موضوع مقاله: شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای | مقدمه: همهٔ ژن‌های منفرد بر اساس موقعیت آنها در ژنوم، جهت رونویسی و طول آن‌ها، در بیرونی‌ترین دایره قرار می‌گیرند. | ## بخش 1: شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای | جهت رونویسی ژن‌های داخلی و خارجی که با فلش نشان داده شده‌اند، به ترتیب در جهت عقربه‌های ساعت و خلاف جهت عقربه‌های ساعت نشان داده شده‌اند. شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای یا شناسه‌گذاری ژنوم در زیست‌شناسی مولکولی و ژنتیک، به معنی توضیح ساختار و عملکرد اجزای یک ژنومبا آنالیز و تفسیر آن برای استخراج اهمیت زیستی و درک فرآیندهایی که در آن دخیل هستند، می‌باشد. همچنین مکان ژن‌ها و تمام نواحی کدکننده در یک ژنوم را شناسایی کرده و تعیین می‌کند که آن ژن‌ها چه کاری انجام می‌دهند. شناسه‌گذاری، پس از اینکه یک ژنوم توالی‌یابی و سرهم‌بندی شود انجام می‌شود و یک مرحلهٔ ضروری در تحلیل ژنوم است. این کار پیش از آن‌که توالی در یک پایگاه داده ذخیره شده و در یک مقاله منتشر شود انجام می‌گیرد. برخی از گزارش‌ها شامل اطلاعات اضافی هستند که فراتر از یک شناسه‌گذاری ساده می‌باشند. علاوه بر این، به دلیل اندازه و پیچیدگی ژنوم‌های توالی‌یابی‌شده، شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای به‌صورت دستی انجام نمی‌شود، بلکه از طریق روش‌های محاسباتی به‌صورت خودکار انجام می‌گیرد. شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای به دو دسته تقسیم می‌شود: شناسه‌گذاری ساختاری، که عناصر موجود در یک ژنوم را شناسایی و مرزبندی می‌کند، و شناسه‌گذاری عملکردی، که وظایفی را به این عناصر اختصاص می‌دهد. این تنها روش دسته‌بندی آن نیست، زیرا روش‌های جایگزین دیگری مانند دسته‌بندی مبتنی بر ابعاد و دسته‌بندی مبتنی بر سطح نیز مطرح شده‌اند. تاریخچه نسل اول ابزارهای شناسه‌گذاری ژنوم از روش‌های موضعی از ابتدا استفاده می‌کردند که صرفاً بر اساس اطلاعات استخراج‌شده از توالی دی‌ان‌ای در مقیاس موضعی عمل می‌کردند. این روش‌ها در اواخر دههٔ ۱۹۷۰، به‌عنوان یک مورد ضروری برای پردازش حجم عظیمی از داده‌های تولیدشده توسط روش‌های توالی‌یابی مکسام-گلیبرت و سنگر توسعه یافتند. اولین نرم‌افزاری که برای تحلیل خوانشهای توالی‌یابی مورد استفاده قرار گرفت، پکیج استادن بود که در سال ۱۹۷۷ توسط راجر استادن ایجاد شد. این نرم‌افزار چندین وظیفهٔ مرتبط با شناسه‌گذاری از جمله شمارش نوکلئوتیدها و کدون‌ها را انجام می‌داد. در حقیقت، میزان استفاده از کدون یکی از استراتژی‌های اصلی بسیاری از روش‌های اولیهٔ پیش‌بینی و شناسایی توالی‌های کدکنندهٔ پروتئین (CDS) بود. این روش مبتنی بر این فرض بود که نواحی ترجمه‌شونده در یک ژنوم شامل کدون‌هایی هستند که دارای بیشترین تعداد tRNAهای متناظر (مولکول‌هایی که آمینواسیدها را در طی فرایند ساختن پروتئین به ریبوزوم منتقل می‌کنند) هستند و این امر موجب ترجمه‌ای کارآمدتر می‌شود. همچنین، این موضوع برای کدون‌های هم‌معنی نیز صادق بود، به‌طوری که این کدون‌ها اغلب در پروتئین‌هایی که دارای سطح بیان پایین‌تری هستند، حضور دارند. ظهور ژنوم‌های کامل در دههٔ ۱۹۹۰ (اولین مورد آن، ژنوم هموفیلوس آنفلوآنزا بود که در سال ۱۹۹۵ تعیین توالی شد) منجر به معرفی نسل دوم ابزارهای شناسه‌گذاری شد. همانند نسل قبلی، این ابزارها نیز شناسه‌گذاری را از طریق روش‌های از ابتدا اما این بار در مقیاس کل ژنوم انجام می‌دادند. مدل‌های مارکوف نیروی محرکهٔ بسیاری از الگوریتم‌های مورد استفاده در شناسه‌گذارهای این نسل بودند. این مدل‌ها را می‌توان به‌عنوان گراف‌های جهت‌داری در نظر گرفت که در آن‌ها، گره‌ها نشان‌دهندهٔ سیگنال‌های مختلف ژنومی (مانند نقاط شروع رونویسی و ترجمه) هستند و یال‌های گراف نشان‌دهندهٔ روند اسکن توالی می‌باشند. برای اینکه یک مدل مارکوف بتواند یک سیگنال ژنومی را شناسایی کند، ابتدا باید با مجموعه‌ای از سیگنال‌های ژنومی شناخته‌شده، آموزش داده شود. خروجی مدل‌های مارکوف در زمینهٔ شناسه‌گذاری شامل احتمال حضور هر نوع عنصر ژنومی در هر بخش از ژنوم است. یک مدل مارکوف دقیق، نمرهٔ احتمال بالایی را به شناسه‌گذاری‌های صحیح و نمرهٔ پایینی را به موارد نادرست اختصاص می‌دهد. جعبه‌های نقطه‌چین نشان‌دهندهٔ چهار نسل مختلف از ابزارهای شناسه‌گذاری ژنوم و ویژگی‌های شاخص آن‌ها هستند. نسل اول (آبی) که در آن شناسه‌گذارها از روش‌های از ابتدا در مقیاس موضعی استفاده می‌کردند، نسل دوم (قرمز) با روش‌های از ابتدا در مقیاس کل ژنوم، نسل سوم (سبز) که با ترکیبی از روش‌های از ابتدا و شناسه‌گذاری مبتنی بر هومولوژی مشخص می‌شود، نسل چهارم (نارنجی) که در آن، شناسایی نواحی غیرکدکنندهٔ دی‌ان‌ای و مفهوم پان‌ژنوم یا مطالعات در سطح جمعیت آغاز گردید. با در دسترس قرار گرفتن تعداد بیشتری از ژنوم‌های توالی‌یابی‌شده در اوایل و اواسط دههٔ ۲۰۰۰، همراه با مجموعهٔ وسیعی از توالی‌های پروتئینی که به‌صورت تجربی به دست آمده بودند، ابزارهای شناسه‌گذاری ژنوم شروع به استفاده از روش‌های مبتنی بر هومولوژی کردند و نسل سوم شناسه‌گذاری ژنوم را پایه‌گذاری نمودند. این روش‌های جدید به شناسه‌گذارها این امکان را می‌دادند که نه‌تنها عناصر ژنومی را از طریق روش‌های آماری (همانند نسل‌های پیشین) استنتاج کنند، بلکه با مقایسهٔ توالی در حال شناسه‌گذاری با توالی‌های موجود و تأییدشده، این فرایند را انجام دهند. این شناسه‌گذارهای ترکیبی که هر دو روش از ابتدا و شناسه‌گذاری مبتنی بر هومولوژی را به کار می‌گیرند، نیازمند الگوریتم‌های هم‌ترازسازی سریعی برای شناسایی نواحی دارای هومولوژی هستند. در اواخر دههٔ ۲۰۰۰، شناسه‌گذاری ژنوم تمرکز خود را به شناسایی نواحی غیرکدکننده در دی‌ان‌ای معطوف کرد. این پیشرفت به لطف ظهور روش‌هایی برای تحلیل جایگاه‌های اتصال فاکتورهای رونویسی، جایگاه‌های متیلاسیون دی‌ان‌ای، ساختار کروماتین و سایر تکنیک‌های تجزیه‌وتحلیل آران‌ای و نواحی تنظیمی امکان‌پذیر شد. علاوه بر این، برخی ابزارهای شناسه‌گذاری ژنوم نیز بر مطالعات در سطح جمعیت، که به پان ژنوم شناخته می‌شود، تمرکز کردند. | ## بخش 2: شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای | به این ترتیب، برای مثال، روال کاری شناسه‌گذاری اطمینان حاصل می‌کند که ژن‌های اصلی یک تبارشاخه در ژنوم‌های گونه‌های جدید همان تبارشاخه نیز یافت شوند. تا دههٔ ۲۰۱۰، توالی ژنومی بیش از هزار انسان (از طریق پروژه ۱۰۰۰ ژنوم) و چندین جاندار مدل در دسترس قرار گرفت. شناسه‌گذاری ژنوم همچنان برای دانشمندانی که به بررسی ژنوم انسانی و سایر ژنوم‌ها می‌پردازند، یک چالش اساسی محسوب می‌شود. ابتدا، مناطق تکراری یک ژنوم سرهم شده با استفاده از یک کتابخانهٔ تکرار پوشانده می‌شوند. سپس، در صورت لزوم، توالی پوشانده شده با تمام شواهد حاضر یعنی ESTها، آران‌ای‌ها و پروتئین‌های) جاندار در حال شناسه‌گذاری، هم‌تراز می‌شود. در نهایت، با کمک پایگاه‌های دادهٔ متشکل از توالی‌های شناخته‌شدهٔ دی‌ان‌ای، آران‌ای و پروتئین و همچنین سایر اطلاعات تکمیلی، نواحی کدکننده و غیرکدکنندهٔ موجود در ژنوم پیش‌بینی می‌شوند. از جمله این عناصر می‌توان به این موارد اشاره کرد: چارچوب خوانش باز (ORFها)، توالی کدکننده (CDSها)، اگزون‌ها، اینترون‌ها، تکرارها، نواحی برش آر‌ان‌ای، بخش‌های تنظیمی، کدون آغاز، کدون پایان، و پروموترها. مراحل اصلی شناسه‌گذاری ساختاری عبارت‌اند از: شناسایی و پوشاندن تکرارها هم‌ترازی شواهد (اختیاری) شناسایی جایگاه‌های برش (فقط در یوکاریوت‌ها) پیش‌بینی ویژگی‌ها (توالی‌های کدکننده و غیرکدکننده) شناسایی و پوشاندن تکرارها اولین مرحله از شناسه‌گذاری ساختاری، شناسایی و پوشاندن تکرارها است که شامل توالی‌های با پیچیدگی کم (مانند AGAGAGAG یا بخش‌های تک‌نوکلئوتیدی مانند TTTTTTTTT) و ترنسپوزون‌ها (که عناصر بزرگ‌تری با چندین نسخه در سراسر ژنوم هستند) می‌شود. تکرارها بخش عمده‌ای از ژنوم‌های پروکاریوتی و یوکاریوتی را تشکیل می‌دهند؛ به عنوان مثال، بین ۰٪ تا بیش از ۴۲٪ از ژنوم‌های پروکاریوتی، از تکرارها تشکیل شده‌اند و سه‌چهارم ژنوم انسان نیز از عناصر تکراری تشکیل شده است. شناسایی تکرارها به دو دلیل اصلی دشوار است: آن‌ها به‌خوبی حفاظت نشده‌اند و مرزهای مشخصی ندارند. به همین دلیل، لازم است که کتابخانه‌های تکرار برای ژنوم مورد نظر ساخته شوند، که این کار می‌تواند با استفاده از یکی از روش‌های زیر انجام شود: روش‌های de novo. تکرارها را با شناسایی و گروه‌بندی جفت‌های توالی در مکان‌های مختلف که میزان شباهت آن‌ها از یک حداقل آستانهٔ توالی حفاظت شده در مقایسهٔ خود-ژنومی بیشتر است، شناسایی می‌کنند. نقطه‌ضعف این روش‌ها این است که می‌توانند هر توالی تکراری را شناسایی کنند، نه فقط ترنسپوزون‌ها، و ممکن است شامل توالی‌های کدکننده (CDS) حافظت‌شده نیز باشند، بنابراین پردازشِ پس از شناسایی برای حذف این توالی‌ها ضروری است. همچنین، این روش ممکن است نواحی مرتبطی را که در طول زمان تخریب شده‌اند، کنار بگذارد و عناصری را که هیچ ارتباطی در تاریخچهٔ تکاملی خود ندارند، در یک گروه قرار دهد. تکرارها بر اساس شباهت (همولوژی) به تکرارهای شناخته‌شدهٔ ذخیره‌شده در یک پایگاه دادهٔ معتبر، شناسایی می‌شوند. این روش‌ها، در مقایسه با روش‌های de novo، حتی اگر تعداد کمتری از ترنسپوزون‌ها را بیابند، با احتمال بیشتری ترنسپوزون‌های واقعی را شناسایی می‌کنند. البته باید دقت شود که نسبت به خانواده‌های از پیش شناسایی‌شده، دچار سوگیری هستند. این روش‌ها تکرارها را به جای تکرار یا شباهت، بر اساس مدل‌هایی از ساختار آن‌ها شناسایی می‌کنند. آن‌ها قادر به شناسایی ترنسپوزون‌های واقعی هستند (همانند روش‌های مبتنی بر همولوژی)، اما دچار سوگیری نسبت به عناصر شناخته‌شده نیستند. بااین‌حال، این روش‌ها به‌شدت برای هر کلاس خاصی از تکرار، اختصاصی هستند و در نتیجه، کاربرد عمومی کمتری دارند. تکرارها به‌عنوان نواحی دارای اختلال در یک هم‌ترازسازی چند توالی که در اثر درج‌های بزرگ ایجاد شده‌اند، شناسایی می‌شوند. این استراتژی از مشکل مرزهای نامشخص که در سایر روش‌ها وجود دارد، اجتناب می‌کند، اما به‌شدت به کیفیت سرهم‌بندی‌ژنوم و میزان فعالیت ترنسپوزون‌ها در ژنوم‌های مورد مطالعه وابسته است. پوشاندن به معنای جایگزینی حروف مربوط به نوکلئوتیدها (A، C، G یا T) با حروف دیگر است. با این کار، این نواحی به‌عنوان تکراری علامت‌گذاری می‌شوند و آنالیزهای بعدی آن‌ها را به‌عنوان نواحی تکراری در نظر خواهند گرفت. در صورتی که این نواحی پوشانده نشوند، ممکن است مشکلاتی در عملکرد پردازش ایجاد کنند و حتی شواهد نادرستی برای شناسه‌گذاری ژنی تولید کنند (برای مثال، در نظر گرفتن یک چارچوب خوانش باز (ORF) در یک ترنسپوزون به‌عنوان یک اگزون). بسته به حروفی که برای جایگزینی استفاده می‌شود، پوشاندن را می‌توان به دو دسته تقسیم کرد: در پوشاندن نرم، نواحی تکراری با حروف کوچک (a، c، g یا t) نشان داده می‌شوند. به این ترتیب، پوشاندن نرم می‌تواند برای حذف تطابق‌های حروف نوکلئوتیدی و جلوگیری از انجام هم‌ترازسازی در این نواحی استفاده شود. پوشاندن سخت، علاوه بر همهٔ این موارد، می‌تواند نواحی پوشانده‌شده را از امتیازات هم‌ترازسازی نیز حذف کند. هم‌ترازی شواهد مرحلهٔ بعدی پس از پوشاندن ژنوم، معمولاً شامل هم‌ترازسازی تمامی شواهد موجود از رونویسی و پروتئینی با ژنوم مورد بررسی است. به عبارت دیگر، تمامی برچسب‌های توالی بیان شده (ESTها)، آران‌ای‌ها و پروتئین‌های شناخته‌شدهٔ موجودات در حال شناسه‌گذاری، با ژنوم هم‌ردیف می‌شوند. با وجود اختیاری بودن، چون آران‌ای‌ها و پروتئین‌ها محصولات مستقیم توالی‌های کدکننده هستند، این مرحله می‌تواند به روشن‌سازی توالی‌های ژنی کمک کند. | ## بخش 3: شناسه‌گذاری دی‌ان‌ای | اگر داده‌های RNA-seq در دسترس باشند، می‌توان از آن‌ها برای شناسه‌گذاری و تعیین کمیت تمام ژن‌ها و ایزوفرم‌های مربوطه در ژنوم استفاده کرد. با این حال، رونوشت‌ها اطلاعات کافی برای پیش‌بینی ژن فراهم نمی‌کنند، زیرا ممکن است از برخی ژن‌ها به دست نیایند، ممکن است اپرون‌هایی با بیش از یک ژن را کد کنند، و همچنین به دلیل تغییر چارچوب خوانش و فاکتورهای آغاز ترجمه، کدون‌های شروع و پایان آن‌ها را نمی‌توان به‌طور دقیق تعیین کرد. برای این کار، معمولا از اطلاعات مربوط به پروتئین‌های بیان‌شده که توسط طیف‌سنجی جرمی به‌دست می‌آید، استفاده می‌کنند. شناسایی جایگاه‌های برش شناسه‌گذاری ژنوم‌های یوکاریوتی به دلیل فرآیند پیرایش آران‌ای که یک فرآیند پس از رونویسی است، پیچیدگی بیشتری دارد. در این فرآیند، اینترون‌ها (ناحیه‌های غیرکدکننده) حذف شده و اگزونها (ناحیه‌های کدکننده) به هم متصل می‌شوند. در نتیجه، توالی‌های کدکننده (CDS) در یوکاریوت‌ها ناپیوسته هستند و برای شناسایی صحیح آن‌ها، باید نواحی اینترونی فیلتر و جدا شوند. برای این منظور، سامانه‌های شناسه‌گذاری باید مرزهای اگزون-اینترون را پیدا کنند و روش‌های مختلفی برای این کار توسعه یافته است. یکی از راه‌حل‌ها، استفاده از مرزهای اگزونی شناخته‌شده برای ترازسازی است؛ برای مثال، بسیاری از اینترون‌ها با "GT" شروع شده و با "AG" پایان می‌یابند. برای حل این مشکل، از الگوریتم‌های یادگیری ماشینی استفاده می‌شود که با استفاده از مرزهای شناخته‌شده و اطلاعات کیفیتی (مانند امتیاز کیفیت)، مرزهای جدید را پیش‌بینی می‌کنند. پیش‌بینی‌کننده‌های مرزهای اگزونی جدید معمولاً نیاز به الگوریتم‌های کارآمد فشرده‌سازی داده و ترازسازی دارند، اما در تعیین مرزهایی که در نواحی دارای پوشش توالی‌یابی پایین قرار دارند یا دارای نرخ خطای بالایی هستند، ممکن است دچار خطا شوند. پیش‌بینی ویژگی‌ها ژنوم به دو بخش توالی کدکننده و توالی غیرکدکننده تقسیم می‌شود و آخرین مرحله در شناسه‌گذاری ساختاری، شناسایی این ویژگی‌ها در ژنوم است. در واقع، وظیفهٔ اصلی در شناسه‌گذاری ژنوم، پیش‌بینی ژن است و به همین دلیل روش‌های متعددی برای این منظور توسعه یافته‌اند. اصطلاح "پیش‌بینی ژن" ممکن است گمراه‌کننده باشد، زیرا بیشتر ابزارهای پیش‌بینی ژن، تنها توالی کدکننده (CDS) را شناسایی می‌کنند و ناحیه‌های ترجمه‌نشده (UTRs) را گزارش نمی‌دهند. پیش‌بینی‌کننده‌های CDS، ویژگی‌های ژنومی را از طریق روش‌هایی به نام سنسورها شناسایی می‌کنند. این روش‌ها شامل سنسورهای سیگنال هستند که جایگاه‌های عملکردی مانند پروموترها و جایگاه‌های پلی‌آدنیلاسیون را شناسایی می‌کنند، و سنسورهای محتوا که توالی‌های دی‌ان‌ای را به بخش‌های کدکننده و غیرکدکننده طبقه‌بندی می‌کنند. پیش‌بینی‌کننده‌های CDS در پروکاریوت‌ها عمدتاً با چارچوب‌های خوانش باز (ORFs) سروکار دارند. پیش‌بینی CDS در یوکاریوت‌ها با چالش‌های بیشتری روبه‌رو است، زیرا ژن‌های یوکاریوتی دارای ساختار پیچیده‌تری هستند. روش‌های پیش‌بینی CDS را می‌توان به سه دستهٔ کلی تقسیم کرد: روش‌های از ابتدا (که به آن‌ها روش‌های آماری، درونی، یا de novo نیز گفته می‌شود). پیش‌بینی CDS تنها بر اساس اطلاعاتی انجام می‌شود که می‌توان از توالی DNA استخراج کرد. برخی روش‌ها از دو یا چند ژنوم برای استنتاج نرخ‌های جهش موضعی و الگوهای تغییر در سراسر ژنوم استفاده می‌کنند. روش‌های مبتنی بر همولوژی (که به آن‌ها روش‌های تجربی، مبتنی بر شواهد، یا بیرونی نیز گفته می‌شود). این روش به‌طور خاص، توالی مورد بررسی را با برچسب توالی بیان‌ شده (ESTs)، دی‌ان‌ای مکمل (cDNA) یا توالی‌های پروتئین هم‌تراز می‌کند. شناسه‌گذاری عملکردی شناسه‌گذاری عملکردی، عملکرد عناصر ژنومی که در شناسه‌گذاری ساختاری شناسایی شده‌اند را تعیین می‌کند، و آن‌ها را به فرآیندهای زیستی مانند چرخه سلولی، مرگ سلولی، تکوین، متابولیسم و غیره مرتبط می‌سازد. همچنین می‌تواند به‌عنوان یک بررسی کیفی اضافی برای شناسایی عناصری که ممکن است به اشتباه شناسه‌گذاری شده باشند، مورد استفاده قرار گیرد. این تصویر عملکردهای مولکولی، فرایندهای زیستی و اجزای سلولی را که کمپلکس ماتریلین، بخشی از ماتریکس خارج‌سلولی، در آن‌ها نقش دارد نشان می‌دهد. هر جعبه یک اصطلاح شناسه‌گذاری است که در یکی از سه دستهٔ GO قرار می‌گیرد و رنگ‌بندی شده است. اصطلاحات شناسه‌گذاری از طریق ویژگی‌های خاصی به هم مرتبط می‌شوند که با انواع مختلف پیکان‌ها نشان داده شده‌اند. شناسه‌گذاری عملکردی ژن‌ها نیازمند یک سری واژگان معیار (یا هستی‌شناسی) برای نام‌گذاری ویژگی‌های عملکردی پیش‌بینی‌شده است. با این حال، از آنجا که راه‌های متعددی برای تعریف عملکرد ژن‌ها وجود دارد، فرایند شناسه‌گذاری زمانی که توسط گروه‌های پژوهشی مختلف انجام شود ممکن است با مشکل مواجه شود. از این رو، باید از واژگان کنترل‌شدهٔ استاندارد استفاده شود که جامع‌ترین آن هستی‌شناسی ژن (GO) است. | ## جمع‌بندی | این روش، ویژگی‌های عملکردی را در یکی از سه دسته (عملکرد مولکولی، فرایند زیستی و جزء سلولی) طبقه‌بندی کرده و آن‌ها را در یک گراف جهت‌دار سازمان‌دهی می‌کند که در آن، هر گره یک عملکرد خاص دارد و هر یال (یا پیکان) بین دو گره نشان‌دهندهٔ یک رابطهٔ والد–فرزند یا زیررده–رده است .