context: Respuestas inmunes mucosas inducidas por la administración oral recombinante Bacillus subtilis que expresa el antígeno COE de PEDV en lechones recién nacidoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6418403/SHA: 5caced13bcb8a42cca41369c5a71ae7df5381ca8Autores: Wang, Jialu; Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianFecha: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Licencia: cc-byAbstract: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad altamente contagiosa en lechones recién nacidos y causa pérdidas económicas sustanciales en el El virus PED (PEDV) se disemina por contacto fecal-oral y puede prevenirse mediante inmunización oral. Por lo tanto, es necesario desarrollar una vacuna oral eficaz contra la infección por PEDV. Actualmente, Bacillus subtilis como portador de la vacuna recombinante se ha utilizado para la administración de antígenos y se ha demostrado que es inmunitaria y segura. El presente estudio evaluó la inmunogenicidad de Bacillus subtilis recombinante (B. subtilis-RC) en lechones por vía oral. Después de la inmunización oral en lechones, B. subtilis-RC aumentó significativamente las respuestas inmunitarias de la mucosa local. La administración oral con B. subtilis-RC mejoró significativamente el nivel de anticuerpos contra la infección por PEDV específicos de la inmunoglobulina A (IgA) mediante la ampliación del área de los parches (PP) de Peyer y Mientras tanto, B. subtilis-RC aumentó notablemente el número de linfocitos intraepiteliales (IEL). También observamos que la administración oral de B. subtilis-RC aumentó significativamente el número de linfocitos CD3(+)T y mejoró la proporción de células T CD4(+)/CD8(+). Además, los títulos altos de inmunoglobulina G (IgG) sérica específica revelaron una respuesta inmunitaria sistémica satisfactoria contra la infección por PEDV. En resumen, nuestro estudio demostró que la administración oral de B. subtilis-RC podría desencadenar un alto nivel de respuestas inmunitarias locales y sistémicas y sería una vacuna candidata prometedora contra la infección por PEDV en lechones. Texto: Diarrea epidémica porcina (PED) caracterizada por diarrea aguda altamente fatal en lechones, resulta en enormes pérdidas en la industria porcina mundial [1] El agente causante del virus PED (PEDV) pertenece a los coronavirus porcinos (CoVs). La infección por PEDV se propaga principalmente a través del tracto digestivo [2], y daña las superficies mucosas del intestino huésped infectando las células epiteliales intestinales [3]. Por lo tanto, la mejora de la inmunidad mucosa intestinal puede provocar respuestas inmunológicas eficaces contra la infección por PEDV [4]. Actualmente, se han desarrollado y aplicado ampliamente en el mercado vacunas tradicionales (vía intramuscular o inyección subcutánea) [5]. Estas vacunas administradas por vía parenteral no pueden inducir eficazmente títulos altos de anticuerpos maternos y anticuerpos IgA específicos del virus, lo que resulta en una protección mucosa inadecuada contra la infección por PEDV [6]. Además, estos anticuerpos maternos en la leche siempre fueron degradados por el ácido gástrico y la pepsina antes de entrar en el tracto intestinal. Las vacunas Como una forma superior de inmunización mucosal, la administración oral puede proteger el intestino y estimular el sistema inmunológico mucosal común [8]. Además, la inmunización oral tiene varias características atractivas que incluyen la seguridad, y un enfoque sencillo, barato y sin agujas [9]. Por lo tanto, la inmunización oral a menudo ofrece grandes cantidades de antígenos para prevenir las enfermedades diarreicas [10]. Sin embargo, hay varios desafíos por la inmunización oral, que consisten en barreras físicas, químicas y biológicas al entregar antígenos al tracto gastrointestinal (como ácidos gástricos, pepsina y tripsina en el tracto GI) [11]. Es un problema sustancial que los ácidos digestivos y las proteasas pueden degradar las proteínas antígenos para la absorción de nutrientes [12]. Por lo tanto, el sistema de administración de vacunas se ha aplicado para resolver el problema. El sistema puede proteger antígenos del entorno severo del tracto GI y entregar antígenos a la mucosa intestinal Actualmente, Bacillus subtilis (B. subtilis) es ampliamente utilizado como un sistema de administración de vacunas por sus características únicas. Como bacteria Gram-positiva no patógena, B. subtilis ha sido considerado como un nuevo probiótico y aditivo alimentario en humanos y animales [14]. El B. subtilis tiene actividad adyuvante y puede entregar antígenos heterólogos al tracto GI, proporcionando estimulación de inmunidad adicional [15]. Además, la investigación había demostrado que B. subtilis administrado por vía oral también podría mejorar la regulación inmunitaria y la salud intestinal en cerdos [16]. Además, la administración oral de B. subtilis podría generar respuestas inmunes humorales y celulares al mantenimiento de la homeostasis intestinal por células dendríticas [17]. Los DC son las células de antígeno profesional más importantes y pueden regular eficazmente los títulos de anticuerpos [18 Los DCs existen naturalmente en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), incluyendo los parches de Peyer (PPs), folículos linfoides aislados (FIL), ganglios linfáticos mesentéricos (MLNs), y se dispersan a través de la lámina subepitelial propria (LP) del intestino delgado y el colon [19]. Además, B. subtilis es conveniente para la manipulación genética y ha desarrollado una gran variedad de herramientas genéticas [20]. Por lo tanto, B. subtilis se utiliza ampliamente como un sistema eficaz de administración de vacunas para inducir respuestas inmunes mucosas y muestra un efecto único en el sistema inmunitario. En el presente informe, exploramos el efecto inmune de un B. subtilis recombinante (B. subtilis-RC) que se había construido con éxito con la expresión de la proteína PEDV COE en lechones. Nuestra investigación indicó que B. subtilis-RC era beneficioso para el desarrollo del sistema inmunológico mucosal, y podía generar anticuerpos específicos contra la infección por PEDV, sugiriendo un posible enfoque para prevenir la infección por PEDV. El B. subtilis WB800 fue amablemente proporcionado por el Dr. Xuewen Gao (del departamento de patología vegetal de la Universidad Agrícola de Nanjing) [21]. B. subtilis-RC construido previamente en nuestro laboratorio fue capaz de expresar el gen COE (499-638 aminoácidos en proteína S). Antes de la administración oral, la cepa recombinante fue cultivada en caldo LB a 37 • C durante 12 h, y luego se lavó dos veces con PBS, y se suspendió en PBS para alcanzar una concentración final de 1 × 10 10 CFU/ml. La cepa PEDV Zhejiang08 fue proporcionada por el Centro El virus se cultivó en células renales de mono verde africano (células VERO) y se purificó utilizando un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa. El virus fue inactivado por UV a dosis UV de 4 J/cm 2 durante 24 h para lograr una pérdida completa de infectividad [23]. La concentración del virus purificado se midió utilizando el kit de análisis de proteínas BCA (Thermo Fisher, MA, EE.UU.). ELISA: Rabbit anti-pig IgG (peroxidasa de rábano caballar (HRP)), Goat Anti-Pig IgA (HRP) fueron comprados a Abcam. Segundo anticuerpo: Anticuerpo IgG de cabra conjugado DyLight 649 anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 488-anticuerpo IgG de cabra conjugado, DyLight 594-anticuerpo IgG de cabra conjugado fueron comprados a Multiciencia, Hangzhou, China. Sistema basado en ABC (anticuerpo IgG de cabra bitinilada) fue utilizado como el anticuerpo secundario con DAB como un cromogeno fue comprado a Boster, Wuhan, China. Cochinchos DLY específicos libres de patógenos (Duroc y Landrace y Yorkshire) fueron amablemente proporcionados por la Academia Jiangsu de Ciencias Agrícolas (Nanjing, China). Los experimentos con animales habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing y siguieron las directrices de los Doce lechones recién nacidos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (cuatro lechones en cada grupo) y alojados en condiciones similares en diferentes establos para evitar la contaminación cruzada probiótica. Los lechones fueron dosificados por vía oral con 100 μl de B. subtilis-RC. Los grupos de control de lechones fueron administrados por vía oral con PEDV inactivado (100 μg/dosis) e igual volumen de PBS. El protocolo de inmunización fue realizado en los lechones que tenían 5 días de edad (Figura 1C ), y firmados como 0 día. Luego se administraron vacunas de refuerzo en 5 días. Luego se realizó la recolección de especímenes cada 7 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 1C ). Se recolectaron muestras de sangre semanalmente de todos los lechones después de la inmunización de refuerzo y se les permitió coagular durante la noche a temperatura Las muestras de sangre se separaron mediante centrifugación y se almacenaron a −20 • C para detectar los niveles de IgG e IgA específicos. Se recolectaron tres hisopos cada semana durante 1 mes, incluyendo hisopos nasales, orales y de heces para el ELISA. Los lechones fueron sacrificados en 33 días. La misma ubicación de los tejidos del intestino delgado y del íleo de cada cerdito se fijaron con el líquido de Bonn y un 4% de paraformaldehído. Los tejidos del intestino delgado en la misma ubicación se fijaron con solución fijadora de Bouin durante 24 h, incrustados en parafina, y seccionaron a un espesor de 4 μm. Las secciones se colocaron en diapositivas de vidrio. La tinción de hematoxilina-eosina se aplicó a las secciones de parafina, y luego se observaron y tomaron fotografías bajo microscopio El número de linfocitos intraepiteliales (IEL) se contaron en cada 100 células epiteliales bajo el mismo microscopio de luz múltiple entre diez imágenes de cada grupo [24]. La detección inmunohistoquímica se realizó con el kit SABC (Boster Bioscience), se utilizó peróxido de hidrógeno para desactivar la peroxidasa intrínseca. La recuperación de antígenos se realizó en un baño de agua utilizando tampón citrato-EDTA (10 mM ácido cítrico, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6.2). Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-IgA diluido (1:100; Abcam) durante la noche a las 4 • C. Como controles negativos, inmunoteñido realizado mediante muestras de control antiserum en lugar de anticuerpo primario. La adición de anticuerpo secundario marcado con biotina a las diapositivas fue seguida por la Después de la tinción con DAB, las diapositivas fueron grabadas utilizando una cámara digital (Leica-DM4000B) [25]. Los intestinos aislados con PP fueron transferidos a PBS helados. Luego, el resto de grasa y tejido conectivo fue removido y lavado a fondo con PBS helado. Luego, el intestino fue cortado longitudinalmente en fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos fueron incubados con 5 ml de EDTA 30 mM y colocados en solución digestiva de 5 ml que contenía 4 % FBS, 0,5 mg/ml cada uno de Collagenasa D (Roche) y Dnasa I (Sigma), y 50 U/ml Dispasa (Fisher). Los fragmentos fueron incubados con PBS de Dulbecco (DPBS) durante 20 min a 37 • C por rotación lenta (100 rpm). Después de la incubación, la capa de células epiteliales que contenía los LIE fueron separadas por un vórtice intensivo y pasaron a través de un colador celular de 70-μm. La suspensión monocelular fue recogida y lavada dos veces por DPBS, la solución fue vórtice intensamente y pasó a través de un colador celular de 40-μm. Los sobrenadantes fueron lavados por medio de RPM 1640 preenfriado (Thermo Fisher Scientific) y suspendidos por 10 ml de la fracción 40% de un gradiente de 40:80 Percoll, superpuestos sobre 5 ml de la fracción 80% en un tubo Falcon de 15 ml. La separación de gradiente de Percoll fue realizada por centrifugación durante 20 min a 2500 rpm. Los linfocitos LP (LPL) fueron recolectados en la interfase del gradiente Mientras tanto, el análisis de citometría de flujo se realizó en instrumentos BD Facscalibur (BD Biosciences) y fue analizado por el software FlowJo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Pharmingen o eBiociencias. Suspensiones unicelulares aisladas fueron manchadas con anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE, todas a la 1:100 dilución durante 30 min sobre hielo, y lavadas con PBS dos veces, y analizadas por FACS [26]. Las citoquinas interleucinas (IL) 10 (IL-10) e IL-1β (Abcam) fueron medidas por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos en un lector de placas ELISA automatizado en OD 450 nm inmediatamente. Los anticuerpos neutralizantes de PEDV fueron medidos en líquido lavado de intestinos La prueba se realizó como se describió previamente con modificaciones menores [27]. Un total de 450 μl de líquido de lavado de intestino fue dos veces diluido en serie y mezclado con 50 μl de suspensión viral que contenía 10 3 TCID 50 PEDV virus durante 1 h a 37 • C en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 12 pocillos. La mezcla fue inoculada durante 1 h a 37 • C y 5% CO 2. Luego, la mezcla fue inoculada con células Vero suspensión (aproximadamente 1,0 × 10 6 ml − 1 ) durante otros 3-4 días. Después de la tinción con Crystal Violet, las placas fueron observadas bajo un microscopio para el efecto citopático. Los datos fueron obtenidos como el medio + − S.E.M. de tres réplicas por prueba en un solo experimento. GraphPad Prism V Las múltiples pruebas de comparación de Tukey y ANOVA de un solo sentido fueron utilizadas para analizar la significación de la diferencia entre los medios. Los valores-P inferiores a 0,05 (P<0,05) fueron considerados significativos y los valores-P inferiores a 0,01 (P<0,01) como altamente significativos. Los PP son un concentrado de tejido linfoide y el sitio primario para la producción de inmunoglobulina A (IgA), lo cual es crucial para regular el equilibrio homeostático del intestino [28]. El área de los PP es un indicador clave de inmunidad. La administración oral con B. subtilis-RC significativamente (P<0,01) aumentó el área de los PP en comparación con dos grupos control como se muestra en la Figura 1A. Además, la longitud de la vili del íleum obtuvo más tiempo por administración oral con B. subtilis-RC (P<0,01) que Estos confirmaron principalmente que B. subtilis-RC fue beneficioso para mantener la estructura del intestino. Los IEL intestinales son una población grande y diversa de células linfoides que residen dentro de las células epiteliales intestinales (IECs), y que forman la barrera mucosa intestinal [29]. Los IELs son una parte importante del sistema inmunológico de la mucosa intestinal. El nivel de anticuerpos específicos anti-PEDV íleum IgA + secretación (SIgA) en lechones fue medido por ELISA en la boca y heces. Como se muestra en la Figura 3A, B, la mucosa específica del antígeno SIgA en los sitios anteriores fue claramente mayor que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Como se esperaba, la boca tenía niveles más altos de SIgA que otros sitios. Después de la inmunización oral, el nivel de anticuerpo anti-PEDV IgG sérico en lechones inmunizados con B. subtilis-RC, PEDV inactivado o PBS fue determinado por ELISA, como se muestra en la Figura 3C. Los resultados indicaron que aunque los títulos cayeron durante el período de muestreo, el nivel IgG de B. subtilis-RC todavía aumentó significativamente de 0 a 33 días que el grupo PEDV inactivado (P<0,05 o P<0,01). Los linfocitos CD3 + T son los marcadores de la superficie celular fundamental de los linfocitos T, por lo que el número de linfocitos CD3 + T podría representar la cantidad de linfocitos T. En consecuencia, se analizó el número de linfocitos CD3 + T en el íleo. Los datos indicaron que tanto B. subtilis-RC como PEDV inactivado podrían aumentar dramáticamente (P<0,05) los linfocitos CD3 + T en comparación con el grupo PBS (Figura 4A ). Estos cambios mostraron evidencia segura de que la administración oral con B. subtilis-RC tuvo una buena influencia en la inmunidad de la mucosa intestinal en lechones. SIgA es el principal isotipo de inmunoglobulina en animales, en gran parte secretado a través de la superficie de la mucosa intestinal especialmente en el intestino delgado [30]. SIgA juega un papel importante en la inmunidad de la mucosa intestinal y refleja en la inmunidad de la mucosa intestinal. Después de la administración oral con B. subtilis-RC, el número de células secretantes IgA había aumentado rápidamente en comparación con los otros dos grupos (P<0,05) (Figura 4B). Estos resultados mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC fue propicia a la inmunidad mucosa intestinal y podría aumentar el número de células secretadoras de IgA para producir efectos positivos sobre la infección por PEDV. Gran parte de las células inmunitarias están dispersas en las células epiteliales. Las IEC interactúan directa o indirectamente con las células inmunes innatas y adaptativas mediante la presentación de antígenos a los linfocitos [31]. Por lo tanto, el aprendizaje sobre cómo se distribuyen los linfocitos en la pequeña mucosa intestinal es muy significativo para la inmunología de la mucosa. Datos previos habían demostrado que los linfocitos CD3 + T aumentaron significativamente (P<0,05) (Figura 4A ), por lo que se analizó más adelante la clasificación inmunológica de CD3 + T linfocitos. El linfocito del íleo con unión de PP Estos resultados mostraron que las células CD3 + CD4 + T han aumentado obviamente (P<0,01) (Figura 5B ), sin embargo las células CD3 + CD8 + T disminuyeron notablemente (P<0,05) (Figura 5C ). Después del cálculo, la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó (Figura 5D ). Esta relación también podría medir más los niveles de inmunidad de los lechones. Los niveles de citoquina IL-1β e IL-10 se determinaron para evaluar las respuestas inmunes celulares inducidas por B. subtilis-RC como se muestra en la Figura 6A,B. Como podemos ver en el diagrama, significativamente (P<0,01) se produjeron IL-1β e IL-10 superiores después de la administración oral con B. subtilis-RC que los otros dos grupos. Todos estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la liberación de citoquinas para mediar la comunicación con y entre las células del sistema inmunitario, mejorando la respuesta inmune mucosa a la infección por PEDV. Los anticuerpos neutralizantes del PEDV fueron detectados por el ensayo PRNT. La administración oral con B. subtilis-RC podría reducir efectivamente la capacidad de formación de placa de PEDV (P<0,01) en comparación con otros dos grupos en la Figura 7. Esto reveló que B. subtilis-RC podría estimular un alto nivel de anticuerpos neutralizantes del PEDV contra la infección por PEDV. En medio del brote del PEDV, se han desarrollado varias vacunas para controlar enfermedades y los efectos son insatisfactorios. Las vacunas orales pueden inducir una inmunidad mucosa más robusta que las contrapartes inyectables [32]. Ahora está claro que la respuesta inmune mucosal efectiva requiere IgG sérico y SIgA mucosal [34]. SIgA es la base del sistema inmune mucosal, desempeñando un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmune, y neutralizando los patógenos invasivos. IgG sérico representa respuestas inmunes sistémicas. Durante las infecciones por PEDV, la inmunización oral provoca no sólo mucosas sino también respuestas inmunes sistémicas muy bien [35]. Nuestros datos mostraron una respuesta IgG anti-PEDV fuerte y de larga duración se detectaron por vía oral con B. subtilis-RC en lechones. Aunque con el paso del tiempo, los títulos de anticuerpos disminuyeron un poco, todavía se mantuvo en la cabeza en comparación con los grupos de control y de acuerdo con la tendencia cambiante de anticuerpos. El cambio de IgA específica mostró resultados similares en la mucosa de boca y heces. A medida que aumenta la inmunidad adicional, B. subtilis-RC reduce la capacidad de los patógenos para cruzar la mucosa intestinal y la propagación sistémica de patógenos invasivos [36]. El sistema inmunitario de la mucosa genera respuestas inmunitarias a través de células inmunitarias que residen en compartimentos de la mucosa. Los linfocitos T residentes en la mucosa desempeñan un papel importante en la inmunidad de la mucosa [37]. Exploramos más a fondo la especie, las cantidades y la distribución de linfocitos T en la mucosa intestinal. CD3 es un marcador de superficie celular fundamental de linfocitos T [38]. El resultado mostró que el número de linfocitos CD3 + T aumentó significativamente, y estos revelaron que B. subtilis-RC podría estimular la maduración de células T. Según las moléculas expresadas en la superficie celular, los linfocitos T pueden dividirse aún más en células T ayudantes Además, observamos que la relación de células CD4 + /CD8 + T aumentó por vía oral. La relación CD4/CD8 mide la relación de células T ayudantes a células T citotóxicas. Por lo tanto, pudimos ver que la administración oral B. subtilis-RC podría fortalecer la respuesta inmune Th1 al aumentar la relación de células CD4 + /CD8 + T. La morfología del intestino delgado puede reflejar directamente la salud intestinal y desempeña un papel importante en el mantenimiento del sistema inmunitario intestinal [40]. La fase temprana de la infección por PEDV se acompaña frecuentemente de necrosis y exfoliación de células epiteliales villosas infectadas, lo que en última instancia resulta en atrofia villosa aguda y severa [41]. Por lo tanto, el trabajo efectivo de mantener la morfología intestinal es un buen indicador para evaluar la eficacia de las vacunas. Después de la Los PP son pequeñas masas de tejido linfático y forman una parte importante del sistema inmunitario mediante el reclutamiento e inducción de las células T para prevenir el crecimiento de patógenos en los intestinos. Además, un aumento en el número de IEL demostró la eficacia de B. subtilis-RC. Además, la longitud de vellosidad del íleo mostró algunos resultados alentadores que una morfología intestinal bien formada llegó a ser por B. subtilis-RC. La morfología intestinal satisfactoria fue el primer paso en la carretera contra la infección por PEDV. Varios resultados de morfología demostraron que B. subtilis-RC podría mantener notablemente la morfología intestinal y formar una protección integral. Como se mencionó anteriormente, la administración oral con B. subtilis-RC podría estimular la proliferación y diferenciación de células T y modular la respuesta inmune. Además, las citocinas son proteínas moléculas pequeñas con amplia actividad biológica, sintetizadas y secretadas por las células inmunes y algunas células no inmunes [42]. Como molécula de señalización celular, actúa principalmente para regular las respuestas inmunes, participando en la diferenciación y desarrollo de las células inmunes, mediando las respuestas inflamatorias, estimulando la hematopoyesis y participando en la reparación de los tejidos. Estudios previos habían demostrado que el PEDV inhibió tanto las citoquinas NF-.B como las citoquinas proinflamatorias [43]. Por lo tanto, las citoquinas son un indicador clave para evaluar la capacidad de una vacuna para estimular las respuestas inmunes. En este estudio, habíamos observado que IL-1β e IL-10 aumentaron notablemente (P<0.01). El IL-1β como una de las primeras citoquinas proinflamatorias y participa centralmente en la iniciación La investigación había demostrado que IL-1β podría aumentar significativamente la regulación de los tejidos inmunes locales y sistémicos post infección microbiana [44]. Además, IL-10 es una potente citocina antiinflamatoria que juega un papel esencial en la prevención de patologías inflamatorias e autoinmunes [45]. En resumen, ambos datos mostraron que la administración oral con B. subtilis-RC regulada y aumenta la inmunidad mediante citocinas IL-1β e IL-10 de alta regulación. En conclusión, los resultados actuales demostraron que la inmunización oral con B. subtilis-RC podría inducir efectivamente a la mucosa local y respuestas inmunes sistemáticas contra la infección por PEDV, al tiempo que mejora y regula la función inmune elevando la proporción de células CD4 + /CD8 + T y citocinas IL-1β e IL-10, apuntando así a una prometedora vacuna oral candidata para la infección
question: ¿Qué es un indicador efectivo de la capacidad de una vacuna para generar una respuesta inmunitaria?
answers.text: citocinas