Patent ES-2898088-T3 (ES)
Title: Inmuno-PETE
Inventor: BERKA JAN
IPC: C12Q1/6881
Filed: 2017-06-01
Granted: 2022-03-03
Abstract: Un procedimiento para enriquecer, a partir de una muestra, una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden regiones del gen V, J y, opcionalmente, C o D, del receptor de células inmunitarias, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una mezcla de reacción, en la que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen V de los polinucleótidos diana; b) extender los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, y, a continuación, retirar los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos, si están presentes, en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos comprenden al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias; c) hibridar un primer adaptador universal al sitio de hibridación de adaptador de [PUENTE] de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos; en el que dicho adaptador universal es un adaptador bicatenario, que comprende: una región con protuberancia monocatenaria en 5' que se puede hibridar al sitio de hibridación de adaptador de PUENTE de dichos cebadores extendidos; d) ligar los primeros adaptadores universales hibridados a los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, y, a continuación, retirar los adaptadores no ligados, si están presentes; e) hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen J en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5' o hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de C de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen C en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5'; y f) extender los cebadores específicos para el gen J o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes, comprendiendo cada uno al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J o región de C del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal, comprendiendo dicha mezcla de reacción i) una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias; y ii) una pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias estructuralmente distintos, en el que la pluralidad comprende al menos 10 cebadores estructuralmente distintos que tienen las siguientes regiones de 5' a 3': [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW], en las que: [5'-Fos] comprende un fosfato en 5'; 5 [PUENTE] comprende un sitio de hibridación de adaptador de 2-8 nucleótidos de longitud; [CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de al menos 6 nucleótidos de longitud, en la que cada nucleótido de la región de código de barras se selecciona independientemente del grupo que consiste en N y W; y [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias comprende una región estructuralmente distinta que se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.