موضوع مقاله: سنجش پروتئین برادفورد | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # سنجش پروتئین برادفورد | مقدمه: آزمون سنجش پروتئین برادفورد (همچنین به عنوان آزمون سنجش پروتئین کوماسی شناخته می‌شود) توسط ماریون ام. | ## بخش 1: سنجش پروتئین برادفورد | این یک روش آنالیزی طیف‌سنجی سریع و دقیق است که برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین در محلول استفاده می‌شود. رنگ :کوماسی بریلینت بلو G-250 به سه شکل آنیونی (آبی)، خنثی (سبز) و کاتیونی (قرمز) وجود دارد. در طی تشکیل این کمپلکس، شکل قرمز رنگ کوماسی ابتدا الکترون آزاد خود را به گروه‌های یونی روی پروتئین اهدا می‌کند که باعث تغییر ساختار پروتئین و در نتیجه باز شدن قسمت آبگریز آن می‌شود. این قسمت‌های آبگریز در ساختار سوم پروتئین از طریق اولین برهمکنش پیوند (نیروهای واندروالس) که گروه‌های آمین مثبت را در مجاورت بار منفی رنگ قرار می‌دهد، به‌صورت غیر کووالانسی به ناحیه غیر قطبی رنگ متصل می‌شوند. هنگامی که رنگ به پروتئین متصل می‌شود، باعث تغییر حداکثر جذب از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر می‌شود به همین دلیل است که قرائت جذب در ۵۹۵ نانومتر گرفته می‌شود شکل کاتیونی (متصل نشده) سبز/قرمز است و حداکثر طیف جذبی آن در ۴۶۵ نانومتر است. شکل آنیونی (متصل شده) رنگ که توسط فعل و انفعالات آبگریز و یونی در کنار هم نگه داشته می‌شود، دارای حداکثر طیف جذبی است که ۵۹۵ نانومتر است. افزایش جذب در ۵۹۵ نانومتر با مقدار رنگ متصل شده و در نتیجه با مقدار (غلظت) پروتئین موجود در نمونه متناسب است و هر چه رنگ اتصال بیشتری با پروتئین داشته باشد جذب بیشتری به دست می‌آید. برخلاف سایر تست‌های سنجش پروتئین، آزمایش برادفورد کمتر در معرض تداخل ترکیبات شیمیایی مختلف مانند سدیم، پتاسیم یا حتی کربوهیدرات‌هایی مانند ساکارز است که ممکن است در نمونه‌های پروتئینی وجود داشته باشد، غلظت بالای دترجنت‌ها تنها استثناء برای احتمال تداخل در این آزمون است. سدیم دودسیل سولفات (SDS)، یک شوینده متداول است که ممکن است در پروتئین استخراج شده یافت شود، زیرا از آن برای لیز سلولی از طریق تخریب لایه لیپیدی غشایی و دناتوره کردن پروتئین‌ها برای SDS-PAGE استفاده می‌شود. در حالی که سایر مواد شوینده در غلظت بالا با این آزمایش تداخل می‌کنند، تداخل ناشی از SDS در دو حالت مختلف است و هر کدام در غلظت متفاوتی رخ می‌دهد. هنگامی که غلظت SDS کمتر از غلظت بحرانی میسل (معروف به CMC، 0.00333% W/V تا ۰٫۰۶۶۷٪) در محلول رنگ کوماسی است، ماده شوینده تمایل دارد به شدت با پروتئین متصل شود و مکان‌های اتصال پروتئین را برای معرف رنگ مهار کند. هنگامی که غلظت SDS بالاتر از CMC باشد، مواد شوینده به شدت با شکل سبز رنگ کوماسی مرتبط می‌شود و باعث می‌شود تعادل تغییر کند و در نتیجه شکل آبی بیشتری تولید شود. بافری که جهت تهیه نمونه پروتئین استفاده می‌شود می‌تواند یکی دیگر از عوامل تداخل باشد. غلظت بالای بافر به دلیل تخلیه پروتون‌های آزاد از محلول توسط باز مزدوج از بافر، باعث می‌شود غلظت پروتئین بیش از حد تخمین زده شود. برخی از ترکیبات بی‌رنگ مانند پروتئین‌ها را به دلیل وجود حلقه آروماتیک مانند تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین می‌توان با چگالی نوری ۲۸۰ نانومتر اندازه‌گیری کرد است، اما اگر هیچ‌یک از این اسیدهای آمینه وجود نداشته باشد، جذب در ۲۸۰ نانومتر قابل اندازه‌گیری نیست. برای اینکار نیاز به اسپکتروفتومترهایی که قادر به اندازه‌گیری در محدوده UV می‌باشد. علاوه بر این، حداکثر جذب در ۲۸۰ نانومتر مستلزم آن است که پروتئین‌ها حاوی اسیدهای آمینه آروماتیک مانند تیروزین (Y)، فنیل آلانین (F) و/یا تریپتوفان (W) باشند. همه پروتئین‌ها حاوی این اسیدهای آمینه نیستند، و به همین دلیل یکی از معایب این روش است. اگر اسیدهای نوکلئیک در نمونه وجود داشته باشد، نور را در۲۸۰ نانومتر نیز جذب می‌کنند، که باعث می‌شود نتایج را بیشتر منحرف کنند. با استفاده از سنجش پروتئین برادفورد، می‌توان با مخلوط کردن نمونه‌های پروتئینی با رنگ Coomassie brilliant blue G-250 (معرف برادفورد) و اندازه‌گیری میزان جذب آنها در ۵۹۵ نانومتر، که در محدوده قابل مشاهده قرار دارد و ممکن است با استفاده از دوربین تلفن همراه هوشمند به دقت اندازه‌گیری شود از بروز این مشکلات جلوگیری کرد. | ## بخش 2: سنجش پروتئین برادفورد | این آزمون در یک مرحله انجام می‌شود که در آن معرف برادفورد به همراه نمونه به یک لوله آزمایش اضافه می‌شود. رنگ از طریق فرآیندی که حدود ۲ دقیقه طول می‌کشد به پروتئین‌ها متصل می‌شود، در محلول‌های اسیدی حداکثر جذب رنگ از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر تغییر می‌کند. این رنگ از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیکی با گروه‌های آمینو و کربوکسیل و همچنین برهمکنش‌های وان دروالس، پیوندهای غیر کووالانسی قوی با پروتئین‌ها ایجاد می‌کند. فقط مولکول‌هایی که به پروتئین‌های موجود در محلول متصل می‌شوند، این تغییر را در جذب نشان می‌دهند، که نگرانی تغییر جذب توسط مولکول‌های متصل نشده رنگ را از بین می‌برد. این فرایند سودمندتر است زیرا نسبت به روش‌های دیگر کم هزینه تر، استفاده از آن آسان و حساسیت رنگ به پروتئین بالایی دارد. پس از آنکه ۵ دقیقه انکوباسیون انجام شد، مقدار جذب را در ۵۹۵ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر یا دوربین تلفن هوشمند تلفن همراه خوانده شود..(روش RGBradford). سنجش پروتئین برادفورد یک تکنیک فوق‌العاده حساس است و به کمک این متد می‌توان مقادیر ۱ تا ۲۰ میکروگرم پروتئین را اندازه‌گیری کند. نمونه‌های پروتئینی معمولاً حاوی نمک‌ها، حلال‌ها، بافرها، نگهدارنده‌ها، عوامل کاهنده و عوامل کلات کننده فلزی هستند. سایر آزمایش‌های پروتئین مانند BCA وLowry به دلیل مولکول‌هایی مانند، عوامل کاهنده که در آزمایش تداخل می‌کنند غیر مؤثر هستند. استفاده از برادفورد می‌تواند در برابر این مولکول‌ها سودمند باشد زیرا آنها با یکدیگر سازگار هستند و تداخلی ندارند. با استفاده از شیب خط نمودار به دست آمده (جذب در برابر غلظت پروتئین در میکروگرم بر میلی لیتر) می‌توان به راحتی بن غلظت پروتئین‌ها را محاسبه نمود. معایب تست برادفورد در یک محدوده ۰ میکروگرم در میلی لیتر تا ۲۰۰۰ میکروگرم بر میلی لیترخطی است، به همین جهت ضروری است که رقت‌های نمونه قبل از آنالیز تهیه شوند. در ساخت این رقت‌ها، خطا در یک رقت در رقت‌های بعدی ترکیب می‌شود که منجر به یک رابطه خطی می‌شود که ممکن است همیشه دقیق نباشد. در شرایط قلیایی ودر حضور دترجنت‌هایی، مانند SDS، می‌توانند در توانایی رنگ برای اتصال به پروتئین از طریق زنجیره‌های جانبی آن اختلال ایجاد کنند. با این حال، برخی از پروتئین‌ها که توسط سد هسته ای بازدارنده شده‌اند، ممکن است سبب خطا در اندازه‌گیری غلظت گردند. معرف‌هایی که در این متد استفاده می‌شود تمایل به ایجاد رنگ بر روی لوله‌های آزمایش دارند. به همین دلیل از همان لوله‌های آزمایشی نمی‌توان استفاده کرد زیرا لکه ایجاد شده بر میزان جذب تأثیر می‌گذارد. هنگامی که بیش از یک محلول آزمایش می‌شود، مهم است که مطمئن شوید هر نمونه برای مدت زمان یکسانی برای مقایسه دقیق انکوبه می‌شود. همچنین پروتئین‌ها با وجود دترجنت‌ها مهار می‌شود، اگرچه این مشکل را می‌توان با افزودن سیکلودکسترین به مخلوط سنجش کاهش داد. این یک نقطه ضعف است زیرا ترجیح رنگ برای اتصال به این اسیدهای آمینه می‌تواند منجر به پاسخ متفاوت سنجش بین پروتئین‌های مختلف شود. | ## بخش 3: سنجش پروتئین برادفورد | می‌توان با ایجاد تغییراتی در روش اصلی، مانند افزایش pH با افزودن NaOH یا افزودن رنگ بیشتر این روش را به مواد شوینده ای که می‌توانند با نمونه تداخل داشته باشند حساس نمود. نمونه روش برادفورد مواد مورد نیاز: گاما گلوبولین پلاسمای گاوی لیوفیلیزه Coomassie brilliant blue 0.15 NaCl اسپکتروفتومتر و کووت میکروپیپت‌ها روش (آزمون استاندارد، ۲۰–۱۵۰ میکروگرم پروتئین؛ ۲۰۰–۱۵۰۰ میکروگرم در میلی لیتر) تهیه یک سری استاندارد رقیق شده با ۰٫۱۵ مولار نمک طعام تا غلظت نهایی ۰ (خالی = بدون پروتئین)، ۲۵۰، ۵۰۰، ۷۵۰ و ۱۵۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر همچنین رقت‌های سریالی نمونه ناشناخته را برای اندازه‌گیری آماده کنید. ۱۰۰ میکرولیتر از هر یک از موارد فوق را به یک لوله آزمایش جداگانه (یا لوله اسپکتروفتومتر در صورت استفاده از اسپکترونیک ۲۰) اضافه کنید. به هر لوله ۵٫۰ میلی لیتر کوماسی بلو اضافه کنید و با گرداب یا وارونگی مخلوط کنید. اسپکتروفتومتر را روی طول موج ۵۹۵ تنظیم کنید نانومتر، با استفاده از لوله ای که حاوی پروتئین نیست (خالی). ۵ دقیقه صبر کنید و هر یک از استانداردها و هر یک از نمونه‌ها را در ۵۹۵ بخوانید طول موج نانومتر جذب استانداردها در مقابل غلظت آنها را ترسیم کنید. روش (سنجش میکرو، ۱–۱۰ میکروگرم پروتئین در میلی لیتر) غلظت‌های استاندارد پروتئین ۱، ۵، ۷٫۵ و ۱۰ میکروگرم بر میلی لیتر را تهیه کنید فقط یک نمونه بلانک از NaCl آماده کنید. ۱۰۰ میکرولیتر از هر یک از موارد فوق را به لوله‌های جدا اضافه کنید (از لوله‌های میکرو سانتریفیوژ استفاده کنید) و ۱٫۰ میلی لیتر Coomassie Blue به هر لوله اضافه کنید. یک اسپکتروفتومتر را روشن کرده و روی طول موج ۵۹۵ نانومتر تنظیم کنید و اسپکتروفتومتر را با استفاده از کووت‌های ۱٫۵ میلی لیتری بلانک کنید یا از دوربین تلفن همراه هوشمند (روش RGBradford) استفاده کنید. ۲ دقیقه صبر کنید و میزان جذب هر استاندارد و نمونه را در ۵۹۵ نانومتر بخوانید جذب استانداردها در مقابل غلظت آنها را ترسیم کنید. استفاده از داده‌های به دست آمده برای یافتن غلظت نمونه مجهول برای به‌دست آوردن یک منحنی استاندارد، باید از غلظت‌های مختلف BSA (آلبومین سرم گاوی) استفاده نمود و منحنی استاندارد را با غلظت رسم شده در محور x و جذب رسم شده در محور y ایجاد کرد. به منظور ایجاد یک منحنی استاندارد دقیق از دامنه غلظتی محدودی از BSA استفاده می‌شود (2-10 ug/mL). استفاده از دامنه وسیعی از غلظت پروتئین، تعیین غلظت پروتئین مجهول را دشوارتر می‌کند. در ادامه نحوه استفاده از منحنی استاندارد جهت محاسبه غلظت پروتئین مجهول توضیح داده شده است. ابتدا یک خط با بهترین تناسب یا رگرسیون خطی اضافه کنید و معادله را روی نمودار نمایش دهید. R نشان دهنده مجموع مقادیر مربع خط است که از هر نقطه داده کم می‌شود؛ بنابراین، اگر R 2 بسیار کمتر از یک شد، بیهتر است که آزمایش را مجدداً تکرار شود تا داده‌های قابل اعتمادتر به‌دست آورید. در نمودار ۱، x غلظت و y جذب است، بنابراین باید معادله را تغییر داد تا x به‌دست آید و جذب نمونه مجهول اندازه‌گیری شده را وارد کرد. این نمونه‌ها را نمی‌توان به کمک این معادله محاسبه نمود زیرا معادله داده شده نمی‌تواند برای اعداد خارج از محدودیت‌های آن اعمال شود. در مقیاس بزرگ، باید ضریب خاموشی را با استفاده از قانون بیر-لامبرت A=εLC محاسبه کرد که در آن A جذب اندازه‌گیری شده، ε شیب منحنی استاندارد، L طول کووت و C غلظت است. در حال تعیین شدن در مقیاس میکرو، ممکن است از یک کووت استفاده نشود و بنابراین فقط باید برای حل x دوباره مرتب شود. | ## جمع‌بندی | برای انجام این کار، ابتدا باید غلظت پروتئین را بر حجم تقسیم کرد تا غلظت را نرمال کرد و سپس در مقدار رقیق شده ضرب کرد تا رقت ایجاد شده در پروتئین قبل از انجام آزمایش تصحیح شود.