Patent ES-2630224-T3 (ES)
Title: Métodos para sintetizar polipéptidos heteromultiméricos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide
Inventor: CREGG JAMES M
IPC: C07K16/00
Filed: 2004-10-22
Granted: 2017-08-18
Abstract: Un método para la síntesis y la recuperación, a partir de una levadura Pichia pastoris, de una proteína de inmunoglobulina heteromultimérica secretada, biológicamente activa, heteróloga (no es de levadura) que se compone de al menos dos cadenas de polipéptidos de subunidades no idénticas; el método se caracteriza por las siguientes etapas: (i) producir una célula o células estables diploides de levadura Pichia pastoris mediante apareamiento o fusión de esferoplastos de células haploides de levadura Pichia pastoris en condiciones de manera que dichos eventos de apareamiento o fusión de esferoplastos resulten en la producción de una célula o células diploides de levadura Pichia pastoris, en donde dicha célula o células diploides de levadura Pichia pastoris después de dicho apareamiento o fusión comprenden constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción de al menos dos cadenas polipeptídicas no idénticas que constituyen dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa, y cuyas células estables diploides de levadura Pichia pastoris son capaces del ensamblaje y expresión y secreción prolongadas de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa en un medio de cultivo que contiene dicha(s) célula(s) de Pichia pastoris cuando dicha célula o células diploides de Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas; (ii) después de efectuar dicho apareamiento o fusión de esferoplastos, identificar y aislar la célula o células diploides de Pichia pastoris que contienen constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción estables de al menos dos cadenas polipeptídicas no idénticas que constituyen dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa cuando dicha célula o células diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas; (iii) cultivar dicha célula o células diploides de Pichia pastoris o su progenie diploide en un medio de cultivo bajo condiciones que resulten en la expresión, ensamblaje y secreción de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica biológicamente activa en el medio de cultivo; y (iv) recuperar la proteína heteromultimérica resultante del medio de cultivo; en donde dicho apareamiento o fusión de esferoplastos se efectúa mediante el apareamiento o la fusión de una primera célula haploide de levadura Pichia pastoris que contiene un primer constructo de expresión, dicho primer constructo de expresión contiene secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la expresión de al menos una subunidad de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa (intacta), unidas operativamente a un primer promotor de levadura; y una segunda célula haploide de Pichia pastoris que contiene un segundo constructo de expresión, dicho segundo constructo de expresión comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la(s) subunidad(es) restante(s) de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica, unidas operativamente a un segundo promotor de levadura.