context: Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.
question: ¿Qué es crítico para el desarrollo de un granuloma protector en infecciones de tuberculosis?
answers.text: factor de necrosis tumoral-α