Patent KR-20150083075-A (KR)
Title: 암 줄기세포 검출을 위한 EpCAM 앱타머
Inventor: DUAN WEI
IPC: C12N15/113
Filed: 2013-08-02
Abstract: 종래의 항-EpCAM 항체 치료의 일정치 않은 결과로 인해, 본 발명자들은 암 줄기세포 표지인 EpCAM를 표적하는 뉴클라아제-내성 RNA 앱타머의 개발을 고안하였다.   앱타머는 항체와 비교하여 10-20배 작기 때문에 최상의 조직 침투성을 갖으므로, 암을 표적하는데 있어서 항체보다 유리하다.   앱타머의 이러한 이점에도 불구하고, 면역조직화학법의 프로브 용도로만 제한적으로 보고되었다.   이론에 얽매이지 않더라도, 핵 내 존재하는 히스톤과 같은 양성 전하된 부위에 대한 다음이온(polyanion)성 핵산 앱타머의 정전기 인력으로 인한 비-특이적 염색이 장애가 되어 왔다. 
본 발명은 EpCAM에 대한 RNA 앱타머이고, 이는 진단 및 치료 용도를 갖는다. 
본 발명은 EpCAM에 특이적으로 결합하는 분리된(isolated) RNA 앱타머를 제공하고, 상기 앱타머는 서열 5’-GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’(서열목록 제1서열)를 갖는 DT3가 아니다. 
본 발명은 분리된 EpCAM에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공하고, 상기 앱타머는 서열 5’-ACGUAUCCCUUUUCCGUA-3’(서열목록 제2서열)을 포함한다.    일 구현예에 따르면, 상기 EpCAM은 인간 EpCAM이다. 
일 구현예에 따르면, 본 발명의 앱타머는 유방암 세포주에서 발현된 EpCAM에 대하여 약 90 nM 또는 그 이하의 해리상수를 갖는다.   다른 구현예에 따르면, 상기 해리상수는 약 65 nM 또는 그 이하이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 해리상수는 45 nM 또는 그 이하이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 해리상수는 MDA-MB-231 세포에 대하여 약 87 nM이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 해리상수는 MCF7 세포에 대하여 약 64 nM이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 해리상수는 T47D 세포에 대하여 약 41 nM이다. 
또다른 구현예에 따르면, 본 발명의 앱타머는 대장아 세포주(HT29 세포)에서 발현된 EpCAM에 대하여 약 37 nM의 해리상수를 갖는다. 
또다른 구현예에 따르면, 상기 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제2서열의 서열을 필수적으로 구성된다. 
또다른 구현예에 따르면, 상기 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제2서열의 서열을 포함하고, 상기 서열의 길이는 19 내지 100 염기 사이이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 서열의 길이는 19 내지 40 염기 사이이다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 서열의 길이는 19 내지 25 염기 사이이다.   본 명세서에서 사용되는 용어 “염기”는 구아닌(guanine; G), 아데닌(adenine; A), 우라실(uracil; U) 또는 시토신(cytosine; C)의 뉴클레오타이드 염기 또는 잔기를 의미한다.   상기 염기는 시토신 및 구아닌, 아데닌 및 우라실, 및 구아닌 및 우라실 사이에 수소결합이 형성될 수 있다. 
또다른 구현예에 따르면, 상기 서열은 서열목록 제2서열 내 하나 이상의 치환을 포함한다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 서열은 서열목록 제2서열의 서열 내 최소 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 치환으로 구성된다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 서열은 서열목록 제2서열에 따른 앱타머의 줄기 부위 내 최소 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환으로 구성된다.   일 구현예에 따르면, 상기 줄기 부위는 앱타머의 2차원 구조로 예측한다. 
일 구현예에 따르면, 상기 앱타머는 앱타머의 안정성( 인 비트로  또는  인 비보 )을 개선하는 하나 또는 이상의 변형(변형된 앱타머)을 포함한다.   적합한 변형은 본 명세서에서 논의된다.   일 구현예에 따르면, 피리미딘 염기는 2'-플루오로(2'-F)로 변형된다.   또다른 구현예에 따르면, RNA 앱타머의 3’말단은 뉴클레아제 소화로부터 보호되도록 변형된다.   또다른 구현예에 따르면, 앱타머는 5' 말단에 형광단 또는 역의(inverted) dT 또는 PEG 분자로 커플링하여 변형된다. 
또한 본 발명은 서열목록 제2서열의 서열을 포함하는 앱타머로서 EpCAM에 대하여 동일한 결합능을 갖는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다.   상기 앱타머는 서열 5’-GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’(서열목록 제1서열)을 갖는 DT3가 아니다. 
일 구현예에서, 상기 앱타머는 EpCAM 발현 세포(EpCAM +  세포)에 특이적으로 결합한다.   또다른 구현예에서, 상기 EpCAM 발현 세포는 줄기세포이다.   다른 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 분리된 암 줄기세포이다. 또다른 구현예에 따르면, 상기 암 줄기세포는 (ⅰ) EpCAM를 발현하고; (ⅱ) 종양형성성을 나타내며; (ⅲ) 자가 재생할 수 있고; (ⅳ) 분화할 수 있으며; (ⅴ) 종래의 치료법에 의한 세포 사멸에 내성을 갖는 특징이 있다. 
상기 암 줄기세포는 생물학적 시료와 같은 시료로부터 분리, 농축(enriched) 또는 정제된 것일 수 있다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 암 줄기세포는 EpCAM +  발현의 수준이 농축된 세포의 파퓰레이션을 나타낸다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 세포의 파퓰레이션은 최소 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 암 줄기세포를 포함하다. 
일 구현예에 따르면, 상기 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는  인 비보  존재한다.   또다른 구현예에 따르면, 상기 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는  인 비트로  존재한다.   추가적인 구현예에 따르면, 상기 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 대상로부터 수득한 생물학적 시료 내 존재한다. 
또다른 구현예에 따르면, 상기 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 CD4, ABCG2, β-카테닌, CD117, CD133, ALDH, VLA-2, CD166, CD201, IGFR 및 EGF1R를 포함하는 하나 이상의 추가적인 항원을 발현한다. 
또다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 암 줄기세포는 유방암 줄기세포, 전립선암 줄기세포, 췌장암 줄기세포, 대장암 줄기세포, 간암 줄기세포, 폐암 줄기세포, 난소암 줄기세포 또는 두경부암 줄기세포이다. 
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 진단제를 제공한다. 
일 구현예에 따르면, 상기 진단제는 검출 가능한 표지가 연결된 본 발명의 RNA 앱타머를 포함한다. 
본 발명의 앱타머는 비 특이적 항체 결합 및 우수한 신호 대 잡음 비율(superior signal to noise ratio)과 관련있는 문제들을 피할 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 것이다. 
일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단제는 본 명세서에 기재된  인 비보  또는  인 비트로  EpCAM 발현 암 줄기세포를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 
일 구현예에 따르면, 본 발명의 RNA 앱타머는 대상 또는 종양으로 의심되거나 갖는 또는 종양, 종양을 갖는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 얻은 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포, 검출을 위해 진단학적으로 사용될 수 있다.    검출은  검출 가능한 표지에 앱타머를 연결함으로 가능할 수 있다.    검출 표지의 예는 각종 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 전자 밀도 라벨, MRI 용 라벨 및 방사성 물질을 포함한다.  
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 생물학적 시료들을 조직학적 실험에 사용하기 위해  본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 진단제를 제공한다.    조직학적 제제를 준비하는 방법은 당업자들에게 자명할 것이다.  
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 항암제를 제공한다. 
일 구현예에 따르면, 상기 항암제는 모이어티(moiety)에 커플링된 본 발명의 RNA 앱타머를 포함한다.  상기 모이어티는 방사성 핵종, 화학요법제, si-RNA 또는 독소 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.   추가적인 예에 따르면, 상기 항암제는 서열 5’-ACG UAU CCC UUU UCG CGU AAA AUG UAG AGA UGC GGU GGU CCU U-3’(서열목록 제3서열)을 포함하는 RNA 앱타머-서비빈 siRNA 컨쥬게이트를 포함한다. 
일 구현예에 따르면, 본 명세서에 기재된 항암제는 대장의 암 치료를 위해 사용된다.   일 구현예에 따르면, 상기 대상은 본 발명의 RNA 앱타머를 가진 치료 이점 중에 하나이다.   또다른 구현예에서, 상기 대상은 암으로 진단된 것 중 하나이다.  또다른 구현예에서, 상기 대상은 고형암을 갖는다.   추가적인 구현예에서, 상기 대상은 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 두경부암 또는 EpCAM +  세포가 존재하는 다른 암으로부터 선택되는 암 중에 하나이다. 
본 발명의 앱타머는 모이어티(moiety)에 커플링할 수 있고, EpCAM 발현 암 줄기세포(들)을 포함하는 것으로 의심되는 종양 부위에 직접적인 모이어티(moiety)로 사용된다.   상기 모이어티는 암 줄기세포를 사멸시키는데 사용될 수 있는 독소, 방사성 핵종 또는 화학요법제, 또는 EpCAM 발현 세포를 포함하는 종양의 위치와 크기를 재는데 사용할 수 있는 이미징 제제를 포함한다. 
본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제는 추가적으로 하나 이상의 유효 성분을 포함 할 수 있다. 
본 발명은 또한 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 EpCAM 발현 세포(들) 및/또는 암 줄기세포(들)의 분리, 정제 또는 농축을 위한 방법, 본 발명의 RNA 앱타머와 세포를 접촉시키는 방법 또는 본 발명의 진단제를 제공한다.    일 구현예에서, 상기 방법은  인 비트로  실시된다. 
EpCAM 발현 세포들 분리, 정제, 농축 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서의 다른 곳에 기재된다. 
본 발명은 또한 대상 또는 암으로 진단, 의심되어지는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료에 EpCAM 발현 세포(들) 및/또는 암 줄기세포의 검출 방법, 본 발명의 분리된 RNA 앱타머 또는 본 발명의 진단제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 
본 발명은 또한 본 발명의 RNA 앱타머 또는 본 발명의 항암제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 
일 구현예에서, 상기 암은 EpCAM 발현 세포 및/또는 암 줄기세포가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 임의의 암이다.    또다른 구현예에서, 상기 대상은 암으로 진단된 대상이다.   또다른 구현예에서, 상기 대상은 고형암을 갖은 대상이다.   추가적인 구현예에서, 상기 대상은 EpCAM +  세포가 존재하는 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 다른 어떤 암으로부터 선택된 암 중에 하나이다. 
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 의학적 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방하기 위해서 본 명세서에 기재된  RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방을 위해서 의약학적 조제에서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 siRNA 또는 리보자임에 커플링된 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 전달체에 관한 것이다.   일 구현예를 따르면, 전달체는 서열 5’-ACG UAU CCC UUU UCG CGU AAA AUG UAG AGA UGC GGU GGU CCU U-3’을 포함하는 RNA 앱타머-서비빈 siRNA 컨쥬게이트를 포함한다. 
본 발명은 또한 의약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 항암제 또는 전달체의 치료학적 유효량을 포함한 조성물을 제공한다. 
본 발명은 또한 종양의 분자 이미지화 용도을 위해서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 전달체를 제공한다. 
본 발명의 RNA 앱타머의 종양 침투 능력은 종양의 분자 이미징을 통해 항체 보다 뚜렷한 장점을 제공한다.    예를 들어, RNA 앱타머는 EpCAM 발현 세포 관련 종양의 검출 및 이미징을 촉진하는 제제에 커플링 할 수 있다.    적합한 제제의 예로는 본 명세서에 기재된 검출 표지들을 포함한다. 
본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 의약학적 조성물은  단독 또는 다른 치료방법과 혼합하여 사용될 수도 있다.    예를 들어, RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 의약학적 조성물은 화학요법 또는 방서선 치료와 조합하여 사용될 수 있다.   이론상 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 화학요법 또는 방사선 치료 제제는 전형적인 암 줄기세포의 자세포로 빠르게 분할하는 세포들을 타겟하여 종양을 축소하는데 사용될 수도 있다는 것을 가정한다.   진단제는 종양에서 암 줄기 세포의 유무를 검출함으로써 암 줄기세포를 제거하기 위한 종래 임의의 치료법의 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.   본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체, 또는 의약학적 조성물은 암 줄기 세포를 특이적으로 감소하기 위해 종양 부위에 투여할 수 있다.    따라서, RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체 또는 의약학적 조성물은 화학 요법 또는 방사선 치료와 함께 또는 화학 요법 또는 방사선 요법 치료 후에 사용될 수 있다.    또한, 본 발명의 RNA 앱타머는 암 줄기세포에 존재하는 항원을 타겟으로 하나 이상의 추가 앱타머를 조합할 수 있다는 것이 고려된다. 
본 명세서의 각 예는 대상에 암을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로 준용하여 취해져야 한다. 
본 명세서의 각 예는 종양의 분자 이미징에 준용하여 취해져야 한다.