Judul: Expression of Lipase Genes from Micrococcus luteus in Pichia pastoris
Abstrak: Lipase merupakan enzim yang akhir-akhir ini semakin menarik perhatian berbagai sektor industri. Terkenal karena multifasetnya menjadikan lipase sebagai salah satu enzim hidrolitik dengan permintaan cukup tinggi. Hal tersebut mengharuskan peningkatan eksplorasi, identifikasi, dan pengembangan lipase-lipase jenis baru dengan karakteristik yang sesuai dengan kebutuhan industri. Lipase EMP48-D merupakan lipase baru yang berasal dari bakteri lipolitik Micrococcus luteus yang diisolasi dari tempe. Lipase EMP48-D adalah lipase yang aktif pada pH rendah (lipase asidik), toleransi terhadap suhu tinggi, dan stabil diberbagai pelarut organik. Karakteristik tersebut membuat lipase EMP48-D berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat diaplikasikan di industri-industri, khususnya untuk bahan baku yang membutuhkan kondisi asam. Gen yang mengkodekan lipase dari EMP48-D sebelumnya telah dioverekspresikan di dalam inang Escherichia coli BL21, optimasi dilakukan dengan penambahan chaperone dan beberapa jenis vektor. Namun aktivitas lipolitik yang dihasilkan masih rendah. Penyebabnya adalah sebagian besar protein hasil overekspresi termanifestasi dalam badan inklusi, akibat keberadaan sinyal peptida bawaan M. luteus yang tidak dikenali oleh sistem E. coli. Berangkat dari hal tersebut untuk memperbaiki ekspresi gen lipase EMP48-D, dilakukan overekspresi ke dalam inang Pichia pastoris. Strategi pertama yang dilakukan berupa optimasi dengan mengeliminasi sinyal peptida bawaan diganti dengan sinyal peptida alpha mating factor (α-MF) yang telah berada dalam vektor pPICZα-A. Lipase EMP48-D berhasil di ekspresikan dalam bentuk protein ekstraseluler dengan kenaikan aktivitas dua kali lipat dari 15,02 ± 2,33 U mg-1 di E. coli BL21 menjadi 31,01 ± 1,08 U mg-1 di P. pastoris. Strategi kedua dilakukan dengan optimasi preferensi kodon agar lebih dikenali oleh sistem P. pastoris. Konstruksi plasmid rekombinan dilakukan di vektor pPIC9K dan pPICZα-A dan ditransformasikan ke dalam P. pastoris galur KM71 (MutS) dan GS115 (Mut+). Optimasi preferensi kodon berhasil menurunkan jumlah pemakaian kodon dalam bentuk Effective Number of Codons (ENc) dari 30 jenis kodon menjadi 20 jenis kodon. Indeks peluang kemunculan kodon atau Codon adaption index (CAI) ditingkatkan dari 0,408 menjadi 0,995. Analisis susunan nukleotida juga menunjukkan sebanyak 432 pb dari 1260 pb berhasil diganti dengan homologi 65,6% dibandingkan sekuen sebelum optimasi serta kandungan GC direduksi dari 76,5% menjadi 44,7%. Aktivitas lipase EMP48-D meningkat 400% dengan plasmid rekombinan pPIC9K dan inang KM71. Aktivitas spesifik optimal dihasilkan pada pH 5,0 pada suhu 40 °C sebesar 145,41 ± 4,83 U mg-1. Lipase EMP48-D memiliki kestabilan yang baik pada kisaran pH 3,0 – 5,0 dengan aktivitas residual mencapai 86,4% setelah inkubasi selama 180 menit pada suhu 40 °C. Lipase EMP48-D juga mampu menghidrolisis berbagai trigliserida rantai panjang terutama minyak zaitun (100%), diikuti dengan minyak biji bunga matahari (88,5%), minyak kanola (74,4%), minyak jagung (73,1%), minyak bekatul (71,8%), minyak kedelai (69,2%), dan minyak kelapa sawit (42,3%). Lipase EMP48-D toleran terhadap pelarut organik, terutama isopropanol (115,7%), diikuti oleh butanol (114,6%), etanol (102,8%), asetonitril (102,2%), dan metanol (101,6%). Sebaliknya pada pelarut organik n-heksana dan n-heptana terjadi penurunan aktivitas menjadi masing-masing 58,9% dan 83,8%. Konsentrasi 0,01 M ion logam (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn+) menurunkan hingga 43,1% aktivitas enzim sementara pada konsentrasi yang sama FeCl2 (213,8%) dan FeSO4 (136,2%) diketahui mampu meningkatkan aktivitas relatif enzim. Kapabilitas lipase EMP48-D sebagai katalis reaksi transesterifikasi masih rendah, hanya sekitar 2,95% dan 1,06% yang berhasil mengonversi asam lemak
Keyword: acidic lipase, codon optimization, Micrococcus luteus, overexpression, signal sequence