context: El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
question: ¿Cuáles son los métodos disponibles clínicamente para detectar antígenos virales de la encefalitis?
answers.text: ELISA e IFA