Patent ES-2686043-T3 (ES)
Title: Método para preparar una biblioteca de moléculas de ácido nucleico
Inventor: SEITZ ALEXANDER
IPC: C12Q1/68
Filed: 2012-09-17
Granted: 2018-10-16
Abstract: Método para generar una biblioteca de partes de ácido nucleico amplificadas de un ácido nucleico molde, que comprende A) obtener dicho ácido nucleico molde, que es ARN, emparejar al menos un cebador oligonucleotídico con dicho ARN molde, emparejar al menos un finalizador oligonucleotídico y/o cebador adicional con dicho ARN molde, preferentemente en el que el finalizador oligonucleotídico se hibrida con al menos un cebador oligonucleotídico adicional por un par de marcadores de secuencia complementarios en el finalizador y cebador, en el que uno cualquiera de los finalizadores oligonucleotídicos comprende un marcador de secuencia o se hibrida con un marcador de secuencia, y uno cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos comprende un marcador de secuencia o se hibrida con un marcador de secuencia, y en el que el marcador de secuencia no se empareja con el molde, elongar el al menos un cebador oligonucleotídico de una manera específica de molde hasta que el ácido nucleico producto de elongación alcanza la posición de un finalizador oligonucleotídico o cebador adicional emparejado, por lo que se detiene la reacción de elongación, en el que en dicha reacción de elongación dicho finalizador oligonucleotídico opcional no se elonga y/o dicho cebador oligonucleotídico adicional se elonga de una manera específica de molde, en el que el ácido nucleico producto elongado se liga con (i) el extremo 5' de dicho finalizador oligonucleotídico que se hibrida con la cadena molde o (ii) el extremo 5' de dicho cebador adicional que se hibrida con la cadena molde o con (iii) un marcador de secuencia que se hibrida con dicho finalizador o cebador adicional en las cercanías del extremo 3' del producto elongado proporcionando el marcador de secuencia hibridado a una región complementaria del finalizador oligonucleotídico o cebador adicional que está unido al extremo 5' de la región hibridada con el molde del finalizador o cebador adicional; o B) obtener dicho ácido nucleico molde, que es preferentemente ARN o ADN, emparejar al menos un cebador oligonucleotídico con dicho ácido nucleico molde, emparejar al menos un finalizador oligonucleotídico con dicho ácido nucleico molde, opcionalmente en el que el finalizador oligonucleotídico se hibrida con al menos un cebador oligonucleotídico adicional por un par de marcadores de secuencia complementarios en el finalizador y cebador, en el que uno cualquiera de los finalizadores oligonucleotídicos comprende un marcador de secuencia o se hibrida con un marcador de secuencia, y uno cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos comprende un marcador de secuencia o se hibrida con un marcador de secuencia, y en el que el marcador de secuencia no se empareja con el molde, elongar el al menos un cebador oligonucleotídico de una manera específica de molde hasta que el ácido nucleico producto de elongación alcanza la posición de un finalizador oligonucleotídico, por lo que se detiene la reacción de elongación, en el que en dicha reacción de elongación dicho finalizador oligonucleotídico no se elonga, y en el que el ácido nucleico producto elongado se liga con (i) el extremo 5' de dicho finalizador oligonucleotídico que se hibrida con la cadena molde o con (ii) un marcador de secuencia que se hibrida con dicho finalizador en las cercanías del extremo 3' del producto elongado proporcionando el marcador de secuencia hibridado a una región complementaria del finalizador oligonucleotídico que está unido al extremo 5' de la región hibridada con el molde del finalizador; o C) obtener dicho ácido nucleico molde, que es preferentemente ARN o ADN, emparejar un primer cebador oligonucleotídico con dicho ácido nucleico molde, emparejar al menos un cebador oligonucleotídico adicional con dicho ácido nucleico molde, en el que uno cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos y uno cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos adicionales comprende un marcador de secuencia o se hibrida con un marcador de secuencia, y en el que el marcador de secuencia no se empareja con el molde, elongar dicho primer cebador oligonucleotídico de una manera específica de molde hasta que el ácido nucleico producto de elongación alcanza la posición de uno de dichos cebadores oligonucleotídicos adicionales, por lo que se detiene la reacción de elongación, y se elonga al menos un cebador oligonucleotídico adicional de una manera específica de molde, en el que el ácido nucleico producto elongado detenido se liga con (i) el extremo 5' de dicho cebador oligonucleotídico adicional que se hibrida con la cadena molde o con (ii) un marcador de secuencia que se hibrida con dicho cebador en las cercanías del extremo 3' del producto elongado proporcionando el marcador de secuencia hibridado a una región complementaria del cebador adicional que está unido al extremo 5' de la región hibridada con el molde del cebador adicional; en el que en A, B y C el producto de elongación se selecciona o amplifica usando un cebador que hibrida con el marcador de secuencia en el finalizador o cebador adicional.