АКТИВНОСТЬ ГИДРОГЕНАЗЫ THIOCAPSA ROSEOPERSICINA В РАСТВОРАХ ИОННЫХ ЖИДКОСТЕЙ

Аннотация: Показано, что гидрогеназа фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina способна осуществлять реакцию поглощения водорода в растворах ионных жидкостей EmimBF4 и BmimBF4, но не EmimNtf2. Был проведён поиск и апробация новых ароматических веществ для ее иммобилизации на поверхность электрода.

Ключевые слова: гидрогеназа, ионные жидкости, ферментные электроды

Гидрогеназа Thiocapsa roseopersicina активно изучается во всём мире . Этот фермент показал себя эффективным катализатором для ферментных водородных электродов . Его преимуществами является устойчивость к кислороду при хранении, способность функционировать в агрессивной среде, содержащей сероводород  - в этой среде платиновый электрод будет неприменим по причине отравления поверхности платины сероводородом. Ингибирование этой гидрогеназы кислородом и монооксидом углерода в растворе обратимо, но на активированном электроде, как правило,  ингибирование кислородом необратимо. Однако устойчивость гидрогеназы к другим каталитическим ядам, прежде всего к сероводороду, привлекательна для разработки на её основе водородных электродов, которые смогут выполнять функции генераторов тока и сенсоров водорода для анаэробных сред – в частности, для анаэробных реакторов, в которых имеет место выделение водорода .

Ионные жидкости – это соли, которые при комнатной или близкой к комнатной температуре находятся в жидком агрегатном состоянии. В последнее время они активно изучаются в энзимологии. Многие исследователи рассматривают их как экологически безопасные растворители для различных реакций, применимых в биотехнологии и так называемой «зелёной химии». Привлекательность ионных жидкостей для биоэлектрокатализа заключается в том, что они диссоциируют на ионы полностью, что обеспечивает их высокую ионную проводимость. Ионные жидкости на основе производных имидазола и тетрафторборной кислоты уже были проверены в среде с ферментным водородным электродом на основе гидрогеназы из Aquifex aeolicus . В этой работе было показано ингибирование гидрогеназы ионными жидкостями. В другой работе  было показано, что ионная жидкость EmimNtf2, не смешивающаяся с водой, может служить в качестве электролита безмембранного ферментного водород-кислородного топливного элемента.

Целью данной работы являлось изучение способности гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina функционировать в присутствии ионных жидкостей, а также поиск новых веществ для её иммобилизации на поверхности электрода.

Активность гидрогеназы в растворе определяли спектрофотометрически, как было описано ранее . В водном растворе ионных жидкостей EmimBF4 (1-этил-3-метилимидазолия тетрафторборат) и BmimBF4 (1-бутил-3-метилимидазолия тетрафторборат) инициацию реакции проводили восстановлением остаточного кислорода дитионитом натрия. В чистой ионной жидкости EmimNtf2 (1-этил-3-метилимидазолия бис-(трифторметилсульфонил)имид) реакцию инициировали, закрепив на пробке пробирки гранулу цинка и встряхнув реакционную смесь. Перед проведением реакции в чистой ионной жидкости остаточную воду из смеси, внесённую с раствором фермента, удаляли вакуумированием при комнатной температуре до исчезновения пузырьков водяного пара.

Новые вещества для иммобилизации гидрогеназы искали методом молекулярного докинга в программе Autodock Vina . Была исследована библиотека ароматических соединений, включающая бензол, нафталин, фенантрен, антрацен, бензпирен, коронен и перилен.

Ферментные электроды изготавливались следующим образом:

Углеродную ткань  площадью 1 см2 активировали в течение часа концентрированной серной кислотой, после чего промывали водой и  иммобилизовали краситель нейтральный красный методом электрополимеризации в течение 25 циклов в диапазоне потенциала от -800 до +800 мВ относительно хлорсеребряного электрода со скоростью 40 мВ/с в растворе 25 мМ KH2PO4, 100 мМ M KNO3, pH 6.0, после чего наносили 30 мкл раствора гидрогеназы (0.6 мг/мл) и инкубировали 16 ч при +4 °С .

Коронен иммобилизовали на углеткань в количестве 0.1 мг/см2 выпариванием раствора коронена (0.5 мг/мл) в толуоле под вакуумом. После этого на углеткань иммобилизовали гидрогеназу (30 мкл, 0.6мг/мл) в течение суток при +4°С.

Электроды проверялись в трёхэлектродной схеме в ячейке, состоящей из катодной камеры с вспомогательным электродом из углеродного войлока и анодной камеры с рабочим (гидрогеназным) электродом и электродом сравнения (хлорсеребряным электродом). Ячейка подключалась к потенциостату IPC Compact, анодная камера продувалась 40 минут аргоном, после чего аргон заменяли водородом либо водород-аргонной смесью.

Было показано, что добавление ионных жидкостей EmimBF4 и BmimBF4 как в раствор гидрогеназы, так и в электролит ячейки, частично ингибирует гидрогеназу, причём при концентрации ионной жидкости меньше 10% сохраняется более 50% активности. Замена электролита на исходный (20мМ К-фосфатный буфер, pH=7.0) не приводит к полному восстановлению активности электрода, что может быть связано с десорбцией гидрогеназы с поверхности электрода при использовании нейтрального красного.

Также мы проверили гидрогеназу в среде ионной жидкости EmimNtf2, не смешиваемой с водой. К сожалению, нам не удалось показать её активность в этой жидкости ни в растворе, ни на электродах с нейтральным красным, несмотря на то, что pH этой жидкости оптимален для активности гидрогеназы (7.4-7.5).

Мы предположили, что причиной ингибирования гидрогеназы ионными жидкостями является нарушение её электростатических взаимодействий с акцептором электронов (метилвиологеном в случае реакции в растворе и положительно заряженным полимером нейтрального красного на электроде).  Ожидалось, что полиароматические углеводороды позволят сделать связь гидрогеназы с электродом более устойчивой к факторам, нарушающим электростатические взаимодействия. При молекулярном докинге полиароматических углеводородов коронен показал энергию связывания с гидрогеназой -8.1 ккал/моль, что соответствует константе связывания, равной 1,4 мкмоль – это на два порядка ниже константы связывания метилвиологена.

Жёлтым показана большая каталитическая субъединица, серым – малая электрон-переносящая. Атомы железа показаны фиолетовыми шариками, серы – зелёными шариками. Атомы углерода показаны голубыми шариками. Связывание коронена шло вблизи от железо-серных кластеров в 17 случаях из 20.

Короненовые гидрогеназные электроды в водной среде показали плотность тока 20 мкА/см2 при перенапряжении 200 мВ, что значительно меньше, чем для электродов без коронена. Однако в среде ионной жидкости EmimNtf2 нам на данный момент не удалось показать активность короненовых гидрогеназных электродов.

Эти электроды также были проверены как сенсоры водорода в водном электролите при разных концентрациях водорода в водород-аргонной смеси.

В настоящее время нельзя однозначно судить о применимости этих электродов в качестве сенсоров водорода, поскольку стабильность потенциала нулевого тока (т.е. сигнала сенсора) недостаточна для адекватной калибровки сенсора по водороду. Ведутся работы по замене углеткани на более стабильный материал – углеродный войлок.

Заключение.