EUCARYOTIC FUSION PROTEINS, THEIR PREPARATION AND USE, AND AGENTS FOR CARRYING OUT THE PROCESS

Abstract: Fusion proteins in which the C- or N-terminal essentially corresponds to the first 100 units of interleukin 2 are new. Also new are gene structures coding for the above fusion proteins, vectors containing these gene structures, and hot cells containing these vectors. Hirudin derivs. with an amino acide sequence begining N-terminally with Pro are new and claimed. Human interleukin 2 derivs. contg. Asp. C-terminally are new and claimed.

Description: Eukaryotische Fusionsproteine, ihre Herstellung und Verwendung sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung bezieht sich auf einen "offenen Leseraster" aus einer DNA, die für Interleukin-2 codiert, und die Verwendung dieser DNA als Expressionshilfe zur Expression von Peptiden bzw. Proteinen. Bei der gentechnischen Herstellung eukaTry6tischer Proteine wird in Bakterien häufig nur eine geringe Ausbeute erhal- ten, insbesondere bei kleinen Proteinen mit einem Molgewicht bis zu etwa 15 000 Dalton, deren Strukturen Disulfidbrücken enthalten. Man nimmt an, dass die gebildeten Proteine durch wirtseigene Proteasen rasch abgebaut werden. Man konstruiert deshalb zweckmässig Genstrukturen, die für Fusionsproteine codieren, wobei der unerwünschte Anteil des Fusionsproteins ein wirtseigenes Protein ist, das nach der Isolation der Primärproduktes nach an sich bekannten Methoden abgespalten wird. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein Nterminaler Anteil von Interleukin-2, der im wesentlichen den ersten 100 Aminosäuren entspricht, besonders gut zur Herstellung von Fusionsproteinen geeignet ist. Man erhält also als Primärprodukt ein Fusionsprotein, das völlig oder zum ganz überwiegenden Teil aus eukaryotischen Proteinsequenzen besteht. Überraschenderweise wird dieses Protein offenbar in dem betreffenden Wirtsorganismus nicht als Fremdprotein erkannt und nicht sofort wieder abgebaut. Ein weiterer Vorteil ist, dass die erfindungsgemässen Fusionsproteine schwer löslich bis unlöslich sind und sich somit einfach, zweckmässig durch Zentrifugation, von den löslichen Proteinen abtrennen lassen. Da es erfindungsgemäss hinsichtlich der Funktion als "Bal- last-Anteil" des Fusionsproteins nicht darauf ankommt, dass der Interleukin-2-Anteil ein biologisch aktives Molekül darstellt, kommt es insofern auch nicht auf die exakte Struktur des Interleukin-2-Anteils an. Es genügt hierfür, dass im wesentlichen die ersten 100 N-terminalen Aminosäuren vorliegen. Es ist also beispielsweise möglich, am N Terminus Variationen vorzunehmen, die eine Spaltung des Fusionsproteins erlauben, falls das erwünschte Protein Nterminal dazu angeordnet ist. Umgekehrt kann man C-terminal Variationen vornehmen, um die Abspaltung des gewünschten Proteins zu ermöglichen oder zu erleichtern, falls dieses im Fusionsprotein - wie üblich -C-terminal - C-terminalgebun den ist. Die für Human-Interleukin-2, im folgenden "IL-2", codierende natürliche DNA-Sequenz ist aus der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP-A1-0 091 539 bekannt. Die dort aufgeführte Literatur bezieht sich auch auf Mäuse- und Ratten-IL-2. Diese Säuger-DNA kann zur Synthese der erfindungsgemässen Proteine herangezogen werden. Zweckmässiger geht man jedoch von einer synthetischen DNA aus, besonders vorteilhaft von der DNA für Human-IL-2, die in der (nicht vorveröffentlichten) deutschen Offenlegungsschrift 34 19 995 (entsprechend der unter der Nummer 0 163 249 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung) vorgeschlagen wurde. Diese synthetische DNA-Sequenz ist im Anhang wiedergegeben (DNA-Sequenz I). Diese synthetische DNA hat nicht nur den Vorzug, dass sie in der Codon-Wahl auf die Gegebenheiten des am häufigsten verwendeten Wirts, E. coli, abgestimmt ist, sondern sie enthält auch eine Reihe von Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen, von denen erfindungsgemäss Gebrauch gemacht werden kann. In der folgenden Tabelle 1 ist eine Auswahl der geeigneten Schnittstellen am Anfang bzw. in der Region des 100. Tripletts wiedergegeben. Hierdurch ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass in dem dazwischenliegenden Bereich Variationen in der DNA vorgenommen werden, wobei von den in der vorstehend genannten Patentanmeldung aufgeführten weiteren Schnittstellen Gebrauch gemacht werden kann. Tabelle 1 Restriktionsenzym Erkennungs- Position des ersten sequenz Nucleotids der Er kennungssequenz (codierender Strang) 5' 3' Aha II, Ban I, Hae II, Nar I, GGCGCC 8 Ban II, Sac I, Sst I GAGCTC 291 Hha I GCGC 9 Hinf I GACTC 35 Pvu I CGATCG 346 Taq I TCGA 387 Wird von den Nucleasen Ban II, Sac I oder Sst I Gebrauch gemacht, so erhält man eine IL-2-Teilsequenz, die für etwa 95 Aminosäuren codiert. Diese Länge ist im allgemeinen ausreichend, um ein unlösliches Fusionsprotein zu erhalten. Wenn die Schwerlöslichkeit, beispielsweise bei einem gewünschten hydrophilen eukaryotischen Protein, noch nicht ausreicht, man aber - um so wenig "Ballast" wie möglich zu produzieren - nicht von den näher am C-Terminus liegenden Schnittstellen Gebrauch machen will, so kann man durch entsprechende Adapter bzw. Linker die DNA-Sequenz am Nund/oder C-terminalen Ende verlängern und so den "Ballast"- Anteil "massschneidern". Man kann natürlich auch die DNA Sequenz - mehr oder weniger - bis zum Ende nutzen und so gegebenenfalls modifiziertes - biologisch aktives IL-2 als "Nebenprodukt" erzeugen bzw. ein bifunktionelles Protein erzeugen, das IL-2 Wirkung zusätzlich zur Wirkung des codierten Proteins zeigt. Die Erfindung betrifft somit Fusionsproteine der allgemeinen Formel Met - X - Y - Z oder Met - Z - Y - X (Ia) (Ib) in der X im wesentlichen die Aminosäurefolge der etwa 100 ersten Aminosäuren von vorzugsweise menschlichem IL-2 bedeutet, Zeine direkte Bindung bedeutet, falls die zum-ge- wünschten Protein benachbarte Aminosäure oder Aminosäurenfolge eine Abspaltung des gewünschten Proteins ermöglicht, oder andernfalls ein Brückenglied aus einer oder mehreren genetisch codierbaren Aminosäuren, das die Abspaltung ermöglicht, und Z eine Sequenz aus genetisch codierbaren Aminosäuren ist, die für das gewünschte Protein codiert. Wie sich aus den Formeln Ia und Ib ergibt - und wie es auch schon vorstehend erwähnt wurde - ist es möglich, das gewünschte Protein vor oder nach dem IL-2-Anteil zur Expression zu bringen. Zur Vereinfachung wird im folgenden im wesentlichen die erste Möglichkeit erläutert, die der herkömmlichen Methode zur Herstellung von Fusionsproteinen entspricht. Wenn also im folgenden diese "klassische" Variante beschrieben wird, soll die andere Alternative hierdurch nicht ausgeschlossen werden. Die Spaltung des Fusionsproteins kann in an sich bekannter Weise chemisch oder enzymatisch erfolgen. Die Wahl der geeigneten Methode richtet sich vor allem nach der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins. Wenn dieses beispielsweise kein Methionin enthält, kann Y Met bedeuten, worauf eine chemische Spaltung mit Chlor- oder Bromcyan erfolgt. Steht im Bindeglied Y am Carboxyterminus Cystein oder steht Y für Cys, so kann eine enzymatische Cysteinspezifische Spaltung oder eine chemische Spaltung, beispielsweise nach spezifischer S-Cyanylierung, folgen. Steht im Brückenglied Y am Carboxyterminus Tryptophan oder Y für Trp, so kann eine chemische Spaltung mit N-Bromsuccinimid erfolgen. Proteine, die in ihrer Aminosäuresequenz nicht Asp - Pro enthalten und hinreichend säurestabil sein, können in an sich bekannter Weise proteolytisch gespalten werden. Hierdurch erhält man Proteine, die N-terminal Prolin bzw. Cterminal Asparaginsäure enthalten. Auf diese Weise können also auch modifizierte Proteine synthetisiert werden. Die Asp-Pro-Bindung kann noch säurelabiler gestaltet werden, wenn dieses Brückenglied (Asp)n-Pro bzw. Glu-(Asp)Pro ist, wobei n 1 bis 3 bedeutet. Beispiele für enzymatische Spaltungen sind ebenfalls bekannt, wobei auch modifizierte Enzyme mit verbesserter Spezifität eingesetzt werden können (vgl. C.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Ist das gewünschte eukaryotische Peptid Proinsulin, so wählt man zweckmässig als Sequenz Y eine Peptidsequenz, bei der eine durch Trypsin abspaltbare Aminosäure (Arg, Lys) an die N-terminale Aminosäure (Phe) des Proinsulins gebunden ist, beispielsweise Ala-Ser-Met-Thr-Arg, da dann die Arginin-spezifische Spaltung mit der Protease Trypsin erfolgen kann. Enthält das gewünschte Protein nicht die Aminosäurefolge Ile-Glu-Gly-Arg, so kann das Fusionsprotein mit Faktor Xa gespalten werden (europäische Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern 0 025 190 und 0 161 973). Das Fusionsprotein wird durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem in an sich bekannter Weise gewonnen. Hierfür eignen sich alle bekannten Wirts-Vektor-Systeme, also beispielsweise Säugerzellen und Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und vorzugsweise Bakterien, insbesondere E. coli. Die DNA-Sequenz, die für das gewünschte Protein codiert, wird in bekannter Weise in einen Vektor eingebaut, der in dem gewählten Expressionssystem eine gute Expression gewährleistet. In bakteriellen Wirten wählt man zweckmässig den Promotor und Operator aus der Gruppe lac, tac, trp, PL oder PR des Phagen X, hsp, omp oder einen synthetischen Promotor, wie sie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift 34 30 683 (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0 173 149) vorgeschlagen sind. Vorteilhaft ist die tac Promotor-Operator-Sequenz, die inzwischen handelsüblich ist (z.B. Expressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, S. 63). Bei der Expression des erfindungsgemässen Fusionsproteins kann es sich als zweckmässig erweisen, einzelne Tripletts der ersten Aminosäuren nach dem ATG-Start-Codon zu verändern, um eine eventuelle Basenpaarung auf der Ebene der mRNA zu verhindern. Solche Veränderungen, ebenso wie Ver änderungen, Deletionen oder Additionen einzelner Aminosäuren im IL-2-Proteinanteil, sind dem Fachmann geläufig und ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In den folgenden Beispielen und in den Figuren wird die Erfindung näher erläutert. Hierbei beziehen sich Figur 1 und deren Fortsetzung, Figur la, auf die Synthese. des Plasmids pK360, das für ein Fusionsprotein codiert, welches die Hirudinsequenz aufweist; Figur 2 und ihre Fortsetzung, Figur 2a, betreffen die Synthese des Plasmids pK410, welches ebenfalls für ein Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz des Hirudin codiert, Figur 3 und ihre Fortsetzungen, Figuren 3a bis 3c, auf die Konstruktion der Plasmide pPH15, 16, 20 und 30, die für Fusionsproteine codieren, die die Aminosäuresequenz von Affen-Proinsulin enthalten, Figur 4 auf die Synthese des Plasmids pPH100, welches für ein Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz des Hirudin codiert, Figur 5 und ihre Fortsetzung, Figur 5a, auf die Konstruktion des Plasmids pK370, welches für ein Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz des Hirudin codiert sowie Figur 6 und ihre Fortsetzung, Figur 6a, auf die Synthese des Plasmids pKH101, das für ein Fusionsprotein mit der Aminosäurefolge von Affenproinsulin codiert. Die Figuren sind i.a. nicht massstabgerecht gezeichnet, vor allem bei der Wiedergabe der Polylinker wurde der Massstab "gedehnt". Beispiel 1 Durch Insertion des lac-Repressors (P.J. Farabaugh, Nature 274 (1978) 765-769) in das Plasmid pKK 177-3 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167) erhält man das Plasmid pJF118 (1) (Fig. 1; vgl. deutsche Patentanmeldung P 35 26 995.2, Bei spiel 6, Fig. 6). Dieses wird an der singulären Restriktionsstelle für Ava I geöffnet und in an sich bekannter Weise durch Exonuclease-Behandlung um etwa 1000 bp verkleinert. Nach Ligierung wird das Plasmid pEW 1000 (2), (Figur 1) erhalten, in dem das lac-Repressorgen vollständig erhalten ist, das aber auf Grund der Verkleinerung in deutlich höherer Kopienzahl als das Ausgangsplasmid vorliegt. Anstelle des Plasmids pKK177-3 kann man auch von dem vor stehend erwähnten handelsüblichen Plasmid pKK223-D ausgehen, den lac-Repressor einbauen und das erhaltene Produkt analog verkürzen. Das Plasmid pEW 1000 (2) wird mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Sal I geöffnet (3). Das für Hirudin codierende Plasmid (4), hergestellt gemäss deutscher Offenlegungsschrift 34 29 430 (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0 171 Beispiel 4 (Figur 3), wird mit den Restriktionsenzymen Acc I und Sal I geöffnet und das kleine Fragment (5), das zum grössten Teil die Hirudin-Sequenz enthält, isoliert. Das Plasmid p159/6 (6), hergestellt gemäss deutscher Offenlegungsschrift 34 19 995 (europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0 163 249), Beispiel 4 (Figur 5), wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Pvu I geöffnet und das kleine Fragment (7) isoliert, das den grössten Teil der IL-2-Sequenz enthält. Diese Teilsequenz und im folgenden auch andere verkürzte IL-2 Sequenzen sind in den Figuren mit "hIL2" bezeichnet. Anschliessend werden die Sequenzen (3), (5), (7) sowie die synthetische DNA-Sequenz (8; Figur la) mit T4-Tigase behandelt. Man erhält das Plasmid pK360 (9). Kompetente E. coli-Zellen werden mit dem Ligationsprodukt transformiert und auf NA-Platten, die 25 llg/ml Ampicillin enhalten, ausplattiert. Die Plasmid-DNA der Klone wird mittels Restriktions- und Sequenzanalyse charakterisiert. Eine Übernachtkultur aus E. coli-Zellen, die das Plasmid (9) enthalten, wird mit BB-Medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Karbon Laboratory, 1972), das 50 Fg/ml Ampicillin enthält, im Verhältnis von etwa 1:100 verdünnt und das Wachstum über OD-Messung verfolgt. Bei OD = 0,5 wird die Schüttelkultur auf 1 mM Isopropyl- > galactopyranosid (IPTG) eingestellt und die Bakterien nach 150 bis 180 Minuten abzentrifugiert. Die Bakterien werden 5 Minuten in einer Puffermischung (7M Harnstoff, 0,1% SDS, 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0) gekocht und Proben auf eine SDS-Gelelektrophoreseplatte aufgetragen. Nach Elektrophorese wird aus Bakterien, die das Plasmid (9) enthalten, eine Proteinbande erhalten, die der Grösse des erwarteten Fusionsproteins entspricht. Nach Aufschluss der Bakterien (French Press; (R)Dyno-Mühle) und Zentrifugation befindet sich das Fusionsprotein im Niederschlag, so dass mit dem Überstand bereits erhebliche Mengen der übrigen Proteine abgetrennt werden können. Nach Isolierung des Fusionsproteins wird durch Bromcyan-Spaltung das erwartete Hirudin-Peptid freigesetzt. Dieses wird nach Isolierung durch Protein-Sequenzanalyse charakterisiert. Die angegebenen Induktionsbedingungen gelten für Schüttelkulturen; bei grösseren Fermentationen sind entsprechend veränderte OD-Werte und gegebenenfalls leicht variierte IPTG-Konzentrationen zweckmässig. Beispiel 2 Das Plasmid (4) (Figur 1) wird mit Acc I geöffnet und die überstehenden Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Anschliessend wird mit Sac I geschnitten und das Fragment (10) isoliert, das den grössten Teil der Hirudin-Sequenz enthält. Der handelsübliche Vektor pUC 13 wird mit den Restriktionsenzymen Sac I und Sma I geöffnet und das grosse Fragment (11) isoliert. Mittels T4-Ligase werden nun die Fragmente (10) und (11) zum Plasmid pK 400 (12) (Fig. 2) ligiert. Das Plasmid (12) ist in der Figur 2 zweimal dargestellt, wobei in der unte ren Darstellung die Aminosäuresequenz des so erhältlichen Hirudin-Derivats hervorgehoben wird. Das Plasmid (4) (Figur 1) wird mit den Restriktionsenzymen Kpn I und Sal I geöffnet und das kleine Fragment (13) isoliert, das die Hirudin-Teilsequenz enthält. Das Plasmid (12) wird mit den Restriktionsenzymen Hinc II und Kpn I umgesetzt und das kleine Fragment (14)- isoliert, das die Hirudin-Teilsequenz enthält. Das Plasmid (9) (Figur 1a) wird mit EcoR I partiell gespalten, die freien Enden mit Klenow-Polymerase in einer fill-in-Reaktion aufgefüllt und mit Sal I geschnitten. Man erhält das Derivat des Plasmids pK36O (15). Durch Ligieren der Fragmente (3), (13), (14) und (15) erhält man das Plasmid pK410 (16), das in der Figur 2a zweifach dargestellt ist, wobei die untere Wiedergabe die Aminosäurefolge des Fusionsproteins und damit des nach Säurespaltung erhaltenen Hirudin-Derivats erkennen lässt. Nach Expression und Aufarbeitung gemäss Beispiel 1 erhält man ein neues Hirudin-Derivat, das in den Positionen 1 und 2 die Aminosäuren Prolin und Histidin aufweist. Dieses Hirudin-Derivat zeigt die gleiche Aktivität wie das Naturprodukt gemäss deutscher Offenlegungsschrift 34 29 430, das in diesen Positionen die Aminosäuren Threonin und Tyrosin aufweist, ist jedoch stabiler gegen den Angriff von Aminopeptidasen, woraus sich Vorteile bei der in-vivo-Anwendung ergeben können. Beispiel 3 Der handelsübliche Vektor pBR 322 wird mit Bam H I geöffnet, wobei man das linearisierte Plasmid (17) erhält. Die freien Enden werden partiell unter Einsatz von dATP, dGTP und dTTP aufgefüllt und das überstehende Nucleotid G mit S1-Nuclease abgebaut, wobei das pBR 322-Derivat (18) erhalten wird. Das Hae III-Pragment (19) aus Affen-Proinsulin (Wetekam et al., Gene 19 (1982) 181) wird mit dem modifizierten Plasmid (18) ligiert, wobei das Plasmid pPH 1 (20) erhalten wird. Da die Insulin-Teilsequenz in das Tetracyclin Gen eingesetzt wurde, sind die Klone, die dieses Plasmid enthalten, nicht gegen Tetracyclin resistent und können so identifiziert werden. Das Plasmid (20) wird mit Bam HI und Dde I geöffnet und das kleine Fragment (21) isoliert. Zusätzlich wird aus der Affen-Proinsulinsequenz die Dde I- Pvu II-Teilsequenz (22) isoliert. Der Vektor pBR 322 wird mit Bam HI und Pvu II geöffnet und das linearisierte Plasmid (23) isoliert. Durch Ligierung der Insulin-leilsequenzen (21) und (22) mit dem geöffneten Plasmid (23) erhält man das Plasmid pPH5 (24). Dieses wird mit Bam HI und Pvu II geöffnet und das kleine Fragment (25) isoliert. Zur Ergänzung der Insulinstruktur wird die DNA-Sequenz (26) synthetisiert. Der handelsübliche Vektor pUC 8 wird mit den Enzymen Bam HI und Sal I geöffnet und das Restplasmid (27) isoliert. Dieses wird mit den DNA-Sequenzen (25) und (26) zum Plasmid pPH 15 (28) ligiert. Dieses wird mit Sal I ge öffnet und die überstehenden Enden aufgefüllt. Aus dem resultierenden Plasmidderivat (29) wird mit Bam HI die DNA Sequenz (30) abgespalten. Der handelsübliche Vektor pUC 9 wird mit den Enzymen Bam HI und Sma I geöffnet und das grosse Fragment (31) isoliert. Dieses wird mit der DNA-Sequenz (30) ligiert, wobei das Plasmid pPH16 (32) erhalten wird. Das Plasmid (32) wird mit Sal I geöffnet und das linearisierte Plasmid (33) partiell mit dCTP, dGUP und dTTP aufgefüllt und das verbleibende Nucleotid T mit S1-Nuclease abgespalten. Das so erhaltene Plasmidderivat (34) wird mit Bam HI behandelt und aus dem Produkt (35) mit S1-Nuclease der überstehende Einzelstrang entfernt, wobei das Plasmidderivat (36) erhalten wird. Die stumpfen Enden des Plasmidderivats (35) werden zum Plasmid pPH 20 (37) cyclisiert. Kompetente E. coli Hb 101-Zellen werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf selektivem Medium ausplattiert. Klone, die das gewünschte Plasmid enthalten, exprimieren Proinsulin, wobei von 70 getesteten Klonen 28 radioimmunologisch nachweisbares Proinsulin enthielten. Die Plasmide werden ferner mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Sie enthalten DNA, die vor dem Codon für die erste Aminosäure der 13-Kette (Phe) für Arginin codiert. Das Plasmid (37) wird mit Hind III gespalten, die überstehenden Enden aufgefüllt und mit Dde I nachgespalten. Das kleine Fragment (38) wird isoliert. Das Plasmid (28) (Figur 3a) wird mit Sal I und Dde I gespalten und das kleine Fragment (39) abgetrennt. Das Plasmid (9) (Figur 1a) wird zunächst mit Acc I gespalten, die freien Enden aufgefüllt und mit Eco RI partiell nachgespalten. Das Fragment (40), das die verkürzte IL-2 Sequenz enthält, wird isoliert. Das linearisierte Plasmid () (Figur 1) und die DNA-Segmente (38), (39) und (40) werden nunmehr zu dem Plasmid pPH 30 (41) ligiert. Dieses Plasmid codiert für ein Fusionsprotein, das im Anschluss an die Aminosäuren 1 bis 114 des IL-2 die folgende Aminosäuresequenz aufweist: Asp-Phe-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg. Das Arginin als letzte Aminosäure dieses Brückengliedes Y ermöglicht die Abspaltung der Insulinketten mit Trypsin. Ausgehend vom Plasmid (9) (Figur la) kann man auch auf folgendem Weg zum Plasmid (41) kommen: Man öffnet (9) mit Acc I, füllt die überstehenden Enden auf, schneidet mit Sal I nach und ligiert das erhaltene Plasmidderivat (42) mit den Segmenten (3), (38) und (39). Beispiel 4 Das Plasmid (6) (Figur 1) wird mit den Restriktionsenzymen Taq I und Eco RI geöffnet und das kleine Fragment (43) isoliert. Dieses Fragment wird mit der synthetisierten DNA-Sequenz (44) und den Segmenten (3) und (5) zum Plasmid pPH 100 (45) ligiert. Dieses Plasmid codiert für ein Fusionsprotein, bei dem auf die ersten 132 Aminosäuren des IL-2 das Brückenglied Asp-Pro und hierauf die Aminosäurefolge von Hirudin folgt. Die proteolytische Spaltung liefert somit ein modifiziertes, biologisch aktives IL-2', in dem in Position 133 an Stelle von Thr Asp enthalten ist, und ein Hirudin-Derivat, das N-terminal Pro vor der Aminosäuresequenz des Naturprodukts enthält. Auch dieses Produkt ist biologisch aktiv und im Vergleich zu dem Naturprodukt stabiler gegen den Angriff von Proteasen. Das IL-2'-Hirudin-Fusionsprotein zeigt ebenfalls biologische Aktivität: Im Zellproliferationstest mit einer IL-2-abhängigen Zelllinie (CTLL2) wurde biologische Aktivität gefunden. Nach Denaturierung in 6 M Guanidiniumhydrochlorid-Lösung und anschliessende Renaturierung in Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) wurde weiterhin hohe IL-2 Aktivität gefunden. Ausserdem wurde die Gerinnungszeit von säurebehandeltem, mit Thrombin versetzem Blut nach Zugabe des Fusionsproteins verlängert. Man erhält somit ein bifunktionelles Fusionsprotein. Beispiel 5 Der handelsübliche Vektor pUC 12 wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sac I geöffnet. In dieses linearisierte Plasmid (46) wird eine IL-2-Teilsequenz eingesetzt, die aus dem Plasmid (6) (Figur 1) mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sac I herausgespalten wird. Diese Sequenz (47) umfasst die kompletten Tripletts für die ersten 94 Aminosäuren des IL-2. Durch Ligieren von (46) und (47) erhält man das Plasmid pK 300 (48). Das Plasmid (9) (Figur la) wird mit Eco RI geöffnet, die überstehenden Enden aufgefüllt und mit Hind III nachgespalten. Man isoliert das kleine Fragment (49), das im Anschluss an die für Hirudin codierende DNA-Sequenz einen Teil des Polylinkers aus pUC 12 enthält. Das Plasmid (48) wird mit den Restriktionsenzymen Sma I und Hind III geöffnet und das grosse Fragment (50) isoliert. Durch Ligierung von (50) mit (49) erhält man das Plasmid pK 301 (51). Mit dem Ligationsgemisch werden kompetente E. coli 294 Zellen transformiert. Klone, die das Plasmid (51) enthalten, werden durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Sie enthalten DNA, die im Anschluss an die Codons für die ersten 96 Aminosäuren des IL-2 Codons für ein Brückenglied von 6 Aminosäuren und darauf folgend die Codons für Hirudin enthalten. Das Plasmid (51) wird mit Eco RI und Hind III umgesetzt und das Fragment (52) isoliert, das die DNA-Sequenz für das genannte eukaryotische Fusionsprotein enthält. Das Plasmid (2) (Figur 1) wird mit Eco RI und Hind III ge öffnet. Das erhaltene linearisierte Plasmid (53) wird mit der DNA-Sequenz (52) ligiert, wobei das Plasmid pK 370 (54) erhalten wird. Wird das Plasmid (54) entsprechend Beispiel 1 in E. coli zur Expression gebracht, so erhält man ein Fusionsprotein, bei dem auf die ersten 96 Aminosäuren des IL-2 das Brückenglied Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr und im Anschluss daran die Aminosäurefolge des Hirudin folgt. Beispiel 6 Aus dem Plasmid (41) (Beispiel 3; Figur 3c) wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Hind III das DNA-Segment herausgespalten, das für Affenproinsulin codiert, und die überstehenden Enden aufgefüllt. Man erhält das DNA-Segment (55). Das Plasmid (48) (Beispiel 5, Figur 5) wird mit Sma I ge öffnet und mit Alkalischer Rinderphosphatase behandelt. Das so erhaltene linearisierte Plasmid (56) wird mit dem DNA-Segment (55) ligiert, wobei das Plasmid pK 302 (57) erhalten wird. E. coli 294-Zellen werden mit dem Ligationsgemisch transformiert, wobei Klone, die das gewünschte Plasmid enthalten, zunächst durch Restriktions- und dann durch Sequenzanalyse der Plasmid-DNA charakterisiert werden. Aus dem Plasmid (57) wird mit Eco RI und Hind III das Segment (58) herausgespalten, das für IL-2 und Affenproinsulin codiert. Das Plasmid (2) (Beispiel 1, Figur 1) wird ebenfalls mit Eco RI und Hind III gespalten und in das linearisierte Plasmid (3) das Segment (58) hineinligiert. Man erhält das Plasmid pKH 101 (59). Die Expression gemäss Beispiel 1 führt zu einem Fusionsprotein, bei dem auf die ersten 96 Aminosäuren des IL-2 ein Brückenglied mit 14 Aminosäuren folgt (entsprechend Y im DNA-Segment (58)), woran sich die Aminosäurefolge des Affenproinsulins anschliesst. Anhang I: DNA-Sequenz des Interleukin-2 Triplett Nr. 0 1 2 Aminosäure Met Ala Pro Nucleotid Nr. 1 10 Cod. Strang 5' AA TTC ATG GCG CCG nicht cod. Strang 3' G TAC CGC GGC 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 30 40 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 50 60 70 CAA CTG GAA CAC OTG CTG CTG GAC CTG CAG GTT GAC OTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTG 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100 ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130 AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160 AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT OTC 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 200 210 220 CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250 GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280 GGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310 GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG CAA GAC CTC GAG TTT CCA ¯ AGA CTT TGG TGC 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340 TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG AAG TAG ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 350 360 370 ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400 ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG TGG AAG ACC GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC 133 134 135 Thr 410 ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5'

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE A fusion protein which has a C- or N-terminal section which essentially corresponds to the first 100 amino acids of interleukin-2 but does not have interleukin-2 activity. A fusion protein as claimed in claim 1 with the formula in which X essentially denotes the amino acid sequence of approximately the first 100 amino acids of human interleukin-2 Y denotes a direct bond or a bridging element which is composed of genetically codable amino acids and which allows the amino acid sequence Z to be cleaved off preferably contains, adjacent to Z, Met, Cys, Trp, Arg or Lys, or is composed of these amino acids, in particular contains, adjacent to Z, the amino acid sequence Asp - Pro, or is composed of this sequence, and Z is a sequence of genetically codable amino acids, preferably of a proinsulin or of a hirudin. A process for the preparation of a fusion protein as claimed in claim 1 or 2, which comprises expression of a gene structure coding for this protein in a host cell, and removal of the fusion protein, preferably by centrifugation from the soluble proteins. The process as claimed in claim 3, wherein the host cell is a bacterium, preferably E. coli. The use of the fusion protein as claimed in claim 2, or of the fusion proteins obtained as claimed in claim 3 or 4, for the preparation of the protein which essentially corresponds to the amino acid sequence Z by chemical or enzymatic cleavage. A gene structure coding for a fusion protein as claimed in claim 1 or 2. A vector containing a gene structure as claimed in claim 6. Plasmids pEW 1000 (Fig. 1), pK360 (Fig. 2), pK410 (Fig. 2a), pPH30 (Fig. 3c), Pk370 (Fig. 5a) and pKH101 (Fig. 6a). A host cell containing a vector as claimed in claim 7. Claims for the following Contracting States : ES, AT A process for the preparation of a fusion protein, which comprises expression in a host cell of a gene which codes for a C- or N-terminal section which essentially corresponds to the first 100 amino acids of interleukin-2 (IL-2), but does not have interleukin-2 activity. The process as claimed in claim 1, wherein the gene codes for a fusion protein of the formula in which X essentially denotes the amino acid sequence of approximately the first 100 amino acids of human interleukin-2 Y denotes a direct bond or a bridging element which is composed of genetically codable amino acids and which allows the amino acid sequence Z to be cleaved off and Z is a sequence of genetically codable amino acids. The process as claimed in claim 2, wherein Y, adjacent to Z, contains Met, Cys, Trp, Arg or Lys, or is composed of these amino acids. The process as claimed in claim 2, wherein Y, adjacent to Z, contains the amino acid sequence Asp - Pro, or is composed of this sequence. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein Z denotes the amino acid sequence of a proinsulin or of a hirudin. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the fusion protein is removed from the soluble proteins by centrifugation. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the host cell is a bacterium. The process as claimed in claim 7, wherein the host cell is E. coli. The use of the fusion proteins obtained as claimed in claims 1 to 8 for the preparation of the protein which essentially corresponds to the amino acid sequence Z, by chemical or enzymatic cleavage.

Inventors: HABERMANN, PAUL, DR., WENGENMAYER, FRIEDRICH, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1986
Main classification: C12P21
IPC codes: C12P21, C12R1, C12N1, C12N15, C07K14