context: Clara Cell 10 kDa Protein Alivia la cepa del virus de la hepatitis murina 3-Hepatitis fulminante inducida por la inhibición de la proteína fibrinógena 2 Expresiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6300492/SHA: f0c2cd2793d71f1ea11a810442a2c06d5013e899Autores: Yu, Haijing; Liu, Yang; Wang, Hongwu; Wan, Xiaoyang; Huang, Jiaquan; Yan, Weiming; Xi, Dong; Luo, Xiaoping; Shen, Guanxin; Ning, QinFecha: 2018-12-13DOI: 10.3389/fimmu.2018.02935Licencia: cc-by Las células Kupffer, la mayor población de células inmunes involucradas en las respuestas inmunes innatas, se consideran centrales para la FH. La proteína 2 de tipo fibrinógeno (Fgl2) es una proteína procoagulante que se induce sustancialmente en los macrófagos después de la infección viral, y el agotamiento de Fgl2 reprime la cepa 3 del virus de la hepatitis murina (MHV-3). La proteína Clara 10 kDa (CC10) es una proteína secreta con propiedades antiinflamatorias en la rinitis alérgica y el asma. Sin embargo, sus mecanismos de acción y funciones patogénicas en otras enfermedades siguen sin estar claros. En este estudio, nuestro objetivo fue determinar el papel de la CC10 en la FH y la regulación de la Fgl2 por la CC10. Métodos: Se estableció un modelo FH de ratón mediante inyección peritoneal de MHV-3. Se examinó la tasa de supervivencia, la función hepática, la histología hepática, la deposición de fibrina y la necrosis; se investigó el efecto regulador de la CC10 sobre la expresión de Fgl2 utilizando células TPH-1 y macrófagos peritoneales de ratón in vitro. Resultados: En el modelo FH del ratón inducido por MHV-3, la tasa de supervivencia aumentó de 0 a 12,5% en el grupo CC10 en comparación con la del grupo control exclusivo de la solución salina; mientras tanto, los niveles de ALT y AST en suero disminuyeron significativamente y se redujo el daño hepático; además, la expresión hepática Fgl2, TNF-α e IL-1β fue claramente desregulada junto con la deposición de fibrina, y la apoptosis hepatocítica se redujo después de la administración de proteína CC10. In vitro, se encontró que CC10 inhibe significativamente la expresión de Fgl2 en las células tratadas con IFN-γ TPH-1 y los macrófagos peritoneales del ratón infectados por MHV-3 por Western blot y PCR en tiempo real. Sin embargo, no hubo interacción directa entre CC10 y Fgl2 como se demostró por coinmunoprecipitación. Investigaciones de microarray sugieren que el factor de transcripción HMG-box 1 (HBP1) fue significativamente bajo en las células tratadas con CC10 y con IFN-γ-primed THP-1. El tratamiento con HBP1-siRN abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión de Fgl2 en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Conclusión:CC10 protege contra la FH inducida por MHV-3 Estos efectos pueden ser mediados por el factor de transcripción HBP1. Texto: Hepatitis Fulminante (FH) es una enfermedad grave que amenaza la vida caracterizada por necrosis hepatocitica masiva, daño hepático severo y alta mortalidad. Los mecanismos subyacentes y la patogénesis de la FH no son claros. Sin embargo, la acumulación de evidencia sugiere que, independientemente de la patogénesis de la FH, las respuestas inflamatorias del huésped contribuyen a los trastornos microcirculatorios hepáticos y lesiones. En consecuencia, se ha demostrado que la activación celular inmune y las citocinas inflamatorias juegan un papel importante en la FH (1). En los últimos años, nuestro laboratorio ha llevado a cabo una extensa investigación sobre la patogénesis de la FH y encontró que las células inmunes desempeñan un papel clave en ella. Las células Kupffer, las células asesinas naturales (NK) (2, 3), los linfocitos T citotóxicos (LCT) y las células T doblemente negativas (DNT) (4) (5) (6) en el hígado y las citocinas producidas por estas células causan daño hepático. Protrombinasa Fgl2 pertenece a la superfamilia fibrinógena y es producida por macrófagos activados o células endoteliales, transformando la protrombina directamente en trombina, con el fin de iniciar rápidamente el proceso de coagulación. Esto promueve la conversión del fibrinógeno en fibrina, dando lugar a trombosis (7) (8) (9) (10) (11) (12). Nuestro estudio encontró que la Fgl2 se expresaba altamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en tejido hepático de humanos o ratones con hepatitis viral grave, y estaba relacionada positivamente con La terapia génica dirigida al silenciamiento de Fgl2 mostró que la tasa de supervivencia de los ratones de hepatitis fulminante aumentó de 0 a 33,3% (15). Hasta el momento, el descubrimiento y la investigación relacionada con Fgl2 han proporcionado nuevas ideas sobre el mecanismo molecular de la necrosis hepatocitica en la HF. En vista del importante papel de Fgl2 en la hepatitis viral grave, las investigaciones sobre la regulación de Fgl2 serán beneficiosas en la búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de la hepatitis grave. La proteína Clara 10 kDa (CC10), también considerada como uteroglobina, proteína secretora de células Clara, es uno de los miembros de la superfamilia de la secretoglobina. Expresada en células epiteliales mucosales de órganos (incluyendo pulmones y nariz) que se comunican con el mundo exterior (16). CC10 tiene efectos inmunomoduladores y anti En comparación con ratones de tipo salvaje, los ratones CC10-knockout mostraron inflamación excesiva de las vías respiratorias Abreviaturas: FH, hepatitis fulminante; MHV-3, cepa 3 del virus de la hepatitis murina; Fgl2, proteína 2 similar a la fibrinógeno; CC10, proteína de la célula Clara 10 KDa; ALF, insuficiencia hepática aguda; PFU, unidades formadoras de placa; PBS, solución salina fosfato-buffered; ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa; PCA, actividad procoagulante; HRP, peroxidasa de rábano; TUNEL, etiquetado final de la desoxinucleotidil transferasa dUTP. causado por reacción alérgica e infecciones bacterianas y virales (17). Los niveles reducidos de CC10 están asociados con enfermedades inflamatorias y alérgicas de las vías respiratorias, incluyendo sinusitis, asma y rinitis alérgica (18) (19) (20) (21). Estudios previos y artículos publicados muestran que la proteína CC10 no sólo puede inhibir las respuestas celulares Th17 al inhibir la expresión de moléculas relacionadas de células dendríticas y citocinas en ratones con rinitis alérgica, sino que también puede inhibir el quitosano-3 como la proteína 1 (22, 23). Además, CC10 inhibe la expresión de un importante regulador inmune, osteopontina (OPN), en modelos de rinitis alérgica (21). En este estudio, investigamos el papel de CC10 en la cepa 3 del virus de la hepatitis (MHV-3) FH inducida en ratones y exploramos si la proteína CC10 podría regular Fgl2 en el proceso de la enfermedad. Las hembras de ratones BALB/cJ (Shanghai Shilaike Animal Seed Center, Shanghai, China), de 6-8 semanas de edad, con un peso corporal de 18,0-20,0 g, se mantuvieron en el Hospital Tongji con alimentos y agua. Los ratones se dividieron en dos grupos: grupo CC10 (grupo experimental) y grupo salino fosfatado (PBS) (grupo de control). Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal del hospital Tongji. La línea de células monocíticas humanas TPH-1 fue adquirida en el Instituto Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). La línea celular de ovario de hámster chino (CHO) fue adquirida del banco celular típico de la comisión de preservación del cultivo, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células CHO fueron cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), y las células THP-1 se mantuvieron en el RPMI 1.640 que contenían 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS, Gibco Life Technologies, EE.UU.), 100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina y cultivadas a 37 • C, 50 mL/L CO 2 y 95% de humedad. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se obtuvieron de ratones BALB/cJ. Las células fueron resuspedidas en RPMI 1.640 suplementadas con un 10% de FBS en 1-2 × 10 6 células/ml en una placa de 6 pozos e incubadas durante 4 h. Luego fueron lavadas con RPMI 1640 células medias y no adherentes desechadas. Las células adherentes fueron macrófagos y fueron incubadas durante 12 h. Los macrófagos exudativos peritoneales (PEM) se dividieron en dos grupos. Un grupo fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml) y en el otro grupo se añadió PBS. Después de 2 h de estimulación, se agregaron 1.000 unidades formadoras de placa (PCU) de MHV-3 a las células, que luego fueron cultivadas durante 4 h. Se recolectaron macrófagos exudativos peritoneales (PEM) y se lis La apoptosis celular fue detectada por el método terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL) con un kit de detección de apoptosis TUNEL (Roche, Suiza). Brevemente, 5 secciones de μm fueron desparafinadas, deshidratadas a través de una serie de alcoholes e incubadas con proteinasa K durante 30 minutos a 37 • C. Después de detener la reacción digestiva proteinasa K con PBS, las muestras fueron incubadas con un cóctel terminal de desoxinucleotidil transferasa (una mezcla de desoxinucleotidil transferasa terminal y dUTP a razón de 2:29, respectivamente), durante 2 h a 37 • C en una caja húmeda inmunohistoquímica. Después del lavado y bloqueo, cada sección fue complementada con reactivo (converter-POD) para cubrir los tejidos e incubada durante 30 minutos a 37 • C en una caja húmeda. Luego, las secciones de tejido hepático fueron lavadas con PBS, y coloreadas con diaminobencidina (DAB) posteriormente. Los hepatocitos con núcleo teñido de amarillo parduzco fueron considerados como células apoptóticas. La expresión de Fgl2 en células TPH-1 fue medida por citometría de flujo (BD FACS Canto II, EE.UU.). Brevemente, las células (2 × 10 5 por tubo) fueron incubadas con anticuerpo humano TruStrain FcX (solución Fc Receptor Blocking, BioLegend, EE.UU.) durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-Fgl2 del ratón (1:100, Abnova,) o suero de cabra normal (control de isotipo) a 4 • C durante 40 min. Las células fueron lavadas con PBS e incubadas en la oscuridad con anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con PE (1:50, BioLegend, EE.UU.) a 4 • C durante 30 min. Las células fueron luego lavadas con PBS y resucitadas en 300 μL PBS para estudio. La inmunohistoquímica de los tejidos hepáticos se realizó utilizando los kits SP-9001 SPlink Detection Kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) (ZSGB-BIO, Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la tinción inmunohistoquímica, se detectó la expresión de Fgl2, fibrinógeno, Fas y TNF-receptor 1 en tejidos hepáticos de ratón con anticuerpo antimouse Fgl2 de conejo policlonal (1:100, Proteintech, EE.UU.), anticuerpo antimouse fibrinógeno de conejo policlonal (1:1.000, Abcam, EngLand), anticuerpo antimouse Fas de conejo policlonal (1:50, Abcam, EngLand), y anticuerpo antimouse TNF-receptor 1 de Después de la incubación con una fracción IgG de cabra marcada con rábano peroxidasa (HRP) a conejo IgG Fc, la proteína diana fue detectada usando un kit de DAB (ZSGB-BIO, Beijing, China). Las diapositivas fueron entonces contrapuestas con hematoxilina y visualizadas bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón). El tejido hepático y las células fueron homogeneizados en el tampón de lisis RIPA con inhibidor de la proteasa de fenilmetano fluoruro de sulfonilo (PMSF). Los lisatos proteicos fueron separados por SDS-PAGE, y el Western Blotting fue realizado usando un ratón monoclonal antihumano/ratón Fgl2 (1:750, Abnova), un ratón monoclonal antihumano HBP1 (1:100, Santa Cruz, EE.UU.), y un conejo monoclonal antihumano/ratón β-actina (1:1,000, Cell Signaling Technology, EE.UU.). Los tejidos hepáticos fueron recolectados de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 a 72 h, y el ARN total fue extraído usando Reagent Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y luego transcriptado en cDNA mediante ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO, Japón). PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) con SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real (TOYOBO, Japón) se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y los niveles de ARNm se normalizaron con referencia a los del gen de mantenimiento doméstico GAPDH. Las secuencias iniciales para la amplificación de qPCR fueron las siguientes: mTNF-α hacia adelante, 5 ′ -TTT GAG ATC CAT GCC GTT-3 ′ ; mTNF-α hacia atrás, 5 ′ -GCCA CCA CCA CCA CCA TCT TCT GT-3 ′ ; mil-1β hacia adelante, 5 ′ -TGT AAT GAA AGA CGC ACC-3 ′ ; mil-1β hacia atrás, 5 ′ -TCT TCT TTG GGT ATT GCT TG-3 ′. mFgl2 hacia adelante, 5 ′ -GCC AAA TGT GAG TCC CTG GAA-3 ′ ; mFgl2 hacia atrás, 5 ′ -TTC CAC CCA AGA GCA CGT TTA AG-3 ′ ; hFgl2 hacia adelante 5 ′ -ACA GTT CAG GCT GGT GGT-3 ′ ; hFgl2 hacia atrás, 5 ′ -GGC TTA AAG TGC TTG GGT-3 ′ ; HBP1 hacia adelante, 5 ′ -TGA AGC AGA AGC TGGG GAGT-3 ′ ; células HBP1 hacia atrás, THP-1 fueron tratadas con 100 ng/ml de forbol 12-miritato 13-acetato (PMA) (Sigma, EE.UU.) El grupo CC10 fue complementado con proteína CC10 (150 ng/ml). Después de 2 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/ml) a estas células, que luego fueron cultivadas durante 12 h antes de ser recolectadas para estudios de borrado occidental y PCR en tiempo real. Las células de ovario de hámster chino (CHO) fueron cultivadas en platos de cultivo celular de 10 cm con DMEM complementado con 10% FBS hasta 80-90% confluencia. A continuación, 12 μg pcDNA3.1-hFgl2 (construido en nuestro laboratorio) fue mezclado con 12 μg pcDNA3.1-hCC10 en DMEM libre de suero. La mezcla fue luego combinada con Lipofectamine 2.000 (Invitrogen, EE.UU.) y mezclada suavemente. Después de la incubación a 27 • C durante 20 min, la solución fue añadida a las células CHO e incubada a 37 • C en 5% CO 2. Cuatro a seis horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con un 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, las células fueron recolectadas para el análisis de co-inmunoprecipitación para evaluar la interacción de CC10 con Fgl2. Las células HUVEC y TPH-1 expresan fgl2. Sin embargo, en los experimentos de transfección es difícil transfectar las células THP-1 con siRNA, por lo que utilizamos HUVEC en lugar de THP-1. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron cultivadas en FIGURE 1  proteína CC10 aumentaron la tasa de (A) La tasa de supervivencia del grupo CC10 es mayor que el grupo control compuesto por ratones BALB/cJ infectados por MHV-3 tratados con solución salina. La proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola. Los ratones BALB/cJ recibieron 100 UFP de MHV-3 intraperitonealmente 24 h más tarde para desarrollar hepatitis viral fulminante. Luego, la proteína CC10 (2 μg) o solución salina se inyectaron en ratones por vena de cola después de la infección por MHV-3 24 h más tarde. La tasa de supervivencia se observó durante 10 días (n = 24/grupo). Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. La curva de supervivencia se analizó mediante la prueba Log-Rank. ***P < 0,001 en comparación con el grupo salino. (B) Se evaluó la histopatología de los tejidos hepáticos (manipulación de H&E; aumento original, ×400, n = 5/grupo) a 72 h de infección post-MHV-3 en los dos grupos de ratones BALB/cJ infectados por MHV-3. Se recogieron hígados de los tratados con salino (a) y CC10 (b) de los ratones BALB/cJ a 72 h después de infección por MHV-3. Las flechas apuntan a áreas de infiltración celular inflamatoria o regiones necróticas con inflamación. (C) Efecto de CC10 en los niveles séricos de ALT y AST (n = 6-8/grupo). Los valores representan el medio y el error estándar de tres experimentos independientes realizados en triplicado. **P < 0,01 en comparación con el grupo salino. 50 pmol HBP1-siRNA se mezcló con 125 μl libres de suero DMEM. Dos microlitros Lipofectamina 2.000 se mezclaron suavemente con DMEM libre de suero. Después de la incubación a 27 • C durante 5 min, la solución se añadió a HUVEC e incubada a 37 • C. Cuatro horas después de la transfección, se eliminó el medio y se añadió un medio fresco con 10% de FBS. A las 48 h después de la transfección, se recolectaron células para PCR en tiempo real y análisis de manchas occidentales para evaluar los efectos de HBP1 en Fgl2. A las 24 h después de la transfección, el grupo CC10 fue complementado con la proteína CC10 (150 ng/mL). Después de 4 h de estimulación, se añadió IFN-γ (10 ng/mL) a estas células. Estas células fueron cultivadas durante 24 h antes de ser recolectadas para estudios de PCR en tiempo real para evaluar los efectos de CC10 sobre Fgl2 por HBP1. El control negativo fue utilizado como control. Para detectar si había una interacción potencial entre la proteína CC10 y Fgl2, las células CHO fueron transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2 durante 48 h. Las células transfectadas con plásmido vacío pcDNA3.1 (mock) fueron utilizadas como controles negativos para la transfección del gen CC10. La inmunoprecipitación e inmunoblotación fueron realizadas utilizando Pierce Co-Immunoprecipitation Kit (Pierce, EE.UU.). Las proteínas celulares totales fueron extraídas como se describió anteriormente (25). Las proteínas fueron inmunoprecipitadas por anticuerpo Fgl2 antihumano Para los experimentos de coinmunoprecipitación, el Western bloting se realizó usando tanto anticuerpo anti-uteroglobina humana de rata/SCGB1A1 (1:750, R&D, USA) Frontiers in Immunology  www.frontiersin.org y anticuerpo anti-humano Fgl2 de ratón (1:500, Abnova). El control isotipo de rata IgG1 fue utilizado como control negativo de anticuerpos primarios. El gen de la región de codificación CC10 humana, incluyendo una secuencia de 389 bp, fue amplificado a partir de tejido turbinado humano homogenizado por RT-PCR. En este estudio, las secuencias de los imprimadores PCR para CC10 fueron las siguientes: hCC10-forward, 5 ′ -CCC TCC ACC ATG AAA CTCG-3 ′ ; hCC10-reverse, 5 ′ -TGA GAT GCT TGT GGT TTA TTG AAG-3 ′. Los productos PCR fueron clonados en el vector de clonación peasy-T1 (TransGEN, Beijing, China) y luego subclonados en HindIII/XbaI sitio de pcDNA3.1 vector (Invitrogen, EE.UU.) para formar plasmidos de expresión eucariótica pcDNA3.1-hCC10. El análisis de microarray se utilizó para detectar cambios en los patrones de expresión génica de todo el genoma en células TPH-1 con o sin proteína CC Los cambios en más de 47,000 patrones de expresión génica humana fueron evaluados utilizando microarrays del gen Affymetrix (Genoma Humano U133 Plus 2.0) (CapitalBio Co.,Ltd., Beijing, China). Se utilizaron tres réplicas para el análisis de microarrays. Los datos obtenidos de los experimentos se expresan como promedio ± SEM. Se realizaron comparaciones de curvas de supervivencia con la prueba Log Rank. Se evaluaron múltiples análisis de grupos para los datos mediante análisis de varianza de un solo sentido. Se realizaron análisis de dos resultados de grupo utilizando la prueba t de Student para evaluar la significancia estadística de las diferencias. Valores de P < 0,05 indicaron significancia. Para establecer un modelo animal de ratón FH, MHV-3 fue inyectado intraperitonealmente a ratones BALB/cJ (24 ratones/grupo). Para seguir estudiando el papel de la CC10 en la FH, se administró la proteína CC10 del ratón recombinante (2 μg/ratón) o solución salina en la vena de la cola 24 h antes de la infección por MHV-3, la misma dosis de proteína CC10 o solución salina se administró 24 h más tarde, se observó la tasa de supervivencia de los grupos CC10 y salina durante 10 días, los resultados mostraron que los ratones de los dos grupos comenzaron a morir a las 48 h después de la inyección de MHV-3 y mostraron síntomas de horripilación, actividad lenta y reducción del consumo de alimentos; en el grupo CC10 24 ratones estaban vivos el día 3 después de la infección, 4 ratones vivos el día 4 y 3 de 24 (12,5%) ratones recuperados de hepatitis viral fulminante; al mismo tiempo, en el grupo tratado con solución salina, había 5 ratones vivos el día 3, 1 ratones vivos Es decir, los ratones del grupo salino murieron en 3 ó 4 días. Tres de los 24 (12,5%) ratones del grupo CC10 recuperados de hepatitis viral fulminante (Figura 1A). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos biológicos de la proteína CC10, se realizó la función hepática (niveles de ALT y AST en suero) y la histología hepática en ratones de VHM-3-infectados. Los tejidos hepáticos fueron recolectados 72 h después de la infección por VHM-3, y la histología hepática fue detectada por tinción H&E. Estos resultados mostraron que hubo infiltración celular inflamatoria sustancial y necrosis generalizada de hepatocitos en el tejido hepático de ratones del grupo salino (Figura 1Ba ). Hubo células inflamatorias raras o no infiltradas, y pocas o ninguna necrosis hepatocitica en los hígados de ratones en el Se observaron niveles séricos de ALT y AST en ratones 72 h después de la infección por MHV-3. Los resultados mostraron que los niveles séricos de ALT y AST en el grupo salino alcanzaron un pico 72 h después de la infección por MHV-3, pero no hubo un aumento significativo en el grupo CC10 en comparación con los niveles en el grupo control (P < 0,01, Figura 1C). Estos resultados sugieren que la proteína CC10 tiene un papel en la protección contra la lesión hepática inducida por MHV-3 en ratones. Para dilucidar aún más los mecanismos de reducción de la lesión hepática después de la inyección de proteína CC10, se investigó la expresión de citocinas TNF-α e IL-1β. Debido a que estas dos citocinas juegan un papel crucial en el daño hepático de la FH. Se caracterizan por un aumento de la apoptosis. Los niveles de TNF-α e IL-1β en los tejidos hepáticos se redujeron notablemente en el grupo CC10 (como se muestra en la Figura 2A). La apoptosis hepática (Figura 2B ) se redujo significativamente en el grupo CC10. Nosotros y los colaboradores tenemos un interés de larga data en estudiar el papel de fgl2 en la hepatitis viral. Fgl2 ha sido verificado para jugar un papel esencial en la progresión de la hepatitis viral fulminante como apreciamos de informes anteriores. Hemos proporcionado cifras de patología hepática y función hepática para ratones infectados por MHV-3 con un knockout genético fgl2 como se muestra en la Figura 1 suplementaria. Los datos fueron comparables con informes anteriores de nuestro centro y colaboradores. A partir de este estudio actual se demostró que la CC10 juega un papel protector en el daño hepático.Para estudiar las moléculas relacionadas de la CC10 en ratones MHV-3 inducidos por FH, se evaluó si había interconversación entre Fgl2 y CC10. Se encontró que la expresión de Fgl2 en el hígado de ratones se redujo 72 h después de la infección por MHV-3 y el tratamiento con proteína CC10 (Figuras 3A,B). Además, la deposición de fibrina, un indicador de lesión hepática asociado con la expresión Fgl2 en la FH, también se redujo en los hígados de ratones tratados con CC10 en comparación con la de control (Figura 3C ). Se examinó el efecto del aumento de dosis de proteína CC10 (0, 50, 150 y 300 ng/ml) en la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. El tratamiento con CC10 mostró una disminución del 10,1% en las células TPH-1 en comparación con el control después de la estimulación con 10 ng/ml IFN-γ durante 12 h. La proteína CC10 inhibió la expresión Fgl2 entre dosis de 0 ng/ml y 300 ng/ml (Figura 4A). En particular, 150 ng/ml proteína CC10 tuvo el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión Fgl2 entre las dosis, y se eligió esta dosis para los siguientes experimentos. Se exploró el efecto de diferentes puntos de tiempo de estimulación con una concentración de 150 ng/ml proteína CC10. Después de la estimulación con proteína CC10 para 6, 12 y 24 h en comparación con el control del PBS, el efecto inhibidor más fuerte sobre la expresión de Fgl2 se observó a las 12 h; por lo tanto, se eligió este momento para los siguientes estudios (Figura 4B ). Un número creciente de estudios sugieren que los macrófagos son la fuente primaria de Fgl2. Para determinar que el CC10 tiene un efecto directo sobre los macrófagos, se trató a las células TPH-1 con CC10 recombinante y se evaluó la expresión de Fgl2. A diferencia de los controles, IFN-γ indujo un aumento significativo en la expresión de Fgl2. Este efecto se atenuó cuando las células fueron tratadas con proteína CC10 (Figuras 4C,D), revelando que el CC10 reduce directamente los niveles de Fgl2 en los macrófagos. Para explorar la posibilidad de que la proteína CC10 actúe directamente sobre los macrófagos, infectamos PEM murinos con MHV-3 en presencia de CC10 recombinante y determinamos la expresión Fgl2. En comparación con los niveles en los controles, los macrófagos infectados con MHV-3 mostraron un aumento significativo en la producción de Fgl2, y este efecto fue abolido mediante el uso de proteína CC10 (Figuras 5A,B), indicando que CC10 modula directamente la producción de Fgl2 en los macrófagos. Para determinar los genes que fueron regulados después de la estimulación por la proteína CC10, utilizamos el análisis de microarray del ADN para detectar genes de expresión diferencial. Los resultados mostraron que los genes más obviamente desregulados fueron UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX, SOX4, HBP1 y Fgl2 (Tabla Suplementaria 1). Y luego estos genes fueron probados por qPCR. Sin embargo, UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX y SOX4 no fueron expresados de manera diferencial por qPCR, mientras que HBP1 y fgl2 todavía eran genes desregulados. El análisis de microarray ADN identificó HBP1 como un gen desregulado involucrado en los procesos patológicos de la regulación de CC10. Recientemente, estudios muy limitados han explorado el papel de HBP1 en FH. Sin embargo, las funciones mecánicas de HBP1 en FH permanecen en gran medida inexploradas. Por lo tanto El análisis de qPCR confirmó que los niveles de ARNm de HBP1 fueron significativamente disminuidos en las células TPH-1 después de la estimulación de la proteína CC10 en comparación con el grupo de control de PBS (Figura 6A ). Derribamos HBP1 usando HBP1-siRNA. Luego, la transfección de HBP1-SiRNA en HUVECs fue detectada por qPCR y métodos de bloqueo occidental. Como era de esperar, el derribo de HBP1 llevó a una disminución significativa de la expresión de HBP1 (Figuras 6B,C). Además, el derribo de HBP1 de la expresión deteriorada de Fgl2 (Figura 6D ), sugiriendo que HBP1 fue capaz de activar Fgl2. HBP1-SiRNA se utilizó para trans Luego, se añadió IFN-γ para inducir la expresión de Fgl2 seguido de estimulación con proteína CC10 (150 ng/ml) después de 2 h. Finalmente, se exploró la expresión de Fgl2 por qPCR. Los resultados mostraron que el tratamiento con HBP1-SiRNA abrogó el efecto inhibidor de CC10 sobre la expresión Fgl2 en HUVECs (Figura 7). Es decir, CC10 podría suprimir la expresión Fgl2 en macrófagos. Tal efecto puede ser mediado por el factor de transcripción HBP1. Es bien sabido que la proteína CC10 puede suprimir la respuesta inmune. En modelos animales de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, la mayoría de las evidencias confirman esta inhibición (26). Su función en FH no ha sido investigada todavía. Para determinar el papel de la CC10 en la patogénesis de la FH, la proteína CC10 se inyectó en un modelo de FH del ratón establecido por la infección MHV-3. En raras ocasiones se produjo una lesión hepática inducida por la MHV-3 en ratones tratados con CC10 y las áreas de lesiones fueron mucho menos que en ratones de control tratados con salino. En resumen, estos resultados sugieren que la CC10 podría reducir el daño hepático patológico en este modelo de FH junto con tasas de mortalidad más bajas seguidas por la infección MHV-3. La hepatitis viral fulminante inducida por MHV-3 progresa rápidamente y los ratones infectados mueren en 3-5 días. Estudios anteriores sugieren que la fgl2 jugó un papel vital en este proceso con un aumento del 15-40% de supervivencia cuando se eliminó la fgl2 (12, 15, 27, 28). Se ha demostrado que múltiples factores o mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α e IFN-γ, IL-1β y C5aR, promueven la progresión de la FH con discrepancias significativas entre el daño hepático y la tasa de supervivencia (29) (30) (31) (32), lo que concuerda con nuestra observación de que la CC10 aliviaba sustancialmente la lesión hepática aunque la tasa de supervivencia mejoraba levemente. La tasa de supervivencia basada en horas puede ser más precisa para examinar el efecto de la CC10 sobre la FH. Se especula que la fgl2 puede mediar la letalidad en la FH inducida por MHV-3. Esto se debe a que la fgl2 induce la deposición de fibrinógeno, lo que conduce a la activación de la cascada de coagulación y la inducción de la actividad procoagulante (15). Para determinar si la necrosis tisular Los resultados sugieren que la expresión de Fgl2 se incrementó significativamente en ratones FH inducidos por MHV-3 y el tratamiento con CC10 redujo significativamente la producción de Fgl2 en el hígado y el suero infectados. Además, también se observó una disminución de la deposición fibrinógena en los hígados de ratones tratados con CC10. Por lo tanto, nuestros resultados de investigación aclaran fuertemente que la menor mortalidad de ratones tratados con CC10 después de la infección por MHV-3 se debe a los niveles más bajos de Fgl2 y a la disminución de la deposición fibrinógena. De hecho, se ha reportado que Fgl2 se expresa en macrófagos, y se cree que la expresión de Fgl2 es inducida por IFN-γ y TNF-α (22). Se han demostrado células TPH-1 cultivadas activadas por IFN-γ o IL Por lo tanto, en este estudio, exploramos esta línea celular para investigar la modulación de CC10 en Fgl2. Sorprendentemente, encontramos que CC10 inhibió directamente la expresión Fgl2 inducida por IFN-γ en las células TPH-1. Como sabemos, IFN-γ ha demostrado ser la principal citocina que conduce al desarrollo y progresión de FH. Además, se demostró que IFN-γ podría ejercer su propia función biológica proinflamatoria mediante la mejora de la expresión Fgl2. Por lo tanto, en nuestro estudio, CC10 podría contrarrestar el efecto de IFN-γ en el establecimiento de FH, lo que confirma su papel en FH. Estos resultados demostraron que CC10 regula la expresión de Fgl2 en macrófagos. En el estudio actual, utilizamos co-inmunoprecipitación para analizar la unión entre CC10 y Fgl2. En este estudio se investigaron posibles interacciones proteína-proteínas entre CC10 y Fgl2 in vitro. Las células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con pcDNA3.1-hCC10 y pcDNA3.1-hFgl2. Las proteínas celulares fueron inmunoprecipitadas con anticuerpos anti-CC10 o anti-Fgl2 y se realizó inmunobloqueo con anticuerpos anti-Fgl2 y anti-CC10. Inmunoprecipitación de extractos proteicos del pcDNA 3,1-CC10 y del pcDNA 3,1-Fgl2 cotransfectados con anticuerpos anti-Fgl2 o anti-CC10 seguidos de blocado occidental con anticuerpos Fgl2 y CC10 indicó que CC10 no coinmunoprecipitado con Fgl2, demostrando que no hay relación directa entre CC10 y Fgl2 (datos no mostrados). Los resultados mostraron que CC10 no tiene interacción directa con Fgl2. De nuestro estudio anterior el gen de fgl2 contribuyó profundamente en la hepatitis fulminante inducida por MHV-3 y se expresa ampliamente en macrófagos y endotelio (12, 33). Nuestro microarray indicó una expresión de fgl2 regulada por CC10 y esto es confirmado por qPCR y Western bloting in vivo (macrófagos peritoneales) e in vitro (THP-1, línea celular macrófaga). Por lo tanto, es razonable centrarse en los macrófagos para mostrar el efecto de CC10 en la expresión fgl2 y finalmente la supervivencia de ratones. Estamos totalmente de acuerdo en que puede haber otras posibilidades de un efecto protector de CC10 para contribuir al proceso de la enfermedad. Esto vale la pena estudios adicionales. El receptor potencial de CC10 no ha sido revelado todavía. Nuestro estudio anterior ha demostrado que CC10 tiene efecto de las células dendríticas en la rinitis alérgica (34). En esta investigación, evaluamos el efecto de CC10 sobre las funciones de los macrófagos y descubrimos que Fgl2 fue sustancialmente regulado sobre el tratamiento CC El análisis de microarray del ADN es uno de los enfoques más poderosos para la identificación potencial de genes inesperados involucrados en procesos patógenos. Usando este enfoque, se encontró que el factor de transcripción HMGbox 1 (HBP1) es uno de los genes más desregulados después del tratamiento de las células THP-1. HBP1 es un represor transcripcional bien descrito que modula la expresión de genes involucrados en la progresión del ciclo celular. En un estudio reciente, se encontró que el HBP1 es un objetivo directo de miR-21 y confirmó que el HBP1 modula la función inhibitoria del miR-21-ASO en hepatoesteatosis y carcinogénesis simultáneamente (23). El HBP1 es un inhibidor endógeno de la vía de señalización Wnt en células normales y cancerosas. El papel supresor del tumor de HBP1 ha sido reportado en algunas neoplasias malignas, como el cáncer oral y el glioma (35). Sin embargo, una asociación entre HBP1 y Fgl2 no ha sido investigada todavía. El estudio actual demostró claramente que CC10 protege contra el MHV-3 inducido FH a través de la supresión de la expresión Fgl2. Tales efectos podrían ser mediados por HBP1. Sin embargo, el estado funcional de HBP1 en la vía CC10 requiere investigación adicional, y tales estudios están realizando en nuestro laboratorio. En conclusión, demostramos que CC10 podría limitar el daño inmunopatológico en ratones MHV-3 inducidos FH. Nuestros resultados sugieren que mejorar la expresión CC10 por un enfoque inmunoterapéutico podría ser un tratamiento eficaz para FH. HY realizó todos los experimentos descritos y escribió el manuscrito. YL ayudó con algunos experimentos XW revisó y editó el manuscrito. JH, WY, DX, XL, GS y QN proporcionaron ayuda experimental y diseño.
question: ¿Cuánto tiempo después de la infección por MHV-3 se tomaron muestras de hígado?
answers.text: 72 h