context: El tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha cambiado drásticamente con el advenimiento de agentes antivirales de acción directa (DAAs) en pacientes infectados del genotipo 1 uruguayoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545245b4f884b48aa2b69c9deb942c3e77Autores: Aldunate, Fabián; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarFecha: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Li Sin embargo, la eficacia de los ADA puede ser atenuada por la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) antes y después del tratamiento. De hecho, los ASA detectados en pacientes infectados por el VHC no tratados previamente por el DAA podrían ser útiles para el manejo clínico y la predicción de los resultados. Aunque la frecuencia de NS5A y NS5B del VHC se ha abordado en muchos países, sólo hay unos pocos informes sobre su prevalencia en la región sudamericana. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de RASs a los inhibidores NS5A y NS5B en un tratamiento DAA cohorte naive de pacientes uruguayos infectados con hepatitis C crónica y compararlos con informes de otros países sudamericanos. Aquí se encontró que las sustituciones naturales que confieren resistencia a los inhibidores del NS5A y NS5B estaban presentes en el Es importante destacar que las sustituciones basales en NS5A y NS5B aquí identificadas difieren de los estudios previamente reportados en Brasil. Además, las cepas uruguayas subtipo 1a agrupadas dentro de todos los principales clados mundiales, demostrando que las variantes del VHC que circulan actualmente en este país se caracterizan por una notable diversidad genética. Texto: Tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) ha mejorado dramáticamente gracias a la introducción de agentes antivirales de acción directa (DAAs). Estos antivirales han aumentado significativamente las tasas de respuesta (hasta el 98%) y reducido considerablemente la duración del tratamiento [1]. En la actualidad, los ADA disponibles se clasifican en cuatro categorías, dados sus objetivos moleculares en el ciclo de replicación del VHC: (1) los inhibidores de la proteasa NS3/4A (IP) se unen al sitio activo de la proteasa NS3/4A; (2) los inhibidores de la NS5A interactúan con el dominio 1 del dímero NS5A, aunque el mecanismo exacto de inhibición del NS5A sigue estando totalmente elucidado; (3) los inhibidores análogos de la polimerasa NS5B nucleosidos se incorporan a la cadena de ARN naciente, lo que da lugar a la terminación de la cadena al comprometer la unión del nucleótido entrante; (4) los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos interactúan con el dominio del pulgar 1, pulgar 2, palma 1 o palma 2 de NS5B e inhiben la actividad Sin embargo, la mutación extrema y las altas tasas de replicación del VHC, junto con la presión del sistema inmunitario, conducen a una notable variabilidad genética que puede comprometer las altas tasas de respuesta a los AAD debido a la preexistencia de sustituciones asociadas a la resistencia (RASs) [5, 6]. Cada fármaco o clase de AAD se caracteriza por perfiles de resistencia específicos.La probabilidad de que un AAD seleccione y permita el crecimiento de poblaciones virales portadoras de RAS depende de la barrera genética del AAD a la resistencia (el número y tipo de mutaciones necesarias para generar una sustitución de aminoácidos que confiere resistencia), la aptitud viral (capacidad replicativa) de la variante resistente, y los genotipos virales y subtipos [7, 8]. La prevalencia de RAS en pacientes no tratados previamente ha sido ampliamente reportada en todo el mundo [9] [10] [11] [11] [14] [16] Sin embargo, aparte de Brasil y Argentina, este tema aún no ha sido tratado plenamente en otros países sudamericanos [9, [17] [18] [19]. La falta de información en relación con los SRAs basales preexistentes, sumados al alto costo de estos nuevos fármacos, son los principales factores limitantes para la amplia implementación de estas nuevas terapias en Uruguay, así como en otros países latinoamericanos (ingreso bajo o bajo medio) [20]. En este estudio, exploramos la presencia de variantes de resistencia a inhibidores NS5A y NS5B en una cohorte de tratamiento de la DAA naïve de pacientes uruguayas crónicamente infectados con hepatitis C. Aquí, nos propusimos contribuir al conocimiento de la circulación de variantes resistentes al VHC en la región sudamericana. Se obtuvieron muestras séricas de 31 pacientes con marcadores serológicos del VHC, que fueron reclutados entre 2015 y 2017 en la Clínica de Gastroenterología del Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay. La infección por VHC fue confirmada por Abbott en tiempo real VHC (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, EE.UU.). Los pacientes seleccionados para este estudio fueron infectados crónicamente con genotipo 1 del VHC y DAA no tratados previamente en el momento de la extracción de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes. Los estudios se han realizado de acuerdo con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki y fueron aprobados por la junta institucional correspondiente (Comité ético Hospital de Clínicas). 2.2. Extracción de ARN, síntesis de cDNA y amplificación NS5A y NS5B. El ARN viral se extrajo de 140 μl de suero utilizando el kit de ARN viral QIAamp (QIAgen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN viral se calentó a 65°C durante 5 minutos y se utilizó como plantilla para una reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa contenía 5 μl de la plantilla de ARN, 1 μl de hexamero aleatorio 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 1 μl de dNTP mix (10 mM cada uno), 4 μl de búfer de primera cadena 5X, 2 μl de 0,1 M DTT, 1 μl de SuperScript II transcriptasa inversa (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó a 42 °C durante 50 min, y luego la enzima de transcriptasa inversa fue inactivada a 70 La amplificación PCR de las regiones del genoma NS5A y NS5B se realizó utilizando imprimaciones y condiciones descritas previamente [10]. Los amplificadores fueron purificados utilizando el kit de purificación de ADN y banda de gel Illustra GFX PCR (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2.3. Secuenciación NS5A y NS5B. El producto purificado fue secuenciado entonces utilizando los mismos conjuntos de imprimaciones utilizados para amplificación PCR. La secuenciación Sanger bidireccional fue realizada por Macrogen Korea (http://www.macrogen.com). 2.4. Determinación del Genotipo NS5A y NS5B. Las secuencias de consenso VHC NS5A y NS5B obtenidas de pacientes uruguayos fueron alineadas con secuencias del VHC que representaban todos Estas secuencias se obtuvieron de la base de datos de secuencias de VHC de Los Alamos y de la base de datos y recurso de análisis de virus patógenos de NIAID (ViPR) [21, 22]. Para las cepas incluidas en estos estudios, ver Tabla de Material Suplementario S1. Las secuencias se alinearon utilizando el software CLUSTAL W [23]. Una vez alineado, el mejor modelo evolutivo que describió nuestros datos de secuencias se evaluó utilizando el programa ModelGenerator [24]. Utilizando el modelo GTR + G + I (tiempo general reversible + gamma + sitios invariantes), se construyeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad tanto para NS5A como NS5B mediante el software MEGA 5.0 [25]. Para NS5A, se incluyeron 953 nucleótidos (posiciones 6367 a 7319, relativas a la cepa de referencia VHC 1a, H77 NC_004102) en el análisis filogenético, mientras que para NS5B, sólo se incluyeron 361 nucleótidos correspondientes a la región de Okamoto (posiciones 8265 a 8625, relativas a la cepa H77 NC_004102). Como medida de la robustez de cada nodo, se utilizó el método de arranque (1000 pseudoreplicados).Para NS5A 1a secuencias uruguayas (n = 20), se generó un segundo alineamiento y un árbol filogenético de máxima probabilidad para analizar las relaciones evolutivas del VHC entre cepas uruguayas, brasileñas y mundiales.Para las cepas no uruguayas incluidas en este análisis, véase la Tabla de Material Suplementa Para identificar adecuadamente los cambios de sustitución en las regiones NS5A y NS5B de cepas VHC que circulan en pacientes uruguayos, se generaron secuencias de consenso mundial para subtipos 1a y 1b utilizando una amplia gama de secuencias NS5A y NS5B de cepas VHC aisladas en todo el mundo. Para ello, se recuperaron secuencias de genes NS5A correspondientes a subtipos 1a (n = 160) y 1b (n = 88) de la base de datos de secuencias VHC de Los Alamos y de la NIAID ViPR [21, 22]. Asimismo, se generaron series de datos de 150 y 124 secuencias NS5B para subtipos 1a y 1b, respectivamente. Utilizando el programa Seqman, implementado en el paquete DNASTAR 5.01 (DNASTAR, Madison Cada secuencia uruguaya fue posteriormente alineada a las secuencias de referencia correspondientes, y luego traducida en silico. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se compararon para explorar la presencia de RAS así como la presencia de polimorfismos en una posición RAS (RAP) en cepas uruguayas del VHC. Los RAP se definen como cualquier cambio de la secuencia de referencia para un genotipo específico en una posición asociada con resistencia NS5A [26]. Para estudiar la variabilidad genética de las regiones NS5A y NS5B de cepas del VHC que circulan en pacientes uruguayos, las secuencias de estas regiones (números de adhesión MH070029-MH070090) se alinearon con las secuencias correspondientes de 59 cepas del VHC aisladas en otros lugares, representando todos los genotipos y subtipos principales Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1 Se asignaron todas las cepas en las filogenias de acuerdo a su genotipo, y cada grupo fue apoyado por valores de bootstrap muy altos para ambas regiones analizadas. Se asignaron cepas aisladas de pacientes uruguayos (n = 31) al genotipo 1, 20 de las cuales correspondían al subtipo 1a y 11 al subtipo 1b. Los resultados de NS5A (Figura 1 a)) y NS5B (Figura 1 Genotipo 1b análisis filogenéticos fueron concordantes para ambas regiones genómicas en las 31 secuencias, sugiriendo no eventos de recombinación entre estas regiones. Para analizar más a fondo las relaciones evolutivas entre las cepas uruguayas y las que circulan en Brasil y en otras partes, se construyó un árbol filogenético de segunda probabilidad máxima de secuencia Las secuencias brasileñas agrupadas en un gran grupo de secuencias relacionadas dentro del clado 1 [9]. Mientras que las cepas uruguayas NS5A (en rojo) no se agruparon en un determinado clado, sino que se agruparon dispersamente dentro de todos los principales clados mundiales. Con el propósito de estudiar las sustituciones de aminoácidos (AA) a lo largo de la proteína NS5A, se identificaron secuencias VHC AA uruguayas alineadas con secuencias de consenso mundial NS5A (residuos 23 a 354 en relación con la secuencia de proteína NS5A). Se identificaron sustituciones AA en posiciones que anteriormente se encontraban potencialmente asociadas con resistencia a inhibidores NS5A, así como polimorfismos en una posición RAS. Estos resultados se resumen en la Tabla 1. Se encontraron RAP en 3 cepas (subtipo 1a): 2 exhibieron la sustitución H58P y 1 la sustitución K24Q. Aunque estas sustituciones no fueron reportadas como resistentes, algunos cambios en estas posiciones fueron descritos previamente como RAS en el subtipo 1a, a saber, H58D y K24R [27, 28]. Finalmente, la sustitución E62D se encontró en una cepa subtipo 1a. Este cambio se considera como una sustitución secundaria porque, aunque no confiere resistencia por sí misma, cuando se combina con un RAS conocido que sí lo hace. De hecho, confiere un nivel de resistencia más alto que el alcanzado por el RAS solo [26]. Además, también se detectaron varios polimorfismos que no han sido reportados previamente como asociados con un fenotipo resistente (ver Tabla de Material Suplementario S3 ). Para estudiar las sustituciones a lo largo de la proteína NS5B, las secuencias VHC AA uruguayas se alinearon a las secuencias de consenso mundial NS5B. Se obtuvieron secuencias AA de casi toda la longitud en 26 de las 31 cepas analizadas. Se observaron residuos de 23 secuencias que abarcan 36 a 539, mientras que los restantes residuos de 3 lapsos de 36 a 557 de la proteína NS5B. Esta cuestión limitó nuestros estudios, ya que muchos de los RAS descritos se observaron como residuos 553. Es importante destacar que se observaron RAS a inhibidores NS5B (Tabla 2) en 5 cepas de 26 muestras secuenciadas (19,2%). Se encontró C451R en dos aislados, mientras que se encontró A421V en sólo uno. En 2 de las 3 cepas para las cuales pudimos obtener secuencias más largas, se observaron S556G RAS Finalmente, encontramos dos RAP: A421V (en cepas subtipo 1b de 2) y A553G (en cepa subtipo 1a de 1). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a beclabuvir (BCV) en pacientes infectados con subtipo 1a de VHC, este fenotipo resistente no ha sido probado en cepas subtipo 1b [29]. En la posición 553, la sustitución reportada como resistente fue A553T [8]. Al igual que en el caso de NS5A, también se detectaron diferentes polimorfismos no asociados previamente con un fenotipo resistente en NS5B (ver Tabla de Material Suplementario S4 ). El advenimiento de las terapias DAAs constituye uno de los mayores avances en el manejo de pacientes infectados por VHC. Sin embargo, estas nuevas opciones de tratamiento están lejos de ser universalmente disponibles, Los principales factores limitantes para el acceso mundial a los ADA en nuestra región son el alto costo, la inadecuada gestión de los sistemas públicos de salud, el limitado acceso de las poblaciones de bajos ingresos o no aseguradas a los proveedores de salud, y la falta de información epidemiológica precisa [20, [30] [31] [32]. En Uruguay, estas terapias se hicieron recientemente disponibles, y aunque algunas han sido aprobadas para su uso por las autoridades de salud pública (terapias de Viekira pak y sofosbuvir/ledipasvir), actualmente no están cubiertas financieramente, excepto en casos específicos. A pesar de las altas tasas de respuesta viral logradas con los tratamientos basados en DAA, todavía 1-10% de los pacientes no logran eliminar la infección, y en estos casos, las variantes de resistencia basal y emergente resultan ser factores clave que contribuyen al fracaso del tratamiento [5, 17, 33]. Desafortunadamente, actualmente no podemos evaluar adecuadamente el número de personas infectadas por el VHC en Uruguay y aún más para averiguar la frecuencia y el tipo de SRA que circulan, hechos que podrían comprometer la efectividad de estas nuevas terapias en nuestro país. Hemos reportado anteriormente que existen sustituciones naturales que confieren resistencia a inhibidores del NS3 en una proporción significativa de pacientes uruguayos infectados con el genotipo 1 del VHC, y hemos demostrado que esta frecuencia parecía ser mayor que en otros países sudamericanos (Brasil y Argentina) [34]. El presente estudio describe la prevalencia de NS5A y NS5B RAS basales en pacientes infectados por el VHC genotipo 1 no infectados por DAA en una cohorte uruguaya. La presencia de sustituciones que confieren resistencia a los inhibidores de NS5A ha sido ampliamente reportada tanto en pacientes no tratados previamente como en pacientes con recaídas de Europa [10, 33, [35] [37] [37], EE.UU. [37, 39, 40], y Asia [42] [42]. Sin embargo, las secuencias de NS5A de América del Sur todavía están mal analizadas [9, 44]. Estudios recientes han revelado que la prevalencia media de NS5A genotipo 1 basal RASs a diferentes inhibidores oscila entre el 6% y el 16% utilizando secuenciación poblacional o secuenciación profunda [27, 37, 45, 46]. Es importante destacar que la prevalencia y el tipo de NS5A basales varía ligeramente según las regiones geográficas. Por ejemplo, se encontró L31M en el 2,2% de los pacientes infectados con genotipo 1a en Europa, en el 4,1% de los de Oceanía, y sorprendentemente en ningún paciente de los EE.UU. [27]. Por esta razón, creemos que es necesario aportar datos de nuestra región, para los cuales todavía no tenemos suficiente información, aparte de Brasil [9, 44]. Los resultados de este estudio indican la presencia de DAA NS5A RAS en 2 cepas del VHC (8% de los pacientes incluidos en este estudio), con RAS basal detectada en la posición 31 (ver Tabla 1 ). La sustitución L31M confiere resistencia a daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) y elbasvir (EBV) en los subtipos 1a y 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], mientras que la sustitución L31V lo hace a DCV en los subtipos 1a y 1b, a LDV en el subtipo 1b y a EBV en el subtipo 1a [5, 6, 28]. Dado que tanto el L31V como el L31M son RAS clínicamente relevantes, su detección al inicio puede influir en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea [28]. Las sustituciones H58P y K24Q encontradas en dos pacientes se consideran polimorfismos asociados a la resistencia (RAPs). Los RAS caracterizados en estas posiciones fueron H58D y K24G/N/R [5, 6, La sustitución H58P se encontró como RAP basal en recidivas a LDV (prescripción HARVONI, https://www.gilead.com/-/media/files/pdfs/medicaments/liver-diseasa/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Sin embargo, a veces se considera como una sustitución RAS [10, 51], a pesar de conferir solo un cambio de 1,2 veces en la resistencia en estudios in vitro utilizando el sistema 1a replicon [39]. No encontramos sustituciones M28T/V, Q30R/H, o Y93H, ya que se habían reportado previamente en Brasil y en todo el mundo [9, 27, 44]. La sustitución de aminoácidos E62H se encontró en un paciente uruguayo. Aunque este cambio no confiere resistencia por sí mismo sino La presencia de NS5A RAS basales impacta el resultado del tratamiento en algunos grupos de pacientes al afectar las tasas de RVS. La detección de NS5A preexistentes puede jugar un papel relevante en la elección de regímenes de tratamiento de primera línea o en la simplificación/acortamiento de los regímenes recomendados, con el fin de acercar las tasas de RVS a las más altas alcanzables [27, 38, 41, 53], en particular en países como Uruguay, donde sólo se aprueban dos regímenes de tratamiento diferentes que contienen DAA para su uso. En cuanto al gen NS5B, el análisis global (con excepción de Sudamérica [17, 19] ) reveló que las sustituciones de resistencia NS5B DAA son infrecuentes [14]. Las sustituciones encontradas en este trabajo fueron A421V y S556G asociadas en el subtipo 1a con resistencia a BCV y dasabuvir (DSV), respectivamente [8, 28, 29, 54, 55] y Q556R asociadas con resistencia a DSV tanto en el genotipo 1a como en el 1b [12, 28]. La sustitución C451R, observada en dos pacientes uruguayos, fue reportada previamente en pacientes que no lograron eliminar la infección después del tratamiento con OBV/PTV/r + DSV ± RBV. En estos casos, apareció en combinación con G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http://www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). También se encontraron RAP en las posiciones 421 y 553 (A421V en dos aislados del subtipo 1b y A553G en un aislado del subtipo 1b). Aunque A421V se ha asociado con resistencia a BCV en pacientes con subtipo 1a, este fenotipo no se ha demostrado en cepas del subtipo 1b [29]. En la posición 553, las sustituciones reportadas como resistentes son A553T en el subtipo 1a [8] y A553V en el subtipo 1b [54], lo que confiere resistencia a DSV. A diferencia de nuestros resultados, Noble y compañeros de trabajo (2016) reportaron la presencia de V321A, A421G, M414V, Y448H, L159F y C316N en aislados brasileños [17], sin embargo no se encontró ninguna de estas mutaciones en este estudio, probablemente debido a la diversidad encontrada entre cepas uruguayas y brasileñas (Figura 2 ). Sin embargo, se encontró sustitución A421V en Brasil [17], Argentina [19], y Uruguay. El RAS S282T no fue detectado ni en informes brasileños ni en este trabajo actual (Uruguay) [17, 18, 56]. Nuestros hallazgos confirman y complementan estudios previos que evidenciaron una baja prevalencia de esta sustitución in vivo, probablemente debido a su baja aptitud replicativa [14, 18, 57]. A pesar de nuestros resultados, no se ha demostrado que la presencia de NS5B RAS basales que confieren resistencia a los inhibidores de nucleótidos o no nucleósidos NS5B tenga ningún impacto en las respuestas virológicas hasta el momento [53, 58]. Estos resultados muestran tanto diversidad en los polimorfismos basales encontrados en diferentes países latinoamericanos como en las relaciones evolutivas de los aislados uruguayos (Figura 2 ). Este hecho podría estar relacionado no sólo con la región geográfica de los aislados y sus características intrínsecas virales sino también con el fondo genético del huésped. Vale la pena mencionar que vivimos en un vasto continente habitado por poblaciones con diferentes características genotípicas que, dependiendo de la situación, podrían requerir diferentes enfoques al tratamiento. De hecho, recientemente hemos encontrado que las frecuencias de alelo y genotipo en el locus IL28B de En conjunto, creemos que podría ser importante realizar estudios en toda la región sudamericana con el fin de establecer la prevalencia de RAS en NS5A y NS5B en diferentes países. De hecho, esto ayudará a entender que no todos los regímenes de tratamiento podrían ser adecuados para cada paciente y país. Los datos que presentamos aquí podrían guiar no sólo a los médicos en la toma de decisiones terapéuticas, sino también a las autoridades de salud pública en la aprobación de combinaciones de tratamiento más diversas. Estas formulaciones de tratamiento cubrirían la mayoría de las cepas circulantes en nuestra región, una región con una población de antecedentes genéticos muy diversa. Actualmente no está claro si las variantes virales preexistentes con menor susceptibilidad a los ADA son clínicamente relevantes para la predicción del fracaso del tratamiento virológico. Sin embargo, la terapia de DAA individualizada basada en el análisis de resistencia basal puede ser beneficiosa para optimizar la eficacia del tratamiento en pacientes con infección por VHC genotipo 1 y factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Por lo tanto, el papel potencial de las pruebas de resistencia basal sigue siendo un área de investigación crítica y preguntas clínicas.Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Fabián Aldunate y Natalia Echeverría contribuyeron igualmente a este trabajo. Material Suplementario Tabla S2 : Secuencias del subtipo 1a del Virus de la hepatitis C NS5A utilizadas para revelar relaciones evolutivas entre cepas uruguayas y otras aisladas en otros lugares. Se indica su país de aislamiento correspondiente y número de adhesión de GenBank. Material Suplementario Tabla S3 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5A no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de NS5A. Material Suplementario Tabla S4 : sustituciones de aminoácidos en proteína NS5B no previamente asociadas con resistencia a inhibidores de polimerasa. (Materiales Suplementarios)
question: ¿Cómo puede disminuirse la eficacia de los ADA?
answers.text: la presencia de sustituciones asociadas a la resistencia