موضوع مقاله: پروتئین فلورسنت سبز | مخاطب: عمومی | لحن: دانشنامه‌ای | ساختار: عنوان، مقدمه، 3 بخش، جمع‌بندی | مقاله: | # پروتئین فلورسنت سبز | مقدمه: پروتئین فلورسنت سبز (GFP) پروتئینی متشکل از ۲۳۸ واحداسید آمینه (۲۶٫۹ کیلو دالتون) است که هنگام قرار گرفتن در معرض نور در محدوده آبی تا فرابنفش ، فلورسانس (فلوئورسنس) سبز روشن از خود نشان می‌دهد. | ## بخش 1: پروتئین فلورسنت سبز | پروتئین‌های مشابهی که به رنگ سبز نیز فلورس (شبرنگ) می‌شوند، در بسیاری از موجودات دریایی یافت می‌شوند، اما برچسب GFP به طور سنتی به این پروتئین خاص اشاره دارد که ابتدا از چتر دریایی جدا شده و گاهی - در صورت لزوم چنین دقت - avGFP نامیده می‌شود. victoria دارای یک قله یا اوج تحریک عمده در طول موج ۳۹۵ نانومترnm است و یک جزئی در ۴۷۵ نانومتر اوج انتشار آن در ۵۰۹ نانومتر است nm، که در قسمت فرو سبز طیف مرئی است. در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، ژن GFP اغلب به عنوان گزارشگر برای بیان ژن استفاده می‌شود. برای ایجاد حسگرهای زیستی از آن در اشکال اصلاح شده استفاده شده‌است و حیوانات بسیاری تولید شده‌اند که بیانگر GFP هستند، که اثبات این مفهوم را نشان می‌دهد که ژن می‌تواند در سراسر ارگانیسم معین، در اندام‌های منتخب یا سلول‌های مورد علاقه بیان شود. GFP می‌تواند از طریق تکنیک‌های تراریخته به حیوانات یا گونه‌های دیگر وارد شود و در ژنوم آنها و فرزندان آنها حفظ شود. تا به امروز، GFP در بسیاری از گونه‌ها، از جمله باکتری‌ها، مخمرها، قارچ‌ها، ماهی‌ها و پستانداران، از جمله در سلول‌های انسانی بیان شده‌است. تسین، اوسامو شیمومورا و مارتین چالفی به دلیل کشف و توسعه پروتئین فلورسنت سبز در ۱۰ اکتبر ۲۰۰۸ جایزه نوبل شیمی را دریافت کردند. ویکتوریا، فلورسانس GFP هنگامی رخ می‌دهد که اکورورین با یون‌های Ca2+ برهم کنش داشته و باعث درخشش آبی می‌شود. مقداری از این انرژی درخشان به GFP منتقل می‌شود و رنگ کلی را به سمت سبز تغییر می‌دهد. با این حال، کاربرد آن به عنوان ابزاری برای زیست شناسان مولکولی محقق نشد تا اینکه در سال ۱۹۹۲ که داگلاس پرشر (Clouding) و توالی نوکلئوتیدی wtGFP در ژن را گزارش کرد. آزمایشگاه مارتین چالفیه بیان برنامه‌نویسی توالی از wtGFP، با چند اسید آمینه حذف شده، در سلول‌های هترولوگ از باکتری E. آزمایشگاه فردریک تسوجی بیان پروتئین فلورسنت سبز نوترکیب را به‌طور مستقل یک ماه بعد گزارش داد. نکته قابل توجه این که، مولکول GFP بدون نیاز به کوفاکتورهای برون زای مخصوص شیرهای دریایی، در دمای اتاق فولد (خمش مخصوص رشته اسیدهای آمینه که ساختار دوم و سوم پروتئین را می‌سازد) و فلورسنت بود. اگرچه این پروتئین بسیار شبینه wtGFP فلورسنت بود، اما دارای اشکالات مختلفی بود، از جمله طیف تحریک دوگانه اوج، حساسیت به pH، حساسیت به کلراید، عملکرد کوانتومی فلورسانس ضعیف، قابلیت پایداری نوری و تا شدن ضعیف در ۳۷ درجه سانتیگراد اولین ساختار کریستالی گزارش شده از GFP، جهش S65T توسط گروه رمینگتون در ساینس در سال ۱۹۹۶منتشر شد. یک ماه بعد، گروه فیلیپس به‌طور مستقل ساختار GFP نوع وحشی را در بیوتکنولوژی طبیعت گزارش کردند. این ساختارهای کریستالی زمینه حیاتی تشکیل کروموفور و فعل و انفعالات باقی مانده همسایه را فراهم می‌کنند. محققان این جهش‌ها را با جهش زایی کارگردانی و تصادفی اصلاح کرده‌اند تا طیف گسترده‌ای از مشتقات GFP را که امروزه استفاده می‌شود، تولید کنند. با توجه به پتانسیل استفاده گسترده و نیازهای در حال توسعه محققان، بسیاری از جهش‌های مختلف GFP مهندسی شده‌اند. اولین پیشرفت عمده جهش تک نقطه ای (S65T) بود که در سال ۱۹۹۵ توسط راجر تسین در طبیعت گزارش شد. این جهش خصوصیات طیفی GFP را به طرز چشمگیری بهبود بخشید و در نتیجه باعث افزایش فلورسانس، قابلیت پایداری و تغییر اوج تحریک عمده به ۴۸۸ نانومتر شد، با اوج امیسیون یا تابش در ۵۰۹ نانومتر نگه داشته شده‌است ناین ویژگیهای طیفی مجموعه فیلترهای FITC که معمولاً در دسترس هستند مطابقت دارد و باعث افزایش کاربرد کاربرد توسط محقق عمومی می‌شود. آنها یک باند جذب گسترده در ماوراio بنفش با مرکز نزدیک به ۳۸۰ نانومتر و حداکثر انتشار در ۴۴۸ نانومتر از خود نشان می‌دهند. اتصال روی (II) شدت فلورسانس را افزایش می‌دهد، در حالی که اتصال مس (II) باعث مهار فلورسانس می‌شود و حداکثر جذب را از ۳۷۹ به ۴۴۴ نانومتر تغییر می‌دهد؛ بنابراین، می‌توان از آنها به عنوان حسگر زیستی Zn استفاده کرد. جهش حیاتی در مشتقات سیان جایگزینی Y66W است که باعث تشکیل کروموفور با یک جز ind ایندول و نه فنل می‌شود. چندین جهش جبرانی اضافی در بشکه اطراف برای بازگرداندن روشنایی به این کروموفور اصلاح شده به دلیل افزایش حجم زیاد گروه ایندول مورد نیاز است. جهش Y145A و H148D در Cerulean این فعل و انفعالات را تثبیت کرده و به کروموفور اجازه می‌دهد مسطح تر، بسته‌بندی بهتری داشته باشد و در معرض خاموش شدن و پوشیده شدن (کوئنچینگ) تصادفی نباشد. طول موج منتقل شده قرمز از مشتقات YFP توسط جهش T203Y انجام می‌شود و به دلیل فعل و انفعالات انباشته شدن n- الکترون بین واحد تیروزین جایگزین شده و کروموفور است. گزارشگران FRET با رمزگذاری ژنتیکی حساس به مولکول‌های سیگنالینگ سلول مانند کلسیم یا گلوتامات، حالت فسفوریلاسیون پروتئین، تکمیل پروتئین، دیمریزاسیون گیرنده و سایر فرایندها، بازده‌های نوری بسیار ویژه ای از فعالیت سلول را در زمان واقعی ارائه می‌دهند. نامگذاری نامگذاری GFPهای اصلاح شده اغلب به دلیل همپوشانی نقشه‌برداری از چندین نسخه GFP روی یک نام واحد گمراه کننده است. با این حال، از همین اصطلاح برای اشاره به GFP مونومری نیز استفاده می‌شود که غالباً با شکستن جهش A206K رابط دایمر بدست می‌آید. نوع وحشی GFP در غلظت‌های بالاتر از ۵ تمایل به دیمر شدن ضعیف دارد میلی‌گرم در میلی لیتر mGFP همچنین مخفف «GFP اصلاح شده» است که از طریق تبادل اسید آمینه برای بیان پایدار در سلولهای گیاه بهینه شده‌است. اوج تحریک ثانویه (480) nm) از GFP مقداری از انتشار آبی اکورین را جذب می‌کند، و باعث ایجاد رنگ سبزتر به بیولومینسانس می‌شود. | ## بخش 2: پروتئین فلورسنت سبز | باقیمانده سرین ۶۵ کروموفور GFP مسئول طیف‌های پیدایش دوقله تحریک در GFP نوع وحشی است. تقریباً همه جهش‌های این مانده طیف تحریک را به یک قله واحد در ۳۹۵ تحریک می‌کند nm یا ۴۸۰ نانومتر مکانیسم دقیق این حساسیت پیچیده‌است، اما، به نظر می‌رسد، شامل اهدای هیدروژن از سرین ۶۵ به گلوتامات ۲۲۲ است که بر یونیزاسیون کروموفور تأثیر می‌گذارد. از آنجا که یک جهش به‌طور چشمگیری می‌تواند اوج تحریک را در ۴۸۰ نانومتر را افزایش دهد، باعث می‌شود GFP به یک شریک بسیار کارآمدتر اکورین تبدیل شود، به نظر می‌رسد A. راجر تسین حدس زده‌است که تغییر فشار هیدرواستاتیک با عمق ممکن است بر توانایی سرین ۶۵ در اهدای هیدروژن به کروموفور و تغییر نسبت دو قله تحریک تأثیر بگذارد؛ بنابراین، ماهی ژله ای (Jellyfish) ممکن است با عمق رنگ بیولومینسانس خود را تغییر دهد. این پروتئین‌ها با تولید پروتئین در ارگانیسم‌های مختلف، گاهی اوقات می‌توانند رویکردهای بدون خطر برای تشکیل کروموفور را نشان دهند. برخی از این موارد، مانند KFP، از پروتئین‌های فلورسنت طبیعی غیر ضعیف یا ضعیف ساخته شده‌اند که با جهش زایی بسیار بهبود می‌یابند. هنگامی که از ساختار پروتئین بشکه‌های GFP مانند با خصوصیات طیف‌های مختلف استفاده می‌شود، می‌توان از طیف‌های تحریک یک کروموفور برای تأمین انرژی کروموفور دیگر (FRET) استفاده کرد و امکان تبدیل بین طول موج‌های نور را فراهم می‌کند. پروتئین‌های فلورسنت متصل به FMN (FbFP) در سال ۲۰۰۷ ساخته شد و دسته ای از پروتئین‌های فلورسنت مستقل از اکسیژن (۱۱–۱۶ کیلو دالتون) هستند که از گیرنده‌های نور آبی گرفته می‌شوند. آنها به ویژه برای استفاده در شرایط بی هوازی یا کمبود اکسیژن در نظر گرفته شده‌اند، زیرا تشکیل و اتصال کروموفور فلاوین به اکسیژن مولکولی نیاز ندارد، زیرا این امر در مورد سنتز کروموفور GFP وجود دارد. پروتئین‌های فلورسنت با سایر کروموفورها، مانند UnaG با بیلی روبین، می‌توانند ویژگی‌های منحصر به فرد مانند انتشار قرمز تغییر یافته در بالای ۶۰۰ نانومترnm را نشان دهند یا تبدیل عکس از حالت ساطع کننده سبز به حالت ساطع کننده قرمز. آنها می‌توانند طول موج‌های تحریک و انتشار به اندازه کافی از یکدیگر فاصله داشته باشند تا بتوانند بین نور قرمز و سبز تبدیل شوند. smURFP نیازی به اکسیژن یا تولید پراکسید هیدروژن ندارد و از کروموفور، بیلیوردین استفاده می‌کند. بررسی در مورد کلاسهای جدید پروتئین‌های فلورسنت و برنامه‌های کاربردی را می‌توان در بررسی‌های ذکر شده یافت. ساختار بشکه بتا یک استوانه تقریباً کامل است، ۴۲Å آنگستروم طول و ۲۴Å آنگستروم قطر (برخی مطالعات قطر ۳۰Å آنگستروم را گزارش کرده‌اندBrejc, K. 1997, 94 (6), 2306-2311.)، ایجاد آنچه که به عنوان «β-قوطی» تشکیل می‌شود، که منحصر به فرد است به خانواده GFP مانند. زنجیره‌های جانبی بشکه ای رو به داخل باعث واکنش‌های خاص چرخشی در Ser65 – Tyr66 – Gly67 می‌شوند که باعث یونیزاسیون HBI به فرم فنلات و تشکیل کروموفور می شوند. از این فرایند اصلاح پس از ترجمه (پیرایش بعد از ترجمه ژنتیکی) به عنوان بلوغ یاد می‌شود. شبکه پیوند هیدروژن و فعل و انفعالات انباشته الکترون با این زنجیره‌های جانبی بر رنگ، شدت و پایداری نوری GFP و مشتقات بی شمار آن تأثیر می‌گذارد. طبیعت بسته‌بندی شده بشکه، از مولکول‌های حلال جلوگیری می‌کند و از فلورسانس کروموفور در مقابل خاموش شدن توسط آب محافظت می‌کند. Arg96 مهم‌ترین باقیمانده تثبیت کننده است به این دلیل که باعث تحقق مجدد ساختارهای لازم برای حلقه HBI می‌شود. هرگونه جهش به واحد Arg96 منجر به کاهش سرعت رشد کروموفور می‌شود زیرا فعل و انفعالات مناسب الکترواستاتیک و استریک از بین می‌رود. برنامه‌های کاربردی سنجش‌های خبرنگار پروتئین فلورسنت سبز ممکن است به عنوان ژن گزارشگر استفاده شود. به عنوان مثال، GFP می‌تواند به عنوان گزارشگر برای سمیت محیطی مورد استفاده قرار گیرد. این پروتئین نشان داده شده‌است به یک راه مؤثر برای اندازه‌گیری سطح سمیت مواد شیمیایی مختلف از جمله اتانول، ص -formaldehyde، فنل، تریکلوزان، و پارابن GFP به عنوان یک پروتئین گزارشگر عالی است زیرا وقتی به محیط سلولی میزبان وارد شود تأثیری روی میزبان ندارد. با توجه به سطح آلاینده‌ها، فلورسانس اندازه‌گیری شد تا بتوان اثرات آلاینده‌ها را بر روی سلول میزبان سنجید. نتایج حاصل از مطالعه انجام شده توسط Song, Kim، & Seo (2016) نشان داد که با افزایش سطح آلاینده‌ها، هم در فلورسانس و هم در تراکم سلولی کاهش یافته‌است. تحقیقات بیشتر در مورد این کاربرد خاص به منظور تعیین مکانیزمی که GFP به عنوان یک نشانگر آلاینده عمل می‌کند. نتایج مشابهی در ماهی گورخرماهی (Zebrafish) مشاهده شده‌است زیرا ماهی گورخری که با GFP تزریق شده بود تقریباً بیست برابر نسبت به ماهی که با GFP تزریق نشده بودبرای تشخیص تنشهای سلولی حساس تر بود. مزایا بزرگ‌ترین مزیت GFP این است که می‌تواند وراثتی باشد، بسته به نحوه معرفی آن، امکان ادامه مطالعه سلولها و بافتهایی که در آنها بیان می‌شود را می‌دهد. GFP به تنهایی در فرایندهای بیولوژیکی تداخل ایجاد نمی‌کند، اما وقتی با پروتئین‌های مورد علاقه ذوب می‌شود، برای حفظ عملکرد پروتئین مورد نظر، طراحی دقیق پیوند دهنده‌ها مورد نیاز است. در دسترس بودن GFP و مشتقات آن میکروسکوپ فلورسانس و نحوه استفاده از آن را در زیست‌شناسی سلول و سایر رشته‌های زیست شناختی کاملاً تعریف کرده‌است. | ## بخش 3: پروتئین فلورسنت سبز | در حالی که اکثر مولکولهای کوچک فلورسنت مانند FITC (ایزوتیوسیانات فلورسئین) وقتی در سلولهای زنده استفاده می‌شود به شدت فتوتوکسیک هستند، پروتئین‌های فلورسنت مانند GFP وقتی در سلولهای زنده روشن شوند معمولاً بسیار مضر هستند. این امر باعث ایجاد سیستم‌های میکروسکوپی فلورسانس سلول زنده بسیار خودکار شده‌است، که می‌تواند برای مشاهده سلول‌ها با گذشت زمان بیان یک یا چند پروتئین برچسب خورده با پروتئین‌های فلورسنت مورد استفاده قرار گیرد. GFP همچنین می‌تواند در ساختارهای مختلف بیان شود که تمایز ریخت‌شناسی را امکان‌پذیر می‌کند. در چنین مواردی، ژن تولید GFP در ژنوم ارگانیسم موجود در ناحیه DNA گنجانده می‌شود که برای پروتئین‌های هدف کدگذاری می‌کند و توسط همان توالی نظارتی کنترل می‌شود؛ یعنی توالی تنظیمی ژن علاوه بر پروتئین (های) برچسب خورده، تولید GFP را نیز کنترل می‌کند. در سلولهایی که ژن بیان شده و پروتئینهای دارای برچسب تولید می‌شوند، GFP همزمان تولید می‌شود؛ بنابراین، فقط سلولهایی که ژن برچسب زده شده در آنها بیان شده یا پروتئینهای هدف تولید می‌شوند، وقتی توسط میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شوند، فلورس خواهند شد. تجزیه و تحلیل چنین فیلم‌های مرور زمان تعریف بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی از جمله خمش پروتئین ، انتقال پروتئین و پویایی RNA را تعریف کرده‌است، که در گذشته با استفاده از مواد غیر ارگانیک مورد مطالعه قرار گرفته بود. از داده‌های بدست آمده همچنین برای کالیبراسیون مدل‌های ریاضی سیستم‌های داخل سلولی و تخمین میزان بیان ژن استفاده می‌شود. به‌طور مشابه، GFP می‌تواند به عنوان شاخص بیان پروتئین در سیستم‌های ناهمگن استفاده شود. در این سناریو، پروتئین‌های همجوشی حاوی GFP به‌طور غیرمستقیم، با استفاده از RNA سازه، یا مستقیماً، با خود پروتئین برچسب دار معرفی می‌شوند. این روش برای مطالعه خصوصیات ساختاری و عملکردی پروتئین برچسب خورده در مقیاس ماکرومولکولی یا تک مولکولی با میکروسکوپ فلورسانس مفید است. یکی دیگر از کاربردهای قدرتمند GFP بیان پروتئین در مجموعه‌های کوچکی از سلولهای خاص است. این به محققان این امکان را می‌دهد تا انواع خاصی از سلولها را به صورت نوری در محیط آزمایشگاهی درون کشتگاهی (In vitro) یا حتی در داخل بدن درون جانداری (In vivo) تشخیص دهند. و غیره همچنین مشخص شده‌است که نسلهای جدیدی از موشهای GFP تراریخته می‌توانند برای ژن درمانی و همچنین داروهای بازساختی کارآمد باشند. با استفاده از «بیانگر بالا» GFP، موشهای تراریخته بیان زیادی در اکثر بافتها دارند و بسیاری از سلولهایی که در موشهای تراریخته قبلی GFP مشخص نشده‌اند یا فقط ضعیف توصیف شده‌اند. نشان داده شده‌است که GFP در روش زیست‌شناسی انجمادی به عنوان یک آزمون حیاتی مفید است. کاربرد دیگر استفاده از GFP همزمان انتقال به عنوان کنترل کارایی انتقال ژن (ترانسفکسیون) در سلول‌های پستانداران است. استفاده احتمالی جدید از GFP شامل استفاده از آن به عنوان مانیتور حساس فرایندهای درون سلولی از طریق سیستم لیزر eGFP ساخته شده از یک رده سلول کلیه جنینی انسان است. اولین لیزر زنده مهندسی شده توسط سلول بیسرمازیست‌شناسیان کننده eGFP در داخل حفره نوری بازتابنده ساخته شده و با پالس‌های نور آبی به آن ضربه می‌زند. در یک آستانه پالس مشخص، خروجی نوری eGFP روشن‌تر و کاملاً یکنواخت به رنگ سبز خالص با طول موج ۵۱۶ تبدیل می‌شود نانومتر قبل از اینکه به عنوان نور لیزر ساطع شود، نور در حفره تشدید کننده به عقب و جلو بازمی‌گردد و بارها از سلول عبور می‌کند. با مطالعه تغییرات فعالیت نوری، محققان ممکن است فرایندهای سلولی را بهتر درک کنند. GFP به‌طور گسترده‌ای در تحقیقات سرطان برای برچسب گذاری و ردیابی سلول‌های سرطانی استفاده می‌شود. سلولهای سرطانی دارای برچسب GFP برای مدل‌سازی متاستاز، فرایندی که سلولهای سرطانی به اندامهای دوردست هجوم می‌برند، مورد استفاده قرار گرفته‌اند. تقسیم GFP از GFP می‌توان برای تجزیه و تحلیل همنشینی (همنشانی) پروتئین‌ها استفاده کرد. با این حال، اگر دو پروتئین مورد علاقه در یک دیگر قرار بگیرند، سپس دو قطعه GFP با هم جمع می‌شوند و ساختاری GFP مانند ایجاد می‌کنند که قادر به فلورسنس است؛ بنابراین، با اندازه‌گیری سطح فلورسانس می‌توان تعیین کرد که آیا این دو پروتئین مورد علاقه در یک مکان قرار دارند. عکاسی ماکرو فرایندهای بیولوژیکی در مقیاس کلان، مانند انتشار عفونت‌های ویروسی، با استفاده از برچسب گذاری GFP قابل پیگیری است. در گذشته، از نور ماورا بنفش جهش زا (UV) برای روشن کردن موجودات زنده استفاده شده‌است (به عنوان مثال، به) برای تشخیص و عکس برداری از بیان GFP. اخیراً تکنیکی با استفاده از چراغهای LED غیر جهش زا برای عکاسی ماکرو ایجاد شده‌است. در این تکنیک از پیوست دوربین اپی فلورسانس بر اساس همان اصلی که در ساخت میکروسکوپ‌های اپی فلورسانس استفاده شده‌است، استفاده می‌شود. در سال ۲۰۰۹ یک تیم کره جنوبی از دانشگاه ملی سئول اولین بگلهای تراریخته را با سلولهای فیبروبلاست از شقایق دریایی پرورش داد. سگها نور قرمز فلورسنت ساطع می‌کنند و هدف آنها این است که به دانشمندان اجازه می‌دهد ژن‌هایی را که باعث بیماری‌های انسانی مانند نارکولپسی و کوری می‌شوند، مطالعه کنند. هنر جولیان ووس-آندره، یک هنرمند متولد آلمان متخصص در «مجسمه‌های پروتئینی»، مجسمه‌هایی را بر اساس ساختار GFP خلق کرد، از جمله "پروتئین سبز فلورسنت" با طول ۱٫۷۰ متر (5'6 ") (2004) و "چتر دریایی استیل" (۱٫۲۰۰ متر) با طول ۱٫۴۰ متر (۴'۷ "). | ## جمع‌بندی | این تصویر مجسمه ای از جنس استنلس استیل را در آزمایشگاه‌های جمعه بندرگاه در جزیره سن خوان (واشینگتن، ایالات متحده آمریکا)، محل کشف GFP نشان می‌دهد.