context: El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7  10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2  0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2  0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA  0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P  0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P  0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.
question: ¿Cuáles son los síntomas del virus venezolano de la encefalitis equina?
answers.text: fiebre, malestar y vómitos