Christian Bale vai Bruce Wayne / Batman:Bruce Wayne là một tỉ phú-tay chơi có tiếng. Sau khi chứng kiến cái chết của cha mẹ mình trong một vụ ám sát năm lên 8 tuổi, Bruce đã đi vòng quanh thế giới trong bảy năm trước khi trở về nhà để hoạt động dưới danh nghĩa một người thực thi công lý đeo mặt nạ dơi, được ngợi ca là "Kỵ sĩ bóng đêm" của thành phố Gotham khi sử dụng nỗi sợ để trấn áp thế giới ngầm tội phạm của thành phố vào ban đêm. Bale nói rằng anh rất tự tin với lựa chọn trở lại đóng vai diễn nhờ những phản hồi tích cực về diễn xuất của anh trong Batman Begins. Anh tiếp tục luyện tập theo phương pháp chiến đấu Keysi và tự thực hiện nhiều pha nhào lộn nhưng không tăng cơ nhiều như phần phim trước vì bộ Batsuit mới cho phép anh di chuyển một cách nhanh nhẹn hơn. Bale miêu tả về tình thế lưỡng nan của Batman, liệu "[cuộc thập tư chinh của anh ấy] có kết thúc. Anh ấy có thể từ bỏ và lấy lại cuộc sống bình thường không? Đó là loại sức mạnh hưng cảm mà người đó phải duy trì đam mê và sự giận dữ mà họ từng cảm nhận khi còn bé, rồi nỗ lực trong một thời gian dài để duy trì nó. Tại một số thời điểm, bạn phải xua đuổi con quỷ của chính mình". Nam diễn viên nói thêm, "Giờ bạn không chỉ là một người đàn ông trẻ tuổi mang nỗi đau cố gắng tìm ra một câu trả lời nào đó, mà bạn còn là một người thực sự có quyền lực cũng như bị quyền lực đè nặng, do đó bạn phải nhận ra sự khác biệt giữa việc đoạt lấy quyền lực và nắm giữ nó." Bale thấy rằng tính cách của Batman đã được hình thành đầy mạnh mẽ trong phần phim đầu, do đó dường như nhân vật của anh sẽ không bị các phản diện chiếm mất đất diễn, "Tôi không gặp vấn đề gì khi phải cạnh tranh với những người khác. Điều đó sẽ làm nên một bộ phim hay hơn".Michael Caine vai Alfred Pennyworth:Alfred là một người quản gia đáng tin cậy và người bạn tri kỷ của Bruce, ông cung cấp những lời khuyên hữu ích cho Bruce và mang hình ảnh chân dung một người cha, do đó Alfred còn được gọi là "Batman's batman".Heath Ledger vai Joker:Joker là một kẻ chủ mưu tâm thần vô chính phủ, tự miêu tả mình là "hiện thân của sự hỗn loạn"; y trỗi dậy từ thế giới ngầm tội phạm bằng cách trút sự tàn phá lên Gotham và kéo Batman gần đến lằn ranh giữa chủ nghĩa anh hùng và chủ nghĩa phản diện. Trước khi Ledger nhận vai Joker vào tháng 7 năm 2006, Paul Bettany, Lachy Hulme, Adrien Brody, Steve Carell và Robin Williams từng công khai bày tỏ sự quan tâm đến vai diễn. Tuy nhiên Nolan chỉ chọn làm việc với Ledger trong một số dự án trước đây (Ledger từng từ chối lời mời đóng vai Batman trong Batman Begins), đồng thời tán thành với diễn xuất nhân vật một cách hỗn loạn của Ledger. Khi Ledger xem Batman Begins, anh đã phát hiện ra cách để làm nhân vật phù hợp với màu sắc của phim: anh miêu tả Joker của mình là một "thằng hề tâm thần phân liệt bị rối loạn nhân cách chống xã hội và tên sát nhân tập thể vô cảm". Trong phim Joker có một nụ cười Glasgow, da phấn trắng và đôi môi đỏ mang thương hiệu là do hóa trang hơn là kết quả tẩy trắng hóa học, giống như ngoại hình nhân vật trong nguyên tác. Trong suốt tác phẩm, Joker có khao khát muốn đảo lộn trật tự xã hội, dẫn đến định nghĩa con người y qua cuộc xung đột với Batman. Để chuẩn bị cho vai diễn, Ledger đã sống một mình tại một căn hộ khách sạn trong một tháng để định hình điệu bộ, giọng nói và tính cách của nhân vật, đồng thời giữ một cuốn nhật ký ghi lại những suy nghĩ và cảm xúc của Joker. Dù từng gặp khó khăn trong giai đoạn đầu, Ledger cuối cùng đã tự tạo ra một giọng nói khác hẳn với nhân vật của Jack Nicholson trong phim Batman năm 1989. Anh còn được tặng hai cuốn truyện Batman: The Killing Joke—Arkham Asylum: A Serious House on Serious Earth, cuốn truyện khiến anh "thật sự cố đọc và đặt nó xuống". Ledger cũng trích dẫn A Clockwork Orange và Sid Vicious là "một sự khởi đầu rất sớm với Christian [Bale] và tôi. Nhưng chúng tôi kiểu như đã nhanh chóng bay xa khỏi đó và tiến vào một thế giới khác biệt hoàn toàn". "Có một chút của tất cả mọi thứ trong con người anh ấy. Không có gì là nhất quán cả", Ledger nói và cho biết thêm, "Có nhiều bất ngờ hơn đối với anh ấy". Ledger được phép quay và chỉ đạo hầu hết video mà Joker gửi đi cảnh báo người dân Gotham trong phim. Mỗi video Ledger thực hiện đều khác biệt so với video trước. Nolan rất ấn tượng với cảnh quay trong video đầu tiên khi Ledger lựa chọn không lộ diện trong cảnh chính anh quay với một phóng viên bị bắt cóc (Anthony Michael Hall). Ngày 22 tháng 1 năm 2008, sau khi hoàn tất Kỵ sĩ bóng đêm, Ledger đã qua đời vì dùng thuốc quá liều, gây nên rất nhiều sự chú ý từ giới báo chí và sau đó là hàng loạt hoạt động tri ân, tưởng nhớ anh. "Thật vô cùng xúc động bởi ngay khi anh ấy qua đời, tôi phải quay trở lại và nhìn anh ấy mỗi ngày [trong khi dựng phim]", Nolan nhớ lại, "Nhưng sự thật là tôi cảm thấy mình cực kỳ may mắn khi có một tác phẩm hay cùng màn trình diễn xuất sắc của anh ấy, tôi rất tự hào khi được anh ấy giao phó hoàn thành nốt bộ phim". Tất cả những cảnh của Ledger đều xuất hiện khi anh hoàn thành chúng trong lúc ghi hình; trong khâu dựng phim, Nolan đã không thêm vào bất cứ "hiệu ứng kĩ thuật số" nào để thay thế diễn xuất thực của Ledger sau khi anh qua đời. Nolan cũng dành tặng bộ phim để tri ân Ledger.Gary Oldman vai James Gordon:Gordon là trung úy thuộc Sở cảnh sát thành phố Gotham và một trong số ít những sĩ quan cảnh sát chính trực; ông đã thành lập một liên minh nhỏ không chính thức với Batman và Dent, cũng như được Thị trưởng thành phố phong làm Ủy viên Cảnh sát sau vụ Joker ám sát hụt ngài Thị trưởng. Oldman miêu tả nhân vật của ông là một người "liêm khiết, đạo đức, anh hùng nhưng hay nói thiếu". Nolan giải thích, "The Long Halloween có một mối quan hệ tuyệt vời giữa bộ ba Harvey Dent, Gordon và Batman—điều đó đã rất thu hút chúng tôi". Oldman cho biết thêm, "Gordon đã vô cùng cảm phục Batman ở đoạn kết nhưng [Batman] giờ đây lại trở thành kỵ sĩ bóng đêm - một kẻ ngoài vòng pháp luật. Giờ tôi tò mò muốn xem: Nếu có một người thứ ba, liệu anh ta sẽ làm gì?" Về khả năng tham gia một phần phim kế tiếp, ông cho biết "việc trở lại [vai diễn] không phụ thuộc vào việc liệu vai đó có vai trò lớn hơn vai diễn trước đó hay không?".Aaron Eckhart vai Harvey Dent / Two-Face:Dent là công tố viên quận được ca ngợi là "Kỵ sĩ trắng" của Gotham khi là người mở chiến dịch chống lại thế giới ngầm tội phạm của thành phố. Sau cuộc chiến với Joker, Dent chỉ còn lại nửa khuôn mặt bị biến dạng, biến anh trở thành một tên sát nhân với khuynh hướng tự trả thù cá nhân. Ban đầu Nolan và David S. Goyer từng cân nhắc sử dụng Dent trong Batman Begins nhưng anh lại bị thay thế bằng một nhân vật mới là Rachel Dawes khi ê-kíp làm phim nhận ra họ không thể "đem lại cho anh ta sự công bằng". Trước khi Eckhart nhận lời đóng Harvey Dent vào tháng 2 năm 2007, Liev Schreiber, Josh Lucas và Ryan Phillippe đều bày tỏ sự quan tâm đến vai diễn, trong khi Mark Ruffalo cũng đi diễn thử. Matt Damon cho biết anh cũng được cân nhắc cho vai Dent nhưng không thể nhận vai do mâu thuẫn về lịch trình. Hugh Jackman lại là một lựa chọn khác cho vai diễn. Cuối cùng Nolan đã chọn Eckhart, diễn viên ông từng cân nhắc cho vai chính trong Memento; ông nhắc đến anh về khả năng "phi thường" trong diễn xuất, hiện thân "nổi bật của chuẩn mực anh hùng Mỹ" do Robert Redford đề xuất và "khía cạnh" ẩn của anh. Eckhart quan tâm đến "những người tốt bị tha hóa" và đã thủ vai những người bị biến chất trong The Black Dahlia, Thank You for Smoking và In the Company of Men. Trong khi Two-Face được miêu tả là một tên trùm tội phạm ở hầu hết các đặc điểm, Nolan lại chọn miêu tả y là một nhân vật bán phản diện "khó lường" (twisted) để nhấn mạnh vai trò làm đối tác của Batman. Eckhart giải thích, "[Y] vẫn đúng với bản chất của y. Y là một đối thủ với tội phạm, y không giết người tốt. Y không hoàn toàn là một kẻ xấu". Về Dent, Eckhart "liên tưởng đến người nhà Kennedy", đặc biệt là Robert F. Kennedy, một người "duy tâm, kìm nén sự ác cảm và đối đầu với bọn mob". Ông có mái tóc sáng và hợp thời khiến cho diện mạo của ông đẹp hơn. Nolan đã dặn Eckhart không tạo nên "những tiếng nhai nhóp nhép hoặc chứng máy giật khiếm nhã" giống như nhân cách Two-Face của Dent.Maggie Gyllenhaal vai Rachel Dawes:Dawes là trợ lý công tố viên quận của thành phố Gotham và người bạn thời thơ ấu của Bruce, cô là một trong số ít người biết rõ danh tính thật của Batman. Gyllenhaal là người đảm nhận vai diễn từ nữ diễn viên thủ vai này trong Batman Begins là Katie Holmes. Vào tháng 8 năm 2005, có thông tin Holmes đang lên kế hoạch đảm nhận vai diễn, nhưng cuối cùng cô đã từ chối để ghi hình Mad Money với Diane Keaton và Queen Latifah. Đến tháng 3 năm 2007, Gyllenhaal đang trong "những cuộc đàm phán cuối cùng" cho vai diễn. Gyllenhaal thừa nhận rằng nhân vật của mình là một công chúa gặp nạn ở một mức nào đó, nhưng cho biết Nolan đã tìm cách để làm tăng khả năng của nhân vật, vì vậy "Rachel thực sự hiểu rõ điều gì quan trọng với cô ấy và không muốn làm tổn hại đạo đức của mình, điều đó tạo nên một sự thay đổi tốt đẹp" so với nhiều nhân vật mâu thuẫn mà cô từng thủ vai trước đây.Morgan Freeman vai Lucius Fox:Lucius là CEO vừa được thăng chức của tập đoàn Wayne Enterprises, hiện giờ ông là người đủ nhận thức về hai mặt cuộc sống của cậu chủ, nên đã phụng sự trong vai trò nhà sản xuất vũ khí của Bruce cho bộ Batsuit, bên cạnh vỏ bọc viên chức của công ty.Hai diễn viên Monique Gabriela Curnen và Ron Dean lần lượt thủ vai Anna Ramirez và Michael Wuertz, những thám tử biến chất trong đơn vị của Gordon. Nestor Carbonell xuất hiện trong vai Anthony Garcia, thị trưởng thành phố Gotham. Ng Chin Han đóng vai Lau, một nhân viên kế toán biến chất của Chinese LSI Holdings kiêm ông chủ Hội Tam Hoàng. Eric Roberts thủ vai Sal Maroni, một tên trùm mafia người Ý tiếp quản vị trí của Carmine Falcone và Ritchie Coster đóng vai Chechen, một tên trùm mafia Chechen phụ trách khâu buôn lậu ma túy. Anthony Michael Hall xuất hiện trong vai Mike Engel, một phóng viên của Gotham Cable News, còn Keith Szarabajka đóng Gerard Stephens, một thám tử trong đơn vị của Gordon. Joshua Harto thủ vai Coleman Reese, một kế toán viên M&A tại Wayne Enterprises, anh là người suy luận danh tính Batman của Bruce từ Fox và lên kế hoạch tiết lộ nó cho Gotham. Melinda McGraw đóng vai Barbara Gordon, vợ của Gordon, trong khi Nathan Gamble đóng James Gordon Jr., cậu con trai mới lên mười của Gordon. Michael Jai White thủ vai Gambol, một tên trùm mafia châu Phi nắm giữ khâu đánh bạc trái phép và tống tiền. Colin McFarlane đảm nhiệm vai Gillian B. Loeb, Ủy viên cảnh sát của Gotham trước khi bị Joker sát hại.