context: La ingeniería metabólica de Escherichia coli en una plataforma de glicosilación versátil: producción de glucósidos de quercetina bioactivoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4573293/SHA: f4cd52975e6a33e8c947082eda9b261952b0f8fAutores: De Bruyn, Frederik; Van Brempt, Maartens; Maertens, Jo; Van Bellegem, Wouter; Duchi, Dries; De Mey, MarjanFecha: 2015-09-16DOI: 10.1186/s12934-015-0326-1Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: Los flavonoides son metabolitos de plantas especializadas bioactivas que se producen principalmente como Debido a la creciente demanda del mercado, se han desarrollado diversos enfoques biotecnológicos que utilizan Escherichia coli como catalizador microbiano para la glucosilación estereoespecífica de flavonoides. A pesar de estos esfuerzos, la mayoría de los procesos todavía muestran bajas tasas de producción y títulos, que los hacen inadecuados para aplicaciones a gran escala. RESULTADOS: En esta contribución, ampliamos una plataforma de glucosilación in vivo previamente desarrollada en E. coli W, en un sistema eficiente de galactosilación selectiva y rhamnosilación. La racionalidad de la nueva estrategia de ingeniería metabólica constituye la introducción de un metabolismo alternativo de sacarosa en forma de una fosforilasa de sacarosa, que deja la sacarosa en fructosa y la glucosa 1-fosfato como precursora de la UDP-glucosa. Para preservar estos intermedios para fines de glucosilación, las reacciones de Debido al papel central de la UDP-glucosa, la sobreexpresión de las enzimas interconvertidoras galE y MUM4 aseguró la formación de tanto UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Al suministrar adicionalmente quercetina alimentada exógenamente y sobreexpresión de una flavonol galactosiltransferasa (F3GT) o una rhamnosiltransferasa (RhaGT), 0,94 g/L hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y 1,12 g/L quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. Además, ambas cepas mostraron actividad hacia otros flavonols dietéticos prometedores como kaempferol, fisetina, morina y mirictina. CONCLUSIONES: Se diseñaron dos mutantes E. coli W que podrían producir eficazmente los glucósidos de flavonol bioactivos hiperósidos y quercitrina a partir de los sustratos baratos sacarosa y quercetina. Esta nueva estrategia de glucosilación basada en fermentación permitirá la producción económicamente viable de varios glucósidos. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12934-015-0326-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Los flavonoides son una clase de metabolitos secundarios de plantas, que se caracterizan químicamente por una columna vertebral de 15 carbono que consiste en dos anillos de fenilo y un anillo heterocíclico. Hasta la fecha, más de 10.000 flavonoides se han caracterizado por diversas plantas, que se clasifican según su estructura química, es decir, el número y la presencia de grupos hidroxilos y otras modificaciones de grupos funcionales en diversos subgrupos, como las antoxantinas, las flavanonas y los flavanonales [1, 2]. En los últimos años los flavonoides han recibido mucha atención de diversos dominios de aplicación debido a los diversos efectos beneficiosos sobre la salud humana que se les han atribuido, como los anticancerosos [3] y antioxidantes [4] a los efectos antiinflamatorios [5], antimicrobianos [6] y antivirales [6, 7]. Como paso final en su biosíntesis, los flavonoides suelen ser glucosilados, lo que tiene un profundo efecto en su solubilidad, estabilidad y bioactividad [8, 9]. Por ejemplo, el flavonol quercetina mejor estudiado, que constituye hasta el 75 % de nuestra ingesta diaria de flavonoides, se presenta predominantemente como glucósidos diferentes. Hasta la fecha se han notificado más de 350 glicoformas diferentes de quercetina con diversas propiedades farmacológicas [10, 11]. En este contexto, el hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y la quercitrina (quercetina 3-O-rhamósido) (fig. 1) han ganado mucha atención como productos valiosos para la industria farmacéutica, por ejemplo, como potentes antioxidantes con efectos citoprotectores [12] [13] [14] [15] y como agentes antivirales prometedores que bloquean la replicación del virus de la gripe [16] o inhiben los virus hepatitis B [17] y SARS [18]. Además, se les han atribuido actividades antiinflamatorias [19, 20], antidepresivos [21, 22], apoptóticos [23] y antifúngicos [24], lo que las hace interesantes terapéuticas que resultan en un aumento constante de la demanda del mercado. Hasta la fecha, la mayoría de la quercetina y sus glucósidos se extraen del material vegetal, lo que generalmente es un proceso laborioso y de bajo rendimiento que requiere muchos pasos de purificación [25]. Los cultivos de plantas in vitro o plantas diseñadas pueden utilizarse para superar los bajos rendimientos y mejorar la producción [26] [27], sin embargo, dado que la ingeniería metabólica de las plantas es a la vez muy controvertida y aún en su infancia [29], este enfoque se limita a menudo a la producción a pequeña escala. Aunque la síntesis química de quercetina (glicósidos) ha demostrado ser factible [30] [31] [32], la formación estereoselectiva de enlaces glicosídicos se ve a menudo obstaculizada por la presencia de varios grupos reactivos [33], lo que requiere muchas medidas de protección y desprotección [34]. Además, la generación de residuos tóxicos y una baja atomeficiencia [35] hacen que estos procesos de producción no sean sostenibles ni económicamente viables. Como resultado, en las últimas dos décadas se han invertido enormes esfuerzos en el desarrollo de métodos de producción alternativos para estos metabolitos vegetales especializados (secundarios) [36]. Los avances en los campos de la ingeniería proteica, los sistemas y la biología sintética han acelerado estos esfuerzos para transformar organismos modelo como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae en fábricas de células microbianas reales para la producción sostenible de flavon Posteriormente, también se han desarrollado estrategias para la glicosiltransferasa in vivo de flavonoides, que se basan en la sobreexpresión de glucosiltransferasas específicas, que transfieren un residuo de azúcar de un nucleótido activado a un aglicón de forma estereo y regioselectiva, así como en la ingeniería o introducción de la vía nucleótida dirigida al azúcar. De esta manera, Fig. 1 Transformación de E. coli W en una plataforma de galactosilación basada en sacarosa y rhamnosilación. La estrategia de ingeniería metabólica aplicada utiliza varias deleciones genéticas (indicadas en rojo) y sobreexpresiones de genes (indicadas en verde). Se aplica el racional de un metabolismo dividido, por el cual la sacarosa se divide por fosforilasa de sacarosa (BaSP) en fructosa para ser utilizada para el crecimiento y Esta última es una molécula pivote universal para la formación de UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, interconversiones catalizadas por las enzimas GalE y MUM4, respectivamente. Para asegurar la producción acoplada al crecimiento, varios genes, involucrados en la metabolización de estos UDPsugars y sus precursores, fueron eliminados (mostrados en rojo). La producción de los glucósidos de quercetina bioactivos hiperósidos y quercitrina fue elegida para evaluar la versatilidad de la plataforma de producción diseñada. Por último, la introducción de los glicosiltransferasa F3GT o RhaGT garantiza la galactosilación eficiente o la rhamnosilación, respectivamente, ya se han producido varios glucósidos de quercetina en E. coli, como el 3-O-glucósido [40], el 3-O-xilosido [41] y el 3,7-O-bisrhamnosido [42], o la quercetina 3-O-(6-deoxitalosa) de nueva naturaleza [43]. Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos de ingeniería, las tasas de producto y los títulos reportados siguen en la gama de miligramos, haciendo que estos hospedadores microbianos no sean adecuados para aplicaciones industriales. Los procesos de producción desarrollados son típicamente procesos de bioconversión bifásicos utilizando células en reposo, lo que dificulta mejorar las tasas de producción [44] Además, estos sistemas a menudo implican medios de crecimiento costosos o la adición de inductores enzimáticos, haciendo el proceso general muy costoso. Para abordar estos problemas, previamente desarrollamos una plataforma eficiente para la glucosilación de pequeñas moléculas en E. coli W [45]. Mediante la ingeniería metabólica, se creó un mutante que combina la producción de glucósidos con el crecimiento, utilizando la sacarosa como una fuente de carbono barata y sostenible. Al introducir la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium teennis (BaSP) la sacarosa se puede dividir en fructosa para ser utilizada con fines de crecimiento y la glucosa 1-fosfato (glc1P) para ser utilizada como precursora de la formación de UDP-glucosa (UDP-glc) (fig. 1). Para impedir la conversión de glc1P en precursores de biomasa, varios genes endógenos implicados en su metabolización, como la fosfoglucomutasa (pgm) y la glucosa-1-fosfatasa (agp) fueron eliminados. Posteriormente, el glc1P puede canalizarse eficientemente hacia UDP-glc al sobreexpresar la uridyltransferasa de Bifidobacterium bifidum (ugpA). La metabolización del UDP-glc se evita al eliminar la hidrolasa UDP-azúcar (ushA) y el operón de galactosa (galETKM). Sin embargo, en vista del papel central de UDP-glc en la producción de una gran variedad de UDP-sugars, este sistema de glucosilación se puede extender fácilmente hacia otros UDP-sugars, tales como UDP-galactosa (UDP-gal), UDPrhamnosa (UDP-rha) y UDP-glucuronato. En la presente contribución, esta plataforma basada en E. coli W basada en E. coli glucosilación se transforma en una plataforma para galactosilación y rhamnosilación (fig. 1), cuyo potencial se demuestra utilizando la galactosilación y la rhamnosilación de quercetina alimentada exógenamente que produce hiperósido y quercitrina, respectivamente, como estudio de caso. Escherichia coli W es una cepa no patógena de rápido crecimiento que tolera el estrés osmótico, las condiciones ácidas, y puede cultivarse a altas densidades celulares, lo que la convierte en un hospedador atractivo para las fermentaciones industriales [46]. Además, E. coli W es capaz de crecer con sacarosa como única fuente de carbono [46], que es una materia prima emergente para la producción de bioproductos. Por lo tanto, E. coli W fue seleccionado como hospedador para la glucosilación in vivo basada en sacarosa. Antes de la producción de los glucósidos hiperósidos y quercitrina en E. coli W, se investigó la toxicidad de su aglicón quercetina. Con este fin, la cepa de tipo salvaje (WT) se cultivaba en un medio mínimo de sacarosa que contenía diferentes concentraciones de quercetina (0, 0,15 y 1,5 g/L). Las tasas de crecimiento específicas (h −1 ) (0,96 ± 0,06, 0,92 ± 0,05 y 0,87 ± 0,06, respectivamente) no fueron significativamente diferentes (p ANOVA = 0,12) ni de la determinada previamente para el WT [45] (p = 0,69, p = 0,98 y p = 0,68, respectivamente). Por otro lado, la densidad óptica a 600 nm después de la incubación de 24 h (6,36 ± 0,12, 5,18 ± 0,16 y 4,77 ± 0,20, respectivamente) fue menor (alrededor del 20 %) cuando se añadió quercetina (p = 0,0002 y p = 0,0001). No se pudo observar diferencia significativa en la densidad óptica entre 0,15 y 1,5 g/L de quercetina (p = 0,14). En vista de lo anterior, se optó por añadir 1,5 g/L de quercetina para Para evaluar el potencial de glicosilación in vivo, las cepas sGAL1 y sRHA1, que expresan constitutivamente la flavonol 3-O-galactosiltransferasa de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de A. taliana, respectivamente, fueron cultivadas en medio mínimo con 1,5 g/L de quercetina durante 16 h. El análisis de los sobrenadantes de ambos cultivos en el TLC produjo dos nuevos puntos amarillos del producto. La mancha de TLC obtenida del cultivo sGAL1, que tuvo el mismo tiempo de retención que el estándar hiperósido (R f = 0,5), fue posteriormente purificada y analizada. Sin embargo, el punto del producto obtenido del cultivo sRHA1 tenía un factor de retención diferente (R f = 0,55) que el estándar de quercitrina (R f = 0,74), y fue identificado como isoquercitrina (quercetina 3-O-glucósido). A diferencia de otros informes sobre cepas silvestres de tipo E. coli que expresaban RhaGT, que simultáneamente producían quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido) e isoquercitrina [47, 48], no se pudo detectar rhamnosido. El examen del genoma de E. coli W reveló que el grupo genético responsable de la producción endógena de dTDP-rhamnosa, que funciona como rhamnosildonante alternativo para RhaGT en E. coli B y K12 [47], no estaba presente [46, 49]. En un experimento de seguimiento, sGAL1 y sRHA1 fueron cultivados en medio mínimo con dos concentraciones diferentes (0,15 y 1,5 g/L) de quercetina. Se monitorizó el crecimiento y la formación de glucósidos durante 30 h. Los títulos finales (C p ) y las productividades específicas (q p ) se muestran en la figura 2. Cabe destacar que un aumento de la concentración de quercetina dio lugar a un aumento de dos a tres veces en la productividad y el título, lo que indica que el suministro de quercetina es limitador de velocidad y crucial para una glucosilación in vivo eficiente. Sin embargo, mientras que sGAL1 produjo hiperósidos continuamente durante la fase exponencial, lo que también se refleja en la productividad específica relativamente alta, sRHA1 sólo comenzó a acumular cantidades significativas de isoquercitrina al final de la fase exponencial. Este inicio de producción coincide con una reducción de la tasa de crecimiento específica, que bajó de 0,35 ± 0,04 a 0,06 ± 0,01 h −1. Como se describe en detalle en la sección de fondo, previamente se diseñó metabólicamente E. coli W para crear una plataforma para la glucosilación in vivo de pequeñas moléculas [45]. En la cepa de glucosilación de base original, la sacarosa fosforilasa codificada por BaSP se encontraba en un plásmido mediocopia y transcrita a partir de un promotor constitutivo medio fuerte (P22) [50]. Por razones de comparación y flexibilidad, se optó por integrar BaSP en el genoma de E. coli W. Además, la integración cromosómica es ventajosa debido a un aumento significativo de la estabilidad genética. Dado que el nivel de expresión génica puede verse considerablemente afectado por el sitio de integración del genoma [51] debido a diferencias estructurales como las regiones de ADN supercoiling, se evaluaron dos sitios de ADN diferentes para la integración de BaSP, es decir, mela y glgC, que codifican una α-galactosidasa y una glucosa-1-fosfato adeniltransferasa, respectivamente. Para ello, se aplicó un procedimiento de knockout adaptado para fragmentos de ADN grandes, que se muestra esquemáticamente en el archivo adicional 1: Figura S2. El BaSP bajo control del promotor P22 fue golpeado en los dos loci diferentes en E. coli W ΔcscAR, lo que resultó en las cepas E. coli W ΔcscAR ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 y ΔcscAR ΔggC::L4-P22-BaSP-L5. Su tasa máxima de crecimiento específico (μ max ) en medio mínimo de sacarosa, que se muestra en la Fig. 3, se comparó con la cepa original ΔcscAR + pBaSP. La influencia del locus tokin en la tasa máxima de crecimiento específico es clara. Interesantemente, la integración en el locus melA resultó en una cepa con un máximo de μ que no fue significativamente diferente de la cepa de referencia ΔcscAR + pBaSP. En vista de esta última y teniendo en cuenta el objetivo de producción acoplada al crecimiento, se optó por integrar BaSP en el locus melA que conduce a la cepa de base de producción final E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA::P22-lacY ΔgalETKM ΔmelA::L4-P22-BaSP-L5 (sGLYC) (sGLYC) como se muestra en el cuadro 1. En la naturaleza, UDP-glc sirve como molécula pivotante en la formación de una variedad de UDP-sugars [44]. Por ejemplo, utilizando las enzimas de interconversión UDP-glucosa 4-epimerasa (GALE) y UDP-rhamnosa syntasa (MUM4) UDP-glc se puede convertir en UDP-gal y UDP-rha, respectivamente. Aunque GalE está nativamente presente en E. coli W, una epimerasa homóloga alternativa (GALE2) de B. bifidum también se seleccionó y clonó debido a la Fig. 2 Comparación de las productividades específicas de glucósidos (q p ) y títulos de glucósidos (C p ) para cepas sGAL1, que produce el 3-O-galactósido, y sRHA1, que produce el 3-O-glucósido, cuando se cultiva durante 30 h en medio mínimo que contiene 0,15 o 1,5 Las barras de error representan desviaciones estándar regulación estricta y compleja de la expresión de GalE en E. coli W. Por otro lado, la síntesis UDP-rhamnosa está restringida a las plantas. Debido a la falta del cúmulo de rfb [46] E. coli W es incluso incapaz de formar dTDP-rhamnosa endógena como donante alternativo de rhamnosil. Por lo tanto, el gen MUM4 de A. thaliana se expresó desde plásmido pMUM4 para lograr la formación de UDP-rhamnosa en E. coli (Fig. 1). Las cepas construidas de galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRHA) fueron cultivadas en medio mínimo con dos niveles (0.15 y 1.5 g/L) de quercetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados para determinar las productividades específicas Una vez más, las concentraciones de quercetina extracelulares más altas dieron lugar a un aumento de cinco veces en q p. Sin embargo, no se observó diferencia significativa en la productividad entre sGAL2 y sGAL3 a 1,5 g/L de quercetina, lo que indica que la formación de galactosa UDP es tan eficiente con ambos homólogos GalE y no es probable que el paso limitante de la velocidad. Con sGAL3, se obtuvo la mayor productividad hiperósida (68,7 mg/g CDW/h) y título (0,94 g/L), siendo este último 3,5 veces más alto que con sGAL1. En contraste con sRA1, el análisis de TLC del sobrenadante de los cultivos de sRHA2 y sRHA3 dio lugar a un punto del producto con un factor de retención que corresponde a la quercitrina, que Se obtuvo un título de quercitrina de 1,18 g/l y una productividad específica de 47,8 mg/g CDW/h después de 30 h de incubación de sRHA3 cuando se añadió 1,5 g/l de quercetina al medio, que correspondía a una conversión del 53%. También se produjeron 51 mg/l de isoquercitrina extracelularmente, lo que corresponde a una relación de producción de quercitrina:isoquercitrina de 24:1. Esto sugiere la preferencia de RhaGT por UDP-rhamnosa cuando están presentes diferentes donantes UDP-azúcar. Posibles explicaciones para la productividad específica significativamente menor (cinco veces menor) de sRHA2 en comparación con sRHA3 son o una carga metabólica mayor [52] causada por el sistema de dos plásmidos o una actividad demasiado limitada de la GalU nativa, que podría ser Para demostrar la escalabilidad del bioproceso desarrollado, la cepa sGAL3 se cultivó en un bioreactor de 1-L, que también asegura un pH constante a 6,80 y evita la limitación del oxígeno. En la figura 5 se ofrece una visión detallada del consumo de sacarosa, crecimiento e hiperósidos. Después de una fase de retraso, la cepa mostró una tasa de crecimiento de 0,32 ± 0,02 h −1 mientras producía simultáneamente hiperósido. La productividad específica observada (65,9 ± 2,6 mg/g CDW/h) fue comparable a la obtenida en la escala del frasco de batidos. Cuando casi toda la quercetina se convirtió, la formación de hiperósidos disminuyó, lo que puede explicarse por la correlación observada entre la concentración de quercetina y q p, o por la reversibilidad reportada de F3GT [53]. Es probable que se puedan lograr mejoras adicionales en el título y la productividad optimizando el suministro de quercetina utilizando un sistema de fed-batch. Según nuestro conocimiento, los resultados obtenidos en este estudio con las cepas sGAL y sRHA para la producción de hiperósidos y quercitrina son los más altos reportados hasta la fecha tanto en términos de título como de tasa de producción. La tasa máxima de producción obtenida en esta contribución fue de 6 a 50 veces mayor que las tasas máximas de producción (r p,max ) de los procesos reportados en la literatura [47, 54], como se ilustra en la Fig. 6. El aumento del rendimiento, en términos de título y productividad, obtenido con la plataforma desarrollada, puede atribuirse al uso de un metabolismo dividido en combinación con un desvío óptimo del flujo de glucosa 1-fosfato hacia UDP-galactosa y UDP-rhamnosa. La conversión no deseada de los azúcares activados en biomasa Fig. 3 Efecto del locus de integración cromosómica de la knokin de BaSP sobre la tasa de crecimiento. Las cepas fueron cultivadas en frascos de batido y las tasas de crecimiento máximas resultantes (μ max ) fueron comparadas con E. coli W ΔcscAR con expresión BaSP a base de plásmido (+pBaSP). Las barras de error representan desviaciones estándar se ve obstaculizada por deleciones genéticas, lo que garantiza un alto rendimiento del producto. Además, ya que la formación de biomasa, alimentada por la fracción fructosa de sacarosa, y la síntesis de glucósidos van de la mano y posteriormente se realizan al mismo tiempo a una alta tasa, una alta productividad está igualmente garantizada (proceso de fermentación en un solo paso). Además de quercetina también otros flavonoles como el kaempferol, fisetina, morina y miricetina contribuyen significativamente a nuestra ingesta diaria de flavonoide, que también tienen efectos beneficiosos muy diversos [55, 56]. Como la moiedad del azúcar es un importante determinante de la absorción intestinal de los flavonoides dietéticos y su posterior bioactividad [57, 58], las cepas sGAL3 y sRHA3 fueron cultivadas en tubos con un medio mínimo de 5 mL, cada uno conteniendo 1,5 g/L de kaempferol, miricetina, morina o fisetina. El crecimiento y la producción fueron monitoreados a lo largo de 48 h y varios puntos fueron observados en TLC con factores de retención similares como hiperósido y quercitrina. Se utilizó espectrometría de masas para identificar los compuestos producidos, lo que confirmó la galactosilación in vivo de miricetina, kaempferol, morina y fisetina (Tabla 2 ). Todos los compuestos ocurrieron con una m/z de [M + 114], debido a la complejidad con ácido trifluoroacético de la fase móvil. El galactosido de morina se produjo a un ritmo lento, lo que está de acuerdo con la muy baja actividad in vitro de F3GT hacia este flavonol [53]. Una posible explicación de esta actividad limitada puede ser la presencia de un grupo hidroxilo inusual en la posición 2′, que puede obstaculizar estericamente la deprotonación y la consiguiente galactosilación de morina en el grupo hidroxi 3 [59]. La incubación de sRHA3 con los diferentes flavonoles investigados mostró dos puntos glucósidos distintos en el TLC, que correspondían al 3-O-rhamnosido y al 3-O-glucósido. Kaempferol demostró ser el mejor sustrato para RhaGT y fue predominantemente rhamnosilado (8:1 ratio), con un título superior a 400 mg/L, que es dos veces superior a lo reportado anteriormente [47]. Fisetin por otro lado fue eficientemente glucosilado, sin embargo la formación de su rhamnosilado no fue tan eficiente, con un título inferior a 5 mg/L. También se observó una preferencia similar hacia la formación de glucósidos con mirictina y morina, lo que indica que el posicionamiento de los grupos hidroxilo es el factor determinante para la glucosilación con Rha La producción de los rhamnosidos, galactósidos o glucósidos deseados puede mejorarse considerablemente utilizando UGTs más específicos para ciertos flavonols y UDP-sugars. La transformación de los UGTs correspondientes en las cepas de glicosilación in vivo desarrolladas presenta una alternativa prometedora para la producción a gran escala de varias glicoformas de flavonol, que hasta la fecha se extraen principalmente del material de la planta. Por otro lado, debido al papel central de UDP-glc, se pueden formar varios otros UDP-sugars in vivo (por ejemplo, UDP-glucuronato, UDP-xilosa, UDP-arabinosa). En combinación con la modularidad de la plataforma de glucosilación desarrollada, que permite la introducción rápida de cualquier vía UGT o UDP-sugar, prácticamente Por lo tanto, esto demuestra que la plataforma microbiana propuesta es una fábrica de células microbianas robusta, versátil y eficiente para la glicosilación (por ejemplo, glucosilación, rhamnosilación, galactosilación) de moléculas pequeñas. Aunque las productividades obtenidas son las más altas reportadas hoy en día y compiten con los procesos de producción actuales, la mejora adicional puede ser limitada debido a problemas de solubilidad del aglicón o del glucósido. Para este fin la investigación de seguimiento puede centrarse en la ingeniería metabólica adicional (por ejemplo, la introducción de la vía aglicón que permite la producción in vivo gradual del aglicón) o en la optimización del proceso [por ejemplo, la fermentación de 2 fases (bicapas) que permite la recuperación in situ] para mejorar estos problemas. En esta contribución, se desarrolló una plataforma biotecnológica para la galactosilación y rhamnosilación de moléculas pequeñas, tales como productos secundarios de metabolitos naturales, a partir de un huésped de glucosilación previamente creado. Para este fin, se introdujeron las rutas para convertir la UDP-glucosa en UDP-galactosa y UDP-rhamnosa, respectivamente. Como prueba de concepto, se seleccionó la flavonol quercetina bioactiva para galactosilación y rhamnosilación, produciendo hiperósido (quercetina 3-O-galactósido) y quercitrina (quercetina 3-O-rhamnosido), respectivamente. A continuación, la flavonol 3-O-galactosiltransferasa (F3GT) de Petunia híbrida y la flavonol 3-O-rhamnosiltransferasa de Arabidopsis thaliana (RhaGT) fueron sobreexpresadas en los mutantes de E. coli W de ingeniería metabólica. Las cepas creadas fueron capaces de producir 940 mg/L de hiperósido y 1176 mg/L de quercitrina a tasas específicas de producción de 68,7 mg/g de CDW/h y 47,8 mg/g de CDW/h, respectivamente, que son las más altas reportadas hasta la fecha. Curiosamente, ambos GT mostraron actividad in vivo hacia otros flavonoles dietéticos, por lo que por ejemplo, más de 400 mg/L de kaempferol 3-O-rhamnosido Todos los plasmidos utilizados fueron construidos utilizando el ensamblaje de Gibson [60] o CLIVA [61]. Todos los fragmentos de PCR fueron amplificados utilizando polimerasa Q5 de New England Biolabs (Ipswich, Massachusetts). Oligonucleótidos fueron comprados a IDT (Leuven, Bélgica). Los plasmidos y cepas bacterianas utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Una lista de imprimaciones para la creación de knockouts/knockins de genes y para la clonación de los plasmidos de expresión se da en el archivo adicional 2: Tabla S1. E. coli DH5α se utilizó para clonación y propagación de plasmidos, mientras que E. coli W se utilizó para la expresión de los plasmidos de producción y la creación de knockouts y knockins de genes El hiperósido, la quercitrina, la isoquercitrina, el kaempferol y la miricetina fueron comprados a Carbosynth (Berkshire, Reino Unido). Todas las demás sustancias químicas utilizadas fueron compradas a Sigma Aldrich (Alemania) a menos que se indique lo contrario. La expresión plásmidos para la prod uction del hiperósido y la quercitrina se construyeron como se describe en el archivo adicional 3: Figura S1A Figura S1D ). Las secuencias galE [Genbank: JW0742] y galE2 [Genbank: KJ543703] fueron amplificadas a partir del ADN genómico de E. coli y Bifidobacterium bifidum, respectivamente. El conjunto CLIVA resultó en el plásmido intermedio pBaSP/F3GT/UgpA (Figura S1A ), que posteriormente fue utilizado para la amplificación de la columna vertebral F3GT/UgpA. El ensamblaje Gibson de los insertos GalE o GalE2 con esta columna vertebral resultó en los plásmidos de galactosilación final pGalE/F3GT/UgpA y pGalE2/F3GT/UgpA, respectivamente (Figura S1B ). Del mismo modo, MUM4 y RhaGT fueron introducidos utilizando un ensamblaje Gibson de 3 piezas (Figura S1C ), resultando en el plásmido final rhamnosylation pMUM4/RhaGT/UgpA. Los mutantes de knockout E La estrategia para la integración cromosómica de BaSP bajo control del promotor constitutivo P22 flanqueado por L4 y L5 en los loci mela y glgC se describe y explica en el archivo adicional 1: Figura S2. Los transformadores se plasmaron en placas de agar medio de sacarosa mínima y se cultivaron durante la noche para su cribado. La cepa interna E. coli W ΔcscAR Δpgm Δagp ΔushA ΔlacZYA:::P22-lacY ΔgalETKM [45] se utilizó para la integración cromosómica de L4-P22-BaSP-L5 en el sitio melA, produciendo la cepa base sGLYC (Tabla 1). Esta cepa y el tipo silvestre E. coli W se transformaron con los plásmidos de producción descritos anteriormente, resultando en las cepas galactosilación (sGAL) y rhamnosilación (sRA) indicadas en el cuadro 1. La composición de LB y medio de sacarosa mínimo se describió previamente [45]. Las placas de agar medio mínimo con sacarosa (50 g/L) tenían la misma composición que el medio de sacarosa mínimo, pero contenían además 15 g/L de agarosa. La agarosa y las sales se autoclavearon por separado a 121 °C durante 21 min. La sacarosa fue filtrada esterilizada a través de un filtro de cornización de 0,22 μm (Fisher, Bélgica) y calentada durante 1 min en un horno de microondas a 800 W antes de mezclarla con la agarosa caliente y las soluciones de sal. Antes de verter las placas se añadió estérilmente 1 mL/L de solución mineral [45]. Se cultivaron precultivos mutantes Escherichia coli W en medio LB de 5 mL con los antibióticos (50 μg/mL de kanamicina o carbenicilina) necesarios para el mantenimiento y selección de los plásmidos. Los cultivos se cultivaron durante 16 h a 37 °C y 200 rpm y se utilizaron para la inoculación del 2 % de 100 mL de medio mínimo de sacarosa en matraces de agitación de 500 mL. Para la producción de hiperósidos y quercitrina, se añadió quercetina al medio mínimo a una concentración de 0,15 o 1,5 g/L. Las condiciones de crecimiento fueron las mismas que se habían descrito anteriormente [45]. Las muestras se tomaron a intervalos regulares del caldo y, tras la centrifugación, Para el análisis de quercetina y sus glucósidos, se recogieron 200 μL del cultivo y se extrajeron con acetato de etilo de 800 μL. La capa orgánica fue recolectada, evaporada en un concentrador de vacío SpeedVac TM (Thermo Fisher, USA) y disuelta en 200 μL de DMSO para la cuantificación de HPLC. Las condiciones de montaje y fermentación del biorreactor son las mismas que se han descrito anteriormente [45]. Los experimentos de producción se realizaron en medio mínimo de sacarosa sin amortiguador MOPS y con la adición de quercetina como aceptor. Las muestras de cultivo fueron analizadas principalmente por TLC en placas prerevestidas de gel de sílice 60 F 254 (Merck, Alemania). Todas las placas fueron ejecutadas en una cámara de TLC cerrada y desarrolladas utilizando técnicas y agentes de visualización estándar: fluorescencia UV (254 nm) o por tinción con 10 % (v/v) H 2 SO 4 y posterior carbonización. La fase móvil para la detección de los diversos flavonols y glucósidos correspondientes consistió en un acetato de etilo:ácido acético:ácido formínico:agua (100:11:11:27 v/v) mezcla [63]. Las intensidades puntuales del producto de otros glucósidos de flavonol fueron procesadas y cuantificadas utilizando ImageJ [64]. La cuantificación HPLC de sacarosa, fructosa y glucosa se realizó utilizando una columna Amida de puente X (35 μm, Waters, USA) como se describió anteriormente [45]. Quercetina, hiperósido, [41] utilizando un sistema Varian HPLC (Tecnologías Agilent, California). La espectrometría de masas para la determinación de los diversos glucósidos de flavonol se realizó con un Quattro LC de Micromasa (McKinley Scientific, EE.UU.). La detección se realizó en modo negativo ESI-224 MS con una tensión capilar de 2,53 kV, una tensión cono de 20 V, flujos de gas cono y desintoxicación de 93 y 420 L/h, y temperaturas de fuente y cono de 150 y 350 °C, respectivamente. Los glucósidos de Quercetina se extrajeron del caldo con un volumen igual de acetato de etilo después de lo cual la capa orgánica fue evaporada a sequedad. La banda que contiene hiperósido (R f 0.53) o quercitrina (R f 0.75) fue raspada, extraída con acetato de etilo y evaporada para producir un polvo amarillo brillante. Los productos fueron confirmados por NMR. Se notificaron espectros en otros lugares [47, 65].
question: ¿Qué características tiene la glicosilación en los flavonoides?
answers.text: solubilidad, estabilidad y bioactividad