USE OF BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDES AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM

Abstract: The process entails the hydrolysis of natural substances in an aqueous medium, and comprises the following steps: a) an aqueous homogenisate of natural substances is prepared, b) enzymatic hydrolysis is carried out with a hydrolytic agent containing alpha-chymotrypsin, c) a fraction containing the polypeptides of specified molecular weight is separated from the hydrolysate, and this fraction is collected. The compositions containing these polypeptides are useful for their actions on cells in vivo and/or in vitro.

Description: PROCEDE DE PRÉPARATION DE POLYPEPTIDES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, POLYPEPTIDES OBTENUS ET<B><U>COMPOSITIONS</U></B> La présente invention concerne des polypeptides biologiquement actifs, un procédé pour leur préparation et les compositions 1.,:s contenant. Les extraits d'organes ou de tissus d'animaux ou de microorganismes so:;t connus depuis longtemps pour leur pouvoir de régénération de la peau et sont utilisés en cosmétologie et en pharmacie dermatologique. Toutefois, CES extraits sont souvent préparés par des techniques conduisant à des produits difficilement reproductibles et de composition variable, en particulier lorsque ces procédés irxpliquent des thermodégradations comme cela est décrit, par enemple, dans le brevet français n 2 472<B>385.</B> Ces variations dans la nature et la structure des composants des extraits ainsi préparés influent, bien entendu, sur leurs activités qui sont, elles aussi, diffi cilement reproductible:. Par ailleurs,. l'activité de nombreux extraits, obtenus par des procédés connus à partir d'organes ou de tissus d'animaux ou de microorganismes sur la régénération de la peau est limité(: en raison de la présence dans ces extraits de quantité Mus ou moins importante de substances possédant une action nitostatique, voire toxique, vis-à-vis des cellules de la peau. Les études :)oursuivies par la Demanderesse lui ont permis de mettre au point la possibilité d'obtenir des ,polypeptides possédant: des propriétés particulièrement utiles, notamment en dermatol)gie, en cosmétique et pour les cultures de cellules, tout en #Titant des effets mitostatiques ou cytotoxiques. En effet,<B>la</B> présente invention concerne des poly peptides caractérisés 3n ce qu'ils sont obtenus par hydrolyse enzymatique de substances biologiques naturelles au moyen de l'alpha-chymotrypsine <B>seule</B> ou associée<B>à une autre</B> enzyme protéolytique telle que la trypsine. Pour la description de la présente invention,on entend par l'expression "substances biologiques naturelles" des macromolécules, généralement des protéines, présentes dans des organismes vivants, par exemple des organes ou tissus animaux, des fluides biologiques ou des microorga nismes. Les essais réalisés par la Demanderesse ont montré que les polypeptides obtenus par le procédé de l'invention possécaient une grande activité biologique, en particulier sur la multiplication des cellules de la peau in vitro, telles que fibroblastes, mélanocytes ou keratinocytes, leur protection contre certaines agressions telles que les rayons ultraviolets, et, in vivo, sur la restructuration de la peau et la prévention de son vieillissement actinique ou naturel. Ces essais ont montré, en outre, que l'activité bio logique de ces polypeptides était, de faon inattendue,<I>géné-</I> ralement et significativement plus importante que celle des produits déjà connus et utilisés pour des applications iden tiques. En outre, et de façon tout aussi inattendue des essais réalisés sur cultures de cellules de la peau par la Deman deresse ont montré que les polypeptides selon l'invention ne présentent généralement aucune cytotoxicité, ou une cytoto- xicité beaucoup plus faible que celle des extraits connus d'organes, de tissus d'animaux ou de microorganismes dont il a été fait mention plus haut. De plus, il a été mis en évidence que certains poly peptides selon l'invention correspondant à une gamme de poids moléculaire déterminée étaient plus actifs que ceux ayant des poids moléculaires inférieurs ou supérieurs. C'est pourquoi la présente invention concerne plus particulièrement des polypeptides de poids moléculaire inférieur à 20 000 Daltons, et plus particulièrement encore des polypeptides de poids moléculaire inférieur à 10<B>000</B> Daltons. Le procédé de préparation de ces polypeptides bio- logiquement actifs par hydrolyse de substances naturelles en milieux aqueux selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes principales suivantes a) on prépare un homogénéisat aqueux de substances naturelles, b) on réalise l'hydrolyse enzymatique avec un agent d'hydrolyse comportant de l'alpha-chymotrypsine, c) on recueille l'hydrolysat, et d) on sépare de l'hydrolysat une fraction comportant les polypeptides de poids moléculaire déterminé et on recueille cette fraction. La préparation de l'homogénéisat aqueux de substances naturelles comprend le broyage des matières premières bio logiques, lorsque celles-ci sont solides. De préférence, selon l'invention, on sépare lors de l'étape d) ci-dessus, la fraction de l'hydrolysat compor tant les polypeptides de poids moléculaire inférieur à en viron 20<B>000</B> Daltons, et en particulier de préférence inférieur à environ 10 000 Daltons. En outre, on peut également selon l'invention, de l'hydrolysat ou de la fraction d'hydrolysat ci-dessus, éliminer les polypeptides de poids moléculaires inférieurs à environ 1 000 Daltons. Les matières premières biologiques utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont d'ori gines variées, comme cela apparaîtra dans les exemples. Elles sont notamment d'origine animale ou issues de microorganismes, et en particulier issues de jeunes animaux ou d'embryons. A titre d'exemples donnés uniquement à titre indicatif et nullement limitatifs, on citera plus particu lièrement comme matières - des organes ou des tissus animaux : coeur, rate, thymus, peau, cerveau ou foie de bovins, d'ovins ou d'embryons bovins ou de poulets, placenta bovin, ovin ou humain, - des fluides ou sécrétions biologiques : sérum de veau ou de boeuf, lait, colostrum, - des protéines : protéines de tissus conjonctifs (collagène, élastine, réticuline, fibronectine), protéines fibreuses (f ibroine de la soie, kératine de poils ou de cheveux), séricine, - des levures : saccharomyces cerevisiae. Lorsque les substances naturelles mises en oeuvre sont solides, elles sont de préférence broyées avant d'être hydrolysées pour obtenir un hydrolysat aqueux. L'obtention d'un broyat peut être réalisée par des techniques connues, en particulier par broyage mécanique et/ou hydrau lique des substances congelées ou non. L'hydrolyse enzymatique constitue un aspect important du procédé, c'est en effet elle qui permet d'ob tenir des polypeptides ayant la caractéristique structurelle évoquée précédemment. Pour cette hydrolyse, on utilisera comme enzyme l'alpha-chymotrypsïne seule ou associée à une autre enzyme protéolytique telle que la trypsine. Ladite association comprendra de préférence des quantités voisines d'alpha-chymotrypsine et de l'autre enzyme protéolytique. Cette hydrolyse est mise en oeuvre dans le domaine d'activité optimum de la ou des enzymes, c'est-à-dire en général à une température de l'ordre de 37 C et à un pH maintenu à une valeur proche de 8, le traitement étant effectué de préférence sous agitation douce, en général pendant 1 heure environ. De façon générale, la quantité d'enzyme ajoutée ne constitue pas un élément caractéristique du procédé car elle peut dépendre de l'activité de la ou des enzymes utilisées, et de la nature de la substance utilisée. A titre d'exemple, dans le cas de l'utilisation d'un mélange alpha-chymotrypsine-trypsine dont l'activité enzymatique est comprise entre 1 000 et 1 500 unités BAEE/mg de solide pour la trypsine et entre 500 et 1<B>000</B> unités ATEE/mg de solide pour l'alpha-chymotrypsine, la quantité d'enzyme utilisée est de l'ordre de 1 à 4 $ en poids par rapport au poids d'organe mis en oeuvre, mais plus parti culièrement 1 $. A la fin de cette étape d'hydrolyse, il importe en général d'écarter les éléments solides ou susceptibles de colmater les filtres et de gêner les opérations suivantes. C'est pourquoi, on préfère effectuer une filtration de type filtration sur filtre-presse. De même, un chauffage modéré peut permettre d'éliminer certaines matières grasses en inactivant en outre les enzymes. Ainsi, à la fin de l'hydrolyse et 'avant filtration sur filtre- presse, l'hydrolysat brut peut être porté en l'espace de quelques minutes à une température de 80 C à 95 C et y est maintenu pendant 10 à 15 minutes. On laisse ensuite refroidir à température ordinaire. On procède alors comme indiqué plus haut, à la filtration sur filtre presse. On obtient une solution dont on élimine les poly peptides et autres macromolécules de poids moléculaires supérieurs à une valeur déterminée en utilisant par exemple une membrane de filtration ayant un "seuil de coupure" de 20 000 D ou de 10 000 D V'cut off " 20 000 ou 10 000) . On recueille le filtrat obtenu. Suivant une variante du présent procédé, on soumet ledit filtrat à une filtration supplémentaire pour éliminer les peptides de faible poids moléculaire, en particulier on effectue une filtration au moyen d'une membrane â "seuil de coupure" 1 000 D et on conserve le retentat. Bien entendu, il est possible d'utiliser d'autres procédés de séparation qui permettent de sélectionner des poids moléculaires. Enfin, les polypeptïdes obtenus par le procédé selon l'invention peuvent être stérilisés, par exemple par autoclavage, par filtration stérilisante ou par tyn- dallisation. Les produits peuvent également être lyophilisés. Les polypeptides selon l'invention sont utiles pour leur action sur les cellules. C'est pourquoi, la présente invention concerne les compositions utiles pour leurs actions sur les cellules <U>in vivo</U> et/ou<U>in vitro</U>, caractérisées en ce qu'elles compor tent une quantité biologiquement active de polypeptides selon l'invention ou obtenus par le procédé de l'invention et un support acceptable. La présente invention concerne plus particulièrement les compositions cosmétiques, les compositions à usage topique externe, en particulier dermatologiques, et les compositions destinées à la mise en oeuvre de cultures cellulaires. En effet, ces polypeptides agissent au niveau des cellules de la peau telles que fibroblastes, mélanocytes ou kératinocytes, en particulier au niveau de la stimulation du métabolisme cellu laire et de l'activation de la réplication des cellules, ce qui les rend intéressantes par exemple dans l'activation de la cica trisation cutanée, dans la prévention du vieillissement et dans la réparation des dommages causés aux cellules, en particulier par les rayonnements ultraviolets, et en général en cosmé tologie et en dermatologie Les propriétés des polypeptides selon l'invention peuvent également être mises à profit dans les milieux de culture de cellules animales. Ces polypeptides favorisent la croissance des cellules et peuvent remplacer le sérum de veau-en tout ou partie. En outre, l'activité des polypeptides selon l'invention peut être renforcée en associant à d'autres composés biologi- quement actifs, par exemple des vitamines telles que vitamine A, vitamine E ou leurs dérivés, des hydrolysats de protéines telles que l'élastine ou le collagène. La présente invention comprend donc aussi les compositions comportant de telles associations. D'autre part, les polypeptides, selon l'invention ou lesdites associations peuvent être avantageusement pré sentés sous des formes particulières permettant d'en déve lopper l'activité. Par exemple, on peut encapsuler ces poly peptides ou associations dans des liposomes. On obtient ainsi des compositions qui sont de façon inattendue signi- ficativement plus actives que lesdits polypeptides ou asso ciations à l'état libre. Les supports sont en particulier des supports cos métiques ou pharmaceutiques connus de l'homme de métier. ' Par exemple, on peut préparer des crèmes oxygénantes pour la peau, des crèmes cicatrisantes, des crèmes régéné- rantes, des lotions de traitement capillaire des crèmes antirides, des lotions après-rasage, des produits solaires, des laits après-soleil réparateurs et des crèmes anti- érythèmes ou des laits et crèmes pour le corps. Bien entendu, les compositions selon la présente invention peuvent compor ter d'autres principes actifs ayant une activité de même type ou une activité complémentaire. Les exemples ci-après,donnés seulement à titre indi catif sans être pour autant limitatifs, permettent de faire mieux comprendre les caractéristiques et avantages de la présente invention. <U>EXEMPLE 1</U> <U>Peptides de thymus de veau (référence Ex 1) obtenus après</U> <U>hydrolyse par</U> l'alpha-chymotrypsine on hache et broie le plus finement possible, en pré sence de 4 litres d'eau déminéralisée, 1 kilogramme de thymus de veau fraichement prélevés dans des conditions aseptiques. Le tout est homogénéisé après l'addition de 0,6 grarct.es de chlorure de calcium. Le pH de la suspension obtenue est ajusté à 8 par une solution de soude à 40 %, et on chauffe pour amener la température à 37 C environ. On ajoute alors 0,2 litres d'une solution aqueuse à 5 $ en poids d'alpha- chymotrypsine pour provoquer l'hydrolyse des protéines. L'hydrolyse est poursuivie pendant 3 heures en mainte nant la température à 37 C et le pH à 8 sous agitation douce, puis on chauffe à 80 C pendant 15 minutes. On laisse refroidir à température ordinaire (23 C environ). La suspension obtenue est d'abord filtrée sur filtre presse, puis le filtrat est ultra-filtré sur membrane "cut off" 10 000. L'ultra-filtrat est stérilisé à l'autoclave à 110 C pendant 20 minutes. Cette stérilisation n'est pas nécessaire si on a opéré précédemment dans des conditions stériles. La quantité d'extrait sec dans la solution de peptides obtenue est de 30 g/litre. <U>EXEMPLE 2</U> <U>Peptides de thymus de veau (référence Ex 2), obtenus après</U> <U>hydrolyse par un mélange</U> alpha-chymotrypsine-trypsine On opère comme dans l'exemple 1, à partir d'un kilo gramme de thymus de veau, avec comme agent d'hydrolyse 0,2 litres de solution aqueuse à 5 $ en poids d'un mélange contenant des quantités voisines d'alpha-chymotrypsine et de trypsine. La solution finale de peptides a une teneur en extrait sec de 40 g/litre. <U>EXEMPLE 3</U> <U>Peptides de coeur de boeuf (référence Ex 3) obtenus après</U> <U>hydrolyse par un mélange</U> alpha-chvmotrvpsine-trvpsine on opère comme dans l'exemple 2, à partir d'un kilogramme de coeur de boeuf fraichement prélevé dans des conditions aseptiques, en utilisant le même mélange d'enzymes La solution finale de peptides a une teneur en extrait sec de 60 g/litre. EXEMPLE <U>4</U> <U>Peptides de tissu placentaire humain (référence Ex 4) obtenus</U> <U>après hydrolyse par</U> l'alpha-chymotrypsine on opère comme dans l'exemple 1, à partir d'un kg de placenta humain fralchement recueilli et débarassé tota lement du sang. La solution finale de peptides a une teneur en extrait sec de 40 g/litre. EXEMPLES <U>5 et 6</U> <U>Peptides de tissu placentaire humain</U> (référence <U>Ex 5 et Ex 6)</U> <U>obtenus après hydrolyse par un mélange</U> alpha-chymotrypsine- trypsine on opère comme dans l'exemple 2, à partir d'un kg de placenta humain fraîchement recueilli et débarrassé tota lement du sang, on obtient une solution de peptides de poids moléculaire ne dépassant pas 10 000 Daltons, que l'on sté rilise à l'autoclave (référence Ex 5). Sur une partie de la solution ci-dessus, on effectue une ultrafiltration supplémentaire sur membrane "cut off" 1<B>000.</B> L'ultra-filtrat est éliminé. Le rétentat obtenu, qui sera stérilisé, est une solution de peptides dont les poids moléculaires sont compris entre 1 000 et 10<B>000</B> (référence Ex 6). Le poids d'extrait sec de la solution de peptides avant la dernière ultrafiltration (solution Ex 5) est de 40 grammes par litre, celui du rétentat après cette ultrafiltration (solution Ex 6) est de 30 grammes/litre. <U>EXEMPLE 7</U> <U>Peptides de sérum de boeuf (référence Ex 7) obtenus</U> <U>après hydrolyse par</U> l'alpha-chymotrypsine On opère comme dans l'exemple 1 avec 5 litres de sérum de boeuf prélevé dans des conditions aseptiques dont on ajuste le pH à 8 par une solution de soude à 40 $. La solution finale de peptides a une teneur en 'extrait sec de 60 grammes par litre. EXEMPLES <U>8 à 10</U> <U>Peptides de sérum de boeuf (références Ex 8, Ex 9, Ex 10)</U> <U>obtenus après hydrolyse par un mélange</U> alpha-chymotrypsine <U>trypsine</U> on opère comme à l'exemple 7, à partir de 5 litres de sérum de boeuf, prélevés dans des condi tions aseptiques avec comme agent d'hydrolyse 0,2 litres d'une solution aqueuse enzymatique identique à celle employée dans l'exemple 2. On obtient une solution de peptides de poids moléculaire ne dépassant pas 10 000 Daltons que l'on stérilise à l'autoclave (référence Ex 8). Une partie de la solution ci-dessus subit une ultrafiltration supplémentaire sur membrane "cut off" 1 000. L'ultra-filtrat et le rétentat sont stérilisés à l'autoclave. Le premier contient des peptides de poids moléculaire inférieur à 1<B>000</B> (référence Ex. 9), le second des peptides de p. m. compris entre 1<B>000</B> et 10<B>000</B> (référence Ex 10). Les extraits secs pour les solutions obtenues sont respectivement - solution Ex 8 : 50 g/litre, - solution Ex 9 : 10 g/litre, - solution Ex 10 : 40 g/litre. <U>EXEMPLE 11</U> <U>Peptides de Saccharomyces</U> cerevisiae <U>(référence Ex 11)</U>, <U>obtenus après hydrolyse par un mélange</U> alpha-chymotrvpsine- trypsine Les levures contenues dans 50 ml d'une suspension aqueuse concentrée par centrifugation, sont broyées au moyen d'un homogénéiseur hydraulique en présence de<B>500</B> ml d'une solution tampon à pH 7,5. Ce broyat est porté à 37 C, et on effectue alors une hydrolyse enzymatique par addition de 20 ml de la solution aqueuse d'enzymes utilisée à l'exemple 2. La température est maintenue à cette valeur pendant une heure. A la fin de l'hydrolyse, le mélange est ultra-filtré sur membranes "cut off" 10.000. L'extrait sec de la solution finale de polypeptides est de 30 grammes par litre. <U>EXEMPLES 12 et 13</U> Peptides <U>de thymus de veau ou de sérum de boeufs</U> enca sulés <U>dans des liposomes (respectivement</U> ref <U>Ex 12 et Ex 13</U>) La préparation de liposomes est effectuée selon le procédé décrit dans le brevet français n 2 521 565. On dissout 90 grammes de lécithine et 10 grammes de cholestérol dans 1 litre de dichlorométhane. La solution obtenue est atomise dans un courant d'air chaud â 60 c. On obtient 100 grammes d'une poudre lipidique qui est dispersée par agitation mécanique dans 2 litres d'une solution aqueuse contenant 0,15 0/co d'extrait sec de peptides de thymus de veau obtenus selon l'exemple 2 ou de peptides de sérum de boeuf obtenus selon l'exemple 7. On obtient une suspension de liposomes dont on améliore la stabilité par le procédé décrit dans la demande de brevet français n' 2 534 487, consistant essentiellement à homogénéiser ladite suspension de liposomes dans un homogénéiseur sous pression pendant 15 minutes à 300 bars et à un débit de 50 litres par heure. On obtient ainsi une suspension homogène de liposomes contenant les peptides de thymus de veau (Ex. 12), ou les peptides de sérum de boeuf (Ex. 13), La taille moyenne de ces liposomes est de 104 nanométres. <U>EXEMPLE 14</U> <U>Composition contenant des peptides de coeur de boeuf et</U> <U>des</U> hydrolysats d'élastine <U>et de collagène</U> (ref. <U>Ex 14)</U> On prépare une solution aqueuse dont la composition est la suivante EMI0012.0020 - <SEP> peptides <SEP> de <SEP> coeur <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> en <SEP> solution <SEP> aqueuse <SEP> à <tb> 3 <SEP> $ <SEP> en <SEP> poids <SEP> d'extrait <SEP> sec <SEP> (Ex <SEP> 3) <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 3.... <SEP> 33 <SEP> ml <tb> - <SEP> hydrolysat <SEP> d'élastine <SEP> .......................... <SEP> 1 <SEP> g <tb> - <SEP> hydrolysat <SEP> de <SEP> collagène <SEP> ........................ <SEP> 1 <SEP> g <tb> - <SEP> Eau <SEP> distillée <SEP> qsp <SEP> ..............................100 <SEP> ml <U>EXEMPLE 15</U> <U>Activité des peptides selon l'invention sur la multiplica</U> <U>tion de fibroblastes en culture</U> Des tests ont été réalisés sur des cultures de f ibro- blastes dans un milieu M.E.M. (milieu minimum de Eagle - GIBCO(D ), en présence ou non de peptides selon l'invention, pour mesurer l'activité multiplicatrice de ces peptides. Les peptides et compositions de peptides selon l'invention ont été testées. En outre, à titre comparatif, les peptides suivants ont également été testés - peptides de sérum de boeuf (référence BBT) obtenus après hydrolyse par la trypsine seule selon le procédé décrit â l'exemple 7 ci-dessus dans lequel on a remplacé l'alpha- chymotrypsine par une quantité de trypsine présentant la même activité enzymatique exprimée en unités BAEE/mg de solide. Extrait sec : 30 mg/ml ; - peptides de thymus du commerce (référence TPP) préparés par extraction aqueuse d'un broyat de thymus, suivie de l'élimination des substances de haut poids moléculaire . Le tableau 1 présente les résultats de ces tests. Les extraits ont été évalués comme très actifs (xxx), actifs (xx), ou moyennement actifs (x). Par@rapport à un extrait du commerce de même ori gine, les extraits selon l'invention sont plus actifs (Exi et TPP). L'ajout d'alpha-chymotrypsine au système enzyma tique permet d'augmenter l'activité (Ex 8-SRT). L'élimination des polypeptides de faible poids mo léculaire ( < 1000 D ) permet d'augmenter l'activité des extraits (Ex 5-Ex 6). On remarque que l'association de peptides selon l'invention, tels que ceux de coeur de boeuf avec des hydro- lysats d'élastine et de collagène, améliore encore l'acti vité (Ex 14, Ex 3). I1 apparalt donc clairement que les peptides selon l'invention favorisent la régénération cellulaire. EMI0014.0001 <U>TABLEAU <SEP> 1</U> <tb> <U>REFERENCE <SEP> ORIGINE <SEP> DES <SEP> SYSTEME(</U>1) <SEP> <U>POIDS <SEP> ACTIVITE</U> <tb> <U>PEPTIDES <SEP> ENZYMATIQUE <SEP> MOLECULAIRE</U> <tb> (<U>PM) </U> <tb> Ex <SEP> 1 <SEP> Thymus <SEP> de <SEP> veau <SEP> A <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> xxx <tb> Ex <SEP> 3 <SEP> Coeur <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> B <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> x <tb> Ex <SEP> 4 <SEP> Placenta <SEP> humain <SEP> A <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> xxx <tb> Ex <SEP> 5 <SEP> Placenta <SEP> humain <SEP> B <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> xx <tb> Ex <SEP> 6 <SEP> Placenta <SEP> humain <SEP> B <SEP> 103 < pM < 104 <SEP> xxx <tb> Ex <SEP> 8 <SEP> Sérum <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> B <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> xx <tb> Ex <SEP> 11 <SEP> Saccharomyces <tb> Cerevisiae <SEP> B <SEP> < <SEP> 10 <SEP> <B>000</B> <SEP> x <tb> Ex <SEP> 14 <SEP> Coeur <SEP> de <SEP> boeuf <tb> f <SEP> élastine <SEP> B <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> xxx <tb> + <SEP> collagène <tb> SBT <SEP> Sérum <SEP> de <tb> boeuf <SEP> C <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> x <tb> TPP <SEP> Extrait <SEP> de <tb> thymus <SEP> de <tb> x <tb> veau <SEP> du <SEP> com merce (1)<U>hydrolyse enzymatique effectuée avec</U> A = alpha-chymotrypsine seule B = mélange équiactif d'alpha-chymotrypsine et de trypsine C = trypsine seule EXEMPLE 16 s <U>Protocole des tests de</U> l'exenïple <U>15</U> On réalise dans trois groupes numérotés de 1 h 3, de trois boites de Pétri des cultures de fibroblastes sous- cutanés de souris, dans 2 millilitres d'un milieu M.E.M. (Milieu Minimum de Eagle) GIBCO0) additionné de 100 micro- grammes par millilitre de streptomycine et 100 UI par milli litre de pénicilline. Le nombre de cellules â l'ensemence ment est de 50 000 cellules par millilitre. Dans les boites n 1 et n 2 on ajoute 5 $ en poids de sérum de veau total et dans les boites n 3, on ajoute 2,5 $ en poids de sérum de veau total. Puis on remplace dans les boites n 1 les 2 milli litres de milieu (contenant les 5 $ de sérum de veau) par la même quantité de milieu frais MEM additionné de 2,5 $ en poids de sérum de veau total et de 1 % en poids d'une solution de peptides à tester. Dans les boites 2 et 3, boites témoin, on remplace également les 2 millilitres de milieu par la même quantité de milieu frais MEM additionné respectivement de 5 % et de 2,5 $ en poids de sérum de veau total. Pour tout ces tests, la concentration en polypep tides est d'environ 0,2 g/1. Toutes les boites sont alors placées dans des conditions optimales de culture (37 C ; 5 $ en C02 ; 98 $ d'hu midité relative). Après trois jours, on traite les cultures à 1a trypsine pour décoller les cellules et on dénombre les cel lules dans chaque boite pour évaluer l'activité. ALE <U>17</U> <U>Activité des peptides selon l'invention sur la réparation</U> <U>de fibroblastes irradiées par des rayons ultraviolets</U> Le test est effectué sur une durée de cinq jours. LD premier jour, on ensemence avec 70 000 f ibroblastes sous- cutanés de souris trois groupes de trois boîtes de Petri, numérotés de 1 à 3, contenant du milieu M.E.M. (GZBCOel) additionné de 2,5 % en poids de sérum de veau. les boîtes n 3 contiennent, en outre,l $ en poids de la solution aqueuse des peptides à tester. Les boites n 1 et n 2 sont des boites témoin. Les trois groupes de boites sont ensuite placés pendant 24 heures à l'étuve à 37 C sous atmosphère de gaz carbo nique. Le deuxième jour, on rince les boites par une solution tampon au phosphate monosodique à 1,8 $, ne contenant ni calcium ni magnésium, puis on expose les boites n 2 et 3 en présence de la solution PBS, à un rayonnement ultraviolet UV de 300 nanomètres de longueur d'onde, et de 0,1 milli-Watt/cm2 d'énergie. La durée d'exposition est de 75 secondes qui, pour lesboites témoin n 2 correspond dans ces conditions à la mort de 50 % des cellules. Après cette irradiation, la so lution saline est remplacée par du milieu de culture M.E.M. additionné de 2,5 $ de sérum de veau, la boîte n 3 contient, comme la veille la même quantité (1 $) de solu tion de peptides à tester. On remplace également dans les boites témoin n 1, qui n'ont pas été irradiées, la solution de rinçage par du milieu M.E.M. additionné de 2,5 % de sérum de veau. Les trois groupes de boites sont à nouveau glacés à l'étuve à 37 C, sous atmosphère de gaz carbonique pendant 72 heures. A l'issue de cette période, le milieu de culture est éliminé. On traite les cultures à la trypsine pour décoller les cellules et on effectue une numération dans chaque boite. Les activités ont<I>été</I> aussi évaluées : très actif (xxx), actif (xx), moyennement actif (x), non actif (-). Les résultats sont rapportés au tableau 2 cï- après. D'après ces résultats, il apparait donc clairement que les peptides selon l'invention favorisent la réparation des effets néfastes des UV. . L'emploi d'alpha-chymotrypsine pour la préparation des peptides est bénéfique (comparaison avec SBT). . L'élimination des polypeptides de faible poids moléculaire ( < 1 000 D) permet d'augmenter l'activité des extraits. EMI0018.0001 <U>TABLEAU <SEP> 2</U> <tb> <U>Référence <SEP> Origine <SEP> des <SEP> Enzyme</U> <SEP> _PM <SEP> <U>Concen</U>- <SEP> <U>Activité</U> <tb> <U>peptides <SEP> Dalton <SEP> tration <SEP> C</U> <tb> 9<B><I>.</I></B><I> <SEP> Li <SEP> <B>-</B></I> <tb> Ex <SEP> 2 <SEP> thyms <SEP> B <SEP> s <SEP> 104 <SEP> 0,4 <SEP> xx <tb> de <SEP> veau <tb> Ex <SEP> 3 <SEP> coeur <SEP> de <SEP> B <SEP> 0,6 <SEP> x <tb> boeuf <tb> Ex <SEP> 7 <SEP> sérum <SEP> de <SEP> A <SEP> 0,6 <SEP> x <tb> boeuf <tb> L'x <SEP> 8 <SEP> sérum <SEP> de <tb> boeuf <SEP> B <SEP> " <SEP> <B>0,5</B> <SEP> xx <tb> Ex <SEP> 1D <SEP> sérum <SEP> de <tb> boeuf <SEP> B <SEP> <B>103</B> <SEP> à <SEP> 104 <SEP> 0, 4 <SEP> xxx <tb> Ex <SEP> 1.4 <SEP> coeur <SEP> de <tb> boeuf <SEP> B <SEP> < <SEP> 1O4 <SEP> 0,1 <SEP> xxx <tb> + <SEP> élastine <tb> t <SEP> collagène <tb> SBT <SEP> <B>SérlüR <SEP> de <SEP> C <SEP> @@ <SEP> 0,3</B> <tb> boeuf (1)<U>hydrolyse</U> enzymatique effectuée avec A = alpha-chymDtrypsine seule B = mélange équiactif d'alpha-chymtrypsine et de tzypsine C = trypsine seule <B>EXEMPLE 18</B> EMI0019.0001 Gel <SEP> cicatrisant <SEP> % <SEP> en <tb> oids <tb> . <SEP> Solution@aqueuse <SEP> de <SEP> peptides <SEP> de <SEP> sérum <tb> de <SEP> boeuf, <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 8 <SEP> <B>10%</B> <tb> . <SEP> Excipient <SEP> pour <SEP> gel <SEP> de <SEP> CARBOPOL@, <SEP> qsp <SEP> 100 EXEMPLE 19 EMI0019.0002 <U>Crème <SEP> de <SEP> soins <SEP> $ <SEP> en</U> <tb> <U>poids</U> <tb> . <SEP> Suspension <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> liposomes <tb> encapsulant <SEP> des <SEP> peptides <SEP> de <SEP> thymus <SEP> de <tb> veau, <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 12 <SEP> 25 <SEP> $ <tb> . <SEP> Excipient <SEP> émulsionné <SEP> huile <SEP> dans <SEP> eau, <SEP> qsp <SEP> <B>100</B> La crème obtenue, utilisée à raison d'une application quotidienne, améliore l'état de surface de la peau. <U>EXEMPLE 20</U> EMI0019.0003 <U>Gel <SEP> régénérant</U> <SEP> <B>%</B> <SEP> en <tb> <U>poids</U> <tb> . <SEP> Suspension <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> liposomes <tb> encapsulant <SEP> une <SEP> composition <SEP> à <SEP> base <SEP> de <tb> peptides <SEP> de <SEP> coeur <SEP> de <SEP> boeuf, <SEP> selon <tb> l'exemple <SEP> 14 <SEP> 20 <SEP> % <tb> . <SEP> Excipient <SEP> pour <SEP> gel <SEP> de <SEP> CARBOPOL´, <SEP> qsp <SEP> 100 Le gel obtenu est particulièrement avantageux pour régénérer les peaux prématurément vieillies par les rayons ultraviolets. EXEMPLE <U>21</U> EMI0020.0002 <U>Lait <SEP> pour <SEP> le <SEP> corps <SEP> $ <SEP> en</U> <tb> <U>op <SEP> ids</U> <tb> . <SEP> Solution <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> peptides <SEP> de <tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae, <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 11 <SEP> <B>10%</B> <tb> . <SEP> Excipient, <SEP> qsp <SEP> <B>100%</B> <U>EXEMPLE 22</U> EMI0020.0003 <U>Crème <SEP> de <SEP> nuit</U> <tb> <U>en</U> <tb> <U>poids</U> <tb> . <SEP> Solution <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> peptides <SEP> de <SEP> tissu <tb> placentaire, <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> $ <tb> . <SEP> Excipient <SEP> émulsionné <SEP> eau <SEP> dans <SEP> l'huile, <SEP> qsn <SEP> 100 <U>EXEMPLE 23</U> EMI0020.0004 <U>Composition <SEP> pour <SEP> milieux <SEP> de <SEP> culture <SEP> cellulaire <SEP> % <SEP> en</U> <tb> <U>poids</U> <tb> . <SEP> Solution <SEP> aqueuse <SEP> d'une <SEP> composition <SEP> à <SEP> base <tb> de <SEP> peptides <SEP> de <SEP> coeur <SEP> de <SEP> boeuf, <SEP> selon <tb> l'exemple <SEP> 14 <SEP> 5 <SEP> $ <tb> . <SEP> Milieu <SEP> M.E.M. <SEP> (Minimum <SEP> Eagle <SEP> Medium) <SEP> 95 <SEP> $ Cette composition peut être avantageusement utilisée pour la culture de f ibroblastes. <U>EXEMPLE 24</U> EMI0020.0006 <U>Lait <SEP> bronzant</U> <tb> <U>% <SEP> en</U> <tb> <U>poids</U> <tb> Solution <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> peptides <SEP> de <SEP> coeur <tb> selon <SEP> l'exemple <SEP> 3 <SEP> 10 <SEP> $ <tb> . <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> vitamine <SEP> E <SEP> 1 <SEP> % <tb> . <SEP> Excipient <SEP> émulsionné <SEP> huile <SEP> dans <SEP> eau, <SEP> qsp <SEP> 100

Claims: Use, for the preparation of cosmetic, dermatologic compositions or composition useful for their action on cells, in vitro, of biologically active polypeptides liable to be obtained by hydrolysis of natural substances in aqueous medium, comprising the following steps : a) preparing an aqueous homogenizate of natural substances, b) hydrolyzing the product enzymatically with a hydrolysis agent comprising alpha-chymotrypsin, c) collecting the hydrolyzate, and d) separating from the hydrolyzate a fraction comprising the polypeptides of particular molecular weight and collecting this fraction. Use according to Claim 1, wherein the hydrolysis agent of step b) is constituted only by alpha-chymotrypsin . Use according to Claim 1, wherein the hydrolysis agent is constituted by alpha-chymotrypsin and trypsin . Use according to Claim 1 or 2, wherein at step d) the fraction comprising the polypeptides of molecular weight less than about 10,000 Daltons is separated. Use according to any of claims 1 to 4, according to which at step d), from the hydrolyzate, a fraction comprising the polypeptides of molecular weight less than about 20 000 Daltons and higher than about 1 000 Daltons is separated. Use according to any of claims 1 to 5, wherein in addition, before separating from the hydrolyzate the fraction comprising the polypeptides of particular molecular weight, a filtration is carried out to remove the solid particles and agglomerates. Process according to any of claims 1 to 6, wherein the natural substances come from biological materials of animal origin or from microorganisms. Use according to any of the claims 1 to 7, wherein the homogenizate of natural substances is prepared from raw materials selected from among : organs or animal tissues such as : heart, spleen, thymus, skin, brain or liver from bovine or ovine cattle or from bovine embryos or from chickens, bovine, ovine or human placentas, or from biological fluids or secretions such as veal or beef serum, milk, colostrum, or from proteins such as proteins of conjunctive tissues such as collagen, elastin, reticulin, or fibronectin, fibrous proteins like fibroins from silk, keratin from fur or from hair, or sericin, or from yeasts. Cosmetic compositions and compositions useful far their action on cells in vitro , which comprise polypeptides according to any of the claims 1 to 8 and an acceptable support. Compositions for external topical use according to claim 9. Compositions according to claims 9 or 10, which comprise in addition veal serum. Compositions according to any of the claims 9 to 11, which comprise, in addition, a vitamin or one of its derivatives such as vitamin E acetate. Compositions according to any of the claims 9 to 12, which comprise in addition a protein hydrolyzate, particularly a hydrolyzate of elastin and/or collagen. Compositions according to any of the claims 9 to 13, wherein the polypeptides are included in liposomes. Use of polypeptides according to any of the claims 1 to 8, with an acceptable support for the preparation of dermatologic composition useful for its action on cells. Use according to the claim 15, wherein the dermatologic composition is for external topical use. Use according to the claims 15 or 16, wherein the composition comprises in addition veal serum. Use according to any of the claims 15 to 17, wherein the composition comprises in addition a vitamin or one of its derivatives such as vitamin E acetate. Use according to any of the claims 15 to 18, wherein the composition comprises in addition a protein hydrolyzate, particularly a hydrolyzate of elastin and/or collagen. Use according to any of the claims 15 to 19, wherein the polypeptides are included in liposomes.

Inventors: MEYBECK, ALAIN, REDZINIAK, GERARD, Redziniak, Gérard
Applicants: LVMH RECHERCHE
Application year: 1987
Main classification: A61K37
IPC codes: A61Q19, A61K38, C12P21, A61K8, A61K47, C12N5, A61P17, A61K35, A61K9