context: C. difficile 630Δerm Spo0A regula la esporulación, pero no contribuye a la producción de toxinas, mediante la unión directa de alta afinidad al ADNhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3485338/SHA: f0fb3bbd96dad4c907c7fd456cd5783ed8fa7bd6Autores: Rosenbusch, Katharina E.; Bakker, Dennis; Kuijper, Ed J.; Smits, Wiep KlaasFecha: 2012-10-31DOI: 10.1371/journal.pone.0048608Licencia: cc-byAbstract: Clostridium difficile es una bacteria grampositiva, anaerobia que puede formar endosporos La bacteria es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI), para la cual los síntomas pueden variar desde una leve diarrea hasta colitis pseudomembranosa potencialmente fatal y megacolon tóxico. La formación endoespora en Firmicutes, incluyendo C. difficile, está gobernada por el regulador clave para la esporulación, Spo0A. En Bacillus subtilis, este factor de transcripción también está implicado directa o indirectamente en varios otros procesos celulares. Aquí, informamos que C. difficile Spo0A muestra un alto grado de similitud con la proteína B. subtilis bien caracterizada y reconoce una secuencia de unión similar. Encontramos que la cepa de laboratorio C. difficile 630Δerm contiene una duplicación de 18bp cerca del dominio de unión al ADN en comparación con su cepa ancestral 630. Los ensayos de unión in vitro mediante el dominio de unión al ADN C-terminal purificado de la proteína C. difficile Spo0A demuestran la unión directa al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, genes de esporulación temprana y varios otros objetivos putativos. Los ensayos de unión in vitro sugieren que el gen que codifica la principal toxina clostridial TcdB puede ser un objetivo directo de Spo0A, pero sobrenadante derivado de una cepa negativa spo0A no fue menos tóxico para las células Vero que el obtenido de una cepa de tipo salvaje, en contraste con informes anteriores. Estos resultados identifican por primera vez los objetivos directos (putativos) de la proteína Spo0A en C. difficile y hacen un efecto positivo de Spo0A en la producción de las grandes toxinas clostridiales improbables. Texto: La esporulación es una estrategia adaptativa que permite a las bacterias sobrevivir a duras condiciones ambientales durante períodos prolongados de tiempo, y es una parte integral de la transmisión de patógenos esporulares y su tolerancia y resistencia a los compuestos antimicrobianos. Spo0A es el regulador clave para la esporulación [1, 2]. La mayor parte de nuestro conocimiento sobre la proteína se basa en el trabajo en Bacilli. Spo0A es un regulador de respuesta que demuestra la unión dependiente de la fosforilación al ADN [3] [5]. La fosforilación se produce a través de la acción concertada de varias proteínas que juntos forman una llamada fosforelay [6]. La cascada de señalización permite la integración de señales ambientales en la regulación de procesos dependientes de Spo0A, incluyendo la esporulación. Los dos dominios funcionales, el dominio de fosforilación y dimerización N-terminal (dominio receptor) y el dominio de unión al ADN C-terminal (efector) están separados por una región bisagra que está relativamente mal conservada [7]. Se cree que la fosforilación resulta en un reordenamiento estructural que facilita la dimerización [8, 9], resultando en la interrupción de los contactos de transcripción-inhibidores entre los dominios receptor y efector. El dominio aislado de unión al ADN puede unir objetivos legítimos de la proteína Spo0A debido a la ausencia de contactos inhibidores de transcripción, evitando así la necesidad de fosforilación [10]. La caracterización extensa de los objetivos Spo0A ha revelado un motivo que representa un sitio de unión Spo0A de alta afinidad, el recuadro 0A [10, 11]. La estructura cristalina del dominio de unión al ADN confirma los contactos específicos y no específicos entre la proteína y la secuencia de consenso [12, 13]. Cabe destacar que Spo0A regula muchos otros procesos además de la esporulación, como la competencia para la transformación genética, la replicación del ADN y la formación de biopelículas en B. subtilis [14] [15] [16], los factores de virulencia y las respuestas de estrés en, por ejemplo, B. anthracis y B. turingiensis [17] [18] [19] [20] [20], y la producción de disolventes en Clostridium acetobutilicum [22, 23]. C. difficile es una bacteria grampositiva y anaerobia que es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI) Aunque muchas personas son colonizadas asintomáticamente por C. difficile, la bacteria puede causar graves problemas de salud, como la colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico, bajo la influencia de factores de riesgo como la edad y el uso de antibióticos. Como resultado, la CDI fue considerada durante mucho tiempo una infección nosocomial. Sin embargo, recientemente, se puede observar un aumento en los casos de CDI adquirida por la comunidad [26]. Los brotes de CDI se han relacionado con las denominadas cepas hipervirulentas, como los ribotipos PCR 027 (BI/ NAP1) y 078 [27, 28]. Sus principales factores de virulencia son las principales toxinas clostridiales A y B [29, 30]. Además, algunas cepas de C. difficile, incluyendo ribotipos 027 y 078, C. difficile se transmite a través de la vía fecal-oral. Se cree que las esporas son cruciales para infectar con éxito a nuevos huéspedes, ya que son capaces de soportar el ambiente duro del estómago, y sobrevivir a los tratamientos antibióticos que alteran la flora endógena, después de lo cual C. difficile puede sobrecrecer [24, 25]. Hay un conocimiento limitado sobre la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha reportado que espo0A, como se espera, es necesario para la formación de esporas [33] y el gen es necesario para la persistencia y transmisión en ratones [34]. Aunque las vías aguas abajo de Spo0A parecen en gran medida conservadas entre B. subtilis y Clostridia, esto es menos para las vías que conducen a la activación de Spo0A [2]. Se ha sugerido que la histidina cinasa huérfana CD2492 está involucrada en la activación de Spo0A [35]. De manera similar, se informó que múltiples quinasas histidina huérfanas pueden fosforilar Spo0A en C. acetobutilicum [36]. Recientemente, se informó que spo0A se puede transcribir de un promotor dependiente de SigH [37]. Se desconoce qué genes están regulados por la unión directa de Spo0A a sus regiones anteriores. Aquí, se establece un ensayo de unión in vitro para C. difficile Spo0A y demostrar por primera vez la unión directa de este factor de transcripción al ADN aguas arriba de varios genes de destino putativo. Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas rutinariamente en el caldo o placas Luria-Bertani, complementadas con antibióticos apropiados. El cloramfenicol se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml para las placas de agar y 10 mg/ml para los cultivos líquidos. La ampicilina se utilizó a una concentración final de 100 mg/ml. La canamicina se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml. La clonación se llevó a cabo utilizando E. coli DH5a, se realizó una sobreexpresión en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Las cepas difficiles se cultivaron en un medio a base de tripton-levadura sin glucosa (TTY; 3% w/v bactotrypton (BD), 2% extracto de levadura (Fluka), 0,1% w/v tioglicol (Sigma) pH 7,4), complementado con 20 mg/ml de lincomycina cuando fue apropiado, o en placas CLO o TSS Todos los plásmidos están listados en la Tabla 1. Los primeros (obtenidos de Sigma Aldrich) están listados en el Texto S1 y las condiciones específicas de ciclismo están disponibles bajo petición. Salvo que se indique lo contrario, las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando Pfu polimerasa (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PWKS1251, Plasmid pWKS1251, para la sobreproducción de Spo0A-DBD con una C-terminal 66His-tag, fue construida de la siguiente manera. Una secuencia correspondiente al dominio de unión del ADN de Spo0A fue amplificada usando los primeros oWKS-1123a y oWKS-1124 usando ADN cromosómico de C. difficile cepa 630Derm como plantilla. El fragmento resultante fue clonado en pCR2.1-TOPO (In Este plásmido fue digerido con NdeI y XhoI, separado en un gel de agarosa al 1%/0,56 TAE (20 mM Tris Acetato, 0,5 mM EDTA), el fragmento correspondiente al dominio de unión al ADN fue recuperado por aislamiento del gel (utilizando un kit de extracción del gel GeneJET, Fermentas) y clonado en pMF14 similarmente digerido [10] que había sido aislado del gel de la misma manera. El constructo fue verificado por PCR, análisis de restricción y secuenciación del ADN utilizando imprimaciones oWKS-135 y oWKS-136 (ver abajo). Plasmid pWKS1245, para la producción de Spo0A de longitud completa con un C-terminal 6xHis-tag, fue construido de manera similar utilizando ADN cromosómico de C. difficile 630Derm como plantilla, pero utilizando el producto PCR de los imprimadores oWKS-1122 y oWKS-1123a. Los plásmidos utilizados como plantillas PCR para generar sondas EMSA fueron construidos clonando los productos PCR en pCR2.1-TOPO. Los insertos, y en el caso de los promotores de PabrB mutados, la presencia de las mutaciones de puntos deseadas en la caja de consenso 0A, fueron verificados mediante secuenciación de ADN usando primers oWKS-24 y oWKS-25 (ver abajo). Los plásmidos de grado secuencial se aislaron utilizando un kit de Nucleospin Plasmid QuickPure (Macherey Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que dos reacciones de lisis se combinaron en un solo filtro y se eludieron con buffer AE precalentado de 65uC. Todos los constructos se secuenciaron utilizando química BigDye Terminator (Invitrogen) en un secuenciador ABI3130 (Perkin Elmer), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. En resumen,,200 ng de plásmido se mezclaron con 3,2 pmol de imprimación, 1 mL Terminator Ready Reaction Mix (Invitrogen) en un volumen final de 20 mL. Después del termociclado, el ADN se precipitó y lavó con un 65% de isopropanol y se disolvió en 12 mL HiDi formamid (Invitrogen) a 96uC durante 2 minutos y se almacenó en la oscuridad a 4uC hasta la secuenciación. Se realizaron análisis de secuencias en CloneManager Professional Suite 7 (SciEd) y Geneious versión 5.6.2 (Biomatters Ltd). Plasmids pWKS1245 y pWKS1251 se transformaron en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Se utilizaron transformadores para inocular 25 mL de LB con antibióticos apropiados. Después de la incubación nocturna, las células fueron 1:100 diluidas en medio fresco de 500 mL que contenía antibióticos apropiados. La producción proteica se indujo con 1 mM Las células se lavaban con PBS helado y se almacenaban en 280uC para su uso posterior. La purificación de las proteínas se realizó esencialmente como se describe [10]. En resumen, las células se interrumpieron en 4 mL de tampón de lisis (2 mM PMSF, 10 mM imidazol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 7,9). Se incubaron células limpias con 2 mL preequilibradas 50% TALON slurry (Clontech) en un volumen final de 15 mL dysis tampón para 1 hora. Se permitió que la resina se asentara en una columna de Polipreparación (BioRad) y se lavaba con 2 mL de tampón de lavado (20 mM imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH La proteína se eludió por etapas en fracciones de 1 mL después de aplicar un tampón de dilución de 2 mL a la columna (idéntico al tampón de lavado pero con 50, 100, 250 o 500 mM de imidazol). Todo el procedimiento se llevó a cabo a 4uC. Se evaluaron las fracciones de pureza y rendimiento y se dializaron fracciones adecuadas contra 26 tampón de diálisis de 1L (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) utilizando casetes Slide-A-Lyzer con un corte molecular de 3,5 kDa (Pierce). Las proteínas se almacenaron a 280uC en tampón de almacenamiento (idéntico al tampón de diálisis pero que contenía 20% de glicerol). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando reactivo Bradford (BioRad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN para uso en el experimento EMSA fueron generados por PCR utilizando GoTaq polimerasa (Promega) y ADN cromosómico de B. subtilis JH642 (Bacillus Genetic Stock Center 1A96; http://www.bgsc.org), plásmidos listados en la Tabla 1, o ADN cromosómico de C. difficile 630Derm [38] como plantilla. Los primeros y condiciones específicas de ciclo para la generación de las sondas EMSA se enumeran en el texto S1. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado fueron aislados de un gel nativo de poliacrilamida 16TAE/8% utilizando tampón de difusión (acetato de amonio de 0,5 M, acetato de magnesio de 10 mM, 1 mM EDTA pH 8, 0,1% SDS) y un kit QIAExII (Qia El ADN recuperado fue marcado con 32P-c-ATP utilizando tampón FR y quinasa T4 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad específica en un contador de centelleo LS6000 (Beckman). Las condiciones de EMSA se basaron en estudios previos [10]. En resumen, se realizaron reacciones de unión en tampón de unión (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerol) en presencia de 200 mg/ml de albúmina sérica bovina (NEB) y 200 cpm/ml de fragmento de ADN radiomarcado. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a 30uC antes de la carga en un gel de poliacrilamida 16TAE/8% que no desnaturalizaba que fue prerun durante 20 minutos La electroforesis se realizó durante 120 min a 85 V. Después de secar al vacío los geles sobre papel filtrante, se tomaron imágenes después de la exposición nocturna en pantallas de Fosforimager sobre un instrumento tifón (GE Healthcare). Los efectos tóxicos de los sobrenadantes de cultivos difficiles de C. sobre las células de Vero (una especie de regalo de Eric Snijder [39] ) se determinaron de la siguiente manera. El sobrenadante de un cultivo bacteriano fue cosechado por células centrifugadoras durante 3 minutos a 140006g y filtrado en un filtro de acetato de celulosa de 0,45 mM utilizando una jeringa. Los sobrenadantes fueron diluidos en serie dos veces en medio de cultivo celular (medio águila modificado de Dulbecco (Lonza) complementado con 100 mg/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomi Como control positivo, se añadió a las células 50 mL 1:10 toxina purificada diluida (Techlab) para determinar si los efectos citotóxicos observados eran específicos para las toxinas clostridiales grandes, se añadió antitoxina comercialmente disponible frente a TcdA y TcdB (Techlab) a un sobrenadante bacteriano diluido de 10 veces durante 60 minutos antes de la incubación en las células Vero. Los títulos de punto final de toxinas se definieron como la dilución más baja en la que no se observaron efectos citopatológicos (redondeo de células) y se evaluó la significación estadística con una prueba t de muestra independiente. Inmunización de ratones con C. difficile Spo0A-6xHis fue amablemente realizada en el Instituto Welcome Trust Sanger (Hinxton, Reino Unido). Las células de 1 mL de cultivo C. difficile fueron recolectadas por centrifugación durante 1 min a 14000 rpm en una centrifugadora de mesa y resuspendidos en tampón de resuspensión de 200 mL (10 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 0,5 mg/mL lisozyme, 1 mM Pefabloc SC (Roche)). Después de incubar durante 30 minutos a 37uC, 50 mL de tampón de muestreo de 56 SDS (0,1 M DTT, 2% SDS, 50 mM Tris HCl pH 6,8, 10% glicerol, 0,0025% BPB) se calentaron a 96uC durante 5 minutos. Los lisatos celulares totales (cantidades corregidas para OD 600 ) se separaron en un gel SDS-PAGE del 12% antes de secarse durante 1 h a 10 V a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF ). Se bloquearon las membranas en el tampón PBST ( solución salina tamponada fosfatada con 0,1% v/v Tween-20 ) que contiene reactivo de bloqueo de membrana 5% (Amersham Biosciences ). Para visualizar el suero policlonal eliminado de la proteína Spo0A de un solo ratón en una dilución 1:3000, seguido de un anticuerpo secundario HRP conjugado por la cabra, seguido por la detección ECL+ (Amersham Bioscience ), o un anticuerpo secundario conjugado por biotina-antimouse (Dako La detección se realizó utilizando un instrumento de tifón (GE Healthcare). Los volúmenes máximos corregidos de fondo se cuantificaron utilizando ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Las alineaciones de B. subtilis y C. difficile spo0A se realizaron utilizando ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) sobre la base de las secuencias de genoma publicadas, los números de adhesión de Genbank AL009126 y AM180355, respectivamente, y la secuencia de 630Derm spo0A según se determinó en este estudio. La secuencia para spo0A de C. difficile cepa 630Derm se depositó en Genbank (adhesión no JX050222). Las posiciones de la caja fueron enlazadas a genes ascendentes y descendentes usando la función ''Añadir gen más cercano a Lista de Motivos de ADN'' y Microsoft Excel. Los resultados fueron inspeccionados manualmente para esas cajas dentro de 500 bp aguas arriba de un gen en la misma hebra. Las figuras para publicación fueron preparadas usando ImageQuant TL (Amersham Biosciences), Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc) y Corel Graphics Suite X5 (Corel Corporation). Para caracterizar C. difficile Spo0A, la proteína de longitud completa y su dominio de unión al ADN (DBD) se expresaron como una proteína Cterminally 66His-tagged en el host heterologous Escherichia coli (Fig. 1A) y purificada a casi homogeneidad usando cromatografía de afinidad metálica (fig. 1A ; carril La proteína de longitud completa se utilizó para aumentar los anticuerpos para detectar Spo0A en los lisatos totales de cepas C. difficile, y el dominio de unión al ADN purificado se utilizó en ensayos de unión in vitro posteriores (ver más adelante). Se determinó la expresión de C. difficile Spo0A durante todo el crecimiento. Se encontró que la proteína está presente en los lisatos de células de fase de crecimiento exponencial a estacionaria. Se realizó inmunobloqueo utilizando anticuerpos policlonales contra C. difficile Spo0A en los lisatos totales de tipo salvaje y células mutantes spo0A cultivadas en un medio basado en triptones y levadura (TTY). Encontramos una señal clara del tamaño esperado para Spo0A de longitud completa (,31 kDa) tan pronto como 3 horas después de la inoculación (fase de crecimiento exponencial), a través de la fase de transición (8 h) así como 24 y 48 horas después de la inoculación (fase de crecimiento estacionario) (Fig. 1B; 630Derm). Las señales fueron específicas para C. difficile Spo0A ya que estaban ausentes de los lisatos del mutante C. difficile spo0A (Fig. 1B, CT::spo0A). Obtuvimos resultados similares en otros medios, como el caldo de perfusión de corazón cerebral complementado comúnmente utilizado (BHIS; datos no mostrados). Para determinar los niveles relativos de Spo0A a lo largo del crecimiento, realizamos un experimento inmunoblot utilizando anticuerpos fluorescentes Se encontró que los niveles de Spo0A aumentan aproximadamente 20 veces a partir de 6 horas después de la inoculación y permanecen en niveles similares de 8 a 48 horas después de la inoculación (Figura 1C ). Aunque se debe notar que las manchas occidentales no proporcionan información sobre el estado de fosforilación de la proteína, se concluye que la proteína en forma activa o inactiva está presente a lo largo del crecimiento y es más abundante en la fase de crecimiento estacionario. Spo0A de C. difficile Strain 630Derm Contiene un 6aminoácido Duplicación BLAST homología búsquedas identificar fácilmente un homólogo de la proteína B. subtilis Spo0A bien caracterizada en C. difficile 630 (CD1214) y trabajo anterior demostró que un mutante spo0A (una inactivación insercional de cd1214) -como se esperaba - En los análisis silicos sugieren una estructura secundaria similar para ambas proteínas (fig. 2A), con un dominio de dimerización conservada y unión al ADN, separado por una región de bisagra mal conservada [7, 12]. Comparamos la secuencia de CD1214 obtenida de nuestra cepa de laboratorio 630Derm [38] con la del genoma publicado C. difficile 630 [42]. La cepa 630Derm es una cepa sensible a la eritromicina espontánea, que se utiliza comúnmente en estudios de mutagenesis y se obtuvo mediante el paso en serie de la cepa 630 [33, 38]. La secuencia 630Derm spo0A (adhesión Genbank no JX050222) se deriva de la expresión plásmidos construidos para este estudio, y se confirma en una secuencia genómica completa de la cepa 630Derm generada en nuestro laboratorio ( Se encontró que 630Derm spo0A contiene una repetición directa de 18 pares base, resultando en una duplicación de 6 aminoácidos (NVGNIE) en comparación con la secuencia de referencia publicada. La duplicación mapea a una región de la proteína con relativamente baja conservación de secuencias (hinga), flanqueando el dominio de unión de ADN altamente conservado (fig. 2A y B). Se verificó la ausencia de esta duplicación en la cepa 630 por PCR (Fig. 2C ) así como la secuenciación del ADN cromosómico de C. difficile 630 (datos no mostrados), para descartar un error en la secuencia de genoma original y demostrar que la diferencia de tamaño del producto PCR era específica para la inserción de 18 pb. Además, comprobamos varias otras cepas de ribotipos PCR 12 (a las que pertenecen 630 y 630Derm) por PCR, pero se encontró que la duplicación es única a 630Derm entre los aislados probados (datos no mostrados). C. difficile Spo0A-DBD muestra especificidad similar a B. subtilis Spo0A-DBD A continuación, examinamos la conservación del dominio de unión al ADN de Spo0A (Spo0A-DBD) entre B. subtilis y C. difficile. En B. subtilis residuos de aminoácidos que entran en contacto con la columna vertebral del ADN e interactúan con residuos específicos de la secuencia de unión a Spo0A se han definido [13]. Encontramos que todos estos residuos se conservaron en la secuencia de proteína C. difficile (fig. 2B La unión de ADN por la longitud completa Spo0A en B. subtilis requiere dimerización dependiente de la fosforilación [8, 9]. Sin embargo, se demostró que el DBD aislado es capaz de unirse a objetivos legítimos de la proteína de longitud completa [10]. Analógicamente, purificamos el C. difficile Spo0A-DBD para su uso en ensayos de unión in vitro. Como no se han reportado objetivos directos para la proteína de C. difficile hasta ahora, utilizamos la región aguas arriba del gen AbrB (PabrB) de B. subtilis. PabrB se utiliza comúnmente como un control de alta afinidad en ensayos de unión con la proteína de B. subtilis Spo0A o Spo0A-DBDD [43, 44]. Cabe destacar que no se pudo identificar un homólogo de abrB en C. difficile usando BLAST, indicando que la regulación indirecta potencial por Spo0A no puede ocurrir a través de abrB en C. difficile como lo hace en B. subtilis. Encontramos que C. difficile Spo0A-DBD unido con alta afinidad a PabrB (Fig. 2D y E). Realizamos ensayos de desplazamiento electroforético (EMSAs) utilizando PabrB radiomarcado y aumentando las cantidades de C. difficile Spo0A-DBD que fue purificado utilizando un C-terminal 66His-tag. La adición de proteína conduce a un retardo dosis-dependiente del fragmento de ADN con una aparente K D de,50 nM. En el mismo rango de concentraciones proteicas, no se observó unión para un control negativo (un fragmento de ADN de B. subtilis citG [45] ) (Fig. 2E), sugiriendo que la unión era específica para la región promotora del abrB. B. subtilis Spo0A reconoce una secuencia distinta (0A box), que se caracteriza por un motivo del núcleo de 7 bp (TGTCGAA) [10, 11]. Estudios estructurales han revelado que la proteína hace contactos específicos con el G en la posición 2 (G2), y la C en la posición 4 (C4) y 5 (G5) de este motivo [13]. Se introdujeron mutaciones G2A, C4A, G5A, G2A/C4A y C4A/G5A en el núcleo de consenso perfecto 0A-box presente en PabrB. Encontramos que la afinidad de C. difficile Spo0A por estos fragmentos PabrB mutados fue muy reducida (Fig. 2E). Realizamos EMSAs utilizando PabrB radiomarcado que contiene la secuencia del núcleo mutado. Para las mutaciones de punto único en el ADN, la afinidad disminuyó 10 veces. No parecía haber un efecto aditivo de una mutación de segundo punto para las dos combinaciones probadas. Ninguna de las mutaciones abolió completamente la unión de C. difficile Spo0A, lo más probable como resultado de la unión de Spo0A a otras cajas (no-consenso) 0A en el promotor abrB [44]. Tomadas juntas, concluimos que los residuos de guanina y citosina en el motivo TGTCGAA del núcleo de PabrB son importantes para la unión específica de este fragmento por C. difficile Spo0A Valor para la unión por C. difficile Spo0A-DBD Arriba, hemos establecido que la Spo0A-DBD de C. difficile es altamente homóloga a la de la proteína B. subtilis Spo0A, y que las proteínas reconocen una secuencia de consenso similar (Fig. 2 ). Basado en esta información, identificamos los varios genes como objetivos directos putativos de C. difficile Spo0A. Preguntamos la secuencia del genoma C. difficile 630 para que coincida perfectamente con la caja del núcleo 0A usando Genome2D [40]. Tal análisis reveló la presencia de 102 motivos coincidentes, de los cuales 45 estaban ubicados dentro de 500 pb del ATG iniciador de un marco abierto de lectura en la misma hebra (ver Tabla S1 ). Se nos llamó la atención sobre spo0A y sigH, ya que estos dos genes fueron previamente regulados por Spo0A en B. subtilis y/o juegan papeles importantes en la esporulación [3, [46] [47]. Encontramos que C. difficile Spo0A se une a secuencias de ADN aguas arriba de spo0A y sigH. Realizamos EMSAs con ADN que abarca 220-281 bp aguas arriba del codón ATG iniciado de los marcos de lectura abiertos spo0A, sigH y spoVG. Encontramos que la adición de Spo0A-DBD a las reacciones causó retardo de los fragmentos de ADN spo0A y sigH (Fig. 3A), pero no de un fragmento spoVG que no contenía un cuadro 0A de consenso (Fig. 3 Cabe señalar que la afinidad de Spo0A-DBD por la región aguas arriba de spo0A fue la más alta que hemos observado hasta ahora para cualquier ADN C. difficile. Además, la presencia de múltiples especies desplazadas podría indicar la presencia de más de un sitio de unión fuerte. Estos resultados establecen que spo0A y sigH son probablemente objetivos legítimos de Spo0A en C. difficile, y confirman que spoVG no lo es, en línea con los resultados obtenidos en B. subtilis [10]. Nos interesó ver si Spo0A en C. difficile podría potencialmente regular genes que no tienen función documentada en la esporulación. Nuestro análisis en silico identificó varios genes sin vínculo obvio con la esporulación que tenían un consenso 0A dentro de 100 bp aguas arriba de su codón inicial. Este posicionamiento es similar al observado para spo Confirmamos la unión in vitro de la C. difficile Spo0A-DBD a las regiones promotoras de lplA y ssuA. Realizamos experimentos EMSA utilizando sondas que incluyeron el sitio de consenso perfecto y proteína purificada Spo0A-DBD. Observamos la unión de la proteína a fragmentos aguas arriba del gen lplA (CD1654; cuadro en 267) y el gen ssuA (CD1484; cuadro en 282) (Fig. 3A). El gen lplA codifica una ligasa de lipoato-proteína predicha, y ssuA está anotado como un transportador de sulfonatos alifáticos ABC; según nuestro conocimiento, ninguno de estos ha sido implicado directamente en la esporulación o ha encontrado ser blanco de Spo0A en otros organismos. Juntos nuestros resultados establecen el potencial de unión de Spo0A al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, dos genes que son importantes para la esporulación, e indican que Spo0A puede tener funciones que van más allá de la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha establecido que un mutante spo0A de C. difficile no produce esporas, consistentes con un papel crucial en la vía de esporulación [33]. Sin embargo, la identificación en silico de las regiones aguas arriba con consenso Spo0A sitio de unión no señaló a ninguno de los genes de esporulación temprana (reducción de spo0A en sí mismo) como objetivos directos de Spo0A. Esto es probablemente el resultado de variaciones en la caja 0A en estos promotores que fueron ignorados en la búsqueda de cajas. En apoyo de esto, muchos objetivos directos legítimos bien caracterizados de B. subtilis Spo0A (como spoIIAA y spoIIE) no contienen una concordancia del 100% con el motivo central, sino más bien una o más cajas de consenso cercano [5, 49]. Encontramos que Spo0A- realizamos experimentos EMSA utilizando cantidades crecientes de Spo0A-DBD purificado de C. difficile 630Derm y los fragmentos de ADN indicados anteriormente (Fig. 3B ). Para spoIIAA (codificación de un factor anti-sigma) y spoIIE (codificación de una fosfatasa de serina), observamos una baja intensidad cambiada de especie a concentraciones tan bajas como 150 nM. Para spoIIGA (codificación de una proteasa específica anti-sigma) observamos la especie desplazada sólo a concentraciones más El control negativo (spoVG) no demostró la unión de Spo0A-DBD a estas concentraciones. Además, el cambio observado fue reversible utilizando ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no utilizando ADN sin etiqueta que carecía de tal sitio (Figura S1B-D). Por lo tanto, consideramos que la unión a los genes spoIIAA, spoIIE y spoIIGA es específica, a pesar de que el aumento de la cantidad de proteína no parecía causar un aumento significativo en la cantidad de ADN en el complejo. Juntos, estos resultados sugieren que Spo0A en C. difficile podría regular la transcripción de al menos un subconjunto de genes de esporulación temprana mediante la unión directa a sus regiones promotoras. C. difficile Spo0A-DBD Encuadernaciones al ADN Corriente ascendente de tcdB Se ha informado previamente que la eliminación de Spo0A en C. difficile resulta en una producción de toxina significativamente menor y una reducción de 1000 veces en la toxicidad del sobrenadante de cultivo derivado de células negativas spo0A hacia las células Vero [35]. Considerando la ausencia de un homólogo del represor abrB, la unión directa de Spo0A y la activación concomitante de la transcripción del gen de la toxina es un mecanismo probable a través del cual esto podría ocurrir. Encontramos evidencia de unión directa de Spo0A-DBD a la región aguas arriba del TCdB, codificando uno de los principales genes de toxina clostridial, y posiblemente TCdC, pero esto no parece resultar en niveles de toxina más bajos en nuestras manos. Se realizaron EMSAs utilizando ADN aguas arriba de tcdR (codificación de un factor sigma responsable de la activación de la transcripción del gen de la toxina), tcdB (toxina B de codificación), tcdA (toxina A de codificación). Con el fin de probar las regiones aguas arriba de todos los marcos de lectura abiertos en el PaLoc, también probamos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de tcdE (codificación de una proteína similar a la holina [50, 51] ) y tcdC (codificación de un regulador putativo negativo de la producción de toxina [52] [53] [54] ), aunque este regulador no tiene un efecto significativo sobre los niveles de toxina bajo las condiciones que usamos [55, 56]. De las regiones analizadas, sólo se observó una especie claramente desplazada, indicativa de unión Spo0A, para tcdB (Figura 4A ); la especie desplazada en nuestro ensayo EMSA fue revertida por la adición de ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no por ADN que carecía de dicho sitio (Figura S1E ). Para tcdC, se observó algún frotis en todas las concentraciones de proteínas analizadas (Figura 4A ), y no parecía haber un efecto claro de la adición de fragmentos de ADN sin etiqueta (Figura S1F ). Las sondas para tcdA, tcdE y tcdR eran indistinguibles de las obtenidas con nuestro control negativo, spoVG. Queríamos determinar si los niveles de toxina en los sobrenadantes de cultivo fueron afectados directa o indirectamente por Spo No encontramos toxicidad menor hacia células Vero de sobrenadantes de cultivo derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje. Cultivamos tres réplicas biológicas independientes de un tipo salvaje (630Derm) o mutante spo0A generado por Clostron (CT::spo0A -una especie de regalo del laboratorio Minton) en medio TTY libre de glucosa. Cosechamos sobrenadante de cultivo en fase de exposición tardía (aproximadamente 7 horas después de la inoculación), la fase de transición entre la fase de crecimiento exponencial y estacionaria (aproximadamente 9 horas después de la inoculación), así como dos puntos de tiempo en fase estacionaria (24 y 48 horas después de la inoculación) y determinamos los títulos de valoración de la toxina (ver Materiales y Métodos). En contraste con hallazgos previos, observamos un pequeño aumento (#4 veces) en la toxicidad de los sobrenadantes derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje, pero en todos los casos esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p.0.05, prueba independiente de muestra t). En otro medio (BHIS), no observamos diferencias en absoluto (datos no mostrados). Concluimos que Spo0A no afecta positivamente a la producción de toxina en C. difficile 630Derm y la relevancia in vivo de la unión a regiones aguas arriba de tcdB y/o tcdC está por lo tanto limitada bajo nuestras condiciones experimentales. La caja Spo0A de C. difficile En B. subtilis, el sitio de unión de Spo0A al ADN diana ha sido bien caracterizado, a través de una combinación de ensayos de unión in vitro, determinación de perfiles de unión in vivo y mutagenesis de secuencias de promotor reguladas. Este trabajo ha llevado a la identificación de un motivo de núcleo conservado, TGTCGAA, o caja Spo0A [5, 10, 11, 45]. Dependiendo del análisis, este motivo está flanqueado por uno o más residuos de adenina o timina [10, 11]. Curiosamente, muchos genes objetivo no contienen una perfecta coincidencia con esta secuencia de consenso, sino que contienen uno o más motivos degenerados. Las diferencias en estos motivos pueden reflejar diferentes arquitecturas promotoras (por ejemplo, contenido AT), modos de acción (por ejemplo, activación o represión) o niveles de regulación. Los genes Spo0A en B. subtilis se pueden dividir en diferentes clases que responden a diferentes niveles de Spo0A fosforilada [43, 57]. Para C. difficile, concluimos que la proteína Spo0A probablemente reconoce un motivo similar a la caja B. subtilis Spo0A sobre la base de cuatro líneas de evidencia; 1. Todos los residuos de unión de ADN/contacto se conservan (Fig. 2B), 2. C. difficile Spo0A puede unirse con alta afinidad a un objetivo de B. subtilis Spo0A (Fig. 2D), 3. Mutagenesis de residuos clave en la caja B. subtilis Spo0A reduce la afinidad de C. difficile Spo0A por ADN (Fig. 2E ) y 4. Una caja de B. subtilis Spo0A tiene valor predictivo para la unión de ADN por C. difficile Spo0A (Fig. 3A). Es concebible que nuestro sistema modelo, utilizando el dominio de unión de ADN purificado, no refleje con precisión la unión a todos los sitios objetivo, si la selectividad del sitio objetivo está determinada en parte por otras partes de la proteína de longitud completa. Es probable que existan diferencias entre los sitios de unión preferidos para ambas proteínas que serán evidentes cuando se realice un análisis exhaustivo de la unión de ADN in vivo de C. difficile Spo0A; basado en el limitado conjunto de datos de este estudio, un análisis MEME [58] ya sugiere posibles diferencias en el motivo Spo0A extendido (W.K. Smits, observaciones no publicadas). Estas diferencias pueden relacionarse con el contenido mucho más alto de AT de C. difficile en comparación con B. subtilis (71 vs. 56.5%, respectivamente), o la dimerización dependiente de la fosforilación, por ejemplo. La iniciación de la esporulación en B. subtilis está sujeta a una regulación compleja (ver ref [1, 59] ). La activación de Spo0A está controlada por un fosforelay multicomponente que puede integrar señales ambientales [60] y asegura un aumento gradual del nivel de Spo0A fosforilado en la célula [57]. Además, la transcripción del gen spo0A está controlada por múltiples bucles de retroalimentación. Por ejemplo, Spo0A regula su propia transcripción mediante la unión al promotor spo0A [46], así como estimulando indirectamente la transcripción de sigH, codificando un factor sigma que reconoce En C. difficile, existen algunas diferencias y similitudes interesantes en las vías regulatorias. Más notablemente, no parece haber fosforelay [2] y el estado de fosforilación de Spo0A está supuestamente controlado por histidina cinasas huérfanas [35]. La transcripción de spo0A en C. difficile está bajo control del factor sigma del estado de transición Sigma H [37], como lo está en B. subtilis [61]. Nuestros datos indican que tanto spo0A como sigH podrían ser objetivos de regulación directa por Spo0A en C. difficile (Fig. 3A), aumentando la posibilidad de autorregulación de spo0A. La supuesta regulación directa de sigH por Spo0A puede reflejar que el genoma de C. difficile no alberga un homólogo del regulador pleiotrópico AbrB, que es responsable de la regulación dependiente de Spo0A de sigH en B. subtilis [48]. De acuerdo con un modelo en el que spo0A es positivamente autorregulado, observamos un fuerte aumento en los niveles de Spo0A a medida que las células se acercan a la fase de crecimiento estacionario (Fig. 3B ). Downstream de Spo0A, encontramos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de varios genes de esporulación temprana, como spoIIAA, spoIIE y spoIIGA (Fig. 3B ). Todas estas observaciones son consistentes con la regulación directa de estos genes por Spo0A en Aunque Spo0A es el regulador clave para la esporulación en Firmicutes, regula numerosos otros procesos en diversas bacterias. En el B. subtilis no patógeno, por ejemplo, la proteína también afecta el desarrollo de la competencia, la formación de biopelículas, la producción y resistencia a compuestos antimicrobianos, la dinámica cromosómica y aspectos de la biología de los fagos [10, [14] [16]. Es importante destacar que varios de estos procesos están regulados indirectamente, a través de la represión dependiente de Spo0A de abrB. Además, la transcripción de abrB responde ya a bajos niveles de Spo0A,P [43]. Como resultado, estos efectos son detectables en fase estacionaria tardía y temprana, ya que algunas Spo0A están presentes durante todo el crecimiento en células de B. subtilis. Aunque abrB está ausente de C. difficile, esto no excluye la posibilidad de regulación de transcripción indirecta a través de Spo0Efectos dependientes sobre otros reguladores. Alternativamente, Spo0A puede ejercer un efecto directo. En Clostridium acetobutilicum y C. beijerinckii, Spo0A es un regulador directo de la formación de disolventes, así como la esporulación [22, 23]. Por lo tanto, parece concebible que Spo0A en C. difficile también afecta aspectos del metabolismo. En este sentido, es importante notar que también en C. difficile Spo0A es detectable desde la fase de crecimiento exponencial temprana en (Fig. 1B). Observamos la unión directa de C. difficile Spo0A a la región promotora de sigH (Fig. 3 Este gen codifica el factor sigma clave para la fase de transición, y regula los procesos fuera de la esporulación también [37]. Además, encontramos niveles significativos de Spo0A desde la fase estacionaria temprana en adelante (fig. 1B y observaciones no publicadas), indicando las acciones regulatorias de Spo0A no necesitan limitarse a la fase estacionaria en C. difficile. En línea con esta idea, encontramos un vínculo regulatorio potencial entre Spo0A y dos genes que según nuestros conocimientos no están relacionados con el proceso de esporulación, la ligasa lpla y el transportador de sulfonatos alifáticos ssuA (fig. 3A). La presencia de un sitio de unión Spo0A putativo aguas arriba de estos genes, así como el espaciado en comparación con el codón inicial, se conserva en la cepa problemática Stoke-Mande Esto podría indicar que estos aspectos de la regulación por Spo0A se conservan en múltiples cepas de C. difficile. Cabe señalar que nuestro trabajo hasta ahora se ha limitado a un análisis in vitro de la unión de Spo0A, y por lo tanto no indica si la activación o represión de los genes de destino putativo ocurre in vivo. Para responder a esta pregunta, hay que realizar estudios detallados del transcriptoma y/o del proteoma. Para distinguir directamente de los efectos indirectos, se deben realizar perfiles de unión in vivo de Spo0A. Los anticuerpos generados para este estudio deben resultar útiles para este tipo de experimentos. En B. anthracis una mutación spo0A resulta en niveles elevados de AbrB, y niveles concomitantemente más bajos de los genes de la toxina pagA, cia y lef que están bajo control AbrB [17]. Del mismo modo, la producción de la toxina emética cereulida en B. cereus es ampliamente reprimida en un mutante spo0A, de una manera dependiente de AbrB [63]. En contraste, Spo0A reprime directamente la expresión de los genes de la toxina del grito en B. turingiensis y un mutante spo0A es, por lo tanto, un hiperproductor de la proteína cristalina insecticida [18, 21]. En Clostridium perfringens TpeL, un miembro de las toxinas clostridiales grandes, al igual que TcdA y TcdB, depende directamente de Spo0A [64] y también la producción de enterotoxina en este organismo parece ser (indirectamente) dependiente de la esporulación [65, 66]. En C. difficile un espo0A insercional mutante generado utilizando tecnología Clostron se informó de tener niveles reducidos de 10 veces de toxina A (TcdA), tanto intracelular como extracelularmente, así como, 1000 veces menor toxicidad hacia las células Vero, que son principalmente sensibles hacia la toxina B (TcdB) [35]. Nuestros datos de unión in vitro indican un sitio de unión potencial para Spo0A antes de tcdB y posiblemente tcdC (Fig. 4A). Sin embargo, la relevancia in vivo de esta unión parece limitada ya que en nuestras manos un mutante independiente pero idéntico (una especie de donación del laboratorio de Minton; [33] ) no demostró una toxicidad reducida hacia las células Vero. En contraste, encontramos que en las TTY los niveles medios de toxina fueron ligeramente elevados en células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje (#2 veces en células de fase exponencial hasta 4 veces en células de fase estacionaria tardía).Las pequeñas, y no significativas, diferencias en los niveles de toxina en nuestros experimentos podrían atribuirse a diferencias en la susceptibilidad de las células para la lisis en lugar de la producción de toxina, pero también podrían indicar un efecto regulador negativo de Spo0A en la producción de toxina. En apoyo de esta última hipótesis, se ha reportado recientemente que un mutante spo0A de C. difficile cepa R20291 (una cepa epidémica PCR ribotipos 027/BI/NAP1) demuestra niveles de toxina 10 veces más altos que su isogénico tipo salvaje 30 h después de la inoculación, y es significativamente más virulento en un modelo de enfermedad del ratón [34]. Las diferencias entre Underwood et al [35], por un lado, y nuestro estudio, así como el estudio de Deakin y compañeros de trabajo [34], por otro, pueden explicarse por diferencias en las condiciones experimentales, como el medio utilizado. Sin embargo, no observamos diferencia en la citotoxicidad entre sobrenadante derivado del tipo salvaje o células mutantes spo0A cuando se cultivaban en BHIS, un medio casi idéntico al utilizado anteriormente (datos no mostrados). Alternativamente, las diferencias podrían indicar la integración del intron del grupo II en más de un lugar del cromosoma en la cepa utilizada en Underwood et al [35]. En ausencia de un experimento de complementación y/o datos de manchas del sur, esto queda por establecer. En resumen, nuestros datos son consistentes con un modelo en el que la regulación de las principales toxinas clostridiales en C. difficile no se ve positivamente afectada por Spo0A, en contraste con los hallazgos previos y otras Clostridias patógenas. Si Spo0A es verdaderamente un regulador negativo de la producción de toxinas queda por confirmar utilizando ensayos de transcripción in vitro e in vivo. En el presente estudio hemos demostrado por primera vez la unión directa del dominio de unión del ADN de C. difficile Spo0A al ADN objetivo putativo. Este trabajo ha revelado que aspectos de la unión Spo0A se conservan entre Bacillus y C. difficile (0A caja, posible autoregulación y unión a promotores de la esporulación temprana), mientras que otros no lo son (la ausencia de abrB como objetivo directo en C. difficile, unión al ADN aguas arriba de lplA, ssuA). Los efectos de Spo0A en la producción de toxinas pueden ser similares a los observados para B. thuringiensis [18, 21]. El trabajo futuro estará dirigido a determinar el efecto de Spo0A en la transcripción de los genes de destino putativo, y llevar a cabo un análisis exhaustivo de Spo0A unión in vivo. La identificación de genes afectados por Spo0A en C. difficile puede arrojar luz sobre el papel de la proteína en la virulencia y patogénesis de este organismo Las descripciones con fragmentos de PCR de PabrB (conteniendo un sitio de unión de alta afinidad) y PtcdA (faltando tal sitio) corresponden aproximadamente a 0,1 nM/mL -0,03 nM/mL. A. La comparación de la unión de Spo0A-DBD-his6, Spo0A-his6 y CD2195-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA. B. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA). C. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIE se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA. D. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. E. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. F. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del TCdC no se ve o moderadamente afectada por la adición de PabrB y/o PtcdA. (TIF) Texto S1 Oligonucleótidos utilizados en este estudio y condiciones de ciclismo PCR para las sondas EMSA. (PDF)
question: ¿Cuál es el regulador clave de la esporulación?
answers.text: Spo0A