DNA fragment containing the cyclodextrin-glycosyl-transferase gene, expression vector, microorganisms for expression and preparation process

Abstract: DNA fragments containing the cyclodextrin glycosyltransferase structural gene are prepared as described.

Description: DNA-Fragment mit dem Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Struk turgen, Expressionsvektor, Nitroorganismen zur Expression und Herstellungsverfahren Cyclodextrine sind Abbauprodukte der Stärke. Sie entstehen bei der Hydrolyse von Stärke durch das Enzym Cyclodextrin- Glycosyl-Transferase (CGT; E.C.2.4.1.19). Cyclodextrin-Glyco- syl-Transferasen sind bisher für 3acillus macerans (z. B. ATCC 8514), Bacillus megaterium (Carbohydr. Res., 61 (1978) 229 - 238), alkalophile Bacillus-Species (z. B. ATCC 21594, 21595, 21783, 31006 und 31007) sowie bei Klebsiella pneumoniae (z. 8. M5al; auch. microbiol., 111 (1977) 271 - 282) beschrieben worden. CGT aus Klebsiella pneumoniae (z. B, M5a1) ist ein monomeres Polypeptid mit einem '.8olekulargewicht von etwa 69000 D. Dieses Polypeptid wird vom 3akterium als Vorläuferprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 73000 D synthetisiert und unter Abspaltung eines Signalpeotids von 30 Aminosäureresten aus der Zelle ins Medium ausgeschleust. Die Synthese des Enzyms wird strikt repuliert, insbesondere unterliegt sie einer Katabolitrepression und der Induktion. Cies bedeutet, dass das Enzym nur synthetisiert wird, wenn beispielsweise Klebsiella pneumoniae M5a1 auf Stärke, Cyclodextrinen oder Maltooligosacchariden wächst. Wächst das Bakterium auf anderen Kohlenstoffquellen, so wird die Enzymsynthese unterdrückt bzw. nicht induziert. Da der Einsatz von :altoolioosacchariden und Cyclodextrinen aus Kostenqviinden nicht in Frage kommt, werden befriedieende Ausbeuten an CGT nur durch kontinuierliche Anzucht von Klebsiella pneumoniae M5a1 erzielt, wobei Stärke als Kohlenstoffquelle limitierend zugegeben werden muss. Da die Stärke aufgrund ihrer Eigenschaften (schlechte Löslichkeit, hohe Viskosität der Lösung) ein schwer handhabbares Substrat ist, ergeben sich bei der Fermentation erhebliche Probleme. Kritisch ist auch die Anwendung von CGT des potentiell pathogenen Bakteriums Klebsiella pneumoniae, insbesondere im Lebensmittelbereich und im pharmazeutischen Bereich. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Lebendmaterial bereitzustellen, mit dem eine oder mehrere der folgenden Teilaufgaben gelöst werden können: - CGT soll in möglichst grosser enge gebildet werden. - Die Regulation der Enzymsynthese soll so verändert werden, dass sie leicht handhabbar wird, also eine Fermentation mit problemlosen Kohlenstoffquellen möglich macht. - Es sollen nicht-pathogene Mikroorganismen, insbesondere Bakterien vorgesehen werden, die CGT produzieren, wobei diese Nikroorganismen das Enzym auch im Lebensmittelbereich und pharmazeutischen Bereich einer Nutzung zugänglich machen sollen. Erfindungsaemäss werden dazu DNA-Fragmente vorgesehen, die das Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Strukturgen (CGT-Strukturgen) umfassen und ferner DNA-Fragmente, deren Einzelstränce mit denen der DNA-Fraemente, die das CGT-Stru4turgen umfassen, ei mindestens 20 C und insbesondere bei einer Konzentration von 1 P NaGl und einer Temperatur von mindestens 25 C hybricisierbar sind. Den genannten DNA-Fragmenten können die Signal- strukturen für ihre Expression fehlen. Die Erfindung betrifft insbesondere derartige DNA-Fragmente mit etwa 2068 F3asenpaaren (bp), wobei diese DNA-Fragmente mit dem Restriktionsenzym MaeI aus DNA-Strukturen von Mikroorganismen herausschneidbar sind, die CGT produzieren. BeisDiele für Spezies und Stämme derartiger ikroorganismen wurden eingangs genannt. Der Fachmann kann sich geeignete Stämme aber auch aus Bodenproben isolieren. Die Erfindung betrifft ferner - Expressionsvektoren, die die genannten DNA-Fragmente umfassen; - tac-Promotor-Plasmide, wie pKK223-3 und pJF118u; Promotor-Plasmide, wie pPL-Lambda; und trp-Promotor-Plasmide, wie pDR720; die jeweils die genannten DNA-Fraomente umfassen; - nicht-pathogene, technisch-kultivierbare Mikroorganismen, die die genannten Expressionsvektoren umfassen; - nicht-pathogene, technisch-kultivierbare Bakterien als Beispiel für Mikroorganismen, die die genannten Exoressionsvektoren umfassen; und - derartige Mikroorganismen, insbesondere derartige Bakterien, die als Nahrungsmittelzusatz zugelassen sind. Erfindungsgemäss wird schliesslich ein Verfahren zur Herstellung der genannten DNA-Fragmente, der genannten Expressionsvektoren und der genannten Nikroorganismen vorgesehen, bei dem man (a) von Mikroorganiamen ausgeht, die CGT oroduzieren, deren Genom isoliert und statistisch zerkle-nert, und (b) die gewonnenen Genom-Fragmente in Vektoren einsetzt, die rekombinanten Vektoren in Kultivierbare Mikroorganismen Überführt, auf solche Klone screent, die OGT oroduzieren, und diese Klone isoliert, (c) und/oder die rekombinanten Vektoren aus den CGT-produzierenden Klonen isoliert, (d) und/oder DNA-Fragmente, die das CGT-Strukturgen umfassen, aus den rekombinanten Vektoren herausschneidet, e) und/oder die herausgeschnittenen DNA-Fragmente in Expres sionsvektoren einsetzt (f) und/oder die gewonnenen rekombinanten Expressionsvektoren in nicht-pathogene, technisch-kultivierbare Mikroorganismen überführt. Erfindungsgemäss werden also rekombinante DNA-!ethoden annewen- det, um das für die Kodierung von CGT verantwortliche Gen in einen Vektor zu übertragen. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann eine hohe Kopienzahl des Gens sowie - durch gezielte Veränderung der Regulation der Genexpression - das Enzym in grosser Konzentration erhalten werden. Demgemäss können der Kulturüberstand oder der Zellrohextrakt direkt oder in immobilisierter Form für die Bildung von Cyclodextrinen einsetzbar sein. Bei der Stufe (a) geht man also von Mikroorganismen-Spezies oder -Stämmen aus, die CGT produzieren, beispielsweise von Klebsiella pneumoniae M5a1. So kann man beispielsweise bei Klebsiella pneumoniae M5a1 die Gesamt-DNA isolieren, die das Gen für CGT enthält. Dies kann durch Anzucht des Stammes in einem geeigneten Nährmedium bei 30 bis 37 OC, anschliessende Lyse der Zellen und Reinigung der DNA durch Dichteoradienten- zentrifugation und Dialyse geschehen. Verwendet man also beispielsweise Klebsiella pneumoniae M5a1, so kann man deren Gesamt-DNA und auch die Do'A des einzusetzenden Vektors durch Inkubation mit der Pestrlktionsendonuklease PstI (E.C.3.1.23.31) bei etwa 37 C inkubieren, bis die Dr!A- Moleküle vollstandig gespalten sind. Anschliessend kann man Ce Endonuklease inaktivieren. Durch Gelelektrophorese können die erhaltenen Fragmente der Gesamt-DNA aus Klebsiella pneumoniae M5a1 aufgetrennt und Fragmente mit einer Länge von etwa 5400 Basenpaaren isoliert werden. Die Rekombination der erhaltenen etwa saco Basenpaare langen DkA-bruchstücke mit dem gespaltenen Vektor kann dadurcn erfolgen, dass man die Fragmente mischt und die Lösung mit einer geeigneten DNA-Ligase inkubiert, bevorzugt mit der DNA-Ligase des Phagen T4 (E.C.6.5.1.1). Die Ligation erfolgt bevorzugt in Gegenwart von ATP, einer Sulfhydryl-Verbindung und ::agne- siumionen. Mit der gewonnenen rekombinanten DNA werden in bekannter reise sogenannte kompetente Stämme transformiert, die die Fähigkeit zur Aufnahme von DNA besitzen. Als transformierbare Stämme können im Rahmen der Erfindung die hierfür bekannten Stämme benutzt werden. Es handelt sich insbesonere um Stämme von E. coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae. Bei diesem ersten Transformationsschritt werden Stämme von E. coli, wie HB101 (DSM 1452; J. Mol. Biol., 41 (1966) 459 - 472). Der Fachmann ist mit der t.ahl von Vektoren vertraut, die für die eingesetzten, zu transformierenden Zellen geeignet sind. Rei der Verwendung von Stämmen von E. coli oder Klebsi- ella pneumoniae kommen für den ersten Rekombinationsschritt (b) des erfindunnsgemäQen Verfahrens beisoielsweise die Plasmide pER322 (Nucl. Acids Res.; 5 (1978) 2721 - 2728) und pHE3 (Gene, 19 (1982) 231 - 234) in Betracht. Um nach dem ersten Transformationsschritt des erfindunosgemä lesen Verfahrens diejenien Zellen aufzufirden, die den das Gen für CGT tragenden Vektor enthalten, kann man die transformierten Zellen auf einem inimalmedium anziehen, das Stärke als Kohlenstoffquelle, die notwendigen Salze und Supplernente, ein Antibiotikum zur Selektion des Vektors und Amylonectin- Azur als Indikator für Stärkeabbau enthält. Die Zellen, die den das Gen für CGT tragenden Vektor enthalten, bilden einen farblosen Abbauhof und werden isoliert. Fijr einen zweiten Rekombinationsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens kann man bei den Stufen (c) unc (d) aus den isolierten Zellen nach bekannten methoden die Plasmid-DNA oewinnen und mit einer Restriktionsendonuklease DA-Fragmente herausschneiden, die das CGT-Strukturgen umfassen. Ein bevorzugtes Restriktionsenzym ist MaeI (E.C.3.1.23.-), mit dem man beispielsweise bei etwa 45 OC partiell spaltet. Durch beispielsweise Gelelektrophorese werden die erhaltenen Fragmente der das Gen für CGT enthaltenden Plasmid-DNA aufgetrennt. Wurde mit der Restriktionsendonuklease laeI geschnitten, so wird ein Fragment mit einer Länge von etwa 208 Basenpaaren isoliert, das das Strukturgen für CGT, nicht aber die Sional- strukturen für seine Expression trägt. Die 5'-überhängenden Enden des Fragments kann man durch Inkubation mit einer geeig- neten DNA-Polymerase mit Desoxy-ATP und Desoxy-TTP auffüllen, so dass glatte Enden entstehen. Bevorzugt verwendet man das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (E.C.2.7.7.7). Gemäss einer anderen Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens kann man aber auch bei der Stufe (d) den im ersten Transformationsschritt erhaltenen Vektor mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease linearisieren und anschliessend mit einer Exonuklease, beispielsweise mit Bal31 so lange inkubieren, bis durch schrittweise Abspaltung von Nukleotiden von den Enden her ein Fragment entsteht, das das Gen für CGT enthält, vorzugsweise ohne seine Signalstrukturen. Überhn- ende Enden des Fragments kann man mit einer DNA-Polymerase mit Desoxynukleotiden auffüllen, so dass clatte Enden entstehen. Für den zweiten Pekombinationsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens, nämlich die Stufe (e), kann man sogenarnte Expressionsvektoren verwenden, die gut steuerbare regulatorische Sequenzen enthalten und eine hohe Exoression des rekombinierten Gens beirken. Für die Transformation von Stämmen von E. coli und Klebsiella pneumoniae können beispielsweise tac-Pro motorolasmide verwendet werden, wie pKK323-2 (im Handel erhhltlich) und pJF1180; pJF11 u entspricht pKK223-3 mit den Ausnahmen, dass ein 0.546 kb BamHI-XmaIII-Fragment deletiert und ein 1.26 kb-Fragment mit Lactose-Repressor-Gen (lacIq) inseriert wurde. Es können jedoch auch andere Plasmide, bei spielsweise Lambda-pL-Promotor-Plasmide, wie pPL-Lambda (im Handel erhältlich), und trp-Promotor-Plasmide verwendet werden, wie pDR720 (im Handel erhältlich). Die Spaltung der Vektor-DNA erfolgt mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease. Anschliessend kann man die Restriktionsendonuklease inaktivieren. Überhängende Enden kann man mit Hilfe einer geeigneten DNA-Polymerase mit Desoxynukleotiden auffüllen oder abspalten, so dass glatte Enden entstehen. Bevorzugt kann man dafür das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I oder die DNA-Polymerase des Phagen T4 verwenden. Die Rekombination des DNA-Fragments, das das CGT-Strukturgen umfasst, mit der Vektor-DNA kann man dadurch erreichen, dass man die Fragmente mischt und die Lösung mit einer geeigneten DNA-Ligase inkubiert, bevorzugt mit D:A-Ligase des Phagen T4 (aus E.C.6.5.1.1). Die Ligation erfolgt zweckmässigerweise in Gegenwart von ATP, einer Sulfhydryl-Verbindung und Magne- siurnionen. Gema. Stufe (f) des erfindungsgemässen Verfahrens kann man die erhaltene rekombinante DNA in bekannter Weise in sogenannte kompetente Stämme transformieren, die die Fähigkeit zur Aufnahme von DNA besitzen. Bei diesem zweiten Trensformations- schritt des erfindungsgemässen Verfahrens erfolat die Auswahl der transformierbaren Zellen nach gewünschten sonstigen Eigenschaften dieser Zellen, wie beispielsweise Eigenschaften des Wachstums, der Pathogenität und der Fähigkeit zum Exoort von Proteinen. Bevorzugt werden Stämme vor . coli, wie HB101 und J. 105 ( im Handel erhältlich), und Klebsiella pneumoniae, wie UN1290 (J. Bacteriol., 133 (1978) 253 -266). Es können jedoch auch transformierbare Zellen anderer Stämme verwendet werden, wie beispielsweise von Saccharomyces cerevisiae und Bacillus subtilis. Nach der Transformation kann man diejenigen Zellen, die Plasmide enthalten, auf einem Nährmedium mit einem Gehalt an einem Antibiotikum anziehen. Und zwar -:ann man diejenigen Zellen, die ein Plasmid enthalten, parallel einerseits auf einem Minimalmedium, welches Glukose als Kohlenstoffquelle, die notwendigen Salze und Supplemente, eir Antibiotikum zur Selektion des Vektors und Amylopektin-Azur als Indikator für Stärkeabbau enthält, und andererseits auf dem gleichen Minimalmedium anziehen, das zusätzlich noch einen Induktor enthält, beispielsweise Isooropyl-ss-D-thicnalactosid im Fall des Vektors pKK223-3. Diejenigen Zellen, die mit dem Induktor einen farblosen Abbauhof bilden und damit offensichtlich unter der Kontrolle des Promotors stehen, werden isoliert. Sie besitzen das Strukturgen für CGT, das unter der Kontrolle des Expressionspromotors steht. Im Fall des Vektors pKK223-3 handelt es sich um den tac-Promotor. Bei den Stufen (d) und (e) des erfindungsgemässen Verfahrens ist es für den zweiten Rekombinationsschnitt vorteilhaft, die partielle Spaltung der nach der ersten Transformation erhaltenen Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease MaeI durchzuführen. Dieses Restriktionsenzym bewirkt nämlich eine Soaltunc an vorteilhaften Stellen der DNA, und zwar einerseits zwischen der Ribosomen-indungsstelle und der Startstelle der Translation und andererseits hinter den Terminationssig- nalen für Transskription und Translation der das Gen für CGT enthaltenden CNA-Sequenz. Es sei nochmals betont, dass die Erfindung neben den DNA-Frac- menten, die das CGT-Strukturgen umfassen und die nach dem erfindungsgemässen Verfahren gewonnen werden können, auch ONA-Fragmente umfasst, deren Einzelstränge mit denen der DNA Fragmente mit dem CGT-Strukturgen hybridisierbar sind. Derartige "hybridisierbare" DNA-Fragmente können beispielsweise durch Modifikation der DNA-Fragmente anfallen, die das CGT Strukturgen umfassen. Mit der Ergänzung der Erfindung um diese "hybridisierbaren" DNA-Fraomente wird auch dem Umstand Rechnung getragen, dass sich die Strukturgene der Mikroorganismen unterscheiden können, die CGT produzieren. Modifizierte DNA Fragmente sind insofern von Interesse, als mit ihrer Hilfe Enzyme mit CGT-Leistung exprimiert werden können. Der Mikroorganismus Klebsiella pneumoniae M5al ist unter der Nummer DSM 3539 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in D-3400 Göttingen, GrisebachstraBe 8, hinterlegt. Nachstehend wird die Erfindung durch eine Schemazeichnung und ein Beispiel näher erläutert. Beispiel 1 Aus der Gesamt-DNA des das Gen für Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase tragenden Stammes Klebsiella pneumoniae M5al werden neue Stämme mit hoher Produktivität für Cyclodextrin-Glycosyl Transferase durch folgende Verfahrensschritte hergestellt: (1) Isolierung von Gesamt-DNA aus Klebsiella pneumoniae M5a1, die die genetische Information für die Cyclodextrin-Glycosyl Transferase enthält. Der Stamm Klebsiella pneumoniae M5al wird von 200 ml Nährbouillon, die 1 % Trypton, 0.5 % Hefe extrakt und 1 % NaCl enthält, bei 370C bis zum Ende des exponentiellen Phase angezogen. Nach der Ernte werden die Zellen in 2.5 ml TES-Puffer (50 mM Tris/Cl pH 7.5; 50 mM NaCl; 5 mM EDTA), der 25 % Saccharose und 5 mg Lysozym enthält, aufgenommen und 10 Minuten lang bei 370C inkubiert. Nach Zugabe von 2.5 ml. Lysislösung (10 mM Tris/Ol pH 7.5; 1 mM EDTA; 0.1 % Triton X100) wird der Ansatz mit Proteinase K zu einer Endkonzentration von 0.1 mg/ml versetzt und 30 Minuten lang bei 370C inkubiert. Die DNA wird aus dem Lysat durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation und Dia lyse gegen Puffer (10 mM Tris/Cl pH 8.0; 1 mM EDTA) iso liert. (2) Isolierung der Vektor DNA. Zur Klonierung des Gens für die Cyclodextrin-Glycosyl-Trans ferase wird DNA des Plasmids pBR322, das Ampicillin- und Tetracyclin-Gene als Marker trägt, verwendet. Es wird in folgender Weise isoliert: Ein E. coli Stamm, der das Plasmid pBR322 enthält, wird bei 370C in 0.5 ml Nährbouillon wie unter (1) bis zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase unter Schütteln angezogen. Nach Zugabe von 150 ssg/ml Chloramphenicol wird 15 Stunden lang bei der gleichen Temperatur weitergeschüttelt. An schliessend werden die Bakterienzellen gewonnen, mit Lyso zym und einem nichtionischen Detergens lysiert und das Lysat bei 48 000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Aus dem Uberstand wird die Plasmid-DNA mit Hilfe zweimaliger Cäsium chlorid-Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation und Dialyse gegen Puffer wie unter (1) gewonnen. (3) Insertion des für Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase kodieren den Gens aus Klebsiella pneumoniae M5al in den Vektor. 10 ug der Gesamt-DNA aus Klebsiella .pneumoniae M5al und 1 Fg der Vektor DNA werden zwei Stunden lang mit der Restriktions endonuklease PstI behandelt, um die DNA-Moleküle komplett zu spalten, und dann jeweils 10 Minuten auf 680C erhitzt. Die Gesamt-DNA aus Klebsiella pneumoniae wird danach in einem 0.6%igen Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt. Die Fragmente mit einer Grösse von etwa 5 400 Basenpaaren werden ausgeschnitten und nach Phenolextraktion und Ethanol fällung in Wasser gelöst. Die Lösung der so gewonnenen Fragmente der Gesamt-DNA von Klebsiella pneumoniae M5a1 wird mit der Lösung der ge spaltenen pBR322 Vektor DNA vermischt und nach Zugabe von ATP, Dithiothreitol und Magnesiumchlorid 16 Stunden lang mit der DNA-Ligase des Phagen T4 bei 170C inkubiert. Die erhaltene Lösung enthält die rekombinante DNA. (4) Genetische Transformation von E. coli-Bakterien mit re kombinanter DNA, die die genetische Information für Cyclo dextrin-Glycosyl-Transferase enthält. Der E. coli Stamm HB101 wird unter Schütteln in 20 ml Nähr bouillon wie unter (1) bei 370C bis zum Ende der exponen tiellen Phase angezogen. Die Zellen werden gewonnen, in 10 ml eiskalter 50 mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert und 30 Minuten im Eisbad inkubiert. Nach anschliessender Gewinnung durch Zentrifugation werden die Zellen in 2 ml eiskalter 50 mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert. 0.2 ml der Suspension werden mit der Lösung der rekombinanten DNA aus Stufe (3) gemischt, 30 Minuten lang im Eisbad und anschliessend 5 Minuten lang bei 430C inkubiert. Die Zellen werden in Nährbouillon wie unter (1) beimpft und 45 Minuten lang bei 370C geschüttelt. Anschliessend werden die Zellen in Portionen auf Agarplatten ausgestrichen, die pro Liter 7.1 g Na2HPO4, 13.6 g KH2P04, 15 mg CaCl2, 0.25 g MgS04, 1.6 g (NH4)2S04, 5 mg Thiamin, 40 mg Prolin, 40 mg Leucin, 20 mg Tetracyclin, 5 g Stärke, 5 g Amylopectin-Azur und 15 g Agar enthalten. Die Platten werden bei 370C bebrütet. Nach drei Tagen Bebrütung erscheinen Kolonien auf den Platten, von denen einige von farblosen Höfen auf den ansonsten tiefblauen Platten umgeben sind. Die letztgenannten Kolo nien werden entnommen, gereinigt und isoliert. Jede der so gewonnenen Kolonien ist zum Abbau von Stärke befähigt und gleichzeitig Tetracyclin-resistent. Sie hat damit andere Eigenschaften als der Stamm, der als Wirtsorganis mus verwendet wird. Das bedeutet, dass die isolierten Zellen das Plasmid pBR322 enthalten, das das PstI-Fragment aus Klebsiella pneumoniae M5a1 mit dem Cyclodextrin-Glycosyl Transferase-Gen trägt. Aus einer der erhaltenen Kolonien wird die Plasmid-DNA nach dem unter (2) beschriebenen Verfahren isoliert. Nach Behandlung mit Restriktionsendonuklease PstI und Analyse durch Elektrophorese in einem Agarosegel zeigen sich zwei Fragmente. Dieses Plasmid wird pCM100 benannt. Bakterien, die dieses Plasmid tragen, können Stärke ab bauen und produzieren Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase. (5) 10 ssg der DNA des Plasmids pCM100 aus HB101 werden mit der Restriktionsendonuklease MaeI bei 450C so behandelt, dass die DNA-Moleküle partiell gespalten werden. Durch Elektro phorese in einem 1%dem Agarosegel werden die DNA-Fragmente aufgetrennt. Das Fragment mit einer Länge von 2 068 Basen paaren wird ausgeschnitten und wie unter (3) isoliert. Die 5'-überhängenden Enden werden durch Inkubation mit dem so genannten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit Desoxy ATP und Desoxy-TTP bei 250C aufgefüllt, so dass glatte Enden entstehen. Die Restriktionsendonuklease MaeI spaltet die DNA des Plas mids pCM100 einerseits zwischen der Ribosomenbindungsstelle und der Startstelle der Translation und andererseits hinter den Terminationssignalen für Transkription und Translation der das Gen für die Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase ent haltenden DNA-Sequenz. Eine partielle Spaltung der DNA des Plasmids pCM100 ist notwendig, da die Restriktionsendonuklease innerhalb des Gens für Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase eine weitere Schnittstelle erkennt. (6) Isolierung der DNA eines Expressionsvektors. Zur Klonierung des Strukturgens der Cyclodextrin-Glycosyl Transferase in einen Expressionsvektor wird DNA des Plas mids pJF118u, das Ampicillin als Marker, einen tac-Promotor und das Gen für einen lac-Repressor trägt, eingesetzt. Die Plasmid-DNA wird nach der unter (2) beschriebenen Me thode isoliert. (7) Insertion des für Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase kodieren den Strukturgens aus Klebsiella pneumoniae MSal in den Ex pressionsvektor (siehe Schemazeichnung). 1 ag der DNA des Plasmids pJF118u wird mit Restriktionsendo nuklease EcoRI vollständig bei 370C gespalten. Die Endo nuklease wird anschliessend inaktiviert und die S'-über- hängenden Enden werden durch Inkubation mit dem sogenannten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit Desoxy-ATP und Desoxy-TTP bei 250C aufgefüllt, so dass glatte Enden ent stehen. Die Lösung des unter (5) erhaltenen MaeI-Fragments mit einer Länge von 2 068 Basenpaaren wird mit der gespalte nen pJF118u-Vektor-DNA gemischt und nach Zugabe von ATP, Dithiothreitol und Magnesiumchlorid 16 Stunden lang bei 170C mit der DNA-Ligase des Phagen T4 inkubiert. Die er haltene Lösung enthält die rekombinante DNA. (8) Genetische Transformation von E. coli Bakterien mit rekombi nanter DNA, die die genetische Information für Cyclodextrin Glycosyl-Transferase unter Kontrolle des tac-Promotors ent hält. Der E. coli Stamm HB101 wird wie unter (4) beschrieben angezogen und zur Transformation vorbereitet. 0.2 ml der wie unter (4) erhaltenen Suspension werden mit der Lösung der rekombinanten DNA aus Stufe (7), wie unter (4) beschrieben, transformiert. AnschlieBend werden die Zellen auf Agarplatten ausgestrichen, die pro Liter 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 100 mg Ampicillin und 15 g Agar enthalten. Die Platten werden bei 370C bebrütet. Nach 24 Stunden Bebrütung erscheinen auf den Platten Kolonien, die gegen Ampicillin resistent sind. Sie werden abgenommen und parallel auf Agarplatten ausgestrichen, die einerseits pro Liter 7.1 g Na2HP04, 13.6 g KH2P04, 15 mg CaCl2, 0.25 g MgS04, 1.6 g (NH4)2S04, 5 mg Thiamin, 40 mg Prolin, 40 mg Leucin, 100 mg Ampicillin, 5 g Glukose, 5 g Amylopectin-Azur und 15 g Stärke, andererseits die gleichen Bestandteile, aber zusätzlich noch 238 mg Isopropyl-B-D-Thiogalactosid als Induktor enthalten. Die Platten werden bei 370C bebrütet. Nach 24 Stunden Bebrütung erscheinen Kolonien auf den Platten, von denen einige auf den Platten, die den Induktor enthalten, von farblosen Höfen auf den sonst tiefblauen Platten umgeben sind. Letztgenannte Kolonien werden abgenommen, gereinigt und isoliert. Jede der so gewonnenen Kolonien ist nach Induktion mit Isopropyl-B-D-Thiogalactosid zum Stärkeabbau befähigt und ausserdem Ampicillin-resistent. Das bedeutet, dass die isolierten Zellen das Plasmid pJF118u enthalten, das das MaeI-Fragment aus pCM100 mit dem Gen für Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase trägt, welches unter Kontrolle des tac-Promotors steht. Das Plasmid wird pCM301 benannt.

Claims: Claims for the following Contracting States : CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL, SE DNA fragment embracing a cyclodextrin glycosyl-transferase structural gene (CGT structural gene) with a size of about 2,100 bp, which can be cut out by means of partial degradation with the restriction enzyme MaeI and subsequent exonuclease digestion from DNA structures of strains of the following species which produce CGT: B. macerans, Bacillus megaterium, alkalophilic Bacillus species or Klebsiella pneumoniae and DNA fragments with the aid of which enzymes with CGT power can be expressed and whose single strands are able to hybridise with those of the above CGT structural genes at not below 20°C and in particular at a concentration of 1M NaCl and a temperature not below 25°C. DNA fragment according to Claim 1, including the DNA region coding for the leader peptide (signal peptide), there being missing from the DNA fragment the signal structures for its expression. Expression vector embracing a DNA fragment according to one of Claims 1 to 2. tac promoter plasmids such as pKK223-3 and the plasmid obtainable from pkk223-3 by deletion of a 546 bp BamHI-XmaIII fragment and insertion of a 1.26 kb fragment containing the lactose repressor gene; lambda-p L promoter plasmids such as pPL-lambda; and trp promoter plasmids such as pDR720; each embracing a DNA fragment according to one of Claims 1 to 2. Non-pathogenic micro-organisms which embrace an expression vector according to Claim 3 or 4 and which can be cultivated industrially. Non-pathogenic bacteria which embrace an expression vector according to Claim 3 or 4 and which can be cultivated industrially. Micro-organisms according to Claim 5 or 6 and approved for addition to foodstuffs. Process for the preparation of DNA fragments according to one of Claims 1 to 2, expression vectors according to Claim 3 or 4 and micro-organisms according to one of Claims 5 to 7, characterised in that (a) starting from micro-organisms which are selected from the strains of the following species Bacillus macerans, Bacillus megaterium alkalophilic Bacillus species or Klebsiella pneumoniae, and which produce CGT, their genome is isolated and randomly fragmented, and (b) the genome fragments which have been obtained are inserted in vectors, the vectors are transferred into micro-organisms which can be cultivated, screening is carried out for those clones which produce CGT, and these clones are isolated, (c) and/or the vectors are isolated from the CGT-producing clones, (d) and/or DNA fragments according to one of Claims 1 to 2 are cut out of the vectors, (e) and/or the DNA fragments which have been cut out are inserted in expression vectors, (f) and/or the expression vectors which have been obtained are transferred into non-pathogenic micro-organisms which can be cultivated industrially. Process according to Claim 8, characterised in that there is use, in stage (e), of DNA fragments whose single strands are able, at not below 20°C and in particular at a concentration of 1 M NaCl and a temperature not below 25°C, to hybridise with the single strands of the DNA fragments cut out in stage (d). Claims for the following Contracting State : AT Process for the preparation of a DNA fragment embracing the cyclodextrin glycosyltransferase structural gene (CGT structural gene) with a size of about 2,100 bp, which can be cut out from DNA structures by means of partial degradation with the restriction enzyme Mae I and subsequent exonuclease digestion, and DNA fragments with the aid of which enzymes with CGT power can be expressed and whose single strands are able to hybridise with those of the DNA fragment which embraces the CGT structural gene at not below 20°C and in particular at a concentration of 1 M NaCl and a temperature not below 25°C, expression vectors which embrace the said DNA fragments, tac promoter plasmids such as pKK 223-3 and the plasmid obtainable from pkk223-3 by deletion of a 546 bp BamHI-XmaIII fragment and insertion of a 1.26 Kb fragment containing the lactose repressor gene, lambda-p L promoter plasmids such as pPL-lambda and trp promoter plasmids such as pDR720, which each embrace the said expression vectors, non-pathogenic micro-organisms which embrace the said expression vectors and can be cultivated industrially, non-pathogenic bacteria as examples of micro-organisms which embrace the said expression vectors and which can be cultivated industrially and micro-organisms of this type, in particular bacteria of this type, which are approved for addition to foodstuffs, characterised in that (a) starting from micro-organisms which are selected from the strains of the following species Bacillus macerans, Bacillus megaterium alkalophilic Bacillus species or Klebsiella pneumoniae, and which produce CGT, their genome is isolated and randomly fragmented, and (b) the genome fragments which have been obtained are inserted in vectors, the vectors are transferred into micro-organisms which can be cultivated, screening is carried out for those clones which produce CGT, and these clones are isolated, (c) and/or the vectors are isolated from the CGT-producing clones, (d) and/or the DNA fragments which have been cut out are inserted in expression vectors, (f) and/or the expression vectors which have been obtained are transferred into non-pathogenic micro-organisms which can be cultivated industrially. Process according to Claim 1, characterised in that cutting is carried out in stage (d) with the restriction enzyme MaeI. Process according to Claim 1 or 2, characterised in that in stage (d) the vectors are linearised with a restriction endonuclease and degraded with an exonuclease to give a DNA fragment. Process according to Claim 3, characterised in that Bal31 is used as exonuclease. Process according to one of Claims 1 to 4, characterised in that in stage (e) tac promoter plasmids (such as pKK223-3 and the plasmid obtainable from pKK223-3 by deletion of a 546 bp BamHI-XmaIII fragment and insertion of a 1.26 kb fragment containing the lactose repressor gene), lambda-p L promoter plasmids (such as pPL-lambda) and trp promoter plasmids (such as pDR720) are used. Process according to one of Claims 1 to 5, characterised in that there is use, in stage (e), of DNA fragments whose single strands are able, at not below 20°C and in particular at a concentration of 1 M NaCl and a temperature not below 25°C, to hybridise with the single strands of the DNA fragments cut out in stage (d).

Inventors: BINDER FLORIAN, BOECK AUGUST PROF DR, MUELLER FRANK DIR DR, BINDER, FLORIAN, BOECK, AUGUST, PROF. DR., MUELLER, FRANK, DIR. DR., Böck, August, Prof. Dr., Müller, Frank, Dir. Dr.
Applicants: CONSORTIUM ELEKTROCHEM IND, CONSORTIUM FUER ELEKTROCHEMISCHE INDUSTRIE GMBH
Application year: 1986
Main classification: C12N15
IPC codes: C12R1, C12N9, C12N15, A23L1, C12N1