Judul: Pre-Treatment of Enzymatic Hydrolysis on Collagen Detection by qPCR and ATR-FTIR
Abstrak: Kolagen memiliki peran penting dalam industri makanan, kosmetik, dan farmasi. Kemungkinan terjadinya kontaminasi dan pencampuran kolagen dari sumber non-halal (seperti kolagen babi) merupakan masalah utama bagi konsumen muslim, sehingga perlu dilakukan pengujian laboratorium. Quantitative PCR (qPCR) dapat digunakan sebagai salah satu metode pengujian DNA yang sensitif dan spesifik dalam mendeteksi sumber bahan sampel, tetapi metode ini memiliki kelemahan dalam mendeteksi kolagen karena adanya aktivitas inhibisi yang menghambat proses amplifikasi. Inhibitor tersebut berupa asam amino Gly- Pro-Hyp (glisin-prolin-hidroksiprolin) dengan struktur triple helix. Aktivitas inhibisi tersebut dapat dihilangkan, salah satunya dengan hidrolisis enzimatik menggunakan kolagenase dan papain. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi kolagen babi dengan metode qPCR. Tujuan khususnya, yaitu (1) mengevaluasi metode pra-perlakuan dengan hidrolisis enzimatik sehingga hidrolisat kolagen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan qPCR, (2) membandingkan profil gugus fungsional kolagen sebelum dan setelah hidrolisis dengan analisis ATR- FTIR. Secara umum, penelitian ini terdiri dari 3 tahap yaitu (1) hidrolisis dengan enzim sebagai pra-perlakuan (2) identifikasi DNA hidrolisat kolagen dengan metode qPCR secara duplo, (3) deteksi gugus fungsi kolagen sebelum dan setelah hidrolisis menggunakan ATR-FTIR. Terdapat tiga jenis sampel pada penelitian ini, yaitu kolagen babi sebelum hidrolisis, sampel kolagen babi hidrolisis papain dan asam format, serta sampel kolagen babi hidrolisis kolagenase. Tahap hidrolisis sebagai pra-perlakuan dilakukan dengan beberapa konsentrasi enzim, proses hidrolisis papain pada konsentrasi 60 IU dan 100 IU selama 8 jam, sedangkan proses hidrolisis kolagenase pada konsentrasi 50 IU, 100 IU, 300 IU, dan 500 IU selama 18 jam. Sampel kolagen yang berhasil dihidrolisis dan terdeteksi DNA babi, selanjutnya dideteksi menggunakan ATR-FTIR untuk melihat perbedaan gugus fungsi sebelum dan setelah hidrolisis. Analisis data hasil qPCR menggunakan metode deskriptif kuantitatif, sedangkan data hasil FTIR menggunakan metode deskriptif kualitatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pra-perlakuan hidrolisis kolagenase mulai konsentrasi 300 IU dapat mendeteksi DNA babi pada kolagen dengan nilai Ct FAM (babi) 35,16 dan 34,99 serta IPC sebesar 27,55 dan 27,04. Namun, pra- perlakuan hidrolisis papain pada beberapa konsentrasi belum mampu menghidrolisis kolagen babi dengan baik, sehingga DNA tersebut tidak dapat terdeteksi menggunakan qPCR. Hal ini diduga pada kolagen babi hidrolisis papain masih terdapat inhibitor. Analisis gugus fungsi kolagen babi menggunakan ATR- FTIR menunjukkan bahwa semua sampel (sebelum dan sesudah hidrolisis) mengandung gugus fungsi alkohol, fenol, alkana, dan 1-amina. Daerah serapan Amida A, Amida B, Amida I, Amida II, dan Amida III yang merupakan wilayah khas serapan kolagen, terdeteksi pada sampel sebelum hidrolisis. Sampel kolagen babi setelah hidrolisis papain tidak ditemukan gugus fungsi pada daerah serapan Amida B, sedangkan sampel setelah hidrolisis kolagenase tidak ditemukan gugus fungsi pada daerah serapan Amida B dan Amida III. Hal tersebut mengindikasikan bahwa inhibitor pada kolagen telah terhidrolisis oleh kolagenase, karena asam amino Gly-Pro-Hyp banyak tersusun dengan adanya atom C-N yang banyak ditemukan pada daerah serapan Amida III.
Keyword: ATR-FTIR, hidrolisis kolagen, kolagenase, kolagen babi, qPCR