ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ЖЕЛУДКА, КИШЕЧНИКА, ПОЧЕК, ПЕЧЕНИ И ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА

Аннотация: Представлена модель участия лейцинаминопептидазы в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований. Впервые продемонстрировано увеличение активности данного фермента в злокачественных новообразованиях различных органов. Впервые изучено распределение активности лейцинаминопептидазы доброкачественных и злокачественных опухолях человека. Практический интерес представляют собой данные о выраженном увеличении активности фермента в злокачественных новообразованиях, что даeт возможность разработки методов диагностики и лечения с использованием специфических ингибиторов данных ферментов.

Ключевые слова: лейцинаминопептидаза, злокачественные новообразования человека, доброкачественные новообразования человека.

К настоящему времени имеется достаточно большое количество экспериментальных работ, раскрывающих роль регуляторных пептидов и белков в развитии злокачественных новообразований в организме человека. Описано участие ростовых факторов в процессе роста и дифференцировки опухолевых клеток , участие пептидных и белковых гормонов в перестройке метаболизма , участие цитокинов и иммуномодулирующих пептидов в регуляции функции иммунной системы при развитии опухоли. Тем не менее, остается большое количество вопросов о механизмах увеличения концентраций активных форм данных пептидов при развитии заболевания. В ряде работ показано увеличение экспрессии генов, кодирующих предшественники данных молекул, однако концентрация биоактивных форм пептидных молекул зависит не столько от работы генома, сколько от активности ферментов их обмена и модификации . Интерес к изучению активности протеолитических ферментов в злокачественных и доброкачественных новообразованиях обусловлен их разнообразным влиянием на процесс канцерогенеза путeм процессинга, модификации или инактивации регуляторных пептидов и ростовых факторов, вовлеченных в этиологию и патогенез злокачественных новообразований .

Патофизиология новообразований характеризуется изменением активности и спектра пептидгидролаз в раковых клетках. Ферментный спектр обусловлен как локализацией, так и степенью дифференцировки опухоли. Если в дифференцированных образованиях ферменты соответствуют таковым данного органа или ткани, то при низкой степени дифференцировки активность и спектр ферментов значительно изменены. Предполагается исключительно высокая роль пептидгидролаз в инвазии опухолевых клеток . В трансформированных клетках протеолитических ферментов синтезируется заметно больше, чем в нормальных клетках. В злокачественных новообразованиях наблюдается выход пептидгидролаз в межклеточное пространство и увеличение их активности. В сыворотке онкологических больных обнаруживается увеличение изменение активности ряда ферментов обмена регуляторных пептидов и белков . Тем не менее, работ по изучению активности пептидгидролаз в злокачественных новообразованиях человека практически нет, практически все исследования выполнены на лабораторных животных, поэтому роль данных ферментов в патофизиологии злокачественных новообразований человека остается неизвестной.

Лейцинаминопептидаза (ЛАП, КФ 3.4.11.1) является ферментом с широкой субстратной специфичностью и отщепляет любые аминокислоты с N-конца полипептидов, кроме Arg и Lis. Фермент имеет по данным Хрусталeвой и Fraticante и соавт. молекулярную массу около 62 кДа, по данным Shimamura и соавт– 53 кДа, по данным Gibson и соавт  – 270 кДа, что позволяет предположить возможность существования четвертичной структуры. ЛАП содержит в активном центре ион Zn2+, проявляет максимальную активность при pH 7,0-7,4, активируется ионами Mn2+, ингибируется ПХМФС, бестатином и амастатином; пуромицин и арфаменин A не влияют на его активность. ЛАП отщепляет остаток тирозина от Tyr-Gly-Gly, Tyr-Gly-Gly-Phe, Leu-энкефалина, динорфина-(1-8), динорфина-(1-10) и динорфина-(1-13), максимальная скорость расщепления наблюдается в случае Leu-энкефалина, с удлинением цепи скорость расщепления субстрата резко уменьшается, что закономерно для всех экзопептидаз. Фермент экспрессируется в нервной системе, где обнаружен как в цитозольной так и мембранной фракциях головного мозга , особенно высокая активность найдена в миелине. К настоящему времени установлена экспрессия фермента во многих тканях организма, отмечается высокая активность в сыворотке крови. Предполагается, что ЛАП принадлежит важная роль в инактивации энкефалинов .

Целью нашей работы являлось изучение активности лейцинаминопептидазы в злокачественных новообразованиях молочной железы, желудка, кишечника, почек, печени и легких человека.

Активность ферментов определяли в доброкачественных и злокачественных новообразованиях, а также в прилегающих здоровых тканях молочной железы, желудка, кишечника и почек человека, удаленных в ходе хирургических операций в ГБУЗ Пензенский областной онкологический диспансер. Изучение активности ферментов было проведено у 160 человек в возрасте от 35 до 70 лет. Новообразования классифицировали в соответствии с клиническими признаками и результатами гистологического анализа. Пробы замораживали и хранили при - 40° С для последующего анализа.

Для определения активности фермента навески ткани гомогенизировали в 50 мМ натрий ацетатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl, рН 5,6, в соотношении 1 : 50 (вес : объем).

Для определения активности ЛАП к 90 мкл сыворотки прибавляли 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы) и 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4 (в случае контрольной пробы). Проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 100 мкл 310 мкМ раствора лей-β-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин, отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Определяли флюоресценцию образовавшегося β-нафтиламина на флюориметре ФМЦ-2 при λex=360 нм и λem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли по разнице прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих пуромицин, и выражали в нмоль β-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в гомогенатах определяли по Лоури.

Проверка принадлежности распределения признаков к нормальному распределению производилась по критерию хи-квадрат. Достоверность отличий между средними величинами определяли с использованием t-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа.

Результаты исследования и их обсуждение

Активность лейцинаминопептидазы в доброкачественных новообразованиях всех исследованных тканей была выше по сравнению с нормальными тканями (Рис 1). При этом отмечается утрата тканеспецифического паттерна активности, свойственного здоровым тканям. По-видимому, повышение активности пептидгидролаз, участвующих в модификации и деградации регуляторных белков и пептидов до одного уровня характерно для всех тканей с измененным типом роста и характеризующимся повышенным уровнем обмена пептидных молекул.

В злокачественных новообразованиях всех исследуемых органов активность лейцинаминопептидазы была выше, чем в доброкачественных опухолях – в молочной железе более чем в два раза, в кишечнике, желудке и почках – более чем на 80 %, легких и печени на 60 %.