context: La secuenciación profunda de células epiteliales pulmonares humanas primarias desafiadas con el virus de la gripe H5N1 revela un papel proviral para CEACAM1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6195505/SHA: ef58c6e981a08c85d2c0efb80e5b32b075f660b4Autores: Ye, Siying; Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnFecha: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-336605-6Licencia: cc-byAbstract: Las actuales estrategias profilácticas y terapéuticas dirigidas a los virus de la gripe humana incluyen vacunas y antivirales. Dadas las tasas variables Aquí se describe el uso de la secuenciación profunda de HiSeq para analizar la expresión génica del huésped en células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II infectadas con el virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógena. A las 24 horas de la infección, 623 genes hospedantes fueron significativamente regulados, incluyendo la molécula de adhesión celular CEACAM1. La infección por el virus H5N1 estimuló significativamente la expresión proteica CEACAM1 en comparación con el virus influenza A PR8 (H1N1), sugiriendo un papel clave para CEACAM1 en la patogenicidad del virus influenza. Además, el silenciamiento de CEACAM1 endógeno resultó en niveles reducidos de producción proinflamatoria citoquina/quimoquina, así como en niveles reducidos de replicación viral después de la infección H5N1. Texto: Los virus de la gripe causan enfermedades respiratorias estacionales agudas y altamente contagiosas en todos los grupos de edad. Entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave relacionada con la gripe y más de 250 000 muertes cada año. Además de los brotes estacionales constantes, las cepas de gripe aviar altamente patógena (IAAP), como la H5N1, siguen siendo una amenaza pandémica constante, con cifras recientes de la OMS que muestran 454 infecciones de laboratorio confirmadas y una tasa de mortalidad del 53%. Es importante señalar que los seres humanos tienen muy poca inmunidad preexistente contra las cepas del virus de la gripe aviar. Además, no existe una vacuna H5N1 humana comercialmente disponible. Dado el potencial de los virus H5N1 para desencadenar una pandemia 1,2, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para combatir las deficiencias conocidas en nuestra capacidad de controlar los brotes. La eficacia de la vacuna es altamente variable, como lo demuestra una epidemia particularmente grave de 2017/18, y se requiere una reformulación frecuente de la vacuna para combatir las mutaciones en curso en el genoma del virus de la gripe. Además, se ha reportado resistencia antiviral para muchas cepas circulantes, incluyendo el virus de la gripe aviar H7N9 que emergió en 2013 3, 4. También se ha demostrado que los virus de la gripe A apuntan y secuestran múltiples vías celulares del huésped para promover la supervivencia y replicación 5, 6. Como tal, hay evidencia creciente que sugiere que la focalización de las vías del huésped influirá en la replicación del virus, la inflamación, la inmunidad y la patología 5, 7. Las estrategias de intervención alternativas basadas en la modulación de la respuesta del huésped podrían utilizarse para complementar los actuales protocolos profilácticos y terapéuticos. En el presente estudio, caracterizamos la infección por el virus de la gripe de células epiteliales alveolares primarias humanas de tipo II (ATII) aisladas del tejido pulmonar humano normal donadas por pacientes sometidos a resección pulmonar. Las células ATII son un modelo de infección fisiológicamente relevante ya que son un objetivo principal para los virus de la gripe A al entrar en el tracto respiratorio 10. Expresión del gen huésped humano tras la infección por el virus HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) de las células ATII primarias se analizó utilizando la secuenciación profunda de Ilumina HiSeq. Con el fin de obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la modulación de la inmunidad del huésped en un entorno antiinflamatorio, también analizamos los cambios en la expresión génica tras la infección por HPAI H5N1 en presencia del inhibidor de la especie de oxígeno reactivo (ROS), apo El análisis HiSeq descrito aquí se ha centrado en genes regulados diferencialmente después de la infección por H5N1. Se consideraron varios criterios al elegir un "hit" para estudios posteriores. Estos incluyen: (1) Novedad; ¿se ha estudiado este gen antes en el contexto de la infección por virus influenza/ patogénesis? (2) Inmunregulación; ¿tiene este gen un papel regulador en las respuestas inmunitarias del huésped para que tenga el potencial de ser manipulado para mejorar la inmunidad? (3) Reactivos terapéuticos; ¿existen reactivos terapéuticos disponibles comercialmente, tales como inhibidores específicos o anticuerpos inhibidores que puedan ser utilizados para estudios in vitro e in vivo para optimizar estrategias terapéuticas? (4) Modelos animales; ¿existe un modelo de ratón knock-out disponible para estudios in vivo de infección por gripe? Basado en estos criterios, la molécula de adhesión celular relacionada con carcinoembrión-antigeno (CEA) 1 (CEAC CEACAM1 (también conocido como BGP o CD66) se expresa en células epiteliales y endoteliales 11, así como células B, células T, neutrófilos, células NK, macrófagos y células dendríticas (DC) [12] [13] [14]. Se ha demostrado que el CEACAM1 humano actúa como receptor de varios patógenos bacterianos y fúngicos humanos, entre ellos Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi y Candida albicans, pero todavía no se ha implicado en la entrada del virus [15] [16] [17]. Sin embargo, hay evidencia emergente que sugiere que el CEACAM1 está involucrado en la inmunidad del huésped ya que se detectó una mayor expresión en linfocitos en mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus 18 y en tejido cervical aislado de Se han notificado 11 variantes de empalme CEACAM1 en humanos 20. Las isoformas CEACAM1 (Uniprot P13688-1 a -11) pueden diferir en el número de dominios similares a inmunoglobulinas presentes, en presencia o ausencia de un dominio transmembrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (es decir, L, larga o S, corta). La proteína CEACAM1 humana de larga duración (CEACAM1-4L) consiste en cuatro dominios extracelulares (un dominio de inmunoglobulina variable similar a la región IgV) y tres dominios constantes de inmunoglobulina 2-como (IgC2)), un dominio transmembrana y una larga cola citoplasmática. La cola citoplasmática larga contiene dos motivos inhibidores a base de inmunorreceptores (ITIM) que están ausentes en la forma corta 20. Las isoformas más comunes expresadas por las células inmunes humanas son CEACAM1-4L y CEACAM1-3L 21. CEACAM1 interactúa homofílicamente consigo mismo 22 o heterofílicamente con CEACAM5 (un miembro relacionado de la familia CEACAM) 23. El estado dimérico permite el reclutamiento de moléculas de señalización como las cinasas SRC-familiar, incluyendo la homología SRC tirosina fosfatasa 2 (SH2)-dominio que contiene proteína tirosina fosfatasa 1 (SHP1) y SHP2 miembros para fosforilar las ITIMs 24. Como tal, la presencia o ausencia de ÍTIMes en las isoformas CEACAM1 influye en las propiedades de señalización y la función celular aguas abajo. Las interacciones homofílicas o heterofílicas CEACAM1 y la fosforilación ITIM son críticas para muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de la función linfocítica, inmunovigilancia, crecimiento celular y diferenciación 25, 26 y activación de neutrófilos y adhesión a las células diana durante las respuestas inflamatorias 27. Cabe señalar que la expresión CEACAM1 ha sido modulada in vivo utilizando un anticuerpo anti-CEACAM1 (MRG1) para inhibir el crecimiento de melanoma xenoinjerto positivo CEACAM1 en ratones SCID/NOD 28. Esto pone de relieve una vía de intervención potencial que puede ser explotada en otros procesos de la enfermedad, incluyendo la infección por virus. Además, los ratones Ceacam1-knockout están disponibles para estudios posteriores de infección in vivo. Nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y expresión proteica CEACAM1 fueron altamente elevados después de la infección por HPAI H5N1. Además, la inhibición del ARN interferente pequeño (siRNA) mediada por CEACAM1 redujo la producción de citocinas inflamatorias y quimioquinas, y más importante aún, inhibió la replicación del virus H5N1 en células ATII humanas primarias y en la línea de células epiteliales respiratorias A549 de tipo humano continuo. Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que CEACAM1 es un candidato atractivo para modular la inmunidad específica de la gripe. En resumen, nuestro estudio ha identificado un nuevo objetivo que puede influir en la inmunidad HPAI H5N1 y sirve para resaltar la importancia de manipular las respuestas del huésped como una forma de mejorar los resultados de la enfermedad en el contexto de la infección por virus.Tres grupos experimentales fueron incluidos en el análisis HiSeq de la infección por H5N1 en presencia o ausencia del inhibidor de ROS, apocinina: (i) células no infectadas tratadas con DMSO 1% (control de vehículos) (ND), (ii) células infectadas por H5N1 tratadas con DMSO 1% (HD) y (iii) células infectadas por H5N1 tratadas con apocinina 1 mM disuelta en DMSO (HA). Estos tres grupos fueron evaluados mediante comparaciones de pares: ND vs. HD, ND vs. HA, y HD vs. HA. La infección por H5N1 y el tratamiento con apocinina Las células ATII aisladas de los pacientes humanos 29, 30 fueron infectadas con H5N1 en el lado apical a una multiplicidad de infección (MOI) de 2 durante 24 horas y se extrajo ARN. HiSeq fue realizado en muestras y se lea cartografiado al genoma humano donde luego fueron ensamblados en transcriptomas para análisis de expresión diferencial. Un total de 13.649 genes fueron identificados con FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) > 1 en al menos uno de los tres grupos experimentales. Un total de 623 genes fueron significativamente regulados y 239 genes fueron significativamente regulados (valor q < 0,05, ≥ 2 veces el cambio) después de la infección por H5N1 (ND vs. HD) (fig. 1A; Tabla S1 ). La infección por HPAI H5N1 de las células ATII activó un estado antiviral, como lo demuestra la regulación ascendente de numerosos genes inducidos por interferón, genes asociados con la defensa de los patógenos, proliferación celular, apoptosis y metabolismo (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, la cartografía de la ruta de la Enciclopedia de los genes y los genomas de Kyoto (KEGG) mostró que muchos de los genes regulados en el grupo HD se asignaron a la señalización del TNF (hsa04668), señalización de receptores similares a los de los peajes (hsa04620), interacción citoquina-citoquina del receptor (hsa04060) y señalización del receptor tipo RIG-I (hsa04622) (en el grupo tratado con H5N1 y apocinina (HA), un gran número de genes también fueron significativamente regulados (509 genes 1B ; Tabla S1 ) relativa al grupo de control de la ND. Aunque un subconjunto de genes se expresó de manera diferencial en los grupos HD y HA, ya sea siendo regulados de forma ascendente (247 genes, Fig. 1D ) o desregulados (146 genes, Fig. 1E ), la mayoría de los genes no se superpusieron de hecho entre los grupos HD y HA (Fig. 1D, E). Esto sugiere que el tratamiento con apocinina puede afectar a la expresión génica independiente de la infección H5N1. El análisis de enriquecimiento de genes regulados por la apocinina mostró la implicación de la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337), la respuesta defensiva al virus (GO:0009615), la regulación negativa de los procesos virales (GO:48525) y la respuesta al estrés (GO:0006950) ( Tabla S2 Los genes regulados por la apocinina incluyen aquellos que están involucrados en la adhesión celular (GO:0007155), la regulación de la migración celular (GO:0030334), la regulación de la proliferación celular (GO:0042127), la transducción de señales (GO:0007165) y los procesos de oxidación-reducción (GO:0055114) (Tabla S2, "ND vs. HA Down"). Un total de 623 genes fueron regulados después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up", Fig. 1F ). Al solapar las dos listas de genes de "ND vs. HD Up" y "HD vs. HA Down", 245 genes se mostraron regulados en presencia de apocinina (Fig. 1F ). Al superponer tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Up", 55 genes de los 245 genes (190 más 55 genes) estuvieron presentes en las tres listas (Fig. 1G), lo que indica que estos 55 genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina, pero a un nivel que todavía era significativamente más alto que el de las células no infectadas. Los 55 genes incluyen aquellos involucrados en la inmunidad de influenza A (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), señalización de Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), señalización de receptores tipo RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) y procesamiento y presentación de antígenos (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Tablas S3 y S4). Por lo tanto, las respuestas inmunológicas críticas inducidas después de la infección por H5N1 no fueron amortiguadas después del tratamiento con apocinina. Los 190 genes restantes de 245 no estaban presentes en la lista "ND vs. HA Up", lo que sugiere que esos genes fueron significativamente inhibidos por la apocinina a un nivel similar a las células de control no infectadas (Fig. 1G ). Los 190 genes incluyen los que participan en la señalización del TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), interacción del receptor de citoquinas-citoquinas (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), vía de señalización del NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, CD40) y señalización del PI3K-Akt (hsa04151; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, Esto es consistente con el papel de la apocinina en la reducción de la inflamación 31. Al superponer las tres listas de genes de "ND vs. HD Up", "HD vs. HA Down" y "ND vs. HA Down", se encontraron 11 genes en las tres comparaciones (Fig. 1H ). Esto sugiere que estos 11 genes están regulados después de la infección por H5N1 y son significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en las células de control no infectadas (Fig. 1H ). Entre ellos estaban los genes inflamatorios citoquinas/quimioquinas, incluyendo CXCL5, IL1A, AXL (miembro de la familia de receptores TAM de tirosina quinasas) y TMEM173/STING (estimulador de los genes IFN) (Tabla S4). Nuestro estudio anterior demostró que la infección por H5N1 de células A549 en presencia de apocinina realzó la expresión de reguladores negativos de la señalización de citocinas (SOCS), SOCS1 y SOCS3 6. Esto, a su vez, dio lugar a una reducción de la producción de citocinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 (IL6, IFNB1, CXCL10 y CCL5 en células A549), que no se atribuyó a una menor replicación del virus ya que los títulos del virus no se vieron afectados por el tratamiento con apocinina 6. Realizamos un análisis qRT-PCR sobre las mismas muestras de ARN presentadas para el análisis HiSeq para validar los resultados de HiSeq. IL6 (fig. 2A), IFNB1 (fig. 2B), CXCL10 (fig. 2 2D ) la expresión génica fue significativamente elevada en las células ATII después de la infección y se redujo por la adición de apocinina (excepto para IFNB1). De acuerdo con hallazgos previos en las células A549 6, la infección por H5N1 solo indujo la expresión de SOCS1 como se muestra en el análisis HiSeq y qRT-PCR (Fig. 2E ). El tratamiento con apocinina aumentó aún más la expresión de SOCS1 mRNA (Fig. 2E ). Aunque el análisis de HiSeq no detectó un aumento estadísticamente significativo de SOCS1 tras el tratamiento con apocinina, los cambios de pliegue de Log2 en la expresión génica de SOCS1 fueron similares entre los grupos HD y HA (4,8 veces frente a 4,0 veces) (Fig. 2E ). El análisis de HiSeq de la transcripción de El análisis de qRT-PCR mostró que aunque el ARNm SOCS3 fue ligeramente aumentado después de la infección por H5N1, fue significativamente mejor regulado en la presencia Tabla 2. Los representantes de las vías de KEGG sobrerrepresentadas con un valor máximo de P de 0,05 y el número de genes que contribuyen a cada vía que se regula significativamente después de la infección por H5N1 ("ND vs. HD Up"). La lista completa de vías de KEGG se presenta en la Tabla S3. de apocinina (Fig. 2F). Por lo tanto, la apocinina también contribuye a la reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas estimuladas por H5N1 en las células ATII. Apocinina, un compuesto que inhibe la producción de ROS, ha demostrado influir en las respuestas específicas de la gripe in vitro 6 e in vivo 5. Aunque los títulos del virus no se ven afectados por el tratamiento con apocinina in vitro 6, se observa cierta actividad antiviral in vivo cuando los ratones han sido infectados con un virus A/HongKong/X31 H3N2 de baja patogenicidad 6. HiSeq análisis del virus HPAI H5N1 transcripción del gen mostró que aunque hubo una tendencia al aumento de la expresión del virus de la gripe tras el tratamiento con apocinina, sólo la expresión del gen influenza no estructural (NS) aumentó significativamente (Fig. 2G). La reducción de la producción de citoquinas y quimioquinas en las células ATII infectadas por H5N1 es poco probable que se asocie con una menor replicación del virus. El análisis de enriquecimiento del GO se realizó en genes que se mejoraron significativamente después de la infección por HPAI H5N1 en células ATII en presencia Muchos de los genes regulados por H5N1 participaron ampliamente en la respuesta defensiva (GO:0006952), la respuesta al estímulo biótico externo (GO:0043207), los procesos del sistema inmunitario (GO:0002376), la vía de señalización mediada por citoquinas (GO:0019221) y la vía de señalización del interferón tipo I (GO:0060337) (Tabla 1; Tabla S2 ). Además, muchos de los genes regulados por H5N1 se asignaron a las vías metabólicas (hsa01100), la interacción del receptor citoquina-citoquina (hsa04060), la gripe A (hsa05164), la señalización del TNF (hsa04668) o la señalización del Jak-STAT (hsa04630) (Tabla S3). Sin embargo, no todos los genes regulados por H5N1 en estas vías fueron inhibidos por el tratamiento con apocinina como se mencionó anteriormente (fig. 1F ; Tabla S3 ).. Los cambios de plegado después del análisis QRT-PCR se calcularon utilizando el método 2 Ct (eje Y derecho) normalizado a β-actina y comparado con el grupo ND. Los datos de HiSeq se calcularon como cambio de plegado Log2 (eje Y izquierdo) comparado con el grupo ND. La transcripción IFNB1 no fue detectada en ND, por lo tanto los datos de HiSeq IFNB1 de los grupos HD y HA se expresaron como FPKM. *p < 0,05 y **p < 0,01, ***p < 0,001 comparado con ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, comparado (G) Análisis Hiseq de perfiles de expresión génica del virus de la gripe H5N1 con o sin tratamiento de apocinina en células ATI primarias humanas. # p < 0,05, en comparación con HD. Reregulación de la molécula de adhesión celular CEACAM1 en células ATI infectadas por H5N1. La molécula de adhesión celular CEACAM1 ha demostrado ser crítica para la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección, inflamación y cáncer 20. La transcripción de CEACAM1 fue significativamente regulada después de la infección por H5N1 (Fig. 3A). En contraste, un miembro relacionado de la familia CEACAM, CEACAM5, no se vio afectado por la infección por H5N1 (Fig. 3B). También vale la pena señalar que se obtuvieron más lecturas para CEACAM5 (>1000 FPKM) (Fi 3B ) que CEACAM1 (~7 FPKM) (Fig. 3A) en células ATII no infectadas, lo cual es consistente con sus patrones de expresión normales en el tejido pulmonar humano 32. Por lo tanto, aunque CEACAM1 forma heterodímeros con CEACAM5 23, la expresión basal más alta de CEACAM5 en células ATII puede explicar por qué su expresión no fue aumentada por la infección por H5N1. La expresión proteica CEACAM1 endógena también fue analizada en células A549 no infectadas o infectadas por el virus influenza (Fig. 3C ) y ATII (Fig. 3D ). La expresión proteica CEACAM1 fue leve, pero no significativamente aumentada en células A549 infectadas por el virus A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) durante 24 o 48 horas No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína CEACAM1 en varios MOI (2, 5 ó 10) o entre los plazos de 24 y 48 hpi (fig. 3C). Después de examinar la expresión proteica CEACAM1 después de la infección por el virus PR8 en células A549, se examinó la expresión proteica CEACAM1 en células AII humanas primarias infectadas con HPAI H5N1 y en comparación con la infección por el virus PR8 (fig. 3D). Las células ATII fueron infectadas con el virus PR8 a un MOI de 2, una dosis que indujo la regulación ascendente de citocinas y el gen Matrix (M) de influenza analizado por qRT-PCR (datos no mostrados). Los niveles de proteína CEACAM1 endógena fueron significativamente elevados y similares en las células ATII infectadas por H5N1 en los tres MOI analizados. La expresión de proteína CEACAM1 en las células ATII infectadas por H5N1 en los MOI de 0,5 fue mayor a 48 hpi que en las observadas a 24 hpi (fig. 3D ). La infección por el virus HPAI H5N1 en los MOI de 0,5, 1 y 2 estimuló niveles endógenos más altos de expresión proteica de CEACAM1 en comparación con la infección por el virus PR8 en un MOI de 2 en el momento correspondiente (un aumento máximo de ~9 veces inducido por H5N1 en los MOI de 0,5 y 1 a 48 hpi en comparación con PR8 en el MOI de 2), sugiriendo un posible papel para CEACAM1 en la patogenicidad del Para entender el papel de CEACAM1 en la patogénesis de la gripe, las células A549 y ATII fueron transfectadas con siCEACAM1 para desmontar la expresión proteica endógena de CEACAM1. Las células ATII y A549 fueron transfectadas con siCEACAM1 o control negativo de siNeg. La expresión de cuatro variantes principales de CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S, y proteína CEACAM1 fueron analizadas utilizando SYBR Green qRT-PCR y Western blotting, respectivamente. El análisis de SYBR Green qRT-PCR mostró que las células ATII transfectadas con 15 pmol de siCEACAM1 redujeron significativamente la expresión de CEACAM1-4L y -4S en comparación con el control de siNeg, mientras que la expresión de CE La expresión proteica CEACAM1 se redujo aproximadamente en un 50% en las células ATII y A549 después de la transfección de siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg (Fig. 4B). El aumento de dosis de siCEACAM1 (10, 15 y 20 pmol) no redujo aún más la expresión proteica CEACAM1 en las células A549 (Fig. 4B ). Como tal, se eligieron 15 pmol de siCEACAM1 para estudios posteriores de caída en las células ATII y A549. Es importante destacar que el anticuerpo anti-CEACAM1 solo detecta isoformas L basadas en la información epítope proporcionada por Abcam. Por lo tanto, las reducciones observadas en la expresión proteica CEACAM1 se pueden atribuir principalmente a la abolición de CEACAM1-4L. Las consecuencias funcionales de la caída de CEACAM1 fueron examinadas en las células ATII y A549 después de la infección por H5N1. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 y TNF fueron analizadas en las células ATII infectadas por H5N1 y A549 usando qRT-PCR. ATII (Fig. 5A ) y A549 células transfectadas con siCEACAM1 mostraron una expresión significativamente menor de IL6, CXCL10 y CCL5 en comparación con las células transfectadas por siNeg. Sin embargo, la expresión de la citocina antiviral, IFNB1, no se vio afectada en ambos tipos de células. Además, la expresión TNF, que puede ser inducida por IFNs de tipo I 33, fue significativamente menor en las células A549 transfectadas por siCEACAM1 (Fig. 5B), pero no se afectó en las células ATII transfectadas por siCEACAM1 (fig. 5A). Se cree que la hipercitokinemia o "tormenta de citoquinas" en los pacientes infectados por el virus H5N1 y H7N9 contribuye al daño tisular inflamatorio 34, 35. La disminución de CEACAM1 en el contexto de una infección viral grave puede reducir la inflamación causada por la infección por H5N1 sin amortiguar la respuesta antiviral. Además, la replicación del virus se redujo significativamente en 5,2 veces en ATII (fig. 5C) y 4,8 veces en células A549 (fig. 5D) transfectadas con siCEACAM1 en comparación con las células transfectadas por siNeg. 5C,D). Los virus de la gripe utilizan maquinaria celular huésped para manipular procesos celulares normales con el fin de promover la replicación y evadir las respuestas inmunes del huésped. Los estudios en el campo se centran cada vez más en la comprensión y modificación de los factores principales del huésped para mejorar la enfermedad. Ejemplos incluyen modulación de ROS para reducir la inflamación 5 e inhibición de NF-B y activación mitogénica de Raf/MEK/ERK cinasa en cascada para suprimir la replicación viral 36, 37. Estas estrategias de enfoque del huésped ofrecerán una alternativa a las intervenciones actuales que se centran en dirigir el virus. En el presente estudio, analizamos perfiles de expresión génica del huésped humano después de la infección por HPAI H5N1 y tratamiento con el antioxidante, apocinina. Como era de esperar, genes que fueron significativamente regulados después de la infección H5N1 estuvieron involucrados en procesos biológicos Además, los genes regulados por H5N1 también participaron en la regulación de la fosforilación proteica, el metabolismo celular y la proliferación celular, que se cree que son explotados por virus para la replicación 38. El tratamiento con apocinina tuvo tanto antiviral (Tablas S2-S4) 5 como proviral impacto (Fig. 2G), lo que no es sorprendente ya que los ROS son potentes agentes microbicidas, así como importantes moléculas de señalización inmune en diferentes concentraciones 39. En nuestras manos, el tratamiento con apocinina redujo la inflamación inducida por H5N1, pero también impactó la respuesta de defensa celular, la producción de citocinas y la señalización mediada por citoquinas. DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5) no fue desregulado (Tabla S1 ). Dada la interferencia significativa de los virus de la gripe en la inmunidad del huésped, centramos nuestra atención en los reguladores clave de la respuesta inmunitaria. Mediante el análisis HiSeq, identificamos la molécula de adhesión celular CEACAM1 como un regulador crítico de la inmunidad. La caída de CEACAM1 inhibió la replicación del virus H5N1 y redujo la producción de citoquinas inflamatorias/quimioquinas estimuladas por H5N1. La infección por H5N1 dio lugar a una regulación significativa de varios genes citoquinas/quimioquinas inflamatorias, incluyendo AXL y STING, que fueron significativamente reducidos por el tratamiento con apocinina a un nivel inferior al observado en células no infectadas (Tabla S Se ha demostrado previamente que el tratamiento con anticuerpos anti-AXL de ratones infectados por PR8 redujo significativamente la inflamación pulmonar y los títulos de virus 40. STING ha demostrado ser importante para promover las respuestas antivirales, ya que las células STING-knockout TPH-1 producen menos IFN de tipo I después de la infección por el virus influenza A 41. La reducción de la expresión del gen STING u otros factores antivirales (por ejemplo, IFNB1, MX1, ISG15; Tabla S1 ) por apocinina, puede explicar en parte el ligero aumento de la transcripción del gen influenza después del tratamiento con apocinina (Fig. 2G). Estos resultados también sugieren que el tratamiento con apocinina puede reducir la inflamación inducida por H5N1 y la apoptosis. De hecho, los efectos antiinflamatorios y antiapoptóticos de la apocinina han sido mostrados previamente en varios modelos de enfermedad, incluyendo diabetes mellitus 42, infarto de miocardio 43, neuroinflamación 44 e infección por el virus de la gripe 6. El reconocimiento del ARN viral intracelular por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) desencadena la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias que reclutan células inmunes innatas, tales como neutrófilos y células NK, al sitio de la infección para ayudar en el aclaramiento viral 45. Los neutrófilos ejercen su función citotóxica al unirse primero a células epiteliales infectadas por gripe a través de moléculas de adhesión, como CEACAM1 46. Además, estudios han indicado que la infección por virus de gripe promueve la apoptosis de neutrófilos 47, La fosforilación de los motivos de CEACAM1 ITIM y la activación de caspasa-3 es fundamental para mediar los eventos antiapoptóticos y para promover la supervivencia de los neutrófilos 27. Esto sugiere que los eventos antiapoptóticos mediados por CEACAM1 pueden ser importantes para la resolución in vivo de la infección por el virus de la gripe, que pueden investigarse más a fondo a través de estudios de infección con ratones Ceacam1-knockout. Las células NK desempeñan un papel crítico en la defensa innata contra los virus de la gripe al reconocer y matar las células infectadas. Se ha demostrado que las interacciones homo-o heterofílicas CEACAM1 inhiben la eliminación de NK 25, 26, y se cree que contribuyen a la evasión inmune de células tumorales 50. Ante estos hallazgos, se podría sugerir la posibilidad de que la regulación de CEACAM1 (para inhibir la actividad de NK) pueda ser una estrategia de evasión inmune novedosa y no característica empleada por virus de la gripe. Nuestro laboratorio está investigando ahora el papel de CEACAM1 en la función celular de NK. Inhibidores de pequeñas moléculas de proteínas cinasas o fosfatasas proteicas (por ejemplo, inhibidores para Src, JAK, SHP2) se han desarrollado como terapias para el cáncer, inflamación, enfermedades inmunitarias y metabólicas 51. Modulación de la fosforilación, dimerización CEACAM1 y la función posterior con inhibidores de moléculas El mecanismo molecular de la acción CEACAM1 después de la infección también ha sido explorado en células A549 utilizando el virus PR8 52. Vitenshtein et al. demostraron que CEACAM1 fue regulado después del reconocimiento del ARN viral por RIG-I, y que esta regulación era dependiente del factor 3 regulador del interferón (IRF3). Además, la fosforilación de CEACAM1 por SHP2 inhibió la replicación viral al reducir la fosforilación del objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) para suprimir la producción global de proteínas celulares. En el presente estudio, utilizamos un modelo de infección más relevante fisiológicamente, células ATII humanas primarias, para estudiar el papel de otros estudios se requerirá investigar/confirmar los mecanismos moleculares de CEACAM1 upregulation después de la infección del virus influenza, especialmente in vivo. Como se ha observado un aumento de la regulación de CEACAM1 en otras infecciones virales, como el citomegalovirus 18 y el papilomavirus 19, será importante determinar si un mecanismo de acción común puede ser atribuido a CEACAM1 para determinar su significación funcional. Si esto se puede establecer, CEACAM1 podría ser utilizado como objetivo para el desarrollo de un agente pan-antiviral. En resumen, moléculas en la superficie celular como CEACAM1 son particularmente atractivas candidatas para el desarrollo terapéutico, ya que los fármacos no necesitan cruzar la membrana celular para ser eficaces. La focalización de genes codificados por el huésped en combinación con antivirales y vacunas actuales puede ser una forma de reducir la morbilidad y mortalidad asociadas a la infección por el virus de la gripe. Es importante destacar que la reducción de la expresión CEACAM1 dio lugar a una reducción de la replicación del virus de la gripe y sugiere que la selección de esta molécula puede ayudar a mejorar los resultados de la enfermedad. El aislamiento y cultivo de células ATII humanas primarias. Las muestras de tejido pulmonar no tumoral humano fueron donadas por pacientes anónimos sometidos a resección pulmonar en el Hospital Universitario, Geelong, Australia. Los protocolos de investigación y ética humana fueron aprobados por los Comités de Ética Humana de la Universidad Deakin, Barwon Health y la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de tejido. Todas las investigaciones se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas en la Declaración Nacional sobre Conducta Ética en la Investigación Humana (2007). El muestreo de tejido pulmonar normal fue confirmado por el Victorian Cancer Biobank, Australia. Las células epiteliales alveolares humanas tipo II (ATII) fueron aisladas y cultivadas utilizando un método descrito previamente 30, 53 con modificaciones menores. Brevemente, el tejido pulmonar con bronquios visibles fue extirpado y perfundido con abundante PBS y sumergido en Trypsin-EDTA (Gibco) dos veces durante 15 minutos a 37 °C. El tejido parcialmente digerido fue cortado en secciones y digerido posteriormente en la Solución Sal Balanzada de Hank (HBSS) que contenía elastasa (12,9 unidades/ml; Roche Diagnostics) y Dnasa I (0,5 mg/ml; Roche Diagnostics) durante 60 minutos a 37 °C. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un colador de células de 40 μm y se permitió que las células (incluyendo macrófagos y fibroblastos) se unieran a platos de Petri tratados con cultivos tisulares en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 (Gibco) y medio de crecimiento de la vía aérea pequeña (SAGM) (Lonza) que contenía 5% de suero fetal de ternera (FCS) y 0,5 mg/ml de Dnasa I durante 2 horas a 37 °C. Se recogieron células no adherentes, incluyendo células ATII, y se sometieron a centrifugación a 300 g durante 20 minutos en un gradiente discontinua de densidad de Percoll (1,089 y 1,040 g/ml). Se recogieron células ATII purificadas de la interfaz de dos gradientes de densidad, lavadas en HBSS y resuspendidas en medio SAGM suplementadas con un 1% de FCS filtrados por carbón (Gibco) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células ATII fueron chapadas en inserciones Transwell de poliéster (0,4 μm de poro; Corning) recubiertas de colágeno de placenta humana de tipo IV (0,05 mg/ml; Sigma) a 300.000 células/cm 2 y cultivadas bajo condiciones cubiertas de líquido en una incubadora humidificada (5% CO 2, 37 °C). El medio de crecimiento se cambió cada 48 horas. Estas condiciones de cultivo suprimieron la expansión de fibroblastos dentro de las células ATII recién aisladas y alentaron A549 células basales alveolares alveolares humanas carcinómicas tipo II y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron provistas por la instalación de cultivo de tejidos del Laboratorio Australiano de Salud Animal (AAHL), CSIRO. Las células A549 y MDCK se mantuvieron en el medio F12K de Ham (GIBCO) y en el medio RPMI-1640 (Invitrogen), respectivamente, complementadas con 10% FCS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (GIBCO) y mantenidas a 37 °C, 5% CO 2. Virus e infección viral. HPAI A/chicken/Vietnam/0008/2004 H5N1 (H5N1) se obtuvo de AAHL, CSIRO. Las existencias virales de A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) se obtuvieron de la Universidad de Melbourne. Las existencias virales se prepararon utilizando la inoculación estándar de huevos embrionados de 10 días de edad. Se preparó un único stock de virus para su uso en todos los ensayos. Todos los experimentos con H5N1 se realizaron en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en AAHL, CSIRO. Las células fueron infectadas con virus influenza A como se describió anteriormente 6, 29. Brevemente, los medios de cultivo fueron eliminados y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces seguidas de inoculación con virus durante 1 hora. Luego se extirparon los virus y las células fueron lavadas con PBS caliente tres veces, e incubadas en los medios de cultivo frescos libres de suero apropiado que contenían 0,3% BSA a 37 ° Para el análisis de HiSeq, las células ATII de tres donantes fueron infectadas en el lado apical con H5N1 en un MOI de 2 durante 24 horas en un medio SAGM libre de suero, suplementadas con albúmina sérica bovina de 0,3% (BSA) que contenía 1 mM de apocinina disuelta en DMSO o 1% de control del vehículo DMSO. Las células ATII incubadas en medios que contenían 1% de DMSO fueron utilizadas como control negativo. Para otros estudios de infección viral posteriores, células ATII de un conjunto diferente de tres donantes (diferentes de los utilizados en el análisis de HiSeq) o células A549 de al menos tres pasajes diferentes fueron infectadas con virus influenza A en varios MOIs, como se indica en el texto. Para los estudios de infección por PR8, se incluyó una concentración final de 0,5 μg/ml L-1-Tosylamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tratada con tripsina (Worthington) en los medios de comunicación post-inoculación para ayudar a la replicación. Los títulos de virus se determinaron utilizando ensayos de placa estándar en células MDCK como se describió anteriormente 55. Extracción de ARN, control de calidad (QC) e HiSeq análisis. Las células ATII de tres donantes se utilizaron para el análisis de HiSeq. El ARN total se extrajo de las células utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Las células infectadas por gripe se lavaron con PBS tres veces y las células se lisaron con tampón RLT complementado con β-mercaptoetanol (10 μL/ml; Gibco). Los lisatos celulares fueron homogeneizados con columnas QIAshredder seguidas de digestión del ADN en la columna con el conjunto de ADN libre de RNASA (Qiagen) y ARN extraídos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó QC inicial para asegurar que la cantidad y calidad de las muestras de ARN para el análisis HiSeq cumplieran los siguientes criterios: 1) las muestras de ARN tenían relaciones OD260/280 entre 1,8 y 2,0 medida con el espectrofotómetro NanoDropTM (Termo Scientific); 2) las concentraciones de la muestra eran de 100 ng/μl como mínimo; 3) el ARN fue analizado por electroforesis de gel de agarosa. La integridad y calidad del ARN fueron validadas por la presencia de bandas claras agudas de 28S y 18S ARN ribosomal, con una relación 28S Como parte del QC inicial y como indicación de infección constante por H5N1, la PCR de transcriptasa inversa cuantitativa paralela en tiempo real (qRT-PCR) utilizando las mismas muestras de ARN utilizadas para el análisis de HiSeq se realizó en duplicado como se describió anteriormente 6 para medir la expresión de ARNm de IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 y SOCS3, todas las cuales se conocen por estar reguladas después de la infección por HPAI H5N1 de las células A549 6 Análisis de secuenciación y anotación. Después de confirmar las sumas de comprobación y evaluar la calidad de los datos brutos de los archivos FASTQ con FASTQC, las lecturas de ARN-Seq se procesaron de acuerdo con los protocolos estándar de tuberías Tuxedo 56, utilizando el genoma humano anotado (GRCh37, descargado de Brevemente, las lecturas crudas para cada muestra fueron cartografiadas al genoma humano usando TopHat2, ordenadas y convertidas al formato SAM usando Samtools y luego ensambladas en transcriptomas usando Cufflinks. Cuffmerge fue usado para combinar anotaciones de transcripción de muestras individuales en un único transcriptoma de referencia, y Cuffquant fue usado para obtener conteos de lectura por muestra. Cuffdiff fue usado para realizar análisis de expresión diferencial. Todos los programas fueron ejecutados usando parámetros recomendados. Es importante notar que el archivo gtf de referencia proporcionado a buffmerge fue editado primero usando un script de pitón personalizado para excluir líneas que contienen características distintas de exon/cds, y contigs distintos de cromosomas 1-22, X, Y. GO término y enriquecimiento de KEGG. Los identificadores de genes oficiales para transcripciones que fueron moduladas diferencialmente después de la infección por HPAI H5N1 con o sin tratamiento con apocinina se compilaron en seis listas de objetivos a partir de comparaciones de pares ("ND vs. HD Up", "ND vs. HD Down", "ND vs. HA Up", "HD vs. HA Up", "HD vs. HA Down"). Las transcripciones expresadas diferencialmente significativamente se definieron como si tuvieran un cambio ≥2 veces con un valor P ajustado de Benjamini-Hochberg < 0.01. Una lista de antecedentes de genes se compiló mediante la recuperación de todos los identificadores de genes identificados en el presente análisis HiSeq con FPKM > 1. El enriquecimiento del proceso biológico GO se realizó utilizando Gorilla, comparando el fondo no alineado y las listas de objetivos 57. Las listas de objetivos también fueron sometidas al análisis de la vía KEGG utilizando un mapeador básico de la vía KEGG 59 y DAVID Bioinformática Recursos Herramienta de Anotación Funcional 60,61. Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las concentraciones de genes de interés de mRNA fueron evaluadas y analizadas utilizando qRT-PCR realizadas en duplicado como se describió anteriormente 6. Brevemente, después de la extracción de ARN total de células infectadas por la gripe, cDNA fue SCIEntIfIC RepoRtS  (2018) 8:15468  DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 preparado utilizando SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). La expresión génica de varias citocinas se evaluó utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Biosistemas aplicados) con imprimaciones y sondas comerciales TaqMan, con la excepción del gen Matrix (M) influenza (imprimación posterior 5′-CTTCTAACGAGGGAACGTA-3′; imprimación inversa 5′-GGTGAGGAGGGGTGTCTTGTCTTTA-3′; sonda 5′-FAM-TCAGGCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3′) 62. Los imprimadores específicos 63 (cuadro S5) fueron diseñados para estimar la expresión de CEACAM1-4L, -4S, -3L y -3S en células ATII y A549 utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de amplificación inespecífica fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa de productos QRT-PCR (15 μL) (datos no mostrados). La expresión génica se normalizó a ARNm de β-actina utilizando el método 2 CT donde se determinaron los niveles de expresión en relación con los controles celulares no infectados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado utilizando un sistema de PCR Applied Biosystems ® StepOnePlus TM en tiempo real. Las cantidades iguales de proteína fueron cargadas en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), resueltas por SDS/PAGE y transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). Las membranas fueron sondeadas con anticuerpo monoclonal CEACAM1 anti-humano EPR4049 (ab108397, Abcam) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rabbit de cabra (Invitrogen). Las proteínas fueron visualizadas mediante membranas incubadoras con Chemiluminiscence potenciado Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) seguido de detección en un sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc TM MP o en Amersham TM Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare). Para usar la β-actina como control de carga, la misma membrana fue despojada en tampón de destripamiento (1,5% (p/v) glicina, 0,1% (p/v) SDS, 1% (v/v) Tween-20, pH 2.2) y re-probada con un anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con HRP en cada muestra, respectivamente. La densidad de la banda proteica se cuantificó utilizando el software Fiji (versión 1.49J10) 64. La densidad de la banda proteica CEACAM1 se normalizó contra la de β-actina y se expresó como cambios de pliegue en comparación con los controles. Las células ATII y A549 fueron cultivadas hasta un 80% de confluencia en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con pequeño ARN interferente (siARN) dirigido al gen humano CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Select Pre-designed siRNA, Ambion ® ) o control de siRNA (siNeg; Silencer ® Select Negative Control No. 1 siRNA, Ambion ® ) utilizando Lipofetamina 3000 (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección y eficiencia silenciadora fueron evaluadas después de 48 horas mediante el análisis de manchas occidentales de la expresión proteica de CEACAM1 y mediante el análisis qRT-PCR de variantes CEACAM1. En experimentos paralelos, se analizó la replicación de virus y la producción de citoquinas/quimoquinas en siCEACAM1 o células transfectadas por siNeg infectadas con virus H5N1 (MOI = 0,01) a 24 hpi. Análisis estadístico. Se evaluaron las diferencias entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t de Student sin emparejar, de dos colas. Diferencias de doble cambio de expresión de mRNA (qRT-PCR) entre tres grupos experimentales se evaluó mediante análisis de varianza de un solo sentido (ANOVA) seguido de una prueba de comparison múltiple de Bonferroni. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p <0,05. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de tres o cuatro experimentos individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism para Windows (v5.02). Todos los Los datos brutos y procesados de HiSeq se han depositado en GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).
question: ¿Cuáles son las isoformas más comunes de CEACAM1?
answers.text: CEACAM1-4L y CEACAM1-3L