Patent ES-2881080-T3 (ES)
Title: Amplificación de ácidos nucleicos
Inventor: BELHOCINE KAMILA
IPC: C07H1/00
Filed: 2014-03-15
Granted: 2021-11-26
Abstract: Un método para copiar una plantilla polinucleotídica, el método comprende: (A) hibridar un ácido nucleico que comprende la plantilla polinucleotídica con un primer cebador, en donde: la plantilla polinucleotídica comprende en la dirección 5' a 3' una segunda secuencia de nucleótidos y una primera secuencia de nucleótidos; y el primer cebador comprende en la dirección 5' a 3' una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la segunda secuencia de nucleótidos del primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la primera secuencia de nucleótidos de la plantilla polinucleotídica; (B) sintetizar un primer producto de extensión a partir del primer cebador en presencia de una polimerasa; (C) hibridar un segundo cebador con el primer producto de extensión, en donde el segundo cebador comprende en la dirección 5' a 3' una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, en donde la segunda secuencia de nucleótidos del segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos asociada, en donde la secuencia de nucleótidos asociada es una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos de la plantilla polinucleotídica; en donde la primera secuencia de nucleótidos del primer y segundo cebadores son complementarias entre sí; (D) sintetizar un segundo producto de extensión a partir del segundo cebador en presencia de la polimerasa; (E) hibridar el primer cebador con el extremo 3' del segundo producto de extensión y sintetizar un tercer producto de extensión a partir del primer cebador en presencia de una polimerasa; (F) generar un ácido nucleico bicatenario que comprende el tercer producto de extensión y el segundo producto de extensión; (G) repetir al menos las etapas (E)-(F) una o más veces adicionales para generar al menos una primera copia y una segunda copia del ácido nucleico bicatenario que comprende el tercer producto de extensión y el segundo producto de extensión; (H) hibridar la región terminal 3' del tercer producto de extensión de la primera copia del ácido nucleico bicatenario con la región terminal 3' del segundo producto de extensión de la segunda copia del ácido nucleico bicatenario para producir una estructura cruzada; (I) sintetizar un cuarto producto de extensión a partir del tercer producto de extensión de la etapa (H) y un quinto producto de extensión a partir del segundo producto de extensión de la etapa (H) en presencia de una polimerasa; y producir un concatémero que comprende al menos dos copias de la plantilla polinucleotídica, en donde el concatémero comprende el cuarto producto de extensión y el quinto producto de extensión, y en donde el concatémero comprende una primera cadena de concatémero, en donde la primera cadena de concatémero comprende un extremo 5' y un extremo 3', y comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la estructura general en la dirección 5' a 3' de: C'-T-C'-T-C', en donde: C' representa la secuencia de nucleótidos de la primera región del segundo cebador y T representa la secuencia de nucleótidos de la plantilla polinucleotídica o una secuencia análoga de esta; y en donde las etapas (A) a (J) se realizan en una mezcla de reacción a una temperatura isotérmica y en donde la mezcla de reacción no comprende una enzima recombinasa; en donde la plantilla polinucleotídica es bicatenaria y, en donde la mezcla de reacción comprende además una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadena.