Anchoring membrane ingredient conjugate, and its use

Abstract: Conjugates are described in which the active ingredient is covalently bonded to the anchoring membrane, which is a compound of the formulae <IMAGE> in which A can be: sulphur, oxygen, disulphide (-S-S-), methylene (-CH2-) or -NH-; n = 0 to 5; m = 1 or 2; C* = an asymmetric carbon atom of R or S configuration, R, R' and R'' are identical or different and are an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 7 to 25 carbon atoms or are hydrogen which can optionally be substituted by hydroxyl, amino, oxo, acyl, alkyl or cycloalkyl groups and R1 and R2 are identical or different and are defined as R, R' or R'' or can be -OR, -OCOR, -COOR, -NHCOR or -CONHR and X is an active ingredient or a spacer active ingredient group. The anchoring membrane active ingredient conjugates increase antibody formation.

Description: Membrananker-Wirkstoffkonjugat, seine Herstellung sowie seine Verwendung Die Erfindung betrifft MembranankerwirkStOffkOnjugate mit mindestens einem kovalent an die Membranankerverbindung (en) gebundenen Wirkstoff, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung. Membranankerverbindungen sind Verbindungen, die in biolo- gische und künstliche Membranen einschleusbar sind. Beispielsweise können derartige Membranankerverbindungen natürliche Membran-Lipoproteine sein, wie sie bereits aus der Aunenmembran von Escherichia coli isoliert wurden und zwischenzeitlich auch synthetisiert worden sind. Die E. coli Membranankerverbindung besteht im N-terminalen Bereich aus drei Fettsäuren, welche an S-Glyceryl-L-cystein gebunden sind (G. Jung et al in "Peptides, Structure anc Function", V. J. Hruby and D.H. Rich, Seiten 179 bis 182, Pierce Chem. Co. Rockford, Illinois, 1983). Zur modellhaften Untersuchung von biologischen Membranen sind auch bereits konformations-stabilisierte Alpha-Helix- Polypeptide beschrieben worden, siehe unter anderem Alamethicin, ein Alpha-helicales amphiphlles Eicosapeptid Antibiotikum, welches spannungsabhängige ionenleitende Systeme im Lipidmembranen bildet (Boheim, G., Hanke, W., Jung, G., Biophys. Struct. Mech. 9, Seiten 181 bis 191 ( 1 sa3 ); Schmitt, H. und Jung, G., Liebigs Ann. Chem. Seiten 321 bis 344 und 345 bis 364 (1985). In der EP-A1-330 ist beschrieben, dafl Lipopeptide, die Analoga des bereits seit 1973 bekannten Lipoproteins aus E. coli sind, immunpotenzierend wirken. Eine weitere europäische Patentanmeldung, EP-A24147ss?,befasst sich mit der Fähigkeit von derartigen Lipopeptiden, Ratten- und Maus-Alveolar-Makrophagen in vitro zu aktivieren, so dass diese nach 24 stündiger Inkubation mit der Substanz Tumorzellen eliminieren können und insbesondere die Antikörperproduktion, beispielsweise gegen Schweineserumalbumln, signifikant steigern. Es wird in EP-A2-114787 vorgeschlagen, diese Lipoprotein- abkommlinge als Aduvanzen bei der Immunisierung einzusetzen, also die Lipoproteinabkömmlinge des E. coli- Membranproteins in Mischung mit Antigenen zur Verbesserung der Immunantwort zu verwenden. Es besteht ein grosser Bedarf an die Immunantwort stimulierennen und verstärkenden Substanzen, insbesondere, da gereinigte Antigene häufig nur ingeringsten Mengen zugÅan- llch sind; ferner ist bei Verwendung neuer Chargen von Antigenen stets die Möglichkeit von neuen Verunreinigungen bzw. Zersetzungsprodukten gegeben. Ferner ist es erwünscht, ein Versuchstier nicht häufig impfen zu müssen, sondern durch möglichst einmalige Gabe des immubogenen Materials die erwünschte Immunantwort zu erhalten. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Antikörper-Bildung gegen Antigene bzw. Haptene zu steigern und somit eine spezifische immunpotenzierende Wirkung zu erhalten. Die Aufgabe wird erfindungsgemäss durch das neue Membranankerwlrkstoffkonjugat gelöst, mit mindestens einer Membranankerverbindung und mindestens einem kovalent an die Mernbranankerverbindung(en) gebundenen Wirkstoff. Erfindungsgemäfl wird auch ein Verfahren zum Herstellen von Membranankerverbindungen vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das mit Schutzgruppen in an sich bekannter Weise an den Funktionen, an denen keinerlei Reaktion stattfinden soll, geschützte Peptid mittels bekannter Kupplungsverfahren an einen festen oder löslichen Träger, wie einem Polymer < z.B. Merrifield-Harz) synthetisiert wird; dass die derart synthetisierten, am Träger gebundenen Peptide über N-Termini oder Seltenfunk tonen des Peptids mit der Membranankerverbindung kovalent gebunden werden: dass das derart hergestellte Peptid-Kon)ugat isoliert wird dadurch dass die Schutzgruppen sowie die Bindung Peptld/Trager in an sich bekannter Weise gespalten werden und somit das Membranankerpeptid oder das Membranankerhlrkstor'konJugat gewonnen wird. Die Erfindung bezieht s:ch auch auf die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung konventioneller und monck'onaler Antikörper in vivo und in vitro; vorteil hafterwelse lassen sich die erfindungsgemänen Verbindungen aber auch in der Gentechnologie zur Erleichterung der Zellfusion, n, zur Herstellung synthetischer Vaccine, zur Herstellung von Zellmarkern mit Fluoreszenzlabeln, Spinla- beln, radioaktiven Labeln oder ähnlichem, für die Affini- tatschromatographie, insbesondere fur affinitätssauler ; für Lipcsomenpraparate; als Zusatz zu Lebensmitteln oder Futterstoffen im Human- und Tierbereich, sowie als Zusatz zu Kulturmedien für Mikroorganismen und allgemein für Zellkulturen einsetzen. Dabei können die erfindungsgemässen Verbindungen gegebenenfalls gemeinsam mit an sich bekann ten Trägern in Losung, Salben, adsorbiert an festen Trägern, in Emulsionen oder Sprays für human- oder tiermedizinische Zwecke angewendet werden. Bevorzugt ist die Membranankerverbindung eine Verbindung einer der folgenden allgemeinen Formeln: EMI4.1 EMI4.2 wobei A: Schwefel, Sauerstoff, Disulfid (-S-S-), Methylen (-sH2-) oder -NH- sein kann; n= 0 bis 5; m =1 oder 2; C* ein asymmetrisches Kohlenstoffatom mit R- oder 5-Konfiguration; R, R',R" gleich oder unterschiedlich sind und eine Alkyl-, Alkenylboder Alkinyl-Gruppe mit 7 bis 25 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff ist, welche gegebenenfalls mit Hydroxi-, Amino-, Oxo-, Acyl-, Alkyl- oder Cylcoalkyl-Gruppen substituiert sein kann und R1 und R2 gleich oder ungleich und wie R, R',R" definiert bzw. -OR, -OCOR,-COOR,-NHCOR, -CONHR sein kann und X ein Wirkstoff oder eine Spacer-Wirkstoffgruppe ist. Vorteilhafterweise kann auch ein erfindungsgemänes Mert;- branankerwirktoffkonjugat folgender allgemeiner Formel eingesetzt werden: EMI5.1 wobei R3 ein Alpha-Acylfettsäurerest mit zwischen 7 und 25 Kohlenstoffatomen; bevorzugt zwischen 10 und 20 Kohlenstoffatomen und ganz besonders bevorzugt mit zwischen 14 und 18 Kohlenstoffatomen; ein Alpha-Alkyl-Beta-Hydroxi Fettsäurerest oder seine Beta-hydroxiester, wobei die Estergruppierung bevorzugt geradkettig oder verzweigt kettig mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen ist, bevorzugt zwischen etwa 10 und 20 und ganz besonders bevorzugt zwischen 14 und 18 Kohlenstoffatomen; bevorzugt kann Formel VIII ein Wirkstoffkonjugat mit folgenden Membranankerverbindungen sein: N,N'- Diacyl-ysin; N,N'-Diacylornithin; Glutaminsäuredi(monoalkyl)amid oder -ester1 As paraginsäure-di(monoalkyl)amld oder -ester1 N,O-Diacylderivat des Serins, Homoserins oder Threonins sowie N,S Diacylderivate des Cysteins oder Homocysteins; Serin und Homoserin; R4 . eine Seitenkette einer Aminosäure oder Wasserstoff; und X I Wirkstoff oder eine Spacer-Wirkstoffgruppe , wobei, wenn R3 eine Seitenkette von Lysin, Or nithin, Glutaminsäure, Asparaginsäure bzw. deren Derivate ist, diese in Alpha- oder Omega-Positionen sowohl esterartig als auch amidartig in demselben Molekül an R4 angebunden sein können. Es ist besonders bevorzugt, wenn die Membranankerwirkstoffkon zugabe dadurch hergestellt werden, dass das mit Schutzgruppen in an sich bekannter Weise an den Funktionen, an denen keinerlei Reaktion stattfinden soll, geschützte Peptid mittels bekannter Kupplungsverfahren an einem festen oder löslichen Träger, wie ein Polymer (z.B. Merrifield-Harz) synthetisiert wird: dass die derart synthetisierten, am Träger gebundenen Peptide über N-Termini oder Seitenfunktionen des Peptids mit der Membranankerverbindung kovalent gebunden werden; dass das derart hergestellte Peptid Konjugat isoliert wird, dadurch dass die Schutzgruppen sowie die Bindung PeptidtTräger in an sich bekannter Weise gespalten werden und somit das Membranankerpeptid oder das Membranankerwirkstoffkonjugat gewonnen wird. Die Verknüpfung Peptid/Membranankerverbindung kann durch Kondensation, Addition, Substitution, Oxidation (bspw. Disulfidbildung) hergestellt werden. Vorteilhafterweise lassen sich als Membrananker konformationsstabilisierende Alpha-Alkylaminosäuren-Helices mit alternierender Aminosäuresequenz verwenden, wobei die Alpha-Helix durch die anderen Aminosäuren nicht destabilisiert werden darf, wie vom Typ X-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)n Y, wobei n = 2 bzw. 4 und X, Y an sich bekannte Schutzgruppen oder -H, -OH oder -NH2 sind. Vorteilhaft kann sein, wenn der Wirkstoff mit zwei gegebenenfalls unterschiedlichen Membranankerverbindungen kovalent verknüpft ist. Zusätzlich kann der Wirkstoff auch mit einem an sich bekannten Adjuvans für Immunisierungstwecke, wie z.B. Muramyldipeptid und/oder einem Lipopolysaccharid kovalent vernüpft sein. Als Wirkstoffe schlagen wir beispielsweise vor : ein Antigen, wie beispielsweise eine niedermolekulare Partialsequenz eines Proteins oder Proteids, beispielsweise eines Glycoproteins, eines Virushüllproteins, eines Bakterienzellwandproteins oder Proteins von Protozoen (antigene Determinante, Epitop). ein intaktes Protein, ein Antibiotikum, Bakterienmembranbestandteile, wie Muramyldipeptid, Lipopolysaccharid, ein natürliches oder synthetisches Hapten, ein Antibiotikum, Hormone, wie beispielsweise Steroide, ein Nukleosid, ein Nukleotid, eine Nukleinsäure, ein Enzym, Enzymsubstrat, einen Enzyminhibitor, Biotin, Avidin, Polyethylenglycol, einen Peptidwirkstoff, wie beispielsweise Tuftsin, Polylysin, einen Fluoreszenzmarker (z. B. FITC, RITC, Dansyl, Luminol oder Cumarin), einen Bioluminiszenzmarker, ein Spinlabel, zuabQ . ein Alkaloid, ein Steroid, biogenes Amin, Vitamin, oder auch ein Toxin wie beispielsweise Digcxin, Phalloidin, Amanitin, Tetrodoxin oder dergl.,einen Komplexbildner oder ein Pharmakon. Je nach Art des Wirkstoffes ergeben sich völlig neuartige Einsatzgebiete der erfindungsgemässen Substanzen. Es kann auch nützlich sein, wenn mehrere Membrananker Wirkstoffkonjugatverbindungen im Lipid- und/oder h'irk- stoffteil miteinander quervernetzt sind. Die Membranankerverbindungen und der Wirkstoff können auch über einen Crosslinker miteinander verbunden sein, was zur Folge hat, dass der Wirkstoff sich mehr von der Membran entfernt, an die er durch den Membrananker befestigt wird. Beispielsweise eignet sich als Crosslinker eine Dicarbonsäure oder ein Dicarbonsäurederivat, Diole, Diamine, Polyethylenglycol, Epoxide, Maleinsäurederivate oder dergl. Erfindungsgemäss wird also ein eindeutig definiertes, niedermolekulares KonJugat, das sich u.a. zur Immunisierung eignet, hergestellt, das die Prinzipien Carrier Antlgen-Adjuvans kovalent miteinander verknüpft. Carrier und Adjuvans können sowohl ein mitogen wirksames Lipopeptid, wie z.B. Tripalmitoyl-S-Glyceryl-Cystein < Pam3cys) und dessen Analoga sein, aber auch lipophile, konferma- tionsstabilisierte Alphahelices sowie Kombinationen derselben, wie Pam3Cys-Antigen-Helix, Alpha-Helix-Antigen-Helix oder auch nur Pam3cys-Antigenbzw. Antigen-Pam3Cys (Noder C-terminale Verknüpfung) , sowie Antigen-Helix oder Helix-Antigen (N-oder C-terminal, oder an Seitenketten vcn Glu, Lys und ähnl.in der Helix eingebaut).Somit unterscheiden sich die neuen Verbindungen in wesentlichen Punkten von allen bisher eingesetzten höhermolekularen Kon3u- gaten von Antigenen mit hochmolekularen Trägersubstanzen, beispielsweise Proteinen wie Serumalbuminen, Globulinen oder Polylysin oder allgemein höhermolekularen, linearen oder quervernetzten Polymeren. Insbesondere unterscheiden sich die neuen Verbindungen aber auch von allen bisher bekannten Adjuvantien, die lediglich zugemischt werden und demzufolge keine gezielte Präsentation des Antigens an der Zelloberfläche ermöglichen. Die bisher bekannten Adjuvantien erforderten häufig mehrfache Immunisierungen und führten auch zu entzündlichen Reaktionen beim Tierversuch. Erfindungsgemäss ist ein besonderer Vorteil die reproduzierbare Herstellbarkeit syrogenfreier, reiner, chemisch eindeutig definierter Verblndungen, die - im Gegensatz zu konventionellen Verbindungen bzw. Mischungen verschiedener Stoffe - auch zu besserer Reproduzierbarkeit der Antikörperbildung führt. Somit wird ein besonderer Einsatzbereich der erfindungsge malen Verbindungen im Bereich der Antikörpergewinnung, der Gentechnologie, der Herstellung synthetischer Vaccine, der Diagnostik und Therapie in Veterinär- und Humanmedizin gesehen, da die neuen Konjugate erstmals eine spezifisch die Immunantwort stimulierende Wirkung haben, wahrend die bisher verwandten Adjuvantien lediglich unspezifisch die Immunantwort stimulierten. Überraschenderweise lassen sich durch die erfindungsgemässen Verbindungen auch schwach immunogene Verbindungen in stark immunogene umwandeln. Somit liegt eine besondere Bedeutung der Erfindung in der Möglichkeit, Tierversuche sowie Kosten für die Herstellung von Antikörpern einzusparen1 da die neuen Immunogene auch in vitro hochaktiv sind. Aufgrund der nicht entzündlichen Zmmunisierungsmethode kann ein Tier auch mehrfach für unterschiedliche Antikörpergewinnungen eingesetzt werden. Schliesslich könnten mit den neuen Immunogenen auch multivalente Impfstoffe hergestellt werden, d.h. beispielsweise ein Mernbrananker, an dessen Seitenketten mehrere Antigene oder Haptene angeknüpft sind, so dass mittels einer Immunisierung mehrere unterschiedliche aktive Antikörper hergestellt werden konnen. Eine wasserlösliche, mitogene Lipidankergruppe ist beispielsweise Pam3Cys-Ser(Lys)n-OH, die sich insbesondere zur Herstellung der neuen Immunogene, aber auch zur Herstellung von fluoreszierenden, radioaktiven und biolo-gisch aktiven Zellmarkern eignet. Eine besondere erwünschte Eigenschaft der erfindungsgemässen Membrananker-Wirkstoff konDugate ist deren Amphiphilie, d.h.eine partielle Was serlöslichkeit. da biologische Tests an Tieren und Unter¯ suchungen mit lebenden Zellen dann wesentlich einfacher durchgeführt werden können. Auch die künstlichen Lipiddop pelschichtmembranen, Liposomen und Vesikel, die für manche Versuche benötigt werden, sind nur im wässrigen Medium herstellbar und stabil. Ein geeigneter amphiphiler, biologisch aktiver Membrananker ist z.B. Pam3Cys-Ser(Lys)n-OH. Der an Pam3Cys gekoppelte Serinrest begünstigt immunogene Eigenschaften, wÅah- rend die polaren, protonierten Epsilon-Aminogruppen der Lysin-Reste den hydrophilen Teil des Moleküls darstellen. Aufgrund seiner mehrfachen Ladungen weist dieser Verbindungstyp weitere interessante Eigenschaften auf. Er kann durch Induktion der Zellwechseiwirkung als Fusionsaktivator bei der Herstellung von Hybridomzellen eingesetzt werden, insbesondere bei längerer Lysinkette, bei Kopplung an Polyethylenglycol oder bei kovalenter Inkorporation des Biotin/Avidinsystems. Weiterhin können vorteilhafterweise die erfindungsgemässen Verbindungen für die Herstellung neuartiger Liposomen durch Ouervernetzung eingesetzt werden, die entweder in Fettsäure oder im Peptidteil stattfinden kann. Die Membrananker (Pam3Cvs und Analoga, sowie die Helles) eignen sich ferner zur Verstärkung der Zeli/Zellwechsel- wirkung, wenn sie beispielsweise mit dem Biotin/Avidlr.sy- stern kovalent kombiniert werden. Weitere vorteilhafte Eigenschaften der erfindungsgemässen Verbindungen sind, dass sie Zellfusionen erleichtern können, wie sie beispielsweise fur gentechnologische Arbeiten benötigt werden. Hierbei können die neuen Immunogene auch bei ELISA, RIA und Bio lumlnjszenzassays eingesetzt werden. Verschiedene Pam3Cys-Derivate sind lipid- und wasserlöslich, und in vivo und in vitro stark mitogen wirksam. Sie eignen sich auch sehr gut zur Markierung von Zellen mit FITC und anderen Markern wie RITC, Dansyl und Cumarin. Insbesondere kann man sie auch bei der rhluoreszenzmikros kopie und dem Fluorescence Activated Ccli Sorting (FACS) einsetzen. Ein kostengünstiger Membrananker bei analoger Wirkung wie Pam3Cys ist S-(1,2- Dioctadecyloxycarbonylethyl) -Cystein, dessen Herstellung im experimentellen Teil genauer beschrieben wird. Spezifische Kopplungen der mitogen wirksamen Lipidanker an Antigene können auch über Crosslinker erfolgen, wie beispielsweise mit Dicarbonsäuremonohydrazidderivaten der allgemeinen Formel: X-NH-NH-CO-A-CO-B-Y oder auch X-NH-SH-CO-A-COCH, wobei A, B r Aminosäure oder (CH2)n und X, Y an sich bekannte Schutzgruppen sind. Es kann auch Jeder andere geeignete Crosslinker oder Spacer zur Herstellung der neuen Stofre verwendet werden1 wobei stets das Prinzip (niedermclekularer Carrier und Adjuvans)-(Antigen) eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung darstellt, sofern es Lipopeptidstruktu ren mit Lipidmembranankerfunktion und/oder konformationsstabilisierte Helices beinhaltet. Besonders vorteilhafte Wirkungen lassen sich durch Anwendung der erfindungsgemässen Verbindungen in der Affinitätschromatographie finden, wofür sich insbesondere Lipopep tld-Antigen-(Hapten)-Konjugate eignen. Diese eignen sich in hervorragender Weise zum Beladen herkömmlicher Rever sed-phase-HPLC-Säulen (oder auch präparativer RP-Säulen), wobei sich beispielsweise eine in organisch wässrigen Systemen aufgetragene Tripalmitoylverbindung in der apolaren Alkylschicht verankert. Das Antigen bleibt wie auf Zelloberflächen der mobilen wässrigen Phase präsentiert und lädt somit die Antikörper zur Adsorption ein. Somit können aus verdünntem Serum direkt auf einer derartigen Affinitätssäule Antikörper angereichert bzw. isoliert werden die mit dem betreffenden Antigen spezifisch reagieren. Die Elution der Antikörper erfolgt wie bei anderen ffinitätssäulen, beispielsweise durch pH-Wert-Einstel Im folgenden soll nun die Erfindung näher anhand von Beispielen erläutert werden1 wobei zunächst die hier verwendeten Abkürzungen aufgeführt werden sollen: Aib = 2 -Methyl-alanin TFE = Trifluoressigsäure EC@ R - Rezeptor des Epidermal Growth Factor Pam = Palmitoyl-Rest DCC = Dlcyclohexyl-carbodiimid DMF = Dimethylformamid FITC = Fluoresceinisothiocyanat Fmoc = Fluorenylmethoxycarbonyl But = tert. Butylrest PS - DVB = Styrol - Divinylbenzol-Copolymeres mit 4 (Hydroxymethyl)phenoxymethyl-Ankergruppen HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol R'TC = Rhodaminisothiocyanat E IFN-(Ly) 11-20 = antigene Determinante von Human Interferon DCH = N,N'-Dicyclohexylharnstoff ;; - Ethylacetat In den beiliegenden Figuren, die zur Erläuterung der Erfindung dienen, zeigt: Fig. 1 das Herstellungsschema von Pam-Cys(C18)2-Ser -Ser-Asn-Ala-OH Fig. 2 die Tabelle der 13C-NMR-Spektren Fig. 3 das 13C-NMR-Spektrum von Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3 TFA in CDCl3 Fig. 4 das 13C-NMR-Spektrum von Pam-Cys(Pam)-OBut in CDCl3 13 Fig. 5 das 3C-NMR-Spektrum von Pam-Cys(Pam)-OH in CDCl3/CD3OD 1: :1 13 Fig. 6 das c-NMR-Spektrum (J-moduliertes Spin-Echo- Spektrum) von Pam(&alpha;-Pam)Cys-OBut) Fig. 7 das C-NMR (100 MHz) der Alpha-Helix Fig. 8 das CD-Spektrum der Alpha-Helix von HuIFN (&alpha;-Ly)-11-20 Fig. 9 die Antikörpergewinnung mit Pam3Cys-Ser-EGF-R (516 bis 529) Fig. 10 ein in vivo Immunisierungsexperiment Fig. 11 einen Vergleich von in vivo/in vitro Immunisie rungsexperiment,und Fig. 12 die mitogene Aktivierung von Balb/c-Maus-Milz- zellen mit Pam3Cys-Ser-(Lys)4FITC. Im¯folgenden werden nun zunächst einige Herstellungsverfahren für erfindungsgemässe Stoffe sowie ihre Vorstufen beschrieben: I. Herstellung von Pam3Cys-EGF-R(516 - 529) Nach üblichem schrittweisen Aufbau (Merrifield-Synthese unter N &alpha;-Fmoc/(But )-Schutz, DCC/HOBt und symmetrische Anhydride) des EGF-R Segments (526-529) wurde als letzte Aminosäure Fmoc-Ser(But)-OH angebaut. Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe mit Piperidin/DMF (1:1, 15 min) wurde das harzgebundene Pentadekapeptid des EGF-RH:Ser(But)-Asn-Leu Leu-Glu-(OBut)-Gly-(OBut)-Pro-Arg(H+)-Glu(OBut)-Phe-Val -Glu(ODu (-Asn-Ser-(Bu t )-O-p-Alkoxy-benzyl-Copoly(Divinyl-- benzol-Styrol) (1g, Beladung 0,5 mmol/g) mit Pam-Cys (CH2- CH(OPam)CH2(OPam) (2mmol, in DMF/CH2Cl2 (1:1)) und DCC/ HOBt (2mmol, bei 0 Grad C 20 min voraktiviert) verknüpft (16 h), dann eine Nachkupplung (4 h). Das Lipohexadekapeptid wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) unter Zusatz von Thioanisol (0,25 ml) innerhalb von 2 h abgespalten. Ausbeute: 960 mg . (76%) Pam-Cys(CH2-CH(OPam)CH2(OPam))Ser-Asn-Leu- Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Arg-Glu-Phe-Val-Glu-AsnSer-OH x CF3COOH (korrekte Aminosäurenanalyse, keine Racemiserung). II. Herstellung von S-(1,2-Dioctsdecyloxycarbonylethyl-) N-palmltovl-L(oder D)cystein-tert-butylester Maleinsäure-di-octadecylester ist nach der allgemeinen Vorschrift für Veresterungen von Maleinsäure zugänglich (H. Klostergaard, J. Org. Chem. 23 (1958), 108.) 3C-NMR-Spektrum: siehe Fig. 2. 1,2 mmol (500 mg) N-Palmitoyl-L-cystein-tert-butylester und 1,2 mmol (745 mg) Maleinsäure-di-octadecylester werden in 20 ml THF gelöst. Nach Zugabe von 20 mmol (3 ml) N,N,N' ,N'-Tetramethylethylendlamin wird unter Stickstoff am Rückfluflkühler 12 h gerührt. Nach Zugabe von 100 ml Methanol und 5 ml Wasser wird der farblose Niederschlag abgesaugt, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum über P205 getrocknet. Ausbeute: 1 9 (83X); Schmelzpunkt: 51 Grad Celsius Dünnschichtchromatographie: RF P 0,80; (Laufmittel : CHCl3/Essigester 1 14:1) 1 3C-NMR: siehe Fig. 2. Molekulargewicht: C63H113NO7S (1035,7) Elementaranalyse: Ber. C 72,99 H 11,76 N 1,35 s 3,09 Gef. C 73,08 H 11,92 N 1,27 S 3,27 III. Herstellung von S-(?,2-Dioctaderyloxycarbonylethyl) N-palmitoyl-cystein 0,48 mmol (500 mg) des unter II. beschriebenen t-Butylesters werden in 65,3 mmol (7,45 g, 5 ml) Trifluoressig Säure 1 h bei Raumtemperatur im geschlossenen Gefäss gerührt. Es wird am Rotationsverdampfer im Hochvakuum abgedampft, der Rückstand in 1 ml Chloroform aufgenommen, mit 50 ml Petrolether bei -20 Grad C ausgefällt und über P205 im Vakuum getrocknet. Ausbeute : 420 mg (89%) ; Schmelzpunkt: 64 Grad Celsius Dünnschichtchronmatographie auf Silicagelplatten : RF = 0,73 ; Laufmittel: CHCl3/MeOH/H2O = 65:25:4) 13C-NMR siehe Tab. 1. Molekulargewicht: C59H113NO7S (980,6) Elementaranalyse: Ber. C 72,27 H 11,62 N 1,43 S 3,27 Gef. C 72,46 H 11,75 N 1,36 S 3,50 Das neue Cysteinderivat und sein t-Butylester lassen sich an Kieselgel und RP-Phasen-Chromatographie in die Diastereomeren trennen. Es können so die beiden Diastereomerenpaare des L- und D- Cysteinderivats hergestellt werden. IV. Herstellung von S-(1,2-Dioctadecyloxycarbonylethyl)-N palmitoyl-Cys-Ser(But)-Ser(But)-Asn-Ala-OBut 0,2 mmol (196 mg) S-(1,2-Dioctadecyloxycarbonylethyl)-N palmitoyl-Cystein werden in 5 ml Dichlormethan gelöst und .lit 0,2 mmol t27 mg) HOBt in 0,5 ml DMF sowie 0,2 mmol (41 mg) DCC 30 min bei 0 Grad C unter Rühren voraktiviert. Nach Zugabe von 0,2 mmol (109 mg) H-Ser (But)-Ser(But)-Asn- Ala-OBut in 3 ml Dichlormethan wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ohne weitere Aufarbeitung werden 40 ml Methanol zum Reaktionsansatz gegeben.Nach 3 h lässt sich das farblose Produkt absaugen. Es wird in wenig Dichlormethan aufgenommen und erneut mit Methanol gefällt. Nach Waschen mit Methanol wird im Vakuum über P2O5 getrocknet. Ausbeute: 260 mg (B6%) Schmelzpunkt: 194 Grad Celsius Dünnschichtchromatographie: RF = 0,95; (Laufmittel: CHCl3/MeOH/H2O 1 65:25:4) RF " 0,70; (Laufmittel : CHCl3/MeOH/Eisessig 90:10:1) 1 3C-NMR: siehe Fig. 2 Molekulargewicht: C84H158N6O14S (1508,3) Elementaranalyse: Ber. C 66,89 H 10,56 N 5,57 Gef. C 67,10 H 10,41 N 5,52 V. Herstellung von S-(1,2-Dioctsdecyloxycarbonylethyl)-N- Palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala 53 mol (80 mg) geschützes Lipopeptid (1V) werden mit 13 mmol (1,5 g; 1 ml) Trifluoressigsäure 1 h bei Raumtemperatur im geschlossenen Gefäss gerührt. Nach Abdampfen im Hochvakuum wird 2 x mit je 10 ml Dichlormethan aufgenommen und jeweils am Rotationsverdampfer abgedampft. Der Ruckstand wird in 3 ml Chloroform aufgenommen und mit 5 ml Methanol bei 4 Grad Celsius innerhalb von 12 h gefällt. Nach dem Absaugen wird mit Methanol gewaschen und im Exsikkator über P205 getrocknet. Ausbeute: 63mg (87%) Schmelzpunkt: 208 Grad Celsius (Zers.) Dunnschichtchromatographie: RF = 0,63; (Laufmlttel: CHCl3/MeOH/Elsessig/H2O = 64:25:3:4) RF S 0,55; (Laufmittel: CHCl3/MeOH/H2O = 64:25:4) RF = 0,06; (Laufmittel: CHCl3/MeOH/Elsessig s 90:10:1) Amlnosaurenanalvse: Cysteinsäure 0,6; Asparaginsäure 0,93; Serin 1,8; Alanin 1,0 Molekulargewicht : C72H134N6O14S (1340) VI. Herstellung von Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH: Pam3Cys-Ser(Lys)4-OH wurde nach der Festphasenmethode (MERRIFIELD) an einem p-Alkoxybenzylalkohol-PS-DVB (1%) Copolymer mit N-Fmoc-Aminosäuren und säurelabilem Seitenkettenschutz (tBu für Serin und Boc für Lysin) aufgebaut. Es wurden die symmetrischen Anhydride der Fmoc Aminosäuren eingesetzt. Die Kupplung an Pam3Cys-OH wurde nach der DCC/HOBt-Methode durchgeführt und wiederholt, um eine möglichst quantitative Umsetzung zu erreichen. Um das Lipopeptid vom Trägerharz abzuspalten und den Seitenket tenschutz zu entfernen, wurde das Harz zweimal 1,5 h mit Trifluoressigsäure behandelt, die anschliessend am Rotationsverdampfer im Hochvakuum entfernt wurde. Das Produkt wurde aus Aceton umkristallisiert. Die Elementaranalyse weist ebenso wie das 13C-Spektrum darauf hin, dass das Lipopeptid als Trifluoracetat vorliegt. Unter der Annahme, dass Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH als Zwitterion vorliegt, bleiben noch drei ±-Aminogruppen übrig, die von drei Trifluoressigsäure-Molekülen protoniert werden können. Das 13C-NMR-Spektrum von Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3 TFE zeigt, dass die Verbindung als Trifluoracetat vorliegt. (Quartett der CF3-Gruppierung bei 110-120 ppm, sowie Carbonylsignale bei 161-162 ppm). Durch die Aggregation des polaren Molekülteils werden die Linien des Lys- und Ser-C-Atome stark verbreitert. Das Carbonyl-Signal bei 206,9 ppm rührt von noch anhaftendem Aceton, das zur Umkristallisation verwendet wurde, her. Molekulargewicht: 1510,4 Elementaranalyse: Ber. C 56,40 H 8,70 N 7,56 S 1173 Gef. C 55,58 H 9,33 N 6,54 S 2,61 Aminosäurenanalyse: Die Aminosäureanalyse ergab ein Verhältnis von Serin zu Lysinwie 1 : 4,2. Die bei der Hydrolyse (6 N HCl, 110 8h) entstehenden charakteristischen Zersetzungsprodukte von S-Glyceryl-cystein waren vorhanden (Vergleich mit bekannten Standards). Die peptidische Anteil wurde zu 83% berechnet. 3 TFE-Moleküle pro Lipopeptid entsprechen einem peptidischen Anteil von 80,2 % in guter Übereinstimmung mit der Analyse. VII. Herstellung von Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3 TFE VII.1. Kupplung von Fmoc-Lys(Boc)-OH an das Trägerharz Fmoc-Lys(Boc)-OH (4,5 g, 9,6 mmol) wird in 15 bis 20 ml DMF/CH2Cl2 1:1 (v/v) bei 0 Grad C mit DCC (0,99 g, 4,8 mmol) versetzt. Nach 30 min wird von ausgefallenem Harnstoff direkt in eine Schüttelente abfiltriert, in welcher sich p-Benzyloxy-benzyl-alkohol-Harz (2,5 g, 1,6 mmol OH Gruppen) befinden. Nach Zugabe von Pyridin (0,39 ml, 4,8 mmol) wird 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und das Harz je 3 x mit je 20 ml DMF/CH2Cl2 und DMF gewaschen. Das Harz wird in 20 ml CH2Cl2 zuerst mit Pyridin (28,8 mmol, 6 Äq) und dann mit Benzoylchlorid (28,8 mmol, 6 Äq) versetzt. Es wird 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und das Harz je 3 x mit 20 ml CH2Cl2, DMF, Isopropanol und PE-30/50 gewaschen. VII.2. Symmetrisches Fmoc-Aminosäureanhydrid Fmoc-Lys(Boc)-OH (9,5 g, 9,6 mmol, 3 Aq) wird in 15 ml CH2C12/DMF gelöst und bei 0 Grad Celsius mit DCCt4,8 mmol, 1,5 Äq) versetzt. Nach 30 min bei 0 Grad Celsius wird vom Harnstoff direkt in den Reaktor abfiltriert und, wie in nachfolgender Tabelle angegeben, weiterverarbeitet. Die folgende Vorschrift gilt für 1/5 der zu Anfang eingesetzten Harzmenge (0,5 g, 0,32 mmol OH-Gruppen). Fmoc-O-Butyl-Serin (0,74 g, 1,92 mmol) wird in 4 ml CH2Cl2/DMF gelöst und bei 0 Grad Celsius mit DCC (0,96 mmol) versetzt. Tabelle: Sequenzaufbau eines Peptids mit symmetrischen Fmoc-Aminosäureanhvdriden EMI21.1 <tb> Cperntion <SEP> Rengenz <SEP> Zeit <SEP> [tin] <SEP> Räufigkeit <tb> <SEP> 1 <SEP> CR2Cl2 <SEP> 2 <SEP> 2 <tb> <SEP> 2 <SEP> DIP <SEP> 2 <SEP> 2 <tb> <SEP> 3 <SEP> 55 <SEP> % <SEP> Piperidin <SEP> /DMF <SEP> (v/v) <SEP> 5 <SEP> 1 <tb> <SEP> 4 <SEP> 55 <SEP> % <SEP> Piperidin <SEP> /DMF <SEP> (v/v) <SEP> 10 <SEP> 1 <tb> <SEP> 5 <SEP> DMP <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 6 <SEP> Isopropenol <SEP> 5 <SEP> 2 <tb> <SEP> 7 <SEP> DMP <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 8 <SEP> CH2Cl2 <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 9 <SEP> DMF <SEP> 2 <SEP> 2 <tb> <SEP> 10 <SEP> Kupplung <SEP> mit <SEP> 3 <SEP> Äq. <SEP> symmetr. <SEP> 90 <SEP> 1 <tb> <SEP> Fzoc-Aminosäure-enhydrid <SEP> in <tb> <SEP> DMF-CH2Cl2 <SEP> 1:1 <SEP> (v:v); <SEP> nach <tb> <SEP> 15 <SEP> min <SEP> Zugabe <SEP> von <SEP> 3 <SEP> Äq. <SEP> NMM <tb> <SEP> 11 <SEP> DMF <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 12 <SEP> CH2Cl2 <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 13 <SEP> Überprüfung <SEP> der <SEP> Vollständig <tb> <SEP> keit <SEP> der <SEP> Kupplung <SEP> mittels <tb> <SEP> Keiser-Test <SEP> : <SEP> wenn <SEP> nätig <tb> <SEP> Schritte <SEP> 10-12 <SEP> wiederholen <tb> <SEP> Acetylieren: <SEP> 2 <SEP> Äq. <SEP> Ac2O <SEP> und <SEP> 15 <SEP> 1 <tb> <SEP> 0.5 <SEP> Äq. <SEP> NMM <SEP> in <SEP> 20 <SEP> ml <SEP> CH2Cl2 <tb> <SEP> 15 <SEP> Cä2Cl2 <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 16 <SEP> Isopropenol <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> <SEP> 17 <SEP> Cä2Cl2 <SEP> 2 <SEP> 3 <tb> Nach 30 min wird bei 0 Grad C vom Harnstoff direkt in den Reaktor abfiltriert und, wie üblich aufgearbeitet. VII.3. Kupplung an Pam3Cys-OH Pam3Cys-OH (0,58 g, 0,64 mmol) wird in 5 ml CH2Cl2/DMF 1:1 (v:v) gelöst und bei 0 C mit HOBt (93 mg, 0,64 mmol) und DCC (0,64 mmol) versetzt. Nach 30 min bei 0 C wird das Gemisch direkt in den Reaktor gegeben. Nach 16 h Schütteln wird mit den gleichen Molverhältnissen wie oben 4 h lang nachgekuppelt. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und das L -z je 3 x mit 20 ml DMF/CH2Cl2 und DMF gewaschen. VII 4. Abspaltung des Hexapeptids vom Polymer Die Boc-geschützte Peptid-Polymerharz-Verbindung (ca. 1 g) auq VII.3 wird gut mit CH2Cl2 gewaschen und 2 x 1,5 h mit einer Mischung aus 5 ml TFE und 0,5 ml Anisol geschüttelt. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand in 5 ml CHCl3 aufgenommen. Pam3Cys-Ser-(Lys)4OH x 3 TFE kristallisiert nach Zugabe von 50 ml Aceton bei -20 Grad Celsius aus, wird abzentrifugiert und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 0,41 g (85*) Schmelzpunkt: 205 Grad Celsius (Zers.) Dünnschichtchromatographie auf Silikaqelplatten: RF - 0,42; (Laufmittel: n-BuOH/Pyridin/H20/Eisessig - 4:1:1:2) RF ' 0,82 (Laufmittel: n-BuOH/MeOH/H2O/Eisessig = 10:4)10:6) Aminosäurenanalyse: Ser 0,95 (1): Lys 4 (4) Molekulargewicht: C87H159N10O19SF9 (1852,6) Elementaranalyse: Ber. C 56,40 H 8,70 N 7,56 5 1,73 Gef. C 55,58 H 9,33 N 6,94 S 2,61 VIII. Herstellung von Pam3Cys-Ser-(Lys),-OH-FITC x ; -;E Flucresceinisothiocyanat (3,9 mg, 10 Mikromol) wird in 2 ml Chloroform gelöst und zu einer Lösung von Pam3Cys-Ser (Lys?4-OH x 3 TFE (18,5 mg, 10 Mikromol) in 2 ml Chloroform gegeben. Nach Zugabe von 4-Methylmorpholin (10 Mikroliter, 10 Mikromol) wird 1 h gerührt und das Lösungsmittel anschliessend am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in 10 ml Chloroform/Aceton 1:1 gelöst. Das gelbe Produkt fällt bei -20 Grad Celsius voluminös aus und wird abzentrifugiert und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 16 mg nach Reinigung an Sephadex LH20 Das Produkt liegt als Trifluoracetat vor und fluoresziert sehr stark bei Anregung mit Uv-Licht der Wellenlänge 366 nm. Im Vergleich zum Ausgangsprodukt ist eine#-Aminogruppe kovalent mit FITC verknüpft. Daraus resultiert die Summenformel Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH-FiTC x 2 TFE, vorausgesetzt die zwitterionische Struktur bleibt erhalten. Molekulargewicht: C 106H 169N11O2252F6 (2127,68 > Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten: R@ = 0,72 (Laufmittel: n-Butanol/Pyridin/Wasser/Eisessig = 4:1:1:2) RF = 0,73 (Laufmittel: n-Butanol/Ameisensäure/Wasser P 7:4:2) Aminosäurenanalyse: Ser 1,11 (1,00) Lys 4,00 (4,00) Die Hydrolyseprodukte von Glycerylcystein sind vorhanden. IX. Herstellung von Pam3Cys-Ser-lLys)4-OH x 3HCl Pam3cys-Ser-(Lys)4-OH x 3 TFE (185,2 mg, 0,1 mmol) werden in wenig Chloroform gerade gelöst und etwa das gleiche Volumen etherische HCl-Lösung zugegeben. Es wird gut geschüttelt, wobei ein Teil ausfällt, der grösste Tell jedoch in Lösung bleibt. Es wird am Rotationsverdampfer bis zur Trockene einrotiert und erneut Ether/HCl zugegeben. Nach mehrfacher Wiederholung dieses Vorgangs wird in wenig Chloroform der Rückstand gelöst und bis zum Trübwerden der Lösung Aceton zugegeben. Das Produkt kristallisiert als farbloses Pulver bei -20 Grad C aus und wird abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 153 mg Molekulargewicht: C81 H059N10O13sC13 (1619, 63) Llementaranalyse: Der. C 60,07 H 9,89 N 8,65 Gef. C 57,64 H 11,20 N 6,39 Dem Produkt haftet noch überschüssige HCl an. Felddesorptions-Massenspektrometrie : ------------------------------------- Der M + -Peak erscheint bei m/e 1510, sowie M++1 und M++2. Charakteristisch sind die protonierten Fragmente Pam3Cys-NH (908,5) bei m/e 909, 910, 911 und 912. X. N,S-Dipalmitoy?-cystein-tert.butylester Palmitinsäure (2,5 g, 9,6 mmol), Dimethylaminopyridin (130 mg, 0,9 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (9,6 mmol) werden in 100 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird eine halbe Stunde gerührt und N-Palmitoyl-cystein tert.butylester < 2 g, 4,8 mmol), der zuvor in 50 ml Chloroform gelöst wurde, zur anderen Lösung zugetropft. Nach 1 1/2 Stunden wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 100 ml Chloroform/Methanol 1:5 aufgenommen. Das Produkt fällt bei -20 Grad C voluminös aus. Es wird abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeuten 2,3 g (73% > Molekulargewicht: (Massenspektrometer) 39 75 4 (655120) Elementaranalyse: Der.: C 71,48 H 11,71 N 2,13 S 4,89 Gef.: C 71,72 H 12,14 N 2,12 S 4,77 Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten: RF s 0,67 (Laufmittel: Chloroform/Essigester 95:5) RF = 0,73 (Laufmittel: Chloroform/Cyclohexan/MeOH 10:7:1) 1 3C-NMR: s.Figur 4 XI. N-(&alpha;-Tetradecyl-ss-hydroxy-octadecanoyl)-cystein- tert butylester N-(&alpha;-Palmicoyl-palmitoyl)-cystein-tert.butylester (1,5 g 2,3 mmol) wird in 10 ml i-Propanol gelöst und die 1,5fache molare Menge Natriumborhydrid zugegeben. Es wird zwei Stunden gerührt und nach beendeter Reaktion tickstoffgesättigte IN Salzsäure zugegeben, bis keine @asserstoffentwicklung mehr erfolgt. Dabei fällt das Produkt voluminös aus. Es wird abgesaugt, mehrfach mit stickstoffgesättigtem Wasser gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 1,4 g (93%) Molekulargewicht: (bestimmt aus Massenspektrum) C39H77NO4S = 656,11 Dunnschichtchromatographie auf Sllicalgelplatten: F = 0,84 (Laufmittel: Chloroform/Essigester 95:5) Elementaranalyse: Ber.: C 71,39 H 11,83 N 2,13 S 4,89 Gef.: C 71,32 H 12,39 N 2,04 S 5,33 XII. N-(&alpha;-Tetradecyl-ss-hydroxy-octadecanoyl)-cystein N-(&alpha;-Tetradecyl-ss-hydroxy-octadecanoyl)-cystein-tert.butyl -ester (1g, 1,5 mmol) wird 1/2 Stunde mit wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt und diese anschliessend im Hochvakuum am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in tert.Butanol gelöst und lyophilisiert. Ausbeute: 0,7 g (78%) Molekulargewicht: (bestimmt aus Massenspektrum) C35H69N04S 600,0 Elementaranalyse: Ber.: C 70,06 H 10,92 N 2,33 S 5,34 Gef.: C 70,36 H 10,44 N 2,45 S 5,01 Dünnschichtchromatographie auf Silicalgelplatte: RF = 0,43 (Laufmittel:Chloroform/Methanol/Wasser 65:25:4) XIII. N,S-Dipalmitovi-cystein N,S-Dipalmitoyl-cystein-tert.butylester (1 g, 1,5 mmol) wird 1 h lang mit wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt. Anschliessend wird diese am Rotationsverdampfer im Hochvakuum entfernt, der Rückstand in tert. Butanol aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute: 0,8 9 (89%) Molekulargewicht: (bestimmt aus Massenspektrum) C35H67 4S (598,00) Elementaranalyse: Ber.: C 70,18 H 11,44 N 2,34 S 5,34 Gef.: C 69,97 H 11,31 N 2,50 S 5,17 Dünnschichtchromatographie: R ' 0,30 F (Laufmittel: Chloroform/Methanol/Eisessig 90:10:1) = 0a75 F (Laufmittel: Chloroform/Methanol/Wasser 65:25:4) RF ' 0,-81 (Laufmittel : Chloroform/Methanol/Ammoniak (25%) /Wasser 65:25:3:4) 1 3C-NMR: s. Fig. 5 XIV. N-(&alpha;-Palmitoyl-palmitoyl)-N'-palmitoyl-cystein-di- tert butylester Palmitoylchlorid (8g, 30 mmol) wird in 40 ml stickstoffge 3atigtem Dimethylformamid gelöst und Triethylamin (60 ml, 60 mmol) zugegeben. Die Mischung wird drei Stunden im Stlckstofrstrom unter Rückfluss gekocht, wobei das bei der H;ldung des Tetradecylketen Dimeren entstehende Triethylammoniumchlorid als farbloses Salz ausfällt. Der Ruckflusskühler wird anschliessend durch einen Tropftrichter ersetzt und eine Lösung von cystein-di-tert.butylester (4,9 g, 15mmol) @ in 20 ml Dimethylformamid langsam zugetropft. Nach 6 Stunden wird das Lösungsmittel am Rotatlonsverdampfer entfernt, der Rückstand in Chloroform aufgenommen und 3e zweimal mit 3e 100 ml 5%-iger Kaliumhydrogensulfatlösung und einmal mit 1200 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel erneut entfernt. Bei - 20 Grad Celsius kristallisiert ein Gemisch aus Palmitoyl-palmitoyl) - N'-palmitoyl-cystein-tert.butyl-ester und N, N'-Dipalmitoyl-cystein-di-tert. butylester aus, das durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 in Choloroform/Methanol 1:1 getrennt wird. Ausbeute: 6,4 g (40j) Molekulargewicht : (Massenspektrum) C62Hll8N2o7s (1067,76? Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten: RF - 0,69 (Laufmittel: Chloroform/-Essigester 91:5) XV. N-(&alpha;-Palmitoyl-palmitoyl)-cystein-tert. butylester ----------------------------------------------------------- N-(&alpha;-Palmitoyl-palmitoyl)-N'-palmitoyl-cystein-di-tert.- butylester (3,2 g, 3 mmol) wird in wenig Methylenchlorid gelöst und 100 ml 9,1 N methanolische Salzsäure zugegeben. Die Lösung wird in eine Elektrolysezelle mit einer Silberelektrode als Anode und Quecksilber als Kathode überführt und bei einer konstanten Spannung von -1,1 V reduziert. Die Stromstärke fällt am Ende der elektrochemischen Reduktion von etwa 200 mA auf fast Null ab. Das Lösungsmittel wird anschliessend am Rotationsverdampfer entfernt und das Produktgemisch aus N-( &alpha; Palmitoyl-palmitoyl)-cystein tert.butylester und N-Palmitoyl-cystein-tert.butylester aus Methanol bei -20 Grad Celsius gefällt. Diese beiden Verbindungen werden durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 in Chloroform/Methanol 1:1 getrennt. Ausbeute 1,5 g (76 .) Molekulargewicht: (bestimmt aus Massenspektrum) C@@H@@NO@S 654, 09 Dünnschichtchromatographie auf Silicalgelplatten: RF - 0,75 (Laufmittel: Chloroforrn/Essigester 95:5) Elementaranalyse: Ber.: C 71,48 H 11,71 N 2,13 S 4,89 Gef.: C 71,16 H 11,31 N 2,00 S 4,65 XVI. Herstellung eines Antigen-Konjugats mit einem konformationsstabllisierten -helikalen Membrananker Synthese von HuIFN-&alpha;(Ly)(11-20)-(L-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2- OMe, ein 20-Peptid, das N-terminal eine antigene Determinante von menschlichem Interferon (&alpha; (Ly)) trägt. Die Synthese des lipophilen Membranankers mit funktioneller Amino-Kopfgruppe H-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala > 2- OMe kann für andere Konjugate übernommen werden. Die Alpha-Helix kann auch ein- oder zweimal um die Einheit Ala-Aib-Ala-Aib-Ala verlängert werden. Dazu wird vorteilhaft vom Pentapeptid Boc-Ala-Aib-L-Ala-Aib-L-Ala-O.Me ausgegangen. (R. Oekonomopulos, G. Jung, Liebigs Ann. Chem. 1979, 1151; H. Schmitt, W. Winter, R. Bosch, G. Jung, Liebigs Ann..Chem. 1982 , 1304). XVII. Herstellung von Boc-Asn-Arg(NO)-Arg(NOq)-OH XVII.1. Boc-Arg(NO,)-OMe Boc-Arg(NO2)-OMe (15.97 g, 50 mmol) und HOBt (6.67 9, 50 mmol) in DMF (100 ml) wurden bei -10 Grad Celsius zu HCl x H-Ar(NO2)-O.Me (13.49 g, 50 mmol) und NMM (5.5 ml, 50 mmol) in CH2Cl2 (12 ml) bei - 10 Grad C gegeben und die Mischung wurde 30 min bei - 10 Grad Celsius, 1 Stunde bei 0 Grad Celsius und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Reaktion mit einigen Tropfen Eisessig abgestoppt. Es wurde vom usgefallenen DCH abfiltriert und das Lösungsmittel am Hochvakuum abgezogen. Der ölige Rückstand wird in Essigester unter Zusatz von etwas n-Butanol gelöst. Nach Waschen mit 5% KHSO4-, 5% KHCO3- und gesättigter NaCl.Lösung wurde die organische Phase über Na2SO4 getrocknet, mit Petrolether (30-50) versetzt und in der Kälte gefällt. Ausbeute: 20.30 g (76%) : Schmelzpunkt: 130 Grad Celsius (Zersetzung) ; Dünnschichtchromatographie: RF (I) - 0.69, R (II) = 0.87, RF(III) = 0,81, R (fV) - 0.32, RF(V) . 0.42. Molekulargewichtsbestimmung C18H54N10O9 (534.5) Elementaranalyse: ber. C 40.45 H 6.41 N 26.20 gef. C.40.39 H 6.55 N 26.11 XVII.2. HCl x H-Arg(NO2)-Arg(NO2)-OMe Boc-Arg-(NO2)-Arg(NO2)-OMe (20.00 g, 37.42 mmol) wurde mit 1.2 N HClSEssigsäure (110 ml) versetzt und nach 30 min in gerührten Ether (600 ml) gegossen. Dabei fiel dünnschichtchromatographisch reines HCl x H-Arg(NO2)-Arg(NO2)-OMe aus. Ausbeute: 17.3 g (98%) ; Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten: R F (1) - 0.37, RF (II) = 0.29, RF (III) = 0,44, R (IV) - 0.07, F RF (V) = 0.10. XVII.3. Boc-Asn-arg(NO2)-Arg(NO2)-OMe Boc-Asn-OH (8.39 g, 36.10 mmol) und HOBt (4.89 g, 36.10 mmol) in DMF (75 ml) wurden bei - 10 C zu HCl x H Arg(NO2)-Arg(NO2)-OMe (17.00 g, 36.10 mmol) und NMM (3.98 mol) in DMF (75 ml) gegeben. Nach Zugabe von DCC (7.53 g, 36.50 mmol) in CH2Cl2 (10 ml) wurde 30 min bei -10 Grad Celsius, 1 Stunde bei 0 Grad Celsius und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abbruch der Reaktion mit wenigen Tropfen Eisessig wird das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der Rückstand in wenig Methanol aufgenommen. Diese Lösung wird unter Rühren zu trockenem Ether getropft. Der Rückstand wird abfiltriert und in Methanol aufgenommen. In der Kälte fällt reines Produkt aus. Ausbeute: 18.25g (78%) Schmelzpunkt: 170 Grad Celsius Dünnschichtchromatographie RF(I) = 0.59, R@ (II) = 0,6 rF(II) = 0.67, RF(III) 8 0.66, RF (IV) = 0,45, RF(V) - 0.65. Aminosäurenanalyse: Asx 1.00 (1), Arg 1.85 (2) Molekulargewichtsbestimmung: C22H40N12O11 (648.6) Elementaranalyse: ber. C 40.74 H 6.22 N 25.91 gef. C 40.70 H 6.40 N 25.79 XVII.4. Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-OH Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-OMe (18.00 g, 27.75 mmol) wurde in Methanol (180 ml) mit 1 N NaOH (80 ml) bei Raumtemperatur verseift. Nach 2 h wurde mit verdünnter HC1 neutralisiert und das Methanol im Vakuum abgedampft. Bei pH 3 wurde erschöpfend mit Essigester extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit wenig gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und aus einer methanolischen Lösung bei -20 Grad Celsius kristallisiert. Ausbeute: 15.84 g (90%); Schmelzpunkt: 228 Grad Celsius (Zersetzung) Dünnschichtchromatographie RF (I) - = 0.49, RF(II) = 0.21 RF (III) = 0.26 RF (IV) = 0.05, RF (V) = 0.21 XVIII. Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-AibXAla-Aib Ala-t-Ome XVIII.1 Boc-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala-OH Boc @@la-Aib-Ala-Aib-Ala-OMe (10.03 g, 20 mmol) wurde in Me R (150 ml) mit 1 N NaOH (40 ml, 40 mmol) verseift. Nach 2. Stunden wurde mit 1 N HCl neutralisiert, im Vakuum eirigtdampft und zwischen EE/5% KHCO3 (1:1; 1000 ml) ver te@lt. Die wässrige Phase wurde mit 5% KHSO4 auf pH 4 answesäuert und mit EE/1-Butanol (5:1) fünfmal extrahiert. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet, mit PE (3@-50) versetzt und die Pentapeptidsäure in der Kälte gefällt. Ausbeute 6.554 g (65%) Scmmelzpunkt: 195 Grad Celsius (Zersetzung) Dünnschichtchromatographie RF(I) = 0.72 ; RF(II) = 0,80, RF (III) = 0.87, RF(IV) = 0.95, (V) = 0.80. R F Aminosäurenanalyse : Ala 3.08 (3). Aib 1.98 (2). Molekulargewicht: C22H39N508 (501.6) Elementaranalyse: ber. C 52.68 H 7.84 N 13.96 gef. C 52.70 H 7.90 N 13.89 XVIII.2. Boc-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe Boc-Ala-Aib-Ala-Alb-Ala-OH (1.75 g, 3.48 mmol) und HOBt (470 mg, 3.48 mmol) in DMF(10 ml) wurden bei -10 Grad Celsius zu HCl x H-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala-OMe (1.57 g, 3.48 mmol) und NMM (384 l, 3.48 mmol) in DMF (8 ml) gegeben. Nach Zugabe von DCC (825 mg) 4.00 mmol) in CH2Cl2 (3 ml) bei - 10 Grad Celsius wurde unter langsamen, selbständigem Erwärmen 15 h gerührt. Nach Abstoppen der Reaktion mit einigen Tropfen Eisessig wurde vom ausgefallenen DCH abzentrifugiert, der Rückstand zweimal mit kaltem DMF gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml CHCl3/HeOH 1:1 aufgenommen und an Sephadex LH 20 in CHC13/MeOH 1:1 chromatographiert. Ausbeute: 2.246 g (72 ), Schmelzpunkt: 160 Grad Celsius, Dünnschichtchromatographie Rr(I) = 0.61, RF(II) = 0,76, RF(III) = 0.83, RF(IV) = 0.95, RFtV) I 0.81. Molekulargewichtsbestimmung: C40H70N10O13 (899.1) Elementaranalyse: ber. C 53.44 H 7.85 N 15.58 gef. C 53.42 H 7.90 N 15.40 XVIII.3. HCl x H-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala),-OMe Boc-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (2.046 g, 2.276 mmol) wurde mit 1.2 N HCl/AcOH (10 ml) versetzt. Nach 30 min Rühren wurde das Hydrochlorid mit Ether gefällt, abfiltriert und am Ölvakuum über KOH getrocknet. Ausbeute: 1.805 g (95%) Dunnschichtchromatographie: RF(I) = 0.50, RFfII) = 0.38, (III) = 0,71, R (IV) - 0.48, R (v) r 0.53. XVIII.4 Boc-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala),-OMe Boc-Gln-OH (997 mg, 4.05 mmol) und HOBt (547 mg, 4.05 mmol) in DMF (10 ml) wurden bei -10 Grad Celsius zu HCl x H-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)?-OMe (2.250g, 2.70 mmol) und NMM (298P1, 2.70 mmol) in DMF (13 ml) gegeben. Nach Zusatz von DCC (846 mg, 4.10 mmol) in CH2Cl2 (2 ml) bei - 10 Grad Celsius wurde unter langsamen selbständigem Erwärmen 15 h gerührt. Nach Abbruch der Reaktion mit einigen Tropfen Eisessig wurde vom ausgefallenen DCH abzentrifugiert, der Rückstand zweimal mit wenig kaltem DMF gewaschen und das Lösungsmittel im Ölvakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 10 ml CHCl3/MeOH 1:1 aufgenommen und an Sephadex LH 20 in CHCl3/MeOH (1:1) chromatographiert. Ausbeute: 2.60 g (94%) Schmelzpunkt 223 Grad Celsius (Zersetzung) Dünnschichtchromatographie: RF(I) = 0.66, RF(II) - 0.73 RF (III) 1 0.79, RF (1V) - 0.94, RF(V) = 0,80. Molekulargewichtsbestimmung: C45H78N12015 (1027.2) Elementaranalyse: ber. C 52.62 H 7.65 N 16.36 gef. C 52.65 H 7.68 N 16.32 XVIII.5. HCl x H-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe Boc-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (2.60 g, 2.701 mmol) wurde mit 1.2 N HCl/AcOH (15 ml) versetzt. Nach 40 min wurde das Hydrochlorid unter Rühren mit Ether gefällt, abfiltriert und am Ölvakuum über KOH getrocknet. Ausbeute: 2.209 g (85%); Dünnschichtchromatographie: RF(I) = 0,48, RF(II) 1 0.25, RF(III) = 0,54, R (Iv) 1 0.24, F RF (V) = 0,35. XVIII.6.Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-OH (760 mg, 1.07 mmol) und HOBt (145 mg, 1.07 mmol) in DMF (12 ml) wurden bei Raumtemperatur zu HCl x H-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (818 mg, 0.85 mmol) und NMM (94 l, 0.85 mmol) in DMF (10 ml) gegeben. Nach Zugabe von DCC (227 mg, 1.10 mmol) in CH2Cl2 (1.5 ml) wurde 64 Stunden gerührt. Nach Abbruch der Reaktion mit wenigen Tropfen Eisessig wurde vom ausge allenen DCH abzentrifugiert, der Rückstand zweimal mit ! m g kaltem DMF gewaschen und das Lösungsmittel im Ölva- um entfernt. Der Rückstand wurde in 8 ml CHCl3/MeOH (1:1) aufgenommen und an Sephadex LH 20 in CHCl3-/MeOH (1:1) C@@omatographiert. Ausbeute: 774 mg (57%); So melzpunkt: 260 Grad Celsius (Zersetzung); d Dunnschichtchromatographie: RF(I) = 0.80, RF(II) - 0.86, RF (III) = 0.91, RF(IV) = 0.77 RF(V) = 0.78. Aminosäurenanalyse: x 1.00 (1), Ile 0.89 (1), Leu 3.10 (3), Aib 4.08 (4), Ala 7.95 (8). Mclekulargewichtsbestimmung C75H132N18O21 (1622.0) Elementaranalyse ber. C 55.54 H 8.20 N 15.54 gef. C 55.58 H 8.31 N 15.52 XIX. Herstellung von Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-Leu- Ile-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe XIX.1. HCl x H-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib- Ala)2)-OMe Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (754 mg, 0.465 mmol) wurde mit 1.2 N HCl/AcOH (10 ml) versetzt. Nach 50 min wurde am Ölvakuum etwas eingeengt und nach Zugabe von Wasser (10 ml) lyophilisiert. Ausbeute: 690 mg (95%) : Dünnschichtchromatographie: RF(I) = 0.71, RF (11) = 0.52, RF (III) = 0.78, RF (IV) = 0.56, RF (V) = 0.54. XIX.2. Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-OH (634 mg, 0.995 mmol) und HOBt (135 mg, 1.13 mmol) in DMF (5 ml) wurden bei -5 Grad Celsius zu HCl x H-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib- Ala-Aib-Ala)2-OMe 20 mg, 0.398 mmol) und NMM (44 Mikroliter, 400 Mikromol) in DMF (7 ml) gegeben. Nach Zusatz von DCC (217 mg, 1.05 mmol) in CH2Cl2 (1.5 ml) bei -5 Grad Celsius wurde unter selbständigem Erwärmen 48 h gerührt. Nach Abbruch der Reaktion mit 3 Tropfen Eisessig wurde vom ausgefallenen DCH abzentrifugiert. Die Aufarbeitung und Reinigung durch Chromatographie erfolgt, wie zuvor beschrieben. Ausbeute: 630 mg (74%); Schmelzpunkt: 195 Grad Celsius (Zersetzung); Dünnschichtchromatographie: RF (I) = 0.70, RF (II) = 0.51, RF (III) = 0.56, RF (IV) = 9.45. R (V) - 0.68. Aminosäurenanalyse: Asx 0.94 (1), Glx 1.00 (1), Ile 0.89 (1), Leu 3.16 (3), Arg 1.95 (2). Molekulargewichtsbestimmung: C91H160N30029 (2138.5) Elementaranalyse: er. C 51.11 H 7.54 N 19.65 gef. C 51.14 H 7.60 N 19.66 XX. Herstellung des freien Eicosapeptids XX.1. Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala Aib-Ala-Aib-Alal2-OMe x 2HCl Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ale Aib-Ala-Aib-Ala) 2-OMe (350 mg, 0.164 mmol) wurde in 3 ml wasserfreiem Methanol mit 35 mg Pd/Aktivkohle sowie 12 l (0.075 mmol) 6 N HCl versetzt. Man leitete unter Rühren bei Raumtemperatur Wasserstoff durch die Lösung. Nach 20 min wurden 8 l (49 Mikromol) und nach 35 min 7 1 (42 Mikromol) 6 N HC1 zugegeben. Nach ca. 50 min. Hydrierdauer war die Abspaltung nach DC-Kontrolle quantitativ. Der Katalysator wurde abfiltriert und mehrmals mit wenig Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer rasch abdestilliert (Ölpumpenvakuum, Badtemperatur 25 Grad Celsius), der Rückstand in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute: 332 mg (95); Dünnschichtchromatographie: RF(l) = 0.16, RF(II) = 0.11, RF(III) = 0.21, RF(IV) - 0.10. XX.2 H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala Aib-Ala-Aib-Ala)-OMe x 3 HCl Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala- Aib-Ala)2-OMe x 2 HCl (600 mg, 0.283 mmol) wurde mit 1.2 N HCl/AcOH (5 ml) versetzt. Nach 30 min wurde etwas am Rotationsverdampfer eingeengt, mit Wasser (10 ml) versetzt und lyophilisiert. Ausbeute: 564 mg (97%); Schmelzpunkt: 245 Grad Celsius (Zersetzung) Dünnschichtchromatographie: RF (I) = 0.11 Molekulargewichtsbestimmung: C86H 157N28023C13 (2057.7) Elementaranalyse: ber. C 50.20 H 7.69 N 19.06 Cl 5.17 gef. C 50.31 H 7.78 N 18.95 Cl 5.28 Materialien und Methoden der Experimente Chemikalien Lösungsmittel p.a. wurden von der Fa. Merck bezogen, ansonsten nach üblichen Methoden getrocknet und destilliert. N-Methyl-morpholin (Merck) wurde zur Entfernung sek. Amine über Ninhydrin destilliert. 1 Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid stammten ebenfalls von Merck. Alle L-Aminosäurederivate wurden von der Fa. Bachem bezogen. Boc-Aib-OH und H-Aib-OMe x HCl wurden nach Literaturvorschriften synthetisiert. Dünnschichtchromatographie Es wurden Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (Fa. Merck) und folgende Flienmittel verwendet: (I) 1-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 (II) Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser 65:25:3:4 (III) Chloroform/Methanol/konz. Ammoniak/Wasser 65:35:3:4 (IV) Chloroform/Methanol/Wasser 6S:25:4 (V) Chloroform/Methanol 1:1 Als Sprühreagentien wurden eingesetzt: Ninhydrinreagens, Chlor/4,4'-Bis (dimethylamino)diphenylmethan (TDM-Reagens) und Sakaguchi-Reagens. Als Referenz diente Dicylohexylharnstoff mit folgenden Werten: RF (1) 0.91, RF (11) 0.82, RF < III) 0.92, RF(IV) 0.81, RF (V) 0.93. A.incsäurenanalysen Zur Feststellung der Identität der Zwischenstufen wurden von den geschützten Peptiden Jeweils ca. 200 Mikrogramm Proben in 6N HCl 24 Stunden bei 110 Grad Celsius hydrolysiert. Zwischenstufen und Zielsequenz des Hexapeptid Segments, das die Leu-Leu-Bindung enthält, wurden unter sonst gleichen Bedingungen 72 Stunden hydrolysierv. Die Aminosäurenanalysen wurden mit einem Biotronik-Aminosäurenanalysator LC 6000 E unter Verwendung der Standard Programmierung durchgeführt. Racematbestimmung Die hydrolysierten Aminosäuren wurden als Pentafluorpropionylaminosäure-n-propylester derivatisiert, und die Enantiomeren an Glaskapillarsäulen mit Chirasil-Val gaschromatographisch getrennt. Die angegebenen Prozentanteile an D-Aminosäuren sind nicht auf hydrolysebedingte Racemisierung korrigiert. Elementar analysen Es wurden C,H,N-Einfachbestimmungen an einem Elemental Analyzer Modell 1104 (Carlo Erba, Mailand) durchgeführt. Schmelzpunkte Schmelzpunkte wurden-nach Tottoli ermittelt und sind nicht korrigiert. Aufnahme der Spektren 13C-NMR-Spektren: 30 mg des geschützten Eicosapeptids wurden in 400 Mikrolitern 12C2 12C2H H (1:1) (Fa. HCl3/ 3 Merck) qelöst und im NMRSpektrometer WM 400 (Fa. Bruker 12 b bei 30 C vermessen. Circulardichroismus-Spektren ; Lösungen des freien Eicosapeptids (c r 1-1.7 mg/ml) in Ethanol, Trifluorethanol, Methanol 1.1.1.3.3.3-Hexafluorpropanol-(2), Wasser sowie Ethanol/Wasser-Mischungen wurden mit dem Dichrograph II (Fa. Jouhan-Roussel) vermessen. Chromatographische Reinigung Die geschützten Peptid-Zwischenstufen wurden nach Beendigung der Kupplungsreaktion und Abziehen des Lösungsmittels am Öl vakuum durch Zugabe des gleichen Volumens an CHCl3/MeOH 1:1 gelöst, vom Dicyclohexylharnstoff abzentrifugiert und an Sephadex LH 20 chromatographiert: Säule 3 x 115 cm; Elutionsmittel CHCl3/MeOH 1:1; Auftragsmenge 35 ml; Fliessgeschwindigkeit 8,40 ml/10 min. Die 3 ml-Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch im System II untersucht (TDM-Reagens). Die Peptide erschienen im Elutionsvolumen 165 -190 ml. Die Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, und der Rückstand über P2o5 getrocknet. Die Aminosäurenanalyse lieferte die erwarteten Werte und einen Peptidgehalt von 92-96%. lmmunisierungsversuche Wir haben erstmals ein B-Zell-Mitogen, das zugleich ein hervorragender Carrier und ein stark wirksames Adjuvans ist, kovalent mit synthetischen antigenen Determinanten verknüpft. Dazu verwendeten wir u.a. das synthetische Lipopeptid S-(2.3-Bis(palmitoyloxy)propyl)-N-palmitoyl eysteinyl-serin (Pam3Cys-Ser), das den N-Terminus des Lipoproteins aus der äusseren Membran von Escherichia coli darstellt. Die in kovalenter Verbindung mit einem Antigen besonders ausgeprägt amphiphilen Eigenschaften gewährlei sten einerseits eine stabile Verankerung der drei Fettsäurereste tragenden S-Glyceryl-Verbindung in der Lipidschicht der Zellmembran. Andererseits wird dadurch das meist polarere Antigen (bzw. Hapten) in der äusseren hydrophilen Schicht der Membran präsentiert. Da die aktivierende Wirkung des Lipoproteins allein von dessen N-terminalem Teil bestimmt wird, bleibt in allen Konugaten, die Pam3Cys-Ser oder Analoga tragen, dessen immunstimulierende Wirkung erhalten. Als Beispiel führen wir die Anwendung des Konzepts zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern gegen den Epidermal Growth Factor-Rezeptor (EGF-R) Fig. 9 an. Dazu wurde durch computerunterstützte Epitopsuche die extracytoplasmatische Region 516-529 ausgewählt, durch Merrifield-Synthese aufgebaut und zuletzt Fmoc-Ser(Bu )-OH und dann Pam3Cys-OH angebaut. Nach Abspaltung vom Harz wurde das analytisch als einheitlich befundene Konjugat ohne weitere Zusätze in einer einmaligen Dosis Mäusen i.p. appliziert. Mittels ELISA Assays wurden bereits nach 2 Wochen hohe Titer an spezifischen Antikörpern gegen das Tetradekapeptid festgestellt. Wesentlich ist, dass bei Kontrollversuchen durch das allein offensichtlich schwach immunogene Tetradekapeptid keine Antikörpertiter erhalten wurden. Da Pam3Cys-Konugate ebenfalls in Zellkulturen stark immunogen sind, können durch in vitro Immunisierung auf eine rasche und elegante Weise konventionelle und monoklonale Antikörper auch gegen schwach immunogene Verbindungen erhalten werden. Die Vorteile unseres Konzepts in Verbindung mit Zellkulturen sind: einfache Herstellung eines chemisch eindeutig definierten Antigen-Aduvans-Konjugats in beliebiger Menge, im Gegensatz zu anderen Konjugaten einmalige Applikation ohne mehrfaches "Boostern", hohe Effizienz in vivo und in vitro. Die erhebliche Einsparung von Versuchstieren, häufig sogar ein völliger Verzicht auf in vivo Immunisierungen und eine drastische Zeitersparnis insbesondere bei gentechnologischem Arbeiten liegen auf der Hand. Die Versuche können auch mit Humanzellkultursystemen durch führt werden. Beispiel für eine in vivo Immunisierung: 6 bis 10 Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden durch einmalige l.p. Applikation von 50 Mikrogramm und 500 Mikrogramm (0,2 ml einer 10 1 bis 10 2 molaren Lösung von kovalent an Antigen gekoppeltem Adjuvans) Pam3Cys-Ser- < EGF-R 515-529) immunisiert. Als Kontrollen dienten Antigen, Adjuvans und eine Mischung von Antigen und Adjuvans jeweils in vergleichbaren molaren Mengen, sowie Medium. Zwei Wochen nach der Injektion wurde den Mäusen aus dem retroorbitalen Venenplexus Blut zur Gewinnung von Serum entnommen und der Antikörpertiter durch ELISA bestimmt. Analoge Immunisierungen können auch durch andere Applikatonen z.B. i.v., oral, rektal, i.m., s.c. erreicht werden. Die Bildung spezifischer Antikörper ohne Freund's Adjuvans gegen das Tetradekapeptid EGF-R 516-529 nach in vivo Immunisierung wurde untersucht. Balb/c-Mäuse wurden, wie in Fig. 10 gezeigt, mit I. Konjugat Pam3Cys-Ser (EGF-R 516-526) II. Freies Tetradekapeptid EGF-R 516-529, alleine III.Pam3Cys-Ser alleine IV. freies Tetradekapeptid (EGF-R 516-529) gemeinsam in Mischung mit Pam3Cys-Ser einmalig i.p. mit 0,2 Mikromol des Konjugat immunisiert. Der Antikörpertiter wurde mittels ELISA Assay bestimmt. (Ordinate OD bei 405 nm) (Fig.10). 14 Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse aus der Augenvene geblutet und das gewonnene Serum in ELISA eingesetzt. Die Werte ergeben sich aus dem Mittelwert (3-5 Mäuse) der Differenz zwischen den ELISA-Werten von PEP 14 - BSA Konjugat und BSA. (Fig. 10) Es zeigt sich, dass nur bei Verwendung des erfindungsgemä allen Menmbrananker-h'irkstoffkonjugats drastisch erhöhte, bisherige Verfahren um ein Vielfaches an Wirdsamkeit übertreffende Antikörperkonzentrationen gefunden werden. Beispiel für eine in vitro Immunisierung Milzzellen aus Mäusen wurden jeweils in Gegenwart von Konjugat Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529), von Adjuvans Pam3Cys-Ser, von Tetradekapeptid EGF-R 516-529, einer Mischung von Antigen und Adjuvans und Medium 5 Tage lang kultiviert. Die Lymphozyten wurden bei einer Zelldichte von 2,5 x 106 /ml 48 h lang in 0,2 ml Aliquote, in RPNI-1640 Medium, angereichert mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, Glutamin (2mM), Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 /mol) und 2-Mercaptoethanol (5 x 10 M) kultiviert. Die Uberstande wurden zur Untersuchung auf spezifische Antikörper durch ELISA-Assay gewonnen. Mltogene Aktivierung von Maus-Milzzellen Die mitogene Aktivierung von Balb/c-Milzzellen durch Pam3cys-Ser-(Lys)4-FITC (Kreise), Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 3 HCl (Dreiecke) und Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x 2 TFE (Vierecke) ist aus Fig. 12 ersichtlich. Die Zellkultivierungs- bedingungen sind beschrieben. (Z.Immunforsch. 153, 1977, 5.11 ff. und Eur. J. Biochem. 115 ,1981). In der Zeichnung ist auf der Ordinate der Stimulationsindex des Einbaus von 3H-Thymidin in die DNA (cpm-Werte der Inkorporation/cpm Werte der Kontrolle ohne Mitogen) gegen die Konzentration des eingesetzten Wirkstoffes aufgetragen. Vercleich in vivo/in vitro In Fig. 11 ist der oben aufgeführte in vivo Versuch einem in vitro Experiment gegenübergestellt: In vitro-Versuch in Mikrotiterplatten: Zelldichte: 2,5 x 106 Zellen/ml; Substanzkonzentration: 5 x 10 7 mmolar; Inkubationsbedingungen: 37 OC, 5 % CO2, 5 Tage. Conj@: Konjugat Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529) Pep : Tetradekapeptid EGF-R 516-529 Adj. : Pam3Cys-Ser Mix : Mischung von freiem Tetradekapeptid EGF-R 516-529 und Pam3Cys-Ser Auch in vitro ergibt sich der drastische Anstieg der Antikörperkonzentration, wodurch die Einsetzbarkeit von Zellkulturen, insbesondere für die Herstellung von Antikörpern, erheblich erweitert wird.

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A membrane anchor/active compound conjugate which comprises at least one membrane anchor compound and at least one active compound covalently bonded to the membrane anchor compound(s), where the membrane anchor compound is a compound of the formula I: it being possible for A to be sulfur, oxygen, disulfide (-S-S-), methylene (-CH₂-) or -NH-; n being 0 to 5; m being 1 or 2; C* being an asymmetric carbon atom with R or S configuration; R, R' and R'' being identical or different and being an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 7 to 25 carbon atoms or hydrogen, which can optionally be substituted by hydroxyl, amino, oxo, acyl, alkyl or cycloalkyl groups, and X being an active compound or a spacer-active compound group, with the exception of the compounds of the formula I' in which R₁ and R₂ are each a saturated or unsaturated, aliphatic or mixed aliphatic-cycloaliphatic hydrocarbon radical which is optionally also substituted by oxygen functional groups and has 11 to 21 carbon atoms and Y is a peptide-bonded natural aliphatic amino acid with free, esterified or amidated carboxyl group, or an amino-acid sequence of 2 to 10 natural aliphatic amino acids whose terminal carboxyl group is in free, esterified or amidated form, where the centers of asymmetry identified by * and ** have the absolute S or S or R configuration, and mixtures of the R and S compounds which are epimeric at the ** carbon atoms. A membrane anchor/active compound conjugate as claimed in claim 1, wherein the membrane anchor compound is Pam₃-Cys or Pam₃Cys-Ser or a Pam₃Cys-peptide having 1 to 10 amino acids. A membrane anchor/active compound conjugate as claimed in claim 1 or 2, wherein the active compound is an antigen such as, for example, a low molecular weight partial sequence of a protein or conjugated protein, for example of a glycoprotein, of a viral coat protein, of a bacterial cell wall protein or of a protein of protozoa (antigenic determinants, epitope), constituents of bacterial membranes, such as muramyldipeptide, lipopolysaccharide, an antibiotic, a hormone, a nucleoside, a nucleotide, a nucleic acid, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme inhibitor, biotin, avidin, polyethylene glycol, peptidic active compounds such as tuftsin; polylysine, an alkaloid, steroid, biogenic amine, vitamin or a toxin such as, for example, digoxin, phalloidin, amanitin or tetrodotoxin. A membrane anchor/active compound conjugate as claimed in one of the preceding claims, wherein the membrane anchor compound and the active compound are covalently bonded together via a crosslinker, for example via a polyethylene glycol. A process for the preparation of membrane anchor compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4, which comprises synthesis of the peptide, which is protected with protective groups in a manner known per se on the functional groups at which no reaction is to take place, by means of known coupling processes on a solid or soluble carrier, such as a polymer (for example Merrifield resin), covalent bonding of the carrier-bound peptides, which have been synthesized in this way, via N-termini or sidegroups of the peptide to the membrane anchor compound; isolation of the peptide conjugate, which has been prepared in this way, by cleavage of the protective groups and the peptide/carrier bond in a manner known per se, and thus the membrane anchor/peptide or the membrane anchor/active compound conjugate being obtained. The process as claimed in claim 5, wherein the peptide/membrane anchor linkage is produced by condensation, addition, substitution or oxidation, for example disulfide formation. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for the preparation of conventional and monoclonal antibodies in vivo and in vitro. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for the preparation of synthetic vaccines. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for liposome preparations. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for addition to human foodstuffs or animal feeds, and for addition to culture media for microorganisms and generally for cell cultures. The use of a membrane anchor/active compound conjugate which comprises at least one membrane anchor compound and at least one active compound covalently bonded to the membrane anchor compound(s), where the membrane anchor compound is a compound of the formula I: it being possible for A to be sulfur, oxygen, disulfide (-S-S-), methylene (-CH₂-) or -NH-; n being 0 to 5; m being 1 or 2; C* being an asymmetric carbon atom with R or S configuration; R, R' and R'' being identical or different and being an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 7 to 25 carbon atoms or hydrogen, which can optionally be substituted by hydroxyl, amino, oxo, acyl, alkyl or cycloalkyl groups, for the preparation of a pharmaceutical for generating an immune response toward the active compound. Claims for the following Contracting State : AT A process for the preparation of a membrane anchor/active compound conjugate comprising at least one membrane anchor compound and at least one active compound covalently bonded to the membrane anchor compound(s), where the membrane anchor compound is a compound of the formula I: it being possible for A to be sulfur, oxygen, disulfide (-S-S-), methylene (-CH₂-) or -NH-; n being 0 to 5; m being 1 or 2; C* being an asymmetric carbon atom with R or S configuration; R, R' and R'' being identical or different and being an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 7 to 25 carbon atoms or hydrogen, which can optionally be substituted by hydroxyl, amino, oxo, acyl, alkyl or cycloalkyl groups, and X being an active compound or a spacer-active compound group, with the exception of the compounds of the formula I' in which R₁ and R₂ are each a saturated or unsaturated, aliphatic or mixed aliphatic-cycloaliphatic hydrocarbon radical which is optionally also substituted by oxygen functional groups and has 11 to 21 carbon atoms and Y is a peptide-bonded natural aliphatic amino acid with free, esterified or amidated carboxyl group, or an amino-acid sequence of 2 to 10 natural aliphatic amino acids whose terminal carboxyl group is in free, esterified or amidated form, where the centers of asymmetry identified by * and ** have the absolute S or S or R configuration, and mixtures of the R and S compounds which are epimeric at the ** carbon atoms, which comprises synthesis of the peptide, which is protected with protective groups in a manner known per se on the functional groups at which no reaction is to take place, by means of known coupling processes on a solid or soluble carrier, such as a polymer (for example Merrifield resin); covalent bonding of the carrier-bound peptides, which have been synthesized in this way, via N-termini or sidegroups of the peptide to the membrane anchor compound; isolation of the peptide conjugate, which has been prepared in this way, by cleavage of the protective groups and the peptide/carrier bond in a manner known per se, and thus the membrane anchor peptide or the membrane anchor/active compound conjugate being obtained. The process as claimed in claim 1, wherein the membrane anchor compound is Pam₃-Cys or Pam₃Cys-Ser or a Pam₃Cys-peptide having 1 to 10 amino acids. The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the active compound is an antigen such as, for example, a low molecular weight partial sequence of a protein or conjugated protein, for example of a glycoprotein, of a viral coat protein, of a bacterial cell wall protein or of a protein of protozoa (antigenic determinants, epitope), constituents of bacterial membranes, such as muramyldipeptide, lipopolysaccharide, an antibiotic, a hormone, a nucleoside, a nucleotide, a nucleic acid, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme inhibitor, biotin, avidin, polyethylene glycol, peptidic active compounds such as tuftsin; polylysine, an alkaloid, steroid, biogenic amine, vitamin or a toxin such as, for example, digoxin, phalloidin, amanitin or tetrodotoxin. The process as claimed in one of the preceding claims, wherein the membrane anchor compound and the active compound are covalently bonded together via a crosslinker, for example via a polyethylene glycol. The process as claimed in one or more of claims 1-4, wherein the peptide/membrane anchor linkage is produced by condensation, addition, substitution or oxidation, for example disulfide formation. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for the preparation of conventional and monoclonal antibodies in vivo and in vitro. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for the preparation of synthetic vaccines. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for liposome preparations. The use of the compounds as claimed in one or more of claims 1 to 4 for addition to human foodstuffs or animal feeds, and for addition to culture media for microorganisms and generally for cell cultures. The use of a membrane anchor/active compound conjugate comprising at least one membrane anchor compound and at least one active compound covalently bonded to the membrane anchor compound(s), where the membrane anchor compound is a compound of the formula I: it being possible for A to be sulfur, oxygen, disulfide (-S-S-), methylene (-CH₂-) or -NH-; n being 0 to 5; m being 1 or 2; C* being an asymmetric carbon atom with R or S configuration; R, R' and R'' being identical or different and being an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 7 to 25 carbon atoms or hydrogen, which can optionally be substituted by hydroxyl, amino, oxo, acyl, alkyl or cycloalkyl groups, for the preparation of a pharmaceutical for generating an immune response toward the active compound.

Inventors: BECKER GERHARD DR, BESSLER WOLFGANG PROF DR, BUEHRING HANS-JOERG DR, JUNG GUENTHER PROF DR, METZGER JOERG, WIESMUELLER KARL-HEINZ, BECKER, GERHARD, DR., BESSLER, WOLFGANG, PROF. DR., BUEHRING, HANS-JOERG, DR., JUNG, GUENTHER, PROF. DR., METZGER, JOERG, WIESMUELLER, KARL-HEINZ, Bühring, Hans-Jörg, Dr., Jung, Günther, Prof. Dr., Metzger, Jörg, Wiesmüller, Karl-Heinz 
Applicants: HOECHST AG, HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1986
Main classification: C07K5
IPC codes: C07K17, C07K16, C07K7, A23K1, C12P21, G01N33, C07C67, C07K19, A61K39, C07K14, B01J20, C07C313, A61K9, A61K38, A61K47, C07C323, C07K1, C12N15, C07K5, C07K4