موضوع مقاله: خالص‌سازی پروتئین | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # خالص‌سازی پروتئین | مقدمه: خالص‌سازی پروتئین به مجموعه ای از فرایندها گفته می‌شود که در آن یک یا تعداد اندکی از پروتئین‌ها از یک ترکیب پیچیده (که ممکن است سلول، بافت یا موجود زنده کامل باشد) خالص می‌شود. | ## بخش 1: خالص‌سازی پروتئین | برای این که بتوانیم عملکردها، ویژگی‌های ساختاری و برهمکنش‌های پروتئین مورد نظرمان را دریابیم ابتدا لازم است تا آن را خالص کنیم. بیشترین چالش مربوط به زمانی است که می‌خواهیم پروتئین مورد نظر را از سایر پروتئین‌ها جداسازی کنیم. مراحل خالص‌سازی معمولاً به اندازه پروتئین، ویژگی‌های فیزیکی وشیمیایی، تمایل اتصالی و فعالیت بیولوژی پروتئین مورد نظر بستگی دارد. هدف از خالص‌سازی مقایسه ای، دست یافتن به حجم زیادی از پروتئین خالص به منظور استفاده از آن در مراحل بعدی است. تولید محصولات تجاری از قبیل آنزیم‌ها (مانند آنزیم لاکتوز)، پروتئین‌های غذایی (مانند پروتئین تخلیص شده سویا) و برخی از زیست داروها (مانند انسولین) از این دسته هستند. در خالص‌سازی آنالیتیکال، مقدار کمی پروتئین خالص می‌شود و از آن برای تحقیقات و بررسی‌های تحلیلی همچون شناسایی، مقدارسنجی، مطالعه ساختار پروتئین، تغییرات پس از ترجمه و عملکرد پروتئین استفاده می‌گردد. مراحل مقدماتی استخراج اگر پروتئین مورد نظر، توسط میکروارگانیسم‌ها به محیط اطراف آزاد نشود، در این صورت اولین مرحله خالص‌سازی، شکستن سلول‌های واجد پروتئین است. در نهایت با استفاده از سانتریفیوژ، بقایای سلول جدا و دور ریخته می‌شود و پروتئین‌ها به همراه سایر ترکیبات، به صورت محلول در مایع رویی (supernatant) باقی می‌مانند. در صورتی که پروتئین مورد نظر ما نسبت به پروتئازها حساس است، توصیه می‌شود که فرایند به سرعت انجام شود و عصاره سریعاً در دمای پایین قرار گیرد تا سرعت تخریب کاهش یابد. | ## بخش 2: خالص‌سازی پروتئین | برخی مواقع اضافه کردن DNAse به منظور از بین بردن مقادیر بالای DNA و کاهش ویسکوزیتهٔ سلول‌های لیز شده، ضروری است. رسوب دهی هنگامی که می‌خواهیم مقادیر بالای پروتئین را خالص کنیم معمولاً اولین مرحله، رسوب دهی پروتئین با سولفات آمونیوم است. در رسوب دهی، گروه‌های آبگریز پروتئین‌ها در معرض قرار گرفته و با گروه‌های آبگریز پروتئین‌های دیگر تجمع پیدا می‌کنند. از مزایای این روشِ رسوب دهی این است که می‌توان با هزینه ای کم، مقادیر بالای پروتئین را رسوب داد. پس از رسوب دهی با سولفات آمونیوم، محتوای پروتئینی با استفاده از سانتریفیوژ جدا می‌شوند. در گیاهان و حیوانات، معمولاً یک پروتئین خاص به‌طور یکسان در سراسر جاندار پخش نشده‌است و برخی از اعضا یا اندام‌های جاندار، غلظت‌های بالاتری از پروتئین مورد نظر را دارا هستند. استفاده از قسمت‌هایی که واجد غلظت‌های بالاتری از پروتئین هستند، حجم مورد نیاز برای بدست آوردن مقدار مشخصی از پروتئین خالص را کاهش می‌دهد. اگر مقدار تولید پروتئین ناچیز باشد، دانشمندان از تکنیک دی ان ای نوترکیب به منظور ایجاد تغییرات در سلول و افزایش مقدار پروتئین تولیدی استفاده می‌کنند. معمولاً در دستورالعمل‌های خالص‌سازی یک پروتئین، یک یا چند مرحله کروماتوگرافی وجود دارد. | ## بخش 3: خالص‌سازی پروتئین | روش ابتدایی در کروماتوگرافی این است که ستون کروماتوگرافی را با مواد مختلفی پر می‌کنند تا بستری نیمه جامد به دست آید. پروتئین‌های مختلف به صورت‌های مختلفی با ماده درون ستون برهمکنش می‌کنند و در نتیجه می‌توانند بر اساس زمانی که برای خروج از سمت دیگر ستون نیاز است، از سایر پروتئین‌ها جدا شوند. معمولاً برای تشخیص پروتئینی که از سمت دیگر ستون بیرون می‌آید، جذب آن در ۲۸۰ نانومتر توسط دستگاه استپکتروفوتومتری خوانش می‌شود. تغلیظ کردن پروتئین خالص شده پس از خالص‌سازیِ پروتئین، معمولاً نیاز است تا پروتئین تغلیظ شود. لیوفیلیزاسیون معمولاً پس از انجام کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا انجام می‌شود. اولترافیلتراسیون در اولترافیلتراسیون با استفاده از غشاهایی که نفوذپذیری انتخابی دارند، پروتئین تغلیظ می‌شود. محلول حاوی پروتئین از طریق یک پمپ مکانیکی، فشار گازی یا سانتریفیوژ، به سمت غشا هل داده می‌شود. ارزیابی محصول خالص شده متداول‌ترین روش به منظور بررسی فرایند تخلیص، انجام SDS-PAGE برای نمونه‌های مراحل مختلف تخلیص است. | ## جمع‌بندی | اگر پروتئین یک ویژگی اسپکتروسکوپی متمایز یا یک فعالیت آنزیمی خاص داشته باشد، از آن ویژگی می‌توان جهت شناسایی و تعیین مقدار آن پروتئین استفاده کرد.