Judul: Konstruksi Vektor Dan Ekspresi Protein Human Egfrviii Domain Ekstraseluler Pada Escherichia Coli
Abstrak: Reseptor faktor pertumbuhan epidermal varian III (EGFRvIII) adalah mutasi dari EGFR yang mengalami delesi pada bagian ekstraseluler dari ekson 2 sampai ekson 7. Reseptor ini berperan penting dalam pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. Bagian dari ujung-N merupakan bagian unik karena memiliki epitop unik yang berbeda dari bentuk EGFR normal dan dapat dikenali dengan antibodi spesifik anti-EGFRvIII. Fragmen antibodi untai tunggal (scFv) merupakan antibodi anti-EGFRvIII yang memiliki aktifitas spesifik yang mampu mengenali epitop EGFRvIII tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengekspresikan bagian ekstraseluler dari protein reseptor ini pada Escherichia coli, mempelajarinya lebih jauh dan menganalisis interaksi antigen EGFRvIII dengan antibodi anti-EGFRvIII dengan bantuan manik magnet. Pada sistem ekspresi di E. coli biasanya menghadapi beberapa kendala, yaitu tingkat ekspresi yang rendah, kebocoran ekspresi, pembentukan badan inklusi, dan protein yang terpotong. Salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut adalah dengan mensekresikan protein rekombinan tersebut menuju bagian periplasma. Selain itu, periplasma E. coli telah dilaporkan dapat menjaga fungsionalitas dan stabilitas protein lebih efisien dibandingkan sitoplasma. Oleh karena itu, dalam penelitian ini telah dikonstruksi sebuah vektor pJ404 rekombinan yang mengandung sekuen gen EGFRvIII domain ekstraseluler dan sebuah peptida sinyal yang berasal dari Bacillus xylanase (xylB-sp) yang difusikan pada bagian ujung-N. Gen penanda lainnya sebuah protein fluoresen biru (bfp, mTurqoise) yang telah disubklon pada bagian ujung-C berfungsi untuk menandai ekspresi protein EGFRvIII rekombinan pada periplasma E. coli. Vektor rekombinan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21(DE3) untuk analisis ekspresi protein dan dipurifikasi. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa fusi gen dari EGFRvIII::bfp telah berhasil diklon dan vektor rekombinan pJ404-EGFRvIII-bfp telah berhasil dikonstruksi. Selanjutnya, protein yang mengandung fusi EGFRvIII-bfp telah berhasil diekspresikan pada periplasma E. coli. Hal tersebut ditunjukkan dengan terdeteksinya protein berukuran sekitar 32 kDa, ukuran protein yang diprediksi dari fusi protein tersebut yang ditunjukkan dari hasil analisis SDS-PAGE dan Western Blot. Pengamatan di bawah mikroskop fluoresen menunjukkan sebuah pendaran cahaya berwarna biru yang dihasilkan dari E. coli transforman yang diinduksi. Eksperimen dengan menggunakan manik magnet yang diselimuti dengan protein antigen EGFRvIII rekombinan menunjukkan bahwa sel transforman Pichia pastoris yang terdapat antibodi scFv anti-EGFRvIII pada permukaan sel dapat melekat pada permukaan manik magnet. Hal tersebut membuktikan bahwa terjadi interaksi antara antigen (pada permukaan manik magnet) dengan antibodi (pada permukaan sel). Hal ini menunjukkan bahwa fusi protein antigen EGFRvIII ini memiliki struktur yang fungsional sehingga dapat dikenali dengan baik oleh antibodi spesifiknya.
Keyword: EGFRvIII, ekspresi periplasma, mTurqoise, sinyal peptida xylanase (xylB_sp)

Judul: Konstruksi dan Ekspresi Protein Fusi anti-EGFRvIII ..scFv::HPRmut ...sebagai kandidat imunotoksin pada Pichia ..pastoris
Abstrak: Reseptor faktor pertumbuhan epidermal (epidermal growth factor receptor, EGFR) varian III atau dikenal sebagai EGFRvIII adalah varian mutan dari EGFR normal yang mengalami delesi sebanyak 267 asam amino (ekson -2 sampai 7). Delesi ini mengakibatkan sebagian besar domain ekstraselular pada EGFR hilang dan terbentuk epitope baru pada ujung-N yang spesifik dan sangat potensial sebagai molekul target pada beberapa jenis sel tumor. Varian mutan ini umumnya ditemui pada beberapa jenis tumor padat termasuk glioblastoma (GBM), kanker payudara, rahim, prosat, otak (medulloblastoma), dan paru-paru. Antibodi atau fragmen antibodi anti-EGFRvIII scFv memiliki aktifitas spesifik yang mampu mengenali epitope EGFRvIII tersebut dan akan mengalami endositosis ke dalam sel setelah berikatan dengan reseptor ini. Human pancreatic ribonuclease (HPR) dapat bersifat sitotoksik bila masuk ke dalam sel karena kemampuannya untuk mendegradasi RNA. Aktivitas ribonuklease tersebut akan menghambat proses biosintesis protein di dalam sel hingga mengakibatkan kematian sel. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi suatu imunotoksin konjugat dari antibodi untai tunggal (scFv) anti-EGFRvIII yang difusi dengan human pancreatic ribonuclease (HPR) mutan dengan dan tanpa protein penanda GFP dan diekspresikan pada Pichia pastoris.Varian GFP yang digunakan adalah EGFP (enhanced green fluorescent protein). Gen anti-EGFRvIII-scFv dan GFP disubklon ke dalam vektor pPICZαA di bawah kontrol dari promoter AOX1 (PAOX1) yang bersifat indusibel dan difusi dengan sinyal sekresi MF-α (mating factor-α), menghasilkan plasmid pPICZα- scFv dan pPICZα-scFv-GFP. Sekuen gen diverifikasi dan plasmid tersebut digunakan pada subkloning berikutnya. Selanjutnya gen HPR di subklon pada ujung-3’ dari gen scFv dan scFv::GFP, menghasilkan konstruk fusi gen scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR. Plasmid rekombinan pPICZ-scFv-HPR dan pPICZ-scFv-GFP-HPR telah berhasil dikonstruksi dan urutan sekuen nukleotidanya telah diverifikasi. Kedua konstruk plasmid tersebut dilinearisasi menggunakan enzim SacI sebelum digunakan untuk transformasi. P. pastoris SMD1168H digunakan sebagai sel inang untuk transformasi dengan teknik elektroporasi. Kedua konstruk fusi gen tersebut berhasil ditransformasi dan diekspresikan pada P. pastoris. Sel transforman diseleksi pada medium YPD yang mengandung zeocin untuk mendapatkan klon transforman yang stabil dan memiliki banyak salinan gen target. Efisiensi transformasi dari konstruk scFv::HPR dan scFv::GFP::HPR masing-masing adalah 54 dan 110 cfu/μg DNA. P. pastoris transforman diseleksi lebih lanjut pada media yang mengandung zeocin dari konsentrasi 100 sampai 1000 μg/ml. Ekspresi protein rekombinan dianalisis dengan mikroskop fluoresen, SDS PAGE dan western blot. P. pastoris yang ditransformasi dengan fusi gen GFP mengeluarkan pendaran fluoresen hijau yang menunjukkan bahwa GFP terekspresi dengan baik. Protein fusi rekombinan telah berhasil diekspresikan dan disekresikan dari P. pastoris seperti ditunjukkan pada analisis imunobloting dan v SDS-PAGE. Protein rekombinan tersebut telah berhasil diisolasi dan dipurifikasi menggunakan metode kromatografi afinitas dengan estimasi yield sebesar 15,85 mg protein per liter kultur.
Keyword: EGFRvIII, HPR (human pancreatic ribonuclease), imunotoksin konjugat, anti-EGFRvIII scFv, Pichia pastoris.

Judul: Thermal Characteristics and Dynamics of Tropical Cyclone over Western North Pacific Ocean: A Case Study of Typhoon Songda (Chedeng) 2011
Abstrak: The frequent occasion of Tropical Cyclone (TC) over Western North Pacific (WNP) Ocean lies from 10˚N to 26˚N and 121˚E to 170˚E. Sources of TC development come from warm ocean temperature where latent heat is released during condensation processes and subsequently concentrated in the boundary layer. Relative humidity at 850-700 hPa is responsible to produce the most intense storm. Meanwhile, weak vertical wind shear between 850-200 hPa is one of the dynamical factors that lead to the development of TC. Pressure level of 850-200 hPa is chosen to minimize the thermodynamic effect in the lower troposphere. Typhoon Songda (Chedeng in the Philippines) or TSC lasted from May 18th to 30th, 2011 and strengthened into powerful Super Typhoon stage between May 24th and 27th. Long curving track and the exhibition of all sequences of TC life cycle, TSC is then considered as an ideal case of TC. The objective of the study with case of TSC is to investigate the role of thermal characteristics and dynamics on TC intensity. The research is carried out by using Advanced Research of Weather Research and Forecasting model (WRF ARW model) version 3.3. Two domains are employed in the model. The first domain situate from 02˚N to 40˚N and 118˚E to 149˚E and cover spatial resolution () of 33.1 km. The second domain situate from 09˚N to 27˚N and 119˚E to 132˚E with of 11 km. Timestep of the model () is 120 seconds. The model is supported by the following physical parameterization, i.e., Yonsei University Scheme (YSU) in the boundary layer, Kain-Fritsch scheme (KF) in the cumulus, and WRF Single-Moment 3-class scheme in the microphysics. Initial meteorological condition prior to the formation of the cyclone is generated using WRF ARW standard-release model. Sensitivity of the model output is obtained from a selected single-parameter change scenarios, namely, 10 % to 20 % decrease and increase of wind shear initial data at 850-200 hPa, and by 10 % to 20 % decrease of relative humidity initial data at 850-700 hPa. The result showed that the negative correlations between wind shear and intensity are found in wind shear scenarios. Wind shears of 10 ms-1 which lead to strengthening of the wind intensity in the early period of Typhoon development are found in wind shear scenarios. The effect of wind shear changes on wind intensity is statistically significant in the 20 % wind shear scenarios. During mature stage, weak wind intensity occurred when wind shear increase as given in the WRF standard-release and the 20 % decreasing scenario. Different situation is found in the 20 % increasing scenario where wind shear tend to weak and lead to strong wind intensity at this stage. Meanwhile, the reduction of moisture supply at 850-700 hPa resulting from 20 % decreasing relative humidity play a major role in the weakening of wind intensity and reduces mechanical energy of the cycle process as much as 300 J kg-1.
Keyword: