Judul: Pengaruh Peptida Sinyal dan Promoter Pada Ekspresi Lipase Novel Dari Micrococcus luteus EMP48-D di Escherichia coli
Abstrak: Lipase (triasilgliserol asilhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan enzim hidrolitik yang dapat menghidrolisis trigeliserida menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Lipase dimanfaatkan dalam beberapa industri, seperti makanan, susu, farmasi, tekstil, surfaktan, pakan ternak, kosmetik, dan biodiesel. Mengingat banyaknya manfaat dari enzim ini, eksplorasi lipase semakin gencar dilakukan, salah satunya dengan rekayasa protein rekombinan baik secara homolog maupun heterolog. Pada penelitian sebelumnya gen penyandi lipase EMP48-D telah berhasil diisolasi dari Micrococcus luteus yang merupakan bakteri yang terdapat di tempe. Gen lipase EMP48-D ini dapat terkekspresi di Escherichia coli, meskipun memiliki aktivitas yang masih rendah. Lipase EMP48-D memiliki karakter unik yaitu dapat bekerja di pH asam (lipase asam). Penelitian terkait lipase asam masih sangat jarang jika dibandingkan dengan eksplorasi lipase golongan alkali. Aktivitas lipase yang diperoleh pada penelitian tersebut masih sangat kecil dan terdapat di intraseluler. Oleh sebab itu pada penelitian ini promoter (T7 dan T5) digunakan untuk memperoleh aktivitas yang lebih tinggi, dan peptida sinyal (ompA, M. lut dan pelB) digunakan untuk sekresi protein rekombinan secara ekstraseluler. Pada penelitian ini gen lipase EMP48-D terlebih dahulu diklon ke dalam plasmid pBSP dengan backbone pET28-a, dengan beberapa variasi yaitu T7_M.lut_EMP, T7_ompA_EMP, T7_pelB_EMP, T5_ompA_EMP, T5_pelB_EMP, dan T7_EMP kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α. Seluruh plasmid rekombinan diekspresikan ke dalam E. coli BL21 (DE3) pLysS dengan T7_EMP sebagai kontrol. Ekspresi lipase EMP48-D diinduksi dengan IPTG 0,5 mM di suhu 30 ⁰C dengan waktu induksi selama 5 jam dan agitasi 200 rpm. Perbedaan nilai OD600 terjadi pada perlakukan induksi dan non induksi yang diamati pada ekspresi T7_M.lut_EMP dan T7_ompA_EMP. Kultur yang diinduksi menunjukkan pertumbuhan yang lebih lambat dibandingkan dengan yang tidak diinduksi. Perbedaan jumlah sel mengindikasikan inang mengalami penghambatan pertumbuhan sel, karena ekspresi dari lipase EMP48-D. Penambahan peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) dalam sekresi lipase EMP48-D memberikan pengaruh yang baik dalam translokasi lipase EMP48-D. Pemberian peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) menunjukkan pengaruh dalam jumlah translokasi lipase EMP48-D baik yang di kontrol oleh promoter T7 maupun T5. Lipase EMP48-D yang terfusi dengan ompA dan dikontrol promoter T7 memiliki aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 418 U mg-1. Hasil ini diikuti oleh fusi dengan peptida sinyal asli M. luteus (292 U mg-1), pelB (125 U mg-1), dan tanpa peptida sinyal (56 U mg-1). Lipase EMP48-D yang terfusi dengan peptida sinyal ompA di bawah pengaruh promoter T5 juga menunjukkan aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 133 U mg-1 dan pelB hanya 74 U mg-1. Di daerah periplasma dan intraselulur, lipase EMP48-D fusi ompA yang dikontrol oleh promoter T5 memiliki aktivitas tertinggi yaitu 107 U mg-1 dan 33 U mg-1. Ekspresi lipase EMP48-D di bawah kontrol promoter T7 lebih tinggi dari promoter T5, sekitar 1,8 kali dengan ompA, dan 1,3 kali dengan pelB. Oleh karena itu, peptida sinyal ompA, di bawah kendali promoter T7, adalah yang paling efektif dalam ekspresi ekstraseluler lipase EMP48-D. Lipase EMP48-D menunjukkan aktivitas spesifik optimum pada suhu 40 °C (95%) dan optimum pada pH 5 (100%). Penggunaan berbagai jenis substrat juga memberikan pengaruh terhadap aktivitas lipase EMP48-D, yaitu minyak zaitun (100%), minyak sawit (64%), kanola (64%) minyak jagung (64%), minyak kedelai (59%), minyak bunga matahari (55%), dan
Keyword: Lipase asam, Micrococcus luteus, Promoter, Sinyal sekresi