context: El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de IL-1β inducida por SRAS-CoV 3a. FIGURA 4  Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.
question: ¿Cuántos aminoácidos hay en la proteína SARS-CoV E?
answers.text: 76 aminoácidos