context: Actividad antiviral en Vitro de la triple hélice circular que forma el ARN del oligonucleótido hacia la replicación felina del virus de la peritonitis infecciosahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3950953/SHA: f5ad2323eb387f6e271e2842bb2cc4a33504fde3Autores: Choong, Oi Kuan; Mehrbod, Parvaneh; Tejo, Bimo Ario; Omar, Abdul RahmanFecha: 2014-02-20DOI: 10.1155/2014/654712Licencia: cc-byResumen: La peritonitis felina infecciosa (FIP) es una enfermedad inmunoagumentada grave en la población de gatos. Es causada por el virus FIP (FIPV), una cepa mutante virulenta del Coronavirus Entérico Felino (FECV). Los tratamientos actuales y los profilácticos no son efectivos. Las propiedades antivirales in vitro de cinco ARNs circulares de triple hélice que forman oligonucleótidos (TFO) (TFO1 a TFO5), que se dirigen a las diferentes regiones del coronavirus felino virulento (FCoV) de la cepa FIPV WSU 79-1146, se probaron en células de riñón felino Crandell-Rees (CRFK) infectadas por FIPV. Los resultados de RT-qPCR mostraron que los ARNs circulares de TFO, excepto TFO2, inhiben la replicación de FIPV, donde los números de copias del genoma viral disminuyeron significativamente por 5 veces log(10) de 10(14) Además, la unión del ARN del TFO circular con el segmento del genoma viral objetivo también fue confirmada mediante el ensayo de desplazamiento electroforético de la movilidad. La fuerza de la cinética de unión entre los ARN del TFO y sus regiones objetivo fue demostrada por el ensayo de NanoITC. En conclusión, los TFO circulares tienen el potencial de ser desarrollados como agentes antivirales contra la infección por FIPV. Texto: Virus de Peritonitis Infecciosa Felina (FIPV) es un virus envuelto con un genoma de ARN sin segmentación, sentido positivo, de una sola cadena. FIPV se agrupa como coronavirus felino (FCoV), bajo la familia Coronaviridae. FCoV se divide en dos biotipos, a saber, Coronavirus Entérico Felino (FECV), un biotipo entérico ubicuro de FCoV, y FIPV, un La relación entre estos dos biotipos aún no está clara. Se han propuesto dos hipótesis: i) teoría de mutaciones internas y ii) teoría de virulenta-baja virulenta circulante. La teoría de mutaciones internas declaró que el desarrollo de FIP se debe a la exposición del gato a variantes de FCoV que se han mutado al adquirir la capacidad de replicarse dentro de los macrófagos [2], mientras que la teoría de virulencia-baja virulenta circulante explica la existencia de linajes distintivos patógenos y benignos de virus dentro de la población de gatos [3]. El estudio ha demostrado que alrededor del 40-80% de los gatos se detectan con el derrame FECV en sus heces [4]. Alrededor del 12% de estos gatos positivos FECV han desarrollado una enfermedad FIP mortal inmunomediada [4]. La prevalencia de FIP entre los felinos se debe a ciclos continuos de infección y reinfección de FECV y síntomas clínicos indiscernibles de gatos infectados con FECV en una etapa temprana antes del desarrollo progresivo de FIPV. La vacunación contra FIPV con una cepa atenuada y sensible a la temperatura de tipo II FIPV induce un bajo título de anticuerpos en gatitos que no han estado expuestos a FCoV. Sin embargo, existe una considerable controversia sobre la seguridad y eficacia de esta vacuna, ya que la vacuna contiene cepa tipo 2, mientras que los virus tipo 1 son más prevalentes en el campo [4]. Además, los anticuerpos contra FIPV no protegen a los gatos infectados, sino que aumentan la infección de monocitos y macrófagos a través de un mecanismo conocido como Mejora Anticuerpo-Dependente [1]. Además de las vacunas, se han utilizado varios fármacos antivirales como ribavirina, 2 interferones BioMed Research International y fármacos inmunosupresores como tratamientos para gatos infectados por FIPV, principalmente para suprimir la respuesta inmune inflamatoria y perjudicial [5] [7] [8]. Sin embargo, esos tratamientos fueron ineficaces. Por lo tanto, todavía hay una necesidad médica no satisfecha significativa de desarrollar tratamientos eficaces y profilácticos para la infección por FIPV. Triple Helix Forming Oligonucleótido (TFO) se define como homopirimidina oligonucleótidos, que pueden formar una triple hélice secuencia específica por Hoogsteen enlaces a la ranura principal de un tramo complementario homopirimidinhomopurine en ADN dúplex [9]. Además, los híbridos de ARN o ADN-ARN doble pueden ser dirigidos como plantilla para la formación de triple hélice, una vez que se determine la composición de Por lo tanto, el TFO se ha utilizado para impedir las expresiones génicas mediante la inhibición de la transcripción de genes virales u oncogenes [11] [12] [13] [14] [15] [16]. El propósito principal de este estudio es desarrollar y evaluar las propiedades antivirales in vitro de los ARN circulares del TFO frente a la replicación del FIPV. La cepa del serotipo II WSU 79-1146 (No ATCC VR-1777) fue cultivada en células CRFK. Se preparó una dilución en serie de FIPV 10 veces a partir del material de trabajo. Se inoculó la placa de 96 pocillos confluentes con 100 L de cada dilución/pozo del virus. La placa fue incubada en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO 2. Se observaron efectos citopáticos (CPE). Los resultados fueron registrados después de 72 horas y se calculó la dosis infecciosa del cultivo tisular del virus 50 (TCID 50 ) utilizando el método de Reed y Muench [17]. ARN del Oligonucleótido. La Triple Helix Forming Oligonucleótidos (TFOs) fue diseñada sobre la base de la secuencia del genoma del serotipo II de FIPV cepa WSU 79-1146 (Adhesión no: AY994055) [18]. Los TFOs, que se dirigen específicamente a las diferentes regiones del genoma FIPV, y se construyó un TFO no relacionado (Tabla 1 ). La especificidad de los TFOs fue identificada utilizando la búsqueda BLAST en la base de datos NCBI. Los TFOs lineales diseñados fueron sintetizados por Dharmacon Research (USA), donde los extremos 5 y 3 de los TFO Estas modificaciones fueron necesarias para la circularización del TFO lineal. El proceso de circularización, utilizando el T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) (New England Biolabs Inc., Inglaterra), se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la ligadura, los ARN TFO circular se recuperaron por precipitación de etanol y la pureza de los ARN TFO circular se midió mediante espectrofotómetro. La desnaturalización de la electroforesis de gel de poliacrilamida de urea se realizó como se describió antes [19] con modificación. Brevemente, el 20% del gel de urea poliacrilamida desnaturalizado se preparó y polimerizó durante 30 minutos. Luego, el gel se prerun a 20 a 40 V durante 45 minutos. Cinco L de ARN TFO mezclado con 5 L de tampón de Finalmente, el gel fue manchado con bromuro de etidium (Sigma, EE.UU.) y visto con un sistema Bio-Rad Gel Doc XR (CA, EE.UU.). (EMSA). Las regiones objetivo del genoma FIPV fueron sintetizadas por Dharmacon Research (EE.UU.) (Tabla 1). Cada ARN de TFO fue mezclado con la región objetivo en un tampón de unión 1X que contenía 25 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl 2 y 10 mMNaCl en un volumen final de 10 L y posteriormente incubado a 37°C durante 2 horas. La muestra se ejecutó con gel de poliacrilamida nativo al 15% a 80 V, en estado fresco. El gel manchado fue visto por un sistema Bio-Rad Gel Doc XR. Regiones. La resistencia a la unión se midió mediante un Calorímetro de Titación Nano Isotérmica (ITC) (Instrumentos AT, Newcastle, Reino Unido). Las mezclas de muestras de ARN, consistentes en TFO circulares (0,0002 mM), fueron incubadas con sus respectivas regiones de destino sintético (0,015 mM) utilizando como diluyente el tampón de unión 1X. El experimento se realizó a 37°C con 2 L/inyección, para un total de 25 inyecciones. Los datos fueron recolectados cada 250 segundos y analizados mediante el software NanoAnalyze v2.3.6 proporcionado por el fabricante. Este experimento se realizó en células CRFK, donde 3 × 10 4 células/pozo fue sembrado en placa de 96 pocillos para alcanzar una confluencia del 80% 24 horas antes de la transfección. 100 nM de ARN de TFO se transfectó por separado en las células CRFK utilizando un reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen, Alemania), según el protocolo del fabricante. La placa fue incubada a 37°C con un 5% de CO2 durante 6 horas. Luego, los cultivos fueron infectados con 100TCID 50 de la cepa de serotipo II FIPV WSU 79-1146 durante 1 hora a 37°C (100 L/well). Finalmente, el inóculo viral fue reemplazado por medios de mantenimiento frescos (MEM conteniendo 1% de FBS y 1% de pluma/estrep). Las células infectadas por virus y no infectadas se mantuvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. La morfología de los cultivos se registró 72 horas después de la infección y las muestras fueron recolectadas en este momento y almacenadas en −80°C antes de la extracción de ARN. Inhibición. Las diferentes concentraciones de ARN TFO1 circular (25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM) fueron transfectadas a células CRFK. La placa fue incubada durante 6 horas seguidas de inoculación del virus durante 1 hora a 37 °C con 5% de CO2. Las células fueron procesadas como se describe anteriormente. Célula de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) (No. de ATCC CCL-34), a una concentración de 4 × 10 4 células/bien, fue sembrada en placa de 96 pocillos hasta alcanzar el 80% de confluencia 24 horas antes de la transfección. Se realizó la misma transfección que antes. Se transfectó 100 nM de ARN TFO circular en células MDCK. Después de 6 horas ORF1a/1b y 530-541ORF1a/1b y 7399-7411ORF1a/1b y 14048-14061- * Destacado en negrita indica la región de unión. * * Circular no relacionada TFO. [20, 21], respectivamente. La transcriptasa inversa cuantitativa PCR en tiempo real (RT-qPCR) se realizó utilizando un sistema de Bio-Rad CFX96 en tiempo real (BioRad, EE.UU.). La reacción se amplió en un volumen final de 25 L utilizando un SensiMix SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, UK), que consistía en 12,5 L 2X SensiMix SYBR No-Rox One-Step buffer de reacción, 10 M hacia adelante e inversos, 10 unidades de inhibidor de Ri Se utilizó el enfoque de cuantificación absoluta para cuantificar los resultados de qPCR donde se trazó una curva estándar de dilución serial de virus antes de la cuantificación, se cuantificó la cantidad del virus en las muestras en base a esta curva estándar, se realizó análisis estadístico con SPSS 18,0, se representaron los datos como promedio ± SE de tres pruebas independientes, se utilizó ANOVA de ida, prueba post hoc de Tukey para analizar el nivel significativo entre los datos, se consideró significativo ≤ 0,05, se seleccionaron los genomas, que juegan un papel importante en la replicación viral, como sitios de unión objetivo para la formación del triplex, las regiones objetivo fueron 5 regiones no traducidas (5 UTR), marcos de lectura abiertos (ORF) 1a y 1b, y 3 regiones no traducidas (3 UTR) (Tabla 1 ). Ambos extremos de los TFO dúplex se ligaron con una secuencia de enlace o pinzas (C-C) para construir ARN TFO circular. El ensayo de desnaturalización de PAGE se llevó a cabo después del proceso de ligadura para determinar la formación del TFO circular. Como se muestra en la Figura 1, los ARN TFO circular migraron más rápido que los ARN TFO lineales, cuando se sometieron a la PÁGINA de desnaturalización del 20%. Región de destino. La capacidad de encuadernación se determinó utilizando Assay de Movilidad Electroforética (EMSA) [23]. La aparición de la banda de movilidad lenta indica la hibridación exitosa del ARN TFO circular con su región de destino. La capacidad de encuadernación de diferentes ARN TFO (TFO1 a TFO5) contra sus regiones de destino fue determinada por EMSA ( TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 mostraron banda de movilidad lenta, mientras que TFO2 mostró la falta de una banda de desplazamiento ascendente, lo que indica la posesión de capacidad de unión triplex para todos los ARN circulares de TFO, excepto TFO2. TFO ARN. El estudio sobre la interacción e hibridación de TFO hacia su región de destino es crucial, ya que cuanto más fuerte es la unión, más estables son las formas de estructura triplex. Como se muestra en la Figura 1 suplementaria (Tabla 3). El efecto antiviral de los ARN circulares de TFO fue investigado por RT-qPCR a las 72 horas después de la transfección. Los resultados mostraron números de copia del genoma del ARN viral de 3,65 × 10 9, 3,22 × 10 14, 5,04 × 10 9, 5,01 × 10 9, 4,41 × 10 9, y 3,96 × 10 14 en células tratadas con TFO1, TFO2, TFO3, TFO4, TFO5 y TFO7, respectivamente. Los datos analizados mediante ANOVA de un solo sentido, prueba post hoc de Tukey mostraron un número significativo de copia del genoma del ARN viral alto de 4,03 × 10 14 para células inoculadas por virus en comparación con tratamientos circulares TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 ( ≤ 0,05). Las copias de ARN viral de las células transfectadas circulares TFO2, TFO3 lineal y TFO4 y ARN circulares no relacionadas TFO7 también mostraron altos números de copias de ARN viral que no mostraron diferencias significativas con las células infectadas ( ≥ 0.05) (Figura 3). Los cambios morfológicos de las células también fueron capturados 72 horas después de la transfección. Las células transfectadas con TFO1, TFO3, TFO4 y TFO5 circulares parecían estar en buenas condiciones después de la inoculación del virus, mientras que las células transfectadas con TFO2 circular y TFO3 lineal y TFO4 mostraron un efecto citopático visible (ECP), lo mismo que las células inoculadas virales (Figura complementaria 2). Además, las células transfectadas con TFO sólo siguen siendo viables, lo que indica que el tratamiento con TFO no es generalmente Por lo tanto, estos resultados ilustraron la capacidad de los ARN circulares del TFO (excepto TFO2) para inhibir la replicación del FIPV. Concentraciones en la replicación del FIPV. Se utilizó la circular TFO1 para examinar la relación dosis-respuesta como representativa de otros TFO. Las condiciones experimentales fueron idénticas a las del experimento anterior, excepto para las concentraciones del TFO1 de 25 nM, 50 nM, 100 nM y 500 nM. No hubo una reducción significativa en las copias del genoma del ARN viral utilizando la concentración de 25 nM TFO1. Las otras concentraciones causaron reducciones significativas en los números de copia en comparación con las células infectadas por el virus. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en los números de copia de todas estas concentraciones (Figura 4 ). La especificidad del TFO hacia el FIPV se probó, utilizando TFO1 y TFO5, como los representantes Los datos analizados utilizando ANOVA de una vía, prueba post hoc de Tukey, no mostraron reducciones significativas en las copias de ARN viral para ambos TFO en comparación con las células inoculadas por el virus influenza ( ≥ 0.05) (figura complementaria 3). Estructura compleja G4/Cir4 Figura 2 : análisis EMSA. El análisis EMSA ilustró la unión de TFO circular 1, 3, 4 y 5 a las regiones objetivo como evidencia el desplazamiento de banda ascendente. La unión de cada TFO circular excepto TFO circular2 a sus respectivos objetivos forma un complejo que migra más lento que el TFO desconectado. G1 a G5 representan la región objetivo para la circular TFO1 a TFO5 y Cir1 a Cir5 representan la circular TFO1 a TFO5, respectivamente. en el proceso de replicación [24]. Mientras tanto, el ORF1a/1b de FIPV se traduce en poliproteínas que se escinden en proteínas no estructurales que se ensamblan en complejos de replicación de transcripción junto con otras proteínas virales [24]. Por lo tanto, el desarrollo de terapia molecular dirigida a estas regiones críticas puede proporcionar la posibilidad de inhibir la replicación de FIPV. El desarrollo de terapias antivirales contra el FIPV utilizando siRNA [25] e inhibidores de la proteasa viral [26] Figura 4 : Estudio de respuesta a la dosis de TFO1 para inhibir la replicación de FIPV. Las concentraciones de 50 nM y superiores mostraron efectos antivirales significativos. 50 nM de ARN TFO1 circular fue capaz de reducir el número de copias virales por 5 veces el log 10 de 10 14 a 10 9, mientras que 100 y 500 nM mostraron una reducción de 4 veces. En este estudio se diseñaron y evaluaron los ARN de Oligonucleótidos (TFO) de triple hélice circular, dirigidos específicamente a las regiones cortas del genoma viral para la formación de triplex. TFO1 y TFO2 se dirigieron a los 5 y 3 UTRs del genoma viral, respectivamente. TFO3 a TFO5 se dirigieron a diferentes regiones del genoma FIPV. Antes del estudio antiviral in vitro, los TFOs circulares ligados fueron evaluados mediante análisis PAGE. Todos los TFO circularizados mostraron un patrón de migración más rápido en comparación con el TFO lineal; sin embargo, sólo se detectaron ligeras variaciones para algunos de los TFO (Figura 1 ). La razón de esto no es clara, pero probablemente debido a las diferencias en la longitud y las estructuras terciarias de los TFOs que llevaron a diferencias en la tasa de migración. Se utilizó la EMSA para mostrar la capacidad de unión de cada TFO circular hacia la región diana en el genoma FIPV excepto para el TFO2 que mostró falta de formación de estructura compleja tras la hibridación (Figura 2). El resultado de la EMSA también estuvo de acuerdo con el estudio antiviral, donde todos los TFO circular (excepto TFO2) fueron capaces de demostrar una reducción significativa en el número de copias del genoma del ARN viral por 5 veces el log 10 de 10 14 en células inoculadas por virus a 10 9 en células transfectadas por TFO (Figura 3 ). Sin embargo, no se detectaron propiedades antivirales a partir de los TFO lineales y ARN circular no relacionado con el TFO7, confirmando que la actividad antiviral está asociada con la unión específica de TFO circular hacia las regiones destinatarias. Además, la unión del TFO circular a la región diana fue confirmada por el análisis nanoITC; donde el bajo valor y la alta estabilidad permitieron a los TFO competir eficazmente con las regiones diana para inhibir la transcripción en sistemas libres de células. Puesto que el TFO1 muestra el valor más bajo (tabla 3), las propiedades antivirales de este TFO fueron evaluadas en el estudio de respuesta a la dosis. Como se muestra en la Figura 4, 50 y 100 nM de TFO1 mostraron efectos antivirales similares que indican la posible aplicación terapéutica de TFO1 en la replicación FIPV. Sin embargo, el aumento de la concentración de TFO1 a 500 nm no logró reducir aún más la carga viral probablemente debido a la ineficiencia del reactivo de transfección para transfectar el TFO en las células. Además, el virus tiene una rápida tasa de replicación sobre la infección in vitro, donde estudios previos sobre el crecimiento de FIPV en células CRFK mostraron que por 2 horas aproximadamente el 67% de FIPV 79-1146 fueron internalizados por células CRFK por endocitosis aumentando a más del 70% a las 3 horas [27, 28]. El hallazgo anterior probablemente también explicó la razón por la cual no se detectó ningún efecto antiviral cuando se realizó la transfección del TFO en células infectadas por el virus (datos no mostrados).Las propiedades antivirales, como lo demuestran los TFO circulares, fueron probablemente asociadas con la unión del TFO a la región diana, basado tanto en los enlaces de hidrógeno Watson-Crick y Hoogsteen, que mejoran la estabilidad en términos de entalpy, lo que se produce al unir dos de los tres hilos de la triple hélice en la orientación adecuada Por lo tanto, la formación del triplex está estrechamente unida y no es fácil de separar. Además, los TFO circulares fueron diseñados de tal manera que la presencia de donantes y aceptadores de enlace de hidrógeno en las purinas es capaz de formar dos enlaces de hidrógeno, mientras que las bases de la pirimidina sólo pueden formar un enlace adicional de hidrógeno con terceras bases entrantes [30]. Sin embargo, hay varios factores que pueden limitar la actividad de los TFO en células como la degradación intracelular del TFO y la accesibilidad limitada del TFO a los sitios objetivo que pueden prevenir la formación del triplex [31]. Estos hallazgos también pueden explicar la incapacidad del TFO1 diseñado para inhibir la replicación del virus en el estudio de dosis-respuesta (Figura 4). Se han desarrollado y probado varias terapias moleculares contra enfermedades infecciosas y cáncer. Sin embargo, sólo la terapia basada en siRNA Recientemente, McDonagh et al. [25] desarrollaron siRNA con actividad antiviral frente al FIPV 79-1146, donde el siRNA diseñado fue capaz de reducir el número de copias del genoma viral en comparación con las células infectadas por el virus. También se ha reportado la posible aplicación terapéutica de los TFOs, como el TFO lineal conjugado con psoralen para inhibir la transcripción del provirus de inmunodeficiencia humana [13] y el TFO para inhibir la transcripción del colágeno 1(I) en fibroblastos de rata [14]. Además, el corto TFO conjugado con daunomicina dirigido a la región promotora de oncogenes ha sido diseñado y evaluado en células cancerosas humanas [31]. Estos estudios indicaron la flexibilidad de usar oligocnucleótidos a base de TFO como una terapia potencial basada en la molecular. En este estudio, se demostró que los ARN del TFO circular corto entre 28 y 34 metros (Tabla 1), que son capaces de inhibir la replicación del FIPV mediante la unión a regiones específicas del genoma del FIPV. Todos los TFO circulares diseñados (excepto TFO2) mostraron efectos inhibidores significativos frente a la replicación del FIPV. Los TFO que formaron estructuras triplex mostraron efectos antivirales hacia la replicación del FIPV. La razón por la cual el TFO2 no mostró ninguna interacción con la región objetivo o actividad antiviral se debe probablemente a la longitud del TFO2 (es decir, 24 metros), que podría ser insuficiente para una formación del triplex tras la hibridación (Figura 2), ser lo suficientemente eficaz para suprimir la transcripción del ARN viral y eventualmente inhibir la replicación del virus. Sin embargo, no se puede descartar la incapacidad del TFO2 de mostrar efecto El estudio antiviral in vitro que no mostró ninguna propiedad antiviral para el TFO no relacionado (TFO7) y la incapacidad de la circular TFO1 y TFO5 para inhibir las células infectadas por el virus influenza A H1N1 confirma la especificidad de la actividad de los TFOs. En conclusión, el ARN del TFO circular tiene el potencial de ser desarrollado como terapia contra la FIPV en gatos. Sin embargo, estudios adicionales sobre la especificidad del TFO, mecanismo real del ARN del TFO circular en la alteración de transcripción consecuencia de la inhibición del proceso de transcripción viral, y estudios in vivo en animales son importantes para que este enfoque funcione como terapia en el futuro.
question: ¿Por qué su controversia en torno a la vacuna FIPV?
answers.text: la vacuna contiene cepa tipo 2, mientras que los virus tipo 1 son más prevalentes en el campo