Patent AR-125217-A1 (AR)
Title: Producción de polirribonucleótidos circulares en un sistema procariota
Inventor: MARTIN BARRY ANDREW
IPC: C12N15/11
Filed: 2022-03-25
Abstract: La presente divulgación se refiere, por lo general, a métodos para producir, purificar y utilizar ARN circular de un sistema procariota.  Reivindicación 1: Un sistema procariota para circularizar un polirribonucleótido, caracterizado porque comprende una célula procariota que comprende: (a) un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-3, en donde los elementos (A), (B), (C), (D) y (E) están unidos de forma operativa, y en donde: (A) comprende una ribozima de autoescisión en 5; (B) comprende una región de hibridación 5 que comprende una región complementaria en 5; (C) comprende una carga polirribonucleotídica; (D) comprende una región de hibridación 3 que comprende una región complementaria en 3; y (E) comprende una ribozima de autoescisión en 3; en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una energía libre de unión inferior a -5 kcal/mol, y/o en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una Tm de unión de al menos 10ºC; y (b) una ARN ligasa; en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 5 produce un grupo 5-hidroxilo libre en el extremo 5 del polirribonucleótido lineal, y en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 3 produce un grupo fosfato 2,3-cíclico libre en el extremo 3 del polirribonucleótido lineal, dando como resultado un polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa; y en donde los extremos 5 y 3 del polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa se ligan por la ARN ligasa, produciendo de este modo un polirribonucleótido circular. Reivindicación 21: Un método para producir un ARN circular, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto en una célula procariota: (i) un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-3, en donde los elementos (A), (B), (C), (D) y (E) están unidos de forma operativa, y en donde: (A) comprende una ribozima de autoescisión en 5; (B) comprende una región de hibridación 5 que comprende una región complementaria en 5; (C) comprende una carga polirribonucleotídica; (D) comprende una región de hibridación 3 que comprende una región complementaria en 3; y (E) comprende una ribozima de autoescisión en 3; en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una energía libre de unión inferior a -5 kcal/mol, y/o en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una Tm de unión de al menos 10ºC; en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 5 produce un grupo 5-hidroxilo libre en el extremo 5 del polirribonucleótido lineal, y en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 3 produce un grupo fosfato 2,3-cíclico libre en el extremo 3 del polirribonucleótido lineal, dando como resultado un polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa; y (ii) una ARN ligasa; mediante lo cual los extremos 5 y 3 del polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa se ligan por la ARN ligasa, produciendo de este modo un polirribonucleótido circular; y (b) opcionalmente, purificar el polirribonucleótido circular. Reivindicación 40: Una célula procariota caracterizada porque comprende: (a) un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-3, en donde los elementos (A), (B), (C), (D) y (E) están unidos de forma operativa, y en donde: (A) comprende una ribozima de autoescisión en 5; (B) comprende una región de hibridación 5 que comprende una región complementaria en 5; (C) comprende una carga polirribonucleotídica; (D) comprende una región de hibridación 3 que comprende una región complementaria en 3; y (E) comprende una ribozima de autoescisión en 3; en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una energía libre de unión inferior a -5 kcal/mol, y/o en donde la región complementaria en 5 y la región complementaria en 3 tienen una Tm de unión de al menos 10ºC; en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 5 produce un grupo 5-hidroxilo libre en el extremo 5 del polirribonucleótido lineal, y en donde la escisión de la ribozima de autoescisión en 3 produce un grupo fosfato 2,3-cíclico libre en el extremo 3 del polirribonucleótido lineal, dando como resultado un polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa; y (b) una ARN ligasa, en donde la ARN ligasa es capaz de ligar el extremo 5 y el extremo 3 del polirribonucleótido lineal compatible con la ligasa para producir un ARN circular.