DEVICE FOR THE DETERMINATION OF COMPOUNDS HAVING AN INFLUENCE ON THE CELLULAR OXIDATION PATHWAY AND METHODS FOR THE DETERMINATION OF THESE COMPOUNDS

Abstract: 1. Device for the specific assay of substrates, inhibitors, or activators of the cellular oxidation chain, characterized in that it contains an oxygen sensor, associated with means for measuring the oxygen detected, and the transporting species of the cellular respiratory chain in the form of immobilized bacteria, of immobilized microorganisms or of their immobilized membrane preparations, these cells having been cultured beforehand on a medium whose composition has produced a modification of the cellular synthesis of the flavoprotein corresponding to the compound to be assayed.

Description: La présente invention concerne un dispositif pour le dosage spécifique des substrats, inhibiteurs et activateurs de la chaîne d'oxydation cellulaire, mettant en jeu les réactions enzymatiques de la chaîne respiratoire et les procédés de dosage de ces composés. On a déjà utilisé des capteurs électrochimiques associés à un film dans lequel était immobilisé une enzyme, pour doser des composés présents dans les milieux biologiques à des concentrations comprises entre 0,01 M à 10-5M. George G. GUILBAULT a fait une revue des utilisations des enzymes immobilisées à des fins analytiques, qui a été publiée dans Applied Biochem. Biotechn. 7, 85-98 (1982). La plupart des électrodes à enzyme décrites jusqu'ici mettent en jeu une seule enzyme isolée de son milieu naturel et ayant subi différentes purifications. D'autres électrodes mettent en jeu des systèmes enzymatiques plus complexes, comme la L-lactate oxydase de Smeqmatis perfrinqens, enzyme nécessitant un coenzyme flavinique, ou la L-lactate deshydrogénase, avec son cofacteur NAD+, ou encore les systèmes présents dans des bactéries entières. On a maintenant trouvé que l'on pouvait utiliser pour le dosage sélectif de certains composés, un dispositif dans lequel est associé à un. capteur d'oxygène non plus une enzyme préalablement purifiée, mais un système multi-enzymatique, à savoir celui intervenant dans les processus d'oxydation cellulaire formant la chaine respiratoire1 sans isoler préalablement ledit système de la cellule où il fonctionne et sans addition de coenzymes ou cofacteurs. Toutefois, dans ces conditions tous les effecteurs de la chaine respiratoire, c'est-à-dire ses substrats, inhibiteurs, activateurs et produits sont dosés simultanément et ceci serait particulièrement gênant dans les cas où les milieux à étudier comprennent des mélanges de plusieurs de ces effecteurs, si une autre caractéristi que de l'invention ne permettait d'éliminer cette difficul té et d'effectuer des dosages sélectifs. Elle consiste, pour éliminer les flavoprotéines parasites à utiliser les chaînes respiratoires de cellules qui ont été préalablement cultivées dans des milieux dont la composition a entraîné une modification au niveau de la flavoprotéine correspondant au composé à doser. Certains milieux induisent la synthèse d'une flavoprotéine de la chaîne respiratoire; autres milieux comportant du glucose réprimeront la synthèse de certaines flavoprotéines. On a constaté que les flavoprotéines correspondant au L-lactate, succinate, glycérol, fumarate ou Lmalate sont inductibles respectivement en présence de lactate, succinate, glycérol ou malate pour les deux derniers. Ces memes flavoprotéines sont réprimées cataboliquement par le glucose, alors que les flavoprotéines correspondant au D-lactate, pyruvate, NADH ou NADH ne sont pas touchées. Parmi les effecteurs pouvant être dosés par le dispositif de la présente invention, on citera les acides D-lactique et L-lactique, pyruvique, succinique, fuma- rique, oxaloacétique, L-malique et leurs sels, le NADH et le NADPH ou encore les acides glutamique, aspartique, citrique, isocitrique, ascorbique, 3-glycéro-phosphorique, oxalique et leurs sels, acides dont le métabolisme conduit a des substrats de la chaîne respiratoire, ou encore les oxydoréductases dépendantes des cofacteurs à NAD+ ou NADP+. Le présent dispositif comporte un capteur d'oxygène, associe à des moyens de mesure de l'oxygène capté, et l'ensemble des transporteurs de la chaîne respiratoire cellulaire qui se présente sous forme de bactéries imnobiiisées, microorganismes immobilisés ou d'une de leurs préparations membranaires immobilisée, ces cellules ayant été préalablement cultivées sur un milieu dont la composition a été choisie de telle sorte qu'il y ait une modification de la synthèse cellulaire de l'enzyme correspondant au composé à doser, c'est-à-dire de la flavoproté- ine intervenant dans une réaction dudit composé. Comme bactérie, on peut utiliser toutes les bactéries aérobies, comme Entérobactériaceae,' Miccococcus et Paracoccus denitrificans, Azotobacter venelandi, Bacillus ou des bactéries thermophiles comme PS3; on préfère les entériobactériacées et particulièrement Escherichia coli; comme microorganismes, on peut citer les levures. Le milieu de culture des bactéries pourra etre quelconque dans le cas de la répression par le glucose du moment qu'au moins 1 g/l de glucose sont présents. Par contre, pour assurer l'induction de la synthèse d'une flavoprotéine, on utilisera un milieu de culture dit "minimum" complémenté par l'agent modificateur convenable. Par milieu minimum, on entend un milieu aéré liquide comportant les minéraux nécessaires au développement cellulaire. Dans le cas d'Escherichia coli, on utilise plus particulièrement le milieu référence (63) concentré deux -fois, auquel on ajoute 1 mg/l de thiamine. La concentration de l'agent modificateur dans ce milieu n'est pas critique; toutefois, comme le rendement de la culture en déprend, on préfère en introduire de 4 g/l à 10 g/l. A titre de modificateur, pour le dosage des acides L-lactique et pyruvique ou de leurs sels, on uti sera un lactate et notamment un racémique; pour le dosage de l'acide 3-glycérophosphorique ou pyruvique, on utilisera le glycérol; pour le dosage des acides succinique et fumarique ou de leurs sels, on utilisera un succinate; pour le dosage des acides L-malique et oxaloacétique ou de leurs sels, un malate et notamment un racémique. Pour le dosage de L'acide pyruvique, de l'acide D-lactique ou de. leurs sels ou du NADH ou du NADPEl, on utilisera, comme modificateur dans un milieu de culture quelconque le glucose qui réprime la synthèse des flavo- protéines inductibles citées ci-déssus. Pour doser les composés qui n'interviennent pas directement au niveau de la chaine respiratoire, mais y aboutissent par voie métabolique, les cultures bactériennes se feront en présence de l'agent modificateur correspondant au composé par lequel ils entrent dans la chai- ne respiratoire. Par exemple, pour le dosage de l'acide oxalique, les bactéries auront été cultivées sur milieu minimum en présence de succinate. Les cellules ou les fragments cellulaires sont immobilisés par des moyens classiques pour former un ensemble insoluble'en milieu aqueux. On utilise de préférence la gélatine; les cellules et fragments cellulaires sont incorporés dans la gélatine et le film obtenu est tanné par action d'un agent bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde. Dans le cas des bactéries entières ou non, une préparation de cellules immobilisées contiendra de 10 à 40 mg de protéines bactériennes, sous la forme de bacté ries r isolées du milieu de culture convenable pour 30 à 70 mg de gélatine. Un film utilisable dans un dispositif se lon l'invention, sera préparé par étalement d'l ml d'une suspension dans l'eau de bactéries, correspondant à 10 à 40 mg de protéines, contenant 30 à 70 mg de gélatine, vers 400C, sur une surface de 40 cm2 environ,puisparséchagedans l'air, suivi de l'introduction du film ainsi obtenu pour quelques minutes, dans une solution aqueuse de glutaraldéhyde de concentration comprise entre 1 et 4X (p/v) maintenue vers O'C, suivie par un lavage abondant avec une solution tamponnée. Pour notamment augmenter la tenue du film de bactéries immobilisées, on préfère étaler la suspension aqueuse de bactéries et de,gélatine sur un film souple de polymère hydrophobe, mais perméable aux gaz, tel que le polypropylène et les deux films solidaires seront utilisés dans le dispositif de l'invention. Pour le dosage sélectif de l'acide pyruvique ou de ses sels, du NADH et du NADPH, on perméabilise les membranes des bactéries avant leur immobilisation. Cette perméabilisation peut résulter d'un traitement chimique, par le toluène, d'un traitement par les ultra-sons ou consistant en congélations et décongélations successives ou en une compression obtenue au moyen de la presse de French, suivie d'une décompression brutale. Par ailleurs, pour permettre un dosage sélectif de l'acide succinique ou de ses sels en présence des autres substrats de la chaîne respiratoire et particulièrement en présence de quantités de lactate qui interfèrent, le dispositif selon l'invention peut être préparé avec des bactéries qui ont été soumises à une élévation de température avant- leur immobilisation. Dans le cas d'Escherichia coli, ce traitement résulte d'une exposition à une température comprise entre 530C et 570C environ pendant 1 à 2 heures. On applique le même traitement pour préparer un dispositif utile au dosage sélectif de l'acide pyruvique ou de ses sels, en présence de NADH ou NADpH. A la lecture de ce qui précède, on comprend que le choix d'une certaine combinaison des différents moyens cités de réalisation des dispositifs selon l'invention permet de préparer des capteurs convenant à des dosages particulièrement sélectifs, dans des milieux contenant des mélanges d'effecteurs. Comme capteur à oxygène, on peut utiliser notamment une électrode à oxygène, du type dit "de Clark", une sonde céramique en zircone ou des transistars à effet de champ (FET). On préfère comme dispositif selon l'invention une électrode à oxygène, sur laquelle a été déposé un film de bactéries immobilisées dans la gélatine, de 0,05 mm à 0,5 mm d'épaisseur. On a montré que dans ces conditions l'oxygène mesuré n'est pas celui consommé dans l'ensemble de l'échantillon mais celui qui à été préalablement stocké dans le support; ainsi le résultat de la mesure est indépendant du degré d'oxygénation du milieu à étudier. Dans une forme de réalisation préférée, on dispose entre l'électrode à oxygène et le film enzymatique, un film hydrophobe qui ne laissera passer que l'oxygène et par exemple un film de polypropylène. Le dispositif préféré de l'invention, constitué d'une électrode à oxygène et d'un film enzymatique, y adhérant éventuellement par l'intermédiaire d'un autre film, est très sensible et convient particulièrement bien aux dosages directs dans des milieux biologiques, sans traitement préalable. On a constaté que lorsque le film au lieu d'etre appliqué sur l'électrode est simplement mis en suspension dans le compartiment électrode contenant l'échantillon à doser, le signal mesurable, pour une même concentration de produit à doser et de matériel biologique immobilisé, est de 100 à 600 fois plus faible. Un tel dispositif est en outre fidèle, puisque les résultats des mesures sont identiques si l'on effectue plusieurs centaines de dosages même à des temps rapprochés (plus de 50 dosages par heure). Enfin, il est stable puisqu'il peut être conservé vers 40C en milieu aqueux tamponné en présence d'un antibactérien pendant plus d'un an, sans altération de ses propriétés. Dans Biotechnol. Bioeng. XXV p.2557-2566 (1983), on décrit un dispositif pour le dosage de la Llysine comportant une électrode à enzyme et des moyens de mesure de la quantité d'oxygène consommée; meme si, dans ce cas, l'électrode comporte une seule enzyme la lysiine- oxydase qui a été isolée puis immobilisée, l'électrode à oxygène et les moyens de mesure qui y sont associés conviennent à la préparation d'un dispositif selon l'invention et on pourra se référer à ce document, cité dans l'invention à titre de référence, pour la description d'une forme de réalisation d'un dispositif selon l'invention, sachant qu'en substituant au film monoenzymatique de l'art antérieur un film'contenant le système des transporteurs de la chaine respiratoire cellulaire, tel que décrit ici, on obtiendra un exemple d'électrode à enzyme de l'invention. La Fig. 1 représente une électrode A et sa cellule de mesure B dans laquelle l'échantillon est introduit en C; a désigne le corps de l'électrode et b son enveloppe, c l'électrolyte et d le film à enzyme qui est appliqué sous le bout de l'électrode. L'électrode a environ 1 cm de diamètre tandis que la partie terminale sensible a 7 mm de diamètre. La cellule de mesure C contient 1 ml d'échantillon. D'autres moyens de mesure de la quantité d'oxygène peuvent etre les moyens classiques, habituellement utilisés avec les capteurs compris dans le dispositif. Un autre objet de l'invention est constitué des procédés de dosage des effecteurs de la chaîne respiratoire dans des milieux divers, qui mettent en oeuvre les dispositifs précédemment décrits. L'application de ces procédés de dosage ne nécessite pas de traitement préalable de ces milieux, tels que dialyse ou filtration, pour éliminer d'éventuels produits genants, ce qui est un autre avantage de l'invention. Parmi les milieux dans lesquels ces dosages peuvent être effectués, on peut citer les liquides biologiques, tels que urine, sang ou plasma, liquide céphalo-rachidien, mais aussi des produits de l'industrie agro-alimentaire, comme les yaourts, les desserts lactés, le vin, les jus de fruits et la bière. Les dispositifs seront en général réalisés de telle sorte qu'ils permettent le dosage des composés lorsqu'ils sont présents dans le milieu à étudier à une concentration comprise entre 0,1 mM et 100 mM. Les procédés de'dosage selon l'invention reposent sur la détermination de la quantité d'oxygène consommee par le système de transporteurs à oxydo-réduction de la chaîne respiratoire, lors de la transformation de l'effecteur à doser. La mesure de l'oxygène consommé est effectuée à l'aide-d'un dispositif selon 1' invention, couplé aux moyens électroniques habituels de quantification. Pour le dosage sélectif des acides, D ou Llactique ou de ses sels en presence des autres substrats de la chaîne respiratoire, et tout particulièrement en présence de succinate qui pourrait interférer, selon l'invention on n'effectue La mesure qu'après avoir ajouté du fumarate -ou du malonate dans le milieu de dosage, ce qui inhibe la respiration du succinate; pour une concentration d'acide lactique dans le milieu à doser comprise entre 1 =n et 10 mM, on introduit de 100 mM à 300 mM de fumarate ou de malonate dans le milieu. Pour le dosage sélectif de l'acide succinique ou ae ses sels en présence des autres substrats de la chaine respiratoire et tout particulièrement en présence de lactate qui interfère, selon l'invention on ajoute du pyruvate dans le milieu de dosage1 avant la mesure; pour une concentration d'acide succinique dans le milieu à doser comprise entre 2 mM et 10 Xt, on introduit de 100 mM à 300 mM de pyruvate. Dans ce qui suit, on décrit la préparation de certains dispositifs conformes à l'invention ainsi que des procèdes de dosage Les mettant en oeuvre. ExempLe L: Préparation d'un dispositif a > Culture des bactéries: 1. EntraLnant l'induction de la synthèse d'une Elavoprotéine: rscherichia coli K12, de la souche 3300, a été cultive à 37VÇ sur un milieu minimum minéral aéré (référence n 63, concentré 2 fois) contenant 10,6 g/l de KH2PO4, 174 g/i de K21iPO48 4.g/l.de (NH4)2So4 0,4 g/l de MgSO4 71120, 0,001 g/l de FeSO4, 7li20 et 1 mg/l de thiamine. On a introduit dans le milieu à chaque fois 10 g/l de modificateur. Quatre cultures différentes ont été effectuées, comportant chacune un modificateur différent: lactate (racémique), succinate, malate (racémique), glycérol. Les bactéries ont été récoltées en phase exponentielle par centrifugation et remises en suspension dans le même milieu minimum, sans modificateur ni autre source de carbone, à raison de 1 à 10 mg de protéines bactériennes par .ml de suspension. Après agitation violente, à 370C, pendant 1 heure pour éliminer la plupart des substrats endogènes respiratoires, on a lavé les bactéries trois fois avec un tampon phosphate de potassium (0,2 X, pH = 7,8), et on les a remis en suspension, à raison de 10 à 40 mg de protéines bactériennes par ml dans un tampon phosphate de K (0,05 M, pd = 7,8) avant de les congeler à -800C pour les conserver. Avant utilisation, on effectue une décongélation rapide à 370C. L'activite respiratoire n'est pas modifiée après une conservation à -800C pendant plus d'un an. 2. Entraînant une répression catabolique: Escherichia coli est cultivé sur un des milieux de culture habituels, minimum ou riche, auquel on a ajouté 10 g/l de glucose. On peut aussi cultiver à 650C la souche thermophile PS3 dans un milieu riche contenant 10 g/l de glucose. La récolte, l'isolement et la conservation des bactéries ainsi cultivées se font comme precédemment, b) procédé de perméabilisation des membranes bactériennes: Cette étape n'est nécessaire que lors de la préparation d'un dispositif convenant au dosage de NADH, NADPH, acide pyruvique et ses sels. La suspension bactérienne préalablement obtenue est traitée par l1une des trois méthodes qui suivent pour perméabiliser les membranes bactériennes. - Action des ultrasons: de 2 à 5 mi de suspension bactérienne sont soumis 4 fois durant 10 secondes, à OQC, à l'action d'un appareil à ultrasons MSEs comportant une sonde de Q,6 cm de diamètre. - Méthode de la presse de French: la suspension bactérienne est passée dans un fractionateur de cellules à 150C et sous une pression de 1600 bars. Les bactéries entières et les fragments de membrane externe sont éliminés par une centrifugation à 60000 g, pendant 20 minutes. - Choc thermique: on effectue 6 congélations/décongélations successives entre -8QOC et +370C. c) Immobilisation: Les bactéries, perméabilisées ou non, sont mélangées à 400C avec une solution aqueuse de gélatine à raison ae 20 mg de protéines bactériennes et de 50 mg de gélatine pour 1 ml de suspension finale. La gélatine, de 250 blooms, est de la gélatine d'os ou de peau de porc commercialisée par la société Rousselot (France). Le mélange est homogénéisé puis étalé rapidement sur un film de polypropylène, d'épaisseur 6 fm, commercialisé par la société Bollore (France). On prépare ainsi 40 cm2 de film par ml de mélange. Après 5 minutes à 40C ou une nuit à 40C, le film est tanné par trempage de l'ensemble à OOC, dans une solution aqueuse à 2% (p/V) de glutaraldéhyde pendant 3 minutes. Le film est alors immédiatement lavé 3 fois avec une solution aqueuse de lysine (0,1 M, pH i 7,6), puis 3 fois avec un tampon phosphate (50 mM, pH 7,6) et lysine (50 mM, pH L 7,6). Le film peut étée conservé à 4ec, en l'absence d'oxygène, dans ce dernier tampon contenant en outre 0,5 mM d'azoture de sodium. d) Préparation d'une électrode à enzyme: On recouvre la zone sensible à l'oxygène d'une électrode de Clark qui fait environ 10 mm2, avec 2 cm2 environ du film enzymatique à support de polypropylène précédemment obtenu, le polypropylène étant au contact de l'électrode. Pour la mesure, l'électrode est reliée à un oxygraphe automatique, du type de celui décrit dans Biotechnol. Bioeng précédemment cité. Exemple 2: Procédé de dosage a) Méthode: On effectue successivement: - le rinçage de l'électrode avec un tampon phosphate de K (0,1 M - pB 7,6) ou un tampon acétate de K (0,1 M - pH 5,5) dans le cas du dosage de NADPH. - la mise de l'électrode à l'air, quelques secondes pour la saturer en oxygène. - l'introduction de l'échantillon à doser dans le compartiment de l'électtode, en maintenant la température à 300C; - la mesure de la pente au point d'inflexion du signal électrique, ce qui donne la vitesse initiale de la consommation d'oxygène; - le retrait de l'échantillon du compartiment de l'électrode et son rinçage avec le même tampon que précédemment pour saturer de nouveau.en oxygène le film de gélatine. b) Résultats Dans ces conditions, on peut déterminer la concentration d'un substrat dans un milieu en mesurant la "vitesse initiale" et en la comparant à celle figurant sur la courbe d'étalonnage, tracée préalablement. Cette Comme paraison peut etée faite automatiquement par un appareil Laye convenable connu de l'homme de métier. On a représenté Fig. 2 la courbe' d'étalonnage obtenue avec une électrode à enzyme, préparée avec Escherichia coli cultivé en présence de lactate, obtenue pour du L-lactate de a en solution aqueuse. à une concentration inférieure à 0,06 M. En abscisse, sont portées les concentrations et en ordonnées la quantité d'oxygène consommée en > 1-moles. Dans le cas où du succinate test présent dans l'échantillon de L-lactate à doser1 ou risque d'etre présent, on introduit préalablement à la mesure, un volume connu d'une solution aqueuse de fumarate de sodium ou malonate de sodium, de telle sorte que la concentration finale soit de 100 mM à 300 mM; la courbe d'étalonnage n'est pas modifiée. On dose ainsi l'acide L-lactique ou ses sels, à des concentrations comprises entre 1 et 40 mM. - On dose ainsi l'acide succinique, ou ses sels1 à des concentrations comprises entre 1 mM et 40 mbl avec une électrode préparée avec Escherichia coli cultivé en présence de succinate. La courbe d'étalonnage obtenue est représentée Fig 3. Dans le cas où du lactate est présent dans l'échantillon à doser, ou risque de l'être, on y introduit préalablement à la mesure du pyruvate, à raison de 100 mM à 300 mM. On peut aussi utiliser des bactéries chauffées à 570C pendant 2 heures, avant leur immobilisation, ce qui n'a aucune influence sur la "respiration du succinate mais diminue dtun facteur superieur à 10 celle du lactate; - On dose ainsi l'acide L-malique, ou ses sels, à des concentrations comprises entre 1 mM et 40 mM, avec une électrode préparée à partir d'Escherichia coli cultivées sur un milieu minimum en présence de malate. L'addition de malonate et de pyruvate, à une concentration de 100 à 300 mM dans l'échantillon à doser, permet d'éviter que les résultats ne soient faussés par la présence simultanée dans l'échantillon respectivement d'acide succinique ou lactique, ou de leurs sels; - On dose ainsi l'acide D-lactique ou ses sels, à des concentrations comprises entre 1 mM et 40 mM, avec une électrode préparée avec Escherichia coli cultivé en présence de glucose. Dans ce cas encore, l'addition de Eumarate et/ou de malonate dans l'échantillon, élimine les conséquences sur le dosage de la présence d'acide succinique ou de ses sels I - On dose ainsi le NADH ou le NADPH à des concentrations comprises entre 0,1 mM et 10 ms en préparant l'électrode avec Escherichia coli cultivé à 370C sur un milieu riche en présence de glucose ou avec des PS3 cultivées à 650C, et perméabilisées avant immobilisation. Pour le NADH, il est préférable d'ajuster le pH de l'échantillon vers 7,6, et pour le NADPH vers 5,8. Le dosage des déshydrogénases à cofacteurs NAD+ et NADP+ s'effectue de la même façon; - On dose ainsi l'acide fumarique ou ses sels à des concentrations comprises entre 1 mM et 40 mM avec une électrode préparée avec des Escherichia coli cultivé sur le milieu minimum en présence de malate, ou succinate. Dans le cas du succinate, on ajoutera du succinate dans le milieu à doser. L'introduction de pyruvate dans l'échantillon à doser, à une concentration comprise entre 100 et 300 mM élimine le risque d'interférence avec les dérivés lactiques pouvant être présents dans l'échantillon. - On dose ainsi l'acide oxalique ou ses sels avec une électrode préparée avec Escherichia coli cultivé sur un milieu minimum contenant 10 g/l de succinate, ou encore ]"acidc 3-glycerophosphocique avec une électrode préparée avec Escherichia coli cultive sur un milieu minimum contenant 10 q/l de glycérol; - On dose ainsi l'acide pyruvique, ou ses sels, à des concentrations comprises entre 2 inM et 100 mM avec une électrode préparée avec Escherichia'coli cultivé en présence de lactate. Le dosage doit alors être effectué en présence de L-lactate; pour une concentration en pyruvate à doser inférieure à 0,2M, on ajoute dans l'échantillon avant la mesure une quantité de L-lactate suffisante pour obtenir une concentration S mM. La Fig. 4 représente la courbe d'étalonnage obtenue pour le pyruvate de sodium en solution aqueuse. On peut aussi doser l'acide pyruvique, ou ses sels avec une électrode préparée avec Escherichia coli, perméabilisé, cultivé sur un milieu minimum contenant 10 g/l de glycérol, ou sur un milieu quelconque contenant du glucose. Dans le cas où l'échantillon peut contenir.du NADH, NADPH ou du D-lactate, le maintien des bactéries à 570C pendant 1 heure; avant leur immobilisation, permet de diminuer les risques de perturbation des résultats .du dosage, puisque l'activité "respiratoire1 de ces 2 composés décroît alors d'un facteur supérieur à 10, sans que la "respiration" du pyruvate soit modifiée.

Claims: REVENDICATIONS 1. Dispositif pour le dosage spécifique de substrats, inhibiteurs ou activateurs de la chaîne d'oxydation cellulaire, caractérisé en ce qu'il comporte un capteur d'oxygène, associé à des moyens de mesure de l'oxygène capté, et les transporteurs de la chaine respiratoire cellulaire sous forme de bactéries immobilisées, de microorganismes immobilisés ou de leurs préparations membranaires immobilisées, ces cellules ayant été préala- blement cultivées sur un milieu dont la composition a en trainé une modification de la synthèse cellulaire de la flavoprotéine correspondant au composé à doser. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture des cellules a induit la synthèse de la flavoprotéine. 3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'induction résulte de la présence dans le milieu de culture minimum d'une seule source de carbone, qui est le substrat de la channe respiratoire correspondant à la flavoprotéine. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient du glu cosy pour réprimer certaines flavoprotéines. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'immobilisation a lieu dans de la gélatine avec un tannage par action du glutaraldéhyde. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules sont immobilisées dans un film préparé à partir d'une suspension de cellules comportant 10 à 40 mg de protéines bactériennes et 50 mg de gélatine par ml, étalé sur 40 cm2, séché puis tanné par ac- tion d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde de concentration comprise entre 1 à 4% (p/v) pendant quelques minutes. 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode à oxygène sur laquelle a été déposé le film de cellules ou préparations cellulaires immobilisées. 8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3 ou 5 à 7 pour le dosage de l'acide L-lactique, de l'acide pyruvique ou de leurs sels, caractérisé en ce qu'il comporte des bactéries immobilisées issues d'un milieu de culture minimum comportant un lactate comme seule source de carbone. 9. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3 ou 5 à 7 pour le dosage de l'acide succinique, de l'acide fumarique ou de leurs sels, caractérisé en ce que les bactéries ont été cultivées sur un milieu minimum comportant un succinate comme seule source de carbone. 10. - Dispositif selon la revendication 9 pour le dosage de l'acide succinique ou de ses sels en présence des autres substrats de la chaîne respiratoire caractérisé en ce que Escherichia coli est soumis à une température de 530C à 570C, pendant 1 à 2 heures, avant immobilisation. 11. Dispositif selon l'une des révendications 1 à 3 ou 5 à 7 pour le dosage de l'acide L-malioue, de l'acide oxaloacétique ou fumarique ou de leurs sels, caractérisé en ce que les bactéries ont été cultivées sur un milieu minimum comportant un malate comme seule source de carbone. 12. Dispositif selon l'une des revendications 4 à 7 pour le dosage de l'acide D-lactique ou de ses sels, caractérisé en ce que les bactéries ont été cultivées sur un milieu comportant du glucose 13. Dispositif selon l'une des revendications 4 à 7 pour le dosage de l'acide pyruvique ou de ses sels, du NADH ou du NADPH, caractérisé en ce que les bactéries proviennent d'un milieu de culture comportait du glucose et en ce que les membranes des bactéries ont été perméabilisdes avant leur immobilisation. 14. Dispositif selon la revendication 13 pour le dosage de l'acide pyruvique ou de ses sels en presence des autres substrats de la chaîne respiratoire caractérisé en ce que Escherichia 'coli sont soumises à une température de 530C à 570C, pendant 1 à 2 heures, avant la perméabilisation de leurs membranes. 15. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3 ou 5 à 7 pour le dosage de l'acide 3 glycérophosphorique, ou pyruvique caractérisé en ce que les bactéries ont été cultivées sur un milieu minimum comportant du glycérol comme seule source de carbone. 16. Procédé de dosage spécifique des substrats, inhibiteurs et activateurs de la chaine d'oxydation cellulaire, caractérisé en ce que l'on détermine la quantité d'oxygène consommée par le système de transporteurs constituant la chaîne respiratoire pour transformer le produit à doser, le système étant introduit dans le milieu à étudier sous forme de bactéries immobilisées, de microorganismes immobilisés ou d'une de leurs préparations membranaires immobilisées, ces cellules ayant été préalablement cultivées dans des milieux dont la composition a entraîné une modification de la synthèse cellulaire de la flavoprotéine correspondant au composé à doser. 17. Procédé de dosage selon la revendication 16, mettant en oeuvre un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 18. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide L-lactique ou de ses sels en présence d'autres substrats pouvant interférer de la chaîne respiratoire avec un dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du fumarate ou du malonate. 19. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide D-lactique ou de ses sels en présence d'autres substrats pouvant interférer de la chaîne respiratoire, avec un dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du fumarate ou du malonate. 20. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide succinique ou de ses sels en présence d'autres substrats pouvant interférer de la channe respiratoire avec un dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du pyruvate. 21. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide L-malique ou de ses sels en présence d'autres substrats pouvant interférer de la chaîne respiratoire avec un dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du malonate et/ou du pyruvate. 22. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide pyruvique ou de ses sels avec un dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du L-lactate. 23. Procédé selon la revendication 16 pour le dosage de l'acide fumarique ou de ses sels en présence d'autres substrats pouvant interférer de la chaîne respiratoire avec un dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de dosage du pyruvate.

Inventors: ADAMOWICZ, ELISABETH, BOUCHERIT, KEBIR, BURSTEIN, CLAUDE, RABOUILLE, CATHERINE, ROMETTE, JEAN-LOUIS, Boucherit, Kébir
Applicants: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
Application year: 1986
Main classification: C12Q1
IPC codes: G01N27, G01N33, C12Q1