context: El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
question: ¿Cuánto tiempo inhaló el paciente en el RTube?
answers.text: 10 minutos