context: El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE  www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
question: ¿Por qué los interferones no promueven la expresión de IFITM5?
answers.text: la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón