Patent ES-2399318-T3 (ES)
Title: Método para la detección e identificación rápidas de microorganismos
Inventor: VOS PIETER
IPC: C12Q1/68
Filed: 2009-10-29
Granted: 2013-03-27
Abstract: Un método para determinar la presencia de microorganismos en un muestra e identificar y caracterizar dichosmicroorganismos si están presentes, que comprende los pasos de: (a) extraer ácidos nucleicos de los microorganismos, dichos ácidos nucleicos comprenden ácidosnucleicos diana; (b) realizar una reacción de detección de la ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, quecomprende: (b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácidonucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de dianalocalizada en 3' complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segundasonda de ácido nucleico comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5'complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmenteadyacente a y en 3' de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácidonucleico comprende una sección I de unión a cebador (PBS(I)) localizada en 5' y posiblemente unrelleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión a cebador(PBS(II)) localizada en 3' y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda deácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una regiónidentificadora que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de capturapreferiblemente en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleicodiana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador, (b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segundasonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicoscomplementarios; (b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente, (b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) esesencialmente idéntico a la sección I de unión a cebador, y el segundo cebador (cebador II) esesencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundocebador está opcionalmente marcado, y (b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido del paso (b3), en donde la amplificación se iniciamediante la unión del cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión a cebador,proporcionando así ácidos nucleicos diana amplificados, en donde una o más moléculas detectoras, que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados están presentes en el paso (b5), (c) seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha moléculadetectora, dicha modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dichasecuencia diana mediante lo cual se determina la presencia de un microorganismo, (d) donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos dianaamplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y (e) detectar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (d), mediante lo cual se identifica elmicroorganismo.