Judul: Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris
Abstrak: Reseptor faktor pertumbuhan epidermal (epidermal growth factor receptor, EGFR) varian III atau dikenal sebagai EGFRvIII adalah varian mutan dari EGFR normal yang mengalami delesi sebanyak 267 asam amino (ekson -2 sampai 7). Delesi ini mengakibatkan sebagian besar domain ekstraselular pada EGFR hilang dan terbentuk epitope baru pada ujung-N yang spesifik dan sangat potensial sebagai molekul target pada beberapa jenis sel tumor. Varian mutan ini umumnya ditemui pada beberapa jenis tumor padat termasuk glioblastoma (GBM), kanker payudara, rahim, prosat, otak (medulloblastoma), dan paru-paru. Antibodi atau fragmen antibodi anti-EGFRvIII scFv memiliki aktifitas spesifik yang mampu mengenali epitope EGFRvIII tersebut dan akan mengalami endositosis ke dalam sel setelah berikatan dengan reseptor ini. Human pancreatic ribonuclease (HPR) dapat bersifat sitotoksik bila masuk ke dalam sel karena kemampuannya untuk mendegradasi RNA. Aktivitas ribonuklease tersebut akan menghambat proses biosintesis protein di dalam sel hingga mengakibatkan kematian sel. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi suatu imunotoksin konjugat dari antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII yang difusi dengan human pancreatic ribonuclease (HPR) mutan dengan dan tanpa protein penanda GFP dan diekspresikan pada Pichia pastoris.Varian GFP yang digunakan adalah EGFP (enhanced green fluorescent protein). Gen anti-EGFRvIII-scFv dan GFP disubklon ke dalam vektor pPICZαA di bawah kontrol dari promoter AOX1 (PAOX1) yang bersifat indusibel dan difusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α), menghasilkan plasmid pPICZα- scFv dan pPICZα-scFv-GFP. Sekuen gen diverifikasi dan plasmid tersebut digunakan pada subkloning berikutnya. Selanjutnya gen HPR di subklon pada ujung-3’ dari gen scFv dan scFv::GFP, menghasilkan konstruk fusi gen scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR. Plasmid rekombinan pPICZ-scFv-HPR dan pPICZ-scFv-GFP-HPR telah berhasil dikonstruksi dan urutan sekuen nukleotidanya telah diverifikasi. Kedua konstruk plasmid tersebut dilinearisasi menggunakan enzim SacI sebelum digunakan untuk transformasi. P. pastoris SMD1168H digunakan sebagai sel inang untuk transformasi dengan teknik elektroporasi. Kedua konstruk fusi gen tersebut berhasil ditransformasi dan diekspresikan pada P. pastoris. Sel transforman diseleksi pada medium YPD yang mengandung zeocin untuk mendapatkan klon transforman yang stabil dan memiliki banyak salinan gen target. Efisiensi transformasi dari konstruk scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR masing-masing adalah 54 dan 110 cfu/μg DNA. P. pastoris transforman diseleksi lebih lanjut pada media yang mengandung zeocin dari konsentrasi 100 sampai 1000 μg/ml. Ekspresi protein rekombinan dianalisis dengan mikroskop fluoresen, SDS PAGE dan western blot. P. pastoris yang ditransformasi dengan fusi gen GFP mengeluarkan pendaran fluoresen hijau yang menunjukkan bahwa GFP terekspresi dengan baik. Protein fusi rekombinan telah berhasil diekspresikan dan disekresikan dari P. pastoris seperti ditunjukkan pada analisis imunobloting dan v SDS-PAGE. Protein rekombinan tersebut telah berhasil diisolasi dan dipurifikasi menggunakan metode kromatografi afinitas dengan estimasi yield sebesar 15,85 mg protein per liter kultur.
Keyword: EGFRvIII, HPR (human pancreatic ribonuclease), imunotoksin konjugat, anti-EGFRvIII scFv, Pichia pastoris.

Judul: Introduksi dan Ekspresi Gen Fragmen Antibodi Untai Tunggal (scFv) Anti-EGFRvIII pada Pichia pastoris
Abstrak: EGFRvIII merupakan salah satu varian mutan Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) yang mengalami mutasi pada bagian ekstraselularnya. EGFRvIII hanya ditemukan pada sel kanker dan tidak pada sel normal, sehingga merupakan target terapi kanker yang sangat menarik. Molekul antibodi utuh telah digunakan sebagai agen terapi kanker. Akan tetapi penggunaannya dalam konstruksi obat dengan sistem penghantaran terarah memiliki kelemahan karena ukurannya yang relatif besar (150 kDa). Hal ini disebabkan karena ukuran yang besar dapat mengurangi kemampuan untuk penetrasi ke dalam sel tumor. Permasalahan tersebut diatasi dengan membuat suatu fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII yang memiliki ukuran 25 kDa. Fragmen antibodi terdiri dari bagian untai berat (VH) dan untai ringan (VL) yang dihubungkan oleh suatu peptida yang disebut linker (G4S)3. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkonstruksi scFv, mengintroduksi dan mengekspresikannya ke dalam Pichia pastoris. Fragmen antibodi dibuat dalam 2 versi, yaitu versi 1 (VH-L-VL) dan versi 2 (VL-L-VH), yang dimaksudkan untuk mempelajari sifat afinitasnya terhadap antigen. Fragmen antibodi versi 1 dirancang dan dibuat secara sintetik dan kemudian diklon ke dalam vektor pPICZαA dan ditransformasikan ke dalam E. coli. Plasmid rekombinan (pPICZαA-scFv-1) dianalisis dengan menggunakan PCR, enzim restriksi dan sekuensing. Plasmid rekombinan dengan urutan DNA yang tepat kemudian difusikan dengan suatu gen penanda yaitu Green Fluorescent Protein (GFP) lalu ditransformasikan ke dalam P. pastoris SMD1168H. Nilai efisiensi transformasi yang diperoleh adalah 1,2x 104 cfu/μg DNA plasmid. Hasil analisis dengan teknik SDS-PAGE dan Slot blot terhadap media kultur bebas sel menunjukkan bahwa fusi scFv-GFP telah berhasil diekspresikan secara ekstraselular dengan ukuran 60 kDa. Fragmen antibodi versi 2 dibuat dengan menggunakan teknik overlap extension PCR lalu diklon ke dalam vektor pTZ57r/t dan ditransformasikan ke dalam E. coli.
Keyword: 

Judul: Socioeconomic and psychological variables influencing household debt
Abstrak: The overall objective of this study was to examine factors influencing total debt, total debt payment, and patterns of debt payments. The study examined the impacts of both psychological (credit attitudes and perception of future income) and socioe- conomic variables on total debt, total debt payment and patterns of debt payments. A conceptual model for this study was developed by incorporating the theory of borrower risk, the economic and psychological economic theory of borrowing, and the results of previous studies. This model identifies socioeconomic and psycholog- ical variables that influence total debt, total debt payment, and patterns of debt payments. Socioeconomic variables included in the model are gender, race, mari- tal status, employment status, household size, age, education, and household assets. Psychological variables are credit attitudes toward the use of credit, and perception of future income. This study used data from the 1989 Survey of Consumer Finances. The survey was sponsored by the Federal Reserve in cooperation with some other federal agencies. Data for the survey were collected by the Survey Research Center at the University of Michigan between August 1989 and March 1990. dst ...
Keyword: Gender