Judul: Evaluasi Metode Isolasi Asam Nukleat Dalam Deteksi Pcr Untuk Patogen Antraknosa, Bulai, Huanglongbing Dan Mosaik
Abstrak: Pengujian dengan metode molekuler seperti Polymerase Chain Reaction (PCR) bagi Badan Karantina Pertanian sangat penting mengingat diperlukan deteksi dan identifikasi yang cepat, efisien dan akurat. Oleh sebab itu perlu dilakukan evaluasi beberapa metode isolasi asam nukleat dalam deteksi PCR untuk beberapa macam penyakit tumbuhan berdasarkan golongan patogen dan tipe penyakitnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi metode isolasi asam nukleat secara konvensional, kit komersial, dan FTA-card yang digunakan dalam teknik PCR dan modifikasinya untuk deteksi patogen-patogen penyakit antraknosa cabai, bulai jagung, huanglongbing jeruk dan mosaik kacang panjang. Sebanyak tiga bagian tanaman diambil dari setiap contoh tanaman sakit di lapangan yaitu buah cabai yang terserang Colletotrichum acutatum, daun jagung yang terserang Peronosclerospora sorghi, daun jeruk yang terserang Candidatus Liberibacter asiaticus dan daun kacang panjang yang terserang BCMV. DNA hasil isolasi masing-masing metode tersebut diukur dengan UV-vis nanodrop-spektrofotometer dalam satuan konsentrasi ng μL-1. Jumlah total asam nukleat dari metode kit dan konvensional dihitung dari perkalian antara konsentrasi dengan volume total suspensi asam nukleat; sedangkan untuk metode FTA-card standar dan modifikasi yaitu perkalian antara konsentrasi, volume suspensi dan luas kertas FTA yang berisi contoh dibagi dengan luas tiap punch. Untuk PCR asam nukleat hasil isolasi sebagai cetakan DNA pada konsentrasi 15 ng μL-1 dan konsentrasi primer yaitu 0.4, 0.6, 0.8 dan 1.0 μM untuk tiap metode isolasi. Konsentrasi DNA tertinggi hasil isolasi total dari jaringan tanaman sakit selalu diperoleh melalui metode konvensional baik pada C. acutatum asal biakan murni atau antraknosa pada buah, bulai jagung, huanglongbing jeruk maupun BCMV. Kemurnian DNA yang baik dari hasil isolasi diperoleh pada C. acutatum asal buah dan huanglongbing jeruk dengan kit komersial (nilai 1.94), C. acutatum asal biakan murni dengan konvensional (nilai 1.91), Ca. L. asiaticus dengan kit komersial (nilai 1.96) dan kemurnian RNA dari BCMV diperoleh dengan metode kit komersial (nilai 2.08). Jumlah DNA total tertinggi secara nyata diperoleh melalui metode FTA-card yang dimodifikasi untuk C. acutatum asal biakan murni, sedangkan untuk patogen lainnya tidak menunjukkan perbedaan nyata antar keempat metode isolasi. Secara umum bahwa kuantitas dan kualitas asam nukleat yang diperoleh pada keempat metode isolasi asam nukleat terhadap keempat patogen termasuk layak untuk digunakan selanjutnya sebagai cetakan (template) dalam amplifikasi DNA menggunakan PCR. Deteksi keempat patogen dengan PCR dengan masing-masing primer spesifik menggunakan DNA template hasil isolasi dengan empat metode pada volume setara tanpa merubah konsentrasi DNA menunjukkan amplifikasi positif walaupun dengan ketebalan pita DNA yang bervariasi. Untuk mencapai hasil terbaik, jumlah DNA cetakan dalam reaksi PCR perlu dioptimasi. PCR lebih lanjut dengan menggunakan konsentrasi primer yang optimal serta penambahan DNA template pada ketiga metode isolasi, 5 menunjukkan bahwa semua contoh DNA menghasilkan pita DNA amplikon yang lebih tebal dan merata. Secara umum ditunjukkan bahwa konsentrasi asam nukleat yang terbaik secara umum diperoleh melalui metode isolasi konvensional yang lebih membutuhkan tahap dan waktu lebih banyak dibandingkan metode kit komersial atau FTA card dan modifikasinya. Kualitas asam nukleat yang baik lebih sering diperoleh melalui metode kit komersial. Jumlah total asam nukleat tertinggi diperoleh melalui metode FTA card yang lebih praktis dan singkat namun kualitasnya lebih rendah. Asam nukleat hasil isolasi keempat metode isolasi keempat jenis patogen tumbuhan dalam penelitian
Keyword: BCMV, Candidatus Liberibacter asiaticus, Colletotrichum acutatum, FTA-card, PCR, Peronosclerospora sorghi, spektrofotometer.