METHOD FOR THE DETECTION OF ALLERGEN CONTAINING HOUSE DUST

Abstract: In a further development of the method for detecting the occurrence of allergen-containing house dust according to European Application 84113705.2, a paper prepared with the aromatic diazo compound (and with starch where appropriate) is used for carrying out the colour reaction.

Description: Verfahren zum Nachweis von allergenhaltigem Hausstaub Beschreibung Dem Auftreten von Hausstaubmilben (Dermatophagoides pteronyssinus, farinae etc.) wird in neuerer Zeit zunehmend Aufmerksamkeit gewidmet (vgl. Zitat 1), Grund dafür ist, dass festgestellt wurde, dass ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung - man rechnet mit etwa 5 % - unter asthmatlschen Erscheinungen leidet, die auf Bestandteile des ausstauben zurückzuführen sind Bei diesen Bestandteilen handelt es sich hauptsächlich um den Kot der obengenannten hausstaubmilben sowie um Bruchstücke abgestorbener Milben Im Darmtrakt der lebenden und abgestorbenen Milben sind die die Gesundheitsstörungen auslösenden Allergene enthalten (vgl, Zitat 2). Eine lebende Milbe selbst enthält nur etwa ein Tausendstel der Allergenmenge, eie sie In der Zeit ihres Lebens erzeugt. Der Kot selbst ist vielfach von Pilzen besiedelt, die ihrerseits ebenfalls Allergene hervorbringen kennen. Die ;4auptmenge der Allergene befindet sich in den Staubablagerungen, und zwar auch dann noch, wenn die ursprüngliche Nllbenpopula- tion durch Bekämpfungsmassnahmen abgetötet bzw. reauziert wurde Auf enthaltsorte der Hausstaubmilben sind Polstermöbel, Betten, Fussböden und Wände, insbesondere wenn sie mit textilen Materialien überzogen sind. Flächenmässig gesehen dürften Teppichböden die grösste Rolle spielen. Von den Fussböden und Polstermöbeln wird durch Begehen und Benutzen Feinststaub aufgewirbelt, der sich oft an unzugäng- lichen Stellen, die weitgehend frei von Luftzug sind, z.B. hinter SchrÅanken, ansammelt Auch beim Staubs augen selbst wird dieser Feinststaub zum Teil aufgewirbelt und gelangt so auch an Stellen1 die selbst nicht von Milben besiedelt sind. in allen Fällen führt erneutes Aufwirbeln zu erneuten Belästigungen der Bewohner der betreffenaer Räume. Die Beseitigung der Ursachen für die Rausstaub-Allergie hat zur Voraussetzung, dass die Ursache erkannt wird. Denn es gibt auch andere Allergien, wie z.B. gegen Pollen (Reuschnupfen). Die Rausstaub-Allergle belastigG jedoch die davon betroffenen Menschen das ganze Jahr über, da Milbenkot und Milbenreste praktisch ununterbrochen vor harzen sind. Arzt und Patient stehen deshalb inzzer wieder vor der Frage, ob ein Milbenbefall vorliegt. Aufgrund des derzeitigen Standes der Technik gibt es als Nachweismethode nur das mikroskopische Erkennen der Milben selbst. Dieses Verfahren ist jedoch mit so grossen Schwierigkeiten verbunden, dass es nur von wenigen darauf spezialisierten Fachlaboratorien durchgeführt werden kann. Dazu sind die Entnahme der Staubprobe, der Versand derselben unter vorgeschriebenen Bedingungen und dann die Untersuchung im Laboratorium notwendig. Da die Milben neben dem sonstigen Schmutz nicht zu erkennen sind, müssen sie von der Staubprobe abgetrennt und dann identifiziert werden. Das bewährteste bekannte Abtrennverfahren besteht in der Flotation, verbunden mit dem manuellen Isolieren der aufschwimmenden Tiere sowie deren Identifikation unter dem Mikroskop (vgl. Zitat 3). Abgesehen von der Tatsache, dass dies nur erfahrene Fachleute durchführen können, ist hervorzuheben, dass ein beträchtlicher Zeitaufwand erforderlich ist, um eine Probe zu bearbeiten; hinzukommen der Versand und das Risiko der Proben-Veränderung während des Transportes. Allen Identifikationsverfahren, die vom Vorhandensein der Milben selbst ausgehen, haftet der Nachteil an, dass Aussagen über die Belastung des Staubes durch Allergene, die die eigentliche Krankheitsursache darstellen, nicht zu erhalten sind. Staubproben, insbesondere solche feinster Struktur, wie sie sich nach den Aufwirbeln aus der Luft ablagern, können besonders reich an Allergenen sein und wenige oder gar keine Milben enthalten. Aufgabe gemäss europäischer Anmeldung 84113705.2 war es daher, ein einfaches und zuverlässiges Nachweisverfahren zum Erkennen von allergenhaltigem Hausstaub zu schaffen. Gemäss dieser Anmeldung wurde festgestellt, dass ein (wesentlich einfacherer) Nachweis geführt werden kann, der charakteristisch für die Belastung des Hausstaubes mit Ausscheidungsprodukten der Hausstaubmilben ist, unabhängig davon, ob nun lebende bzw. tote Milben im Moment des Nachweises vorhanden sind oder nicht. Der Nachweis knüpft an Bestandteile der Ausscheidungspro edukte der Milben an, wie sie sich sowohl im Verdauungstrakt der Milben selbst als auch in deren EXkrementen befinden. Dieser Nachweis ist problemlos sowohl von Fachleuten als auch Laien durchführbar und gibt nicht nur eine Aussage über die Anwesenheit von Exkrementen der Hausstaubmilben i Hausstaub, sondern ermöglicht auch eine Beurteilung des momentanen bzw. früheren Befall es mit Milben. Anmeldung 841137052 Das Nachweisverfahren gemass europäische4zur Feststellung des Vorkommens von allergenhaltigem Hausstaub, wie er sich bei oder nach dem Auftreten von Hausstaubmilben ergibt, besteht - darin, dass man Proben von vorkommendem Staub, wie er in Gebäuden anfällt, in wässrig-alkoholischer Alkalimetallhydroxid-tösung gründlich suspendiert und mit den entstehenden Extrakt eine Farbreaktion mit Hilfe einer aromatischen Diazoverbindung aurchführt, wobei die Farbreaktion hinsichtlich ihres Auftretens als Indiz für die Belastung des Staubes mit Hausstaubmilben Rückständen bewertet wird. Im einzelnen ist für die Durchführung des Nachweisverf ah- rens gemäss europäischer Anmeldung 84113705.2 folgendes zu bemerken. Als Alkohol für die eingesetzte wässrig-alkoholische bö- srng verwendet man bevorzugt einen mit Wasser unbegrenzt mischbaren Alkohol, wie z.B. niedere einwertige alipha sce Alkohole. Dabei ist Methanol besonders bevorzugt; aber auch Äthanol kann eingesetzt werden. Das Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser in der wässrig-alkoholi sehen Lösung kann variieren und beträgt im allgemeinen < 40 bis 95) : (90 bis 5). Besonders bewährt hat sich ein Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser von (50 bis 90) : (50 bis 10), speziell von (75 bis 90) : (25 bis 10). Das in der wässrig-alkoholischen Lösung eingesetzte Alkalimetallhydroxid ist bevorzugt Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid. Aber auch Lithiumhydroxid kann eingesetzt werden. Die Menge des Alkalimetallhydroxids in der wässrig-alkoho lischen Lösung kann variieren; im allgemeinen beträgt sie 0,1 bis 50 Gew.-%. Vorteilhaft ist ein Alkalimetallhydro- oxidgehalt von 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 10 Gew.-%. Ganz speziell bevorzugt beträgt der Alkalimetallhydroxidgehalt in der wässrig-alkoholischen Lösung etwa 4 bis 5 Gew, -O/o, Für die Farbreaktion eignen sich grundsätzlich alle Verbindungen, die zusammen mit dem Milbenrückstände enthaltenden Staub Farbreaktionen ergeben. Die im vorliegenden Fall angewandte Reaktion beruht auf der Fähigkeit der Milbenrückstände (Milbenkotreste und Bruchstücke abgestorbener Milben), mit aromatischen Diazoverbindungen eine Farbreaktion zu ergeben. Als aromatische Diazoverbindung ist daher jede aromatische Diazoverbindung geeignet, die mit der Extraktionslösung (im Falle des Vorhandenseins von Hausstaubmilbenrückständen) eine Farbreaktion eingeht. Als aromatische Diazoverbindung besonders bewährt hat sich Diazosulfanilsäure (4-Diazobenzosulfonsäure), die eine ziegelrote Färbung ergibt. Die vorliegende Anmeldung betrifft nun eine besondere Weiterbildung des Verfahrens gemäss der genannten älteren Anmeldung 84113705.2. Diese Weiterbildung besteht darin, dass man zur Durchführung der Farbreaktion zwischen dem Extrakt und der aromatischen Diazoverbindung ein mit der Diazoverbindung und gegebenenfalls mit Stärke präpariertes Papier verwendet. Bei dem vorliegenden erfindungsgemässen Nachweisverfahren geht man zweckmässig in der Weise vor, dass man eine gewonnene Staubprobe (nach Entfernung der Grobanteile) mit der ässrig-alkoholischen Alkalimetallhydroxid-Lösung durchtränkt. Dabei kann das Volumenverhältnis der Staubprobe zur Extraktionslösung variieren. Im allgemeinen beträgt dieses Volumenverhältnis der Staubprobe zur Extraktionslösung (0,1 bis 2) : (1). Besonders bewährt hat sich ein Volumenverhältnis von 0,5 : 1. Die Staubprobe wird mit der Extraktionslösung versetzt und durch Schütteln oder Rühren gut vermischt. Die erhaltene Extraktsuspension lässt man stehen, wobei sich der Staub im allgemeinen von der Extraktionslösung absetzt (wenige Minuten). Die Extraktionslösung wird sodann mit dem mit der aromatischen Diazoverbindung (und gegebenenfalls mit Stärke) prä parierten Papier in Kontakt gebracht. Vorteilhaft erfolgt dies durch Rintauchen des präparierten Papiers in die Ex traktionslösung. Aufgrund der auf dem präparierten Papier vorhandenen aro ma-schen Diazoverbindung, z.B. Diazosulfanilsäure, entsteht bei Anwesenheit von Milbenexkrementen eine ziegelrote Fär- bung des Papiers, die, wie die Annelderin festgestellt hat, in ihrer Intensität proportional zu der in der Staubprobe vorhandenen Milbenkotkonzentration ist. Die bevorzugte erfindungsgemässe Ausführungsform besteht darin, einen Papierstreifen, z.B. Filterpapier, mit der aro naischen Diazoverbindung (z.B. mit ca. 5 Gew.-% Diazoverbindung, bezogen auf das Papier) zu präparieren und den so präparIerten Papierstreifen direkt in die überstehende Ex- traktionslösung zu tauchen, wobei die Farbreaktion dann auf den Papier erfolgt, Die Benutzung ist vergleichbar mit der jenlgen des pH-Indikatorpapiers. Unter definierten Nachweisbedingungen kann man die Farbentwicklung mit einer vorgege bienen Farbskala vergleichen. Mittels eines solchen Vergleichs gegenüber einer standardisierten Parbskala lassen sich dann aussagen über die Intensität an Hausstaubmilbenrückständen In. hausstaub machen. In Falle der erwähnten Arbeitweise, d.h. der Präparierung eines Papierstreifens mit der aromatischen Diazoverbindung, hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn die aromatische Diazoverbindung zusammen mit Stärke auf den Papierstreifen aufgebracht wird. Dadurch lässt sich bei der Farbreaktion eine noch gleichmässigere Färbung auf dem derart präparierten Papierstreifen erzielen. Die Menge der zusammen mit der aromatischen Diazoverbindung verwendeten Stärke kann variieren; jedoch beträgt sie im allgemeinen etwa 50 Gew.-% der Menge der aromatischen Diazoverbindung. In diesem Zusammenhang hat die Anmelderin in überraschender Weise festgestellt, dass ein mit der aromatischen Diazoverbindung präparierter Papierstreifen (z.B. ein mit etwa 50 mg Diazosulfanilsäure, pro g Papier, und mit etwa 25 mg Stärke, pro g Papier, präparierter Papierstreifen) ohne jedes Risiko über längere Zeit hinweg (mehrere Monate) gefahrlos und stabil gelagert werden kann; dies ist im Einblick auf die bekannten Eigenschaften aromatischer Diazoverbindungen durchaus unerwartet. Dem Nachweisverfahren selbst liegen einige spezielle und zum Teil überraschende Befunde zugrunde: 1) Um die für den Farbnachweis relevanten Kotbestandteile bei Normaltemperatur mit der wässrig-alkoholischen Extraktionslösung schnell und erschöpfend zu extrahieren, ist eine Alkalimetallhydroxid-Lösung (z.B. von KOH oder von NaOH) in der angegebenen Konzentration nötig (eine entsprechend konzentrierte Sodalösung, ie sie eigentlich gemäss der nachfolgenden Ziffer 2) nötig wäre, führt nicht zum Erfolg). 2) Die Farbreaktion mit der aromatischen Diazoverbindung, insbesondere mit Diazosulfanilsäure, würde an sich am besten in nur wässriger, sodaalkalischer Lösung verlaufen. (In nur wässriger Alkalimetallhydroxid-Lösung, z B. von KOH oder Na0H, finaet die gewünschte Farbreaktion - wie die Anmelderin festgestellt hat - nicht statt.) Ausgehend von dieser oesonderen Problematik im Hinblick auf die Gestaltung eines einfachen Nachwelaverfahrens, wurde nun aber überrraschend gefunden, dass bei Einsatz einer Ex traktionslösung von Alkalimetallhydroxid in einem Lösungs mittelgemisch von Alkohol und Wasser, insbesonaere in einem Gemisch, bei dem das Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser (50 bis 90) : (50 bis 10) beträgt, einerseits die für den Farbnachweis relevanten Kotbestandteile praktisch quantitativ extrahiert werden, und dass andererseits in derselben Extraktionslösung bei Kontakt mit dem präparierten Papier (mit der aromatischen Diazoverbindung, insbesondere Diazosulfanilsäure) die gewunschte Farbreaktion stattfindet. Ausserdem verbessert der Alkohol die Benetzung der Staubproben und bewirkt gleichzeitig eine schnelle und gleichmässige Farbverteilung auf dem Nachweispapier. Nachstehend werden weitere Einzelheiten zur Durchführung des Nachweisverfahrens angegeben. Das gefundene Analy- senverfahren auf Befall von Haus staub mit allergenhalti- gen Rückständen von Hausstaubmilben lässt sich mannigfaltig ausgesoalten Dies gilt sowohl für die Probenentnahme des Staubes, als auch für das Zusammenbringen des Staubes mit der Extraktionslösung, als auch für den Ablauf der Farbreaktion Im Sinne einer besonders effizienten Staubgewinnung kann in die Ansaugröhre eines üblichen Staubsaugers ein Filter (insb. Stoff- oder Papier-Filter) eingelegt werden, z.B. in Form eines kleinen Tuches (Insbesondere Taschentuches). Es hat den Vorteil, dass der Feinstaub gezielt und konzentriert gesammelt wird Bei der Probenentnahme selbst ist zu berücksichtigen, dass Bodenflächen, die des öfteren abgesaugt werden, eine für den Nachweis ausreichende Staubmenge eventuell nicht mehr enthalten können; in diesem Falle führt man dann zweckmässig das Absaugen an weniger zugänglichen Stellen durch. Besonders vorteilhaft erfolgt die Staubgewinnung durch Absaugen von Polstermöbeln und Betten. Für die Extraktion der Staubproben eignen sich besonders kleine verschliessbare Glas- und Kunststoffbehälter mit einem Fassungsvermögen von einigen Millilitern (z.B. 1 bis 10 Milliliter), die mit Markierungen zur Volumendosierung der Staubprobe und der Extraktionslösung versehen sind. In speziellen Fällen kann die Extraktion der Staubprobe aber auch z.B. auf einem Uhrglas erfolgen. Eine zusätzliche Vereinfachung kann man - bei der vorliegenden Weiterbildung des Verfahrens der europäischen Anmeldung 84113705.2 - dadurch erzielen, dass man die (dünnflüssige und z.T. leicht flüchtige) Extraktionslösung verdickt, beispielsweise mit einem üblichen Verdickungsmittel, insbesondere Celluloseäther. Bevorzugt wird die so verdickte Extraktionslösung in kleinen Kunststoffbehältern vorgelegt. Nach dem Einrühren der dosierten Staubprobe erhält man eine breiige Masse. Für den Farbnachweis drückt man das präparierte Papier (z.B. das mit der aromatischen Diazoverbindung präparierte Filterpapier) einseitig auf die breiige Probe in dem Behälter, wobei nach dem Abheben des Papiers ein Teil der feuchten Staubmasse daran haften bleibt. Die Beurteilung der Färbung erfolgt über die andere (unverschmutzte) Seite des Papiers. Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemässen Weiterbildung wird besonders die Verdunstung und die Gefahr des Verspritzens verringert. Die Effizienz des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch den folgenden Vergleich illustriert: An 20 Staubproben, die von Ärzten aus verschiedenen Häusern mit Verdacht auf Hausstaub-Allergie eingesandt wurden, erfolgte zunächst eine biologische Beurteilung unter Anwendung des Flotationsverfahrens (gemäss Stand der Technik, wie oben beschrieben). Diese Bewertung der Proben ergab einen mittelstarken, schwachen bzw. keinen Befall. Danach trurden mit den gleichen Proben erSinaurl6sgemässe Be wertungen durchgeführt, und zwar von einer Person, die keine Kenntnis von der (vorherigen) biologischen Beurteilung hatte. Die erfindungsgemässen Farbreaktionen zeigten mittleren, schwachen und keinen Befall. Beim Vergleich dieser Ergebnisse mit dem Laborjournal, in dem die (vorherigen) biologischen Befunde registriert waren, ergab sich völlige übereinstimmung. Beispiel 1 Man versieht einen normalen Staubsauger mit einem neuen Staubbeutel und saugt den zu untersuchenden Textilbereich (z.B. Teppiche, Polstermöbel, Deckbetten, Mftrat- zen) gründlich ab. Nach Beendigung des Absaugens ent leert man den gesamten Staubbeutelinhalt auf ein Blatt Papier und entfernt durch leichtes Abklopfen und Abheben die Grob anteile Der auf dem Papier verbleIbende Feinstaub wird für den Farbnachweis verwenaet. Für den Farbnachweis dosiert man die Feinstaubprobe (ca. 2 ml) in einen Glas- oder Kunststoff zylinder von ca. 8 ml Inhalt (Durchmesser ca. 1,5 cm). Dazu dosiert man ca. 4 ml einer wässrig-methanolischen Extraktionslösung, bei der das Gewichtsverhältnis von Methanol zu Wasser 75 : 25 beträgt und in der 5 Geas.-% KOH gelöst sind, und schüttelt das verschlossene Gefäss ca. 10 Sekunden. Nach etwa 3 Minuten taucht man einen Teststreifen aus Filterpapier, der mit 50 mg Diazosulfanilsäure und 25 mg wasserlöslicher Stärke (jeweils pro g Papier) präpariert war, kurz in die vom Staub abgesetzte Extraktionslösung (entsprechend der Anwendung eines pH-Papiers). Nach spätestens ca. 15 Sekunden zeigt sich bei Milbenbefall eine ziegelrote Färbung (diese bleibt bei Abwesenheit von Milbenrückständen aus). Beispiel 2 Die Staubprobenahme erfolgt analog dem Beispiel 1. Man dosiert die Feinstaubprobe auf ein Uhrglas von ca. 6 cm Durchmesser, fügt die geeignete Menge Extraktions- lösung (Methanol/Wasser-Gemisch im Gewichtsverhältnis 75 : 25, worin 4 Gew.-% WaOE gelöst sind) hinzu und verrührt den Staub kurzzeitig mit der Eatraktionslösung. Daran anschliessend drückt man einen gemäss Beispiel 1 mit Diazosulfanilsäure präparierten Papierstreifen einseitig gegen die breiige Masse. Nach spätestens ca. 15 Sekunden zeigt sich bei Milbenbefall eine ziegelrote Färbung auf der unverschmutzten Papierseite. Zitat 1 G. Hoffmann in "Luftqualität in Innenräumen" Gustav Fischer Verlag Stuttgart - New York 1982 Seite 385 bis 401 Zitat 2: E. Petri et al in Allergologie, Jg. 5, Nr. 3/1982 Seite 109 bis 119 Zitat 3: J.E.M.H. van Bronswijk et al in Allergie und Immunol. 24 (1978) Seite 18 bis 28

Claims: Method of detecting the presence of allergen-containing house dust such as occurs during or after the appearance of house dust mites, wherein samples of dust found in buildings are suspended thoroughly in a aqueous-alcoholic alkali metal hydroxide solution and a dye reaction is carried out with the resulting extract using an aromatic diazo compound, the occurrence of dye reaction being evaluated as an indication of the presence of house dust mite residues in the dust, the dye reaction between the extract and the aromatic diazo compound being carried out using a piece of paper pretreated with the diazo compound and optionally with starch. Method according to claim 1, characterised in that an extraction solution is used which has been thickened with a conventional thickener. Method according to one of the preceding claims, characterised in that, once a dye reaction has occurred, the intensity of the coloration is compared with a standardised colour scale and the concentration of mite residues is assessed on the basis of this comparison. Method according to one of the preceding claims, characterised in that the content of alkali metal hydroxide in the aqueous-alcoholic solution is 0.1 to 50 by weight. Method according to one of the preceding claims characterised in that the weight ratio of alcohol to water in the extraction solution is 10 to 95: 90 to 5. Method according to one of the preceding claims characterised in that the ratio by volume of the dust sample to the extraction solution is 0.1 to 2: 1.

Inventors: BISCHOFF, EDELBERT, DR., SCHIRMACHER, WOLFGANG, DIPL.-CHEM.
Applicants: WERNER & MERTZ GMBH
Application year: 1985
Main classification: G01N31
IPC codes: G01N33, C12Q1, G01N21