ENHANCER FOR EUKARYOTIC EXPRESSION SYSTEMS

Abstract: An enhancer has been located in the upstream region of the major immediate early gene of human cytomegalovirus and has been isolated and shown to be more active than that of SV40 and to have a wide cell spectrum. It is therefore suitable for eukaryotic expression systems, where it can be incorporated above or below the structural gene or the regulatory region.

Description: Enhancer für eukaryotische Expressionssysteme Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert, bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens nach Anspruch 3 sind in den Ansprüchen LI und 5 wiedergegeben. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen folgen. Die '1Enhancer-Falle" ist beschrieben bei F. Weber et al., Cell 36 (1984) 983-992, zur HCMV-DNA siehe G. Jahn et al., J. Virology, Feb. 1984, Vol. 49, 363-370 und dort zitierte Literatur, ferner D. R. Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 659-663, und P. J. Greenaway et al., Gene 18 (1982) 355-360. Der Enhancer ist in der HCMV-DNA im Hind III E-Fragment lokalisiert (Greenaway et al., a.a.O.), das das Pst I m Fragment umfasst (etwa 2,1 kb). Nach Anspruch 2 wurden 2 Recombinanten isoliert, die 341 bzw. 262 bp HCTW-DNA enthielten, angeordnet bei Position -118 bis -458 bzw. -263 bis -524 der publizierten DNA Sequenz (Greenaway et al., a.a.O.). Die Überlappung von 196 bp enthält einen wesentlichen Teil des Enhancers. Deletionsmutanten, z. B. erhalten durch Aha II und Religieren der Fragmente in unterschiedlichen Kombinationen, sind ebenfalls Enhancer-aktiv. DNA, die zu mindestens 75, vorzugsweise mindestens 80 % Sequenz-homolog mit reisolierter HCMV-spezifischer Enhancer-DNA ist bzw. damit hybridisiert, ist ebenfalls Erfindungsgegenstand. Der Enhancer erhöht die Expression von Kaninchen-Betaglobin in HeLa-Zellen nach Einbau unterhalb des entsprechenden Gens um mindestens zwei Grössenordnungen, unabhängig von der Orientierung. Damit ist der Enhancer um den Faktor 3-5 besser als der von SV4O, abhängig vom Wirtssystem. Der HCMV-Enhancer besitzt die Aktivität in einem weiten Spektrum an Wirtszellen (Primaten-, Mäuse-, Ratten- und Froschzellen). Er stimuliert die Expression von Proteinen in eukaryotischen Systemen und erleichtert dadurch die Produktion von modifizierten Proteinen, z. B. Glycoproteinen. Bei der Anwendung kann auch der HCtIV-eigene Promotor eliminiert werden, beispielsweise durch Abbau von etwa 100 bp mit Bal 31 über die Sac I-Schnittstelle hinaus. Gegebenenfalls kann die Enhancer-Sequenz durch Anbau von Adaptoren oder Linkern modifiziert werden. Bei Verwendung mit dem eigenen Promotor kann ein eukaryotischer Promotor ersetzt werden, z. B. durch Einbau inklusive der ersten nsplice donor consensus sequence des IE-Gens vor der splice acceptor sequenzen des zu exprimierenden Gens. In dem folgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert. Beispiel Nach Weber et al., a.a.O., wurde eine "Enhancer-Falle" durch Entfernen der 72 bp flrepeat region (Schneiden mit XbaI und KpnI) aus dem SV40-Genom hergestellt. Das PstI-m Fragment (2,1 kb) von HCMV, Stamm AD 169, wurde durch Sonifikation in etwa 300 bp-grosse Stücke zerlegt und mit der "Enhancer-Falle" cotransfiziert. Aus den Kolonien, die das beste lytische Wachstum zeigten, wurde die rekombinante DNA isoliert. Es wurde durch Sequenzierung ein 262 bp-Segment von HCMV-DNA ermittelt, wobei auf einer Seite eine Ende-an Ende-Ligierung eingetreten war, während auf der anderen Seite die Rekombination über eine 6 bp-Homologie zwischen HCMV (Nucleotide -531 bis -526, Figur la) und SV40 (Nucleotide 67 bis 72) erfolgte. Hierdurch ergabesich eine Deletion von 27 bp der SV40-DNA (Nucleotide 73 bis 99), die beide 21 bp-nrepeats des SV40 early promoter" betraf. In der Restriktionskarte (Figur la) und in der DNA-Sequenz (Figur lb) ist das 262 bp-Segment durch die eckigen Klammern und die Angabe "C4" bezeichnet. Eine weitere Enhancer-aktive Rekombinante mit 341 bp HOMV- DNA erwies sich als Ligationsprodukt mit den Enden eines linearen "Enhancer-Falle"-Moleküls (wobei einige Basen von den KpnI- und XbaI-Enden der SV40-DNA abgespalten waren, vermutlich durch exonucleolytischen Abbau vor der Ligation innerhalb der transfizierten Zelle). Die HCr'N-DNA dieser Rekombinante ist in den Figuren la und lb mit "C2" bezeichnet; sie erstreckt sich von -188 bis -458. Die Segmente C2 und C4 überlappen sich somit über einen Bereich von 196 bp. Das Hind III C-Fragment des rekombinanten Viruses mit der Insertion C4 und das PstI-m-Fragment von HCtS wurden zunächst in pUC8 (J. Vieira et al., Gene 19 (1982) 259-268) in beiden Orientierungen kloniert, als Hind III-SalI-Frag mente ausgeschnitten und zwischen die HlndIII- und XhoI Schnittstelle von pgX14 rekloniert, also unterhalb des Kaninchen-B-Globin-Gens (J. Banerji et al., Cell 27 (1981) 299-308; J. de Villiers et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981) 6251-6254; S. Rusconi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 5051-5055; H. Weber et al., ICN-UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 33 (1981) 367; B. Wasylyk et al., Cell 32 (1983) 503-514). Die Enhancer-Wirkung auf die ss-Globin- Transkription wurde durch S1 Nuclease-Analyse cytoplasmatischer RNA nach transient expression" in HeLa-Zellen bestimmt. Alle Konstruktionen wurden zusammen mit analogen Konstruktionen mit dem SV40-Enhancer unter standardisierten Bedingungen verglichen. Es zeigte sich, dass der HCtR- Enhancer die Synthese von ss-Globin mindestens um 2 Grössenordnungen - unabhängig von der Orientierung - steigert.

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A DNA fragment with enhancer activity for eukaryotic expression systems, wherein the DNA fragment extends from the PstI cleavage site which is located upstream from the transcription start point of the PstI-m fragment of human cytomegalovirus (HCMV) to position -118 of said fragment, or enhancer-active parts or mutants thereof. A DNA fragment as claimed in claim 1, wherein the DNA fragment extends from positions -524 to -118, -524 to -263, -524 to -458, -458 to -118, -458 to -263 or -263 to -118, preferably from -118 to -458 or -263 to -524. A process for the improvement of eukaryotic expression systems, which comprises incorporation of a DNA fragment as claimed in claim 1 or 2, upstream or downstream of the structural gene or of the regulation region. The process as claimed in claim 3, wherein the DNA fragment is incorporated not more than about 7,000 bp upstream or downstream of the sites specified. The process as claimed in claim 3 or 4, wherein the DNA fragment is incorporated less than 3,000 bp upstream or downstream of the sites specified. The use of a DNA fragment as claimed in claim 1 or 2 for the improvement of eukaryotic expression systems, wherein the DNA fragment is incorporated upstream or downstream of the structural gene or of the regulation region. Claims for the following Contracting State : AT A process for the preparation of a DNA fragment with enhancer activity for eukaryotic expression systems, which comprises isolation of a DNA fragment which extends from the PstI cleavage site which is located upstream from the transcription start point of the PstI-m fragment of human cytomegalovirus (HCMV) to position -118 of said fragment, or enhancer-active parts or mutants thereof. The process for the preparation of a DNA fragment as claimed in claim 1, wherein the DNA fragment extends from positions -524 to -118, -524 to -263, -524 to -458, -458 to -118, -458 to -263 or -263 to -118, preferably from -118 to -458 or -263 to -524. A process for the improvement of eukaryotic expression systems, which comprises incorporation of a DNA fragment which extends from the PstI cleavage site which is located upstream from the transcription start point of the PstI-m fragment of human cytomegalovirus (HCMV) to position -118 of said fragment, or enhancer-active parts or mutants thereof, upstream or downstream of the structural gene or of the regulation region. The process for the improvement of eukaryotic expression systems as claimed in claim 3, wherein a DNA fragment which extends from positions -524 to -118, -524 to -263, -524 to -458, -458 to -118, -458 to -263 or -263 to -118, preferably from -118 to -458 or -263 to -524 is incorporated upstream or downstream of the structural gene or of the regulation region. The process as claimed in claim 3 or 4, wherein the DNA fragment is incorporated not more than about 7,000 bp upstream or downstream of the sites specified. The process as claimed in at least one of claims 3 to 5, wherein the DNA fragment is incorporated less than 3,000 bp upstream or downstream of the sites specified. The use of a DNA fragment which extends from the PstI cleavage site which is located upstream from the transcription start point of the PstI-m fragment of human cytomegalovirus (HCMV) to position -118 of said fragment, or enhancer-active parts or mutants thereof for the improvement of eukaryotic expression systems, wherein the DNA fragment is incorporated upstream or downstream of the structural gene or of the regulation region. The use of a DNA fragment as claimed in claim 7, which extends from positions -524 to -118, -524 to -263, -524 to -458, -458 to -118, -458 to -263 or -263 to -118, preferably from -118 to -458 or -263 to -524.

Inventors: BOSHART, MICHAEL, DR., DORSCH-HAESLER, KAROLINE, DR., FLECKENSTEIN, BERNHARD, PROF. DR., JAHN, GERHARD, DR., SCHAFFNER, WALTER, PROF. DR., WEBER, FRANK, DR., Dorsch-Häsler, Karoline, Dr.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N15