PROCESS FOR THE PRODUCTION BY FERMENTATION OF BRANCHED ALIPHATIC OR AROMATIC L-AMINO ACIDS FROM ALPHA-KETOCARBOXYLIC ACIDS

Abstract: the process entails the use of Brevibacterium flavum to produce L-leucine from alpha -ketoisocaproate, and phenylalanine from the corresponding aromatic carboxylic acid.

Description: Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen aliphatischen oder aromatischen L-Aminosäuren aus ct-Ketocarbonsäuren Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen aliphatischen oder aromatischen L-Aminosäuren aus den analogen o(-ketocar- bonsäuren in einem Kulturmedium. Als für Mensch und Tier essentielle Aminosauren haben L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin grosse Bedeutung. Neben der klassischen Gewinnung im grossen Massstab durch Hydrolyse von Proteinen sind in den letzten zwanzig Jahren insbesondere mikrobielle und enzymatische Syntheseverfahren entwickelt worden. Bei den mikrobiellen Syntheseverfahren finden hauptsächlich Vertreter der Gattungen Corynebacterium, Brevibacteriumund Arthrobacter Verwendung, deren Regulationsmechanismen der Biosynthesewege für verzweigtkettige Aminosäuren durch Mutation so verändert wurden, dass die Mutanten grosse Mengen dieser Aminosäuren aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen bilden und im Fermentationsmedium akkumulieren (z.B. Isoleucin mit Brevibacterium thiogenitalis, US-PS 4 329 427). Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Starke Hydrolysate, Cellulose-Hydrolysate und Melassen, organische Säuren wie Acetat und Succinat, Alkohole wie Glycerin und Ethanol und Kohlenwasserstoffe wie n-Paraffine. Beispiele gängiger Stickstoffquellen beinhalten Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniate. Anorganische Salze wie Phosphate und Sulfate sowie Calcium, Magnesium, Mangan und Eisen finden Verwendung.Zus tze von Vitaminen wie Biotin und Thiamin oder komplexer Nährstoffe wie Hefeextrakt, Pepton, Casamino-Acids und Sojabohnen-Hydrolysate ermog- lichen ein optimales Wachstum der Mikroorganismen. Die mikrobielle Gewinnung von Aminosauren aus Vorstufen ist für einige Aminosauren, wie Tryptophan aus Indol und Serin oder Anthranilat, Isoleucin aus L-Aminobuty- rat, D-Threonin, L-Hydroxybutyrat oder DL-o(-Bromobuty rat ist bekannt. Die Gewinnung von Aminosauren aus ihren analogen i-Keto- carbonsäuren konnte für L-Glutamat aus &alpha;-Ketoglutarat (Otsuka et al, 1. Gen. Appl. Microbiol. 3(1)35-53, 1957) und für DL-Alanin aus Pyruvat (Shah et al, 1. Gen. Microbioi. 17, 620-624, 1957) gezeigt werden. Dagegen verliefen Versuche zur mikrobiellen Gewinnung von L-Leucin aus &alpha;-Ketoisocaproat und L-Valin aus Ct-Ketoisova- lerat mit Bacillus subtilis wenig vielversprechend. Die eingesetzten Mikroorganismen waren zur Gewinnung der verzweigtkettigen, aliphatischen Aminosäuren aus ihren analogen Gt-Ketocarbonsäuren ungeeignet, da sie den grössten Teil der Ketosäuren decarboxylierten, und somit nur geringe Ausbeuten erzielt werden konnten. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen, ali tishen oder aroratisien L-Aminosäuren aus den analogenietocarburen in einem Kulturmedium, der dadurch gekennzeichnet ist, dass man Glutamat-produzierende Bakterien auf die d -Ketocarbonsäuren einwirken lässt und nach Beendigung der Umsetzung die gewünschte Aminosaure isoliert. Geeignet sind Vertreter der Gattung Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, speziell Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, und Vertreter der Gattung Brevibacterium, insbesondere Brevibacterium flavum, speziell Brevibacterium flavum ATCC 14067. In dem Kulturmedium sind assimilierbare Kohlenstoffund Stickstoffquellen enthalten. Als Kohlenstoffquelle setzt man bevorzugt eine Kohlehydrat wie z.B. Glucose oder eine niedere Fettsäure bzw. deren Na-Salz wie z.B. Natriumacetat ein. Diese Stoffe haben in dem erfindungsgemässen Verfahren hauptsächlich eine Bedeutung als Kohlenstoff- und Energiequelle für das Wachstum der Mikroorganismen und als Energiequelle für die Umwandlung der & Ketocarbonsäuren in die entsprechenden L-Aminosäuren. Da die Bildung der Aminosäuren aus den analogen i-Ketocarbonsäuren in dem vorliegenden Prozess nicht an das Wachstum der Bakterien gekoppelt ist, erlaubt dies gleichzeitig, die Konzentration assimilierbarer Kohlenstoffquellen niedrig zu halten und die s-Ketocarbonsäure z.B. in einem Fermenter mit Biomasse-Rückhaltung kontinuierlich in die analoge Aminosäure umzuwandeln und hohe Produktkonzentrationen zu erzielen, wobei die Bildung von Nebenprodukten weitgehend unterdrückt wird. Demgegenüber laufen übliche Biosynthesen zur Herstellung z.B. von Isoleucin aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen batchweise ab und führen nur zu geringen und so die Aufarbeitung erschwerenden Aminosäurekonzentrationen. Als ¯x-Ketocarbonsäuren besonders geeignet sind 4-Ketoiso- capronsäure, w-Ketoisovaleriansäure, d-Keto-B-methylvaleriansäure und Phenylbrenztraubensäure. Die Fermentation wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 25 bis 4O0C unter aeroben Bedin gungen für 2 bis 10 Tage durchgeführt. Das Nährmediumweist insb. eine Biotin-Konzentration von mehr als 50 Pg/l auf. Bei niedrigeren Biotin-Konzentrationen ist das Wachstum suboptimal. Dies kann eine Erniedrigung der Ausbeute zur Folge haben. Die Ausgangskonzentration des Fermentationsmediums an Ot -Ketocarbonsäure sollte 30 g/l nicht ubersteigen, da bei höheren Xonzentrationen eine signifikante Wachstumshemmung auftritt. Durch kontinuierliches Nachdosieren der Vorstufe lassen sich jedoch unter Umgehung kritischer Ketosäurekonzentrationen hohe Aminosaurekonzentrationen erreichen. Die Isolierung und Reinigung der Aminosaure aus der Fermentationsbrühe wird durch konventionelle Methoden vorgenommen. Das gemäss der Erfindung produzierte I-teucin, L-Isoleucin, Valin oder Phenyla1anin wurde Durch einen minosäure-Analy- sator sowie einen enzymatischen Test mit L-Aminosäure Oxidase identifiziert und quantifiziert. Beispiel 1: In einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen wurden 100 ml einer Nährlösung mit folgender Zusammensetzung gegeben: 40 g/l Glucose x H2O 20 g/l Na-&alpha;-Ketoisocapronsaure 20 g/l (NH4)2SO4 0.5 g/l K2HPO4 0.5 g/l SH2PO4 0.25 g/l MgSO4 x 7 H2O 0.01 g/l FeSO4 x 7 H2O 0.01 g/l MnSO4 x 4 H2O 0.4 mg/l Biotin 2 mg/l Thiamindichlorid 20 g/l CaCO3 Vor dem Autoklavieren (20 min bei 1210 C und 1 atm Druck) wurde der pH-Wert mit 2 N NaOH auf 7.4 eingestellt. Glucose undO( -Ketoisocaproat wurden getrennt autoklaviert, Thiamindichlorid sterilfiltriert und CaCO3 trocken sterilisiert (8 h bei 1500 C) und nach dem Erkalten der Losungen steril zugegeben. Eine 15 Stunden alte Vorkultur von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, gewachsen in 100 ml Komplex- medium (20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2.5 g/l NaCl, pH 7.4) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen bei 300 C und 100 rpm wurae 2x in steriler 0.9% NaCl gewaschen und in 20 ml steri ler 0.9% NaCl resuspendiert. 2 ml dieser Zellsuspension dienten als Inokulum der Hauptkultur, die bei 300 C und 100 rpm inkubiert wurde. Nach einer Kultivierungsdauer von 57 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 15.8 g/l L-Leucin. Das Fermentationsmedium des Kontrollansatzes ohne 0± -Ketoisocaproat wies kein L-Leucin auf. Beispiel 2: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet. Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 14.5 g/l L-Leucin. Beispiel 3: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 40 g/l Na-Acetat anstelle von Glucose. Nach einer Xultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 10.9 g/l L-Leucin. Beispiel 4: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben verfahren, je doch Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet. Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 7.1 g/l L-Leucin. Beispiel 5: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, je doch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose, 30 g/l Na-cL-Ketoisocapronsäure und 40 g/l (NH4)2SO4. Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 21.8 g/l L-Leucin. Beispiel 6: Da bei einer Ausgangskonzentration von mehr als 3% w/v &alpha;-ketoisocaproat eine signifikante Wachstumsheznmung auftritt, wurde durch Nachfuttcrn von oL-Ketoisocaproat unter Umgehung hoher O( -Ketoisocaproat-Xonzentrationen eine hohe L-Leucin-Xonzentration erreicht. Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, je doch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose und 40 g/l (NH4)2SO4. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurden 2% w/v Na--Ketoisocapronsäure nachdosiert und fur weitere 53 Stunden inkubiert. Bei dieser Ver fahrensweise konnten 24.9 g/l L-Leucin im Permentations medium erreicht werden. Beispiel 7: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 20 g/l Na-&alpha;-Ketoisovaleriansäure Nach einer xultivierungsdauer von 48 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 12.3 g/l L-Valin. Beispiel 8: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 20 g/l Na-DJL-i-Keto-B-methylvale riansäure. Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 4,8 g/l L-threo-Isoleucin und 1,8 g/l L-allo-Isoleucin. Beispiel 9: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose x H20, 40 g/l (NH4)2SOv und 20 g/l Ca-&alpha;-Ketoisocapronsäure. Da das Ca-Salz der &alpha; -Ketoisocapronsäure schwer löslich ist, wurde es in ungelöster Form zusammen mit den anderen Bestandteilen der Nährlösung autoklaviert. Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 12,5 g/1 L-Leucin. Der Xontrollansatz mit dem Na-Salz der -Ketoisocapronsäure enthielt 12,3 g/l L-Leucin. Die vorstehend für verzweigtkettige aliphatische Aminosäuren beschriesene tJasetzung kann auch für die Umwandlung von aromatischen > -etosäuren in die entsprechenden aromatischen & Aminosäuren wie z.B. Phenylalanin angewandt werden. Beispiel 10: Es wurde wie in Beispiel 9 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 10 g/l Ca-Phenylpyruvat. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 4.1 g/l L-Phenylalanin. Beispiel 11: Es wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose x H2O und 40 g/l (NH4)2SO4. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren von der Nährlösung getrennt, 2 x in steriler 0.9% NaC1-Lösung gewaschen und in 35 ml steriler 0.98 NaCl-Lösung resuspendiert. 2 ml dieser Zellsuspension wurden zu 8 ml einer sterilen Inkubationslösung zugegeben, bestehend aus 5 ml eines 0.2 M Tris-HCl Puffers pH 8.0, 1 ml einer 1M Glucoselösung, 1 ml einer 1M (NH4)2S04 Lösung und 1 ml einer 1M Na-d-Ketoisocaproatlösung. Nach einer Inkubationsdauer von 48 Stunden bei 300C und 100 rpm enthielt die Inkubationslösung 0.0943 Mol/l L-Leucin, entsprechend 94.3% Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Menge an Na-d-Ketoisocaproat.

Claims: Process for the fermentative preparation of branched chain aliphatic or aromatic L-amino acids from the analogous ∝-keto carboxylic acids in a culture medium, characterised in that a stock of corynebacterium glutamicum or brevibacterium flavum is caused to act on the ∝-keto carboxylic acids and the amino acid formed is isolated after termination of the reaction. A process according to Claim 1, characterised in that a temperature from 20 to 45°C is employed under aerobic conditions at a pH from 5 to 9 for a duration of 1 to 10 days and in that the culture medium contains a source of assimilable carbon and nitrogen. A process according to Claims 1 to 2, characterised in that growing cells are used. A process according to Claims 1 to 2, characterised in that non-growing ("resting") cells are used. A process according to Claims 1 to 4, characterised in that the concentration of ∝-keto carboxylic acid does not exceed 30 g/1. A process according to Claims 1 to 5, characterised in that the biotin concentration is greater than 50 µg/l. A process according to Claims 1 to 6, characterised in that the ∝-keto carboxylic acid used is ∝-ketoisocaproic acid, ∝-ketoisovaleric acid or ∝-keto-β-methylvaleric acid. A process according to Claim 1, characterised in that corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is used. A process according to Claim 1, characterised in that brevibacterium flavum ATCC 14067 is used. Claims for the Contracting States : DE, FR, GB Process for the fermentative preparation of branched chain aliphatic L-amino acids from the analogous ∝-keto carboxylic acids in a culture medium, characterised in that a stock of corynebacterium glutamicum or brevibacterium flavum is caused to act on the ∝-keto carboxylic acids and the amino acid formed is isolated after termination of the reaction. A process according to Claim 1, characterised in that a temperature from 20 to 45°C is employed under aerobic conditions at a pH from 5 to 9 for a duration of 1 to 10 days and in that the culture medium contains a source of assimilable carbon and nitrogen. A process according to Claims 1 to 2, characterised in that growing cells are used. A process according to Claims 1 to 2, characterised in that non-growing ("resting") cells are used. A process according to Claims 1 to 4, characterised in that the concentration of ∝-keto carboxylic acid does not exceed 30 g/l. A process according to Claims 1 to 5, characterised in that the biotin concentration is greater than 50 µg/l. A process according to Claims 1 to 6, characterised in that the ∝-keto carboxylic acid used is ∝-ketoisocaproic acid, ∝-ketoisovaleric acid or ∝-keto-β-methylvaleric acid. A process according to Claim 1, characterised in that corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is used. A process according to Claim 1, characterised in that brevibacterium flavum ATCC 14067 is used.

Inventors: GROEGER, ULRICH, LEUCHTENBERGER, WOLFGANG, DR., SAHM, HERMANN, PROF.
Applicants: DEGUSSA AKTIENGESELLSCHAFT, FORSCHUNGSZENTRUM JUELICH GMBH
Application year: 1985
Main classification: C12P13
IPC codes: C12P13