Judul: The cellular and molecular studies of sperm X and sperm Y separation based on viability on extremely acidic and alkaline media
Abstrak: Separasi sperma adalah suatu proses untuk memisahkan sperma X dan sperma Y menggunakan metode spesifik sehingga diharapkan dapat memperoleh keturunan sesuai dengan jenis kelamin yang diinginkan. Beberapa metode yang telah dikembangkan untuk separasi sperma diantaranya adalah: coloumn albumin, densitas gradien, elektroforesis, antigen H-Y, filtrasi dengan kolom Sephadex dan flow cytometry. Metode yang memiliki akurasi 85-95% sampai saat ini adalah flow cytometry. Aplikasi metode flow cytometry sangat mahal, memerlukan waktu lama dan terjadinya kerusakan selama proses separasi yang menyebabkan berkurangnya fertilitas sperma serta abnormalitas pada embrio. Metode separasi berdasarkan pada sifat alami yang mampu memisahkan sperma X dan sperma Y dikembangkan. Ilmuwan meyakini bahwa sperma X dan sperma Y dapat dipisahkan berdasarkan pada perbedaan ketahanan pada media asam dan basa. pH vagina yag cukup extrem yaitu antara 3,8-4 kemungkinan berperan penting dalam pengaturan seleksi sperma X atau sperma Y sehingga berpengaruh terhadap jenis kelamin keturunan yang dihasilkan. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa sperma Y tidak dapat bertahan lama pada media asam, suhu tinggi, ataupun lingkungan yang mengandung reactive oxygen species (ROS) tinggi. Pada penelitian ini dilakukan separasi sperma berdasarkan pada hipotesis perbedaan ketahanan dan sifat fisiologis sperma pada media yang memiliki pH asam dan basa ekstrem. Proses separasi tersebut diharapkan dapat memisahkan sperma X dan sperma Y secara akurat. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan kajian komprehenship secara seluler dan molekuler serta fertilitas sperma hasil separasi dengan metode inkubasi menggunakan media pH ekstrem. Penelitian dibagi menjadi tiga tahap: (1) Karakteristik sperma pada media dengan pH yang berbeda, (2) Kajian seluler dan molekuler sperma pada inkubasi menggunakan media asam dan basa ekstrem, (3) Separasi sperma dan uji fertilitas serta potensi perkembangan embrio. Pada tahap pertama, dilakukan penelitian untuk mengevaluasi kisaran nilai pH media yang dapat ditoleransi oleh sperma dan pengaruhnya terhadap kualitas sperma. Sejumlah 250 x 106 sperma beku Sapi Pasundan di thawing dan dibagi menjadi 10 bagian yang sama. HCL atau NaOH ditambahkan ke dalam media bufer untuk membuat media asam dengan pH 3,4,5,6 kontrol 7,2-7,4 dan media basa dengan pH 8,9,10,11,12. Sampel diinkubasi dalam media dengan nilai pH yang spesifik selama 5 menit pada suhu ruang, selanjutnya segera ditambahkan larutan bufer untuk mengembalikan ke pH 7,2-7,4. Evaluasi dilakukan setelah 10 menit inkubasi di suhu ruang. Penelitian tahap dua, metode thawing dan preparasi media dilakukan sesuai dengan penelitian tahap 1. Media yang digunakan memiliki pH 4 untuk asam ekstrem, kontrol memiliki pH 7,2-7,2 dan pH 11 untuk basa ekstrem. Sperma diinkubasi di dalam media yang memiliki pH spesifik selama 5 menit pada suhu ruang, kemudian segera ditambahkan larutan buffer mengembalikan ke pH 7,2-7,4 dan diinkubasi selama 10 menit di suhu ruang. Evaluasi terhadap motilitas, viabilitas, membran utuh, akrosom utuh, morfologi dan DNA utuh pada menit ke 0, 15 dan 30 pasca 10 menit inkubasi di suhu ruang. Level H2O2, aktivitas mitokondria, dan level Ca2+intraseluler dianalisa dengan menggunakan confocal laser scanning microscope (CLSM). Produksi embrio in vitro dilakukan dengan metode intracytoplasmic sperm injection (ICSI) menggunakan sperma yang diinkubasi pada media pH 4 dan pH 11 dibandingkan dengan kontrol. qPCR dilakukan untuk menganalisa ekspresi gen PLP, ZFY, BAX dan PLC ζ pada sperma dan PLP, ZFY
Keyword: asam, basa, sperma, embrio, separasi