Patent AR-117637-A2 (AR)
Title: Métodos para identificar plantas de algodón con tolerancia a insectos que comprenden ee-gh5
Inventor: VAN HERCK HANS
IPC: C12Q1/68
Filed: 2019-08-14
Abstract: La presente proporciona métodos que permiten la identificación rápida e inequívoca de plantas de algodón transgénicas, material vegetal y semillas, caracterizadas por albergar un evento de transformación específico en una ubicación específica en el genoma del algodón. También se proporcionan células de plantas de algodón aisladas que comprenden el evento de trasformación específico, métodos para producir plantas de algodón que comprenden el evento de transformación específico, y moléculas de ácido nucleico aisladas características para el evento de transformación específico. Reivindicación 1: Un método para identificar el evento élite EE-GH5 en muestras biológicas, excluida la planta involucrada en dicho método, donde el evento élite EE-GH5 comprende: a) un ADN extraño que comprende la secuencia codificante de un gen cry1Ab modificado bajo el control de un promotor S7 del virus del raquitismo del trébol subterráneo; b) SEQ ID Nº 12 en el ADN extraño; c) SEQ ID Nº 16, los nucleótidos 1 - 563 estando inmediatamente aguas arriba de y contiguos con dicho ADN extraño y los nucleótidos 564 - 700 de la SEQ ID Nº 16 siendo ADN extraño, y los nucleótidos 466 - 799 de la SEQ ID Nº 16 que corresponden a la SEQ ID Nº 1; y d) SEQ ID Nº 2, los nucleótidos 41 - 452 estando inmediatamente aguas abajo de y contiguos con dicho ADN extraño, y los nucleótidos 1 - 40 de SEQ ID Nº 2 siendo ADN extraño; donde dicho evento élite está comprendido como referencia habiéndose depositado en la ATCC con el número de depósito PTA-8171, donde el ADN genómico, cuando es analizado usando el protocolo de identificación de evento élite para EE-GH5 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11, respectivamente, permite obtener un fragmento de ADN de 262 bp o cuando es analizado usando el protocolo de identificación de evento élite para EE-GH5 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 3 y de la SEQ ID Nº 6, respectivamente, permite obtener un fragmento de ADN de 369 bp, caracterizado porque comprende la detección de una región específica para EE-GH5 con un cebador específico que reconoce específicamente la región flanqueadora 5’ o 3’ de EE-GH5 y un cebador específico que reconoce específicamente el ADN extraño en EE-GH5, o con una sonda, donde a) dicho cebador que reconoce a la región flanqueadora 5’ se selecciona de: a. un cebador que consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 98 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 16 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 563, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 98 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 16 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 563; b) dicho cebador que reconoce a la región flanqueadora 3’ se selecciona de: a. un cebador que consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 41 hasta el nucleótido 452, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 41 hasta el nucleótido 452; c) dicho cebador que reconoce el ADN extraño se selecciona de: a. un cebador que consiste de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 99 hasta el nucleótido 334 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 40, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 99 hasta el nucleótido 334 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 40; d) dicha sonda presenta la secuencia de SEQ ID Nº 1, desde el nucleótido 78 hasta el nucleótido 119, o la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 20 hasta el nucleótido 61, o el complemento de dichas secuencias. Reivindicación 6: Una molécula sonda específica aislada para identificar el evento élite EE-GH5 tal como se define en la reivindicación 1 en muestras biológicas, caracterizada porque presenta la secuencia de SEQ ID Nº 1, desde el nucleótido 78 hasta el nucleótido 119, o SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 20 hasta el nucleótido 61, o el complemento de dichas secuencias. Reivindicación 8: Un método para determinar el estado cigosidad de una planta, material vegetal o semillas que comprende al evento élite EE-GH5 tal como se define en la reivindicación 1 en muestras biológicas, caracterizado porque dicho método comprende amplificar fragmentos de ADN de entre 100 y 500 bp a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos tres cebadores, donde dos de dichos cebadores reconocen específicamente el ADN vegetal de preinserción, tal como la región flanqueadora 5’ de EE-GH5, donde dicha región flanqueadora 5’ presenta la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 98 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 16 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 563, o la región flanqueadora 3’ de EE-GH5, donde dicha región flanqueadora 3’ presenta la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 41 hasta el nucleótido 452 o el ADN de preinserción presenta la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 15 o el complemento de la misma, donde el tercero de dichos cebadores que reconocen una secuencia dentro del ADN extraño presenta la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 99 hasta el nucleótido 334 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 40, donde a) dicho cebador que reconoce a la región flanqueadora 5’ se selecciona de: a. un cebador que consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 98 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 16 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 563, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 98 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 16 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 563; b) dicho cebador que reconoce a la región flanqueadora 3’ se selecciona de: a. un cebador que consiste de una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 41 hasta el nucleótido 452, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ una secuencia de nucleótidos de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 41 hasta el nucleótido 452; c) dicho cebador que reconoce el ADN extraño se selecciona de: a. un cebador que consiste de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucléotidos del complemento de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 99 hasta el nucleótido 334 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 40, y b. un cebador que comprende en su extremo 3’ de 17 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 99 hasta el nucleótido 334 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 40. Reivindicación 12: Una molécula aislada de ácido nucleico característica para el evento élite EE-GH5 tal como se define en la reivindicación 1, caracterizada porque dicha molécula aislada de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 88 hasta el nucleótido 109 o la SEQ ID Nº 2 desde el nucleótido 30 al 50, o el complemento de dichas secuencias.