ANTIBODIES USEFUL AS PILOTING AGENTS, AND CONJUGATES CONTAINING THEM

Abstract: The invention relates to an antibody (Ab) or antibody fragment as an agent for piloting substances having pharmacological activity and/or which undergo intracellular accumulation in target cells, characterised in that: a) corresponding antigens (Ag) are in practice accessible only at the surface of the target cells, b) the Ab or Ab fragment can gain access to the target cells, c) the Ab or Ab fragment is endocytosed and has access to the lysosomes of the target cells, d) the Ab or Ab fragment does not induce the permanent disappearance of the corresponding Ag from the surface of the target cells.

Description: ANTICORPS UTILES COMME AGENTS DE PILOTAGE ET CONJUGUES LES INCORPORANT La présente invention concerne des anticorps utilisés comme agents de pilotage de substances à activité pharmacologique et/ou à accumulation intracellulaire, utilisés d des fins thérapeutiques ou diagnostiques, ainsi que des conjugués actifs comportant lesdits agents de pilotage. La technique du pilotage des substances à activité pharmacologique est connue. Elle consiste essentiellement à adjoindre à ladite substance à activité pharmacologique et/ou à accumulation intracellulaire un anticorps présentant une affinité particulière pour une partie de l'être vivant, par exemple des cellules spdcifiques, lesquelles doivent être plus particulièrement atteintes par la substance à activité pharmacologique et/ou à accumulation intracellulaire. En théorie, on peut donc espérer que l'agent de pilotage amènera la substance à activité pharmacologique et/ou à accumulation intracellulaire au voisinage ou à l'intérieur des cellulés à traiter ou à diagnostiquer et que, dans ces conditions, au voisinage desdites cellules la concentration en substance active sera très importante et donc permettra une meilleure activité thérapeutique ou diagnostique. En fait, il apparat que cette approche théorique ne conduit pas forcément à des résultats parfaitement satisfaisants. En particulier, bien que l'on ait songé à utiliser titre d'agents de pilotage des anticorps, les résultats qui ont pu être observés ne sont pas en rapport avec les résultats que llon pouvait espérer. C'est précisément l1un des objets de la présente invention que de définir les caractéristiques des anticorps ou des fragments d'anticorps pouvant être utilisés en tant qu'agents de pilotage et qui sont susceptibles de fournir des résultats prévisibles, à la différence des conjugués utilisant les techniques antérieures qui, pour l'essentiel, donnaient des résultats aléatoires suivant le type d'anticorps utilisé, ces résultats étant, en outre, très décevants par rapport à ce que l'on pouvait attendre de l'activité desdits conjugués. C'est pourquoi la présente invention concerne à titre d'agent de pilotage de substances à activité pharmacologique et/ou à accumulation intracellulaire dans des cellules cibles, un anticorps (Ac) ou un fragment d'anticorps, caractérisé en ce que : a) les antigènes (Ag) correspondants ne sont pratiquement accessibles qu'à la surface des cellules cibles, b) l'Ac ou le fragment d'Ac peut accéder aux cellules cibles, c) l'Ac ou le fragment d'Ac est endocyté et à accès au > : lysosomes des cellules cibles, d) l'Ac ou le fragment d'Ac n'induit pas la disparition définitive des Ag correspondants de la surface des cellules cibles. Dans ce qui suit, on utilisera souvent la dénomination "anticorps" pour désigner aussi bien la molécule entière d'immunoglobuline qu'un fragment d'anticorps tel que F(aS), F(ab), ou F(ab)'2, ces différents éléments étant utiles à titre d'agents de pilotage dans le cadre de la présente invention. Le premier critère retenu pour caractériser les agents de pilotage selon lâ présente invention est que les antigènes correspondants ne soient pratiquement présents ou accessibles qu'à la surface des cellules cibles. Dans la majorité des cas, on souhaitera, en effet, que cet anticorps soit le plus sélectif possible ; par exemple, dans le cas du traitement des cellules tumorales que cet anticorps ne reconnaisse que les antigènes présents à la surface des cellules tumorales ; mais dans certains cas, on peut très bien envisager que cette sélectivité soit moins contraignante dans la mesure où les cellules autres que les cellules cibles qui pourraient être reconnues par les anticorps ne sont pas ou peu affectées par la substance à activité pharmacologique ou à accumulation qui est liée à l'agent de pilotage. La sélectivité des anticorps en Cause peut s'envisager d plusieurs niveaux suivant, d'une part, la nature de l'antigène visé et, d'autre part, le type d'administration que l'on envisage. Tout d'abord, l'antigène correspondant peut être spécifique d'un organe ou d'un type de cellule précis et n'etre présent qu'à la surface des cellules dudit organe ou d'un type hystologique particulier. Dans ce cas, l'anticorps reconnaitra tant les cellules normales que tumorales de cet organe ou de ce type cellulaire. L'antigène peut être associe à une transformation cancéreuse et dans ce cas l'anticorps ne pourra reconnaître que les différents types de cellules transformées. L'antigène, peut également être spécifique d'un type de cellules tumorales et dans ce cas l'anticorps ne reconnaitra que les cellules de ce type de tumeur. Enfin, cet antigène peut être présent à la surface d'un type de cellules particulier d'un individu particulier, comme c'est le cas, par exemple, de l'idiotype des immunoglobulines de surface des lymphocytes B (normaux ou transformés). Lorsque la sélectivité dépend du type d'administration de l'Ac envisagé, on peut distinguer le cas de l'administration in vivo des conjugués à des patients ; il est primordial, dans ce cas, que l'Ac puisse reconnaStre toutes les cellules qui constituent la cible thérapeutique ou diagnostique, ce qui implique que l'Ag soit présent à la surface de toutes ou presque toutes les cellules tumorales ; ceci afin d'éviter, en particulier au niveau de la thérapeutique, de voir se sélectionner un type de cellule particulier qui ne serait pas touché par le conjugué. Comme cella a été dit, dans ce cas, l'Ac peut également être reconnu par d'autres cellules de l'organisme7 dans la mesure où elles ne seront pas affectées par l'interaction avec la substance pilotée. Dans d'autres cas, bien entendu, il sera indispensable d'avoir une sélectivité beaucoup plus fine, par exemple dans le cas ae traitements ex vivo, comme les purges de moëlle, où il est primordial que l'Ac ne provoque pas la destruction d'autres cellules que les cellules tumorales. La sélectivité possible des anticorps en cause, qu'ils soient monoclonaux ou polyclonaux, peut être évaluée par des techniques histoffjmmunochimiques qui permettent d8Xtablir le profil de l'anticorps monoclonal et en particulier déterminer les types de cellules normales ou tumorales qu'il reconnatt et pour chaque cellule la localisation de l'interaction qu'elle soit cytoplasmique, membranaire, ou autre. L'un des éléments importants au niveau de la sélectivité des Ac mis en oeuvre est que ceux-ci ne soient que peu ou pas présents dans le sérum du patient. Dans la mesure où ces Ag peuvent neutraliser les Ac injectés et provoquer leur capture aspécifique par d'autres cellules cecinécessitera, bien entendu, avant l'application des conjugués comportant les agents de pilotage selon la présente invention une étude sérologique préalable du patient à traiter. Le second critère mis en évidence dans le cadre de la présente invention est la possibilité pour les Ac d'accéder aux cellules cibles7 par exemple aux cellules tumorales. En effet, on a pu constater, dans certains cas, que les anticorps monoclonaux ne pouvaient accéder aux cellules possédant l'Ag correspondant ou bien ne pouvaient y accéder qu'en quantité très faible. Cette accessibilité peut se faire, soit Cirectement à partir du sang, soit parce que l'agent de pilotage peut franchir certaines barrières vasculaires. D'ailleurs, cette possibilité d'accéder aux cellules cibles peut dépendre également de la présence ou non dans le sérum du patient d'Ag circulants correspondants, comme cela a été dit précédemment, et qui sont susceptibles de limiter l'accès aux cellules cribles. D'ailleurs, l'accès des Ac à la tumeur, en particulier lorsqu'il s'agit d'anticorps monoclonaux, peut être facilité par l'utilisation de fragments plutôt que de l'immunoglobuline complète. Le troisième critère-de sélection des anticorps monoclonaux est qu'ils puissent être endocytés et aient accès aux lysosomes des cellules cibles. En effet, il est possible de concevoir des liens stables dans le milieu extracellulaire mais hydrolysables par les enzymes lysosomiaux qui permettent de libérer à l'intérieur de la cellule la substance à activité pharmacologique ou à accumulation que l'on désire libérer. Idéalement, il faudrait que l'anticorps soit détaché de son antigène dans les lysosomes sous l'action, soit du pH acide, soit des enzymes, et qu'il soit ensuite digéré. Mais, alternativement, il peut suffire que l'Ac transite par les lysosomes pendant un temps suffisant pour permettre llhydrolyse du lient unissant l'Ac à la substance pilotée. Enfin, il est important que ces agents de pilotage qui sont des anticorps n'induisent pas la disparition définitive des antigènes de la membrane cellulaire, ce qui implique d'auprès endocytose -du complexe Ag-Ac il y ait réapparition de l'Ag à la surface des cellules, soit par suite d'une néosynthèse ae nouvelles molécules d'Ag, soit par suite du recyclage des Ag endocytés, soit par suite du passage vers la membrane plasmique,d'Agqui sont stockés dans un réservoir intracellulaire. En effet, il est connu que dans un certain nombre deccas llinteracticn d'un Ac, et en particulier lorsque celui-ci est plurivalent, avec son Ag induise la disparition de la surface cellulaire, très probablement par endocytose ; ceci, bien entendu, va limiter le nombre de molécules de conjugués qui pourront reconnaitre la cellule cible et être endocytés et,par là même, limiter la concentration intracellulaire pour obtenir l'effet thérapeutique ou diagnostique désiré, ce qui pourra être particulièrement gênant dans le cas de molécules à activité cytotoxique dont on sait qu'elles dcivent, pour être actives, être présentes en concentration suffisante dans la cellule et pendant une période suffisamment longue Bien entendu, l'utilisation d'Ac ou de fragments d'Ac à titre d'agents de pilotage pourrait, lorsqu'ils sont utilisés in vivo, induire une réaction immunitaire humorale; ainsi il pourrait apparaître des Ac anti-isotype suite à l'administration d'Ac de souris à l'homme, c'est pourquoi on préférera, dans la mesure du possible, utiliser des Ac humains qui devraient permettre de lever cet obstacle ; cependant, même dans ce cas, on ne peut exclure, a priori, l'apparition d'Ac anti-allotype et surtout anti-idiotype. Ce type de réaction immunologique possible devra, bien entendu, être pris en compte dans la réalisation d'un Ac à titre d'agent de pilotage. Dans le cadre de la présente invention, on utilisera plus particulièrement d titre d'Ac comme agent de pilotage un anticorps monoclonal d'origine murine ou humaine ; de façon encore plus précise, on utilisera Unr Ac monoclonal dressé contre la membrane de globules graisseux de liait humain ou contre des antigènes de la membrane plasmique de cellules de carcinomes humains. Ces Ac sont plus particulièrement utilisables pour le pilotage de substances à. activité anticancéreuse tels des dérivésd'anthracycline ou d'alcaioides de vinca. Dans les exemples qui suivent on décrira plus particulièrement un anticorps dénommé CT-M-01 qui présente l'ensemble des propriétés énumérées précédemment et qui a été testé à titre d'agent de pilotage pour des produits anticancéreux. La présente invention concerne également des conjugués actifs caractérisés en ce qu'ils comportent un agent de pilotage tel que défini précédemment lié par un lien covalent à une substance à activité pharmacologique ou à accumulation intracellulaire dans des cellules cibles. Ce lien covalent ne sera pratiquement hydrolysé que dans les lysosomes, cette hydrolyse étant le résultat d'une hydrolyse enzymatique acide. De tels liens covalents sont dejà connus de la technique antérieure et il faut citer, par exemple, les bras hémisuccinyl déjà utilisés pour coupler la vindésine en position C4 et le bras tétrapeptidique déjà utilisé pour coupler la daunorubicine, la doxorubicine et la primaquine. Mais, d'autres liens peuvent être envisagés sans sortir du cadre de la présente invention. Lorsque 1 'Ac monoclonal est plus particulièrement destiné à piloter un médicament anticancéreux, ce médicament anticancéreux sera de préférence, mais de manière non exclusive, choisi dans la famille des dérivés d'anthracycline ou d'alcalo9des de vinca, par exemple parmi la vinblastine, la vinddsinev la daunorubicine ou la doxorubicine. Pour la réalisation de ces conjugués, il convient de vdrifier que,par hydrolyse dans Les lysosomes, le médicament ou le produit de diagnostic sera libéré sous une forme active, c'est à-dire que le lien de covalence n'est pas susceptible de masquer l'activité du produit, et il faudra vérifier, d'autre part, que le lien de covalence ne modifie pas les sites de reconnaissance spécifiques de l'Ac utilisé. I1 convient de vérifier également que les dimensions ou les propriétés des molécules actives liées aux Ac sont telles qu'elles leur permettent de franchir les différentes barrières leur permettant d'accéder au lysosomes. Les études effectuées qui seront rapportées ci-après dans les exemples ont mis, en outre, en évidence l'importance de la concentration intracellulaire en médicament suffisante pour obtenir l'effet cytotoxique. En effet, pour obtenir une concentration suffisante, il est possible de jouer sur deux paramètres, soit la drogue est très active, c'est-à-dire requiert des concentrations intracellulaires relativement faibles, et à ce moment il devient possible d'utiliser un Ac reconnaissant l'Ag présent à la surface cellulaire en cuantité relativement réduite, soit il est nécessaire de réaliser une concentration intracellulaire élevée en médicament, comme par exemple dans le cas de la daunorubicine, et dans ce cas il faut utiliser un Ac reconnaissant un Ag présent en plus grande quantité sur la membrane plasmique des cellules et/ou recyclant continuellement et permettant ainsi de faire endocyter plus de molécules d'Ac par Ag exposé. Cet aspect du problème doit, dans une certaine mesure, faire reconsidérer le problème de la sélectivité de l'Ac. En effet, si l'Ag reconnu par l'Ac monoclonal est très spécifique de la cellule tumorale, il sera fort probablement présent en très petit nombre et dans ces conditions ne permettra pas d'obtenir des concentrations intracellulaires élevées en médicament. On conçoit à la lecture de la description précédente que les agents de pilotage selon l'invention peuvent être utilisés à titre d'agents de diagnostic dans le domaine de l'imagerie médicale et de la radiothérapie en couplant un radio-isotope par exemple de manière covalente à l1Ac, ledit lien étant lui-même hydrolysable dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment, bien que le problème de l'hydrolyse du lien unissant le radio-isotope et l'Ac soit moins important que dans le cas d'un composé à activité pharmacologique. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention sans pour autant la limiter en aucune façon. EXEMPLE 1 Préparation de l'anticorps monoclonal CT-M-O1 Le protocole expérimental utilisé pour la préparation des Ac monoclonaux dressés contre la membrane de globules graisseux de lait humain est comparable à celui qui a été décrit par Taylor-Papadimitriouet al. (1981). La fusion d'une lignée cellulaire de myélome murin ne sécrétant pas d'immunoglobuline,et dénommée SP 207, avec les lymphocytes spléniques de souris immunisées avec des membranes de globules graisseux de lait humain (la fusion étant effectuée 3 et 5 mois après la dernière injection subcutanée) conduit à la production d'un grand nombre de cultures d'hybridomes sécrétant des immunoglobulines. La sélection des hybridomes a été effectuée en testant, tout d'abord, leur réaction d'anticorps en utilisant les antigènes correspondants immobilisés, puis la sous-classe d'Ac a été déterminée, on a éliminé les hybridomes sécrétant des IgM, puis on a étudié la réactivité avec la membrane de cellules MCF-7 en culture (cellules d'un carcinome humain de la glande mammaire) et on a, enfin, sélectionné les cultures d'hybridomes qui maintenaient une sécrétion d'IgG réactives à la fois avec la membrane de globules graisseux de lait humain et de cellules MCF-7, même après congélation à - 80"C. Ces cultures d'hybridomes ont été administrées en injection intrapéritonéale à des souris et les Ac ont été purifiés à partir des ascites qui se sont développées. On a, ainsi, retenu 6 anticorps monoclonaux de sous-classes différentes pour une étude plus complète qui ont été dénommés : CT-M-O1 (sous-classe IgG2 B), CT-M-02 (IgG2b), CT-M-03 (IgGl ), CT-M-04 (IgG3), CT-M-05 (IgG7), et CT-M-06 (IgG3). EXEMPLE 2 Etude des propriétés des anticorps monoclonaux Les différents anticorps monoclonaux préparés à l'exemple 1 ont, tout d'abord, été étudiés quant à la distribution des épitopes sur les tissus humains normaux (tableau I ci-annexé) et néoplasiques (tableau IB ci-annexé) fixés à la formaldéhyde et enrobés à la paraffine par des techniques d'immunohistologie indirecte à l'aide d'un second anticorps anti-IgG de souris, marqué à la peroxydase. D'autres essais complémentaires effectués ont montré que dans tous les cas l'Ac CT-M-01 était le seul des Ac étudiés à reconnaître les Ag de façon uniforme à la surface de toutes les cellules néoplasiques origine mammaire, tumeurs primaires et embolies tumorales des vaisseaux veineux et lymphatiques, de même que dans les métastases lymphatiques axillaires dans tous les cas testés. Les 5 autres Ac marquent de façon aléatoire et hétérogène les cellules néoplasiques avec des profils particuliers pour chacun d'eux. TABLEAU 1. A. REACTION CROISEE S'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA MEMBRANE DES GLOBULES GRAISSEUX DU LAIT HUMAIN AVEC DES TISSUS HUMAINS NORMAUX CT-M-01 02 03 04 05 06 ESTOMAC: EP(THELIUM DE SURFACE a a a a a a GLANDES GASTRIQUES a d Neg. Neg. d d INTESTIN GRELE: EPITHELIUM DE SURFACE Neg. a a d c d CRYPTES DE LIEBERKUHN a d a d d d GLANDES DE BRUNNER a d d d d d PANCREAS EXOCRINE : ACINI Neg. Neg. c c d a CANAUX b a a b b a FOIE : CANALICULES BILIAIRES b b a b b b COLON: EPITHELIUM DE SURFACE ET CRYPTES Neg. d a Neg. Neg. d APPENDICE : EPITHELIUM DE SURFACE ET CRYPTES Neg. b c b b a GLANDES SALIVAIRES : ACINI Neg. d b b c b CANAUX d a b b b b REIN : TUBES COLLECTEURS a Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. TRACHEE : EPITHELIUM RESPIRATOIRE Neg. d Neg. d d d GLANDES DE LA MUQUEUSE b b b b b b TROMPE DE FALLOPE : EPITHELIUM DE SURFACE a d b c b d ENDOMETRE : SURFACE ET GLANDES a Neg. c Neg. Neg. d COL UTERIN : EXOCOL Neg. a a a a a ENDOCOL a a a a a a PEAU : GLANDES SUDORIPARES a d d c Neg. b GLANDES SEBACEES a Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. TABLEAU 1. A. (SUITE) GLANDE MAMMAIRE AU REPOS : CANALICULES TERMINAUX Neg. CANALICULES INTERLOBULAIRES a b b d b b CANALICULES GALACTOPHORES a Neg. b c Neg. d MOELLE OSSEUSE : aÚ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. GLANDES THYROIDES : CELLULES FOLLICULAIRES d Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. COLLOIDES d Neg. Neg. d Neg. d CANAL DEFERENT : EPITHELIUM a Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. GLANDE PROSTATIQUE d Neg. d d d d CERVEAU, CERVELET, TISSU CONJONCTIF, ENDOTHELIUM, OVAIRE, EPIDERME, VESICULE BILLIAIRE, HEPATOCYTES, MUSCLES ILOTS DE LANGHERANS, TISSU LYMPHATIQUE, GLOMERULES RENAUX, Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. MYOEPITHELIUM, GLANDES SURRENALES, RETINE, MOELLE EPINIERE 1 : MONOCYTES MARQUAGE : a : uniforme b : légèrement hétérogène (la plupart des cellules sont marquées) c : moyen d : fortement hétérogène (la plupart des cellules ne sont pas marquées) Neg.: négatif (pas de marquage) TABLEAU 1.B. REACTION IMMUNOCHISOCHIMIQUE DES ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA MEMBRANE DES GLOBULES GRAISSEUX DU LAIT HUMAIN AVEC DIFFERENTS TISSUS NEOPLASIQUES HUMAINS CT-H-O1 02 03 04 05 O6 CARCINOME CANALAIRE DU SEIN a d c d b b CARCINOME LOBULAIRE DU SEIN e d c d c c CARCINOME RENAL a Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. CARCINOME DE LA VESSIE c d b d c d HEPATOCARCINOME Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. CARCINOME EPIDERMOIDE DU COL UTERIN b d c d c d CARCINOME EPIDERMOIDE DE L'OESOPHAGE Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. CARCINOME EPIDERMOIDE DE LA PEAU Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. CARCINOME BASAL DE LA PEAU Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. ADENOCARCINOME DE L'ESTOMAC c b a d a d ADENOCARCINOME DU COLON c d a b b b ADENOCARCINOME DE L'ENDOMETRE a d c c c b CYSTADENOCARCINOME ENDOMETROIDE DE L'OVAIRE a d b c c b MELANOME DE LA PEAU Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. LYMPHOME B Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. LIPOSARCOME Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Même échelle de marquage que pour le tableau 1.A. EXEMPLE 3 Interaction des anticorps monoclonaux avec les cellules MCF-7 L'étude de la fixation des Ac monoclonaux par les cellules MCF-7 est effectué en utilisant un marquage à l'hydrogène tritié des anticorps monoclonaux. Pour ce faire, une culture confluente de cellules MCF-7 (21106 cellules dans des flocons de25 cm2) est incubée à 40C pendant 3 heures en présence de différentes concentrations d'anticorps monoclonaux marqués. A la fin de l'incubatior. la quantité de marqueur radioactif associé aux cellules est déterminée. La constante d'affinité et le nombre de sites antigéniques par cellule caractérisant les différents Ac monoclonaux est calculée par analyse de Scatchard des paramètres de fixation. Le nombre des sites antigéniques par cellule est estimé en attribuant 1 mg de protéines cellulaires à 3.106 cellules MCF-7 et en tenant compte d'une stoechiométrie 1:1 pour la liaison entre les AC et leurs épi topes. Les résultats figurent au tableau II ci-annexé. Les études suivantes ont porté plus particulièrement sur l'étude de l'anticorps CT-M-01. L'étude de la distribution de l'Ac marqué dans des cultures de cellules MCF-7 confluentes a permis de mettre en dvidence que cet Ac était endocyté, qu'il se détachait à pH acide et qu'il rejoignait les lysosomes où il est digéré (tableau III ci-annexé). Ces résultats ont d'ailleurs été confirmés par l'effet d'un certain nombre de substances connues pour interférer avec l'endocytose et la fonction digestive des lysosomes. TABLEAU Il ANALYSE SELON LA METHODE DE SCATCHARD DES PARAMETRES DE FIXATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA MEMBRANE DES GLOBULES GRAISSEUX DU LAIT HUMAIN A DES CELLULES D'UN CARCINOHE MAMMAIRE ROUMAIN (LIGNEE MCF-7) Anticorps monoclonal Kd (M) nombre de sites antigéniques par cellule CT-M-01 1.39.10-8 1.2.106 CT-M-02 6.26.10-7 17-0-106 CT-M-03 2-95-10-8 1.6.106 CT-M-04 3.02.10-8 4.6.106 CT-M-05 1.50.10 7 7.8.106 5.20.10-8 4.4.106 CT-M-06 3.16.10-9 8.1.104 6.20.10-7 5.6.106 Des cellules confluentes de la lignée MCF-7 (2.106 cellules par flacon de 25 cmê) ont été incubées à 4 C pendant 3 heures en présence de différentes concentrations des anticorps monclonaux marqués au 3H.A la fin de l'incubation, la quantité de matériel radioactif associé aux cellules a été déterminée. Les constantes d'affinité et le nombre de sites antigéniques par cellule ont été déterminés pour chaque anticorps selon la méthode de Scatchard (1949). Le nombre de sites antigéniques a été estimé en attribuant 1 mg de protéine cellulaire à 3.106 cellules MCF-7 et en considérant une stéchiométrie 1:1 pour la fixation des anticorps à leurs épitopes. TABLEAU III PARAMETRES CINETIQUES DE LA CAPTURE DE SIX ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LA MEMBRANE DES GLOBULES GRAISSEUX DU LAIT HUMAIN PAR DES CELLULES DE TUMEURS DE LA GLANDE MAMMAIRE (LIGNEE MCF-7) anticorps K capture nombre de molécules d'IgG/cell/14 h. monoclonal accumulation digestion capture CT-M-01 4.9.10-7 7.0.106 2.4.106 9.4.106 CT-N-02 16.7.10-7 3.0.106 2.5.106 5.5.106 CT-M-03 8.6.10-7 1.7.106 - 1.7.106 CT-M-04 3.4.10-7 4.5.106 3.4.106 7.9.106 CT-H-05 5.6.10 7 4.4.106 3.7.106 8.1.106 CT-M-06 - 5.0.106 1.0.106 6.0.106 Des cellules MCF-7 confluentes (2.106 par flacon de 25 cmê) ont été incubées a 37 C pendant 24 heures en présence de différentes concentrations de chacun des anticorps monoclonaux marqués. A la fin de l'incubation, on e déterminé le nombre de molécules radioactives associées aux cellules (accumulation) digérées (retrouvées dans le milieu de culture sous forte de fragments marqués solubles dans l'acide trichloroacétique à 15 Z) ou captées (somme de l'accumulation et de la digestion). Le K capture correspond à la demi saturation de la courbe de capture Le nombre de molécules d'anticorps interréagissant avec chaque cellule MCF-7 a été calculé au atributant 1 mg de protéine cellulaire à 3.106 cellules MCF-7. EXEMPLE 4 C'est cet Ac monoclonal CT-M-01 qui est utilise pour servir d'agent de pilotage dans les conjugués avec des substances à activité cytotoxique. Parmi les dérivés à activité cytotoxique, on a choisi des dérivés de type anthracyclique, c'est-d-dize la daunorubicine (DNR) et la doxorubicine (DOX) et des dérivés de vinca, en particulier la vinblastine (VBL) et la vindésine (VDS). Tous ces produits sont déjà connus pour présenter une activité antitumorale. Les conjugués selon la présente invention sont préparés en utilisant la méthode dite à l'hémisuccinate, dans le cas de la vindésine, par les procédés décrits dans le brevet européen n" O 124 502 et l'article de K.S.P. Bhushana Rao et al., 1985, et par l'intermédiaire d'un bras tétrapeptidique L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-succinyl, dans le cas de la daunorubicine, comme cela est décrit dans les brevets américain nO 4 376 765, européen nO O 037 388 et dans les articles de A. Trouet et al., 1982, et B. Lesur et al., 1984. Dans un premier temps, on a vérifié que le conjugué selon l'invention conservait en grande partie son affinité d'anticorps pour les antigènes présents à la surface des cellules MCF-7. Ensuite, on a vérifié que les conjugués selon l'invention libéraient bien le principe actif après incubation en présence d'enzymes lysosomaux. Ainsi, pour le conjugué DNR/CT-M-01, 32,5 % de la DNR est libéré sous forme intacte au bout de 6 heures d'incubation, ce taux de libération de la DNR atteint 60 % au bout de 24 heures d'incubation. Pour le conjugué VDS/CT-M-01, 33 8 du principe actif est libéré au bout de 6 heures d'incubation, aucune hydrolyse supplémentaire d'intervient par la suite. EXEMPLE 5 Activité des conjugués selon l'invention Une culture non confluente de cellules E dérivées deXlalignée MCF-7 ou de cellules d'hépatoblastomes humains HEPG2 est incubée pendant 6 jours à 370C en présence de différentes concentrations de DNR/CT-M-01 ou de VDS/CT-M-01 (rapport molaire 1:2 et 1:4,5 respectivement), ainsi qu'avec l'Ac CT-M-O1 seul à des concentrations analogues et également avec les drogues libres. A la fin des 6 jours d'incubation, les cellules sont lavées et testées pour leur contenu en protéines. Les résultats sont présentés dans le tableau IV sous forme du pourcentage de protéines associées aux cellules pour les cellules traitées par rapport aux cellules non traitées en fonction de la concentration de drogues conjuguées ou libres dans le milieu extracellulaire. L'Ac. non conjugué CT-M-01 est incapable de produire un effet cytotoxique dans les cellules MCF-7. Le conjugué VDS/CT-M-01 présente un eff et cytotoxique marqué sur le carcinome mammaire, alors qu'aucune activité cytotoxique n'est observée pour les cellules de l'hépatocarcinome (lignée cellulaire HEPG2) dans les mêmes conditions expérimentales. La moitié des cellules de la lignée E sont tuées par une concentration extracellulaire de 75 ng/ml de VDS conjugué à CT-M-O1. La concentration d'Ac à cette dose correspond à environ 1,102 Ag/ml dans le milieu extracellulaire. TABLEAU IV EFFET CYTOTOXIQUE DE LA DAUNORUBICINE (DNR) ET DE LA VINDESINE (VDS) LIBRES OU CONJUGUEES A DES ANTICORPS MONOCLONAUX SUR DES CELLULES EN CULTURE DROGUE DUREE DE LD50 (ng/ml) (1) L'EXPOSITION cellules H.pG2 cellules MCF-7 cellule. MCF-7 (lignée parentale) (sousclone E) DNR 24 h. - (2) 20 6 j. 44 ¯ 68 DNR CT-M-01 6 j. > 360 - > 360 IgG VDS 1 h. - - 100 3 h. - - 62 6 h. - - 38 1 j. - 12.7 19 6 j. 3.4 - 1.1 VDS- 3 h. - - > 1000 CT-M-01 3 h. - - 800 IgG 1 j. - - 98 3 j. - - 45 6 j. > 872 - 52 VDS- 1 j. - - > 1000 IgG(3) 3 j. - - > 1000 6 j. 1000 (1) : concentration extracellulaire de drogue libre ou conjuguée requise pour diminuer la quantité de protéines cellulaires après 6 jours de culture à 50 Z de celle atteinte par des cellules cultivées en absence de drogue. (2)-: valeur non déterminée. (3) : IgG à spécificité non déterminée. L'absence de résultats déterminants observée avec le conjugué DNR dans un modèle in vitro peut trouver son origine dans le fait que la DNR ne peut pas atteindre son site d'activité intracellulaire en quantité suffisante pour que l'on observe une activité cytotoxique. Pour ce qui concerne le conjugué VDS/CT-M-01, on a démontrd qu'il était capable de tuer sélectivement les cellules de carcinome mammaire sans affeter les cellules qui ne portent pas les antigènes correspondants à l'anticorps. Des essais complémentaires ont permis de mettre en évidence que cette activité ne pouvait pas être attribuée au produit cytotoxique libre. DOCUMENTS CITES DANS LA DESCRIPTION - Brevet américain n 4 376 765 (15 mars 1983) "Medicaments, their preparation and compositions containing same"; Trouet A.B.L., Masquelier M.M.L.G., Baurain R.M. - Brevet européen n O 037 388 B1 (12 décembre 1984) "Formes pharmaceutiques, leur préparation et les compositions qui les contiennent" ; Trouet A.B.L., Masquelier M.M.L.G., Baurain R.M. q. - Brevet européen n 0 124 502 A2 (7 novembre 1984) "Noveaux conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués ; Trouet A.B.L., RAO K.S.B., Hannart J.A.A. - Trouet A., Masquelier M., Baurain R., DEPREZ-DE CAMPENEERE D., A covalent linkage between daunorubicin and proteins that is stable in serum and reversible by lysosomal hydrolase, as required for a lysosomotropic drug-carrier conjugate in vitro and in vivo studies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 626-629 (1982). - Lesur B., Masquelier M., Baurain R., Schneider Y.J. et Trouet A. Covalent linkage of anthracyclines to macromolecular carriers. Protides Biol. Fluids 32, 437-440 (1984). - Taylor-Papadimitriou J., Peterson JA., Burchell J. Ceriani R.L. Int. J. Cancer 28 (17), (1981). - Scatchard G. Ann. N-Y Acad. Sci. 51, 660 (1949). - Bhushana Rao K.S.P., Collard M-P, Trouet A. Vinca-alkaloid-protein conjugates : preparation, biological properties and antitumoral activities. 14th International Congress of Chemotherapy, Kyoto, June 23-28, 1985 (abstract S 67, n 8).

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT LI, LU, NL, SE By way of a targeting agent for substances which show pharmacological activity or substances useful for diagnostic in human carcinoma target cells, an antibody (Ab) or an antibody fragment, defined as follows : a) it is a monoclonal antibody raised against the membrane of fat globules of human milk and against the plasma membrane of human carcinoma target cells, b) the corresponding antigens (Ag's) are, in practice, accessible only at the surface of the target cells, c) the Ab or Ab fragment can gain access to the target cells, d) the Ab or Ab fragment is endocytosed and has access to the lysosomes of the target cells, e) the Ab or Ab fragment does not induce the permanent disappearance of the corresponding Ag's of the surface of the target cells. The targeting agent as claimed in claim 1, which consists of a whole immunoglobulin in molecule or of a Fa, Fab' or F(ab')₂ antibody fragment. The targeting agent as claimed in one of claims 1 and 2, in which the serum of the patient to be treated contains few or no corresponding Ag's. The targeting agent as claimed in one of claims 1 to 3, which is a monoclonal Ab or murine or human origin. The targeting agent as claimed in one of claim 1 to 4, which is the antibody CT-M-01. An active conjugate, which contains a targeting agent as claimed in one of claims 1 to 5, linked through a covalent bond to a substance which shows pharmacological activity or intracellular accumulation in tumor cells. The active conjugate as claimed in claim 6, in which the covalent bond is, only hydrolyzed in the lysosomes. The active conjugate as claimed in claim 7, in which the hydrolysis is an acid enzymatic hydrolysis. The active conjugate as claimed in one of claims 6 to 8, in which the component is an anticancer drug. The active conjugate as claimed in claim 9, in which the anticancer drug is chosen from the family of anthracycline derivatives or Vinca alkaloid derivatives. The active conjugate as claimed in claim 10, in which the component is chosen from vindesine, daunorubicin and doxorubicin. The active conjugate as claimed in one of claims 6 to 11, in which the covalent bond is a hemisuccinyl or tetrapeptide branch. The active conjugate as claimed in one of claims 6 to 12, in which the active component is chosen from vindesine, daunorubicin and doxorubicin and the targeting agent is the antibody CT-M-01. Claims for the following Contracting State : AT Process for the preparation of a targeting agent for substances which show pharmacological activity or substances useful for diagnostic in human carcinoma target cells, characterized in that an antibody (Ab) or an antibody fragment is used defined as follows : a) it is a monoclonal antibody raised against the membrane of fat globules of human milk and against the plasma membrane of human carcinoma target cells, b) the corresponding antigens (Ag's) are, in practice, accessible only at the surface of the target cells, c) the Ab or Ab fragment can gain access to the target cells, d) the Ab or Ar fragment is endocytosed and has access to the lysosomes of the target cells, e) the Ab or Ab fragment does not induce the permanent disappearance of the corresponding Ag's of the surface of the target cells. The process as claimed in claim 1, which consists of a whole immunoglobulin molecule or of a Fab, Fab' or F(ab')₂ antibody fragment. The process as claimed in one of claims 1 and 2, in which the serum of the patient to be treated contains few or no corresponding Ag's. The process as claimed in one of claims 1 to 3, which is a monoclonal Ab of murine or human origin. The process as claimed in one of claims 1 to 4, which is the antibody CT-M-01. Process for the preparation of an active conjugate, characterized in that a targeting agent as claimed in one of claims 1 to 5, is linked through a covalent bond to a substance which shows pharmacological activity or intracellular accumulation in tumor cells. The process as claimed in claim 6, in which the covalent bond is, only hydrolyzed in the lysosomes. The process as claimed in claim 7, in which the hydrolysis is an acid enzymatic hydrolysis. The process as claimed in one of claims 6 to 8, in which the component is an anticancer drug. The process as claimed in claim 9, in which the anticancer drug is chosen from the family of anthracycline derivatives or Vinca alkaloid derivatives. The process as claimed in claim 10, in which the component is chosen from vindesine, daunorubicin and doxorubicin. The process as claimed in one of claims 6 to 11, in which the covalent bond is a hemisuccinyl or tetrapeptide branch. The process as claimed in one of claims 6 to 12, in which the active component is chosen from vindesine, daunorubicin and doxorubicin and the targeting agent is the antibody CT-M-01.

Inventors: ABOUD-PIRAK, ESTHER, SCHNEIDER, YVES-JACQUES EMILE, TROUET, ANDRE BENOIT LEON, Trouet, André Benoít Léon
Applicants: IRE-CELLTARG S.A.
Application year: 1986
Main classification: A61K47
IPC codes: C07K16, A61K51, A61K39, C07K14, C07K1, A61K47, C12P21