context: El virus de la estomatitis vesicular con la glicoproteína del virus de la rabia dirige el transporte transsináptico retrógrado entre las neuronas in vivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3566411/SHA: ee48061797d29eeef5a9e606841bf8ab04b1d75bAutores: Beier, Kevin T.; Saunders, Arpiar B.; Oldenburg, Ian A.; Sabatini, Bernardo L.; Cepko, Constance L.Fecha: 2013-02-07DOI: 10.3389/fncir.2013.00011Licencia: cc-byAbstract: Definir las conexiones entre neuronas es crítico para nuestra comprensión de la estructura y función del sistema nervioso. Los virus recombinantes diseñados para transmitir a través de las sinapsis proporcionan un enfoque poderoso para la disección de los circuitos neuronales in vivo. Recientemente demostramos que el virus de la estomatitis vesicular recombinante (VSV) puede estar dotado de una capacidad de rastreo transsináptico anterograda o retrógrada, proporcionando al virus diferentes glicoproteínas. Aquí ampliamos la caracterización de la transmisión y expresión génica del VSV recombinante (rVSV) con la glucoproteína del virus de la rabia (RABV-G), y proporcionamos ejemplos de su actividad relativa a la forma de trazador transsináptico anterograda de rVSV. rVSV con RABV-G se encontró para impulsar la fuerte expresión de los transgenes y para propagarse rápidamente de la neurona a la neurona de una manera sólo retrógrada. Dependiendo de cómo se entregara el RABV-G, VSV sirvió como un rastreador polisináptico o monosináptico, o pudo definir proyecciones a través de la captación axonal y el transporte retrógrado. En animales coinfectados con rVV en su forma anterógrada, rVSV con RABV-G podría ser utilizado para comenzar a caracterizar las similitudes y diferencias en las conexiones a diferentes áreas. rVSV con RABV-G proporciona una herramienta de rastreo flexible, rápida y versátil que complementa el trazador transsináptico basado en VSV previamente descrito. Texto: Mapear la conectividad neuronal en el sistema nervioso central (CNS) de organismos incluso simples es una tarea difícil. Los virus recombinantes diseñados para rastrear conexiones sinápticas y expresar transgenes prometen permitir un mapeo de mayor rendimiento de conexiones entre neuronas que otros métodos, por ejemplo, la reconstrucción en serie a partir de micrografías electrónicas (Bock et al., 2011; Briggman et al., 2011). Los virus Pseudorabies (PRV) y Rabies (RABV) han sido los virus de rastreo de circuitos mejor caracterizados y más utilizados hasta la fecha (Ugolini et al., 1989; Kelly y Strick, 2000). RABV fue recientemente modificado por Wickersham y colegas de tal manera que puede viajar a través de una sola sinapsis, permitiendo una definición directa de conexiones monosinápticas (Wickersham et al., 2007b). Esta estrategia permitió la primera identificación inequívoca de células retrógradamente conectadas desde una célula inicialmente infectada Además, la célula de arranque podría definirse a través de la expresión de un receptor viral específico que limitaba la infección inicial. Recientemente, creamos un virus monosináptico anterogrado que complementa los marcadores virales retrógrados previamente disponibles (Beier et al., 2011). El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus relacionado con el VRAB, con su propio gen de la glucoproteína (G) (VSV-G), o con un G del virus no relacionado de la coriomeningitis linfocítica (LCMV-G), se disemina en la dirección anterograda a través de las sinapsis. VSV puede ser utilizado como un rastreador polisináptico que se propaga a través de muchas sinapsis, debido al hecho de que la forma normal, replicacióncompetente del virus no causa enfermedades graves en los seres humanos (Brandly y Hanson, 1957; Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). Si el virus es un rastreador monosináptico o polisináptico está determinado por el método de entrega del gen G (Figura 1A). Ventajas de VSV son que es bien caracterizado, es relativamente simple en comparación con PRV, y crece rápidamente a alto título en células de cultivo de tejidos. También se está desarrollando como un vector de la vacuna, a menudo utilizando un G de otro virus como el inmunogeno, así como se está desarrollando como un agente citocida que se dirigirá a las células tumorales en los seres humanos (Balachandran y Barber, 2000; Stojdl et al., 2000 Stojdl et al., 2003. Estudios anteriores de los patrones anatómicos de transmisión, así como registros fisiológicos, han demostrado que la transmisión de VSV y RABV entre neuronas es vía sinapsis (Kelly y Strick, 2000; Wickersham et al., 2007b; Beier et al., 2011). Además, se ha demostrado que RABV, así como lentivirus con RABV-G en su envoltorio, viajan retrógradamente desde un lugar de inyección (Mazarakis et al., 2001; Wicker Hipotemamos que proporcionar un VSV recombinante (rVSV) con el RABV-G crearía un rastreador polisináptico retrógrado sin las preocupaciones de bioseguridad inherentes a RABV. Nuestra caracterización inicial de rVVV con RABV-G mostró que de hecho FIGURE 1  Estrategias de rastreo sináptico utilizando VSV. (A) Esquema que ilustra las estrategias para la transmisión retrógrada o antierograda de la codificación de rVSV transsináptica polisináptica. La célula inicialmente infectada está indicada por un asterisco. VSV codificación de una glucoproteína (G) dentro de su genoma puede propagarse polisinápticamente. La dirección de la propagación depende de la identidad de la glucoproteína. Las neuronas infectadas se muestran en verde. En algunos casos, la célula de arranque inicialmente infectada puede definirse por la expresión de un receptor aviar, TVA (marcado con una proteína fluorescente roja). Las neuronas que expresan TVA pueden entonces ser infectadas específicamente por rVSV G con la glicoproteína EnvA/RABV-G (A/RG) (Wickersham et al., 2007b) en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)]. Estas células de arranque son entonces amarillas, debido a GFP viral y mCherry de la expresión TVA-mCherry. Para el rastreo monosináptico, la proteína G se expresa en la célula de expresión TVA, y por lo tanto complementa rVSV G para permitir la transmisión en una dirección específica. (B) Diagramas genómicos de vectores rVSV. Todos los VSV contienen cuatro proteínas esenciales: N, P, M y L. Algunos virus codifican un gen G en su genoma, lo que les permite diseminar polisinápticamente. Los vectores rVSV típicamente codifican un transgen en la primera posición, mientras que otros llevan un transgen adicional en la posición G. (C) Caracterización morfológica de neuronas infectadas por rVSV en varios lugares dentro del cerebro del ratón. (i,ii) neuronas de Caudate-putamen (CP) a 4 dpi de una inyección de CP con virus rVSV(VSV-G) codificando i) CFP o ii) Korange. (iii) Las neuronas etiquetadas de la región CA1 del hipocampo se muestran a 5 dpi después de la inyección en el hipocampo de rVSV(VSV-G) codificando Venus. (iv,v) Las neuronas piramidales corticales se muestran después de la inyección en la CP de rVSV(RABV-G) expresando iv) GFP a 24 hpi, o v) mCherry a 48 hpi. Inserto en iv) es una alta magnificación de la neurona en el panel iv), destacando el etiquetado de las espinas dendríticas. (vi) Múltiples virus se pueden inyectar en el mismo animal. Aquí, los virus rVSV G(VSV-G) individuales codificando CFP, GFP, Venus, Korange, y mCherry se utilizaron para infectar la corteza. Barras de escala = 50 μm. www.fronterizosin.org Febrero 2013  Volumen 7  Artículo 11  2 se podría tomar como un trazador retrógrado (Beier et al., 2011) Para determinar si podía transmitir entre las neuronas después de su replicación en neuronas, y para analizar más a fondo los patrones de transmisión tanto de las formas monosinápticas como polisinápticas de rVSV con RAVV-G, hicimos inyecciones en varios puntos del SNC y periféricos. Además, realizamos coinfecciones de rVVV con RAV-G y la forma anterógrada de rVSV para aprovechar las diferencias en la direccionalidad de la transmisión de estos dos virus en circuitos cartográficos. Esquemáticas de virus creados y utilizados a lo largo de este estudio se muestran en la Figura 1. Creamos plásmidos vectoriales de rVSV con diferentes transgénicos en las posiciones genómicas primera o quinta (Figura 1B). Después de rescatar cada virus, probamos la capacidad de cada uno de ellos de expresar transgénicos en diferentes regiones cerebrales Todos los vectores rVSV impulsaron la expresión robusta del fluoroforo 1 o 2 días después de la infección (hpi) (Figura 1C ) (van den Pol et al., 2009). De hecho, por 12 hpi, el etiquetado fue lo suficientemente brillante como para imagenar detalles morfológicos finos, tales como espinas dendríticas (Figura 1C, iv). Para caracterizar las propiedades fisiológicas de las células infectadas con rVSV, probamos una codificación rVSV competente GFP, con RABV-G en el genoma en lugar de VSV-G [en adelante designado rVSV(RABV-G)]. van den Pol et al. Sin embargo, por 2 dpi, las propiedades electrofisiológicas eran tan anormales en las células piramidales corticales infectadas que no se podían realizar mediciones fisiológicas. La velocidad y la fuerza de la expresión de transgenes codificados por VSV depende de la posición genómica del gen (van den Pol et al., 2009; Beier et al., 2011). Los genes en la primera posición se expresan más alto, con una disminución en el nivel de expresión en posiciones más 3 dentro de la fila viral plus. Cuando GFP fue insertado en la primera posición de VSV, la fluorescencia de GFP fue detectable por primera vez en aproximadamente 1 hpi en células cultivadas (van den Pol et al., 2009). Con el fin de cuantificar la expresión relativa de una proteína fluorescente en la primera posición genómica en neuronas, las rodajas de hipocampo de rata fueron infectadas con una replicación incompetente rVSV que expresa mCherry (rVSV G, Figuras 1A, B). Se trata de un virus G que tuvo el RABV-G suministrado en trans durante la preparación del stock del virus [referido como rVSV G(RABV-G)]. La intensidad media de fluorescencia de las células infectadas se midió cada hora a lo largo de 18 h. Por 4 hpi a 37 • C, la fluorescencia roja era claramente visible, y alcanzó niveles máximos de aproximadamente 14 hpi (N = 3, Figura 3 ). Resultados similares se obtuvieron con un virus codificando GFP en la primera posición genómica en lugar de mCherry (es decir, Figura 1B ) (N = 3). Anteriormente se demostró que el rVVSV(RABV-G) podía ser tomado retrógradamente por neuronas (Beier et al., 2011), pero estos experimentos no distinguían entre la absorción axonal directa de la transmisión inocula Para distinguir entre estos dos mecanismos y ampliar los análisis anteriores, se realizaron más experimentos en el sistema visual mamífero (Figuras 4A-G). Como el área visual de la corteza 1 (V1) no recibe proyecciones directas de las células ganglionares de la retina (RGCs), sino que recibe una entrada secundaria de los CGRs a través del núcleo genogénico lateral (GNL), la infección de los CGRs por inyección de V1 demostraría la transmisión retrógrada de células que soportaban al menos una ronda de replicación viral. Tras una inyección V1 con rVSV(RABV-G), los CGRs positivos de GFP fueron observados en la retina por 3 dpi (N = 3; Figura 4G ). Importantemente, el etiquetado viral en el cerebro se restringió a áreas de proyección primaria y secundaria, incluso a 7 dpi. Entre ellos se encontraban el LGN (Figura 4D ) y el hipotálamo (Figura 4E ), dos áreas conocidas por proyectar directamente a V1 (Kandel, 2000). Se observó etiquetado selectivo en otras áreas, como áreas corticales que rodean a V1 (Figura 4C), que proyectan directamente a V1, y también en el estrato central superior de colliculus (SC), que proyectan al LGN (Figura 4F ). También se observó etiquetado en el núcleo basalis, que proyecta a la corteza, así como muchos componentes del circuito de ganglios basales, que proporcionan entrada al tálamo [como el caudato-putamen (CP), el globus pallidus (GP), y el núcleo subtalámico (STn)]. En consonancia con la falta de transmisión viral generalizada, los animales no mostraron signos de enfermedad a 7 dpi. Estos datos muestran que rVSV(RABV-G) puede propagarse en una dirección retrógrada desde el lugar de inyección, pero no abordan si el virus puede propagarse exclusivamente en la dirección retrógrada. La especificidad transsináptica direccional sólo se puede abordar definitivamente mediante un circuito unidireccional. Por lo tanto, nos dirigimos a la corteza motora primaria (M1) a la conexión CP, en la que las neuronas se proyectan desde la corteza a la CP, pero no en la otra dirección (Figura 4H ) (Beier et al., 2011). Las inyecciones de rVSV(RABV-G) en M1 no deben etiquetar las neuronas en la CP si el virus sólo puede etiquetar las células a través de sinapsis en la dirección retrógrada De hecho, en 2 dpi, se etiquetaron áreas que proyectaban directamente al lugar de inyección, incluyendo la corteza contralateral (Figura 4I ). Sólo se observaron axones de células corticales en la CP, sin cuerpos celulares marcados con GFP presentes en la CP (Figura 4J), consistentes con la falta de diseminación transsináptica anterograda. Por 3 dpi, se observó un pequeño número de neuronas medianas espinosas (MSN) en la CP, probablemente a través de diseminación secundaria de neuronas talámicas o GP inicialmente infectadas (datos no mostrados). Una ventaja particular de los trazadores virales retrógrados es la capacidad de etiquetar neuronas del SNC proyectando a sitios periféricos. Esto ha sido una poderosa aplicación tanto de RABV y PRV (Ugolini et al., 1989; Standish et al., 1994). Para comprobar si el rVSV (RABV-G) también podría realizar esta función, examinamos la inervación de la superficie de la dura por neuronas del ganglio trigémino, un circuito neuronal que se cree que está involucrado en migrañas (Penfield y McNaughton, 1940; Mayberg et al., 1984). Estas neuronas tienen axones, pero no dendritas canónicas, y envían proyecciones a la médula espinal y tronco cerebral. Por lo tanto, la única manera en que las neuronas trigéminas podrían ser etiquetadas desde la aplicación viral a la dura es mediante la absorción retrógrada del virus. Aplicamos el rVSV(RABV-G) a la dura mater intacta y analizamos la dura, el ganglio trigémino y el CNS para la etiquetación (Figura 4K ). En el momento más temprano examinado, 3 dpi, observamos axones viajando a lo largo de la dura, pero poca otra evidencia de infección (Figura 4L). No se observaron cuerpos de células neuronales etiquetados en la dura, consistentes con la falta de neuronas en esta superficie. En contraste, encontramos cuerpos celulares etiquetados en el ganglio trigémino (Figura 4M ). No se observó infección en el SNC, incluso a 4 dpi, consistente con la falta de entradas del cerebro en el ganglio trigémino (N = 4 animales). Para caracterizar más patrones y cinética de transmisión viral y especificidad direccional de la propagación transsináptica, se hicieron inyecciones de rVSV(RABV-G) en la CP (Figura 5A ). Para determinar qué células fueron etiquetadas por absorción directa de virus en el inóculo, se inyectó un conjunto separado de animales en la CP con la replicación incompetente rVSV G(RABV-G) (N = 3 animales, analizados 3 dpi). Se observaron células etiquetadas por rVSV G(RABV-G) en la CP, GP, substantia nigra (SN), tálamo y capas 3 y 5 de la corteza, consistentes con infección en el terminal de axón y etiquetado retrógrado de cuerpos celulares de neuronas conocidas por proyectar directamente a la CP (Figura 5C ) (Albin et al., 1995). Las áreas etiquetadas por inyección de CP se indican en la Figura 5B. Los patrones de propagación para la replicación-competente rVSV(RABV-G) se caracterizaron a lo largo de 1-5 dpi (Figuras 5D-H). Durante este intervalo, progresivamente más células en regiones infectadas fueron etiquetadas por rVSV(RABV-G), incluyendo dentro de la CP, núcleo basalis, corteza y GP (listado en la Figura 5B ). Además, más células corticales fueron etiquetadas en grupos cercanos a neuronas piramidales corticales, tanto ipsilaterales como contralaterales al lado inyectado, incluyendo células neurogliaformas (datos no mostrados). Estos datos contrastan con los observados después de la infección por un virus de rastreo transsináptico anterogrado, como rVSV con su propio gen G, rVSV(VSV-G) (Figura 5B) A 3 dpi después de la inyección de rVSV(VSV-G) en la CP, la corteza cerebral no fue etiquetada, pero las regiones que recibieron proyecciones de la CP, como el STn, GP y SN, fueron etiquetadas (Beier et al., 2011). Para investigar otras áreas de evidencia de diseminación transsináptica retrógrada de células a células, se examinó el núcleo basalis después de la infección de la CP con rVSV (RABV-G). El núcleo basalis fue etiquetado por 2 dpi (Figuras 5E-H), consistente con al menos un salto transsináptico único, ya que esta área no se proyecta directamente a la CP. El virus parecía viajar transsinápticamente a la velocidad de aproximadamente 1 sinapsis por día, como evidencia la falta de células neurogliaformas etiquetadas en la corteza, y la falta de neuronas en el núcleo basalis a 1 dpi, y la etiqueta que aparece en estos tipos/áreas celulares a 2 dpi, como se observó previamente (Beier et al., 2011). La etiqueta se mantuvo bien restringida a los circuitos corticostriatales esperados a 5 dpi, sugiriendo que la propagación viral se vuelve menos eficiente después de cruzar una o dos conexiones, consistentes con inyecciones en V1 (Figura 4). Mientras que las células gliales se pueden infectar y se observaron cerca del lugar de inyección (van den Pol et al., 2002; Chauhan et al., 2010), las células gliales infectadas fuera del lugar de inyección generalmente no se observaron. Una ventaja de tener formas tanto anterogradas como retrógradas del mismo virus es que pueden utilizarse en paralelo, o en tándem, para rastrear circuitos desde y hacia un único o múltiple lugar de inyección, con cada virus con cinética similar de propagación y expresión génica. De hecho, si diferentes fluoroforos se utilizan en diferentes virus, por ejemplo, rVSV(VSV-G) y rVSV(RABV-G), entonces los virus pueden ser co-inyectados en el mismo lugar y su transmisión puede ser rastreada de forma independiente (Figura 6A ). Esto es más sencillo si no hay células en el lugar de inyección que estén infectadas inicialmente por ambos virus. Las células coinfectadas pueden ser fácilmente detectadas, ya que expresarían ambas proteínas fluorescentes poco después de la inyección. Para determinar si dos virus permitirían el rastreo transsináptico simultáneo anterogrado y retrógrado desde un único lugar de inyección, se inyectaban individualmente un rVSV(VSV-G) que expresaba Venus y un rVSV(RABV-G) que expresaba mCherry (figuras 6B-D) o co-inyección (figuras 6E-G) en la corteza motora, y se examinaban los cerebros 3 dpi. El patrón de etiquetado de los cerebros co-inyectados era equivalente a los patrones observados cuando cada virus se inyectaba individualmente: se observó que rVSV(VSV-G) infectaba neuronas en la corteza, CP y núcleos posteriores, mientras que el rVSV(RABV-G) no se observó que infectaba neuronas en la CP, sino más bien en el tálamo y La tasa de coinfección inicial depende de La presencia o ausencia de etiquetado está indicada por (+) y (−), respectivamente. La extensión del etiquetado está indicada por el número de (+). Algunos animales fueron infectados con virus G para determinar qué áreas fueron marcadas por la absorción directa de los viriones, en lugar de por la replicación y transmisión. Estos fueron sacrificados a 3 dpi. (C) Sección parasaggital de un cerebro infectado con VSV[delta de Grecia]G(RABV-G). El lugar de inyección está marcado por una flecha roja. Varias áreas que se proyectan directamente a la CP fueron etiquetadas debido a la absorción directa de los viriones, incluyendo la corteza, el tálamo y GP (cabezas de flecha), 3 dpi. la dosis de la ínócula inicial. Al inyectar 3 × 10 3 unidades de conformación de foco (ffu) rVSV(VSV-G) y 3 × 10 4 ffu rVSV(RABV-G), no se observó coinfección en el lugar de inyección. Así, la coinfección de la misma región cerebral, sin coinfección de las mismas células, no altera el comportamiento de propagación de rVSV(VSV-G) ni de rVSV(RABV-G). Un ejemplo de cómo este sistema de rastreo transsináptico retrógrado y anterogrado puede utilizarse es determinar si tres Fronteras en los Circuitos Neuales www.fronterizosin.org Febrero 2013  Volumen 7  Artículo 11  8 regiones distintas están conectadas y la direccionalidad de cualquier conexión. Por ejemplo, el virus transsináptico anterogrado puede inyectarse en una región, el retrógrado en otra, y una tercera región puede entonces ser examinada para evidencia de etiquetado por uno o ambos virus (por ejemplo, Figura 6H ). Para probar esta posibilidad, se inyectó rVSV(VSV-G) en la corteza motora, se inyectó rVSV(RABV-G) en la substantia nigra pars reticulara (SNr), y se sacrificaron animales a 3 dpi. Observamos que las células estaban marcadas individualmente, ya sea con Venus [rVSV(VSV-G)] o con mCherry [rVSV(RABV-G)], y se encontraban en gran parte en diferentes regiones del CP (Figuras 6I,J) (N = 3). Estos resultados sugieren que las conexiones anterogradas de las células infectadas con rVSV(VSV-G) en el M1 fueron con CP MSNs que no proyectaban a la región del SNr inyectado con rVSV(RABV-G) (N = 3 animales). Además del rastreo polisináptico, VSV puede ser modificado a circuitos traza monosinapticamente (Beier et al., 2011). Con RABV, esto se logró in vivo por primera vez infectando con un virus asociado adeno (AAV) que expresa TVA, un receptor para un retrovirus aviar, y RABV-G (Wall et al., 2010). Esto fue seguido 3 semanas más tarde por una infección con un VRABG con una glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virión (Wickersham et al., 2007b), que permitió la infección específicamente de las células que expresan TVA. Se utilizó una estrategia similar para probar la capacidad de rVSV de rastrear monosinápticamente neuronas retrógradas conectadas in vivo. Se utilizaron para esta prueba las entradas a las neuronas de expresión de la colina acetiltransferasa (ChAT) en el estriato. Estas neuronas reciben principalmente la entrada de la corteza y el tálamo (Thomas et al., 2000; Bloomfield et al., 2007) (Figura 7A). Para marcar esta población, cruzamos ratones ChAT-Cre a ratones Ai9, que expresan tdTomato en células con antecedentes de expresión Cre (Madisen et al., 2010). Los ratones de seis semanas de edad de esta cruz fueron inyectados en la CP con dos vectores AAV: uno que expresa una proteína de fusión Cre-condicional ("floxed") TVA-mCherry, y otro que expresa una floxed RABV-G. Dos semanas más tarde, los ratones fueron inyectados en las mismas coordenadas con rVSVG con la glucoproteína quimérica EnvA/RABV-G en la superficie del virion [rVSV G(A/RG)] (Beier et al., 2011). Las células infectadas con éxito con estos dos vectores AAV podrían albergar infección por un rVSV y deberían ser capaces de producir vi Estas células de arranque también deberían expresar tdTomato y GFP. Si se produjeran rVSV, y si se transmitiera a través de la sinapsis retrógradamente, las neuronas corticales y talámicas deberían ser etiquetadas por GFP. Los ratones inyectados con estos virus AAV y rVSV fueron sacrificados 5 días después de la infección por rVSV, y los cerebros analizados para la fluorescencia. Como se esperaba para las células de arranque, algunas neuronas en la CP expresaron tdTomato y GFP (Figura 7B). Fuera de la CP, se observaron pequeños números de neuronas GFP+ que no eran mCherry+ en la corteza (Figuras 7C,D) y thalamus (Figura 7E), consistentes con la propagación retrógrada. Los animales de control que no expresan Cre, o no se inyectan con la codificación AAV RABV-G, no etiquetan las células en la corteza o el tálamo (N = 3 para ambos controles y condición experimental). Aquí, informamos sobre el uso de rVSV como un rastreador transsináptico retrógrado para el circuito CNS. VSV se puede modificar para codificar la proteína RABV-G en el genoma viral, permitiendo que el virus se reproduzca y transmita a través de múltiples células sinápticamente conectadas, es decir, como un trazador polisináptico. Alternativamente, si el virus tiene el gen G eliminado de su genoma y RABV-G se proporciona en trans, se comporta como un trazador monosináptico (Beier et al., 2011). Aunque se sabe desde hace muchos años que el VRAB viaja retrógradamente entre las neuronas (Astic et al., 1993; Ugolini, 1995; Kelly y Strick, 2003), y el seudotipado de lentivirus con RABV-G es suficiente para el transporte axonal (Mazarakis et al., 2001), la especificidad de transmisión retrógrada entre neuronas no había demostrado claramente ser una propiedad de la proteína G en sí, ya que podría haber sido debido a otras proteínas virales además de, o en lugar de, la proteína G viral. Dado que el VSV nativo no tiene estas propiedades transsinápticas retrógradas (van den Pol et al., 2002; Beier et al., 2011), y la única alteración al genoma del VSV fue la sustitución del gen VSV G por el gen G de RABV, está claro que la glicoproteína RABV es responsable de la dirección retrógrada de la transmisión viral a través de las sinapsis, al menos en el caso del rVVV. El inicio temprano de la expresión génica del VSV en relación con el RABV (una hora frente a varias horas) lo hace beneficioso en paradigmas experimentales en los que el experimento debe realizarse dentro de una ventana estrecha del tiempo, como cortes de tejido y explantes. Además, más de un transgene puede codificarse en el genoma viral sin necesidad de un elemento 2A o IRES. El uso de la primera posición del genoma aumenta el nivel de expresión del transgéne insertado en esa ubicación, ya que VSV (y RABV) expresan genes en un gradiente transcripcional; por lo tanto, el primer gen es el más transcrito (Knipe, 2007). Esto conduce a predicciones racionales de los niveles de expresión para que uno pueda elegir la posición de inserción de un transgéne, o transgénes, de acuerdo con este gradiente y el nivel deseado de expresión. El tamaño del capsid viral aparentemente no es rígido, permitiendo la inclusión de genomas que son sustancialmente más grandes que el genoma nativo, a diferencia de la capacidad rígida para algunos otros vectores virales, como AAV Yan et al., 2000). El hecho de que el VSV pueda ser hecho para diseminar anterogradamente (Beier et al., 2011) o retrógradamente a través de sinapsis con el cambio de un único gen ofrece varias ventajas sobre los trazadores virales que hasta ahora no han mostrado tal flexibilidad en la direccionalidad del rastreo. Además de la aplicación obvia de rastrear conexiones anterogradas, se pueden hacer combinaciones para explotar las diferentes formas del virus. Un ejemplo que emplea la infección simultánea con una forma anterograda y retrógrada de VSV se demuestra en la Figura 6. Este experimento fue diseñado para abordar si las proyecciones anterogradas de la corteza a la CP etiquetarían las mismas regiones cerebrales que fueron etiquetadas por un virus retrógrado inyectado en la SN. Aunque un bloque de superinfección por el virus puede impedir la infección de la misma célula con múltiples VSVr, las células adyacentes podrían seguir siendo etiquetadas por diferentes virus (Whitaker-Dowling et al., 1983). Los resultados observados podrían deberse a un etiquetado preferencial por el virus transsináptico anterógrado de las vías indirectas MSNs en este experimento, que luego se sinapizan en el GP, reflejando así un sesgo viral. Alternativamente, podría indicar que las neuronas corticales en la región inyectada en gran medida no etiquetan las NSM que proyectan al área de la SN inyectada con el virus retrógrado. Otra posibilidad es que se utilizó demasiado poco virus para observar el co-etiquetado de una región dada. Sin embargo, dada la densidad de infección (es decir, Figuras 6I,J), esta última posibilidad parece poco probable. Además, la propagación del rVSV polisináptico (RABV-G) parece atenuarse con el aumento del número de sinapsis cruzadas, lo que permite un análisis de la propagación viral más restringida. Esto es bastante fortuito, como si la propagación continuara, llevaría a una infección generalizada y letalidad. Además, la reconstrucción de la conectividad sería más difícil. Esta eficiencia reducida parece sostener también la forma monosináptica de VSV complementada con RABV-G, ya que la eficiencia de la transmisión parecía inferior al experimento comparable con RABV (Watabe-Uchida et al., 2012). Esto es probablemente debido a la atenuación viral cuando VSV-G es reemplazado por RABV-G.Nos sentimos atraídos por el uso del VSV como rastreador viral debido a su largo historial como agente de laboratorio seguro, replicante y competente. Los trabajadores de laboratorio que utilizan VSV no han contraído ninguna enfermedad, y las infecciones por VSV naturales entre las poblaciones humanas de América Central y el suroeste de Estados Unidos (Rodríguez, 2002) se producen sin patología evidente (Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). VSV fue así un candidato atractivo para su uso como rastreador polisináptico para estudios del SNC, lo que requiere una capacidad de replicación a través de múltiples ciclos de transmisión. Tanto las formas de replicación como las formas incompetentes de VVV están en uso bajo contención de Bioseguridad Nivel 2. Es probable que las diferencias de patogenicidad entre VSV y VRAB se deban a la capacidad del VRAB para evadir el sistema inmunitario innato, en particular el interferón (Hangartner et al., 2006; Junt et al., 2007; Lyles and Rupprecht, 2007; Rieder and Conzelmann, 2009; Iannacone et al., 2010). La infección por VSV provoca eficazmente una respuesta al interferón, y no ha evolucionado un método de escape de esta respuesta, a diferencia de RABV (Brzózka et al., 2006). De hecho, el VSV se está persiguiendo como vacuna contra otros virus, entre ellos el VRAB (Lichty et al., 2004; Publicover et al., 2004; Kapadia et al., 2005; Schwartz et al., 2007; Iyer et al., 2009; Geisbert El VSV no se disemina típicamente más allá del sitio inicialmente infectado en la periferia (Kramer et al., 1983; Vogel y Fertsch, 1987). Esto probablemente es la causa de los síntomas menores o ausentes en humanos y animales infectados en la naturaleza. Los vectores VSV polisinápticos son así predichos para ser mucho más seguros que los vectores RABV polisinápticos. Hemos probado esta predicción inyectando una serie de ratones en las almohadillas y músculos de las piernas traseras con rVSV(RABV-G), con el resultado de que ningún animal inyectado mostró ninguna evidencia de morbilidad o mortalidad (Beier, Goz et al., en preparación). Aunque más seguro para los trabajadores de laboratorio que RABV, el principal inconveniente al uso del VSV es su toxicidad celular rápida (van den Pol et al., 2009; Beier et al., La toxicidad se debe a la supresión de la transcripción celular y a un bloqueo en la exportación de ARN celulares del núcleo al citoplasma (Black and Lyles, 1992; Her et al., 1997; Ahmed and Lyles, 1998; Petersen et al., 2000; von Kobbe et al., 2000), así como a la inhibición de la traducción de mRNA celulares (Francoeur et al., 1987; Jayakar et al., 2000; Kopecky et al., Frontiers in Neural Circuits www.fronterizosin.org Febrero 2013  Volumen 7  Artículo 11  10 2001). El VSV es mucho más rápido para promulgar su programa de expresión genética que el RABV, de modo que las células sufren los efectos tóxicos más rápidamente que después de la infección por RABV. Un aspecto de VSV que puede ser explotado en el futuro para mejorar la velocidad de toxicidad es el uso de mutantes y variantes de VSV. Uno de estos mutantes es el M51R, que nos permitió realizar análisis fisiológicos de células pre y post-sinápticas (Beier et al., 2011). Estamos en el proceso de examinar las propiedades de transmisión de este mutante in vivo, así como los efectos de otras mutaciones o variantes virales en la prolongación de la salud de las neuronas después de la infección. vectores rVSV se pueden utilizar para estudiar la conectividad de circuitos neuronales. Además de combinaciones de formas de replicación-competentes de VSV, las formas de replicación-incompetentes, monosinápticas del virus se pueden combinar fácilmente, sin la necesidad de cambiar virus (Beier et al., 2011). Esto permite una forma directa de estudiar tanto las proyecciones hacia una población celular genéticamente definida como hacia fuera. Esto se puede hacer con el mismo genoma viral, siendo el único cambio necesario la glucoproteína, para la selección de la dirección de transmisión. Esta flexibilidad del VSV lo convierte en un poderoso vector multi-aplicación para el estudio de la conectividad en el SNC. Todos los clones del rVSV fueron clonados de la columna vertebral del rVSV G (Chandran et al., 2005). mCherry, Kusabira naranja, Venus y CFP fueron clonados en la primera posición (GFP) usando sitios XhoI y MscI, y VSV-G (un regalo de Richard Mulligan, Harvard Medical School, Boston, MA) y RABV-G (un regalo de Ed Callaway, Salk Institute, San Diego, CA) fueron clonados en la quinta posición (G) utilizando los sitios de restricción MluI y NotI. Los genes para proteínas fluorescentes fueron obtenidos de Clontech. Los virus fueron rescatados como se describió anteriormente (Whelan et al., 1995). A 95% de confluencia, ocho placas de células BSR de 10 cm fueron infectadas en un MOI de 0,01. Los sobrenadantes virales fueron recolectados a intervalos de 24h y ultracentrífugos a 21.000 RPM usando un rotor SW28 y resuspendido Para la titulación, las reservas virales concentradas se aplicaron en una serie de dilución a células BSR 100% confluentes y las placas se examinaron a 12 hpi. Las existencias virales se almacenaron a −80 • C. En el caso de los virus G, las células 293T fueron transfectadas con IEP (Ehrhardt et al., 2006) a un 70% de confluencia en platos de 10 cm con 5 μg de pCAG-RABV-G. Veinticuatro horas después de la infección, las células fueron infectadas a un MOI de 0,01 con rVSVG que expresaba GFP o mCherry. Los sobrenadantes virales se recogieron durante los siguientes 4 días a intervalos de 24 h. Los preparados virales están ahora disponibles en el núcleo viral de Salk GT3 (http://vectorcore.salk.edu/). Todos los Los plásmidos AAV-FLEx-RABV-G y AAV-FLEx-TVA-mCherry se originaron en el laboratorio de Naoshige Uchida (Watabe-Uchida et al., 2012), y las existencias de virus fueron regalos generosos de Brad Lowell, Harvard Medical School. Los ratones ChAT-Cre (B6;129S6-Chat tm1(cre)Lowl /J) y Ai9 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor<tm9(CAG-tdTomato)Hze>/J) se obtuvieron del laboratorio Jackson (Madisen et al., 2010). Los ratones CD-1 de ocho semanas de edad se inyectaron utilizando microdispensadores capilares tirados (Drummond Scientific, Cat. No: 5-000-2005), utilizando coordenadas del Ratón Cerebro en coordenadas estereotáxicas (Franklin y Paxinos, 1997). Las coordenadas de inyección (en mm) utilizadas fueron: Para el análisis multicolor (Figuras 1C,D) se inyectó 3 × 10 9 ffu/mL rVSV en varias regiones. Para las inyecciones de CP, 100 nL de rVSV(RABV-G) o rVSV(VSV-G) a 3 × 10 7 ffu/mL se inyectó a una velocidad de 100 nL/min. Para los virus incompetentes de replicación, se inyectó 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV G(RABV-G) o rVSV G (VSV-G). En la corteza motora, se inyectaron 100 nL de 1 × 10 7 ffu/mL rVSV(RABV-G) y ratones cosecharon 2 dpi. Para las inyecciones de V1, se inyectaron 100 nL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) y se examinó a los ratones 3 o 7 dpi. Para las infecciones de la dura mater, se aplicó 1 μL de 3 × 10 10 ffu/mL rVSV(RABV-G) a la superficie de la dura. Se permitió la absorción del virus, y la superficie fue cubierta posteriormente con cera ósea, y la herida suturada. Para la coinyección de virus en el mismo animal, 100 nL de una combinación de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) y 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) fueron coinyectados en la corteza motora, y los cerebros examinaron 3 dpi. Para la inyección de virus en diferentes regiones, 100 nL de 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) se inyectaron en M1, y 100 nL de 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) en el SNr, y los cerebros examinaron 3 dpi. Se utilizó un título inferior de rVSV(VSV-G), ya que rVSV(RABV-G) está atenuado. Todo el trabajo del ratón se realizó en condiciones de contención de bioseguridad nivel 2 y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales del Área Médica de Longwood. Las grabaciones fueron hechas de neuronas piramidales corticales en rebanadas tomadas de ratones del día 12-18 postnatales, inoculadas en el CP 12-18 h previo con rVSV(RABV-G). Las rebanadas coronales (300 μm de espesor) fueron cortadas en solución externa helada conteniendo (en mM): 110 colina, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 25 glucosa, 11,6 Na-ascorbato, y 3,1 Na-piruvato, burbujado con 95% O 2 y 5% CO 2. A continuación, se transfirieron las rebanadas al líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenía (en mM): 127 NaCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, y 25 glucosa, burbujas con 95% O 2 y 5% CO 2. Después de un período de incubación Fronteras en Circuitos Neurales www.frontiersin.org Febrero 2013  Volumen 7  Artículo 11  11 de 30-40 min a 34 • C, las rebanadas se almacenaron a temperatura ambiente. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (25 • C). En todos los experimentos se detectaron picrotoxina de 50 μM, 10 μM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2, 3, 4 -tetrahidrobenzo [f]quinoxalina -7-sulfonamida (NBQX), y 10 μM 3-(R)-2-carboxipiperazin-4-il)-propil-1-ácido fosfónico (CPP) en el ACSF para bloquear la transmisión mediada por receptores GABAA/C, AMPA y NMDA, respectivamente. Todas las sustancias químicas fueron de Sigma o Tocris. Se obtuvieron registros de células enteras de neuronas piramidales corticales de capa profunda infectadas y no infectadas identificadas con la fluorescencia video-IR/DIC y GFP mediante iluminación de epifluorescencia. Con las capas profundas de la corteza, se utilizó la microscopía de escaneo láser de 2 fotones (2PLSM) para confirmar los tipos celulares basados en la morfología. Las neuronas piramidales de capa profunda tenían cuerpos celulares grandes, forma piramidal clásica y espinas dendríticas. Los electrodos de vidrio (2-4 M) se llenaron con solución interna que contenía (en mM): 135 KMeSO 4, 5 KCl, 5 HEPES, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 10 Na 2 HPO 4, 1 EGTA, y 0.01 Alexa Fluor-594 (para imagen de morfología neuronal) ajustado al pH 7.4 con KOH. Las grabaciones de corriente y voltaje se realizaron a temperatura ambiente utilizando un amplificador AxoPatch 200B o un Multiclamp 700B. Los datos se filtraron a 5 kHz y se digital Los datos de imagen y fisiología fueron adquiridos y analizados según lo descrito previamente (Carter y Sabatini, 2004). El potencial de membrana de reposo fue determinado por el promedio de tres barridos de 5-s sin corriente inyectada. Las propiedades pasivas de la célula, membrana (RM) y resistencia en serie (Rs) y capacitancia (Cm), fueron medidas mientras que las células de sujeción a −65 mV y aplicando pasos de tensión de −55 a −75 mV. La relación de corriente con fuego fue determinada en la abrazadera actual con 1-s períodos de corriente inyectada de 100 a 500 pA. El curso temporal de los experimentos de expresión génica viral se llevó a cabo en cultivos de rebanadas de hipocampo organotípicas preparados a partir de ratas postnatales 5-7 Sprague-Dawley como se describió anteriormente (Stoppini et al.,
question: ¿Qué tipos de virus se pueden utilizar para estudiar la conectividad de los circuitos neuronales?
answers.text: vectores rVSV