context: Caracterización de un nuevo miembro del alfacoronavirus con características genómicas únicas en los murciélagos de Rhinolophushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6521148/SHA: ee14de143337eec0e9708f8139bfac2b7b8fdd27Autores: Wang, Ning; Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, ZhengliFecha: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Licencia: cc-byAbstract: Los murciélagos han sido identificados como Varios de ellos han causado enfermedades en humanos y animales domésticos por transmisión de interespecies. Teniendo en cuenta la diversidad de coronavirus de murciélagos, especies de murciélagos y poblaciones, esperamos descubrir más CoV de murciélagos a través de la vigilancia del virus. En este estudio, describimos un nuevo miembro de alfaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) en murciélagos con características únicas del genoma. Se encontraron genes accesorios únicos, ORF4a y ORF4b entre el gen de pico y el gen de sobre, mientras que el gen ORF8 se encontró aguas abajo del gen nucleocápsido. Todos los genes putativos fueron confirmados por análisis de transcripción inversa. Un gen único en el 3’ final del genoma BtCoV/Rh/YN2012, ORF9, muestra ~30% identidad de aminoácidos a ORF7a del corona El análisis funcional mostró que la proteína ORF4a puede activar la producción de IFN-β, mientras que ORF3a puede regular la producción de NF-B. También examinamos la entrada de virus mediados por picos utilizando el sistema de retrovirus pseudotipados, aunque no encontramos células totalmente permisivas. Nuestros resultados amplían el conocimiento sobre la diversidad genética de los coronavirus de murciélagos. La exploración continua de virus de murciélagos nos ayudará a entender más el importante papel que desempeñan los murciélagos en la evolución y transmisión del coronavirus. Texto: Los miembros de la familia Coronaviridae son virus de ARN de cadena positiva no segmentados con tamaños de genoma que van desde 26-32 kb [1]. Estos virus se clasifican en dos subfamilias: Letovirinae, que contiene el único género: Alphaletovirus; y Orthocoronavirinae (CoV), que consiste en alfa, beta, gamma y deltacoronavirus (CoVs) [2, 3]. Alfa y betacoronavirus infectan principalmente mamíferos y causan enfermedades humanas y animales. Gamma-y delta-CoVs infectan principalmente aves, pero algunos también pueden infectar mamíferos [4, 5]. Se sabe que seis CoVs humanos (HCoVs) causan enfermedades humanas. HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y HCoV-NL63 suelen causar enfermedades respiratorias leves o infecciones asintomáticas; sin embargo, el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus (SARS-CoV) y todos los procedimientos de muestreo fueron realizados por veterinarios, con la aprobación del Comité de Ética Animal del Instituto de Virología Wuhan (WIVH5210201). El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y el uso de mamíferos silvestres en la investigación de la República Popular China. Las muestras de hisopos fecales y pellets de murciélagos se recolectaron de noviembre de 2004 a noviembre de 2014 en diferentes estaciones en el sur de China, como se describió anteriormente [16]. El ARN viral se extrajo de 200 μL de muestras de hisopos fecales o pellets utilizando el kit de El ARN fue eludido en 50 μL de tampón de elución, alícuota, y almacenado en -80 • C. Se empleó PCR (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de hemi-nedificado en un solo paso para detectar el coronavirus, como se describió anteriormente [17, 18]. Para confirmar la especie de murciélago de una muestra individual, nosotros PCR amplificamos el citocromo b (Cytob) y/o el gen de la subunidad 1 (ND1) de la deshidrogenasa NADH utilizando ADN extraído de las heces o hisopos [19, 20]. Las secuencias genéticas fueron ensambladas excluyendo las secuencias de imprimación. BLASTN fue utilizado para identificar especies de huésped basadas en las secuencias más estrechamente relacionadas con la mayor cobertura de consulta y una identidad mínima del Las secuencias genómicas completas se determinaron mediante PCR de un solo paso (Invitrogen, San Diego, CA, USA) amplificación con imprimaciones degeneradas (Tabla S1) diseñadas sobre la base de múltiples alineaciones de secuencias alfa-CoV disponibles depositadas en GenBank o amplificadas con SuperScript IV Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) con imprimaciones específicas (secuencias primarias disponibles bajo petición). Las secuencias de los extremos genómicos 5' y 3' se obtuvieron mediante amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cDNA (SMARTER Viruses 2019, 11, 379 3 de 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), respectivamente. Los productos PCR fueron Los productos PCR de más de 5kb fueron sometidos a secuenciación profunda utilizando el sistema Hiseq2500. Para algunos fragmentos, los productos PCR fueron clonados en el pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) para secuenciación. Al menos cinco clones independientes fueron secuenciados para obtener una secuencia de consenso. Los datos de la secuenciación de la siguiente generación (NGS) fueron filtrados y mapeados a la secuencia de referencia de BatCoV HKU10 (número de adhesión de GenBank NC_018871) usando Geneious 7.1.8 [21]. Los genomas fueron ensamblados preliminarmente usando DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Se predijeron marcos de lectura abierta (ORF) Putativos utilizando el buscador de ORF de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) con una longitud mínima de 150 nt, seguido de una inspección manual. Se definieron las secuencias de la región 5' no traducida (5'-UTR) y 3'-UTR, y la secuencia líder, la secuencia reguladora de transcripción corporal y líder (TRS) fueron identificadas como previamente descritas [22]. La escisión de las 16 proteínas no estructurales codificadas por ORF1ab fue determinada por la alineación de secuencias aa de otras CoVs y el patrón de reconocimiento de la proteinasasa 3C y la proteinasasa similar a la papaína. Los árboles filogenéticos basados en secuencias nt o aa fueron construidos utilizando el algoritmo de máxima probabilidad con valores de bootstrap determinados por 1000 réplicas en el paquete de software MEGA 6 [23]. Las secuencias de genoma de larga duración obtenidas en este estudio fueron alineadas con las de alfa-CoVs previamente reportadas usando MUSCLE [24]. Las secuencias alineadas fueron escaneadas para eventos de recombinación mediante el Programa de Detección de Recombinación [25]. Los eventos potenciales de recombinación como sugieren los fuertes p-valores (<10 -20 ) fueron confirmados mediante diagrama de similitud y análisis bootscan implementados en Simplot 3.5.1 [26]. El número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ks, y el número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimas, Ka, para cada región de codificación, se calcularon utilizando la herramienta de cálculo Ka/Ks de la Plataforma Norwegian Bioinformática (http://services.cuib.no/tools/kaks) con parámetros por defecto [27]. La detección de homología de proteínas se analizó utilizando HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hpred) con parámetros por defecto [28]. Se utilizó un conjunto de RT-PCRs anidados para determinar la presencia de mRNA subgenómica viral en las muestras positivas de CoV [29]. Los imprimadores delanteros se diseñaron con la secuencia líder al Células primarias de murciélago o inmortalizadas (Rhinolophus sinicus riñón inmortalizado, RsKT; Rhinolophus sinicus células primarias de pulmón, RsLu4323; Rhinolophus sinicus cerebro inmortalizado, RsBrT; Rhinolophus affinis células primarias de riñón, RaK4324; Rousetus leschenaultii células inmortalizadas de riñón, RlKT; Hipposideros pratti células inmortalizadas de pulmón, HpLuT) generadas en nuestro laboratorio fueron cultivadas en DMEM/F12 con 15% FBS. Las células renales de Pteropus alecto (Paki) se mantuvieron en DMEM/F12 complementadas con 10% FBS. Otras células fueron mantenidas según las recomendaciones de American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Los genes accesorios putativos del virus recién detectado fueron generados por RT-PCR a partir de ARN viral extraído de muestras fecales, como se describió anteriormente [30]. El plásmido del virus influenza NS1 fue generado en nuestro laboratorio [31]. El bocavirus humano (HBoV) VP2 plásmido fue amablemente proporcionado por el prof. Hanzhong Wang del Instituto de Virología Wuhan, Academia China de Ciencias. SRAS-CoV ORF7a fue sintetizado por Sangon Biotech. Las transfecciones fueron realizadas con Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). La expresión de estos genes accesorios fue analizada por Western blotting usando un mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Brevemente, el sobrenadante fecal fue adquirido mediante centrifugación de gradiente y luego agregado a las células Vero E6, 1:10 diluidas en DMEM. Después de la incubación a 37°C durante 1 h el inóculo fue reemplazado por DMEM fresco que contenía 2% FBS y el antibiótico antimicótico (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se realizaron tres pasajes ciegos. Las células fueron revisadas diariamente para detectar el efecto citopático. Tanto el sobrenadante de cultivo como el pellet celular fueron examinados para CoV por RT-PCR [17]. La Apoptosis fue analizada como se describió previamente [18]. Brevemente, las células 293T en placas de 12 pocillos fueron transfectadas con 3 μg de plasma de expresión o vector vacío, y las células fueron recolectadas 24 h después de la transfección La apoptosis fue detectada por citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis V-FITC/PI de la anexina (YEASEN, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Células anexina-V-positivas y IP-negativas se consideraron en la fase apoptótica temprana y se consideró que las teñidas para la apoptosis o necrosis tardía de la anexina V y la IP se sometieron a apoptosis o necrosis tardía.Todos los experimentos se repitieron tres veces. Las células HEK 293T fueron sembradas en placas de 24 pocillos y luego cotransfectadas con plásmidos reporteros (pRL-TK y pIFN-βIFN-o pNF-B-Luc) [30], así como plásmidos que expresan genes accesorios, plásmidos vectoriales vacíos pcAGGS, virus influenza NS1 [32], SARS-CoV ORF7a [33], o HBoV VP2 [34]. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el virus Sendai (SeV) (100 unidades de hemaglutinina [HAU]/ml) o el factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF-α; sistema R&D) durante 6 h para activar IFNβ o NF- Se prepararon lisatos celulares y se midió la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de doble luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron retrovirus pseudotipados con BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, o pico MERS-CoV, o ningún pico (mock) para infectar células humanas, murciélagos u otras células de mamíferos en placas de 96 pozos. Las partículas de pseudovirus fueron confirmadas con electromicroscopía de borrado occidental y de mancha negativa. El proceso de producción, mediciones de infección y actividad de luciferasa se llevaron a cabo, como se describió anteriormente [35, 36]. Las secuencias nucleótidas del genoma completo de las cepas BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3, y RaGD obtenidas en este estudio han sido sometidas al GenBank bajo MG916901 a MG916904. La vigilancia se realizó entre noviembre de 2004 y noviembre de 2014 en 19 provincias de China. En total, se recolectaron 2061 muestras fecales de al menos 12 especies de murciélago Rhinolophus (Figura 1A ). Se detectaron COVs en 209 de estas muestras (Figura 1B y Tabla 1 ). Cinco de estos virus están relacionados con especies conocidas: Mi-BatCoV 1 (> 94% nt identity), Mi-BatCoV HKU8 [37] (> 93% nt identity), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (> 99% nt identity), SRASr-CoV [38] (> 89% nt identity) y HKU2 related CoV [39] (> 85% nt identity). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies de CoV. El aislamiento del virus se realizó como se describió previamente [12], pero no tuvo éxito. identidad). Mientras que las otras tres secuencias de CoV mostraron menos de 83% nt identity a especies conocidas de CoV. Estos tres virus deben representar nuevas especies A continuación caracterizamos una novela alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Fue detectada en 3 R.affinis y 6 R.sinicus, respectivamente. Con base en las secuencias, definimos tres genotipos, que fueron representados por RsYN1, RsYN3, y RaGD, respectivamente. Strain RsYN2 fue clasificado en el genotipo RsYN3. Se obtuvieron cuatro genomas de longitud completa. Tres de ellos fueron de R.sinicus (Strain RsYN1, RsYN2 y RsYN3), mientras que el otro fue de R.affinis (Strain RaGD). Los tamaños de estos 4 genomas son entre 28.715 y 29.102, con contenidos de G+C entre el 39,0% y el 41,3%. Los genomas presentan estructuras similares y secuencias reguladoras de transcripción (TRS) que son idénticas a las de otros alfa-CoVs (Figura 2 y Tabla 2). Se observaron excepciones incluyendo tres ORF adicionales (ORF3b, ORF4a y ORF4b). Todas las 4 cepas tienen ORF4a y ORF4b, mientras que sólo la cepa RsYN1 tiene ORF3b. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. El gen de réplicas, ORF1ab, ocupa~20.4 kb del genoma. Codifica las poliproteínas 1a y 1ab, las cuales podrían separarse en 16 proteínas no estructurales (Nsp1-Nsp16). El 3'-fin de los sitios de escote reconocidos por la proteinasa similar a 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) y la proteinasa similar a papaína (Nsp1-Nsp3) fueron confirmados. Las proteínas incluyendo Nsp3 (papain-like 2 proteas, PL2pro), Nsp5 (quimotripsina-like proteasa, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (helicase), y otras proteínas de función desconocida (Tabla 3 ). Los 7 dominios concatenados de poliproteína 1 comparten la identidad de secuencia <90% aa con los de otros alfa-CoV conocidos (Tabla 2 ), sugiriendo que estos virus representan una nueva especie de CoV dentro de la alfa-CoV. Las especies de CoV más cercanas asignadas a BtCoV/Rh/YN2012 son BtCoV-HKU10 y BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Las tres cepas de la provincia de Yunnan fueron agrupadas en dos genotipos (83% identidad del genoma) correlacionados con su localización de muestreo. El tercer genotipo representado por la cepa RaGD fue aislado a las cepas encontradas en Yunnan (<75,4% identidad del genoma). Luego examinamos los genes individuales (Tabla 2). Todos los genes mostraron una baja identidad de secuencia aa a CoV conocidos. Las cuatro cepas de BtCoV/Rh/YN2012 mostraron diversidad genética entre todos los genes diferentes excepto ORF1ab (>83,7% aa identidad). Cabe destacar que las proteínas de pico son muy divergentes entre estas cepas. Otras proteínas de estructura (E, M La comparación de los genes accesorios entre estas cuatro cepas reveló que las cepas del mismo genotipo compartían un ORF3a 100% idéntico. Sin embargo, las proteínas codificadas por ORF3as eran altamente divergentes entre los diferentes genotipos (<65% aa identity). Los genes accesorios putativos también fueron BLASTed contra los registros de GenBank. La mayoría de los genes accesorios no tienen homólogos en GenBank-database, excepto ORF3a (52,0-55,5% aa identity with BatCoV HKU10 ORF3) y ORF9 (28,1-32,0% aa identity with SARSr-CoV ORF7a). Analizamos la homología proteica con el software HHpred. Los resultados mostraron que ORF9s y SARS-CoV OR7a son homólogos (posibilidad: 100%, Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORF predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis de agarosa-gel y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORFs, excepto ORF4b, tenían un TRS anterior. Por lo tanto, el ORF4b puede ser traducido a partir de mRNAs bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de la secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Para confirmar la presencia de ARN subgenómico, diseñamos un conjunto de imprimaciones dirigidas a todos los ORFs predichos como se describe. Los amplicones fueron confirmados primero a través de electroforesis gel de agarosa y luego secuenciación (Figura 3 y Tabla 2 ). Las secuencias mostraron que todos los ORF, excepto ORF4b, tenían TRS anteriores. Por lo tanto, los ORF4b pueden ser traducidos de ARNm bicistrónicos. En RsYN1, se encontró un ARN subgenómico adicional a partir del interior del ORF3a a través de secuenciación, lo que llevó a un ORF3b único. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoVs representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos los BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados juntos y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas del corona Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. Dentro de BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos.Uno fue de Ra muestreado en Guangdong, mientras que el otro fue de Rs muestreado en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 fueron agrupadas, mientras que RsYN1 fue aislado. La topología de estas cuatro cepas fue correlacionada con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una alta diversidad entre estas cepas, lo que indica una larga evolución independiente. Los árboles filogenéticos fueron construidos usando las secuencias aa de RdRp y S de BtCoV/Rh/YN2012 y otras CoV representativas (Figura 4). En ambos árboles, todos BtCoV/Rh/YN2012 fueron agrupados y formaron un linaje distinto a otras especies conocidas de coronavirus. En BtCoV/Rh/YN2012 se observaron dos sublineamientos distintos, uno de Ra en Guangdong, mientras que el otro de Rs en Yunnan Entre las cepas de Yunnan, RsYN2 y RsYN3 se agruparon, mientras que RsYN1 se aisló. La topología de estas cuatro cepas se correlacionó con el lugar de muestreo. Las ramas relativamente largas reflejan una gran diversidad entre estas cepas, lo que indica un largo historial de evolución independiente. Las ratios Ka/Ks (Ks es el número de sustituciones sinónimos por sitios sinónimos y Ka es el número de sustituciones no sinónimos por sitio sinónimos) fueron calculadas para todos los genes. Las ratios Ka/Ks para la mayoría de los genes fueron generalmente bajas, lo que indica que estos genes estaban bajo selección purificada. Sin embargo, las ratios Ka/Ks de ORF4a, ORF4b y ORF9 (0,727, 0,623 y 0,843, respectivamente) fueron significativamente más altas que las de otros ORFs (Tabla 4 ). Para la evaluación de la presión de selección adicional del gen ORF4a y ORF4b, secuenciamos otros cuatro genes ORF4a y ORF4b (estreno Rs4223, Rs4236, Rs4240 y Ra13576 se mostró en la Figura 1B Como SARS-CoV ORF7a fue reportado para inducir apoptosis, realizamos análisis de apoptosis en BtCoV/Rh/YN 2012 ORF9, a~30% aa homólogo de identidad de SARSr-CoV ORF7a. Transfectamos transitoriamente ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 a células HEK293T para examinar si esta ORF9 desencadena apoptosis. Se realizó Western blot para confirmar la expresión de ORF9 y SARS-CoV ORF7a (Figura S1). ORF9 no pudo inducir apoptosis como la ORF7a de SARS-CoV Tor2 (Figura S2). Los resultados indicaron que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 no estuvo involucrado en la inducción de la apoptosis. Para determinar si estas proteínas accesorias modulan la inducción de IFN, transfectamos plasmidos reporteros (pIFNβ-Luc y pRL-TK) y plasmidos de expresión a células 293T. Todas las células que sobreexpresaban los genes accesorios, así como el virus influenza NS1 (tramo PR8), HBoV VP2, o el vector vacío fueron probados para la actividad de luciferasa después de la infección por SeV. La actividad luciferasa estimulada por SeV fue notablemente superior a la esperada sin tratamiento con SeV. El virus influenza NS1 inhibe la expresión del promotor de IFN, mientras que HBoV VP2 activa la expresión. En comparación con esos controles, las proteínas ORF4a exhiben un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). fue notablemente mayor que sin tratamiento con SeV como se esperaba. El virus influenza En comparación con estos controles, las proteínas ORF4a presentan un efecto activo como HBoV VP2 (Figura 5A ). Otras proteínas accesorias no mostraron ningún efecto en la producción de IFN (Figura S3 ). La expresión de estos genes accesorios fue confirmada por Western blot (Figura S1 ). Las muestras fueron recolectadas a las 6 h de postinfección, seguidas por el ensayo de doble luciferasa. Los resultados fueron expresados como el valor luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). NF-B juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con reportero Las muestras fueron recolectadas a 6 h de postinfección, seguidas de ensayo de doble luciferasa. Los resultados se expresaron como el valor de luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lucifera de la lu Las células 293T fueron transfectadas con 100 ng pNF-B-Luc, 10 ng pRL-TK, vector vacío (500 ng), un plásmido NS1 que expresaba (500 ng), un plásmido ORF7a de expresión SARS-CoV (500 ng), o plásmidos ORF3a de expresión ORF (500 ng). Después de 24 h, las células fueron tratadas con TNF-α. La actividad de la doble luciferasa se determinó después de 6 h. Los resultados se expresaron como la actividad de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la luciferasa de la Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (en comparación con el vector-NC vacío, p < 0,05, según lo determinado por la prueba t del estudiante). El NF-B desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección viral y es también un factor clave frecuentemente dirigido por virus para hacerse cargo de la célula huésped. En este estudio, se probó si estas proteínas accesorias podían modular las células NF-B. 293T fueron cotransfectadas con plásmidos reporteros (pNF-B-Luc y pRL-TK), así como con plasmidos que expresan proteínas accesorias, o controles (vector vacío, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Las células fueron tratadas con TNF-α durante 6 h a 24 h después de la transfección. Se determinó la actividad luciferasa. RsYN1-ORF3a y RaGD-ORF3a activaron NF-B como SARS-CoV ORF7a, mientras que RsYN2-ORF3a inhibió NF-B como NS1 (Figura 5B ). Las expresiones de ORF3as fueron confirmadas con Western blot (Figura S1 ). Otras proteínas accesorias no modularon la producción de NF-B (Figura S4 ). Para comprender la infectividad de estos nuevos BtCoV/Rh/YN2012, seleccionamos las proteínas de pico RsYN1, RsYN3 y RaGD para estudios de entrada de pseudovirus mediados por picos. Tanto el análisis de manchas occidentales como la observación de microscopía electrónica de mancha negativa confirmaron con éxito la preparación de BtCoV/Rh Un total de 11 líneas celulares humanas, 8 células de murciélagos y otras 9 líneas celulares de mamíferos fueron probadas, y no se encontró ningún fuerte positivo (Tabla S2). En este estudio, una nueva especie alfa-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, fue identificada en dos especies Rhinolophus. Las 4 cepas con genoma de largo alcance fueron secuencias. Los 7 dominios de replicación conservados de estos virus poseían una identidad secuencial <90% aa a los de otros alfa-CoV conocidos, lo que define una nueva especie de acuerdo con el estándar de taxonomía ICTV [42]. Estos nuevos alfa-CoV mostraron una alta diversidad genética en sus genes estructurales y no estructurales. La cepa RaGD de R. affinis, recolectada en la provincia de Guangdong, formó una rama independiente divergente de las otras 3 cepas de R. sinicus, muestreadas en la provincia de Yunnan, indicando un proceso de evolución independiente asociado con el aislamiento geográfico y la restricción del huésped. Aunque recolectadas de la misma provincia, estas tres cepas de virus formaron dos genotipos correlacionados con lugares de muestreo. Estos dos genotipos tenían una baja identidad de secuencia del genoma, especialmente en el gen S y genes accesorios. Teniendo en cuenta la ubicación geográfica remota del hábitat del murciélago huésped, el tropismo anfitrión y la diversidad del virus, suponemos que BtCoV/Rh/YN2012 puede haberse diseminado en estas dos provincias con una larga historia de circulación en su reservorio natural, los murciélagos Rhinolophus. Con la evidencia de secuencia, suponemos que En primer lugar, se identificaron nuevos genes accesorios, que no tenían homólogos en los genomas. En segundo lugar, se encontraron múltiples TRS entre los genes S y E, mientras que otros alfacoronavirus solo tenían un TRS allí. Estos TRS preceden a ORF3a, ORF3b (sólo en RsYN1) y ORF4a/b respectivamente. En tercer lugar, el gen accesorio ORF9 mostró homología con los de otras especies conocidas de CoV en otro género de coronavirus, especialmente con genes accesorios de SRASr-CoV. Los genes accesorios suelen estar involucrados en interacciones virus-anfitriones durante la infección por CoV [43]. En la mayoría de los CoVs, los genes accesorios son dispensables para la replicación del virus. Sin embargo, se requirió un gen 3c intacto de felina CoV para la replicación viral en el intestino [44] [45] [4 La supresión de los genes específicos del género en el virus de la hepatitis del ratón llevó a una reducción de la virulencia [47]. SARS-CoV ORF7a, que fue identificado como involucrado en la supresión del silenciamiento del ARN [48], inhibición de la síntesis de proteínas celulares [49], bloqueo del ciclo celular [50], e inducción de la apoptosis [51, 52]. En este estudio, encontramos que BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 comparte ~ 30% aa identidad secuencial con SARS-CoV ORF7a. Curiosamente, BtCoV/Rh/YN2012 y SRASr-CoV fueron detectados en R. sinicus de la misma cueva. Suponemos que el SARS-CoV y el BtCoV/Rh/YN2012 pueden haber adquirido ORF7a o ORF9 de un ancestro común a través de la recombinación del genoma o la transferencia horizontal de genes. Mientras que el ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012 no indujo la apoptosis ni activaron la producción de NF-Karabaj, estas diferencias pueden ser inducidas por la evolución divergente de estas proteínas en diferentes presiones. Aunque diferentes BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a comparten < 64,4% de identidad de aminoácidos, todos ellos podrían activar IFN-β. El ORF3a de RsYN1 y RaGD incrementan la patogenicidad del virus con una vía diferente. A pesar de la falta de líneas celulares intestinales del huésped natural de BtCoV/Rh/YN2012, examinamos el tropismo celular de su proteína de pico a través de la entrada de retrovirus pseudotipados con líneas celulares humanas, murciélagos y otras células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares examinadas fueron insospechables a BtCoV/Rh/YN2012, lo que indica un bajo riesgo de transmisión de interespecies a humanos y otros animales. Múltiples razones pueden conducir a una infección fallida del sistema retrovirus de pico de coronavirus-pseudotipo, incluyendo ausencia de receptor en células diana, reconocimiento fallido al homólogo receptor de especies no huésped, mala adaptación en células no huésped durante la maduración de pico o entrada de virus, o la limitación del sistema retrovirus en la entrada de coronavirus estimulante. La débil infectividad del retrovirus pseudotipado RsYN1 en células Huh-7 podría explicarse por la unión de la proteína de pico a polisacárido secretada a la superficie. La suposición debe ser confirmada por experimentos. Nuestras vigilancias a largo plazo sugieren que los murciélagos Rhinolophus parecen albergar una amplia diversidad de CoVs. Coincidentemente, los dos agentes altamente patógenos, SRAS-CoV y Rh-BatCoV HKU2 ambos se originaron de murciélagos Rhinolophus. Teniendo en cuenta la diversidad de CoVs transportados por este género de murciélagos y su amplia distribución geográfica, puede haber un bajo riesgo de derrame de estos virus a otros animales y humanos. Vigilanciaes a largo plazo y estudios de patogénesis ayudarán a prevenir futuras enfermedades humanas y animales causadas por estos murciélagos CoVs. Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/1999-4915/11/4/379/s1, Figura S1 : análisis de manchas occidentales de la expresión de proteínas accesorias. Figura S2 : análisis de Apoptosis de proteínas ORF9 de BtCoV/Rh/YN2012. Figura S3 : análisis funcional de proteínas ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de interferón de tipo I. Figura S4 : análisis funcional de ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 y ORF9 en la producción de NF- Tabla S2 : Primeros para la detección de ARNm sugbenómicos virales. Tabla S3
question: ¿Cuál es el tamaño del genoma del coronavirus?
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