GLYCOSIDES OF RESOFURIN DERIVATIVES, METHOD FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE IN THE DETERMINATION OF THE ACTIVITY OF GLYCOSIDASES

Abstract: The glycosides of resorufin derivatives have the general formulae Ia and Ib <IMAGE> in which R<1> is hydrogen, R<2>, R<3> and R<5>, which can be identical or different, are hydrogen, halogen or a lower alkyl group, R<4> and R<6>, which can be identical or different, are hydrogen, halogen, a cyano, lower alkyl, lower alkoxy, carboxyl, lower alkoxycarbonyl, carboxy-lower alkyl, lower alkoxycarbonyl-lower alkyl or an optionally mono- or disubstituted carboxamide group or the group -COO-(CH2CH2O)n-R<7> in which R<7> is hydrogen or a lower alkyl group and n is an integer from 1 to 4, where R<6> can additionally be a sulphonyl or nitro group, and Y is a nitrogen or the group NO. These compounds are particularly suitable as chromogenic and fluorogenic substrates for determining the activity of corresponding glycosidases or oligosaccharide-cleaving enzymes. The glycosides are obtained by reacting resorufin derivatives with a mono- or oligosaccharide or a 1-halogeno derivative thereof, whose hydroxyl groups are substituted by customary protective groups. This initially results in per-O-substituted glycosides, which can be converted into the claimed compounds by elimination of the protective groups. The glycosides are used as chromogenic and fluorogenic substrates in diagnostic agents for detecting glycosidases or oligosaccharide-cleaving enzymes. The resorufin derivatives employed as starting materials in the preparation of the compounds are also claimed.

Description: clycoside von Resorufin-Derivaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Glycosidasen Glycosidasen erfüllen im menschlichen und tierischen Organismus eine vielfache physiologische Funktion. So spielt beispielsweise die ss-D-Galactosidase eine qewichtige Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel, da durch sie die Hydrolyse der Lactose erfolqt. Darüberhinaus stellt die ss-D-Galactosidase das Schlüsselenzym beim Abbau von Glycolipiden, Mucopolysacchariden und Glycooroteinen dar. Als weitere physiologisch bedeutsame Glycosidasen sind zu nennen: Die s-D-Galactosidase, die i-D- und ss-D-Glucosidase sowie i-D-Mannosidase. Über ihren physiologischen Stellenwert hinaus haben die Glycosidasen in den letzten Jahren im diagnostischen sowie im biotechnologischen Bereich an Bedeutung gewonnen. So werden beispielsweise diese Enzyme in zunehmendem Masse als Indikator-Enzym für Enzymimmunoassays eingesetzt. Besonders bevorzugt wird in diesem Zusammenhang die ss-D-Galactosidase [siehe beispielsweise Annals of Clinical Biochemistry 16, 221 - 240 (1979)]. Die Bestimmung der Aktivität der Glycosidasen spielt demnach sowohl in der klinischen Chemie als auch in der Diagnostik eine zunehmende Rolle. Hierzu wird ganz allgemein die Glycosidase-haltige Probe mit einem geeigneten Substrat versetzt. Das Substrat wird von dem Enzym gespalten. Eines der Spaltprodukte wird in geeigneter Weise nachqewiesen. Es kann entweder das durch Einwirkung des Enzvms freigesetzte Glycon oder das Aglycon gemessen werden. In der Reqel wird letzteres bestimmt. Als Substrat eignen sich oft die natürlichen Substrate der nachzuweisenden Enzyme. Besonders bevorzugt werden jedoch Glycoside verwendet, bei denen das Aglycon einen spektroskopisch leicht nachweisbaren Rest darstellt. Es sind eine Reihe von Glycosidase-Substraten bekannt, bei denen nach der Spaltung durch die Glycosidase das Aglycon spektroskopisch im sichtbaren oder auch UV-Bere:ich sowie fluorometrisch gemessen werden kann. So sind in Biochem. Z. 333, 209 (1960) Phenyl-ss-Dgalactosid sowie einige weitere am aromatischen Rina substituierte Derivate (z. B. o-Nitrophenyl- und p-Nitrophenyl-ss-D-galactosid) als Substrate der ss-D-Galactosidase beschrieben. Die durch Hydrolyse freiqesetzten Phenole werden Dhotometrisch im UV-Bereich bzw. bei den Nitrophenolen im kurzwelligen sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt. Auch kann als Indikatorreaktion eine oxidative Kupplung mit Aminoantipyrin angeschlossen werden [Analytical Biochem. 40, 281 (1971)]. Für histochemische Untersuchungen werden Naphthyl-ss-D- galactoside verwendet, so z. B. die l-Naphthyl-Verbindunq in Histochemie 35, 199 (1973), das 6-Brom-2-naphthyl Derivat in J. Biol. Chem. 195, 239 (1952) oder das Naphthol-ss-D-galactosid (Histochemie 37, 89 (1973)1. Zur Visualisierung werden dabei die entstehenden Nanhthole mit verschiedenen Diazoniumsalzen zu Azo-Farbstoffen umgesetzt. Die Bestimmung von Enzymaktivitäten mit fluoroqenen Substraten ist weitverbreitet, da gegenüber den photometrischen Methoden die Empfindlichkeit fluorometrischer Bestimmungen oft um einige Zehnerpotenzen erhöht ist. Tn manchen Fallen muss mit fluorogenen Substraten gearbeitet werden, beispielsweise bei der Untersuchung enzymatischer Aktivität in Zellen mit automatischen Geräten zur Zelldifferenzierung (Zytofluorometrie) sowie bei der Analyse immobilisierter Enzyme mit Durchflussmikrofluorometrie. In anderen Fällen, beispielsweise bei der Bestimmung enzymatischer Markierung von Testsystemen (Enzymimmunoassays) wird der Multiplikationseffekt der enzymatischen Katalyse durch Verwendung fluorogener Substrate beträchtlich verstärkt. Die bisher bekannten fluorogenen Substrate für ss-D-Galactosidase und andere Glycosidasen besitzen als Fluorophore Derivate von Fluorescein, Indoxyl oder Methylumbelliferon. Für die kinetische Analyse komplexer Systeme besitzen diese Verbindungen jedoch schwerwiegende Nachteile. Die disubstituierten Derivate von Fluorescein werden in einer mehrstufigen Reaktionsfolqe hydrolysiert. Monosubstituierte Fluorescein-Glycoside fluoreszieren bereits selbst. Indoxyl-Derivate unterlieqen nach ihrer enzymatischen Spaltung einer Reihe von chemischen Umwandlungen, die ebenfalls die kinetische Analyse komplizieren. Derivate von Methylumbelliferon müssen im UV angeregt werden. Hierbei kann die Figenfluoreszenz von bioloqischen oder synthetischen Materialien stören. Darüberhinaus ist die UV-Anregung, insbesondere bei Laseroptik, kostenaufwendig. Die meisten fluorogenen Substrate führen zu Reaktionsprodukten, die nur eine geringe Löslichkeit aufweisen, so dass sie für die kinetische Analyse von Enzymaktivitäten, wofür gerade qute Löslichkeit von Substrat und Produkt erforderlich ist, nicht geeignet sind. Es bestand daher weiterhin ein Bedarf an Substraten, mit denen verschiedene Glycosidasen auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise bestimmt werden können und die möglicherweise sowohl bei photometrischen als auch fluorometrischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, diesen Bedarf zu befriedigen. gelöst wird diese Aufgabe durch die neuen Glycoside von Resorufin-Derivaten, die sich mit Hilfe von Glycosidasen in den Zuckeranteil und in die Resorufin-Derivate spalten lassen. Letzere sind gut wasserlösliche Verbindungen, die eine gut messbare Absorption im sichtbaren Bereich aufweisen und sich ferner leicht zur Fluoreszenz anregen lassen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach Glycoside von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib EMI4.1 in denen R Wasserstoff, R2, R3 und R5, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen oder eine Niederalkyl grupoe, R und R 6, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Halogen, eine Cyano-, Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Carboxy-, Niederalkoxycarbonyl-, Carboxyniederalkyl-, Niederalkoxycarbonyl-niederalkyl- oder eine gegebenenfalls ein- oder zweifach substituierte Carboxamidogruppe oder die Gruppe 7 -COO- (CH2CH2O) nur 7 in der R Wasserstoff oder eine Niederalkyl-Gruppe und n eine qanze Zahl von 1 bis 4 bedeuten, wobei R6 zusätzlich eine Sulfonyl-oder Nitrogruppe vorstellen kann, und Y ein Stickstoff oder die Gruppe N#O bedeuten. Die Glycoside von Resorufin-nerivaten der allgemeinen Formel I sind neue Verbindungen. Sie können nach an sich aus der Kohlenhydratchemie bekannten Methoden herqestellt werden. Vorzuasweise werden in an sich bekannter Weise Resorufin Derivate der allqemeinen tautomeren Formeln TTa und TTb EMI5.1 dieser R5 bis R6 und Y die angegebene und @@@ mit einem Mono- oaer Oligo-Saccharid oder einem l-Halogeno-Derivat niervon, wobei jeweils alle Hydroxygruppen mit einer in der Kohlennydratchemie üblicnen Scnutzgruppe substituiert sind, zu per-O-substituierten Glycosiden umgesetzt, aus denen durch Aospaltung aer Scnutzgruppen in an sicn bekannter Weise aie Glycoside von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel I ernalten werden. Die Umsetzung der Verbindungen der Formel II mit den per-O-substltulerten l-Halogeno-Saccharluen wird vorzugsweise in Gegenwart von Säurefängern, wie Alkali- hydroxid oder -carbonat, in wässrigem Aceton oder (unter Phasentransferbedingungen) in einem Wasser/Benzol- oder Wasser/Cnloroform-Gemlscn vorgenommen. DarüDerninaus Kann dieses Verfanren durchgeführt werden, indem man die Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel II zunäcnst mittels Alkalihydroxid oder -alkoholat in die Alkalisalze ozw. mittels gegebenenfalls substituierter Amine in oie Ammoniumsalze überführt und diese dann in aipolar aprotischen Lösungsmitteln wie Aceton, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid mit aen per-O-substituierten l-Halogeno-Saccnariden umsetzt. Ferner naDen sich bei der Synthese der per-O-substituierten Glycoside aus aen Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel II und den per-O-substituierten l-Halogeno-Saccnariden Zusätze von einzelnen Silbersalzen ooer Gemiscnen von Silbersalzen (Silberoxid, -carbonat, -carbonat auf Celite, -triflat, -salicylat) und/oder von einzelnen Quecksilbersalzen oder Gemischen von Quecksilbersalzen (Quecksilberbromid, -cyanid, -acetat, -oxid), gegebenenfalls unter Verwendung von Trocknungsmitteln wie Calciumchlorid, Molekularsieb oder Drierit, in Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid, Chloroform, Benzol, Toluol oder Dioxan, bewährt. Zur Synthese derOk-verknupf'ten Glycoside wird zweckmässigerweise eine Verbindung aer allgemeinen Formel II mit einem Saccnarid, dessen Hydroxygruppen mit einer Schutzgruppe, besonders bevorzugt mit einer Acetylgruppe, substituiert sind, in Gegenwart einer Lewissäure, wie z.B. Zinntetrachlorid, Aluminiumchlorid, vorzugsweise ZinKchlorid, geschmolzen (vgl. Chem. Ber. 66, 378-383 [1933] und Methods in Carbonydr. Chem. 2, 345-347 [1967]). Die Temperatur wird hierbei zwischen 80 und 1500 C, bevorzugt zwischen 110 una 1300 C gewänlt. Die so erhaltenen per-O-substituierten Glycoside von den Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel II sind ebenfalls neue Verbindungen. Die Abspaltung der Schutzgruppen von den per-O-substituierten Glycosiden zu den Glycosiden aer allgemeinen Formel I wird nach in der Konlenhydratchemie gängigen Methoden Ls. z. B. Advances Carbohydrate Chem. 12, 157 (1975), beispielsweise bei aen Acyl-Schutzgruppen mittels Natriummethylat oder Bariummethylat oder Ammoniak in Methanol, durchgeführt. Unter Halogen in der Definition von R1 bis R7 ist Fluor, Cnlor, Brom und Iod, vorzugsweise Chlor und Brom, zu verstehen. Die "Niederalkylgruppe" in der Definition von R1 bis R6 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Metflylgruppe besonders bevorzugt ist. Die NiederalKoxygruppe in der Definition von R4 und R6 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Methoxygruppe besonders bevorzugt ist. Die Nieaeralkoxy-" bzw. die "Niederalkyl-"Reste der Niederalkoxycarbonyl-, Carboxy-niederalkyl- sowie der Niederalkoxycarbonyl-niederalkyl-Reste in der Definition aer Suostituenten R4 und R6 weisen ebenfalls 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Konlenstoffatome auf, wobei die Metnoxy-Gruppe bzw. der Methylen-Rest besonders bevorzugt sind. Als "in der Kohlenhydratcnemie gebräuchliche Schutzgruppe' eignet sich besonders ein Acetyl-, Benzoyl-, Benzyl- oder Trimethylsilyl-Rest. Als Substituenten der Carboxamiaogruppe Kommen Alkyl-, Alkoxyalkyl-, Carboxylakyl- und Alkoxycarbonylalkylreste in Frage, wobei die Alkylreste jeweils 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Konlenstoffatome aufweisen. Bei einer zweifacn substituierten Carboxamidfunktion können die beiden Substituenten zu einem Ring geschlossen sein, der aurcn Heteroatome, z. B. Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, unterbrocnen sein kann. Als glycosiaischer Rest, der mit den Resorufin-Derivaten aer aligemeinen Formel II zu Glycosiden der allgemeinen Formel I verknüpft ist, eignen sicn alle Mono- und Oligo-Saccnaride, aie sicn durch die entsprechenden Glycosidasen wieder von dem Resorufin-Grundgerüst aDspalten lassen. Als Beispiele für erfindungsgemässe Glycoside seien erwähnt: ii-D-Galactopyranoside -D-Galactopyranoside, b-D-Glucopyranoslde, t-D-Glucopyranosioe sowie W-D-Mannopyranoside. Als glycosidischer Rest sind auch Oligo-Saccharid-Ketten geeignet, die sich von Saccharidketten spaltenden Enzymen bis auf die Stufe eines mono- bzw. Oligo-Saccharids abbauen lassen, das sich seinerseits mit den entsprechenden Glycosiden direkt von Resorufin-Grundgerüst abspalten lässt. Als solche Oligo-Saccharidketten werden insbesondere Ketten verstanden, die aus 2 bis 10, vorzugsweise aus 2 bis 7 Mono-Saccharid-Einheiten aufgebaut sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die neuen Verbindungen der allgemeinen tautomeren Formeln II'a und II'D EMI10.1 in denen R1' bis R6 dieselbe Bedeutung wie die Substi tuenten R1 bis R6 besitzen, wobei R1' bis R6' nicht alle gleichzeitig Wasserstoff bedeuten können, und Y die oben angegebene Bedeutung hat. Diese Verbindungen sind neu. Sie eignen sich insbesondere als Zwischenprodukt zur Herstellung der erfindungsgemässen Glycoside von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel T. Die Verbindungen der allgemeinen Formel lT' lassen sich in Analogie zu Verfahren herstellen, die zur Herstellung des bekannten Resorufins (Verbindunq der allqemeinen Formel II, in der R1 bis R jeweils ein Wasserstoffatom darstellt) geeignet sind. Die verbindunqen der allgemeinen Formel IT' werden in vorteilhafter Weise hergestellt, indem Nitrosoresorcin Derivate der allgemeinen Formel ITT EMI11.1 mit Resorcin-Derivaten der allgemeinen Formel IV EMI11.2 in denen R1 bis R61 die oben anqeqebene Bedeutunq haben, in Anwesenheit von Braunstein und Schwefelsäure bei niedriqen vemseraturen umqesetzt werden. Es entstehen dabei zunächst Verbindungen der allgemeinen Formel II', in der Y eine NO-GruDpe darstellt. Diese Substanzen lassen sich leicht mit Zinkpulver in Anwesenheit von Ammoniak in Verbindungen der allgemeinen Formel II', in der Y Stickstoff bedeutet, überführen. Die Reaktion der Verbindungen der allgemeinen Formel ITT mit Verbindungen der allgemeinen Formel IV wird üblicherweise bei einer Temperatur zwischen -10 bis 500 C, vorzugsweise zwischen 0 und 300 C durchqeführt. Besonders schonend verläuft die Umsetzunq, wenn man die Substanzen der allgemeinen Formel III und der Formel IV bei ungefähr 00 C vermischt und das Reaktionsqemisch sich anschliessend auf Raumtemperatur erwärmen lässt. nie Konzentration an Braunstein sollte zweckmässiqerweise bei 0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 2 mol/l lieqen. Die Schwefelsäurekonzentration sollte 0,5 bis 5, vorzuqsweise 1 bis 3 mol/l betragen. Die Reduktion von Verbindunoen der allqemeinen Formel TT', in der Y eine N#O-Gruppe darstellt, zu Verbindungen der allgemeinen Formel IT', in der Y ein Stickstoff bedeutet, wird vorzugsweise in ammoniakalischer Lösung mit Zinkstaub durchgeführt (val. Nietzki et al., Ber. Dtsch. nahem. es. 22, 3020 (18891). 91s Lösunasmittel verwendet man zweckmässiqerweise wasser-nlkohol-emische, bevorzuat ein Gemisch aus 1 Teil Wasser mit 0 bis 4 Teilen Methanol. Pro Mol zu reduzierender Substanz werden 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 5 Mol Zinkstaub portionsweise zugegeben. Die Temperatur der Reaktionslösunq wird dabei bei -10 bis +350 C, vorzuqsweise bei +5 bis +100 C gehalten. Die genaue Einhaltung des Temperaturbereiches hat sich als notwendiq für einen eindeutisen Reaktionsverlauf erwiesen. Ohne Kühlunq führt die exotherme Reaktion zu Nebenprodukten, die schwer abtrennbar sind. Unter den gewählten milden Bedinqunqen verläuft die Umsetzung zwischen den Substanzen der allqemeinen Formel ITT und der allgemeinen Formel IV eindeutig und mit guter Ausbeute. Der gewählte Syntheseweg ist variationsfähia. Dies eröffnet insbesondere im Hinblick auf die Darstellung unsymmetrisch substituierter Resorufin-bzw. auch Resazurin- Derivate zahlreiche Synthesemöglichkeiten. Resorufin-Derivate der Formel II', in der R4' oder/und R6' eine Niederalkoxycarbonyl-, eine gegebenenfalls einoder zweifach substituierte Carboxamidoqruppe oder die Gruppe -COO-(CH2CH2O)n-R' bedeuten, werden bevorzugt über die triacylierten Dihvdroresorufine der allgemeinen Formel V dargestellt, EMI13.1 (V) in der R1 R2 R3 und R5 die oben angegebene Bedeutung haben, R4" und R6" eine Carboxygruppe und R7" Wasserstoff oder eine Niederalkylaruppe vorstellen. Die Carbonsäure-Funktion wird durch literaturbekannte Verfahren, z. b. mit Oxalylchlorid/DMF oder Thionylchlorid/DMF in das Säurechlorid überführt, aus dem durch Reaktion mit beliebigen Alkoholen und Aminen die entsprechend substituierten Carbonsäureester- bzw. Carboxamid-Derivate erhalten werden. Durch Behandlung der so erhaltenen acetylierten Derivate der allgemeinen Formel III mit Lauqe, bevorzugt 0,1 - 5 d Natron- oder Kalilauge, oder mit 1 - 15 M wässriqem Ammoniak und einem Oxidationsmittel, bevorzuqt Kaliumhexacyanoferrat-III, unter Zugabe von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie 1,4-Dioxan oder Methanol, erhält man die entsprechenden Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel TI. Als Alkoholkomponente eignen sich im Prinzip alle möglichen Alkohole. Besonders bevorzugt sind Diethylenglycol-monoethyl-ether, Triethylenglycol-monoethyl-ether oder einfache Alkohole, wie Methanol oder Ethanol. Die Amin-Komponente kann ebenfalls aus allen möglichen Aminen ausgewählt werden. Besonders bevorzugt sind Amine mit einer polaren Gruppe, wie beispielsweise Morpholin, Methoxyethylamin oder Glycinamid oder Ammoniak, ein primäres oder sekundäres Niederalkylamin. Ferner können Aminocarbonsäuren mit in üblicher Weise geschützter Carboxyl-Funktion, wie z. B. Glycin-tert-butyl-ester, Glycinbenzylester oder NK BOC-Lysinmethylester eingesetzt werden. Nach Abspaltung der Schutzgruppen erhält man so Resorufine lT bzw. Resorufin-glycoside I mit aliphatischer Carbonsäure-Funktion. Die acetylierten Dihydroresorufine der allqemeinen Formel V erhält man aus dem entsprechenden Resorufin oder Resazurin durch Umsetzunq mit einem starken Reduktionsmittel, wie z. B. Zinn-lT-chlorid oder Chrom-TT-acetat oder durch elektrochemische Reduktion und anschliessende Acetylierung. Zur Reduktion erwärmt man das Resorufin oder Resazurin 10 min bis 1 Std. mit 2 bis 10, bevorzugt 2 bis 6 Äquivalenten Zinn-II-chlorid in 5 bis 35 %iger wässriqer Salzsäure. Beim Abkühlen fällt die Dihydroverbindung aus. Die Acetylierung erfolgt in üblicher Weise mit Acetanhydrid. Bevorzugt werden die Verbindungen der allgemeinen Formel V in einem Eintopfverfahren durch reduktive Acetvlieruna heraestellt. Das entsprechende Resorufin oder Resazurin wird mit 2 bis 6 Äquivalenten Zinn-II-chlorid 5 min bis 5 Std., bevorzuat 10 min bis 3 Std. in Acetanhydrid unter Rückfluss erhitzt oder bei RT 4 bis 16 Std. qerührt. Bei der Synthese der Glycoside der Resorufin-Derivate der allqemeinen Formel II entstehen nicht-fluoreszierende Verbindungen, aus denen durch enzymatische Spaltung mit Hilfe der entsprechenden C-lycosidasen wieder die fluoreszierenden Resorufin-Derivate freigesetzt werden. Die erfindungsgemässen fluorogenen Resorufin-Derivate besitzen im Vergleich zu den bisher bekannten Glycosiden anderer chromogener bzw. fluorogener Gruppen sehr vorteilhafte Eigenschaften. Als monosubstituierte Derivate weisen sie eine Kinetik der enzymatischen Hydrolyse auf, die sehr einfach durch die Michaelis-Menten-Reziehung beschrieben werden kann. Für das Resorufin-ss-D-galactopyranosid gilt beispielsweise eine Michaelis-Konstante KM = 0,38 mmpl/l. Die Hemmung dieser Hydrolyse durch das natürliche Substrat Lactose ist kompetitiv, so dass für bestimmte Untersuchungen der spezifische Umsatz von Glycosiden der Resorufin-Derivate durch Zugabe von natürlichen Glycosiden, wie Lactose im Falle der ss-D-(;alaktosidase, definiert und reversibel verändert werden kann. Die erfindungsgemässen Glycoside von Resorufin-Derivaten sind in wässriger Lösung bei +40 C praktisch unbegrenzt haltbar. Schon die Löslichkeit der Glycoside des Resorufin-Grundgerüstes ist für die meisten kinetischen Zwecke ausreichend. Durch Einführunq von Carbonsäureresten, Carbonsäure-Deriraten mit polaren Gruppen bzw. Sulfonsäureqrupoen wird die Löslichkeit der entsprechenden Glycoside noch wesentlich verbessert. Anregung und Emission der erfindungsqemässen Produkte liegen im sichtbaren Spektralbereich bei hinreichender Quantenausbeute. Die maximale Fluoreszensintensität des Resorufins wird bei pH-Werten über 7,0 erreicht und fällt zu niedrigeren pH-Werten nur lanqsam ab. Die Glycoside des Resorufins sind in wässriger Lösung meist gelb gefärbt (tmax bei ca. 470 nm). Nach der enzymatischen Reaktion weisen die Produkte meist eine rote Farbe auf max bei ca. 570 nm), so dass die Substanzen ebenfalls ausgezeichnet für photometrische Bestimmungen und nicht-instrumentelle, visuelle Verfahren geeignet sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der neuen Glycoside von Resorufin-Derivaten der all gemeinden Formel 1 zur Bestimmung der Aktivität von entsprechenden Glycosidasen, beispielsweise der A-D- und 15-D-Galactosidase, der &alpha;-D- und ss-D-Glucosidase sowie der &alpha;-D-Mannosidase. Resorufin-Derivate der allgemeinen Formel I, in denen der Glycosid-Rest eine Oligo-Saccharid-Kette darstellt, eignen sich insbesondere auch zum Nachweis von Saccharidketten spaltenden Enzymen, wie beispielsweise Amylase. HierDei wird uie Oligo-Saccharidkette durch das nachzuweisende Enzym in cnarakteristische Weise gespalten, vorzugsweise DiS zur Stufe des Monosaccnarids, wobei erforderlicnenfalls weitere Hilfsenzyme verwendet werden können. Dieses wird dann durch die entsprechende Glycoside in vorstehend beschriebener Weise in das Resorufln-Grundgerüst und das Monosaccharid gespalten. Ferner werden aiagnostische Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Glycosidasen beansprucnt, die die neuen Glycoside von Resorufin-Derivaten der allgemeinen Formel I enthalten. Die Verwendung der Glycoside von Resorufin Derivaten der allgemeinen Formel I als Substrate für die Glycosidasen führt zu deutlich empfindlicheren Testsystemen, als sie bisher bekannt sind. Die neuen Substrate können zur Bestimmung der Aktivität von Glycosidasen mit Vorteil sowohl im biochemischen, biotechnologischen als auch im Klinisch-chemischen Bereich eingesetzt werden. Sie sind empfindlicher. Daraus ergeben sich mehrere Vorteile: a) Es Können geringere Enzym-Aktivitäten gemessen werden. b) Es Können kleinere Probenmengen eingesetzt werden. c) Die Bestimmung der Aktivität kann in erheblich kürzerer Zeit erfolgen. d) Der geringe Probeneinsatz und die günstige Messwellen länge vermindern ausserdem die Störanfälligkeit der Methode durcn andere Probenbestandteile. e) Es Kann der Umsatz in Trägermatrizen mit immobilisiertem Enzym gemessen werden. Es hat sicn gezeigt, dass die beanspruchten Substrate zur Bestimmung der Aktivität von Glycosidasen jeglicher Her Kunft geeignet sind. Die erfindungsgemässen diagnostischen Mittel mit Substraten der allgemeinen Formel I reagieren deutlich empfindlicher als die bisher bekannten Testmittel. Geeignet sind die Glycoside von Resorufin-Derivaten der Formel I auch für immunologische Bestimmungsmethoden, bei denen Glycosidasen als Indikator-Enzyme verwendet werden, deren Aktivität nach Durchführunq der immunologischen Reaktion ermittelt werden muss. Solche immunologischen Bestimmungsmethoden mit enzymatischer Indikatorreaktion sind dem Fachmann als Enzymimmunoassays bekannt. Diese Methoden dienen zur Bestimmung der Konzentration von Proteinen, Polysacchariden, Hormonen, Arzneistoffen und anderen nieder-molekularen Substanzen im Bereich von 1O 5 bis 10-12 mol/l. Je nach Erfordernis von Phasentrennschritten unterscheidet man zwischen homogener und heterogener Testführunq. zinke weitere Unterteilung kann in kompetitive und nicht-kompetitive Testprinzipien erfolgen. Alle Testprinzipien arbeiten jedoch mit Enzym-Antigenbzw. Enzym-Antikörper-Konjugaten. Die enzymatische Indikator reaktion ist allen Enzymimmunoassays gemeinsam. Für solche Zwecke geeignete Indikatorenzyme sind beispielsweise Glycosidasen, insbesondere die ss-D-Galacto- sidase. Die Bestimmung der Glycosidasen in solchen Enzymimmunoassays erfolgt üblicherweise, indem ein geeianetes Substrat zuqesetzt wird, das enzymatisch gespalten und in üblicher Weise photometrisch oder auch fluorometrisch vermessen wird. Eine Verbesserung des Glycosidase-Testsystems führt demnach ebenfalls zu erheblichen Vorteilen bei solchen Enzymimmunoassays: 1. Die höhere Empfindlichkeit ermöqlicht auch hier eine weitere Frniedriqunq der Nachweisgrenzen, kürzere Reaktionszeiten und geringeren Probeneinsatz und damit auch gerinqere Störungen durch andere Probenbestand teile. 2. Die günstigere Messwellenlänge vermindert bei bestimmten Reaktionsfu'hrungen die Störanfälliqkeit der Methode durch unlösliche Bestandteile, beispielsweise durch Trübungen. Das diagnostische Mittel enthält neben einem oder mehreren der erfindungsgemässen Substrate der allgemeinen Formel I, ein geeignetes Puffersystem sowie gegebenenfalls weitere geeignete, üblicherweise für solche diagnostische Mittel verwendete Zusatzsstoffe, wie beispielsweise Netzmittel, Stabilisatoren usw. Das diagnostische Mittel kann in Form einer Lösung, als Lyophilisat, als Pulvergemisch, Reaqenztablette oder auf einem saugfähigen Träger aufgezogen, vorliegen. Das erfindungsgemässe diagnostische Mittel in Form einer Lösung enthält vorzugsweise sämtliche für den Test benötigten Reagentien. Als Lösungsmittel kommen Wasser oder Gemische von Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Methanol, Aceton oder Dimethylformamid, in Frage. Aus Haltbarkeitsgründen kann es vorteilhaft sein, die für den Test benötigten Reagentien auf zwei oder mehr Lösungen zu verteilen, die erst bei der eigentlichen Untersuchung vermischt werden. Zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Form eines Lyophilisats im Gesamtgewicht von jeweils etwa 5 - 20 mg, vorzugsweise etwa 10 mg, wird eine Lösung getrocknet, die neben sämtlichen für den Test benötigten Reagentien übliche Gerüstbildner, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, und eventuelle weitere Füllstoffe, wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit enthält Ein diaqnostisches Mittel in Form von Pulvermischunqen oder Reagenztabletten lässt sich herstellen, indem die Bestandteile des Testes mit üblichen galenischen Zusatzstoffen versetzt. und granuliert werden. Zusatzstoffe dieser hrt sind z. B. Zuckeralkohole, wie Mannit, Sorbit oder Xylit, oder andere lösliche inerte Verbindunqen, wie Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon. Die Pulvermischungen oder Reaqenztabletten weisen im allgemeinen ein Endgewicht von ungefähr 30 bis 200 mg, vorzugsweise 50 bis 80 mg, auf. Zur Herstellung des diaqnostischen Mittels in Form eines Teststreifens wird ein sauqfähiqer Träger, vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservlies mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zur Herstellung von Teststreifen verwendeten Reagentien in leicht flüchtiqen Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton imprägniert. Dies kann in einem Tmprägnierschritt erfolgen. Oft ist es jedoch zweckmässig, die TmDrägnieruna in mehreren Schritten durchzuführen, wobei Lösunqen eingesetzt werden, die jeweils einen Teil der Bestandteile des diagnostischen Mittels enthalten. So kann beisoiels- weise in einem ersten Schritt mit einer wässrigen Lösunq, die den Puffer und andere wasserlösliche Zusatzstoffe enthält, und dann in einem zweiten Schritt mit einer Lösung, die das fycosidase-Substrat enthält, imDrägniert werden. Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffen angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken gemäss DBP 2118455 eingesiegelt werden. Die nachfolgenden Beispiele zeigen einiqe der zahlreichen Verfahrensvarianten, die zur Synthese der erfindungsgemässen Verbindungen beschritten werden können sowie beispielhaft die Verwendung der neuen Glycoside von Resorufin-Derivaten zur Bestimmung der Aktivität von Glycosidasen. Sie sollen jedoch nicht eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes bedeuten. Beispiel 1 Resorufin-ss-D-galactopyranosid a) Darstellung von Resorufin Resorufin wird aus seinem Oxidationsprodukt Resazurin, das in guter Reinheit kommerziell erhältlich ist, in Anlehnunq an die Beschreibung von Nietzki et al. (Ber. Dtsch. Chem. Ges. 22 (1889) Seite 3020 - 3038) dargestellt. Hierzu werden 10 g (43 mmol) Resazurin (Fluka, Buchs, Schweiz) in einem Becherglas mit 50 ml 25 %iger Ammoniaklösunq, 25 ml 37 %iger Natriumhydrogensulfit-Lösung und 50 ml Wasser für 30 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt. Es werden nochmals 20 ml der Ammoniaklösung, 7 ml der Hydroqen sulfit-lösung und 20 ml Wasser dazugegeben und weitere 30 Minuten erhitzt. Die Umwandlung kann am Farbumschlag von blau nach rot oder über Dünnschicht-Chromatographie beobachtet werden. Nachdem die Reaktion vollständiq abgelaufen ist, werden 10 ml 32 %iger Salzlösung dazugegeben, bis DH 5 erreicht ist. Die Reaktionslösunq wird für einen Tag im Kühlschrank stehen gelassen. Danach wird der bräunliche Niederschlag abgesaugt, mit eiskalter Salz säurelösunq, pH 4, gewaschen und bei 1100 C getrocknet. Ausbeute 7,8 g (36,7 minol; 85 % d. Th.). b) Glycosylierung von Resorufin zu Resorufin-ss-D galactopyranosid Die Glycosylierung an der phenolischen Hydroxylqruppe über die Zwischenstufe des Tetraacetats gelanq nach dem folgenden Verfahren. 2,13 g (10 mmol) feingepulvertes Resorufin, 4,12 g (10 mmol) Acetobromo-o(-D-galactose (Siqma, München}, 1,16 g (5 mmol) Silber-T-oxid (Fluka, Buchs, Schweiz), 5 9 Calciumsulfat (CaSO4. 1/2 H2O; Drierit), einige Körnchen Jod und 50 /ul Chinolin werden in 50 ml Methylenchlorid bei Raumtemperatur für 40 Stunden gerührt. 40 % des Resorufins werden dabei zu Resorufin-ss-D-galactopyranosid-tetra-acetat umgewandelt. Die Kontrolle der Reaktion kann wiederum mit Hilfe der Dünnschicht-Chromatographie durchgeführt werden. Nach Abtrennen der festen Bestandteile über Faltenfilter und Zentrifugation wird das Methylenchlorid im Rotavapor abgezogen. Das Resorufin-ss-D-galactopyranosid-tetra-acetat bleibt als braungelblicher SiruP zurück. Ausbeute ca. 2 q (35 % d. Th.). 2 g Resorufin-ss-D-galactopyranosid-tetra-acetat werden ohne weitere Reinigung in 80 ml trockenem Methanol aufgenommen. 0,5 q Natrium werden in kleinen Stücken, im Eisbad, in 20 ml trockenem Methanol aufqelöst. Unter Rühren im Fisbad werden 6 - 8 ml der Methoxidlösunq innerhalb von 30 Minuten in Portionen von 1 ml zu der Resorufin-ss-D- galactopyranosid-tetra-acetat-Lösung gegeben und die Deacetylierung über Dünnschicht-Chromatographie beobachtet. Das ausgefallene, orange farbige Resorufin-ss- D-galactopyranosid wird abqesaugt und mit wenig eiskaltem Methanol gewaschen. Ausbeute ca. 1 g Rohsubstanz (70 % d. Th.). Umkristallisation aus Methanol mit nachfolqender Trockunq (nicht über 600 C > liefert 0,2 g reines Produkt. Alle Dünnschicht-Chromatographie-Untersuchungen zur Kontrolle des Reaktionsablaufes können mit dem System Kieselgel 60 (Merck, Darmstadt) und Fliessmittel Methylen chlorid/Methanol (9/1) durchgeführt werden. Für dieses System gelten die folgenden Rf -Werte: Resorufin 0,4 Resazurin 0,35 Resorufin-ss-D-galactopyranosid-tetra-acetat 0,9 Resorufin-ss-D-galactopyranosid 0,1. Beispiel 2 Resorufin-ss-D-glucosid 2,13 g (10 mmol) Resorufin (hergestellt qemäss Beispiel 1 a), 4,11 g (10 mmol) Acetobromo-0C-D-glucose und 3,64 g (10 mmol) Hexadecyltrimethylammoniumbromid werden 4 Std. in einer Mischung von 11,5 ml 1 N Natronlauge und 50 ml Chloroform unter Rückfluss erhitzt. Danach wird zur Trockne eingedampft und mit Essigester digeriert. Die Essigester- Lösung wird erneut zur Trockne eingedampft. Es wird mit 20 ml Ethanol aufgenommen. Das aus dieser Lösunq ausgefallene Tetraacetylresorufin-ss-D-glucosid wird aus Methanol unter Zusatz von Aktivkohle umkristallisiert. Zur Deacetylierung wird mit 10 ml Methanol aufgenommen. Nach 2 Std. Rühren bei Raumtemperatur wird das ausgefallene Produkt abgesaugt und getrocknet. Ausbeute: 50 mq. 1H-NMR ([D]6-DMSO): #=3.15 - 3.80 (m, 6H) 4.5 - 6.5 (breit, 4H); 5.12 (d, J = 6,9 Cz, lH); 6.29 (d, J = 2,0 Hz, lH); 6.80 tdd, J = 9.6 und 2.0 Hz, lH); 7.12 (dd,, J = 8.5 und 2,0 Hz, 1H); 7.16 (d, J = 2.0 Hz, lH) ; 7.55 (d, J = 9,6 Fz, 1H); 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H). Beispiel 3 Resorufin-l-carbonsäuremethylester 50 g Nitrosoresorcin, 53,3 a 3,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester und 28,0 g Braunstein werden in 500 ml Methanol gelöst bzw. susoendiert. Unter Eiskühlung werden bei 5 bis 100 C 34,4 ml konzentrierte Schwefelsäure zugetropft. Nach Entfernen des Eisbades wird noch zwei Stunden weitergerührt. Danach werden unter Kühlung 200 ml wässrige Ammoniaklösung zugegeben. Der ausgefallene Nieder schlag wird über einen Glasfaserfilter abfiltriert. Zu dem Filtrat gibt man portionsweise bei 5 bis 100 C 10 q Zinkpulver. Bei Raumtemperatur wird so lanqe gerührt, bis die Reduktion vollständig ist (DC-Kontrolle, Essig ester/Methanol 4:1 als Fliessmittel, Reaktionszeit ca. 1,5 Std.). Am Rotationsverdampfer wird bei 250 C Badtemperatur auf 1/3 des Volumens eingeengt. Durch ansäuern mit konzentrierter Salzsäure bis zum Farbumschlag unter Kühlung wird das gewünschte Produkt ausgefällt. Nach Waschen mit verdünnter Salzsäure und Trocknen im Vakuum über Calciumchlorid erhält man Resorufin-l-carbonsäuremethylester. Ausbeute: 30,9 q (36 96 d. Th.). 1H-NMR: (jD]6-DMSO) : = 3.98 (s, 3H); 6,47 (d, J = 2.2 Yz, 1 H); 6.85 - 6.95 (m, 2H); 7.09 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.60 (d, J = 9.6 Hz, 1 H). Fluoreszenz: Absorption: = 570 nm max Remission: 1 = 588 nm. max In analoger Weise erhält man aus a) 3,5-Dihydroxybenzoesäure und Nitrosoresorcin über die Resazurin-1-carbonsäure Resorufin-1-carbonsäure UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): #max = 569 nm max b) 4-O-Methyl-gallussäuremethylester und Nitrosoresorcin über 4-Methoxy-resazurin-1-carbonsäuiremethylester 4-Methoxy-resorufin-l-carbonsäuremethylester UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): : #max = 592 nm c) 3,5-Dihydroxybenzeosäuremethylester und 4-Chlor-6-nitrosoresorcin über 8-Chlor-resazurin-1-carbonsäuremethylester 8-Chlor-resorufin-1-carbonsäuremethylester d) 4-O-Methylgallussäuremethylester und 4-Brom-6-nitrosoresorcin über 8-Brom-4-methoxy-resazurin-l-carbonsäuremethylester 8-Brom-4-methoxy-resrufin-1-carbonsäuremethylester e) 5-Nitroresorcin und Nitrosoresorcin über l-Nitro-resazurin l-Nitro-resorufin f) Resorcin-5-sulfonsäure und Nitrosoresorcin über Resazurin-l-sulfonsäure Resorufin-l-sulfonsäure Beispiel 4 Resazurin-4-carbonsäure 1,60 g (10,5 mmol) Nitrosoresorcin, 1,55 g (10,0 mmol) 2,6-Dihydroxybenzoesäure und 0,86 q (10 mmol) Braunstein werden in 20 ml Methanol aufgenommen und auf 0 C gekühlt. Dazu werden 1,06 ml konz. Schwefelsäure zugetropft. Es wird noch 2 Stunden ohne Kühlung weitergerührt. Das ausgefallene rote Produkt wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 2,3 g (85 % d. Th.). UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5): #max = 614 nm (# = 48 cmê mol-1) Nach Ansäuren: #max = 522 nm (# = 32 cmê mol-1) Beispiel 5 Resorufin-4-carbonsäure 2,3 g Resazurin-4-carbonsäure (hergestellt nach Beispiel 4) werden in 20 ml Wasser und 5 ml 25 %igem Ammoniak gelöst. Zu der blauen Lösunq werden unter Eiskühlung 5 q Zinkstaub gegeben. Danach wird die Eiskühlunq entfernt, so dass sich die Lösung allmälich auf Raumtemperatur erwärmt. Die Reduktion lässt sich leicht am Farbumschlaq von blau nach dunkelviolett erkennen bzw. mit Hilfe der Dünnschicht-Chromatographie (Fliessmittel: Methanol/Essigester 1:1) beobachten. Das überschüssige Zinkpulver wird abfiltriert. Die. Reaktionslösunq wird mit 5 ml Eisessig und konz. Salzsäure angesäuert. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit verdünnter Salzsäure gewaschen und im Vakuum über Calciumchlorid getrocknet. Ausbeute : 1,8 g (82 96 d. Th.) UV/VIS: (0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5): #max = 579,4 nm # = 48,6 cmê mol-1); Nach Ansäuren: #max = 485,9 nm # = 34,7 cmê mol-1). Fluoreszenz: Absorption: 1max= 579 nm Emission: #max = 593 nm. Beispiel 6 l-Methylresorufin-4-carbonsäure 840 mg 2,6-Dihydroxy-4-methylbenzeosäure, 760 mg Nitro- soresorcin, 430 mg Braunstein und 0,53 ml Schwefelsäure werden analoq Beispiel 4 zu l-Methylresazurin-4- carbonsäure umgesetzt. Ausbeute: 0,8 q. Die so erhaltene l-Methylresazurin-4-carbonsäure wird analog Beispiel 5 zu 1-Methylresorufin-4-carbonsäure reduziert. Ausbeute: 0,4 g. @ max Beispiel 7 Resorufin-4-carbonsäure-morpholid 1) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure Variante a) 5 g (19,4 mmol) Resorufin-4-carbonsäure oder 5,3 g (19,4 mmol) Resazurin-4-carbonsäure werden in 100 ml 10 %iger Salzsäure 0,5 Std. mit 7 g (38 mmol) Zinn-lT-chlorid unter Rückfluss erhitzt. Dabei färbt sich die Lösung grün. Man lässt erkalten, filtriert die ausgefallene Dihydroresorufin-4-carbonsäure unter Stickstoff ab und trocknet im Vakuum über Phosphorpentoxid. Das so erhaltene Rohprodukt wird 30 min mit 30 ml Acetanhydrid und 20 mg Natriumacetat unter Rückfluss erhitzt. Man gibt das Reaktionsqemisch auf 200 ml Eiswasser und rührt 14 Std. Der Niederschlaq wird aus Ethanol/Wasser umkristallisiert. Man erhält 4,8 g (65 %) der gewünschten Verbindung. Schmelzpunkt: 197 - 1990 C DC (Kieselgel, Fliessmittel Chloroform/Methanol/Eisessig 9:1:0,1), Rf = 0,33 Variante b) 5,1 g (20 mmol) Resorufin-4-carbonsäure werden in 20 ml Acetanhydrid mit 11 g (60 mmol) Zinn-II-chlorid 1 Std. bei 800 C gerührt. Man gibt auf 230 ml Eiswasser, rührt 1 Std., filtriert und arbeitet analog Variante a) auf. Ausbeute: 5,4 g (71 %) 2) N,O,O-Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäurechlorid 3,85 g (10 mmol) N,O,O-vriacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure werden mit 5,4 ml (60 mmol) Oxalylchlorid versetzt und auf -100 C qekühlt. Dazu gibt man einen Tropfen Dimethylformamid und lässt das Reaktionsgemisch unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmen. Das Edukt löst sich dabei unter Gasentwicklung. Nach Beendigunq der gasentwicklung rührt man noch 0,5 Std., dampft ein, nimmt je 3mal mit 20 ml trockenen Methylenchlorid auf und dampft bis zur Trockne ein. Man erhält so 4 g Rohprodukt, das ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet wird. DC (Kieselgel, Fliessmittel Chloroform/Methanol/Eisessiq 9:1:0,1) Rf = 0,42; farbloser Fleck, der sich nach einiaen Stunden rot färbt. 3) N ,O,O-Tr iacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure-morpholid 11,3 g (31,4 mmol) rohes Säurechlorid werden in 150 ml trockenem Methylenchlorid gelöst. Dazu tropft man 8,7 ml (63 mmol) Triethylamin und anschliessend 3,3 ml (37,7 mmol) Morpholin. Man rührt noch 2 Std., wäscht die Lösung mit 1 %iger Citronensäure, Natriumhydrogen carbonat-lösung und Wasser, trocknet die organische Phase über Mgnesiumsulfat und dampft ein. Der Rückstand wird aus Methanol kristallisiert. Ausbeute: 8,1 g (63 %), Schmelzpunkt: 133 - 1350 c (Zersetzunq) 4) Resorufin-4-carbonsäure-morpholid 3,7 q (9 mmol) Triacetyldihydroresorufin-4-carbonsäure morpholid werden mit 250 ml Methanol und 250 ml Wasser aufgenommen. Dazu gibt man 36 ml 1 n Natronlauqe und 6,0 q (18 mmol) Kaliumhexacyanoferrat-TTT und rührt 14 Std. bei Raumtemperatur. Nach Ansäuern mit Salzsäure auf pH 3 dampft man zur Trockne ein und digeriert mit Aceton. Die Farbstoff-Lösung wird über 500 ml Kieselgel mit Aceton als Fliessmittel filtriert. Nach Eindampfen des farbstoffhaltigen Eluats erhält man 2,3 g (80 %) Produkt. UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): = 575 nm, # = 55.000 cmê mol-1 max DC (Fliessmittel, siehe unter 2) Rf = 0,52. 1H-NMR ([D]6-DMSO): d= = 3,3 - 3,8 (m, 8 H); 6,50 (d, J = 2 Hz, 1 H); 6,64 (d, J = 10 Hz, 1 H); 6,76 (dd, J = 10 und 2 Hz, 1 H); 7,44 und 7,51 (jeweils d, J = 10 Hz, 2 H). Beispiel 8 Tetraacetylresorufin-1-carbonsäuremethylester-ss-Dgalactopyranosid und Tetraacetylresorufin-9-carbon säuremethylester-ss-D-galactopyranosid 6,8 g Resorufin-l-carbonsäuremethylester (hergestellt nach Beispiel 3), 5,75 g Silber-I-oxid, 6,75 g Silbercarbonat, 15 g Molekularsieb 4 A und 10 g cl-Brom-tetraacetylgalactose werden mit 250 ml absolutem Chloroform 4 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von weiteren 5 g -Brom-tetraacetyl-galactose wird über Nacht weltergerührt. Die Reaktionsmischung wird über einen Glasfaserfilter filtriert und eingedampft. Das ölige Rohprodukt wira an 2 1 Kieselgel mit Chloroform/Essigester 2:1 als Eluent chromatographiert. Man eluiert 2,5 g einer gelben Fraktion mit Rf = 0,28 (HPTLC Kieselgel, dasselbe Fliessmittel). Durch Rühren mit Methanol wird Tetraacetylresorufin-1-carbonsäuremethylester-ss-D-galacto pyranosid in Form orangefarbener Kristalle erhalten. Ausbeute 1,5 g. 1H-NMR ([D]6-DMSO): # = 1.95, 2.03, 2.04 und 2.14 (je s, 12 H); 3.88 (s, 3H); 4.11 (d, J = 7 Hz, 2H); 4.51 (t, J = 7 Hz, 2 H); 5.24 (m, 2 H); 5.36 (m, 1H); 5.69 (m, 1H); 6.31 (d, J = 2 Hz, 1H); 6.97 (d, J = 2 Hz, 1H); 7.04 (dd, J = 8.8 und 2.4 Hz, 1H); 7.14 (d, J = 2.4 Hz, 1H); 7.78 (dd, J = 8.8 Hz, 1H). Danach werden 1,6 g einer ebenfalls gelben Fraktion mit Rf = 0,24 eluiert. Aus Methanol kristallisiert Tetraacetylresoruf in-l-carbonsäuremethylester-ss-Dgalactopyranosid in Form gelboranger Kristalle. Ausbeute: 1,2 g. 1H-NMR ([D]6-DMSO): # = 1.95, 2.02, 2.04 und 2.14 (je s, 1211); 3.90 (s, 3 H); 4.09 (m, 2H); 4.51 (m, 1H); 5.24 (d, J = 7 Hz, 1H); 5.25 (m, 1H); 5.36 (m, 1H); 5.71 (m, 1H); 6.50 (d, J = 2 Hz, 1H); 6.83 (dd, J = 10 und 2Hz, 1H); 7.20 und 7.24 (je d, J = 2Hz, 2H); 7.47 (d, J = 10 Hz, 1H). Zwischen den reinen Produkten lässt sich noch eine Mischfraktion eluieren aus der sich durch Umkristallisieren aus Methanol 2,5 g Kristalle eines Gemisches der beiden isomeren Verbindungen erhalten lassen. In analoger Weise erhält man aus N-Brom- tetraacetylgalactose und a) 4-Methoxy-resorufin-l-carbonsäuremethylester Tetraacetyl-4 -methoxy-resorufin-l-carbonsäuremethylester -ss-D-galactopyranosid und Tetraacetyl-6-methoxy-resorufin-9-carbonsäuremethyl ester-u-D-galactopyranosid. b) 8-Chlor-resorufin-1-carbonsäuremethylester Tetraacetyl-8-chlor-resorufin-1-carbonsäuremethylester-ss -D-galactopyranosid und Tetraacetyl-2-chlor-resorufin-9-carbonsäuremethylester-ss -D-galactopyranosid. Beispiel 9 Tetraacetylresorufin-4-carbonsäure-morpholid-ss-D-galactopyranosid und Tetraacetylresorufin-6-carbonsäure-morpholid- i3-D-galactopyranosid 3,26 g (10 mmol) Resorufin-4-carbonsäuremorpholid werden analog Beispiel 8 galactosidiert. Das Rohprodukt wird an 1 1 Kieselgel mit Essigester/Aceton 3:1 als Fliessmittel chromatographiert. Man erhält so 0,9 g Tetraacetylresorufin-6-carbonsäuremorpholid-ss-D-galactopyranosid. DC (Kieselgel, Fliessmittel siehe Beispiel 7) Rf = 0,71, und 0,4 g Tetraacetylresorufin-4-carbonsäuremorpholid ss-D-galactopyranosid, DC (Kieselgel, dasselbe Flielomittel Rf = 0,76 sowie 1,2 g einer Mischfraktion aus beiden Isomeren. Beispiel 10 Resorufln-l-carbonsäuremethylester-ss-D-galactopyranosid 1,2 g Tetraacetylresorufin-9-carbonsäuremethylester ss-D-galactopyranosid werden analog Beispiel 2 mit Natriummethylat/Methanol deacetyliert. Ausbeute: 0,8 g. UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): *(max = 464 nm (#= 21,8 cm2, mol¯lì Nach Spaltung mit ss-Galactosidase erhält man das Anion des Resorufin-l-Carbonsäuremethylesters: #max = 572 nm (#=65,4 cmê mol-1). 1H-NMR ([D]6-DMSO): #=3.20 - 3.80 (m, 6H); 3.91 (s, 3F); 5.09 (d, J = 7.5 Hz, IH); 6.30 (d, J = 2.1 Hz, 15); 6.81 (dd, J = 9.8 und 2.1 Hz, lH); 7.30 (m, 2H); 7.51 (d, J = 9.8 Hz, 1H); OH-Protonen sehr breit um 5. In analoger Weise erhält man durch Deacetylierung der entsprechenden Tetraacetate a) Resorufin-1-carbonsäuremethylester-ss-D-galactopyranosid 1H-NMR ([D]6-DMSO): # = 3,4 - 3,7 (m, 6H); 5.09 (d, J = 7.5 Hz, 1 H); 6,34 (d, J = 2 Hz, 1 H); 6,97 (d, J = 2 Hz, 1 H); 7,08 - 7,17 (m, 2 H); 7,75 (d, J = 10 Hz, 1 H); OH: sehr breit, um 5 ppm. b) 4-Methoxy-resorufin-1-carbonsäuremethylester-ss-D galactopyranosid c) 6-Methoxy-resorufin-9-carbonsäuremethylester-ss-D galactopyranosid d) 8-Chlor-resorufin-l-carbonsäuremethylester-ss-D galactopyranosid e) 2-Chlor-resorufin-9-carbonsäuremethylester-ss-D- galactopyranosid f) Resorufin-6-carbonsäuremorpholid-ss-D-galactopyranosid Rf (Essigester/Isopropanol/Wasser 9:4:2) :0.3 Nach Spaltung mit ss-Galactosidase: UV/VIS (0.1 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7.5): max = 574,6 nm Fluoreszenzemission: max = 593 nm g) Resorufin-4-carbonsäuremorpholid-ss-D-galactopyranosid Rf (Essigester/Isopropanol/Wasser 9:4:2) :0.3 Nach Spaltung mit ss-Galactosidase: UV/VIS (0.1 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7.5): max = 574,6 nm Fluoreszenzemission: max = 593 nm Beispiel 11 Resorufin-9-carbonsäure-ss-D-galactopyranosid-triethylammoniumsalz 266 mg Resorufin-9-carbonsäuremetflylester-ss-D-galacto- pyranosid werden in 50 ml Wasser und 20 ml 1,4-Dioxan aufgenommen. Dazu werden in Portionen von 0,5 ml 5 ml 0,1 N Natronlauge zugegeben, wobei der pH-Wert der Lösung nicnt über 12,5 steigen darf. Das Reaktionsgemisch wird auf 6 ml DEAE-Sepnadex, Carbonat-Form, gegeben. Es wird mit 180 ml Wasser gewaschen. Danach wird das Produkt mit 0,1 M Triethylammoniumcarbonat-Puffer, pH 7,5 eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingenampft. Danach wird menrmals mit Ethanol abgedampft. Ausbeute: 110 mg Resorufin-9-carbonsäure-ss-Dgaiactopyranosld-triethylammonlumsalz. UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): = 465 nm max Nacn Spaltung mit ss-Galactosidase: #max = 570 nm Beispiel 12 Resazurin--D-galactopyranosid 12,6 g Resazurln-Natriumsalz werden in 65 ml 1 N Natronlauge und 80 ml Wasser gelöst. Dazu werden 20,6 g Aceto orom- & D-galactose und 18,2 g Hexadecyltrimethylammoniumbromid in 150 ml Chloroform gegeben. Die Mischung wird 3 Sta. unter Rückfluss erhitzt. Danach wird zur Trockne eingeaampft, und mit Essigester digeriert. Die Essigester Lösung wird wieder eingeengt und an 500 g Kieselgel chromatographiert (Eluent: Methylenchlorid/Essigester 3:1). Es wellen 2,13 g Tetraacetylresazurin-ss-D-galactopyranosid mit Rf = 0,5 (HPTLC Kieselgel, dasselbe Fliessmittel) ernalten. Zur Deacetylierung werden 2,13 g Tetraacetyl-Derivat mit 0,1 g Natriummethylat in 100 ml absolutem Methanol 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt und über Calciumchlorid im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,0 g. Rf = 0,62 (HPTLC Kieselgel, Essigester/Isopropanol/Wasser 9:4:2). 1H-NMR ([D]6-DMSO): # = 3.30 - 3.90 (m, 6H); 4.54 (br.d, J = 4.4 Hz, 1H) ; 4,67 (br. t, J = 4.4 Hz, 1H); 5.07 (d, J = 7 Hz, 1H); 5.27 (br. d, J = 4.4 Hz, 1H); 6.15 (d, J = 2 Hz, 1H); 6.63 (dd, J = 9.6 und 2 Hz, 1H); 7.10 (dd, J = 9 und 2 Hz, 1H); 7.2 (m, 2H); 7.96 (d, J = 9.6 Hz, 1H); 8.07 (d, J = 9 Hz, 1H). Beispiel 13 8-Chlor-resazurin-4-carbonsäure 4,3 g (30 mmol) 4-Chlor-resorcin werden in 20 ml Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 2,4 g Kaliumhydroxyd, wird auf C C gekühlt. Unter Kühlung werden 2,81 ml Isopentylnitrit zugetropft. Danach wird über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert, in Wasser aufgelöst und angesäuert. Der gelbe Niederschlag wird erneut filtriert und bei 400 C im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,5 g ( 48 %) 4-Chlor-6-nitrosoresorcin Rf: 0,28 (HPTLC, Kieselgel, FlieISmittel: Methanol/Essigester 1:3). 1,83 g 4-Chlor-6-nitrosoresorcin, 1,55 g 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 0,86 g Braunstein und 1,06 ml Schwefelsäure werden in 20 ml Methanol gegeben und 2 Stunden bei 0 C sowie 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man erhält einen roten Niederscnlag, der abfiltriert und getrocknet wird. Ausbeute: 2,45 g (80 t) 8-Chlor-resazurin-4-carbonsäure. UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): f max = 621,5 nm. In analoger Welse erhält man aus a) 2-Methyl-resorcin über das 2-Methyl-6-nitrosoresorcin 6-Methyl-resazur in-4-carbonsäure b) 4-Methyl-resorcin über das 4-Methyl-6-nltrosoresorcin 8-Methyl-resazurin-4-carbonsäure c) 4-Brom-resorcln über das 4-Brom-6-nitrosoresorcin 8-Brom-resazurin-4-carbonsäure. Beispiel 14 8-Chlor-resorufin-4-carbonsäure 2 g 8-Chlor-resazurin-4-carbonsäure (hergestellt nach Beispiel 10) werden in 20 ml Wasser und 5 ml 25 %igen Ammoniak gelöst. Unter Eiskühlung wird Zinkpulver bis zum vollständigen Farbumschlag nach rot-violett zugegeben. Vom überscnüssigen Zink wird abfiltriert. Nach dem Ansäuern wird das ausgefallen Produkt abfiltriert und im Vakuum bei 40 C über Kalziumchlorid getrocknet. Ausbeute: 1,5 g (79 %) 8-chlor-resorufin-4-carbonsäure. UV/VIS (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5): kmax = 585,5 nm. In analoger Weise erhält man aus a) 6-Methyl-resazurin-4-carbonsäure 6-Methyl-resorufin-4-carbonsäure, b) 8-Methyl-resazurin-4-carbonsäure b-Methyl-resorufin-4-cartonsäure, c) 8-Brom-resazurin-4-carbonsäure 8-Brom-resorufin-4-carbonsäure. Beispiel 15 Resorufín-9-carbonsäuremethylester-d-D-galactopyranosid 3,9 g Pentaacetylgalactose werden mit 0,1 g wasserfreiem Zinkchlorid versetzt und auf 1250 C erhitzt. Es wird 20 Minuten bei 10 Torr gerührt. Zu der Schmelze werden 1 g Resorufin-L-carDonsäuremetnylester gegeben. Die Mischung wird 1 Stunde bei 410 C gerührt und danach in der in Beispiel 7 bescnriebenen Weise an Kieselgel mit Chlroform/Essigester 2:1 chromatographiert. Ausbeute: 25 mg Tetraacetyl-resorufln-9-carbonsäure methylester-&alpha;-D-galactopyranosid (gelbes Öl) Rf = 0,22 (HPTLC, Kieselgel, dasselbe Fliessmittel). Die Deacetylierung zu Resorufin-9-carbonsäuremethylester ot-D-galactopyranosld wird analog Beispiel 10 ausgeführt. Beispiel 16 Resorufin-9-carbonsäure-(3.6-dioxaoctyl)-ester-ss-Dgalactopyranosid 0,6 g Tetraacetylresorufin-9-carbonsäuremethylester-ss-D -galactopyranosid werden mit 50 ml Diethylenglycolmonoethylether und einer Spatelspitze Natriumhydrid versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danacn werden 100 ml Aceton zugegeben. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 56 mg Resorufin-9-carbonsäure-(3.6-dioxaoctyl)- ester-ss-D-galactopyranosid Rf: 0,54 (Kieselgel HPTLC, Fliessmittel: Essigester/Isopropanol 9:4) Beispiel 17 Resorufln-maltoheptaosid Amylase (E.C. 2.4.1.19), beispielsweise Amylase aus Bacillus macerans hat neben hydrolytiscner und cyclislerender Wirkung auch glycosyl-transferierende Eigenscnaften, die zur Syntnese von Oligosacchariden und -derivaten ausgenützt werden können (Methods in Carbonydrate Chemistry II, 347). 680 mg Amylase aus Bacillus macerans DSM 24 (Lyopnilisat; 0,46 U/mg Einwaage; Proteingehalt der Einwaage 28,5 %), 500 mg Resorufin-glucosid, 3,5 g &alpha;-Cyclodextrin und 70 ml Soerensen Phosphat-Puffer (pSH 6.2; 0,01 M) werden gemiscnt. Der Ansatz wird 24 Stunden lang bei 370 C inkubiert. Zur Aufreinigung wird dann &alpha;- und entstandenes ls-Cycloaextrin zunächst über die Tetrachloräthyleneinschlussverbindung abgetrent. Nach Cnromatograpnie an vernetztem Dextran (Sepnadex LH 20) erhält man 50 mg Lyophilisat von im Amylasetest hochaktivem Resorufinylmaltoheptaosid. Beispiel 18 Bestimmung der Aktivität der ss-D-Galactosidase a) Zubereitung der verwendeten Lösungen: Pufferlösung: HEPES 100 mmol/l Natriumcnlorid 154 mmol/l Magnesium-L-Aspartat 2 mmol/l BSA 10 g/l Tween-20 0,5 g/l pH-Wert (mit Natronlauge 7,3 eingestellt) (370 C) keagenslösung 1: In der vorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 0,8 mmol/l Resorufln-M-D-galactopyranosid gelöst. Reagensiösung 2: In aer vorstehend beschriebenen Puffer lösung werden 3,5 mmol/l Resorufin-9-carbonsäure--D-galacto- pyranosid gelöst. Reagenslösung 3: In der vorstehend beschriebenen Puffer lösung werden 1,0 mmol/l Resorufin-9-carbonsäuremethylester-ss-D galactopyranosid gelöst. Enzymlösung Handelsübliche ss-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in der vorstehend genannten Pufferlösung gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben). b) Durcnfünrung der Messungen Die Messung erfolgt photometrisch bei 579 nm. 950 ul Reagens werden in einer l-cm-Küvette bei 37 C mit 50 ul Enzymlösung vermischt. Als Mass für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeit reinheit in [mExt/minl ermittelt. Er wird berechnet aus der gemessenen Extinktion durch Division mit der ReaKtionszeit. In der folgenden Tabelle sind die gefundenen Messwerte aufgefünrt: Reagens Nr. Reaktion (mExt/min) 1 85 2 46 3 76 Beispiel 19 Nachweis von ss-D-Galactosidase mit Hilfe eines IndiKatorf ilms Zu einer nomogenen Masse werden verarbeitet: 5 ml einer wässrigen Lösung mit 0,5 M Kaliumphosphat und 0,05 M Magnesiumchlorid, pH 7,3 0,13 g Natriumalginat 8 g einer 50 %igen Dispersion von Polyvinylpropionat 10 g Kieselgel 12 ml Wasser 0,4 g Triton X-100 50 mg Resorufln-ss-D-galactopyranosid, in 5 ml Methanol gelöst. Diese Masse wird auf eine 0,1 mm starke Polycarbonatfolie (PoKalon, Fa. Lonza) mit einer Spaltbreite von 0,2 mm aufgetragen. Die Beschichtung wird bei 500 C getrocknet und danach in Stücke von 6 auf 6 mm geschnitten. Diese werden mit Hilfe von Klebeband auf eine 400 /um starke Polystyrolfolie aufgeklebt. Die so erhaltenen Teststreifen werden kurze Zeit in die zu prüfende, ss-D-Galactosioase enthaltende Lösung getaucht. Nach einer Wartezeit von 2 Minuten bei Raumtemperatur hat sich eine rote Reaktionsfarbe herausgebildet, deren Intensität von der Konzentration der ss-D-Galactosidase in der Testlösung aonängt. Mit Hilfe von Testlösungen mit einem bestimmten, bekannten ss-D-Galactosidase-Gehalt kann man eine Farbskala erhalten, anhand derer der unbekannte Genalt an ss-D-Galactosidase in einer Probe ermittelt werden Kann. Die vorstehend Deschriebenen Teststreifen lassen sich auch dazu benutzen, die in einer Probe vorhandene ld-D-Galactosidase Aktivität kinetisch mit Hilfe der Reflexionspnotometrie zu bestimmen. Auch hierzu wird in üblicher Weise anhand von Proben mit bekannter l5-D-Galactosidase-Aktivität eine Eichkurve erstellt, mit deren Hilfe eine unbekannte ss-D-Galactosidase-Aktivität einer Probe ermittelt werden kann. Beispiel 20 Bestimmung der Aktivität freier und konjugierter ii-D-Galactos idase a) Herstellung der verwendeten Lösungen Pufferlösung: HEPES 100 mmol/l Natriumchlorid 154 mmol/l Magnesium-L-Aspartat 2 mmol/l BSA 10 g/l Tween-20 0,5 g/l pH-Wert (mit Natronlauge 7,3 eingestellt) (37 C) Reagenslösung; In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 0,8 mmol/l Resorufin-v5-D-galactopyranosid gelöst. Enzymlösung: Handelsübliche ss-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in Puffer gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller Angaben). Enzym-Konjugat-Lösung: Verwendet wird ein ss-D-Galactosidase-Antikörper Präparat. Die Herstellung solcher Enzym-Antikörper Konjugate ist bekannt. Sie ist beispielsweise in Biochem. Biophys. Acta 612, 40 - 49 (1980) beschrie ben. Das Präparat wird in Puffer so verdünnt, dass sich eine mit der oben beschriebenen Enzymlösung ungefähr vergleichbare Aktivität ergibt. b) Durchführung der Messung: Die Messung erfolgt photometrisch bei 578 nm. 950 l Reagenlösung werden jeweils in einer 1-cm-Küvette bei 37 C mit 50 l Enzymlösung bzw. mit 50 /ul Enzym-Konjugat-Lösung vermischt. Als Mass für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt. Für die Reaktion mit der freien ss-D-Galactosidase werden 85 mExt/min; für die ReaKtion mit ss-D-Galactosidase-Antikörper-Konjugat 92 mExt/min gemessen. Beide Messwerte zeigen, dass sowohl mit freier als auch mit Kon7ugierter ss-D-Galactosidase ein sehr gut messbarer Extinktionsunterschied gefunden wird. Daraus ergibt sich, da die beschriebenen Verbindungen als Substrate sowonl für freie Glycosidase als auch für Glycosldase-Konjugate in gleicher Weise geeignet sind. Die neuen Substrate können somit nicht nur als alagnostische Mittel für die Bestimmung freier Glycosidasen eingesetzt werden. Sie sind in vorteil hafter Weise auch bei immunologischen Bestimmungsmethoden einsetzbar, bei denen eine Glycosidase als Indikator-Enzym verwendet wird. Beispiel 21 Bestimmung der ct-Amylase-Aktivität Filterpapier wird mit Resorufin-maltoheptaosid (hergestellt gemäss Beispiel 17), gelöst in Citratpuffer, pH 6, getränkt. Das so ernaltene Reagenzpapier wird nacneinanoer mit der Amylase enthaltenden Probe sowie mit &alpha;- una ss-Glucosidase versetzt. Nacn wenigen Minuten ist eine aeutlich sicntbare Rotfärbung nachzuweisen, deren Intensität oder -Amylase-Konzentration in aer Probe proportional ist. Mit Hilfe von Proben mit beKannter &alpha;-Amylase-Konzentration lässt sicn eine Eichkurve ermitteln, anhand derer der unbemannte &alpha;-Amylase-Gehalt einer Probe bestimmt werden kann. In den vorstehenden Beispielen wurde die folgenden Abkürzungen verwendet: HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethan sulfonsäure BSA Rinderserum-Albumin, (bovineserum-albumin) zweien 20 Polyoxyethylen(20)sorbltanmonolaurat

Claims: Glycosides of resorufin derivatives of the general formulae Ia or Ib in which R¹ signifies hydrogen, R², R³ and R⁵, which can be the same or different, hydrogen, halogen or a C₁-C₅-alkyl group, R⁴ and R⁶, which can be the same or different, hydrogen, halogen, a cyano, C₁-C₅-alkyl, C₁-C₅-alkoxy, carboxyl, C₁-C₅-alkoxycarbonyl, carboxy-C₁-C₅-alkyl, C₁-C₅-alkoxy carbonyl-C₁-C₅-alkyl or a carboxamido group possibly substituted once or twice or the group -COO-(CH₂CH₂O) n -R⁷, in which R⁷ signifies hydrogen or a C₁-C₅-alkyl group and n a whole number from 1 to 4, whereby R⁶ can additionally represent a sulphonyl or nitro group and Y nitrogen or the group N→O. Glycosides according to claim 1, characterised in that the glycoside residue represents a β-D-galactopyranoside, α-D-galactopyranoside, β-D-glucopyranoside, α-D-glucopyranoside or α-D-mannopyranoside residue. Glycosides according to claim 1, characterised in that the glycoside residue represents an oligosaccharide with 2 to 10 monosaccharide units. Process for the preparation of glycosides of resorufin derivatives of the general formulae Ia or Ib in which R¹ signifies hydrogen, R², R³ and R⁵, which can be the same or different, hydrogen, halogen or a C₁-C₅-alkyl group, R⁴ and R⁶, which can be the same or different, hydrogen, halogen, a cyano, C₁-C₅-alkyl, C₁-C₅-alkoxy, carboxyl, C₁-C₅-alkoxycarbonyl, carboxy-C₁-C₅-alkyl, C₁-C₅-alkoxycarbonyl-C₁-C₅-alkyl or a carboxamido group possibly substituted once or twice or the group -COO-(CH₂CH₂O) n -R⁷, in which R⁷ signifies hydrogen or a C₁-C₅-alkyl group and n a whole number from 1 to 4, whereby R⁶ can additionally represent a sulphonyl or nitro group and Y nitrogen or the group N → 0, characterised in that, in per se known manner, one reacts compounds of the general tautomeric formulae IIa or IIb in which R¹ to R⁶ and Y have the above-given meaning, with a mono- or oligosaccharide or a 1-halo derivative hereof, whereby, in each case, all hydroxyl groups are substituted with a protective group usual in carbohydrate chemistry, to give per-O-substituted glycoside from which, by splitting off of the protective groups in per se known manner, glycosides of resorufin derivatives of the general formula Ia or Ib are obtained in per se known manner. Use of the glycosides of resorufin derivatives according to one of claims 1 or 2, for the determination of the activity of corresponding glycosidases. Use of the glycosides of resorufin derivatives according to one of claims 1 or 3 for the determination of the activity of enzymes cleaving saccharide chains. Diagnostic agent for the detection of glycosidases containing one or more chromogenic and/or fluorogenic substrates, a suitable buffer substance, as well as possibly further usually employed adjuvants, characterised in that, as chromogenic and fluorogenic substrates, glycosides of resorufin derivatives according to one of claims 1 or 2 are used. Diagnostic agent for the detection of enzymes cleaving saccharide chains, containing one or more chromogenic and/or fluorogenic substrates, a suitable buffer substance, possibly further usually employed adjuvants, a suitable glycosidase, as well as possibly further adjuvant enzymes, characterised in that, as chromogenic and fluorogenic substrates, glycosides of resorufin derivatives according to one of claims 1 or 3 are used. Diagnostic agent according to one of claims 7 or 9, characterised in that wetting agents, galenical additives and/or structure formers are used as additional adjuvants. Resorufin derivatives of the general tautomeric formulae II'a and II'b in which R 1' signifies hydrogen, R 2' , R 3' and R 5 ', which can be the same or different, hydrogen, halogen or a lower alkyl group, R 4' and R 6' , which can be the same or different, hydrogen, halogen, a cyano, lower alkyl, lower alkoxy, carboxyl, lower alkoxycarbonyl, carboxy lower alkyl, lower alkoxy carbonyl lower alkyl or a carboxamido group possibly substituted once or twice or the group -COO-(CH₂CH₂O) n -R⁷, in which R⁷ signifies hydrogen or a lower alkyl group and n a whole number from 1 to 4, whereby R 1' to R 6' cannot all simultaneously signify hydrogen, and Y nitrogen or the group N → O, whereby at least one of the radicals R 4' and R 6' signifies a C₁-C₅-alkoxy, a carboxamido group possibly substituted once or twice or the group -COO-(CH₂CH₂O) n -R⁷. Use of resorufin derivatives according to claim 10 for the preparation of compounds according to one of claims 1 or 2.

Inventors: BATZ, HANS-GEORG, DR. RER. NAT., HOFMANN, JUERGEN, DR. RER. NAT., KLEIN, CHRISTIAN, DR., SERNETZ, MANFRED, PROF. DR. MED. VET., Hofmann, Jürgen, Dr. rer. nat.
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1985
Main classification: C07H17
IPC codes: G01N33, C12Q1, C07D265, C08B37, A61K31, C07H17, C07H3