Judul: Isolation and Cloning of Thermo-halotolerant Lipase Gene from Bacillus tequilensis isolated from Lainea Hot Spring in Southeast Sulawesi
Abstrak: Kebutuhan lipase oleh berbagai bidang industri dengan aplikasi yang beragam membuat lipase perlu diproduksi secara cepat dan banyak. Namun lipase yang diproduksi saat ini belum sepenuhnya sesuai dengan industri yang memerlukan pemrosesan dengan kondisi suhu tinggi dan pelarut organik serta interaksi ion dalam larutan seperti kadar garam atau salinitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri penghasil lipase termo-halotoleran dari sumber air panas, mengkloning dan mengekspresikan gen penyandi lipase serta karakterisasi biokimia lipase termo-halotoleran. Pengayaan dilakukan sebelum mengisolasi bakteri lipolitik dari habitat ekstrim seperti sumber air panas. Pengayaan dilakukan secara langsung pada habitat asli atau in situ enrichment. Bakteri lipolitik diisolasi dari sampel hasil pengayaan in situ dengan metode Spread Plate pada media Rhodamin B–Agar. Isolat bakteri lipolitik diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA. Gen penyandi lipase diisolasi dengan teknik PCR menggunakan degenerate primer. Gen lipase diklon pada vektor pGEM-T Easy kemudian ditransformasi ke Escherichia coli DH5α untuk preservasi gen dan diklon pada vektor pET24a, ditransformasi ke E. coli BL21 (DE3) pLysS untuk diekspresikan. Ekspresi LipA_BTeq dilakukan 2 perlakuan yaitu mengikutsertakan sekuen signal peptida dan diekspresikan tanpa signal peptida (lipase mature). Analisis massa molekuler protein enzim lipase dilakukan dengan SDS-PAGE dan zimogram. Selain itu dilakukan analisis struktur 3D serta kekerabatan dalam Family lipase dianalisis menggunakan aplikasi MEGA XI. Karakterisasi lipase yang dilakukan adalah suhu optimum, pH optimum, stabilitas enzim terhadap salinitas (larutan NaCl), spesifisitas substrat, ketahanan terhadap pelarut organik, serta pengaruh ion logam. Tujuh belas isolat berhasil diisolasi dari sampel hasil pengayaan. Gen lipase dari 5 isolat bakteri lipolitik berhasil diklon dengan kode isolat HSAS, HSDS2, HSC3.1, HSC3.2 dan HSB3. Hasil identifikasi terhadap isolat HSAS, memiliki tingkat kemiripan 99.5% dengan Bacillus tequilensis strain A13 dengan panjang gen lipase (LipA_Bteq) 639 bp yang menyandikan 213 asam amino dengan 31 asam amino di awal sekuen merupakan sekuen signal peptida. Hasil ekspresi gen lipase menunjukkan perlakuan lipase mature memiliki aktivitas spesifik lebih tinggi (17 ± 1.12 U/mg) daripada yang memiliki signal peptida (8 ± 1.11 U/mg), sehingga lipase mature dipilih untuk dikarakterisasi. Hasil analisis SDS-PAGE dan Zimogram menunjukkan berat protein LipA_Bteq sebesar ~20 kDa. Hasil tersebut dikonfirmasi pula analisis MEGA XI yang membentuk klad dengan subfamily lipase I.4. LipA_Bteq memiliki suhu optimum 30 oC, dan memiliki rentang stabilitas suhu 30 oC - 60 oC dengan rata-rata aktivitas relatif 98 %. LipA_Bteq memiliki ketahanan terhadap konsentrasi NaCl 0.1M sampai 3M, dan memiliki aktivitas optimum pada konsentrasi NaCl 2 M. LipA_Bteq digolongkan sebagai lipase halotoleran karena membutuhkan NaCl untuk mencapai aktivitas optimum. Untuk parameter pH, LipA_Bteq memiliki aktivitas tertinggi pada pH 8. LipA_Bteq memiliki preferensi yang baik pada substrat C6 (rantai pendek). Kehadiran ion logam (Fe3+, Cu2+, Mg2+, Ca2+, Na+, dan Mn2+) dengan konsentrasi 100 mM dalam campuran reaksi mampu meningkatkan aktivitas LipA_Bteq. Disisi lain Zn2+ menurunkan aktivitas lipase sampai 83%. Penambahan pelarut organik 50% metanol, isopropanol dan etanol menurunkan aktivitas enzim, sedangkan kehadiran butanol dan n-heksan meningkatkan aktivitas enzim sebesar 12 % dan 20 % secara berurutan., The need for lipase by various industrial fields with diverse applications makes lipases need to be produced quickly and in large quantities. However, the lipases produced today are not fully suitable
Keyword: lipase bakteri, kloning gen lipase, lipase termo-halotoleran