context: Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.
question: ¿ A qué temperatura se completó el ensayo?
answers.text: 32uC, 37uC, 42uC