Patent WO-2023209532-A1 (WO)
Title: Vecteurs plasmidiques recombinants, procédé de production d'enzymes hydrolysant des insecticides organophosphorés, carbamates et pyréthroïdes, et formulation de telles enzymes en tant que constituants fonctionnels
Inventor: VANGNAI ALISA
IPC: C02F3/34
Filed: 2023-04-24
Abstract: La présente invention concerne un processus de production de trois enzymes recombinantes capables d'hydrolyser chaque classe d'insecticides organophosphorés, carbamates et pyréthroïdes, ainsi qu'une formulation contenant ces enzymes. La présente invention concerne le vecteur d'ADN plasmidique recombinant, dans lequel le système sécrétoire de protéines a été modifié pour améliorer la sécrétion de protéines recombinantes dans l'espace périplasmique ou le milieu de culture. Une séquence signal de PelB (pectate lyase B) codant pour une séquence nucléotidique pour une localisation périplasmique a subi une délétion et a été remplacée par une séquence signal de LamB (récepteur de maltoporine ou de phage lambda) codant pour une séquence nucléotidique pour obtenir une protéine recombinante sécrétoire plus efficace. Le mode de réalisation divulgue trois vecteurs d'ADN plasmidique recombinant pour l'expression de protéines recombinantes qui ont été construites, à l'aide du vecteur d'ADN plasmidique modifié décrit ci-dessus. Les protéines recombinantes comprennent (a) une enzyme recombinante d'hydrolyse de composés organophosphorés ayant au moins 80 pour cent d'identité de séquence avec la séquence d'acides aminés de la méthylparathion hydrolase (MPH) (ID dans la base de données de protéines (PDB) : 1P9E) telle que représentée dans la SEQ ID NO : 1, l'enzyme recombinante d'hydrolyse de composés organophosphorés ayant une activité hydrolytique envers des insecticides organophosphorés ; (b) une enzyme recombinante d'hydrolyse de carbamates ayant au moins 80 pour cent d'identité de séquence avec la séquence d'acides aminés de la L-aminopeptidase-D-Ala-estérase/amidase (arylamidase) (MAH) (ID dans la PDB : 1B65) telle que représentée dans la SEQ ID NO : 2, l'enzymere recombinante d'hydrolyse de carbamates ayant une activité hydrolytique envers des insecticides carbamates ; et (c) une enzyme recombinante d'hydrolyse de pyréthroïdes ayant au moins 80 pour cent d'identité de séquence avec la séquence d'acides aminés de carboxylestérase d'hydrolyse de pyréthroïdes (EstA) (ID dans la PDB : 4CCY) telle que représentée dans la SEQ ID NO : 3, l'enzyme recombinante d'hydrolyse de pyréthroïdes ayant une activité hydrolytique envers des insecticides pyréthroïdes. Le mode de réalisation concerne en outre trois souches bactériennes recombinantes faisant appel à la souche d'Escherichia coli BL21(DE3) en tant que cellule hôte qui a été transformée avec chacun des vecteurs d'ADN plasmidique recombinants décrits ci-dessus. La présente invention divulgue également les conditions de culture pour les souches bactériennes recombinantes décrites ci-dessus, comprenant la composition de milieu, la condition d'induction et des procédés de récolte d'enzymes et de dosages d'activités enzymatiques. De plus, le présent mode de réalisation concerne une formulation, comprenant les trois enzymes recombinantes décrites ci-dessus en tant que ses constituants fonctionnels.