TUMOUR THERAPEUTIC AGENT AND PROCESS FOR ITS PREPARATION

Abstract: The process entails either tumour cells which carry antigens which are bound by the monoclonal antibodies described in German Offenlegungsschrift 33 29 184 being dried or stabilised by a chemical treatment, or antigens being isolated from human cells using these monoclonal antibodies, and converted into a therapeutic agent, adding neuraminidase where appropriate.

Description: Tumortherapeutikum und Verfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums aus Tumorzellen zur Therapie von Tumorerkrankungen sowie ein solches Theraneutikum. Es ist beispielsweise aus wMechanisms of Tumor Immunity, Gree et al., eds., John Wiley Sons, N.Y., 1977, Seite 196, bekannt, dass bereits versucht wurde, Tumorerkrankungen durch Impfen mit Tumorzellen, die durch Gefrieren und Auftauen, Lyophilisieren, Druck oder Homogenisieren modifiziert waren, zu therapieren. Auch subzelluläre Fraktionen oder Zellextrakte wurden zu diesem Zweck verwendet. Es ist jedoch bisher kein Impfstoff genen eine Tumorerkrankung bekannt. Wir haben uberraschenderweise gefunden, dass lyophilisierte oder mit einem Aldehyd behandelte Zellen aus menschlichen Tumoren oder aus solchen gewonnene Zellaqqreqate, die Antigene tragen, die von den in der deutschen Offenlegungsschrift 33 29 184 beschriebenen monoklonalen Antikorper gebunden werden, als Therapeutikum zur Behandlung von Tumorerkrankungen benutzt werden können. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Therapeutikum zur Behandlung einer Tumorerkrankung, enthaltend getrocknete oder durch eine chemische Behandlung stabilisierte menschliche Zellen, die Antigene tragen, welche von den in der deutschen Offenlegungsschrift 33 29 184 beschriebenen monoklonalen Antikörpern gebunden werden. Ein Vorteil eines solchen Therapeutikums qeqenüber einer Verwendung von nativen Zellen besteht darin, dass native Zellen nicht stabil sind, so dass sie jeweils frisch hergestellt werden müssen. Sie können deshalb auch nicht standardisiert werden. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung einer Tumorerkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass menschliche Tumorzellen, die Antigene traqen, welche von den in der deutschen Offenlegungsschrift 33 29 184 beschriebenen monoklonalen Antikörper gebunden werden, getrocknet oder durch eine chemische Behandlung stabilisiert und zu einem Therapeutikum aufgearbeitet werden, wobei gegebenenfalls Neuraminidase zugegeben wird. Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung einer Tumorerkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines in der deutschen Offenlequngsschrift 33 29 184 beschriebenen monoklonalen Antikörpers ein Antigen aus menschlichen Zellen isoliert und zu einem Therapeutikum aufgearbeitet wird, wobei sesebenenfalls Neuraminidase zugegeben wird. Die Möglichkeit, eine Immunantwort durch Neuraminidase zu verstärken, ist aus der deutschen offenlequngsschrift 26 20 649 bekannt. Als Therapeutikum ist ein Mittel zu verstehen, das sowohl prophylaktisch als auch zur Behandlung einer manifesten Erkrankung qeeiqnet sein kann. Die im Rahmen der Erfindung verwendbaren Zellen werden nach bekannten Zellkulturverfahren aus Tumoren gewonnen. Auf mechanische oder enzymatische Weise aus solchen Kulturen gewonnene, gegebenenfalls mit Mitomycin C inaktivierte Zellen werden getrocknet, vorzugsweise lyophilisiert, oder mit einem dem Fachmann als Stabilisierungsmittel für organische Gewebe bekannten Agenz, vorzugsweise einem Mono- oder Dialdehyd mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, behandelt. Zu den zur chemischen Stabilisierung und Fixierung besonders geeigneten Agenzien gehören besonders bifunktionelle Verbindungen, also solche, die zwei Gruppen enthalten, die mit funktionellen Gruppen auf dem biologischen Material reagieren - es also "vernetzen" können. Das sind beispielsweise Dialdehyde, besonders aliphatische Dialdehyde mit 2-8 Kohlenstoffatomen. Dazu sind jedoch auch geeignet Monoalkanale mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wie Formaldehyd, der bifunktionell reagieren kann, aber auch bifunktionelle Immunoester wie Subero midat, Isocyanate oder Isothiocyanate. Als Agenzien, die biologisches Material stabilisieren können, können auch sogenannte Gerbmittel dienen wie zum Beispiel Gerbsaure und ihre Derivate oder Chromsalze. Auch Sulfosalicylsaure ist geeignet. Im allgemeinen liegen die Zellen als Zellklumpen oder als Einzelzellen vor. Es können auch aus den Tumorzellen isolierte Antigene oder Zellbruchstucke verwendet werden. Derartige Antigene können aus Tumorgewebe von Patienten wie aus humanen Tumoren, die in immundefizienten Tieren wachsen, gewonnen und verwendet werden. Definierte Antigene werden mit den in der DOS 33 29 184 beschriebenen monoklonalen Antikörpern aus den Tumorzellen oder Bruchstücken davon gewonnen. Beispiele für derartige Antigene sind C A (carcinoembryonic antigen; J.exp.Med. (1965) 122, 467) oder NCA (nonspecific crossreactinq antigen; J.Immun. (1973) III, 1926), welche mittels Immunaffinith.tschromatographie aus den Tumorzellen isoliert werden können. Hierzu werden die in der Tabelle I in der deutschen Offenlegungsschrift 34 16 774 beschriebenen monoklonalen Antikörper als gereinigte Proteine kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gebunden und die von diesen monoklonalen Antikörpern erkannten Antigene (C A, NCA) aus D -TA Colonkarzinomzellextrakten isoliert. in geeignetes Verfahren ist im Pharmacia Buch "Affinity Chromatography, Principles and Methods", 12-18 (1979), zusammengefasst auf Seite 15, beschrieben. Ein solches mittels monoklonaler Antikörper gewonnenes Antigen kann als Therapeutikum besipielsweise als Wirkstoff in Impfstoffen gegen eine Erkrankung, die durch die Tumorzellen verursacht wird, aus denen das Antigen gewonnen wurde, verwendet werden. Die Qualitätskontrolle eines als Impfstoff zu benutzenden Materials wird beispielsweise durch TyDisierung mit monoklonalen Antikörpern, oder durch Auftrennung der Gesamtzellproteine mittels SDS-Polyacrylamidqelelektro- phorese oder isoelektrischer Fokussierung (1. Dimension) kombiniert mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (2. Dimension) mit nachfolgender Anfärbung des Gels (Silberfärbung) durchgeführt. Das antigene Material wird bevorzugt in Kombination mit einem Adjuvans, besonders Neuraminidase (Deutsche Offenlegungsschrift 26 20 649), intradermal vorzugsweise nach dem Verfahren der Schachbrettvakzination (Cancer Immunol. and Immunother. 6, 47-58 (1979), spez. S.48) appliziert. Ein solcher Impfstoff wird vorzugsweise gegen bestimmte Stadien des Colonkarzinoms (Duke C) sowie gegen andere Tumoren eingesetzt, die Antigene oder pitope tragen, welche im Impfstoff vorhanden sind. Solche anderen Tumoren sind solide Tumoren, beispielsweise Pankreaskarzinom, Magenkarzinome, Mammakarzinome und Lungenkarzinome. Der Impfstoff kann parenteral oder oral verabreicht werden. Die Antigene können in physiologischer Kochsalzlösung gelöst oder suspendiert appliziert werden, vorzugsweise intradermal in PBS. Als Qualitatskriterien für die StabilitEt der Antigenzusammensetzung des Impf stoffs wurden zwei Tests durchgeführt: a) Der Terasaki-IIF-Assay (indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Tumorzellen, die in den Näpfchen der Terasaki-Mikrotiterplatte wachsen) mit monoklonalen Antikörpern verschiedener Spezifität. Mittels dieses Tests ist es möglich, die Expression von Membranantigenen auf intakten Tumorzellen zu messen, gegen die eine Reihe monoklonaler Antikörper verfüqbar sind (Cancer Detection and Prevention 6, 181-184, 1983). Hiermit liessen sich drastische Veränderungen auf der DE-TA-Zellmembran im Laufe der Kultivierung feststellen; b) Solubilisierung der Gesamtzellproteine durch ein Deterqens (Hybridoma 1, 413-421, 1982) sowie nachfolgende SDS-Polyacrylamid- gelelektrophorese kombiniert mit Silberfärbung (Anal. Biochem. 105, 361-363, 1980). Die Kombination dieser Techniken stellt sicher, dass keine signifikanten Veränderungen im Gesamtproteingehalt der DE-TA-Zellinie eingetreten sind. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Die Karzinomzellinie BW X wurde in Zellkultur als Monolayer wachsend in RPMI-1640-Medium (Moore, G.E., Gerner, R.E., Franklin, H.A., Culture of normal human leucocytes, J.A.M.A. 199, 519-524 (1967)) mit 10% foetalem Kälberserum in Plastikflaschen kultiviert. Die adhärent wachsenden Zellen konfluenter Kulturen wurden mechanisch oder mittels Trypsin, das in foetalem Kälberserum-freien RPMI-1640-Medium gelöst war, abgelöst, die Kollagenase durch Zugabe von in RPMI-1640 gelostem foetalen Kälberserum inaktiviert, anschliessend die Zellen aus den Gewebekulturflaschen herausgelöst und 3 mal in 37"C warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Etwa 107 Zellen, die grösserenteils als Klumpen vorliegen, wurden 1 Stunde bei 370C in 1 ml PBS, das 100 pg Mitomycin C enthält, inkubiert. Anschliessend wurden die so inaktivierten Zellen 3 mal mit PBS gewaschen und a) 3 mal in 0,18 molarem Ammoniumbicarbonat-Puffer, der mit Essigsäure auf pH 7,4 eingestellt worden war, ewa- schen. Ein 107 Zellen entsprechendes Zellsediment wurde in 100 pl desselben Ammoniumbicarbonat-Puffers aufgenom- men und bei -70 C gefroren. Anschliessend wurde das gefrorene Material gefriergetrocknet und bei +40C im Kühlschrank in einem luftdicht verschlossenen Glasfläschchen gelagert. Das so behandelte Zellmaterial kann, in PBS aufgenommen, in eine Vakzination am Patienten eingesetzt werden. Alternativ wurde b) 5 Minuten bei +4 C mit 0,14 Glutaraldehyd in PBS inkubiert, der tberschüssige Glutaraldehyd durch 3 malises Waschen mit PBS entfernt, anschliessend mit 2% BSA (Bovine Serum Albumin) für 5 Minuten bei +40C inkubiert und 3 mal in PBS gewaschen. Die so behandelten Zellen können bei +40C gelagert werden und in die Vakzination am Patienten eingesetzt werden. Oder es wurde c) bei 250C in Formalin nach Lilly (Benno Romeis (1968), S. 65, Kap. 266, Oldenburg Verlag München) unter gelegentlichem Schütteln huber Nacht inkubiert. Die Zellen (ca. 108) wurden zentrifugiert, der Überstand dekantiert (10 Minuten bei 800 g) und das Zellsediment in 7 ml doppelt destilliertem Wasser suspendiert (= l-mal Waschen). Dieser Waschvorgang wurde in l-stündigen Abständen 4-mal wiederholt. Anschliessend wurde das Zellsediment 3-mal in l-stündigen Abständen in je 7 ml ?0%-igem Ethanol qewa- schen. Anschliessend wurde das Zellsediment 3-mal in 30minütigen Abständen in je 7 ml 80%igem Ethanol gewaschen. Anschliessend wurde das Zellsediment 3-mal in 30-minütigen Abständen in je 7 ml 96%igem Ethanol gewaschen. Anschliessend wurde das Zellsediment 3-mal in 30-minütigen Abständen in je 7 ml 99%igem Ethanol gewaschen. Anschliessend wurde das Zellsediment 3-mal in 30-minütigen Abständen in je 7 ml sterilem PBS gewaschen und steril bei 4"C aufbewahrt. Die so behandelten Zellen können bei 40C gelagert werden und in die Vakzination am Patienten eingesetzt werden. Beispiel 2 Zur Isolierung von Antigenen mittels Immunaffinitätschromatographie aus Tumor zellen wurden gereinigte monoklonale Antikörper, die eindeutig mit Antigenen auf den als Impfstoff zu verwendenden Tumorzellen reagieren, kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gebunden. Es wurde nach dem Pharmacia Buch wAffinity Chromatography", Principles and Methods, 12-18 (1979), spez. S. 15, gearbeitet. Anschliessend wurden die trägergebundenen monoklonalen Antikörper für 2 Stunden bei +4 C unter gele- gentlichem Aufschütteln mit Zellsolubilisaten inkubiert. Diese waren aus mechanisch von den Kulturflaschen abgelösten Kulturzellen mittels Lysispufferextraktion (5 g/l Natriumdesoxycholat, 0,5 mmol/l PMSF = Phenylmethylsulfonylfluorid, PBS, pH 8,3), wie in Hybridoma 1, 413-421 (1982), sp. auf Seite 414, beschrieben, gewonnen worden. Der beladene Träger wurde zentrifugiert und in Lysispuffer-SDS (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mmol/l DMSF, 5 g/l Nonidet P-40 (= octylphenyl ethylene oxide; Fluka AG), 5 g/l Natriumdeoxycholat, 1 mmol/l thylendiaminotetraacetat, 1 g/l Natriumdodecylsulfat (SDS)) zur Waschung suspendiert. Dieser Waschvorgang wurde 3-mal wiederholt. Anschliessend wurde der Träger 2-mal in Lysispuffer ohne Zusatz von SDS gewaschen und anschliessend l-mal mit einem Waschpuffer (2 M Tris-HCl, pH 8,0, 10 mmol/l NaCl, 0,1 mmol/l EDTA, 0,5 g/l NP-40) gewaschen. Die so gereinigten Antigene wurden vom festen Träger entweder durch 5-minütiges Aufkochen bei +950C oder durch Inkubation in 6 mol/l NH4SCN für 30 Minuten bei +40C abgelöst.

Claims: A therapeutic agent for the treatment of a tumorous disease, containing human tumor cells which have been freeze-dried or stabilized by a chemical treatment and which carry the membrane-associated antigens CEA or NCA. A therapeutic agent as claimed in claim 1, which contains an adjuvant which potentiates the immune response, preferably neuraminidase. A process for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of a tumorous disease, which comprises the freeze-drying or stabilization by a chemical treatment, and, the processing to a therapeutic agent, of human tumor cells which carry the membrane-associated antigens CEA or NCA. The process as claimed in claim 3, wherein an adjuvant which potentiates the immune response, preferably neuraminidase, is additionally added to the therapeutic agent. The use of human tumor cells which carry the membrane-associated antigens CEA or NCA, where appropriate in combination with an adjuvant which potentiates the immune response, preferably neuraminidase, for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of tumorous diseases.

Inventors: BOSSLET, KLAUS, DR., SEDLACEK, HANS-HARALD, DR.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: A61K37
IPC codes: A61K39, A61K38, A61K35