context: La bomba de protones principal que acidifica los compartimentos intracelulares de las células eucariotas aumenta la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales mediante la acumulación de colágeno extracelularhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6133348/SHA: f1b81916fac1ca3d50dde774df2e1bb26bf0fb39Autores: Luong, Betty; Schwenk, Rebecca; Bräutigam, Jacqueline; Müller, Rolf; Menche, Dirk; Bischoff, Iris; Fürst, RobertFecha: 2018-09-11DOI: 10.1371/journal.pone.0203053Licencia: cc-byAbstract: La H(+ Debido a que la inhibición de la v-ATPasa dio lugar a efectos antitumorales y antimetastáticos en diferentes modelos tumorales, esta enzima ha surgido como una estrategia prometedora contra el cáncer. Aquí, utilizamos el bien establecido archazolid inhibidor de la v-ATPasa, un producto natural aislado por primera vez del mixobacterio Archangium gephyra, para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en las células endoteliales (ECs), en particular en la interacción entre las CEs y las células cancerosas, que ha sido descuidado hasta ahora. Las células endoteliales humanas tratadas con archazolid mostraron una mayor adhesión de las células tumorales, mientras que la migración transendotelial de las células tumorales se redujo. El proceso de adhesión fue independiente de las moléculas de adhesión CE ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N En cambio, la adhesión fue mediada por las integraciones β1 expresadas en las células tumorales, ya que el bloqueo de la subunidad integrina β1 invirtió este proceso. Las células tumorales se adhirieron preferentemente al colágeno de ligando β1-integrante y archazolid, lo que llevó a un aumento de la cantidad de colágeno en la superficie de las CE. La acumulación de colágeno fue acompañada por una fuerte disminución de la expresión y actividad de la catepsina de proteasa B. La sobreexpresión de la catepsina B en las CE evitó la capacidad de archazolid para aumentar la adhesión de células tumorales a las CE. Nuestro estudio demuestra que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid induce un fenotipo pro-adhesivo en células endoteliales que promueve su interacción con células cancerosas, mientras que la transmigración de células tumor Texto: La enzima tipo vacuolar H + -ATPasa (v-ATPasa) es la mayor bomba de protones responsable de la acidificación de los compartimentos intracelulares en células eucariotas [1]. La enzima consiste en dos complejos multisubunidades, el subcomplejo transmembrana V 1 soluble que se requiere para el transporte de protones a través de membranas [1, 2]. En la mayoría de los tipos de células las v-ATPasas se expresan únicamente en el sistema de endomembrana para regular y mantener el pH ácido de los compartimentos intracelulares como lisosomas, endosomas, el aparato Golgi, gránulos secretores y vesículas recubiertas [3]. La función de las v-ATPasas es esencial para procesos celulares como el tráfico vesicular, la endocitosis mediada por receptores y la degradación y En los tipos de células especializadas incluyendo osteoclastos y células epiteliales renales, las v-ATPasas también se pueden expresar en la membrana plasmática, donde bombean protones en el espacio extracelular [2] [3] [4]. En las células cancerosas las v-ATPasas se expresan en la membrana plasmática para eliminar la citosólica tóxica H +. Lo más importante, las v-ATPasas contribuyen al microambiente tumoral ácido, lo que conduce a la activación de proteasasas, facilitando así la migración, invasión y angiogénesis de las células tumorales [5] [7]. Dado que la inhibición de la v-ATPasa ha demostrado reducir la invasividad de las células cancerosas y la formación de metástasis [8, 9], esta enzima ha surgido como un fármaco prometedor en los últimos años. Archazolid A y B son inhibidores altamente potentes y específicos de las v-ATPasas [10]. Se aislaron por primera vez del mixobacterium Archangium gephyra [11]. Estos compuestos inhiben la v-ATPasa a bajas concentraciones nanomolares [10, 12] mediante la unión a la subunidad c del complejo V o. Como su actividad biológica es comparable a los inhibidores de la v-ATPasa bafilomicina y concanamicina [10, 11], los archazolids son compuestos naturales de alto interés que se pueden utilizar tanto como herramienta para estudiar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa como como como plomo para el desarrollo de fármacos. Los arcazolids pueden ser producidos por fermentación [11] o por síntesis total [13, 14]. En el campo de la investigación del cáncer se reportan varios estudios sobre efectos farmacológicos interesantes del archazolid: Redujo la migración de diferentes células tumorales invasivas in vitro y de células cancerosas metástasis in vivo en Además, las vías activadas de archazolid de respuesta al estrés celular y apoptosis en células tumorales altamente invasivas [16]. En los macrófagos clásicamente activados, el archazolid indujo selectivamente la generación de factor de necrosis tumoral α (TNFα), que puede promover indirectamente la supresión tumoral [17]. Hasta ahora, el papel de las v-ATPasas en las células endoteliales sólo se ha investigado raramente. El endotelio juega un papel crucial en la patogénesis y progresión del cáncer: La cascada metastásica incluye la angiogénesis local en el sitio del tumor primario y la adhesión de células tumorales en el sitio de metástasis [18]. La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos fuera de los existentes, depende de la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales [19 Las células cancerosas circulantes pueden adherirse al endotelio en sitios distantes. Esta interacción adhesiva está mediada por receptores y ligandos correspondientes expresados en células tumorales y endoteliales [18, 21]. Se ha informado que las V-ATPasas regulan el pH intracelular y la migración celular en células endoteliales microvasculares [22, 23]. Un estudio reciente mostró que la inhibición de la v-ATPasa por la concanamicina previno la proliferación, la reducción de la migración y el deterioro de la señalización relacionada con la angiogénesis en células endoteliales [24]. Hasta el momento, no hay investigaciones sobre el papel de las v-ATPasas endoteliales para el proceso de adhesión de células tumorales al endotelio. Así, nos interesaron las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa endoteliales por Varias moléculas de adhesión celular en el endotelio, como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), la proteína de adhesión celular vascular (VCAM-1), la e-selectina o la N-cadherina [21], así como las integrinas expresadas en las células cancerosas, han sido reportadas para mediar la adhesión celular de las células cancerosas a las células endoteliales [25] [26]. Así, nos enfocamos en estas moléculas de adhesión celular e integrinas. Por primera vez, nuestro estudio reveló un vínculo entre la función de las v-ATPasas y las propiedades de adhesión y transmigración de las células endoteliales. CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para determinar la viabilidad celular de las células después del tratamiento con archa Este ensayo se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir la resazurina, lo que da lugar a resorufina fluorescente. El reactivo CellTiter-Blue se añadió a las células 4 h antes del final del tratamiento. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas Infinite F200 (Tecan, Männedorf, Suiza) a 560 nm (excitación) y 590 nm (emisión). El ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después del tratamiento con archazolid. El tampón de lisis se añadió a las células no tratadas 45 min antes del final del tratamiento para inducir la liberación de esta enzima. La LDH es una enzima citosólica que La LDH liberada cataliza la conversión enzimática de lactato a piruvato, que proporciona NADH para la conversión de violeta iodonitrotetrazolio en un producto de color rojo formazán en presencia de diaforasa. La absorbancia se midió con un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) a 490 nm. LysoTracker Red DND-99 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) es un tinte para medir los valores de pH en células viables. Los HUVEC fueron cultivados para confluir en μ-deslizantes con recubrimiento de colágeno G (80826, ibidi, Martinsried, Alemania) antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. 1 μg/ ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) fue utilizado para visualizar los núcleos y 50 nM LysoTracker Red DND-99 fue utilizado para visualizar los compartimentos ácidos que corresponden a los lisosomas. Ambos tintes fueron incubados durante 10 minutos a 37°C antes de la adquisición de imágenes individuales por un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las células fueron incubadas con concentraciones indicadas de archazolid durante 24 h. Las células MDA-MB-231 o PC-3 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (5 μM en DMEM libre de suero, 37 μC) durante 30 minutos antes de que se añadieran 100.000 células por pozo a los HUVEC y se les permitió adherirse durante varios puntos de tiempo a 37 μC. Las células tumorales no compatibles fueron lavadas tres veces con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+. La adhesión de células tumorales se determinó mediante mediciones de fluorescencia con un lector de microplacas Infinite F200 pro (Tecan) a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Para bloquear la subunidad de integrina β1 en células MDA-MB-231 o PC-3, CellTracker se incubaron células MDA-MB-231 o PC-3 con un anticuerpo antiintegrante β1 (P5D2, ab24693, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración de 1 μg de anticuerpo por millón de células en 1 ml de DMEM. Antes de añadir a las células HUVEC tratadas con archazolid, MDA-MB-231 o PC-3 se lavaron una vez con DMEM. Para bloquear la subunidad de integrina β1 en las células HUVEC, las células se incubaron con el anticuerpo antiintegrante β1 (0,1 μg/pozo en ECGM). Las HUVEC se lavaron una vez con ECGM antes de añadir células MDA-MB-231 o PC Para la adhesión de células MDA-MB-231 o PC-3 a los componentes de la matriz extracelular (ECM) las placas de 24 pocillos fueron recubiertas con colágeno G (10 μg/ml en PBS), fibronectina plasmática humana (10 μg/ml PBS) o laminin-411 (10 μg/ml en PBS de Dulbecco [DPBS] que contenía Ca 2+ y Mg 2+ ) a 4oC durante la noche. La adhesión de células MDA-MB-231 y PC-3 a estos tres componentes ECM más prominentes se llevó a cabo como se describe anteriormente (10 min de adhesión a 37oC). Los HUVECs fueron cultivados sobre una membrana filtrante porosa (Inserto Transwell, membrana de policarbonato, 8 μm poros; Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 48 h y Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con CellTracker Green CMFDA Dye (como se describe en el ensayo de adhesión celular de sección) y resucitadas en el medio 199 (PAN-Biotech) que contenía 0,1% BSA. Los HUVECs fueron lavados dos veces con medio 199 que contenía 0,1% BSA antes de que las células MDA-MB-231 pudieran transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Medio 199 que contenía 0,1% BSA fue utilizado como control negativo y medio 199 que contenía 20% FCS fue utilizado como quimioatractante para la transmigración en el compartimento inferior. Las células no migradas que permanecían en el compartimento superior fueron cuidadosamente removidas mediante un hisopo de algodón. Las células transmigradas se lisaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón y la transmigración se cuantificó midiendo la señal de fluorescencia a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 6 pozos antes de ser tratados con archazolid durante 12 h. Las células fueron inducidas a aumentar la expresión génica de las moléculas de adhesión celular por TNFα. El ARN fue aislado usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La digestión de la Dnasa en la columna se realizó para eliminar el ADN genómico. El ARN fue transcrito al cDNA por Superscript II (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Los experimentos con qPCR se realizaron utilizando un Sistema StepOnePlus (Aplicated Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y los datos fueron analizados por StepOne y Ste-pOnePlus Software v2.3. Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) y se utilizó el método comparativo de cuantificación C T (2 -+CT ). Los HUVEC fueron cultivados para confluir en placas de 12 pocillos antes de ser tratados con archazolid durante 24 h. Las células fueron tratadas con TNFα durante 24 h para inducir la expresión de moléculas de adhesión celular. Posteriormente, las células fueron separadas con HyClone HyQTase (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). En el caso de ICAM-1, las células separadas se fijaron con un 4% de formaldehído (Polysciences, Hirschberg an der Bergstraße, Alemania) en PBS durante 10 min y se lavaron una vez con PBS antes de incubar con el anticuerpo anti-humano CD54 (ratón, ICAM-1) marcado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (MCA1615F, Biozol, Eching, Alemania) a temperatura ambiente durante 45 min. Para todas las demás proteínas, las células no se fijaron y lavaron una vez con PBS antes de incubar con los anticuerpos anti-humanos CD106 (ratón, VCAM-1), anti-humanos CD62E (ratón, E-selectina) y anti-humanos CD325 (ratón, N-cadherina) de Becton Dickinson en hielo durante 45 min. Estos anticuerpos se diluyeron en PBS que contenían un 0.2% de BSA. La expresión superficial de moléculas de adhesión celular se midió mediante citometría de flujo (FACSVerse, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Para manchar la superficie de colágeno en los HUVEC, las células se incubaron con un anticuerpo de colágeno antihumano (rabbit, 1:40, ab36064, Abcam) en hielo durante 30 min. El procedimiento de tinción se realizó en hielo para asegurar que las proteínas superficiales o anticuerpos no se endocitosan. Las células se lavaron una vez con PBS que contenían Ca 2+ y Mg 2+ antes de que se fijaran con Roti-Histofix (Carl Roth). Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbits (cabra, 1:400, A11008, Life Technologies) se utilizó como anticuerpo secundario y Hoechst 33342 (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) se utilizó para visualizar núcleos. Las células se lavaron con PBS helados y se lisaron con tampón RIPA complementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre; Roche, Mannheim, Alemania), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fenilmetilsulfonil fluoruro, β-glicerofosfato, pirofosfato de sodio y H 2 O 2. La determinación de proteínas se realizó utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Cantidades iguales de proteínas (10-20 μg) fueron separadas por electroforesis de gel dodecil sulfatepoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE; Laboratorios Bio-Rad, Munich, Alemania). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche atornillada en polvo (Carl Roth) en TBS que contenía 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-catepsina B de ratón (IM27L, Merck) (1:500), anticuerpo anti-β-actina-peroxidasa de ratón (A3854, Sigma-Aldrich) (1:10.000) y anticuerpo vinculado a la peroxidasa de rábano de caballo IgG (HRP) (7076, Cell Signaling, Frankfurt, Alemania) (1:5.000). ImageJ versión 1.49m se utilizó para el análisis densitométrico. El ensayo de actividad de la catepsina B se realizó como se describe en la publicación de Kubisch et al. [28]. Las células se lavaron con PBS y se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER no desnaturalizante (78501, Thermo Fisher Scientific) suplementado con inhibidores de la proteasa (completa Mini EDTA-libre, Roche), ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El sustrato de catepsina B fluorogénica Z-Arg-Arg-7-amido-4-metilcoumarina clorhidrato (C5429, Sigma-Aldrich) se añadió a 30 μg de lisato celular diluido en tampón de ensayo complementado con 2 mM de L-cisteína (C7880, Sigma-Aldrich) e incubado durante 30 min a 40°C. La fluorescencia se midió a 348 nm (excitación) y 440 nm (emisión) con un lector de microplacas (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la señal de fluorescencia correspondió a la actividad de la enzima catepsina B. Para la sustracción de fondo el inhibidor de la catepsina B CA-074Me (Enzo Life Sciences, Lörrach, Alemania) se añadió a una reacción adicional. El kit de nucleofectores HUVEC (Lonza, Colonia, Alemania) se utilizó para transfectar a los HUVEC. La transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 2,5 μg de plásmido ADN para 500.000 células (Nucleofector 2b Device, Lonza). 48 h después de la transfección las células fueron tratadas para experimentos posteriores. El plásmido addgene #11249 hCathepsin B fue amablemente proporcionado por Hyeryun Choe [29]. hCathepsin B fue digerido con PmeI y XbaI y el fragmento de ADN lineal no correspondiente al gen CTSB humano fue religado para generar el plásmido vacío pcDNA3.1 (-) delta MCS que se utilizó para controlar las transfecciones. La columna vertebral original de hCathepsin B es el pcDNA3.1 (-) de Thermo Fisher Scientific. El vector de control pcDNA3.1 (-) delta MCS utilizado para nuestras transfecciones fue clonado sobre la base de hCathepsin B y por lo tanto carece casi de toda la parte del sitio de clonación múltiple del pcDNA3.1 (-). Los análisis estadísticos se realizaron Para la evaluación de un mínimo de tres experimentos independientes se utilizó el ANOVA de ida seguido de la prueba post-hoc de Tukey o t-test sin emparejar. El número de experimentos realizados de forma independiente (n) se indica en las leyendas de la figura correspondientes. p 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Dado que el inhibidor de la v-ATPasa archazolid nunca ha sido utilizado para estudios en células endoteliales, primero se realizaron ensayos de citotoxicidad. Tratamos a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 y 48 h y observamos que este tratamiento no tiene influencia en la actividad metabólica ni en la liberación de LDH después de 24 h (Fig 1A y 1B, paneles izquierdos). La actividad metabólica y la liberación de LDH sólo se vieron levemente afectadas por la mayor concentración de archazolid después de 48 h (Fig 1A y 1B, paneles derecho). En consecuencia, los siguientes experimentos se llevaron a cabo después de 24 h (o menos) de tratamiento con archazolid con el fin de excluir cualquier efecto citotóxico de archazolid dentro de nuestros entornos experimentales. El análisis microscópico reveló que también la integridad de la monocapa endotelial no se vio afectada por el archazolid, pero las células mostraron una morfología ligeramente diferente (Fig 2A): las células tratadas con archazolid se hincharon en comparación con las células de control, lo que no fue inesperado, ya que la vacuolación del retículo endoplasmático (ER) se ha descrito para otros tipos de células y es típica para inhibidores de la v- Este efecto fue evidente tanto en las células subconfluentes como en las confluentes (Fig 2A). La inhibición de la v-ATPasa impide la acidificación de los lisosomas [1, 31]. Utilizando el tinte permeable a las células LysoTracker Red DND-99, es posible etiquetar los lisosomas ácidos en las células vivas. Así, este tinte puede servir como indicador de inhibición de la v-ATPasa. Para demostrar que el archazolid también es funcionalmente activo como inhibidor de la v-ATPasa en los HUVECs, las células fueron tratadas con archazolid de 1 nM antes de ser incubadas con LysoTracker Red DND-99 y Hoechst 33342. Como se muestra en la figura 2B, la tinción vesicular roja correspondiente a los lisosomas acidificados en las células En resumen, el tratamiento con archazolid durante 24 h no fue citotóxico para los HUVEC quiescentes, pero inhibió la funcionalidad de la V-ATPasa. Analizamos la adhesión de células MDA-MB-231 a los HUVEC. Se trató a los HUVEC confluentes con un archazolid de hasta 1 nM durante 24 h. Las células MDA-MB-231 no tratadas fueron etiquetadas con un color verde CMFDA de Tracker celular. Curiosamente, la inhibición de la V-ATPasa aumentó fuertemente la unión de la línea de células de carcinoma de mama metastásico MDA-MB-231 a los HUVEC después de 10 y 120 min de adhesión (Fig 3A y 3B). También investigamos la influencia de los archazolid en la migración transendotelial de células MDA-MB-231. Las células HUVEC sembradas en una cámara de Boyden fueron tratadas con 1 nM de archazolid durante 24 h. CellTracker Células MDA-MB-231 de marca verde (no tratadas con archazolid) fueron autorizadas a transmigrar a través de la monocapa endotelial durante 24 h. Como se muestra en la figura 3C, archazolid disminuyó significativamente la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. La influencia de los archazolid en la adhesión de las células tumorales no sólo se estudió en las células HUVEC, que representan células macrovasculares endotelial, sino también en células microvasculares HMEC-1. Además, además de la línea de células de cáncer de mama MDA-MB-231, también se utilizaron células de cáncer de próstata PC-3 como segunda línea de células de cáncer El tratamiento con Archazolid de las células endoteliales aumentó la unión de las células MDA-MB-231 a la monocapa HMEC-1 después de 120 min de adhesión (fig. 4A) y aumentó la unión de las células PC-3 a la monocapa HUVEC después de 30 y 60 min de adhesión (fig. 4B). Cabe destacar que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas, una línea celular de leucemia de células T aguda, no se vio afectada tras el tratamiento de las células HUVEC con archazolid (S1A Fig.). Tomadas juntas, el tratamiento con archazolid aumentó las propiedades adhesivas de las células endoteliales micro y macrovasculares para las células tumorales metastásicas, pero no para las no metastáticas. La adhesión de las células tumorales al endotelio es en principio similar a la de los leucocitos, pero difiere ligeramente en las moléculas que median el proceso de adhesión. Se encontró que los ligandos para las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina se expresan en las células tumorales y para mediar la interacción de células endoteliales-tumorales [21]. La inhibición de la v-ATPasa puede afectar la expresión de moléculas de adhesión de células endoteliales en los niveles de ARNm o proteína. Para determinar la expresión de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherina, los HUVECs fueron tratados con archazolid durante 12 h. TNFα es conocido por aumentar la regulación de la expresión de La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la inhibición de la V-ATPasa en los HUVECs no alteró los niveles de ARNm de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5A). La expresión proteica de estas moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales fue analizada por citometría de flujo. Archazolid (1 nM, 24 h) no afectó a la expresión celular de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina (Fig 5B). Además de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, también las integrinas son capaces de mediar el proceso de adhesión celular [33] [35]. Dado que ninguna de las moléculas de adhesión celular expresadas en los HUVEC se regulaba mediante el tratamiento con archazolid, se consideró que las integrinas eran socios potenciales de interacción. En esta familia de proteínas se ha informado que las integraciones β1 median la adhesión de células tumorales a células endoteliales quiescentes [25]. Con el fin de dilucidar el papel de las integraciones β1-para la adhesión de células tumorales inducidas por archazolid, la subunidad de integrina β1- fue bloqueada ya sea en células MDA-MB-231, células PC-3 o en HUVEC. (Obra de notar, como en todos los experimentos a lo largo de este estudio, sólo las células endoteliales fueron tratadas con archazolid.) Después de bloquear las integraciones β1 en las células MDA-MB-231 o PC-3, la adhesión a las células tumorales inducida por archazolid se redujo casi al nivel de control (Fig 6A y 6B, paneles izquierdos), mientras que el bloqueo de las integraciones β1 en los HUVEC no tuvo un efecto significativo en el aumento de la adhesión a las células tumorales por inhibición de la V-ATPasa (Fig 6A y 6B, paneles derecho). Dependiendo de su subunidad α, las integraciones β1 tienen una variedad de ligandos incluyendo componentes de matriz extracelular (ECM) como colágeno, fibronectina y lamina [35]. Por lo tanto, hipotetizamos que el tratamiento archazolid de células endoteliales podría conducir a una regulación ascendente de estos componentes. Las células MDA-MB-231 y Este ensayo de adhesión celular reveló que las células MDA-MB-231 así como las células PC-3 favorecen la interacción con el colágeno del componente ECM, ya que la adhesión al colágeno es mucho más alta que en el control plástico no recubierto (Fig 7A). Las células MDA-MB-231 y PC-3 también se adhirieron al plástico recubierto con fibronectina, pero en un grado mucho menor en comparación con el recubrimiento de colágeno. Por lo tanto, nos centramos en la interacción entre estas dos líneas celulares tumorales y colágeno. Bloqueo de la subunidad integrina β1 en las células MDA-MB-231 y PC-3 claramente abolió la interacción con colágeno (Fig 7B), indicando que la unión de estas células tumorales al colágeno está mediada por β1-integrantes. Dado que el colágeno es el principal componente del ECM MDA-MB-231 y las células PC-3 interactúan con, el siguiente paso fue probar si la inhibición de la V-ATPasa influye en la cantidad de colágeno expresada por los HUVEC como matriz extracelular. Para detectar colágeno en la superficie endotelial, los archazolidos tratados con HUVEC fueron etiquetados con un anticuerpo contra el colágeno tipo I-IV en el hielo para prevenir la endocitosis y para asegurar que el anticuerpo no se une al colágeno intracelular. Curiosamente, los archazolidos aumentaron la cantidad de colágeno superficial en los HUVEC en aproximadamente un 50% (Fig 7C). Se informó que la inhibición de la v-ATPasa por archazolid perjudica la actividad de la catepsina B [28, 36], una enzima lisosómica que degrada los componentes de la matriz extracelular incluyendo colágeno [37] [38] [39] [40] [41]. Como el colágeno es degradado por la catepsina B y la activación de la catepsina B depende de la actividad de la v-ATPasa [28, [36] [37] [38] 42], se sugirió que una acumulación de colágeno en la superficie de las células endoteliales podría ser consecuencia de una funcionalidad alterada de la catepsina B. Por lo tanto, se realizó un ensayo de actividad enzimática basado en la proteólisis de un sustrato de la fluorogénica catepsina B. En los HUVECs tratados con archazolidos y HMEC-1, la actividad de la catepsina B fue inducida tanto por el ARNm (1 ng/ml TNF) como por la expresión de la superficie celular (10 ng/ml TNF) de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y Ncadherin. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203053.g005 La inhibición de la vATPasa endotelial aumenta la adhesión de células tumorales a las células endoteliales fuertemente disminuida en aproximadamente un 50% en comparación con las células de control a una concentración archazolida de 1 nM (Fig 8A). En línea con este resultado, el análisis de manchas occidentales mostró que el archazolido (1 nM) reduce la expresión proteica de la forma madura Para comprobar si la adhesión a las células tumorales inducida por archazolidos es consecuencia de la disminución de la cantidad de catepsina B, los HUVEC fueron transfectados con un plásmido de codificación para la catepsina B humana o con el vector vacío como control. Después de 48 h, las células transfectadas fueron tratadas con 1 nM de archazolido. El nivel de catepsina B después de la transfección y el tratamiento fue evaluado por el análisis de Western blot (Fig 9A). La sobreexpresión de la catepsina B disminuyó fuertemente tanto la adhesión basal como la inducida por archazolidos de las células MDA-MB-231 (Fig 9B). Así, se realizaron investigaciones intensivas relacionadas con las v-ATPasas en células cancerosas, mientras que son pocos los estudios que investigan las v-ATPasas en células endoteliales que indican un papel en la migración, proliferación y posiblemente angiogénesis [22] [23]. En el presente estudio se utilizó el producto natural mixobacterial archazolid para investigar las consecuencias de la inhibición de la v-ATPasa en el endotelio en las interacciones entre células tumor-endoteliales. Por primera vez, pudimos mostrar un vínculo entre la v-ATPasa y las propiedades de adhesión y transmigración del endotelio. La inhibición de la v-ATPasa en células endoteliales por archazolid aumentó significativamente la adhesión de células cancerosas metastásicas y disminuyó la migración transendotelial de células cancerosas que se atribuyó a niveles aumentados de colágeno Cabe destacar que la adhesión de la línea celular Jurkat no metastática a las células endoteliales tratadas con archazolid permaneció inalterada. La adhesión inducida por archazolid de las células tumorales fue independiente de las moléculas de adhesión de células endoteliales ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y N-cadherina, ya que su expresión no fue regulada por el compuesto. Sin embargo, encontramos que la adhesión de células tumorales inducida por archazolid fue mediada por β1-integrantes expresadas en cáncer de mama MDA-MB-231 y células de cáncer de próstata PC-3 como bloqueo de la subunidad integrina β1 en estas células tumorales revirtieron el efecto proadhesivo de archazolid. En experimentos de adhesión en plástico recubierto con componentes de matriz extracelular, podríamos demostrar que las células MDA-MB-231 y PC-3 favorecieron claramente la interacción con el colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat no metastáticas era en gran medida independiente de las proteínas de matriz extracelular (S1B Fig). Las diferentes propiedades de adhesión de las células cancerosas metastásicas y las células Jurkat podrían ser el resultado del patrón de expresión de integración de cada línea celular. Las células MDA-MB-231 y PC-3 expresan α2β1- y α3β1-integrantes, que representan receptores de colágeno [43, 44], mientras que las células Jurkat expresan α4β1-integrantes pero carecen de α2β1-, α3β1-integrantes [44]. Las α4β1integrantes son receptores para VCAM-1 y fibronectina [35] y se ha demostrado que las células Jurkat interactúan con las células endoteliales humanas que expresan VCAM-1 después del tratamiento con citoquinas o células transfectadas con VCAM-1 [45]. Nuestros resultados están en línea con estudios anteriores que muestran que las células α2β1- y α3β1-integrantes que expresan MDA-MB-231 y PC-3 fueron capaces de unirse rápidamente al colágeno en la matriz ósea cortical. En contraste, las células Jurkat no fueron capaces de adherirse [44] y podrían interactuar preferentemente con moléculas de adhesión celular en lugar de con proteínas ECM. Las α2β1- y α3β1-integrantes pueden actuar además como receptores de lamina [46] y al menos α3β1integrantes reconocen fibronectina [46, 47] Aunque expresan receptores de fibronectina y laminina, las células MDA-MB-231 y PC-3 se adhirieron a la fibronectina en una medida mucho menor y no se adhirieron a laminina, probablemente debido a una menor afinidad a estos componentes de la matriz extracelular. Importantemente, la inhibición de la V-ATPasa por archazolid aumentó los niveles superficiales del colágeno del componente de la matriz extracelular, lo que podría explicar que el aumento de las células MDA-MB-231 y PC-3 en las HUVEC tratadas con archazolid es independiente de las moléculas de adhesión celular endotelial. Al realizar un ensayo de proteólisis de células vivas, Cavallo-Medved et al. demostraron degradación del ECM, en particular de gelatina y colágeno IV, en asociación con la catepsina B activa en las caveolas de células endotelial durante la Además, estudios recientes reportaron que la inhibición de la v-ATPasa perjudica la actividad de la catepsina B en las células cancerosas [28, 36]. Por lo tanto, sugerimos que la acumulación de colágeno en la superficie endotelial podría ser consecuencia de la actividad o expresión de la catepsina B alterada en las células endoteliales. De hecho, confirmamos el deterioro de la actividad de la catepsina B por archazolid ya que los niveles de expresión de la forma activa madura de esta enzima fueron fuertemente reducidos. La catepsina B se sintetiza como preprocatepsina B en ribosomas unidos a la membrana. Tras el transporte al aparato Golgi, la preprocatepsina B es glicosilada con oligosacáridos que contienen mannosa. La focalización de la procatepsina B a los lisosomas es dependiente del receptor mannoso-6-fosfato y su disociación del receptor, así como su procesamiento proteolítico hacia la catepsina B madura requiere la acidificación del compartimento [48]. En las células cancerosas la inhibición de la v-ATPasa por archazolid altera el tráfico mediado por el receptor mannoso-6-fosfato desde la red trans-Golgi a los compartimentos prelisosomales resultando en una disminución de proteasasas activa como la catepsina B [28]. Asumimos que la disminución inducida por la archazolida en la actividad y expresión de la catepsina B se basó en el mismo mecanismo. Curiosamente, la sobreexpresión de la catepsina B atenuó la adhesión de las células de cáncer de mama inducida por archazolido a las células endoteliales, indicando que la adhesión se correlaciona negativamente con la expresión de la catepsina B. Como la catepsina B también puede degradar otros componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y lamina [38, 49], la inhibición de la v-ATPasa podría conducir a una acumulación de estas proteínas y un aumento de la adhesión de células que expresan receptores de fibronectina o lamina. Sin embargo, no nos centramos en estos componentes ECM ya que no eran relevantes para la adhesión de las células MDA-MB-231 y PC-3. Estas células se adhirieron predominantemente al colágeno, mientras que la adhesión de las células Jurkat es principalmente independiente de las proteínas ECM colágeno, fibro En las células de cáncer hepático, el archazolid reduce la señalización de Ras/Raf/MEK/ERK alterando la composición de la membrana y la fluidez [51]. Asumimos que el archazolid afecta a las células endoteliales de manera similar, lo que conduce a la inhibición de la señalización de Ras y, por lo tanto, a la reducción de la migración transendotelial de las células MDA-MB-231. Tomado en conjunto, nuestro estudio muestra que el archazolid reduce la actividad y la expresión de la catepsina B en las células endoteliales. Como resultado, la cantidad de colágeno en la superficie de las células endoteliales fue significativamente regulada, lo que finalmente resultó en un aumento de la adhesión de las líneas de células de cáncer metastásicas β1-integrantes MDA-MB-231 y PC Este estudio muestra que la v-ATPasa desempeña un papel importante en la regulación de la adhesión de las células que expresan receptores para los componentes de la matriz extracelular. Archazolid representa una herramienta prometedora para dilucidar el papel de la v-ATPasa en las células endoteliales. Además, por primera vez vinculamos la función de la v-ATPasa a la adhesión y transmigración de las células tumorales a las células endoteliales, así como a la remodelación de la matriz extracelular en la superficie de las células endoteliales. El hecho de que la adhesión de las células tumorales metastásicas a las células endoteliales se incrementa mientras que su migración transendotelial se reduce tras la inhibición de la v-ATPasa endotelial por archazolid apoya aún más la visión de arcazolid como un potencial compuesto antimetastático.
question: ¿Cuál es el papel de la v-ATPasa en la membrana plasmática de los osteoclastos y las células epiteliales renales?
answers.text: bombean protones en el espacio extracelular