PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AROMATIC SUBSTITUTED L-AMINO ACIDS

Abstract: 1. A process for the preparation of aromatically substituted L-amino acids by enzymatic cleavage of the racemate of the lower alkyl esters (except tert.-butylester) using alpha-chymotrypsin in the weakly acid pH range and extraction of the ester of the D form, which comprises the reaction mixture obtained in the enzymatic cleavage being made weakly alkaline, the ester of the D-amino acid being extracted from this alkaline solution using an organic solvent, and being racemized, whereupon the racemate is returned to the process, and the extracted alkaline solution being made weakly acid, whereupon the L-amino acid is isolated from it.

Description: Verfahren zur Herstellung aromatisch substituierter L-Amino8äuren Aus der deutschen Offenlegungsschrift 2 215 853 ist es bekannt, racemische mono- und di-ringsubstituierte Phenylalanine in die entsprechenden L-Aminosuren dadurch zu tiberführen, dass man das Racemat zunächst mit einem Alkanol mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen verestert, den racemischen Ester der Einwirkung eines Chymotrypsins bei einem sauren pH unterwirft, die tAminosäure durch Fällung isoliert und gegebenenfalls den Ester der D-Aminosäure aus dem Filtrat extrahiert und verseift. Als Enzym wird das a-Chymo- trypsin bevorzugt, der bevorzugte pH-Bereich bei der enzymatischen Spaltung liegt bei 5 bis 6. Die nach Abtrennung der L-Aminosäure verbleibende Flüssigkeit wird vor der Extraktion des Esters der D-Aminosäure alkalisch gestellt. Es wurde nun gefunden, dass aromatisch substituierte L Aminosäuren besonders vorteilhaft dadurch zugänglich werden, dass das bei der enzymatischen Spaltung erhaltene Gemisch zunächst alkalisch gestellt wird, hierauf der Ester der D-Aminosäure extrahiert, gegebenenfalls nach Trocknung des Extrakts der Ester racemisiert und das Racemat in den Prozess zurückgeführt wird. Aus dem alkalischen Rückstand nach Extraktion des Esters der D Aminosäure wird dann die L-Aminosäure nach Ansäuern isoliert. Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von aromatisch substituierten L-Aminosäuren durch Spaltung der racemischen niederen Alkylester mit -Chymo- trypsin im schwach sauren wässrigen Medium, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Reaktionsgemisch schwach alka lisch gestellt wird, der Ester der D-Aminosäure mit einem organischen Lösemittel extrahiert, der Ester racemisiert und wieder in den Prozess zurückgeführt wird, und die L Aminosäure aus dem wässrigen alkalischen Extrakt nach Ansäuern isoliert wird. Bevorzugte Ausgestaltungen dieser Erfindung werden im folgenden näher erläutert bzw. in den Patentansprüchen definiert. Als aromatisch substituierte Aminosäuren kommen vor allem Tryptophan, insbesondere Phenylalanin, Tyrosin und 3,4 Dihydroxy-Phenylalanin in Betracht. Die Veresterung der racemischen Aminosäuren kann nach den Angaben der deutschen Offenlegungsschrift 2 215 853 erfolgt gen. Bevorzugt sind niedere Alkanole mit bis zu 4 Kohlen. stoffatomen (ausgenommen tert-.-Butanol), insbesondere Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol und n-Butanol, Das a-Chymotrypsin wird vorteilhaft in fixierter Form ein. gesetzt, wobei anorganische Träger bevorzugt sind. Dieses fixierte Enzym wird dann im Fest- oder Fliessbett mit der wässrigen Substratlösung in Kontakt gebracht. Die Umsetzung erfolgt zweckmässig bei 20 bis 4500, vorteilhaft bei 300C 400C, und einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,5, vorteilhaft bei einem konstanten pH-Wert im Bereich von 5,Q bis 6,o, Je nach eingesetztem Ester. Die Substratkonzentration ist an sich unkritisch, zweckmässig sind 5-15 Gew*-% insbesondere 10 bis 15 Gew.-%. Die nach der enzymatischen Spaltung erhaltene wässrige Lösung der L-Aminosäure und des Esters der D-Aminosäure wird schwach alkalisch gestellt, vorteilhaft auf einen pH Wert im Bereich von 7,5 bis 8,5, vorteilhaft 8,0, und - zweckmässig bei 20 bis 400C, insbesondere Raumtemperatur mit einem geeigneten organischen Lösemittel extrahiert. Als organisches Lösemittel für die Extraktion wählt man zweckmässig ein solches, das wenig wassermischbar ist, da dann die Racemisierung besonders vorteilhaft ohne Isolierung des Esters erfolgen kann (die Anwesenheit von Wasser bei der Racemisierung kann Nebenreaktionen wie Hydrolyse bedingen). Vorteilhaft ist deshalb ein Lösemittel, das mit Wasser ein Azeotrop bildet und hierdurch eine leichte Trocknung des Extraktes erlaubt. Es ist aber auch möglich, wenn auch im allgemelnen nicht vorteilhaft, das zur Extraktion benutzte Lösemittel völlig abzutrqnnen und den Ester in Substanz zu racemisieren. Geeignete Lösemittel für die Extraktion sind aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, insbesondere aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol oder Xylol, Ether, insbe sondere niedere Dialkylether wie Diethylether, Diisopropylether oder Di-n-butylether, Ketone, insbesondere niedere Dialkylketone wie Methyl-Ethyl-Keton oder Methyl-Isobutyl-Keton, halogenierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere chlorierteniedere Aliphaten wie Methylenchlorid, Chloroform oder Tetrachlormethan sowie Ester, insbesondere niedere Alkylester niederer aliphatischer Carbonsäuren wie Ethylacetat oder Butylacetat. Die Racemisierung kann in an sich bekannter Weise durch Ketoverbindungen und/oder Säuren katalysiert werden. Falls also das Lösemittel kein Keton ist, kann ein Zusatz von Aldehyden oder Ketonen die Racemisierung wesentlich beschleunigen. Die Racemisierung optisch aktiver Aminosäureester in Ketonen, ggfs. unter Zusatz einer Säure, ist aus der veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung 109 912/1979 bekannt. Bei dieser bekannten Racemierungsreaktion kann auch ein Lösemittel wie Toluol, Tetrachlormethan oder Methanol zugesetzt werden. Die Racemisierung freier optisch aktiver Aminosäuren mit Aldehyden und Säuren ist bekannt aus der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 57 092 sowie aus S.Yamada et al., J. Org. Chem. 48 (1983) 843-846. Zweckmässig werden diese Ketoverbindungen in katalytischen Mengen, bevorzugt 0,001 bis 0,1 Mol pro Mol Ester, eingesetzt. Bevorzugt sind Acetaldehyd und Salicylaldehyd. Das bei der Racemisierung entstandene D-,L-Gemisch wird dann mit leicht angesäuertem Wasser aus dem Racemisierungs ansatz extrahiert, wobei der Ester in die Salzform über- führt wird. Diese wässrige Lösung wird durch Zugabe von neuem Substrat auf die gewünschte Konzentration, vorteilhaft 5 bis 15, insbesondere 10 bis 15 Gew.-%, eingestellt und in den Prozess zurückgeführt. Aus dem schwach alkalischen wässrigen Rückstand, der die L, Aminosäure enthält, wird diese durch Ansäuern isoliert. Je nach Löslichkeit der Säure kann sie unmittelbar oder nach Konzentration kristallisieren. Die Säure kann auch in bekannter Weise durch Extraktion mit geeigneten Lösemitteln isoliert werden. Die Reinigung erfolgt in bekannter Weise. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt die Gewinnung von aromatisch substituierten L-Aminosäuren in Ausbeuten von über 90 % und in einer optischen Reinheit von über 98 S. Durch die Kombination von enzymatischer Spaltung, Extraktion des D-Esters, dessen Racemisierung und Rückführung ist eine besonders zweckmässige Verbindung dieser Arbeitsschritte gegeben, die auch eine kontinuierliche Ausgestaltung des Verfahrens erlaubt. In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern keine anderen Angaben gemacht sind. Beispiel 1 Immobilisierung von a-Chymotrypsin Die Fixierung des Enzyms kann auf Aluminiumsilikat nach Halwachs et al., Biotechnology and Bioengineering XIX (1977) 1667-1677 erfolgen. Besonders bevorzugt ist jedoch die folgende Arbeitsweise: 138 g trockenes Kieselgel (Korngrösse 0,1 bis 0,3 mm) werden in 1 1 3,5einer acetonischer 3-Aminopropyl-triethoxy- silan-Lösung aufgenommen und 2 Stunden bei Raumtemperatur gelinde gerührt. Anschliessend wird das Aceton in einem Rotationsverdampfer abgezogen und das Kieselgel im Vakuumtrockenschrank 8 Stunden bei 1000C getrooknet. Das Produkt enthält 0,89 mMol Aminogruppen pro Gramm Kieselgel. Dieses aminierte Kieselgel wird in 400 ml 25zeiger wässriger Glutardialdehyd-Lösung aufgenommen und 2 Stunden bei Raums temperatur unter Vakuum (etwa 130 mbar) gehalten. Anschliessend wird der Träger abfiltriert und gründlich mit entsalztem Wasser nachgewaschen. 138 g des so aktivierten Kieselgels werden in eine Lösung von 13,8 g a-Chymotrypsin (Firma Novo, 800 S Oral Grade) in 300 ml 0,5 m Phosphat-Puffer (pH 7,5) eingetragen und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird der Katalysator abfiltriert und jeweils mit 1 1 entsalztem Wasser, gesättigter Kochsalzlösung und entsalztem Wasser gewaschen. Zur Aufbewahrung wird das immobilisierte a Chymotrypsin in 500 ml 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5, 0,1 mMol Natriumazid) aufgenommen. Zur Aktivitätsbestimmung gibt man 1 g des immobilisierten a-Chymotrypsins zu 50 ml einer 10%eigen wässrigen Lösung von D,L,Phenylalaninmethyleser-Hydrochlorid, eingestellt auf pH 6,0 und thermostatisiert auf 300C, und rührt diese Lösung. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,1 N Natronlauge über eine automatische Bürette konstant gehalten. Die Menge an verbrauchter Natronlauge ist die Messgrösse und direkt proportional der Konzentration an L-Phenylalanin. Aktivität: 338 U/g Träger (trocken) - 3,35 kg L Phenylalanin/kg Träger und h (U = internationale Einheit für Enzymaktivität, 1 U 1 pMol/Minute Umsatz). Beispiel 2 Enzymatische Racematspaltung In ein thermostatisierbares Reaktionsgefäss, versehen mit Innenrührer, pH-Elektrode und automatischer Bürette, werden 100 g D,L-Phenylalaninmethylester-Hydrochlorid (Restgehalt an D,L-Phenylalanin unter 0,3 %, HPLC Nachweisgrenze) gegeben und in 1 1 entsalztem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit 5 N Natronlauge (9,5 ml) auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wird auf 300C thermostatisiert und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5,0 1 pro Stunde im Kreislauf über eine Säule gepumpt, die mit 150 ml des nach Beispiel 1 fixierten Enzyms gefüllt ist (5,0 cm Durchmesser, 8 cm Betthöhe). Der pH-Wert der Lösung wird während der Reaktion durch Zugabe von 5 N Natronlauge (37,8 ml) auf 6,o gehalten. Nach 25 Minuten Reaktionszeit ist laut HPLC-Analyse ein Umsatz von 49,2 %, bezogen auf D,L-Phenylalaninmethyl ester, erzielt. Hierauf wird die Reaktion abgebrochen und das Enzymbett mit 300 ml entsalztem Wasser gewaschen. Beispiel 3 Extraktion von D-Phenylalaninmethylester und anschliessende Racemisierung Die nach Beispiel 2 erhaltene wässrige Lösung von D Phenylalaninmethylester und L-Phenylalanin wird unter Rühren durch Zugabe von 5 N Natronlauge (36,5 ml) auf pH 8,o gestellt und bei Raumtemperatur dreimal mit je 300 ml Methylisobutylketon ausgeschüttelt. Nach der dritten Extraktion ist in der wässrigen Phase laut HPLC-Analyse kein Ester mehr enthalten (Nachweisgrenze; unter 0,2 S). Die vereinigten Extrakte werden mit 14,0 g Eisessig versetzt (0,5 Mol-Xquivalent, bezogen auf D-Ester) und das im Extrakt enthaltene Wasser über eine Vigreux-Kolonne azeotrop abdestilliert. Der trockene Extrakt wird weitere zwei Stunden unter Rückfluss erhitzt, wobei der Racemi sierungsgrad durch Bestimmung des optischen Drehwertes der Lösung mit Hilfe eines Polarimeters ermittelt wird. Die Lösung wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur dreimal mit je 300 ml 0,05 N Salzsäure ausgeschüttelt. In den vereinigten wässrigen Phasen ist laut HPLC-Analyse 98,5 % des eingesetzten Esters enthalten. Diese wässrige Lösung wird durch Zugabe von D,L-Phenylalaninmethylester Hydrochlorid auf 10 % eingestellt und für eine weitere enzymatische Spaltung eingesetzt. Werden als Extraktionsmittel n-Hexan, Di-n-butylether, Toluol oder Xylol eingesetzt, so werden zur Beschleunigung der Reaktion katalytische Mengen Acetaldehyd, Salicylaldehyd oder Benzaldehyd zugegeben. Anstelle des Eisessigs können auch Salzsäure, Benzoesäure, Zitronensäure, p-Toluolsulfonsäure oder Ameisensäure eingesetzt werden. Ohne Säuren verläuft die Racemisierung sehr viel langsamer und erfordert mehr als 10 Stunden. Säurekonzentrationen über 0,5 Mol-Xquivalent bewirken keine weitere Geschwindigkeitserhöhung. Beispiel 4 Aufarbeitung und Isolierung von L-Phenylalanin Die nach der Extraktion mit Methylisobutylketon nach Beispiel 3 resultierende Lösung, die ca. 3,5 % L Phenylalanin enthält, wird mit konzentrierter Salzsäure auf pH 5,5 (iaoelektrischer Punkt von Phenylalanin) eingestellt und in einem Rotationsverdampfer auf einen Gehalt von etwa 10 % L-Phenylalanin eingeengt. Das ausgefallene L-Phenylalanin wird durch Erhitzen auf gOOC in Lösung gebracht und die Lösung heiss filtriert. Die klare Lösung lässt man bei Raumtemperatur stehen, wobei das L Phenylalanin in grossen Kristallen ausfällt. Die Mutterlauge wird über Nacht bei +50C aufbewahrt, wobei weisse Kristalle ausfallen, die abfiltriert und mit wenig kaltem Wasser nachgewaschen werden. Die Kristalle werden drei Stunden bei 1050C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhält 35,3 g L-Phenylalanin oder 92 %, bezogen auf 50 g eingesetztes L-Phenylalaninmethylester-Hydrochlorid. Die optische Reinheit liegt bei 98,5 bis 99,5 %. Beispiel 5 Enzymatische Racematspaltung: D,L-Phenylalaninethylester Analog Beispiel 2 werden 150 g D,L-Phenylalaninethylester Hydrogensulfat in 1 1 entsalztem Wasser gelöst. Der pH Wert der Lösung wird mit 5 N-Natronlauge auf 5,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 400C thermostatisiert und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 60 1/Stunde im Kreislauf über die Säule gepumpt, wobei während der gesamten Reaktion durch Zugabe von 5 N-Natronlauge der pH-Wert auf 5,5 gehalten wird. Die Weiterverarbeitung verläuft entsprechend Beispiel 3 und 4. Beispiel 6 Enzymatische Racematspaltung: D,L-Phenylalanin-n-propylester Analog Beispiel 5 wird D,L-Phenylalanin-n-propylester- Hydrogensulfat umgesetzt, wobei jedoch der pH-Wert auf 5,3 eingestellt und gehalten wird. Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 3 und 4. Mit gleichem Erfolg kann auch der Isopropyl- oder n Butylester des D,L-Phenylalanins eingesetzt werden. Beispiel 7 L-Tryptophan Analog Beispiel 2 werden 50 g D,L-Tryptophanmethylester Hydrochlorid in 1 1 entsalztem Wasser gelöst und wie be schrieben enzymatisch gespalten. Aus der so erhaltenen wässrigen Lösung wird nach Beispiel 3 der D-Tryptophanmethylester extrahiert und die zurückbleibende wässrige Phase analog Beispiel 4 mit konzentrierter Salzsäure auf pH 5,9 (isoelektrischer Punkt von Tryptophan) eingestellt und in einem Rotationsverdampfer auf einen Gehalt von etwa 5 S L-Tryptophan eingeengt. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Wasser nachgewaschen und bei 1050C 3 Stunden getrocknet. Man erhält 19,4 g oder 97 %, bezogen auf 25 g eingesetztes L-Tryptophan Methylester-Hydrochlorid. Die optische Reinheit liegt bei 98,7 S.

Claims: PATENTANSPRU CHE 1. Verfahren zur Herstellung von aromatisch substituierten L-Aminosäuren durch enzymatische Spaltung des Racemats der niederen Alkylester mit a-Chymotrypsin im schwach sauren pH-Bereich und Extraktion des Esters der D-Form, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der enzymatischen Spaltung erhaltene Reaktionsgemisch schwach alkalisch gestellt wird, aus dieser alkalischen Lösung der Ester der D-Aminosäure mit einem organischen Lösemittel extrahiert und racemisiert wird, worauf das Racemat in den Prozess zurückgeführt wird, und die extrahierte al kalische Lösung schwach sauer gestellt wird, worauf aus dieser die L-AminosMure isoliert wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das a-Chymotrypsin in fixierter Form eingesetzt wird. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das a-Chymotrypsin an einen anorganischen Träger fixiert ist. 4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Extraktion des Esters ein wenig wassermischbares organisches Lösemittel eingesetzt wird. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittel eingesetzt wird, das mit Wasser ein Azeotrop bildet. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der gegebenen falls getrocknete Extrakt des D-Esters der Racemi sierung unterworfen wird. 7.Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der racemisierte Ester sauer extrahiert und nach Aufstärken in den Prozess zurückgeführt wird. 8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester ein Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ausgenommen tert.-Butyl, ist. 9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl- oder n-Butylester des Phenylalanins oder Tryptophans ist.

Inventors: KELLER, REINHOLD, DR., SCHLINGMANN, MERTEN, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C12P13
IPC codes: C12P13, C12P41