ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И СВОЙСТВА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ИНГИБИТОРА КАРБОКСИПЕПТИДАЗО-B-ПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ МОЗГА ЖИВОТНЫХ

Аннотация: Из мозга млекопитающих различных видов выделен, очищен и изучен термостабильный ингибитор карбоксипептидазо-В-подобных ферментов. Получено несколько форм, которые имеют молекулярную массу в пределах от нескольких сотен до 2 000 Да. Не исключено, что низкомолекулярные формы описанного нами ингибитора представляют собой продукты протеолитического расщепления формы с наиболее высокой молекулярной массой, обладающие ингибиторной активностью.

Ключевые слова: ингибитор карбоксипептидазо-B-подобных ферментов, термостабильный эндогенный ингибитор.

Одним из механизмов регуляции активности протеолитических ферментов является подавление ее специфичными эндогенными ингбиторами. Интерес к ингибиторам пептид-гидролаз нервной ткани в последнее время значительно вырос. Широко исследуются белковые ингибиторы лизосомальных пептид-гидролаз , неплохо изучены эндогенные регуляторы активности белковой природы кальпаина , однако имеются лишь единичные работы по изучению эндогенных ингибиторов других пептид-гидролаз нелизосомальной локализации . В литературе имеются сведения об обнаружении в спинном мозге эндогенного ингибитора энкефалиндеградирующих ферментов (аминопептидазы M, дипептидиламинопептидазы, энкефалиназы и АПФ) гептапептида спинорфина. Интересно, что его фрагмент, тиорфин, обладает ингибиторной активностью по отношению к дипептидил-пептидазе III . В периферических тканях обнаружен пептидный ингибитор АПФ . Результаты наших исследований позволяют предположить возможность существования эндогенного ингибитора карбоксипептидазо-B-подобных ферментов. Однако никаких сведений в литературе по этому вопросу нам найти не удалось. Поэтому мы предприняли попытку выделения и очистки ингибитора основных карбоксипептидаз из мозга животных.

В опытах с фракционированием мембраносвязанных форм карбоксипептидазо-B-подобных ферментов неионным детергентом X-100 было установлено, что обработка суспензии мембран детергентом в конечной концентрации 0,1% приводит к высвобождению из связанного с мембранами состояния около половины активности фермента. Ферментативная активность в седиментируемой фракции при этом не снижается, а повышается относительно исходного ее уровня в 1,7 раза. Суммарная активность в солюбилизате и седиментируемой фракции превышала таковую в исходном осадке субклеточных структур в 2 раза.

Увеличение суммарной активности ферментов при отделении растворимой фракции от мембранной может быть обусловлено либо высвобождением фермента из субклеточных структур (лизосом, секреторных везикул), либо отделением ингибитора. Для выяснения причины повышения ферментативной активности при фракционировании мы исследовали высвобождение карбоксипептидазо-B-подобных ферментов из связанного с мембранами состояния  дробными концентрациями тритона X-100 (рис. 1).

Характер зависимости высвобождения карбоксипептидазо-B-подобной активности от концентрации тритона X-100 (линейная) свидетельствует о том, что высвобождение активности не связано с разрушением везикулярных образований тритоном X-100, так как для ферментов, находящихся в ограниченных мембранами структурах, характерен S-образный тип высвобождения .

Далее мы прокипятили в течение 15 мин тритоновый экстракт, отделили денатурированные белки центрифугированием, а супернатант (ингибитор?) добавили как к исходному осадку, так и к осадку, который получен после отделения солюбилизата. И в том и в другом случае наблюдалось снижение активности ферментов на 35 и 40% соответственно.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что феномен увеличения активности карбоксипептидазо-B-подобных ферментов при фракционировании тритоном X-100 не связан с высвобождением этих ферментов из везикулярных структур, а обусловлен отделением ингибитора.

Для выделения и очистки ингибитора использовали мозг крупного рогатого скота. При подборе условий исходили из предварительных данных о его свойствах. В связи с этим, на первой стадии выделения суспензию мозга подвергали кипячению с целью инактивации протеолитических ферментов и отделения большей части денатурированных баластных белков.

Экстракт, полученный после тепловой денатурации примесных белков, фракционировали на КМ-сефадексе C-25. Колонку с ионообменником уравновешивали 0,02 М натрий-ацетатным буфером, pH 4,5, и наносили экстракт. Несвязавшиеся белки удаляли, промывая колонку стартовым буфером. Ингибитор элюировали линейным градиентом NaCl (0-1 М) на 0,02 М натрий-ацетатном буфере, pH 4,5. Во фракциях определяли содержание белка по поглощению при 280 нм и ингибиторную активность (рис. 2). При этих условиях большая часть пептидов экстракта не сорбируется на катионообменнике. Линейным градиентом NaCl элюируется 4 пика пептидов – один основной и три минорных, причем каждому из них соответствует пик ингибиторной активности. Степень очистки ингибитора по отношению к солюбилизату составляет 50, 70, 90 и 140 соответственно для 1, 2, 3 и 4 пика.

Дальнейшую очистку ингибитора осуществляли гель-фильтрацией на биогеле P-2. Фракции с ингибиторной активностью, полученные после разделения на КМ-сефадексе С-25, объединяли, концентрировали выпариванием на роторном испарителе, и наносили на колонку с биогелем P-2. Результаты опыта представлены на рис. 3. Ингибитор выходит в виде 4-5 пиков.

В свободном объеме колонки выходит небольшое количество ингибитора. Максимум ингибиторной активности обнаруживается в 15-16 и 24-25 фракциях. Степень очистки ингибитора в 15-16 фракциях составляет 160, в 24-25 фракциях – 300-320 раз. Следует отметить, что обе формы ингибитора полностью подавляли отщепление аргинина от Leu-энкефалин-Arg6 очищенным препаратом карбоксипептидазо-B-подобных ферментов (рис. 4).

Результаты двух, принципиально различающихся методов фракционирования свидетельствуют о том, что термостабильный ингибитор карбоксипептидазо-B-подобных ферментов представлен в мозге несколькими формами, причем их молекулярная масса лежит в пределах от нескольких сотен до 2 000 Да.

Большой интерес представляют полученные нами данные по влиянию очищенной формы ингибитора на гидролиз (3H-Tyr)-Leu-энкефалина экстрактом мембран головного мозга крысы. Экстракт инкубировали с ингибитором и (3H-Tyr)-Leu-энкефалином, продукты гидролиза разделяли тонкослойной хроматографией на Silicagel 60, Merk, в системе изопропанол:этилацетат: 5% уксусная кислота (2:2:1). Пластинку разрезали по длине разделения пептидов и меченые продукты гидролиза определяли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре SL-30.

Как свидетельствуют представленные на рис. 5 данные, экстракт мембранной фракции головного мозга крыс проявлял аминопептидазную и дипептидилкарбоксипептидазную активность. Очищенный ингибитор практически полностью подавлял дипептидилкарбоксипептидазную активность, вероятнее всего активность АПФ и/или нейтральной эндопептидазы 24.11, и на 70-80% ингибировал аминопептидазную активность. Таким образом, очищенный нами термостабильный низкомолекулярный ингибитор проявлял групповую специфичность по отношению к карбоксипептидазо-B-подобным ферментам, дипептидилкарбоксипептидазам и аминопептидазам, хотя его ингибирующий эффект в отношении аминопептидазной активности был, менее выражен, чем по отношению к карбоксипептидазо-B-подобной и дипептидилкарбоксипептидазной активностям. Что же может представлять собой обнаруженный ингибитор? Получено несколько форм, которые имеют молекулярную массу в пределах от нескольких сотен до 2 000 Да.

Нельзя, конечно, исключать возможность того, что речь идет об одном типе молекул, которые могут образовывать комплексы с другими биополимерами, что может приводить к появлению множества форм при фракционировании. Однако в связи с низкой молекулярной массой ингибитора и отделением большинства высокомолекулярных полимеров при температурной обработке такая возможность представляется маловероятной. В настоящее время имеются многочисленные данные о том, что многие эндогенные ингибиторы пептид-гидролаз могут ингибировать не один фермент, а целую группу ферментов со сравнительно близкой субстратной специфичностью . Кроме того, ингибиторной активностью часто обладает не только нативный ингибитор, но и его фрагменты, причем иногда эти фрагменты специфичны по отношению к разным ферментам . То есть, не исключено, что низкомолекулярные формы описанного нами ингибитора представляют собой продукты протеолитического расщепления формы с наиболее высокой молекулярной массой, обладающие ингибиторной активностью. Кроме того, и карбоксипептидазо-B-подобные ферменты и дипептидилкарбоксипептидаза ингибируются многими биологически активными пептидами (энкефалинами и их предшественниками, веществом P, брадикинином) , молекулярная масса которых находится в пределах от нескольких сот до нескольких тысяч Да. Поэтому можно было бы предположить, что обнаруженные нами формы ингибитора соответствуют различным нейропептидам. Однако ни в одном из описанных в литературе случаев при использовании сравнительно высоких концентраций очищенных пептидов не достигалось такой высокой степени ингибирования как в нашем случае. .