context: Dinámica viral acelerada en las líneas celulares de murciélagos, con implicaciones para la emergencia zoonóticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7064339/SHA: f2cc0d63ff2c4aaa127c4caae21d8f3a0067e3d5Autores: Brook, Cara E; Boots, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeFecha: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Licencia: cc-byAbstract: Bats host virulent zoo Se necesita una comprensión mecánica del impacto de las capacidades de alojamiento del virus de los murciélagos, incluyendo vías inmunológicas exclusivamente constitutivas, en la dinámica viral a escala celular para dilucidar la emergencia zoonótica. Realizamos ensayos de infectividad del virus en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos inmunes inducidos y constitutivos, y luego desarrollamos un modelo teórico de nuestro sistema in vitro, que encajamos con los datos empíricos. Los modelos más adecuados recapitularon los fenotipos inmunes esperados para líneas celulares representativas, apoyando defensas antivirales robustas en células de murciélagos que se correlacionaron con estimaciones más altas para las tasas de propagación viral dentro del huésped. En general, las respuestas inmunológicas aumentadas limitan la morbilidad celular inducida por patógenos, lo que puede facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de rápida propagación dentro del huésped. Texto: Los murciélagos han recibido mucha atención en los últimos años por su papel como anfitriones de reservorios de zoonosis virales emergentes, incluyendo la rabia y los lissavirus relacionados, Hendra y Nipah henipavirus, Ebola y Marburg filovirus, y el coronavirus SARS (Calisher et al., 2006; Wang y Anderson, 2019). En la mayoría de los mamíferos no quirópteros, henipavirus, filovirus y coronavirus inducen morbilidad y mortalidad sustancial, muestran corta duración de la infección, y provocan inmunidad robusta y a largo plazo en los huéspedes que sobreviven infección (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty y Bray, 2004). Los murciélagos, por el contrario, no demuestran síntomas obvios de enfermedad al infectarse con patógenos altamente virulentos en mamíferos no volátiles (Schountz et al., 2017), pero pueden, en cambio, apoyar virus como infecciones persistentes a largo plazo, en lugar de patologías transitorias e inmunizantes (Plowright et al., 2016). Los avances recientes de las investigaciones están comenzando a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares por los cuales los murciélagos evitan la patología de estos patógenos de otro modo virulentos (Brook y Dobson, 2015). Los murciélagos aprovechan un conjunto de mecanismos específicos de la especie para limitar la carga viral, que incluyen las incompatibilidades de la secuencia del receptor del huésped para algunas combinaciones de virus del murciélago (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) y la expresión constitutiva de la citocina antivir Típicamente, la presencia de ARN viral o ADN en el citoplasma de células de mamíferos inducirá la secreción de proteínas de interferón tipo I (IFN-a e IFN-b), que promueven la expresión y traducción de genes estimulados por interferón (ISGs) en células vecinas y las hacen efectivamente antivirales (Stetson y Medzhitov, 2006). En algunas células de murciélago, los planos transcripcionómicos para esta respuesta de IFN se expresan constitutivamente, incluso en ausencia de estimulación por ARN viral o ADN (Zhou et al., 2016). En los mamíferos no voladores, la expresión constitutiva de IFN probablemente provocaría inflamación generalizada e inmunopatología concomitante sobre la infección viral, pero los murciélagos apoyan adaptaciones únicas para combatir la inflamación (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) que pueden haber evolucionado para mitigar el daño metabólico inducido durante el vuelo (Kacprzyk et al., 2017). La medida en que la expresión constitutiva de IFN-a significa defensa antiviral constitutiva en forma de proteína funcional IFN-a permanece sin resolver. En las células de murciélago que expresan constitutivamente IFN-a, algunos ISGs estimulados por proteínas, aguas abajo parecen ser también expresados constitutivamente, pero la inducción ISG adicional es posible después de desafío viral y estimulación de IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). A pesar de los recientes avances en la comprensión molecular de la tolerancia viral del murciélago, las consecuencias de esta inmunidad única del murciélago en la dinámica del virus dentro del huésped-y sus implicaciones para la comprensión de la emergencia zoonótica-todavía no han sido aclaradas. El campo de 'dinámica del virus' fue desarrollado por primera vez para describir los fundamentos mecánicos de los patrones a largo plazo de la carga viral en estado estacionario exhibida por los pacientes en infecciones de fase crónica con VIH, que parecían producir y virus claro a tasas equivalentes (Nowak y May, 2000; Ho et al., Los modelos de agotamiento celular objetivo simple, en los que la carga viral es dictada por un digestivo de eLife inferior Los murciélagos pueden transportar virus que son mortales a otros mamíferos sin mostrar síntomas graves. De hecho, los murciélagos son reservorios naturales para virus que tienen algunas de las tasas de mortalidad más altas de cualquier virus que la gente adquiere de animales salvajes -incluyendo la rabia, el ébola y el coronavirus SARS. Los murciélagos tienen un conjunto de defensas antivirales que mantienen la cantidad de virus en control. Por ejemplo, algunos murciélagos tienen una respuesta inmune antiviral llamada vía del interferón perpetuamente encendido. En la mayoría de otros mamíferos, tener una respuesta inmune hipervigilante causaría inflamación dañina. Los murciélagos, sin embargo, han adaptado los rasgos antiinflamatorios que los protegen de tales daños, incluyen la pérdida de ciertos genes que normalmente promueven la inflamación. Sin embargo, nadie ha explorado previamente cómo estas defensas Los experimentos hicieron uso de células de una especie de murciélago - el zorro volador negro - en el que la vía del interferón está siempre encendido, y otro - el murciélago de la fruta egipcia - en el que esta vía sólo se activa durante una infección. Las células del murciélago se infectaron con tres virus diferentes, y luego Brook et al. observaron cómo la vía del interferón ayudó a mantener las infecciones en control, antes de crear un modelo informático de esta respuesta. Los experimentos y el modelo ayudaron a revelar que las defensas de los murciélagos pueden tener una desventaja potencial para otros animales, incluyendo humanos. En ambas especies del murciélago, las respuestas antivirales más fuertes fueron contrarrestadas por el virus que se propaga más rápidamente de la célula a la célula. Esto sugiere que las defensas inmunes del murciélago pueden impulsar la evolución de virus de transmisión más rápida, y mientras que los murciélagos están bien protegidos de los efectos nocivos de sus propios virus prolíficos, otras criaturas como los Los hallazgos pueden ayudar a explicar por qué los murciélagos son a menudo la fuente de virus que son mortales en los seres humanos. Aprender más acerca de las defensas antivirales de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus puede ayudar a los científicos a desarrollar mejores maneras de predecir, prevenir o limitar la propagación de virus de los murciélagos a los seres humanos. Se necesitan más estudios en los murciélagos para ayudar a estos esfuerzos. Mientras tanto, los experimentos destacan la importancia de advertir a las personas para evitar el contacto directo con murciélagos salvajes. aumentar el suministro de recursos de células de huésped susceptibles de infección, se desarrollaron por primera vez para el VIH (Perelson, 2002), pero desde entonces se han aplicado a otras infecciones crónicas, incluyendo el virus de hepatitis-C (Neumann et al., 1998), virus de hepatitis-B (Nowak et al., 1996) y citomegalovirus (Emery et al., 1999 En trabajos recientes se han adoptado técnicas similares para modelar la dinámica interna de las infecciones agudas, como la gripe A y el sarampión, que inspiran el debate sobre la medida en que el modelado explícito del control inmunológico descendente puede mejorar la inferencia más allá de las hipótesis básicas de limitación de recursos del modelo celular objetivo (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Para investigar el impacto de procesos inmunes únicos de murciélagos en la cinética viral in vitro, primero realizamos una serie de experimentos de infección viral en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos de interferón divergentes, y luego desarrollamos un modelo teórico que aclara la dinámica de la propagación viral dentro del huésped. Evaluamos nuestro modelo teórico analíticamente independiente de los datos, luego ajustamos el modelo a los datos recuperados de los ensayos experimentales in vitro con el fin de estimar las tasas de transmisión del virus dentro del huésped y la progresión celular al estado antiviral bajo diversos supuestos de inmunidad ausente, inducida y constitutiva. Finalmente, confirmamos nuestros hallazgos en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de series temporales ajustadas de nuestro modelo medio de campo. Hipotemamos que los procesos inmunes descendentes rebaten la limitación de recursos clásicos en líneas de células de murciélago descritas como antivirales constitutivas en la literatura, ofreciendo una predicción testable para modelos que se ajusten a los datos empíricos. Predecimos además que las respuestas antivirales más robustas estarían asociadas con las tasas de propagación de virus más rápidas dentro del huésped, pero también protegen a las células contra la mortalidad inducida por virus para apoyar las infecciones de larga duración en el cultivo de tejidos. Primero exploramos la influencia del fenotipo inmune innato en la propagación viral dentro del huésped en una serie de experimentos de infección en cultivo celular. Se realizaron ensayos de placa en monocapas de placa de seis pozos de tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizadas: [1] células Vero (mono verde africano), que son defectuosas de IFN y, por lo tanto, limitadas en capacidad antiviral (Desmyter et al., 1968) ; [2] células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) que demuestran respuestas idiosincráticas inducidas por interferón sobre el desafío viral (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018) ; y [3] células PaKiT01 (Pteropus alecto) que expresan constitutivamente IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Para intensificar las diferencias celulares específicas en la inmunidad constitutiva, realizamos ensayos de infectividad con la estomatitis vesicular rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV, previamente descritos (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Dos de estos virus, rVSV-EBOV y rVSV-MARV, son recombinantes cuya entrada celular está mediada por la glucoproteína de los filovirus de murciélago, Ébola (EBOV) y Marburg (MARV), lo que nos permite modular el grado de defensa estructural, así como inmunológica, antiviral en juego en cada infección. El trabajo anterior en este laboratorio ha demostrado incompatibilidades en el receptor de filovirus NPC1 que hacen a las células PaKiT01 refractarias a la infección con rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos), haciéndolos estructuralmente antivirales, más allá de su expresión constitutiva de IFN-a. Las tres líneas celulares fueron desafiadas con los tres virus en dos multiplicidades de infección (MOI): 0,001 y 0,0001. Entre 18 y 39 ensayos se realizaron en cada combinación celular-virus-MOI, excepto infecciones por rVSV-MARV en las células PaKiT01 en MOI = 0,001, para las cuales sólo se realizaron ocho ensayos (ver Materiales y métodos; Figura 1 -figura suplementos 1-3, archivo suplementario 1). Debido a que los ensayos de placa restringen la transmisión viral de vecinos a vecinos en el espacio celular bidimensional (Howat et al., 2006), pudimos rastrear la propagación de células infectadas por virus que expresan GFP a través de monocapas de tejido a través de microscopía de fluorescencia invertida. Para cada ensayo de infección, monitoreamos y reimaginamos placas hasta 200 horas de observación o hasta la destrucción total de monocapas, procesamos imágenes resultantes, y generamos una serie de tiempo de la proporción de espacio de placa ocupada por células infecciosas a lo largo de la duración de cada ensayo (ver Materiales y métodos). Utilizamos modelos aditivos generalizados para inferir el curso temporal de todos los cultivos celulares replicados y construir el conjunto de datos multi-trial al que finalmente encajamos nuestro modelo de transmisión mecanística para cada combinación específica de línea celular-virus (Figura 1; Figura 1 -figura 1 - Los tres virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV-G, rVSV-EBOV y rVSV-MARV) infectaron Vero, RoNi/7.1, y cultivos tisulares PaKiT01 en ambos MOIs focales. Después de la invasión, el virus se diseminó rápidamente a través de la mayoría de las monocapas celulares, resultando en una extinción epidémica inducida por el virus. Las epidemias fueron menos graves en los cultivos de células de murciélago, especialmente cuando se infectaron con los filovirus recombinantes, rVSV-EBOV y rVSV-MARV. La destrucción de monocapas se evitó en el caso de infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células de PaKiT01: en las primeras, la infección viral persistente se mantuvo a lo largo de Asumimos que este patrón era el resultado de la extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario (Figura 1). Los patrones del MOI = 0,001 fueron ampliamente recapitulados en el MOI = 0,0001, aunque con proporciones totales algo reducidas (Figura 1-figura suplemento 5). Un modelo teórico adecuado a los datos in vitro recapitula los fenotipos inmunes esperados para las células de murciélagos A continuación, desarrollamos un modelo dentro del huésped para adaptarse a estos datos para dilucidar los efectos de la inmunidad inducida y constitutiva sobre la dinámica de propagación viral en el tejido huésped (Figura 1 ). El sistema compartimental dentro del huésped imitaba nuestra monocapa de cultivo celular bidimensional, con células que ocupaban cinco estados de infección distintos: susceptibles (S), antivirales (A), expuestos (E), infecciosos (I) y muertos (D). Modelamos las células expuestas como infectadas pero aún no infecciosas, capturando la "fase eclipsa" de la integración viral en una célula huésped que precede a la replicación viral. Las células antivirales eran inmunes a la infección viral, de acuerdo con el "estado antiviral" inducido por la estimulación del interferón de los ISG en los tejidos adyacentes a la infección (Stetson y Medzhitov, 2006). Debido a que nuestro objetivo era traducir los datos disponibles en procesos modelados, no modelamos explícitamente la dinámica del interferón, sino que escalamos la tasa de progresión celular de las células sensibles a los antivirales (r) por la proporción de células expuestas (globalmente) en el sistema. En sistemas que permiten la inmunidad constitutiva, una segunda tasa de adquisición celular del estado antiviral (") adicionalmente escalada con la proporción global de células sensibles en el modelo. En comparación con el virus, las partículas IFN son pequeñas y altamente difusivas, justificando esta suposición de señalización global en la extensión espacial limitada de una placa de seis pozos y manteniendo la coherencia con las aproximaciones de modelado previas de la señalización IFN en el ensayo de placa (Howat et al., 2006). Para representar mejor nuestro sistema de monocapa empírica, expresamos nuestras variables de estado como proporciones (P S, P A, P E, P I, y P D ), bajo supuestos de transmisión dependiente de la frecuencia en una población bien mezclada (Keeling y Rohani, 2008), aunque note que la inclusión de P D (representando la proporción de espacio muerto en el tejido modelado) tuvo el efecto funcional de variar la transmisión con densidad celular infecciosa. Esto resultó en el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias:Definimos la 'inmunidad inducida' como completa, modelando todas las células como susceptibles a la invasión viral en equilibrio libre de enfermedad, con defensas inducidas después de la exposición viral a través del término r. Por el contrario, permitimos que el grado de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros de " > 0, definiendo un sistema 'constitutivo' como aquel que contiene cualquier célula antiviral en equilibrio libre de enfermedad. Al ajustar este modelo a los datos de cultivo de tejidos, estimamos independientemente tanto r como "; así como la tasa de transmisión de células a células, b, para cada combinación de células y virus. Dado que la medida en que IFN-a se expresa constitutivamente se traduce constitutivamente en proteína funcional todavía no se conoce para los anfitriones de murciélagos (Zhou et al., 2016), este enfoque permitió que nuestros datos de cultivo de tejidos para impulsar la inferencia de modelado: incluso en las líneas celulares PaKiT01 conocidas por expresar constitutivamente IFN-a, la verdadera extensión constitutiva del sistema (es decir, la cantidad de células antivirales presentes en el equilibrio libre de enfermedad) se permitió variar a través de la estimación de ": Para los fines de ajuste del modelo, fijamos el valor de c, la tasa de retorno de las células antivirales a estado susceptible, en 0. La pequeña escala espacial y el corto curso de tiempo (máximo 200 horas) de nuestros experimentos probablemente prohibieron cualquier retorno de las células antivirales al estado susceptible en nuestro sistema empírico; sin embargo, conservamos el término c en las evaluaciones analíticas de nuestro modelo porque la regresión del estado antiviral al estado susceptible es posible durante largos periodos de tiempo in vitro y a la escala de un organismo completo (Radke et al., 1974; Rasmussen y Farley, 1975; Samuel y Knutson, 1982). Antes de adaptarnos a la serie de tiempo empírico, realizamos análisis de bifurcación de nuestro modelo teórico y generamos hipótesis probables sobre la base de resultados de modelos. De nuestro sistema de modelo interno (Ecuación 1-5), derivamos la siguiente expresión para R 0, el número de reproducción básica de patógenos (Fichero complementario 2):Los patógenos pueden invadir un cultivo de tejido Las tasas rápidas de adquisición antiviral constitutiva (") impulsarán R 0 <1: los cultivos tisulares con inmunidad antiviral altamente constitutiva serán por lo tanto resistentes a la invasión del virus desde el principio. Dado que, por definición, la inmunidad inducida se estimula después de la invasión inicial del virus, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) no se incorpora a la ecuación para R 0; mientras que los procesos inmunes inducidos pueden controlar el virus después de la invasión inicial, no pueden evitar que ocurra a partir de. En casos de inmunidad totalmente inducida o ausente (" 1⁄4 0), la ecuación R 0 se reduce así a una forma típica del modelo SEIR clásico:En equilibrio, el modelo de campo teórico, medio demuestra uno de los tres estados de infección: equilibrio endémico, ciclos límite estables, o ninguna infección (Figura 2). Respectivamente, estos estados se aproximan a la infección persistente, la extinción epidémica inducida por virus y los fenotipos de extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario previamente observados en experimentos de cultivo de tejidos (Figura 1 ). Teóricamente, el equilibrio endémico se mantiene cuando se generan nuevas infecciones al mismo ritmo que se pierden las infecciones, mientras que los ciclos límite representan un espacio paramétrico bajo el cual las poblaciones infecciosas y susceptibles están bloqueadas en oscilaciones predecibles. Equilibrios endémicos resultantes de la regeneración celular (es decir, nacimientos) se han descrito in vivo para el VIH (Coffin, 1995) e in vitro para los ensayos de placas de herpesvirus (Howat et al., 2006), pero debido a que se aproximan tan estrechamente a cero, los verdaderos ciclos límite probablemente sólo ocurren teóricamente, en lugar de producir extinciones estocásticas en series El análisis de bifurcación de nuestro modelo medio de campo reveló que las regiones de ninguna infección (extinción de patógenos) estaban limitadas a valores de umbral más bajo (punto Branch) para b, por debajo de los cuales el patógeno no pudo invadir. No encontramos ningún umbral superior a invasión para b bajo ninguna circunstancia (es decir, b lo suficientemente alto como para impulsar la extinción inducida por patógenos), pero los valores altos de b resultaron en bifurcaciones Hopf, que delinean regiones de espacio paramétrico caracterizadas por ciclos límite. Puesto que los ciclos límite se aproximan tan estrechamente a cero, los bs altos recuperados en este rango probablemente producirían extinciones epidémicas inducidas por virus en condiciones experimentales. Consistente con nuestra derivación para R 0, encontramos que el umbral de punto de Rama para invasión viral fue independiente de cambios en el parámetro inmune inducido (r) pero saturado en valores altos de " que caracterizan la inmunidad altamente constitutiva (Figura 3). A continuación, encajamos nuestro modelo teórico por mínimos cuadrados a cada combinación de línea celular-virus, bajo ausente, inducido, y constitutivo suposiciones de inmunidad. En general, los modelos mejor adaptados recapitularon resultados esperados basados en el fenotipo inmune de la línea celular en cuestión, como se describe en la literatura general (Tabla 1 Irónicamente, el modelo inmune inducido ofreció un ajuste ligeramente mejor que el constitutivo a las infecciones por rVSV-MARV en la línea celular PaKiT01 (la combinación de línea celular-virus para la que conocemos una incompatibilidad constitutiva antiviral de receptor de células para estar en juego). Debido a que los supuestos constitutivos inmunes pueden prohibir la invasión de patógenos (R 0 < 1), el modelo se ajusta a esta serie temporal bajo supuestos constitutivos se vieron impedidos por sobreestimación de ", que prohibió la invasión de patógenos. Sólo mediante la incorporación de una tasa extremadamente rápida de adquisición antiviral inducida podría el modelo garantizar que la infección inicial se permitiría y luego se controlaría rápidamente. En todas las parcelas del panel (A) la tasa de adquisición inmune antiviral inducida (r) se fijó en 0.01. El panel (B) representa la dinámica bajo inmunidad invariablemente inducida, que va desde ausente (izquierda: r=0) hasta alta (derecha: r=1). En todas las parcelas del panel (B) la tasa de adquisición antiviral constitutiva (") se fijó en 0.0001 Las curvas de puntos de rama se representan como líneas sólidas y curvas Hopf como líneas rayadas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclos límite y el espacio negro no indica infección (extinción).Otros valores de parámetro para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo complementario 3. Al ajustar nuestro modelo teórico a los datos in vitro, estimamos la tasa de transmisión del virus dentro del huésped (b) y la tasa(s) de adquisición celular al estado antiviral (r o r + ") (cuadro 1 ; archivo suplementario 4). Bajo supuestos inmunes ausentes, r y " se fijaron en 0 mientras que b se estimó; bajo supuestos inmunológicos inducidos " se fijó en 0 mientras que r y b se estimaron; y bajo hipótesis inmunológicas constitutivas, los tres parámetros Las estimaciones de parámetros de mejor ajuste para los datos de MOI=0,001 se visualizan en conjunción con br y b -" bifurcaciones en (r) y (B) la tasa de inmunidad constitutiva de adquisición antiviral ("). Los paneles muestran variación en el grado de inmunidad, de ausente (izquierda) a alto (derecha). Las curvas de punto de rama se representan como líneas sólidas y las curvas de Hopf como líneas discontinuas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclo límite y el espacio negro no indica infección (extinción). Otros valores de parámetros para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo suplementario 3. A diferencia de las células Vero, el modelo de inmunidad inducida ofrecía el mejor ajuste a todos los datos de RoNi/7.1, consistentes con los patrones reportados en la literatura y nuestra propia validación por qPCR (Tabla 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Al igual que en los ensayos con células Vero, estimamos los valores b más altos para las infecciones por rVSV-G en las líneas celulares de RoNi/7.1 pero aquí recuperamos estimaciones b más altas para rVSV-MARV que para rVSV-EBOV. Esta inversión se equilibró con una tasa estimada más alta de adquisición a estado antiviral (r) para rVSV-EBOV frente a rVSV-MARV. En general, observamos que las tasas más rápidas de adquisición antiviral (ya sea inducida, r, constitutiva, ", o ambas) se correlacionaban con mayores tasas de transmisión (b). Al compensarse por r, los valores estimados para las infecciones por RoNi/7.1 mantuvieron la misma amplitud que los estimados para las líneas celulares de Vero inmune-ausente pero causaron epidemias más suaves y reducción de la mortalidad celular (Figura 1). Las estimaciones de parámetros de RoNi/7.1 localizadas en la región correspondientes al equilibrio endémico para el modelo determinista teórico (Figura 4), produciendo epidemias menos agudas que sin embargo se extinguieron en experimentos estocásticos. Finalmente, los ensayos de rVSV-G y rVSV-EBOV en células PaKiT01 se ajustaron mejor por modelos que asumen inmunidad constitutiva, mientras que las infecciones por rVSV-MARV en PaKiT01 se emparejaron equivalentemente con modelos que asumen inmunidad inducida o constitutiva-con modelos inducidos favorecidos sobre constitutivos en comparaciones AIC porque se estimó un parámetro menos (figura 1-figura suplementos 4-5; archivo suplementario 4). Para todas las infecciones por virus, las líneas celulares de PaKiT01 produjeron b estima un orden completo de magnitud superior a Vero o RoNi/7.1 células, con cada b equilibrado por una respuesta inmune (ya sea r, o r combinado con ") también un orden de magnitud superior al recuperado para las otras líneas celulares (figura 4 ; tabla 1 ). Al igual que en células RoNi/7.1, el parámetro PaKi Debido a que los procesos inmunes constitutivos pueden realmente prohibir la invasión inicial de patógenos, la inmunidad constitutiva se ajusta a las infecciones por rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01 constantemente localizadas en o por debajo del umbral del punto de Rama para la invasión del virus (R 0 1⁄4 1). Durante el ajuste del modelo para la optimización de ", cualquier prueba de parámetros de " valores que producen R 0 < 1 no dio lugar a ninguna infección y, en consecuencia, produjo un ajuste extremadamente deficiente a los datos de las series temporales infecciosas. En todos los modelos, asumiendo inmunidad constitutiva, en todas las líneas celulares, las contribuciones antivirales de " virus prohibidos de invadir en absoluto. Con el fin de comparar las contribuciones relativas de los diferentes procesos inmunes de cada línea celular a la dinámica epidémica, a continuación utilizamos nuestras estimaciones de parámetros de campo promedio para calcular la 'tasa antiviral' inicial de acumulación de células antivirales tras la invasión del virus para cada combinación de células-virus-MOI basado en la siguiente ecuación:donde P E se calculó a partir de la dosis infecciosa inicial (MOI) de cada experimento de infección y P S se estimó en equilibrio libre de enfermedad:Porque y "ambos contribuyen a esta tasa antiviral inicial, las hipótesis inmunológicas inducidas y constitutivas son capaces de producir tasas igualmente rápidas, dependiendo de los ajustes de parámetros. De hecho, bajo supuestos inmunes totalmente inducidos, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) estimada para la infección por rVSV-MARV en las células PaKiT01 fue tan alta que la tasa antiviral En realidad, sabemos que las incompatibilidades con los receptores NPC1 hacen que las líneas celulares PaKiT01 constitutivamente sean refractarias a la infección por rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos) y que las células PaKiT01 también expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a. Los resultados de ajuste del modelo sugieren que esta expresión constitutiva de IFN-a puede actuar más como una respuesta inmune rápidamente inducible tras la invasión del virus que como una secreción constitutiva de la proteína funcional IFN-a. Sin embargo, como hipotetizado, las líneas celulares PaKiT01 fueron con mucho la más antiviral de cualquiera en nuestro estudio-con tasas antivirales iniciales estimadas en varios órdenes de magnitud superiores a cualquier otro en nuestro estudio, bajo supuestos inducidos o constitutivos (Tabla 1 ; Ficha complementaria 4). Las células RoNi/7.1 mostraron la segunda firma de inmunidad más pronunciada, seguida de las células Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue esencialmente cero incluso bajo supuestos forzados de inmunidad inducida o constitutiva (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Utilizando parámetros ajustados para b y ", calculamos adicionalmente R 0, el número de reproducción básico para el virus, para cada combinación de línea celular-virus-MOI (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Encontramos que R 0 fue esencialmente sin cambios en diferentes supuestos inmunes para las células RoNi/7.1 y Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue baja. En el caso de las células PaKiT01, una alta tasa inicial de antiviral bajo inmunidad inducida o constitutiva resultó en una estimación correspondientemente alta de b (y, por consiguiente, R 0 ) que aún produjo la misma curva epidémica que resultó de las estimaciones mucho más bajas para b y R 0 emparejadas con inmunidad ausente. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes antivirales protegen los tejidos huésped contra la mortalidad celular inducida por virus y pueden facilitar el establecimiento de tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped. La destrucción total de monocapas se produjo en todas las combinaciones de virus celulares excepto infecciones por rVSV-EBOV en células RoNi/7.1 e infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en células PaKiT01. La destrucción de monocapas correspondió al agotamiento celular sensible y al recambio epidémico donde R efectivo (el producto de R 0 y Para las infecciones por rVSV-EBOV en las células antivirales inducidas RoNi/7.1, las células vivas remanentes salvaguardadas, que dieron a luz nuevas células sensibles tardíamente en la serie temporal. En las infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células PaKiT01, esta protección antiviral detuvo la epidemia (Figura 5 ; R-efectiva <1) antes de que los susceptibles declinaran completamente. En el caso de las infecciones por rVSV-EBOV en las células PaKiT01, el nacimiento de nuevos susceptibles a partir de células vivas remanentes protegidas por el estado antiviral mantuvo la transmisión tardía para facilitar la persistencia de la epidemia a largo plazo. Es importante destacar que bajo los valores de parámetros fijos para la tasa de incubación de la infección (s) y la tasa de mortalidad inducida por la infección (a), los modelos no pudieron reproducir las series de tiempo infeccioso a más largo plazo captadas en los datos de infecciones por rVSV-EBOV en las líneas celulares de PaKiT01 sin incorporación de nacimientos celulares, suposición adoptada en representaciones de modelos anteriores de la dinámica viral mediada por IFN en el cultivo de tejidos (Howat et al., 2006). En nuestros experimentos, observamos que la reproducción celular se llevó a cabo como ensayos de placa alcanzó confluencia. Finalmente, debido a que el efecto protector de las células antivirales es más claramente observable espacialmente, confirmamos nuestros resultados simulando series de tiempo ajustadas en una reconstrucción estocástica espacialmente explícita de nuestro modelo de campo medio. En las simulaciones espaciales, las tasas de adquisición antiviral se fijaron en valores ajustados para r y " derivados de las estimaciones medias de campo, mientras que las tasas de transmisión (b) se fijaron en valores diez veces superiores a los estimados en condiciones medias de campo, teniendo en cuenta la intensificación de los umbrales de parámetros que permitían la invasión de patógenos en las interacciones espaciales locales (véanse Materiales y métodos; Videos 1-3; Suplemento 3 de la figura 5; Fichero complementario 5; Webb y otros, 2007). En series temporales inmunitarias, las células antivirales espaciales actuaron como "refugios" que protegían a las células vivas de la infección como cada onda epidémica inicial "lavada" a través de una monocapa celular. Los murciélagos son reservorios para varias zoonosis emergentes importantes, pero parecen no experimentar la enfermedad de patógenos virales de otro modo virulentos. Aunque la literatura biológica molecular ha hecho grandes progresos en el esclarecimiento de los mecanismos por los cuales los murciélagos toleran infecciones virales (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus dentro del huésped no ha sido bien aclarada. Utilizamos una combinación innovadora de experimentación in vitro y modelado dentro del huésped para explorar el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus. Críticamente, descubrimos que las líneas de células de murciélago demostraron una firma de respuesta inmune mejorada mediada por interferón, de forma constitutiva o inducida, que permitió establecer tasas rápidas de transmisión del Estos resultados fueron apoyados por el análisis bifurcado independiente de los datos de nuestro modelo teórico de campo medio, así como por el ajuste de este modelo a las series de tiempo de infección viral establecidas en el cultivo de células de murciélagos. Además, demostramos que el estado antiviral inducido por la vía del interferón protege a las células vivas de la mortalidad en el cultivo de tejidos, resultando en epidemias in vitro de larga duración que aumentan la probabilidad de establecer una infección persistente a largo plazo. Nuestros hallazgos sugieren que los virus evolucionados en depósitos de murciélagos que poseen capacidades mejoradas de IFN podrían lograr tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped sin causar patología a sus huéspedes. Estos virus de rápida reproducción probablemente generarían una virulencia extrema sobre el derrame a los huéspedes que carecen de capacidades inmunes similares a los murciélagos. Para lograr estos resultados, primero desarrollamos un modelo teórico novedoso, dentro del huésped, elucidando los efectos de la inmunidad Consideramos que una línea celular es constitutivamente inmune si posee cualquier número de células antivirales en equilibrio libre de enfermedad pero permite que la extensión de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros para ", la tasa constitutiva de adquisición antiviral. Al derivar la ecuación para R 0, el número básico de reproducción, que define las condiciones umbral para la invasión viral de un tejido (R 0 > 1), demostramos cómo el umbral de invasión se eleva a valores altos de adquisición antiviral constitutiva, ". Los procesos inmunes constitutivos pueden así prohibir la invasión de patógenos, mientras que las respuestas inducidas, por definición, sólo pueden controlar las infecciones post-hoc. Una vez que se han alcanzado los umbrales de invasión patogénica, las suposiciones de inmunidad constitutiva limitarán la mortalidad celular (virulencia) incurrida a altas tasas de transmisión. Independientemente del mecanismo (inducido o constitutivo), las células antivirales estimuladas por interferón parecen desempeñar un papel clave en el mantenimiento de infecciones persistentes o a largo plazo al proteger a las células sensibles de la infección rápida y la muerte celular concomitante. El ajuste de nuestro modelo a los datos in vitro apoyó los fenotipos inmunes esperados para diferentes líneas celulares de murciélagos, como se describe en la literatura. Modelos simples de células diana que ignoran los efectos de la inmunidad mejor serie temporal infecciosa recapitulada derivada de células Vero deficientes de IFN, mientras que los modelos que asumen procesos inmunes inducidos reprodujeron con mayor precisión ensayos derivados de células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), que poseen una respuesta IFN inducida por virus estándar. En la mayoría de los casos, los modelos que asumen procesos inmunes constitutivos mejor recrean epidemias de virus producidas en las células de PaKiT01 (Pteropus alecto), que se sabe que expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). El apoyo del modelo para suposiciones inmunológicas inducidas en ajustes a infecciones por rVSV-MARV en las células de PaKiT01 sugiere que la expresión constitutiva IFN-a característica de las células de P. alecto puede representar más un proceso de primogenitura inmune constitutivo que una defensa perpetua, funcional y antiviral. Los resultados del ajuste del modelo de campo medio fueron confirmados adicionalmente en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de cada serie temporal. Como se ha demostrado anteriormente en los modelos internos para el VIH (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), los supuestos de agotamiento simple de las células diana a menudo pueden proporcionar aproximaciones satisfactorias de la dinámica viral, especialmente las reproducidas en sistemas in vitro simples. Críticamente, nuestro ajuste del modelo enfatiza la necesidad de incorporar los efectos descendentes del control inmunológico para reproducir con precisión las series de tiempo infecciosas derivadas de cultivos de células de murciélago, especialmente las resultantes de la línea celular PaKiT01 P. alecto robustamente antiviral. Estos hallazgos indican que las vías inmunes mejoradas mediadas por la IFN en los reservorios de murciélagos pueden promover tasas elevadas de replicación del virus dentro del huésped antes de la aparición de especies cruzadas. No El trabajo futuro debe extender estos estudios de cultivo celular para incluir mediciones de múltiples variables de estado (es decir, células antivirales) para mejorar la inferencia epidemiológica.La continua recurrencia de epidemias de Ébola en toda África central destaca la importancia de entender el papel de los murciélagos como reservorios para la enfermedad zoonótica virulenta. La última década ha nacido testigo de un consenso emergente con respecto a las vías únicas por las cuales los murciélagos resisten y toleran infecciones altamente virulentas (Brook y Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Sin embargo, sigue siendo difícil comprender los mecanismos por los cuales los murciélagos apoyan patógenos endémicos a nivel poblacional, o promueven la evolución de El mantenimiento endémico de la infección es una característica definitoria de un reservorio de patógenos (Haydon et al., 2002), y los murciélagos parecen merecer tal título, apoyando la persistencia a largo plazo de infecciones virales altamente transmisibles en poblaciones insulares aisladas muy por debajo de los tamaños críticos esperados de la comunidad (Peel et al., 2012). Los investigadores debaten la influencia relativa de los mecanismos a nivel de la población y dentro del huésped que podrían explicar estas tendencias (Plowright et al., 2016), pero cada vez más, los datos de campo son difíciles de conciliar sin reconocer un papel para las infecciones persistentes (Peel et al., 2018; Brook et al., 2019). Presentamos métodos generales para estudiar la dinámica viral a escala cruzada, que sugieren que la persistencia dentro del huésped está respaldada por respuestas antivirales robustas características de los procesos inmunes al murciélago. Los virus que evolucionan rápidamente las tasas de replicación bajo estas robustas defensas antivirales pueden representar el mayor riesgo para la aparición de patógenos de especies cruzadas en huéspedes de derrames con sistemas inmunes que difieren de los únicos a los murciélagos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizados: Vero (mono verde africano), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) y PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Las identificaciones de especies de todas las líneas de células de murciélago se confirmaron morfológica y genéticamente en las publicaciones en las que se describieron originalmente (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009 Las monocapas de cada línea celular fueron cultivadas hasta 90% de confluencia (~9Â10 5 células) en placas de 6 pocillos. Las células fueron mantenidas en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO 2 y cultivadas en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY), complementadas con suero bovino fetal 2% (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), y 1% penicilina-estreptomicina (Life Technologies).Las células fueron analizadas mensualmente para detectar la contaminación por micoplasma mientras se realizaban experimentos; todas las células determinaron negativo para la contaminación en cada prueba. El trabajo anterior ha demostrado que todas las líneas celulares utilizadas son capaces de montar una respuesta IFN de tipo I en caso de desafío viral, con la excepción de las células Vero, que poseen una deficiencia IFN-b (Desmyter et al., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny y Morgan, 1979). Las células RoNi/7.1 han demostrado montar defensas IFN inducidas idiosincráticas ante infección viral (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), mientras que las células PaKiT01 son conocidas por expresar constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). Este trabajo es la primera documentación de la señalización de IFN inducida en caso de desafío con los VSV recombinantes particulares descritos a continuación. Verificamos fenotipos inmunes antivirales conocidos a través de qPCR. Los resultados fueron consistentes con la literatura, indicando un papel menos pronunciado para la defensa del interferón contra la infección viral en las células RoNi/7.1 versus PaKiT01. Se han descrito previamente los virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Los virus fueron seleccionados para representar una amplia gama de respuestas antivirales anticipadas de las células huésped, basadas en una gama de historias evolutivas pasadas entre la entrada de células glucoproteínas del virus y el receptor de entrada de la célula huésped. Estas interacciones variaron desde la ausencia total de historia evolutiva en el caso de infecciones por rVSV-G en todas las líneas celulares hasta una incompatibilidad de entrada celular a nivel de receptor conocido en el caso de infecciones por rVSV-MARV en las líneas celulares PaKiT01. Para medir las infecciones de rVSV en cada una de las líneas celulares descritas anteriormente, para calcular la dosis viral correcta para cada MOI, se añadió NH 4 Cl (20 mM) a cultivos celulares infectados a 1-2 horas de postinfección para bloquear la propagación viral, y las células eGFP positivas individuales se contabilizaron manualmente a las 12-14 horas de postinfección. Los trabajos publicados anteriormente indican que las líneas de células renales inmortalizadas de Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) y Pteropus alecto (PaKiT01) exhiben diferentes fenotipos inmunes antivirales innatos a través de, respectivamente, inducidos (Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) y expresión constitutiva (Zhou et al., 2016) de los genes de interferón tipo I. Verificamos estos fenotipos publicados en nuestras propias líneas celulares infectadas con rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV vía qPCR de genes IFN-a e IFN-b a través de una serie longitudinal de infecciones. Específicamente, realizamos múltiples series temporales de infección de cada línea celular con cada uno de los virus descritos anteriormente, bajo condiciones de infección simuladas y en MOIs de 0,0001 y 0,001-con excepción de rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01, para lo cual la infección sólo se realizó en MOI = 0,0001 debido a las limitadas existencias virales y a la extremadamente baja infectividad de este virus en esta línea celular (requeriendo así altas cargas virales para la infección inicial).Todos los experimentos se ejecutaron en duplicado en placas 6well, de tal manera que una placa típica para cualquiera de los tres virus tenía dos pozos de control (mock), dos MOI = 0,0001 pozos y dos MOI = 0,001 pozos, excepto las placas PaKiT01, que tenían dos controles y cuatro MOI = 0,0001 pozos en un momento dado. Justificamos esta exención de PaKiT01 a través de la expectativa de que IFN-una expresión es constitutiva para estas células, y por la suposición de que cualquier expresión exhibida en el MOI inferior también debería estar presente en el MOI superior. Para estas series de tiempo de expresión génica, cuatro placas de 6 pocillos para cada combinación de línea celular-virus fueron incubadas con virus durante una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y los monocapas celulares fueron lavados en PBS, luego cubiertos con un ensayo de placa de agar superpuesto para imitar las condiciones bajo las cuales se realizaron los ensayos de infección. Las placas se recolectaron secuencialmente en los puntos de tiempo de aproximadamente 5, 10, 15 y 20 horas después de la infección (el tiempo exacto variaba como múltiples ensayos se ejecutaban simultáneamente). Después de la cosecha de cada placa, se eliminó la capa de agar y se lisó el virus y se extrajo ARN de las células utilizando el kit Zymo Quick ARN Mini Prep, de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluyendo el paso para la digestión del ADN celular. Después de la extracción, la calidad del ARN se verificó a través de nanodrop, y el ARN se convirtió a cDNA utilizando el kit de síntesis de cDNA de Superscript III Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se almacenó a 4oC y como un stock congelado a À20oC para esperar qPCR. Nos encargamos de qPCR de cDNA para evaluar la expresión de los genes de interferón tipo I, IFN-a e IFNb, y el gen de mantenimiento de la casa, b-Actin, utilizando imprimaciones Para qPCR, se incubaron 2 ml de cada muestra de cDNA con 7 ml de agua desionizada, 1 ml de 5 UM de mezcla de imprimación hacia adelante/reversa y 10 ml de iTaq Universal SYBR Green, luego se cicló en una máquina de PCR QuantStudio3 en tiempo real bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de: desnaturalización a 95 C (5 s), recocido a 58 C (15 s), y extensión a 72 C (10 s). Se reportan valores d-Ct simples para cada ejecución, con Ct en bruto del gen objetivo de interés (IFN-a o IFN-b) restado de Ct en bruto del gen de limpieza b-Actin en la Figura 1 -figura suplemento 6. El cálculo del cambio de pliegue sobre la infección viral en comparación con el simulacro usando el método d-d-Ct (Livak y Schmittgen, 2001) fue inapropiado en este caso, ya que deseábamos demostrar la expresión constitutiva de IFN-a en células PaKiT01, por lo que los datos de células simuladas eran idénticos a los producidos a partir de células infectadas. Después de crecer a ~ 90% de confluencia, las células fueron incubadas con rVSV en pellets expresando eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Las líneas celulares fueron desafiadas con una baja (0,0001) y alta (0.001) multiplicidad de infección (MOI) para cada virus. En una monocapa celular infectada en un determinado MOI (m), la proporción de células (P), infectadas por k partículas virales puede ser descrita por la distribución de Poisson: P k ð 1⁄4 e Àm m k!, de tal manera que el número de células inicialmente infectadas en un experimento es igual a: 1 À e Àm. Asumimos que un cultivo confluente ~90 % en el origen de cada ensayo estaba compuesto por ~9x10 5 células y conducía todos los experimentos en MOIs de 0,0001 y 0,001, lo que significa que comenzamos cada ensayo introduciendo virus a, respectivamente, ~81 u 810 células, que representan la variable de estado 'E' en nuestro modelo teórico. Los MOIs bajos fueron seleccionados para aproximar mejor la dinámica de infección de campo media y limitar artefactos de estructuración espacial, tales como extinción epidémica prematura cuando las placas en crecimiento Se prepararon placas de seis pocillos con cada infección por duplicado o triplicado, de manera que un pozo de control (sin virus) y 2-3 pozos cada uno en el MOI 0,001 y 0,0001 fueron incubados simultáneamente en la misma placa. En total, se realizaron entre 18 y 39 ensayos en cada combinación de células-virus-MOI, excepto infecciones por r-VSV-MARV en células PaKiT01 en el MOI = 0,001, para lo cual se realizaron sólo ocho ensayos debido a la baja infectividad de este virus en esta línea celular, lo que requirió altas cargas virales para la infección inicial. Las células fueron incubadas con virus por una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y las monocapas celulares fueron lavadas en PBS, luego cubiertas con una capa viscosa fundida (50% 2X MEM/Lglutamina; 5% FBS; 3% HEPES; 42% agarosa), enfriadas durante 20 min, y re-incubadas en su ambiente original humidificado 37°C, 5% CO 2. Después de la aplicación de la superposición, las placas fueron monitoreadas periódicamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertido hasta que se presenciaron los primeros signos de expresión de GFP (~6-9.5 hr post-infección, dependiendo de la línea celular y el virus bajo investigación). A partir de ese momento, un subconjunto cuadrado del centro de cada pozo (compuesto por 64 o 36 sub-marcos y que correspondía aproximadamente al 60% y 40% del espacio de pozo entero) fue fotografiado periódicamente, utilizando una plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS) con un objetivo aéreo 4X (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Los ajustes de microscopios se mantuvieron estándar en todos los ensayos, con tiempo de exposición fijado en 0,0006 s para cada imagen. Se implicó un canal de color, de modo que las imágenes producidas muestran células que expresan GFP en células blancas y no GFP en negro (Figura 1-figura suplemento 1). Los pozos fueron fotografiados en rotación, con la mayor frecuencia posible, desde el inicio de la expresión GFP hasta el momento en que la mayoría de las células del pozo fueron consideradas muertas, la expresión GFP ya no pudo ser detectada, o la terminación temprana fue deseada para permitir la tinción de Hoechst. En el caso de las células PaKiT01 infectadas con rVSV-EBOV, donde se estableció una infección aparentemente persistente, el ensayo fue terminado después de 200+ horas (8+ días) de observación continua. Al finalizar todos los ensayos, las células fueron fijas en formaldehído (4% durante 15 min), incubadas con mancha Hoechst (0,0005% durante 15 min) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), luego imágenes en 4X en la plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS). Un canal de color fue permitido de tal manera que las imágenes producidas mostraron núcleos vivos en células blancas y muertas en negro. Colores de la mancha Hoechst ADN celular, y la infección viral se cree que interfiere con la claridad de la mancha (Dembowski y DeLuca, 2015). Como tal, la terminación de la infección, la fijación celular y la tinción Hoechst permite la generación de una serie de tiempo áspero de células vivas no infecciosas (es decir, susceptibles + células antivirales) para complementar las imágenes que produjeron series temporales de proporciones infecciosas. Debido a la incertidumbre sobre el estado epidémico exacto de las células manchadas de Hoechst (es decir, las células expuestas pero aún no infecciosas pueden todavía mancharse), elegimos adaptar nuestros modelos sólo a las series infecciosas de tiempo derivadas de imágenes que expresan GFP y utilizaron las imágenes de mancha Hoechst como un control visual Las imágenes recuperadas de la serie temporal anterior fueron procesadas en forma binaria ('infecciosa' vs. 'no infecciosa' o, para las imágenes manchadas de Hoechst, 'live' vs.'muerta') utilizando el paquete EBImage (Pau et al., 2010) en la versión R 3.6 para MacIntosh, después de métodos más detallados en el archivo suplementario 7. Las imágenes binarias fueron procesadas posteriormente en series temporales de imágenes infecciosas o, para las imágenes manchadas de Hoechst, células vivas utilizando una serie de scripts de recuento de células. Debido a limitaciones logísticas (es decir, muchas placas de ensayos simultáneos de infección en ejecución y sólo un microscopio de imágenes disponible), el curso temporal de la imagen a lo largo de la duración de cada ensayo fue muy variable. Como tal, ajustamos una serie de modelos estadísticos a nuestros datos de imagen procesados para reconstruir valores confiables de la proporción infecciosa de cada pozo por hora para cada ensayo distinto en todas las combinaciones de línea celular-virus-MOI (Figura 1 Para derivar la expresión de R 0, el número básico de patógenos reproductivos in vitro, utilizamos técnicas de Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), empleando Wolfram Mathematica (versión 11.2) como herramienta analítica. R 0 describe el número de nuevas infecciones generadas por una infección existente en una población huésped completamente susceptible; un patógeno invadirá una población cuando R 0 > 1 (archivo suplementario 2). Luego analizamos las propiedades de estabilidad del sistema, explorando la dinámica a través de un rango de espacios de parámetros, utilizando MatCont (versión 2.2) (Dhooge et al. La tasa de natalidad, b, y la tasa de mortalidad natural, m, equilibrio para producir una tasa de crecimiento a nivel de población, de tal manera que es imposible estimar tanto b como m simultáneamente a partir de los datos del tamaño total de la población. Como tal, fijamos b en 025 y estimamos m mediante el ajuste de una versión ausente de infección de nuestro modelo de campo medio a las series de tiempo susceptibles derivadas de la tinción de pozos de control de Hoechst para cada una de las tres líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). Esto produjo una tasa de mortalidad natural, m, correspondiente a una vida útil de aproximadamente 121, 191 y 84 horas, respectivamente, para Vero, RoNi/7.1, y PaKiT01 líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). A continuación, fijamos la tasa de incubación del virus, s, como la inversa de la duración más corta observada del tiempo desde la infección inicial hasta la observación de las primeras células infecciosas a través del microscopio fluorescente para todas las combinaciones de nueve líneas celulares -virus (con un rango de 6 a 9,5 horas). Fijamos a, la tasa de mortalidad inducida por infección, en 1/6, un estándar aceptado para la cinética viral general (Howat et al., 2006), y mantuvimos c, la tasa de regresión celular antiviral a estado susceptible, en 0 para el intervalo de tiempo (< 200 horas) de los ensayos de infección celular experimental. Estimamos valores específicos de línea celular-virus-MOI para b, r, y " mediante el ajuste de la producción determinista de proporciones infecciosas en nuestro modelo de campo medio a la serie completa de resultados estadísticos de todos los ensayos para cada serie de tiempo de cultivo celular El ajuste se realizó minimizando la suma de las diferencias cuadradas entre la salida del modelo determinista y la proporción infecciosa específica de la línea celularvirus-MOI de los datos en cada paso del tiempo. Optimizamos los parámetros para el MOI = 0,001 y 0,0001 simultáneamente para aprovechar la potencia estadística a través de los dos conjuntos de datos, estimando una tasa de transmisión diferente, b, para ensayos que se ejecutan a cada dosis infecciosa pero, cuando proceda, estimando las mismas tasas de r y " a través de las dos series temporales. Utilizamos el solucionador de ecuaciones diferenciales lsoda() en el paquete R deSolve (Soetaert et al., 2010) para obtener soluciones numéricas para el modelo de campo medio y se llevó a cabo la minimización utilizando el algoritmo 'Nelder-Mead' de la función optim() en la base R. Todos los ajustes del modelo se En el caso de ataques fallidos o hessianos indefinidos, generamos una serie de conjeturas aleatorias alrededor de las condiciones de inicio y continuamos la estimación hasta que se lograron los ajustes exitosos. Todas las combinaciones de datos de dieciocho líneas celulares-virus-MOI fueron ajustadas por una versión inmune ausente (" = r = 0) del modelo teórico y, posteriormente, una inmunidad inducida (" = 0; r > 0) e inmunidad constitutiva (" > 0; r > 0) del modelo. Finalmente, comparamos los ajustes a través de cada combinación celular-virus-MOI vía AIC. Al calcular AIC, el número de parámetros ajustados en cada modelo (k) variaba entre los fenotipos inmunes, con un parámetro (b) estimado para supuestos inmunes ausentes, dos (b y r) para supuestos inmunológicos inducidos, y tres (b, r El tamaño de la muestra (n) correspondió al número de pasos de tiempo discretos en todos los ensayos infecciosos empíricos a los que se ajustó el modelo para cada combinación de virus de línea celular. Todos los scripts de ajuste y comparación de modelos están disponibles libremente para su descarga en el siguiente repositorio FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Finalmente, verificamos que todos los campos promedio encajan en un contexto espacial, con el fin de dilucidar más a fondo el papel de las células antivirales en cada serie temporal. Construimos nuestro modelo espacial en C++ implementado en R utilizando los paquetes Rcpp y RcppArmadillo (Eddelbuettel y Francois, 2011; Eddelbuettel y Sanderson, 2017). (2006), modelamos este sistema en una celosía hexagonal bidimensional, utilizando un tiempo epidémico de diez minutos para transiciones del estado celular. En la inicialización de cada simulación, asignamos aleatoriamente una duración de vida útil natural, período de incubación, período de infectividad y tiempo de estado antiviral a estado susceptible a todas las células en una monocapa teórica. Las duraciones paramétricas se extrajeron de una distribución normal centrada en la inversa de las tasas fijas respectivas de m, s, a, y c, según lo reportado con nuestro modelo de campo medio. Las transiciones que involucraban las tasas inducidas (r) y constitutivas (") de adquisición antiviral se gobernaban probabilísticamente y se ajustaban dinámicamente en cada paso del tiempo basado en el entorno global. Como tal, fijamos estos parámetros en los mismos valores estimados en el modelo de campo medio, y multiplicamos tanto r como " por la proporción global de, respectivamente, células expuestas y susceptibles en un tiempo dado. A diferencia de las tasas de adquisición antiviral, las transiciones que involucran la tasa de nacimiento (b) y la tasa de transmisión (b) ocurrieron probabilísticamente en base al entorno local de cada célula. La tasa de nacimiento, b, se multiplicó por la proporción de células sensibles dentro de una circunferencia de seis vecinos de una célula muerta focal, mientras que b se multiplicó por la proporción de células infecciosas dentro de una vecindad de treinta y seis de una célula susceptible focal, permitiendo así que la transmisión viral se extienda más allá de los límites más cercanos de una célula infecciosa. Para compensar los umbrales más altos de persistencia celular e invasión de virus que se producen en condiciones espaciales locales (Webb et al., 2007), aumentamos la tasa de natalidad, b, y la tasa de transmisión de células a células, b, respectivamente, a seis y diez veces los valores utilizados en el modelo de campo medio (Fichero complementario 4). Derivamos estos aumentos sobre la base de la suposición de que los nacimientos tuvieron lugar exclusivamente sobre la base de interacciones de par-vecino más cercano (las seis células inmediatamente adyacentes a una célula muerta focal), mientras que la transmisión viral se concentró localmente pero incluyó una pequeña contribución global (7,5%), que representa las treinta y seis células que rodean a una susceptible focal. Justificamos estos aumentos y derivamos sus orígenes más adelante en el archivo suplementario 5. simulamos diez series de tiempo espacial estocástico para todas las combinaciones de células-virus bajo las tres suposiciones inmunes a un tamaño de población de Formulario de notificación transparente Disponibilidad de datos Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el manuscrito y los archivos de soporte. Todas las imágenes y códigos utilizados en este estudio se han puesto a disposición para su descarga en el siguiente Figshare
question: ¿Qué sería causado por esta hipervigilancia en la mayoría de los otros mamíferos?
answers.text: inflamación dañina