موضوع مقاله: ویروئید | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # ویروئید | مقدمه: اصطلاح ویروئید اولین بار توسط دینر در سال ۱۹۷۱ برای توصیف عامل بیماری دوکی شدن غده سیب زمینی (PSTVd) به کار برده شد. | ## بخش 1: ویروئید | ویروییدها دارای یک رشته RNA تک لایه حلقه‌ای به طول ۲۴۶ تا ۴۰۱ نوکلئوتید، با ساختمان‌های ثانویهٔ متعدد و فاقد پوشش پروتئینی هستند. به رغم فقدان پروتئین پوششی، به علت دارا بودن ساختار پیچیده ثانویه، در مقابل عوامل مخرب نوکلئیک اسیدها مقاومت زیادی دارند. ویروئیدهای گیاهی حاوی مولکول RNA حلقوی تک رشته ایی متصل می‌شود به‌طور کووالانسی و دارای ۳۶۰ نوکلئوتید می‌باشند که از بازهای جفت شده با ساختمان میله ایی تشکیل شده‌اند. ویروییدها نمی‌توانند پروتئین بسازند اما درون سلول‌های میزبان تکثیر می‌شوند، که ظاهراً از آنزیم‌های میزبان استفاده می‌کنند. ارتباط تکاملی فرضیهٔ دیرر که در سال ۱۹۸۹ منتشر شد، بیان می‌کند که خصوصیات منحصر به فرد ویروئیدها، آنها را به عنوان ماکرومولکول‌هایی قابل قبول تر از اینترانین یا دیگر RNAهایی که در گذشته به عنوان «موجود زنده» در نظر گرفته می‌شدند، تبدیل کرده‌است. فرضیهٔ او تا سال ۲۰۱۴ میلادی، تقریباً فراموش شده بود تا اینکه در مقاله ای که در آن فلورس و همکارانش این فرضیه را مورد بررسی قرار داده بودند، دوباره این فرضیه مورد توجه محافل علمی قرار گرفت. روش‌های شناسایی ویروییدها روش‌های شناسایی ویروییدها در ۲ قالب صورت می‌گیرد: روش بیولوژیک روش‌های مولکولی روش‌های مولکولی عمدتاً خود به ۳ روش انجام می‌شود: - الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید - RT-PCR - هیبریداسیون مولکولی از آنجایی که ویروییدها هیچ پروتئین اختصاصی تولید نمی‌کنند؛ امکان استفاده از روش‌های سرولوژی در تشخیص ویروییدها وجود ندارد. همچنین چون پیکرهٔ خاصی که به امر تشخیص کمک کند به آسانی قابل ردیابی نیست، استفاده از میکروسکوپ الکترونی نیز امکان‌پذیر نمی‌باشد. در این روش به گیاهان محک مناسب نیاز داریم تا پاتوژن در آن‌ها علایم اختصاصی تولید نماید به گونه‌ای که از سایر پاتوژن‌ها قابل تفکیک باشد. | ## بخش 2: ویروئید | انتقال بیماری به گیاهان محک به روش‌های مختلف از جمله: از طریق پیوند، ناقل، مکانیکی یا روش‌های تکثیری صورت می‌گیرد. اطلاعات مورد نیاز در روش بیولوژیک شناخت دامنه میزبانی ویرویید شناخت علایم گونهٔ ویرویید مد نظر و همین‌طور سایر گونه‌های پاتوژن در گیاه محک هدف شناخت علائم جهت رد احتمال وجود سایر عوامل بیماری‌زا یا تشخیص آلودگی‌های هم‌زمان مهم می‌باشد. عوامل مؤثر بر روش بیولوژیک نژاد ویرویید رقم گونهٔ میزبان هم افزایی (Synergy) عوامل محیطی دما نور طول روز وضعیت تغذیه‌ای گیاه وضعیت فیزیکی گیاه زمان ایجاد علایم روش مایه زنی ایجاد برش یا زخم تلقیح مالشی پیوند مزیت روش بیولوژیک سنجش عینی فعالیت‌های بیولوژیکی از قبیل توان انتقال، تکثیر و تولید علایم را فراهم می‌کند. معایب روش بیولوژیک در مقیاس بالا عملی نیست در قیاس با روش‌های مولکولی بسیار کند و وقت گیر می‌باشد برای تمام ویروییدها امکان‌پذیر نمی‌باشد روش‌های مولکولی الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید ابتدا ویرویید استخراج و سپس بر روی ژل بررسی می‌شود الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به ۲ شکل انجام می‌شود: الکتروفورز پی در پی (S-PAGE) الکتروفورز برگشتی (R-PAGE) الکتروفورز پی در پی (S-PAGE) ۲بار عمل الکتروفورز انجام می‌شود؛ تحت شرایط غیر واسرشتی و به دنبال آن در شرایط واسرشتی اولین الکتروفورز: به مدت ۳ ساعت با جریان ثابت ۵۵ میلی‌آمپر، در دمای ۴ درجه سانتی گراد در قالب ژل ۵٪ به ابعاد ۱۵۰*۱۲۰*۱/۵ میلی‌متر، حاوی بافر TAE زمانی که رنگ زایلن سیانول به اواسط ژل رسید، دومین الکتروفورز را انجام می‌دهیم. دومین الکتروفورز: قسمتی از ژل که حاوی RNAهای ویروییدی است را بریده و در بالای ژل ۵٪ واسرشتی ثانویه که حاوی بافر TAE (PH 6.5) و ۸ مول اوره است، قرار داده می‌شود. به مدت ۴–۴/۵ ساعت، با جریان ثابت ۱۵ میلی‌آمپر در دمای ۵۵درجه سانتی گراد با استفاده از بافر TBE x0/25 انجام می‌شود. الکتروفورز برگشتی (R-PAGE) براساس تفاوت در ویژگی‌های مولکول ویرویید، تحت شرایط طبیعی و واسرشتی استوار است. اولین الکتروفورز، در شرایط طبیعی که حرکت الکتروفورزی ویرویید، مشابه سایر مولکول‌های اسیدنوکلئیک خطی گیاه است، انجام می‌شود. این مرحله در ولتاژ ثابت و تا زمانی که زایلن سیانول به یک سانتی‌متری پایین ژل برسد؛ صورت می‌گیرد. | ## بخش 3: ویروئید | سپس دستگاه خاموش، بافر الکترود تخلیه و برای اجرای الکتروفورز برگشتی بافر داغ با دمای ۷۰ درجه سانتی گراد با آن جایگزین می‌شود. قطبیت معکوس می‌شود و تانک الکتروفورز در اینکوباتور ۷۰ درجه سانتی گراد قرار داده و مرحله را تا زمانی که رنگ زایلن سیانول به بالای ژل برسد؛ ادامه می‌دهیم. رنگ آمیزی ژل این عمل با تولوئیدن بلو یا اتیدیوم بروماید یا نیترات نقره صورت می‌گیرد. عوامل زیر در انتخاب هر کدام از روش‌های فوق مؤثر است: مقدار RNA موجود ویرویید مدت زمان مورد نیاز هدف استفاده از RNA آنالیز شده مزایا و معایب الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید علی‌رغم حساسیت کمتر نسبت به بسیاری از روش‌ها، ارزانتر و در دسترس تر می‌باشد نیاز به آموزش‌های کمتری دارد ابزار مناسب و ضروری جهت شناسایی ویروییدهای ناشناخته می‌باشد برخلاف سایر روش‌های مولکولی، نیازی به داشتن اطلاعات در مورد توالی نوکلئوتیدی نیست برای تشخیص ویرویید در غلظت‌های بسیار پایین یا تمایز برخی ویروییدها نظیر CCCVd از CTiVd استفاده از روش RT-PCR یا هیبریداسیون اسیدنوکلئیک ضروری می‌باشد. RT-PCR نیاز به مقدارکمتری نمونه می‌باشد معمولاً ۱۰ تا ۱۰۰ بار حساس تر از روش هیبریداسیون و ۲۵۰۰ بار حساس تر از روش الکتروفورز برگشتی ژل پلی اکریل آمید می‌باشد اغلب نیاز به شناساگرهای نشانه دار شده با مواد رادیواکتیو ندارد علی‌رغم حساسیت این روش به دلیل تشکیل ساختار ثانویه در ویروئیدها، امکان بروز نتایج غیرقابل استناد همواره وجود دارد. سادرن بلات عمدتاً برای DNA، نورترن بلات برای RNA و دات بلات هم بر پایهٔ لکه‌گذاری روی صفحات نیتروسلولزی می‌باشد. روش‌های تلفیقی در تشخیص ویروییدها تلفیق روش بیولوژیک و روش‌های مولکولی:تشخیص قطعی ۲ ویرویید CEVd و HSVd از یکدیگر در مرکبات با استفاده از روش بیولوژیک و روش‌های مولکولی مثل هیبریداسیون و RT-PCR به خاطر اختلاف در اندازه، توالی نوکلئوتیدی و بیماری زایی آن‌ها امکان‌پذیر است. | ## جمع‌بندی | ایزدپناه، ۱۳۸۹، شناسایی وتعیین برخی خصوصیات، مولکولی ویروئیدهای مو در استان فارس، بیماری‌های گیاهی، ۴۶، ۳: ۲۴۹–۲۶۲.