PROCESS FOR PREPARING DOUBLED HAPLOIDS OF CEREALS

Abstract: Process for obtaining doubled haploids of cereals, wherein the plants are treated by a chemical hybridation agent, after the pollination period the abnormal caryopsis are taken and the plants are regenerated from the embryo of abnormal caryopsis and the self-fertilization is effected for each of the regenerated plants to obtain seeds corresponding to homozygous plants and the following generations.

Description: PROCEDE DE PREPARATION D' w LOIDES DOUBLES DE CEREALES. La présente invention concerne un procédé pour la production de lignées haploides doublées de céréales. Une plante haploide doublée par définition est une plante qui provient d'une déviation du processus normal de reproduction sexuée. Dans les plantes à fleurs, le cycle végétatif est appelé 2n (diploïde), chaque cellule de l'organisme se divise par mitose. La mitose est un processus par lequel une cellule se divise pour donner 2 cellules filles qui portent chacune la même information génétique que la cellule mère et également le même nombre de chromosomes, unité d d'information héréditaire. Pour initier le cycle sexuel, il est nécessaire d'avoir un processus de reduction du nombre des chromosomes (la méiose) pour donner naissance à des cellules gamétiques portant n chromosomes (nombre haploïde). Dans les plantes à fleurs, la reproduction sexuée implique une double fécondation. Une cellule mâle s'unit avec une ovule pour former un zygote qui produit l'embryon, en restaurant le nombre de chromosomes somatiques. Une autre cellule màle s'unit avec les 2 noyaux polaires, en général fusionnés en un noyau contral. La cellule résultante triploïde conduit à l'endosperme. Dans certains cas, cette double fécondation ne @t produit pas et l'une des deux cellules gàmétiques se divine seule pour donner lieu a une plante haplolde. Ces plantes haploldes sont très intEressantes dans les domaines de la génétique et de l'amélioration des plantes car, après le doublement chromosomique, les informations héréditaires seront identiques sur les deux chromosomes de chaque paire. De cette façon, l'information génétique sera fixée et les haploïdes doublés seront des outils permettant de simplifier et d'accélérer les processus de sélection Dans le cadre de la présente description, la terminologie "haploïde double designera une lignée diplolde de blé, par exemple descendant de la phase haploïde de cette espèce (gamètes mâles ou femelles). Les recherches sur l'haplodiploïdisation des plantes supérieures ont été marquees au cours des 15 dernières années par plusieurs découvertes qui ont ouvert des étapes importantes dans ce domaine. Les travaux de Guha et Maheshwari (1964) sur la culture d'anthères in vitro ont incontestablement provoqué un très grand nombre de recherches sur cette technique d'obtention d'haplo des à partir des gamètes mâles (androgénèse in vitroN. A la même époque les croisements interspécifiques et intergénériques, ainsi que des systèmes génétiques inducteurs, étaient déjè reconnus comme inducteurs d'haploïdes, soit qu'ils provoquaient une parthénogénèse, une semigamie ou une élimination chromocomlque toutes et Peloquin, 1957 ; Turcotte et Feaster, 1963 ; Kasha et Kao, 1970 : Chase, 1949). Le cas de l'orge est, ce titre, tout rait remarquable puisque le croisement interspécifique dc cette espèce avec Hordeum bulbosum a ouvert une voic très efficace d'obtention et d'utilisation des haploldes doublés en sélection (Kesha et Reinbergs, 1980). Puis les travaux de San Noeum (1976) sur l'orge ouvraient une autre étape, celle de la gynogénèse in vitro. Ainsi, ce sont les techniques de culture in vitro appliquées aux gamétophytes, cette "générstion oubliée" (Heslop-Harrison, 1980) qui ont permis d'étudier au niveau haploïde et à l'état homozygote qui en découle, le plus grand nombre d'espèces. Elles continuent de marquer profondément les recherches en génétique végétale, non seulement en ce qui concerne les possibilités remarquables qu'elles ouvrent pour la sélection, mais egalement parce qu'elles sont source d'une nouvelle variabilité génétique (Larkin et Scowcroft, 1981). Cependant, si on analyse les résultats concrets obtenus par l'utilisation de l'haplodiploldisation en amélioration des plantes, on doit reconnaître encore aujourd'hui que cette méthode n'a donné de résultats pratiques que chez très peu d'espèces. On en trouve en effet chez le mais, la pomme de terre, l'orge et le cotonnier, pour les techniques n'utilisant pas l'androgenèse in vitro. Quant aux haploïdes doublés androgénétiques sur lesquels les essais agronomiques sont déjà très avancés ou qui sont déjà inscrits comme cultivars, on peut en citer quelques uns chez l'asperge, la pomme de terre, le colza, le riz, le blé, l'orge, l'hévéa et le tabac (Loo Chiwei, 1982). Les causes de cette lenteur du transfert de l'haplométhode au niveau de l'application sont à rechercher, en partie, dans les limites actuelles des techniques de culture in vitro qui sont : a) la grande spécificité génotypique de réponse à la culture in vitro , b) les faibles pourcentages de microspores ou de cellules du sac embryonnaire se dédifférenciant pour donner naissance à des embryons, et c) la perte importante de ces embryons quand on veut les conduire vers une organogénèse complote. Le blé tendre fait donc partie de ces espèces où l'effort déployé est très important, étant donné l'enjeu, pour surmonter ces problèmes. Dans ce contexte les premiers résultats obtenus dans le cadre de la présente invention ouvrent une nouvelle voie d'obtention d'haploldes doublés in vivo chez le blé, grâce à l'utilisation d'un agent chimique d'hybridation (A.C.H.). Ce nouveau procédé se caractérise, en effet, par une haploidie induite in vivo à une fréquence suffisamment élevée pour en envisager l'application, cas qui jusqu'à présent ne s'était pas présenté (Lacadena, 1974). La présente invention concerne un procédé d'obtention d'haploïdes doublés de céréales dans lequel a) on traite les plantes par un agent chimique d'haplodiploldisation entre le stade de croissance de 5 à 9 selon l'échelle de Feekes modifiée par Large b) après pollinisation par un pollen fertile, on trie les caryopses anormaux parmi tous les caryopses obtenus ; c) on régénère les plantes à partir des embryons des caryopses anormaux ; et d) on réalise l'autofécondation de chacune des plantes régénérées pour obtenir les semences correspondant, dans certains cas, à des plantes homozygotes dans la génération suivante. Le traitement est effectué, de préférence, aux stades 6, 7 ou 8 de l'échelle de Feekes. Parmi les céréales qui doivent dtre traitées, il faut citer notamment : le blé dur, le blé tendre, l'orge, le trlticaX l'avoine, le sarrasin, le malus, le riz, le sorgho et le seigle. Les agents chimiques d'haplodiploIdisation sont des composés chimiques susceptibles de conduire à la formation de caryopses anormaux haploldes. Parmi ces agents d'haplodiploldisation, il faut citer les agents chimiques d'hybridation (A.C.H.), les gamétocides, les composés agissant comme substance de croissance. Les agents induisant, en outre, une stérilité mâle sont les plus intéressants lors de l'utilisation ultérieure des produits végétaux obtenus. Parmi les agents chimiques utilisables, il faut citer les composés objet des brevets FR - 2 352 801 US - 3 576 814 US - 3 503 986 US - 3 761 240 FR - 2 383 605 US - 4 028 084 US - 4 038 065 US - 4 238 220 US - 4 147 528 US - 4 051 142 US - 4 345 934 EP - 83301057 qui sont notamment des oxo et thio-pyridazines, des pyrimidines ou des oxonicotinates. Mais il faut citer également d'autres agents b action gamétocide tels que l'acide glbberellique, le TIBA, l'oestrone, les méthanopyrolidines du brevet DT - 2 641 295 ou les dérivés de l'acide cinchoninique décrits au brevet US - 4 009 020, ainsi que les composés mentionnds dans l'article de J.J. Batch, Monogr. Br. Crop. Proc. Counc., 1978, 21, 33-43. Il faut citer également l'acide 2-chloroéthylphosphonique et ses sels et dérivés, ainsi que le chlormequat et ses dérivés et sels. Parmi les agents précédents, il faut citer, en particulier, les composés de formule EMI6.1 dans laquelle Ph représente un radical phényle non substitué ou substitué, par exemple par un ou plusieurs atomes d'halogène ; Alk est un radical alkyle, de préférence en C1 à C5 ; R est un radical alkyle en C1 à C5, un halogène ou un atome d'hydrogène ; et leurs sels, Ces composés peuvent être préparés par des procédés décrits aux brevets FR-2 392 980 et FR - 2-383 605. Il s'agit plus particulièrement du composé de ltacide 1-(4-chlorophényle)-1,4-dihydro-4-oxo-6-méthyl- pyridazine-3-carboxylique et ses sels, en particulier le sel de potassium. L'époque de traitement ainsi que le dosage des A.C.H. pourront varier suivant la nature de l'A.C.H. et de la céréale traitée, ainsi pour le blé le traitement sera effectué de préférence avec une dose de l'ordre de 0,04 à 10 kg/ha de principe actif, et de préférence à une dose de 0,1 b 2 kg/ha. L'agent chimique d'haplodiploïdisation peut être appliqué sous une forme quelconque utilisable en agriculture, le principe actif étant formulé avec un support acceptable, par exemple sous forme d'une pulvérisation de poudre ou de liquide sur les plantes. Une caractéristique importante du procédé est le fait que les plantes traitées doivent être pollinisées par un pollen fertile, et pour cela, par exemple, présenter dans leur voisinage des plantes non traitées qui fourniront le pollen. Les caryopses anormaux sont nettement visibles, en particulier sur le blé car il présente un aspect plat et fripé ; ces caryopses anormaux présentent, en général, un albumen réduit et possèdent un embryon, dont le point de départ est une cellule haplolde. De préférence, les plantes sont régénérées par culture in vitro de l'embryon prélevé des caryopses anormaux sur un milieu de régénération tel que Rg. Les plantes peuvent être régénérées également par germination des caryopses anormaux et culture desdits germes. Les milieux de culture in vitro pour les embryons sont connus de l'homme de métier et ne constituent pas une caractéristique de la présente invention. Les plantes obtenues sont sutofêcondees par des procêdês connu tels que l'ensachage des épis afin d'obtenir Ces semences correspondant à des plantes homozygotes. Les lignées pures fixées ainsi obtenues sont utiles comme outil de recherche, mais également comme parents d'hybrides. Les exemples ci-aprs sont destinés & illustrer d'autres caractéristiques et avantages du procédé selon la présente invention. EXEMPLE 1 Le matériel était constitué de 240 lignées F'3 de blé tendre d'hiver installées au champ obtenues après deux années de sélection dans un programme de sélection récurrente multilocale. La variabilité génétique intra-lignees et inter-lignées de ces F'3 était très importante car la population servant de matériel de base provenait d'un croisement pyramidal à 16 parents Ces lignées devant être intercroisées entre elles, ce qui constitue une opération normale de la fin d'un cycle de sélection récurrente, il a semblé intéressant de traiter une partie de ces lignées avec le produit A.C.H. n 1 afin de rendre mâle-stérile une partie des plantes de chaque lignée ce qui devait rendre de grands services pour faciliter le croisement. C'est donc la moitié de chaque ligne de 11 plantes qui a été traitée en avril 1981, toutes les lignes ayant été traitées le même jour à un stade repéré comme étant en moyenne proche du stade optimum tel que cela est notamment décrit dans le brevet français ROHM & HAAS n 2 383 605. Dans le cas présent, les plantes ont été traitées avec 1kg/ha d'une formulation de 1-(4-chlorophényl)4-oxo-6-méthylpyridazinone-carboxylate Ce potassium. Au moment Ce l'application, les plantes se trouvaient à des stades de croissance compris entre 5 et 9 (échelle de Feekes), le stade de développement étant en moyenne de 6 à 7. On a utilisé à titre d'agent tensio-actif du triton X-100 a 0,03 @ et le composant actif a été utilise dans un volume porteur de 500 1/ha. Il est cependant important de remarquer que compte tenu de le variabilité génétique des lignées traitées, il est évident qu'une partie des plantes ont Cte traitées à un stade pi us ou moins éloigné du stade optimum d'application pour obtenir des mâles-stériles. Les fleurs des épis des plantes traitées ont été observées in situ pendant les semaines qui ont suivi la période de pollinisation. On a pu observer aprbs 2 fl semaines suivant cette période un Grand nombre d'épis portant des caryopset anormaux. La principale caractéristique de ces caryopses était qu'ils étaient dépourvus d'albumen et spparsissaient donc comme des caryopses plats. Leur aspect était assez semblable à des caryopsec plats que l'on obtient lorsque l'on croise, par exemple, Hordeum vulgate par Hordeum bulbosum. Ces caryopses pouvaient présenter presque la longueur du grain normal résultant de la double fécondation. La fréquence de ce phénomène a été notée et s'est montrée très différente d'une plante à l'autre comme cela est indiqué dans le tableau 1. Ainsi, sur 15 plantes différentes, un total de 234 caryopses anormaux a été dénombré pour 93 épis observés avec de 4 à 9 épis comptés par plante. Le nombre moyen de caryopses anormaux variait de U,8 a 8,50 par épi et par plante. On a ensuite pratiqué la dissection de ces caryopses anormaux prélevés quelques semaines après la fécondation Cette dissection a montré que ces caryopses étaient réellement dépourvus d'albumen normal, celui-ci n'apparaissant que sous la forme d'un liquide plus ou moins blanc, mais par contre ces caryopses possédaient un embryon visible à sa -place normale. Ces embryons paraissaient plus petits que les embryons issus de grains normaux avec une diversité dans l'aspect moiphologique de leur scutellum. Sur certains des caryopses il na pas été trouvé d'embryon, soit parce qu'ils étaient absents, soit parce que trop petits ils ont été perdus dans l'albumen liquide. Afin d'effectuer une culture in vitro des plantes à partir de ces embryons, on a procédé de la façon suivante = Les caryop@es ont d'abord été désinfectés suivant le procédé habituel lavage pendant z minute dans une solution de teepol b 2 X, désinfection dans une solution d'hypochlorite de calcium à 4 % pendant 3 minutes, rinçage b l'eau stérile deux fois. Les embryons, une fois disséquées et sortis de l'cnveloppe des grains ont été transportés sur un milicu de régénération R9 ayant la composition suivante Macro-éléments et micro-éléments de Miller Vitamines de Fuji Fer EDTA 10 4 M A.I.A. 10 Saccharose 2 X Agar 0,8 X pH 5,9. Il s'agit là d'un milieu couramment employé pour régénérer les plantes haploides à partir des embryons androgénétiques obtenus en culture d'anthères in vitro Après 3 semaines, 74 des 88 embryons mis en culture ont donné naissance à des plantules chlorophyliennes complètes et qui ressemblaient de façon très frappante à des plantes haploïdes. Leur croissance était vigoureuse et leur enracinement in vitro était normal. Afin de connaître le niveau de ploidie des plantules, on a prélevé des pointes de racines suivant le procédé habituel (préfixation dans une solution d'alpha-monobromonaphtalene à 2 %, fixation dans l'alcool à 700 , coloration au carmin acétique). 2 à 3 pointes de racine par plante ont t comptées pour 15 plantes. Ce compte a permis de découvrir que le niveau de ploidie b l'intérieur d'une même ricine, et ceci pour toutes les plantes. variait de l'état haploïde à l'état diploïde. D'une plaque métaphasique à l'autre dans une même racine, on a constaté que le nombre des chromosomes variait de l'état haploïde n = 21 à l'état diploïde n = 42 avec des niveaux intermédiaires : 21 - 27, 28, 29 -33, 35, 36 - 41, 42. Ce résultat pourrait signifier que la cellule initiale de l'embryon était haploïde et qu'au cours des divisions cellulaires de ces embryons le niveau de ploïdie est devenu-instable, peut-etre du fait de l'absence d'albumen bien constitué. Le plus extraordinaire est que le phénomène d'endoreduplication se passait comme si le doublement avait lieu génome par génome = A B D # A A B D # A A B B D # A A B B D D Il n'est pour l'instant pas possible de se prononcer sur l'origine de cette celle haplorde ; il pourrait s'agir d'une parthénogénèse induite ou bien d'une androgénèse in situ. Cependant, l'origine étant certainement haploide et une endoreduplication se manifestant dans ces plantes, celles-ci devaient à ce moment là donner lieu à une descendance haploïde, doublee, homozygote. C'est ce qui a été démontré dans l'exemple ci-après. EXEMPLE 2 Les plantules obtenues par culture d'embryons ont tout d'abord été clonées in vitro, puis vernalisées 8 semaines en tube afin de leur permettre une floraison normale à la sortie en serre. Seule une partie des plantes r pu store repiquée avec auccbs tn serre et finalement 18 plantes ont pu fleurir normalement. Comme on pouvant s'y attendre, suivant que le doublement spontané était pluc ou soins efficace, les territoires cellulaires des épis étaient mixoploïdes. Ainsi la fertilité variait de 2 4 A grains par épi jusqu' une fertilité normale. 2 épis par plante avaient été ensachés pour vérifier ce point. Afin de vérifier que les grains récoltés sur chaque plante avaient bien tous la même constitution génétique, résultat attendu si les plantes issues des caryopses anormaux étaient bien des homozygotes, on s'est intéresses à l'étude des gliadines et des glutènines de ia grains issus du même épi pour chaque plante. 6 descendances ont ainsi été analyses par électrophorégramme en comparaison avec des descendances F'4 des mêmes lignées F'3 d'origine. obtenues par autofécondation. Pour 4 descendances des caryopses anormaux, les 14 électrophorégrammes de gliadines se sont montrés rigoureusement identiques entre eux. Pour une descendance, seul un grain différait seulement par une bande des 13 autres identiques entre eux. Pour le dernier cas, 7 grains présentaient un spectre identique, les 7 grains présentaient un spectre identique au premier avec 2 bandes en moins. Par contre, pour les glutènines, la stabilité était parfaite. En comparaison, les descendances F'4 présentaient pour la plupart de nombreuses différences dans leur bande de gliadines. tl ressort des exemples précédents que les plantes obtenues à partir des caryopses anormaux sont des plantes haploïdes doublées à car@ctère mixoploïde pouvant alors donner lieu à une descendance homozygote. Ceci ouvre une nouvelle voie totalement originale d'haplodiploidisation du blé tendre sur des plantes ayant subi un traitement par un A.C.H. TABLEAU @ N de la Nombre d'épis Nombre de Nombre moyen plante observés caryopses par épi anormaux 1 4 29 7,25 2 4 3a 8,50 3 6 6 1 4 6 19 3,17 5 5 5 1 6 4 5 1,25 7 6 13 2,17 8 6 22 3,67 9 7 18 2,57 10 6 5 0,83 11 6 10 1,67 12 6 15 2,50 13 9 23 2,56 14 9 17 1,89 15 9 13 1,44 Totaux 93 234 2,52 EXEMPLE 3 ETUDES SUR L'APPLICATION DE LA TECHNIQUE AUX CHAMPS Détermination du meilleur stade et de la meilleure dose de traitement Sauf indication contraire, le traitement est effectué comme dans l'exemple 1. L'objectif est de déterminer les "doses stades les plus efficaces pour l'apparition du phénomène "grains plats" et de voir s'il y a une liaison ou pas entre ce phénomène et le taux de stérilité mâle obtenu Le produit, en solution aqueuse et additionné d'un mouillant, est pulvérisé sur la totalité de la plante à traiter. En 1983, deux doses du produit ont été testées, d1 et d2, et en 1984, trois doses, d1, d2 et d3 d1 = 1,0 kg/ha ; d2 = 1,4 kg/ha et d3 = 1,8 kg/ha. A chaque traitement, des échantillons ont été prélevés pour déterminer le stade de développement atteint par les plantes. En 1983, on a travaillé, aux champs, sur un seul dispositif expérimental, comprenant 4 variétés et 2 hybrides F1. Codes : A = Frandoc, B = Festin F1 A x B = Frandoc x Festin C = Courtôt, D = Fidel F1 C x D = CourtÏt x Fidel. Deux stades ont été testés, codés t2 et t3. Stade t2 : traitement le 3 mai 1983. Les variétés Fidel et Frandoc avaient le 2ème noeud visible ; la dissection de quelques plantes prélevées au hasard dans l'essai montrait que l'épi était en moyenne à 0,7 cm du plateau de tallage. Au stade t3, le 9 mai, Frandoc avait atteint le stade 8 de l'échelle de Feekes modifiée par Large (dernière feuille pointante), l'épi était à 1,5 cm du plateau de tallage, Fidel, plus tardif, n'avait pas encore la dernière feuille pointante et sans épi était à 1 cm du plateau de taillage. L'échelle de Feekes modifiée par Large est donnée à la fin de la description. Le tableau 2 montre le nombre moyen de grains plats par épi pour les deux F1 A x B et C x D. TABLEAU 2 ANNEE 1983 - NOMBRE MOYEN DE GRAINS ANORMAUX PAR EPI (MOYENNE DE DEUX REPETITIONS PAR DOSE-TEMPS) Effectif d'épis par dose-temps et répétition : 20 sauf pour d2 t3 : 40 F1 A x B F1 C x D EMI18.1 <tb> <SEP> T2 <SEP> T3 <SEP> T2 <SEP> T3 <tb> d1 <SEP> 1,05 <SEP> 0,575 <SEP> <SEP> d10,80,7 <SEP> <tb> d2 <SEP> 0,8 <SEP> 2,03 <SEP> d2 <SEP> 0,5 <SEP> 1,31 <tb> De plus, sur les 4 variétés et les 2 F1, on a mesuré pour 5 épis ensaches la fertilité exprimée en nombre de grains normaux par épillet. Les résultats sont donnés au tableau 3. Pour cet essai, on a étudié plus particulièrement les deux hybrides F1 pour trois raisons Pour l'aspect production d'haploldes doublés agronomiquement intéressants, il est préférable de travailler un matériel hybride. Le tri des haploïdes doublés (HD) obtenus par cette méthode est beaucoup plus aisé à partir d'un matériel hétérozygote qu'à partir de lignées. En effet, un pourcentage d'erreur existe et le dépistage précoce des diploldes issus d'autofécondations ou d'hybridations n'est pas aisé par comptage chromosomique. En ce qui concerne l'essai dose-temps, la première constatation est que la fréquence d'apparition du phénomène est faible pour l'année 1983 : la valeur maximum de 2,03 grains plats/épi est infdrieure aux premières observations faites depuis 1981. En effet, tous les battages depuis 1981 montrent une fréquence proche de 3 grains plats par épi. Au temps t21 les doses d1 et d2 ne semblent pas très discriminantes, les différences observées sont faibles et les fréquences les plus élevées sont trouvées pour la dose d1, la plus faible. Au temps t3, par contre, on constate pour les deux F1 une nette augmentation de la fréquence pour la dose d2. Il semble donc que le traitement soit le plus efficace à un stade relativement avancé et à une dose importante (d2 t3). Toutefois, il n'est pas utile apparamment d'augmenter la dose de traitement à un stade trop jeune. Le tableau 3 concernant la fertilité fait apparattre plusieurs points intéressants Pour tous les génotypes testés, c'est effectivement la combinaison stade-dose d2 t3 qui produit le plus grand taux de stérilité. Pour la série A, B et A x B, on se rend compte que le stade du traitement a été très important puisque c'est toujours au stade t3 que la stérilité est la plus forte par rapport au stade t2. A t2, la dose employée n'est pas très discriminante, sauf pour B. A t3 par contre, c'est la dose d2 la plus efficace Pour la série C, D et C x D, le problème est différent et on trouve un fort taux de stérilité seulement à d2 t3 pour D ; d1 t3 d2 t3 d1 t2 ne se démarquent pas vraiment les uns des autres d'une façon claire. A cela deux explications sont possibles - Les 6 génotypes ont été traités aux mêmes dates, or la série C, D, C x D est un peu plus tardive que la série A, B, A x B. Il se peut donc que le stade ait été moins favorable et l'essai moins discriminant. - Il ne faut pas omettre la possibilité d'une interaction traitement-génotype, que ce soit au niveau de la stérilité induite par le traitement ou au niveau du phénomène "grains plats". Détermination du meilleur stade et de la meilleure dose Dour un autre génotype (la variété Festival) Pour cet essai, on a utilisé des parcelles expérimentales de 6 m2 des variétés Festival et Fidel implantdes aux champs. Ces parcelles avaient été semées à la dose de 250 grains germant au m2 à l'automne 1983. TABLEAU 3 FERTILITE, APRES TRAITEMENT GAMETOCIDE, MESUREE POUR CINQ EPIS ENSACHES, POUR QUATRE VARIETES ET LEURS DEUX HYBRIDES F1 (La fertilité est exprimée en nombre de grains "normaux" par épillet) A B A x B EMI22.1 @ <SEP> T2 <SEP> T3 <SEP> T2 <SEP> T3 <SEP> T2 <SEP> T3 <tb> d1 <SEP> 2,56 <SEP> 1,2 <SEP> d1 <SEP> 2,18 <SEP> 0,3 <SEP> d1 <SEP> 3 <SEP> 0,64 <tb> d2 <SEP> 2,8 <SEP> 0,07 <SEP> d2 <SEP> 1,08 <SEP> 0,04 <SEP> d2 <SEP> 2,09 <SEP> 0,42 <tb> C D C x D EMI22.2 T2 <SEP> T3 <SEP> T2 <SEP> T3 <SEP> T2 <SEP> T3 <tb> d1 <SEP> 1,82 <SEP> 1,22 <SEP> d1 <SEP> 2 <SEP> 1,45 <SEP> d1 <SEP> 1,7 <SEP> 2,23 <tb> d2 <SEP> 0,85 <SEP> 0,84 <SEP> d2 <SEP> 1,45 <SEP> 0,2 <SEP> d2 <SEP> 2.9* <SEP> 2,06 <tb> * un seul épi Le protocole expérimental a été le suivant 3 doses (d1, d2, d3) ont été testées b trois stades différents (t1, t2, t3). Chaque parcelle expérimentale était constituée par 1/4 de parcelle d'essai ; chaque dose-temps a été répétée 4 fois au hasard parmi les parcelles traitées, un nombre égal de parcelles témoins. Les dates de traitement ont été les suivantes stade t : 25 avril 1984 stade t2 : 30 avril 1984 stade t3 : 4 mai 1984. Cet essai a été dépouillé de la manière suivante - Sur chaque dose-temps, en fécondation libre, on calcule la fréquence de grains plats par épi, sur un effectif total de 20 à 40 épis. Ce même résultat est exprimé en indice de fertilité (8) en grains plats Ft indice de fertilité (%) = - x 100 Fc Ft = Nb grains plats/épillet sur plantes traitées Fc = Nb grains normaux/épillet sur témoin (non traité). - Les parcelles témoins ont permis de mesurer la fertilité hors traitement, en autofécondation et en fécondation libre - Sur les parcelles traitées, des sachets d'autofécondation ont été utilisés ; la stérilité induite par chaque traitement en pourcentage du témoin est calculée suivant la formule Sc - St stérilité (%) = - x 100 Sc Sc = Nb grains/épillet des autofécondations sur plantes témoins St = Nb grains/épillet des autofécondations sur plantes traitées. Pour le calcul de St, les trois types de grains ont été comptabilisés (grains normaux, échaudés, plats). Les résultats sont synthétisés dans le tableau 4. TABLEAU 4 ANNEE 1984 - ESSAI DOSE-TEXPS SUR LA VARIETE FESTIVAL Résultats sur plantes traitées en fécondation libre A - Exprimés en nombre moyen de grains plats par épi. B - Exprimés en indice de fertilité (t) en grains plats. Effectif d'épis analysés par dose-temps : 10 (sauf d3 : 5) A EMI25.1 <tb> <SEP> temps <tb> <SEP> T <SEP> T <SEP> T <tb> <SEP> aose <SEP> T2 <SEP> tri <tb> <SEP> dose <tb> 1 <SEP> dl <SEP> 0,45 <SEP> 0,87 <SEP> 2,95 <tb> 1,4 <SEP> d2 <SEP> 0,8 <SEP> 1,82 <SEP> 3,3 <tb> i <SEP> ,8 <SEP> d3 <SEP> 0,85 <SEP> 2,5 <SEP> 3 <tb> B EMI25.2 <tb> <SEP> teuips <tb> <SEP> dose <SEP> T3 <tb> <SEP> dose <tb> 1 <SEP> dl <SEP> 1,33 <SEP> Z <SEP> 2,56 <SEP> Z <SEP> 8,55 <SEP> Z <tb> 1,4 <SEP> d2 <SEP> .2.37 <SEP> Z <SEP> 5,4 <SEP> Z <SEP> 9,6Z <SEP> Z <tb> 1,8 <SEP> d3 <SEP> 2,52 <SEP> Z <SEP> 7,42 <SEP> Z <SEP> 8,87 <SEP> Z <tb> En ce qui concerne la fréquence de grains plats par épi, on constate d'abord - qu'il existe des nettes différences selon les doses-temps (7,5 fois plus de grains plats en d2 t3 qu'en d1 t1) - pour chaque dose, c'est le traitement le plus tardif qui a été le plus efficace - si par contre on s'intéresse,pour un stade donné, à l'opportunité d'augmenter la dose, on s'aperçoit que cela semble plus efficace aux stades les plus précoces (peut-être t1 mais surtout t2) ; par contre, au stade t3, la dose n'a qu'une relative importance ; la fréquence la plus élevée est observée en d2 t3, en d3 t3, cette fréquence baisse comme si on avait atteint un seuil d'efficacité à la dose d2. Ce tableau montre clairement qu'il est très important de bien isoler le stade de traitement qui ne doit pas être trop précoce. Si le stade est bien choisi, il n'est pas utile de traiter à des doses élevées. L'ensemble des résultats 1983 et 1984 sont donc cohérents sur un certain nombre de points - Importance de traiter à un stade assez tardif, proche du stade 8 de l'échelle de Feekes. - Si le stade de traitement est correct, une dose moyenne suffit (dose d2). En ce qui concerne la stérilité induite par le traitement, elle est totale pour les doses-temps d2 t3, d3 t3 et d3 t2, très forte pour d2 t2 et d1 t3. Là encore, le stade de traitement semble le plus important et le stade le plus tardif le plus efficace. La liaison stérilité induite-apparition de grains plats parait bonne, si on compare les résultats, et les deux phénomènes paraissent liés. Le coefficient de corrélation entre les deux est de ,8, ce qui indique effectivement une liaison positive. En ce qui concerne la correspondance entre le stade atteint au moment du traitement par la plante traitée et l'efficacité du traitement, un certain nombre d'épis ont été disséqués aux dates de traitement et on a observé le développement des pièces florales. C'est l'épi du martre brin qui a toujours été observé. Dans le cas de l'essai Festival, il semble que le traitement est le plus efficace au stade C2, c'est-à-dire quand les anthères ont fini leur différenciation. Il faut remarquer que l'ovaire se différencie plus tardivement : au stade C2 le stigmate est en train de se former. EXEMPLE 4 ROLE DU POLLEN DANS LE DECLENCHEMENT DU PHENOMENE GRAINS PLATS Afin d'élucider le rôle de la qualité du pollen et de l'état de l'ovaire dans le déclenchement du phénomène "grains plats", on a mis en place en 1984 une expérience de castration pollinisation contrôlée de plantes traitées par le gamétocide. Des plantes de la variété Festival non traitées (témoins) et des plantes traitées à une seule dose mais à deux stades différents (d2 t2 et d2 t3) ont été castrées puis pollinisées avec des pollens différents - Par du pollen viable, issu de plantes non. gamétocidées, ce pollen était soit de l'autopollen, soit de l'allopollen provenant de la variété Fidel - Par du pollen provenant de plantes traitées par le gamétocide, auto et allo comme dans le cas précédent. La pollinisation a bté fate par 3 épis mules pour chaque épi castré, de la meme façon pour tous les cas de figure. Ajoutons que ce que l'on sait de l'action du gamétocide fait penser qu'il n'y a pas ou très peu d'émission de pollen chez les plantes traitées. Mais on souhaiterait savoir si un reliquat de pollen plus ou moins viable ne pouvait pas jouer un rible dans le déclenchement du phénomène. Enfin, un certain nombre de plantes ont été castrées et n'ont pas été pollinisées, ceci pour éventuellement mettre en évidence une parthénogénèse induite par le traitement gamétocide et en absence de pollen. Les résultats de cette expérience sont donnés au tableau 5. Chaque case de ce tableau représente une valeur moyenne de deux répétitions. TABLEAU 5 VALEUR MOYENNE DE LA FREQUENCE DE FORMATION DE GRAINS PLATS PAR FLEUR CASTREZ CHEZ LA VARIETE FESTIVAL EMI29.1 <tb> <SEP> traitement <SEP> des <tb> type <SEP> de <SEP> plantes <SEP> plantes <SEP> * <SEP> traitement <SEP> traitement <tb> polliaisztion <SEP> \ <SEP> non <SEP> traitees <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> D2 <SEP> T3 <tb> <SEP> non <SEP> tritéef <SEP> D, <SEP> T2 <SEP> D, <SEP> f3 <tb> Pas <SEP> de <SEP> pollen <SEP> 0,000 <SEP> 0,000 <SEP> 0,000 <tb> <SEP> . <SEP> .¯ <SEP> ¯. <tb> PoLIinisation <tb> <SEP> 0,000 <SEP> o,oai <SEP> 0,000 <tb> Autopollen <SEP> Gamétocide <tb> <SEP> . <SEP> . <SEP> -¯ <tb> Pollinisation <SEP> par <SEP> 0,010 <SEP> 0,048 <SEP> 0,082 <tb> Allopollen <SEP> Gametocide <tb> Pollinisation <SEP> par <SEP> 0,270 <SEP> Q,276 <SEP> 0,528 <tb> Autopollen <SEP> non <tb> Gatnetocide <tb> Pollinisation <SEP> par <tb> Allopollen <SEP> non <SEP> ¯ <SEP> 0,239 <SEP> 0,373 <tb> Gametocide' <tb> Autofecondations <SEP> 0,626 <SEP> 0,Q14 <SEP> 0,005 <tb> * Pour les plantes non traitées, les fréquences de grains sont celles de grains normaux ; aucun grain plat n'a été observé. ** Pour les autofécondations, il s'agit de la fréquence de grains par fleur à partir d'une estimation de 3 fleurs fertiles par épillet. Les résultats paraissent relativement clairs et intéressants t - En ce qui concerne les épis non pollinisés, aucun grain n'a été trouvé, ce qui montre que le traitement gamétocide, en l'absence de pollen, n'induit pas la parthénogdnèse dlune façon détectable. - Les autofécondations étaient des témoins de la fertilité mâle et femelle pour les plantes traitées. Dans le cas des témoins, elles permettent d'avoir une idée de "l'effet castration" ; en effet, en autofécondation on a 0,626 graines par fleur fertile en moyenne et quand on castre puis pollinise avec de l'autopollen, 0,270 grains par fleur castrée. Le choc castration aurait donc réduit d'environ un facteur 2 la probabilité de formation d'un grain. Bien sûr, ce calcul est approximatif, mais il semble important d'avoir une idée sur cette question pour estimer la fiabilité des résultats, un résultat négatif pouvant être dû aussi à un problème technique ; ce n'est apparamment pas le cas pour cette manipulation. - Les résultats des autres cas de figure permettent de dégager plusieurs points : . Les différences importantes qui existent entre fréquence d'apparition de grains plats selon la qualité du pollen (gamétocide ou pas) indiquent que la présence de pollen viable provenant de plantes non traitées est indispensable au déclenchement du phénomène. Que ce pollen soit de l'auto ou de l'allopollen, n'a apparamment pas d'incidence du moins en première approche. . Les faibles quantités de grains plats observées dans le cas de pollinisation par du pollen gamétocide' sont probablement dues à des reliquats de pollen fertile. Cette hypothèse est cohérente avec les résultats obtenus en ce qui concerne l'autopollen gamétocide : il n'y a aucun grain plat obtenu pour d2 t3, où le taux de stérilité est de 100 %, par contre une faible fréquence pour d2 t2, où le taux de stérilité était légèrement plus faible (99,1 %). Enfin, il semble qu'on obtienne plus de grains plats au temps-dose d2 t3 (pollinisation avec du pollen non gamétocide), ce qui laisse supposer que le produit a aussi une action sur l'ovaire, action plus ou moins marqué selon le stade de traitement. Ainsi, c'est le pollen des plantes non traitées sur un ovaire de plante traitée qui déclenche le phénomène apparition de grains plats. EXEMPLE 5 OBTENTION D'HAPLOIDES PAR MISE EN CULTURE D'EMBRYONS TAUX DE REGENERATION En juillet, au cours de la maturation du grain, on peut observer des symptomes de développement anormal ou d'avortement sur certains grains des plantes traitées. Le grain est à cette date au stade laiteux (11-1 sur l'échelle de Feekes). Les grains des plantes témoins sont verts, lisses ; l'albumen est abondant, de couleur laiteuse. Le caryopse peut être disséqué aisément, et l'embryon a un aspect normal d'embryon immature. Chez certains grains des plantes traitées, on observe un début de recroquevillement du grain, il se ride, prend parfois une couleur sombre. Si on dissèque le caryopse, on se rend compte que l'albumen est en train de dégénérer, l'embryon présente deux caractéristiques - Souvent il est totalement anormal, de taille variable, avec le scutellum de forme extravagante ; parfois on a du mal même à reconnaitre les différents organes d'un embryon, mais on se trouve devant une masse cellulaire apparamment indifférenciée. - Parfois il a une apparence normale, mais il est de taille extrèmement petite par rapport à un embryon témoin. Ces embryons jugés anormaux" prélevés sur des plantes traitées et dont t les grains présentaient des signes de dégénérescence de l'albumen ont été mis en culture. En 1981, au cours de la première manipulation, 88 embryons transplantés sur milieu de régénération Rg avaient régénéré 74 plantules. Après clonage et vernalisation 18 plantes fertiles avaient été obtenues1 soit : , taux de régénération : 84 % . taux de survie : 24 % (dû à des conditions stressantes de serre). En 1983, compte tenu des difficultés à observer le phénomène, 38 embyons seulement ont été mis en culture, et 20 d'entre eux ont régénéré en plantes chlorophyliennes, après sortie du tube vernalisation et repiquage en serre, 15 ont survécu, ce qui donne taux de régénération : 52 % . taux de survie : 75 %. L'origine de ces plantes est la suivante : F1 CxD : 7 t F1 Ax B:4; A:3; D : 1. En 1984, les cultures d'embryons ont concerné le blé, mais également l'orge et le tricicole. Pour le blé, 189 embryons ont été mis en culture ; 41 ont régénéré (soit 21,7 %) et 36 plantes ont survécu à cette date (soit 87,8 %). On peut remarquer que le taux de régénération est particulièrement faible en 1984. Dans ce cas, un seul rinçage à l'eau stérile après l'hypochlorite de calcium a été fait, ce qui peut expliquer ce faible taux. Par contre, que ce soit en 1983, en 1984, on perd peu de plantes après la régénération, c'est-à-dire à la sortie de tube ou en vernalisation. EXEMPLE 6 OBTENTION D'HAPLOIDESPAR GERMINATION DES GRAINS PLATS L'autre voie pour obtenir des haploIdes à partir des plantes traitées consiste b attendre la maturité puis à battre délicatement les épis récoltés. Si l'on prend soin, après le battage, de ne pas aspirer les glumes et les glumelles et qu'on trie soigneusement, on trouve des "grains plats". Ce sont des grains petits, ridés,presque sans albumen, parfois à peine identifiables comme grains. Si on met à germer ces grains, on s'aperçoit avec surprise qu'un certain nombre d'entre eux germent. Il ne reste plus qu'à suivre les plantules obtenues par germination après avoir prélevé leurs racines très précocement (pour comptages chromosomiques). Cette technique comme on le voit a le mérite de la simplicité et évite le passage in vitro. Cependant, là aussi, se pose le problème du crible choisi dans le tri des grains plats : c'est un crible uniquement visuel et il n'est pas toujours très objectif. Par ailleurs, le tri des grains plats est long et fastidieux. Les tableaux 6 et 7 résument les résultats de deux manipulations réalisées en 1983. Le tableau 6 montre sur 19 F3 un nombre élevé de grains plats par épi, proche de 3,5 : 38 % de ces grains germent. Les résultats du tableau 7 sont concordants 40 % des grains plats issus de A, B, C, D, et de leurs hybrides F1, sont capables de germer. Sur 100 grains qui germent, 72 plantules survivent après vernalisation et repiquage en serre. Sur la base de tous ces résultats, un calcul rapide montre l'intérêt de la méthode : un traitement bien effectué, au bon stade, peut donner 3 à 3,5 grains plats par épi s compte tenu du pourcentage de germination et de survie, on peut espérer régénérer, dans les meilleurs cas, une plantule supposée haplolde par épi traité. Ce rendement semble relativement bon comparé par exemple à celui de l'androgénèse in vitro où on obtient i à 2 haploldes doublés pour 1 000 anthères mises en culture (soit environ 15 épis). TABLEAU 6 ANNEE 1983 - RESULTATS DU BATTAGE DE 19 F'3 CINQ EPIS ONT ETE BATTUS PAR ORIGINE Fertilité : nombre de graines par épillet EMI35.1 <tb> ORIGINE <SEP> FERTILITE <SEP> NOMBRE <SEP> DE <SEP> GRAINS <SEP> % <SEP> GERMINATION <tb> <SEP> PLATS/EPI <tb> BCF4 <SEP> pl <SEP> 7-5 <SEP> 2,55 <SEP> 2 <SEP> 40 <tb> BCF7 <SEP> l2 <SEP> pl4-3 <SEP> 2,72 <SEP> 2,6 <SEP> 23,1 <tb> DCF5 <SEP> pl7-3 <SEP> 1,74 <SEP> 9,8 <SEP> 36,7 <tb> DCF11l2 <SEP> pl1-2 <SEP> 0,28 <SEP> 6,2 <SEP> 41,9 <tb> DR9 <SEP> pl4-4 <SEP> 0,25 <SEP> 3,2 <SEP> 31,25 <tb> ECF3 <SEP> pl8-5 <SEP> 3,28 <SEP> 4,8 <SEP> 8,33 <tb> <SEP> ECF4 <SEP> pl9-3 <SEP> 2,25 <SEP> 2,4 <SEP> 41,7 <tb> ECF5 <SEP> pl8-4 <SEP> 0,58 <SEP> 2,2 <SEP> 27,3 <tb> ER7 <SEP> l1 <SEP> pl5-4 <SEP> 0,25 <SEP> 3,8 <SEP> 57,9 <tb> FCF1 <SEP> l1 <SEP> pl5-5 <SEP> 1,84 <SEP> 1,4 <SEP> 0 <tb> FCF6 <SEP> l1 <SEP> pl4-5 <SEP> 1,72 <SEP> 2,4 <SEP> 50 <tb> FCF8 <SEP> l1 <SEP> pl4-5 <SEP> 0,7 <SEP> 2,6 <SEP> 69,2 <tb> FeF13 <SEP> pl4-2 <SEP> 0,31 <SEP> 0,8 <SEP> 50 <tb> FR8 <SEP> l1 <SEP> pl1-1 <SEP> 2,8 <SEP> 2 <SEP> 21,4 <tb> FR8 <SEP> l1 <SEP> pl1-2 <SEP> 2,6 <SEP> 6,2 <SEP> 32,3 <tb> GR2 <SEP> l1 <SEP> pl1-1 <SEP> 1,94 <SEP> 6,8 <SEP> 50 <tb> GR2 <SEP> l2 <SEP> pl4-4 <SEP> 1,3 <SEP> 1,6 <SEP> 50 <tb> GR4 <SEP> pl1-5 <SEP> 0,4 <SEP> 1,8 <SEP> 33,3 <tb> GR5 <SEP> pl7-5 <SEP> 1,81 <SEP> 2 <SEP> 70 <tb> <SEP> MOYENNE <SEP> 3,44 <SEP> 38,65 <tb> TABLEAU 7 RESULTATS DE LA GERMINATION DE GRAINS PLATS (RECOLTE 1983) EMI36.1 <tb> <SEP> ORIGINE <SEP> EFFECTIF <SEP> EFFECTIF <SEP> % <SEP> GERMINATION <SEP> % <SEP> DE <SEP> SURVIE <tb> <SEP> GERME <tb> <SEP> A <SEP> 26 <SEP> 10 <SEP> 38,5 <SEP> 70 <tb> <SEP> B <SEP> 52 <SEP> 16 <SEP> 30,8 <SEP> 37,5 <tb> <SEP> C <SEP> 31 <SEP> 8 <SEP> 25,8 <SEP> 12,5 <tb> <SEP> D <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 66,7 <SEP> 65 <tb> F1 <SEP> C <SEP> x <SEP> D <tb> <SEP> d1 <SEP> t2 <SEP> 12 <SEP> 9 <SEP> 75 <tb> <SEP> d1 <SEP> t3 <SEP> 11 <SEP> 5 <SEP> 45,5 <tb> <SEP> d2 <SEP> t2 <SEP> 11 <SEP> 4 <SEP> 36,4 <tb> <SEP> d3 <SEP> t3 <SEP> 22 <SEP> 6 <SEP> 18,2 <tb> <SEP> TOTAL <SEP> 56 <SEP> 24 <SEP> 39,3 <SEP> 92 <tb> <SEP> F1 <SEP> A <SEP> X <SEP> B <tb> <SEP> d1 <SEP> t2 <SEP> 12 <SEP> 8 <SEP> 58,3 <tb> <SEP> d1 <SEP> t3 <SEP> 11 <SEP> 5 <SEP> 45,5 <tb> <SEP> d2 <SEP> t2 <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 44,4 <tb> <SEP> d2 <SEP> t3 <SEP> 19 <SEP> 9 <SEP> 42,1 <tb> <SEP> TOTAL <SEP> 51 <SEP> 27 <SEP> 47,1 <SEP> 85 <tb> <SEP> 246 <SEP> 100 <SEP> 40,65 <SEP> 72 <tb> EXEMPLE 7 COMPTAGES CHROMOSOMIQUES Les comptages chromosomiques effectues sur les premières plantes obtenues par cette méthode avaient montré un phénomène de <RTI ID=37.1> mixoploldie (exemple 2) caractérisé par des plaques métaphasiques de différents niveaux de ploSdie à l'intérieur de chaque racine observée. Ces niveaux variaient de 21 à 42, avec notamment des intermédiaires entre les deux. Il faut rappeler que ces premières plantes étaient issues de culture in vitro. Au cours du printemps 1983, on a compté un grand nombre de pointes de racines prélevées très précocement, sur des germinations de grains plats, pour voir si on observe le même phénomène. La technique de coloration utilisée est celle de Feulgen. Il en résulte que - la majorité des plaques comptées comportaient 42 chromosomes, ce qui indique que le doublement commencerait très précocement; - on a observé plusieurs fois, très clairement, des plaques à 21 chromosomes, ce qui montre qu'il y a bien un passage par une phase haplolde; - beaucoup d'intermédiaires entre ces deux extrèmes sont présents, avec notamment des groupes autour de 28 et de 35 chromosomes. Cela laisse supposer que le doublement aurait lieu par génome (soit par unité de 7 chromosomes). Parmi tous ces comptages, on en cite 3 ci-dessous qui paraissent intéressants. Ils illustrent ce qu'on peut observer par "unité planten et la nécessité d'observer beaucoup de divisions sur une même plante avant de pouvoir conclure Origine Nombre de plaques à ce chromosome 4 à 42 Fc F6 l1 Pl4-5/3 1 à 36 1 à 28 1 à 21 GR2 l1 pl1-1/1 4 à 42 1 à 27 1 à 21 DCF10 11 pl3-4 13 à 42 1 à 41 1 à 21 EXEMPLE 8 OBSERVATION DES PLANTES AUX CHAMPS L'observation des plantes aux champs après une génération de multiplication sous tunnel est aussi un bon critère de jugement qui peut éclairer sur l'origine des plantes obtenues. Il faut rappeler que toutes les premières lignées (codé GAM 1 à 229) sont issues de plantes F3 de la PAO et qui en étaient à leur 3ème année du premier cycle de sélection récurrente ; 80 d'entre elles ont été choisies pour l'intercroisement devant donner la PA1. On s'est attaché à produire des HD de ces 80 familles en particulier, par la technique décrite ici même. L'observation de la stabilité aux champs permet théoriquement de discerner les haploldes doublés issus de ces F3 des lignées qui sont des F5 (donc en disjonction) et qui proviendraient d'une reproduction sexuée normale. On a observé en 1984 133 "lignées" GAM. Ces plantes étaient semées en semis "Seed matiez " sur 3 à 6 lignées selon le nombre de semences disponibles. Chaque lignée GAM est maintenue en autofécondation par ensachage sous tunnel, puis aux champs, de quelques épis t on a semé systématiquement ces lignées issues d'autofécondation à côté des lignées issues de fécondation libre pour pouvoir les comparer. La stabilité de ces plantes b des moments diffé- rents de la végétation a été notée ; on a observé surtout les critères morphologiques : taille, glaucescence, port de la dernière feuille, forme de l'épi, aristation et la précocité (épiaison, floraison). Les autres notations concernant ces plantes ont été faites par l'équipe blé, conjointement aux notations des BD androgénétiques. Il est apparu nécessaire, à la fin des observations, de nuancer le jugement concernant ces plantes en faisant 4 classes d'homogénéitd phénotypique. Les résultats sont donnés au tableau 8. Au total, environ 37 % de ces plantes sont d'emblée en disjonction. 17 % sont stables sans aucune réserve, 34,6 % avec des réserves dues à des légères différences de taille entre lignées. Au total, environ 52 % de plantes sont donc fortement soupçonnées d'être des haploldes doublés. Pour le reste, le jugement n'était pas possible en 1984. Les plantes de la classe 4 n'ont pas été récoltées, les plantes des. classes 1, 2 et 3 ont été récoltées et resemées en 1985. EXEMPLE 9 ELECTROPHORESE DES GLIADINES En 1983, on a ainsi observé la stabilité de la première série de GAM, codée de 5 à 50 ; cette série comporte 13 plantes. Parmi les descendances de ces plantes, 10 étaient homogènes, 3 en disjonction. TABLEAU 8 ANNEE 1984 - RESULTATS DE L'OBSERVATION DE 133 LIGNEES GAM AUX CHAMPS POUR LEUR HOMOGENEITE EMI40.1 CLASSE <SEP> DEFINITION <SEP> EFFE#TIF <SEP> % <tb> CLASSE <SEP> 1 <SEP> Homogène <SEP> 23 <SEP> 17,3 <tb> CLASSE <SEP> 2 <SEP> Homogène <SEP> avec <SEP> réserves* <SEP> 46 <SEP> 34;6 <tb> CLASSE <SEP> 3 <SEP> Jugement <SEP> difficile** <SEP> 15 <SEP> 11;3 <tb> CLASSE <SEP> 4 <SEP> En <SEP> disjonction. <SEP> 49 <SEP> 36,8 <tb> TOTAL <SEP> 133 <SEP> 100 <tb> * Les réserves sont dues à des faibles différences de taille entre lignées, différences probablement dues au terrain ** Jugement difficile à cause d'un nombre de plantes insuffisant D'autre part, on a réalisé une analyse électro- phonétique des gliadines sur les grains issus de ces 13 plantes. Il est intéressant de constater qu'il se trouve 9 plantes pour lesquelles l'analyse ne discerne aucune différence dans les diagrammes des gliadines de plusieurs grains. Ainsi, 9 plantes trouvent leur place, cette année là, parmi le groupe jugé stable aux champs et ne montrant pas de variabilité lors de l'analyse des gliadines. Tous ces arguments : comptages chromosomiques, observations aux champs, électrophorèse des gliadines, montrent que certaines plantes produites par cette technique sont bien des haplordes doublés. EXEMPLE 10 UTILISATION D'AUTRES SUBSTANCES D'HAPLODIPLOIDISATION POUR L1 INDUCTION DU PHENOMENE 'GRAINS PLATS En 1983, on a traité les deux F1 A x B et C x D par deux régulateurs de croissance, le Céroene et le Cycocel, utilisés sur céréales à paille. Le Céronne contient de l'Etherel (acide 2-chroroéthylphosphonique), le Cycocel du chlormequat chlorure ou CCC, qui est un régulateur de croissance. Seuls une dose et un stade d'application ont pû être testés. Le traitement a été fait alors que les plantes étaient au stade un noeud visible. On a utilisé des doses correspondant au double de la dose préconisée par le fabricant comme régulateur de croissance. Les résultats sont donnés au tableau 9. TABLEAU 9 NOMBRE MOYEN DE GRAINS PLATS PAR EPI POUR DEUX F1 TRAITEES PAR DEUX REGULATEURS DE CROISSANCE ET FERTILITE EN AUTO FECONDATION DES DEUX F1 ET DE LE LEURS QUATRE PARENTS CERONNE EMI42.1 FERTILITE <SEP> NB <SEP> MOYEN <SEP> GRAINS <tb> PLATS/EPI <tb> A <SEP> B <SEP> F1 <SEP> A <SEP> x <SEP> B <SEP> F1 <SEP> A <SEP> x <SEP> B <tb> 2,95 <SEP> 2,3 <SEP> 3,09 <SEP> 0,3 <tb> C <SEP> D <SEP> F1 <SEP> C <SEP> x <SEP> D <SEP> F1 <SEP> C <SEP> x <SEP> D <tb> 1,5 <SEP> 1,82 <SEP> 1,8 <SEP> 0,875 <tb> TABLEAU 9 (SUITE) CYCOCEL EMI43.1 FERTILITE <SEP> NB <SEP> MOYEN <SEP> GRAINS <tb> PLATS/EPI <tb> A <SEP> B <SEP> F1 <SEP> A <SEP> x <SEP> B <SEP> F1 <SEP> A <SEP> X <SEP> B <tb> 2,8 <SEP> 2,68 <SEP> 2,18 <tb> C <SEP> D <SEP> F1 <SEP> C <SEP> x <SEP> D <SEP> F1 <SEP> C <SEP> x <SEP> D <tb> 1,91 <SEP> 2,14 <SEP> 1,96 <SEP> 0,6 <tb> En ce qui concerne la F1 A x B, la fréquence de grains plats est extrêmement faible et on ne dispose que d'une seule valeur. Par contre, pour la F1 C x D, la fréquence de grains plats n'est pas inférieure aux valeurs obtenues pour d1 t2, d1 t21 d1 t3 et d2 t2 avec le gamétocide de l'exemple 1. EXEMPLE 11 ESSAIS D'APPLICATION DE CETTE TECHNIQUE A L'ORGE ET AU TRITICALE 1) L'orge On a traité avec le produit de l'exemple 1, en 1984, 64 F'3 d'orge provenant de Clermont-Ferrand, semés en "Seedmatic". La moitié de chaque lignée a été traitée, l'autre moitié a servi de témoin. Deux doses ont été testées (d2 et d3), chacune à deux stades de développement différents (t1 et t2). En outre, 7 variétés ont été traitées, ainsi que 6 hybrides F1 suivant le schéma suivant : - variétés : 1 dose, 2 stades testées (d2 t1 et d2 t2) , F1 : 1 dose et 2 stades testés (d3 t1 et d3 t2). Les premiers battages font état de la présence de grains plats à une fréquence faible. On a obtenu par culture in vitro d'embryons immatures deux plants d'orge provenant de deux F3 de Clermont-Ferrand. 2) Le triticale On a traité, avec le produit de l'exemple en 1984, 30 F3 provenant de Clermont-Ferrand ainsi que 5 variétés, suivant le protocole suivant - F3 I dose au stade t1 (= d2) à la dose d3, 2 stades (t1 et t2 > - variétés : toutes traitées à d3 t2. De plus, un essai triticale a été mis en place avec des F2 provenant de Clermont-Ferrand. Une dose (d2) a ete testée à 3 stades différents (t3, t4, t5, traitements les 4, 10, 15 mai). Des prélèvements ont été faits pour l'orge et le triticale à chaque traitement pour détermination du stade. Quelques battages ont été faits sur triticale et montrent la présence de grains plats. On a obtenu aussi 20 plantes de triticale à partir de culture in vitro d'embryons immatures. EXEMPLE 12 APPLICATION AU MAIS Après traitement comme précédemment, on a pu observer que certains épis traités présentaient des grains à phénotype différent des grains normalement développés ces grains anormaux étaient plus petits, parfois avec une dépression, parfois fripés. L'albumen de ces grains étaient moins abondant (parfois absent) ou qualitativement différent de l'albumen des grains normaux provenant des mêmes épis ou des témoins. Après dissection, on constatait que les embryons de'ces grains étaient plus petits mais on n'a jamais observé de phénotype anormal chez ces embryons comme chez le blé. Les cultures d'embryons ont été menées sur un milieu à 1 % de saccharose, 1 % d'agar et 10 mg/l de Thiamine, et les embryons ont été prélevés plus de 20 jours après la fécondation. On a mis en culture environ 200 embryons, 103 ont été régénérés (soit environ 52 ) en plantules après sortie de tube en pots de vermiculite ces plantes ont été gardées au laboratoire dans la chambre de culture puis transportées au phytotron. 68 plantes ont survécu (soit environ 66 t). On a effectué des comptages sur les pointes de racines prélevées sur les plantules à la sortie de tube ; la plupart des plantes comptées se sont révélées diploïdes. Dans quelques cas, des niveaux de ploidie inférieurs à 2n (= 20 chromosomes-)ont été observés (ex : 14, 15, 18). ECHELLE DE FEEKES MODIFIE PAR LARGE Définition et repère des stades de croissance des céréales d'après les caractères visibles extérieurement à l'oeil nu EMI47.1 Stade <SEP> Description <tb> 1 <SEP> une <SEP> feuille <tb> Période <SEP> 2 <SEP> début <SEP> du <SEP> tallage <tb> des <SEP> 3 <SEP> formation <SEP> des <SEP> talles, <SEP> port <SEP> rampant <SEP> du <SEP> blé <SEP> Tallage <tb> feuilles <SEP> 4 <SEP> commencement <SEP> du <SEP> redressement <tb> 5 <SEP> La <SEP> pseudo-tige <SEP> formée <SEP> par <SEP> les <SEP> gaines <SEP> foliaires <SEP> est <SEP> nettement <SEP> redressée <tb> 6 <SEP> premier <SEP> noeud <SEP> de <SEP> la <SEP> tige <SEP> principale <SEP> formé <tb> Extension <tb> Période <SEP> 7 <SEP> deuxième <SEP> noeud <SEP> formé <tb> de <SEP> la <tb> des <SEP> 8 <SEP> dernière <SEP> feuille <SEP> visible <SEP> mais <SEP> encore <SEP> enroulée, <SEP> l'épi <SEP> commencant <SEP> à <SEP> gonfler <tb> tige <tb> tiges <SEP> 9 <SEP> ligule <SEP> de <SEP> la <SEP> dernière <SEP> feuille <SEP> juste <SEP> visible <tb> (montaison) <tb> 10 <SEP> gaine <SEP> de <SEP> la <SEP> dernière <SEP> feuille <SEP> complètement <SEP> sortie, <SEP> épi <SEP> gonflé <SEP> mais <SEP> non <tb> visible <tb> 10-1 <SEP> premiers <SEP> épis <SEP> juste <SEP> visibles <SEP> (barbes <SEP> commencant <SEP> à <SEP> apparaître <SEP> dans <tb> l'orge; <SEP> épi <SEP> sortant <SEP> d'une <SEP> fente <SEP> de <SEP> la <SEP> gaine <SEP> dans <SEP> le <SEP> blé <SEP> et <SEP> l'avoine) <tb> 10-2 <SEP> quart <SEP> de <SEP> l'épiaison <SEP> achevé <tb> Epiaison <tb> 10-3 <SEP> moitié <SEP> de <SEP> l'épiaison <SEP> achevée <tb> 10-4 <SEP> trois <SEP> quarts <SEP> de <SEP> l'épiaison <SEP> achevés <tb> 10-5 <SEP> tous <SEP> les <SEP> épis <SEP> hors <SEP> de <SEP> la <SEP> gaine <tb> Période <SEP> 10-5-1 <SEP> commencement <SEP> de <SEP> la <SEP> floraison <SEP> (blé) <tb> des <SEP> 10-5-2 <SEP> floraison <SEP> complète <SEP> de <SEP> l'extrémité <SEP> de <SEP> l'épi <SEP> Floraison <tb> épis <SEP> 10-5-3 <SEP> floraison <SEP> à <SEP> la <SEP> base <SEP> de <SEP> l'épi <tb> 10-5-4 <SEP> amande <SEP> aqueuse <tb> 11-1 <SEP> grain <SEP> laiteux <tb> 11-2 <SEP> grain <SEP> farineux, <SEP> mou <SEP> mais <SEP> sec <SEP> Maturation <tb> 11-3 <SEP> amande <SEP> dure <SEP> (difficile <SEP> à <SEP> diviser <SEP> par <SEP> l'ongle) <tb> 11-4 <SEP> bon <SEP> à <SEP> couper, <SEP> paille <SEP> morte <tb>

Claims: REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'haploIdes doublés de céréales dans lequel a) on traite les plantes par un agent chimique dthaplodlploldisation entre le stade de croissance de 5 à 9 selon l'échelle de Feekes modifiée par Large b) après pollinisation par un pollen fertile, on trie les caryopses anormaux parmi tous les caryopses obtenus c) on régénère les plantes à partir des embryons des caryopses anormaux, et d) on réalise l'autofécondation de chacune des plantes régénérées pour obtenir les semences correspondant, dans certains cas, à des plantes homozygotes dans la génération suivante. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la céréale traitée est choisie parmi le blé dur, le blé commun, l'orge, le tritical, l'avoine, le sarrasin, le maïs, le riz, le sorgho et le seigle. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape a) est effectuée au stade de croissance 6, 7 ou 8. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pollen fertile provient de plantes non traitées situées dans l'environnement des plantes traitées. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent chimique d'haplodiploldisation est choisi parmi les agents chimiques d'hybridation (A.C.H.), les gamétocides ou les substances de croissance. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent chimique d'haplodiploldisation est choisi parmi l'acide 1-(4-chlorophényle)-1,4-dihydro-4-oxo-6- méthylpyridazine-3-carboxylique et ses sels, l'acide 2-chloroéthylphosphonique et ses sels et le chlormequat et ses sels. 7) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent chimique d'hybridation utilise est l'acide 1-(4-chlorophényle)-4-oxo-6-méthylpyridazinone 3-carboxylique et ses sels, en particulier le sel de potassium. 8). Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les plantes sont traitées à des doses d'A.C.H. de 0,04 à 10 kg/ha. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les caryopses anormaux prélevés présentent un albumen réduit et possèdent un embryon, dont le point de départ est une cellule haploïde. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les plantes sont régénérées par culture in vitro de l'embryon prélevé à partir du caryopse. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les plantes sont régénérées directement par germination et mise en culture des caryopses anormaux.

Inventors: PICARD, EMMANUEL
Applicants: ETABLISSEMENT PUBLIC DIT: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS), INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA), UNIVERSITE PARIS-SUD (PARIS XI)
Application year: 1985
Main classification: A01H1
IPC codes: A01H4, A01H1