context: Un ensayo de reducción de la neutralización de anticuerpos neutralizantes del virus de la hepatitis Chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1852297/SHA: ee8dca216514deeed4c9415bc2ad8a78d3d9670Autores: Fournier, Carole; Duverlie, Gilles; François, Catherine; Schnuriger, Aurelie; Dedeeurwaerder, Sarah; Brochot, Etienne; Capron, Dominique; Wychowski, Czeslaw; Thibault, Vincent; Castelain, SandrineFecha: 2007-03-30DOI: 10.1186/1743-422x-4-35Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRANO/AIM: El papel de la Sin embargo, existe un creciente interés en la caracterización de anticuerpos neutralizantes en el suero de pacientes infectados por el VHC. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a una gama de virus no citopáticos. Basados en el reciente desarrollo de un sistema de cultivo celular del VHC utilizando la cepa JFH-1 de genotipo 2, se desarrolló un ensayo de reducción de focos para anticuerpos neutralizantes contra el VHC. MÉTODOS: El ensayo de reducción de focos se basó en un ensayo estándar de microneutralización en el que se cuentan focos inmunosos en placas de cultivo tisular. Los títulos neutralizantes de anticuerpos anti-VHC de muestras de inmunoglobulinas séricas purificadas de setenta y siete individuos se determinaron utilizando un ensayo de neutralización de enfoque del 50%. Los anticuerpos IgG fueron purificados por primera vez de cada suero para evitar el efecto facilitador del HDL en la entrada del VHC. RESULTADOS: El corte del ensayo utilizando muestras ELISA y ARN VHC negativo fue de 1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18. El ensayo fue comparado con un ELISA comercial del VHC y mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y 96,5%, respectivamente, y buena reproducibilidad (con coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo de 6,7% y 12,6%, respectivamente). El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras anti-VIH, anti-HBs o anticuerpos heterofílicos positivos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron 2,13 log (1:134) para muestras homólogas de pacientes infectados por el genotipo 2 del VHC que albergaban el mismo genotipo que JFH-1 y 1,93 log (1:85) para muestras heterólogas de pacientes infectados por genotipos distintos del tipo 2. Estos resultados confirman la presencia de anticuerpos ampliamente neutralizantes ya reportados utilizando el sistema de pseudopartículas del VHC. CONCLUSIÓN: Este estudio presenta un ensayo sencillo, específico y reproducible basado en cultivos celulares para la determinación de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos. El ensayo debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta de anticuerpos neutralizantes y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda o crónicamente y para investigar la posible erradicación o prevención de la infección por VHC mediante anticuerpos neutralizantes. Texto: El virus de la hepatitis C (VHC, miembro de la familia Flaviviridae) es un virus del ARN envuelto y de cadena positiva que se replica preferentemente en los hepatocitos. Al menos 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas persistentemente con el virus de la hepatitis C. La infección crónica por el VHC se asocia con un riesgo significativo de progresión a cirrosis y carcinoma hepatocelular [1]. La terapia antiviral con el alfa-interferón pegilado y ribavirina (el mejor régimen terapéutico actual) sólo tiene éxito en aproximadamente el 50% de todos los pacientes tratados. Se necesita un mejor conocimiento de los factores virales y de los huéspedes que determinan el aclaramiento o la persistencia del VHC durante la etapa aguda de la infección para mejorar la terapia antiviral y desarrollar vacunas eficientes. En la actualidad, el chimpancé es el único modelo animal confiable en el que se pueden evaluar los eventos iniciales de infección post-VHC y la eficacia de los candidatos a la vacuna [2]. Se ha demostrado que la inmunidad de células T específicas del VHC es importante para el control de la infección por el VHC [3, 4]. Varios estudios han indicado un papel para la inmunidad humoral en la etapa aguda de la infección por el VHC, pero este aspecto sigue estando mal caracterizado. Se cree que las glicoproteínas E1 y E2 son las proteínas de unión viral y, por lo tanto, los principales objetivos de anticuerpos neutralizadores del VHC; por lo tanto, la identificación de epitopos protectores conservados en diferentes cepas del VHC es un reto importante en el diseño de la vacuna. Se han descrito varios anticuerpos capaces de bloquear la unión de E2 a células o receptores celulares [5] [6] [7] [8]. Se ha demostrado que la entrada celular involucra varias moléculas superficiales (en particular, el CD81 de tetraspanina y el receptor SR-BI [11, 12] ), aunque se necesitan más estudios para entender mejor cómo se produce la entrada viral y cómo se puede neutralizar. La detección de anticuerpos neutralizantes en sangre humana había sido problemática hasta que se dispusiera de un sistema de cultivo celular eficiente y fiable para el VHC. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo de neutralización in vitro para el VHC podría ser extremadamente valioso para caracterizar la respuesta inmune humoral al VHC y para evaluar el potencial de inmunización pasiva y activa contra la hepatitis C. Estudios recientes que utilizan un sistema de neutralización in vitro (basado en pseudopartículas retrovirales infecciosas (HCVpp) que contienen glucoproteínas de envoltura del VHC) han confirmado que el sera del paciente infectado por VHC puede neutralizar la infección [13, 14] Sin embargo, también se ha demostrado que la actividad neutralizante de anticuerpos de pacientes infectados por el VHC es atenuada por un factor presente en el suero humano, identificado como la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) [11, 13, 15]. La facilitación de la entrada del VHCpp por HDL es un evento post-vinculante [16], sug-gestivo que los HDL favorecen la internalización de los viriones y por lo tanto el escape de estos últimos de anticuerpos neutralizantes. Recientemente, se ha desarrollado un modelo de cultivo celular del VHC (HCVcc) [17] [18] [19], permitiendo la producción de partículas virales que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular. Los ensayos de reducción de focos han sido ampliamente utilizados para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes a virus que pueden formar focos en células infectadas. Siguiendo el reciente desarrollo del modelo VHCcc, el principio del ensayo de reducción de focos se ha aplicado a la detección de anticuerpos neutralizantes del VHC. La cepa viral JFH-1 VHC 2a fue cultivada en una línea celular de hepatoma humano Huh-7. Después de tres días de infección y permeabilización celular, la detección de los focos del VHC se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario sérico del paciente VHC positivo inactivado y una peroxidasa acoplada, un anticuerpo IgG humano específico del Fc. La reacción se reveló con el sustrato de la peroxidasa DAB. Los focos virales fueron, por lo tanto, teñidos de color marrón, lo que los hace fáciles de contar (ver Figura 1a ). Por lo tanto, los HDLs fueron capaces de facilitar la entrada de VHCpp y VHCcc a través de un mecanismo que dependía de la expresión del receptor BI (SR-BI) y su función selectiva de absorción de lípidos [11, 15, 16, 20]. En vista del papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes (ver Fig. 1b ). La especificidad del ensayo de neutralización del VHC fue evaluada mediante la prueba de 20 muestras anti-VHC-ELISA-negativas, incluyendo cinco positivas para anticuerpos de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco positivas para anticuerpos heterofílicos. Todas las muestras probadas negativas con dos ensayos comerciales de detección de anticuerpos anti-VHC (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania; Vitros ® Anti-HCV Reagent Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido) y VHC-ARN negativo con un ensayo cualitativo y comercial (Cobas Amplicor VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Estas muestras anti-VHC negativas se compararon con 11 muestras de pacientes infectados crónicamente con el genotipo 2 del VHC. Los títulos de neutralización de muestras séricas anti-VHC negativos se muestran en la figura 2., con un valor medio de 1.083 ± 0.083 (correspondiente a una dilución de 1:12). El ensayo mostró valores de especificidad y sensibilidad del 100% y del 96,5%, respectivamente.El ensayo no mostró ninguna reactividad cruzada con muestras positivas de anticuerpos anti-VIH, anti-HB o anti-heterofilos (datos no mostrados).A la inversa, las muestras positivas de genotipo 2 del VHC mostraron reacciones fuertes, con un valor medio de 2,128 ± 0,365 (correspondiente a una dilución de 1:134) (p < 0,001).La variabilidad inter-ensayo se determinó probando una muestra de genotipo 2 del VHC en 10 experimentos consecutivos (n = 10), mientras que la variabilidad intra-ensayo fue evaluada probando la misma muestra 10 veces (n = 10) en el mismo experimento, mientras se ejecutaba la serie de dilución.Los coeficientes intra-ensayo e inter-ensayo de variación (CV) de los títulos de neutralización de log Se evaluaron 57 muestras de anticuerpos VHC positivos utilizando el ensayo de neutralización de la reducción del enfoque del VHC; los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera: para los tipos 1a, 1b, 2, 3, 4 y 5, se estudiaron 11, 11, 11, 11, 12, 10 y 2 muestras, respectivamente; los valores medios de los diferentes genotipos se muestran en la figura 3 y en la tabla 1 ; los títulos medios de neutralización de log para los genotipos 1a, 2 y 3 son muy similares (2,046 ± 0,671 para el genotipo 1a, 2,128 ± 0,365 para el genotipo 2 y 2,148 ± 0,478 para el genotipo 3); los valores medios son menores para el genotipo 1b (1,747 ± 0,462) y el genotipo 4 (1,786 ± 0,236); se observaron títulos he Hubo muy pocas muestras de genotipo 5 para compararlas con los otros genotipos, pero los resultados correspondientes indican que el ensayo de neutralización es adecuado para este genotipo. Los dos títulos de neutralización de logs en todas las muestras de ELISA y ARN positivos del VHC en función del genotipo del VHC se muestran en la Fig. 3b. Más del 60% de los títulos de anticuerpos neutralizantes cayeron en el rango de 1,7 a 2,69 títulos de log, correspondientes a diluciones de 1:50 y 1:500, respectivamente. En general, el 3,5% de las muestras mostraron un título mayor que el log 3.0 (1:1000) y, al contrario, el 3,5% mostraron un título por debajo del valor de corte, es decir, log 1,25 (1:10). Así, de 57 pacientes infectados por VHC, sólo dos no probaron positivo para neutralizar anticuerpos en este ensayo (los El papel de los anticuerpos neutralizantes durante la infección viral aguda y crónica sigue siendo una cuestión importante y ha generado resultados controvertidos. Inicialmente, se demostró que la presencia de anticuerpos neutralizantes controlaba la carga del VHC y contribuía a la erradicación viral en pacientes capaces de eliminar la infección [13]. En otros estudios, la aparición de anticuerpos neutralizantes se retrasó y se restringió a anticuerpos IgG1 en pacientes que desarrollan una infección crónica [2, 21]. El modelo de chimpancé ha sido crítico para el estudio de la transmisión del VHC y las respuestas inmunitarias del huésped; sin embargo, no se detectaron anticuerpos neutralizantes en algunos animales que resolvieron su infección -sugiriendo un papel mínimo en el aclaramiento viral, como también se observó en estudios humanos [14, 15]. Los chimpancés infectados experimentalmente y los humanos infectados naturalmente pueden ser reinfectados con cepas del VHC homólogas y heterólogas, lo que sugiere que la inmunidad humoral que se desarrolla después de la resolución espontánea de la hepatitis C aguda no esteriliza [22] [23] [24]. Durante la infección crónica en los seres humanos, la presencia y/o producción de anticuerpos neutralizantes no bastan para curar la infección, sino que podría regular la propagación del virus. Así, se puede postular que durante la infección crónica, los mutantes virales pueden escapar continuamente de la renovación de la producción de anticuerpos neutralizantes. Seudopartículas retrovirales se han utilizado para desarrollar una herramienta muy interesante para medir anticuerpos neutralizantes in vitro [14]. El ensayo ha demostrado la presencia de anticuerpos neutralizantes del VHC en sueros humanos con títulos relativamente altos (> 1:320) y una actividad Sin embargo, este modelo no representa genuinos viriones del VHC; en particular, se cree que el brote de partículas retrovirales es muy diferente y puede implicar una variedad de vías celulares. La caracterización de partículas pseudotipo retrovirales infecciosas que contienen glucoproteínas del VHC ha demostrado ser muy heterogénea, por lo que es posible que estas pseudopartículas no sean tan relevantes como las viriones nativas del VHC [25]. El reciente desarrollo de un modelo de cultivo celular para el VHC permite la producción de viriones nativas del VHC que pueden propagarse eficientemente en el cultivo celular [17] [18] [19]. Este sistema de cultivo celular nos ha permitido desarrollar un ensayo de neutralización para evaluar el nivel y la proporción de anticuerpos neutralizantes del VHC en pacientes con VHC crónicamente infectados. Analizamos una serie de parámetros (como la practicabilidad, la reproducibilidad y la especificidad) y probamos el efecto de una gama de variables (tamaño del inóculo viral, tiempo de incubación, métodos de fijación y permeabilidad, reactivos de bloqueo y revelación) sobre estos parámetros (datos no mostrados). En general, el ensayo de neutralización descrito en este estudio se realiza de manera similar a los ensayos de neutralización estandarizados para muchos otros virus [26] [27]. El ensayo se basa en la capacidad de la cepa viral específica genotipo 2 de JFH para replicarse y multiplicarse en una línea celular hepatoma humana Huh-7 en un modelo de cultivo celular, permitiendo la detección rápida de focos virales después de 72 horas de infección. Además, no se detectaron focos secundarios en este momento. La fijación con paraformaldehído y la permeabilización con Triton X-100 fueron elegidas para preservar la antigenicidad y evitar que la monocapa celular se desprendiera durante los lavados. El desarrollo con sustrato de peróxido de DAB facilitó el recuento de focos virales de color específico. El tamaño del inóculo viral es un parámetro importante; debe ser lo suficientemente bajo como para permitir una buena sensibilidad al ensayo pero lo suficientemente alto como para producir un número estadísticamente significativo de focos, es decir, permitir la reducción del número de focos (y por lo tanto el efecto de la neutralización). Así, se utilizaron 100 FUs como inóculo en este ensayo de neutralización. Para probar diferentes muestras humanas, tuvimos que tener en cuenta la capacidad de HDL para facilitar la entrada del VHCcc a través de un mecanismo que depende de la expresión del receptor de escavenger BI [11, 15 Dado el papel del HDL en la entrada del VHC, las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada muestra sérica antes de determinar el título de anticuerpos neutralizantes; esto libera el ensayo del riesgo de actividad de neutralización inespecífica del suero a través de los efectos del HDL, el sistema de complemento y/o la proteína amiloide A sérica (SAA) [29]. El ensayo de neutralización del VHC mostró buena reproducibilidad, tanto para ensayos duplicados como para pruebas independientes. Como era de esperar, el coeficiente de variación intra-ensayo (CV) fue menor que el CV interensayo. La prueba también mostró una buena especificidad, ya que no hubo interacción con anticuerpos anti-VIH, anti-VHB o heterofílicos. Se encontraron títulos muy bajos con muestras ELISA del VHC y ARN negativos, y el corte del ensayo se determinó como el título medio para muestras negativas más dos desviaciones estándar (1,25 log, correspondiente a una dilución de 1:18). Dado que sólo la cepa JFH-1 del genotipo 2a del VHC estaba disponible para el ensayo, se evaluó el título de neutralización de sera de pacientes infectados crónicamente con otros genotipos del VHC, es decir, 1, 2, 3, 4 y 5. La mayoría de estos sera fueron detectados como positivos por el ensayo de neutralización, excepto para dos sera de pacientes infectados por el VHC genotipo 1; estas dos muestras presentaron una alta proporción de anticuerpos específicos según el estudio ELISA, pero sólo muy baja inhibición por neutralización (muy por debajo del corte, de hecho). Concluimos que o las muestras carecían de anticuerpos neutralizantes o que cualquiera de los anticuerpos presentes no se La sensibilidad fue del 100%, no sólo para el genotipo 2 (el genotipo de la cepa utilizada para el ensayo) sino también para otros genotipos del VHC (excepto el genotipo 1). También se midieron anticuerpos del VHC genotipo 5 pero hubo muy pocas muestras para pruebas precisas. Además, el sera positivo (96,5%) tenía títulos comparables y significativamente altos (1,99 ± 0,63), cualquiera que sea el genotipo. Este hallazgo sugiere que la mayoría de los anticuerpos neutralizantes son reactivas cruzadas. Otra posibilidad es que la mayoría de los pacientes habían sido previamente infectados por una cepa del genotipo 2; sin embargo, esto es improbable porque en Francia circulan pocas cepas del genotipo 2 [30]. Como se esperaba para una prueba de neutralización, el ensayo presentado en el presente estudio parecía ser muy específico (independientemente del genotipo) y utilizable Por lo tanto, estamos seguros de que a medida que otros genotipos del VHCcc estén disponibles, estos ensayos reemplazarán el ensayo de pseudopartículas en un futuro próximo, ya que probablemente sean más relevantes. Nuestro ensayo es algo lento y podría simplificarse utilizando una dilución para contar los focos; sin embargo, este tipo de "corte corto" haría difícil extrapolar a la dilución neutralizando el 50% del inóculo. Otro enfoque consistiría en utilizar VHC recombinante capaz de expresar genes reporteros (como la luciferasa) con el fin de utilizar una sola dilución y obtener un resultado cuantitativo [31]. Sin embargo, se necesitan estudios de neutralización adicionales utilizando otros genotipos para completar nuestras observaciones y para el ensayo de neutralización basado en cultivos celulares simples, específicos y reproducibles para la determinación de anticuerpos neutralizantes anti-VHC en sueros humanos. Esta prueba debe ser una herramienta importante para medir la relación entre la respuesta neutralizante y la cinética de la carga viral en pacientes infectados aguda y crónicamente. Las células hepatoma humanas Huh-7 [32] fueron cultivadas en el medio esencial mínimo de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en 5% CO 2 a 37°C. El plásmido pJFH-1 que contiene el ADNc de largo alcance del aislado JFH-1 (que pertenece al subtipo 2a (adhesión del GenBank no. AB047639)), fue un regalo del Dr. Wakita (Departamento de Microbiología, Instituto Metropolitano de Tokio para Neurociencia, Tokio, Japón) y ha sido descrito previamente [17]. Para generar ARN VHC genómico, el plásmido pJFH-1 fue linealizado al final de 3' del VHC cDNA y utilizado como plantilla para la transcripción in vitro, como se describió anteriormente [33]. Las existencias virales se obtuvieron mediante la recolección de sobrenadantes del cultivo celular y congelándolos a -80°C. La titulación del virus se realizó en células Huh-7 con placas de microtitulado de 6 pocillos (Corning, NY) 72 horas después de la incubación, mediante inmunotenedumbre de las células con anticuerpos de un suero de paciente con VHC positivo que previamente había sido inactivado a 56°C (ver sección sobre el ensayo de neutralización del virus). El título viral se determinó por triplicado a partir del número medio de focos y se expresó como unidades de conformación focalización/mL (FFU/mL). Se probaron La recolección de los sueros fue aprobada por el Comité de Ética local y se obtuvo el consentimiento informado de los donantes. Cincuenta y siete de estas muestras fueron obtenidas de pacientes con VHC infectados crónicamente. La presencia de anticuerpos contra el VHC fue determinada y confirmada mediante dos ensayos de EIA del VHC de tercera generación (Axsym ® VHC Version 3.0, Abbott, Wiesbaden, Alemania y Vitros ® Reactivo Anti-VHC Pack, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Reino Unido). El ARN del VHC se determinó con un ensayo comercial cualitativo (Cobas Amplicior VHC Test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Francia) y el genotipado del VHC se realizó mediante secuenciación directa, como se describe en otras partes [34]. Los genotipos se distribuyeron de la siguiente manera Se utilizó un conjunto de 20 muestras séricas anti-VHC negativas para evaluar la especificidad del ensayo, incluyendo cinco muestras séricas con anticuerpo positivo de la superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs) y cinco sueros de pacientes infectados por el virus de Epstein-Barr que habían dado positivo para anticuerpos heterófilos. Todas las muestras séricas se habían almacenado a -80°C en el momento de la recogida y no habían sido descongeladas hasta el momento del ensayo. La fracción de inmunoglobulinas serum G (IgG) fue purificada utilizando proteína G-Sefarosa (GE Healthcare, Orsay, Francia El ensayo de neutralización de la reducción del foco del VHC se realizó en placas microtitulares de 96 pocillos. Se establecieron diluciones seriales de IgG purificada (10 μg) de 1:10 a 1:1.280. 25 μL de cada muestra se mezclaron con 25 μL de virus (100 UFU) en placas de microtitular de 96well e incubaron durante 1 hora a 37°C, 5% CO 2. Se añadió un volumen de 100 μL de suspensión celular Huh-7 (10.000 células/pozo) en medio de cultivo y se incubaron durante 5 horas a 37°C, 5% CO2. Después de 5 horas, se extirparon los sobrenadantes y se añadieron 100 μL de medio de cultivo a las monocapas. Después de 72 horas, las células se fijaron con paraformaldehído y permeabilizaron con 0,5% Tritón X-100. El anticuerpo primario (un suero de paciente con VHC positivo inactivado a 56°C) se diluyó a 1:500 antes de su uso y luego se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente Un anticuerpo IgG antihumano específico de Fc acoplado a peroxidasa (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) diluido a 1:200 fue dispensado en la monocapa celular e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se desarrolló con sustrato de la peroxidasa DAB (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se detuvo después de 10 minutos de incubación con agua destilada. Se determinó el número de focos del VHC en cada dilución. Se incluyeron controles en cada ensayo (virus no neutralizado, IgG purificado de cada paciente en una dilución 1:10). La dilución que neutralizaba el 50% del virus se calculó mediante análisis de regresión curvilínea utilizando el software XLSTAT 2006 (Addinsoft SARL, París, Francia) [35]. Cada título fue determinado como valor logarítmico de la dilución de anticuerpos recíprocos que redujo el número de focos virales en un 50%; se expresaron como valores logarítmicos y se calcularon medias ± desviación estándar; se utilizó la prueba t del estudiante para comparar datos entre grupos; se consideraron significativos los valores de p por debajo de 0,05.
question: ¿Cuál es el riesgo a largo plazo de infección crónica por hepatitis C?
answers.text: cirrosis y carcinoma hepatocelular