Judul: The Potential of Polyclonal Aptamer DNA for  Simultaneous Detection of Pathogenic Bacteria Staphylococcus aureus,  Streptococcus agalactiae, and Escherichia coli
Abstrak: Mastitis adalah peradangan pada ambing yang umumnya disebabkan oleh infeksi mikroba. Mastitis subklinis sulit dideteksi karena tidak ada gejala klinis pada ambing dan fisik susu, kecuali adanya penurunan produksi susu yang menyebabkan kerugian ekonomi pada peternak. Berbagai patogen penyebab mastitis diantaranya bakteri, mikoplasma, virus dan cendawan. Bakteri penyebab mastitis pada sapi perah diantaranya yaitu Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, dan Escherichia coli. Deteksi dan identifikasi patogen penyebab mastitis perlu dilakukan untuk diagnosis mastitis. Deteksi mastitis subklinis secara langsung melalui penghitungan jumlah sel somatik dan secara tidak langsung dengan uji CMT, IPB-1 mastitis test, konduktivitas elektrik, dan deteksi enzim (LDH, NAGase). Identifikasi agen patogen penyebab mastitis dapat dilakukan dengan pemeriksaan mikrobiologi dan metode molekuler berbasis PCR. Patogen penyebab mastitis semakin cepat terdeteksi maka semakin baik untuk pengobatan mastitis. Aptamer telah banyak dikembangkan untuk diagnostik pada berbagai penyakit hewan. Aptamer digunakan untuk mendeteksi virus, bakteri, dan parasit patogen penyebab penyakit. Berbagai penelitian telah berhasil memanfaatkan aptamer untuk deteksi masing-masing bakteri S. aureus, Streptococcus sp., dan E. coli. Penggunaan aptamer untuk deteksi secara bersamaan bakteri S. aureus, S. agalactiae, dan E. coli belum pernah dilaporkan dan belum tersedia komersial. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi dan seleksi DNA aptamer poliklonal yang memiliki reaktivitas pada ketiga bakteri patogen mastitis S. aureus, S. agalactiae, dan E. coli dengan menggunakan metode sequential toggle cell - systematic evolution of ligands by exponential enrichment (STC-SELEX). Metode STC-SELEX dipilih karena pada proses seleksi in vitro dapat digunakan lebih dari satu target sehingga dihasilkan aptamer yang mampu mengikat ke beberapa target. DNA aptamer dari hasil SELEX 9, SELEX 12, dan SELEX 15 dilakukan kloning ke plasmid pGEM-T easy. Hasil transformasi SELEX 9, SELEX 12, dan SELEX 15 dengan metode heat shock diperoleh banyak klon yang tumbuh pada media seleksi. Sebanyak 40 klon transforman berwarna putih dipilih secara acak untuk diseleksi dengan metode PCR koloni yang dilanjutkan isolasi plasmid (29 klon terpilih), dan sekuensing (22 klon terpilih). Hasil analisis sekuensing diperoleh 14 DNA aptamer poliklonal (S9K12, S9K13, S9K19, S9K22, S12K2, S12K6, S12K7, S12K10, S15K3, S15K4, S15K6, S15K13, S15K15, S15K20) yang memiliki constant region benar dan berukuran 81 pb. Sekuen 14 DNA aptamer poliklonal dikarakterisasi secara in silico untuk mengetahui hubungan filogenetik dan memprediksi struktur sekunder. Program MEGA11 dengan metode statistik maximum parsimony dan bootstrap 1000 ulangan digunakan dalam pembuatan pohon filogenetik. Hasil analisis menunjukkan terdapat pembagian pohon filogenetik dalam 2 klad besar. Program Mfold digunakan untuk prediksi struktur sekunder menunjukkan bahwa 14 DNA aptamer poliklonal memiliki struktur sekunder dengan struktur stem dan loop yang bervariasi. Program QGRS Mapper digunakan untuk menentukan urutan Gquadruplex menunjukkan terdapat 9 DNA aptamer poliklonal (S9K12, S12K2, S12K6, S12K10, S15K3, S15K4, S15K6, S15K13, dan S15K20) mempunyai sekuen G-quadruplex dan 5 DNA aptamer poliklonal tidak terdapat sekuen Gquadruplex (S9K13, S9K19, S9K22, S12K7, S15K15). Analisis kapasitas pengikatan, afinitas pengikatan, dan spesifisitas pengikatan DNA aptamer poliklonal dilakukan dengan metode qPCR. Hasil analisis menunjukkan kapasitas pengikatan tertinggi aptamer S12K6 terhadap S. agalactiae (nilai Cq 8,40), aptamer S12K2 terhadap S. aureus BPA-12 (nilai Cq 7,94), dan aptamer S9K22 terhadap E. coli EPEC 4 (nilai Cq 8,38). Aptamer S15K3 menunjukkan kapasitas pengikatan yang tinggi pada ketiga bakteri
Keyword: DNA aptamer poliklonal, STC-SELEX, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, qPCR