METHOD FOR THE DETERMINATION OF FREE SUBSTANCES IN BIOLOGICAL FLUIDS

Abstract: In the determination of free substances, in particular free hormones such as the thyroid hormones T3 and T4, in biological fluids, a third component is added to the biological fluid in addition to the usual components tracer and antibody, which lessens the rebinding of the tracer to the binding proteins present in the sample. Suitable third components of this type are in particular various thyroid hormone analogues and highly concentrated solutions of ionisable salts.

Description: Verfahren zur Bestimmung freier Substanzen in biologischen Flüssigkeiten Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von freien Substanzen in biologischen Flüssigkeiten, und zwar ein Verfahren, das iiblicberweise als Immunoassay bezeichnet wird. Derartige Verfahren existierten in vielfachen Abwandlungen und ihre Prinzipien sind dem Fachmann gut bekannt. Eine einfache Zusammenfassung der Grundlagen derartiger Verfahren findet sich z.B. in T.G. Cooper, Biochemische Arbeitsmethoden, S. 269 ff. GrundsätzAich wird bei derartiqen Verfahren so vorgegangen, dass man der biologischen Flüssigkeit, die die zu bestimmende Substanz enthält, zusetzt: a) eine erste Komponente, die eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz oder ein markiertes Derivat dieser Substanz enthält sowie b) eine zweite Komponente, die spezifisch die zu bestimmen de Substanz in unmarkierter k'orm sowie die erste Kom ponente gemäss a) bindet, danach das erhaltene Gemisch fur einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, die bei der Umsetzung des Gemischs aus der zu bestimmenden Substanz und der ersten Komponente gemäss a) mit der zweiten Komponente gemäss b) gebildete gebundene Phase von dem restlichen Gemisch abtrennt, den Anteil der ersten Komponente in der gebundenen Phase anhand ihrer Markierung ermittelt und schliesslich aus diesem ermittelten Anteil rechnerisch auf die Menge der zu bestimmenden freien Substanz in der biologischen Flüssigkeit rückschliesst. Ublicherweise sind die Substanzen, die nach derartigen Verfahren bestimmt werden, Antigene oder Haptene, insbesondere Hormone und ähnliche biologisch aktive Substanzen, und als zweite Komponente werden Antikörper gegen die jeweiligen Antigene oder Haptene verwendet. Bei Zusatz der ersten Komponente, im folgenden kurz Tracer genannt, der im wesentlichen in gleicher Weise wie die zu bestimmende Substanz an die zweite Komponente, im folgenden Antikörper (Ak) genannt, bindet, kommt es zu einer Konkurrenz der zu bestimmenden Substanz und des Tracers um die Bindungsstellen des Antikörpers. Da so ohl der Tracer als auch der Antikörper in bekannter Konzentration zugesetzt werden, lässt sich aus dem Anteil des Tracers inder qebildeten gebundenen Phase Substanz/Tracer- Antikörper die Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der biologischen Flüssigkeit ermitteln Der Tracer enthält Merkmale, die die Bestimmung seiner Konzentration mit physikalischen oder biochemischen Verfahren ermöglichen. In der bekanntesten Form als Radioimmunassay (RIA) enthält der Tracer ein radioaktives Atom. Das vorliegende Verfahren wird nachfolgend insbesondere in seiner Ausgestaltung als derartiger Radioimmunoassay beschrieben. Die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens ist jedoch nicht auf RIAts beschränkt, sondern es kann in wirksamer Weise auch mit enzymgekoppelten Tracern als Enzymimmunoassay, mit fluoreszierendem Tracer als Fluoreszenzimmunoassay oder mit einem lumines zierenden Tracer als Lumineszenzimmunoassay durchgeführt werden. Von den den allgemeinen Stand der Technik bildenden Ver öffentlichungen seien stellvertretend für zahlreiche andere Publikationen erwähnt: Ein Artikel von R.S. Yalow und S.A. Berson in: Nature, 184, S. 308 bis 312, die US-PS 36 54 090 und die DE-OSen 27 22 391, 32 05 506 und 29 21 781. Während derartige Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Gesamtmenge der in einer biologischen Flüssigkeit vorliegenden Substanzen gut entwickelt und praktisch eingeführt sind, treten bei einer Reihe von physiologisch wichtigen Substanzen insofern Probleme auf, als diese Substanzen nebeneinander in einer freien Form und einer qebundenen Form an physiologische Bindeproteine gebunden vorliegen. Es hat sich nunmehr aufgrund medizinischer Befunde herausgestellt, dass physiologisch vormngig der "freie " Anteil wichtig ist, so dass nach Verfahren zur Bestimmung ausschliesslich dieses freien Anteils gesucht wurde. Es wurden bereits eine Reihe derartiger Verfahren entwickelt, die beispielsweise in einem Artikel von R. Ekins "The radioimmunoassay of free hormones in blood" in Freie Hormones in Blood", S. 73 bis 90, Elsevier Biomedical Press 1982 zusammengefasst dargestellt werden. Derartige Verfahren sind auch in den europäischen Patentanmeldungen EP 0026103A1 und EP 0073865A1 näher beschrieben. Ein weiteres Verfahren, das aufgrund der speziellen Derivate der zu bestimmenden Substanz, die als Tracer verwendet werden, ebenfalls ein Verfahren zur Messung der freien Substanzen darstellt, ist in der DE-PS 28 18 644 beschrieben. In der Einleitung dieser Patentanmeldungen finden sich weitere Erläuterungen zur Bedeutung der Bestimmung freier Substanzen wie z.B. freier Hormone. Bei der Bestimmung derartiger "freier" Substanzen ergeben sich Probleme daraus, dass in der biologischen Flüssigkeit zwischen der gebundenen und freien Form einer Substanz ein Gleichgewicht herrscht, das durch den Zusatz des Tracers und das Binden der freien Substanz gestört wird. Der Tracer wird daher in sehr geringen Mengen zugesetzt. Durch Zusatz eines Tracers, der eine stärkere oder vergleichbare Bindungsneigung gegenüber den physiologischen Bindeproteinen aufweist, kann es jedoch dazu kommen, dass gebundene Substanz aus den Bindeproteinen freigesetzt wird und andererseits Tracer gebunden wird. Dabei kommt es zu einer Verminderung der zugesetzten Tracerkon zentration, ggf. begleitet von einer Erhöhung der Konzentration an freien Substanzen, und das bei dem Bestimmungsverfahren erhaltene Ergebnis ist verfälscht. Zur Lösung diese Problems wurde in den bereits zitierten Anmeldungen versucht, Tracer zu entwickeln, die zwar gegen über dem Antikörper die gleiche Bindungsneigung aufweisen wie die zu bestimmende Substanz, die jedoch gegenüber den Bindeproteinen sehr viel geringere Affinitäten zeigen. Bei dem in der genannten EP 0026103 beschriebenen Verfahren werden zur Bestimmung der Schilddrüsenhormone Thyroxin (T4) oder Trijodthyronin (T3) als Tracer derivatisierte Formen dieser Schilddrüsenhormone verwendet, die sich durch chemische Modifizierungen an der Carboxyl- und/ oder Aminogruppe von T4 bzw. T3 unterscheiden. Ferner kann an Stelle der das Hormon bildenden L-Form auch die D-Form verwendet werden. Bei dem in der EP 0073865 beschriebenen Verfahren werden Tracer verwendet, die Schild druSenhornnderivate bzw. -analoga enthalten, die kovalent gebundene Polyamine, insbesondere als Komplexbildner bekannte Substanzen wie EDTA, DTPA und NTA enthalten. Die in der DE-PS 28 78 644 beschriebenen Derivate, die in der 3 '- Stellung ein Bromatom aufweisen, umfassen ebenfalls entsprechende Derivate, die bei ihrer Verwendung als Tracer nicht oder kaum an die Bindeproteine binden, dagegen gegenüber der zweiten Komponente (Ak) eine Bindefähigkeit aufweisen, die der der zu bestimmenden Substanz vergleichbar ist. Bei ihrer Verwendung werden somit ebenfalls die freien Formen bestimmt. Soweit in dieser Anmeldung im Zusammenhang mit der ersten Komponente davon gesprochen wird, dass diese markierte Derivate der zu bestimmenden Substanz enthält, sind damit insbesondere Derivate gemeint, wie sie in der DE-PS 28 18 644 beschrieben sind, sowie ferner in der EP 0026103 und der EP 73865. Durch die Derivatisierung bzw. die Verwendung der D-Form konnte erreicht werden, dass derartige Tracer bei weitgehender Erhaltung der Bindungsfähigkeit an die Antikörper eine geringere Bindungsneigung gegenüber den Serumsproteinen, die als Thyroxin-bindendes Globulin (TBG) und Thyroxin-bindendes Prealbumin (TBPA) bezeichnet werden, aufweisen. Es wurde angenommen, dass auch das dritte bekannte physiologische Bindeprotein, das Albumin, nicht zu einer Verfälschung der Messergebnisse führt. Es hat sich nunmehr aber herausgestellt, dass auch bei einem derartigen Zweikomponentensystem Fehler bei der Bestimmung der freien Substanzen, insbesondere der freien Schilddrüsenhormone, dadurch auftreten können, dass die Uberschüsse an physiologischen Bindeproteinen dazu führen, dass der Tracer im Sinne einer "Rückbindung" an diese Bindeproteine gebunden wird, wodurch seine Konzentration herabgesetzt wird und die Messergebnisse verfälscht werden. Diese "Tracer-Rückbindung" führte vor allem bei abnormalen Bindungsproteinverteilungen in einigen Proben zu falschen Ergebnissen. Es kann in diesem Zusammenhang auf verschiedene wissenschaftliche Artikel verwiesen werden: J.R. Stockigt, V. Stevens, E.L. White und J.W. Barlow in Clin. Chem. 29/7, 1408 bis 1410 (1983); N. Amino et al in Clin. Chem. 29/2, (1983), S. 321 bis 325. In diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass insbesondere der Albuminanteil in der biologischen Flüssigkeit die Bindung des Tracers an den Antikörper behindert. Ferner ist es als genereller Mangel bei einer Verwendung von derivatisierten Formen als Tracer anzusehen, dass jede Derivatisierung in der Regel eine von 100% abweichende Kreuzreaktivität zur Folge hat. Ein Verfahren, das eine Bestimmung der freien Form unter Verwendung eines Tracers, der bis auf die Markierung mit der zu bestimmenden Substanz identisch ist, ermöglicht, weist somit einen Vorteil auf, der den bisher bekannten Verfahren fehlt. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Bestimmungsprinzip zur Bestimmung freier Substanzen, insbesondere freier Hormone wic Thyroxin und Trijodthyronin anzugeben, bei dem es zu keiner Verfälschung der Messergebnisse durch Tracer-Rückbindung kommt und das es ausserdem gestattet, die bei der Verwendung von derivatisierten Tracern durch Rückbindung auftretenden Fehler zu vermeiden. Diese Aufgabe wird erfindungsgeinäss durch ein Verfahren gelöst, wie es in allgemeiner Form in den Ansprüchen 1 und 2 beschrieben ist und in spezifischer Ausgestaltung in den Ansprüchen 3 ff. beansprucht wird. Zur Bedeutung der Angaben der Patentansprüche wird auf die vorliegende Beschreibung verwiesen, der weitere Merkmale des er findungsgemässen Verfahrens entnommen werden können. Das erfindungsgemässe Verfahren unterscheidet sich von den herkömmlichen Verfahren, bei denen nur 2 Komponenten verwendet werden, nämlich der "Tracer" und der "Antikörper", dadurch, dass eine dritte Komponente zugesetzt wird, die spezifisch eine Rückbindung des Tracers an die Bindeproteine verhindert. Dadurch kommt es zu keiner Veränderung der Tracer-Konzentration durch Rückbindung, und die erhaltenen Ergebnisse spiegeln die tatsächlich vorliegende Konzentration der freien Hormone besser wieder. Grundsätzlich unterscheidet sich das erfindungsgemässe Verfahren von den vorbekannten Verfahren dadurch, dass nicht der Tracer oder der Antikörper verändert werden, sondern dass gezielt auf die Bindeproteine, insbesondere auf die im Uberschuss in freier Form in der biologischen Flüssigkeit vorliegenden Bindeproteine, eingewirkt wird, so dass diese die Messung nicht verfälschen. Die durch die dritte Komponente erzielte Veränderung der Bindeproteine lässt sich allgemein als Herabsetzung oder Eliminierung ihrer Bindungsaffinität gegenüber dem Tracer beschreiben. Diese Verminderung der Bindungsaffinität kann prinzipiell auf verschiedene Weise erfolgen, wobei einmal eine "Neutralisierung" der Bindeproteine durch die dritte Komponente erfolgt, die nicht zum eigentlichen Messsystem gehört und an die freien Bindeproteine bindet, so dass eine Tracer-Rückbindung verhindert wird. Es ist jedoch genauso möglich, die Bindungsaffinität der Bindeproteine an sich dadurch herabzusetzen, dass bei Bedingungen gearbeitet wird, die für die Ausbildung einer Bindung Bindeprotein/ Tracer ungünstig sind. Die dritte Komponente kann der zu bestimmenden Probe vor der Zugabe des Tracers zugesetzt werden, jedoch auch mit diesem zusammen. Die Möglichkeit, direkt das zu bestimmende Hormon in der markierten Form einzusetzen, stellt sicher, dass Kreuzreaktivitäten von 100 & erreicht werden können. Durch die Verhinderung der Tracer-Rückbindung durch Zusatz einer dritten Komponente konnte überraschenderweise eine entscheidende Verbesserung der Bestimmungsgenauigkeit freier Hormone erzielt werden. Diese Ergebnisse waren insofern unerwartet, als zu befürchten war, dass bei dem Versuch einer Beeinflussung der Bindungsaffinität der Bindeproteine eine Freisetzung der gebundenen Form der zu bestimmenden Substanz erfolgt. Die vorliegenden praktischen Ergebnisse haben gezeigt, dass diese Befürchtung nicht gerechtfertigt ist, wenn Art und Konzentration der dritten Komponente entsprechend ausgewählt werden. Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Messprinzip lässt sich grundsätzlich bei der Messung aller Substanzen anwenden, die in biologischen Flüssigkeiten nebeneinander in freier und gebundener Form vorliegen. Derartige Substanzen sind neben den bereits erwähnten Schilddrüsenhormonen T3 und T4 das Cortisol, die Geschlechtshormone Progesteron, Testosteron und östradiol sowie weitere ähnliche hormonale Substanzen. Das erfindungsgemässe Verfahren kann so durchgeführt werden, dass einmal als Tracer direkt die markierte Form der zu bestimmenden Substanz verwendet wird, und dass die dritte Komponente durch Verminderung der Tracer-Rückbindung das Gleichgewicht freie zu bestimmende Substanz/ an das Bindeprotein gebundene Substanz/ Bindeprotein mit freien Bindungsstellen so beeinflusst, dass bei dem Immunoassay nur die freie Form gemessen wird. Das erfindungsgemässe Verfahren kann ferner auch als Verbesserung des Immunoassays mit dem derivatisierten Tracer, z.B. gemäss DE-PS 28 18 644, EP 0026103 oder EP 00 73865 verwendet werden, indem es in einem solchen System die Rückbindung verhindert. Besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens betreffen die Bestimmung der freien Schilddrüsenhormone T3 und T4. Dabei hat es sich gezeigt, dass das erfindungsgemässe Ver fahren eine Bestimmung des freien T3 ermöglicht, ohne dass ein derivatisierter Tracer verwendet werden muss. Der Tracer (die erste Komponente gemäss a)) kann somit ein markiertes T3 sein, insbesondere ein T3, das ein radioaktives Jodisotop enthält, beispielsweise 131J und insbesondere 125J. 125J-markiertes T3 ist als Tracer bevorzugt. sinne besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ferner die Verwendung eines Lumineszenztracers, insbesondere gemäss DE-OS 29 21 781. Ein erfindungsgemässer Immunoassay zur Bestimmung des freien T3 enthält somit ausser den üblichen Bestandteilen 125J-markiertes T3 als erste Komponente und einem T3-Antiserum (T3-Antikörper) als zweite Komponente eine dritte Komponente, die vorzugsweise eines der Schilddrüsenhormonanaloga 3,3 ',5-Trijodthyronin (rT3), 3 ',5''Dijodthyronin, 3,5-Dijod-3'-isopropyl-thyronin, IrThyroxin, 3,3',5,5'-Tetrajodthyreoessigsäure, 3', 5' -Dijodthyreoessigsäure oder 3,3',5'-Trijodthyreoessigsäure ist. Soweit die genannten Verbindungen in L und D-Form vorliegen können, können ausser den L-Formen auch die Formen verwendet werden. Die Schilddrüsenhormonanaloga werden in solchen Konzentrationen eingesetzt, dass einerseits die Rückbindung des markierten T3-Tracers verhindert wird, andererseits kein gebundenes TZ freigesetzt wird. Als geeignete Mengen haben sich, bezogen auf jeweils 0,1ml Hurnanserumeinsatz,0,05 bis 1,5 nmol, bevorzugt 0,1 bis 1 nmol des Hormonanalogen erwiesen. Praktisch sehr befriedigende Ergebnisse werden dabei in der Regel bei ca. 0,8 nmol erhalten. Es konnte bei einem derartigen speziellen Assaysystem mittels Charcoaltrennung gezeigt werden, dass in einem derartigen Dreikomponentensystem eine Tracer-Rückbindung unterdrückt ist. Klinische Tests ergaben, dass die Radioimmunoassays auf Basis der erfindungsgemässen Dreikomponentensysteme Ergebnisse liefern, die herkömmlichen Radioimmunoassays vergleichbar sind, wobei in speziellen Fällen Fehler der herkömmlichen Systeme vermieden werden. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren betrifft die Bestimmung Von freiem Thyroxin < FT4) aus Humanserum. Bei einem solchen System wurde gezeigt, dass die bekannte Derivatisierung des Thyroxin-Tracers zur Verhinderung der Rückbindung an das Serumsprotein TBG falsche Werte lieferte, da eine Tracer-Rückbindung an eine weitere bindende Komponente erfolgte, nämlich an das Albumin. Diese Fehlerquelle konnte überraschenderweise bei dem erfindungsgemässen Verfahren eliminiert werden, indem als dritte Komponente eine wäBrige Salzlösung hoher lonenstärke verwendet wurde. Geeignete Salze sind beispielsweise Kalium-, Natrium- und Magnesiumchlorid, Kalium-, Natriumbromid, Kalium-, Natriumphosphat, Kalium-, Natriumsulfat und ähnliche ionisierbare Salze, die in hohen Konzentrationen,insbesondere von 0,25 bis 1,8 M, bevorzugt 0,4 bis 1,5 M, beispielsweise in der Grössenordnung von 1M, verwendet werden. Die Anwesenheit derartiger Salz- oder Pufferlösungen mit hoher Ionenstärke verhindert offensichtlich ebenfalls eine Rückbindung an die physiologischen Serumsproteine. Bei einem erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von freiem T4 wird somit ausser den bekannten Komponenten 125J-markiertes Thyroxin-Derivat (insbesondere ein Derivat gemäss DE-PS 28 18 644) und T4-Antikörper eine dritte Komponente verwendet, die eine Salzlösung hoher Ionenstärke ist. Als dritte Komponente kann auch, ggf. zusätzlich, eines der weiter oben näher bezeichneten Schilddrüsenhormonanaloga angewandt werden. Orientierende Versuche zeigten, dass es auch im Falle der Bestimmung von freiem T4 möglich ist, als Tracer ein radioaktiv markietes, nichtderivatisiertes T4 zu verwenden. Bei den erfindungsgemässen Verfahren erfolgt die Trennung der gebundenen Phase von der restlichen freien Fraktion nach den üblichen klassischen Verfahren, beispielsweise durch Solidphase-Techniken (Mikropartikeln, Makrokugeln oder beschichteten Röhrchen) oder als präpräzipitiertes Antiserum. Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von konkreten Anwendungsbeispielen unter Bezugnahme auf zwei Figuren noch näher erläutert. Es zeigen: Fig.1 eine typische Standardkurve für einen FT3-Test Fig.2 eine typische Standardkurve für einen ET4-Test Beispiel 1 3-Komponentensystem zur Bestimmung von freiem Trijod thyronin: Herstellung der Assay-Komponenten: 1) Standards Standards in Humanserum werden nach Standardverfahren hergestellt und mit einer Primärmethode wie Gleichge wichtsdialyse nach Ellis S. und Ekins R. (1973, Acta Endocrinologica (Kbh) Suppl. 177; 106) kalibriert. Die Konzentrationen für den freien Anteil an Trijodthyronin wurden für dieses Beispiel wie folgt bestimmt: Nullserum: Weitgehend frei von Trijodthyronin (ca. 99%). Standard 1: 1,1 pmol T3/l Standard 2: 2,2 pmol T3/l Standard 3: 4,4 pmol T3/l Standard 4: 8,8 pmol T3/l Standard 5: 17,6 pmol T3/l Standard 6: 35,2 pmol T3/l Die Standards müssen so gewählt werden, dass sie sich über den physiologisch relevanten Messbereich erstrecken. 2) Tracer Ein 125J-markiertes Trijodthyronin als Tracer (spezifische Aktivität ca. 2300 Ci/g) in Natriumbarbitalpuffer (50 mmol/l; pH 8,4) wird analog zu H. Rokos und H. SteirLus (1981, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol. 19,pp. 191194) hergestellt. 3) Dritte Komponente Eine Lösung von 3 microgr/ml L-3',5' Dijodthyronin (Fa. Henning Berlin GmbH) in Natriumbarbitalpuffer (50 mmol/l; pH 8,4) wurde als dritte Komponente gemäss c) nach Anspruch 2 verwendet. 4) Antiserum Zur Vereinfachung der Handhabung des Tests wird ein T3-Antiserum als Festphasen-gekoppeltes Antiserum vom Kaninchen verwendet: Als Konjugat zur Immunisierung des Versuchstieres wurde ein Trijodthyronin-Rinderserumkonjugat benutzt. Das daraus gewonnene Antiserum zeigte eine Bindecharakteristik von ca. 65% Trijodthyronintracer bei einer Verdünnung von 1:30.000. Kreuzreaktivitäten zu anderen Schilddrüsenhormonanaloga lagen unter 0,18%. Dieses Antiserum wird nach Gooch G.T. et al. (1983 Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 8 105-114) an Micropartikel aus Polyamid kovalent gebunden und als Suspension in Kaliumphosphatpuffer (50 mmol/l; pH 7,4) mit 2% Ovalbumin in das Testsystem eingesetzt. Testdurchführung: Zur Durchführung des Testes werden in verschiedene Teströhrchen jeweils 0,1 ml Standards bzw. unbekannte Serumproben pipettiert. Danach wird nacheinander je 0,1 ml Komponente III (wie oben), 0,1 ml T3-Tracer (ca. 30.000 Impulse pro Minute entspr. ca. 750 Bq) und 1 ml FT3 Antiserum-Suspension (wie oben) in jedes Röhrchen zugesetzt und 2 Std. bei 370C in- einem Brutschrank oder Wasserbad inkubiert. Anschliessend werden die Röhrchen mit mindestens 1000 g für 5 Min. zentrifugiert und die im überstand befindliche freie Phase abgesaugt. Die im Pellet gebundene Menge an Tracer wird in einem Gammazähler gemessen und entspricht der gebundenen Phase. Testergebnisse: Die Messwerte der Standards ergeben in einer für den Radioimmunoassay typischen Auswertung (B/Bo) und halblogarithmischeh Auftragung eine Standardkurve (Abb. 1), an der die Konzentrationen der unbekannten Proben abgelesen werden können. Klinische Wertigkeit: Zur Uberprüfung der klinischen Wertigkeit der FT3-Bestimmung wurden drei Patientenkollektive herangezogen, deren Schilddrüsenstatus an Hand von klinischen Anzeichen, sowie den derzeit üblichen Laborparametern wie Gesamt-thyroxin, Gesamt-Trijodthyronin sowie dem TSH/TRH Test (P. Pfannenstiel, "Diagnostik von Schilddrüsenerkrankungen", 4. Auflage, ISBN 3-87018-031-5) eindeutig als "hyperthyreot", "euthyreot" und "hypothyreot" einzustufen waren. Die Mittelwerte aller FT3-Bestimmungen und die entsprechenden 2s-Abweichungen liegen bei: 1,15 + 1,6 pmol/l für hypothyreote Personen (n = 20) 5,42 + 2,4 pmol/l für euthyreote Personen (n = 42) 15,8 + 10 pmol/l für hyperthyreote Personen (n = 18) Damit ist eine hinreichende Klassifizierung des Schilddrüsenstatus durch die erfindungsgemässe FT3-Bestimmung mit folgenden Normgrenzen gegeben: Hypothyreosen: e 3,2 pmol/l Euthyreosen: 3,2-9 pmol/l Hyperthyreosen: > 9 pmol/l In einigen speziellen Serumproben mit veränderten Schilddrüsenhormon-Bindeproteinen wie sie z.B. auch bei schwangeren Frauen auftreten können, zeigte das erfindungsgemässe Verfahren bessere Korrelationen der FT3-Werte zu dem diagnostizierten Schilddrüsenstatus als herkömmliche Zweikomponentenverfahren. Beispiel 2 3-Komponentensystem zur Bestimmung von freiem Thyroxin: Herstellung der Assay-Komponenten: 1) Standards Standards in Humanserum werden nach Standardverfahren hergestellt und mit einer Primärmethode wie Gleichgewichtsdialyse nach S. Ellis und R. Ekins (1973, Acta Endocrinologica (Kbh) Suppl. 177; 106) kalibriert. Die Konzentrationen für den freien Anteil von Thyroxin wurden für dieses Beispiel wie folgt bestimmt: Nullserum: Weitgehend frei von Thyroxin (ca. 99%). Standard 1: 2 pg T4/ml Standard 2: 4 pg T4/ml Standard 3: 8 pg T4/ml Standard 4: 16 pg T4 .1 Standard 5: 32 pg T4 1 Standard 6: 64 pg T4/ml Die Standards müssen so gewählt werden, dass sie sich über den physiologisch relevanten Messbereich erstrecken. 2) Tracer Ein 125J-markiertes Thyroxinderivat, gemäss DEO 28 18 644 Nw etyl-3'-brom-5'-(jod-125)-3,5-dijod-L-thyronin, (spezifische Aktivität ca. 2300 Ci/g) in Natriumphosphatpuffer (50 mmol/l; pH 7,4) mit 1 mol/l Kaliumchlorid wird als Tracer in diesem Beispiel benutzt. Zu vergleichbaren Ergebnissen kommt man auch mit anderen N-substituierten Niederalkanoyl-Thyroxinderivate, sowie mit Thyroxinderivaten wie in EP 0026103 und EP 0073865 beschrieben. 3) Dritte Komponente Als dritte ru ponente nach Anspruch 2 dient in diesem Bei- spiel die Salzlösung (1mol/l Kaliumchlorid als Zusatz in der Tracerlösung 2), die mit dem Tracer zugleich zugegeben werden kann. 4) Antiserum Zur Vereinfachung der Handhabung des Tests wird ein T4 Antiserum als Festphasen-gekoppeltes Antiserum vom Kaninchen verwendet: Als Konjugat zur Immunisierung des Versuch stieres wurde ein Thyroxin-Rinderserumkonjugat benutzt. Das daraus gewonnene Antiserum zeigte eine Bindecharakteristik von ca. 65% Thyroxintracer bei einer Verdünnung von 1:800. Kreuzreaktivitäten zu anderen Schilddrüsenanaloga lagen unter 0,1%, die Kreuzreaktivität zu dem in diesem Beispiel als Tracer verwendeten Thyroxinderivat lag bei 102%. Dieses Antiserum wird nach G.T. Gooch et al. (1983 Applied Biochemistry and Biotechnology Vol.8 105-114) an Micropartikel aus Polyamid kovalent gebunden und als Suspension in Kaliumphosphatpuffer (50 mmol/l; pH 7,4) mit 2% Ovalbumin in das Testsystem eingesetzt. Testdurchführung: Zur Durchführung des Testes werden in verschiedenen Teströhrchen jeweils 0,1 ml Standards bzw. unbekannte Serumproben pipettiert. Danach wird 0,1 ml Tracer (ca. 30 000 Impulse pro Minute entspr. ca. 750 Bq) und 1 ml FT4-Antiserum-Suspension (wie oben) in jedes Röhrchen zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend werden die Röhrchen mit mindestens 1000 g für 5 Min. zentrifugiert und die im Uberstand befindliche freie Phase abgesaugt. Die im Pellet gebundene Menge an Tracer wird in einem Gammazähler gemessen und entspricht der gebundenen Phase. Testergebnisse: Die Messwerte der Standards ergeben in einer für den Radioimmunoassay typischen Auswertung (B/Bo) und halblogarithmischen Auftragung eine Standardkurve (Abb. 2), an der die Konzentrationen der unbekannten Proben abgelesen werden können. Klinische Wertigkeit: Zur Uberprüfung der klinischen Wertigkeit der FT4-Bestimmung wurden drei Patientenkollektive herangezogen, deren Schilddrüsenstatus an Hand von klinischen Anzeichen, sowie den derzeit üblichen Laborparametern wie Gesamt thyroxin, Gesamt-Trijodthyronin sowie dem TSH/TRH-Test (P. Pfannenstiel, Diagnostik von Schilddrüsenerkrankun gen, 4. Auflage, ISBN 3-87018-031-5) eindeutig als "hyperthyreot", "euthyreot" und "hypothyreot" einzu- stufen waren Die Mittelwerte aller FT4-Bestimmungen und die entsprechenden 2s-Abweichungen liegen bei: 6 + 2,5 pg/ml für hypothyreote Personen (n = 23) 14 + 3 pg/ml für euthyreote Personen (n = 143) 26 + 8 pg/ml für hyperthyreote Personen (n = 43) Damit ist eine hinreichende Klassifizierung des Schilddrüsenstatus durch die erfindungsgemässe FT4-Bestimmung mit folgenden Normgrenzen gegeben: Hypothyreosen: C 9 pg/ml Euthyreosen: 10-19 pg/ml Hyperthyreosen:. > pg/ml

Claims: Process for the determination of free triiodothyronine or free thyroxine in biological fluids in the presence of one or more physiological binding proteins for the named free substances, wherein there is added to the biological fluid: a) a first component which contains a marked form of the substance to be determined or a marked derivative of this substance, and b) a second component which specifically combines with the substance to be determined in the unmarked form as well as with the first component according to a), and thereafter incubating the mixture so obtained for a sufficient period, followed by the separation from the remainder of the mixture of the bound phase formed by reaction of that mixture containing the substance which is to be determined and the first component according to a) with the second component according to b), determining the amount of the first component in the bound phase by means of its marking and then finally using this amount to calculate the amount of the free substance which is to be determined in the biological fluid, characterised in that, a third component c) chosen from analogues of thyroid gland hormones and/or aqueous salt solutions with a concentration corresponding to 0.25 to 1.8 M is additionally added to the biological fluid. Process according to Claim 1, characterised in that, the analogues of thyroid gland hormones L-3,3',5'-triiodothyronine, L-3',5'-diiodothyronine, L-3,5-diiodo-3'-isopropylthyronine, 3,3',5,5'-tetraiodo-thyreo-acetic acid, 3',5'-diiodothyreo-acetic acid, 3,3',5'-triiodo-thyreo-acetic acid, or L-thyroxine in the case of the determination of free triiodothyronine, are used in amounts from 0.05 to 1.5 nmol based on 0.1 ml of human serum as the biological fluid. Process according to Claim 1, characterised in that, solutions of potassium chloride, sodium chloride and/or magnesium chloride or suitable buffer solutions of high concentration are used as the aqueous salt solutions. Process according to one of the Claims 1 to 3 for the determination of free triiodothyronine, characterised in that, the first component is a radioactively marked triiodothyronine, the second component is a triiodothyronine antiserum and the third component is an analogue of a thyroid gland hormone. Process according to one of the Claims 1 to 3 for the determination of free triiodothyronine, characterised in that, the first component is a radioactively marked triiodothyronine derivative having a reduced bonding capability towards at least one of the physiological binding proteins, the second component is a triiodothyronine antiserum and the third component is an analogue of a thyroid gland hormone. Process according to Claim 4 or Claim 5, characterised in that, the first component is a ¹²⁵I-marked triiodothyronine or triiodothyronine derivative. Process according to one of the Claims 1 to 3 for the determinaton of free thyroxine, characterised in that, the first component is a radioactively marked thyroxine, the second component is a thyroxine antiserum and the third component is an analogue of a thyroid gland hormone and/or a salt solution. Process according to one of the Claims 1 to 3 for the determination of free thyroxine, characterised in that, the first component is a marked thyroxine derivative having a reduced bonding capability towards at least one of the physiological binding proteins, the second component is a thyroxine antiserum and the third component is an analogue of a thyroid gland hormone and/or a salt solution. Process according to one of the Claims 7 or 8, characterised in that, the first component is radioactively marked with ¹²⁵I. Process according to one of the Claims 1 to 3 or 8, characterised in that, the first component is marked with a group known per se which is capable of luminescence.

Inventors: BIENHAUS, GERHARD
Applicants: HENNING BERLIN GMBH CHEMIE UND PHARMAWERK
Application year: 1985
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33