موضوع مقاله: آنتی‌بادی منوکلونال | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # آنتی‌بادی منوکلونال | مقدمه: پیوند= نمایش کلی از روش مورد استفاده برای تولید آنتی‌بادی‌های منوکلونال که از طریق برداشت از طحال موش به دست می‌آید. | ## بخش 1: آنتی‌بادی منوکلونال | پادتن‌های تَک‌تیرهبرابر فارسی از: سازمان دامپزشکی استان آذربایجان غربی یا آنتی‌بادی منوکلونال به اختصار mAb یا moAb، پادتنهایی تک‌گونه و همانند یکدیگر هستند. علت این همانندی این است که پادتن‌ها منوکلونال توسط نوعی سلول ایمنی همانندسازی‌شده از یک سلول والد تولید می‌شوند. آنتی‌بادی‌های منوکلونال ممکن است میل ترکیبی تک‌ظرفیتی داشته باشند و فقط به همان اپی‌توپ (بخشی از آنتی‌ژن که توسط آنتی‌بادی شناسایی می‌شود) متصل شوند. در مقابل، آنتی‌بادی‌های پلی کلونال به اپی توپ‌های متعدد متصل می‌شوند و معمولاً توسط چندین نوعِ مختلف سلول‌های پلاسما ترشح کننده آنتی‌بادی ساخته می‌شوند. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال دو گونه ای را نیز می‌توان برای اهداف درمانی، به یک آنتی‌بادی مونوکلونالِ دو اپی‌توپی تولید کرد. تقریباً برای همه نوع ماده‌ای می‌توان پادتن تک‌تیره ساخت که به آن اتصال یابد و برای شناسایی یا پاکسازی آن، استفاده کرد. این توانایی به ابزار مهمی در زیست‌شیمی، زیست‌شناسی مولکولی و پزشکی تبدیل گشته‌است. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال در سطح بالینی برای تشخیص و هم برای درمان چندین بیماری استفاده می‌شوند. تجویز آنتی‌بادی‌های مونوکلونال توسط چندین کشور برای درمان علائم متوسط COVID-19، مجاز در نظر گرفته شده‌است. نحوه تولید پادتن‌های تک‌تیره در محیط کشت خارج از بدن به‌طور طبیعی لنفوسیت‌های B (تولیدکننده پادتن‌ها) طی چند هفته می‌میرند. به همین علت این لنفوسیت‌ها با سلول‌های توموری که سلول‌های میلوم نام دارند، ادغام می‌شوند. سلول‌های میلوم مانند بقیه سلول‌های سرطانی قادر هستند، به صورت نامحدود تقسیم شوند و به «سلول‌های نامیرا» معروف گردند. این رده سلولی نامیرا که ادغامی از لنفوسیت B و سلول‌های میلوم هستند، یک رده سلولی هیبریدی را تشکیل می‌دهند که خصوصیات هر دو سلول ادغام شده را داراست. برای اینکه پادتن‌های تک تیره تولید شوند، باید یک حیوان با آنتی‌ژن مورد نظر در تماس قرار گیرد و بدن جاندار شروع به ایمن‌سازی کند. در طی چند هفته متوالی سلول‌های B اختصاصی آنتی‌ژن شروع به تکثیر و ترشح پادتن‌های اختصاصی می‌کنند. بافت طحال که مملو از لنفوسبتهای B است از موش استخراج شده و لنفوسیت‌های B جدا شده با سلول‌های میلوم ادغام می‌شوند. با وجودی که بسیاری از سلول‌ها در محیط کشت قادر به ادغام شدن و تکثیر هستند، تنها میزان بسیار کمی ار آن‌ها (سلولهای هیبریدی تولیدکننده پادتن) قادر به بقا هستند. روش تشخیص سلول‌های هیبریدی از سلول‌های دیگر به این صورت است که به محیط کشت هیپوکسانتین، آمینوپترین و تیمیدین(HAT) افزوده می‌شود. این محیط کشت اختصاصی از رشد سلول‌های میلوم ادغام نشده جلوگیری می‌کند چرا که این سلول‌ها قادر نیستند از هیپوکسانتین و تیمیدین به خاطر آمینوپترین که یک بلوک‌کننده متابولیکی است، استفاده کنند. سلول‌های میلوم یک نقص ژنتیکی‌ای را حمل می‌کنند که پس از ادغام با سلول‌های B به تعادل می‌رسند. سلول‌های B ادغام نشده نیز پس از چند روز می‌میرند به این دلیل که این سلول‌ها در محیط کشت قادر به رشد و تکثیر نیستند. پس از ادغام سلولی باید سلول‌های هیبریدی تولیدکننده پادتن شناسایی و استخراج شوند. پس از شناسایی و استخراج این کلونهای سلولی می‌توان آن‌ها را به صورت in vivo به عنوان یک تومور تولیدکننده پادتن یا به صورت ex vivo در یک محیط کشت، کشت داد. پادتن‌ها می‌توانند از خون حیوان که دچار لوسمی شده‌است یا از محیط کشت جداسازی شوند. کاربردهای درمانی از پادتن‌های تک‌تیره برای شناسایی یا پالایش مواد بهره می‌گیرند. امروزه پادتن‌های تک‌تیره کاربردهای درمانی زیادی دارند مانند درمان بیماری‌های خودایمنی (مانند مولتیپل اسکلروز)، مهار دستگاه ایمنی در هنگام پیوند عضو و درمان سرطان. اکتشاف ایده «گلوله جادویی» ابتدا توسط پل ارلیش ارائه شد، که این دانشمند در ابتدای قرن بیستم ادعا کرد که اگر ترکیبی ساخته شود که بتواند به‌طور اختصاصی به ارگانیسم ایجادکننده بیماری متصل شود، سپس می‌توان این ماده را سوار بر یک توکسین نموده و به سمت آن ارگانیسم فرستاد. او و الی مچنیکوف به خاطر این کار علمی که درمان موفقیت‌آمیزی برای سیفلیس در سال ۱۹۱۰ ایجاد نمود، در سال ۱۹۰۸ موفق به دریافت جایزه نوبل پزشکی شدند. در دهه ۱۹۷۰، سرطان مالتیپل میلومای سلول B شناخته شد، و کشف شد که سلول‌های سرطانی B، همه از یک نوع پادتن تولید می‌نمایند (پاراپروتئین). این اکتشاف برای مطالعه ساختار پادتن مورد استفاده قرار گرفت اما هنوز تولید پادتن‌های اختصاصی برای یک آنتی‌ژن ممکن نبود. تولید پادتن تک‌تیره که شامل سلول‌های هیبرید موش-انسان بود در سال ۱۹۷۳ توسط جرالد شوابر بیان شد و بین افرادی که از هیبریدوماهای انسانی استفاده می‌کردند به‌طور گسترده مورد بحث واقع شد، اما بحث بر اینکه چه کسی برای بار اول فرضیه را بیان کرده‌است باقی‌ماند. یک سند عملی تاریخی روی این موضوع اعتباری را برای شوابر جهت اختراع این تکنیک به همراه داشت که به‌طور گسترده هم مورد بحث قرار گرفت ولی خیلی زود بیان شد که او تقلب کرده‌است. این اختراع توسط کاتن و میل اشتاین و سپس کوهلر و میل اشتاین به عرصه عمل گذاشته شد. کوهلر، میل اشتاین و کاج یرن در سال ۱۹۸۴ جایزه نوبل پزشکی و فیزیولوژی را دریافت نمودند. ایده اصلی بر این قرار بود که سلول‌های سرطانی میلوما که توانایی ترشح پادتن را از دست داده‌اند، توسط یک تکنیک با سلول‌های سالم B لقاح کرده و در نهایت نیز بتوان سلول‌های لقاح کرده را جدا نمود. | ## بخش 2: آنتی‌بادی منوکلونال | این ایده توسط میل اشتاین و کوهلر در تحقیقشان برای یافتن ابزاری جهت یافتن تنوع پادتن‌ها به عمل درآمد. در ۱۹۸۸، گِرگ وینتر و تیم او پیشگام این تکنیک‌ها برای انسانی نمودن پادتن‌های تک‌تیره شدند، و واکنش‌هایی را که پادتن‌های تک‌تیره ایجاد می‌نمودند را از بین بردند. تولید سلول‌های هیبریدوما پادتن‌های تک‌تیره معمولاً از سلول‌های لقاح شده میلوما با طحال موش که توسط آنتی‌ژن مورد نظر امیونیزه شده‌است، ساخته می‌شود. به هر حال پیشرفت‌های اخیر سبب استفاده سلول‌های B خرگوش برای تولید هیبریدومای خرگوش نیز گردیده‌است. پلی اتیلن گلیکول برای لقاح غشاهای پلاسمایی مجاور به هم استفاده می‌شده، اما حاصل این روش کم بوده بنابراین یک محیط انتخابی که فقط سلول‌های لقاح شده بتوانند در آن رشد کنند مورد استفاده قرار می‌گیرد. این کار امکان‌پذیر است چون سلول‌های میلوما توانایی سنتز هیپوزانتین گوانین فسفوریل ترانسفراز(HGPRT) را که برای سنتز رهاسازی اسیدهای نوکلئیک لازم است، از دست داده‌اند. غیاب این آنزیم تا زمانی که مسیر سنتز پورین de novo از بین نرود برای این سلول‌ها مشکلی ایجاد نمی‌کند. با قرار دادن سلول‌ها در معرض آمینوپترین (یک آنالوگ فولیک اسید، که دهیدروفولات ردوکتاز را مهار می‌کندDHFR)، آن‌ها دیگر نمی‌توانند از مسیر de novo استفاده کرده و نسبت به اسیدهای نوکلئیک کاملاً اوکسوتروفیک می‌شوند که برای زنده ماندن نیاز به مکمل غذایی خواهند داشت. این محیط انتخابی HAT نامیده می‌شود زیرا آن حاوی هیپوزانتین، آمینوپترین و تیمیدن است. سلول‌های میلومای لقاح نشده به دلیل فقدان HGPRT نمی‌توانند رشد کنند، و بنابراین نمی‌توانند DNA را همانند سازی نمایند. سلول‌های لقاح نیافته به دلیل چرخه زندگی کوتاه خود نمی‌توانند به‌طور نامحدود زندگی کنند. فقط سلول‌های هیبرید (هیبریدوما) در این محیط قادر به زندگی هستند چون سلول طحالی همراه آن HGPRT را تأمین کرده و سلول میلوما ویژگی‌هایی دارد که آن را نامیرا می‌نماید (مثل یک سلول سرطانی). سپس مخلوط سلول‌ها رقیق شده و کلون‌ها از سلول‌های تک والد روی چاهک‌های میکروتیتر رشد می‌کنند. پس از آن پادتن‌های ترشح شده با کلون‌های مختلف از جهت تواناییشان برای اتصال به آنتی‌ژن مورد بررسی قرار می‌گیرند (توسط روش ELISA یا آنتی‌ژن میکروارای یا ایمونو دات بلات). محیط کشت باید در طی انتخاب آزمایشگاهی غنی شود تا هیبریدوما به‌طور ایده‌آل رشد کند. این عمل را می‌توان با استفاده از یک لایه سلول تغذیه‌کننده فیبروسیت یا محیط مغذی بریکلون (briclone) انجام داد. تولید در محیط کشت معمولاً بر تکنیک آسیت ترجیح داده می‌شود چون این روش برای حیوان دردناک است. تخلیص پادتن تک‌تیره بعد از به دست آوردن نمونه از محیط کشت سلولی یا نمونه مایع آسیت، پادتن مطلوب باید استخراج شود. آلودگی‌های موجود در محیط کشت سلولی همان مواد موجود در آن شامل فاکتورهای رشد، هورمون‌ها و ترانسفرین‌ها هستند. بر خلاف آن، نمونه‌های آزمایشگاهی دارای پادتن‌های میزبان، پروتئازها، نوکلئازها، نوکلئیک اسیدها، و ویروس‌ها می‌باشند. در هر دو مورد، بقیه ترشحات سلول‌های هیبریدوما مثل سیتوکاین‌ها ممکن است وجود داشته باشند. سلول‌ها، بقایای سلولی، چربی‌ها و لخته‌ها در ابتدا باید حذف شوند، که اصولاً پس از فیلتراسیون با فیلتر۰٫۴۵ میکرولیتر توسط سانتریفوژ صورت می‌گیرد. این ذرات بزرگ می‌تواند به عنوان پدیده‌ای به نام ترسیب غشا در مراحل بعدی تخلیص مطرح شود. به علاوه، غلظت محصول در نمونه ممکن است کافی نباشد، به خصوص در مواقعی که پادتن مورد نظر توسط سلولی با سطح ترشح پایین تولید شود. اغلب ناخالصی‌های باردار معمولاً آنیون‌هایی از جنس نوکلئیک اسیدها و اندوتوکسین‌ها هستند. همچنین کروماتوگرافی تعویض کاتیونی، در pH پایین استفاده شده که پادتن مطلوب در ستون باقی‌مانده در حالی که آنیون‌ها عبور می‌کنند یا آنیون کروماتوگرافی در pH بالا استفاده شده که پادتن مطلوب از ستون رد شده در حالی که آنیون‌ها به ستون می‌چسبند. پروتئین‌های مختلفی همراه آنیون‌ها با توجه به نقطه ایزوالکتریکشان (pI) جدا می‌شوند. برای مثال، آلبومین pI برابر با ۴٫۸ دارد که به‌طور عمده‌ای کمتر از پادتن تک‌تیره‌است که دارای pI برابر با ۶٫۱ می‌باشند. به عبارت دیگر، در یک pH، میانگین بار مولکول‌های آلبومین بیشتر به سمت منفی سوق پیدا می‌کند. ترانسفرین، pI برابر با ۵٫۹ دارد بنابراین با این روش به راحتی نمی‌تواند جدا گردد. از آنجایی که کار ما با پروتئین هاست، ویژگی‌هایی مثل بار و توانایی اتصال ثابت نیستند و با توجه به pH مولکولی که دارای پروتون یا فاقد آن است متفاوت می‌باشند در حالی که اندازه تقریباً ثابت می‌ماند. با این حال، این روش معایبی مثل تفکیک‌پذیری کم، ظرفیت کم و دفعات شست‌وشوی کم را دارد. کمی سریعتر، روشی یک مرحله‌ای از جداسازی به نام کروماتوگرافی اتصال پروتئین A/G وجود دارد. پادتن به‌طور انتخابی به پروتئین A/G متصل شده بنابراین خلوص بالایی (عموماً بالاتر از ۸۰٪) می‌دهد. به هر حال، این روش ممکن است برای پادتن‌هایی که به آسانی آسیب می‌بینند مشکل ساز باشد چون شرایط سختی در آن استفاده می‌شود. | ## بخش 3: آنتی‌بادی منوکلونال | به علاوه تأثیر احتمالی بر محصول، pH پایین می‌تواند سبب نشت پروتئین A/G از ستون شده و آن را در نمونه شسته شده ظاهر کند. سیستم‌های شست‌وشوی بافری ملایم که از غلظت‌های بالای نمکی استفاده می‌کنند نیز برای جلوگیری از مواجهه پادتن‌ها با pH پایین وجود دارند. برای رسیدن به بیشترین خلوص در یک مرحله، تخلیص اتصالی را می‌توان با استفاده از آنتی‌ژن برای داشتن بیشترین اختصاصیت پادتن به کار برد. در این روش، آنتی‌ژنی که برای جمع‌آوری پادتن استفاده می‌شود با پیوند کووالانسی به آگارز متصل شده‌است. اگر پادگن (آنتی‌ژن) یک پپتید باشد، آن را معمولاً با یک سیستئین انتهایی سنتز می‌کنند، که اجازه اتصال به یک پروتئین حامل را می‌دهد، مثل KLH در حین پیشروی و حمایت برای تخلیص. سپس محیط حاوی پادتن با آنتی‌ژن غیرمتحرک انکوبه شده، که به صورت کلی یا در هنگام عبور پادتن از ستون انجام می‌شود، که در آن به‌طور انتخابی متصل گردیده و در حالی که ناخالصی‌ها از ستون شسته می‌شوند می‌توان آن را حفظ نمود. سپس شست‌وشو با بافر pH پایین یا بافر پرنمک برای حاصل کردن پادتن تخلیص شده مورد استفاده قرار می‌گیرد. برای انتخاب بیشتر پادتن‌ها، آن‌ها را می‌توان با استفاده از سدیم سولفات یا آمونیوم سولفات رسوب داد. پادتن‌ها در غلظت پایین نمک رسوب می‌کنند در حالی که اکثر پروتئین‌ها در غلظت‌های بالاتر رسوب می‌نمایند. ناخالصی‌ها سبب ایجاد باندهایی با شدت‌های مختلف می‌شوند که به مقدار آن مربوط می‌شود. عدم تجانس پادتن عدم تجانس پادتن برای تک‌تیره پادتن‌ها و سایر محصولات نوترکیب رایج است و معمولاً در حین بیان یا تولید نشان داده می‌شود. این واریانت‌ها معمولاً متراکم می‌شوند (محصولات دآمیداسیون، واریانت‌های گلیکوزیلاسیون، زنجیره‌های جانبی آمینواسید اکسید شده، همچنین اضافات آمینو و کربوکسیل انتهایی آمینو اسید). این تغییرات ظاهری لحظه‌ای در ساختار یک تک‌تیره پادتن می‌تواند اثر عمیقی بر پایداری پیش بالینی و بهبودسازی فرایند داشته باشد همچنین در پتانسیل درمانی محصول، دسترسی زیستی و ایمنی. روش عمومی پذیرفته شده برای فرایند تخلیص پادتن تک‌تیره، شامل گیرانداختن پروتئین محصول مورد نظر با پروتئین A، شست‌وشو، اسیدیفیکاسیون برای غیرفعال‌سازی ویروس‌های بالقوه پستانداران، کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و کروماتوگرافی تعویض آنیون می‌باشد. کروماتوگرافی جانشین‌سازی برای تشخیص و تعیین این واریانت‌های نادیده در حجم‌هایی که برای تأیید در سیستم‌های بعدی پیش بالینی مثل مطالعات فارماکوکینتیک حیوانی مناسب هستند، استفاده می‌شده‌است. دانش به دست آمده در حین گسترش فاز پیش بالینی برای فهم کامل کیفیت محصول ضروری است و یک پایه برای مدیریت ریسک و انعطاف‌پذیری تنظیمی افزوده شده ایجاد می‌کند. ابتکار اخیر کیفیت توسط طراحی اتحادیه‌های غذا و دارو در تلاش است تا هدایتی در جهت توسعه ایجاد کرده و طراحی محصولات و فرایندهایی که کارایی و پروفایل ایمنی را افزایش می‌دهد به حداکثر رسانده درحالی که امکان تولید محصول را بالا می‌برند. نوترکیب تولید پادتن‌های تک‌تیره نوترکیب شامل فناوری‌هایی است که به نام کلونینگ جمعی یا نمایش فاژ/مخمر شناخته می‌شود. مهندسی پادتن نوترکیب شامل استفاده از ویروس‌ها یا مخمر برای ساختن پادتن‌ها است به جای استفاده از موش. این روش‌ها به کلونینگ سریع قطعات ژن ایمونوگلوبولین برای ایجاد مجموعه‌هایی از پادتن‌ها با اختلافات ناچیز آمینواسیدی نسبت به پادتن‌هایی با اختصاصیت‌های مطلوب که قابل انتخاب است، بستگی دارد. مجموعه‌های پادتن فاژ نوعی از مجموعه‌های آنتی‌ژن فاژ هستند که توسط جورج پیژنیک اختراع شد. این تکنیک‌ها می‌تواند برای بالابردن اختصاصیتی که پادتن‌ها آنتی‌ژن‌ها، پایداریشان در شرایط محیطی مختلف، کارایی درمانی، و قابل جستجو بودن در کاربردهای تشخیصی را تشخیص دهند، استفاده شود. پادتن‌های کیمریک به زودی متوجه شدند که مشکل اساسی برای کاربرد درمانی پادتن‌های تک‌تیره روش ابتدایی است که پادتن موشی به جای انسانی ایجاد می‌کند. علی‌رغم تشابه ساختاری، اختلافات بین این دو برای ایجاد یک پاسخ ایمونولوژیک بعد از تزریق این پادتن به بدن انسان کافی بود، که در نهایت سبب حذف سریع آن‌ها از خون به علت فعالیت سیستم التهابی و تولید پادتن ضد موش انسانی (HAMA) می‌گردید. در تلاشی برای رفع این مانع، روش‌هایی برای استفاده از دی ان ای نوترکیب از سالهای ۱۹۸۰ به بعد کشف شد. در یکی از این روش‌ها، DNA کدکننده بخش اتصالی پادتن تک‌تیره با DNA تولیدکننده پادتن در سلول انسانی زنده ادغام شد. پادتن کاملاً انسانی از زمانی که فهمیده شد که می‌توان پادتن تک‌تیره ایجاد نمود، دانشمندان برای جلوگیری از برخی اثرات جانبی پادتن‌های انسانی شده یا کیمریک به دنبال ساخت پادتن کاملاً انسانی رفتند. موش ترانس ژنی تقریباً موفقترین روش برای ایجاد داروهای پادتن تک‌تیره کاملاً انسانی بوده‌است: که ۷ تا از ۹ روش کنونی در بازار تجارت از این روش تبعیت می‌کند. دانشمندان CAT نشان دادند که تظاهر فاژ می‌تواند مورد استفاده باشد، به‌طوری‌که دامنه‌های متغیر پادتن می‌تواند روی پادتن‌های فاژی رشته‌ای بیان شود. کاربردها آزمون‌های تشخیصی هرگاه پادتن تک‌تیره‌ای برای یک ماده مشخص ایجاد شود، می‌توان به وسیله پادتن، حضور آن ماده را بررسی کرد. این تست‌ها آنتی‌ژن ثابت شده روی قطعات بافتی را تشخیص می‌دهند و تست ایمونوفلورسانس ماده را در یک قطعه بافتی یخ زده یا سلول زنده تشخصی می‌دهند. درمان دارویی درمان سرطان یک راه ممکن برای درمان سرطان استفاده از پادتن تک‌تیره‌است که فقط به آنتی‌ژن اختصاصی سلول سرطانی متصل شده و یک پاسخ ایمونولوژیک علیه سلول سرطانی ایجاد می‌کند. این mAb همچنین برای ارسال یک توکسین، رادیوایزوتوپ، سیتوکاین یا کونژوگه فعال دیگری قابل استفاده می‌باشد. علاوه بر این این امکان وجود دارد که پادتن‌هایی با دو ویژگی تولید کرد که بتواند به وسیله ناحیه Fab به آنتی‌ژن هدف و یک کونژوگه یا سلول اثرگذار متصل شود. در واقع، هر پادتن سالم می‌تواند به سلول گیرنده یا سایر پروتئین‌ها به وسیله ناحیه Fc متصل شود. | ## جمع‌بندی | بیماری خودایمن پادتن تک‌تیره که برای این بیماری‌ها استفاده می‌شود شامل اینفیلیکسیماب و ادالیموماب است که در پسوریازیس، آرتریت روماتوئید، بیماری کرون و کولیت اولسراتیو به وسیله تواناییشان در اتصال به و ممانعت از TNF آلفا است.