REAGENT FOR THE DETERMINATION BY HAEMAGGLUTINATION OF ANTIBODIES AGAINST BACTERIAL TOXINS, METHOD FOR ITS PREPARATION AND ITS USE

Abstract: The reagent is non-toxic. Bacterial toxins are coupled to erythrocytes by the action of glutaraldehyde and the whole is simultaneously detoxified; the reagent is stable in aqueous suspension or in lyophilised form. Use in the determination of antidiphtheria and antitetanus antibodies.

Description: La présente invention concerne un nouveau réactif, constitué d'érythrocytes couplés, permettant un dosage par hémagglutination des anticorps dirigés contre des toxines bactériennes, le procédé de préparation de ce réactif, ainsi que le coffret de réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre du dosage et le procédé de dosage correspondant. On sait doser les anticorps, en utilisant l'hémaggiutination comme révélateur de leur présence dans un milieu biologique; on utilise pour cela des érythrocytes porteurs d'un antigène, réagissant avec les anticorps à doser; mais les érythrocytes traités sont peu stables et c'est un inconvénient majeur de ce type de procédé, par ailleurs intéressant puisqu'il n'impose pas d'utiliser un appareillage de mesure coûteux. Dans le brevet FR-A-2 331 352 est décrit un moyen pour améliorer notamment la stabilité du réactif d'hémagglutination qui consiste à traiter les érythrocytes en suspension dans un tampon par un aldéhyde aliphatique inférieur et un sel de chrome tydrosoluble avant de les mettre en contact avec l'antigène choisi; la durée de conservation est alors améliorée si l'on conserve les érythrocytes traités à 4"C dans une solution colloïdale ou à l'état lyophilisé. Dans FR-A-2 475 737, on décrit un autre moyen d'amélioration de la stabilité des hématies traitées pour servir de réactif dans des réactions d'hémagglutination, qui diminue simultanément les phénomènes d'agglutination spontanée; du sang total est soumis à l'action d'un aldéhyde, tel que le formol ou le glutaraldéhyde, on isole ensuite les hématies et les traite par un tannin avant de les mettre en contact avec l'antigène choisi pour obtenir un réactif qui sera conservé sous forme lyophilisée. On a maintenant trouvé un nouveau réactif pour le dosage par hémagglutination des anticorps antitoxines bactériennes, particulièrement stable, très sensible, dépourvu de toute toxicité, et donc manipulable sans précautions particulières: la technique de dosage est par ailleurs simple et rapide, et applicable avec de petits échantillons de sang sur le terrain. Selon l'invention, le réactif qui est constitué d'érythrocytes sensibilisés à l'antigène correspondant à l'antitoxine à doser, est préparé en faisant réagir sur une suspension aqueuse d'érythrocytes du glutaraldéhyde de telle sorte que ceux-ci ne soient pas hémolysés lorsqu'ils sont ensuite mis au contact de la toxine bactérienne correspondant aux anticorps à doser, puis en traitant ces érythrocytes par une certaine quantité de la toxine bactérienne en présence de glutaraldéhyde pour fixer la toxine sur les érythrocytes et simultanément en modifier la structure de telle sorte qu'elle perde son activité toxique pour l'homme ou les animaux sans dénaturation de ses sites antigéniques. On a déjà décrit dans FR-A-2 478 470 un procédé de préparation de cellules immunogéniques résultant de la fixation sur des lymphocytes de différents agents tels qu'antigènes, hormones, toxines, par action du glutaraldéhyde sur le mélange des lymphocytes et des agents immunogéniques; dans le cas de la fixation des toxines tétanique et diphtérique, les préparations cellulaires -ainsi obtenues se trouvaient détoxifiées. Toutefois, il n'était pas évident qu'un tel procédé appliqué à des cellules aussi fragiles que les érythrocytes permette d'obtenir un réactif de dosage par hémagglutination, stable, atoxique, non-agglutinant et sensible La stabilité des hématies sensibilisées utilisées dans les dosages par hémagglutination est un réel problème et on a cité dans ce qui précède certaines des solutions précédemment trouvées; il est surprenant qu'aucun des traitements plus ou moins complexes précédemment préconisés ne soit nécessaire pour le réactif de l'invention. Par ailleurs, pour que l'hémagglutination serve comme réaction de révélation dans un procédé de dosage, elle doit avoir lieu même en présence de faibles quantités d'anticorps, et sans agglutination parasite; or on ne pouvait déduire du document précédent que les toxines détoxifiées fixées sur les érythrocytes seraient encore suffisamment antigéniques pour permettre un dosage d'anticorps en faible concentration dans les milieux biologiques. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, le procédé d'obtention du réactif comporte une étape supplémentaire qui consiste à traiter les hématies porteuses de la toxine détoxifiée, par un composé porteur d'une fonction susceptible de réagir sur les fonctions aldéhydes libres; le blocage des groupes aldéhydes qui en résulte améliore encore la stabilité du réactif, diminue les hémagglutinations parasites dues aux réactions avec les diverses protéines présentes dans l'échantillon à doser, ce qui augmente la sensibilité du réactif, et enfin élimine tout risque de réapparition d'une activité toxique due à une réversion partielle des structures détoxifiées de- la toxine bactérienne au cours de la conservation du réactif. Comme agent de bîccaçe, on peut citer les aminoacides tels que glycocolle ou lysine, les peptones, tels que, peptones de viande et l'hydrolysat de caséine, les amines primaires telles que glycine et éthanolamine. Parmi les toxines bactériennes qui peuvent etre couplées àux érythrocytes par le procédé selon l'invention, on peut citer les toxines diphtérique et tétanique; il est préférable que ces toxines soient de haute pureté pour être couplées aux hématies; on utilise par exemple la toxine diphtérique cristallisée et dialysée contre la solution aqueuse tamponnée utilisée pour la mise en suspension des cellules, pour la réaction. On préfère utiliser des hématies nucléées, d'oiseaux comme pigeons, dindes, dont on sait que la sédimentation est plus rapide que celle des hématies de mouton, pour préparer les réactifs de l'invention. De cette façon, un dosage utilisant le procédé de l'invention peut etre réalisé en 15 minutes environ, alors qu'avec les techniques mises en oeuvre actuellement, il faut attendre plusieurs heures avant d'effectuer la lecture des résultats. Dans une forme de réalisation particulière de l'invention, on fera réagir à température ambiante pendant quelques minutes du glutaraldéhyde sur des érythrocytes d'oiseaux en suspension dans une solution tamponnée isotonique, de pH compris entre 6,5 et 8,0 environ. a solution tampon peut etre une solution aqueuse de phosphate salin, dans laquelle on mettra en suspension des érythrocytes pour obtenir une concentration de 1 à 12% (V/V > ; le glutaraldéhyde y est ensuite introduit sous forme d'une solution aqueuse diluée pour obtenir une concentration finale de 0,001 à 0,1 M d'aldéhyde dans la solution d'érythrocytes. On peut aussi ajoutes les érythrocytes à une solution aqueuse tamponnée de glutaraldéhyde, de concentration comprise entre 0,0025 M et 0,25 M, pour obtenir les mêmes concentrations finales. A ce stade, il n'est pas nécessaire d'isoler les érythrocytes, on peut introduire la toxine bactérienne directement dans la suspension; pour cela on ajoute une solution de toxine dans le nieme tampon, de concentration comprise entre 4 mg et 20 mg/ml- environ, à raison de 0,4 mg à 2 mg de toxine par ml d'érythrocytes à traiter. Pour réaliser le couplage et la détoxification de toute la toxine ajoutée, le mélange doit etre maintenu au moins une heure de préférence, ou 2 à 3 heures, suivant les toxines a fixer, à température ambiante. Les cellules sensibilisées sont alors isolées par centrifugation et lavées par une solution aqueuse tamponnée isotonique. Pour saturer les groupes aldéhydes libres, on met les cellules ainsi obtenues en suspension pendant au moins 15 minutes dans une solution tamponnée de l'agent de blocage choisi, de concentration 0,1 M à 1 M environ à raison d'un volume d'érythrocytes pour 7 volumes de solution. Après les lavages habituels, les érythrocytes isolés par centrifugation peuvent être remis en suspension dans une solution aqueuse tamponnée isotonique en présence d'un agent bactéricide usuel, comme l'azoture de sodium ou le merthiolate, en concentration finale de respectivement 1:5000 et 1:10000 (p/v), et conservés tels que à 40C pendant plus d'une année, ou à 37"C pendant près d'un mois; on peut aussi effectuer une lyophilisation de cette suspension, toutefois on préfère ne pas lyophiliser, car on sait que si la conservation du réactif en est amélioré, ses propriétés sont fréquemment modifiées lors de cette opération et de façon non reproductible. Les temps de contact des réactifs dans les diverses étapes du procédé sont fonction de la température à laquelle est effectuée le traitement ainsi que de la concentration des réactifs dans la solution et de leurs quantités relatives et ces divers paramètres pourront être adaptés par le spécialiste. Les réactifs obtenus par ce procédé sont un autre objet de l'invention. Ils sont constitués de corpuscules non toxiques, ce qui est un avantage de l'invention, consistant en érythrocytes sur lesquels Ont été fixés par l'intermédiaire du .glutaraldéhyde des toxines bactériennes. Les fonctions aldéhydes de ces corpuscules peuvent éventuellement avoir été saturées par réaction chimique avec un agent de blocage ; dans le cas des réactifs à base de toxine diphtérique, la saturation des fonctions aldéhydes est très souhaitable. Les réactifs de l'invention sont avantageusement utilisés pour le dosage d'anticorps dirigés contre les toxines bactériennes correspondantes, présents dans les liquides biologiques, sans que les échantillons aient été préalablement traités par dialyse, centrifugation, précipitation ou autre; une simple dilution aqueuse sera en général suffisante. C'est un des avantages de l'invention dont l'importance doit etre soulignée. En effet, aucun des procédés de dosage des anticorps antitétanique ou antidiphtérique, actuellement pratiqués, ne permettent d'utiliser le sang total; aussi dans la mesure ou seul du sérum peut être utilisé, on doit prélever une quantité suffisamment importante de sang, au moins quelques ml, à 11 individu dont on veut déterminer le taux de protection contre la diphtérie ou le tétanos, pour permettre une séparation du sérum par centrifugation. Cette opération, bien que courante, ne peut être effectuée que par un personnel qualifié et avec un matériel coûteux. Avec les réactifs de l'invention, le prélèvement d'une seule goutte de sang suffit pour effectuer un dosage des anticorps par le procédé de dosage de l'invention. Ce procédé de dosage consiste a mélanger différentes dilutions de 1' échantillon à étudier dans une solution aqueuse tamponnée à un pH compris entre 6,5 et 8, avec une quantité déterminée d'un réactif de l'invention, puis à observer après 15 minutes à température ambiante, et de préférence après 20 minutes, pour quelles dilutions il y a hémagglutination, la concentration en anticorps de l'échantillon est alors déterminée en se référant à un étalon. Comme il a été mentionné plus haut, l'échantillon peut être du sang frais, ou conservé sur anticoagulant ou absorbé sur une matière absorbante tel qu'un papier buvard utilisé en biologie, du sérum ou encore une préparation d'anticorps provenant d'un animal immunise. Lorsque l'on recherche si un individu a un taux suffisant d'anticorps pour être protégé contre la diphtérie ou le tétanos, on effectue une dilution préalable du sang au 1/20 environ, dans de l'eau distillée ou faiblement acide; dans ces conditions, les globules rouges lysés et les protéines du sang n'interfèrent pas Pour le sérum, la dilution de départ sera en général au 1/10 ou 1/20; des dilutions successives peuvent ensuite être préparées par exemple selon une progression géométrique de raison 2. S1 l'essai est effectué en introduisant la composition de réactifs et les différentes dilutions de l'échantillon dans les cupules d'une plaque en polystyrène comportant au moins 8 puits, il suffit de 10 p1 d'échantillon de liquide biologique pour effectuer un dosage, ce qui est un avantage important de l'invention. Dans le cas du dosage des anticorps antidiphtériques, il est préférable d'ajouter dans le milieu du dosage une protéine, telle que la sérum albumine humaine (SAH) ou un autre composant de forte masse moléculaire, tel que la polyvinylpyrrolidone pour que la sensibilité de la méthode soit comparable à celle obtenue pour le dosage. des anticorps antitétaniques; on peut introduire la sérum albumine en même temps que la composition de réactif, en mélangeant celle-ci à une solution tamponnée de SAH. Dans ces conditions, on peut déceler de façon reproductible la présence de 0,003 à 0,0004 unités internationales antitoxiques (UIA), dans le sang total. La composition de réactif utilisée peut être la suspension des érythrocytes sensibilisés qui a servi à leur conservation, c'est-à-dire une suspension aqueuse tamponnée à un pH compris entre 6,5 et 8,0 environ, comportant de 1% à 20% (v/v) d'érythrocytes couplés; aucun traitement préalable de la suspension de conservation n'est nécessaire et un coffret de réactifs, objet de l'invention, peut comporter cette suspension avec un certain volume de solution aqueuse tamponnée pour dilution, un sérum de référence et la mention de la concentration en anticorps minimale donnant une hémagglutination observable, c'est-à-dire la concentration pour laquelle les hématies décantent sous forme d'un réseau homogène, réparti sur toute la surface des parois et non en un culot de petit diamètre. La composition de réactifs utilisée peut aussi être préparée instantanément ou quelque temps avant l'essai par remise en suspension des érythrocytes sensibilisés lyophilisés. A la lecture de ce qui précède, on comprend que le procédé de dosage selon l'invention est facile à mettre en oeuvre, peu coûteux, en particulier parce qutil ne nécessite aucun appareillage de mesure compliqué, rapide, puisque la lecture de la microplaque peut être effectuée moins de 20 minutes après l'introduction de l'échantillon, qu'il peut être pratiqué en l'absence de sources de réfrigération, puisque les réactifs ne sont pas modifiés après plusieurs semaines à la température ambiante, et pratiqué un certain temps après le prélèvement de l'échantillon, puisque le titre en anticorps d'un sang total -n'est pas modifié après conservation d'un échantillon de 10 pl sur une pastille de papier buvard de 2 mm de diamètre pendant une semaine à température ambiante et plusieurs -semaines à 40C. L'invention est illustrée par des exemples de mise en oeuvre du procédé de préparation de l'invention pour l'obtention d'érythrocytes sensibilisés à l'anatoxine tétanique et à l'anatoxine diphtérique, ainsi que par des exemples de titrage des anticorps présents dans le sang avec des réactifs de l'invention. Exemple 1: Couplage des toxines tétanique ou diphtérique aux érythrocytes Des globules rouges de dinde, recueillis sur Alsever sont lavés avec un tampon phosphate isotonique à pH 7,4, contenant du NaCI (PBS), puis mis en suspension dans le meme tampon à raison de 3,6 ml de globules rouges pour un volume final de 100 ml de tampon phosphate (pH = 7,4). On ajoute lentement à 100 ml de cette suspension, sous agitation, 71,5 ml d'une solution de glutaraldéhyde dans le même tampon, de concentration 0,025 M. Après une minute de contact, on introduit 71,5 ml d'une solution de toxine tétanique ou diphtérique dans le même tampon, contenant 4 mg de toxine par ml. Le mélange est agité pendant une heure pour la toxine tétanique et 2 heures pour la toxine diphtérique, à température ambiante, puis les globules rouges sensibilisés sont séparés par centrifugation et lavés 3 fois avec un volume égal (243 ml) du même tampon. On verse alors sur le culot de centrifugation un volume égal d'une solution 0,1 M de glycocolle dans le même tampon phosphate et on laisse 30 minutes sous agitation. Les globules rouges ainsi traités sont isolés par centrifugation, lavés par 3 fois avec le même volume de tampon phosphate PBS avant d'être remis en suspension dans le PBS contenant 2:10000 (p/v) d'azoture de sodium, à raison de 5 ml de globules rouges sensibilisés pour 100 ml de tampon. I1 est important d'utiliser un tampon de pH peu basique; ainsi, les résultats obtenus avec un tampon de pH = 8,65. sont négatifs. Exemple 2: Dosage d'anticorps antidiphtériques dans un sérum humain de référence: Le sérum de référence, contenant 1 UAI/ml, est dilué au 1/10, puis de 2 en 2, jusqu'au 1/2560ème, dans les cupules d'une microplaque contenant 50 yl de PBS. Dans un premier essai , on introduit ensuite dans chaque cupule, 50 pl de suspension de globules rouges sensibilisés. Dans un second essai, on ajoute dans chaque cupule 50 jil d'une suspension à 1% des globules rouges sensibilisés dans du PBS contenant aussi 0,18 de sérum albumine humain. L'aspect des puits est observé apres 20 minutes de contact à température ambiante, après avant recouvert la microplaque pour éviter l'évaporation. Les résultats obtenus figurent dans le Tableau I ci-dessous et montrent qu'en l'absence d'albumine la détermination de la dilution limite est pratiquement impossible. Tableau I EMI10.1 <tb> <SEP> Dilutions <SEP> du <SEP> sérum <SEP> de <SEP> référence <tb> Réactif <SEP> 1/10 <SEP> 1/20 <SEP> 1/40 <SEP> 1/80 <SEP> 1/160 <SEP> 1/320 <SEP> 1/640 <SEP> 1/1280 <SEP> 1/2560 <tb> Globules <SEP> sensi- <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <tb> bilisés <SEP> à <SEP> 1% <tb> en <SEP> PBS <tb> Globules <SEP> sensi- <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> <tb> bilisés <SEP> à <SEP> 1% <SEP> <tb> en <SEP> PBS <tb> + <SEP> sérum <SEP> albumine <tb> + : hémagglutination nette E : hémagglutination partielle (illisible) - : absence d'hémagglutination Exemple 3. Dosage d'anticorps antitétaniques dans le sang On prélève le sang par piqûre au bout du doigt avec un vaccinostyle et en dilue 10 fil avec 190 d'eau distillée Dans les deux premières cupules, on introduit 50 jil de la dilution de sang au 1/20, puis 50 ,ul de diluant dans les cupules 2 à 8. On effectue ensuite des dilutions géométriques des cupules 3 à 11, en y introduisant à chaque fois 5Q l de la cupule précédente, suf dans la cupule n 11 ce qui conduit à rejeter 50 l de la cupule ne10. Dans chacune des cupules on ajoute 50 p1 de globules sensibilisés obtenus selon l'exemple 1, en suspension à 1% dans le tampon phosphate salin; on agite la plaque pendant une minute et laisse incuber couvert environ 15 minutes. Une gamme préparée avec un sérum antitétanique de référence à 1 UAI/ml effectuée simultanément montre que la dilution limite de sérum donnant une hémagglutination nette (réseau homogène réparti dans toute la cupule) correspond à la dilution du sérum au 1/2560, ce qui correspond à environ 1 UAI/ml. Dans ces conditions, la dilution du sang d'un individu à la limite de la protection contre le tétanos se trouve dans la cupule-n03 et correspond à 0,032 UAI/ml de sang.

Claims: Method of preparing a non-toxic reagent for the determination by haemagglutination of antibodies to bacterial toxins, characterised in that erythrocytes and the toxoid corresponding to the bacterial toxin are coupled by means of glutaraldehyde, by reacting glutaraldehyde with the erythrocytes in an aqueous buffer medium and then adding the bacterial toxin directly to the reaction medium. Method of preparing a reagent for the determination by haemagglutination of antibodies to bacterial toxins, wherein the product obtained according to Claim 1 is further treated with a reagent for blocking aldehyde groups. Method according to one of Claims 1 and 2, characterised in that a) glutaraldehyde is reacted with a suspension of erythrocytes in a buffered isotonic medium of pH 6.5 to 8 for a few minutes at a temperature of between 0°C and 37°C, such that the erythrocytes are present in the proportion of 0.75 to 8% (v/v) for a glutaraldehyde concentration of between 0.001 M and 0.1 M. b) toxin is reacted with the erythrocytes thereby obtained, in buffered isotonic suspension, for at least one hour in the presence of glutaraldehyde, in the proportion of 0.4 mg to 2 mg of toxin per ml of erythrocytes. c) the cells thus treated are washed to remove the excess reagents. Method according to one of Claims 2 and 3, characterised in that the coupled cells are further treated, after centrifugation for at least 15 minutes, with an equal volume of a buffered aqueous solution of glycine or lysine having a final concentration of between 0.1 M and 1 M. Method according to any one of the preceding Claims, characterised in that it relates to the preparation of a reagent for the determination of antitetanus antibodies. Method according to any one of Claims 1 to 4, characterised in that it relates to the preparation of a reagent for the determination of antidiphtheria antibodies. Non-toxic reagent for the determination by haemagglutination of antibodies to bacterial toxins, consisting of erythrocytes to which the toxoid corresponding to the bacterial toxin is coupled through the agency of glutaraldehyde, the structure of the said toxin being modified in such a way that it loses its toxic activity towards man or animals without denaturation of its antigenic sites. Reagent according to Claim 7, characterised in that it is further stabilised by treatment with an agent for blocking the glutaraldehyde. Reagent according to one of Claims 7 and 8, for the determination of antitetanus antibodies. Reagent according to one of Claims 7 and 8 for the determination of antidiphtheria antibodies. Method for determining antibodies to bacterial toxins, characterised in that the sample to be studied is mixed at different dilutions, in an aqueous buffer solution, with a reagent according to any one of Claims 7 to 10, in that there are observed the dilutions at which haemagglutination occurs and in that the concentration of antitoxin in the sample is determined by reference to a standard. Method according to Claim 11, characterised in that the sample to be assayed is whole blood. Method according to one of Claims 11 and 12, for the determination of antitetanus antibodies. Method according to one of Claims 11 or 12, for the determination of antidiphtheria antibodies, characterised in that human serum albumin or a similar component is introduced into the determination medium. Reagent kit for the determination by haemagglutination of antibodies to bacterial toxins, characterised in that it comprises a reagent according to any one of Claims 7 to 10, in the form of a buffered aqueous suspension containing coupled erythrocytes and a preservative, a buffered aqueous solution and a reference serum.

Inventors: RELYVELD, EDGARD HANS
Applicants: INSTITUT PASTEUR
Application year: 1986
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33, A61K39