Patent AR-109914-A1 (AR)
Title: Método de preparación de péptidos que comprenden una cadena lateral de lisina modificada lipofílicamente
IPC: C07K14/605
Filed: 2017-10-10
Abstract: Reivindicación 1: Un método de preparación de un péptido aislado que comprende una cadena lateral de lisina modificada lipofílicamente, que comprende las etapas de: (i) ensamblar la secuencia de aminoácidos de dicho péptido con los grupos funcionales reactivos protegidos en las cadenas laterales por etapas utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), en donde la cadena lateral de lisina que se va a modificar está protegida por un grupo protector basado en tritilo, concretamente monometoxitritilo (Mmt) o 4-metiltritilo (Mtt); (ii) secar la resina de la fase sólida después de que se haya completado el ensamblaje de la secuencia de aminoácidos; (iii) tratar la resina seca varias veces con una solución de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM) con el fin de desproteger la cadena lateral de lisina que se va a modificar; (iv) neutralizar la resina; (v) acoplar al menos un radical conector unido a 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) activado a la cadena lateral de lisina desprotegida; (vi) desproteger el grupo funcional terminal del conector acoplado a la cadena lateral de la lisina en la etapa (v); (vii) acoplar un radical lipófilo activado, concretamente un ácido graso activado, al grupo funcional terminal desprotegido del conector de la etapa (vi); (viii) secar la resina; y (ix) escindir el péptido de la resina. Reivindicación 4: El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente las etapas de: (viii-a) analizar el rendimiento de desprotección de la etapa (iii) escindiendo una muestra de ensayo del péptido unido a la resina; y (viii-b) opcionalmente repetir las etapas (iii) a (viii-a) hasta que el contenido del péptido escindido que contiene la cadena lateral de lisina modificada sea de al menos 85%, concretamente al menos 90%, más concretamente al menos 95% en comparación con el péptido sin cadena lateral de lisina modificada. Reivindicación 13: El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de: (i) ensamblar la secuencia de aminoácidos de un péptido de SEQ ID Nº 1 con los grupos funcionales reactivos protegidos en las cadenas laterales por etapas utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), en donde la cadena lateral de la lisina 14 está protegida por monometoxitritilo (Mmt); (ii) secar la resina de la fase sólida durante al menos 5 horas a la temperatura ambiente después de que se haya completado el ensamblaje de la secuencia de aminoácidos; (iii) tratar la resina seca nueve veces durante 10 minutos cada una con una solución de ácido trifluoroacético (TFA) al 1% (v/v) en diclorometano (DCM) con el fin de desproteger la cadena lateral de la lisina en la posición 14; (iv) neutralizar la resina con una solución de diisopropil etilamina (DIPEA) al 3% en DCM, hasta que el pH de la solución permanezca a ³ 8; (v) acoplar un radical conector de Fmoc-Glu-OtBu activado a la cadena lateral de lisina desprotegida en condiciones alcalinas; (vi) escindir el grupo Fmoc del conector acoplado a la cadena lateral de la lisina en la etapa (v) con piperidina al 20% (v/v) en DMF; (vii) acoplar ácido palmítico activado al grupo funcional terminal desprotegido del conector de la etapa (vi); (viii) secar la resina; (viii-a) analizar el rendimiento de desprotección de la etapa (iii) escindiendo una muestra de ensayo del péptido unido a la resina; (viii-b) repetir las etapas (iii) a (viii-a) hasta que el contenido del péptido escindido que contiene la cadena lateral de lisina modificada sea de al menos 85%; (ix) escindir el péptido de la resina utilizando un cóctel de escisión que consiste en TFA al 96,0 - 97,5% (p/p), EDT al 1,7 - 2,6% (p/p) y 3-metilindol al 0,7 - 1,5% (p/p); (x) filtrar la solución de péptido después de la escisión a la temperatura ambiente; (xi) destilar la solución de péptido filtrada a vacío a £ 30ºC; (xii) añadir la fracción residual de la destilación a un antidisolvente que consiste en DIPE y n-heptano en una proporción de 25:75 (v/v) a 35:65 (v/v); (xiii) agitar la solución precipitada a 10 - 15ºC durante 1 - 18 horas; (xiv) filtrar la solución precipitada; (xv) lavar el producto precipitado 4 - 5 veces (xv-a) resuspendiendo el producto precipitado en acetato de etilo, (xv-b) agitando la suspensión resultante durante 30 - 60 minutos y (xv-c) separando por filtración el acetato de etilo; y (xvi) secar el péptido húmedo a vacío.