context: El ARN no codificante largo NEAT1 ejerce efectos antihantavirales actuando como retroalimentación positiva para la señalización RIG-Ihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5391460/SHA: d18636f47e3c7dd93da309d556ba464d964fd24fAutores: Ma, Hongwei; Han, Peijun; Ye, Wei; Chen, Hesong; Zheng, Xuyang; Cheng, Linfeng; Zhang, Liang; Yu, Lan; Wu, Xing'an; Xu, Zhikai; Lei, Yingfeng; Zhang, FanglinFecha: 2017-04-13DOI: 10.1128/jvi.02250-16Licencia: cc-byAbstract: En las últimas décadas, la acumulación de evidencia sugiere que los ARNs no codificantes (lncRNAs) de larga duración desempeñan un papel regulador clave en la inmunidad innata. Sin embargo, la participación de lncRNAs huésped en el control hantaviral sigue siendo no característica. En este estudio, identificamos el lncRNA NEAT1 como un modulador antiviral vital. NEAT1 fue dramáticamente regulado después de la infección por el virus de Hantaan (HTNV), mientras que su regulación in vitro o in vivo retardada respuestas innatas innatas y aumenta la replicación de HTNV. La expresión ectópica de NEAT1 aumentó la producción de interferón beta (IFN-β) y suprimió la infección por HTNV. La infección por HTNV activó la transcripción NEAT1 a través de la vía RIG-I-IRF7, mientras que NEAT1 eliminó los efectos inhibidores transcripcionales del factor de empalme de la proteína rica en prolina y glutamina (SFPQ) mediante la reubicación de SFPQ a los paraspeckles, promoviendo así la expresión de RIG-I y DDX60. RIG-I y DDX60 tuvieron efectos sinérgicos en la producción de IFN. Tomados en conjunto, nuestros hallazgos demuestran que NEAT1 modula la respuesta innata inmune contra la infección por HTNV, proporcionando otra capa de información sobre el papel de los lncRNA en el control de infecciones virales. Recientemente, la evidencia creciente ha destacado los ARNs no codificantes (INCRNAs) como reguladores clave de la inmunidad innata; sin embargo, sus roles en la infección por hantavirus permanecen desconocidos. En el presente trabajo, se encontró una nueva función no explorada de lncRNA NEAT1 en el control de la replicación de HTNV. NEAT1 promovió las respuestas de interferón (IFN) actuando como retroalimentación positiva para la señalización RIG-I. Este lncRNA fue inducido por HTNV a través de la vía RIG-I-IRF7 de manera dependiente del tiempo y de la dosis y promovió la producción de HTNV inducida por FIN facilitando la expresión RIG-I y DDX60. A nuestro leal saber, este es el primer estudio que aborda el papel regulador del lncRNA NEAT1 en la inmunidad innata del huésped después de la infección por HTVV. En resumen, nuestros hallazgos proporcionan información adicional sobre el papel del lncRNA en el control de infecciones virales. Texto: glicoproteína (GP) y proteína polimerasa dependiente del ARN viral (RdRp), respectivamente. Los humanos se infectan inhalando aerosoles contaminados o entrando en contacto con excretas de roedores, y desarrollan dos enfermedades agudas graves, a saber, fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS) y síndrome pulmonar del hantavirus (HPS) (2). La infección por hantavirus afecta hasta 100.000 a 200.000 seres humanos anualmente, con casos fulminantes de HFRS más representados en China (3). Los casos de HFRS chinos, causados principalmente por la infección por el virus Hantaan (HTNV), representan aproximadamente el 90% de todos los casos globales, con una tasa de mortalidad que oscila entre el 0,1 y el 15% (4). Dado que no existe una vacuna terapéutica eficaz ni una vacuna con licencia de la FDA, una mayor comprensión de las respuestas inmunes del huésped frente a la infección por hantavir es de gran importancia para la salud pública y la seguridad mundiales. El sistema inmunitario innato, caracterizado por las respuestas al interferón (IFN) y la activación de los inmunocitos, proporciona la defensa inicial contra las invasiones virales. Los ARN no codificantes largos (lncRNAs) han surgido como moduladores importantes de la expresión génica. lncRNA nuclear paraspeckle ensamblaje transcripción 1 (NEAT1) es un componente arquitectónico esencial de los paraspeckles en el núcleo mamífero, interactuando con las proteínas de unión a ARN DBHS de Drosophila tales como el factor de empalme prolina y proteína rica en glutamina (SFPQ) y el dominio no POU, proteína de unión a octamero (NO/p54) (6). Hasta la fecha, dos transcripciones isoformadas del gen NEAT1 han sido identificadas, a saber, el NEAT1-1 (MEN) de 3.7-kb y el NEAT1-2 (MEN) de 23 kb (Fig. 1A). Una gran cantidad de investigación ha demostrado que NEAT1 se asocia con la oncogénesis y la progresión tumoral (7) (8) (9), promoviendo la formación de cáncer en ratones al amortiguar la activación dependiente de oncogenes de p53 (10). Sin embargo, los estudios que evalúan la función de NEAT1 en infecciones virales son escasos. Aquí, el transcriptoma de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fue analizado después de la infección por HTVV por el perfil de expresión génica digital (DGE), y se encontró que el INCRNA NEAT1 estaba notablemente regulado por infección viral. La investigación posterior mostró que NEAT1 promovía la expresión RIG-I y DDX60 al reubicar SFPQ y eliminar los efectos inhibidores de la transcripción de SFPQ, que son críticos para las respuestas de IFN contra la infección por HTNV. También encontramos que la señalización RIG-I, en lugar de TLR3 y TLR4, explicaba la elevación del NEAT inducido por HTNV1. Tomados en conjunto, nuestros hallazgos proporcionan información novedosa sobre el mecanismo regulador mediado por lncRNA de defensa innata del huésped contra la infección por HTNV. Para explorar el papel potencial de los ARN no codificantes largos en las respuestas inmunitarias innatas del huésped, el análisis DGE de HUVECs para el perfil de genoma completo se realizó a 24 h de infección por HTNV. 1B, el nivel NEAT1 en el grupo HTNV fue más alto que en el grupo simulado (P  6.86  10 13, tasa de descubrimiento falso [FDR]  9.75  10 12 ) o el grupo HTNV coinactivado 60 (P  1.75  10 14, FDR  3.10  10 13 ); sin embargo, la diferencia entre el grupo HTNV coinactivado 60 y el grupo simulado no fue significativa (P  0.21034, FDR  0.58211). Para confirmar los resultados de perfil, dos pares de imprimación de la literatura publicada (11 ), uno reconociendo tanto NEAT1-1 y NEAT1-2 y el otro específico para NEAT1-2 (Fig. 1A), se aplicó para cuantificar las isoformas de ARN NEAT1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Se ha reportado que NEAT1-2 en lugar de NEAT1-1 juega un papel regulador clave en la formación de paraspeckle (11), y también se encontró que los niveles elevados de NEAT1 dependen de la infección por NHTV viva en lugar de 60 estimulación por NHTV coinactivada (Fig. 1C). La hibridación in situ (FISH) con sondas específicas para NEAT1-2 se realizó con HUVECs, y los resultados confirmaron el aumento de la expresión NEAT1-2 y la agregación de NEAT1-2 en el núcleo a 24 y 48 h postinfección (hpi) (Fig. 1D). Para investigar más a fondo si la expresión NEAT1 fue alterada en otras líneas Todas estas células podrían ser infectadas por HTVV (fig. 1E y F) y generaron progenie de hantavirus (fig. 1G ). Similar a los datos obtenidos de las células HUVECs, NEAT1 fue efectivamente regulado por HTVV a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 a partir de 24 hpi en las células HUVECs y A549, HEK293, y HeLa, y la tendencia al aumento se produjo de manera dependiente del tiempo (fig. 1H ). Cabe señalar que la elevación de NEAT1 a 2 hpi podría no estar relacionada con el virus, pero resultó en respuestas de estrés celular. Además, la expresión NEAT1 aumentó de un MOI de 0,1 a 1, lo que indica que la elevación ocurrió de manera dependiente de la dosis viral (fig. 1I). NEAT1-2 y no NEAT1-1 suprime la replicación Los datos descritos anteriormente mostraron que la infección por HTVN aumentó NEAT1, y nos preguntamos cómo NEAT1 podría influir recíprocamente en la replicación por HTVN. La pequeña eficiencia de transfección por ARN interferente (siRNA) en los HVECs fue confirmada por citometría de flujo, y la expresión NEAT1 fue significativamente disminuida, según lo evaluado por qRT-PCR después de la interferencia por ARN (RNAi) (fig. 2A). Cabe destacar que si-NEAT1 se dirige tanto a NEAT1-1 como a NEAT1-2, mientras que el siRNA silento NEAT1-2 (st-NEAT1-2) es específico para NEAT1-2. En comparación con las células transfectadas con control por siRNA (NC), los HVECs con si-NEAT1 podrían promover dramáticamente la producción por HTVN El agotamiento de NEAT1-2 por sí solo podría imitar los efectos antivirales del silenciamiento simultáneo NEAT1-1 y NEAT1-2 (Fig. 2C), indicando que NEAT1-2 era crítico para las respuestas antivirales. De acuerdo con esos datos, las expresiones de HTVN mRNA del segmento S (Fig. 2D) y HTVN títulos (Fig. 2E ) se incrementaron después del silenciamiento del NEAT1. Por otro lado, los plásmidos, de los cuales pCMV-NEAT1-1 se transcriben en el NEAT1-1 (MEN) de 3.7-kb y pCMV-NEAT1-2 se transcriben en el NEAT1-2 de 2 a 3 kb (MEN), fueron aplicados para investigar directamente el papel del NEAT1 en la infección por HTVN (Fig. 2F) Sorprendentemente, encontramos que la sobreexpresión NEAT1-1 restringido NEAT1-2 transcripción (Fig. 2F ). La sobreexpresión de NEAT1 con pCMV-NEAT1-1 y pCMV-NEAT1-2 podría reprimir visiblemente la expresión NP de HTNV, y la expresión NP parecía estar asociada con los plásmidos transfectados (Fig. 2G). Además, la sobreexpresión de NEAT1-2 en lugar de NEAT1-1 podría suprimir eficazmente la replicación HTNV (Fig. 2H ). NEAT1-1 upregulación incluso agrava la infección por HTNV (Fig. 2H ), que puede ser el resultado de la regulación descendente de NEAT1-2. Constantemente, mediante el análisis de la carga viral detectada por qRT-PCR y la prueba de dosis infec 2I ) y los títulos de HTNV (Fig. 2J ) fueron limitados en HUVECs en los que NEAT1-2 se expresó ectopicamente en comparación con los transfectados con vector de control o pCMV-NEAT1-1. Estos datos mostraron además que NEAT1-2 y no NEAT1-1 suprime la replicación de HTNV en HUVECs. La alteración de NEAT1-2 afecta la expresión de IFN inducida por HTN en HUVECs. La producción de IFN- o el pretratamiento en una etapa temprana de infección juega un papel importante en la limitación de la infección por HTNV, mientras que IFN- el tratamiento después de 24 hpi ejerce poco efecto antiviral (12, 13). Se ha reportado que el GnT de hantavirus suprimió la expresión de las células hospederas en una Aquí, también encontramos que los HUVECs no podían producir eficientemente IFN- hasta 12 hpi en un MOI de 0,1 o hasta 24 hpi en un MOI de 1 (Fig. 3A), lo que indicaba que altas dosis de HTNV podrían obstaculizar las respuestas rápidas de IFN. En particular, la transcripción mejorada de NEAT-1-2 apareció a 8 hpi en un MOI de 0,1 o a 20 hpi en un MOI de 1 (Fig. 3B), sugiriendo que la expresión NEAT-1-2 aumentó justo antes de la producción de IFN. Encontramos que la expresión de IFN- mRNA endógena era mucho más baja en células transfectadas con si-NEAT1-2 en MOIs de 0.1 (Fig. 3C) y 1 (Fig. 3D ) que en aquellas transfectadas con control siRNA (NC En contraste, la sobreexpresión de NEAT1 en HUVEC aumentó la expresión de IFN- después de la infección por HTNV (MOI  1) a 24 y 48 hpi (Fig. 3E ). Lo más importante, HUVEC transfectó con pCMV-NEAT1-2 aumentó visiblemente la expresión génica de IFN- en comparación con las células con plásmidos vectoriales a 12 hpi (MOI  1), demostrando que la sobreexpresión de NEAT1-2 aceleró las respuestas robustas de IFN en las células huésped contra la infección por HTNV. Con un sistema de reportero de doble luciferasa Veinticuatro horas después de la transfección, las células que expresan FAM fueron calculadas por citometría de flujo. Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron infectadas con HTNV a un MOI de 1. A 48 hpi, los niveles de expresión NEAT1 fueron medidos por qRT-PCR. Los valores son medios  SD (n  3; *, P  0.01; **, P  0.001; ***, P  0.0001; t test de Student, comparado con el grupo NC). NS, no significativo. (B) Los HUVEC en placas de seis pocillos fueron transfectados con secuencias NC (la cantidad de Si-NEAT1-2 se considera 0 g) o cantidades crecientes de si-NEAT1 (0,1, 0,5, 1, y 3 g). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron infectadas con HTNV en un MOI de 0,1 por 48 h. La expresión de NP de H (C) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel A, derecha, pero con un MOI de 0,1. El análisis in-cell Western (ICW) para HTNV NP se realizó a 48 hpi. La tinción ICW para HTNV NP se muestra a la izquierda, mientras que la intensidad relativa de fluorescencia (NP/-actina) se analizó utilizando la prueba t de Student. (n  4; *, P  0,01; **, P  0,001; la prueba t de Student, en comparación con el grupo NC). (D) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel A, derecha, pero en un MOI de 0,1. La expresión del segmento HTNV S fue medida por qRT-PCR. Los valores son medios SD (n  3; *, P  0,01; la prueba t de (E) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel A, derecha, pero en un MOI de 0,1. El HTVV propagado fue adquirido a 72 hpi, y los títulos virales fueron detectados por TCID 50 con ELISA en células Vero E6. Los valores son medios  SD (n  3; *, P  0.01; prueba t de Student, en comparación con el grupo NC). (F) A la izquierda, los HUVEC en placas de seis pocillos fueron transfectados con vectores o pGFP (3 g). Veinticuatro horas después de la transfección, las células que expresan proteína fluorescente verde (GFP) fueron calculadas por citometría de flujo. Derecha, los HUVEC en placas de seis pocillos fueron transfectados con plásmidos de control (vector), pCMV-NEAT1-1 Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron infectadas con HTNV en un MOI de 1. En (Continuado en la página siguiente) NEAT1 Promueve Respuestas Antivirales Innatas Diario de Virología manteniendo promotores IFN-, encontramos NEAT1-2 silenciar o sobreexpresión podría inhibir o aumentar la actividad promotora del gen IFN- después de la infección por HTN, respectivamente, mientras que silenciar NEAT1-2 o expresar ectopialmente NEAT1-2 sin infección por HTNV no podría inhibir o mejorar la expresión IFN- (Fig. 3F). Estos resultados mostraron que NEAT1-2 regula la expresión inducida por HTN-. Para explorar si los efectos antihantavirus de NEAT1 fueron causados por alteración de IFN-, se diseñó una serie de experimentos compensatorio En los HUVEC de noqueo NEAT1-2, la adición de IFN- a 12 hpi podría bloquear eficazmente la producción de HTVN NP (MOI  0.1), y estos fenómenos también fueron determinados por la cantidad de IFN- aplicada (Fig. 3G ). Además, en las células con alta expresión NEAT1-2, el tratamiento con anticuerpos neutralizantes (NAbs) de IFN- e IFN- podría contrarrestar los efectos antivirales de NEAT1-2 (MOI  1), y los efectos compensatorios dependían de la magnitud de los NAbs. Juntos estos resultados demostraron que NEAT1-2 mejoró especialmente las respuestas inmunes innatas antihantavirales del huésped mediante la regulación de la señalización IFN-. RIG-I y DDX60 regulados por NEAT1-2 facilitan la producción de HTVN Las RRP mantienen un papel vital en la promoción de las respuestas de IFN, y hemos conjeturado que NEAT1 podría amplificar las respuestas de IFN modulando estas moléculas. Se ha demostrado que TLR3, TLR4 y RIG-I reconocen la infección por HTNV (5, 15, 16). DDX60 fue reportado recientemente como un importante activador de RIG-I, pero los efectos antivirales de DDX60 siguen siendo un tema de debate (17, 18), Aquí, encontramos que múltiples receptores tipo peaje como TLR1, TLR2, TLR3 y TLR4, así como MDA5, fueron aumentados después de la infección por HTNV, pero ninguno de ellos fue influenciado por silenciar NEAT1-2 (fig. 4A ). 4A ). Los HUVECs con expresión declinante NEAT1-2 mostraron una expresión decreciente de RIG-I y DDX60 (Fig. 4B), y se encontró que el aumento de la transcripción de NEAT1-2 activaba la producción de RIG-I y DDX60 en consecuencia (Fig. 4C ). Estos datos indicaron que NEAT1-2 podría modular positivamente la expresión RIG-I y DDX60, mientras que el papel de RIG-I y DDX60 sobre la infección por HTNV es oscuro. Luego encontramos que RIG-I y DDX60 se colocalizaron después de la infección por HTNV (Fig. 4D ), implicando que RIG-I y DDX60 podrían colaborar entre sí para ejercer efectos antivirales. Para verificar el papel antiviral de RIG-I y DDX60, diseñamos una serie de siRNAs dirigidos a RIG-I y DDX60, y seleccionamos el si-RIG-I-2 y siRNA-DDX60-1 con la mayor eficiencia de golpe por qRT-PCR en HUVECs (datos no mostrados). Simultáneamente derribando RIG-I y DDX60 promovieron significativamente la expresión NP de HTNV (Fig. 4E ), y el derribo de ambos podría afectar grandemente la expresión IFN- (Fig. 4F y G). Expresión ectópica de la replicación viral inhibida de RIG-I o DDX60, mientras que la sobreexpresión de ambos resultó en efectos antivirales superiores (Fig. 4H ), indicando Más importante aún, la sobreexpresión de RIG-I o/y DDX60 realzó la expresión de IFN- inducida por HTNV, y tuvieron efectos sinérgicos en la producción de IFN- (fig. 4I y J). En consecuencia, NEAT1 podría regular la producción de IFN- al aumentar la regulación de RIG-I y DDX60, y por lo tanto estábamos interesados en cómo NEAT1 regulaba la expresión de RIG-I y DDX60. SFPQ, que es reubicada por infección de NEAT1 HTNV, regula la expresión de RIG-I y DDX60. NEAT1 interactuaba con SFPQ por inmunoprecipitación de ARN (RIP) después de la infección de HTNV (fig. 5A), indicando que los efectos moduladores de Los valores son medios  SD (n  3; *, P  0.01; **, P  0.001; ***, P  0.0001; prueba t de Student, en comparación con el grupo vectorial). (G) Los HUVECs en placas de seis pozos fueron transfectados con plásmidos de control (vector, la cantidad de pCMV-NEAT1-1 más pCMV-NEAT1-2 se considera 0 g) o cantidades crecientes de pCMV-NEAT1-1 más pCMV-NEAT1-2 (0.05  0.05 g, 0.25  0.25 g, 0.5  0.5 g, 1.5  1.5 g, respectivamente). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron infectadas con HTNV en un MOI de 1 durante 48 h. La expresión de HTNV (H) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel F, derecha. El análisis In-Cell Western (ICW) para HTVN NP fue realizado a 48 hpi. El ICW para HTVN NP tinción se muestra a la izquierda, mientras que la intensidad relativa de fluorescencia (NP/-actina) fue analizada usando la prueba t de Student. (n  4; *, P  0.01; **, P  0.001; la prueba t de Student, comparada con el grupo vectorial). (H) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel F, derecha. La expresión del segmento HTVN S fue medida por qRT-PCR. Los valores son medios SD (n  3; *, P  0.01; **, P  0.001; la prueba t de Student, comparada con el grupo (I) Los HUVEC fueron tratados como se describe para el panel F, derecha. El HTNV propagado fue adquirido a 72 hpi, y los títulos virales fueron detectados por TCID 50 con ELISA en células Vero E6. Los valores son medios  SD (n  3; *, P  0.01; prueba t de Student, en comparación con el grupo vectorial). Podría estar involucrado en SFPQ. Curiosamente, el nivel de proteína de SFPQ, así como otro componente de formación de paraspeque, NONO, se mantuvo inalterado después de la infección por HTNV (Fig. 5B ) o después de la sobreexpresión y caída NEAT1 (Fig. 5C ). Sin embargo, SFPQ se volvió centralizado en lugar de difuso en el núcleo después de la infección por HTNV (Fig. 5 La interacción mejorada de SFPQ y NONO indicó la formación excesiva de paraspeckles en el núcleo (Fig. 5E ) y la relocalización de SFPQ. SFPQ knockdown podría inhibir la replicación de HTNV (Fig. 5F y G), lo que podría haber estado relacionado con el aumento de RIG-I (Fig. 5H ) y DDX60 (Fig. 5I ). SFPQ ha sido sugerido para unirse a la región promotora de RIG-I y DDX60 (11), evitando así la expresión de RIG-I y DDX60. Tomados en conjunto, los resultados anteriores sugieren que NEAT1 podría reubicar SFPQ de la señalización RIG-I es crucial para la expresión NEAT1 después de la infección por HTNV. Elevado NEAT1 ejerce efectos antivirales modulando la respuesta innata inmune, sin embargo, no está claro cómo HTNV activa la transcripción NEAT1. Curiosamente, la sobreexpresión del segmento S o M de HTNV en células HEK293 no indujo la expresión NEAT1, sugiriendo que la transcripción NEAT1 estaba estrechamente relacionada con la replicación viral viva (Fig. 6A). Cabe señalar que la regulación ascendente de NEAT1 por HTNV no pudo revertirse aplicando anticuerpos neutralizantes IFN-I (Fig. 6B). Mientras tanto, la expresión NEAT1 no pudo ser inducida por estimulación con diferentes tipos de IFNs (Fig. 6C, D y E) o citocinas (Fig. 6F y G). Al derribar varios PRRs, encontramos que las vías RIG-I y TLR4 jugaron un papel importante en la regulación del upAT1 inducida por HTNV (Fig. 7A). Usando líneas celulares deficientes RIG-I y TLR4- que podrían estar bien infectadas por HTNV (Fig. 7B), se confirmó que RIG-I era indispensable para la inducción de NEAT1 después de la infección por HTNV (Fig. 7C). Además, utilizando STAT1 como control positivo, encontramos que el factor de transcripción IRF7, en lugar de IRF3 y p65, translocado en el núcleo en HTNV-infectados por HUVECs a 2 dpi (Fig. 7D). Además, el knockdown de HTNV bloqueado por HTNV upregulation (Fig Por lo tanto, el HTVN causó la activación transcripcional del gen NEAT1, probablemente a través de la vía RIG-I-IRF7. El silenciamiento del NEAT1 tiene efectos profundos en las respuestas innatas inmunitarias después de la infección por HTVN en ratones. Aunque los experimentos basados en células revelaron que el NEAT1-2 es un regulador crucial de las respuestas antihantavirales innatas, su función in vivo no ha sido clara. Para hacer frente a esta pregunta, inyectamos siRNAs por vía intravenosa dirigidos al ratón NEAT1-2 a 1 día antes de la infección por HTVN. Los niveles de expresión del NEAT1-2 en el hígado, riñón y bazo se redujeron a 2 dpi (Fig. 8A). Estudios anteriores han demostrado que el nocaut del NEAT1 no afecta a los procesos fisiológicos excepto potentia generandi en ratones Se observó pérdida de peso corporal en ratones abatidos por NEAT1-2 de 2 dpi a 5 dpi, y la producción de IFN en suero disminuyó notablemente en el grupo silenciado por NEAT1-2 que en el grupo NC a 3 dpi (Fig. 8B). Como era de esperar, los ratones abatidos por NEAT1-2 mostraron niveles considerablemente más altos de NP de HTNV en el hígado, bazo y riñón a 3 dpi (Fig. 8C). Además, los títulos de virus en órganos relacionados fueron más altos en el grupo silenciado por NEAT1-2 que en el grupo NC (Fig. 8D). Además, se observó una disminución de la filtración celular inflamatoria pero un aumento de la lesión tisular en ratones abatidos por NEAT1-2 durante la fase temprana de la infección (Fig. 8E). La infiltración 8F), y la activación de los macrófagos también fue suprimida (por citometría de flujo; datos no mostrados). Además, las células CD8  IFN-  T fueron reducidas en los bazos de los ratones neat-1-2 en comparación con los del grupo NC a 3 dpi (Fig. 8G). Sin embargo, el silenciamiento de NEAT-1-2 no tuvo ningún efecto en la producción de anticuerpos neutralizantes a 7 dpi (datos no mostrados). Los hallazgos descritos anteriormente indicaron que el agotamiento de NEAT-1-2 podría influir en múltiples aspectos de la respuesta inmunitaria innata en ratones infectados por HTNV. La inmunidad innata es un sistema filogenéticamente antiguo y conservado que contrarresta microbios invasores, cuyo mecanismo regulador es sofisticado y complejo. Se ha demostrado que los ARN no codificantes largos, que una vez fueron considerados materiales oscuros en el genoma mamífero, ejercen efectos moduladores vitales sobre la inmunidad innata del huésped (19). En este informe, primero demostramos que NEAT1 fue inducido por HTNV a través de la vía RIG-I-IRF7 y sirvió como retroalimentación positiva para la señalización RIG-I. Utilizando el análisis DGE, observamos NEAT1 mejorado y confirmamos su alteración en Para determinar aún más la función de NEAT1 después de la infección por HTNV in vivo, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con si-NEAT1-2 (1 g/g) o control no dianado siRNA (NC) (1 g/g); 1 día después, fueron infectados con HTNV (100 LD 50 ) por inyección intramuscular. (A) Para mantener una alta eficiencia de (A) La eficiencia de derribo fue evaluada por qRT-PCR en muestras de riñón, hígado y bazo a 2 dpi (n  6 en cada grupo). (B) Los efectos de NEAT1 sobre la virulencia de HTVV en ratones fueron determinados por la pérdida de peso corporal de 0 a 10 dpi (panel izquierdo, n  10 en cada grupo). El IFN- en sura de diferentes grupos fue medido por ELISA a 3dpi (panel derecho, n  8 en cada grupo). Los valores son  SD (*, P  0.01; **, P  0.001; prueba t del estudiante, en comparación con el grupo NCHTNV). (C) Los ratones fueron sacrificados en 3 dpi, y los hígados, bazos y riñones fueron recolectados para la detección ELISA de títulos de HTVN NP (paneles superiores, n  8 en cada grupo) y qRT-PCR para evaluar los niveles del segmento HTVN S (paneles inferiores, n  8 en cada grupo) en 3 dpi. Los valores son medios  SD (*, P  0,01; **, P  0,001; la prueba t del estudiante, en comparación con el grupo NCHTNV). (D) Los efectos NEAT1 sobre la cinética de infección HTVN en 3 dpi fueron determinados mediante la prueba de los títulos HTVNV en hígados, bazos y riñones. Los valores son medios  SD (n  8; *, P  0,01; **, P  0,001; la (E) Se realizaron tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) para el hígado de ratón, bazo o riñón (3 dpi, n  8 en cada grupo). Después de la infección por HTNV, los hígados del grupo NC mostraron infiltración celular inflamatoria en ciertas regiones, mientras que los del grupo si-NEAT1-2 mostraron hepatitis viral aguda leve; los bazotes del grupo NC mostraron hiperplasia de los ganglios linfáticos, mientras que los del grupo si-NEAT1-2 fueron severamente congestivos; los riñones del grupo NC también mostraron infiltración celular inflamatoria, mientras que los del grupo si-NEAT1-2 presentaron congestión intersticial moderada. (F) La infiltración de macrofagos en bazos fue analizada mediante la detección de CD11b y F4/80 por citometría de flujo a 3 dpi, y se presentan los resultados obtenidos para (G) CD3  CD8  IFN-  Células T fueron analizadas por citometría de flujo a 3 dpi, y se presentan los resultados obtenidos para tres ratones en cada grupo. líneas celulares diferentes. Para evaluar sus efectos en la replicación de HTVV, NEAT1 fue silenciado tanto in vitro como in vivo, lo que resultó en un aumento de la infección por HTVV y respuestas inmunes innatas suprimidas. Un análisis adicional indicó que NEAT1 podría interactuar con SFPQ y regular la expresión DDX60 y RIG-I. En virtud de ARNi, se confirmó que la vía RIG-I-IRF7 era necesaria para la elevación de NEAT1 desencadenada por HTVV. Recientemente, estudios transcripcionómicos a gran escala identificaron numerosas transcripciones no codificantes en el genoma mamífero, que fueron especuladas para influir Entre estos ARNs no codificantes (ncRNAs), los ARNs no codificantes largos (lncRNAs) surgieron como reguladores importantes de la expresión génica y están estrechamente relacionados con la activación del sistema inmunitario innato del huésped. TLR2 controla la expresión lncRNA-COX2 de una manera dependiente de MyD88- y NF-B, mientras que lncRNA-COX promueve la secreción de interleucina 6 (IL-6) o reprime la expresión ISG15 y CCL5 (20). La activación de TLR2 o la estimulación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF- La señalización TLR4 en respuesta al lipopolisacárido (LPS) induce el lncRNA IL-1-eRNA e IL-1-RBT46, cuyo derribo atenua la liberación de IL-1 y CXCL8 (22). El lncRNA Lethe, activado por TNF-1 e IL-1, actúa como un regulador de retroalimentación negativa de la señalización de NF-B (23). Las funciones de lncRNAs en las interacciones del huésped-virus se han revelado progresivamente. Varios virus, como el virus de la gripe (IAV), coronavirus, enterovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la encefalitis japonesa (JEV), y virus de la rabia, han sido reportados para activar la transcripción de Es importante destacar que en los últimos años se ha demostrado que los múltiples lncRNA afectan a la respuesta de la IFN y se han convertido gradualmente en puntos calientes en el campo de la investigación antiviral. NeST ha demostrado mejorar la producción de IFN-+, controlando la susceptibilidad de los ratones a la infección persistente por el virus de Theiler, así como la resistencia a la infección por Salmonella enterica serovar Typhimurium (27). Tanto CMPK2 como NRAV fueron identificados como reguladores negativos de las reacciones inmunitarias de la IFN. CMPK2, inducida por la infección por IFN-+ o VHC, suprime varios ISG, cuya caída bloquea dramáticamente la replicación del VHC (26). NRAV inhibe algunos ISG críticos, como IFITM3 y Mx1, cuyo agotamiento suprime la replicación del IAV tanto in vitro como Numerosos lncRNAs, incluyendo lnc-ISG15 e ISR2, responden a IFNs tales como ISGs, aunque su función real requiere mayor investigación (28). Considerando la pobre conservación evolutiva pero la rápida divergencia de lncRNAs, sus funciones pueden ser altamente específicas de especies y virus. Aunque se ha logrado un progreso considerable para demostrar los efectos antivirales de lncRNAs en virus modelo, no hay informes publicados que evalúen el papel de lncRNAs en la infección hantaviral. NEAT1 ha sido reportado para interactuar con Drosophila DBHS proteínas de unión ARN (por ejemplo, SFPQ, NONO-p54nrb, y PSPC1), reclutándolos a paraspeckles, una subestructura nuclear encontrada en todas las células cultivadas y primarias excepto células madre embrionarias (24). Se ha informado que NEAT1 participa en la patogénesis de múltiples tipos de cáncer (7) (8) (9). NEAT1 también participa en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington (29) y parece contribuir potencialmente a la producción elevada de citoquinas y quimioquinas en pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) (30). Además, el poli I·C puede activar la transcripción del NEAT1 a través de la vía TLR3, mientras que el NEAT1 regula positivamente la transcripción del IL-8 y puede afectar la expresión de múltiples ISG después de la estimulación poli-I·C (11). Además, se ha informado de que el NEAT1 suprime la exportación del elemento de inestabilidad reverdependiente (INS) que contiene el VIH-1 mRNA del núcleo al citoplasma, inhibiendo así la replicación del VIH (24). En este informe, NEAT1 ha sido identificado como un importante regulador del sistema inmunitario innato del huésped contra la infección por NHT. NEAT1 elevado promueve la secreción de IFN, lo más probable mediante la mejora de la expresión RIG-I y DDX60. DDX60, una helicasa de ARN de la caja DEXD/H similar a Saccharomyces cerevisiae Ski2, es inducida después de la infección viral (31). DDX60 reconoce el ARN viral y activa el RIG-I endógeno, promoviendo así la respuesta a la NIF relacionada con la señalización RIG-I. Sin embargo, los efectos antivirales de DDX60 parecen variar entre los virus (17). Descubrimos que NEAT1 regulado DDX60 estuvo involucrado en la producción de NIF en respuesta a la infección por NHT. En las células infectadas por HTVV, el ARN de doble cadena (DSRNA) no pudo ser detectado, y no está claro cómo los PRRs del huésped, especialmente RIG-I, reconocen la invasión de HTVV (5). Aquí, considerando la interacción de RIG-I y DDX60 y el efecto de DDX60 en la producción de IFN-, hipotetizamos que DDX60 podría mediar la activación de la señal de RIG-I sobre la infección por HTVV, lo que requiere una investigación adicional. Cabe destacar que aplicamos líneas celulares múltiples para explorar el papel de NEAT1 durante la infección por HTVV. HTVV se dirige principalmente a las células endoteliales vasculares in vivo y contribuye al aumento de la permeabilidad vascular y los trastornos de coagulación en HFRS; por lo tanto, los HUVEC son el modelo celular in Las células EVC-304 también son células endovasculares, mientras que las células EVC-304 TLR4  son células TLR4-suprimidas, ambas han sido utilizadas para estudios relacionados con la infección por NVH (15, 33). Las células A549 fueron usadas una vez para aislar NVH, y se confirmó que eran un modelo maduro de infección (34) (35) (36) (37). Además, las células Huh 7.0 y Huh 7.5 (RIG-I  ) utilizadas en nuestro estudio han sido reportadas como infectadas por NVHVH por Lee y otros (5) y pueden ser utilizadas como un modelo celular para estudiar respuestas inmunes contra la replicación de NVH (38, 39). Además, las células HEK293 (40) y HeLa (41) han sido reportadas como infectadas por NVH. Utilizando qRT-PCR, Western blotting, e inmunofluorescencia, también hemos demostrado que las células HEK293 y HeLa pueden ser infectadas por HTNV. Para estudiar el mecanismo molecular subyacente al efecto de NEAT1 sobre la expresión IFN y la infección HTNV, puede ser adecuado utilizar células HEK293 y HeLa como modelo celular, especialmente en condiciones en las que se puede detectar HTNV NP utilizando análisis de Western blot o inmunofluorescencia. En experimentos para evaluar el efecto de NEAT1 sobre el control de los hantavirus, el análisis In-Cell Western (ICW) se aplicó para calificar la producción de HTNV NP. Las alteraciones en la intensidad relativa de fluorescencia de NP después de silenciar o sobreexpresar NEAT1-2 no parecían ser tan notables como los resultados de qRT-PCR o Western b Sin embargo, los valores específicos escaneados y analizados por el ensayo ICW reflejan sólo la intensidad de fluorescencia del pozo integral en lugar del número de manchas. Como consecuencia, la intensidad representaba la cantidad de producción de NP, pero no podía indicar directamente la virulencia, que se demostró mejor mediante los ensayos de formación de placa. Los estudios de RNAi in vivo son alentadores (Fig. 8), pero la NC utilizada por nuestro grupo no fue mutada si-NEAT1-2 (es decir, hilo del mismo sentido, pero con una mutación de punto en la hebra de destino). Los resultados serían más convincentes si los ratones de control hubieran sido tratados con el si-NEAT1-2 mutado. Un hallazgo importante de nuestro estudio es que el lncRNNA NEAT1 sirve como retroalimentación positiva para la señalización RIG-I. Después de observar que NEAT1 puede regular la expresión de IFN por infección de HTNV, nos interesó la función de NEAT1. Se observó que silenciar NEAT1-2 o expresar ectopícamente NEAT1-2 no podía inhibir o mejorar la expresión de IFN sin infección de HTNV (Fig. 3F), lo que indica que NEAT1-2 no podía afectar directamente a la expresión de IFN-. Este hallazgo excluye la posibilidad de que NEAT1-2 promoviera directamente IFN- y que IFN- promoviera la expresión de PRRs como RIG-I. Posteriormente, se encontró que NEAT1 modulaba la expresión de RIG-I inducida por HTNV y DDX60. Los hallazgos recientes han demostrado que la señalización de RIG-I es esencial para una respuesta eficiente de células T polifuncionales durante la infección de IAV (42) 8G), que podría deberse a la alteración de la señal RIG-I en las células T silenciadas NEAT-1-2. En conclusión, este es el primer estudio en describir el papel de NEAT1 en la infección por NVHT. La infección por NVHT indujo la expresión NEAT1 a través de la vía RIG-I-IRF7, mientras que NEAT1 mostró retroalimentación positiva para la señalización RIG-I. NEAT1 reubicó SFPQ de la región promotora potencial de varios genes antivirales a los paraspeckles, eliminando los efectos inhibidores transcripcionales de SFPQ. Este fenómeno facilitaría la expresión de DDX60 y RIG-I, promoviendo así las respuestas de IFN y suprimiendo la infección por NVHT (fig. 9). El control no objetivo (es decir, control negativo [NC]) o RIG-I y DDX60 específicos fueron diseñados por Gene-Pharma de la siguiente manera: NC, 5=-UUCUCUCGAACGUGUCUCUTT-3=; si-RIG-I-1, 5=-GCCCAUAUAAACCAAGAATT-3=, si-RIG-I-2, 5=-GGUGGAAUAUUGAUCUTT-3=, y si-RIG-I-3, 5=-CCCAACGAUAUCAUUCUUTT-3=; si-DDX60-1, 5=-GUCAGGUUCAGUUUGAUTT-3=, si-DDX60-2, 5=-CCGAAGUGAAGUAGAAGUAATT-3=, y si-DDX60-3, 5=-GAUGGAU Los plásmidos pCMV-NEAT1-1 y pCMV-NEAT1-2, que transcriben NEAT1-1 y NEAT1-2, respectivamente, fueron suministrados por Nakagawa Shinichi (10). Los plásmidos Flag-RIG-I y pUNO-DDX60 fueron comprados a Invitrogen. Reactivos. Anticuerpo monoclonal del ratón (MAb) 1A8 para la proteína nucleocápsida HTNV (NP) como se describió anteriormente (43). Abs contra RIG-I, IRF3, IRF7, p65 y STAT1, así como los anticuerpos neutralizantes contra IFN-فارسى e IFN-, fueron comprados a Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). El acetato de miristato de Phorbol (PMA) y Ab contra DDX60 fueron comprados a Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EE.UU.). Abs contra SFPQ, NONO, GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), y -actina fueron comprados a Protein Tech, Inc. (Wuhan, China). Los Abs dirigidos a CD11b, F4/80, CD3, CD8, IFN-®, óxido nítrico inducible sintasa (iNOS) y CD206 para citometría de flujo fueron comprados a BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). IFN-, -, y - Los kits ELISA para la detección de IFN- fueron fabricados por R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA). Extracción de ARN y análisis cuantitativo PCR en tiempo real (qRT-PCR). Se extrajeron ARN celulares totales con ARNiso (TaKaRa, Dalian, China), cuya concentración se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 1000. Posteriormente se realizó la transcripción inversa (RT) con la mezcla maestra PrimeScript RT (TaKaRa) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Cada CDNA fue desnaturalizado a 95°C durante 5 minutos y amplificado durante 40 ciclos de 15 s a 98°C, 30 s a 58°C y 30 s a 72°C utilizando un LightCycler 96 (Roche, Basel, Suiza). El nivel de expresión Las secuencias de imprimación qRT-PCR para NEAT1, NEAT1-2, IFN-, HTNV S, RIG-I, DDX60, -actina y GAPDH se obtuvieron de informes anteriores (24, 45). Los métodos utilizados para cuantificar la carga de ARN HTNV han sido descritos previamente por nuestro grupo (46). Análisis de DGE y secuenciación de lncRNA. HUVECs con una confluencia de 80% en 6 pozos fueron simulados infectados o infectados con HTNV vivo o 60 coinactivados a un MOI de 1. Los ARNs fueron extraídos como se describió previamente a 24 hpi, y la calidad fue analizada mediante software FastQC por el Instituto de Genómica de Beijing (BGI, Shenzhen, China). Las etiquetas de expresión génica digital (DGE) fueron anotadas al transcriptoma humano (Ensembl version 58) al asignar las lecturas a la secuencia que flanquea los sitios de restricción de NlaIII tanto en cadenas codificantes como no codificantes. Se descartaron las etiquetas correspondientes a más de una región génica. Los recuentos de etiquetas se normalizaron a TPM (transcritos por millón) dividiendo el recuento de etiquetas en bruto por el número total de etiquetas de cada biblioteca y multiplicándose por 1 millón. Para evitar la posible señal de ruido de la secuenciación de alto rendimiento, se excluyeron los genes con TPM promedio de menos de 1 en estos tres estados. En este estudio, se seleccionó a los genes como expresados diferencialmente utilizando un umbral de valor P de 0,01. Los ensayos de FISH e inmunofluorescencia (IFA). La hibridación in situ (FISH) de fluorescencia se realizó con un kit FISH (Ribobio Co.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos a temperatura ambiente. La prehibridación se realizó con mezcla de sonda FISH de lncRNA a 37°C durante 30 minutos, y luego se hibridó añadiendo mezcla de sonda FISH NEAT1-2 e incubando la mezcla a 37°C durante la noche. Después de lavarse con 4, 2 y 1 SSC, los núcleos celulares fueron manchados con DAPI (4=6,6-diamidin-2-fenil Finalmente, las muestras fueron observadas utilizando un microscopio de fluorescencia BX60 (Olympus, Tokio, Japón). Se realizó IFA después de FISH o de forma independiente. Las células fueron fijas con PFA 4% durante 10 min y permeabilizadas con Triton X-100 al 0,1% durante 15 min. Se añadieron Abs Primarios e incubadas a 37°C durante 2 h. Después de cinco lavados con DPBS, se añadió IgG (Sangon, Shanghai, China) con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado de cabra o anti-rabbit de cabra (Sangon, Shanghai, China) y se incubaron a 37°C durante 2 h. Los núcleos celulares fueron manchados con DAPI. Finalmente, las muestras fueron observadas mediante un microscopio de fluorescencia BX60 (Olympus). Las células fueron lavadas dos veces con DPBS helado y lisadas con tampón de carga de proteínas SDS 1 (50 mM Tris, 2% SDS, 10% glicerol, 2% 2-mercaptoetanol y 0,1% azul bromofenol). Las muestras fueron hervidas a 95°C durante 10 min. Los lisatos fueron resueltos en 10%, 12% o 15% SDS-PAGE y transferidos a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). Las membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios, seguidos por anticuerpos secundarios etiquetados con tintes infrarrojos (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.). Las señales en la membrana PVDF fueron visualizadas mediante un sistema de imagen infrarroja Odissey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU. El ensayo In-Cell Western (ICW) se realizó utilizando un sistema de imagen de Odisea (Li-Cor) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los HUVEC fueron transfectados simuladamente o transfectados con secuencias NC, si-NEAT1, st-NEAT1-2, plásmidos vectoriales, pCMV-NEAT1-1, o pCMV-NEAT1-2 y cultivados en placas de 96 pocillos (2  10 4 células/pozo). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron infectadas o simuladas con HTVV en un MOI de 1. A 48 hpi, los HUVEC fueron lavados dos veces con DPBS helado, fijados con 4 % de PFA durante 10 min, y permeabilizados con 1,0 % Triton X-100 durante 15 min. Las células fueron añadidas con Li-Cor Odyssey solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 30 minutos e incubadas a 4°C durante la noche con el ratón IgG MAb 1A8 frente a HTNV NP junto con el anticuerpo IgG de conejo contra -actina, ambos diluidos en PBS que contenían 3% de albúmina sérica bovina (BSA; Hyclone). Posteriormente, las células fueron lavadas y manchadas con anticuerpo IgG IRDye 800 antimouse de cabra (1:5.000; Li-Cor) y anti-rabbit de cabra
question: ¿Qué juega un papel en la inmunidad innata a la infección por Hantavirus?
answers.text: ARN no codificantes largos (lncRNAs)