context: Análisis basado en la secuenciación del ARN del transcriptoma del bazo después de la infección por el virus de la bronquitis infecciosa de pollos seleccionados para diferentes concentraciones séricas de lectina de unión de manoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4729133/SHA: f5f1cd43740b5b6eca8b3cf2714fc0854a746519Autores: Hamzić, Edin; Kjærup, Rikke Brødsgaard; Mach, Núria; Minozzi, Guilietta; Strozzi, Francesco; Gualdi, Valentina; Williams, John L.; Chen, Jun; Wattrang, Eva; Buitenhuis, Bart; Juul-Madsen, He La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para la mejora de las estrategias de control del IB. Para ello, se estudiaron dos líneas de pollo, seleccionadas para la concentración sérica alta (línea L10H) y baja (línea L10L) de lectina de unión a manosa (MBL). En total, se utilizaron 32 aves de cada línea. Dieciséis aves de cada línea fueron infectadas con IBV y dieciséis no fueron infectadas. Ocho aves no infectadas e infectadas de cada línea fueron eutanizadas a las 1 y 3 semanas después de la infección. Se realizó secuenciación de ARN en muestras de bazo de las 64 aves y se realizó análisis de expresión genética diferencial para cuatro comparaciones: línea L10L frente a L10H para aves no infectadas en las semanas 1 y 3, respectivamente, y de la misma RESULTADOS: Comparando aves no infectadas L10H y L10L, identificamos 1698 y 1424 genes expresados diferencialmente (DE) en las semanas 1 y 3, respectivamente. Para las aves infectadas por IBV, 1934 y 866 genes DE fueron identificados entre las dos líneas en las semanas 1 y 3, respectivamente. Los dos términos de GO más enriquecidos que surgieron de la comparación de aves no infectadas entre las dos líneas fueron “Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune” y “Recombinación somática de genes inmunoglobulinos involucrados en la respuesta inmune” en las semanas 1 y 3, respectivamente. Al comparar aves infectadas por IBV entre las dos líneas, los términos de GO más enriquecidos fueron “Activación de células T alfa-beta” y “Regulación positiva de la activación de leucocitos” en las semanas 1 y 3, respectivamente. CONCLUSIONES: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, mientras que la comparación de las aves infectadas por el IBV de las dos líneas mostró diferencias en la expresión de genes relacionados con la inmunidad involucrados en la activación y proliferación de las células T. Las diferencias observadas en el transcriptoma entre las dos líneas indican que la selección para el MBL había influido en la inmunidad innata, así como en la inmunidad adaptativa. MATERIAL COMPLEMENTARIO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.11866/s12864-016-2403-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Conclusiones: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad Las diferencias de transcriptoma observadas entre las dos líneas indican que la selección de MBL influyó en la inmunidad innata y adaptativa.Keywords: IBV, Coronavirus, Bronquitis infecciosa, Pollo, secuenciación de ARN, Transcriptome, Bazo, Lectina de unión de Mannosa, Respuesta Inmune Antecedentes La bronquitis infecciosa aviar (IB) es una enfermedad aguda y altamente contagiosa del tracto respiratorio superior causada por el virus de la bronquitis infecciosa (IBV). El virus es un miembro de la familia Coronaviridae y tiene numerosos serotipos y cepas. La replicación rápida combinada con alta tasa de mutación y recombinación son las principales causas de la alta diversidad observada [1]. El tracto respiratorio es el órgano principal y punto de entrada del virus, antes de su posterior propagación a riñones y gónadas. Los síntomas más comunes del IB están relacionados con el tracto respiratorio e incluyen jadeo, tos, estornudos, rales traqueales y secreción nasal [2]. La conversión de alimento y el aumento diario medio se ven afectados en los pollos de engorde, y la infección suele ir seguida de infecciones bacterianas secundarias. En capas, el IBV causa una reducción en la producción y calidad de los huevos. Hoy en día, el IB es una de las enfermedades más importantes económicamente en la industria avícola [2]. Los brotes de infección se controlan mediante una combinación de prácticas estrictas de manejo y vacunación. Las prácticas de manejo estrictas, que incluyen el mantenimiento de la temperatura de la vivienda y la ventilación, son esenciales, ya que el IBV es altamente contagioso y se propaga muy rápido. Las vacunas vivas atenuadas e inactivadas se utilizan ampliamente para el control y la prevención de la infección por IBV [3, 4 Debido a que hay poca o ninguna protección cruzada entre los diferentes serotipos/variantes del virus, por lo tanto las vacunas deben contener serotipos presentes en un área particular para inducir una protección adecuada [1]. Nuevas vacunas de múltiples cepas con la combinación óptima de antígenos y adyuvantes óptimos son necesarias para el futuro control del IBV. Comprender los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para mejorar aún más las vacunas. La infección por IBV induce una amplia gama de respuestas inmunes en pollos. Una respuesta inmune innata se activa durante las etapas iniciales de infección en el revestimiento mucosa de la tráquea después de la unión de viriones del IBV a los receptores de células epiteliales [5]. La activación de esta respuesta inmune innata puede ser iniciada por el receptor de Además, se ha observado una rápida activación de las células asesinas naturales (NK) un día después de la infección por el IBV [8], así como un aumento del número de macrófagos en los pulmones y la tráquea después de la infección primaria por el IBV [9]. En el caso de las respuestas inmunes adaptativas, las subpoblaciones de linfocitos T participan activamente en las primeras etapas del aclaramiento del IBV [7, 10], exhibiendo una rápida activación sobre la infección por el IBV [6]. Además, los estudios han demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LCT) desempeñan un papel importante en la respuesta a las infecciones primarias por el IBV [10, 11]. Además de las respuestas a las células T, se han notificado anticuerpos específicos del IBV, de las tres clases de anticuerpos presentes en los pollos [12] [13] [14]. Los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos están fuertemente interconectados, lo que también se observa en la respuesta a la infección por IBV, y la conexión posiblemente implica la coleccion de suero, la lectina de unión a la mano (MBL) como agente clave [16]. En el presente estudio se utilizaron dos líneas de pollo seleccionadas para concentraciones séricas altas y bajas de MBL (designadas L10H y L10L, respectivamente). La cría selectiva se ha llevado a cabo durante 14 generaciones utilizando la combinación de dos cepas (67,5 % de pollos UM-B19 y 33,5 % de Cornish Blanco) como población inicial, según lo descrito por Juul-Madsen y otros [17]. El resultado final fue dos líneas divergentes, con concentraciones séricas medias de MBL de 33,4 μg/ml para la línea L10H y 7,6 μg/ml para la La concentración sérica media de MBL para 14 líneas de pollo diferentes que representan tanto pollos de engorde como capas es de alrededor de 6 μg/ml, pero varía de 0,4 a 37,8 μg/ml en pollos sanos normales con proteína producida en el hígado como principal fuente de MBL circulante [17]. En pollos, se ha observado una correlación positiva entre las concentraciones séricas de MBL y la gravedad de varias infecciones, tales como infecciones causadas por IBV [19], Escherichia coli [20] y Pasteurella multocida [21]. En pollos, el MBL se une al IBV [16, 22], por lo que es posible que el MBL facilite respuestas innatas como la opsonofagocitosis, la activación complementaria o la neutralización del virus, en las primeras etapas de la infección por IBV. En apoyo del papel de la MBL en respuesta al IBV, Kjaerup et al. [18] observaron diferencias considerables en los parámetros inmunes adaptativos celulares en respuesta a una infección por IBV entre las líneas L10L y L10H. Además, las aves de la línea L10H presentaron cargas virales menores y daño menos grave de los cilios traqueales después de la infección por IBV en comparación con las aves de la línea L10L. El objetivo de este estudio fue caracterizar el transcriptoma del bazo de las aves sanas de las dos líneas seleccionadas para el MBL sérico, e investigar las diferencias en los mecanismos moleculares detrás del desarrollo de inmunidad adaptativa sistémica entre las líneas L10L y L10H infectadas con IBV. La línea temporal experimental y los puntos de tiempo de muestreo están ilustrados en la figura 1 y Kjaerup et al. [18] Las aves fueron infectadas a las 3 semanas de edad y a partir del día 2 post-infección (p.i.), mostraron signos clínicos característicos de infección por IBV, incluyendo estornudos y respiración laboriosa. Se evaluaron cargas virales en hisopos traqueales para todas las aves como se informó en el artículo anterior publicado en el estudio experimental de infección [18]. No se detectaron virus en las aves no infectadas en ningún momento a lo largo del experimento. Se detectaron genomas virales en hisopos de aves infectadas del día 1 al 8 p.i. Cabe destacar que se observaron cargas virales significativamente menores (p < 0.03) en las aves de la línea L10H en comparación con las aves infectadas de la línea L10L [18]. Se produjeron datos de detección y cuantificación de la secuenciación de ARN de expresión génica esplénica de ocho aves infectadas y ocho Todas las muestras pasaron las medidas de control de calidad para las lecturas secuenciadas crudas y recortadas excepto para el individuo número 46, que fue eliminado debido a un número muy bajo de lecturas secuenciadas. Para las aves restantes, se obtuvo un promedio de más de 37 millones de lecturas por muestra para las 63 muestras analizadas, con el 81% de las lecturas cartografiadas a la secuencia de referencia del genoma del pollo, como se describe en la sección de materiales y métodos (Ver estadísticas resumidas con el número de lecturas cartográficas y totales se presenta en el archivo adicional 1: Tabla S1 ). En total, se identificaron 17.113 genes expresados. Después de filtrar genes con menos de una lectura por millón en ocho muestras [24] (genes que no alcanzarían significación estadística para la expresión diferencial), la lista final contenía 11.292 genes expresados. Antes de realizar el análisis diferencial de expresión génica, se realizó un análisis multivariable El diagrama de escalamiento multidimensional (SMD) en genes expresados entre las dos líneas, L10H y L10L, mostró que difieren considerablemente en sus perfiles del transcriptoma tanto para aves no infectadas como infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Además, la variación interindividual en la expresión génica en la semana 1 fue considerablemente mayor que la observada en la semana 3 para aves no infectadas e infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Las aves 22 y 47 fueron separadas del resto en la parcela del SMD [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Sin embargo, la inspección de los datos de secuencias en bruto y los parámetros de mapeo no identificaron ningún problema técnico que explicara el out-grouping observado de estas aves. Además, se realizó un análisis de componentes principales interclase (PCA) utilizando recuentos La interclase PCA reveló que las aves 22 y 47 fueron colocadas fuera de los intervalos de confianza del 95 % de sus respectivos tratamientos [Ver ficha adicional 3: Figura S2]. Sin embargo, la PCA no identificó ningún gen con perfiles de recuento extremos que pudieran haber contribuido a la dispersión del transcriptoma de las aves 22 y 47 con respecto a sus grupos de tratamiento.Aunque no hubo una clara explicación técnica o biológica para su fuera de grupo, estas muestras fueron retiradas del análisis posterior.Se realizó un análisis de expresión genética diferencial para comparar las dos líneas de pollo (L10L y L10H) en dos momentos para las líneas no infectadas (C1 y C2, ver Figura 1 ) y las aves infectadas por el IBV (C3 y C4, ver Figura 1 ).Un gran número de genes se expresaron diferencialmente (DE) entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, tanto para las aves no Se identificaron 1.698 y 1.424 genes DE para las aves no infectadas entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total 692 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.006 tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 1 [Ver Fichero adicional 4: Tabla S2 ] y 774 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 650 genes tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 3 [Ver Fichero adicional 5: Tabla S3 ]. Comparando las aves infectadas por IBV L10H y L10L, se identificaron 1.934 y 866 genes DE en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total, 931 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.003 tenían mayor expresión en la línea L10L en la semana 1 y en la semana 3, 508 tenían mayor expresión en la línea L10H y 358 tenían mayor expresión en la línea L10L (tabla 1, archivo adicional 6: tabla S4 y archivo adicional 7: tabla S5 ). También hubo cambios relacionados con el estado en la expresión génica como se muestra en el diagrama de Venn (fig. 2). En la semana 1, el número total de genes DE en aves no infectadas Fig. 2 ). De 3.011 (1077 + 621 + 1313) genes DE para aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas sólo 621 (~20 %) fueron comunes para dos comparaciones (fig. 2 ). En la semana 3, el número total de genes DE en aves no infectadas entre las dos líneas fue de 1424 (883 + 541) 2 ) que fue mayor en comparación con 866 (541 + 325) en las aves infectadas entre las dos líneas (Tabla 1, Fig. 2 ). Al comparar las aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas, 541 (~30 %) genes fueron comunes de un total de 1749 (883 + 541 + 325) genes DE para ambas comparaciones (Fig. 2). Además, también se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar dos puntos de tiempo (semana 1 y semana 3) en las dos líneas de pollo (L10L y L10H) para las aves no infectadas (C5 y C6, ver Fig. 1 ) y IBV (C7 y C8, ver Fig. 1 ). Finalmente, se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar los dos estados de infección (infectados e infectados por IBV) en dos puntos de tiempo para la línea de pollo L10L (C9 y C10, ver Tabla S6, Fichero adicional 9: Tabla S7, Fichero adicional 10: Tabla S8, Fichero adicional 11: Tabla S9, Fichero adicional 12: Tabla S10, Fichero adicional 13: Tabla S11, Fichero adicional 14: Tabla S12 y Fichero adicional 15: Tabla S13 ]. Se realizó un análisis de conjunto de genes de enriquecimiento para identificar términos de Ontología (GO) "Proceso del Sistema Inmune" sobrerrepresentados utilizando las listas de genes DE de comparaciones entre aves no infectadas e infectadas de las dos líneas a 1 y 3 semanas p.i. Los términos más enriquecidos del Sistema Inmune GO entre las dos Los términos del Sistema Inmune GO asociados a genes que se expresaron diferencialmente entre las dos líneas para las aves no infectadas en la semana 1 fueron "Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002285), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218), "Inmunidad mediada por linfocitos" (GO:0002449), y "Comparación de leucocitos entre las dos líneas, L10H y L10L, aves no infectadas e infectadas en dos momentos (semanas 1 y 3). 1 Para las aves no infectadas en la semana 3, los términos del Sistema Inmunitario GO más enriquecidos fueron "Recombinación somática de genes de inmunoglobulina involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002204) y "Reacción inmune adaptativa basada en la recombinación somática de receptores inmunes construidos a partir de la superfamilia inmunoglobulina" (GO:0002460) [Ver Fig. 3, Ver Fichero adicional 17: Figura S4 ]. En total, 47 genes DE mapeados a términos del Sistema Inmunitario GO en esta comparación (Fig. 4). Entre los genes DE que tuvieron una expresión más alta en la línea L10H en la semana 3, en el grupo no infectado, fueron IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22, que también fueron vistos diferencialmente expresados entre líneas en la semana 1 [Ver Fig. 4 Comparando las aves infectadas de las dos líneas, en la semana 1, "Activación de células alfa-beta T" (GO:0046631), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218) y "Diferenciación de leucocitos" (GO:0002521) las funciones fueron los tres términos más enriquecidos del sistema inmunológico GO (Fig. 3). CXCR4 (Receptor de quimioterapia 4), PTPN22 y FAS estaban entre los genes más altamente expresados en L10H [Ver Fig. 4, Fichero adicional 18: Figura S5 ]. El término principal del sistema inmunológico GO que fue fuertemente enriquecido para las aves infectadas en la semana 3 fue "Regulación positiva de la activación de leucocitos" (GO:0002696) [Ver Figura S6 ]. El presente estudio utilizó dos líneas, L10L y L10H, que han sido seleccionadas divergentemente para una concentración sérica alta y baja de MBL durante 14 generaciones, Fig. 3 Mapa funcional de genes expresados diferencialmente enriquecidos para términos del Sistema Inmune GO. Las categorías superiores de los términos del Sistema Inmune GO asociados con genes expresados diferencialmente (DE), todas ellas estadísticamente significativas (valor p ajustado < 0,001). Los fragmentos de la tabla representan el número de genes asociados a los términos como proporción del número total de genes dentro del término GO respectivo. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris respectivamente. Estas dos líneas han sido ampliamente utilizadas para estudios inmunológicos y muestran diferencias en parámetros inmunológicos después de ser desafiados con varios patógenos [18, 22, 25]. El bazo es un órgano linfoide secundario donde las respuestas inmunes innatas y adaptativas pueden ser montadas de Además, se considera que el bazo aviar desempeña un papel inmunológico muy importante, ya que los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos aviares están mal desarrollados [26]. Se investigaron las diferencias del transcriptoma en el bazo entre las dos líneas, L10L y L10H, para las aves no infectadas (saludables) y las infectadas por el IBV, centrándose en la expresión diferencial de genes inmunorelacionados dentro de términos de GO significativamente enriquecidos relacionados con el inmune. Se observaron grandes diferencias en los perfiles del transcriptoma entre las aves de las dos líneas, tanto no infectadas (saludables) como siguiendo el desafío experimental del IBV [Ver ficha adicional 2: Figura S1 ]. La representación del mapa de calor de los genes expresados diferencialmente (DE) asociados con los términos del Sistema Inmune GO para las cuatro comparaciones entre las dos líneas, L10H y L10L, no infectados e infectados en dos puntos de tiempo, semanas 1 y 3. El mapa de calor se construye utilizando los valores promedio de recuentos por millón para cada grupo que la selección de los niveles séricos de MBL en las dos líneas tuvo un efecto mucho más amplio que va más allá de la expresión del gen MBL [27]. Las diferencias de transcriptoma observadas pueden probablemente atribuirse a una respuesta correlacionada a la selección [28] o deriva genética aleatoria [29]. La selección relacionada ocurre cuando un rasgo se ve afectado por la selección en otro rasgo y depende de una correlación genética entre los dos rasgos, que es bien conocida en la cría animal [30]. Alternativamente, la deriva genética aleatoria podría contribuir a las diferencias observadas Centrándose en la expresión de genes relacionados con la inmunidad: en la semana 1, las aves no infectadas mostraron diferencias en la expresión de genes involucrados tanto en la inmunidad adaptativa como en las vías relacionadas con la inmunidad innata [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 ]. Además, la línea L10H tuvo una expresión inferior para el subconjunto de los genes inmunes innatos, TYRO3, TRAF3 y TLR7 en la semana 1 [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 y Fig. 4 ]. TYRO3 codifica el receptor de tirosineproteína cinasa 3 (TYRO3) que está involucrado en la inhibición de las vías de señalización de TLR y las vías de señalización de citoquinas inducidas por TLR. Estas dos vías influyen en los procesos relacionados con la inmunidad, incluyendo proliferación celular/supervivencia, adhesión celular y migración e inhibe la respuesta inflamatoria innata a los TRAF3 codifica una proteína de señalización citoplasmática, que juega un papel crítico en la regulación de la respuesta antiviral y la evasión viral [32] [33]. TLR7 también fue uno de los genes innatos de inmunidad DE con mayor expresión en la línea L10H. Chicken TLR7 ha demostrado desempeñar un papel en la respuesta a las infecciones por VBI [9, 35]. Además de las diferencias en los perfiles de expresión de un subconjunto de genes inmunes innatos, las dos líneas también difieren en su expresión de genes inmunes adaptativos. Las aves no infectadas de L10H tuvieron una expresión genética más alta en comparación con la línea L10L, para TGFB3, IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Estos genes son conocidos por estar involucrados en una amplia gama de procesos inmunes adaptativos. En los seres humanos, la reducción de la señalización TGF-β en las células T ha demostrado aumentar la función de las células CD8 T de manera indirecta, lo que resulta en la rápida eliminación de virus, lo que permite la creación de una respuesta eficaz de la memoria [36]. Del mismo modo, la IL-7 humana desempeña un papel clave en la supervivencia de ambas células ingenuas [37] y de la memoria [38, 39] CD4 y CD8 T. Además, un estudio in vitro mostró que la inhibición de FKBP1B y otras ciclofilinas bloquearon la replicación de diferentes Coronavirus, incluyendo el IBV [40]. Por analogía, las aves no infectadas de la línea L10H tuvieron una mayor expresión de IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Generalmente las aves no infectadas (saludables) de las dos líneas exhiben diferentes perfiles de La selección en la cría de animales ha demostrado tener un efecto extenso en una variedad de rasgos incluyendo inmunológicos [30]. Además, se ha observado una respuesta correlacionada a la selección en el caso en que la selección se realizó en rasgos menos complejos como los niveles de testosterona [41]. Finalmente, diferentes perfiles de expresión para el subconjunto de inmunes innatos y adaptativos en las aves no infectadas de las dos líneas podrían deberse al equilibrio en el efecto de los niveles séricos de MBL. Altos niveles de MBL humanos han sido reportados principalmente como beneficiosos mientras que en caso de enfermedad parasitaria intracelular el efecto del nivel sérico de MBL podría ser opuesto [42]. Los resultados indican que la selección de los niveles séricos de MBL podría conducir a favorecer modos específicos de respuestas inmunes dependiendo de la función de MBL. Se observaron grandes diferencias en los patrones de expresión entre las dos líneas que siguieron a la infección por el IBV y estas diferencias involucraron vías adaptativas relacionadas con la inmunidad que se asocian con la activación de las células T alfa-beta (GO:0046631) y la activación de la respuesta inmune innata (GO:0002218) [Ver archivo adicional 18: Figura S5 ]. El enriquecimiento observado para los términos GO relacionados con la activación de las células T está de acuerdo con un estudio previo de estas líneas que mostró que las células T específicas del IBV están presentes en grandes números en el bazo después de la infección por el IB [43]. En la semana 1 post infección CXCR4, FAS y PTPN22 mostraron mayor expresión en la línea L10H. Los receptores de quimioquinas CXC se expresan en las células T efectoras y de memoria y desempeñan un papel clave en la homeostas Se ha demostrado que la FAS está regulada en el riñón de los pollos con VBI [45]. La vía Fas/FasL es una vía importante para matar células T citotóxicas [46]. Del mismo modo, se ha demostrado que la PTPN22 se expresa de manera diferencial en los pollos después del desafío patógeno, y en particular después de la infección por Escherichia coli [47]. Además, VCAM1 y JMJD6 estuvieron entre los genes adaptativos relacionados con la inmunidad DE entre líneas en la semana 3 [Ver Fig. 4, Fichero adicional 19: Figura S6 ]. Se sabe que el gen VCAM1 está involucrado en la activación de células T [48]. Además, un estudio reciente demostró que JMJD6 regula la proliferación de células T de memoria durante una infección viral [49], lo que es de gran interés teniendo en cuenta que Los resultados muestran que las dos líneas difieren grandemente en la expresión de genes adaptativos relacionados con la inmunidad después de la infección, lo que puede implicar la presencia de diferentes modos de regulación génica. Los tiempos de muestreo fueron elegidos para acceder a las respuestas tanto en la fase efectora (semana 1) como en la fase de memoria (semana 3) de la respuesta inmune adaptativa al IBV. De acuerdo, a la semana 1 los subconjuntos de infección post-infección de genes que participan activamente en la proliferación de células T muestran diferencias entre las líneas. Además, en la semana 3 los perfiles de expresión génica inmune en respuesta a la infección por IBV que difieren entre las líneas están más relacionados con el mantenimiento de la memoria de las células T. Se sabe que el MBL está involucrado en la regulación de la maduración de las células dendríticas, así como en la producción de citocinas [50]. Por lo tanto, las dos líneas seleccionadas para diferentes concentraciones séricas de MBL pueden mostrar diferencias en las respuestas inmunes adaptativas y el desarrollo de inmunidad adaptativa como resultado de diferencias en la respuesta a la señalización de citoquinas de células dendríticas. Otros estudios de las dos líneas, L10L y L10H, han demostrado que difieren en los parámetros de respuesta a la enfermedad después de ser desafiados con diferentes patógenos. La línea L10L se ha asociado con un aumento de la replicación viral en las vías respiratorias después de una infección por el virus de la bronquitis infecciosa (VII) [18], una tasa de crecimiento reducida después de una infección por Escherichia coli [20] y una mayor colonización intestinal después de la infección por Salmonella Infantis [51]. Además, las aves L10H en el presente estudio mostraron un daño menos severo de los cilios traqueales después de la infección por VBI en comparación con la línea L10L (datos no publicados).En el experimento actual se observaron diferencias fenotípicas en rasgos adicionales relacionados con la inmunidad adaptativa, incluyendo el número de células B circulantes y células T citotóxicas [18]. A partir de estas observaciones parece que la selección de alta concentración sérica de MBL permite a las aves hacer frente mejor después de infectarse con una gama de patógenos. Por lo tanto, las diferencias observadas en los perfiles de expresión para los genes inmunes adaptativos e innatos son un reflejo de las diferencias en la resistencia a la enfermedad y las respuestas inmunitarias entre las líneas L10L y L10H. En conclusión, se observaron grandes diferencias en el transcriptoma del bazo entre las dos líneas de pollo Las aves no infectadas de las dos líneas mostraron diferencias en los perfiles de expresión para un subconjunto de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, lo que puede representar diferencias en la preparación para responder a una infección. Después de la infección por IBV, las dos líneas mostraron grandes diferencias en la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune celular adaptativa como la activación y las vías de proliferación de las células T y por lo tanto su capacidad para responder a la infección, lo que se refleja en la diferencia en la carga de patógenos observada entre las dos líneas. Este estudio es un seguimiento del experimento realizado por Kjaerup et al. [18] que caracterizó la respuesta inmune celular y humoral de las dos líneas de pollo, L10H y L10L, divergentemente seleccionadas para concentraciones séricas de MBL tras la infección por IBV. En total, 96 aves fueron utilizadas en el estudio experimental provenientes de las dos Las 96 aves fueron criadas juntas en un ambiente bioseguro libre de IBV hasta que tenían 3 semanas de edad y luego asignadas a dos grupos diferentes con 24 aves de cada línea en cada grupo (no infectadas e infectadas). Las aves fueron transferidas a una instalación de nivel de bioseguridad 2 y colocadas en aisladores. Dos aisladores contenían pollos no infectados y dos aisladores contenían pollos infectados. Cada aislador tenía una mezcla igual de las dos líneas descritas por Kjaerup et al. [18]. La cepa virulenta IBV-M41 se utilizó para la infección (un regalo amable del Dr. med. vet. Hans C. Philipp en la Lohmann Animal Health GmbH, Cuxhaven, Alemania). La inócula IBV fue preparada en solución salina fosfatada (PBS) inmediatamente antes de su uso y contenía 2 × 10,2 EID 50 /200 μl de virus IBV-M41. El primer y el segundo grupo (los grupos no infectados) fueron infectados con 200 μl de PBS por ave. El tercero y el cuarto grupo (los grupos infectados) recibieron 200 μl de IBV-M41. La inócula fue administrada medio nasal y medio por vía oral para imitar las vías naturales de infección del IBV en el pollo. Los pollos fueron alimentados con dietas que cumplían o superaban los requisitos del Consejo Nacional de Investigación. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Las aves fueron monitoreadas diariamente para detectar signos clínicos de enfermedad y los parámetros de enfermedad fueron medidos según lo reportado por Kjaerup et al. [18]. El estudio se realizó bajo estricta aprobación ética y monitoreo (ver la declaración al final de la sección Materiales y Métodos). Para este estudio se recolectaron 64 muestras de bazo y se utilizaron para la secuenciación del ARN. Las aves fueron sacrificadas 1 y 3 semanas después de la infección por dislocación cervical y se recolectaron muestras de bazo. En ambos momentos, se recolectaron ocho muestras de las dos líneas, L10H y L10L, de cada grupo (no infectadas e infectadas) como se ilustra en la Fig. 1. Después de la recolección, los bazos fueron seccionados (rebanda transversal triangular de la parte superior) y muestras idénticas de cada pollo fueron inmediatamente colocadas en la Solución de Estabilización RNAlater® (Ambion Inc., Austin, Texas) que fueron incubadas a 4°C durante la noche y luego transferidas a -20°C el día siguiente. Las muestras de tejido fueron homo El ARN total se extrajo con el kit Qiagen RNAeasy (Catalog ID 74104, Qiagen, Venlo, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad de las 64 muestras de ARN total se verificó utilizando un dispositivo de cinta adhesiva ARN de 2200 TapeStation (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.) y la concentración se determinó utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (Nano-Drop, Wilmington, DE). Las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de muestras de Ilumina TruseqRNA (Catalog ID FC-122-1001, Ilumina, San Diego, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se evaluaron con la Estación Agilent Tape 2200. Las bibliotecas fueron cuantificadas por Picogreen y luego normalizadas a 10 nM Las cantidades equimolares de cada biblioteca se mezclaron antes de la desnaturalización de NaOH. El kit de clúster de Ilumina Truseq PE v3 (Catalog ID PE-401-3001) se utilizó para generar clústeres en la célula de Ilumina Flowcell injertada y las bibliotecas hibridadas se secuenciaron en seis líneas de una célula de Flowcell en el Hiseq2000 con 100 ciclos de un módulo de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de Truseq SBS v3 (Catalog ID FC-401-3001). Control de calidad, mapeo de secuencias de ARN lee y recuento mapeo lee La calidad de control inicial fue evaluada por el software FastQC versión 0,11.3 [52]. Las lecturas en bruto fueron recortadas para bases de baja calidad utilizando la herramienta Trimmomatic versión 0.32 [ Las lecturas recortadas fueron cartografiadas al genoma de referencia de Gallus gallus (Gallus_gallus-4.0, versión 80 [54] ) utilizando un alineador empalmado TopHat2 versión 2.014 [55]. La anotación del gen Gallus gallus utilizada para el mapeo fue recuperada de la base de datos Ensembl versión 80 (www.ensembl.org ). La calidad del mapeo fue evaluada utilizando un conjunto de scripts Python dentro del conjunto de herramientas RSeQC [56]. La evaluación del control de calidad incluyó la inspección de la cobertura de lectura sobre todo el cuerpo genético para evaluar si la cobertura de lectura era uniforme y si había algún sesgo de 5' o 3', así como cómo las lecturas cartografiadas fueron distribuidas sobre las características del genoma. El HTSEq-count es un script Python dentro del marco HTSEq, versión 0.7.1, que es un kit de herramientas de código abierto que permite la entrada de los recuentos brutos de lecturas alineadas para ser anotados con nombres genéticos basados en características genómicas [57]. Los recuentos de lectura obtenidos se utilizaron para estimar la expresión génica e identificar genes expresados diferencialmente (DE). Esto se logró utilizando la versión 3.10.0 del paquete Bioconductor edgeR [58] y la versión 3.24.5 [59], siguiendo un protocolo descrito anteriormente [24]. Antes de realizar análisis estadísticos, los genes con bajos niveles de expresión se filtraron utilizando un umbral de al menos una lectura por millón en n de las muestras, donde n es el tamaño del grupo más pequeño de réplicas, que en este caso era ocho. Para tener en cuenta los efectos técnicos y biológicos, los recuentos se normal Esta función normaliza los datos encontrando un conjunto de factores de escalado para los tamaños de las bibliotecas que minimizan los cambios de log-fold entre las muestras. Los factores de escala fueron calculados utilizando la media recortada de valores M (TMM) entre las muestras [58]. Se calcularon estimaciones de dispersión comunes y etiquetadas con el método de probabilidad ajustado del perfil Cox-Reid con el fin de corregir la variación técnica y biológica al instalar el modelo binomio negativo multivariado [60]. El escalado multidimensional (MDS) se implementó en el paquete edgeR, para evaluar visualmente la similitud de las muestras. El gráfico MDS fue creado para visualizar la relación entre las muestras e identificar posibles valores atípicos [58]. El MDS se basa en comparar la relación entre todos los pares de muestras mediante la aplicación de una medida de distancia pareja específica [58]. La matriz fue construida para adaptarse al modelo saturado donde cada combinación de tratamiento fue considerada separadamente. Ocho combinaciones de tratamiento fueron consideradas como ilustradas en la Fig. 1 : aves no infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10H en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3. Una prueba de la relación de probabilidad del modelo lineal generalizado, especificando la diferencia de interés, fue utilizada para probar la expresión diferencial entre estas combinaciones de tratamiento. El análisis de expresión diferencial se realizó comparando las diferencias de log-fold en los recuentos genéticos entre dos líneas (L10H y L10L) en diferentes puntos de tiempo (semanas 1 y 3) y para diferentes estados (no infectados e infectados) por separado (Fig. 1 ). Las tasas de falso descubrimiento de Benjamini Hochberg (FDR) para un experimento con transcriptoma en todo el área fueron calculadas para corregir para pruebas múltiples [61]. Todos los genes con un valor p ajustado en FDR <0,05 fueron considerados genes de interés individuales y fueron retenidos para un análisis posterior. El análisis funcional de los genes DE se realizó utilizando la versión Citoscape 3.2.1 [62, 63] con la versión ClueGo 2.1.7 plug-in [64] para enriquecer la anotación y enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente (DE) para cuatro comparaciones (C1- ClueGO determina la distribución de los genes diana a través de los términos y vías de GO (ontología genética): este estudio se centró en: el valor p se calculó utilizando pruebas hipergeométricas del lado derecho y el ajuste de Benjamini-Hochberg se utilizó para la corrección de múltiples pruebas; un valor p ajustado de 0,001 indicó una desviación estadísticamente significativa de la distribución esperada, y que los términos y vías de GO correspondientes se enriquecieron para los genes diana; la fuerza de asociación entre los términos se calculó utilizando una estadística de kappa corregida de 0,4; la red creada representó los términos como nodos que estaban vinculados en base a un nivel de puntuación de 0,4 kappa; el tamaño de los nodos reflejó la significancia de enriquecimiento de los términos; la red se estableció automáticamente mediante el algoritmo de diseño orgánico apoyado por Cytoscape; los grupos funcionales fueron creados mediante la fusión iterativa de grupos inicialmente definidos Sólo los grupos funcionales representados por su término más significativo fueron visualizados en la red proporcionando una visión perspicaz de sus interrelaciones [64]. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Inspección Danesa de Experimentos Animales y cumplieron con la Ley No 382 del Ministerio de Justicia de Dinamarca (10 de junio de 1987) y las Leyes 739 (6 de diciembre de 1988) y 333 (19 de mayo de 1990) sobre experimentación y cuidado de animales experimentales. La licencia para realizar el experimento animal fue obtenida por Helle R. Juul-Madsen. comparación entre aves no infectadas en la semana 1. Los términos del Sistema Inmune GO fueron identificados como nodos y vinculados basados en su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Grupos relacionados funcionalmente parcialmente superpuestos. Los términos GO están etiquetados en colores de acuerdo con la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos Las tablas circulares de color de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 60 kb)Archivo adicional 17: Figura S4. Representación en red de los términos enriquecidos del sistema inmunológico GO de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves no infectadas en la semana 3. Los términos del sistema inmunológico GO se identificaron como nodos y se vincularon en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Los grupos relacionados funcionalmente parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores según la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos circulares de color de los nodos del sistema inmunológico GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 55 kb) Fichero adicional 18: Figura S5. Representación en red Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y enlazados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y valor p < 0.001. Los grupos funcionalmente relacionados parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores de acuerdo a la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos de color de los nodos GO Immune System muestran la proporción de genes asociados con el término respectivo. (PDF 70 kb) Archivo adicional 19: Figura S6. Representación en red de los términos enriquecidos GO Immune System de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves infectadas en la semana 3. Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y vinculados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y p-valor < 0.001. Los grupos funcionalmente Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Las tablas de colores de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción de genes asociada con el término respectivo. (PDF 30 kb)
question: ¿Qué causa la bronquitis infecciosa aviar?
answers.text: virus de la bronquitis infecciosa (VII)