context: La actividad bacteriana de 4- y 5-Chloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas frente a MRSAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4321674/SHA: f0e6cef57dbae030aea2f324e21e00945ac659cfAutores: Zadrazilova, Iveta; Pospisilova, Sarka; Pauk, Karel; Imramovsky, Ales; Vinsova, Jarmila; Cizek, Alois; Jampilek, JosefFecha: 2015-01-15DOI: 10.1155/2015/349534Licencia: cc-byAbstract: Una serie de nueve aislados clínicos de 2-hidroxi La concentración bactericida mínima se determinó mediante la subcultura de alícuotas desde la determinación del CMI hasta las placas de agar libres de sustancia. La cinética bactericida de los compuestos 5-cloro-2-hidroxi-N-[(2S)-3-metil-1-oxo-1-{[4-(trifluorometil)fenil]amino}butan-2-il]benzamida (1f), N-{(2S)-1-[(4-bromofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-4-cloro-2-hidroxibenzamida (1g), y 4-cloro-N-{2S)-1-[(3,4-diclorofenil)amino]-3-metil-1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se estableció mediante un ensayo de determinación del tiempo con una concentración final del compuesto igual a 1x, 2x y 4x MIC; los alícumos se eliminaron en 0, 4, 6, 8 y 24 h. El agente bactericida más potente fue el compuesto 1f con un notable efecto bactericida rápido dependiente de la concentración, incluso a 2 veces MIC a 4, 6 y 8 h (con una reducción en el recuento bacteriano que va de 3,08 a 3,75 log(10) UFC/ml) y a 4 veces MIC a 4, 6, 8 y 24 h (5,30 log(10) UFC/ml reducción en el recuento bacteriano) después de la incubación frente a MRSA 637118. El efecto bactericida fiable frente a otras cepas se mantuvo a 4 veces MIC a 24 h.Texto: La resistencia antibiótica de patógenos invasores se ha convertido en uno de los problemas de salud más difíciles y persistentes [1]. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se ha convertido en el patógeno multirresistente clínicamente más común [2] La prevalencia del MRSA está aumentando en todo el mundo y, según la información más reciente del Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades a partir de 2012 [4], puede considerarse alarmante en algunos países europeos, especialmente en Portugal y Rumanía, donde ≥50% de todos los aislados de S. aureus de infecciones invasivas fueron identificados como MRSA en 2012 (aunque, por ejemplo, en Rumanía la prevalencia del MRSA fue de 25-50% en 2010), seguido por Italia, Grecia y Polonia, con 25-50% de aislados de MRSA en 2012 (para comparación, en Polonia, los aislados de MRSA constituyeron 10-25% de todos los aislados de S. aureus en 2010). El fracaso del tratamiento de la vancomicina, el agente terapéutico anti-MRSA de elección, debido a las cepas con valores elevados de concentración mínima inhibitoria de vancomicina (MIC) (es decir, la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo) dentro del rango susceptible se describió previamente [5, 6]. Así, la aparición de MRSA (y S. aureus resistente a la vancomicina en los últimos años también [7] ) hace que el descubrimiento de nuevos andamios moleculares sea una prioridad, y la situación actual incluso requiere la reingeniería y reposicionamiento de algunas antiguas familias de fármacos para lograr un control adecuado de estas bacterias [8]. Sin embargo, para el tratamiento de las infecciones del torrente sanguíneo de S. aureus, los agentes antimicrobianos bactericidas se consideran superiores a los medicamentos La historia del uso clínico de salicilanilidas (2-hidroxi-N-fenilbenzamidas) se remonta a la década de 1940 en terapia de la capitis tinea, seguida por el descubrimiento de sus propiedades antihelmínticas a mediados de la década de 1950 [10]. Hoy en día, las salicilanilidas (SAL) son una clase de compuestos aromáticos que poseen una amplia gama de interesantes actividades farmacológicas, como la antihelmíntica [11], la antibacteriana [12, 13], la antimicobacteriana [13], la antifúngica [14] y la antiviral [15, 16], entre otras. A pesar de ser estudiada desde la década de 1960, el mecanismo de acción responsable de las actividades biológicas de estos compuestos no se ha explicado hasta ahora. Los últimos estudios los especificaron también como inhibidores selectivos de la producción de interleucina-12p40 que desempeña un papel específico en la iniciación, expansión y control de la respuesta celular a la tuberculosis [18]. Además, las salicilanilidas han sido reconocidas como inhibidores de algunas enzimas bacterianas, como sortasa A de S. aureus [19], d-alanina-d-alanina ligasa [20], o transglicosilasas de S. aureus (pero no de M. tuberculosis) [12]. Estas enzimas participan en la secreción de diversas proteínas o en la biosíntesis de la pared celular bacteriana. Recientemente, los derivados similares a salicilanilidas fueron descritos para inhibir dos enzimas esenciales para la micobacteria: (i) metionina aminopeptidasa, catalizando un paso clave de la modificación posttranslacional de las proteínas nacientes, y (ii) isocitrato liasa, que es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos [21]. Así, las SAL parecen ser candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos con un nuevo mecanismo de acción. Estos nuevos agentes podrían ser una solución a los desafíos de resistencia. Este estudio es un documento de seguimiento de un artículo publicado recientemente [13]. La síntesis de la serie de nuevos derivados de salicilamidas, 4 y 5-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas, llamadas diamidas debido a su esqueleto (para la estructura general ver Tabla 1 ), fue descrita previamente [13, 22], y se reportaron sus actividades antimicobacterianas y antibacterianas contra diversas especies bacterianas [13]. Como estos compuestos expresaron una actividad antibacteriana muy significativa con bajos valores de CMI frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, decidimos ampliar el conocimiento sobre las propiedades antibacterianas de estos compuestos frente a MRSA. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad bactericida in vitro global de nueve diamidas recientemente sintetizadas en dependencia del tiempo y de la concentración frente a aislados clínicos de MRSA como representantes de bacterias multirresistentes, siendo el primer estudio que se refiere a la evaluación de las características microbiológicas nuevas de los análogos de SAL y revelando su efecto bactericida. La vía sintética de la serie de nuevas diamidas fue descrita recientemente [13, 22] y sus estructuras (véase el cuadro 1) fueron confirmadas por la espectrometría IR, NMR y MS, y la pureza de los compuestos fue verificada por el análisis CHN [13, 22]. [27] ; y MRSA SA 3202 [27] (Instituto Nacional de Salud Pública, Praga, República Checa) ambos de origen humano. Las colonias sospechadas fueron confirmadas por PCR; se detectó un fragmento de 108 pb específico para S. aureus [28]. Todos los aislados fueron probados para la presencia del gen mecA que codificaba la resistencia a la meticilina [29]. Estos tres aislados clínicos fueron clasificados como vancomicina-susceptible (pero con un CMI más alto de vancomicina igual a 2 g/ml (VA2-MRSA) dentro del rango susceptible para MRSA 63718) meticilina-resistente S. aureus (VS-MRSA). Para los CMI de vancomicina, ver Tabla 1. Vancomicina-susceptible meticilina-susceptible Staphylococcus aureus (VS-MSSA) ATCC 29213, obtenido de la American Type Culture Collection, se utilizó como cepa Las bacterias fueron almacenadas en −80oC y se mantuvieron en placas de agar de sangre (base de agar de Columbia con 5% de sangre de ovino) entre experimentos. (MBCs) Los MBCs (es decir, las concentraciones más bajas de agentes antibacterianos requeridas para matar una bacteria particular) fueron determinados subculturbando alícuotas (20 L) de pozos sin crecimiento bacteriano visible y de pozos de control de la determinación del MIC en placas de agar de Mueller-Hinton (MHA) libres de sustancia. Las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37oC durante 24 horas para el recuento de colonias. El MBC se definió como la concentración más baja de sustancia, que produjo ≥99,9% de muerte Tabla 1 : Estructuras químicas y valores in vitro de MIC y MBC [ g/mL] de 5 y 4-cloro-2-hidroxi-N-[1-oxo-1-(fenilamino)alkan-2-il]benzamidas probadas (efecto bacterial de compuestos individuales frente a cepas particulares marcadas en negrita). después de 24 h de incubación en comparación con el recuento de colonias del inóculo inicial [30]. Para garantizar la reproducibilidad, cada ensayo de MBC se realizó por lo menos triplicado en ocasiones separadas. N H O H N O OH 1 2 R 1 R 3 R 2 Comp. R 1 R 2 3 MIC [ g/mL] MBC [ g/mL] 1 2 3 4 2 3 4 1a 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH 3 >256 >256 >256 >256 128 >256 1c 5-Cl 4-CH 3 (S)-bencil >256 >256 >256 >256 >256 >256 -256 1d 5-CH 3 (R)-CH 2 -indolyl >256 >256 >256 >256 >256 >4-C -256 1e 5-Cl 4 (S) 4 (S) 1 CH 3 256 356 >1 556 >456 >456 >1 5-C Brevemente, los frascos que contienen caldo fresco estéril Mueller-Hinton (MHB) con el agente antimicrobiano apropiado fueron inoculados con el organismo de ensayo en fase de crecimiento logarítmico para obtener el inóculo inicial con una concentración de aproximadamente 7,5 × 10 6 UFC/ml (las concentraciones reales de inóculo oscilaron entre 0,9 × 10 5 y 2,9 × 10 6 UFC/ml) y una concentración final del antibiótico igual a 1x, 2x y 4x MIC en volumen de 10 ml. Para la determinación de los recuentos viables, se eliminaron alícuotas en 0, 4, 6, 8 y 24 h puntos de tiempo después de la inoculación, se diluyeron en serie en solución salina estéril tamponada, y se plasmó alícuota (20 L) en placas MHA en duplicado. Se realizaron recuentos El transporte antimicrobiano fue controlado por dilución e inspección visual de la distribución de colonias en las placas con la observación de una posible inhibición del crecimiento en el sitio de las rayas iniciales. Las placas fueron incubadas a 37oC durante 24 a 48 horas, y se determinó el número de colonias. Para asegurar la reproducibilidad, cada experimento de matar el tiempo se realizó en duplicado en ocasiones separadas con resultados presentados como la media de todos los experimentos. El control del crecimiento sin la adición de agentes antimicrobianos y el control conteniendo DMSO sin ningún agente antimicrobiano para excluir la actividad antibacteriana de este disolvente fueron incluidos. Se construyeron curvas de habilidad del tiempo trazando el registro 10 UFC por mililitro versus tiempo (más de 24 h), y se determinó el cambio en la concentración bacteriana. Los resultados fueron analizados evaluando el número de cepas que produjeron valores de Δ(log 10 UFC/ml) de −1 (correspondiente al 90% de muerte), −2 (99% de muerte) y −3 (99,9% de muerte) a 4, 6, 8 y 24 h en comparación con los recuentos a 0 h. La actividad bactericida se definió como una reducción de al menos 99,9% (≥3 log 10 ) del recuento total de UFC/ml en el inóculo original. Las diamidas parecen ser candidatos prometedores para agentes antibacterianos con una actividad anti-MRSA muy fuerte, como se publicó recientemente [13]. En el presente estudio se evaluó la serie de nueve diamidas recientemente sintetizadas como agentes bactericidas prospectivos frente a los representantes de bacterias multirresistentes, tres aislados clínicos de MRSA y Staphylococcus aureus ATCC 29213 (meticilina-sosceptible) como cepa de referencia y control de calidad, ya que las SAL y sus análogos se conocen como compuestos con efecto bacteriostático [31], este es el primer estudio en el que se consideraron compuestos similares a las SAL como agentes bactericidas prospectivos y se evaluó la dependencia del efecto bactericida de estos compuestos en el tiempo y la concentración, por lo que se revelaron características microbiológicas absolutamente novedosas de estos compuestos en el presente estudio. Recientemente se publicaron valores MIC de diamidas expresados como concentraciones molares en mol/L [13]. Para permitir la comparación con los valores de MBC del presente estudio, se calcularon los MIC en g/ml y se registraron en la Tabla 1 junto con la actividad de los fármacos antibacterianos de referencia, ampicilina, ciprofloxacino y vancomicina. La actividad bactericida potencial de las diamidas se evaluó utilizando el ensayo de MBC [26]. Los valores de MBC de todos los compuestos probados también se registran en la Tabla 1. Basándose en los resultados obtenidos, todos los compuestos evaluados como activos según los valores de MIC de nuestro estudio anterior (1f-i) mostraron valores de MBC bajos o moderados frente a las cuatro cepas. Los valores de MBC de estos compuestos no superaron la concentración de fármaco más alta probada y variaron de 1 a 16 g/ml. En todos los casos, hubo valores comparables de MBC para los aislados clínicos de MRSA y La actividad bactericida se define como una relación de MBC a MIC de ≤4 [32]. La tabla 1 se expresa en negrita. Como se mencionó anteriormente, se sabe que las sales de sal presentan un efecto bacteriostático [31], por lo que fue muy interesante descubrir que las diamidas poseen actividad bactericida. El enlace amida (-CONH-) puede causar interacciones con una variedad de enzimas [33] ; por lo tanto, la presencia de dos enlaces amidas podría ser responsable del efecto bactericida de las diamidas contra el MRSA. La actividad de las sales de sal y sus análogos resulta de múltiples mecanismos, que todavía están en investigación; por ejemplo, se encontró que las sales de sal son capaces de inhibir las transglucosilasas en etapas posteriores de la biosíntesis de pared celular de S. aureus (incluyendo MRSA Estas enzimas catalizan el paso previo a la transpeptidación en la biosíntesis del peptidoglicano y son responsables de la polimerización del lípido II, que ocurre en la cara externa de la membrana [12]. Dado que los agentes antibacterianos dirigidos a la biosíntesis de la pared celular actúan como agentes bactericidas [30, 34], el fallo en la biosíntesis de la pared celular debido a la inhibición de las transglicosilasas podría ser responsable de la actividad bactericida de las diamidas frente al MRSA. Basándose en estos hallazgos, las diamidas activas antibacterianas con efecto bactericida frente a las cuatro cepas probadas como agentes bactericidas prospectivos fueron seleccionadas para estudios de curva timehabilidad posteriores para determinar la dependencia real del efecto bactericida de la concentración a lo largo del tiempo. 1-oxobutan-2-il}-2-hidroxibenzamida (1h) se probaron en estudios de time-kill a 1x, 2x y 4x MIC frente a todos los aislados de MRSA y la cepa de referencia S. aureus. El efecto antibacteriano de DMSO [35] utilizado como disolvente de los compuestos probados se excluyó en este ensayo, ya que las curvas de time-kill de este disolvente eran idénticas o muy similares a las del control de crecimiento. El grado de muerte bacteriana se estimó por el número de estas cepas que mostraban una disminución de 1 a 3 log 10 UFC/ml en el recuento celular viable en diferentes momentos después de la incubación. Se presenta un resumen de estos datos en la Tabla 2. Basándose en estos datos se puede concluir que la potencia bactericida de las diamidas probadas contra las cuatro cepas disminuyó No se observó actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para ninguna cepa y tiempo después de la incubación ensayada. A 4x MIC de las cuatro cepas, los compuestos 1f, 1g y 1h mataron 2, 1, y 2 cepas, respectivamente, a 8 h después de la incubación y 4, 2 y 2 cepas, respectivamente, a 24 h después de la incubación. Los hallazgos de estudios de time-kill para cada una de las cuatro cepas de estafilococos en exposición a los compuestos 1f, 1g y 1h se resumen en la Tabla 3. La actividad bactericida (es decir, disminución de ≥3 log 10 UFC/ml) se expresa en negrita. El tiempo no fue el factor predictivo que influyó en la actividad antibacteriana porque las diferencias logarítmicas en la UFC/ml desde el inóculo inicial fueron las mismas para 4 veces CMI (con la mayor eficiencia con una reducción en el recuento bacteriano de 5,30 log 10 UFC/ml) o muy similares para 2 veces CMI (con un crecimiento moderado después de 24 h causando una pérdida de actividad bactericida) a lo largo de 24 h. El efecto bactericida se mantuvo incluso a 2 veces CMI a las 4 h después de la incubación de esta cepa (reducción de 3,08 log 10 UFC/ml). Para las cepas restantes, se registraron aislados clínicos de MRSA SA 630, MRSA SA 3202 y S. aureus ATCC 29213, efecto bactericida fiable a 4x MIC a las 24 h después de la incubación para todas estas cepas con una reducción del recuento bacteriano de 3,22, 3,30 y 3,65 log 10 UFC/mL, respectivamente. Para el efecto bactericida compuesto 1g frente a MRSA 63718, se observó 2x MIC a las 6 y 8 h después de la incubación y 4x MIC a las 4, 6 y 8 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,10 a 3,58 log 10 UFC/mL. La muerte más eficaz se logró a 6 h para ambas concentraciones. Como en el caso del compuesto 1f, se observó un recrecimiento después de 24 h después Para los aislados restantes de MRSA, SA 630 y SA 3202, el efecto bactericida se produjo sólo a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,38 y 4,01 log 10 UFC/ml, respectivamente. El efecto bactericida más alto se registró para MRSA SA 3202 a 4 veces MIC a las 24 h después de la incubación. Se observó una reducción consistente con el efecto bacteriostático (0,03 a 2,37 log 10 UFC/ml) en otras concentraciones a lo largo del tiempo para ambos aislados. No se observó ningún efecto bactericida para la cepa de referencia de S. aureus; el compuesto 1g demostró un patrón de actividad bacteriostática frente a esta cepa con una reducción del recuento bacteriano de 0,07 a 2,33 log 10 UFC/ml a 4 veces MIC En otros casos, se observó un ligero aumento de los recuentos bacterianos (es decir, sobrecrecimiento) en comparación con el inóculo inicial, con valores que oscilaban entre 0,10 y 1,57 log 10 UFC/ml para esta cepa de referencia. Para el efecto bactericida 1h compuesto frente a MRSA 63718 se mantuvo a 4 veces MIC a 6 y 8 horas después de la incubación con una reducción del recuento bacteriano de 3,54 y 3,31 log 10 UFC/ml, respectivamente. Al igual que para 1 g, el efecto bactericida más potente se mantuvo a 6 horas después de la incubación. El recrecimiento a 24 horas después de la incubación se registró una pérdida de actividad bactericida similar a la de compuestos anteriores. Lo más probable es que la selección de mutantes resistentes sea responsable de este fenómeno [30] ; no se asume la degradación del fármaco en el medio de crecimiento, ya que el rebrote fue Número de cepas que mostraron el siguiente log 10 UFC/ml disminución a en el tiempo de incubación designado no observado para ninguna otra cepa probada. Para MRSA SA 630 la muerte dependiente de la concentración se registró en 4x MIC a las 6, 8 y 24 h después de la incubación con el log 10 diferencias en UFC/ml desde que el inóculo inicial fue muy similar con el tiempo (de 3,18 a 3,39 log 10 UFC/ml). Para MRSA SA 3202 el efecto bactericida confiable se mantuvo sólo a las 4x MIC a las 24 h después de la incubación con una reducción en el recuento bacterial de 3,02 log 10 UFC/ml. En cuanto al compuesto 1g, se observó actividad bacteriostática frente a la cepa de referencia S. aureus con una reducción del recuento bacteriano que variaba de 0,34 a 2,62 log 10 UFC/ml a 2x y 4x MIC. Se registró sobrecrecimiento (valores que van de 0,04 a 1,43 log 10 UFC/ml) a 1x MIC para esta cepa. Es de notar que en todas las cepas de estafilococos con similares MICs y MBCs para compuestos 1g y 1h la respuesta a la actividad antibacteriana de estos compuestos variaba con cepas clínicas de MRSA siendo eficazmente eliminadas y la cepa de referencia que no se ve afectada a 4x MIC. Existe una discrepancia entre los resultados bactericidas del ensayo de MBC en comparación con la cinética del tiempo-kill. Esta diferencia podría ser causada por la comparación de microtiter (ensayo de MBC) con diluciones de macrobrotes (ensayo de matar el tiempo) [36]. Por otra parte, aunque los ensayos de matar el tiempo son más intensivos en el trabajo y consumen más tiempo que los ensayos de MBC, se reconoce que proporcionan un mayor grado de caracterización del potencial de erradicación celular de los agentes antibacterianos [37]. En cuanto al efecto antibacteriano, no es generalmente importante si el agente antibacteriano es también bactericida a concentraciones más altas, porque la inhibición de la proliferación bacteriana generalmente logra un efecto terapéutico; el sistema inmunitario del paciente es capaz de hacer frente a la infección entonces [34]. Sin embargo, la terapia bactericida podría producir un mejor resultado en el tratamiento mediante una rápida reducción de la carga bacteriana [38]. Los agentes bactericidas están inequívocamente indicados. Teniendo en cuenta el aumento constante del número de pacientes inmunocomprometidos con endocarditis, meningitis o osteomielitis en los últimos años, es necesario lograr la muerte bacteriana y ampliar el espectro de agentes antimicrobianos con compuestos activos bactericidas [30]. El resultado clínico de la bacteriemia por MRSA está influenciado significativamente por vancomicina MIC. El fracaso del tratamiento superior al 60% para S. aureus con vancomicina MIC de 4 g/ml dio lugar al cambio del punto de ruptura de susceptibilidad de 4 g/ml a 2 g/ml por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en 2006 [23] así como por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) en 2008 [39]. Se ha recomendado que para las infecciones causadas por cepas de MRSA con niveles elevados de vancomicina MICs (2 g/mL), se considere tratamiento alternativo [40]. Cabe señalar que, en base a los ensayos de determinación del tiempo realizados en el presente estudio, todas las diamidas probadas (particularmente las compuestas 1f que presentaban un efecto rápido dependiente de la concentración bactericida incluso a 2 veces MIC) fueron más eficaces frente al MRSA aislado 63718, que es la cepa con un valor elevado de vancomicina MIC de 2 g/mL. La actividad frente a los aislamientos restantes con un valor de vancomicina MIC de 1 g/mL fue menor. Teniendo en cuenta la aparición de una susceptibilidad decreciente de vancomicina de los aislados de MRSA y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento con vancomicina, nuestro A partir de los resultados obtenidos, las diamidas pueden ser candidatas idóneas para estos compuestos activos bactericidas novedosos, presentando un prometedor punto de partida para futuras investigaciones para determinar la actividad real in vivo y el mecanismo exacto de acción. El presente estudio es la primera evidencia del efecto bactericida de los análogos de la SAL. Contra otras cepas, el efecto bactericida confiable se mantuvo en 4x MIC a las 24 h después de la incubación. Teniendo en cuenta la necesidad de ampliar el espectro de agentes bactericidas, las diamidas del presente estudio con un nuevo mecanismo de acción podrían presentar una solución muy prometedora e interesante a este desafío para el futuro.
question: ¿Qué enzima es esencial para el metabolismo de los ácidos grasos?
answers.text: isocitrato liasa