Patent ES-2906186-T3 (ES)
Title: Método para la preparación de nanoporo y usos del mismo
Inventor: JU JINGYUE
IPC: C12Q1/42
Filed: 2013-04-08
Granted: 2022-04-13
Abstract: Un método para determinar la secuencia de nucleótidos de un ADN o ARN monocatenario, el método comprende: (a) poner en contacto el ADN o ARN monocatenario con un sistema de medida de conductancia que comprende: (i) un primer y segundo compartimento con una primera y segunda solución de electrolito separadas por una barrera física, barrera que tiene al menos un poro con un diámetro en la escala nanométrica; (ii) un medio para aplicar un campo eléctrico a través de la barrera; (iii) un medio para medir un cambio en el campo eléctrico; (iv) al menos una polimerasa unida al poro adyacente a la entrada del poro, y opcionalmente (v) más de una enzima fosfatasa unida al poro y un compuesto que tiene la estructura **(Ver fórmula)** en donde la etiqueta comprende un oligonucleótido, en donde R1 es OH, en donde R2 es H u OH, en donde X es O, NH, S, o CH2, en donde Z es O, S, o BH3, en donde la base es adenina, guanina, citosina, timina o un derivado de una de estas bases, y en donde n es 1, 2, 3, o 4, y opcionalmente en donde la etiqueta tiene una carga que es de signo inverso relativa a la carga en el resto del compuesto, en donde el ADN o ARN monocatenario está en una solución de electrolito en contacto con la polimerasa unida al poro y en donde el ADN o ARN monocatenario tiene un cebador hibridado a una porción del mismo, en condiciones que permiten que la polimerasa catalice la incorporación del compuesto al cebador si es complementario al residuo de nucleótido del ADN o ARN monocatenario que está inmediatamente 5' respecto a un residuo de nucleótido del ADN o ARN monocatenario hibridado al residuo de nucleótido 3' terminal del cebador, de modo que se forme un producto de extensión de ADN o ARN, en donde si el compuesto no se incorpora, repetir iterativamente el contacto con diferentes compuestos hasta que un compuesto se incorpore, con la condición de que (1) el tipo de base en el compuesto es diferente del tipo de base en cada uno de los compuestos previos, y (2) el tipo de etiqueta en el compuesto es diferente del tipo de etiqueta en cada uno de los compuestos previos, en donde la incorporación del compuesto produce la liberación de un polifosfato que tiene una etiqueta unida al mismo, opcionalmente en donde la enzima fosfatasa unida al poro corta la etiqueta del polifosfato para liberar la etiqueta; (b) determinar qué compuesto se ha incorporado al cebador para formar el producto de extensión de ADN o ARN en la etapa (a) aplicando un campo eléctrico a través de la barrera y midiendo un cambio electrónico a través del poro resultante de la translocación de la etiqueta generada en la etapa (a) a través del poro, y detectar la etiqueta con ayuda de al menos un electrodo, en donde detectar dicha etiqueta con la ayuda del electrodo comprende: (i) pasar una corriente iónica a través de dicha primera solución de electrolito, dicho poro, y dicha segunda solución de electrolito con un potencial eléctrico entre dicha primera y dicha segunda solución de electrolito; (ii) medir la corriente iónica que pasa a través de dicho poro y registrar la duración de cambios en la corriente iónica como una serie temporal de conductancia, en donde dicha serie temporal de conductancia abarca periodos de tiempo cuando dicho poro está sin obstruir por dicha etiqueta y también periodos de tiempo cuando dicha etiqueta produce pulsos de conductancia reducida; y (iii) delinear segmentos de la serie temporal de conductancia en regiones estadísticamente consistentes con el nivel de conductancia de poro sin obstruir, pulsos de conductancia reducida, y segmentos estadísticamente estacionarios en pulsos individuales de conductancia reducida; en donde el cambio electrónico es diferente para cada tipo de etiqueta, identificando de esta manera el residuo de nucleótido en el ADN o ARN monocatenario complementario al compuesto incorporado; y (c) realizar iterativamente las etapas (a) y (b) para cada residuo de nucleótido del ADN o ARN monocatenario que se secuencia, determinando mediante ello la secuencia de nucleótidos del ADN o ARN monocatenario.