Patent BR-112015005857-A2 (BR)
Title: métodos para identificação de anticorpos com imunogenicidade reduzida
Inventor: FIONA A HARDING
IPC: C07K16/24
Filed: 2013-09-18
Abstract: reivindicações 1. método de identificação de uma variante de um anticorpo de referência com imunogenicidade reduzida, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) contato de uma biblioteca de célula hospedeira com um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente a um anticorpo de referência, o dito anticorpo de referência sendo um anticorpo monoclonal que se liga a uma molécula alvo, a dita biblioteca de célula hospedeira compreendendo células hospedeiras de mamífero que expressam, cada uma, na superfície celular uma variante de anticorpo diferindo do anticorpo de referência por uma mutação pontual de aminoácido único; (b) identificação de uma população de células na dita biblioteca de célula hospedeira que expressa variantes de anticorpo que exibem ligação menor ao anticorpo anti-idiotípico com relação ao anticorpo de referência; e (c) identificação de uma variante de anticorpo que é enriquecida na dita população, desta maneira identificando uma variante de um anticorpo de referência com imunogenicidade reduzida. 2. método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender submissão da biblioteca de célula hospedeira à citometria de fluxo e classificação da dita população da biblioteca de célula hospedeira. 3. método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da citometria de fluxo ser classificação de célula ativada por fluorescência (facs). 4. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda (d) determinação de se a variante de anticorpo retém sua habilidade em se ligar à molécula alvo. 5. método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da etapa (d) compreender ensaio do nível de ligação da variante de anticorpo à molécula alvo através de citometria de fluxo, classificação de conta magnética, biacore, facs, elisa, alphalisa e kinexa. 6. método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da etapa (d) compreender ensaio do nível de ligação da variante de anticorpo à molécula alvo através de citometria de fluxo, em um método compreendendo as etapas de (i) contato das células da biblioteca de célula hospedeira ou dita população com uma molécula alvo fluorescentemente marcada; (ii) submissão das ditas células à citometria de fluxo; (iii) classificação das células em subpopulações pela quantidade de molécula alvo fluorescentemente marcada ligada; e (iv) determinação de se a variante do anticorpo é enriquecida em uma subpopulação de células que expressa variantes de anticorpo que se ligam à molécula alvo substancialmente igualmente a ou melhor do que o anticorpo de referência, desta maneira determinando se a variante de anticorpo retém a habilidade em se ligar à molécula alvo. 7. método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato das etapas (d)(i) a (d)(iii) serem realizadas antes, simultaneamente com ou após a etapa (b). 8. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato da etapa (d)(iv) ser realizada antes, simultaneamente com ou após etapa (c). 9. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de compreender ainda (e) determinação do nível de expressão da variante comparado com o nível de expressão do anticorpo de referência. 10. método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato da etapa (e) compreender ensaio do nível de expressão da variante de anticorpo através de citometria de fluxo, classificação de conta magnética, biacore, facs, elisa, alphalisa e kinexa. 11. método de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato da etapa (e) compreender ensaio do nível de expressão da variante de anticorpo através de citometria de fluxo, em um método compreendendo as etapas de (i) contato das células da biblioteca de célula hospedeira ou dita população com um anticorpo fluorescentemente marcado que se liga a um epítopo conservado dentre as variantes de anticorpo e o anticorpo de referência; (ii) submissão das ditas células à citometria de fluxo; (iii) classificação das células em subpopulações pela quantidade de anticorpo fluorescentemente marcado ligado; e (iv) determinação de se a variante de anticorpo é enriquecida em uma subpopulação de células que se ligam ao anticorpo fluorescentemente marcado em um nível substancialmente igual a ou melhor do que as células que expressam o anticorpo de referência, desta maneira determinando se a variante de anticorpo é expressa em um nível substancialmente igual a ou melhor do que o anticorpo de referência. 12. método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato do dito epítopo ser uma região constante das variantes de anticorpo e do anticorpo de referência. 13. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelo fato das etapas (e)(i) a (e)(iii) serem realizadas antes, simultaneamente com ou após a etapa (b). 14. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelo fato da etapa (e)(iv) ser realizada antes, simultaneamente com ou após a etapa (c). 15. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato do anticorpo anti-idiotípico ser fluorescentemente marcado. 16. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato da etapa (c) compreender ácidos nucleicos de sequenciamento massivamente paralelo obtidos da população. 17. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato da etapa (d)(iv) compreender ácidos nucleicos de sequenciamento massivamente paralelo obtidos da subpopulação de células que expressam variantes de anticorpo que se ligam à molécula alvo substancialmente igualmente a ou melhor do que o anticorpo de referência. 18. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato da etapa (e)(iv) compreender ácidos nucleicos de sequenciamento massivamente paralelo obtidos da subpopulação de células que se liga ao anticorpo fluorescentemente marcado em um nível substancialmente igual a ou melhor do que células que expressam o anticorpo de referência. 19. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato da biblioteca de célula hospedeira ter menos do que 10.000 membros únicos. 20. método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato da biblioteca de célula hospedeira ter cerca de 50 a cerca de 10.000 membros únicos. 21. método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato da biblioteca de célula hospedeira ter cerca de 1.000 a cerca de 1.300 membros únicos. 22. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato das células hospedeiras serem células 293c18. 23. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato das variantes de anticorpo serem expressas a partir de vetores compreendendo origem de replicação de do vírus epstein-barr e antígeno nuclear e onde os domínios variáveis de anticorpo são exibidos como parte de uma proteína de fusão âncora transmembrana-igg de comprimento integral sobre a superfície da célula. 24. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato do anticorpo de referência compreender dois domínios variáveis de anticorpo e onde as variantes de anticorpo compreendem domínios variáveis de anticorpo onde pelo menos um deles tem uma mutação pontual única com relação aos domínios variáveis no anticorpo de referência. 25. método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato das substituições de aminoácido único estarem nas regiões de determinação de complementaridade (cdrs) dos dois domínios variáveis de anticorpo. 26. método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de cerca de 50 a cerca de 60 posições de aminoácido nas cdrs dos dois domínios variáveis de anticorpo serem substituídas com cada um dos aminoácidos de ocorrência natural. 27. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato da biblioteca de célula hospedeira ser construída usando mutagênese nnk. 28. variante de um anticorpo anti-tnf-a de referência ou um fragmento de ligação anti-tnf-a de referência de um anticorpo, caracterizado pelo fato do anticorpo de referência ou fragmento de ligação compreender seis regiões de determinação de complementaridade ("cdrs") tendo sequências de aminoácido correspondendo à seq id no:5 (cdr-hl), seq id no:6 (cdr-h2), seq id no:7 (cdr-h3), seq id no:8 (cdr-ll), seq id no:9 (cdr-l2) e seq id no:10 (cdr-h3), onde a variante compreende pelo menos uma substituição selecionada de g5f em cdr-l1, g5i em cdr-l1, g5v em cdr-l1, g5w em cdr-l1, g5y em cdr-l1, r7i em cdr-l1, r7t em cdr-l1, r7v em cdr-l1, n8a em cdr-l1, n8d em cdr-l1, n8e em cdr-l1, n8g em cdr-l1, n8l em cdr-l1, n8m em cdr-l1, n8q em cdr-l1, n8r em cdr-l1, n8t em cdr-l1, a1i em cdr-l2, a1t em cdr-l2, a1v em cdr-l2, t4d em cdr-l2, r2g em cdr-l3, n4f em cdr-l3, n4m em cdr-l3, n4w em cdr-l3, n4y em cdr-l3, r5l em cdr-l3, r5n em cdr-l3, r5w em cdr-l3, r5y em cdr-l3, t9y em cdr-l3, d1s em cdr-h1, y2a em cdr-h1, y2c em cdr-h1, y2k em cdr-h1, y2m em cdr-h1, y2r em cdr-h1, y2s em cdr-h1, y2v em cdr-h1, h5c em cdr-h1, h5d em cdr-h1, h5e em cdr-h1, h5s em cdr-h1, h5t em cdr-h1, t3a em cdr-h2, t3g em cdr-h2, t3n em cdr-h2, w4a em cdr-h2, w4f em cdr-h2, w4h em cdr-h2, w4l em cdr-h2, w4m em cdr-h2, w4v em cdr-h2, n5g em cdr-h2, s6d em cdr-h2, s6l em cdr-h2, i9k em cdr-h2, d10l em cdr-h2, y11a em cdr-h2, y11c em cdr-h2, y11e em cdr-h2, y11f em cdr-h2, y11g em cdr-h2, y11h em cdr-h2, y11i em cdr-h2, y11k em cdr-h2, y11l em cdr-h2, y11m em cdr-h2, y11n em cdr-h2, y11q em cdr-h2, y11r em cdr-h2, y11s em cdr-h2, y11v em cdr-h2, y11w em cdr-h2, a12y em cdr-h2, d13n em cdr-h2, v15d em cdr-h2, v15l em cdr-h2, v15m em cdr-h2, v15q em cdr-h2, v15t em cdr-h2, e16f em cdr-h2, e16h em cdr-h2, e16k em cdr-h2, e16r em cdr-h2, e16t em cdr-h2, e16w em cdr-h2, g17a em cdr-h2, g17c em cdr-h2, g17e em cdr-h2, g17h em cdr-h2, g17i em cdr-h2, g17k em cdr-h2, g17l em cdr-h2, g17m em cdr-h2, g17n em cdr-h2, g17p em cdr-h2, g17q em cdr-h2, g17r em cdr-h2, g17s em cdr-h2, g17t em cdr-h2, g17y em cdr-h2, v1g em cdr-h3, v1r em cdr-h3, v1w em cdr-h3, l4t em cdr-h3, l4v em cdr-h3, t6v em cdr-h3, s9k em cdr-h3, s9w em cdr-h3, s9y em cdr-h3 e d11v em cdr-h3, onde as seis cdrs no total têm até 8 substituições de aminoácido comparado com sequências de cdr do anticorpo de referência ou fragmento de ligação. 29. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de g5f em g5f em cdr-l1, g5i em cdr-l1, g5y em cdr-l1, r7i em cdr-l1, r7t em cdr-l1, r7v em cdr-l1, n8a em cdr-l1, n8d em cdr-l1, n8e em cdr-l1, n8g em cdr-l1, n8l em cdr-l1, n8m em cdr-l1, n8q em cdr-l1, n8r em cdr-l1, n8t em cdr-l1, a1v em cdr-l2, r2g em cdr-l3, n4f em cdr-l3, n4m em cdr-l3, n4w em cdr-l3, r5l em cdr-l3, r5n em cdr-l3, r5w em cdr-l3 e r5y em cdr-l3. 30. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de r2g em cdr-l3, r5l em cdr-l3, r5n em cdr-l3 e r5y em cdr-l3. 31. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluem pelo menos uma substituição selecionada de g5f em cdr-l1, g5i em cdr-l1, g5y em cdr-l1, r7i em cdr-l1, n4m em cdr-l3 e r5w em cdr-l3 32. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluem pelo menos uma substituição selecionada de n8d em cdr-l1 e n8e em cdr-l1. 33. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de r7t em cdr-l1, r7v em cdr-l1, n8a em cdr-l1, n8g em cdr-l1, n8l em cdr-l1, n8m em cdr-l1, n8q em cdr-l1, n8r em cdr-l1, n8t em cdr-l1, a1v em cdr-l2, n4f em cdr-l3 e n4w em cdr-l3. 34.anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de g5f em cdr-l1, g5i em cdr-l1, g5v em cdr-l1, g5w em cdr-l1, g5y em cdr-l1, r7i em cdr-l1, r7t em cdr-l1, r7v em cdr-l1, n8a em cdr-l1, n8g em cdr-l1, n8l em cdr-l1, n8m em cdr-l1, n8q em cdr-l1, n8r em cdr-l1, n8t em cdr-l1, a1i em cdr-l2, a1t em cdr-l2, a1v em cdr-l2, t4d em cdr-l2, n4f em cdr-l3, n4m em cdr-l3, n4w em cdr-l3 e r5w em cdr-l3. 35. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição g5v em cdr-l1. 36. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de g5w em cdr-l1, a1i em cdr-l2, a1t em cdr-l2 e t4d em cdr-l2. 37. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de g5w em cdr-l1, r7t em cdr-l1, r7v em cdr-l1, n8a em cdr-l1, n8d em cdr-l1, n8e em cdr-l1, n8l em cdr-l1, n8m em cdr-l1, n8q em cdr-l1, n8r em cdr-l1, a1i em cdr-l2, a1t em cdr-l2, a1v em cdr-l2, t4d em cdr-l2, n4f em cdr-l3, n4w em cdr-l3, n4y em cdr-l3 e t9y em cdr-l3 38. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de n4y em cdr-l3 e t9y em cdr-l3. 39. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de d1s em cdr-h1, y2a em cdr-h1, y2c em cdr-h1, y2k em cdr-h1, y2m em cdr-h1, y2r em cdr-h1, y2s em cdr-h1, y2v em cdr-h1, h5c em cdr-h1, h5d em cdr-h1, h5e em cdr-h1, h5s em cdr-h1, h5t em cdr-h1, t3a em cdr-h2, t3g em cdr-h2, t3n em cdr-h2, w4a em cdr-h2, w4f em cdr-h2, w4h em cdr-h2, w4l em cdr-h2, w4m em cdr-h2, w4v em cdr-h2, d10l em cdr-h2, v1g em cdr-h3, v1r em cdr-h3, v1w em cdr-h3, l4t em cdr-h3, l4v em cdr-h3, t6v em cdr-h3, s9k em cdr-h3 e d11v em cdr-h3. 40. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de n5g em cdr-h2, s6d em cdr-h2, s6l em cdr-h2, i9k em cdr-h2, y11a em cdr-h2, y11c em cdr-h2, y11e em cdr-h2, y11f em cdr-h2, y11g em cdr-h2, y11h em cdr-h2, y11i em cdr-h2, y11k em cdr-h2, y11l em cdr-h2, y11m em cdr-h2, y11n em cdr-h2, y11q em cdr-h2, y11r em cdr-h2, y11s em cdr-h2, y11v em cdr-h2, y11w em cdr-h2, a12y em cdr-h2, v15d em cdr-h2, v15l em cdr-h2, v15m em cdr-h2, v15q em cdr-h2, v15t em cdr-h2, e16f em cdr-h2, e16h em cdr-h2, e16k em cdr-h2, e16r em cdr-h2, e16t em cdr-h2, e16w em cdr-h2, g17a em cdr-h2, g17c em cdr-h2, g17e em cdr-h2, g17h em cdr-h2, g17i em cdr-h2, g17k em cdr-h2, g17l em cdr-h2, g17m em cdr-h2, g17n em cdr-h2, g17p em cdr-h2, g17q em cdr-h2, g17r em cdr-h2, g17s em cdr-h2, g17t em cdr-h2, g17y em cdr-h2, s9w em cdr-h3 e s9y em cdr-h3. 41. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de n5g em cdr-h2, s6d em cdr-h2, s6l em cdr-h2, y11m em cdr-h2, y11q em cdr-h2, a12y em cdr-h2, e16h em cdr-h2, g17h em cdr-h2, s9w em cdr-h3 e s9y em cdr-h3. 42. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de i9k em cdr-h2, y11a em cdr-h2, y11c em cdr-h2, y11e em cdr-h2, y11f em cdr-h2, y11g em cdr-h2, y11h em cdr-h2, y11i em cdr-h2, y11k em cdr-h2, y11l em cdr-h2, y11n em cdr-h2, y11r em cdr-h2, y11s em cdr-h2, y11v em cdr-h2, y11w em cdr-h2, v15d em cdr-h2, v15l em cdr-h2, v15m em cdr-h2, v15q em cdr-h2, v15t em cdr-h2, e16f em cdr-h2, e16k em cdr-h2, e16r em cdr-h2, e16t em cdr-h2, e16w em cdr-h2, g17a em cdr-h2, g17c em cdr-h2, g17e em cdr-h2, g17i em cdr-h2, g17k em cdr-h2, g17l em cdr-h2, g17m em cdr-h2, g17n em cdr-h2, g17p em cdr-h2, g17q em cdr-h2, g17r em cdr-h2, g17s em cdr-h2, g17t em cdr-h2 e g17y em cdr-h2. 43. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem pelo menos uma substituição selecionada de cdr-h2, y11a em cdr-h2, y11c em cdr-h2, y11e em cdr-h2, y11f em cdr-h2, y11g em cdr-h2, y11h em cdr-h2, y11i em cdr-h2, y11k em cdr-h2, y11l em cdr-h2, y11n em cdr-h2, y11r em cdr-h2, y11s em cdr-h2, y11v em cdr-h2, y11w em cdr-h2, d13n em cdr-h2, v15d em cdr-h2, v15l em cdr-h2, v15m em cdr-h2, v15q em cdr-h2, v15t em cdr-h2, e16f em cdr-h2, e16k em cdr-h2, e16r em cdr-h2, e16t em cdr-h2, e16w em cdr-h2, g17a em cdr-h2, g17c em cdr-h2, g17e em cdr-h2, g17i em cdr-h2, g17k em cdr-h2, g17l em cdr-h2, g17m em cdr-h2, g17n em cdr-h2, g17p em cdr-h2, g17q em cdr-h2, g17r em cdr-h2, g17s em cdr-h2, g17t em cdr-h2, and g17y em cdr-h2. 44. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato das cdrs incluírem a substituição d13n em cdr-h2. 45. anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 44, caracterizado pelo fato do anticorpo anti-tnf-a de referência ou fragmento de ligação anti-tnf-a de referência compreender um fragmento de cadeia pesada variável tendo uma sequência de aminoácido correspondendo à seq id no: 2 e um fragmente de cadeia leve variável tendo uma sequência de aminoácido correspondendo à seq id no: 4. 46. molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45. 47. célula hospedeira caracterizada pelo fato de compreender uma molécula de ácido nucleico codificando o anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45. 48. composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45 e um carreador farmaceuticamente aceitável. 49. método de tratamento de um paciente humano sofrendo de um distúrbio imune, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao paciente humano uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-tnf-a ou fragmento de ligação anti-tnf-a como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45. 50. método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato do distúrbio imune ser selecionado de artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite psoriática, espondilite anquilosante, doença de crohn, psoríase de placa e espondiloartrite axial.