context: El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse de forma segura en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo de LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por arenavirus, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP y eGFP estreñidos en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, la cadena de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación relacionada con la semilla [33]. Además, las OTPs están diseñadas sobre la base del algoritmo SMARTselection (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión de proteínas mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de rLCMV que expresaba proteínas etiquetadas con estreptococos. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) células sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCSs y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Estreptocope-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que ha demostrado la https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores pro y antivirales de células huésped identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores provirales de células huésped, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.
question: ¿Durante cuánto tiempo las células fueron infectadas antes del análisis?
answers.text: 48 h