PROCESS AND APPARATUS FOR THE ENZYMATIC HYDROLYSIS OF FATTY SUBSTANCES

Abstract: 1. Process of enzymatic hydrolysis of a fatty substance for the purpose of liberation of the fatty acids which it contains, by contact of a solution of this substance in an organic solvent with water in the presence of a mycelium carrying lipase, characterised in that the water is homogenized with the organic solvent by means of a third solvent or a surface-active agent.

Description: PROCEDE ET APPAREIL-POUR L'HYDROLYSE ENZYMATIQUE DE CORPS GRAS, L'invention se rapporte à un procédé et un appareil pour l'hydrolyse enzymatique de corps gras ; elle s'applique plus particulièrement à la production diacides gras à partir de leurs esters et plus spécialement des triglycérides. La production industrielle des acides gras s 'opère généralement par l'hydrolyse thermique de graisses ou huiles, en présence de la vapeur d'eau à une température assez élevée. C'est un procédé qui permet une fabrication rapide de fortes quantités d'acides désirés, mais il consomme beaucoup d'énergie et requiert des investissements coûteux ; de plus, l'application- d'une température élevée favorise la dégradation des matibres traitées, sensible surtout en ce qui con cerne ives acides-insaturés. Or, comme on le sait, il est possible.de produire l'hydrolyse des esters gras, notamment des triglycérïdes, par l'action de certaines enzymes c'est ainsi que l'action des lipases extracellulaires, secrétées par des microorganismes, est connue depuis longtemps. Dans certaines conditions de cultures, des microorganismes et en particulier certains champignons filamenteux ont la propriété d'exprimer une activité liasique intracellulaire qui reste liée aux parois du mycélium. Le système enzyme/paroi se comporte alors comme une enzyme purifiée, immobilisée sur un support solide ; le mycélium à activité enzymatique présente en fait les mêmes stabilité et commodité d'emploi que les systèmes d'enzymes immobilisées sur support, mais il est plus économique, puisqu'il est produit par voie naturelle. On a donc essayé d'appliquer un tel système à la production des acides gras. Cependant, pour obtenir des résultats viables, il a fallu employer un solvant pour dissoudre la matière grasse de départ. De telles tentatives sont décrites par BELL C, TODD J.R., BLAIN J.A., PATTERSON J D E, SRAW C.E.L. Bioteh. Bioeng (1981) 23(7) 1703-19. Ces auteurs ont utilisé le mycélium du champignon Rhizopus arrhizus en tant que source de lipase, et ont employé l'huile en solution dans l'éther-diisopropylique. Toutefois, ces travaux n'ont conduit qu'à des rendements assez faibles, en moyenne de 20 à 50% en acides gras recherchés ; d'autre part, dans ces conditions opératoires, la perte de l'activité de l'enzyme est assez sensible, d'environ 0,6 à 1% par heure. Il apparat nettement que la proportion d'eau à introduire dans le milieu réactionnel joue un grand rôle, et les auteurs ont trouvé que l'optimum de cette concentration se situait aux environs de 0,17% en poids par rapport au volume du mélange réactionnel, et que de part et d'autre de cette valeur la conversion de la matière grasse baisse fortement. Il résulte de cet art antérieur que la quantité d'eau tolérée doit même être inférieure à la proportion stoechioinétrique correspondant aux esters traités. En dé finitivef bien que le principe décrit paraisse intéressant, sa réalisation industrielle ne pourrait pas être envisagée à cause des inconvénients susmentionnés. La présente invention apporte un perfectionnement sensible au principe de l'hydrolyse des matières grasses en présence d'un mycélium porteur de lipase, au sein d'un solvant organique, par des modifications inattendues qui permettent l'obtention de résultats vraiment industriels. En effet, perfectionné suivant l'invention, le procédé précité est susceptible de fournir des acides gras avec des rendements dépassant 80% et même 90% sur la matière grasse mise en oeuvre, alors que la désactivation de l'enzyme est extré- mement lente, ne dépassant généralement pas 0,01% par heure. ssien entendu, le procédé de l'invention comme tous ceux qui utilisent les enzymes, bénéficie des conditions opératoires très douces, puisqu'on opère en général d des températures ne dépassant pas 500C et, le plus -souvent, entre 15 et 350C. Cela évite toute dégradation des acides gras formés et fournit par conséquent un produit plus pur que la technique industrielle classique. Le procédé suivant l'invention, qui consiste à hydrolyser une matière grasse dissoute dans un solvant organique, additionné d'une faible quantité d'eau, en présence du mycélium porteur de lipase, est caractérisé en ce que le milieu réactionnel, comprenant l'eau, est rendu homogène par l'adjonction d'un agent susceptible d'y dissoudre ou microémulsionner l'eau nécessaire à l'hydrolyse. Dans une première forme d'exécution, l'agent d'homogénéisation est constitué par un solvant tiers, capable de former une phase unique entre le solvant contenant la matière grasse et l'eau. De tels solvants tiers peuvent être choisis-par exemple parmi des cétones, des amides, des solvants azotés cycliques, etc. Ainsi, peut-on employer des liquides tels que : acétone, méthyl-éthylcétone, di-éthylcétone, acétophénone, glycérol-formal, diméthyl-acétamide, N-méthyl-pyrrolidone, etc. Ce solvant tiers doit être naturellement présent en une proportion adéquate pour produire la dissolution de l'eau dans la solution du corps gras employé dans le solvant organique ; cette proportion dépend de la nature des autres matières en présence, mais elle est généralement de l'ordre de 5 à 30% du total. En tant qu'exemples non limitatifs de cette forme d'exécution, voici les proportions particulières des constituants du mélange réactionnel Corps gras 10 à 30% en poids Acétone 15 à 20% " Eau 1 à 3% " Solvant organique du corps gras 58 à 74% en poids Un tel mélange est parfaitement limpide à la température d'opération de 300C, et ne donne lieu à aucune démixtion au cours de la réaction. Dans la variante de l'invention, qui consiste à microémulsionner l'eau dans la solution de la matière grasse, un solvant tiers peut ne pas etre nécessaire, lorsque le solvant organique de la matière grasse, lui-même, peut servir de cotensioactif à l'émulsifiant que l'on ajoute au milieu, dans cette variante. Ici il est important d'incorporer, au mélange réactionnel, un agent tensioactif convenable. La préparation de microémulsions de l'eau dans des solvants hydrophobes étant connue dans l'art, il n'y a pas lieu d'en donner ici des détails. On notera cependant que des agents tensioactifs tels que sulfates d'alcools gras, sulfosucci nates, esters oxyéthylénés de sorbitol, alcools, acides ou huiles oxyéthylénés, esters de saccharose, polyglycols, phosphates d'alkyle lourds, etc., conviennent particulièrement bien à la réalisation de l'invention. Comme on le sait, dans une microémulsion de l'eau au sein d'un solvant hydrophobe, l'eau se trouve généralement à l'intérieur des micelles inverses, constituées par un com- posé tensioactif accompagné d'un co-tensioactif. Ce dernier peut être le solvant tiers indiqué plus haut, ou bien le solvant organique lui-même, du corps gras. Cette forme d'exécution de l'invention présente, entre autre, l'avantage de permettre d'élever jusqu'à environ 30% la teneur en corps gras du solvant organique utilisé, sans que le tout cesse de présenter l'aspect d'une véritable solution. A titre d'exemple non limitatif, la composition d'un milieu, soumise à l'action enzymatique d'un mycélium, peut se composer en poids de Corps gras 10 à 45% Tensioactif- (plus éventuelle ment co-tensioactif) I à 5% Bau 1 à 3% Solvant organique 47 à 88% Une autre particularité tout à fait nouvelle, de l'invention, réside en ce que l'eau, nécessaire à l'hydrolyse de la matière grasse, est introduite à différents moments de l'avancement de la réaction. On compense ainsi la quantité d'eau consommée par la réaction qui peut être schématisée de la façon suivante dans le cas des triglycérides corres 1 2 pondant à des acides gras des groupes R , R2 et R3 EMI5.1 <tb> OCO <SEP> R1 <SEP> OH <SEP> RCOOH <tb> O <SEP> CO <SEP> R2 <SEP> + <SEP> 3H20 <SEP> OH <SEP> + <SEP> R <SEP> COOH <tb> OCO <SEP> R3 <SEP> OH <SEP> R3COOH <tb> Cette eau peut être introduite en continu ou en discontinu, selon la technique adoptée pour ltexécution du procédé. La caractéristique de l'invention, qui consiste à dissoudre ou microémulsionner l'eau dans le milieu réactionnel, rend possible l'utilisation d'un certain excès en H20 par rapport à la proportion stoechiométrique ; cela s'accompagne d'un accroissement très sensible du rendement en acides gras obtenus. Alors que dans la technique antérieure, citée plus haut, la quantité d'eau permise n'atteint pas celle qui serait nécessaire au point de vue stoechiométrique, le procédé suivant l'invention utilise des quantités de H20 nettement supérieure à la théorie ; cette quantité est généralement comprise entre 1 à 2 fois la quantité théorique, et, de préférence, 1,1 à ,6. Dans le procédé de l'art antérieur cité plus haut, le choix des solvants organiques pour la matière grasse de départ est fortement limité,parce que la plupart des solvants, compatibles avec les enzymes utilisées, ne permettent pas la mise en solution de la quantité d'eau nécessaire à la réaction.Par contre, le perfectionnement suivant l'invention élargit grandement le domaine des solvants utilisables, puisque l'eau y est dissoute à 1'aide d'un solvant tiers ou de la microémulsion. C'est ainsi qu'à titre d'exemple, les solvants de la liste qui suit peuvent être utilisés dans le procédé de l'invention. SOLVANT ACTINITE RELATIVE (%) Pi-éthyl-éther (DEE) 125 Di-isopropyl-éther (DIPE) 100 Méthyl-t-butyl-éther (MTBE) 94,6 Di-isobutyl-éther (DIBE) 89,2 Di-n-butyl-éther 78,4 Di-méthoxy-propane (DMP) 75,0 Phényl éthyl éther (Phénétole) 35,1 Phényl éthyl éther (Anisole) 27,0 1,2-diéthoxy-éthane 32,4 1,2-diméthoxy-éthane 24,3 Diméthyl éther du diéthylène glycol (diglyme) 24,0 Dioxane 18,9 . Diméthylformamide (DMF) O Diméthyl sulfoxyde-(DM.mO) O Les activités relatives pour ces différents solvants ont été déterminées par l'hydrolyse de l'huile d'olive dans les conditions suivantes : huile d'olive % en poids 10 eau 0,5 acétone 5 solvant 84,5- 0,1 g de mycélium par gramme d'huiles réaction discontinue à 300C pendant. 60 minutes. Le diéthyl-éther ne peut pas être employé pratiquement à cause de sa forte volatilité. Parmi les autres solvants, les demandeurs ont sélectionné le-méthyl-t-butyl-ether (MTBE) comme solvant particulièrement intéressant, parce qu'il est beaucoup moins toxique que le di-isopropyl-éther de l'art antérieur et qu'il présente, par rapport à tous les autres solvants viables, la tendance la plus faible à former des dérivés peroxydés dangereux. L'application de ce solvant fait donc partie de la nouveauté de l'invention. Etant donné que la culture des microorganismes, la récolte et traitement ultérieur de mycélium obtenu, pour servir d'enzyme immobilisée, sont connus, il n'y a pas lieu de les décrire ici. On doit cependant noter que l'invention s'applique à des mycélia provenant de différents microorganismes, dont on cice ci-après quelques-uns, seulement à titre d'exemples non limitatifs. Les Rhizopus stolonifer, arrhizus; delemar et japonicus t Geotrichum candidum ; Mucor javanicus, hiemalis et miehei Aspergillus oryzae et niger. L'invention comprend également un appareillage pour la réalisation du procédé décrit plus haut. L'installation comprend au moins une capacité de stockage du mélange réactionnel, au moins une colonne garnie de matières de remplissage appropriées supportant l'enzyme et des moyens de transport du mélange réactionnel du stockage à la colonne. La nouveauté de l'appareil suivant l'invention réside en ce que celui-ci est également muni de moyens d'introduction de l'eau à différents stades d'avancement du mélange réactionnel. A titre d'exemple, on décrit, ci-après, une installation qui a donné les bons résultats décrits dans les exemples qui suivent. Le dessin unique, annexé, représente schématiquement une installation suivant l'invention, comportant trois colonnes à réaction enzymatique Bien entendu, le nombre de colonnes ou réacteurs peut varier selon les besoins. La cuve 1 constitue la capacité nécessaire au mélange et au stockage des matières de départ. Elle est munie d'un agitateur 2 et de quatre admissions de liquides : repère 3 pour le solvant du corps gras, 4 pour ce dernier lui-même, 5 pour le solvant tiers, ou/et pour un agent tensioactif, et 6 pour l'eau. Be mélange, homogénéisé dans 1, est repris par la pompe PI pour être envoyé au bas de la colonne de réaction 7. Celle-ci contient le mycélium enzymatique. De préférence, celui-ci est mélangé avec des grains d'un support minéral, en particulier silice, alumine, silicoalumina te, verre etc. Le dessin représente le cas où le mélange réactionnel chemine de bas en haut, dans la colonne 7, mais il est bien entendu que l'invention peut être également réalisée'avec la disposition connue de circulation de haut en bas. Elle peut d'ailleurs être mise en oeuvre avec un lit fluidisé. La colonne 7 est entourée d'une chemise 8 pour la circulation d'un fluide thermostatique. Be liquide qui sort de la colonne 7 par la canalisation 9, en vue de son passage dans une seconde colonne 12, est d'abord reçu dans un mélangeur intermédiaire 11, où il est agité avec une portion d'eau d'ajustement, introduite par 10. La proportion d'eau, ainsi rajoutée; est telle qu'il y ait toujours, dans le milieu réactionnel, suffasamment d'eau, notamment 1 à 2 fois la quantité stoechiométrique correspondant à la matière grasse présente en une zone de réaction donnée. Ainsi, le mélange il intermédiaire, entre les colonnes 7 et 12, qui n'existe pas dans les installations classiques d'hydrolyse enzymatique, constitue-t-il un élément nouveau, caractéristique de l'appareillage suivant l'invention. Du mélangeur 11, par la pompe P2, le mélange à teneur en eau ajustée est transféré dans la colonne 12 entourée d'un chemisage thermostatique 13. L'hydrolysat passe ensuite, par une canalisation 14, dans un second mélangeur intermédiaire 16, alimenté en eau d'appoint par 15, et fonctionnant comme le précédent (11). De 16 le mélange est envoyé, au moyen de la pompe P3, dans une 3ème colonne (17), et ainsi de suite s'il le faut. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs, suivants. EXEMPLE î L'hydrolyse du suif est effectuée au moyen des lipases d'un mycelium de Rhïzopus arrhizus (ATCC 24563), dans un appareil de laboratoire constitué comme décrit plus haut avec référence au dessin. On fait passer un mélange initial, homogène, ayant la composition suivante suif ............. 20 (corps gras) méthyl t.butyl éther (MTBE) .......... 58 (solvant organique) eau ............. 2 (environ 1,6 fois stoechiométrique) acétone ............. 20 (solvant tiers) successiveeentpar les trois colonnes, à 300C. Chaque colonne contient 5,5 g de mycélium en poudre mélangée avec 10 ml de silice en grains de 0,05 mn de moyenne, en tout un volume de 35 ml. Le volume mort par colonne est d'environ 15 ml pour un débit de l'ordre de 12 ml/h, ce qui correspond à un temps de séjour du mélange liquide de 75 minutes environ dans chaque colonne. Le taux de conversion du suif, après la première colonne (repère 7 sur le dessin), atteint 60%. On ajuste alors la teneur en eau du mélange traité, par l'addition de 0,8E d'eau dans le premier mélangeur intermédiaire (11 sur le dessin). A la sortie de la 2ème colonne (12) la conversion du suif est de 83% et l'on ajoute 0,7% d'eau dans le mélangeur intermédiaire (16) qui la suit. A la suite de la troisième colonne (17) la conversion du suif ressort à 91%. Après l'évaporation des solvants on recueille 71,8g d'hydrolysat ayant la composition suivante en acides gras (en poids) myristique (C14) 2 r 6 2,6 palmitique (C16) 30,4 palmitoléique (C16:1) 3,3 stéarique (C18) 21,3 EMI10.1 <tb> oléique <SEP> (C.18=1 <tb> linoléique <SEP> (C18:2) <SEP> 42,0 <tb> déterminée par chromatographie en phase gazeuse des dérivés triméthyl-silylés d'échantillons d'hydrolysats. EXEMPLE 2 Comparatif avec la technique antérieure. On opère comme dans l'exemple 1, dans le même appareil, mais sans adjonction d'acétone, donc sans tiers solvant et sans ajustement de l'eau dans les mélangeurs intermédiaires. La composition des 100 g- de mélange initial est ici suif .... 20 g méthyl t. butyl éther q 79 g eau .................... 1 g (limite de solubilité) La conversion du suif après la 3ème colonne est alors seulement de 27%. Cela prouve le remarquable avantage du mode opératoire de l'exemple 1. EXEMPLE 3 Dans une hydrolyse, menée avec le tiers solvant (acétone) comme dans l'exemple 1, mais sans addition d'eau dans les mélangeurs intermédiaires (11 et 16), la conversion après la 3ème colonne (17) est de 65% donc moindre que dans l'e- xemple 1, tout en restant encore bien supérieure à celle de la technique antérieure, illustrée par l'exemple 2. La teneur en eau au départ étant de 10% par rapport au suif, soit environ 1,6 fois la quantité théorique, nécessaire, elle n'a pas pu baisser au dessous de la valeur stoechiométrique au cours de la réaction. L'amélioration de la conversion du fait de l'ajustement de la proportion d'eau entre colonnes successives est donc un résultat tout-à-fait imprévu, slajoutant à celui qu'apporte l'emploi d'un solvant tiers. EXEMPLE 4 L'appareil et les opérations sont identiques à ceux de l'exemple 1, mais appliqués à de l'huile de colza en tant que substrat. Le mélange de départ se composait de : . (pour 190 g) 20 g d'huile de colza 63,5g MTBE 1,5g d'eau 15 g d'acétone. Le poids d'eau, introduit au départ, représente ainsi 7,58 de celle de l'huile, soit environ 1,25 fois la proportion théoriquement nécessaire. On a alors Conversion 8 g H2O ajoutée après la 1ère colonne 55 1,1 n w 2ème colonne 63 0,7 n n 3ème colonne 70 La masse d'hydrolysat, recueilli après l'élimination des solvants, est de 95,5 g et sa composition en acides gras est la suivante : palmitique ............... 7,8 stéarique .2,8 oléique ) linoléique ) 85,3 linoSénique) C20 et C22 ................. 4,1 EXEMPLE 5 Hydrolyse du suif en microémulsion. Dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, on effectue llhydrolyse du suif en solution dans du méthyl tert-butyl éther (MTBE), l'eau étant microémulsionnée dans cette solution par l'addition d'un agent tensioactif. Le mélange de départ est constitué par : 30,6 g de suif 66 g de solvant MTssE 2 ,lg d'eau. (soit 6,8% par rapport au suif) 1,3g de dioctyl-sulfq-succinate de Na (tensioactif ) Ce mélange est bien homogène tout au long de son passage dans les colonnes de réaction. Après la 1ère colonne, la conversion est de 60,8%, et l'on ajoute 1,8 g d'eau, ce qui fait porter la proportion d'eau par rapport au suif restant à environ 10z. A la sortie de la seconde colonne la conversion s'est élevée à 83,5%. On recueille 120 g d'hydrolysat dont les acides gras se répartissent comme suit myristique ............ 3,3 palmitique 27,5 palmitoléique 4,1 stéarique 20,0 oléique linoléique ) 45,2 On voit qu'en microémulsion les résultats sont pratiquement les mêmes qu'avec le tiers solvant de l'exemple 1, mais avec l'avantage supplémentaire de permettre l'utilisation d'une plus forte charge de corps gras au départ, notamment 30,6 au lieu de 20. EXEMPLE 6 Hydrolyse sélective des acides gras insaturés. Le catalyseur utilisé est un mycelium de Geotrichum Candidum préparé de façon identique à celui de Rhizopus. Le substrat utilisé est le même que celui de l'exemple 1 il est envoyé sur une seule colonne contenant 5,5 g de mycelium mélangé à 10 ml de silice. Un temps de séjour de l'ordre de- 75 mn, semblable aux exemples précédents, permet d'obtenir un taux de conversion de 18%. Si l'on recueille cet hydrolysat, la composition suivante en acide gras libre est observée acide myristique , 2,3 palmitique 11,9% N palmitoléique ....... 2,3% n oléique et linoléique 76,1% w stéarique 7,4% La teneur totale en acide gras insaturé est donc de 78,4% contre 45,3% dans l'exemple 1 où l'on utilisait une lipase de Rhizopus. Il y a donc hydrolyse sélective des acides gras insaturés.

Claims: Revendications 1. Procédé d'hydrolyse enzymatique d'une matière grasse en vue de la lijération des acides gras qu'elle contient, par contact d'une solution de cette matière, dans un solvant organique, avec de l'eau, en présence d'un mycelium porteur de lipase, caractérisé en ce que cette eau est homogénéisée avec le solvant organique à l'aide d'un tiers solvant ou d'un agent tensioactif. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le tiers solvant est une cétone, ou un amide. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le tiers solvant est l'acétone. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la proportion de tiers solvant est d'environ 5 à 30% du mélange soumis à l'hydrolyse. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'eau est microémulsionnée avec la solution du corps gras dans le solvant organique, par l'adjonction d'environ 1 à 5% d'un agent tensioactif. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le tensioactif est accompagné d'un co-tensioactif, lorsque le solvant organique du corps gras ne joue pas luimême le rôle de ce dernier. 7. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange à traiter contient 10 à 30% de corps gras. 8. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le mélange à traiter contient 10 à 45% de corps gras. 9. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la teneur en eau du élange à traiter est supérieure à la proportion stoechiométrique par rapport aux corps gras, et elle est en particulier 1 à 2 fois la quantité théorique. 10. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant organique pour la matière grasse est le méthyl-tert.butyle éther. 11.Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une addition d'eau est effectuée à différents stades de la réaction, en continu ou en discontinu. 12. Appareillagepour la réalisation du procédé suivant une des revendications 1 à 11, comprenant un premier mélangeur (I) et une série de colonnes successives (7,12,16) renfermant du mycelium porteur de lipase, ainsi que des moyens (P7, P2, P3) pour faire circuler le mélange liquide à traiter dans les colonnes, caractérisé en ce qu'entre chaque colonne et la colonne suivante est branché un mélangeur intermédiaire(II,16) équipé pour l'addition de l'eau au mélange circulant.

Inventors: GANCET, CHRISTIAN, GUIGNARD, CLAUDE
Applicants: CECA S.A., SOCIETE NATIONALE ELF AQUITAINE SOCIETE ANONYME DITE
Application year: 1986
Main classification: C12P7
IPC codes: C12P7, C11C1, C12M1