ИЗМЕНЕНИЯ В РЕГУЛЯЦИИ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА КЛЕТОК В НЕЙРОГЛИАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ ГИППОКАМПА МЫШЕЙ ЛИНИИ NMRI ПРИ ДЕЙСТВИИ БЕТА-АМИЛОИДА

Аннотация: Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным расстройством, приводящим к нарушению когнитивных функций головного мозга. БА соотносят с отложением бляшек бета-амилоида (Аβ) в головном мозге. В работе показан эффект действия преинкубацииАβ(5мкМ) в течение 24 часов на восстановление кальциевого гомеостаза во время деполяризации астроцитов (KCl 35мМ) в нейроастроцитарной культуре гиппокампа мыши. Он выражен в постоянном росте внутриклеточного кальция и появлении спайковой активности в сравнении с контролем для астроцитов. Nifedipine (10 мкM), L-typeкальциевых каналов блокатор, не смог повлиять на рост внутриклеточного кальция в астроцитах и их спайковую активность, в то время как у нейронов уменьшил уровень кальция почти до базального. Так же была установлена гипервозбудимость сети нейронов, которая проявляется в виде осцилляции кальция с высокой частотой и никогда не наблюдается в контроле. Результаты свидетельствуют, что под влиянием Аβ происходит дисрегуляция кальциевого гомеостаза как в астроцитах, так и нейронах первичной культуры гиппокампа мышей.

Ключевые слова: бета-амилоидный пептид (Aβ), кальциевый гомеостаз, нейроны, глия, культуры гиппокампа, флуоресцентная микроскопия.

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным заболеванием, которое приводит к необратимой потере высших мозговых функций и развитиюсерьезных когнитивныхнарушений у лиц пожилого возраста. БА ассоциируется с нарушенным процессингом белка-предшественника бета-амилоида, что приводит к накоплениюАβ и отложению его в виде бляшек в головном мозге. Вместе с отложением бляшек наблюдается гиперфосфорилирование тау-белка, связанным с микротрубочками и образованием внутриклеточных нейрофибриллярных сплетений, приводящих кклеточным дисфункциям. Нарушение работы митохондрий и эндоплазматического ретикулума (ER) в начальные стадии БА тесно связано с повышенным оксидативным стрессом и нарушением регуляции гомеостаза кальция. Установлено, что бета-амилоид оказывает влияние на ряд центральных сигнальных регуляторов динамики внутриклеточной концентрации кальция (Ca2+i): метаботропные глутаматные рецепторы (mGluR), Ca2+-каналы на внутриклеточных кальциевых депо (SOCC), клеточный прионный белок (PrPC), ионотропные NMDAрецепторы , никотиновые ацетилхолиновые рецептиорыα7 типа (α7-nAChR) , нейротрофический рецептор p75 , а также вольт-зависимые Ca2+-каналы (VOCC)  и др. В представленной статье исследуются нарушения регуляции кальциевого гомеостаза (путем измеренияCa2+i, а также с применением ингибитораVOCC под влияниемАβ в покое и при деполяризации мембран нейронов и астроцитов в первичной культуре гиппокампа мышей.

Подготовка культур клеток. Клеточные культуры гиппокампальных нейронов и астроцитов были получены из мозга новорожденных мышей линии NMRI (1–3 день жизни), как это было описано ранее .

Мозг быстро извлекали в чашки Петри с холодным раствором Hank’s Balanced salt solution (HBSS), содержащим Ca2+ и Mg2+, и под стереомикроскопом тщательно отделяли менингеальные оболочки и выделяли гиппокамп, который измельчали ножницами и центрифугировали в течение 2 мин при 1000 об/мин. К осадку добавляли 500 мкл Trypsin-EDTA 0.05% (Gibco) и инкубировали при 37°С в течение 10 минут на шейкере. Осадок ресуспендировали пипеткой Пастера в среде Neurobasal-A (Gibco) (НС), содержащей Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Gibco) (1 мл на 99 мл среды), 5% Hepes 1M (Gibco), 2% B-27 (Gibco). Суспензию клеток дважды центрифугировали в течение 3 минут при 1000 об/мин, осадок ресуспендировали в НС. По 50 мкл суспензии клеток наносили на дно лунки культурального планшета, которое предварительно обрабатывали полиэтиленимином (Sigma) (5 мкг/50 мл воды) следующим образом: 200 мкл полимера наносили на дно лунок, выдерживали 10 мин под УФ, потом еще 20 минут в темноте, после чего лунки дважды промывались дистиллированной водой и высушивались. Культуральные планшеты с клетками помещались в СО2-инкубатор (5% СО2, 37°С) на 2 часа. После прикрепления клеток добавляли 2,5 мл НС и помещали планшеты в СО2-инкубатор. Каждые 6-7 дней заменяли треть среды на свежую. Эксперимент проводили через 14 дней после начала культивирования в СО2-инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО2 при 37°С.

Флуоресцентные измерения. Для измерений внутриклеточного Ca2+ (Ca2+i) был использован инвертированный конфокальный флуоресцентный микроскоп Leica TCS SP5в комплектации с аргоновым лазером и акустооптическим фильтром (на базе ИБК РАН). Кальциевые сигналы были записаны при помощи одноволнового флуоресцентного зонда Fluo-8. Нейроны при прокрашивании зондом были помещены в Hanks balanced salt solution (HBSS), состоящего из (мM): 156 NaCl, 3 KCl, 2 MgSO4, 1.25 KH2PO4, 2 CaCl2, 10 глюкозы и 10 HEPES, pH 7.4, при финальной концентрации Fluo-8 зонда 5 мкM, при 37°C в течение 40 мин, и затем отмыты в течение 15 минут. L-arginine (0,2 мM) был включен в HBSS среду. Эксперименты выполнены с использованием3микроскопических стеколс 3 разными клеточными культурами. Интервал между кадрами съемки составил 1 сек, что позволило оптимально регистрировать скорость изменения быстрых кальциевых флуктуаций, а также существенные кальциевые изменения и избежать эффекты фотобличинга зонда. Все эксперименты по регистрации Ca2+i были проведены при 28–30°C. Excel, ImageJиOrigin 8 программное обеспечение было использовано для анализа данных, создания графиков и статистической обработки данных.

Идентификация нейронов и астроцитов былапроведенапо характерным формам ответа этих клеток на добавление в среду культивирования KCl35 мM. Нейроны отличаются существенно большей полушириной ответного спайка и в подавляющем большинстве случаев не возвращают внутриклеточную концентрацию кальция к первоначальному уровню, образуя плато. В отличии от нейронов в астроцитах после одиночного ответного спайка Ca2+iвозвращается к базовому уроню или даже падает ниже исходного значения.

Нейроастроцитарная культура гиппокампа мышей была преинкубирована сАβ 1-42 (5мкМ) в течение 24 часов до момента регистрации сигнала. Была проведена запись кальциевых сигналов клеток в покое и в ответ на умеренную деполяризацию, вызываемую KCl35мМ. Следует отметить, что кальциевый сигнал отражает основные параметры явления деполяризации . По типу ответов на KClбыли выделены две популяции астроцитов. Для первой (40% от общего числа) эффект на введение в среду KClвыражался в неспособности астроцитовудерживать уровень внутриклеточного кальция на исходном базальном уровне и постоянном его росте, что резко отличало такие астроциты от клеток, не подвергавшихся воздействию Аβ (Рис 1Б, кривая 2), что является аномальным для такого типа культур . Для второй группы астроцитов (60% от общего числа) эффект воздействия Аβ был выражен в активации спайковой активности (Рис 1Б, кривая 3). Следует отметить, что оба типа ответов астроцитов являются аномальными для таких культур. ПреинкубациясАβне вызвала значительных изменений в характере ответов нейронов на деполяризацию, вызванную КСl (Рис 1А, Б, кривая 1). Установлено, что Aβ олигомеры могут напрямую регулировать активность IP3i рианодиновых рецепторов (RyRs), а также и увеличивать продукцию IP3, тем самым, индуцируяIP3 рецепторы, открытиеCa2+каналов и его выход из эндоплазматического ретикулума . Эти факты могут служить наиболее вероятным объяснением постоянного роста Ca2+i в астроцитах и требуют дальнейших исследований. Так же актуально для этих работучитывать факт неспецифического образования Са2+-проницаемых каналов из молекул Aβ.

В качестве возможной причины нарушений в работе кальциевого сигналинга в исследуемых клетках может выступить дисрегуляция в работе дигидропиридиновых L-типа каналовпод влиянием длительной инкубации с Aβ . Для проверки этого предположения в работе исследовали влияние блокатора этого типа каналов нимодипина. Известно, что нимодипин L-VGCC (VOCC) оказывает положительный эффект на больных с БАи снижает прогрессию заболевания . Его дериват, MEM-1003, завершил Phase II клинических испытаний . Нимодипин (10 мкM) в наших исследованиях не повлиял на рост внутриклеточного кальция в астроцитах и их спайковую активность, в то время как у нейронов уменьшил уровень кальция почти до базального (Рис 1), что наблюдалось и в культурах, не подвергавшихся преинкубации с Aβ, что указывает на отсутствие его краткосрочных эффектов в регуляции кальциевого гомеостаза, но и не исключает долговременных. Так же былоустановлено, что после инкубации с Aβ наблюдается гипервозбудимость сети нейронов (осциляции кальция с высокой частотой) (Рис.1Б). Это указывает на дисрегуляцию кальциевого гомеостаза в нейронах под влиянием Aβ.