context: Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
question: ¿Cuál es el porcentaje de transmisión del VIH-1 de madre a hijo cuando no hay intervención?
answers.text: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45%