Patent ES-2781837-T3 (ES)
Title: Método para determinar perfiles cinéticos en el descubrimiento de fármacos
Inventor: ALFONSO SAN-SEGUNDO ANA PATRICIA
IPC: G01N33/557
Filed: 2016-09-15
Granted: 2020-09-08
Abstract: Método para calcular el perfil cinético de un compuesto de interés frente a una proteína o poliproteína diana, que comprende las siguientes etapas: a. mezclar simultáneamente en un pocillo de una microplaca: (i) una primera molécula a una primera concentración de entre 1 y 500 nM, (ii) dicha proteína o poliproteína diana a una segunda concentración de entre 0,5 - 50 nM, y (iii) una tercera molécula a una concentración de saturación para la proteína o poliproteína diana de (ii), en el que dicha primera molécula tiene afinidad por dicha proteína o poliproteína diana y se marca con una primera molécula fluorescente, y dicha proteína o poliproteína diana se une a entre 0,5 - 5 nM de un anticuerpo marcado con una segunda molécula fluorescente, o dicha proteína diana o la poliproteína se marca con dicha segunda molécula fluorescente, en el que dicha primera molécula fluorescente es un fluoróforo aceptor y dicha segunda molécula fluorescente es un fluoróforo donador, y en el que la tercera molécula es un inhibidor de la proteína o poliproteína diana que compite por los mismos sitios de unión de la diana con la primera molécula; b. mezclar simultáneamente en cada uno de n pocillos diferentes de dicha microplaca: (i) dicha primera molécula a dicha primera concentración, (ii) dicha proteína o poliproteína diana a dicha segunda concentración, y (iii) un compuesto de interés a una tercera concentración en el que dicha primera molécula tiene afinidad por dicha proteína o poliproteína diana y se marca con dicha primera molécula fluorescente y dicha proteína o poliproteína diana se une a 0,5 - 5 nM de un anticuerpo marcado con dicha segunda molécula fluorescente, o dicha proteína o poliproteína diana se marca con dicha segunda molécula fluorescente, en el que la tercera concentración es diferente en cada uno de los n pocillos diferentes de dicha microplaca, en el que las etapas a) y b) se realizan simultáneamente; c. medir la intensidad de emisión de las señales de fluorescencia emitidas por el fluoróforo donador y el fluoróforo aceptor en cada mezcla obtenida en las etapas a) y b) con un lector de microplacas en tiempos específicos desde 0 hasta 15 horas, en el que se miden dichas intensidades de emisión simultáneamente para todos los pocillos de dicha microplaca en cada tiempo específico o se miden dichas intensidades de emisión para todos los pocillos de dicha microplaca en el plazo de cinco minutos de cada punto en el tiempo específico; d. calcular la razón de emisión corregida (ER*) para cada una de las n mezclas diferentes obtenidas en la etapa b) en cada tiempo específico, en el que la razón de emisión corregida para una mezcla dada obtenida en la etapa b) en un tiempo específico, se calcula restando la razón de emisión de la mezcla obtenida en la etapa a) en dicho tiempo específico dado (ERa) a partir de la razón de emisión de dicha mezcla obtenida en la etapa b) en dicho tiempo específico dado (ERb), en el que: ERa se calcula dividiendo la intensidad de emisión de fluoróforo aceptor en dicha mezcla obtenida en la etapa a) en dicho tiempo específico dado (afEIa) entre la intensidad de emisión de fluoróforo donador en dicha mezcla obtenida en la etapa a) en dicho tiempo específico dado (dfEIa) y ERb se calcula dividiendo la intensidad de emisión de fluoróforo aceptor en dicha mezcla obtenida en la etapa b) en dicho tiempo específico dado (afEIb) entre la intensidad de emisión de fluoróforo donador en dicha mezcla obtenida en la etapa b) en tiempo específico dado (dfEIb); y e. calcular el perfil cinético de cada compuesto de interés frente a una proteína o poliproteína diana a partir de las razones de emisión corregidas (ER*) obtenidas en la etapa d) ajustando dichas razones de emisión corregidas (ER*) a un modelo cinético de unión competitiva, en el que el perfil cinético de dicho compuesto de interés frente a dicha proteína o poliproteína diana se define mediante: la constante de afinidad (Kd), la constante de velocidad de asociación (Kon), la constante de velocidad de disociación (koff) y el tiempo de permanencia (t1/2) de dicho compuesto de interés frente a dicha proteína o poliproteína diana, con la condición de que no es necesario predeterminar el valor de la constante de inhibición (Ki) del compuesto de interés frente a la proteína o poliproteína diana.