Judul: Deteksi Vibrio parahaemolyticus Menggunakan Marka Gen pirA pada Udang Vaname Litopenaeus vannamei dengan Real Time PCR
Abstrak: Udang adalah produk perikanan andalan Indonesia yang menjadi komoditas ekspor, salah satu jenis paling dominan untuk diekspor adalah udang vaname (Litopenaeus vannamei). Tahun 2009 di negara Cina, budidaya udang vaname menghadapi kendala dengan munculnya kasus kematian dini yang menyerang udang sekitar hari ke-30 setelah penebaran pada kolam pemeliharaan yang ditandai dengan kerusakan pada hepatopankreas (nekrosis hepatopankreatik akut). Awalnya penyakit ini disebut sindrom kematian dini (EMS/ Early mortality syndrome), tetapi setelah ditemukannya Vibrio parahaemolyticus strain unik penyebab penyakit ini, nama penyakit dirubah menjadi nekrosis hepatopankreatik akut atau disebut dengan AHPND (Acute hepatopancreatic necrosis disease). Oleh karena itu, Vibrio parahaemolyticus penyebab penyakit AHPND pada udang vaname disebut V. parahaemolyticus strain AHPND. V. parahaemolyticus strain AHPND pada udang vaname memiliki kelompok gen tdh dan trh yang dapat menghasilkan toksin pir A/B penyebab kerusakan pada hepatopankreas dan mengakibatkan kematian pada udang. Pada awal penggunaan metoda biomolekular untuk mendeteksi AHPND hanya dengan PCR konvensional yaitu dengan pasangan primer AP1 dan AP2, kemudian pasangan primer AP3. Tahun 2015 muncul terobosan mendesain pasangan primer VpPirA real time PCR untuk mendeteksi AHPND dan membandingkannya dengan pasangan primer AP3 single step pada PCR konvensional, hasilnya adalah pasangan primer VpPirA real time PCR lebih sensitif, spesifik dan efisien dari pasangan primer AP3 single step PCR konvensional. Tahun 2015 juga muncul pasangan primer AP4 nested PCR konvensional untuk mendeteksi AHPND yang lebih baik dari pasangan primer AP3 single step. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk menguji validitas metoda real time PCR pasangan primer VpPirA. Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Mei 2019, di Laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM), Jakarta. Pelaksanaan penelitian ini terbagi ke dalam dua tahapan, yaitu validasi metoda uji dan uji performa metoda. Validasi metoda uji terdiri dari beberapa tahap, yaitu pembuatan kontrol positif dan kurva standar, dilanjutkan dengan uji spesifisitas dan uji sensitivitas, kemudian uji repeatability (keterulangan) dan reproducibility (ketertiruan). Uji spesifisitas dilakukan dengan menentukan selektifitas dan eksklusifitas metoda uji real time PCR pasangan primer VpPirA, sedangkan untuk uji sensitivitas metoda uji real time PCR pasangan primer VpPirA dilakukan dengan menentukan limit deteksi (LoD) dan nilai cut off. Uji keterulangan dan ketertiruan dilakukan berdasarkan antar analis dan waktu pengujian metoda uji real time PCR pasangan primer VpPirA. Uji performa metoda dilakukan dengan pengujian lapang dengan pengambilan sampel pada beberapa sentra budidaya udang vaname di Indonesia. Data yang diperoleh merupakan data deskriptif dengan melihat persentase koefisien varians (CV%). Pengujian validitas dalam mendeteksi gen penyandi toksin pirA dengan menggunakan metoda real time PCR diawali pembuatan kontrol positif berupa plasmid DNA V. parahaemolyticus strain AHPND dengan konsentrasi 6 x 109 kopi μL-1, sedangkan hasil pembentukan kurva standar metoda qPCR pasangan primer VpPirA mempunyai efisiensi pengujian sebesar 99.857% dan kemiringan antar Ct adalah -3.472. Hasil pengujian spesifisitas menunjukkan bahwa metoda qPCR pasangan primer PirA bersifat selektif dan eksklusif, karena tidak bereaksi terhadap matriks sampel yang berupa DNA atau RNA udang dan tidak bereaksi silang (cross reactive) terhadap berbagai spesies bakteri dan penyakit udang lain yang tidak mengandung gen penyandi toksin pirA. Performa sensitivitas analitik metoda qPCR pasangan primer PirA menunjukkan bahwa qPCR pasangan primer
Keyword: Udang vaname, real time PCR, Vibrio parahaemolyticus strain AHPND