context: La dinámica evolutiva del león Panthera leo Revelado por Host and Viral Population Genomicshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2572142/SHA: f2af8027b6801850481d09ad0d4c5eb8e31c7d7fAutores: Antunes, Agostinho; Troyer, Jennifer L.; Roelke, Melody E.; Pecon-Slattery, Jill; Packer, Craig; Winterbach, Christiaan; Winterbach, Hanlie; Hemson, Graham; Frank, Laurence; Stander, Philip; Siefert, Ludwig; Driciru, Margaret; Funston, Paul J.; Alexander, Kathy A.; Prager, Katherine C.; Mills En este caso, se utilizó un gran conjunto de datos de 357 leones que comprendían 1,13 megabases de datos secuenciales y genotipos de 22 loci microsatélites para caracterizar su historia evolutiva reciente. Se compararon patrones de variación genética molecular en múltiples marcadores genéticos maternos (mtDNA), paternos (y-cromosoma) y biparentales nucleares (nDNA) con patrones de secuencia y variación subtipo del virus de inmunodeficiencia felina del león (FIV(Ple)), un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH). A pesar de la capacidad de los leones para dispersar largas distancias, los patrones de diversidad genética del león sugieren una importante subdivisión poblacional (mtDNA Φ(ST) = 0,92; nDNA F (ST) = 0,18), y un flujo genético reducido, lo que, junto con grandes diferencias en la prevalencia de seis subtipos distintos de la FIV (Ple) entre las poblaciones de leones, refutan la hipótesis de que los leones africanos consisten en una sola población panmíctica. Nuestros resultados sugieren que las poblaciones de leones existentes derivan de varias refugias del Pleistoceno en África Oriental y Meridional (hace 324.000–169.000 años), que se expandieron durante el Pleistoceno Tardío (hace 100.000 años) hacia África Central y Septentrional y Asia. Durante la transición del Pleistoceno/Holoceno (de 14.000–7.000 años), se produjo otra expansión En particular, la variación León y FIV (Ple) afirma que la gran población de leones bien estudiada que ocupa el gran ecosistema Serengeti se deriva de tres poblaciones distintas que se mezclaron recientemente. Texto: Los fósiles León trazan el Plioceno Tardío en África Oriental y el Pleistoceno Temprano en África Oriental y Meridional coinciden con el florecimiento de pastizales, hace 2-1,5 millones de años [1, 2]. Por Pleistoceno Medio (500.000 años atrás), los leones ocuparon Europa y por Pleistoceno Tardío (130,000-10000 años atrás) los leones tuvieron la mayor distribución intercontinental para un gran mamífero terrestre (excluido el hombre), que va desde África hasta Eurasia y las Américas [3]. Los leones fueron extirpados de Europa hace 2.000 años y dentro de los últimos 150 años desde Oriente Medio y África del Norte. Hoy en día, hay menos de 50.000 leones de libre alcance [4] que sólo ocurren en el África subsahariana y el Bosque Gir, India (Figura 1A).Comprender los aspectos más amplios de la historia evolutiva del león se ha visto obstaculizado por la falta de muestreo completo y marcadores genéticos adecuadamente informativos [5] [6] [7] [9], que en especies de félidos modernos requieren grandes conjuntos de datos multigénicos debido a su especiación generalmente rápida y muy reciente [10, 11]. Sin embargo, la ecología social única de los leones [12] [13] [14] y el hecho de que los leones hayan experimentado brotes de enfermedades infecciosas bien documentados, como el virus del distemper canino, el parvovirus felino, el calicivirus, el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV Ple ) [15] [16] [17] [18] proporcionan una buena oportunidad para estudiar la historia De hecho, la genética de la población de patógenos transmitidos puede reflejar con precisión la historia demográfica de sus huéspedes [19, 20]. A diferencia de otras 36 especies de gatos, los leones tienen un sistema social cooperativo (prides de 2-18 hembras adultas y 1-9 machos) y sus poblaciones pueden tener altas frecuencias de FIV Ple, un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH), que causa una enfermedad de inmunodeficiencia similar al SIDA en los gatos domésticos. FIV Ple es un retrovirus que se integra en el genoma del huésped y se transmite por contacto celular-celular, que en los felides se produce durante el apareamiento, la lucha y las interacciones madre-hierba. Así, la diseminación viral es una función en parte de la frecuencia de contacto entre leones infectados y naïve dentro y entre las poblaciones. El virus es genéticamente diverso en leones [15, 18] Para desentrañar la historia demográfica de la población de leones se utilizó un gran conjunto de datos multigénicos.Distintos conjuntos de marcadores pueden no necesariamenteEl león Panthera leo, un formidable carnívoro con un complejo sistema social cooperativo, ha fascinado a la humanidad desde tiempos prehistóricos, inspirando cientos de alusiones religiosas y culturales. Aquí, utilizamos una muestra completa de 357 individuos de la mayoría de las principales poblaciones de leones en África y Asia. Ensayamos adecuadamente información autosómica, cromosoma Y y marcadores genéticos mitocondriales, y evaluamos la prevalencia y variación genética del virus de la inmunodeficiencia felina específica del león (FIV Ple ), un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que causa la enfermedad de inmunodeficiencia similar al SIDA en gatos domésticos. Comparamos los grandes conjuntos de datos multigénicos de leones con patrones de variación genética Rechazamos la hipótesis de que los leones africanos consisten en una sola población panmíctica, destacando la importancia de preservar a las poblaciones en declive en lugar de priorizar esfuerzos de conservación a mayor escala. Curiosamente, la variación León y FIV Ple reveló evidencia de una insospechada diversidad genética incluso en la bien estudiada población de leones del ecosistema Serengeti, que consiste en animales recientemente mezclados derivados de tres diferentes grupos genéticos. Un código de tres letras que señala un círculo punteado en blanco representa la ubicación geográfica de las 11 poblaciones de leones determinadas por los análisis bayesianos [22] y los análisis de correspondencia factorial [23] de las características genéticas de 357 muestras de leones (véase el texto): GIR, Gir Forest, India; UGA, Uganda (Parque Nacional Queen Elizabeth); KEN, Kenya (Laikipia), SER, Serengeti National Park, Tanzania; NGC, Ngorongoro Crater, Tanzania; KRU, Kruger National Park, Sudáfrica; BOT-I, Botswana meridional y Kalahari, Sudáfrica; BOT-II, Botswana septentrional; y NAM, Namibia. Las plazas verdes representan muestras individuales cautivas para explorar la relación de leones de zonas más aisladas/en peligro de extinción/depleta: ATL, Morocco Atlas leones (n = 4 Las expansiones históricas deducidas (M1 y M2) están representadas por flechas rojas (ver texto). (B) Frecuencias de haplotipo observadas en las 11 poblaciones de león para genes nDNA (ADA y TF) y mtDNA (12S-16S), paralelas con las frecuencias de prevalencia sérica FIV Ple (negro-sero-positivo; gris-indeterminado; blanco-sero-negativo).Los tamaños de las muestras de población se indican entre paréntesis. (C) Redes de parsimonia estadística de haplotipos de león ADA, TF y 12S-16S. El tamaño del círculo es proporcional a la frecuencia de haplotipo y las barras transversales representan el número de mutaciones de pasos que conectan haplotipos. Los haplotipos de mtDNA H5 y H6 son grises sombreados ya que fueron detectados sólo en las muestras individuales de ANG, ATL y ZBW, que no se agrupan en grupos de población únicos (ver texto). doi:10.1371/journal.pgen.1000251.g001 producen inferencias similares de la historia de la población, ya que los tiempos carbonescentes varían en función de su patrón de herencia [21]. También hay una gran variación en los tiempos carbonescentes a través de loci que comparten un patrón común de herencia, especialmente en historias demográficas complejas (Tabla 1). Sin embargo, la interpretación precisa de las diferencias entre los loci puede proporcionar una historia de población más resuelta y coherente, proporcionando perspectivas más nutridas sobre procesos demográficos pasados, niveles de mezcla, cuestiones taxonómicas, y sobre los pasos más apropiados para la conservación El objetivo de este estudio fue evaluar la historia evolutiva del león mediante (1) caracterizar la estructura de la población del león en relación con los patrones de variación genética FIV Ple, (2) detectar firmas de migración utilizando genómica tanto de la población huésped como viral, y (3) reconstruir la historia demográfica del león y discutir sus implicaciones para la conservación del león. Evaluamos la variación genética de 357 leones de la mayor parte de su distribución actual, incluyendo secuencias mitocondriales (mtDNA; 12S-16S, 1.882 bp), nucleares (nDNA) cromosoma Y (SRY, 1.322 bp) y autosómicas (ADA, 427 bp; TF, 169 bp) y 22 marcadores microsatélites. Los análisis genéticos de 357 leones de toda la gama de especies existentes mostraron que la variación de la secuencia de nDNA (SRY) hereditaria paternal y materna hereditaria (mtDNA) fue generalmente baja (sólo un haplotipo de SRY paterno y 12 haplotipos de 12 mtDNA; p = 0,0066) (Figura 1 ; Figura S1 ; Tablas S1 y S2). Las secuencias de mtDNA haplotipo H11 más comunes fueron ubicuas en Uganda/Tanzanía y partes de Botswana/Sudáfrica, H1 fue común en el sur de África, y H7 y H8 fueron únicas en los leones asiáticos. Las secuencias de nDNA autosómica mostraron patrones de variación bastante distintos (Figura 1 ; Figura S1 ). De los cinco haplotipos de ADA, A2 fue la más común Los otros cuatro haplotipos, derivados y mucho menos comunes, incluían uno (A5) fijado en leones asiáticos. Los tres haplotipos de la TF estaban distribuidos de manera más amplia y uniforme. Los niveles de subdivisión de población entre leones se evaluaron utilizando datos de microsatélite y secuenciación. Se identificaron 11 grupos utilizando análisis bayesianos [22] y análisis de correspondencia factorial tridimensional [23] (Figura 2 ; Tabla S3 ). La mayoría de los grupos representaban poblaciones geográficamente circunscritas: Namibia (NAM), Parque Nacional Kruger (KRU), Cráter Ngorongoro (NGC), Kenya (KEN), Uganda (UGA) y Gir (GIR). Se encontraron dos grupos distintos en Botswana, BOT-I que incluían leones del sur de Botswana y Kalahari (Sudáfrica) (F k = 0,24) y BOT-II Sorprendentemente, se encontraron tres grupos distintos en una sola localidad geográfica (aproximadamente 60640 km cuadrados) en la gran población panmítica del Parque Nacional del Serengeti (SER-I/SER-II/SER-III) (F k = 0,18, 0,21 y 0,15, respectivamente). Dos leones cautivos de Angola (ANG), uno de Zimbabwe (ZBW) y cuatro leones del Zoo Atlas de Marruecos (ATL; actualmente extintos de la naturaleza) (Figura 1A) fueron incluidos en los análisis para explorar la relación de los leones de zonas más aisladas, amenazadas o agotadas. Los leones ANG y ZBW fueron asignados a BOT-II (q = 0,90 y 0,87; 90%CI: 0,47-1,00) y KRU (q = 0,85; 90%CI: 0,52-1,00) (análisis bayesianos [22] Sin embargo, estos leones difirieron de BOT-II y KRU por mutaciones de hasta 8 mtDNA, compartiendo haplotipos con los leones ATL (H5 en ANG y H6 en ZBW) (Figura 1B y 1C). Los leones ATL no se agruparon en un cúmulo único. Tanto el nDNA como el mtDNA distancias genéticas en pares entre las 11 poblaciones de leones mostraron una relación significativa con la distancia geográfica (R 2 = 0,75; prueba de Mantel, P = 0,0097; y R 2 = 0,15; prueba de Mantel, P = 0,0369; respectivamente) (Figura 3 ). La correlación positiva y monotónica significativa entre todas las comparaciones de par de plotes dispersos para los marcadores de nDNA (biparental) fue consistente con el aislamiento-distancia Sin embargo, la correlación entre el nDNA F ST y la distancia geográfica disminuyó considerablemente cuando se eliminó la población asiática GIR (R 2 = 0,19; prueba de Mantel, P = 0,0065) sugiriendo que se debe tener precaución en la interpretación del patrón de aislamiento por distancia en leones. Se comparó además las estimaciones linealizadas de F ST [24] trazadas tanto en relación con la distancia geográfica (modelo asumiendo que el hábitat debe estar alineado en una celosía unidimensional infinita) y la distancia geográfica logarítmica (modelo asumiendo una celosía bidimensional infinita). La amplia distribución de leones podría sugerir a priori que un modelo de aislamiento por distancia bidimensional proporcionaría el mejor ajuste para los datos del nDNA (R 2 = 0,25; prueba de Mantel, P = 0,0022), pero en cambio el modelo de aislamiento por distancia unidimensional se realizó mejor (R 2 El patrón observado para el ADNmt (maternal) fue más complejo, si bien hubo una relación significativa entre el ADNmt F ST y la distancia geográfica, hubo un patrón inconsistente a través de distancias geográficas más amplias (Figura 3 ). Esto se debe en parte a la fijación o fijación cercana del haplotipo H11 en seis poblaciones y a la fijación de un haplotipo H4 muy divergente en la población KEN (Figura 1B y 1C). La eliminación de la población KEN aumentó considerablemente la correlación entre el ADNmt F ST y la distancia geográfica (R 2 = 0,27; test de Mantel, P = 0,0035). Así, se rechaza la hipótesis nula de equilibrio regional para el ADNmt en toda la región muestreada, a pesar de la posibilidad de que el aislamiento por distancia pueda ocurrir regionalmente. Estos resultados contrastantes de ADNn y ADNn mt pueden ser indicativos de diferencias en los patrones de dispersión entre machos y hembras, lo que sería consistente con evidencia de que las hembras son más filopátricas que los machos. Alternativamente, se ha sugerido un proceso similar en ballenas (p = 0,0007) [25] y elefantes de sabana africana (p = 0,0200) [26], donde ambas especies tienen filopatía femenina y como leones, una estructura social matriarcal. Sin embargo, la deriva genética tiende a la selección sobrecogedora en poblaciones pequeñas aisladas, afectando predominantemente a elementos haploides debido a su menor tamaño poblacional efectivo (Tabla 1). Por lo tanto, sugerimos que los resultados contrastantes obtenidos para el nDNA y el mtDNA son más probables evidencia adicional de que las poblaciones de león sufrieron estrangulamientos severos. Las matrilinas de león altamente estructuradas comprenden cuatro grupos haplo-mtDNA monofiléticos (Figura 4A; Figura S3 ). El linaje I consistió en un haplotipo H4 divergente de KEN, linaje II se observó en la mayoría de las poblaciones de África meridional, linaje III fue ampliamente distribuido desde África central y septentrional a Asia, y linaje IV ocurrió en África meridional y oriental. Los estudios de seroprevalencia indican que la FIV Ple es endémica en ocho de las 11 poblaciones, pero ausente de los leones GIR asiáticos en la India y en Namibia y en las regiones meridionales de Botswana/Kalahari (NAM/ BOT-I) en África sudoccidental (Fi El análisis filogenético de la región de pol-RT conservada en 117 leones infectados por FIV representa linajes monofiléticos [15, 18] que afirman seis subtipos distintos (A-F) que se distribuyen geográficamente en tres patrones distintos (Figura 4B; Figura S4 ). En primer lugar, los subtipos múltiples pueden circular dentro de la misma población como ejemplificados por los subtipos A, B y C todos ubicuos dentro de las tres poblaciones de león del Serengeti (SER-I, SER-II y SER-III) y los subtipos A y E dentro de los leones de Botswana (BOT-II) (Figuras 4B y 4C y Figura S4 ). En segundo lugar, los subtipos únicos FIV Ple pueden restringirse a un lugar como subtipo F en Kenya, subtipo E en Botswana (BOT-II), subtipo C en Serengeti y subtipo D en Krugar Park (figuras 4B y 4C y figura S4). En tercer lugar, las cepas intrasubtipo se agrupan geográficamente, como lo muestran distintos clados dentro del subtipo A que se restringieron a leones dentro de Krugar Park, Botswana y Serengeti y dentro del subtipo B que correspondían a Uganda, Serengeti y Ngorongoro Crater (figuras 4B y 4C y figura S4). No inesperadamente, las distancias genéticas FIV Ple, representadas como población F ST entre las ocho poblaciones infectadas por FIV de león, no se correlacionaron significativamente con la distancia geográfica (R 2 = 0,08; test de Mantel, P = 0,165) (Figura 3 ), y afirma que los patrones de diseminación viral no se ajustan a un modelo estricto de aislamiento por distancia. Más bien, los dos cúmulos distintos observados (Figura 3 ) reflejan la distribución compleja de FIV Ple entre los leones africanos. De hecho, a pesar de la baja distancia geográfica entre las poblaciones de leones de África Oriental, la divergencia genética FIV Ple mostró un rango más amplio en F ST (0,03 a 0,79 para la mayor parte del primer racimo; Figura 3 ). Por el contrario, aproximadamente la mitad del rango en F ST (0,26 a 0,69 para el segundo grupo; Figura 3 ) se En contraste con los patrones observados en los leones, las estimaciones linealizadas de F ST [24] para FIV Ple se correlacionaron mejor con la distancia geográfica logarítmica (modelo de celosía bidimensional) (R 2 = 0.15) que con la distancia geográfica (modelo unidimensional) (R 2 = 0.02), aunque en ambos casos la prueba del Mantel no fue significativa (P.0.2474) (Figura S2). La datación de la carbonescencia de mtDNA sugirió que el linaje de África Oriental I (haplotipo KEN H4) tenía un origen antiguo de 324.000 años (IC 95%: 145.000-502.000). Además, la diversidad del subtipo FIV Ple fue mayor en los clados de África Oriental (exhibiendo cuatro de las seis cepas virales conocidas), incluyendo el subtipo C más divergente de FIV Ple (Figuras 4B y 4C). Estos datos genéticos de leones y FIV Ple concuerdan con el origen más antiguo de los leones existentes de África Oriental, que es apoyado además por los fósiles de león más antiguos descubiertos en África Oriental [1]. El linaje II, encontrado en NAM, BOT-II y KRU tiene una coalescencia estimada de 169.000 años (IC 95%: 34.000-304.000) y el linaje IV más extendido encontrado en las poblaciones meridionales de BOT-I, BOT-II y KRU, así como las poblaciones orientales de SER (I, II y III), NGC y UGA, coalesces hace 101.000 años (IC 95%: 11.000-191.000). Sin embargo, los niveles similares de diversidad genética nDNA, la ocurrencia de un linaje exclusivamente sureño de mtDNA II y subtipos FIV Ple altamente divergentes, subtipo FIV Ple encontrado sólo en KRU y subtipo E exclusivo de BOT-II, sugieren que tanto África Oriental como África Meridional fueron importantes para los leones durante el Pleistoceno. Por lo tanto, la co-ocurrencia de haplotipos de ADNmt divergentes (6 a 10 mutaciones; Figuras 1B y 1C) en poblaciones del sur puede ser la consecuencia de un mayor aislamiento dentro de la refugia durante períodos climáticos más fríos. La fragmentación contemporánea de las poblaciones de leones podría explicar aún más los resultados del análisis filogeográfico de las capas anidadas (NCPA [27] ) (Figura S5 ), que indujo un flujo genético restringido con aislamiento por distancia entre los haplotipos H9 (BOT-II) y H10 (KRU) (x 2 = 10.00, P = 0.0200), entre los haplotipos H1 (BOT-II/NAM) y H2 (KRU) (x 2 = 71,00, P#0,0001), y entre los haplotipos H9-H10 (BOT-II/KRU) y los haplotipos H11-H12 (BOT-I/KRU/NGC/UGA) (x 2 = 187,83, P#0,0001). Esto lo sugieren el característico haplotipo H4 del ADNmt y el único subtipo FIV Ple que se encuentra en la población de Kenia, que puede haber resultado de la reducción del flujo genético a través del valle del Rift, un escenario que se ha sugerido para varias poblaciones bóvidas y carnívoras (véase [28] y referencias en él). El mejor ejemplo de concordancia entre los marcadores del genoma del huésped y los patrones de transmisión viral se observa en el Parque Nacional del Serengeti en Tanzania. Nuestros hallazgos anteriores describieron niveles notablemente altos de subtipos A, B y C del FIV Ple que circulan dentro de la población de león del Serengeti hasta tal punto que el 43% de los leones muestreados fueron infectados por dos o tres subtipos [15, 18] y fueron hipotetizados para representar una mezcla reciente de tres poblaciones anteriormente separadas. Además, aunque los leones dentro del Serengeti pueden ser asignados a una de las tres poblaciones (SER-I, SER-II o SER-III) por marcadores genómicos del huésped, los subtipos FIV Ple se distribuyen ubicuamente en los tres, característicos de la rápida transmisión retroviral horizontal posterior a la mezcla de población huésped. El posible mecanismo de aislamiento queda por dilucidar, ya que no hay barrera aparente al flujo genético en este ecosistema. Basado en patrones de diversidad genética y análisis filogenético de marcadores de león nDNA/mtDNA y FIV Ple, proponemos un escenario de un período de refugia/aislamiento en el Pleistoceno Tardío seguido de dos grandes expansiones del león en África y Asia. La primera expansión, apoyada por el mtDNA NCPA [27] (x 2 = 690,00, P#0,0001; Figura S5 ), fue una colonización a larga distancia del linaje mtDNA-III (GIR/ATL/ANG/ZBW) hace unos 118.000 años (IC 95%: 28.000-208.000), con la posterior fragmentación de los haplotipos H5-H6 en África Central y Norte y los haplotipos H7-H8 en Asia Occidental (M1-Figura 1A). El apoyo para esta expansión inicial también se encuentra en el nDNA. El haplotipo ADA A5 fijado en el GIR también presente en KEN, SER-II y SER-III, sugiriendo que los leones probablemente colonizaron Asia Occidental desde la refugia de África Oriental (Figura 1B). Tal expansión podría haber sido favorecida por el inicio de un período más cálido y menos árido en África hace 130.000-70.000 años [29]. Este "evento fuera de África" habría ocurrido mucho más tarde que la expansión inicial del león a través de Eurasia basada en fósiles (,500.000 años atrás) [3]. Es probable que se produjeran múltiples expansiones del león en el Pleistoceno, como ocurrió con los humanos [21]. Una segunda expansión más reciente del león probablemente ocurrió en la transición del Pleistoceno/Holoceno, ésta desde el sur de África hacia África oriental (M2-Figura 1A, Figura 3 ). Esto se refleja en el linaje del ADNmt IV, donde los haplotipos presentes en los leones del sur son basales (más antiguos) a los encontrados en el este. En general, la diversidad de los nucleótidos de la población de mtDNA disminuye de África meridional a África oriental (Figuras 1B y 1C), un hallazgo apoyado por el análisis de desajuste entre pares [30] (ragitud, r = 0,086; P,0.001). La fijación del haplotipo de mtDNA H11 en las poblaciones de BOT-I (de otro modo fijado sólo en las poblaciones de África oriental) sugiere que los leones colonizadores se expandieron hacia el norte desde el desierto de Kalahari, que incluyó hábitats de arbustos, bosques y sabanas durante las fluctuaciones climáticas del Pleistoceno [31]. Esta expansión también se apoya en el subtipo A de la FIV Ple, donde los haplotipos presentes en los leones del sur (KRU y BOT-I) son basales a los encontrados en el este (SER-I, SER-II y SER-III) y se observa una disminución de la diversidad nucleótida de este subtipo de la FIV Ple desde el sur (p = 0.15) hasta el este de África (p = 0.03) (Figura 3B ). Curiosamente, se ha sugerido un proceso de colonización similar hacia el norte desde el sur de África para algunas de las presas del león, a saber, el impala, el mayor kudu y el ñúñeco [32, 33]. Si hubiéramos limitado nuestras inferencias al ADNmt, podríamos haber llegado a la conclusión de que las poblaciones de leones de África oriental, que están fijas o casi fijadas para el haplotipo H11, se extinguieron durante la transición del Pleistoceno/Holoceno (similar a las bien conocidas extinciones de megafauna del Pleistoceno tardío [34] ) y luego fueron colonizadas por poblaciones del Sur. Sin embargo, nuestros datos de genómica poblacional se ajustan mejor a un escenario de expansión de la población del león y de entrecruzamiento en lugar de un simple reemplazo. En segundo lugar, los leones SER llevan dos diversos subtipos FIV Ple encontrados solamente en África Oriental (B-C), y no sólo el subtipo A de FIV Ple, que presumiblemente fue introducido en África Oriental coincidiendo con el evento de expansión de mtDNA hacia el norte desde el sur. En tercer lugar, el subtipo B de FIV Ple de África Oriental encontrado en UGA/SER-I/SER-II/SER-III/NGC mostró evidencia de una expansión poblacional (ragitud, r = 0,004; P,0.01; F s = 220.37; P,0,00001) y la mayor diversidad de nucleótidos observada dentro de los subtipos FIV Ple (p = 0.09). Cuatro, la diversidad de subtipo FIV Ple es mayor en los clados de África Oriental (cuatro de las seis cepas virales). La utilidad de la FIV Ple pol-RT como marcador de la estructura de la población del león y la historia natural es que puede ser informativa en una escala de tiempo contemporánea, aunque puede ser menos útil para capturar eventos demográficos más antiguos. La extrema divergencia entre los subtipos FIV Ple, considerados con alta prevalencia en ocho de las 11 poblaciones del león, y combinados con patrones de concordancia geográfica, apoyan la hipótesis de que la FIV Ple no es una aparición reciente dentro de los leones modernos [35]. Poblaciones que albergan un subtipo privado FIV Ple como KEN (subtipo F), BOT-II (subtipo E) y KRU (subtipo D) deben haber estado suficientemente aisladas por tiempo suficiente para que el virus evolucione a subtipos únicos, un resultado corroborado por la alta estructura genética nDNA y mtDNA presente en estas poblaciones del león (Figura 4 ). Así, es posible que la aparición inicial de la FIV Ple sea anterior a las expansiones del Pleistoceno tardío de las poblaciones de león contemporáneo [36], pero las distribuciones actuales son indicadores más útiles de la dinámica de la población huésped muy reciente, resultado también observado con la FIV Pco en una población panmíctica de pumas en el oeste de América del Norte [19]. La interpretación precisa de los escenarios demográficos pasados y contemporáneos es un objetivo principal para la conservación efectiva de las especies en peligro de extinción.En este estudio, encontramos importantes subdivisiones poblacionales, flujo genético reducido y grandes diferencias en la secuencia y seroprevalencia de la FIV Ple entre las poblaciones de león, así como evidencia de contacto secundario histórico entre las poblaciones (Figura 3C ; Tabla S4 a S9). El nivel muy bajo de población de la diversidad de nucleótidos del ADNmt, el número de haplotipos privados a una sola población (Figura 1) y probablemente también la falta de variación genética del SRY en todos los leones machos (haplotipo S1, n = 183) sugieren que el número de leones disminuyó considerablemente después del Pleistoceno tardío. La reducción del siglo pasado en la distribución del león erosionó aún más su diversidad genómica, y la variación microsatélite sugirió estrangulamientos recientes de población en siete de las 11 poblaciones (prueba de diferencias estandarizadas, P,0,05; Tabla S5 ) [37]. Aunque no tratamos explícitamente de abordar la adecuación de las designaciones de subespecies de león (actualmente sólo una subespecie africana es ampliamente reconocida) [38, 39], proporcionamos pruebas contundentes de que no hay evidencia de un intercambio genético sustancial de matrilinas entre las poblaciones existentes, ya que el componente AMOVA [40] dentro de la población era uniformemente alto en todos los escenarios de subdivisión distintos (W ST <0,920; P,0,0001; tres grupos de seis; Tabla S6 ). Del mismo modo, se detectó una estructura poblacional significativa a partir del nDNA (F ST = 0,18), con bajos niveles de mezcla evidentes a partir del análisis bayesiano [22] (a = 0,033). Por lo tanto, utilizando una perspectiva ascendente que prioriza a las poblaciones, en lugar de unidades de gran escala (por ejemplo, todos los leones africanos), podría preservar y mantener la Se obtuvo un total de 357 individuos en la mayor parte de la gama de leones en África y Asia (Figura 1A ; Tabla S1 ). La variación genética entre los especímenes de leones se evaluó utilizando genes maternos (12S y 16S), paternos (gen SRY) y autosómicos biparentales (22 loci microsatelita, y los genes ADA y TF) marcadores (Números de adhesión de GenBank: FJ151632-FJ151652). Los análisis de mtDNA en especies Panthera se complican por la presencia de una integración de 12.5 kb mtDNA en cromosoma F2 [42]. En consecuencia, los imprimadores específicos de mtDNA fueron diseñados para los genes 12S y 16S (Tabla S2 ) y utilizamos amplificación de PCR de largo alcance. Se diseñaron imprimaciones para amplificar segmentos del ADA (exon 10 e intron 10) y los genes del TF (intrón 3) (tabla S2), dos de los loci de proteína más variables en poblaciones de león [5], localizados en el gato doméstico Felis catus cromosoma A3p y C2q, respectivamente. El gen del cromosoma Y SRY-39UTR también fue amplificado [43]. Los productos PCR fueron amplificados a partir de 50 ng de ADN genómico en un sistema de reacción de 25 mL que contenía 1,5 mM MgCl 2, 1,0 mM dNTPs, 0,25 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Aplicado Biosistemas), y 16 PCR buffer II; el protocolo de amplificación fue: desnaturalización 10 min a 95uC, un ciclo de touch-down de 95uC para 30 s, 52uC para 60 s disminuyó 1uC en el siguiente ciclo durante 10 ciclos, 72uC para 120 s, luego 35 ciclos de amplificación de 95uC para 30 s, 52uC para 60 s, y 72uC para 120 s, seguido de una extensión de 10 min a 72uC. Los productos PCR fueron secuenciados en un ABI 377. Las secuencias fueron alineadas Veintidós loci de microsatélites polimórficos (20 repeticiones de dinucleótidos: FCA006, FCA008, FCA014, FCA069, FCA077, FCA085, FCA091, FCA098, FCA105, FCA126, FCA129, FCA139, FCA205, FCA208, FCA211, FCA224, FCA229, FCA230, FCA247 y FCA281; y dos repeticiones de tetranucleótidos: FCA391 y FCA441) fueron amplificadas [44]. Los microsatélites fueron puntuados en un ABI 377 y analizados utilizando GENESCAN 2.1 y GENOTYPER 2.5. Estos loci se encuentran en 11 de los cromosomas de 19 F. catus, que se producen en diferentes grupos de El sobrenadante de células infectadas por virus fue centrifugado a 200 g durante 10 min a 5uC. El sobrenadante resultante fue centrifugado a 150.000 g a 4uC durante 2 horas. Las proteínas virales peladas fueron resucitadas en 1/20 o del volumen original y el contenido total de proteínas fue evaluado utilizando el Ensayo de Proteínas de Biorad. Veinte mg de proteína viral se ejecutaron en geles Tris-Glycine 4-20% y se transfirieron a membranas PDVF (BioRad). Las tiras de membrana fueron expuestas 2-12 h a una dilución de suero o plasma de 1:25 ó 1:200. Después del lavado, las muestras fueron etiquetadas con HRP anti-cat de cabra o anticuerpo conjugado de fosfato (laboratorios KPL) en una dilución 1:2000, lavadas e incubadas en reactivos de detección de ECL Western Blotting (Amersham Biosciences) durante 2 minutos, luego expuestas a la película de detección quimioluminiscente Lumi-Film (Boehringer Mannheim) o incubadas en sustrato de fosfatasa BCIP/NBP (laboratorios KPL) durante 15 minutos [46] [47] [48]. Los resultados fueron visualizados y anotados manualmente en base a la presencia e intensidad de anticuerpos que se unen a la proteína capsid de gag p24. Se realizó amplificación PCR Nested de FIV Ple parcial pol-RT [18, 46]. Brevemente, las reacciones PCR de primera vuelta utilizaron 100 ng de ADN genómico, 2,5 mMgCl 2 y una temperatura de recocido de 52uC. Las reacciones PCR de segunda vuelta utilizaron condiciones idénticas con 1-5 ml de producto de primera vuelta como plantilla. Todos los productos PCR fueron secuenciados como se describe anteriormente para los análisis genéticos del león (números de adhesión GenBank: AY549217-AY552683; AY878208-AY878235; FJ225347-FJ225382). Utilizamos el GENETIX 4.02 [49], GENEPOP 3.3 [50], MICROSAT [51], y DNASP 4.10 [52] para calcular las siguientes estadísticas descriptivas: i) porcentaje de loci polimórfico (P 95 ), número de alelos por locus (A), heterocigosidad observada y esperada (H E y H O ), y número de alelos únicos (A U ); ii) evaluación de desviaciones de HWE; iii) estimación del coeficiente de diferenciación (F ST ), y iv) diversidad de nucleótidos (p) y haplotipo (h). Probamos la hipótesis de que todos los loci están evolucionando bajo neutralidad tanto para el león como para los datos FIV Ple. Para los datos de frecuencia, se utilizó el método descrito por Beaumont y Nichols [53] e implementado en FDIST (http://www.rubic.rdg.ac.uk/mab/software.html). Los valores de F ST estimados a partir de loci microsatélites trazados contra la heterocigosidad mostraron que todos los valores caen dentro del límite de confianza esperado del 95% y, por consiguiente, no se identificó ningún locus atípico.Para los datos de secuencia (lion nDNA/ mtDNA y FIV Ple pol-RT), descartamos cualquier evidencia significativa para el autostop genético y la selección de antecedentes mediante la evaluación de las pruebas D* y F* de Fu y Li [54] y las estadísticas F S de Fu [55]. Se utilizó un método de agrupamiento bayesiano implementado en el programa ESTRUCTURA [22] para inferir el número de poblaciones y asignar leones individuales a poblaciones basadas en el genotipo multilocus (microsatélites) y datos secuenciales ( genes ADA, TF y mtDNA) y sin incorporar el origen de la muestra. Para los datos haploid mtDNA, cada haplotipo observado fue codificado con un número entero único (por ejemplo, 100, 110) para el primer alelo y los datos faltantes para el segundo (ESTRUCTURA [22] análisis con o sin los datos mtDNA fueron esencialmente idénticos). Para los grupos de población K, el programa estima la probabilidad de los datos, Pr(XK), y la probabilidad de membresía individual en cada grupo utilizando un método Markov chain Monte Carlo bajo el supuesto de equilibrio Hardy- Las pruebas iniciales de la HWE en cada una de las poblaciones definidas por el origen geográfico del muestreo no revelaron ninguna desviación significativa de las expectativas de HW con la excepción de la población SER y BOT (más tarde subdividida por ESTRUCTURA [22] en 3 y 2 grupos, respectivamente; tales desviaciones de las expectativas de HW fueron interpretadas como evidencia de una mayor estructuración poblacional). Realizamos seis carreras independientes con K = 1-20 para guiar una estimación empírica del número de poblaciones identificables, asumiendo un modelo de mezcla con frecuencias de alelos correlacionadas y con valores de quemadura y replicación establecidos en 30.000 y 10 6, respectivamente. ESTRUCTURA también estima frecuencias de alelos de una población ancestral hipotética y un valor alfa que mide individuos mezclados en el conjunto de datos. La asignación de individuos mezclados a poblaciones utilizando ESTRUCTURA [22] ha sido considerada en análisis posteriores Para cada grupo de población k, el programa estima F k, una cantidad análoga a la F ST de Wright, pero que describe el grado de diferenciación genética de la población k de la población ancestral. Patrones de flujo genético y divergencia entre las poblaciones fueron descritos utilizando una variedad de pruebas. Primero, para visualizar relaciones sutiles entre los genotipos autosómicos individuales, análisis de correspondencia factorial tridimensional [23] (FCA) se realizaron en GENETIX [49], que proyecta gráficamente a los individuos en el espacio factorial definido por la similitud de sus estados alélicos. Segundo, análisis de unión vecina (NJ) implementando la distancia genética de acordes de Cavalli-Sforza & Edwards [56] (D CE ) fueron estimados en PHYLIP 3.6 [57], y el soporte de topología de árboles fue evaluado por 100 bootstraps. En tercer lugar, se comparó la diferencia en la media de H O y A entre los grupos de población mediante una prueba bilateral en FSTAT 2.9.3.2 [58], que permite evaluar la significación de la estadística OS x utilizando 1.000 aleatorizaciones. En cuarto lugar, se probó el equilibrio entre deriva y flujo genético utilizando una regresión de la F ST binaria en la matriz de distancia geográfica entre todas las poblaciones para datos nDNA(microsatélites)/mtDNA y FIV Ple. Se utilizó una prueba de Mantel [59] para estimar la probabilidad superior del 95% para cada correlación de matriz. Suponiendo que un modelo gradual de migración donde el flujo genético es más probable entre las poblaciones adyacentes, se puede rechazar la hipótesis nula de que las poblaciones de una región están en equilibrio si (1) hay una asociación no significativa entre distancias genéticas y geográficas, y/o (2) un diagrama de dispersión de las distancias También evaluamos el F ST linealizado [es decir, F ST /(12F ST )] [24] entre las poblaciones. Probamos dos modelos competidores de aislamiento por distancia, uno asumiendo que el hábitat debe ser arraigado en una celosía unidimensional infinita y otro asumiendo una celosía bidimensional infinita. Ambos modelos mostraron que la diferenciación genética aumentó con distancias euclidianas crudas y logtransformadas, respectivamente [24]. Determinamos el valor del intervalo de confianza de la pendiente de la regresión para los datos nDNA utilizando un boottrap ABC no paramétrico [61] en GENEPOP 4.0 [62]. La historia demográfica de las poblaciones se comparó utilizando una variedad de estimadores basados en la teoría de la carbonescencia. Primero, se investigaron firmas de la antigua expansión demográfica de la población para mtDNA y FIV Ple pol-RT haplotipos utilizando La bondad de ajuste de los datos observados a un modelo simulado de expansión se probó con el índice de ragidez (r) [64]. En segundo lugar, se evaluó la aparición de cuellos de botella recientes para datos microsatélites utilizando el método de Cornuet & Luikart [37] en BOTTELENECK [65] y utilizando 10.000 iteración. Este enfoque, que aprovecha el hecho de que los alelos raros generalmente se pierden primero por deriva genética después de la reducción del tamaño de la población, emplea la prueba de diferencias de estandarización, que es la más apropiada y potente cuando se utilizan 20 o más loci polimórficos [37]. Se realizaron pruebas utilizando el modelo de mutación gradual (SMM), que es un modelo de mutación conservador para la detección de firmas de cuello de botella con microsatélites [66]. En tercer lugar, para discriminar entre el flujo génico recurrente y los eventos históricos se utilizó el análisis filogeográfico de clase anidada [27, 67] (NCPA) para los datos del ADNmt. Cuando se rechaza la nullhypothesis de ninguna correlación entre genealogía y geografía, se extraen inferencias biológicas utilizando criterios a priori. La NCPA comenzó con la estimación de una red de parsimonía estadística del 95% [68] mtDNA en TCS 1,20 [69]. Las ambigüedades de los árboles se resolvieron aún más utilizando un criterio de coalescencia [70]. La red se convirtió en una serie de ramas anidadas (clades) [71, 72], que luego se probaron en su ubicación geográfica mediante un análisis de contingencia permutacional en GEODIS 2.2 [73]. Las inferencias obtenidas también fueron corroboradas con la Para abordar posibles debilidades en algunos aspectos del análisis de la NCPA [75, 76], se validó además las inferencias de la NCPA con métodos independientes para detectar el flujo genético restringido/aislamiento por distancia (utilizando la correlación matricial del ST del par y la distancia geográfica) y la expansión de la población (utilizando las distribuciones de desajustes entre pares). Cuatro, para probar la significación de la varianza genética total del ADNmt, se realizaron análisis jerárquicos de la varianza molecular [40] (AMOVA) utilizando ARLEQUIN 2.0 [77]. La variación genética total se dividió para comparar la cantidad de diferencias entre los grupos de población, entre las poblaciones dentro de cada grupo y dentro de las poblaciones. Las relaciones filogenéticas entre las secuencias de mtDNA y FIV Ple pol-RT se evaluaron utilizando enfoques de evolución mínima (ME), par El análisis ME para mtDNA consistió en árboles NJ construidos a partir de distancias de dos parámetros de Kimura seguidas de un procedimiento de intercambio de ramas y para los datos FIV Ple utilizaron las mismas estimaciones de parámetros que se utilizaron en el análisis ML. El análisis MP se llevó a cabo mediante una búsqueda heurística, con agregados aleatorios de intercambio de ramas de taxones y bisección de árboles. El análisis ML se realizó después de seleccionar el mejor modelo evolutivo que se ajustaba a los datos utilizando MODELTEST 3.7 [79]. La fiabilidad de las topologías de árboles fue evaluada por 100 bootstraps. Para los datos FIV Ple, la confiabilidad de la topología de árboles fue evaluada posteriormente mediante análisis adicionales utilizando 520 bp de secuencias FIV Ple pol-RT en un subconjunto representativo de individuos. El tiempo hasta el ancestro común más reciente (TMRCA [80], donde calculamos la relación de las diferencias medias de nucleótidos dentro de la muestra de león a la mitad de la diferencia media de nucleótidos entre leopardos (P. pardus) y leones y multiplicamos la relación por una estimación del tiempo de divergencia entre leones y leopardos (2 millones de años basado en fósiles de león indiscutibles en África) [81, 82]. El mtDNA TMRCA fue estimado con un método de árbol linealizado en LINTREE [83] y utilizando la ecuación H = 2mT, donde H era la altura de la rama (correlacionada con la distancia media paritaria entre los haplotipos), m la tasa de sustitución, y T el tiempo de divergencia. Se utilizaron secuencias de leopardo y leopardo de nieve (P. uncia) como outgroups. Inferencia [6] donde la estimación de la varianza de microsatélites en el tamaño medio de repetición de alelos se utilizó como sustituto para el tiempo evolutivo basado en la tasa de reconstitución del rango de alelos posterior a un efecto fundador severo. Se ha demostrado que la varianza de alelos microsatélites es un estimador fiable para la evolución de los microsatélites y la inferencia demográfica en las especies félidas [6]. [24] para el león (nDNA y mtDNA) y los datos genéticos FIV Ple (pol-RT) trazados tanto en relación con la distancia geográfica (modelo asumiendo que el hábitat se arquea en una celosía unidimensional infinita; aislamiento de una dimensión por distancia [IBD]) y la distancia geográfica logarít (mo asumiendo una celosía bidimensional infinita; aislamiento de dos dimensiones por distancia) en la distancia geográfica. Se encuentra en: doi:10.1371/journal.pgen.1000251.s002 (0,13 MB PDF) Figura S3 Relaciones filogenéticas de los haplotipos de león 12S-16S mtDNA. Árbol de unión de vecinos de las secuencias 12S-16S mtDNA de 1.882 bp. Los valores de arranque se colocan en cada punto de rama para los análisis de evolución/ parsimonia máxima/máxima probabilidad, respectivamente (ME/MP/ML). Outgroups: Ppaleopard, Panthera pardus; Pun -snow-leopard, Panthera uncia. El símbolo (N) representa nodos con soporte de bootstrap,50 o una politomía inferida en el árbol de consenso de mayoría de reglas de bootstrap 50%.
question: ¿Cuál era el propósito de este estudio?
answers.text: evaluar la historia evolutiva del león