PROCESS FOR OBTAINING PHENYL ALANINE-CONTAINING MICROORGANISMS AND THEIR USE IN THE PREPARATION OF L-ALPHA-AMINO ACIDS

Abstract: 1. Process for obtaining microorganisms containing phenylalanine dehydrogenase by aerobic culture of microorganism-containing samples in aqueous nutrient media which contain a source of carbon, nitrogen and mineral salts and thiamine, characterized in that the samples are first incubated in a nutrient medium with an alkali metal propionate content of 0.1 to 0.5 g/l, colony patterns formed are then transinoculated onto a nutrient medium which contains L-phenylalanine or L-phenylalanine amide as an inducer for the formation of phenylalanine dehydrogenase, the system is incubated and the microorganisms which grow in both nutrient media are selected.

Description: Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydro genase enthaltenden Mikroorganismen, Mikroorga nismen, die in ihnen enthaltene Phenylalanin Dehydrogenase und deren Verwendung zur Her stellung von L-$-Aminosäuren. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen, Mikroorganismen, die in ihnen enthaltene Phenylalanin-Dehydrogenase und deren Verwendung zur Herstellung von L-drAminosäuren. Für die stereospezifische Herstellung von L-Phenylalanin hat sich die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren als vorteilhaft erwiesen. Aus der DE-OS 33 07 095 ist bekannt, Phenylpyruvat mit einer Phenylalanin-Dehydrogenase reduktiv zu aminieren und das entsprechende Enzym aus Brevibacterium spec. (DSM 2448) zu gewinnen. Das so isolierte Enzym erweist sich jedoch als relativ instabil. Versuche, weitere die Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltende Mikroorganismen mit Hilfe der dort beschriebenen Methode zu erhalten, führten nicht zum Erfolg. Dies liegt darin begründet, dass das aus der DE-OS 33 07 095 bekannte Nährmedium ein unspezifisches Wachstum verschiedenster Mikroorganismen ermöglicht, was natürlich die Auswahl der gewünschten Stämme sehr erschwert. Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen, das eine schnelle Auswahl geeigneter Stämme ermöglicht und eine stabile Phenylalanin Dehydrogenase. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen durch aerobes Kultivieren von Mikroorganismen-haltigen Proben in wässrigen Nährmedien, die eine Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalze und Thiamin enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben zuerst in einem Nährmedium mit einem Alkalipropionatgehalt von 0,1 - 0,5 g/l bebrütet, anschliessend entstandene Koloniemuster auf ein Nährmedium überimpft, das einen Induktor enthält, bebrütet und die Mikroorganismen auswählt, die in beiden Nährmedien wachsen. Als Mikroorganismen-haltige Proben wählt man beispielsweise Bodenproben, die man mit steriler Salzlösung (0,9 % NaCl) aufschlemmt, in üblicher Weise verdünnt und Aliquots auf Petrischalen mit festem Nährboden ausspatelt. Der Nährboden hat zum Beispiel die Standard-Zusammensetzung, der erfindungsgemäss ein Alkalipropionat, bevorzugt Natriumpropionat, hinzugesetzt wird: Propionsäure, Na-salz 0,1 - 0,5 g, bevorzugt 0,2 g KNO3 0,01 g KH2PO4 0,1 g NaCl 0,25 g MgSO4.7H20 100 mg CaC03 20 mg Spurenelemente-Lösung 1 ml Destilliertes Wasser 1 1 Agar 20 g pH-Wert 6,5 - 7,5, bevorzugt 7,0 Das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert, nach dem Abkühlen werden 1 ml sterilfiltrierte Vitamin lösung pro 1 1 Medium sowie 50 mg Cycloheximid (Actidione) pro 1 1 zugesetzt (Zusammensetzung der Vitaminlösung nach: Schlegel, B.G. "Allgemeine Mikrobiologie", Thieme Verlag, S. 169 t19817 ) und der Nährboden in sterile Petrischalen gegossen. Die beimpften Platten werden 4-6 Tage bei 23 bis 32 cc, bevorzugt bei 270C, bebrütet. Nach Wachstum der Mikroorganismen wird das Koloniemuster von Agarplatten mit einer geeigneten Koloniezahl (50-200) steril auf einen Samtstempel abgeimpft; dann auf 2 Platten überstempelt, die unterschiedliche Agarnährböden enthalten: Eine Platte enthält das oben angeführte Propionat-Medium, die andere ein Nährmedium mit L-Phenylalanin als Induktor und mit beispielsweise folgender Zusammensetzung (Phenylalanin-Medium): L-Phenylalanin 1 bis 15 g, bevorzugt 10 g/l KH 2P04 2g Hefeextrakt 0,2 g Agar 20 g Destilliertes Wasser 1 1 Der pH-Wert liegt zwischen 6 bis 8, bevorzugt bei 7,2 Die Platten werden erneut 3-5 Tage bei 23 bis 320C, bevorzugt bei 270C bebrütet. Durch Vergleich des Koloniemusters kann man diejenigen Organismen heraussuchen, die sowohl auf Propionat als auch auf Phenylalanin-Medium wachsen können; diese werden abgeimpft und im folgenden auf Phenylalanin Medium gehalten. Die isolierten Mikroorganismen werden dann in tb- licher Weise auf Reinheit überprüft (Verdünnungsaus- strich, Mikroskopieren), einheitlich erscheinende Stämme werden sodann bei 23 bis 32 C, bevorzugt bei 270C vermehrt. Das Flüssigmedium hat folgende Zusammensetzung (MP-Medium): L-Phenylalanin 1 bis 15 g, bevorzugt 10 g Maisquellwasser 2 g (Trockenpulver) KH2PO4 2 g Destilliertes Wasser 1 1 pH-Wert 6 bis 8, bevorzugt 7,2 Nach 2 bis 3 Tagen werden die Zellen sedimentiert und das Enzym aus den aufgeschlossenen Mikroorganismen in bekannter Weise gewonnen. Mit dieser Isolierungsmethode ist es auf einfache Weise möglich, aus der Mikroorganismen Population einer Bodenprobe diejenigen Organismen anzureichern und zu isolieren, die die gewünschte Phenylalanin-Dehydrogenase-Aktivität enthalten. So konnten aus 20 Bodenproben aus der Umgebung von Braunschweig 7 Isolate erhalten werden, die Phe-DH-Aktivität besitzen (Tab. 1). Die isolierten Organismen können in 2 Gruppen eingeteilt werden: 5 Isolate, die zur Gattung Brevibacterium gehören (jedes aus einer anderen Bodenprobe) sowie 2 Isolate, die zur Gattung Rhodococcus gehören, wie die folgenden Eigenschaften zeigen: Wachstum iii kurzen, gram-positiven Stäbchen, die mit zunehmendem Alter in kokkoide Formen übergehen; Zellen sind unbeweglich und bilden keine Sporen; strikt aerobes Wachstum; Säurebildung aus Glucose; Katalase und Nitratreduktion positiv, Harnstoffspaltung positiv; Gelatine-, Casein- und Stärkeabbau negativ; H2S-Bildung negativ; Wachstum bei 410C negativ. Die Zellwände enthalten meso-Diamino- pimelinsäure, als Zellwandzucker wurden Arabinose und Galaktose nachgewiesen. Die Menachinone sind vom Typ MK-8 (H2). Beide Isolate enthalten Tuber culostearinsäure und Mykolsäuren mit 30 bis 50 Kohlenstoffatomen. Die durch pyrolytische Spaltung aus Mycolsäuremethylestern freigesetzten Fettsäuren enthalten 12-18 Kohlenstoffatome. Die Koloniefarbe beider Isolate ist safrangelb (Typ 41 nach dem RAL Farbcode) (Seiler, H., J. Gen.Microbiol. 129, 1433-1471 E983J). Die Organismen benötigen Thiamin zum Wachstum. Die Isolate sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung und wurden am 7.9.84 bei der DSM hinterlegt und zwar als Rhodococcus spec. M4 unter der Nr. 3041 und als Rhodococcus spec. 13 unter der Nr. 3040. Die Mikroorganismen können aufbewahrt werden als lyophylisierte Kultur, durch Einfrieren bei -800C oder in flüssigem Stickstoff bei -1960C; Arbeitskulturen werden auf Schrägagar-Röhrchen (Phenylalanin-Medium) gehalten. Beide Stämme verwerten die Aminosäure D-Phenylalanin nicht. Tabelle 1: Charakterisierung der Isolate Bezeichnung Herkunft der Zugehörigkeit PheDH Stabilität des Isolats Bodenprobe des Isolats spez. Akt. Volumenakt. (% Restaktivität) nach 4 Tagen 4 C) M4 Schlamm von Ufer Rhodococcus 16 13.000 90 % "Ententeich" 13 Maisfeld Rhodococcus 11 8.600 44 % Ribbesbüttel 12 Maisfeld Brevibacterim 1,5 640 0 % Ribbesbüttel IV/6 Rasen Eingang GBF Brevibacterium 1,0 520 0 % V/II Kompostende Brevibacterium 0,5 205 0 % VI/4 Rasen, Stöckhein Brevibacterium 0,1 133 0 % (Matthiesen) T2 Parkplatz, Brevibacterium 0,7 840 0 % Zimmerstrasse Vorversuche mit Rohextrakt-Enzympräparaten haben gezeigt, dass die Phenylalanin-Dehydrogenasen aus den einzelnen Isolaten der Gattung Brevibacterium vergleichbar sind mit dem in der DE-OS 33 07 095.4 beschriebenen Enzym in Bezug auf die spezifische Enzymaktivität, Volumenausbeute, Induzierbarkeit und Stabilität. Die Enzyme aus den beiden Isolaten der Gattung Rhodococcus erweisen sich im Vergleich dazu als deutlich überlegen: a) Die Enzyme im Rohextrakt zeigen.höhere spezifische Aktivitäten (20-30 U/mg Protein statt 2-5 U/mg); b) man erreicht bei Wachstum auf 1 % L-Phenylalanin höhere Volumenausbeuten (20-25.000 Ull statt 3-6.000 Null); c) die Enzyme sind von deutlich besserer Stabilitat. Die Phenylalanin-Dehydrogenase kann enzymologisch wie folgt beschrieben werden: a) sie katalysiert die reduktive Aminierung von aromatischen -getosäuren, der systematische Name ist L-Phenylalanin: NAD -oxidoreduktase (desaminierend), und sie gehört in die E.C. Gruppe 1.4.1-; b) optimaler pH-Wert der reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat ist 9,3 1; c) optimaler pH-Wert der oxidativen Desaminierung von L-Phenylalanin ist 10,0- 1; d) der Kg-Wert für NADH beläuft sich auf 0,08 mM; L-Phenylalanin und L-Phenylalaninamid werden bevorzugt als Induktoren eingesetzt, aber auch L-Histidin ist in begrenztem Umfang geeignet. Die Phenylalanin-Dehydrogenase wird eingesetzt, um in Gegenwart von Ammoniumionen und NADH als Coenzym Phenylpyruvat, p-Hydroxyphenylpyruvat, Indolpyruvat oder 2-Keto-4-methylmercaptobutyrat , in die entsprechenden L-X-Aminocarbonsäuren umzuwandeln. Das Verfahren wird bevorzugt bei 20 bis 30 OC und einem pH-Wert von 8,5 bis 10 durchgeführt. Vorteilhaft arbeitet man unter Coenzym-Regenerierung, wie sie aus DE-OS 33 07 095 bekannt ist. In analoger Weise kann man auch nicht aufgeschlossene Bakterienzellen verwenden. Das Enzym ist auch geeignet, auf enzymatischem Wege in wässrigen Lösungen die Konzentration der oben erwähnten a-Ketocarbonsäuren bzw. a-Aminosäuren zu bestimmen. Nach Identifizierung der Isolate wurden bekannte Stämme der Gattung Rhodococcus aus der Stammsammlung (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen) auf Phenylalanin-Dehydrogenase Aktivität getestet. Zur Zeit sind 11 Arten dieser Gattung bekannt (Goodfellow, M. und Minnikin, D.E. in: The Prokaryotes (Starr, M.P. et al. eds.) S. 2016-2027, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York,(1981 > ; Goodfellow, M., System. Appl. Microbiol. 5, 225-229 (1984)); jeweils der Typstamm wurde in MP-Medium (1 % L-Phenylalanin, 0,2 % Maisquellwasser, 0,2 % KH2PO4) angezogen. Nach 40 Stunden Wachstum bei 270C wurden die Zellen aufgeschlossen und im Rohextrakt die Aktivität der Phenylalanin-Dehydrogenase bestimmt. Es zeigte sich, dass nur die Stämme von Rhodococcus erythropolis (DSM 43 066 und 743) L-Phenylalanin verwerten (OD578 28,0 für 43 066 und OD 15,3 für 743) und Phenylalanin-Dehydrogenase Aktivitäten besitzen (1260 U/l für 43 066 und 1031 Ull fiir 743), die aber deutlich unter denen der neuen Rhodococcusstämme liegen. Grössere Mengen an Phenylalanin-Dehydrogenase kann man aus Rhodococcus spec. M4 und I3 gewinnen, indem man die Mikroorganismen in bekannter Weise in einem Bioreaktor in gewünschtem Massstab anzieht und daraus das Enzym isoliert. Für eine erfolgreiche Anzucht gelten folgende bevorzugte Bedingungen: a) Eine gute Belüftung (obligat aerober Organismus); b) ein Ausgangs-pH-Wert von 6,0 - 8,0; bevorzugt 7,0 bis 7,6 c) die Anwesenheit von Mineralsalzen (z.B. in kom plexer Form als Maisquellwasser); d) die Anwesenheit von geringen Mengen an Thiamin (1-2 gg/l); e) ein L-Phenylalanin-Gehalt von 0,5 - 1,5 % im Medium zur Induktion der PheDH; f) eine Temperatur von 23 bis 32 C. In den Proben werden gemessen: a) die optische Dichte (Trübung) der Kultur bei 578 nm als Mass für das Wachstum; b) der Phenylalaningehalt im Medium (nach Abzentrifu gieren der Zellen) mit Hilfe eines Aminosäureanaly sators; c) der Enzymgehalt unter Anwendung eines photometrischen Tests. Der Testansatz enthält: 0,7 X Ammonium chlorid/Ammoniakpuffer pH 8.5, 0.1 mM NADH, 10 mM Phenylpyruvat und limitierende Mengen an Enzym (1-20 Fg Protein pro Test). Die Abnahme der Extinktion von NADH bei 340 nm wird gemessen. Von den erhaltenen Werten wird ein Nullwert abge zogen, dem man erhält, wenn der Test ohne Zugabe von Phenylpyruvat abläuft. Die Enzynaktivität wird in internationalen Einheiten angegeben, wobei eine Einheit die Abnahme von 1 )1Mol NADH/min bedeutet. Für einen technischen Einsatz können diedurch Züchtung erhaltenen Zellen direkt verwendet werden oder das in den Zellen enthaltene Enzym isoliert und dann im zellfreien System eingesetzt werden. Die Enzymisolierung ist nach Zellaufschluss durch Kombination an sich bekannter Methoden der Enzymreinigung möglich. Zuerst setzt man aus der Bakterien-Feuchtmasse bevorzugt durch einen mechanischen Zellaufschluss zum Beispiel mit Hilfe einer Glasperlenmühle, eines Hochdruckhomogenisators oder eine Ultraschallbehandlung die Inhaltsstoffe frei. In einem zweiten Schritt werden die Zelibruchstücke gemäss DE-PS 26 39 129 aus dem Rohextrakt fieber ein wässriges Zweiphasensystem abgetrennt. Die Oberphase enthält praktisch die gesamte Aktivität an L-Phenylalanin-Dehydrogenase und wird weiter einem Dialyseverfahren unterworfen. Das dialysierte Enzym wird anschliessend mit Hilfe der DEAE-Cellulose-Chromatographie weitergereinigt und erreicht dann den gewünschten Grad der Aufreinigung nach Durchlaufen der Interfacial Salting Out-Chromatographie zum Beispiel an Sepharose 4B. Beispiel 1: Produktion der Phenylalanin-Dehydrogenase Zur Anzucht wird ein 2 1 Bioreaktor verwendet, der mit 1,5 1 Medium gefüllt ist. Das Medium enthält pro 1 10 g L-Phenylalanin; 2 g KH2PO4; 2 g Maisquellwasser (Trockenpulver); der pH-Wert beträgt 7,0. Nach Sterilisation wird das Medium mit 50 ml einer Vorkultur angeimpft, die 48 Stunden im gleichen Medium angezogen wurde. Die Wachstumsbedingungen im Fermenter sind: Temperatur: 270C Belüftungsrate: 60 1 Luft/Std. Turbinenrührer mit 400 UpM Zu verschiedenen Zeiten des Wachstums wurden Proben (40 ml) entnommen und nach einem Test auf enzymatische Aktivität in diesen Zellen der maximal erreichbare Enzymgehalt bzw. der günstigste Erntezeitpunkt bestimmt. Die Abb. 2 zeigt, dass das Enzym in einer friihen Wachstumsphase gebildet wird; der Enzymgehalt steigt besonders an, wenn der Organismus anfängt, Phenylalanin abzubauen. Enzymgehalte von deutlich über 20.000 Einheiten pro 1 Liter Medium können hier erreicht werden. Im weiteren Verlauf des Wachstums sinkt der Enzymgehalt dann wieder ab. Aus einer 1,5 1 Fermentation wurden nach Abzentrifugieren der Bakterien 70 g Zellen (Feuchtmasse) mit einer Gesamt-Enzymaktivität von 22.000 Einheiten erhalten. Beispiel 2: Bildung der PheDH in AbhAngigkeit von der Aminosäure im Medium Stamm M4 wird in einem Medium angezogen mit 0,2 % Maisquellwasser (Trockenpulver), 0,2 % KH2PO4 und jeweils 1 % einer Aminosäure; der pH-Wert beträgt var Beginn der Kulti- vierung 7,4. Es wurden jeweils 100 ml Medium beimpft; nach 40 Std. Wachstum die Zellen abzentrifugiert und nach Auf schluss der Zellen mit Glasperlen die Aktivität der PheDH bestimmt. Tabelle 2 zeigt, dass für eine gute Enzymausbeute der Zusatz von L-Phenylalanin notwendig ist, andere natürliche Aminosäuren ergeben geringene (Histidin) oder keine (Isoleucin) Enzymgehalte. L-Phenylalanin kann als Induktor durch das Derivat L-Phenylalamin- Amid ersetzt werden. Auf einigen natürlichen Aminosäuren kann der Stamm M4 nicht wachsen (z.B. L-Tryptophan, L-Tryrosin, L-Alanin oder L-Glutaminsäurre). Ebenso verwertet der Stamm im Gegensatz zu Brevibacterium spec. (DSM 2448) die Aminosäure D-Phenylalanin nicht. Tabelle 2 Aminosäure CD578 U/mg U/1 L-Phenylalanin 31 7,25 15.200 Histidin 4 1,81 820 L-Phenylalanin-Amid 8 8,49 3.550 L-Isoleucin 14 0 0 D-Phenylalanln O Beispiel 3: Bildung der PheDH in Abhängigkeit von der Phenylalanin-Konzentration im Medium Stamm M4 wird in einem Medium angezogen mit 0,2 % Maisquellwasser (Trockenpulver), 0,2 % KH2PO4 und steigenden Mengen L-Phenylalanin (bis 1,5 %); der pH-Wert vor Beginn der Kultivierung beträgt 7,4. Es wurden jeweils 100 ml Medium beimpft; nach 40 Stunden Wachstum wurden die Zellen abzentrifugiert und nach Aufschluss der Zellen mit Glasperlen die Aktivität der PheDH bestimmt. Die Tabelle 3 zeigt, daS durch Erhöhung des Phenylalanin-Gehalts im Medium auch die Enzymausbeute erhöht werden kann, mit 1,5 % Phenylalanin erhält man so ca. 26.000 U pro 1 1 Medium. Der Verlauf der spezifischen Enzymaktivität (U/mg) zeigt zudem, dass ein Gehalt an Phenylalanin über 0,5 % zu bevorzugen ist. Phenylalanin-Dehydrogenase L-Phe g/l U/mg U/l 1 0 0 2 0 0 5 1 2 000 8 12,2 14 000 10 14,6 18 000 12 16,6 23 000 15 20,4 26 000 Tabelle 3 Beispiel 4: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert a) Reduktive Aminierung Die Reaktionsgeschwindigkeit der reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert der Reaktionslösung unter sucht. Der Testansatz hatte folgende Zusammen setzung: 0,25 mM NADH, 1,5 mM Phenylpyruvat und limitierende Mengen an Enzym in einer 0,7 M Ammoniumchlorid lösung bei unterschiedlichen pH-Werten. Unteriedliche pH-Werte wurden durch Zugabe von Ammoniak bzw. Salzsäure zu der 0,7 M AnIInonium- chloridlösung vor Zusammenmischen des Testansatzes eingestellt. In Abb. 2 ist die Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion des pH-Wertes im Bereich von 6,0 bis 10,2 aufgetragen. Das pH-Optimum liegt bei 9,25. Der pH-Wert wurde im Reaktionsgemisch gemessen. b) Oxidative Desaminierung Die Reaktionsgeschwindigkeit der oxidativen Desami nierung von L-Phenylalanin, katalysiert durch die L-Phenylalanin-Dehydrogenase, wird gleichfalls in Abhängigkeit vom pH-Wert untersucht. Der Test ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 3 mM NAD und 6 mM L-Phenylalanin in einem 0,1 M Glycin/NaCl/NaOH-Puffer bei unterschiedlichen pH-Werten. Es wurden unterschiedliche pH-Werte durch Zugabe von Salzsäure oder Natronlauge zu dem Puffer vor Zusammenmischen des Testansatzes eingestellt. Die Ergebnisse sind zusammenfassend gleichfalls in Abb. 1 dargestellt für den Bereich von pH 6,5 bis 10,1. Die Rückreaktion steigt bis pH 10,1 an. Der pH-Wert wurde im Reaktionsgemisch gemessen. Beispiel 5: Abhängigkeit der Reaktion sgeschwindigkeit von den Substratkonzentrationen Reduktive Aminierung a) Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit der reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin für das Substrat NADH wurde in fol gendem Testansatz untersucht: 0,7 M Ammoniumchlorid/Ammoniak-Puffer (pH 9,5), 1,5 mM Phenylpyruvat, limitierende Mengen an Enzym. Die NADH-Konzentration im Testansatz wurde im Bereich von 0,025-0,3 mM variiert. Es zeigte sich, dass die optimale Reaktionsgeschwin digkeit bei 0,25 mM erreicht wird. Der R-Wert für NADH beträgt 0,08 mM. b) Die reduktive Aminierung verschiedener .c-Ketocarbon- säuren wurde in Abhängigkeit von der Ketosäure- konzentration untersucht. Dazu wurde folgender Testansatz verwendet: 0,7 M Ammoniumchlorid/Ammoniak-Puffer (pB 9,5), 0,25 mM NADH, limitierende Mengen an Enzym. Die Ketosäurekonzentration wurde jeweils im Bereich von 0,01 bis 30 mM variiert. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit (Extinktionsändenng 340 nm/Minute) wird nach Michaelis-Menten ausge wertet. Die gefundenen KM und V Werte sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Wegen der Störung des optischen Testes im Falle der Substrate Indolpyruvat und p-Hydroxyphenylpyruvat wurden die reduktiven Aminierungen zu L-Tryptophan bzw. Tyrosin als Funktion der Zeit am Aminosäureanalysator bestimmt (Biotronik BC 6000, ausgerüstet mit einem Inte grator Biotronik, System 1, in einem l-Säulen-Pro gramm; als Eichlösung wurde ein Aminosäure-Standard IV der Firma Pierce verwendet). Oxidative Desaminierung a) Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit der oxidativen Desaminierung von L-Phenylalanin von der NAD+-Konzentration wurde in folgendem Test ansatz untersucht: 0,1 M Glycin-NaCl/NaOH-Puffer (pH 10,7, 4 mM L-Phenylalanin, limitierende Mengen an Enzym. Die NAD+-Konzentration wurde im Bereich von 0,1 bis 5,0 mM variiert. Es zeigte sich, dass der optimale Umsatz bei einer Konzentration von 3 mM erreicht wird. b) Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit der oxidativen Desaminierung von der L-Aminosäure Konzentration wurde in folgendem Testansatz unter sucht: 0,1 M Glycin-NaCl/NaOH-Puffer (pH 10,7), 3 mM NAD, limitierende Mengen an Enzym. Die L-Aminosäure Konzentration wurde im Bereich von 0,3 bis 15 mM variiert. Der K..-Wert für L-Phenylalanin beträgt 0,8 mM; die entsprechenden Werte für die anderen Aminosäuren sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 4: Substratspezifität für die oxidative Desaminierung der Phenylalanin-Dehydrogenase Vmax KM Substrat (relativ zum Phenylpyruvat) [M] Phenylpyruvat 100 1,6.10-4 p-Hydroxyphenylpyruvat 5 2,4.10-3 Indolpyruvat 3 7,7.10-3 2-Keto-4-methyl-mercapto 33 2,1.10-3 butyrat NADH 8.10-5 Tabelle 5: Substratspezifität für die oxidative Desaminierung der Phenylalanin-Dehydrogenase Vmax KM Substrat (relativ zu L-Phenylalanin) M L-Phenylalanin 100 7,5.10-4 L-Tryptohan 2 1,05.10-2 L-Methionin 4 4,3-10-3 NAD+ 2,2.10-4 Beispiel 6: Stabilität der PheDH Stamm M4 wird in 100 .ml Medium folgender Zusammensetzung angezogen: 0,2 % Maisquellwasser (Trockenpulver), 0,2 % KH2PO41 1 % L-Phe, pH-Wert beträgt 7,0. Nach 40-stündiger Inkubation bei 270C auf der Rundschüttelmaschine werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit Glasperlen aufgeschlossen und der Zellüberstand durch Zentrifugation des Zellbreis erhalten (Rohextrakt). In gleicher Weise wird Rohextrakt von Brevibacterium spec. (DSM 2448) gewonnen. In beiden Extrakten werden die PheDH Aktivitäten bestimmt, dann werden Aliqots bei 4 0C und bei 225C gelagert und nach bestimmten Zeiten die Restaktivität bestimmt. Tabelle 6 zeigt, dass die Lagerstabilität der PheDH aus Stamm M4 im Rohextrakt deutlich besser ist als die der PheDH aus Brevibacterium spec., nach 1 Woche bei 40C sind noch 90 96 Aktivität nachweisbar. Tabelle 6 Enzym aus Lager- Restaktivitit nach Tagen temperatur 1 2 3 4 ( C) (8) Rhodococcus spec. 4 98 93 93 91 Rhodococcus spec. 22 84 74 66 60 Brevibac- 4 70 55 30 20 terium spec. Beispiel 7: Herstellung von L-Phenylalanin mit ganzen Zellen Die stereospezifische Umsetzung von Phenylpyruvat wird auch erreicht bei Verwendung der ganzen Mikroorganismen-Zelle. Inkubiert man unter geeigneten Bedingungen Phenylpyruvat, Glucose und ein Ammoniumsalz mit Zellen von Stamm M4, kann die Bildung von Phenylalanin nachgewiesen werden, das für die Umsetzung notwendige NADH wird dabei durch die Enzyme des Glucosemetabolismus kontinuierlich regeneriert. Im einzelnen enthielt der Ansatz: 2 ml NH4Cl-Lösung pH 7,0 (200 mM) 3 ml Z91lsuspension (0,1 g Feuchtmasse pro 1 ml) 2 ml Glucose (200 mM) 1 ml RH2PO4 pH 7,0 (0,1 M) 2 ml Phenylpyruvat (50 mM) In Klammern sind die Endkonzentrationen der Einzelkomponenten im Test angegeben. Als Enzymquelle wurde eine Zellsuspension von Stamm M4 verwendet, die entsprechend Beispiel 1 gewonnen wurde. Zum Vergleich wurde zudem ein paralleler Ansatz inkubiert, der Zellen von Brevibacterium spec. DSM 2448 enthält. Die Inkubationen wurden in 100 ml Erlenmeyer-Kolben bei 300C auf einer Schüttelmaschine (100 UpM) durchgeführt. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben entnommen und der Gehalt an gebildetem Phenylalanin mit einem Amino-Säureanalysator bestimmt. Wie die Tabelle 7 zeigt, sind die Zellen von beiden Mikroorganismen in der Lage, Phenalalanin zu bilden: Stamm M4 hat nach 7 Stunden 36,1 uMol Phelml (= 53 mg Phe/g Bakterien-Feuchtmasse) gebildet; das entspricht einer Umsetzung von 64 % des eingesetzten Substrats. Brevibacterium spec. (DSM 2448) hat 18,5 uMol Phe/ml gebildet (= 46,1 mg Phe/g Bakterien- Feuchtmasse); das entspricht einer Umsetzung von 37 % des eingesetzten Phenylpyruvats. Tabelle 7 Stamm Phenylalanin nach 1 h 3h 7h (mg/g Zellen) Rhodococcus spec. 23 35 53 Brevibacterium spec. 15,5 27,5 46 Beispiel 8: Herstellung von L-Phenylalanin im zellfreien System unter NADH- Regenerierung Die stereospezifische Umsetzung von Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin kann im zellfreien System mit der Phenylalanin-Dehydrogenase durchgeführt werden. Der Reaktionsgleichung entsprechend muss das Coenzym NADH zugesetzt werden. Um das bei der Umsetzung oxidierte Coenzym zu regenerieren, werden dem Ansatz Formiat-Dehydrogenase (E.C. 1.2.1.2) und Formiat zugesetzt, als zusätzliches Produkt erhält man dann CO2. Der Ansatz enthält im einzelnen: 400 mM Ammoniumformiat (pH 9,2) 150 mM Tris-HC1 (pH 9,2) 0,3 mM NADH 2 U/ml Formiat-Dehydrogenase (Präparat gemäss Kroner et al. (1982), J.Chem.Tech. Biotechnol. 32, 130-137) 2 U/ml Phenylalanin-Dehydrogenase (Präparat mit 110 U/mg; Top-Phase nach 1. Flüssig-Flüssig- Verteilung, gemäss Tab. 2) 20 mM Phenylpyruvat Das Gesamtvolumen beträgt 2 ml, die Inkubation erfolgte unter Rühren bei 28 0C. Die Produktbildung wurde am Aminosäure-Analysator verfolgt. Die Tab. zeigt, dass nach 90 min 19 mM Produkt gebildet wurden (96 % Umsatz). Tab.: Umsetzung von Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin im zellfreien System (Umsatz = bezogen auf einge setztes Phenylpyruvat) Zeit min L-Phe mM Umsatz % 15 7,4 37 30 12,8 64 60 16,8 84 90 19,1 96

Claims: Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydro genase enthaltenden Yikroorganismen, -likroorga- nismen, die in ihnen enthaltende Phenylalanin Dehydrogenase und deren Verwendung zur Herstellung von L-k-Aminosäuren, Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen durch aerobes Kulti vieren von Mikroorganismen-haltigen Proben in wässrigen Nährmedien, die eine Quelle für Kohlen stoff, Stickstoff und Mineralsalze und Thiamin enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben zuerst in einem Nährmedium mit einem Alkalipropionatgehalt von 0,1 - 0,5 g/l bebrütet, anschliessend entstandene Koloniemuster auf ein Nährmedium überimpft, das einen Induktor enthält, bebrütet und die Mikroorganismen auswählt, die in beiden Nährmedien wachsen. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Rhodococcusstamm bebrütet und als Induktor t-Phenylalanin oder L-Phenylalaninamid verwendet. 3. Rhodoccus specM4, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Nr. DSM 3041. 4. Rhodoccus speci3, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Nr. DSM 3040. 5. Phenylalanin-Dehydrogenase, gewonnen aus den Rhodoccusstämmen gemäss den Ansprüchen 3 und 4. 6. Verwendung der Rhodoccusstämme gemäss den An sprüche 3 und 4 zur reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat, p-Hydroxyphenylpyruvat, Indolyl pyruvat oder 2-Keto-4-(methylmercapto)buttersaure in die entsprechenden L-&alpha;-Aminosäuren. 7. Verwendung der Phenylalanin-Dehydrogenase gemäss Anspruch 5 zur reduktiven Aminierung von Phenyl pyruvat, p-Hydroxyphenylpyruvat, Indolylpyruvat oder 2-Keto-4- (methylmercapto) -buttersäure in die entsprechende L-eC-Aminosäure.

Inventors: HUMMEL, WERNER, DR., KULA, MARIA-REGINA, DR., LEUCHTENBERGER, WOLFGANG, DR., SCHUTTE, HORST, Schütte, Horst
Applicants: DEGUSSA AKTIENGESELLSCHAFT, GESELLSCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Application year: 1985
Main classification: C12N9
IPC codes: C12R1, C12N1, C12N9, C12P13