LYMPHOKINE IN THE PURE STATE, MONOCLONAL ANTIBODIES, HYBRIDOMA CELL LINES, PROCESSES AND APPLICATIONS

Abstract: The invention relates to purified human macrophage migration inhibitory factor (human MIF) and its individual proteins, to a process for the purification of human MIF and for the isolation of its individual proteins, to monoclonal antibodies against human MIF, derivatives thereof, processes for the preparation of these antibodies and derivatives thereof, hybridoma cell lines which produce these antibodies, processes for the preparation of said hybridoma cell lines, and to the use of the monoclonal antibodies and derivatives thereof for the qualitative and quantitative determination of human MIF in biological fluids and on cell surfaces, and to the use of the monoclonal antibodies for the purification of human MIF. Human MIF and monoclonal antibodies against human MIF are important for the diagnosis and therapy of immunoregulatory disorders and chronic inflammatory disorders.

Description: Lymphokin in reiner Form, neue monoklonale Antikörper, Hybridoma-Zellinien, Verfahren und Anwendungen Die Erfindung betrifft gereinigten Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF) und seine Einzelproteine, ein Verfahren zur Reinigung von Human-MIF und zur Isolierung seiner Einzelproteine, neue monoklonale Antikörper gegen Human-MIF, Derivate davon, Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper und ihrer Derivate, Hybridoma-Zellinien, die diese Antikörper produzieren; ; Verfahren zur Herstellung besagter Hybridoma-Zellinien, die Ver wendung der monoklonalen Antikörper und ihrer Derivate zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-MIF in biologischen Flüssigkeiten und auf Zelloberflächen, die Verwendung der mono klonalen Antikörper zur Reinigung von Human-MIF, ferner pharmazeutische Präparate enthaltend gereinigten Human-MIF, seine Einzelproteine, monoklonale Antikörper gegen Human-MIF oder deren Derivate. Hintergrund der Erfindung Human-MIF aus menschlichen Zellen ist zwar als aktives Prinzip bekannt, hingegen bisher nur als Gemisch und zusammen mit anderen Proteinen in biologischen Flüssigkeiten beschrieben und von der Struktur her nicht charakterisiert. MIF gehört zur Gruppe der sogenannten Lymphokine, die biologisch aktive, lösliche Polypeptide umfasst, die von Lymphozyten und Monozyten oder Makrophagen ausge schieden werden, wenn diese durch Antigene, Mitogene oder dergleichen stimuliert werden. Andere Beispiele von Lymphokinen sind Immun-Interferon (t-Interferon), Interleukin 1 und 2 und Makro phagen-aktivierenden (MAF). Diese Lymphokine regeln die Dlfferenzieleng, Aktivierung und Proliferation verschiedener Zelltypen des Immunsystems. Fach dem bekannten Stand der Technik besteht Human-MIF aus einer Gruppe von Polypeptiden, die die Wanderungsfähigkeit von Hakrophagen humman. Humman-MIF wird nicht nur von aktivierten Lyxphozyten, T- und B-Zallen, sondern auch von nicht-lyiphoiden Zellen sezerniert, beispielsweise von wachsenden Fibroblasten und gewissen Tusorzellen. MIF set sich klar unterscheiden von r-Interferon, Hakrophagenaktivierenden Faktor (MAF) und anderen Lymphokinen. Disher war es aber nicht möglich, MIF aus nenschlichen Zellen rein darzustellen und seine Struktur aufzuklären. Ueber Hu an-HIP war bekannt, dass er wahrscheinlich aus einer Gemisch von strukturell verwandten Polypeptiden mit ein Molekulargewicht von ungefahr 8,5, 18, 27, 36, 45 bzw. 67 kg/Mol. (Kilo-Dalton) und eine isoelektrischen Punkt bei pH 5,1 und 2,9 besteht [G. Burmeister, H. Steffen, U. Beige und C. Sorg, Immunobiology 160, 15 (1981)). Human-MIF spielt in der fdiben Phase einer Entzündungsreaktion ("delayed type hypersensitivity reaction") eine entscheidende Rolle. Er induziert die Differenzierung von Honozyten und ruhenden Gewebe Makrophagen zu funktionsbereiten entzündlichen Makrophagen. Gereinigter Human-MIF und seine Einzelproteine und monoklonale Antikörper, die spezifisch Human-MIF binden und seine Aktivität hemmen, sind deshalb von Bedeutung fUr die Diagnose und Therapie von Immunregulationskrankbeiten und chronischen Entzündungskrankheiten Monoklonale Antikörper, die Human-MIF binden und hemmen, sind wertvoll in der Bekämpfung von Kontaktekzemen, primärer chronischer Polyarthritis und verschiedenster Autoimmunkrankheiten. Gereinigter Human-MIF und seine Einzelproteine können die Infektresistenz, beispielseise gegen Tuberkulose, Lepra oder Leishianiose und gegen Candidose, sowie die Resistenz gegen Tumoren, insbesondere gegen Metastasen, erhöhen Die Verwendung von Antikörpern in Diagnose und Therapie war bis vor kurzem in ihrem Anwendungsbereich stark eingeschränkt. Antikörper wurden in geringen Mengen aus tierischem Serum als komplexe Mischung verschiedener Proteine gewonnen. Standardisierung der Antikörper war nicht möglich, weil jedes immunisierte tierische Individuum und auch ein einzelnes Individuum bei wiederholter Immunisierung Jeweils ein Serum mit Antikörpern verschiedener Zusammensetzung ergibt. Durch Anwendung einer von Köhler und Milstein [G. Köhler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975)1 entwickelten Technik ist es nun möglich geworden, Antikörper in homogener Form, d.h. sogenannte monoklonale Antikörper, reproduzierbar in industriellen Mengen aus Zellkulturen zu gewinnen. Durch Fusion von geeigneten Myeloma-Zellen mit Antikörper-produzierenden Lymphozyten aus einem mit Antigen immunisierten Spender entstehen Hybridoma-Zellen, die die FÅaffiigkeit zur unbegrenzten Zellteilung und zu unbegrenztem Wachstum in vitro mit der Produktion eines homogenen Antikörpers verbinden. Somit ist es möglich, die Immunantwort eines Organismus auf ein bestimmtes Antigen zu verselbstandigen und monoklonale Antikörper durch permanentes Kultivieren von Hybridoma-Zellen herzustellen. Obwohl bis heute viele Beispiele für die Herstellung spezifischer Antikörper durch Hybridoma-Technik bekannt geworden sind und das allgemeine Vorgehen prinzipiell beschrieben ist, so treten doch bei jedem neuen Beispiel spezifische Probleme auf, die eine Anpassung der Technik an den gegebenen Fall erfordern. Ohne solche Anpassung gibt es keine Gewissheit, dass die gewünschten Hybridoma-Zellen je gebildet werden, dass sie genetisch stabil sind, die gewUnschten Antikörper herstellen und dass die dermassen hergestellten Antikörper die gewünschte Spezifität aufweisen. Der Grad des Erfolges wird im Prinzip beeinflusst durch Art und Reinheit des für die Immunisierung des Spenders verwendeten Antigens, die Technik der Zell-Fusion, das Vorgehen bei der Selektion geeigneter Hybridoma Zellinien und die Art und Weise der Isolierung und Reinigung der Antikörper. Eine wichtige Anwendung von Antikörpern, die die Verfügbarkeit von henogenen nonoklonalen Antikörpern in grossen Hengen voraussetzt, wie sie jetzt durch die Hybrifomstechnik ermöglicht wird, ist die Immunaffinitäts-Chromatographie. Dabei werden Antikörper ait einer gewünschten Spezifität auf ein festes Trägermaterial aufgebracht. Aus einer Lösung enthaltend eine Vielzahl verschiedener Verbindungen werden selektiv jene Verbindungen an die Antikörper und damit an das feste Trägermaterial gebunden, die ein Strukturelement (Deter sinantet Epitop aufweisen, das von Antikörper erkannt und gebunden wird. Mach Entfernung der Lösung nit den nicht erwünschten Verbindungen werden die erwünschten Verbindungen durch Auswaschen nit Reagention, die die Bindung an die Antikörper aufbrechen, aus de. Trägermaterial berausgelbat und durch klassische Methoden isoliert. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, gereinigten Human-MIF und seine Elnzelproteine zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird mittels der erfindungageilEssen monoklonalen Antikörper gelost. Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft gereinigten Human-Makrophagen-Migrations- inbibitonsfaktor (Human-MIF) und seine Einzelproteine. Gereinigter Human-HIF enthält nur Proteine humanen Ursprungs, die Epitope aufweisen. die von Antikörpern gegen Human-MIF erkannt und gebunden werden. Gereinigter Human-HIF besteht aus mindestens vier Einzelproteinen von Molekulargewicht ca. 8, ca. 14, ca. 28 und ca. 45 kg/Mol und gegebenenfalls weiteren Einzelproteinen oder oligomaren Protein-Aggregaten mit höheren Molekulargewicht als ca. 45 kg/Mol. Gereinigter Human-MIF ist in Standard-Testanordnungen, bei denen die Wanderung von Makrophagen gemessen wird, aktiv. Einzelproteine von gereinigtes Human-MIF sind Proteine, die nach den Ueblichen Methoden der Protein-Analyse, beispielsweise SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) oder Gel-Filtration-HPLC (Hochdruck-Flüssigchromatographie), homogen, die. in Standard-Testanordnungen, bei denen die Wanderung von Makrophagen gemessen wird, aktiv und die Bestandteile von gereinigtem Human-MIF sind. Werden im Verlaufe der Trennung und Isolierung der Einzelproteine Detergentien oder andere denaturierende Reagentien zugegeben, so verändert sich die natürliche Tertiärstruktur der Proteine und damit die Eigenschaft, die Wanderung der Makrophagen zu hemmen, obwohl die Primärstruktur unverändert bleibt. Solche denaturierte Formen der Einzelproteine sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Beispiele für Einzelproteine von gereinigtem Human-MIF sind die beiden Proteine mit dem Molekulargewicht von ca. 8 kg/Mol bzw. ca 14 kg/Mol und der N-terminalen Aminosäure-Sequenz Xl-Leu- 5 10 15 Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr-His-Lys-Tyr, worin die Bedeutung der Aminosäure X1 nicht festgelegt ist, ferner Proteine mit dem Molekulargewicht von ca. 28 kg/Mol und ca. 45 kg/Nol. In erster Linie betrifft die Erfindung das Einzelprotein von gereinigtem Human-MIF mit dem ungefähren Molekulargewicht von 8 kg/Mol und der N-terminalen Aminosäure-Sequenz Met-Leu-Thr-Glu- 5 10 15 2S Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr-His-Lys-Tyr-Ser- 25 30 35 Leu-Ile-Lys-Gly-Asn-Phe-His-Ala-Val-Tyr-Arg-Asp-Asp-Leu-Lys-Lys- so 55 50 I.eu-Leu-Glu-Thr-Glu-X42-Pro-Gln-Tyr-Ile-Arg-Lys-Lys-Gly-Ala-Asp- 55 60 65 Val-Trp-Phe-Lys-Glu-Leu-Asp-Ile-Asn-X62-X63-X64-Ala-Val, worin die Bedeutung der Aminosäuren X42 X62, X63 und X64 nicht festgelegt ist, X42 aber nur Ser oder Cys bedeuten kann. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Human-MIF und seiner Einzelproteine, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Human-MIF enthaltende Lösung, z.B. einen Zellextrakt, Zellkulturüberstand oder ein Zellkulturfiltrat menschlicher Zellen, gewünschtenfalls nach an sich bekannten Reinigungsschritten, a) mit einem Trägermaterial mit auf Human-MIF spezifischen mono klonalen Antikörpern in Kontakt bringt, ungebundene Proteine und andere Frendstoffe entfernt, den an die Antikörper gebundenen Human-MIF selektiv abspaltet und isoliert und, b) wenn erwünscht, den gereinigten Human-MIF in seine Einzelproteine auftrennt, Lösungen, z. B. Zellextrakte, Zellkulturüberstände oder Zellkulturfiltrate menschlicher Zellen. die HIF enthalten, werden nach an eich bekannten Methoden zubereitet. Geeignete zenschliche Zellen sind beispielsweise mononukleäre Zellen, die aus "buffy coat", der Schicht weisser Blutt5rperchen, die sich bei der Zentrifugation von mit Citrat oder Heparin versetztes venöses Blut abscheidet, durch leukapherese und/oder Zentrifugation in eines Dichtegradienten gewonnen werden können. Die mononukleären Zellen werden durch geeignete Hilfsstoffe, beispielsweise Concanavalin A oder Phytohänngglutinin, zur Produktion von MIF und anderen Lymphokinen angeregt und nach den Üblichen Methoden während ca. 12 bis ca. 72 Stunden, bevorzugt zwischen 18 und 36 Stunden in geeigneten Kulturmedien, beispielsweise des Media RPHI 1640, denen gewunsch- tenfalls fötales Kälberserum, Pufferlösungen und/oder Antibiotica, wie Penicillin oder Streptozycin, zugesetzt werden, bei ca. 370C und gewünschtenfalls CO2-Begasung kultiviert. Lösungen enthaltend Human-MIF werden 8.1 den Zellen und/oder den Zellkulturüberständen beispielsweise durch Extraktion, Filtration undZoder Zentrifugation gewonnen und gewünschtenfalls durch Zusatz von Antibiotica und/oder Protease-Inhibitoren stabilisiert. Solche Human-MIF-Lösungen können direkt mit en Trägermaterial gebundenen Antikörpern in Schritt a) in Kontakt gebracht werden, werden hingegen bevorzugt vorgängig mittels Ultrafiltration an Membranen mit Trenngrezen von Molekulargewicht ca. 6 kg/Mol oder kleiner vorgereinigt, aufkonzentriert, gegebenenfalls dialysiert und gewünschtenfalls durch Chronstographie, z.B. an DEAE-Cellulose oder Sephadex* weiter gereinigt. In Schritt a) wird Human-MIF von anderen in den Lösungen enthaltenen Proteinen und Fremdstoffen abgetrennt, wobei die Trennwirkung beruhend auf bindenden Wechselwirkungen zwischen monoklonalen Antikörpern spezifisch auf Human-MIF und den erkannten antigenen Determinanten von Human-MIF genutzt werden. Dazu werden die Human MIF enthaltenden Lösungen nach der an sich bekannten Methode der Immunaffinitäts-Chromatographie mit einem Trägermaterial, an welches auf Human-MIF spezifische monoklonale Antikörper gebunden sind, in Kontakt gebracht. Ein geeignetes Trägermaterial auf anorganischer oder organischer Basis, beispielsweise Silikate, vernetzte Agarose, Dextran oder Polyacrylamid in geeignet funktionalisierter Form, wird auf an sich bekannte Weise, gegebenenfalls unter vorheriger Aktivierung, mit den weiter unten beschriebenen erfindungsgemdssen monoklonalen Antikörpern oder ihren Derivaten belegt. Beispielsweise wird ein Trägermaterial enthaltend aktivierte Esterfunktionen, z.B. N-hsydroxysuccinimidester-Gruppen, in einer wässrigen Puffer-Lösung suspendiert, mit einer Lösung des monoklonalen Antikörpers vermischt, anschliessend ungebundene monoklonale Antikörper ausgewaschen und unbesetzte reaktive Stellen des Trägermaterials z.B. mit einem primären Amin, wie Aethanolamin, blockiert. Das Trägermaterial wird in einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel, z.B. einer Salzlösung, wie NaCl-Tösung, oder einer Pufferlösung, wie Phosphat-gepufferter NaCl-Lösung, NaHCO3-Lbsung oder 3-(N Morpholino) propansulfonsaure-lösung , suspendiert und mit der Human-MIF enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht, z.B. in eine Chromatographiesäule eingefüllt und die Human-MIF enthaltende Lösung aufgetragen und, gewünschtenfalls mit Druck, durch das Träger material durchgepumpt. Ungebundene Proteine und andere Verunreini- gungen werden mit wässrigen Lösungen, beispielsweise Puffer-Lbsungen im pH-Bereich von ca. pH 5 bis ca. pH 9 und/oder Salz-Lösungen, z.B. NaCl-Lösung, weggewaschen. Der an die Antikörper auf dem Trägermaterial gebundene Human-MIF wird mit geeigneten wässrigen Lösungen, beispielsweise Puffer-Lösungen im pH-Bereich von ca. pH 2 bis ca. pH 5, wie Glycin-Puffer, oder pH-Gradienten verschiedener Zusammen setzung oder Salz-Lösungen, z. B. konzentrierter NH4CSN-Lösung, eluiert. Die anfallenden, gereinigten Hu-an-HIP enthaltenden Lösungen werden gegebenenfalls neutralisiert und daraus nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Chrosatographie über Sephadex , Elektrodialyses elektrophoretische Konzentration und/oder Vakummentrifugation, der gereinigte Human-MIF isoliert. Gev nschtenfalla wird in Schritt b) der gereinigte Human-MIF in seine Einzelproteine aufgetrennt, beispielsweise indes man nach an sich bekannten Methoden das Proteingemisch cbromatographisch in Fraktionen verschiedenen Molekulargewichts trennt. Beispielsweise wird der gereinigte Human-MIF durch präparative Natriuzdodecyl- sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorase (SDE-PAGE) aufgetrennt, huogene Molekulargewichtsfraktionen aus des Gel eluiert und, 2.B. durch Chromatographie über Sephadei , elektrophoretische Konzentration undfeder Vakummentrifugation, in reiner Fors isoliert. Der gereinigte Human-MIF kann auch durch präparative Gel-Filtration-HPLC in homogene Molekulargewichtsfraktionen aufgetrennt und daraus die Einzelproteine isoliert werden. Die Erfindung betrifft ferner neue monoklonale Antikörper gegen Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF), sowie Derivate davon. Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper binden und/oder hemden die biologische Aktivität von Human-MIF. Die Bindung von monoklonalen Antikörpern an Human-MIF wird mit Vorteil in eines Immunoassay bestimmt, beispielsweise mit einer Testanordnung, bei der Human-MIF auf einen festen Träger aufgebracht, der beschichtete Trager mit einer monoklonalen Antikörper-Lösung inkubiert und dabei gebundene monoklonale Antikörper mit eines Zweit-Antikörper, der eine Radioisotop- oder Enzymmarkierung trägt, entwickelt werden. An Human-MIF gebundene monoklonale Antikörper werden so durch Messung der Radioaktivität bzw. durch eine Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt. Geeignet ist beispielsweise auch eine Testanordnung, bei der die monoklonalen Antikörper auf einen Träger fixiert, mit einer Human MIF-haltigen Lösung inkubiert und schliesslich der Restgehalt an Human-MIF-Aktivität dieser Lösung bestimmt wird. Die Human-MIF-Aktivität einer Lösung wird in an sich bekannter Weise durch Bestimmung der Hemmwirkung auf die Wanderung von geeignet aktivierten menschlichen Makrophagen gemessen. Beispielweise kann eine Versuchsanordnung gewählt werden, bei der die Wanderungsstrecke von in Agarosetropfen auf Titerplatten aufgebrachten Makrophagen in einer Probelösung gemessen wird. Bevorzugt sind monoklonale Antikörper gegen Human-MIF, die von Maus/Maus-, RattelRatte- oder Ratte/Maus-Hybridoma-Zellen produziert werden. Beispiele für solche bevorzugte erfindungsgemässe monoklonale Antikörper sind der monoklonale Antikörper der Subklasse IgG1K mit der Bezeichnung 1C5, der von der Hybridoma-Zellinie 1C5 produziert wirds und der monoklonale Antikörper der Subklasse IgG2a mit der Bezeichnung 7D10, der von der Hybridoma Zellinie 7D10 produziert wird. Die monoklonalen Antikörper 1C5 und 7D10 binden an Human-MIF, ohne seine biologische Aktivität zu hemmen. Erfindungsgemässe Derivate von monoklonalen Antikörpern sind beispielsweise Bruchstücke, wie Fab, Fab' oder F(ab')z-Fragmente, die ihre Spezifität für die antigenen Determinanten von Human-MIF beibehalten, radioaktiv markierte monoklonale Antikörper, die beispielsweise mit radioaktivem Iod (1251, 1311), Kohlenstoff (1WC), Schwefel (35S), Tritium (3H) oder dergleichen markiert sind, monoklonale Antikörper-Konjugate mit Biotin oder Avidin oder monoklonale Antikörper-Konjugate mit Enzymen, wie Meerrettich Peroxidase, alkalischer Phosphatase, ss-D-Galactosidase, Glucose Oxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylchlolinesterase, Lysozym, Malat-Dehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Bevorzugte Derivate sind mit l25Iod markierte monoklonale Antikörper und Antikörper-Konjugate mit Biotin. Die Erfindung betrifft auch an sich bekannte Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper gegen Human-MIF und ihrer Derivate, gekennzeichnet dadurch, dass nan besagte monoklonale Antikörper produzierende Hybridona-Zellen a) in vitro kultiviert und aus den Kulturüberständen die mono klonalen Antikörper isoliert, oder b) in vivo in einen geeigneten Saugetier vermehrt und aus den Körperflüssigkeiten dieses Säugetiers die monoklonalen Antikörper isoliert, und, c) wenn erwünscht, einen erhaltenen monoklonalen Antikörper in ein Derivat davon überführt. Geeignete Kulturmedien flir die in vitro Kultivierung nach Verfahren a) sind die üblichen Standard-Kulturmedien, beispielsweise Dulbecco's Modified Eagles-Medium oder RPNI 1640-Medium, gegebenenfalls ergänzt mit fötalen Kälber-Serum. Zur Isolierung der monoklonalen Antikörper werden die Proteine in den Kulturüberständen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen gefällt und mit den üblichen chromatographischen Methoden, beispielsweise Gel-Filtration, Ionenaustauscher-Chromatographie, Chromatographie an DEAE-Cellulose oder Immunaffinität-Chromatographie, gereinigt. Grosse Mengen der gewiinsehten Antikörper können erhalten werden durch Vermehrung der Hybridoaa-Zellen in vivo genass Verfahren b). Dazu werden Zellklone in Säugetiere, bevorzugt in syngene Säugetiere injiziert und nach 1-3 Wochen die monoklonalen Antikörper aus den Körperflüssigkeiten dieser Sauger isoliert. Beispielsweise werden Hybridenn-Zellen abstammend von Balb/c-Mäusen intraperitoneal in gegebenenfalls mit einen Kohlenwasserstoff wie Pristan vorbehandelte Balb/c-Mäuse injiziert und nach 8-10 Tagen diesen Tieren Aszitesflüssigkeit entnommen. Die gewünschten monoklonalen Antikörper werden aus den rperfllissigkeiten nach an sich bekannten Methoden isolier, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder dergleichen und chromatographische Reinigung, z.B. über DEAE Cellulose, Hydroxylapatit (HPHT, high performance hydroxylapatite column chromatography), Ionenaustauscherharz, durch Gel-Filtrstion oder Immunaffinitäts-Chromatographig. Erfindungsgemässe Bruchstücke von monoklonalen Antikörpern, beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab')2-Fragmente, die ihre Spezifität für die antigenen Determinanten von Human-MIF beibehalten, werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Behandlung von nach Verfahren a) oder b) hergestellten monoklonalen Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain und/oder Spaltung von Disulfid-Bindungen durch chemische Reduktion. Mit Iod (l25I, 131I) radioaktiv markierte monoklonale Antikörper werden aus den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpern durch an sich bekannte lodierung, beispielsweise mit radioaktivem Natriumoder Kaliumiodid und einem chemischen Oxidationsmittel, wie Natriumhypochlorit, Chloramin T oder dergleichen, oder einem enzymatischen Oxidationsmittel, wie Lactoperoxidase, Glucoseoxidase und Glucose, erhalten. Erfindungsgemässe radioaktiv markierte monoklonale Antikörper werden auch hergestellt, indem man auf an sich bekannte Weise den Kulturmedien für die in vitro-Rultivierung radioaktiv markierte Nährstoffe enthaltend radioaktiven Kohlenstoff (1WC), Tritium (3H), Schwefel (35S) oder dergleichen, beispielsweise L-(14C)-Leucin, L-(3H)-Leucin oder L-(35S)-Methionin, zugibt und die monoklonalen Antikörper nach Verfahren a) gewinnt. Enzymrmarkierte erfindungsgemässe monoklonale Antikörper erhält man nach an sich bekannten Methoden, indem man nach Verfahren a) oder b) hergestellte monoklonale Antikörper und das gewünschte Enzym mit einem Kupplungsreagens, beispielsweise Glutaraldehyd, Periodat, N,N'-o-Phenylendimaleimid, N-(m-Maleimidobenzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2'-Pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid oder dergleichen, umsetzt. Gleichermassen erhält man Konjugate von erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpern mit Avidin. Konjugate mit Biotin erhält man nach an sich bekannten Methoden, index man erfindungsgemässe monoklonale Antikörper beispielsweise mit Biotin-N-hydroxysuccin- imidylester umsetzt. Die Erfindung betrifft ferner Hybridoma-Zellinien, dadurch gekennzeichnet, das sie monoklonale Antikörper gegen Human-Makrophagen Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF) produzieren, Bevorzugt sind -onoklonale, gegen Human-MIF gerichtete Antikörper produzierende Hybridoma-Zellinien, die Hybride von Maus-Myelona Zellinien und Maus- oder Ratten-Lymphozytem sind. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridoma-Zellinie mit der Bezeich nung 1C5, die an 13.7.1984 in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-316 hinterlegt worden ist. Die Zellinie 1C5 ist ein Hybrid der Maus-Myelona-Zellinie F3-X63-Ag8.653 und eines B-Lymphozyten der Hilz einer Balb/c-Maus. Gleichermassen bevorzugt ist die Hybridoms Zellinie mit der Bezeichnung 7D10, die an 29.1.1985 in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganisues" des Institut Pastenr in Paris unter der Nummer I-418 hinterlegt worden ist. Die Zellinie 7010 ist ein Hybrid der Maus-Myelona-Zellinie P3-X63-Ag8.653 und eines B-Lyiphozyten der Milz einer DA-Ratte. Beide Zellinien sind genetisch stabil, scheiden nonoklonale Anti k5rper gleichbleibender Spezifität aus und können aus tiefgefro- renen Kulturen durch Anftauen und Ra-Klonierung aktiviert werden. Die Erfindung betrifft ferner an sich bekannte Verfahren zur Herstellung von Hybridoms-Zellen, die sonoklonale Antikörper gegen Buean-NIF produzieren, dadurch gekennzeichnet, dass man geeignete Säugetiere mit MIF oder MIP-Koniugaten immunisiert, den Säugetier entnommene Antikörper-produzierende Zellen mit Myelona-Zellen fusioniert, die erhaltenen Hybridona-Zellen kloniert und diejenigen Zellklone, die die gewünschten monoklonalen Antikörper produzieren, selektioniert. Als Antigene können irgendwelche MIF-haltige Protein-Fraktionen oder MIF-Konjugate verwendet werden, z.B. aus menschlichen mononukleären Zellen wie oben beschrieben gewonnene MIF-haltige Protein-Fraktionen oder Konjugate dieser Protein-Fraktionen mit geeigneten immunogenen Trägern, beispielsweise Proteinen, Polysacchariden, Latex-Partikeln oder Zellen. Voraussetzung für die Verwendung von tierischem, z.B. murinem, MIF enthaltenden Protein-Fraktionen ist, dass der betreffende tierische MIF und Human-MIF identische Epitope aufweisen. Konjugate werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Kopplung mit Carbodiimiden, Periodat, Glutaraldehyd, N,N'-o-Phenylendimaleimid, N-(m-Maleimidobenzoyloxy)succinimid, N-(3-(2'-Pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid oder dergleichen. Bevorzugt werden zur Immunisierung Konjugate von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Schaf-Erythrozyten und MIF-haltigen Protein-Fraktionen aus menschlichen oder aus Mäuse-Zellen eingesetzt. Bevorzugte Säugetier zur Immunisierung mit Human-MIF sind Mäuse oder Ratten, insbesondere Balb/c-Mause. Zur Immunisierung mit Maus-MIF werden bevorzugt Ratten, z.B. DA-Ratten, verwendet. Die Immunisierungen werden in an sich bekannter Weise vorgenommen, beispielsweise indem man drei bis acht Injektionen parenteral, z.B. intraperitoneal und subcutan mit antigenen Human-MIP-Ronjugaten in Abständen von ein bis zehn Tagen verabreicht, gewünschtenfalls zusammen mit einem die Lymphozyten-Produktion anregenden Hilfsstoff, beispielsweise komplettem oder inkomplettem Freund'schen Adjuvans. Es ist auch möglich, die Tiere durch zwei bis vier Injektionen vorzuimmunisieren und erst nach einer Pause von 8 bis 12 Monaten weitere Injektionen zu verabreichen. Antikörper-produzierende Zellen der immunisierten Tiere, vorzugsweise Milzzellen, werden zwei bis sechs Tage nach der letzten Immunisierung den Tieren entnommen und mit Myeloma-Zellen einer geeigneten Zellinie in Gegenwart eines Fusions-Promotors fusioniert. Mehrere verschiedene Myeloma-Zellinien und daraus abgeleitete Zellinien sind bekannt als geeignete Fusionspartner. Bevorzugt sind Myeloma-Zellen, denen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl Transferase (MGPRI) oder das Enzym Thyiidin-Kinase (TK) fehlt und die deshalb in einem selektiven Kulturmedium, das Hypoxanthin, Asinopterln und Thymidin (HAT-Medium) oder Hypoxanthin und Azaserin enthält, nicht überleben. Besonders bevorzugt sind Myelona-Zellen und daraus bergestellte Zellinien, die in HAT-Mediun oder Hypoxanthin/Axaserin-Medium nicht überleben und keine Immunglobuline oder Teile davon ausscheiden, beispielsweise die Zellinien X63-Ag8.653 und Sp2/0-Agl4. Die von Balb/c-Mäusen abstammende Zellinie X63-Ag8.653 ist nicht nur geeignet zur Pusion -lt Lymphoxytem von Mäusen, z. B. Balb/c Mäusen, sonders auch mit Lymphozytem von Ratten, wie DA-Ratten. Als Fusions-Prometer kommen Sendai-Virus oder andere Paranyxoviren, gegebenenfalls in UV-induktivierter Form, Kalzium-Ionen, oberflächenaktive Lipide, vie Lysolezithin, oder Polyäthylenglykol in Frage. Bevorzugt wurden Myelona-Zellen mit einem zwei- bis zehnfachen Deberschuas un Milzzellen aus immunisierten Tieren in einer Lösung enthaltend etwa 30 bis etwa 50 X Polyäthylenglykol eines Molekulargewichte zwischen etwa 1000 und etwa 6000 fusioniert. Nach der Fusion werden die Zellen aufgeteilt.und in selektives HAT-Medium oder Hypoxanthin/Azaserin-Medium kutiviert, wobei nur Hybridonn-Zellen Bberleben, weil diese von den Myelona-Zellen die Fähigkeit zum Wachstum in vitro und von Antikörper-produzierenden Zellen der immunisierten Tiere die fehlenden HGPRT- oder TK-Gene und damit die Fähigkeit zum Ueberleben in selektiven Medium vereinen. Geeignete Kulturmedien für die Expansion der Hybridoma-Zellen sind die ühlichen Standard-Kulturmedien, beispielsweise Dulbecco's Modified Eagles-Medium oder RPMI 1640-Medium. Vorzugsweise werden zu Beginn des Zellwachstu e sogenannte Feederzellen zugegeben, beispielsweise normale peritoneale Mäuse-Exeudatzellen, Hilzzellen, Knochenmark-Makrophagen oder dergleichen. In regelmässigen Inter vallen werden besagte Kulturmedien durch selektives HAT-Medium oder Hypoxanthin/Azaserin-Medium ergänzt, um ein Ueberwachsen der Hybridoma-Zellen durch gewöhnliche Myeloma-Zellen zu verhindern. Die Zellkultur-Ueberstände der Hybridoma-Zellen werden daraufhin untersucht, ob sie die gewünschten monoklonalen Antikörper enthalten. Bevorzugt wird dazu ein Radioimmunoassay, ein Enzymimmunoassay und/oder eine Bestimmung der MIF-Aktivität verwendet, wie sie oben beschrieben sind. Die solchermassen ausgewählten Zellklone werden in den üblichen Standardmedien kultiviert und gewünschtenfalls auf an sich bekannte Weise tiefgefroren und/oder durch begrenzende Verdünnung oder durch Austragen auf Agar rekloniert. Die Erfindung betrifft im weiteren die Verwendung der monoklonalen Antikörper gegen Human-Makrophagen-Migration 5 inhibitionefaktor (Human-MIF) und ihrer Derivate zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-MIF, insbesondere in biologischen Flüssigkeiten und auf Zelloberflächen. Beispielsweise können die erfindungsgemessen monoklonalen Antikörper in irgendeinem der an sich bekannten Immunoassays verwendet werden, die die bindenden Wechselwirkungen zwischen Antigen (Human-MIF) und monoklonalem Antikörper nutzen. Beispiele für solche Assays sind Radioimmunoassays (RIA), Enzym-Immunoassays, Immuno-Fluoreszenz-Tests, Latex-Agglutination oder Hämagglutination. Die erfindungsgemässen Antikörper können als solche oder als radioaktiv markierte Derivate gegebenenfalls in Kombination mit andern markierten Antikörpern und/oder Proteinen in einem Radioimmunoassay (RIA) eingesetzt werden. Irgendeine der bekannten Abwandlungen eines RIA kann verwendet werden, beispielsweise RIA in homogener Phase, Festphasen- oder heterogener RIA, einfacher RIA oder doppelter (Sandwich) RIA mit direkter oder indirekter (kompetitiver) Bestimmung von Human-MIF. Bevorzugt ist ein RIA, bei den ein geeigneter Träger, beispielsweise die Plastik-Oberfläche einer Titerplatte oder eines Test-Rährchens, z.B. aus Polystyrol, Polypropylen oder Polyvinylchlorid, Glas- oder Plastik-Perlen, Filterpapier, Dextrsn-, Celluloseacetat- oder Nitrocellulose-Blatter oder dergleichen, mit einer Husan-XIF-halti- gen Probe- oder Standard-Lösung durch einfache Adsorption oder gegebenenfalls nach Aktivierung des Trägers, beispielsweise -lt Glutaraldehyd oder Bromcyan, beschichtet und mit einer Lösung eines erfindungsgemässen monoklonalen antikörpers und dann mit einer Lösung eines Zweitantikörpers inkubiert wird, wobei der Zweitanti körper, beispielsweise ein Kanischen-anti-Maus-Immunoglobulin, den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper erkennt und bindet. Die Menge gebundenen Zweitantikörpers wird durch Messung der gebundenen Radioaktivität bestimmt, entweder direkt, wenn der Zweitantikörper radioaktiv markiert ist, oder nach Entwicklung mit einen radioaktiv markierten Protein mit hoher Affinität gegenüber diessen Zweitantikörper, beispielsweise 125I-markiertem Protein A aus Staphylococcus aurens. Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können als solche oder als Enzyn-markierte Derivate in einen Enzym-Immunoassay eingesetzt werden. Solche In unoassays sind beispielsweise Test-Anordnungen, bei denen an sich bekannte Enzym-markierte Antikörper, die Epitope der erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper erkennen und binden, oder Enzye-markierte erfindungsgemässe monoklonale Antikörper-Derivate eingesetzt werden. Anstelle von Enzym-markierten Antikorpern können auch Antikörper-Biotin-Konjugate zusammen mit Avidin-Enzym-Konjugaten eingesetzt werden. Beispiele für in Enzym Immunoassays eingesetzte Enzyme sind Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, S-D-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glucoanylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozya, Malat-De- hydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Bevorzugt ist ein ILISA-Test (enzywe-linted immunosorbent assay), in welche man einen Träger, wie er oben fur einen einfachen RIA-Test beschrieben ist und der gewünschtenfalls mit Erythrozyten belegt ist, entweder mit einer Human-MIF-haltigen Probe- oder Standard Lösung durch einfache Adsorption oder gewünschtenfalls nach Aktivierung des Tragers bzw. der Träger-gebundenen Erythrozyten mit Glutaraldehyd beschichtet oder mit auf Human-MIF zu untersuchenden Zellen belegt, anschliessend diesen Träger mit einer Lösung eines erfindungogemässen monoklonalen Antikörpers und schliesslich mit einer Lösung eines Enzym-markierten Zweitantikörpers, der den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper erkennt und bindet, inkubiert. Dabei wird die Menge des gebundenen Zweitantikörpers, beispielsweise eines Peroxidase-markierten Kaninchen-anti-Maus Immunglobulins, durch Entwicklung mit Enzym-Substrat sichtbar gemacht und bestimmt. Besonders bevorzugt ist ein ELISA-Test (enzyme-linked immunosorbent assay), in welchem man einen Träger, wie er oben für einen einfachen RIA-Test beschrieben ist, mit einer Lösung eines erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers durch einfache Adsorption oder gegebenenfalls nach Aktivierung des Trägers, beispielsweise mit Glutaraldehyd oder Bromcyan, beschichtet, anschliessend diesen Träger mit einer Human-MIF-haltigen Probe- oder Standard-Lbsung und schliesslich entweder mit einer Lösung eines Enzym-markierten erfindungsgemässen Antikörpers, der gegebenenfalls ein anderes Epitop von Human-MIF erkennt, oder bevorzugt mit einer Lösung eines mit Biotin konjugierten erfindungsgemdssen Antikörpers gefolgt von einer Lösung eines Avidin-Enzym-Konjugats inkubiert. Dabei wird die Menge des gebundenen Enzym- oder Biotin-markierten Antikörpers durch Entwicklung mit Enzym-Substrat sichtbar gemacht und bestimmt. Bevorzugte Enzyme in den erfindungsgemässen Enzym-Immunoassays sind Meerrettich-Peroxidase, die beispielsweise mit den Enzym-Substraten 5-Aminosalicylsäure, o-Phenylendiamin, 3,3'-Dimethoxybenzidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,2'-Azino-bis-(3-äthylbenzthiazolin6-sulfonsäure) oder dergleichen und Wasserstoffperoxid entwickelt werden kann, und alkalische Phosphatase, die beispielsweise aus dem Enzym-Substrat p-Nitrophenylphosphat p-NStrophenol freisetzt. Die erfindungsgemässe Verwendung von sonoklonalen Antikbrpern gegen Human-MIF und ihrer Derivate zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-HIf u enfasst auch andere an sich bekannte Immunoassays, beispielsweise Immunofluoreszenz-Tests unter Verwendung von Antikörper- oder antigen-Konjugaten mit fluoreszierenden Stoffen, Later-Agglutination mit antikörper- oder Antigen-beschichtteten Latex-Partikeln oder Hänagglutination mit Antikörper- oder Antigen-beschichteten roten Blutkörperchen oder dargleichen. Die beschriebenen Immunoassays können verwendet werden zur Bestim -ing der in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in menschlichen Blut, oder auf Zelloberflachen in fixierter Form vorhandenen Menge Human-MIF und erleichtern daiit die Diagnose von durch Immunregula- tionsstörungen verursachten Krankheiten. Beispielsweise kann bei geringer Infektionsresistenz eine ursächliche Immunregulationsstörung diagnostiziert werden, wenn im Blut keine oder unterdurchschnittliche Mengen von Human-MIF gefunden werden. Ferner kann die Bestimmung von Human-MIF in pathologischen Geweben, z.B. in Melanomen, Granulomen und Ryperplssion, eine einfache Diagnose ermöglichen, weil MIF nur in bestimmten Gewebetypen und nur in bestimmten pathologischen Zuständen verkommt (Tabelle). Tabelle: Bindung des monoklonalen Antikörpers 1C5 an gefrorene Gewebe schnitte EMI19.1 <tb> Normale <SEP> Gewebe: <tb> A) <SEP> Leber <tb> B) <SEP> Milz <SEP> + <SEP> (nur <SEP> wenige <SEP> Zellen) <tb> C) <SEP> Haut <SEP> + <SEP> (nur <SEP> wenige <SEP> Makrophagen) <tb> D) <SEP> Lunge <tb> Pathologische <SEP> Gewebe: : <tb> E) <SEP> Primäre <SEP> Melanoma <SEP> (viel <SEP> Zell <tb> <SEP> Infiltrate) <SEP> ++ <SEP> (Zell-Infiltrate) <tb> <SEP> Melanoma-Metastasen <SEP> (wenig <tb> <SEP> Zell-Infiltrate) <SEP> + <SEP> (nur <SEP> wenige <SEP> Zellen) <tb> <SEP> Melanoma-Mikrometastasen <SEP> <tb> <SEP> (in <SEP> Lymphknoten) <SEP> <tb> F) <SEP> BCG-Granuloma <SEP> (1, <SEP> 3 <SEP> oder <SEP> 5 <tb> <SEP> Wochen <SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung) <SEP> - <SEP> + <tb> G) <SEP> Sézary-Syndrom <SEP> + <tb> H) <SEP> Syringolympboide <SEP> Hyperplasie <SEP> + <tb> I) <SEP> Subakutes <SEP> Ekzem <tb> J) <SEP> Hypereosinophiles <SEP> Syndrom <SEP> ¯ <tb> + Bindung nachgewiesen, - keine Bindung nachgewiesen Die Erfindung betrifft auch Test-Kits zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF), dadurch gekennzeichnet, dass sie monoklonale Antikörper gegen Human-MIF und/oder Derivate davon und gegebenenfalls Hilfsmittel enthalten. Erfindungsgemässe Test-Kits für einen Radioimmunoassay enthalten beispielsweise einen geeigneten Träger, gegebenenfalls gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines erfindungsgemässen Antikörpers oder eines radioaktiv markierten erfindungsgemdssen Antikörper-Derivats, Lösungen eines gegebenenfalls radioaktiv markierten Zweitantikdrpers und/oder gegebenenfalls Lösungen von radioaktiv markiertem Protein A aus Staphylococcus aureus, Standardlösungen von gereinigtem Human-MIF oder seiner Einzelproteine, Puffer-Lösungen, Fixier-Lösungen enthaltend Glutaraldehyd, Detergentien zur Verhinderung von unspezifischer Adsorption und Aggregatbildung, Pipetten, Reaktionsgefässe, Eichkurven und dergleichen. Erfindungsgemässe Test-Kits für einen Enzym-Immunoassy enthalten beispielweise einen geeigneten Träger, gegebenenfalls gefriergetrocknets oder konzentrierte Lösungen eines erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers, eines Enzym-markierten oder eines Biotinmarkiertem erfindungsgemässen Antikörper-Derivate, gegebenenfalls gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines Enzym-markier- ten Antikörpers, der die erfindungsgesassen nonoklonalen Antikörper erkennt und bindet, gegebenenfalls gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen von Avidin-Enzym-Konjugaten, Enzym-Substrate is fester oder gel8ster Fori, Standardlösungen von gereinigtes Humen-MIF- oder seiner Einzelproteine, Puffer-Lösungen, Fixier-Lösungen enthaltend Glutaraldehyd, Detergentien, Pipetten, Reaktionsgefässe, Eichkurven und dergleichen. Die Erfindung betrifft in weiteren die Verwendung der nonoklonalen Antikörper gegen Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF) und ihrer Derivate zur Reinigung von Human-MIF. Beispielsweise kann Human-MIF mit an sich bekannten Trenmethoden, deren Trennwirkung auf bindenden Wechselwirkungen zwischen mono- klonalen antikörper und antigenen Determinanten von Human-MIF beruhen, getrennt werden. Eine bevorzugte Trennmethode ist die Immunaffinitäte-Chromatographie, wie sie oben beschrieben ist. Die Erfindung betrifft ii weiteren pharmazeutische Präparate enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von gereinigtes flunan-MiF, seiner Einaelproteine, von monoklonalen Antikörper gegen Human-MIF oder von Derivaten solcher monoklonalen Antikörper und eine eignifikante Menge eines pharmaceutischen Hilfsmittels. Geeignete Derivate von nonoklonalen Antlkörpern sind Bruchstiicke, z.B. Fab, Fab' oder F(ab')z-Fragmente, die ihre Spezifität für die antigenen Determinanten von Human-MIF beibehalten haben. Bei den erfindungsgamässen pharmazeutischen Präparaten handelt es sich um solche zur enteralen, z.B. nasalen, rektalen oder oralen, sowie bevorzugt zur parenteralen, z.B. intramuskulären, subcutanen oder intravenösen, Verabreichung an Wsrmblüter, z.B. den Menschen. Je nach beabsichtigter Methode der Verabreichung können die pharmazeutischen Präparate in Dosiseinheitsform, z.B. in Ampullen, Vials, Suppositorien, Dragees, Tabletten, Kapseln oder Nasalsprays in flüssiger oder fester Form vorliegen. Die zu verabreichende Menge der therapeutisch wirksamen Verbindungen hängt vom Zustand des Warmblüters, z.B. des Menschen ab, wie dem Körpergewicht, der Art und Schwere der Erkrankung und dem Allgemeinzustand, ferner von der Art der Verabreichung, und erfolgt gemäss der Einschätzung des behandelnden Arztes. Die wirksame Dosis für Human-MIF und seine aktiven Sinzelproteine liegt in der Grössenordnung von 0,001-1 pg pro kg Körpergewicht und Tag, fUr monoklonale Antikörper gegen Human-MIF und deren Derivate in der Grössenordnung von 0,001-1 mg pro kg Körpergewicht und Tag. Die erfindungegemassen pharmazeutischen Präparate enthalten die üblichen anorganischen oder organischen, festen oder flüssigen pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffe, gegebenenfalls zusammen mit anderen therapeutisch wirksamen Verbindungen und/oder Hilfe stoffen. Vorzugsweise verwendet man Lösungen oder Suspensionen des Wirkstoffes, insbesondere isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen, ferner auch lyophilisierte Präparate, welche kurz vor Gebrauch in Wasser gelöst werden. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und/oder Konservierstoffe, Stabilisiermittel, Netzmittel, Emulgiermittel, Löslichkeitsvermittler, viskositäts-erhöhende Stoffe, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer, ferner auch andere Proteine, z.B. Human-Serum Albumin oder menschliche Blutplasma-Präparate, enthalten. Bevorzugt sind pharmazeutische Präparate in Form von Liposomen in wässriger Dispersion enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von gereinigtem Human-MIF oder seiner Einzelproteine. Geeignet sind insbesondere Liposomen mit einer Population von möglichst honogener Grösse und einem Durchmasser von ca. 2,0 x 10-8 bis 5,0 x 10-8 m bestehend aus einer oder mehreren Doppel schichten von Lipidkompo- nenten, beispielsweise anphipatischen Lipiden, z.B. Phospholipiden, wie Lecithin' Kephalin oder Phosphatidsäurs, und gegebenenfalls neutralen Lipiden, s.B. Cholesterin, unschliessend einen wässrigen Innenraum mit erfindungsgemässen gereinigtem Human-MIF oder seinen Einzelproteinen. Bevorzugt sind Liposonen aus einen Gemisch von synthetischen Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin. Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, schränken jedoch deren Umfang in keiner Weise ein. Die in den Beispiele verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: ELISA Enzym-Assay (enzyme-linked immunosorbent assay) HAT Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin HPLC Hochdruck-Flüssigchromatographie (high pressure liquid chroiatography) HT Hypoxauthin/Thymidin Min. Minute(n) MIF Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor PBS Pbosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung RIA Radioimmunno-Assay SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese SRBC Schaf-Erythrosyten Std. Stunde(n) Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan upm Undrehtungen pro Minute Beispiel 1: Gewinnung einer Protein-Fraktion enthaltend Human-MIF Mononukleäre Zellen werden aus "buffy coat", der Schicht weisser Blutkörperchen, die eich bei der Zentrifugation von nit Citrat oder Heparin versetzten venösen Blut abscheidet, gewonnen und gereinigt durch eine Zwei-Schritt-Methode bestehend aus Leukapherese und kontinuierlicher Zentrifugation über einen Ficoll -Gradienten im IBM Blut-Zellseparator (IBM 2997) [U. Feige und C. Sorg, J. Immunol. Methods 66, 161 (1984)1. Die mononukleären Zellen werden in Spinner Medium (Seromed) gewaschen, dann in einer Konzentration von 5 x 106 Zellen in 0,17 ml RPMI 1640 Medium pro cm2 Kulturgefässboden filr 2 Std. mit 0,67 Bg Concanavalin A pro 106 Zellen stimuliert. Erneuerung des Mediums RPMI 1640 und anschliessende 20stündige Inkubation bei 37 C und 5 % CO2-Begasung liefert den Lymphokine enthaltenden Kulturüberstand. Dieser wird 30 Min. bei 17'000 upm (SS34 Rotor, Sorvall-Zentrifuge) bei 4 C zentrifugiert. Der zellfreie Ueberstand wird über Sephadex G25, das in 0,05M NH4HCO3 äquilibriert ist, entsalzt und die Protein enthaltenden Fraktionen anschliessend lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 0,01M Natriumphosphat-Puffer pH 7,5, dem 0,1M NaCl zugesetzt ist, aufgenommen und im gleichen Puffer über Sephadex G100 chromatographiert. Die Human-MIF enthaltenden Fraktionen umfassend Proteine im Molekulargewichtsbereich 8 bis 14 k & Mol (Kilo-Dalton) werden vereinigt und durch Einengen an einem Rotavapor 16fach aufkonzentriert. Beispiel 2: Herstellung der Hybridoma-Zellen 2.1 Konjugation von Human-MIF enthaltenden Protein-Fraktionen an Schaf-Erythrozyten 2,5 ml gepackte Schaf-Erythrozyten (sheep red blood cells, SRBC, Behringwerke) werden in 20 ml PBS suspendiert. 100 p1 dieser SRBC-Suspension werden mit 900 p1 einer Glutaraldehyd-Lösung in PBS während 5 Min. inkubiert, so dass die Endkonzentration des Glutaraldehyds 0,05 % beträgt. Die derart vorbehandelten SRBC werden zweimal mit eiskaltem dest. Wasser gewaschen, abzentrifugiert und anschliessend während 1 Std. bei 20 C mit 300 p1 der Human-MIF enthaltenden Fraktionen aus Beispiel 1 inkubiert. Diese Suspension wird zur Immunisierung eingesetzt. 2.2 Immunisierung Balb/c-Mäuse werden durch 3 Injektionen von je 0,5 al der nit Human-MIF gekoppelten SRBC-Suspension aus Beispiel 2.1 zusammen mit 0,5 ml kcpletten Freund'schen Adjuvans an Tag 0, 7 und 10 immuni- siert. Dabei wird eine Hälfte der Injektionsmenge intraperitoneal (i.p.), die andere Hälfte in vier Portionen subcutan (s.c.) injiziert. Zwei weitere ("boester") Injektionen von je 0,5 nl Konjugat Suspension ohne Adjuvans werden am Tag 13 und 14 i.p. verabreicht. Die Milz der behandelten Weise wird am tag 18 entnommen. 2.3 Zellfusion Entsprechend den Verfahren von Köhler und Hilstein CG. Kohler und C. Hilstein, Nature 256, 495 (1975)] werden 106 Milz-Lyaphozyten mit 3,3 x 107 Mauz-Myelomazellen P3-X63-Ag8.653 [J.F. Kearney, A. Radbruch, B. Liesegang und K. Rajewsky, J. Immunol. 123, 1548 (1979)) in 1,5 sl einer Lösung von 35 % Polyäthylenglykol 4000 (Merck, Darmstadt) und 9,7% Dimethylsulfoxid in Dulbecco's Modified Bagle Medium vermischt. Mach der Fusion verden die Zellen in óOO Lbchern von Falcon 3040 96-Loch-Platten ausplattiert und in Littlefielde HAT-Medium (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-Standardmedium) [J.F. Littlefield, Scieuce 145, 709 (1974)) zusammen mit Knochenmark-Makrophagen als Peeder-Zellen kultiviert. Nach 10 Tagen in NAT-Medium wird in RPMI 1640 HI-Medium veiterkultiviert. Beispiel 3: Prüfung der Hybridome-Zellen auf Antikörper-Spezifität 3.1 &gamma;-Globulin-Eachweis Die Uberstände der Hybridona-Zellkulturen werden in einen ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) gepriift, bei den ein mit Peroxidase konjugierter Zweitantikbrper aus Kaninchen, der Maus-&gamma;-Globulin erkennt und bindet, eingesetzt wird. Von 103 Hybridome-Zellinien produzieren 72 Klone y-Globuline. 3.2 Spezifität auf Proteine im gewünschten Molekulargewichts- Bereich Syngene Maus-Erythrozyten (1 x 106 Erythrozyten in 100 p1 PBS pro Loch) werden auf mit poly-L-Lysin (25 mg/ml) beschichtete 96-Loch Platten (Dynatech Microtiter) aufgebracht und über Nacht bei 40C inkubiert. Nicht gebundene Erythrozyten werden durch mehrmaliges Waschen mit PBS entfernt. Die so gebundenen Erythrozyten werden wie in Beispiel 2.1 beschrieben in Glutaraldehyd anfixiert, gewaschen und anschliessend mit den Human-MIF enthaltenden Fraktionen im Molekulargewichts-Bereich 8 bis 14 kg/Mol (Beispiel 1) inkubiert. Nicht gebundenes Protein wird durch mehrmaliges Waschen entfernt und die Platten in PBS enthaltend 0,1 % NaN3 gelagert. Die Platten werden mit Kulturüberstand der Hybridoma-Zellen, anschliessend mit einem mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Kaninchen-anti-Maus-Immun- globulin-Zweitantikörper inkubiert und mit p-Nitrophenylphosphat in 2-Amino-2-äthyl-1,3-propandiol-Puffer (Serva) entwickelt. Das freigesetzte p-Nitrophenol wird photometrisch bei 405 nm nachgewiesen. Durch den beschriebenen ELISA werden monoklonale Antikörper erkannt, die an die Erythrozyten-gekoppelten Proteine der Human-MIF enthaltenden Molekulargewichtsfraktionen aus Beispiel 1 binden. Von den 72 Zellklonen, die t-Globuline ausscheiden, produzieren 15 Klone monoklonale Antikörper, die in diesem Assay gebunden werden. 3.3 Spezifität auf Human-MIF y-Globuline aus den Kulturüberständen der gemäss Beispiel 3.2 identifizierten Klone werden mit Ammoniumsulfat bei 50 % Sättigung gefällt, die Fällungen in PBS aufgenommen und nach einer Vorschrift des Herstellers an Affi-Gele 10 (Bio-Rad) gekoppelt. Die so immobilisierten t-Globuline werden mit Human-MIF enthaltenden Ueberständen von mit Concanavalin A stimulierten mononukleären Zellen (Beispiel 1) über Nacht bei 40C inkubiert und anschliessend bei 3000 upm und 40C 10 Min. in einer IEC-Zentrifuge zentrifugiert. Die über- stehende Lösung wird anschliessend auf ihren Rest-Gehalt an Human-MIF in MIF-Test gemäss Beispiel 4 überprüft. Auf diese Weise wird eine Zellinie mit der Bezeichnung 1C5 identifiziert, die monoklonale Antikörper gegen Human-MIF produziert. Beispiel 4: Test auf Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (MIF-Test) 4.1 Herstellung des Percoll-Gradienten 9 Teile Percoll der Dichte 1,007 (Pharmacia), 1 Teil 10-fach konzentriertes NEN Earl's Medium (Seroaed) und 10 Teile Spinner Medium (Seromed) werden 12 Hin. bei 12'000 upn in einer Sorvall Zentrifuge (DuPont) bei 20 C vermischt. 4.2 Zielzellgewinnung für den MIF-Test "Buffy coat", d.h. Zellkonzentrat weisser Blutkörperchen, von 9-12 Spenders wird nit Spinner-Medium (Seromed) in Verhältnis 1:2 verdünnt, auf 20 C erwärmt und auf Ficoll paque (Pharmacis) nach Vorschrift des Herstellers bei 20 C aufgetrennt. Die mononukleären Zellen der Interphase werden nach der Zentrifugation zweimal nit den gleichen Medium gsssechen, dann in eine. nach Beispiel 4.1 hergestellten Percoll-Gradienten durch Zentrifugation in 40 Min. bei 200C und 1600 upm in einer IEC-Zentrifuge in Monozyten und Lyphozyten aufgetrennt. Die Monozyten werden dreimal mit Spinner-Medium gewaschen, in McCoy'n Medium (Seromed), dem 20 % Pferdeserum zugesetzt ist, aufgenommen und aber Nacht bei 370C und 7 % CO2-Begasung in selben Medium in Teflon-Säckchen kultiviert. 4.3 Durchfüchrung des Nil-Tests Die kultivierten Monozyten aus Beispiel 4.2 werden zweimal in MEM-Dulbecca Medium (Sermed) gewaschen und in eine Gemisch aus einen Teil doppelt-konzentrierten MEM-Dulbecco Medium und eines Teil 0,4%iger Agarone (Miles) so aufgenommen, dass die Zellkonzetration 5 x 10e Zellen pro ml beträgt. Diese Zellsuspension wird in Tropfen zu 1 pl mittels einer Hanilton-Spritze in die inneren 60 Löcher einer 96-Loch-Platte (Palcon, Microtest III) pipettiert. Nach 15 Min. bei 4'C ist die Agarose erstarrt. Anschliessend werden 100 pl der zu testenden Probelösungen pro Loch aufgegeben. Als Kontroll-Lösung wird MEM-Dulbecco Medium, dem 1 % Pferdeserum zugesetzt ist, verwendet. Verdünnungen der zu testenden Probelösungen werden im selben Medium hergestellt. Inkubiert werden die Platten für 15 Std. bei 370C in einer feuchten Atmosphäre und 7 % COz-Begasung. Gemessen wird die Wanderung der Monozyten aus den Agarose-Tropfen mit Hilfe eines skalierten Fadenkreuzes im Okular eines Mikroskopes. Die Messung wird so durchgeführt, dass man die eine Achse des Fadenkreuzes tangential an den Tropfenrand legt und mit der senkrecht dazu stehenden Achse die Strecke vom Tropfenrand bis zur Wanderungsgrenze der Zellen bestimmt. Die Wanderung der Zellen in der Kontroll-Lösung, gemessen in Skalenteilen, wird als 100 % Wanderung bzw. 0 % Wanderungshemmung festgelegt. Darauf bezogen wird die in den Probelösungen erreichte Wanderungsstrecke als % Hemmung der Wanderung ausgedrückt. Die biologische Aktivität einer Probelösung wird in MIF-Einheiten ausgedrückt. Eine MfF-Einheit ist definiert als jene biologische Aktivität, die in der beschriebenen Test-Anordnung 30 % Wanderungshemmung hervorruft. Die Anzahl MIF-Einheiten einer Probelösung entspricht demnach dem Faktor, um den diese Lösung verdünnt werden muss, um gerade 30 % Wanderungahemmung hervorzurufen. Beispiel 5: Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper aus Aszites Balb/c Mäuse werden intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan (Carl Roth) vorbehandelt. Nach einer Woche werden 2 bis 5 x 106 klonierte Hybridoma-Zellen intraperitoneal injiziert. Aszitische Flüssigkeit wird von jeder Maus wiederholt genommen und bei -800C gefroren. Die gesammelte Flüssigkeit wird aufgetaut und 30 Min. bei 40C mit 16'000 upm zentrifugiert. Das Fett wird abgesaugt und zum verbleibenden Debris-freien Ueberstand langsam unter Rühren bei OOC eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugetropft, bis eine Konzentration von 50 % erreicht ist. Die derart ausgefällte rohe Immun globulin-Fraktion wird mit 0,1M Tris-HCL (pH 8,2) über DEAE Affi-Gel Blue (Bis-Red) gemäss den Angaben des Herstellers chromato graphiert. Aktive Fraktionen werden vereinigt und mit Anicon XM50-Filter (Amicon) konzentriert. Beispiel 6: Herstellung einer Austikörper-Säule Affi-Gal 10 (Bio-Rad) wird nach den Angaben des Herstellers nit kalten destillierten Wasser und Kupplungspuffer pH 7,5 (MOPS, 3-(N-Morpholino)propensulfonsäure) gewaschen. Eine 50 %ige Suspension des Gels in Kupplungspuffer (1 ml) wird in ein Plastikrohr übertragen, mit der gleichen Menge gereinigter Antikörperlösung (20 mg monoklonale Antikörper 1C5) vernischt und 4 Std. bei Ziner- temperatur rotiert. Danach wird das Gel mit Kupplungspuffer gewaschen. Zar Blockierung der noch freien aktiven Stellen wird das Gel mit 0,1 ml 1M Aethanolamin-HCl (pH 8,0) pro ml Gel während 2 Std. bei Raumtemperatur behandelt, dann mit PBS enthaltend 10 mM Natriumoxid pro ml. Gel gewaschen und darin bei 40C gehalten. Der Kuppelungsgrad wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt und beträgt 12 bis 30 mg monoklonaler Antikörper pro ml Gel. Beispiel 7: Isolierung und Reinigung von Human-MIF-Proteinen 7,1 Produktion von Human-MIF 101l mononukleäre Zellen werden nach der in Beispiel 1 be- schriebenen Verfahren aus "buffy coat" isoliert und nit Concanavalin A (ConA) zur Lymphokinproduktion stimuliert. Die stimulierten Zellen werden in Nunc-Wannenstapeln mit einer Kulturfläche von je 6000 cmê bei einer Zellkonzentration von 5 x 106 Zellen in 0,25 isl Medium RPMI 1640 pro cu2 Oberfläche bei 37 C und 5 X CO2-Begasung 24 Std. kultiviert. Danach wird der Zellkulturüberstand 30 Min. bei 35000 g und 40C zentri fugiert. Der klare Ueberstand wird mit Phenylmethansulfonyl- fluorid, einem Serinprotease-Inhibitor, (Endkonzentration: 50 Mol/l) und mit Natriumazid (Endkonzentration: 0,05%) versetzt. 7.2 Konzentration des Zellkulturiiberstandes Die Zellkulturüberstände aus Beispiel 7.1 werden mittels Ultrafiltration in einer Amicon Rührzelle über eine YMS-Membran (nominelle Trenngrenze: Molekulargewicht 5 kg/Mol) 15-fach konzentriert. Um Verluste durch Adsorption zu vermeiden und einer möglichen Aggregation der Proteine entgegenzuwirken, wird die Ultrafiltration unter Zugabe von Triton X-100 (Alkylphenyl polyäthylenglykol, Rohm & Haas) durchgeführt; die Endkonzen tration an Triton X-10O beträgt ca. 0,2 % (w/v). Das Konzentrat wird bei 35000 g zentrifugiert und durch einen 0,25 pm Filter (Nillipore) filtriert. 7.3 Immunaffinit8tschromatographie 1 1 des Lymphokin-Konzentrates aus Beispiel 7.2 wird bei 40C mit einer Flussrate von ca. 10 ml/Std. durch eine Antlkörpersäule (Beispiel 6) enthaltend 4 ml Gel mit einem Kupplungsgrad von 12 mg Antikörper pro ml Gel gepumpt. Unspezifisch gebundene Proteine und Begleitsubstanzen werden durch Waschen mit 100 ml PBS/ 0,5 M NaCl/ 0,2 % Triton X-1000/ 0,02 % Natriumazid, pH 7,3, dann 20 ml PBS und schliesslich 10 ml 0,1 M NaCl bei einer Flussrate von 15 ml/Std. aus der Säule eluiert. Die spezifisch gebundenen Human-MIF-Proteine werden mit einer Lösung von 0,1 M Glycinhydrochlorid/ 0,1 M NaCl, pH 2,6, eluiert, wobei die Elution durch automatische Messung der Absorption bei 280 nm (Uvicord S, LKB Instruments) verfolgt wird. Um Verluste durch Adsorption zu vermeiden, wird das Eluat fraktionsweise (je 3 ml) in Polypropylen-Röhrchen, die je 100 p1 einer 3 % SDS-Lösung enthalten, aufgefangen. Die Protein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch Zugabe von 1 M Tris-Lösung neutra lisiert. 7.4 Elektrodialyse, elektrophoretische Konzentration Das neutralisierte Eluat aus Beispiel 7.3 wird mittels eines "ISCO Electrophoretic Concentrators" Model 1750 (Isco. Inc.) und einer Spectrapor -Membran (Spectrum Medical Industries) mit einer nominallen Trenngrenze Molekulargewicht 3,5 kg/Mol gegen 25 mM Ammoniumacetat/0,01 X SDS, pH 8,3 dialysiert und gleich zeitig auf ein Volumen von 0,2 ml konzentriert. Das dialysierte Konzentrat wird zur Entfernung des Ammoniumacetate in einer Vakuumzentrifuge (Speed Vac Concentrator, Savant Inc.) zur Trockne eingedampft. 7.5 Analyse der MIF-Proteine durch SDS-Polyacrylsaidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) Ein Aliquot (ca. 2 %) des dialysierten Konzentrates (Bei spiel 7.4) wird nach der Methode von Laemmli [U.K. Laemali, Nature 227, 680-685 (1970)] auf 15% Polyacrylamid-Flachgel einer Elektrophorese unterworfen. Die Proteinbanden werden durch Aufärbung mit Comassie Brillantblau (Fluka) und mit der Silber färbungsmethode nach C.R. Merril at al. [Anal. Biochem. 110, 201 (1981)] sichtbar gemacht. Das von der Antikörpersäule eluierte Haterial enthalt danach Proteine nit Molekulargewicht ca. 8 kg/Mol und ca. 14 kg/Mol. ferner vergleichsweise geringe Mengen mit Molekulargewicht ca. kg/Mol und ca. 45 kg/Mol. 7.6 Charakterisierung der MIF-Aktivität der durch Immunaffinitäts Chromatographie isolierten Proteine Eine verlusterme präparative Auftrennung und Isolierung der Einzelproteine von Humna-MIF geschieht vorteilhafterweise in Gegenwart eines Detergens, z.B. von SDS (siehe Beispiele 7.3, 7.4 und 7.7). Die MIF-Aktivität der Proteine wird durch die Wechselwirkung mit SDS zerstört. Die MIF-Aktivität wird den einzelnen Molekulargewichtsfraktionen mit Hilfe von biosyn thetisch radioaktiv markierten Lymphokinen wie folgt zugeordnet: 10 humane mononukleäre Zellen in 5 ml RPMI 1640 Medium, das 3 PS Concanavalin A pro nl enthält, suspendiert und in einen Zellkulturgefäss mit 25 cmê Oberfläche (Nuncoln TC 25) 2 Std. bei 37'C unter 3 X CO2-Begasung inkubiert. Anschliessend wird das Medium entfernt und die Zellen in Laucin-freien RPMI 1640 Medium, der 10 FCi L-[U-14C]Leucin (Amershan) pro nl zugefügt wird, 20 Std. kultiviert. Der radioaktive Zellkulturüberstand wird mit 500 ml nichtmarkiertem, Human-MIF enthaltendem Zellkul turüberstand (Beispiel 7.1) vereinigt und, wie in Beispiel 7.2 beschrieben, 15-fach konzentriert. Analog Beispiel 7.3 werden die Human-MIF-Proteine durch Immunaffinitäts-Chromatographie mit einer Säule enthaltend 0,5 ml Gel isoliert, wobei das Eluat ohne SDS-Zusatz aufgefangen wird. Nach Neutralisation mit 1 M Tris-Lösung wird das Eluat durch Chromatographie über eine Sephadex G 25 Säule (Pharmacia) in 50 mM Ammoniumbicarbonat Lösung überführt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml PBS gelöst und bei ca. 35000 g zentrifugiert. Ein Aliquot von 0,1 ml wird mittels HPLC auf einer Bio-Sils TSK-125 Säule (7,5 x 300 mm, BioRad) fraktioniert. Die Fraktionen werden durch Messung der Radioaktivität (als Mass für markierte Proteine) und durch Bestimmung der MIF-Aktlvität (Beispiel 4) charakterisiert. Die RadioaktQvität und MIF-Aktivität befinden sich in den gleichen Fraktionen, deren Position Molekulargewichtsbereichen von ca. 8 kg/Mol bzw. ca. 14 kg/Mol entsprechen. Ein weiteres Aliquot des radioaktiven Eluats wird analog Beispiel 7.5 einer SDS-PAGE unterworfen. Die radioaktiven Proteine werden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Starke Banden erscheinen in Molekulargewichtsbereichen von ca. 8 kg/Mol und ca. 14 kg/Mol, schwachere Banden in den Bereichen von ca. 28 kg/Mol.und ca. 45 kg/Mol. 7.7 Präparative Trennung der Human-MIF-Proteine durch SDS-PAGE und Isolierung durch Elektroelution Nach Beispiel 7.4 aufbereitetes Material aus ca. 50 1 Zell kulturüberständen wird durch SDS-PAGE in einem diskonti nuierlichen Puffersystem nach der Methode von Laemmli {Nature 227, 680 (1970)1 in einem vertikalen Slab-Gel-Elektro phorese-System aufgetrennt. Die Probe wird in 300 p1 einer Pufferlösung der Zusammensetzung 0,05 M Tris'HCl/ 3 % (w/v) SDS/ 0,02 M Dithiothreitolf 10 % (vor) Glycerin, pH 6,8, aufgelöst und in einer Breite von 1,5 cm auf das 1,5 mm dicke Gel ent haltend 15 % Acrylamid aufgetragen. Um einer möglichen Derivati sierung der Proteine durch freie Radikale und Oxidantien in Gel vorzubeugen, wird dem Kathodenpuffer Natriumthioglycolat in einer Konzentration, von 0,1 rH zugegeben (siehe M.W. Nunkspiller et al., Methode in Eazymology 91, 227 (1983)1. Zur Sichtbarmachung der Proteine wird das Gel für 5 Min. in eine eiskalte Q,25 X KCL-Lösung gelegt [siebe D.A. Hager und R.R. Durgess, Anal. Biochem. 109. 76 (1980)]. Sichtbare Bandes in der Molekulargewichtsregion von 8 kg/Mol und 14 kg/Nol werden herausgeschnitten und die Proteine ait einer von Bhown et al. Anal. Biochem 103, 184 (1980)] beschriebenen Technik aus den Gel eluiert. Nierze werden in einen "ISCO Electrophoretic Concentrator", Model 1750 (Isco Inc.) mit einer Spectropor Membran (Spectrum Medical Industries, nominelle Trenngrenze 3,5 kg/Mol) die Proteine bei einer Leistung von 2 Watt nit 0,05 M Ammoniumacetat/ 0,01 % SDS in 8 Std. eluiert. Die eluierten Proteine befinden sich in "empling cup" in eines Volumen von ca. 150 l und sind frei von Puffersubstanzen (Glycin, tris). Zur Entfernung des Ammoniumacetates werden die Elektrocluste in einer Vakuumzentrifuge (Speed Vac Concentrater, Savant Inc.) nr Trockene eingedampt. Die Monogenität der eluierten Proteine und die Ausbeuten werden Überpräft, inden jeweils ca. 5 % der Eluate einer analytischen SDS-PAGE unterzogen werden (Beispiel 7.5), wobei parallel zu den Proben definierte Mengen von Proteinen nit bekannten Nolekular- gewichten der Elektrophorese unterworfen werden. SDS-PAGE zeigt in Klust aus der Molekulargewichtsregion 8 kg/Mol eine homogene Proteinbande und in Klust aus der Molekulargewichtsregion 14 kg/Mol eine homogene Bande. 7.8 Präparative Trennung und Isolierung der Human-MIF-Proteine durch Gel-Filtration-HPLC 2 1 eines Konzentrates von Human-MIF enthaltenden Kulturüber ständen aus Beispiel 7.2 werden nit einer Flussrate von ca. 15 nl/Std. durch eine Antikörpersäule (Beispiel 6) enthal tend 5 ml ml mit einen Kupplungsgrad von ca. 12 ag 1C5 Anti körper pro ml Gel gepumpt. Die Säule wird analog Beispiel 7.3 gewaschen und die spezifisch gebundenen Human-MIF-Proteine mit 0,1 M Glycinhydrochlorid / 0,1 M NaCl, pH 2,6, eluiert, wobei das Eluat fraktionsweise in Polypropylen-Röhrchen ohne Zusatz von SDS aufgefangen wird. Die Elution wird durch Messung der Absorption bei 280 nm und durch Bestimmung der MIF-Aktivität (Beispiel 4) verfolgt. Die vereinigten Eluate aus 4 Ansätzen (aus insgesamt 8 1 Kultur übersstand-Konzentrat) werden analog Beispiel 7.4 gegen 0,005 M Ammoniumacetat, pH 7,5, dialysiert.und gleichzeitig auf ein Volumen von 0,2 ml konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine mit 0,05 M Ammoniumacetat, pH 7,5, äquilibrierte HPLC-Säule (9,5 mm x 500 mm) enthaltend Si 300 Polyol 0,003 mm (Serva, Heidelberg, BRD) aufgetragen und bei einem Druck von 40 bar und einer Durchflussgeschwindigkeit von.0,3 ml/Min. mit 0,05 M Ammoniumacetat, pH 7,5, eluiert. Die Elution wird durch Messung der Absorption bei 280 nm, durch Bestimmung der MIF-Aktivität (Beispiel 4) und durch den Enzym-Immunoassay von Beispiel 10 verfolgt. Die Hauptanteile an Proteingehalt und MIF-Aktivität finden sich in Fraktionen, deren Position Molekulargewichts bereichen von ca. 8 kg/Mol bzw. ca. 14 kg/Mol entspricht; geringere Anteile werden in Fraktionen der Molekulargewichts bereiche von ca. 28 kg/Mol und ca. 45 kg/Mol bestimmt. Zur Entfernung des Ammoniumacetats werden die Human-MIF-Proteine enthaltenden Fraktionen wiederholt lyophilisiert. Beispiel 8: Aminosäure-Sequenzanalyse 8.1 MIF-Protein mit Molekulargewicht 8 kg/Mol Das gereinigte Protein mit Molekulargewicht 8 kg/Mol aus Beispiel 7.7 wird mit einem "Gas-phase Protein Sequencer Model 470" (Applied Biosystems) nach der von M.W. Hunkapiller und L.E. Hood [Methods in Enzymology 91, 399 (1983)] beschrie benen Methode sequenziert. Die Umlagerung der Anilino-thi azolinon-Derivate zu Phenylthiohydantoin-(PTH)-Aminosäuren erfolgt durch Behandlung mit 25 % Trifluoressigsäure bei 50QC. Me PTM-Aminosäuren werden auf einer Zorbax CM -Säule (De Pont, 200 % 4,6 mm) [siehe R. Knecht at al., Anal. Biochem. 131. 65 (1983)l analysiert. Folgende eindeutige N-terminale Asino- säuresequenz wird ermittelt: 5 10 15 Met-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Als-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val 20 25 30 Tyr-Mis-Lys-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Gly-Asn-Phe-His-Ala-Val-Tyr 35 40 45 Arg-Asp-Asp-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-X42-Pro-Gla-Tyr 50 55 60 Ile-Arg-Lys-Lys-Gly-Ala-Asp-Val-Trp-Pha-Lys-Glu-Leu-Asp-Ile S5 Asn-X6 2-X6 3-X64-A1a-Val. X42 bedeutet Ser oder Cys. X6z, X62 und X64 stellen nicht be stimmte Aminosäuren dar. 8.2 MIF-Protein mit Molekulargewicht 14 kg/Mol Das gereinigte Protein mit Molekulargewicht 14 EgRHol aus Beispiel 7.7 wird analog Beispiel 8.1 sequenziert. Folgende eindeutige N-terminale Aminosäuresequenz wird ermittelt: 5 10 15 X1-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr His-Lys-Tyr X1 stellt eine nicht bestimmte Aminosäure dar. Beispiel 9: Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haus-MIF 9.1 Gewinnung von Protein-Fraktionen enthaltend Maus-MIF Nach den von C. Sorg [Molecular Iseunology 17, 565 (1980)] beschriebenen Verfahren wird durch Stilulierung von Milzzellen aus 100 Balb/c-Mäusen mit Concanavalin A ein Zellüberstand erhalten, der nach Chroiatographie an Sephadex G 100 ca. 50 ml einer Lösung ergibt, die Maus-MIF-Proteine des Holekular gewichtsbereiches 40 bis 70 EglSol enthält. 9.2 Konjugation von Maus-MIF enthaltenden Protein-Fraktionen an Schaf-Erythrozyten Die Fraktionen aus Beispiel 9.1 werden auf ein Gesamtvolumen von 4,5 ml eingeengt und analog Beispiel 2.1 an mit Glutaraldehyd vorbehandelte Schaf-Erythrozyten (SRBC) gekoppelt. 9.3 Immunisierung von Ratten DA-Ratten werden durch sieben Injektionen von Je 0,5 ml der mit Maus-MIF gekoppelten SRBC-Suspension aus Beispiel 9.2 zusammen mit 0,5 ml kompletten Freund'schen Adjuvans am Tage 0, 10, 43 und 309 immunisiert. Dabei wird eine Hälfte der Injektionsmenge intraperitoneal (i.p.), die andere Hälfte in vier Portionen subcutan (s.c.) injiziert. Weitere ("booster") Injektionen von je 0,5 ml Konjugatsuspension ohne Adjuvans werden am Tage 312, 313 und 314 i.p. verabreicht. Die Milz der behandelten Ratten wird am Tage 317 entnommen. 9.4 Zellfusion Analog Beispiel 2.3 werden 1,14 x 108 Milz-Lmphozyten immunisierter Ratten mit 3,5 x 107 Maus-Myleomazellen P3-X63-Ag8.653 fusioniert und in HAT-Medium kultiviert. 9.5 Selektion von Hybridoma-Zellen, die Antikörper gewünschter Spezifität ausscheiden Analog dem in Beispiel 3.1 und 3.2 beschriebenen Verfahren werden aus den insgesamt 244 nach Beispiel 9.4 gewonnenen Hybridoma-Zellinien 49 Klone ausgewählt, die monoklonale Antikörper ausscheiden, welche an mit Ratten-Erythrozyten gekoppelte Proteine (Kopplung analog Beispiel 9.2) aus Frak tionen enthaltend Maus-MIF binden. r-Globuline aus den Kulturüber ständen dieser 49 Zellklone werden nach dem Verfahren von Beispiel 3.3 an Affi-Gels 10 (Bio-Rad) gekoppelt und mit Maus-MIF enthaltenden Ueberständen von mit Concanavalin A stimulierten Milz-Zellen (Beispiel 9.1) inkubiert. Die ü%er- stehende Lösung wird anschliessend auf ihren Rest-Gehalt an Maus-MIF geprüft. Der Gehalt an Maus-MIF wird dazu in einem analog Beispiel 4.3 vorgenommenen MIF-Test bestimmt, wobei anstelle der kultivierten Human-Monozyten jedoch peritoneale Maus-Makrophagen eingesetzt und diese in MEM-Dulbecco Medium enthaltend 10 % FCS aufgenommen und in Agarase-Tropfen fixiert werden. Mit diesem Selektionsvorfahren werden 6 Hybridoma-Kellinien, m.a. der Zellklon mit der Bezeichnung 7D10 identifiziert, die monoklonale Antikörper gegen Maus-MIF produzieren. Diese Antikörper binden ebenfalls Human-MIF in einen HIP-Test gemäss Beispiel 4, zeigen alse Kreuzaktivität. 9.6 Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper aus Aszites Analog Beispiel 5 werden mit Pristan vorbehandelten Balb/c-Mäusen (mm/nn) 1 x 107 klonierte Hybridoma-Zellen intraperitoneal injiziert und. die Antikörper aus Aszites- Flüssigkeit gewonnen. Beispiel 10: Enzyme-Immunoassay zur Bestimmung von Humna-MIF (MIF-ELISA) Je 100 l einer gereinigten Antikörperlöstung 1C5 (anti-Human-MIF) einer Konzentration von 10 g/ml werden in den Llöchern einer 96-Loch-Xikrotiterplatte (Costart; Technorama) 1 Std. bei 370C inkubiert. Die Platten werden dreimal mit PGT-20-Puffer (PBS, den 0,2 % Gelatine (Nerck) und 0,05 X Tween 20 zugesetzt sind) gewaschen und noch vorhandene Protein-reaktive Bindungastellen des Plattenbodens durch Inkubation mit je 250 Pl PGT-20-Puffer pro Loch während 1 Std. bei 370C abgesättigt. Je 50 Pl von Verdünnungsreihen einer Prnbelösung oder einer Standardlösung enthaltend Human-MIF werden in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten 1 Std. bei 37µC inkubiert. Ungebundene Anteile werden dreimal mit PGT-20-Puffer weggewaschen und dann je 50 Pl einer Lösung eines aus Antikörper 7D10 (anti Maus-MIF, kreuzreaktiv mit Human-MIF) und Biotin-N-Hydroxysuccinimidylesters (Medac, Mol-Verhältnis Biotin zu Antikörper 7D10 - 4 - 7 : 1) in PBS hergestellten und über Sephadex G 25 gereinigten Konjugats (10 pgOml) in den Vertiefungen 30 Min. bei 37 C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Platte mit PGT-20-Puffer werden die auf die Platte gebundenen Biotin-Antikörper-Konjugate durch Inkubation (30 Min. bei 370C) mit je 100 l einer 1:3000-fach verdünnten Lösung eines Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats (0,3 pg/ml) (Sigma) umgesetzt. Die aufgenommene Menge Enzym wird nach Waschen der Platte durch Entwicklung (30 Min. bei 370C) mit einer Lösung von 2,2'-Azino-bis-(3-äthyl-benzothiazolin-6-sulfonsäure)-diammoniumsalz (ABTS, Boehringer Mannheim, 55 mg in 100 ml Citrat/Phosphat-Puffer, 0,05 M Citrat, 0,1 M Na2HPO4, pH 4,0, enthaltend 16 l 30 % H202 > und einer photometrischen Messung bei 405 nm bestimmt. Anstelle des Biotin-Antikörper 7D10-Konjugats kann auch ein analog hergestelltes Biotin-Antikörper lC5-Konjugat eingesetzt werden, doch weist ein solchermassen duchgeführter ELISA eine geringere Empfindlichkeit für Human-MIF auf. Beispiel 11: Test-Kit für MIF-ELISA Ein Test-Rit für den in Beispiel 10 beschriebenen Enzym-Immunoassay enthält: Mikrotiterplatten aus Polypropylen 20 ml Lösung des monoklonalen Antikörpers 1C5 (10 pg/ml) 10 ml Lösung eines Biotin-Konjugats des monoklonalen Anti körpers 7D10 (Mol-Verhältnis Biotin zu Antikörper 7D10 - 5 : 1, 10 pg/ml3 1 ml Lösung eines Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats (0,3 pg/ml) 11 mg 2,2-Azino-bis-(3-äthylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)- Diammoniumsalz 20 ml Citrat/Phosphat-Puffer (0,05 M Citrat / 0,1 M Na2HPO4) 1 ml 30 % H202 100 ml PBS 200 ml PGT-20-Puffer (PBS enthaltend 0,2 % Gelatine und 0,05 % Tween 20). Patentansprüche fflr aie Vertragsstaaten: DE, GB, FR, CH3 LI, IT, NL, BE, SE, LU 1. Gereinigter Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF) und seine Einzelproteine. 2. Gereinigter Human-MIF gemäss Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass er nur Proteine hmranen Ursprungs, die Epitope aufweisen, die von Antikörpern gegen Human-MIF erkannt und gebunden werden, enthält und in Standard-Testanordnungen, bei denen die Wanderung von Makrophagen gemessen wird, aktiv ist. 3. Gereinigter Human-MIF gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch chsrak- terisiert, dass er aus mindestens vier Einzelprotein von Mole- kulargewicht ca. 8, Ca 14, ca. 28 und ca. 45 kg/Mol und gegebenenfalls weiteren Einzelproteinen oder oligomeren Protein-Aggregaten mit höheren Molekulargewicht als ca. 45 kg/Mol besteht. 4. Ein Protein gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 5 N-terminale Aminosäure-Sequenz X1-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu 10 15 Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr-His-Lys-Tyr lautet, worin die Bedeutung der Aminosäure X1 nicht festgelegt ist. 5. Ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 4, dadurch carakterisiert, 5 dass die N-terminale Aminosäure-Sequenz Met-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu 10 15 20 Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr-His-Lys-Tyr-Ser-Leu-Ile 25 30 35 Lys-Gly-Asn-Phe-His-Ala-Val-Tyr-Arg-Asp-Asp-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu 40 45 50 Glu-Thr-Glu-X42-Pro-Gln-Tyr-Ile-Arg-Lys-Lys-Gly-Ala-Asp-Val-Trp 55 60 65 Phe-Lys-Glu-Leu-Asp-Ile-Asn-X62-X53-X64-Ala-Val-lautet, worin die Bedeutung der Aminosäuren Xlz, X62, X63 und X64 nicht festgelegt ist, X*t aber nur 5er oder Cys bedeuten kann. 6. Ein Protein gemäss Anspruch 1, 4 oder 5 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 8 kg/Mol. 7. Ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 4 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 14 kg/Mol. 8. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Human-MIF und seiner Einzelproteine, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Human-MIF enthaltende Lösung, gewünschtenfalls nach an sich bekannten Reinigungsschritten, a) mit einem Trägermaterial mit auf Human-MIF spezifischen monoklonalen Antikörpern in Kontakt bringt, ungebundene Proteine und andere Fremdstoffe entfernt, den an die Antikörper gebundenen Human-MIF selektiv abspaltet und isoliert und, b) wenn erwünscht, den gereinigten Human-MIF in seine Einzelproteine auftrennt. 9. Verfahren gemäss Anspruch 8, worin die Human-MIF enthaltende Lösung ein Zellkulturüberstand von mit Concanavalin A stimulierten und kultivierten mononukleären Zellen ist. 10. Verfahren gemäss Anspruch 8 oder 9, worin die Human-MIF enthaltende Lösung vorgängig einer Ultrafiltration unterworfen und aufkonzentriert wird. 11. Verfahren gemäss Anspruch 8, 9 oder 10, worin der in Schritt a) gereinigte Human-MIF durch präparative Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in seine Einzelproteine getrennt wird. 12. Verfahren gemäss Anspruch 8, 9 oder 10, worin der in Schritt a) gereinigte Human-MIF durch präparative Gel-Filtration-HPLC (Hochdruck-Flüssigchromatographie) in seine Einzelproteine getrennt wird. 13. Monoklonale Antikörper gegen Human-Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor (Human-MIF), sowie Derivate davon. 14.Monoklonale Antikörper und Derivate davon gemäss Ansprüch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie von Maus/Maus-Hybridons-Zelles produziert werden. 15. Monoklonale Antikörper und Derivate davon gesäas Anspruch 13t dadurch gekennzeichnet, dass sie von Ratte/Maus-Hybridomn-Zellen produziert werden. 16. Der monoklonale Antikörper 1C5 genäss Anspruch 13. 17. Der monoklonale Antikörper 7D10 geläss Anspruch 13. 18. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und Derivaten davon gemäss Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, dass man diese monoklonale Antikörper prodnzierende Hybridona-Zellen a) in vitro kultiviert und aus den Kulturüberständen die mono klonalen Antikörper isoliert, oder b) in vivo in einen geeigneten Säugstier verzehrt und aus den Körperflässigkeiten dieses Säugetiers die monoklonalen Antikörper isoliert, und, c) wenn erwünscht, einen erhaltenen sonoklonalen Antikörper in ein Derivat davon überführt. 19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass von Belb/c-Mäusen absteunnende Hybridoma-Zellen in gegebenenfals mit einen Kohlenwasserstoff vorbehandelte Balb/c-Mäuse injiziert, nach 8-10 Tagen diesen Tieren Aszites-Flüssigkeit entnommen und die Antikörper daraus durch Fällung mit Ammoiniumsulfat und chromato graphische Reinigung isoliert werden. 20. Hybridoma-Zallinien, dadurch gekennzeichnet, dass sie mono klonale Antikörper gegen Human-MIF produzieren. 21. Hybridoma-Zellinien gemäss Ansprüch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie Hybride von Maus-Myelona-Zellen und Maus-Lymphozyten sind. 22. Hybridoma-Zellinien gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie Hybride von Maus-Myeloma-Zellen und Ratte-Lymphozyten sind. 23. Die Hybridoma-Zellinie 1C5 gemäss Anspruch 20, die in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-316 hinterlegt ist. 24. Die Hybridoma-Zellinie 7D10 gemäss Anspruch 20, die in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganlsmes" des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer 1-418 hinterlegt ist. 25. Verfahren zur Herstellung von Hybridoma-Zellen gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man geeignete Säugetiere mit MIF oder MIF-Konjugaten immunisiert, dem Säugetier entnommene Antikörper-produzierende Zellen mit Myeloma-Zellen fusioniert, die erhaltenen Hybridoma-Zellen kloniert und diejenigen Zellklone, die die gewünschten monoklonalen Antikörper produzieren, selektioniert. 26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper-produzierende Zellen von Balb/c-Mäusen mit Myeloma-Zellen der Zellinien X63-Ag8.653 oder Sp2/0-Ag14 fusioniert werden. 27. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper-produzierende Zellen von DA-Ratten mit Hyeloma-Zellen der Zellinie X63-Ag8.653 fusioniert werden. 28. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immunisierung Konjugate von Human-MIF-haltigen Protein-Fraktionen mit einem immunogenen Träger eingesetzt werden. 29. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immunisierung Konjugate von Maus-MIF-haltigen Protein-Fraktionen mit einem immunogenen Träger eingesetzt werden. 30. Verwendung der wonoilonalen Antikörper und Derivate geadas Anspruch 13 zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-MIF. 31. Verwendung der monoklonalen Antikörper und Derivate in einen Radioimmunoassay ss Anspruch 30. 32. Verwendung der monoklonalen Antikörper und Derivate in eine Eazym-Immunoassey gemäss Anspruch 30. 33. Test-Kits zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Human-MIF, dadurch gekennzeichnet, dass sie monoklonale Antikörper und/oder Derivate gemäss Anspruch 13 und gegebenenfalls Hilfsmittel enthalten. 34. Test-Kits geSss Anspruch 33 fEr einen Radioimmunoassay. 35. Test-Kits gemäss Anspruch 33 für einen Enzym-Immunoassay. 36. Verwendung der monoklonalen Antikörper und Derivate gemäss Anspruch 13 zur reinigung von Human-MIF. 37. Pharmaceutische Präparate enthaltend eine therapeutisch wirkaane Menge von gereinigtes Human-MIF oder seiner Einzelproteine geuäss Anspruch 1 und eine signifikante Menge eines pharmazeutischen Hilfsmittels. 38. Pharmazeutische Präparate enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge monoklonaler Antikörper gegen Human-MIF oder deren Derivate ges Anspruch 13 und eine signifikante Menge eines pharmazeuti- schen Hilfsmittels. 39. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 37 in Form von Liposomen aus einem Gemisch von synthetischem Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin in wässriger Dispersion.

Claims: Claims for the following Contracting States : DE, GB, FR, CH, LI, IT, NL, BE, SE, LU Purified human MIF, characterised in that it comprises only proteins of human origin that have epitopes that are recognised and bound by the monoclonal antibody 1C5 to human MIF, and is active in standard test procedures in which the migration of macrophages is measured, and its individual proteins. Purified human MIF according to claim 1, characterised in that it consists of at least four individual proteins of molecular weight approximately 8, approximately 14, approximately 28 and approximately 45 kg/mole. A protein according to claim 1, characterised in that the N-terminal amino acid sequence is in which the meaning of the amino acid X₁ is not fixed. A protein according to claim 1 or 3, characterised in that the N-terminal amino acid sequence is in which the meaning of the amino acids X₄₂, X₆₂, X₆₃ and X₆₄ is not fixed, but X₄₂ may represent only Ser or Cys. A protein according to claim 1, 3 or 4 having an approximate molecular weight of 8 kg/mole. A protein according to claim 1 or 3 having an approximate molecular weight of 14 kg/mole. A process for the manufacture of purified human MIF and its individual proteins, characterised in that a solution comprising human MIF, if desired after purification steps that are known per se , a) is brought into contact with a carrier material having monoclonal antibodies 1C5 specific to human MIF, unbound proteins and other foreign substances are removed, the human MIF bound to the antibodies is selectively split off and isolated and, b) if desired, the purified human MIF is separated into its individual proteins. A process according to claim 7 in which the solution comprising human MIF is a cell culture supernatant of mononuclear cells that have been stimulated and cultured with concanavalin A. A process according to claim 7 or 8 in which the solution comprising human MIF is subjected beforehand to ultrafiltration and concentration. A process according to claim 7, 8 or 9 in which the human MIF purified in step a) is separated into its individual proteins by preparative sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. A process according to claim 7, 8 or 9 in which the human MIF purified in step a) is separated into its individual proteins by preparative gel filtration-HPLC (high pressure liquid chromatography). A monoclonal antibody to human macrophage migration inhibition factor (human MIF), or a derivative thereof. A monoclonal antibody or a derivative thereof according to claim 12, characterised in that it is produced by mouse/mouse hybridoma cells. A monoclonal antibody or a derivative thereof according to claim 12, characterised in that it is produced by rat/mouse hybridoma cells. The monoclonal antibody 1C5 according to claim 12. The monoclonal antibody 7D10 according to claim 12. A process for the preparation of a monoclonal antibody or a derivative thereof according to claim 12, characterised in that hybridoma cells producing the monoclonal antibody a) are cultured in vitro and the monoclonal antibody is isolated from the culture supernatants, or b) are multiplied in vivo in a suitable mammal and the monoclonal antibody is isolated from the body fluids of that mammal, and, c) if desired, a resulting monoclonal antibody is converted into a derivative thereof. A process according to claim 17, characterised in that hybridoma cells originating from Balb/c mice are injected into Balb/c mice that have optionally been pretreated with a hydrocarbon, after 8-10 days ascitic fluid is taken from these animals and the antibody is isolated therefrom by precipitation with ammonium sulphate and purification by chromatography. A hybridoma cell line, characterised in that it produces a monoclonal antibody to human MIF. A hybridoma cell line according to claim 19, characterised in that it is a hybrid of a mouse myeloma cell and a mouse lymphocyte. A hybridoma cell line according to claim 19, characterised in that it is a hybrid of a mouse myeloma cell and a rat lymphocyte. The hybridoma cell line 1C5 according to claim 19 which is deposited at the "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" of the Institut Pasteur in Paris under number I-316. The hybridoma cell line 7D10 according to claim 19 which is deposited at the "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" of the Institut Pasteur in Paris under number I-418. A process for the preparation of hybridoma cells according to claim 19, characterised in that a suitable mammal is immunised with MIF or an MIF conjugate, antibody-producing cells taken from the mammal are fused with myeloma cells, the resulting hybridoma cells are cloned and those cell clones which produce the desired monoclonal antibodies are selected. A process according to claim 24, characterised in that antibody-producing cells of Balb/c mice are fused with myeloma cells of the cell lines X63-Ag8.653 or Sp2/0-Ag14. A process according to claim 24, characterised in that antibody-producing cells of DA rats are fused with myeloma cells of the cell line X63-Ag8.653. A process according to claim 24, characterized in that, for immunisation, a conjugate of a human MIF-containing protein fraction with an immunogenic carrier is used. A process according to claim 24, characterised in that, for immunisation, a conjugate of a mouse MIF-containing protein fraction with an immunogenic carrier is used. Use of a monoclonal antibody or a derivative according to claim 12 for the qualitative and quantitative determination of human MIF. Use of a monoclonal antibody or a derivative in a radioimmunoassay according to claim 29. Use of a monoclonal antibody or a derivative in an enzyme-immunoassay according to claim 29. A test kit for the qualitative and quantitative determination of human MIF, characterised in that it comprises a monoclonal antibody and/or a derivative according to claim 12 and optionally adjuncts. A test kit according to claim 32 for a radioimmunoassay. A test kit according to claim 32 for an enzymeimmunoassay. Use of a monoclonal antibody or a derivative according to claim 12 for the purification of human MIF. A pharmaceutical preparation comprising a therapeutically effective amount of purified human MIF or its individual proteins according to claim 1 and a significant amount of a pharmaceutical adjunct. A pharmaceutical preparation comprising a therapeutically effective amount of a monoclonal antibody to human MIF or a derivative thereof according to claim 12 and a significant amount of a pharmaceutical adjunct. A pharmaceutical preparation according to claim 36 in the form of liposomes consisting of a mixture of synthetic phosphatidylserine and phosphatidylcholine in aqueous dispersion. Claims for the following Contracting State : AT 1. A process for the manufacture of purified human macrophage migration inhibition factor (human MIF) comprising only proteins of human origin that have epitopes that are recognised and bound by the monoclonal antibody 1C5 to human MIF, and is active in standard test procedures in which the migration of macrophages is measured, and its individual proteins, characterised in that a solution comprising human MIF, if desired after purification steps that are known per se , is brought into contact with a carrier material having monoclonal antibodies specific to human MIF, unbound proteins and other foreign substances are removed, the human MIF bound to the antibodies is selectively split off and isolated and, if desired, the purified human MIF is separated into its individual proteins. 2. A process according to claim 1 in which the solution comprising human MIF is a cell culture supernatant of mononuclear cells that have been stimulated and cultured with concanavalin A. 3. A process according to claim 1 or 2 in which the solution comprising human MIF is subjected beforehand to ultrafiltration and concentration. 3. A process according to claim 1, 2 or 3 in which the purified human MIF is separated into its individual proteins by preparative sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. 5. A process according to claim 1, 2 or 3 in which the purified human MIF is separated into its individual proteins by preparative gel filtration-HPLC (high pressure liquid chromatography). 6. A process according to any one of claims 1 to 5 for the preparation of an individual protein of human MIF having the N-terminal amino acid sequence in which the meaning of the amino acid X₁ is not fixed. 7. A process according to any one of claims 1 to 5 for the preparation of an individual protein of human MIF having the N-terminal amino acid sequence in which the meaning of the amino acids X₄₂, X₆₂, X₆₃ and X₆₄ is not fixed, but X₄₂ may represent only Ser or Cys. 8. A process according to any one of claims 1 to 7 for the preparation of an individual protein of human MIF having an approximate molecular weight of 8 kg/mole. 9. A process according to any one of claims 1 to 7 for the preparation of an individual protein of human MIF having an approximate molecular weight of 14 kg/mole. 10. A process for the preparation of a monoclonal antibody to human macrophage migration inhibition factor (human MIF) or a derivative thereof, characterised in that hybridoma cells producing the monoclonal antibody are cultured in vitro and the monoclonal antibody is isolated from the culture supernatants, or are multiplied in vivo in a suitable mammal and the monoclonal antibody is isolated from the body fluids of that mammal, and, if desired, a resulting monoclonal antibody is converted into a derivative thereof. 11. A process according to claim 10, characterised in that hybridoma cells originating from Balb/c mice are injected into Balb/c mice that have optionally been pretreated with a hydrocarbon, after 8-10 days ascitic fluid is taken from these animals and the antibody is isolated therefrom by precipitation with ammonium sulphate and purification by chromatography. 12. A process according to claim 10 or 11 for the manufacture of the monoclonal antibody 1C5. 13. A process according to claim 10 or 11 for the manufacture of the monoclonal antibody 7D10. 14. A process according to claim 10 for the manufacture of a biotin conjugate of the monoclonal antibody 7D10. 15. A hybridoma cell line, characterised in that it produces a monoclonal antibody to human MIF. 16. A hybridoma cell line according to claim 15, characterised in that it is a hybrid of a mouse myeloma cell and a mouse lymphocyte. 17. A hybridoma cell line according to claim 15, characterised in that it is a hybrid of a mouse myeloma cell and a rat lymphocyte. 18. The hybridoma cell line 1C5 according to claim 15 which is deposited at the "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" of the Institut Pasteur in Paris under number I-316. 19. The hybridoma cell line 7D10 according to claim 15 which is deposited at the "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" of the Institut Pasteur in Paris under number I-418. 20. A process for the preparation of hybridoma cells according to claim 15, characterised in that a suitable mammal is immunised with MIF or a MIF conjugate, antibody-producing cells taken from the mammal are fused with myeloma cells, the resulting hybridoma cells are cloned and those cell clones which produce the desired monoclonal antibodies are selected. 21. A process according to claim 20, characterised in that antibody-producing cells of Balb/c mice are fused with myeloma cells of the cell lines X63-Ag8.653 or Sp2/0-Ag14. 22. A process according to claim 20, characterised in that antibody-producing cells of DA rats are fused with myeloma cells of the cell line X63-Ag8.653. 23. A process according to claim 20, characterised in that, for immunisation, a conjugate of a human MIF-containing protein fraction with an immunogenic carrier is used. 24. A process according to claim 20, characterised in that, for immunisation, a conjugate of a mouse MIF-containing protein fraction with an immunogenic carrier is used. 25. A test kit for the qualitative and quantitative determination of human MIF, characterised in that it comprises a monoclonal antibody and/or a derivative prepared according to claim 10 and optionally adjuncts. 26. A test kit according to claim 25 for a radioimmunoassay. 27. A test kit according to claim 25 for an enzymeimmunoassay.

Inventors: BURMEISTER, GERD, DR., SORG, CLEMENS, PROF. DR., TARCSAY, LAJOS, DR., WIESENDANGER, WALTER
Applicants: CIBA-GEIGY AG
Application year: 1985
Main classification: C07K15
IPC codes: C12N15, C07K16, A61K39, C12N5, A61K38, C12R1, A61P29, C07K19, C12P21, C07K14, A61P37, C07K1, G01N33