ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ

Аннотация: Продукты пчеловодства являются перспективным источником биологически-активных веществ для биотехнологии и медицины. К настоящему времени из мёда, маточного молочка и гомогената личинок пчел выделено и охарактеризовано большое количество индивидуальных веществ, комбинации которых широко используются для создания биологически-активных веществ и лекарственных препаратов. Совокупность свойств уже охарактеризованных веществ не может объяснить многообразие фармакологических эффектов продуктов пчеловодства в неочищенном виде. Таким образом, целью нашей работы являлось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств пептидов из пыльцы.

Ключевые слова: низкомолекулярные пептиды, пыльца растений.

Мед, цветочная пыльца (обножка), маточное молочко, прополис – уникальные  продукты природы, содержащие в сбалансированном сочетании ряд важнейших биологически активных компонентов: белков, липидов, аминокислот, витаминов, ферментов, макро- и микроэлементов. Обладая достаточно высокой терапевтической активностью, они действуют мягче, физиологичнее синтетических лекарственных средств, характеризуются высокой степью безопасности, а относительная дешевизна делает их доступными практически для всех социальных слоев населения.

Пыльца, например, является прекрасным лечебным и профилактическим средством при многих заболеваниях, а также биостимулятором, благотворно действующим на организм. Пыльца содержит все микроэлементы и аминокислоты, необходимые для нормального развития организма. Особенно много в ней калия, железа, меди и кобальта. Провитамина А (каротина) в пыльце в 20 раз больше, чем в моркови. В ней есть витамины группы В, Е, С, D, Р, РР, К и др., фитогормоны, стимулирующие рост тканей, антибактериальные вещества, а также соединения, обладающие противосклеротическим, противовоспалительным, капилляроукрепляющим, антиоксидантным, мочегонным, желчегонным, противоопухолевым и другими свойствами, однако механизмы подобного воздействия практически не изучены. Возможным фармакологическим агентом, оказывающим подобное действие, могут являться пептиды, поскольку для пептидных молекул характерно мощное полифункциональное воздействие на организм.

Таким образом, целью нашей работы являлось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств пептидов из пыльцы.

Перед нами были поставлены следующие задачи: 1. Выделить низкомолекулярные пептиды из гомогената пыльцы; 2. Очистить гомогенат от примесей белков, липидов; 3. Определить наличие пептидов во фракции очищенного гомогената пыльцы пчел.

Полученные данные позволят определить состав пчелиной обножки и качественные характеристики ее состава.

Объектом  исследования являлась цветочная обножка, т.е. цветочная пыльца, обработанная ферментами пчел.

Для приготовления 20% экстракта на лабораторных аналитических весах (AXIS-1530) взвешивали навеску пыльцы массой 15 г с последующим растиранием ее в фарфоровой ступке с добавлением 100 мл 0,9% физиологического раствора. Далее использовался метод замораживания и оттаивания материала, в результате чего, образующиеся кристаллы льда разрушали субклеточные структуры. Потом полученную суспензию отфильтровывали на холоду 1 раз через фильтр состоящий из слоя ваты с марлей. И нерастворимые части осаждали центрифугированием на рефрижераторной центрифуге при 10000 об. 40 мин. После этого осадок удаляли, а супернатант отфильтровывали, так же на холоду, 2 раза через фильтровальную бумагу и 1 раз через хроматографическую до получения прозрачного раствора.

Полученный экстракт замораживался при -40˚ С и хранился  не более месяца.

Для дальнейшего использования 20%-й  экстракт цветочной обножки разбавляли 0,9% физиологическим раствором для получения  необходимых концентраций.

Для получения пептидной фракции экстракт подвергали кипячению с последующим осаждением денатурированных белков центрифугированием.

Методы исследовании: 1. Гель-фильтрация на сефадексе G-25. 2. Электрофорез в полиакриламидном геле. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография на хроматографической системе Bio-Rad NGC, на колонке 4,5 х 150 мм, размер гранул 5 мкм, в системе 0,5 % раствор трифторуксусной кислоты в воде: 0,5 % раствор трифторуксусной кислоты в 50% ацетонитриле в воде.

Результаты:

С целью изучения присутствия пептидов в пыльце была проведена колоночная гель-хроматография, где разделение происходило при перемещении по колонке в потоке элюэнта смеси веществ разного молекулярного веса.

На обоих графиках четко видно два основных пика, где первый соответствует высокомолекулярным белкам, а второй пептидам.

После анализа получившихся данных было решено отделить фракцию пептидов от фракции белков. И было проведено два основных метода для выявления наиболее оптимального. Первый – это осаждение фракции белков трихлоруксусной кислотой, второй метод кипячения, в котором белки должны необратимо денатурировать. Определение концентрации белка методом Лоури показало, что более точным методом отделения пептидной фракции является кипячение. В результате была опять проведена колоночная гель-хроматография с 2-я экстрактами, но уже после кипячения.

Таким образом, методом колоночной гель-хроматографии было доказано наличие белков и пептидов в исследуемых экстрактах. А использованием разных методов осаждения был найден оптимальный способ отделения белковой фракции от пептидной.

Далее проводили подбор наиболее оптимальных условий для электрофореза, при которых  наблюдалось бы разделение белков и пептидов продуктов пчеловодства (раствора меда, экстрактов перги, пыльцы и трутневого расплода) на наибольшее количество идентифицируемых зон.

На первых этапах были проведены исследования белково-пептидных спектров продуктов пчеловодства в 7,5% ПААГ.

На электрофореграмме после окрашивания и отмывки геля было получено четкое разделение белков всех вышеперечисленных продуктов пчеловодства. Так, на дорожке №1 представлен белково-пептидный спектр 15% экстракта пыльцы, состоящий из 14 фракций; на дорожке №2 – 10% экстракт перги, состоящий из 12 белково-пептидный фракций; на дорожке №3 представлен 50% раствор меда, включающий 15 зон белков и пептидов; на дорожке №4 – 20% экстракт трутневого расплода, состоящий из 13 белково-пептидных фракций.

Для сравнения были нанесены белки сыворотки крови (дорожка №5, состоящая из 11 белково-пептидных зон).

Однако белково-пептидные спектры взятых в качестве образцов продуктов пчеловодства различаются по количеству белковых зон, идентифицируемых данным методом. В данных условиях не удалось идентифицировать относительно низкомолекулярные пептиды продуктов пчеловодства. При этом следует отметить, что на электрофореграмме видны следы, возможно, пептидых зон.

Процесс идентификации пептидов, их разделение и окрашивание методом электрофореза представляет определенную сложность, о чем свидетельствуют многочисленные сведения других авторов. По-видимому, разделение пептидов в наших условиях происходит, однако после фиксации красителем и последующей отмывки геля пептиды в силу своих молекулярных масс вымываются из него. В связи с этим была использована система проведения электрофореза в 15% ПААГ. Как и предполагалось, в данных условиях разделение белков произошло в меньшей степени по сравнению с их разделением в 7,5% геле.

Однако и в этом случае после фиксации красителем и отмывки геля на электрофореграмме заметны лишь следы Кумасси-положительных продуктов, возможно, пептидов.

Еще одним методом идентификации пептидов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.