COUPLING REAGENT, METHOD FOR ITS PREPARATION AND ITS USE

Abstract: 1. A compound of the general formula I. see diagramm : EP0207415,P7,F1 in which R**1 is an aliphatic or aromatic radical having up to 10 carbon atoms and X is a succinimide or benzotriazole residue.

Description: Verbrtlckungsreagenz, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Anwendung Der Bedarf an Verbrückungsreagenzien zur Kupplung von Aminosäuren, Peptiden oder biologischen Wirkstoffen an Proteine und inerte Träger nimmt ständig zu. Hierzu sind heterobifunktionelle Reagenzien mit der allgemeinen Formel B entwickelt worden, mit welchen z.B. Peptide spezifisch Nterminal an Proteine und andere Träger gekuppelt werden können (Christner, J.: Synthese von Peptiden zur immunologischen Bestimmung von Proteinen; Dissertation 1984, Universität Tübbingen). V-NH-NH-CO- A-CO-Y B Es bedeutet: V Boc, Z, Fmoc oder andere Schutzgruppen YO OH, OSu oder andere Aktivestergruppen As Ethylen- oder Propylengruppe Oben und im folgenden Text genannte Abkürzungen sind in einer Liste zusammengefasst. Kupplungen mit solchen Reagenzien können in einer mehrstufigen Arbeitsweise ausgeführt werden. Die aktivierte Carboxygruppe reagiert in erster Stufe mit Aminogruppen einer bestimmten Verbindung, z.B. einen Polymer oder einem Peptid. In den darauffolgenden Schritten wird die Schutzgruppe V abgespalten, das entstandene Hydrazid ins Azid Uberführt, welches man dann unter schonenden Bedingungen mit der Aminogruppe einer anderen Komponente reagieren passt, Dieses Verfahren ist Jedoch umständlich und zeitaufwendig. Es ergibt sich daher der Bedarf an Aktivierungsreagenzien, die in der Lage sind, lIoleküle mit Aminogruppen selektiv und einfach an ein Trägermolekül zu binden. Dieses Problem konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden, indem man Aldehydsäuren, deren Carboxygruppe in einen geeigneten kupplungsfähigen Zustand gebracht wurde, während die Carbonylgruppe ungeschützt vorliegt, als Verbrückungsreagenzien einsetzt und in einem zweistufigen Verfahren selektiv mit Aminogruppen-tragenden Substanzen zur Reaktion bringt. Die Erfindung betrifft somit: 1. Die Verbindung der allgemeinen Formel I, EMI2.1 in der a) R ein inerter Rest ist, der unter den Kondensations bedingungen die Reaktion der beiden Reaktionspartner nicht behindert und nicht mit Carboxy-, Carbonyl-, Hydroxyl- und Thiolgruppen reagiert, und b) X eine Gruppe ist, die unter den Reaktionsbedingungen zur Amidbildung mit primären und sekundären Alkyl anirwogruppen als XOH abgespalten wird. 2. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der all gemeinen Formel I, die erhalten wird, indem eine Verbind dung der allgemeinen Formel II, EMI2.2 in der R1 die obengenannte Bedeutung hat, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, XOH III in X die obengenannte Bedeutung hat, zusammen mit einem Kondensationsmittel unter Abspaltung von Wasser umgesetzt wird. 3. Die Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel I a) als bifunktionelles Kupplungsreagenz, b) zur Herstellung von Amiden mit Aldehydfunktion c) zur Herstellung von Schiffschen Basen. In der folgenden Beschreibung und in den PatentansprOchen werden bevorzugte Ausgestaltunen der Erfindung aufgeführt. Als Aldehydsäuren (Verbindung der Formel II) können aliphatische, alicyclische, araliphatische und aromatische Verbindungen mit bis zu 10 C-Atomen, 10 H-Atomen und 5 O-Atomen eingesetzt werden, wobei aromatische Aldehydsäuren, insbesondere 4-Carboxybenzaldehyd, bevorzugt sind. Zur Aktivierung der Carboxygruppen werden die in der Peptidchemie üblichen tlethoden benutzt. Bevorzugt geschieht die Aktivierung durch Bildung von symmetrischen Anhydriden oder von sogenannten Aktivestern mit aktivesterbildenden Mole kühlen, wie sie beispielsweise in H. Bodanszky, Principles or Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984, beschrieben werden, insbesondere mit N-Hydroxysuccinimid oder Hydroxybenzotriazol. Die Reaktion wird in Gegenwart von Carbodiimiden, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid, durchgeführt. Diese aktivierten Verbindungen werden dann zusammen mit einer Aminogruppen-tragenden Substanz in einem polaren organischen Ldsemtttel suspendiert oder gelöst. Hier sind beispielsweise Dioxan, Tetrahydrofuran, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Methylenchlorld, Trichlormethan oder ganz besonders Dimethylformamid geeignet. Dem Reaktionsgemisch wird eine Base hinzugegeben, wobei sich tertiäre Amine, insbesondere N-Methylmorpholin oder Triethylamin, besonders bewährt haben. Die Reaktion wird so ausgeführt, dass die Amlnogruppen- tragende Substanz äquimolar oder im Unterschuss vorliegt. Gute Umsatzraten lassen sich erhalten, wenn das Molver- hältnis der Aminokomponente zum Kupplungsreagenz in dem Bereich 1 : 1 bis 1 : 10, bevorzugt bei 1 : 1 bis 1 : 3, gehalten wird. Überraschenderweise kuppelt die Aminogruppe bei dieser Reaktion selektiv mit der aktivierten Carboxygruppe der erfindungsgemässen Verbindung und nicht mit der Carbonylgruppe. Es lassen sich somit Amide mit Aldehydfunktion gewinnen, die in einem weiteren Reaktionsschritt selektiv an andere Aminogruppen-tragende Verbindungen gekuppelt werden können. Zu diesem Zweck können die Amide isoliert werden. Bei Peptiden geschieht dies bevorzugt durch Extraktion oder Fällung und bei polymeren Trägern durch Wa- schen mit Lösemitteln. Zur Anknüpfung an eine zweite Aminokomponente werden die Reaktionspartner in einer wässrigen Lösung zusammengegeben, die gegebenenfalls in einem pH-Bereich von 5 bis 10, bevorzugt 6 bis 9, gepuffert ist, und über einen Zeitraum von 2 Stunden bis 7 Tage, bevorzugt 1 Tag, inkubiert. Die dabei auftretenden Schiffschen Basen sind im Falle aromatischer Aldehyde mit einer genügenden Stabilität gegen Hydrolyse ausgestattet. Insbesondere bei weniger hydrolysestabilen Schiffschen Basen kann eine Hydrierung der Aldimingruppe zur sekundären Aminogruppe erfolgen. Die Reduktion mit komplexen Hydriden, z.B. mit Natriumcyanoborhydrid, erwies sich als günstig bezüglich der Verkürzung der Reaktionszeit. Die Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens liegen in seiner Schnelligkeit, in der selektiven Umsetzung bei den Kupplungsreaktionen, den hohen Ausbeuten und Stabilitäten der Produkte. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Amide mit Aldehydfunktion unter entsprechenden Bedin gungen, gegebenenfalls unter Einführen einer Spacergruppe, Über Kupplung an den N-Terminus mit weiteren Aminosäuren umgesetzt werden können und so Peptide aufgebaut werden können. Weitere detaillierte Ausgestaltungen werden im folgenden anhand von Beispielen dargestellt. Beispiel 1 Immobilisierung von H-E-Aca-Gly-Ala-Lys(Boc)-Gln-Ala-OTle an aniniertes Harz ¯¯¯ Stufe 1 150 mg 4-Carboxybenzaldehyd und 153 mg l-Hydroxybenzotria- zol-(1,2,3) werden in 5 ml DMF gelöst und mit 210 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bevor 110 iil N-Methylmorpholin und 736,5 mg H-E-Aca-Gly-Ala-Lys(Boc)-a.ln-Ala-OMe (in DMF vorgelöst) zugesetzt werden. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wird abgedampft, der Rückstand mit Essigester und Dichlormethan ausgerührt und abfiltriert. Der Rückstand wird gesammelt und getrocknet. Ausbeute: 720 mg " 83 % d. Th. Reinheitskontrollen: DC Rf= 0,37 Laufmittel: Chloroform/Methanol/Essig säure (5:2:0,5;v:v:v) Detektion: Ninhydrin, UV, TDrl und 2,4-Dinitrophenylhydrazin positiv Stufe 2 10 ml einer Suspension eines Copolymerisats mit Aminogruppen aus Pentaerythrit, Methacrylsäurederivaten und Poly ethylenglykol, vernetzt mit Divinylbenzol, (Fractogel(R) TSK HW 65 (F) - 1,5 g trockene Substanz mit 0,18 mmol Aminogruppen in wässriger Suspension) wird mit 1 tI Natriumphosphatpuffer auf pH 9 gebracht und mit 347 mg des nach Stufe 1 aktivierten Peptids versetzt. Der Ansatz wird 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschliessend wird das Harz mit Wasser und Methanol gewaschen. Eine Peptidgehaltsanalyse erbrachte 0,033 mmol Peptid pro g trockenem Harz. Beispiel 2 Herstellung von aminiertem Harz mit Aldehydfunktion 10 ml der in Beispiel 1 genannten Polymer-Suspension (= 1,5 g Trockensubstanz) wird mit Dioxan-Wassergemischen steigender Dioxankonzentration entwässert. Separat werden 150 mg 4-Carboxybenzaldehyd und 153 ng l-Hydroxybenzotriazol(-1,2,3) in 5 ml DMF gelöst und mit 210 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Der Ansatz wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann über eine G 3-Glas filter- fritte zu dem in 10 ml Dioxan suspendierten Harz gegeben. Man fügt 100 itl N-llethylmorpholin hinzu und schüttelt den Ansatz über Nacht. Überschüssige Reagenzien werden durch Filtration und Waschen mit Dioxan entfernt. Das Harz wird mit Wasser-Dioxan-05ischungen steigender Wasserkonzentration in eine rein wässrige Phase überführt. Beispiel 3 Anlagerung von biologisch aktiven Substanzen an aminiertes Harz nit Aldehydfunktion ¯ ¯ 0,5 g des gemäss Beispiel 2 hergestellten Harzes mit ca. 0,05 mmol Aldehydgruppen pro Gramm Polymer werden in 3 ml 1 tl Natriumphosphatpuffer pH 9 suspendiert und mit 100 mg H-Ar6'MCl)-ANBS-Lys(Z)-OTle versetzt. Man schüttelt 2 Tage bei Raumtemperatur und wäscht überschüssige Reagentien mit Wasser aus. Beladungsprüfung: Nach Trocknung des Harzes ergab eine Aminosäurenanalyse 0,05 mmol/g Beladung. Beispiel 4 Konjugation von H-e-Aca-Glu-Glu-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-OH anKT, Stufe 1 7,5 mg 4-Carboxybenzaldehyd und 7,65 mg l-Hydroxybenzotriazol-(1,2,3) werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 10,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Der Ansatz wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und mit 20 ul N-Methylmorpholin versetzt. Darauf hin werden 56 mg H-± Aca-Glu-Glu-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-OH x 3 H20 x ACOH, die in 2 ml Dimethylformamid gelöst waren, langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wird Uber Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösemittel abgedampft und der Rückstand zwischen Diethylether und Wasser verteilt. Nach Lyophilisation der Uasserphase erhält man das Peptid mit Aldehydfunktion in quantitativer Ausbeute in Form eines lockeren, schneeweissen Pulvers. Reinheitsprüfung: DC: Rf = 0,53 Laufnittel: Butanol/Essi6säure/Wasser (3:1:1; v:v:v) Detektion: Ninhydrin negativ UV, 2,4-Dinitrophenylhydrazin- test und TDtM positiv zum Vergleich, DC freies Peptid: RF = 0,12 Laufmittel: s.o. Detektion: TDM und Ninhydrin positiv UV und 2,4-Dinitrophenylhydrazin negativ Stufe 2 25 mg des nach Stufe 1 aktivierten Peptids werden in LI ml Phosphatpuffer (0,5 M, pH 8,3) gelöst und mit 125 mg KLH ver setzt. Hierzu gibt man 1,5 mg festes Natriumcyanoborhydrid und rührt den Ansatz über Nacht. Das Konjugat wird durch Dialysieren gegen destilliertes Wasser gereinigt und anschliessend durch Lyophilisation in fester Form gewonnen. Beispiel 5 Herstellung von Bpoc-Gly-Pro-Arg(HC1)-Pro-HDA-(4)-Benz- aldehyd Dieses kupplungsfähige Peptid wurde nach Plan 1 hergestellt. Plan 1 EMI8.1 Abkürzungen Lys L-Lysin Cys L-Cystein #-Aca #-Aminocapronsäure Gly Glycin Ala L-Alanin Gln L-Glutamin One Methylester DC Dünnschicbtchromatographie DllF Dimethylformamid RF Retentionsfaktor UV Ultraviolettvisualisation TDfl (Chlor/4,4-Bis-(dimethylamino)di phenylmethan-Test Arg L-Arginin ANBS 5-Amino-2-nitrobenzoesäure Z Benzyloxycarbonyl Glu L-Glutaminsäure Leu Leucin Asn L-Asparagin KLH Keyhole Limpet Hemocyanine ACOH Essigsäure HrIDA Hexamethylendiamin Pro L-Prolin Bpoc 2-[Biphenylyl-(4)]-propyl-(2)-oxycarbonyl- DCC Dicyclohexylcarbodiimid HOBt N-Hydroxybenzotriazol Boc tert.-Butyloxycarbonyl Fmoc 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl HOSu N-Hydroxysuccinimid DCHA Dicyclohexylammoniumsalz

Claims: Patentansprüche 1. Verbindung der allgemeinen Formel I, EMI10.1 in der a) R1 ein inerter Rest ist, der unter den Kondensations bedingungen die Reaktion der beiden Reaktionspartner nicht behindert und nicht mit Carboxy-, Carbonyl- und Hydroxyl- und Thiolgruppen reagiert und b) X eine Gruppe ist, die unter den Reaktionsbedingungen einer Anidbildung mit primären und sekundären Alkyl aninogruppen als XOH abgespalten wird. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 ein aliphatischer, alizyklischer, araliphatischer oder aronatischer Rest mit bis zu 10 C-Atonen und 10 H Atomen ist und X der Rest einer phenolischen Verbindung, einer N-Hydroxyverbindung oder der Bestandteil eines Anhydrids ist. 3. Verbindung nach Anspruch loder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R der p-Phenylenrest ist. 4. Verbindung nach Anspruch loder 2, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Succinimid- oder Benzotriazolrest ist. 5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ver oir.duno der allgemeinen Formel II, EMI11.1 in der R1 die obengenannte Bedeutung hat, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, XOH III in der X die obengenannte Bedeutung hat, zusammen mit einem Kondensationsmittel unter Abspaltung von Wasser ungesetzt wird. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kondensationsmittel ein Carbodiinid ist. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Carbodiimid Dicyclohexylcarbodiimid ist. 8. Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel I, EMI11.2 in der a) R1 ein inerter Rest ist, der unter den Kondensations bedingungen die Reaktion der beiden Reaktionspartner nicht behindert und nicht mit Carboxy-, Carbonyl- und Hydroxyl- oder Thiolgruppen reagiert und b) X eine Gruppe ist, die unter den Reaktionsbedingungen zur Amidbildung mit primären oder sekundären Alkyl aninogruppen als XOH abgespalten wird, als bifunktionelles Kupplungsreagenz. 9. Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel I nach Anspruch 8 zur Herstellung von Aniden mit Aldehyd funktion. 10. Verwendung der Verbindung der allgemeinen Formel 1 nach Anspruch 8 zur Herstellung von Schiffschen Basen.

Inventors: STUBER, WERNER, DR., Stüber, Werner, Dr.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1986
Main classification: C07D249
IPC codes: C07B51, C07D207, C07D249, C07K17