PROCESS FOR THE POLYMERIZATION OF HEMOGLOBIN UTILIZING CROSS-LINKING AGENTS

Abstract: 1. Process for the polymerization of hemoglobin by means of cross-linking agents, characterized in that the hemoglobin is polymerized in highly concentrated solutions at concentrations higher than 20 g/dl by means of polyfunctional agents, whereby the polyfunctional agents are added from another phase, that is an inhomogeneous polymerization is carried out.

Description: Verfahren zur Polymerisation von Hämoglobin mittels verknüpfender Reagenzien Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Polymerisation von Hämoglobin mittels verknüpfender Reagenzien. Bekanntlich können sauerstofftragende Blutersatzlösungen im Katastrophenfall, also beispielsweise bei einem Operationszwischenfall mit schwer zu beherrschenden Blutungen, bei Unfällen unter Blutverlust oder für den Fall eines Infektionsrisikos (Hepatitis, AIDS = Aquiriertes Immun-Defekt-Syndrom) als Ersatz für eine momentan nicht verfügbare passende Blutkonserve infundiert werden; dies gilt insbesondere dann, wenn ein Mensch z. B. in den genannten Fällen in einen Volumen Mangel-Schock geraten ist. Es ist möglich, dass eine sauerstofftragende Blutersatzlösung einen Volumen-Mangel-Schock eher durchbrechen kann, als eine Blutkonserve, da die Erythrozyten bekanntlich in der Konserve versteift sind und dadurch eine verringerte Kapillardurch- gängigkeit aufweisen. An Tierversuchen ist gezeigt worden, dass mit sauerstofftragenden Blutersatzlösungen ein Volumen-Mangel-Schock wirksamer bekämpft werden kann als mit einfachen Plasmaexpandern (übersichtliche Literaturstelle hierzu: R. Pabst, Med. Klin. 72 (1977), Seiten 1555 bis 1562). Zur Herstellung sauerstofftragender Blutersatzmedien sind bereits verschiedene Wege beschritten worden, nämlich 1. Verwendungen von Emulsionen von Fluorkohlenwasserstoffen, in welchen der Sauerstoff sehr gut löslich ist (übersicht liche Literaturstelle hierzu: Hirlinger et al., Anaethesist 31 (1982), Seiten 660 bis 666). 2. Die Mikroverkapselung konzentrierter Hämoglobinlösungen in Phospholipid-Vesikeln (Literaturstelle hierzu: Gaber et al., Encapsulation of Hämoglobin in Phospholipid Vesicles; Preparation and Properties of a Red Cell Surrogate in "The Red Cell, Sixth Ann Arbor Conference", G. J. Brewer (Herausgeber), Alan R. Liss, Inc., New York, 19ss4, Seiten 179 bis 190). 3. Herstellung geeigneter Hämoglobinlösungen, auch unter kovalenter Bindung des Hämoglobins an Dextrane. Die DE-06 24 77 619 beschreibt beispielsweise polymerisiertes, verknüpftes Hämoglobin als Plasmaprotein-Ersatz, wobei d icarboxyli- da tverknüp ftes Hamoglobin hergestellt wird. Die DE-06 27 14 252 beschreibt pyridoxalphosphat-verknupftes Hämoglobin. Die DE-OS 30 29 307 betrifft ein Blutersatzmittel, hergestellt durch kovalente Verknüpfung von Polysaccharid, beispielsweise Dextran, mit zellfreiem Hämoglobin. Die BE-PS 838 933 beschreibt ein wasserlös1iehes, verknüpftes, polymerisiertes Hämoglobin, das hergestellt wird durch Umsetzung freien Hämoglobins mit einem polifkkktionellen verknüpfenden Agens und ausschliessendem Abstoppen der Reaktion mit einem inaktivierenden Mittel. Es wird ein polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von 64 000 bis 1 000 000 Dalton erhalten. Die US-PS 40 01 401 betrifft Poly-Hämoglobin, ein verknüpftes Hämoglobin, als Blutersatz und PlasmSexpander, mit einem Molekulargewicht von 64 000 bis zu 1 000 000 Dalton . Als verknüpfende Agenzien werden Glutardialdehyd, Hexamethylendiisocyanat oder Butadiendiepoxid verwendet. Diese bekannte Verfahren können zumindest in gewisser Hinsicht nicht befriedigen. So ist es beispielsweise beim Verfahren der US-PS 40 01 401 erforderlich, Amine zur Verhinderung der Entstehung unlöslicher Produkte vor Zugabe des Verknüpfungsmittels zuzugeben. AuRerdem werden unzureichend polymerisierte Polyhämoglobine erhalten. Bei Anwendung von Fluorkohlenwasserstoffen wurden gewebliche Reaktionen festgestellt (siehe oben bei Hirlinger et al.). Für die Hämoglobin-Vesikel liegen bisher keine ausreichenden in-vivo-Versuche vor (siehe oben bei Gaber et al.). Der routinemässigen klinisch-praktischen Nutzung von Hämoglobinlösungen stehen bisher jeweils mehr oder weniger fünf verschiedene Probleme entgegen, nämlich: 1. Erhöhung der Sauerstoffaffinität (zu geringer Halbsättigungsdruck, P50), so dass der in der Lunge aufgenommene Sauerstoff nur ungenügend an das Gewebe abgegeben werden kann; dies tritt ausgeprägt bei der kovalenten Bindung des Hämoglobins an Dextran auf. 2. Zu geringe Verweildauer des Hämoglobins im GefäRsystem, Ausscheidung über die Niere. 3. Mit dem unter (2) aufgezeigten Nachteil ist ferner ein intravasaler Volumenmangel verbunden, so dass man gerade das erzeugt, was man bekämpfen will; 4. Nephrotoxizität und 5. Stimulierung des Immunsystems sowie Besetzung der phagozytierenden Kapazität des retikuloendothelialen Systems durch das infundierte Hämoglobin. Es wurde gezeigt, dass zur Einstellung eines hohen gemischt venösen O2-Partialdrucks nicht so sehr ein hoher Halbsättigungsdruck (P50) erforderlich ist (ein P50 von 15 mmHg ist nämlich ausreichend), als vielmehr eine hohe Sauerstoffbindungskapazität im Plasma, d. h. eine hohe Massenkcnzentration des Hämoglobins (Literaturstelle hierzu: Moss et al., "Hemoglobin Solution-From Tetramer to Polymer", in "The Red Cell: Sixth Ann Arbor Conference't, G.J. Brewer (Herausgeber), Seiten 191 bis 220, Alan R Liss, Inc., New York, 1984). Um das eben genannte Erfordernis zu befriedigen und gleichzeitig eine geringe onkotische Wirksamkeit zu erreichen, muss das Hämoglobin zu Molekülen mit möglichst hohem Polymerisationsgrad polymerisiert werden. Bisher wurden mittlere Polymerisationsgrade von 10, d. h. mittlere Molekulargewichte von etwa 700 000 Dalton erreicht. Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, natürliche Hämoglobine bis zu einem möglichst hohen Polymerisationsgrad, mindestens bis zu einem mittleren Molekulargewicht von 3-106 Dalton zu polymerisieren. Diese erfindungsgeeess hergestellten sehr hoch polymeren löslichen Hämoglobine dienen in erster Linie zur Produktion sauerstofftregde Blutersatzlösungen. Die vorgenannte Aufgabe wird beim erfindungsgemessen Verfahren zur Polymerisation von Hämoglobin mittels verknüpfender Reagenzien dadurch gelöst, dass man das Hämoglobin durch Einwirkung poliSunk- tioneller Agenzien polymerisiert7 wobei die polifunktionellen Agenzien von einer anderen Phase aus zugefUhrt werden, d .h. eine inhomogene Polymerisation durchgefUhrt wird. Bevorzugte AusfUhrungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass man das Hämoglobin in hochkonzentrierten Lösungen polymerisiert, dass man bei Konzentrationen grösser als 20 g/dl polymerisiert, dass man bei Konzentrationen grösser als 30 g/dl polymerisiert, dass man Polymerisate mit einem Molekulargewicht von 60 000 bis mehr als 6-106 Dalton herstellt und dass die Phase, aus der die polifunktionellen Agenzien kommen , eine feindisperse ist. Noch weitere besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation an intakten Erythrozyten durchgeführt wird, dass die Polymerisation an osmotisch geschrumpften Erythrozyten durchgeführt wird, dass die Polymerisation bei einer Temperatur zwischen OOC und 40 C durchgeführt wird, dass man Glutardialdehyd als polifunktionelles Agens verwendet und dass der Hämatokrit zwischen 0,1 und 99,9 Vol.-% liegt. Es ist auch möglich, direkt und ohne weitere Präparation das Hämoglobin im intakten Erythrozyten selbst zu polymerisieren. Es liegt hier in einer Konzentration von etwa 35 g/dl vor. Um die Konzentration des Hämoglobins im Erythrozyten vor Zugabe des verknüpfenden Agens noch weiter zu steigern, und damit eine weitere Erhöhung des Polymerisationsgrades zu erzielen, können die Zellen in hypertonen Natriumchloridlösungen geschrumpft werden. Allerdings kann das verknüpfende Agens (z. B. Glutardialdehyd) bei diesen hohen Konzentrationen nicht direkt zugesetzt werden. Es entstände namlich, insbesondere direkt an der Zugabestelle, momentan ein unlösliches Produkt. Das verknüpfende Agens wird vielmehr indirekt zugegeben, und zwar aus einer fein verteilten nichtwässrigen Phase. Das verknüpfende Agens wird in der nicht wässrigen Phase vorher gelöst. Die Reaktion wird zwischen 0 und 400C ausgeführt Der Hämatokrit liefert zwischen 0,1 und 99,9 Vol.-% unter Anpassung des zugesetzten Volumens an mit Glutardialdehyd gesättigtem Chloroform. Die Reaktion d3xyt je nach der gewählten Temperatur zwischen einigen Minuten und mehren Stunden. Das erzielte hohe Molekulargewicht des löslichen Hämoglobins erleichtert wesentlich eine nachfolgende (insbesondere chromatographische) Reinigung des Polymerisats von anderen Substanzen. Die MWglichkeit, die Polymerisation direkt am intakten Erythrozyten durchzufüren, macht eine vorhergehende aufwendige biotechnologische Präparation der hochkonzentrierten Hämogl obinlösung überflüssig, womit man auch eine unerwünschte Bildung von inaktivem Met Hämoglobin vermeidet. Das Wesen vorliegender Erfindung wird nun anhand der folgenden Ausführungsbeispiele, die bevorzugte Ausführungsformen zeigen, weiterhin erläutert: Beispiel 1 Polymerisation einer hochkonzentrierten Hämoglobinlösung Blut wird vcn einem gesunden Menschen aus einer Vene entnommen und mit Heparin ungerinnbar gemacht. Die Erythrozyten werden zur Entfernung der Plasmas mit isotonischer Natriumchloridlösung (0,9 g/dl) zwei- bis dreimal unter Zentrifugieren gewaschen. Zum Schluss erfolgt eine scharfe Zentrifugation (15 Minuten bei 15 000 g), damit die Erythrozyten dicht gepackt sind. Die gepackten Zellen werden durch Eintauchen des Röhrchens nach Absaugen der überstehenden Lösung in flüssige Luft durch Kälteschock zerstört (Kryolyse). Das Zellhomogenat wird mit "extrazellulärer" Elektrolytlösung (diese enthält in mmol/l: 145 NaCl; 4 KCl; 1,lot5 CaCl2) etwa 1 : 20 verdünnt, scharf zentrifugiert und die überstehende klare Hämoglobin-Lösung zur Entfernung von Rest-Stroma durch 0,22 um Filter (Millipore, Neu-Isenburg, Bundesrepublik Deutschland) filtriert. Die Lösung wird darauf mittels Ultrafiltration mit dem TCF 10 und /oder TCF 2 (Amicon, Witten, Bundesrepublik Deutschland) an PM 10- oder PM 30-Membranen auf etwa 35 g/dl konzentriert. 1 ml der hochkonzentrierten Hämoglobinlösung werden in einem 25 ml-Becherglas mit 120 1 einer GlutfflxEaldehydlösung in Chloroform versetzt und mit einem Magnetrührer bei 200 Umdrehungen pro Minute und 220C gerührt. Die Glutardialdehydlösung stellt man kurz zuvor her, indem man 25 %ige wässrige Aldehydlösung im Verhältnis 1 : 1 mit Chloroform zusamnengibt und kräftig schüttelt. Nach etwa 1,5 Stunden unterbricht man die Reaktion durch Verdünnen und zentri fugiert scharf. Man erhält in der überstehenden Lösung lösliches Hämoglobin mit einer Ausbeute von etwa 75 % mit einem Met Hämoglobingehalt von 7 %. Das lösliche Hämglobin ist zu 30 % monomer (64 000 Dalton) und zu 70 % polymer (mittleres Molekulargewicht 3.106 Dalton), so dass man eine Gesamtausbeute an polymerem Hämoglobin von etwa 50 % erreicht. Die Molekulargewichts- bestimmung erfolgt mit Hilfe der Dünnschichtgelchrogaphie an geeigneten Gelen (Sephadex oder Sephacryl : Deutsche Phamacia, Freiburg, Bundesrepublik Deutschland). Als Eichsubstanzen wurden monomeres Hämoglobin (64 000 Dalton), Blaues Dextran ( 2-106 Dalton) und Erythrocruorin vom Regenwurm (3- 106 Dalton) verwendet. Beispiel 2 Polymerisation in intakten Erythrozyten Die Zellen werden gewonnen und gereinigt wie im Beispiel 1. Sie werden dann im 11extrazellulären11 Milieu (siehe oben) mit einem Hämatokrit von 50 % aufgeschwemmt. 3 nil der Suspension werden in ein 25 ml-Becherglas gegeben, die Polymerisation wird wie im Beispiel 1 ausgefUhrt. Während der Reaktion tritt Hämolyse ein. Nach etwa 1,5 Stunden wird die Reaktion durch Verdünnen mit "extrazellulärem" Milieu unterbrochen. Es folgt eine Zentrifugation. Die überstehende klare Hämoglobinlösung hat die gleichen Eigenschaften wie im Beispiel 1, auch die Ausbeute ist gleich gross. Die Polymerisate beider Beispiele haben auch gleiche sauerstoffbindende Eigen schaften. Der Halbsättigungsdruck einer 1,5 %igen Lösung beträgt bei pH = 7,40 und bei einem CO2-Partialdruek von 40 nrig, gemessen gemass Barnikol et al. (Respiration 36 (1978), Seiten 86 bis 95), 13 mmHg. Der mittlere Hillsche Index (n) ist gleich 2,0.

Claims: Ansprfche 1. Verfahren zur Polymerisation von Hämoglobin mittels verknüpfender Reagenzien, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hämoglobin durch Einwirkung polifunktioneller Agenzien polymerisiert, wobei die polifunktionellen Agenzien von einer anderen Phase aus zugeführt werden, d. h. eine inhomogene Polymerisation durchgeführt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hämoglobin in hochkonzentrierten Lösungen polymerisiert. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man bei Konzentrationen grösser als 20 g/dl polymerisiert. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man bei Konzentrationen grösser als 30 g/dl polymerisiert. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Polymerisate mit einem Molekulargewicht von 60 000 bis mehr als 6-106 Dalton herstellt. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Phase, aus der die polifunktionellen Agenzien kommen , eine feindisperse ist. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation an intakten Er:ythrozyten durchgeführt wird. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation an osmotisch geschrumpften Erythrozyten durchgeführt wird. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation bei einer Temperatur zwischen OOC und 400C durchgeführt wird. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet dass man Glutardialdehyd als polifunktionelles Agens verwendet. 11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der HÜiatokrit zwischen 0,1 und 99,9 Vol.-% liegt.

Inventors: BARNIKOL, WOLFGANG, PROF. DR.DR., BURKHARD, OSWALD, DR.
Applicants: BARNIKOL, WOLFGANG, PROF. DR.DR., BURKHARD, OSWALD, DR.
Application year: 1985
Main classification: A61K37
IPC codes: A61K38, C07K14, G01N21