Patent ES-2653642-T3 (ES)
Title: Detección de una secuencia de ácido nucleico diana mediante ensayo sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO
Inventor: CHUN JONG YOON
IPC: C12N15/11
Filed: 2013-12-27
Granted: 2018-02-08
Abstract: Método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra de ácido nucleico mediante un ensayo PCE-NH (sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO), que comprende: (a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido en el sentido de 5' y un PTO (oligonucleótido de estudio con sonda y etiquetado); en el que el oligonucleótido en el sentido de 5' comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; el PTO comprende (i) una porción de direccionamiento en 3' que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) una porción de etiquetado en 5' que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la porción de direccionamiento en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y la porción de etiquetado en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido en el sentido de 5' está ubicado en el sentido de 5' del PTO; (b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad nucleasa 5' en condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido en el sentido de 5' o su cadena extendida induce la escisión del PTO mediante la enzima que tiene la actividad nucleasa 5' de manera que la escisión libera un fragmento que comprende la porción de etiquetado en 5' o una parte de la porción de etiquetado en 5' del PTO; (c) hibridar el fragmento liberado del PTO con un CTO (oligonucleótido de captura y formación de molde); en el que el CTO comprende en una dirección de 3' a 5' (i) una porción de captura que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la porción de etiquetado en 5' o una parte de la porción de etiquetado en 5' del PTO y (ii) una porción de formación de molde que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la porción de etiquetado en 5' y la porción de direccionamiento en 3' del PTO; en el que el fragmento liberado del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO; (d) realizar una reacción de extensión usando el resultante de la etapa (c) y una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende para producir una cadena extendida complementaria a la porción de formación de molde del CTO y se forma un dúplex extendido; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana no está presente en la muestra de ácido nucleico, no se forma el dúplex extendido; (e) realizar un análisis de fusión o un análisis de hibridación para el resultante de la etapa (d) a lo largo de un intervalo de temperaturas con un HO (oligonucleótido de hibridación) que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria al CTO; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana no está presente en la muestra de ácido nucleico, no se forma el dúplex extendido y el CTO y el HO forman un híbrido, proporcionando de ese modo una señal indicativa de la presencia del híbrido entre el CTO y el HO; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra de ácido nucleico, se forma el dúplex extendido para impedir la formación del híbrido entre el CTO y el HO, no proporcionando de ese modo la señal; en el que la señal se proporciona mediante (i) un marcador unido al HO, (ii) un marcador unido al CTO, (iii) un marcador unido al HO y un marcador unido al CTO, o (iv) un marcador de intercalación; y (f) detectar la señal indicativa de la presencia del híbrido entre el CTO y el HO; en el que la presencia del híbrido entre el CTO y el HO indica la ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la ausencia del híbrido entre el CTO y el HO indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.