BIOCATALYST AND PROCESS FOR PREPARING IT

Abstract: Biocatalysts which are produced in the form of beads, filaments, lattices etc., with or without a mechanical support, and whose enzymatically active substances are immobilised in a crosslinked gel produced from an aqueous phase, are produced, in order to prevent the washing out of the enzymatically active substances, using a protective layer which is free of enzymatically active substances and is composed of a crosslinked gel having no permeability for the enzymatically active substances, and which envelops the core containing the active substances.

Description: Biokatalysator und Verfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Biokatalysators mit immobilisierten, enzymatisch aktiven Substanzen, bei dem die enzymatisch aktiven Substanzen in eine durch Vernetzung zum Gel werdende aus einer wässrigen Phase gebildeten Flüssigkeit eingebracht werden und anschliessend durch Vernetzung der Biokatalysator in Form von Perlen, Fä- den, Gittern usw. mit oder ohne einen mechanischen Träger gebildet wird. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Biokatalysator mit in einem vernetzten Gel immobilisierten, enzymatisch aktiven Substanzen. Die enzymatisch aktiven Substanzen können dabei durch Zellen, Organellen und Enzyme sein. Biokatalysatoren werden für die verschiedensten Anwendungsgebiete eingesetzt. Mit ihnen lassen sich beispielsweise Arzneimittel, wie Antibiotika, oder Äthanol herstellen, Ab wässer reinigen o. dgl. Bekannt ist der Einsatz der entsprechenden Zellen bei der Sektherstellung, wo durch Zugabe von Hefe eine zweite Gärung in Gang gebracht wird. Diese Gärung wird in grossen Tanks oder in der Sektflasche vorgenommen. Diese Verfahren gestalten sich dadurch besonders aufwendig, dass die freien, aktiven Zellen nach der Durchführung der Gä rung aus der Flüssigkeit entfernt werden müssen. Bei der Flaschengärung werden die Flaschen hierzu gerüttelt und nach und nach auf den Kopf gestellt, so dass sich die Zellen im Flaschenhals absetzen. Durch Vereisung des Flaschenhalses wird mit den Zellen ein entfernbarer Pfropfen gebildet. Bei der Tankgärung muss eine Filtration des Sektes vorgenommen werden. Es ist seit einiger Zeit bekannt, für derartige Anwendungsfälle für Biokatalysatoren immobilisierte Zellen zu verwenden. Diese Zellen sind durch geeignete Massnahmen an einen Ort gebunden, bleiben aber weiterhin lebensfähig und aktiv. Nach der Durchführung der mikrobiologischen Reaktion können sie zusammen mit der Immobilisierungsmasse im allgemeinen leicht entfernt werden. Es ist bekannt, eine derartige Immobilisierung durch in wässriger Phase vernetzende Gele zu bewerkstelligen (vgl. Klein, Wagner ethods for the Immobilization of Microbial Cells" in Applied Biochemistry and Bioengineering 1983 Vol. 4, Seiten 11 - 51). In der Praxis hat es sich jedoch gezeigt, dass für längerwährende Vorgänge, wie beispielsweise die Sektgärung, die durch die Immobilisierung angestrebten. Effekte nicht erzielt werden. Es zeigt sich nämlich, dass die Zellen aus dem Immobilisierungsmaterial "auswachsen". Zwar verhindern die Gele durch ihre Netzstruktur ein Auswandern der eingeschlossenen Zellen, es lässt sich aber nicht vermeiden, dass bei der Herstellung der Gele auch Zellen an der Oberfläche des Biokatalysators sitzen. Diese finden gegenüber den eingeschlossenen Zellen begünstigte Ernährungsbedingungen vor und vermehren sich wesentlich stärker als die eingeschlossenen Zellen. Diese Zellen nehmen als freie Zellen am Gärungsvorgang teil und gelangen in die Flüssigkeit und führen zu einer erheblichen Trübung. Ein unter der Bezeichnung "Mikrokapselung" bekanntes Verfahren eignet sich zur Immobilisierung der Zellen nicht, weil hierbei ein Polymer in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden muss, das die Zellen praktisch vollständig abtötet. Die verbleibende Aktivität des Katalysators würde in den mei- sten Fällen nicht ausreichen. Darüber hinaus lässt sich auch bei der Mikrokapselung ein Auswachsen der Zellen nicht sicher verhindern. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Biokatalysator zu erstellen, bei dem ein Auswachsen der enzymatisch aktiven Substanzen, insbesondere Zellen, bzz. ein Auswaschen von Enzymen auch bei Langzeitverfahren sicher verhindert tjrd. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss mit dem eingangs erwähnten Verfahren dadurch gelöst, dass die Oberfläche des Biokatalysators durch eine von den aktiven Substanzen freie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die aktiven Substanzen aufweisenden Gel gebildet wird, die den die aktiven Substanzen enthaltenden Kern umschliesst. Erfindungsgemäss wird der Biokatalysator mit einer zusätzlichen Schicht aus einem vernetzten Gel umgeben, die so hergestellt wird, dass sie keine enzymatisch aktiven Substanzen aufweist, so dass die Oberfläche des Biokatalysators mit Sicherheit frei von aktiven Substanzen ist. Als Gele für die Immobilisierung können dabei sowohl Gele verwendet werden, die durch Temperaturerniedrigung vernetzen als auch solche Gele, die den Zusatz eines besonderen Vernetzungsmittels benötigen. Der die enzymatisch aktiven Substanzen enthaltende Kern kann in herkömmlicher Weise gebildet sein, also bereits in einem Gel immobilisierte Zellen aufweisen. Die Bildung geschieht dabei vorzugsweise durch Einbringen der mit den en zymatisch aktiven Zellen versehenen gelbildenden Flüssigkeit in ein Vernetzungsmittel, wodurch beispielsweise Perlen o. ä. gebildet werden. Unter Ausnutzung des in dem Kern noch befindlichen Vernetzungsmittels wird die Anordnung nunmehr vor zugsweise in dieselbe gelbildende Flüssigkeit getaucht, wie sie für den Kern verwendet worden ist. Unter Einwirkung des aus dem Kern diffundierenden Vernetzungsmittels entsteht an dem Kern eine dünne Schutzschicht. Die Stärke der Schutzschicht kann durch die Konzentration der gelbildenden Flüssigkeit und die Reaktionszeit gesteuert werden. Vorzugsweise liegt diese niedriger als bei der gelbildenden Flüssigkeit des Kerns. Nach Ausbildung der Schutzschicht wird der Biokatalysator wiederum in das Vernetzungsmittel getaucht, wodurch die Schutzschicht stabil vernetzt. Neben diesem zweistufigen Verfahren kann die Erfindung auch in einem einstufigen Verfahren realisiert werden. Hierzu wird der die enzymatisch aktiven Substanzen enthaltende Kern vor dem Vernetzungsvorgang mit der die Schutzschicht bildenden gelbildenden Flüssigkeit umgeben. Hierbei kann der Kern weiterhin flüssig sein. Die aktiven Substanzen werden dabei in die die Schutzschicht bildende gelbildende Flüssigkeit eingebracht, ohne sich mit ihr zu vermischen. Dies kann durch Einstellung unterschiedlicher Viskositäten der Kernflüssigkeit und der gelbildenden FLüssigkeit geschehen. Daraufhin kann die gesamte Anordnung in ein Vernetzungsbad getaucht werden, das ein Vernetzungsmittel enthalten kann oder lediglich für eine schnelle Temperaturabsenkung eines hierdurch vernetzenden Gels sorgt. Hierfür eignet sich eine Düsenanordnung mit einer zentralen Austrittsöffnung für die Substanz des Kerns und eine darum angeordnete ringförmige Austritts öffnung für die gelbildende Flüssigkeit der Schutzschicht. Eine besonders stabile Schutzschicht wird erzielt, wenn die Substanz des Kerns ein Vernetzungsmittel für die gelbildende Flüssigkeit der Schutzschicht enthält. Beim Einbringen der Gesamtanordnung in das Vernetzungsmittel findet die Vernet zung der Schutzschicht sowohl von innen als auch von aussen statt, wobei auch hierbei der Kern flüssig bleiben kann. Es ist aber auch möglich, für den Kern eine gelbildende, mit den Zellen versehene Flüssigkeit vorzusehen und diese mit einer entsprechenden gelbildenden, zellenfreien Flüssigkeit zu umgeben und sofort in ein Vernetzungsbad zu tauchen. Das Vernetzungsmittel durchdringt die Schutzschicht so schnell, dass die Immobilisierung der enzymatisch aktiven Substanzen im Kern so rechtzeitig erfolgt, dass keine aktiven Substanzen in die Schutzschicht eindringen können. Bei diesem Verfahren ist es wesentlich, dass sich die Kernflüssigkeit und die gelbildende Flüssigkeit für die Schutzschicht nicht auf dem Wege in das Vernetzungsbad vermischen. Durch entsprechende Zugaben in die Kernflüssigkeit kann dafür gesorgt werden, dass beide Flüssigkeiten eine stark unterschiedliche Viskosität und Oberflächenspannung aufweisen, so dass die Durchmischung gehemmt wird. Hierzu kann der Kernflüssigkeit beispielsweise ein Verdickungsmittel, das nicht aushärtend sein muss, zugegeben werden. Die Erfindung bietet den weiteren Vorteil, dass die Züchtung Zellen als von/enzymatisch aktiven Substanzen bereits in deren immobilisiertem Zustand erfolgen kann. Es ist nunmehr möglich, in dem Kern des Biokatalysators nur eine Vorkultur der Zellen einzuschliessen und den Biokatalysator in eine für die Züchtung der Zellen geeignete Umgebung einzubringen, nämlich in eine Nährlösung, die auf einer geeigneten Temperatur gehalten wird und ggf. beispielsweise mit Sauerstoff begast wird. Die Züchtung der Zellen im immobilisierten Zustand war bisher nicht möglich, weil die Züchtung wegen des Auswachsens der Zellen im wesentlichen an der Oberfläche stattgefunden hätte und daher überwiegend freie Zellen produziert worden wären. Da bei dem erfindungsgemässen Verfahren eine von den Zellen freie Schutzschicht vorhanden ist, die das Auswachsen sicher verhindert, kann der Biokatalysator mit der Vorkultur in die Nährlösung eingebracht werden, ohne dass die Produktion von freien Zellen an der Oberfläche des Katalysators zu befürchten wäre. Dadurch ist es möglich, das aufwendige Zentrifugieren der gezüchteten Zellen aus der Nährlösung zu vermeiden, da die Zellen bereits im immobilisierten Zustand gezüchtet werden können. Die von den enzymatisch aktiven Substanzen freie Schutzschicht aus dem Gel bildet sehr feine Poren, durch die die enzymatisch aktiven Substanzen nicht hindurchdringen können, wohl aber eine Nährflüssigkeit oder das Vernetzungsmittel. Wird dagegen aus dem gleichen Material der mit Zellen versehene Kern gebildet, entstehen hierbei auch grössere Poren, die ein geringes Auswandern ermöglichen. Daher wird erst durch das erfindungsgemässe Verfahren durch die Ausbildung der von den Zellen freien Schutzschicht eine Immobilisierung ohne Auswachsen der Zellen erreicht. Bestehen die enzymatisch aktiven Substanzen aus Enzymen, besteht bei normalen Immobilisierunsmethoden die Gefahr, dass die Enzyme aus dem Gel o. ä. ausgewaschen werden. Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es möglich, über die im Kern befindlichen Enzyme eine dünne Schutzschicht zu ziehen, die eine grosse Dichtigkeit aufweist und somit das Auswaschen der Enzyme wirksam verhindert. Da nur eine dünne Oberflächen schicht vorgesehen werden muss, wird für die in den Biokatalysator eindringende Flüssigkeit nur eine geringe Diffusionshemmung erzeugt, da der Kern aus einem die leichte Diffusion der Flüssigkeit erlaubenden Material bestehen kann. Die obengenannte Aufgabe wird weiterhin gelöst durch einen Biokatalysator mit in einem vernetzten Gel immobilisierten enzymatisch aktiven Substanzen, wenn diese einen die enzymatisch aktiven Substanzen enthaltenden Kern und eine den Kern umgebende Schutzschicht aus einem von den enzymatisch akti ven Substanzen freien vernetzten Gel aufweist. Die mit der Erfindung erzielbaren Vorteile bestehen beispielsweise in der Vermeidung des Auswachsens von Zellen, das beispielsweise beschrieben ist in Stöcklein, Eisgruber, Schmidt Konversion of L-Phenylalanine to L-Tyrosine by Immobilized Bacteriat in Biotechnology Letters Vol. 5 No. 10, Seiten 703 - 708 (1983). Der hierfür erforderliche zusätzliche Aufwand ist gering, während beispielsweise bei der Sektherstellung der für die Trennung der freien Zellen von der Sektflüssigkeit bisher erforderliche Aufwand völlig vermieden wird. Die Erfindung lässt sich mit den bekannten vernetzenden Gelen durchführen. Als thermisch vernetzendes Gel kommt insbesondere Agar in Frage, während die mit einem Vernetzungsmittel vernetzenden Gele beispielsweise die ionisch vernetzenden Gele Ca-Alginat, K- und/oder Ca-Kappa-Carrageenan, Chitosan, Mg- oder Ca-Pektinat, Carboxymethylcellulose oder die kovalent vernetzenden Gele Polyacrylamid, Polyurethan, Polyepoxid, Silicagele u. a. sind. Für die Sektherstellung ist Ca-Alginat besonders geeignet, wobei als gelbildende Flüssigkeit Na Alginat und als Vernetzungsmittel CaCl2 verwendet werden, die beide im Lebensmittelbereich seit vielen Jahren verwendet werden und daher unbedenklich sind. Die Schutzschicht kann auch aus mehreren Komponenten gebildet sein. So kann es vorteilhaft, sein, dass die Schutzschicht aus einem ionotropen Gel gebildet ist, das eine zur kovalenten Vernetzung befähigte Substanz enthält. Solche Substanzen sind beispielsweise Isocyanat-, Epoxy- und Silikon-Präpolymere. Beispiel 1 Zur Herstellung eines Biokatalysators in Form von Perlen wird eine 3,3 %ige Na-Alginatlösung durch Einrühren von 3,3 g Na-Alginat in 100 ml dest. Wasser eingerührt und anschliessend 15 Minuten bei 1 bar Überdruck und bei 121 OC autoklaviert. Hefezellen (Saccharomyces bayanus; Lalvin C1108 der Boehringer KG) wird in einer 0,9 %igen NaCl-Lösung suspendiert. Die 3,3 %ige Na-Alginatlösung wird nun in der Suspension verrührt. Mit Hilfe einer in Figur 1 dargestellten Tropfarmatur 1 wird mit Hilfe von in die Armatur eingegebener Druckluft die Alginat-Zellsuspension durch eine am unteren Ende der Armatur 1 angesetzten Kanüle 2 in ein Fällungsbad getropft, das aus einer 2 Eigen CaCl 2-Lösung besteht. Beim Eintauchen des Tropfens in das Fällungsbad entsteht eine ca. 3 mm grosse Gelperle, da durch Austausch der Na + -Ionen durch Ca Ca-Ionen die Vernetzungs des Alginats zum Gel entsteht. Die durch die ionotrope Gelbildung entstandenen Perlen werden zur weiteren Vernetzung 30 Minuten in der CaCl2-Lösung gerührt. Anschliessend werden die Perlen abgesiebt und mit Leitungswasser mehrmals gewaschen. Die Perlen werden dann mit dest. Wasser in eine 0,5 %ige bzw. 0,2 %ige Na-Alginatlösung gespült. Die Herstellung dieser Alginatlösung erfolgt analog wie oben beschrieben. Durch Diffusion von Ca-Ionen aus den Gelperlen in die Na-Alginatlösung bildet sich eine Hülle aus Ca-Alginat um die Perlen. Nach ca. fünfminütigem Rühren mit hängendem Rührer hat sich eine genügend dicke Hülle gebildet, so dass die Na-Alginatlösung abgegossen werden kann. Die Perlen werden mit Leitungswasser gewaschen und in einer2 %ige CaCl2-Lösung gespült. Nach einer Vernetzungszeit von einer Stunde werden die Perlen mehrfach mit Leitungswasser gewaschen. Zur Durchführung einer Flaschengärung werden die Perlen in einem am oberen Ende als Korken 5 ausgebildeten Hohlzylinder 6 eingefüllt, dessen Boden 7 mittels eines Gewindes am Zylinder 6 befestigbar ist. Für die Sektherstellung aus einem Rieslingwein mit 22 g Zukker/Liter und 2,6 g Weinsäure/Liter werden 0,2 g Trockehefe (Lavin C 1108) in 1 - 2 ml 0,9 %ige NaCl-Lösung suspendiert. Diese Suspension wird in 10 g der 3,3 %igen Na-Alginatlösung gegeben. Nach der Vernetzung in der 2 eigen CaCl2 -Lösung beträgt die Zellbeladung ca. 2 % (0,02 g Trockenhefe/g feuchtem Katalysator) . Von diesem Katalysator wird jeweils soviel eingesetzt, dass 0,2 g Trockenhefe auf 1 1 Cuvee kommen. Die gebildeten Perlen werden vorsorglich 5 Minuten mit einer 6 Watt UV-Lampe bestrahlt, um etwaige, durch Verunreinigung auf die Alginathülle gelangte Zellen abzutöten. Das in Figur 3 gezeigte Bild des Katalysators zeigt eine deutliche Ca-Alginatschutzschicht 8, die frei von Zellen 9 ist, die im Kernbereich 10 deutlich zu erkennen sind. Da in dieser Abbildung die Schutzschicht zur Verdeutlichung etwas stufenartig nach hinten versetzt ist, sind die an der Oberfläche des Kerns befindlichen Zellen 9' erkennbar, die bei der herkömmlichen Immobilisierung ausgewachsen wären. In Testansätzen in 0,7 Flaschen mit dem in Figur 2 dargestellten Korken bei einer Gärtemperatur von 15 OC konnte nach 4 Monaten kein Auswachsen der Hefezellen festgestellt werden. Ebenso zeigte sich bei dem Weinsäuregehalt von 2,6 g Weinsäure/l und der Verwendung eines Alginats mit einem hohen K-Wert für Ca 2+ Na+ keine Ca-Tartratausscheidung. Die Verwendung des hohlen, seitlich durchbohrten Korkens 5,6 zur Aufnahme der Perlen ermöglicht ein müheloses Entfernen der Katalysatorperlen aus den Flaschen nach Abschluss der Zweitgärung innerhalb von weniger als 2 Sekunden. Beispiel 2 Wie beim Beispiel 1 wird eine 3,3 %ige Na-Alginatlösung angesetzt. Eine zweite, 1 %ige Na-Alginatlösung wird in gleicher Weise hergestellt. Beide Lösungen werden 15 Minuten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen autoklaviert. Die in Beispiel 1 erwähnte Trockenhefe wird in 0,9 %iger NaCl-Lösung suspendiert und in die 3,3 %ige Na-Alginatlösung gegeben. Die Alginat-Zellsuspension wird so eingestellt, dass sich 1 g Trockenhefe in 10 g Na-Alginatlösung befinden. Zur Herstellung eines Biokatalysators wird ein Bau:nwollfa- den mit ca. 18 cm Länge, der alle 1,5 cm mit einem Knoten versehen ist, ausgekocht, um störende Geschmacksstoffe aus dem Baumwollfaden zu entfernen. Anschliessend wird der Faden in Leitungswasser gewaschen und als Träger für das Katalysatorgel eingesetzt. In die Alginat-Zellsuspension wird der Baumwollfaden getaucht, so dass der Faden gut getränkt ist. Die Knoten sollen die Haftung des Alginatgels erleichtern. Der Baumwollfaden wird nun mit der daran haftenden Alginat Zellsuspension in eine 2 %ige CaCl2-Lösung zur ionotropen Gelbildung gegeben. Der Katalysatorfaden wird unter leichtem Rühren 30 Minuten in der CaCl2-Lösung belassen. Anschliessend wird der Fadem mit Leitungswasser gewaschen und in die 1 %ige Na-Alginatlösung getaucht. Durch Diffusion von Ca Ionen aus dem Gel am Faden in die Na-Alginatlösung bildet sich nun eine Hülle aus Ca-Alginat um den Katalysatorfaden. Es ist darauf zu achten, dass der Katalysator am Faden ganz von der Ca-Alginathülle überzogen wird. Der Katalysatorfaden wird zur weiteren Vernetzung der Alginathülle für eine Stunde in eine leicht gerührte 2 Zige CaCl2-Lösung gegeben. Anschliessend wird der Katalysatorfaden mehrfach mit Leitungswasser gewaschen und dabei 5 Minuten mit einer 6 Watt UV Lampe bestrahlt. An dem Katalysatorfaden befindet sich in dem Alginatgel ca. 0.07 g Trockenhefe. Es werden zwei Katalysatorfäden pro 0,7 Flasche eingesetzt, so dass ca. 0,14 g Trockenhefe auf 0,7 1 Cuvee kommen. Die beiden Baumwollfäden werden zusammengebunden und an einem dünnen Zwirnsfaden befestigt. Der Zwirnsfaden wird aus der Flasche herausgeführt und mit einem handelsüblichen Sektkorken beim Verschliessen der Flasche eingeklemmt. Auf diese Weise lassen sich die Katalysatorfäden nach der Zweitgärung aus der Flasche beim öffnen entfernen. Während der in Figur 2 dargestellte Korken, der vorzugsweise aus Polyäthylen hergestellt ist, wiederverwendbar ist, gilt dies für den beschichteten Baumwollfaden nicht. Beispiel 3 Wie beim Beispiel 1 wird eine 3,3 %ige Na-Alginatlösung angesetzt. Ferner wird eine 1 %ige wässrige Na-Kappa-Carra- geenanlösung in gleicher Weise hergestellt. Beide Lösungen werden 15 Minuten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen autoklaviert. Die in Beispiel 1 erwähnte Trockenhefe wird in einer 0,9 %igen NaCl-Lösung suspendiert und in die 3,3 %ige Na-Alginatlösung gegeben. Die Alginat-Zellsuspension wird so eingestellt, dass sich 1 g Trockenhefe in 10 g Na-Alginatlösung befindet. Zur Herstellung des Biokatalysators wird als Träger ein in Figur 4 dargestellter Polyäthylenkorken 11 verwendet, an dem eine flache Sange 12 befestigt ist, die in regelmässigen Abständen Löcher 13 aufweist, die eine analoge Funktion wie die Knoten in dem in Beispiel 2 erwähnten Baumwollfaden haben. Zur Unterstützung der Haftung ist die Oberfläche der Stange 12 aufgerauht. Die Stange wird in die Alginat-Zellsuspension getaucht, so dass sie von einem Film der Alginat Zellsuspension überzogen wird. Die überzogene Stange wird nun in eine 2 %ige CaCl2-Lösung zur ionotropen Gelbildung gegeben und für 30 Minuten in der CaCl2-Lösung belassen. Anschliessend wird die Stange 12 gewaschen und in die 1 %ige Na-Carrageenanlösung getaucht. Durch Diffusion von Ca-Ionen aus dem Gel an der Stange 12 in die Na-Carrageenanlösung bildet sich nun eine Hülle aus Ca-Carrageenan. Der Korkenkatalysator 11,12 wird zur weiteren Vernetzung der Carrageenanhülle für eine Stunde in eine leicht gerührte Lösung bestehend aus 10 g KCl + 10 g CaCl2 /1 1 Wasser gegeben. Anschliessend wird der Katalysator gewaschen und dabei 5 Minuten mit einer 6 Watt UV-Lampe bestrahlt. An dem Korkenkatalysator befinden sich ca. 0,14 g Trockenhefe. Dieser Korkenkatalysator wird nun wie in Beispiel 1 beschrieben zur Sektherstellung eingesetzt. Nach abgeschlossener Zweitgärung kann der Korkenkatalysator innerhalb von 2 Sekunden aus der Flasche entfernt werden. Nach Abtrennung der Gelschichten von der Stange 12 kann der Korken 11 mit der Stange 12 erneut verwendet werden. Beispiel 4 Wie beim Beispiel 1 wird eine 3,3 %ige Na-Alginatlösung angesetzt und 15 Minuten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen autoklaviert. Die in Beispiel 1 erwähnte Trockenhefe wird in 0,5 %iger CaCl2-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wird so eingestellt, dass sich 1 g Trockenhefe in 10 g Zellsuspension befindet. Die Katalysatorherstellung erfolgt mit der in Figur 5 und 6 dargestellten Apparatur, die aus zwei Vorratsbehältern A,B besteht, deren Inhalt in eine Zweistoffdüse 14 gelangt, deren Aufbau in Figur 6 verdeutlicht ist. Die Zellsuspension wird in den Vorratsbehälter A und die Alginatlösung in den Vorratsbehälter B gegeben. Beide Lösun gen werden nun mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/m durch die Zweistoffdüse 14 in eine 2 %ige CaCl2 Lösung gefördert. Durch Vernetzung der Na-Alginatlösung von innen und von aussen bildet sich momentan ein sehr stabiler Biokatalysatorfaden aus. Die Zweistoffdüse enthält einen äusseren ringförmigen Kanal 15 für die Lösung in dem Behälter B sowie einen inneren ringförmigen Kanal 16 für die Lösung aus dem Behälter A. Der innere ringförmige Kanal 16 wird innen durch einen verschiebbaren Kolben 17 begrenzt. Der äussere ringförmige Kanal endet in einer ringförmigen Düsenöff nung18, die um eine zentrale Düsenöffnung 19 angeordnet ist, durch die Flüssigkeit aus dem inneren ringförmigen Kanal 16 austritt. Der Kolben 17 weist an seiner Unterseite eine Spitze 20 auf, die beim Herabdrücken des Kolbens 17 an einem Betätigungsglied 21 die Düsenöffnung 19 verschliesst. Das Verschliessen der Düsenöffnung 19 wird am Fadenanfang und -ende vorgenommen, um auch am Fadenanfang und am Fadenende einen dichten Abschluss mit einer zellenfreien Alginatlösung zu erhalten. Der erhaltene Biokatalysatorfaden wird für weitere 30 Minuten in der CaCl2-Lösung belassen. Anschliessend wird der Katalysator mit Leitungswasser gewaschen und dabei 5 Minuten mit einer 6 Watt UV-Lampe bestrahlt. Dieser Katalysatorfaden wird nun wie in Beispiel 1 beschrieben zur Sektherstellung eingesetzt. In diesem Fall erfolgt jedoch die Sektherstellung nach dem Tankgärverfahren im Rührkessel. Hierzu werden Biokatalysatorfäden, die 0,4 g Trockenhefe/l Cuvée enthalten, eingesetzt. Nach 14 Tagen ist die Zweitgärung abgeschlossen, und der Sekt wird aus dem Gärtank abgepumpt, wobei die Katalysatorfäden durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 2 mm zurückgehalten werden. Beispiel 5 Eine 1,5 %ige Alginatlösung, die analog der früheren Beispiele hergestellt worden ist, wird mit 10 g Zellen/100 g Alginatlösung versetzt. Die Zellen wurden zuvor in 0,9 %iger NaCl Lösung suspendiert. Diese Suspension wird durch den inneren Kanal 16 der Zweistoffdüse 14 aus dem Behälter A mit Über- druck gedrückt. Eine zellfreie 3,5 %ige Alginatlösung wird durch den äusseren Ringkanal 15 aus dem Behälter B gedrückt. Für den inneren Kanal 16 ist eine Flussrate von 200 ml/h und für den äusseren Kanal 15 eine Flussrate von 300 ml/h eincestellt. Die entstandene Kugel tropft in eine gerührte Vernetzerlösung (2 %ige CaCl2-Lösung). Nach 45 Minuten Vernetzungszeit werden die Katalysatorperlen gewaschen und 5 Minuten mit einer 6 Watt UV-Lampe bestrahlt. Die nach diesem einstufigen Verfahren hergestellten Katalysatorperlen werden in gleicher Weise angewendet wie die zweistufig hergestellten Katalysatorperlen gemäss Beispiel 1. Beispiel 6 Eine 2%ige wässrige Na-Kappa-Carrageenanlösung wird 15 Minuten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen autoklaviert. Die in Beispiel 1 erwähnte Trockenhefe wird in einer 1%igen KCl-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wird so eingestellt, dass sich 1 g Trockenhefe in 10 g Lösung befindet. Die Katalysatorherstellung erfolgt mit der in Figur 5 und 6 dargestellten Apparatur. Die Zellsuspension wird durch den inneren Kanal 16 der Zweistoffdüse 14 aus dem Behälter A mit Uberdruck gedrückt. Die zellfreie 2%ige Na-Kappa-Carrageenanlösung wird durch den äusseren Ringkanal 15 aus dem Behälter gedrückt. Für den inneren Kanal 16 ist eine Flussrate von 100 ml/min und für den äusseren Kanal 15 eine Flussrate von 500 ml/min eingestellt. Der Faden wird bei Raumtemperatur (200C) in eine 3%ige Lösung eingedüst. Durch Vernetzung der Carrageenanlösung von innen und von aussen bildet sich momentan ein sehr stabiler Biokatalysatorfaden aus. Der erhaltene Biokatalysatorfaden wird für weitere 30 Minuten in der KCl-Lösung belassen. Anschliessend wird der Katalysator mit Leitungswasser gewaschen und dabei fünf Minuten mit einer 6 Watt UV-Lampe bestrahtl. Dieser Katalysatorfaden wird nun wie in Beispiel 4 beschrieben zur Sektherstellung eingesetzt. Nach 14 Tagen ist die Zweitgärung abgeschlossen, und der Sekt wird aus dem Gärtank abgepumpt. Die nach allen Beispielen hergestellten Biokatalysatoren verhindern wegen ihrer zellenfreien mikroporösen Schutzschicht nicht nur ein Auswachsen der Zellen aus dem Kern sondern auch ein Einwachsen von Fremdzellen. Die Kontaminationsgefahr durch Fremdzellen ist daher vermindert. Es ist somit möglich, unter verringerten Anforderungen an die Sterilität zu arbeiten. Ferner können die Biokatalysatoren getrocknet und in geeigneter Form gelagert werden. Beim späteren Aufquellen entsteht ein geringerer Wassergehalt als vor dem Trocknen, so dass die relative Zellbeladung dadurch etwas erhöht wird. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht erstmalig die praktikable Verwendung von Carrageenan zur Immobilisierung von Zellen bei Raumtemperatur. Zellen, die nicht in einem sehr aufwendigen, mehrstufigen Verfahren extra gereinigt worden sind, weisen an sich nicht störende Verunreinigungen durch NH Ca-, K-Ionen usw. auf. Diese geringfügigen Ionen konzentrationen verursachen ein Aushärten des Carrageenans auch bei höheren Temperaturen, so dass bisher die Carrageenanzugabe bei relativ hohen Temperaturen (beispielsweise 60 C) erfolgen musste, um nicht eine vorzeitige Aushärtung des Carrageenans zu erhalten. Da zur Bildung der erfindungsgemässen Schutzschicht um den immobilisierten Zellkern das Carrageenan praktisch nicht mehr mit den Zellen in Berührung kommt, bleibt es auch bei niedrigeren Temperaturen flüssig und verarbeitbar und kann kontrolliert vernetzt werden.

Claims: Process for preparing a biocatalyst having immobilized cells, in which the cells are introduced into a liquid which is gelled by a crosslinking agent and is formed from an aqueous phase, and the biocatalyst is then formed with or without a mechanical carrier by crosslinking, characterized in that the core containing the cells is surrounded by a gel-forming liquid, and in that the gel is crosslinked at the core under the action of a crosslinking agent diffusing out of the core, so that a protective layer free of the cells is formed from the crosslinked gel, which has no permeability to the cells, and this protective layer encloses the core containing the cells. Process according to Claim 1, characterized in that an ionotropic gel is used for the protective layer. Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the core containing the cells is formed by crosslinking a gel-forming liquid in which the cells have been suspended. Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the protective layer is formed around a liquid core containing the free cells. Process according to Claim 3, characterized in that the cells are added to the gel-forming liquid and the latter is fed into the crosslinking agent, and in that the core thus formed is then added to a gel-forming liquid which, with the crosslinking agent adhering to the surface of the core, forms the gel which forms the protective layer and is free of the cells. Process according to one of Claims 1 to 5, characterized in that an additional crosslinking of the protective layer is carried out in that the core is surrounded by the gel-forming liquid forming the protective layer and is then passed into a crosslinking bath. Process according to Claim 6, characterized in that the liquid of the core, containing the cells, is surrounded by the gel-forming liquid of the protective layer by means of a first, central nozzle opening and a second, annular nozzle opening surrounding this first nozzle opening. Process according to one of Claims 1 to 7, characterized in that the enclosed cells of the core are yeast cells for performing a champagne fermentation. Process according to one of Claims 1 to 8, characterized in that only a preliminary culture of cells is introduced into the core, and in that the catalyst produced with the preliminary culture is introduced into an environment suitable for culturing the cells. Biocatalyst having immobilized cells, in which the cells are introduced into a liquid formed by an aqueous phase and the surface of this biocatalyst being formed by a protective layer comprising a crosslinked gel surrounding the core containing the cells, with or without a mechanical carrier, characterized in that the protective layer is free of the cells and is formed by a crosslinking agent diffusing out of the core. Biocatalyst according to Claim 10, characterized in that the protective layer is formed by an ionotropic gel. Biocatalyst according to Claim 10 or 11, characterized in that the core is formed by a crosslinked gel. Biocatalyst according to Claim 12, characterized in that the crosslinked gel of the core is crosslinked with the same crosslinking agent as the gel of the protective layer. Biocatalyst according to Claim 10 or 11, characterized in that the core is formed by an uncrosslinked liquid. Biocatalyst according to Claim 14, characterized in that a thickening agent is added to the uncrosslinked liquid. Biocatalyst according to one of Claims 10 to 15, characterized in that the core is anchored to a mechanically stable carrier. Biocatalyst according to one of Claims 10 to 16, characterized in that the core contains only one preliminary culture of cells. Process for preparing a biocatalyst having immobilized cells, in which the cells are introduced into a liquid which is gelled by a crosslinking agent and is formed from an aqueous phase, and the biocatalyst is then formed with or without a mechanical carrier, characterized in that the liquid containing the cells is surrounded by the gel-forming liquid and then, before mixing the liquid containing the cells with the gel-forming liquid, is passed into the crosslinking agent, as a result of which a protective layer having no permeability to the cells is formed by the crosslinked gel. Process according to Claim 18, characterized in that the crosslinking agent for the gel-forming liquid forming the protective layer is added to the liquid containing the cells. Process according to Claim 18 or 19, characterized in that the liquid containing the cells is also crosslinked with the crosslinking agent for the gel-forming liquid of the protective layer. Process according to one of Claims 18 to 20, characterized in that the liquid, containing the cells, of the core is surrounded with the gel-forming liquid of the protective layer by means of a nozzle arrangement comprising a first, central nozzle opening and a second, annular nozzle opening surrounding this first nozzle opening. Process according to Claim 21, characterized in that the gel-forming liquid is transported through the second, annular nozzle opening at a higher speed of transportation than the liquid containing the cells is transported through the first, central nozzle opening. Process according to one of Claims 18 to 22, characterized in that the enclosed cells of the core are yeast cells for carrying out a champagne fermentation. Process according to one of Claims 18 to 23, characterized in that only one preliminary culture of cells is introduced into the core, and in that the catalyst produced with the preliminary culture is introduced into an environment suitable for culturing the cells.

Inventors: KLEIN, JOACHIM,PROF. DR., STEINERT, HANS-JUERGEN, DR., VORLOP, KLAUS-DIETER, PROF. DR., Steinert, Hans-Jürgen, Dr.
Applicants: KLEIN, JOACHIM,PROF. DR., STEINERT, HANS-JUERGEN, DR., VORLOP, KLAUS-DIETER, PROF. DR.
Application year: 1985
Main classification: C12N11
IPC codes: C12N11, C12G1