Patent ES-2904909-T3 (ES)
Title: Método para la identificación y la cuantificación relativa de cambios en la expresión de secuencias de ácidos nucleicos, en variantes de corte y empalme, en la translocación, en el número de copias o en la metilación utilizando reacciones combinadas de nucleasa, de ligadura y de polimerasa con prevención de arrastre
Inventor: BARANY FRANCIS
IPC: C12Q1/6827
Filed: 2015-10-08
Granted: 2022-04-06
Abstract: Un método para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana cuya secuencia difiera de la de otras moléculas de ácido ribonucleico en la muestra debido a un corte y empalme alternativo, a una transcripción alternativa, a un sitio de inicio alternativo, a una secuencia codificante alternativa, a una secuencia no codificante alternativa, a una inserción de exones, a una deleción de exones, a una inserción de intrones, a una translocación, mutación u otra redisposición genómica, comprendido dicho método: proporcionar una muestra que contenga una o más moléculas de ácido ribonucleico diana cuya secuencia difiera potencialmente de la de otras moléculas de ácido ribonucleico; poner en contacto la muestra con una o más enzimas capaces de digerir moléculas de ácido nucleico que contengan dU potencialmente presentes en la muestra; proporcionar uno o más cebadores de oligonucleótidos, siendo cada cebador complementario a la una o más moléculas de ácido ribonucleico diana; combinar la muestra que se ha puesto en contacto, el uno o más cebadores de oligonucleótidos, una mezcla de desoxinucleótidos que incluya dUTP y una transcriptasa inversa, para formar una mezcla de transcripción inversa; generar moléculas de ácido desoxirribonucleico complementarias (ADNc) en la mezcla de transcripción inversa, comprendiendo cada molécula de ADNc una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la molécula de ácido ribonucleico diana y que contiene dU; proporcionar uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos, comprendiendo cada conjunto de cebadores (a) un primer cebador de oligonucleótido que comprenda una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia de nucleótidos de ADNc adyacente a la secuencia de la molécula de ácido ribonucleico diana complementaria al ADNc, y (b) un segundo cebador de oligonucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de un producto de extensión formado a partir del primer cebador de oligonucleótido; combinar la mezcla de transcripción inversa que contiene las moléculas de ADNc, el uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos, una mezcla de desoxinucleótidos que incluya dUTP y una polimerasa, para formar una mezcla de reacción de polimerasa; someter la mezcla de reacción en cadena de la polimerasa a uno o más ciclos de reacción en cadena de la polimerasa que comprenden un tratamiento de desnaturalización, un tratamiento de hibridación y un tratamiento de extensión formando de este modo uno o más productos de extensión primarios diferentes; proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos, comprendiendo cada conjunto de sondas (a) una primera sonda de oligonucleótidos que tiene una porción específica del cebador en 5' y una porción específica de secuencia diana en 3', y (b) una segunda sonda de oligonucleótidos que tiene una porción específica de secuencia diana en 5' y una porción específica de cebador en 3', en donde la primera y la segunda sonda de oligonucleótidos de un conjunto de sondas, se configura para hibridarse, de una manera específica, en partes complementarias de un producto de extensión primario correspondiente a la secuencia de la molécula de ácido ribonucleico diana; poner en contacto los productos de extensión primarios con una ligasa y con el uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos para formar una mezcla de reacción de ligadura; someter la mezcla de reacción de ligadura a uno o más ciclos de reacción de ligadura, por lo cual la primera y la segunda sondas del uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos se ligan entre sí para formar secuencias de producto ligadas en la mezcla de reacción de ligasa, en donde cada secuencia de producto ligada comprende la porción específica de cebador en 5', las porciones específicas diana y la porción específica de cebador en 3'; proporcionar uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos secundarios, comprendiendo cada conjunto de cebadores de oligonucleótidos secundarios (a) un primer cebador de oligonucleótido secundario que comprenda la misma secuencia de nucleótidos que la porción específica de cebador en 5' de la secuencia de producto ligada y (b) un segundo cebador de oligonucleótido secundario que comprenda una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a la porción específica de cebador en 3' de la secuencia de producto ligada; combinar las secuencias de producto ligadas, el uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos secundarios con una o más enzimas capaces de digerir moléculas de ácido nucleico que contengan desoxiuracilo (dU), una mezcla de desoxinucleótidos que incluya dUTP y una ADN polimerasa para formar una segunda mezcla de reacción en cadena de la polimerasa; someter la segunda mezcla de reacción en cadena de la polimerasa a condiciones adecuadas para digerir las moléculas de ácido nucleico que contengan desoxiuracilo (dU) presentes en la segunda mezcla de reacción en cadena de la polimerasa, y a uno o más ciclos de reacción en cadena de la polimerasa que comprendan un tratamiento de desnaturalización, un tratamiento de hibridación y un tratamiento de extensión mediante lo cual se forman productos de extensión secundarios; y detectar y diferenciar los productos de extensión secundarios en la muestra identificando así la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico que difieran en secuencia de otras moléculas de ácido ribonucleico en la muestra debido a un corte y empalme alternativo, a un transcrito alternativo, a un sitio de inicio alternativo, a una secuencia codificante alternativa, a una secuencia no codificante alternativa, a una inserción de exones, a una deleción de exones, a una inserción de intrones, a una translocación, una mutación u otra redisposición a nivel genómico.