موضوع مقاله: توالی‌یاب دی‌ان‌ای | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # توالی‌یاب دی‌ان‌ای | مقدمه: توالی‌یاب دی‌ان‌ای ابزاری علمی است که برای خودکارسازی فرایند توالی‌یابی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود. | ## بخش 1: توالی‌یاب دی‌ان‌ای | با استفاده از نمونه‌ای از دی‌ان‌ای، از یک توالی‌یاب دی‌ان‌ای برای تعیین توالی چهار باز G (گوانین), C (سیتوزین), A (آدنین) و T (تیمین) استفاده می‌شود. برخی از توالی‌یاب‌های دی‌ان‌ای را همچنین می‌توان به عنوان ابزار و تجهیزات اپتیکی در نظر گرفت، زیرا آن‌ها سیگنال‌های نوری را که از فلوئورسازه‌های متصل به نوکلئوتید سرچشمه می‌گیرند، تجزیه و تحلیل می‌کنند. از روش توالی‌یابی به روش سنگر استفاده می‌کرد، فناوری که اساس «نسل اول» توالی‌یاب‌های دی‌ان‌ای را تشکیل می‌داد. پروژه ژنوم انسان موجب توسعه پلتفرم‌های ارزان‌تر، با توان عملیاتی بالا و دقت بیشتر، موسوم به توالی‌یاب‌های نسل بعدی (NGS) برای تعیین توالی ژنوم انسان شد. ماشین‌های توالی‌یابی نسل بعدی، سرعت توالی‌یابی دی‌ان‌ای را به‌طور قابل توجهی نسبت به روش‌های سنتی سانگر افزایش داده‌اند. نمونه‌های دی‌ان‌ای می‌توانند در عرض ۹۰ دقیقه به صورت خودکار آماده شوند، در حالی که ژنوم انسان می‌تواند با پوشش ۱۵ برابری ظرف چند روز توالی‌یابی شود. به دلیل محدودیت‌های فناوری توالی‌یابی دی‌ان‌ای، خوانش‌های بسیاری از این فناوری‌ها کوتاه‌تر از طول یک ژنوم هستند؛ بنابراین، این خوانش‌ها باید بازسازی توالی شوند تا به کانتیگهای بلندتری تبدیل شوند. داده‌ها همچنین ممکن است شامل خطاهایی باشند که به دلیل محدودیت‌های تکنیک توالی‌یابی یا خطاهای حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ایجاد می‌شوند. تولیدکنندگان توالی‌یاب‌های دی‌ان‌ای از روش‌های مختلفی برای شناسایی بازهای دی‌ان‌ای استفاده می‌کنند. پروتکل‌های خاصی که در پلتفرم‌های مختلف به کار می‌روند، تأثیر مستقیمی بر کیفیت داده‌های تولیدشده دارند؛ بنابراین، مقایسه کیفیت داده‌ها و هزینه در فناوری‌های مختلف ممکن است دشوار باشد. هر تولیدکننده روش‌های خاص خود را برای اطلاع‌رسانی خطاهای توالی‌یابی و امتیازات مربوط ارائه می‌دهد. ازآنجاکه این سیستم‌ها بر رویکردهای مختلف توالی‌یابی دی‌ان‌ای متکی هستند، انتخاب بهترین توالی‌یاب و روش معمولاً به اهداف آزمایش و بودجه موجود بستگی دارد. تاریخچه اولین روش‌های توالی‌یابی دی‌ان‌ای توسط گیلبرت (۱۹۷۳) و سانگر (۱۹۷۵) توسعه یافت. اولین توالی‌یاب خودکار دی‌ان‌ای، AB370A، در سال ۱۹۸۶ توسط اپلاید بایوسیستمز معرفی شد. این دستگاه قادر به توالی‌یابی ۹۶ نمونه به‌صورت هم‌زمان با سرعت ۵۰۰ کیلوباز در روز و با طول خوانش تا ۶۰۰ باز بود. این روش‌ها شامل توالی‌یابی سانگر، نوکلئوتیدهای فلورسانت dideoxy و ژل پلی‌اکریل‌آمید میان صفحات شیشه‌ای بودند. این سیستم‌ها هنوز هم به دلیل هزینه رقابتی، دقت و عملکرد بالا رایج‌ترین سیستم‌های NGS هستند. | ## بخش 2: توالی‌یاب دی‌ان‌ای | روش‌های توالی‌یابی این دستگاه‌ها نیازی به واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ندارند که باعث تسریع آماده‌سازی نمونه و کاهش خطاها می‌شود. همچنین داده‌های توالی‌یابی از واکنش‌های ایجادشده در زمان افزودن نوکلئوتیدها به رشته مکمل در زمان واقعی جمع‌آوری می‌شوند. شرکت پاسیفیک بایوساینسز از روش «توالی‌یابی تک‌مولکولی در زمان واقعی» (SMRT) استفاده می‌کند، درحالی‌که آکسفورد نانوپور تکنالاجیز از سامانه‌های الکترونیکی مبتنی بر فناوری نانوپوره بهره می‌برد. تولیدکنندگان توالی‌یاب‌های دی‌ان‌ای توالی‌یاب‌های دی‌ان‌ای توسط شرکت‌های زیر، از جمله دیگر شرکت‌ها، توسعه داده شده، تولید و عرضه شده‌اند. فناوری ۴۵۴ از شناسایی پیروفسفات آزادشده در واکنش پلیمراز دی‌ان‌ای هنگام افزودن نوکلئوتید به رشته الگو استفاده می‌کند. در سال ۲۰۰۹، Roche دستگاه GS Junior را عرضه کرد که یک نسخه رومیزی از توالی‌یاب ۴۵۴ با طول خوانش تا ۴۰۰ جفت باز و فرایند ساده‌تر آماده‌سازی کتابخانه و پردازش داده بود. با خودکارسازی آماده‌سازی کتابخانه و نیمه‌خودکارسازی واکنش PCR امولسیونی، نیروی انسانی می‌تواند کاهش یابد. یکی از معایب سیستم ۴۵۴ احتمال خطا در تخمین تعداد بازها در یک رشته بلند از نوکلئوتیدهای مشابه است. این خطا به عنوان خطای هموپلیمر شناخته می‌شود و هنگامی رخ می‌دهد که ۶ باز مشابه یا بیشتر به‌صورت متوالی وجود داشته باشد. یک عیب دیگر هزینه بالاتر مواد مصرفی این سیستم‌ها نسبت به سایر توالی‌یاب‌های نسل بعدی است. در سال ۲۰۱۳، Roche اعلام کرد که توسعه فناوری ۴۵۴ را متوقف کرده و دستگاه‌های ۴۵۴ را تا سال ۲۰۱۶ که فناوری آنها رقابتی نبود، به‌طور کامل از خط تولید خارج خواهد کرد. روش چندین ابزار نرم‌افزاری تولید می‌کند که برای تحلیل داده‌های توالی‌یابی ۴۵۴ بهینه‌سازی شده‌اند. نرم‌افزار همچنین نرمال‌سازی، اصلاح سیگنال، خواندن بازها و امتیازدهی کیفیت برای خوانش‌های جداگانه را اعمال می‌کند. این نرم‌افزار همچنین از مونتاژ de novo و تحلیل رونوشت‌ها و همچنین شناسایی انواع ایزوفورم پشتیبانی می‌کند. این نرم‌افزار قادر به تولید فایل‌های خروجی برای ارزیابی است که نشان‌دهنده درج‌ها، حذف‌ها و SNPها هستند. در سال ۲۰۰۹، خروجی از 20G در هر اجرا در آگوست به 50G در هر اجرا در دسامبر افزایش یافت. در سال ۲۰۱۰، ایلومینا دستگاه HiSeq 2000 را با خروجی ۲۰۰ و سپس 600G در هر اجرا (در مدت ۸ روز) منتشر کرد. | ## بخش 3: توالی‌یاب دی‌ان‌ای | در زمان عرضه، HiSeq 2000 یکی از ارزان‌ترین پلتفرم‌های توالی‌یابی با هزینه ۰٫۰۲ دلار برای هر میلیون باز بود که توسط گروه بی‌جی‌آی محاسبه شد. یک اجرای توالی‌یابی می‌تواند در صورت استفاده از آماده‌سازی خودکار نمونه دی‌ان‌ای در ۱۰ ساعت انجام شود. پس از پنج ارتقا، سیستم توالی‌یابی 5500xl در سال ۲۰۱۰ منتشر شد که طول خوانش را به 85bp افزایش داد، دقت را به ۹۹٫۹۹٪ بهبود بخشید و در هر اجرای ۷ روزه 30G تولید کرد. این محدودیت استفاده از آن را در آزمایش‌هایی که طول خوانش اهمیت کمتری دارد، مانند توالی‌یابی مجدد و تحلیل ترانسکریپتوم، و اخیراً آزمایش‌های ChIP-Seq و متیلاسیون، محدود کرده است. زمان آماده‌سازی نمونه دی‌ان‌ای برای سیستم‌های SOLiD با استفاده از روش‌های خودکار آماده‌سازی کتابخانه‌های توالی‌یابی مانند سیستم Tecan به میزان قابل‌توجهی کاهش یافته است. با این حال، نرم‌افزارهایی که اطلاعات اصلی فضای رنگی را در نظر می‌گیرند می‌توانند نتایج دقیق‌تری ارائه دهند. بکمان کولتر بکمان کولتر (در حال حاضر داناهر) قبلاً دستگاه‌های توالی‌یاب دی‌ان‌ای مبتنی بر پایان زنجیره و الکتروفورز مویینه را تحت مدل CEQ، شامل CEQ 8000 تولید می‌کرد. این شرکت اکنون سیستم تحلیل ژنتیکی GeXP را تولید می‌کند که از توالی‌یابی دی‌ان‌ای استفاده می‌کند. خطاهای خام بیشتر توسط روش اجماع دایره‌ای - که در آن یک رشته بارها خوانده می‌شود - یا با استفاده از استراتژی‌های بهینه‌سازی‌شده بازسازی توالی تصحیح می‌شوند. MinION دی‌ان‌ای را مستقیماً با عبور مولکول از میان یک نانوپوره معلق در غشا، با سرعت ۴۵۰ باز در ثانیه رمزگشایی می‌کند. در ابتدا دقت دستگاه ۶۰ تا ۸۵ درصد بود، در حالی که در دستگاه‌های معمولی این مقدار ۹۹٫۹ درصد است. حتی نتایج با دقت کمتر نیز ممکن است مفید باشد، زیرا این دستگاه طول خوانش‌های بلندی تولید می‌کند. در اوایل سال ۲۰۲۱، پژوهشگران دانشگاه بریتیش کلمبیا با استفاده از برچسب‌های مولکولی خاص توانستند نرخ خطای پنج تا ۱۵ درصد دستگاه را به کمتر از ۰٫۰۰۵ درصد کاهش دهند، حتی هنگام توالی‌یابی بخش‌های طولانی دی‌ان‌ای. این فناوری بر اساس توالی‌یابی نانوبال دی‌ان‌ای و فناوری‌های ترکیبی پروب-لنگر طراحی شده است که در آن نانوبال‌های دی‌ان‌ای (DNBs) روی یک تراشه آرایه الگودار با استفاده از یک سامانهٔ سیال بارگذاری می‌شوند و سپس یک آغازگر توالی‌یابی به ناحیه آداپتور DNBs اضافه می‌شود تا فرایند هیبریداسیون انجام شود. دستگاه DNBSEQ-T7 می‌تواند خوانش‌های کوتاه را با مقیاس بسیار بزرگی تولید کند—تا ۶۰ ژنوم انسانی در روز. | ## جمع‌بندی | پژوهشگران بانک ملی ژن چین از روش‌های جدیدی استفاده کردند که برای اولین بار توالی‌یابی کل ژنوم بدون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) را با آرایه‌های DNBSEQ انجام دادند.