Patent ES-2582554-T3 (ES)
Title: Composiciones y método para medir y calibrar el sesgo de la amplificación en reacciones de PCR multiplexadas
Inventor: ROBINS HARLAN S
IPC: C12Q1/68
Filed: 2013-05-08
Granted: 2016-09-13
Abstract: Una composición para la normalización de la eficacia de la amplificación de un conjunto de cebadores oligonucleótidos para amplificar secuencias de ácidos nucleicos reordenadas que codifican uno o más receptores del sistema inmunitario adaptativo en una muestra biológica obtenida de células linfoides de un sujeto mamífero, comprendiendo cada receptor del sistema inmunitario adaptativo una región variable y una región de unión, comprendiendo la composición: una pluralidad de oligonucleótidos molde sintéticos, teniendo cada oligonucleótido molde sintético una concentración conocida antes de la amplificación y una secuencia de oligonucleótido de una fórmula general: 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I) en donde: (a) V es una secuencia de oligonucleótido que comprende al menos 20 y como máximo 1000 nucleótidos contiguos de una región variable (V) de receptor del sistema inmunitario adaptativo, o su complementario, y comprendiendo cada V una secuencia de oligonucleótido de región V única; (b) J es una secuencia de oligonucleótido que comprende al menos 15 y como máximo 600 nucleótidos contiguos de una región de unión (J) de receptor del sistema inmunitario adaptativo, o su complementario, y comprendiendo cada J una secuencia de oligonucleótido de región J única; (c) U1 es nada o comprende una secuencia de oligonucleótido que se selecciona de (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia de oligonucleótido específico de plataforma de secuenciación, que está unida a y situada 5' respecto a una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (d) U2 es nada o comprende una secuencia de oligonucleótido que se selecciona de (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia de oligonucleótido específico de plataforma de secuenciación, que está unida a y situada 5' respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (e) está presente al menos uno de B1, B2, B3 y B4 y cada uno de B1, B2, B3 y B4 comprende un oligonucleótido que comprende una secuencia de código de barras de 3-25 nucleótidos contiguos que identifica de forma única, como una combinación emparejada, (i) la secuencia de oligonucleótido de la región V única de (a), y (ii) la secuencia de oligonucleótido de la región J única de (b); (f) R es nada o comprende un sitio de reconocimiento de enzima de restricción que comprende una secuencia de oligonucleótido que está ausente de (a)-(e), y en donde: (g) la pluralidad de oligonucleótidos molde sintéticos comprende una serie de al menos a o al menos b secuencias de oligonucleótidos únicas, la que sea mayor, en donde a es el número de segmentos génicos que codifican la región V de receptor del sistema inmunitario adaptativo única en el sujeto y b es el número de segmentos génicos que codifican la región J de receptor del sistema inmunitario adaptativo única en el sujeto. y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde sintético para la secuencia de oligonucleótido de región V única y al menos un oligonucleótido molde sintético para cada secuencia de oligonucleótido de región J única.