Judul: Optimasi Imobilisasi Sefalosporin C Asilase Menggunakan Teknik Cross-Linked Enzyme Aggregates dengan Koagregat Kitosan
Abstrak: Sefalosporin merupakan antibiotik β-laktam semisintetik yang diprioritaskan oleh WHO dan sudah mencakup 30% dari total penggunaan antibiotik di dunia karena memiliki spektrum antibakteri yang luas dan lebih kebal terhadap enzim β-laktamase yang dihasilkan bakteri resisten antibiotik. Sefalosporin umumnya disintesis dari senyawa prekursor asam 7-aminosefalosporanat (7-ACA), hasil hidrolisis senyawa antibakteri alami sefalosporin C (CPC) yang dihasilkan jamur Acremonium chrysogenum. Dengan demikian, produksi 7-ACA yang efisien sangat penting dalam industri sefalosporin. Produksi 7-ACA secara enzimatis terus dikembangkan karena lebih efisien dan ramah lingkungan dibandingkan proses kimia. Sefalosporin C asilase (CCA) merupakan enzim yang dapat mengkonversi CPC menjadi 7-ACA dalam satu tahap. Disisi lain, imobilisasi enzim diperlukan untuk menghasilkan biokatalis yang efisien untuk proses enzimatik skala industri. Imobilisasi terikat matriks umum dilakukan untuk keperluan tersebut karena terbukti dapat meningkatkan stabilitas enzim. Namun, penggunaan matriks menyebabkan penurunan aktivitas karena biokatalis mengalami dilusi enzim hingga 99%. Penggunaan matriks juga meningkatkan biaya produksi biokatalis dan menyisakan limbah matriks biokatalis nonaktif. Cross-linked enzyme aggregates (CLEA) merupakan teknik imobilisasi enzim tanpa matriks yang prospektif untuk mengatasi masalah tersebut. CLEA juga terbukti sebagai teknik yang sederhana dan efisien untuk mengimobilisasi enzim. Namun sampai saat ini, belum ada laporan mengenai aplikasi teknik CLEA untuk CCA. Secara prinsip, teknik CLEA terdiri dari dua tahap utama, yaitu: presipitasi enzim bebas yang menghasilkan agregat enzim dan taut silang antar agregat enzim yang membentuk partikel CLEA. Dalam hal ini, presipitasi menggunakan amonium sulfat dan taut silang menggunakan glutaraldehida umum dilakukan. Namun, taut silang glutaraldehida kurang efektif ketika diaplikasikan pada enzim dengan sedikit residu asam amino lisin permukaan, enzim terimobilisasi mudah terlepas dari struktur CLEA saat pembilasan atau aplikasinya. CCA merupakan enzim heterodimer dengan sembilan (sedikit) residu lisin permukaan. CCA juga mengandung asam amino serin (dekat situs aktifnya) yang reaktif terhadap glutaraldehida sehingga berpotensi mengalami inaktivasi. Penambahan koagregat kaya gugus amino reaktif, seperti: bovin serum albumin, polietilenimin, atau polilisin dilaporkan menghasilkan partikel CLEA yang terikat kuat, dapat mencegah disosiasi subunit enzim, dan meminimalkan taut silang berlebihan glutaraldehida. Kitosan adalah koagregat alternatif yang kaya gugus amina reaktif, melimpah di alam, dan ramah lingkungan dibandingkan polimer atau biopolimer lain. Gugus amina reaktif kitosan potensial untuk memediasi taut silang agregat enzim. Oleh karena itu, Penambahan kitosan pada imobilisasi CCA-CLEA perlu dipertimbangkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi imobilisasi CCA-CLEA dengan koagregat kitosan agar menghasilkan enzim imobil yang memiliki aktivitas maksimum dan stabil terhadap perubahan pH dan suhu. Dalam penelitian ini, lisat CCA dihasilkan dari fermentasi Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET21a-S12 mutan yang disolasi melalui proses lisis sel dan sentrifugasi. Lisat CCA selanjutnya dimurnikan secara parsial menggunakan teknik salting-out dengan penambahan amonium sulfat jenuh 20-60% untuk menghasilkan suspensi fraksi aktif CCA. Suspensi tersebut kemudian dikoagregasikan dengan kitosan agar membentuk agregat CCA-kitosan. Agregat tersebut selanjutnya ditautsilangkan menggunakan glutaraldehida sehingga terbentuk partikel CCA-CLEA. Dalam penelitian ini, imobilisasi CCA-CLEA dioptimasi melalui tiga tahap, yaitu: (i) penapisan faktor signifikan menggunakan 2n-2 fractional factorial design (2n-2 FFD), (ii) pendugaan area optimum faktor signifikan menggunakan metode jalur pendakian tercuram, dan (iii) optimasi kondisi imobilisasi menggunakan response surface methodology (RSM) dengan central composite design (CCD). Aktivitas CCA-CLEA (U/g) digunakan sebagai respon. Stabilitas CCA-CLEA teroptimasi terhadap pH dan suhu juga
Keyword: asam 7-aminosefalosporanat, cross-linked enzyme aggregates, imobilisasi enzim, kitosan, sefalosporin C asilase