context: Generación eficiente de virus de ARN recombinante utilizando mutagenesis mediada por recombinación dirigida de cromosomas artificiales bacterianos que contienen cDNA de larga duraciónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3840674/SHA: ef38ed2f4cc96e16ce011623cc5d15d2d8ca58c3Autores: Rasmussen, Thomas Bruun; Risager, Peter Christian; Fahnøe, Ulrik; Friis, Martin Barfred; Belsham, Graham J; Höper, Dirk; Reimann, Ilona; Beer, MartinFecha: 2013-11-22DOI: 10.1186/1471-2164-14-819Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Los clones infecciosos Aquí se describe una estrategia para facilitar la manipulación y el rescate de los virus de la peste porcina clásica (VFC) de los CDNA de larga duración presentes en los cromosomas artificiales bacterianos (BACs). Esta estrategia permite la manipulación del ADNc viral mediante mutagenesis mediada por recombinación dirigida dentro de las bacterias. RESULTADOS: Se ha construido una nueva CSFV-BAC (pBeloR26) derivada de la cepa de la vacuna Riems y posteriormente modificada en la secuencia de codificación E2, utilizando la estrategia de recombinación dirigida para permitir el rescate de los pestivirus quiméricos (vR26_E2gif y vR26_TAV) con potencial como nuevos candidatos a la vacuna marcadora. La secuenciación de los BAC reveló una alta estabilidad genética durante los pasajes dentro de las bacterias. Las secuencias del genoma completo de los virus rescatados, después Se observó una única sustitución de aminoácidos (D3431G) en la polimerasa dependiente del ARN en los virus rescatados vR26_E2gif y vR26, que fue reversión a la secuencia de Riems parentales. CONCLUSIONES: Estos resultados muestran que la mutagénesis dirigida mediada por recombinación proporciona una poderosa herramienta para acelerar la construcción de nuevos genomas del ARN y debe ser aplicable a la manipulación de otros virus del ARN. Texto: Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son ideales para el mantenimiento estable de grandes secuencias de ADN derivadas de genomas virales [1]. Se han establecido un número considerable de sistemas de BAC para grandes virus del ADN; en particular muchos genomas del herpesvirus han sido clonados en BACs (ver revisión [2] ). Se han descrito los primeros sistemas BAC que utilizan CDNAs del virus ARN para los coronavirus [3] [4] [5] [6] y recientemente se han insertado en los BACs los primeros BAC que contienen un ADNc de larga duración para un virus ARN negativo [7]. Del mismo modo, se han insertado CDNAs correspondientes a los genomas de larga duración de miembros de la familia Flaviviridae (virus de la encefalitis japonesa [8] y virus del dengue [9] ). Recientemente se han establecido BACs que contienen cDNAs de larga duración de pestivirus (también dentro de los Flaviviridae), incluyendo el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y el virus de la peste porcina clásica (VFC) [10, 11]. Los pestivirus infecciosos se pueden rescatar utilizando transcripciones de ARN derivadas de estos BACs. Los pestivirus tienen genomas de ARN de sentidos positivos aislados, de aproximadamente 12,3 kb de longitud, que incluye un único marco de lectura abierto largo, codificando una poliproteína grande, flanqueada por 5′ y 3′ regiones no traducidas (UTRs) que son críticas para la replicación autónoma del genoma [12, 13]. La poliproteína está dividida por proteasas celulares y virales en cuatro proteínas estructurales (proteína C nucleocápsida, glucoproteínas envolventes E rns, E1 y E2) y ocho proteínas no estructurales (N pro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). La disponibilidad de BACs de pestivirus genéticamente definidos y estables facilita el estudio funcional de las proteínas virales o estructuras de ARN y también el desarrollo de nuevos candidatos a A lo largo de los años se han desarrollado varias vacunas CSFV con propiedades marcadoras basadas en pestivirus quiméricos [14]. En particular, se han descrito los pestivirus quiméricos con sustitución de toda la proteína E2 [15] [16] [17], pero también los mutantes con modificaciones más sutiles, como la modificación del importante epítopo de TAV [18] dentro de la proteína CSFV-E2 [19, 20] son candidatos prometedores a la vacuna marcadora. La manipulación de los BAC utilizando procedimientos tradicionales de clonación puede ser difícil (por ejemplo, debido a la falta de sitios de restricción enzimática convenientes) y, por lo tanto, se ha desarrollado una gama de metodologías que aplican la genética bacteriana, incluida la recombinación homóloga (por ejemplo, la recombinación roja/ET homóloga) dentro del huésped E. coli, (para su El uso de la recombinación homóloga permite la mutagenesis de los BAC dirigida por el sitio [22] y, mediante un esquema de contraselección, se pueden obtener modificaciones específicas sin dejar secuencias residuales "extranjeras" [23]. La principal ventaja de este método es que no hay limitaciones de objetivo (por ejemplo, basadas en el tamaño o la ubicación) y no hay necesidad de sitios de restricción adecuados. La integración de la secuencia modificada se realiza in vivo (dentro de E. coli) por lo que potencialmente es más precisa que los enfoques in vitro como los métodos basados en PCR. Aunque los enfoques de clonación in vitro basados en el uso de polimerasas de alta fidelidad para la amplificación de PCR han mejorado significativamente en los últimos años, el uso de enfoques in vivo debe permitir un método más preciso de mutagenesis debido al uso de los propios sistemas de replicación de alta fidelidad que incluyen Mientras que la recombinación BAC se ha utilizado comúnmente para modificar virus de ADN, hay muy pocos reportes sobre el uso de esta tecnología para virus de ARN [7, 24, 25]. Aquí, una estrategia generalmente aplicable para la manipulación y rescate de pestivirus quiméricos de BACs se describe como un modelo, y la flexibilidad de este enfoque se demuestra generando diferentes modificaciones en el ADNc viral del nuevo CSFV-BAC, pBeloR26, derivado de la cepa de vacuna viva modificada "C-train Riems". La mutagenesis mediada por recombinación dirigida descrita aquí incluye la sustitución del 9 aminoácido (aa) epítopo TAV lineal (TAVSPTTLR) presente en la proteína E2 por la región correspondiente (TTVSTSTLA) de un pestivirus heterólogo (virus de la enfermedad fronteriza, BDV, cepa "Gifhorn") y también la sustitución de toda la región de codificación de la proteína CSFV E2 por toda la región de codificación E2 de la misma BDV, para generar virus vacunales marcados que pueden ser discriminados utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E2. También se han evaluado las estabilidades genéticas de los constructos BAC (dentro de E. coli) y los virus rescatados. El riñón porcino (PK15) y las células timoides fetales de oveja (SFT-R) fueron cultivadas a 37°C (con 5% (v/v) CO 2) en el medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco, complementado con 5% (v/v) suero de ternera fetal libre de pestivirus. El virus de un cebo que contiene la vacuna viva modificada CSFV "C-strain Riems" (Riemser Arzneimittel AG, Alemania) se propagó una vez en células PK15 y se llamó vRiemser. El ARN obtenido de la cepa BDV "Gifhorn" [26] se utilizó para amplificar la secuencia de codificación de Gifhorn E2. Los imprimadores de oligonucleótido utilizados se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. El constructo de BAC, pBeloR26, fue construido usando el largo método RT-PCR descrito anteriormente [11] utilizando ARN derivado de los "Riems de transmisión C". Brevemente, los CDNA virales de larga duración flanqueados por sitios de NotI fueron amplificados por RT-PCR largos usando imprimadores 5′Cstrain_T7_Not1 (que incluye un promotor T7 para la transcripción in vitro, un sitio de NotI y una región correspondiente a los primeros 44 nt del genoma) y 3′CSFV_Not1 (que contiene un sitio de NotI y secuencia complementaria al 3′-terminal 35 nt del genoma que se conservan entre muchos CSFVs incluyendo el Cstrain). El producto (ca. 12,3 kbp) fue digerido con NotI e insertado en pBeloBAC11 (New England Biolabs, GenBank accessing U51113). Todos los BAC fueron modificados y mantenidos en células E. coli DH10B (Invitrogen) cultivadas a 37°C en un medio LB que contenía cloranfenicol (Cam, 15 μg/ml). La electroporación de bacterias se realizó en cubetas de 0,1 cm utilizando 1 pulso a 1800 V, 25 μF y 200 Los BAC necesarios para la secuenciación directa del genoma fueron purificados a partir de cultivos de 500 ml utilizando el kit de construcción grande (Qiagen). Se realizaron modificaciones al CSFV cDNA de longitud completa en E. coli DH10B (resistente a la estreptomicina, Strep R ) utilizando el Kit de Modificación de BAC de Counter Selection (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania). La recombinación Red/ET involucró tres pasos (i-iii). Paso i) el plásmido de expresión pRedET sensible a la temperatura (Gene Bridges) fue introducido en células E.coli DH10B electroporacioncompetentes que contenían el BAC parental (fenotipo Cam R, Strep R ). El pRedET expresa las proteínas de fage lambda rojoα, rojoβ y rojoγ, bajo control del promotor de pBAD inducible con arabinosa, permitiendo la recombinación homóloga. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió un medio LB precalentado sin antibióticos (1 ml) a las células que luego fueron incubadas a 30°C durante 1 hora, antes de propagarse sobre placas de agar que contenían Cam (15 μg/ml) y tetraciclina (Tet) (3 μg/ml) y luego se incubaron a 30°C durante la noche para mantener el pRedET. La presencia del plásmido pRedET (conferring Tet R ) se verificó mediante una inspección visual de las preparaciones BAC-DNA de las colonias Cam R / Tet R utilizando electroforesis de gel de Paso ii) los cassettes de marcadores de contraselección con un sitio extra de NotI para fines de cribado (rpsL-neo, 1325 bp) fueron amplificados por PCR utilizando imprimaciones con extensiones de 30 nt o 50 nt que eran homólogas al sitio objetivo en el BAC utilizando el plásmido rpsL-neo (Gene Bridges) como plantilla y la Phusion Hot Start II HF ADN polimerasa (Thermo Scientific) con condiciones de ciclismo como sigue: 98°C para 30s, seguido de 35 ciclos de 98°C para 10s, 60°C para 20s, 72°C para 60s, y 1 ciclo a 72°C durante 4 min. Los productos de PCR (ca. 1400 bp) fueron aislados en geles de agarosa TBE 1% (w/v) y purificados Las muestras (30 μl), de un cultivo de E. coli que contenía pRedET y el BAC parental cultivado durante la noche a 30 °C en medio LB (Cam, Tet), se utilizaron para inocular 1,4 ml de medio LB fresco con los mismos antibióticos para obtener bacterias de crecimiento exponencial a 30 °C. Las proteínas de recombinación rojo/ET se indujeron añadiendo 50 μl de 10% (w/v) L-arabinosa (Sigma). El producto PCR (200 ng) que contenía el cassette rpsL-neo se introdujo en estas bacterias mediante electroporación (como anteriormente). Después de la electroporación, las células fueron cultivadas a 37 °C durante 70 minutos (para permitir la recombinación) y luego seleccionadas en placas que contenían Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) y kanamicina (Kan, 15 μg/ml) durante la noche a 30 °C para mantener el pRedET. Nota: el cassette rpsL confiere sensibilidad a la Streptomicina (Estrep S ) en la cepa resistente DH10B y la neoconfiere resistencia a la Kanamicina (Kan R ). El fenotipo correcto (Cam R, Kan R, Tet R, Strep S ) de las colonias resultantes fue confirmado por rayar las colonias en placas que contenían Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) y Kan (15 Es importante destacar que, para el tercer paso, la sustitución del cassette rpsL-neo (utilizando la contraselección), las colonias seleccionadas también fueron estriadas en placas que contenían Cam (15 μg/ml) más Strep (50 μg/ml) y se demostró que era Strep S indicando la incorporación de un gen funcional rpsL. Las estructuras de los BAC intermedios fueron verificadas mediante análisis de enzimas de restricción y secuenciación alrededor de las inserciones. Paso iii) el reemplazo de los cassettes de selección rpsL-neo de los constructos intermedios utilizando fragmentos de ADN lineales se logró mediante la contraselección y la recombinación Red/ET. De nuevo, las secuencias homólogas al final del fragmento de ADN fueron utilizadas para eventos de recombinación mediada Red/ET para reemplazar el cassette rpsL La contraselección contra el cassette de rpsL-neo (fenotipo Cam R, Kan R, Tet R, Strep S ) se utilizó utilizando medios que contenían Cam (15 μg/ml) y Strep (50 μg/ml) para aislar los derivados requeridos (fenotipo Cam R y Strep R ). Inicialmente, el constructo intermedio, pBeloR26_E2rpsLneo (Figura 1 ), se generó utilizando la recombinación Red/ET mediante la inserción del cassette de rpsL-neo con un sitio extra de Noti para propósitos de screening que fue amplificado con los primers Criems-TAVfor y Criems-TAVrev (Archivo adicional 1: Tabla S1 ) en lugar de la secuencia de codificación TAVSPTTLR ( En segundo lugar, el cassette rpsL-neo en este constructo intermedio fue reemplazado por la contraselección Red/ ET recombinación utilizando un oligonucleótido de una sola cadena, Riems_TAV_Gifhorn (Archivo adicional 1: Tabla S1 ) con los mismos brazos homológicos utilizados para el cassette rpsL-neo, para introducir la secuencia de codificación para la secuencia de epítopo BDV "Gifhorn" (TTVSTLA). El constructo resultante fue nombrado pBeloR26_TAV (Figura 1 ). El constructo intermedio inicial (con rpsL-neo) fue utilizado entonces para producir el constructo pBeloR26_E2gif (Figura 1 ). Para ello, la secuencia de codificación E2 fue amplificada a partir de cDNA preparada a partir de ARN BDV "Gifhorn" utilizando dos pares de imprimación diferentes, uno con brazos homológicos de 50 nt (Criems_E2_gifFlong/Criems_E2_gifRlong) y otro con secuencias homólogas de 30 nt (Criems_E2_gifF/Criems_E2_gifR). Para la generación de BACs con sustitución de todas las secuencias de codificación E2, los productos PCR consistentes en la secuencia de interés flanqueado con brazos homológicos idénticos al área objetivo fueron generados por PCR (como para el cassette rpsLneo). El precalentamiento de los oligonucleótidos de una sola cadena a 95°C durante 2 minutos seguido de congelación por snap, antes de la electroporación, mostró empíricamente los mejores resultados. En cada caso, las moléculas de ADN fueron introducidas en E. coli que contenía los derivados BAC incluyendo los cassettes de rpsL-neo junto con el plásmido pRedET por electroporación como se describe anteriormente. Las estructuras de los BAC modificados fueron verificadas mediante análisis de enzimas de restricción y posterior secuenciación de genoma completo (ver abajo). El ADN BAC (1 μg) fue linealizado con NotI o 1 μl El ADN BAC fue utilizado como plantilla para la amplificación de PCR largo usando imprimaciones 5′C-strain_T7_Not1 y 3′CSFV (Fichero adicional 1: Tabla S1 ). Los BAC linealizados o productos PCR fueron purificados con el kit de purificación GeneJet PCR (Thermo Scientific) y transcrito in vitro utilizando un kit Megascript T7 (Invitrogen). Los virus fueron rescatados de las transcripciones de ARN (1 a 5 μg) por electroporación de células porcinas (PK15) o ovinas (SFT-R) esencialmente como se describió anteriormente [24]. Las células fueron analizadas utilizando microscopía de inmunofluorescencia (típicamente después de 3 días) para la expresión de proteínas NS3 y E2 utilizando anticuerpos monoclonales específicos (mAbs), estos fueron anti-NS3 (WB103/105, pan-pestivirus), anti-CSFV E2 (WH211, WH303, ambos específicos de CSFV) y anti-BDV E2 (WB166, BVDV/BDV específico) (AHVLA Scientific, Reino Unido) junto con el anticuerpo IgG de cabra conjugado Alexa 488 (sondas moleculares, Invitrogen). Los núcleos de células fueron visualizados utilizando DAPI (Vector Laboratories) y las imágenes fueron grabadas utilizando un microscopio de fluorescencia BX63 (Olympus). Para la tinción de la peroxidasa, las células fueron fijas y teñidas para la presencia de antígenos del pestivirus utilizando anti-CSFV/BVDV policlonal IgG seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con avidina (eBioscience) como se describió anteriormente [27]. El mismo procedimiento de tinción también se realizó utilizando el anti-E2 mAbs. Las muestras que contenían células virales positivas fueron pasadas a nuevas células. Las curvas de crecimiento del virus fueron generadas como se describió anteriormente [24]. Brevemente, las células PK15 o SFT-R fueron infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 pfu/células y cultivadas durante tres días. Las DNA BAC (5 μg), purificadas utilizando el kit de construcción grande (Qiagen) o productos PCR (1 μg) amplificados a partir del ADNc viral o de los BACs utilizando el método de PCR largo (como anteriormente) fueron secuenciadas por consenso utilizando un 454 FLX (Roche) o un PGM Ion (Life Technologies). Tanto Newbler (Roche) como el algoritmo de alineación bwa.bwasw [28] se utilizaron para mapear las lecturas a la secuencia esperada. Una combinación de Samtools [29] y LoFreq SNV-caller [30] se utilizó para el análisis de la variante nucleótida única (NSV) aguas abajo. Finalmente, las secuencias de consenso clones se alinearon utilizando MAFFT en la plataforma de software Geneious (Biomaterias). La generación de un BAC que contiene ADNc de larga duración correspondiente a la vacuna viva modificada Riems "C-train" Los BACs que contienen el ADNc de larga duración correspondiente al vRiemser parental ("Riems C-train") se construyeron de acuerdo con el método descrito anteriormente para la cepa "Paderborn" de CSFV [11]. Los BACs que contienen el CSFV cDNAs completos se identificaron mediante restricción Figura 1 Representación esquemática de la organización del genoma del CSFV y los BACs construidos y utilizados en este estudio. Se muestran las posiciones de nucleotida (nt) y aminoácido (aa) dentro de R26 para los termini de 5′ y 3′, junto con los codones de inicio y parada traslacionales de la región de codificación de poliproteínas más los sitios de escote utilizados para fabricar las proteínas individuales (N pro, C, E rns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). Se indica la inserción del rpsL-neo en lugar del TAV-epitope dentro del E2 del CSFV para el constructo intermedio (R26_rpsLneo) y el reemplazo posterior con la secuencia TTVSTSTLA (R26_TAV) y la sustitución completa de la secuencia E2 (R26_E2gif). Los nombres de los constructos BAC comienzan con "pBelo" y los virus rescatados con "v" (p. ej. pBeloR26 y vR26). El paso de cultivo celular no. del virus se indica con "/P" (p. ej. vR26/P-4). análisis de digest y posterior linealización por NotI, las transcripciones del ARN fueron producidas y electroporadas en células PK15. Este cribado resultó en la identificación de un BAC conteniendo un inserto de cDNA de 12316 nt, pBeloR26 (Figura 1), que produjo virus infecciosos, llamado vR26, que podría propagarse en células SFT-R (Figura 2, paneles superiores) y en células PK15 (Figura 3 ). El vR26 rescatado mostró una tasa de crecimiento más alta en la etapa inicial (una diferencia de 10 veces en el rendimiento del virus a las 24 h) en comparación con el virus de la vacuna parental, pero después de 48 horas se obtuvieron títulos similares del virus (Figura 3). La secuenciación del genoma completo de la plantilla de BAC clonada, pBeloR26, reveló una serie de diferencias a lo largo del genoma cuando se comparó con la secuencia de consenso de duración completa del ADNc utilizado para el procedimiento de clonación (véase Tabla 1 ). Estas diferencias son variantes no representativas dentro del ADNc. En general, la secuencia de BAC difería de la secuencia de ADNc en 18 posiciones, 9 de ellas conducen a sustituciones de aminoácidos predichas dentro de la poliproteína; una en cada una de N pro, E rns, E1, E2 y NS3 y cuatro sustituciones En comparación con la secuencia de referencia publicada (adhesión de GenBank AY259122.1), la secuencia BAC pBeloR26 difería en 11 posiciones adicionales, 1 de ellas conduce a una sustitución predicha de aminoácidos y hubo una gran inserción (27 nt) en la región hipervariable de la 3′-UTR (archivo adicional 2: Tabla S2). Para determinar la utilidad del sistema de recombinación mediada de mutagenesis para los pestivirus, se generaron dos modificaciones diferentes de la secuencia de codificación de proteínas E2 dentro de pBeloR26 utilizando la metodología de recombinación Red/ET. Inicialmente, la secuencia codificando el TAV-epitope lineal (TAVSPTTLR) dentro del CSFV-E2 fue sustituida por la secuencia codificando la región correspondiente (encodificación TTVSTLA) de la cepa Más del 90% de las colonias obtenidas con este procedimiento contenían los patrones de reacción anticuerpos de células infectadas con pestivirus BACanti-CSFV E2 requeridos (WH211) Figura 2 Patrones de reacción anticuerpo de células infectadas con pestivirus. Las células SFT-R fueron infectadas con vR26 y sus dos derivados vR26_E2gif y vR26_TAV más vGhorn [26]. Después de 72 h, las células fueron fijas y manchadas con anticuerpos monoclonales contra la proteína NS3 (WB103/105, columna izquierda), la proteína CSFV E2 (WH303 y WH211, columnas medias) y la proteína BDV E2 (WB166, columna derecha) según lo indicado y visto mediante un microscopio de fluorescencia. Estructura determinada por Digestiones Noti. Se han verificado las secuencias completas del Además, la secuencia de codificación completa (1119 nt) de la proteína CSFV-E2 fue sustituida por la secuencia correspondiente de BDV "Gifhorn". De nuevo más del 90% de las colonias obtenidas contenían el BAC requerido y la misma proporción de BAC correctamente recombinados se obtuvo utilizando brazos homológicos de 30 nt o 50 nt. Se designó el BAC quimérico, pBeloR26_E2gif y se verificó la secuencia completa del genoma del virus (cDNA) (datos no mostrados). Después de la electroporación con transcripciones de ARN derivadas de pBeloR26_TAV o pBeloR26_E2gif se pudo observar un gran número de células positivas de CSFV NS3 (datos no mostrados) y existencias de virus quiméricos, llamadas vR26_TAV y v Las células infectadas con estos virus y con las cepas parentales vR26 y vGifhorn fueron teñidas con mAbs dirigida contra la proteína NS3 (Figura 2 ). Sin embargo, en contraste con el virus parental vR26, los virus quiméricos rescatados de los BACs recombinados no fueron reconocidos por las proteínas anti-E2 mAbs específicas para las proteínas CSFV-E2 (Figura 2 ) y por lo tanto, de acuerdo con su estructura, mostraron el mismo patrón de reacción de anticuerpos que vGifhorn. Dos diferentes anti-CSFV E2 mAbs, WH211 y WH303, fueron utilizados para la tinción y este último ha sido demostrado previamente para dirigir el TAV-epitope [18]. Como era de esperar, las células infectadas con el vGifhorn o con el quimérico vR26_E2gif pudieron ser mostradas para expresar la proteína "Gifhorn" E2 usando tinción con un anti-BDV mAb (Figura 2 ). La presencia del epítopo BDV TTVSTLA en vR26_ TAV fue insuficiente para permitir el reconocimiento eficiente por este anti-BDV mab, aunque se observó una señal débil en algunas células. Los constructos de BAC pBeloR26 y pBeloR26_E2gif fueron analizados para la estabilidad genética del cDNA para determinar la idoneidad del vector BAC para mantener el pestivirus cDNAs de larga duración. Las células E. coli DH10B que contenían los BAC fueron pasadas 15 veces, por crecimiento nocturno, y los cDNAs virales completos dentro de los BACs fueron secuenciados después del paso 1o y 15o. No se observaron mutaciones dentro de las secuencias de cDNA del virus 12316 nt después de esta extensa propagación de los BACs en el huésped bacteriano, indicando un sistema altamente estable para el mantenimiento de secuencias de cDNA del pestivirus completo. Los virus, vR26 y vR26_E2gif, rescatados de sus respectivos constructos BAC, también fueron probados para su estabilidad genética dentro de las células mamíferas. El ADN BAC lineal fue transcrito in vitro y el ARN fue electroporado en células PK15. Tres días después de la electroporación las células fueron manchadas con el anticuerpo anti-NS3 para detectar Las muestras que contenían células virales positivas se pasaron a nuevas células, este proceso *La posición Nt 10665 en vR26/P-12 se revierte de A a G como en el ADNc parental. se repitió durante 12 pasajes separados (cada uno de tres días).El título del virus (como TCID 50/ml) se determinó para cada pasaje. El paso del virus quimérico vR26_E2gif rescatado en células PK15 dio lugar a una rápida disminución de los títulos del virus y se interrumpió después del segundo pasaje (Figura 4A ). En cambio, el paso posterior de este virus quimérico se realizó en células SFT-R ovinas (el tipo de célula preferido para BDV) y resultó en títulos mucho más altos del virus quimérico. Los títulos del virus alcanzaron más de 10 6 TCID 50/ml después del primer pasaje y permanecieron estables El vR26 rescatado también se propagó eficientemente en las células SFT-R, pero mantuvo un título ligeramente más bajo que el virus quimérico vR26_E2gif (Figura 4A ). Para comprobar que los virus conservaron sus propiedades de reacción de anticuerpos (Figura 2 ) después de estos pasajes, las células fueron infectadas con virus del paso del cultivo celular SFT-R 12 (denominado vR26/P-12 y vR26_E2gif/P-12) y manchadas con un suero anti-pestivirus policlonal y con mAbs específicos dirigidos contra las proteínas CSFV-E2 y BDV-E2 (Figura 4B ). Las células infectadas con el vR26/P-12 o el vR26_E2gif/P-12 quimérico fueron detectadas cada una por el suero anti-pesti Los anti-CSFV-E2 mAb detectaron células infectadas con vR26/P-12 pero no células infectadas por el virus quimérico que contiene la proteína BDV-E2 (consistente con los resultados mostrados en la Figura 2). En contraste, los anti-BDV-E2 mAb detectaron específicamente infección por el vR26_E2gif/P-12 y no reconocieron células infectadas con vR26/P-12. Cada resultado está de acuerdo con la estructura de los virus. El cuarto paso de vR26 (vR26/P-4) mostró una tasa de crecimiento más lenta que el virus obtenido después de 12 pasajes (ver Figura 5A ). También tuvo una tasa de crecimiento reducida en comparación con los vR26_E2gif/P-4 y vR26_E2gif/P-12. La secuencia completa de pBeloR26 había revelado diez mutaciones no silenciosas en comparación con la secuencia de referencia (AY25 9122.1) para este virus (archivo adicional 2: Tabla S2). Cualquiera de estas mutaciones podría ser responsable del deterioro del crecimiento actuando solo o en concierto. Para una investigación más profunda de este problema, cDNAs de longitud completa preparados a partir de vR26/ P-4, vR26/P-12, vR26_E2gif/P-4 y vR26_E2gif/P-12 se secuenciaron profundamente utilizando las plataformas 454 FLX e Ion PGM para la comparación y para determinar la distribución de cuasiespecies (archivo adicional 3: Figura S1 y archivo adicional 4: Figura S2 ). Los datos de secuenciación de ambas plataformas revelaron que tanto el vR26/P-12 como el vR26_E2gif/P-12 fueron casi 100% cambiados en la posición nt A10665G en comparación con los clones BAC (resultando en la sustitución predicha de aminoácidos D3431G dentro de la proteína NS5B, la ARN polimerasa dependiente de ARN, ver Figura 5B ). Esta adaptación es una reversión a la secuencia cDNA del consenso del virus vacuna parental, vRiemser (Fichero Adicional 2: Tabla S2 ). Además, vR26/P-4 y vR26_E2gif/P-4 ya mostraron evidencia de que esta reversión está presente en la población. Para vR26/P-4, el nivel de reversión fue del 57%, mientras que para vR26_E2gif/P-4 En este estudio, hemos establecido el primer BAC que contiene el ADNc de larga duración de una cepa vacunal CSFV. El BAC difería de la secuencia de ADNc parental en 18 posiciones que conducen a 9 sustituciones aa (Tabla 1 ). El método que se ha utilizado para la generación de pBeloR26 se basa en la amplificación del genoma completo del ADNc seguido de clonación directa para obtener los BACs [11]. Este enfoque resulta en clones cDNA que reflejan la composición cuasiespecífica del ARN viral parental y por lo tanto no está garantizado obtener clones de ADNc correspondientes a la secuencia de consenso del ADNc utilizado. Sin embargo, es posible corregir las mutaciones utilizando el enfoque de recombinación BAC si se necesita un clon de consenso. Para demostrar la utilidad del método de recombinación mediada por Red/ET hemos generado una serie de BACs modificados derivados de este CSFV cDNA de longitud completa. Estos incluyen BACs con sustitución del epítopo TAV lineal presente en la proteína E2 y también BACs con sustitución de la proteína E2 completa con secuencias de pestivirus heterólogos. También hemos utilizado el mismo enfoque para una gama de diferentes modificaciones dirigidas dentro de CSFV BACs incluyendo deleciones específicas y sustituciones en la 5′UTR de CSFV [24] y para inserciones de secuencias de reporteros heterólogos en replicos de CSFV [25]. Utilizando Red/ET recombinationmediated mutagenesis para el diseño específico, el trabajo puede acelerarse y centrarse, en principio, en cualquier secuencia dentro del genoma viral y no depende del uso de sitios Los resultados demuestran que la mutagenesis mediada por Red/ ET de los BAC cDNAs pestivirus proporciona una herramienta útil para avanzar en la construcción de pestivirus modificados. Las células infectadas con el virus vR26 parental fueron reconocidas por los dos mAbs anti-E2 (WH211 y WH303) específicos para las proteínas CSFV-E2, en las células de contraste infectadas con los virus modificados vR26_TAV y vR26_E2gif, rescatadas de los BACs recombinados, no fueron detectadas por estos mAbs. Además, como se esperaba, las células infectadas con el vR26_E2gif fueron reconocidas por el anti-BDV mAb (WB166) mientras que no se observó tinción con este anticuerpo en células infectadas vR26 o en células con vR26_TAV. El mAb WH303 reconoce el epítopo TAV de CSFV [18] y la diferencia en 4 aa entre el epítopo TAV y la secuencia correspondiente de la cepa BDV "Gifhorn" es suficiente para abolir completamente el reconocimiento por este mAb. La falta de tinción de las células infectadas por vR26_TAV por el WH211 indicó que la secuencia TAV también es importante para el epítopo reconocido por este mAb. Así, los pestivirus quiméricos, vR26_TAV y vR26_E2gif, que contienen secuencias E2 heterólogas, pueden ser discriminados fácilmente de la vR26 utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E2. Estos nuevos pestivirus quiméricos representan candidatos a vacunas marcadas basadas en Cstrain con las características deseadas para vacunas DIVA seguras y eficaces contra De hecho, los cerdos vacunados con vR26_E2gif podrían ser discriminados eficazmente de los cerdos vacunados con C-cetra y de los cerdos infectados con CSFV utilizando anticuerpos específicos ELISAs (Rasmussen et al., resultados inéditos).Los datos de secuencia de nucleótida para el pBeloR26 mostraron una serie de cambios de la secuencia de referencia publicada para "C-cetra Riems".Algunas de estas diferencias están presentes en el ADNc derivado de la población vacunal a un nivel detectable, mientras que otras pueden representar variantes de bajo nivel dentro del ADNc o errores introducidos por la amplificación RT-PCR. La secuenciación completa reveló que no se produjeron cambios en el ADNc durante la propagación extensiva en E. coli DH10B del pBeloR26 y el derivado E2chimeric, pBeloR26_E2gif, lo que indica una muy alta estabilidad de estos CSFV cDNAs cerrados por BAC. Esto es esencial para que este sistema sea útil para la clonación y la manipulación de secuencias, y contrasta con problemas de estabilidad encontrados con plásmidos convencionales que contienen pásmidos que contienen pestivirus cDNAs de larga duración [31]. La estabilidad de estos BACs es consistente con informes anteriores sobre la estabilidad de los BACs que contienen otros virus de la familia Flaviviridae en E. coli [8, 10].
question: El BAC difería de la secuencia de ADNc parental por qué sustituciones de aminoácidos?
answers.text: aa