Judul: Analisis In Silico dan Ekspresi Fragmen Faktor C dari Tachypleus gigas Pada Khamir Pichia pastoris
Abstrak: Belangkas merupakan hewan laut yang sering dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan endotoksin bakteri gram negatif. Darah belangkas mengandung komponen protein faktor C yang berfungsi sebagai biosensor yang dapat mendeteksi keberadaan endotoksin/lipopolisakarida dari bakteri gram negatif. Pengujian endotoksin dari darah belangkas dibutuhkan dalam jumlah yang sangat banyak sehingga tidak efisien dalam penggunaan bahan percobaan hidup. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk efisiensi dari percobaan ini adalah dengan mensintesis gen fragmen faktor C yang terdapat dalam lisat/darah belangkas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui interaksi protein fragmen faktor C dengan substrat lipopolisakarida (lipid A) secara in silico, serta mensintesis gen fragmen faktor C secara heterologus pada khamir Pichia pastoris GS115. Penelitian ini terbagi menjadi dua tahapan yaitu analisis in silico meliputi kelarutan protein, pemodelan protein, penambatan molekuler dan Simulasi dinamika molekuler protein fragmen faktor C. Protein fragmen faktor C dimodelkan menggunakan tiga server web pemodelan yang memiliki struktur 3D diantaranya α-helix, β-sheet dan loop/coil. Validasi model protein dengan Ramachandran plot, ERRAT dan verify 3D. Tahapan kedua yaitu analisis in vitro yang dilakukan dengan konstruksi plasmid rekombinan, kloning plasmid rekombinan pada Escherichia coli DH5α, transformasi gen fragmen faktor C untuk diekspresikan pada sel inang P. pastoris GS115. Hasil analisis fisikokimia protein fragmen faktor C diprediksikan memiliki kelarutan yang tinggi dengan nilai titik Isoelektrik (pI) yaitu 6,57. Pemodelan AlphaFold menunjukkan Ramachandran plot terbaik dengan residu di area yang paling disukai sebesar 95,8% dan diikuti oleh nilai ERRAT sebesar 89,83% serta 3D Verify sebesar 71,93%. Simulasi penambatan molekuler fragmen faktor C dengan tiga ligan yaitu diposphoryl lipid A, core lipid A dan kdo2 lipid A dapat menjadi aktivator protein fragmen faktor C dengan mengikat daerah reseptor untuk membentuk kompleks reseptor-ligan lipid A. Simulasi dinamika molekuler untuk evaluasi stabilitas interaksi protein dengan ligan (lipid A) pada ketiga kompleks/model menunjukkan bahwa kompleks 2 (fragmen faktor C-diposphoryl lipid A) adalah model yang paling stabil diikuti masing-masing oleh model 3 dan 1. Vektor ekspresi pPIC9K yang membawa gen fragmen faktor C telah berhasil ditransformasikan ke dalam sel inang Escherichia coli DH5α. Plasmid rekombinan pPIC9K-fragmen faktor C juga telah berhasil ditransformasi ke dalam sel inang P. pastoris GS115 dengan ditunjukkan beberapa koloni yang tumbuh pada media YPD. Perlakuan senyawa inducer metanol 1% (v/v) pada kultur transforman P. pastoris GS115 dengan inkubasi 30 oC selama 72 jam secara optimal dapat menginduksi ekspresi protein fragmen faktor C. Protein fragmen faktor C terkonfirmasi memiliki berat molekul 18.6 kDa melalui SDS-PAGE. Fragmen faktor C memiliki aktivitas proteolitik berdasarkan hasil analisis zimogram dan aktivitas proteolitik berkorelasi dengan waktu tumbuh dari P. pastoris GS115 rekombinan.
Keyword: Tachypleus gigas, endotoxin, Factor C, Pichia pastoris

Judul: Ekspresi Fragmen Antibodi Untai Tunggal (scFv) Anti-EGFRvIII pada Permukaan Sel Pichia pastoris
Abstrak: Sistem tampilan permukaan khamir telah menjadi teknik yang semakin popular untuk rekayasa protein dan seleksi pembuatan pustaka protein. Sistem ini membutuhkan suatu protein permukaan agar protein target bisa berada di permukaan sel. α-agglutinin merupakan salah satu protein yang ditemukan dipermukaan sel Saccharomyces cerevisiae dan bisa dimanfaatkan untuk tampilan permukaan sel khamir lainnya seperti Pichia pastoris. Pada C-terminal α-agglutinin terdapat gugus glycosylphosphatidylinositol (GPI) yang akan berikatan secara kovalen dengan penyusun komponen dinding sel khamir, yaitu glukan. Sistem ini dapat digunakan untuk mengekspresikan suatu protein antibodi rekombinan pada permukaan sel khamir. Antibodi pada penelitian ini merupakan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) yang dapat mengenali antigen EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor variant III). EGFRvIII merupakan salah satu varian mutan EGFR yang mengalami delesi pada ekson ke 2 hingga ekson ke 7 di bagian domain ekstraseluler. EGFRvIII berperan penting dalam pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. P. pastoris merupakan salah satu khamir metilotropik yang dapat menggunakan metanol sebagai sumber karbon. Kelebihan utama yang dimiliki oleh P. pastoris dibandingkan sel prokariot adalah sel ini mampu melakukan modifikasi protein pascatranslasi seperti pelipatan protein, glikosilasi, dan pembentukan ikatan disulfida. Proses glikosilasi pada P. pastoris tidak mengalami hiperglikosilasi seperti yang sering ditemukan pada S. cerevicae. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti EGFRvIII pada permukaan sel P. pastoris. Gen scFv diamplifikasi dari plasmid pJ201-scFv dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dan difusi dengan separuh bagian ujung-C gen AGα dalam vektor ekspresi pJ912-Agα-RFP. TagRFP (Tag Red Fluorescent Protein) adalah gen reporter penyandi protein fluoresen merah yang disisipkan di antara gen scFv dengan gen AGα. Konstruk gen tersebut disubklon terfusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α) dan di bawah regulasi promoter indusibel AOX1 ( PAOX1 ). Ekspresi protein terjadi apabila dilakukan induksi dengan menggunakan metanol dan MF-α mengarahkan protein disekresikan keluar sel. Vektor rekombinan diintroduksikan ke dalam P. pastoris SMD1168H melalui rekombinasi homolog. Seleksi transforman P. pastoris dilakukan menggunakan media seleksi mengandung zeocin. Analisis ekspresi protein rekombinan dilakukan, antara lain melalui pengamatan sel dengan mikroskop fluoresense, analisis SDS-PAGE, hibridisasi Western blot, dan analisis interaksi antibodi-antigen dengan bantuan manik magnet. Gen scFv anti-EGFRvIII telah berhasil disisipkan pada vektor pJ912-Agα-RFP. Namun, gen scFv tersebut mengalami dua mutasi titik, masing-masing satu pada bagian rantai berat (VH) dan rantai ringan (VL). Satu mutasi berupa mutasi sunyi (silent) yang tidak mengubah asam amino, sedangkan mutasi lainnya mengubah asam amino dari asparagin (N194) menjadi asam aspartat (D194). Plasmid pJ912-AGα-RFP dan pJ912-AGα-RFP::scFv berhasil berintegrasi ke dalam genom P. pastoris SMD1168H. Stabilitas genetik sel transforman diperoleh melalui seleksi pada media zeocin hingga konsentrasi 1000 μg/mL. Pengamatan menggunakan mikroskop fluoresen membuktikan bahwa sel-sel transforman berhasil memancarkan fluoresensi berwarna merah yang berasal dari protein fungsional TagRFP. Adanya pita protein yang terdeteksi pada hasil hibridisasi Western blot menunjukkan bahwa sel P. pastoris berhasil mengekspresikan protein target (scFv) yang terfusi dengan protein TagRFP dan α-agglutinin. Eksperimen dengan menggunakan manik magnet yang diselimuti dengan protein rekombinan antigen EGFRvIII menunjukkan bahwa sel transforman P. pastoris yang terdapat antibodi anti EGFRvIII pada permukaan sel dapat melekat pada permukaan manik magnet yang membuktikan bahwa terjadi interaksi antara antibodi (pada permukaan sel) dengan antigen (pada permukaan
Keyword: Sistem tampilan permukaan sel, Pichia pastoris, scFv anti-EGFRvIII, α-agglutinin, TagRFP

Judul: Perencanaan Lanskap Kawasan Wisata Budaya Desa Adat Bualu Nusa Dua, Bali
Abstrak: Desa Adat Bualu adalah suatu wilayah yang terletak di sebelah barat Kawasan Pariwisata Nusa Dua (KPND) yang mempunyai budaya Bali yang kuat. Dengan dijadikannya Desa Adat Bualu sebagai kawasan wisata budaya diharapkan dapat melestarikan budaya tradisional di Desa Adat Bualu sekaligus meningkatkan kesejahteraan hidup masyarakatnya serta mempertahankan keberadaan Kawasan Pariwisata Nusa Dua sebagai kawasan pariwisata internasional yang sudah terkenal di seluruh dunia.
Keyword: