PROCESS FOR THE PREPARATION OF THROMBIN INHIBITORS

Abstract: The invention relates to DNA sequences which code for the amino-acid sequence of the thrombin inhibitor hirudin, to hybrid vectors containing such DNA sequences, to host cells transformed with such hybrid vectors, to polypeptides produced by such transformed host cells and having thrombin inhibitory activity, to processes for preparing these DNA sequences, hybrid vectors and transformed host cells and processes for preparing these thrombin inhibitors using the transformed host cells. The hirudin compounds have valuable pharmacological properties.

Description: Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, welche für die Aminosäuresequenz des Thrombin-Inhibitors Hirudin kodieren, solche DNA Sequenzen enthaltende Hybridvektoren, mit solchen Hybridvektoren transformierte Wirtszellen, von solchen transformierten Wirtszellen produzierte neue Polypeptide mit Thrombin-Inhibitor-Aktivität, Verfahren zur Herstellung dieser DNA-Sequenzen, Hybridvektoren und transformierten Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung dieser Thrombin-Inhibitoren mit Hilfe der transformierten Wirtszellen. Im Plasma des gesunden Säugetierorganismus besteht ein dynamisches Gleichgewicht zwischen dem fibrinolytischen System und dem Koagulationssystem, wodurch ein funktionstüchtiges Gefässnetz aufrechterhalten wird. Bei Gefässverletzungen lagert das Koagulationssystem eine Fibrin-Matrix ab, welche nach Erreichung des hämostatischen Zustands durch das fibrinolytische System wieder abgebaut wird. In Fällen, in denen das fibrinolytische Potential des Organismus nicht ausreicht, um gebildete intravaskuläre Thrombi abzubauen, z.B. bei Patienten, die unter Thromboembolien oder postoperativen Komplikationen leiden, erweist es sich als unerlässlich, den Organismus durch Verabreichung von thrombolytischen Mitteln oder Antikoagulantien zu unterstützen. In der herkömmlichen Antikoagulationstherapie wurden bisher vor allem Heparin, ferner auch 4-Hydroxycumarin- und 1,3-lndandion Derivate eingesetzt. Obwohl mit diesen Mitteln bemerkenswerte Erfolge erzielt worden sind, weisen sie doch einige Nachteile auf. So wirkt Heparin nicht direkt auf den Blutgerinnungsvorgang ein, sondern entfaltet seine koagulationshemmende Wirkung indirekt durch Beschleunigung der Hemmung von Thrombin und des Faktors X durch Antithrombin III. Heparin geht im Organismus weiterhin zahlreiche unspezifische Reaktionen ein und wird vom Platelet-Faktor 4 neutralisiert, was insbesondere seine Anwendbarkeit bei der Verbrauchs Koagulopathie bzw. disseminierten intravasalen Gerinnung (DIC) beeinträchtigt. Es besteht daher ein Bedarf nach alternativen und spezifischeren Mitteln zur Antikoagulationstherapie. Seit langem ist ein natürliches im Blutegel (Hirudo medicinalis) vorkommendes Antikoagulans, Hirudin, bekannt. Hirudin ist ein aus 65 Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit vollständig aufgeklärter Primärstruktur (1) und weist als strukturelle Charakteristika eine Anhäufung hydrophober Aminosäuren am N-Terminus und polarer Aminosäuren sm C-Terminus, einen als Sulfatmonoester vorliegenden Tyrosin-Rest (Tyr63) und drei Disulfidbrücken, deren exakte Anordnung allerdings noch nicht bekannt ist. auf. Hirudin ist mit einem Ki-Wert (Komplex-Di8soziationskonstante) von 6.10 11 M der stärkste bekannte Thrombin-Inhibitor und durch eine spezifische Affinität zu Thrombin charakterisiert; andere Enzyme der Blutgerinnungskaskade werden nicht inhibiert. Im Gegensatz zu Heparin übt Hirudin seinen inhibierenden Einfluss auf Thrombin direkt aus und wirkt nicht, wie jenes, über Antithrombin III. Der einzige pharmakologisch fassbare Effekt von gereinigtem Hirudin ist die Hemmung der Blutkoagulation bzw. die Prophylaxe von Thrombose. Bei intravenöser Verabreichung an Hunden war selbst bei hohen Dosen kein Einfluss auf Herzschlagfrequenz, Atmung, Blutdruck, Thrombocytenzahl, Fibrinogen und Hämoglobin zu beobachten. Bei Versuchen an der Ratte, am Schwein und am Hund erwies sich Hirudin als wirksam bei experimenteller Thrombose (hervorgerufen entweder durch Stasis oder durch Injektion von Thrombin), beim Endotoxin-Schock sowie bei DIC (disseminierter intravasaler Gerinnung). Bei direkten Ver gleichsversuchen mit Heparin, wo immer sie durchgeführt wurden, zeigte sich Hirudin diesem überlegen. Obwohl seit langem bekannt, erlangte Hirudin bis heute nicht die breite therapeutische Anwendung, die man sufgrund seiner ausgezeichneten biologischen Eigenschaften erwarten durfte. Seiner allgemeinen Anwendung in der Medizin steht nämlich als ein schwerwiegender Nachteil seine äusserst beschränkte Zugänglichkeit im Wege. Bis jetzt waren Hirudin-Präparate ausschliesslich aus teurem und schwer zugänglichem Naturmaterial, ausgehend von Blutegel-Extrakten durch zeit- und kostenaufwendige Isolier- und Reinigungsverfahren, erhältlich (vgl. Ref. 2). Die relativ lange Sequenz von 65 Aminosäuren liess auch die klassische Peptid-Synthese aus ökonomischen Gesichtspunkten wenig erfolgsversprechend erscheinen. Zur Herstellung ausreichender Mengen an Hirudin, welche detaillierte klinische Untersuchungen über dessen therapeutisches Potential und seine breite therapeutische Anwendung in der Antikoagulations-Therapie erst ermöglichen, müssen daher neue Wege beschritten werden. Hierzu bietet sich insbesondere die rekombinierte DNA-Technologie an. Mit ihrer Hilfe ist es möglich, die unterschiedlichsten physiologisch aktiven Polypeptide durch Kultivierung entsprechend genetisch modifizierter Mikroorganismen oder Säugetierzellkulturen herzustellen. Der vorliegenden Erfindung liegt demgemäss die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe von gentechnologischen Mitteln ein Expressionssystem zur Verfügung zu stellen, welches die mikrobiologische Herstellung von Polypeptiden mit Hirudin-Aktivität im industriellen Massstab erlaubt. Diese Aufgabe wird in der vorliegenden Erfindung gelöst durch die Bereitstellung von Hybridplasmiden, welche eine für die Aminosäuresequenz des Hirudins kodierende DNA-Sequenz enthalten, die von einer Expressionskontrollsequenz derart kontrolliert wird, dass in einer mit diesen Hybridvektoren transformierten Wirtszelle Polypeptide mit Hirudin-Aktivität exprimiert werden. Es war zu erwarten, dass die Expression derartiger DNA-Sequenzen in transformierten Wirtszellen (mit Ausnahme von transformierten Egelzellen) in Abwesenheit eines zusätzlich eingebauten Sulfat übertragenden Enzym-Systems zu einem Produkt führen würde, dass sieb von natürlichem Hirudin im wesentlichen durch das Fehlen des Sulfatrestes am Tyrosin-63 unterscheidet. Die biologische Funktion des Sulfatrestes in Proteinen im allgemeinen und im Hirudin im besonderen ist im einzelnen nicht definitiv geklärt; jedoch soll der Sulfat-Rest nach dem jetzigen Kenntnisstand die physiologischen Eigenschaften des Proteins nicht unwesentlich beeinflussen. So soll der Sulfat-Rest folgende Funktionen ausüben: (1) Positive Beeinflussung der biologischen Aktivität des Proteins; (2) Beteiligung an regulatorischen Zellprozessen (wie es bei der reversiblen Phosphorylierung bekannt ist); (3) Stimulierung der Sekretion, d.h. die Sulfatierung dient als Markierung für die Erkennung als sekretorisches Protein: Alle bekannten sulfatierten Proteine sind sekretorische oder trans membranale Proteine. Ueberraschenderweise wurde jetzt gefunden, dass entgegen den theoretischen Vorstellungen die wertvollen biologischen Eigenschaften des Hirudins auch dann erhalten bleiben, wenn die charakteristi- 63 sche Sulfatmonoester-Gruppe vom phenolischen Hydroxyl des Tyr - Restes entfernt wird. Die mit Hilfe der erfindungsgemässen transformierten Mikroorganismen hergestellten Hirudin-Verbindungen ohne Sulfatrest ("Desulfatohirudine") erweisen sich nämlich gegenüber dem natürlichen Hirudin in ihren biologischen Eigenschaften, insbesondere in ihrer antikoagulativen Wirkung, qualitativ und quantitativ als zumindest ebenbürtig. Im folgenden sind unter DNA-Sequenzen oder Genen, die für die Aminosäure sequenz von Hirudin kodieren, solche DNA-Sequenzen oder Gene zu verstehen, welche bei der Expression Hirudin-ähnliche Polypeptide ergeben, die sich von natürlichem Hirudin insbesondere durch das Fehlen der Sulfatester-Gruppe am Tyrosin-63 unterscheiden ("Desulfatohirudine"). Herstellung von DNA-Sequenzen, die für die Aminosäureseguenz von Hirudin kodieren Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, welche für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodieren, und Fragmente davon. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodieren, und von Fragmenten davon, gekennzeichnet dadurch, dass man aus genomischer Egel-DNA das Hirudin-Strukturgen isoliert, oder aus Hirudin-mRNA eine komplementäre doppelsträngige Hirudin-DNA (Hirudin-ds cDNA) herstellt, oder dass man ein für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierendes Gen oder Fragmente davon mittels chemischer und enzymatischer Verfahren herstellt. Die Gewinnung von genomischer Hirudin-DNA und von Hirudin-ds cDNA erfolgt beispielsweise nach an sich bekannten Methoden. So gewinnt man genomische Hirudin-DNA beispielsweise aus einer Egel-Genbank, welche das Hirudin-Gen enthält, indem man die Egel-DNA-Fragmente in einem Mikroorganismus kloniert und Klone, die Hirudin-DNA enthalten, identifiziert, beispielsweise durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, Hirudin-DNA spezifischen Oligodesoxynucleotids, welches mindestens 15, vorzugsweise 15 bis 30, Desoxynucleotide enthält. Die so erhaltenen DNA-Fragmente enthalten neben dem Hirudin-Gen in der Regel weitere unerwünschte DNA-Bestandteile, welche durch Behandlung mit geeigneten Exo- oder Endonucleasen abgespalten werden können. Doppelsträngige Hirudin-cDNA kann beispielsweise hergestellt werden, indem man aus geeigneten, vorzugsweise zur Hirudin-Bildung induzierten Egelzellen mRNA gewinnt, das so erhaltene mRNA-Gemisch in an sich bekannter Weise an Hirudin-mRNA anreichert, diese mRNA als Templat für die Herstellung von einsträngiger cDNA verwendet, daraus mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase die ds cDNA synthetisiert und diese in einen geeigneten Vektor kloniert. Klone, die Hirudin-cDNA enthalten, werden beispielsweise, wie oben beschrieben, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, Hirudin-DNA spezifischen Oligodesoxynucleotids identifiziert. Die auf diese Weise gewonnene genomische Hirudin-DNA oder die Hirudin-cDNA werden vorzugsweise am 5'- und am 3'-Ende mit chemisch synthetisierten Adapter-Oligodesoxynucleotiden verknüpft, welche die Erkennungssequenz für eine oder verschiedene Restriktionsendonuclease(n) enthalten und damit den Einbau in geeignete Vektoren erleichtern. Zusätzlich muss das Adaptermolekül für das 5'-Ende der Hirudin-DNA bzw. -cDNA noch das Translationsstartsignal (ATG) enthalten. Das Translationsstartsignal muss derart angeordnet sein, dass ihm das Codon für die erste Aminosäure des Hirudins direkt folgt. Da die Struktur des natürlichen Hirudin-Gens nicht bekannt ist und die chemische Synthese eines für die Aminosäuresequenz des Hirudins kodierenden Gens ("Desulfatohirudin-Gen') auf Grund der modernen Synthesemöglichkeiten Vorteile, insbesondere in zeitlicher Hinsicht, bietet, stellt letztere eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Chemische Synthese eines Desulfatohirudin-Gens Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Strukturgens für Desulfatohirudin oder von Fragmenten davon, dadurch gekennzeichnet, dass man Segmente des kodierenden und des l-orplementären Stranges des Desulfatohirudin-Gens chemisch syntheti inert und erhältliche Segmente enzymatisch in ein Strukturgen des rlatohirudins @@@fatohirudins oder in Fragmente davon überführt. t L-findung betrifft ferner doppelsträngige DNAs, die für iiesulfatohirudin kodieren. Die erfindungsgemässen DNAs enthalten zusätzlich zu den Codons für Desulfatohirudin Translations-Stsrt- und Stopsignale, die eine Expression in geeigneten Wirtszellen, beispielsweise E. coli, ermöglichen, ferner Nukleotidsequenzen an den Enden, die für einen Einbau in einen Vektor geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst die DNA am 5'-Ende eine durch ein Restriktionsenzym schneidbare Nukleotidsequenz gefolgt vom Translations-Startsignal, Codons für die Aminosäuren von Hirudin, die gegebenenfalls an einer oder mehrenen Stellen das Schneiden durch ein Restriktionsenzym ermöglichen, ein Translations-Stopsignal und am 3'-Ende eine durch ein Restriktionsenzym schneidbare Nukleotidsequenz. Erfindungsgemäss anwendbare Restriktionsenzyme sind beispielsweise EcoRI, EcoRII, BamHI, HpaII, PstI, HinfI oder HindlIl. Insbesondere umfasst die Erfindung eine doppelsträngige DNA bestehend aus einer Nukleotidsequenz der Formel I und der komplementären Nukleotidsequenz Met 5)n ATG Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu GTX GTX TAY ACX GAY TGY ACX GAM Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys QRS GGX CAM AAY YTZ TGY YTZ TGY Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln GAM GGX QRS AAY GTX TGY GGX CAM Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser GGX AAY AAM TGY ATN YTZ GGX QRS Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val GAY GGX GAM AAM AAY CAM TGY GTX Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro ACX GGX GAM GGX ACX CCX AAM CCX Gln Ser His Asn Asp Gly Aep Phe CAM QRS CAY AAY GAY GGX GAY TTY Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu GAM GAM ATN CCX GAM GAM TAY YTZ Gln NON 3' CAM TMK (X')m (I) worin die Nukleotidsequenz beginnend mit dem 5'-Ende dargestellt ist und zum besseren Verständnis die Aminosäuren, für die jedes Triplett codiert, angegeben sind, und worin bedeuten A Desoxyadenosyl, T Thymidyl, G Desoxyguanosyl, C Desoxycytidyl, X A, T, C oder G, y T oder C, Z A, T, C oder G, wenn Y - oder Z - A oder G, wenn Y Q T oder A, R C und S = A, T, C oder G, wenn Q oder R - G und S - T oder C, wenn Q M A oder G, L A oder C, N T, C oder A K A oder G, wenn M oder K - A, wenn M w und (X') n und (X')m Nukleotidsequenzen mit n und m grösser als 3 und kleiner als 100, insbesondere grösser als 5 und kleiner als 15, bedeuten, welche durch ein Restriktionsenzym erkannt und geschnitten werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz am 5'-Ende eine durch EcoRI spaltbare, in der Mitte eine durch EcoRII spaltbare und am 3'-Ende eine durch BamHI spaltbare Nukleotidsequenz. In erster Linie umfasst die Erfindung eine doppelsträngige DNA, welche von E. coli bevorzugte und für die Aminosäuren von Hirudin kodierende Tripletts enthält. Solche Tripletts sind insbesondere für Glycin (Gly) GGT Cystein (Cys) TGC Valin (Val) GTT Leucin (Leu) CTG Serin (Ser) TCT Threonin (Thr) ACC Phenylalanin (Phe) TTC Tyrosin (Tyr) TAC Methionin (Met) ATG Asparaginsäure (Asp) GAC Glutaminsäure (Glu) GAA Lysin (Lys) AAA Isoleucin (Ile) ATC Histidin (His) CAC Prolin (Pro) CCG Glutamin (Gln) CAG Asparagin (Asn) AAC Bevorzugtes Stopsignal (NON) ist der Codon TAG. Eine bevorzugte Ausführungsform eines für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierenden Gens in der oben dargestellten Weise ist die DNA der Formel II, MetValValTyrThrAspCyssThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGly CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA (EcoRI) SerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCyVal TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT AGATTGCAAACGCCAGT CCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA (EcoRII) ThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGlu ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGACTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGCCCTTCTT TyrLeuGlnNON TACCTGCAGTAGGATCCTG ATGGACGTCATCCTAGGAC (BamHI) (11), worin A, T, G, C die unter Formel I angegebenen Bedeutungen haben und zum besseren Verständnis die Aminosäuren, für die jedes Triplett kodiert, und die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme angegeben cind. Die Erfindung umfasst auch Fragmente einer DNA, die für Desulfatohirudin, kodiert. Insbesondere umfasst die Erfindung doppelsträngige DNA-Fragmente des Desulfatohirudin-Gens, besonders solche, deren Enden durch Restriktionsenzyme geschnitten werden können. Solche doppelsträngigen DNA-Fragmente des Hirudin-Gens haben insbesondere 30 bis 70 Basenpaare. Beispielsweise umfasst die Erfindung die DNA-Fragmente der Formel III (F1) und der Formel IV (F2): MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGly CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA (EcoRI) SerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCyslleLeuGlySer TCTAACGTTTCCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG AGATTGCAAACGCCAOTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC (EcoRIl) F1 (III) IleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysPro CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGIGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGC (EcoRII) GlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGlulleProCluGluTyrLeuGlnNoN CACTCTCACAACGACGGTGACTTC & AGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG GTCAGAGTGTIGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC (BamHI) F2 (IV) Die Erfindung umfasst auch einsträngige DNA-Fragmente des Desulfatohirudin-Gens, insbesondere solche, die sich durch chemische und/oder enzymatische Methoden zum Desulfatohirudin-Gen zusammenfügen lassen. In erster Linie betrifft die Erfindung einsträngige DNA-Fragmente mit mehr als zwanzig Nukleotiden, insbesondere mit 20 bis 70 Nukleotiden. Vorzugsweise betrifft die Erfindung die in den Beispielen beschriebenen einsträngigen und doppelsträngigen DNA-Fragmente. Methoden der Synthese von DNA sind von S.A. Narang (3) zusammenfassend dargestellt worden. Die bekannten Synthesetechniken erlauben die Herstellung von Polynukleotiden mit einer Länge von gegen 20 Basen in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in verhältnismässig kurzer Zeit. Ceeignet geschützte Nukleotide werden durch die Phosphodiestermethode (4), die noch effizientere Phosphotriestermethode (5) oder Phosphit-Triestermethode (6) miteinander verknüpft. Eine Vereinfachung der Synthese der Oligo- und Polynukleotide wird mit der Festphasen-Methode ermöglicht, bei der die Nukleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden sind. Itakura et al. (7) verwenden bei der Festphasen-Synthese anstelle einzelner Nukleotide durch Phosphotriester-Methode geknüpfte Trinukleotide, die so in kurzer Zeit und guten Ausbeuten beispielsweise zu einem Polynukleotid mit 31 Basen kondensiert werden können. Die eigentliche doppelsträngige DNA kann aus chemisch hergestellten kurzen Segmenten enzymatisch aufgebaut werden. Khorana et al. (8) verwenden dazu überlappende Polynukleotid-Sequenzen aus beiden DNA-Strängen, die durch Basen-Paarung in richtiger Anordnung zusammengehalten und dann durch das Enzym DNA-Ligase chemisch verknüpft werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, je eine Polynukleotid-Sequenz aus den beiden DNA-Strängen mit einem kurzen überlappenden Segment in Gegenwart der vier benötigten Desoxynukleosid-Triphosphate mit einer DNA-Polymersse, z.B. DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, oder mit AMV (avian myeloblastosis virus) reverse Transcriptase, zu inkubieren. Dabei werden durch Basenpaarung die beiden Polynukleotid-Sequenzen in der richtigen Anordnung zusammengehalten und durch das Enzym mit den benötigten Nukleotiden zu einer vollständigen doppelsträngigen DNA ergänzt (9). Itakura et al. (10) beschreiben, wie basierend auf diesem Prinzip in Gegenwart von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus 4 chemisch synthetisierten Fragmenten einer Länge von 39 bis 42 Basen ein 132 Basen-Paare langes Segment des humanen Leukozyten-lnterferon a2-Gens aufgebaut werden kann, wobei 40 % Einsparung an chemischer Synthese gegenüber der oben beschriebenen Methode, bei der nur Ligase verwendet wird, erzielt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von DNAs, welche ein Strukturgen des Desuifatohirudins enthalten und für eine Expression in Wirtszellen geeignet sind, und deren Enden einen Einbau in Vektoren ermöglichen, und von Fragmenten davon, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein geeignet geschütztes Desoxynukleosid an einen festen Träger gebunden wird, b) geeignet geschützte Di-, Tri- oder Tetranukleotide nach der Phosphotriester- oder Phosphit-Methode hergestellt werden, c) ein an den Träger gebundenes Desoxynukleosid oder Oligodesoxy nukleotid mit geeignet geschützten Mono- oder (gemäss b) herge stellten) Di-, Tri- oder Tetranukleotiden nach der Phosphotri ester- oder der Phosphit-Methode verknüpft wird, d) nach c) erhältliche, an Träger gebundene Oligodesoxynukleotide mit einer Länge zwischen etwa 20 und etwa 70 Basen vom Träger abgespalten, gegebenenfalls gereinigt, von Schutzgruppen befreit und die freien 5'-terminalen Hydroxygruppen phosphoryliert werden, el) 2 Oligodesoxynukleotide einer Länge von je etwa 20 bis etwa 70 Basen aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang mit mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15, überlappenden Basen paaren annelliert und mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxynukleosid-Triphosphate zu doppelsträngigen DNA-Segmenten (Fragmenten des Desulfatohirudin-Gens) ergänzt werden, und gegebenenfalls 2 doppelsträngige DNA-Segmente mit geeigneten gemäss d) phosphorylierten Enden mit einer Ligase zum Desulfato hirudin-Strukturgen verknüpft werden, oder 2 erhältliche doppelsträngige DNA-Segmente in geeignete Vektoren subkloniert, anschliessend gemäss d) phosphoryliert und mit einer Ligase zum Desulfatohirudin-Strukturgen verknüpft werden, oder e2) alternativ je 2 Oligodesoxynukleotide aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang mit einer Länge von z.B. 20 bis 70 Basen und mit je mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15, über lappenden Basenpaaren annelliert, mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxynukleosid-Triphosphate aufgefüllt und mit Ligase zum Desulfatohirudin-Strukturgen verknüpft werden. Das erfindungsgemässe Verfahren ist an sich bekannt, ermöglicht aber erst durch geeignete Kombination der Bedingungen und erfindungswesentliche Verbesserungen die Herstellung von für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierenden DNAs. In Schritt a) können eine Vielzahl von festen Trägermaterialien, wie Polystyrol verschiedener Vernetzung und Quellfähigkeit, Polyacrylamide, Polyacrylamid-Copolymere, auf anorganisches Material wie Kieselguhr, Kieselgel oder Alox aufgezogene Polyamide oder funktionalisierte Silane, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als feste Trägermaterialien quervernetzte Polystyrole eingesetzt, die über "Spacer", wie Alkylen-Gruppen mit 2 bis 12 C-Atomen unterbrochen von 1 bis 5 polaren zweiwertigen funktionellen Gruppen, wie Imino, Oxo, Thio, Oxycarbonyl oder Amidocarbonyl, auf an sich bekannte Weise mit der 5'-OH-Gruppe geeignet geschützter Desoxynukleoside verknüpft werden. Besonders bevorzugt ist die Reaktion von in 5'-Stellung und gegebenenfalls im Basenteil geschützten Nukleosiden der Formel V, worin R1 eine durch Säure abspaltbare Schutzgruppe, wie eine Triarylmethylschutzgruppe, beispielsweise eine 4-Methoxytrityl- oder eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe, oder eine Triniederalkylsilylschutzgruppe, beispielsweise eine tert.-Butyldimethylsilylgruppe, und worin B eine gegebenenfalls geschützte Base ausgewählt aus Thymyl, Cytosyl, Adenyl oder Guanyl bedeutet, mit Bernsteinsäureanhydrid, gegebenenfalls in Gegenwart von Basen, wie Pyridin, Triäthylamin oder Dimethylaminopyridin, gefolgt von de Reaktion mit amino methyliertem Polystyrol, das durch 0,5 bis 2 % Divinylbenzol quervernetzt ist, mit Hilfe von den Carbonsäure-Rest aktivierenden Reagentien, vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid, oder p-Nitrophenol und wasserentziehenden Mitteln, wie Carbodiimiden, beispielsweise Dicyclohexylcarbodimid (Schema 1). Die Umsetzung erfolgt in einem inerten nicht-protischen Lösung mittel, z.B. Pyridin, Tetrahydrofuran, Dioxan, Essigsäureäthylester, Chloroform, Methylenchlorid, Dimethylformamid oder Diäthylacetamid oder in Mischungen davon, bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter oder erniedrigter Temperatur, z.B. in einem Temperaturbereich von ca. -100C bis ca. 500C, bevorzugt bei Raumtemperatur, die Umsetzung in Gegenwart des wasserentziehenden Mittels auch bei niedrigerer Temperatur, z.B. bei ca. OOC. Schema 1 EMI15.1 Bei der erfindungsgemässen Herstellung von Di-, Tri- oder Tetranukleotiden gemäss Schritt b) (Schema 2) werden in 5'-Stellung und gegebenenfalls im Basenteil geschützte Nukleoside der Formel V, worin R1 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit aktivierten Phosphorestern der Formel VII, worin X1 und X2 unabhängig voneinander Hydroxy oder davon abgeleitete Salze, Halogen, Imidazolyl, 1,2,4-Triazol-1-yl, Tetrazolyl oder l-Benztriazolyloxy und X2 zusätzlich auch 2-Cyanoäthyloxy, 2-Trihalogenäthyloxy, 2-Arylsulfonyläthyloxy, 2-Niederalkylthioäthyloxy, 2-Arylthioäthyloxy oder 2-(4-Nitrophenyl)-äthyloxy und R2 eine durch eine Base oder ein Nukleophil, wie Ammoniumhydroxid, Thiophenolat oder ein Arylaldoximat, abspaltbare Schutzgruppe, wie gegebenenfalls durch Halogen, Nitro und/oder Niederalkyl substituiertes Phenyl, Methyl oder gegebenenfalls durch Nitro substituiertes Benzyl, oder eine durch Metallionen abspaltbare Schutzgruppe, wie 8-Chinolyl oder 5-Chloro-8-chinolyl, bedeutet, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen umgesetzt. Anschliessend wird eine dermassen gebildete Verbindung der Formel VIII, worin R1, X2 und R2 die oben angegebenen Bedeutungen haben, zuerst gegebenenfalls mit einem 2-substituierten Aethanol umgesetzt, das den Rest X2 in eine Gruppe OR3 umwandelt, worin R3 Cyanoäthyl, 2-Trihalogenäthyl, 2-Arylsulfonyläthyl, 2-Niederalkylthioäthyl, 2-Arylthioäthyl oder 2-(4-Nitrophenyl)-äthyl bedeutet, und dann die Schutzgruppe R abgespalten, und die dermassen hergestellte Verbindung der Formel IX mit einer andern Verbindung der Formel VIII, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen, zu einem Dinukleotid X umgesetzt (Schema 2). Gegebenenfalls wird eine Verbindung der Formel VIII durch Reaktion mit Basen und Wasser in eine andere Verbindung der Formel VIII, worin x2 Hydroxy oder davon abgeleitete Salze bedeutet, umgewandelt. Die Umsetzungen erfolgen in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter oder erniedrigter Temperatur, z.B. bei Raumtemperatur. Die Abspaltung der Schutzgruppe R wird z.B. mit Hilfe von Säuren, wie Mineralsäuren, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, Carbonsäure, z.B. Essigsäure, Trichloressigsäure oder Ameisensäure. Sulfonsäure, z.B. Methan- oder p-Toluolsulfonsäure, oder insbesondere Lewis Säure, z.B. Zinkchlorid, Zinkbromid, Aluminiumchlorid, Dialkylaluminiumhalogenid, z.B. Dibutyl- oder Diäthylaluminiumchlorid, oder Bortrifluorid, bei LOOC bis 500C, insbesondere bei Raumtemperatur, durchgeführt. Bei Verwendung eines Dialkylaluminiumhalogenids erfolgt die Abspaltung in einem lipophilen Lösungsmittel, insbesondere in Toluol, und bei Verwendung einer anderen der genannten Lewis-Säuren in einem Lösungsmittelgemisch, bestehend aus einem Halogenkohlenwasserstoff, z.B. Methylenchlorid, und einem Niederalkanol, z.B. Aethanol oder Isopropanol. Schema 2 EMI17.1 Die Herstellung von Dinukleotiden der Formel X umfasst auch die Reaktion von Nukleosiden der Formel V, worin RI und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit Phosphiten der Formel VIIA, worin XÚ Halogen, insbesondere Chlor, Xê Halogen, insbesondere Chlor, oder Diniederalkylamino, insbesondere Dimethylamino oder Diisopropylamino, oder Morpholino, Piperidino oder Pyrrolidino, bedeuten und R2 die für VII oben angegebene Bedeutung, insbesondere Methyl, hat. gegebenenfalls in Gegenwart einer geeigneten Base (Schema 3). Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen der Formel VIIIA werden einerseits mit einem 2-substituierten Aethanol umgesetzt, das den Rest Xê in eine Gruppe OR umwandelt, worin R die oben angeführten Bedeutungen hat, dann mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, zum Phosphat oxidiert und die Schutzgruppe R1 abgespalten, wobei eine Verbindung der Formel IX entsteht, andererseits mit einer Verbindung der Formel IX umgesetzt, dann mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, zu einer Verbindung der Formel X oxidiert. Schema 3 EMI18.1 Zur erfindungsgemässen Herstellung von Trinukleotiden wird in Dinukleotiden der Formel X, worin RÚ, Rê und R die oben angegebenen Bedeutungen haben und worin B1 und B2 unabhängig voneinander Thymyl, cytosyls Adenyl oder Guanyl bedeuten, die Schutzgruppe R1 abgespalten und die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel VIII, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen, oder mit einer Verbindung der Formel YIIIA und nachfolgender Oxidation umgesetzt, wobei eine Verbindung der Formel XI entsteht (Schema 4). Die Abspaltung der Schutzgruppe R1 und die Kondensation zu den Trinukleotiden der Formel XI erfolgt in gleicher Weise, wie bei der Herstellung der Dinukleotide der Formel X beschrieben. EMI18.2 Zur erfindungsgemässen Herstellung von Tetranukleotiden werden Trinukleotide der Formel XI so zur Reaktion gebracht, wie oben für Dinukleotide der Formel X beschrieben. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird als Schutzgruppe R1 die 4-Methoxytritylgruppe, als Schutzgruppe R2 eine durch Chlor substituierte Phenylgruppe, insbesondere 2-Chlorphenyl, und als Schutzgruppe R3 die 2-Cyanoäthylgruppe verwendet. Bevorzugter Rest X1 und X2 in der Verbindung der Formel VII ist der l-Benztriazolyloxy-Rest. Trinukleotide der Formel XI werden vorzugsweise hergestellt, indem in Dinukleotiden der Formel X die Schutzgruppe R1 abgespalten und die erhaltene Verbindung mit Verbindungen der Formel VIII, worin X2 Hydroxyl oder davon abgeleitete Salze bedeutet, in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels umgesetzt wird (Schema 4). Erfindungsgemässe wasserentziehende Mittel sind beispielsweise 2,4,6-Trimethyl- oder TriisopropylbenzolsuIfonyl-chlorid, -imidazol, -tetrazol oder -1,2,4-triazol, gegebenenfalls substituiert durch Nitro. Bevorzugtes wasserentziehendes Mittel ist 1-(2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol (XII). Vorzugsweise werden Nukleoside eingesetzt, deren freie Aminogruppe im Basenteil geschützt ist. Bevorzugte Schutzgruppen sind Benzoyl für Adenin, Benzoyl oder 4-Methoxybenzoyl für Cytosin, Isobutyryl oder Diphenylacetyl für Guanin. Thymin wird vorzugsweise ohne Schutzgruppe eingesetzt. Bei der erfindungsgemässen Herstellung von Oligonukleotiden gemäss Schritt c) wird eine an sich bekannte Apparatur mit halbautomatischem oder vollautomatischem, mikroprozessorgesteuertem Zufuhrungs- system für Lösungsmittel und Reagentien verwendet. In einer gemäss Schritt a) hergestellten Verbindung der Formel VI wird die Schutzgruppe R , wie oben beschrieben, abgespalten und anschliessend entweder mit einer Verbindung der Formel VIII, oder mit einer Verbindung der Formel VIIIA, oder mit einer Verbindung der Formel X oder XI, in der vorgängig die Schutzgruppe R3 mit Basen abgespalten worden ist (eine Gruppe 2-Cyanoäthyl beispielsweise mit einem Triniederalkylamin, z.B. Triäthylamin, in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische bei 100C bis 400C, insbesondere bei Raumtemperatur), gegebenenfalls in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels oder in Gegenwart einer Base umgesetzt. Die Erfindung umfasst auch Reaktionen, bei denen anstelle eines Dinukleotids der Formel X oder eines Trinukleotids der Formel XI ein gemäss Schritt b) hergestelltes Tetranukleotid eingesetzt wird. Wird ein Phosphit der Formel VIIIA verwendet, so wird anschliessend mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, nachbehandelt. Die dermassen hergestellte Verbindung der Formel XIII, worin R11 R2 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, wird so oft den für die Verbindung der Formel VI beschriebenen Reaktionsschritten (Abspaltung von R1, Reaktion mit VIII, VIIIA, X, XI oder dem entsprechenden Tetranukleotid, gegebenenfalls mit oxidativer Nachbehandlung) unterworfen, bis eine Verbindung der Formel XIII entsteht, in der n eine beliebige ganze Zahl zwischen etwa 19 und etwa 69 ist. EMI20.1 In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Schutzgruppe R1 4-Methoxytrityl verwendet und die Abspaltung mit Zinkbromid in Gegenwart einer OH- oder NH-aciden Verbindung, insbesondere 1,9,4-Triazol oder Tetrazol, durchgeführt. Die Verwendung von z.B. 1,2,4-Triazol bei der Abspaltung der 4-Methoxytrityl-Schutz- gruppe ist neu und führt überraschenderweise dazu, dass die Abspaltung schnell, mit hohen Ausbeuten und ohne Nebenreaktionen abläuft. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Zinkbromid und 1,2,4 Triazol in einem molaren Verhältnis zwischen 20:1 und 100:1 in einem Lbsuagsmittelgeitiisch bestehend aus einem aprotischen Lösungsmittel und einem Alkohol, beispielsweise Methylenchlorid und 2-Propanol. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Verbindung der Formel VI oder der Formel XIII, in der die Schutzgruppe R abgespalten worden ist, mit einem Trinukleotid der Formel XI, in dem die Schutzgruppe R3 abgespalten worden ist, umgesetzt in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels, wie beispielsweise 2,4,6-Trimethyl- oder Triisopropylbenzolsulfonylchlor, -imidazol, -tetrazol oder -1,2,4-triazol gegebenenfalls substituiert durch Nitro. Besonders bevorzugt ist 1-(2,4,6 Trimethylbenzolsulfonyl)-3-nitro-l,2,4-triazol (XII). Die besonders bevorzugte Kombination, darin bestehend, dass als Schutzgruppe R1 die 4-Methoxytritylgruppe verwendet, zur Abspaltung von R Zinkbromid in Gegenwart von 1,2,4-Triazol eingesetzt und als wasserentziehendes Mittel für die Reaktion von entschütztem Oligonukleotid-Polystyrol-Harz der Formel XIII mit einem entschützten Trinukleotid der Formel XI das Triazol der Formel XII verwendet wird, ermöglicht es, dass überraschenderweise auch lange Nukleotidketten mit etwa 40 bis etwa 70 Basen in kurzer Zeit, in hohen Ausbeuten und mit hoher Reinheit hergestellt werden können. Zur erfindungsgemässen Abspaltung der Oligodesoxynukleotide vom Träger und zur Entfernung der Schutzgruppen gemäss Schritt d) werden an sich bekannte Verfahren verwendet. Besonders bevorzugtes Reagens zur Abspaltung vom Träger und zur Entfernung der bevorzugten 2-Chlorphenyl-Schutzgruppe ist ein Arylaldoximat, beispielsweise das 1,1,3,3-Tetramethylguanidinium-2-nitrobenzaldoximat. Die Reaktion erfolgt in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel, dem etwas Wasser beigefügt wird, z.B. in 95%igem Pyridin, bei Raumtemperatur. Anschliessend wird mit wässrigem Ammoniak bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, z.B. bei 20 C bis 700C, insbesondere bei 500C, umgesetzt. Zur Ligation der erfindungsgemässen Oligodesoxynukleotide wird an der 5'-terminalen Hydroxygruppe ein Phosphatrest eingeführt. Die Einführung des Phosphatrestes (Phosphorylierung) erfolgt in an sich bekannter Weise mit Hilfe von T4 Polynucleotid-Kinase in Gegenwart von ATP. Erfindungsgemäss hergestellte Oligodesoxynukleotide aus dem kodierenden und dem komplementären DNA-Strang enthalten überlappende Sequenzen, bestehend aus mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15 überlappenden Basenpaaren. Solche Oligodesoxynukleotid-Paare werden beim Mischen durch Wasserstoffbrückenbindung zusammengehalten. Die überhängenden, einsträngigen Enden dienen gemäss Schritt ei) und e2) als Matrix (Templat) für den Aufbau des zweiten (komplementären) Stranges durch eine DNA-Polymerase, z.B. DNA-Polymerase 1, Klenow Fragment der DNA-Polymerase I oder T4 DNA-Polymerase, oder mit AMV reverse Transcriptase, in Gegenwart der vier Desoxynukleosid-Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und TTP). Die bei der Komplementierung entstehenden Duplex-DNAs, bei denen es sich insbesondere um Fragmente des Desulfatohirudin-Gens (Verfahren el) oder um das komplette Desulfatohirudin-Gen (Verfahren e2) handelt, besitzen flache Enden. Die gemäss Verfahresschritt el) erhältlichen Fragmente des Desulfatohirudin-Gens enthalten an den Enden Nukleotidsequenzen, die von Restriktionsendonucleasen erkannt und gespalten werden können. Je nach Wahl der Nukleotidsequenzen und dementsprechend der Restriktionsendonucleasen entstehen bei der Spaltung vollständig basengepaarte (flache) Enden ("bunt ends") oder Enden mit einem überhängenden DNA-Strang ('staggered ends"). Die Restriktions-Erken- nungssequenzen werden so gewählt, dass die Ligation der DNA-Fragmente, die mit einer flache Enden bildenden Restriktionsendonuclease behandelt worden sind, bzw die Basenpaarung der kohäsiven Enden und die anschliessende Ligation von DNA-Fragmenten mit überhängenden Y-Strängen das vollständige Desulfatohirudin-Strukturgen ergibt. üle Ligierung zweier doppelsträngiger DNA-Fragmente erfordert eine 5'-terminale Phosphatgruppe am Donor-Fragment und eine freie 3'-terminale Hydroxygruppe am Akzeptor-Fragment. Die in Schritt el) anfallenden DNA-Fragmente sind bereits 5'-terminal phosphoryliert und werden in an sich bekannter Weise mit einer Ligase, insbesondere T4 DNA-Ligase, verknüpft. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden auf dem beschriebenen Wege zwei Fragmente des Desulfatohirudin-Gens, insbesondere die Fragmente F1 und F2 gemass Formel III bzw. IV. hergestellt. Die Fragmente, welche erforderlichenfalls in einem geeignetem Vektor subkloniert werden können, enthalten vorzugsweise an den Verknüpfung senden jeweils die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, insbesondere EcoRII, weswegen nach Spaltung mit besagtem Restriktionsenzym und Ligation der beiden Fragmente die korrekt kodierende Desulfatohirudin-DNA-Sequenz entsteht. Zusätzlich enthält das Teilstück 1 vor dem Translationsstartsignal (ATG) und das Teilstück 2 nach dem Translationsstopsignal (z.B. TAG) zusätzliche "terminale" Restriktionsstellen, die den Einbau des Desulfatohirudin-Gens bzw. der Desulfatohirudin-Gen Fragmente in einen geeigneten Vektor erlauben. Beispielsweise betrifft die Erfindung die Herstellung des Desulfatohirudin-Gens in zwei Teilstücken F1 und F2 der Formel III bzw. IV, welche gegebenenfalls subkloniert werden und nach Schneiden mit dem Restriktionsenzym EcoRII und Ligation die korrekte Desulfatohirudin DNA-Sequenz ergeben, und worin F1 vor dem Translationsstartsignal eine EcoRI-Resstriktionsstelle und F2 nach dem Translationsstopsignal eine BamHI-Restriktionsstelle aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform (Verfahren e2) werden je zwei Oligodesoxynukleotide, die alternativ aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang stammen, mittels mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15 komplementären Basen annelliert, mit einer DNA Polymerase, z.B. eine der oben genannten, aufgefüllt und mit T4 DNA-Ligase zum Desulfatohirudin-Strukturgen ligiert. Herstellung von Expressionsvektoren, welche ein für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierendes Gen enthalten Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, welche eine für Desulfatohirudin kodierende DNA-Sequenz enthalten, die von einer Expressionskontrollsequenz derart reguliert wird > dass in einer mit diesen Expressionsvektoren transformierten Wirtszelle Polypeptide mit Hirudin-Aktivität exprimiert werden. Die Expressionsvektoren der vorliegenen Erfindung werden z.B. hergestellt, indem man in eine Vektor-DNA, welche eine Expressionskontrollsequenz enthält, eine für Desulfatohirudin kodierende DNA-Sequenz derart einfügt, dass die Expressionskontrollsequenz besagte DNA- Sequenz reguliert. Die Wahl eines geeigneten Vektors ergibt sich aus der zur Transformation vorgesehenen Wirtszelle. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere Bakterienstämme, die über kein Restriktions- oder Modifikationsenzym verfügen, vor allem Stämme von Escherichia coli, z.B. E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110 A102, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221(30) oder E. coli K12 Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, ferner Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte humane oder tierische Zellinien. Bevorzugte Wirtszellen sind die genannten Stämme von E. coli, insbesondere E. coli Hub101, E. coli JA221 und E. coli W3110A102. Grundsätzlich sind alle Vektoren geeignet, welche die erfindungsgemässen heterologen > für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierenden DNA-Sequenzen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren. Beispiele für Vektoren, die zur Expression des Desulfatohirudin-Gens in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bacteriophagen, z.B. Derivate des Bacteriophagen X > oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid colEl und seine Derivate, z.B. pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Die bevorzugten Vektoren der vorliegenen Erfindung leiten sich von Plasmid pBR322 ab. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replicon und ein Markierungsgen, welches die Selektion und Identifizierung der mit den Expressionsplasmiden transformierten Mikroorganismen auf Grund eines phänotypischen Merkmals ermöglicht. Geeignete Markierungsgene verleihen dem Mikrooganismus beispielsweise Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen. Weiterhin enthalten bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung ausserhalb der Replicon- und Markierungsgen-Regionen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so dass an diesen Stellen die für die Aminosäure sequenz von Hirudin kodierende DNA-Sequenz und gegebenenfalls die Expressions-Kontrollsequenz eingefügt werden können. Der bevorzugte Vektor, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktes Replicon, gegen Tetracyclin und Ampicillin Resistenz verleihende Markierungsgene (tetR und ampR) ) und eine Reihe von nur einmal vorkommenden Erkennungssequenzen für Restriktions endonucleasen. z.B. PstI (schneidet im ampR-Gen, den, das text Gen bleibt intakt). BamHI, Hindill, SalI (schneiden alle im tetRGen, das ampR-Gen bleibt intakt), NruI und EcoRI. Mehrere Expressionskontrollsequenzen können zur Regulation der Desulfatohirudin-Expression eingesetzt werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen stark exprimierter Gene der zu transformierenden Wirtszelle verwendet. Im Falle von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsmikroorganismus sind beispielsweise die Expressionskontrollsequenzen (welche unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) des Lactoseoperons, Tryptophanoperons, Arabinoseoperons und dergleichen, des ss-Lactamasegens, die entsprechenden Sequenzen des Phage #N-Gens oder des Phage fd-Schichtproteingens und andere geeignet. Während der Promotor des ss-Lactamasegens (B-lac-Gen) bereits im Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die übrigen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden. Bevorzugt als Expressionskontrollsequenz in der vorliegenden Erfindung ist diejenige des Tryptophanoperons (trp po). Zur Replikation und Expression in Hefe geeignete Vektoren enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikationsstart enthalten, z.B. das chromosomale autonom replizierende Segment (ars), bleiben nach der Transformation innerhalb der Hefezelle extrachromosomal erhalten und werden bei der Mitose autonom repliziert. Ferner können Hybridvektoren, die der Hefe-2p-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination innerhalb der Zelle bereits vorhandenen 2-Plasmiden einverleibt oder replizieren autonom. 2p-Sequenzen sind besonders für Plasmide mit grosser Transformationshäufigkeit geeignet und gestatten eine hohe Kopienzahl. Geeignete Markierungsgene für Hefe sind vor allem solche, die dem Wirt antibiotische Resistenz verleihen oder, im Fall von auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsdefekte komplementieren. Entsprechende Gene verleihen z.B. Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, 2. 3 z.B. das URA3-, LEU2-, HIS3- oder vor allem das TRP1-Gen. Vorzugsweise enthalten Hefe-Hybridvektoren weiterhin einen Replikationsatart und ein Harkierungegen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, damit die Konstruktion und die Klonierung der Hybridvektoren und ihrer Vorstufen in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann. Für die Expression in Hefe geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise diejenigen des TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03- oder PHOS-Gens, ferner im glykolytischen Abbau involvierte Promoter, z.B. der PGK- und der GAPDH-Promoter. Insbesondere betrifft die Erfindung zur Replikation und phänotypischen Selektion befähigte Expressionsvektoren, welche eine Expressionskontrollsequenz und eine für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierende DNA-Sequenz enthalten, wobei besagte DNA-Sequenz mitsamt Transkriptionsstartsignal und -terminationssignal sowie Translationsstartsignal und -stopsignal in besagtem Expressionsplasmid unter Regulation besagter Rxpressionskontrollsequenz so angeordnet ist, dass in einer mit besagtem Expressionsplasmid transformierten Wirtszelle Desulfatohirudin exprimiert wird. Um eine effektive Expression zu erreichen., muss das Desulfatohirudin-Gen richtig (in "Phase") mit der Expressionskontrollsequenz angeordnet sein. Es ist vorteilhaft, die Expressionskontrollsequenz in den Bereich zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ATG der Genkodiersequenz, welche natürlich mit der Expressionskontrollsequenz verknüpft ist (z.B. die ss-lac-Kodiersequenz bei Verwendung des ss-lac-Promotors). mit dem Desulfatohirudin-Gen, welches vorzugsweise sein eigenes Translationsstartsignal (ATG) und Translationsstopsignal (z.B. TAG) mitbringt, zu verknüpfen. Dadurch wird eine effektive Transkription und Translation gewährleistet. Beispielsweise wird ein Vektor, insbesondere pBR322, mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten und, gegebenenfalls nach Modifikation des so gebildeten linearisierten Vektors, eine mit entsprechenden Restriktionsenden versehene Express ionskontroll- sequenz eingeführt. Die Expressionskontrollsequenz enthält am 3'-Ende (in Translationsrichtung) die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuclease, sodass der die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltende Vektor mit besagtem Restriktionsenzym verdaut und das mit passenden Enden versehene Desulfatohirudin-Gen eingesetzt werden kann. Dabei entsteht ein Gemisch von zwei Hybridplasmiden, welche das Gen in richtiger bzw. in falscher Orientierung enthalten. Vorteilhaft ist es, den die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltenden Vektor noch mit einer zweiten Restriktionsendonuclease innerhalb der Vektor-DNA zu spalten und in das entstandene Vektor-Fragment das mit richtigen Enden versehene Desulfatohirudin-Gen einzusetzen. Alle Operationen am Vektor erfolgen vorzugsweise in einer Weise, dass die Funktion des Replicons und zumindest eines Markierungsgens nicht beeinträchtigt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein von pBR322 abgeleiteter Vektor, welcher eine Expressionskontrollsequenz, insbesondere diejenige vom Tryptophan-Operon (trp po), enthält, die am 3'-Ende (zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ersten ATG) die Erkennungssequenz für eine, vorzugsweise kohäsive Enden bildende, Restriktionsendonuclease, z.B. EcoRI, trägt, mit der genannten Restriktionsendonuclease und im Vektor-DNA-Teil mit einer zweiten Restriktionsendonuclease, welche flache oder bevorzugt kohäsive Enden bildet, z.B. BamHI, verdaut, wonach der so linearisierte Vektor mit dem entsprechende Enden aufweisenden Desulfatohirudin-Gen (z.B. mit einem EcoRI-Ende vor dem ATG-Start und einem BamHI-Ende nach dem Translationsstop-Codon) verknüpft wird. Die Verknüpfung erfolgt in bekannter Weise durch Paarung der komplementären (kohäsiven) Enden und Ligierung z.B. mit T4-DNA-Ligase. Das über den mRNA-Weg, aus genomischer DNA oder synthetisch gewonnene, mit entsprechenden kohäsiven (insbesondere EcoRI- und BamHI-) Enden versehene Desulfatohirudin-Gen kann vor dem Einbringen in ein Expressionsplasmid auch in einen Vektor, z.B. pBR322, kloniert werden, um grössere Mengen an Desulfatohirudin-Gen, beispielsweise für die Sequenzanalyse, zu gewinnen. Die Isolierung der Klone, welche das-Hybridplasmid enthalten, wird beispielsweise mit einer Desulfatohirudin-Gen-spezifischen, radioaktiv-markierten Oligodesoxynucleotid-Probe (siehe oben) durchgeführt. Die Charakterisierung des Desulfatohirudin-Gens erfolgt beispielsweise nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (11). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zwei Teilstücke des Desulfatohirudin-Gens synthetisiert. Teilstück 1, welches den 1. Teil des Gens umfasst, enthält vor dem ATG und am Ende jeweils die Erkennungssequenz für kohäsive Enden bildende Restriktionsendonucleasen, z.B. vor dem ATG EcoRI und am Ende EcoRII. Teilstück 2, welches den hinteren Teil des Gens umfasst, besitzt entsprechende Erkennungssequenzen, am Anfang z.B. EcoRII und nach dem Translationsstopsignal (z.B. TAG) BamHI. Die Teilstücke werden an den äusseren Erkennungssequenzen gespalten (Teilstück 1 z.B. mit EcoRI und Teilstück 2 entsprechend mit BamHI) und in einen entsprechend zugeschnittenen Vektor (z.B. pBR322) subkloniert. Die Identifizierung der Klone, welche die Teilstücke enthalten, und die Charakterisierung der Teilstücke erfolgt wie oben beschrieben. Die Teilstücke werden dann mit den entsprechenden Restriktionsendonucleasen aus den Hybridvektoren herausgeschnitten (Teilstück 1 z.B. mit EcoRI und EcoRII und Teilstück 2 z.B. mit EcoRII und BamHI) und über ihre kohäsiven Enden, insbesondere EcoRII-Enden, ligiert, wobei das komplette Desulfatohirudin-Gen entsteht, das wie angegeben in eine Vektor-DNA eingefügt wird. Transformation der Mikroorganismen Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Wirtszellen, dadurch gekennnzeichnet, dass man eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformiert. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise die oben genannten Mikroorganismen, wie Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis und insbesondere Escherichia coli. Die Transformation mit den erfindungsgemässen Expressionsplasmiden erfolgt beispielsweise wie in der Literatur beschrieben, so für S. cerevisiae (12), B. subtilis (13) und E. coli (14). Die Isolierung der transformierten Wirtszellen erfolgt vorteilhaft aus einem selektiven Nährmedium, dem das Biocid zugesetzt wird, gegen welches das im Expressionsplasmid enthaltene Markierungs-Gen Resistenz verleiht. Wenn, wie bevorzugt, die Expressionsplasmide das amp -Gen enthalten, wird dem Nährmedium demgemäss Ampicillin zugesetzt. Zellen, welche das Expressionsplasmid nicht enthalten, werden in einem solchen Medium abgetötet. Die Erfindung betrifft ebenfalls die auf dem genannten Weg erhältlichen transformierten Wirtszellen. Kultivierung der transformierten Wirtszellen und Gewinnung von Desulfatohirudinen Die transformierten Wirtszellen können zur Herstellung von Verbindungen mit Hirudin-Aktivität verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass die transformierten Wirtszellen kultiviert und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird. Unter "Verbindungen mit Hirudin-Aktivität" werden solche1 von den genannten transformierten Wirtszellen exprimierte Polypeptide verstanden, welche eine Thrombin-inhibierende Wirkung und eine positive Reaktion mit anti-Hirudin-Antikörpern zeigen und welche die Primärstruktur von Desulfatohirudin oder eine davon abgeleitete Struktur aufweisen. Unter Desulfatohirudin-Verbindungen mit einer von der Primärstruktur von Desulfatohirudin abgeleiteten Struktur werden modifizierte Desulfatohirudin-Verbindungen verstanden, wobei die Modifizierung vorzugsweise in einer Verkürzung der Primär struktwr de oDesulf ataM rudins, z.B. um 1 bis 10, insbesondere 1 bis 6, Aminosäurebausteine am N-Terminus undloder um 1 bis 6, insbesondere 2, Aminosäurebausteine am C-Terminus oder in einer Modifizierung am N-Terminus, z.B. in einer N-terminalen Acetylierung oder Methionylierung, des Desulfatohirudin-Moleküls besteht. Die Erfindung betrifft daher vor allem ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit Hirudin-Aktivität und von Salzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierte Wirtszellen in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen enthält, kultiviert werden und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird, und, falls erforderlich, ein verfahrens gemäss erhältliches Produkt mit einem zur Aufspaltung der Disulfidbindungen geeigneten Reduktionsmittel versetzt und das erhältiche reduzierte Polypeptid mit einem zur Neuknüpfung von Disulfidbindungen geeigneten Oxidationsmittel behandelt wird, und falls gewünscht, eine erhältliche Hirudin-Verbindung in eine andere Hirudin-Verbindung überführt wird, und, falls gewünscht, ein verfahrensgemäss erhältliches Gemisch von Verbindungen mit Hirudin-Aktivität in die einzelnen Komponenten aufgetrennt wird, und/oder, falls gewünscht, ein erhaltenes Salz in das freie Polypeptid und ein erhaltenes Polypeptid in ein Salz desselben überführt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Hirudin-Verbindungen der Formel VValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluWLeuGln (XIV), worin V für Val oder für Met-Val steht und W Tyr oder Tyr(-OSO3H) bedeutet, und von Salzen solcher Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Desulfatohirudin der Formel XIV, worin V für Val und W für Tyr steht. In den verfahrensgemäss erhältlichen Verbindungen mit Hirudin Aktivität, insbesondere in den Verbindungen der Formel XIV, sind die Cystein-Reste Cys vorzugsweise in gleicher Anordnung wie im natürlichen Hirudin paarweise durch Disulfid-Brücken verknüpft. Die Kultivierung der erfindungsgemässen transformierten Wirtszellen erfolgt in an sich bekannter Weise. So können für die Kultivierung der erfindungsgemässen, transformierten Wirtsmikroorganismen verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder allein oder in geeigneten Gemischen verwendet werden kann. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte; weiterhin Hefeextrakte, Malzextrakt, wie auch Ammoniumsalze. z.B. Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die ebenfalls verwendet werden können, sind z.B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Weiterhin enthält das Medium z.B. wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, z.B. Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen, die das Expressionsplasmid verloren haben, verhindern. So wird dem Medium beispielsweise Ampicillin zugesetzt, wenn das Expressionsplasmid ein amp den enthält. Ein solcher Zusatz von antibiotisch wirksamen Substanzen bewirkt auch, dass kontaminierende, Antibiotika-empfindliche Mikroorganismen abgetötet werden. Die Kultivierung erfolgt nach an sich bekannten Verfahren. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, dass maximale Hirudin-Titer erhalten werden. So wird ein E. coli- oder ein Hefe-Stamm bevorzugt unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwas 20 bis 400C, vorzugsweise etwa 30"C, und einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise bei pH 7, während etwa 4 bis 20 h, vorzugsweise 8 bis 12 h, kultiviert. Dabei sammelt sich das Expressionsprodukt intrazellulär an. Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultivierung abgebrochen und das Produkt aus den Zellen des Mikroorganismus freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, z.B. durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder mit Lysozym oder einem gleichartig wirkenden Enzym lysiert. Alternativ oder zusätzlich kann man mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z.B. X-Presse, French-Presse, Dyno-Mill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndes Einfrieren, z.B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, z.B. auf 300 bis 400C, sowie Ultraschall zum Brechen der Zellen anwenden. Die resultierende Mischung, die Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, wird nach der Zentrifugation in an sich bekannter Weise an Proteinen angereichert. So wird z.B. der grösste Teil der Nicht Protein-Bestandteile durch Polyäthylenimin-Behandlung abgetrennt und die Proteine einschliesslich der Hirudin-Verbindungen z.B. durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen ausgefällt. Bakterielle Proteine können auch mittels Ansäuern mit Essigsäure (z.B. 0,1 %, pH 4-5) ausgefällt werden. Eine weitere Anreicherung an Hirudin-Verbindungen kann durch Extraktion des essigsauren Ueberstandes mit n-Butanol erreicht werden. Weitere Reinigungsschritte umfassen bespielsweise chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelpermeationschromatographie, Partitionschromatographie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und dergleichen. So erfolgt die Auftrennung der Nischbestandteile durch Dialysat, nach Ladung mittels Gel- oder trägerfreier Elektrophorese, nach Molekülgrösse mittels einer geeigneten Sephadex-Säule, durch Affinitätschromatographie, z.B. mit Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin gekuppelt an einen geeigneten Träger zur Affinitätschromatographie, oder durch weitere, insbesondere aus der Literatur bekannte Verfahren. Beispielsweise umfasst die Isolierung der exprimierten Hirudin Verbindungen die folgenden Stufen: Abtrennung der Zellen aus der Kulturlösung mittels Zentrifugation; Herstellung eines Rohextrakts durch Zerstören der Zellen, z.B. durch Behandlung mit einem lysierenden Enzym und/oder abwechselndem Einfrieren und Wiederauftauen; Abzentrifugieren der unlöslichen Bestandteile; Ausfällen der DNA durch Zugabe von Polyäthylenimin; Fällung der Proteine durch Ammoniumsulfat; Affinitätschromatographie des gelösten Niederschlags an einer monoklonalen Anti-Desulfatohirudin-Antikörper-Säule oder einer Thrombin-Säule; Entsalzung der so gewonnen Lösung mittels Dialyse oder Chromatographie an Sephadex G25 oder Sephadex G10. Alternativ können nach Abtrennen der DNA die bateriellen Proteine mittels 1%Der Essigsäure ausgefällt werden1 aus dem sauren Ueberstand die Hirudin-Verbindung mit n-Butanol extrahiert oder der saure Ueberstand direkt der Ionenaustausch-Chromatographie (z.B. an Diäthylaminoäthylcellulose DEAE 53) unterworfen werden. Weitere Reinigungsschritte schliessen Gelfiltration an Sephadex G50 (oder G75), und Umkehrphasen-HPLC ein. Entsalzung erfolgt wieder an Sephadex G25. Zum Nachweis der Hirudin-Aktivität kann der Test mit Anti-Hirudinoder Anti-Desulfatohirudin-Antikörpern (z.B. aus Kaninchen erhältliche, oder aus Hybridomazellen erhältliche monoklonale Antikörper), der Thrombin-Test (15) oder der Blutgerinnungstest < 16) herangezogen werden. Verfahrensgemäss erhältliche Hirudin-Verbindungen können in an sich bekannter Weise in andere Hirudin-Verbindungen überführt werden. So können z.B. Verbindungen der Formel XIV, worin W für Tyr steht, durch Umsetzen mit einer Tyrosin-Sulfotransferase, welche z.B. aus Egelzellen erhältlich ist, in Verbindungen der Formel XIV überführt werden, worin W für Tyr (-OS03H) steht. Ferner können z.B. Verbindungen der Formel XIV > worin V für Met-Val steht, in Verbindungen der Formel XIV übergeführt werden, worin V Val bedeutet. Beispielsweise können erfindungsgemäss erhältliche Hirudin-Verbindungen mit einem N-terminalen Methionylrest in entsprechende Verbindungen ohne N-terminalen Methionylrest übergeführt werden, indem man den terminalen Methionylrest in üblicher Weise mittels Bromcyan abspaltet. Die Reaktion mit Bromcyan erfolgt z.B. in einem wässrig-sauren Medium, z.B. in stark verdünnter Salzsäure, beispielsweise in 0,1-0,3 N Salzsäure, oder in einer starken organischen Säure, z.B. in 50-70%iger Ameisensäure, bei Raumtemperatur oder geringfügig erhö rr oder erniedrigter Tempera tur, z.B. bei ca. 150 bis etwa 250C, über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Unversehrtheit der Disulfidbrücken für die gerinnungshemmende Aktivität von natürlichem Hirudin von Bedeutung ist (vgl. Lit. 2). Je nach Wahl der Wirtszelle kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Verknüpfung der sechs Cystein-Reste im primären Translationsprodukt unter Bildung der drei Disulfidbrücken in einer Weise erfolgt, die sich vom natürlichen, in Egelzellen ablaufenden Vorgang unterscheidet. Es ist möglich, dass die sich einstellende "falsche" Tertiärstruktur des Produktes eine Verminderung oder sogar den Verlust der wertvollen pharmakologischen Eigenschaften. insbesondere der gerinnungshemmenden Aktivität, zur Folge hat, was sich mit Hilfe der oben genannten Hirudin-Assays (z.B. Thrombin-Test) feststellen lässt. In einem solchen Fall ist es zwecksmässig, die Disulfidbindungen mit einem geeigneten Reduktionsmittel zu spalten und das reduzierte Polypeptid zur Neuknüpfung der Disulfidbindungen mit einem geeigneten Oxidationsmittel zu behandeln. Anhand der Hirudin-Aktivität des gebildeten Produktes (z.B. im Thrombin-Test) lässt sich feststellen, ob die gewählten Bedingungen (Reduktions-und/oder Oxidationsmittel) zum gexünschten biologisch aktiven Hirudin geführt haben oder ob die Bedingungen in bekannter Weise modifiziert werden müssen. Zur Aufspaltung von Disulfidbindungen geeignete Reduktionsmittel sind beispielsweise Thiol-Verbindungen, wie Thiophenol, 4-Nitrothiophenol, 1,4-Butandithiol und insbesondere 1,4-Dithiothreitol. Die Reduktion wird vorteilhaft in einem wässrig-alkalischen Medium, beispielsweise in der verdünnten wässrigen Lösung eines Alkali metallhydroxids, z.B. Natriumhydroxid, Alkalimetallcarbonats, z.B. Natriumcarbonats, oder einer organischen Base, insbesondere eines Triniederalkylamins, z.B. Triäthylamin, bei Raumtemperatur durchgeführt. Oxidationsmittel. welche zur Neuknüpfung von Disulfidbindungen in den reduzierten Polypeptiden geeignet sind, sind beispielsweise Luftsauerstoff. welcher durch eine wässrige Lösung des Polypeptids, der gegebenenfalls eine katalytische Menge eines Uebergangsmetallsalzes, z.B. Eisen-(III)-sulfat, Eisen-(III)-chlorid oder Kupfer (II)-sulfats beigefügt wurde, geleitet wird; Jod, auch in Form des Xaliumjodid-Adduktes KJ31 welches vorzugsweise in alkoholischer, z.B. methanolischer, oder wässrig-alkoholi6cher, z.B. wässrig- methanolischer, Lösung eingesetzt wird; Kaliumhexacyanoferrat-(III) in wässriger Lösung; 1 > 2-Dijodäthan oder Azodicarbonsäuredimethyl- ester oder -diäthylester, welche in Wasser oder in-einer Mischung bestehend aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Alkohol, z.B. Methanol, zur Reaktion gebracht werden. Die Oxidation wird insbesondere bei Raumtemperatur ausgeführt, Die Abtrennung der Reagentien, insbesondere der Salze und der Oxidations- bzw. der Reduktionsmittel und ihrer Folgeprodukte, von der gewünschten Hirudin-Verbindung erfolgt nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Molekulargewichtsfiltration, z.B. an Sephadex oder Biogel. Ein verfahrensgemäss erhältliches Gemisch von Verbindungen mit Hirudin-Aktivität kann in an sich bekannter Weise in die einzelnen Komponenten aufgetrennt werden. Geeignete Trennverfahren sind beispielsweise chromatographische Verfahren, z.B. Adsorption Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, HPLC oder reversedphase HPLC, ferner multiplikative Verteilung oder elektrophoretische Methoden, z.B. Elektrophorese an Celluloseacetat oder Gelelektro phorese, insbesondere Polyacrylamid-Gelelektrophorese ("PAGE"). Die Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Desulfatohirudin-Verbindungen, insbesondere solche der Formel XIV, worin V Met-Val ist und W die angegebenen Bedeutungen hat, und Salze davon. Die Erfindung betrifft ferner nest;* Desulfatohirudin-Verbindungen, welche durch RP-HPLC-Konstanten [Bedingungen: Vydac 218TP5415; 4,6 x 150 mm; Durchflussgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluent: A: 0,1 % Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser 8:2 + 0.07 % Trifluer- essigsäure. Gradient: 2 min 16 % B, dann während 3-min. auf 20 % B steigern, dann während 15 min auf 25 % 3 steigern, dann während 27 min. auf 64 X B steigern], FPL0-Ko-nstanten [Bedingungen: Mono Q-Säule (Pharmacia), 4,6mm x 150 mm. Puffer A: 20 mM Tris HC1 pH 7,5; Puffer B: 20 mM Tris HC1/1 M NaCl. Linearer Salzgradient: A: während 9 ml mit 15 % Puffer B eluieren, während 10,7 ml auf 70 % Puffer B steigern und UV-Absorption wie folgt charakterisiert sind: Verbindung A: RP-HPLC, Retentionszeit 16,83 min; FPLC; Elution bei 390 mM NaCl; W (Wasser): man = 275 nm; Verbindung B: RP-HPLC: Retentionszeit 18,43 min; Verbindung C: RP-HPLC: Retentionszeit 19,6 min; FPLC: Elution bei 420 mM NaCl; Verbindung D: RP-HPLC: Retentionszeit 20,6 min; FPLC: Elution bei 460 mM NaCl; Verbindung E: RP-HPLC: Retentionszeit 21,53 min; FPLC: Elution bei 500 mM NaCl; W (Wasser): X = 273 nm; max und das Verfahren zu ihrer Herstellung mittels der transformierten Wirts stämme. Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen bzw. die neuen Verbindungen, z.B. der Formel XIV, können nicht nur in freier Form, sondern auch in Form ihrer Salze, insbesondere ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, vorliegen. Da sie mehrere Aminosäurereste mit freien Aminogruppen enthalten, können-die erfindungsgemässen Verbindungen z.B. in Form von Säuresdditionssalzen vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen insbesondere physiologisch verträgliche Salze mit üblichen, therapeutisch anwendbaren Säuren in Betracht; als anorganische Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren, wie die Chlorwasserstoffsäure, aber auch Schwefelsäure und Phosphor- bzw. Pyrophosphorsäure zu nennen; als organische Säuren sind in erster Linie Sulfonsäuren. wie die Benzol- oder p-Toluolsulfonsäure oder Niederalkansulfonsäuren. wie Methansulfonsäure, sowie Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitin- und Stearinsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Citronensäure, geeignet. Da die Hirudin-Verbindungen auch Aminosäurereste mit freien Carboxylgruppen enthalten, können sie auch als Metallsalz, insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, z.B. Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalz, oder auch als Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammoniak oder einer physiologisch verträglichen, organischen stickstoffhaltigen Base, vorliegen. Da sie aber zugleich freie Carboxylgruppen und freie Aminogruppen enthalten, können sie auch als inneres Salz vorliegen. Je nach Arbeitsweise erhält man die erfindungsgemässen Verbindungen in freier Form, in Form von Säureadditionssalzen oder Salzen mit Basen. Aus den Säureadditionssalzen und den Salzen mit Basen können tn an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Einstellen des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt, die freien Verbindungen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzen mit Säuren bzw. Basen, z.B. mit solchen, die die obengenannten Salze bilden, und Eindampfen oder Lyophilisieren therapeutisch annehmbare Säureadditionssalze bzw. Salze mit Basen gewinnen. Monoklonale Antikörper gegen Desulfatohirudin und Test-Kits, die solche Antikörper enthalten. Die Eigenschaft von Antikörpern, spezifische Antigene tu binden, findet ausserhalb des Körpers praktische Anwendung bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung (Immuno-Assay) une bei der Reinigung der Antigene (Immunoaffinitätschromatographie). Serum immunisierter Tiere enthält normalerweise eine Vielzahl ver- schiedener Antikörper, die mit dem gleichen Antigen an warschiedenen Bindungsstellen mit verschiedener Affinität reagieren, dzu aber auch Antikörper gegen andere Antigene, die die früheren Jrfahrungen des Individuums widerspiegeln. Die erfolgreiche Anwendung von Antikörpern zur Bestimmung und Reinigung von Antigenen erfordert aber hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit. Homogene Antikörper, die diese Anforderungen erfüllen, sind durch die von Köhler und Milstein (17) beschriebene Hybridoma-Technik zugänglich geworden. Prinzipiell besteht die Technik darin, dass Antikörper ausscheidende B-Lymphozyten, z.B. aus der Milz, immunisierter Tiere mit Tumorzellen verschmolzen (fusioniert) werden. Die gebildeten Hybridoma-Zellen kombinieren die Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung durch Teilung mit der Fähigkeit, einen einheitlichen Typ Antikörper zu bilden und auszuscheiden. Durch Kultivierung in einem selektiven Medium, in dem nicht fusionierte Tumorzellen absterben, Hybridoma-Zellen sich aber vermehren, und durch geeignete Manipulationen können Klone, d.h. Zellpopulationen, die sich von einer einzigen Hybridoma-Zelle ableiten und genetisch identisch sind, gewonnen und kultiviert und die durch die Zellen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen Desulfatohirudin und Hirudin, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedene monoklonale Antikörper, die spezifisch mit Desulfatohirudin oder Hirudin reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti Desulfatohirudin-und Anti-Hirudin-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, dass man Mäuse mit Desulfatohirudin oder Hirudin immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kodiert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert. Die Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitätschromatographie Säulen und Test-Kits für Immunoassays, die diese Antikörper enthalten. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden Mäuse, z.B. Balb/c Mäuse, auf an sich bekannte Weise immunisiert. Ueberraschenderweise gelingt die Immunisierung, obwohl Desulfatohirudin und Hirudin verhältnissmässig kleine Protein-Moleküle sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Desulfatohirudin bzw. Hirudin etwa wöchentlich oder auch in grösseren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise 5 bis 12 Wochen, injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat. B-Lymphozyten enthaltende Organe, z.B. Milzzellen, der immunisierten Häuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jéne mit der Bezeichnung X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 oder SP 2/0. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zell Linie X63-Ag8.6.5.3 fusioniert. Die Fusion wird nach an sich bekannten Verfahren durch Mischen der B-Lymphozyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zellfusionsagens, wie Polyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polyethylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, das mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myelomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten. Die Ueberstände der Hybridoma-Kulturen können mit an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit Radio-Immunoassay oder Agglutinierung. Dabei wird überraschenderweise festgestellt, dass mit dem beschriebenen Verfahren Hybridoma-Zellen gewonnen werden können, die Antikörper spezifisch gegen Desulfatohirudin oder Hirudin ausscheiden. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an sich bekannten Verfahren, das "limiting dilution genannt wird, Kulturen ausgehend von einer einzigen wachsenden Zelle angesetzt. Zur Massenproduktion werden die Hybridoma-Zellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medien in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszites-Flüssigkeit 0 entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfat-Lösung Antikörper isoliert. Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen Desulfatohirudinund Hirudin-spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörper-Lösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschliessend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert. Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnenen Desulfatohirudin- und Hirudin-spezifischen Antikörper können auf sn sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedenen Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immunodiffusion, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno Fluoresznz oder immunochemischen Enzym-Tests. Solche Kits können neben gewöhnlichen Antikörpern verschiedener Herkunft Antikörper Konjugate mit Enzymen oder Fluoreszenzträgern enthalten, dazu Desulfatohirudin oder Hirudin markiert mit radioaktiven Isotopen wie J125 oder konjugiert mit Enzymen, beispielsweise mit Meerrettich Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, ferner Enzymsubstrate, geeignete Puffer, Gele, Latex, Polystyrol oder andere Füllmate nahen und Träger. Pharmazeutische Präparate Die gemäss der vorliegenden Erfindung erhältlichen bekannten (Hnatürliches Hirudin) und neuen (z.B. Desulfatohirudin) Hirudine weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf und können, wie aus Blutegeln extrahiertes Hirudin, prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch angewendet werden. Die erfindungsgemäss herstellbaren Desulfatohirudin-Verbindungen erweisen sich hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität als zumindest äquivalent zu natürlichem Hirudin. So weist beispielsweise Desulfatohirudin einen Ki-Wert von ca. 10 M auf. Desulfatohirudin ist vollständig spezifisch für Thrombin und zeigt keinerlei Wechselwirkungen mit anderen Proteinasen des Blutgerinnungssystems. Die aktive Toxizität ist äusserst gering; so sind in der Ratte bei Dosen von z.B. 1 g/kg keinerlei toxische Anzeichen festzustellen. Desgleichen werden keinerlei Hypersensitivitäts- und Allergie-Reaktionen beobachtet. Die erfindungsgemässen neuen Desulfatohirudin-Verbindungen können daher in Analogie zu natürlichem Hirudin zur Therapie und Prophy. -axe von Thrombosen und Thromboembolien, einschliesslich zur Prophylaxe von postoperativen Thrombosen, zur akuten Schock-Therapie (z.B. ei septischem oder polytraumatischem Schock), zur Therapie von Verbrauchskoagulopathien, bei Hämodialysen, Hämoseparationen unc im extrakorporalen Kreislauf verwendet werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzun;em, welche wenigstens eine der erfindungsgemässen Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, gegebenenfalls zusammen c.t einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Hilfsstoffen, enthalten. Diese Zusammensetzungen können snsbesondere bei den oben angegebenen Indikationen Verwendung finden, wenn sie z.B. parenteral, wie intravenös, intracutan, subcutan oder intramuskulär, oder topisch verabreicht werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemässen neuen Verbindungen und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen für die prophylaktische und therapeutische Behandlung des menschlichen und tierischen Körpers, insbesondere bei den oben angegebenen Krankheitsbildern, in erster Linie zur Hemmung der Gerinnung des Blutes innerhalb und ausserhalb des menschlichen und tierischen Körpers. Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie bzw. Prophylaxe ab. Die Grösse der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema kann am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles bestimmt werden; die dazu erforderlichen Methoden zur Bestimmung von relevanten Blutfaktoren sind dem Fachmann geläufig. Im Normallfall liegt bei einer Injektion die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemässen Verbindungen im Dosisbereich von etwa 0,005 bis etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Bevorzugt wird der Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt durch intravenöse, intramuskuläre oder subcutane Injektion. Dementsprechend enthalten pharmazeutische Präparate zur parenteralen Verabreichung in Einzeldosis-Form in Abhängigkeit von der Applikationsart pro Dosis etwa 0,4 bis etwa 7,5 mg der erfindungsgemässen Verbindung. Neben dem Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise noch einen Puffer, z.B. einen Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 halten soll, und ferner Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zur Einstellung der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen, wobei Lösungen mit Vorteil ein antibakteriell wirkendes Konservierungsmittel, z.B. 0,2 bis 0,3 % 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester, enthalten können. Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wässrige Lösung, Lotion oder Gelee, ölige Lösung oder Suspension, oder fetthaltige oder insbesondere Emulsions-Salbe vorliegen. Ein Präparat in Form einer wässrigen Lösung erhält man beispielsweise dadurch, dass man die erfindungsgemässen Wirkstoffe oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon in einer wässrigen Pufferlösung von pH 4 bis 6,5 löst und gewünschtenfalls einen weiteren Wirkstoff, z.B. ein Antiinflammatorikum, und/oder ein polymeres Haftmittel, z.B. Polyvinylpyrrolidon, und/oder ein Konservierungsmittel zufügt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in 10 ml einer Lösung bzw. 10 g eines Gelees. Eine ölige Applikationsform für die topische Verabreichung erhält man beispielsweise durch Suspendieren der erfindungsgemässen Wirkstoffe oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon in einem Oel, gegebenenfalls unter Zusatz von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder grenzflächenaktiven Mitteln (Tensiden), deren 8LB-Wert (1,hydrophilic-lipophilic-balance11) unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z.B. Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fetthaltige Salbe erhält man z.B. durch Suspendieren der erfindungsgemässen Wirkstoffe oder deren Salze in einer streichbaren Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tensids vom HLB-Wert unter 10. Eine Emulsionssalbe erhält man durch Verreiben einer wässrigen Lösung der erfindungsgemässen Wirkstoffe oder deren Salze in einer weichen, streichbaren Fettunterlage unter Zusatz eines Tensids, dessen HLB-Wert unter 10 liegt. Alle diese topischen Applikationsformen können auch Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration des Wirkstoffes beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg, in etwa 10 g der Grundmasse. Neben den oben beschriebenen und ihnen analogen pharmazeutischen Zusa=ensetzungen, welche für einen direkten medizinischen Einsatz am Körper des Menschen oder eines Säugetieres bestimmt sind, betrifft die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Präparate zur medizinischen Anwendung ausserhalb des lebenden Körpers des Menschen oder der Säugetiere. Solche Zusammensetzungen und Präparate verwendet man in erster Linie als gerinnungshemmenden Zusatz zu Blut, welches ausserhalb des Körpers einer Zirkulation oder Behandlung (z.B. extrakorporaler Kreislauf oder Dialyse in künstlichen Nieren), Konservierung oder Modifizierung (z.B. Hämoseparation) unterzogen wird. In ihrer Zusammensetzung sind derartige Präparate, wie Vorratslösungen oder auch Zubereitungen in Einzeldosis-Form, den oben beschriebenen Injektionspräparaten ähnlich; zweckmässigerweise wird aber die Wirkstoffmenge bzw. -konzentration auf das Volumen des zu behandelnden Blutes oder, noch exakter, auf dessen Thrombingehalt bezogen. Dabei ist zu beachten, dass die erfindungsgemässen Wirkstoffe (in freier Form) eine etwa Sfache Gewichtsmenge Thrombin völlig desaktivieren, auch in grösseren Mengen physiologisch harmlos sind, und vom zirkulierenden Blut auch in hohen Konzentrationen sehr schnell ausgeschieden werden, so dass keine Gefahr einer Ueberdosierung, auch z.B. bei Transfusionen, besteht. Je nach dem spezifischen Zweck beträgt die geeignete Dosis etwa O,O-bis etwa 1,0 mgWirkstoff/ll Blut, wobei die obere Grenze ohne Gefahr noch überschritten werden darf. Insbesondere betrifft die Erfindung die in den Beispielen beschriebenen, für die Aminosäuresequenz von Hirudin kodierenden DNA Sequenzen, solche DNA-Sequenzen enthaltende Expressionsplasmide, mit solchen Expressionsplasmiden transformierte Mikroorganismen, monoklonale Antikörper gegen Hirudin, Hybridoma-Zellen, die solche Antikörper produzieren, und Test-Kits für Immunoassays, die solche Antikörper enthalten, die in den Beispielen beschriebenen Verfahren zu ihrer Herstellung und das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit Hirudin-Aktivität mit Hilfe der transformierten Mikroorganismen, sowie die in den Beispielen beschriebenen neuen Desulfatohirudin-Verbindungen. Die folgenden Beispiele und Zeichnungen dienen zur Illustration der Erfindung und sollen sie in keiner Weise einschränken. Experimenteller Teil Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung: TNE Lösung, die 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl pH 7.5 und 5 mM EDTA enthält, SDS Natriumdodecylsulfat EDTA Aethylendiamintetraessigsäure DTT 1,4-Oithiothreitol (1,4-Dimercapto-2,3-butandiol) BSA Rinder-Serumalbumin EtBr Ethidiumbromid Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TriswHCl Monohydrochlorid von Tris Beispiel 1: Herstellung des geschützten Nucleosid-Polystyrol-Harzes EMI46.1 2,57 g (5 mMol) 5'-(4-Methoxytrityl3-thymidin (NNT-O-T-OH) in 20 ml abs. Pyridin werden mit 750 mg Bernsteinsäureanhydrid und 910 mg 4-Dimethylaminopyridin versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach Einengen der Pyridin-Lösung wird in 200 ml Essigsäureäthylester aufgenommen, zweimal mit je 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer unter Zusatz von 10 ml gesättigter Kochsalz-Lösung ausgeschüttelt, nochmals mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, eingeengt und Hexan zugetropft. Das ausgefallene Produkt wird abgetrennt und zweimal mit Aether zerrieben, dann in 300 ml Essigsäureäthylester gelöst und bei 0 C mit 180 ml 0,1 M Kaliumhydrogensulfat von pH 2,5 ausgeschüttelt. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird die Essigesterlösung mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert, mit 0,5 ml Pyridin versetzt, eingeengt und tropfenweise mit Hexan verdünnt. Das ausgefallene Bernsteinsäurederivat wird abfiltriert. 1,0 g dieser Verbindung werden zusammen mit 190 mg N-Hydroxysuccinimid in 4 ml Essigsäureäthylester und 2 ml Dimethylformamid gelöst und bei OOC mit 370 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wird der ausgefallene N,N'-Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat mit Essigsäureäthylester verdünnt, mit kaltem 0,1 M Natriumhydrogencarbonat und Wasser extrahiert, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigsäureäthylester an Kieselgel chromatographiert. DC: Rf 0,45 in Dichlormethan-Methanol (9:1). 100 mg dieses N-Succinimidoyl-bernsteinsäureesters werden mit 1 g Aminomethyl-polystyrol (Amingehalt 110 gMoL/g) in 2 ml Dichlormethan und 4 ml Dimethylformamid 20 Stunden gerührt. Das Polymer-Harz wird abfiltriert und mit Dimethylformamid, Methanol, Dichlormethan und Methanol ausgewaschen. Nach dem Trocknen werden die nicht umgesetzten Aminogruppen acetyliert, indem das Harz in 6 ml Pyridin mit 1 ml Essigsäureanhydrid und 100 mg 4-Dimethylaminopyridin 30 min. gerührt wird. Das Polymer-Harz wird mit Dichlormethan, Dimethylformamid, Methanol und Dichlormethan ausgewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die spektroskopische Methoxytrityl (MMT)-Bestimmung ergibt eine Beladung von 57 FLMol/g. Beispiel 2: Analog Beispiel 1 wird das folgende geschützte Nucleosid-Polystyrol-Harz hergestellt: EMI47.1 aus 5'-(4-Methoxytrityl) N-isobutyryl-deoxyguanosin, Beladung 32 pNol/g. Beispiel 3: Synthese des Trinukleotids EMI48.1 a) Synthese des Dinukleotids: 7.73 g (15 mMol) 5'-(4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-O-T-OH) werden zweimal mit abs. Pyridin eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und zu 80 ml einer 0,2 M Lösung von 2-Chlorphenyl-di-(1-benzotriazolyl)-phosphat in Tetrahydrofuran unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss getropft und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung des 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'- phosphats wird in drei Teile geteilt. a) Hydrolyse zu Triethylammonium-2-chlorphenyl-5'- < 4-metboxytrityl)- thymidin-3' -phosphat: Zu einem Drittel der obigen Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotri- azolyl-5' (4-methoxytrityl)-thymidin-3' -phosphat werden unter Kühlung 100 ml 0,5 M Triäthylammoniumbicarbonat gegeben. Nach IS min. wird mit Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Lösung wird mit Wasser gewaschen, eingeengt und tropfenweise mit Petrolether versetzt. Die erhaltene Fällung wird abgenutscht, mit Aether Petrolether 1:1 ausgewaschen und im Vakuum getrocknet. DC: u 0,35 in Dichlormethan-Methanol-Wasser (75:22:3). 8) Veresterung zu 2-Cyanoäthyl-2-chlorphenyl-5'-(4-methoxytrityl > thymidin-3'-phosphat und Abspaltung der 4-Methoxytrityl-Schutz gruppe: Zu einem Drittel der Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'- (4-methoxytrityl)-thymidin-phosphat werden 1,3 ml 2-Cyanoäthanol und 2 ml Pyridin gegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtem peratur belassen. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Essigsäureäthylester gelöst und mehrmals mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt und in Hexan eingetropft. Der Niederschlag wird abfiltriert, in 50 ml Dichlormethan-Methanol 7:3 gelöst und bei OOC mit einer Lösung von 3,8 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 75 ml Dichlormethan-Methanol 7:3 versetzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionslösung mit Dichlormethan verdünnt und mit einer kalten Natriumhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird eingeengt und mit Hexan versetzt. Das ausgefallene 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat wird an Kieselgel mit Dichlormethan-Methanol 96:4 chromatographiert. DC: Rf von 0,45 in Dichlormethan-Methanol (9:1). r) Kondensation zum 5'-(4-Methoxytrityl)-3'-cyanoäthyl)-bis- thymidin-dinukleotid: 2,2 g 2-Cyanoäthyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat werden zweimal durch Eindampfen mit abs. Pyridin entwässert, in 20 mol abs.-Tetra- hydrofuran gelöst und zum restlichen Drittel der Lösung von 2-Chlor phenyl-1-benzotriazolyl-5' -( 4-methoxytrityl)-thymidin.3' -phosphat gegeben. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur werden zur Reaktionslösung unter Eiskühlung 10 ml Wasser und 200 ml Essigsäureäthylester zugegeben. Die organische Phase wird mehrmals mit Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Das im Phosphat-Teil und am 5'- bzw. 3'-Ende geschützte Dinukleotid wird durch Eintropfen in Aether-Hexan 1:1 gefällt. DC: Rf 0,48 in Dichlormethan-Methanol (9:1). b) Synthese des Trinukleotids: 1,17 g (1 mMol) des oben beschriebenen vollgeschützten Dinukleotids werden in 30 ml Dichlormethan-Methanol 7:3 gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,9 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 20 ml Dichlormethan-Methanol 7:3 versetzt. Nach 2 Stunden wird eiskalte Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt und in Hexan eingetropft. Das ausgefallene rohe Dinukleotid mit freier 5'-Hydroxygruppe wird an Kieselgel mit einem Gradienten von 2-8 % Methanol in Dichlormethan chromatographiert. DC: Rf 0,33 in Dichlormethan-Methanol (9:1). 850 mg dieses 5'-Hydroxy-dinukleotids und 1,06 g Triethylammonium-2 chlorphényl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat [vgl. Abschnitt a > a)) werden zweimal mit Pyridin eingedampft, dann in 10 ml abs. Pyridin gelöst und mit 560 mg l-Nesitylensulfonyl-3-nitro1,2,4-triazol (HSNT) versetzt. Nach 2 Stunden werden 2 ml eiskaltes Wasser zugegeben und nach einer weiteren Stunde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet, eingeengt und mit Aether versetzt. Das ausgefallene Trinukleotid wird durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Rf 0,45 in Dichlormethan-Methanol (9:1). Beispiel 4: Analog Beispiel 3 werden folgende geschützte Trinukleotide der allgemeinen Formel EMI50.1 abgekürzt B1B2B3, hergestellt. Für die Nukleoside B1, B2, B3 werden folgende Abkürzungen verwendet: A a N-Benzoyl-deoxyadenosin C g N-Benzoyl-deoxycytidin G s N-Isobutyryl-deoxyguanosin T 3 Thymidin Verbindung R a) Verbindung Rfa) TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 ATT 0,55 TGC 0,44 ACA 0,53 TAG 0,60 AAC 0,46 TGT 0,42 AAA 0,51 TGA 0,44 AGT 0,45 CTT 0,53 AGG 0,38 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GTC 0,44 CCC 0,59 GTG 0,35 CCG 0,47 GCA 0,49 CCA 0,51 GCG 0,48 CAT 0,55 GAT 0,44 CAC 0,51 <RTI ID=51.6> GAC 0,48 000 0,46 GAG 0,48 CGA 0,38 GAA 0,50 CAG 0,44 GGC 0,42 CGG 0,38 GGT 0,46 CGT 0,49 GGG 0,35 GGA 0,44 a) Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel in Dichlormethan-Methanol 9:1. Beispiel 5: Synthese des DNA-Fragments einer Länge von 67 Basen von Base Nr. 96 bis Base Nr. 162 des DNA-Stranges (96/67 > a) Abspaltung der 2-Cyanäthylschutzgruppe der Trinukleotide: 10 Mol der Trinukleotide aus Beispiel 3 oder 4 werden unter Feuchtigkeitsausschluss in 60 ul Pyridin-Acetonitril-Triäthylamin 1:1:1 gelöst. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur werden 0,7 ml peroxidfreier Aether zugetropft und der Niederschlag abzentrifugiert. Das rohe Triethylammoniumsalz wird in 50 u1 Pyridin gelöst und nochmals mit 0,5 ml Aether ausgefällt, abzentrifugiert und 15 Stunden am hochvakuum getrocknet. b) Kupplung der teilgeschützten Trinukleotide mit der an Polystyrol Harz gebundenen Oligonukleotidkette: Alle Operationen werden unter Feuchtigkeitsausschluss in einem Reaktionsgefäss mit 220 u1 Inhalt und mikroprozessorgesteuerter Lösungsmittel- und Reagens-Zugabe durchgeführt. 13 mg (0,74 pMol) des Thymidin-Polystyrol-Harzes (Beispiel 1) werden im Reaktionsgefäss vorgelegt und folgenden Operationen unterworfen: 1. Methylenchlorid, 2 ml/min., 4 min. 2. Nethylenchlorid-Isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 min. 3. Zinkbromid 1 M und 1,2,4-Triazol 0,02 H in Methylenchlorid Isopropanol (85:15), 2 m1/min., 2-3,5 min. 4. Metbylenchlorid-Isopropanol (85:15), 2 mL/min., 4 min. 5. Triäthylammoniumacetat 0,5 N in DMF, 2 ml/min., 5 min. 6. Nolekularsieb-getrocknetes Pyridin, 2 ml/min., 3 min. 7. Tetrahydrofuran (Peroxid-frei, Molekularsieb-getrocknet), 2 ml/min., 3 min. 8. Stickstoffstrom, 10 min. 9. Injektion 10 uMol Trinukleotid GTC (Trimethylammoniumsalz aus Abschnitt a)) und 8,9 mg (30 gHol) 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro 1,2,4-triazol (MSNT) gelöst in 150 u1 Pyridin 10. 450C, 20 min. 11. Pyridin, 2 ml/min., 4 min. 12. Acetanhydrid 5 % und 4-Dimethylaminopyridin 2,5 % in Pyridin, 2 ml/min., 4 min. 13. Pyridin, 2 ml/min., 4 min. 14. Pyridin-Isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 min. Alle 14 Operationen werden 21 mal wiederholt, wobei bei der 9. Operation anstelle von GTC jeweils folgende Trinukleotide in Form ihrer Triäthylammoniumsalze (Abschnitt a)) in der angegebenen Reihenfolge eingesetzt werden: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGG, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Die mittlere Kupplungsausbeute beträgt 97 %. Das Endprodukt hat folgende Struktur: MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAUlUtAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG TCT-Polystyrol c) Abspaltung des DNA-Fragments vom Träger und Abspaltung der Schutz gruppen: 40,0 mg (ca. 0,60 gMol) DNA-Syntheseharz 96/67 werden mit 66 mg (0,40 mMol) o-Nitrobenzaldoxim und 50 p1 (0,40 mMol) 1,1,3,3 Tetramethylguanidin in 400 u1 95%igem Pyridin während 3 Stunden bei 500C und während 12 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Abblasen des Pyridins mit Stickstoff wird der Rückstand mit 1,6 ml wässerigem Ammoniak (33 L) versetzt und im geschlossenen Gefäss während 24 Stunden bei 500C gehalten. Die abgetrennte flüssige Phase wird im Vakuum vom Ammoniak befreit und 3 mal mit je 3 ml peroxidfreiem Diäthyläther gewaschen. Nach dem Abtrennen der niedermolekularen Bestandteile an einer Biogel P6 Säule (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 Molar Trimethylammoniumhydrogencarbonat pH 7,5, 1,5 min.) werden 285 ODs (260 nm) DNA isoliert. Insgesamt 60 ODs werden an einer HPLC-Säule aufgetrennt (PRP-1/ Hamilton, 250 x 4,6 mm). Gradient (Lösung A: 0,05 M Triäthylammoniumacetat pH 7,0; Lösung B: Lösung A:Acetonitril 1:1): 30 % B in A 4 60 % B in A in 20 min. bei 500C und 2 ml/min. Der lipophile Hauptpeak (Retentionszeit ca. 14 min.) wird gesammelt, an einer DE52-Cellulose (Whatman) Säule aufkonzentriert, eluiert und mit Aethanol gefällt. Zur Abspaltung der 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe wird der Niederschlag in 50 u1 Essigsäure/HzO (4:1) gelöst und 45 min. bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsprodukt wird lyophilisiert, mit Aethanol gefällt und zur Reinigung auf einem 8 % Polyacrylamidgel (7 M Harnstoff) elektrophoretisch aufgetrennt. Die der erwarteten DNA-Grösse entsprechende Bande wird ausgeschnitten und das Produkt elektroeluiert, an DE52-Cellulose aufkonzentriert und die DNA 96/67 der Struktur 5' CATCCTGGGTTCTGAC(;GTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG CAGTCT-3' mit Aethanol gefällt. Beispiel 6: Analog Beispiel 5 werden folgende DNA-Fragmente (5'-3') hergestellt: 1/58 CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT 46/64 komplementär CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTT 154/64 komplementär CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGMGTCACCGTCGTTGTGAGAGTGCGG Beispiel 7: Phosphorylierung der Fragmente 1/58, 46/64 komplementär, 96/67 und 154/64 komplementär Die Phosphorylierung und die radioaktive Markierung an den 5'-Enden erfolgt mit [7- 32P]ATP und T4 Polynukleotid-Kinase (Boehringer) wie beschrieben (18). Beispiel 8: Polymerisation zu Duplex II (Teilstück F2 des Desulfatohirudin-Gens) Je 50 pMol Fragment 96/67 kinasiert und Fragment 154/64 kinasiert werden in 24 u1 Wasser gelöst, die Lösung während 3 min. auf 900C erwärmt und innerhalb von 5 min. auf 1200 abgekühlt. Nach Zugabe von 4 p1 Endo-R Puffer (0,1 Molar Tris*HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM B-Mercaptoäthanol, 0,6 M NaCl), 10 u1 Deoxynucleosidtriphosphat Gemisch (dATP, dCTP, dGTP, TTP, je 2j10 Molar, mit NH3 auf pH 7.0 eingestellt) und 2 1ll (10 Einheiten) DNA-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer) wird während 30 min. bei 1200 inkubiert. Die Reaktion wird durch 3 minütiges Erhitzen auf 900C gestoppt und das Gemisch bis zur Weiterverarbeitung bei -800C aufbewahrt. In analoger Weise werden die Fragmente 1/58 kinasiert und 46/64 kinasiert zum Duplex 1 (Teilstück F1 des Desulfatohirudin-Gens) umgesetzt. Die Duplexe I und II haben die folgenden Strukturen: Duplex I CTGCAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACC(;AATCTGGTCAGAACCTGTGOCTGTGCGAAGGTTC GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGCACACGGACACGCTTCCAAG TAACGTTTGCCGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC Duplex II CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTITGGCGTCAGAG ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC Die Herstellung der Teilstücke F1 und F2 des Desulfatohirudin-Gens ist im folgenden Schema I dargestellt: Schema 5: Herstellung der Teilstücke F1 und F2 des Desulfato hirudin-Gens und der F1-F2 -DNA EMI56.1 <tb> <SEP> 1/58 <SEP> 96/67 <tb> <SEP> 46/64 <SEP> 154/64 <tb> <SEP> T4-Polynucleotid- <SEP> T4-Polynucleotid <tb> <SEP> Kinase <SEP> Kinase <tb> <SEP> nellierung <SEP> .Annellierung <tb> <SEP> 1111111 <SEP> liii; <tb> <SEP> DNA-Polymerase <SEP> I <SEP> DNA-Polymerase <SEP> 1 <tb> <SEP> (Klenow), <SEP> dNTPs <SEP> (Klenow), <SEP> dNTPs <tb> lll1llllllllliillll111111111 <SEP> 11111111111111111111111111111 <tb> . <tb> EcoRI <SEP> EcoRII <SEP> EcoRII <SEP> BamHI <tb> <SEP> Teilstück <SEP> F1 <SEP> Teilstück <SEP> F2 <SEP> <tb> <SEP> (Subklonierung) <SEP> (Subkionierung) <tb> <SEP> EcoRII <SEP> EcoRII <tb> IIIIIIIIIIIIIII;IIIIII <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> i <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> I <tb> t <SEP> t <tb> EcoRI <SEP> EcoRII <SEP> EcoRII <SEP> BamHI <tb> <SEP> |Annellierung <tb> IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII <tb> t <SEP> t <SEP> t <tb> EcoRI <SEP> EcoRII <SEP> BamHI <tb> <SEP> F <SEP> 1-F2-DNA <SEP> (Desulfatohirudin-Gen) <tb> Beispiel 9: Polymerisation und Ligation der Fragmente 1/58, 46/64 kinasiert, 96/67 kinasiert und 154/64; Herstellung des Desulfatohirudin-Gens Je 50 pMol Fragment 1/58, 46/64 kinasiert. 96/67 kinasiert und 154/64 werden in 48 u1 Wasser gelöst, die Lösung während 3 min. auf 900C erwärmt und innerhalb 5 min. auf 1200 abgekühlt. Nach Zugabe von 8 u1 Endo-R Puffer (vgl. Beispiel 8), 20 u1 Deoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dATP, dCTP, dGTF, TTP, je 0,002 Molar, mit NH3 auf pH 7.0 eingestellt) und 2 u1 (10 Einheiten) DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer) wird während 30 min. bei 1200 inkubiert. Die Reaktion wird durch 3-minütiges Erhitzen auf 900C gestoppt und die DNA nach Phenol/Chloroform-Extraktion durch Aethanolfällung isoliert. Das entstandene DNA-Gemisch wird in 100 iil Ligase-Puffer (66 mM TrisHCl pH 7.5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 5 mM ATP) gelöst, mit 50 Einheiten (2 p1) T4 DNA-Ligase (Biolabs) versetzt und während 20 Stunden bei 200C inkubiert. Die Reaktion wird durch 5-minütiges Erhitzen auf 70"C gestoppt und die DNA nach Phenol/Chloroform-Extraktion durch Aethanolfällung isoliert. Nach Auftrennung des Gemisches an einem 8 % Polyacrylamidgel (denaturierend) durch Elektrophorese wird das Ligationsprodukt mit 217 Basenpaaren elektroeluiert, an einer DE52-Cellulose-Säule aufkonzentriert und nach Elution durch Ethanolfällung isoliert. Das Desulfatohirudin-Gen hat die folgende Struktur: CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGMTCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT GACCTTAAGTACCMCAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACMCGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGMGCTTCTTTAGGGCCTTCTT TACCTGCAGTAGGATCCTG ATGGACGTCATCCTAGGAC Die Herstellung des Desulfatohirudin-Gens aus den vier Fragmenten ist im folgenden Schema II dargestellt: Schema 6: Herstellung des Hirudin-Gens aus den vier synthetischen Fragmenten EMI58.1 <tb> <SEP> 1/58 <SEP> 96/67 <tb> <SEP> 46/64 <SEP> 154/64 <tb> <SEP> T4-Polynucleotid <SEP> Kinase <tb> <SEP> ellierung <tb> <SEP> 11111 <SEP> 11111 <SEP> II <SEP> III <tb> <SEP> DNA-Polymerase <SEP> I <SEP> (Klenow) <tb> <SEP> dNTPs <tb> 11111111111111111111ll11llrr <SEP> 11111 <SEP> 111111111111111 <SEP> 1111111111111 <tb> <SEP> 1 <SEP> T4- <SEP> DNA-Ligase <tb> LLIIIIIIIIIIIIIIIIIIilliI(lrli1lilllIlll <tb> t <SEP> F1-F2-DNA <SEP> t <tb> EcoRI <SEP> F1-F2-DNA <SEP> BamHI <tb> (i)esulfatohirudin-Gen) Beispiel 10: Herstellung des Plasmids pML 300, enthaltend die F1-DNA des Desulfatohirudin-Gens (Fig. 1) a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/PvuII. 5 ug pBR322 Plasmid-DNA werden mit 5 Einheiten PvuII Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 200 ml einer Lösung aus 100 pgSml Gelatine für 1 Stunde bei 370C verdaut. Anschliessend wird diese Lösung auf 100 mM Tris°HCl (pH 7.5), 50 mM NsCl eingestellt und die DNA mit 30 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease (Biolabs) für 2 Stunden bei 370C verdaut. Dann wird die Lösung auf 50 mM Tris-HCl pH 8 eingestellt und bei einer DNA-Konzentration von 10 pg/pl mit 2 Einheiten intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30 min. bei 370C inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung während 60 min. bei 650C inaktiviert. Dann wird die Lösung auf TNE eingestellt, mit 1 Volumen Phenol und Chloroform extrahiert und die verdaute DNA mit 2 Volumen Alkohol bei -20 C über Nacht ausgefällt. Der aus der pBR322 DNA herausgeschnittene Vektor (pBR322/EcoRI/- PvuII, 2297 Basenpaare) wird durch Gelelektrophorese an 1%iger niedrig schmelzender Agarose(Biorad) in Tris-Acetat-EDTA Puffer pH 8 vom kleinen DNA-Fragment (2067 Basenpaare) abgetrennt. Nach Anfärben der DNA im Agarosegel mit EtBr wird die Stelle des Gels, welche die DNA-Bande des pBR322ZEcoRI/PvuII Vektors(- 2297 Basenpaare) enthält, aus dem Gel ausgeschnitten und bei 65 C 10 min. verflüssigt. Zu dieser DNA-Lösung werden 20 Volumina TNE hinzugefügt, die DNA nach Mueller et al. (19) durch DE-52 Chromatographie gereinigt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA bei -200C über Nacht mit Alkohol ausgefüllt. Der DNA-Niederschlag wird in 50 u1 0,01 M TrisXHCl (pH 8), 0,1 mM EDTA gelöst und bis zur Verwendung bei -200C aufbewahrt. 1,4 ug ( 3,2 pMol Enden) DNA werden erhalten. b) Herstellung der F1-DNAXEcoRI 24 ng (- 1,3 pMol Enden) der chemisch synthetisierten F1-DNA (siehe Beispiel 8) werden mit 5 Einheiten EcoRI Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 50 u1 100 ni Tris.HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl und 100 g/ml Gelatine für 30 min. bei 37 C verdaut. Danach werden der Lösung 0,06 ug (- 0,14 pMol Enden) des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/PvuII (Beispiel 10a) zugesetzt. Anschliessend wird das Enzym durch Erhitzen auf 650C nach 10 min inaktiviert, die Lösung auf TNE eingestellt und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit Alkohol präzipitiert. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -20 C bis zur Weiterverarbeitung gelagert. c) Ligierung der pBR322/EcoRI/PvuII Vektor-DNA mit der F1 DNA/EcoRI und Konstruktion des Plasmids pML300. Der in Beispiel 10b) erhaltene DNA-Niederschlag, welcher die beiden genannten DNA-Bruchstücke enthält, wird in 20 ul einer Lösung von 50 mM Tris*HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5 mM ATP, 100 llg/ml Gelatine gelöst und mit 25 Einheiten/pl T4 DNA-Ligase (Biolabs) bei 15 C für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung das rekombinierte Plasmid pML300, welches die F1-DNA enthält d) Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML300 Die für die Transformation notwendigen mit Calcium vorbehandelten E. coli HB101 Zellen werden, wie von Mandel et. al. (14) beschrie bein, hergestellt. Die unter c) erhaltene Lösung, welche das rekombinierte Plasmid pML300 enthält, wird für 10 min. auf 650C erhitzt, um die T4-DNA Ligase zu inaktivieren und anschliessend auf 37 C abgekühlt. 10 u1 dieses Reaktionsgemisches werden zu 150 u1 Calcium-behandelten E. coli HB101-Zellen in 10 mM MgC12 und 10 mM TrisHCl (pH 7.5) in einem Gesamtvolumen von 200 pl gegeben. Danach wird diese Mischung für 30 min. in Eis gekühlt, 2 min. auf 42 C erwärmt und dann 50 min. in 1 ml L-Medium (vgl. Beispiel 18) bei 37 C stehen lassen. Darauf wird die Mischung in Aliquoten à 0.2 ml auf 5 Agarplatten (McConkey-Agar, Difco), welche 60 llg/ml Ampicillin (Serva) enthalten, ausgestrichen. Die Agarplatten werden hernach bei 37 C für 16-18 Stunden gehalten. 484 Ampicillin-resistente Kolonien des transformierten E. coli HB 101 werden erhalten. e) Screening der Kolonien, die F1-DNA enthalten 470 transformierte Kolonien (Beispiel 10d) werden auf Nitrozeilu- losefilter B85 (Schleicher und Schüll) abgedrückt. Nach Grunstein und Hogness (20) werden die Kolonien lysiert und ihre denaturierte DNA auf dem Filter fixiert. Anschliessend erfolgt eine Vorhybridi sierung der Filter in 20 ml (pro Filter) 4xSET [t Lösung von 30 mM TrisHCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA], 0.1 % (g/v) Ficoll 400 (Pharmacia), 0.5 % SDS, 50 g/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA für 4 Stunden bei 64"C. Danach werden die Nitrozellulosefilter in 20 ml (pro Filter) SxSET (g/v) Ficoll 400, 0.2 X SDS und 50 g/ml denaturierter Kalbsthymus-DNA für 16 Stunden bei 640C mit der 32P-radio- aktiv markierten Probe (ca. 10 -10 Cerencov cpm pro Filter) behandelt. Als Probe wird das Oligonucleotid 46/64 komplementär (vgl. Beispiel 6) verwendet. Anschliessend werden die Filter in 2xSET, 0.2 7O SDS bei Raumtemperatur zweimal gewaschen, danach zweimal in 2xSet, 0.5% SDS bei 600C (zuerst 30 min., dann 60 min. lang). Dann werden die Filter zwischen 3 MM Papier (Whatman) getrocknet und bei -80 C auf einen Röntgen Film (Fuji) mit einer Verstärkerfolie (Intensifying screen, Ilford) für 1-2 Tage gelegt. Das erhaltene Autoradiogramm zeigt 71 positive Kolonien (Klone), die zur Weiterarbeit verwendet werden können, eine davon erhielt die Bezeichnung pML300. Beispiel 11: Herstellung des Plasmids pML305, welches die F2-DNA des Desulfatohirudin-Gens enthält (Fig. 2). a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/BamNl/Nrul 5 ug pBR322 Plasmid-DNA werden mit 30 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease 30 min. bei 370C in einer Lösung von 100 mM NaCl, 6 mM Tris*HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl2 und 100 llgOml Gelatine verdaut. Anschliessend werden der Lösung 15 Einheiten PvuII Restriktionsendonuclease zugefügt und 2 Stunden bei 370C verdaut. Das Reaktionsgemisch wird für 10 min. auf 700C erwärmt, um die Enzyme zu inaktivieren. Danach werden die beiden DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese an 1%iger niedrigschmelzender Agarose in Tris Acetat EDTA Puffer pH 8 voneinander getrennt. (siehe Beispiel 10a). Die DNA-Bande des pBR322 BamHI/PvuII Vektors (o 2672 Basenpaare) wird ausgeschnitten, verflüssigt und nach Mueller et al. (19) durch DE-52 Chromatographie gereinigt. 0,75 pg ( 1,5 pMol Enden) DNA werden erhalten. b) Herstellung der F2-DNA/BamHI 25 llg (- 1,3 pMol Enden) der chemisch synthetisierten F2-DNA (Beispiel 8) werden mit 16 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 20 p1 150 mM NaCl, 6 mM TrisHCl (pH 7.9), 6 mM MgCl2 und 100 tlgXml Gelatine für 30 min. bei 370C verdaut. Anschliessend werden der Lösung 60 ng (- 96 nMol Enden) des linearisierten Vektors pBR322/BamHI/PvuII (Beispiel 11a) zugesetzt, die ganze Lösung auf TNE eingestellt und mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit 2 Volumen Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird bis zur Weiterverarbeitung unter Alkohol bei -200C gelagert. c) Ligierung der pBR322/BamHI/PvuZI Vektor-DNA mit der F2-DNA/BamHI und Konstruktion des Plasmids pML305 Der unter Beispiel 11b) erhaltene DNA-Niederschlag, der die beiden genannten DNA-Bruchstücke enthält, wird in 20 u1 einer Lösung von 50 mM Tris*HCl (pH 7.8), 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 0.5 mM ATP, 100 ug/ml Gelatine gelöst und mit 15 Einheiten/pl T4 DNA-Ligase (Biolabs) bei 15 C für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung das rekombinierte Plasmid pML305, welches die F2-DNA enthält. d) Transformation von E. coli 1.101 mit dem Plasmid pML305 Die Transformation der mit Calcium behandelten E. coli HB101 Zellen erfolgt wie in Beispiel 10d) beschrieben. Es werden 10 yl des in Beispiel 12c) erhaltenen Reaktionsgemisches verwendet. 313 Ampicillin-resistente Kolonien werden erhalten. e) Screening der Kolonien, die F2-DNA enthalten 65 transformierte Kolonien (Beispiel mild) werden auf F2-DNA geprüft, wie in Beispiel 10e) beschrieben. Als radioaktive Probe wird das Oligonucleotid 154/64 komplementär (vgl. Beispiel 6) verwendet. Im Autoradiogramm werden 2 positive Kolonien erhalten, eine davon erhält die Bezeichnung pML305. Beispiel 12: Charakterisierung der Klone pML300 und pML305 Die DNAs der rekombinierten Plasmide pML300 und pML305 werden nach Ish-Horowitz isoliert (21). Die Nucleotidsequenzen des F1-DNA- und F2-DNA-Inserts werden nach Maxam und Gilbert bestimmt (11). Zu diesem Zweck werden je 10 pg Plasmid-DNA von pML300 mit EcoRI Restriktionsendonuclease und 10 ug Plasmid-DNA von pML305 mit BamHI-Restriktionsendonuclease gespalten und die linearisierten DNAs durch Gelelution aus Agarosegel isoliert [vgl. Beispiel 10a)]. Anschliessend werden die isolierten DNAs mit alkalischer Phosphatase verdaut und über DE-52 chromatographiert (vgl. Beispiel lla). Danach werden die DNAs am 5'-Ende mit [&gamma;-32P]ATP (spezifische Aktivität) 5000 Ci/mmol, Amersham) und T4-Polynucleotid-Kinase (P-L-Biochemicals) radioaktiv markiert. Die radioaktiv markierten DNAs werden dann mit einer zweiten Restriktionsendonuclease (EcoRII) gespalten. Die entstandenen DNA-Fragmente werden durch Gelelution aus Agarose isoliert. Im Falle von pML300 wird dann vom EcoRII-EcoRI* Fragment (ca. 109 Basenpaare) die Nucleotidsequenz der F1-DNA, im Fall vom pML300 die der F2-DNA im EcoRII-BamHI*-Fragment (ca. 122 Basenpaare) bestimmt. (* gibt das DNA-Ende an, das radioaktiv markiert ist). Die Nucleotidsequenzen, welche für die F1-DNA, und F2-DNA bestimmt werden, sind identisch mit den im Beispiel 8 dargestellten. Beispiel 13: Herstellung des Expressionsplasmids pldL310 a) Konstruktion des linearisierten Vektors pHRil48XEcoRI4amHI, welcher den trp-Promotor-Operator enthält (Fig. 3 und Fig. 4) A. Konstruktion des Plasmids p159 10 ug Plasmid pBRHtrp (22) werden mit 50 Einheiten EcoRI (Biolabs) gespalten während 60 min. bei 37 C, und das Verdauungsgemisch wird nach Phenolextraktion durch einen Saccharose-Dichtegradienten (5-23 %) in 50 mM Tris*HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA in einem TST41 (Kontron AG) Rotor fraktioniert. Die Zentrifugation dauert 14 Stunden bei 40 000 upm und 1500. 0.3 ml Fraktionen werden mit einem ISCO-Gradientkollektor bei 1 ml/min. gesammelt. Die Fraktionen, welche das kleinere Fragment enthalten, werden vereinigt, die Lösung wird auf TNE eingestellt und mit 2 Volumen Aethanol bei -200C gefällt. Die DNA wird nach Zentrifugation in einer Eppendorf Zentrifuge in 100 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA gelöst. 5 ug dieses DNA-Fragmentes werden mit 5 Einheiten BglII (Biolabs) 60 min. bei 37 C gespalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol und Chloroform extrahiert und die DNA wird mit 2 Volumen Aethanol bei -800C während 10 min. inkubiert und die DNA durch Zentrifugation gesammelt und erneut in 50 u1 50 mM Tris*HCl (pH 8,0) gelöst. 2 p1 von dieser Lösung werden entnommen (0,2 pg DNA) und bei einer DNA-Konzentration von 10 ng/ l in 50 mM Iris*HCl (pH 8,0) mit 1 Einheit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30 min. bei 37 C inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung während 60 min. bei 65 C inaktiviert. 0,04 ug DNA wird entnommen und 5u-terminal mit 10 llCi [r-32P]-ATP ( > 5000 Ci/mmol, Amersham) und 5 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase (P-L Biochemicals) in 20 u1 Reaktionsvolumen in 50 mM TriseHCl (pH 9.5), 10 mM MgCl2, und 5 mM DTT, während 30 min. bei 37 C inkubiert. Die radioaktive Probe wird mit der nicht-markierten Probe (siehe oben) gemischt und die DNA-Fragmente werden durch einen 5-23 % Saccharose-Dichte gradienten in 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA in einem TST60 Rotor fraktioniert. Die Zentrifugation erfolgt während 5 Stunden bei 60 000 upm und 1500. Es werden 0,2 ml Fraktionen gesammelt. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird durch Messung der Cerencov Strahlung bestimmt und die Fragmente damit identifiziert. Die gewünschten Fraktionen, welche das kleine DNA-Fragment enthalten, werden vereinigt, die DNA mit 2 Volumina Aethanol gefällt und nach Zentrifugation wieder in 20 u1 10 mM TrisHCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA gelöst. Das P-markierte EcoRI-BglII DNA-Fragment wird mit 0,2 Einheiten TaqI (Biolabs) in 50 u1 Volumen während 10 min. bei 370C partiell gespalten. Das Reaktionsgemisch wird auf 0,2 % SDS, 10 % Glycerin. 10 mM EDTA, 0,05 % Bromphenol-Blau eingestellt und die DNA-Pragmente auf einem 6 % Polyacrylamidgel in Tris-Borat-EDTA (23) aufgetrennt. Auf dem Autoradiogtamm wird die das gewünschte EcoRI-TaqI enthaltende Bande (das grösste Teilfragment) identifiziert. Dieses Fragment (L, siehe Fig. 3) wird aus dem Gel extrahiert und gereinigt (19) und in 10 u1 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst. Als Akzeptor-Plasmid wird pBR322, welches mit ClaI und EcoRI gespalten ist, verwendet: 2 ug pBR322 werden mit 4 Einheiten ClaI (Biolabs) in 20 u1 Reaktionsvolumen während 60 min. bei 370C verdaut. Das Protein wird mit Phenol extrahiert und die DNA anschliessend mit 2 Volumina Aethanol bei -800C während 10 min. gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation gesammelt und dann mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) während 30 min. bei 37"C in 20 pl Reaktionsvolumen verdaut. Anschliessend wird die Lösung mit 2 Volumina 0,1 M TrisHCl (pH 8,7) versetzt und mit 1 Einheit alkalischer Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30 min. bei 370C inkubiert. Die Phosphatase wird anschliessend durch Inkubation bei 650C während 60 min. inaktiviert. 100 ng des Akzeptor-Plasmids werden mit 5 pl Fragment L-DNA in 15 u1 Reaktionsvolumen in 10 mM MgC12, 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP mit 30 Einheiten pro ul Reaktionsvolumen T4 DNA-Ligase (Biolabs) während 2 Stunden inkubiert. 5 u1 dieser Lösung werden zu einem Gemisch gegeben, das 150 ml mit Calciumchlorid behandelte E. coli HB101-Zellen (14) in 10 mM MgCl2, 10 mM CaClz und 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) in einem Gesamtvolumen von 200 ul enthält. Das Gemisch wird 20 min. in Eis gekühlt, 1 min. auf 42 C erhitzt und 10 min. bei 20 C inkubiert. 1 ml Trypton-Medium [Trypton-Medium enthält 10 g Bacto-Trypton (Difco); 1 g Hefeextrakt (Difco); 1 g Glucose; 8 g NaCl und 294 mg CaCl2H2O in 1 1 destil- liertem Wasser] wird zugesetzt und das Gemisch 30 min. bei 37 C unter Schütteln bei 300 U/min. inkubiert. Die Mischung wird auf zwei Agarplatten (McConkey Agar, Difco; 0.6 ml/Platte), supplementiert mit 50 ug/m1 Ampicillin (Sigma), plattiert. Die Platten werden 12 bis 17 Stunden bei 370C inkubiert. Die Plasmid-DNA von 10 verschiedenen Kolonien wird wie folgt isoliert: Die Kolonien werden zur Inokulierung von 10 ml Trypton-Medium, supplementiert mit 50 ug/ml Ampicillin, wie oben, in einem 25 ml Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen werden 15 bis 18 Stunden bei 37 C und 300 U/min. geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (Sorval, HS-4 Rotor, 10 min. bei 4000 U/min., 40C) geerntet. Man erhält etwa 0,1 g Zellen, und diese werden in 1 ml 50 mM Tris*HCl (pH 8,0) resuspendiert. 0,25 ml Lysozymlösung [10 mg/ml in 50 mM TrisHCl (pH 8,0); Lysozym wird von Sigma vertrieben] werden zugesetzt und nach 10-minütiger Inkubation bei OOC werden 0,15 ml 0,5 m EDTA (pH 7,5) zugegeben. Nach weiteren 10 min. bei 0 C werden 60 ul 2%iges Triton X-100 (Merck) zugegeben. Nach 30 min. bei OOC wird die Probe 30 min. bei 15'00O U/min. und 4 C in einem Sorval SA-600 Rotor zentrifugiert. Der Ueberstand wird mit 1 Vol. Phenol (gesättigt in TNE) deproteinisiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (Sorval HB-4 Rotor) während 10 min. bei 5000 U/min. und 4 C getrennt. Die obere Phase wird zweimal mit 1 Vol. Chloroform extrahiert. Pankreatische RNAse A (Sigma; 10 mg/ml in TNE 10 min. bei 850C vorerhitzt) wird bis zu einer Endkonzentration von 25 ug/ml zugegeben und das Gemisch 40 min. bei 370C inkubiert. Die Lösung wird dann auf 1M NaCl und 10 % Polyethylenglykol 6000 (Fluka, 20 min. bei 1200C im Autoklaven behandelt) eingestellt und 2 Stunden bei -10 C inkubiert. Das Präzipitat wird in einem Sorval HB-4 Rotor (20 min. bei 10 000 U/min., 0 C) gesammelt und erneut in 100 u1 TNE gelöst. Die DNA-Lösung wird mit 1 Vol. Phenol extrahiert und die DNA wird mit 2 Vol. Aethanol 10 min. bei -80 C präzipitiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt und die DNA erneut in 20 1ll 10 mM TrisHCl (pH 7,5) und 0,5 mM EDTA gelöst. Aus einer 10 ml Kultur gewinnt man 8 bis 10 ug Plasmid-DNA. Die Plasmid-DNAs werden nach Verdauung mit den folgenden Restriktionsenzymen analysiert: Je 0,5 ug Plasmid-DNA wird mit HpaI (Biolabs) sowie mit HpaI (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) mit ClaI (Biolabs) nach Standard Vorschriften, gemäss Angaben des Enzym-Herstellers, gespalten. Die DNAs werden auf einem 1 % Agarose-Gel in 40 mM Tris'Acetat (pH 7,8) 1 mM EDTA und 0,5 pg/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Die gewünschten Plasmide enthalten eine HpaI-Stelle und ergeben nach der 3-fachen Verdauung neben dem grossen DNA-Fragment 2 kleinere Fragmente, welche grösser sind als das kleine EcoRI-ClaI-Fragment von pBR322. Eines dieser Plasmide wird mit p159 bezeichnet (siehe Fig. 3). B. Konstruktion des Plasmids pHRi145 2 ug p159-DNA werden mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) während 30 min. bei 370C verdaut. Die DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Aethanol gefällt und nach Zentrifugation in 10 u1 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA gelöst. Die mit EcoRI verdaute DNA wird weiterhin mit 5 Einheiten DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) (Boehringer) in 10 mM Mg12, 10 mM B-Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P & Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P & Biochemicals) während 15 min. bei 1200 behandelt. Die Polymerase wird anschliessend durch Inkubation bei 850C während 5 min. inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird in 20 mM TrisHCl (pH 7,8), 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) auf das 10fache verdünnt und mit 30 Einheiten T4 DNA-Ligase pro u1 Reaktionsgemisch während 1 Stunde bei 1500 inkubiert. 50 ng der DNA werden in E. coli transformiert (wie oben beschrieben) und auf McConkey-Agarplatten supplementiert mit 50 pg/ml Ampicillin, ausplattiert. Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien wird, wie oben beschrieben, isoliert. Die Plasmid-DNAs werden analysiert durch Verdauung mit EcoRI. Die gewünschten Plasmide sind EcoRI-resistent. Die Analyse erfolgt wie oben beschrieben. Eines der gewünschten Plasmide wird als HRil4S bezeichnet (Fig. 3). C. Konstruktion des Plasmids pHRil48 2 pg pHRil45-DNA werden mit 5 Einheiten ClaI (Boehringer) während 60 min. bei 37 C behandelt, dann mittels Phenol-Extraktion deproteiniert. Die DNA wird mit Aethanol gefällt und dann in 20 u1 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA gelöst. Die überhängenden Enden werden, wie oben beschrieben, mit DNA Polymerase 1 (Klenow-Fragment) aufgefüllt, mit der Aenderung, dass dATP und dTTP ersetzt werden durch dCTP (P & Biochemicals) und dGTP (P & Biochemicals). Die Polymerase wird inaktiviert durch Inkubation bei 85 C während 5 min. Das Reaktionsgemisch wird mit 2 Volumina 0,1 M TrisHCl (pH 8,7) versetzt und mit 0,5 Einheiten Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30 min. bei 370C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird deproteiniert durch Phenol-Extraktion. Die DNA wird mit Aethanol gefällt und in 8 Pl 10 mM TrisHCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA gelöst. Ein chemisch synthetisierter DNA-Linker der Formel 5, -GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' wird am 5'-Ende phosphoryliert, indem 8 pMol des Linkers mit 5 uoi [r- P)-ATP (5500 Cimmol 1 Amersham) in 8 u1 Reaktionsvolumen, welches 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM TrisHCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT und 2 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase (P & Biochemicals) enthält, während 30 min. bei 370C inkubiert werden. Die Reaktion wird gestoppt durch Einfrieren bei -800C. Der radioaktiv markierte Linker wird anschliessend mit 1 ijg ClaI und Phosphatase behandelt und mit pHRil45-DNA (siehe oben) in einem 20 u1 Reaktionsvolumen ligiert. welches 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM TriseHCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2 und 800 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) enthält. Die Inkubation erfolgt bei 1500 während 2 Stunden. Die Ligase wird inaktiviert durch Inkubation bei 850C während 10 min. Anschliessend werden 2 Volumina Wasser hinzugegeben, die Kochsalz-Konzentration auf 10 mM eingestellt und 20 Einheiten KpnI (Biolabs) hinzugegeben während 30 min. bei 37"C. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform wird die Mischung durch ein 0,9 % niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Biorad) in 40 mM Tris'Acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA und 0,5 ug/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Die durch UV-Bestrahlung sichtbare Bande, welche die gleiche Mobilität wie eine Marker-DNA gleicher Grösse aufzeigt, wird mit einem Skalpell herausgeschnitten. Das Gelstück wird 5 min. bei 650C geschmolzen und dann auf 370C abgekühlt. Man erhält ein Volumen von ca. 20 p1. 5 Ill dieser Lösung werden entommen und mit 400 Einheiten T4-Ligase (Biolabs) in 10 u1 Reaktionsvolumen, welches auf 0,5 mM ATP, 10 mM DTT. 10 mM MgC12, 20 mM TrisHCl (pH 7,8) eingestellt wird. während 12 Stunden bei 1500 inkubiert. 1/10 Volumen einer Lösung mit 100 mM Tris*HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 und 100 mM MgCl2 werden zum Ligase-Gemisch (solifidiziert bei 15 C) hinzugegeben und bei 650C während 5 min. inkubiert. Die Lösung wird dann verwendet, um mit Calcium behandelte E. coli HB101-Zellen, wie oben beschrieben, zu transformieren. Es wird auf McConkey-Agarplatten, supplementiert mit 50 ug/ml Ampicillin, ausplattiert. Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien werden isoliert, wie oben beschrieben, und die DNA wird der folgenden Restriktionsenzymanalyse unterworfen: Je 0,5 ug Plasmid DNA wird nacheinander mit KpnI (Biolabs), NcoI (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) nach den Vorschriften des Enzym-Herstellers gespalten. Die Spaltprodukte werden auf 1 % Agarose-Gelen in 40 mM Tris'Acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 ug/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Alle Plasmide zeigen je eine dieser Enzymspaltstellen, wie gewünscht. Eines wird als HRil48 bezeichnet. Das Plasmid HRil43 enthält einen Tryptophan-Promotor-Operator und eine ribosomale Bindungsstelle bis und mit ATG. Hirudin als auch andere heterologe Gene können direkt über die einmalig im Plasmid vorhandenen EcoRI, NcoI, KpnI-Stellen angekoppelt werden. Desweiteren ermöglicht diese Konstruktion das direkte Koppeln und Exprimieren von heterologen Genen, ohne dass das für die Initiation der Translation notwendige ATG auf dem entsprechenden Gen vorhanden sein muss. Dies kann leicht erreicht werden durch Spaltung mit 13com und Auffüllen der überhängenden Enden mit DNA-Polymerase I, wie beschrieben, oder durch Spalten mit KpnI und Entfernen der überhängenden Enden durch Nuklease S1. Das Plasmid HRil48 ist somit ein breit anwendbares Expressionsplasmid. D. Herstellung des linearisierten Vektors pHRil48/EcoRI/BamHI 5 ug Plasmid-DNA von pHRil48 werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI, verdaut. Der herausgeschnittene Vektor pHRil48/EcoRI/BamHi wird mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. b) Herstellung der F1-DNA/EcoRI/EcoRII und der F2-DNA/BamHI/EcoRII I. Herstellung der F1-DNA/EcoRI/EcoRII 5 ,ug Plasmid DNA vom pML 300 werden zuerst mit 10 Einheiten Ecokl Restriktionsendonuclease in 50 pl einer Lösung von 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl und 100 } mol Gelatine für 1 Stunde bei 37C verdaut. Ein Aliquot (0,5 ug) dieser linearisierten Plasmid DNA/EcoRI wird durch Gelelution aus einem Agarosegel isoliert (vgl. Beispiel 10a)) und mit [t-32P]ATP radioaktiv markiert (vgl. Beispiel 12). Die Hauptmenge der Plasmid DNA/EcoRI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA vermischt, mit EcoRII Restriktionsendonuclease verdaut und das EcoRII-EcoRI* DNA Fragment (109 Basenpaare) durch Gelelektrophorese an 8 % Polyacrylamid getrennt. 200 pg der Fl-DNA/EcoRI*/EcoRII werden durch Gelelution isoliert. II) Herstellung der F2-DNA/BamHI/EcoRII 5 Fg Plasmid DNA vom pML 305 werden mit 10 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease gespalten. Ein Aliquot (0,5 pg) dieser linearisierte Plasmid DNAxBamHI wird durch Gelelution aus einem Agarosegel isoliert (vgl. Beispiel 10a)) und mit [732 p] radioaktiv markiert, (vgl. Beispiel 12)). Die Hauptmenge der Plasmid DNA/BamHI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA vermischt, mit EcoRII Restriktionsendonuclease verdaut und das EcoRII-BamHI* DNA Fragment (122 Basenpaare) durch Gelelektrophorese an 8 % Polyacrylamid getrennt. 250 ug der F2-DNA/BamHI*/EcoRII werden isoliert. c) Ligation der P1-DNA mit der F2-DNA und Konstruktion des Expres sions-Plasmids pML310 10 ng (r 473 nMol Enden) Fl-DNA/EcoRI/EcoRII und 9 ng (r 495 nMol Enden) F2-DNASBamHI/EcoRII werden in einem Volumen von 20 ijl mit T4-DNA Ligase, wie bereits unter Beispiel 10c) beschrieben, behandelt. Anschliessend wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol präzipitiert. Der DNA-Niederschlag wird dann wie in Beispiel 10c) beschrieben gelöst und mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease verdaut. Die Lösung wird dann auf TNE eingestellt und 30 ng (= 50 nMol Enden) der Vektor-DNA pHR148/EcoRI/BamHI (vgl. Beispiel 13aD) zugegeben. Anschliessend wird die Lösung abermals mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol ausgefällt. Die präzipitierte DNA-Mischung wird, wie in Beispiel 10c) angegeben, mit T4-DNA Ligase (Biolabs) behandelt, Auf diese Weise entsteht in der Lösung ein rekombiniertes Plasmid, welches die F 1-F2-DNA (Desulfatohirudin-Gen) als Insert enthält. d) Transformation von E. coli liBlOl mit dem Plasid puML 310 Die Transformation der mit Calcium behandelten E. coli HB101 Zellen erfolgt wie in Beispiel 10d) beschrieben. Es werden 10pl des in Beispiel 13c) erhaltenen Reaktionsgemisches verwendet. 420 Ampicillin resistente Kolonien werden erhalten. e) Screening derKolonien, die F1 -F2-DNA enthalten 18 transformierte Kolonien (Beispiel 13d) werden auf ihren F1-F2 DNA-Gehalt geprüft, wie in Beispiel 10e) beschrieben. Als radioaktive Probe wird eine Mischung der in den Beispielen 5 und 6 boschriebenen Oligodeoxynucleotide verwendet. Im Autoradiogramm werden 12 positive Kolonien erhalten, fünf davon erhalten die Bezeichnung pML310, pML311, pML312, pML313, pML314. Beispiel 14: Charakterisierung des Klons pML310 Die Charakterisierung der F1-F2-DNA-Sequenz- in dem rekombinierten Plasmid pML310 erfolgt durch Sequenzierung der F1-F2-DNA nach Maxam und Gilbert (11), wie in Beispiel 12 beschrieben. 10 g Plasmid -DNA werden geprüft. Die Nucleotidsequenz der F1-F2-DNA ist mit der für das synthetische Desulfatohirudin-Gen beschriebenen identisch. Beispiel 15: Herstellung des ExpressionsplasmidspML 315 a. Ligation der F1-DNA mit der F2-DNA und Konstruktion des Expressionsplasmids pML315 24 ug (" 1,3 pMol Enden) bzw. 26 ug (t 1,3 pMol Enden) des chemisch synthetisierten F1- bzw. .F2-DNA (siehe Beispiel 8 und Schema I) werden in einem Volumen von 20 pl mit 5 Einheiten EcoRII Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 50 mM Tris-HOl (pH 8), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 llg/ml Gelatine für 30 min. bei 37 C verdaut. Anschliessend wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol präzipitiert. Der DNA-Niederschlag wird dann wie in Beispiel 10c) beschrieben gelöst und mit T4-DNA-Ligase drei Stunden bei 1500 behandelt. Danach wir die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und wie in Beispiel 10b) beschrieben gefällt. Der DNA-Niederschlag wird anschliessend gelöst (vgl. Beispiel 10c) und mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease für 30 min. bei 370C verdaut. Danach werden der Lösung 70 ng (= 0.1 pMol Enden) des linearisierten Vektors pHRil48/EcoRI/BamHI (Beispiel 13aD) zugesetzt, die ganze Lösung auf TNE eingestellt und mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit 2 Volumen Alkohol ausgefällt. Der erhaltene DNA Niederschlag, der die beiden DNA Bruchstücke (F 1-F2 -DNA/EcoRI/BamHI und pHRil48/EcoRI/BamHI) enthält, wird in 20 u1 einer Lösung von 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM Mg12, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 ug/ml Gelatine gelöst und mit 15 Einheiten/pl T4-DNA Ligase (Biolabs) bei 15"C für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung das rekombinierte Plasmid pML315, welches die F 1-F2-DNA (t Desulfatohirudin-Gen) enthält. b) Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML315 10 jil des das Plasmid pML315 enthaltenden Gemisches (Beispiel 15a) werden für die Transformation der Calcium-behandelten E. coli Hb101 Zellen verwendet. Ca. 236 Ampicillin-resistente Kolonien werden erhalten. c) Screening der Kolonien, die F1-F2-DNA enthalten Transformierte Kolonien (Beispiel 15b) werden auf das Vorhandensein von F1-F2-DNA geprüft, wie in Beispiel 13e) angegeben. Es werden fünf positive Kolonien erhalten, welche die Bezeichnung pML315 - pML319 erhalten. Beispiel 16: Herstellung des Expressionsplasmids pML320 a. Ligation der synthetischen F 1-F2 -DNA mit der Vektor-DNA pHRil48/EcoRI/BamHI 20 llg des total synthetisch hergestellten Desulfatohirudin-Gens (F1-F2-DNA, vgl. Beispiel 9) werden in 20 u1 einer Lösung von 50 u1 100 mM TrisHCl (pH 7,5), 50 mM NaCl und 100 yg/ml Gelatine mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschliessend mit BamHI verdaut. Die Lösung wird auf TNE eingestellt, woraufhin 30 pg (= 50 nMol Enden) der Vektor-DNA pHRil48/EcoRI/BamHI (vgl. Beispiel 13aD) zugegeben wird. Die Lösung wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wird, wie in Beispiel 10c) angegeben, mit T4-DNA-Ligase (Biolabs) behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung ein rekombiniertes Plasmid (pML320), welches die F1 -F2-DNA (Hirudin-Gen) als Insert enthält. b. Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML320 Die Transformation der mit Calcium behandelten E. coli HB101 Zellen erfolgt wie in Beispiel 10d) beschrieben. Es werden 10p1 des in Beispiel 16a) erhaltenen Reaktionsgemisches verwendet. 173 Ampicillin resistente Kolonien werden erhalten. c. Screening der Kolonien, die F 1-F2-DNA enthalten 11 transformierte Kolonien (Beispiel 16b) werden, wie in Beispiel 10e) beschrieben, auf ihren F1-F2-DNA-Gehalt geprüft. Als radioaktive Probe wird eine Mischung der in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Oligodesoxynucleotide verwendet. Im Autoradiogramm werden 14 positive Kolonien erhalten. Fünf davon erhalten die Bezeichnung pML320, pML321, pML322, pML323 und pML324. Beispiel 17: Charakterisierung d: Klone pML315 und pML320 Die Charakterisierung der F1-F2-Sequenzen in den Plasmiden pML315 und pML320 erfolgt durch Sequenzierung der F1 -F2-DNA nach Maxam und Gilbert (11), wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Nuclotidsequenzen der DNA-Inserts beider Plasmide sind mit derjenigen des synthetischen Hirudin-Gens identisch. Beispiel 18: Synthese von Polypeptiden mit Hirudin-Aktivität durch E. coli-Zellen, die Plasmide mit rekombinierten Hirudin-Genen enthalten a. Synthese von Polypeptiden mit Hirudin-Aktivität Jeder der 15 Klone, die das rekombinierte Desulfatohirudin-Gen enthalten, nämlich E. coli HB101 pML 310, E. coli Hb101 pML 311, E. coli HBl0l pML 312, E. coli HB101 pML 313, E. coli HB101 pML 314, E. coli HB101 pML 315, E. coli HB101 pML 316, E. coli HB101 pML 317, E. coli HB101 pML 318, E. coli HB101 pML 319, E. coli HB101 pML 320, E. coli HB101 pML 321, E. coli HB101 pML 322, E. coli HB101 pML 323, E. coli HB101 pML324 wird auf die Bildung von Hirudin-Aktivität getestet. Zu diesem Zweck werden die oben genannten Klone in 5 ml L-Medium über Nacht (16 Stunden) bei 37 C und 250 upm kultiviert. L-Medium ist wie folgt zusammengesetzt: Bacto Tryptone 10 g Bacto Hefe-Extrakt 5 g NaCl 5 g Glucose 5 g Ampicillin 0,1 g 1 ml dieser Uebernachtkultur wird am nächsten Tag in 25 ml M9-Medium Ubertragen. M9-Medium ist wie folgt zusammengesetzt: Ns2HPO4°7H20 13,25 g KH2PO4 3,0 g t3aCl 0,5 g NH4Cl 1,0 g CaCl2N2H20 0,015 g MgsO4s7H2O 0,25 g Casaminosäuren 2,5 g Vitamin B1 0,0099 g Glucose 5,0 g Ampicillin 0,1 g Es wird bei 37 C und 250 upm solange kultiviert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte (OD623) von ca. 0.9.-1,0 erreicht hat. Anschliessend erntet man die Zellen (5 ml der wachsenden Kultur) und resuspendiert die Bakterien in 0.5 ml einer Lösung von 50 mM TrisHCl (pH 8) und 30 mM NaCl. Danach wird die Suspension auf 1 mg/ml Lysozym (Boehringer) eingestellt und 30 min. in Eis gestellt. Durch abwechselndes Einfrieren der Suspension in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37 C werden die Bakterien zerstört. Dieser Vorgang wird 5 mal wiederholt, anschliessend wird die Mischung 30 min. bei 16000 upm bei 4 C zentrifugiert. Die Ueber stände werden auf Desulfatohirudin-Gehalt untersucht, indem man mit Antikörpern (vgl. Beispiel 18) versetzt, die Ueberstände im HPLC prüft oder die Hemmung von Thrombin (15) misst. Folgende Resultate werden erhalten: Bakterienextrakt Desulfatohirudin-Bildung E. coli HB101 pML 310 + E. coli HB101 pML 311 + E. coli HBl0l pML 312 + E. coli HB101 pML 313 + E. coli HB101 pML 314 + E. coli HB101 pML 315 + E. coli HB101 pML 316 + E. coli HB101 pML 317 + E. coli HB101 pML 318 + E. coli HB101 pML 319 + E. coli HB101 pML 320 + E. coli HB101 pML 321 + E. coli HB101 pML 322 + E. coli HB101 pML 323 + E. coli HB101 pML 324 + E. coli HB101 pHRi 148 (Kontrolle) E. coli HB101 pBR322 (Kontrolle) E. coli HB101 (Kontrolle) Beispiel 19 : Nachweis der Hirudin-Aktivität Ca. 5-10 u1 einer Probe, welche Polypeptide mit Hirudin-Aktivität 2 enthält (vgl. Beispiel 18), werden auf 1 cm Nitrocellulosepapier (NZ) (BIORAD) aufgetropft und 30 min. bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wird das NZ für 1 Stunde bei 370C in einer Lösung von 3 % Serumalbumin in 0,01 M TrisHCl (pH 8) und 0,9 % NaCl inkubiert. Anschliessend wird das NZ in einer Lösung von 0,01 M TrisXHCl (pH 8) und 0,9 % NaCl für 30 min. gewaschen. Dabei wird die Lösung 5 mal gewechselt. Danach wird das gewaschene NZ für 2 Stunden bei 250C in einer Lösung von 3 % Serumalbumin in 0,01 M TrisHCl (pH 8) und 0,9 % NaCl, die 2 pg/ml Antikörper (aus Kaninchen hergestellte, oder monoklonale Antikörper) gegen Hirudin enthält, behandelt. Danach wird das NZ, wie oben beschrieben gewaschen. Anschliessend wird das NZ für 2-3 Stunden bei 25QC mit einer Lösung von 3 % Serumalbumin in 0,01 M Tris-HCl (pH 8) und 0,9 X NaCl, die 0,2 pCi/ml 125I-Protein A (sp. Aktivität 89,8 uCi/mg) (NEN) enthält, behandelt. Danach wird abermals das NZ, wie oben beschrieben, gewaschen, getrocknet und in einem r-Zähler (Multi Gramma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace) die gebundene Radioaktivität bestimmt, welche ein Mass für das auf dem NZ vorhandene Polypeptid mit Hirudin-Aktivität ist. in einem alternativen Verfahren wird obige Probe einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) unterworfen [vgl. (24)1. Das PAGE-Elektropherogramm wird durch Elektro-Blotting auf NZ übertragen. Danach wird die NZ wie oben beschrieben behandelt und/oder über Nacht zusammen mit einem Röntgenfilm (Fuji) autoradiographi.rt. Stellen auf dem NZ, welche Polypeptide mit Hirudin-Aktivität enthalten, erscheinen auf dem Film als schwarze Flecken. Beispiel 20: Isolierung und Reinigung von Desulfatohirudin mit Hilfe einer Thrombin-Säule a. Herstellung der Polypeptidlösung für die Thrombin-Säule. 150 ml Kulturbrühe (erhalten gemäss Beispiel 18) werden auf 40C abgekühlt und die Zellen durch Zentrifugation (5000 upm, 15 min., Sorvall RC 3B) abgetrennt. Der klare Ueberstand enthält keine Hirudin-Aktivität. Anschliessend werden die Zellen in 12 ml Lyse Puffer (50 mH TrisHCl pH 8, 30 mM NaCl) suspendiert. Dieser Mischung werden 15 mg Lysozym (Boehringer) zugesetzt und diese dann 30 min. bei 4"C aufbewahrt. Anschliessend werden die Zellen durch 4 maliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschliessendem Auftauen bei 370C zerstört. Danach wird 30 min. bei 16000 upm 40C zentrifugiert. Der Ueberstand enthält die Hirudin-Aktivität. In dem Ueberstand (15 ml) werden dann 7,7 g festes Ammoniumsulfat aufge ost. Die trübe Mischung wird bei 40C für 30 min. stehengelassen und dann zentrifugiert (8. oben). Das nasse Sediment wird in 1 ml 0,05 mM TrisHCl pH 8 Puffer gelöst und man erhält die gewünschte Polypeptidlösung. b. Reinigung von Hirudin auf einer Thrombin-Säule. Die Thrombin-Säule (Bettvolumen 4 ml) ist mit 0,05 M Tris-HCl pH 8 äquilibriert. 5 ml-Portionen der oben erhaltenen Polypeptid-Lösung werden bei 40C auf die Säule mit einer Fliessgeschwindigkeit von 7 ml/Stunde aufgetragen. Gewaschen wird dann mit 25 ml 0.05 M TrisHCl (pH 8). Die ersten Fraktionen enthalten die nicht adsorbierten Polypeptide, welche verworfen werden. Anschliessend wird die Säule mit 10 mll,5 M Benzamidin (Merck) vgl. (25)] in 0,05 M Tris.HCl (pH 8) gewaschen und die erhaltenen Fraktionen auf Hirudin Aktivität mit dem Thrombin-Test (15) geprüft. Die Fraktionen, welche die Polypeptide enthalten, werden durch Messung der OD280nm bestimmt. Fraktionen 25 und 26 enthalten die Hirudin-Aktivität; sie werden bei -20 C aufbewahrt oder bis zur Weiterverarbeitung im Eisbad. Die Hirudin-Aktivität beträgt in Fraktion 25 20 ug/ml und in Fraktion 26 52 ug/ml. Danach werden die Fraktionen dialysiert oder über Sephadex-G25 (Pharmacia) entsalzt. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (24) des Produktes ergibt ein Molekulargewicht von ca. 7000-8000 Dalton und ganzzahlige Vielfache davon (Oligomere). c. Herstellung der Thrombin-Säule Affi-Gel 10 (Bio Rad) wird nach Angaben des Herstellers mit kaltem destilliertem Wasser und Kupplungspuffer pH 8,5 (0.1 M NaHCO3/ Na2CO3-Lösung) gewaschen. Eine 50 %ige Suspension der Gels in Kupplungspuffer (4 ml) wird in ein Plastikrohr übertragen, mit der gleichen Menge Thrombinlösung (120 mg in 4 ml Kupplungspuffer) (Calbiochem) vermischt und über Nacht bei 40C rotiert. Danach wird das Gel mit Kupplungspuffer gewaschen. Zur Blockierung der noch freien aktiven Stellen wird das Gel mit 0,1 ml 1 M Aethanolamin-HCl (pH 8,0) pro Gel während 3 Stunden bei 40C behandelt dann mit phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 10 mM Natriumazid pro ml Gel gewaschen und darin bei 40C gehalten. Der Kupplungsgrad wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt und beträgt 15 bis 30 mg Hirudin pro ml Gel. 4 ml des entstandenen Thrombin-Gels werden verwendet, um die Affinitätssäule herzustellen. Beispiel 21: Transformation verschiedener E. coli-Stämme mit dem Plasmid pML310 und Kultivierung der transformierten Wirtszellen In analoger Weise, wie in Beispiel 10d) beschrieben, werden die Stämme E. coli JA221, E. coli LM1035 und E. coli W3110A102 mit dem Plasmid pML310 transformiert. Transformierte Kolonien werden auf das Vorhandensein von F1-F2-DNA geprüft, wie in Beispiel 10e) beschrieben. Es werden 5, 3 bzw. 5 positive Kolonien erhalten, die die folgenden Bezeichnungen erhalten: E. coli JA221/pML310/1 E. coli JA221/pML310/2 E. coli JA2211pML310/3 E. coli JA221/pML310/4 E. coli JA221/pML310/5 E. coli LM 1035/pML310/1 E. coli LM 1035/pML310/2 E. coli LM 1035/pML310/3 E. coli W3110ss102/pML310/1 E. coli W3110A102/pML31012 E. coli W31108102/pML310/3 E. coli W3110A102/pML310/4 E. coli W3110#102/pML310/5 Die genannten Klone werden in einem modifizierten M9-Medium kultiviert, welches die folgende Zusammensetzung aufweist: : Na2HPOe7H20 9,0 g KH2PO, 3,0 g NaCl 0,5 g NH4Cl 3,5 g CaC1202H20 0,015 g MgSo4*7H20 0,25 g Casaminosäuren 7,0 g Hefeextrakt 5,0 g Vitamin B1 0,0099 g Eisen-III-citrat 0,006 g MOPS (3-Morpholinopropan-1- 34,0 g sulfonsäure) Glucose 20,0 g Ampicillin 0,1 g Es wird bei 370C und 180 upm solange kultiviert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte (OD623) von ca. 1 erreicht hat. Anschliessend erntet man die Zellen (5 ml der wachsenden Kultur) und resuspendiert die Bakterien in 0,5 ml einer Lösung von 50 mM Tris*HCl (pE 8) und 30 mM NaCl. Danach wird die Suspension auf 1 mg/ml Lysozym (Boehringer) eingestellt und 30 min. in Eis gestellt. Durch abwechselndes Einfrieren der Suspension in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 370C werden die Bakterien zerstört. Dieser Vorgang wird 5 mal wiederholt. Anschliessend wird die Mischung 30 min. bei 16000 upm bei 40C zentrifugiert. Alle Klone werden auf die Bildung von Polypeptiden mit Hirudin-Aktivität untersucht, in dem die Hemmung von Thrombin (15) gemessen wird. In allen Bakterienextrakten wird Hirudin-Aktivität (300-600 nglml Kulturlösung) festgestellt. Beispielsweise werden folgende Hirudin-Aktivitäten bestimmt: Stamm Hirudin-Aktivität (Ug/l Kulturlösung) E. coli LM1035/pML310/1 300 E. coli JA 221/pML310/1 500 E. coli W3110Q102/pML310/1 600 Beispiel 22: Fermentation des transformierten Stammes E. coli M3110102fPML310/1 im 5000 1 Fermenter und Aufarbei tung der Kulturbrühe In analoger Weise, wie in Beispiel 21 beschrieben, werden in einem 5000 1 Fermenter E. coli W3110h102/pML310/1-Zellen in 3000 1 modifiziertem M9-Medium kultiviert, bis die Suspension eine optische Dichte (OD623) von ca. 10-13 erreicht hat. Die Kulturbrühe (pH 7,4) wird auf 1000 abgekühlt, und die Zellen werden mit einer Alfa-Laval BRPX-207 Entschlammvorrichtung behandelt. Der klare Ueberstand enthält keine Hirudin-Aktivität und wird verworfen. Während der Entschlammung wird der Schlammraum fortwährend mit Lysepuffer A (50 mM TrisHCl, 30 mM NaCl, eingestellt mit HOl auf pH 8,0) teilentschlammt und am Schluss der Inhalt der Zentrifugenschale (7 1) unter voller Entschlammung mit Lysepuffer A ausgestossen. Die erhaltene Zellmasse wird mit Puffer A auf 375 1 eingestellt und besitzt einen pH-Wert von 7,6. Nach dem Kühlen auf 5-10 C wird die Suspension durch eine Dyno-Mühle (Typ KD5) geleitet, welche mit 4,2 1 Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5-0,75 mm ausgerüstet ist. Dabei werden die Zellen zerstört. Die so erhaltene Suspension wird mit Essigsäure auf einen Essigsäure- gehalt um 2 % (v/v) eingestellt und über Nacht bei 1000 gerührt. Die Suspension mit einem pH von 3,9 wtrd mit der oben beschriebenen Technik entschlammt. Der klare Ueberstand von 300 1 wird in einem Fallfilmverdampfer (Stundenleistung 60 1 Wasser) auf 35 1 aufkonzentriert. Das leicht trübe Konzentrat wird zentrifugiert und der eo erhaltene klare Ueberstand auf einer Ultrafiltrationsanlage DDS s Lab 35, welche mit GR 81 pY Membrane bestückt ist (Fläche 2,5 m2), gegen 2 % Essigsäure oder 0.02 M Tris-HCl pH 7.5 Puffer diafiltriert. Das Endvolumen beträgt 31 1. Ein aliquoter Teil von 2 1 dieser klaren Proteinlösung wird auf eine Sephadex G-50 F-Säule (KS 370 Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 96 1 aufgetragen, wobei die Säule mit 2 % Essigsäure äquilibriert ist. Die in 15 1 Eluat enthaltene Hauptfraktion wird mittels Ultrafiltration eingeengt und anschliessend gegen Wasser diafiltriert. Die so erhaltene klare wässrige Lösung wird lyophilisiert. Die Aufarbeitung kann, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, durchgeführt werden. Beispiel 23: Kultivierung des Stammes E. coli W3110hl02/pML31011 im Labormassstab Der Stamm E. coli W3110h102/pML31011 wird bei 37 C und 200 upm 24 Stunden in Schüttelkolben inkubiert. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/l): Na2HPO47H2O 9,0 g KH2PO4 3,0 NaCl 0,5 CsC12 0,015 MgSO4u7HzO 0,25 Eisen(III > -citrat 0,006 MOPS 40 NH4C1 3,5 Casamino Säuren 7,0 Hefeextrakt 5,0 Cerelose (Glucose) 20 Ampicillin 0,1 Das Medium hat einen pH-Wert von 6,54. Während der Kultivierung wird eine optische Dichhte (OD6o5nm) von 14,9 erreicht. Die Zellen (50 ml der wachsenden Kultur) werden geerntet und in 5 ml einer Lösung von 50 mM Tris HC1 (pH 8.0) und 30 mM NaCl resuspendiert. Danach wird die Suspension mit 5 g gekühlten Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm), oder durch Zugabe von Lysozym (Boehringer), Endkonzentration 1 mg/ml, während 30 bis 45 Minuten in Intervallen auf einem Multi-Tube Vortexer bei hoher Intensität geschüttelt. Zu 0,5 ml der Mischung werden 0,5 ml 2 % Essigsäure zugegeben und die Mischung wird 20 min bei 40C und 12'000 upm zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird auf Hirudin-Aktivität (Hemmung von Thrombin) geprüft. Der Thrombin-Hemmtest wird wie folgt durchgeführt: Der Test beruht auf der Bestimmung der enzymatischen Abspaltung von p-Nitroanilin aus dem Substrat Chromozym TH (Tosyl-glycyl-prolylarginin-4-nitroanilid-acetat). Das gebildete p-Nitroanilin wird kolorimetrisch bei 405 nm gemessen (Micro-Elisa Auto Reader von Dynatech, Kloten). Der Test wird in Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Costar, Serocluster, Catalog Nr. 3590) durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 2 h bei 370C im Brutschrank. Für den Test werden 20 u1 der zu bestimmten Lösung mit 30 jil Füllpuffer (0,2 M Tris*HCl pH 7,5, 1 M NaCl, 100 pg!ml Rinderserumalbumin) verdünnt und mit 20 ul Enzym-Lösung [10 mg lyophilisiertes Thrombin aus Humanplasma (Boehringer) in 1 ml bidestilliertem Wasser gelöst und ca. 1:400 mit obigem Füllpuffer verdünnt] und mit 150 u1 Substrat Lösung [20 ng Chromozym TH (Boehringer) in 4 ml bidestilliertem Wasser gelöst und 1:15 mit obigem Füllpuffer verdünnt versetzt. Alle Lösungen werden gegen eine Blank-Lösung, bestehend aus 70 P1 Füllpuffer (s.o.) und 150 ul Substrat-Lösung und gegen eine Enzym Kontrollösung, bestehend aus 50 u1 Füllpuffer, 20 u1 Enzym-Lösung und 150 u1 Substrat-Lösung gemessen. Der OD405nm-Wert der Enzym Kontrollösung nach 2 h bei 370C ergibt 100 % Aktivität und sollte ca. 0,8 + 0,2 betragen. Die Thrombin-Hemmung (in %) der Proben errechnet sich nach der Formel 100 x OD405nm der Probe %-Thrombin-Hemmung - 100 OD405nm der Enzym-Kontrollösung Die überstehende Lösung weist eine Thrombin-Hemmung von 49,7 %/20 p1 auf. Beispiel 24: Reinigungsverfahren zur Anreicherung von Hirudin Verbindungen aus Kulturbrühen In analoger Weise wie in Beispiel 22 beschrieben, wird der Stamm E. coli W3110A102/pML310/1 im Fermenter kultiviert. Dann werden die Zellen aufgeschlossen, abzentrifugiert und der aufkonzentrierte Ueberstand nach Essigsäurebehandlung ultrafiltriert oder dialysiert. Solcherart gewonnene Lösungen können beispielsweise mittels Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. a) Anionenaustauschchromatographie über eine MONO Q Säule (Pharmacia) zur Gewinnung von Thrombin hemmenden Fraktionen) 8,5 ml Proteinlösung (20 iM Tris i HC1 pH 7,51150 mM NaCl) werden auf die Mono Q Säule mittels eines Chromatographiesystems der Fa. Pharmacia (fast protein liquid chromatography" FPLC) aufgetragen und bei folgenden Bedingungen eluiert. Experimentelle Bedingungen: Säule: Mono Q, 4,6mm x 150 mm. Puffer A: 20 mM Tris HC1 pH 7,5; Puffer B: 20 mM Tris * HCl/l M NaCl. Linearer Salzgradient: A: während 9 ml mit 15 % Puffer B eluieren, während 10,7 ml auf 70 % Puffer B steigern. AUFS 1.0 bei 280 nm, 1 ml Fraktionen. Im Ausschlussvolumen (Fraktionen 1-10) wird ein grosser Proteingipfel von den nachfolgend eluierenden Hirudin-Verbindungen abgetrennt. Die Fraktionen 17-23 zeigen im Thrombin-Test eine Thrombin Hemmung zwischen 20 und 100'ei, wobei die Hauptfraktion (Fraktionen 20 und 21) mit 92 % Hemmung, bei einer Konzentration von ca. 500 mM NaCl eluiert. b) Anionenaustauschchromatographie an einer DEAE Cellulose-Säule zur Anreicherung von Hirudin Verbindungen. 10 ml eines Dialysat wird der Anionenaustauschchromatographie an DE 53 (Fa. Whatman) bei pH 7,5 unterworfen (Chromatographiebedingungen: Säule 1 x 5 cm (10 ml). Elutionspuffer A: 20 mM Ammoniumacetat, 100 mM NaCl, pH 7,5. Elutionspuffer B: 20 mM Ammoniumacetat 1 M NaCl, pH 4,0. Linearer Salzgradient je 4 Säulenvolumen Puffer A, resp. B). Hirudin-Verbindungen eluieren ab 0,4 M NaCl. Der Nachweis gelingt mit dem Thrombin-Hemmtest. c) Entsalzung an P-6 DG Desalting Gel" (Fa. Bio-Rad) 110 ml Dialysat (20 mM Tris HC1, pH 7,5, konzentrierte Proteinlösung aus 2,6 1 Ueberstand) wurden in analoger Weise wie in Beispiel 24b beschrieben an DE 53 getrennt. Hirudin-Verbindungen eluieren zwischen Fraktionen 46 und 52 (150 ml), getrennt von verschiedenen, rascher eluierenden nicht-aktiven Proteingipfel, und werden am Rotationsverdampfer auf ca. 12 ml konzentriert. Die so erhaltene, klare Proteinlösung wird auf eine Biogel P-6 DG Säule aufgetragen und wässerig eluiert. Experimentelle Bedingungen: Säule 2,5 x 9 cm, stationäre Phase 45 ml Biogel P-6 DG Desalting Gel, Durchflussgeschwindigkeit 1,15 ml/min, 4,6 ml Fraktionen. Der Salzgehalt kann durch Leitfähigkeitmessung oder Testierung mittels Silbernitrat (AgCl-Fällung) überprüft werden. Die Hauptaktivität eluiert zwischen den Fraktionen 7 bis 10, wobei der Nachweis mittels dem Thrombin Hemmtest gelingt. Die Fraktionen 8-10 (13,5 ml) werden vereinigt, am Rotationsverdampfer auf 1 ml aufkonzentriert und die klare Lösung auf eine Sephadex G 50 fine-Säule (Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 160 ml aufgetragen, wobei die Säule mit 1 % Essigsäure äquilibriert ist. d) Gelfiltration an Sephadex G50 fine (Fa. Pharmacia) Experimentelle Bedingungen: Säule: Sephadex G50 fine (31 g), 2,5 cm x 64 cm, Volumen 310 ml; Lösungsmittel: 1 X Essigsäure; Durchflussgeschwindigkeit 43 ml/h, 3,8 ml Fraktionengrösse. AUFS: 0,1 bei 282 nm. Papiervorschub 3,0 cm/h. Der Nachweis der eluierten Aktivität erfolgt mit dem Thrombin-Hemmtest. Die in 50 ml Eluat (Fraktionen 39-52) enthaltene Hauptfraktion eluiert rascher als nicht-aktive Nebenkomponenten. (Fraktionen 53 bis 80). Die Thrombin Hemmung der aktiven Fraktionen beträgt zwischen 80 und 100 % Hemmung. e) Kationenaustauschchromatographie an einer CM-Cellulose zur Voranreicherung von aktiven Lysaten 10 ml Dialysat [20 mM Tris HC1, Konzentrat (1:20) aus 200 ml Ueberstand, pH 2,0 eingestellt mit 3 ml 4N Nol] wurden auf einem Kationentauscher (CM-Cellulose) getrennt. Hirudinverbindungen eluieren im Ausschlussvolumen zwischen Fraktionen 4-8. Der Nachweis erfolgt mittels des Thrombin-Hemmtests. Die Fraktionen 5 und 6 hemmen zu 89 X, respektive 88 Z pro 20 P1 Eluat. Experimentelle Bedingungen: Säule: 1,5 x 8 cm, stationäre Phase: 19 ml CM-Cellulose (los MZ-3146). Durchflussgeschwindigkeit:43 ml/h, 3,8 ml Fraktionen. Linearer Salzgradient Puffer A: 20 mM NH4OAc, pH 2 eingestellt mit 4N HC1, Puffer B: 200 mM NH40Ac pH 6.5. Je 5 Säulenvolumen, AUFS 1,0 bei 282nm. Beispiel 25: Fermentation des transformierten Stammes E. coli W31101021pML310/1 und Aufarbeitung der Kulturbrühe In analoger Weise wie in Beispiel 22 beschrieben, werden in einem Fermenter E. coli W31108102lpML310/1 Zellen in 8 1 Medium L während 5 h kultiviert, wobei die Suspension eine optische Dichte (OD623) von ca. 5 erreicht hat. Die aus der Kulturbrühe (pH 7,2) abzentrifugierten Zellen werden auf 1000 abgekühlt, durch Lysozymbehandlung und durch mehrmaliges (4x) abwechselndes Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen auf ca. 300C aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension (2,5 1) wird mit 1,5 % Essigsäure (2,4 1) verdünnt und 30 min. bei 40C gerührt. Die ausgefallenen bakteriellen Proteine und andere Zellbestandteile werden für 30 min. bei 40C bei 9000 Upm abzentrifugiert. Der klare Ueberstand von 3,2 1 wird in einem Rotationsverdampfer (Fa. Büchi) auf 320 ml aufkonzentriert. Das Konzentrat wird über Nacht gegen 20 mM Tris e HC1 pH 7.5 bei 40C dialysiert und das leicht trübe Dialysat nochmals zentrifugiert. Das Endvolumen beträgt 300 ml. Die klare Proteinlösung (0,02 M Tris HC1 pH 7,0) wird auf eine Di äthylaminoäthyl-cellulose-(DE53 der Fa. Whatman) (20 g) Säule mit einem Bettvolumen von 20 ml aufgetragen, wobei die Säule mit Puffer A äquilibriert ist (Puffer A: 20 mM Ammoniumacetat/100 mM NaCl, pH 7,5). Vorerst wird mit 1 Säulenvolumen (45 ml) bei konstantem Fluss (43 ml/h) gewaschen und anschliessend mit einem linearen Salzgradienten mit je fünf Säulenvolumen Puffer A, respektive Puffer B eluiert (Puffer B: 20 mM Ammoniumacetat/4 M NaCl, pH 5,0). Die in 100 ml Eluat enthaltene, im Thrombin-Hemmtest aktive Hauptfraktion (Fr. 24-26) wird über Nacht bei 4"C gegen 20 mM Tris . HC1 pH 7,5 dialysiert und anschliessend am Rotationsverdampfer bei 350C auf 5 ml Endvolumen aufkonzentriert. Die so erhaltene klare wässerige Lösung wird auf eine Sephadex G-50 fine Säule (Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 160 ml aufgetragen, wobei die Säule (2,5 x 64 cm Biorad) mit 5 X Essigsäure äquilibriert ist. Die in 50 ml Eluat (Fraktionen 5-7, Fluss 50 ml/h, 25 min./Fraktion) enthaltene Hauptaktivität wird am Rotationsverdampfer eingeengt und anschliessend einer "Reverse Phase" HPLC-Trennung unterworfen. Ein Aliquot (500 p13 der einzelnen Fraktionen wird am "speed vac" Konzentrator (Fa. Savant) 1:10 konzentriert und mittels der "Reversed Phase'-HPLC-Analyse auf ihren Gehalt an Desulfatohirudin-Verbindungen untersucht. Die Lösungen enthalten Desulfatohirudin-Verbindungen. Fraktion 6 (18 ml) enthält prozentual den geringsten Anteil an Nebenkomponenten und wird mittels semipräparativer Reverse Phase"-HPLC weiter gereinigt. Experimentelle Bedingungen: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-Säule, 10 x 250 mm; Aliquote Anteile der Fraktion 6 (200 p 1:10 konzentriert) pro Trennung; AUFS 0,5 bei 220 nm; Durchflussgeschwindigkeit: 2 ml/min. Eluent: A:0.1 % Trifluoressigsäure, B:Acetonitril/Wasser 8:2 + 0.07 % Trifluoressigsäure, 1 min 16 % B, dann während 40 min auf 64 % B steig. Die so erhaltenen Fraktionen werden 1:1 mit Wasser verdünnt und lyophilisiert. Der Rückstand besteht aus reinen Desulfatohirudin-Verbindungen. Beispiel 26: Analvse des Produktgemisches aus der Fermentation von E. coli W3110A102/pML310/1 Die gemäss Beispiel 25 erhaltenen, im Thrombin-Hemmtest aktiven Fraktionen werden einer HPLC-Analyse unter zwei verschiedenen Bedingungen unterworfen. a) Experimentelle Bedingungen Nr. 1: Nucleosil (MN) C18, 5 um RP-HPLC Säule, 4,6 x 120 mm; 50 p1 Hirudin-Verbindungen pro Trennung, Att. 6 bei 214 nm; Durchflussgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluent: A:0.1 % Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser 8:2 mit 0.07 % Trifluoressigsäure, 2 min 16 % B, dann während 30 min. auf 64 % B steigern. Gegendruck: 107 bar. In einminütigem Abstand werden Fraktionen genommen (insgesamt 30), die dem Thrombin-Hemmtest und dem Antikörpertest (vgl. Beispiel 19) unterworfen werden. Fraktionen 12-15 erweisen sich als aktiv. Ausserdem werden die Aminosäurezusammensetzung, der N-Terminus und der C-Terminus für die aktive Hirudin-Verbindung der Fraktion 14 bestimmt. Diese Fraktion (Nr. 14) wird zudem mit Desulfatohirudin verglichen, welches analog wie in Beispiel 28 beschrieben durch Umsetzung von natürlichem Hirudin aus Blutegel mit dem Enzym Arylsulfatase erhalten wird. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: EMI90.1 <tb> Fraktion <SEP> Retentionszeit <SEP> Thrombin- <SEP> Antikörper <tb> <SEP> (min) <SEP> Hemmung <SEP> (%) <SEP> Test <SEP> # <SEP> (cpm) <tb> Fr <SEP> 12 <SEP> 11,75 <SEP> + <SEP> 35 <SEP> + <tb> <SEP> Fr <SEP> 14 <SEP> 12,80 <SEP> ++ <SEP> 79 <SEP> + <SEP> 13850 <tb> <SEP> Fr <SEP> 15 <SEP> 13,14 <SEP> + <SEP> 27 <SEP> * <SEP> <SEP> 12440 <tb> <SEP> Kontrolle <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> <SEP> 9 <SEP> - <SEP> 250 <tb> Desulfato- <SEP> 12.8 <SEP> ++ <SEP> 86 <SEP> + <tb> Hirudin <tb> Fraktionen des Kontrollstammes E. coli W3110#102 ("Kontrolle")) sind weder im Thrombin-Hemmtest noch im Antikörpertest aktiv. Solche Fraktionen werden erhalten durch Kultivierung des nicht-transformierten Stammes E. coli W31108102 unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 22 beschrieben, und durch Aufarbeitung der Kulturbrühe gemäss Beispiel 25. b.) Experimentelle Bedingungen Nr. 2: RP-HPLC Säule, Vydac 218 TP 5415 4,6 x 150 mm; 100 p1 (1:10 Konz.) Fraktion 6 (vgl. Beispiel 25) pro Trennung; AUFS 0,1 bei 214 nm; Durchflussgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluent: A: 0,1 % Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser 8:2 + 0.07 % Trifluoressigsäure. Gradient: 2 min 16 S B, dann während 3 min. auf 20 % B steigern, dann während 15 min auf 25 % B steigern, dann während 27 min. auf 64 % B steigern. Gegendruck 160 bar. In der folgenden Tabelle 2 sind die im Thrombin-Hemmtest und im Antikörpertest aktiven Fraktionen aufgelistet. Die Tabelle enthält weiterhin die Konzentrationen an NaCl in mM, die zur Eluierung der Fraktionen von einer Mono Q-Säule (Anionenaustauschchromatographie) erforderlich sind (vgl. Beispiel 24a), sowie die langwelligsten UV-Absorptionsbanden einiger Fraktionen. Alle Fraktionen zeigen zudem eine positive Reaktion mit anti-Hirudin-Antikörpern (vgl. Beispiel 30). Tabelle 2 EMI91.1 <tb> Fraktion <SEP> Reten- <SEP> Thrombin- <SEP> Anti- <SEP> FPLC <SEP> UV(X <SEP> ) <SEP> Ausbeute <tb> Nr. <SEP> tions- <SEP> Hemmung <SEP> % <SEP> körper <SEP> mM <SEP> max <SEP> <tb> <SEP> zeit <SEP> Test <SEP> hIcpm <SEP> <SEP> iN <SEP> NaCl <SEP> g <SEP> <tb> <SEP> (min.) <SEP> <tb> <SEP> RP-HPLC <tb> <SEP> 1 <SEP> 15,63 <SEP> 97,8 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 16'196 <SEP> 350 <SEP> 223s,274 <SEP> 4 <tb> <SEP> 2 <SEP> 16,83 <SEP> 91,9 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 14'157 <SEP> 390 <SEP> 275 <SEP> 1.6 <tb> <SEP> 3 <SEP> 18,43 <SEP> 79,9 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 9'257 <SEP> 1 <tb> <SEP> 4 <SEP> 19,6 <SEP> 81,7 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 11'877 <SEP> 420 <SEP> 1.5 <tb> <SEP> 5 <SEP> 20,6 <SEP> 50,4 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 7'647 <SEP> 460 <SEP> 1.5 <tb> <SEP> 6 <SEP> 21,53 <SEP> 66,1 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 9'584 <SEP> 500 <SEP> 273 <SEP> 1.5 <tb> Kontrolle <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 508 <tb> PBS- <SEP> - <SEP> - <SEP> 66 <tb> Puffer <tb> Desulfato- <SEP> 15,45 <SEP> 97,3 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 15'400 <SEP> 350 <SEP> 274 <SEP> ca. <SEP> 4 <tb> Hirudin <tb> Beispiel 27: Charakterisierung von Desulfatohirudin-Verbindungen aus der Fermentation des Stammes E. coli W3110102/pML310/1 I. Die Hirudin Verbindung aus Fraktion 14 (vgl. Beispiel 26 unter "Experimentelle Bedingungen Nr. 1", Tabelle 1) oder Fraktion 1 (vgl. Beispiel 26 "Experimentelle Bedingungen Nr. 2", Tabelle 2) wird wie folgt charakterisiert: a) Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung Ca. 2,5 g Hirudin-Verbindung werden mit 6 N HC1 bei 11000 während 24 h hydrolysiert und dann nach Chang et al. (DABS-Cl-Methode) (Zitat 31) analysiert. Das Hydrolysat weist die folgende Zusammensetzung auf. Aminosäure Hydrolisat Aminosäure Hydrolisat Asp 9,8 (9) Ile 1,8 (2) Thr 4,2 (4) Leu 3,9 (4) Ser 4,4 (4) Tyr 1,5 (2) Glu 12,6 (13) Phe 1 (1) Pro 3,7 (3) His 1.1 (1) Gly 9,3 (9) Lys 3,4 (3) Val 3,5 (4) Met O (O) Cystin 2,2 (3) Total (65) b) Partielle Sequenzanalyse 5 pg (750 pMol) der Hirudin-Verbindung wird einer klassischen Sequenzanalyse nach Edman unterworfen und die N-terminalen Phenylthiohydantoin (PTH)-aminosäuren mittels RP-HPLC bestimmt. Ergebnis: Cyclus 1 5 10 Aminosäure Val Val Tyr Thr Asp n.b. Thr Glu Ser Gly Cyclus 11 15 Aminosäure Gln Asn Leu n.b. Leu n.b. Glu (n.b. nicht bestimmt). Die N-terminale Sequenz der untersuchten biosynthetischen Hirudin Verbindung ist somit identisch mit derjenigen des natürlichen Hirudins (Zitat 1). c) Bestimmung der C-terminalen Aminosäuren mittels Carboxy peptidase Y-Abbau Der zeitabhängige Abbau der C-terminalen Aminosäuren mit Carboxypeptidase Y ergibt als C-Terminus 60 65 - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr - Leu - Gln Die Bestimmung der Aminosäuren erfolgte mit dem Aminosäureanalysator. Es ergibt sich, dass Tyr nicht sulfatiert ist (Desulfato-hirudin!). Bei dem Hauptprodukt der Fermentation des transformierten Stammes E. coli W3110A102lpML310/1 handelt es sich, wie die Strukturdaten und der Vergleich mit aus natürlichem Hirudin gewonnenen Desulfatohirudin beweisen, um Desulfatohirudin. II. Die Struktur der übrigen Fermentationsprodukte ist noch nicht vollständig geklärt. Bei den Fraktionen 2-6 (vgl. Tabelle 2) handelt es sich um definierte Verbindungen, die anhand der HPLC- und FPLC-Daten sowie des UV-Absorptionsmaximums ausreichend definiert sind. Mit Sicherheit handelt es sich bei diesen Verbindungen um Desulfatohirudin-ähnliche Verbindungen, die sich von Desulfatohirudin durch eine strukturelle Mikroheterogenität (z.B. unterschiedliche verknüpfte S-S-Brücken) oder durch Modifikation am Nbzw. C-Terminus unterscheiden (z.B. N-terminaler Methionyl-Rest oder N-terminal acyliert, wie formyliert oder acetyliert). Auch bei der Fermentation der Stämme E. coli LM1035/pML310/1, E. coli JA221/pML 310/1 und E. coli HB101/pML310 kann Desulfatohirudin als Hauptprodukt identifiziert werden. Beispiel 28: Herstellung von Desulfatohirudin aus natürlichem Hirudin zu Vergleichszwecken Natürliches Hirudin wird zu 2 mg/ml Puffer (0,1 M Ammoniumacetat, pH 5,5) gelöst. Zu 20 pg Hirudin (10 pl Lösung) werden 100 iil einer entsalzten Arylsulfatase (Boehringer)-Lösung gegeben, die 16 pg Arylsulfatase enthält. Man inkubiert bei 250C und verfolgt die Umsetzung mittels HPLC-Analyse. Nach 6 Stunden Inkubation sind über 90 % des Hirudins desulfatiert. Die Retentionszeit des gebildeten Desulfatohirudins beträgt unter den in Beispiel 26 ("Experimentelle Bedingungen a":) beschriebenen Bedingungen 12,8 min. und unter den in Beispiel 26 ("Experimentelle Bedingungen b") beschriebenen Bedingungen 15,45 min. Die Aminosäurezusammensetzung, die Sequenzanalyse mittels Edman Abbau und die Bestimmung der C-terminalen Aminosäuren durch Carboxypeptidase Y-Abbau ergeben das fiir Desulfatohirudin erwartete Ergebnis. Beispiel 29: Expression von Desulfatohirudin-Verbindungen in Hefe (S. cerevisiae) Die Expression von Fremdproteinen in Hefe erfordert ein definiertes Expressionssystem. Es soll einen starken Hefe-Promoter, bevorzugt einen induzierbaren Hefe-Promoter, und geeignete Transkriptionsstopsignale auf einem Plasmidvektor enthalten, mit dem Hefe zellen transformiert werden können. Der Vektor enthält auch DNA-Sequenzen, bevorzugt Hefe 2P Sequenzen, die extrachromosomale Replikation mit hoher Kopienzahl gewährleisten. Er soll ausserdem einen Selektionsmarker für Hefe, bevorzugt das Hefe LEU2 Gen, und pBR322 DNA Sequenzen mit Replikationsursprung und Selektionsmarker, bevorzugt das Ampicillin-Resistenzgen, für die Verwendung in E. coli enthalten. Solche Vektoren sind als sog. Shuttle-Vektoren für die Vermehrung in E. coli und Hefe geeignet. Ein Expressionssystem, das diese Voraussetzungen erfüllt, ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 100,561 beschrieben und mit Beispielen für effiziente Expression in Hefe belegt. Fremdgene werden unter der Kontrolle des induzierbaren PH05 Promoters der sauren Phosphatase aus Hefe exprimiert. PH05 Promoter, Fremdgen und PH05 Transcriptionsstop sind in Serie in dem Hefe Vektor pJDB207 integriert, der auch DNA Sequenzen des Hefe 2p Plasmids, das Hefe LEU2 Gen, das Ampicillin Resistenzgen und den E. coli Replikationsursprung enthält. Das Expressionsplasmid pJDB207R/PH05-HIR wird wie folgt hergestellt: a) Isolierung des pJDB207 Vektor Fragments: 6 pg des Plasmids pJDB207R/IF(a-3) (EP 100,561) werden mit der Restriktionsendonuclease BamHI komplett verdaut. Die entstehenden DNA Fragmente (6,85 kb und 1,15 kb) werden mit Aethanol gefällt und in 400 pl 50 mM TrisHCl pH 8.0 aufgenommen. 4,5 Einheiten Kälberdarm-Phosphatase (Boehringer, Mannheim) werden zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde bei 370C inkubiert, danach wird die Phosphatase bei 650C für 1,5 Stunden inaktiviert. Die Lösung wird auf 150 mM NsCl gebracht und dann auf eine DE52 (Whatman) Anionenaustauschersäule (100 pl Volumen) aufgetragen, die vorher mit 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA äquilibriert wurde. Nach einem Waschgang mit demselben Puffer wird die DNA mit 400 jil 1,5 M NaCl, 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 1 mM EDTA eluiert und mit Aethanol gefällt. Das grosse 6,85 kb BamHI Fragment wird vom kleinen Fragment auf einem 1,2 %igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8,3 abgetrennt. b) Isolierung des 534 bp PH05 Promoter Fragments 6 pg des Plasmids p311R (EP 100,561) werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Die entstehenden 3 DNA Fragmente werden auf einem 1,2 %igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8,3 getrennt. Das 534 bp BamHI-EcoRI Fragment wird isoliert. Es enthält den PHOS Promoter einschliesslich der Transkriptionsstartstellen. c) Isolierung eines 206 bp DNA Fragments mit der für Hirudin kodierenden Sequenz 9 pg des Plasmids pML310 (vgl. Beispiel 13c) werden mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI komplett verdaut. Die entstehenden zwei DNA Fragmente werden auf einem 1,2 %igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8,3 getrennt. Das 206 bp EcoRI-BamHI Fragment wird isoliert. d) Ligierung der DNA Fragmente: Die drei in Abschnitt a-c (s.o.) erwähnten DNA Fragmente werden aus Agarosegelblöcken durch Elektroelution gewonnen, über DES2 (Whatman) Anionen-Austauscher gereinigt, mit Aethanol gefällt und in H2O resuspendiert. 0,1 pMol (0,45 Fg) des 6,85 kb BamHI Vektor Fragments, 0,3 pMol (0,1 pg) des 534 bp BamHI-EcoRI PH05 Promoter Fragments und 0,25 pMol (34 ng) des 206 bp EcoRI-BamHI Fragments von pML310 werden in 15 pl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP mit 600 Einheiten T4 DNA Ligase (Biolabs) bei 1500 für 16 Stunden ligiert. 24 transformierte, amp Kolonien werden getrennt in LB Medium mit 100 pg/ml Ampicillin kultiviert. Plasmid DNA wird nach der Methode von Holmes et al. (32) isoliert und durch einen HindlII/EcoRI Doppelverdau analysiert. Das Auftreten eines ca. 600 bp grossen EcoRI-HindIII Fragments zeigt an, dass bei dem betreffenden Klon das PH05 Promoter-Hirudin DNA Fragment in der richtigen Orientierung zu den Transkriptionsstopsignalen auf dem Vektor vorliegt. Wie erwartet haben etwa 50 % der Klone die richtige Orientierung des Inserts. Einer dieser Klone wird als pJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet. e) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18: Saccharomyces cerevisiae Stamm GRAF18 (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, canR) wird mit dem Plasmid pJDB207R/PH05-HIR nach dem Protokoll von Hinnen et al. (12) transformiert. Für transformierte Hefezellen wird auf Agarplatten mit Hefe-Minimalmedium ohne Leucin selektioniert. Eine transformierte Hefekolonie wird isoliert und als Saccharomyces cerevisiae GRF18lpJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet. f) Züchten von S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHo5-HIR: Zellen von S. cerevisiae GRF181pJDB207R/PH05-HIR werden in 20 ml Hefe-Minimalmedium (Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren mit Zusatz von 2 Z Glukose und 20 mg/l L-Histidin) bei 300C geschüttelt und bis zu einer Zelldichte von 3.107 Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden in 0,9 Z NaCl gewaschen und dann zum Animpfen von 50 ml Kulturen in low Pi-Minimalmedium benutzt. Low Pi-Minimalmedium wird entsprechend der Zusammensetzung des Difco Yeast Nitrogen Base Mediums (ohne Aminosäuren) angesetzt, enthält 3edoch 0,03 gll KH2PO4, 1 gll KC1, 10 gil L-Asparagin anstelle von (NH4)2SO4, 2 X Glukose und 1 g/l L-Histidin. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4.106 Zellen/ml angeimpft und bei 30"C für 24 Stunden bei 200 upm geschüttelt. g. Analyse des Produktgemisches aus der Fermentation von S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-RIR Die Zellen (vgl. Beispiel 29f) werden wie üblich aufgeschlossen (vgl. z.B. Europäische Patentanmeldung Nr. 100,561). Der mit 1,5 % Essigsäure behandelte Ueberstand wird zentrifugiert und je 2 ml der klaren Lösung am "Speed Vac" Konzentrator und im Hochvakuum getrocknet. Die Proben werden einzeln in 100 pl Wasser gelöst und einer HPLC-Analyse (Bedingungen wie in Beispiel 26a) unterworfen. Die Thrombin-Hemmung der einzelnen Fraktionen wird getestet. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 12,8 min weist eine Thrombin Hemmung von 89,6 % auf. Gemäss Aminosäurezusammensetzung handelt es sich um Desulfatohirudin. Beispiel 30: Test-Kit mit monoklonalen anti-Hirudin-Antikörpern zur Bestimmung von Hirudin, kompetitiver Radio-Immunoassay a. Herstellung der monoklonalen Anti-Hirudin-Antikörper A) Immunisierung von Mäusen Reines Hirudin (3 mg) in lyophilisierter Form wird in wenig 0,1 X Essigsäure gelöst und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 3 ml ergänzt. Der pH wird auf 7,2 eingestellt. Portionen dieser Antigen-Lösung werden mit gleichen Mengen komplettem Freund's Adjuvans oder phosphatgepufferter Salzlösung gemischt. Weibliche Balb/c Mäuse (8 Wochen alt, erhalten von der Tierfarm Sisseln, Schweiz) werden durch Injektion von 100 pg Hirudin-Lösung in gepufferter Salzlösung intravenös injiziert. Vier Tage später wird die Milz für die Fusion entnommen. B) Herstellung der Hybridoma und Antikörper-Test Die Herstellung der Hybridomazellen erfolgt durch Verschmelzung der erhaltenen Milzzellen mit der Myeloma-Zellinie X63-Ag8.6.5.3 (26). Dabei werden 10 Milzzellen und 10 Myelomazellen eingesetzt. Die Fusion wird wie beschrieben (27) durchgeführt. Die Bestimmung der anti-Hirudin-Aktivität in den Hybridoma-Ueberständen erfolgt mit Hilfe eines Radioimmunoassays [RIA, (28)1. C) Isolierung und Reinigung der Anti-Hirudin-Antikörper aus Aszites Balb/c Mäuse werden intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan (Carl Roth) vorbehandelt. Nach einer Woche werden 2 bis 5x106 klonierte Hybridoma-Zellen intraperitoneal injiziert. Aszitische Flüssigkeit wird von jeder Maus wiederholt genommen und bei -80 C gefroren. Die gesammelte Flüssigkeit wird aufgetaut und 30 min. bei 40C mit 16 000 upm zentrifugiert. Das Fett wird abgesaugt und zum verbleibenden Debri-freien Ueberstand langsam unter Rühren bei OOC 0,9 Volumenäquivalente einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugetropft. Die erhaltene rohe Immunoglobulin-Fraktion wird unter Verwendung von 0,1 m TrisHCl (pH 8.2) durch Sephacryl G 2000 (Pharmacia), gemäss den Angaben des Herstellers, gegeben. Aktive Fraktionen werden vereinigt und mit Amicon XM50-Filter (Amicon) konzentriert. b. Test-Kit für kompetitiven Radio-Immunoassay Eine nach Beispiel 30aC) hergestellte Lösung von anti-Hirudin-Antikörpern wird mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS-Lösung) auf eine Konzentration von 1 pg pro 100 Pl verdünnt. 100 p1 dieser Lösung werden 2 Stunden bei 370C in Plastik-Röhrchen oder auf Plastik-Mikrotiterplatten inkubiert, wobei Antikörper unspezifisch auf die Plastikoberfläche adsorbiert werden. Zur Absättigung der noch freien aktiven Stellen auf der Plastikoberfläche wird mit einer Bovinserum-Albumin-Lösung (BSA-Lösung) nachbehandelt. Verdünnungsreihen einer Probelösung oder der Standardlösung in BSA-Lösung werden mit je 50 pl einer Lösung von nach bekannter Weise (29) mit radioaktivem 125Jod markiertem Hirudin der Aktivität 10 000 cpm pro S0 pl versetzt und dann auf der Plastikoberfläche 2 Stunden bei 370C und anschliessend 12 Stunden bei 40C inkubiert. Die Röhrchen oder Mikrotiterplatten werden mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und die Radioaktivität gemessen. Die Konzentration an Hirudin in der Probelösung wird durch eine mit Standardlösung gemessene Eichkurve bestimmt. Ein Test-Kit für den beschriebenen Radio-Immunoassay enthält: 2 ml Lösung von anti-Hirudin-Antikörper aus Beispiel 30aC) mit einer Konzentration von 1 bis 10 mg pro ml, 100 mol phosphatgepufferte Salzlösung (PBS-Lösung) 100 ml 0,3 % Bovinserum-Albumin und 0,1% Natriumazid in PBS-Lösung (BSA-Lösung), 2 ml Lösung von radioaktivem Hirudin der Aktivität 200 000 cpm/ml, 2 ml Standardlösung enthaltend 100 ng/ml Hirudin, 1 ml-Röhrchen oder Mikrotiterplatten aus Plastik. Beispiel 31: Pharmazeutisches Präparat enthaltend eine Desulfato hirudinverbindung für parenterale Applikation Eine Lösung, welche eine Desulfatohirudin-Verbindung gemäss Beispiel 27 enthält, wird gegen eine 0,9 %ige NaCl-Lösung dialysiert. Die Konzentration der Lösung wird danach durch Verdünnen mit der gleichen NaCl-Lösung auf 0,2 mg/ml oder 2 mg/ml eingestellt. Diese Lösungen werden durch Ultrafiltration (Membranen mit 0,22 pm Poren) sterilisiert. Die sterilisierten Lösungen sind direkt verwendbar, z.B. für die intravenöse Verabreichung. In analoger Weise werden parenteral applizierbare Lösungen hergestellt, die Mischungen von Desulfatohirudin-Verbindungen gemäss Beispiel 27 enthalten. Referenzen 1. J. Dodt et al., FEBS Letters 165, 180 (1984) 2. P. Walsmann et al., Pharmazie 36, 653 (1981) 3. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983) 4. K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 84, 489 (1972) 5. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 6. R.L. Letsinger and W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976) 7. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 8. H.G. Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976) 9. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982) 10. K. Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982) 11. A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977); siehe auch Neth. Enzym. 65, 499 (1980) 12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978) 13. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961) 14. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) 15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. II, 3. Auflage, S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim 1983. 16. F. Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 47, 226 (1982) 17. Köhler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) 18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125 19. W. Müller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978 > 20. M. Grunstein und D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979) 21. Ish-Horowitz, in loc. cit. 18), S. 368 22. DE-OS 3 111 405 (Genentech) 23. A.C. Peacock e-t al., Biochemistry 6, 1818 (1967) 24. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970) 25. P. Walsmann, Pharmazie 36, 860 (1981) 26. J.F. Kearney et al., J. 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Claims: An expression vector that contains a DNA sequence coding for desulphatohirudin of the formula which sequence is regulated by an expression control sequence in such a manner that the said desulphatohirudin is expressed in a microorganism transformed with that expression vector. An expression vector according to claim 1, in which the expression control sequence is that of the E. coli tryptophan operon. An expression vector according to claim 1, in which the expression control sequence is that of the yeast- PHO5 gene. A process for the manufacture of an expression vector according to any one of claims 1 to 3, characterised in that a DNA sequence coding for desulphatohirudin of the formula is inserted in such a manner into a vector DNA that contains an expression control sequence that the expression control sequence regulates the said DNA sequence. A microorganism that is transformed with an expression vector according to any one of claims 1 to 3. A transformed microorganism according to claim 5, wherein the microorganism is selected from a strain of Escherichia coli , Bacillus subtilis or Saccharomyces cerevisiae . A transformed Escherichia coli strain according to claim 5. A transformed Saccharomyces cerevisiae strain according to claim 5. A process for the manufacture of a transformed microorganism according to any one of claims 5-8, characterised in that a microorganism is transformed with an expression vector according to any one of claims 1-3. A process for the manufacture of biologically active desulfatohirudin of the formula and salts thereof, characterised in that microorganisms transformed with an expression vector that contains a DNA sequence coding for the said hirudin compound and regulated by an expression control sequence are cultivated in a liquid nutrient medium that contains assimilable carbon and nitrogen sources, and the said desulphatohirudin is freed from the host cells and isolated. A process according to claim 10, characterised in that a free desulphatohirudin obtained is converted into a salt thereof or a desulphatohirudin salt obtained is converted into the free compound. Claims for the following Contracting State: AT A process for the manufacture of an expression vector that contains a DNA sequence coding for desulphatohirudin of the formula which sequence is regulated by an expression control sequence in such a manner that the said desulphatohirudin is expressed in a microorganism transformed with that expression vector, characterised in that a DNA sequence coding for the said desulphatohirudin is inserted in such a manner into a vector DNA that contains an expression control sequence that the expression control sequence regulates the said DNA sequence. A process according to claim 1, characterised in that the expression control sequence is that of the E. coli tryptophan operon. A process according to claim 1, characterised in that the expression control sequence is that of the yeast- PHO5 gene. A process for the manufacture of a transformed microorganism that contains an expression vector that can be manufactured according to any one of claims 1-3, characterised in that a microorganism is transformed with an expression vector that contains a DNA sequence coding for desulphatohirudin of the formula and regulated by an expression control sequence. A process according to claim 4, characterised in that the microorganism is a strain of Escherichia coli , Bacillus subtilis or Saccharomyces cerevisiae . A process according to claim 4, characterised in that the microorganism is an Escherichia coli strain. A process according to claim 4, characterised in that the microorganism is a Saccharomyces cerevisiae strain. A process for the manufacture of biologically active desuphatohirudin of the formula and salts thereof, characterised in that microorganisms transformed with an expression vector that contains a DNA sequence coding for the said hirudin compound and regulated by an expression control sequence are cultivated in a liquid nutrient medium that contains assimilable carbon and nitrogen sources, and the said desulphatohirudin is freed from the host cells and isolated. A process according to claim 8, characterised in that a free desulphatohirudin obtained is converted into a salt thereof or a desulphatohirudin salt obtained is converted into the free compound.

Inventors: GRUETTER, MARKUS GERHARD, DR., LIERSCH, MANFRED, DR., MAERKI, WALTER, DR., MEYHACK, BERND, DR., RINK, HANS, Grütter, Markus Gerhard, Dr., Märki, Walter, Dr.
Applicants: CIBA-GEIGY AG, UCP GEN-PHARMA AG
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: A61K35, C12R1, C12N5, C07K16, C07H21, C12N15, C12N9, A61P7, C12N1, C07K14, C12P21, A61K38, C07K1