Patent DE-102017002092-B4 (DE)
Title: Verfahren zur Detektion von bekannten Nukleotid-Modifikationen in einer RNA
Inventor: HELM MARK
IPC: C12Q1/68
Filed: 2017-03-04
Granted: 2018-11-08
Abstract: Verfahren zur Ermittlung von Anzahl und Position (Lokus) einer ausgewählten (vorbestimmten), bekannten Nukleotid-Modifikation in einer RNA oder mehreren RNAs (inkl. Transkriptom), der (den) Template-RNA(s), umfassend die folgenden Schritte in der genannten Reihenfolge:(1) Reverse Transkription der Template-RNA(s) unter Einsatz des Enzyms Reverse Transkriptase und Erstellen einer cDNA-Bibliothek enthaltend die Reverse Transkriptions-Produkte (= cDNAs) der eingesetzten Reversen Transkriptase mit dieser/diesen Template-RNA(s),(2) Amplifizierung der cDNAs und Sequenzierung der amplifizierten cDNAs mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methode), wobei die gewonnenen Sequenz-Daten in digitaler Form, den Reads, ausgegeben werden,(3) Adapter-Trimming (= Entfernung der Adaptersequenzen) und Mapping (=Zuordnung) der sequenzierten cDNAs/Reads zum Referenzgenom oder Referenztranskriptom mittels computergestützter Alignment-Verfahren,(4) computergestützte Auswertung (Analyse) des Mappingergebnisses hinsichtlich des Reverse-Transkriptions-Ereignismusters, der RT-Signatur, unter Verwendung der Ereignisse ‚Abbruch‘ und/oder ‚Read-Through mit Mismatch‘ als RT-Signatur-Merkmal(e), und Diagnostizierung der RT-Signatur an jeder Nukleotid-Position der Template-RNA(s),(5) Einspeisung der digitalisierten Daten der RT-Signaturen in ein computer-basiertes, automatisches, auf überwachtem maschinellem Lernen („Machine-Learning“) beruhendes Klassifizierungssystem,wobei in einer ersten Phase (I) des Verfahrens, der Kalibrierungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren verschiedenen, bekannten und hinsichtlich Nukleotidsequenz und gegebenenfalls vorhandener Nukleotid-Modifikation(en) identifizierten und annotierten RNAs als Template-RNAs ausgeführt werden,und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen mit der bekannten Nukleotid-Modifikation und ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen des gleichen Nukleosids ohne Nukleotid-Modifikation in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,und das Klassifizierungssystem während Trainings- und Selbsttestungsläufen implizit das (charakteristische) Profil der RT-Signatur (d.h. die charakteristische quantitative Ausprägung der RT-Signatur-Merkmale) an der die Nukleotid-Modifikation aufweisenden Nukleotid-Position erstellt und optimiert („erlernt“), und (infolgedessen) als Klassifizierungsergebnis diejenigen Positionen auf der/den (jeder) Template-RNA(s) ermittelt und angibt, die eine RT-Signatur aufweisen, die mit diesem (charakteristischen) Profil annähernd oder vollständig übereinstimmt, und die somit auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation an diesen Positionen hinweist,und wobei in einer zweiten Phase (II) des Verfahrens, der Anwendungs- bzw. Untersuchungsphase, die Schritte (1) bis (5) mit einer oder mehreren zu untersuchenden unbekannten Test-RNA(s) als Template-RNA(s) durchgeführt werden,- und die Schritte (1) bis (4) unter den gleichen Bedingungen wie in Phase (I) erfolgen,- und in Schritt (5) ermittelte RT-Signaturen von Nukleotid-Positionen der Test-Template-RNA(s) in das Klassifizierungssystem eingespeist werden,- und das Klassifizierungssystem auf der Basis des in Phase (I) Schritt (5) implizit erlernten (charakteristischen) Profils die eingegebenen RT-Signaturen dahingehend klassifiziert, inwieweit sie diesem Profil ähnlich sind oder damit übereinstimmen, und wobei Klassifizierungsergebnisse mit der Aussage „ähnlich“ oder „annähernd übereinstimmend“ oder „übereinstimmend“ auf das Vorliegen der betreffenden Nukleotid-Modifikation in der/den Test-Template-RNA(s) an der Nukleotid-Position mit dieser RT-Signatur hinweisen,dadurch gekennzeichnet,dass in Schritt (1) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Reverse Transkription der Template-RNAs in zwei oder mehr Reaktionsansätzen und - durchläufen mit voneinander verschiedenen Reversen Transkriptasen unter den gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit (der) gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen je Ansatz durchgeführt wird, wobei mit/von jedem Ansatz eine cDNA-Bibliothek erhalten wird,dass in Schritt (4) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens die Auswertung der Mapping-Ergebnisse hinsichtlich der RT-Signatur unter Verwendung der Ereignisse ‚Abbruch‘ und/oder ‚Read-Through mit Mismatch‘ und/oder des zusätzlichen Ereignisses ‚Read-Through mit Sequenzlücke(n)‘ als RT-Signatur-Merkmal(e) erfolgt,und dass in Schritt (5) von Phase (I) und Phase (II) des Verfahrens Daten von RT-Signaturen aus den in Schritt (1) mit den verschiedenen Reversen Transkriptasen unter gleichen Reaktionsbedingungen und/oder mit der/den gleichen Reversen Transkriptase(n) unter voneinander abweichenden Reaktionsbedingungen erhaltenen cDNA-Bibliotheken in das Klassifizierungssystem eingespeist werden.