Patent SU-1626683-A1 (SU)
Title: ФРАГМЕНТ ДНК AMYAMYLLICH 6, КОДИРУЮЩИЙ ГИБРИДНУЮ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ α-АМИЛАЗУ, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ, РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PPTLICH 6, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНУЮ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ α-АМИЛАЗУ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ α-АМИЛАЗЫ
IPC: C12N15/52
Filed: 1989-01-03
Granted: 1999-05-27
Abstract: 1. Фрагмент ДНК amyamyllich 6, кодирующий гибридную термостабильную α-амилазу, полученный в результате замены нуклеотидных остатков с 562 по 680 на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis без регуляторной области, со следующей нуклеотидной последовательностью фрагмента amyamyllich 6:2. Способ конструирования фрагмента ДНК amyamyllich 6, заключающийся в том, что однонитевую ДНК рекомбинантного фага M13mWBamy, содержащего часть фрагмента ДНК, кодирующего α-амилазу B.amyloliquefaciens, выращенного на клетках Escherichia coli RZ1032, смешивают с фрагментом ДНК, кодирующим часть гена α-амилазы B.licheniformis, ограниченную последовательностями узнавания рестрикционных эндонуклеаз KpnI и HindII, полученную смесь нагревают до 100C, медленно охлаждают до 20C, затем достраивают однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым фрагментом ДНК-полимеразы 1 E.coli, затем обрабатывают ДНК-лигазой, фага Т4, полученной смесью трансфецируют клетки E.coli TGl, после трансфекции анализируют полученные рекомбинантные фаги на наличие в их ДНК нуклеотидных замен, отличающих фрагмент ДНК, кодирующий α-амилазу B.amyloliquefaciens, от фрагментов ДНК amyamyllich 6, затем выделяют двунитевую ДНК фагов, содержащих указанные замены, смешивают с ДНК плазмиды pNS15BamHI, полученную смесь гидролизуют эндонуклеазами рестрикции PstI и HindIII, продукты гидролиза обрабатывают ДНК-лигазой, фага Т4, трансформируют клетки E. coli TGl, отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу и содержащие плазмиду pTG29lich 6 с фрагментом ДНК amyamyllich 6.3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pRTlich 6, кодирующая термостабильную α-амилазу Bacillus amyloliquefaciens размером 774 о.п. и массой 3,2 мл, содержащая:Pst1-BamH1 - фрагмент плазмиды pRT5 размером 2430 п.о. с генами, необходимыми для репликации в клетках Bacillus sustilis;HindIII-HindIII - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1804 п.о. с геном устойчивости Bacillus sistilis к эритромицину;BamH1-HindIII - фрагмент плазмиды pBR322 размером 309 п.о. с частью гена устойчивости к тетрациклину Pst1-EcoR1;HindIII-HindIII - фрагмент плазмиды pRT5 размером 1377 п.о. с регуляторной областью, необходимой для экспрессии гибридного гена α-амилазы и Isl - элемента Escherichia coli и частью фрагмента ДНК amyamyllich 6;EcoR1-HindIII - фрагмент фага M13mWBamyразмером 635 п.о. с частью гена гибридной термостабильной α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, в котором нуклеотидные остатки с 562 по 680 заменены на гомологичный фрагмент ДНК, кодирующий часть α-амилазы Bacillus licheniformis - HindIII-HindIII - фрагмент ДНК плазмиды pRT5 размером 1184 п.о. с частью гена α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens;уникальные сайты рестрикции: pSTI, E.corI, 3HindIII, BamHIOri - ген, кодирующий белок и область начала репликации плазмиды pRT5;E- ген, обеспечивающий синтез метилазы, определяющей устойчивость клеток B.subtilis к эритромицину;amyamyllich 6 - структурный ген гибридной термостабильной α-амилазы; деконьюгативна.4. Способ конструирования плазмиды pRTlich 6, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pRTсмешивают с плазмидой ДНК pTG29 lich 6, содержащей фрагмент ДНК amyamyllich 6, подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI, полученные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки B.subtilis 2lrecE4amy4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоны, продуцирующие α-амилазу.5. Штамм бактерий Bacillus sustilis ВКПМ B-4633 - продуцент термостабильной α-амилазы.