METHOD FOR THE IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF HEPARAN SULPHATE PROTEOGLYCAN, AND METHOD FOR THE EXTRACTION OR PURIFICATION OF HEPARAN SULPHATE PROTEOGLYCAN SUITED THEREFOR FROM OR OF TISSUES CONTAINING BASAL MEMBRANES

Abstract: The invention relates to a method for the immunological determination of basement membrane heparan sulphate proteoglycan of low density in body fluids and to the preparation or isolation of a heparan sulphate proteoglycan of low density suitable for this purpose and to the corresponding highly specific antibodies.

Description: MAX-PLANCK-GEsELLsCHAFT ZL? rÖRDuiIG DER WiSSENSCI!AFTrN e.V. und HOECHST AKTIENGESELLS^HAFT HOE 85/F 752 Dr.KH/ml Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Heparansul- fat-Proteoglykan, Verfahren zur Herstellung bzw. Reinigung von dafür geeignetem Heparansulfat-Proteoglykan aus basalmembranhaltigen Geweben Heparansulfat-Proteoglykan kommt in Basalmembranen vor und wirkt dort als ionenselektiver Filter. In pathologischen Situationen wie z. B. Diabetes mellitus wurde eine Verringerung dieses Proteoglykans in Basalmembranen beschrieben. Diese Verringerung wird in ursächlichem Zusammenhang mit dem Auftreten diabetischer Spätkomplikationen wie Nephropathie gesehen. Die für den Nachweis der Verringerung verwendeten Verfahren setzen eine Gewebsextraktion und damit die Verfügbarkeit von Gewebe voraus. Es wäre wünschenswert, eine solche Veränderung durch eine Serumanalyse bestimmen zu können. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte aus basalmembranhaltigem Gewebe rein isoliert werden kann. Unter Verwendung dieses Antigens und der entsprechenden hochspezifischen Antikörper kann eine hochsensitive immunologische Bestimmungsmethode erstellt werden. Mit dieser erfindungsgemässen Bestimmungsmethode ist der Nachweis auch von geringen Mengen (ng/ml) Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut bzw. im Serum möglich. Dies bedeutet eine wertvolle Erweiterung der Diagnostikmethoden. Üblicherweise werden im Serum normaler Individuen Konzentrationen von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte im Bereich von 100-150 ng/ml gefunden. Diese Konzentration ist bei Basalmembranveränderungen, wie z. B. bei experimentell erzeugtem Diabetes mellitus, statistisch signifikant erhöht. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens sind solche Veränderungen nunmehr schnell und sicher erfassbar. Die Erfindung betrifft: a) Ein Verfahren zur Herstellung von Heparansulfat-Proteo glykan niederer Dichte (Q = 1,33-1,39), das dadurch gekennzeichnet ist, dass Basalmembrangewebe in Gegen wart von Proteaseinhibitoren homogenisiert wird und Heparansulfat-Proteoglykan aus dem Geweberückstand ex trahiert wird und durch Ionenaustauschchromatographie mit anschliessender Molekularsiebchromatographie und Auf trennung im Dichtegradienten gereinigt wird, und das Produkt, das somit erhältlich ist. b) Ein Verfahren zur Produktion eines Serums mit hoch spezifischen Antikörpern gegen Heparansulfat-Proteogly kan, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Versuchstiere mit Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte immuni siert werden und ihr Serum gewonnen wird, und das Pro dukt, das somit erhältlich ist. c) Ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von He paransulfat-Proteoglykan, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Antigen Heparansulfat-Proteoglykan nied rer Dichte und/oder dessen antigene Determinanten in Körperflüssigkeit bestimmt werden. In der folgenden Beschreibung werden die aufgeführten Punkte näher erläutert bzw. in den Ansprüchen definiert. Das Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte lässt sich mit dem erfindungsgemässen Verfahren prinzipiell aus allen basalmembranhaltigen Geweben gewinnen. Bei diesem Verfahren wird auf die Reindarstellung von Basalmembranen völlig verzichtet. In Abhängigkeit von der Art des Gewebes erfolgt die Isolierung des Antigens direkt mit Hilfe hoher Konzentrationen chaotroper Salzlösungen oder nach der Entfernung störender Proteine, die mit Alkalisalzen extrahiert werden können. Geeignete chaotrope Salze sind beispielsweise Kaliumrhodanid, Guanidinrhodanid und Guanidinchlorid. Vorzugsweise wird Guanidinchlorid verwendet. Diese Salze werden in Konzentrationen von 1 - 8 molar eingesetzt wobei der Bereich von 4 bis 7 molar bevorzugt ist. Im Falle der Vorextraktion zur Entfernung störender Proteine gibt es, je nach Verunreinigung, mehrere Möglichkeiten: 1. Das Gewebe wird in wässriger Pufferlösung mit so hohen Alkalisalzkonzentrationen, dass keine Gewebsbestandteile in Lösung gehen, zerkleinert und homogenisiert. Bevor zugt werden NaCL oder KCl verwendet in 3,4 - 4 molarer Konzentration. 2. Man arbeitet in Gegenwart niedriger Salzkonzentrationen, bevorzugt Pufferlösungen mit 0,1 - 1 molarer Konzentra tion an NaCL oder KCl. 3. Man kombiniert 1 und 2. Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte wird nach der Vorextraktion wie oben erwähnt isoliert. Sowohl bei der eigentlichen Extraktion des Antigens wie auch bei der Vorreinigung wird vorzugsweise in Gegenwart von Proteaseinhibitoren und bei neutralem pH gearbeitet. Aus dem Extrakt wird dann Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte durch Ionenaustauschchromatographie, vorzugsweise an einem schwach basischen Kationenaustauscher wie z. B. DEAE Cellulose oder ein DEAE-vernetztes Dextran (z.B. (R) Sephadex, Pharmacia Fine Chemicals Inc.) in Gegenwart hoher Konzentration von Harnstoff bzw. dessen Derivaten gereinigt. Eine erste Feinreinigung erfolgt über Molekularsiebchromatographie. Man erhält so ein Produkt von ausreichender Reinheit zur Herstellung von Antikörpern. Eine anschliessende Dichtegradientenzentrifugation liefert ein Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte (Q= 1,33- 1,39 g/ml), das protein- und nucleinsäurefrei ist. Für das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren ist es entscheidend, dass ein geeignetes Antiserum gegen Heparansulfat Proteoglykan niederer Dichte zur Verfügung steht. Die Rerstellung der Antiseren kann in üblicher Weise durch subcutane oder intramusculäre Injektion an Versuchstieren, wie Meerschweinchen, Ziegen, Schafe, Esel und vorzugsweise Kaninchen, erfolgen. Zweckmässig wird dabei in Gegenwart von komplettem Freund'schen Adjuvans gearbeitet. Es können die in diesen Fallen üblichen Antigendosen angewendet werden. Die bevorzugte Dosis am Kaninchen ist 0,5 bis 1 mg pro Tier. Das gebildete Antiserum wird dann in der dem Fachmann bekannten Weise gewonnen und kann als solches verwendet werden. Es ist auch möglich, die im Serum vorhandenen Antikörper vor der weiteren Verwendung noch zu reinigen. Eine bevorzugte Methode dabei ist die Affinitätschromatographie, beispielsweise an Affinitätsmatrices, an die das Antigen kovalent gebunden wurde, z.B. bromcyanaktivierte epharose. Die, für die im folgenden aufgeführte immunologische Bestimmung, notwendige Markierung des Antigens kann in den für Proteinmarkierung bekannten Methoden erfolgen. Bs wird be vorzugt radioaktiv-, enzym- oder fluoreszenzmarkiert. Im Falle der radioaktiven Markierung wird als Radionuklid be vorzugt Jod 125 verwendet. Die Markierung kann dann nach der bekannten Ghloramin T Methode (Int. Arch. Allergy 29, 185, 1966) erfolgen. Das nach den obengenannten erfindungsgemässen Verfahren isolierte Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte sowie das Antiserum ermöglichen, wie bereits erwähnt, die erfin dungsgemässe Bestimmung von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte in Körperflüssigkeiten sowie dessen anti gene Determinanten, insbesondere im Serum, unter Anwendung der an sich bekannten immunologischen Nachweismethoden. Es können bei diesen Verfahren sowohl die bekannten Radio Immun-Assay-(RIA)-Varianten, als auch die Enzym-Immun Assay-Varianten und analoge Bestimmungen unter Verwendung andersartiger Markierung, beispielsweise Fluoreszenzmarkierung, Farbstoffmarkierung und dergleichen angewendet werden. Derartige Methoden sind dem Fachmann bekannt und sollen hier nicht im einzelnen aufgeführt werden. Bei diesen Nachweisreaktionen konkurriert das markierte Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte in bekannter Weise mit unmarkiertem Antigen, das in der zu bestimmenden Probe vorhanden ist, um den Antikörper, so dass im gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex die Menge markierten Antigens umso geringer ist, je mehr nicht markierte Antigene in der zu bestimmenden Probe enthalten sind. Es kann entweder die Markierung des Komplexes, beispielsweise die Radioaktivität oder die Enzymaktivität, oder die Markierung des Überstand des nach Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes verwendet werden, um anhand einer Eichkurve, die mittels Proben bekannten Gehaltes an Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte erstellt wurde, die in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Mengen Antigen festzustellen. Es wird bevorzugt die Markierung im Komplex bestimmt. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen immunologischen Methode besteht darin, die Abtrennung des mit dem spezifischen Antiserum gebildeten Antigen Antikörper-Komplexes mittels eines zweiten Antikörpers durchzuführen. Bevorzugt wird dazu ein gegen Immunglobulin G, der für die Gewinnung des spezifischen Antiserums verwendeten Tierart gerichteter Antikörper verwendet. Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von der Lösung kann mit hierfür üblichen Methoden wie Fällung, Zentrifugation oder Abfiltrieren erfolgen. Alternativ wird das Antiserum bzw. der zweite Antikörper an einen festen Träger gebunden. Nach Abtrennung des Antigen Antikörper-Komplexes wird dann die im Komplex enthaltene, bzw. die in der Lösung verbliebene Radioaktivität oder andere Markierung bestimmt. Eine andere Variante zur Bestimmung von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte kann auch dergestalt durchgeführt werden, dass der Antikörper gegen Immunglobulin G der betreffenden Tierart, z. B. vom Kaninchen, markiert ist, wobei ebenfalls die schon aufgeführten Markierungen geeignet sind, bevorzugt jedoch die Enzymmarkierung verwendet wird. Bei einem Enzym-Immun-Assay z.B. wird der nach Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes verbleibende Teil des Anti-Heparansulfat-Proteoglykan(niederer Dichte)-Serums bestimmt, indem man diesen an trägergebundenes Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte bindet und anschliessend mit enzymmarkiertem Antikörper gegen Immunglobulin G des Kaninchens zur Reaktion bringt. Die Menge gebundenen enzymmarkierten Antikörpers wird anschliessend durch Messung der Enzymreaktion bestimmt und ist der unbekannten Menge von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte in der Probe indirekt proportional. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1 Herstellung von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte a) Als Ausgangsmaterial wird Humanplacenta verwendet. Das Gewebe wird zwei- bis dreimal in einem 20-fachen Über schuss an 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris/HCl (pH 7,4) in Gegen wart der Proteaseinhibitoren Phenylmethansulfonsäure fluorid (PMSF) (2,5 mM), Quecksilbersalz der pChlor- benzoesäure (3 mg/ml), EDTA (10 mM) und N-Ethylmaleimid (NEM) (2,5 mM) homogenisiert und extrahierbares Protein durch Zentrifugation entfernt. Der Rückstand wird dann zweimal mit 6 M Guanidinchlorid, 0,05 M Tris/HCl pH 7,4 in Gegenwart der Proteaseinhibi toren bei 4"C extrahiert. Der Extrakt enthält Heparan sulfat-Proteoglykan. Durch Ionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose die in 7 M Harnstoff, 0,05 M Tris/HCl (pH 8,6), 0,5 mM EDTA, 0,5 mM NEM, 0,5 mM PMSF bei 4"C aquilibriert wurde und Elution mit einem Gradienten von 0-0,6 M NaCl wird Heparansulfat-Proteoglykan, welches in der zweiten Hälfte des Gradienten eluiert, weiter gerei nigt. Nach Molekularsiebchromatographie über ein Allyldextran vernetzt mit N-N'-Methylenbisacrylamid (z.B. (R) Sepha cryl S400, Pharmacia Fine Chemicals Inc.) äquilibriert in 6 M Guanidinchlorid 0,05 M Tris/HCl pH 7,4 mit den bei der DEAE Chromatographie verwendeten Inhibitoren und CsCl-Dichtegradientenzentrifugation in 6 M Guanidin chlorid-Puffer mit einer anfänglichen Dichte von 1,34 g/ml ( > 100.000 g, 8 h, 18"C) erhält man in der zentra len Portion des Gradienten ( f = 1,33-1,39 g/ml) ein He paransulfat-Proteoglykan niederer Dichte, das frei ist von Heparansulfat-Proteoglykan hoher Dichte, Glykopro teinen und Nukleinsäuren. b) Bei der Verwendung eines Mäusetumors [EHS-Sarkom, be schrieben bei Orkin et al., J. Exp. Med. 145, 204 - 220 (1977)3 als Ausgangsmaterial verfährt man gemäss 1a). Eine Vorreinigung zur Extraktion störender Proteine ist je doch nicht notwendig. Beispiel 2 Herstellung des markierten Antigens 25 ng von Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte werden mit 0,5 mCi Jod 125 nach der Chloramin T-Methode markiert und ungebundenes Jod durch Dialyse oder Gelfiltration an ei nem Polyacrylamid-Gel (z.B. (R) Biogel P2, Pharmacia Fine Chemicals Inc.) entfernt. Beispiel 3 Durchführung der immunologischen Bestimmung (RIA) Alle für die immunologische Bestimmung notwendigen Schritte werden in Gegenwart von 0,04 < eines nichtionischen Detergens wie z.B. Tween 20, ein polyethoxyliertes Sorbit Monolaurats, durchgeführt, Mindungskurven werden mit 1 ng markiertem Heparansulfat-Proteoglykan bestimmt. Die Konzentration an Reparansulfat-Proteoglykan in einer unbekannten Probe von Serum oder anderen Körperflüssigkeiten wird in folgendem Inhibitionstest bestimmt: Eine bestininte Menge des spezifischen Antikörpers oder Antiserum wird mit der unbekannten Probe 16 h bei 4 C vorinkubiert und nach Zugabe von 1 ng markierten Antigens weitere 8 Stunden bei 40C inkubiert. Danach wird ein Ueberschuss von Antikörpern gegen Kaninchen-Immunoglobulin G zugesetzt und nach weiteren 16 h bei 4"C das im Immunkomplex gebundene Antigen durch Zentrifugation abgetrennt. Die Inhibitonsaktivität der unbekannten Probe wird mit der Aktivität einer Standard-Kon- zentration nicht-markierten Antigens verglichen. Beispiel 4 Herstellung des Antiserum Kaninchen werden mit 0,5 - 1 mg Heparansulfat-Proteoglykan niederer Dichte pro Tier immunisiert, indem die Antigenlösung, gemischt mit gleichen Volumen komplettem Freund'schen Adjuvans, subcutan oder intramuskulär injiziert wird. 4 Wochen nach der ersten Injektion wird eine gleiche Menge Antigenlösung, gemischt mit komplettem Freund'schen Adjuvans subcutan oder intramuskulär injiziert. 4 bis 8 Wochen nach der 2. Injektion wird das Blut gewonnen und daraus nach Gerinnung das Antiserum erhalten.

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A process for the preparation of low density (ρ = 1.33-1.39) heparan sulfate-proteoglycan, which comprises basement membrane tissue from human placenta a) being homogenized and extracted with 3.4 to 4 molar alkali metal salt solution and/or with 0.1 to 1 molar alkali metal salt solution in the presence of protease inhibitors, b) the residue being extracted with a 1 to 8 molar chaotropic salt solution in the presence of protease inhibitors and, from the resulting extract, c) the said low-density heparan sulfate-proteoglycan being purified by ion exchange chromatography followed by molecular sieve chromatography and fractionation in a density gradient. A process for the production of highly specific sera containing antibodies against low-density (ρ - 1.33-1.39) heparan sulfate-proteoglycan obtainable as claimed in claim 1, which comprises immunization of experimental animals with the said low-density heparan sulfate-proteoglycan, and obtaining of their serum. A method for the immunological determination of low-density heparan sulfate-proteoglycan, which comprises determination of the antigen low-density heparan sulfateproteoglycan, and/or of its antigenic determinants, in body fluids, with the aid of antibodies obtainable as claimed in claim 2. A low-density (ρ = 1.33-1.39) heparan sulfateproteoglycan which is obtainable by the process as claimed in claim 1. A highly specific serum containing antibodies against low-density (ρ = 1.33-1.39) heparan sulfateproteoglycan, which is obtainable by the process as claimed in claim 2. The method as claimed in claim 3, wherein a) the said antigen or its antigenic determinants in body fluids is reacted with a defined amount, which is in excess relative to the sample which is to be investigated, of antibodies, there being formation of an antigen-antibody complex, and b) the said antibodies from the said antigen-antibody complex are quantified. The method as claimed in claim 6, wherein for the quantification a) the amount of antibodies, which is in excess relative to the sample, is reacted with an excess of labeled antigens, in addition to the antigens present in the sample to be investigated, and b) the resulting product is separated into antigenantibody complex and supernatant, and c) the amount of labeled antigen is determined either in the complex or in the supernatant after removal of the complex. The method as claimed in claim 3, wherein the labeled antigen is radioactively, enzyme- or fluorescence-labeled. The method as claimed in claim 6, wherein for the quantification a) the amount, which is in excess relative to the sample, of antibody, is reacted with an excess of antigen which is bound to a carrier, and then b) the antigen-antibody complex from a) is reacted with an excess of a second, labeled, antibody, and c) the product resulting from b) is separated into antigen-antibody complex and supernatant containing free, labeled, second antibodies, and d) the amount of the second, labeled, antibody is determined either in the complex or in the supernatant. The method as claimed in claim 8, wherein the second, labeled, antibody is radioactively, enzyme- or fluorescence-labeled. Claims for the following Contracting State : AT A process for the preparation of low density (ρ = 1.33-1.39) heparan sulfate-proteoglycan, which comprises basement membrane tissue from human placenta a) being extracted with 3.4 to 4 molar alkali metal salt solution and/or with 0.1 to 1 molar alkali metal salt solution in the presence of protease inhibitors, b) the residue being extracted with a 1 to 8 molar chaotropic salt solution in the presence of protease inhibitors and, from the resulting extract, c) the said low-density heparan sulfate-proteoglycan being purified by ion exchange chromatography followed by molecular sieve chromatography and fractionation in a density gradient. A process for the production of highly specific sera containing antibodies against low-density (ρ = 1.33-1.39) heparan sulfate-proteoglycan obtainable as claimed in claim 1, which comprises immunization of experimental animals with the said low-density heparan sulfate-proteoglycan, and obtaining of their serum. A method for the immunological determination of low-density heparan sulfate-proteoglycan, which comprises determination of the antigen low-density heparan sulfateproteoglycan, and/or of its antigenic determinants, in body fluids, with the aid of antibodies obtainable as claimed in claim 2. The method as claimed in claim 3, wherein a) the said antigen or its antigenic determinants in body fluids is reacted with a defined amount, which is in excess relative to the sample which is to be investigated, of antibodies, there being formation of an antigen-antibody complex, and b) the said antibodies from the said antigen-antibody complex are quantified. The method as claimed in claim 4, wherein for the quantification a) the amount of antibodies, which is in excess relative to the sample, is reacted with an excess of labeled antigens, in addition to the antigens present in the sample to be investigated, and b) the resulting product is separated into antigenantibody complex and supernatant, and c) the amount of labeled antigen is determined either in the complex or in the supernatant after removal of the complex. The method as claimed in claim 5, wherein the labeled antigen is radioactively, enzyme- or fluorescence-labeled. The method as claimed in claim 4, wherein for the quantification a) the amount, which is in excess relative to the sample, of antibody, is reacted with an excess of antigen which is bound to a carrier, and then b) the antigen-antibody complex from a) is reacted with an excess of a second, labeled, antibody, and c) the product resulting from b) is separated into antigen-antibody complex and supernatant containing free, labeled, second antibodies, and d) the amount of the second, labeled, antibody is determined either in the complex or in the supernatant. The method as claimed in claim 8, wherein the second, labeled, antibody is radioactively, enzyme- or fluorescent-labeled.

Inventors: BROCKS, DIETRICH, DR., PAULSSON, MATS, DR., TIMPL, RUPERT, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
Application year: 1986
Main classification: A61K37
IPC codes: C07K14, C07K19, G01N33