Judul: Konstruksi Pelacak DNA Papaya ringspot virus Berdasarkan Gen Helper Component untuk Metode Deteksi Hibridisasi Asam Nukleat
Abstrak: Penyakit bercak cincin pepaya yang disebabkan oleh Papaya ringspot virus (PRSV) merupakan salah satu penyakit yang paling merusak pada tanaman pepaya. Penyakit ini tidak ditemukan di Indonesia untuk jangka waktu yang lama, sampai dengan tahun 2012 dilaporkan penyakit ini mewabah di Nanggroe Aceh Darussalam. Sejak itu, penyakit ini menyebar dengan cepat di daerah pertanaman pepaya di Jawa, Sumatera dan Bali. Deteksi PRSV pada umumnya menggunakan metode serologi atau polymerase chain reaction (PCR). Pengembangan metode deteksi diperlukan untuk memfasilitasi cara deteksi dalam mencegah penyebaran PRSV. Tujuan penelitian adalah mengonstruksi pelacak DNA PRSV untuk pengembangan metode deteksi berdasarkan metode hibridisasi asam nukleat. Konstruksi pelacak DNA diawali dengan mengarakterisasi gen helper component protein (HCPro) PRSV, dilanjutkan dengan desain primer spesifik, kloning DNA dan optimalisasi metode deteksi dengan hibridisasi asam nukleat menggunakan pelacak non radioaktif DNA. Isolat PRSV dari Boyolali, Medan, Sleman dan Tabanan digunakan sebagai sampel dalam merancang pelacak DNA spesifik dan sampel uji dalam optimalisasi metode hibridisasi asam nukleat . Berdasarkan analisis urutan gen HCPro diperoleh hasil bahwa keempat isolat memiliki kekerabatan tinggi dengan homologi 97.88% sampai 99.05%. Analisis filogeni gen HCPro menunjukkan bahwa isolat PRSV Indonesia memiliki kekerabatan paling tinggi dengan isolat PRSV tipe P dari negara Vietnam dengan homologi 94.72% sampai 95.42%. Perancangan primer spesifik PRSV gen HCPro telah dilakukan dengan memilih primer yang mampu mengamplifikasi keempat isolat pada daerah nukleotida yang sama. Gen HCPro berukuran 1371 pb, berlokasi pada posisi nukleotida ke-1727 sampai 3098 genom PRSV. Primer yang dipilih telah berhasil mengamplifikasi keempat isolat pada daerah gen HCPro dengan lokasi basa nukleotida pada urutan ke-2854 sampai 2955 dan ke-2936 sampai 3075. Kloning kedua fragmen spesifik gen HCPro telah berhasil dilakukan dengan metode TA kloning menggunakan plasmid pTZ57R. Keefektifan transformasi fragmen DNA target berukuran 102 pb dan 140 pb berkisar antara 67.99% sampai 94.43%, dengan tingkat keefektifan lebih tinggi untuk fragmen DNA berukuran 140 pb. Perunutan nukleotida klon DNA target telah dilakukan dan analisis homologi menunjukkan tingkat homologi 85.52% sampai 94.51% dengan isolat PRSV dari bebeberapa negara. Klon DNA target dengan ukuran 102 pb memiliki tingkat homologi lebih tinggi jika dibandingkan dengan klon DNA berukuran 140 pb. Pembuatan pelacak DNA dengan pelabelan klon DNA HCPro menggunakan pelabel non radioaktif digoxigenin/DIG (Roche) telah berhasil dilakukan. Teknik hibridisasi asam nukleat menggunakan stringency washes (1x SSC, 0.1% SDS) pada suhu 60 oC selama 15 menit berhasil digunakan untuk mendeteksi DNA PRSV. Pelacak DNA PRSV yang dikonstruksi dari daerah HCPro memiliki spesifisitas tinggi dan sensitivitas pada kisaran faktor pengenceran 10-1 yaitu konsentrasi terendah sebesar 62 ng/μL. Metode deteksi menggunakan iv teknik hibridisasi asam nukleat dapat menjadi salah satu alternatif dalam deteksi patogen yang dilakukan dalam tindakan karantina karena memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang baik serta kemudahan dalam pelaksanaannya.
Keyword: DIG-digoxigenin, kloning DNA, primer spesifik