Patent ES-2741740-T3 (ES)
Title: Métodos que usan moléculas sintéticas que contienen segmentos de nucleótidos aleatorios
Inventor: SHERWOOD ANNA M
IPC: C07H21/04
Filed: 2015-03-05
Granted: 2020-02-12
Abstract: Un método para corregir el sesgo de amplificación en una reacción de PCR de una muestra, el método comprende: A) amplificar por PCR múltiple, secuenciar, y cuantificar las lecturas de salida de: (i) moléculas plantilla biológicas que comprenden secuencias oligonucleotídicas de CDR3 reordenadas de loci de receptor de células T (TCR) de células T o loci de inmunoglobulina (Ig) de células B, cada secuencia comprende un segmento V de TCR o IG y un segmento J de TCR o IG, para obtener un número total de lecturas de secuencias biológicas de salida; y (ii) moléculas plantilla sintéticas que comprenden cada una un segmento V de TCR o Ig y un segmento J de TCR o IG, secuencias adaptadoras universales de cebadores directos y/o inversos, uno o más códigos de barras que identifican las moléculas plantilla como sintéticas, una secuencia oligonucleotídica de marcador interno, y una secuencia oligonucleotídica aleatoria, en donde cada secuencia oligonucleotídica aleatoria comprende una secuencia de nucleótidos única, y en donde cada molécula plantilla sintética comprende una combinación única de un segmento V y un segmento J, para obtener un número total de lecturas de secuencias sintéticas de salida; B) agrupar las lecturas de secuencias al: (i) extraer dichas lecturas de secuencias; (ii) identificar si una lectura de secuencia es una lectura de secuencia biológica o una lectura de secuencia sintética al: (a) comparar las lecturas de secuencias contra las secuencias plantilla sintéticas conocidas mediante el uso de una primera métrica para identificar secuencias plantilla sintéticas, mientras se ignora la porción de la lectura de secuencia que se espera corresponda a la secuencia oligonucleotídica aleatoria en secuencias sintéticas; (b) comparar las lecturas de secuencias sin coincidencia restantes contra las secuencias plantilla sintéticas conocidas mediante el uso de una segunda métrica, mientras se ignora la porción de la lectura de secuencia que se espera corresponda a la secuencia oligonucleotídica aleatoria en secuencias sintéticas; (iii) agrupar las lecturas de secuencias sintéticas mediante el colapso de las lecturas de secuencias que coinciden con la misma secuencia oligonucleotídica sintética esperada y comparten la misma secuencia oligonucleotídica aleatoria; (iv) asignar a cada grupo de lecturas de secuencias sintéticas, en base a la secuencia oligonucleotídica sintética esperada con la que coincidieron, una secuencia consenso que comprende la secuencia esperada de la secuencia oligonucleotídica sintética con la que coincidieron, que incluye un segmento V y un segmento J; y (v) determinar un número total de lecturas de secuencias sintéticas observadas en cada grupo; C) calcular uno o más factores de normalización para los segmentos V y los segmentos J en las lecturas de secuencias sintéticas al: (i) calcular un recuento de lecturas promedio entre todos los grupos de secuencias que coincidieron con cada secuencia oligonucleotídica sintética; (ii) calcular una media general de los recuentos de lecturas promedio para cada segmento V y J único, entre las secuencias oligonucleotídicas sintéticas que contienen un V dado y cualquier J o viceversa; (iii) calcular un sesgo de amplificación promedio mediante la división del recuento de lecturas promedio de cada segmento V y segmento J calculado en la etapa C(ii) por la media general de los recuentos de lecturas promedio de los segmentos V o de los recuentos de lecturas promedio de los segmentos J calculada en la etapa C(ii) para llegar a un factor de amplificación para cada segmento V y J; y (iv) producir el factor de normalización para un segmento V o J dadomediante el cálculo del recíproco del sesgo de amplificación promedio producido en la etapa C(iii); y D) multiplicar el recuento de lecturas de secuencias observadas de cada secuencia biológica única dada por el factor de normalización calculado en la etapa C(iv) correspondiente al segmento V presente en esa secuencia biológica única y por el factor de normalización calculado en la etapa C(iv) correspondiente al segmento J presente en esa secuencia biológica única, para corregir de este modo el sesgo de amplificación en la reacción de PCR múltiple de la muestra.