ALTERATION OF THE DNA SEQUENCE BETWEEN THE SHINE-DALGARNO SEQUENCE AND THE START CODON OF THE TRP OPERON TO INCREASE THE EXPRESSION OF PROTEINS

Abstract: For the contracting states : BE, CH, DE, GB, IT, LI, LU, NL, SE 1. DNA segment of the trp operon from E. coli, characterized by the sequence (coding strand) I 5' CTATCGACC 3' (I) which is connected at the 5' end to the Shine-Dalgarno sequence AAGG, and at the 3' end to the start codon ATG. For the contracting state : AT 1. A process for the preparation of a vector having the trp expression system of E. coli, characterized by cleavage with the restriction enzyme Nco l of an E. coli vector which contains the DNA sequence I 5' GTATCGACC 3' (I) (coding strand) followed by 5' ATGG 3', and a) ligation of a gene structure of DNA sequence II 5' CATG X... 3' 3' Y... 5' (II) in which X and Y denote the first complementary pair of nucleotides downstream of the start codon of a structural gene, in the cleavage site, or b) enzymatic filling in of the cleavage site and ligation of the DNA of the sequence III 5' GTA TCG ACC ATG 3' (III) 3' CAT AGC TGG TAC 5' with a DNA of the sequence IV 5' X... 3' (IV) 3' Y... 5' in which X and Y have the abovementioned meaning, or c) enzymatic degradation of the protruding sequence of the cleavage site, and ligation of the DNA of the sequence VI 5' GTA TCG AC 3' (VI) 3' CAT AGC TG 5' with a DNA of the sequence VII 5' Z ATG X... 3' (VII) 3' Z'TAC Y... 5' Z and Z' denoting any desired pair of nucleotides, which can also be dispensed with.

Description: Veränderung der DNA-Sequenz zwischen Shine-Dalgarno Sequenz und Startcodon des trp-Operons zur Steigerung der Proteinexpression Regulationssequenzen des trp-Operons werden vielfach zur Expression eukaryotischer Proteine in R. coli verwendet. Ein den Promotor und den Operator des trp-Operons enthaltender DNA-Abschnitt ist inzwischen handelsüblich. Modifikationen der Regulationssequenzen des trp-Operons sind schon bekannt. So ist beispielsweise in der Deutschen Offenlegungsschrift 3 247 922 beschrieben, wie in die Nucleotid-Sequenz der Regulationselemente des trp-Operons aus Serratia marcescens zwischen ribosomaler Bindungsstelle und Startcodon eine Hind III-Schnittstelle eingebaut werden kann. Aus J.C. Edman et al., Nature 291 (1981) 503 - 506, ist es bekannt, in die entsprechende Sequenz aus E. coli eine Cla I-Schnittstelle einzufügen. Diese Variation verändert jedoch die Zahl der Nucleotide zwischen ribosomaler Bindungsstelle und Startcodon gegenüber der natürlichen Sequenz. Es wurde nun gefunden, dass durch den Austausch eines einzigen Nucleotids, also ohne Veränderung der Nucleotidanzahl, eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym in die DNA Sequenz zwischen ribosomaler Bindungsstelle und Startcodon eingefügt werden kann. Erfindungsgemäss wird das unmittelbar vor dem Startcodon angeordnete Nucleosid Adenosin durch Cytidin ersetzt. Die Erfindung betrifft somit einen modifizierten DNA Abschnitt des trp-Operons von E. coli, der zwischen der "Shine-Dalgarno"-Sequenz und dem ersten Startcodon liegt und gekennzeichnet ist durch die DNA-Sequenz I 5' GTATCGACC 3' (I) 3' CATAGCTGG 5' Diese Sequenz I schliesst am 5'-Ende des oberen Stranges an die nShine-Dalgarno-Sequenz 5' AAGG 3' 3' TTCC 5' des trp-Operons an (die der eigentlichen ribosomalen Bindungsstelle auf der Ebene der RNA entspricht), und am 3'-Ende des oberen Strangs an das Startcodon ATG. Im folgenden wird die erfindungsgemässe Sequenz I der natürlichen E. coli-Sequenz und der aus Edman et al., a.a.O., bekannten Sequenz gegenübergestellt, wobei - aus Gründen der Übersichtlichkeit - nur der obere Strang, im folgenden codierender Strang genannt, wiedergegeben ist: E. coli GTA TCG ACA Edman et al. GTA TCG AT Sequenz I GTA TCG ACC (Änderungen gegenüber der E. coli-Sequenz sind unterstrichen). Dieser erfindungsgemässe Austausch von C gegen das A der natürlichen Sequenz bringt folgende Vorteile mit sich: Folgt im Anschluss an das Startcodon ATG das Nucleosid Guanosin, so wird dadurch die Erkennungssequenz C+ CATGG für das Restriktionsenzym Nco I gebildet. Diese Schnittstelle erlaubt die Insertion von DNA unmittelbar in der Nachbarschaft zum Startcodon, beispielsweise mit Hilfe synthetischer Oligonucleotide der Formel II 5' CATGX... 3' (11) 3' y.. 5' in der X und Y das erste komplementäre Nucleotidpaar nach dem Startcodon eines Strukturgens bedeuten. Wenn hierbei X für G und Y für C stehen, ist in dem Ligierungsprodukt die Nco I-Schnittstelle erhalten geblieben. Wird dagegen beispielsweise ein synthetischer Linker eingesetzt, dessen überhängende Sequenz 5' CATG 3' an ein anderes Nucleotid anschliesst, so ist zwar die Nco I-Schnittstelle aufgehoben, dafür aber die volle Variabilität hinsichtlich der ersten Aminosäure nach dem Startcodon gegeben. Man kann natürlich auch die überstehenden Enden der mit NcoI geschnittenen DNA enzymatisch auffiillen, z.B. mittels Klenow-Polymerase, und die so erhaltene stumpfendige DNA der Sequenz III 5' GTA TCG ACC ATG 3' 3' CAT AGC TGG TAC 5' (III) mit einer stumpfendigen Sequenz IV 51 x ... 3' (Iv) 3' Y ... 5' zur DNA-Sequenz V 5' GTA TCG ACC ATG X ... 3' 3' CAT AGC TGG TAC Y ... 5' (V) ligieren, wobei X und Y die genannten Bedeutungen haben. Hierbei wird kein weiteres Startcodon für ein bestimmtes zu exprimierendes Strukturgen benötigt. Dies ist beispielsweise zur Herstellung von am N-terminalen Ende verkürzten Proteinen günstig. Möglich ist auch ein enzymatischer Abbau der überstehenden Enden, wobei ebenfalls eine stumpfendige DNA-Sequenz VI 5' GTA TCG AC 3' (VI) 3' CAT AGC TG 5' entsteht, die mit einer stumpfendigen Sequenz VII 5' z ATG X ... 3' 3' Z'TAC Y ... 5' (VII) zur DNA-Sequenz VIII 5' GTA TCG ACZ ATG X ... 3' 3' CAT AGC TGZ'TAC Y ... 5' (VIII) ligiert werden kann, wobei Z und Z' ein beliebiges Nucleotidpaar bedeuten, das auch entfallen kann. Wenn Z und Z' für A bzw. T stehen, wird die natürliche E. coli-Sequenz gebildet. Ausser diesen vielfältigen Klonierungsmöglichkeiten bietet die Erfindung den Vorteil, dass die Expression des Strukturgens in überraschendem Ausmass verbessert wird. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit dem trp-Expressionssystem aus E. coli, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen E. coli-Vektor, der die DNA-Sequenz I (codierender Strang), gefolgt von 5' ATGG 3', enthält, mit dem Restriktionsenzym Nco I schneidet und a) in die Schnittstelle eine Genstruktur der DNA-Sequenz II ligiert oder b) die Schnittstelle enzymatisch auffüllt und die DNA der Sequenz III mit einer DNA der Sequenz IV ligiert oder c) die überstehende Sequenz der Schnittstelle enzymatisch abbaut und die DNA der Sequenz VI mit einer DNA der Se quenz VII ligiert. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft E. coli-Wirtsorganismen, die durch einen Gehalt an einem erfindungsgemäss erhaltenen Vektor gekennzeichnet sind. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Poly peptiden aus genetisch codierbaren Aminosäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man mit einem erfindungsgemässen Vektor transformierte E. coli-Zellen in bekannter Weise zur Expression bringt. Weitere Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausführungsformen werden im folgenden näher erläutert und in den Patentansprüchen niedergelegt. Die Piguren 1 bis 3 erläutern die Ausführungsbeispiele näher. So zeigt Figur 1 die Herstellung des Plasmids pH 131/5 aus dem bekannten Plasmid ptrpt 1. Figur 2 zeigt die Herstellung des für Interleukin-2 codierenden Plasmids pH 185/11 aus dem bekannten Plasmid p 159/6 und dem Plasmid pH 131/5 (Figur 1). Figur 3 zeigt schliesslich das für ss Interferon codierende Plasmid pH 192/5. Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, dass der Vektor eine Ampicillin-Resistenz mit dem ss-Lactamase- Promotor in der gleichen Orientierung wie der trp-Promotor aufweist. Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, dass durch das erfindungsgemäss modifizierte trp-Operon nicht nur eine sehr starke Expression des nach dem Startcodon angeordneten Gens erfolgt, sondern auch die ss-Lactamase induziert werden kann. Eine erhöhte Konzentration der ss Lactamase verleiht eine Resistenz gegen höhere Konzentrationen an Ampicillin, wodurch eine weitere Selektionsmöglichkeit eröffnet wird. Hierdurch wird es ermöglicht, besonders günstige Promotormutationen oder auch Variationen der Nucleotide im Bereich der ribosomalen Bindungsstelle bei jedem zu exprimierenden Protein schnell zu prüfen. Wenn die gleichzeitige Bildung von B-Lactamase unerwünscht ist, aber von Vektoren mit der Ampicillin-Resistenz Gebrauch gemacht werden soll, kann diese durch Insertion eines Terminators zwischen dem Strukturgen für das erwünschte Polypeptid und dem Strukturgen für die B-Lactamase unterdrückt werden. Bine weitere Ausgestaltung dieses Aspekts der Erfindung besteht dementsprechend in der Einfügung eines geeigneten Terminators, vorzugsweise eines bakteriellen Terminators, zwischen die genannten Gene. Besonders geeignet ist der Terminator des trp-Operons, der an geeigneter Stelle eingebaut wird, beispielsweise 10 bis 20 Nucleotide nach dem Stcodon (oder den Stopcodons) für das Strukturgen oder unmittelbar vor dem B-Bactamase- Operon. Die erfindungsgemässe Genkonstruktion mit dem trp-Promotor/ Operator kann in alle in B. coli replizierenden Plasmide eingebaut werden. Vorteilhaft verwendet man die handels üblichen E. coli-Vektoren wie pBR 322, pBR 725, pACYC 177, pACYC 184, pUC 8 und deren Derivate. Als Derivate kommen beispielsweise solche Plasmide in Betracht, aus denen nicht essentielle Regionen entfernt, Schnittstellen oder Marker eingebaut oder verändert wurden. Die Gensequenzen II, IV, V, VII und VIII enthalten mit dem Nucleotidpaar XP den Anfang eines beliebigen Strukturgens, beispielsweise zunächst eines wirtseigenen Gens, welches für ein Protein codiert, das den Transport in den periplasmatischen Raum oder an eine Zellmembran bewirkt. Man kann auf diese Weise Fusionsproteine herstellen, die aus dem Plasma entfernt und so leichter isoliert und/oder vom Abbau durch zelleigene Enzyme geschützt werden können. Man kann aber auch Fusionsproteine erzeugen, die auf Grund ihrer Unlöslichkeit leicht von den zelleigenen Proteinen abgetrennt werden können. Ausserdem ist es möglich, die gewünschten Proteine direkt zu exprimieren, indem man das Strukturgen unmittelbar hinter das Startcodon ATG setzt. Beispiele für Polypeptide, die erfindungsgemäss gewonnen werden können, sind Insulin, Interferone, Interleukine wie Interleukin-2, Hirudin oder Somatostatin. Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Beziiglich der einzelnen Verfahrensschritte wird auf das Lehrbuch Molekular Cloning" von Maniatis et al., Cold Spring Harbor (1982),verwiesen. Beispiel 1 Chromosomale E. coli-DNA wird mit Hinf I geschnitten und das 492 bp-Fragment isoliert, das aus dem trp-Operon den Promotor, Operator, das Strukturgen des I-Peptids, den Attenuator und die Kodons für die ersten sechs Aminosäuren des trp-E Strukturgens enthält. Dieses Fragment wird mit Hilfe von Klenow-Polymerase mit Desoxynucleotidtriphosphaten aufgefüllt, an beiden Enden mit einem Oligonucleotid verbunden, das eine Erkennungssequenz fiir Hind III enthält, und mit Hind III nachgeschnitten. Das so erhaltene Hind III Fragment wird in die Hind III-Schnittstelle von pBR 322 ligiert. Man erhält so das Plasmid ptrpE2-1 (J.C. Edmann et al., a.a.O.). Dieses wird wie beschrieben in das Plasmid ptrptl überführt. Zur Umwandlung dieses Ausgangsprodukts in einen erfindungsgemässen Vektor wird dieses mit Cla I nach den Empfehlungen des Herstellers (New England Biolabs) umgesetzt. Nach beendeter Inkubation wird das Inkubationsgemisch mit Phenol extrahiert, die organische Phase abgetrennt und die DNA durch Zusatz des 2,5fachen Volumens Ethanol und Inkubation bei -20 C ausgefällt. Nach Abzentrifugieren der DNA wird diese mit Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannhein) behandelt, um 5'-Phosphat-Reste zu entfernen. Das synthetisch hergestellte Oligonucleotid IX 5' CGACCATGGI 3' (IX) wird mit dem Enzym Polynucleotid-Kinase und ATP am 5'-Ende phosphoryliert. Hierzu wird das synthetische Oligo nucleotid 5 Minuten auf 70"C erwärmt und dann sofort im Eisbad abgekühlt. Die Phosphorylierung erfolgt in 25 Wl Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol (DTT)) unter Zusatz von 100 WM ATP und etwa 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase bei 57 C im Laufe von 30 Minuten. Die Reaktion wird durch Zusatz des Natriumsalzes von Ethylendiamintretraessigsäure (EDTA) bis zu einer Endkonzentration von 50 WM beendet. Überschüssiges ATP kann abgetrennt werden, beispielsweise durch Gelfiltration an Sepharose ((R)SEPHADEX G 50, fine). Das Oligonucleotid IX ist selbst-komplementär und kann sich zur doppelsträngigen Struktur X 5' CGACCATGGT 3' TGGTACCAGC (x) assoziieren. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid X weist überstehende Enden auf, die eine Insertion in die Cla I Stelle des geöffneten Plasmids ptrptl erlauben. Etwa 50 ng des Oligonucleotids werden mit ca. 1 Rg des umgesetzten, mit Phosphatase behandelten Plasmids in 30 Wl Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10 mM MgCl2, 10 mM DTT) unter Zusatz von 1 mM ATP und 0,1 ng/ml Rinderserum-Albumin (RSA) bei 12"G 20 Stunden inkubiert. Man erhält das Plasmid pH 131/5 (Figur 1). Das Reaktionsgemisch kann unmittelbar zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen eingesetzt werden. Die Selektion erfolgt auf Agar-Platten mit t-Broth (H.J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972) und 50 Wg/ml Ampicillin. Da in das Plasmid pH 131/5 eine Nco I-Schnittstelle eingeführt wurde, wurden die Ampicillin-resistenten Kolonien daraufhin überprüft, ob die enthaltene Plasmid-DNA ein etwa 700 bp grosses Hind III-Nco I-Fragment enthält. Über 80 % der Kolonien wies dieses Fragment auf. Die Sequenzanalyse nach Maxam-Gilbert bestätigte den Einbau des synthetischen DNA Fragments und die angegebene Sequenz des Plasmids pH 171/5 gemäss Figur 1. Beispiel 2 Das Plasmid p 159/6 gemäss Figur 5 der Deutschen Offenlegungsschrift 3 419 995 wird mit den Enzymen EcoR I und Sal I nach den Empfehlungen der Hersteller inkubiert und gelelektrophoretisch ein 420 bp DNA-Fragment abgetrennt, das die genetische Information für Human-Interleukin-2 enthält. Die einzelsträngigen überstehenden Enden werden mit Mung-Bean-Nuclease (Pharmacia P-S Biochemicals) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen abgebaut. Das Plasmid pH 131/5 wird mit Nco I umgesetzt und die überstehenden einzelsträngigen Enden werden ebenfalls mit Mung-Bean-Nuclease abgebaut. Anschliessend erfolgt der Einbau des nun stumpfendigen Strukturgens für Interleukin-2 in das stumpfendig gemachte geöffnete Plasmid unter blunt end"-Bedingungen mit DNA-Ligase. Hierbei wird die Nco I Schnittstelle rückgebildet. Nach Transformation in coli 294 erfolgt die Selektion der Ampicillin-resistenten Klone, die passende Restriktionsfragmente aufweisen, beispielsweise ein etwa 260 bp umfassendes Eco RI-Xba I-Fragment oder ein Eco RI-Sac I-Fragment mit etwa 150 bp. Bei dem Plasmid pH 185/11 (Figur 2) wurde die Nucleotidsequenz durch Sequenzanalyse bestätigt. Bei dieser Konstruktion bleibt die Nco I-Restriktionsstelle erhalten. Zur Expression des Interleukins-2 werden E. coli 294-Bakterien, die das Plasmid pH 185/11 enthalten, in LB-Medium (H.J. Miller, a.a.O.) mit 50 Wg/ml Ampicillin über Nacht unter Belüftung inkubiert. Anschliessend wird eine 1 : 100 Verdünnung im M 9-Medium (H.J. Miller,a.a.O.) mit 1 Wg/ml Thiamin und 500 Wg/ml Casaminosäuren (casamino acids) hergestellt. Bei OD = 0,5 kann mit Indolyl-3-acrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 15 Wg/ml induziert werden. Nach weiteren 2 bis 3 Stunden werden die Bakterien abzentrifugiert. Durch SDS-Gelelektrophorese kann bei den induzierten Bakterien eine starke Proteinbande festgestellt werden, die mit Antikörpern gegen ein nach der deutschen Offenlegungschrift 3 419 995 hergestelles Interleukin-2 reagiert. Die Bande entspricht dem erwarteten Molekulargewicht von Interleukin-2 und tritt bei nicht-induzierten Bakterien nicht auf. Die biologische Aktivität des Interleukin-2 kann in hoher Konzentration in den induzierten Bakterien nachgewiesen werden. Die vorstehend genannten Bedingungen für die Anzucht der Bakterien gelten für Schüttelkolben. Bei der Fermentation zu höheren OD-Werten (über 3) sind höhere Konzentrationen an Casaminosäuren und/oder B-Tryptophan zuzusetzen. Beispiel 3 Das Strukturgen für menschliches ss-Interferon wurde aus einer cDNA-Bank gewonnen. Die Klone enthalten die Insertion in der Pst I-Stelle des Plasmids pBR 322. Durch Einwirkung der Restriktionsenzyme Hinf I und Pst I wurde aus dem Strukturgen des B-Interferons ein Abschnitt von 120 bp isoliert. Die Erkennungssequenz der Hinf I-Stelle beginnt dabei 16 Nucleotide nach dem Codon für das N-terminale Methionin des biologisch aktiven ss-Interferons. Das synthetisch gewonnene Oligonucleotid XI 5' CATGAGCTACAATCTTCTTGG 3' 3' TCGATGTTAGAAGAAGCTAA 5' (XI) Nco I Hinf I wird mit DNA-Ligase an das Hinf I-Ende des Fragments addiert. Man erhält den DNA-Abschnitt XII. Aus dem Strukturgen des B-Interferons wurde weiterhin mit Pst I und Bgl II ein DNA-Abschnitt mit 365 bp isoliert. Dieser Abschnitt wurde in das handelsübliche Plasmid pUC 12 kloniert, das vorher mit Pst I und Bam HI umgesetzt wurde. Man erhält das Plasmid pH 188. Nach Amplifikation und Reisolierung wird das Plasmid pH 188 mit Pst I und Eco RI inkubiert und das B-Interferon-Genfragment isoliert (DNA Abschnitt XIII). Das Plasmid pH 131/5 wird mit den Restriktionsenzymen Nco I und Eco RI umgesetzt. Anschliessend erfolgt die Inkubation der DNA-Abschnitte XII und XIII mit dem geöffneten Plasmid in Anwesenheit des Enzyms DNA-Ligase unter Bedingungen, die zu einer covalenten Verknüpfung der Bindungen führen. Durch Restriktions- und Sequenzanalyse wird die erwartete Sequenz im Plasmid pH 192/5 bestätigt (Figur 3). Zur Expression des B-Interferons wird analog Beispiel 2 verfahren. Auch hier wird nach Induktion auf dem Elektrophoresegel eine deutliche Bande festgestellt, die bei nicht induzierten Bakterien nicht vorhanden ist. In den Extrakten der Bakterien kann die biologische Aktivität des B-Interferons nachgewiesen werden. In die Nco I-Stelle des Plasmids pH 131/5 wurde gemäss Beispiel 2 das Strukturgen für Interleukin-2 inseriert. Nach Umsetzung des Plasmids mit Eco RI wurden die überstehenden Enden durch Inkubation mit Klenow-Polymerase in Anwesenheit von Desoxyadenosintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat stumpfendig gemacht. Der handelsübliche Terminator des trp-Operons (Pharmacia P-L Biochemicals) wird in dieses geöffnete, stumpfendige Plasmid unter blunt end"-Bedingungen und unter gleichzeitigem Ringschluss eingebaut. Nach Wachstum und Induktion der Bakterien, wie in Beispiel 2 und vorstehend beschrieben, werden die Bakterien abgetrennt und lysiert. SDS-Gelelektrophorese zeigt unverändert die Bande des Interleukin-2-Proteins in der gleichen Intensität wie bei Beispiel 2. Die der ss-Lactamase entsprechende Bande weist jedoch eine deutlich geringere Intensitat auf.

Claims: Patentansprüche: 1. DNA-Abschnitt des trp-Operons aus E. coli, gekennzeich net durch die Sequenz (codierender Strang) I 5' GTATCGACC 3' (I) die am 5'-Ende an die Shine-Dalgarno-Sequenz AAGG und am 3'-Ende an das Start-Codon ATG anschliesst. 2. DNA nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz (codierender Strang) Ia 5' GTATCGACCATGG 3' (Ia). die am 5'-Ende an die Shine-Dalgarno-Sequenz AAGG anschliesst und bei der das G am 3'-Ende das erste Nu cleotid eines Strukturgens nach dem Startcodon ist. 3. Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit dem trp Expressionssystem aus E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass man einen E. coli-Vector, der die DNA-Sequenz I (codierender Strang), gefolgt von 5' ATGG 3', enthält, mit dem Restriktionsenzym Nco I schneidet und a) in die Schnittstelle eine Genstruktur der DNA Sequenz II 5' CATGX... 3' 3' y... 5' (11) in der X und Y das erste komplementäre Nucleotidpaar nach dem Startcodon eines Strukturgens bedeuten, li giert oder b) die Schnittstelle enzymatisch auffüllt und die DNA der Sequenz III 5' GTA TCG ACC ATG 3' 3' CAT AGC TGG TAG 5' (III) mit einer DNA der Sequenz IV 5' X ... 3' (IV) 3' y ... 5' in der X und Y die vorstehende Bedeutung haben, ligiert oder c) die überstehende Sequenz der Schnittstelle enzymatisch abbaut und die DNA der Sequenz VI 5 GTA TGG AC 3' (VI) 3' GAT AGG TG 5' mit einer DNA der Sequenz VII 5' z ATG X ... 3' 3t Z'TAG Y ... 5' (VII) ligiert, wobei Z und Z' ein beliebiges Nucleotidpaar bedeuten, das auch entfallen kann. 4. E. coli, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem ge mäss Anspruch 3 erhaltenen Vector. 5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids aus genetisch codierbaren Aminosauren, dadurch gekennzeichnet, dass man E. coli-Zellen gemäss Anspruch 4 zur Expression bringt. 6. Plasmid pH 131/5 gemäss Figur 1. 7. Plasmid pH 185/11 gemäss Figur 2. 8. Plasmid pH 192/5 gemäss Figur 3. Patentansprüche Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit dem trp Expressionssystem aus E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass man einen E. coli-Vector, der die DNA-Sequenz I 5' GTATGGAGG 3' (I) (codierender Strang), gefolgt von 5' ATGG 3', enthält, mit dem Restriktionsenzym Nco I schneidet und a) in die Schnittstelle eine Genstruktur der DNA Sequenz II 5' CATGX... 3' 3' y... 5' (11) in der X und Y das erste komplementäre Nucleotidpaar nach dem Startcodon eines Strukturgens bedeuten, li giert oder b) die Schnittstelle enzymatisch auffüllt und die DNA der Sequenz III 5' GTA TGG ACG ATG 3' 3' GAT AGC TGG TAC 5' (III) mit einer DNA der Sequenz IV 5' X ... 3' (IV) 3' Y ... 5' in der X und Y die vorstehende Bedeutung haben, ligiert oder c) die überstehende Sequenz der Schnittstelle enzymatisch abbaut und die DNA der Sequenz VI 5' GTA TGG AC 3' (VI) 3' CAT AGC TG 5' mit einer DNA der Sequenz VII 5' Z ATG X ... 3' 3' Z'TAG Y ... 5' (VII) ligiert, wobei Z und Z' ein beliebiges Nucleotidpaar bedeuten, das auch entfallen kann. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz (codierender Strang) Ia 5' GTATGGAGGATGG 3' (Ia), die am 5'-Ende an die Shine-Dalgarno-Sequenz AAGG anschliesst und bei der das G am 3'-Ende das erste Nu cleotid eines Strukturgens nach dem Startcodon ist, anstelle der Sequenz I eingesetzt wird. 3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids aus genetisch codierbaren Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Vektor nach Anspruch 1 oder 2 in E. coli-Zellen zur Expression bringt.

Inventors: ENGELS, JOACHIM, PROF. DR., LEINEWEBER, MICHAEL, DR., UHLMANN, EUGEN, DR., WENGENMAYER, FRIEDRICH, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1986
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N15, C12N1, C12P21, C07K14, C12N9, C12R1