Patent AR-061471-A1 (AR)
Title: Un control interno de amplificacion (iac) para la tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) mk
Filed: 2007-06-14
Abstract: Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un importante patogeno emergente transmitido por alimentos asociado a síndrome urémico hemolítico (SUH). En argentina el SUH es endémico y a partir de abril de 2000 se lo declaro de notificacion, obligatoria, inmediata, e individualizada (Resolucion 346/00). El diagnostico temprano en las primeras etapas de la infeccion es fundamental para un adecuado tratamiento del caso clínico y control de los convivientes y contactos. El principal reservorio son los rumiantes. E. coli O157:H7 es el prototipo de más de 150serotipos productores de toxinas Shiga que comparten el mismo potencial patogénico. La recomendacion de aplicacion de una técnica de tamizaje sensible como la PCR es citado en la bibliografía para el diagnostico clínico y para la deteccion en alimentos. En la industria de alimentos cárnicos se realiza la deteccion de STEC O157:H7/NM de acuerdo al Codigo Alimentario Argentino (Artículos 156tres, 255 y 302). Sin embargo, la deteccion de STEC no-O157 no se realiza rutinariamente. Se propone utilizar como técnica de tamizaje la PCR-MK para la deteccion de los genes stx1 y stx2 utilizando un control interno de amplificacion (IAC), a partir de alimentos cárnicos. La utilizacion de IAC es fundamental para garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos trabajando directamente con la matriz del alimento. Teniendo en cuenta que en Argentina la frecuencia de deteccion de Stec no-O157 en casos de SUH es aproximadamente frl 30%, es indispensable contar con una técnica sensible para dicho patogeno. La PCR-MK en presencia del IAC es una técnica rápida, economica y apropiada para la deteccion de microorganismos productores de toxina Shiga O157 y no- O157 en muestras de alimentos cárnicos luego de un enriquecimiento en medios de cultivo líquido. En la presente patente se presenta un fragmento de ADN de 150 pb especialmente disenado para ser utilizado como Control Interno de Amplificacion (IAC) en la PCR-MK para la deteccion de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) O157 y no-O157. Se denomina IAC competitivo a un fragmento de ADN de secuencia conocida que presenta los sitios de reconocimiento para los mismos cebadores utilizados para amplificar el ADN blanco (Siebert y Larrick, 1992). Esta secuencia de ADN es incorporada a cada tubo de PCR y compite con el ADN blanco por los cebadores, por lo que se la denomina PCR competitiva. Este tipo de PCR permite asegurar los resultados obtenidos pues confirma si el sistema de PCR funciono correctamente en cada tubo. La interpretacion de los resultados obtenidos utilizando una PCR que incluye un IAC competitivo puede ser la siguiente: 1) si la secuencia blanco es amplificada pero la secuencia IAC no, se asume que la secuencia blanco está presente en mayor proporcion que el IAC. Cuando esto ocurre, el resultado positivo es válido porque la amplificacion del IAC es innecesaria; 2) si la secuencia blanco no es amplificada pero la secuencia IAC si, se asume que la secuencia blanco no está presente o lo está en menor proporcion que el IAC. Cuando esto ocurre se considera que el resultado es negativo; 3) si ambas secuencias IAC y blanco no son ampliadas, se asume que la muestra posee inhibidores de la PCR y por lo tanto el ensayo no es válido.