Patent ES-2784754-T3 (ES)
Title: Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo
Inventor: AUERBACH WOJTEK
IPC: C12N15/90
Filed: 2015-06-05
Granted: 2020-09-30
Abstract: Un método para la modificación en serie de un locus objetivo en una célula, que comprende: (a) proporcionar la célula que comprende el locus objetivo, en donde el locus objetivo comprende un polinucleótido que codifica un primer marcador de selección unido operativamente a un primer promotor y que comprende un primer sitio de reconocimiento para un primer agente de nucleasa, en donde el primer sitio de reconocimiento de nucleasa está ubicado en una región codificante del primer marcador de selección o cualquier región no codificante de proteína del primer marcador de selección, opcionalmente en donde el locus objetivo está en el genoma de la célula o está ubicado en un vector en la célula; (b) introducir en la célula: (i) el primer agente de nucleasa, en donde el primer agente de nucleasa induce un corte o ruptura de doble cadena en el primer sitio de reconocimiento de nucleasa, interrumpiendo así la expresión o actividad del primer marcador de selección; y (ii) un primer vector de transformación que comprende un primer polinucleótido de inserción flanqueado por un primer brazo de homología correspondiente a un primer sitio objetivo ubicado en el locus objetivo y un segundo brazo de homología correspondiente a un segundo sitio objetivo ubicado en el locus objetivo, en donde el primer polinucleótido de inserción comprende: (I) un primer polinucleótido de interés; y (II) un polinucleótido que codifica un segundo marcador de selección unido operativamente a un segundo promotor y que comprende un segundo sitio de reconocimiento de nucleasa para un segundo agente de nucleasa, en donde el primer marcador de selección y el segundo marcador de selección son diferentes, en donde el primer agente de nucleasa es diferente del segundo agente de nucleasa, y en donde el segundo sitio de reconocimiento de nucleasa está ubicado en una región codificante del segundo marcador de selección o cualquier región no codificante de proteínas del segundo marcador de selección; (c) identificar una célula modificada que comprende el primer polinucleótido de inserción en el locus objetivo, en donde la célula modificada tiene la actividad del segundo marcador de selección pero no tiene la actividad del primer marcador de selección, opcionalmente en donde la identificación se lleva a cabo a través de un ensayo de modificación de alelos (MOA); (d) introducir en la célula modificada: (i) el segundo agente de nucleasa, en donde el segundo agente de nucleasa induce un corte o ruptura de doble cadena en el segundo sitio de reconocimiento de nucleasa, interrumpiendo así la expresión o actividad del segundo marcador de selección; y (ii) un segundo vector de transformación que comprende un segundo polinucleótido de inserción flanqueado por un tercer brazo de homología correspondiente a un tercer sitio objetivo ubicado en el locus objetivo y un cuarto brazo de homología correspondiente a un cuarto sitio objetivo ubicado en el locus objetivo, en donde el segundo polinucleótido de inserción comprende: (I) un segundo polinucleótido de interés; y (II) un polinucleótido que codifica un tercer marcador de selección unido operativamente a un tercer promotor activo en la célula y que comprende un tercer sitio de reconocimiento de nucleasa para un tercer agente de nucleasa, en donde el primer marcador de selección y el tercer marcador de selección son idénticos, y en donde el tercer sitio de reconocimiento de nucleasa es idéntico al primer sitio de reconocimiento de nucleasa y diferente del segundo sitio de reconocimiento de nucleasa, y el primer agente de nucleasa y el tercer agente de nucleasa son idénticos entre sí y son diferentes del segundo agente de nucleasa; y (e) identificar al menos una célula que comprende el segundo polinucleótido de inserción integrado en el locus objetivo, opcionalmente en donde la identificación se lleva a cabo mediante un ensayo de modificación de alelos (MOA).