GENETIC ENGINEERING PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HIRUDINS, AND AGENTS FOR CARRYING OUT SAID PROCESS

Abstract: Hirudin can be obtained using a specific DNA sequence in a genetic engineering process. The gene is advantageously synthesised in the form of several fragments which are enzymatically ligated to give two larger part-sequences which are incorporated into hybrid plasmids and amplified in host organisms. The part-sequences are reisolated and then combined to form the complete gene which is incorporated into a hybrid plasmid and the latter is expressed in a host organism. <IMAGE>

Description: Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Hirudinen und Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens Hirudin ist ein aus Hirudo medicinalis gewonnenes Polypeptid, das eine spezifische Antithrombin-Aktivität zeigt und als Antikoagulans dient. Es wurde nun gefunden, dass sich Polypeptide der allgemeinen Formel I (X)m-A-B-C-Tyr-D-Asp-Cys-E-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu -Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile -Leu-Gly-Ser-Asp-F-G-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu -Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu -H-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-(Z)n-OH (I) in welcher m= 0 - 50, n= 0 - 100 und X für gleiche oder verschiedene Reste genetisch codier barer Aminosäuren steht, A Ile oder eine direkte Bindung, B Ile, Thr oder eine direkte Bindung, C Thr, Val, Ile, Leu oder Phe, D Thr oder eine direkte Bindung, E Thr oder Ile, F Gly oder eine direkte Bindung, G Glu oder eine direkte Bindung, H Glu oder Pro bedeuten, und Z für gleiche oder verschiedene Reste genetisch codier barer Aminosäuren steht und in der gegebenenfalls Jeweils 2 der 6 Cys-Reste über Disulfid-Brücken verknüpft sind, auch gentechnologisch herstellen lassen, wenn man in ein Expressionsplasmid ein Gen einbaut, das für ein Polypeptid der Formel I oder Teilsequenzen davon codiert. Dieses wird im folgenden auch als "Hirudin" bezeichnet. Das erforderliche Gen kann nach bekannten Methoden chemisch synthetisiert, aus dem Genom isoliert und prozessiert werden oder aus induzierten Zellen nach bekannten Methoden die mRNA isoliert und hieraus die cDNA gewonnen werden. Bevorzugt ist der Weg über die cDNA und vor allem die chemische Synthese, insbesondere nach der Phosphit Methode. Bevorzugt ist weiterhin die Synthese eines Gens, welches für das Polypeptid der Formel I codiert, in welcher m 1 und n Null ist, X für Met oder Arg, B für Thr oder eine direkte Bindung, C für Thr und G für Glu stehen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Polypeptide der Formel I, in der (X)n-A-B-C- nicht für Val-Val steht, wenn n Null ist, D und E Thr, F Gly und G und H Glu bedeuten. Besonders bevorzugt ist die Synthese von Polypeptiden der Formel I, in denen m 1 ist, X Met oder Arg, A und B direkte Bindungen, C, D und E Thr, F Gly, G und H Glu und n Null bedeuten. Die hierfür bevorzugte DNA-Sequenz I ist im Anhang wiedergegeben und dient im folgenden zur Erläuterung der Erfindung. Der genetische Code ist bekanntlich entartet, d.h. dass nur für zwei Aminosäuren eine einzige Nucleotid-Sequenz codiert, während den restlichen 18 genetisch codierbaren Aminosäuren 2 bis 6 Tripletts zuzuordnen sind. Von den hierdurch gegebenen Variationsmöglichkeiten machen ausserdem die Wirtszellen unterschiedlicher Spezies nicht immer den gleichen Gebrauch. Für die Synthese der Gene besteht somit eine unübersehbare Vielfalt von Codon Möglichkeiten. Es wurde nun gefunden, dass die DNA-Sequenz I (Anhang), die für die gesamte Aminosäurensequenz codiert, sowie die zur Synthese der Sequenz I benutzten DNA-Teilsequenzen II A und II B besonders vorteilhaft für die gentechnologische Synthese der besonders bevorzugten Form des Hirudin sind. Am 5'-Ende des codierenden Stranges der DNA-Sequenz I befindet sich eine überhängende DNA Sequenz, entsprechend der Restriktionsendonuclease XbaI, am 3'-Ende des codierenden Stranges dagegen die einzelsträngige, überhängende Sequenz entsprechend dem Restriktionsenzym Sal I. Diese beiden unterschiedlichen Erkennungssequenzen gewährleisten die Insertion der DNA in Plasmide in der gewünschten Orientierung. (Es ist aber auch möglich, gleiche Erkennungssequenzen zu wählen und nach Charakterisierung der Plasmid-DNA mittels entsprechender Restriktions- oder DNA-Sequenzanalyse oder durch Expression eine entsprechende Selektion vorzunehmen). Zwischen diesen Erkennungssequenzen und den Codons für die Aminosäurefolge befindet sich am 5'-Ende des codierenden Stranges das Codon für die Aminosäure Methionin (das in der DNA-Sequenz I mit 0 beziffert ist). Alternativ hierzu kann eine Praesequenz (auch Signal- oder leader-Sequenz genannt) eines bakteriellen oder sonstigen wirtseigenen Proteins stehen (Ubersichtsartikel: Perlman und Halvorson; J. Mol. Biol. 167 (1983), 391), welche die Sekretion des gewünschten Polypeptids aus dem Cytoplasma bewirkt und bei diesem Exkretionsprozess von einer in der Wirtszelle natürlich vorkommenden Signal-Peptidase abgespalten wird. Am Ende des codierenden Stranges folgen dann erfindungsgemäss auf das für Glutamin codierende Triplett ein Stop-Codon oder bevorzugt - wie in der DNA-Sequenz I dargestellt zwei Stop-Tripletts. Zwischen diesen Stop-Codons überhängenden SalI-Ende ist zusätzlich in der DNA Sequenz I eine Nucleotidsequenz entsprechend dem Restriktionsenzym SstI eingebaut. Eine interne singuläre Schnittstelle für das Restriktionsenzym Bam HI (im Codon 30/31) ermöglicht die Subkionierung zweier Genfragmente HIR-I und HIR-II (siehe DNA-Sequenz II), die in gut untersuchte Klonierungsvektoren, wie etwa pBR 322, pUC 8 oder pUC 12, eingebaut werden können. Zusätzlich wurden innerhalb des Gens eine Reihe von weiteren singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme eingebaut, die einerseits einen Zugang zu Teilsequenzen des Hirudin schaffen und andererseits die Durchführung von Variationen erlauben (Tabelle 1): Tabelle 1: Restriktions- Schnitt nach Nucleotid-Nr. enzym (codierender Strang) Ras Ia) 8 Acc I 12 Hinf 1 27 Xho IIa) 57 Fnu 4 HI 71 Hae III 73 Bst NI 75 Hph 1 117 Rsa Ib) 137 Kpn 1 139 Taq I 172 Xho IIb) 178 Dde I 184 Mbo II 186 Sst 1 210 a) singulär bezüglich der Teilsequenz HIR-I b) " " " " HIR-II Die DNA-Sequenz I lässt sich aus 14 Oligonucleotiden mit einer Länge von 25 bis 35 Nucleotiden aufbauen (siehe DNA Sequenz II),indem diese zunächst chemisch synthetisiert und dann über "sticky ends" von 4 bis 6 Nucleotiden enzymatisch verknüpft werden. Bei der DNA-Sequenz 1 wurde weiterhin berücksichtigt, dass bei denjenigen Aminosäuren, denen mehrere Codons zuzuordnen sind, diese nicht gleichwertig sind, sondern vielmehr in der jeweiligen Wirtszelle wie E. coli unterschiedliche Präferenzen zeigen. Weiterhin wurden palindromische Sequenzen auf ein Mindestmass reduziert. DLe Genstruktur der DNA-Sequenz I ist somit leicht aus relativ kleinen Bausteinen zugänglich, ermöglicht die Subklonierung zweier Genf ragmente in gut bekannte Vektoren und erlaubt deren Kombination zum Gesamtgen sowie gegebenenfalls Veränderungen derselben. Je nach Einbau des synthetischen Gens in den Klonierungsvektor wird das erwünschte Peptid mit der Aminosäuresequenz des Hirudins unmittelbar (DNA-Sequenz IC) oder in Form eines Fusionsproteins mit einem bakteriellen Protein wie B-Galactosidase oder Partialsequenzen desselben exprimiert. Solche Fusionsproteine können dann in bekannter Weise chemisch oder enzymatisch gespalten werden. Steht beispielsweise in der Position 0 der Sequenz I die Aminosäure Methionin (DNA-Sequenz IA), so kann eine chemische Spaltung mit Bromcyan erfolgen, steht in dieser Position die Aminosäure Arginin (DNA-Sequenz IB), so kann eine enzymatische Spaltung mit Trypsin erfolgen. Bevorzugte Variationen der Aminosäuresequenzen sind in der Tabelle 2 dargestellt, wobei m und n Null sind: Tabelle 2: A B C D E F G H a) Ile Thr Thr Thr Thr Gly Glu Glu b) Ile - Thr Thr Thr Gly Glu Glu c) Ile - Thr Thr Ile Gly Glu Glu d) Ile - Thr Thr Thr Gly Glu Pro e) Ile - Thr Thr Ile Gly Glu Pro f) - - Thr - Thr Gly - Glu g) - - Thr Thr Thr Gly - Glu Diese Modifikationen lassen sich nach Zusammensetzung des synthetischen Gens auf DNA-Ebene leicht durch Austausch der entsprechenden Genfragmente gegen de-novo-synthetisierte DNA-Sequenzen unter Ausnutzung entsprechender Restriktionsenzym-Schnittstellen realisieren. Als Beispiel für eine Variation der Aminosäuresequenz sei das (bekannte) Polypeptid der Formel I genannt, in der m 1 ist, X und C für Val stehen, A und B direkte Bindungen darstellen, D und E Thr, F Gly, G und H Glu und n Null bedeuten. Diese Modifikation lässt sich auf der DNA-Ebene leicht über die Schnittstelle entsprechend dem Restriktionsenzym Acc I realisieren. Der Einbau der synthetischen Gene bzw. Genfragmente in Klonierungsvektoren, beispielsweise in die handelsüblichen Plasmide pUC 8, pUC 12 und pBR 322 bzw. andere allgemein zugängliche Plasmide wie ptac 11 und pKK 177.3, erfolgt in an sich bekannter Weise. Auch können die chemisch synthetisierten Gene zuvor mit geeigneten chemisch synthetisierten Kontrollregionen versehen werden, die eine Expression der Proteine ermöglichen. Hierzu kann auf das Lehrbuch von Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982) verwiesen werden. Die Transformation der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen, vorteilhaft E. coli, ist ebenfalls an sich bekannt und in dem vorstehend genannten Lehrbuch eingehend beschrieben. Die Gewinnung des exprimierten Proteins und dessen Reinigung können nach an sich bekannten Verfahren erfolgen. Die erfindungsgemäss erhaltenen Genf ragmente HIR-I und HIR-II, die damit erhaltenen Hybridplasmide und die transformierten Wirtsorganismen sind neu und Gegenstand der Erfindung. Dasselbe gilt für aus der DNA-Sequenz I abgewandelte neue DNA-Sequenzen. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen niedergelegt. In den folgenden Beispielen werden noch einige Ausgestaltungen der Erfindung im einzelnen erläutert, woraus sich die Vielzahl der möglichen Abwandlungen und Kombinationen für den Fachmann ergeben. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist. Beispiele 1. Chemische Synthese eines einzelsträngigen Oligonucleotids Am Beispiel des Genbausteins Ia, der die Nucleotide 1-32 des codierenden Strangs umfasst, wird die Synthese der Genbausteine erläutert. Nach bekannten Methoden (M.J. Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096)) wird das am 3'-Ende stehende Nucleosid, im vorliegenden Falle also Thymidin (Nucleotid Nr. 32), an Kieselgel ((R)FRACTOSIL, Firma Merck) über die 3'-Hydroxyfunktion covalent gebunden. Hierzu wird zunächst das Kieselgel unter Abspaltung von Ethanol mit 3-(Triethoxysilyl) propylamin umgesetzt, wobei eine Si-O-Si-Bindung ent steht. Das Thymidin wird als 3'-0-Succinoyl- 51-dimethoxytritylether in Gegenwart von Paranitro phenol und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid mit dem modifizierten Träger umgesetzt, wobei die freie Carboxygruppe der Succinoylgruppe den Aminorest der Propylaminogruppe acyliert. In den folgenden Syntheseschritten wird die Basenkomponente als 5'-O-Dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorigsäuremonomethylester-dialkylamid oder -chlorid eingesetzt, wobei das Adenin als N6-Benzoyl-VerbLndung, das Cytosin als N4-Benzoyl-Verbindung, das Guanin als N2-Isobutyryl-Verbindung und das keine Aminogruppe enthaltende Thymin ohne Schutzgruppe vorliegen. 50 mg des polymeren Trägers, der 2 mol Thymidin gebunden enthält, werden nacheinander mit den folgenden Agentien behandelt: a) Nitromethan, b) gesättigte Zinkbromidlösung in Nitromethan mit 1 % Wasser, c) Methanol, d) Tetrahydrofuran, e) Acetonitril, f) 40 mol des entsprechenden Nucleosidphosphits und 200 mol Tetrazol in 0,5 ml wasserfreiem Acetonitril (5 Minuten), g) 20 Z Acetanhydrid in Tetrahydrofuran mit 40 Z Lutidin und 10 X Dimethylaminopyridin (2 Minuten), h) Tetrahydrofuran, i) Tetrahydrofuran mit 20 % Wasser und 40 Z Lutidin, j) 3 % Jod in Kollidin/Wasser/Tetrahydrofuran im Volu menverhältnis 5:4:1, k) Tetrahydrofuran und 1) Methanol. Unter "Phosphit" wird hierbei der Desoxyribose-3'-monophosphorigsäure-monomethylester verstanden, wobei die dritte Valenz durch Chlor oder eine tertiäre Amino gruppe, beispielsweise einen Morpholinorest, abgesättigt ist. Die Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte können jeweils nach der Detritylierungsreaktion b) spektropho tometrisch durch Messung der Absorption des Dimethoxy tritylkations bei einer Wellenlänge von 496 nm bestimmt werden. Nach abgeschlossener Synthese des Oligonucleotids werden die Methylphosphatschutzgruppen des Oligomers mit Hilfe von p-Thiokresol und Triethylamin abgespalten. Anschliessend wird durch 3-stündige Behandlung mit Ammoniak das Oligonucleotid vom festen Träger abge trennt. Eine 2- bis 3-tägige Behandlung der Oligomeren mit konzentriertem Ammoniak spaltet die Aminoschutz gruppen der Basen quantitativ ab. Das so erhaltene Roh produkt wird durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gerei nigt. Ganz entsprechend werden auch die übrigen Genbausteine Ib-Ilh synthetisiert, deren Nucleotidfolge aus der DNA Sequenz II hervorgeht. 2. Enzymatische Verknüpfung der einzelsträngigen Oligo nucleotide zu den Genfragmenten HIR-I und HIR-II Zur Phosphorylierung der Oligonucleotide am 5'-Terminus wurde je 1 nmol der Oligonucleotide Ib bis Ie mit 5 nmol Adenosintriphosphat mit vier Einheiten T4-Polynucleotid Kinase in 20 pl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Dithiothreitol (DTT) 30 Minu ten bei 37*C behandelt. Das Enzym wird durch fünf minütiges Erhitzen auf 95iC desaktiviert. Die Oligo nucleotide Ta, If, Ila und lIh, welche in der DNA Sequenz IIA und IIB die "überhängende" Sequenz bil- den, werden nicht phosphoryliert. Dies verhindert bei der nachfolgenden Ligation die Ausbildung grösserer Subfragmente als sie der DNA-Sequenz IIA oder IIB entsprechen. Die Oligonucleotide Ia-If werden wie folgt zum Sub fragment HIR-I ligiert: Je 1 mmol der Oligonucleotide Ia und If sowie der 5'-Phosphate von Ib, Ic, Id und Ie werden zusammen in 45 l Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM Magnesiumchlorid, 25 mM Kaliumchlorid und 10 mM DTT, gelöst. Für das "Annealing" der Oligonucleotide gemäss DNA-Sequenz IIA wird die Lösung der Oligonucleotide 2 Minuten auf 95C erhitzt und dann langsam (2-3 Stunden) auf 200C abgekühlt. Zur enzymatischen Verknüpfung setzt man dann 2 l 0,1 M DTT, 8 l 2,5 mM Adenosintriphosphat (pH 7) sowie 5 l T4-DNA-Ligase (2 000 Units) zu und inkubiert 16 Stunden bei 22'C. Analog werden die Oligonucleotide IIb bis lIg phos phoryliert und dann mit den Oligonucleotiden IIa und IIh zusammen zum Subfragment HIR-IT ligiert. Die Reinigung der Genfragmente HIR-I und HIR-IT erfolgt durch Gelelektrophorese auf etnem 10%igen Polyacrylamid gel (ohne Harnstoffzusatz, 20 , 40 cm, 1 mm Dicke), wo bei als Markersubstanz jX 174 DNA (Fa. BRL), geschnitten mit Hinf I, oder pBR 322, geschnitten mit Hae III, dient. 3. Herstellung von Hybridplasmiden, die die Genfragmente HIR-I und HIR-II enthalten a) Einbau des Genfragmentes HIR-I in pUC 12 Das handelsübliche Plasmid pUC 12 wird in bekannter Weise mit den Restriktionsendonucleasen Xba I und Bam HI nach den Angaben der Hersteller geöffnet. Der Verdauungsansatz wird auf einem 5%igen Poly acrylamidgel durch Elektrophorese in bekannter Weise aufgetrennt und die Bruchstücke durch Anfär ben mit Ethidiumbromid oder durch radioaktive Markierung ("Nick-Translation" nach Maniatis, a.a.0.) sichtbar gemacht. Die Plasmidbande wird anschliessend aus dem Acrylamidgel ausgeschnitten und elektrophoretisch vom Polyacrylamid abge trennt. Die Auftrennung des Verdatiingsansatzes kann auch auf 2%igen niedrigschmelzenden Agarosegelen (wie in Beispiel 5a) beschrieben) erfolgen. 1 pg Plasmid wird dann mit 10 ng Genfragment HIR-I, das zuvor wie in Beispiel 2 beschrieben phosphory liert wurde, über Nacht bei 16C ligiert. Man er hält das Hybridplasmid gemäss Figur 1. b) Einbau des Genfragments HIR-II in pUC 8 Analog zu a) wird das handelsübliche Plasmid pUC 8 mit Bam HI und Sal I aufgeschnitten und mit dem Genfragment HIR-II, das zuvor wie in Beispiel 2 beschrieben phosphoryliert wurde, ligiert. Man er hält das Hybridplasmid gemäss Figur 2. 4. Synthese des kompletten Gens und Einbau in ein Plasmid a) Transformation und Amplifikation Die so erhaltenen Hybridplasmide werden in E. coli transformiert. Hierzu wird der Stamm E. coli K 12 durch Behandlung it einer 70 mM Calciumchloridlösung kompetent gemacht und mit der Suspension des Hybrid plasmids in 10 mM Tris-HC1-Puffer (pH 7,5), der 70 mM an Calciumchlorid ist, versetzt. Die transformierten Stämme werden wie üblich unter Ausnutzung der durch das Plasmid vermittelten Antibiotikaresistenzen bzw. -empfindlichkeiten selektioniert und die Hybrid vektoren amplifiziert. Nach Abtöten der Zellen werden die Hybridplasmide isoliert, mit den ursprünglich eingesetzten Restriktionsenzymen aufgeschnitten und die Genf ragmente HIR-I und HIR-II durch Gel elektrophorese isoliert. b) Verknüpfung der Genfragmente Die durch Amplifikation erhaltenen Subfragmente HIR I und HIR-II werden wie im Beispiel 2 beschrieben (Annealing bei 600C) enzymatisch verknüpft und das so erhaltene synthetische Gen mit der DNA-Sequenz I in den Klonierungsvektor pUC 12 eingeführt. Man erhält ein Hybridplasmid gemäss Figur 3. c) Herstellung eines Gens für Val1, Val2 -Hirudin Aus dem Plasmid gemäss Figur 3 wird wie in Beispiel 5a) beschrieben das AccI-SalI-Fragment (Nucleotide 13-212) erhalten, welches dann mit Hilfe des fol genden Adaptors 5' CT AGA ATG GTT GTA T 3' 3' T TAC CAA CAT ATA 5' XbaI AccI in das Plasmid pUC 12, das zuvor mit XbaI und SalI geöffnet wurde, ligiert werden kann. d) Herstellung eines Gens für die Variante a) der Tabelle 2 Hierzu wird die folgende DNA-Sequenz synthetisiert: Glu Phe Met Ile Thr Thr 5' GG GAA TTC ATG ATC ACA ACG T 3' CC CTT AAG TAC TAG TGT TGC ATA SmaI AccI Diese Sequenz kann als SmaI-AccI-Adaptor in die mit den Restriktionsenzymen SmaI und AccI geöffnete DNA aus dem Plamid gemäss Figur 3 eingebaut werden. e) Herstellung eines Gens für die Variante b) der Tabelle 2 Zunächst wird die folgende DNA-Sequenz synthetisiert: Glu Phe Met Ile Thr 5' GG GAA TTC ATG ATC ACG T 3' CC CTT AAG TAC TAG TGC ATA SmaI AccI Diese um das ACA-Triplett verkürzte DNA-Sequenz wird wie unter d) beschrieben eingebaut. f) Herstellung eines Gens für die Variante c) der Tabelle 2 Man geht von der DNA-Sequenz aus, wie sie vorstehend unter e) beschrieben ist (Variante b) der Tabelle 2). Nach Spaltung mit AccI und SalI erhält man zwei Fragmente, die isoliert werden. Das AccI-SalI (Hirudin)-Fragment wird mit dem Enzym HinfI ge schnitten und das grössere der erhaltenen Fragmente isoliert. Dieses Fragment, die mit AccI-SalI-geöff nete Restplasmid-DNA und die synthetische DNA Sequenz Thr Asp Cys Ile 5' AT ACT GAC TGC ATC G 3' TGA CTG ACG TAG CTT A AccI HinfI werden im gleichen Gefäss ligiert. Das erhaltene Hybrid plasmid kodiert für die Variante c) der Tabelle 2. g) Herstellung eines Gens für die Variante d) der Tabelle 2 Man geht ebenfalls von der DNA-Sequenz aus, wie sie vorstehend unter e) beschrieben ist (also für die Variante b) der Tabelle 2 kodiert), die mit AccI und SalI geschnitten wird. Das AccI-SalI-(Hirudin) Fragment wird aber mit TaqI und DdeI umgesetzt und das herausgespaltene Fragment durch die synthetische DNA-Sequenz Glu Pro Ile 5' C GAA CCG ATC CC 3' TT GGC TAG GGA CT TaqI Dde I ersetzt. Das derart veränderte AccI-SalI-(Hirudin) Fragment wird nun mit der Restplasmid-DNA ligiert. Das erhaltene Plasmid kodiert für die Variante d) der Tabelle 2. h) Herstellung eines Gens für die Variante g) der Tabelle 2 Aus dem Hybridplasmid gemäss Figur 2 wird das BamHI SalI-(Hirudin)-Fragment isoliert und mit KpnI nach geschnitten. Das grössere der beiden entstandenen Fragmente wird isoliert und mit der synthetischen DNA-Sequenz Ser Asp Gly Lys Asn Gln Cys Val 5' GA TCC GAC GAA AAG AAC CAG TGC GTT G CTG CTT TTC TTG GTC ACG CAA BamHI Thr Gly Glu Gly 5' ACT GGC GAA GGT AC 3' TGA COG OTT C Kpn 1 ligiert. Das Ligationsprodukt wird nun mit dem XbaI BamHI-(Hirudin)-Fragment, isoliert aus rlasmla-vNA gemäss Figur 1, verknüpft und - wie unter 4b) be schrieben - in pUC 12 eingeführt. Man erhält ein Hybridplasmid, das für die Variante g) der Tabelle 2 kodiert. i) Herstellung eines Gens für die Variante f) der Tabelle 2 Aus der DNA, die für die Variante g) der Tabelle 2 kodiert, wird das XbaI-SalI-(Hirudin)-Fragment isoliert und mit HinfI umgesetzt. Das grössere der beiden entstandenen Fragmente wird dann mit der syn thetischen DNA-Sequenz Arg Met Thr Tyr Asp Cys Thr 5' CT AGA ATG ACG TAT GAC TGC ACT G 3' T TAC TGC ATA OTG ACG TGA CTT A XbaI Hinf I ligiert und das Ligationsprodukt in das mit XbaI und SalI geöffnete Plasmid pUC 12 inseriert. Das Hybrid plasmid kodiert für die Variante f) der Tabelle 2. j) Herstellung weiterer Varianten Als Beispiele für weitere mögliche Varianten seien die folgenden angeführt: Die DNA-Sequenzen, die für die Varianten c) und d) der Tabelle 2 kodierten, enthalten die BamHI Erkennungsstelle entsprechend Position 97 bp der DNA-Sequenz I. Unter Ausnutzung dieser Schnittstelle lassen sich nun die vorstehend beschriebenen AccI BamHI- bzw. BamHI-SalI-Teilsequenzen der beiden Varianten beliebig miteinander verknüpfen. Alle diese Varianten können, analog wie für die DNA Sequenz I beschrieben, in E. coli transformiert und exprimiert werden. 5. Konstruktion von Hybridplasmiden für die Expression der DNA-Sequenzen IA, IB und IC a) Einbau der DNA-Sequenz IC in pKK 177.3 (Direktex pression) Das Expressionsplasmid pKK 177.3 (Plasmid ptac 11, Amman et al., Gene 25 (1983) 167, bei dem in die Eco RI-Erkennungsstelle synthetisch eine Sequenz einge baut wurde, die eine Sal I-Schnittstelle enthält) wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I geöffnet. Aus dem Plasmid gemäss Figur 3 wird die DNA Sequenz IC folgendermassen gewonnen. Man schneidet das Plasmid zuerst mit dem Restriktionsenzym Sal I, dann mit dem Enzym Acc I und trennt dann das kleine Acc I Sal I-Fragment durch Gelelektrophorese auf einem 2%igen niedrig schmelzenden Agarosegel von der Plas midbande ab, indem man die DNA durch Auflösen des Gels bei erhöhter Temperatur (nach Massgabe der Hersteller) wiedergewinnt. Dieses DNA-Fragment lässt sich mit Hilfe des folgenden Adaptors 5' AATTC ATG ACG T 3' 3' G TAC TGC ATA 5' Eco RI Acc I zur DNA-Sequenz IC umsetzen. Durch Ligation des aufgeschnittenen Plasmids pKK 177.3 mit dem Gen IC wird ein Hybridplasmid geschaffen, bei dem der Insertion eine Expressions- bzw. Regulations region vorgeschaltet ist. Nach Zugabe eines geeigneten Induktors wie Isopropyl-ss-thiogalactopyranosid (IPTG) wird eine mRNA gebildet, die zur Expression des Methionyl-Polypeptids entsprechend der DNA-Sequenz IC führt. b) Einbau der Hirudin-Gene IA bzw. IB in das Ex pressionsplasmid pCK-5196 (Fusionskonstruktion) Das Expressionsplasmid pCK-5196 (Fig. 4) ist ein Derivat des Plasmids pAT 153 (Twigg u. Sherrat), welches selbst ein "high-copy-number"-Derivat des bekannten Plasmids pBR 322 darstellt. Es enthält den bekannten Lac UV5-Promotor mit der bekannten Sequenz der ss-Galaktosidase bis Nukleodid Nr. 1554 (entsprechend Aminosäure Nr. 518:Trp), eingesetzt zwischen das tetR-Gen (Hind III von pBR 322) und den Terminator des ampR-Gens (Aha III in Pos. 3231 in pBR 322). Ein weiteres Merkmal dieses Vektors ist die zwischen die R-Galaktosidasesequenz und die Terminatorsequenz eingesetzte, aus dem bekannten Plasmid pUC 13 stammende Polylinker-Sequenz. Die Transkription des lac UV5-Promoters läuft gegen das tetR-Gen ab. Dieses Plasmid enthält bei der Aminosäure Nr. 518 der R-Galactosidase den Polylinkeranteil Xba I-Bam HI Sma I-Sst I aus dem Plasmid pUC 13, der als Klonierungsstelle für eukaryotische Gene dient. Das Plasmid pCK-5196 wird mit Hilfe der Restriktionsenzyme Xba I und Sst I geöffnet und mit der DNA-Sequenz IA ligiert, welche man aus dem Plasmid gemäss Fig. 3 durch Xba I-Sst I-Verdauung isolieren kann. Man erhält ein Hybridplasmid gemäss Fig. 5, das hinter der lac UV5-Kontrollregion die Codons für die ersten 518 Aminosäuren der ss-Galactosidase und daran anschliessend die Codons für Ser-Arg-Met-(Hirudin 1-64) enthält. Auf gleiche Weise kann man ein Hybridplasmid gem. Fig. 6 erhalten, welches im Plasmid pCK-5196 die Insertion mit der DNA-Sequenz IB enthält, bei welcher dem Codon für die Aminosäure Nr. 1 (Threonin) nun aber das Codon für die Aminosäure Arginin vorangestellt ist. Die DNA Sequenz IB erhält man aus dem Plasmid gemäss Fig. 3, indem man dieses mit den Restriktionsenzymen Sst I und Acc I schneidet und mit dem folgenden Adaptor ligiert: 5' CT AGA OGT ACG T 3' 3' T GCA TGC ATA 5' Xba I Acc I 6. Transformation der Hybridplasmide. Kompetente E. coli-Zellen werden mit 0,1 bis 1 rg der Hybridplasmide, die die Sequenz I bzw. IA, IB oder IC enthalten, transformiert und im Falle der tac-Plasmide auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten, im Falle der pCK-5196 Hybridplasmide auf Tetracyclin enthaltenden Agarplatten plattiert. Anschliessend lassen sich Klone, die die korrekt integrierten Hirudin-Sequenzen in den entsprechenden Plasmiden enthalten, durch DNA-Schnellauf arbeitung identifizieren (Maniatis, a.a.O.). 7. Expression der Hirudin-Aktivität aufweisenden Polypeptide Nach Transformation der genannten tac-Hybridplasmide in E. coli wird ein Polypeptid exprimiert, das ausser der Hirudin-Aminosäuresequenz am Aminoterminus noch eine zusätzliche Methionylgruppe trägt, welche aber durch Bromcyanspaltung eliminierbar ist. Dagegen erhält man nach der Transformation von E. coli mit dem Hybridplasmid gemäss Fig. 5 bzw. Fig. 6 Fusionsproteine aus 518 Amino säuren der ss-Galactosidase und Hirudin, die über die Sequenz Ser-Arg-Met bzw. Ser-Arg-Arg miteinander ver brückt sind. Diese Fusionsproteine lassen sich mit Brom cyan bzw. mit Trypsin zu Hirudin und R-Galactosidase- Fragmenten spalten. 8. Aufarbeitung und Reinigung Die zur gewünschten optischen Dichte kultivierten Bakterienstämme werden mit einem geeigneten Induktor, beispielsweise IPTG, hinreichend lange, beispielsweise 2 Stunden, inkubiert. Anschliessend werden die Zellen mit 0,1 % Kresol und 0,1 mM Benzylsulfonylfluorid abgetötet. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren wird die Zellmasse in einer Pufferlösung (50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,5) aufgenommen und mechanisch aufgeschlossen, beispielsweise mit einer French-Presse bzw. (R)DYNO-Mühle (Fa. Willy Bachofer, Basel), worauf die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert werden. Aus dem Überstand wird das das Hirudin enthaltende Protein nach üblichen Verfahren gereinigt. Geeignet sind Ionenaustauscher-, Adsorptions-, Gelfiltrationssäulen oder Affinitätschromatographie an Thrombin- oder Antikörpersäulen. Durch Natriumdodecylsulfat-Acrylamidgel-oder HPLC-Analytik werden Anreicherung und Reinheit des Produktes kontrolliert. Fusionsproteine mit einem ss-Galactosidase-Anteil lassen sich bereits in Rohextrakt der lysterten BakterLen anhand Ihres unterschiedlichen Laufverhaltens von der ss Galactosidase (1-518) nachweisen. Die Charakterisierung des gentechnologisch erzeugten Hiradins erfolgt durch Vergleich mit der aus Blutegeln isolierten, allthen- tischen Substanz bzw. mit Hilfe von Tests, die auf den blutgerinnungshemmenden Eigenschaften des Hirudins beruhen. DNA-Sequenz I Triplett Nr. 0 1 2 3 4 5 Aminosäure Met Thr Tyr Thr Asp Cys Nucleotid Nr. 1 10 20 Cod. Strang 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC nicht cod. Strang 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 30 40 50 ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn 60 70 80 GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG CAA ACG CCG GTC CCA TTG 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG TTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe 150 160 170 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 56 57 58 59 60 61 62 63 64 Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Stp 180 190 200 GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT Stp 210 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 5' DNA-Sequenz IA: 0 Met (Aminosäuren 1-64) 1 5 205 210 5' CT AGA ATG (Nucleotide 9-200) TAA TAG AGC T 3' 3' T TAC (complement. Nucl.) ATT TAC 5' XbaI SstI DNA-Sequenz IB: 0 Arg (Aminosäuren 1-64) 1 5 205 210 5' CT AGA CGT (Nucleotide 9-200) TAA TAG AGC T 3' 3' T TAC (complement. Nucl.) ATT ATC 5' XbaI SstI DNA-Sequenz IC: 0 Met (Aminosäuren 1-64) 205 210 5' AA TTC ATG (Nucleotide 9-200) TAA TAG AGC TCG 3' G TAC (complement. Nucl.) ATT ATC TCG AGC AGC T 5' EcoRI SalI DNA-Sequenz II A (HIR-I) Ia Nucleotid-Nr. 10 20 Cod. Strang 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC nicht cod. Strang 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG XbaI Ib Ic 30 40 50 ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG Ib Id I c I e 60 70 80 GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG CAA ACG CCG GTC CCA TTG Id If Ie 90 AAA TGC ATC CTT G Bam HI 3' TTT ACG TAG GAA CCT AG 5' If DNA-Sequenz II B (HIR-II) II a Nucleotid-Nr. 100 110 cod. Strang 5' GA TCC GAC GGT GAA AAG nicht cod. Strang 3' BamHI G CTG CCA CTT TTC II b II a II c 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC II b II d II c 150 160 170 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CGT AAG II d II f II e II g 180 190 200 GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT II f IIh II g 210 TAG AGC TCG Sal I 3' ATC TCG AGC AGC T 5' II h

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A process for the preparation of a polypeptide having hirudin activity, of the formula I in which m = 0 - 50, n = 0 - 100, and X and X¹ represent identical or different residues of genetically codable amino acids, C denotes Thr, Val, Ile, Leu, or Phe, D denotes Thr E denotes Thr F denotes Gly G denotes Glu H denotes Glu, and Z represents identical or different residues of genetically codable amino acids, which comprises incorporation into an expression plasmid of a gene which codes for a polypeptide of the formula I, it being possible for other amino acids to be omitted or replaced by (an)other genetically codable amino acid(s), excepting the preparation of the following polypeptides in which a) X¹ and C are both Val or b) X¹ denotes Ile and C denotes Thr or c) N-terminal amino acids are eliminated up to position 10. The process as claimed in claim 1, wherein the non-coding strand of the incorporated gene hybridizes with the coding strand of the gene coding for the polypeptide of the formula I. The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the gene has been synthesized chemically, preferably by the phosphite process The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the gene contains two stop codons down-stream of the codon for the carboxy-terminal amino acid. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the gene corresponds to the DNA sequence I in Table 1. DNA sequences I, IA, IB, IC, IIA and IIB corresponding to Tables 1 to 4. A fusion peptide which contains a polypeptide as claimed in claim 1, and wherein its bacterial fraction preferably contains all or part of the amino acid sequence of β-galactosidase. A hybrid plasmid which contains a DNA sequence which codes for the polypeptide of the formula I. A host organism, preferably E. coli, which contains a hybrid plasmid as claimed in claim 8. Claims for the following Contracting State : AT A process for the preparation of a polypeptide having hirudin activity, of the formula I in which m = 0 - 50, n = 0 - 100, and X and X¹ represent identical or different residues of genetically codable amino acids, C denotes Thr, Val, Ile, Leu, or Phe, D denotes Thr E denotes Thr F denotes Gly G denotes Glu H denotes Glu, and Z represents identical or different residues of genetically codable amino acids, which comprises incorporation into an expression plasmid of a gene which codes for a polypeptide of the formula I, it being possible for other amino acids to be omitted or replaced by (an)other genetically codable amino acid(s), excepting the preparation of the following polypeptides in which a) X¹ and C are both Val or b) X¹ denotes Ile and C denotes Thr or c) N-terminal amino acids are eliminated up to position 10. The process as claimed in claim 1, wherein the non-coding strand of the incorporated gene hybridizes with the coding strand of the gene coding for the polypeptide of the formula I. The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the gene has been synthesized chemically, preferably by the phosphite process The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the gene contains two stop codons down-stream of the codon for the carboxy-terminal amino acid. The process as claimed in one or more of the preceding claims, wherein the gene corresponds to the DNA sequence I in Table 1.

Inventors: BRAUER, DIETER, DR., ENGELS, JOACHIM, PROF. DR., HABERMANN, PAUL, DR., UHLMANN, EUGEN, DR., WENGENMAYER, FRIEDRICH, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N15, C07H21, C07K14, C12N1, C12P21, C12R1, A61K38