context: La coinfección viral y bacteriana en neumonía grave desencadena respuestas inmunes innatas y mejora específicamente IP-10: un estudio traslacionalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5138590/SHA: ef3d6cabc804e5eb587b34249b539c1b5efa4cc4Autores: Hoffmann, Jonathan; Machado, Daniela; Terrier, Olivier; Pouzol, Stephane; Messaoudi, Mélina; Basualdo, Wilma; Espínola, Emilio E; Guillen, Rosa M.; Rosa-Calatrava, Manuel; Picot, Valentina; Bénet, Thomas; Endtz, Hubert; Russomando, Graciela; Paranhos-Baccalà En este estudio se investigaron microARN, mRNA y perfil de secreción de citoquinas/quimoquinas para los macrófagos humanos infectados in vitro por el virus de la influenza A/H1N1 y/o Streptococcus pneumoniae. Se observó que la coinfección in vitro sinérgicamente aumentó la expresión inducida por interferón-γ-10 (CXCL10, IP-10) en comparación con las condiciones de las células infectadas por separado. Se demostró que el miRNA-200a-3p endógeno, cuya expresión fue inducida sinérgicamente después de la coinfección, regula indirectamente la expresión CXCL10 mediante el supresor de la señal de citocina-6 (SOCS-6), un conocido regulador de la vía de señalización JAK-STAT. Además, en un estudio clínico piloto posterior, se evaluaron los niveles de inmunomoduladores en muestras de 74 niños (≤5 años) hospitalizados con neumonía viral y/o bacteriana adquirida en la comunidad. Clínicamente, entre los 74 casos de neumonía, los pacientes con detección mixta identificada tuvieron niveles séricos IP-10 significativamente más altos (3,6 veces) que aquellos con una única detección (P = 0,03), y se asociaron significativamente con neumonía grave (P < 0,01). Este estudio demuestra que la coinfección viral y bacteriana modula la vía de señalización JAK-STAT y conduce a una expresión exacerbada IP-10, que podría desempeñar un papel importante en la patogénesis de la neumonía. Texto: Scientific RepoRts  6:38532  DOI: 10.1038/srep38532 patogénesis de varias enfermedades y se ha sugerido como un potencial biomarcador de infección viral 10, 11, infección bacteriana de inicio tardío en lactantes prematuros 12, y un prometedor biomarcador de sepsis y shock séptico 13, 14. El análisis combinado de IP-10 e IFN-γ también se ha notificado como un biomarcador útil para el diagnóstico y el seguimiento de la eficacia terapéutica en pacientes con tuberculosis activa [15] [16] [17], y ambos permanecen detectables en la orina de pacientes con enfermedades pulmonares en ausencia de disfunción renal 18. Con las células epiteliales de las vías respiratorias 19, los macrófagos alveolares residentes (AMs) y los macrófagos derivados de los monocitos de la sangre (reclutados en los tejidos bajo condiciones inflamatorias 20, 21 ) representan una línea principal de defensa contra ambos neumocócicos (a través de su alta capacidad fagocítica [22] [23] ) y la infección por gripe 25, 26. Hasta ahora, ningún estudio se ha centrado en los mecanismos intracelulares que regulan IP-10 en leucocitos sanguíneos humanos durante la infección mixta por VAI y SP. Varios estudios indicaron que los pequeños ARN no codificantes (incluidos los microARNs) pueden funcionar como inmunomoduladores regulando varios procesos intracelulares pivotales, como la respuesta inmune innata 27 y la actividad antiviral 28, 29 ; ambos procesos están estrechamente En este estudio se investigaron en primer lugar los mecanismos intracelulares in vitro que median la respuesta inmune innata en los macrófagos humanos infectados por monocitos IAV y/o SP (MDMs). Utilizando este enfoque, se observó que la infección mixta de MDMs induce una producción sinérgica de IP-10 que puede estar relacionada con una vía reguladora miRNA-200a/JAK-STAT/SOCS-6. Posteriormente, en un análisis retrospectivo de muestras clínicas recogidas de niños ≤ 5 años hospitalizados con neumonía, se confirmó que el nivel sérico IP-10 podría estar relacionado tanto con etiologías virales y/o bacterianas como con severidad de la enfermedad. En primer lugar, la replicación activa del VAI fue evaluada por qRT-PCR y cuantificación de nuevas partículas virales infecciosas en los sobrenadantes celulares (fig. 1a,b ). El título del VAI aumentó con el tiempo después de una única infección con VAI y se correlacionó con el aumento de la producción de ARN IAV de cadena negativa. La replicación viral máxima se observó a las 18-24 horas después de la infección, después de lo cual disminuyó tanto la replicación de ARN como la cantidad de partículas infecciosas. En este modelo in vitro, el posterior desafío de los MDM infectados con VAI con SP no tuvo un impacto significativo en la producción de nuevas partículas virales infecciosas (fig. 1b). Juntos, estos resultados indican una infección permisiva y productiva de MDM por el VAI. En segundo lugar, evaluamos si los MDM son permisivos tanto para la infección La presencia de neumococos dentro de los MDMs primarios infectados por el VAI y el SP se confirmó a las 8 h postinfección (fig. 1c), sugiriendo que los MDM son permisivos para la coinfección viral y bacteriana en los primeros pasos de infección. Es importante destacar que la codetección confocal de los VAI y SP mixtos sólo fue efectiva después de 8 h postinfección debido al impacto bactericida de la internalización del SP dentro de los macrófagos humanos (después de 24 h, datos no mostrados). En tercer lugar, evaluamos el impacto de la infección única y mixta con el VAI y el SP en la viabilidad del MDM. La infección mixta disminuyó significativamente la viabilidad celular (65,2 ± 4,5% muerte celular total a las 48 horas postinfección; P < 0,0001) en comparación con la infección única por SP e IAV Tomados en conjunto, estos resultados confirmados MDM humanos son permisivos a la infección viral y bacteriana mixta. mRNA, microRNA y perfil de expresión proteica revelan una inducción global de la respuesta inmune innata del huésped después de la infección IAV y/o SP de MDMs. Para investigar la respuesta inmune innata orquestada por MDMs humanos infectados por IAV y SP, primero evaluamos la expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas (Tabla S1); los principales genes expresados diferencialmente se resumen en la Fig. 2a. El perfil de expresión indicó una inducción global de genes relacionados con las vías de señalización JAK-STAT, NF- De hecho, todos los genes estimulados por interferón (ISG) examinados, incluyendo CXCL10 (cambio doble [FC] = 240.9), CCL-2 (FC = 34.2) y MX-1 (FC = 151.4) fueron regulados después de una infección mixta en comparación con las células no infectadas, la mayoría de las cuales están estrechamente relacionadas con STAT-1 (FC = 52.3), IRF-7 (FC = 6.8) e IFNB1 (FC = 5.2) también se encontraron regulados en células infectadas mixtas. En segundo lugar, investigamos los perfiles de expresión de microRNA endógeno de MDM infectados por VAI y SP. Una selección de microRNA que se encontraron expresados diferencialmente bajo diferentes condiciones de infección se muestran en la Fig. 2b y la Tabla S2. El miRNA-200a-3p fue sobreexpresado después de la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana (FC = 6,9), el único SP (FC = 3,7) y la mezcla de infección IAV/SP (FC = 7,3), lo que indica que este miRNA puede jugar un papel en la respuesta inmune innata a la coinfección viral y bacteriana. Se obtuvieron perfiles similares de disregulación miRNA-200a-3p después de infecciones IAV y/o SP de macrófagos humanos (macrófagos derivados de monocitos THP-1) o MDM primarios (datos no mostrados). En tercer lugar, los niveles segregados de diversos antivirales, proinflamatorios e inmunomoduladores citoquinas/quimoquinas fueron evaluados en sobrenadantes de células IAV- y SP-infectadas-THP De hecho, el nivel de IP-10 se incrementó sinérgicamente en el sobrenadante de MDM TPH-1 infectados por el VAI expuesto a SP (media: 30.589 ± 16.484 pg ml −1 ) en comparación con la infección única por el VAI (1.439 ± 566.5 pg ml −1 ) y la infección única por SP (4.472 ± 2.001 pg ml −1 ; P≤ 0.05; Fig. 2c ) a las 24 horas después de la infección. En esas células, la expresión IP-10 se redujo con el tiempo (48 a 72 horas), coincidiendo con una proporción significativamente mayor de células necróticas y apoptotóticas (fig. 1d). La expresión sinérgica del IP-10 se observó de manera similar a las 24 horas después de la infección utilizando MDM primarias (fig. 2d) No se observó una secreción significativamente mayor de las otras citoquinas y quimioquinas probadas después de la infección, incluso en MDMs infectados mixtos (Fig. S1 ). Curiosamente, se observó una producción significativa de IP-10 en sobrenadantes de células epiteliales primarias de la vía aérea humana (HAEC) infectadas mixtamente por VAI y SP en comparación con las infecciones únicas (Fig. 2e). Tomadas juntas, los resultados del análisis de ARNm y proteínas sugieren que la infección viral y bacteriana mixta de MDMs induce una respuesta proinflamatoria sinérgica relacionada con las vías de señalización tipo 1 del interferón y JAK-STAT, con IP-10 como firma de coinfección del VIA/SP. Entre todos los microARN analizados, miR-200a-3p fue el más Scientific RepoRts  6:38532  DOI: 10.1038/srep38532 sobreexpresado en la coinfección IAV/SP de MDMs humanos. En el resto de este estudio, decidimos investigar la interconexión entre la expresión miR-200a-3p y la respuesta inmune innata. La expresión miRNA-200a-3p endógena correlaciona con la inducción CXCL10 (IP-10) después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos. Utilizando un ensayo específico de la sonda Taqman dirigido a miR-200a-3p, confirmamos una regulación significativa de miR-200a-3p después de la infección mixta IAV y SP de MDMs humanos (Fig. 3a). En este experimento, se observó una regulación más marcada de miR-200a-3p después de IAV+ SP en comparación con los resultados obtenidos previamente (Fig. 2b). Esta discrepancia se ha atribuido al uso de dos enfoques diferentes para cuantificar la expresión miR-200a-3p. El uso de un imprimador de transcripción inversa de tallo específico en la Fig. 3a permite una mejor sensibilidad de detección de miR-200a-3p en comparación con el tinte fluorescente no específico utilizado en la Fig. 2b. Como la tendencia general fue sugerente de una inducción sinérgica de miR-200a-3p en respuesta a la infección mixta (Fig. 3a), podemos hipotetizar el microRNA-200a-3p puede jugar un papel en la regulación de CXCL10 (IP-10), que también fue sinérgicamente regulado en MDMs infectados mixtos (fig 2c y d) y HAEC primario (los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. RepoRts científicos  6:38532  DOI: 10.1038/srep38532 CXCL10 (Fig. 3d). Estos resultados sugieren que miR-200a-3p regula indirectamente CXCL10 y nos lleva a hipotetizar que miR-200a-3p controla un potencial represor de la vía de señalización JAK-STAT.. A las 18 h después de la transfección, los MDM fueron infectados por separado o mezclados como se describió anteriormente. A las 8 h post-IAV y/o infección SP, el mRNA total fue extraído y amplificado por Los valores representan la mediana ± IQR (a, c) o media ± SEM (d, e) de tres réplicas biológicas.Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba Kruskal-Wallis (no paramétrica, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunn) para los datos presentados en (a, c).Se utilizó una ANOVA bidireccional ordinaria (con la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey) para los datos presentados en (d, e). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. MiRNA-200a-3p regula indirectamente la expresión IP-10 dirigiéndose a SOCS6. 2a, varios genes de la vía de señalización de JAK-STAT fueron desregulados en MDM humanos mixtos infectados por IAV y SP; por lo tanto, hipotetizamos que miR-200a-3p regula directamente un regulador de la vía de señalización de JAK-STAT. El análisis predictivo del objetivo indicó que el 3' UTR del supresor de la señal de citocina-6 (SOCS6) puede ser dirigido por miR-200a-3p (Fig. 3b). Las proteínas SOCS constituyen una clase de reguladores negativos de las vías de señalización de JAK-STAT que son inducidas por citoquinas y TLR señalización. MiRNA-200a-3p no fue predicho para apuntar a cualquiera de los otros seis miembros de la familia de genes SOCS. Transfección de MDMs humanos con SOCS MIM-200a regulados a la baja (FC = 0,57) mientras que la inhibición de miR-200a-3p (INH-200a) SOCS 6 regulados a la baja (FC = 1,55), confirmando que miR-200a-3p regula efectivamente la expresión de SOCS6 (Fig. 3e). Además, el SOCS6 fue regulado a la baja sinérgicamente en MDMs infectados por AVIA o AVIA/SP sobreexpresando miRNA-200a (Fig. 3e), sugiriendo que tanto la infección como el SOC-200a-3p regulan negativamente la expresión de SOCS6. Por último, Western blotting confirmó que la expresión de SOCS-6 se redujo bruscamente después de la infección, especialmente después de la infección mixta por AVIA Estos resultados indican que miR-200a-3p es fuertemente inducido en respuesta a la coinfección viral y bacteriana mixta, lo que a su vez conduce a la disminución de la regulación de la JAK-STAT SOCS-6 tanto en los niveles de ARNm y proteínas y posterior upregulation de IP-10. análisis demostraron infección mixta IAV y SP de MDMs humanos y HAEC inducido producción significativa de IP-10. Como leucocitos sanguíneos y células epiteliales del tracto respiratorio contribuyen activamente a la inflamación durante la neumonía, se hipotetiza que el nivel de IP-10 en el suero de paciente con neumonía puede ser tanto indicativo de infección respiratoria mixta y gravedad de la enfermedad. Como parte de un estudio prospectivo, hospitalario, multicéntrico de control de casos sobre la etiología de la neumonía en niños menores de 5 años, un total de 74 pacientes (44 hombres, 30 mujeres) fueron incluidos en esta evaluación piloto. De acuerdo con las directrices de la OMS, el análisis retrospectivo indicó que 44 (59,5%) niños tenían signos clínicos de neumonía no grave y 30 (40,5%) niños tenían signos de neumonía grave. Las principales características de los pacientes al momento de la inclusión se muestran en la Tabla 1. Los pacientes con neumonía grave presentaron episodios de disnea significativamente más registrados (P < 0,001), cianosis (P = 0,03), injerencia en el pecho inferior (P < 0,001), embolia a percusión (P < 0,001) y letargo (P < 0,001) durante el examen torácico que los pacientes con neumonía no grave. Además, las efusiones pleurales fueron significativamente más observadas entre los pacientes críticamente enfermos y la duración de la hospitalización fue significativamente mayor para los niños con neumonía grave que para aquellos con neumonía no grave (P = 0,0015). La evaluación de la respuesta inflamatoria sistémica de los 74 casos se muestra en la Tabla 2. Los niveles séricos de PCR, IP-10, PCT, G-CSF, IL-6, IL-8 y MIP-1β fueron significativamente más elevados en muestras séricas de pacientes críticamente enfermos. Los pacientes con neumonía grave tenían niveles séricos IP-10 significativamente más altos (4,2 veces) que aquellos con neumonía no grave (P < 0,001) sugiriendo IP-10 como marcador pronóstico prometedor en neumonía. Las medidas de precisión diagnóstica para predecir la gravedad de la neumonía utilizando biomarcadores basados en sangre se resumen en la Tabla S3. Brevemente, en este estudio, el valor óptimo de corte IP-10 para identificar paciente con neumonía grave fue de 4.240 pg ml-1, con un área bajo la curva característica operativa del receptor de 0,69 (IC 95%, 0,57 a 0,82, P < Definir como positivo un nivel de IP-10 sérico por encima de este corte resultó en una sensibilidad de 63,3%, especificidad de 63,6% y una relación de probabilidad positiva de 1,74. Los valores pronósticos de IP-10 se cerraron a procalcitonina (PCT; AUC = 0,70; IC 95%, 0,58 a 0,82, P < 0,001) e IL-6 (AUC = 0,70; IC 95%, 0,58-0,83; P < 0,001). Los exámenes multiples basados en PCR de muestras respiratorias y sanguíneas revelan una alta variedad de asociaciones de patógenos (Tabla 3). Se detectaron virus respiratorios en los aspirados nasales (NAs) de 63/74 pacientes (85,1%). Las bacterias etiológicas de la neumonía (S. pneumoniae, n = 19; S. aureus, n = 1; o H. influenzae tipo B, n = 7) fueron identificadas a través de PCR en tiempo real en las muestras sanguíneas de 27/74 (36,5 %) de los pacientes. Los ensayos multiplex de PCR permitieron la identificación de bacterias respiratorias en la sangre de 19 pacientes con resultados negativos en los cultivos sanguíneos.De los 74 casos PCR positivos para patógenos respiratorios, se detectó un único virus o bacteria en los pacientes de 7 (9,4%) y 3 (4,0%), respectivamente; estos casos 10/74 (13,5%) fueron definidos como el único grupo infectado. El grupo de infección mixta incluyó los 62/74 (83,8%) casos en los que (1) se identificaron múltiples virus y/o bacterias en NA (38/74; 51,3%) sin ninguna bacteria identificada en muestras de sangre o (2) uno o más virus y/o bacterias fueron identificados en NA y asociados con una bacteremia sanguínea (24/74; 32,4%). Se evaluó si el nivel sérico IP-10 podría correlacionarse con las etiologías virales y bacterianas de la neumonía. Los pacientes con infección mixta tuvieron un nivel sérico IP-10 significativamente mayor (3,6 veces) que el paciente con detección única (P = 0,03; Tabla 4 ). Un análisis estratificado revela que se observó el nivel sérico IP-10 más alto entre los pacientes con varios patógenos respiratorios identificados (grupo de detección mixta) y neumonía grave (14,427 pg ml −1, IQR (3,981-82,994). En detalle, se observó un notable nivel sérico IP-10 (142,531 pg ml −1 ), que representa 33 veces más alto valor de corte que predice la gravedad de la neumonía en el paciente con RVH en NA codetectado con S. pneumoniae (serotipo 14) en derrame pleural y sangre. De acuerdo con nuestro modelo in vitro de coinfección, se cuantificó un nivel IP-10 significativo (90,338 pg ml −1 ) en la muestra de sangre de paciente con neumonía neumocócica bacterémica grave (serotipo 14) con una codetección positiva del virus Influenza B en NA. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que los niveles séricos elevados de IP-10 están significativamente asociados con la detección viral y bacteriana mixta y también relacionados con la patogénesis de la neumonía. Este estudio proporciona datos in vitro y clínicos adicionales para mejorar nuestra comprensión de la inmunopatología de la neumonía viral y bacteriana mixta (Fig. 4). El modelo in vitro de la gripe y la superinfección neumocócica de MDM humanos demostró que la liberación sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 inducida por infección mixta, sugiere fuertemente RepoRts Científicos humanos  6:38532  DOI: 10.1038/srep38532 leucocitos en sangre contribuyen a la inmunopatología de la neumonía. Además, los análisis transcriptómicos y omics proporcionaron nuevos datos sobre las vías inflamatorias que se activan durante la infección mixta y están relacionados con la inducción sinérgica de la quimioquina proinflamatoria IP-10 en células infectadas mixtas. Nuestras observaciones son consistentes con un estudio reciente que describe la inducción IP-10 como firma host-proteoma de infecciones De los genes diferencialmente expresados observados en los MDMs infectados mixtos, los factores de transcripción STAT-1 e IRF-7 parecen jugar un papel crucial en la regulación de genes estimulados por interferón, incluyendo CXCL10 (IP-10). Al centrarse en los mecanismos intracelulares que regulan las vías inflamatorias, demostramos un papel novedoso para el miRNA-200a-3p en la regulación de CXCL10 (IP-10). Estas observaciones son consistentes con informes anteriores que muestran que la infección por el virus del ARN aumenta miR-155 en macrófagos y células dendríticas y también regula el supresor de la señal de citocina 1 (SOCS1), sugiriendo la existencia de una vía reguladora miRNA/JAK-STAT/SOCS durante la infección viral 29. Nuestro estudio sugiere que la co-infección conduce a la sobreexpresión de miR-200a-3p, que a su vez se dirige y desregula el regulador JAK-STAT SOCS-6 y, en consecuencia, aumenta la expresión CXCL10 (IP-10). Curiosamente, un enfoque complementario in-silico revela que varios microARNs que se encontraron disregulados en nuestros experimentos de co-infección IAV y SP de MDMs o HAEC, podrían dirigirse a varios genes de la familia SOCS y jugar un papel similar a miR-200a-3p. De hecho, miRNA-142-3p podría dirigirse a SOCS4, 5, 6 mRNA mientras que miRNA-194-5p podría dirigirse a SOCS2, 3, 4, 5 y 7 mRNA. Estas observaciones subrayan que la regulación intracelular de IP-10 no se limita a la contribución de un único microARN. Se produce una compleja interrelación entre numerosos microRNAs huésped e inhibidores de la vía de señalización JAK-STAT para controlar la respuesta inflamatoria innata del huésped frente a infecciones virales y/o bacterianas. Clínicamente, la mayoría de los casos de CAP pediátrica en este estudio se asociaron con detección positiva viral y/o bacteriana. Se detectaron microorganismos respiratorios en el 97% de los casos; 51,3% de los cuales fueron virales, virales, bacteriales o bacteriales codetectados sólo en aspirados nasales, 32,4% de los cuales fueron codetectados en aspirados nasales y muestras de sangre. Estos datos son consistentes con estudios etiológicos previos de CAP 3.31-33. S. pneumoniae fue la principal bacteria identificada en sangre (19/74; 25,7%) y principalmente codetectada con virus respiratorios en NAs (16/19; 84,2%). Se observó una gran diversidad de asociaciones virales y bacterianas en muestras biológicas de niños con neumonía. En comparación con la combinación IAV y SP14 evaluadas in-vitro, no hubo casos de neumonía por separado infectados por influenza y neumocococo, y no se ha observado una codetección similar con esos dos patógenos. Sin embargo, la combinación de Influenza B (IVB) fue identificada en 5 pacientes y dos de ellos tuvieron una codetección positiva de SP en sangre (una cepa no tipable y un serotipo 14 utilizando nuestra prueba de mecanografía molecular). La combinación IVB y SP14 parece ser la codetección de patógenos más cercana a la que se investigó in-vitro. Clínicamente, esta codetección se asoció con una expresión IP-10 muy alta y una definición de caso de neumonía muy severa. Curiosamente, nuestra evaluación piloto traslacional revela que Como la respuesta inmunitaria a cada patógeno es diferente, se necesitan más investigaciones in vitro utilizando diferentes asociaciones de patógenos para caracterizar mejor los mecanismos involucrados en la inmunopatología de la neumonía. En esta cohorte, se identificaron los niveles séricos más altos de IP-10 entre los pacientes con varios patógenos detectados y neumonía grave, lo que sugiere un papel significativo de IP-10 en la patogénesis de la neumonía. De hecho, se han notificado niveles plasmáticos elevados de IP-10 en pacientes con sepsis 12, y se asociaron con una alta tasa de mortalidad, especialmente entre los pacientes con CAP 34. Además, el eje IP-10-CXCR3 se ha relacionado con lesiones pulmonares inmunitarias agudas y apoptosis linfocítica durante el desarrollo de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) 35, 36. Además, un estudio in vivo que modeló la gripe y la sobreinfección neumocócica en ratones indicó que las quimioquinas proinflamatorias, incluyendo IP-10, desempeñan un papel crucial en la susceptibilidad inducida por la gripe a la neutrofilia pulmonar, inmunopatología grave y mortalidad 37. En este estudio, se cuantificaron en la muestra sérica de un niño que murió, en el que se identificó S. pneumoniae (serotipo 9 V) en la sangre (PCR y cultivo sanguíneo) y se codetectó con Haemophilus influenzae tipo B en aspirado nasal, una relación entre la codetección, la elevación de la IP-10 sérica y la patogénesis de la neumonía. Es necesario reconocer varias limitaciones de este estudio experimental traslacional antes de concluir que la infección mixta está relacionada con la elevación de la IP-10 y la gravedad de la enfermedad. De hecho, aunque el derrame viral (por ejemplo, de VFC y VHB) es común en niños asintomáticos, no pudimos evaluar los niveles de inmunomoduladores en las muestras séricas de un grupo control. Además, aunque las muestras se recogieron dentro de las primeras 24 horas después del ingreso, sólo se procesó una muestra de sangre única para cada paciente. Por lo tanto, será necesario un estudio longitudinal más amplio sobre la etiología y la gravedad de la neumonía para confirmar estos resultados. En conclusión, los hallazgos actuales sugieren que las infecciones respiratorias mixtas e IP-10 pueden desempeñar papeles importantes e interconectados en la patogénesis de la neumonía. Clínicamente, la evaluación y el seguimiento del nivel sérico inducido IP-10 pueden ayudar a los médicos a mejorar el Los 10 ng ml −1 M-CSF (Miltenyi Biotec). THP− 1 MDM se obtuvieron mediante el cultivo de células con 10 ng ml -1 acetato de miristato de forbol (PMA; Invivogen, Toulouse, Francia) durante 72 horas. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas (HAEC, tipo de célula bronquial) originadas en una mujer de 54 años de edad sin patología reportada (número de lote MD056501) fueron proporcionadas por Mucilair (Epithelix, Ginebra, Suiza). La esterilidad, integridad tisular (TEER), la producción de mucosidad y la frecuencia de batir ciliares han sido certificadas por la empresa. Perfil de expresión genética. El mRNA total fue purificado utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania La expresión de 84 genes involucrados en las respuestas inmunes innatas y adaptativas humanas se evaluó utilizando el perfilador RT 2 TM PCR Array (SAbiociencias) según las recomendaciones del fabricante. El método Δ Δ Ct se aplicó para calcular los cambios en la expresión génica de cada gen en relación con las células de control no infectadas utilizando el software de análisis de datos de perfil RT 2 PCR Array (SAbiociencias). Matriz de perfil de microRNA. Los microRNA celulares totales se purificaron utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen) y se transcriben inversamente utilizando el kit de transcripción inversa miScript (Qiagen). El perfil de 84 miRNAs se realizó utilizando el kit de matriz de miRNA miRNA de Inmunopatología Humana (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el portal web de análisis de datos de miRNA miRNA de miScript. En la predicción de objetivo de miRNA de silico se recuperaron y compilaron genes objetivo de miRNA usando TargetScan 38 y recurso microRNA.org 39. Las interacciones entre miRNAs y vías intracelulares fueron predichas usando DIANA-miRPath v2.0 40. Los MDM de THP-1 fueron sembrados en placas de 24 pozos (0,5 × 10 6 por pozo) por triplicado, expuestos al virus H1N1 de Influenza A (A/Islas Salomón/3/2006) bajo condiciones libres de suero durante 1 hora y luego cultiva Se añadió el serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae (SP) a las 4 horas después de la infección por el VAI. Gentamicina (10 μ g ml −1 ) se añadió 2 horas después de la infección por el VSP (es decir, 6 horas después de la infección por la gripe) y se mantuvo en los medios de cultivo durante todo el experimento para matar bacterias extracelulares y limitar el crecimiento bacteriano. La viabilidad celular se determinó mediante la citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis FITC/Anexina V (BD Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. #4427975). En este ensayo, los cambios de pliegues se han definido mediante el método Δ Δ Ct utilizando el control RNU-44 y -48 como microARNs de referencia. El ARNm total se purificó a partir de MDM transfectados e infectados utilizando el kit RNeasy (Qiagen) y se utilizaron imprimaciones específicas para amplificar el factor de crecimiento transformador beta-2 (TGFB2; F: 5′ -CCATCCGCCCACTTTCTAC-3′, R: 5′ -AGCTCAATCCGTTGTTCAGGC-3′ ), SOCS6 (F: 5′ -AAGAATCATCCCTTTGGAGTAAC-3′, R: 5′ -CAGACTGGAGGTGGAA-3′ ) 41 43, y 3) ausencia de sibilancia en la auscultación, y 4) primeros síntomas que aparecieron en los últimos 14 días, y 5) confirmación radiológica de neumonía según las directrices de la OMS 44. Con base en estos criterios primarios que definen los casos de neumonía, los 74 casos fueron reevaluados retrospectivamente de acuerdo con el "Pocket book of hospital care for children" de la OMS 45 criterios para evaluar la gravedad de la neumonía. Los casos que murieron durante el estudio, o que tuvieron al menos un signo clínico adicional incluyendo cianosis central, embotamiento a la percusión durante el examen torácico, postración/letargo, derrame pleural observado en la radiografía torácica fueron incluidos retrospectivamente en el grupo de neumonía grave. Los pacientes sin ninguno de estos signos clínicos adicionales fueron incluidos en el grupo de neumonía no grave. Tabla 4. Los valores de IP-10 se expresan en pg ml -1. Las diferencias de concentración IP-10 entre los grupos fueron comparadas mediante pruebas de Mann-Whitney no pareadas; cambios significativos (P < 0,05) son en negri A partir de muestras de sangre completa se obtuvieron muestras de Nasofaringe Aspirados (NAs) y sangre completa de niños dentro de las 24 horas siguientes al ingreso. Se utilizaron muestras de sangre completa para recuentos sanguíneos completos, cultivos sanguíneos y PCR multiplex en tiempo real para identificar Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo B 46. Se definieron serotipos de S. pneumoniae utilizando un ensayo de PCR multiplex en tiempo real dirigido a los 40 serotipos o serogrupos representados con mayor frecuencia según el protocolo desarrollado por Messaoudi y otros 47. Se utilizó PCR multiplex no cuantitativo en tiempo real (Fast-Track Diagnostic, Sliema, Malta) para detectar 19 virus y cinco bacterias en las muestras respiratorias (NAs y derrames pleurales).Se definió la detección mixta como 1) PCR positivo para múltiples virus en NAs, 2) cultivo sanguíneo positivo o PCR positivo para múltiples bacterias en sangre o 3) PCR positivo para uno o múltiples virus en NAs y una o múltiples bacterias en sangre (identificado por PCR y cultivo sanguíneo).Aprobación ética.El protocolo del estudio, declaración de consentimiento informado, formulario de investigación clínica, cualquier modificación y todos los demás documentos del estudio fueron presentados y aprobados por el Comité Ético del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) y el Hospital Pediátrico Niños de Acosta Ñu. La investigación clínica se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Análisis estadístico. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para comparar variables categóricas; se compararon variables continuas y datos no distribuidos normalmente utilizando la prueba U de Mann-Whitney; se compararon datos normalmente distribuidos utilizando pruebas t sin emparejar. Se realizaron análisis comparativos entre condiciones experimentales (es decir, MOCK, IAV, SP o IAV + SP) utilizando ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey o el análisis de Kruskal-Wallis con las pruebas posthoc de Dunn. Se utilizó el análisis de la curva operativa del receptor (ROC) para determinar el valor óptimo de corte para IP-10 para diferenciar entre los casos de neumonía no grave y grave. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (La Jolla, California, Estados Unidos).
question: ¿Qué sugiere que la IP-10 juega un papel significativo en la patogénesis de la neumonía?
answers.text: niveles séricos más altos de IP-10