METHOD TO DETERMINE THE BINDING CAPACITY OF THYROXINE-BINDING GLOBULIN

Abstract: 1. Process for the determination of the binding capacity of thyroxine-binding globulin (TBG) according to the principle of heterogeneous enzyme immune assay, characterised in that one incubates the serum sample to be investigated with an enzyme-labelled T4 or T3 , in which T4 or T3 and enzyme are bound via a spacer, and immobilised antibody against TBG or T4 or dissolved antibody against TBG or T4 and immobilised antibody against the Fc part of the antibody against TBG or T4 , separates the phases and measures the labelling enzyme in one of the phases.

Description: Beschreibung Die Erfindung betrifft ein heterogenes Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG), auch als T-Uptake bezeichnet. Die Thyroid-Hormone liegen im Blut weitgehend in proteingebundener Form vor. Dabei bindet Thyroxin (T4) insbesondere an das Thyroxin bindende Globulin (TBG). Die Bestimmung der Bindungskapazität von TBG ist im Rahmen der Schilddrüsendiagnostik von besonderer Bedeutung. Ausserdem korreliert in der überwiegenden Anzahl der Fälle das Produkt aus Gesamt-T4-Konzentration und 1/TBG gut mit der FT4-Konzentration. (L. R. Witherspoon, Journal of Clinical Immunoassay 7,'(1984)). Bekannte Verfahren zur Bestimmung der TBG-Bindungskapazität sind in DE-A 28 25 650 der gleichen Anmelderin beschrieben. Der Nachteil der bekannten Verfahren liegt darin, radioaktive Markierungen verwenden zu müssen und/oder lange Inkubationszeiten (z. B. 2 Stunden) in Kauf nehmen zu müssen. Das Verfahren der DE-A 28 25 560 weist ebenfalls noch gewisse Nachteile auf die darauf beruhen, dass es sich um ein kompetitives Verfahren handelt und sowohl T4 als auch T4-Enzym-Konjugat zugegeben werden müssen. Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, welches nicht kompetitiv abläuft, ohne radioaktives Material auskommt, nur kurze Zeiten benötigt und bei einfachster Testführung hohe Genauigkeit aufweist. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG) nach dem Prinzip des heterogenen Enzymimmunassays, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die zu untersuchende Serumprobe mit enzymmarkiertem T4 oder T3 und immobilisiertem Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert, die Phasen trennt und das Markierungsenzym in einer der Phasen misst. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich bei einfachster Testführung in kurzer Zeit mit maximal 15 Minuten Inkubationszeit durchführen. Im Gegensatz zu allen bekannten heterogenen Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität von TBG, die mit immobilisierten Anti-T4-Antikörpern arbeiten, so dass bei ihrer Durchführung TBG bzw. Anti-T4-Antikörper um das T4 bzw. ein T4-Konjugat konkurrieren, arbeitet die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahren mit immobilisierten Anti-TBG-Antikörpern. Es ist auch als sehr überraschend anzusehen, dass bei der erfindungsgemässen Verfahrensführung exakte Resultate erhalten werden, da es bekannt war, dass enzymmarkiertes oder T4 nicht von den Serumproteinen (TBG) gebunden wird. Auf diesen speziellen Eigenschaften beruht sowohl das der FR-A 81 17 997 (Corning) als auch das in der DE-A 28 25 650 beschriebene Verfahren. Als Enzymmarkierung für das T3 oder T4 können im Rahmen der Erfindung alle hierfür geeigneten, leicht bestimmbaren Enzyme verwendet werden, wie sie dem Fachmann zahlreich bekannt sind. Bevorzugte Beispiele hierfür sind Peroxidase und B-Galactosidase. Vorzugsweise wird das Enzym über ein Distanzstück (Spacer) an das Hormon gekoppelt, wobei die Distanzlänge 3 bis 8 C-Atome, vorzugsweise 4 bis 5 C-Atome betragen soll. Die Kopplung erfolgt beispielsweise über einen aktiven Ester des Hormons oder des Hormonderivats. Als Spacer für die Verbindung von T4 bzw. T3 und Markierungsenzym werden besonders bevorzugt AminobuttersÅaure oder Glycylglycin und zwar zweckmässig in Form ihrer Hydroxysuccinimidester verwendet. Das enzymmarkierte T4 oder T3, im folgenden als Konjugat bezeichnet, wird beim erfindungsgemässen Verfahren in solcher Konzentration eingesetzt, dass T4 nicht merklich aus dem im Serum vorhandenen TBG-T4-Komplex verdrängt wird. Bevorzugt wird deshalb das Konjugat im Unterschuss gegenüber der zu erwartenden TBG-Gesamtkonzentration eingesetzt. Als Konjugat wird vorzugsweise ein solches verwendet, bei dem das molekulare Verhältnis von T4 bzw. T3 zum Markierungsenzym, wie insbesondere ss-Galactosidase 1 bis 5 : 1 beträgt. Aufgrund seiner grösseren Bindungskapazität wird beim Verfahren der Erfindung bevorzugt mit einem T4-haltigen Konjugat gearbeitet, was zu einer besseren Empfindlichkeit führt. Die Erfindung lässt sich jedoch in gleicher Weise auch mit T3-Konjugat durchführen. Als Anti-TBG-Antikörper kann ein polyklonaler wie auch ein monoklonaler Antikörper, wobei letzterer bevorzugt wird, oder ein Fragment eines solchen Antikörpers, verwendet werden. Die Immobilisierung des Antikörpers kann in bekannter Weise erfolgen derart, dass der Antikörper direkt an den Träger gebunden wird oder unter Ausnützung seiner immunologischen Bindefähigkeit über einen immobilisierten Anti-Antikörper oder ein Fragment desselben fixiert wird. Die Immobilisierung des Anti-TBG-Antikörpers über einen an die feste Phase gebundenen Anti-Antikörper oder ein Fragment davon hat den grossen Vorteil, dass der wertvolle Anti-TBG-Antikörper praktisch zu 100 % aktiv gebunden wird und damit in geringerer Menge eingesetzt werden kann als bei direkter Fixierung, die immer mit einem gewissen Aktivitätsverlust verbunden ist. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Ausführungsform, bei welcher ein gegen den Fc-Teil des Anti-TBG-Antikörpers gerichteter immobilisierter Antikörper verwendet wird, der mit dem gelösten Anti-TBG-Antikörper unter Fixierung des letzteren umgesetzt wird. Die obigen Ausführungen gelten analog, wenn anstelle von Anti-TBG-Antikörper Anti-T4-Antikörper verwendet wird. Das Verfahren der Erfindung kann zweistufig durchgeführt werden, wobei in erster Stufe die Probe mit dem Konjugat inkubiert und in zweiter Stufe dann mit dem immobilisierten Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert wird. Soweit hierbei Anti-T4- Antikörper verwendet werden, wird die zweite Inkubation zweckmässig nicht länger als 5 Minuten, vorzugsweise 0,5 bis 2 Minuten, durchgeführt. Bei darüberhinausgehender Dauer der zweiten Inkubation können Konkurrenz reaktionen auftreten, welche die Genauigkeit herabsetzen. Bei Verwendung von Antikörpern gegen TBG wird das Verfahren bevorzugt auch einstufig durchgeführt, derart, dass alle Komponenten, auch die feste Phase gleichzeitig zusammengegeben werden. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung. In dieser stellen dar: Fig. 1 eine Eichkurve, die mit dem erfindungsgemässen Verfahren mit Proben, deren TBG-Bindungskapa zität bekannt war, erhalten wurde und Fig. 2 einen Vergleich der erfindungsgemäss erhalte nen Werte (Ordinate) mit den Werten eines bekannten Verfahrens (Abszisse). Beispiel 1 1. Reagenzien: a) Puffer: 100 mmol/l Hepes 2 mmol/l Mg-Aspartat 1 % RSA 0,9 % NaCl 2 o/oo oberflächenaktives Mittel (Tween), pH = 7,25 (370C) b) T4-B-Galactosidase: 600 mU/ml Puffer c) monoklonaler Antikörper (gerichtet gegen TBG); 108 ssg/ml (Die Entwicklung des monoklonalen Antikörpers erfolgte nach der Methode von Köhler und Milstein (Eur. J. Immunol. 6, 292- (1976), als Immunogen wurde TBG verwendet). d) immobilisierter Antikörper (gerichtet gegen Fc-Teil des monoklonalen Antikörpers). Der Antikörper wurde durch Immunisierung von Schafen mit Fc-Teilen von Maus-Immunglobulinen nach üblichen Verfahren gewonnen. Das Anti serum wurde über Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgerei nigt. Die Fixierung des Antikörpers auf Filterpa pier erfolgte nach der von P. Gemeiner und M. Pasteka in Applied Biochemistry and Biotechnology 8, 381-393 (1983) beschriebenen Plethode zur Herstellung von Protein-Cellulose Konjugaten durch reduktive Alkylierung von perDodatoxidierter Cellulose. Angeboten wurden 15 mg gereinigter Antikörper/g Papier. Nach Kupplung wurde das Papier mit H2 0 und RSA-haltigem Phosphatpuffer gewaschen und bei 35"C getrocknet. e) Chlorphenolrotgalactosid (CPRG)-Vlies: 0,25 ssmol/5 mg Papier, hergestellt nach DE-A 33 45 748. Testdurchführung: Serum wird im Volumenverhältnis von 1:75 mit folgendem Gemisch verdünnt: 172 1 Puffer 30 ssl T4-ss-Galactosidaselösung 20 Fl tEK < TBG > -Lösung (monoklonaler Antikör per gegen TBG) Nach 5 Minuten Inkubation bei 37"C lässt man 50 1 des Gemisches von 10 mg des gemäss d) hergestellten Kupplungs-Papieres aufsaugen und inkubiert weitere 5 Minuten bei 370C. Durch anschliessende Zentrifugation wird die - Flüssigkeit, die-den ungebundenen Anteil an T4-B-Galactosidase enthält, vom Papier abge trennt, über das Chlorphenolrotgalactosid Vlies geleitet und die Enzymkinetik (mE/min) bei 37"C und 578 nm in einer Mikroküvette mit einem Füllvolumen von 27 iil und einer Schicht dicke von 0,6 cm gemessen. Die Umrechnung des Messsignals in TBG-Bindungs kapazitätswerte erfolgt über eine Eichkurve, die mit Proben, deren TBG-Wert bekannt ist, erhalten wurde (Fig. 1). Fig. 2 zeigt einen Methodenvergleich: Abszisse: Thyroxin-Bindungskapazität im Serum (%),erhalten mit einem Radioassay Ordinate: TBG-Bindungskapazität (%), erhalten gemäss Beispiel. Stand. Hauptkomp. Analyse: Y - 1.325 + 1.049 X Korrelations koeffizient: 0.964. 2. Herstellung des T4-B-Galactosidase-Konjugats mit Aminobuttersäure als Spacer N-tertiär-Butyloxycarbonyl-Thyroxin (BOC-T4) wird aus Thyroxin-Na-Salz und Di-tertiärbutyldicarbonat analog der in Eu-A 01 08 400 angegebenen Vorschrift hergestellt. N-tertiär-Butioxycarbonyl-thyroxinyl-hydroxysuccini midester (BOC-T;4-OSu) wird aus 0,5 mmol BOC-T4, 3,6 mmol N-Hydroxysuccinimid und 3,6 mmol Dicyclohexyldiimid analog der Vorschrift zur Darstellung von BOC-Phenylalanin-OSu hergestellt (Houben-Weyl, Methoden der anorganischen Chemie Band XV/2, Jahrgang 74, S. 150). Der nach Eindampfen erhaltene Rückstand wird in Essigester gelöst und durch Zugabe von-Petrolether ausgefällt. N-tertiär-Butyloxycarbonyl-thyroxinyl-aminobuttersäure-hydroxy-succinimidester (BOC-T4-Abs-OSu) wird folgendermassen dargestellt: Zu einer Lösung von 0,5 g BOC-T4-OSu in 8 ml Dioxan wird eine Lösung von 0,27 g Aminobuttersäure in 0,5 ml 0,1 m Phosphatpuffer pH 8,5 getropft. Nach zweistündiger Reaktionszeit wird angesäuert und mit Essigester ausgeschüttelt. Die Essigesterphase wird mit H2 0 gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Ethylenglycoldimethylether gelöst und mit 0,07 g N-Hydroxysuccinimid und 0,12 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 12stündiger Reaktionszeit wird abfiltriert. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand in Essigester gelöst und BOC T4 Abs OSu mit Petrolether ausgefällt. DC (HPTLC, RP 18; Laufmittel: Nitromethan/Ethanol 9:-1) Pxf: 0,77 H-NMR (d6-Dimethylsulfoxid), d(ppm): 1,32 (s, 9H), 1,77 (m, 4H), 2,80 (s, 4H), 7-,03 (s,-2H), 7,79 (s, 2H). 15,8 mg B-Galactosidase werden in 2,5 ml 0,01 m Phosphatpuffer, pH = 7,0 gelöst. Unter Eiskühlung werden 0,307 ml einer 0,1%gen Lösung von BOC-T4 Abs-OSu langsam zugegeben. Das erhaltene Konjugat wird über Gelfiltration entsalzt und über Sphero sil gekuppeltes TBG affinitätschromatographisch gereinigt. Beispiel 2 a) Puffer: 110 mmol/l Hepes, 2,2 mmol/l Mg-Aspartat, 1 % RSA, 0,9 % May1, 2 o/oo Tween, pH = 7,25 (370C) b) T3-B-Galactosidase: 125 mU/ml Puffer c) Auf Papier immobilisierter Antikörper, gerichtet gegen TBG Die Antikörper wurden durch Immunisierung von Schafen mit TBG nach üblichem Verfahren gewonnen. Die Antikörper wurden nach Ammoniumsulfatfällung und DEAE-Cellulose-Chromatographie zusätzlich über an Spherosil gekuppeltes TBG immunsorptiv gerei nigt. Die Fixierung des Antikörpers an Papier erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. Angeboten wurden 20 mg gereinigter Antikörper/g Papier. d) Chlorphenolrotgalactosidlösung (5 mmol/l) Puffer: 100 mmol/l Hepes, 2 mmol/l Mg-Aspartat, 0,5 % RSA, 0,9 % NaCl, 2 o/oo Tween. Testdurchführung: Serum wird im Volumenverhältnis von 1:10 mit T3-ss- Galactosidaselösung verdünnt. 50 ijl dieses Gemisches werden von 10 mg des TBG-Antikörper tragenden Papiers aufgesaugt und 10 Minuten bei 370C inkubiert. Zur Entfernung von ungebundener T3-ss-Galactosidase wird das Papier dreimal mit je 100 ssl Puffer gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang die Waschlösung durch Zentrifugation entfernt wird. Anschliessend wird das Papier mit 50 1 Chlorphenolrotgalactosidlösung getränkt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37"C wird die gebildete Farbstofflösung durch Zentrifugation vom Papier abgetrennt und in einer Mikroküvette mit einem Füllvolumen von 27 ssl und einer Schichtdicke von 0,6 cm bei einer Wellenlänge von 578 nm gemessen. Die gemessene Extinktion ist proportional der Bindungskapazität der Probe. Probe XE578nm (bezogen auf eine Schichtdicke von 1 cm) Serum mit niedriger 357 mE Bindungskapazität T3U (Radioassay): 59 % TBG Z 2 g/ml Serum mit normaler 1351 mE Bindungskapaz ität T3U: 28 % TBG: 16 iig/ml Herstellung des T3-B-Galactosidasekonjugats Die Herstellung des N-tertiär-Butyloxycarbonyl-trijod- thyronins (BOC-T3) und des N-tertiär-Butyloxycarbonyltrijodthyronin-hydroxysuccinimidesters (BOC-T3-OSu) erfolgt analog wie in Beispiel 1 beschrieben. BOC-T3-OSu: DC (HPTLC, RP 18, Laufmittel: Nitromethan/ Ethanol 9:1) Rf = 0,6 Die Umsetzung der B-Galactosidase mit BOC-T3-OSu und die anschliessende Aufreinigung wird ebenfalls wie im Beispiel 1 durchgeführt. Beispiel 3 Reagenzien: a) Puffer: 100 mMol/l Hepes 2 mMol/l Mg-Aspartat 1 % RSA (Rinderserumalbumin) 0,9 % NaCl 2 o/oo Tween, pH = 7,25 (370C) b) T4-B-Galactosidase: 170 mU/ml Puffer (Herstellung nach Beispiel 1) c) Auf Papier immobilisierter Anti-T4-Antikörper (S < T4 > -Papier). Die Antikörper wurden durch Immunisierung von Schafen mit T4, , das über Glutardialdehyd an Rinder- serumalbumin gebunden ist, nach üblichem Verfahren gewonnen. Das Antiserum wurde über Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgereinigt. Die Fixierung des Antikörpers an Papier erfolgte analog, wie im Beispiel 1 beschrieben. Eingesetzt wurden 10 mg gereinigter Antikörper/g Papier. d) Chlorphenolrotgalactosid (CPRG)-Vlies: 0,25 ssmol/5 mg Papier (wie im Beispiel 1) Testdurchführung: Serum wird im Volumenverhältnis von 1:20 mit folgen dem Gemisch verdünnt: 140 rl Puffer a) 50 ssl T4-B-Galactosidaselösung b) Nach 5 Minuten Inkubation bei 370C lässt man 50 ssl des Gemisches von 10 mg des S < T4 > -Papiers c) aufsaugen und inkubiert weitere 5 Minuten bei 370C. Durch anschliessende Zentrifugation wird die Flüssig keit, die die Komplexe aus TBG und T4-ss-Galactosi dase enthält, vom Papier abgetrennt, über das Chlor phenolrotgalactosid-Vlies d) geleitet und die Enzym kinetik (mE/min) bei 37"C und 578 nm in einer Mikro küvette mit einem Füllvolumen von 27 iil und einer Schichtdicke von 0,6 cm gemessen. Die Umrechnung des Messsignals in T-uptake-Werte erfolgt über eine Eichkurve, die mit Proben, deren uptake-Wert bekannt ist, erhalten wird EMI12.1 <tb> Serum <SEP> au578 <SEP> nm <SEP> T-uptake <SEP> T3U <SEP> TBG <tb> <SEP> bezogen <SEP> auf <SEP> % <SEP> <SEP> (Radioassay) <SEP> (Elisa) <tb> <SEP> Schichtdicke <SEP> % <SEP> <SEP> ssg/ml <SEP> <tb> <SEP> von <SEP> 1 <SEP> cm <tb> <SEP> 1 <SEP> 665 <SEP> mE <SEP> 42,3 <SEP> 40,1 <SEP> 5,6 <tb> <SEP> 2 <SEP> 1028 <SEP> mE <SEP> 28 <SEP> 28,2 <SEP> 14,6 <tb> <SEP> 3 <SEP> 947 <SEP> mE <SEP> 30,5 <SEP> 30,0 <SEP> 12,0 <tb> <SEP> 4 <SEP> 1129 <SEP> mE <SEP> 25 <SEP> 18,3 <SEP> 18,6 <tb>

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG) nach dem Prin zip des heterogenen Enzymimmunassays, dadurch gekennzeichnet, dass man die zu untersuchende Serumprobe mit enzym markiertem T4 oder T3 und immobilisiertem Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert, die Phasen trennt und das Markierungsenzym in einer der Phasen misst. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man mono klonalen Anti-TBG-Antikörper verwendet. 3. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man gelösten Antikörper gegen TBX oder T4 und immobilisierten Antikörper gegen den Fc-Teil des Antikörpers gegen TBG oder T4 verwendet. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein T4- oder T3-Enzymkonjugat verwendet, bei dem T4 bzw. T3 und Enzym über einen Spacer gebunden sindt 5. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass ein Spacer mit einer Länge von 3 bis 8 C-Atomen verwendet wird. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren zweistufig durchführt und in erster Stufe die Probe mit dem enzymmarkierten T3 oder T4 inkubiert und in zweiter Stufe mit dem immobilisierten Antikörper gegen T4 oder TBG inku biert. 7. Verfahren nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man bei Verwendung von Anti-T4-Antikörper die zweite Inku bationsstufe nicht länger als 5 Minuten durchführt. 8. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass als Spacer Aminobuttersäure oder Glycylglycin verwendet wird.

Inventors: ALBERT, WINFRIED, DR. PHIL., DRAEGER, BRIGITTE, DR.RER.NAT., JUNIUS, MARTINA, DR.RER.NAT.
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1986
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33