Judul: Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris
Abstrak: Reseptor faktor pertumbuhan epidermal (epidermal growth factor receptor, EGFR) varian III atau dikenal sebagai EGFRvIII adalah varian mutan dari EGFR normal yang mengalami delesi sebanyak 267 asam amino (ekson -2 sampai 7). Delesi ini mengakibatkan sebagian besar domain ekstraselular pada EGFR hilang dan terbentuk epitope baru pada ujung-N yang spesifik dan sangat potensial sebagai molekul target pada beberapa jenis sel tumor. Varian mutan ini umumnya ditemui pada beberapa jenis tumor padat termasuk glioblastoma (GBM), kanker payudara, rahim, prosat, otak (medulloblastoma), dan paru-paru. Antibodi atau fragmen antibodi anti-EGFRvIII scFv memiliki aktifitas spesifik yang mampu mengenali epitope EGFRvIII tersebut dan akan mengalami endositosis ke dalam sel setelah berikatan dengan reseptor ini. Human pancreatic ribonuclease (HPR) dapat bersifat sitotoksik bila masuk ke dalam sel karena kemampuannya untuk mendegradasi RNA. Aktivitas ribonuklease tersebut akan menghambat proses biosintesis protein di dalam sel hingga mengakibatkan kematian sel. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi suatu imunotoksin konjugat dari antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII yang difusi dengan human pancreatic ribonuclease (HPR) mutan dengan dan tanpa protein penanda GFP dan diekspresikan pada Pichia pastoris.Varian GFP yang digunakan adalah EGFP (enhanced green fluorescent protein). Gen anti-EGFRvIII-scFv dan GFP disubklon ke dalam vektor pPICZαA di bawah kontrol dari promoter AOX1 (PAOX1) yang bersifat indusibel dan difusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α), menghasilkan plasmid pPICZα- scFv dan pPICZα-scFv-GFP. Sekuen gen diverifikasi dan plasmid tersebut digunakan pada subkloning berikutnya. Selanjutnya gen HPR di subklon pada ujung-3’ dari gen scFv dan scFv::GFP, menghasilkan konstruk fusi gen scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR. Plasmid rekombinan pPICZ-scFv-HPR dan pPICZ-scFv-GFP-HPR telah berhasil dikonstruksi dan urutan sekuen nukleotidanya telah diverifikasi. Kedua konstruk plasmid tersebut dilinearisasi menggunakan enzim SacI sebelum digunakan untuk transformasi. P. pastoris SMD1168H digunakan sebagai sel inang untuk transformasi dengan teknik elektroporasi. Kedua konstruk fusi gen tersebut berhasil ditransformasi dan diekspresikan pada P. pastoris. Sel transforman diseleksi pada medium YPD yang mengandung zeocin untuk mendapatkan klon transforman yang stabil dan memiliki banyak salinan gen target. Efisiensi transformasi dari konstruk scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR masing-masing adalah 54 dan 110 cfu/μg DNA. P. pastoris transforman diseleksi lebih lanjut pada media yang mengandung zeocin dari konsentrasi 100 sampai 1000 μg/ml. Ekspresi protein rekombinan dianalisis dengan mikroskop fluoresen, SDS PAGE dan western blot. P. pastoris yang ditransformasi dengan fusi gen GFP mengeluarkan pendaran fluoresen hijau yang menunjukkan bahwa GFP terekspresi dengan baik. Protein fusi rekombinan telah berhasil diekspresikan dan disekresikan dari P. pastoris seperti ditunjukkan pada analisis imunobloting dan v SDS-PAGE. Protein rekombinan tersebut telah berhasil diisolasi dan dipurifikasi menggunakan metode kromatografi afinitas dengan estimasi yield sebesar 15,85 mg protein per liter kultur.
Keyword: EGFRvIII, HPR (human pancreatic ribonuclease), imunotoksin konjugat, anti-EGFRvIII scFv, Pichia pastoris.

Judul: Ekspresi Fragmen Antibodi Untai Tunggal (scFv) Anti-EGFRvIII pada Permukaan Sel Pichia pastoris
Abstrak: Sistem tampilan permukaan khamir telah menjadi teknik yang semakin popular untuk rekayasa protein dan seleksi pembuatan pustaka protein. Sistem ini membutuhkan suatu protein permukaan agar protein target bisa berada di permukaan sel. α-agglutinin merupakan salah satu protein yang ditemukan dipermukaan sel Saccharomyces cerevisiae dan bisa dimanfaatkan untuk tampilan permukaan sel khamir lainnya seperti Pichia pastoris. Pada C-terminal α-agglutinin terdapat gugus glycosylphosphatidylinositol (GPI) yang akan berikatan secara kovalen dengan penyusun komponen dinding sel khamir, yaitu glukan. Sistem ini dapat digunakan untuk mengekspresikan suatu protein antibodi rekombinan pada permukaan sel khamir. Antibodi pada penelitian ini merupakan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) yang dapat mengenali antigen EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor variant III). EGFRvIII merupakan salah satu varian mutan EGFR yang mengalami delesi pada ekson ke 2 hingga ekson ke 7 di bagian domain ekstraseluler. EGFRvIII berperan penting dalam pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. P. pastoris merupakan salah satu khamir metilotropik yang dapat menggunakan metanol sebagai sumber karbon. Kelebihan utama yang dimiliki oleh P. pastoris dibandingkan sel prokariot adalah sel ini mampu melakukan modifikasi protein pascatranslasi seperti pelipatan protein, glikosilasi, dan pembentukan ikatan disulfida. Proses glikosilasi pada P. pastoris tidak mengalami hiperglikosilasi seperti yang sering ditemukan pada S. cerevicae. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan fragmen antibodi untai tunggal (scFv) anti EGFRvIII pada permukaan sel P. pastoris. Gen scFv diamplifikasi dari plasmid pJ201-scFv dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dan difusi dengan separuh bagian ujung-C gen AGα dalam vektor ekspresi pJ912-Agα-RFP. TagRFP (Tag Red Fluorescent Protein) adalah gen reporter penyandi protein fluoresen merah yang disisipkan di antara gen scFv dengan gen AGα. Konstruk gen tersebut disubklon terfusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α) dan di bawah regulasi promoter indusibel AOX1 ( PAOX1 ). Ekspresi protein terjadi apabila dilakukan induksi dengan menggunakan metanol dan MF-α mengarahkan protein disekresikan keluar sel. Vektor rekombinan diintroduksikan ke dalam P. pastoris SMD1168H melalui rekombinasi homolog. Seleksi transforman P. pastoris dilakukan menggunakan media seleksi mengandung zeocin. Analisis ekspresi protein rekombinan dilakukan, antara lain melalui pengamatan sel dengan mikroskop fluoresense, analisis SDS-PAGE, hibridisasi Western blot, dan analisis interaksi antibodi-antigen dengan bantuan manik magnet. Gen scFv anti-EGFRvIII telah berhasil disisipkan pada vektor pJ912-Agα-RFP. Namun, gen scFv tersebut mengalami dua mutasi titik, masing-masing satu pada bagian rantai berat (VH) dan rantai ringan (VL). Satu mutasi berupa mutasi sunyi (silent) yang tidak mengubah asam amino, sedangkan mutasi lainnya mengubah asam amino dari asparagin (N194) menjadi asam aspartat (D194). Plasmid pJ912-AGα-RFP dan pJ912-AGα-RFP::scFv berhasil berintegrasi ke dalam genom P. pastoris SMD1168H. Stabilitas genetik sel transforman diperoleh melalui seleksi pada media zeocin hingga konsentrasi 1000 μg/mL. Pengamatan menggunakan mikroskop fluoresen membuktikan bahwa sel-sel transforman berhasil memancarkan fluoresensi berwarna merah yang berasal dari protein fungsional TagRFP. Adanya pita protein yang terdeteksi pada hasil hibridisasi Western blot menunjukkan bahwa sel P. pastoris berhasil mengekspresikan protein target (scFv) yang terfusi dengan protein TagRFP dan α-agglutinin. Eksperimen dengan menggunakan manik magnet yang diselimuti dengan protein rekombinan antigen EGFRvIII menunjukkan bahwa sel transforman P. pastoris yang terdapat antibodi anti EGFRvIII pada permukaan sel dapat melekat pada permukaan manik magnet yang membuktikan bahwa terjadi interaksi antara antibodi (pada permukaan sel) dengan antigen (pada permukaan
Keyword: Sistem tampilan permukaan sel, Pichia pastoris, scFv anti-EGFRvIII, α-agglutinin, TagRFP

Judul: Socioeconomic and psychological variables influencing household debt
Abstrak: The overall objective of this study was to examine factors influencing total debt, total debt payment, and patterns of debt payments. The study examined the impacts of both psychological (credit attitudes and perception of future income) and socioe- conomic variables on total debt, total debt payment and patterns of debt payments. A conceptual model for this study was developed by incorporating the theory of borrower risk, the economic and psychological economic theory of borrowing, and the results of previous studies. This model identifies socioeconomic and psycholog- ical variables that influence total debt, total debt payment, and patterns of debt payments. Socioeconomic variables included in the model are gender, race, mari- tal status, employment status, household size, age, education, and household assets. Psychological variables are credit attitudes toward the use of credit, and perception of future income. This study used data from the 1989 Survey of Consumer Finances. The survey was sponsored by the Federal Reserve in cooperation with some other federal agencies. Data for the survey were collected by the Survey Research Center at the University of Michigan between August 1989 and March 1990. dst ...
Keyword: Gender