context: La amplificación isotérmica mediante un dispositivo de calentamiento químico para la detección en el punto de cuidado del VIH-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285652/SHA: ef7110a9022bac2e50c995b0f6b826ff071e48f8Autores: Curtis, Kelly A.; Rudolph, Donna L.; Nejad, Irene; Singleton, Jered; Beddoe, Andy; Weigl, Bernhard; LaBarre, Paul; Owen, S. MicheleFecha: 2012-02-23DOI: 10.1371/journal.pone.0031432Licencia: cc0Abstracto: ANTERIOR: Hasta la fecha, el uso de pruebas tradicionales de amplificación del ácido nucleico (NA La disponibilidad de un NAAT rápido con aplicabilidad para entornos de límite de recursos o punto de atención (POC) cubriría una gran necesidad en el diagnóstico del VIH, permitiendo el diagnóstico oportuno o la confirmación del estado de infección, así como facilitar el diagnóstico de infección aguda, detección y evaluación de los bebés nacidos de madres infectadas por el VIH. Métodos de amplificación isotérmica, como la transcriptación inversa, la amplificación isotérmica mediada por bucles (RT-LAMP), exhiben características ideales para los ajustes de COP, ya que normalmente son más rápidos, fáciles de realizar y permiten la integración en dispositivos de calefacción portátiles de baja tecnología. METODOLOGÍA/SIGNIFICANTES METODOLOGÍA: En este estudio, evaluamos el ensayo RT-LAMP de VIH-1 utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) portátiles y no instrumentales que generan calor a partir de la reacción Los aparatos de calefacción NINA mostraron temperaturas estables a lo largo de la reacción de amplificación y resultados de amplificación consistentes entre tres dispositivos separados y un ciclo térmico.El rendimiento de los calentadores NINA fue validado utilizando muestras de sangre entera de pacientes infectados por VIH-1. CONCLUSIÓN: El método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico proporciona una plataforma NAAT portátil, rápida y robusta que tiene el potencial de facilitar la prueba del VIH-1 en entornos limitados de recursos y COP. Texto: Las pruebas de diagnóstico del VIH-1 se llevan a cabo con un alto nivel de rendimiento, ya que el diagnóstico tiene un impacto directo en el cuidado del paciente y la reducción de la transmisión. A pesar de los avances tecnológicos en el campo del diagnóstico del VIH y la alta sensibilidad y especificidad asociadas con la mayoría de las pruebas de diagnóstico del VIH que están disponibles actualmente, se estima que aproximadamente el 20% de las personas infectadas Además, los sitios de pruebas han informado de que entre el 35 y el 50% de las personas con un resultado positivo inicial no regresarán para un diagnóstico confirmatorio si se requieren pruebas de laboratorio de seguimiento [2]. Las pruebas rápidas basadas en anticuerpos contra el VIH, que pueden realizarse con un entrenamiento mínimo y normalmente proporcionan resultados en menos de 30 minutos [3], han facilitado las pruebas de VIH en el punto de atención y posteriormente han aumentado el número de personas conscientes de su serostatus [4]. Las pruebas rápidas son actualmente un componente clave de la detección del VIH en el punto de atención (POC), ampliando significativamente las capacidades diagnósticas de los sitios de pruebas en los países desarrollados, así como los entornos limitados de recursos. A pesar de los avances realizados por la disponibilidad generalizada de pruebas rápidas, todas las pruebas basadas en anticuerpos para la detección del VIH presentan algunas limitaciones. Los anticuerpos específicos del VIH normalmente comienzan a aparecer alrededor de tres semanas después de la La ventana de tiempo antes o durante la seroconversión temprana puede conducir a resultados falsos negativos en individuos recientemente infectados. Además, el diagnóstico preciso de bebés nacidos de madres infectadas por VIH puede ser difícil si se basa únicamente en la positividad de anticuerpos, ya que los anticuerpos maternos transferidos verticalmente pueden persistir durante 12-18 meses después del nacimiento [6, 7]. Para el diagnóstico confirmatorio de infección temprana por VIH o diagnóstico infantil, se prefieren pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT), ya que el ARN del VIH-1 se puede detectar tan pronto como 10-12 días después de la infección y el ADN y/o ARN del VIH-1 son indicadores definitivos de infección activa [5]. Sin embargo, en su forma actual, los ARN del NAAT no son factibles para las pruebas de COP, porque son lentos, costosos y técnicamente complicados. Hasta la fecha, el ensayo Aptima HIV-1 ARN (Gen-Probe, Inc., http://www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ ApprovedProducts/ LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisase/ UCM080466) es el único NAAT aprobado por la FDA para el diagnóstico o la confirmación de la infección por VIH-1 y sólo es adecuado para pruebas de laboratorio. Para satisfacer las necesidades de diagnóstico del VIH-1 en el COP, un NAAT rápido que puede realizarse con un entrenamiento mínimo, un equipo limitado y un tiempo de respuesta relativamente corto (1,1 hora) es deseable [8]. El desarrollo de un NAAT rápido ha demostrado ser especialmente difícil ya que la tecnología implicada en la simplificación del procedimiento de Además, la reducción de la complejidad técnica no debe comprometer la sensibilidad y especificidad de las pruebas.Para una mayor aplicabilidad en el POC, se ha desarrollado un número creciente de nuevas técnicas de amplificación isotérmica [9]. La amplificación isotérmica es una alternativa atractiva a la PCR tradicional o RT-PCR, ya que no es necesario el termociclismo, lo que permite una mayor versatilidad en términos de dispositivos de calentamiento o amplificación. Uno de estos métodos de amplificación, denominado amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) [10], se ha optimizado para la detección de ADN y/o ARN (RT-LAMP) a partir de una amplia gama de patógenos bacterianos y virales [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19], incluido el VIH [20, 21]. La reacción de amplificación requiere seis imprimaciones específicas para ocho regiones separadas dentro de la secuencia diana, contribuyendo a la alta especificidad del método de amplificación. El material amplificado puede ser típicamente detectado dentro de 15-60 minutos cuando se incuba a una temperatura de reacción constante de 60-65uC [22]. LaMP también ha demostrado ser menos sensible a los inhibidores biológicos que la PCR [23, 24], lo que permite la amplificación directa de especímenes clínicos, eliminando así la necesidad de un paso adicional de extracción de ácido nucleico. La amplificación directa del plasma, sangre entera y líquido oral ha sido previamente demostrada para el VIH-1 [20, 21, 25]. Por último, la detección visual inmediata de productos amplificados es facilitada por la gran cantidad de ADN que se genera por cada reacción. Varios grupos han incorporado métodos de detección fluorescente en el ensayo de LAMP para la detección en tiempo real o inmediata de ojo desnudo [ La simplicidad y la naturaleza isotérmica del procedimiento LAMP abre la puerta para la evaluación de dispositivos integrados de baja tecnología o nuevos elementos de calefacción, adecuados para entornos de bajo recurso, donde no se pueden obtener equipos y electricidad costosos. En este estudio, el ensayo de HIV-1 RT-LAMP se evaluó utilizando dispositivos de amplificación de ácido nucleico (NINA) no instrumentalizados y portátiles que generan calor a partir de la reacción exotérmica del óxido de calcio y el agua [27, 28]. Demostramos la estabilidad de temperatura de los dispositivos de calentamiento NINA y la viabilidad para la prueba de COP de muestras enteras de sangre de individuos infectados por el VIH-1. Los calentadores de Prototipo NINA fueron diseñados y proporcionados por el Programa de Tecnología Apropiada en Salud (PATH, Seattle, WA), como se describe [27, 28]. Brevemente, la reacción exotérmica del óxido de calcio (CaO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y el agua proporcionaban una temperatura de amplificación de aproximadamente 60uC. Los aparatos de calefacción, que contenían la reacción química, se diseñaron utilizando botes de acero inoxidable aislantes térmicamente con tapas de rosca de plástico (Fig. 1). Las tapas se modificaron para contener tres pozos de muestra que se ajustaban a los tubos PCR estándar de 200 ml y se llenaban con un material de cambio de fase propietario (PCM) que se utilizaba para amortiguar el calor derivado de la reacción exotérmica, proporcionando así una temperatura constante. Por último, se diseñaron tapas de plástico que contenían aislamiento de espuma para caber en la parte superior de las tapas de bote. Los perfiles térmicos de los pozos de muestra se midieron y registraron mediante un te Se prepararon paneles de linealidad de ADN y ARN para determinar la sensibilidad del ensayo RT-LAMP específico para el VIH. Se generó un panel de ADN a partir del ADN extraído de la línea celular monocítica humana OM-10.1 [29], utilizando un kit de sangre de ADN QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA). Se utilizó el recuento celular para cuantificar el número de copia de ADN de entrada, ya que en cada célula se contiene un único provirus integrado [29]. El ADN extraído se diluyó diez veces en agua libre de RNase para crear un panel de linealidad, que va desde 10 5 copias/ml hasta 10 3 copias/ml. Se obtuvo un panel de linealidad de ARN comercialmente (PRD801; SeraCare Life Sciences, Mil- ford, MA) y varió de 2.9610 6 copias/ml a 8 copias/ml, según lo determinado por Roche AMPLICOR HIV MONITOR TM v 1.5, Bayer VERSANT HIV-1 ARN bDNA 3.0 Ensayo, bioMerieux NucliSensH HIV-1 QT, y Abbott Real Time HIV-1 m2000 TM. El ARN se extrajo de los miembros del panel utilizando un mini kit de ARN viral (QIAGEN). Los controles negativos incluyeron ADN extraído de PBMC infectado con VIH-2 SLRHC [30] y ARN extraído del virus purificado por HIV-2 NIH-Z (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD). Se recolectó sangre entera de individuos infectados por el VIH-1 como parte de un estudio independiente, aprobado por el IRB [31], u obtenida comercialmente (SeraCare Life Sciences). Todas las muestras seropositivas fueron confirmadas utilizando las siguientes pruebas: Sistemas Genéticos VIH-1/ VIH-2 más O EIA (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA), GS HIV-1 Western blot (Bio-Rad Laboratories), Aptima HIV-1 ARN assay (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) y Amplicor HIV-1 DNA assay (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ ). Se desconocen las cargas virales y provirales, ya que las muestras fueron probadas con ensayos cualitativos basados en ácido nucleico. Todos los especímenes clínicos evaluados en este estudio fueron obtenidos Como control negativo, se incluyeron muestras de sangre seronegativa del VIH-1 (SeraCare Life Sciences) en todos los experimentos que involucraban sangre completa. Un control positivo incluyó sangre seronegativa del VIH-1 con 5610 6 partículas virales/ml de VIH-1 BaL (Advanced Biotechnologies Inc.). Los imprimadores RT-LAMP específicos del VIH-1 fueron diseñados para reconocer una secuencia conservada dentro del gen de la transcriptasa inversa (RT). Los seis imprimadores necesarios para la reacción RT-LAMP, externa hacia adelante (F3), externa hacia atrás (B3), interna hacia adelante (FIP), interna hacia atrás (BIP), y los imprimadores de bucle (LoopF y LoopB), fueron diseñados utilizando el software PrimerExplorer V4 (Eiken Chemical Co. Ltd.; http:// primerexplorer.j Los imprimadores LAMP y el ciclo de amplificación han sido descritos en detalle por Nagamine et al. [32]. Otras modificaciones incluyen una secuencia de enlace de cuatro timidinas insertadas entre las secuencias F2 y F1c del imprimador FIP, como se describe [20], y la adición de la molécula fluorescente HEX al extremo 59 del imprimador LoopF. El imprimador etiquetado, junto con una sonda de apagador, permitió la detección visual inmediata de productos amplificados [21]. La sonda de apagador consistía en la secuencia complementaria del imprimador LoopF con Black Hole Quencher-1 (BHQ-1) añadido al extremo 39. La secuencia HXB2 del HIV-1 (número de adhesión de GenBank AF033819) se utilizó como referencia para generar los primeros RT-LAMP. La reacción RT-LAMP se realizó utilizando la siguiente mezcla de reacción: 0,2 mM (concentración final) de cada primer F3 y B3, 1,6 mM de cada primer FIP y BIP, 0,8 mM de cada primer LoopF y HEX-LoopB, 0,8 M betaína (Sigma-Aldrich), 10 mM MgSO 4, 1,4 mM dNTPs, 16 ThermoPol Reaction Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 16 U Bst ADN polimerasa (New England Biolabs) y 2 U AMV transcriptasase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). La reacción se realizó en un volumen total de 25 ml para amplificación del ácido nucleico extraído, 10 ml de los cuales constituye la muestra. Para la amplificación de muestras de sangre entera, se utilizó un volumen de reacción de 100 ml para facilitar la detección visual de productos amplificados. La sangre entera se añadió directamente a la reacción a un volumen total de 40 ml, después de una dilución de 1:4 con tampón de lisis de glóbulos rojos (2,5 mM KHCO 3, 37,5 mM NH 4 Cl, y 0,025 mM EDTA), como se ha descrito anteriormente [21]. La mezcla de reacción se incubaba a 60uC durante 60 minutos, utilizando un sistema GeneAmpH PCR (Applicated Biosystems, Foster City, CA) o los calentadores NINA. Para las reacciones amplificadas en el termocilcer, se añadió un paso de calentamiento adicional de dos minutos de 80uC al final del ciclo de amplificación para terminar la reacción. Los tubos de reacción fueron evaluados para la presencia de amplificación, después de la adición de la sonda de enfriamiento en una relación de 2:1 de apagador a primer etiquetado, como se describió previamente [21]. La amplificación fue determinada visualmente observando fluorescencia en los tubos de reacción, utilizando la lámpara UV de un sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA). La amplificación fue confirmada por electroforesis utilizando un gel de agarosa del 1,2% que contenía mancha de gel seguro SYBRH (Invitrogen), que posteriormente fue visualizada mediante el sistema ChemiDoc XRS. Para comparar la temperatura y la consistencia de amplificación, se probaron tres calentadores NINA en paralelo. La reacción de calentamiento se inició añadiendo 18 g de CaO a cada bote NINA, seguido de 6 ml de agua. La tapa Después de añadir 200 ml de agua a cada uno de los pozos de la muestra, se inició el registro de temperatura. Se añadieron tubos de reacción a los pozos de la muestra una vez que cada cámara de reacción alcanzó una temperatura de 58,5 uC. Para todas las muestras incubadas en el calentador NINA, se añadieron 15 ml de aceite mineral al tubo de reacción durante la preparación de la mezcla de reacción. Las muestras se incubaron en los calentadores durante un total de 60 minutos. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un laboratorio controlado por la temperatura con una temperatura ambiente de 28 uC, a menos que se indique lo contrario. Después de la reacción de amplificación, las muestras se incubaron durante dos minutos en un bloque de calor a 80 uC. Después de cada ciclo de amplificación, se analizó el perfil de temperatura de cada dispositivo mediante el cálculo de la media de temperatura, desviación estándar, mediana, mínima y máxima a partir de los datos La estabilidad de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas y altas fue evaluada colocando los recipientes en un refrigerador a 4uC o una incubadora de 37uC durante la duración de la reacción de amplificación. Los perfiles de temperatura fueron registrados y comparados con los de las reacciones que ocurrieron a la temperatura ambiente de laboratorio de 28uC. Para determinar la sensibilidad de la reacción RT-LAMP utilizando imprimaciones RTespecíficas, se probaron paneles de linealidad de ADN y ARN en un ciclo térmico. El límite de detección del ADN VIH-1 fue de 10 copias/reacción. Para el panel de linealidad ARN, la muestra conteniendo 1700 copias/reacción fue detectada en las tres réplicas, mientras que la muestra conteniendo 140 copias/reacción fue detectada en tres de cinco réplicas (60%). En cuanto a la positividad, los resultados de amplificación fueron consistentes entre los tres calentadores y el ciclo térmico (Tabla 2). Dado que el ensayo RT-LAMP requiere una temperatura constante de 60uC para la duración de la reacción de amplificación, se compararon los perfiles de temperatura de los pozos de muestra durante la incubación y entre los tres calentadores NINA. En la Figura 2 se muestra un perfil de temperatura representativo, mostrando una temperatura de reacción constante a o cerca de 60uC para la duración de la reacción de amplificación. Durante la incubación de 60 minutos, la temperatura media de cada dispositivo fue de 60.2, 59.8 y 59.7 (Tabla 3 ). La temperatura mínima alcanzada durante la reacción refleja el hecho de que la temperatura del puerto de muestra descendió temporalmente después de que los tubos de muestra se añaden al dispositivo, como se muestra en la Figura 2. La temperatura máxima de los dispositivos se desvió de la temperatura de reacción deseada de 60uC en menos de un grado. La capacidad de los calentadores NINA para mantener una temperatura de reacción constante en una amplia gama de temperaturas ambientes es esencial para las pruebas de COP, ya se refiera a un laboratorio climatizado o sitio de campo de alta temperatura. Para evaluar el rendimiento de los calentadores NINA a temperaturas extremas bajas o altas, los botes se colocaron en una nevera 4uC o una incubadora 37uC para la duración de la reacción de amplificación. El límite de detección para los paneles de linealidad de ADN y ARN fue similar a los resultados obtenidos en nuestro laboratorio controlado por temperatura (28uC; Tabla 2 ). El mayor grado de variación de temperatura de los pozos muestra se observó a la temperatura ambiente de 4uC (Tabla 3 ). La temperatura media fue aproximadamente dos grados menor que la temperatura de reacción deseada de 60uC. Además, la temperatura de los dispositivos tendió a disminuir desde su estado estacionario durante los últimos 20 minutos de la reacción (datos no mostrados). Los perfiles de temperatura a la temperatura ambiente de 37uC, sin embargo, fueron similares a los de 28uC. Las muestras de sangre entera de los individuos infectados por el VIH-1 se añadieron directamente a la reacción RT-LAMP y se probaron en los calentadores NINA. La positividad de los especímenes clínicos fue consistente entre el ciclo térmico y los dispositivos (Tabla 4 ). La consistencia de amplificación fue más evidente con dos de las muestras de pacientes (paciente #4 y #5) que fueron sólo positivas en una de las tres réplicas, Todas las muestras de sangre HIVnegative, incluidas en cada reacción, fueron negativas (datos no mostrados). En la Figura 3 se muestra un experimento representativo utilizando los calentadores NINA, que muestra la detección por gel de agarosa y la identificación visual de fluorescencia en los tubos de reacción. En este estudio, se demuestra el rendimiento de los calentadores NINA de ácido nucleico portátiles, económicos y no instrumentales para amplificación del VIH-1 mediante RT-LAMP. La reacción de amplificación isotérmica acoplada con un dispositivo que genera calor a partir de una reacción química exotérmica, en lugar de electricidad de red o energía de batería, comprende un NAAT de punto de cuidado que es práctico para su uso en entornos limitados a recursos. Los dispositivos de calefacción requieren un entrenamiento mínimo y experiencia técnica para operar y tomar aproximadamente 10-15 minutos para alcanzar una temperatura de reacción de 60uC una vez iniciada la reacción Además, la temperatura de los pozos muestra se mantiene relativamente estable a la temperatura de reacción deseada de 60uC a lo largo de toda la reacción de amplificación, como lo demuestran los perfiles de calentamiento y la consistencia en la amplificación entre los dispositivos y el ciclo térmico. Dado que los ensayos en el punto de cuidado pueden referirse a un laboratorio climatizado o a un sitio de campo con altas temperaturas y humedad, la estabilidad de la temperatura generada por los dispositivos de calentamiento debe ser fiable. Aunque los perfiles de temperatura a una temperatura de frío representativa de 4uC indicaron una pérdida de temperatura de reacción hacia el final de la incubación de 60 minutos, las fluctuaciones de temperatura no fueron lo suficientemente significativas como para afectar la reacción de amplificación. Sin embargo, este efecto térmico podría mitigarse con pequeñas modificaciones en el dispositivo para reducir la pérdida de calor a temperaturas más bajas. Debería ser posible ampliar el rango de temperatura de los calentadores NINA a 4uC y más abajo Es más preocupante el rendimiento de los calentadores NINA en sitios de campo de alta temperatura, donde el control de temperatura no es una opción. No demostramos ninguna diferencia en la estabilidad de temperatura de los calentadores NINA y la consistencia de amplificación a una temperatura ambiente de 37uC en comparación con nuestro laboratorio controlado por temperatura. Para una mayor aplicabilidad para el uso en el POC, se pueden hacer varias modificaciones a los calentadores NINA. Los dispositivos prototipo evaluados en este estudio contenían sólo tres pozos de muestra; sin embargo, hasta 16 pozos de muestra se pueden añadir a la tapa de los botes aislados para un volumen de prueba mayor. En este estudio, se retiraron muestras de los calentadores NINA después de la reacción de amplificación y se calentaron durante dos minutos adicionales en un bloque de calor 80uC para terminar la reacción. Si bien el paso de calentamiento adicional no es necesario para observar los productos amplificados a partir del ácido nucleico extraído, la incubación corta y de alta temperatura facilita la observación visual de la etiqueta fluorescente en las muestras de sangre enteras. Se pueden realizar modificaciones al método de preparación de la muestra de sangre para eliminar la necesidad del paso de calentamiento. Alternativamente, se puede añadir un segundo compartimento moderador de temperatura al extremo alternativo de los botes NINA, de modo que las muestras puedan retirarse del compartimento de amplificación y reinsertarse en el compartimento 80uC. Por último, el registrador de datos DaqPRO se utilizó en este estudio únicamente con fines de validación y no sería necesario para el producto final POC. Se ha demostrado la viabilidad de utilizar el LAMP como método de diagnóstico en entornos limitados de recursos para la tuberculosis [33]. Para reducir el error de preparación y tiempo de uso, los autores describen el uso de tubos de reacción Para el uso de POC, se desea una manipulación limitada de muestras y preparación de reactivos y, por lo tanto, se espera que el procedimiento de prueba del producto final incluya la reconstitución de los reactivos de amplificación en el agua y la adición de la muestra directamente al tubo de reacción. Demostramos el uso de los calentadores NINA para amplificación directamente de muestras de sangre entera, eliminando la necesidad de un procedimiento de extracción de ácido nucleico que consume mucho tiempo y reduciendo el volumen de muestra necesario para la reacción de amplificación. Se añadió un volumen total de 10 ml de sangre entera a cada tubo de reacción, que se puede obtener fácilmente mediante un dedo-stick en entornos donde la venopuntura no es factible. Además, nuestro método de detección fluorescente permite la visualización inmediata de productos amplificados en ausencia de equipos especializados. Para evitar la contaminación cruzada de material amplificado, se prefiere que los tubos de reacción permanezcan cerrados después de la amplificación Las futuras modificaciones incluirán la optimización de las secuencias de primer/quencher etiquetados para que todos los componentes puedan ser añadidos a la mezcla de reacción antes de la amplificación. Debido a la disponibilidad, el sistema Bio-Rad ChemiDoc fue utilizado como fuente UV en este estudio; sin embargo, una luz de llavero barata sería más adecuada para la detección de ojos desnudos en el POC. Para la detección sensible y específica de diversos aislados del VIH-1, incluyendo subtipos no-B, la identificación del conjunto o conjuntos óptimos de imprimadores es un paso clave en el desarrollo del ensayo RT-LAMP. Aunque todos los experimentos realizados en este estudio involucran estándares y especímenes subtipo B, la investigación en curso implica el desarrollo continuo y la optimización de los primos RT-LAMP basados en regiones del genoma del VIH-1 que se conservan entre diversos subtipos. En resumen, el método de amplificación isotérmica RT-LAMP utilizado junto con un dispositivo de calentamiento químico simplificado exhibe características que son ideales para un NAAT rápido para las pruebas de POC. El ensayo simplificado y portátil tiene el potencial de llenar un vacío importante en el diagnóstico del VIH-1, proporcionando conocimiento inmediato o confirmación del estado de infección por VIH-1 en el POC.
question: ¿Qué porcentaje de personas infectadas por el VIH no son detectadas en los Estados Unidos?
answers.text: 20%