COMPOSITIONS CONTAINING OLIGO-MURAMYLPEPTIDES AND THEIR APPLICATION, IN PARTICULAR FOR THE ACTIVATION OF MACROPHAGES

Abstract: 1. Claims for the contracting states BE, CH, DE, GB, IT, LI, LU, NL, SE. A composition comprising a muramylpeptide or oligo-muramylpeptide, combined or not combined with an antigen or with a hapten carrier of an antigenic site, characteristic of this hapten, and an antibody specific against this muramylpeptide and capable of forming therewith an immuno-complex for use in the in vivo activation of macrophages. 1. Claims for the contracting state AT. Process for preparation of a composition for employment in the activation of macrophages in vivo, characterized in that with a pharmaceutical excipient one associates an immuno-complex previously-formed between on the one hand a muramylpeptide or oligomuramylpeptide, combined or not combined with an antigen or with a hapten bearing an antigen site characteristic of this hapten, and an antibody specific against this muramylpeptide and capable of forming this immunocomplex with it.

Description: Nouvelles compositions contenant des oligo-muramylpeptides et leur application, notamment pour l'activation des macrophages L'invention est relative à de nouvelles compositions contenant des muramylpeptides et possédant d'importantes propriétés d'activation des macrophages. Elle concerne également des compositions pour.réaliser l'activation des macrophages in vivo, ces compositions contenant ces nouveaux dérivés de muramylpeptides en association avec un véhicule biologiquement acceptable, en vue de l'administration à un hôte vivant. On désigne en général sous l'expression "muramylpeptides" les produits comportant un motif saccharidique, notamment du type N-acétyl-muramyle ou N-acétyl-normuramyle, et une chaine peptidique rattachée à ce motif saccharidique. Le premier résidu aminoacyle de cette chalne peptidique (et rattaché au motif saccharidique) peut correspondre à l'un quelconque des aminoacides naturels (le cas échéant aussi aux isomères dextrogyres correspondants), voire même à des dérivés de substitution de ces aminoacides. Le second résidu aminoacyle est en général dérivé de l'acide glutamique. Les fonctions carboxyle de ce dernier peuvent être engagées dans des liaisons chimiques, notamment ester ou amide ou encore, notamment en ce qui concerne le groupe gamma-carboxyle, avec un autre résidu aminoacyle. Des résidus aminoacyle supplémentaires préférés sont constitués par des groupes L-lysyle ou alanyle, notamment L-lysyle ou L-alanyle. De nombreuses études ont été réalisées sur le MDP (N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine), en tant qu'éventuel agent susceptible de stimuler l'i.oeunité faisant intervenir les macrophages et plus particulière- ment une immunité antitumorale. Le MDP lui-même, dont est bien connue l'activité stimulante non spécifique de la réponse immunitaire à l'égard d'antigènes déterminds, témoigne cependant d'une activité réduite à ltégard de l'immunité à médiation cellulaire. Pour renforcer l'immunité à médiation cellulaire du MDP ou d'autres muramylpeptides, diverses transformations de ces molécules ont été envisagées. Parmi ces transformations, on retiendra essentiellement les produits résultant de la conjugaison des groupes muramylpeptides à une molécule porteuse, tels que des polymères peptidiques de synthèse et plus particulièrement des polymères de L-lysine portant des ramifications de résidus aminoacyle distincts, notamment D- ou L-alanyle ou les deux à la fois. On peut se reporter utilement au brevet français no 79 00079 pour ce qui est de la constitution de telles molécules porteuses. On rappellera que, dans ce brevet, les polypeptides du genre en question jouaient le aryle de molécule porteuse à l'égard de muramylpeptides dans lesquels les premier et second résidus aminoacyle de la chaîne peptidique reliée au groupe muramyle étaient tous deux dextrogyres. Les produits résultant de la susdite conjugaison entre des molécules de MDP ou analogues et de telles molécules porteuses possédant en effet des propriétés de stimulation de l'immunité à médiation cellulaire in vivo. Ils présentent cependant également un certain niveau de toxicité, de sorte que les doses susceptibles d'être mises en oeuvre doivent être maintenues dans diverses limites. Il a également été proposé de conjuguer des muramylpeptides à des antigènes, par l'intermédiaire de liaisons covalentes (brevet européen nO 0003833). Ces produits de conjugaison sont diun intérêt particulier lorsqu'est recherché un accroissement sensible de le stimulation de la réponse immunitaire à l'égard de l'antigène entrant dans ce conjugué. L'utilisation effective de ces conjugués aux fins décrites dans le brevet n'est pas non plus sans inconvénient, dès lors que les doses à mettre en oeuvre deviennent relativement importantes. L'invention a pour but de remédier au moins en partie à ces difficultés, et plus particulièrement de fournir de nouvelles compositions à base de muramylpeptide, caractérisées par une capacité accrue d'activation des macrophages, que cette activité soit non spécifique ou au contraire spécifique et orientée contre un antigène déterminé, et ce à des doses extrêmement faibles. Les compositions selon l'invention sont constituées par l'association d'un muramylpeptide ou d'un oligo-muramylpeptide et d'au moins un anticorps apte à reconnaître ce muramylpeptide ou cet oligomuramylpeptide, en d'autres termes à former un complexe avec ce muramylpeptide ou cet oligomuramylpeptide, plus particulièrement un immun-complexe. Les compositions selon l'invention présentent des capacités d'activation de macrophages à des doses remarquablement plus faibles que les dérivés de muramylpeptides de l'état de la technique. En particulier, elles possèdent des propriétés de stimulation de l'immunité à médiation cellulaire qui les rendent particulièrement utiles à plusieurs niveaux. Elles sont par elles-mêmes capables d'exercer une immunité renforcée à l'égard des proliférations de cellules tumorales. Lorsqu'elles sont administrées en association ou en combinaison avec un antigène déterminé, elles manifestent un effet d'adjuvant immunologique extrêmement efficace à des doses infinitésimales. D'une façon générale, l'expression muramylpeptide, telle qu'elle sera utilisée ci-après désignera toute molécule comprenant un ou plusieurs motifs muramylpeptide dans sa molécule. I1 s'agit par exemple d'un oligomère de muramylpeptide, ou encore du produit résultant de la fixation de groupes muramylpeptides sur une molécule porteuse, notamment un polypeptide synthétique du genre déjà rappelé plus haut, ou encore sur une protéine naturelle, telle qu'une sérum-albumine, une hémocyanine ou une anatoxine vaccinante, par exemple l'anatoxine tétanique. A ces muramylpeptides se rattachent encore ceux dans lesquels des groupes muramylpeptides sont fixés sur un antigène ou un haptène porteur d'un site ou déterminant antigénique, caractéristique de antigène, en ce que la conjugaison de lthaptène avec un muramylpeptide conduit à une molécule susceptible d'induire in vivo la production d'anticorps contre ledit antigène. L'anticorps peut être un sérum pblyclonal ou sa fraction -immunoglobulinique, obtenue à partir d'un sérum d'un animal préalablement immunisé contre le muramylpeptide concerné ou un muramylpeptide analogue. De préférence, l'anticorps considéré sera un anticorps monoclonal, et de préférence encore un anticorps monoclonal réagissant sélectivement contre la structure muramylpeptide globale, et ne réagissant que peu ou pas du tout contre soit la partie muramyle, soit la partie peptidique. Sous l'expression anticorps, on entendra encore tout fragment d'anticorps susceptible d'être reconnu par un récepteur porté par les membranes de macrophages. D'une façon générale, que 11 anticorps soit monoclonal ou polyclonal, ou encore fragmentaire, il ést préférable que son site Fc reste disponible et fonctionnel, dans la mesure pù l'anticorps est apte à se fixer, par l'intermédiaire de ce site, sur le récepteur correspondant porté par par la mem- brane du macrophage. I1 est à cet égard important de noter que l1inven- tion s'étend aussi à des compositions dans lesquelles le muramylpeptide et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) seraient couplés l'un à l'autre, notamment par l': :ntermé- diaire d'une liaison covalente obtenue par des procédés classiques, par exemple dans la synthèse des potines. Mais des compositions préférées de l'invention sont celles dans lesquelles la liaison entre lianticorps et le murimylpepide est du type liaison immunologique antigene-anticerps. Comme il sera montré dans la description, la liaison immunologi que ne doit pas interférer avec le site de fixation de l'anticorps sur les macrophages. Ceci étant, la liaison immunologique est particulièrement préférée, parce qu'elle peut être réalisée de façon spontanée, par simple mise en contact du muramylpeptide et de l'anticorps dirigé contre lui, donc sans qu'il soit nécessaire d'avoir recours aux techniques, souvent compliquées, de couplage chimique entre le muramylpeptide et l'autre partie de la composition. D'une façon générale, il va de soi que la liaison, covalente ou non, entre le muramylpeptide et l'anticorps devra toujours être telle qu'elle n'interfère pas avec le site actif de l'anticorps à l'égard du récepteur correspondant des macrophages. La vérification de l'absence d'interférence entre les sites présumés distincts qui, au niveau de l'anticorps, apparaissent comme intervenant dans ces deux types de réaction, pourra chaque fois être effectuée par un test d'activité biologique in vivo de la composition obtenue, précisément au niveau-de l'activation des macrophages. On a en effet constaté que l'association avec l'anticorps se manifestait par une exaltation considérable de l'activité stimulante du muramylpeptide. Cette exaltation est particulièrement remarquable car l'activation considérable des macrophages pouvait a priori être considérée comme inattendue. On aurait en effet pu s'attendre à ce que la présence de l'anticorps soit plutôt de nature à inhiber l'activité stimulante du MDP. Comme on l'a déjà remarqué, les compositions de l'invention sont actives à des doses excessivement faibles. Les résultats observés peuvent en effet être interprétés comme résultant d'un ciblage particulièrement efficace du muramylpeptide sur les macrophages. On peut même être tenté de forme muler l'hypothèse que l'action de stimulation n'est due qu'à la faible proportion de muramylpeptide éventuellement internalisé à l'intérieur des macrophages, par l'intermédiaire de l'anticorps, éventuellement après séparation de ce dernier au niveau de la paroi cellulaire. En ce qui concerne les molécules porteuses faisant éventuellement partie des muramylpeptides de l'invention, il sera toujours préférable d'utiliser des molécules qui, de toute façon ne conduiraient qu'à des réactions antigéniques faibles chez l'hôte, même lorsqu'elles sont administrées à fortes doses. En l'occurrence, dans le cas où les molécules porteuses sont elles-mêmes d'origine biologique (cas des immunoglobulines par exemple, il est préférable d'avoir recours à des molécules'originaires du même hôte que celui auquel les compositions selon l'invention sont destinées. Dans le cas de compositions destinées à l'homme, la molécule porteuse sera égalemént avantageusement d'origine humaine. Les molécules porteuses ne peuvent alors conduire dans la pratique à aucune activité biologique réelle en raison des doses excessivement faibles mises en oeuvre, tant en valeur absolue que vis-à-vis des proportions importantes des molécules circulantes de l'hôte, par exemple des immunoglobulines circulantes. I1 n'y a pas de limitation à retenir à l'égard des muramylpeptides eux-m8mes dont le caractère généralement adjuvant découle de la littérature technique abondante disponible à ce jour. Pour mémoire, on fera néanmoins référence ci-après aux brevets et demandes de brevets dans lesquels des catégories de muramylpeptides susceptibles d'être mis en oeuvre également dans le cadre de la présente invention ont été définies. A titre non limitatif, on signalera les familles de muramylpeptides définies ou envisagées dans les brevets français nO 74 22909, 76 06821, 78 080049, 78 16793 et 79 00819, le brevet américain nO 4.153.684 et les demandes de brevet européen nO 0003833, 0025495 et 0089290. Sans qu'il y ait lieu d'y voir une restriction à la portée de l'invention revendiquée, on observera que la catégorie préférée de muramylpeptides susceptibles d'hêtre mis en oeuvre est celle répondant à la formule générale suivante EMI7.1 dans laquelle les substituants R1, R4, R6, X, R7 R8 A et n ont respectivement les significations suivantes - R1 est -NH2, -OH; -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle ou alcoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone ; - R4 est hydroxyle, scyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle ; - R6 est -NH2, -OH,-NHZ ou -OZ; Z étant un radical linéaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle contenant de 1 à 90 atomes de carbone et portant* le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cyclopropyle ou méthoxyle ; - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, arginyle, asparagyle, aspartyle, cystéinyle, glutaminyle, glutamyle, glycyle, histidyle, hydroxypropyle, isoleucyle, leucyle, lysyle, méthionyle, phénylalanyle, propyle, séryle, thréonyle, tryptophanyle, tyrosyle et valyle, N-méthyl-alanyle ; ; - R7 est un groupe -OH, -NH2, alcoylemide, alcoxy linéaire ou ramifié, aryle ou alcoxy-aryle comprenant au plus 10 atomes de carbone, - R8 est un groupe -OH, -NH2 ou un groupe alcoxy comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, - A représente un acide aminé tel qu'un résidu alanyle'. lysine, glutamine et - n est égal à Q, 1 ou 2. De préférence, les acides aminés intervenant dans la constitution de la chaîne peptidique sont (à ltexcep tion de la glycine) lévogyres. Des oligo-muramylpeptides préférés sont formés des polymères comportant une chaîne de nature peptidique soit nsturelle, soit synthétique, sur laquelle sont greffés des motifs muramylpeptides, par l'intermédiaire de liaisons covalentes. Une catégorie préférée de polymères de ce type comporte une chaîne dont les maillons sont des résidus aminoacides correspondant au groupe des acides aminés comprenant l'acide alpha, bêta-diaminobutyrique, l'ornithine, la lysine, lthomo-lysine, les fonctions amines latérales pouvant porter les ramifications peptidiques dont les maillons correspondent aux résidus aminoacides de l'alanine, de la glycine, de l'acide alpha-aminobutywique, de la valine, de la leucine, de la proline, le susdit polymère peptidique présentant une masse moléculaire moyenne comprise entre environ 50.000 et 250.000, et sur lequel sont liés de façon covalente des motifs muramylpeptide dont le premier résidu aminoacide (lié au groupe muramyle) est un stéréo-isomère de la série L, le second résidu aminoacide présentant la structure de l'acide D-glutamique. Parmi ces polymères, celui dont la chaîne est une polylysine portant des ramifications peptidiques polyalanyle est préférée. D'autres caractéristiques préférées des chaînes en question (lesquelles jouent le rôle de molécules porteuses de l'oligo-muramylpeptide envisagé dans le cadre de la présente invention) résultent du brevet Errance nO 79 00819. Cette catégorie d'oligo--muramyl- peptides peut être préparée par des procédés en tous points semblables à ceux qui ont été décrits dans le brevet précité, si ce n'est que dans les produits de départ mis en oeuvre pour constituer le fragment peptidique de l'oligo-muramylpeptide, le résidu L-alanyle est substitué au résidu D-alanyle. Une autre catégorie d' oligo-muramylpeptides avantageusement mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention consiste en des oligomèras de muramylpeptides du type de ceux qui ont été décrits dans le brevet France n" 78 16792. Les proportions relatives de motifs muramylpeptide vis-à-vis de l'anticorps peuvent varier dans de grandes proportions, pour autant que soit maintenu le caractère de solubilité dans liteau des complexes obtenus. A titre indicatif, on mentionnera que la proportion pondérale de motifs muramylpeptide vis-à-vis de la totalité de la molécule sera de préférence comprise entre 5 % et 50 %. On peut aussi mentionner que des complexes préférés conformes à l1inven- tion peuvent comprendre de 5 à 30 motifs muramylpeptide par molécule-vecteur. Les compositions selon l'invention peuvent être miser en oeuvre seules ou en association ou combinaison avec un antigène déterminé. La composition selon l'invention sera utilisée seule dans les cas où une stimulation générale de l'activation des macrophages sera recherchée, notamment pour accroître la résistance de l'hôte contre des infections bactériennes ou virales, ou contre des proliférations de cellules tumorales. Par contre, lorsque l'on souhaitera bénéficier des propriétés stimulantes non spécifiques de l'immunité contre des antigènes déterminés,les compositions selon l'invention pourront être administrées à l'hôte, conjointement avec l'antigène. Le muramylpeptide ou oligomuramylpeptide, d'une part, l'anticorps, d'autre part, et l'antigène, d'autre part encore, peuvent être administrés simultanément ou séparément selon un protocole préalablement établi, pour obtenir le meilleur effet de synergie souhaité. On peut aussi avoir recours à des compositions contenant des produits de combinaison entre le muramylpeptide et l'antigène particulier contre lequel une protection est recherchée, sous forme d'immun-complexe préparé d'avance ou non, avec l'anticorps. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples de conjugués conformes à l'invention et des conditions dans lesquelles ceux-ci peuvent être utilisés. I1 sera d'ailleurs fait référence aux dessins dans lesquels - la fig. 1 contient des courbes représentatives des variations de l'effet cytostatique in vitro exprimées en pourcentage d'inhibition de croissance des cellules tumorales (en ordonnées), en fonction de dosages croissants, en microgrammes, de MDP-A--L seul (courbe A) ou-en association avec des anticorps monoclonaux anti-MDP M-52-ll, à raison de 10 microgrammes par millilitre (courbe B) - la fig.- 2 comporte des courbes représentatives de la variation de l'inhibition de la croissance des cellules tumorales (en X sur l'axe des ordonnées), en fohction de doses croissantes en microgrammes par millilitre de MDP-A--L, soit seul (courbe C), soit en présence de 10 microgrammes par millilitre de l'anticorps monoclonal M-52-ll (courbe E), soit de F(ab) 2 (courbe D) - la fig. 3 est représentative des résultats obtenus in vivo, après immunisation de animal d'essai avec un con jugué formé entre une albumine humaine et le MDP-lysine (50 microgrammes dans l'essai considéré) et des molécules témoins, en présence ou non d'anticorps anti-MDP (à raison de 0 ; 0,8 ; 4 ; 20 ; 100 et 500 microgrammes respectivement), les susdits résultas étant exprimés en accroissements relatifs des taux d'anticorps mesurés contre l'albu- mine humaine en question - la fig. 4 présente des résultats d'essais analogues, dans lesquels le conjugué selon l'invention met en jeu un complexe immun MDP-A--L et des anticorps monoclonaux anti MDP. EXEMPLE I Les conjugués d'oligo-muramylpeptides ont été préparés à partir de multi-[poly-(N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- isoglutaminyl)-D,L-alanyl]-poly-L-lysine,soit de façon abrégée le MDP-A--L et d'anticorps monoclonaux murins. MDP-A--L Le MDP-A--L a été préparé dans les conditions décrites par Chedid et Coll. 7979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 6557. Ce produit est caractérisé par des rapports molaires MDP/Lys/Ala : 1/1/20, soit encore 0,2 mg de MDP par mg de MDP-A--L. Anticorps monoclonaux murins La préparation et la caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-MDP ont été décrites dans la littérature (Bahr et Colt. 1983, Molec. Immunol.,20, 745), Dans cette étude, trois anticorps monoclonaux relatifs à des sousclasses différentes d1IgG ont été sélectionnés. Les clones retenus ont été désignés comme suit : 2-4-5 (IgG3 > ,M.-52-11 (IgG2a) et M-5-5 (IgG2b). Ces trois anticorps monoclonaux se fixent au MDP, mais ne reconnaissent ni l'acide Nacétyl-muramique, ni le dipeptide L-alanyl-D-isoglutamine dans des essais d'inhibition de la fixation de MDP-Lys marqué à la péroxydase aux anticorps anti-MDP (Bahr et Coll. 1982). On rappellera que l'on a sélectionné ceux des clones qui ont produit des anticorps monoclonaux qui ont reconnu sélectivement le MDP-A--L, sans cependant réellement reconnaitre le composé DP-A--L (c'est-à-dire le composé dans lequel le MDP est remplacé par la L-alanyl-Disoglutamine (DP)). En particulier, les dilutions limites de MDP-A--L que ces anticorps monoclonaux étaient capables de reconnaître sont plus de 100 fois plus élevées que les dilutions limites de DP-A--L et également reconnues par ces memes anticorps, dans les essais sur microplaques défrits dans le premier des articles sus-indiqués. Des anticorps monoclonaux de contrôle avec spécifirite ant-A--L ou anti-DNP ont été préparés comme cEcr2t dans la littérature (Eshhar et Colt., ly8G ; Behnaz Parhami et Coll., 1983). Le précipité en sulfate d'ammo- nium (50 %) de fluide ascitique de chaque clone est utilisé pendant l'étude, sauf mention contraire. Préparation de F(ab)2 On fait passer les ascites contenant les immunoglobulines des clones M-52-ll sur une colonne du tamis moléculaire commercialisé sous la marque SEPHACRYL S-200 (PHARMCIA) et on ressemble les fractions du pic correspondant à des poids moléculaires de 160.000 daltons et capables de se fixer au MDP. On les concentre et on les dialyse à l'aide d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire, pH 4,5. On ajoute à 25 mg d'IgG dans 3 ml, 1 mg de pepsine solide (SIGMA) et on laisse incuber à 370C pendant 18 heures. On ajuste ensuite le pH à 8,0 avec du Tris 2 M et on dialyse l'IgG digéré à l'aide de PBS à pH 7,4. On élimine le fragment Fc et l'IgG non digéré en faisant passer la préparation deux fois sur 10 ml d'une colonne de protéine A-SEPHAROSE (PHARMCI9!. Le fraoment F(ab)2 non retenu est récupéré et contrôlé pour sa pureté selon la méthode ELISA en utilisant des antisérums de lapin spécifique de sous-classes anti-souris (Biometics). La préparation pure de F(ab) 2 obtenue à partir de M-52-11 a une activité identique à celle de l1lgG non digéré, vis-à-vis de la fixation au MDP-Lys-péroxydase. Cellules Des macrophages récoltés à partir d'exsudats péritonéaux quatre jours après une injection intrapéritonéale de 2 ml de milieu thioglycolate (INSTITUT PASTEUR, Paris) sont utilisés comme cellules effectrices. Les mastocytomes P815 utilisés comme cellules cibles sont des cellules tumorales ascitiques péritonéales provenant de souris DBA2. Préparation de monocouches de macrophages Après récupération, on lave les macrophages et on les ensemence à la concentration de 3,5 x 105 cellules dans 0,2 ml de milieu dans les puits de microplaques (NUNCLON, Roskilde, Danemark). Le milieu de culture est un milieu RPMI (FLOW LABORATORIES, Rockville, Md) contenant du sérum de veau foetal inactivé à la chaleur à 10 > , de la glutamine et des antibiotiques. On laisse incuber les cultures à 370C, sous une atmosphère contenant du C02 7,5 % (volume/volume). Après avoir maintenu les cellules adhérer pendant 180 mn à 370C, donc dans des conditions leur permettant d'adhérer aux parois des puits, on enlève les cellules qui n'adhèrent pas en lavant les Flaques avec du milieu 199 (INSTITUT PASTEUR, Paris). Test d'activation des macrophages On fait incuber des quantités variables de différentes substances avec des macrophages pendant 24 heures, ce après quoi on les enlève par lavage avant d'ajouter les cellules cibles. On ajoute ensuite 2 x 104 cellules mastocytomes P815 aux monocouches de macrophages et on laisse incuber pendant 24 heures. 4 heures avant la fin de l'essai, on ajoute à chaque puits 0,1 microCI de thymidine (3H). Les cellules marquées sont récupérées sur des disques en fibres de verre dans un collecteur d'échantillons multiples (SKATRON, FLOW LABORATORIES). Estimation de la cytostase des cellules cibles On exprime les résultats sous forme de pourcentages d'inhibition de la croissance. Ce pourcentage résulte de la formule suivante inhibition de croissance en % = 100 (C - A)/C. Dans cette formule, C représente la radioactivité incorporée par les cellules de mastocytomes cultivées sur monocouches de macrophages de contrôle et A la radioactivité incorporée par les cellules mastocytomes cultivées sur monocouches de macrophages activées. On a fait trois fois l'essai pour chaque groupe d'expérimentations et les résultats obtenus sont représentatifs d'au moins ceux expériences effectuées dans les mêmes conditions. RESULTATS activation in vitro des macrophaqes par MDP-A--L en combinaison avec 1' anti-MDP monoclonal On fait incuber les macrophages péritonéaux pendant 24 heures avec des doses différentes de MDP-A--L seul ou en combinaison avec l'anticorps anti-MDP (clone e-52-11, 10 microgrammes/millilitre). Comme on le voit sur la fig. 1, une concentration rinimum de 1 microgramme/millilitre de MDP-A--L est nécessaire pour rendre les macrophages cytostatiques vis-à-vis ces cellules tumorales P815. Au contraire, lorsqu'on laisse incuber les macrophages avec MDP-A--L en présence oe 10 microgrammes/mill itre d' anti-MDP monoclonal, une quantité aussi faible que 0,001 microgramme/millilitre de fIDP-A--L est suffisante pour activer les macrophages. Cette concentration de MDP-A--L représente 0,2 ng (4 x 10-10 mati) de MDP par millilitre. On observe des effets synergiques similaires entre MDP-A--L et anti MDP avec 100, 10 ou 1 microgramme/millilitre d'anticorps conoclonaux (données non représentées). On note que lors cu'il est ajouté seul l'anticorps M-52-1l n'a pas d'effet cytostatique sur les macrophages. absence de synerqie entre MDP-A--L et les anticorps F(ab)2 a-,ti-MDP Les anticorps F(ab)2, préparés comme indiqué plus haut, ont une activité identique quant à leur capacité de fixation à la MDP-Lys-péroxydase que les IgG non digérés. On laisse incuber les macrophages pendant 24 heures avec 0,0001 à 100 microgrammes/millitre de 3P-A--L, soit seuls, soit en présence de 10 micro crammes/millilitre de M-52-ll ou de F(ab) 2 On peut voir après la fig. 2 qu'il n'y a pas de synergie entre eDP-A--L et F(ab)2, contrairement à ce qui est observé avec les anticorps intacts. I1 résulte des essais qui précèdent qu'il faut au moins 1 microgramme/millilitre de MDP-A--L pour induire une activité cytostatique spécifique de macrophages péritonéaux murins. Au contraire, en présence d'anticorps monoclonaux anti-MDP, une quantité aussi faible que 0,001 microgramme/millilitre de MDP-A--L est suffisante pour activer les macrophages. Cette concentration de MDP-A--L correspond à 0,2 ng (4 x 10-10 mM) de MDP par millilitre. Cet effet synergique avec des quantités correspondant à la limite inférieure de MDP-A--L est observé avec les anticorps monoclonaux anti-MDP de différents isotypes (IgG2a, TEJ b et IgG3) et également avec un anticorps monoclonal dirigé contre la chaîne A--L. Ainsi, l'effet synergique semble être lié à la formation de complexes immuns entre MDP-A--L et les anticorps. Enfin l'activité synergique entre MDP-A--L et les anticorps spécifiques suppose que le conjugué selon l'invention comporte bien la partie Fc de l'immunoglobuline, comme le démontre l'inaptitude de F(ab)2 à induire une telle activité, ce qui tend à soutenir l'hypothèse selon laquelle l'accroissement de l'activité observée implique la fixation des complexes immuns MDP sur les récepteurs Fc de la membrane des macrophages. EXEMPLE Il Des conjugués entre le MDP-lysine (N-acétyl-Lalanyl-D-isoglutaminyl-L-lysine) et une sérum-albumine humaineont été obtenus par coupage au glutaraldéhyde. Ce couplage a été réalisé dans les conditions suivantes Les proportions relatives de XD -Ly et de sérumalbumine humaine dans le produit final ont été de 16:1. Des groupes de cinq souris ont été immunisées avec des cases égales chaque fois à 50 microgrammes du conjugué obtenu en présence de doses croissantes d'anticorps monoclonal contre le MDP. 7 jours plus tard, des échantillons de sang ont été prélevés sur les animaux des divers groupes. Leurs teneurs respectives en anticorps à l'égard de la sérum album ne ont été testées par une méthode ELISA mettant en jeu des plaques de microtitration dont les puits avaient été revêtus de solutions ccr=enartt :I nicroerammesirl de sérum-albumine roumaine par puits. Les sérums des ani mat:x de chaque groupe avaient été réunis et dilués au 1/100e avant d'être introduits ans les puits. Après lavage de ces puits, dans des conditions classiques, des immunoglobulines de lapin anti-souris, couplées à de la pércxydase, ont ensuite été ajoutées dans les puits. Les activités des enzymes fixées ont été mesurées par leur actif sur un mélange de O-phénylène-diamine et d'eau oxygénée. Les taux d'anticorps mesurés résultent de l'examen de la fig. 3. Les barres verticales attestent de l'accroissement des taux d'anticorps mesurés (en or données) , en fonction des proportions en microgrammes d'anticorps anti-MDP mesurés. Comme le montre la fig. 3, l'utilisation de 20 à 500 microgrammes d'anticorps anti MDP, au niveau de l'immunisation, conduit à une exaltation de la réponse immunitaire. En particulier, celle-ci est maximum lorsque l'immunisation a été réalisée en présence du complexe obtenu par réaction de 50,ug du conjugué formé entre la sérum-albumine et le MDP-Lys et 100 microgrammes d'anticorps anti-MDP. On observe que lorsque l'immunisation a été effectuée en présence de 50 microgrammes du premier conjugué mentionné et de 500 microgrammes d'anticorps anti-MDP (soit 10 fois plus), on obtient toujours encore une réponse immunitaire plus importante que celle qui pouvait être observée après immunisation avec le conjugué albumjne-MDP-Lys, en l'absence d'anticorps anti MDP ou en présence de faibles doses de ce dernier. EXEMPLE III Des groupes de cinq souris ont été immunisées avec du MDP-A--L, en présence ou non d'anticorps anti-MDP. Ces immunisations ont été réalisées en ayant recours au protocole suivant a) 25 microgrammes A--L, b) 25 microgrammes A--L + 100 microgrammes anti-MDP ascitique I-2á (M-52-11), c' 2 mi crogrammes MDF-A--', d; 25 microgrammes MDF-A--L + 100 microgrammes anti-MDP ci tique IgS (2-4-5" e) < 5 microgrammes MDP-A--L + 100 ,icrogrammes anti-MF' ascitique IgG2a (M-52-11). Des prélèvements de sang sont effectués et les sérums des animaux de chaque groupe sont réunis aux jours 14 et 28 respectivement après l'immunisation.Iîs sont ensuite testés contre A--L par une méthode ELISA sur microplaques dont les puits ont au préalable été revêtus avec une solution contenant 10 microgrammes/millilitre de A--L. Les sérums réunis, dilués au 1/400e ont été introduits dans les puits. Après incubation et lavage des puits avec des tampons appropriés, des immunoglobulines de lapin anti-souris marquées à la péroxydase diluée au 1/10.000e ont été ajoutées. L'activité enzymatique a été mesurée contre le même substrat que ci-dessus. Les résultats sont exprimés dans la fig. 4 par des barres verticales correspondant au taux de densité optique mesuré en réponses primaire et secondaire aux jours 14 et 28, respectivement dans les cas a) à e) définis ci-dessus. Comme dans l'exemple II, on observe une forte exal tation de 'attivite stimulante du Mtr-A--L, en présent d anti c:o F 5 anti-MDP. Les compositions obtenues paraissent particulièrement bien adaptées à l'activation des macrophages vis-àvis de proliférations tumorales. Elles doivent pouvoir etre utilisées efficacement chaque fois qu'il est nécessaire ou utile d'augmenter l'activité des immunomodulateurs au niveau du macrophage. L'invention concerne également les préparations pharmaceutiques dans lesquelles les compositions à base de muramylpeptides et d'anticorps anti-muramylpeptides sont associées à un excipient pharmaceutique permettant leur administration in vivo. Ces préparations se présentent avantageusement sous forme de solutions, suspensions ou liposomes in3ectarles, cor tenant une dose efficace des éléments essentieis de la composition selon l'invention. De préférence, ces solutions, suspensions ou formes liposomes sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, ae préférence saline ou glucosée. L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou formes liposomes qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarificatirons. Elle concerne également des préparations pharmaceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous forme d'aéro- sols destinés à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales. Er. conséquence, elle concerne des préparations pharmaceutiques dans lesquelles l'une au moins des compositions selon l'invention se trouve associée à des exci p ents pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la constitution de formes orale, oculaire ou na sale, ou avec des excipients adaptés à la constitution de formes d'administration rectale, ou encore avec des excipients gélatineux pour l'administration vaginale. Elle concerne aussi des préparations liquides isotoniques contenant les constituants - au préalable séparés ou non - ou les immun-complexes de la composition selon l'invention, adaptées à l'administration sur les muqueuses, notamment oculaire ou nasale. Elle concerne enfin des compositions formées de gaz liquéfiés pharmaceutiquement acceptables, dans lesquels les constituants de la composition selon l'invention ou les immun-complexes formés entre ces constituants sont dissous ou maintenus en suspension, et dont la détente provoque la dispersion en un aérosol. Lorsque les compositions selon l'invention sont utilisées en association avec un antigène vaccinant, elles contiennent avantageusement en outre un véhicule, tel que la polyvinyl-pyrrolidone, facilitant l'administration du vaccin. A la place de la polyvinyl-pyrrolidone, on peut utiliser tout autre type d'adjuvant au sens classique que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est-à-dire d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou facilitant son action dans l'organisme. A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce dernier type, on mentionnera encore la carboxyméthyl-cellulose, les hydroxydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adjuvants de ce type, bien connus de l'homme de l'art. Les préparations pharmaceutiques selon l'invention sont essentiellement destinées à moduler l'activité des macrophages. Elles sont utiles chaque fois que l'on cherche à provoquer une immunité à médiation cellulaire à l'égard d'antigènes pathogènes (par exemple de nature bactérienne, virale ou parasitaire) ou contre des proliférations des cellules tumorales. Sans que les indications qui suivent puissent avoir un caractère limitatif, on mentionnera que les doses unitaires actives du médicament, rapportées aux muramylpeptides peuvent être de l'ordre de 1 à 100 microgrammes par kg. De préférence, les proportions relatives de muramylpeptide et d'anticorps peuvent être de l'ordre de 1 molécule de muramylpeptide (ou motif muramylpeptide) pour 10 à 100 molécules d'anticorps. L'invention concerne encore plus particulèrement des préparations pharmaceutiques dans lesquelles le muramylpeptide ou l'oligo-muramylpeptide, d'une part, et la moléculevecteur, d'autre part, sont en fait présentées dans des conditionnements séparés : elles comportent par exemple un flacon contenant l'oligo-muramylpeptide et un flacon combinant la molécule-vecteur. Cette forme de présentation est particulièrement avantageuse puisque la réaction entre les deux constituants est en général spontanée à l'occasion de leur mise en contact, de sorte que l'immun-complexe selon l'inven- tion peut alors être formé extemporanément au moment de l'usage. Les deux constituants sont mélangés et dissous (ou vice versa) dans une solution injectable. I1 est préférable de laisser reposer la solution formée pendant quelque temps, par exemple 10 minutes à la température ambiante, avant l'administration, par exemple par injection. Les proportions relatives des deux constituants sont dans un tel cas avantageusement conformes à celles qui permettent l'obtention d'une composition finale comportant les proportions relatives en muramylpeptides et en anticorps contenus dans les intervalles qui ont été indiqués ci-dessus à titre d'exemple. L'invention concerne de même encore les compositions du type sus-indiqué, présentées en conditionnements séparés, les constituants qu'ils contiennent étant le cas échéant destinés à êtreadministrés ensemble ou séparément dans le temps, en conformité avec un protocole d'administration pré-établi, en vue d'obtenir la manifestation, avec le maximum d'efficacité de leurs effets thérapeutiques du type indiqué plus haut. Par exemple, les anticorps anti-muramylpeptide sontdestinés à être administrés avant le muramylpeptide lui même ou vice versa. L'invention concerne alors plus particulièrement les présentations de ces conditionnements sous des emballages appropriés et, le cas échéant, avec notices générales d'utilisation, en ce qui concerne les intervalles de temps devant s'écouler entre les administrations décalées des constituants séparés. Ces conditionnements peuvent contenir des doses unitaires efficaces des constituants des préparations pharmaceutiques selon l'invention. Les compositions selon l'invention, notamment les immuns-complexes, peuvent également être pré-conditionnées à l'état lyophilisé. I1 peut là encore s'agir de doses unitaires pré-établies, en vue de la préparation de solutions extemporanées. I1 est remarqué que les doses administrables sont à ce point faibles que, notamment dans le cas de compositions administrables par injection, leur mise en solution dans les volumes de liquide requis pour l'injection ne pose en général aucun problème. I1 va sans dire que les pré-conditionnements pharmaceutiques ainsi obtenus entrent dans le cadre des revendications qui suivent et relatives à des compositions pour la stimulation des macrophages in vivo. L'invention concerne encore les réactifs biologiques que constituent les compositions à base de muramyl peptides et d'anticorps selon l'invention. Les compositions selon l'invention peuvent également être utiles pour la fabrication d'anticorps efficaces et en quantités importantes contre un antigène déterminé, par immunisation d'un animal avec un conjugué préalablement formé, conformément aux enseignements de cette invention. L'antigène est alors utilisé comme "molécule-porteuse", celle-ci étant associée avec à la fois un muramylpeptide et un anticorps répondant aux définitions qui ont été données plus haut. L'invention concerne enfin un procédé d'activation in vivo des macrophages, ce procédé étant caractérisé par l'administration à un hôte de doses efficaces, soit simul tanément, soit à des instants distincts, d'un muramylpeptide et d'anticorps dirigés contre ce muramylpeptide, soit encore d'une dose efficace d'une composition contenant l'un et l'autre et, dans laquelle, le cas échéant, l'immun-complexe entre le muramylpeptide et l'anticorps aura été préformé. I1 va sans dire que, dans le cas où les administrations du muramylpeptide et des anticorps sont décalées, ce décalage ne doit pas excéder celui qui aurait pour effet de réduire l'effet d'exaltation recherché de l'Åac- tivation des macrophages par le muramylpeptide. L'invention concerne enfin un procédé d'utilisation de la composition selon l'invention ou de ses constituants essentiels (muramylpeptide et anticorps) pour la préparation d'une composition pharmaceutique utilisable pour le traitement de maladies sensibles à l'action de macrophages activés et par conséquent susceptibles d'être combattues par des compositions ayant la capacité d'activer des macrophages ou encore pour la préparation de compositions destinées à la vaccination contre un agent pathogène déterminé ou à l'utilisation conjointe avec un vaccin contre ledit agent pathogène.

Claims: REVENDICATIONS 1 - Composition associant un muramylpeptide ou oligo-muramylpeptide, combiné ou non avec un antigène ou un haptène porteur d'un site antigénique, caractéristique de cet haptène, et un anticorps dirigé contre ce muramylpeptide et apte à former avec lui un immun-complexe pour l'utilisation en vue de l'activation in vivo des macrophages. 2 - Composition selon la revendication 1, caractériséeen ce que l'anticorps est monoclonal et dirigé préférentiellement contre l'ensemble de la structure muramylpeptide. 3 - Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal n'estque peu actif ou même inactif à l'égard de la structure de l'acide Nacétyl muramique ou de celle du peptide entrant dans la constitution dudit muramylpeptide. 4 - Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'oligo-muramylpeptide est un oligomère du muramylpeptide correspondant. 5 - Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'oligo-muramylpeptide comporte une molécule porteuse sur laquelle sont fixées une ou plusieurs molécules de muramylpeptide. 6 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le muramylpeptide ou le muramylpeptide monomère dont est dérivé le susdit oligo-muramylpeptide est caractérisé par la formule suivante EMI26.1 dans laquelle les substituants R1, R4, R6, X, R7, R8, A et n ont respectivement les significations suivantes : : - R1 est -NH2, -OH, -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle -ou alcoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone ; - R4 est hydroxyle, acyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle ; - R6 est NH2, -OH,-NHZ ou -OZ, Z étant un radical linéaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle contenant de 1 à 90 atomes de carbone et portant, le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cyclopropyle ou méthoxyle ; - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant : alanyle, arginyle, asparagyle, aspartyle, cystéinyle, glutaminyle, glutamyle, glycyle, histidyle, hydroxypropyle, isoleucyle, leucyle, lysyle, méthionyle, phénylalanyle, propyle, séryle, thréonyle, tryptophanyle, tyrosyle et valyle, N-méthyl-alanyle ; - R7 est un groupe -OH,- -NH2,- alcoylamide, alcoxy linéaire ou ramifié, aryle ou alcoxy-aryle comprenant au plus 10 atomes de carbone, - R8 est un groupe -OH, -NH2 ou un groupe alcoxy comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, - A représente un acide aminé tel qu'un résidu alanyle, t lysine, glutamine et - n est égal à 0, 1 ou 2. 7 - Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que les acides aminés intervenant dans la constitution de la chaine peptidique sont (à l'exception de la glycine) lévogyres. 8 - Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la molécule porteuse est constituée par un antigène, une molécule ayant-des propriétés immunogènes ou un haptène portant un déterminant antigénique caractéristique de cet antigène ou de cette molécule immunogène. 9 - Préparation pour la stimulation des macrophages in vivo, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule biologique permettant l'administration de ladite composition in vivo, une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10 - Préparation pour la stimulation de la réponse immunitaire in vivo contre un antigène déterminé, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule biologique permettant son administration in vivo -, une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et un agent immunogène apte à induire in vivo la production d'anticorps actifs contre le susdit antigène. 11 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les proportions relatives de muramylpeptides et d'anticorps sont de l'ordre de 1 molécule de muramylpeptide pour 10 à 100 molécules d'anticorps. 12 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous forme de doses unitaires en équivalent muramylpeptide de 1 à 100 microgramme/kg.

Inventors: BAHR, GEORGES, CHEDID, LOUIS, LECLERE, CLAUDE
Applicants: ANVAR  AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE
Application year: 1985
Main classification: C12P21
IPC codes: C07K14, A61K47, C07K9, A61K39, A61K38, C07K16