Patent RU-2754874-C1 (RU)
Inventor: Raskurazhev Anton Alekseevich
IPC: C12N15/10
Filed: 2020-12-30
Granted: 2021-09-08
Abstract: Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к способу выделения и определения атерогенных микроРНК из биологических жидкостей у больных с атеросклерозом. Выделение из крови атерогенных микроРНК выполняют в три этапа. На  первом этапе проводят лизис эритроцитов путем перемешивания на вортексе образца крови в течение 10 секунд с Лизис-буфером RBC. Затем  инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют в течение 3 минут при 1000 об/мин для осаждения клеток. К полученному осадку вновь добавляют Лизис-буфер RBC, после чего к полученной лейкоцитарной взвеси добавляют буфер RL и встряхивают на вортоксе до получения гомогенного состояния - лизата. На втором этапе лизат пропускают через колонку и центрифугируют в течение 3 минут при 14000 об/мин. К  полученной суспензии-смеси добавляют 70% спирт. Вновь  пропускают через колонку и центрифугируют в течение одной минуты при 6000 об/мин. Полученную  суспензию еще раз вносят в колонку и добавляют промывочный раствор А.   Центрифугируют  в течение одной минуты при 14 об/мин, затем вносят в колонку DNase I.   Вновь  центрифугируют в течение одной минуты при 14 об/мин. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. На третьем этапе в колонку вновь дважды вносят промывочный раствор А и дважды центрифугируют в течение одной минуты при 14000 об/мин. Затем  колонку с образцом высушивают на воздухе в течение 2 минут и вносят в нее Elution solution А для элюирования микроРНК, после чего центрифугируют в течение одной минуты при 2000 об/мин и затем в течение двух минут при 14000 об/мин. Далее проводят определение в полученном образце микроРНК количества их копий на амплификаторе CFX Touch. Полученный образец вносят в мини-пробирку Эппендорфа в количеств 2 мкл, добавляют к образцу буфер 3 мкл Polly А, 3 мкл АТФ, 1,8 мкл фермента Polly А и 10,2 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 65°С в течение 10 минут, после чего вносят 18 мкл лигазного буфера, 27 мкл PEG 800 А, 3,6 мкл адаптера для лигирования, 9 мкл РНК-лигазы, 2,4 мкл дистиллированной воды и вновь полученную смесь инкубируют при 16°С в течение 1 часа. Затем   добавляют следующее: 36 мкл 5х BufferRT, 7,2 мкл смеси dNTP, 9 мкл праймера Universal RT, 15 мкл смеси Enzyme, 20 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 85°С в течение 5 минут, получая экстрагированный образец. Далее готовят раствор перемешивания 300 мкл MiR Amp master Mix, 30 мкл MiR Amp primer Mix и 210 мкл дистиллированной воды. После чего 45 мкл полученного раствора добавляют к 5 мкл экстрагированного образца и проводят ПЦР, начиная с этапа обратной транскрипции по следующей программе РНК-1: 1 цикл - 5 минут при температуре 95°С, 14 циклов - 30 секунд при температуре 60°С, 10 минут при температуре 99°С, затем удержание при температуре 4°С. Далее образец вносят в 5 чистых мини-пробирок Эппендорфа по 5 мкл в каждую, в которые затем вносят по 4 мкл дистиллированной воды и праймеры-зонды микроРНК в количестве 2 мкл при следующем порядке внесения праймеров-зондов микроРНК: в первую - 126-5р; во вторую - 126-3р; в третью - 33а-5р; в четвертую - 21-5р; в пятую - 21-3р. Затем в каждую пробирку добавляют 10 мкл раствора основной смеси, содержащей TaqMan Fast Advanced и буфер TaqMan Fast Advanced Buffer в соотношении 1:100 соответственно.   Проводят  программу амплификации РНК-2: 1 цикл - 20 мин при температуре 95°С, 40 циклов по 1 минуте при температуре 95°С, затем удержание при температуре 4°С, получая при этом количество копий атерогенных микроРНК.   Изобретение позволяет   с высокой точностью выделить и определить атерогенные микроРНК из крови пациентов с каротидным атеросклерозом. 2 табл., 1 пр.