Judul: Pengaruh Peptida Sinyal dan Promoter Pada Ekspresi Lipase Novel Dari Micrococcus luteus EMP48-D di Escherichia coli
Abstrak: Lipase (triasilgliserol asilhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan enzim hidrolitik yang dapat menghidrolisis trigeliserida menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Lipase dimanfaatkan dalam beberapa industri, seperti makanan, susu, farmasi, tekstil, surfaktan, pakan ternak, kosmetik, dan biodiesel. Mengingat banyaknya manfaat dari enzim ini, eksplorasi lipase semakin gencar dilakukan, salah satunya dengan rekayasa protein rekombinan baik secara homolog maupun heterolog. Pada penelitian sebelumnya gen penyandi lipase EMP48-D telah berhasil diisolasi dari Micrococcus luteus yang merupakan bakteri yang terdapat di tempe. Gen lipase EMP48-D ini dapat terkekspresi di Escherichia coli, meskipun memiliki aktivitas yang masih rendah. Lipase EMP48-D memiliki karakter unik yaitu dapat bekerja di pH asam (lipase asam). Penelitian terkait lipase asam masih sangat jarang jika dibandingkan dengan eksplorasi lipase golongan alkali. Aktivitas lipase yang diperoleh pada penelitian tersebut masih sangat kecil dan terdapat di intraseluler. Oleh sebab itu pada penelitian ini promoter (T7 dan T5) digunakan untuk memperoleh aktivitas yang lebih tinggi, dan peptida sinyal (ompA, M. lut dan pelB) digunakan untuk sekresi protein rekombinan secara ekstraseluler. Pada penelitian ini gen lipase EMP48-D terlebih dahulu diklon ke dalam plasmid pBSP dengan backbone pET28-a, dengan beberapa variasi yaitu T7_M.lut_EMP, T7_ompA_EMP, T7_pelB_EMP, T5_ompA_EMP, T5_pelB_EMP, dan T7_EMP kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α. Seluruh plasmid rekombinan diekspresikan ke dalam E. coli BL21 (DE3) pLysS dengan T7_EMP sebagai kontrol. Ekspresi lipase EMP48-D diinduksi dengan IPTG 0,5 mM di suhu 30 ⁰C dengan waktu induksi selama 5 jam dan agitasi 200 rpm. Perbedaan nilai OD600 terjadi pada perlakukan induksi dan non induksi yang diamati pada ekspresi T7_M.lut_EMP dan T7_ompA_EMP. Kultur yang diinduksi menunjukkan pertumbuhan yang lebih lambat dibandingkan dengan yang tidak diinduksi. Perbedaan jumlah sel mengindikasikan inang mengalami penghambatan pertumbuhan sel, karena ekspresi dari lipase EMP48-D. Penambahan peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) dalam sekresi lipase EMP48-D memberikan pengaruh yang baik dalam translokasi lipase EMP48-D. Pemberian peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) menunjukkan pengaruh dalam jumlah translokasi lipase EMP48-D baik yang di kontrol oleh promoter T7 maupun T5. Lipase EMP48-D yang terfusi dengan ompA dan dikontrol promoter T7 memiliki aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 418 U mg-1. Hasil ini diikuti oleh fusi dengan peptida sinyal asli M. luteus (292 U mg-1), pelB (125 U mg-1), dan tanpa peptida sinyal (56 U mg-1). Lipase EMP48-D yang terfusi dengan peptida sinyal ompA di bawah pengaruh promoter T5 juga menunjukkan aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 133 U mg-1 dan pelB hanya 74 U mg-1. Di daerah periplasma dan intraselulur, lipase EMP48-D fusi ompA yang dikontrol oleh promoter T5 memiliki aktivitas tertinggi yaitu 107 U mg-1 dan 33 U mg-1. Ekspresi lipase EMP48-D di bawah kontrol promoter T7 lebih tinggi dari promoter T5, sekitar 1,8 kali dengan ompA, dan 1,3 kali dengan pelB. Oleh karena itu, peptida sinyal ompA, di bawah kendali promoter T7, adalah yang paling efektif dalam ekspresi ekstraseluler lipase EMP48-D. Lipase EMP48-D menunjukkan aktivitas spesifik optimum pada suhu 40 °C (95%) dan optimum pada pH 5 (100%). Penggunaan berbagai jenis substrat juga memberikan pengaruh terhadap aktivitas lipase EMP48-D, yaitu minyak zaitun (100%), minyak sawit (64%), kanola (64%) minyak jagung (64%), minyak kedelai (59%), minyak bunga matahari (55%), dan
Keyword: Lipase asam, Micrococcus luteus, Promoter, Sinyal sekresi

Judul: Expression of Lipase Genes from Micrococcus luteus in Pichia pastoris
Abstrak: Lipase merupakan enzim yang akhir-akhir ini semakin menarik perhatian berbagai sektor industri. Terkenal karena multifasetnya menjadikan lipase sebagai salah satu enzim hidrolitik dengan permintaan cukup tinggi. Hal tersebut mengharuskan peningkatan eksplorasi, identifikasi, dan pengembangan lipase-lipase jenis baru dengan karakteristik yang sesuai dengan kebutuhan industri. Lipase EMP48-D merupakan lipase baru yang berasal dari bakteri lipolitik Micrococcus luteus yang diisolasi dari tempe. Lipase EMP48-D adalah lipase yang aktif pada pH rendah (lipase asidik), toleransi terhadap suhu tinggi, dan stabil diberbagai pelarut organik. Karakteristik tersebut membuat lipase EMP48-D berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat diaplikasikan di industri-industri, khususnya untuk bahan baku yang membutuhkan kondisi asam. Gen yang mengkodekan lipase dari EMP48-D sebelumnya telah dioverekspresikan di dalam inang Escherichia coli BL21, optimasi dilakukan dengan penambahan chaperone dan beberapa jenis vektor. Namun aktivitas lipolitik yang dihasilkan masih rendah. Penyebabnya adalah sebagian besar protein hasil overekspresi termanifestasi dalam badan inklusi, akibat keberadaan sinyal peptida bawaan M. luteus yang tidak dikenali oleh sistem E. coli. Berangkat dari hal tersebut untuk memperbaiki ekspresi gen lipase EMP48-D, dilakukan overekspresi ke dalam inang Pichia pastoris. Strategi pertama yang dilakukan berupa optimasi dengan mengeliminasi sinyal peptida bawaan diganti dengan sinyal peptida alpha mating factor (α-MF) yang telah berada dalam vektor pPICZα-A. Lipase EMP48-D berhasil di ekspresikan dalam bentuk protein ekstraseluler dengan kenaikan aktivitas dua kali lipat dari 15,02 ± 2,33 U mg-1 di E. coli BL21 menjadi 31,01 ± 1,08 U mg-1 di P. pastoris. Strategi kedua dilakukan dengan optimasi preferensi kodon agar lebih dikenali oleh sistem P. pastoris. Konstruksi plasmid rekombinan dilakukan di vektor pPIC9K dan pPICZα-A dan ditransformasikan ke dalam P. pastoris galur KM71 (MutS) dan GS115 (Mut+). Optimasi preferensi kodon berhasil menurunkan jumlah pemakaian kodon dalam bentuk Effective Number of Codons (ENc) dari 30 jenis kodon menjadi 20 jenis kodon. Indeks peluang kemunculan kodon atau Codon adaption index (CAI) ditingkatkan dari 0,408 menjadi 0,995. Analisis susunan nukleotida juga menunjukkan sebanyak 432 pb dari 1260 pb berhasil diganti dengan homologi 65,6% dibandingkan sekuen sebelum optimasi serta kandungan GC direduksi dari 76,5% menjadi 44,7%. Aktivitas lipase EMP48-D meningkat 400% dengan plasmid rekombinan pPIC9K dan inang KM71. Aktivitas spesifik optimal dihasilkan pada pH 5,0 pada suhu 40 °C sebesar 145,41 ± 4,83 U mg-1. Lipase EMP48-D memiliki kestabilan yang baik pada kisaran pH 3,0 – 5,0 dengan aktivitas residual mencapai 86,4% setelah inkubasi selama 180 menit pada suhu 40 °C. Lipase EMP48-D juga mampu menghidrolisis berbagai trigliserida rantai panjang terutama minyak zaitun (100%), diikuti dengan minyak biji bunga matahari (88,5%), minyak kanola (74,4%), minyak jagung (73,1%), minyak bekatul (71,8%), minyak kedelai (69,2%), dan minyak kelapa sawit (42,3%). Lipase EMP48-D toleran terhadap pelarut organik, terutama isopropanol (115,7%), diikuti oleh butanol (114,6%), etanol (102,8%), asetonitril (102,2%), dan metanol (101,6%). Sebaliknya pada pelarut organik n-heksana dan n-heptana terjadi penurunan aktivitas menjadi masing-masing 58,9% dan 83,8%. Konsentrasi 0,01 M ion logam (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn+) menurunkan hingga 43,1% aktivitas enzim sementara pada konsentrasi yang sama FeCl2 (213,8%) dan FeSO4 (136,2%) diketahui mampu meningkatkan aktivitas relatif enzim. Kapabilitas lipase EMP48-D sebagai katalis reaksi transesterifikasi masih rendah, hanya sekitar 2,95% dan 1,06% yang berhasil mengonversi asam lemak
Keyword: acidic lipase, codon optimization, Micrococcus luteus, overexpression, signal sequence

Judul: Closed Knight’s Tour pada Papan Catur Berbentuk Persegi Panjang dengan Ukuran Maksimal 8 × 8
Abstrak: Closed Knight’s Tour merupakan langkah kuda yang mengunjungi setiap kotak pada papan catur tepat satu kali dengan langkah kuda berawal dan berakhir pada kotak yang sama. Graf yang terbentuk dari closed knight’s tour dinotasikan sebagai graf G(m,n), dengan m adalah banyaknya baris dan n adalah banyaknya kolom. Graf tersebut memuat Hamiltonian cycle. Sebuah graf terhubung G adalah graf bipartite jika dan hanya jika graf tersebut tidak memiliki cycle dengan panjang ganjil. Papan catur yang memenuhi syarat cukup untuk memiliki closed knight’s tour adalah papan catur berukuran 5 × 6, 5 × 8, 6 × 6, 6 × 7, 6 × 8, 7 × 8, dan 8 × 8.
Keyword: bipartite, closed knight’s tour, hamiltonian cycle, knight’s tour, teori graf