Patent ES-2533370-T3 (ES)
Title: Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas
Inventor: HELLINGA HOMME W
IPC: C12N15/90
Filed: 2006-10-18
Granted: 2015-04-09
Abstract: Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende: transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos que incluyen (i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión; en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa 1-Msol de SEC ID Nº: 6; y en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa 1-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8; en el que: (1) se ha alterado la especificidad en la posición -1: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79, o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o (2) se ha alterado la especificidad en la posición -2: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, 147 y L47; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47 y E81; yo (3) se ha alterado la especificidad en la posición -3: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 y L26; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o (c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o (4) se ha alterado la especificidad en la posición -4: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28; (b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K82, o (c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o (5) se ha alterado la especificidad en la posición -5: (a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o (c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o (6) se ha alterado la especificidad en la posición -6: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o (7) se ha alterado la especificidad en la posición -7: (a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41; (b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41; (c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e I41; y/o (8) se ha alterado la especificidad en la posición -8: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o (9) se ha alterado la especificidad en la posición -9; (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34, en la que la meganucleasa recombinante no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa I-Msol de SEC ID Nº: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.