MECHANICAL PROCESS FOR DISLODGING BACTERIAL CELLS FOR THE ISOLATION OF PEPTIDES PREPARED BY RECOMBINANT TECHNIQUES

Abstract: 1. Process for isolating a polypeptide prepared by recombinant methods from bacterial cells, characterised in that bacterial cells containing a polypeptide prepared by genetic engineering, these cells being suspended in an aqueous acid at a pH of from 2.0 to 4.0, are mechanically destroyed by shear forces and subsequently the polypeptide now present in the resulting suspension is separated and further purified by known methods.

Description: Neues mechanisches Aufschlussverfahren von Bakterienzellen zur Isolierung von rekombinant hergestellten Peptiden In der EP-A-O.O52.861 wird ein chemisches Aufschlussverfahren von Bakterienzellen zur Isolierung von recombinant hergestelltem Interferon, insbesondere von IFN-a, beschrieben, welches durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist: 1. Eine Bakteriensuspension, insbesondere eine E. coli-Suspension, deren Bakterien das gentechnologisch hergestellte IFN enthalten, wird zur Abtötung der Bakterien mittels einer Mineralsäure auf pH 2,0 bis 2,5 eingestellt. 2. Die abgetöteten Bakterienzellen werden abgetrennt. 3. Die erhaltene saure Biomasse wird in einem Puffer, z.B. in Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol) + Natriumchlorid, resuspendiert und mittels Natronlauge auf pH 7.3 eingestellt, wobei die Bakterienzellwände zerstört werden. 4. Nach Abtrennen der Bakterienzellen wird das nunmehr in der Lösung enthaltene Interferon nach bekannten Methoden abgetrennt und weiter gereinigt. Desweiteren ist bekannt, dass Polypeptide wie Interferone gegenüber mechanischen Einflüssen (siehe Proceedings of the Society for experimentel Biology and Medicine 146, 249-253 (1974)) wenig stabil sind. Derartige mechanische Einflüsse treten jedoch bei der mechanischen Zerstörung der Bakterienzellen durch die hierbei auftretenden Scherkräfte auf. Aus diesem Grunde ist auch wohl bis heute kein mechanisches Aufschlussverfahren von Bakterienzellen zur Isolierung von einem gentechnologisch gebildetem Polypeptid, z.B. von Interferon, bekannt geworden, bei welchem dieses in hohen Ausbeuten isoliert werden kann. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Extraktionsverfahren aus Bakterienzellen für recombinant hergestellte Polypeptide aufzufinden, bei welchem die Bakterienzellen mechanisch aufgeschlossen werden. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass nach Auftrennen der mittels einer Mineralsäure nach bekannten Methoden abgetöten Bakterien (siehe beispielsweise "Sterili- sation, Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie - Verfahren, Wirkstoffe, Prüfungsverfahren von Dr. K. H. Wallläusser und Pool. Dr. H. Schmidt, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967, Seiten 145-161), welche das recombinant hergestellte Polypeptid, z.B. ein säurestabiles Interferon, enthalten, die erhaltene Biomasse in einer wässrigen Säure bei einem pH von 2,0 bis 4,0, z.B. in einer Mineralsäure wie verdünnte Salzsäure oder in einer wässrigen Alkansäure wie Essigsäure oder Propionsäure resuspendiert wird, die Bakterienzellwände durch die auftretenden Scherkräfte mechanisch zerstört werden, z.B. mit Hilfe eines Homogenisators, vorzugsweise mit einem Homogenisator vom Typ des Ultra-Turrax, und anschliessend nach Neutralisation der erhaltenen Suspension und Abtrennen der Bakterienbruchstücke das nunmehr sich in der Lösung befindliche Polypeptid nach bekannten Methoden abgetrennt und weiter gereinigt wird. Zur Isolierung von einem rekombinant hergestellten säurestabilen Interferon, z.B. einem a-Interferon wie IFN-a2(arg), wird das erfindungsgemässe Verfahren besonders vorteilhaft bei einem pH von 2,5 bis 3,5, vorzugsweise in verdünnter Salzsäure von pH 2,5 oder in l%iger Essigsäure, durchgeführt. Die Drehzahl des Homogenisators und die erforderliche Zeit, um die Bakterienzellen aufzuschliessen, hängt hierbei von der Dichte der eingesetzten Biomasse ab. Weist beispielsweise die Biomasse eine Dichte von 1,03 bis 1,05 auf, so liegt die Drehzahl des Homogenisators zweckmässigerweise zwischen 5000 und 10000 U/Min.. Bei einer Dichte der Biomasse von beispielsweise 1,04 liegt die Drehzahl des Homogenisators vorzugsweise zwischen 7000 und 8000 U/Min. und die Aufschlusszeit bei 2 Minuten. Desweiteren kann es in manchen Fällen von Vorteil sein, wenn nach der Homogenisation vor der Neutralisation ein Fällungsmittel, z.B. Polyäthylenimin in einer Konzentration von 0,1-0,5 %, zugesetzt wird. Am besten lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren im Labor Massstab mit einem IKA-Ultra-Turrax T 45 und im grösseren Massstab mit dem Dispax-Reactor 3-6/6 jeweils der Firma Janke & BR< Kunkel KG (D-7813 Staufen) durchführen. Hierbei liegt die Drehzahl ungefähr zwischen 5000 und 10000 U/Min. und die Aufschlusszeit zwischen 1 und 10 Minuten. Der Ultra-Turrax T 45 ist ein Dispergiergerät, bei dem ein Messer mit hoher Umdrehungszahl gegen ein Spaltenkranz rotiert und somit die Bakterienzellen in einem hochturbulenten Feld zerschlägt. Zur Zerstörung der Bakterienzellen wird das Gerät in ein Becherglas mit dem zu homogenisierenden Medium gehalten, wobei dieses durch einen Pumpeneffekt umgewälzt wird. Demgegenüber ist der Homogenisator Dispax-Reactor 3-6/6 ein dreistufiger Ultra-Turrax mit Zwangsführung, das heisst, es müssen alle Bakterienzellen die Homogenisierkammern mit der gleichen Durchflussgeschwindigkeit durchwandern. Hierdurch wird ein gleichmässig aufgeschlossenes Bakterienhomogenisat erhalten. In diesem Dispax-Reactor beträgt die Drehzahl 3.000 bis 8.000 U/Min. und der Förderdruck maximal ca. 2 bar am Ablauf. Mit diesem Homogenisator können 50 1 Biomasse innerhalb von 1 bis 10 Minuten homogenisiert werden. Figur I stellt einen Querschnitt durch einen Homogenisator nach Art des Dispax-Reactors 3-6/6 dar. In dieser Figur ist F die Zulaufkammer für das zu homogenisierende Füllgut, E eine Gleitringdichtung an der Antriebsstelle H; G stellt das Hauptlager dieser Antriebswelle dar. Auf der Antriebswelle H sitzen in Reihe zueinander drei zylinderförmige Rotoren C, die im Eingriff zu entsprechend ausgestellten Statoren D stehen, welche an den Innenwänden des Homogenisator-Gehäuses befestigt sind. Am Ende der Antriebswelle H ist eine Forderschnecke B befestigt, die in den Ablauf A hineinragt. Zur Kühlung der Statoren dient eine sich um die Statoren erstreckende Kühlkammer mit Einlass L und Auslass K für die Kühlwasserführung Die Gleitringdichtung am Hauptlager wird über den Wassereinlauf J mit Kühlwasser, vorzugsweise unter erhöhtem Druck, beispielsweise 1,5 bar, versorgt. Die zylinderförmigen Rotoren können als Doppel-Trommeln oder Dreifach- bzw. Mehrfach-Trommeln ausgebildet sein, ihre Trommel wände ragen in die Zwischenräume entsprechender Gegentrommelwände der Statoren hinein. Die zu homogenisierende Flüssigkeit wird, angetrieben durch die Schnecke B, durch die Zwischenräume zwischen den Rotoren und Statoren gezogen, durch die rasche Rotation der Rotoren werden die Bakterienzellwände durch die auftretenden Scherkräfte zerstört, das so homogenisierte Gut verlässt den Homogenisator durch den Ablauf A. Prinzipiell ist das Verfahren auch mit anderen bekannten mechanischen Zellaufschlussverfahren durchführbar wie sie beispielsweise in Biochemical Engineering, Seiter 358ff (Second Edition, Academic Press 1973) beschrieben sind. Die Ausbeuten sind jedoch dann niedriger, während man mit dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung von Ultra Turrax T45 oder vom Dispax-Reactor 3-6/6 eine höhere Ausbeute, beispielsweise an Interferon, bezogen auf die eingesetzte Biomasse erhält als mit den bisher bekannten Verfahren, was auf Grund des oben angeführten Standes der Technik nicht vorhersehbar war. Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: Beispiel 1 Eine Bakteriensuspension des E.Coli-Klons HB 101/pER 33 (siehe EP-A-0.115.613), deren Bakterien das Human-Interferon Alpha 2 enthalten, wird zur Abtötung der Bakterien mittels Mineralsäuren auf pH 2,0 bis 2,5 eingestellt. Die abgetöteten Bakterienzellen werden aus der Suspension abgetrennt und bei -200C tiefgefroren. 20 kg einer tiefgefrorenen Biomasse der Charge A wurden in 250 1 einer 1%gen Essigsäure bei 80C aufgeschlämmt. Nach dem vollständigen Auftauen der Biomasse wurde mit dem dreistufigen Homogenisator (Dispax-Reactor 3-6/6) dispergiert. Zum feindispergierten Lysat wurde als Fällungshilfsmittel 0,1%ges Polyäthylenimin zugesetzt. Dann erfolgte die pH Wert-Änderung mit 5n Natronlauge auf pH 7,5. Nach zweistündiger Extraktionszeit wurde die ausgelaugte Biomasse mittels Tellerseperator (Westfalia) bei der Durchflussrate von 1,5 1/min abgetrennt. Von der Kläre wurden Proben zur Bestimmung des Interferon- und Proteingehaltes gezogen und ausgetestet. Ausbeute: 46,9 x 106 I.E./g Biomasse Um den Einfluss des Homogenisators auf die Interferon-Ausbeute beurteilen zu können, wurden 500 ml der aufgeschlämmten Biomasse vor dem Dispergieren entnommen und ohne Homogenisationsschritt nach EP-A-0.052.861 extrahiert. Die pH-Wert-Än- derung auf 7,3 erfolgte mit 3n Natronlauge. Nach einstündiger Extraktionszeit wurde das Lysat von der ausgelaugten Biomasse mit einer Laborzentrifuge geklärt. Vom Überstand wurden wie oben. Proben für Interferon- und Proteingehalt gezogen und getestet. Ausbeute nach EP-A-0.052.861: 25,3 x 106 I.E./g Biomasse. Beispiel 2 Hergestellt analog Beispiel 1 unter Verwendung der Biomasse der Charge B. Ausbeute: 21,3 x 10 I.E./g Biomasse. Ausbeute nach EP-A-0.052.861: 9,7 x 106I.G./g Biomasse. Beispiel 3 Hergestellt analog Beispiel 1 unter Verwendung der Biomasse der Charge C. 6 Ausbeute: 13,8 x 10 I.E./g Biomasse. 6 Ausbeute nach EP-A-0.052.861: 5,1 x 10 I.E./g Biomasse. Beispiel 4 Hergestellt analog Beispiel 1 unter Verwendung von 1000 g Biomasse der Charge BC24, welche in 10000 ml verdünnter Salzsäure (pH 2,5; 4 ml 37%ige Salzsäure mit Wasser auf 10.000 ml aufgefüllt) aufgenommen und mit dem IKA-Ultra-Turrax T45 dispergiert wurde. Ausbeute: 50 x 106 I.E./g Biomasse.

Claims: Patenansprüche 1. Verfahren zur Isolierung von einem recombinant hergestelltem Polypeptid aus Bakterienzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterienzellen, welche ein gentechnologisch hergestelltes Polypeptid enthalten, suspendiert in einer wässrigen Säure bei einem pH von 2,0 bis 4,0 mechanisch zerstört werden und anschliessend, das nunmehr in der erhaltenen Suspension befindliche Polypeptid nach bekannten Methoden abgetrennt und weiter gereinigt wird. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterienzellen, welche ein rekombinant hergestelltes säurestabiles Interferon enthalten, eingesetzt werden. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterienzellen, welche ein rekombinant hergestelltes a-Interferon enthalten, eingesetzt werden. 4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterienzellen, die recombinant hergestelltes IFN-a2(arg) enthalten, eingesetzt werden. 5. Verfahren gemäss den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses bei einem pH von 2,5 bis 3,5 durchggführt wird. 6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienzellen durch die auftretenden Scherkräfte zerstört werden. 7. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienzellen mit einem Homogenisator zerstört werden. 8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Homogenisator ein Homogenisator vom Typ des Ultra-Turrax, vorzugsweise ein Dispax-Reactor 3-6/6, verwendet wird. 9. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Säure eine Mineralsäure oder eine Alkansäure wie Essigsäure oder Propionsäure verwendet wird. 10. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als wässrige Säure verdünnte Salzsäure (pH 2,5) oder 1%ige Essigsäure verwendet wird.

Inventors: ADOLF, GUNTER, DR., BODO, GERHARD, PROF. DR., GIBLEY, WOLFGANG, KONOPITZKY, KURT, DIPL.-ING., Adolf, Günter, Dr.
Applicants: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH
Application year: 1985
Main classification: C12N1
IPC codes: C12N1, C12P21, C12N15, C07K14, A61K38, C07K1, C12R1