Judul: Efisiensi pemakaian bahan ekstraksi pada isolasi Dna Mitokondria (mtDNA) ikan Patin (Pangasius hypophthalmus)
Abstrak: DNA adalah substansi dasar pembawa informasi genetik dan sumber yang dapat dimanipulasi untuk tujuan tertentu baik mumi ilmu peng.etahuan maupun aplikasi sains dan pengobatan. Aplikasi DNA saat ini telah meliputi bidang kedokteran, pertanian, petemakan, arkeologi, farma"i dan kepoJisian (forensik) serta bidang perikanan. Di bidang perikanan, DNA banyak digunakan sebagai penanda (markel) dalam mengukur hubungan kekerabatan antara kelompok ikan dalam populasi, studi taksonomi dan genetika populasi. DNA mitokondria (mtDNA) banyak digunakan dalam analisa DNA untuk mengidentifikasi variasi genetik dan penyebaran populasi ikan. Di Indonesia analisa DNA masih belum banyak dilakukan. Hal ini disebabkan peralatan dan bahan-bahan yang masih sulit ditemukan dan mahal harganya. Salah satunya adalah bahan ekstraksi DNA. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk l1lengetahui pcmakaian bahan ekstraksi yang efisien pada proses isolasi DNA mitokondria (mtDNA) 'kan patin (Pangasi/ls hypophthalm/ls). Penelitian dilaksanakan dari bulan April-Juli 200 I, bertempat di Laboratorium Pengembangb.iakan dan Genetika Ikan, Jurusan BDl', FPIK, il'E. Penelitian terdiri dari saiu kontrol dan 4 perlakuan. Kontrol adalah ekstraksi dcngan mengikuti prosedur yang dikeluarkan oleh Amersham Phormacia dengan menggunakan GenomicPrep Ceils and Tissue DNA [solatioll Kit, yaitu 600 III lal'lltan eel! lysis, 3 III proteinase K, 3 III RNase, 400 III protein precipitation, 600 JlI isopropanol 100%, 600 III etanol dingin (4°C), 100 III DNA hydration dan 20 mg sampel hati ikan patin. Sedangkan perlakuan I - IV adalah ekstraksi dengan bahan 0,75 kali kontrol, 0,5 kali kontrol, 0,25 kali kontrol dan 0,125 kali kontrol. Ekstraksi tahap pertama dilakukan dengan menggel'lls sampel di dalam tabung mikro. Sete1ah itu tabung mikro dipindahkan ke atas es dan ditambahkan lal'lltan cell lysis serta lal'lltan proteinase K. Selanjutnya sampel diinkubasi pada suhu 55°C selama 3 jam. Lal'lltan sel hasil inkubasi ditambah dengan RNase, dibolak-balik sebanyak 25 kali kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit. Pengendapan protein dilakukan dengan menambahkan lal'lltan protein precipitation. Setelah divorteks selama 20 detik kemudian disentrifius pada 14000 rpm selama 3 menit. Kemudian larutan supernatan dipindahkan ke tabung mikro bal'll yang telah bedsi isopropanol 100%. Tabung dibolak-balik 50 kali, selanjutnya disentrifius pada 14000 rpm selama I menit. Larutan supernatan dibuang dan tabung mikro dibiarkan kering udara. Selanjlltnya ditambah etanol 70% dingin (4°C) dan diaduk beberapa kali. Tabung mikro disentrifius selama I menit kemudian larutan dibuang dan tabung mikro dikeringkan di atas tissue. Tahap terakhir dilakukan dengan menamb,·hkan larutan DNA /cFdratioll pada masing-l11ilsmg tabung mikro. Setelah tahap ekstraksi selesai kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi ekstrak DNP. menggunakan mesin DNA Quantification Hagi] ekstraksi :dielektroforesis menggunakan gel agaros konsentrasi 0,8%. Seballyak 3 ~tl sampel DNA dicampur dengan 1 Ill/oading bl!ffer dan dimasukkan ke dalaIll lubang-Iubang pada gel. Marker sebanyak 3 III juga dimasukkan ke dalam gel. Isolasi dan amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR. Seba'lyak 2,5 Ili 10 x buffer Ex Taq, 2,0 III deoxyribonucleotide tripho.17Jhate (dNTP), 0,25 III Ex Taq, 'l,o III primer forward dan reverse, I ~tl DNA dan sterile dc·.ltilat,'u' water (SDW) masing-masing 17,25 III dicampur di dalam tabung mikro. Seianjutnya dimasukkan ke dalam mes·in PCR yang telah diprogram untuk proses denaturasi pada suhll 94°C selama 20 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detile dan proses extension pada suhu nOc selama 1
Keyword: