Patent UA-153434-U (UA)
Title: Тест-система для оцінки життєздатності грибів у нігтьових пластинах
Filed: 2022-12-15
Abstract: Тест-система для оцінки життєздатності грибів у нігтьових пластинах методом полімеразної ланцюгової реакції включає екстракцію ДНК з біологічного матеріалу нігтя, проведення ПЛР та детекцію продуктів ампліфікації в агарозному гелі. При цьому доставлені у лабораторію нігтьові пластини ретельно подрібнюють, екстракцію тотальної ДНК/РНК з клінічного матеріалу, який беруть в кількості 100 мкл, проводять з розчином гуанідину тіоціанату як хаотропним агентом, який складається з 6 Μ гуанідин-НСl, 10 мМ Трис-НСl, 20 % тритон Х-100, рН 4,4, якого беруть у кількості 300 мкл; негативний контроль - 100 мкл очищеної води, вільної від РНК-аз; при цьому вміст усіх пробірок ретельно перемішують та центрифугують; реакційну суміш інкубують протягом 20 хвилин при 65 °C в термостаті, перемішують. Далі у кожну пробірку додають 500 мкл ізопропанолу, перемішують та центрифугують; при цьому супернатант обережно відбирають, осад залишають для відмивання; відмивання виконують двічі; додають 500 мкл розчину для відмивання, який містить 95 % розчину етанолу (кінцева концентрація після додавання абсолютного етанолу 20 мМ NaCl, 2 мМ Трис-НСl, рН 7,5), обережно промивають осад та центрифугують, після центрифугування супернатант обережно відбирають, осад залишають для подальшого відмивання. Далі в кожну пробірку додають 500 мкл розчину для відмивання, який містить 70 % розчину етанолу, обережно промивають осад та центрифугують, після цього супернатант відбирають; пробірки з осадом інкубують в термостаті протягом 5 хвилин при температурі 65 °C; при цьому в пробірки з осадом додають 70 мкл ТЕ-буферу, який складається з 10 мМ Трис-НСl, рН 7,4; 1 мМ ЕДТА, рН 8,0, для розчинення очищеної суміші ДНК/РНК, перемішують. Частину суміші продуктів екстракції тотальної ДНК/РНК відбирають для проведення ПЛР для підтвердження наявності специфічної ділянки ДНК грибів у матеріалі, що досліджується; для деградації ДНК до проведення реакції зворотної транскрипції до суміші продуктів екстракції тотальної ДНК/РНК додають розчин ДНК-ази І, вільної від РНК-ази (1 U/μL), з відповідним буфером, виробництва ThermoFisher Scientific, Литва, та інкубують при 37 °C протягом 30 хвилин. Після інкубації та інактивації частину суміші відбирають для проведення ПЛР для підтвердження відсутності специфічної ділянки ДНК; отримані зразки використовують як матрицю для синтезу кДНК для проведення зворотної транскрипції за допомогою M-MLV зворотної транскриптази (200 U/μL) виробництва ThermoFisher Scientific з відповідним буфером та ТЕ-буфер (ДНК буфер); реакцію зворотної транскрипції проводять з використанням комерційного набору реагентів REVERTA-FL RT reagents kit варіант 100 виробництва AmpliSens; після реакції зворотної транскрипції частину суміші відбирають для проведення ПЛР для підтвердження відсутності чи присутності кДНК; при цьому кДНК використовують для подальшої ампліфікації; як праймери використовують ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3, Taq ДНК-полімеразу виробництва ThermoFisher Scientific, Литва. Для ампліфікації використовують наступний температурний та часовий режим: 1 цикл: попередня денатурація при 95 °C 10 хвилин; 45 циклів: денатурація при 94 °C 30 секунд, відпал при 60 °C 30 секунд, елонгація 72 °C 30 секунд; детекцію продуктів ампліфікації проводять методом горизонтального електрофорезу в 2,0 % гелі агарози з вмістом 0,5 нг/мл етидіуму броміду з візуальним аналізом на трансілюмінаторі при довжині світла 310 нм; позитивний результат реакції на електрофореграмі вважається, коли присутній амплікон відповідного розміру на тому ж рівні, що і амплікон позитивного контрольного зразка; як стандарт молекулярної маси використовують маркер молекулярної маси SM 1191 "Fermentas", Литва; продукти ампліфікації мають розмір від 600 до 700 н.п.