context: Secuenciación del genoma completo y análisis filogenético de cepas humanas de metapneumovirus de Kenia y Zambiahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838e056ab5fcc98dfAutores: Kamau, Everlyn; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, MatthewFecha: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zLicencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO: El metapneumovirus humano (HMPV) es una causa La secuenciación del genoma completo permite una mejor identificación de eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con secuencias subgenómicas.RESULTADOS: Informamos de un método de secuenciación de próxima generación basado en 2 reacciones amplificadas para determinar las secuencias completas del genoma de cinco cepas HMPV, que representan tres subgrupos (A2, B1 y B2), directamente a partir de muestras clínicas. Además de reportar cinco genomas nuevos HMPV de África, examinamos la diversidad genética y los patrones de secuencia de genomas HMPV públicamente disponibles. Encontramos que la identidad general de la secuencia de nucleótidos fue del 71,3 y 80% para los grupos HMPV A y B, respectivamente, la diversidad entre los grupos HMPV fue mayor a nivel de aminoácidos para los genes de proteína de superficie SH y G, y múltiples subgrupos cocirculados en varios países. El análisis filogenético de todo el genoma mostró congruencia con los conjuntos de secuencias genéticas individuales excepto con los genes F y M2. CONCLUSIÓN: Esta es la primera caracterización genómica de genomas del VPHM de pacientes africanos. Texto: El metapneumovirus humano (VPHM) es un virus de ARN de una sola cadena en la familia Paramyxoviridae y está estrechamente relacionado con el virus sincitial respiratorio humano (VSR) [1]. El VPHM causa enfermedades respiratorias similares a la VSR, que van desde infecciones respiratorias superiores leves a bronquiolitis y neumonía [2]. Las infecciones por VPHM son estacionales y la coinfección con otros patógenos respiratorios es común [1]. El genoma del HMPV es de aproximadamente 13 kb y comprende ocho marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la glucoproteína de fusión (F), la proteína potenciadora de la transcripción (M2), la proteína hidrofóbica pequeña (SH), la glicoproteína de unión (G) y la proteína polimerasa grande (L) [3]. Las secuencias de las glicoproteínas de membrana F y G se utilizan para definir dos grandes genotipos o grupos, A y B, que además se clasifican en cuatro subgrupos (A1, A2, B1 y B2). El HMPV A2, el subgrupo más frecuentemente observado, se divide además en dos sublineaciones propuestas (A2a y A2b) [3]. Se informa que el HMPV tiene una importante contribución a las infecciones respiratorias Por ejemplo, la hospitalización asociada al VPHM se estimó en 6,5 por cada 1.000 años en lactantes de Soweto, Sudáfrica [4] ; en 4% en niños hospitalizados con IAR grave durante un período de 2 años en Camerún [5] ; y en la zona rural occidental de Kenia, la incidencia de VPHM asociada a IHM en las consultas ambulatorias fue estimada en 0,43 por cada 100 años/persona [6]. En Kilifi, Kenia costera, entre enero de 2007 y diciembre de 2011, los niños menores de 6 meses de edad representaron el 44% de los casos positivos del VPHM, mientras que el 74% eran niños menores de 1 año y el 1,3% (2/160) eran niños > 36 meses [7]. En los campamentos de refugiados de Dadaab y Kakuma en Kenia, se detectó VPHM en un 5,7% de hospitalizaciones, y la tasa de hospitalización bruta positiva por virus (por En Malí, la contribución del VPHM a la neumonía tuvo una fracción de población atribuible del 9% (95% IC: 7-11%) [9] ; mientras que en Marruecos [10], el 8,9% de los niños < 5 años admitidos con neumonía grave fueron infectados con VPHM. La prevalencia e incidencia del VPHM en otros lugares a nivel mundial, se indica en el expediente adicional 4: Tabla S1. Cabe destacar que las variaciones en las tasas de incidencia podrían atribuirse a la población en estudio, la estacionalidad e incluso los métodos de detección. Sin embargo, la epidemiología genómica del VPHM en África es insuficiente y no se documenta la comparación de similitudes genéticas y diferencias entre cepas africanas y mundiales. Las secuencias del genoma proporcionan recursos valiosos para caracterizar la evolución viral y la epidemiología de la enfermedad, y para identificar eventos de transmisión y brotes, lo que no siempre es posible con fragmentos subge El aumento del número de sitios de variantes filogenéticamente informativas obtenidos a partir de genomas completos puede permitir una mejor vinculación de los casos y ayudar a las intervenciones de salud pública en tiempo real durante epidemias [14, 15]. Los enfoques PCR para la secuenciación del genoma completo dirigida, en contraste con la amplificación aleatoria, pueden amplificar preferentemente el virus objetivo sobre los ácidos nucleicos del huésped o del medio ambiente [16, 17] potencialmente centrando la secuenciación en el virus de interés. Hasta la fecha, el conjunto de datos más grande de genomas enteros HMPV (n = 61) secuenciados de cualquier país tropical procede de tres ciudades peruanas, Lima, Piura e Iquitos [18]. org/, accessed April 30, 2019). Esto ha llevado a una comprensión limitada de la diversidad genética y genómica del HMPV en el continente. Este trabajo describe todo un enfoque de secuenciación del genoma (WGS) para el HMPV a partir de un pequeño número de muestras clínicas positivas del HMPV recogidas en Kilifi County Hospital en Kilifi, Kenia y University Teaching Hospital en Lusaka, Zambia. Los genomas fueron generados por secuenciación superpuesta PCR amplicons que abarcan todo el genoma. Estas son las primeras secuencias completas del genoma reportadas de cepas de HMPV de circulación local obtenidas directamente de muestras clínicas en África. También combinamos los nuevos genomas con secuencias disponibles públicamente para examinar patrones en diversidad genética global del HMPV. La secuenciación del genoma completo fue exitosa para las 5 muestras clínicas que se intentaron obtener de cada muestra, y la longitud de los 5 nuevos genomas del H En la Tabla 1 se muestran los parámetros de secuenciación y ensamblaje de datos, incluyendo la profundidad de la cobertura. La anotación secuencial de los genomas de larga duración utilizando Geneious R8.1.5 (https://www.geneous.com) identificó las ocho regiones genómicas esperadas de codificación ORF y no codificantes. La identidad general de nucleótidos (es decir, sitios idénticos promediando en todos los pares de secuencias y excluyendo posiciones que contienen huecos) entre las 143 secuencias del genoma analizadas (5 genomas nuevos más 138 de ViPR) fue 58,2%. La identidad de secuencia de nucleótidos fue 71,3% dentro de HMVV-A y 80% dentro de HMVV-B. Los genomas intrasubgrupo, A1, A2, B1 y B2 compartieron 92,1% (10 secuencias), 76,8% (secuencias 88), 91% (24 secuencia Para los 143 genomas del HMPV, comprobamos la conservación de la secuencia en las regiones de control transcripcional, en los terminis de cada gen, así como la longitud de las secuencias intergénicas entre los límites del gen. La longitud de la región intergénica del F-M2 fue diferente entre los virus del grupo A y B, es decir, 13 nt y 2 nt, respectivamente. Las regiones intergénicas del SH-G y G-L fueron las más largas, hasta 125 nt y hasta 190 nt, respectivamente. Los nucleótidos de consenso (9 a 19 longitudes) en las regiones de inicio y final putativo flanqueando el ORF de los genes virales se muestran en la Fig. 1. Las regiones de inicio y final del gen de N y P se conservaron (> 90% de identidad de pareja media) en ambos grupos del HMPV, y los genes El codón de inicio ATG putativo se encontraba consistentemente en las posiciones 14-16 aguas arriba de un motivo de inicio del gen (consenso: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), excepto para el M2-2 interno. Se observó un codón de inicio ATG adicional aguas arriba del motivo de inicio del gen en el gen SH para las cepas B1 y B2. En cinco de los ocho genes anotados (N, P, F, M2 y G (sólo cepas B1 y B2)), las regiones intergénicas fueron cortas y los ORFs para estos 5 genes terminaron dentro de los motivos de fin del gen propuestos. Combinamos las cinco secuencias del genoma de Kenia y Zambia con las secuencias globales disponibles, alineando genes individuales y calculando el porcentaje de nucleótido (nt) y la identidad del aminoácido (aa) (Tabla 2). Las secuencias codificantes de los genes N, M, F, M2-1, M2-2 y L se conservaron en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, compartiendo > 85% entre el subgrupo identidad de nucleótidos y 90% identidad de proteínas (Tabla 3 ). El gen de nucleoproteínas fue el más conservado entre todos los subgrupos en los niveles de nt y aa. Los genes de SH y G glicoproteínas fueron más divergentes entre los subgrupos de HMPV en el nivel de nucleótidos con identidad de 76 y 63%, respectivamente. La longitud de la proteína de SH fue variable entre las cepas de grupo A y B debido a una sustitución de nucleótidos (CAA La diversidad de las secuencias de aminoácidos para las glicoproteínas G y SH se muestra en la figura 2 y en el archivo adicional 2: Figura S2, respectivamente. La diversidad de las secuencias completas de nucleótidos de los genes SH y G se representa en los árboles filogenéticos en la figura 3. Se evaluó la clasificación filogenética y la relación entre los 5 nuevos genomas obtenidos en este estudio y los genomas publicados previamente (Fig. 3). El genoma completo figura S3. Hubo congruencia filogenética con los conjuntos de secuencias genéticas individuales como con el conjunto completo de datos del genoma, excepto para los genes F y M2 (Fig. 3: Figura S3 ). Las cepas virales variantes o derivadas pueden disminuir la sensibilidad de la detección resultando en una disminución de la cuantificación de la carga viral y subestimación de la incidencia de la enfermedad [19]. Comprobamos los nuevos genomas del HMPV para detectar las diferencias entre los nucleótidos en las regiones genómicas objetivo de nuestros primeros y sondas diagnósticas del rRT-PCR (archivo adicional 7: Tabla S4) utilizados para la detección del HMPV. Se identificaron hasta ocho desajustes entre el primer y la sonda (Fig. 4): un desajuste en la región del primer hacia adelante en el grupo del HMPV A (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4a); un desajuste en cada una de las regiones diana hacia delante y la sonda en el grupo B (ensayo del rRT-PCR basado en genes F, Fig. 4b); y 5 desajustes diferentes con el ensayo del rRT-PCR basado en genes N-Gene ( El HMPV causa enfermedades respiratorias que se presentan como infección leve del tracto respiratorio superior o bronquiolitis grave potencialmente mortal y neumonía principalmente en niños, a veces adultos, así como en individuos inmunocomprometidos [2]. Sin embargo, los datos de la secuencia del genoma del HMPV de África son escasos y la información sobre la diversidad del genoma es limitada. En el presente estudio, se determinaron las secuencias del genoma completo de cinco cepas del HMPV de Kenia y Zambia y se compararon con los genomas publicados anteriormente de todo el mundo. El análisis comparativo de secuencias indicó una posición bastante conservada de las regiones de inicio y fin de los genes, así como de los codones de inicio y fin de la traducción. La variación de las secuencias del genstart y final puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la iniciación de la transcripción para que exista una presión más selectiva que impida cambios en estas regiones [20], El codón de inicio ATG adicional encontrado aguas arriba del motivo de inicio del gen del gen SH fue consistente con un informe anterior [21], aunque su papel en la expresión génica aún no se ha identificado. Estos genes de secuencia observada en N, M, F, M2-1, M2-2 y L no son inusuales y sugieren limitaciones funcionales y estructurales sobre la diversidad, pero menos esperadas del gen F debido a su estado como antígeno de neutralización y protección, similar a su RSV'relativo' cercano [22]. También se ha sugerido que la baja diversidad en el gen F podría hacer una contribución sustancial a la neutralización cruzada y la protección cruzada entre los subgrupos HMPV [21]. La frecuencia relativamente alta de diversidad de aminoácidos en la G (y en menor medida la SH) podría atribuirse a la presión selectiva para el cambio de aminoácidos proveniente de la inmunidad del huésped; y la capacidad de la proteína para tolerar sustituciones, que podría deberse a su naturaleza extendida y desenvuelta propuesta [22]. La incongruencia filogenética observada entre el árbol del genoma completo y los árboles del gen F y G, es la reportada anteriormente para el HMPV [23], y podría atribuirse a tasas diferenciales de evolución, presión de selección o eventos de recombinación anteriores [24]. La prevalencia de VPHM en población pediátrica hospitalizada en el condado de Kilifi en la costa de Kenia ha sido reportada [7, 25]. Sin embargo, es notable que en los últimos años se ha detectado VPHM con baja prevalencia en Kilifi (observaciones no publicadas de vigilancia Aún no se ha establecido si esta baja prevalencia se debe a la reducción de la transmisión del virus o a la disminución de la sensibilidad de nuestro ensayo de diagnóstico molecular del HMPV debido a los desajustes progresivos entre el primer y la sonda. Presentamos las primeras secuencias del genoma completo de las cepas de HMPV circulantes del África subsahariana. Una limitación de nuestro método de secuenciación, como es común con los protocolos de secuenciación del amplificador [26, 27], no hubo cobertura en las regiones líderes de 3′ y 5′ de remolque no capturadas por estos imprimadores. Nuestros resultados demuestran la aplicación de la secuenciación amplicon para generar genomas de HMPV de longitud completa directamente a partir de muestras clínicas. La diversidad observada de los genes individuales es comparable a la descrita anteriormente [20] [22]. Este método y datos proporcionan una referencia útil para el diseño de diagnósticos moleculares locales y para Se recogieron muestras de hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos (NP-OP) de niños (1-59 meses) hospitalizados con neumonía, cuatro de los cuales fueron incluidos en el estudio PERCH [18] en 2012. La quinta muestra fue recogida de un niño inscrito en el estudio rutinario de vigilancia de la neumonía en el Hospital del Condado de Kilifi, Kenia, en 2015. Las muestras fueron analizadas para el VPHM mediante ensayos multiplex semicuantitativos de transcripción inversa en tiempo real PCR (rRT-PCR). Los primeros y sondas rRT-PCR utilizados, condiciones de ciclismo y ensayos establecidos se han descrito en otras partes [28, 29]. Los genes codificantes de fusión (F) y glicoproteína (G) de las muestras positivas de HMPV fueron amplificados en un ensayo RT-PCR de un solo paso (boti de OneStep RT- Las secuencias parciales de nucleótidos G o F fueron analizadas por árboles filogenéticos de máxima probabilidad (ML) utilizando IQ-TREE [30], junto con cepas de referencia de subgrupos de HMPV (números de adhesión AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY530095, JN184401 y AY297748). Cinco muestras de HMPV positivas de los sitios de estudio de Kenia y Zambia, pertenecientes a los A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) y B2 (n = 1), basadas en sus secuencias de genes G y F, fueron seleccionadas para secuenciación del genoma completo. Los datos sobre la información de evaluación clínica y de edad recolectada en el momento de la recolección de la muestra, para las cinco muestras seleccionadas, se muestran El protocolo de secuenciación consistió en cuatro pasos: (i) diseño de imprimación, (ii) preparación de mezclas de imprimación, (iii) cDNA y PCR (iv) secuenciación de Ilumina y análisis de datos. Todas las secuencias del genoma completo del metapneumovirus humano (HMPV) fueron recuperadas de GenBank (enero de 2018) utilizando la consulta (txid162145 (Organismo) Y 12000 (SLEN): 14000 (SLEN) NO patente). Se excluyeron entradas de secuencia con huecos mayores de 6 nt para generar un conjunto de 178 genomas. Todas las secuencias posibles de 23 nt fueron generadas a partir del conjunto de datos del genoma y recortadas a una temperatura de fusión (Tm) calculada final de 47,9-49.5°C. Se descartaron secuencias con homología a secuencias de ARNr, con contenido de GC fuera de < 0,3 o > 0,75 o con un único contenido fraccional de nucleótidos de > 0,6. El set de imprimación se hizo entonces no redundante produciendo 60.746 imprimaciones potenciales. Todos los imprimaciones potenciales fueron cartografiadas con los genomas completos de 178 HMPV y se determinó el número de coincidencias perfectas (puntuación de frecuencia) como una medida de conservación de la secuencia de imprimación. Para seleccionar los imprimaciones, las secuencias del genoma del HMPV se dividieron en amplificadores con 222 nt de superposición que abarcaban el genoma del virus. Se identificaron los imprimaciones potenciales que se mapearon dentro de los terminales 5′ y 3′ 222 nt de cada amplificador y se seleccionó la secuencia con la puntuación De esta manera, se seleccionaron 24 imprimaciones para cada uno de los genomas representativos del genotipo HMPV (número de adhesión de GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843, y HMPV B2: FJ168778). Debido a la conservación entre los genotipos, hubo redundancia de imprimación que fue eliminada. El conjunto final de 65 secuencias de imprimación, sus longitudes, Tm calculado, contenido de GC fraccionado y posición de mapeo en el genoma HMPV se presentan en el archivo adicional 5: Tabla S2. Los imprimaciones se probaron computacionalmente con cada uno de los 4 subgrupos de HMPV. En el archivo adicional 1 se presenta una representación gráfica de los sitios objetivo de imprimación: Figura Para evitar la generación de pequeños productos a partir de imprimaciones adyacentes hacia adelante e inversas, se asignaron amplicones para alternar la Tabla 3 ). Se indican valores de soporte de Bootstrap (evaluados por 1000 réplicas) a lo largo de las ramas. Se indican subgrupos genéticos A1, A2a, A2b, B1 y B2. La alineación de múltiples secuencias se realizó utilizando MAFFT y la filogenia ML inferida utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + Cada transcripción inversa utiliza mezclas de primer hacia adelante (PMF) hechas con 3,0 μl de cada imprimación inversa (100 pmol/μl) más agua a 200 μl para generar una concentración de primer hacia adelante de 24 pmol/μl. Dos microlitros de la MPF se utilizan entonces en una reacción de transcripción inversa de 20 μl (2,4 pmol/μl concentración final en reacción o 2,4 μM/primer). Para amplificación de PCR, cada reacción de primer hacia adelante de PCR utilizaba un mix de primer PCR (PPM) separado que contenía 1,5 μl de cada primer hacia adelante de 100 pmol/μl y 1,5 μl de cada imprimación inversa (5,3-5,5 pmol/μl en el PPM). Se utilizó 2 μl PPM por reacción de PCR de 25 μl = 0,5 Los ácidos nucleicos virales se extrajeron de las muestras originales utilizando el kit QIAamp Viral ARN Mini (QIAGEN). El ARN (5 μl) se transcribe de forma inversa en cDNA mediante SuperScript III (200 U, Invitrogen), tampón RT (1X concentración final, Invitrogen) y 2 μl de FPM en reacciones de 20 μl. Se amplificó un alícuota de cDNA (5 μl) en 35 ciclos utilizando el kit Phusion Highfidelity PCR (New England Biolabs) y 2 μl de PPM en una reacción de 25 μl. La mezcla PCR fue incubada a 98 °C durante 30 s, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 43 °C durante 30 s y 72 ° Los productos de PCR esperados para cada amplicón fueron aproximadamente 1500 pb. Los productos de PCR de las dos reacciones para cada muestra fueron agrupados para la preparación de la biblioteca Illumina. Fig. 4 Mismatches entre los imprimadores de diagnóstico rRT-PCR y las sondas y sus sitios de unión esperados en los cinco genomas de Kenia y Zambia. 'Fwd imprimar' = Imprimador Adelante y 'Rev imprimador' = Imprimador Inverso. Dos ensayos de rRT-PCR fueron usados para la detección de HMPV. Las barras de color en la figura indican diferencias de nucleótidos (mismatches) entre: a) tres genomas HMPV-A y imprimaciones y sondas específicas HMPV-A dirigidas al gen de fusión; b) dos genomas HMPV-B y imprimaciones y sondas específicas HMPV-B también dirigidas al gen de fusión; y c) los cinco genomas reportados aquí y los imprimaciones y sondas específicas dirigidas al gen de nucleoproteína. Las secuencias de los imprimadores y sondas rRT-PCR verificados con los genomas africanos HMPV se enumeran en el archivo adicional 7: Tabla S4 Secuenciación de iluminaciones y análisis de datos Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de Nextera XT (Ilumina) y secuenciación de pares (2 × 300 pares base) con el kit MiSeq Reagent V3 La mezcla enzimática de Nextera se utilizó para fragmentar simultáneamente el ADN de entrada y etiquetar con adaptadores universales en una única reacción del tubo, seguida de la reacción PCR de 12 ciclos para la indexación dual. Las cuentas AMPure XP de Agencourt (Beckman Coulter) se utilizaron para todos los pasos de purificación y las bibliotecas se cuantificaron y verificaron la calidad utilizando el Qubit (Thermo Fisher) y Bioanalyzer (Agilent). El recorte del adaptador, el filtrado de calidad, la normalización de la secuenciación de kmer lee, el ensamblaje de novo, el cálculo de la cobertura media del genoma fue como se describió anteriormente [31]. Se recuperó un conjunto de datos de las secuencias del genoma del HMPV de ViPR para inferir la relación entre los virus del HMPV de Kenya y Zambia y las poblaciones virales muestreadas a nivel mundial. La alineación de secuencias se realizó utilizando MAFFT v.7.221 [32] utilizando los parámetros 'localpair -maxiterate 1000'. IQ-TREE se utilizó para inferir árboles de máxima probabilidad (ML) del genoma completo y genes individuales bajo el modelo de sustitución de tiempo reversible general (GTR) con heterogeneidad de frecuencia distribuida gamma entre el sitio. Un resumen de la metodología descrita aquí se muestra en la Fig. 5.
question: ¿Cuál es el subgrupo más común de HMPV?
answers.text: HMPV A2