FUSION PROTEINS WITH AN EUKARYOTIC BALLAST SEQUENCE

Abstract: Suitable as "ballast portion" for fusion proteins is a part of the amino-acid sequence of interleukin-2 (IL-2) which comprises considerably less than 100 amino acids. It is advantageous to start from a synthetic IL-2 gene which is divided by unique cleavage sites into six segments of which up to three can be linked in any desired sequence by the building block principle. Specific constructions allowing the solubility of the fusion protein to be varied are possible.

Description: Beschreibung Fusionsproteine mit eukaryotischem Ballastanteil Es wurden bereits Fusionsproteine vorgeschlagen, die durch einen C- oder N-terminalen Anteil gekennzeichnet sind, der im wesentlichen den ersten 100 Aminosäuren von Interleukin-2 entspricht (deutsche Patentanmeldung P 35 41 856.7). Der Interleukin-2-Anteil kann sich hierbei von Säuger Interleukin-2 ableiten, beispielsweise vom Mäuse- oder Ratten-Interleukin-2, die aus der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer (im folgenden 'BEP-A") 0 091 539 bekannt sind, bevorzugt von Human-Interleukin-2. Diese Fusionsproteine sind in der Wirtszelle überraschend stabil und können aufgrund ihrer geringen Löslichkeit einfach von den löslichen wirtseigenen Proteinen abgetrennt werden. In Weiterentwicklung dieses Erfindungsgedankens wurde nun überraschenderweise gefunden, dass auch wesentlich kleinere Anteile des Interleukin-2-Moleküls als "Ballast"-Anteil für derartige Fusionsproteine geeignet sind. Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Bevorzugte Ausgestaltungen werden im folgenden näher erläutert. Besonders vorteilhaft geht man von dem synthetischen Gen für Human-Interleukin-2 (im folgenden "IL-2") aus, das in der EP-A 0 163 249 beschrieben und im Anhang wiedergegeben ist. Dieses synthetische Gen enthält eine Reihe von singulären Restriktionsschnittstellen, die es erlauben, die für IL-2 kodierende DNA in "handliche" Segmente zu zerlegen. Mit diesen Segmenten kann nach dem Baukastenprinzip der Ballastanteil für Fusionsproteine massgeschneidert werden, wobei man je nach Kombination der Segmente und nach der Art des gewünschten Proteins leicht- bis schwerlösliche Fusionsproteine erhält. Die Erfindung gestattet es also, je nach der möglichen oder gewünschten Aufarbeitung des Produktes die vorteilhafteste Löslichkeit anzusteuern, also eine hohe Löslichkeit, wenn das Produkt chromatographisch gereinigt werden soll, beispielsweise mit Hilfe einer Antikörpersäule, oder aber eine geringe Löslichkeit, wenn zur Vorreinigung die wirtseigenen löslichen Proteine abgetrennt, beispielsweise abzentrifugiert werden sollen. Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass man Fusionsproteine mit einem sehr kleinen "Ballastanteil" herstellen kann, da hierdurch die relative Ausbeute am gewünschten Protein beträchtlich erhöht wird. Ein weiterer Vorzug der Erfindung liegt darin, dass der "tallastanteil" so konstruiert werden kann, dass er die räumliche Struktur des gewünschten Proteins möglichst wenig behindert und so beispielsweise eine Auffaltung nicht verhindert. Bei der Spaltung der Fusionsproteine erhält man neben dem gewünschten Protein den "Ballastanteil", also das IL-2- Derivat. Dieses kann IL-2-Aktivität aufweisen (T-Zell Proliferationstest) oder an IL-2-Rezeptoren binden. Das erfindungsgemässe "Baukastenprinzip" kann also auch dazu dienen, als Nebenprodukte" IL-2-Derivate zu erzeugen, die die biologischen Aktivitäten des IL-2 mehr oder weniger ausgeprägt zeigen. Besonders zweckmässige Ausgestaltungen der Erfindung werden im folgenden anhand des synthetischen Gens erläutert, das in der EP-A 0 163 249 beschrieben ist. Dieses Gen ist am 5'-Ende mit der Restriktionsendonuklease EcoRI und am 3'-Ende mit SalI geschnitten. Ausser den drei singulären Restriktionsschnittstellen für die Enzyme PstI, XbaI und SacI, die zur Konstruktion dieses Gens dienten, sind auch die singulären Schnittstellen für MluI und PvuI günstig angeordnet. Bezeichnet man die zwischen diesen Schnittstellen liegenden Sequenzen mit A bis F, so kann man das synthetische Gen wie folgt systematisch darstellen (EcoRI)-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI) Die Segmente A bis F stellen somit besonders geeignete "Bausteine" für das erfindungsgemässe Baukastensystem dar. In dieser Darstellung entspricht also der "Ballastanteil" für die Fusionproteine entsprechend der deutschen Patentanmeldung P 35 41 856.7 den Segmenten A bis E und für das in der gleichen Anmeldung genannte bifunktionelle Protein mit dem gesamten IL-2-Gen allen Segmenten A bis F. Demgegenüber betreffen die erfindungsgemässen Genkonstruktionen andere Kombinationen der Segmente A bis F, vorzugsweise mit weniger als 4 dieser Segmente, wobei das Segment A den N-Terminus der Fusionsproteins kodiert. Die Anordnung der weiteren Segmente ist beliebig, wobei gegebenenfalls entsprechende Adaptoren oder Linker eingesetzt werden. Entsprechende Adaptoren- oder Linkersequenzen können auch am C-Terminus des "Ballastanteils" eingeführt werden, die in diesem Falle auch für Aminosäuren oder kurze Aminosäuresequenzen kodieren können, die die enzymatische oder chemische Abspaltung des "Ballastanteils" vom gewünschten Protein ermöglichen oder erleichtern. Die Adapter- oder Linkersequenzen können selbstverständlich auch dazu dienen, den "Ballastanteil" für ein bestimmtes Fusionsprotein masszuschneidern, beispielsweise zur Erzielung einer gewünschten Löslichkeit. Überraschenderweise hat es sich nämlich gezeigt, dass die Löslichkeit der Fusionsproteine nicht von der Molekülgrösse abhängig ist, sondern dass vielmehr auch relativ kleine Moleküle eine geringe Löslichkeit aufweisen können. In Kenntnis dieser Zusammenhänge, die in den Beispielen im einzelnen erläutert sind, kann somit der Fachmann ohne grossen experimentellen Aufwand erfindungsgemäss Fusionsproteine mit kleinem "Ballastanteil" gewinnen, die bestimmte gewünschte Eigenschaften aufweisen. Wenn das gewünschte Protein ein eukaryotisches Protein ist, werden also erfindungsgemäss Fusionsproteine erhalten, die ausschliesslich oder praktisch ausschliesslich aus eukaryotischen Proteinsequenzen bestehen. Überraschenderweise werden diese Fusionsproteine jedoch von prokaryotischen Wirtszellen nicht als Fremdproteine erkannt und nicht durch wirtseigene Proteasen rasch abgebaut. Dieser Abbau erfolgt besonders häufig bei von cDNA-Sequenzen kodierten wirtsfremden Proteinen, die in Bakterien exprimiert werden sollen. Es hat sich nun gezeigt, dass cDNA-Sequenzen sehr effektiv exprimiert werden können, wenn sie in die erfindungsgemässen Segmente "eingebettet werden. Hierfür lassen sich spezielle Vektoren konstruieren, die zwischen den erfindungsgemässen Sequenzen eine Polylinker Sequenz enthalten, die mehrere Klonierungsstellen für die cDNA-Sequenzen aufweist. Sofern die einklonierte cDNA kein Stop-Codon enthält, so wird die von der cDNA-Sequenz kodierte Polypeptidsequenz durch das Polypeptid zusätzlich geschützt, für das das G-terminale Segment kodiert. Die Spaltung des Fusionsproteins kann in an sich bekannter Weise chemisch oder enzymatisch erfolgen. Die Wahl der geeigneten Methode richtet sich vor allem nach der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins. Wenn dieses beispielsweise kein Methionin enthält, kann das Bindeglied Met bedeuten, worauf eine chemische Spaltung mit Chloroder Bromcyan erfolgt. Steht im Bindeglied am Carboxyterminus Cystein oder steht das Bindeglied für Cys, so kann eine enzymatische Cystein-spezifische Spaltung oder eine chemische Spaltung, beispielsweise nach spezifischer S-Cyanylierung, folgen. Steht im Brückenglied am Carboxyterminus Tryptophan oder das Bindeglied für Trp, so kann eine chemische Spaltung mit N-Bromsuccinimid erfolgen. Gewünschte Proteine, die in ihrer Aminosäuresequenz nicht Asp - Pro enthalten und hinreichend säurestabil sind, können als Fusionsproteine mit diesem Brückenglied in an sich bekannter Weise proteolytisch gespalten werden. Hierdurch erhält man Proteine, die N-terminal Prolin bzw. C-terminal Asparaginsäure enthalten. Auf diese Weise können also auch modifizierte Proteine synthetisiert werden. Die Asp-Pro-Bindung kann noch säurelabiler gestaltet werden, wenn dieses Brückenglied (Asp)n-Pro bzw. Glu-(Asp)n-Pro ist, wobei n 1 bis 3 bedeutet. Beispiele für enzymatische Spaltungen sind ebenfalls bekannt, wobei auch modifizierte Enzyme mit verbesserter Spezifität eingesetzt werden können (vgl. C.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Ist das gewünschte eukaryotische Peptid Proinsulin, so wählt man zweckmässig eine Peptidsequenz, bei der eine durch Trypsin abspaltbare Aminosäure (Arg, Lys) an die N-terminale Aminosäure (Phe) des Proinsulins gebunden ist, beispielsweise Ala-Ser-Met-Thr-Arg, da dann die Arginin-spezifische Spaltung mit der Protease Trypsin erfolgen kann. Enthält das gewünschte Protein nicht die Aminosäurefolge Ile-Glu-Gly-Arg, so kann das Fusionsprotein mit dem entsprechenden Brückenglied mit Faktor Xa gespalten werden (EP-A 0 025 190 und 0 161 973). Das Fusionsprotein wird durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem in an sich bekannter Weise gewonnen. Hierfür eignen sich alle bekannten Wirts Vektor-Systeme, also beispielsweise Säugerzellen und Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und vorzugsweise Bakterien, insbesondere E. coli. Die DNA-Sequenz, die für das gewünschte Protein codiert, wird in bekannter Weise in einen Vektor eingebaut, der in dem gewählten Expressionssystem eine gute Expression gewährleistet. In bakteriellen Wirten wählt man zweckmässig den Promotor und Operator aus der Gruppe lac, tac, trp, P oder P des L R Phagen X, hsp, omp oder einen synthetischen Promotor, wie sie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift 34 30 683 (EP-A 0 173 149) vorgeschlagen sind. Vorteilhaft ist die tac Promotor-Operator-Sequenz, die inzwischen handelsüblich ist (z.B. Expressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, S. 63). Bei der Expression des erfindungsgemässen Fusionsproteins kann es sich als zweckmässig erweisen, einzelne Tripletts der ersten Aminosäuren nach dem ATGStart-Codon zu verändern, um eine eventuelle Basenpaarung auf der Ebene der mRNA zu verhindern. Solche Veränderungen, ebenso wie Veränderungen, Deletionen oder Additionen einzelner Aminosäuren im IL-2-Proteinanteil, sind dem Fachmann geläufig und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Beispielhaft kann eine Eliminierung von Cystein oder der Ersatz von Cystein durch andere Aminosäuren erwähnt werden, um eine Bildung unerwünschter Disulfidbrücken zu verhindern, wie es beispielsweise aus der EP-A 109 748 bekannt ist. Die Figuren 1 bis 13 veranschaulichen nach Art eines Fliessbildes die Verfahren der in den Beispielen gleicher Nummer beschriebenen Synthesen. Zur Erleichterung der Übersicht wurde die Herstellung der Ausgangsmaterialien bzw. Zwischenprodukte in den Figuren A bis C dargestellt. Zur Verbesserung der Übersichtlichkeit wurden in den Figuren 1 bis 13 die Bezugsziffern mit einer neuen lOer- Reihe begonnen, also in Figur 1 mit (11). Bezugsziffern von Ausgangsmaterialien, die nicht Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind, enden auf 0, also beispielsweise in Figur 2 (20). Die Figuren sind nicht massstäblich gezeichnet, insbesondere im Bereich der Polylinkersequenzen ist der Massstab entsprechend gedehnt. IL- 2- Sequenzen werden durch dicke Linien charakterisiert, Strukturgene für gewünschte Proteine sind anderweitig hervorgehoben. Die Figur A gibt eine Übersicht über die erfindungsgemässen Segmente A bis F bzw. die Segment-Kombination A und B. Ausgangsmaterial ist das Plasmid p159/6, dessen Herstellung in der EP-A 0 163 249 eingehend beschrieben ist und durch die Figur 5 in dieser Druckschrift charakterisiert ist. Die Figur B zeigt das Expressionsplasmid pEW1000, dessen Herstellung in der deutschen Patentanmeldung P 35 41 856.7 beschrieben und in deren Figur 1 dargestellt ist. Durch entsprechende Doppelverdauung wird dieses Plasmid in der Polylinkersequenz geöffnet, wobei die linearisierten Plasmide (Exl) bis (Ex4) erhalten werden. Die Figur C zeigt die Herstellung des pUC12-Derivats pW226 und des Expressionsplasmids pW226-1, die beide die Segmente A und F, getrennt durch eine Polylinkersequenz, enthalten. Die Figur 1 zeigt die Herstellung des pUC12-Derivats pKH40 und des Expressionsplasmids pK40, die für Fusionsproteine kodieren, in denen auf die Proteinsequenz entsprechend dem Segment A, also die ersten 22 Aminosäuren von IL-2, das Brückenglied Thr-Arg folgt, worauf sich die Aminosäuresequenz des Proinsulins anschliesst. Die Figur 2 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSL11 und des Expressionsplasmids pSL12, die für Polypeptide kodieren, in denen auf das Segment A ein Brückenglied entsprechend den Polylinkersequenzen (2) und (20a) folgt, worauf sich die Aminosäurefolge von Proinsulin anschliesst. Die Figur 3 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pK50, das für ein Polypeptid kodiert, bei dem auf die Segmente A und B, also auf die ersten 38 Aminosäuren von IL-2, unmittelbar die Aminosäuresequenz von Proinsulin folgt. Die Figur 4 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pK51, das für ein Polypeptid kodiert, bei dem auf die Segmente A und B ein Brückenglied entsprechend den Sequenzen (42) und (41) folgt, an das sich die Aminosäuresequenz des Proinsulins anschliesst. Die Figur 5 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pK52, das sich von pK51 durch den eingeschobenen MluI-Linker (ski) unterscheidet, der für die Aminosäuresequenz kodiert, die eine Spaltung mit dem Faktor Xa ermöglicht. pK52 kann auch aus pK50 (Figur 3) durch Spalten mit MluI und Einfügen des genannten MluI-Linkers gewonnen werden. Die Figur 6 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pK53 aus pK51 (Figur 4), ebenfalls durch Einfügen des MluI Linkers. Die Figur 7 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pSLI4 aus pSL12 (Figur 2) durch Einfügen des Fragments C in den Polylinker. Hierdurch wird das Segment C unmittelbar an das Segment A angefügt. Im folgenden Polylinker entsprechen die ersten beiden Aminosäuren (jeweils Glu) den Aminosäuren 60 und 61 von IL-2. Somit besteht also der I1-2 Anteil aus den Aminosäuren 1 bis 22 und 37 bis 61. Die weitere Aminosäurefolge entspricht derjenigen, für die das Plasmid pSL12 (Figur 2) kodiert. Die Figur 8 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pH31, das für ein Fusionsprotein kodiert, bei dem auf die Segmente A bis C ein Brückenglied folgt, das in der Sequenz (81) dargestellt ist, woran sich die Aminosäurefolge von Proinsulin anschliesst. Die Figur 9 zeigt die Konstruktion des Plasmids pK192, das für ein Fusionsprotein kodiert, in dem auf die Segmente A und B Methionin und hierauf die Aminosäurefolge von Hirudin folgt. Die Figur 10 zeigt die Konstruktion des Plasmids pW214, das für ein Fusionsprotein kodiert, in dem auf die Segmente A und B die Aminosäuresequenz folgt, die eine Spaltung mit Faktor Xa ermöglicht, woran sich die Aminosäuresequenz des Granulocyten-Makrophagen "Colony Stimulating Facto" (CSF) anschliesst. Die Figur 11 zeigt die Konstruktion des Expressionsplamids pW233, das für ein Fusionsprotein kodiert, in dem auf die Segmente A und C (entsprechend den Aminosäuren 1 bis 22 und 37 bis 61 von IL-2) das Brückenglied Leu-Thr-Ile-Asp-AspPro folgt, worauf sich die Aminosäuresequenz von CSF anschliesst. Die Figur 12 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pW234, das für ein Fusionsprotein mit der folgenden Aminosäuresequenz kodiert: Auf das Segment A (Aminosäuren 1 bis 22) folgt ein Brückenglied Thr-Arg, hierauf das Segment D (Aminosäuren 59 bis 96 von IL-2), als weiteres Bindeglied Thr-Asp-Asp-Pro und schliesslich CSF. Die Figur 13 zeigt die Konstruktion des Plasmide pH200 und pH201 sowie des Expressionsplasmids pH202. Diese Plasmide haben einen Polylinker zwischen den Segmenten A und F bzw. A, B und F angeordnet, in deren zahlreiche Schnittstellen Fremd-DNA kloniert werden kann. Diese Plasmide eignen sich besonders zur Klonierung von cDNA-Sequenzen. In den folgenden Beispielen, deren Numerierung mit der der Figuren übereinstimmt, wird die Erfindung näher erläutert. Sofern keine anderen Angaben gemacht sind, beziehen sich Prozentangaben auf das Gewicht. Beispiel A Das Ausgangsplasmid p159/6 ist in der EP-A 0 163 249 beschrieben (Figur 5). Die dort als "IL-2" bzw. im Text als "DNA-Sequenz 1" definierte Sequenz ist in der Figur A in die Segmente A bis F aufgeteilt, die durch die Schnittstellen für die Enzyme EcoRI, PstI, MluI, XbaI, SacI, PvuI und SalI begrenzt sind. Durch Doppelverdauung mit den entsprechenden Enzymen erhält man die Segmente (A) bis (F) oder auch zusammenhängende Segmente, beispielsweise mit EcoRI und MluI das Segment (A,B). Beispiel B Die Herstellung des Expressionsplasmids pEW1000 ist in der (nicht vorveröffentlichten) deutschen Patentanmeldung P 35 41 856.7 vorgeschlagen (Figur 1). Dieses Plasmid ist ein Derivat des Plasmids ptac 11 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167 - 178), bei dem in die Erkennungsstelle für EcoRI eine synthetische Sequenz eingebaut wurde, die eine SalI-Schnittstelle enthält. Man erhält so das Expressionsplasmid pKK 177.3. Durch Insertion des lac-Repressors (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765 - 769) erhält man das Plasmid pJF118. Dieses wird an der singulären Restriktionsschnittstelle für AvaI geöffnet und in bekannter Weise durch Exonuklease-Behandlung um etwa 1000 bp verkürzt und ligiert. Man erhält das Plasmid pEW1000. Durch Öffnen dieses Plasmids im Polylinker mit den Enzymen EcoRI und HindIII, SalI, PstI oder SmaI erhält man die linearisierten Bxpressionsplasmide (Ex1), (Ex2), (Ex3) und (Ex4). Beispiel C Das handelsübliche Plasmid pUC12 wird mit EcoRI und SalI geöffnet und das linearisierte Plasmid (1) isoliert. Durch Ligieren von (1) mit dem Segment (A), der synthetischen Linkersequenz (2) und dem Segment (F) erhält man das Plasmid pW226 (3). Der Stamm E coli 79/02 wird in bekannter Weise mit der Plasmid-DNA des Ligationsansatzes transformiert. Die Zellen werden auf Agarplatten ausplattiert, die Isopropyl-B-Dthiogalacto-pyranosid (IPTG), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl ss-D-galactopyranosid (X-gal) sowie 20 ,ug/ml Ampicillin (Ap) enthalten. Von weissen Klonen wird die Plasmid-DNA gewonnen und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse die Bildung des Plasmids (3) bestätigt. Aus dem Plasmid (3) wird das kleine EcoRI-EindIII-Fragment (4) ausgeschnitten und isoliert. Dieses wird in einer T4-DNA-Ligasereaktion mit dem linearisierten Expressionsplasmid (Ex1) ligiert. Das entstandene Plasmid pW226-1 (5) wird durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Kompetente Zellen des Stammes E. coli Mc 1061 werden mit DNA des Plasmides pW 226-1 transformiert. Klone, die resistent gegen Ampicillin sind, werden auf Ap-haltigen Agar-Platten isoliert. Die Plasmid-DNA wird aus Mc 1061 Zellen reisoliert und anschliessend erneut mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. Kompetente Zellen des E. coli-Stammes W 3110 werden nun mit Plasmid-DNA, die aus E. coli Mc 1061-Zellen isoliert wurde, transformiert. E. coli W 3110-Zellen werden im folgenden stets zur Expression benutzt. Entsprechend den folgenden Bedingungen werden alle Expressionsversuche zu den angegebenen Beispielen durchgeführt. Eine Übernachtkultur aus E. coli-Zellen, die das Plasmid (5) enthalten, wird mit LB-Medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), das 50 lug1ml Ampicillin enthält, im Verhältnis von etwa 1:100 verdünnt und das Wachstum über OD-Messung verfolgt. Bei OD = 0,5 wird die Kultur auf 1 mM IPTG eingestellt und die Bakterien nach 150 bis 180 Minuten abzentrifugiert. Die Bakterien werden 5 Minuten in einer Puffermischung (7M Harnstoff, 0,1% SDS, 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0) gekocht und Proben auf eine SDS-Gelelektrophoreseplatte aufgetragen. Nach Elektrophorese wird aus Bakterien, die das Plasmid (5) enthalten, eine Proteinbande erhalten, die der Grösse des erwarteten Proteins (6 kD) entspricht. Die angegebenen Induktionsbedingungen gelten für Schüttelkulturen; bei grösseren Fermentationen sind entsprechend veränderte OD-Werte und gegebenenfalls leicht variierte IPTG-Konzentrationen zweckmässig. Das erhaltene Protein zeigt keine biologische Aktivität im Zellproliferationstest mit einer IL-2-abhängigen Zellinie (CTLL 2). Beispiel 1 Das Plasmid (3) wird mit MluI und SalI geöffnet und die beiden entstehenden Fragmente gelelektrophoretisch voneinander getrennt. Das grössere Fragment (11) wird isoliert. Das synthetische Oligonukleotid (12) wird mit der stumpfendigen, für Proinsulin kodierenden DNA (13) (Wetekam et al., Gene 19 (1982) 179 - 183) ligiert, wobei die DNA-Sequenz (14) erhalten wird. Diese wird mit MluI und SalI geschnitten, wobei die DNA-Sequenz (15) erhalten wird. Diese wird nun mit dem Fragment (11) ligiert, wobei das Plasmid pKH40 (16) gebildet wird. Dieses wird durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid (16) wird mit EcoRI und HindIII verdaut und das kleine Fragment (17) durch Gelelektrophorese isoliert. Durch Ligieren mit dem linearisierten Expressionsplasmid (text) erhält man das Expressionsplasmid pK40 (18). Bei der Expression gemäss Beispiel C erhält man ein Protein, das nach Zellaufschluss in der löslichen zellulären Proteinfraktion gefunden wird. Die intakte Proinsulinsequenz wird durch "Western Blotn-Technik nachgewiesen. Beispiel 2 Ausgangsprodukt ist das Plasmid pPH30, das in der (nicht vorveröffentlichten) deutschen Patentanmeldung P 35 41 856.7 in Figur 3c dargestellt ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wurde in Figur 2 die IL-2-Teilsequenz als "A-E" wiedergegeben (20). Das Ende dieser Sequenz und das Brückenglied bis zur Proinsulinsequenz ist in Figur 2 als (20a) wiedergegeben. Das Plasmid (20) wird mit PvuI und HindIII verdaut und das kleine Fragment (22) isoliert. Weiterhin wird das Plasmid (3) mit EcoRI und PvuI geöffnet und das kleine Fragment (23) isoliert. Ausserdem wird der Vektor pUC12 mit EcoRI und HindIII verdaut und das grosse Fragment (21) isoliert. Durch Ligieren der Fragmente (21), (23) und (22) erhält man das Plasmid pSL11 (24). Das Plasmid (24) wird mit HindIII und partiell mit EcoRI verdaut und das Fragment (25) isoliert, das das Segment A und das Proinsulingen enthält. Durch Ligieren von (25) in das linearisierte Expressionsplasmid (Ex1) erhält man das Expressionsplasmid pSL12 (26). Die Expression gemäss Beispiel C und die anschliessende Aufarbeitung ergibt ein lösliches Fusionsprotein. Die 1,Western Blot-Analyse mit Insulinantikörpern bestätigt, dass dieses Protein die intakte Insulinsequenz enthält. Beispiel 3 Zur Amplifizierung des Proinsulingens dient das Plasmid ptrpED5-1 (30) (Hallewell et al., Gene 9 (1980) 27 - 47). Dieses wird mit HindIII und SalI geöffnet und das grosse Fragment (31) isoliert. Das Fragment (31) wird mit der DNA-Sequenz (14) ligiert, wobei das Plasmid pH106/4 (32) erhalten wird. Das Plasmid (32) wird mit SalI und MluI verdaut und das kleine Fragment (15) isoliert. Das linearisierte Expressionsplasmid (Ex2), das Segment (A,2) und das Fragment (15) werden nun ligiert, wobei das Expressionsplasmid pK50 (33) erhalten wird. Die Expression des kodierten Fusionsproteins wird gemäss Beispiel G durchgeführt. Die Zellen werden anschliessend aus der Kulturbrühe abzentrifugiert und in der "French-Press" aufgebrochen. Die Proteinsuspension wird nun durch Zentrifugation in ihre löslichen und unlöslichen Proteinbestandteile separiert. Beide Fraktionen werden mittels Gelektrophorese in bekannter Weise auf 17,5 %igen SDS-Polyacrylamidgelen und anschliessend durch Anfärbung der Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Blue analysiert. Überraschend wird gefunden, dass das Fusionsprotein in dem unlöslichen Sediment gefunden wird. Die Western Blot" Analyse mit Insulinantikörpern bestätigt, dass intaktes Pro-Insulin im Fusionsprotein vorliegt. Das Sediment des "French-Press"-Aufschlusses kann nun direkt zur Isolation von Pro-Insulin weiterverwendet werden. Beispiel 4 Ausgangsprodukt ist das Plasmid pPH20 (40), das in der deutschen Patentanmeldung P 35 41 856.7 in Figur 3c dargestellt ist. Durch Schneiden dieses Plasmids mit EcoRI, Auffüllen der überstehenden Enden und Schneiden mit HindIII erhält man das Fragment (41), aus dem die DNA-Sequenz des hier interessierenden Teils von (40) ersichtlich ist. Durch Ligieren des linearisierten Expressionsplasmids (Ex4) mit dem Segment (A,B), dem synthetischen Oligonukleotid (42) und dem Fragment (41) erhält man das Plasmid pK51 (43). Beispiel 5 Durch Ligieren des linearisierten Expressionsplasmids (Ex2) mit dem Segment (A,B), dem synthetischen Oligonukleotid (51) und der DNA-Sequenz (15) erhält man das Plasmid pK52 (52). Die richtige Orientierung des Oligonukleotids (51) wird durch Sequenzanalyse entdeckt. Das Plasmid kodiert für ein Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz entsprechend dem Oligonukleotid (51) enthält und somit durch aktivierten Faktor Xa spaltbar ist. Das Plasmid (52) ist auch auf dem folgenden Wege erhältlich: Schneidet man das Plasmid (33) partiell mit MluI und ligiert das erhaltene geöffnete Plasmid (53) mit der DNA-Sequenz (51), so resultiert ebenfalls das Plasmid pK52. Beispiel 6 Schneidet man das Plasmid (43) partiell mit MluI und ligiert das erhaltene linearisierte Plasmid (61) mit der synthetischen DNA-Sequenz (51), so erhält man das Plasmid pK53 (62). Dieses kodiert ebenfalls für ein Fusionsprotein, das mit dem aktivierten Faktor Xa spaltbar ist. Die richtige Orientierung der Sequenz (51) wird wie in Beispiel 5 durch DNA-Sequenzanalyse festgelegt. Beispiel 7 Das Plasmid (26) wird mit XbaI und partiell mit MluI gespalten und das grosse Fragment (71) isoliert. Durch Ligieren mit dem Segment (C) erhält man das Plasmid pSL14 (72). Nach Expression und Zellaufschluss wird das Fusionsprotein in der löslichen zellulären Proteinfraktion gefunden. Beispiel 8 as Plasmid (20) wird mit XbaI und partiell mit EcoRI gespalten und die überstehenden Enden aufgefüllt, wobei die DNA-Sequenz (81) erhalten wird. Durch Ligieren unter blunt end"-Bedingungen wird das Plasmid pPH31 (82) erhalten. Das Fusionsprotein wird in der unlöslichen zellulären Proteinfraktion gefunden. Beispiel 9 Als Ausgangsmaterial dient das Plasmid (90), das in der EP-A 0 171 024 (Figur 3) beschrieben ist. Dieses Plasmid wird mit SalI und dann mit AccI umgesetzt und das kleine Fragment (91) isoliert. Dieses wird mit dem synthetischen Oligonukleotid (92) ligiert, wobei die DNA-Sequenz (93) erhalten wird. Diese wird mit MluI geschnitten, wobei das DNA-Fragment (94) resultiert. Das Plasmid (33) wird mit MluI partiell und SalI verdaut und das grosse Fragment (95) isoliert. Dieses wird mit der DNA-Sequenz (94) ligiert, wobei das Expressionsplasmid pK192 (96) erhalten wird. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein, bei dem auf die ersten 38 Aminosäuren von IL-2 Methionin und hierauf die Aminosäuresequenz von Hirudin folgen. Das Fusionsprotein wird in der löslichen zellulären Proteinfraktion gefunden. Beispiel 10 Als Ausgangsmaterial dient das Plasmid pHG23 (100), das in der EP-A 0 183 350 beschrieben ist und das bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 39000 allgemein zugänglich ist. Dieses Plasmid wird mit SfaNI geschnitten, die überstehenden Enden aufgefüllt, dann mit PstI umgesetzt und das kleine Fragment (101) isoliert. Durch Ligieren des linearisierten Expressionsplasmids (Ex3) mit dem Segment (A,B), dem synthetischen Oligonukleotid (102) und dem Fragment (101) erhält man das Expressionsplasmid pW214 (103). Dieses Plasmid kodiert für ein Fusionsprotein, in dem auf die ersten 38 Aminosäuren von IL-2 die Sequenz aus dem Oligonukleotid (102) folgt, welche die Spaltung des Moleküls mit Faktor Xa erlaubt, woran sich die Aminosäurefolge von CSF anschliesst. Nach Zellaufschluss wird das Fusionsprotein in der unlöslichen zellulären Proteinfraktion gefunden. Beispiel 11 Das Ausgangsplasmid pW216 (110) ist in der deutschen Patentanmeldung P 35 45 568.3 (Figur 2b) vorgeschlagen. In diesem Plasmid folgt auf die IL- 2- Sequenz entsprechend den Segmenten A bis E (PvuI-Schnittstelle) ein Linker, der für die Aminosäuren Asp-Asp-Pro kodiert, unmittelbar gefolgt von der Aminosäurefolge für CSF. Die Verbindungssequenz zwischen IL-2 und CSF erlaubt die proteolytische Spaltung des Fusionsproteins. Aus dem Plasmid (110) wird durch Schneiden mit PvuI und HindIII die Sequenz (111) isoliert. Das Plasmid (3) wird MluI und XbaI geschnitten und das grosse Fragment (112) isoliert. Dieses wird mit dem Segment (C) ligiert, wobei das Plasmid pW227 (113) erhalten wird. Dieses Plasmid wird mit EcoRI und HindIII umgesetzt und das kurze Fragment (114) isoliert. Wird dieses Fragment mit dem linearisierten Expressionsplasmid (Exl) ligiert, so erhält man das Plasmid pW227-1 (115). Das Plasmid kodiert für ein von IL-2 abgeleitetes Protein, das keine IL-2-Aktivität besitzt. Das Plasmid (113) wird weiterhin mit EcoRI und PvuI geschnitten und das kurze Fragment (116) isoliert. Durch Ligieren des linearisierten Expressionsplasmids (Exl) mit den Fragmenten (116) und (111) erhält man das Expressionsplasmid pW233 (117). Dieses kodiert für ein unlösliches Fusionsprotein, das auf Grund des vorstehend genannten Linkers proteolytisch spaltbar ist. Beispiel 12 Das Plasmid (3) wird mit XbaI und SacI geschnitten und das grosse Fragment (121) isoliert. Durch Ligieren mit dem Segment (D) erhält man das Plasmid pW228 (122). Dieses wird mit EcoRI und flindlll geschnitten und das kleine Fragment (123) isoliert. Durch Legieren des linearisierten Expressionsplasmids (Ex1) mit dem Fragment (123) erhält man das Expressionsplasmid pW228-1 (124). Dieses Plasmid kodiert ein biologich inaktives IE2-Derivat. Dieses wird mit EcoRI und PvuI verdaut und das kurze Fragment (125) isoliert. Durch Ligieren des linearisierten Expressionsplasmids (Ex1) mit den Fragmenten (125) und (111) erhält man das Expressionsplasmid pW234 (126). Dieses kodiert für ein schwerlösliches Fusionsprotein, das ebenfalls proteolytisch spaltbar ist. Beispiel 13 Zur Konstruktion von Plasmiden, die insbesondere für die Expression von cDNA-Sequenzen geeignet sind, wird zunächst die Polylinkersequenz (131) synthetisiert. Durch Legieren des linearisierten Plasmids (1) mit dem Segment (A), der Polylinkersequenz (131) und dem Segment (F) erhält man das Plasmid pH200 (132). Das Plasmid (132) wird mit EcoRI und MluI umgesetzt und das grosse Fragment (133) isoliert. Wird dieses mit dem Segment (A,B) ligiert, so erhält man das Plasmid po201 (134). Das Plasmid (134) wird mit EcoRI und HindIII umgesetzt und das kurze Fragment (135) isoliert. Durch Ligieren dieses Fragments mit dem linearisierten Expressionsplasmid (Ex1) erhält man das Expressionsplasmid pH 202 (136). Das Plasmid (136) wird mit BamHI geöffnet und in das linearisierte Plasmid die zu exprimierende cDNA über einen handelsüblichen BamHI-Adapter eingefügt. Je nach Orientierung der cDNA ist jede dritte Sequenz im Leseraster an (A,B) angeschlossen. Wenn die cDNA-Sequenz kein Stop-Codon enthält, so wird die von ihr kodierte Polypeptid-Sequenz zusätzlich durch die dem Segment (F) entsprechende Aminosäuresequenz geschützt. Ist die cDNA nicht im richtigen Leseraster angeschlossen, so erzeugt man eine Verschiebung des Leserasters, indem man z.B. die cDNA-haltigen (ursprünglichen oder vermehrten) Plasmide mit MluI oder XbaI spaltet (sofern die cDNA keine Schnittstellen für diese Enzyme aufweist) und durch Klenow Polymerasereaktion die überstehenden Enden auffüllt. Anhang: DNA-Sequenz I Triplett Nr. 0 1 2 Aminosäure Met Ala Pro Nucleotid Nr. 1 10 God. Strang 5' AA TTC ATG GCG CCG nicht cod. Strang 3' G TAC CGC GGC (EcoRI) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 30 40 ACC TGT TCT TGT ACC AAA AAG ACT CAA CTG TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 50 60 70 CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG GTT GAC CTT GTG GAG GAC GAC CTG GAC GTG PstI 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100 ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130 AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC TTG GGC TTT GAG TGC GGA TAC GAC TGG AAG MluI 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160 AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 190 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC XbaI 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val teu Asn Leu 200 210 220 CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250 GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280 CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 300 310 GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC SacI 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340 TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 350 360 370 ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG PvuI 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400 ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC 133 134 135 Thr 410 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5' (SalI)

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE A fusion protein having an interleukin-2 (IL-2) portion and a desired protein, which has the feature that it contains a C- or N-terminal portion which essentially corresponds to the amino acid sequence of IL-2 but which is not biologically active, excepting fusion proteins whose IL-2 portion corresponds essentially at least to the first 100 amino acids of IL-2. A fusion protein as claimed in claim 1, wherein the amino acid sequence corresponds to that of human IL-2. A fusion protein as claimed in claim 2, wherein the gene coding for IL-2 contains part of DNA sequence I (addendum). A fusion protein as claimed in claim 3, wherein the gene coding for the IL-2 portion is essentially composed of one, two or three of the segments A to F of the IL-2 gene (EcoRI)-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI) in arbitrary sequence, where appropriate linked via adaptor or linker sequences. A fusion protein as claimed in one or more of the preceding claims, wherein is located, between the IL-2 sequence and the amino acid sequence of the desired protein, an amino acid or amino acid sequence which allows the desired protein to be cleaved off, chemically or enzymatically, from the IL-2 portion. A fusion protein as claimed in claim 5, wherein the amino acid is Met, Cys, Trp, Lys or Arg, or the amino acid sequence contains these amino acids at the C-terminal end. A fusion protein as claimed in claim 6, wherein the amino acid sequence is Asp-Pro or contains this amino acid sequence at the C-terminal end. A fusion protein as claimed in claim 6, wherein the amino acid sequence is Ile-Glu-Gly-Arg or contains this amino acid sequence at the C-terminal end. A process for the preparation of the fusion proteins as claimed in one or more of claims 1 to 8, which comprises causing the expression of a gene coding for the fusion protein in a host cell. The process as claimed in claim 9, wherein the gene is incorporated in an expression vector and is expressed in a bacterial cell. The process as claimed in claim 10, wherein the bacterial cell used is E. coli. The use of the fusion proteins as claimed in claims 1 to 8, or of the fusion proteins obtainable as claimed in claims 9 to 11, for the preparation of the desired proteins. A gene structure coding for a fusion protein as claimed in claims 1 to 8. A vector containing a gene structure as claimed in claim 13. The pUC12 derivatives pW226 (Fig. C), pW227 (Fig. 11), pW228 (Fig. 12), pH 200 and pH 201 (Fig. 13); expression plasmids pW226-1 (Fig. C), pW227-1 (Fig. 11), pW228-1 (Fig. 12) and pH 202 (Fig. 13); expression plasmids coding for a fusion protein composed of an IL-2 portion as claimed in claim 1, of a bridging element and proinsulin: pK40 (Fig. 1), pSL12 (Fig. 2), pK50 (Fig. 3), pK51 (Fig. 4), pK52 (Fig. 5), pK53 (Fig. 6), pSL14 (Fig. 7), pPH31 (Fig. 8); expression plasmid coding for a fusion protein composed of an IL-2 portion as claimed in claim 1, of a bridging element and hirudin: pK192 (Fig. 9); expression plasmids coding for a fusion protein composed of an IL-2 portion as claimed in claim 1, of a bridging element and GM-CSF: pW214 (Fig. 10), pW233 (Fig. 11), pW234 (Fig. 12). A host cell containing a vector as claimed in claim 14 or 15. Claims for the following Contracting States : AT, ES A process for the preparation of a fusion protein having an interleukin-2 (IL-2) portion and a desired protein having a C- or N-terminal portion which essentially corresponds to the amino acid sequence of IL-2 but which is not biologically active, which comprises causing the expression of a gene coding for the fusion protein in a host cell, excepting the preparation of fusion proteins whose IL-2 portion corresponds essentially at least to the first 100 amino acids of IL-2. The process as claimed in claim 1, wherein the amino acid sequence of the IL-2 portion corresponds to that of human IL-2. The process as claimed in claim 2, wherein the gene coding for IL-2 Contains part of DNA sequence I (addendum). The process as claimed in claim 3, wherein the gene coding for the IL-2 portion is essentially composed of one, two or three of the segments A to F of the IL-2 gene (EcoRI)-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI) in arbitrary sequence, where appropriate linked via adaptor or linker sequences. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein is located, between the IL-2 sequence and the amino acid sequence of the desired protein, an amino acid or amino acid sequence which allows the desired protein to be cleaved off, chemically or enzymatically, from the IL-2 portion. The process as claimed in claim 5, wherein the amino acid is Met, Cys, Trp, Lys or Arg, or the amino acid sequence contains these amino acids at the C-terminal end. The process as claimed in claim 6, wherein the amino acid sequence is Asp-Pro or contains this amino acid sequence at the C-terminal end. The process as claimed in claim 6, wherein the amino acid sequence is Ile-Glu-Gly-Arg or contains this amino acid sequence at the C-terminal end. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the gene is incorporated in an expression vector and is expressed in a bacterial cell, preferably E. coli. The use of the fusion proteins obtainable as claimed in claims 1 to 9, for the preparation of the desired proteins.

Inventors: HABERMANN, PAUL, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1986
Main classification: C12N15
IPC codes: A61K35, C07K14, C12N15, A61K38, A61P37, C12N1, C07K19, C12P21, C07H21, C12R1