GLUCOPYRANOSIDES

Abstract: Palmityl-glucopyranoside of the formula I <IMAGE> is prepared as described and used to protect cherries from attack by cherry flies.

Description: Neues Glucopyranosid Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Palmityl-glucopyr- anosid, ein Verfahren zu seiner Gewinnung, sowie seine Verwendung zum Schützen von Kirschen vor dem Befall durch Kirschenfliegen. Das erfindungsgemässe Palmityl-glucopyranosid entspricht der Formel I EMI0001.0006 und ist somit ein N-[15-(ss-Glucopyranosyl)oxy-8-hydroxypalmi- toylj-taurin. In der Formel I sind alle 4 möglichen optischen Isomeren, die durch die beiden Chiralitätszentren bedingt sind, eingeschlossen. Die Verbindung der Formel I kann auch in Form ihres Natrium- oder Kalium-Salzes vorliegen. Die Weibchen der Kirschenfliege Rhagoletis cerasi legen ihre Eier in halbreife Kirschen. Bis zum Zeitpunkt des Pflückens der reifen Früchte entwickeln sich die Larven in den Kirschen und machen diese als Tafelobst unbrauchbar. Es war somit ein dringendes Bedürfnis, ein Mittel zu finden, mit dem die heranreifenden Früchte vor der Eiablage behandelt werden können, um so die Kirschenfliege an der Eiablage zu hindern. Auf Grund der Beobachtung, dass in der Regel in einer Kirsche nur eine einzige Larve zu finden ist, wurde die Oberfläche von befal lenen Kirschen gereinigt. Der Reinigungsextrakt wurde auf heran wachsende Kirschen appliziert und eine Abnahme des Befalls durch Kirschenfliegen festgestellt. Zur Gewinnung grösserer Mengen des Markierungsstoffes der Kirschen fliegen wurden Zuchtkäfige aus Plexiglas verwendet. Nach 2 bis 4 Wochen nach Versuchsbeginn wurden die Exkremente der Fliegen von den Glaswänden abgestossen und mit Methanol extrahiert. Die braune Lösung wurde eingeengt und mit Aethanol verdünnt. Dieser Extrakt ist bei -20 C beliebig lange haltbar und wurde für die weitere Aufarbei tung verwendet. _ "s <B>e</B> <B>4</B> Die Reinigung des Extraktes erfolgte mittels mehrfacher, abwechs lungsweiser Säulen- und Dünnschicht-Chromatographie. Als Laufmittel wurden Mischungen von Methanol, Aethanol, Acetonitril und Wasser sowie die reinen Lösungsmittel verwendet. Die Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde im Verhaltensexperiment und elektrophysiologisch an der Kirschenfliege geprüft. Nach sechs Reinigungsoperationen war der Extrakt so rein, dass weder die FAA-Spektren noch die FD-Spektren auf wesentliche Verunreinigungen hinwiesen. Die eigentliche Strukturaufklärung erfolgte mit einem handelsübli chen HF-Massenspektrometer und einem ebenfalls handelsüblichen NMR-Spektrometer, wobei nach üblichen Methoden vorgegangen wurde. Die erhaltenen Signale wurden nach bekannten Methoden ausgewertet und bestätigten die Struktur der Formel I. <U>Beispiel</U> A.<U>Gewinnung des Rohmaterials</U> Zur Gewinnung des Rohmaterials werden Zuchtkäfige aus Plexiglas (30x30x40 cm) verwendet, die mit Glasplatten ausgekleidet und zur Vergrösserung der Oberflächen mit weiteren Glasplatten senkrecht unterteilt sind. Diese Käfige werden mit einer Wasserquelle und Futter bestehend aus Hefehydrolysat und Zucker versehen. Die Kirschenfliegen (Rhagoletis cerasi) werden alsdann in diesen Käfigen zum Schlüpfen gebracht. Die auf den Glasplatten deponierten Exkre mente der Kirschenfliegen werden nach 3 Wochen mit einer Rasier klinge abgestossen. 7,3 g dieser braunen, klebrigen Masse werden in 75 ml Methanol während 10 Minuten in einem Ultraschallbad aufgeschlämmt. An- schliessend wird bei 2 C während 4 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt und 20 Minuten lang bei 12 000 g zentrifugiert. Der Boden satz wird zwei weitere Male in 40 ml Methanol aufgeschlämmt und wie beschrieben extrahiert und zentrifugiert. Die vereinigten methano- lischen Extrakte werden am Rotationsverdampfer auf 20 ml eingeengt und dann mit 20 ml Aethanol verdünnt (= 40 ml Rohextrakt). B.<U>Reinigung des Rohextraktes</U> 1. Flüssigkeits-Chromatographie <U>an</U> Cellulosesäule Ein Glasrohr 50/600 mm wird nach dem Schüttverfahren mit Cellulose- pulver (123 A, Schleicher-Schüll, Dassel, BRD) in Methanol/Aethanol 1:1 auf eine Säulenhöhe von 400 mm gefüllt. 40 ml des unter (A) erhaltenen Rohextraktes werden auf diese Säule gegeben und bei einem Säulenfluss von 10-15 ml#min 1 zuerst mit 1400 ml Methanol/Aethanol 1:1 und dann mit 1000 ml Methanol/Wasser 1: 1 eluiert. Elektrophysiologisch wird im Intervall zwischen 1100 ml und 2000 ml Elutionsvolumen Aktivität nachgewiesen. Diese 900 ml werden am Rotationsverdampfer auf 0,5 ml eingeengt und in 3,5 ml Methanol aufgenommen. 2. Dünnschicht-Chramatographie <U>an</U> präparativer Celluloseplatte 8 PSC-Celluloseplatten mit den Massen 200/200 mm und 0,5 mm Schicht dicke, ohne Fluoreszenzindikator (Merck, Darmstadt, BRD), werden zur Reinigung einmal mit Wasser und nach Trockenwerden einmal mit Methanal bis zum oberen Rande entwickelt. In trockenem Zustand werden auf jede Platte 0,5 ml des unter B.1 erhaltenen methano- lischen Konzentrates mit Hilfe eines Auftraggerätes aufgebracht. Die Entwicklung erfolgt mit Aethanol/Wasser 1:1. Nach beendeter Ent wicklung wird das Schichtmaterial in Streifen von 0,1 Rf-Einheiten entfernt und wie folgt eluiert: Die Streifen werden in 15 ml Methanol aufgeschlämmt, 15 Minuten lang mit dem Magnetrührer extrahiert und anschliessend während 15 Minuten bei 3000 g zentri fugiert. Der Bodensatz wird nochmals mit 10 ml Methanol der gleichen Extraktion unterworfen. Die vereinigten methanolischen Lösungen werden am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 0,5 ml eingeengt. Elektrophysiologische Aktivität zeigt sich bei<B>0,9</B> und 1,0 R# Einheiten. 3. Flüssigkeits-Chromatographie <U>an C-18 Säule</U> EMI0004.0029 Säulentyp <SEP> : <SEP> Ultrasphere-ODS <SEP> (Altei, <SEP> USA) <SEP> 4,6x250 <SEP> mm; <tb> Korngrösse <SEP> 5 <SEP> u. <tb> Laufmittel: <SEP> 20 <SEP> % <SEP> Methanol <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> bis <SEP> 100 <SEP> % <SEP> Methanol <SEP> bei <tb> einem <SEP> Gradienten <SEP> von <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Methanol#min <SEP> 1 <SEP> (steiler <tb> Gradient) <tb> Säulenfluss: <SEP> 0,5 <SEP> ml-min-1 <tb> Fraktionsvolumen: <SEP> 0,5 <SEP> ml Der unter B.2 erhaltene Extrakt wird in Portionen von 0,1 ml auf die Säule gegeben. Elektrophysiologisch wird im Intervall zwischen 7,5 ml und 9 ml Elutionsvolumen Aktivität nachgewiesen. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden am Vakuum auf 0,1 ml eingeengt und dann mit Methanol auf 0,5 ml verdünnt. 4. Dünnschicht-Umkehr-Phasen-Chromatographie <U>an C-12 Platten</U> Plattentyp: OPTI-UP C-12; 10x20 cm; Schichtdicke 0,25 mm mit Fluoreszenzindikator (Antec, Beinwil, CH) 5 Platten werden wie unter B.2 beschrieben gereinigt. Auf die gereinigten trockenen Platten wird je 0,1 ml des unter B.3 ge wonnenen Extraktes mit einem Auftraggerät aufgebracht. Die Ent wicklung der Platten erfolgt mit Methanol als Laufmittel. Nach beendeter Entwicklung wird das Schichtmaterial in Streifen von 0,1 Rf-Einheiten entfernt und wie folgt eluiert: Die Streifen werden <I>je in</I> 3 ml Methanol aufgeschlämmt und 15 Minuten lang mit einem Magnetrührer extrahiert und anschliessend während 20 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Die Bodensätze werden nochmals der gleichen Extraktion unterworfen und die entsprechenden Ueberstände vereinigt. Diese 10 Fraktionen werden einzeln am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt und je in 0,3 ml Methanol/Acetonitril 1:1 aufge nommen. Elektrophysiologisch wird im Rf-Einheitenbereich 0,5-0,7 Aktivität nachgewiesen. 5. Flüssigkeits-Chromatographie <U>an</U> NH2-Säule EMI0005.0017 Säulentyp <SEP> : <SEP> Lichrosorb <SEP> NH2 <SEP> (Merck, <SEP> Darmstadt, <SEP> BRD) <SEP> 4x250 <SEP> mm; <tb> Korngrösse <SEP> 5 <SEP> u. <tb> Laufmittel: <SEP> 100 <SEP> I <SEP> Acetonitril <SEP> bis <SEP> 100 <SEP> % <SEP> Wasser <SEP> bei <SEP> einem <tb> Gradienten <SEP> von <SEP> 6 <SEP> I <SEP> Wasser#min <SEP> 1 <tb> Säulenfluss: <SEP> 0,5 <SEP> ml-min-1 <tb> Fraktionsvolumen: <SEP> 0,5 <SEP> ml Die unter B.4 erhaltenen aktiven Extrakte werden in Portionen von 0,1 ml auf die Säule gegeben. Elektrophysiologisch wird im Intervall von 12,5 ml bis 15 ml Elutionsvolumen Aktivität nachgewiesen. In diesem Bereich wird das Wasser durch Lyophilisation entfernt und der Rückstand in 0,3 ml 40%igem Methanol/Wasser-Gemisch aufgenommen. 6. Flüssigkeits-Chromatographie <U>an C-18</U> Umkehr-Phasen-Säule EMI0006.0007 Säulentyp <SEP> t <SEP> Ultrasphere-ODS <SEP> (Altex, <SEP> USA) <SEP> 4,6x250 <SEP> mm; <tb> Korngrösse <SEP> 5 <SEP> u. <tb> Laufmittel: <SEP> 40 <SEP> % <SEP> Methanol <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> bis <SEP> 100 <SEP> % <SEP> Methanol <SEP> bei <tb> einem <SEP> Gradienten <SEP> von <SEP> 2 <SEP> % <SEP> Methanol-min-1 <SEP> (flacher <tb> Gradient) <tb> Säulenfluss: <SEP> 0,5 <SEP> ml#min <SEP> 1 <tb> Fraktionsvolumen: <SEP> 0,5 <SEP> ml Der unter B.5 erhaltene Extrakt wird in zwei Portionen von 0,15 ml auf die Säule gegeben. Jede der erhaltenen 50 Fraktionen wird am Rotationsverdampfer auf 0,1 ml und in einem Gefäss mit konischem Boden in einem leichten Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt. Die Fraktionen Nr. 16 bis Nr. 22 zeigen biologische Aktivität. Der trockene Rückstand dieser Fraktionen bildet an der Gefässwand einen farblosen, lackartigen und nicht verdampfbaren Film von hoher Polarität und ohne Lichtabsorption im UV-Bereich. Jede der sieben aktiven Fraktionen wird in 50 V1 Methanol aufgenom men. Die Fraktion Nr. 19 weist die höchste Konzentration auf und ist elektrophysiologisch bis zu einer 107 fachen Verdünnung nachzu weisen. Im labormässigen Verhaltensexperiment mit Kirschenfliegen an behandelten Ceresin-Wachsdomen (E. Boller und J. Hurter: Entomol.exp.appl. 39, 163-169, 1985) wird der elektrophysiologische Befund bestätigt. C.<U>Elektrophysiologische Prüfung</U> Die Prüfung auf biologische Aktivität der Fraktionen erfolgt mittels elektrophysiologischen Ableitungen von tarsalen Kontakt-Chemorezep- toren, wobei nach der von E. Städler beschriebenen Methode vorge gangen wird (E. Städler: Contract Chemoreception; Chemical Ecology of Insects, 1984, p. 3-35). Die zu messenden Proben bestehen aus 10 p1 Fraktionslösung aufgelöst in 1 ml 10 mN Natriumchlorid-Lö- sung. 2 u1 dieser verdünnten Lösung werden in eine Glas-Kapillar- elektrode aufgesogen und zur Stimulierung von 4 bis 8 Rezeptoren des Prothorax tarsus einer weiblichen Kirschenfliege verwendet. D.<U>Strukturaufklärung</U> Fast Atom Bombardment (FAB) einer Probe von B.6 liefert ein Massen spektrum, das intensive Signale für das protonierte Molekül [M + H] + (m/z 558) sowie von Addukten des Moleküls mit Alkalimetallionen, z.B. [M + Na] + (m/z 580) und [M + K]+ (m/z 596), zeigt. Als Matrix wird Thioglycerin verwendet. Eine Massenbestimmung unter Hochauf- lösungsbedingungen (Matrix:Polyäthylenglykol) ergibt für das [M + Naj Ion<B>580,277 8,</B> was mit der Bruttoformel C24H47011NSNa (berechnete Masse 580,2764) gut übereinstimmt. Das 400 MHz 1H-NMR-Spektrum in CD30D zeigt das Vorhandensein einer Glucose an, die ss-glykosidisch mit dem w-1 Kohlenstoff eines geradkettigen Dihydroxyfettsäure-Derivates verknüpft ist. Die GC/MS-Analyse der mit Bis-trimethylsilyl-acetamid silylierten Methanolyseprodukte liefert die Information über die Kettenlänge der Dihydroxyfettsäure und die Position der freien OH-Gruppen in der Kette. Das EI-MS-Spektrum des Trimethylsilyl (TMS)-Derivates des Methylesters (M - 446, extrapoliert vom [M-CH3] +-Fragment m/z m 431 und von [M + H]+-Ion m/z = 447, das durch chemische Ionisation mit Isobutan als Reaktandgas erhalten wird) zerfällt in charakteristi schen a-Brüchen in die Fragmente TMS-@=CH(CH2)6COOCH3 m/z = 245; CH3CH(0-TMS)-(CHZ)6-CH=5TMS, m/z = 303; und CH3CH=0-TMS, m/z = 117. Aus diesen Fragmenten folgen die Hydroxylpositionen C-8 und C-15 und somit auch die Kettenabschnitte m=n=6. Bei der Methanolyse wird als weiteres Spaltprodukt von B.6 Taurin mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen (DC-Fertig- platten, Kieselgel 60 F 254; Laufmittel n-Butanol/99%ige Essig säure/Wasser 8:3:1 und n-Propanol/25%iger Ammoniak 8:2; Nachweis- reagenz:Cl2/KJ/N,N,N',N'-Tetramethyl-4,4'-diaminodiphenylmethan). Die auf Grund der NMR-Signale postulierte Amid-Verknüpfung zwischen Fettsäure und Taurin steht mit der Nichtacetylierbarkeit des N-Atoms von B.6 in vollem Einklang. <U>Tabelle I:</U> Methanolyse von B.6 EMI0008.0023 EMI0009.0001 <U>Tabelle <SEP> 1I:</U> <SEP> 400 <SEP> MHz <SEP> IH-NMR-Parameter <SEP> von <SEP> 1 <SEP> und <SEP> la <SEP> in <SEP> CD30D. <tb> Ha') <SEP> ö <SEP> (1) <SEP> d <SEP> (la)b') <SEP> Kopplungskonstanten <tb> J(Hz) <SEP> 1 <SEP> la <tb> 1 <SEP> 4.31 <SEP> 4.70 <SEP> J(1.2) <SEP> 8.0 <SEP> 8.0 <tb> 2 <SEP> 3.13 <SEP> 4.84 <SEP> J(2.3) <SEP> 9.0 <SEP> 9.5 <tb> 3 <SEP> 3.33 <SEP> 5.24 <SEP> J(3.4) <SEP> 9.0 <SEP> 9.5 <tb> 4 <SEP> 3.28 <SEP> 4.99 <SEP> J(4.5) <SEP> 9.0 <SEP> 10.0 <tb> 5 <SEP> 3.23 <SEP> 3.84 <SEP> <B>1</B>(5.6) <SEP> 6.0 <SEP> 2.5 <tb> 6 <SEP> 3.66 <SEP> 4.11 <SEP> J(5.6) <SEP> 2.0 <SEP> 5.0 <tb> 6' <SEP> 3.84 <SEP> 4.25 <SEP> J(6.6) <SEP> 12.0 <SEP> 12.5 <tb> X-CH2 <SEP> 2.95 <SEP> 2.94 <SEP> zwei <SEP> Tripletts <SEP> mit <tb> I <SEP> J(CH2, <SEP> CH2) <SEP> = <SEP> 7 <SEP> Hz <tb> Y-CH2 <SEP> 3.58 <SEP> 3.58 <tb> 2-C0 <tb> I <tb> C-2 <SEP> CH2 <SEP> 2.18 <SEP> 2.18 <SEP> Triplett <SEP> J <SEP> = <SEP> 7 <SEP> Hz <tb> I <tb> (CH2) <SEP> n <SEP> C.) <SEP> c.) <SEP> C.) <tb> I <SEP> 3.50 <SEP> 4.84 <SEP> Multiplett <tb> "C-i" <SEP> CH-OR <tb> i <tb> (CH21 <SEP> c.<B>)</B> <SEP> C.) <SEP> C.) <tb> t <SEP> 3.85 <SEP> 3.78 <SEP> Multiplett <tb> C(w-i) <SEP> CHOR' <tb> t <tb> <B>CH3</B> <SEP> 1.16 <SEP> .1.11 <SEP> Dublett <SEP> J <SEP> = <SEP> 6 <SEP> Hz EMI0010.0001 b.) Die Signale der fünf Acetylgruppen erscheinen als Singuletts bei 2.04, 2.01, 2.00 (2x) und 1.95 ppm. c.) Die Signale der (CH2)m und (CH2)n Gruppen absorbieren als Multipletts bei 1.60 und 1.45-1.25 ppm-für 1 sowie 1.65-1.50 und 1.45-1.25 ppm für la.

Claims: The compound of formula The compound obtainable from excrement of the cherry maggot Rhagoletis cerasi by repeated chromatographic purification. Use of the compound as claimed in claims 1 and 2 for protecting cherries from attack by cherry maggots. A process for obtaining the compound as claimed in claims 1 and 2, which comprises taking up the excrement of the cherry maggot Rhagoletis cerasi in methanol and effecting purification by column and thin-layer chromatography.

Inventors: BOLLER, ERNST, DR., HURTER, JAKOB, DR., RASCHDORF, FRITZ, STAEDLER, ERICH, DR., Städler, Erich, Dr.
Applicants: EIDGENOESS WEIN & GARTENBAU
Application year: 1987
Main classification: C07H15
IPC codes: A01N43, C07H15