METHOD FOR DETERMINING THE FIBRINOLYTIC STATE OF PLASMA

Abstract: 1. Process for the determination of the fibrinolytic state of plasma, characterised in that to a native plasma sample one a) adds an amount of fibrin sufficient for a turbidity formation or produces this in situ and measures the time-dependent turbidity change or the time-dependent formation of fission products or b) adds a chromogenic plasmin substrate and an amount of fibrin, fibrinogen fission products or of an enzyme producing fibrin in situ insufficient for the turbidity formation and measures the time-dependent colour formation.

Description: Beschreibung Fibrinolyse ist die gegenläufige Reaktion der Blutgerinnung. Bei der Blutgerinnung entsteht aus Fibrinogen unter dem Einfluss des Enzyms Thrombin Fibrinmonomer, welches unter dem Einfluss von Kalziumionen und anderen Faktoren zu einem unlöslichen Gerüst von Fibrin polymerisiert. Die entstehenden Fibrinmoleküle bewirken eine Verfestigung von Blutgerinnseln. Da dieser Vorgang der Fibrinbildung im Gefäss system ständig abläuft, ist ein gegenläufiges System, das fibrinolytische System, ebenfalls ständig aktiv um zu verhindern, dass es ohne besonderen AnlaS zur Bildung von Thromben kommt. Dieses fibrinolytische System führt unter dem Einfluss von Plasminogenaktivator zur Bildung von Plasmin aus Plasminogen und Plasmin bewirkt die Auflösung von Fibrin unter Bildung von Fibrinspaltprodukten. Die Bestimmung des fibrinolytischen Zustands eines Plasmas ist daher von grosser Bedeutung für die Beurteilung von Thrombosegefahren. Es sind bereits Testmethoden bekannt, welche die spontane fibrinolytische Aktivität des Blutes (des Plasmas) bzw. die fibrinolytische Reaktion auf Stimulantien, welche Plasminogenaktivator aus der Gefässwand freisetzen, messen. Hierbei ist es erforderlich, die Einwirkung von Plasmainhibitoren auszuschalten, was in der Praxis jedoch meist nur unzulänglich gelingt und gleichzeitig auch eine artifizielle Veränderung der Probe bedeutet. Bei der Bestimmung der Euglobulin-Lysezeit geht man von Citratplasma aus. Dieses wird mit Essigsäure versetzt und abzentrifugiert. Der Niederschlag wird in Puffer gelöst und mit Thrombin versetzt. Es wird bei 370C inkubiert und die Zeit bis zur Auflösung des Gerinnsels gemessen. Die Messzeit wird hierdurch zwar wesentlich verkürzt, man bestimmt hierbei jedoch eine in vitro Fibrinolyseaktivität, die nicht notwendigerweise mit der in vivo Aktivität korreliert. Man hat daher auch schon Verfahren entwickelt, die ohne Eliminierung der Plasmainhibitoren durchgeführt werden. Eine solche Methode ist z. B. die Bestimmung der Vollblut-Lysezeit. So wird bei Bestimmung der Vollblutlysezeit Vollblut mit Thrombin versetzt und das gebildete Gerinnsel bei 370C inkubiert und die Zeit bis zu seiner Auflösung gemessen. Diese Zeit beträgt bei Normalwerten nicht unter 24 Stunden. Die Methode ist daher zeitaufwendig, nicht automatisierbar und nur zur groben Abschätzung des fibrinolytischen Zustands geeignet. Eine abnormal niedrige fibrinolytische Aktivität kann gar nicht bestimmt werden. Etwas kürzere Zeiten ergeben sich, wenn mit verdünntem Blut gearbeitet wird, die erwähnten Nachteile bleiben jedoch im übrigen bestehen. Genaue Ergebnisse sollte der sogenannte Fibrinplattentest liefern, der mit Citratplasma oder resuspendierten Euglobulinniederschlägen arbeitet. Hauptnachteil liegt hier in der langen Inkubationszeit von 18 Stunden bei 370C. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Fibrinolyseglobaltest zu schaffen, welcher die Nachteile der oben erwähnten bekannten Methoden vermeidet und insbesondere in relativ kurzer Zeit Ergebnisse liefert, welche den in vivo Zustand zuverlässig wiederspiegeln, der sich automatisieren lässt und photometrisch -ausge- wertet werden kann. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einer nativen Plasmaprobe a) eine zur Trübungsbildung ausreichende Menge an Fibrin zusetzt oder diese in situ erzeugt und die Trübung oder die gebildeten Fibrin-Spaltprodukte misst oder b) ein chromogenes Plasminsubstrat und eine nicht zur Trübungsbildung ausreichende Menge an Fibrin, Fibrinogen-Spaltprodukten oder eines Fibrin in situ erzeugenden Enzyms zusetzt und die gebildete Farbe misst. Unter Trübungsmessung wird hierbei im Rahmen der Erfindung verstanden die Messung der Trübungsabnahme oder -zunahme pro Zeiteinheit, die Messung der Zeit bis zum Erreichen des Trübungsmaximums oder die Messung der zeit bis zum Erreichen einer bestimmten Trübungsabnahme oder -zunahme, bezogen auf das Trübungsmaximum. Auch eine Kombination dieser Messmöglichkeiten kann angewendet werden. Besonders bevorzugt wird die Zeit bis zum Erreichen einer definierten Trübungsabnahme oder die Zeit bis zum Erreichen des Trübungsmaximums gemessen. Die Farbmessung kann durch kinetische Verfolgung der Farbbildung erfolgen, wobei die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit ermittelt wird. Ebenso kann die nach einer vorgegebenen Zeit erreichte Extinktion bestimmt werden oder es kann die Farbbildungsreaktion nach einer vorgegebenen Zeit abgestoppt und zu beliebiger Zeit später dann die gebildete Farbe gemessen werden. Die Messung der gebildeten Fibrin-Spaltprodukte kann mit handelsüblichen Testreagenzien bzw. -Verfahren erfolgen. Beispiele sind Staphylokokken-clumping-Test (Hersteller Boehringer Mannheim GmbH) oder immunologische Verfahren z. B. über antikörperbeschichtete Latexpartikel (Hersteller Wellcome Corp.). Das Abstoppen der Farbbildungsreaktion kann durch Zusatz geeigneter Inhibitoren, vorzugsweise Plasmininhibitoren oder Säuren wie z. B. Essigsäure oder Zitronensäure, erfolgen. Bevorzugt wird die Zeit bis zum Erreichen einer bestimmten Extinktion gemessen. Das vorstehend definierte erfindungsgemässe Verfahren ergibt eine Bestimmung der hyperfibrinolytischen Aktivität des Plasmas. Dabei lösen bereits im Plasma vorhandene oder entstandene Plasminogenaktivatoren die Reaktion aus. Diese Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens eignet sich besonders für die Verfolgung einer Fibrinolysetherapie. Man kann damit feststellen, wie sich der fibrinolytische Zustand des nativen Plasmas im Verlauf der Therapie ändert. Gemäss einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird ausserdem eine bestimmte Menge an Plasminogenaktivator zugesetzt, wobei bevorzugt therapeutisch angewandte Konzentrationen eingesetzt werden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens bestimmt man die mögliche Reaktivität des Plasmas in Gegenwart von definierten Mengen Plasminogenaktivator. Dies ist besonders wichtig für die Einleitung einer Fibrinolysetherapie. Man kann dabei feststellen, wie sich der fibrinolytische Zustand des Plasmas ändert, wenn die für eine Fibrinolysetherapie vorgesehenen Therapeutika wie t-PA (EPA), Urokinase oder Streptokinase, zugesetzt werden. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fibrin in situ durch Zusatz von Thrombin oder einem thrombin ähnlichen Enzym wie Batroxobin oder Arvin erzeugt. Als Fibrinogenspaltprodukte werden bevorzugt solche verwendet, die durch Behandlung von Fibrinogen mit Bromcyan erhalten werden (I. H. Verheijen, Thromb. Haemostas 48, 266-269 (1982). Bevorzugt werden Konzentrationen von 10 bis 150 g/ml eingesetzt. Fibrinmonomere werden hergestellt durch Behandlung von Fibrinogen mit Batroxobin, Inaktivierung des Batroxobins mit Diisopropylfluorophosphat, Entfernen und anschliessendem Auflösen des Fibrinclots in 1- bis 3molarer Harnstofflösung. Bevorzugt werden Konzentrationen von 1 bis 100 ssg/ml Fibrinmonomer eingesetzt. Als chromogenes Plasminsubstrat kann jedes Plasminsubstrat verwendet werden, aus welchem unter der Einwirkung von Plasmin eine zur Farbbildung geeignete Gruppe abgespalten wird. Als farbbildende Gruppen kommen hierbei sowohl solche in Frage, die direkt photometrisch gemessen werden können wie z. B. Nitroanilin, Dinitroanilin und deren Derivate als auch solche Verbindungen, die durch Reaktion mit einer weiteren Komponente eine Farbbildung bewirken. Beispiele hierfür sind: Bei der Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Zusatz eines Plasminogenaktivators kann man als Plasminogenaktivator EPA (Extrinsic Plasminogen-Aktivator t-PA), Urokinase oder Streptokinase verwenden. Ein bevorzugtes chromogenes Plasminsubstrat ist Tos-Gly-Pro Lys-p-Nitroanilin. Das Verfahren der Erfindung kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen etwa 20 und 400C durchgeführt werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma, welches für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeignet ist. Ein derartiges Reagenz ist dadurch gekennzeichnet, dass es Plasminogenaktivator, Thrombin oder thrombinähnliches Enzym und Puffer enthält. Anstelle von Thrombin oder thrombinähnlichem Enzym kann das Reagenz auch Fibrinspaltprodukte oder Fibrinmonomer enthalten. Falls das erfindungsgemässe Reagenz für die Variante b) des erfindungsgemässen Verfahrens, also die Farbmessung, bestimmt ist, enthält es zusätzlich ein chromogenes Plasminsubstrat. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemässe Reagenz ausserdem wenigstens eine Substanz aus der Gruppe Polyethylenglykol, nichtionogenes, oberflächenaktives Mittel und Rinderserumalbumin. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemässen Reagenz enthält dieses EPA, Batroxobin, Trispuffer pH 7 bis 8, Polyethylenglykol und nichtionogenes oberflächenaktives Mittel. Für die Farbmessung enthält dieses Reagenz zweckmässig anstelle des Batroxobins durch Bromcyanbehandlung von Fibrinogen hergestellte Fibrinogen-Spaltprodukte oder statt dessen Fibrinmonomer und ausserdem Tos-Gly-Pro Lys-p-Nitroanilin. Für die einzelnen Bestandteile des erfindungsgemässen Reagenz gelten die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit der Erläuterung des Verfahrens entsprechend. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung. In dieser stellen dar: Fig. 1 eine Eichkurve für einen Trübungstest mit EPA als Plasminogenaktivator. Beispiel 1 Trübungstest mit EPA als Plasminogenaktivator Reagenz zusammensetzung: Tris/HCl, 0,1 mol/l, pH 7,5 Polyethylenglycol 6000, 2 Gew.-% oberflächenaktives Mittel (Tween 80), 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin (RSA), 1 Gew.-% Batroxobin 0,02 BU/ml EPA (0,01 - 10 ng/ml Testansatz) Testansatz: 50 1 Probe (Plasma) 1000 1 Reagenz Reagenz und Probe werden bei 25"C gemischt und die Trübung sofort an einem Photometer bei = 334 nm verfolgt. Die Extinktionsänderung wird mit einem Schreiber (Papiervorschub 0,1 cm/min) registriert. Die Erstellung einer Eichkurve erfolgt entweder durch Erfassen der Zeit t1 bis das Trübungsmaximum erreicht wird (Fig. 1, Kurve 1) oder der Zeit t2 bis - ausgehend vom Trübungsmaximum - eine Extinktionsabnahme von 100 mE erfolgt ist (Fig. 1, Kurve 2). Beispiel 2 Trübungstest mit Streptokinase bzw. Urokinase als Plasminogenaktivator. Reagenzzusammensetzung, Testansatz und Testdurchführung entsprechen Beispiel 1, wobei anstelle von EPA Streptokinase bzw. Urokinase in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt wird. Es werden dabei folgende Messwerte erhalten: a) Streptokinase EMI9.1 <tb> Kanzentration <SEP> <tb> iu/ml <SEP> Testansatz <SEP> 0 <SEP> 0,05 <SEP> 0,10 <SEP> 0,15 <SEP> 0,20 <SEP> 0,25 <tb> tl <SEP> <tb> (vgl. <SEP> Beispiel <SEP> 1) <SEP> 55 <SEP> 40 <SEP> 36,5 <SEP> 17,0 <SEP> 15,0 <SEP> 10,5 <tb> t2 <SEP> rw <SEP> <tb> (vgl. <SEP> Beispiel <SEP> 1) <SEP> # <SEP> <SEP> 35 <SEP> 27 <SEP> 23 <SEP> 15 <SEP> 14 <tb> b) Urokinase EMI10.1 <tb> Konzentration <tb> ng/ml <SEP> Testansatz <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 200 <SEP> 300 <SEP> 400 <tb> t1 <SEP> [min] <SEP> 65 <SEP> 50 <SEP> 23,5 <SEP> 16,5 <SEP> 12,0 <SEP> 9,5 <SEP> 8,5 <tb> t2 <SEP> [min] <SEP> d5 <SEP> 55 <SEP> 13 <SEP> 7,5 <SEP> 4,0 <SEP> 3,5 <SEP> 3,0 <tb> Beispiel 3 Farbtest mit EPA als Plasminogenaktivator Reagenz zusammensetzung: Tris/HCl 0,1 mol/l, pH 7,5 Polyethylenglycol 6000, 2 Gew.-% Tween 80, 0,1 Gew.-% RSA, 1 Gew.-t EPA: 0,01 bis 10 ng/ml Testansatz BrCN-Fragmente des Fibrins, 75 ssg/ml Plasminsubstrat TOS-Gly-Pro-Lys-pNA, 0,15 mmol/l Testansatz: 50 1 Probe (Plasma) 1000 1 Reagenz Reagenz und Probe werden bei 25"C gemischt und die Farbbildung an einem Photometer bei 405 nm verfolgt. Die Extinktionsänderung wird mit einem Schreiner (Papiervorschub 0,1 cm/min) registriert. Es wird die Zeit t3 gemessen bis - ausgehend von der Basislinie (Reagenzleerwert) - ein Extinktionsanstieg von 100 mE erreicht ist. Als Ergebnisse werden erhalten: EMI11.1 <tb> Konzentration <SEP> EPA <tb> ng/ml <SEP> Testansatz <SEP> 0,048 <SEP> 0,119 <SEP> 0,238 <SEP> i <SEP> 0,475 <tb> <SEP> t3 <SEP> JminZ <SEP> 118 <SEP> 58 <SEP> 36 <SEP> 24 <tb>

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung des fibrinolytischen Zu stands von Plasma, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man einer nativen Plasmaprobe a) eine zur Trübungsbildung ausreichende Menge an Fibrin zusetzt oder diese in situ erzeugt und die Trübung oder die gebildeten Fibrin Spaltprodukte misst oder b) ein chromogenes Plasminsubstrat und eine nicht zur Trübungsbildung ausreichende Menge an Fibrin, Fibrinogen-Spaltprodukten oder eines Fibrin in situ erzeugenden Enzyms zu setzt und die gebildete Farbe misst. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man ausser dem eine bestimmte Menge Plasminogenaktivator zusetzt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Fibrin in situ durch Zusatz von Thrombin oder einem thrombinähnlichen Enzym wie Batroxobin oder Arvin erzeugt. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Plasminogenaktivator EPA, Urokinase oder Streptokinase zusetzt. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fibrinogen-Spaltprodukte solche ver wendet, die durch Behandlung von Fibrinogen mit Bromcyan erhalten werden. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als chromogenes Plasminsubstrat Tos-Gly Pro-Lys-p-Nitroanilin verwendet. 7. Reagenz zur Bestimmung des fibrinolytischen Zu stands von Plasma, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es Plasmino genaktivator, Thrombin oder thrombinähnliches Enzym und Puffer enthält. 8. Reagenz zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es Plasmino genaktivator und Fibrinogenspaltprodukte oder Fibrinmonomer enthält. 9. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich ein chromogenes Plasminsubstrat enthält. 10. Reagenz nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es Polyethylenglykol, ein nichtionogenes, oberflächenaktives Mittel und/oder Rinderserumal bumin enthält. 11. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es EPA, Batroxobin, Trispuffer pH 7 bis 8, Polyethylenglykol und nichtionogenes oberflächen aktives Mittel enthält. 12. Reagenz nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es EPA, Trispuffer pH 7 bis 8, Polyethylenglycol, nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel und durch Bromcyanbehandlung von Fibrinogen hergestellte Fibrinogen-Spaltprodukte oder Fibrinmonomer und Tos-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilin enthält. 13. Verwendung von Thrombin oder thrombinähnlichem Enzym zusammen mit Puffer als Reagenz zur Bestimmung des fibrinolytischen Zustands von Plasma.

Inventors: BARTL, KNUT, DR.RER.NAT., LILL, HELMUT, DR.RER.NAT.
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1986
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1