor de um micro-organismo tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo e expressando uma alcano oxidase recombinante, preferivelmente para a conversão de alquilas a alquilas oxidados tais como álcoois. em uma modalidade preferida, o termo "alcano oxidase", como aqui usado, refere-se a qualquer enzima capaz de oxidar um alcano e/ou alquilas. várias alcano oxidasses foram descritas na literatura, por exemplo, basidiomiceto heme-tiolato peroxidases (gutierrez, a., babot, e. d., ullrich, r., hofrichter, m., martinez, a. t., del rio, j. c. (2011), arch. biochem. biophys. 514 (1-2), 33-43), the alkane hydroxylase system of gardonia sp. strain socg (lo piccolo, l., de pasquale, c., fodale, r., puglia, a. m., quatrini, p. (2011), appl. environm. microbiol. 77 (4), 1204-12013; alkane oxidases from alcanivorax (grant, c., woodley, j. m., baganz, f. (2011) enzyme and microbial technology, 480-486) and cytochrom p450 systems (koch, d. j., chen, m. m., van beilen, j. b., e arnold f. h. (2009) appl. and env. microbiology, 337-344). em uma modalidademodalidade particularmente preferida, a alcano oxidase é uma alcano oxidase tipo alkb. alkb é uma óxido reductase do sistema alkbgt pseudomonas putida, dependente de dois polipeptídeos auxiliares, alkg e alkt. alkt é uma rubredoxina reductase dependente-fad transferindo elétrons de nadh para alkg. alkg é uma rubredoxina, uma proteína redox contendo ferro funcionando como um doador de elétrons direto para alkb. em uma modalidade preferida, o termo "alcano oxidase tipo alkb", como aqui usado, refere-se a alkb de pseudomonas putida gpo1 (código de acesso: cab54050.1, qualquer código de acesso usado no pedido de patente refere-se à respectiva sequuência da base de dados genbank corrida pela ncbi, onde a liberação referida é aquela na linha em 15 de dezembro de 2011) ou uma sua variante. em uma modalidade preferida, o termo "alquila" refere-se a um substituinte representado pela fórmula h-(ch2)x-r, onde r é qualquer grupo químico e x é 1, 2, 3, ..., preferivelmente 8 ou mais, mais preferivelmente 11 ou mais, ou a um composto compreendendo um tal substituinte. [0035] em uma modalidademodalidade preferida, o termo "alcano oxidase dependente de rubredoxina", como aqui usado refere-se a uma óxido reductase que reconhece como seu substrato um alcano recebendo elétrons via rubredoxina, a última sendo, em uma modalidade mais preferida, uma proteína ferro - enxofre tendo uma dobra classe a + ß com 2 hélices alfa e 2 a 3 fitas beta transferindo elétrons para a alcano oxidase e é, em uma modalidade mais preferida, alkg de pseudomonas putida ou uma sua variante. exemplos incluem alkg de pseudomonas putida. [0036] em uma modalidade preferida, o termo "enzima de citocromo p450", como aqui usado, refere-se a um óxido reductase tendo um citocromo tipo p450 tendo, em sua forma ligada-co uma banda de absorção em 450 nm e preferivelmente capaz de oxidar um alcano. exemplos incluem citocromo p450 bm-3 de bacillus megaterium (koch, d. j., chen, m. m., van beilen, j. b., and arnold, f. h. (2009) appl. and environm. microbiol. 75(2), 337-344). [0037] em uma modalidade preferida, o termo "xileno mono-oxigenase", como aqui usado, refere-se a uma óxido reductase enzima diferro não-heme, espalhando - membrana, com um sítio ativo rico em histidina e preferivelmente capaz de oxidar um alcano. exemplos incluem xylm de pseudomonas putida (austin, r. n., buzzi, k., kim, e., zylstra, g. j., and groves, j. t. (2003) j. biol. inorg. chem. 8, 733-740. [0038] em uma modalidademodalidade preferida, o termo "metano mono-oxigenase", como aqui usado, refere-se a um óxido reductase que é tanto uma metano mono-oxigenase solúvel compreendendo centro diferro ligado com ponte por um átomo de oxigênio (fe-o-fe) e compreendendo três componentes proteínas, uma hidroxilase, uma unidade ß, e uma reductase, a partir de uma bactéria metanotrópica ou é uma metano mono-oxigenase em partículas, uma proteína de membrana em uma bactéria metanotrófica, compreendendo um sítio ativo contendo cobre. exemplos de metano mono-oxigenases solúveis e em partículas compreendem a metano mono-oxigenase solúvel de methylosinus trichosporium ob3b (a c rosenzweig, frederick, c. a., lippard, s. j., nordlung, p. (1993) nature, 366, 537-543) e a metano mono-oxigenase em partículas de methylococcus capsulatus (bath) (nguyen, h. h. t., elliot, s. j., yip, j. h. k, e chan, s. i. (1998), j. biol. chem. 273, 7957-7966), respectivamente. [0039] os ensinamentos da presente invenção podem não somente ser realizados usando macromoléculas biológicas tendo as exatas sequências de aminoácidos ou ácidos nucleeicos explicitamente referidas neste pedido de patente, por exemplo, por nome ou número de acesso, ou implicitamente, mas também usando variantes de tais sequências. em uma modalidade preferida, o termo "variante", como aqui usado, compreende sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos, respectivamente, que são de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idênticas à sequência de aminoácido ou ácido nucleico de referência, onde preferivelmente aminoácidos outros que não aqueles essenciais para a função, por exemplo, a atividade catalítica de uma proteína, ou a dobra ou estrutura de uma molécula são suprimidas, substituídas por inserções ou aminoácidos essenciais são substituídos em uma maneira conservadora. o estado da técnica compreende algoritmos que podem ser usados para alinhar duas sequências de ácido nucleicos ou aminoácidos e calcular o grau de identidade, ver arthur lesk (2008), introduction to bioinformatics, 3rd edition, thompson et al., nucleic acids research 22, 4637-4680, 1994, e katoh et al., genome information, 16(1), 22-33, 2005. o termo "variante" é usado sinonimamente e intercambiavelmente com o termo "homólogo". tais variantes podem ser preparadas através de introdução de supressões, inserções ou substituições em sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos assim como fusões compreendendo tais macromoléculas ou suas variantes. em uma modalidade preferida, o termo "variante", com relação à sequência de aminoácidos, compreende, preferivelmente em adição à identidade de sequência acima, sequências de aminoácidos que compreendem uma ou mais mudanças de aminoácidos conservativas com relação à respectiva sequência referência ou tipo selvagem com compreende sequências de ácidos nucleicos codificando sequências de aminoácidos que compreendem um ou mais mudanças de aminoácidos conservativas. em uma modalidade preferida, o termo "variante" de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos compreende, preferivelmente em adição ao grau acima de identidade de sequência, qualquer porção ativa e/ou fragmento da sequência de aminoácido ou sequência de ácidos nucleicos, respectivamente, ou qualquer sequência de ácidos nucleicos codificando uma porção ativa e/ou fragmento de uma sequência de aminoácidos. em uma modalidade preferida, o termo "porção ativa", como aqui usado, refere-se a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos, que é menor que a sequência de aminoácidos de inteiro comprimento ou codifica menos que o inteiro comprimento de sequência de aminoácidos, respectivamente, onde a sequência de aminoácidos ou a sequência de aminoácidos codificada, respectivamente retém pelo menos alguma de sua atividade biológica essencial. por exemplo, uma porção e/ou fragmento ativo de uma protease é capaz de hidrolisar ligações peptídicas em polipeptídeos. em uma modalidade preferida, o termo "retém pelo menos alguma de sua atividade biológica essencial", como aqui usado, significa que a sequência de aminoácidos em questão tem uma atividade biológica excedendo e distinta da atividade de fundo e os parâmetros cinéticos caracterizando a dita atividade, mais especificamente kcat e km, estão preferivelmente dentro de 3, mais preferivelmente 2, mais preferivelmente uma ordem de magnitude dos valores mostrados pela molécula referência com relação a um específico substrato. em uma modalidade preferida, o termo "variante" de um ácido nucleico compreende ácidos nucleicos a fira complementar dos quais hibridiza, preferivelmente sob condições rigorosas, para o ácido nucleico referência ou tipo selvagem. rigorosidade de reações de hibridização é facilmente determinável por aqueles versados na técnica, e genericamente é um cálculo empírico dependendo de comprimento de sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. em geral maiores sondas requerem maiores temperaturas para anelamento, enquanto menores sondas necessitam de menores temperaturas. hibridização genericamente depende da habilidade de dna desnaturado reanelar para fitas complementares presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. quanto maior o grau de homologia desejada entre a sonda e sequência hibridizável, maior a temperatura relativa que pode ser usada. como um resultado segue-se que maiores temperaturas relativas podem tender a tornar as condições de reação mais rigorosas, enquanto menores temperaturas tornam as condições de reação menos rigorosas. para adicionais detalhes e explicação de rigorosidade de reações de hibridização, ver f. m. ausubel (1995), current protocols in molecular biology. john wiley & sons, inc. além disso, aqueles versados na técnica podem seguir as instruções dadas no manual "the dig system users guide for filter hybridization", boehringer mannheim gmbh, mannheim, germany, 1993 e em liebl et al. (international journal of systematic bacteriology 41: 255-260 (1991) sobre como identificar sequências de dna por meio de hibridização. em uma modalidade preferida, condições rigorosas são aplicadas para qualquer hibridização, isto é, hibridização somente ocorre se a sonda é 70% ou mais idêntica à sequência-alvo.sondas tendo um menor grau de identidade com relação à sequência alvo podem hibridizar, mas tais híbridos são instáveis e serão removidos em uma etapa de lavagem sob condições rigorosas, por exemplo, diminuição de concentração de sal para 2 x ssc ou, opcionalmente e subsequentemente, para 0,5 x ssc, enquanto a temperatura é, em ordem de preferência crescente, aproximadamente 50oc - 68oc, aproximadamente 52oc - 68oc, aproximadamente 54oc - 68oc, aproximadamente 56oc - 68oc, aproximadamente 58oc - 68oc, aproximadamente 60oc - 68oc, aproximadamente 62oc - 68oc, aproximadamente 64oc - 68oc, aproximadamente 66oc - 68oc. em uma modalidade particularmente preferida, a temperatura é de aproximadamente 64oc - 68oc ou aproximadamente 66oc - 68oc. é possível ajustar a concentração de sal de 0,2 x ssc ou mesmo 0,1 x ssc. fragmentos de polinucleotídeos tendo um grau de identidade com relação à sequência referência ou tipo selvagem de pelo menos 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% podem ser isolados. em uma modalidade preferida, o termo "homólogo" de uma sequência de ácido nucleico , como aqui usado, refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a mesma sequência de aminoácidos como a sequência de ácidos nucleicos referência, em linha com a degenerescência do código genético. [0040] os ensinamentos inventivos podem ser realizados usando uma ampla faixa de micro-organismos. em uma modalidade preferida, o termo "micro-organismo", como aqui usado, refere-se a qualquer micro-organismo permanentemente unicelular compreendendo bactérias archaea, fungos, algas e semelhantes. em uma modalidade preferida, o micro-organismo é um micro-organismo bacteriano, mais preferivelmente um do grupo compreendendo pseudomonas, corynebacterium e escherichia, mais preferivelmente escherichia coli. em uma outra modalidade preferida, o micro-organismo é um eucarioto inferior, mais preferivelmente um fungo do grupo compreendendo saccharomyces, candida, picchia, schizosaccharomyces e yarrowia, e é mais preferivelmente saccharomyces cerivisiae. por todo este pedido de patente, o termo "micro-organismo" é usado sinonimamente e intercambiavelmente com o termo "célula". o micro-organismo pode ser um micro-organismo isolado, em outras palavras uma cultura pura de uma linhagem simples de micro-organismo, ou pode compreender uma mistura de pelo menos duas linhagens. micro-organismos biotecnologicamente relevantes são comercialmente disponíveis, por exemplo, do american type culture collection (atcc) ou o german collection of microorganisms and cell cultures (dsmz). partículas para manutenção e modificação de micro-organismos são disponíveis da técnica anterior, por exemplo, sambroke/fridge/maniadis (1989): molecular cloning - a laboratory manual, cold spring harbour press, 2nd edition, fuchs/schlegel (2007), allgemeine mikrobiologie, 2008, georg thieme verlag. [0041] o micro-organismo inventivo tem uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo. em uma modalidade preferida, o termo "tendo uma reduzida capacidade de degradação de ácido graxo", como aqui usado, significa que o respectivo micro-organismo degrada ácidos graxos, preferivelmente aqueles tomados do ambiente, em uma taxa menor que um micro-organismo comparável tendo uma capacidade normal de degradação de ácido graxo pode fazer. em uma modalidade preferida, a degradação de ácido graxo de um tal micro-organismo é menor por conta de supressão, inibição ou inativação de pelo menos um gene codificando uma enzima envolvida no caminho de beta - oxidação. em uma modalidade preferida da presente invenção, pelo menos uma enzima envolvida no caminho de beta - oxidação perdeu, em ordem de preferência crescente, 5, 10, 20, 40, 50, 75, 90 ou 99% de atividade em relação à atividade da mesma enzima sob condições comparáveis no respectivo micro-organismo tipo selvagem. aqueles versados na técnica são familiares com várias técnicas que podem ser usadas para suprimir um gene codificando uma enzima ou reduzir a atividade de uma tal enzima em um micro-organismo, por exemplo, através de exposição de células a radioatividade seguido por acumulação ou seleção dos resultantes mutantes, introdução direcionada a sítio de mutações de ponto ou nocaute de um gene integrado em cromossoma codificando uma enzima ativa, como descrito em sambrook / fritsch / maniatis (1989). em adição, o repressor transcricional fadr pode ser superexpresso para o efeito de que a expressão de enzimas envolvidas no caminho de beta-oxidação é reprimida (y fujita, h matsuoka, e k hirooka (2007) mol. microbiology 66(4), 829-839). em uma modalidade preferida, o termo "supressão de um gene", como aqui usado, significa que a sequência de ácidos nucleicos codificando o dito gene é modificada de modo que a expressão de polipeptídeo ativo codificado pelo dito gene é reduzida. por exemplo, o gene pode ser suprido através de remoção na estrutura de uma parte da sequência compreendendo a sequência codificando um centro ativo catalítico do polipeptídeo. alternativamente, o sítio de ligação de ribossoma pode ser alterado de modo que os ribossomas não mais traduzem o correspondente rna. além disso, aqueles versados na técnica são capazes de medir rotineiramente a atividade de enzimas expressas por células vivas usando ensaios