context: La secuenciación de nanoporos como herramienta de diagnóstico revolucionaria para complejos de enfermedades entéricas virales porcinas identifica el kobuvirus porcino como un virus entérico importantehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e8f0c51a8b1ec4b6ca5b6329eAutores: Theuns, Sebastiana; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Marilou; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J. Fecha: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Licencia: cc-byAbstract: Las enfermedades entéricas en los cerdos a menudo son causadas por diferentes patógenos y por lo tanto la metagenómica son una herramienta útil para el diagnóstico. Las capacidades de secuenciación de nanoporos para diagnósticos virales fueron investigadas aquí. Primero, el virus de la diarrea epidémica porcina de cultivo celular y el rotavirus A fueron agrupados y secuenciados en un Minion. Las lecturas ya fueron detectadas a los 7 segundos del inicio de la secuenciación, resultando en profundidades de alta secuenciación (19.2 a 103.5X) después de 3 h. A continuación, se analizaron las heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad. Casi todas las lecturas (99%) pertenecían a bacteriófagos, que pueden haber modificado el microbioma del cer Por otra parte, el kobuvirus porcino se descubrió en las heces por primera vez en Bélgica. Los lechones chupadores eliminan el kobuvirus a partir de una semana de edad, pero durante un estudio de seguimiento no se observaron signos diarreicos y una asociación entre el pico de eliminación viral (10(6.42)–10(7.01) copias/swab) y signos diarreicos. El análisis retrospectivo mostró la difusión (n = 25.56.8% positivo) de kobuvirus genéticamente moderadamente relacionados entre los lechones diarreicos belgas. Minion permite la detección rápida de virus entéricos. Estas nuevas metodologías cambiarán los diagnósticos, pero se deben realizar validaciones más extensas. Debe cuestionarse la verdadera patogenicidad entérica del kobuvirus porcino, mientras que su importancia subclínica no puede excluirse. Texto: la metagenómica es un activo valioso para el diagnóstico en cerdos, lo que lleva al descubrimiento de nuevos virus e identificación de complejos de enfermedades entéricas virales porcinas. Aunque se han desarrollado procedimientos estandarizados para estudiar los metagenomas virales en muestras fecales, todavía requieren una extensa preparación de muestras, incluyendo preamplificación aleatoria o dirigida de genomas virales presentes en la muestra 13. La mayoría de las plataformas de secuenciación todavía requieren inversiones de capital y altas tasas de rotación de muestras para ser rentables. Realizar los análisis necesarios a menudo resulta en largos períodos de tiempo entre la llegada de la muestra y la notificación diagnóstica, ya que los resultados sólo pueden procesarse después de terminar la secuenciación. La secuenciación de tercera generación utilizando Minion (Oxford Nanopore Technologies, ONT) podría ser una herramienta de diagnóstico útil y asequible para la medicina veterinaria porcina, ya que Las células de flujo utilizadas para la secuenciación consisten en una membrana que contiene múltiples proteínas CsgG nanoporas de Escherichia coli 14. Se establece una corriente de iones a través de este poro que resulta en cambios típicos de la corriente tras el paso de nucleótidos específicos. Esta señal se convierte en una secuencia de nucleótidos mediante algoritmos computacionales (basecalling). Desde la liberación de la tecnología Minion, se han hecho grandes avances en cuanto al número y la calidad de las lecturas generadas 15. En el campo de la virología, la tecnología se ha aplicado principalmente en la medicina humana. Utilizando la secuenciación nanopora, fue posible distinguir tres poxvirus con similitud de nucleótidos del 98% a nivel de cepa 16. Minion también se ha utilizado como herramienta diagnóstica durante los recientes brotes de Ébolavirus Junto a un flujo de trabajo de bioinformática basado en ordenador portátil, Minion pudo detectar el virus de Chikungunya, el virus del Ébola y el virus de la hepatitis C en menos de 6 horas utilizando versiones anteriores de la tecnología 19. Un método multiplex PCR para la secuenciación completa del genoma del Zikavirus in situ en muestras con bajas cargas virales ha sido desarrollado recientemente por Quick y compañeros de trabajo 20. Los genomas parciales del virus del dengue fueron amplificados isotérmicamente seguidos de secuenciación, permitiendo la clasificación de cepas en serotipos 21. En la virología veterinaria, el uso de secuenciación del nanoporo está creciendo. Se identificó una nueva especie de papilomavirus en verrugas de jirafas, utilizando amplificación del círculo rodante y secuenciación del nanoporo 22. El genoma completo de un parapoxvirus aislado Un estudio ha reportado la detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de ARNc no amplificado creado a partir de ARNc poli-A mediante virus cultivados en cultivos celulares 24. Según el conocimiento del autor, el presente estudio es el primero que utiliza Minion como ayuda en el manejo de la salud porcina, con el objetivo de explorar las posibilidades de Minion como herramienta de diagnóstico rápida y fácil de usar en el manejo de la salud porcina para el diagnóstico de complejos de enfermedades entéricas virales. Se evaluó la capacidad de detectar altas cargas de rotavirus y coronavirus cultivados en cultivos celulares, imitando cantidades de derrame observadas en lechones diarreicos. En un segundo caso, se investigó la capacidad de detectar virus (novela) en heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad con diarrea. No se realizó preamplificación génica o aleatoria de ácidos nucleicos En este último caso se descubrió un kobuvirus porcino y en adelante se realizó un estudio longitudinal de campo para dilucidar los patrones de eliminación de este virus. Además, se investigaron muestras fecales de archivos (2014) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de dos semanas de edad para la presencia de kobuvirus, para estudiar su epidemiología en Bélgica. se realizaron 243.313 lecturas con una longitud media de 740 nucleótidos. Se filtraron lecturas con una puntuación q inferior a 7, resultando en 177.015 secuencias restantes (longitud media 816 nt) para su uso en análisis aguas abajo. Resultados de la secuenciación, incluyendo clasificación taxonómica y mapeo de lecturas contra genomas de referencia PEDV y rotavirus A (RVA) se muestran en la Fig. 1A. Después de 24 horas de secuenciación, un total de 15.232 lecturas fueron clasificadas como virales por comparación tBLASTx sensible frente a una base de datos viral completa. De éstas, el 39,3% (n = 5.985) y el 10,3% (n = 1.564) fueron asignadas a familias virales que incluían el virus de la diarrea epidémica porcina (familia Coronaviridae) y Rotavirus (familia Reoviridae, subfamilia Sedoreovirinae), respectivamente. Una fracción de las lecturas (29,3%, n = 4.468) fueron asignadas al orden Caudovirales. Estas lecturas se originaron en el ADN del fago lambda utilizado en un control previo en la misma célula de flujo. A los 7,5 y 24,2 segundos después del inicio de la secuenciación, respectivamente, las primeras lecturas coinciden con PEDV y RVA fueron translocadas a través de un 1B). Las secuencias PEDV y RVA fueron extraídas del conjunto de datos y cartografiadas con genes de referencia viral para calcular las profundidades de secuenciación en el tiempo (Fig. 1C). Después de una hora, las profundidades de secuenciación fueron mayores para PEDV (43.0X) que para RVA (4.9 a 22.1X). Se adquirieron profundidades de alta secuenciación después de tres horas de secuenciación para PEDV (103.5X) y para la mayoría de segmentos de genes RVA (19.2 a 48.2X). El ensamblaje de novo se ejecutó en las lecturas filtradas de calidad antes de la identificación (tBLASTx) para recuperar genomas virales, lo que resultó en la recuperación de los segmentos de genoma y gen PEDV casi completos con identidades que variaban entre 95 y 99% en comparación con los genes de referencia (Tabla 1). Sin embargo, la ejecución de ensamblaje de novo antes de la clasificación taxonómica (tBLASTx) redujo el tiempo para identificar genomas virales enteros en el conjunto de datos. La composición del viroma de un cerdito diarreico joven utilizando secuenciación nanopora. Se generaron un total de 30.088 lecturas mediante secuenciación de la muestra fecal diarreica durante tres horas. De éstas, 25.466 lecturas (q-score > 7, longitud media de lectura 653 nt) se utilizaron para análisis adicionales. Se utilizaron diferentes métodos para comparar las lecturas con una base de datos virales utilizando el grupo HPC de la Universidad de Gante y los resultados se muestran en la Fig. 2. La comparación con una base de datos viral completa resultó en la detección de 6.781 a 8.677 lecturas virales potenciales, dependiendo de la configuración BLAST. BLASTn resultó en una rápida Sin embargo, hubo una diferencia muy alta entre los tiempos de pared en el grupo HPC, con sólo 26 segundos de tiempo de análisis para BLASTn, frente a casi 24 horas para tBLASTx. La mayoría de las secuencias fueron asignadas a bacteriófagos dentro del orden Caudovirales y familias Siphoviridae (n = 3.213 a 4.163 lecturas), Podoviridae (n = 2.506 a 3.002 lecturas) y Myoviridae (n = 912 a 1.202 lecturas). Un conjunto de novo fue ejecutado en la base llamada, lecturas filtradas de calidad y los contigs resultantes fueron utilizados como material de entrada para el análisis VirSorter. Diecinueve contigs fueron clasificados como seguros (n = 4; categoría 1), algo seguro (=14; categoría 2) y no tan seguro (=1; categoría 3) ser contigs tipo fago (Fig La comparación de estos contigs con la base de datos de GenBank mediante BLAST permitió su clasificación en cuatro grupos diferentes. Diez contigs mostraron similitudes entre moderado y alto nucleótidos con el fago B124-14 de Bacteroides, lo que sugiere que todos ellos pertenecían a un genoma de fagotos, lo que también fue apoyado por el hecho de que todos estos contigs mapeados bien distribuidos a través del genoma de referencia de Bacteroides fago B124-14 (datos no mostrados). El contig más largo con un tamaño de 39,069 nucleótidos, junto con otros cuatro contigs mostraron similitudes (95% nt identidad) con diferentes fagotos de Escherichia. Dos contigs mostraron poca similitud tanto con el Enterococcus fage vB_EfaS_IME_196, aislado de las aguas residuales hospitalarias en China de una cepa de Enterococcus faecalis, como con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Este último podría ser un profago insertado en el genoma bacteriano. Curiosamente, se identificaron tres contigs para los cuales no se encontraron similitudes con virus existentes en GenBank, pero contig 0105 cartografiado al genoma de referencia del Enterococcus fage vB_EfaS_IME196 (datos no mostrados). Estos podrían ser fagos novedosos o variantes divergentes de los fagos existentes presentes en GenBank. Tres virus porcinos eucariotas, kobuvirus porcino (n = 18 a 22 lecturas), enterovirus G Los géneros Kobuvirus y Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, mientras que el género Mamastrovirus pertenece a la familia Astroviridae. Kobuvirus lee que fueron cartografiados contra una cepa europea de referencia S-1/HUN/2007/Hungría, como se muestra en la Fig. 2C. Sin embargo, no se obtuvo cobertura completa del genoma a alta profundidad de secuenciación. Cosechado de kobuvirus porcino y rotavirus en lechones lactantes. La eliminación de kobuvirus porcino, RVA y rotavirus C (RVC) se investigó cuantitativamente en 5 cerdos lactantes de la misma granja de la que se originaron las heces diarreicas. Los patrones de derrame fecal de los diferentes virus y la presencia de signos diarreicos se muestran en la Fig. 3A. Todos los lechones comenzaron a derramar kobuvirus porcino al final de En dos lechones (A y D) el desprendimiento se mantuvo y duró por lo menos 2 semanas (por encima del límite de cuantificación). Los títulos de desprendimiento máximo del kobuvirus porcino variaron entre 6,42 y 7,01 log 10 copias/swab, que es generalmente menor que el desprendimiento máximo observado para virus entéricos típicos como el rotavirus y el PEDV. Además, el pico de desprendimiento no se relacionó con episodios diarreicos, cuestionando el papel de este virus en la patogénesis de la diarrea en la granja. Los signos diarreicos sólo se observaron en dos lechones (A y B). En el lecho B, se observó una asociación entre el desprendimiento alto de VCR y episodios diarreicos. En contraste, no hubo asociación directa entre el desprendimiento máximo de kobuvirus y episodios Curiosamente, se observó un pico en el derrame de kobuvirus en el lechoncito C en el día 11 post-estrechamiento. Este animal murió en breve, pero no estaba claro si esto puede ser atribuible a la infección por kobuvirus. El derrame agudo de RVA se observó al final del período de lactancia en tres de cinco lechones, aunque todas las cerdas fueron vacunadas antes del parto utilizando una vacuna contra el rotavirus inactivada bovina. Análisis retrospectivo de los kobuvirus porcinos que se derramaron en cerdos lactantes diarreicos belgas y análisis filogenético. Un total de 44 muestras fecales diarreicas recogidas en 2014 fueron examinadas para detectar la presencia de kobuvirus utilizando el nuevo RT-qPCR. De estas, 25 muestras (56,8%) probaron positivas y 18 muestras mostraron cargas virales cuantificables (4,31 a 6,83 log 10 copias Siete muestras fueron positivas, pero las cargas virales fueron demasiado bajas para permitir una cuantificación precisa. La presencia de RVA y RVC había sido evaluada cuantitativamente en estas muestras en un estudio previo y la ocurrencia de coinfecciones entre rotavirus y kobuvirus se muestra en la Fig. 3B 25. Kobuvirus se encontró en proporciones iguales en muestras rotavirus negativos y positivos. Doce muestras contenían una única infección por rotavirus con una alta carga de RVA y en cuatro de ellas se observó una alta carga de kobuvirus (5.16 a 5.42 log 10 copias/g). Se encontró una única infección por RVC en siete muestras y en cuatro de ellas se demostró positiva para kobuvirus a altas cargas (4.31 a 5.59 log 10 copias/g). Se observó una infección por RVC/RVC doble en dos muestras, pero no contenía cargas cuantificables por kobuvirus. Muchas (n = 10) de las muestras negativas de rotavirus contenían altas cargas de kobuvirus. La cepa 17V079 mostró una gran similitud con otros aislados belgas de kobuvirus porcino desde 2014 (92,1 a 94,0% de identidad de secuencia de nucleótidos) y con la cepa de referencia húngara S-1/Hun/2017 (93,4%). Además, hubo un alto nivel de variabilidad genética entre los aislados belgas de kobuvirus porcino de 2014, con identidades de secuencia de nucleótidos que oscilaban entre 90,1 y 97,2%. Un análisis filogenético, utilizando el gen 3D de 17V079 y doce aislados belgas de 2014 (fig. 3C), muestra las cepas belgas que se agrupan entre cepas de diferentes lugares geográficos. La prevención y el tratamiento de problemas de enfermedades entéricas en lechones jóvenes se ve frecuentemente obstaculizado Los veterinarios están restringidos a una lista corta de virus conocidos, bacterias, parásitos y factores de manejo para definir un diagnóstico diferencial. Sólo las causas más probables de la enfermedad serán investigadas diagnósticamente, lo que a menudo conduce a resultados negativos, no concluyentes o incompletos. Sin embargo, los estudios de metagenomía han indicado la existencia de complejos de enfermedades entéricas virales, potencialmente involucrando múltiples virus conocidos y novedosos 3, 4, 6, 7, 9, 10. La detección de ácidos nucleicos a partir de patógenos utilizando enfoques metagenómicos basados en NGS es una solución parcial a problemas de pruebas diagnósticas y puede proporcionar una lectura completa de virus y otros patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, la mayoría de las plataformas NGS requieren grandes inversiones y el procesamiento de las lecturas sólo puede comenzar al final de la secuenciación. La metagenómica viral también requiere extensas preparaciones de laboratorio, incluyendo centrifugación, filtración y tratamiento de nucleasas para descartar los ácidos nucleicos bacterianos y hospedantes que constituyen la mayor parte de los ácidos nucleicos presentes 13. Además, la cantidad de ácidos nucleicos virales en una muestra es muy baja, requiriendo amplificación específica o aleatoria de estos genomas antes del análisis de NGS. La amplificación puede inducir sesgo y dificulta el desarrollo de tuberías de diagnóstico rápido debido a una pérdida de tiempo considerable. Todos estos factores conducen a un largo tiempo de rotación entre la recolección de muestras y la notificación diagnóstica. El dispositivo de secuenciación de tercera generación Minion (ONT), mantiene la promesa como plataforma diagnóstica, ya que permite secuenciar y análisis en tiempo real de todo el ADN/RN en una muestra, teóricamente sin necesidad de preampl Fue el objetivo del presente estudio evaluar esta tecnología para su uso como herramienta rápida para la identificación del complejo de la enfermedad entérica viral porcina, sin la conducción de amplificación del ácido nucleico viral. En un primer experimento, el cultivo celular de PEDV y RVA, conocidos por inducir diarrea en cerdos jóvenes, fueron agrupados a altas cargas imitando cantidades de derrame en lechones diarreicos. La secuenciación de esta muestra agrupada con el Minion resultó en una rápida identificación de ambos virus. El análisis en tiempo real de las lecturas de secuencia no fue realizado, pero es alcanzable como lo demostraron previamente Greninger y colegas utilizando la tubería de análisis SURPI para la rápida identificación de virus humanos de diferentes matrices clínicas 19. Interesantemente, la primera lectura coincide con PEDV y RVA fueron generadas respectivamente después de 7 y 24 segundos de secuenciación. Se adquirieron profundidades de alta secuenciación (43,0X) dentro de una hora de secuenciación para el PEDV y dentro de tres horas para la mayoría de los once segmentos genéticos del RVA (19,2-48,2X). En general, se generaron profundidades de secuenciación más altas para el PEDV que podrían indicar que la secuenciación de genomas virales más largos está favorecida sobre segmentos genéticos más pequeños, ya que el PEDV tiene un tamaño del genoma de aproximadamente 28 kb, y los segmentos genéticos del RVA son más cortos (0,6 a 3,3 kb). Este sesgo podría haberse introducido durante la ligadura de los adaptadores de secuenciación a los ácidos nucleicos virales. Se puede suponer que los adaptadores están más fácilmente unidos a fragmentos de ADN más largos, y se debe evitar el sesgo mediante la estandarización de la longitud de entrada de ácido nucleico viral. Mientras que la tecnología puede ser útil para dar lecturas rápidas de virus (<3 horas) presentes en una muestra, validación completa, utilizando existencias de virus bien definidas, experimentos de spiking en matrices (por ejemplo, heces) y muestras clínicas reales es necesario para asegurarse de que todos los miembros del complejo de la enfermedad entérica viral porcina están siendo diagnosticados con precisión. Además, la precisión de la tecnología necesita mayor mejora, ya que las tasas de error de los contigs de los conjuntos de novo todavía oscilaban entre 1 y 5%, obstaculizando el análisis preciso de mutaciones sutiles pero importantes en el genoma viral. Después de la identificación exitosa de los virus cultivados por células, el rendimiento de la Minion fue explorado más a fondo mediante el análisis de una muestra fecal diarreica de un lecho de leche de una semana de edad. Se realizaron análisis de PCR en tiempo real para RVA, RVC, PEDV Enterococcus hirae se aisló en un laboratorio de diagnóstico privado, pero esta especie bacteriana no se considera una causa típica de enfermedad diarreica en cerdos 26. La metagenómica viral se realizó en esta muestra utilizando el Minion y se utilizaron dos algoritmos de búsqueda BLAST diferentes para identificar taxonómicamente las lecturas comparándolas con una base de datos viral completa. En general, tBLASTx con un valor e de 10 −3 fue capaz de identificar las lecturas más virales en comparación con otras opciones de búsqueda realizadas. Sin embargo, las opciones de búsqueda de BLASTn también alcanzaron una alta sensibilidad, pero con un costo de tiempo mucho menor: 26 segundos en lugar de casi 24 horas. Para el análisis de lectura rápida y la búsqueda de secuencias virales no divergentes estrechamente relacionadas, BLASTn u otra metodología rápida debería utilizarse de manera preferente. Sin embargo, tBLASTx En la muestra 17V079 se identificaron tres virus porcinos, incluyendo el kobuvirus porcino, el mamastrovirus porcino y el enterovirus G. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas y no diarreicas de cerdos belgas y en las heces de cerdos de todo el mundo 9,10,27. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas (8,4%) frente a las no diarreicas (4,6%), los lechones de menos de 4 semanas de edad no fueron estadísticamente significativos. Asimismo, otros estudios han demostrado que el papel del astrovirus porcino en la patogénesis de la diarrea porcina no es completamente claro 28. En contraste, se han establecido asociaciones entre la diarrea y las infecciones por astrovirus humanos 29. Un estudio reciente realizado en 5 países europeos (Hungría, España, Alemania, Austria y Suecia) ha indicado la propagación de los astrovirus porcinos en la población porcina. Se ha encontrado una prevalencia de astrovirus cien veces mayor en cerdos diarreicos y no diarreicos de Austria y España. Los astrovirus porcinos también se han relacionado recientemente con brotes de trastornos neurológicos en lechones destetados de Hungría, y en cerdos y cerdas de 5 semanas de edad en los Estados Unidos 30, 31. El intestino podría ser un puerto hipotético de entrada para tales infecciones neurológicas por astrovirus. Los enterovirus se han relacionado más generalmente con trastornos neurológicos en cerdos, aunque se encuentran comúnmente en heces también 11, 12, [33]. En un estudio de Vietnam, no se encontró ninguna correlación significativa entre el estado de diarrea y la presencia de enterovirus G en heces 35. La participación de los astrovirus y enterovirus en la patogénesis de los trastornos entéricos puede ser cuestionada aquí, pero no se puede descartar completamente. Además, aunque se utilizaron aquí búsquedas sensibles tBLASTx, todavía existe la posibilidad de que un virus completamente nuevo esté presente en la materia oscura de la secuencia lee. Sin embargo, el reporte de un kobuvirus porcino en lechones belgas con Minion es único. En Bélgica, los kobuvirus sólo se habían encontrado anteriormente en muestras diarreicas de terneros y ganado joven en Bélgica 36. En el presente estudio, un nuevo ensayo RT-qPCR, dirigido al gen 3D conservado que codifica la ARN-ARN-polimerasa, fue desarrollado y utilizado para evaluar, por primera vez, la cinética cuantitativa longitudinal de derrame de kobuvirus porcino en cerdos en condiciones de campo. También se analizaron cinéticas similares para el rotavirus porcino A y C. Mientras los lechones lactantes comenzaron a despojarse del kobuvirus porcino a partir de una semana de edad, asociación entre el pico de despojamiento viral (6,42 a 7,01 log 10 copias/swab) y signos diarreicos. En un cerdo, se realizó una asociación entre episodios diarreicos y el pico de despojamiento del rotavirus C, un patógeno entérico bien conocido 37, 38. Muy interesantemente, las cargas fecales del kobuvirus fueron típicamente inferiores a las reportadas de virus entéricos bien descritos de los cuales la patogenicidad ha sido probada utilizando modelos de infección por cerdas, como PEDV y rotavirus [39] [40] [41]. También se encontraron cargas virales similares para el kobuvirus porcino (4,60 ± 1,76 copias/reacción de qPCR) y para el control de cerdos (4,79 ± 1,72 copias/reacción de qPCR) durante un reciente estudio danés para evaluar el papel de los virus en la patogénesis del nuevo síndrome de diarrea porcina neonatal. El estudio demostró que el kobuvirus, el astrovirus, el rotavirus A, el teschovirus porcino, el norovirus porcino y los coronavirus porcinos no estaban involucrados en la patogénesis del síndrome 42. El hallazgo de bajas cargas de kobuvirus en las heces arroja dudas sobre el verdadero tropismo patógeno entérico del virus. Hipotéticamente, es probable que su replicación no se distribuya a través de toda la vellosidad, sino que se limita a enterocitos en las extremidades de la vellosis La presencia de ARN del kobuvirus en el suero también se ha demostrado en cerdos húngaros, pero no se sabía si el virus también se está replicando en otros órganos 43. Tanto la vía orofecal como la alimentación de leche para lactantes cerdos podrían estar involucrados en la transmisión del virus. Las tasas más altas de infección se observaron en lechones lactantes, en comparación con cerdos mayores, en otros países [44] [45] [46]. En nuestro estudio, se observó un derrame relativamente largo de kobuvirus porcino en tres de cada cinco animales, lo que puede indicar que este virus puede inducir infecciones persistentes. Un estudio brasileño de 2011 demostró la presencia de ARN del kobuvirus en el suero de lechones de 3 días, que habían desaparecido para el día 21, indicando el aclaramiento viral de la sangre y excluyendo la persistencia sistémica 45. No se puede excluir una falta total de patogenicidad, ya que los kobuvirus porcinos pueden jugar un papel como virus subclínicamente importante. Estas propiedades subclínicas, aunque inmunosupresoras, se han atribuido al circovirus porcino porcino de importancia económica 47. De interés, uno de los lechones murió en el pico del derrame de kobuvirus, aunque no estaba claro si había causalidad entre la replicación del virus y la muerte del cerdito. Los experimentos in vivo con animales en un modelo de lechones neonatales, convencionales kobuvirus negativos se deben llevar a cabo para elucidar la patogénesis de los kobuvirus porcinos. Se intentó aislar el virus en diferentes líneas celulares (MA104, ST y SK), y células mononucleares de la sangre periférica. No hubo evidencia de efecto citopatógeno después de varios días de incubación. No se disponía de anticuerpos para visualizar la expresión de antígenos y, por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de replicación sin los informes científicos  (2018) 8:9830  DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 efecto citopatógeno evidente. Se intentará aislar el virus en cultivos enterocíticos primarios porcinos, una vez disponible. Para evaluar más ampliamente la prevalencia del kobuvirus en la industria porcina belga, se realizó un análisis retrospectivo de muestras diarreicas de lechones lactantes de menos de dos semanas de edad. Una proporción elevada (40,9%) de las muestras (n = 44) contenía cargas virales cuantificables que oscilaban entre 4,31 y 6,83 log 10 copias/g de heces. Las cargas virales encontradas fueron comparables a las cargas excretadas por lechones en el análisis longitudinal y el estudio mencionado de Dinamarca, demostrando la presencia endémica del virus en En el presente estudio, no se incluyeron lechones no diarreicos y, por lo tanto, no se puede establecer ninguna asociación entre la prevalencia del kobuvirus y la enfermedad. Sin embargo, la prevalencia del kobuvirus ha sido ampliamente descrita en cerdos de varios países europeos (Países Bajos (16,7%), Eslovaquia (63,4%), Hungría (81,0%), República Checa (87,3%), Austria (46,2%), Italia (52,4%), Alemania (54,5%) y Suecia (45,0%)), países americanos (Estados Unidos (21,9%) y Brasil (53,0%)), países africanos (Kenya (14,9%) y Uganda (15,5%) y países asiáticos (Tailandia (99%), Corea del Sur (52,1%) y Vietnam (29,3%) [44] [45] [46] [48] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [53]. En una pequeña proporción de estos estudios, se demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre la prevalencia de kobuvirus y la diarrea en cerdos, como en Hungría (prevalencia de 54,5% en cerdos sanos frente a 92,3% en cerdos diarreicos), España (47,5% en sanos frente a 74,4% en diarreicos), Brasil (41% frente a 78,4%), Tailandia (19,3% frente a 84,5%) y Vietnam (27,6% frente a 40,9%) 35, 45, 46, 52. De hecho, es difícil establecer correlaciones entre la prevalencia del virus y la diarrea, ya que la patogenicidad del virus podría estar influenciada en gran medida por otros factores como las coinfecciones con otros virus entéricos, la microbiota y los factores de manejo. Los aislados belgas mostraron una variabilidad genética moderada a alta, con identidades nucleótidas entre 90,1 y 97,2%. Además, se agruparon difusamente entre cepas de diferentes países del mundo, lo que indica que las cepas no se distinguen por su origen geográfico. Debido a que la mayor parte (99%) de las lecturas generadas durante la secuenciación de la muestra fecal 17V079 emparejaron bacteriófagos tras el análisis con BLAST, los bacteriófagos pueden haber jugado un papel importante en la patogénesis de la enfermedad diarreica. De novo se analizaron contigs ensamblados utilizando VirSorter, un paquete de software para extraer señales virales de datos genómicos microbianos. Tales herramientas permiten maximizar la posibilidad de detectar frágidos dsDNA 54. Varios contigs mostraron similitudes altas con el phage B124-14 de Bacteroides, encontrado en las aguas residuales municipales y muestras fecales humanas. Se demostró que estaba ausente en 30 muestras recogidas de El hallazgo de varios contigs, genéticamente similares a los fagos B124 y probablemente pertenecientes a un genoma de fagos, indica que este fago encontrado en la muestra fecal de cerdo también puede replicarse en el microbioma del intestino del cerdo joven y no sólo en humanos. Sin embargo, es posible que la capacidad de replicación del fago en el intestino del cerdo sea dependiente de la edad y que los grupos de edad muy jóvenes no fueron muestreados en estudios previos. Curiosamente, varios de los contigs encontrados también mostraron similitudes con los fagos de Escherichia. Dos de los contigs fueron similares a los fagos de Escherichia PhAPEC5 y PhAPEC7, aislados de ríos belgas en el barrio de avellanas y conocidos por causar infecciones líticas en Escherichia coli aviar. Las imágenes microscópicas de los fagos PhAPEC5 y PhAPEC7 indicaron que pertenecían a la familia Podoviridae 57. Otros dos contigs fueron similares a dos fagos Escherichia estrechamente relacionados, St11Ph5 y G7C, encontrados en las heces de aguas residuales y caballos, respectivamente 58. Finalmente, uno de los contig mostró similitud limitada a un Enterococcus fage, aislado de las aguas residuales del hospital en China, mientras que un último contig mostró similitudes moderadas con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Esta región puede ser un profago, insertado en el genoma bacteriano. Los fagos encontrados en este lechoncillo pueden haber remodelado la microbiota intestinal, permitiendo que bacterias oportunistas como Enterococcus hirae proliferen y comiencen a secretar toxinas. También es posible que una infección fagosa de bacterias en el intestino del cerdo llevó a un estado de estrés para estas bacterias, provocando la secreción de toxinas. El nuevo síndrome de diarrea neonatal descrito anteriormente muestra altas similitudes con la enfermedad descrita en el caso 17V079 y puede ser que los bacteriófagos están involucrados en la patogénesis de este síndrome. Hasta ahora, el papel de los fagos no se ha considerado en la patogénesis de varios trastornos entéricos, pero dada la gran abundancia aquí, debe ser en estudios futuros. Está claro que las nuevas tecnologías cambiarán la forma en que se realizan los diagnósticos en el futuro próximo. La fijación de precios podría ser actualmente un aspecto que obstaculiza el análisis de muestras de alta resistencia en la medicina veterinaria porcina, pero a medida que la tecnología evoluciona rápidamente, esto podría ser muy menos relevante. En una única lectura, en lugar de requerir diferentes ensayos diagnósticos, se dará una visión general completa de todos los virus y otros patógenos de una muestra. Sin embargo, se debe tener cuidado con la interpretación de tales resultados, ya que sólo deben ser analizados por veterinarios entrenados. Virus. Rotavirus porcino A (RVA) cepa RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] se aisló de un cerdito diarreico y creció durante tres pasajes sucesivos en células MA104 a un título de virus infeccioso de 10 7,8 CCID 50 / ml. Las secuencias de nucleótidos de los 11 segmentos genéticos de esta cepa se resolvieron antes utilizando la secuenciación de Sanger (números de adhesión de GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP4), KM820728 (VP6), KM820735 (VP7), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) y KM820693 (NSP5) 59. Una cepa del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, CV777) aislada en Bélgica en la década de 1970 se adaptó para el crecimiento en células Vero en la década de 1980 60. En nuestro Laboratorio, el virus fue cultivado a un título de virus infeccioso de 10 6,0 CCID 50/ml (número de adhesión de GenBank: AF353511). Origen de una muestra fecal de lechones lactantes diarreicos. Se recogió una muestra fecal diarreica de un cerdo belga en una granja con un total de 620 cerdas y utilizando un sistema de producción por lotes de 2 semanas, con una edad de destete de 23 días. Se cruzaron cerdas Topigs Norsvin con jabalíes Piétrain, produciendo 32 toxinas (Suiseng, Hipra). Se realizó una vacunación rotavirus sin etiqueta con una vacuna rotavirus A bovina inactivada (Lactovac, Zoetis). Hasta hace poco, los problemas diarreicos eran raramente presentes en los lechones lactantes y también se observaron porcentajes de mortalidad muy bajos (6,2-7,1%). Desde la primavera de 2017, la enfermedad entérica comenzó a causar problemas más graves acompañados de mortalidad en esta finca, principalmente en lechones lactantes de 7 días de edad. Se investigó una muestra fecal diarreica de este tipo de lechones en un laboratorio de diagnóstico privado (Dialab, Belsele, Bélgica) y etiquetada 17V079. No se encontró ninguna causa virológica que explicara los problemas diarreicos en la granja. La única bacteria aislada fue Enterococcus hirae. Esta bacteria fue añadida al programa de vacunación de cerdas (autovacuna inactivada). No se encontraron otros patógenos en esta muestra. Como el cuadro clínico insinuó una causa viral de la enfermedad, la muestra fue enviada al Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Ghent) para su posterior análisis. La muestra probó negativo para RVA, RVC, PEDV y TGEV utilizando los ensayos internos RT-qPCR 25, 61, 62. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis de metagenomía con Minion descrito en este estudio. Purificación de ácidos nucleicos virales. En primer lugar, el enriquecimiento viral se realizó con base en el protocolo NetoVIR para obtener ácidos nucleicos virales puros para la preparación de la biblioteca de secuenciación 13. En el Laboratorio de Virología Clínica (Instituto Rega, KU Leuven) se realizaron análisis Minion de virus cultivados en cultivos celulares RVA y PEDV, mientras que la muestra fecal diarreica fue analizada en el Laboratorio de Virología (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante). Las existencias de RVA y PEDV fueron centrifugadas a 1 El sobrenadante de ambas suspensiones se diluyó a 6 log 10 CCID 50/ml y 500 μl de cada suspensión se mezcló para alcanzar una concentración igual de ambos virus. Esta mezcla se filtró utilizando un filtro de poliéterulfono de 0,8 μm durante 1 min a 17.000 × g, seguido de un tratamiento de nucleasa durante 2 horas a 37 °C para digerir ácidos nucleicos libres en la suspensión: 250 μl de la muestra se añadió a 14 μl de tampón casero (1 M Tris, 100 mM CaCl 2 y 30 mMgCl 2, pH 8), 4 μl de Benzonase Nuclease (Millipore) y 2 μl de Micrococcal Nuclease (NEB) como se describió anteriormente 13. Se agregaron 14 microlitros de EDTA para detener la reacción, seguidos de la extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales mediante el kit QIAamp Viral ARN Mini Kit (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante, pero no se añadió ARN portador y se realizó la elución en 30 μl de AVE para concentrar el extracto de ácido nucleico viral. La muestra fecal diarreica 17V079 fue procesada de manera similar como el cultivo celular de virus crecidos, con algunas modificaciones menores. Se realizó una suspensión del 10% w/v de la diarrea en Medio Esencial Mínimo y centrífuga. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Sarstedt) y tratado con Benzonase Nuclease durante 1 hora para acelerar la tubería diagnóstica. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos fueron calentados a 95 °C durante 2 minutos y refrigerados sobre hielo para resolver las estructuras secundarias de ARN y para desnaturalizar el ARN de doble cadena. Se utilizó Superscript IV Transcriptasa Inversa (ThermoScientific) para generar ADNc. Se mezclaron diez microlitros de ácidos nucleicos plantilla con imprimaciones aleatorias de 0,5 μl (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μl dNTP mix (NEB) y 2,5 μl de agua libre de nucleasa. El primer recocido se realizó a 65 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 4 μl Superscript IV Reaction Buffer (ThermoScientific), 1 μl ditiothreitol (ThermoScientific) y 1 μl Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) en un volumen de reacción total de 20 μl. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 23 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 80 °C durante 10 min y un paso de retención infinito a 10 °C. Se generó un segundo hilo de ADN a partir de moléculas de ADN de una sola cadena (c) utilizando el kit de síntesis NEBNext Second Strand (NEB). Veinte microlitros mezcla de reacción a la ADNc fueron añadidos a 10 μl NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 5 μl NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix y 45 μl de agua libre de nucleasa (80 μl de volumen de reacción total). La amplificación isotérmica se realizó a 16 °C durante 1 h y los ácidos nucleicos de doble cadena fueron purificados utilizando 144 μl de AMPure XP magnética (Beckman Coulter). Se realizaron dos pasos de lavado con etanol recién preparado 70% antes de elutar en 52 μl de agua libre de nucleasa. Cincuenta microlitros de ADN amplificado (no) se mezclaron con 7 μl de buffer Ultra II de reacción de preparación final (New England Biolabs) y 3 μl de mezcla de enzima Ultra II de preparación final (New England Biolabs), y se incubaron a 20 °C durante 5 minutos y 65 °C durante 5 minutos. A continuación, los ácidos nucleicos se purificaron utilizando 60 μl AMPure XP Beads y se eludieron en 31 μl de agua libre de nucleasa. Los adaptadores de secuenciación, provistos con el Kit de secuenciación de ligadura 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), se ligaron a los ácidos nucleicos colados dA. El ADN preparado en el extremo (30 μl) se mezcló con una mezcla de adaptadores de 20 μl (AMX, ONT) y 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) en un volumen de reacción total de 100 μl e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. La biblioteca de secuenciación, que contiene ADN de doble cadena con adaptadores ligados a los extremos 3′, se purificó a continuación utilizando perlas de 40 μl AMPure XP. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando un tampón de fijación de cuentas de 140 μl Adaptador (ABB, ONT) antes de salir en 15 μl de tampón de elución (ELB, ONT). (EXP-LLB001, ONT), biblioteca adaptada y atada de 12 μl y agua libre de La secuenciación se realizó utilizando el programa de software MinKNOW software (ONT). Análisis bioinformáticos. Las lecturas en bruto fueron producidas por MinKNOW. Se activaron las llamadas de base en vivo para el primer experimento utilizando MinKNOW versión 1.5.5. En el segundo experimento, se omitió la llamada de base después de la secuenciación usando Albacore (versión 1.2.5., ONT). Se visualizaron puntuaciones de calidad y longitudes de lectura utilizando NanoPlot, seguidas de filtrado de calidad con NanoFilt 63. Se omitieron lecturas con una puntuación q inferior a 7. Se analizaron secuencias utilizando diferentes métodos BLAST, incluyendo BLAST y tBLASTx (BLAST versión 2.6.0; corte de valor electrónico 1e −3 -1e −10 ) para comparar sensibilidad y tiempos de ejecución para detectar secuencias virales entre las lecturas. Una base de datos viral completa se compuso de todas las secuencias de virus en GenBank (taxonomía ID 10239, que contiene secuencias hasta el 17 de septiembre de 2017). El mejor resultado (valor electrónico más bajo) se visualizó utilizando KronaTools 64. Se extrajeron los virus correspondientes utilizando Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se utilizaron en los análisis posteriores. GraphMap (versión 0.5.2) y Samtools (versión 1.6) se utilizaron para cartografiar lecturas contra secuencias de referencia, mientras que Canu 1.6 se utilizó para el ensamblaje de novo de genomas virales [65] [66] [68]. VirSorter se ejecutó utilizando la base de datos 'Viromes' para buscar fagos, con el Modo de Descontaminación Viromérico para identificar Los análisis bioinformáticos se realizaron en un clúster local de computadoras y en las instalaciones informáticas de alto rendimiento de la Universidad de Gante. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Secuenciación Sanger del gen polimerasa kobuvirus porcino. Se descubrió un kobuvirus porcino en la muestra 17V079 utilizando el Minion. La secuencia del gen 3D del kobuvirus porcino codifica la polimerasa y se considera que se conserva más entre diferentes cepas. La secuencia exacta de nucleótidos de este virus se verificó utilizando la reacción inversa de la cadena de la polimerasa transcription seguida de la secuencia de Sanger, ya que se obtuvo una baja cobertura con Minion. RT-PCR se ejecutó utilizando el OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) con los nuevos imprimadores Kobu_6049Fw y Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Tabla 2). La reacción RT-PCR contenía 5 μl 5 × Qiagen OneStep RT-PCR Buffer, 1 μl dNTPs, 3 μl de cada imprimador (10 μm), 7 μl de agua libre de nucleasa, 1 μl de mezcla enzimática OneStep RT-PCR y 5 μl de ARN plantilla o agua (volumen total de reacción de 25 μl). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min, seguidas de 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 90 s) y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Las reacciones se mantuvieron a 10 °C antes de cargar el producto PCR de 5 μl con 1 μl de tinte de carga en un gel de agarosa del 1,5%. La electroforesis se realizó durante 30 min a 100 V y el producto PCR se visualizó mediante tinción de bromuro de etidium y luz UV. El control de calidad de los cromatogramas en bruto se realizó utilizando 4Peaks (Nucleobytes BV, Países Bajos) y BLASTn (NCBI, Estados Unidos).Primeros específicos de RT-qPCR (Tabla 2) para el gen codificador de polimerasa del kobuvirus porcino se diseñaron utilizando Primerquest y Oligoanalyzer (IDT DNA Technologies) para permitir la cuantificación exacta en heces de lechones. Cada reacción RT-qPCR consistió en 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix que contenía SYBR Green, ROX y un tinte pipeteado azul inerte (Primerdesign, Southampton, Reino Unido), 0,4 μl de cada imprimador (200 nM) y 6,2 μl de agua libre de nucleasa. Se Un control positivo de ARN sintético (175nt) fue generado por RT-PCR utilizando los imprimadores Kobu3D_qPCR +T7_Fw y Kobu3D_qPCR_Rv, seguido por la transcripción in vitro de este producto PCR utilizando una polimerasa de ARN T7. El control positivo fue medido utilizando Nanodrop y utilizado para establecer una curva estándar sobre un rango dinámico lineal (LDR) de seis a un log 10 copias/reacción. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 55 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s) y recocido (58 °C durante 60 s). La detección de fluorescencia verde SYBR se realizó al final de cada fase de recocido. Se realizó un análisis de curva de fusión para evaluar la Cada punto de dilución en la curva estándar y cada muestra se probó en duplicados. Se analizaron los amplicones una vez en un gel de agarosa para evaluar la longitud correcta del amplicón y se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar la amplificación del gen de la polimerasa parcial del kobuvirus porcino. Los ensayos fueron válidos si la eficiencia sobre el LDR estaba entre el 90 y el 110%, y R 2 de la curva estándar replicada fue >0,99. La cuantificación de las cargas virales fue posible si los valores Cq de dos réplicas de qPCR cayeron dentro del LDR del ensayo. Ambas réplicas tuvieron que ser positivas para que una muestra se considerara positiva. Si los valores Cq de los amplicones específicos han caído detrás del punto más bajo de la curva estándar, la muestra fue considerada positiva pero no cuantificable. Tras la caracterización del viroma con el Minion, se realizó un estudio longitudinal de seguimiento entre agosto y septiembre de 2017. Para garantizar el estado de salud del ganado porcino, la entrada a la finca fue estrictamente regulada. El agricultor realizó la toma de muestras. Se proporcionaron instrucciones detalladas y materiales de muestreo al agricultor. La recolección de muestras en el estudio longitudinal de campo se realizó de acuerdo con la legislación europea sobre experimentos con animales. La recogida de muestras fue aprobada y realizada de acuerdo con los requisitos del Comité Ético Local de la Facultad de Medicina Veterinaria e Ingeniería Bioscience de la Universidad de Gante. Un día después del parto de las cerdas, se seleccionaron cinco camadas al azar. Dentro de cada camada, se identificó un lechoncito para el seguimiento longitudinal durante todo el período de lactancia. El hisopo se colocó inmediatamente en 2 ml de medio de transporte viral (salina fosfatada tamponada que contiene 1000 U/ml de penicilina (Continental Pharma, Puurs, Bélgica), 1 mg/ml de estreptomicina (Certa, Braine l′Alleud, Bélgica), 1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,01% v/v de Fungizona (Bristol-Myers Squibb, Braine l′Alleud, Bélgica)) en un tubo estéril de halcón de 15 ml (Sarstedt) y almacenado a −20 °C. Cada semana se recogieron muestras de la granja y se transportaron al Laboratorio de Virología. Se pidió al agricultor que marcara el tubo de cada muestra para detectar presencia o ausencia de signos diarreicos. A su llegada al Laboratorio de Virología, las muestras fueron descongeladas y colocadas en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para liberar partículas virales en el medio de transporte. Las muestras fueron extraídas utilizando el Kit Mini Patógeno QIAamp Cador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los ácidos nucleicos purificados se eludieron en 100 μl de AVE y se almacenaron a −70 °C hasta el análisis RT-qPCR. El análisis RT-qPCR se realizó, como se describe anteriormente, para cuantificar copias del genoma del kobuvirus porcino por hisopo. Además, se evaluó la eliminación de RVA y RVC utilizando los ensayos RT-qPCR descritos anteriormente en la casa 25, 61. Las muestras fecales (n = 44) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de 2 semanas de edad fueron enviadas a un laboratorio privado por veterinarios (Dialab, Belsele, Bélgica) para diagnóstico etiológico, como se describió anteriormente. Estas muestras fueron recolectadas en 2014 y almacenadas a −70 °C en el laboratorio. Anteriormente habían sido evaluadas para la presencia de rotavirus utilizando RT-qPCR 25. La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) como se describió anteriormente y RT-qPCR se realizó para cuantificar la carga de copias de ARN de kobuvirus. Las muestras con carga viral cuantificable fueron sometidas a RT-PCR para amplificar el gen polimerasa 3D, después de lo cual se realizó la secuenciación de Sanger. Las secuencias que codifican la polimerasa de 11 aislados de kobuvirus porcinos belgas fueron depositadas en GenBank con los números de adhesión MH184664-MH184674. Las secuencias fueron utilizadas para realizar una alineación de secuencias múltiples junto con otras cepas de kobuvirus porcino en MEGA 7 usando el plug-in ClustalW 69. Se construyó un árbol filogenético de tipo máximo con RAxML utilizando un modelo reversible de tiempo general con distribución gamma (20 gatos, alfa: 0,121, LogLK = 14938.461) y intercambio de rama heurística 70. La edición de árboles se realizó con Affinity Designer (Serif). Las distancias de pares se calcularon utilizando el modelo de distancia p en Mega con valores de bootstrap establecidos en 500 réplicas.
question: ¿Qué cepa fue similar a otras cepas de kobuvirus porcino belgas?
answers.text: 17V079