context: La proteína transmembrana inducida por interferón 3 inhibe la infección por el virus de Hantaan y su polimorfismo nucleótido único rs12252 Influye en la gravedad de la fiebre hemorrágica con síndrome renalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206578/SHA: 4328e18bdf9b52875c87f3f5ddb1911636a192d2Autores: Xu-yang, Zheng; Pei-yu, Bian; Chuan-tao, Ye; Wei, Ye; Hong-wei, Ma; Kang, Tang; Chun-mei, Zhang; Ying-feng, Lei; Xin, Wei; Ping-zhong, Wang; Chang-xing, Huang Los estudios anteriores han identificado las proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) como una familia de genes estimulados por interferón. Sin embargo, el papel de los IFITM en la infección por NVHT no está claro. En este estudio, observamos que los polimorfismos mononucleótidos IFITM3 (SNP) rs12252 C alelo y genotipo CC asociados con la gravedad de la enfermedad y la carga de NVHT en el plasma de los pacientes con HFRS. Los experimentos in vitro mostraron que la proteína truncada producida por el alelo rs12252 C presentaba una actividad anti-NVHT alterada. También demostramos que IFITM3 fue capaz de inhibir la infección por NVHT tanto en células HUVEC como A549 por sobreexpresión y ensayos de ARNi, probablemente a través de un mecanismo de Además, se demostró que la transcripción del IFITM3 está regulada negativamente por un regulador negativo del INCRNA de la respuesta al interferón (NRIR). Tomado en conjunto, se concluye que el IFITM3, regulado negativamente por el NRIR, inhibe la infección por HTNV, y su SNP rs12252 se correlaciona con la carga plasmática de HTNV y la gravedad de la enfermedad de los pacientes con HFRS. Texto: asociado con la gravedad de la enfermedad, indicando la importancia de la viremia en la patogénesis del HFRS (2). Por lo tanto, estudios adicionales de factores de huésped que limitan la infección por HTNV e influyen en la respuesta antiviral así como la progresión de la enfermedad son clínicamente significativos y oportunos. La familia humana de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITMs) fue descubierta hace 25 años para consistir en genes estimulados por Esta familia incluye cinco miembros, a saber, IFITM1, 2, 3, 5 y 10, entre los cuales IFITM1, 2 y 3 poseen actividad antiviral (4). Diferentes proteínas IFITM tienen espectro antiviral diferente (5). Por ejemplo, IFITM3 ha demostrado prevenir la infección por el virus de la gripe in vitro y en ratones (6, 7), y también inhibe múltiples virus, incluyendo filovirus, rabdovirus, flavivirus, e incluso virus Ébola y Zika (7) (8) (9) (10) (11). El mecanismo antiviral de IFITM3 se cree que es la restricción de la entrada viral en las células (4, 12). Los polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) son variaciones únicas de nucleótidos en una secuencia genética que ocurren a una frecuencia apreciable en la población. Varios SNPs han sido identificados en IFITM3, entre los cuales el sitio con alelo C rs12252 resulta en una truncación N-terminal de la proteína IFITM3, lo que conduce a una inhibición alterada del virus de la gripe in vitro (13, 14). En particular, las frecuencias de alelo C rs12252 y genotipo CC se correlacionan con la gravedad de la enfermedad en pacientes infectados con el virus de la gripe (13, 15). Se ha demostrado que el HTNV induce una respuesta de interferón tipo I (aunque en el tiempo posterior a la infección) (16, 17). Si bien la sobreexpresión de las células IFITM1, 2 y 3 de Vero E6 sigue siendo desconocida en las células Vero E6 para inhibir la infección por HTNV (18), sin embargo, el efecto de los IFITMs sobre la El LncRNA comprende un grupo de ARNs no codificantes de más de 200 nt que funcionan como reguladores genéticos. Se ha demostrado que algunos lncRNAs desempeñan un papel en la inmunidad innata (19). Entre ellos, el regulador negativo de la respuesta al interferón (NRIR) (INCRNA NRIR, también conocido como lncRNA-CMPK2) es un ISG no codificante que regula negativamente la expresión IFITM1 y Mx1 en la infección por VHC (20). En particular, el IFITM3 es en gran medida homólogo del IFITM1, pero el papel del NRIR en la regulación del IFITM3 en la infección por NHT sigue sin estar claro. En el presente estudio, investigamos el efecto del IFTTM3 en la replicación del HTNV y su papel en el desarrollo del HFRS en humanos. Proveemos evidencia primaria que sugiere que el IFITM3, regulado por el NRIR, puede inhibir la infección por HTNV y su SNP rs12252 se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y la carga viral en pacientes con HFRS. Este estudio amplía nuestra comprensión de la actividad antiviral del IFITM3 y enriquece nuestro conocimiento de las respuestas inmunes innatas a la infección por HTNV. Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de las guías de investigación biomédica en las que participan participantes humanos establecidas por la Comisión Nacional de Salud y Planificación Familiar de China. El Comité de Ética Institucional del Hospital de Tangdu aprobó este estudio. Todos los sujetos dieron consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Antes de la inclusión, todos los participantes fueron informados de los objetivos del estudio y firmaron el formulario de consentimiento antes de obtener muestras de sangre y registros médicos. El diagnóstico de HFRS se basó en los síntomas y signos típicos, así como en anticuerpos IgM e IgG positivos frente a la NVHT en el suero evaluado por el ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA) en nuestro departamento. La clasificación de la gravedad de HFRS y los criterios de exclusión fueron descritos de la siguiente manera (21): glóbulos blancos (WBC), plaquetas (PLT), nitrógeno de urea sanguínea (BUN), creatinina sérica (Scr) y linfocitos heteromórficos que fueron probados por el Departamento de Laboratorio Clínico (mostrados en la Tabla 1 ). De acuerdo con los síntomas y signos clínicos, tales como fiebre, derrame, hemorragia, edema y función renal, la gravedad del HFRS puede clasificarse como previamente descrito (21): 1) pacientes leves fueron identificados con insuficiencia renal leve sin una etapa oligúrgica obvia; 2) pacientes moderados fueron aquellos con síntomas obvios de uremia, derrame (conjuntiva bulbar), hemorragia (piel y membrana mucosa) e insuficiencia renal con una etapa oligúrica típica; 3) pacientes graves tuvieron uremia grave, derrame (conjuntiva bulbar y <50 ml/día) durante ≤2 días; y 4) pacientes críticos presentaron ≥1 de los siguientes signos durante la enfermedad: shock refractario, hemorragia visceral, insuficiencia cardíaca, edema cerebral, infección secundaria y pérdida grave de la piel, de la piel y de la mucosa, de la oliguria (50 ml/día) durante ≤5 Debido a la cantidad de la muestra requerida para la mecanografía del SNP, los pacientes leves y moderados fueron evaluados juntos en el grupo leve, y combinamos pacientes graves y críticos como grupo severo. Los criterios de exclusión para este estudio fueron los siguientes: (1) cualquier otra enfermedad renal, (2) diabetes mellitus, (3) enfermedad autoinmune, (4) enfermedad hematológica, (5) enfermedad cardiovascular, (6) hepatitis viral (tipos A, B, C, D o E) o (7) cualquier otra enfermedad hepática. Además, ningún paciente recibió corticosteroides u otros fármacos inmunomoduladores durante el período del estudio (21). El ADN genómico se extrajo de la sangre periférica de los pacientes utilizando el kit de aislamiento del ADN de PureGene (Gentra Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). La región que abarca el IFITM3 humano rs12252 fue amplificada por PCR (primario delantero, 5′-GGAAACTGTTGAGAAACCGAA-3′ y primer inverso, 5′-CATACGCACCTTCACGAGT-3′). Los productos PCR fueron purificados y secuenciados utilizando un analizador de ADN de Biosistemas Aplicados 3730xl (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Las frecuencias de alelos y genotipos de Han China saludable y otros grupos se obtuvieron a partir del proyecto de 1.000 genomas (http:// www.1000genomes.org). La carga de HTVV en muestras de plasma (recogidas durante la fase aguda) de 24 pacientes HFRS de edad y sexo con diferentes genotipos se midieron utilizando métodos notificados previamente (2). Brevemente, el ARN viral se extrajo del plasma de pacientes con HFRS utilizando kits de ARN/ADN viral Purelink (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El kit de sistema RT-PCR cuantificativo Platinum One-Step (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) fue empleado para el ensayo RT-PCR en tiempo real. Los imprimadores y sonda (proporcionados por Sangon Biotech, Shanghai, China) fueron los siguientes: adelante, 5′-TACAGAGGGAAATCAATGCC-3′, reverso, 5′-TGTTCAACTCATCTGATCCTT-3′, y sonda, 5′-(FAM) ATCCCTCACCTTCTCTCGCGCTTATCTC (TAMRA)-3′. Se utilizó como calibrador cuantitativo el segmento sintético S de la cepa estándar HTNV 76-118 ARN transcrita. El estándar externo fue el sobrenadante de cultivo de células Vero E6 infectadas con HTNV 76-118, que fue cuantificado utilizando calibradores cuantitativos sintéticos. Para cada experimento, se extrajo un alícuota de estándar calibrado 76-118 en paralelo con las muestras clínicas y se diluyó en serie 10 veces con concentraciones que iban de 10,56 a 2,56 log10 copias/ml. PCR se realizó utilizando un Ciclor iQ5 (Bio-Rad, Hércules, CA, EE.UU.) con las siguientes condiciones: 42°C durante 15 min, 95°C durante 2 min, y 50 ciclos de 15 s a 95°C, 30 s a 53°C y 30 s a 72°C. La Las células HUVEC (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) fueron cultivadas en ECM BulletKit (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) en una incubadora de CO2 al 5%. Las células A549 (ATCC Cat# CRM-CCL-185, RRID:CVCL_0023) fueron cultivadas en nuestro laboratorio en DMEM con 10% FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) en una incubadora de CO2 al 5%. Las células fueron utilizadas dentro del paso 10 después del cultivo primario. La cepa HTNV 76-118 fue cultivada en células Vero E6 (ATCC Cat# CRL-1586, RRID:CCL_0574) en nuestro laboratorio y tituladas utilizando un ensayo de tinción de inmunofluorescencia para El TCID50 fue de 10 5 /ml, que se calculó utilizando el método Reed-Muench. La IFN-α2a humana recombinante se obtuvo de PBL Interferon Source (Piscataway, NJ, EE.UU.) y se disolvió en el tampón proporcionado por el fabricante (composición no revelada). Las células HUVEC y A549 fueron infectadas por incubación con HTVV como moi indicado a 37°C durante 60 minutos. Posteriormente, la solución del virus fue removida y se añadió un medio fresco al cultivo celular. Las células fueron transfectadas con vectores lentivirales de C-Myc-tagged IFITM1, IFITM2, IFITM3 e IFITM3 NΔ21 (comprado de GENECHEM, Shanghai, China) en un moi de 10. Se utilizó la puromycin (2 μg/ ml para HUVEC y 6 μg/ml para células A549) para crear líneas celulares que expresaban los IFITM de forma estable. Las células fueron transfectadas con ARN de interferencia corta (siRNA), IFITM1 siRNA, IFITM2 siRNA, o IFITM3 siRNA (10 nM) usando reactivo de transfección de Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los siRNAs fueron comprados a Orígene (Rockville, MD, USA), y las secuencias no fueron reveladas. El ARN total fue extraído usando reactivo de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), y cDNA fue sintetizado usando el kit K1622 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se realizó utilizando SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology Co., Dalian, China) con un ciclor Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, Hércules, CA, EE.UU.). Los primeros (Sangon Biotech, Shanghai, China) eran los siguientes: IFITM1 (a continuación, 5′-ACTCCGTGAAGTCTAGGGACA-3′ e inversa, 5′-TGTACAGAGAGAGAGATACCAG-3′); IFITM2 (a continuación, 5′-ATCGCGCGACACCAT-3′ e inversa, 5′-TGTCCCTAGACTTCAGAGAGAGGA-3′); IFITM3 premRNA (a continuación, 5′-CATAGCGCGCGCTACCAT-3′ e inversa, 5′-CGGCCAACCTCTCTCTGGGG-3′); HHTTM3 premRNA (a continuación, 5′-GCCGAGACGGGGG-3′ e inversa, 5′-CGGCCATCTCTCTCTCTCTCTGGG-3′); S seg Para la detección de miR-130a, cDNA fue sintetizado usando el kit de transcripción inversa de microRNA de TaqMan (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) con un imprimador específico en el kit de ensayo de TaqMan específico para el gen (000454, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). El nivel de MiR-130a fue determinado usando el kit de ensayo de TaqMan específico para el gen (000454, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). U6 (001973, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fue usado como un control endógeno (23). Debido a que los niveles de pre-mRNA pueden representar la tasa de transcripción inicial (24), los imprimadores utilizados para detectar el pre-mRNA de IFITM3 fueron diseñados para el intron de I IFITM3 tiene dos exones y un intron. Para qPCR de IFITM3 pre-mRNA, los imprimadores delanteros fueron posicionados en el intron, y el imprimador inverso fue posicionado al principio del segundo exon (24). Debido a que la expresión basal de IFITM3 es baja en las células A549, detectamos IFITM3 mRNA y pre-mRNA en las células A549 después del tratamiento con IFN-α2a (20 UI/ml durante 12 h) después de la sobreexpresión de NRIR. Los lisatos celulares fueron preparados utilizando el tampón Radio Inmunoprecipitation Assay (RIPA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Cantidades iguales de proteína (20 μg de proteína/lana) fueron electroforizadas en un gel de 10%-SDS-poliacrilamida y transferidas electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Después de bloquear con 5% de albúmina sérica bovina en solución salina trisbuferada a temperatura ambiente durante 1 h, las membranas fueron incubadas con anticuerpos contra IFITM1 (Grupo Proteintech Cat# 60074-1-Ig Lot# RRID:AB_2233405), IFITM2, IFITM3 (Grupo Proteintech Cat# 66081-1-Ig Lot# RRID:AB_11182821), y β-actina (Proteintech, Wuhan, Hubei, China) o HTVN NP (proporcionado por el Departamento de Microbiología, la Cuarta Universidad Médica Militar) durante la noche a 4°C. Las membranas fueron luego lavadas e incubadas con anticuerpo IgG (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) Las manchas fueron desarrolladas utilizando un kit mejorado de detección de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA, USA) y visualizadas con película de rayos X. Las densidades de blot fueron analizadas con el software Quantity One (Bio-Rad, Hércules, CA, USA). Además, el búfer RIPA contiene 50mM Tris (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicholato de sodio, 0,1% SDS. Se añadió un cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Basel, Suiza) antes de su uso. Las células fueron cultivadas en lamas de vidrio (Millipore, Billerica, MA, USA) hasta que fueron semiconfluencia y luego incubadas con HTNV durante 60 min (moi = 1). En los momentos indicados después de la infección por HTVV, las células se fijaron con un 4% de PFA, incubadas con un 0,3% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), y bloqueadas con 5% de BSA durante 1 h. Tras la incubación con un anticuerpo monoclonal de ratón contra c-myc-tag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich Cat# M5546), IFITM3, glucoproteína 1 de membrana asociada al lisosoma (LAMP1, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, USA), o HTVN NP a 37°C durante 2 h, las células fueron lavadas e incubadas con anti-rabbit Ig conjugada con Alexa 555 y anti-mouse Ig conjugada con Se utilizaron un sistema de microscopio de fluorescencia Olympus BX51 y un sistema de microscopía confocal FV1000 (Olympus, Tokio, Japón) para capturar las imágenes. Ensayo de unión y entrada hTnV Las células transducidas con IFITM3 o el vector vacío fueron desprendidas y lavadas extensamente con PBS fríos. Las células y HTVV fueron pre-refrigeradas sobre hielo durante 30 min, mezcladas a un moi de 1 e incubadas a 4°C durante 1 h con rotación. Parte de las células fueron lavadas extensamente con PBS frío-hielo y recolectadas para el ensayo de unión. Otra parte de las células fueron cambiadas a 37°C durante 2 h para permitir la entrada HTVV. El HTNV que permanecía en la superficie celular fue eliminado mediante tratamiento con proteinasa K (0, Para lograr la entrada directa de HTNV en las células por fusión de la membrana viral-plasma como control positivo, las células fueron pre-refrigeradas sobre hielo durante 10 min con 20 mM NH4Cl. La adsorción de HTNV (moi = 1) se realizó a 4°C durante 1 h. Las células fueron luego lavadas, y la fusión del virus con la membrana plasmática se desencadenó por incubación en medio bajo pH (20 mM succinato de sodio, pH = 5.5) durante 10 min a 37°C. La infección fue seguida por incubación durante 2 h a 37°C en presencia de 20 mM NH4Cl (26). El análisis de qPCR del segmento HTNV S se realizó para evaluar la influencia de IFITMs en la adhesión de células HTNV y la entrada de HTNV. Todos los Para el análisis de asociación del alelo y el genotipo rs12252 se utilizó la prueba exacta de Fisher, se utilizaron muestras independientes t-tests para datos normalmente distribuidos, se determinaron diferencias entre grupos mediante análisis de varianza en un solo sentido (ANOVA) con medidas repetidas, seguidas de la prueba post hoc de Bonferroni. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo, se examinó la relación entre el alelo y el genotipo cc iFiTM3 snP rs12252 c asociado con enfermedad grave de hFrs y una carga de plasma hTnV más altaPara determinar la significación clínica de IFITM3 SNP en infección por HTNV, se examinó la relación entre rs12252 SNP y la gravedad del HFRS en 69 pacientes. La secuenciación de 300 pb del locus IFITM3 abarcando SNP rs12252 en todos los pacientes incluidos. Luego, estratificamos a estos pacientes en leves y graves, según la evaluación clínica que se describe en la sección "Material y Métodos". Encontramos una frecuencia significativamente mayor del alelo C entre los pacientes con HFRS grave en comparación con el Han chino sano en la base de datos de secuencia de 1.000 genomas (68,29 vs. 52,16%, P = 0,0076). La frecuencia de rs12252 C en pacientes graves también fue mayor que los pacientes leves (68,29 vs. 46,43%, P = 0,013, Figuras 1A,B; Tabla 2 ). Estos datos sugieren que albergar rs12252 C alle aumenta el riesgo de sufrir enfermedad grave en individuos infectados por HTNV, con una proporción de probabilidades (IC Para los genotipos, el 43,90% de los pacientes graves tenían el genotipo CC, una frecuencia significativamente mayor que la base de datos de secuencias de genomas Han Chinese por 1.000 (genotipo CC 26,92%, P = 0,03), así como pacientes levemente infectados (14,29%, P = 0,02, Figuras 1A,B; Tabla 2 ). Sin embargo, individuos levemente enfermos no exhibieron una prueba exacta de Fisher para probar la asociación entre el alelo/genotipo rs12252 y la gravedad del HFRS. c) La carga de NVHT plasmática en pacientes con genotipo CC y pacientes con genotipo TC/TT, probada por el análisis qRCR. Cada símbolo representa a un paciente individual. Se utilizó una prueba t de muestras independientes para comprobar la diferencia de la carga NVHT entre grupos. *P Además, también se encontró que los pacientes con genotipo CC tenían mayor carga viral plasmática en fase aguda (Figura 1C). Estos resultados apoyan la noción de que la función normal de IFITM3 juega un papel crítico en la respuesta inmune a la infección por NHTV in vivo, lo que tiene una influencia sustancial en la manifestación clínica de HFRS. Estudios previos revelan que la proteína truncada IFITM3 producida por SNP rs12252 alelo C (Figura 2A, la parte faltante representa los 21 aminoácidos truncados de N-terminal de IFITM3, la hélice intramembrana y la hélice transmembrana se presentaron como cajas) conduce a una actividad anti-influenza deteriorada (14). Para probar la significación funcional de este polimorfismo en la infección por NHTV, transfectamos los alelos mayoritarios T o minoritarios C de la variante IFITM3 que producen proteínas truncadas de longitud completa o N-terminal (NΔ21) (Figura 2A) con c-mic-tag a la célula HUVEC y A549 usando vectores de lentivirus (Figura 2B). Luego, desafiamos las células con NHTV a moi = 1 durante 24 h y encontramos que las células con la variante C minoritaria eran más susceptibles a la infección por NHTV con mayor expresión del segmento S de HTVV (Figura 2C) y más positivas de NHTVP (Figura S3 en Material Suplementario). En efecto, en comparación con el control simulado (vector vacío) infectado, la proteína NΔ21 casi perdió la capacidad de inhibir la infección por NHTV tanto en células HUVEC como A549 (Figuras 2C,D ; Figura S3 en Material Suplementario). Para determinar el papel de la infección por NHTV en la inducción de IFITMs, qPCR así como Western blot de IFITMs se realizaron en células HUVEC y A549 (Figuras 3A,B ; Figura S1 en Material Suplementario). Si bien observamos sólo una regulación moderada del aumento de IFITM1, 2 y 3 mRNA y proteína en HUVECs después de más de 24 h postinfección; IFITM1, 2 y 3 mRNA, sin embargo, sólo fueron regulados transitoriamente en células A549 y no causaron ningún cambio significativo Derribamos la expresión IFITM1, 2 y 3 por transfección de sus siRNAs individualmente. El efecto de los siRNAs sobre la expresión de los IFITMs diana fue probado por qPCR en HUVECs (Figura S2 en Material Suplementario), y el efecto del mejor oligo contra cada IFITMs (IFITM1C, IFITM2A, IFITM3B) fue probado por Western blot en A549 (Figura 4A ) y células HuVEC (Figura 4B). Para evaluar el papel de los IFITMs en el efecto anti-HTNV de IFN-α2a, IFITM1, 2 y 3 fueron derribados respectivamente mediante transfecciones de los oligos anteriormente probados durante 12 h, seguidos por el tratamiento IFN-α2a (20 UI Las células fueron luego desafiadas con HTVN (moi = 1) durante 24 h. El segmento HTVN S y los niveles NP fueron significativamente suprimidos en las células HUVEC y A549 en respuesta al tratamiento con IFN-α2a. En particular, el derribo de IFITM3 restauró significativamente los niveles de HTVN S y NP en las células HUVEC y A549. El derribo de IFITM1 también restauró parcialmente el nivel de HTVN en las células A549 (Figuras 4C,D). Estos resultados demuestran que Para evaluar los efectos anti-HTVN de las IFITMs, se probó el efecto de la sobreexpresación de IFITM1, 2 y 3 sobre la infección por HTVN. Las células con marcado c-myc IFITM1, 2 y 3 fueron expresadas tanto en células HUVEC como en A549 (Figura 5A), y las células fueron rebatidas con HTNV (moi = 1) durante 24 h. El segmento HTNV S y los niveles NP fueron suprimidos por la sobreexpresión IFITM3 en células HUVEC (Figuras 5B-D). También fueron suprimidas al expresar IFITM1 e IFITM3 en células A549 (Figuras 5B-D). El efecto inhibidor de IFITM3 fue confirmado por el análisis de inmunofluorescencia de HTNV NP (Figura S3 en Material Suplementario). Estos resultados fueron de acuerdo con los resultados ARNi descritos anteriormente. Para determinar si IFITM3 inhibió la unión o entrada de HTNV, las células HUVEC y A549 fueron incubadas con HTNV (moi = 1) a 4°C durante 1 h, se lavó el virus no unido, y el ARN HTNV recogido en este momento representa el HTNV unido a la superficie celular. Después de la unión del virus, las células se desplazaron a 37°C durante 2 h para permitir la internalización de HTNV, y el ARN HTNV recogido en este momento representa el virus interiorizado celular. Como control positivo para la inhibición de la entrada del virus, incubamos un grupo paralelo de células con HTNV a pH = 5,5 como se describe en la sección "Materiales y Métodos". La expresión de IFITM3 no afectó la unión de HTNV (figura 6A Para dilucidar el mecanismo de la función IFITM3, se investigó la localización subcelular de IFTIM3 en las células del huésped. IFITM3 se encontró parcialmente localizado a LAMP1 + endosomas tardíos en los HUVEC analizados por microscopía confocal (Figura 6C). La colocalización de IFITM3 y LAMP1 + endosomas tardíos también se había encontrado en células A549 (27). Debido a que la transferencia a LAMP1 + endosomas tardíos es un paso necesario para la entrada de HTVV (28), este resultado proporciona una evidencia para el mecanismo anti-HTNV de IFITM3. La regulación mediada por LncRNA y microRNA de IFITM3 ha sido reportada en varios estudios. Se probó el cambio de reguladores previamente reportados de IFITMs, tales como NRAV, NRIR y miR-130a después de la infección por HTVN, entre los cuales el NRIR fue el único modificado (reproducida) después de la infección por HTVN (Figura 7A; Figura S4 en Material Suplementario) en HUVEC. Sin embargo, la expresión de NRIR no se modificó en las células A549. sobreexpresamos el NRIR en las células HUVEC y A549 utilizando el vector pcDNA3.1 (Figura 7B). Es importante destacar que la sobreexpresión de NRIR suprimió significativamente los niveles de ARNm y pre-mRNA y facilitó la infección por HTVN en las células HUVEC y A549 (Figuras 7C-E). Estos datos sugieren que l El virus Hantaan es un virus de ARN envuelto, de sentido negativo del género Hantavirus dentro de la familia Bunyaviridae. Causa HFRS, que es una amenaza importante para la salud pública en todo el mundo. También es un arma potencial para el terrorismo biológico. Los animales de reserva, generalmente roedores, son asintomáticos durante la infección persistente. A diferencia de los roedores, la infección por Hantavirus conduce a HFRS y síndrome pulmonar de Hantavirus (HPS) en los seres humanos (21). Las principales características clínicas del HFRS incluyen fiebre, hemorragia, hipotensión y lesión renal (1, 21), causando manifestaciones graves y muerte en algunos casos. El estándar actual de atención del HFRS se basa en el tratamiento sintomático y de apoyo. Se ha confirmado que la carga viral plasmática está asociada con la gravedad del HFRS, implicando la importancia de la viremia en la patogénesis del H Sin embargo, en la actualidad no se dispone de medicamentos antivirales directos para esta enfermedad. El interferón es la molécula clave para la respuesta antiviral y se ha utilizado como medicamento antiviral en muchas enfermedades. Se ha informado que la infección por HTNV induce una respuesta tardía de interferón tipo I (16). Sin embargo, el conjunto de ISG necesarios para la inhibición mediada por IFN de HTNV todavía no se ha identificado. Por lo tanto, la identificación de ISG que son eficaces contra HTNV es una estrategia atractiva para identificar nuevos objetivos terapéuticos. En este estudio, se demostró una frecuencia significativamente alta de los rs12252 alelos C y genotipo CC entre los pacientes con HFRS con enfermedad grave en comparación con los individuos levemente infectados y los chinos sanos Han. El alelo C y el genotipo CC rs12252 también se encuentran asociados con una mayor carga También descubrimos que la infección por HTNV induce IFITMs, y el alelo IFITM3 truncado producido por rs12252 C presenta una disminución significativa de la actividad anti-HTNV. Curiosamente, se encuentra que IFITM3 restringe la infección por HTNV con un mecanismo de inhibición de la entrada celular. De hecho, IFITM3 se encuentra localizado al endosoma tardío en las células huésped, que es una estructura necesaria para la entrada de HTNV. Además, encontramos que la infección por HTNV rincrregulada NRIR 48 h después de la infección, que regula negativamente la transcripción de IFITM3. Colectivamente, estos resultados sugieren que IFITM3, regulada por NRIR, inhibe la infección por HTNV, y su SNP rs12252 se correlaciona con la gravedad de la enfermedad y la carga viral Las propiedades antivirales de las proteínas IFITM se identificaron en 2009 en una pantalla de ARNi para los factores huéspedes que influyen en la replicación del virus de la gripe (29). IFITM1, 2 y 3 han demostrado poseer actividad antiviral en varios estudios. Everitt et al. demostraron que la gravedad de la infección por el virus de la gripe aumentó considerablemente en ratones IFITM3-knockout en comparación con animales salvajes (15). También se ha confirmado que diferentes miembros de IFITM inhiben la entrada celular de varias familias de virus (incluyendo filovirus, rabdovirus y flavivirus) (7, (9) (10) (11) 30). Por ejemplo, la infección por VIH-1 y VHC son inhibidas por IFITM1 (31) (32) (33) (34). Se cree comúnmente que los IFITM restringen la infección viral en la etapa de entrada celular (12 Estudios recientes sugieren que la ubicación celular de diferentes IFITMs puede influir en el rango de virus restringidos por cada proteína (5). IFITM1 impide la entrada del VHC porque colocaliza con CD81 en la membrana celular, interrumpiendo la endocitosis de partículas del VHC (32), mientras que IFITM3 limita el virus de la gripe en compartimentos endosómicos acidificados (27). En particular, las partículas del subvirus retrovirus (ISVPs), que no requieren acidificación endosomal para la entrada, no son inhibidas por la expresión IFITM3, lo que sugiere que IFITM3 puede funcionar en la etapa de entrada endosomal (35). Estudios que utilizan análisis de fusión de células celulares han sugerido que IFITM3 bloquea la entrada del virus envuelto al prevenir la fusión de la membrana viral con una membrana limitante de la célula Los resultados obtenidos mediante escaneo láser de dos fotones e imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) sugieren que las proteínas IFITM pueden reducir la fluidez de la membrana y aumentar la curvatura positiva espontánea en el prospecto exterior de membranas (36). En el presente estudio, demostramos que IFN-α2a (20 U/ ml) inhibió significativamente la infección por HTVV, el agotamiento mediado por siRNA de IFITM3 solo mitigó significativamente el efecto antiviral de IFN-α2a tanto en células HUVEC como A549, mientras que el agotamiento de IFITM1 solo alivió el efecto antiviral de IFN-α2a en células A549. La sobreexpresión de la infección por HTVV IFITM3 inhibió las células HUVEC y A549. La sobreexpresión IFITM1 también fue eficaz en Todos estos resultados sugieren que IFITM3 es un factor de control importante bajo infección natural de HTVV. Nuestros resultados también demuestran que la efectividad de IFITM3 es celular independiente, lo que está de acuerdo con los resultados de virus similares, como RVFV (18). Ensayos de unión y entrada, realizados mediante el control de la temperatura y el pH, mostraron que IFITM3 no influyó significativamente en la unión de HTVV pero inhibió la entrada de HTVV en células HUVEC y A549. De hecho, IFITM3 se localiza parcialmente al endosoma tardío de las células huésped, que es un sitio necesario para la entrada de HTVV. Sin embargo, fallamos en el seguimiento del transporte de HTVV en células infectadas posiblemente debido a la falta de virus marcado por fluorescencia. Además, IFITM1 también suprimió la infección por HTVV en Según un estudio reciente sobre la estructura tridimensional de IFITM3, hay una transmembrana C-terminal α-hélice y una intramembrana dos-N-terminal α-hélices (mostrada en la Figura 2A como cajas negras) en IFITM3 (14). Hay dos variantes de empalme que difieren por la presencia o ausencia de los primeros N-terminal 21 aminoácidos (parte suprimida, mostrada en la Figura 2A como línea punteada roja). Varios SNPs incluyendo 13 sinónimos, 13 sinónimos, 1 parada en el marco, y 1 aceptación del sitio del empalme han sido reportados en la secuencia traducida IFITM3 (15, 29). Entre ellos, el raro alelo SNP rs12252C de IFITM3 trunca la proteína tal como se describe anteriormente, lo que reduce la inhibición de la infección por el virus de la gripe en las células A549 (15). Demostramos que la proteína IFITM3 truncada también pierde la capacidad de inhibir la infección por HTVV in vitro. En los pacientes de Europa del Norte hospitalizados con gripe estacional o virus de gripe pandémica A, aumentó la homocigosidad del alelo C menor de SNP rs12252 en IFITM3 (37). En los pacientes chinos infectados con el virus de la gripe A (H1N1), también hubo un aumento de la frecuencia del alelo C y el genotipo CC de SNP rs12252 (13). En el presente estudio, observamos un aumento de la frecuencia del alelo C y Los pacientes portadores del genotipo CC también presentaron mayores cargas virales plasmáticas en comparación con los del genotipo CT/TT. Dada la función alterada de la proteína IFITM3 producida por la mutación C, y el hecho de que el enriquecimiento del alelo rs12252 C en pacientes con enfermedad grave y la mayor carga viral en pacientes con genotipo CC, esta fundación sugiere que el IFITM3 juega un papel fundamental en la respuesta anti-VHT in vivo. Especulamos que el nivel mucho más alto de alelo CC en la población sana de Han China en comparación con los caucásicos puede colocar a los chinos en un mayor riesgo de desarrollar enfermedades graves sobre la infección por NVHT, lo que requiere una investigación adicional. Por ejemplo, el lncRNA NEAT1 ha demostrado ser regulado por el virus de la gripe o la estimulación PolyI:C, que promueve la expresión IL-8 (38). lncRNA NRAV ha demostrado regular negativamente la transcripción inicial de IFITM3 y Mx1 al afectar la modificación histona de estos genes (25). lncRNA NRIR es un ISG no codificante, que se ha reportado regular negativamente la expresión IFITM1 y Mx1 en infección por VHC (20). Mir-130a también fue reportado como un regulador de IFITM1 (23). En este análisis, lncRNA NRIR fue regulado en HUVECs después de la infección por HTVV durante 48 h, la sobreexpresión de NRIR regula negativamente la transcripción inicial de IFITM3, evidenciada por la disminución de los niveles pre-mRNA así como mRNA La sobreexpresión NRIR también facilitó la infección por NHTV. Estos resultados indican que la regulación de la NRIR después de la infección por NHT está posiblemente involucrada en la activación de las respuestas inmunes innatas contra la infección por NHTV. También hemos evaluado otros reguladores potenciales de IFITM3 antes de elegir NRIR para un estudio posterior. Otro ARNn que puede regular IFITM3, es decir, NRAV (NR_038854), se mantuvo inalterado después de la infección por NHTV (Figuras S4A,B en Material Suplementario). Además, miR-130a, que potencialmente regula IFITM3, también no se alteró después de la infección por NHTV (Figuras S4C,D en Material Suplementario). En conclusión, este estudio reveló un papel crítico para IFITM3 en la infección por NHTV. Demostramos, por primera vez a nuestro conocimiento, que el IFITM3 es un ISG anti-HTNV recién identificado; su expresión está regulada negativamente por el NRIR; y su actividad antiviral parece a través de un mecanismo de inhibición de la entrada del virus en las células huésped. Además, descubrimos que el alelo y el genotipo del IFITM3 SNP rs12252 C se correlacionan con la carga de HTVV en plasma y la gravedad del HFRS; y el alelo del rs12252 C produce una proteína IFITM3 truncada (NΔ21) que atenúa su función anti-HTNV. Estos resultados proporcionan nuevas percepciones sobre el papel del IFITM3 en la regulación de la inmunidad innata contra la infección por HTLV, que es la base para identificar nuevos objetivos para desarrollar agentes novedosos contra esta enfermedad infecciosa en aUThOr cOnTribUTiOns ZX-y, BP-y, YC-t y MH-w realizaron los experimentos; WP-z, BX-f, LY-f, ZY y JZ-s diseñaron la investigación; HC-x, YW y WX analizaron los datos; TK y ZC-m proporcionaron datos clínicos; ZX-y y BP-y escribieron el artículo.
question: ¿Cuál es el reservorio de vectores animales para el virus Hantaan?
answers.text: roedores