EQUINE INTERFERONS

Abstract: Method for producing recombinant horse and dog interferons, as well as said interferons.

Description: Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Pferde und Hunde Interferonen sowie die Interferone selbst. Interferone sind Proteine, die von eukaryotischen Zellen nach Virus Infektion oder anderen Stimulationen sekretiert werden und ihrerseits die Zellen vor Virusinfektionen schützen können. Mittlerweile sind vier Klassen an Interferon be kann; zur zeichnet werden sir ist Interferon-alpha, intorfero n-beta, Interferorromega und Interferon-gamma (abgekürzt: IFN-&alpha;, IFN-ss, IFN-# und IFN&gamma;). Sie unterscheiden sich in ihrem Aufbau und in ihren Wirkungen. So können Interferone regulierend die Zellen des Immunsystems, oder auch die Differenzierung von Zellen und das Wachstum von Tumoren beeinflussen. Lange Zeit war angenommen worden, dass die Interferone speziesspezifisch wirken. Irrvitro Versuche zeigten jedoch, dass IFN-Präparate vor. Rindern eine antivirale Wirkung beim Affen und beim Menschen auslösen können (32). Diese Speziesinteraktivität hängt möglicherweise mit der mehr oder weniger grossen Homologie der Gene bzw. der Proteine zusammen; aufgrund der geringen Mengen. an tierischen Interferonen konnte diese Annahme nicht überprüft werden. Trotz der festgestellten Speziesinteraktivitäten sind Nebenwirkungen wie Antigenitätèn bei der Anwendung speziesfremder Interferone zu erwarten, die für eine Therapie nicht zu toleriereri sind. Da andererseits jedoch die Nutz- und Haustierhaltung einer. beaeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt, besteht ein Bedarf an Interferonen für die verschiedenen Spezies, die der Veterinärmediziner anwenden kann. Hochgereinigtes Tieriliterferorl der verschiedener. Spezies winde darüberhinaus die willkommene Gelegenheit bieten, die Wirkmechanismen für Interferone zu untersuchen, um zu Modell-vor- stellungen zu kommen, die auf den Menschen zu übertragen sind. Die ersten Untersuchungen mit tierischen Interferonen wurden mit Präparationen aus natürlichem Zellmaterial durchgeführt; Ausbeute und Reinheit der nach diesem Verfahren hergestellten Interferone lassen sie als ungeeignet für die Herstellung von Arznelmitteln erscheinen. Durch die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, von Mikroorganismen heterologe Proteine produzieren zu lassen. So hergestellt wurden beispielsweise auch Human Interferone (Hu-IFN)i seit neuestem auch ein Rinder-alpha- und ein Rinder-beta-Interferon. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Pferde und Hunde Interferone (EqIFN und CaIFN) und ihre gegebenenfalls N-glykosilierten Derivate. Gegenstand der Erfindung sind ausserdem die für diese Interferone codierenden Gensequenzen ebenso wie rekombinate Moleküle, die diese Sequenzen enthalten, Expressions-Vektoren wie Plasmide, mit den Sequenzen als Inserts und verschiedene Wirtsorgarìismel; oder Kulturen, die die Herstellung der Pferde Interferone ermöglichen. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind die Pferde Interferone und die sie codierenden Sequenzen der nachfolgenden Formeln: 1 5 10 15 Cys Asp lieu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asri Thr Arg Val Leu TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG 20 25 30 Met Leu Ieu Gly Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu ATG CTC CTG GGG CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG 35 40 45 Itys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp Gly AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC 60 Asn Gln Phe Arg Lys Pro Gln Ala ne Ser Ala Val His Glu Thr AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCT GCG GTC CAT GAG ACG 65 70 75 Ile Gln Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCC 80 85 90 Ala Trp Asp Glu Ser Leu leu Asp Lys leu Tyr Thr Gly Leu Tyr GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAA CTC TAC ACT GGA CTC TAT 95. 100 105 Glr. Gin Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gln Glu Val Gly CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG 110 115 120 Val Glu Glu Thr Pro leu Met Asn Glu Asp Ser Ieu Ieu Ala Val GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 125 130 135 Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Ala Leu Tyr teu Gln'Glu Lys Lys AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GTC CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA 140 145 150 Tyr r Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 155 160 165 Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Pro Gln Ser + TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CCG CAG AGT TAA, Formel I 1 5 10 15 Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser leu Gly Asn Thr Arg Val Leu TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG 20 25 30 Met Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG 35 40 45 Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC 60 Asn Gin Phe Arg Lys Pro Gln Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCC GCG GTC CAT GAG ACG 65 70 75 Ile Gln Gln Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT 80 85 90 Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Ilys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT 95 100 105 <RTI ID=4.3> Glr, Gln Leu Thr Glu Ieu Glu Ala Cys Leu Ser Qn Glu Val Gly CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG 110 115 120 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 125 130 135 Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Ala Leu Tyr Ieu Gln Glu lys lys AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GTC CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA 140 145 150 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 155 160 165 Cys Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Glr, G11; ; Ser + TGC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CAG CAG AGT TAA Formel II 5 10 15 Val Asrl Tyr Asp Leu Leu Arg Ser Gln Leu Arg Ser Ser Asi Ser GTG AAC TAT GAC TTG CTT CGG TCC CAA CTA AGA AGC AGC AAT TCA 20 25 30 Ala Cys Leu Met Leu Leu Arg Gin Leu Asn Gly Ala Pro Gln Arg GCA TGT CTG ATG CTC CTG CGG CAG TTG AAT GGA GCC CCT CAA CGT 35 40 45 Cys Pro Glu Asp Thr Met Asn Phe Gln Val Pro Glu Glu Ile Glu TGC CCC GAG GAC ACA ATG AAC TTC CAG GTC CCT GAG GAG ATT GAG 60 Gln Ala Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Val Ile Tyr CAA GCA CAG CAG TTC CAG AAG GAG GAT GCT GCA TTG GTC ATC TAT 65 70 75 Glu Met leu Gln His Thr Trp Arg Ile Phe Arg Arg Asn Phe Ala GAG ATG CTC CAG CAC ACC TGG CGT ATT TTC AGA AGA AAT TTC GCT 80 85 90 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Lys Asn Leu Leu Val Glu AGC ACT GGC TGG AAT GAG ACC ATC GTT AAG AAC CTC CTT GTG GAA 95 100 105 Val His Leu Gln Met Asp Arg Leu Glu Thr Asn Leu Glu Glu Ile GTC CAT CTG CAG ATG GAC CGT CTG GAG ACA AAC CTG GAG GAA ATA 110 115 120 Met Glu Glu Glu Ser Ser Thr Trp Gly Asn Thr Thr Ile Leu Arg ATG GAG GAG GAA AGC TCC ACC TGG GGA AAC ACA ACC ATT CTG CGC 125 130 135 Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly Arg Ile Ser Glii Tyr Leu Ilys Ala Lys CTG AAG AAA TAC TAC GGA AGG ATC TCG CAG TAC CTG AAG GCC AAG 140 145 150 Lys Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Ala Glu Met Leu AAG TAC AGC CAC TGT GCC TGG ACA GTG GTC CAA GCG GAA ATG CTC 155 160 165 Arg Asn Leu Ala Phe Leu Asn Gly Leu Thr Asp Tyr Leu Gir Asi + AGG AAC TTG GCC TTC CTT ASC GGA CTC ACA GAT TAC CTC CAA AAC TGA Formel III una 1 5 10 15 Cys Asp Leu Pro Ala Ser Leu Asp Leu Arg Lys Gln Glu Thr Leu TGC GAC CTG CCT GCG AGC CTT GAC TTG AGA AAG CAG GAG ACC CTC 20 25 30 Arg Val Leu His Gln Met Glu Thr Ile Ser Pro Pro Ser Cys Leu AGA GTT CTG CAC CAG ATG GAG ACA ATC TGT CCT CCT TCC TGT CTG 35 40 45 Lys His Arg Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Gln Leu Asp Gly AAG CAC AGG ACA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG CAG CTG GAT GGC 50 55 60 Arg Gln Phe Pro Glu Ala Gln Ala Thr Ser Val Leu Gln Glu Met AGG CAG TTC CCA GAG GCC CAG GCC ACG TGT GTC CTC CAG GAG ATG 65 .70 75 Leu Gln Gln Ile Val Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala CTC CAG CAG ATC GTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCG TCT GCT 80 85 90 Ala Trp Asn Thr Thr ieu Leu Asp Arg Leu Leu Ala Gly Leu His GCC TGG AAC ACG ACT CTG CTG GAC CGA CTC CTC GCG GGA CTC CAT 95 100 105 G1 G1 Leu Glu Asp Leu Asn Thr Cys Leu Asp Glu G1 Thr Gly CAG CAG CTG GAA GAC CTC AAC ACC TGC TTG GAT GAG CAG ACA GGA 110 115 120 Glu Glu Glu Ser Ala Leu Gly Thr Val Gly Pro Thr Ieu Ala Val GAG GAA GAA TCC GCC CTG GGA ACT GTG GGC CCT ACA CTG GCC GTG 125 130 135 Lys Arg Tyr Phe Arg Arg Ile Arg Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys AAG AGG TAC TTC AGG AGA ATC CGT CTG TAC CTG ACA GAG AAG AAA 140 145 150 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Asp Ile Met Arg TAC AGT GAC TGT GCC TGG GAG ATT GTC AGA GTG GAC ATC ATG AGA 155 160 165 Ser Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gln Gly Arg Leu Gly Met Arg TCC TTC TCT TCA TCA GCA AAC CTG CAA GGA AGG TTA GGA ATG AAG 170 175 180 Asp Gly psp Leu Gly Ser Pro + GAT GGA GAC CTG GGG TCA CCT TGA Formel IV das Hunde Interferon und die sie codierende Sequenz der nachfolgenden Formel: 1 5 10 15 Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val leu TGC CAC CTG CCC GAC ACC CAC GGC CTG CGC AAC TGG AGG GTC CTG 20 25 30 Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp ACG CTC CTG GGA CAG ATG AGG AGA CTC TCC GCC GGC TCT TGT GAC 35 40 45 His Tyr Thr Ast Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly CAC TAC ACC AAT GAC TTT GCC TTC CCC AAG GAC CTG TTT GAT GGC 50 55 60 Gln Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met CAG CGG CTC CAC GAG GCG CAG GCC CTC TOT GTG GTC CAC GTG ATG 65 70 75 Thr Gln Lys Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala ACC CAG AAG GTC TTC CAC CTC TTC TGC CCG GAC ACG TCC TCT GCT 80 85 90 Pro Trp Asn Met Thr Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser CCT TGG AAC ATG ACT CTC CTG GAG GAA CTG TGC TCG GGG CTC TCT 95 100 105 Glu Gin Ieu Asp Asp Leu Glu Ala Cys Pro Leu Gin Glu Ala Gly GAG CAG CTG GAT GAC CTG GAG GCC TGT CCC CTG CAG GAG GCG GGG 110 115 120 Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr CTG GCC GAG ACC CCC CTC ATG CAT GAG GAC TCC ACC CTG AGG ACC 125 130 135 Tyr Phe Gln Arg fle Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Asn His Ser TAC TTC CAA AGG ATC TCC CTC TAC CTG CAA GAC AGG AAC CAC AGC 140 145 150 Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg Ser Pne CCG TGT CCC TGG G; ;.3 ATG GTC CGA GCA GAA P.TC GGG AGA TCC TTC 155 160 165 Phe Ser Ser Thr Ile. Leu Gln Glu Arg Ile Arg Arg Arg Lys + TTC TCC TCG ACA ATC TTG CAA GAA AGA ATC AGG AGG AGG AAA TGA Formel V und die Pferde-Interfernone der Formeln: : 1 5 10 Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC 20 25 30 Met Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG 35 40 45 Lys Asp A 9 Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp G1 AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GTG TTT GAC 50 55 Asn Gln Phe Arg Lys Pro Gln Ala Ile Ser Ala Val Glu AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCT GCG GTC CAT GAG ACG 65 70 75 Ile Gln Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT 80 85 90 Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT 95 100 105 Gln Gln Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser. Gln Glu Val Gly CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG 116 115 120 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 125 130 Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Glu Lys AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA 140 145 150 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 155 160 Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Pro Gln Ser TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CCG CAG A6T TAA Formel VI 1 5 10 15 Cys Asp Leu Pro His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val Leu TGT GAC CTG CCT CAC ACC CA1 AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG 20 25 30 Met Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG 35 50 45 Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAC GTG TTT GAC GGC 50 55 60 Asn Gln Phe Arg Lys Pro Gln Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr AAC CAG fTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCC GCG GTC CAT GAG ACG 65 70 75 Ile Gln Gln Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCC 8G 85 90 Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT.GGA CTC TAT 95 100 105 Gln Gln Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gin Glu Val Gly CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG 110 115 120 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Aia Val GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 125 130 135 Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG CAA GAG AAG. AAA 140 145 150 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 155 160 Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Pro Gln Ser TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC rTG CCG CAA AGT TAA Formel V und 1 5 10 15 Cys Asp Leu Pro Gin Asn Hls Ile Leu Val Ser Arg Lys Asn Phe TGT GAC CTG CCT CAG AAC CAC ATC CTG GTT AGC AGG AAG AAC TTC 20 25 30 Val Leu Leu Gly Gln Met Ser Arg Ile Ser Ser Ala Ile Cys Leu GTG CTT CTG GGC CAA ATG AGC AGA ATC TCC TCC GCA ATC TGT CTG 35 40 45 Lys Asp Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Gln Asp Met Ala Asp Gly AAG GAC AGA AAA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAC ATG GCG GAT GGC 50 55 60 Arg Gln Phe Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ser Val Leu His Glu Met AGG CAG TTC CCA GAG GCC CAG GCC GCG TCT GTC CTC CAC GAG ATG 65 70 75 Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Aia CTC CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCG TCT GCT 80 85 90 Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Glu Leu Cys Thr Gly Leu Leu GCC TGG AAC ACG ACC CTC CTG GAC GAA CTC TGC ACG GGA CTC CTT 95 100 105 Arg Gln Leu Glu Asp Leu Asp Thr Cys Leu Glu Gin Giu Met Gly CGG CAG CTG GAA GAC CTG GAC ACC TGT TTG GAG CAG GAG ATG GGA 110 115 120 Glu Glu Glu Ser Ala Leu Gly Thr Val Arg Pro Thr Leu Ala Val GAG GAA GAA TCT GCC CTG GGA ACT GTG CGC CCT ACA CTG GCC GTG 125 130 135 Lys Arg Tyr Phe Arg Gly Ile His Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys AAG AGG TAC TTC CGG GGG ATC CAT CTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 140 145 150 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Met Glu ile Met Arg TAC AGT GAC TGT GCC TGG GAG ATT GTC CGA ATG GAA ATC ATG AGA 155 160 165 Ser Phe Ser Ser Ser Al a Asn Leu Gin Gly Arg Leu Arg Met Lys TCC TTC TCT TCA TCA GCA AAC CTG CAA GGA AGG TTA AGA ATG AAG 170 Asp Gly Asp Leu Gly Ser Pro * GAT GGA GAC CTG GGC TCA CCT TGA Formel VI Die Aufgabe der Erfindung wurde dadurch gelöst, dass man hochmolekulare DNA aus dem Gewebe der genannten Tiere, vorzugsweise aus der leber nach einem modifizierten Verfahren gemäss Blin und Stafford (18) isolierte und mit Hilfe spezieller Endonucleasen statistisch fragmentierte. Die so erhaltenen unterschiedlich grossen Fragmente wurden nach der Grösse fraktioniert, vorzagsweise zur Bildung von 10-23 kb Fragmenten, um in einem Vektor, beispielsweise in einem Lambda Vektor geklont zu werden. Anschliessend wurden diese Vektoren in einem Bakterium, vorzugsweise E. coli, vermehrt. Die Pferde-DNA wurde mit Hilfe der Er reifes Humaninterferon-alpha2ARG codierenden DNA ui-d dem für humanes ss-Interferon codierenden cDNA unter nicht stringenten Bedingungen gescreent. Die Hunde-DNA wurde mit Hilfe der für reifes Humaninterferorralpha2ARG codierenden DNA unter nicht stringenten Bedingunger, gescreent. Durch die niedrige Stringenz wurden auch Klone erfasst, die in ihren Sequenzen erhebliche Unterschiede zu dem HuIFN-alpha- 2Arg bzw.HuIPN-ss aufweisen. Bei der Untersuchung der Pferde-DNA mit dem umanem-alpha-Gen, wurden wie bei Rindern, Schweinen und Menschen durch Southern-Analyse mehrere Banden festgestellt, so dass man davon ausgehen kann, dass es auch beim Pferd eine Klasse von alpha-Interferongenen geben muss. Von den hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen DNA hergestellt und von den resultierenden Klonen Eq-alpha, Eq-betaS wurden Restriktionskarten erstellt (Fig. 2 lJrìd 3). Weitere mit der humanen IFN Probe hybridisierdende Lambda-Klone wurden Eq-alpha9, Eq-alphal6, Eq-alpha20 und Eq-aTpha24 genannt. Ein 3,2 kb Hind III- Fragment aus dem Kloi Eq-alphal, ein 4,5 kb PvuII-Fragmen.t des Klons Eq-beta6, eiii 2,8 kb langes HindIII-Fragment des Kloms Eq-alpha9, ein 3,3 kb EcoRI- und ein 5, 5 kb langes EcoRI-fragment des Klons Eq-alphal 6, ein 2,2 kb EcoRI-Fragment des Klons Eq-alpha20 bzw. ein 3, 2 kb langes HindIII Fragment aus dem Klon Eq-alpha24 wurden in einem Vektor, beispielsweise pUC9 oder pUC8. subkloniert und anschliessend in einen Wirtsorganismus, beispielsweise E.coli JM101 transformiert. Die Isolierung der korrekten Phenotypen ergab die Plasmide pAH50, pAH60, pRH61, pRH62, pRh63, pRH82 bzw. pRH83 dic als Inserts die fir die Pferde-Interferone codierenden Sequenzen enthalten. Die Restriktionskarten für pRh61, pRh63 sind in Figur 9 und für pRH62 in Figur 30 abgebildet. Die Inserts der Plasmide wurden nach der Dideoxy-Methode von Sanger (23) nach dem "Shotgun-Verfahren" sequenziert. Die Teilsequenzen dieser Inserts wurden mit Hilfe eines modifi- zierten Computerprogrammes zu einer Totalsequenz vereint (Fig. 4, 8, 10, 12, 31, 34, und 35). Der längste offene Leseraster fir das Eq-IFN-alpha Ge1 aus dem Klon Eq-alpha1 codiert ein Polypeptid mit 184 Aminosäuren Beachtenswert ist die signifikante Homologie zu bekannten alpha-Iterferonen anderer Spezies. Wie bei den humanen, bovinen und murinen alpha-Interferonen besteht dieses Pferde- alpha-Interferon aus einem hydrophoben Signalpeptid mit 23 Aminosäuren, das einem reifen Protein mit überraschenderweise nur 161 Aminosäuren vorausgeht (Eq-IFN-alphal). Vier Cysteinreste an den Stellen 1, 29, 99 und 139 sind zwischen den Spezies Pferd, Rind, Maus, Ratte und Mensch exakt erhalten (Fig. 7). Die verkürzung dieses Pferde-alpha-Interferons auf 161 Aminosäuren #rfte durh die Delation einer Base naht der 159. Aminosäure bewirkt worden sei, ohne die die Transcriptio# bis zur 166. Aminosäure, bis zum Stopcodon TGA weitergeschrieben worden wäre Dieser Befund weist darauf hin, dass die Polypeptidkette für reifes Pferde-Interferon-alphal eine Länge von 161 Aminosäuren haben kann, dass jedoch auch andere Formen mit bis zu 166 Aminosäuren existieren können. Auch diese Peptide sind selbstverständlich Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Überraschenderweise zeigte sich beim paarweisen Vergleiht der Aminosäuresequensen, dass das Pferde-Interferon-älpha1 zu den menchlichen alpha-Interferon eine grössere Homologie aufweist (71-77%) als zu den Rinder- (57-67%), Ratte (61%) oder Maus-alpha-Interferonen (54-59%) (Fig. 5) . Die Homologie zwischen den verschiedenen alpha-Interferonen einer Gattung ist deutlich grösser, als zwischen denen verschiedener Spezies (z.B. Mensch 77-100%, Rind 91-99%). Der längste offene Leseraster für das Eq-IFN-alpha-Gen aus dem Klon Eq-alphal6 codiert ebenfalls ein Polypeptid mit 184 Aminosäuren (Si.gnalpeptid 23 Aminosäuren, reifes Protein 161 Aminosäuren). Die DNA5equenz des Klons pRH63 ist in der proteinkodieren Region sehr ähnlich der des Klons pAH50, was für die Expression des Genes ausgenutzt werden kann (siehe Beispiel M; Fig. 11 und 15). Das Interferon aus I(lon pRH63 wurde aufgrund der hohen Homologie mit Eq-IFN-alphal (aus Klon pAH50) Eq-IFN-alpha2 benannt. Reifes Eq-IFN-alpha2 weist gegenüber Eq-IFN-alphal nur zwei unterschiedliche Aminosäurereste am C-terminalen Ende auf, wobei sich durch den Austausch an Position 151 Ser -- Cys in Eq-IFN-alpha2 ein fünfter Cysteinrest an einer bisher bei keinem anderen Interferon beobachteten Position befindet (siehe Fig. 19). Ansonsten trifft das für das Eq-IFN-alpha1 Gesagte auch a'.f das Eq-IFN-alpha2 zu' Die aus den Plasmiden pRH82 und pRH83 ermittelten DNASequenzen (Fig. 34 und 35) ergaben, dass es sich um zwei funktionelle alpha-Interferongene des Pferdes handelt, die Eq-IFN-alpha3 (aus pRH83) bzw. Eq-IFN-alpha4 (aus pRH82) benannt wurden. Sie codieren iür Polypeptide bestehend aus einem 23 Aminosäuren langen Signalpeptid gefolgt vor, einem reifen Protein von 161 Aminosäuren. Der Homologiegrad, der DNA-Sequenzen zwischen Eq-IFN-alpha 1 (pAM50) und Eq-IFN-alpha3 (pRH83) bzw. zwischen Eq-IFN-alpha2 (pRH62) und Eq-IFN-alpha4 (pRH82) ist ausserordentlich hoch. Die Aminosäuresequenzen der reifen Proteine sind vollkommen gleich. Durch die Degenerierung des genetischen Codes führen die Unterschiede in der Nukleotidsequenz in diesem Fall zu keinem Austausch in der Aminosäuresequenz. Möglicherweise handelt es sich bei Eq-IFN-alpha3 um eine allele Form des Eq-IFN-alphal. Das DNA-Fragment des Eq-alpha20 enthält die codierende Sequenz für ein Protein mit 172 Aminosäuren und ein hydrophobes Signalpeptid mit 23 Aminosäuren. An Position 78-80 des reifen Proteins befindet sich eine potentielle N-Glycosilierungsstelle Asn-Thr-Thr, die genau der vor. Eq-IFN-ss , Hu-I?N-E, Mu-IFN-ss, Mu-IFN-alpha 1,2,4,5,6 entspricht (Fig. 19). Die Proteinsequenzen in dieser Abbildung wurden so angeordnet, dass # ie grösstmögliche Homologie zwischen den einzelnen Inte feronen erreicht wurde. Zum Vergleich von IFN-alpha und IFN-3- Sequenzen wurden letztere um 3 Aminosäuren verschoben und eine Lücke eingeführt. Der paarweise Vergleich der Aminosäuresequenzen in Fig. 20 erfolgte ausgehend von dieser Anordnung über die längste gemeinsame Länge der Proteine. Aus den Abbildungen 19 und 20 geht hervor, dass das von der DNA-Sequenz des Klones pRH61 codierte Protein mit den Typ 1 Interferonen verwandt ist (alpha- und ss-IFN). Die Charakteristika von 172 Aminosäuren, Glykosilierungsstelle an Position 78 und der etwa gleich grossen Homologie der Inter ferone dieser Klasse zwischen verschiedener. Spezies (Mensch, Rind, Pferd) wie zwischen diesen längeren Interferonen und den alpha-Interferonen innerhalb einer Gattung, sowie die unterschiedlichen Sätze von hybridisierenden DNA-Fragmenten mit alpha-Interferon und Proben aus dem Klon pRH61 (Fig.18) lassen die'Annahme zu, dass das Insert des Klons pRH61 einer neuen Klasse von Typ I Interferonen angehört, welche als Interferon-omega bezeichnet wird (33) . Diese Bezeichnung ist weniger verwirrend als die von Capon et al. (34) verwendete: : Typ I, Klasse II Interferon, welche zur Verwechslung mit Typ II Interferon (IFN-gamma) führen könnte. Die aus dem Plasmid pRH62 ermittelte DNA-Sequenz (Fig.31) enthält die gesamte codierende Region für ein funktionelles Pferde-Interferon-Gen, das aufgrund der Homologie zu dem Interferon aus Plasmid pRH61 (Fig. 32) und Hu-IFN-omegal Eq-IFN-omega2 benannt wurde. Eq-IFN-omega2 enthält überraschenderweise an Position 86 des reifen Proteins einen fürften Cysteinrest. Die Homologie zwischen den beiden equinen omega-Interferonen ist ab der 29. Aminosäure des reifen Proteins sehr hoch, die vier Cysteinreste sowie die potentielle N-Glykosylierunsstelle an Position 78-80 (Asn-Thr-Thr) sind vollkommen konserviert (Fig.31,32). Die Aminosäure-Homologe zu den Interferonen der omega-Klasse von Rid und Mensch ist höher (61-70%) als zu den equinen alpha-Interferonen (57-60%, Fig. 33). Die Sequenz des Pferde- beta- Interferons wurde analog der des alpha bestimmt. Der längste offene leseraster für das beta-IFN-Gen codiert für ein Polypeptid mit 186 Aminosäuren, wobei auch in diesem Fall die Homologie zu bekannten beta-Interferonen anderer Spezies zu beobachten ist. Wie bei dem humanen, den 3 bovinen und den murinen beta-Interferonen weist das Pferde-beta-Interferon ein hydrophobes Signalpeptid mit 21 Amirsäuren auf. Überraschenderweise zeigte sich auch beim beta-Interferon beim paarweisen Vergleich der Aminosäuresequenzen, dass das Pferde beta-Interferon zu dem menschlichen beta-Interferon eine grössere Homologie aufweist (59%) als zu den Rinder- (50-55%) oder Maus-beta-Interferonen (44%) (Fig. 6). Andererseits, trotz der überraschend hohen Homologie Pferd/Menschbeta-Interferon, fehlt wie bei den drei bovinen beta-Interferonen die im humanen beta-Interferon an Position 119 stehende Aminosäure auch im Pferde-beta-Interferon! Das Pferde-beta-Interferon trägt zwei potentielle N-Glykosylierungsstellen: an Position 80 des reifen Proteins (ASN-GLU- THR, genau wie beim humanen und Maus- beta- Interferon) und an Position 115 (ASN-THR-THR). Bei den bovinen beta-Interferorlen sind zwei mögliche N-Glykosylierungsstellen an Position 110 (ASN-PHE-THR bzw. ASN-SER-PHE) und 152 (ASN-VAL-SER bzw. ASN-PHE-SER) lokalisiert. Wie beim Rind und beim Menschen sind die 3 Cysteinreste exakt erhalten geblieben (Position 17, 31 und 140 bzw. 141 beim Menschen) Bei der Untersuchung der Hunde-DNA mit dem humanen-alpha-Gen wurden wie bei Rindern, Schweinen und Menschen ebenfalls mehrere Banden festgestellt, so dass man davon ausgehen kann, dass es auch beim Hund eine Klasse von alpha-Irlterferongenen geben muss. Von . den hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen DNA hergestellt und von dem resultierenden Klon Ca alphall-2 wurde eine Restriktionskarte erstellt (Fig. 22) . Ein 3, 7 kb Smal Fragment und ein 2,4 kb Sma I Fragment dieses Klons wurden in einem Vektor, beispielsweise pUC 9, subkloniert und anschliessend in einen Mikroorganismus, beispielsweise E.2oli Je 101 transformiert. Die Isolierwig der korrekten Pheliotypel ergab zwei Plasmide pAH2 und pAH4, die als Inserts die für die Hur.d e-Interferone codierenden Sequenzen enthalten. Die Inserts dieser Plasmide wurden nach der DideoxyMethode von Sanger (23) nach dem " "Shotgun-Verfahren" sequenziert. Die Teilsequenzen dieser Inserts wurden mit Hilfe eines modifizierten Computerprogrammes zu einer Totalsequenz vereint (Fig. 24 und 25). Überraschenderweise codiert der längste offene Leseraster beider Plasmidsequenzen für vollkommen identische Polypeptide mit 187 Aminosäuren. Beachtenswert ist die signifikante Homologie zu bekannten alpha-Interferonen anderer Spezies. Die proteincodierenden Sequenzen sind exakt gleich; 170 Basen der 5 -nichttranslatierten Region unterscheiden sich nur durch 3 Nukleotide (1, ) (vgl. 28) . Wie bei den humanen, bovinen und murinen alpha-Interferonen besteht das Hunde-alpha-Interferon aus einem hydrophoben Signalpeptid mit 23 Aminosäuren, das einem reifen Protein mit überraschenderweise nur 164 Aminosäuren vorausgeht. Verglichen mit den Proteinsequenzen anderer beschriebener alpha-Interferongene fehlen dem Hunde-alpha-Interferon zwei Aminosäuren an Position 119 und 120 des reifen Proteins (Fig. 26). Überraschenderweise weist reifes Hunde-alpha-Interferon als einziges bisher bekanntes alpha-Interferon 6 Cysteinreste auf; möglich sind also drei intramolekulare Disulfidbrücken! Vier dieser Cysteinreste an den Stellen 1, 29, 99 und 139 sind zwischen den Spezies Hund, Rind, Maus, Ratte und Mensch exakt erhalten. Das (stein an Position 86 ist zwischen Ca IFN -alpha1, CaIFN-alpha2, MuIFN-alphai, MuIFN-alpha2, RiiFfl-alpha und RuIFN-alphaD konserviert. Überraschenderweise besitzt das- Hunde-alpha Interferon zwei potentielle N-Glycoaylierungsstellen, und zwar an den Positionen 78 (ASN-MET-THR) und 133 (ASN-HIS-SER). Die Glycosylierungsstelle an Position 78 entspricht der im Mu IFN-alpha1 und 2 (ASN-ALA-THR); ; sie entspricht auch der Glycosylierungsstelle der beta-Interferone von Mensch und Maus an Position 80 (ASN-GLU-THR)! Ein paarweiser Vergleich der Aminosäuresequenzen ergab, dass das Rundealpha-Interferon zum menschlichen alpha-Interferon eine Homologie von 52-57%, zu den Rinder-alpha-Interferonen von 54-55%, zu den Ratter=alpha-Interferonen von 50% und zu den Maus-alpha-Interferonen von 48-51% zeigt (Figur 27) An dieser Stelle sei erwähnt, dass es sich bei den erfindungsgemässen Interferonen nicht nur um die reifen interferone, die im einzelnen beschrieben sind, handelt, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieser Polypeptide, die die Pferde/Hunde-IFN-Aktivität nicht wesentlich verändert. Diese Modifikationen beinhalten z.B. Verkürzung des Moleküls z.B am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, chemische oder biochemische Bindunqen des Moleküls an andere Moleküle, die inert oder aktiv sind. Bei den letztgenannten Modifikationen kann es sich beispielsweise um Hybridmolküle aus einem oder mehreren erfindungsgemässen Interferonen und/oder bekannten a- oder ss-Interferonen handeln. Gegenstand der Erfindung sind daher nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die erfindungsgemässen Interferone codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemässig durch Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemässen Interferone codiert (d.h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen der codierenden Regionen zu degenefieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der erfindungsgemässen Interferone codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (beispielsweise Bedingungen, die für mehr als 85 %, bevorzugt mehr als 90 t Homologie selektieren) beinhaltet. Die Hybridisierungen werden in 6 x SSC/5 x Denhardt's ¯ösung/G . % SDS be ;50C durch abführt. L Grad de Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen alk ca. 85 oder nehr Homologie die Bedingungen c.z - SSC/0.01 SD3/85 C und für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 90 t oder mehr Iiomologie die Bedingungen 0,1 x SSC/0,01 % SDS/650C geeignet. Erfindungsgemässe Interferon-Gene können unter Bedingungen in jeden Organismus eingebracht werden, die zu hohen Ausbeuten führen. Geeignete Wirte und Vektoren sind dem Fachmann bestens bekannt; als Beispiel sei auf die EP-A-0.093 119 hingewiesen. Insbesondere sind Prokaryoten für die Expression bevorzugt, beispielsweiee E. co)'. K 12, Stamm 294 (ATCC Nr 31 e46) oder L. coli X1776 (ATCC Nr 31.537). Ebenso wie die vorerwähnten Stämme können auch E. coli W 3110 (F-, Lambda , Prototroph, ATCC Nr. 27325), Bazillen wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie Salmoneila typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonaden verwendet werden. Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die Replikon und Kontrollsequenzen, die aus Spezies stammen1 die kompatibel mit den Wirtszellen sind, enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, die transformierten Zellen phenotypisch zu selektieren. Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise mit pBR32Z transformiert, ein Plasmid, das aus E. coli Spezies stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (197)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Res.stenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid oder auch andere Plasmide müssen ausserdem von sich aus Promotoren enthalten oder müssen dahingehend so modifiziert sein, dass sie Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet seren können Die Promotoren die am häufigsten bei der Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden, beinhalten die Beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 61b (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) und Tryptophan(trp) Promotor Systeme (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Während die erwähnten die gebräuchlichsten Promotoren sind, sind darüber hinaus auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die erfindungsgemässen Interferone kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (PL) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist einer der als besonders stark bekannten Promotoren, der steuerbar ist. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressent, von der benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches Allel dieses Repressor-Gens kann in einem Vektor, der eine vollständige IFN-omega-Sequenz enthält, eingefügt werden. Wird die Temperatur auf 42 C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor bis zu seiner maximalen Konzentration exprimiert. Die Summe der mRNA, die unter diesen Bedingungen produziert wird, sollte ausreichend sein, um eine Zelle zu erhalten, die unter ihren neuen synthetischen Ribonukleinsäuren ungefähr 10 % enthält, die von dem PL-Promotor stammt. Auf diese Weise ist es möglich, eine Clon-Bank zu etablieren, in der eine funktionelle IFN-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-PL-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden. Die Expression und Translation einer Sequenz codierend für die erfindungsgemässen Proteine kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablCen. So enthält z.B. chromosome DNA von einem Lactose-abhär.gigen E. coli ein Lactose oder Lac-Operon, der durch AusschE:talng des Enzyms Beta-Galactosi dase den Lactose-Abbau ermöglicht. Die Lac-Kontrollelemente können aus dem Bacteriophagen Lambda-plac5, der infektös für E. coli ist, erhalten werden. Das Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus derselben Bakterien-Spezies stammen. Regulationssysteme, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren Verwendung finden können, können aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden. Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile hiervon können genausogut verwendet werden beispiel'eise Arabinose-Opera- t3r, Colicine El-Operator, GalacLose-Operator, alkalischer Phosphatase-Operator, trp-Operator, Xylose-A-Operator, tac Promotor u.ä.. Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefekulturen verwendet werden Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete unter den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) und das Plasmid YEp 13 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)) üblicherweise verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRPl-Gen, das eine Selektionierungsmarkierung für eine Hefemutante, die unfähig ist, in trypthophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr. 44076. Das Vorhandensein des TRP1 Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, indem ohne Tryptophan kultiviert wird. Ganz ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YEpl3, das das beta-Gen LEU 5, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält. Geeignete Promotor-Sequenzen für Hete Vektoren beinhalten die 5-flankierende Region der Gene des ADH I (mmerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-Phosphoglycerate-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 273 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Kawaski und Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6 Phosphat-Isomerase, Phósphoglucose-Isomerase und -Glucokinase. Bei der Konzentration geeigneter.Expressions- plasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenyiierung und Termination der mRMn vorzusehen. Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumshedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerlnaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFal, STE2, STE3, STES können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine PH.D. in Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet. Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeingete Wirtsorganisnen. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen. eislsetzbaL, ob von wirbeltier- oder wirbel losen Tierkulturen. Grösstes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so dass die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemässigen Methode wurde (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973)). Beispiele solch nützlicher Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Hamster-Eierstock (CHO)-Zellen und WI38, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) eine Peplikations- stelle, einen Promotor. der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit jeder notwendigen Ribosomenbindungsstelle. RNA-Splicing-Stelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen. Bei der Ver-:endung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Polyoma Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die frühen und späten Endpromotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch noch die virale Replikationsstelle des SV 40 enthält. (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Auch können kleinere oder grössere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz, die von der HindIII Schnittstelle bis zur Bgl 1 Schnittstelle in der viralen Replikationsstelle reicht. Ausserdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen. Eine Replikationsstelle kann entweder durch entsprechend. Vektor restruktio vorgesehen werden, ur eine eigene Stelle einzubauen, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z.B. @olyome, Adeno, VSV, 2BV, etc.) oder kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirts zelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert. reicht die zuletztgenannte Massnahme meistens aus. Die Gene können jedoch vorzugsweise in einem Expressions Plasmid pERlO3 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) und EP-A-0.115-613 - hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983) oder auch in dem Plasmid parpER33 (EP-A-0.115-613) exprimiert werden, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen. Ausgehend von dem Expressionsplasmid parpER33 wurde die für die erhöhte Plasmidstabilität in E.coli verantwortliche "par"-Sequenz und die Tryptophan Promoter-Operator-Sequenz samt der künstlichen ribosomalen Bindungsstelle in den Plasmidvektor pAT153 eingesetzt pAT153 ist ein verkürztes Derivat des Plasmides pBR322, dem ein Abschnitt fehlt, der für die Mobilisierung von DNA notwendig ist (36). Die Vorgangsweise der Herstellung von Plasmid parpATER103 ist in Fig. 13 dargestellt. Das Plasmid parpER33 wurde mit HindIII vollständig und mit EcoRI partiell geschnitten, das entstandene 0,47kb lange DNA-Fragmenf on einem Agarosegel isoliert und gereinigt und mit EcoRI und HindIII zweifach geschnittenem pAT153 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur, die man durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen bestimmte, wurde parpATER103 benannt. Dieses Plasmid enthält den Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen von Plasmid pAT153, sowie die für die Stabilisierung in E.coli wirksame par-Sequenz und für die effiziente Expression von Genen verwendbare Tryptophan-Promoter-Operator-Region und ribosomale Bindungsstelle. Die Herstellung der Expressionsplasmide pkd52, pAH52/2 und pAH53 sowie deren Vorstufen ist in Fig. 14 dargestellt. Zur Herstellung der Expressionsplasmide wurde das Plasmid pAH5O mit HindII verdaut und das 4,2 kb lange DNA-Fragment, das das gesamte EqIFN-ll Gen enthält, isoliert und gereinigt. Die Enden des HindII-Fragmentes wurden mit Sphl-Linkern versehen. Anschliessend wurde die DNA mit SphI verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde mit Ligase zirkularisiert und E.coli HB101 transformiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur erhielt die Bezeichnung pAH51. Es enthält das EqIFN-ol-Gen mit einer verkürzten wµ-nichttranslatierten Region und Einer 7llsatzlichen Sohl- Schnittstelle. Um in der Endkonstruktion die DNA-Sequenz für das reife Pferde &alpha;-Interferon in der richtigen Distanz mit der Promotersequenz ZU verbinden, wurde von einem 0,4 kb langen DNA-Fragment ausgegangen, das aus mit PvuII geschnittenem Plasmid pAH50 isoliert wurde. Synthetisches 15mer Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-TGTGACCTGCCTCAC wurde mit Polynukleotid-Kinase kinasiert. Es enthält die Sequenz ,- die für die ersten 5 Aminosäuren des reifen EqIFN- l aus Klon pAH50 codiert. Das 15mer wurde mit dem 0,4 kb PvuII-Fragment gemischt, der DNA-Doppelstrang denaturiert. Der an den Einzelstrang gebundene nligonukleotid-Primer wurde mit dem Klenow-Fragment verlängert. Um einen eventuell verbliebenen 3'-Überhang sicher zu entfernen wurde die DNA anschliessend mit T4 DNA-Polymerase inkubiert. Die entstandene DNA mit geraden Enden wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und ausgefällt. An dieses DNA-Stück wurde ein Gemisch zweier kinasierter, zueinander komplementärer Oligonukleotide: 12mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8mer 5' CATCTTTA (europäische Patentanmeldung No. 83 112 812.9) ligiert, das eine HindIII-Schnittstelle und das Iranslationsstartcodon ATG erzeugt. Beide Oligonukleotide wurden mit Ligase an das DNA-Fragment ligiert. Nach Inaktivierung des Enzyms wurde die erhaltene DNA mit HindIII und BglII geschnitten und DNA-Fragmente von etwa 190 bp Länge isoliert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit HindIII und BglII doppelt geschnittenem pAH5l-Vektor ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von 65 erhaltenen Kolonien wurde aus 4 Plasmiden, die das gewünschte Restriktionsmuster aufwiesen, ein HindIII/BamHI DNA-Fragment isoliert und mit der Sanger Methode sequenziert, wobei zwei Klone genau die gewünschte Sequenz enthielten. Ein solches Plasmid wurde pAH51/2 benannt. Dieses enthält die Sequenz für reifes EqIFN4l mit vorangestelltem Translationsstartcodon ATG und HindIII-Schnittstelle. Zur Herstellung der Expressionsplasmide pAH52 und pAH52/2 wurde das Plasmid pAH51/2 mit SphI und Hind III zweifach geschnitten. das entstehende 1,0 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und mit HindIII und SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur wurde pAH52 benannt. Es enthält alle für eine induzierbare Expression von reifem EqIFN-&alpha;1 notwendigen Informationen. In analoger Weise wurde aus mit HindIII und BamHI doppelt geschnittenem pAH51/2 und mit HindIII/ BamHI geschnittenem parpATER103 das Plasmid pAH52/2 hergestellt. Dieses Expressionsplasmid ist etwa 0,2 kb grösser als pAH52 und weist zusätzlich eine singuläre BamHI-Schnittstelle auf. Ein wesentlich verkleinertes Expressionsplasmid zur Herstellung von reifem EqIFN-al in E.coli, in dem Tryptophan-Promoter, Interferongen, Ampicillin-Restenzgen und Replikationsursprung in einer Richtung orientiert sind, wurde aus den Plasmiden pAH52 und pBR322 hergestellt: pAH53. pAH52 wurde mit SphI und EcoRI geschnitten, die Enzyme bei 70 C inaktiviert und die DNA-Enden nach Zusatz von dATP, dGTP, dCTP, dTTP mit Klenow-Fragment stumpf gemacht. Die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel nach der Grösse fraktioniert und ein 1,1 kb langes Stück isoliert, das Promoter und Interferongen enthält. pBR322 wurde mit EcoRI und PvuII doppelt verdaut, die Enden wie oben beschrieben mit Klenow-Fragment begradigt und anschliessend mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Ein DNA-Fragment von 2,4 kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert. Die beiden so erhaltenen DNA-Stücke wurden mit T4 DNA-Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, in dem zwei EcoRI-Erkennungsstellen geschaffen wurden, erhielt die Bezeichnung pAH53. Aufgrund der hohen Homologie der Gene für EqIFN-&alpha;1 (pAH5O) und Eq/IFN,-a2 (pRH63, Fig. 11) ist es möglich, aus dem Expressionsplasmid pAH52/2 und dem Lambda-Subklon pRH63 ein Expressionsplasmid für EqIFN-d2 erzustellen Fig. 15). ir, bis zur ge..insamen Bg;.I-Stelle im für reifes Interferon codierenden Bereich nur zwei Basenunterschiede lestehen, di jedoch auf cind des degel,erierten Aninosäurecodes keiner. Aminosäurenterschied bewirken, kann der erste Teil des Gens für EqIFN < tl im Expressionsplasmid pAH52/2 auch für die Expression von EqlFNna2 verwendet werden. pRH63 wurde mit BglII und BamHI zweifach geschnitten und das entstehende DNA-Fragment von 1,0 kb Länge, das die codierende Sequenz für EqIFNtr2 ab der 64.Aminosäure enthält, von einem Agarosegel isoliert. pAH52/2 wurde ebenfalls mit BglII und BamHI geschnitten, die Enden mit Kalbsdarm phosphatase dephosphoryliert und das grössere der zwei entstehenden DNA-Fragmente von einem Agarosegel gewonnen. Dieses DNA-Stück enthält den Plasmidvektoranteil, den Promoter und die codierende Sequenz für die ersten 63 Aminosäuren des reifen Interferons. Die beiden beschriebenen DNA-Fragmente wurden mit Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, welches das Insert in der korrekten Orientierung enthält (mit BamHI und BglII schneidbar!) wurde pAH55 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die Expression von reifem EqIFN-2 in E.coli. Für die Herstellung eines Expressionsplasmides für EqIFN-ss wurde zunächst das Pferde-DNA-Insert aus Plasmid pAH60 am 3'-Ende verkürzt und dieses in weiterer Folge so manipuliert, dass ein reifes EqIFN-B Protein von einem bakteriellen Promoter exprimiert wird. Die Vorgangsweise ist in Fig. 16 schematisch dargestellt. pAH60 wurde mit HgiAI geschnitten. Nach Inaktivierung des Enzyms wurden die 3'überhängenden DNA-Enden mit T4 DNA-Polymerase (Zugabe von dATP, dGTP, dCTP, dTTP) begradigt. An die stumpfen Enden wurden SphI-Linker ligiert und die erhaltene DNA mit SphI und HindIII geschnitten. Ein entstandenes DNA-Fragment von 1,85 kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert und mit HindIII und SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATERlO3 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB 101 erhaltener Klon mit dem gewünschten Plasmid wurde pAH61 benannt. Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die weitere Konstruktion des Expressionsplasmides dar. pAH61 wurde mit BamHI und SalI zweifach geschnitten und ein entstandenes 1,3 k langes DNA-rragment von einem Agarosegel isolier;, gereinigt und mit BamHI/SalI doppelt verdauter M13mp9 Phagen-DNA ligiert. Nach Transformation von E.coli JMl0l konnte von einem rekombinanten M13-Phagen (M13pAH61) einzelsträngige Phagen-DNA gewonnen werden. Diese Einzelstrang-DNA wurde mit kinasiertem 15mer Oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTG gemischt, auf 95 C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligonukleotid bindet genau ab der ersten Base der Sequenz des reifen 8-Interferons. Die Zweitstrangsynthese an der Einzelstrangvorlage, ausgehend vom 15mer-Primer wurde nach Zugabe von dATP, dGTP, dCTP, dTTP und Klenow-Fragm.ent durchgeführt. Die DNA wurde extrahiert und ausgefällt. Verbliebene, einzelsträngige DNA-Abschnitte wurden mit Sl-Nuklease verdaut. An die durch diese Behandlung stumpfendig gemachte DNA wurde das Gemisch der 12mer und Einer Oligonukleotide 5'-AGCTTAAAGATG und 5'-CATCTTTA anligiert und die entstandene DNA mit HindIII und SphI geschnitten. Ein DNA-Fragment der gewünschten Länge von 1,1 kb wurde von einem Agarosegel isoliert und mit HindIII/ SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 ligiert. Nach Transformation von ±.coli HB107 wurden 54 Kolonien erhalten. Von 9 daraus isolierten Plasmid-DNAs wurde ein 1,3 kb langes EcoRI/SalI Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Ein daraus ermitteltes Plasmid mit der gewünschten Sequenz wurde pAH62 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht d e effiziente Expression von reifem EqIFN-B Protein in E.coli. Ein Plasmid das eine Deletion der ersten Base (G) des reifen B-IFN Genes trägt, wurde pAH62deltaGl benannt. Dieses Plasmid erlaubt die Expression eines am Amino-Terminus verkürzten B-IFN durch Translationsstart am nächstfolgenden ATG (entspricht Aminosäure 19 des reifen ss-IFN), das überraschenderweise antivirale Aktivität, wenn auch deutlich weniger, verglichen mit dem unverkürzten Protein, aufweist; Zum Nachweis der Expression der Interferonaktivität durch E.coli HB101, die das Plasmid pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 oder pAH62 enthalten, wurden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten Kulturmedium aufgebrochen und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytopathischen Effekt (CPE) von VSV oder EMCV misst, getestet. Verwendet wurden dazu NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-Epidermis-Zellen), die mit Vesicular-Stomatitis-Vir;is (VSV) infiziert worden waren und/oder A549 (4TCC CCL185, humane Lungencarcinom-Zellinie) die mit Encephalomyocarditis Virus (EMCV) infiziert worden waren. Die Ergebnisse sind im Beispiel 0 aufgelistet. Der Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone wurde durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (37) selektiv in vivo markiert werden. Der E.coli Stamm CSR603 (CGSC 5830) (F-, thr-l, leu6, proA2, phr-l, recAl, argE3, thi-l, uvrA6, ara-14, lacyl, galK2, xyl-5, mtl-l, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, A , supE44,) besitzt keine Mechanismen für die Reparatur von durch UV-Bestrahlung entstandene Schäden der DNA. Durch Bestrahlung mit einer geeigneten UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandenen Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, sich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch am Plasmid codierte Gene transkribiert und translatiert und die gebildeten Proteine können durch Einbau von35S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E.coli CSR603 wurde nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf Ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgte nach einer Vorschrift von A. Sancar (37). in Fig. 17 ist das Autoradiogramm des getrockneten Geles dargestellt. Als Molekulargewichtsstandard wurde ein 14C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrollen wurden das Plasmid pER103, das nur den Promoter ohne Interferongen enthält und das Plasmid pER21/1 eingesetzt, welches zwei Kopien des humanen IFN-oc2arg Genes enthält. Die Proteinbanden bei etwa 18 kd sind die von den Plasmiden exprimierten Interferone. Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, welche hohe Homologie mit Interferongenen der Klasse IFN-o; IFN-B bz?J. IFN-omega aufweisen, wurde hochmolekulare Pferde-DNA mit dem entsprechenden Restriktionsenzym vollständig verdaut und diese geschnittene DNA nach der Grösse aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, denaturieren und fixieren der DNA wurde jedes Filter mit nicktranslatierter Probe hybridisiert. Als Probe für EqIFN- wurde ein 1,0 kb langes HindIII/SphI-Fragment aus Plasmid pAH52, für EqIFN-E ein 1,1 kb langes HindlII/SphI-Fragment aus Plasmid pAH62 verwendet, welches jeweils die codierende Sequenz für das-gesamte reife Interferon enthält. Als Probe für EqIFN-omega wurde das 2,1 kb EcoRI-Insert aus Plasmid pRH67 eingesetzt. Die Filter wurden anschliessend unter stringenten Bedingungen gewaschen, dass keine Kreuzhybridisierung zwischen diesen 3 Interferonsequenze eintritt: Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -80"C. Das Ergebnis ist in Figur 18 gezeigt. Es zeigte überraschenderweise, dass im Pferdegenom mindestens 7 Gene der IFN- Klasse, mindestens 2 Gene der IFN-ss Klasse und mindestens 8 Gene der IFN-omega Klasse vorhanden sind. Zur Herstellung des Expressionsplasmides pRH 100 wurde das Plasmid pER 103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) mit der Restriktionsendonuklease HindIII linearisiert und die 5'terminalen Phosphatreste wurden entfernt. Diese Plasmid-DNA wurde mit den phosphorylierten Oligonukleotiden d(AGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCÄTTTA gemischt und ligiert. Die Ligasereaktion wurde mit der Restriktionsendonuklease SacI verdaut und durch Zugabe von f4-PNK ligiert. Die Oligonukleotide wurden analog der in der EP-A-0.115-613 beschriebenen Methode hergestellt. Kompetenter E.coli HblOl wurde mit dieser Ligasereaktion versetzt und inkubiert. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromassstab die Plasmide isoliert (Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Die resultierende DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease SacI geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1 %, lx TBE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Grösse von etwa 4.400 bp bestätigte die Einführung einer SacI-Erkennungsste,le in das Plasmid Eins dieser Plasmide wurde willkürlich ausgesucht. Mit der DNA aus der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E.coli HB101 transformiert. Von den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewählt und in grösserem Massstab angezüchtet. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten, die DNA auf einem l%-igen Agarosegel aufgetrennt, und das kleinere Fragment aus dem Gel durch Elektroelution isoliert. Dieses etwa 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sanger sequenziert (F. Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1977) 5463-5467). Das dermassen analysierte Plasmid wurde pRH 100 genannt. Zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH4/2 wurde das Plasmid pRH100 vollständig mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten und anschliessend wurden mit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP) die 5'terminalen Phosphatreste entfernt. Das Plasmid pAH4 wurde mit BamHI verdaut und ein 0,6kb langes DNA-Fragment, das die gesamte codierende Sequenz für CaIFN-alphal enthält, isoliert und gereinigt. Dieses 0,6 kb DNA-Fragment wurde mit der mit BamHI linearisierten pRHlOO VektorDNA ligiert; kompetenter E.coli HB 101 wurde transformiert und auf LB-Agar ausgestrichen. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden im MikromaBstab Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen charakterisiert. Ein Plasmid, das Interferongen und Tryptophanpromotor in derselben Orientierung enthielt, wurde pAH104 benannt (Figur28). Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die Herstellung des endgültigen Expressionsplasmides für reifes CaIFN-alphal dar. Das 0,6 kb lange BamHI Fragment aus dem Plasmid pAH4 wurde mit synthetischem Oligonukleotid (5'TGCCACCTGCCbGAC), hergestellt analog EP-A-0.115-613, gemischt. Das 15mer Oligonukleotid enthält die codierende Sequenz für die N-terminalen 5 Aminosäuren des reifen Hunde alpha-Interferons. Die DNA-Lösung wurde erhitzt und anschliessend abgekühlt, wobei das in hohem Überschuss vorhandene Oligonukleotid an die komplementäre Stelle des DNA-Einzeistranges bindet. Anschliessend erfolgte die Zweitrangsynthese ausgehend vom gebundenen Oligonukleotidprimer. Die verbliebenen, einzelsträngigen DNA-Abschnitte wurden mit S1 Nuklease entfernt. Die erhaltene DNA wurde verdaut und anschliessend elektrophoretisch aufgetrennt. DNA-Fragmente einer Länge von etwa 300Ap bp wurden isoliert und gereinigt. EMI35.1 Das Plasmid pAH104 wurdeYverdaut und mit Klenow Polymerase inkubiert, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die erhaltene DNA wurde partiell mit PstI geschnitten, die DNA elektrophoretisch aufgetrennt und Fragmente einer Länge von 4,3 kb isoliert und gereinigt. Die erhaltene DNA wurde mit dem zuvor beschriebenen 0,3 kb langen DNA-Fragment ligiert. Mit dieser Ligasereaktion wurde E.coli HB101 transformiert und auf Amipicillin-haltigem LB-Agar plattiert. Die entstandenen Bakterienkolonien wurden auf frische Agarplatten und im Duplikat auf Nitrozellulosefilter, die auf Agarplatten aufgelegt waren, übertragen. Nach Inkubation wurden die Bakterien nach einer Vorschrift von Grunstein und Hogness (M.Grunstein & D. Hogness, Proc Natl. Aca.Sci. USA (1975) 72, 3961 - lysiert und die DNA nach Denaturierung an die Nitrozellulose gebunden. Die Zellbruchstücke wurden entfernt. Die Filter wurden anschliessend mit 32p markiertem Oligodesoxy nukleosid d(TGCCACCTGCCCGAC) hybridisiert. Die Filter wurden auf Kodak X-omat S Röntgenfilm unter Verwendung von Kodak X-omat Regular Verstärkerfolien bei -80 C exponiert. Von Bakterienkolonien, die im Autoradiogramm ein positives Hybridisierungssignal lieferten, wurde durch ein Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert. Die Plasmide wurden mit HindIII und BamHI vollständig geschnitten. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel wurden 0,5 kb lange Restriktionsfragmente isoliert und der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger zugeführt. Ein Plasmid, das die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/2 benannt. Es ermöglichte-die Expression von reifem CaIFN-alpha in E.coli. Zur Herstellung des Plasmides pAH4/3 wurde das für die bakterielle Expressi : von CaIFN phal manip .ierte Gen s dem Plasmid pAH4/2 in einem modifizierten Plasmidvektor parpATER103 subkloniert, das eine höhere Kop nzahT pro zelle und err.' 0te Plasmid abilität aL4veist. Das 0,5 kb lange HindIII/BamHI Fragment von pAH4/2 wurde mit HindIII und BamHI geschnittenem und gelgereinigtem Plasmidvektor parpATER103 ligiert. Kompetenter E. coli HB 101 wurde mit der Ligasereaktion transformiert und plattiert. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 6 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikrorriassstab die Plasmide isoliert. Ein Plasmid, das nach Restriktionsanalyse mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/3 benannt. Zum Nachweis der Expression der Interferonaktivität durch E.coli HB101, die das Plasmid pAH4/2 oder pAH4/3 enthalten, wurden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten Kulturmedium aufgebrochen und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytophatischen Effekt (CPE) von VSV misst, getestet.Verwendet wurden dazu A-72 Zellen (ATCC CRL 1542, caniner Tumor), die mit Vesicular -Stomatitis-Virus (VSV) infiziert worden waren. Die Ergebnisse sind im Beispiel K aufgelistet. Zum Nachweis der Gesamtzahl von Sequenzen im Hundegenom, die hohe Homologie mit Interferongenen der Klassen IFN-alpha und IFN-omega aufweisen, wurde hochmolekulare Hunde-DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen vollständig verdaut und geschiittene DNA nach der Grösse aufgetrennt. Nach SouthernTransfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wurde jedes Filter mit nicktranslatierter DNA-Probe hybridisiert. Als Probe für CaIFN-alpha wurde ein 0,6 kb langes BamHI Fragment aus Plasmid pAH4 verwendet, das die gesamte codierende Sequenz für das Interferon enthält.Als Probe für EqIFN -omega wurde das 2,1 kb EcoRI-Insert des Plasmides pRH61 eingesetzt. Die hybridisierten Filter wurden anschliessend unter stringenten Bedingungen gewaschen. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film u..er Verwendung von Koda Lanex-Regutar Verstärke,tolie 7 Tage bei -80"C. Das Autoradiogramm (Figur29) zeigt, dass im Hundegenom ausser den beiden, für identische alpha-Interferone codierenden Gene keine weiteren Sequenzen nachweisbar sind, die mit CaIFN-alphal einen ähnlich hohen Homoiogie- grad aufweisen, wie er bei anderen Spezies innerhalb einer Interferonklasse auftritt.Mit der DNA für EqIFN-omega ist unter weniger stringenten Bedingungen mindestens ein Gen nachweisbar, das unterschiedlich von den beschriebenen alpha-Interferonen des Hundes ist. Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben oder die Zellen einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt werden. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, die für trans-formierte Zellen selektieren. Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemässen Proteine exprimiert wird, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Leader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemässen Interferone können mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden (Pre-lFN), die von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist eine Abspaltung des Leader-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes IFN zu erhalten. Alternativ kann der IFN Klon so modifiziert werden, dass das reife Protein im Mikroorganismus direkt statt des Pre-IFN produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-l verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die DNA-Sequenz für funktionelles oder reifes IFN kann mit MF-alpha-1- an der vermuteten Kathepsinähnlichen Schnittstelle (nach Lys-Arg) an Position 256 vom Initiationscodon ATG aus (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)) verbunden sein. Basierend auf ihrem biologischen Wirkungsspektrum sind die neuen, e-findungsgzmässen Intvrferone verwendbar tür jede Art der Behandlung für die auch die bekannten Interferone ei zersetzt wç den. Diese beinhalLcn beispie,sweise Herpes, Rhinovirus. Equine-/Canine-Abortion-Virus, Verschiedene Krebsarten und ähnliches. Die neuen Interferone alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Interferonen oder biologisch aktiven Produkten eingesetzt werden, beispiels- weise mit IFN-alpha, IL-2, anderen Immun-Modulatoren und ähnlichen. Die erfindungsgemässen Interferone können parenteral verabreicht werden in Fällen, in denen Antitumor oder antivirale Behandlung erforderlich ist und in Fällen, in denen sich immunosuppressive Eigenschaften zeigen. Dosierung und Dosierungsrate können ähnlich denen sein, die zur Zeit bei klinischen Untersuchungen für IFN-a-M.aterialien gelten z.B. ca. (1-10) x 10 Einheiten täglich und bei Präparaten, die zu mehr als 1 % rein sind, bis zu beispielsweise 5 x 107 Einheiten täglich. Beispielsweise können für eine zweckmässige Dosierungsform bei einem im wesentlichen homogenen, bakteriell produzierten erfindungsgemässen IFN, bei parenteraler Verwendung 3 mg IFN-omega in 25 ml 5%igem tierischem Serum Albumin vorzugsweise Pferde/Hunde Serum Albumin gelöst werden. Diese Lösung wird dann durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die gefilterte Lösung aseptisch auf 100 Fläschchen verteilt, von dem jedes 6 x 106 Einheiten reines IFN zur parenteralen Applikation geeignet, enthält. Die Gläschen werden vor Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20 C) aufbewahrt. Die erfindungsgemässen Substanzen können in bekannter Weise formuliert werden, um pharmazeutisch verwendbare Mittel zu erhalten, wobei das erfindungsgemässe Polypeptid mit einer pharmazeutischen, akzeptablen Trägersubstanz vermischt wird. Gebräuchliche Trägerstoffe und ihre Formulierung sind bei E.W. Martin in Remingtoms Pharmaceutical Sciences beschrieben, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird. Die erfindungsgemässen Interferone werden mit einer angemessenen Menge des Trägerstoffes vermischt, um geeignete :larmazeuti..che Mittel zu schafen, die f. eine effektive Anwendung beim Empfänger (Patienten) geeignet sind. bevorzugt sird eine parenterale Applikatiçn vorgeno.L.men. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es also erstmals möglich, Pferde und Hunde Interferone und die sie codierendsn Gensequenzen zu erhalten. Gegenstand der Erfindung sind im Einzelnen Proteine: Pferde-alpha-Interferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft - in im wesentlichen reiner Form. - frei von nativer Glykosylierung. - ein Leader-Peptid enthaltend. - eine Aminosäuresequenz nach Formel I, II, VI oder VII oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend. - nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbar. Pferde-omega-Interferone, im wesentlichen frei vor. anderen Proteinen tierischer Herkunft. - in im wesentlichen reiner Form. .g;} - frei von nativer Glykosylierung. - ein Beader-Peptid enthaltend. - eine Aminosäuresequenz nach Formel IV oder VIII oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend. - nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstelbar. Pferde-beta-Interferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft. - in im wesentlichen reiner Form. - frei von nativer Glykosylierung. - ein Ieader-Ieptid enthaltend. - eine Aminosäuresequenz nach Formel 1 oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend. - nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbar. Hunde-alpha-Interferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft. - in im wesentlichen reiner Form. - frei von nativer Glykosylierung. - ein Leader-Peptid enthaltend. - eine Aminosäuresequenz nach Formel V oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend. - nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbar. DNA-Sequenzen: - für EqIFN-alpha codierende Sequenzen. - für Eq IFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die Hind III Schnitt- stellt des Plasmides pUC9 oder pUC8 eingefügt sind. - das Plasmid pAH50. - das Plasmid pRH63. - das Plasmid pRH82. - das Plasmid pRH83. - für EqIFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie grösser als 85% vorzugsweise grösser als 95% erkennen lassen, mit den Inserts der Plasmide pAH50, pRH63, pRH82 oder pRH83 hybridisieren. - für EqIFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten und in Säugetierzellen replizierbar ist. - die DNA-Sequenz nach Formel I, II, VI oder VII oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen. - für EqIFN-omega codierende Sequenzen. - für EqIFN-omega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die EcoRI Schnittstelle des Plasmides pUC9 oder pUC8 eingefugt sind. - das Plasmid pRH61 - das Plasmid pRH62. - für EqIFN-anega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie grösser als 85% vorzugsweise grösser als 95% erkeilrlen lassen, mit den Inserts der Plasmide pRH61 oder pRH62 hybridisieren. - für EqIFN-omega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten und in Siugetierzellen replizierbar ist. - die DNA-Sequenz nach Formel IV oder VIII oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen. - für EqIFN-beta codierende Sequenzen. - für EqIFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die HindIII Schnittstelle des plasmides pAH60 eingefügt ist. - das Plasmid pAH60. - für EqIFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungerl, die eie Homologie grösser als 85% vorzugsweise grösser als 95% erkennen lassen, mit den Inserts des Plasmides pAH60 hybridisieren. - iir EqIFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte · Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten und in Saugetierzellen replizierbar ist. - die DNA-Sequenz nach Formel tR oder degenerierte Variationen dieser Sequenz. - fWr Ca IFN-alpha codierende Sequenzen. - für CaIFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die HindIII Schnitt stelle des Plasmides pAH2 oder pAH4 eingefügt ist. - das Plasmid pAH2. - das Plasmid pAH4. - für CaIFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie grösser als 85% vorzugsweise grösser als 95% erkennen lassen, mit den Inserts der Plasmide pAH2 oder pAH4 hybridisieren. - für CaIFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten und in Säugetierzellen replizierbar ist. - die DNA Zequenz nach Formel V oder degenerierte Variationen dieser Sequenz. transformierte Wirtsorganismen: - die die für EqIFN-alpha, -omega oder -beta oder die iür Ca IFN-alpha codierenden genetischen Informationen enthalten, vorzugsweise Prokaryoten, Eukaryoten oder SÅaugetierzellers, insbesondere E.coli oder E.coli JM 101. - die die genetischen Sequenzen für die erfindungsgemässen Proteine in einem in den Wirtsorgani3men replizierharen Vektor enthalten. Plasmide: - Plasmid pAH51, dadurch gekennzeichnet, dass ein 4,2 kb langes DNA-Fragment des mit HindII geschnittenen Plasmides pAH50 mit SphI-Linkern versehen und nach Schneiden mit SphI zirkularisiert ist. - Plasmid pAH51/2, dadurch gekennzeichnet, dass es. in der Hind III/BglII-Schnittstele des Plasmides pAH51 anstelle des plasmideigenen, längeren Fragmentes ein Fragment enthält, das aus dem 0,4 kb langen PvuII Fragment des Plasmides p.UR50 erhalten wurde, nachdem in Gegenwart des 15-mer Oligonukleotid - Primers 5 TG?GACCTGCCTCAC denaturiert, mit Klenow-Fragment verlängert, der Oligonukleotidkomplex 5 AGCTTAAAGATG 3 ATTTCTAC anligiert und mit HindIII und BglII geschnitten worden war. -Expressionsplasmid parpATER103, dadurch gekennzeichnet, dass in die ScoRI/HindIII-Schnittstelle des Plasmides pAT153 ein 0,47 kb langes DNA-Pragment des mit EcoRI partiell und mit HindIII vollständig geschnittenen Plasmides parpER33 eingefügt ist. - Expressionsplasmid pAH52/2, dadurch gekennzeichnet, dass in die HindIII/BamHI-Schnittstelle des Plasmides par pATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das. 1, 0 kb lange HindIII/BamHI-Fragment des Plasmides pAH51/2 eingefügt ist. - Expressionsplasmid pAH52 dadurch gekennzeichnet, dass ir die HindIII/Sph I-Schnittstelle des Plasmides parpaATER103 anstelle des plasmideigenen, Kürzeren Fragmentes das HindIII/Sph I-Fragment des Plasmides pAH1/2 eingefügt ist. - Expressionsplasmid pAH53, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Klenow-Fragment begradigt und dephosphorylierte 2,4 kb lange EcoRI/PvuII-Fragment aus pBR322 mit einem, mit Klenow-Eragment begradigtem, 1,1 kb langem EcoRI/SphI- Fragment des Plasmides pAH52 verknüpft ist. - Expressior,splasmid pAH55, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pAH52/2 anstelle des plasmideigenen, Mirzeren BglII/BamHI-Fragmentes des 1,0 kb lange BglII/Bam HI-Fragment des Plasmides pRH63 aufweist. - Plasmid pAH61, dadurch gekennzeichnet, dass in die HindIII/SphI-Schrlittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes ein 1,85 kb langes DNA-Fragment des mit HgiAI geschnittenen Plasmides pAH60, das mit T4-DNA Polymerase begradigt, mit SphI-Linkern versehen und anschliessend mit HindlIl und SphI geschnitten wurde, eingefügt ist. - M13pAH61, dadurch gekennzeichnet, dass das 1,3kb lange BamHI/5alI-Fragment des Plasmides pAH61 mit BamHI/SalI doppelt verdauter M13 mp 9-Phagen-DNA verknüpft ist. - Expressionsplasmid pAH62, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Hilfe des 15-mer 5'GTGAACTATGACTTG doppelsträngig gemachtes, mit S1 Nuklease behandelstes, mit dem Oligonukleotidkomplex 5 AGCTTAAAGATG 3 ATTTCTAC - ligiertes und mit HindIII und SphI geschnittenes Fragment des Mi3pAH61 in die HindIII/SphI-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzereh Fragmentes eingefügt ist. - Expressionsplasmid pRH100, dadurch gekennzeichnet, dass in die HindIII-Schnittstelle des Plasmides pER103 der Oligonukleotidkomplex 5AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA 3 ATTTCTACTCGAGTGAAATTCGA eingefugt ist. - Plasmid pAH104, dadurch gekennzeichnet, dass es in der BamHI-Schnittstelle des Plasmides pRH100 die codierende Sequenz für das CaIFN-alphal enthält. - Expressionsplasmid pAH4/2, dadurch gekennzeichnet, dass in die stumpfendig gemachte SacI-Schnittstelle des Plasmides pAH104 die codierende Sequenz für das reife CaIFN-alphal eingefügt ist. - Expressionsplasmid pAH4/3, dadurch gekennzeichnet, dass das 0,5 kb lange HindIII/BamHI Fragment des Plasmides pAS4/2 in die HindIII/BamHI-SchrAittstelle des Plasmides parpATER103 eingefügt ist. Ausserdem werden Verfahren zur Herstellung dieser Plasmide beschrieben: - Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH51, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pAH50 mittels HindII geschnitten, das 4,2 kb lange Fragment mit SphI-Linkern versehen wird, anschliesscnd mit SphI geschnitten und mit DNA-Ligase zirkularisiert wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH51/2, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pAH50 mit PvuII geschnitten wird, das 0,4 kb lange Fragment in Gegenwart d-es 15-mer Oligonukleotid-Primers 5 TGTGACCTGCCTCAC denaturiert, der an den Einzeletrang gebundene Primer mit Klenow-Fragment verlängert, ein möglicher 3 -Uberhang entfernt, der Oligonukleotidkomplex 5' AGCTTAAAGATG 3 ATTTCTAC anligiert wird, das erhaltene DNA-Fragment nach Restriktionsendonukleaseverdauung mit HindIII und BglII in die HindIII/BglII-Schnittstelle des Plasmides pAH51 anstelle des plasmideigenen, längeren Fragmentes eingefügt wird und das so erhaltene PLasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Plasmides parpATER1O3, dadurch gekennzeichnet, dass in das durch Restriktionsendonukleaseverdauung mit EcoRI und Hind III linearisierte Plasmid pAT153 ein 0,47 kb langes Fragment des mit HindIII vollständig, mit EcoRI partiell geschnittenen Plasmides parpER33 mittels Ligasereaktion eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH2/2, dadurch gekennzeichnet, dass in die HindIII/Bam HI- Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzerer, Fragmentes das 1, 0 kb lange HindIII/BamHI-Fragment des Plasmides pAH51/2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH52, dadurch gekennzeichnet, dass in die Hind III/Sph I-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das Hind III/Sph I-Fragment des Plasmides pAHS1 /2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HE 101 transformiert und kultiviert wira. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH53, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Klenow-Fragment begraaigte und dephosphorylierte 2,4 kb lange EcoRI/P vu II - Fragment aus pBR322 mit einem, mit Klenow-Fragment begradigtem 1,1 kb langem BcoRI/SphI-Fragment des Plasmides pAH52 verknüpft wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH55, dadurch gekennzeichnet, dass in das Plasmid pAH52/2 anstelle des plasmideigenen, kürzeren BglII/BamHI-Fragmentes das 1,Okb lange Bgl II/BamHI-Fragment des Plasmides pRH63 eingefugt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des plasmides pAH61, dadurch gekennzeichnet, dass in die Hind III/Sph I-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, Mirzeren Fragmentes ein 1,85 kb lar,ges DNA-Fragment des mit HgiAI geschnittenen Plasmides pAH60, das mit T4-DNA Polymerase begradigt, mit SphI-Linkern versehen und anschliessend mit Hindlil und SphI geschnitten wird, eingefügt wiro und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des M13pAH61, dadurch gekennzeichnet, dass das 1,3 kb lange BamHI/SalI-Fragment des Plasmides pAH61 mit BamHI/SalI doppelt verdauter M 13 mp 9-Phagen-DNA verknüpft wird und zur Replikation in E.coli2M M 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH62, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Hilfe des 15-mer 5 GTGAACTATGACTTG doppelsträngig gemachtes, mit S1 Nuklease behandeltes, mit dem Oligonukleotidkomplex 5' AGCTTAAAGATG 3' ATTTCTAC ligiertes und mit HindIII und SphI geschnittenes Fragment des M1DpAH61 in die Hind III/SphI-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH4/2, dadurch gekennzeichnet, dass in die stumpfendig gemachte SacI Schnittstelle des Plasmides pAH104 die für das reife CaIFN-alphal codierende Sequenz eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB 101 transformicrt und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH4/2, dadurch gekennzeichnet, dass das 0,6 kb lange BamHI-Fragment des Plasmides pAH4 mit dem Oligonukleotidprimer 5' TGCCACCTGCCCGAC verbunden wird, die Zweitstrangsynthese mit Hilfe des Klenow Fragmentes durchgeführt wird, die verbliebenen Einzelstränge mit S1-Nuklease entfernt wird, die DNA mit PstI geschnitten wird und mit dem 4, 5 kb langen Fragment des Plasmides pAH104, das nach partiellem PstI-Verdau des mit Klenow Polymerase stumpfendig gemachten SacI-Fragmentes erhalten wird, mit Hilfe von DNA Ligase ligiert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmiaes pRH100, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pER 103 mittels Hind III linearisiert, mit dem Oligonukleotidkomplex 5' AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA 3' ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGA ligiert, die Ligasereaktion mit SacI verdaut und anschliessend zirkularisiert wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E. colli HB 101 transformiert und kultiviert wird. - Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH4/3, dadurch gekennzeichnet, dass in die Hind III/PamHI-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 das 0,5 kb lange HindIII/BamHI Fragment des Plasmides pAH4/2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E. coli HB 101 transformiert und kultiviert wird. Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Proteine: Verfahren zur Herstellung von EqIFN-alpha, -beta, -omega oder CaIFN-alpha, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Wirtsorganisme, vorzugsweise cin Prokaryot, Eukaryot oder aine Säutierzelle, insbesondere E. coli oder Saccharomyces cerevisiac mit genetischen Informationen, codierend i1.r EqIFN-alpha, -beta, -omega oder CaIFN-alpha, vorzugsweise mit den für die erfindungsgemässen Proteine codierenden Sequenzen aus den Plasmiden pAH50, pRH63, pRH82, pRH83, pRH61, pAH60, pRH62, pAH2 oder pAH4 oder den mit diesen masmiaen unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie grösser als 85% vorzugsweise grösser 90% erkennen lassen, hybridisierende Sequenzen, insbesondere Sequenzen gemäss einer der Formeln I bis VIII oder degenerierten Variationen dieser Sequenzen transformiert,' b) die codierende Sequenz in einem Expressionsvektor, vorzugsweise in einem der Expressionsvektoren pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55, pAH62, pAH4IZ oder pAH4/3 enthalten ist und diese Information zur Produktion des EqIFN-alpha, -beta, -omega oder CaIFN-alpha im Wirtsorganismus exprimiert und c) das Interferon EqIFN-alpha, -beta, -omega oder CaIFN-alpha, vorzugsweise ein Interferon gemäss einer der Formeln I bis VIII isoliert und gereinigt wird. weiterhin ist die Verwendung der erfindungsgemässen Proteine zur therapeutischer, Behandlung, sowie Mittel für die therapeutische Behandlung, die neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge an diesen Proteinen enthalten, Gegenstand der Erfindung. A) Isolierung von Pferde-DNA Gefrorenes Gewebe, z.B. Pferdeleber wurde in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen und in 0,5M EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 %SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K (20 ml/g Gewebe) 3 Stunden bei 55 C inkubiert. Die erhaltene, viskose Lösung wurde durch eine Phetolextrak- tion und 3-malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1 Vol) von Protein befreit, gegen 50mM Tris-HCl pH 8,0, 10mM EDTA, 10 mM NaCl dialysiert und die DNA mit 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Nach voll ständiger Trocknung im Vakuum wurde die DNA in TE-Puffer (10mM Tris-HCl pH 8,0, 1mM EDTA) bei 4 C in Lösung ge bracht und mit 1,273 q CsCl/ml Lösung 62 Stunden mit 40.000UpM bei 200C zentrifugiert (Sorvall SOTi-Rotor). Der CsCl-Gradient wurde ausgetropft, die DNA enthaltenaen Fraktionen gegen TE-Puffer dialysiert und die DNA an schliessend mit 2 Volumina Äthanol gefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen, getrocknet und wieder in TE-Puffer gelöst (40C). Das fertige DNA-Präparat war frei von RNA und länger als 50 kb (durch Elektrophorese an einem 0,45 %igen Agarosegel bestimmt). B) Partielle Endonuklease Verdauung und Grössenfraktionierunq von Pferde-DNA Zweimal SO.pg Pferde-DNA wurden mit 1,6 Einheiten Sau3A in 450p1 Reaktionsmedium (10 mfi1 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 lmM Dithiothreitol). bei 37 C inkubiert. Nach 15,25 und 40 Minuten wurden 150 l Aliquots entnommen und mit 15 mM EDTA versetzt und durch 10minutiges Erwärmen auf 700C die Reaktion gestcppt. Nach Zusatz von G,3M NaAcetat pH6,0 wurde die DNA mit 2,5 Volumina Äthanol gefällt. Nach dem Wiederauflösen in TE-Puffer wurde die DNA auf einem 0,45%igen Agarosegel in TBE-Puffer (10,8g/l Tris, 5,5 g/l Borsäure,0,93 g/l (Na2EDTA) bei ca. 1V/cm über Nacht elektrophoretisch der Grösse nach getrennt. Anhand von Grössenmarkern (mit EcoRI und HindIII doppelverdaute und mit HindIII verdaute Lambda-DNA) wurde das Gelstück mit DNA einer Länge von lO-23kb herausgeschnitten, die DNA aus dem Gel in einen Dialysenschlaucll 3 Stunden bei 300v elektroeluiert (Puffer 0,1 x TBE), auf einer Elutip-D-Säule (Schleicher und Schüll) gemäss der Verwendungsvorschrift gereinigt und anschliessend mit Äthanol gefällt. Um die Selbstligation von Pferde-DNA-Fragmenten zu verhindern, was einerseits zu artifiziellen Hybriden von Pferde-DNA Sequenzen, andererseits zu zu grossen und damit nicht mehr in Lambda-Phagen verpackbaren DNA-Stücken führen kann, wurden die grössenfraktionierten PferdetNA-Stücke dephosphoryliert. Dazu wurde die DNA in 140 l Reaktionsmedium (50 mM vris- HCl pH 9,5, XOmM MgCl2,o,l mM ZnAcetat, 1 mM Spermidin) mit 5 Einheiten Bovine Tntestinal Phosphatase 30 Minuten 37 C inkubiert, weitere 5 Einheiten Enzym zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von EDTA auf 25mM Endkonzentration wurde die DNA einmal mit Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1 Voll 2-mal mit Chloroform/Isoamyl- alkohol (24/1 Vol) und 3-mal mit Diäthyläther extrahiert, mit Äthanol gefällt, getrocknet und in 0,1 x TE-Puffer gelöst. o3 Aufbau der pferdegenom-DNA-Bibliothek Die dephosphorylierten. 10-23kb Pferde-DNA-Fragmente wurden in einem lambda-Vektor. beispielsweise Lambda-EMBL3 oder -3A (3) mit G-A-T-C kohäsiven Enden. durch Entfernllng des internen BamHI-Fragmentes der Phagen-DNA gewonnen, geklont. Der Vektor wurde in einem E.coli Stamm mit dem Suppressor- faktor sup F. beispielsweise E. coli NM 526, 538 oder 539 (3). in LB-Brühe (20) mit 5mM MgSO4 gezüchtet, mit Polyäthylen glykol gefällt und durch 2-malige CsCl-Dichtegradientenzentri- fugation (0.71 g CsCl/ml Losung. 40 Stunden 45.000 UDM. 20 C) gereinigt. Nach Dialyse gegen TE-Puffer wurde die Phagen-DNA durch 2-malige Extraktion mit Phenol/Chloro form/Isoamylalkohol (25/2l/1 Vol) und 2-malige Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 Vol) von Protein befreit und durch Äthanolfällung aufkonzentriert. Zur Gewinnung der Endfragmente von EMBL3A wurden 50pg Phagen-DNA 2 Stunden bei -37 C in 450p1 Reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, lmM Dithiothreitol) vollständig mit BamHI verdaut, mit l5mM EDTA 10 Minuten. bei 70 C die Reaktion gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt. Zur Vermeidung der Religation wurde das Mittel fragment mit EcoRI nachgeschnitten und das wegfallende Oligonukleotid mittels Isopropanolfällung entfernt. Die BamHI-verdaute Lambda-DNA wurde hierzu 2 Stunden bei 370C in 450p1 10mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 mit EcoRI vollständig verdaut und die Reaktion durch Zusatz von 15 mM EDTA und 10 minütiges Erwärmen auf 70 C gestoppt. Nach Zusatz von NaAcetat zu einer Endkonzentration von 0,3M wurden die 3 grossen DNA-Fragmente mit 0 < 6 Volumina Isopropanol 15 Minuten bei 0 C gefällt, 2-mal mit 0,45M NaAce'tat/0, 6 Volumina Isopropanol und l-mal mit O,3M NaAcetat/2,5 Volumina Äthanol gewaschen und in 151zl 0,1 x TE-Puffer gelöst. Die BamHI/EcoRI-Linker bleiben bei dieser Prozedur in Lösung. Die EMBL3A Fragmente (8 g) wurden mit ca. 5 g 10-23kb Pferde-DNA und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) vereinigt und über Nacht bei 140C und einen Tag bei 4 C in 50p1 Ligationsmedium (66mM Tris-HCl pH 7,2, 0,1M NaCl, lOmM MgCl2, lmM EDTA, SmM Dithiothreitol, 0,5mM ATP) inkubiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde mittels eines in vitro-Lambda-Verpackungssystems (27) in reife Lambda Phagenpartikel gepackt. Die Kómponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE), Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Puffer M1 und A wurden gemäss (27) hergestellt. lOpl Aliquots des ligierten DNA Gemisches wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 25p1 SE inkubiert, das ebenso wie FTL 30 Minuten aus Eis aufgetaut worden war, mit 100 l FTL versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur weiterinkubiert. Das Packungs gemisch wurde mit 150 l Lambda-Diluent (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10mM MgSO4 I=M EDTA) verdünnt und bei 40C gelagert. Ein kleiner Anteil der gepackten Lambda-Phagen wurde am E.coli Stamm NM 528 SupF titriert. insgesamt ergab das Verfahren etwa 1x106 unabhängige PferdeCDA-Rekombinanten. Der Rest des verpackten Materials wurde durch Plattieren auf NM528 in einer Dichte von 30.000 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro 13,5 cm LB/MgS04-Agar-Platte ver vielfach. D) Screeninq derPferde-Genbibliothek für Interferongene Zur Identifizierung der rekombinanten Phagen, die Hundeinterferongene beinhalten, wurde die durch Southern Blots (17) nachgewiesene Nukleotidhomologie mit radio aktiv markierten Human-IFN-alpha-Genen ausgenützt. Hierzu wurden je 10p9 hochmolekularepferde-DNA vollständig mit EcoRI bzw. HindIII verdaut, auf 0,8%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Aus einem aus dem Expressionsplas- mid pER33 (14) stammenden 845 bp HindIII-Fragment, das den gesamten proteincodierenden Bereich für reifes Humaninterferon-alpha2ARG enthält, wurde nach üblichen Verfahren (25) ein P-32-markiertes DNA-Stück hergestellt. Für das Screening nach equinen beta-Interferongenen wurde wie oben aus einem 363 bp Pst1-B lII Fragment eines fir humanes beta-Interferon codierenden cDNA-Klons P1F12 (15) eine radioaktiv markierte DNA-Probe hergestellt. Diese Probe codiert für die Aminosäuren 48-166 des reifen ss-Interferons. Die Nitrocellulosefilter wurden 7 Stunden bei 65 C in 5xSSPE(0,9M NaCl, 5OmM NaH2PO4 5mM EDTA, pH 7,4), 5 x Denhardt-Lösung (0,1 % Ficoll, 0,1%- Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS, 20 mg/ml Lachs sperma-DNA prähybridisiert und anschliessend mit 13 x 106 cpm der markierten Probe in der gleichen Lösung, jedoch ohne Lachssperma-DNA, hybridisiert. Nach Inkubation bei 650C über Nacht wurden die Filter 4-mal 1 bis 1,5 Stunden in 3 x SSC (0,45 M NaCl,45mM NaCitrat), 0,1 % SDS bei 65 0C gewaschen und 7 Tage auf Kodak X-omat S-Röntgenfilm mit Kodak Regular Verstärkerfolien exponiert (Fig.l). Das Auftreten von mehreren Banden beweist eine Familie von alpha-lnterferongenen bei Pferden wie sie bei Rindern, Schweinen und Menschen früher nachgewiesen wurde. Für das Screening der Interferongene in der Pferde-DNA Bibliothek wurden daher die gleichen Hybridisierbe dingungen angewandt. 600.000 rekombinante Lambda-Phagen wurden auf E.coli NM528 in einer Dichte von 30.000pfu/13,5 cm Platteplattiert. VierfacheNitrocellulosereplikas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (19)- hergestellt. Nach 2 Stunden Backen bei 8O0C wurden die Filter 1,5 Stunden bei 650C in in lM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 % SDS gewaschen, über Nacht wie oben beschrieben, prähybridisiert und je 2 Filterreplikas von jeder Platte 24 Stunden mit 1,5 x 106 cmp radioaktiver alpha-Inter feron-Probe bzw. l x 106 cpm ss-Interferon -Probe pro Filter hybridisiert. Nach 3-mal wiederholtem Screening wurden 8 Pferde-alpha-Interferon-Klone und 6 Pferde beta-Interferon-Klone erhalten, die positive Hybridisierungs signale ergaben. E)Charakterisieruns der rekon.binanten Phagen Von 7 mit humanem alpha-IFN und 3 mit humanem ss-IFN hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen-DNA herge stellt.Die DNAs wurden mit EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, BglII, SalI, SmaI verdaut und in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Grösse der hybridiserenden Fragmente wurde nach dem Southern-Ver fahren bestimmt. Die Position der Restriktionsstellen innerhalb des Lambda-Inserts wurde mittels einer Methode von Rackwitz et al. (4) nach partiellem Re striktionsverdau der Lambda-DNA, Markierung der rechten bzw. linken kohäsiven Enden der Lambda-Arme mit synthetischen, P-32-markierten Oligonukleotiden und Elektrophorese in 0,45 %igen Agarosegelen bestimmt. Die daraus erhaltenen Restriktionskarten der Klone Eq-alphal, Eq-alphal6, Eq-alpha2O und Eq-beta6 sind in Fig. 2, 3 und 30 dargestellt. F) Subklonierunc des Pferdeinterferon-alpha-Gens Ein Restriktionsfragment des Klons Eq-alphal , das mit dem humanen alpha-Interferon-Marker hybridisiert hatte, wurde in die Mehrfachrestriktionsenzym-Klonierungsstelle des pBR322-Derivates pUC9 subkioniert. Die Insertion eines fremden DNA-Fragments führt zu einer Unterbrechung der lac z-Genes der ss-Galaktosidase und verändert damit den Phänotyp des mit dem Plasmid transformierten'E.coli Stammes JMl0l von lac+ zu lac-. Aufgrund der nicht funktionierenden ss-Glaktosidase kann mit Isopropylthiogalaktosid(IPTG) induzierter JMlOl das farblose Substratanalog'5-Brom-4- chlor-3-indolyl-ss-D-galactosid (BCIG) nicht zum blauen Farbstoff spalten. Bakterienkolonien mit lac-Phänotyp können daher an der weissen Farbe erkannt werden. Ein 3,2 kb HindTII-Fragment aus dem Klon Eq-alphal wurde aus einem Agarosegel eluiert, auf einer Elutip-D-Säule gereinigt und in etwa lO-fach molarem Überschuss mit 40ng mit SmaI geschnittenem und dephosphoryliertem pUC9-Vektor ligiert, in E. coli JM 101 transformiert und mit LB Top-Agar mit 0,2mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG und 0,1 mg/ml Ampicillin ausgegossen. Weisse Kolonien wurden in Sml LB-Brühe mit O,lmg/ml Ampicillin über Nacht bei 37 C hochgezüchtet und nach dem eingesetzten Fragment mit einem Plasmid-Minipräparationsverfahren (25) ge screent. Ein so erhaltenes Plasmid wurde pAH50 benannt. G ) DNA-Sequenz von Pferde-alpha-Interferon-Genen aus Klon Eq-alpha1 Das 3,2 kb HindIII-Insert von pAH50 (3,2 kb HindIII-Fragment Subklon von Eq-alphal I Fig.3) wurde nach der Dideoxy Methode von Sanger (23) nach dem Shotgun-Verfahren se quenziert. 60pg pAH50 Plasmid-DNA wurde vollständig mit Hind ItI verdaut, das 3,2kb Fragment aus einem l %igen Agaro segel isoliert und wie oben beschrieben gereinigt. lSg dieses Fragments wurden in lOOpl Ligationsmedium mit 14 Einheiten T4 -DNA-Ligase über Nacht bei 140C und weitere 4 Tage bei 4 0C mit sich selbst ligiert. Diese ligierte DNA wurde in einem Eisbad mit Ultraschall in 20 Sekunden Pulsen, insgesamt 100-140 Sekunden, in kleine Stücke zerteilt. Die DNA-Enden wurden 2 Stunden bei 140C in 25Opl Reaktionsmedium 150mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, lmM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin je 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 15 Einheiten des grossen Fragmentes der E.coli Polymerase I (Klenow Fragment) repariert. Nach Konzentrierung durch Äthanolfällung wurde die so vorbehandelte DNA auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und DNA-Fragmente in einem Grössenbereich von 0,35-1,0kb isoliert und gereinigt. Die Fragmente wurden in etwa lO-fach molarem Überschuss mit der mit SmaI geschnittenen und dephosphorylierten, replikativen Form von Bakteriophage Ml3mp8 (22) ligiert und E.coli JMlOl transformiert.Die Einzelstrang-DNA der so erhaltenen, rekombinanten Phagen wurde isoliert und nach Binden eines synthetischen Oligonukleotides die Zweitstrangsynthese in 4 Einzel reaktionen mit dem Klenow Fragment der E.coli DNA-Polymerase I durchgeführt Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten Phagen wurden mit Hilfe eines von C. Pieler modifizierten Computerprogrammes von Staden (24) zu einer Totalsequenz vereint, die in Fig.4 dargestellt ist. H) Subklonierung des Pferde-ss-Interferon-Gens Für die Subklonierung des im Lambda-Klon Eq-betaS identifizierten Pferde-ss-Interferongens wurde analog wie bei F) vorgegangen. Ein 4.5 kb PvuII-Fragment, das mit der humanen ss-Interferonprobe hybridisiAerte. wurde isoliert. gereinigt und in die SmaI Restriktionsstelle des Plasmides pUC9 mit glatten Enden ligiert und E.coli JM 101 transformiert. Ein Transformant mit gewünschtem Insert (pAH60) wurde grossgezüchtet und das Plasmid mittels Southern-Analyse genauer charakterisiert. Die erhaltene Restriktionskarte ist in Fig. 3 dargestellt. Das 2,5 kb Hind III-Fragment wurde analog G) nach der Dideoxv-Methode von Sanger sequenziert. Die in Fig.8 dargestellte Gesamtsequenz des 2,5 kb Fragmentes wurde aus 52 Ei nzelsequenzen zusammengesetzt I) Subklonierung und Sequenzierung des Pferde-Interferon-Genes aus Klon Eq-a16 Ein 3,3 kb langes EcoRI Restriktionsfragment aus dem Lambda Klon Eq-X16, das mit einem humanen &alpha;-IFN-Marker hybridisiert hatte (siehe Beispiel D,E), wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides pUCS subkloniert. Ein erhaltenes Plasmid wurde pRH63 benannt. Anhand einer erstellten Restriktionskarte (Fig. 9) wurden definier te Restriktionsfragmente gerichtet in M13-Phagen subkloniert und nach der Sanger-Methode die DNA-Sequenz bestimmt (Fig. 10). J) Subklonierung und Sequenzierung des Pferde-Interferon-Genes aus Klon Eq-a20 Ein 2,2 kb langes EcoRI-Fragment des Lambda-Klons Etwa20, das schwach mit der humanen or-IFN Probe hybridisiert hatte, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC9 subkloniert. Ein erhaltener Klon wurde pRH61 benannt (Fig. 9), Das gesamte 2,2 kb EcoRI-Insert wurde isoliert und nach dem Shotgun-Verfahren mit der Sanger-Metho de (Beispiel G) die DNA-Sequenz bestimmt (Fig. 12). K) Herstellung des Expressionsplasmides parpATER103 Ausgehend von dem Expressionsplasmid parpER33 wurde die für die erhöhte Plasmidstabilität in E.coli verantwortliche "par"-Se quenz und die Tryptophan Promoter-Operator-Sequenz samt der künstlichen ribosomalen Bindungsstelle in den Plasmidvektor pAT153 (Amersham) eingesetzt. pAT1.53 ist ein verkürztes Derivat des Plasmides pBR322, dem ein Abschnitt fehit, der für die Mobilisierung von DNA notwendig ist (36). Die Vorgangsweise der Herstellung von Plasmid parpATER103 ist in Fig. 13 dargestellt.Das Plasmid parpER33 wurde mit HindIII vollständig und mit EcoRI partiell geschnitten, das entstandene 0,47 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und gereinigt und mit EcoRI und HindIII zweifach geschnittenem pAT153 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur, die man durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen bestimmte, wurde parpATER103 benannt. L) Direkte Expression von reifem EqIFN-ccl in E.coli Die Herstellung der Expressionsplasmide pAH52, pAH52/2 und pAH53 sowie deren Vorstufen ist in Fig. 14 dargestellt. 20 pg des Plasmides pAHSO (Beispiel F) wurden mit 30 Einheiten HindIl (Boehringer Mannhei) verdaut und das 4,2 kb lange DNA-Frag ment, welches das gesamte EqIFN- l Gen enthält von einem Agarosegel mit it DE81-Papier (Whatman) isoliert und gereinigt. Dazu wird nach Auftrennung der DNA-Fragmente im Agarosegel vor und hinter die zu isolierende DNA-Bande ein Schlitz geschnitten, in den ein Streifen DE81-Papier gesteckt wird. Die Elektrophorese wird weitergeführt, bis das gewünschte DNA-Fragment vollständig an dem vorderen DE81-Streifen gebunden ist. Der hintere DE81-Strei fen verhindert eine Verunreinigung durch grössere DNA-Fragmente. Das as DE81-Papier mit dem gebundenen DNA-Fragment wird zweimal 5 Minuten in 400 Pl Niedrigsalz-Puffer (0,2 M NaCl, 25 mM Tris-HOl pH 8,0, 1 mM EDTA) gewaschen und anschliessend die DNA zweimal 10 Minuten mit'200 Pl Hochsalz-Puffer (1 M NaCl, 25 mM Tris HC1 pH 8,0, 1 mM EDTA) vom DE8l -Papi er eluiert und mit 1 ml Äthanol ausgefällt. Die Enden des HindII-Fragmentes wurden mit SphI-Linkern versehen. Dazu wurden 0,2 ijg SphI-Linker (Worthington) mit 2 Einheiten Polynukleotid-Kinase in 10 P1 Reaktionsmedium 45 Minuten bei ei 37 C inkubiert (70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM nM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM Dithiothreit). Die kinasierten SphI-Linker und das HindII-Fragment wurden mit 8 Einheiten T4-DNA-Ligase 20 Stunden bei ei 4 C ligiert. Anschliessend wurde das Enzym bei ei 70 C inaktiviert und die DNA mit 30 Einheiten SphI in einem Gesamtvolumen von 100 00 l verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde mit Ligase zirkularisiert und E.coli HB101 transformiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur erhielt die Bezeichnung pAH5l. Es enthält das as EqIFN-&alpha;1-Gen mit einer verkürzten 3'-nichttranslatierten Region und einer zusätzlichen SphI-Schnittstelle. Um in der Endkonstruktion die DNA-Sequenz für das reife Pferde &alpha;-Interferon in der richtigen Distanz mit der Promotersequenz zu verbinden, wurde von einem 0,4 kb langen DNA-Fragment ausgegangen, das aus 20 ug mit PvuII geschnittenem Plasmid pAH50 isoliert wurde. 1 nmol synthetisches 15mer Oligonukleotid mit der Sequenz '-TGTGACCTGCCTCAG wurde mit Polynukleotid-Kinase kinasiert. Es enthält die Sequenz, welche für die ersten 5 Aminosäuren des reifen EqIFN- i aus Klon pAH50 codiert. Das 15mer wurde mit etwa 7 pmol des 0,4 kb PvuII-Fragmentes gemischt und in einem Gesamtvolumen von 34 l fünf Minuten gekocht, um den DNA-Doppelstrang zu denaturieren. Nacii Abkühlen wurde der an den Einzel strang gebundene Oligonukleotid-Primer in 70 l Reaktionsmedium (50 mM Tris-MOl pH 7,2, 10 mM MgS04, 0,1 mM Dithiothreit, 50 pg/ml Rinderserumalbumin,je 1 mM dATP, dGPT, dCTP, dTTP) mit 30 Einheiten Klenow-Fragment 3 Stunden bei 37 C verlängert. Um einen eventuell verbliebenen 3'-Überhang sicher zu entfernen wurde die DNA anschliessend mit 16 Einheiten T4 DNA-Polymerase 20 Minuten bei 37 C in 120 l Reaktionsedium inkubiert (33 mM Tris-Acetat pH 7,9, 66 mM KAc, 10 mM Mg(Ac)2, 0,5 mM Dithiothreit, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Die entstandene DNA mit geraden Enden wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit 0,45 M NaAcetat und 0,6 Volumsteilen 2-Propanol 15 Minuten bei O"C ausgefällt. An dieses DNA-Stück wurde ein Gemisch zweier kinasierter, zueinander komplementärer Oligonukleotide: 12mer 5'-AGOUAAAGATG, 8mer 5'-CATCTTTA ligiert, das eine HindIIl-Schnittstelle und das Translationsstartcodon ATG erzeugt. Je 1 nmol dieser zwei Oligonukleotide wurde in 20 pl mit 14 Einheiten Ligase 40 Stunden bei 4 C an das DNA-Fragment ligiert. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 70 C wurde die erhaltene DNA in 100 l mit 80 Einheiten HindIII und 20 Einheiten BglII geschnitten und DNA-Fragmente von etwa 190 bp Länge aus einem 2%igen Agarosegel mit DE81-Papier isoliert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit etwa 50 ng mit HindIII und BglII doppelt geschnittenem pAH51-Vektor ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von 65 erhaltenen Kolonien wurde aus 4 Plasmiden, die das gewünschte Restriktionsmuster aufwiesen, ein HindIII/BamHI DNA-Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert, wobei zwei Klone genau die gewünschte Sequenz enthielten. Ein solches Plasmid wurde pAH51/2 benannt. Dieses enthält die Sequenz für reifes EqIFN < l mit vO;rangestelltem Translationsstartcodon ATG und HindIII-Schnittstelle. Herstellung der Expressionsplasmide pAH52 und pAH52/2 20 g Plasmid pAH51/2 wurden mit SphI und HindIII zweifach geschnitten, das entstehende 1,0 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und mit 40 ng HindIII und SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 (Beispiel K) ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur wurde pAH52 benannt. Es enthält alle für eine induzierbare Expression von reifem EqIFN-zl notwendigen Informationen. In analoger Weise wurde aus mit HindIII und BamHI doppelt geschnittenem pAH51/2 und mit HindIII/BamHI geschnittenem parpATER103 das Plasmid pAH52/2 hergestellt. Dieses Expressionsplasmid ist etwa 0,2 kb grösser als pAH52 und weist zusätzlich eine singuläre BamHI-Schnittstelle auf. Herstellung des Plasmides pAH53 Ein wesentlich verkleinertes Expressionsplasmid zur Herstellung von reifem EqIFN- l in E.coli, in dem Tryptophan-Promoter, Interferongen, Ampicillin-Resistenzgen und Replikationsursprung in einer Richtung orientiert sind, wurde aus den Plasmiden pAH52 und pBR322 hergestellt. 10 g pAH52 wurden mit SphI und EcoRI geschnitten, die Enzyme bei 70 C inaktiviert und die DNA-Enden nach Zusatz von je 0,15 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP mit Klenow-Fragment 1 Stunde bei 22 C stumpf gemacht. Die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel nach der Grösse fraktioniert und ein 1,1 kb langes Stück isoliert, das Promoter und Interferongen enthält-10 g pBR322 Plasmid wurde mit EcoRI und PvuII doppelt verdaut, die Enden wie oben beschrieben mit Klenow-Fragment begradigt und anschliessend mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Ein DNA-Fragment von.2,4 kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert. Die beiden so erhaltenen DNA-StUcke wurden mit T4 DNA-Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, in dem zwei EcoRI-Erkennungsstellen geschaffen wurden, erhielt die Bezeichnung pAH53. M) Herstellung eines Expressionsplasmides für EqIFN- 2 (pAH55) Aufgrund der hohen Homologie der Gene für EqIFN-oi (pAH5O) und EqlIFN-2 (pRH63, Fig. 11) ist es möglich, aus dem Expressions plasmid pAH52/2 (Beispiel L) und dem Lambda-Subklon pRH63 ein Expressionsplasmid für EqIFN-2 herzustellen (Fig. 15). 20 ,ug pRH63 Plasmid wurden mit BglII und BamHI zweifach geschnitten und das entstehende DNA-Fragment von l,O kb Länge, das die codierende Sequenz für EqIFN-&alpha; ;2 ab der 64.Aminosäure enthält von einem Agarosegel isoliert. 10 g des Plasmides pAH52/2 wurde ebenfalls mit BglII und BamHI geschnitten, die Enden mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert und das grössere der zwei entstehenden DNA-Fragmente von einem Agarosegel gewonnen. Dieses DNA-Stück enthält den Plasmidvektoranteil, den Promoter und die codierende Sequenz für die ersten 63 Aminosäuren des reifen Interferons. Die beiden beschriebenen DNA-Fragmente wurden mit Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, welches das Insert in der korrekten Orientierung enthält (mit BamHI und BglII schneidbar!) wurde pAH55 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die Expression von reifem EqIFN-M2 in E.coli. N) Herstellung eines Expressionsplasmides für reifes EqIFN-ss (pAH62) Die Vorgangsweise ist in Fig. 16 schematisch dargestellt. 30 pg pAH60 Plasmid wurden mit 30 Einheiten HgiAI in 150 jjl Volumen geschnitten. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 70"C wurden die 3'überhängenden DNA-Enden mit 7 Einheiten T4 DNA-Polymerase (Zugabe von je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 30 Minuten bei 37 C begradigt. An die stumpfen Enden wurden SphI-Linker ligiert (siehe Beispiel L) und die erhaltene DNA mit SphI und HindlII geschnitten. Ein entstandenes DNA-Fragment von 1,85 kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert und mit 50 ng mit HindIII und SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 (Beispiel K) ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB 101 erhaltener Klon mit dem gewünschten Plasmid wurde pAH61 benannt. Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die weitere Konstruktion des Expressionsplasmides dar. 20 pg Plasmid pAH6l wurden mit BamHI und SalI zweifach geschnitten und ein entstandenes 1,3 kb langes DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert, gereinigt und mit BamHI/SalI doppelt verdauter M13mp9 Phagen-DNA ligiert. Nach Transformation von E.coli JM101 konnte von einem rekombinan ten M13-Phagen (M13pAH67) einzelsträngige Phagen-DNA gewonnen werden. 3 pmol dieser Einzelstrang-DNA wurden mit 38pmol kinasier tem 15mer Oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTS in 50 ul 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 10 mM MgCl2 gemischt, auf 95 C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligonukleotid bindet genau ab der ersten Base der Sequenz des reifen B-Interferons. Die Zweitstrangsynthese an der Einzelstrangvorlage, ausgehend vom 15mer-Primer wurde in 100 ijl Volumen nach Zugabe von je 3 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP und 15 Einheiten Klenow-Fragment 1 Stunde bei ei 22 C durchgeführt. Nach Zusatz von 20 mM EDTA wurde die DNA mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Verbliebene, einzelsträngige DNA-Abschnitte wurden mit 150 Einheiten Sl-Nuklease (Sigma) in 400 pl Reaktionsmischung 2 Stunden bei 14"C verdaut (4 mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAC, 250 mM NaCl, 5% Glycerin, pH 4,6). Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA und Extraktion mit Phenol und Chloroform gestoppt und die DNA mit Äthanol ausgefällt. An die durchdiese Behandlung stumpfendig gemachte DNA wurde wie in Beispiel H das Gemisch der 12mer und 8mer Oligonukleotide 5'-AGCTTAAAGATG und 5'-CATCTTTA anligiert und die e,ltstandene DNA mit Hindill und SphI geschnitten. Ein DNA-Fragment der gewünschten Länge von 1,1 kb wurde von einem Agarosegel isoliert und mit HindIII/SphI doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 ligiert. Nach Transformation von E.coli HB101 wurden 54 Kolonien erhalten. Von 9 daraus isolierten Plasmid-DNAs wurde ein 1,3 kb langes EcoRI/SalI Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Ein daraus ermitteltes Plasmid mit der gewünschten Sequenz wurde pAH62 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die effiziente Expression von reifem EqIFN-ss Protein in E.coli. Ein Plasmid, das eine Deletion der ersten Base (G) des reifen B-IFN Genes trägt, wurde pAH62deltaGl benannt. Dieses Plasmid erlaubt die Expression eines am Amino-Terminus verkürzten B-IFN durch Translationsstart am nächstfolgenden ATG (entspricht Aminosäure 19 des reifen ss-IFN), das überraschenderweise antivirale Aktivität, wenn auch deutlich weniger, verglichen mit dem unverkürzten Protein, aufweist (siehe Beispiel O) . O) Expression der Interferonaktivität durch E.coli HB 101 enthaltend das Plasmid pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 oder pAH62 100 ml Bakterienkultur werden bei 37 C unter kräftigem Schütteln bis zur unten angegebenen optischen Dichte bei 600 nm in folgendem tryptophanfreiem Medium inkubiert (Angaben pro Liter Medium): 10 g (NH4)2P04, 3,5 g KH2P04 pH 7,3 mit NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g Casaminosäuren (sauer hydrolysiert), 11 g Glucose, 1 mM MgS04, 0,1 mM CaCl2, 1 mg Thiamin-HCl, 20mg L-Cystein, 20mg 3-B-Indol acrylsäure (IAA, Induktor für das Tryptophan-Operon), optionsweise 50-lOOmg Ampicillin. Anschliessend werden die Bakterien durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 4000 UpM pelletiert, mit 1/10 des Kulturvolumens eiskaltem 50 mM Tris-HOl pH 8,0, 30 mM NaCl suspendiert und unter Eiskühlung zweimal 30 Sekunden mittels Ultraschallsonde (20 kHz, 100 Watt) aufgebrochen. Die Zelltrümmer werden 10 Minuten bei 10.000 UpM (4 C) entfernt und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytopathischen Effekt (CPE) von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) oder Encephalomyocarditis Virus (EMCV) misst, getestet. Testsystem: NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-Epidermis Zel len)/VSV A549 (ATCC CCL 185, humane Lungencarcinom-Zellinie)/EMCV HB 101 mit IFN-Aktivität (Einheiten/l kultur) Plasmid OD600nm NBL-6/VSV A549/EMV E/1 IE/1 pAH52 4,2 1,8x106 5,2x104 pAH52/2 6,0 2,0x106 7,6x104 pAH53 5,7 1,8x106 6,2x104 pAH55 5,7 1,2x106 9,0x104 pAH62 3.C. 1,lxlO9 < 103 pAH62deltaG1 2, 4,5x105 < 103 HS12(HuIFN-a2C Standard) . 5,2x102 2,6x104 Der Titer auf A 549-Zellen wurde mit human-Interferonstandard auf internationale Einheiten normiert. P) Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone durch Markierung der Proteine in Maxizellen Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizell technik (37) selektiv in vivo markiert werden. E.coli CSR603 wurde nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf Ampicillin-haltigen Agarplatten auf transfor mierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgte nach einer Vorschrift von A. Sancar (37). Die Zellen wurden in 15 ml Medium (siehe Beispiel 0) ohne Indolacrylsäure bei 37"C bis zu einer OD6D0nm=0 > S gezüchtet und 10 ml dieser Kultur in einer Petrischale 5 Sekunden aus 50 cm Entfernung mit einer UV-Germicid-Lampe (15 Watt) unter Schwenken bestrahlt und eine Stunde bei 370C weiterinkubiert. Die Kulturen wurden mit 100 llg/ml D-Cycloserin versetzt und 14 Stunden bei 37"C inkubiert und die Bakterien anschliessend durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 5 ml Hershey-Salzlösung gewaschen, in 5 ml Hershey Medium mit 20 pg/ml Indocrylsäure suspendiert und 2 Stunden bei 37"C inku biert. Zu jeder Kultur wurden 5 pCi/ml 35S-Methionin (1000 Ci/mMol) zugesetzt und eine Stunde bei 37 C geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet in SDS- und 2-Mercaptoethanol-haltigem Elektrophorese-Probenpuffer lysiert und die Proteine auf einem 15 %-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Hershey-Salzlösung (pro Liter): Hershey Medium (pro 100ml Hershey-Salziösung): 5,4 g NaCl 2 ml 20% Glucose 3,0 g KC1 - 0,5 ml 2% Threonin 1,1 g NH4C1 1,0 ml 1% Leucin 15mg CaC12.2H20 1,0 ml 2% Prolin 0,2 g MgC12.6H20 1,0 ml 2% Arginin 0,2 mg FeC13.6H20 0,1 ml 0,1% Thiamin 87 mg KH2PO4 12,1 g Tris + HC1 pH 7,4 In Fig. 17 ist das Autoradiogramm des getrockneten Geles nach 2 Tagen Exponierung auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung einer Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie bei -800C dargestellt. Als Molekulargewichtsstandard wurde ein 14C-methyliertes Protein gemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrollen wurden das Plasmid pER103, das nur den Promoter ohne Interferongen enthält und das Plasmid pER21/1 eingesetzt, welches zwei Kopien des humanen IFN-&alpha;2arg Genes enthält- Die Proteinbanden bei etwa 18kd sind die von den Plasmiden exprimierten Interferone. Q) Nachweis von mit EqIFN-a, EqIFN-B und EqIFN-omega hybridisierenden Sequenzen in genomischer Pferde-DNA Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, welche hohe Homologie mit Interferongenen der Klassen IFN-o; IFN-S bzw. IFN-omega aufweisen, wurde wie folgt vorgegangen. 30 g hochmolekulare Pferde-DNA (Beispiel A) wurden mit 100 Einheiten des entsprechenden Restriktionsenzyms in 300 yl Reaktionsvolumen vollständig verdaut und jeweils 10 g dieser geschnittenen DN pro Spur auf einem 0,8%igen Agarosegel nach der Grösse aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, denaturieren und fixieren der DNA wurde jedes Filter mit etwa 6x106 cpm nicktranslatierter Probe hybridisiert (17 Stunden bei 65"C, 5x SSPE, 5x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 20 pg/ml denaturierte Lachssperma-DNA). Als Probe für EqIFN-N wurde ein 1,0 kb langes HindIII/SphI-Fragment aus Plasmid pAH52, für EqIFN-B ein 1,1 kb langes HindIII/SphI-Fragment aus Plasmid pAH62 verwendet, welches jeweils die codierende Sequenz für das gesamte reife Interferon enthält. Als Probe für EqIFN-omega wurde das 2,1 kS EcoRI-Insert aus Plasmid pRH61 eingesetzt. Die Filter wurden anschliessend unter stringenten Bedingungen gewaschen, dass keine Kreuzhybridisierung zwischen diesen 3 Interferonsequenzen eintritt: 4mal 45 Minuten bei 65 C mit 0,3x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3Citrat), 0,1X SDS. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -80 C. Legende zu Figur 18: Spaltenbezeichnung: M = Grössenmarker (Lambda x EcoRl/HindllI) E=EcoRI, H=HindIII, Ba=BamHI, P=Pstl, B=Bgl II 1-). Isolieruna von Hunde-DNA Gefrorenes Gewebe, z.B. Bundeleber, wurde in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen n und in 0,5M EDTA, 10 0 mM M Tris-HCl pE 8,0, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K (20 ml/g Gewebe) 3 Stunden bei 550C inkubiert. Die erhaltene, viskose Lösung wurde durch eine Phenolextrak- tion und 3-malige Extraktion mit -t Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1 Vol) von Protein befreit, gegen 50mM Tris-HCl pH 8,0, 10mM EDTA, 10mM NaCl dialysie und die DNA mit 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Nach voll ständiger Trocknung im Vakuum wurde die DNA in TE-Puffer (lOmM M Tris-HCl pH 8,0, lmM EDTA) bei 40C in Lösung ge Bracht und mit 1,273 g CsCl/ml Lösung 62 Stunden mit 40.000pM bei 20 C zentrifugiert (Sorvall 50Ti-Rotox Der CsCl-Gradient wurde ausgetropft, die DNA enthaltenden Fraktionen gegen TE-Puffer dialysiert und die DNA an schliessend mit 2 Volumina Äthanol gefällt, mit t 70%igem Äthanol gewaschen, getrocknet und wieder in TE-Puffer gelöst (40C). Das fertige DNA-Präparat war frei von RNA und länger als 50 kb (durch Elektrophorese an einem 0,45 %igen Agarosegel bestimmt). 2) Partielle Endonuklease verdauuna und Grössenfroktioniernc von Hunde-DNA Zweimal 5O;g Hunde-DNA wurden mit 2,0 Einheiten Sau3A in 450l Reaktionsmedium (lO mM Tris-HCl pH 7a5, 10 mM MsCl2, ImM Dithiothreitol) bei 37 C inkubiert. Nach 40 und 60 Minuten wurden 225 l Aliquots entnommen und mit 15mM N versetzt und durch lominütiges Erwärmen auf 700C die Reaktion gestoppt. Nach Zusatz von 0,3M NaAcetat pH6,O wurde die DNA mit 2,5 Volumina Äthanol gefällt. Nach dem Wiederauflösen in TE-Puffer wurde die DNA auf einem 0,45%igen Agarosegel in TBE-Puffer ir (10.8g/1 Tris, 5,5 g/l Borsäure, 0,93g/I (Na2EDTA) bei ca. 1V/cm über NaCl elektrophoretisch der Gröbe Nach getrennt. Anhand Grössenmarkern (mit EcoRI und HindIII doppelverdaute und mit HindIII verdaute Lambda-DNA) wurde das Gelstück m: DNA einer Länge von 10-23kb herausgeschnitten, die DN aus dem Gel in einen Dialysenschlauch 3 Stunden bei 30 elektroeluiert (Puffer 0,1 x TBE), auf einer Elutip-D-Säule (Schleicher und Schüll) gemäss der er Verwendungsvorschrift gereinigt und anschliessend mit Äthanol gefällt. Um die Selbstligation von Hunde-DN-Fragmenten zu verhindern, was einerseits zu artifiziellen Hybriden von Hunde-DNA Sequenzen, andererseits zu zu grossen und damit nicht mehr in Lambda-Phagen verpackbaren DNA-Stücken führen kann, wurden die grössenfraktionierten Hunde-DNA-Stücke dephosphoryliert. Dazu wurde die DNA in 140p1 Reaktionsmedirn (50 mM Tris HCl pH 9,5, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnAcetat,I mM Spermidin mit 5 Einheiten Bovine Intestinal Phosphatase 30 Minu 37 C inkubiert, weitere 5 Einheiten Enzym zugegeben u 30 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von EDTA auf 25mM End konzentration wurde die DNA einmal mit Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1 Vol) 2-mal mit Chloroform/Isoamyl- alkohol (24/1 Vol) und 3-mal mit Diäthyläther extrahiert, mit Äthanol gefällt, getrocknet und in 0,1 x TE-Puffer gelöst. 3) Aufbau der Hundegenom-DNA-Bibliothek Die dephosphorylierten. 10-23kb Hunde-Dna-Fragmente wurden in einem lambda-Vektor, beispielsweise Lambda-EMBL3 oder -3A (3) mit G-A-T kohäsiven Enden, durch Entfernung des internen BamHi-Fragmentes der Phagen-DNA gewonnen, geklärt. Der Vektor wurde in einem E.coli Stamm mit dem Suppressor faktor sup F, beisDielsweise E.coli NM526, 538 oder 539 (3). in LB-Brühe (20) mit 5mM MgSO4 gezüchtet. mit Polyäthylen glykol gefällt und durch 2-malige CsCl-Dichtegradientenzentri fugation (0.71 g CsCl/ml Lösung. 40 Stunden 45.000 UbM. 2O0C) gereinigt. Nach Dialyse gegen TE-Puffer wurde die Phagen-DNA durch 2-malige Extraktion mit Phenol/Chloro form/Isoamylalkohol (25/24/1 Vol) und 2-malige Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 Vol) von Protein befreit und durch Äthanolfällung aufkonzentriert. Zur Gewinnung der Endfragmente von EMBL3A wurden 50g Phagen-DNA 2 Stunden bei 37 0C in 45 l Reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, lmM Dithiothreitol) vollständig mit BamHI verdaut, mit 15mM EDTA 10 Minuten bei 700C die Reaktion gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt. Zur Vermeidung der Religation wurde das Mittel fragment mit EcoRI nachgeschnitten und das wegfallende Oligonukleotid mittels Isopropanolfällung entfernt. Die BamHI-verdaute Lambda-DNA wurde hierzu 2 Stunden bei 370C in 450 l lOmM Tris-HCi pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 mit EcoRI vollständig verdaut und die Reaktion durch Zusatz von 15mM EDTA und 10 minütiges Erwärmen auf 70 C gestoppt. Nach Zusatz von NaAcetat zu einer Endkonzentration von 0,3M wurden die 3 grossen DNA-Fragmente mit 0,6 Volumina Isopropanol 15 Minuten bei OOC gefällt, 2-mal mit 0,45M NaAcetat/0t6 Volumina Isopropanol und l-mal mit 0,3M NaAcetat/2,5 Volumina Äthanol gewaschen und in 15 l 0,1 x TE-Puffer gelöst. Die BamHI/EcoRI-Linker bleiben bei dieser Prozedur in Lösunc. Die EMBL3A Fragmente (8pg) wurden mit ca. i g lO-23kb Hunde-DNA und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) vereinigt und über Nacht bei 14 0C und einen Tag bei 4QC in 50pl Ligationsmedium (66mM Tris-HCl pH 7,2, O,lM NaCl, l0mM MgC12, ImM EDTA, 5mM Dithiothreitol, 0,5mM ATP) inkubiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde mittels eines in vitro-Lambda-Verpackungssystems (27) in reife Lambda Phagenpartikel gepackt. Die Komponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE), Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Puffer Ml und A wurden gemäss (27) hergestellt. lopl Aliquots des ligierten DNA Gemisches wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 25p1 SE inkubiert, das ebenso wie FTL 30 Minuten aus Eis aufgetaut worden war, mit lOOpl FTL versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur weiterinkubiert. Das Packungs gemisch wurde mit lSOpl Lambda-Diluent (lOO mM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgSO4lmM'EDTA) verdünnt und bei 40C gelagert. Ein kleiner Anteil der gepackten Lambda-Phagen wurde am E.coli Stamm NM 528 SupF titriert. Insgesamt ergab das Verfahren etwa 1x106 unabhängige Hunde -DNA-Rekombinanten. Der Rest des verpackten Materials wurde durch Plattieren auf NM528 in einer Dichte von 30.000 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro 13,5 cm LB/MgSO4-Agar-Platte ver vielfacht. 4) Screening der Hunde-Genbibliothek für Interferongene Zur Identifizierung der rekombinanten Phagen, die Hundeinterferongene beinhalten, wurde die durch Southern Blots (17) nachgewiesene Nukleotidhomologie mit radio aktiv markierten Human-IFN-alpha-Genen ausgenützt. Hierzu wurden je 10 g hochmolekulare Hunde-DNA vollständig mit EcoRI bzw. HindIII verdaut, auf O,8%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Aus einem aus dem 'Expressionsplasmid pER33 (14) stammenden 845 bp HindIII-Fragment, das den gesamten proteincodierenden Bereich für reifes Humaninter feron-aplha2ARG enthält, wurde nach üblichen Verfahren (25) ein P-32-markiertes DNA-Stück hergestellt. Die Nitrocellulosefilter wurden 7 Stunden bei 65 C in 5xSSPE(O,SM NaCl, 50mM NaH2PO4, 5mM EDTA, pH 7,4), 5 x Denhardt-Lösung < 0,1 % Ficoll, O,lt Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS., 20 mg/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert und anschliessend mit 13 x 106 cpm der markierten Probe in der gleichen Lösung, jedoch ohne Lachssperma-DNA, hybridisiert. Nach Inkubation bei 650C über Nacht wurden die Filter 4-mal 1 bis 1,5 Stunden in 3 x SSC (0,45 NaCl, 45mM NaCitrat), 0,1 % SDS bei 65 C gewaschen und 7 Tage auf Kodak X-omat S-Röntgenfilm mit Kodak Regular Verstärkerfolien exponiert (Fig21). Das Auftreten von mehreren Banden beweist eine Familie von alpha-Interferongenen bei Hunden, wie si# bei Rindern, Schweinen und Menschen früher nachgewiesen wurde. Für das Screening der Interferongene in der Hunde-DNA Bibliothek wurden daher die gleichen Hybridisierbedingungen angewandt. 1.000.000 rekombinante Lambda-Phagen wurden auf E.coli NM528 in einer Dichte von 30.000pfu/13,5 cm Platteplattiert. Zweifache Nitrocellulosereplikas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (19) hergestellt. Nach 2 Stunden Backen bei 800C wurden die Filter 1,5 Stunden bei 650C in lM NaC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% SDS gewaschen, über Nachtwie oben beschrieben, prähybridisiert und 24 Stunden mit 1,5 x 106 cpm radioaktiver alpha-Interferon-Probe pro Filter hybridisiert. Nach 3-mal wiederholtem Screening wurden 9 Hunde-alpha Interferon-Klone erhalten, die positive Hybridisierungs signale ergaben. 5) Charakterisierung der Rekombinantenphagen Von 9 mit humanen alpha-IFN hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen-DNA hergestellt. Die DNAs wurden mit EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, BglII, SalI, SmaI verdaut und in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Grösse der hybridisierenden Fragmente wurde nach dem Southern-Verfahren bestimmt. Die Position der Restriktions stellen innerhalb des Lambda-Inserts wurde mittels einer Methode von Rackwitz et al. (4) nach partiellem Re striktionsverdau der Lambda-DNA, Markierung der rechten bzw. linken kohäsiven Enden der Lambda-Arme mit synthetischen, P-32-markierten Oligonukleotiden und Elektrophorese in 0,45 %igen Agarosegelen bestimmt. Die daraus erhaltene Restriktionskarte des Klones Ca-alpha-l1-2 ist in Fig.22 dargestellt. G > Subklonierung der Hundeinterferon-alpha-Gene Zwei Restriktionsfragmente des Klons Ca-alphall-2, die mit dem humanen alpha-Interferon-Marker hybridisiert hatten, wurden in die Mehrfachrestriktionsenzym-Klonierungsstelle des pBR322 Derivates pUC9 subkloniert. Die Insertion eines fremden DNA-Fragments führt zu einer Unterbrechung des lac z-Genes der ss-Galaktosidase und verändert damit den Phänotyp des mit dem Plasmid transformierten E.coli Stammes JMlOl vcn lac+ zu lac-. Aufgrund der nicht funktionierenden B-Glaktosidase kann mit Isopropylthiogalaktosid(IPTG) induzierter JMlOl das farblose Substratanalog 5-Brom-4 chlor-3-indolyl-ss-D-galactosid (BCIG) nicht zum blauen Farbstoff spalten. Bakterienkolonien mit lac-Phänotyp können daher an der weissen Farbe erkannt werden. Ein 3,7 kb SmaI-Fragment aus dem Klon Ca-alphall-2 wurde aus einem Agarosegel eluiert, auf einer Elutip-D-Säule gereinigt und in etwa l0-fach molarem Überschuss mit 40ng mit SmaI geschnittenem und dephosphoryliertem cUC9-Vektor ligiert, in E.coli JMlOl transformiert und mit LB Top-Agar mit O,2mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG und 0,1 mg/ml Ampicillin ausgegossen. Weisse Kolonien wurden in 5ml LB-Brühe mit O,lmg/ml Ampicillin über Nacht bei 37 ob hochgezüchtet und nach dem eingesetzten Fragment mit einem Plasmid-Minipräparationsverfahren (25) ge screent. Ein so erhaltenes Plasmid wurde pAH2 benannt. In gleicher Weise wurde ein 2,4kb SmaI-Fragment aus demselben Lambda-Klon in pUC9 subkloniert. Das er haltene Plasmid wurde pAH4 benannt. 7) DNA-Sequenz von Hunde alpha-Interferon-Genen aus Klone Ca-alphall-2 Das 1,7kb HindIII-Insert von pAH2 -(3,7kb SmaI-Fragment Subklon von Ca-alphall-2, Fig23) wurde nach der Dideoxy Methode von Sanger (23) nach dem Shotgun-Verfahren se quenziert. 60pg pAH2 Plasmid-DNA wurde vollständig mit HindIII verdaut, das l,7kb Fragment aus einem 1%igen Agaro segel isoliert und wie oben beschrieben gereinigt. 15pg dieses Fragments wurden in lOOpl Ligationsmedium mit 14 Einheiten T4 -DNA-Ligase über Nacht bei 140C und weitere 4 Tage bei 4 0C mit sich selbst ligiert. Diese ligierte DNA wurde in einem Eisbad mit Ultraschall in 2Q Sekunden Pulsen, insgesamt 100-140 Sekunden, in kleine Stücke zerteilt. Die DNA-Enden wurden 2 Stunden bei 140C in 250p1 Reaktionsmedium (50mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC12, linM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin je 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 15 Einheiten des grossen Fragmentes der E.coli Polymerase I (Klenow Fragment) repariert. Nach Konzentrierung durch Äthanol fällung wurde die so vorbehandelte DNA auf einem ltigen Agarosegel aufgetrennt und DNA-Fragmente in einem Grössenbereich von 0,35-1,0kb isoliert und gereinigt. Die Fragmente wurden in etwa lO-fach molarem Überschuss mit der mit SmaI geschnittenen und dephosphorylierten, replikativen Form von Bakteriophage Ml3mp8 (22) ligiert und E.coli JMlOl transformiert.Die Einzelstrang-DNA der so erhaltenen, rekombinanten Phagen wurde isoliert und nach Binden eines synthetischen Oligonukleotides die Zweitstrangsynthese in 4 Einzelreaktionen mit dem Klenow Fragment der E.coli DNA-Polymerase I durchgeführt. Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten Phagen wurden mit Hilfe eines von C. Pieler modifizierten Computerprogrammes von Staden (24) zu einer Totalsequenz vereint, die in Fig.24 dargestellt ist. Vollkommen analog wurde ein 1,9kb HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAH4 (2,4kb SmaI-Subklon aus Ca-alphall-2, Fig.23) sequenziert (Fig.25). 8) Konstruktion von Expressionsplasmid pRH 100 Alle Enzymreaktionen wurden unter den von den Herstellern angegebenen Bedingungen durchgeführt. 7 g Plasmid pER 103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 248, EP-A-0.115-613) wurden in 50 ul Reaktionsmedium mit der Restrik tionsendonuklease HindIll- linearisiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 C wurden 50 l 2x CIP-Puffer zugesetzt (2x CIP-Pu = 20 mM Tris, pH=9,2, 0,2 mM EDTA). Durch Zugabe von 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) wurden die 5'terminalen Phosphatreste entfernt; inkubiert wurde bei 45 C 30 Minuten 1 Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 p1 0,5 EDTA-Lösung sowie Zugabe von 10 p1 1M Tris, pH=8,0 Lösung gestoppt. Die Proteine wurden durch zweimalige Phenol- und einmalige Phenol-lChloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde aus der wässrigen Phase nach Zugabe von 0,1 vol 3M Natriumacetatlösung pH=5,5 und 250 ul Äthanol ausgefällt, das DNA Präzipitat nach Zentrifugieren einmal mit 70%-iger Äthanollösung gewaschen.Die DNA wurde getrocknet, und das Pellet anschliessend in 20 ,ul TE-Puffer (10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA) gelöst. Jeweils 1 tjg der synthetisch hergestellten Oligodesoxynukleotide d(AGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCTTTA) wurden in je 10 pl Reaktions lösung unter Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK (Polynukleotidkinase) sowie 1mM rATP phosphoryliert. Die Reaktion fand bei 37 C s und dauerte 45 Minuten. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 C abgebroc Jeweils 5 pl der Plasmidlösung und der phosphorylierten Oligonukleo tide wurden gemischt und 5 Minuten auf 70 C erwärmt. Danach wl die Lösung auf 0 C abgekühlt, 2 l 10 x Ligasepuffer (500 mM 1 pH=7,5), 100 mM MgCl2 200 mM DTT (Dithiothreit), 1 mM rATP, 500 pG/ml BSA (Rinderserumalbumin), sowie 2 ul Wasser und 10 Einheiten T4-DNA Ligase zugesetzt. Die Reaktion dauerte 40 Stunden und wurde bei 4 C durchgeführt. Sie wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 C abgebrochen. 2 P1 dieser Ligasereaktion wurden in insgesamt 30 Pl Lösung mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease SacI (New England Biolabs) 3 Stunden bei 37 C verdaut. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 C abgebrochen. 5 Pl dieser Reaktionsmischung wurden in insgesamt 30 Pl durch Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK bei 14 C 16 Stunden lang ligiert. 200 pl kompetenter E.coli HblOl wurden mit 10 P1 dieser Ligasereaktion versetzt. Die Bakterien wurden 45 Minuten auf Eis gehalten und anschliessend 2 Minuten auf 42 C erwärmt, um die DNA-Aufnahme zu ermöglichen. Anschliessend wurde die Bakteriensuspension wieder bei 0 C 10 Minuten inkubiert. Abschliessend wurden die transformierten Bakterien auf einem LB-Agar, der 50 pg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich aus gesucht und daraus im Mikromassstab die Plasmide isoliert (Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Die resultierende DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease SacI geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1 %, lx TBE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Grösse von etwa 4.400 bp bestätigte die Einführung einer SacI-Erkennungsstelle in das Plasmid. Eines' dieser Plasmide wurde willküriich ausgesucht. Mit der DNA aus der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E.coli HB101 transformiert. Von den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewält und in gröBerem-Massstab angezüchtet. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten, die DNA auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt, und das kleinere Fragment aus dem Gel durch Elektroelution isoliert. Dieses etwa 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sanger sequenziert. (F. Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1977) 5463-5467). Das dermassen analysierte Plasmid wurde pRH 100 genannt. g) Direkte Expression von reifem CaIFN-alphal in E.coli Die Vorgangsweise für die Konstruktion des Expressionsplasmides pAH4/2 für reifes CaIFN-alphal ist schematisch in Figur28 dargestellt. 5 pg Plasmid pRH100 wurden vollständig mit der Restiktionsendonuklease BamHI geschnitten und anschliessend mit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP) die 5'terminalen Phosphatreste entfernt. 30 g Plasmid pAH4 (siehe Beispiel 6) wurden mit BamHI verdaut. Nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA in einem Agarosegel wurden DNA-Fragmente einer Länge von 0,6 kb, die die gesamte codierende Sequenz für CaIFN-alphal enthalten, aus dem Gel isoliert und gereinigt. Etwa 1 pg dieser 0,6 kb DNA-Fragmente wurde mit 25 ng geschnittener pRH100 Vektor-DNA in 10 pl Licationsmedium (66 mM Tris-HOl pH 7,2, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM Dithiotreit, 0,5 mM ATP) mit 10 Einheiten T4-DNA Ligase bei 14 C 24 Stunden ligiert. Kompetenter E.coli HB 101 wurde mit 5 l dieser Ligasereaktion transformiert und auf LB-Agar, der 50 g/m1 Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden im Mikromassstab Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen charakterisiert. Ein Plasmid, das Interferongen und Tryptophanpromoter in derselben Orientierung enthielt, wurde pAH104 benannt (Figur 28). Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe-für die Herstellung des endgültigen Expressionsplasmides für reifes CaIFN-alphal dar. Herstellung von Expressionsplasmid pAH4/2 Etwa 7 pmol des 0,6 kb langen BamHI Fragments aus dem Plasmid pAH4 wurden mit 1 nmol synthetischem Oligodesoxynukleotid (d(TGCCACCTGCCCGAC) gemischt, das zuvor am 5'Ende mittels T4 Polynukleotid Kinase mit einer Phosphatgruppe versehen wurde, und mit Wasser auf 34 p1 Gesamtvolumen gebracht. Das l5mer Oligonukleotid enthält die codierende Sequenz für die N-terminalen 5 Aminosäuren des reifen Hunde alpha-Interferons. Die DNA-Lösung wurde 5 Minuten auf 100 C erhitzt und anschliessend abgekühlt, wobei das in hohem Überschuss vorhandene Oligonukleotid an die komplementäre Stelle des DNA-Einzelstranges bindet. Die Zweitstrangsynthese ausgehend vom gebundenen Oligonukleotidprimer erfolgte in 70 ul Reaktionsmedium (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreit, 0,5 mg/mlRinderserumalbumin, je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 35 Einheiten Klenow Fragment der E.coli DNA Polymerase I 90 Minuten bei 22"C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 mM EDTA gestoppt und die Proteine durch Phenol/Chloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde nach Zugabe von 0,1 Vol 3M Natriumazetatlösung pH 6 mit Äthanol ausgefällt und mit 70%-igem Äthanol gewaschen. Die verbliebenen, einzelsträngigen DNA-Abschnitte wurden mit ST Nuklease entfernt. Dazu wurde das getrocknete DNA-Pellet in 300 ul S1-Reaktionspuffer (4 mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAc, 250 mM NaCl, 5 % Glyzerin, pH 4,6) gelöst und mit 150 Einheiten S1 Nuklease (Sigma) 2 Stunden bei 14 C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugahe von 20 rBM EDTA abgebrochen. Die Proteine wurden durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt. Nach Zugabe von 0,15 Vol 3M Natriumazetatlösung und 0,6 Vol Isopropanol wurde die DNA bei 0 C aus der wässrigen Phase ausgefällt und mit 70 Äthanol gewaschen. Die erhaltene DNA wurde mit 60 Einheiten PstI 2,5 Stunden bei 37"C verdaut und anschliessend elektrophoretisch in einem 2%-igen Agarosegel aufgetrennt. DNA-Fragmente einer Länge von etwa 300 bp wurden isoliert und gereinigt. 30 pg Plasmid pAH104 wurden mit 50 Einheiten SacI 2 Stunden bei 37 C verdaut und das Enzym 10 Minuten bei 70 C inaktiviert. Nach Zusatz von je 0,5 mM aller vier Desoxynukleotide und 30 Einheiten Klenow Polymerase wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die Proteine wurden durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die DNA mit Äthanol ausgefällt. Die erhaltene DNA wurde mit 20 Einheiten PstI 40 Minuten bei 37 C partiell geschnitten und die Reaktion durch Zusatz von 20 mM. EDTA abgebrochen. Die DNA wurde elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt und Fragmente einer Länge von 4,3 kb isoliert und gereinigt. Die erhaltene DNA wurde mit dem zuvor beschriebenen 0,3 kb langen DNAFragment in 10 p1 Ligationsmedium mit 10 Einheiten T4-DNA Ligase 20 Stunden bei 14 C ligiert. Mit dieser Ligasereaktion wurde E.coli HB101 transformiert und auf Ampicillin-haltigem LB-Agar plattiert. Die entstandenen Bakterienkolonien wurden auf frische Agarplatten und im Duplikat auf Nitrozellulosefilter, die auf Agarplatten aufgelegt waren, übertragen. Nach Inkubation bei 37 C wurden die Bakterien nach einer Vorschrift von Grunstein und Hogness (M.Grunstein & D. Hogness, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1975) 72, 3961- ) lysiert und die DNA nach Denaturierung an die Nitrozellulose gebunden. Die Zellbruchstücke wurden durch 16 stündige Inkubation bei 5"C in einer Vorwaschlösung (1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl 1 pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 Z SDS) entfernt. Die Filter wurden anschliessend in 10 ml Hybridisierlösung (0,9 EI MaCl, 90 mM Trqs-HCl pH 7,S, 6 mm EDTA, 0,1° SDS, 0,1 pg/ml tRNA aus E.coli (Sigma) mit 2x107 cpm mit 32p markiertem Oligodesoxynukleotid d(TGCCACCTGCCCGAC) 3 Stunden bei 47 C hybridisiert. 18 pmol Oligonukleotid wurden mit 18 pmol /t-32PJATP ( 3000 Ci/mmol, Amersham) in 20 pl Kinasierungspuffer (70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM Mg12, 5 mM Dithiothreit) mit 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (BRL) 45 Minuten bei 370C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 mM EDTA gestoppt und die nicht eingebaute Radioaktivität durch Ausschlusschromatographie über eine 1 ml Biogel P6-DG (Biorad) Säule abgetrennt. Die Filter wurden 4-mal 30 Minuten bei 47"C gewaschen. Die Waschlösung entsprach der Hybridisierlösung ohne Zusatz von tRNA. Die Filter wurden auf Kodak X-omat S Röntgenfilm unter Verwendung von Kodak X-omat Regular Verstärkerfolien bei -80 C exponiert. Von Bakterien kolonien, die im Autoradiogramm ein positives Hybridisierungssignal lieferten, wurde durch ein Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert. Die Plasmide wurden mit HindIII und BamHI vollständig geschnitten. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel wurden 0,5 kb lange Restriktionsfragmente isoliert und der DNA-Se quenzanalyse nach Sanger zugeführt. Ein Plasmid, das die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/2 benannt. Es ermöglichte die Expression von reifem CaIFN-alphal in E.coli. lo) Herstellung des Plasmides pAH4/3 Das für die bakterielle Expression von CaIFN-alphal manipulierte Gen aus dem Plasmid pAH4/2 (Beispiel 9) wurde in einem modifizierten Plasmidvektor parpATER103 (Beispiel K' > subkloniert, welcher eine höhere Kopienzahl pro Zelle und erhöhte Plasmidstabilität aufweist. Etwa 0,5 ug des 0,5 kb langen HindIII/BamHI Fragmentes von pAH4/2 (Beispiel 9) wurde mit 25 ng, mit HindIII und BamHI geschnittenem und gelgereinigtem Plasmidvektor parpATER103 in 10 l Ligationsmedium mit 5 Einheiten T4-DNA Ligase 3 Stunden bei 22 C inkubiert. Kompetenter E.coli HB 101 wurde mit 5 p1 dieser Ligasereaktion transformiert und auf LB-Agar mit 50 pg/ml Ampicillin plattetiert. Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 6 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromassstab die Plasmide isoliert. Ein Plasmid, das nach Restriktionsanalyse mit verschiedenen Restri kti onsendonukl easen die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/3 benannt. 11) Expression der Interferonaktivität durch E.coli HB 101 enthaltend das Plasmid pAH4/2 oder pAH4/3 100 ml Bakterienkultur wurden bei 37 C unter kräftigem Schütteln bis zur unten angegebenen optischen Dichte bei 600nm in folgendem tryptophanfreiem Medium inkubiert (Angaben pro Liter Medium): 10 g (NH4)2P04, 3,5 g KH2PO4 pH 7,3 mit NaOH, 0,5 g NaCl, 21g Cas aminosäuren (sauer hydrolysiert), 11g Glucose, lmM MgS04, 0,lmM CaCl2, 1 mg Thiamin-HCl, 20mg L-Cystein, 20mg 3-B-Indolacrylsäure IAA, Induktor für das Tryptophan-Operon), optionsweise 50-100 mg Ampicillin. Anschliessend wurden die Bakterien durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 4000 UpM pelletiert, mit 1/10 des Kulturvolumens eiskaltem 50 mM Tris-HOl pH 8,0, 30 mM NaCl suspendiert und unter Eiskühlung zweimal 30 Sekunden mittels Ultraschallsonde (20 kHz, 100 Watt) aufgebrochen.Die Zelltrümmer wurden 10 Minuten bei 10.000 UpM (40C) entfernt und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivi tät in einem Assay getestet, der die Reduktion des cytophatischen Efffekts CPE) von Vesicular Virus (VSV) misst. Testsystem: A-72 (ATCC CRL 1542) caniner Tumor / Vesicular Stomatitis Virus Plasmid D600nm - IFN-Einheiten / 1 Bakterienkultur pAH4/2 4,2 3,2x105 pAH4/3 3,2 3,oxlO5 12) Nachweis von mit CaIFN-alphal und EqtFN-omega hybridisierenden Sequenzen in genomischer Hunde-DNA Zum Nachweis der Gesamtzahl von Sequenzen im Hundegenom, die hohe Homologie mit Interferongenen der Klasse IFN-alpha, bzw. IFN-omega aufweisen, wurde folgendermassen vorgegangen: 20 g hochmolekulare Hunde-DNA (Beispiel 1) wurden mit 60 Einheiten des entsprechenden Restriktionsenzyms in 200 tul Reaktionsvolumen vollständig verdaut und jeweils 10 sich dieser geschnittenen DNA pro Spur auf einem 0,8 %igen Agarosegel nach der Grösse aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DN wurde jedes Filter mit etwa 6x106 cpm nicktrans latierter DNA-Probe hybridisiert (17 Stunden bei 65 C, 5x SSPE, 5x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 20 pg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, siehe Beispiel 4). Als Probe für CaIFN-alpha wurde ein 0,6 kb langes BamHI Fragment aus Plasmid pAH4 verwendet, das die gesamte codierende Sequenz für das Interferon enthält. Als Probe für EqIFN-omega wurde das 2,1 kb EcoRI Insert aus Plasmid pRHG] eingesetzt. Das mit CaIFN-alphal hybridisierte Filter wurde anschliessend unter stringenten Bedingungen gewaschen, 4-mal 45 Minuten bei 65 C mit 0,3 x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3Citrat), 0,1% SDS. Das mit EqIFNomega hybridisierte Filter wurde bei 65"C mit 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Na3Citrat), 0,1 X SDS gewaschen, 4-mal 45 Minuten bei 65 C mit 0,3 x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3Citrat), 0,1% SDS. Das mit EqIFN-omega hybridisierte Filter wurde bei 65 C mit 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Na3Citrat), 0,1 % SDS gewaschen. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -80"C. Das Autoradiogramm (Figur ) zeigt, dass im Hundegenom ausser den beiden, für identische alpha-Interferone codierenden Gene keine wEiteren Sequenzen nachweisbar sind, die mit CaIFN-alphal einen ähnlich hohen Homologiegrad aufweisen, wie er bei anderen Spezies innerhalb einer Interferonklasse auftritt. Mit der DNA eines equ-nen omega-Interferongenes ist unter etwas weniger stringenten Bed'7gungen mindestens ein Gen nachweisbar, das unterschiedlich von den beschriebenen alpha-lnterferonen des Hundes ist. 13) Subk]onieruung und Sequenzierung eines zweiten Pferde-Interferon-Genes (EqIFN-omega2) aus Lambda-K)on Eq-&alpha;16 Ein 5,5 kb langes EcoRI Restriktionsfragment aus dem Lambda-Klon Eq &alpha;16 (siehe Fig.30), das mit einem humanem &alpha;-IFN-Marker scwach hybr1 dosiert hatte (siehe Beispiel D,E), wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides puc8 subkioniert und E.col1 JM101 mit dem Ligationsgemisch transformiert. Eln erhaltenes Plasmid mit dem gewünschten DNA-Insert wurde pRH62 benannt. Das ECORI-Insert des Plasmides pRH62 wurde aus einem Agarosegel isoliert, und wle in Beispiel G beschrieben nach dem Shotgun-Verfahren in m13mp8 subkloniert. Die nach Transformation von E.col1 JMlOl erhaltenen M13 Phagen-Plaques wurden nach dem Verfahren von Benton und Davis (19) auf Nitrocellulose-Filter Ubertragen (Beispiel D) und hybridisiert. Als Hybridisierungsprobe wurde das 1,0 kb lange Hindlil Fragment des Plasmides pRH61 eingesetzt, das die gesamte codierende Sequenz fUr EqIFN-omegal enthalt. Von rekombinanten M13-Phagen, die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurde Einzelstrang-DNA isoliert und nach der Sanger-Methode sequenziert. 14) Subkionierung und Sequenzierung von zwei weiteren Pferde-alpha-Inter feron-Genen (EqIFN-&alpha;3, EqIFN-&alpha;4 Eln 3,2 kb langes HindIII Restriktionsfragment aus dem Lambda-Klon Eq &alpha;24, das mit einem humanen -IFN-Marker hybridisiert hatte (siehe BeispielD ,E), wurde 1n die HindIII-Stelle des Plasmides pUCE sub klonlert und E.col1 JMlOl transformiert. Eln erhaltenes Plasmid mit dem gewunscnten Insert wurde pRH83 benannt. Auf die gleiche Weise wurde ein 2,8 kb langes HindIII Restrlktlonsfragment aus dem Lambda Klon Eq-a9 1n pUC8 geklont und das erhaltene Plasmid pRH82 benannt. Die HindIII Inserts der Plasmide pRH82 und pRH83 wurden nach dem Shotgun-Verfahren (Beispiel G) 1n M13mp8 sublloniert und E.col1 JM10 transformiert. Die erhaltenen Phagen-Plaques wurden wie zuvor be schieben nach der Benton und Davis Methode hybridisiert. Von Phagen, die mit dem 1,0 kb langen HindIII-BamHI Fragment aus Plasmid pAH52/2 (Beispiel L), welches die codierende Sequenz für reifes EqIFN-&alpha;1 enthielt, hybridisierten, wurde Einzelstrang-DNA isoliert und nach der Sanger-Methode sequenziert LITERATURVERZEICHNIS: 1) D:W.Leung, D.J. Capon, D.V.Goeddel The structure and bacterial expression of three distinct bovine interferon-beta genes. 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Claims: Recombinant DNA-molecule which contains a sequence coding for EqIFN-alpha, -beta or -omega, characterised in that the coding sequence is selected from a) the inserts of the plasmids pAH50 (Fig.4), pRH63 (Fig.10), pRH82 (Fig.27), pRH83 (Fig.26), pRH61 (Fig.12), pRH62 (Fig.23) or pAH60 (Fig.8) and b) DNA-sequences which hybridise with the inserts of the plasmids pAH50, pRH63, pRH83, pRH61, pRH62 or pAH60 under stringent conditions which show a homology of more than 85% and preferably more than 90%, and which code for a protein with the activity spectrum of EqIFN-alpha, -beta or -omega. Recombinant DNA-molecule according to claim 1, characterised in that the DNA-sequence is selected from the following sequences: and the degenerate variants thereof. Recombinant DNA-molecule for expressing a DNA sequence in microorganisms, characterised in that a DNA-sequence according to one of claims 1 and 2 is introduced into an expression vector which is replicable in prokaryotes, eukaroytes or in mammalian cells. Recombinant DNA-molecule according to claim 3, characterised in that it is the expression plasmid pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 or pAH62. Transformed host organism which contains the sequence coding for EqIFN-alpha, -beta or -omega according to one of the preceding claims. Transformed host organism according to claim 5, characterised in that it is a prokaryote or a eukaryote, preferably E. coli or Saccharomyces cerevisiae or a mammalian cell. Transformed host organism according to claim 5 or 6, characterised in that the genetic sequence is contained in a vector which is replicable in the host organism and expresses the protein, preferably in one of the plasmids according to claim 3 or 4. Interferon, characterised in that it is an EqIFN-alpha, -beta or -omega coded by a DNA-sequence according to one of claims 1 or 2, substantially free from other proteins of animal origin, and preferably present in substantially pure form. Interferon according to claim 8, characterised in that it is free from native glycosylation. Interferon according to claim 8 or 9, characterised in that it corresponds to the amino acid sequence according to one of the formulae or biologically active variants of these sequences, with the activity spectrum of EqIFN-alpha, -beta or -omega. Process for preparing EqIFN-alpha, -beta or -omega, characterised in that a) a host organism, preferably a host organism according to one of claims 5 to 7, is transformed with genetic information according to one of claims 1 to 3, b) the coding sequence is contained in an expression vector, preferably in one of the expression vectors according to claim 3 or 4 and this information is expressed in the host organism and c) the interferon EqIFN-alpha, -beta or -omega according to one of claims 8 to 10, preferably an interferon according to claim 11, is isolated and purified. Use of the interferons according to one of claims 8 to 10 for preparing pharmaceutical compositions. Agent for therapeutic treatment, characterised in that it contains, in addition to pharmaceutically inert carriers, an effective amount of an interferon according to one of claims 8 to 10. EqIFN-alpha, -beta or -omega according to one of claims 8 to 10 for use as a pharmaceutical composition.

Inventors: ADOLF, GUENTHER, DR., HAUEL, NORBERT, DR., HAUPTMANN, RUDOLF, DR., HIMMLER, ADOLF, DIPL.-ING., SWETLY, PETER, DR., Adolf, Günther, Dr.
Applicants: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: C12R1, A61P35, C12N1, A61P43, C12N15, A61P37, C07K14, A61P31, A61K38, C12P21, C07K16