Patent ES-2582369-T3 (ES)
Title: Método optimizado y definido para el aislamiento y la preservación de células precursoras de cordón umbilical humano
Inventor: GANCHAS SOARES RITA ISABEL
IPC: C12N5/0775
Filed: 2008-10-03
Granted: 2016-09-12
Abstract: Método de selección para aislar células de la matriz del codón umbilical humano caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) Una etapa de recuperación en la que el cordón umbilical humano se transportado a las instalaciones del laboratorio en un recipiente cerrado estéril, bien seco o sumergido en una solución tampón estéril, con o sin antibióticos, que preferentemente contiene 186 μg/ml de CaCl2·2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, 90 μg/ml de NaH2PO4 · 7H2O, 2000 μg/ml de glucosa, 10 U/ml de penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina; preferentemente a temperatura ambiente si se procesa en un periodo de 72 h, o entre 2 y 8 ºC, preferentemente a 4 ºC, si se procesa en un periodo entre 48 y 144 h después de la recogida; b) Tres etapas de lavado del cordón umbilical con una solución salina estéril, que contiene preferentemente 186 μg/ml de CaCl2,2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, y 90 μg/ml de NaH2PO4·7H2O; c) Una etapa de retirada de la membrana amniótica externa, donde la membrana amniótica se retira con la ayuda de pinzas estériles; d) Una etapa de fraccionamiento donde el cordón umbilical se fracciona transversalmente a lo largo de su eje longitudinal con ayuda de un escalpelo para producir fracciones de 2,5 cm (2,5 g); e) Una etapa de eliminación de coágulos de las fracciones resultantes de d), donde se realizan incisiones, con la ayuda de un escalpelo, en la ubicación donde los coágulos se identifican, y donde los coágulos se eliminan; f) Una etapa de agrupamiento donde las fracciones resultantes de e) se reúnen en grupos de 7, que se procesarán de manera independiente en las siguientes etapas; g) Una etapa de disociación celular para cada grupo de 7 fracciones, resultantes de f), llevadas a cabo en un matraz estéril y precintado que contiene una solución de digestión con pH tamponado, mediante la acción combinada de la colagenasa II y tripsina, donde la colagenasa II está a una concentración entre 0,0375 % y 0,075 % (peso/volumen de digestión total) y la tripsina está a una concentración de 0,125 % (peso/volumen de digestión total); manteniendo una relación constante entre la masa de tejido (gramos), el área superficial de la parte inferior del matraz (cm2), volumen de digestión (ml), y el volumen total del matraz (ml), de aproximadamente 1:2:2:37; y donde el matraz se incuba en condiciones definidas de tiempo de incubación, temperatura, dispersión térmica, humedad ambiente y agitación; más específicamente, comenzando a partir de un grupo de 7 fracciones de cordones umbilicales con aproximadamente 2,5 g cada uno, exento de coágulos de sangre; utilizando un volumen de solución de digestión de 35 ml; en un matraz de cultivo no ventilado y cerrado tal como un T175 con un volumen total de 650 ml, y un espacio de cabeza durante la digestión de 615 ml menos el volumen sumergido de las 7 fracciones en digestión; y donde la solución de digestión consiste en, además de enzimas, 186 μg/ml de CaCl2·2H2O, 400 μg/ml de KCl, 60 μg/ml de K2HPO4, 200 μg/ml de MgSO4·7H2O, 8000 μg/ml de NaCl, 350 μg/ml de NaHCO3, 90 μg/ml de NaH2PO4·7H2O, 1000 μg/ml de glucosa, y 76 μ/ml (0,260 mM) de EDTA; manteniendo el pH a 6,4 o superior; y donde la reacción enzimática se incuban durante un período de 4 h; a una temperatura constante de 37 ºC; en una incubadora seca cerrada; con agitación a una velocidad constante de 100 o 140 oscilaciones.min-1 (opm); preferentemente 100 opm, h) Una primera etapa de recuperación de las células disociadas del tejido, como se describe en g), que se recuperan mediante incubación horizontal estática del matraz cuando la digestión tiene lugar; durante un periodo de tiempo de 5 a 300 minutos, preferentemente de 30 minutos; a temperatura ambiente; seguido por transferencia del sobrenadante de la digestión por medio de pipeteado, evitando la succión de cualquier tejido sin digerir, a un tubo de centrífuga de 50 ml; que a su vez va seguida de la eliminación de todo el tejido sin digerir del matraz de digestión; al que se añaden 35 ml de medio de cultivo basal suplementado con desoxirribonucleasas, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos y 10 % de suero de feto bovino (FBS) y antibióticos; y en el que el tapón del matraz no venteado se sustituyó por un filtro que contenía un tapón venteado; seguido por incubación a 37 ºC, en una atmósfera humidificada que contenía un 7 % de CO2; con cambios del medio de cultivo cada 72 h para estimular la adhesión y el crecimiento/multiplicación celular hasta obtener la máxima confluencia en la superficie; i) Una segunda etapa de recuperación de células, donde las células disociadas del tejido, como se describe en g) y contenidas en el sobrenadante de centrifugación obtenido como se describe en h) se recuperan mediante centrifugación del tubo de centrífuga de 50 ml de h) a 350 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente; transferir 35 ml de volumen de sobrenadante tras la centrifugación a un matraz de cultivo estático (T175) con un filtro que contenía un tapón venteado; añadir al mismo matraz de cultivo 35 ml de medio de cultivo base suplementado con desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, glutamina, antibióticos y suero de feto de ternera (FBS) al 10 % y antibióticos; incubar el matraz de cultivo a 37 ºC, en una atmósfera humidificada que contenía un 7 % de CO2; y cambiar el medio de cultivo cada 72 h para estimular la adhesión y el crecimiento/multiplicación celular hasta obtener la máxima confluencia en la superficie; j) Una tercera etapa de recuperación donde las células disociadas del tejido, como se describe en g) se recuperan como aglomerado celular obtenido mediante la centrifugación del sobrenadante de la digestión como se describe en i), resuspendido en 2 ml de una solución que consiste en suero de feto bovino (FBS), y dimetil sulfóxido (DMSO) al 10 %, y criopreservación directa utilizando un congelador de velocidad controlada con una velocidad de disminución de la temperatura de 1 ºC.min-1, hasta -80 ºC, en un criovial estéril de 2,5 ml que contiene 2 ml de suspensión celular y 0,5 ml de espacio vacío; k) Una etapa de criopreservación de las poblaciones de células originadas como se describe en h) e i), después que los cultivos celulares alcanzan la máxima confluencia de la superficie, que consiste en la crioconservación directo en la fase de vapor de nitrógeno líquido de una mezcla de 0,5 ml de suspensión celular y 0,5 ml de una solución de suero de feto bovino (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO)al 10 %, de tal forma que la densidad celular final después de la criopreservación es de aproximadamente 3x106 célula/ml, en un criovial estéril de 1,5 ml, que contiene el 1,0 ml final de la suspensión celular y 0,5 ml de espacio vacío.