HYBRID CELL LINE, PROCESS FOR PREPARING IT AND ITS USE

Abstract: 1. Monoclonal antibody RB 21 - 7, which binds specifically to brain cells of various mammalian species, obtainable by cultivation of the cell line RB 21 - 7 (CNCM I-288).

Description: Hybridzell-Linie, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung Beschreibung Die Erfindung betrifft eine Hybridzell-Linie, die monoklonale Antikörper sezerniert, welche mit Humangehirnzellen, insbesondere Neuronen des Cortex, Purkinje Zellen des Cerebellum und Neuronen der äusseren Molekularschicht im Kleinhirn sowie mit Neuroblastomzellen reagieren, ein Verfahren zur Herstellung dieser Hybridzell-Linie sowie ihre Verwendung zur Herstellung dieser monoklonalen Antikörper. Die erfindungsgemässen Antikörper können als Diagnostika und bei der Therapie von Tumorerkrankungen verwendet werden. Die Fusion von Zellen des Immunsystems mit Tumorzellen wurde von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) 49597) beschrieben. Danach wird ein Lymphocyt, der Antikörper sezerniert, mit einer Tumorzelle fusioniert, wobei das gebildete Hybrid die Eigenschaften beider Ausgangszellen behält. Die Fähigkeit der unbegrenzten Teilungsfähigkeit wird von der Tumorzelle und die Fähigkeit, Antikörper eines bestimmten Typs zu sezernieren, wird vom Lymphocyten übernommen. Somit ist es möglich, die Antikörperantwort eines B-Lymphocyten gegen ein bestimmtes Immunogen auf Dauer zu erhalten und besonders interessante monoklonale Antikörper durch ständiges Kultivieren der sie sezernierenden Hybridzell-Linien herzustellen. Wegen ihrer Einheitlichkeit und Spezifität bedeuten monoklonale Antikörper eine Verbesserung gegenüber Antikörpergemischen (Antiseren) für diagnostische und therapeutische Zwecke. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern für den Nachweis von Tumorzellen wird z.B. im USP 4 172 124 beschrieben. In der EP-OS 90 343 wird die Herstellung eines Zellhybrids beschrieben, das monoklonale Antikörper sezerniert, die mit einem Bestandteil tierischer Zellen reagieren und die zur Therapie von Lungentumoren verwendet werden können. Die Autoren J.T.Kemshead et al. (Biol.Abstr. Bd.73,Nr.11, 1982) diskutieren einen Antikörper M1/N1, der mit frischem Neuroblastomgewebe, Humanneuroblastomzell Linien und Myeloidlinien reagiert. Die Untersuchungen der genannten Autoren zeigen jedoch, dass die Bindungsfähigkeit des genannten Antikörpers erheblichen quantitativen und qualitativen Schwankungen unterworfen ist. Die Autoren C.J. Wikstrarrlet al. (Biol.Abstr.Bd.75, Nr.9, 1983) beschreiben verschiedene Antikörper, die an Neuroblastom- und fetale Gehirnzellen binden. Die genannten Antikörper haben keine Bindungsfähigkeit an das Gewebe des Gehirns von Erwachsenen. Ein Antikörper A4, der einen Antikörper des IgM-Typs darstellt und an Neuronen von Ratten bindet1 wird weiterhin von J.Cohen et al. (Nature 291 (1981) S.421 ff.) beschrieben. Dieser Antikörper bindet ausschliesslich an Neuronen des zentralen Nervensystems bei Ratten und wurde dadurch hergestellt, dass Balb/c-Mäuse mit Ratten Cerebellum-Zellen von 1 Woche alten Wistar-Furth-Ratten immunisiert wurden, gefolgt von der bekannten Hybridoma-Technik. Durch Chemo- und Radiotherapie wird das Knochenmark von Patienten mit Tumorerkrankungen stark geschädigt. In Fällen mit metastasierenden Neuroplasmen, die man durch konventionelle.Chemo- oder Radiotherapie behandeln will, müsste die Dosierung so hoch gewählt werden, dass sie für das Knochenmark und damit für den Patienten letal ist. Für solche Fälle wird die Transfusion von vor Therapiebeginn entnommenem autologen Knochenmark empfohlen. Neben der Kältekonservierung menschlichen Knochenmarks kommt es vor allem darauf an, möglichst viele für die Repopulation des Knochenmarks wichtige Zellen zu gewinnen, ohne gleichzeitig maligne Zellen miteinzuschleppen (Imbach et al., Schweiz. med.Wschr. 109 (1979) S. 283-287). Ein Mittel zur Eliminierung eventuell im Knochenmark vorhandener metastatischer Tomorzellen wäre wünschenswert.Die Transplantation von autologem Knochenmark nach in-vitro Behandlung mit einem monoklonalen Antikörper wird von Ritz et al. (Lancet, 10.Juli 1982, S.60-63) beschrieben. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Immunisierung von Mäusen mit praenatalen Gehirnzellen von Säugetieren eine Hybridzell-Linie erzeugen kann, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert, der spezifisch an Gehirnzellen verschiedener Säugerspezies bindet, und zwar insbesondere an Neuronen des Cortex, Purkinje-Zellen des Cerebellum und Neuronen der äusseren Molekularschicht im Kleinhirn. Ausserdem bindet dieser Antikörper besonders stark an Zellen einer Vielzahl menschlicher Neuroblastome und ist für diese in Anwesenheit von Komplement cytotoxisch, wobei menschliche Knochenmarkszellen nicht angegriffen werden. Der Antikörper bindet im adulten menschlichen Grosshirn an Neuronen des Cortex sowie an Purkinje-Zellen und Neuronen der äusseren Molekularschicht im adulten menschlichen Kleinhirn. Eine weitere wesentliche Eigenschaft des von der er findungsgemässen Hybridzell-Linie sezernierten Antikörpers war die zusätzliche Bindungsfähigkeit an Rattengehirnzellen. Durch den weiten systematischen Abstand von Menschen und Ratten im Evolutionssystem war dieses breite Spektrum an Bindungsfähigkeit des erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers völlig überraschend. Gegenstand der Erfindung ist somit eine Hybridzell Linie, die einen monoklonalen Antikörper vom IgM-Typ ausscheidet, der an Säuretiergeirnzellen bindet, beispielsweise spezifisch mit Humangehirn- oder Rattengehirnzellen reagiert, und Neuroblastomzellen menschlichen Ursprungs in Gegenwart von Komplement lysiert. Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine Hybridzell-Linie RB 21-7. Gegenstand der Erfindung ist auch der von der Hybridzell-Linie seziernierte monoklonale Antikörper (MAK), insbesonders der von der Hybridzell Linie RB 21-7 sezernierte MAK RB 21-7. Gegenstand der Erfindung ist ferner das Verfahren zur Herstellung der Hybridzell-Linie. In diesem Verfahren werden nach an sich bekannten Methoden Mäuse mit praenatalen Gehirnzellen von Säugetieren immunisiert, Lymphocyten aus den immunisierten Mäusen gewonnen und mit Myelomzellen fusioniert und die Hybridzell-Linie isoliert. Säugetiere, deren Gehirnzellen zur Immunisierung einge- setzt werden, sind u.a. Primaten, z.B. Mensch oder Affe, oder Nager, z.B. Maus, Hamster, Kaninchen, insbesondere Ratte. B-Lymphocyten enthaltende Organe, z.B. Milz, Lymphknoten, oder peripheres Blut, der immunisierten Mäuse werden aseptisch entnommen und mit solchen Myelomzellen fusioniert, die in einem bestimmten Selektionsmedium nicht wachsen, z.B. X63-Ag8.653 in HAT-Medium. Als Myelomzellen kommen solche verschiedenen Ursprungs in Frage, z.B. soche von Maus, Ratte oder Mensch. Bevorzugt sind Mäuse-Myelomzellen. Als Beispiele für im erfindungsgemässen Verfahren einsetzbare Myelomzell Linien seien genannt P3-X63-Ag8 (Nature 256 (1975)S.495) P3-NSI/1-Ag4-1 (Eur.J.Immunol.6 (1976) S.292), Sp2/0 Ag14 (Nature 226 (1978) S.269), insbesondere X63-Ag8.653 immun. 123 (1979) S.158). Die Zell-Linie X63-Ag8.653 ist beispielsweise beim Institut für Zellbiologie (Tumorforschung) der Universität Essen (GH) erhältlich. Sie ist ferner bei ATCC unter der No. CRL-1580 hinterlegt. Die Fusion wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, z.B. durch Mischen der Lymphocyten mit den Myelomzellen unter Zugabe eines bekannten Zellfusionsreagenz, beispielsweise Polyethylenglykol oder Sendaivirus. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybridzellen in einem Selektionszellkulturmedium, das zur Schaffung optimaler Bedingungen mit 20% FCS komplementiert ist, kultiviert. Die Zellkulturüberstände der entstandenen Hybridklone werden auf ihren Gehalt an spezifischem Antikörper getestet. Die Zellkulturüberstände können mittels Radioimmunoassay (RIA), Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) oder Immunfluoreszenztechnik an Zellmaterial, Extrakten oder gereinigtem Antigen auf spezifische Antikörper geprüft werden. Die Hybridzellen, deren Zellkulturüberstände spezifische Antikörper gegen das zum Immunisieren verwendete Antigen enthalten, werden nochmals kloniert und erneut nach obigen Methoden auf ihre Fähigkeit überprüft, spezifische Antikörper zu sezernieren. Die Hybridzellen werden nach Abtrennung vom Überstand unter üblichen Bedingungen aufbewahrt, z.B. weiterkultiviert oder unter Bedingungen eingefroren, die ihre Rekultivierung nach Auftauen ermöglichen. Die Überstände werden auf Reaktivität mit anderen als dem spezifischen Antigen überprüft. Die Ergebnisse mit MAK RB 21-7 werden in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1 Bindungscharakteristika von MAK RB21-7 an verschiedene Zelltypen Humanzellen Bindung Neuroblastomzell-Linien Lan-1, Lan-5, CHP 134, SH, KA, Lan-4, IMR Neuronen (Cortex) Purkinje-Zellen (Cerebellum) Neuronen der äusseren Molekularschicht Neuroblastomzell-Linien CHP100 und MC + Coloncarcinomzell-Linie HT29 Blasencarcinomzell-Linie EJ Osteogene Sarcomzell-Linie H1080 Hämatopoetische Stamrnzellen Rattenzellen (BDIX-Ratte) Leberzellen Bindegewebszellen Gehirnzellen* a) Neuronen (Neurofilament positiv) + b) Vimentin-positive Vorläuferzellen von Neuronen + c) Vimentin-positive Vorläuferzellen von Astrozyten + Subklone der Zell-Linien BT1C-BT15C** Subklone der Zell-Linien GV1C, TV1C,NV1C*** sehr starke Bindung schwache Bindung <RTI ID=7.7> - keine Bindung praenatale Gehirnzellen; die MAK RB21-7 bindende Zell-Subpopu lation ist ab 13.Tag der Pränatalentwicklung nachgewiesen (13.Tag:16%, 14.Tag:32 %, 15.Tag: 59%, 16.Tag: 86%), ab dem 17. Praenataltag nimmt dann nur noch die Zahl der antigenen Determinanten zu, nicht aber der Anteil der von MAK RB21-7 erkannten Gehirnzellen. maligne oder praemaligne neuroektodermale Zell-Linien (O.D. Laerum u.M.F.Rajewsky J.Natl.Cancer Inst. 55 (19753.1177-87) entstanden durch Transformation in vitro nach Einwirkung von Ethylnitrosoharnstoff auf fetale Rattengehirnzellen in vivo. maligne Zell-Linien, abgeleitet von durch Ethylnitrosoharn stoff induzierten Tumoren des Nervensystems der BDIX-Ratte. Der von der kultivierten Hybridzell-Linie sezernierte monoklonale Antikörper, insbesondere MAK RB21-7, kann als solcher zur Diagnose von normalen Zellen oder malignenentarteten Neuroblasten und zur Therapie von neuralen Tumoren verwendet werden. Weiterhin kann der monoklonale Antikörper, insbesondere MAK RB21-7, zur Neuron-Lokalisierung, vorzugsweise zur Neuroblastom-Lokalisierung, mit einem Indikator, z.B. 111In, 99mTc, 125I, markiert werden, um als Diagnostikum eingesetzt zu werden (vgl. Eckelmann, W. et al. Cancer Res.40 (1980)33036-3042, Radiolabelling of antibodies). Für therapeutische Zwecke kann der monoklonale Antikörper,vorzugsweise MAK RB21-7, als Transportmolekül für cytotoxische Substanzen dienen, welche mittels chemischer Methoden oder über Liposomen indirekt an den Antikörper gekoppelt sind. In der Therapie besitzt der erhaltene Antikörper, vorzugsweise MAK RB21-7, besondere Bedeutung für die autologe Knochenmark-Reimplantation aufgrund seiner Fähigkeit, an menschliche Neuroblastomzellen zu binden und diese Zellen in Gegenwart von Komplement zu lysieren. Dabei wird der Antikörper dazu benutzt, Tumorzellen im entnommenen Knochenmark zu zerstören, d.h. das Knochenmark, bevor es wieder infundiert wird, von malignen Zellen zu säubern. Dazu wird die Knochenmarksprobe mit Antikörper enthaltender Lösung inkubiert, z.B. bei 0-400C, Komplement hinzugefügt und einige Zeit stehen gelassen, z.B. 20 bis 40 Minuten; die Suspension wird zentrifugiert, anschliessend werden die Knochenmarkszellen mit Puffer-Lösung,z.B. PBS, gewaschen. Gegebenenfalls wird anstelle der Antikörper enthaltenden Lösung ein Antikörper-Cocktail, d.h. eine den erfindungsgemässen und weitere Antikörper enthaltende Lösung, eingesetzt. Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung. Eine Erklärung der verwendeten Abkürzung folgt auf Seite 15. Beispiel 1 Zur Immunisierung wurden 8 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen jeweils 2 x 107 mechanisch dissozierte, fetale (21.Tag der Praenatalentwicklung) Gehirnzellen von Ratten des Inzuchtstammes BDIX (in 1 ml PBS) intraperitoneal an den Tagen 0 und 21 injiziert. Am Tag 42 wurden die gleichen Zellen in gleicher Anzahl intravenös injiziert. Am Tag 46 wurden die Milzzellen der immunisierten Tiere aseptisch entnommen, mittels eines Siebes zerkleinert und in Zellkultur-Medium RPMI 1640 ohne Serum aufgenommen. Die Zahl der Lymphocyten wurde mittels einer Zählkammer bestimmt. Parallel hierzu wurden in Gewebekultur gehaltene Mausmyelomzellen vom Stamm X63-Ag8.653 in serumfreiem RPMI aufgenommen und die Zahl der Tumorzellen mittels einer Zählkammer ermittelt. Zur Fusion wurden die Maus-Myelomzellen (2,2 x 108 Zellen) mit den Lymphocyten (2,2 x 108 Zellen) gemischt, zentrifugiert (10 Minuten, 95xg) und zum Pellet 1,5 ml 5o7oige PEG-Lösung (PEG: Molgewicht 4000) in 45 Sekunden zugesetzt. Unter leichtem Schütteln wurden die Zellaggregate dissoziiert und sofort 10 ml RPMI innerhalb 7 Minuten tropfenweise zugegeben, danach wurden innerhalb 7 Minuten weitere 40 ml RPMI zugesetzt. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 55xg wurde das Sediment so in RPMI (+20 % FCS) verdünnt, dass 2x105 Zellen pro Vertiefung einer Zellkultur-Platte mit 24 Vertiefungen ä 2 cm2 ausgesät werden konnten. Nachdem die Hybridklone soweit herangewachsen waren, dass sie den Boden der Löcher total bedeckten, wurde von jeder Kultur die einen wachsenden Zell-Klon enthielt, 50p1 Überstand entnommen und der Hybridom-Überstand auf seinen spezifischen Antikörpergehalt überprüft. Die Prüfung der Hybridzell-Klone auf Produktion monoklonaler Antikörper, die gegen Strukturkomponenten der Zelloberflächen der zur Immunisierung verwendeten neuralen Rattengehirnzellen gerichtet sind, erfolgte durch einen indirekten solid phase radioimmunoassay (RIA) auf Plasmamembranen von fetalen Rattengehirnzellen (21. Tag der Praenatalentwicklung) nach der Methode von Howard et al. (J.Immunol.Meth.38 (1980t.75-82) Hybridzell-Klone, deren Kulturüberstände im RIA eine spezifische Bindung an Plasmamembranen zeigten, wurden weiter kultiviert. Durch indirekte Immunfluoreszenz (Methode s.u.) an fetalen Gehirnzellen (21.Tag der Praenatalentwicklung) in Primärkultur werden diejenigen Hybridzell-Klone selektioniert, die gegen die Aussenseite der Zellmembranen gerichtete monoklonale Antikörper sezernieren. Diese Hybridzell-Klone wurden noch 3 mal rekloniert. Eine Zell-Linie, deren Antikörper an menschliche Neuroblastomzellen bindet, stellt die Hybridzell-Linie RB21-7 dar. Eine Probe dieser Hybridzell-Linie wurde hinterlegt beim Institut Pasteur (CNCM), Hinterlegungsnummer I-288. Indirekte Immunfluoreszenzmessungen an kultivierten praenatalen Gehirnzellen wurden wie folgt durchgeführt: Die praenatalen Rattengehirne wurden mit Hilfe einer kombinierten enzymatisch-mechanischen Technik dissoziiert (R.Mül ler und M.F.Rajewsky: Cancer Res.43 (1983)S. 2897-2904). 5 x 105 Zellen wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern (13 mm Durchmesser) in Eagle-Medium FM (Modifikation nach Frank) mit einem Zusatz von 10 % FCS ausgesät. Man liess die Zellen 24 Stunden wachsen, wusch mit FM-Medium, dem 0,1% BSA zugefügt war, und inkubierte 10 Minuten mit 40 ul des Hybridzell-Überstandes. Nach zweimaligem Waschen mit FM, dem 0,1 % BSA zugefügt war, wurden die Zellen 5 Minuten in PBS mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und zweimal mit CMF-PBS, dem 0,1 % BSA zugefügt war, gewaschen. Die fixierten Zellen wurden 20 Minuten mit 40p1 Schaf-F(AB)2-anti-Maus-Ig, das mit Fluorescein markiert ist, inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit CMF-PBS, dem 0,1 % BSA zugefügt war, wurden die Präparate mit 90 %iger Glycerinlösung in PBS unter Zusatz von 0,1 % p-Phenylendiamin auf Objektträgern eingedeckt und im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Alle Verfahrensschritte erfolgten bei Raumtemperatur (ca. 200C). RB21-7 wird in folgendem Milieu (M) kultiviert: RPMI 1640 unter Zusatz von 100 I.U. Penicillin/ml 100 I.U. Streptomycin/ml 2,5ug Amphotericin B/ml 0,055 mM 2-Mercaptoethanol Die Züchtung erfolgt in 20%igem FCS bei 370C. Zur Daueraufbewahrung werden 3 x 106 Zellen/ml in M unter Zusatz von 20 % fetalem Kälberserum und 20 % Dimethylsulfoxid eingefroren. Der durch RB21-7 sezernierte monoklonale Antikörper MAK RB 21-7 (Isotyp: IgM) hat die folgenden Eigenschaften: Er bindet im praenatalen Rattengehirn an eine Zellpopulation, die sich in ihrem Anteil an der Gehirnzellgesamtpopulation bis zum 16.Tag der Praenatalentwicklung ständig vergrössert. Diese Ergebnisse wurden durch indirekte Immunfluoreszenz im fluoreszenzaktivierten elektronischen Zellsorter (FACS) ermittelt und, was die mittlere Zahl der Antigendeterminanten pro MAK RB21-7 bindende Zellen angeht, durch RIA auf Gehirnzell Membranen aufeinanderfolgender Tage der Praenatalentwicklung bestätigt. MAK RB21-7 bindet nicht an Leberund Bindegewebs-Zellmembranen der BDIX-Ratte und nicht an die malignen und praemalignen neuroektodermalen BDIX-Rattenzell-Linien BT1C -BT15C, GV1C, NV1C, TV1C (siehe Tabelle). MAK RB21-7 bindet an menschliche Neuroblastomzellen und ist in Anwesenheit von Komplement für diese cytotoxisch, jedoch nicht für menschliche Knochenmarkszellen. MAK RB21-7 bindet im adulten Cerebrum des Menschen an Neuronen des Cortex sowie an Purkinjezellen und Neuronen der äusseren Molekularschicht im adulten menschlichen Cerebellum. Beispiel 2 Züchtung von MAK RB21-7 in vitro: Ca. 2 x 106 Hybridzellen werden in einer Kulturflasche mit 150 cm2 Grundfläche in 50 ml M ausgesät. Wenn sich nach 3-4 Tagen ein dichter Zellrasen gebildet hat, wird das gesamte M abgenommen und bei 320 x g abzentrifugiert. Es enthält ca. 10 ug MAK RB21-7/ml. Die Hälfte der Hybridzellen wird durch Abspülen mit neuem M gewonnen und entweder auf eine zweite Flasche ausgesät oder verworfen. Die Ursprungskultur wird wieder mit neuem M aufgefüllt. Aus einer 150 cm2 Kulturflasche werden 2 x wöchentlich 50 ml MAK RB21-7 enthaltender Zellkultur überstand gewonnen. Züchtung von MAK RB21-7 in vivo: 0,5 ml Pristan werden 6-8 Wochen alten Balb/c-Mäusen intraperitoneal inji ziert. Nach 7-9 Tagen werden 5 x105 Hybridzellen in die Peritonealhöhle gespritzt. Nach weiteren 8-10 Tagen werden die Tiere durch cervicale Dislokation getötet. Die Ascitesflüssigkeit (6-10 ml/Tier) wird durch Kanülierung der Bauchhöhle gewonnen. Nach Zentrifugation bei 320 x g enthält der Überstand ca. 1-1,5 mg MAK RB21-7/ml. Beispiel 3 MAK RB21-7 kann als Diagnostikum analog Ionak, Z.L. (Hybridoma 1/4 (1982)S.349-368) eingesetzt werden. Gewebsschnitte (Gefrierschnitte) oder cytologisches Material (Cytozentrifugenpräparat) werden zuerst mit MAK RB21-7, dann mit normalem Kontrollserum inkubiert (je 20 Minuten bei Raumtemperatur). Die Präparate werden 3 mal mit PBS gewaschen, anschliessend mit biotinyliertem Anti-Maus-Ig weitere 10 Minuten inkubiert, und danach wieder 3 mal mit PBS gewaschen. Anschliessend wird 10 Minuten mit Avidin-Biotin Peroxidase-Komplex inkubiert und wiederum 3 mal mit PBS gewaschen, dann unter Zugabe von H202 mit oxidierbarem Peroxidase-Substrat inkubiert und nochmals 3 mal mit PBS gewaschen. Die nachzuweisenden RB21-7 positiven Zellen sind an ihrer Färbung erkennbar. Entsprechend kann die MAK RB21-7-Bindung durch einen fluoreszenzgekoppelten Anti-Maus-Ig-Antikörper analog Kemshead, I.T. et al. (Lancet 1 (1983)S.8314-15) nachgewiesen werden. Beispiel 4 Die Markierung von MAK RB21-7 mit 125I wird nach der Chloramin-T-Methode (Hunter and Greenwood, Nature 194 (1962)S. 495) vorgenommen. Die Jodmarkierung kann auch nach Bolton und Hunter (Biochem.J. 133 (1973)S.529), nach der Lactoperoxidase Methode (Machalonis, Biochem.J. 113 (1969)5.299) oder nach der Iodmonochlorid-Methode (Mac Farland, Nature 182 (1958)S.53) erfolgen. Beispiel 5 Komplementabhängige Lysis von Tumorzellen in vitro Die zu testenden Zellen werden in RPMI 1640 für die Dauer von 24 Stunden kultiviert und anschliessend mit Na251Cr (5OuCi/106 2 04 Zellen) 15-18 Stunden unter den gleichen Kulturbedingungen markiert. Die Zellen werden mit EDTA-haltigem CMF-PBS und Glucose abgelöst, zweimal mit PBS gewaschen und wieder in RPMI + 5 % FCS auf 4 genommen. 2 x 10 Zellen in 50 pl RPMI werden in die U-förmigen Vertiefungen einer 96-Loch-Mikrotiterplatte verteilt und mit 75 ul Hybridzellüberstand (enthaltend MAK RB21-7) bzw. RPMI 5 % FCS als Kontrolle 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden einmal mit 100 ul RPMI gewaschen und dann mit 50 ul einer 1:20 Verdünnung von Kaninchenkomplement bzw. RPMI als Kontrolle 1 Stunde bei 370C in einem mit 5 % C02 begasten Brutschrank inkubiert. Zu jeder Probe werden 100 ul RPMI hinzugegeben. Die Mikrotiterplatte wird bei 200xg 10 Minuten zentrifugiert. Die Hälfte des Überstandes wird zur Bestimmung des freigesetzten Na251 Cr04 in einem r -Zähler verwendet. Die maximal mögliche Freisetzung von Na251 Cr04 von Na251CrO4 wird durch Inkubation der markierten Zellen in PBS + 1 % Triton über Nacht bei Raumtemperatur bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen Komplement-abhängigen Zell-Lyse wird berechnet nach: cpm, freigesetzt durch den Hybridzellüberstand 100 x - cpm, freigesetzt durch Mediumkontrolle maximal freigesetzte cpm - cpm, freigesetzt durch Mediumkontrolle Beispiel 6 In vitro-Behandlung von Knochenmark zur Eliminierung von metastatischen Tumorzellen Die Knochenmarkszellen werden bei einer Konzentration von 2 x 107 Zellen/ml dreimal hintereinander einer Behandlung mit MAK RB21-7 (1:100 Verdünnung aus Ascites) und mit Kaninchen-Komplement (1:10 Verdünnung) unterzogen. Sie werden jeweils für 15 Minuten bei 4 C mit MAK RB21-7 und bei 370C 30 Minuten mit Komplement inkubiert und nach jeder Behandlung zweimal mit RPMI 1640 gewaschen. Um die Effektivität des Verfahrens zu überprüfen, werden 51Cr markierte antigenpositive Tumorzellen einer Kontrollprobe von Knochenmark zugesetzt, die gleich behandelt wird. Liste der verwendeten Abkürzungen BSA bovine serum albumin CMF - calcium, magnesium free cpm counts per minute ELISA Enzym-linked-Immunoadsorbens-Assay EDTA ethylenediaminetetraacetic acid FCS fetal calf serum FM Franksche Modifikation von Eagle's Medium (Frank et al. Experimentell Cell Res. 70 (1972)S390-396) HAT Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin Ig Immunoglobulin M Milieu (RPMI 1640 + Zusätze) MAK monoklonaler Antikörper PBS phosphate buffered saline (NaCl 8.000 g Na2HPO4 1.150 g KCl 0.200 g MgCl2 0.047 g KH2PO4 0.200 g CaCl2 0.200 g Aqua bidest.ad 1 Liter) PEG polyethylene glycol RIA radioimmunoassay RPMI 1640 Rosewell Park Memorial Institute (Medium 1640) (Culture of Normal Human Leucocytes, Moore et al. J.A.M.A. 199 (1967)S.519-524)

Claims: Hybridzell-Linie, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung Patentansprüche 1. Hybridzell-Linie, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der Antikörper an Humangehirnzellen, insbesondere an Neuronen des Cortex, Purkinje-Zellen des Cerebellum und Neuronen der äusseren Molekularschicht im Kleinhirn sowie an Neuroblastomzellen bindet. 2. Zell-Linie nach Anspruch 1, dadurch g e k e n nz e i c h n e t , dass der sezernierte Antikörper auch an Rattengehirnzellen bindet. 3. Zell-Linie nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der sezernierte Antikörper vom IgM-Typ ist, der in Gegenwart von Komplement Neuroblastomzellen lysiert. 4. Zell-Linie nach einem der vorhergehenden An sprüehe mit der Bezeichnung RB 21-7 und der Hinterlegungsnummer I-288 (CNCM). 5. Verfahren zum Herstellen einer Hybridzell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die einen monoklonalen Antikörper sezerniert, dadurch g e k e n n z e i chn e t , dass man Mäuse mit praenatalen Gehirnzellen von Säugetieren immunisiert, Lymphocyten von der Maus entnimmt und mit einer Myelomzelle fusioniert und die Hybridzell-Linie isoliert. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e n nz e i c h n e t , dass Balb/c-Mäuse immunisiert werden. 7. Verfahren nach Anspruch 5 und/oder Anspruch 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass mit praenatalen Rattengehirnzellen immunisiert wird. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass Milz-Lymphocyten entnommen werden. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass als Myelomzellen die der Myelomlinie X 63-Ag 8.653 eingesetzt werden. 10. Verwendung der Zell-Linie nach Anspruch 1 zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers. der an Humangehirnzellen, insbesondere an Neuronen des Cortex, Purkinje-Zellen des Cerebellum und Neuronen der äusseren Molekularschicht im Kleinhirn sowie an Neuroblastomzellen bindet. 11. Verwendung der Zell-Linie nach Anspruch 2 zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der auch an Rattengehirnzellen bindet. 12. Verwendung der Zell-Linie nach Anspruch 3 zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der vom IgM-Typ ist, der in Gegenwart von Komplement Neuroblastomzellen lysiert. 13. Verwendung der Zell-Linie RB 21-7 nach Anspruch 4, zur Herstellung des MAK RB 21-7. 14. Monoklonaler Antikörper, der an Humangehirnzellen, insbesondere an Neuronen des Cortex, Purkinje Zellen des Cerebellum und Neuronen der äusseren Molekularschicht im Kleinhirn sowie an Neuroblastomzellen bindet, erhältlich durch Züchtung einer Zell-Linie nach Anspruch 1. 15. Monoklonaler Antikörper, der auch an Rattengehirnzellen bindet, erhältlich durch Züchtung einer Zell-Linie nach Anspruch 2. 16. Monoklonaler Antikörper vom IgM-Typ, der in Gegenwart von Komplement Neuroblastomzellen lysiert, erhältlich durch Züchtung einer Zell-Linie nach Anspruch 3. 17. Monoklonaler Antikörper RB 21-7, erhältlich durch Züchtung der Zell-Linie RB 21-7. 18. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 14 bis 17 als Diagnostikum. 19. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 14 bis 17 als Therapeutikum, insbesondere zur Säuberung von Knochenmark.

Inventors: KINDLER-ROHRBORN, ANDREA, DR., RAJEWSKY, MANFRED F., PROF. DR., Kindler-Röhrborn, Andrea, Dr.
Applicants: BYK GULDEN LOMBERG CHEMISCHE FABRIK GMBH
Application year: 1985
Main classification: C12N5
IPC codes: C12P21, A61K38, C07K16