context: La aplicación intranasal de Zanamivir y Carragenan es sinérgicamente activa contra el virus de la gripe A en el modelo murinohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459876/SHA: f0b1fa4036434b57c8307d43c39a4193f7e8053aAutores: Morokutti-Kurz, Martina; König-Schuster, Marielle; Koller, Christiane; Graf, Christine; Graf, Philipp; Kirchoff, Norman; Reutwer, Benjamin; Seifert, Jan-Marcus; Unger, Hermann; Grassauer, Andreas; Prieschl-Grassauer, Eva; Nakowitsch, SabineFecha: 2015-06-08DOI Como las infecciones causadas por el virus de la gripe suelen ir acompañadas de infecciones por otros virus respiratorios, la combinación de un compuesto anti-influenza específico con el polímero antiviral ampliamente activo tiene un enorme potencial para el tratamiento de infecciones respiratorias. Así, la combinación del fármaco anti-influenza específico Zanamivir junto con carragenano en una formulación adecuada para la aplicación intranasal se evaluó in-vitro e in-vivo. Además, se demuestra en un modelo de gripe letal con un virus H7N7 de baja patogenicidad (HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar A(H7N9)) y un virus de la gripe H1N1(09)pdm en ratones C57BL/6 que el uso combinado de ambos compuestos aumenta significativamente la supervivencia de los animales infectados en comparación con las monoterapias o placebo. Cabe destacar que este beneficio se mantiene incluso cuando el tratamiento comienza hasta 72 horas después de la infección. CONCLUSIÓN: Por lo tanto, se debe probar un aerosol nasal que contenga carragenan y Zanamivir para prevenir y tratar la gripe no complicada en ensayos clínicos. Texto: La aparición periódica de nuevas variantes de gripe plantea una amenaza pandémica mundial. Desde la aparición del nuevo virus A(H7N9), más de 400 casos humanos fueron reportados a la OMS con una tasa de mortalidad de más del La mayoría de los pacientes con infecciones por el virus A(H7N9) tuvieron contacto con aves de corral o visitaron mercados de animales vivos. Sin embargo, algunos casos esporádicos parecían ser resultado de transmisiones humanas a seres humanos [1, 2]. A diferencia de los virus pandémicos que entran fulminantemente en la población humana y causan altas tasas de mortalidad, los virus estacionales de la gripe generalmente causan infecciones no complicadas y transitorias en humanos, con replicación viral localizada en el tracto respiratorio superior [3, 4]. Sin embargo, en su forma plenamente desarrollada la gripe es una enfermedad respiratoria aguda que resulta en hospitalizaciones y muertes principalmente entre grupos de alto riesgo. En todo el mundo, las epidemias anuales resultan en cerca de tres a cinco millones de casos de enfermedad grave, y entre 250.000 y 500.000 muertes [5]. Por esta razón, la OMS [6] y los CDC [7] recomiendan el tratamiento antiviral Según el método de detección (qRT-PCR o inmunofluorescencia) se han encontrado diferentes proporciones de coinfecciones. El análisis por qRT-PCR reveló que el 54,5-83,3% de los pacientes positivos de influenza A o B tenían al menos una infección viral respiratoria concomitante [9] [10] [11] [12]. La frecuencia de detección con inmunofluorescencia fue aún mayor (90-100%) [13, 14]. Los patógenos virales potenciales concomitantes de infecciones por virus de gripe incluyen rinovirus humano (RVH), virus respiratorio sincitial, adenovirus, coronavirus humano, metapneumovirus humano y virus de parainfluenza [14, 15]. Como resultado de las múltiples infecciones, una monoterapia antiinfluenza específica trata la infección por virus de gripe solamente, pero no la infección con el patógeno viral concomitante. Esto también se refleja en el hecho de que los inhibidores de la neuraminidasa (NI) son altamente eficaces en modelos animales que investigan las monoinfecciones por gripe [16, 17] pero muestran menor eficacia frente a los síntomas de gripe en ensayos clínicos en adultos con infecciones naturales [18]. Por lo tanto, existe una alta necesidad médica de una terapia antiviral de acción amplia en combinación con una terapia anti-influenza específica para el tratamiento de pacientes con síntomas del tracto respiratorio superior. Idealmente, las sustancias presentes en la combinación se complementan entre sí por diferentes modos de acción, lo que conduce a un tratamiento que proporciona una protección completa contra una amplia gama de virus respiratorios diferentes, así como diferentes cepas de gripe con una baja probabilidad de inducir mutaciones de escape. Carragenan es un polímero sulfatado de alto peso molecular derivado de algas rojas (Rhodophyceae) que se ha utilizado ampliamente en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica y que es generalmente reconocido como seguro por la FDA (GRAS) (revisado en [19] ). Se utilizan comercialmente tres formas principales de carragenanos: kappa, iota y lambda. Se diferencian entre sí en el grado de sulfación, solubilidad y propiedades gelificantes [20]. El mecanismo antiviral del carragenano se basa en la interferencia con el apego viral; como consecuencia, se inhibe la entrada viral [21, 22]. Su actividad antiviral depende del tipo de polímero, así como del virus y de las células hospedantes [23] [25] [26] [27] [28] [30] [32] y Se publicó que iota-carragenan es un potente inhibidor de la replicación de hRV [36] y influenza A [37] y demostró la eficacia antiviral de iota-carragenan frente a virus resfriados comunes por aplicación intranasal en varios ensayos clínicos aleatorizados, doble ciego, grupo paralelo, controlados con placebo [38] [39] [40]. El análisis combinado de dos estudios realizados en 153 niños y 203 adultos reveló que los pacientes infectados con cualquier virus respiratorio, que fueron tratados intranasalmente con iota-carragenan, mostraron una recuperación más rápida de 1,9 días de los síntomas de resfriados comunes que los pacientes tratados con placebo en la población con intención de tratar [41, 42]. La actividad antiinfluenza se mostró por el análisis de subgrupo de 49 pacientes infectados con gripe que se beneficiaron de una recuperación de síntomas más rápida de 3,3 días. El uso del aerosol nasal carragenano se asoció con una reducción significativa de la carga viral de la gripe en los fluidos nasales y un aumento significativo en el número de pacientes libres de virus en el período de tratamiento de 7 días. De acuerdo con Prieschl-Grassauer son cofundadores de Marinomed Biotechnologie GmbH. Marinomed Biotechnologie GmbH tuvo un papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y el análisis, la decisión de publicar, la preparación del manuscrito y está financiando la carga de procesamiento del manuscrito. con la literatura [9] [10] [11] [12] [13] [14] observamos que la mayoría de los pacientes infectados por el virus de la gripe sufrían de una infección viral respiratoria concomitante (66%) determinada por PCR en tiempo real. Carragenan que contiene aerosoles nasales ya se comercializan para el tratamiento de infecciones virales respiratorias bajo diferentes marcas en 18 países. En la actualidad, los únicos medicamentos eficaces disponibles para el tratamiento y la prevención de la gripe después de la exposición son los NI (Oseltamivir y Zanamivir en todo el mundo; Peramivir en Japón y Corea del Sur). Desde el uso a gran escala de bloqueadores M2 para la profilaxis y el tratamiento en humanos [43] y la cría [44], los virus de la gripe que circulan actualmente carecen ya de sensibilidad a este grupo de fármacos [45]. Ya hemos demostrado un efecto terapéutico aditivo de una terapia combinada con iota-carragenano aplicado intranasalmente y oseltamivir administrado por vía oral en ratones infectados con H1N1 A/PR/ 8/34 y un tratamiento comienza 48 horas después de la infección (hpi) [37]. En contraste con Oseltamivir, que necesita ser activado por conversión metabólica, Zanamivir se aplica directamente como fármaco activo y también puede ser administrado intranasal [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]. GlaxoSmithKline investigó el potencial de una administración intranasal de Zanamivir. En siete ensayos clínicos de desafío 66 voluntarios fueron infectados con gripe B/Yamagata/16/88 y 213 con gripe A/Texas/36/91 (H1N1). 156 de estos participantes recibieron Zanamivir intranasal a diferentes dosis (niveles diarios de dosis de 6,4 mg a 96 mg) para profilaxis o terapia [46, 47, 53, 54]. Estos ensayos de desafío mostraron que el tratamiento que comenzó antes y hasta 36 horas después de la inoculación viral se asoció con la prevención de la gripe confirmada en laboratorio y la enfermedad febril, así como con una reducción de los títulos virales, la duración de la eliminación y los síntomas.En total, se publicaron datos de seguridad de 1.092 pacientes después de la aplicación intranasal de Zanamivir y no se encontraron pruebas de que Zanamivir indujera acontecimientos adversos o aumento de las frecuencias de intolerancia nasal local en comparación con los grupos placebo [46, 49, 52]. En conjunto, la combinación de un aerosol nasal carragenano que proporciona una amplia actividad antiviral contra las infecciones respiratorias superiores -incluyendo la gripe- con Zanamivir, un fármaco específico contra la gripe, satisface la necesidad médica existente para tratar múltiples infecciones virales.En el presente trabajo se investiga el efecto terapéutico de una combinación de carragen La identidad, pureza (>95%) de los subtipos carragenanos y el peso molecular (>100.000) fueron confirmados por el análisis NMR descrito en otra parte [55] y la presencia de lambda-carragenano estaba por debajo del límite de detección del 3%. Los polvos de polímeros secos se disuelven en aqua bidest (Fresenius Kabi, Austria) a una concentración final de 2,4 mg/ml de iota y 0,8 mg/ml de kappa-carragenano. Esta solución madre 2x fue filtrada estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm (PAA, Suiza) y almacenada a temperatura ambiente hasta su uso. Para las pruebas posteriores, la solución madre se diluyó a una mezcla que contenía 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano (en adelante, "carragenano"). Zanamivir fue comprado como polvo (Haosun Pharma, China) y la identidad y pureza fue confirmada por el análisis NMR. Zanamivir fue disuelto en soluciones de carragenano o placebo, seguido por filtración estéril a través de un filtro de 0,22 μm (Sarstedt, Alemania). Para los estudios in vivo todas las soluciones que contenían Zanamivir fueron recién preparadas. Las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y cultivadas en una incubadora de 37°C (Sanyo, Japón; CO Las células MDCK fueron cultivadas en el mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) medio de glucosa alta (PAA, Austria) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; PAA, Austria; calor inactivado). El virus de la gripe A/Hansa Hamburg/01/09 (H1N1(09)pdm) fue proporcionado amablemente por el Departamento de Virología de Peter Staeheli, Universidad de Friburgo, Alemania, y descrito previamente en [56] ; A/Teal/Alemania/Wv632/05 (H5N1) publicado anteriormente en [57] (números de adhesión CY061882-9) y A/Turquía/Alemania/R11/01 (H7N7) (taxonomía ID 278191, número de adhesión AEZ68716) fueron suministrados por cortesía de Martin Beer, Instituto de Virología Diagnóstica, Friedrich-Loeffler-Institute, Riems, Alemania; A/Aichi/2/68 (H3N2) fue comprado a la ATCC. Todos los virus de la gripe se propagaron en células MDCK a 37°C y 5% de CO2 en medio de la gripe [medio libre de suero Opti-Pro (Gibco, Austria) complementado con 4 mM de L-glutamina (PAA, Austria), 1% de mezcla antibiótico-antimicótica (PAA, Austria) y 5 μg/ml de tripsina (Sigma Aldrich, Austria)]. Para determinar la concentración inhibitoria del 50% (IC 50 ) y el efecto combinado de carragenano y Zanamivir, se desarrolló un ensayo de placa semilíquida. En 96 placas de cultivo de tejidos de pozo 1.7x10 4 células/pozo de MDCK fueron sembradas e infectadas a confluencia del 90% (24-28 horas más tarde). Se prepararon diluciones seriales de carragenano y Zanamivir en medio Para la infección, los virus fueron diluidos a un MOI de 0,003 (H1N1(09)pdm y H3N2 Aichi), 0,015 (H5N1) o 0,004 (H7N7), respectivamente, en medio de ensayo e incubados a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos con las diluciones en serie de carragenan y/o Zanamivir, respectivamente. Para la evaluación del efecto combinado de carragenan y Zanamivir, los virus fueron diluidos en medio de ensayo que contenía concentraciones constantes de carragenan o Zanamivir. La otra sustancia se diluyó en serie y se utilizó para la incubación del virus. Las células fueron infectadas en 6 repeticiones/dilución compuesta, respectivamente, e incubadas en RT durante 45 minutos antes de la extracción del inóculo. Las células fueron incubadas además con la concentración respectiva de las sustancias investigadas presentes en el revestimiento [medio de la gripe con 2,25% de carboximetilcelulosa (CMC, Fluka, Austria)] durante 30-42 horas a 37°C. Las placas en evolución fueron evaluadas después de la fijación de células de metanol/acetona por tinción inmune con anticuerpos dirigidos contra la nucleoproteína A de la gripe (AbD Serotec, Alemania) (para H1N1(09)pdm, H5N1 y H7N7) o la hemaglutinina (AbD Serotec, Alemania) (para H3N2). El análisis se realizó con un anticuerpo de detección etiquetado HRP (Thermo Scientific, Alemania) utilizando TMB (Biolegend, Alemania) como sustrato y un lector de microplacas a 450 nm. La reducción de la señal detectada representa una reducción en el número y tamaño de las placas e indica la supresión de la replicación viral durante la infección y el cultivo. Después de que las células inmunotensivas fueron teñidas con solución violeta cristalina de 0,005% para evaluar el estado de la capa celular y la toxicidad de los compuestos. IC 50 valores y desviaciones estándar se calcularon para un modelo de respuesta a dosis sigmoidal utilizando XLfit Excel add-in versión 5.3.1.3. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la "Convención Europea para la Protección de Animales Vertebrados Utilizados para Experimentales y otros Propósitos Científicos" y la ley austríaca para experimentos con animales.Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad Veterinaria de Viena y realizados bajo el Ministerio Federal de Ciencia e Investigación Austriano. Se compraron ratones C57BL/6 a Janvier Labs, Francia, y se mantuvieron bajo condiciones estándar de laboratorio en las instalaciones animales de la Universidad Veterinaria de Viena. Para la eutanasia y la asfixia anestésica a través del CO 2 se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento. Para los experimentos de infección, ratones hembra de 3-5 semanas de edad fueron inoculados por vía intranasal con solución de 50 μl de virus influenza (25 μl/nostril) que contenía 2,27x10 3 ó 1,65x10 3 unidades formadoras de placa de H1N1(09)pdm o H7N7, respectivamente. Posteriormente, el tratamiento comenzó 24, 48 ó 72 hpi, según lo indicado para los diferentes experimentos. El tratamiento se realizó por vía intranasal con solución terapéutica de 50 μl o placebo dos veces al día durante 5 días. Como tratamiento, ya sea carragenano (que contiene 1,2 mg/ml de iota-carragenano y 0,4 mg/ml de kappa-carragenano para proporcionar una dosis diaria de 12 mg/kg de peso corporal (BW)), Zanamivir (que contiene 130 μg/ml o 390 μg/ml de Zanamivir, para proporcionar una dosis diaria de 1 o 3 mg/kg de peso corporal, respectivamente) o una combinación de carragenano y Zanamivir se utilizaron. Carragenan y Zanamivir se utilizan a concentraciones no tóxicas como se muestra en [58] y [59]. Los ratones fueron monitorizados dos veces al día durante 15 días para la supervivencia y la pérdida de peso. La mortalidad también incluye ratones sacrificados por consideraciones éticas cuando habían perdido más del 25% de su peso corporal inicial. Confirmamos la infección viral en estos Como los mecanismos subyacentes a la actividad antiviral de los NI y los carragenanos son fundamentalmente distintos, es probable que presenten diferentes actividades hacia las cepas individuales del virus de la gripe. Como resultado, en combinación podrían complementarse entre sí para proporcionar protección contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. Para probar esta hipótesis, investigamos la sensibilidad de varias cepas del virus de la gripe a Zanamivir y carragenano en un ensayo de reducción de placa adaptado con superposición semilíquida en células MDCK [60, 61]. Utilizando este método, determinamos el IC 50 de Zanamivir y carragenano contra los virus de la gripe A de origen humano y animal, a saber, H1N1(09)pdm (A/Hansa Hamburg/01/09), H3N2 (A/Aichi/2/68), H5N1 (A/Teal/Alemania/Wv632/05) y LP H7N7 (A/Turquía/Alemania/R11/01) (Tabla 1). Ambas sustancias no eran tóxicas en la concentración más alta probada (400 μM Zanamivir y 533 μg/ml carragenan), ni su combinación. Además, el CMC en la superposición no mostró ningún efecto inhibidor del virus (datos no mostrados). Se logró la inhibición de la replicación viral de todas las cepas de gripe probadas con ambas sustancias. Los valores de IC 50 de Zanamivir oscilaron entre 0,18 μM para H5N1 y 22,97 μM para H7N7 y el de carragenano de 0,39 μg/ml a 118,48 μg/ml para H1N1(09)pdm y H7N7, respectivamente (ver Tabla 1 ). Estos resultados demuestran que el carragenano y el Zanamivir se dirigen a cepas individuales de gripe en diferentes grados para que puedan complementarse mutuamente para proporcionar una mayor actividad anti-influenza. El tipo de interacción compuesta se caracterizó por el empleo de isobologramas (Fig 1). Como se describe en [62], los isobologramas comparan gráficamente las dosis de dos compuestos necesarios para alcanzar la inhibición del 50% con las dosis previstas calculadas sobre la base de un modelo de aditividad farmacológica. Se espera una linealidad curvada de ~1 para una interacción compuesta aditiva mientras que una progresión curvada <1 aboga por una interacción sinérgica y >1 para una interacción compuesta antagónica. Se seleccionaron dos cepas de virus para esos experimentos, siendo una la más sensible al carragenano (H1N1(09)pdm) y otra la menos sensible (H7N7). En ambos casos los isobologramas muestran una interacción sinérgica del carragenano y el Zanamivir (Fig 1). Así, se demostró que Zanamivir y el carragenano se dirigen a virus individuales de gripe con diferentes eficiencias, probablemente debido a sus diferentes estrategias antivirales. Como resultado, la combinación proporciona una actividad sinérgica con mayor protección contra un espectro más amplio de cepas de virus de gripe que los compuestos individuales. En el modelo de influenza animal, los ratones C57Bl/6 son desafiados con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). La infección y el tratamiento (dos veces al día durante 5 días) se realizan intranasalmente sin anestesia. Investigamos si la combinación de Zanamivir y carragenano es más eficaz para reducir la mortalidad que las monoterapias correspondientes. Primero, determinamos la dosis mínima efectiva de un monoterapia de Zanamivir que mejoró significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones infectados por H1N1 y H7N7. Para la infección letal por H7N7 la dosis mínima efectiva de Zanamivir como monoterapia varió entre 1 y 3 mg/kg de peso corporal/día (datos no mostrados). A continuación, comparamos la actividad antiviral de carragenan (12 mg/kg BW/ día) y Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) con la combinación respectiva frente al tratamiento con placebo. En la figura 2A se muestran las tasas de supervivencia de ratones con tratamiento inicial de 24 hpi. Todos los ratones tratados con placebo murieron entre los días 7 y 9 y también en todos los grupos de monoterapia se observó una letalidad del 100% hasta el día 15. En cambio, las terapias combinadas dieron lugar a una supervivencia del 50% y el 90%, dependiendo de la concentración de Zanamivir. El análisis estadístico mostró que la monoterapia de Zanamivir 1 mg/kg BW/día no mostró un beneficio significativo (p = 0,1810), mientras que la monoterapia con 3 mg/kg BW/día aumentó significativamente la tasa de supervivencia en comparación con los ratones tratados con placebo ( Del mismo modo, las terapias combinadas resultaron en un notable aumento de la supervivencia (p = 0,0421 para 1 mg y p <0,0001 para 3 mg/kg de peso corporal/día) en comparación con la monoterapia con carragenina. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre la combinación que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir y la que contiene 1 mg/kg de peso corporal/día (p = 0,0525). Sin embargo, se observó una tendencia a un aumento de la tasa de supervivencia con la concentración de Zanamivir más alta. Por lo tanto, para una investigación ulterior se evaluó la terapia combinada que contiene 3 mg/kg de peso corporal/día de Zanamivir en ratones infectados letalmente por H7N7. A continuación, se encontró el potencial terapéutico de la combinación con un inicio tardío de la terapia 48 o 72 hpi frente al tratamiento con placebo. En contraste, la terapia de combinación que comenzó con 48 hpi proporcionó una tasa de supervivencia mejorada estadísticamente significativa en comparación con ratones tratados con placebo (p = 0,0010). En resumen, la combinación de dos monoterapias efectivas y establecidas dio lugar a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H7N7. Además, la terapia de combinación fue altamente eficiente en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento de hasta 48 hpi. La terapia intranasal con carragenano y Zanamivir que comenzó con 72 hpi protege significativamente a ratones infectados con influenza H1N1(09)pdm A continuación, se evaluó la dosis mínima efectiva de Zanamivir utilizada como monoterapia en un modelo letal de ratón H1N1(09)pdm, siguiendo el mismo esquema descrito en los experimentos con H7N7. La dosis efectiva más baja de Zanamivir después de iniciar el tratamiento con 24 hpi fue de 1 mg/kg de peso corporal/ día y su combinación con carragenan fue altamente eficaz (no se muestran los datos).En el siguiente experimento se investigó el potencial terapéutico de la combinación con un tratamiento con inicio de 48 o 72 hpi en comparación con el tratamiento con placebo respectivo.Como se muestra en la figura 3, las tasas de supervivencia de los ratones tratados con el tratamiento combinado aumentaron significativamente en comparación con el grupo placebo (p<0,0001).No hubo diferencia en la supervivencia entre los dos puntos de inicio del tratamiento, 48 o 72 hpi, lo que dio lugar a que se investigara el efecto antiviral de una combinación de carragenan con el NI Zanamivir en los estudios de cultivo celular y en los modelos de infección por gripe en ratones. Anteriormente hemos demostrado que una terapia combinada de iota-carragenano con el NI Oseltamivir llevó a una supervivencia significativamente mejorada en ratones infectados con H1N1 PR/8/34 en comparación con las respectivas monoterapias [37]. Sin embargo, Oseltamivir es un profármaco administrado por vía oral, que tiene que ser convertido en su forma activa mediante el procesamiento metabólico. Por lo tanto, no fue posible un mayor desarrollo de una combinación de aerosol nasal con Oseltamivir. En cambio Zanamivir-un NI que se aplica como fármaco activo-fue elegido para el desarrollo de una combinación compuesta. Durante el proceso de evaluación se encontró que la eficiencia de unión de diferentes subtipos carragenanos en diferentes cepas de gripe varía. El uso combinado de iota- y kappa-carragenano para el tratamiento de los ratones infectados por la gripe letal C57Bl/6 reveló un efecto terapéutico mejor que el uso de iota-carragenano solo (S1 Fig). Así, para proporcionar un espectro más amplio de actividad contra diferentes cepas del virus de la gripe, se utilizó una mezcla de iota- y kappa-carragenano (designado como carragenano) para una evaluación adicional. Para la investigación del efecto de una combinación compuesta de carragenano y Zanamivir, examinamos su eficiencia de inhibición, individual y en combinación, contra los virus de la gripe en un ensayo adaptado de reducción de placa con superposición de semilíquido en células MDCK. La combinación mostró una inhibición sinérgica de la replicación del virus en ensayos in vitro con todos los virus de la gripe probados (Fig 1). Esto indica que la interacción física del polímero con el virus no perturba la inhibición de la neuraminidasa por Zanamivir, lo que fue confirmado en pruebas in vitro que examinan una posible influencia del polímero en la actividad inhibidora de la neuraminidasa de Zanamivir (datos no mostrados). Por lo tanto, el efecto sinérgico observado se basa en la combinación de dos mecanismos subyacentes distintos. Como resultado, en la combinación propuesta ambos mecanismos se complementarían entre sí para proporcionar una protección más eficiente contra un espectro más amplio de cepas del virus de la gripe que los compuestos individuales. El efecto sinérgico también se mostró en modelos de ratones letales (Fig 2 y Fig 3). La patogenicidad de los virus de la gripe en ratones varía y depende de la cepa y su adaptación al huésped. Dependiendo de la dosis y cepa del virus, los virus de la gripe pueden inducir infecciones letales en ciertas cepas En nuestro modelo, los ratones C57Bl/6 son desafiados intranasalmente con una dosis letal del virus respectivo y tratados con diferentes regímenes en comparación con un control del vehículo (placebo). En este modelo, la replicación temprana del virus tiene lugar en el tracto respiratorio superior. A partir de ahí, el virus se disemina al pulmón y causa neumonía letal. El efecto del tratamiento sobre la mortalidad se evalúa en comparación con los ratones de control tratados con placebo. De todas las cepas de gripe in vitro probadas, el H1N1(09)pdm y el LP H7N7 son particularmente interesantes por dos razones. Primero, son patógenos altamente relevantes, como placebo o con las monoterapias consistentes en carrageenan (12 mg/kg BW/día) o Zanamivir (1 y 3 mg/kg BW/día) o una combinación de estos. El tratamiento comenzó 24 hpi (B) Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o una combinación de carragenan con Zanamivir (3 mg/kg de peso corporal/día). El tratamiento comenzó con 48 hpi o 72 hpi y continuó durante 5 días. En el eje y la supervivencia de ratones [%] y en el eje x se da el tiempo posterior a la infección [días]. Los ratones control tratados con Placebo mostraron una supervivencia del 100% en ambos experimentos (datos no mostrados).Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. El H1N1(09)pdm está asociado con más de 18.400 muertes en la temporada 2009/2010, mientras que el LP H7N7 lleva un HA estrechamente relacionado con el virus de la gripe aviar H7N9 que ha causado más de 175 muertes hasta octubre de 2014 [64]. En segundo lugar, son de especial interés para el enfoque de combinación carragenano/Zanamivir. Han demostrado ser diferentes en susceptibilidad in vitro a carragenano, Zanamivir (Tabla 1 ) y la combinación de los mismos (Fig 1). Si bien H1N1(09)pdm era altamente sensible a la inhibición por ambas sustancias solo, el H7N7 requería concentraciones mucho más altas de carrageneno y Zanamivir, respectivamente, para lograr eficiencias de inhibición similares. Se establecieron modelos de ratón letales con ambos virus que resultaron en 6,8 y 8,5 días medios de supervivencia para LP H7N7 y H1N1(09)pdm, respectivamente. Estos resultados están en buena consonancia con modelos similares de gripe letal ya publicados [65] [66] [67]. En nuestros modelos se encontró que la dosis efectiva más baja para Zanamivir en un inicio de tratamiento 24 hpi fue entre 1 a 3 mg/kg BW/día para ambos virus. Este rango de concentración es relativamente alto en comparación con otros estudios publicados. Sin embargo, estos estudios se realizaron bajo anestesia con diferentes virus y una terapia profiláctica comienza [65, 66]. El hecho de que se necesite una dosis más alta de NI para un tratamiento efectivo cuando se inicia la terapia 24 hpi ya se conoce para Oseltamivir [68]. Sin embargo, también se publicaron datos con concentraciones efectivas mucho más altas (10 mg/kg BW/día [69] ) y con concentraciones similares de Zanamivir (2,5 mg/kg BW/día [67] ). Encontramos que la combinación de carragenano con 3 mg/kg BW/día Zanamivir utilizado para el tratamiento de ratones infectados con H7N7 resultó en una supervivencia significativamente mejorada de ratones en comparación con las dos monoterapias (fig 2). La supervivencia significativamente mejorada en comparación con el grupo tratado con placebo también se encontró después de un inicio de tratamiento tardío 48 hpi. Además, en el modelo H1N1(09)pdm la combinación de carragenano con 1 mg/kg BW/día Zanamivir mostró una supervivencia estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento con placebo incluso después de un inicio de tratamiento 72 hpi. Este es un hallazgo notable ya que Como el régimen de tratamiento intranasal es incapaz de tratar eficazmente las infecciones virales pulmonares, el objetivo principal de este producto es la profilaxis y el tratamiento de la gripe no complicada. Dado que la mayoría de las infecciones por gripe causan enfermedades no complicadas y prácticamente todos los casos de gripe comienzan con una infección de la cavidad nasal o del tracto respiratorio superior, el potencial terapéutico es enorme. Sin embargo, se requieren estudios clínicos para dilucidar y demostrar el potencial de la terapia combinada propuesta. La combinación de estrategias antivirales ha dado lugar a logros impresionantes en la lucha contra otras enfermedades virales como el VIH. En particular, el problema de la resistencia antiviral podría abordarse con esta estrategia. En la última década se han planteado preocupaciones sobre la creciente aparición de virus de la gripe resistente a Oseltamivir. La aparición aumentada de virus portadores de la mutación H275Y en la neuraminidasa de virus H1N1(09)pdm que confiere resistencia a Oseltamivir dejó Zanamivir como única opción de tratamiento para pacientes sintomáticos infectados con una cepa de gripe resistente a Oseltamivir [70]. A diferencia de Oseltamivir, la resistencia a Zanamivir es menos frecuente. Hasta la fecha, la gripe resistente a Zanamivir se ha detectado sólo una vez, en un paciente inmunocomprometido [71, 72]. Sin embargo, se deben aprender lecciones de intervenciones previas contra la gripe que dieron lugar a la aparición de resistencia contra fármacos actualmente aprobados [73]. Por lo tanto, es comprensible que el aumento del uso de Zanamivir también pueda conducir a la aparición rápida de resistencias [74]. Para superar esta amenaza, una combinación de antivira Comprobamos la posibilidad de generar virus mutantes de escape de doble compuesto al pasar virus en presencia de concentraciones crecientes de combinaciones de compuestos. Después de 10 pasajes en células MDCK no se pudo encontrar resistencia a la combinación de compuestos para cualquier virus de gripe probado (datos no mostrados). Sin embargo, este hallazgo no garantiza que la aparición de mutantes de escape de Zanamivir pueda detenerse completamente. En resumen, demostramos que los mecanismos anti-influenza de ambos compuestos individuales se complementan entre sí. La combinación proporciona una mejor protección sinérgica contra un espectro más amplio de virus de gripe que los compuestos individuales. Un aerosol nasal que contiene carragenano junto con Zanamivir proporciona un tratamiento fácil de aplicar de infecciones del tracto respiratorio superior en pacientes sospechosos de estar infectados por gripe. Los pacientes se beneficiarían del tratamiento rápido y eficiente de la gripe no complicada en el tracto respiratorio superior. Debido al aclaramiento más rápido del virus de la gripe en el tracto respiratorio superior y al mecanismo antiviral independiente de carragenan y Zanamivir, se reducirá la probabilidad de desarrollar mutaciones de escape contra Zanamivir. Ambos compuestos individuales son capaces de reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad de la gripe y se espera que una combinación funcione de manera similar. Además, debido a la amplia eficacia antiviral de carragenan, los pacientes recibirán en paralelo un tratamiento de infecciones virales concomitantes. Por lo tanto, los pacientes se beneficiarán de una menor probabilidad de desarrollar complicaciones. Teniendo en cuenta las complicaciones conocidas que acompañan una enfermedad del virus de la gripe, esta terapia combinada satisface una necesidad médica urgente. Un segundo ámbito de esta combinación es la protección contra virus pandémicos recién emergentes durante el tiempo hasta la identificación del virus seguido por la fabricación y distribución de vacunas [43]. Incluso si, debido a las nuevas técnicas genéticas inversas, se necesita menos tiempo para la producción de vacunas, todavía toma meses antes de que grandes cantidades de vacunas estén disponibles [75]. Durante este tiempo la población humana debe estar protegida para desacelerar la propagación viral. En este momento las únicas oportunidades disponibles para la protección personal son las medidas de higiene y el uso de Tamiflu (nombre comercial de Oseltamivir). Se necesitan desesperadamente nuevas opciones de protección y tratamiento para la gripe. Basado en nuestros resultados alentadores en ratones, sugerimos probar un aerosol nasal que contenga carragenan en combinación con el inhibidor de la neuraminidasa Zanamivir en ensayos clínicos para la prevención o el tratamiento de infecciones de gripe no complicadas. Los ratones (n = 20 por grupo) fueron infectados letalmente por vía intranasal sin anestesia en el día 0 y, por lo tanto, fueron tratados intranasalmente dos veces al día con placebo o con iota-carragenano o con una mezcla de iota-y kappa-carragenano. El tratamiento comenzó 24 hpi y continuó durante 5 días. En el eje Y la supervivencia de ratones [%] y en el eje X se da el tiempo post infección [días]. Los ratones de control tratados con Placebo, no infectados, mostraron una supervivencia del 100% (datos no mostrados). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de rango logarítmico y se muestran debajo de los gráficos. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos; no significancia (n.s.) se obtuvieron con valores p >0,05. (TIFF)
question: ¿Cuál es la ventana óptima para iniciar el tratamiento con caragenan y Zanamivir?
answers.text: 72 horas después de la infección