Patent BR-112015005718-A2 (BR)
Title: uso de íons divalentes, proteases, detergentes, e ph baixo na extração de ácidos nucleicos
Inventor: DONALD CULLIS
IPC: C12Q1/68
Filed: 2013-09-18
Abstract: relatório descritivo da patente de invenção para "uso de íons divalentes, proteases, detergentes, e ph baixo na extração de ácidos nucleicos". referência cruzada aos pedidos de depósito correlatos [001] este pedido reivindica a prioridade sobre o pedido us n° 61/703.112, depositado em 19 de setembro de 2012, que está aqui totalmente incorporado, a título de referência. antecedentes da invenção [002] os ensaios diagnósticos à base de pcr são uma ferramenta poderosa para análise de ácidos nucleicos, permitindo a detecção de mesmo uma única cópia de uma molécula de ácido nucleico alvo. as sequências de ácidos nucleicos alvo podem ser amplificadas por pcr ("polymerase chain reaction", reação em cadeia da polimerase) e o produto amplificado pode ser detectado e quantificado. [003] as sensibilidade e confiabilidade de ensaios diagnósticos à base de ácido nucleico dependem de métodos eficientes não enviesados de extração de ácidos nucleicos puros, de alta qualidade, provenientes de amostras biológicas. nucleases que degradam ácidos nucleicos e substâncias que inibem o processo de amplificação estão presentes em amostras biológicas. por exemplo, dnase ou rnase degradam ácidos nucleicos alvo, edta quelata cátions divalentes como mg2+ que são essenciais para as atividades de protease e de nuclease, e substâncias como heparina, fenol, albumina desnaturada, poliaminas, polissacarídeos e alginato de cálcio inibem a pcr. [004] os dois desafios principais na purificação de ácidos nucleicos, especialmente de amostras clínicas, são as lise e atividade de nuclease não específica. de fato, durante o processo de purificação ocorrem simultaneamente tanto a extração dos ácidos nucleicos quanto a sua degradação. para superar a degradação não específica de ácidos nucleicos, várias abordagens têm sido tentadas. as técnicas mais amplamente utilizadas são o uso de proteases não específicas e vários detergentes iônicos e não iônicos para garantir a lise completa. entretanto, para um ótimo desempenho da protease, é necessária uma faixa de ph fisiológico. próximo ao ph fisiológico, várias nucleases são ativas, levando assim, também, à perda de ácidos nucleicos alvo. [005] os métodos de extração de ácidos nucleicos eficazes devem minimizar a atividade de nucleases, mantendo assim a integridade dos ácidos nucleicos que são analisados no ensaio diagnóstico. de modo similar, inibidores de amplificação presentes na amostra são desejavelmente reduzidos nos métodos de amplificação. a presente invenção fornece estas e outras vantagens. breve sumário da invenção [006] a presente invenção fornece métodos e composições para extrair ácidos nucleicos de amostras biológicas pelo uso de íons divalentes, proteases, detergentes, e condições de ph baixo. [007] em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para a extração de ácidos nucleicos alvo de uma amostra biológica que compreende células ou micro-organismos, o método compreendendo: (a) adicionar um sal de metal de transição, um sal de metal alcalino terroso, ou sua combinação à amostra biológica em uma quantidade suficiente para inativar as nucleases na amostra; (b) adicionar uma solução para extração à amostra biológica em uma quantidade suficiente para lisar as células ou os micro-organismos, formando assim um lisado; (c) adicionar um tampão ácido ao lisado em uma quantidade suficiente para reduzir o ph do lisado; e (d) separar o ácido nucleico alvo do lisado para extrair o ácido nucleico alvo da amostra biológica. [008] em um outro aspecto, os métodos da invenção compreendem adicionalmente realizar uma amplificação de ácido nucleico após a etapa (d). a amplificação de ácido nucleico é realizada com o uso de pcr em algumas modalidades. [009] em um aspecto, os métodos da invenção compreendem adicionalmente detectar um de produto ácido nucleico amplificado gerado da amplificação de ácido nucleico. [0010] em alguns aspectos, a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas simultaneamente. [0011] em alguns aspectos, a amostra biológica é sangue inteiro, soro, plasma, escarro, saliva, urina, fezes, células, ou micro-organismos. [0012] em alguns aspectos, o sal de metal de transição é selecionado do grupo que consiste em um sal de manganês ou um sal de zinco. [0013] em alguns aspectos, o sal de metal alcalino terroso é selecionado do grupo que consiste em um sal de magnésio ou um sal de cálcio. [0014] em alguns aspectos, o ácido nucleico alvo é rna. em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é rna viral. [0015] em alguns aspectos, o ácido nucleico alvo é dna. em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é dna viral. [0016] em alguns aspectos, o tampão ácido é tampão de ácido cítrico ou tampão de ácido acético. em algumas modalidades, (c) (isto é, após a adição do tampão ácido) está na faixa ácida entre cerca de ph 1 e cerca de ph 5. [0017] em alguns aspectos, a solução para extração compreende proteinase k, detergente, ou uma sua combinação. [0018] em alguns aspectos, o detergente é um detergente catiônico ou não iônico. em algumas modalidades, o detergente catiônico é brometo de cetrimônio. em algumas modalidades, o detergente não iônico é triton x-100. em algumas modalidades, o detergente não iônico é np-40. em outras modalidades, o detergente é um copolímero em bloco (por exemplo, solução de pluronic). [0019] em alguns aspectos, por exemplo, quando a amostra compreende o vírus da hepatite b, os métodos da invenção compreendem adicionalmente uma etapa de aquecer a amostra biológica antes da separação do ácido nucleico alvo do lisado. em uma modalidade típica, a amostra biológica é aquecida para uma temperatura entre cerca de 50°c e cerca de 80°c, habitualmente entre cerca de 65°c e cerca de 75°c. a etapa de aquecer pode ser realizada durante cerca de 30 segundos a cerca de 90 segundos ou durante cerca de 50 segundos a cerca de 70 segundos. em algumas modalidades, a etapa de aquecer é realizada após a adição da solução para extração e antes da adição do tampão ácido. [0020] em alguns aspectos, a etapa (d) é conduzida pela adição de partículas magnéticas ao lisado na etapa (c); separação das micropartículas magnéticas do lisado com o uso de separação de micropartículas magnéticas; adição de uma uma solução para lavagem às micropartículas magnéticas, e adição de um tampão de eluição às micropartículas magnéticas para eluir o ácido nucleico. [0021] em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar um produto ácido nucleico amplificado em uma amostra que compreende um ácido nucleico alvo e uma nuclease, o método compreendendo: (a) adicionar um sal de metal de transição, um sal de metal alcalino terroso, ou sua combinação à amostra em uma quantidade suficiente para inativar a nuclease na amostra; (b) adicionar um tampão ácido à amostra em uma quantidade suficiente para inativar a nuclease na amostra; (c) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico para produzir o produto ácido nucleico amplificado a partir do ácido nucleico alvo; (d) detectar o produto ácido nucleico amplificado. [0022] em um aspecto, a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas simultaneamente. [0023] em um aspecto, o sal de metal de transição é selecionado do grupo que consiste em um sal de manganês ou um sal de zinco. em um aspecto, o sal de metal alcalino terroso é selecionado do grupo que consiste em um sal de magnésio ou um sal de cálcio. [0024] em alguns aspectos, o tampão ácido é tampão de ácido cítrico ou tampão de ácido acético. [0025] em alguns aspectos, a reação de amplificação de ácido nucleico é um processo de pcr. [0026] em alguns aspectos, o ácido nucleico alvo é rna. em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é rna viral. [0027] em alguns aspectos, o ácido nucleico alvo é dna. em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é dna viral. [0028] em um aspecto, a invenção fornece um kit para extrair ácido nucleico de uma amostra biológica que compreende ácidos nucleicos, nucleases e inibidores que compreende: (a) uma solução para extração; (b) uma solução de sal de metal de transição, uma solução de sal de metal alcalino terroso, ou sua combinação; (c) um tampão ácido, e (d) uma solução para lavagem. [0029] em alguns aspectos, a solução para extração compreende proteinase k, detergente, ou uma sua combinação. [0030] em alguns aspectos, o sal de metal de transição é selecionado do grupo que consiste em um sal de manganês ou um sal de zinco. [0031] em alguns aspectos, o sal de metal alcalino terroso é selecionado do grupo que consiste em um sal de magnésio ou um sal de cálcio. [0032] em alguns aspectos, o tampão ácido é tampão de ácido cítrico ou tampão de ácido acético. [0033] em alguns aspectos, a solução para lavagem é solução de ácido trifluoroacético ou solução de ácido clorídrico. [0034] outros objetivos, outras características, e vantagens da presente invenção serão evidentes para a pessoa versada na técnica a partir da seguinte descrição detalhada e das figuras. breve descrição dos desenhos [0035] a figura 1 ilustra uma modalidade da invenção aqui descrita. mostra as etapas de extração de rna de uma amostra com o uso de sal divalente. as etapas de pré-lise incluem as etapas 1 e 2. as etapas de lise incluem as etapas 3 a 6. a remoção de sal divalente, como mn2+ e outro inibidor de extração de rna e amplificação por pcr ocorre a partir da etapa 5 com a adição de tampão ácido à etapa 9 após a lavagem final das microesferas magnéticas para a captura de ácido nucleico. a etapa de eluição de rna inclui a etapa 10. antes da realização da amplificação por pcr (por exemplo, rt-pcr) o rna eluído é tratado com um ácido tal como hcl. [0036] a figura 2 mostra o efeito de concentrações equimolares baixas de íons divalentes sobre a extração de rna viral de uma amostra com hiv-1 adicionado. tratamento com mncl2 40 mm durante a extração de rna deu mais rna de hiv-1 que os tratamentos com mgcl2 40 mm ou de cacl2 40 mm. [0037] a figura 3 mostra o efeito de concentrações equimolares baixas de íons multivalentes sobre a extração de rna viral de uma amostra com hiv-1 adicionado. as amostras tratadas com mncl2 40 mm geraram mais rna de hiv-1 em comparação com aquelas tratadas com quer cacl2 40 mm, mgcl2 40 mm, nh4so4 40 mm, quer nh4cl2 40 mm. a adição de cacl2 257,8 mm às amostras também foi eficaz para o isolamento de rna de hiv-1. [0038] a figura 4 mostra o efeito de concentrações equimolares altas de íons multivalentes sobre a extração de rna viral de uma amostra com hiv-1 adicionado. as amostras foram tratadas com cacl2 1,48 m, nacl 1,48 m, mgcl2 1,48 m, mncl2 1,48 m, zncl2 1,48 m, nh4cl 1,48 m, nh4(so4)2 1,48 m, zncl2 229,6 m ou sem íon. os dados revelaram que em concentrações equimolares altas, os sais de metais alcalinos terrosos e os sais de metais de transição apresentam desempenhos similares. [0039] a figura 5 mostra uma comparação de sais divalentes diferentes sobre a extração de rna viral de amostras de plasma com hcv adicionado. os dados de pcr quantitativa mostram que as extrações que usam mn(oac)2 superaram aquelas com mg(oac)2, zn(oac)2 ou mncl2. os resultados também sugerem que os métodos de extração com zn(oac)2 92,7 mm podem ser eficazes. [0040] a figura 6 ilustra que a adição de íons divalentes a uma amostra no início da extração de rna pode preservar a integridade do rna durante as etapas de pré-lise (antes da adição de mn(oac)2 ao plasma e após a adição de mn(oac)2) e as etapas de lise (adição de detergente como triton x-100, protease como proteinase k, ou tampão de ligante de microesfera magnética como ácido cítrico). [0041] a figura 7 ilustra que os sais de metais de transição podem ser usados na extração de dna de uma amostra de plasma com vírus ebv adicionado. é apresentada a análise quantitativa de métodos de extração de dna de ebv com o uso de mgcl2 ou mncl2. [0042] a figura 8 mostra a comparação quantitativa de dna em amostras tratadas com sais divalentes específicos. os teores de dna foram comparados com o uso de valores de cp determinados por pcr quantitativa. [0043] a figura 9 mostra os resultados de pcr quantitativa em tempo real em comparação com os métodos de extração diferentes que incluíram a adição de várias concentrações de quer cacl2 quer mncl2 às amostras clínicas de plasma com hiv-1 adicionado. [0044] as figuras 10a, 10b, e 10c mostram uma comparação de vários métodos de extração com o uso de detergentes diferentes para o isolamento de rna de amostras com hiv-1 adicionado. a figura 10a mostra os dados de pcr quantitativa em tempo real para o controle de processo hiv-1. a extração de rna viral com triton x-100 10% ou ctab 10% foi comparável. a figura 10b mostra que triton x-100 10% e ctab 10% foram os mais eficazes conforme medido pelo valor de cp (ct, "threshold cycle", ciclo limite, ciclo limiar) para a extração de rna de hiv-1. a figura 10c mostra que a adição de triton x-100 10%, de np-40 10% ou np-40 10% alternativo foram igualmente eficazes para o isolamento de rna de hiv de uma amostra com hiv-1 adicionado. [0045] a figura 11 mostra que a extração de dna de hbv de amostras de plasma é aprimorada por incubação da mistura de lise contendo cacl2 em uma incubadora a 70 °c durante 50 a 70 segundos. [0046] as figuras 12a e 12b mostram que a extração de 70 ui de dna de hbv (figura 12a) e de 700.000 ui de dna de hbv (figura 12b) de amostras de soro é aprimorada por incubação da mistura de lise contendo cacl2 em uma incubadora a 70 °c durante 60 segundos. descrição detalhada da invenção i. introdução [0047] a presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que o uso de sais de metais de transição, sais de metais alcalinos, ou suas combinações (chamados aqui de "sais divalentes"), juntamente com ph baixo, durante a extração de ácidos nucleicos, inativa nucleases e inibidores de amplificação que podem estar presentes em amostras biológicas. além disso, os métodos da invenção pode incluir o uso de proteases (por exemplo, para amostras que contêm células) para adicionalmente inativar as nucleases na amostra. a invenção fornece métodos e composições para eficazmente inativar nucleases durante a extração e/ou a amplificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica. a invenção também se refere a um método de detectar um produto ácido nucleico amplificado pela inativação de em uma amostra biológica. [0048] os métodos da invenção são tipicamente usados com amostras que compreendem células. em tais métodos, uma solução para extração é utilizada para lisar células e liberar os ácidos nucleicos das células. neste processo, nucleases e inibidores de amplificação podem ser liberadas (liberados) ao mesmo tempo. sem o desejo de se vincular à teoria, tem sido observado que os sais de metais de transição e/ou os sais de metais alcalinos, especificamente em concentrações saturadas, transientemente inativam as nucleases liberadas pela inibição dos resíduos de aminoácidos carregados específicos na proteína. subsequentemente, o abaixamento do ph da amostra (por exemplo para um ph abaixo de 5) resulta em perda de afinidade dos íons divalentes pelas nucleases e os íons por conseguinte retornam para a solução. entretanto, em ph baixo, as nucleases são estruturalmente deformadas e são removidas por lavagem durante as etapas subsequentes. conforme demonstrado na presente invenção, o uso de inativação de nuclease por íons divalentes e desnaturação de proteína em ph ácido (e opcionalmente incluindo a adição de uma protease) aprimora a extração de ácidos nucleicos de uma variedade de amostras biológicas. ii. amostras biológicas [0049] uma amostra biológica útil na presente invenção é qualquer amostra que contém, ou é suspeita em conter, ácidos nucleicos alvos juntamente com nucleases e/ou inibidores de amplificação. na modalidade típica, a amostra biológica compreende células ou micro-organismos. os micro-organismos incluem archaea, bactérias, fungos, protista e vírus. a amostra pode ser derivada de uma variedade de fontes biológicas. tais fontes incluem tecidos inteiros, que incluem aspirado e materiais de biopsia, fezes, explantes celulares; sangue inteiro, eritrócitos, leucócitos, e fluidos corporais como linfa, urina, escarro, sêmen, secreções, lavagens e aspirados oculares, lavagens e aspirados pulmonares de um indivíduo. a amostra também pode ser células cultivadas in vitro, incluindo células primárias e secundárias, e linhagens celulares transformadas, e meios de cultura de células. uma amostra biológica também pode ser derivada de tecidos de plantas, como folhas, raízes, ou caules. em algumas modalidades, micro-organismos (por exemplo, bactérias, fungos, algas, protozoários e vírus) podem estar presentes na amostra biológica. em algumas modalidades, a amostra biológica está isenta de células e contém vírus. os termos "amostra biológica" e "amostra" são usados de modo intercambiável. [0050] o indivíduo do qual a amostra biológica é derivada pode ser um ser humano, um mamífero comercialmente significativo, incluindo, por exemplo, um macaco, uma vaca, ou um cavalo. as amostras também podem ser obtidas de animais de companhia, incluindo, por exemplo, um cão, um gato ou um pássaro. em algumas modalidades, o indivíduo é um animal de laboratório utilizado como um modelo animal de doença, por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, um porquinho-da-índia, ou um macaco. [0051] em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é rna como rna de ser humano, rna viral, rna bacteriano, rna fúngico, rna algáceo ou rna protozoário. em uma modalidade típica, o rna alvo é rna viral. [0052] em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é dna como dna de ser humano, dna viral, dna bacteriano, dna fúngico, dna algáceo ou dna protozoário. em uma modalidade típica, o dna alvo é dna viral. [0053] a nuclease que é inativada nos métodos da invenção pode ser qualquer enzima capaz de clivar as ligações fosfodiéster entre as subunidades nucleotídeo de ácidos nucleicos. as nucleases podem ser caracterizadas como endonucleases, exonucleases, ou ambas. exemplos não limitadores de dnase incluem dnase i, dnase ii, dnase iv, endonucleases de restrição, outras endonucleases, e seus fragmentos (que retêm a atividade de nuclease). exemplos não limitadores de uma rnase incluem um membro da família rnase a, rnase b, rnase c, rnase 1, rnase t1, rnase t2, rnase l, um membro da família rnase h, um membro da família rnase angiogenina, rnase eosinofílica, uma nuclease micrococácea, um membro da família ribonuclease i de mamíferos, um membro da família ribonuclease 2, uma rna-mensageiro-ribonuclease, 5'-3'-exorribonuclease, 3'-5'-exorribonuclease, uma enzima de decapeamento, uma deadenilase, rnase p, rnase m, rnase e, rnase i,i* rnase hi, rnase hii, rnase m, rnase r, rnase iv, f; rnase p2,0, piv, pc, rnase n, rnase ii, pnpase, rnase d, rnase bn, rnase t, rnase ph, oligornase, rnase r, rnase sa, rnase f1, rnase u2, rnase ms, rnase st, e seus fragmentos (que retêm a atividade de nuclease). [0054] conforme observado acima, a amostra também pode compreender inibidores de amplificação. tais inibidores são tipicamente inibidores de amplificação por pcr. os inibidores de amplificação habitualmente influenciam tais ensaios mediante a interação com o ácido nucleico alvo ou interferência com a dna polimerase. os inibidores podem escapar da remoção durante o procedimento de purificação pela ligação diretamente aos ácidos nucleicos na amostra. alternativamente, os inibidores podem inibir a pcr pela redução da disponibilidade de cofatores (por exemplo, mg2+) ou podem interferir de maneira diferente com a interação dos cofatores com a dna polimerase. inibidores exemplificadores incluem heme, hemoglobina, e lactoferrina e imunoglobinas (em sangue); sais biliares (em fezes); polissacarídeos complexos (em fezes e material de origem vegetal); melanina (em cabelo e pele); proteinases (em leite); mioglobina (em tecido muscular); ácido húmico (em solo e material de origem vegetal); colágeno (em tecidos); e ureia (em urina). iii. extração de ácidos nucleicos [0055] conforme observado acima, a presente invenção fornece métodos para a extração de ácidos nucleicos alvo de uma amostra biológica que compreende nucleases e/ou inibidores de amplificação. os sais divalentes usado nos métodos da invenção podem ser sais de metais alcalinos terrosos como berílio, magnésio, cálcio, estrôncio, bário e rádio. os sais divalentes também podem ser sais de metais de transição como manganês, cobalto, níquel, cobre, zinco, ítrio, zircônio, nióbio, molibdênio, tecnécio, rutênio, ródio, paládio, prata, cádmio, lantânio, háfnio, tântalo, tungstênio, rênio e ósmio. o contraíon pode ser, por exemplo, cloreto, acetato, óxido, hidróxido, oxalato, carbonato, citrato, e trifluoroacetato. [0056] sais divalentes exemplificadora úteis na presente invenção incluem cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, acetato de manganês, cloreto de manganês, acetato de zinco, e suas combinações. [0057] em uma modalidade típica, concentrações hipermolares como quantidades saturadas de sais divalentes são convenientemente usadas. uma tal quantidade é suficiente para inativar nucleases na amostra e assim evitar que as nucleases degradem os ácidos nucleicos alvo. esta quantidade tipicamente será uma concentração final de pelo menos cerca de 250 mm a cerca de 400 mm, e com frequência até cerca de 500 mm. em uma modalidade típica, a quantidade do sal divalente é pelo menos cerca de 250 mm. [0058] os métodos de extração também podem incluir uma etapa de adicionar uma solução para extração à amostra biológica em uma quantidade suficiente para lisar célula, formando assim um lisado. em algumas modalidades, a solução para extração compreende uma protease, um detergente, ou uma sua combinação. a protease digere proteínas (por exemplo, nucleases) liberadas das células durante a lise. as proteases úteis para este propósito são bem conhecidas por aquelas pessoas versadas na técnica. uma protease pode ser uma enzima que catalisa a clivagem de ligações peptídicas, por exemplo, em proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos. proteases exemplificadoras incluem subtilases, subtilisinas, e serina-proteases alcalinas. as subtilases são uma família de serina-proteases encontradas em organismos procarióticos e eucarióticos, como, bactérias, fungos, e levedura. as subtilisinas são subtilases bacterianas que têm amplas especificidades por substratos. as subtilisinas são relativamente resistentes à desnaturação por caótropos, como cloridrato de guanidina e ureia, tensoativos aniônicos, como dodecilsulfato de sódio (sds). subtilisinas exemplificadoras incluem, mas não se limitam a: proteinase k; proteinase r; proteinase t, subtilisina a, nagarse, subtilisina b, e termitase. em uma modalidade típica, proteinase k é usada nos métodos da invenção. aquelas pessoas versadas reconhecerão que o uso de proteases em métodos de extração de ácido nucleico também é conhecido e que a concentração apropriada de protease dependerá de numerosos fatores que incluem a protease específica utilizada e a amostra sendo analisada. em uma modalidade típica, a concentração final de protease será de pelo menos cerca de 20 u/ml, habitualmente até cerca de 40 u/ml. [0059] um detergente é tipicamente usado para romper as membranas virais, bacterianas, celulares (por exemplo, derivadas de um animal, um micróbio, uma planta, um ser humano) e liberar as moléculas biológicas como proteína, rna e dna de dentro da partícula viral ou da célula. o lisado assim formado está tipicamente em ph neutro ou próximo de neutro (por exemplo, cerca de ph 7). o uso de detergentes em métodos de extração de ácido nucleico é bem conhecido. aquelas pessoas versadas reconhecerão que a concentração final de detergente dependerá de numerosos fatores que incluem o detergente específico utilizado e a amostra sendo analisada. em uma modalidade típica, a concentração final de detergente será pelo menos cerca de 0,1%, habitualmente até cerca de 5%. [0060] os detergentes úteis para este propósito são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica. em algumas modalidades, o detergente é um tensoativo catiônico. os tensoativos catiônicos podem conter aminas quaternárias ou aminas terciárias. tensoativos catiônicos exemplificadores incluem brometo de cetiltrimetilamônio (ctab), cloreto de cetiltrimetilamônio (ctacl), brometo de dodeciltrimetilamônio (dtab), cloreto de dodeciltrimetilamônio (dtacl), brometo de octiltrimetilamônio, brometo de tetradeciltrimetilamônio (ttab), cloreto de tetradeciltrimetilamônio (ttacl), brometo de dodeciletildimetilamônio (dedtab), brometo de deciltrimetilamônio (d10tab), brometo de dodeciltrifenilfosfônio (dtpb), brometo de octadecililtrimetilamônio, cloreto de estearoalcônio, cloreto de olealcônio, cloreto de cetrimônio, metossulfato de alquiltrimetilamônio, cloreto de palmitamidopropiltrimetila, quatérnio 84. tensoativos à base de amina terciária exemplificadores incluem octildimetilamina, decildimetilamina, dodecildimetilamina, tetradecildimetilamina, hexadecildimetilamina, octildecildimetilamina, octildecilmetilamina, didecilmetilamina, dodecilmetilamina, cloreto de triacetilamônio, cloreto de cetrimônio, e cloreto de alquildimetilbenzilamônio. classes adicionais de tensoativos catiônicos incluem grupos fosfônio, imidazolina, e amina etilada. em uma modalidade típica, o detergente catiônico é ctab. [0061] em algumas modalidades, o detergente é um detergente não iônico. exemplos não limitadores de um detergente não iônico incluem np-40, triton x-100, triton x-114, tween-20, tween-80, brij-35, brij-58, octil glicosídeo, octiltioglicosídeo, copolímero em bloco (por exemplo, solução de pluronic). em uma modalidade típica, o detergente não iônico é triton x-100. em outras modalidades, o detergente não iônico é np-40. [0062] em algumas modalidades, o detergente é um detergente zwiteriônico. exemplos não limitadores de um detergente zwiteriônico incluem 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato (chaps), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-2-hidroxi-1-propanossulfonato (chapso), n-decil-n,n-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato (sulfobetaína 3-10), n-tetradecil-n,n-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato (sulfobetaína 3-14), n-dodecil-n,n-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato (sulfobetaína 3-12), amidossulfobetaína-14, amidossulfobetaína-16, 4-n-octilbenzoilamido-propil-dimetilamônio-sulfobetaína, e 3-(1-piridino)-1-propanossulfonato (não detergente sulfobetaína 201). [0063] em algumas modalidades, o detergente é formulado com um agente antiespumante (eliminador de espuma). o antiespumante é um aditivo químico que reduz e/ou impede a formação de espuma em um líquido. exemplos não limitadores de um agente antiespumante incluem agente antiespumante orgânico (por exemplo, antiespumante 204, antiespumante o-30) e agente antiespumante à base de silicone (por exemplo, antiespumante a, antiespumante b, antiespumante c, antiespumante y-30). em uma modalidade típica, a concentração final de uma agente antiespumante será pelo menos cerca de 0,001% habitualmente até cerca de 0,5%. [0064] em algumas modalidades, o sal divalente e a solução para extração são adicionados à amostra biológica simultaneamente. em algumas modalidades, o sal divalente é adicionado à amostra antes da adição da solução para extração ou de qualquer componente da solução para extração durante a fase de pré-lise da extração. [0065] nos métodos da invenção, um tampão ácido é adicionado ao lisado em uma quantidade suficiente para reduzir o ph para menor que cerca de ph 5, tipicamente menor que cerca de 4, habitualmente menor que cerca de ph 3, e frequentemente tão baixo quanto cerca de ph 1. sob condições de ph baixo, as nucleases residuais são adicionalmente desnaturadas, permanecem inativas e são incapazes de degradar ácidos nucleicos. também, os íons de metais de transição e os íons de metais alcalinos terrosos perdem afinidade pelas nucleases e outras metaloproteases no lisado, e retornam para a solução. assim as condições de ph baixo facilitam a remoção dos sais de metais e de outros inibidores durante as etapas de lavagem subsequentes. aquelas pessoas versadas reconhecerão que a concentração final do tampão ácido dependerá de numerosos fatores que incluem o tampão específico usado e a amostra sendo analisada. em uma modalidade típica, a concentração final do tampão ácido será pelo menos cerca de 10 mm, habitualmente até cerca de 250 mm. [0066] em algumas modalidades, o tampão ácido é um tampão de ácido acético ou um tampão de ácido cítrico. outros exemplos de tampões ácidos úteis na invenção incluem ácido oxálico, ácido fluorídrico, ácido trifluoroacético, glicina, ácido pirúvico, ácido lático, e quaisquer aminoácidos em uma concentração de pelo menos 10 mm, habitualmente até cerca de 250 mm. [0067] os resultados experimentais aqui fornecidos mostram que, no caso de amostras que compreendem o vírus da hepatite b, a extração de ácido nucleico alvo pode ser adicionalmente aprimorada por aquecimento da amostra biológi