Con trai của Mary với Darnley, James, chào đời ngày 19 tháng 6 năm 1566 ở Lâu đài Edinburgh, nhưng cái chết Rizzio vẫn là nguyên nhân dẫn đến sự đổ vỡ của hôn nhân. Tháng 10 năm 1566, khi ở Jedburgh thuộc Scottish Borders, Mary cưỡi ngựa đến thăm Bá tước Bothwell trong khoảng ít nhất 4 tiếng đồng hồ tại Lâu đài Hermitage, nơi ông ta đang nằm bệnh vì vết thương trong trận chiến ở biên cương. Việc này được những người chống đối Mary coi như là bằng chứng họ đã là tình nhân của nhau, mặc dù không một ai nghi ngờ ngay vào thời điểm đó và Mary được ủy viên Hội đồng đi theo bảo vệ. Bất ngờ sau khi trở lại Jedburgh, bà mặc một căn bệnh nặng với triệu chucngws là môn nửa thường xuyên, mất thị giác, giọng nói, thường co giật và nhiều khi bất tỉnh. Bà được cho là đã sắp băng hà. Sự phục hồi của Nữ vương từ ngày 25 tháng 10 có thể là do trình độ cao của bác sĩ người Pháp của bà. Nguyên nhân của căn bệnh này không ai biết; dự đoán là do thể chất suy yếu và tinh thần căng thẳng, xuất huyết vì loét dạ dày, và porphyria.Tại Craigmillar Castle, gần Edinburgh, cuối tháng 11 năm 1566, Mary và các quý tộc trong nước đã mở cuộc họp thảo luận về "vấn đề Darnley". Việc li hôn cũng đã được tính đến, nhưng quyết định cuối cùng được các quý tộc thống nhất là sẽ dần loại bỏ Darnley bằng nhiều cách khác nhau: ""Thực là thích hợp và có lợi nhất cho sự thịnh vượng chung;... một kẻ ngốc trẻ con, xảo quyệt và tàn bạo như thế không nên cai trị hay lãnh đạo mọi người;  ... ông ta nên bị loại bỏ bởi một trong những phương thức nào đó,. và bất cứ ai cũng nên chấp thuận và thực hiện điều đó, họ cần phải bảo vệ." Darnley lo sợ cho sự an toàn của mình sau lễ rửa tội cho con trai ông tại Stirling không lâu trước Giáng sinh, ông đến Glasgow cư trú tại lãnh địa của phụ thân. Khi vừa mới lên đường, ông lên cơn sốt, có thể do bệnh đậu mùa, bệnh giang mai, hoặc là do bị đầu độc; ông ốm nặng sau vài tuần.Cuối tháng 1 năm 1567, Mary yêu cầu phu quân trở về Edinburgh. Ông dần hồi phục trong ngôi nhà của em trai của Sir James Balfour thuộc một tu viện cũ ở Kirk o' Field, nằm gọn trong lòng thành phố. Mary đến thăm chồng mỗi ngày, và hai người dường như đã hòa giải với nhau. Vào đêm 9-10 tháng 2 năm 1567, Mary đến thăm phu quân vào chập tối và sau đó đến dự hôn lễ của một thành viên hoàng tộc là Bastian Pagez. Tờ mờ sáng hôm sau, một vụ nổ làm tan hoang Kirk o' Field, và xác của Darnley được tìm thấy trong một khu vườn, dường như là bị bóp mũi cho chết. Không có bằng chứng của vết thắt cổ hay vết bầm nào trên thi thể. Bothwell, Moray, Bộ trưởn Maitland, Bá tước Morton và chính Mary là những người bị tình nghi hàng đầu. Elizabeth viết cho Mary nói về tin đồn, "Bản vương thấy xui rủi thay cho người em họ trung thành và một người bạn yêu quý ... nói cho bản vương biết cả thế giới đang nghĩ gì. Người ta nói rằng, thay vì phát giác kế hoạch mưu sát, Nữ vương đã phớt lờ cho bộ hạ khi chúng bỏ trốn; rằng Nữ vương sẽ không tìm cách trả thù những người đem đến cho Nữ vương niềm vui, như thể rằng các hành động có lẽ sẽ không bao giờ xảy ra cũng như kẻ gây ra nó sẽ không bị trừng phạt. Với bản thân bổn vương, bổn vương cầu xin Nữ vương sẽ tin rằng bản vương không nuôi dưỡng một ý nghĩ như thế."Cuối tháng 2, Bothwell bị tuyên bố là có liên can trong cái chết của Darnley. Lennox, cha của Darnley, đòi Bothwell trình diện trước Nghị viện Scotland, điều này được Mary đồng ý, nhưng yêu cầu của Lennox trong việc hoãn thời gian xét xử để có thêm chứng cứ bị từ chối. Khi Lennox không có mặt, và không có bằng chứng cụ thể, Bothwell được tha bổng sau phiên tòa kéo dài 7 giờ ngày 12 tháng 4. Một tuần sau, Bothwell lập mưu thuyết phục hơn 20 lãnh chúa và Giám mục ký vào Ainslie Tavern Bond, theo đó họ ủng hộ Bothwell kết hôn với Nữ vương.