موضوع مقاله: همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم | مقدمه: همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم، یک روش همگذاری دنبالهٔ de novo یا ازسرنو، برای ساخت رشتهٔ ترانسکریپتومیکس بدون کمک گرفتن از ژنوم مرجع است. | ## بخش 1: همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم | مقدمه به دنبال توسعهٔ تکنولوژی‌های جدید برای توالی‌یابی، در سال‌های ۲۰۰۸ تا ۲۰۱۲ کاهش شدیدی در هزینهٔ توالی‌یابی اتفاق افتاد. مهم‌تر، این بود که تنها ترانسکریپتوم مربوط به جاندارانی که در حوزهٔ تحقیقات علمی بیشتر مورد توجه و جالب بودند و امکانات برای آن‌ها فراهم تر بود توالی‌یابی می‌شدند. بررسی موجودات غیر مدل می‌تواند دید جدیدی از مکانیزم‌های زیربنای «تنوع نوآوری‌های شگفت‌انگیز مورفولوژیکی» که فراوانی زندگی روی سیارهٔ زمین را ممکن ساخته، فراهم کند. همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم معمولاً روشی است که در مطالعهٔ موجودات غیر مدل ترجیح داده می‌شود، زیرا این روش کم‌هزینه‌تر و آسان‌تر از ساخت ژنوم است و متدهای مبتنی بر مرجع بدون وجود ژنوم امکان‌پذیر نیستند. ترانسکریپتوم این موجودات می‌تواند پروتئین‌های جدید و ایزوفورم‌های آن‌ها را که در این‌چنین آثار یکتای زیستی وجود دارند آشکار سازد. همگذاری ازسرنو در مقایسه با روش مبتنی بر مرجع مجموعه‌ای از ترانسکریپت‌های همگذاری شده، امکان مطالعات ابتدایی بیان ژن را فراهم کرده و می‌کنند. پیش از توسعهٔ برنامه‌های کامپیوتریِ همگذاری ترانسکریپتوم، داده‌های ترانسکریپتوم ابتدائاً با نگاشت روی ژنوم مرجع تحلیل می‌شدند. تنوع جایگزینی، بعضی از اگزون‌ها را (نه لزوماً تمام آن‌ها را) دقیقاً به ترتیب آمدنشان در ژنوم، کنار هم قرار می‌دهد که این می‌تواند به نوعی ایزوفورم‌های مختلف پروتئین را بسازند و همین تنوع درآمدن اگزوم‌هاست که باعث این تنوع و تفاوت می‌شود. حتی در زمانی که ژنوم مرجع در دسترس است، همگذاری ازسرنو باید انجام گیرد، این کار ترانسکریپت‌هایی را که از بخش‌هایی از ژنوم، که در ژنوم همگذار شده قرار ندارند و رونویسی کرده‌است را پوشش می‌دهد.Martin, Jeffrey A. همگذاری ترانسکریپتوم در مقایسه با ژنوم برخلاف سطح پوشش دنبالهٔ ژنوم- که در نتیجهٔ محتوای تکراری در نواحی غیر کدینگ اینترون دی‌ان‌ای، می‌تواند به صورت تصادفی متفاوت باشد- سطح پوشش توالی ترانسکریپتوم مستقیماً نشان‌دهندهٔ سطح بیان ژن‌هاست. این توالی‌های تکرار شده هم‌چنین می‌توانند باعث ایجاد ابهام در تشکیل contigها در همگذاری ژنوم شوند، در حالیکه ابهام در contigهای فرایند همگذاری ترانسکریپتوم، معمولاً به ایزوفورم‌های تقسیم شده یا تنوع جزئی مربوط به اعضای خانواده‌ای از ژن‌ها ارتباط دارد. همگذاری ژنوم به چندین دلیل، به صورت مستقیم نمی‌تواند در همگذاری ترانسکریپتوم مورد استفاده قرار بگیرد. | ## بخش 2: همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم | اول، عمق تعیین توالی ژنوم معمولاً به اندازه سراسر طول ژنوم می‌باشد، اما عمق ترانسکریپتوم می‌تواند متنوع باشد. دوم اینکه هر دو رشتهٔ دی‌ان‌ای همیشه در ژنوم توالی‌یابی می‌شوند، اما دادهٔ RNA-seq می‌تواند فقط یک رشته باشد. زیرا تنوع ترانسکریپت حاصل از یک ژن، می‌تواند با استفاده از اگزون‌های مختلف و ترکیب آن‌ها ایجاد شده باشد و حل این ابهام و چندگانگی سخت‌تر است. انواع روش‌ها Rna-seq پس از این‌که آران‌ای از سلول به صورت خالص استخراج شد، به عنوان ورودی به ابزارهای توالی‌یابی با توان عملکردی بالا داده می‌شود، جایی که در ابتدا با استفاده از آنزیمی خاص به صورت معکوس رونویسی می‌شود تا cDNA یا دی‌ان‌ای مکمل ساخته شود. سپس این cDNA بر حسب پلت‌فرمی که استفاده می‌شود می‌تواند به طول‌های متنوعی تقسیم‌بندی شود. الگوریتم‌های همگذاری Readهای توالی cDNAها بوسیلهٔ برنامه‌های همگذاری ترانسکریپت، به ترانسکریپت همگذار می‌شوند. به احتمال زیاد تنوع بعضی از آمینواسیدها بین ترانسکریپت‌ها، که به طریق دیگری مشابه هستند، ایزوفورمهای متفاوت پروتئین‌ها را ایجاد می‌کنند. هم‌چنین ممکن است ژن‌های متفاوت در یک خانوادهٔ مشابه را نشان دهند، یا می‌تواند ژن‌هایی باشند که فقط بخش حفاظت شده‌ای از ترانسکریپت را به اشتراک دارند و این بستگی به درجهٔ تنوع آن‌ها دارد. با این که این برنامه‌ها در همگذاری ژنوم موفق عملکرده‌اند، همگذاری ترانسکریپتوم چالش‌های منحصربفرد خودش را دارد. درحالی‌که پوشش بالای توالی برای ژنوم، می‌تواند نشان دهندهٔ وجود توالی‌های تکراری باشد و در نتیجه پنهان شود، اما برای ترانسکریپتوم، می‌تواند نشان دهندهٔ فراوانی باشد. علاوه بر این، برخلاف تعیین توالی ژنوم، توالی یابی ترانسکریپتوم می‌تواند یک رشته‌ای باشد. همگذارهای readهای کوتاه، معمولاً یکی از این دو الگوریتم پایه‌ای را انتخاب می‌کنند: گراف هم‌پوشانی و گراف دی براین. | ## بخش 3: همگذاری ازسرنو ترانسکریپتوم | گراف هم‌پوشانی برای بیشتر همگذاری‌هایی بکار گرفته می‌شود که برای توالی‌یابی با تکنولوژی Sanger طراحی شده‌اند. هم‌پوشانی بین هر جفت از readها محاسبه می‌شود و به یک گراف، ترجمه و تبدیل می‌شود که در آن هر گره نشان‌دهندهٔ دنبالهٔ یک read است. این الگوریتم از نظر محاسباتی سنگین تر از گراف دی‌براین است، هم‌چنین در همگذاریِ تعداد کمتری از readهای با درجهٔ بالاتری از هم‌پوشانی، مؤثرتر عمل می‌کند. گراف دی براین، k تایی‌های متوالی موجود در هر read را (معمولاً بین ۲۵ تا ۵۰ باز) بر اساس دنبالهٔ k-1 تایی محافظت شده، همگذاری می‌کند تا contigها را بسازد. تفسیر کاربردی تفسیر کاربردی‌ ترانسکریپت همگذاری شده، به ما تفسیر و دیدی در مورد کاربردهای مولکولی خاص، مؤلفه‌های سلولی و فرایندهای زیستی‌ای که احتمالاً پروتئین‌هایی در آن‌ها درگیر هستند، می‌دهد. نحوهٔ کارکردش به این صورت است که contigهای همگذار شده را بین پایگاه داده‌های پروتئین‌های غیر مدل (در NCBI) بلاست می‌کند، سپس بر اساس تشابه دنباله‌ای، آن‌ها را تفسیر می‌کند. Goanna یکی دیگر از برنامه‌های تفسیر هستی‌شناسی ژنی است که مخصوص حیوانات و ژن محصولات گیاهان کشاورزیِ در یک سبک است. تأیید و کنترل کیفیت زمانی که ژنوم مرجع موجود نیست، کیفیت contigهای همگذار شده باید تأیید شود. این تأیید یا از طریق مقایسه دنباله‌های تولید شده با readهایی که از آن‌ها ساخته شده‌است بدون نیاز به مرجع انجام می‌گیرد، یا با هم‌ردیفی دنباله‌های محافظت شدهٔ حوزهٔ ژن در mRNA ترانسکریپتوم، با ترانسکریپتوم یا ژنوم گونه‌های مربوطِ نزدیک به مرجع. یک روش دیگر، طراحی پرایمرهای PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) برای ترانسکریپت پیش‌بینی شده‌است، سپس باید با استفاده از cDNA تقویت و زیاد شوند. ابتدا مجموعه داده‌ها را به مجموعهٔ کوچکتری از contigهای غیر هم‌پوشان کاهش می‌دهد، و رخدادهای پیوند از قبیل پرش از اگزون، اگزون‌های جدید، اینترون‌های حفظ شده، اینترون‌های جدید و جابجایی جایگزینی را تشخیص می‌دهد. Trinity از سه ماژل نرم‌افزاری مستقل که به صورت پشت سر هم برای تولید ترانسکریپت عمل می‌کنند، تشکیل شده‌است: Inchworm ابتدا داده‌های RNA-seq را به دنباله‌های ترانسکریپت همگذار می‌کند، و معمولاً برای ایزوفورم غالب، ترانسکریپت با طول کامل را تولید می‌کند، اما نهایتاً فقط بخش‌های یکتایی از ترانسکریپت پیوند زده شدهٔ جایگزین را گزارش می‌دهد. | ## جمع‌بندی | هر خوشه نمایش‌دهندهٔ پیچیدگی ترانسکریپت به صورت کامل برای یک ژن است (یا یک خانواده یا مجموعه‌ای از ژن‌ها که دارای بخش محافظت‌شدهٔ مشترکی هستند).