Judul: Validasi Metode Analisis DNA Babi pada Produk Pangan dengan Primer Terseleksi dan Exogenous Internal Positive Control pada Real-Time PCR
Abstrak: Pengujian DNA babi menggunakan real-time PCR banyak diaplikasikan dalam proses sertifikasi halal maupun pengawasan produk pangan. Namun belum adanya standar metode pengujian ini perlu dilakukan validasi. Penelitian ini ditujukan untuk melakukan validasi metode amplifikasi DNA babi pada real-time PCR dengan menggunakan primer terseleksi dan exogenous internal positive control (IPC) sebagai alternatif metode yang digunakan pada Laboratorium LPPOM MUI. Adapun validasi metode ekstraksi tidak menjadi cakupan pada tesis ini karena menggunakan metode ekstraksi eksisting yang sudah tervalidasi pada Laboratorium LPPOM MUI, yaitu dengan metode solid-phase extraction menggunakan spin column. Tahapan penelitian dimulai dari seleksi pustaka untuk mendapatkan primer terseleksi dan dilanjutkan dengan ekstraksi sampel, uji efisiensi dan uji validasi metode. Sebelum validasi metode amplifikasi DNA, dilakukan uji efisiensi konsentrasi IPC terendah dan konsentrasi DNA sampel maksimum yang dapat diamplifikasi. Hasil uji efisiensi menunjukkan penggunaan IPC pada konsentrasi setengah dari konsentrasi awal, yaitu Exo IPC Mix 5X dan Exo IPC DNA 25X masih memberikan performa yang baik dengan mengamplifikasi DNA IPC pada Ct 27.57 ± 0.28 dan RFU pada 205.5 ± 14.85. Selain itu, diperoleh konsentrasi maksimum isolat DNA yang dapat diamplifikasi dengan baik tanpa ada inhibisi sebesar 100 ng/μl. Validasi metode amplifikasi DNA babi dilakukan pada lingkup uji spesifisitas, sensitifitas, linearitas, efisiensi amplifikasi dan uji robustness. Sebanyak 23 sampel positif dan 23 sampel negatif dievaluasi pada uji spesifitas. Dua sampel positif (kolagen babi dan kolagen peptida babi) menghasilkan hasil false negative dan maksimum nilai Ct untuk hasil true positive adalah 35.69 ± 0.95 pada sampel kapsul gelatin babi. Metode yang digunakan sudah sesuai untuk semua sampel yang diujikan, kecuali kolagen dan kolagen peptida. Di sisi lain, tiga sampel negatif menghasilkan hasil false positive dan terdeteksi di atas Ct 42.26. Oleh karena itu, dari sejumlah sampel yang diujikan, batasan Ct maksimum pada metode ini yang memberikan hasil true positive atau tidak memberikan hasil false positive adalah 35.69 ± 0.95. Nilai LOD yang memenuhi nilai keberterimaan berada pada konsentrasi 0.01 ng/μl pada Ct 33.29 ± 0.92 yang diperoleh dari hasil uji sensitivitas, linearitas (r2 = 0.996) dan efesiensi PCR (ɛ = 96.32). Metode ini teruji robust terhadap beberapa perubahan kecil seperti jenis master mix, volume master mix, konsentrasi primer, konsentrasi probe dan suhu annealing, yaitu DNA babi pada titik LOD yang masih teramplifikasi pada rentang 33.29 ± 0.92. Tidak hanya robust terhadap beberapa perubahan kecil yang mungkin terjadi secara tidak sengaja pada saat pengujian, metode ini juga tahan terhadap keberadaan beberapa inhibitor seperti alginat, selulosa, EDTA, ion kalsium, kolagen peptida dan polisakarida pada konsentrasi 1 μg/μl. Berdasarkan hasil validasi ini, metode amplifikasi DNA babi dengan menggunakan primer terseleksi dan exogenous IPC dapat digunakan sebagai metode alternatif pengujian DNA babi.
Keyword: Method Validation, Porcine DNA, Primer, Internal Positive Control, Real-Time PCR