موضوع مقاله: کتابخانه سی‌دی‌ان‌ای | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # کتابخانه سی‌دی‌ان‌ای | مقدمه: این قطعات با یکدیگر بخشی از رونوشت ارگانیسم را تشکیل می‌دهند و به عنوان یک «کتابخانه» ذخیره می‌شوند. | ## بخش 1: کتابخانه سی‌دی‌ان‌ای | در سلول‌های یوکاریوتی، mRNA بالغ پیرایش شده‌است، از این رو cDNA ساخته شده فاقد اینترون‌ها می‌باشد و می‌تواند به آسانی در یک سلول باکتریایی بیان شود. از آنجایی که محصولات ژن‌ها به راحتی شناسایی می‌شوند، اطلاعات کتابخانه‌های cDNA یک ابزار قدرتمند و مفید می‌باشد؛ اما این کتابخانه‌ها فاقد اطلاعات مربوط به افزاینده (enhancers)، اینترون و دیگر عناصر تنظیمی که در یک کتابخانه DNA ژنومی یافت می‌شوند، می‌باشند. در یوکاریوت‌ها، یک دم پلی آ (A) (متشکل از یک رشته بلند از نوکلئوتیدهای آدنین) mRNA را از tRNAها و rRNA‌ها متمایز می‌کند و بنابراین می‌توان از آن به عنوان یک سایت آغازگر (پرایمر) برای رونویسی معکوس استفاده کرد. البته این مشکل وجود دارد که تمام رونوشت‌ها ناحیه دم پلی آ را ندارند، از جمله رونوشت‌های رمزگردان هیستون‌ها. تصفیه به روش ستون با استفاده از رزین‌های پوشش داده شده با نوکلئوتیدهای الیگومری dT انجام می‌گیرد که در آن تنها mRNAهای دارای دم پلی آ به ستون متصل می‌شوند. ساخت cDNA هنگامی که mRNA خالص سازی می‌شود oligo-dT (توالی کوتاهی از نوکلئوتید دئوکسی-تیمیدین) به عنوان یک پرایمر مکمل به دم پلی آ متصل شده و یک انتهای آزاد ’۳-OH فراهم می‌کند که می‌تواند توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس طویل شود تا رشته DNA مکمل را ایجاد کند. با این حال، DNA پلیمراز برای سنتز یک رشته مکمل، به یک انتهای آزاد ’۳-OH نیاز دارد. | ## بخش 2: کتابخانه سی‌دی‌ان‌ای | این انتهای آزاد توسط خود sscDNA با ایجاد یک حلقه سنجاق سری در انتهای ۳' از طریق پیچش بر روی خود فراهم می‌شود. پلیمراز انتهای '۳-OH را طویل می‌کند و بعد از آن حلقهٔ انتهای ’۳ با عملکرد قیچی مانند آنزیم نوکلئاز S1 باز می‌شود. سپس آنزیم‌های اندونوکلئاز محدودکننده و DNA لیگاز برای کلون کردن توالی به درون پلاسمید باکتریایی استفاده می‌شوند. پس از انتخاب، ذخیره ای از این باکتری‌ها تولید می‌شود که بعدها رشد داده شده و برای گردآوری در کتابخانه cDNA توالی یابی شوند. موارد استفاده از کتابخانه‌های cDNA از آنجایی که میزان اطلاعات هنگام تولید مثل ژنوم یوکاریوتی کاهش می‌یابد، کتابخانه‌های cDNA معمولاً هنگام تولید مثل ژنوم یوکاریوتی استفاده می‌شوند، تا تعداد زیاد نواحی غیر کدشونده را از کتابخانه حذف نماید. پروکاریوت‌ها فاقد اینترون در DNAی خود هستند و به همین دلیل فاقد آنزیم‌هایی هستند که می‌توانند اینترون‌ها را در طول فرایند رونویسی قطع کنند. کتابخانه‌های cDNA برای روش ژنتیک معکوس که در آن اطلاعات ژنومی اضافی کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرد، بسیار مناسب هستند. | ## بخش 3: کتابخانه سی‌دی‌ان‌ای | کتابخانه‌های DNAی ژنومی اطلاعات جزئی تر بیشتری در مورد ارگانیسم‌ها ارائه می‌دهند، اما تولید و حفظ آن‌ها شدیداً وابسته به منبع است. کلون کردن cDNA مولکول‌های cDNA می‌توانند با استفاده از اتصال دهنده‌های سایت‌های محدودکننده کلون شوند. اتصال دهنده‌ها، قطعات دو رشته‌ای DNA کوتاه با حدود ۸ تا ۱۲ جفت باز هستند که شامل یک سایت برش اندونوکلئاز محدودکننده می‌باشند مثل BamHI. اتصال دهنده و cDNA، هر دو انتهای صاف دارند که می‌توانند با استفاده از غلظت بالایی از DNA لیگاز T4 به هم متصل شوند. سپس در مولکول cDNA به وسیله برش نواحی انتهایی cDNA (که در حال حاضر اتصال دهنده‌هایی با یک سایت گنجانیده شده‌اند) با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز مناسب، انتهاهای چسبنده تولید می‌شود. | ## جمع‌بندی | یک حامل کلون کننده (پلاسمید) نیز پس از آن با آنزیم اندونوکلئاز مناسب برش داده می‌شود.