context: Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado a HIV-1 Tat como mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)
question: ¿Cuántas proteínas mostraron un cambio significativo en el pliegue?
answers.text: 49