COMPOUNDS CONTAINING AN OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCE LINKED TO AN INTERCALATING AGENT AND TO AN ACTIVABLE CHEMICAL GROUP, THEIR SYNTHESIS AND APPLICATIONS TO ARTIFICIAL SEQUENCE-SPECIFIC NUCLEASES

Abstract: Chemical compounds consisting of an oligonucleotide or an oligodeoxynucleotide comprising a chain sequence of natural or modified nucleotides and bonded by a covalent bond to an insertion radical and to a reactive chemical radical. These compounds can be employed as artificial nucleases specific for nucleic acid sequences. They can be employed for selective blocking of the expression of a gene chosen beforehand by acting directly either on the genetic data or on the messenger RANs.

Description: NOUVEAUX COMPOSES COMPORTANT UNE SEQUENCE D'OLIGONUCLEOTIDE LIEE A UN AGENT D'INTERCALATION ET A UN GROUPEMENT CHIMIQUE ACTIVABLE, LEUR SYNTHESE ET LEURS APPLICATIONS, A TITRE DE NUCLEASES ARTIFICIELLES SPECIFIQUES DE SEQUENCES. La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux ainsi que leur application, notamment, A titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences. La présente invention concerne également l'application de ces composés pour le blocage sélectif de l'expres- sion d'un gène. Par gène on entend non seulement le gène endogène (oncogène par exemple) mais également le gène exogène (ADN ou ARN de virus, de parasites ou de bactéries, par exemple). Les composés chimiques selon la présente invention sont constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaSnement de nucléotides naturels ou modifiés et lié par une liaison covalente j un radical intercalant et un radical chimique porteur d'au moins une fonction réagissant directement ou indirectement avec les channes de nucléotides (qui sera appelé ci-après "radical chimique réactif"), ce radical chimique réactif pouvant également constituer le radical intercalant. Parmi ces composés, il faut citer plus particulièrement les composés de formule EMI1.1 dans laquelle les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique, naturelle ou modifiée les radicaux X, qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un oxoanion O , un thioanion S 0 , un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, alcoxy ou alkyle substitué par un hétérocycle azoté, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle ou un groupement -Y-z R et R' peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un groupement -Y-Z ou un groupement -Y'-Z' dans lesquels Y et Y' représentent un radical alcoylène droit ou ramifié elK-, ou des radicaux EMI2.1 dans lesquels E peut avoir les mêmes significations que Xtou un radical -alK-O-alK-, ou un radical EMI2.2 ou un radical EMI2.3 ou un radical EMI2.4 Z et Z' représentent chacun un radical intercalant ou un radical porteur d'au moins une fonction, réagissant directement ou indirectement avec les chaînes de nucléotides, l'un des R ou R' pouvant représenter H lorsque le radical chimique réactif est également un radical intercalant sous réserve que le composé A comporte au moins un radical intercalant et un radical chimique réactif, dans le cas où Z ou Z' représente un radical intercalant qui est également un radical chimique réactif, alors Z et Z' peuvent être identiques ou bien l'un des R ou R' peut représenter l'hydrogène ; L représente un atome d'oxyg4ne, un atome de soufre ou un groupe -NH-; J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy n est un nombre entier y compris 0. Dans la description, on utilise la représentation condensée des nucléotides suivante EMI3.1 qui correspond d la formule développée EMI3.2 sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5'). il convient de remarquer que la formule A représente un enchaînement de nucléotides qui peuvent être identiques ou différents, n indiquant simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule ; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 50, et de préférence entre 1 et 25. Les radicaux intercalants correspondent d des agents d'intercalation qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques ; il s'agit de composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN. Ces agents d'intercalation sont, en général, constitués par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que ltacridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroline, la phénanthridinium, les porphyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a 3',2'- d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés. Les radicaux chimiques réactifs sont, de préférence, les radicaux chimiques de scission, c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une channe de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique. Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, les dérivés de composés tels que l'acide éthylène-diamine-tétracétique l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique les porphyrines, la 1,10-phdnanthroline, et autres groupes aromatiques absorbant les radiations du proche U.V. et du visible. Les groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur (acide dthylène-diamine-tdtracdtique, acide diéthylène-triamine-penta-acétique, porphyrine, phénanthroline) induisent des coupures dans des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage. Par irradiation dans le domaine visible ou ultraviolet, on peut activer les dérivés absorbant ces radiations et réaliser des réactions de photolyse des acides nucléiques sur lesquels est fixé l'oligonucléotide porteur du groupement photoactivable. Parmi les radicaux Z et Z', il faut citer en particulier - les radicaux dérivés de l'EDTA EMI4.1 -l'EDTA R = H, ou - Me3 EDTA R s Me, - les radicaux dérivés de la méthylpyroporphyrine EMI5.1 - les radicaux dérivés de la phénanthroline EMI5.2 Le radical B est, de préférence, constitué par une base naturelle d'un acide nucléique, par exemple la thymine, l'adénine, la cytosine, la guanine ou l'uracile mais, il est également possible d'utiliser des bases d'acides nucléiques modifiées, comme la 2-amino-adénine et ses dérivés substitués, par exemple sur la N6 par un groupe aminoalkylène ou par un groupe azidophénylalkylène ou la quanine substituée sur le O6, par exemple par un groupe (#-alkylène)-9-acridine ; ou la 8-(w-aminoalkyl)amino-adénine et ses dérivés substitués sur le NH2 en w par un groupe acridine ; ou des dérivés halogénés ou azidés, par exemple la 5-bromÏ-uracile ou la 8-azidoadénine. En outre, il est possible d'utiliser des drivés photoactivables des bases. Le radical X, bien qu'il représente de préférence un oxoanion, peut avoir d'autres significations t lorsque le radical X représente un groupement alkyle, il s'agit de préférence d'un groupement alkyle inférieur en C1 à C7 et, par exemple, les groupements éthyle, méthyle ou propyle lorsque le radical X représente un groupe alcoxy, il s'agit de préférence d'un groupement alcoxy inférieur en C1 à C7, par exemple le groupement méthoxy ou éthoxy ; lorsque X représente un groupement amino-alkyle ou amino-alcoxy, il peut s'agir d'un groupement amino-alkyle mono-substitué, disubstitué ou bien d'un radical amino sous forme de sel d'ammonium quaternaire. Dans ces conditions, les substituants sont, de préférence, des radicaux alkyles inférieurs comme définis précédemment ; quant à la channe allyle ou alcoxy reliant le radical amino au phosphore, il s'agit de préférence d'une chaîne droite ou ramifiée comportant de 1 à 10 atomes de carbone. Lorsque le radical alkyle ou alcoxy est substitué par un hétérocycle azoté, il s'agit notamment de cycle saturé à 5-6 chaînons comportant un atome d'azote qui peut être quaternaire. Enfin, lorsque le radical X est un radical thioalkyle, il s'agit de préférence d'un radical thioalkyle inférieur, c'est-à-dire qui comporte entre 1 et 7 atomes de carbone. Les composés de la présente invention peuvent être préparés par voie chimique par des procédés déjà connus, en particulies par les procédés décrits dans les demandes de brevets français nO 83 01223 du 27 janvier 1983 et 84 11795 du 25 juillet 1984. Selon la présente invention, on peut également préparer les dérivés totalement protégés et éliminer les groupements protecteurs. Les composés de l'invention peuvent également être préparés par des méthodes semi-synthetiques, en particulier en utilisant des fragments d'ADN ou d'ARN préparés par des méthodes de génie génétique sur lesquels sont ensuite fixés un agent intercalant et un groupe chimique réactif. La présente invention concerne également l'application des composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et des composés sous forme racémique, ou sous forme d'isomères R ou S optiques purifiés ou en mélange. Les composés selon la présente invention sont constitues d'une chaîne oligonucléotidique liée de façon covalente à un agent intercalant et à un groupe chimique réactif, ou à un agent intercalant qui est également un groupe chimique réactif. Dans ces nouvelles substances, l'oligonucléotide assure la reconnaissance de la séquence d'acide nucléique complémentaire, l'agent intercalant augmente fortement la stabilité du complexe d'hybridation et le groupe réactif conduit par activation à une hydrolyse de la chaîne d'acide nucléique complémentaire. Ce système permet donc de couper avec une grande efficacité une chaîne d'acides nucléiques en un site préalablement choisi. Les composés de formule A de l'invention, par leur grande affinité spécifique pour les séquences nucléiques complémentaires, sont à la fois supérieurs aux oligonucléotides liés à un groupe éthylène-diamine-tétraacétique déjà connus (FEBS Letters, 172 (1984), 43-46 ; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 968-972 ; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 963-967) dont l'affinité pour les séquences complémentaires est beaucoup plus faible (voir exemple VIII) et aux composés comportant un agent intercalant relié à un groupe éthylène-diamine-tétraacétique (Biochemistry, 23, (1984), 3934-3945) ou à une porphyrine (J. Chem. Soc., Commun 1982), 1298-1300 ; Tetrahydron Letters, 24 (1983), 1523-1526) qui ne possèdent pas de spécificité vis-à-vis d'une séquence d'acides nucléiques donnée. Les composés de la présente invention, par leur propriété de se fixer fortement sur la séquence nucléique complémentaire puis d'induire la coupure de la channe d'acide nucléique en ce site, sont utilisables à titre de nucléases artificielles spdcifiques de séquences. Ils peuvent être utilisés comme réactifs en biologie moléculaire ou en génie génétique. Ils peuvent être également utilisés pour obtenir des fragments d'acides nucléiques, en particulier des fragments d'ARNs pour lesquels il n'existe pas de nucléase spécifique de séquences. L'objet de la présente invention est également l'application des composés de formule A pour réaliser le blocage spécifique des gènes cellulaires ou d'agents pathogènes préalablement choisis (virus, bactéries, parasites). Les composés selon l'invention sont donc utiles comme médicament afin de détruire sélectivement les gènes indésirables, exogènes (virus, bactéries, parasites) ou endogènes (gènes cellulaires oncogènes par exemple). L'expression de ces gènes peut être bloquée en agissant soit directement sur l'ADN ou l'ARN porteur de l'information génétique, soit sur l'ARN messager, copie du gène, en bloquant alors toute traduction par coupure de l'ARN messager choisi pour cible. -Ce blocage peut être réalisé en utilisant un composé de formule A dont la séquence est complémentaire de celle d'une région non complexée d'un ADN ou d'un ARN, et en particulier d'un ARN messager. L'hybridation puis la coupure de l'ARN messager par ces substances empêchent la synthèse de la protéine correspondante. Si cette protéine est vitale pour le virus ou pour la bactérie ou pour le parasite, alors les composés de formule A agiront comme substances antivirales ou comme antibiotiques ou comme produits antiparasitaires. Si cette protéine n'est pas vitale pour l'organisme, on peut alors supprimer sdlectivement ses effets. Dans ce cas, les composés de formule A agiront par exemple soit comme substances antitumorales, lorsque le gène visé (ou son ARN messager) code pour une protéine transformante, soit comme une substance qui permet de supprimer le caractère de résistance aux antibiotiques, aux antiviraux et aux antiparasitaires lorsque la protéine codée est responsable de 1' inactivation de ces antibiotiques, de ces antiviraux et de ces antiparasitaires. Les exemples ci-après sont destinés à illustrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention Dans les exemples, les abréviations ci-après sont utilisées : A 2' -déoxyadénosine bzA N-benzoyl-2'-déoxyadénosine ABH acide benzohydroxamique Ar parachlorophényle CNEt B-cyanoéthyle DBU 1,8-diazabicyclo (5-4-0 undec-7-ène) Me méthyle DMTr diméthoxytrityle MMTr monométhoxytrityle MST mésitylènesulfonyltétrazolide T thymidine Dans les formules (DMTr) (T +)n n T-Ar, la liaison phosphodiester est représentée par un trait et la liaison phosphotriester est représentée par le symbole (7), chaque phosphate est protégé par le groupe p-chlorophényle (Ar). Acr EMI10.1 EDTA (R = H) Me3 EDTA (R = Me) EMI10.2 MPPo méthylpyrroporphyrine XXI EMI10.3 Phe EMI10.4 EXEMPLE I EMI11.1 1) Me3EDTA-NH- (CH2-) 60H On fait réagir pendant 1 heure à 1000C sous atmosphère d'azote 1 équivalent d'ester tétraméthylique d'acide éthylène-diamine-tétraacétique, 1 équivalent d'amino-6-hexanol-1 et 0,5 équivalent d'hydroxy-2-pyridine puis on purifie le produit obtenu par chromatographie sur silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, MeOH (98 : 2 à 95 : 5, v/v). Rendement : environ 40 %. 2) Ar-(T+)6(CH2)5Acr On ajoute sous-agitation,et à -200C, 3 équivalents de méthyl-p-chlorophényl-chlorophosphate dans la pyridine anhydre ; l'addition terminée, on continue l'agitation pendant 1 heure à la température ambiante, puis on ajoute à -100C une solution de 1 équivalent d'hexanucléotide (T+)6 (CH2)5Acr (préparé selon le brevet français n 83 01223). Après 1 heure de réaction à la température ambiante, on ajoute de l'eau glacée puis on extrait le composé Ar-(T +)6- (CH2)5Acr avec du dichlorométhane. Le rendement de la préparation est pratiquement quantitatif. EMI11.2 A une solution de 3 équivalents de Me3EDTA-NH (CH2-)60H et de 1 équivalent de Ar-(T+)6 (CH2)5Acr dans la pyridine anhydre, on ajoute à la température ambiante et sous agitation 2,5 équivalents de mésitylène-sulfonyltétrazolide (MST). On continue l'agitation pendant 1 heure la la température ambiante puis on détruit l'excès de réactif de couplage par addition d'eau glacée, le produit est extrait avec du dichlorométhane puis purifié sur gel de silice en utilisant le système te solvant CH2Cl2, MeOH (85 : 15, v/v). 4) L'hexanucléotide totalement protégé préparé selon exemple I-3 est traité pendant 24 heures sous agitation et à la température ambiante avec une solution molaire en acide benzohydroxamique (ABH) et en 1,8-diazabicyclo-(5-4-O undec-7-ène) (DBU) dans la pyridine anhydre et en utilisant 10 équivalents de ABH-DBU par équivalent de phosphoester arylé à déprotéger ; b ce mélange reactionnel, on ajoute ensuite 2 volumes de solution de soude 0,7 M puis on continue l'agitation pendant 4 heures à température ambiante. Après avoir neutralisé le milieu réactionnel avec l'acide chlorhydrique, on lave la phase aqueuse avec de l'éther puis on purifie ltoligonucléotide déprotégé par chromatographie liquide d'abord par échange d'ion puis en phase inverse. Colonne de polyanion HR 5/5 (Pharmacia), débit 1 ml/mn, solvant NaCI 10 2 M et NaCl 1,5 M, gradient linéaire de O à 100 % en NaCl 1,5 M en 20 minutes, temps de rétention : il minutes 42 secondes. Le temps de rétention sur colonne C18 est donné par le tableau I. EXEMPLE II EMI13.1 1) MPPo-NH- (CH2-) 6O-H On fait réagir pendant 5 heures à 100 C sous atmosphère d'azote et à l'abri de la lumière 1 équivalent d'ester éthylique de la méthylpyrroporphyrine XXI, 10 équivalents d'amino-6-hexanol-1 et 2 équivalents d'hydroxy-2pyridine dans la pyridine. On élimine la pyridine sous vide, on reprend le résidu avec du chlorure de méthylène puis on acidifie avec HClN ; la phase organique est lavée à l'eau puis évaporée sous vide. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, MeOH (98 : 2 à 95 : 5, v/v).. Rendement : 70 %. 2) DMTr (T+)7(CH2)6NH MPPo On opère comme dans l'exemple I-3 et en utilisant 1 équivalent de DMTr(T+)6T-Ar (préparé selon le brevet français 83 01223), 1,5 équivalents de MPPoNH(CH2)6OH et 3 équivalents de MST, on obtient l'heptanucléotide totalement protégé qui est ensuite purifié par chromatographie sur silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, H20, acétone (54 : 1 : 45 à 38 : 2 : 60, v/v). Rendement : 60 %. 3) Un équivalent d'heptanucléotide protégé préparé selon l'exemple II-2 est traité avec 70 équivalents de ABH-DBU (solution molaire) pendant 24 heures à la température ambiante ; le milieu réactionnel est neutralisé avec du DOWEX 50 (forme pyridinium) puis évaporé sous vide. Le résidu est repris avec l'acide acétique à 80 % puis la solution est laissée 2 heures à la température ambiante. On élimine l'acide acétique sous vide par évaporation plusieurs fois avec de I'éthanol ; on reprend le résidu avec de l'eau puis on lave la phase aqueuse avec de l'éther. Le produit protégé est purifié par chromatographie liquide par échange d'ion puis en phase inverse ; le tableau I donne le temps de rétention du produit obtenu. EXEMPLE III EMI14.1 EMI14.2 On fait réagir pendant 1 heure à la température ambiante 1 équivalent de 5'-monométhoxytritylthymidine, 1,1 équivalents de bromoacétate de méthyle et de 2,5 équivalents de DBU dans l'acétonitrile anhydre. Après avoir évaporé le solvant sous vide, on reprend le résidu avec du chloroforme puis on lave la phase chloroformique avec une solution de NaH C03 à 50 %. On classe le solvant sous vide et on purifie le produit par chromatographie sur silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, MeOH (98 : 2 à 95 : 5, v/v). Rendement : 90 t. EMI14.3 On chauffe sous atmosphère d'azote à 1000C pendant 1,30 heure un mélange d'un équivalent de composé préparé selon exemple III-1 de 5 équivalents d'éthylène- diamine, de 2 équivalents d'hydroxy-2-pyridine dans la pyridine anhydre. On chasse les produits volatils sous vide puis on purifie le produit par chromatographie sur gel de silice en utilisant le système de solvant MeOH, NH4OH concentré (100 : 0à 95 : 5, v/v), Rendement 80 %. EMI15.1 On fait rdagir pendant 24 heures à la température ambiante 1,3 équivalents de composé préparé selon l'exemple II1-2, 1 équivalent de sel de pyridinium de la méthylpyrroporphyrine XXI (préparé par hydrolyse d'ester dthylique de la méthylpyrroporphyrine XXI), 10 équivalents de dicyclohexylcarbodiimide dans la pyridine anhydre. On détruit l'excès de dicyclohexylcarbodiimide par addition d'eau, on filtre le précipité, on extrait le produit avec du chloroforme puis on le purifie par chromatographie sur silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, MeOH (98 : 2 à 94 : 6, v/v). Rendement : 90 %. EMI15.2 Un équivalent de composé préparé selon l'exemple III-3 est traité avec l'acide benzène sulfonique (2 % en solution dans le chloroforme, méthanol (7:3, v/v)) à OOC pendant 30 minutes à 1 heure. Le mélange est repris avec du chloroforme et lavé avec une solution aqueuse de NaHC03 à 5 % puis séché sur Na2SO4 et concentré sous vide. A ce résidu on ajoute un équivalent de DMTr(T+)5T-Ar puis on élimine les traces d'eau par évaporation 3 fois avec la pyridine. On ajoute à cette solution 2,5 équivalents de MST puis on termine la préparation comme dans l'exemple I-3 en utilisant les sytèmes de solvant CH2Cl2, H20, acétone (54 : 1 : 45 ; 46 : 2 : 52 et 38 : 2 : 60, v/v) pour la chromatographie sur gel de silice. 5) On opère comme dans l'exemple II-3 en utilisant 60 équivalents de solution de ABH-DBU, on obtient 1'oligonucléotide déprotégé dont le temps de rétention est donné par le tableau I. EXEMPLE IV EMI16.1 On opère comme dans l'exemple III en remplaçant l'éthylène diamine par la 1,4-diaminobutane, on obtient lloligonucléotide dont le temps de rétention est donné par le tableau I. EXEMPLE V EMI16.2 EMI16.3 On fait réagir pendant 1 heure, sous agitation et à la température ambiante, 1 équivalent de dérivé de la méthylpyrroporphyrine XXI (préparé selon l'exemple 11-1), 1 équivalent d'hexanucléotide Ar-(T+)6CH2CH2CN (préparé selon le brevet français n 83 01223) et 3 équivalents de MST dans la pyridine anhydre. Après avoir détruit l'excès de MST par addition d'eau glacée, le produit est extrait avec du chloroforme puis purifié sur gel de silice en utilisant le système de solvant CH2Cl2, H2O, acétone (54 : 1 : 45 et 46 : 2 : 52, v/v). EMI17.1 Le composé de l'exemple V-l (1 équivalent) est traité pendant 2 heures à la température ambiante avec une solution de pyridine-triéthylamine (2 : 1, v/v) -; on chasse le solvant sous vide puis on lave le solide obtenu avec de l'éther. A ce produit on ajoute 1 équivalent de T+(CH2)5Acr (préparé selon le brevet français n" 83 01223) ; après avoir séché le mélange par évaporation avec la pyridine, on ajoute à cette solution 2,5 équivalents de MST et on termine la préparation comme dans l'exemple I-3 en purifiant le produit par chromatographie sur gel de silice (plaque préparative, solvant CH2Cl2, MeOH (85 : 15, v/v)). 3) L'heptanucléotide protégé (1 équivalent) préparé d'après l'exemple V-2 est traité pendant 40 heures à la température ambiante avec une solution moléculaire en ABH-DBU (70 équivalents). On neutralise le milieu réactionnel avec le DOWEX 50 (forme pyridinium), on filtre et on chasse le solvant sous vide ; le résidu est repris avec de l'eau, la phase aqueuse est lavée avec de l'éther. Le produit est ensuite purifié par chromatographie liquide par échange d'ion puis en phase inverse, le tableau I donne le temps de rétention de l'oligonucléotide préparé. EXEMPLE VI EMI18.1 En utilisant 1,3 équivalents de DMTr(T+)5T-Ar, 1 équivalent de EMI18.2 équivalents de MST et en opérant comme dans l'exemple I-3, on obtient l'hexanucléotide protégé EMI18.3 qui est ensuite déprotégé puis purifié selon l'exemple II-3. Le temps de rétention du produit purifié est donné par le tableau I. EXEMPLE VII EMI18.4 1) dT F T w T w T r T T bzA F bzA F T F T F T r (CH2)sAcr Ce composé est préparé selon le brevet français n 83 01223 en utilisant le schéma de réaction suivant : : EMI19.1 <SEP> DMTr <SEP> dT <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> - <SEP> Ar <SEP> HO(CH2)5Acr <tb> <SEP> # <SEP> MST <tb> <SEP> DMTr <SEP> dT <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> (CH2)5Acr <tb> <SEP> # <SEP> H# <tb> DMTr <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> - <SEP> A <SEP> r <SEP> dT <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> (CH2)5Acr <tb> <SEP> # <SEP> MST <tb> <SEP> DMTr <SEP> dT <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> BzA <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> (CH2)5Acr <tb> <SEP> # <SEP> H <SEP> # <tb> <SEP> DMTr <SEP> dT <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> bzA <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> T <SEP> # <SEP> (CH2)5Acr <tb> EMI20.1 On opère comme dans les exemples I-2 et I-3 et en remplaçant les composés (TT)6(CH2)5Acr), et Ar-(T;)6(CH2)5Acr respectivement par les composés : d(TT)5(bzA;)2(TT)3(CH2)5 Acr et dAr-(TF)5(bzAF)2(TF)3(CH2)5Acr on a obtenu le décamère totalement protégé. Chromatographie sur couche mince : gel de silice 60F254 ; solvant CH2Cl2, MeOH (9 : 1, v/v). Rf environ 0,1. 3) En partant du décamère totalement protégé préparé précédemment (exemple VII-2) et en opérant selon l'exemple I-4, on a obtenu le décamère déprotégé dont les temps de rétention en HPLC sont les suivants Colonne de polyanion HR 5/5 (Pharmacia), débit 1 ml/mn, solvant NaCl 10-2 M et NaCl 2 M, gradient linéaire de O à 100 % en NaCl 2 M en 12 minutes, temps de rétention : 10 minutes 8 secondes. Colonne Lichrosorbe RP-18 (Merck), débit 1,2 ml/mn solvant CH3CN, acétate de triéthylammonium à 10 % en poids dans l'eau, eau (15,8 : 9,47 : 74,72, v/v) (pH 5,9), isocratique, temps de rétention : 3 minutes 51 secondes. Tableau I EMI21.1 Exemple <SEP> Système <SEP> de <SEP> solvants <SEP> Temps <SEP> de <SEP> rétention <tb> <SEP> I <SEP> A <SEP> - <SEP> B <SEP> , <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 40 <SEP> % <SEP> de <SEP> B <SEP> 2 <SEP> mn <SEP> 44 <SEP> sec <tb> <SEP> II <SEP> A <SEP> - <SEP> B <SEP> , <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 95 <SEP> % <SEP> de <SEP> B <SEP> 6 <SEP> mn <SEP> 30 <SEP> sec <tb> <SEP> III <SEP> A <SEP> - <SEP> B <SEP> , <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 95 <SEP> % <SEP> de <SEP> B <SEP> 3 <SEP> mn <SEP> 24 <SEP> sec <tb> <SEP> IV <SEP> A <SEP> - <SEP> B <SEP> , <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 95 <SEP> % <SEP> de <SEP> B <SEP> 4 <SEP> mn <SEP> 54 <SEP> sec <tb> <SEP> V <SEP> A <SEP> - <SEP> B <SEP> , <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 75 <SEP> % <SEP> de <SEP> B <SEP> 4 <SEP> mn <SEP> 04 <SEP> sec <tb> <SEP> VI <SEP> A <SEP> - <SEP> B', <SEP> isocratique <SEP> avec <SEP> 80 <SEP> % <SEP> de <SEP> B' <SEP> 2 <SEP> mn <SEP> 04 <SEP> sec <tb> HPLC, colonne Lichrosorbe RF -18 (Merck); débit 1,2 ml/um A : CH3CN, AAc, eau (2 : 10 : 88, v/v) (pH = 5,9) B : CH3CN, AAc, eau (48 : 10 : 42, v/v) (pH = 5,9) C : CH3CN, AAc, eau (24 : 10 : 66, v/v) (pH = 5,9) AAc : solution aqueuse d'ammonium à 10% en poids (pH = 5,9) EXEMPLE VIII - Coupure spécifique du poly(dA) par le composé EMI22.1 Le poly(dA) est marqué à son extrémité 3' par la terminale transférase et le (a-32P)dATP. Du polynucléotide non marqué est ajouté de façon à ce que sa concentration soit 10 à 50 fois supérieure à celle du polynucléotide marqué. Les concentrations indiquées sont celles du polynucléotide non marqué. Une solution franche de Fe(NH4)2(S04)2 est ajoutée ainsi que de l'eau oxygénée, du tampon Tris pH 8,3 et du chlorure de sodium. Des aliquots sont répartis dans des tubes où les oligonucléotides ont été lyophilisés et le volume total est complété à 4,5 l. La réaction de coupure est déclenchée par l'addition de 0,5 l dithiothréitol (DTT) 50 mM. Les concentrations finales sont / A7 = 50 M, [EDTA-Fe] = 20 M, [NaCl] = 160 mM, [Tris](pH 8,3) = 8 mM, [H2O2] = 1mM, [DTT] = 5mM. Les réactions de coupure sont arrêtées par addition de 2 l de ter-butanol qui capte les radicaux hydroxyles, intermédiaire de la réaction de coupure. Les échantillons sont lyophilisés, resuspendus dans 3 l de formamide et appliqués sur gel de séquence à 8 % en acrylamide (1/20 réticulation) et 50 % en urée. La durée de lrélectrophorèsè est 2 heures 30 minutes (sous 1300 V). Le gel est ensuite autoradiographié à 20 C avec un film Kodak Li figure 1 représente des résultats d'lectro- phorèse sur gel de polyacrylamide et montre l'effet d'une incubation du poly (dA) en présence de différents additifs à 190 C pendant 140 minutes. Les concentrations utilisées sont indiquées précédemment (A : H202 + Fe(II) ; B : H202 + Fe (II) + DTT ; C : H202 + Fe(II) + DTT + EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) ; D : H2O2 + Fe (II) + DTT + (TP)7(CH2)6NH-EDTA ; E : H202 + Fe (II) + DTT + EDTA NH(CH2)6 P(TP)6 (CH2)5Acr). L'oligonucléotide EDTA-NH(CH2)6- O(Tp)6 (CH2)5 Acr hydrolyse très efficacement le poly(dA) comme l'indiguent la disparition de la bande principale due au poly(dA) intact et l'apparition de bandes correspondant à des fragments de taille variahle (y compris des fragments très courts) .L'oligonucléotide (Tp)7(CH2)6 NH-EDTA possède une efficacité beaucoup plus faible. L'acide Fthylène- tétraacétique seul n'a pratiquement aucun effet sur le poly(dA) dans les mêmes conditions. Si le poly(dA) est remplacé par du poly(dT), aucune hydrolyse n'est observée en présence de EDTA-NH(CH2)6p(Tp)6CH2)5Acr. Cette expérience démontre que la réaction est spécifique de la séquence complémentaire de l'hexathymidylate. EXEMPLE IX - Coupure spécifique du poly(dA) par le composé de l'exemple VI Le poly(dA) marqué est préparé comme indiqué à l'exemple VIII. I1 est incubé à 200C (concentration 19 M) en présence du composé VI (5 M,) de phénanthroline (5 M,) de Cu(II) (5 M) et de dithiothréitol (1 mM) dans un tampon phosphate (50 mM) contenant 0,1 M NaCl. Le poly(dA) est dégradé sélectivement dans ces conditions. Aucun effet n'est observé sur le poly(dT) ou la double hélice poly(dA). poly(dT). Aucune coupure n'est observée en l'absence de l'un des constituants du mélange réactionnel. Si le composé VI est remplacé par de la phénanthroline libre à la même concentration (5 M) aucune coupure n'est observée pour le poly(dA), les doubles hélices poly(dA).oligo(dT)8 et poly(dA).poly(dT).

Claims: REVENDICATIONS 1) Composés chimiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels ou modifiés et lié par une liaison covalente à un radical intercalant et à un radical chimique réactif ou à un radical intercalant qui est également un radical chimique réactif. 2) Composés selon la revendication 1 de formule : EMI24.1 dans laquelle les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique, naturelle ou modifiée les radicaux X, qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un oxoanion ou, un thioanion Sv, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, alcoxy ou alkyle substitué par un hétérocycle azoté, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle ou un groupement -Y-Z R et R' peuvent étre identiques ou différents et représentent chacun un groupement -Y-Z ou un groupement -Y'-Z' dans lesquels Y et Y' représentent un radical alcoylène droit ou ramifié elK-, ou des radicaux EMI24.2 dans lesquels E peut avoir les mêmes significations que X, ou un radical -alK-O-alKS ou un radical EMI24.3 ou un radical EMI24.4 ou un radical EMI24.5 Z et 2' représentent chacun un radical intercalant ou un Radical porteur d'au moins une fonction, réagissant directement ou indirectement avec les channes de nucléotides, l'un des R ou R' pouvant représenter H lorsque le radical chimique réactif est également un radical intercalant sous réserve que le composé A comporte au moins un radical intercalant et un radical chimique réactif, dans le cas où Z ou Z' représente un radical intercalant qui est également un radical chimique réactif, alors Z et Z' peuvent être identiques ou bien l'un des R ou R' peut représenter l'hydrogène L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy n est un nombre entier y compris 0. 3) Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce que le radical intercalant est dérivé des.composés polycycliques ayant une configuration plane. 4) Composés selon la revendication 3, caractérisés en ce que le radical intercalant est dérivé de l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroline, le phénanthridinium, les porpbyrines, les dérivés de la dipyrido(1,2-a : 3',2'-d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et les dérivés de ces agents intercalants. 5) Composés selon les revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les groupes chimiques réactifs sont choisis parmi les dérivés de l'acide éthylènediaminetétraacétique, de l'acide diéthylènetriamine-pentaacétique, des porphyrines, de la 1,10-phénanthroline. 6) Composés selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que le radical B est un radical correspondant à la thymine, l'adénine, la 2-aminoadénine et ses dérivés substitués, par exemple sur le N6, par un groupe aminoalkylène ou par un groupe azidophénylalkylène, la cytosine, la guanine ou la guanine substituée sur le O6, par exemple par un groupe (X-alkyldne)-9-acridine ou la 8-(w-amfnoalkyl)-aminoadénine et ses dérivés substitués sur le NH2 en # par un groupe acridine l'uracile, le 5-bromo-uracile, le 8-azido-addnine ou un dérivé photoactivable des bases. 7) Composés selon la revendication 1 de formule choisie parmi EMI26.1 EMI27.1 8) Procédé de préparation de composés selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on prépare les dérivés totalement protégés et que l'on élimine les groupements protecteurs. 9) Application des composés selon l'une des revendications 1 à 7 à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences d'acides ribo et désoxyribonucléiques. 10) Application des composés selon l'une des revendications 1 à 7 pour obtenir des fragments d'acides nucléiques déterminés à partir d'acides ribo et désoxyribonucléiques. 11) Application des composés selon l'une des revendications 1 à 7 comme réactifs pour analyser les structures secondaires et tertiaires d'acides ribo et désoxyribonucléiques, par coupures sélectives de la séquence cible et des séquences voisines dans l'espace. 12) ApiiCation des composés selon l'une des revendications 1 'a 7 pour couper et dégrader sélectivement les acides nucléiques en particulier les ARN messagers in vivo. 13) Application selon la revendication 12, pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène par coupure sélective du gène ou de son ARN messager. 14) A titre de médicament, un composé selon l'une des revendications 1 à

Inventors: HELENE, CLAUDE, THUONG, NGUYEN THANH
Applicants: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
Application year: 1986
Main classification: C07H21
IPC codes: C12N15, C07H19, C07H21, C12Q1, C07D487