Judul: In Vitro Dexamethasone Toxicity Evaluation on Mouse Embryos through Immunofluorescence Analysis of Hippo Signaling Mechanisms
Abstrak: Deksametason merupakan glukokortikoid sintetik yang banyak diresepkan pada hewan dan manusia. Deksametason merupakan antiemetikum poten yang dilarang diberikan kepada pasien pada fase gestasi karena berbahaya bagi janin dan fetus. Perkembangan keilmuan terakhir menunjukkan adanya indikasi manipulasi deksametason pada mekanisme Hippo signaling (faktor penentu apakah sel embrio menjadi sel trophectoderm/TE sebagai bakal plasenta atau inner cell mass/ICM sebagai bakal fetus). Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi keamanan deksametason secara in vitro terhadap perkembangan embrio mulai dari 2-sel dan mendapatkan blastosis untuk bahan evaluasi deksametason dalam mengarahkan diferensiasi ICM/TE tersebut. Harapannya, deksametason mampu menginiasi nuklearisasi Yes-associated protein (YAP) ke dalam sel yang diikuti dengan pengarahan diferensiasi sel embrio totipoten menjadi sel TE. Pengujian dilakukan pada Juli 2019 sampai Februari 2021 dengan diawali dengan 2 tahap uji pendahuluan. Uji pendahuluan 1 adalah optimasi metode pewarnaan imunofluoresens Frum dan Ralston tahun 2019 untuk deteksi YAP, pYAP, dan Cdx2. Pemanjangan waktu fiksasi menjadi 20 menit, waktu permeabilisasi 30 menit, penggunaan konsentrasi anti-YAP dan anti-pYAP 1:100, serta anti-Cdx2 1:200 cukup untuk menghasilkan pendaran yang optimal dan layak digunakan untuk menghasilkan gambar multicolor immunofluorescence staining. Uji pendahuluan 2 adalah evaluasi dinamika YAP, pYAP, dan Cdx2 pada fase fransisi embrio praimplantasi. Uji ini ditujukan untuk menggambarkan dinamika normal ketiga protein tersebut dalam proses penentuan takdir pertama sel embrio. Sampel penelitian ini mencangkup embrio pada fase transisi (8-sel, morula, dan blastosis). Hasil pengujian menunjukkan bahwa YAP diekspresikan hanya di area nukleus (disebut sebagai sel polar), baik di nukleus dan sitoplasma (sel apolar), atau di sitoplasma saja (sel non-polar). Seiring perkembangan fase transisi, sel polar menurun persentase jumlahnya dan menempati area tepi blastosis. Sebaliknya, sel non-polar semakin meningkat dan menempati area dalam embrio. Sel apolar sebagai transisi antara sel polar dan non-polar ditemukan dalam jumlah sedikit. Di antara ketiga sel tersebut, hanya sel polar yang diekspresikan pada rentang pendaran yang paling luas (dari pendaran rendah/<1.500 piksel hingga pendaran tinggi/>3.000) dan dapat dikelompokkan menjadi empat berdasarkan tingkat polaritasnya, yaitu sel dengan polaritas sangat kuat, kuat, sedang, dan lemah. Protein YAP yang sedang terdegradasi melalui reaksi fosforilasi pada Ser127 (pYAP) sedikit diekspresikan dan spesifik ditemukan di sitoplasma sel. Protein pYAP ditemukan berkorelasi negatif dengan nuklearisasi YAP, yang berarti mobilisasi YAP ke dalam nukleus menurunkan ekspresi pYAP sitoplasma. Sebaliknya, ekspresi Cdx2 didukung oleh nuklearisasi YAP (korelasi positif). PENELITIAN UTAMA: Evaluasi Toksisitas dan Pengaruh Deksametason pada Mekanisme Hippo Signaling Embrio Praimplantasi. Evaluasi potensi toksik deksametason dilakukan dengan memapar embrio fase 2-sel pada dosis 0, 1, 10, dan 100 µM selama 66 jam. Observasi dilakukan pada kemampuan perkembangan, kapasitas penghambatan nilai cell block, angka blastocyst rate, viabilitas blastosis, rasio sel ICM/TE blastosis, dan ekspresi protein YAP, pYAP, dan Cdx2 sebagai penanda mekanisme Hippo signaling. Hasil yang diperoleh dinarasikan secara deskriptif dan dianalisis dengan ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Turkey. Hasil pengujian menunjukkan bahwa deksametason 1 µM ditemukan memiliki 72% blastocyst rate yang setimbang dengan kontrol. Paparan deksametason pada dosis 10 dan 100 µM menghasilkan lebih sedikit blastosis akibat peningkatan angka cell block. Blastosis yang terbentuk seiring dengan paparan deksametason berbagai dosis tersebut memiliki diamater yang nyata lebih lebar daripada perlakuan kontrol, viabilitas sel yang baik (>92,85% adalah sel
Keyword: Cdx2, deksametason, Hippo signaling, toksisitas praimplantasi, YAP