context: La actividad inmunomoduladora y los efectos protectores del polisacárido del extracto de hoja de adenoforo del Eupatorium sobre la infección por gripe altamente patógena H5N1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789439/SHA: efba2008a6ccf1ad2614aebd79a6a741ea6538b9Autores: Jin, Yi; Zhang, Yuewei; Wan, Chunyan; Wang, Hongjun; Hou, Lingyu; Chang, Jianyu; Fan, Kai; Xie, XiangmingFecha: 2013-09-18DOI: 10.1155/2013/194976Licencia: cc-byAbstract: El desarrollo de nuevos agentes antivirales de amplio espectro contra la infección por H5N En este estudio, se evaluaron las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del polisacárido de Eupatorium adenophorum (EAP) frente al subtipo altamente patógeno del virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP aumentó significativamente la producción de IL-6, TNF-α e IFN-γ tanto in vivo como in vitro, medida por qPCR y ELISA. En un modelo de infección por ratón, la administración intranasal del EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal antes del desafío viral H5N1 inhibió eficientemente la replicación viral, la disminución de las lesiones pulmonares y el aumento de la tasa de supervivencia. Nuestra investigación sugiere una estrategia alternativa para el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza y beneficios de los productos de E. adenophorum. Texto: El virus de la gripe subtipo H5N1 altamente patógeno puede transmitirse directamente de las aves de corral al ser humano y causar infecciones respiratorias agudas. El virus de la gripe pandémica H5N1 representaba una amenaza mundial para la salud pública debido a la rápida propagación y alta patogenicidad [1, 2]. Los síntomas en animales o seres humanos infectados con H5N1 incluyen fiebre, encefalitis, neumonía y síndrome respiratorio agudo grave (SARS) [3, 4]. La Organización Mundial de la Salud informó 622 casos humanos de infección por el virus de la gripe H5N1, incluidas 371 muertes (tasa de mortalidad > 50%), de 2003 a 2013 (http://www.who.int/ influenza/human animal interface/H5N1 Actualmente, la medida preventiva más eficaz contra el virus de la gripe es la vacunación. Varios medicamentos antiinfluenza han sido ampliamente utilizados, incluyendo zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu). Desafortunadamente, sus beneficios han sido significativamente restringidos por la resistencia a los medicamentos y la mutación antigénica frecuente [5, 6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos agentes antiinfluenza contra el subtipo H5N1 es muy importante. La planta invasiva Eupatorium adenophorum, nativa de Centroamérica, tiene una gran capacidad de adaptación a diferentes ambientes en todo el mundo. Esta planta invadió por primera vez la provincia de Yunnan en el sur (China) en la década de 1940 desde Birmania y Vietnam, y rápidamente se extendió por todo el suroeste de China a lo largo de la década de 1950 [7, 8]. En los últimos 50 años, E. adenophorum ha afectado gravemente el medio ambiente ecológico en las zonas subtropicales medias de China, incluidas las provincias de Yunnan, Guizhou, Sichuan y Guangxi, invadiendo tierras de cultivo, pastizales y bosques [7]. El control manual, químico o biológico de E. adenophorum ha obstaculizado su desarrollo y utilización integrales para beneficio económico. Muchos componentes bioactivos aislados de E. adenophorum han mostrado actividad antimicrobiana e inmunomodulando 2 propiedades de Medicina Complementaria y Alternativa Basadas en Evidencia [9]. En un estudio reciente, se evaluaron las propiedades antiinflamatorias del extracto de hoja etanólica [10]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la bioactividad del polisacárido de E. adenophorum (EAP). Se han reportado las propiedades inmunomodula Varios polisacáridos de Cordyceps militaris, Portulaca oleracea, Gracilaria lemaneiformis, Gyrodinium impudium y Panax ginseng han sido descritos como agentes antiinfluenza eficaces frente a cepas H1N1 y H3N2 [12] [13] [14] [15]. En informes recientes, los adyuvantes a base de polisacáridos mejoraron la inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas H5N1 en modelos de infección animal [16, 17]. Sin embargo, a nuestro conocimiento no ha habido ningún informe sobre el tratamiento con EAP contra la gripe H5N1 altamente patógena. En el presente estudio, investigamos el efecto potencial de la EAP contra la infección por influenza H5N1 en un modelo de ratón. Nuestros resultados sugieren que los efectos anti-H5N1 de la EAP ofrecen una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes antiinfluenza y la utilización de productos de E. adenophorum. Virus. El virus de la gripe H5N1 (A/cacaca de barra/ Qinghai/1/2010) utilizado en este estudio fue aislado del lago Qinghai en mayo de 2010. Este aislamiento es altamente patógeno en aves de corral, ratones y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). El virus se propagó en células MDCK a 37°C durante 48 h, y el sobrenadante viral fue cosechado, alícitado y almacenado en −80°C. Los títulos virales fueron determinados por el ensayo de placa descrito anteriormente [18]. De 8 a 10 semanas de edad, se obtuvieron ratones BALB/c hembra de Vital River Laboratories (Beijing, China), y las parejas reproductoras originales se compraron de Charles River (Beijing, China). Los ratones fueron criados en jaulas ventiladas independientes (IVC) y recibieron alimentos y agua libres de patógenos. Los tratamientos animales se regían por el Reglamento de Animales Experimentales de la Autoridad de Beijing, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Agricultura de China. La línea celular monocítica Raw 264,7, línea celular adenocarcinoma pulmonar humano epitelial A549, y líneas celulares de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron proporcionadas por el Centro de Recursos Celulares de Peking Union Medical College. Las células fueron cultivadas y mantenidas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Yunnan provincia, China. 100 g de materiales secos fueron pulverizados en un mezclador y luego filtrados con 40 mallas. El polvo de hoja fue extraído mediante tratamiento ultrasónico con 1000 mL de agua destilada durante 45 min. El sobrenadante fue recolectado y el precipitado resuspendido en 1000 mL de agua destilada y nuevamente extraído por tratamiento ultrasónico durante 30 min. El sobrenadante resultante fue combinado con el obtenido del primer tratamiento ultrasónico. La fracción acuosa final fue evaporada a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo obtenido fue disuelto en agua destilada y se mantuvo congelado a 4°C.El extracto fue centrifugado a 3000 g/min durante 25 min. y se concentró bajo 80°C durante 8 h para preparar polisacárido. El sobrenadante se desproteinizó con el método Sevag y se dializó contra el agua durante 48 h. El líquido final se mezcló con un volumen de 95% de etanol (v/v) y se centrifugó a 3000 g/min durante 10 min. Los precipitados se lavaron sucesivamente con etanol absoluto, éter y se secaron bajo vacío a 40 °C para obtener el polisacárido bruto (yield = 1,2%). El contenido del EAP se determinó mediante el método fenol-H 2 SO 4 [19]. Vitro. 2.5 mL A549 y 264,7 células Raw (4 × 10 5 / mL) por pozo se plató en placas de 6 pocillos y se cultivó a 37 °C por debajo del 5% de CO 2 durante 24 h. Se eliminó el medio de cultivo de 2,5 mL y se añadieron a cada pozo diferentes concentraciones de Los controles fueron tratados con solución salina fosfatada (PBS), se recolectaron células 36 h después del tratamiento para la extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). Ensayo. Se administraron ratones EAP a una dosis de 5, 10, 25 ó 50 mg/kg de peso corporal, intranasalmente una vez al día durante 5 días antes del desafío. Se administró PBS a ratones de control utilizando la misma pauta. Las existencias de virus de la gripe se diluyeron en PBS. Se anestesiaron ratones con Zotile (Virbac, Francia) intramuscularmente a 15 mg/kg (peso corporal) y luego infectaron intranasalmente con 120 unidades plaqueformantes (PCU) del virus de la gripe H5N1 en 50 L. El tejido pulmonar de cinco ratones por grupo se recogió el día 0 antes del desafío para qPCR y Se recolectó tejido pulmonar de otros cinco ratones en el día 3 postinfección para el ensayo de placa y qPCR. Se observaron diez ratones por grupo para la supervivencia durante 14 días y se registraron pesos corporales. 2.6. Ensayo de placa. Células MDCK fueron cultivadas en DMEM (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) que contenían 10% FBS (Hyclone Laboratories), 100 U/ml penicilina, y 100 g/ml estreptomicina (Invitrogen, San Diego, CA, USA). El sobrenadante de tejido pulmonar se diluyó 10 veces y se añadió a una monocapa celular cubierta por agar semisólido que contenía 0,5 g/ml de tripsina TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Las placas fueron incubadas a 37o C El ARN total de 1 × 10 6 células o 10 mg de tejido pulmonar fue preparado por Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN tratado con DNaseI (0,2 g) fue transcrito inversamente al ADNc mediante imprimaciones aleatorias. La expresión del gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe H5N1 fue detectada por qPCR utilizando el kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applicated Biosystems, Foster City, CA, USA). Se utilizaron los siguientes imprimadores AGG CAC CA-3 5 -CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 h IL-6 5 -CCT TCG GTC CAG TTG CCT TCT-3 5 -CCA GTG CCT CTT TGC TGC TGC TTT C-3 h IFN: imprimador delantero, 5 -CGC AGT ATT CAG AAG AAG CAAGAC-3 ; e imprimador inverso, 5 -TCC ATA AGG ATA GAC CTA CCA-3. La reacción se realizó en un ciclor térmico ABI 7500 con un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s. El número de copia del gen HA fue calculado por el software 7500 v2.0 (Aplicado Biosistemas) utilizando un plásmido de concentración conocida con HA como estándar. Se realizó qPCR relativo para otros ocho genes: hactina, h IL-6, h IFN- y hTNF- para células A549; mactina, mTLR-2, mTLR-4, mDectin-1, mMR, mIL-6, mIFN- y mTNF- para células Raw264. La reacción se realizó con 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, recocido a 52°C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 40 s. El cambio de pliegues en la expresión génica se normalizó en controles (ratones naive) por 2 CT utilizando -actina como norma interna [20]. 2.8. ELISA. Los niveles de IL-6, TNF- e IFN en pulmón se probaron con kits ELISA (Boster, Wuhan, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un gramo de tejido pulmonar de cada ratón fue molido en 1 mL PBS y centrifugado durante 20 min a 5000 rpm. Los sobrenadantes fueron recolectados y diluidos 10 veces para ELISA. 2.10. Análisis Estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVAs de una vía con SPSS 12.0 (SPSS Taiwan Corp., Taiwán) y se consideró significativo < 0,05. Muchos polisacáridos botánicos presentan un efecto inmunomodulador [11]. Para determinar las propiedades inmunomoduladoras del EAP, se investigó el efecto potencial de los polisacáridos sobre las células A549 y Raw264,7. Las células fueron tratadas con diversas concentraciones de EAP (50, 100, 200 g/ml) durante 36 h. Los niveles de ARNm de IL-6, TNF- e IFN fueron detectados por qPCR. La Figura 1 muestra las actividades inmunomoduladoras del EAP in vitro. Varias concentraciones de EAP desencadenaron una fuerte secreción de IL-6, TNF- e IFN de forma dosis dependiente tanto en las células A549 (Figuras 1(a)-1(c)) y Raw264,7 células (Figuras 1(d) -1(f))) en comparación con el grupo de tratamiento con PBS. Para comprobar si el EAP podía proteger a los ratones infectados con H5N1, los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 5, 10, 25 o 50 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días antes del desafío viral con 120 UFP. Diez ratones por grupo fueron monitorizados durante 14 días para la tasa de supervivencia. Como se muestra en la Figura 2(a), todos los ratones que recibieron PBS murieron en el día 11. Los ratones administrados con 25 mg/kg de EAP tuvieron una tasa de supervivencia del 50% en el día 14, que fue El tratamiento con EAP de 10 mg/kg y 50 mg/kg también pareció tener una ventaja de supervivencia, pero no estadísticamente significativa, lo que sugiere que el efecto protector de la EAP contra la infección por H5N1 requiere una dosis moderada. El tratamiento con EAP también alivió la pérdida de peso en ratones infectados (Figura 2(b) ). Para determinar la carga viral en el pulmón de los ratones infectados, se realizaron ensayos de placa y qPCR. Los títulos virales pulmonares en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los títulos en los ratones que recibieron PBS en el día 3 postinfección (Figuras 2(c) y 2(d) ). Estos datos indican claramente que la administración intranasal de EAP controla la replicación viral H5N1 y mejora las tasas de supervivencia en un modelo de ratón. El efecto protector de EAP contra el virus Para detectar la expresión IL-6, TNF- e IFN, los pulmones de cinco ratones por grupo fueron recolectados en el día 0 antes de la infección y probados por qPCR y ELISA. Los niveles de ARNm en el grupo EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más altos que los del grupo control PBS (ratones naive) (Figuras 3(a)-3(c) ). Los niveles de citoquinas solubles en el día 0 fueron medidos por ELISA, y los resultados fueron consistentes con los resultados de qPCR, aunque la producción de IFN en el grupo EAP no fue significativamente mayor que la del grupo PBS (= 0,0599) (Figuras 3(g)-3(i) ). Estos resultados sugieren que la EAP aumenta la producción IL-6, TNF- e IFN. La expresión IL-6, TNF- e IF En contraste, los niveles de TNF-mRNA tras el tratamiento con EAP (25 mg/kg) fueron significativamente más bajos que los del grupo PBS (Figura 3(e) ), mientras que la expresión IL-6 e IFN fue sólo ligeramente menor (no significativa) (Figuras 3(d) y 3(f) ). Estos resultados pueden ser explicados por una mayor carga viral, y la respuesta inflamatoria más severa en ratones tratados con PBS. La inflamación excesiva puede causar lesiones pulmonares graves durante la infección por influenza H5N1. Para evaluar los cambios histopatológicos en los pulmones de ratones infectados, se examinaron tejidos de cada grupo en el día 3 postinfección. Los pulmones de ratones tratados con PBS mostraron una respuesta inflamatoria severa, caracterizada por edema intersticial, infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos, lumen alveolar inundado con líquido edema mezclado con células epiteliales alveolares exfoliadas, y un engrosamiento de las paredes alveolares (Figuras 4(c) y 4(d) ). Los pulmones de ratones tratados con EAP (25 mg/kg) mostraron lesiones más leves que los que recibieron PBS, caracterizadas por signos de bronconeumonía con edema intersticial, e infiltración celular inflamatoria alrededor de pequeños vasos sanguíneos (Figuras 4(a) y 4(b) ). Se correlacionaron cargas virales y producción de citocinas inflamatorias en el pulmón; sugiriendo que el tratamiento con EAP reduce lesiones pulmonares en ratones infectados con H5N Los polisacáridos derivados de muchas plantas mejoran la secreción de citoquinas y quimioquinas, tales como TNF-, IL-6, IL-8 e IL-12 [11]. Este efecto inmunomodulador está mediado principalmente por el reconocimiento de polisacáridos polímeros por varios receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Para determinar qué receptor contribuye directamente al reconocimiento inmune innato de EAP, el receptor de Toll-como 2 (TLR2), TLR4, Dectin-1 y receptor de manosa (MR) fueron examinados por qPCR tanto in vivo como in vitro. Los ratones fueron tratados con EAP a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal intranasal una vez al día durante 5 días, con ratones de control recibiendo PBS. El ARN total pulmonar fue preparado para qPCR. La expresión de Dectin-1 y MR en ratones tratados con EAP fue significativamente elevada en comparación con los controles, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 fue ligeramente mayor, pero no estadísticamente significativa (Figura 5(a) ). El ensayo in vitro mostró tendencias similares. Como se muestra en la Figura 5(b), las células Raw264,7 fueron tratadas con 200 g/ml EPA durante 36 h antes de qPCR. Los niveles de Dectin-1 y MR fueron significativamente más altos, mientras que la expresión de TLR2 y TLR4 no cambió. Estos datos sugieren que el reconocimiento del EAP ocurrió principalmente a través de la vía Dectin-1 y MR. En este estudio, evaluamos las actividades inmunomoduladoras y el efecto protector del EAP frente a la infección por gripe H5N1 en un modelo de ratón. La administración intranasal de EAP antes del desafío viral H5N1 mejoró las tasas de supervivencia de ratones infectados con la correspondiente reducción de la carga viral pulmonar. El efecto anti-H5N1 fue muy probable debido al reconocimiento inmune innato de EAP y a la secreción de mediadores inmunes innatos (IL-6, TNFand IFN-) antes de la infección. Además, el efecto del EAP sobre la expresión PRR (incluyendo TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR) fue determinado tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el reconocimiento inmune innato de EAP fue dependiente de la activación de las vías Dectin-1 y MR. Nuestros datos demuestran la viabilidad de usar EAP como un nuevo agente inmunomodulador contra la infección por influenza. La aparición de nuevas cepas farmacorresistentes derivadas de la deriva antigénica limita los beneficios terapéuticos de la vacunación y los agentes antivirales en el control de la gripe [6, 21, 22]. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevas estrategias antiinfluenza de amplio espectro. La mayoría de los polisacáridos botánicos son candidatos ideales para nuevos agentes inmunomoduladores debido a sus propiedades no tóxicas y a menos efectos secundarios en comparación con los polisacáridos de origen bacteriano. Varios polisacáridos aislados de plantas y hongos exhiben beneficios antivirales eficaces contra el virus A de la gripe (incluidos los subtipos H1N1 y H3N2) [12] [13] [14] [15]. El uso de polisacáridos como agente inmunomodulador en estudios anti-H5N1 es poco frecuente. El tratamiento con EAP aumentó la producción de IL-6, TNF- e IFN y proporciona una ventaja de supervivencia en ratones infectados con H5N1. La tasa de supervivencia tras el pretratamiento con EAP (25 mg/kg de peso corporal) fue significativamente mayor que en ratones que recibían PBS (50% a 0%). En informes anteriores, se detectaron altos niveles de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (incluyendo TNF-, IL-6 e IFN-) durante la infección con H5N1 [23, 24]. Esta "tormenta de citoquinas" conduce a los síntomas respiratorios severos y a la lesión inmune del huésped. Así, las tormentas de citoquinas inducidas por H5N1 se hipotesan para ser la principal causa de mortalidad, y el uso de agentes antiinflamatorios puede, por lo tanto, proporcionar un efecto terapéutico [25, 26]. Curiosamente, 8 ratones de medicina complementaria y alternativa basados en pruebas deficientes en TNF-, TNF-receptor, IL-6, MIP-1, e IL-1R o tratados con esteroides, de tipo salvaje no tuvieron una ventaja de supervivencia en comparación con ratones de tipo salvaje después de la infección por gripe H5N1 [27, 28]. Curiosamente, el tratamiento profiláctico del agonista TLR3 PolyICLC, que aumenta fuertemente la producción de citoquinas, proporciona protección contra las infecciones por H1N1 y H5N1 [29, 30]. Estos estudios contradictorios se pueden explicar en que la respuesta inflamatoria ayuda a eliminar el virus, mientras agrava el daño patológico del huésped. Producción elevada de citocinas, como IL-6, TNF- e IFNare muy importante para el aclaramiento viral en la etapa temprana de la infección mediante la activación Una vez que la infección viral ha desencadenado una tormenta de citoquinas debido a la alta carga viral, la respuesta inflamatoria causa lesiones patológicas graves o incluso la muerte. En este caso, recibir un inmunomodulador por sí solo no puede ayudar a los animales a sobrevivir [25], lo que probablemente explica por qué el tratamiento inmunomodulador previo a la infección viral resulta en una mejor tasa de supervivencia [26, 30]. En nuestro estudio, el tratamiento de EAP poco después de la infección o postinfección 24 h no proporcionó una ventaja de supervivencia (datos no mostrados). Las propiedades antiinfluenza de IL-6, TNF- e IFN han sido discutidas en muchos estudios, a pesar de su participación en tormentas citoquinas desencadenadas por la infección por gripe. IL-6 juega un papel importante en la protección contra el virus influenza A, ya que es necesario para el aclaramiento viral y esencial para El tratamiento con IFN en las primeras etapas de la infección por gripe mejora la tasa de supervivencia en los modelos de ratón [33]. Además, los altos niveles de secreción de IFN estimulados por polisacáridos de ginseng proporcionan un efecto antiinfluenza in vivo [12]. En este informe, la administración intranasal de EAP antes del desafío H5N1 eleva la expresión de IL-6, TNF- e IFN en comparación con ratones que reciben PBS. Los altos niveles de estos mediadores contribuyen al aclaramiento viral y a la respuesta antiviral. Los títulos virales pulmonares después del tratamiento con EAP fueron más bajos en el día 3 postinfección. En contraste, los niveles de IL-6 e IFN-mRN fueron ligeramente más bajos, mientras que la producción de TNF fue significativamente menor que la del grupo PBS. En cuanto a la inflamación excesiva inducida por el virus H5N Por lo tanto, el momento del tratamiento con EAP como agente profiláctico es muy importante. Se cree que las actividades inmunomoduladoras de los polisacáridos botánicos son mediadas por varios PRR [11]. En este estudio, examinamos los niveles de ARNm de TLR2, TLR4, Dectin-1 y MR después del tratamiento con EAP. Se encontró que el EAP aumenta significativamente las expresiones de Dectin-1 y MR mRNm tanto in vivo como in vitro. Nuestra hipótesis es que el reconocimiento inmune innato del EAP se impulsa principalmente a través de una vía dependiente de Dectin-1 y MR. La unión a estos receptores, el EAP puede activar vías de señalización intracelulares complejas y aumentar la producción de citocinas, conduciendo a una respuesta antiviral. Así, la protección contra H5N1 por el tratamiento con EAP es menos probable que cause resistencia En conclusión, nuestro estudio demuestra que el extracto de hoja de EAP es un agente profiláctico e inmunomejorante contra la infección por el virus de la gripe H5N1. El tratamiento con EAP inhibe eficazmente la replicación viral de H5N1 y mejora la supervivencia animal. Este enfoque ofrece una estrategia alternativa para el desarrollo de agentes inmunomoduladores antiinfluenza y beneficia la utilización de productos de E. adenophorum.
question: En este estudio, ¿cómo afectó el tratamiento de la EAP después de la infección a la supervivencia?
answers.text: no proporcionó una ventaja de supervivencia