POLYNUCLEOTIDES COVALENTLY BONDED TO A SOLID SUPPORT, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION

Abstract: 1. Oligonucleotides or polynucleotides fixed on a solid support, characterised in that they comprise at least a structure of formula : see diagramm : EP0174879,P18,F1 in which : N represents a base such as uracil, methyl-5-uracil, guanine, xanthine, methyl-5-cytosine, cytosine, amino-2-adenine, hypoxanthine, S represents a ribose or a deoxy-2'-ribose moiety with R1 representing an OH group, a phosphate or even an oligo- or polynucleotide, R2 a hydrogen atom or an OH group and R3 an OH group, a phosphate or even an oligo- or polynucleotide, the numbers (2'), (3') and (5') corresponding to the positions of the sugar residues in question, numbered in the accepted manner, the oligo- or polynucleotide sequences being or not complementary and forming a double strand or the oligonucleotide fixed on the primer may be bent into a loop by forming a double strand and being fixed on the primer by one of the nucleotides of the loop, X represents a NH or O divalent group fixed on the base N at the level of the positions 4 or 6 respectively for a pyrimidine base and for a purine base, B represents a carbon chain of 4 to 20 carbon atoms, and A represents a solid support, n represents the number of chains fixed on a same support A, said chains may be different from one another and fixed by identical or different arms on the support, with the proviso that when N represents an adenin and one of the group R1 and R3 represent an -OH group and X represents NH, B be different from a dodecylamine radical.

Description: POLYNUCLEOTIDES LIES DE FACON COV;iTjNTE A UN SUPPORT SOLIDE, ET PROCEDE POUR LEUR OBTENTION L'invention concerne des polynucléotides, plus particulièrement des fragments d'oligonucléotides, fiXés de façon covalente à un support solide, un procédé de préparation de ces polynucléotides - ou oligonucléctides supportés, des produits intermédiaires utiles pour leur fabrication, des procédés pour leur obtention, ainsi que leurs applications. L'invention concerne plus particulièrement encore des techniques permettant la production de sondes à l'aide des polynucléotides plus particulièrement des fragments d'oligonucléotides ci-dessus. Il s'agit plus spécialement de sondes mettant en oeuvre des séquences d'acides nu cleotidiques de petite taille, notamment des oligonucléotides pouvant comporter moins de 50 ou même moins de 20 nucléoti- des, ces sondes étant supportées par un support solide ou fixées à celui-ci. Les techniques de détection basées sur l'hybridation entre une séquence déterminée de nucléotides utilisée en tant que sonde et une séquence de nucléotides complémentaires de ceux de la sonde, éventuellement contenue dans une composition renfermant des acides nucléiques, sont maintenant bien connues au spécialiste. Ces techniques restent cependant difficiles à mettre en oeuvre et ne sont susceptibles deconduire à des résultats reproductibles qu'entre les mains de spécialistes très entraînés, et ce plus particulièrement lorsque c'est la sonde qui est fixée à un support et que la composition d'acides nucléiques contenant éventuellement le fragment de nucléotides à détecter est amenée et maintenue au contact de ces sondes dans des conditions permettant 1 'hybridation. La fabrication de sondes supportées fait en géné- ral intervenir des réactions de fixation des séquence sondes au support. Ces fixations, evéntuellement renforcées par l'usage de réactifs chimiques (par exemple carbo du imide ou réactifs de di;iotation), s'effectuent cependant en général en des points ou sites répartis au hasard le long des séquences nucléotidiques en cause. il en résulte cependant que seules les parties non fixées de la sonde sont exposées, dans des conditions permettant leur hybridation éventuelle, avec les séquences nucléotidiques complémentaires éventuellement contenues dens une composition. On comprendra par conséquent que les modes de fixation classiques cessent rapidement d'être applicables à des séquences sondes de faible longueur. L'invention a pour but de remédier à ces difficultés et de fournir des polynucléotides, de préférence des oligonucléotides ,supportés qui ne présentent plus ces inconvénients. En particulier, l'invention a pour but de fournir des séquences nucléotidiques supportées de très faible taille, celles-ci pouvant soit elles-mêmes intervenir dans les réactions d'hybridation avec des séquences nucléotidiques complémentaires dans des conditions classiques, soit servir d'amorces à la fixation de séquences plus longues à ce même support. L'.nvention concerne également un procédé d'obtention de ces polynucléotides supportés, procédé qui résulte de l'adaptation eppropriée des techniques de synthèse d'ol.gonucléotides en phase solide, par exemple les méthodes dites aux phospho-triesters ou aux phosphoramidites, dans des conditions telles que l'on puisse en définitive disposer d'oligonucléotides non protégés, caractérisés par des séquences déterminées, liés de façon covalente a un support solide. L'invention concerne tout d'abord une molécule supportée qui, en quelque sorte, peut être considérée comme l'amorce possible de la réalisation d'un oligonucléotide ou polynucléotide supporté. Cette molécule supportée comporte dans sa structure au moins un groupe nucléoside ou nucléotide fixé de façon covalente à un support solide, le site de fixation au groupe nucléoside intervenant au niveau de l'hétérocycle entrant dans la constitution dudit groupe nucléoside. Ce mode de liaison laisse alors libre les hydroxyles du sucre et permet de constituer des chaînes oligonucléotidiques (ADN ou ARN) dans le sens 3'5' et/ou dans le sens 5'-j3'. L'invention concerne en outre les oligonucléotides ou polynucléotides supportés qui notamment peuvent etre formés à partir de la molécule supportée ci-dessus, par la mise en jeu des techniques antérieurement connues d'allongemment de chaînes de nucléotides en phase solide, par exemple dans des conditions qui ont été décrites dans les articles (1) à (6) de la bibliographie figurant à la fin de cette description. Le support permet également la synthèse enzymatique de fragments d'ADN ou d'ARN avec une ARN ligase comme décrit dans les références (13) et (14)(voir bibliographie). On observera cependant qu'en substituant la molécule supportée définie ci-dessus aux produits résultant de l'ancra- ge d'un premier nucléoside (désoxyribonucléoside ou ribonucléoside) sur un support fonctionnalisé approprié dans les procédés d'allongement de la chaîne nucléotidique selon les méthodes classiques, il sera possible au moment de la réalisation des opérations de déprotection des séquences oligonucléotidiques synthétisées, d'obtenir la séquence nucléotidique ainsi synthétisée libre de tout groupe protecteur, mais tou jours encore liée de façon covalente au support solide. En cela, le procédé de l'invention se distingue des procédés antérieurs de synthèse a'oligonucléotides en phase solide, dont l'étape finale de déprotection ou élimination des groupes protecteurs, notamment par un traitement acide, basique ou enzymatique, ou deux ou tous ces traitements, implique également l'élimina tion du support. De préférence, le site de fixation au support du groupe nucléosidique ou du nucléotide terminal de l'oligo nucléotide ou polynucléotide se situe au niveau du sommet C-4 du cycle pyrimidine ou du sommet C-E du cycle purine, selon le cas, dudit groupe nucléoside- ou dudit nucléotide terminal. De préférence, la fixation covalente desdits groupes nucléosides ou nucléotides au support du genre en question se fait par l'intermédiaire d'un bras dont la longueur correspond de préférence à celle d'une channe carbonée ayant de 4 à 20 atomes de carbone. I1 est clair que la longueur de cette cheine ne constitue pas en soi un facteur critique essentiel, si ce n'est qu'un bres trop court serait éventuellement incompatible avec l'exposition complète ultérieure de l'oligonucléotide supporté à des acides nucléiques contenant une séquence complémentaire de nucléotides venant à leur contact, à l'occasion d'opérations d'hybridation, et que des chaines trop longues seraient d'une trop grande flexibilité pouvant également interférer avec la réalisation d'une hybridation dans des conditions semblables. En particulier, les channes risqueraient de se replier. Des molécules supportées préférées de l'invention répondent è la formule générale suivante EMI4.1 dans laquelle - la lettre C, entourée d'un cercle représente une base, telle que uracile, méthyl-5-uracile, guanine, xanthine, méthyl-5-cytidine, cytidine, amino-2-adénine, inosine - la lettre S, entourée d1un cercle, représente un groupe ribose ou désoxv-2'-ribose avec R1 représentant un groupe OH, phosphate ou encore oligo ou polynucléotide, R2 représentant H ou OH et ?.3 représentant OH, phosphate ou encore oligo ou polynucléotide, les nombres (2'), (3') et (5') apparalssant sur le schéma correspondant aux sommets numérotés de façon classique des sucres en question - la lettre X représente un groupe divalent NH ou O - la lettre B représente un bras et - la lettre A représente le support solide. Un bras B préféré est constitué par une chaîne carbonée comprenant de préférence de 4 à 20 atomes de carbone, dont certains peuvent ie cas échéant être remplacés par des hétéroatomes tels que O, N ou 5. De préférence, le bras est obtenu à partir de toute chaîne bifonctionnelle correspondante. On peut citer par exemple l'éthylène diamine, le diamino 1-6 hexane, le diamino 1-10 décane, la spermine, des diéthyléne-glycols ou dialcoylène-glycols. Selon une autre variante préférée, le bras B comporte une chaîne carbonée terminée par un radical fonctionnel M, par exemple un radical azoté tel qu'un radical amino hydrazino, un radical soufré, un radical fonctionnel éther, un radical carboxyle ou encore carbonyle. Il est entendu que l'expression support solide" recouvre tout support qui peut rester insoluble dans au moins un milieu déterminé susceptible de contenir des acides nucléiques en solution. De nombreux supports peuvent être utilisés. Dans le cas de bras B formé d'une chaîne carbonée, le support solide A est plus spécialement choisi parmi ceux compatibles à la fois avec les solvants organiques et les tampons aqueux mis en oeuvre pour la préparation des molécules supportées. Il s'agit par exemple de polymères, de silice ou de billes de verre, ces supports ayant cependant, le cas échéant, fait l'objet d'un traitement préalable (fonctionnalisation), leur conférant des groupements fonctionnels susceptibles d'être mis en jeu dans une réaction de fixation d'une molécule distincte, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras. Des supports de ce type sont disponibles dans le commerce. Il s'agit par exemple des gels du type polyacrylmorpholide, par exemple ceux commercialisés sous la désignation "ENZACRYL K-2". Lorsque le bras B est terminé par un radical fonctionnel M, le support solide A ne doit pas forcément répondre à ces exigences et est choisi parmi n'importe quel type de support existant sur le marché tels que les aoaroses, notamment ceux commercialisés sous la marque Sépharose, les polyacrylamides, polystyrènes ou cellulose. Un procédé préféré pour fabriquer les molécules supportées selon l'invention consiste à faire réagir le nucléoside ou le nucléotide terminal d'un oligonucléotide, dont le sommet en C-4, lorsque la base est constituée par une pyrimidine, ou en C-6 lorsqu'elle est constituée par une purine, a préalablement été activé, avec un support A, de préférence préalablement "fonctionnalisé" par fixation sur celuici d'un bras approprié, porteur d'une fonction réactive avec le sommet activé de la base, la réaction impliquant alors la réalisation d'une liaison covalente au niveau du sommet impliqué et de l'extrémité du bras. Un mode d'activation préféré du sommet approprié de la base comprend la fixation sur ce sommet d'un dérive hétérocyclique, du type triazole, nitro-triazole, tétrazole, par exemple selon l'une des techniques décrites dans les références bibliographiques indiquées à la fin de cette description. Des nucléosides (ou le nucléotide terminal d'un oligonucléotide) ainsi activés peuvent alors être mis en réaction avec un support fonctionnalisé porteur de groupes fonctionnels terminaux NH2, par exemple pour produire la réaction représentée par le schéma qui suit EMI7.1 Dans les formules chimiques qui précèdent - A représente un support solide - Bz représente un groupe benzoyle et - DMT représente un groupe diméthoxytrityle. Il va de soi que tout autre type de réaction chimique mettant en jeu l'activation préalable des mêmes sommets des hases hétérocycliques, ou de tout autre groupe éventuellement préalablement fixé sur ces bases, et le réaction du groupe activé le support dans les conditions sus-indiquées petit être envisagée. Pour mémoire, on rappellera par exemple les procédés d'activation qui ont été décrits des mêmes sommets des bases hétérocycliques, par l'intermédiaire d'un chlorure acide (références bibliographiques (10) et (11). Le procédé selon l'invention permet donc de réaliser nucléotide par nucléotide (ou groupe de nucléotides par groupe de nucléotides) des oligonucléotides de synthèse finalement exempts de tout groupe protecteur et liés de façon stable à un support solide. il a été constaté que les traitements chimiques basiques et acides classiquement utilisés pour la déprotection des séquences oligonucléotidiques ne modifient pas la stabilité de la séquence nucléotidique complètement déprotégée sur le support. Les supports portant ainsi des séquences nybridables peuvent être mis en oeuvre dans toutes applications mettant en jeu un tel type de réaction. La technique selon l'invention permet donc, non seulement la réalisation de séquences oligonucléotidiques de faible taille, liées de façon covalente et stable à un support, mais encore d'acides nucléiques plus importants, également liés à ce même support. Il peut également être envisagé de fixer sur un même support plusieurs oligonucléotides ayant des séquences nucléotidiques distinctes, notamment après activation des bases de leurs nucléotides d'extrémites respectives et fixation a des extrémités de bras distincts portés par ce meme support. Comme indiqué ci-dessus, les fragments d'A D N ou d'A R N peuvent être synthétisés -:ur la molécule supportée par voie enzymatique à l'aide d'une. A R N ligase (voir 13 et 14) selon le schéma EMI9.1 Selon une autre variante, pour effectuer la synthèse de fragments d'A D N ou A R N, liés de façon covalente sur un support solide, on synthétise des séquences d'oligonucléotides (fragments d'A D N ou d'A R N) comportant Åa l'extrémité 3'51 ou en un ou plusieurs sites à l'intérieur de la séquence, un nucléoside modifié de formule: : EMI9.2 dans laquelle S, N, X et B sont tels que définis ci-dessus et M' représente un groupe fonctionnel, et on f-ait réagir ces séquences avec un support portant une fonction réactive A', M' et A' étant choisis de manière à permettre l'établissement d'une liaison covalente entre une séquence et le support. M' et A' sont choisis avantageusement parmi les fonctions amino, notamment -NH2, soufrées1 notamment -SH, hydroxylées, carbocylées ou encore M' représente un groupe -SH ligand. La lia son entre A et A' est réalisée selon les techniques classiques, ilustrées en particulier par les schémas suivants: EMI10.1 La synthèse des oligonucléotides comportant un bras M' est effectuèe chimiquement à l'aide des nucléosides modifiés X et Y décrits dans la demande de brevet 8413096 du 22 août 1984 aux noms de l'Institut Pasteur et du CNRS. En incorporant les nucléosides modifiés tT (X) et tG (v) en 3', 5' ou en un ou plusieurs sites quelconques de la séquence, on fat roacir la fin de la synthèse une chaîne X#B#M' comme illustré dans les exemples (II.2 et III.1) On s'assurera naturellement que le fragment d'oligonucléctide porte un bras avec une extrémité réactive M, pour que la liaison covalente puisse s'étabilit entre le support activé et les autres extrémités réactives de l'oligonucléotide (OH en 3', 5' NH2 des bases) On rapelle que selon l'aspect le plus général, les fragments d'oligonucléotides décrits dans la demande de brevet FR 8413096 sont caractérisés en ce qu'une partie au moins des bases prymidiques y est remplacée par des groupes X et/ou une partie au moins des bases puriques y est re- placée par des croupes Y, les croupes X et Y répondant respectivement aux formules EMI11.1 R représentant un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. Chaque ambiguité an niveau d'une base pyrimidique v peut être remplacée par un groupe X et chaque ambiguité a niveau d'une base pu-icue y peut être remplacée par un groupe Y, les groupes X et Y étant tels que définis ci-dessus. Il peut s'agir d'un fragment de désoxyligonucléotide et, dans le groupe X, R peut représenter le groupe méthyle. D'un manière avantageuse, cette variante permet de greffer la séquence d'ADN (ou ARN) purifiée, sur le support avec une machine ou manuellement purifiée, par CLHP ou électrophorèse avant d'être mise en réaction avec une fonction activée du support, ce qui conduit a l'obtention d'un frag- ment d'ADN purifié lié de façon covalente au support solide. On remarquera également qu'il est possible de mettre 2 ou plusieurs fragments d'oligonucléotide monobrin ou double brin en une seule réaction chimique. On notera en outre, que l'invention peut être mise en oeuvre de façon à autoriser la séparation finale de l'oligonucléotide formé du support par des réactions chimiques ou biochimiaues décrites dans la littérature (12). La séparation peut intervenir, soit en un site spécifique à proximité du support ou à l'extrémité du bras, soit dans un site prévu dans la chaîne nucléotidique elle-même. Par exemple, il peut être envisagé que les premiers éléments de la séquence nucléotidique soient formés de ribonucléotides, les suivants étant alors tous constitués par des désoxyribonucléotides. La séparation entre la chaîne de désoxyribonucléotides et le support pourra alors être réalisée de façon en soi connue, par exemple par un traitement au moyen de réactifs chimiques, ou d'une ribonucléase. Les molécules supportées comportant un groupe oligo ou polynucléotidique sont utilisables pour l'élaboration de sondes pour la détection de séquences complémentaires, ce qui permet de purifier ou d'identifier de llARN ou de 1'ADN monobrin. Ces sondes revêtent également un grand intérêt pour la séparation d'un polynucléotide complémentaire contenu dans une solution amenée au contact de cette molécule supportée, la détection ou la séparation étant mise en oeuvre dans des conditions autorisant leur hybridation mutuelle. Grâce à la formation d'un double brin sur le support il est possible de purifier les protéines donnant lieu à une interaction avec un fragment d'ADN. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples préférés de construction ce molécules supportées conformes l'invention et d'élongation aux fins d'élaboration d'oligonucléotides. Bien entendu, cette description ne présente aucun caractère limitatif. EXEMPLE I: "FONCTIONNALISATION D'UN SUPPORT POLYACRYLAMIDE" On utilise comme supports, les résines A1, A2 et A3 dont la fonctionnalisation est réalisée comme suit Résine A On porte à 1750C un mélange de polyacrylmorpholide (gel ENZACRYL K-2, 1 g) et de diamino 1-10 décane (1 g) dans l'éthylène glycol (14 ml) à 1750C pendant une nuit. On ajoute de la glace au milieu réactionnel refroidi, puis on filtre. La résine est lavée successivement par de l'eau (35 ml), de l'acide chlorhydrique 0,1 N (35 ml), du carbonate de sodium 0,1 N (35 ml), de l'eau (35 mi), du méthanol (70 ml), puis séchée sous vide (1 g). La proportion de fonction amine greffée, déterminée par dosage gisin est de 440 micro M/g pour la résine A1. Résine A2 : On prépare de même, à partir de 3 g du gel ENZACRYL K-2 et de 25 ml d'éthylène diamine, la résine A2. Résine A3 : 100 mg du gel ENZACRYL K-2 et 100 mg de spermine, chauffés à 1600C dans 2 ml d'éthylène glycol pendant une nuit, conduisent à 80 mg de résine A3. 1 / Fixation du triazolo-4 0-dimethoxytrityl-5' benzoyl 3'-thymidine (composé 1) sur la résine A1 EMI14.1 On laisse è température ambiante un mélange de 200 mg de résine fonctionnalisée Al et de 150 mg du comoosé 1 dans d ml de dioxane. Après 5 Jours, la résine est esso r ee, rincée avec du dioxane ou du méthanol et dosée Le dosage du diméthoxytrityl (DMT) (par UV a 507 nm) à l'aide de l'acide benzène sulfonique (ABS) indique une substitution de 31 microM/g. Si on fait réagir la résine avec E5 mg supplémentaires du composé l, la substitution après 3 Jours passe à 63 microM,g. Un traitement à l'ammoniaque concentrée à 50 C (une Ces conditions de déprotection des séquences d'oligonucléotides pendant 5 heures n'altère en rien l'accrochage du nucléotide (dosage du groupe diméthoxytri- tyle). Si l'on chauffe dans l'ammoniaque concentrée à 50 C pendant une nuit, le dosage du DMI montre une perte de capacité de 10 %. 2 ) Fixation de triazolo-4 O-diméthoxytrityl 5' O-(chloro 2 phényl têta-cyanoéthyl, phosphate-3' thyamine (com posé 2) sur la résine A: EMI15.1 On laisse à température ambiante pendant 20 Jours, 220 mg de résine A1, 105 mg du composé 2 dans 2 ml de dioxane. la charae de la résine évaluée par détritylation est de 71 microM/g. sur la résine A2 EMI15.2 On laisse à température ambiante pendant 14 Jours, 250 mg de résine B, 190 mg de composé 2 dans 4 ml de dioxane. Le dosage par#ABS indique une substitution de 32 microM/g. 3 ) Fixation du triazolo-4 dibenzoyl-2',5' 0-(chloro-2 phé nyl-bêta cyanoéthyl)phosphate-3' uridine (composé 3) sur la résine A1: EMI16.1 On laisse à température ambiante 200 mg de résine A1, 100 mc du composé 3 dans 4 ml de dioxane pendant 25 Jours. Afin de quantifier la substitution d < ? la résine, on effectue un couplage après acétylation des aminés du support (anhydride acétique à 10% dans la pyridine). Aprés décyanoéthylation de la résine dans un mé lange de triéthylamine/pyridine/sau (1/3/1), coévaporation dans la pyridine, on ajoute 60 mg du composé I et 60 mg d'agent de couplage (le trisopropyl benzène-sulfonyl nitrotroazole (IPSNI) dans 300 microlitres de pyridine. Après une heure, la résine est rincée avec de la pyridine, puis un mélange CH2Cl2/Me OH : 90/10 puis dosée. La détritylation par l'ABS (acide benzènesulfonique), indique une substitution de 29 microM/s en dimère. 40/ Fixation du triazolo-4 O-diméthoxytrityl-5' benzoyl-3' thymidine (composé 1) sur la résine A3 EMI17.1 On laisse à température ambiante pendant 13 jours 65 mg de résine A3, 30 mg du composé 1 dans 1 ml de dioxane. La charge de la résine substituée est de 94 microM/g. EXEMPLE Il : SUPPORT DE SILICE. 10/ Fixation du triazolo-4 0-dimGthoxytrityl-5' benzoyl-3' thymidine composé 1 sur la silice "fonctionnalisée" EMI17.2 On laisse à température ambiante 500 mg de silice "fonctionnalisée" avec une chaîne aminopropyle (Si-(CH2)3- et et 200 mg du composé 1 dans 4 ml de dioxane. Après 20 jours, on obtient une substitution de 85 microM/g. 20/ Fixation du triazolo-6 0-diméthoxytrityl-5' benzoyl 3' N-isobutiryl-2 désoxy 2' quanosine (composé 4) EMI18.1 On laisse à température ambiante 500 mg de silice PORASIL fonctionnalisée avec une chaîne aminopropyle et 200 mg du composé 4 dans 4 ml de dioxane. Après 20 jours, on obtient une substitution de 16 microM/g. EXEMPLE III : BILLES DE VERRE. 10/ Fixation du triazolo-4 O-diméthoxytrityl-5' benzoyl-3' thymidine (composé 1) sur un support de verre poreux (en billes) EMI18.2 On laisse à température ambiante l g de billes de verre poreux (de diamètres 500 Angströms) fonctionnalisées par les chaînes apparaissant dans la formule sus-indiquée et commercialisées par la société PIERCE sous la désignation CPG:AALC 500 Angströms, et 310 mg du composé 1 dans 8 ml de dioxanne. Après 16 jours, le support présente une substitution de 22 microM/g. Afin de vérifier la stabilité de la liaison nucléoside-support, les billes de verre ainsi fonctionnalisées sont chauffées à 50' C pendant une nuit : le dosage du diméthoxytrityl en 5' n'a pas chanaé ; d'autre part, le controle par chromatographie en phase liquide sous haute pression (CLHP) montre l'absence d'hétérocycle dans le filtrat. Ce support a servi à construire une séquence de "l8- mer" avec un rendement moyen de couplage de 85 E avec la méthode au phosphotriester, selon la méthode décrite dans la référence bibliocraphique (4). Apres déblocage de tous les groupements protecteurs, le fragement d'ADN lié au support est hydrolysé par l'acide chlorhydrique 2 N pendant 5 heures : on retrouve dans le filtrat les 4 bases utilisées dans le rapport convenable (dosage CLHP). 20/ Fixation du triazolo-4 O-diméthoxytrityl-5' benzoyl 2' 0-(chloro-2 thényl-bêta-cvanoéthyl) chosphate-3' uridine (composé 5) sur un support de verre poreux EMI20.1 On laisse à température ambiante 200 mg de billes de verre CPG/AALL 500 Angstroms (PIERCE), 50 mg du composé 5 dans 2 ml de dioxane. Après 17 jours, la substitution est de 10 microM/g. EXEMPLE IV : SYNTHESE D'UN 15-mère A PARTIR DE LA MOLECULE SUPPORTEE AS AVEC ELONGATION DANS LE SENS 5' -3' : 5' CCCAGTCACGACGTT 3'. 150 mg de support A5 (1,8 umoles) sont décyanoéthylés par un mélange 1/9 de t-bytylamine/pyridine puis couplés avec les trimères suivants : HOCCC, HOAGT, HOCAC, HOGAC et HOGTTTr' chaque étape de couplage étant précédée de la décyanoéthylation de l'oligomère intermédiaire formé. Le support est ensuite soumis aux conditions de déblocage de la séquence TMGPAO 1 M une nuit puis NH4OH 500C 5 h. Afin de vérifier la présence de l'oligomère synthétisé sur le support, on soumet 50 mg de ces billes à une hydrolyse alcaline (NaOH 2 N à 600C pendant 10 min.). Après purification sur Sephadex G-l0 (TEAB 0,05 M), les 2 OD recueillis sont purifiés par chromatographie liquide sous haute pression (CLHP) (Zorbax ODS ; gradient d'acétonitrile dans un tampon d'acétate de triéthylammonium 10-2 M pH 6,5 ; temps de rétention 10,64 min.). Apres détritylation par l'acide acétique 80% pendant 4 h, on obtient 0,23 OD du 15-mère (11% du produit brut) (temps rétention 11,52 min. pour l'oligomère 3' OH et 18,69 min. pour l'oligomère 3' OTr sur HS-5 C18. EXEMPLE V : SYNTHESE D'UN :15-mère A PARTIS DU SUPPORT A5 ANEC ELONGATION DANS LE SENS 3'-5' 5' CCCAGTCACGACGTT 3' 100 mg de support AS (1,2 moles) sont détritylés par l'ABS à 2% puis acétylés par un mélange 1/9 d'anhydride acétique dans la pyridine. La première étape consiste en un couplage 3'-3' entre le support décyanoéthylé et le nucléoside DMTT OH (rendement 618), puis 5 couplages classiques 3'-5' avec DMTGT, DMTGAC, DMTCAC, DMTAGT, et TrCCC (rdt moyen 80%). Le support est soumis aux conditions de déblocage (TMGPAO 1 M une nuit et NH4OH 50tC 5h). L'oliaomère est décroché du support pour caractérisation, par hydrolyse alcaline (NaOH) 2 N 10 min.). 50 mg de ces billes conduisent à 1,6 OD après purification sur Sephadex G-l0. Après purification par CLHP et détritylation on choient '.,35 OD du 15-mère (22% du produit brut) (HS-5 Cl8; .-, rétention 11,57 min. pour le 3'OH et 17,25 min. pour 3' OTr). EXEMPLE VI : SYNTHESE D'UN 34-mère COMPORTANT UN SITE DE RESTRICTION RsaI A PARTIR DU SUPPORT A4. La synthèse a été réalisée manutellement par la méthode au phosphotriester (sur 100 mg de billes) et automatiquement par la méthode au phosphoramidite (! partir de 30 mg de billes). La présente d'un site de restriction RsaI dans la séquence permet de contrbler la synthèse. La première étape consiste à marquer les extrémités 5' du support (polynucléotide kinase) puis à faire agir l'enzyme de restriction RsaI en présence d'un 16-mère complémentaire synthétisé de façon classique. Sur le gel d'électrophorèse des surnageants, on note la présence pour les deux supports d'une bande correspondant à un 9-mère résultant de la coupure enzymatique. EMI22.1 EMI23.1 Après synthèse en phase liquide selon la méthode au phosphotriester de l'heptamère "activé" DMTtTGCGCGC puis substitution par l'hexanediamine, l'oligomère fonctionnalisé (118 mg; 32 umoles) est débloqué selon les conditions classiques. Après purification sur Sephadex G-10, et CLHP (Zorbax ODS; tps de rétention 11,40 min.), on obtient 2,3 mg de l'hptamère 2 aant l'hydroxyle 5' diméthoxytrilé. EMI23.2 Aux 200 mg de Sepharose 4B activée lavés selon les conditions décrites (HCl 10-3M), on ajoute 1,2 mg (0,54 umoles) de l'heptamère 1 en solution dans un ml de tampon a de réaction (NaHCO3 0,1 M et NaC1 0,5 M). Après 1 h à température ambiante et la nuit à 4 C, le support est essoré sur fritté et lavé avec le tampon a. Les fonctions activées du support n'ayant pas réagi sont bloquées par un tampon b (Tris-HCl 0,1 M; pH 8; 1 ml pendant i h à 40C). Le support est ensuite rincé par un cycle de tampons c et d (c: Tris 0,1 M et NaCl 0,5 M pH 8. d: acétate de sodium 0,1 M et NaCl 0,5 M pH 4). EMI23.3 Aux 200 mg de Sepharose 4B activée lavés selon les conditions décrites on ajoute 1,1 mg (0,50 moles) de l'heptamère 2 en solution dans 1 ml de tempon a. Après l h à température ambiante et la nuit à 40C, le support 2 est traité comme précédemment (cf support 1). La substitution des supports i et 2 peut être évaluée par dosage en UV à 507 nm du cation DMT+ (détritylation par l'acide trichloracétique). L'incorporation est de 90% environ, soit 2,4 moles/g pour le support 1 et 2,2 mole/g pour le support 2. VERIFICATION-CONTROLE -s supports 1 et 2 (10 à 20 mg essorés) sont soumis à une hydrolise acide (HCl 2N à 80 C, ainsi que le support activé de départ 3 et ce même support activé soumis à un hexamère non fonctionnalisé CGMECGCG 4. Ceux-ci serviront de blancs à notre test. L'analyse par CLHP des hydrolysats indique la presence des bases cytosine et guanine pour les supports 1 et 2 et une faible association ( 10%) dans le cas du support 4 qui peut être due à une absorption de l'hexamère sur le support. On soumet les supports I et 2 à l'action de la phosphodiesté- rase I (Crotalus durcissus) : lmg de support dans 100 ul de tampon (0,025 M Tris et 0,05 MgCl2 pH 9) et 10 ul d'enzyme (10 ug) portés 3 h à 370C puis une nuit à tepmérature ambiante. L'analyse des surnageants bruts par CLHP sur Partisil PXS 10/25 SAX (isochratique; 10- 2M KH2PO4 et 10-1M de KCl, pH = 5) indique pour les supports 1 et 2 la présence de pdC et pdG (tps de rétention de 10,7 et 18,4 min. identiques aux témoins) alors que le test est négatif pour le support 4. BIBLIOGRAPHIE (1) F. Koster et Coll., Tetrahedron, 40, 103, 1984. (2) H. Caruthers et Coll., letrahedron letters, 21, 719, 1980. (3) M.J. Cait et Coll., Nucleic Acids Research, 10, 6243, 1982. i4) K. Itakura et Coll., Nucleic Acids Research, 8, 5507, 1980. (5) A. Rosenthal et Coll. Tetrahedron Letters, 24, 1691, 1983. (6) C.K. Brush et Coll., Nucleic Acids Research, 10, 6295, 1982. (7) C.c. Reese et Coll., Tetrahedron Letters, 21, 2265, 1980. (8) W.L. Sung, J. Org. Chem., 47, 3623, 1982. (9) C.B. Reese et Coll., Nucleic Acids Research, Symposium Series 7, Koster Editor, p. 5. (lO)C.B. Reese et Coll., Tetrahedron Letters, 22, 4755, 1981. (11)R.A. Jones et Coll., Tetrahedron Letters, 40, 3, 1984. (12)G.R. Gough et Xoll., Tetrahedron Letters, 24, 5317, 1983. (13) R. Gumport et coll. The Enzymes vol. XV, p. 31. P.D. Boyer Edit (1982) Academic Press. (14) R. Wu, L. Grossman et X. Moldave, Nethods in Enzymo logy, vol. 100, p. 38, Academic Press (1983).

Claims: REVENDICATIONS 1 - Molécule supportée comportant dans sa structure eu moins un groupe nucléoside fixé de façon covalence b un support solide, le site de fixation au groupe nucldo- side intervenant au niveau de la base entrant dans la constitution dudit groupe nucléoside. 2 - Molécule supportée selon la revendication 1, caractérisée en ce que le groupe nucléoside appartient à un nucléotide terminal d'un oligonucléotide ou polynucléotide. 3 - Molécule supportée selon la revendication 1 ou le revendication 2, caractérisée en ce que le site de fixation au support du groupe nucléosidique ou du nucléotide terminal de l'oligonucléotide ou polynucléotide se situe au niveau du sommet C-4 du cycle pyrimidine ou du sommet C-6 du cycle purine, selon le cas, dudit groupe nucléoside ou dudit nucléotide terminal. 4 - Molécule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 è 3, caractérisée en ce qu'elle peut être représentée par le schéma EMI26.1 dans lequel - la lettre N, entourée d'un cercle, représente une base, telle que uracile, méthyl-5-uracile, guanine, xanthine, méthyl-5-cytidine, cytidine, amino-6-adénine, inosine - la lettre S, entourée d'un cercle, représente un groupe ribose ou désoxy-2-ribose avec R1 représentant un groupe OH, phosphate ou encore oligo ou polynucléotide, R2 repré sentant H ou OH et R3 représentant OH, phosphate ou encore oligo ou polynucléotide, les nombres (2'), (3') et (5') apparaissant sur le schéma correspondant aux sommets numé rotés de façon classique des sucres en question ; ; - la lettre X représente un groupe divalent NH ou O - la lettre B représente un bras et - la lettre A représente le support solide. 5 - Molécule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la fixation covalente desdits groupes nucléosides ou nucléotides au support du genre en question se fait par l'intermédiaire d'un bras B dont la longueur correspond de préférence a celle d'une chaîne carbonée ayant de 4 a 20 atomes de carbone, dont certains peuvent, le cas échéant, être remplacés par des hétéroatomes, tels que O, N ou S. 6 - Molécule supportée selon la revendication 5, caractérisée en ce que le bras est obtenu a partir d'une chaîne bifonctionnelle telle que celle dérivée de l'éthylène diamine, le diamino 1-6 hexane, le diamino 1-6 décane, la spermine, des diéthylène-glycols ou dialcoylene-glycols. 7 - Molécule supportée selon l'une quelconque des revendications l a 4 caractérisée en ce que la fixation covalente se fait par l'intermédiaire d'un bras B terminé par un radical fonctionnel par exemple un radical azoté tel qu'un radical amino hydrozino, un radical soufré, ou un radical carboxyle ou carbonyle. 8 - Molécule supportée selon la revendication 7, Caractérisée en ce que la chaîne X-BM' est fixée sur un nucléoside modifié dans lequel @une partie au moins des bases pyrimidiques y est remplacée par des groupes X et/ou une partie au moins des bases puriques Y est remplacée par des groupes Y, les groupes X et Y répondant respec tivement aux formules: EMI28.1 R représentant un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle. 9 - Molécule supportée selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que l'oligcnucle-o- tide ou le polynucléotide peuvent être séparés du support solide, soit en un site de restriction spécifique à proximlte du support ou de l'extrémité du bras, soit dans un site prévu dans le bras lui-même. 10 - Oligonucléotides ou polynucléotides supportés comportant une molécule supportée selcn l'une quelconque des revendications l à o, résultant de l'allcngement dans le sens 3'#5' et/ou 5'#3' de la chaîne nucléotidique. 11 - Procédé de fabrication d'une molécule supportée selon l'une quelconque des revendications l à 9, caractérisé en ce que l'on fait réagir le susdit nucléoside ou le nucléotide terminal d'un oligonucléotide ou polynucléotide, sont le sommet en C-4, lorsque la base est constituée par une pyrimidine ou en C-6 lorsqu'elle est constituée par une purine, a préalablement été activé, avec un support A, de préférence préalablement %fonctionnalisé" par fixation sur celui-ci d'un bras approprié porteur d'une fonction réactive avec le sommet activé de la susdite base, la réaction impliauant alors la réalisation d'une liaison covalente au niveau du sommet susdit et de l'extrémité du bras. 12 - Procédé selon la revendication li caractérisé en ce que l'activation préalable du sommet particulier de la base a été réalisée par fixation sur ce sommet d'un dérivé hétérocyclique, notamment du type triazole, nitrotriazole ou têtrazole. 13 - Procédé selon la revendication il ou 12, caractérisé en ce qu'on allonge la molécule supportée obtenue dans le sens 3- 5' ,5' et/ou 5'. .3', l'addition de fragments d'ADN ou d'ARN étant réalisée le cas échéant par voie synthétique 1 1 aide d'une ARN ligase. 14 - Application d'une molécule supportée comportant un groupe oligonucléotide ou polynucléotide, selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 et d'oligonucléotides et polynucléotides supportées selon la revendication 8, à la constitution de sondes pour la détection de séquences complémentaires ou à la séparation d'un polynucléotide complémentaire contenu dans une solution amenée au contact de cette molécule supportée, la détection ou la séparation étant mise en oeuvre dans des conditions autorisant leur hybridation mutuelle. 15 - Application selon la revendication 14 à la purification et à l'identification d'ARN et d'ADN monobrin. 16 - Application selon la revendication 15 à la purification des protéines ayant une interaction avec un fragment d'ADN grâce à la formation d'un double brin sur le support.

Inventors: HUYNH-DINH, TAM, IGOLEN, JEAN, POCHET, SYLVIE
Applicants: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS), INSTITUT PASTEUR
Application year: 1985
Main classification: C07H21
IPC codes: C08B37, C08F8, C07H21, C07H19, C08B15, G01N33, C12Q1