Judul: Introduksi dan Ekspresi Gen Fragmen Antibodi Untai Tunggal (scFv) Anti-EGFRvIII pada Pichia pastoris
Abstrak: EGFRvIII merupakan salah satu varian mutan Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) yang mengalami mutasi pada bagian ekstraselularnya. EGFRvIII hanya ditemukan pada sel kanker dan tidak pada sel normal, sehingga merupakan target terapi kanker yang sangat menarik. Molekul antibodi utuh telah digunakan sebagai agen terapi kanker. Akan tetapi penggunaannya dalam konstruksi obat dengan sistem penghantaran terarah memiliki kelemahan karena ukurannya yang relatif besar (150 kDa). Hal ini disebabkan karena ukuran yang besar dapat mengurangi kemampuan untuk penetrasi ke dalam sel tumor. Permasalahan tersebut diatasi dengan membuat suatu fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII yang memiliki ukuran 25 kDa. Fragmen antibodi terdiri dari bagian untai berat (VH) dan untai ringan (VL) yang dihubungkan oleh suatu peptida yang disebut linker (G4S)3. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkonstruksi scFv, mengintroduksi dan mengekspresikannya ke dalam Pichia pastoris. Fragmen antibodi dibuat dalam 2 versi, yaitu versi 1 (VH-L-VL) dan versi 2 (VL-L-VH), yang dimaksudkan untuk mempelajari sifat afinitasnya terhadap antigen. Fragmen antibodi versi 1 dirancang dan dibuat secara sintetik dan kemudian diklon ke dalam vektor pPICZαA dan ditransformasikan ke dalam E. coli. Plasmid rekombinan (pPICZαA-scFv-1) dianalisis dengan menggunakan PCR, enzim restriksi dan sekuensing. Plasmid rekombinan dengan urutan DNA yang tepat kemudian difusikan dengan suatu gen penanda yaitu Green Fluorescent Protein (GFP) lalu ditransformasikan ke dalam P. pastoris SMD1168H. Nilai efisiensi transformasi yang diperoleh adalah 1,2x 104 cfu/μg DNA plasmid. Hasil analisis dengan teknik SDS-PAGE dan Slot blot terhadap media kultur bebas sel menunjukkan bahwa fusi scFv-GFP telah berhasil diekspresikan secara ekstraselular dengan ukuran 60 kDa. Fragmen antibodi versi 2 dibuat dengan menggunakan teknik overlap extension PCR lalu diklon ke dalam vektor pTZ57r/t dan ditransformasikan ke dalam E. coli.
Keyword: 

Judul: Ekspresi Fragmen Antibodi Untai Tunggal (scFv) Anti-EGFRvIII pada Permukaan Sel Pichia pastoris
Abstrak: Sistem tampilan permukaan khamir telah menjadi teknik yang semakin popular untuk rekayasa protein dan seleksi pembuatan pustaka protein. Sistem ini membutuhkan suatu protein permukaan agar protein target bisa berada di permukaan sel. α-agglutinin merupakan salah satu protein yang ditemukan dipermukaan sel Saccharomyces cerevisiae dan bisa dimanfaatkan untuk tampilan permukaan sel khamir lainnya seperti Pichia pastoris. Pada C-terminal α-agglutinin terdapat gugus glycosylphosphatidylinositol (GPI) yang akan berikatan secara kovalen dengan penyusun komponen dinding sel khamir, yaitu glukan. Sistem ini dapat digunakan untuk mengekspresikan suatu protein antibodi rekombinan pada permukaan sel khamir. Antibodi pada penelitian ini merupakan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) yang dapat mengenali antigen EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor variant III). EGFRvIII merupakan salah satu varian mutan EGFR yang mengalami delesi pada ekson ke 2 hingga ekson ke 7 di bagian domain ekstraseluler. EGFRvIII berperan penting dalam pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. P. pastoris merupakan salah satu khamir metilotropik yang dapat menggunakan metanol sebagai sumber karbon. Kelebihan utama yang dimiliki oleh P. pastoris dibandingkan sel prokariot adalah sel ini mampu melakukan modifikasi protein pascatranslasi seperti pelipatan protein, glikosilasi, dan pembentukan ikatan disulfida. Proses glikosilasi pada P. pastoris tidak mengalami hiperglikosilasi seperti yang sering ditemukan pada S. cerevicae. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti EGFRvIII pada permukaan sel P. pastoris. Gen scFv diamplifikasi dari plasmid pJ201-scFv dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dan difusi dengan separuh bagian ujung-C gen AGα dalam vektor ekspresi pJ912-Agα-RFP. TagRFP (Tag Red Fluorescent Protein) adalah gen reporter penyandi protein fluoresen merah yang disisipkan di antara gen scFv dengan gen AGα. Konstruk gen tersebut disubklon terfusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α) dan di bawah regulasi promoter indusibel AOX1 ( PAOX1 ). Ekspresi protein terjadi apabila dilakukan induksi dengan menggunakan metanol dan MF-α mengarahkan protein disekresikan keluar sel. Vektor rekombinan diintroduksikan ke dalam P. pastoris SMD1168H melalui rekombinasi homolog. Seleksi transforman P. pastoris dilakukan menggunakan media seleksi mengandung zeocin. Analisis ekspresi protein rekombinan dilakukan, antara lain melalui pengamatan sel dengan mikroskop fluoresense, analisis SDS-PAGE, hibridisasi Western blot, dan analisis interaksi antibodi-antigen dengan bantuan manik magnet. Gen scFv anti-EGFRvIII telah berhasil disisipkan pada vektor pJ912-Agα-RFP. Namun, gen scFv tersebut mengalami dua mutasi titik, masing-masing satu pada bagian rantai berat (VH) dan rantai ringan (VL). Satu mutasi berupa mutasi sunyi (silent) yang tidak mengubah asam amino, sedangkan mutasi lainnya mengubah asam amino dari asparagin (N194) menjadi asam aspartat (D194). Plasmid pJ912-AGα-RFP dan pJ912-AGα-RFP::scFv berhasil berintegrasi ke dalam genom P. pastoris SMD1168H. Stabilitas genetik sel transforman diperoleh melalui seleksi pada media zeocin hingga konsentrasi 1000 μg/mL. Pengamatan menggunakan mikroskop fluoresen membuktikan bahwa sel-sel transforman berhasil memancarkan fluoresensi berwarna merah yang berasal dari protein fungsional TagRFP. Adanya pita protein yang terdeteksi pada hasil hibridisasi Western blot menunjukkan bahwa sel P. pastoris berhasil mengekspresikan protein target (scFv) yang terfusi dengan protein TagRFP dan α-agglutinin. Eksperimen dengan menggunakan manik magnet yang diselimuti dengan protein rekombinan antigen EGFRvIII menunjukkan bahwa sel transforman P. pastoris yang terdapat antibodi anti EGFRvIII pada permukaan sel dapat melekat pada permukaan manik magnet yang membuktikan bahwa terjadi interaksi antara antibodi (pada permukaan sel) dengan antigen (pada permukaan
Keyword: Sistem tampilan permukaan sel, Pichia pastoris, scFv anti-EGFRvIII, α-agglutinin, TagRFP

Judul: Peranan hutan dalam kehidupan rumah tangga masyarakat desa hutan (Studi kasus kampung Nyungcung, Desa Malasari, Kecamatan Nanggung, Kabupaten Bogor, Jawa Barat)
Abstrak: Hutan merupakan sumberdaya alam yang sangat berperan dalam kehidupan manusia. Hutan memiliki hubungan yang sangat erat dengan masyarakat yang tinggal disekitar hutan. Bagi masyarakat yang tinggal di sekitar kawasan hutan, hutan merupakan tempat tinggal dan sebagai tempat untuk memenuhi keperluan sehari-hari. Desa Malasari merupakan salah satu Desa yang berada dikawasan Ekosistem Taman Nasional Gunung Halimun. Sehubungan dengan dikeluarkannya Surat Keputusan Menteri Kehutanan RI Nomor 175Kpts- IZ tahun 2003 tentang perluasan Taman Nasional Gunung Halimun-Salak, maka Desa Malasari terletak di areal perluasan tersebut dan menjadi kawasan Taman Nasional Gunung Halimun. Sejak tahun 1992 Taman Nasional Gunung Halimun mengambil alih pengelolaan hutan dam di Desa Malasari, dan sebesar 37,37 persen masuk dalam areal konservasi Taman Nasional Gunung Halimun.
Keyword: