Judul: Extracellular Expression of thermostable Geobacillus stearothermophilus T1.2RQ Lipase for Biodiesel Production
Abstrak: The extracellular expression of enzymes in an excellent secretion host such as Bacillus subtilis is a useful strategy for making enzymes of industrial significance more affordable by lowering the cost of its downstream processing. Lipases are a category of hydrolases that catalyze the hydrolysis of triglycerides to glycerol and free fatty acids. Also, lipases catalyze the hydrolysis and transesterification of other esters as well as the synthesis of esters. They can perform very specific biotransformation reactions and are widely used in food, organic synthesis, detergents, cosmetic, and pharmaceutical industries. Geobacillus stearothermophilus T1.2RQ lipase is an industrially-desired thermostable lipolytic enzyme with an excellent hydrolytic and transesterification activity. This study aimed to express T1.2RQ lipase, in B. subtilis WB800 and ensure its secretion into the extracellular medium. Three signal peptides (AmyQ, Epr, LipA) and two promoters (Pgrac01 and Pgrac100) were used in the secretory-expression of T1.2RQ lipase, based on five constructed expression vectors constructed by restriction cloning and PCR mutagenesis. Sangers sequencing was used to verify constructs to ensure they are in the correct reading frame. Recombinants vectors, pHT43 (plasmid control), pHT43-T1.2RQ, pHT43- T1.2RQ_AmyQ, pHT43-T1.2RQ_Epr, and pHT43-T1.2RQ_LipA, were transformed by electroporation into Bacillus subtilis WB800. The electroporation was successful with the optimum condition of 2500V, 200 ohms, 25µF, and 5milliseconds. Recombinant B. subtilis pHT43 (negative control) and pHT43-T1.2RQlip + signal peptides were streaked on the lipidic agar, LA+TBN. All four recombinants, including the negative control (B. subtilis WB800-pHT43), produced clear zones on the TBN agar plate after overnight incubation (fig 2), indicating the presence of a lipolytic enzyme in all of the recombinant B. subtilis cells. pHT43-T1.2RQlip + signal peptides (AmyQ, Epr, and LipA) have clear zones with significantly higher diameters than B. subtilis WB800-pHT43 (negative control). This phenomenon suggests that the recombinant thermostable lipase T1.2RQ introduced into these cells was successfully expressed, thereby increasing the lipolytic capability of its host cells T1.2RQ lipase was expressed in 50ml terrific broth medium (TB) and the expression induced with 1mM IPTG. Lipase activity assay using p-nitrophenyl esters showed that all three signal peptides directed the secretion of T1.2RQ lipase into the extracellular medium. Signal peptide, LipA, resulted in the highest extracellular activity of 5.6 U/mL, which corresponds to a 6-fold increase over the parent B. subtilis WB800 strain. Meanwhile, signal peptides, AmyQ and Epr produced 4.2 U/mL and 3.4 U/mL activity respectively. SDS-Zymogram analysis confirmed that T1.2RQ lipase was correctly processed and secreted in its original size of 44 kDa. An attempt to further increase lipase expression level by promoter optimization showed that, contrary to expectation, promoter Pgrac100 exhibited similar expression levels as the original Pgrac01. Nevertheless, the demonstration of the successful secretion of T1.2RQ lipase in this work confirms the latter as a promising approach for the industrial production of the enzyme
Keyword: Bacillus subtilis, Expression, Extracellular, Heterologous, Lipase, Thermostable

Judul: Isolation and Cloning of Thermo-halotolerant Lipase Gene from Bacillus tequilensis isolated from Lainea Hot Spring in Southeast Sulawesi
Abstrak: Kebutuhan lipase oleh berbagai bidang industri dengan aplikasi yang beragam membuat lipase perlu diproduksi secara cepat dan banyak. Namun lipase yang diproduksi saat ini belum sepenuhnya sesuai dengan industri yang memerlukan pemrosesan dengan kondisi suhu tinggi dan pelarut organik serta interaksi ion dalam larutan seperti kadar garam atau salinitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri penghasil lipase termo-halotoleran dari sumber air panas, mengkloning dan mengekspresikan gen penyandi lipase serta karakterisasi biokimia lipase termo-halotoleran. Pengayaan dilakukan sebelum mengisolasi bakteri lipolitik dari habitat ekstrim seperti sumber air panas. Pengayaan dilakukan secara langsung pada habitat asli atau in situ enrichment. Bakteri lipolitik diisolasi dari sampel hasil pengayaan in situ dengan metode Spread Plate pada media Rhodamin B–Agar. Isolat bakteri lipolitik diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA. Gen penyandi lipase diisolasi dengan teknik PCR menggunakan degenerate primer. Gen lipase diklon pada vektor pGEM-T Easy kemudian ditransformasi ke Escherichia coli DH5α untuk preservasi gen dan diklon pada vektor pET24a, ditransformasi ke E. coli BL21 (DE3) pLysS untuk diekspresikan. Ekspresi LipA_BTeq dilakukan 2 perlakuan yaitu mengikutsertakan sekuen signal peptida dan diekspresikan tanpa signal peptida (lipase mature). Analisis massa molekuler protein enzim lipase dilakukan dengan SDS-PAGE dan zimogram. Selain itu dilakukan analisis struktur 3D serta kekerabatan dalam Family lipase dianalisis menggunakan aplikasi MEGA XI. Karakterisasi lipase yang dilakukan adalah suhu optimum, pH optimum, stabilitas enzim terhadap salinitas (larutan NaCl), spesifisitas substrat, ketahanan terhadap pelarut organik, serta pengaruh ion logam. Tujuh belas isolat berhasil diisolasi dari sampel hasil pengayaan. Gen lipase dari 5 isolat bakteri lipolitik berhasil diklon dengan kode isolat HSAS, HSDS2, HSC3.1, HSC3.2 dan HSB3. Hasil identifikasi terhadap isolat HSAS, memiliki tingkat kemiripan 99.5% dengan Bacillus tequilensis strain A13 dengan panjang gen lipase (LipA_Bteq) 639 bp yang menyandikan 213 asam amino dengan 31 asam amino di awal sekuen merupakan sekuen signal peptida. Hasil ekspresi gen lipase menunjukkan perlakuan lipase mature memiliki aktivitas spesifik lebih tinggi (17 ± 1.12 U/mg) daripada yang memiliki signal peptida (8 ± 1.11 U/mg), sehingga lipase mature dipilih untuk dikarakterisasi. Hasil analisis SDS-PAGE dan Zimogram menunjukkan berat protein LipA_Bteq sebesar ~20 kDa. Hasil tersebut dikonfirmasi pula analisis MEGA XI yang membentuk klad dengan subfamily lipase I.4. LipA_Bteq memiliki suhu optimum 30 oC, dan memiliki rentang stabilitas suhu 30 oC - 60 oC dengan rata-rata aktivitas relatif 98 %. LipA_Bteq memiliki ketahanan terhadap konsentrasi NaCl 0.1M sampai 3M, dan memiliki aktivitas optimum pada konsentrasi NaCl 2 M. LipA_Bteq digolongkan sebagai lipase halotoleran karena membutuhkan NaCl untuk mencapai aktivitas optimum. Untuk parameter pH, LipA_Bteq memiliki aktivitas tertinggi pada pH 8. LipA_Bteq memiliki preferensi yang baik pada substrat C6 (rantai pendek). Kehadiran ion logam (Fe3+, Cu2+, Mg2+, Ca2+, Na+, dan Mn2+) dengan konsentrasi 100 mM dalam campuran reaksi mampu meningkatkan aktivitas LipA_Bteq. Disisi lain Zn2+ menurunkan aktivitas lipase sampai 83%. Penambahan pelarut organik 50% metanol, isopropanol dan etanol menurunkan aktivitas enzim, sedangkan kehadiran butanol dan n-heksan meningkatkan aktivitas enzim sebesar 12 % dan 20 % secara berurutan., The need for lipase by various industrial fields with diverse applications makes lipases need to be produced quickly and in large quantities. However, the lipases produced today are not fully suitable
Keyword: lipase bakteri, kloning gen lipase, lipase termo-halotoleran

Judul: Pengaruh Konsep Lanskap Keraton Ngayogyakarta Hadinigrat terhadap Lanskap Kota Yogyakarta
Abstrak: Kota Yogyakarta merupakan kota yang menjadi pusat kebudayaan Jawa dengan adanya Keraton Yogyakarta dan bekas Kerajaan Mataram Islam. Sebagai sebuah kota dengan latar historis kerajaan yang kuat dan legilimasi keraton yang sampai saat ini masih cukup kuat, maka kehidupan keraton mempengaruhi pula kehidupan rakyat Kota Yogyakarta. Keraton dan kawasan kerajaan dibangun berdasarkan konsep-konsep filosofis yang menghasilkan wujud fisik penuh makna dan merupakan cikaI bakaI Kota Yogyakarta. Namun dalam perkembangannya, dengan adanya pengaruh pendatang dan globalisasi, malta banyak terjadi pergeseran nilai dan kebudayaan serta filosofi yang melingkupinya Hal. ini dikhawatirkan akan semakin mengaburkan identitas Kota Yogyakarta.
Keyword: