Judul: Deteksi Kerusakan Dna Spermatozoa Sapi Menggunakan Pewarnaan Toluidine Blue Dan Kit Halomax® Yang Dimodifikasi
Abstrak: Keutuhan deoxyribonucleic acid (DNA) spermatozoa sangat penting dalam keberhasilan fertilisasi dan perkembangan embrio. Tingginya jumlah DNA spermatozoa yang rusak akan menurunkan angka kebuntingan. Terdapat beberapa faktor yang dapat menjadi penyebab rusaknya DNA spermatozoa, seperti kurangnya protamin pada saat spermatogenesis, umur, infeksi, ketidakseimbangan hormonal, paparan zat kimia beracun, obat-obatan, hipertermia testis, apoptosis dan tingginya kadar reactive oxygen species (ROS) pada proses pembekuan dan thawing. Beberapa cara dapat digunakan untuk mendeteksi kerusakan DNA pada spermatozoa, seperti metode sederhana dengan prinsip Cytochemical Assays (pewarnaan Aniline Blue and Toluidine blue) yang dievaluasi menggunakan mikroskop cahaya dan Flow Cytomatic-Based Sperm Chromatin Structure Assay menggunakan mikroskop fluorescent. Saat ini, tersedia Kit Halomax® (Halotech DNA® SL Madrid, Spanyol) yang dapat mendeteksi kerusakan DNA spermatozoa. Metode ini bekerja berdasarkan sebaran dari kromatin spermatozoa yang dapat dibedakan dalam dua bentuk morfologi spermatozoa, yaitu dari terbentuk atau tidaknya “halo” yang berkorelasi terhadap tingkat sebaran kromatinnya. Penelitian ini bertujuan untuk menguji beberapa parameter kualitas semen segar dan semen beku, dibandingkan dengan kerusakan DNA spermatozoa yang di evaluasi menggunakan Toluidine Blue dan Kit Halomax® yang telah dimodifikasi. Penelitian dilakukan di Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang dan di laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Semen dikoleksi menggunakan vagina buatan sebanyak 2 kali dalam seminggu, yang diperoleh dari 8 ekor sapi pejantan unggul (2 Brahman, 2 Ongole, 2 Simental dan 2 Limousin) kemudian dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis (motilitas, viabilitas, konsentrasi, abnormalitas, membran plasma utuh (MPU), tudung akrosom utuh (TAU), dan keutuhan DNA spermatozoa). Kualitas semen yang digunakan dalam penelitian ini harus menunjukkan motilitas >70%, konsentrasi spermatozoa >1000x106 dan abnormalitas spermatozoa <20%. Setelah dikoleksi semen diolah menggunakan pengencer skim kuning telur, selanjutnya dikemas dalam mini straw, diekuilibrasi dan dibekukan dengan N2 cair, dan disimpan dalam kontainer N2 cair untuk pengujian lebih lanjut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semen segar yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas yang baik dan dapat diproses menjadi semen beku. Kualitas semen setelah pembekuan dan thawing mengalami penurunan secara signifikan (P<0.05) pada motilitas, viabilitas, MPU dan TAU spermatozoa dibandingkan dengan semen segar. Penurunan kualitas semen tertinggi ditunjukkan oleh motilitas (28.3%), diikuti viabilitas (21.6%), MPU (14.1%) dan TAU (11.8%). Tidak terdapat perbedaan yang signifikan (P >0.05) pada keutuhan DNA spermatozoa dari semen segar 93.91±4.77% dibandingkan dengan semen beku 92.06±2.41%. Persentase penurunan kerusakan DNA spermatozoa hanya 1.84%. Perbandingan persentase keutuhan DNA spermatozoa setelah thawing, menggunakan Toluidine Blue dan Kit Halomax® menunjukkan bahwa Kit Halomax® (85.44 ±7.52%) lebih rendah (P <0.05) dibandingkan dengan Toluidine Blue (92.06 ±2.41%). Kesimpulan yang diperoleh dalam penelitian ini adalah semen segar dan semen beku sapi yang terdapat BIB Lembang mempunyai kualitas yang baik. Kit Halomax® lebih akurat dibandingkan dengan Toluidine Blue untuk mendeteksi kerusakan DNA serta tidak terdapat hubungan antara parameter kualitas semen segar dan semen beku yang diuji kecuali pada motilitas dan viabilitas spermatozoa. Kerusakan DNA spermatozoa pada sapi pejantan yang digunakan dalam penelitian ini sangat kecil (3-5%). Hasil ini dapat digunakan sebagai standar kualitas kerusakan DNA spermatozoa untuk dibandingkan dengan sapi pejantan lain, terutama sapi pejantan dengan masalah reproduksi.
Keyword: Kerusakan DNA, Toluidine Blue, Kit Halomax®, spermatozoa sapi