Patent ES-2686168-T3 (ES)
Title: Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada
Inventor: TANGY FRÉDÉRIC
IPC: C12N15/86
Filed: 2007-12-21
Granted: 2018-10-16
Abstract: Una célula recombinante que comprende integrados en su genoma al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de manera estable, y donde dichos derivados funcionales de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la nucleoproteína (N) y/o la fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o de la proteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en: a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación del 50 % de formamida, 6X SSC a 42º C y condiciones de lavado a 68º C, 0,2X SSC y el 0,1 % de SDS) con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 y la proteína P de SEQ ID NO: 15 de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada; b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % o incluso el 99 % de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias; y c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15 en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido; o, siendo un fragmento que representa al menos el 70 %, particularmente el 80 % y más particularmente el 90 % o incluso el 95 % de la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15.