context: La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE  www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 mantiene la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.
question: Nombre algunos adyuvantes que se han utilizado con una vacuna contra la gripe.
answers.text: liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs)