Process for the production of a pasteurized isoagglutinin-free Faktor VIII preparation from a cryoprecipitate.

Abstract: The process allows a pasteurised preparation of blood clotting factor VIII, which is virtually free of immunoglobulins, isoagglutinins, fibronectin and coagulable fibrinogen, to be obtained. A preparation of this type can be used to treat disturbances of blood clotting.

Description: Pasteurisierte, isoagglutininfreie Faktor VIII-Präparation und Verfahren zu ihrer Herstellung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pasteurisierten und qereinigten Präparation des Blutgerinnungsfaktors VIII. Diese Präparation kann zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen verwendet werden. Die Blutgerinnung ist ein komplexer Vorgang, der über mehrere Reaktionsstufen abläuft und an dem mindestens 13 Gerinnungsfaktoren (F) beteiligt sind, die mit römischen Ziffern gekennzeichnet werden. Bei den Gerinnungsfaktoren handelt es sich vorwiegend um Proteine und speziell solche, die mit den Eigenschaften von Proteasen oder Akzelleratoren ausqestattet sind. Das einziq wirkliche Substrat ist Fibrinogen, das bei Verletzungen vom Thrombin in seine unlösliche Form, das Fibrin, überführt wird, das den primären Wundverschluss bildet. Wenn einer der 13 Gerinnungsfaktoren fehlt, bleibt die Bildung von Thrombin und Fibrin aus; die Folge sind Blutungen. Ein solcher Fall liegt bei der Hämophilie A vor, der am meisten verbreiteten Blutungskrankheit, gekennzeichnet durch einen Mangel an Faktor VIII. Die Hämophilie A und auch B (F IX-Mangel) kann nur durch Substitution des fehlenden Faktors wirksam therapiert werden. Die Gewinnung von F VIII aus Humanplasma mit guter Ausbeute und hoher Reinheit, wie sie speziell für die Selbstbehandlung von Patienten erforderlich ist, stellt immer noch ein nicht optimal gelöstes Problem dar. Das trifft vor allem auf pasteurisierte F VIII-Konzentrate zu, welche die übliche Handelsware zunehmend verdrängten, weil damit das Risiko einer Hepatitisbertragunq ausgeschaltet werden konnte. Die Isolierung eines hochgereinigten F VIII mit guter Ausbeute wird vor allem dadurch erschwert, dass der F VIII zwar im Kryopräzipitat angereichert aber mit Fibrinogen und Fibronectin, zwei relativ hochmolekularen und schwerlöslichen Proteinen mit ahnlichen physikalischchemischen Eigenschaften wie der F VIII vergesellschaftet ist. Ein Faktor VIII-Konzentrat sollte so rein wie nur möglich sein, also frei von unerwünschten anderen Proteinen und speziell von Immunglobulinen einschliesslich der Isoagglutinine; denn es gibt Hinweise, dass die Zufuhr von unspezifischen Proteinen zu einer Überforderung des retikuloendothelialen Systems (RES) führt und zu einer Beeinträchtigung der Immunabwehr, gekennzeichnet durch eine Xnderung in der Zusammensetzung der Lymphozyten Population und der Immunglobuline. Dies qewinnt an Bedeutung in Verbindung mit der Tatsache, dass Hämophile lebenslang mit solchen F VIII-Konzentraten behandelt werden müssen. Daraus resultiert die Forderung nach einem nativen, hochgereinigten pasteurisierten F VIII Konzentrat, d.h. einem Produkt, das eine Übertragung von Hepatitisviren und anderem infektiösen Material und eine Sensibilisierung gegen Alloantigene ausschliesst. Ein solches eine Übertragung von Hepatitis ausschliessendes und isoagglutininfreies Präparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung sind Gegenstand dieser Erfindung. Es wurde gefunden, dass eine F VIII-haltige Lösung, die praktisch frei von Faktoren des Prothrombinkomplexes ist (F II, VII, IX und X), in an sich bekannter Weise nach Zusatz von Stabilisatoren zum Schutze gegen eine thermische Inaktivierung pasteurisiert, die erhitzte Lösung im pH-Bereich von 5-6,5 mit einen Anionenaustauscher behandelt, der adsorbierte F VIII von BegleitProteinen, besonders Fibrinogen, Fibronectin und Immunglobulinen einschliesslich Isoagglutininen, freigewaschen, mit einer konzentrierten Lösung von Na-, K- oder Ca-Salzen mit einem Halogen eluiert und beispielsweise durch Präzipitation aus dem Eluat gewonnen werden kann. Ecteola-Cellulose und ein QAE-(Quaternary Amino Ethyl-) gruppentragender Anionenaustauscher wurden bereits für die F VIII-Reinigung verwendet (van Creveld, S. et al., Thromb.Diath.Haem. (1961) VI, No.2/3, 282 und Bauqh, R. et al., Bioch.Biophys.Acta (1974) 371, 360). Eine Über- tragung in den Technikums- oder Produktionsmassstab war jedoch nicht möglich. Lediglich zur Hochreinigung von vorfraktioniertem Material konnte Ionenaustauscherchromatographie eingesetzt werden (Fay, Ph.J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1982) 79, 7200). Die Adsorption mit hoher Spezifität erfolgt nur bei einem pH-Wert um 5,5; da aber fallen die meisten der im Kryopräzipitat enthaltenen Proteine, vor allem das Humanfibrinogen, bereits aus und speziell beim Kontakt mit dem Adsorbens in der Säule. Zudem sind nach den zitierten Arbeiten relativ grosse Mengen Adsorbens erforderlich. Das wiederum scheint einen enormen Einfluss auf die Ausbeute gehabt zu haben, die minimal war, bedingt offenbar durch eine unspezifische Adsorption des F VIII - seine physiologische Aufgabe ist ja, an unphysioloaischen Oberflächen zu adhärieren - an die grossen Adsorbensmengen. Es war auch gefunden worden, dass das an QAE-Austauscher hochgereinigte Material schnell an Aktivität verlor; daher wurden Anionenaustauscher für die F VIII-Produktion nicht verwendet. Es wurde jedoch nun überraschenderweise gefunden, dass eine Chromatographie an basischen Ionenaustauschern durchaus für die Produktion von F VIII-Präparationen geeignet ist. Es war überraschend, dass ausgehend von einem pasteurisierten Kryopräzipitat in einem Schritt mittels einer Anionenaustauscherchromatoaraphie eine hochgereinigte F VIII-Präparation gewonnen werden kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIII-Präparation, in dem eine Faktor VIII-enthaltende Lösung in Gegenwart von Stabilisatoren pasteurisiert und gereinigt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung mit einem Anionenaustauscher auf Kohlenhydratbasis behandelt, der Austauscher gewaschen und der F VIII eluiert wird. Als Ausgangsmaterial kommen ein nach Pool et al., Nature (1964) 203, 312 gewonnenes Kryopr?zipität, die Cohn Fraktion I (Minot, G.R. et al., J.Clin.Invest. (1945) 24, 704), Plasma, F VIII:C-haltiges Zellkulturmedium sowie aus diesen gewonnene F VIII-haltige Nebenfraktionen in Betracht. Vorteilhafterweise verwendet man jedoch direkt Kryopräzipitat oder Cohn I-Fraktion. Als Stabilisatoren zum Schutz gegen eine thermische Inaktivierung des F VIII während der Pasteurisierung können Kohlenhydrate und Aminosäuren, vorzugsweise 35-60 g Saccharose auf 100 g Lösung und 1-3 mol Glycin pro Liter Lösung sowie gegebenenfalls Calciumionen verwendet werden. Es kann beispielsweise nach den deutschen Offenlegungsschriften 29 16 711 oder 32 37 512 gearbeitet werden. Als Anionenaustauscher für die Adsorption des F VIII kommen beispielsweise DEAE-, QAE- oder Ecteolagruppentragende Austauscher und zwar besonders solche auf Basis von Cellulose, Sephadex oder Sepharose in Betracht, vorzugsweise jedoch DEAE-Sepharose. Im Unterschied zu van Creveld und Baugh (s. früher) kommen diese Austauscher für die F VIII-Reiniqung doch in Betracht, jedoch unter Bedinqungen, wie sie bisher nicht bekannt waren und nachfolqend noch beschrieben werden. Als wesentlich haben sich die Adsorptionsbedingungen erwiesen. Nämlich ebenfalls überraschend wurde gefunden, dass der F VIII im physiologischen Salzmilieu, bevorzugt bei pH 5,5, weitgehend selektiv an DEAE -Sepharose gebunden wird, während Begleitproteine wie das Fibrinoqen und Fibronectin im Überstand bleiben (Batch-Verfahren) oder eine Säule passieren. Schliesslich wurde auch überraschend gefunden, dass eine pasteurisierte Lösung der Kryoglobuline überhaupt bei pH 5,5 im physiologischen Salzmilieu chromatographiert werden kann, da bei diesen Bedingungen bereits bestimmte Kryoglobuline präzipitieren, vor allem das Fibrinogen. Die Adsorption und speziell die Spezifität, mit der der F VIII an die Anionenaustauscher gebunden wird, nimmt zum Neutralpunkt hin stark ab. Unter normalen Chromatographiebedingungen jedoch wird DEAE erst oberhalb pH 7,0 beladen. Die Präzipitation bleibt in dem hier beschriebenen Verfahren jedoch aus, weil die Kohlenhydrate, die von der Pasteurisation her in der Kryolösung vorliegen, das Fibrinogen und Cig im leicht sauren Medium in Lösung halten. Ein Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht also darin, dass bei der Anionenaustauscheradsorption von pasteurisiertem Kryoglobulin Fibrinogen und Fibronectin im Überstand oder Durchlauf bleiben und daraus als pasteurisierte Produkte gewonnen werden können. Fibronectin bespielsweise nach der deutschen Offenlequngsschrift 28 48 529. Die Chromatographie beispielsweise an DEAE- oder QAE Austauschern erfolgt im leicht sauren Milieu (pH 5,5) und an Austauschern, die entsprechend äquilibriert wurden, zum Beispiel mit 0,1 mol/l Na-Acetat-Puffer, der 0,1 mol/l Lysin enthielt. Mit diesem Puffer kann auch die pasteurisierte F VIII-haltise Lösung auf das doppelte Volumen verdünnt werden, bevor sie im Batch- oder Säulenverfahren mit dem Austauscher behandelt wird. Die Adsorption im Batch, die vorzugsweise verwendet wird, hat den Vorteil, dass man während der Adsorption die Bindung des F VIII an den Austauscher über die funktionelle Bestimmung des F VIII im Überstand verfolqen kann und nach Verschwinden der Aktivität die nicht adsorbierten Faktoren durch Sedimentation oder Zentrifugation vom Ionenaustauscher abtrennen und unmittelbar danach mit der Waschung des F VIII-beladenen Austauschers beginnen kann. Während die Waschung vorteilhafterweise im Batch durchzuführen ist, beispielsweise auf einer Nutsche, empfiehlt sich für die Elution die Überführung des Austauschers in eine Säule, denn die säulenchromato- graphische Elution hat den Vorteil, dass der F VIII relativ konzentriert anfällt. Unter Versuchsbedinqungen in der Grössenordnung von 50 - 100 IE F VIII/ml. Für die Waschung des mit F VIII beladenen Austauschers sind besonders solche Puffer geeignet, die einerseits den F VIII nicht ablösen, andererseits aber für eine möglichst quantitative Abtrennung unspezifischer Proteine wie der Immunglobuline und damit auch der Isoaqglutinine geeignet sind. Als ein entsprechender Puffer erwies sich überraschenderweise ein Puffer, in welchem das Ausgangsmaterial zur Adsorption gelöst werden kann, und der 0,1 mol/l Na-Acetat, 0,1 mol/l Lysin und 1 g/l NaCl bei pH 5,5 enthält. Mit diesem Puffer wurde der F VIII beladene Ionenaustauscher so lange gewaschen, bis das Eluat frei von Isoaqglutininen war. Für die Testung wurde der hochempfindliche Coombs-Test verwendet, der auch inkomplette Antikörper anzeigt. Für die Desorption des F VIII von den Anionenaustauschern kommen konzentrierte Salzlösungen in Betracht, beispielsweise NaCl enthaltende. Als vorteilhafter jedoch haben sich andere Salze von Halogenen mit Na, K oder Ca erwiesen: KBr, NaBr und CaC12. Sie haben den Vorteil, dass der F VIII als relativ scharfer Peak mit einer hohen Aktivität pro Volumen eluiert wird, ein Vorteil, der für die Fällung wichtig ist. Die Konzentrationen liegen im Bereich von 0,05 mol/l bis zur Sättigungsgrenze. Die Ausbeute hängt schliesslich auch ganz wesentlich von der Elutionsgeschwindigkeit ab, die in einer Grössenordnung von 1-10 ml/cm2/h, vorzugsweise 5-7 ml/cm2/h, sein sollte. Das F VIII-haltige Eluat lässt sich mit den üblichen Methoden konzentrieren, nämlich durch die Fällung mit Neutralsalzen, wie Ammoniumsulfat oder NaCl, vorteilhafterweise mit NaCl, das im Gegensatz zu Ammonsulfat schneller ausdialysiert werden kann und auch nicht komplett entfernt werden muss. Die Weiterverarbeitung der F VIII-haltigen Fällung erfolgt in der Weise, dass der Fällungsrückstand beispielsweise in einem Puffer pH 6,9, der Na-Citrat (0,02 mol/l), NaCl (0,06 mol/1), Glycin (20 g/l) und Albumin (5 q/l) enthält (Dialysepuffer), gelöst und gegen denselben Puffer ohne Albumin bis zum Gleichgewicht dialysiert wird. Die dialysierte Lösung wird durch Verdünnung mit dem albumin-haltigen Dialysepuffer auf eine Aktivität von 25 bis 30 IE F VIII/ml eingestellt und nach Sterilfiltration abgefüllt und gegebenenfalls gefriergetrocknet. Das Endpräparat ist als ein weisses Lyophilisat qekennzeichnet, das sich in weniger als einer Minute löst, eine F VIII-Aktivität von 5-10 IE/mg Protein besitzt, pasteurisiert und isoagglutininfrei ist. Gegenüber Produkten des Standes der Technik hat es den Vorteil, dass es frei von unerwünschten Proteinen ist und speziell solchen, die als Alloantigene zu einer Sensibilisierung führen könnten. Blutgruppenunverträglichkeiten wurden durch das Präparat nicht hervorgerufen. Eine Übertragung von Viruserkrankungen, speziell der verschiedenen Formen der Hepatitis, erscheint ausgeschlossen. Zu den Vorteilen des Verfahren qehört, dass es vergleichsweise einfach ist und deshalb problemlos in einen industriellen Massstab übertragen werden kann und aus wenigen Arbeitsschritten besteht. Die geringe Zahl der Arbeitsschritte dokumentiert sich in der guten Ausbeute, denn erfahrungsgemäss ist jeder Reinigungschritt mit einem mehr oder weniger grossen Aktivitatsverlust verknüpft. Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine pasteurisierte, hochgereiniqte Faktor VIII-PräDaration, die praktisch frei von Immunqlobulinen, Isoaqglutininen, Fibronectin und gerinnbarem Fibrinogen ist und durch eine spezifische Clotting (C)-Aktivität (F VIII:C) von etwa 100 E/mg Protein und ein Verhältnis von F VIII:C zu F VIII R:Ag (Related Antigen) > 1 charakterisiert ist. F VIII kann nach folqendem Verfahren bestimmt werden: Ein Teil, zum Beispiel 0,1 ml partielles Thromboplastin, zum Beispiel hergestellt nach der deutschen Offenleaunqsschrift 23 16 430 wird mit einem Teil F VIII-Mangelplasma und einem Teil verdünnten Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 6 Minuten bei 370C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37"C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchlorid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Calciumchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erstellte Eichkurve heranqezogen. 1 Internationale Einheit (= 1 IE) F VIII entspricht der F VII 1-Aktivität von 1 ml Normalplasma als Substandard zum 3. Internationalen WHO-Standard. Im folgenden ist das Verfahren für die Gewinnung einer pasteurisierten und isoagglutininfreien F VIII-Präparation erläutert: Beispiel 1. Ausgangsmaterial 250 g Roh-Kryopräzipitat wurden in 750 ml einer NaCl Lösung (0,08 mol/l), die Glycin (0,25 mol/l) und He parin (1,25 USP-E/ml) enthielt, unter Erwärmen auf 30-370C gelöst. Das ergab 1 000 ml Lösung mit einer Konzentration von 0,06 mol/l NaCl, 0,2 mol/l Glycin und ca. 1 USP-E Heparin/ml. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HC1 auf pH 6,5 eingestellt. 2. Aluminiumhydroxid-Adsorption Zu 1 000 ml Lösung aus 1. wurden 80 ml einer 10 q/l Aluminiumhydroxid enthaltenden Suspension (Behrin- werke Marburg) zugegeben und 15 min gerührt (Tempera tur etwa 300C). Danach wurde 15 min bei 3 000 x g zentrifugiert, der Rückstand verworfen und der Abquss nach Zusatz von Stabilisatoren pasteurisiert. 3. Pasteurisierung 1 000 ml Abguss aus 2. wurden in dieser Reihenfolge mit folgenden Stabilisatoren versetzt: 5 ml CaC12-Lösung, 1 mol/l (5 mmol/l) 1 000 g Saccharose (500 g/kg Lösung) 150 g Glycin (2 mol zu 1 1 Lösung). Der pH-Wert wurde mit 2 N NaOH auf pH 7,3 eingestellt. Durch die Zusätze vergrösserte sich das Volumen auf 1 700 ml. Die Lösung wurde 10 Stunden bei 600C im Wasserbad gehalten. 4. Ionenaustauscher-Behandlung 1 700 ml Lösung aus 3. wurden mit 1 700 ml einer Lösung, die 0,2 mol/l Na-Acetat, pH 5,5, und 0,2 mol/l Lysin enthielt, verdünnt. Der pH-Wert wurde mit ver dünnter Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und 70 ml mit einer Lösung, enthaltend Na-Acetat (0,1 mol/l), pH 5,5, Lysin (0,1 mol/l) und NaCl (1 g/l), äquili brierte DEAE-Sepharose 6B C1 zugesetzt. Es wurde 2-3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Bindung des F VIII durch Bestimmung der Aktivität im Überstand bestimmt. Als die F VIII-Aktivität von 4 IE auf 0,1 IE/ml gefallen war, wurde das Adsorbens durch Zentri fugation abgetrennt. Der Über stand wurde abgegossen und das Adsorbens vom Rest des Überstandes abgetrennt. Durch Waschen mit einer Lösung enthaltend 0,1 mol/l Na-Acetat, PH 5,5, 0,1 mol/l Lysin und 1 g/l NaCl wurde die Sepharose von eingeschlossenem Protein befreit und dann mit demselben Puffer in eine Säule eingeschlämmt (Masse: 10x3 cm). In der Säule wurde der Austauscher so lange gewaschen, bis keine Lichtabsorption bei 280 nm mehr messbar war und die Isoagglutininwerte mit dem Coombstest an der Nachweisgrenze lagen. 5. Elution Der Austauscher aus 4. wurde mit einer 0,1 mol/l Na Acetat, 0,1 mol/l Lysin und 0,3 mol/l CaC12 enthal tenden Lösung, pH 5,5, eluiert. Dabei erschien ein bei einer Wellenlänge von 280 nm messbarer Peak. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und ein Volumen von 180 ml mit 40 IE F VIII/ml erhalten. Fällung von F VIII 180 ml Eluat aus 5. wurden mit 2,2 mol/l Glycin sowie 150 g/l NaCl versetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Fällung war an einer deutlichen Trübung erkennbar. Der Niederschlag wurde durch 30 min Zentrifugation bei 30 000 x g in der Ultrazentrifuge abgetrennt und nach Abgiessen des Überstandes über Nacht bei 40C gehalten. Aufarbeitung Der Niederschlag aus 6. wurde in 145 ml Puffer, pH 7,0, aufgenommen, der 0,02 mol/l Tri-Na-Citrat, 0,06 mol/l NaCl, 10 g/l Glycin und 5 g/l Human-Albumin (Lösepuffer) enthielt. Für die Lösung wurde eine Aktivität von 40 IE F VIII:C/ml bestimmt. Sie wurde 3 Std. bei Raumtemperatur gegen obigen Puffer, der kein Albumin enthielt, dialysiert, das Dialysat auf 30"C erwärmt und 30 min bei 30 000 x g und 250C zentrifugiert. Nach einer F VIII-Bestimmung, die 36 IE/ml ergab, wurde die Lösung mit Lösepuffer auf 30 IE/ml eingestellt, die Lösung auf 37"C erwärmt und auf einem Membranfilter sterilfiltriert. Es wurde in Fläschchen abgefüllt, eingefroren und lyophilisiert.

Claims: A process for the production of a factor VIII preparation, which comprises a pasteurized solution, containing factor VIII, of a cryoprecipitate of human plasma being treated with an exchanger which carries DEAE, QAE or Ecteola groups and is based on cellulose, Sephadex® or Sepharose® at a pH of 5 - 6.5 in the presence of a carbohydrate and of an amino acid, the exchanger being washed, and the F VIII being eluted with chaotropic solutions, preferably with a solution of CaCl 2 . A process for the production of a factor VIII preparation, which comprises cryoprecipitate being dissolved with the addition of sucrose and glycine, preferably 35 - 60 g of sucrose/100 ml and 1 - 3 mol of glycine/l, calcium ions, preferably 1 - 20 mmol/l, being added, where appropriate pasteurization, cooling and dilution being carried out and, at pH 5 - 6.5, the F VIII:C being adsorbed onto an exchanger which carries DEAE, QAE or Ecteola groups and is based on cellulose, Sephadex® or Sepharose®, and the adsorbent being washed until it is free of foreign proteins, in particular isoagglutinins, and the F VIII:C being eluted by elution with a buffered concentrated chaotropic salt solution, preferably with a solution of CaCl 2 , and being dialyzed and freeze-dried. The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the adsorbent is washed with a buffered dilute salt solution. The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the exchanger is DEAE-Sepharose®.

Inventors: HEIMBURGER NORBERT PROF DR, KUMPE GERHARDT, WORMSBAECHER WILFRIED, HEIMBURGER, NORBERT, PROF. DR., KUMPE, GERHARDT, WORMSBAECHER, WILFRIED, Wormsbächer, Wilfried
Applicants: BEHRINGWERKE AG, BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: A61K35
IPC codes: A61K38, A61P7, A61K35, A61K39, C07K14