Patent RU-2710368-C2 (RU)
Inventor: Volchkov Stanislav Evgenevich
IPC: C12N5/00
Filed: 2018-05-29
Granted: 2019-12-26
Abstract: Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток. Способ включает выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения. В качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфа-МЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри. При достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7 дней. При получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа. В результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами. Полученные экзосомы могут быть использованы в течение 2 недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6 месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2 лет при отрицательных температурах или +4°С. Использование данного способа позволяет получить и концентрировать микроРНК-содержащие экзосомы мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в средствах для стимуляции регенеративных процессов.