Judul: Ekspresi, Purifikasi, dan Karakterisasi Protease dari Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Aktivitasnya pada Protein Produk Hasil Ternak
Abstrak: Lactobacillus plantarum IIA-1A5 adalah isolat lokal yang diisolasi dari daging sapi Peranakan Ongole yang ada di Bogor. Bakteri ini memiliki beberapa keunggulan, antara lain mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli. Staphylococcus aureus, dan Salmonella typhimurium; memiliki toleransi terhadap pH yang rendah; sebagai bahan preservasi alami dan mempunyai sifat proteolitik. Anotasi genom L. plantarum IIA-1A5 menunjukkan adanya gen penyandi protease menyerupai Lon (Lon-Like) yang berpotensi untuk aplikasi lebih lanjut. Protease merupakan enzim yang sangat penting dan paling banyak diaplikasikan pada bidang sains, fisiologis (pengobatan), dan industri pangan maupun non-pangan. Sampai saat ini Indonesia masih mengimpor enzim protease dan setiap tahun terjadi peningkatan impor. Sebaliknya, Indonesia adalah negara yang sangat kaya akan biodiversitas hayati yang sangat memungkinkan untuk mengeksplorasi sumber-sumber protease lokal untuk memenuhi kebutuhan dalam negeri yang terus meningkat. Penelitian ini dilakukan dalam 3 (tiga) tahap. Tahap 1 bertujuan untuk melakukan optimasi, sintesis, dan kloning gen Lon-Like IIA-1A5 in silico; memprediksi struktur tiga dimensi dan menganalisis sisi aktif enzim. Optimasi, sintesis, dan kloning gen Lon-Like IIA-1A5 dilakukan secara in silico dengan sistem OptimumTM dari GenScript (New Jersey, USA). Analisis struktur tiga dimensi protease Lon-Like IIA-1A5 menggunakan server SWISS-MODEL dan analisis sisi aktif menggunakan aplikasi CLUSTAL OMEGA. Tujuan penelitian tahap ke 2 (dua) adalah mempelajari dan mengevaluasi ekspresi protease Lon-Like IIA-1A5, aktivitas proteolitik, dan overproduksi. Proses transformasi dilakukan dengan metode heat shock. Plasmid pET-28a (+) yang telah disisipi gen Lon-Like IIA-1A5 diekspresikan dalam vektor ekspresi yaitu E. coli BL21 (DE3). Validasi keberhasilan transformasi dilakukan dengan menumbuhkan E. coli BL21 (DE3) pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin. Penelitian tahap 3 bertujuan untuk melakukan purifikasi Lon-Like IIA-1A5 dan mempelajari aktivitasnya pada protein produk hasil ternak. Purifikasi kromatografi afinitas dilakukan dengan menggunakan column HisTrapTM FF dan bufer elusi dengan komposisi Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM dan imidazole (10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 dan 500 mM). Hasil penelitian tahap 1 menunjukkan Lon-Like-IIA-1A5 mempunyai 1080 pasang basa yang membangun 360 asam amino. Ada 19 asam amino kecuali sistein yang menyusun Lon-Like IIA-1A5. Optimasi gen meningkatkan nilai CAI (codon adaptation index) Lon-Like-IIA-1A5 dari 0,43 menjadi 0,97 dan nisbah GC meningkat dari 48,34% menjadi 56,57%. Analisis gel agarose menunjukkan gen penyandi protease Lon-Like IIA-1A5 berhasil disisipkan ke dalam vektor plasmid pET-28a (+). Dari analisis SWISS-MODEL diperoleh struktur tiga dimensi (3D) Lon-Like IIA-1A5 adalah berbentuk monomer yang terdiri atas 6 α-heliks 8 β-sheet dan 15 loop. Analisis situs aktif dilakukan dengan server CLUSTAL OMEGA dan diperoleh hasil bahwa Lon-Like IIA-1A5 mempunyai dua residu asam amino pada
Keyword: animal product, characterization, L. plantarum IIA-1A5, protease

Judul: Ekspresi dan Aplikasi Clp-protease Lactobacillus plantarum IIA-1A5 pada Produk Hasil Ternak
Abstrak: Lactobacillus plantarum IIA-1A5 adalah bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari daging sapi Indonesia, Peranakan Ongol, yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Gram positif dan negatif serta bersifat probiotik. Sekuens dari genom bakteri ini tidak hanya mengungkapkan keberadaan gen-gen kunci untuk probiotiknya, tetapi juga gen-gen pengkode enzim hidrolitik yang berpotensi untuk berbagai aplikasi. Salah satu gen tersebut adalah protease kaseinolitik (Clp) yang termasuk dalam kelompok protease serin dan memainkan peran penting dalam homeostasis protein seluler dari strain ini. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan gen Clp secara heterologus dan mengaplikasikan aktivitas proteolitiknya pada produk ternak. Untuk tujuan pertama, sistem ekspresi gen Clp dibuat dengan menggunakan gen yang telah dioptimalkan terlebih dahulu secara in silico. Optimasi ini bertujuan untuk meningkatkan kompatabilitas gen tersebut dalam proses ekspresi di dalam sel inang Escherichia coli. Optimasi tersebut menghasilkan peningkatan indeks adaptasi kodon (CAI) dan kandungan GC menjadi 0.94 dan 53.62%, yang cukup sesuai untuk ekspresi dalam sistem E. coli. Optimasi hanya dilakukan pada level DNA, tanpa merubah sekuens asam amino protein tersebut. Gen yang telah dioptimasi kemudian disintesis secara kimia, dimasukkan ke dalam vektor pET28a (+) antara situs Nde1-BamH1 dan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 (DE3) Codon Plus. Gen ini berhasil diekspresikan di sitoplasma sel (larut) dengan induksi 1 mM Isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pada suhu 37 oC. Fraksi terlarut ini kemudian digunakan dalam kajian aplikasi sesuai dengan tujuan kedua penelitian ini. Uji aktivitas menunjukkan bahwa Clp dari L. plantarum IIA-1A5 (Clp-IIA) aktif terhadap kasein susu. Zona bening yang dihasilkan protein tersebut menunjukkan peningkatan hingga hari ke-2 selama proses inkubasi di suhu 37 oC. Aktivitas spesifik protein tersebut adalah 7739.89 AU mg-1, yang secara nyata lebih besar dibandingkan dengan chymotrypsin. Sementara itu, aktivitas proteolitik protein ini tidak terdeteksi ketika diaplikasikan pada protein sarkoplasmik dan miofibrilar dari daging. Hal ini menunjukkan bahwa Clp-IIA lebih cocok untuk aplikasi pada protein susu dibandingkan dengan protein daging. Hal ini mungkin berkaitan dengan struktur Clp-IIA yang lebih sesuai untuk protein susu. Untuk mengkonfirmasi hal tersebut, struktur Clp-IIA telah dibangun dengan menggunakan SWISS-MODEL berdasarkan pemodelan homologi struktural protein. Secara umum, struktur Clp-IIA menunjukkan bahwa protein ini membentuk struktur homotetradecameric (14-mer) dengan setiap monomer terdiri dari 7 α-helix dan 10 β-sheet. Identifikasi sisi aktif menunjukkan bahwa sisi aktif Clp-IIA adalah Ser-97, His-122 dan Asp-171 yang menunjukkan bahwa protein ini memang tergolong dalam serin protease dengan tiga sisi aktif (catalytic triad). Sisi aktif tersebut terletak di Ser-97, His-122 dan Asp-171 serta membentuk kantung pengikatan substrat (substrate binding cavity) dengan ukuran sekitar 29.5 Ǻ. Geometri sisi aktif menunjukan bahwa protein ini tidak bisa menampung protein dengan ukuran yang besar (fibril) sehingga menyebabkan aktivitasnya terhadap protein daging tidak terdeteksi. Selain itu, kantung pengikatan substrat juga secara kimia didominasi oleh asam amino bermuatan negatif yang kemungkinan tidak cocok untuk protein-protein dari daging. Secara keseluruhan, pendekatan kami ini dapat dijadikan dasar untuk produksi Clp dari L. plantarum IIA-1A5 dalam produksi skala besar untuk berbagai aplikasi di produk susu dan turunannya. Akan tetapi, penelitian dasar pada protein ini masih harus dilakukan untuk bisa diaplikasikan secara optimal.
Keyword: Clp-protease, ekspresi heterologus, gen sintetis, Lactobacillus plantarum IIA-1A5, pemodelan homologi struktural

Judul: Cycle Hamilton pada Graf Lengkap, Graf Regular, dan Graf 2-Connected 4-Regular Berorder Kurang dari Sepuluh
Abstrak: Suatu graf disebut graf Hamilton apabila graf tersebut memuat cycle Hamilton, yaitu cycle yang melewati setiap vertex tepat satu kali. Menentukan keberadaan cycle Hamilton pada suatu graf dapat menggunakan syarat cukup yang berupa teorema-teorema yang telah diperkenalkan sejak tahun 1950-an. Beberapa syarat cukup yang dibahas dalam karya ilmiah ini adalah syarat cukup yang berhubungan dengan graf lengkap dan graf regular. Suatu graf lengkap berorder 𝑛������ ≥ 3 dan graf r-regular berorder 𝑛������ ≤ 2𝑟������ + 1 merupakan graf Hamilton, Karena kedua graf tersebut memuat cycle Hamilton. Selanjutnya, syarat cukup tersebut digunakan untuk menentukan keberadaan cycle Hamilton pada graf 2-connected 4- regular berorder kurang dari 10.
Keyword: graf Hamilton, graf regular, graf lengkap, graf 2-connected 4-regular