Vua Francois II qua đời ngày 5 tháng 12 năm 1560, vì chứng nhiễm trùng tai giữa dẫn đến áp xe trong não. Mary tỏ ra đau buồn. Mẹ chồng của bà, Catherine de' Medici, trở thành Nhiếp chính cho người em chồng vừa lên 10, Charles IX, người kế nhiệm ngôi vua Pháp.Mary trở về Scotland 9 tháng sau cái chết của chồng, cập bến Leith ngày 9 tháng 8 năm 1561. Đã sống ở Pháp từ lúc 5 tuổi, Mary có ít kinh nghiệm về tình hình chính trị nguy hiểm và phức tạp ở Scotland. Là một người Công giáo mộ đạo, bà nhận được ánh mắt nghi ngờ bởi nhiều người, ví dụ như người cô họ Elizabeth. Scotland đang nổ ra một cuộc tranh chấp giữa các tôn giáo, Công giáo Chính Thống và Kháng Cách, trong đó người anh khác mẹ của Mary, Bá tước Moray, là người lãnh đạo phe Kháng Cách. Giám mục Tin Lành John Knox tuyên truyền chống lại Mary, lên án bà vì đã tham dự lễ mét, khiêu vũ và ăn mặc trang phục Công giáo. Bà triệu tập ông ta đến gặp mình khiển trách nhưng không được, và sau đó buộc tội ông ta là phản quốc, nhưng Knox được trắng án và phóng thích.Nỗi thất vọng lớn đến với người Công giáo khi Mary bổ nhiệm các thành viên Kháng Cách vào triều, và giữ lại anh trai bà, Lãnh chúa Moray làm cố vấn. hội đồng cơ mặt gồm 16 người, được bổ nhiệm ngày 6 tháng 9 năm 1561, mà chiếm ưu thế là những nhà lãnh đạo theo Kháng Cách; vốn thắng thế ở Scotland từ cuộc khủng hoảng cải cách 1559 - 1560: Bá tước Argyll, Glencairn, và Moray. Chỉ có bốn người trong Hội đồng theo Công giáo: Bá tước Atholl, Erroll, Montrose, và Huntly, là người đang giữ chức Quan Chưởng ấn. Nhà sử học hiện đại Jenny Wormald nhấn mạnh rằng Nữ vương Mary có vẻ như đã thất bại trong việc chỉ định một Hội đồng bao dung cho người Công giáo và những hành động của quân Pháp, đây còn là dấu hiệu cho thấy bà quan tâm việc giành ngai vàng ở Anh hơn là vấn đề ở Scotland. Ngay cả sự bổ sung đáng kể vào nội đồng vào tháng 12 năm 1563, Lãnh chúa Ruthven,cũng là một người Kháng Cách mà Mary không ưa.Về vấn đề này, bà nhận thức được rằng mình đã thất thế khi đối mặt với các lãnh chúa Kháng Cách, vốn liên kết chặt chẽ với nước Anh. Bà hợp tác với Lãnh chúa Moray cùng tiêu diệt nhà lãnh đạo Công giáo, Lãnh chúa Huntly, vào năm 1562 khi ông ta lãnh đạo nhân dân vùng cao chống lại bà. Mary gửi William Maitland xứ Lethington làm đại sứ đến triều đình Anh để đề nghị về việc kế vị của Mary đối với ngai vàng của Elizabeth. Elizabeth từ chối công nhận bà là người kế nhiệm hợp pháp, sợ rằng làm như vậy thì khiến những người chống đối sẽ lập ra âm mưu lật đổ bà và đưa người kế nhiệm lên thay thế. Tuy nhiên, Elizabeth nói với Maitland rằng bà biết rằng không ai thích hợp để kế vị hơn Mary. Cuối năm 1561, đầu năm 1562, một cuộc hội kiến giữa hai Nữ vương dự định sẽ được diễn ra ở York hoặc Nottingham thuộc Anh quốc vào tháng 8 hoặc 9 năm 1562, nhưng Elizabeth cử Sir Henry Sidney hủy bỏ cuộc gặp vào tháng 7 vì vấn đề ở nước Pháp.Mary tính chuyện tái hôn với một thành viên hoàng tộc ở châu Âu. Tuy nhiên, khi cậu của bà, Hồng y Lorraine, bắt đầu đàm phán về một hôn nhân giữa bà với Đại Công tước Charles của Áo mà không có sự đồng ý của bà, bà tức giận và phản đối cuộc đàm phán ngầm. Nỗi lực của bà trong việc đàm phán hôn sự với Don Carlos, người vốn mắc bệnh tâm thần nhưng giữ địa vị kế thừa hợp pháp của Nhà vua Philip II của Tây Ban Nha, bị từ chối bởi Philip. Elizabeth cố gắng xoa dịu Mary bằng cách gợi ý về hôn sự của bà với một người Kháng Cách là Robert Dudley, Bá tước thứ nhất của Leicester (em rể của Sir Henry Sidney và là sủng thần của Elizabeth), người Elizabeth tin cậy và cho rằng mình có thể kiểm soát ông ta. Bà gửi đại sứ Thomas Randolph, nói với Mary rằng nếu bà lấy kết hôn với một quý tộc Anh, Elizabeth sẽ "tiến hành xem xét lại quyền lợi và danh hiệu của bà với tư cách em họ và là người thừa kế". Đề xuất trên cũng không đi đến đâu, bởi vì vị hôn phu không sẵn lòng kết hôn.Ngược lại, một nhà thơ Pháp trong triều đình Mary, Pierre de Boscosel de Chastelard, dường như say đắm Mary. Đầu năm 1563, ông ta được phát hiện đã nấp dưới gầm giường của Nữ vương, gây bất ngờ và sợ hãi cho Nữ vương vì khi đó bà đang ở một mình và ông ta công khai bày tỏ tình yêu với bà. Mary sợ hãi và trục xuất ông ta khỏi Scotland. Ông ta chống lại chỉ dụ trên, và hai ngày sau ông ta lại lẻn vào phòng của Nữ vương lúc bà đang thay quần áo. Bà giận dữ và sợ hãi, và khi Moray vội vã vào phòng vì nghe bà khóc và yêu cầu giúp đỡ; bà hét lên, "Hãy dùng con dao của anh đâm vào kẻ hung ác!", điều mà Moray từ chối làm, khi đó Chastelard đã bị khống chế. Chastelard bị buộc tội phản quốc và bị chặt đầu. Maitland tuyên bố rằng lòng nhiệt thành của Chastelard là giả tạo, một phần trong âm mưu của những người Kháng Cách làm nhằm làm mất uy tín và lu mờ danh tiếng của Mary.