Judul: Konstruksi Dan Ekspresi Gen Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase Pada Permukaan Sel Khamir Pichia Pastoris
Abstrak: D-tagatosa, isomer dari D-galaktosa merupakan golongan ketoheksosa yang langka di alam. D-tagatosa memiliki kemiripan tingkat kemanisan (92%) dan rasa dengan sukrosa, namun sedikit menghasilkan kalori, sehingga D-tagatosa berpotensi menjadi pemanis dan pengganti gula pada industri makanan dan farmasi. Belakangan ini mulai berkembang pembuatan D-tagatosa dari D-galaktosa secara biologis menggunakan biokatalis. Beberapa enzim yang terlibat dalam biotransformasi D-tagatosa telah banyak dipelajari dan L-arabinosa isomerase (L-AI) dianggap paling berpotensi untuk digunakan pada produksi D-tagatosa karena dapat mengkatalis isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa. Penelitian sebelumnya menunjukkan aktivitas relatif L-AI dalam mengkatalis D-galaktosa menjadi D-tagatosa meningkat sejalan dengan kenaikan temperatur. Oleh karena itu, penggunaan temperatur tinggi pada L-AI diharapkan dapat meningkatkan produksi D-tagatosa. Teknologi berbasis permukaan sel adalah salah satu pendekatan yang memungkinkan peptida atau protein target diekspresikan pada permukaan sel dan sejauh ini sistem ekspresi pada permukaan sel khamir merupakan sistem yang paling banyak digunakan dibandingkan sistem ekspresi yang lain. Sistem ini membutuhkan suatu protein permukaan yang dapat menampilkan protein target pada pemukaan sel khamir. α-agglutinin adalah protein yang terdapat pada permukaan Saccharomyces cerevisiae dan dapat digunakan dalam sistem tampilan permukaan pada khamir lainnya, seperti Pichia pastoris. P. pastoris merupakan khamir metilotropik yang dapat menggunakan metanol sebagai sumber karbon. Kelebihan utama yang dimiliki oleh P. pastoris dibandingkan sel prokariot adalah sel ini mampu melakukan modifikasi pascatranslasi seperti pelipatan protein, glikosilasi, dan pembentukkan ikatan disulfida. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dan mengekspresikan gen penyandi L-AI pada permukaan sel khamir P. pastoris. Gen araA, penyandi L-AI, telah disubkloning ke dalam vektor pJ912-AGα di bawah kontrol promotor terinduksi metanol (PAOXI) dan difusi dengan sinyal sekresi MF-α, α-agglutinin, dan tag His sehingga menghasilkan vektor rekombinan pJ912-AGα-araA. Vektor rekombinan tersebut telah berhasil dikonstruksi dan urutan basanya telah diverifikasi, serta telah dilinearisasi dengan enzim SacI sebelum digunakan untuk transformasi. P. pastoris GS115 digunakan sebagai inang dalam transformasi. Vektor rekombinan tersebut telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris GS115. Sel transforman yang stabil secara genetik telah diperoleh melalui seleksi pada media yang mengandung zeocin hingga konsentrasi 1000 μg/mL. Protein rekombinan L-AI juga telah berhasil diekspresikan pada permukaan sel P. pastoris GS115. Pengamatan menggunakan mikroskop fluoresence telah membuktikan bahwa sel transforman berhasil memancarkan pendaran berwarna hijau pada permukaan sel yang berasal dari interaksi protein fungsional His6 dan antibodi rabbit polyclonal to 6×His tag®. Hal ini didukung dengan adanya pita protein target berukuran sekitar 91 kDa dalam analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa sel transforman telah berhasil mengekspresikan protein target yang menyatu dengan α-agglutinin dan tag His. Percobaan menggunakan manik magnet menunjukkan bahwa sel P. pastoris rekombinan melekat pada permukaan manik magnet. Secara keseluruhan hasil tersebut meyakinkan bahwa fusi protein L-AI telah berhasil diekspresikan pada permukaan sel P. pastoris.
Keyword: Sistem tampilan permukaan khamir, Pichia pastoris, araA, L-arabinosa isomerase, D-tagatosa.