Judul: Fusi Gen Kitinase Aeromonas caviae WS7b dengan Promotor sigB dari Bacillus subtilis 168 dan Ekspresinya pada Escherichia coli
Abstrak: Hama dan penyakit adalah salah satu masalah yang dihadapi oleh petani dalam sistem pertanian. Banyak metode pengendalian yang dilakukan oleh petani untuk mengurangi kehilangan hasil yang disebabkan oleh hama dan penyakit, salah satunya adalah penggunaan agens antagonis. Di alam, banyak organisme yang berpotensi menjadi agens antagonis bagi patogen tanaman. Organsime yang memiliki potensi tersebut dan digunakan dalam penelitian ini adalah Aeromonas caviae WS7b. Bakteri ini mampu mengendalikan beberapa cendawan patogen tanaman. Bakteri ini memiliki gen yang mampu menghasilkan enzim kitinase, yaitu gen chiA. Enzim ini mendegradasi dinding sel cendawan yang tersusun dari kitin. Tetapi bakteri ini tidak dapat langsung dilepas di alam sebagai agens antagonis karena bakteri ini bersifat patogen pada manusia. Sehingga perlu dilakukan rekayasa genetik terhadap gen chiA tersebut. Gen chiA ini akan digabung dengan promotor gen sigB yang terdapat pada Bacillus subtilis 168, gen sigB ini akan terekspresi sebagai respon terhadap cekaman lingkungan secara umum. Sehingga gen chiA ini akan terekspresi saat bakteri berada dalam cekaman lingkungan. Tahap awal penelitian ini adalah ekstraksi DNA total dari Bacillus subtilis 168 dan Aeromonas caviae WS7b dengan metode yang berbeda untuk masing-masing bakteri. Kemudian dilakukan amplifikasi terhadap gen chiA dan promotor gen sigB menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR). Fragmen promotor sigB dan chiA berhasil diamplifikasi dengan PCR. Tahap berikutnya adalah penyiapan plasmid pDL2 yang akan digunakan sebagai pembawa gen rekombinan. Plasmid pDL2 diperbanyak dengan cara mentransformasikannya ke dalam bakteri Escherichia coli DH5 . Kemudian bakteri E. coli tersebut diperbanyak pada media nutrient agar (NA) yang mengandung ampisilin dengan konsentrasi 50 μg/ml. E. coli DH5 yang telah tertransformasi oleh pDL2 dibiakan pada media ampisilin dengan konsentrasi yang sama dengan saat melakukan trasnformasi. Plasmid yang telah diperbanyak dalam sel bakteri E. coli DH5 , kemudian diekstraksi. Hasil amplifikasi fragmen promoter sigB dan chiA, dipotong menggunakan enzim restriksi. Promoter gen sigB dipotong menggunakan enzim restriksi HpaI dan NheI, sedangkan gen chiA dipotong menggunakan NheI dan ApaI. Promotor gen sigB dan chiA digabungkan dengan enzim ligasi. Kedua fragmen tersebut telah berhasil digabungkan, sehingga menjadi gen rekombinan. Plasmid pDL2 yang telah dipurifikasi, dipotong menggunakan dua enzim restriksi, yaitu HpaI dan ApaI, sehingga membentuk ujung yang sama dengan gen rekombinan. Kemudian gen rekombinan yang telah dihasilkan sebelumnya, digabungkan dengan plasmid dan direkatkan dengan enzim ligasi. DNA rekombinan yang telah disambungkan dengan plasmid, berhasil ditransfomasikan ke dalam sel bakteri E. coli DH5 . Bakteri transforman ini menunjukkan aktivitas kitinase pada media kitin, karena di sekitar koloni bakteri transforman tersebut terbentuk zona bening. Hal ini menandakan bahwa gen kitinase A. caviae WS7b mampu terekspresi dengan baik di bawah promotor sigB dari B. subtilis 168.
Keyword: