موضوع مقاله: آزمایشگاه مایکوپلاسما | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # آزمایشگاه مایکوپلاسما | مقدمه: مایکوپلاسما ژنیتالیوم در اصل به این دلیل به عنوان مبنای این پروژه انتخاب شد که در آن زمان، در میان تمام ارگانیسم‌های تحلیل‌شده، کمترین تعداد ژن را داشت. | ## بخش 1: آزمایشگاه مایکوپلاسما | برای شناسایی ژن‌های حداقلی مورد نیاز برای حیات، هر یک از ۴۸۲ ژن مایکوپلاسما ژنیتالیوم به صورت جداگانه حذف شد و زیست‌پذیری جهش‌یافته‌های حاصل مورد آزمایش قرار گرفت. این کار منجر به شناسایی یک مجموعه حداقلی متشکل از ۳۸۲ ژن شد که از نظر تئوری باید نمایانگر یک ژنوم حداقلی باشد. در سال ۲۰۰۸، مجموعه کامل ژن‌های مایکوپلاسما ژنیتالیوم در آزمایشگاه ساخته شد و «واترمارک‌هایی» به آن افزوده شد تا این ژن‌ها به عنوان ژن‌های مصنوعی شناسایی شوند. با این حال، مایکوپلاسما ژنیتالیوم بسیار به کندی رشد می‌کند و به همین دلیل مایکوپلاسما میکوئیدس به عنوان تمرکز جدید انتخاب شد تا آزمایش‌های با هدف تعیین مجموعه ژن‌های واقعاً مورد نیاز برای رشد، سرعت یابد. تخمین زده می‌شود که تولید ژنوم مصنوعی مورد استفاده برای این پروژه، ۴۰ میلیون دلار آمریکا هزینه و ۲۰۰ نفر-سال زمان برده است. پس از آزمایش‌های تکمیلی برای شناسایی مجموعه کوچک‌تری از ژن‌ها که بتوانند یک ارگانیسم کارا تولید کنند، JCVI-syn3.0 ساخته شد که حاوی ۴۷۳ ژن بود. از آنجا که ژنوم JCVI-syn3.0 یک ژنوم کاملاً جدید است، این ارگانیسم به عنوان اولین موجود زنده حقیقتاً مصنوعی در نظر گرفته می‌شود. کریگ ونتر توسط تیمی متشکل از تقریباً ۲۰ دانشمند به سرپرستی برنده جایزه نوبل، همیلتون اسمیت و با حضور پژوهشگر DNA، کریگ ونتر و میکروب‌شناس، کلاید ای. هدف کلی این پروژه، تقلیل یک موجود زنده به اجزای ضروری آن و در نتیجه، درک این موضوع است که برای ساختن یک ارگانیسم جدید از ابتدا چه چیزی لازم است. تمرکز اولیه بر روی باکتری مایکوپلاسما ژنیتالیوم بود؛ یک انگل اجباری درون‌سلولی که ژنوم آن از ۴۸۲ ژن شامل ۵۸۲٬۹۷۰ جفت‌باز تشکیل شده و بر روی یک کروموزوم دایره‌ای قرار گرفته است (در زمان شروع پروژه، این کوچک‌ترین ژنوم در میان موجودات طبیعی شناخته‌شده‌ای بود که می‌توانستند در کشت آزاد رشد کنند). آنها با استفاده از جهش‌زایی با ترانسپوزون، ژن‌هایی را که برای رشد ارگانیسم ضروری نبودند شناسایی کردند و به یک مجموعه حداقلی ۳۸۲ ژنی دست یافتند. و هم به دلیل کاربردهای بالقوه‌اش به عنوان یک ارگانیسم مدل به خاطر اندازه کوچک ژنومش، توجه زیادی را به خود جلب کرده است. در سال ۱۹۹۶، پس از مقایسه مایکوپلاسما ژنیتالیوم با باکتری کوچک دیگری به نام هموفیلوس آنفلوآنزا، آرکادی موشگیان و یوجین کونین پیشنهاد کردند که ممکن است یک مجموعه مشترک از ۲۵۶ ژن وجود داشته باشد که می‌تواند مجموعه حداقلی ژن‌های لازم برای زیست‌پذیری باشد. انتخاب این سرده برای پروژه سینتیا به سال ۲۰۰۰ بازمی‌گردد، زمانی که کارل رایش عبارت مایکوپلاسما لابراتوریوم را ابداع کرد. ارگانیسم‌های دیگر با ژنوم‌های کوچک تا سال ۲۰۰۵، باکتری پلژی‌باکتر اوبیکه (یک آلفاپروتئوباکتریا از راسته ریکتسیالس) کوچک‌ترین ژنوم شناخته‌شده (۱٬۳۰۸٬۷۵۹ جفت‌باز) را در میان موجودات زنده آزاد داشت و یکی از کوچک‌ترین سلول‌های خودتکثیر شناخته‌شده است. این باکتری احتمالاً پرتعدادترین باکتری در جهان است (شاید ۱۰۲۸ سلول) و تخمین زده می‌شود که همراه با دیگر اعضای کلاد SAR11، بین یک‌چهارم تا نیمی از کل سلول‌های باکتریایی یا آرکئایی اقیانوس را تشکیل می‌دهند. این باکتری در سال ۲۰۰۲ از طریق توالی‌های rRNA شناسایی شد و در سال ۲۰۰۵ به‌طور کامل توالی‌یابی شد. کشت این گونه که در محیط آزمایشگاهی به تراکم رشد بالایی نمی‌رسد، بسیار دشوار است. پیوند ژنوم باکتریایی در سال ۲۰۰۷، تیم ونتر گزارش داد که موفق شده‌اند کروموزوم گونه مایکوپلاسما مایکویدس را به مایکوپلاسما کاپریکولوم منتقل کنند. mycoides: لیز (شکافت) ملایم سلول‌های به دام افتاده در آگار — آگار مذاب با سلول‌ها مخلوط شده و به شکل ژل در می‌آید — و سپس استفاده از الکتروفورز ژل در میدان پالسی (PFGE) و جداسازی باندی با اندازه صحیح (کروموزوم حلقوی ۱٫۲۵ مگاباز). | ## بخش 2: آزمایشگاه مایکوپلاسما | تراریختی با واسطه پلی‌اتیلن گلیکول برای انتقال کروموزوم حلقوی به سلول‌های فاقد DNA و سپس انجام گزینش. سنتز کروموزوم باکتریایی در سال ۲۰۰۸، گروه ونتر تولید یک ژنوم مصنوعی را توصیف کردند که نسخه‌ای از توالی M. این کار با استفاده از یک استراتژی سلسله‌مراتبی انجام شد: سنتز ← ۱ کیلوباز: توالی ژنوم توسط شرکت Blue Heron به صورت ۱٬۰۷۸ کاست ۱٬۰۸۰ جفت‌بازی با همپوشانی ۸۰ جفت‌بازی و جایگاه‌های برش آنزیم NotI سنتز شد. PCR چندگانه (Multiplex PCR) ← ۱۰۰ کیلوباز: ۱۱ گروه از مجموعه‌هایی شامل ۱۰ قطعه ۱۰ کیلوبازی متوالی (که در مخمر رشد داده شده بودند) با استفاده از PCR چندگانه و با به‌کارگیری یک جفت پرایمر برای هر قطعه ۱۰ کیلوبازی، به هم متصل شدند. جداسازی و نوترکیبی ← قطعات ثانویه جداسازی شده، به هم متصل و به اسفروپلاست‌های مخمر (بدون توالی وکتور که در قطعه ۹۰۰–۸۱۱ وجود داشت) تراریختی داده شدند. ژنوم مصنوعی در سال ۲۰۱۰، ونتر و همکارانش سویه مایکوپلاسما مایکویدس JCVI-syn1.0 را با یک ژنوم مصنوعی ایجاد کردند. برای یافتن خطا — که باعث تأخیری سه‌ماهه در کل پروژه شد — مجموعه‌ای از سازه‌های نیمه‌مصنوعی ایجاد شد. هدف از ساخت یک سلول با ژنوم مصنوعی، آزمایش روش‌شناسی به عنوان گامی برای ایجاد ژنوم‌های اصلاح‌شده در آینده بود. چندین تفاوت در مایکوپلاسما مایکویدس JCVI-syn1.0 نسبت به ژنوم مرجع وجود دارد؛ به ویژه یک ترانسپوزون IS1 از E.coli (یک آلودگی از مرحله ساخت قطعات ۱۰ کیلوبازی) و یک تکرار ۸۵ جفت‌بازی، و همچنین عناصری که برای تکثیر در مخمر لازم بودند و بقایای جایگاه‌های برش آنزیمی. بحث و جدل‌هایی در مورد اینکه آیا JCVI-syn1.0 یک ارگانیسم واقعاً مصنوعی است یا خیر، وجود داشته است. اگرچه ژنوم آن به صورت شیمیایی و در قطعات متعدد سنتز شد، اما این ژنوم به گونه‌ای ساخته شد که شباهت زیادی به ژنوم والد داشته باشد و به سیتوپلاسم یک سلول طبیعی پیوند زده شد. DNA به تنهایی نمی‌تواند یک سلول زنده ایجاد کند: پروتئین‌ها و RNAها برای خواندن DNA ضروری هستند و غشای لیپیدی برای محصور کردن DNA و سیتوپلاسم مورد نیاز است. در JCVI-syn1.0، دو گونه‌ای که به عنوان دهنده و گیرنده استفاده شدند از یک سرده بودند که این امر مشکلات بالقوه ناشی از عدم تطابق بین پروتئین‌های سیتوپلاسم میزبان و ژنوم جدید را کاهش می‌دهد. پال کیم (یک متخصص ژنتیک مولکولی در دانشگاه آریزونای شمالی در فلگستف) خاطرنشان کرد که «چالش‌های بزرگی پیش روی مهندسان ژنتیک برای ترکیب، تطبیق و طراحی کامل ژنوم یک ارگانیسم از ابتدا وجود دارد». کریگ ونتر و تیمش با استفاده از کدون پایان واترمارک‌هایی را برای امضای مخلوق خود اضافه کردند. این ۴ واترمارک (که در شکل S1 در مطالب تکمیلی مقاله نشان داده شده‌اند) پیام‌های کدگذاری‌شده‌ای هستند که به ترتیب با طول‌های ۱۲۴۶، ۱۰۸۱، ۱۱۰۹ و ۱۲۲۲ جفت‌باز در DNA نوشته شده‌اند. این پیام‌ها از کد ژنتیکی استاندارد (که در آن توالی‌های ۳تایی بازهای DNA، اسیدهای آمینه را کد می‌کنند) استفاده نمی‌کنند، بلکه از یک کد جدید که برای این منظور ابداع شده بود، بهره می‌برند و خوانندگان برای حل آن به چالش کشیده شدند. محتوای واترمارک‌ها به شرح زیر است: واترمارک ۱: یک سند اچ‌تی‌ام‌ال که در مرورگر وب به صورت متنی خوانده می‌شود و به رمزگشا تبریک می‌گوید و حاوی دستورالعمل‌هایی برای ایمیل زدن به نویسندگان جهت اثبات رمزگشایی است. واترمارک ۲: فهرستی از نویسندگان و نقل قولی از جیمز جویس: «زیستن، خطا کردن، افتادن، پیروز شدن، بازآفریدن حیات از دل حیات». واترمارک ۳: نویسندگان بیشتر و نقل قولی از رابرت اوپنهایمر (بدون ذکر نام او): «چیزها را نه آن‌گونه که هستند، بلکه آن‌گونه که می‌توانند باشند، ببینید». | ## بخش 3: آزمایشگاه مایکوپلاسما | واترمارک ۴: نویسندگان بیشتر و نقل قولی از ریچارد فاینمن: «آنچه را نتوانم بسازم، نمی‌توانم بفهمم». در این ارگانیسم جدید، تعداد ژن‌ها تنها به ۴۷۳ عدد کاهش یافته که از این تعداد، کارکرد ۱۴۹ ژن (تا سال ۲۰۱۶) کاملاً ناشناخته است. ژن‌های اضافه‌شده شامل پروتئین‌های تقسیم سلولی FtsZ و SepF و برخی پروتئین‌ها با عملکرد ناشناخته بودند. باکتری حاصل دارای ۴۹۳ ژن (۴۵۲ پروتئین و ۳۸ RNA) بر روی یک ژنوم ۵۴۳ کیلوبازی بود. یک مدل محاسباتی کامل از تمام مسیرهای متابولیک در syn3A در سال ۲۰۱۹ منتشر شد که اولین مدل درون‌رایانه‌ای (in silico) برای یک ارگانیسم زنده حداقلی محسوب می‌شود. ۸ مورد از این ژن‌ها دارای یک ارتولوگ در پایگاه داده KEGG بودند که تا حدی عملکرد احتمالی آنها را روشن می‌کند. ژنوم آن در سال ۲۰۲۴ به عنوان بخشی از مقاله‌ای منتشر شد که کاربرد آن را به عنوان یک ارگانیسم مدل برای مطالعه تعامل بین M. Syn3B قادر به اتصال به این سلول‌ها یا زندگی در درون آنها به عنوان یک انگل درون‌سلولی نبود، اما Syn1.0 این توانایی را داشت. تلاش‌ها برای شناسایی عملکرد ژن‌های ناشناخته به خوانندگان توصیه می‌شود برای آگاهی از تلاش‌های انجام شده برای شناسایی عملکرد ژن‌های ناشناخته در سویه‌های JCVI، به بخش مقدمه مقاله بیانکی و همکاران (۲۰۲۲) مراجعه کنند. هم روش‌های آزمایشگاه خیس و هم روش‌های بیوانفورماتیک برای روشن کردن عملکرد این ژن‌ها به کار گرفته شده‌اند. کار بیانکی و همکاران خود تلاشی برای یافتن پروتئین‌های همولوگ از طریق بیوانفورماتیک است. نگرانی‌ها و بحث‌ها واکنش‌ها در ۶ اکتبر ۲۰۰۷، کریگ ونتر در مصاحبه‌ای با روزنامه گاردین بریتانیا اعلام کرد که همان تیم، نسخه اصلاح‌شده‌ای از کروموزوم منفرد مایکوپلاسما ژنیتالیوم را به صورت شیمیایی سنتز کرده است. روز بعد، گروه اخلاق زیستی کانادایی، گروه ای‌تی‌سی، از طریق نماینده خود، پت مونی، بیانیه‌ای صادر کرد و گفت که «مخلوق» ونتر «شاسی است که می‌توان تقریباً هر چیزی را روی آن ساخت. این می‌تواند کمکی به بشریت مانند داروهای جدید یا تهدیدی بزرگ برای بشریت مانند سلاح‌های بیولوژیکی باشد». وقتی در این مقیاس کار می‌کنید، نمی‌توانید انتظار داشته باشید که همه خوشحال باشند.» در ۲۱ مه ۲۰۱۰، مجله ساینس گزارش داد که گروه ونتر با موفقیت ژنوم باکتری مایکوپلاسما مایکویدس را از روی یک رکورد کامپیوتری سنتز کرده و ژنوم سنتز شده را به سلول موجود باکتری مایکوپلاسما کاپریکولوم که DNA آن حذف شده بود، پیوند زده است. ونتر آن را «اولین ارگانیسم طراحی‌شده در تاریخ» نامید و استدلال کرد که این واقعیت که عملکرد ۱۴۹ ژن از ژن‌های ضروری آن ناشناخته است، به این معناست که «کل حوزه زیست‌شناسی یک‌سوم از آنچه برای حیات ضروری است را نادیده گرفته است». پوشش رسانه‌ای این پروژه به دلیل نمایشگری ونتر، پوشش رسانه‌ای گسترده‌ای دریافت کرد، تا حدی که جی کیزلینگ، یکی از پیشگامان زیست‌شناسی مصنوعی و بنیان‌گذار شرکت امیریس، اظهار داشت: «تنها مقرراتی که ما نیاز داریم، کنترل دهان همکار من است.» کاربرد ونتر استدلال کرده است که باکتری‌های مصنوعی گامی به سوی ایجاد ارگانیسم‌هایی برای تولید هیدروژن و سوخت زیستی، و همچنین برای جذب کربن دی‌اکسید و دیگر گازهای گلخانه‌ای هستند. چرچ، یکی دیگر از پیشگامان زیست‌شناسی مصنوعی، دیدگاه مخالفی را ابراز کرده و معتقد است که ایجاد یک ژنوم کاملاً مصنوعی ضروری نیست، زیرا اشریشیا کلی حتی با تمام DNA اضافی خود، کارآمدتر از M. گروه ETC، یک گروه اخلاق زیستی کانادایی، با این استدلال که دامنه این پتنت بیش از حد گسترده است، به آن اعتراض کرد. | ## جمع‌بندی | با حذف عناصر IS، شبه‌ژن‌ها و فاژها، نگهداری از ژن‌های سمی کدگذاری‌شده در پلاسمیدها، که اغلب توسط ترانسپوزون‌ها غیرفعال می‌شوند، بهبود یافت.