Patent ES-2660185-T3 (ES)
Title: Métodos para acoplar péptidos direccionadores a enzimas lisosomales recombinantes para optimizar los tratamientos de las enfermedades por depósito lisosomal
Inventor: DO HUNG
IPC: C12N9/16
Filed: 2012-05-25
Granted: 2018-03-21
Abstract: Un método para preparar un péptido direccionador conjugado con una enzima lisosomal recombinante, método que comprende lo siguiente: (a) i. modificar el término amino (N) y uno o más residuos de lisina en una enzima lisosomal recombinante humana, usando un primer agente entrecruzador para generar una enzima lisosomal recombinante humana modificada por un primer agente entrecruzador; ii. modificar el primer aminoácido de un enlazador corto en el término amino (N) en un péptido de la variante IGF-2, usando un segundo agente entrecruzador para generar un péptido de la variante IGF-2 modificado por el segundo agente entrecruzador y iii. conjugar la enzima lisosomal recombinante humana modificada con el primer agente entrecruzador con el péptido de la variante IGF-2 que contiene un enlazador corto modificado por el segundo agente entrecruzador o (b) conjugar un agente entrecruzador heterobifuncional con un péptido de la variante IGF-2; y conjugar el péptido de la variante IGF-2 modificado por un agente entrecruzador heterobifuncional con una enzima lisosomal recombinante humana, por reacción con el término N y uno o más residuos de lisina en la enzima lisosomal recombinante humana o (c) conjugar un agente entrecruzador heterobifuncional con una enzima lisosomal recombinante humana por reacción con el término N y uno o más residuos de lisina en la enzima lisosomal recombinante humana; y conjugar la enzima lisosomal recombinante humana modificada por el agente entrecruzador heterobifuncional con un péptido de la variante IGF-2; donde la enzima lisosomal recombinante humana se selecciona entre α-glucosidasa recombinante humana (rhGAA), δ-galactosidasa A (GLA) recombinante humana, ß-glucuronidasa ácida (GUS) recombinante humana, δ-iduronidasa A (IduA) recombinante humana, isuronidato 2-sulfatasa (I2S) recombinante humana, ß-hexosaminidasa A (HexA) recombinante humana, ß-hexosaminidasa B (HexB) recombinante humana, δ-manosidasa A recombinante humana, ß-glucocerebrosidasa (GlcCerase) recombinante humana, lipasa ácida recombinante humana (LPA) o cualquiera de sus combinaciones y donde el primer agente entrecruzador se selecciona entre N- succinimidil-6-hidrazinonicotinato acetona (S-Hynic), sulfo-succinimidil-6-hidrazonicotinato acetona (sulfo-S-HyNic), C6-succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (C6-SHynic), clorhidrato de succinimidil-4-hidrazidotereftalato (SHTH) clorhidrato de succinimidil-4-hidrazino nicotinato (SHNH) o N-hidroxisuccinimida-éster-(PEG)n-hidrazida, donde n está representado por 3-24 unidades de PEG; y el segundo agente entrecruzador se selecciona entre PEG4-pentafluorobencen-4-formilbenzoato (PEG4-PFB), succinimidil-4-formilbenzoato (SFB) y C6-succinimidil-4-formilbenzoato (C6-SFB) o el primer agente entrecruzador se selecciona entre N-hidroxisuccinimida éster fosfina (NHS-fosfina), sulfo-Nhidroxisuccinimida éster-fosfina (sulfo-NHS-fosfina), N- hidroxisuccinimida éster-tetraoxapentadecan-acetileno (NHS35 PEG4-acetileno) o N- hidroxisuccinimida éster-(PEG)n acetileno, donde n representa 3-24 unidades de PEG, entrecruzadores heterobifuncionales escindibles, tales como NHS-PEG3-S-S-acetileno o entrecruzadores heterobifuncionales que contienen ciclooctinas, tales como difluorociclooctina (DIFO) y dibenzociclooctina (DIBO); y el segundo agente entrecruzador se selecciona entre N-hidroxisuccinimida éster-PEG4-azida (HS-PEG4-azida), Nhidroxisucciniminda éster azida (NHS-azida), N-hidroxisuccinimida éster-(PEG)n azida, donde n representa 3-24 unidades de PEG, o NHS-PEG3-S-S-azida o el agente entrecruzador heterobifuncional se selecciona entre m-maleimidobenciol-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), sulfo-m-maleimidobenciol-N-hidroxisuccinimida éster (sulfo-MBS) y sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC); y donde el péptido de la variante IGF-2 comprende uno o más de las siguientes modificaciones con respecto a la secuencia IGF-2 nativa humana: sustitución de leucina por tirosina en la posición 27; sustitución de leucina por valina en la posición 43; sustitución de arginina por lisina en la posición 65; y/o el péptido de la variante IGF-2 comprende una etiqueta de afinidad y/o una región de extensión enlazadora de al menos 5 aminoácidos que preceden al IGF-2. sustitución de arginina por ácido glutámico en la posición 6; eliminación de aminoácidos 1-4 y 6; eliminación de aminoácidos 1-4, 6 y 7; eliminación de aminoácidos 1-4 y 6 y sustitución de lisina por treonina en la posición 7; eliminación de aminoácidos 1-4 y sustitución de glicina por ácido glutámico en la posición 6 y sustitución de lisina por treonina en la posición 7;