МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ  В РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ

Аннотация: Показана эффективность применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и лизата тромбоцитов в составе биотрансплантата для регенерации дефектов костной ткани. Отмечено увеличение плотности костного регенерата и формирование зрелой пластинчатой костной ткани в зоне имлантации биотрансплантата.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, биокомпозиционные материалы, лизат тромбоцитов.

По современным представлениям для конструирования костных трансплантатов и их эффективного приживления у пациентов необходимы три компонента: остеогенные клетки, материал-носитель (scaffold) и биоактивные молекулы (ростовые факторы, цитокины, костные морфогенетические белки и т.д.) [1, c.20; 2, c.258; 3, с.210]. К настоящему времени остеогенные клетки человека в достаточных количествах с успехом получают in vitro из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) различного происхождения – костного мозга,  жировой ткани и других источников . МСК обладают высоким пролиферативным потенциалом и способностью вступать в дифференцировку в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. Наиболее распространенным источником получения МСК для аутологичного применения в настоящее время является костный мозг. Более того, клиническая практика  свидетельствует, что с целью усиления остеогенеза в костных дефектах с успехом можно использовать обогащенную активированными тромбоцитами аутоплазму, содержащую растворимые факторы тромбоцитов, в связи с их способность оказывать костимулирующее действие in vitro при дифференцировке МСК в остеогенном направлении .

Эффективность формирования костной ткани с использованием костных трансплантатов зависит не только от особенностей заселяемых клеток, но и от свойств поддерживающей матрицы. Выбор материала определяется их влиянием на тканевые процессы и общие показатели всего организма: отсутствие воспалительной и иммунной реакций, адгезивность, способности поддерживать пролиферацию эксплантированных клеток in vitro и in vivo, биорезорбируемость и др. Наиболее перспективными считают материалы на основе фосфатов кальция (гидроксиапатит, трикальцийфосфат, ситталы, биоактивные стекла), близкие по своему составу к костной ткани человека . Поэтому, учитывая естественную роль мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и растворимых факторов тромбоцитов в репаративных процессах, представляется интерес совместного их использования при конструировании остеогенного трасплантата.

Целью этой работы являлось изучение регенерации костной ткани в эксперименте на животных с применением ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток и лизата тромбоцитов.

Материалы и методы. МСК выделяли из костного мозга здоровых лиц методом  адгезии на пластике. Культивировали в среде α-МЕМ (Sigma, США) c 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и антибиотиками  при 37°С и 5% CO2со сменой среды каждые 3-4 дня. Прилипшие к пластику МСК, снимали 0,25% раствором трипсин-ЭДТА и пассировали 2-3 пассажа. Остеогенную дифференцировку МСК проводили в течение четырех дней в ППС с добавлением 10 мМ β-глиферофосфата, 50 µМ аскорбиновой кислоты и 0,1 µМ дексаметазона [3, c.212; 4, c.40].

Лизат тромбоцитов (ЛТ) получали из стандартной дозы (200 мл, 200х109 тромбоцитов) концентрата тромбоцитов (КТ) от 10 доноров крови. КТ переносили в полипропиленовые пробирки и центрифугировали в режиме 3500 g 20 мин. Плазму удаляли, а осадок тромбоцитов отмывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Затем тромбоциты ресуспендировали в культуральной среде α-МЕМ в концентрации 5х109/мл клеток. Полученные образцы взвесей тромбоцитов замораживали при - 80°С на ночь [6, с.2682]. Для  осаждения стромы тромбоцитов образцы центрифугировали при 3500g. Готовили общую пробу (пул) из всех образцов ЛТ, а потом проводили стерилизующую фильтрацию  через фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,2 мкм. Хранили при температуре -20°С до применения.

В состав биотрансплантата включали остеопластический материал, преддифференцированные в остеогенном направлении МСК костного мозга человека, ЛТ. В качестве остеопластического материала-носителя использовали Коллппан (пр-во ООО «Интермедапатит», РФ). Регенерацию трубчатых костей  с использованием  биотрансплантата изучали на модели краевого дефекта лучевой кости кроликов (1,5 см). Контролем служил дефект кости, заживающий под кровяным сгустком, и дефект, заполненный остеопластическим материалом без МСК и ЛТ. Биотрансплантат в дефекте фиксировали фибриновым гелем («Фибриностат М», Беларусь). Восстановление костного дефекта оценивали с помощью окрашивания гематоксилин-эозином гистологических срезов костей в месте формирования биотрансплантата через 3 месяца после операции.

Результаты. Влияние биотрансплантата на регенерацию трубчатых костей проводили на модели  краевого дефекта  лучевой кости кроликов (1,5 см) (рис.2).

С увеличением срока наблюдения в группе Коллапан + МСК +ЛТ отмечалось увеличение показателей плотности в зоне дефекта (n=3, p&lt;0.05). Наблюдаемое увеличение показателей плотности может свидетельствовать о физиологическом течении репаративных процессов в зоне дефекта с использованием биотрансплантата (рис 3).