Patent WO-2014141170-A8 (WO)
Title: Procédé pour la génération de vecteurs polycystroniques
Inventor: RAHMAN WASSIM ABDUL
IPC: C12N15/66
Filed: 2014-03-14
Abstract: La présente invention concerne un procédé de génération de vecteurs acides nucléiques polycystroniques, ledit procédé comprenant les étapes de a) apport d'un premier vecteur acide nucléique, ledit premier vecteur acide nucléique comprenant : i) une origine de réplication placée devant ii) au moins un premier gène d'intérêt cloné fonctionnellement à l'intérieur d'une première cassette d'expression, ladite première cassette d'expression comprenant une séquence promotrice ainsi qu'une séquence de terminaison, ledit premier gène d'intérêt étant situé entre ladite séquence promotrice et ladite séquence de terminaison, iii) un gène marqueur, conjointement avec sa séquence de terminaison, ledit gène marqueur étant situé en aval d'une séquence cible pour une recombinase, le promoteur nécessaire pour l'expression dudit gène marqueur dans une cellule hôte étant absent dudit premier vecteur acide nucléique, et facultativement iv) un premier gène marqueur supplémentaire qui est différent du gène marqueur de iii), ledit premier gène marqueur supplémentaire étant situé à l'intérieur de ladite première cassette d'expression de ii) ou à l'intérieur d'une autre cassette d'expression, ledit premier gène marqueur supplémentaire permettant la sélection de cellules comprenant ledit premier vecteur acide nucléique au cours du procédé de génération dudit premier vecteur acide nucléique ; b) apport d'un second vecteur acide nucléique, ledit second vecteur acide nucléique comprenant i) une origine de réplication placée devant ii) au moins un second gène d'intérêt fonctionnellement cloné à l'intérieur d'une seconde cassette d'expression, ladite seconde cassette d'expression comprenant une séquence promotrice ainsi qu'une séquence de terminaison, ledit second gène d'intérêt étant situé entre ladite séquence promotrice et ladite séquence de terminaison, iii) un promoteur situé en amont de la même séquence cible pour une recombinase telle que présente devant le gène marqueur de iii) dans le premier vecteur acide nucléique, ledit promoteur étant approprié pour l'expression, dans une cellule hôte, dudit marqueur compris dans ledit premier gène de vecteur acide nucléique, et iv) facultativement un second gène marqueur supplémentaire qui est différent du gène marqueur de iii), le second gène marqueur supplémentaire étant situé à l'intérieur de ladite seconde cassette d'expression de ii) ou à l'intérieur d'une cassette d'expression supplémentaire, ledit second gène marqueur supplémentaire permettant la sélection de cellules comprenant ledit premier vecteur acide nucléique au cours du procédé de génération dudit second vecteur acide nucléique, et c) mise en contact, dans des conditions appropriées pour qu'ait lieu une recombinaison, un mélange des premier et second vecteurs acides nucléiques avec une recombinase, laquelle recombinase recombine spécifiquement les séquences cibles de iii) qui sont respectivement situées en aval du promoteur du second vecteur acide nucléique et en amont du gène marqueur du premier vecteur acide nucléique.