SIGNAL PEPTIDE FOR THE EXCRETION OF POLYPEPTIDES IN STREPTOMYCETES

Abstract: 1. Claims for the contracting states : BE. CH. LI. DE. FR. GB. IT. LU. NL. SE DNA sequence B, obtainable from Streptomyces tendae strains, which produce tendamistat and have preferably been treated with sublethal doses of acriflavine, by isolation of the complete DNA, digestion with Pst l, Southern hybridization with the DNA sequence A, 5'-(**32 P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' (A) isolation of the 2.3 kb Pst l fragment, cutting with BamHl, Southern hybridization with the sequence A, isolation of the 0.94 kb Pst l-BamHl subfragment, cutting with Sau 3a, Southern hybridization with the sequence A, isolation of the 0.525 kb BamHi-Sau 3a subfragment and sequencing of the DNA, and which has the following features : a) it is located immediately upstream of the tendamistat structural gene, b) it codes at the amino terminal end for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) it codes at the carboxyl terminal end for Ala-Ser-Ala and d) it codes in the middle for a hydrophobic region X which comprises 10 to 25, preferably 17 to 20, amino acids. 1. Claims for contracting state AT A process for the preparation of polypeptides composed of genetically codable amino acids, characterized by the expression, in a host cell of the genus Streptomyces, of a gene structure which contains in the reading frame with the structural gene for the desired polypeptide the DNA sequence B of a prepeptide, which sequence is obtainable from Streptomyces tendae strains, which produce tendamistat and have preferably been treated with sublethal doses of acriflavine, by isolation of the complete DNA, digestion with Pst l, Southern hybridization with the DNA sequence A, 5'-(**32 P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' (A) isolation of the 2.3 kb Pst l fragment, cutting with BamHI, Southern hybridization with the sequence A, isolation of the 0.94 kb Pst l-BamHl subfragment, cutting with Sau 3a, Southern hybriridization with the sequence A, isolation of the 0.525 kb BamHl-Sau 3a subfragment and sequencing of the DNA, and a) is located immediately upstream of the structural gene, b) codes at the amino terminal end for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) codes at the carboxyl terminal end for Ala-Ser-Ala and d) codes in the middle for a hydrophobic region X which comprises 10 to 25 amino acids.

Description: Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten Die Erfindung betrifft ein Signalpeptid, das Bestandteil eines Propeptids ist, welches in einer Streptomyceten-Zelle, die eine Signalpeptidase enthält, in das Signalpeptid und ein Polypeptid gespalten wird, wobei letzteres aus der Zelle entfernt und in das Kulturmedium ausgeschieden wird. Die Erfindung betrifft weiterhin DNA-Sequenzen, die für dieses Signalpeptid codieren, Genstrukturen, die diese DNA Sequenz im Lese rahmen mit einem Strukturgen enthalten, Plasmide, die eine solche Genstruktur enthalten sowie Wirtsorganismen mit solchen Plasmiden. Weitere Aspekte der Erfindung sowie deren bevorzugte Ausgestaltungen sind im folgenden näher erläutert. In der deutschen Patentanmeldung P 33 31 860.3 wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung von Tendamistat durch Fermentation von Streptomyces tendae vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Tendamistat produzierende S. tendae-Stämme eingesetzt werden, die mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden. Aus so erhaltenen Stämmen wurde ein DNA-Fragment mit dem Gen für Tendamistat isoliert, und zwar ein 2,3 kb-Pst I-Fragment. Durch Einbau dieses Fragments in mit Pst I geschnittenem pBR 322 konnte diese DNA in E. coli amplifiziert und wieder isoliert werden. Es wurde nun gefunden, dass auf diesem 2,3 kb-Fragment unmittelbar vor dem Strukturgen für Tendamistat das Signalpeptid (Präpeptid) der Formel I Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala (I) codiert ist, wobei X für einen hydrophoben Bereich steht, der 17 bis 20 Aminosäuren umfasst. Es wurde weiterhin gefunden, dass dieses Signalpeptid be fähig ist, auch andere Peptide aus Wirtszellen aus zu schleusen, die eine entsprechende Signalpeptidase enthalten. Die Erfindung betrifft deshalb auch Propeptide der Formel II Sig-R (11) in der Sig die Aminosäuresequenz der Formel I bedeutet und R für den Rest eines aminoterminal verknüpften genetisch codierbaren Peptids steht, bei dem vorzugsweise am Amino-Terminus eine saure Aminosäure, insbesondere Asparaginsäure, steht. Ein Aspekt der Erfindung betrifft somit Peptide der Formel II, in der R Wasserstoff oder einen Peptidrest, beispielsweise den Tendamistatrest, bedeutet. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die entsprechende DNA Sequenz, die erhältlich ist aus Tendamistat-produzierenden Streptomyces tendae-Stämmen, die mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden, durch Isolieren der Gesamt-DNA, Verdauen mit Pst 1, Southern-Hybridisierung mit der DNA- Sequenz A 5t 2P-)GCT TCA GTG TGG TCT TCG TA-3' (A) Isolieren des 2,3 kb-PstI-Fragments, Schneiden mit BamHI, Southern-Hybridisieren mit der Sequenz A, Isolieren des 0,94 kb-PstI-BamHI-Subfragments, Schneiden mit Sau 3a, Southern-Hybridisieren mit der Sequenz A, Isolieren des 0,525 kb-BarnHI-Sau 3a-Subfragments und Sequenzieren der DNA und die gekennzeichnet ist durch die Merkmale: a) sie liegt unmittelbar vor dem Tendamistat-Strukturgen, b) sie codiert am Amino-Terminus für et-Arg-Val-Arg-Ala-Leu- Arg, c) sie codiert am Carboxy-Terminus für Ala-Ser-Ala und d) sie codiert in der Mitte für einen hydrophoben Bereich, der 17 bis 20 Aminosäuren umfasst. Diese DNA-Sequenz wird im folgenden als Sequenz B bzw. Signalpeptid bezeichnet. Die durch Vergleich mit Standardmarkern ermittelten kb Zahlenwerte haben die übliche Genauigkeit. Anstelle der Sequenz A kann zur Southern-Hybridisierung eine beliebige, dem Tendamistatgen oder dem Gegenstrang komplementäre Sequenz gewählt werden. Für die verschiedenen Schritte zur Charakterisierung der DNA-Sequenz B wird in der Praxis jeweils die DNA in einen geeigneten Vector eingebracht, dieser in eine Wirtszelle transformiert, dort amplifiziert, durch Kolonie-Hybridisierung mit der Sequenz A die Transformanten ermittelt und die DNA reisoliert. Diese Schritte sind an sich bekannt. Die DNA-Sequenz C, deren codierender Strang im Anhang niedergelegt ist, zeigt die Nucleotidfolge des Tendamistat Strukturgens aus S. tendae. Die genannten Genstrukturen enthalten somit die DNA Sequenz B im Lese rahmen mit einem Strukturgen, welches beispielsweise für Tendamistat codiert, und zwar vorzugsweise die DNA-Sequenz C. Die Erfindung betrifft weiterhin Plasmide, die gekennzeichnet sind durch die DNA-Sequenz B, im Lese rahmen mit einem Strukturgen, welches beispielsweise für Tendamistat codiert, insbesondere für die DNA-Sequenz C. Diese Plasmide können ein in E. coli wirksames Replicon enthalten und sind dann befähigt, die DNA in E. coli zu amplifizieren und gegebenenfalls auch zu exprimieren. Bevorzugte Plasmide enthalten zusätzlich ein im Streptomyceten wirksames Replicon. Wird mit einem solchen Plasmid ein Streptomycet transformiert, so wird er befähigt, das durch das Strukturgen determinierte Peptid in Form des Propeptids der Formel II zu exprimieren, welches dann im Rahmen der Prozessierung durch eine Signalpeptidase gespalten und das gewünschte Peptid in das Kulturmedium exkretiert wird. Vorteilhaft sind auch sogenannte "Shuttle-Plasmide, die sowohl ein in E. coli als auch ein in Streptomyceten wirksames Replicon enthalten. Diese "Shuttle"-Vectoren können in E. coli amplifiziert und nach Reisolierung in Streptomyceten transformiert werden, wo dann die Produktion des gewünschten Polypeptids erfolgt. Die Erfindung betrifft auch Wirtsorganismen, die mit den genannten Plasmiden transformiert wurden, insbesondere Wirtsorganismen der Gattung Streptomyces, vor allem der Art S. tendae oder insbesondere S. lividans. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der allgemeinen Formel III H2N-R (III) in der R die bei Formel II genannte Bedeutung hat, bei dem man einen der genannten transformierten Wirtsorganismen einsetzt, welcher eine Signalpeptidase enthält, die das Propeptid der Formel II spaltet und das gewünschte Polypeptid sekretiert. Während es für gram-negative Bakterien eine Fülle von Vectoren gibt, sind für gram-positive Bakterien nur wenige Vectoren beschrieben. Vectoren für Bakterien der Art S. tendae sind bisher nicht bekannt. Die Erfindung ermöglicht somit einen Zugang für die Nutzung von S. tendae als Wirtsorganismen. Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass transformierte Streptomyces-Stämme, insbesondere S. lividans-Stämme, optimal versporen, das heisst der Gehalt an dem rekombinanten Plasmid beeinträchtigt diese Stämme in ihrer generativen Phase nicht. Die transformierten Organismen sind somit auch für weitere Stammverbesserungen geeignet, beispielsweise zur Herstellung und Selektion von metabolischen Mutanten, bei deren Herstellung mit Sporen gearbeitet wird. Gegenüber den bekannten Stämmen von S. tendae bilden die transformierten Stämme, insbesondere S. lividans, kein Melanin. Es entfällt somit dessen Abtrennung, was die Isolierung des erwünschten Peptids, beispielsweise Tendamistat, wesentlich erleichtert und Ausbeuteverluste verhindert. Ein weiterer Vorzug der Erfindung liegt darin, dass Fremdgene auch in S. lividans exprimiert werden und die entsprechenden Polypeptide exkretiert werden, was ebenfalls vielfältige Möglichkeiten zur Stammverbesserung und auch Modifizierung des so hergestellten Polypeptids bietet. Erfindungsgemäss können jedoch auch andere Streptomyces Arten transformiert werden, beispielsweise S. ghanaensis oder aureofaciens. Werden plasmidfreie Stämme, die in der Lage sind, eine spezifische Signalpeptidase zu synthetisieren, mit den erfindungsgemässen Hybridplasmiden transformiert, so werden stabile Transformanten erhalten, die das codierte Peptid exprimieren und sekretieren. Besonders bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, sofern nichts anderes vermerkt ist. Die Hybridplasmide darstellenden Figuren zeigen die Schnittstellen massstabsgerecht. In den Beispielen wurden die folgenden literaturbekannten Vectoren eingesetzt: Einzelstrang-Phagen M 13 mp 8 und M 13 mp 9: Messing et al., Gene 19 (1982) 269; pUC 8: Vierra et al., Gene 19 (1982) 259; pAC 177 und 184: Chang et al., J. Bacteriology 134 (1978) 1141; pIJ 102 und 350: Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223. Die Stammhaltung von 5. tendae ist in der US-Patentschrift 4 226 764 beschrieben. Die Isolierung des Tendamistatgens kann grundsätzlich aus jedem Tendamistat produzierenden Stamm erfolgen. Besonders vorteilhaft ist jedoch das Vorgehen gemäss der deutschen Patentanmeldung P 33 31 860.3, in deren Beispiel 3 die Isolierung der DNA beschrieben ist. Diese isolierte Gesamt-DNA ist das Ausgangsmaterial für das folgende Beispiel 1. Beispiel 1 5 tig DNA wird mit dem Restriktionsenzym Pst I komplett verdaut und nach Auftrennung in einem 0,8 S Agarose-Gel auf Nitrocellulose-Filter übertragen (Southern-Transfer). Der Filter mit der gebundenen, denaturierten DNA wird 6 Stunden in 5 ml Vorhybridisierungsmedium (0,6 M NaCl, o,o6 M Na-EDTA, 0,1 % Natriumdodecylsulfat-Lösung, 100 iig/ml ultraschallbehandelter Kalbsthymus-DNA und 4nach konzentrierter Denhardt-Lösung) vorhybridisiert. Anschliessend wird erneut mit 5 ml des Vorhybridisierungsmediums behandelt, dem jedoch 500 000 cpm/ml radioaktiv markierter DNA zugesetzt sind. Diese radioaktiv markierte Probe wird wie folgt erhalten: Die DNA- Sequenz A wird chemisch nach dem Phosphit-Verfahren synthetisiert. Sie enthält 20 Nucleotide (Molgewicht etwa 13 000) und ist komplementär zur putativen DNA-Sequenz für Tendamistat, abgeleitet von der Aminosäure sequenz von Tendamistat ab Aminosäure 37 des Tendamistats unter Gebrauch der von E. coli bevorzugten Tripletts. Diese DNA-Sequenz A wird an 5'-Ende mit Hilfe von t-32P-ATP und Nucleotid-Kinase radioaktiv markiert. Zur Hybridisierung dieser radioaktiven Probe zur komplementären DNA-Sequenz in der Gesamt-DNA lässt man das Gemisch 24 Stunden bei 370C stehen. Danach wird die nichtgebundene radioaktive DNA entfernt und der Filter bei 370C 5 x jeweils 30 Minuten mit Je 200 ml Hybridisierungsmedium gewaschen und anschliessend autoradiographiert. Nach 24 Stunden Exposition zeigen die Hybridisierungssignale, dass das Gen auf einem 2,3 kb Pst Fragment liegt. Dieses Fragment wird durch Elektroelution eines dieser Fragmentgrösse entsprechenden Anschnittes aus einem präparativen Agarose-Gel gewonnen, auf dem PstI-verdaute Gesamt-DNA aufgetrennt wurde. Die eluierte DNA wird in die Pst I- Schnittstelle des Plasmids pUC 8 kloniert. Diese Hybridplasmide werden in E. coli JM 103 transformiert und amplifiziert. Der Nachweis derjenigen Klone, die die gesuchte Insertion mit dem Tendamistat-Gen tragen, wird durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung der radioaktiven DNA-Probe A geführt. Die so erhaltenen Hybridplasmide pKAI 1 a bzw. 1 b sind auf der Fig. 1 a und b dargestellt. Durch weitere Southern-Hybridisierungen gegen das isolierte 2,3 kb Pst Fragment und dessen Subfragmente lässt sich die Lokalisation des Gens exakt ermitteln (Fig. 2a bis 2c). Beispiel 2 In die singuläre Schnittstelle des Plasmids pIJ 102 für Pst I wird das 2,3 kb Pst Fragment aus S. tendae kloniert. Die so erhaltenen Hybridplasmide pAX 1 a und 1 b, die sich durch die Orientierung der Insertion unterscheiden, befähigen nach Transformation in S. lividans Stämme diese zur Produktion von Tendamistat. Fig. 3 zeigt das Plasmid pAX 1 a. Beispiel 3 Der handelsübliche Stamm S. lividans TK 24 (John Innes Institute, Norwich, England) wird in bekannter Weise in Protoplasten überführt und 1 llg Hybridplasmid pAX 1 a mit 108 Protoplasten unter Zusatz von 20 % Poly- ethylenglykol 6000 versetzt. Die transformierten Protoplasten werden auf Regenerationsmedium R2YE (Thompson et al., Nature 286 (1980) 525) bei 30"C 5 Tage bebrütet. Der Nachweis, dass ein extrazellulärer Amylase-Inaktivator gebildet wurde, kann durch einen Plattentest erfolgen: Die regenerierten Kolonien werden mit 5 ml einer 0,4 bis 1,0 mg/ml Pankreatin enthaltenden wässrigen Lösung übergossen und 1 Stunde bei 37-C inkubiert. Die Lösung wird dann entfernt und durch 5 ml eines 2 eigen Stärke-Agars ersetzt. Nach 2 Stunden Inkubation bei 370C werden die Platten mit 5 ml einer Jod-Kaliumjodid-Lösung zur Entwicklung übergossen. Kolonien mit einem blauen Hof zeigen an, dass die Klone Tendamistat synthetisieren und exkretieren. Zur Kontrolle kann aus Tendamistat produzierenden, gut sporulierenden Stämmen die Plasmid-DNA isoliert und kartiert werden. Alle Tendamistat produzierenden Stämme weisen die eingesetzte Plasmid-DNA auf. Beispiel 4 Man verfährt gemäss Beispiel 2, setzt jedoch das Plasmid pIJ 350 ein, das als Selektionsmarker in Streptomyceten ein Thiostrepton-Resistenzgen trägt. Man erhält so die Hybridplasmide pAX 350 a und b (die sich durch die Orientierung der Insertion unterscheiden). Fig. 4 zeigt das Plasmid pAx 350 a. Nach Transformation gemäss Beispiel 3 werden auf Minimalmedium (Hopwood, Bacteriological Reviews 31 (1967) 373 403) in Gegenwart von 50 llg/ml Thiostrepton resistente Klone selektiert und entweder direkt auf Minimalmedium oder nach Umstempeln auf nicht selektiven R2YE-Agar auf Tendamistat-Produktion getestet. Beispiel 5 Hybridplasmide, die das 2,3 kb Pst Fragment enthalten und ausser dem Streptomyceten-Replicon auch ein E. coli Replicon enthalten, weisen als "Shuttle"-Vectoren eine Reihe von Vorteilen auf: Auf Grund des E. coli-Replicons und in E. coli wirksamen Resistenzmarkern können sie in diesen Organismen gut amplifiziert werden. Nach Isolierung und Transformation in Streptomyceten, insbesondere S. lividans, zeigen sie eine hohe Stabilität. In Folge ihrer im Streptomyceten wirksamen Selektionsmarker und des Streptomyceten-Replicons können sie auch in diesen Organismen gut amplifiziert werden und exprimieren und sekretieren Tendamistat. Das Plasmid pAC 184 wird komplett mit dem Restriktionsenzym Sal I verdaut und das Enzym durch Phenol-Chloroform-Extraktion entfernt. Die überhängenden 5'-Enden werden in Gegenwart von ATP, CTP, GTP und TTP mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) aufgefüllt. An die stumpfen Enden (blunt ends) wird in einer Ligase Reaktion bei 1600 ein Pst I-Linker der Struktur 5'TCG AGC TGC AGC TCG A 3' 3'AGC TCG ACG TCG AGC T 5' ligiert (2 llg Linker auf 0,4 wg DNA). Die DNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert und nach Fällung mit dem Enzym Pst I zur Gewinnung ligierbarer Pst I-Enden verdaut. Die DNA wird anschliessend dephosphoryliert, erneut mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit partiell Pst I- verdautem Plasmid pAX 1 a ligiert. Das Ligationsgemisch wird in E. coli (HB 101 bzw. MC 1061) transformiert. Gegen Chloramphenicol resistente Klone werden von der Platte abgeschwemmt und die DNA isoliert. S. lividans TK 24 wird mit 1 bis 2 iig DNA transformiert und auf Tendamistat-Produktion hin geprüft. Im Tendamistat-Test positiv reagierende Klone werden isoliert, die Plasmid-DNA durch alkalische Schnell-Lyse isoliert und in E. coli HB 101 bzw. MC 1061 rücktransformiert. Nach Amplifizierung reisolierte Plasmide unterscheiden sieh nicht von den aus S. lividans-StEmmen isolierten Plasmiden. Je nach Orientierung der Insertion, die das Tendamistat-Gen trägt, werden die rekombinanten Plasmide als pSA 2 a oder b bezeichnet (Fig. 5 a und b). Beispiel 6 Verfährt man gemäss Beispiel 5, geht jedoch vom Plasmid pAX 350 a aus, selektioniert in E. coli auf Chlor amphenicol-Resistenz und in S. lividans auf Thiostrepton Resistenz und Tendamistat-Produktion, so erhält man die Plasmide pSA 351 a bzw. b (Fig. 6 a/b). Beispiel 7 Verfährt man gemäss Beispiel 5, geht jedoch an Stelle des Plasmids pAC 184 von pAC 177 aus, so erhält man die Plasmide pSA 3 a bzw. b (Fig. 7 a/b). Hierzu wird das Plasmid pAX 1 a partiell mit Pst I gesehnitten und das Enzym durch 15 minütiges Erhitzen auf 680C hitzeinaktiviert. Die DNA wird in das mit Pst I geschnittene dephosphorylierte und deproteinierte Plasmid pAC 177 ligiert. Nach Transformation von E. coli HB 101 bzw. MC 1061 werden gegen Kanamycin resistente Klone von der Platte abgeschwemmt, die Plasmid-DNA isoliert und S. lividans TK 24 mit 1 bis 2 g dieser DNA transformiert. Tendamistat produzierende Klone werden selektioniert und die Plasmide charakterisiert. Beispiel 8 Verfährt man gemäss Beispiel 7, setzt jedoch an Stelle des Plasmids pAX 1 das Plasmid pAX 350 a ein und selektioniert in S. lividans auf Thiostrepton-Resistenz, so erhält man die Plasmide pSA 352 a bzw. b (Fig. 8 a/b). Beispiel 9 Wie sich aus Fig. 2 ergibt, ist das für Tendamistat und die Signalsequenz codierende Gen - 0,3 kb gross. Das in den vorstehend beschriebenen Beispielen eingesetzte 2,3 kb-Fragment kann also in verkürzter Form zur Konstruktion von Hybridplasmiden eingesetzt werden, die die Produktion von Tendamistat bewirken: Das Plasmid pKAI 1 a wird mit Sal I verdaut und religiert. Man erhält so das um ca. 750 Basenpaare verkürzte Plasmid pKAI 2. Dieses wird kloniert, isoliert und mit Pst I geschnitten. Die DNA wird mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert und mit Phenol-Chloroform deproteinisiert. Das Plasmid pIJ 102 wird komplett mit Pst I geschnitten und die Fragmente nach Hitze-Inaktivierung des Enzyms in die Pst I-Schnittstelle von pKAI 2 ligiert. Das Ligationsgemisch wird in E. coli HB 101 oder MC 1061 transformiert. Die Plasmid-DNA aus gegen Ampicillin resistenten Klonen wird durch alkalische Schnell-Lyse-Verfahren isoliert und S. lividans TK 24 mit 1 bis 2 jig dieser DNA transformiert. Man selektioniert auf Tendamistat-Produktion und isoliert die Plasmid-DNA dieser Klone durch alkalische Schnell Lyse. Durch Rücktransformation in E. coli HB 101 bzw. MC 1061 und nach Isolierung der Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli-Stämmen charakterisiert man das Plasmid pSA 1 durch Restriktionsanalyse (Fig. 9). Das Plasmid zeigt keinen Unterschied zu den aus S. lividans Stämmen isolierten Plasmiden, jedoch ist die DNA-Aufarbeitung aus E. coli ergiebiger und in kürzerer Zeit möglich. Beispiel 10 Verfährt man gemäss Beispiel 9, setzt jedoch an Stelle des Plasmids pIJ 102 das Plasmid pIJ 350 ein, wobei in S. lividans dann zusätzlich nach der Thiostrepton-Resistenz selektioniert werden kann, so erhält man die Plasmide pSA 350 a bzw. b. Die Fig. 10 zeigt das Plasmid pSA 350 a. Dieses Plasmid führt in der Schüttelkultur zu höheren Ausbeuten an Tendamistat als das Plasmid pSA 350 b, das die Insertion mit dem Tendamistat-Gen in umgekehrter Orientierung enthält. Hingegen hat die Verkleinerung der Insertion auf 1,5 kb keinen signifikanten Einfluss auf die Produktbildung. Beispiel 11 Zur Ermittlung der Struktur und Nucleotidsequenz des Tendamistat-Gens wurde das 0,94 kb Pst I-Bam HI-Subfragment (Fig. 2 a und b) sowie das 295 bp Sau 3a-Bam HI Subfragment (Fig. 2c) in die Einzelstrangphagen M 13 mp 8 und M 13 mp 9 kloniert. Als Primer für die Di-Deoxy Sequenzierreaktion diente die 20 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz A sowie ein kommerziell erhältlicher 15 bp Primer (Bethesda Research Laboratories GmbH, Neu-Isenburg). Es wurde die DNA-Sequenz C ermittelt. Beispiel 12 Vor dem Strukturgen von Tendamistat befindet sich auf der DNA ein offener Leserahmen bis zum Startcodon ATG (Met) für ein Protein, das dem aminoterminalen Ende von Tendamistat nahtlos vorgelagert ist. Diesem Signalpeptid entspricht die DNA-Sequenz B. Anhang: DNA-Sequenz C (codierender Strang) 5 10 5'-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro Ser Cys Val 15 20 ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC Thr beu Tyr Gln Ser Trp Arg Tyr Ser Gln Ala sp 25 30 35 AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC Asn Gly Cys Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Val Val 40 45 TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC Tyr Glu Asp Asp Th Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Val so ss so GCh CCG GGC CAC ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC Ala Po Gly Gln Ile Tnr Thr Val Gly Asp G1 Tyr 65 70 AvC GGC TCG CAO GGC CAC GCG CGC <RTI ID=13.12> TAO CTG GCT CGC Ile Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Ag TGC CTT TAG-3' Cys Leu Stp Beispiele 1 und 3 der deutschen Patentanmeldung P 33 31 860.3: Beispiel 1 Mutations-Verfahren: Ca. 0,25 cmê versporten Mycels des Stammes DSM 2727, der auf Haferflockenagar angezüchtet wird (EP-A 49 847), werden in 100 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die mit 25 ml des folgenden Kulturmediums gefüllt sind: Sojamehl 2 % Glucose 3 % Maisstärke 0,2 % Harnstoff 0,1 % Ammoniumcitrat 0,1 % Malzextrakt 0,5 S KH2PO4 0,2 % Das Medium wird 30 Minuten bei 121 0C und 1 Bar autoklaviert, der pH-Wert beträgt 7,0. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 30 C auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Dann werden 2 ml der gewachsenen Vorkultur in 20 ml Hauptkulturmedium, das sich in 100 ml Erlenmeyer-Kolben befindet (EP-A 49 847), überimpft: lösliche Stärke 2 - 4 S Sojamehl 0,4 % Cornsteep flüssig 0,4 S Magermilchpulver 0,7 S Glucose 1,0 % (NH4)2RPo4 1,2 S Der pH-Wert des Mediums beträgt nach dem Autoklavieren pH 7,6. Diesem Medium wird Acriflavin in einer Konzentration von 10 25 ,ug/ml als mutagenes Agens zugesetzt. Die Kultur wird für 5 Tage bei 28 C und 220 U/min geschüttelt. Danach wird die Kulturlösung zentrifugiert (1 300 g, 5 Minuten) und das Zellpellet in Hauptkulturmedium gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden mit einem Glashomogenisator fragmentiert und auf Agarpiatten mit folgendem Medium ausplattiert: Rohrzucker 0,3 S Dextrin 1,5 S NaCI 0,05 % K2HP04 0,05 % FeS04 x 7 H20 0,001 % Tryptone Soja 0,5 % Broth (Fa. Oxoid) Fleischextrakt 0,1 % (Fa. Difco) Hefeextrakt 0,2 % (Fa. Difco) Agar (Fa. Merck) 1,5 % Der pH-Wert der Lösung beträgt 7,1 (Autoklavierungsbedingungen wie oben). Die Platten werden 5 Tage bei 280C bebrütet und Einzelkolonien in Schrägröhrchen mit Haferflockenagar überimpft. Diese werden wie beschrieben bebrütet, bis das Mycel versport ist. Das versporte Mycel wird wie oben beschrieben in der Vorund Hauptkultur venmirt und das Kulturfiltrat nach 5-tägiger Hauptkultur auf seinen Gehalt an Tendamistat geprüft (vgl. EP-A 49 847). Auf diese Weise können die Stämme I-9353, I-9362, In9417, I-9418 selektioniert werden, die in ihrer Wachstumsperiode unter den beschriebenen Bedingungen ca. 90 000 - 100 000 IE Tendamistat/l Kulturlösung, entsprechend 1,5 - 1,8 g lnaktivator/l produzieren. Beispiel 3 Isolation der Desoxyribonucleinsäure aus S. tendae und deren molekularbiologische Charakterisierung. Die Anzucht der Zellen erfolgt entsprechend Beispiel 1. Nach 3-tägigem Wachstum im Hauptkulturmedium werden die Zellen eines Erlenmeyer-Kolbers durch 5-minütige Zentrifugation bei 3000 g bei 4 C geerntet und zweimal mit 50 ml einer Lösung aus 50 mM Tris/HCl-Puffer, 100 mM NaCl und 25 p EDTA gewaschen. Bei einer typischen Präparation werden 3 g fest-zentrifugierter Zellen in flüssigem Stickstoff bei -1980C schockartig tiefgefroren und anschliessend mit einem Schneidmesserhomogenisator (Warring Commercial Blender) in Gegenwart von N2 zu einem feinen Pulver homogenisiert. Dieses Pulver wird in 10 ml des genannten Puffers aufgenommen, auf Eis gelöst und mit 0,8 ml Lysozymlösung (30 mg/ml) 20 Minuten bei 28 C unter leichtem Schütteln inkubiert. Der Suspension wird dann 0,8 ml einer Proteinase K-Lösung (15 mg/ml) und 0,8 ml einer 20 % Lösung des Natriumsalzes von N-Lauroylsarcosin zugefügt. Nach vorsichtigem Hischen wird das Gemisch 30 Minuten auf Eis und weitere 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Zugabe und Lösung von 22 g festem Caesiumchlorid wird das Volumen mit dem obengenannten Puffer auf 22 ml eingestellt und die Suspension bei 12 000 g und 4 C 25 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit Ethidiumbromid versetzt und derBrechungs- index mit CsCl refraktometrisch auf n= 1,3920 eingestellt. Nach präparativer Ultrazentrifugation (120 000 g, 36 Std., 150c) wird die Bande chromosomaler DNA aus den Zentrifugenröhrchen entnommen und unter denselben Bedingungen rezentrifugiert. Die isolierte Bande wird durch Ausschütteln mit n-Butanol vom Ethidiumbromid befreit und zur restlosen Entfernung des CsCl dialysiert. Die so gewonnene DNA ist schneidbar z.B. mit den Enzymen Pst I, Bam H I, Sau 3A sCla I, Bgl II und Xho I, und nicht schneidbar z.B. mit den Endonukleasen Eco R I und Hind III. Die beispielsweise aus den Mutanten I-9353 und I-9362 gewonnene DNA ist gegenüber der DNA von ATCC 31210 bzw.DSM 2727 charakterisiert durch ein amplifiziertes genetisches Element, dessen Einzelfragmente deutlich sichtbar nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid aus dem Hintergrund nicht selektiv vermehrter Fragmente hervor treten. Die Grösse des amplifizierten Elementes sowie die charakteristischen Einzelfragmente nach Verdauung mit Restriktionsendonukleasen sind nachfolgend wiedergegeben: EMI17.1 <tb> Fragment <SEP> Fragmentgrösse <SEP> (kbp) <tb> <SEP> Nr. <SEP> Pst <SEP> I <SEP> Xho <SEP> I <SEP> Bam <SEP> H <SEP> I <tb> <SEP> 1 <SEP> 9,0 <SEP> 13,5 <SEP> 7,2 <tb> <SEP> 2 <SEP> 7,0 <SEP> 11,5 <SEP> 6,1 <tb> <SEP> 3 <SEP> 6,8 <SEP> 9,3 <SEP> 5,3 <tb> <SEP> 4 <SEP> 4,6 <SEP> 2,8 <SEP> 2,9 <tb> <SEP> 5 <SEP> 3,4 <SEP> 0,7 <SEP> 2,6 <tb> <SEP> 6 <SEP> 3,1 <SEP> 2,5 <tb> <SEP> 7 <SEP> 2,3 <SEP> 2,15 <tb> <SEP> 8 <SEP> 1,1 <SEP> 2,1 <tb> <SEP> 9 <SEP> 1,5 <tb> <SEP> 10 <SEP> 1,2 <tb> <SEP> 11 <SEP> 1,1 <tb> <SEP> 12 <SEP> 1,0 <tb> <SEP> 13 <SEP> o,8 <tb> <SEP> 14 <SEP> 0,5 <tb> <SEP> 15 <SEP> 0,48 <tb> Gesamt <SEP> 37,3 <SEP> 37,8 <SEP> 37,43 <tb>

Claims: Patentansprüche: 1. Peptid der allgemeinen Formel Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala-R in der R Hydroxy oder den Rest eines genetisch codierbaren Peptids bedeutet und X für einen hydrophoben Bereich steht, der 10 bis 25, vorzugsweise 17 bis 20, Aminosäuren umfasst. 2. DNA-Sequenz, die für das Peptid nach Anspruch 1 codiert. 3. DNA-Sequenz B, erhältlich aus Tendamistat-produzieren den Streptomyces tendae-Stämmen, die vorzugsweise mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden, durch Isolieren der Gesamt-DNA, Verdauen mit Pst I, Southern Hybridisierung mit der DNA- Sequenz A 5'-(32P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' (A) Isolieren des 2,3 kb-PstI-Fragments, Schneiden mit BamHI, Southern-Hybridisieren mit der Sequenz A, Iso lieren des 0,94 kb-PstI-BamHI-Subfragments, Schneiden mit Sau 3a, Southern-Hybridisieren mit der Sequenz A, Isolieren des 0,525 kb-BamHI-Sau 3a-Subfragments und Se quenzieren der DNA, gekennzeichnet durch die Merkmale: a) sie liegt unmittelbar vor dem Tendamistat-Strukturgen, b) sie codiert am Amino-Terminus für Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) sie codiert am Carboxy-Terminus für Ala-Ser-Ala und d) sie codiert in der Mitte für einen hydrophoben Bereich, der 10 bis 25, vorzugsweise 17 bis 20, Aminosäuren umfasst. 4. Genstruktur, enthaltend die DNA-Sequenz B, vorzugsweise unmittelbar im Leserahmen mit einem Strukturgen, insbe sondere dem Strukturgen für Tendamistat, vor allem der DNA-Sequenz C. 5. Plasmid, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 bis 4, vorzugsweise mit einem in Streptomyce ten wirksamen Replicon und/oder einem in E. coli wirk samen Replicon. 6. Wirtsorganismus, vorzugsweise der Gattung Streptomyces, insbesondere der Art S. tendae oder S. lividans, ent haltend ein Plasmid nach Anspruch 5. 7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Wirtsorganismus nach Anspruch 6 einsetzt, der eine Signalpeptidase ent hält, welche das der DNA-Sequenz B entsprechende Prä peptid abtrennt. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadruch gekennzeichnet, dass das Polypeptid nach Abtrennung des Präpeptids aus der Zelle ausgeschleust wird. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Wirtsorganismus mit einem Plasmid ein setzt, das eine Genstruktur nach Anspruch 4 enthält. Patentansprüche Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden aus genetisch codierbaren Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Wirtszelle der Gattung Streptomyces eine Genstruktur exprimiert, die im Leserahmen mit dem Struk turgen für das gewünschte Polypeptid die DNA- Sequenz eines Praepeptids enthält, welches a) unmittelbar vor dem Strukturgen liegt, b) am Amino-Terminus für Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg codiert, c) am Carboxy-Terminus für Ala-Ser-Ala codiert und d) in der Mitte für einen hydrophoben Bereich codiert, der 10 bis 25 Aminosäuren umfasst. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA des Praepeptids in der Mitte für einen hydropho ben Bereich codiert, der 17 bis 20 Aminosäuren umfasst. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für das Praepeptid aus S. tendae isoliert ist. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle von der Art S. tendae oder S. livi dans ist. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeich net, dass die Wirtszelle eine Signalpeptidase enthält, welche das Praepeptid abspaltet, und das gewünschte Poly peptid in das Kulturmedium ausscheidet. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Genstruktur in die Wirtszelle mit einem Plasmid eingebracht wird, das ein in Streptomyceten wirksames Replicon enthält. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid ausser dem in Streptomyceten wirksamen Replicon ein in E. coli wirksames Replicon enthält. 8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturgen für Tendamistat codiert. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturgen die DNA-Sequenz C (Anhang) aufweist.

Inventors: KOLLER, KLAUS-PETER, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C07K7
IPC codes: C12N15, C12N1, C07K14, C12P21, C07H21, C12R1