context: El cribado de fármacos aprobados por la FDA para inhibidores de la infección por el virus de la encefalitis japonesahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f848446d3d36f964Autores: Wang, Shaobo; Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiFecha: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17Licencia: cc-byResumen: virus de la encefalitis japonesa (JEV), un flavivirus transmitido por artrópodos, es una de las principales causas de la encefalitis viral aguda en No se dispone de ningún medicamento aprobado para el tratamiento específico de las infecciones por JEV, y las vacunas disponibles no son eficaces contra todos los aislados clínicos de JEV. En el estudio descrito aquí, se realizó una revisión de alto rendimiento de una biblioteca de medicamentos aprobada por la FDA para inhibidores del JEV. Se identificaron cinco fármacos afectados que inhibieron la infección por JEV con un índice selectivo de >10. También se validaron las actividades antivirales de estos cinco fármacos afectados contra otros flavivirus, incluido el virus Zika. El análisis de mutantes adaptativos reveló que la sustitución de Q130, ubicada en el dominio transmembrana 3 de la proteína NS4B no estructural, que se conserva relativamente en flavivirus, con la resistencia de JEV conferida a la manidipina R o K, un inhibidor del canal Ca(2+) activado por voltaje (VGCC), sin una pérdida aparente del perfil de crecimiento viral. Además, se indicó que manidipina protegía a ratones contra la letalidad inducida por JEV disminuyendo la carga viral en el cerebro, mientras que abrogaba los cambios histopatológicos asociados a la infección por JEV. Este estudio proporciona cinco candidatos a antiflavivirus e identifica el calcio citoplasmático como un nuevo objetivo antiviral para el tratamiento de la infección por JEV. Los hallazgos reportados aquí proporcionan posibilidades terapéuticas para combatir infecciones causadas por flavivirus. La reutilización de fármacos aprobados aceleraría el desarrollo de una estratagema terapéutica. En este estudio, examinamos una biblioteca de fármacos aprobados por la FDA e identificamos cinco fármacos afectados, especialmente inhibidores del calcio, que ejercen actividad antiflavivirus que bloquea la replicación viral. La eficacia in vivo y la toxicidad de manidipina fueron investigados con un modelo de ratón de infección por JEV, y el objetivo viral fue identificado generando un mutante adaptativo. Texto: Los lavivirus F están clasificados taxonómicamente en el género Flavivirus y la familia Flaviviridae. Estos virus comprenden más de 70 patógenos diferentes, como el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus Zika (ZIKV), el virus del dengue (DEV), el virus del Nilo Occidental (WNVW), y el virus de la fiebre amarilla (YFV). La mayoría de los flavivirus El desarrollo y uso de vacunas contra algunos flavivirus, como el JEV, el YFV y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), han disminuido las tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones causadas por estos virus (2) ; sin embargo, las enfermedades inducidas por flavivirus siguen siendo pandemias, y hay pocas terapias disponibles además de los cuidados intensivos de apoyo. Los flavivirus tienen un genoma de ARN de aproximadamente 11 kb de cadena positiva que contiene un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por regiones no traducidas (UTR) en ambos termini. El ORF codifica tres proteínas estructurales, incluyendo el capsid (C), membrana (premembrana [prM] y membrana [M]), y envoltorio (E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, Estas siete proteínas no estructurales participan en la replicación viral, el ensamblaje del virión y el escape del virus de la vigilancia inmune. Hasta la fecha, no hay antivirales específicos con actividad contra los flavivirus. Para ello, realizamos una pantalla de una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA. Dado que los flavivirus son similares en estructura y patogénesis, primero utilizamos el JEV como prototipo para examinar la biblioteca de medicamentos y posteriormente validamos las actividades antivirales con ZIKV, WNV y DENV tipo 2 (DEV-2). Los fármacos afectados identificados en este estudio ofrecen nuevas terapias potenciales para el tratamiento de la infección y enfermedad por flavivirus. Para seleccionar inhibidores se utilizaron partículas virales recombinantes (RVP) con el replicon notificado por luciferasa envuelto por las proteínas estructurales del JEV, con un enfoque en aquellos que inhiben la entrada y replicación del virus, mediante un ensayo de detección de alto rendimiento (HTS) (4, 5). Se determinó que el número de copias de RVP de ARN genómico era de 8,4  10 6 copias/ml utilizando una curva estándar generada con plásmidos que transportaban el clon infeccioso. Las condiciones de ensayo del HTS, incluyendo la densidad celular de siembra y la dosis de RVP, fueron optimizadas para ser 10.000 células por placa de 96 pocillos y 20 l (16 copias/célula) RVP para la dosis infecciosa, respectivamente. En las condiciones optimizadas, la relación señal-basal (S/B), el coeficiente de variación (CV) y el factor Z= fueron 38.374, 2,8% y 0.89, respectivamente, lo que demostró que el ensayo era robusto y adecuado para el cribado a gran escala de compuestos. Se seleccionó un esquema del ensayo HTS en la Fig. 1B. Después de tres rondas de cribado, cinco hits con un índice selectivo (SI; que es igual a la concentración citotóxica del 50% [CC 50 [ concentración inhibitoria del 50% [IC 50 ]]) de 10. Los valores CC 50 de los fármacos afectados exhibidos en la Fig. 1B fueron similares a los publicados anteriormente para diversos sistemas celulares pero determinados utilizando diferentes ensayos de toxicidad (6) (7) (8) (9) (10) (12) (13) (13). Tres de los fármacos afectados, manidipino, cilnidipino y hidrocloruro de benidipina, fueron antagonistas del canal Ca 2 (VGCC) activados por dihidropiridina, mientras que el pimecrolimus es un inhibidor de la secreción inflamatoria de citoquinas y el mesilato de nelfinavir es un bloqueador de proteasa VIH-1. Todos los cinco fármacos afectados mostraron una inhibición dosis-dependiente de la infección por JEV RVP (Fig. 1C). Para validar el efecto antiviral, los fármacos afectados fueron comprados de otras fuentes comerciales y probados. En la pantalla de reconfirmación, todos los fármacos afectados mostraron efectos antivirales y citotóxicos similares a los encontrados en la pantalla primaria. Validación de los fármacos afectados. Para verificar los resultados obtenidos por los ensayos del reportero de luciferasa, también investigamos Como se esperaba del ensayo HTS, los cinco fármacos inhibieron robustamente la producción de virus, con una reducción de aproximadamente 4 a 5 unidades log en la concentración más alta y una disminución de aproximadamente 1 log-unidad con 2,5 M los fármacos (Fig. 2B). También se detectó una fuerte disminución de los niveles de ARN JEV (Fig. 2C). Los niveles de ARN atenuados en los grupos de dosis altas, dosis media y dosis bajas fueron todos superiores al 40%. En particular, en el grupo tratado con manidipina, el efecto inhibitorio fue al menos del 80% en comparación con el control, que mostró una fuerte inhibición de la replicación viral. Coherente con la inhibición de la replicación y producción del virus, la expresión de la proteína estructural viral prM fue apenas detectable después del tratamiento con los fármacos en la concentración alta (Fig. 2D) 2 confirmó que los cinco fármacos afectados inhibieron in vitro la infección por JEV de forma dosis-dependiente. Los fármacos inhiben la infección por JEV durante la síntesis del ARN viral. Debido a que los RVP, que tienen un sobre natural similar al virus en el exterior y un replicon en el interior, permitieron la cuantificación de la entrada y replicación productiva del JEV, se realizó un experimento de tiempo de adición para investigar si los fármacos afectados bloquearon el paso de entrada o el paso de replicación. Como se muestra en la Fig. 3B, no se observó supresión de la actividad de luciferasa por cualquiera de los fármacos afectados cuando se utilizaron como tratamientos antes de la infección o durante la infección o como virúcida, sugiriendo que estos fármacos no inhiben la infección por JEV ya sea inactivando el virus directamente o bloqueando la entrada del JEV. Sin embargo, estos Para confirmar esta sugerencia, se investigaron los efectos inhibidores de estos fármacos en el JEV replicon. La concentración más alta de manidipino y mesilato de nelfinavir en las células de hámster bebé (BHK-21) se ajustó a 5 M y 10 M, respectivamente. Se demostró que los cinco fármacos inhiben la síntesis del ARN del JEV de manera dependiente de la dosis, mientras que ninguno de ellos inhibió la traducción inicial del ARN del réplico (5, 14) (Fig. 3C), confirmando que estos fármacos inhibieron la infección del JEV en la etapa de replicación. Los fármacos hit exhiben actividad antiflavivirus de amplio espectro. Para determinar si la actividad antiviral de los cinco fármacos afectados se extendió a otros flavivirus, exploramos su efecto antiviral contra ZIKV. Similar a los hallazgos para JEV, el título de ZIKV fue disminuido por unidades de registro múltiples cuando ZIKV fue tratado con una alta concentración de cada uno de los fármacos (Fig. 4A). Además, ZIKV mostró una mayor sensibilidad a los dos inhibidores de canales de calcio manidipina y cilnidipina que JEV, sin que se observe formación de placa a 10 M. De acuerdo con este resultado, se detectaron también disminuciones bruscas en el nivel de replicación del ARN de ZIKV y el nivel de expresión de proteína viral (Fig. 4A). Cabe destacar que el tratamiento con 5 M manidipina produjo una inhibición del 95% de la replicación viral, traducción y rendimientos virales. Tomados juntos, estos resultados indican que los fármacos afectados podrían efectivamente inhibir la infección por ZIKV. Dado que estos fármacos exhibieron sus efectos anti-JEV en la etapa de replicación viral, se probaron además los efectos contra WNV y DENV-2 mediante el uso de los replicadores WNV y DENV-2. Al igual que los resultados para JEV, se observó una reducción dosis-dependiente en el nivel de replicación de WNV con los tratamientos farmacológicos. El mismo fenotipo se observó para DENV-2 para todos los fármacos excepto mesilato de nelfinavir, que no mostró ningún efecto en las concentraciones probadas (fig. 4B y C). Juntos, estos resultados indican que los cinco fármacos afectados son excelentes candidatos para el tratamiento antiflavivirus de amplio espectro. Efecto antiviral de inhibidores del calcio. Ya que tres fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina, eran inhibidores de DHP VGC Verapamil, un prototipo de inhibidor de fenilalquilamina (PAA) VGCC (15), mostró una inhibición dosis-dependiente del JEV tanto en el riñón de mono verde africano (Vero) como en las células de carcinoma hepatocelular humano (Huh-7) (Fig. 5), lo que fue consistente con los efectos inhibitorios de los inhibidores del DHP, sugiriendo que los canales de calcio juegan un papel importante en la infección por JEV. También se encontró que la ciclosporina y el borato de 2-aminobifenilo (2-APB), que inhiben el eflujo de Ca 2 del grupo mitocondrial y endoplasmático (ER), respectivamente (16) (17) (18) (19), bloquean eficazmente la infección por JEV. Del mismo modo, el tratamiento con el quelante celular Ca 2 1,2-bis-(o-aminofenoxi)-etano-N,N,N=,N=-tetraacético, ester tetraacetoximetilo (BAPTA-AM), también podría suprimir la infección por JEV. Tomado en conjunto, se concluyó que el Ca 2 intracelular es esencial para la infección por JEV y el calcio citoplasmático es un objetivo potente para el tratamiento con antiflavivirus. Selección y caracterización del JEV resistente a manidipina. Para identificar el objetivo viral del inhibidor del canal de calcio, se seleccionó un virus resistente a manidipino por transpiración serial del JEV en presencia de manidipina. Los virus del pasaje 20 (P20) mostraron resistencia robusta en comparación con el tipo salvaje (WT) (Fig. 6A ). Cuando el JEV de P20 fue tratado con 5 M o 10 M manidipina, el título viral fue aproximadamente 10 y 100 veces más alto que el del WT, respectivamente. Los clones individuales del virus fueron aislados, y dos aislados fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados. Se observó una sustitución de aminoácidos en dos clones aislados, resultando en un cambio de glutamina (Q) a a arginina (R) en la posición de aminoácido 130 en el dominio transmembrana 3 (TMD3) de NS4B, es decir, la posición 2401 de la poliproteína traducida en el clon cDNA infeccioso JEV (Fig. 6B ). La alineación secuencial de NS4B indicó que el Q130 fue conservado en todos los flavivirus excepto YFV, que poseía una lisina en esa posición (Fig. 6B ). El Q130 conservado de NS4B puede explicar la sensibilidad de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2 a manidipina, como se describe anteriormente (Fig. 4), mientras que el YFV mostró resistencia al fármaco (datos no mostrados). Para confirmar que la mutación Q130R confirió resistencia a manidipina e investigar el papel del Q130 en la función NS4B, produjimos clones de JEV con la mutación Q130R, Q130K, Q130E o Q130A introduciendo las mutaciones deseadas en el clon de ADNc infeccioso y rescatando los virus mutantes. Para investigar las propiedades biológicas de los virus mutantes, primero examinamos la cinética de crecimiento de los virus rescatados. Como se muestra en la Fig. 6C, todos los virus mutantes tuvieron una acumulación de viriones infecciosas y alcanzaron el título La infección de los virus mutantes Q130R y Q130K resultó en curvas de crecimiento similares a la curva de crecimiento para el WT (Fig. 6C), mientras que los mutantes Q130E y Q130A produjeron cantidades menores de virus entre 24 y 60 h. El análisis de la morfología de la placa reveló que las placas de los mutantes Q130R, Q130K y Q130E eran similares a las placas del WT, mientras que las placas del mutante Q130A eran menores que las del WT. A continuación se investigó la sensibilidad de los cuatro virus mutantes a manidipino. Como se muestra en la figura 6D, los virus mutantes Q130R y Q130K eran resistentes a manidipino. En una concentración de 10 M, la manidipina inhibió eficientemente la infección WT JEV y redujo los rendimientos virales en aproximadamente 4 unidades log, mientras que los virus mutantes Q130R y Q130K fueron resistentes a la manidipina y el título viral disminuyó menos de 2 unidades log.El virus mutante Q130A demostró resistencia moderada y un poco más alto Tomado juntos, se pudo concluir que Q130 no sólo es crítico para conferir sensibilidad a la manidipina sino que también es importante para la replicación del JEV. El reemplazo de glutamina por aminoácidos básicos confirió resistencia a la manidipina sin una aparente pérdida de crecimiento. Eficacia in vivo de la manidipina. Como manidipina mostró las actividades inhibidoras más fuertes en la replicación del JEV, así como la infección por ZIKV cuando sus actividades se compararon con las de los cinco fármacos afectados ( 2 y 4A), examinamos además el efecto protector de la manidipina frente a la letalidad inducida por el JEV en un modelo de ratón. Como era de prever, los ratones del grupo tratado con el JEV comenzaron a mostrar síntomas, incluyendo parálisis en las extremidades, restricción de movimiento, piloerección, rigidez corporal y temblor en todo el cuerpo, a partir del día 5 postinfección. En los 21 días posteriores a la infección, la mayoría de los ratones del grupo infectado por el JEV sucumbieron a la infección, con una tasa de mortalidad del 73% (4 de 15 animales sobrevivieron). El tratamiento con manidipina tras la infección por el JEV redujo la tasa de mortalidad al 20% (12 de 15 animales sobrevivieron) (Fig. 7A ). Los ratones tratados con manidipina solos o tratados con manidipina e infectados con JEV mostraron poco comportamiento anormal, similar a los Para relacionar aún más estos efectos protectores con la carga viral y los cambios histopatológicos en el cerebro del ratón, se determinó el título viral y se recogieron y analizaron las secciones cerebrales del ratón en el día 5 y el día 21 postinfección, ya que los ratones comenzaron a mostrar síntomas de infección por JEV desde el día 5 postinfección y la mayoría de los ratones sobrevivientes se habían recuperado en el día 21. Los resultados indicaron que, durante la progresión de la enfermedad, el tratamiento con manidipina redujo significativamente la carga viral en ratones infectados en comparación con la de ratones infectados que no recibían tratamiento, mientras que no se formaron placas ni en el grupo tratado con manidipino ni en el vehículo, y las cargas virales fueron indetectables en cada grupo el día 21 postinfección (fig. 7B). Como el JEV fue rápidamente eliminado de la sangre después de la inoculación y estuvo presente en el sistema linfático durante la fase preclínica, los efectos de la manidipina sobre la infección del suero y el bazo fueron evaluados en momentos anteriores para detectar si el fármaco redujo las cargas virales periféricas (20, 21). Como se muestra en la figura 7C, la manidipina tuvo poco efecto sobre la infección periférica del JEV, lo que indica que la manidipina protegió a los ratones contra la letalidad inducida por el JEV al disminuir la carga viral en el cerebro. Del mismo modo, se observó un daño aparente en el cerebro, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, degeneración vacuolar y nódulos gliales en el grupo infectado y tratado con JEV el día 5 de postinfección, mientras que el tratamiento con manidipina aliviaba notablemente estos Estos resultados indican que el alivio de los cambios histopatológicos fue acompañado por una reducción de la carga viral, así como una reducción en la tasa de mortalidad, confirmando aún más los efectos curativos de la manidipina sobre la encefalitis viral. Entre los cinco fármacos afectados, manidipina, cilnidipina e hidrocloruro de benidipina fueron inhibidores del VGCC. Ha sido bien documentado en la literatura que los inhibidores de Ca 2 sirven para inhibir la infección viral en la etapa de entrada (15, 22) o replicación (18) e incluso en la etapa de brote (23). Con este fin, primero revisamos los 21 inhibidores del calcio incluidos en la actual biblioteca de fármacos aprobados por la FDA y encontramos que, además de los cuatro inhibidores del DHP VGCC enumerados en la Fig. El 1B, otros dos inhibidores de calcio, es decir, dihidrocloruro de flunarizina y clorhidrato de lomerizina, también fueron identificados como candidatos primarios con niveles de inhibición de 90%. Del mismo modo, tres antagonistas de los canales de calcio, nisoldipino, felodipino y clorhidrato de nicardipina, mostraron niveles de inhibición de 75%, 72% y 66%, respectivamente, en la pantalla primaria. Juntos, 9 de los 21 inhibidores de calcio de la biblioteca, que representan casi la mitad de los inhibidores de calcio, mostraron niveles de inhibición de flavivirus superiores al 50%, lo que sugiere que el calcio, especialmente el canal de calcio, es un potencial objetivo antiviral. Para abordar este, se investigó otro tipo de inhibidor del VGCC, verapamilo, un fármaco aprobado por la FDA que aún no se incluye en la biblioteca de medicamentos utilizada en este Del mismo modo, un quelante Ca 2, BAPTA-AM, así como los inhibidores Ca 2 2-APB y ciclosporina, dirigidos a la ER y el canal mitocondrial Ca 2, respectivamente, fueron empleados para investigar la respuesta de la infección por JEV a la disminución de los niveles intracelulares de Ca 2. En línea con las actividades de los tres fármacos inhibidores DHP VGCC golpeados, los inhibidores adicionales Ca 2 ejercieron actividad anti-JEV, lo que indicó que Ca 2 es indispensable para la infección por JEV. Así, los inhibidores Ca 2 podrían ser utilizados como tratamientos eficaces para la infección por flavivirus. Como los fármacos afectados ejercieron actividad inhibitoria completa cuando fueron añadidos al tratamiento, creemos que Ca 2 es importante para la replicación del genoma del flavivirus. Además, la selección y el análisis genético de NS4B es parte del complejo de replicación viral y se supone que ancla la replicasa viral a la membrana ER (24). Mientras tanto, el dominio N-terminal 125aminoácido de DENV NS4B fue indicado como responsable de la inhibición de la respuesta inmune (25). En particular, varios compuestos estructuralmente distintos han sido identificados para inhibir la replicación de flavivirus al dirigir intensivamente la TMD de NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32). Es así concebible que los inhibidores que se dirigen a la TMD de NS4B perturben su función, lo que conduce a la supresión de la replicación de ARN viral. En este estudio, la sustitución de Q130 de NS4B por un aminoácido básico confirió el efecto de resistencia sin suprimir la replicación del JEV, sugiriendo que la posición 130 podría tolerar un aminoácido básico y que el aminoácido básico podría estar involucrado en la interacción del NS4B con proteínas huésped en lugar de proteínas virales. Además, la eficacia y toxicidad de manidipina fueron monitoreadas in vivo, con manidipina demostrando una actividad antiviral efectiva con biocompatibilidad favorable. Sin embargo, la dosis utilizada en este estudio fue mayor que la dosis típicamente utilizada clínicamente, representando uno de los escenarios más comúnmente encontrados en la repurposición de fármacos (33, 34). Como manidipina fue aprobada para el tratamiento a largo plazo de la hipertensión (35, 36), el tratamiento de dosis de pulso con manidipina durante el período más corto requerido para el tratamiento de la infección viral podría ser relativamente Además, el uso de una combinación de manidipina con otros inhibidores de Ca 2 podría mejorar su eficacia terapéutica, reducir su toxicidad y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia (37) (39). Además de los tres inhibidores de VGCC, dos fármacos afectados, pimecrolimus y mesilato de nelfinavir, mostraron actividades inhibitorias equivalentes en la replicación de JEV, ZIKV, WNV y DENV-2. Aunque no se ha reportado el uso de pimecrolimus para el tratamiento de enfermedades infecciosas, se demostró que tuvo un efecto robusto contra JEV con un SI de 32. La concentración plasmática máxima (C max ) de mesilato de nelfinavir alcanzado con una dosis adulta fue de 3 a 4 g/ml (40), lo que fue comparable al IC 50 reportado aquí. En particular, se confirmó que el mesilato de nelfinavir inhibe el virus del herpes simplex 1 (HSV-1) y la replicación de varios otros herpesvirus interfiriendo directa o indirectamente con los pasos posteriores de la formación del virus, como la maduración de la glucoproteína o la liberación de virus, además de funcionar en la proteasa del herpesvirus (41, 42). Se desconoce si el mesilato de nelfinavir inhibe el flavivirus por interferencia con la proteasa del virus o por otros efectos no deseados. La comprensión del mecanismo de los efectos antiflavivirus de estos fármacos podría descubrir nuevos objetivos de los medicamentos, proporcionando una visión más profunda de la patogénesis de los flavivirus. Las células BHK-21, SH-SY5Y (neurblastoma humano), Vero, y Huh-7 fueron cultivadas en el medio de águila modificado Dulbecco (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY, USA). La cepa JEV AT31, el replicado WNV, y el replicado DENV-2 que expresa Renilla luciferasa (Rluc) fueron amablemente proporcionados por Bo Zhang, Wuhan Institute of Virology, Academia China de Ciencias (CAS), China. Las partículas virales recombinantes de JEV replicon (RVPs) fueron generadas como se describió previamente (4, 5). La cepa H/PF/2013 de ZIKV, amablemente proporcionada por el Archivo Europeo de Virus Goes Global, fue propagada y titulada en La densidad celular y la dosis de RVP fueron optimizadas para el ensayo de HTS. Las células de Vero en diferentes densidades (2.500 a 12.500 células por pozo) fueron infectadas con RVPs de 1,25 a 20 l (1 a 16 copias por pozo). La densidad celular apropiada así como la dosis de RVP fueron seleccionadas comparando la relación S/B, CV y valores de Z= en diferentes condiciones como se describió previamente (43). Se utilizaron metil--ciclodextrina y sulfóxido de dimetilo (DMSO) como controles positivos y negativos respectivamente. Ensayo de HTS de una biblioteca compuesta aprobada por la FDA. Se compró una biblioteca de 1.018 medicamentos aprobados por la FDA a Selleck Chemicals (Houston, TX, EE.UU.). Los compuestos fueron almacenados como soluciones de stock de 10 mM en DMSO a 4°C hasta su uso. La primera ronda del ensayo de H Los criterios utilizados para identificar los candidatos primarios no fueron citotoxicidad aparente y un nivel medio de inhibición de 90% en pozos duplicados. Los criterios de inhibición dosis-dependiente y viabilidad celular de 80% se aplicaron para la pantalla de reconfirmación. Además, se calculó el CC 50 de cada compuesto, y los compuestos que mostraban SI mayores de 10 fueron considerados hits en este estudio. Identificación de efectos antivirales de cinco fármacos golpeados. Los efectos antivirales de los fármacos fueron evaluados mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR), ensayo de inmunofluorescencia (IFA), y ensayo de placa como se informó previamente (44) (45) (46) (47). El cronograma experimental se describe en la figura 2A. Para asegurar la efectividad de los fármacos afectados en la replicación de flavivirus, se incubaron células BHK-21 transfectadas con el JEV, WNV o DENV-2 con cada fármaco en las concentraciones indicadas anteriormente, y se determinaron las actividades de luciferasa 24 h, 48 h o 72 h más tarde, respectivamente. Experimentación de tiempo de adición. Para evaluar qué etapa del ciclo de vida del JEV fue inhibida por cada golpe, se realizó un experimento de tiempo de adición como se describió previamente (43). Las células Vero fueron infectadas con 20 l de VPR durante 1 h (0 a 1 h). Los compuestos de prueba fueron incubados con las células durante 1 h antes de la infección (1 a 0 h), durante la infección (0 a 1 h), y durante 23 h postinfección (1 a 24 h) (fig. 3A). Para excluir un posible efecto inactivador directo de los fármacos, los RVP fueron incubados con cada fármaco a 37°C durante 1 h, y las mezclas fueron diluidas 25 veces para infectar las células Vero. Veinticuatro horas después, las actividades de luciferasa se determinaron como se describe anteriormente (Fig. 3A). Virus resistente a manidipina. Virus resistente a manidipina fue generado por transpiración de JEV en células Vero en presencia de manidipina. Pasajes 1 a 10 usaron 5 M manidipina, y pasajes 11 a 20 usaron 10 M manidipina. Como control, el virus WT fue pasaje en presencia de 2 % DMSO en paralelo. El pasaje fue terminado en el pasaje 20, cuando no se detectó ninguna mejoría adicional en la resistencia. Dos aislados del virus resistente a manidipina fueron purificados en placa y amplificados en presencia El ARN viral fue extraído, amplificado y purificado para la secuenciación. Se utilizó un clon cDNA infeccioso de JEV, cepa AT31 (pMWJEAT), amablemente proporcionado por T. Wakita, Instituto Metropolitano de Neurociencia de Tokio, para recuperar los virus WT y mutantes, como se describió anteriormente (4). Los títulos de virus y sensibilidades manidipinas fueron determinados por el ensayo de placa en células Vero. La administración de manidipina a ratones infectados por JEV. Los ratones adultos BALB/c (edad, 4 semanas) fueron mantenidos en el Centro Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China). Los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos (30 ratones por grupo): un JEV infectado y un vehículo (2% Tween 80 plus 5% DMSO en el grupo tratado con solución salina fosfatada [PBS]), un grupo tratado con manidipino, un grupo tratado con JEV infectado y manidipino, y un grupo tratado con vehículo. Para la infección, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 5  10 6 UFP de cepa JEV AT31. Para el tratamiento con manidipino y vehículo, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de peso corporal manidipino o PBS con 2% Tween 80 y 5% DMSO, respectivamente. Los tratamientos fueron administrados dos veces al día durante los primeros 2 días y luego administrados consecutivamente una vez al día durante 21 días. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados en los días 1, 3 y 5 Se recogieron muestras de sero, tejido del bazo y tejido cerebral para la determinación del título viral y la investigación histopatológica. Quince ratones fueron monitorizados diariamente por morbilidad y mortalidad. Los ratones que mostraron signos neurológicos de enfermedad fueron eutanasiados de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos relativos a Animales Experimentales en China. Los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de Laboratorio del Instituto de Virología Wuhan, CAS (Wuhan, China).
question: ¿Cuántos marcos de lectura abiertos hay en el genoma del flavivirus?
answers.text: solo