context: Técnicas para estudiar respuestas específicas de células B de antígenoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6667631/SHA: ee632fa425607e8ff91fc3730bc0782d43ce9c0cAutores: Boonyaratanakornkit, Jim; Taylor, Justin J. Fecha: 2019-07-24DOI: 10.3389/fimmu.2019.01694Licencia: cc-byAbstract: Los anticuerpos contra antígenos extraños son un componente crítico de la respuesta inmune general y pueden facilitar el aclaramiento de patógenos durante una infección primaria y también proteger contra infecciones posteriores. Desde la delineación experimental de un linaje distinto de células B en 1965, se han desarrollado varios métodos para entender las respuestas específicas de las células B en el contexto de enfermedades autoinmunes, inmunodeficiencias primarias, infección y vacunación. En esta revisión, se resumen las técnicas establecidas y se discuten las nuevas y emergentes tecnologías para probar la respuesta de células B in vitro e in vivo aprovechando la especificidad de los anticuerpos B asociados y segregados al receptor de células B (BCR), que incluyen ELISPOT, citometría de flujo, citometría de masa y microscopía de fluorescencia para identificar y/o aislar células B específicas de antígenos primarios. También se presenta nuestro enfoque para identificar células B específicas de antígenos raras utilizando enriquecimiento magnético seguido por citometría de flujo. Una vez que estas células están aisladas, los ensayos de proliferación in vitro y experimentos de transferencia adoptiva en ratones se pueden utilizar para caracterizar aún más la activación, Los modelos transgénicos de ratones de células B dirigidos a antígenos modelo y de señalización de células B también han avanzado significativamente en nuestra comprensión de las respuestas de células B específicas de antígenos in vivo. Texto: En su conferencia Nobel en 1908, Paul Ehrlich comparó la interacción anticuerpo-antígeno a un bloqueo y clave. Razonaba que las antitoxinas (anticuerpos) contenidas en una solución en el suero de animales inmunizados deben ser idénticas a un receptor celular "para una llave realmente bien hecha no abrirá cerraduras diferentes al mismo tiempo" (1). Tomó casi cinco décadas antes de que se usara la microscopía de inmunofluorescencia para confirmar el origen celular de anticuerpos (2). Grandes pasos en el campo de células B y anticuerpos seguidos en la década de 1970 con el desarrollo de la tecnología del hibridoma para producir anticuerpos monoclonales y el descubrimiento de que el reordenamiento somático La posterior explosión de los anticuerpos monoclonales disponibles llevó a los reactivos diagnósticos, terapéuticos y de investigación revolucionarios a distinguir diferentes tipos de células inmunes (5). Juntos, estos descubrimientos nos han permitido investigar la inmunidad humoral a nivel de la célula B específica del antígeno. Métodos para investigar la respuesta específica de células B del antígeno han avanzado en nuestra comprensión de cómo aprovechar la notable amplitud del repertorio de células B y la exquisita especificidad de la célula B individual en el desarrollo de (1) candidatos vacunales que provocan anticuerpos protectores; (2) anticuerpos que previenen la enfermedad cuando se administra profilácticamente; y (3) anticuerpos que pueden administrarse como terapia después del inicio de la enfermedad. Muchas de las vacunas disponibles actualmente se desarrollaron empíricamente ya sea inactivando, atenuando o administrando una subunidad del patógeno. Sin embargo, el desarrollo de la vacuna contra patógenos que son tradicionalmente difíciles de vacunar contra puede depender de una investigación más profunda de la respuesta Para el VIH-1, el descubrimiento de anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAbs) que protegen contra la infección a través de diversos aislados virales ha intensificado los esfuerzos para entender la vía de desarrollo de las células B raras que producen estos anticuerpos (6) (7) (8) (9). Perspectivas sobre la ontogenia de estas células B raras podrían permitir el diseño de un régimen de vacunas graduales que estimula el precursor de la línea germinal para expandirse y madurar para producir bnAbs circulantes que podrían proteger contra la adquisición del VIH (10, 11). Para el VSR, versiones estabilizadas de la proteína de fusión (F) en la conformación de prefusión han llevado a la comprensión de la respuesta de la célula B a la infección y ha generado candidatos a vacunas potencialmente más seguros y eficaces (12, 13). La gripe también realiza la fusión a través de la región madre de la proteína hemaglutinina, y la identificación de las células B que se dirigen a este sitio relativamente conservado ha estimulado la investigación sobre el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe (14) (15) (16). Al igual que el VRS, el VIH y la gripe, las proteínas de fusión del VET y el VMC existen en una conformación prefusional, y la estabilización en sus estados prefusionales podría acelerar en gran medida el desarrollo de vacunas contra estos patógenos (17-19). Células B de memoria raras que producen anticuerpos específicos para la maquinaria de fusión del VET han sido aisladas; estas pueden neutralizar tanto la infección por células B como la epitelial (20). También está surgiendo un nuevo paradigma en el desarrollo de vacunas contra la malaria con el descubrimiento de células IgM+ e IgD+ de memoria B dirigidas a la proteína superficial de merozo Además, los anticuerpos neutralizantes altamente potentes dirigidos a un sitio nuevo y conservado en la proteína Circumsporozoita se han aislado de las células B (22). Juntos, estos ejemplos demuestran la importancia de estudiar las respuestas humorales específicas de antígenos a enfermedades infecciosas. Las soluciones a las estructuras cristalinas de las proteínas superficiales para una variedad de patógenos, la estabilización conformacional de estos antígenos, y la aplicación de los métodos resumidos en esta revisión, para sondear respuestas de células B específicas de antígenos, han creado nuevas oportunidades para el diseño sistemático y racional de vacunas para el VIH, el VSR, el VSE, la malaria y muchos otros patógenos. El estudio de las respuestas de células B no sólo ha informado el diseño de vacunas, sino que también ha avanzado en nuestra comprensión de las enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico (23, 24 Aunque estas células son potencialmente patógenas, la eliminación de células B con alta afinidad al autoantígeno a través de la apoptosis, la anergia de células B con baja afinidad al autoantígeno y la ausencia de células T ayudan a combinarse para proteger contra la enfermedad autoinmune en ratones (26). El estudio de células B específicas de autoantígenos y un análisis detallado de subconjuntos de células B con potencial patógeno en humanos podrían conducir a una mejor comprensión de cómo prevenir y tratar enfermedades autoinmunes. Aunque el término célula B específica de antígenos se utiliza a lo largo de esta mini revisión para denotar el análisis de células B basado en la unión entre el receptor de células B (BCR) y un antígeno específico utilizado como cebo, es importante tener en cuenta que las BCR dentro del repertorio de células B policlonales exhiben un espectro de polireactividad. En un extremo del espectro La frecuencia de polireactividad en el repertorio normal de células B humanas adultas se ha estimado en el 4% de las células B naïve, el 23% de las células B IgG+ de memoria y el 26% de los plasmablastos IgA+ e IgG+ intestinales (27-29). En el otro extremo del espectro, un BCR mono reactivo se activa sólo cuando se encuentra con un antígeno cognato único. Aunque hay excepciones, la acumulación de hipermutaciones somáticas dentro de las regiones variables del BCR durante el proceso de maduración de afinidad se piensa generalmente que conduce a un aumento de afinidad y especificidad para el antígeno cognato (30, 31). Varias técnicas generales se utilizan comúnmente para identificar células B específicas de antígenos (Tabla 1 ). La técnica de inmunospot vinculado a la enzima B (ELISPOT) se basa en el principio de capturar el anticuerpo secreto en las proximidades de cada En la célula B ELISPOT, las células B secretadoras de anticuerpos (ASC) presentes en una muestra o diferenciadas in vitro se añaden a las placas recubiertas con el antígeno de interés. Los anticuerpos específicos de antígenos se unen muy cerca de la ubicación de las células B individuales que producen esos anticuerpos. Los anticuerpos secundarios enzimáticos o fluorescentes etiquetados se utilizan para visualizar puntos de secreción de anticuerpos y unión a antígenos unidos a placas en la ubicación de las ASCs. Cada punto corresponde a un anticuerpo producido a partir de una célula B específica de antígenos y por lo tanto la técnica es extremadamente sensible. Los anticuerpos secundarios conjugados a cuentas de color combinatoria también se pueden utilizar para detectar los anticuerpos segregados de células B individuales con la ventaja de multiplexar el ensayo (32). Una limitación del ensayo es su requisito para la secreción de anticuerpos por células B, limitando así el ensayo a sólo un subconjunto de células B Las células B de memoria pueden ser estimuladas in vitro para diferenciarse en ASCs antes de añadirse a la placa recubierta de antígenos (34). Además, las células B específicas de antígenos identificadas por ELISPOT generalmente no están disponibles para el análisis posterior. Limitar la dilución es otra técnica que se ha utilizado para aislar células B específicas de antígenos. En este enfoque, las células primarias se pueden diluir en serie hasta que las células B individuales se separan en placas de micropozo (36). Las células B pueden entonces ser cultivadas y expandidas ex vivo o inmortalizadas utilizando EBV de tal manera que cada pozo contiene un anticuerpo monoclonal (3, 37, 38). Las células B específicas de antígenos pueden ser seleccionadas mediante el cribado de los sobrenadantes de cultivo para detectar anticuerpos monoclonales que se unen a un antígeno de interés. Aunque los anticuerpos pueden ser secuenciados Esta técnica puede ser potencialmente prolongada y laboriosa, pero el uso de microfluídicas y robóticas ha mejorado en gran medida el rendimiento para seleccionar células B específicas de antígenos (39). Los avances en tecnología de secuenciación de una sola generación han permitido un perfil de transcripción de alto rendimiento y secuenciación de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina emparejadas (40). En este enfoque, la especificidad del antígeno se puede probar después de clonar anticuerpos monoclonales y producirlos utilizando los datos de secuenciación. Este método puede ser útil para identificar células B específicas de antígenos que han sufrido expansión clonal después de la vacunación o infección aguda (41). La citometría de flujo es el método más común utilizado para el análisis y aislamiento de células monocelulares (39). El análisis basado en citometría de flujo de células B específicas de antígenos depende del etiquetado del antígeno con una etiqueta fluorescente para permitir la detección. Los fluorocromos se pueden unir covalentemente a través de conjugación química al antígeno, expresado como una proteína de fusión recombinante, o bien se unen no covalentemente mediante biotinilación del antígeno. Después de la biotinilación, se añade estreptavidina conjugada con fluorocromo para generar un tetramero etiquetado del antígeno. La biotinilación del antígeno en una relación ≤1 biotina a 1 antígeno es importante, ya que cada estreptavidina tiene el potencial de unirse a cuatro biotinas. Si la relación entre biotina y antígeno es >1:1, entonces el clumping y la precipitación del antígeno fuera de solución puede ocurrir tan pronto como se añade estreptavidina. Alternativamente, la biotinilación dirigida en el sitio se puede lograr añadiendo una etiqueta AviTag o BioEase al antígeno recombinante antes de la expresión (77, 78) Cuando se utiliza biotinilación específica del sitio, los investigadores deben tener en cuenta que la etiqueta puede ocluir un epítopo del reconocimiento por las células B que puede ser problemático para los antígenos de la vacuna. Además, para las proteínas que oligomerizan, se pueden incorporar múltiples etiquetas, posiblemente dando lugar a la agregación. Otra consideración importante es el potencial de confusión por las células B en el repertorio que se unen a los fluorocromos, estreptavidina, o cualquier enlace en lugar del antígeno de interés. La unión entre fluorocromos, enlaces o estreptavidina y BCRs de humanos y ratones nunca expuestos a estos antígenos son generalmente de baja afinidad, y estos BCRs se expresan generalmente por células B naïve y potencialmente polireactivas (62, 79, 80). El etiquetado dual, en el que el mismo antígeno está etiquetado por separado con dos fluorocromos diferentes, se puede utilizar para identificar las células B de doble positivo y eliminar la confusión por las células B que unen el fluorocromo (12, 42). Sin embargo, incluso cuando los tetrameros se utilizan para el etiquetado dual, las células B específicas de estreptavidina contaminarán la población de doble positivo. Para eliminar completamente la confusión del fluorocromo, la estreptavidina y los enlaces, se puede utilizar un tetramero "decoy" para identificar estas células B contaminantes (21, 26). En este enfoque, el mismo fluorocromo utilizado para identificar las células B específicas de antígeno se conjuga a un fluorocromo diferente tal que el espectro de emisión se altera por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (26). En particular, es fundamental utilizar la misma fuente de estreptavidina conjugada de fluorocromo en el tetramero y reactivo de señuelo, porque los métodos de conjugación, estreptavidina recombinante y fluorocromos proteínicos como la R-ficoeritrina varían lo suficiente de compañía en compañía para alterar algunos de los epítopos disponibles para que las células B se unen. Una debilidad del enfoque citométrico de flujo es la dependencia de antígenos que se pueden conjugar fácilmente a un fluorocromo o biotinilado. Además de las proteínas recombinantes y los péptidos sintetizados, se han utilizado polisacáridos, lípidos, haptenes, partículas similares a los virus y pseudo virus para identificar células específicas de antígenos por citometría de flujo (33, [43] [44] [45] [47] [47] [47] [49] [50] [50] [52] [53] [53] [55] [56] [57] [57] [58] [58] [59]. Además, se han identificado células B específicas de epitopos mediante la detección de bacteriofagos o bibliotecas de péptidos de microarrayo con anticuerpos policlonales dirigidos al antígeno nativo para seleccionar epitopos conformacionales que pueden fusionarse con proteínas fluorescentes para su uso en citometría de flujo (47, 60]. Con avances tecnológicos que aumentan el número de parámetros simultáneamente medibles, las células B específicas Además, el ensayo de captura de inmunoglobulina es una adaptación basada en citometría de flujo del ensayo ELISPOT en el que se utiliza un anticuerpo anti-CD45 con estreptavidina que transporta cuatro anticuerpos anti-IgG biotinilados para unir simultáneamente los plasmablastos y capturar anticuerpos secretados seguidos de antígenos fluorescentes para detectar plasmablastos específicos (61). La intensidad media de fluorescencia medida por citometría de flujo y normalizada al nivel de expresión BCR también proporciona una medida de la cantidad relativa de antígenos que se unen a una célula B y puede utilizarse como sustituto áspero para la afinidad de unión (79, 81, 82). La preincubación de células B con concentraciones crecientes de un antígeno monomérico antes de etiquetarse con antígeno tetramérico también puede utilizarse para cuantificar la afinidad de unión. Las células que expresan una alta afinidad BCR se unen al antígeno monomérico en concentraciones bajas, mientras que las BCR de baja afinidad requerirán concentraciones más altas de antígeno monomérico para competir e inhibir la unión tetramérica (26). Las células individuales también pueden ser aisladas mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación de BCR, la medición de afinidad BCR, la proliferación in vitro y el perfil transcripcional. Recientemente se han desarrollado métodos para mejorar aún más la sensibilidad para detectar células B específicas de antígenos raras. Las nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos dirigidos al fluorocromo sobre el antígeno de interés, permiten el enriquecimiento de células B específicas de antígenos antes de la citometría de flujo (20, 26, 80, 83). Este enfoque es particularmente útil para detectar células B naïve raras específicas de antígenos, células La estrategia de enriquecimiento magnético permite el análisis de significativamente más células en un período de tiempo más corto concentrando las células de interés antes de la citometría de flujo (Figura 1). En particular, como con cualquier método que busca identificar una población de células a una frecuencia muy baja, el fondo y el ruido inherente al sistema de detección se magnifican con respecto a la señal de interés, especialmente cuando esa señal es débil. Por lo tanto, para detectar la población de interés específica de antígenos, las siguientes consideraciones son críticas: (1) Utilizar señuelos para excluir las células B de especificidades no deseadas;(2) diseño cuidadoso de paneles de citometría de flujo para evitar el derrame de emisiones en el canal para el antígeno de interés; y (3) elegir los fluorocromos más brillantes, como la R-ficoerythrin o la aloficocianina. Los métodos in vivo para sondear las respuestas de células B específicas de antígenos en presencia de otras células presentadoras de antígenos y ayudantes de células T, han aumentado nuestra comprensión mecánica de la respuesta inmune humoral durante la vacunación, infección y autoinmunidad. Las células B transferidas por adopción pueden distinguirse de los linfocitos receptores aprovechando cepas de ratón con variaciones alélicas en CD45 o ratones sin células B. Las células B transferidas por adopción pueden provenir de ratones de tipo salvaje o de ratones que expresan BCR transgénicos (Tabla 2), y las células B específicas de antígenos pueden analizarse utilizando las técnicas descritas anteriormente. La microscopía es otra técnica general que se ha utilizado para identificar células específicas de antígenos in vivo y ofrece la ventaja de la visualización directa. En la primera aplicación reportada de esta técnica para demostrar el origen celular de los anticuerpos en 1955, se utilizaron anticuerpos conjugados con fluoresceína contra la ovoalbúmina y la inmunoglobulina humana para tincionar secciones de tejido del bazo de conejos hiperinmunes (2). Desde entonces, otros grupos han etiquetado fluorescentemente antígenos para localizar células B específicas de antígenos mediante microscopía (62, 65). Los avances en la disección de captura láser microscopía, ya utilizada en el campo celular T, también proporcionan una oportunidad para aislar células B específicas de antígenos individuales para el análisis posterior, incluyendo la secuenciación y clonación del BCR o el perfil transcripcional (66). Sin embargo, la tinción de antígenos de BCR in situ puede ser un desafío dependiendo de la unión de antígenos de patógenos a otros receptores celulares o una alteración de la especificidad de BCR durante la fijación La microscopía bifotónica o multifotónica tiene la capacidad de resolver imágenes a mayor profundidad y con menor fotoblanqueo que la microscopía confocal (67, 68). Como resultado, esta tecnología ha permitido la obtención de imágenes en tiempo real en tejidos linfoides vivos e intactos de ratones, permitiendo la observación directa in vivo de interacciones inmunitarias. Los movimientos dinámicos e interacciones de células B específicas de antígenos pueden ser estudiados in vivo combinando una transferencia adoptiva de células B individuales (aisladas limitando la dilución o FACS) con microscopía bifotónica (63, 69, 70). Los modelos de ratón humanizados son herramientas poderosas para traducir experimentos en ratones a aplicaciones en humanos. Los ratones transgénicos con completa humanización de los loci de inmunoglobulina de ratón proporcionan una oportunidad para recapitular la amplitud del repertorio de células B humanas y sirven como una herramienta valiosa para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos (71). Sin embargo, una advertencia es que las frecuencias de alelos que se encuentran en los repertorios de células B de estos modelos de ratón no necesariamente recapitulan los encontrados en humanos (72). La citometría de masa tiene el potencial de proporcionar más análisis de alta dimensión de células B específicas de antígenos. En este método, las etiquetas de iones de metal pesado en lugar de fluorocromos se utilizan para etiquetar las células. Como los datos se recogen como espectrometría de masa de tiempo-desluz, hasta 42 parámetros únicos pueden medirse simultáneamente a partir de una sola muestra sin derrame significativo entre canales o la necesidad de compensación. La citometría de masa con tetrameros metálicos pesados se puede construir utilizando es La citometría de masas con tetrameros péptidos MHC metálicos ha sido utilizada con éxito para identificar y caracterizar células T específicas de antígenos, pero hasta ahora no se ha aplicado a células B específicas de antígenos (73, 74). Una limitación de este enfoque es que las células no están disponibles para el análisis posterior, ya que son vaporizadas por una antorcha de plasma para atomizar las etiquetas de los iones. Sin embargo, al detectar simultáneamente muchos más marcadores de superficie y citocinas intracelulares, factores de transcripción y detectar más moléculas de señalización de células individuales de lo que antes era posible con etiquetas fluorescentes tradicionales, la aplicación de citometría de masa con algoritmos de reducción de dimensión podría ayudar a diseccionar la complejidad del compartimento de células B, proporcionar una visión de mayor resolución del desarrollo de células B, y revelar nuevos subconjuntos de células B específicas de antígenos involucradas en la mediación de enfermedades autoinmunes En el horizonte, las tecnologías de secuenciación de ARN de células únicas (ARN-seq) tienen el potencial de revolucionar el estudio de células inmunes específicas de antígenos (75, 76). La capacidad de generar una biblioteca de tetrameros con códigos de barras únicos podría permitir el examen simultáneo de perfiles de expresión génica de un gran número de células con diferentes especificidades de antígenos en un solo experimento. Combinar tetrameros codificados con anticuerpos con oligonucleótidos y ARN-seq para medir simultáneamente la proteína y expresión génica de células específicas de antígenos podría aumentar aún más la cantidad de información multiómica imparcial sobre células específicas de antígenos individuales en estados normales y de enfermedad y ayudar al diseño racional de vacunas y terapéuticas (105) (106) (107). El análisis en curso de respuestas específicas de células B de antígenos ha llevado al desarrollo de nuevos reactivos diagnóstico Los métodos para estudiar las respuestas específicas de las células B de antígenos se están aplicando cada vez más para hacer frente a enfermedades como el VIH, el VRS y las enfermedades autoinmunes, en las que la respuesta inmune no protege o aclara la enfermedad, o donde mejora la enfermedad o es responsable de la enfermedad misma. Existen en el horizonte oportunidades considerables para aplicar estos métodos a una miríada de enfermedades en las que las células B desempeñan un papel activo. JB y JT revisaron la literatura, generaron cifras y tablas, y escribieron el manuscrito.
question: ¿Qué invención tecnológica produjo anticuerpos que son clones de una célula madre única?
answers.text: en la década de 1970 con el desarrollo de la tecnología del hibridoma para producir anticuerpos monoclonales