context: Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith, 1985 Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott and Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología  www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3  Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso de péptidos diseñados que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.
question: ¿Cuál es el potencial de los fagos para las enfermedades infecciosas y crónicas?
answers.text: agente profiláctico y terapéutico