context: Mejora de las propiedades farmacológicas y estructurales del inhibidor de la fusión del VIH AP3 sobre la enfuvirtida: ventajas destacadas de la estrategia artificial de Peptidehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC454141410/SHA: f2fcc16391f946c99717b63ec9a24e5384aac381Autores: Zhu, Xiaojie; Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu; Zhang, Ro Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a la corta semivida, resistencia al fármaco y reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH. Utilizando una estrategia de péptido artificial, diseñamos un péptido con secuencia de proteínas no nativas, AP3, que mostró una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de cepas del VIH-1, incluyendo aquellas resistentes a T20, y tuvo una semivida in vivo notablemente mayor que T20. Mientras que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH suprimieron significativamente la actividad antiviral de T20, estos anticuerpos no reconocieron AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Estructuralmente diferentes de T20, AP3 podrían doblarse en una hélice e interactuar con gp41 NHR. Los dos residuos, Met y Thr, en el N-terminal de AP3 forman una estructura similar a gancho para estabilizar Por lo tanto, AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH con mejor eficacia antiviral, perfil de resistencia y propiedades farmacológicas sobre la enfuvirtida. Mientras tanto, este estudio destacó las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente, y confirmó que esta estrategia podría utilizarse en el desarrollo de inhibidores de la fusión viral basados en péptidos artificiales contra el VIH y otros virus envueltos. Texto: Las secuencias de péptidos derivados de la NHR-gp41 o CHR. Los residuos correspondientes a la región de bolsillo de la NHR están marcados en rojo. Los residuos de la PBD están marcados en azul, y los residuos de ganglio MT adyacentes al término N de la PBD están marcados en verde. El péptido 5HRu consta de 5 copias de plantilla de secuencia artificial (AEELAKK) subrayado. Los residuos mutantes en la P b) La actividad inhibitoria de AP1, AP2, AP3 y T20 sobre la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4) en células MT-2 (panel izquierdo) por HIV-1 Bal (subtipo B, R5) en células M7 (panel derecho); cada muestra se probó por triplicado y el experimento se repitió dos veces; los datos se presentan como medios ± SD. RepoRts científicos  5:13028  DOi: 10.1038/srep13028Para hacer frente a estos obstáculos, se han hecho muchos esfuerzos para optimizar los péptidos derivados de T20 y gp41 CHR. Algunos de estos péptidos tienen mejores actividades inhibitorias contra cepas resistentes a T20 y/o una semivida más larga que T20. Sin embargo, todavía tienen el problema de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos preexistentes en la su Basándonos en la plantilla de péptido artificial universal de 5HRu, hemos diseñado previamente los péptidos artificiales de AP1 (PBD-m4HR) y AP2 (PBDtrp-m4HR), y hemos realizado investigaciones preliminares sobre su actividad inhibitoria contra la fusión de células mediadas por Env VIH-1 16. En el presente estudio, hemos diseñado un nuevo péptido artificial, AP3 (Fig. 1a), con el objetivo de aplicar la estructura "M-T gancho" para estabilizar la interacción del péptido artificial con el bolsillo hidrofóbico en el recortador NHR gp41 17, 18. Después de estudiar exhaustivamente su actividad antiviral, propiedad bioquímica, estructura cristalina, mecanismo funcional, semivida in vivo y, por primera vez, el efecto de anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH, encontramos que el péptido artificial de nuevo diseño, AP3, mostró una mejor actividad antiviral, perfil de resistencia a fármacos y propiedades farmacológicas sobre T20. En particular, los anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH no suprimieron, sino que mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3. Estos resultados sugieren que el AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo fármaco anti-VIH y confirman que esta estrategia se puede utilizar para diseñar péptidos antivirales artificiales contra otros virus envueltos, como el SARS-CoV 19, el MERS-CoV 20 y el paramixovirus 21. Nuestros péptidos artificiales AP1 y AP2 previamente diseñados podrían inhibir la fusión de la membrana celular mediada por el VIH-1 16. Él y sus colegas reportaron que la adición de dos aminoácidos de Met y Thr al N-terminal de un CHR-péptido podría mejorar su actividad anti-VIH-1 17, 18. Aquí diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo Met y Thr al N-terminal de AP2 (Fig. 1a). Luego comparamos AP3 con AP1, AP2 y T20 para su actividad anti-VIH-1 contra cepas divergentes del VIH-1, incluyendo los virus adaptados al laboratorio, IIIB (subtipo B, X4) y Bal (subtipo B, R5), y una serie de aislamientos primarios del VIH-1, así como las cepas resistentes al T20. 1b, AP3 mostró mayores actividades inhibitorias sobre la infección por cepas HIV-1 IIIB y HIV-1 Bal (IC 50 : 3,06 y 15,09 nM, respectivamente) que AP1 (IC 50 : 86,25 y 396,14 nM, respectivamente), AP2 (IC 50 : 23,05 y 49,95 nM, respectivamente) y T20 (IC 50 : 13,63 y 30,21 nM, respectivamente). La actividad inhibitoria de AP3 sobre la infección por cepas primarias divergentes de VIH-1 con distintos genotipos (subtipos A -E y grupo O) y fenotipos (R5 y X4) también fue superior a la de AP2 y T20 (Tabla 1). Si bien la T20 no fue eficaz frente a cepas de VIH-1 resistentes a T20 a una concentración de hasta 2.000 nM, la AP3 podría efectivamente inhibir la infección de estas cepas con IC 50 en el rango de 13 ~ 90 nM, que era aproximadamente 2 a 4 veces más eficaz que la AP2 (Tabla 1 ). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 ha mejorado notablemente la actividad anti-VIH-1 contra un amplio espectro de cepas de VIH-1, incluyendo variantes resistentes a T20, sobre T20 y los péptidos artificiales AP1 y AP2. Los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 no reconocieron la AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Los estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH-1, incluidos los que reaccionan de forma cruzada con T20 y los específicos para los sitios de unión de T20 en gp120 (por ejemplo, las regiones del bucle C1 y V3) y gp41 (por ejemplo, el dominio NHR), podrían bloquear significativamente la actividad inhibitoria de fusión de T20 14, 15. Aquí investigamos la influencia de anticuerpos preexistentes contra el péptido AP3. Como se muestra en la figura 2a, tanto T20 como C46 reaccionaron con los anticuerpos en sueros de cinco pacientes infectados por el VIH-1; sin embargo, ninguno de los tres péptidos artificiales AP1, AP2 y AP3 fue reconocido por los anticuerpos preexistentes.La actividad inhibitoria de T20 sobre la infección por el VIH-1 IIIB se redujo aproximadamente 1,9 veces a > 3,6 veces en presencia de 2b y Tabla Suplementaria S1), confirmando que los anticuerpos preexistentes en sera de pacientes con VIH/SIDA pueden atenuar la actividad anti-VIH-1 de T20 14, 15. Sin embargo, ninguno de los péptidos artificiales en el presente estudio mostró disminución significativa de la actividad anti-VIH-1 en presencia de sera de pacientes. En cambio, la actividad antiviral de AP3 aumentó en presencia de antisera de pacientes infectados con VIH-1 (fig. 2b y Tabla Suplementaria S1), sugiriendo que los anticuerpos anti-VIH-1 realmente mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3, posiblemente porque la unión de los anticuerpos a algunos sitios en gp120 o gp41 promueve la interacción de AP3 con la región viral de gp41 NHR. AP3 tuvo una semivida mayor que T20. Aunque la T20 ha demostrado eficacia en la inhibición de la infección por el VIH-1, su principal debilidad radica en su corta semivida en plasma (aproximadamente 2 h) [22] [23]. Como resultado, la T20 debe administrarse por vía subcutánea dos veces al día a 90 mg por dosis, causando a menudo reacciones graves en el lugar de inyección 25, 26. Aquí, se realizaron estudios farmacocinéticos por administración intravenosa de AP3, AP2 y T20, respectivamente, a rata SD a una dosis de 1 mg/kg, para comparar su tiempo de circulación in vivo. Como era de esperar, la T20 mostró una semivida más corta y un AUC menor (0-t) por circulación sistémica, mientras que la AP3 y la AP2 demostraron una concentración mucho mayor y un tiempo de circulación más largo (Tabla 2 ). Los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2 se ajustaron a un modelo de no-compartimento. La semivida de eliminación in vivo de AP3 (t 1/2 = 6,02 h) fue aproximadamente 2,8 veces mayor que la de T20 (t 1/2 = 1,57 h). Este resultado proporcionó la base teórica para reducir la frecuencia de inyección y la dosis del inhibidor de la fusión, en conjugación con la potencia antiviral mejorada de AP3. Por lo tanto, la sustitución de T20 por AP3 puede reducir significativamente las reacciones en el lugar de inyección y el costo del fármaco, lo que promovería las aplicaciones clínicas del inhibidor de la fusión del VIH en regiones o países pobres en recursos. AP3 fue mucho más resistente que T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogenato hepático de rata. Comparamos la estabilidad de T20 y AP3 en presencia de proteinasa K (una proteína de serina de amplio espectro) y homogenato hepático de rata. Después del tratamiento con 20 ng/ml de proteinasa K durante 2 h a 37 °C, sólo quedó el 29% del péptido parental T20, detectado por el análisis LC-MS. Bajo la misma condición, AP3 retuvo el 100% de su prototipo (Fig. 3a ). Además, AP3 mostró una estabilidad metabólica significativamente aumentada sobre T20 in vitro en presencia de homogenato hepático (Fig. 3b). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 es mucho más resistente a la degradación proteolítica que el péptido natural T20, lo que puede contribuir a su significativa vida media in vivo más larga que T20 como se describe anteriormente. AP3 formó un complejo estable α-helical y la formación de bloque gp41 6-HB. Para investigar el mecanismo antiviral de AP3, se comparó la estabilidad térmica del complejo AP3/N36 con la de AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 y C34/N36 complejos por espectroscopia circular-dicroísmo (CD) 27. Debido a que T20 carece del dominio de encuadernación de bolsillo (PBD), el complejo T20/N36 no mostró una conformación α-helical típica, en consistencia con nuestros estudios anteriores 8, 9. Similar a la α-helicidad del complejo C34/N36 3, los complejos AP1/N36, AP2/N36 y AP3/N36 formaron un pico negativo en forma de sillín a 208 nm y 222 nm, indicando sus estructuras α-helical (fig. 4a) Fig. 4b), indicando que el complejo helicoidal α formado por AP3 y N36 es el más estable entre los cuatro complejos. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con la de AP1 y AP2 en la formación de 6-HB entre C34 y N36. Como T20 no puede bloquear la formación de 6-HB 8, 9, utilizamos un inhibidor de fusión de pequeña molécula VIH-1, ADS-J1 28, 29, para reemplazar a T20 como un control de inhibición de 6-HB. Como se esperaba, ADS-J1 podría efectivamente inhibir la formación de 6-HB con IC 50 de 2,75 μ M 8, 9, [27] [28]. AP3 fue altamente eficaz contra la formación de 6-HB de forma dosis-dependiente con un valor IC 50 de 0,24 μ M, aproximadamente 30 y 15 veces más potente 4c), confirmando que AP3 puede bloquear potentemente la formación del núcleo de fusión gp41 6-HB, inhibiendo así la fusión del VIH-1 con la membrana celular diana. Base estructural para la potente actividad inhibitoria de fusión del péptido artificial AP3. Para dilucidar los determinantes moleculares de estos péptidos artificiales, resolvimos con éxito las tres estructuras complejas de péptidos AP1/AP2/AP3 que se unen con gp41 NHR. Para AP1 y AP2, un enlace optimizado Cada muestra fue probada por triplicado y el experimento se repitió dos veces. Los datos se presentan como medios ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. "SGGRGGG" se utilizó para ensamblar el NHR y el péptido artificial en una única proteína recombinante (N Sin embargo, una estrategia similar falló en la cristalización de AP3; por lo tanto, decidimos cocristalizar el péptido sintético N45 y péptido AP3, y finalmente se obtuvieron los cristales complejos. Curiosamente, los cristales de tres inhibidores diferentes pertenecen a tres grupos espaciales distintivos: P2 1 para N36-L6-AP1, R32 para N36-L6-AP2, y P6 3 para N45/AP3. Como era de esperar, las porciones de NHR en tres estructuras forman un núcleo trimérico, mientras que la porción AP1, AP2 o AP3 se pliega en una conformación de una hélice única y se une a NHR-trimer para formar un típico 6-HB, similar a la de la estructura central de HIV-1 gp41 formada por el péptido CHR nativo C34 y N36 (Fig. 5a). Además, los residuos hidrofóbicos conservados, como el W43, el W46 y el I50, en los péptidos artificiales fueron profundamente enterrados en la Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de AP2, AP3 y T20 tras la administración intravenosa a 1 mg/kg en ratas SD macho (n = 2). Figura 3. Sensibilidad de AP3 y T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogeneato hepático de rata. a) Después de la digestión por proteinasa K a pH 7,2 y b) homogeneato hepático de rata, la cantidad residual de AP3 y T20 fue detectada mediante análisis LC-MS. El experimento se realizó en triplicado y los datos se presentan como medios ± SD. La inhibición de AP1, AP2, AP3, T20 y ADS-J1 frente a la formación de 6-HB entre N36 y C34 fue detectada por ELISA utilizando el mAb NC-1 específico de 6-HB. Cada muestra se probó por triplicado, y los datos se presentan como media ± DE. surcos formados entre cada par de hélices NHR, similares a los residuos correspondientes de W628, W631 y I635 en la gp41 CHR nativa (Fig. 5b). Los péptidos AP mostraron mejor afinidad contra la Gp41 CHR natural. En C34, que contiene la secuencia CHR natural de W628 a L661, no se encontró interacción fuerte entre I642 y Q565 en el complejo de GP41 NHR-CHR viral (Fig. 5c). Sin embargo, en la secuencia correspondiente (de W43 a K76) de AP1 y AP2, se estableció un enlace de hidrógeno entre S57 (correspondiente a I642 en CHR) y Q18 (correspondiente a Q565 en NHR) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3. Así, S57 en AP1/AP2/AP3 desempeña un papel en la estabilización de las interacciones entre el inhibidor péptido artificial y su objetivo NHR, resultando en su afinidad de unión más fuerte. Además, en NHR-CHR, L567 y L568 en dos NHR adyacentes forman una ranura hidrofóbica, en la que T639 está enterrado (Fig. Suplemental S1a ). Sin embargo, en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3, I54 (correspondiente a T639 en CHR) puede unirse fuertemente a L20 y L21 a través de interacciones de cadenas laterales totalmente hidrofóbicas. Del mismo modo, la interacción de I64 (correspondiente a S659 en CHR) con L10 y L11 (correspondiente a L567 y L568 en NHR, respectivamente) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3 se ha mejorado significativamente (Suplementary Fig. S1b ). Al igual que la hélice gp41 CHR, las hélices de AP1, AP2 y AP3 también tienen dos lados diferentes, un lado hidrofóbico orientado hacia la NHR y un lado hidrofílico orientado hacia Se espera que la mejora de la hidrofilia del lado expuesto de los inhibidores pueda aumentar su actividad antiviral y solubilidad. Para lograr este objetivo, los residuos de aminoácidos con hidrofobia, o baja hidrofilia, como N637, S640, L641 y S644 en CHR, fueron cambiados a los residuos de aminoácidos con alta hidrofilia, como E52, K55, K56 y E59 en AP1, AP2 y AP3, respectivamente. Además, el residuo hidrofóbico M629 en CHR fue reemplazado por un residuo hidrofílico E44 en AP2 y AP3 (Figura suplementaria S2 ). Estos residuos hidrofílicos, como ácido glutámico y lisina, pueden aumentar la solubilidad de péptido entero y, por lo tanto, estabilizar el complejo formado por el inhibidor y su objetivo. Se ha demostrado que el puente de sal doble EE-KK puede estabilizar la conformación de la hélice 30. Hemos identificado este tipo de interacción entre i e i + 3 o i + 4 posiciones en las tres estructuras complejas. En N36-L6-AP1, R48 interactúa con E45 y E52 para formar una red de puente de sal. En N36-L6-AP2, E45 interactúa con K48, y E52 se une a K56, mientras que en N45/AP3, K69 se une a E66 ( Suplementary Fig. S2 ). Estos fuertes puentes de sal formados por los residuos cargados opuestamente estabilizan la conformación de péptidos AP, llevando su efecto inhibidor en pleno juego. Como se informó anteriormente, la adición del "gancho M-T" a los péptidos CHR C34 y sifuvertida podría mejorar dramáticamente la actividad Como era de esperar, el N-terminal Met y Thr de AP3 forma una estructura similar a un gancho (Fig. 5d). La cadena lateral de la metionina hidrofóbica de M41 acomoda la ranura entre hélices AP3 y NHR, tapando el bolsillo hidrofóbico. Esta interacción conduce a una serie de cambios conformacionales. La cadena principal de AP3 en W43 se mueve 1,91 Å más cerca de NHR en comparación con AP2 (Suplemental Fig. S3 ). La cadena lateral de W43 en AP3 gira alrededor de 90 grados y está enterrada más profundamente que la de AP2. La cadena lateral de E44 vuelve a interactuar a D47, pero la cadena lateral de E45 retrocede desde K48 e interactúa con T42. Por lo tanto, esta estructura de gancho M-T podría estabilizar aún más la unión entre AP3 y NHR La Enfuvirtida, también conocida como T20, fue aprobada por la FDA como el primer medicamento antiviral basado en el inhibidor de la entrada del VIH para su uso con otros medicamentos anti-VIH para tratar adultos y niños infectados por el VIH-1 a los 6-16 años 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Aunque la T20 es un medicamento anti-VIH indispensable para los pacientes con VIH/SIDA que no han respondido a la terapia antirretroviral actual, sus deficiencias han limitado su aplicación clínica. La T20 tiene una actividad anti-VIH menor y una semivida más corta que otros péptidos de la CHR que contienen PBD, como C34 y C38 8, 9, 33. Además, las variantes resistentes al VIH-1 T20 surgieron en breve (por ejemplo, 14 días) después de su uso en pacientes 34. La mayoría de los virus resistentes a T20 presentaban mutaciones en el motivo GIV (residuos 36-45: GIVQQNNLL) en el dominio Gp41 NHR 10, [34] [35] [36] [37] [38]. La falta de PBD contribuye a las principales debilidades de T20 descritas anteriormente. Dado que el bolsillo hidrofóbico conservado en el trimer de NHR gp41 desempeña un papel crítico en la estabilización de la interacción entre el NHR gp41 y CHR y la formación del núcleo fusogénico de 6-HB 1, 39, 40, el péptido CHR que contiene PBD, como C34, puede unirse al trimer de gp41 viral más fuerte y estable, poseyendo así una actividad anti-VIH más potente que T20, un péptido CHR sin PBD 8, 9. En ausencia de PBD, T20 interactúa principalmente con la región media del dominio NHR que contiene el motivo GIV. Por lo tanto, un virus con mutaciones en este motivo es generalmente resistente a T20 10, [34] [35] [36] [37] [38]. En comparación con otros fármacos anti-VIH, otra debilidad de T20 es su reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1. Además de gp41, T20 también podría unirse a algunas regiones en gp120. Los anticuerpos preexistentes específicos para los sitios de unión del T20 en gp120 y gp41 pueden suprimir indirectamente la actividad anti-VIH de T20 14, 15. La adición de PBD al N-terminal de T20, como T-1249, podría mejorar significativamente la potencia anti-VIH-1, la semivida y el perfil de resistencia a fármacos 33, [41] [42] [43]. La adición de la estructura de gancho M-T al N-terminal de un PBD-CHR-péptidos que contienen PBD, como MT-C34 o MT-SFT, podría aumentar aún más la actividad anti-VIH-1 de los correspondientes CHR-péptidos 17, 18. La supresión del dominio GIV-motif-vinculante de un CHR-péptido, como CP621-652 y CP32M, es otro enfoque eficaz para aumentar la barrera genética a la resistencia a drogas 44, 45. Sin embargo, ninguno de los enfoques anteriores es eficaz para prevenir la reacción cruzada de T20 con los anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA, ya que los péptidos previamente modificados contienen principalmente las secuencias nativas del dominio HIV-1 gp41 CHR. Nuestros estudios anteriores han demostrado que AP1 y AP2, péptidos artificiales con secuencias de proteínas no nativas, podrían formar estructura de bobina en espiral para interactuar con gp41 NHR e inhibir la fusión celular mediada por VIH-1 Env 16. En el presente estudio, diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo la estructura de gancho M-T al N-terminal de AP2 (Fig. 1a), seguido de investigar la influencia de anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes infectados por VIH en AP3, utilizando AP1, AP2 y T20 como controles. Se demostró que los sueros de los pacientes infectados por el VIH podían unirse a la T20 y reducir significativamente su potencia frente al VIH-1. Sin embargo, estas mismas muestras séricas no interactuaban con los tres péptidos artificiales y apenas afectaban su actividad antiviral. Sorprendentemente, los anticuerpos en el sera incluso podrían mejorar la actividad anti-VIH-1 de AP3 (Fig. 2a,b y Tabla Suplementaria S1). Estos resultados confirmaron, por primera vez, que la sustitución de la secuencia viral nativa en la T20 por una secuencia artificial es un enfoque eficaz para superar una deficiencia clave de la T20, por lo que su actividad anti-VIH podría ser atenuada por anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA. Vale la pena explorar por qué los anticuerpos en la sera son capaces de mejorar la actividad anti-VIH-1 de la AP3. Nuestro estudio reciente ha demostrado que la actividad anti-VIH-1 de T20 se ve aumentada por un anticuerpo no neutralizante dirigido contra el dominio NHR del VIH-1 gp41 46. Por lo tanto, hipotetizamos que algunos de los anticuerpos anti-gp41 en pacientes con VIH/SIDA pueden unirse a un sitio en el dominio NHR adyacente a la región de unión de AP3, lo que resulta en una mayor interacción entre AP3 y NHR-trimer y una mayor actividad antiviral de AP3. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con el gancho M-T y T20/AP2 sin gancho M-T sobre la infección por cepas divergentes del VIH-1. AP3 fue más eficaz que AP2 o T20 en inhibir la infección por cepas adaptadas al laboratorio y los aislamientos primarios del VIH-1, incluyendo los resistentes al T20 (fig. 1b, Tabla Se puede cuestionar si AP3 también puede inducir virus farmacorresistentes en pacientes si se usa en clínicas para tratar pacientes infectados por VIH. Creemos que AP3 tiene una barrera genética mucho mayor a la resistencia que T20 porque AP3 contiene PBD, mientras que T20 carece de PBD. Dwyer et al. 33 utilizaron T2544, un péptido CHR que contiene PBD, para llevar a cabo un experimento de paso, utilizando T20 como control. Demostraron que T20 podría inducir un virus mutante con alta resistencia (81 veces) a T20 en aproximadamente 1 mes, mientras que T2544 no indujo una cepa resistente en más de 2 meses en cultivo. Después de extender el experimento de paso por casi 8 meses, identificaron una cepa con una resistencia débil (8,3 veces) a T-2544, y los sitios de mutación relacionados no estaban en la región de bolsillo gp41, lo que sugiere que los péptidos CHR que contienen PBD, incluyendo AP3, pueden tener dificultad para inducir resistencia al fármaco. AP3 también tuvo una vida media más larga que T20 (Tabla 2), posiblemente porque el péptido artificial AP3 es menos sensible a las enzimas proteolíticas que T20 con la secuencia de proteínas virales nativas. Se espera que la eliminación de los sitios de escisión de enzimas proteolíticas en el péptido AP3 amplíe aún más su vida media. Estos resultados confirmaron que la sustitución de la secuencia de proteínas nativas por secuencia artificial y la adición del gancho M-T al péptido que contiene PBD es una estrategia sólida para diseñar Dado que las estructuras tridimensionales de los péptidos AP no habían sido investigadas antes del presente estudio, la optimización de estos inhibidores de los péptidos artificiales no pudo ser realizada racionalmente. Nuestros estudios estructurales de los péptidos artificiales AP1/AP2/AP3 en complejo con NHR mostraron que los péptidos AP, al igual que el péptido CHR C34, podrían unirse a gp41 NHR para formar una estructura canónica 6-HB (Fig. 5a). Es bien sabido que existe un bolsillo hidrofóbico profundo en cada ranura en la superficie del trimer viral gp41 NHR. Los residuos hidrofóbicos I635, W631 y W628 en la unión gp41 CHR con los residuos hidrofóbicos en la pared de este bolsillo, resultando en la formación de 6-HB estable por la fuerte interacción entre CHR Esta importante característica ha sido bien preservada en las estructuras AP1/AP2/AP3 6-HB (Fig. 5b), que pueden explicar las potentes actividades inhibitorias de la fusión VIH-1 de estos péptidos artificiales. Un nuevo enlace de hidrógeno, que se estableció entre S57 y Q18 en los complejos AP1/AP2/AP3, no existe en el complejo viral gp41 CHR-NHR, sugiriendo que S57 puede jugar un papel importante en la estabilización de las interacciones entre el péptido y NHR, dando lugar a afinidades de unión de AP1/AP2/AP3 que son más fuertes que las de HIV-1 gp41 CHR a NHR. Además, el puente de sal doble EE-KK formado entre las posiciones i e i + 4 en las estructuras AP1/AP2/AP3 podría estabilizar la conformación de la hélice y aumentar el efecto inhibitorio de estos pé En comparación con AP1, las mutaciones en el sitio triple se introdujeron en AP2 y AP3, es decir, M44E, R48K y E49K. Estas sustituciones no sólo aumentan la solubilidad del péptido, sino que también desencadenan una serie de reordenamientos de ciertos puentes de sal intrahelical para mejorar la estabilidad de la estructura de la hélice de la CHR y la actividad inhibidora de la fusión del VIH-1. Anteriormente se demostró que el gancho M-T era un paso efectivo hacia el aumento de la interacción estable entre un péptido de la CHR y el bolsillo del HIV-1 gp41 17, 18. Por lo tanto, AP2 se optimizó aún más mediante la incorporación de Met y Thr en su terminal N. Los resultados de espectroscopia de CD y desnaturalización térmica indican que la incorporación de gancho M-T contribuye a la formación de una Además, el puente salino doble EE-KK formado entre i e i + 4 posiciones en la estructura N36-L6-AP3 contribuyó a aumentar la estabilidad de la hélice CHR y 6-HB, lo que resultó en una mejor potencia de AP3, como se ha observado en estudios de CHR-péptidos con mutaciones dobles EE-KK 30, 33, 47, 48. Además, la actividad de fusión del VIH-1 y la semivida de AP2 pueden haber sido reforzadas y ampliadas, respectivamente, mediante la adición de gancho M-T en el diseño de AP3. En conclusión, AP3, un péptido artificial con estructuras de gancho PBD y M-T, mostró una mejor actividad anti-VIH-1 y perfil de resistencia a fármacos, así como una vida media prolongada. Además, no reaccionó con los anticuerpos preexistentes en la sura de pacientes con VIH/SIDA. Consecuentemente, su actividad antiviral RepoRts Científicos  5:13028  DOi: 10.1038/srep13028 no fue significativamente afectada por estos anticuerpos. Por lo tanto, AP3 muestra la promesa como un candidato para el desarrollo ulterior como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH para uso clínico. Este estudio también proporciona información importante de estructura e actividad para el diseño racional de nuevos inhibidores de péptidos artificialmente. Además, nuestros resultados destacaron las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente y confirmaron que esta estrategia podría ser ampliamente utilizada en el desarrollo de inhibidores de la fusión de virus basados en péptidos artificiales contra el VIH-1 y otros virus envueltos con proteínas de fusión de membrana de clase I, tales como SARS-CoV 19, MERS-CoV 20, y paramixovirus 49. Este estudio no implicó experimentación humana; los únicos materiales humanos utilizados fueron muestras séricas obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 con la aprobación del Comité de Ética del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan (Protocolo No. SPHCC-125-2). Los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. Todas estas muestras de sueros procedían de adultos; ningún menor estuvo involucrado en este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado escrito para el uso de los especímenes clínicos de todos los pacientes involucrados en este estudio. Síntesis de Peptide. Un panel de péptidos (Fig. 1a), incluyendo T20, C34, C46, AP1, AP2, AP3, así como N-péptidos derivados de NHR, N36 y N45, fueron sintetizados con un método FMOC de fase sólida estándar, como se describió anteriormente 8, 50. Todos los péptidos fueron acetilados en el término N y mediados en el término C. Los péptidos fueron encontrados alrededor del 95% puros por el CLAR y fueron identificados por espectrometría de masas (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Las concentraciones de los péptidos fueron determinadas por la absorbancia UV y un coeficiente de extinción molar calculado teóricamente basado en residuos de triptófano y tirosina. Ensayo de calificación. Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando una columna SAO-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil se compuso de ácido acetonitrilo-agua-fórmico en la proporción de 50:50:0.1 (v/v/v) a un caudal de 0,3 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μ L. El acetonitrilo fue de grado HPLC, y otros reactivos químicos y disolventes fueron de grado analítico. Para el análisis de LC-MS se utilizó un espectrómetro de masa tándem tricuadruple MAX de Thermo TSQ Quantum Discovery MAX equipado con fuente ESI (San José, CA) y una bomba LC Surveyor. Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software Xcalibur y el programa de análisis de datos LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), respectivamente. Los parámetros de MS optimizados fueron los siguientes: tensión de pulverización de 4800 V, presión de gas de vaina de 40,0 psi, flujo de válvula auxiliar de 1,0 psi y 300 °C de temperatura capilar. Al ejecutar la disociación inducida por colisión (CID), la El modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) se utilizó para AP3 mientras que el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM) se preformó para T20. Se registraron las siguientes transiciones: m/z 670.5 para AP3, m/z 1498.6 para T20. Las masas de péptidos sintéticos T20, AP1, AP2 y AP3 fueron determinadas por MALDI-TOF-MS (Fig. Suplementario S4 y S5 ). Expresión y purificación de proteínas de fusión N36-L6-AP1 y N36-L6-AP2. Utilizando PCR superpuesta, el fragmento de ADN que codificaba AP1 o AP2 péptido fue unido al fin 3′ del cDNA de gp41 NHR ("N36", 546-581), con un enlace corto ("L6", SGGRGG) entre ellos. Luego, toda la secuencia se subclonó en el vector pET-28a (Novagen, EE.UU.) con una etiqueta SUMO artificial entre la etiqueta HIS de N-terminal y la proteína diana. Las células E. coli de pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-o pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2-transformadas fueron inducidas añadiendo 1 mM IPTG e incubando durante la noche a 16 °C. La proteína de fusión fue purificada por resina de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y la etiqueta His-SUMO fue cortada por el tratamiento enzimático Ulp1 a 4 °C durante 2 h. El recortador purificado N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fue aplicado a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). Las fracciones que contenían N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fueron recolectadas y concentradas en diferentes concentraciones por ultrafiltración. Cristalización, recolección de datos y determinación de la estructura. La proteína de fusión N36-L6-AP1 fue cristalizada a 16 °C utilizando el método de gota colgante, difusión de vapor. Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizada equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (25 mg/ml N36-L6-AP1 recortador en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 ) frente a una solución de depósito de 400 μ l. Después de una semana, se formaron cristales únicos y se congelaron por chispa con nitrógeno líquido para la recogida de datos en el futuro. La proteína de fusión N36-L6-AP2 se cristalizó de manera similar con una solución de depósito diferente (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 34% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 Para obtener el cristal complejo de AP3 y NHR, el AP3 sintetizado se mezcló primero con el péptido N45 a razón de 1:1 molar y luego se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) para aislar el recortador formado de 6-HB. Se recogieron fracciones que contenían N45/AP3 y se concentraron hasta 30 mg/ml, luego se cristalizaron a 16 °C utilizando la gota colgante, método de difusión de vapor.Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizado equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (20 mM Tris-HCl pH 8.0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,2 M de sulfato de amonio, 0,1 M Los conjuntos de datos de N36-L6-AP1 se recogieron a 100 K en la línea 19-ID de la fuente avanzada de fotones (Argonne National Laboratory, EE.UU.). Los conjuntos de datos de N36-L6-AP2 se recogieron en una fuente de rayos X interna (MicroMax 007 generador de rayos X, Rigaku, Japón) en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias. Los conjuntos de datos de los cristales complejos AP3/N45 se recolectaron en la línea BL-19U1 de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai, China. Los datos de difracción de rayos X se integraron y escalaron utilizando el programa HKL2000 51. El problema paulatino de las tres estructuras fue resuelto mediante el método de reemplazo molecular utilizando PHENIX.faser 52 con una estructura cristalina de HIV gp41 NHR-CHR (entrada PDB: 1SZT) como modelo de búsqueda. Los modelos finales fueron ajustados manualmente en COOT 53 y refinados con PHENIX.refine 54. Todas las coordenadas fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; y N45/AP3: 5CMZ). Las estadísticas de recolección de datos y refinamiento de la estructura se dan en la Tabla Suplementaria S2. Determinación de la reactividad cruzada de los péptidos nativos y artificiales con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 por el sandwich ELISA. Se realizó un T20, C46, AP1, AP2 y AP3 fueron recubiertos en los pocillos de placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) a 10 μ g/ml. Los pocillos fueron bloqueados con gelatina al 1%, seguidos de la adición de 50 μ l de sueros diluidos serialmente de pacientes infectados por VIH-1 e incubación a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron secuencialmente HRP-IgG antihumano (Abcam, UK) y TMB. Se determinó A450 con un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). pacientes. Inhibición de péptidos en VIH-1 IIIB (subtipo B, X4)infección en presencia de sera de pacientes infectados por VIH-1 se determinó como se describe anteriormente 55. Brevemente, cada péptido fue mezclado con suero serialmente diluido de un paciente infectado por VIH-1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de péptido/suero y VIH-1 (100 TCID 50 ) fue añadida a las células MT-2 (1 × 10 5 /ml) en medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, los sobrenadantes del cultivo fueron reemplazados por medio de cultivo fresco. Al cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados para la detección del antígeno p24 por ELISA. Brevemente, cada mezcla de péptido o péptido fue disuelta en solución salina fosfatada (PBS: 50 mM de fosfato sódico y 150 mM de NaCl, pH 7,2) a la concentración final de 10 μ M e incubada a 37 °C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 4 °C. Los espectros CD de cada muestra fueron adquiridos en un espectropolarímetro Jasco (Modelo J-815, Jasco Inc., Japón) a 4 °C utilizando un ancho de banda de 5 nm, resolución de 0,1 nm, longitud de trayectoria de 0,1 cm y un tiempo medio de 5,0 seg. Los espectros fueron corregidos por la sustracción de un blanco correspondiente a la composición solvente de cada muestra. Se utilizó el análisis térmico de punto medio para determinar la temperatura a la que el 50% de los 6-HB formados Se monitorizó a 222 nm de 4 °C a 98 °C aplicando un gradiente térmico de 5 °C/min. Se alisó la curva de fusión, y se calculó el punto medio de los valores de transición de despliegue térmico (Tm) utilizando las utilidades de software de Jasco descritas anteriormente. Inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante sandwich ELISA. Se determinó la inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante un péptido de prueba con un sandwich ELISA descrito previamente 57. Brevemente, se preincubaron un péptido de prueba (ADS-J1 como control) a concentraciones graduadas con péptido N36 (1 μ M) a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de péptido C34 (1 La mezcla se añadió a una placa de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) prerevestida con anticuerpos anti-N36/C34 (2 μ g/ml) purificados de antisera de ratón específicamente contra el haz de seis hélices de gp41 58. Luego, se añadieron en orden mAb NC-1, IgG anti-ratón marcado con HRP y TMB. A450 fue determinado por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). Las actividades de inhibición de AP1, AP2 y AP3 sobre la infección por VIH-1 fueron determinadas como se describió previamente 57. Para la inhibición de la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4), se añadió 100 TCID 50 del virus a 1 × 10 5 /ml de células MT-2 en el medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en presencia o ausencia del péptido de prueba durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo se cambiaron a medios frescos. En el cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recogidos para la detección del antígeno p24 por ELISA. Para la inhibición de la infección por la cepa VIH-1 Bal (subtipo B, R5), las células M7 (1 × 10 5 /ml) fueron precultivadas durante la noche e infectadas con Bal a 100 TCID 50 en presencia o ausencia del péptido de prueba o proteína durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo fueron cambiados a medios frescos. Los sobrenadantes fueron recolectados en el séptimo día post-infección y probados para el antígeno p24 por ELISA como se describió previamente 55. El porcentaje de inhibición de la producción de p24 fue calculado. Análisis de la semivida de los inhibidores de los péptidos. Cuatro ratas SD macho de aproximadamente 200 g cada una fueron obtenidas del Centro de Animales de la Escuela Médica de Shanghai y fueron usadas para el ensayo de semivida. Los animales fueron tratados de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publication 86-23, revisado 1985). O bien AP2 o AP3 fue inyectado por vía intravenosa a la concentración de 1 mg/ml. Después de la inyección, se obtuvieron muestras de sangre de la órbita de ratas en varios puntos de tiempo (8 y 30 min y 1.5, 3, 6, 9, 12 y 24 h después de la inyección de péptidos) y Para estudiar la farmacocinética de AP2 y AP3 en ratas y proporcionar evidencia experimental de la posible farmacocinética en humanos, se estableció un método de sandwich de doble anticuerpo ELISA para la determinación rápida de AP2 y AP3 en plasma de ratas. Brevemente, las placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) fueron prerevestidas con anticuerpos frente a AP2 o AP3 (5 μ g/ml) purificadas a partir de antisera de conejo 59. Luego fueron preincubadas con muestras séricas diluidas 20 veces a 37 °C durante 1 h, seguidas por la adición de anticuerpos anti-AP2 o anti-AP3 (1:1000) purificados a partir de antisera de ratón específicamente frente a AP2 o AP3 59 a 37 °C durante otra 1 h. Luego, se agregaron IgG La absorción a 450 nm fue determinada por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan), obteniendo primero los parámetros péptidos estándar, determinando las concentraciones de péptidos plasmáticos en función del tiempo, y calculando la semivida utilizando PK Solver para Microsoft Excel para obtener parámetros farmacocinéticos. Evaluación de la sensibilidad de los péptidos a la digestión proteolítica por proteinasa K y enzimas proteolíticas en homogeneato hepático. Los péptidos (10 μ g/ml) se prepararon en PBS pH 7,2 conteniendo 20 ng/ml de proteinasa K. La mezcla resultante fue incubada a 37 °C en un baño de agua y sacada en diferentes intervalos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos), seguida de saturación de las muestras con alcohol etílico y cuantificación de los péptidos Para probar la sensibilidad de los péptidos a las enzimas proteolíticas en el homogeneato hepático, se sacrificaron 3 ratas SD macho (250 ± 20 g) bajo anestesia; se extrajo rápidamente de cada rata todo el hígado, se lavó en PBS helado (50 mM, pH 7,2), se pesaron y cortaron en trozos pequeños, que fueron resuspendidos en PBS a 100 mg de tejido hepático húmedo/2,5 ml de PBS; las muestras fueron agrupadas y homogeneizadas, seguidas de centrifugación a 9.000 g durante 20 minutos a 4 °C; se recolectaron los sobrenadantes; se agregaron los péptidos de prueba al homogeneato hepático a una concentración final de 10 μ g/ml; la mezcla resultante fue incubada 37 °C en un baño de agua, y los péptidos de residuo
question: ¿Cuál es la semivida de eliminación in vivo de AP3?
answers.text: 6,02 h