context: Efecto inhibidor y posible mecanismo de acción del alcohol pachulí contra la gripe A (H2N2) Virushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6264369/SHA: f2d842780b9928cc70f38a4458553f2431877603Autores: Wu, Huaxing; Li, Beili; Wang, Xue; Jin, Mingyuan; Wang, GuonianFecha: 2011-08-03DOI: 10.3390/moléculas16086489Licenciado: cc-byAbstract: En el presente estudio, se estudió in vitro, in vivo y en silico la actividad antiinfluenza A (H2N2) del alcohol pachulí fue superior a 20 μM. El alcohol pachulí podría inhibir el virus de la gripe con un IC(50) de 4,03 ± 0,23 μM. El ensayo de MTT mostró que la inhibición por el alcohol pachulí aparece fuertemente después de la penetración del virus en la célula. En el modelo de ratón de gripe, el alcohol pachulí mostró una protección obvia contra la infección viral a una dosis de 5 mg/kg/día. Las simulaciones de acoplamiento flexible y dinámica molecular indicaron que el alcohol pachulí se unía a la proteína neuraminidasa del virus de la gripe, con una energía de interacción de –40,38 kcal mol(–1). Los residuos invariantes clave del sitio activo Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 y Tyr406 jugaron papeles importantes durante el proceso de unión. Los resultados presentados aquí sugieren que el alcohol pachulí posee propiedades del virus anti-influenza A (H2N2), y por lo tanto es una fuente potencial de agentes anti-influenza para la industria farmacéutica. Texto: El virus de la gripe, que es una de las principales causas de infecciones respiratorias agudas en los seres humanos, puede conducir a epidemias anuales y pandemias poco frecuentes. Las dos pandemias de gripe del siglo XX, "Influenza asiática (1957/H2N2)" y "Hong Kong Influenza (1968/H3N2)" resultaron en la muerte de unas 2-3 millones de personas en todo el mundo [1, 2]. Hoy en día, sus descendientes siguen causando la mayoría de las infecciones de gripe en los seres humanos [3]. Hasta donde se sabe que el fármaco antiviral más eficaz es el inhibidor de la neuraminidasa (NA), que se dirige a las g La liberación de nuevos viriones de la célula infectada es un paso clave en el ciclo de vida de la gripe y necesita neuraminidasa (NA) para cortar el vínculo α-cetosídico entre el ácido siálico terminal y un residuo de azúcar adyacente [6]. Los inhibidores de la NA fueron diseñados para evitar el paso clave bloqueando el sitio activo de la enzima y así dar tiempo suficiente para que los sistemas inmunes anfitriones eliminen los virus infectados [7]. Se han dedicado esfuerzos constantes al desarrollo de inhibidores de la NA, utilizando la estructura cristalina de la proteína N2 subtipo NA [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]. De hecho, oseltamivir (Tamiflu) es el inhibidor de la NA representativo que ha demostrado ser un fármaco oral de aplicación exclusiva en la práctica clínica para el tratamiento de la infección por gripe [4, 8, 9 Sin embargo, con un aumento en el uso médico, las cepas resistentes a oseltamivir se han encontrado y probablemente conducen a un brote a gran escala de nueva gripe pandémica [16, 17]. El alcohol pachulí (Figura 1 ) ha sido bien conocido durante más de un siglo. Es un componente importante del aceite pungente del arbusto de la India oriental Pogostemon cablin (Blanco) Benth, y ampliamente utilizado en fragancias. El aceite pachulí es un aceite esencial importante en la industria del perfume, utilizado para dar una base y carácter duradero a una fragancia [16, 17]. El aceite esencial es muy apreciado por su característico olor leñoso, terroso y alcanforácea agradable y duradero, así como por sus propiedades fijadoras, siendo adecuado para su uso en jabones y productos cosméticos [16, 17]. La parte aérea de Pogostemon cablin se ha utilizado salvajemente para el tratamiento del resfriado común y como agente antifúngico en China [16, 17]. Además, la planta es ampliamente utilizada en la Medicina Tradicional China, ya que presenta varios tipos de actividad farmacológica según la composición del aceite [16, 17]. El alcohol pachulí, como principal componente volátil del aceite pachulí, se ha encontrado que inhibe fuertemente la replicación H1N1 e inhibe débilmente la replicación B/Ibaraki/2/85 [18]. Hasta donde sabemos, las actividades del virus anti-influenza (H2N2) del alcohol pachulí todavía no han sido evaluadas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad anti-influenza A virus (H2N2) de alcohol pachulí por MTT assay y modelo de gripe por ratón. Sobre esta base, se aplicaron métodos explícitamente solvatados de acoplamiento y dinámico molecular (MD) para investigar el modo de unión del alcohol pachulí con la proteína NA del virus influenza. Prevemos que la comprensión del mecanismo de inhibición será de valor en el diseño racional de nuevos fármacos anti-influenza. Primero se examinó la eficacia del alcohol pachulí en la replicación del virus influenza A (H2N2) y la viabilidad celular. CC 50 se utilizó para expresar la citotoxicidad del alcohol pachulí en MDCK. El CC 50 de alcohol pachulí estaba por encima de 20 mM, lo que indicó que el alcohol pachulí no afectó el crecimiento de MDCK (Tabla 1). Así, parece que los efectos antivirales del alcohol pachulí no se debieron a la citotoxicidad. Además, se encontró que el alcohol pachulí inhibió el virus influenza A (H2N2) con un Con base en los valores de IC 50 y CC 50, el índice de selectividad (SI) fue calculado como >4,96. Se reporta que un SI de 4 o más es apropiado para un agente antiviral [18], sugiriendo que el alcohol pachulí puede ser considerado con actividad anti-influenza A (H2N2). Hasta ahora, se ha encontrado que el alcohol pachulí mostró actividad anti-influenza dependiente de la dosis (A/PR/8/34, H1N1), con un valor IC 50 de 2.635 μM. Además, mostró actividad débil frente a B/Ibaraki/2/85 (IC 50 = 40,82 μM) [19]. Con la adición de la actividad inhibitoria H2N2 anterior, tenemos una visión integral de la actividad anti-influenza del alcohol pachulí. Las células fueron pretratadas con alcohol pachulí antes de la infección viral (células de pretratamiento), los virus fueron pretratados antes de la infección (virus de pretratamiento), y el alcohol pachulí fue añadido durante el período de adsorción (adsorción) o después de la penetración de los virus en las células (replicación).Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces y los datos presentados son el promedio de tres experimentos.Los símbolos * indicaron una diferencia muy significativa p < 0,01 con respecto a otro modo (virus de pretratamiento, adsorción y célula de pretratamiento). Se observó mejor actividad antiviral cuando se añadió a una concentración de 8 μM durante el período de replicación con inhibición de la replicación viral de 97,68% ± 2,09% para la gripe A (H2N2) a 72 h. Sin embargo, no se detectó ningún efecto significativo cuando se utilizó alcohol pachulí para el pretratamiento de células o virus o cuando sólo se añadió alcohol pachulí durante la fase de adsorción. Estos resultados sugieren que la inhibición del virus influenza A (H2N2) por el alcohol pachulí parece ocurrir mucho más fuerte después de la penetración del virus en la célula. Además, estudios bioquímicos han indicado que la bioactividad de la proteína NA es determinante esencial después de la replicación del virus influenza A (H2N2) [20] [21] [22]. Por lo tanto, se concluye que la función de la proteína NA puede ser suprimida por el alcohol Para evaluar la toxicidad del alcohol pachulí, se analizó estadísticamente el valor medio del peso corporal de los ratones en cada grupo. Los pesos medios de los ratones administrados en los ratones de 2 mg/kg/dosis oseltamivir, 2 mg/kg/dosis de alcohol pachulí y 10 mg/kg/dosis de alcohol pachulí una vez al día durante 7 días no fueron significativamente diferentes en comparación con los ratones control normales, no mostrando toxicidad del alcohol pachulí y oseltamivir dentro de la concentración de prueba (P > 0,05). Se observó estado fisiológico en ratones infectados por virus. Tres días después de la infección viral, algunos ratones, especialmente ratones en el grupo control infectado con H2N2, mostraron cambios en el comportamiento, como una tendencia a acurrucarse, disminución de la vitalidad, y pelaje escurrido, etc. En el modelo de gripe por ratón, la infección viral conduce a la Por lo tanto, la eficacia del alcohol pachulí y oseltamivir se evaluó sobre la base de la tasa de supervivencia medida durante 15 días después de la infección, en animales infectados tratados en relación con animales infectados (control) no tratados. Una comparación de la eficacia del alcohol pachulí y oseltamivir en vivo modelo de gripe por ratón (tratamiento oral) mostró que a una dosis de 5 mg/kg/día, el alcohol pachulí mostró una protección evidente contra el virus de la gripe, ya que el día medio hasta la muerte se detectó como 11,8 ± 1,1 (Tabla 2). Cuando la dosis se redujo a 1 mg/kg/día, el alcohol pachulí mostró una protección más débil (medida por los sobrevivientes/total) que la de 5 mg/kg/día, la media del día hasta la muerte fue de 7,5 ± 1,8. En el grupo de control infectado con H2N2 no hubo sobrevivientes. Teniendo en cuenta los datos in vitro e in vivo, se concluye que el alcohol pachulí podría ser utilizado en el tratamiento de infecciones por virus de la gripe humana. Basándose en los datos del experimento anterior, se determina que el alcohol pachulí se une a la proteína NA. Como indican las energías totales y las desviaciones radiculares medias cuadradas (RMSD) de la columna vertebral en la Figura 3, el complejo de alcohol pachulí minimizado en energía ha estado en equilibrio desde cerca de 0,5 ns, y luego se mantiene bastante estable en las últimas 19,5 ns. Es consistente con los resultados de MD anteriores de otros inhibidores de la NA [23] [24] [26] [27]. Por lo tanto, los análisis geométricos y energéticos se realizaron sobre las estructuras medias de 0,5 ~ 20.0 ns de las La energía de interacción (E inter ) del alcohol pachulí con NA se calculó en −40,38 kcal mol −1, donde se encontró que las interacciones VDW más que electrostáticas desempeñaban un papel dominante, contribuyendo a alrededor del 72% (−29,18 kcal mol −1 ). Como se muestra en la Figura 4, el alcohol pachulí se unía al sitio activo que también se unía a oseltamivir y zanamivir [28]. Como muestra la Figura 5, el átomo de oxígeno del alcohol pachulí se orientó hacia las cadenas laterales de residuos Glu119 y Tyr406, con un lazo H formado con cada residuo. Los valores de distancias en la Figura 6 revelan además que el complejo acoplado permanece bastante estable a lo largo de la simulación, con las distancias medias de Glu119:OE2patchouli alcohol:O y Tyr406:OH -patchouli alcohol:O menos de 2,8 Å. Las contribuciones de la suma (E sum ) de residuos Glu119 y Tyr406 ascendieron a −8,46 y −7,37 kcal mol −1, respectivamente (Tabla 3). Además, el alcohol pachulí fue estabilizado por residuos Arg118, Asp151, Arg152, Trp178, Ala246, Glu276, Arg292, Asn294 y Gln347, especialmente residuos Asp151, Arg152 y Glu276 (Figura 5 y Tabla 3 ). De hecho, los residuos Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 y Tyr406 de la proteína NA ya han recibido suficiente atención de los diseños racionales de fármacos [14, 30, 31]. Los residuos catalíticos Asp151, Arg152 y Glu276 son cruciales para las funciones NA y los residuos Glu119 y Tyr406 son importantes para estabilizar los sitios activos de NA [32, 33]. Sugiere que las funciones NA se verán afectadas por la presencia de alcohol pachulí, consistente con los experimentos anteriores. El alcohol pachulí coincide con el sitio activo de NA y tiene una energía de interacción aceptable. Teniendo en cuenta las obvias discrepancias de estructura con los inhibidores de NA actuales, representa un compuesto de plomo ideal para los diseños de nuevos agentes anti-influenza. El alcohol pachulí y oseltamivir se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU., pureza > 99%) y se almacenaron en viales de vidrio con tapas selladas de Teflon a −20 ± 0,5 °C en ausencia de luz. MDCK (Reniño Canino Madin-Darby) fue comprado al Harbin Veterinary Research Institute (Harbin, Heilongjiang, China). Las células fueron cultivadas en cultivo monocapa con el medio esencial mínimo de Águila (EMEM) complementado con suero fetal de pantorla (FCS), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Las monocapas fueron retiradas de sus superficies plásticas y pasaban serialmente cada vez que llegaban a ser confluentes. La cepa de gripe A/Leningrad/134/17/1957 H2N2) fue comprada al Instituto Nacional de Control de Bioproductos Veterinarios y Farmacéuticos (Beijing, China). El virus se cultivaba rutinariamente en células MDCK. Los cultivos se preparaban a partir de sobrenadantes de células infectadas y se almacenaban a −80 °C. La toxicidad celular del alcohol pachulí en las células MDCK fue evaluada por el método MTT. Brevemente, las células fueron sembradas en una placa microtitular en ausencia o presencia de varias concentraciones (20 μM -0.0098 μM) de alcohol pachulí (ocho réplicas) e incubadas a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 durante 72 h. Los sobrenadantes fueron desechados, lavados con PBS dos veces y reactivo MTT (5 mg/ml en PBS) fue agregado a cada pozo. Después de la incubación a 37 °C durante 4 h, los sobrenadantes fueron eliminados, luego 200 μL DMSO fue añadido e incubado a 37 °C durante otros 30 min. Después de que las placas fueron leídas en un lector de ELISA (Thermo Molecular Devices Co., Union City, EE.UU.) a 570/630 nm. La media de los pozos de La concentración máxima no tóxica (TD 0 ) y la concentración citotóxica del 50% (CC 50 ) fueron calculadas mediante análisis de regresión lineal de las curvas de respuesta a la dosis generadas a partir de los datos. La inhibición de la replicación vírica fue medida por el método MTT. La dilución serial del virus tratado fue adsorbida a las células durante 1 h a 37 °C. El inóculo residual se dispersó y se añadieron células infectadas con EMEM que contenían 2% FCS. Cada ensayo se realizó en ocho réplicas. Después de la incubación durante 72 h a 37 °C, los cultivos fueron medidos por el método MTT como se describe anteriormente. La concentración de alcohol pachulí y oseltamivir que inhibió el número de virus en un 50% (IC 50 ) se determinó a partir de curvas de dosis-respuesta. Las células y los virus fueron in Las células fueron tratadas previamente con alcohol pachulí antes de la infección viral, los virus fueron incubados con alcohol pachulí antes de la infección y las células y los virus fueron incubados junto con alcohol pachulí durante la adsorción o después de la penetración del virus en las células huésped. El alcohol pachulí siempre se utilizó en la concentración no tóxica. Las monocapas celulares fueron pretratadas con alcohol pachulí antes de la inoculación con el virus añadiendo alcohol pachulí al medio de cultivo e incubación durante 1 h a 37 °C. El compuesto fue aspirado y las células fueron lavados inmediatamente antes de la adición del inóculo influenza A (H2N2). Para el virus pretratamiento, Influenza A (H2N2) fue incubada en medio que contenía alcohol pachulí durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la infección de las células MDCK. Para el análisis de la inhibición anti-influenza A (H2N2) durante el período de adsorción, la misma cantidad de influenza A (H2N2) se mezcló con el fármaco y se añadió a las células inmediatamente. Después de 1 h de adsorción a 37 °C, se eliminó el inóculo y se añadió a las células un 2 % de FCS. El efecto del alcohol pachulí contra la gripe A (H2N2) también se probó durante el período de replicación al añadirlo después de la adsorción, como típico realizado en estudios de susceptibilidad anti-influenza A (H2N2). Cada ensayo se realizó en ocho réplicas. Se adquirieron ratones Kunming de 18-22 g (6 semanas de edad) de Harbin Veterinary Research Institute Animal Co., Ltd. (Harbin, Heilongjiang, China). En primer lugar, la toxicidad del alcohol pachulí y oseltamivir se evaluó en ratones sanos por la pérdida de peso corporal en comparación con el grupo control (2% de DMSO en solución salina fisiológica), los ratones se administraron por vía oral con 10 mg/kg/dosis de alcohol pachulí, 2 mg/kg/dosis de alcohol pachulí o 2 mg/kg/dosis de oseltamivir (disuelto en 2% de DMSO en solución salina fisiológica) una vez al día durante 7 días, se determinó el peso de los ratones diariamente, se realizaron procedimientos de acuerdo con el Principio de Cuidado de Animales de Laboratorio (NIH Publicación No 85-23, revisada en 1985) y las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Peking. Los ratones Kunming fueron anestesiados con isoflurano y expuestos al virus (A/Leningrad/134/17/1957) por instilación intra Los fármacos se prepararon en un 2% de DMSO en solución fisiológica salina y se administraron 4 h antes de la exposición al virus y continuaron diariamente durante 5 días. Todos los ratones se observaron diariamente para cambios en el peso y para cualquier muerte. Los parámetros para la evaluación de la actividad antiviral incluyeron la pérdida de peso, la reducción de la mortalidad y/o el aumento en la media del día hasta la muerte (MDD) determinado a lo largo de 15 días. La estructura cristalina de N2 subtipo neuraminidasa (PDB código 1IVD) se obtuvo del RCSB Protein Data Bank [34]. Para mayor comodidad, la estructura se denomina NA en adelante. La geometría y las cargas atómicas parciales del alcohol pachulí (Figura 1) se calcularon con el módulo Discover 3.0 (Insight II 2005) [35] mediante la aplicación del algoritmo BFGS [36] y el campo de fuerza Las simulaciones de acoplamiento y dinámica molecular (MD) fueron realizadas por los protocolos generales en los paquetes de software Insight II 2005, consistentes con las literaturas anteriores [24, 26, 28, 35, [37] [38]. Durante las simulaciones de MD, el conjunto canónico (NVT) fue empleado a temperatura normal (300 K). La temperatura MD fue controlada por el termostato de escalado de velocidad [40]. Las integraciones de las ecuaciones clásicas de movimiento fueron logradas usando el algoritmo Verlet. Los sistemas fueron solvados en una gran esfera de moléculas de agua TIP3P [40] con el radio de 35,0 Å, que es suficiente para sostener los conjuntos [40]. Las trayectorias de MD fueron generadas utilizando un paso de tiempo de 1,0 fs para un total de 20,0 ns, ahorradas a intervalos de 5,0 ps. Las energías de interacción del alcohol pachulí con NA y los residuos respectivos en el sitio activo de NA fueron calculadas por el módulo de acoplamiento [35], sobre las trayectorias de MD de 0,5 ~ 20,0 ns. Todos los resultados se expresan como valores medios ± desviaciones estándar (SDs) (n = 3). La significación de la diferencia fue calculada por el análisis de varianza en un solo sentido, y los valores p < 0,001 fueron considerados significativos. En conclusión, el alcohol pachulí posee actividad del virus anti-influenza A (H2N2) mediante interferencia con la función NA que separa el enlace α-glucosídico entre el ácido siálico y el glucoconjugado. Nuestros resultados proporcionan la información prometedora para el uso potencial del alcohol pachulí en el tratamiento de la enfermedad infecciosa del virus influenza A (H2N2). Se necesitan más estudios
question: ¿Cuál fue la prueba del nivel de citotoxicidad utilizado en este estudio?
answers.text: CC 50