ANTIBIOTIC POLYPEPTIDE, PROCESS FOR ITS PREPARATION AND ITS USE

Abstract: The polypeptide is called epidermin and is used as an antibiotic for controlling infectious diseases. Also described is a strain of Staphylococcus epidermidis DSM 3095 which is resistant to this substance.

Description: Antibiotisches Polypeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung Die Erfindung betrifft ein antibiotisch wirkendes Polypeptid, in der Folge Epidermin genannt, ein Verfahren zu seiner Herstellung, mittels eines gegen diese Substanz resistenten neuen Stammes von Staphylococcus epidermidis, den neuen resistenten Stamm, den Wirkstoff Epidermin enthaltende antibiotische Zubereitungsformen und die Verwendung des Wirkstoffes zur Bekämpfung von infektiösen Erkrankungen. Durch die EP-A-O 027 710 ist es bekannt, dass ein besonderer Stamm des Staphylococcus epidermidis, nämLich Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (hinterlegt bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen) ein niedermolekulares, antibiotisch wirkendes Polypeptid mit einer breiten Wirkung auf grampositive Keime erzeugt, welches Bakterienzellen lysiert. Es ist ferner bekannt, dass der Stamm Staphylococcus epidermidis MF 205 (S.M. Taylor et al., Int. J.Mass Spectrom. and Ion Physics 48, 161-164, 1983) ebenfalls ein Oligopeptid mit Wirkung gegen grampositive Bakterien produziert. Aus der Veröffentlichung ist es nicht ersichtlich, ob dieser Stamm mit dem oben erwähnten Stamm NCIB 11536 identisch ist. Es wurde nun gefunden, dass eine resistente Mutante des Staphylococcus epidermidis, die am 26.10.1984 bei der "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" unter der Nummer DSM 3095, hinterlegt wurde und die mit dem obenerwähnten Stamm NCIB 11536 verwandt ist, nach einem modifizierten Herstellungs- und Aufarbeitungsverfahren das ähnliche antibiotisch, vorzugsweise auf grampositive Keime, wirkende Polypeptid Epidermin erzeugt, welches beim Vergleich mit den Produkten aus Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 und MF 205 unter anderem erhebliche Unterschiede in der Aminosäurenzusammensetzung aufweist: Vergleich der Bausteine: : Epidermin Produkte von Staph.epidermidis MF 205 NCIB 11536 Asn 1 Asx - 2 1 Glx - 3 1 Pro 1 1 1 Gly 2 2 2 Ala 2 2 1 Ile 2 2 1 Phe 2 2 1 Lys 2 2 1 Lan 2 ss-Me-Lan 1 Dhb 1 Tyr 1 1 S-(2-Aminovinyl) D-cystein 1 X - 1-2 Dhb entspricht der a,ss-Dehydroaminobuttersäure, Asx und Glx bedeuten Asn/Asp bzw. Gln/Glu. Nach Totalhydrolyse von Epidermin mittels 6N Salzsäure (18 Stunden bei llO"C) lieferte die quantitative Aminosäurenanalyse durch Ionenaustauscherchromatographie (Standardprogramm mit dem Gerät Biotronik LC 6000 E) folgende a-Aminosäuren Zusammensetzung: Asp (1,00), Pro (0,95), Gly (2,09), Ala (2,03), Ile (2,03), Tyr (0,30), Phe (2,02) und Lys (2,00) (vgl. Abb. 1). Durch Zugabe von Thioglykolsäure erhöhte sich der Tyrosingehalt des Totalhydrolysats auf den weitgehend stöchiometrischen Wert von 0,93. Die Konfiguration der Proteinaminosäuren wurde durch Gaschromatographie der Pentafluoropropionyl-aminosäure-n-pr-o- pylester aus dem Totalhydrolysat ermittelt. Die Trennung erfolgte an der chiralen stationären Phase L-Valin-tert.-butylamid-polysiloxan (Chirasil-Val). Durch Vergleich mit einer Testmischung von Aminosäuren bekannter Konfiguration konnte den oben angeführten Bausteinen die L-Konfiguration zugeordnet werden (vgl. Abb. 2). Zu diesen Proteinaminosäuren kommen noch folgende Nichtproteinaminosäuren: Lanthionin (2), ss-Methyllanthionin (1) und a,ss-Dehydroaminobuttersäure (1); hierbei besitzt Lanthionin die meso- und ss-Methyllanthionin die 2S,3S,6R-Konfiguration. Zusätzlich enthält Epidermin den Baustein S-(2-Aminovinyl)-D-cystein. Die neue Verbindung Epidermin kann durch folgende Angaben charakterisert werden: 1. Natur: farbloses Pulver 2. Löslichkeit: Sehr gut löslich in Mischungen aus Wasser/Eisessig bzw. Methanol/Eisessig, löslich in niederen Alkoholen, unlöslich in Chloroform, Aceton, Diethylether, Petrolether. 3. Farbreaktion auf Kieselgelplatten: Ninhydrin, Chlor/TDM (TDM=4,4'-Bis-(dimethylamino)diphenylmethan), Orcin/Schwefelsäure, Anisaldehyd/Schwefelsäure. Zerstö rungsfreier Nachweis im UV-Licht bei 254 nm und durch Sprühen mit Wasser. 4. Dünnschichtchromatographie: Es wurden Kieselgelfertig- platten 60 F254 (Merck) verwendet. System A: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (2/2/1), RF = 0,73 System B: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (70/35/10) RF = 0,30 System C: n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/1/1) RF = 0,05 5. HPLC : siehe Abb. 7. 6. Stabilität: Stabil von pH=2 bis pH=7, bei höheren pn-Werten tritt starker Aktivitätsabfall ein. 7. Molmasse: im Bereich von 2160. Je nach Isolierungs methoden können als Anionen, z.B. Chlorid, Acetat oder Phosphat, enthalten sein. 8. Ultraviolettabsorptionsspektrum: In wässriger Lösung langwelliges Maximum bei 267 nm (Abb. 3). 9. Infrarotabsorptionsspektrum: IR-Spektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette (Abb. 4). 10. Kernmagnetische Resonanzspektren 1H-NMR Spektrum: Abb. 5, 13C-NMR-Spektrum: Abb. 6 Geeignete Fragmente zur Sequenzierung des Epidermins wurden durch tryptische Spaltung erhalten. Die Umsetzung mit Trypsin führte in kurzer Zeit zum Verlust der antibiotischen Aktivität. Makroskopisch beobachtete man bei der tryptischen Spaltung einen gallertartigen weissen Niederschlag, welcher durch Zentrifugation abgetrennt werden konnte. Der Überstand wurde lyophilisiert und an Sephadex G-25 (Dextrangel der Firma Pharmacia) in ltiger Essigsäure gelchromatographiert. Die mit Ninhydrin, Chlor/TDM und Wasser anfärbbare, chemisch einheitliche Fraktion (im folgenden als P1 bezeichnet) erwies sich als N-terminales Bruchstück der tryptischen Spaltung von Epidermin (siehe unten). Der extrem hydrophobe, gallertartige Niederschlag bestand aus mehreren chemischen Komponenten, welche bei der tryptischen Spaltung aus dem C-terminalen Bruchstück des Gesamtmoleküls entstanden. Ein chemisch einheitliches Produkt (im folgenden P2 bezeichnet) erhielt man durch Auflösen des Niederschlags in Dimethylformamid und anschliessender Gelchromatographie an Sephadex LH-20 (Dextrangel, durch Hydroxypropylierung aus Sephadex G-25 hergestellt, Firma Pharmacia) mit Dimethylformamid als Fliessmittel. P2 liess sich mit Wasser, Chlor/TDM und unter UV-Licht detektieren. Die Ninhydrinreaktion an P2 verlief negativ. Die Aminosäurenanalyse des Fragments P1 ergab folgende Zusammensetzung: Pro (1), Lan (1), ss-Me-Lan (1), Gly (lot, Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (2). Da durch Dansylierung des Gesamtmoleküls Isoleucin als N-terminale Aminosäure bestimmt wurde und das Fragment P2 kein Isoleucin enthält, muss das Fragment P1 das N-terminale Spaltprodukt des Gesamtmole küls sein. Die C-terminale Aminosäure von Fragment P1 muss auf Grund der tryptischen Spaltung Lysin sein. Zur weiteren Strukturaufklärung von P1 wurde die C-terminale Aminosäure Lysin enzymatisch mittels Carboxypeptidase B (Firma Boehringer Mannheim) entfernt. Das daraus entstandene Fragment P12 konnte durch Gelchromatographie an Sephadex G-25 (1% Essigsäure) in reiner Form isoliert werden. P12 besteht aus folgenden Aminosäuren: Pro (1), Lan (1) , ss-Me Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (1). Die Schwefelbrücken der Thioetheraminosäuren Lanthionin und ss-Methyllanthionin verhindern eine Sequenzanalyse nach Edman. Durch Umsetzung von P12 mit Raney-Ni W2 erhielt man ein schwefelfreies Dodekapeptid. Dabei wird meso-Lan in D- und L-Alanin überführt und ss-Methyllanthionin in D-Aminobuttersäure und L-Alanin. Die Dodekapeptidsequenz wurde durch Edman-Abbau und FAB-Spektrometrie aufgeklärt: 11e1-Ala2-Ala3-Lys4-Phe5-11e6-Ala7-Abu8- Pro9-Glyl0-Alall-Alal2 Verschiedene Untersuchungen für die Zuordnung der Schwefelbrücken beim Fragment P12 ergaben folgende Struktur: EMI6.1 Das durch tryptische Spaltung erhaltene C-terminale Bruchstück P2 liess sich wie folgt charakterisieren: Asn (1), Lan (1), Gly (1), Phe (1), Tyr (1), a-Ketobuttersäure und S-(2-Aminovinyl)-D-cystein. Die a-Ketobuttersäure stammt aus der Dehydroaminobuttersäure, welche in der Sequenz des Gesamtmoleküls direkt auf 13 Lysin folgt. Die tryptische Spaltung setzt die Amint- gruppe der Dehydroaminobuttersäure frei; da Dehydroaminosäuren mit freier Aminogruppe instabil sind, lagern sie sich unter anderem in a-Ketosäuren um. Das tryptische Fragment P2 ist N-terminal mit der a-Ketobuttersäure blockiert (Ninbydrinreaktion an P2 verläuft negativ). Neben den durch Totalhydrolyse und Aminosäurenanalyse identifizierten Aminosäuren Lanthionin, Glycin, Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure besitzt P2 einen weiteren Baustein, der durch saure Totalhydrolyse zerstört 13 wird. Dieser liess sich an Hand seiner Signale in den 1 C Kernresonanzspektren von Epidermin (Abb. 6) und im Fragment P2 (Abb. 8) charakterisieren. Einen Hinweis auf die chemische Natur dieser Aminosäure erhielt man durch Umsetzung von P2 mit Raney-Ni W2, bei der zwei Hauptprodukte entstanden. Bei beiden durch präparative HPLC isolierten Produkten zeigte sich nach Totalhydrolyse ein zusätzlicher D-Alaninrest im Aminosäurenchromatogramm, der durch diese Umsetzung entstand. Die Struktur dieses Bausteins konnte durch heterogene Hydrierung des nativen Antibiotikums geklärt werden. Die vier Reaktionsprodukte H1, H2, H3 und H4 wurden durch semipräparative HPLC gereinigt, totalhydrolysiert und der Gaschromatographie an chiraler stationärer Phase unterworfen (Abb. 15). Dabei trat im Vergleich zum Chromatogramm in Abb. 2 bei H1 und H3 ein zusätzlicher Peak auf, der über sein Massenspektrum als S-(2-Aminoethyl)-D-cystein identifiziert wurde. In Epidermin war diese Aminosäure als säurelabiler Baustein S-(2-Aminovinyl)-D-cystein enthalten. Die beiden aus dem C-terminalen Bruchstück P2 durch Behandlung mit Raney-Nickel W2 entstandenen Peptide P21 und P22 konnten durch Aminosäurenanalyse und Gaschromatographie an Chirasil-Val wie folgt charakterisiert werden: Reaktionsprodukte P 21 P 22 Aminosäurenanalyse und Gas- 2 D-Ala 1 D-Ala chromatographie an Chirasil-Val 1 L-Ala meso-Lan 1 L-Phe 1 L-Phe 1 L-Tyr 1 L-Tyr 1 L-Asp 1 L-Asp 1 Gly 1 Gly Zusätzlich waren beide Produkte C-terminal durch Ethylamin blockiert. S-(2-Aminovinyl)-D-cystein zerfiel bei der Entschwefelung bei gleichzeitiger Hydrierung in D-Alanin und Ethylamin. Die Sequenzierung des brückenfreien Heptapeptides P21 (Partialhydrolyse; 0.1 N-Salzsäure, 930C, 16 Stunden) ergab folgende Struktur: H3C-CH2-CO-CO-Gly-D-Ala-L-Phe-L-Asn-D-Ala-L-Tyr-L-Ala-NHEt Die Zuordnung der in P22 enthaltenen meso-Lanthioninbrücke durch Partialhydrolyse und diverse chemische Untersuchungen an enzymatischen Fragmenten aus P21 und P22 waren nur mit folgender Struktur des aus tryptischer Spaltung entstandenen Fragments P2 zu vereinbaren: EMI8.1 Die formale Substitution der P2 N-terminal blockierenden 2-Ketobuttersäure durch die im nativen Antibiotikum vorhandene Aminosäure Dehydrobutyrin und eine anschliessende Fragmentkondensation der tryptischen Peptide P1 und P2 führte direkt zu der nachstehenden Sequenz des heterodet tetracyclischen Peptidantibiotikums Epidermin: : Struktur des ribosomal synthetisierten, heterodet cyclischen Dokosapeptidantibiotikums EPIDERMIN: EMI9.1 Die dem N-Terminus näherstehenden Hälften der einzelnen T;ioetheraminosäuren sind jeweils D-konfiguriert (entspricht d r (S)-Konfiguration in der R,S-Nomenklatur). Gegenstand der Erfindung ist also ein einheitliches und damit als rein anzusehendes Produkt, Epidermin genannt, desweiteren Verfahren zu seiner Herstellung, Isolierung und Reinigung. Die Zucht des Produzenten Staphylococcus epidermidis DSM 3095 erfolgt aerobisch bei 370C in einem Komplexmedium der Zusammensetzung 2 bis 4% Fleischextrakt, 1 bis 3% Malzextvalst und 0 25 bis 1t CaCO? oder 0 25 bis O f 5t Ca (OH)2. (Bei den Prozentangaben handelt es sich hler und im folgenden immer, sofern nichts anderes angegeben wird, um Gewichtsprozente.) Das Maximum an antibiotischer Aktivität wird nach 18-23 Stunden erreicht. Versuche zur Anreicherung des Antibiotikums wurden beispielsweise am Kulturfiltrat von 10 l-Fermentern vorgenom znen, wobei die Effektivität einzelner Schritte durch den Plattendiffusionstest überprüft wurde. Die aktive Komponente konnte durch Extraktion des von Zellen und Kalk befreiten Kulturfiltrats mit n-Butanol angereichert werden. Die Extraktion mit n-Butanol gelang aber nur beim natürlichen End-pH des Kulturfiltrats von 8,0. Eine weitere Reinigung konnte durch die Abtrennung lipidischer Begleitstoffe durch Etherfällung erreicht werden. Dazu wurde der Butanolextrakt evaporiert, der Rückstand in Methanol gelöst und in die fünffache Menge kalten Diethylether eingerührt. Die Aktivität blieb dabei vollständig im Niederschlag zurück (Schema Abb. 9). Ein besonders geeignetes Verfahren zur Anreicherung ist auch die Adsorption des zentrifugierten Kulturfiltrats an Amberlite XAD-8 oder verwandten Typen dieses Polymeren auf Acrylesterbasis (Firma Serva). Die Anheftung von Epidermin erfolgt dabei nicht durch einfache Adsorption, sondern durch die Kationenaustauschwirkung freier Acrylsäuregruppierungen am Harz. Dafür spricht die Tatsache, dass die aktive Komponente nur durch Elution mit Methanol/konz. EC1 (99:1) vom Harz gelöst werden konnte. Das stark saure Eluat muss vor dem Einengen am Vakuum mit Ammoniak neutralisiert werden. Auf ein anschliessendes Umfällen aus Methanol/Ether konnte nach dieser Aufarbeitung mittels Adsorption an Amberlite XAD-8 verzichtet werden. Eine Isolierung von Epidermin durch Adsorption kann auch bereits während der Kultivierung des Mikroorganismus direkt in der Kulturbrühe erfolgen. Stabilitätstests und chromatographische Untersuchungen wurden am lyophylisierten Butanolextrakt durchgeführt. Die Inkubation des Extraktes mit wässrigen Lösungen verschiedener pH-Werte ergab ab pH 10 eine starke Abnahme der Aktivität, im Bereich von pH 2-7 ist das Antibiotikum jedoch stabil. In den Dünnschichtchromatogrammen des eingeengten Butanolextraktes fanden sich eine Vielzahl mit verschiedenen Sprühreagentien anfärbbarer Verbindungen. Parallel dazu durchgeführte Bioautogramme ergaben wichtige Hinweise auf die Natur des neuen Wirkstoffs. In sauren und fast allen neutralen Systemen bleibt das Antibiotikum bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60 am Start sitzen, während die Chromatographie mit alkalischen Laufmitteln R-Werte zwischen 0,3 und 0,75 ergab. Die Kombination der Bioautographie mit der Dünnschichtchromatographie in alkalischen Systemen zeigte eine Korrelation mit einer Verbindung, welche durch Ninhydrin anfärbbar war. Als Ergebnis dieser Vorversuche konnte festgehalten werden, dass es sich bei dem Antibiotikum um ein stark basisches Peptid handelt, welches sich einer weiteren Aufreinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 entzog, da es mit sauren oder neutralen Systemen nicht von der Säule eluiert werden konnte. Die Chromatographie'des Amberlite XAD-Eluats bzw. des von Lipiden befreiten Butanolextrakts an Sephadex LH-20 mit Methanol/Essigsäure (95:5) trennte eine grosse Zahl von kleinen Peptiden, Aminosäuren und Salzen aus dem Medium vom Antibiotikum ab (Schema Abb. 9). Bei der sich anschliessendefl multiplikativen Gegenstromver teilung nach Craig konnten die bei der Extraktion des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat gemachten Erfahrungen herangezogen werden. In einer ersten Flüssig-Flüssig-Verteilung mit dem System n-Butanol/Essigester/O,l N Essigsäure (3:1:3) blieb das Antibiotikum am Start sitzen. Bei der zweiten Craig-Verteilung mit dem neutralen System 2-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (1:1) fand man das Antibiotikum in der Mitte der Apparatur. Ammoniumacetat konnte durch Lyophilisation am Hochvakuum wieder entfernt werden. Epidermin fiel nach Gefriertrocknung als ein in allen verwendeten Dünnschichtsystemen einheitliches Pulver an. Während die Reinigung gemäss der Verfahrensweise der Europäischen Patentanmeldung 0 027 710 durch Gefrier-Auftau-Extraktion, Verdampfung der Extraktionsmittel, Ultrafiltration, Fällung durch Ammoniumsulfat, Ionen-Austausch-Chromatographie und Gelfiltration an Sephadex G-50 oder G-25 oder G-15 oder an Biogel P2 erfolgte, führt die erfindungsgemässe Reinigung zu einem einheitlichen Reinprodukt durch die Adsorption des zentrifugierten Kulturfiltrates an Amberlite XAD-8, gefolgt von einer Gelchromatographie an Sephadex LH-20, und anschliessender zweifacher Gegenstromverteilung nach Craig. Die Isolierung und Reinigung gemäss dem Verfahren der vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung und dem erfindungsgemässen Verfahren erweist sich somit als völlig unterschiedlich. Weitere Unterschiede gegenüber dem bekannten Verfahren gemäss der obengenannten EP-A-0.027.710 bestehen in der Wahl der komplexen Nährlösung. Während die bekannte Nährlösung Brain Heart Infusion (37 g BHI/1) nur eine sehr geringe Antibiotika-Ausbeute erbrachte, zeigt eine erfindungsgemässe Nährlösung, bestehend aus 2 bis 4 8 Fleischextrakt, 1 bis 3 % Zucker bzw. Zuckeralkohole, wie Malzextrakt, Maltose, Ca- laktose, Laktose, Mannit, Glucose, Glycerin und 0,25 bis 1 % Calciumcarbonat oder 0,25 bis 0,5% Calciumhydroxid sehr gute Ergebnisse. Die beste Produktion wurde bei einer Nährlösung folgender Zusammensetzung erhalten: 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt und 0,37 % Calciumhydroxid. Von allen C-Quellen zeigte Maltose nach Malzextrakt die beste Produktion. Glucose sollte nur in Verbindung mit anderen C-Quellen eingesetzt werden. Auch die Kombination von Laktose und Maltose bzw. Galaktose und Maltose lieferten gute Ergebnisse. Alle anderen üblichen C-Quellen zeigten keine oder nur eine geringe Produktion. Die Zugabe aller 20 Aminosäuren als N-Quelle in Konzentrationen von jeweils ? g/l brachte die gleichen Ergebnisse wie der Fleischextrakt. Casaminoacid (Firma Difco) eignet sich als N-Quelle nur bei Zugabe von Tryptophan (1-2 mM) und Vitaminen. Als Vitamine eignen sich (bevorzugte Konzentrationen in Klammer): Biotin (0,006 mg/l), Nicotinsäure (2,3 mg/l), Thiamin (1,0 mg/l), Py.ridoxin.HCl (12,0 mg/l), Calciumpantothenat (1,2 mg/l). Die Fermentation erfolgt unter guter Belüftung bei Temperaturen zwischen 34 und '370C. Den besten Produktionsverlauf erhält man, wenn der pH-Wert vor der Fermentation bei 6,0 bis 7,0 liegt. Bei Fehlen von Carbonaten oder Hydroxiden zweiwertiger Kationen, wie Calciumkarbonat oder Calciumhydroxid, findet keine Produktion statt. Nach der Zugabe von beispielsweise Calciumcarbonat zeigt der pH-Wert einen charakteristischen Verlauf mit Abfall in den sauren Bereich, dabei fand keine Produktion statt. Beim anschliessendem Anstieg des pH-Wertes in den schwach alkalischen Bereich setzte die Produktion ein. Anstelle von Calciumcarbonat kann auch Magnesiumcarbonat verwendet werden, Calciumhydroxid lieferte bessere Ergebnisse als Calciumcarbonat. Mit 50 mM Calciumhydroxid konnte die Produktion gegenüber 25 mM Calciumcarbonat noch etwas gesteigert werden. Bei der Verwertung von C-Quellen (Zucker) durch den Stamm kommt es zur Bildung organischer Säuren, die durch zweiwertige Kationen komplexiert werden, wobei gleichzeitig eine Abpufferung des Mediums erfolgt. In Abbildung 10 sind die Ergebnisse anhand des Verlaufs der Lebendkeimzahl und der Antibiotikum-Produktion-, ausgedrückt in mm Hemmhof gegen Micrococcus luteus ATCC 9341, der erfindungsgemässen Medien im Vergleich zu Brain Heart Infusion Medium (Firma Difco) gemäss der oben zitierten Europäischen Patentschrift angegeben. Mittels einer Eichgeraden ergaben sich im Plattendiffusionstest nachstehend aufgeführte Aktivitätssteigerungen zum Zeitpunkt des Produktionsmaximums. Die Aktivität in Nährlösung Brain Heart Infusion wurde gleich 100% gesetzt. a) Brain Heart Infusion Agar 100 % b) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt, 25 mM Calciumcarbonat 200 % c) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt, 50 mM Calciumhydroxid 320 % Diese Angaben stellen keine absoluten Produktionswerte dar. Ein Vergleich der mit Hilfe des Plattendiffusionstests gewonnenen Werte zeigt aber eindeutig, dass gegenüber der bekannten Arbeitsweise bei Einhaltung der erfindungsgemässen Arbeitsweise eine signifikante Steigerung der Ausbeuten erzielt wurde. Der zur Herstellung von Epidermin verwendete Stamm wird nach Schleifer & Kloos (Int. J. Syst. Bact. 25, 50-61 (1975)) wie folgt charakterisiert: Gramfärbung : positiv Zellgrösse : Durchmesser 0,5-0,8 pm Roloniengrösse : ca. 1 mm Durchmesser Aussehen der Kolonien : glatt, glänzend, in der Mitte leicht erhöht Kolonienfarbe : gräulich - weiss Zellen in Kultur : oft Einzelzellen oder Zweier-Pakete, selten grössere Haufen Hämolyse : auf Blutplatten ausge strichene Kulturen zeigten starke Hämolyse Anaerobes Wachstum : der Stamm wächst auch unter anaeroben Bedingungen Lysozymempfindlichkeit: : die Zellen sind bis 2 mg/ml resistent gegen Lysozym Lysostaphinempfindlichkeit : die Zellen sind schon bei 20 pg/ml sensitiv für Lysostaphin Epidermin-Resistenz : bis 1 mg/ml nachgewiesen Sonstige Resistenzen : in Flüssigkultur zeigt der Stamm eine ausgeprägte Re sistenz gegenüber Strepto mycin (bis 1 mg/ml) und Spectinomycin (0,5 mg/ml) Erhöhter NaCl-Gehalt : Der Stamm wächst noch gut bis 15% Gew.-% Natrium chlorid. Kolonien oder ausgestrichene Kulturen sind sehr klebrig. Die Verwertung von verschiedenen C-Quellen unter Säurebildung und andere Enzymreaktionen wurden mit Hilfe des Api-Staph-Systems (Firma Biomerieux, Nürtingen) bestimmt. Dieses System beruht auf einer Kombination von 20 biochemischen Reaktionen, die auf die Klassifizierung von KLOOS & BR< SCHLEIFER (J.Clin.Microbiol. 1, 82-88 (1975)) zurückzuführen sind. Tabelle 1: C-Quellenverwertung und andere Enzymreaktionen C-Quelle bzw. Enzym Pro- Staph. epid. Staph.epid. duzent Kloos & chleifer APi - Staph Kontrolle D-Glucose + k.A. + D-Fructose + + + D-Mannose (+) (+) + Maltose + + + Laktose (+) (+) + D-Trehalose D-Mannitol Xylitol D-Melibiose - k.A. Raffinose - k.A. D-Xylose Saccharose + + + a- Methylglucosid - k.A. N-Acetylglucosamin - k.A. + Nitratreduktion + + + Phosphatase + + + Bildung von Acetylmethyl- + k.A. + carbinol (Voges-Proskauer Reaktion) Arginindehydrolase - k.A. + Urease + k.A. + + positive Reaktion - negative Reaktion (+) eindeutig positive Reaktion tritt erst etwas später auf + variable Eigenschaft k.A. keine Angaben Der Stamm Staphylococcus epidermidis DSM 3095 wurde auf Schrägröhrchen mit einem Medium der Zusammensetzung Pepton 10 g Dinatriumhydrogenphosphat 2 Fleischextrakt 8 g Glucose 10 g (separat autoklaviert) Kochsalz 3 g pH überimpft, über Nacht bei 37eC inkubiert und anschliessend bei -200C eingefroren. Für neue Versuchsansätze wurde jeweils ein frisches Röhrchen aufgetaut, da bei längerer Lagerung bei 40C Aktivitätsverluste beobachtet wurden. Im folgenden wird eine genauere Beschreibung zur Herstellung des Antibiotikums Epidermin gegeben: Die Fermentation lässt sich in dazu geeigneten Schüttelkolben durchführen, zur Herstellung grösserer Substanzmengen können auch Fermenter von 200 Liter und mehr verwendet werden. Für Kolbenversuche wurden 500 ml Erlenmeyerkolben mit einem seitlichen Einstich verwendet. Die Kolben wurden mit 100 ml Nährlösung gefüllt und 20 Minuten bei 121 C autoklaviert. Als Impfmaterial diente 1% einer 4 Stunden alten Vorkultur. Die Inkubation erfolgte bei 370C auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 140 rpm. Für die Fermentation im 10-Liter-Massstab wurden Fermenter mit 10 1 Nutzinhalt (Modell MF-14 New Brunswick, Scientific Co., New Brunswick, USA) mit 9,9 1 Nährlösung gefüllt und 30 Minuten bei 1340C autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde mit 100 ml einer 4 Stunden alten Vorkultur beimpft und bei 370C, 0,6 vvm und 240 rpm des Blattrührers fermentiert. Der relativ starken Schaumbildung wurde durch wiederholte Zugabe von sterilem Polyol begegnet. Für die Fermentation im 25 1 Massstab wurde ein 25 1 Fermenter (Typ b 25, Braun/Melsungen mit Umwurfsystem) mit 25 1 Nährlösung unter Zusatz von 3 ml Polyol beschichtet und in situ bei 121"C 30 Minuten sterilisiert. Als Impfmaterial dienten 300 ml einer 4 Stunden alten Vorkultur. Die Fermentation erfolgte bei 370C, 0,6 vvm und 1000 rpm. Der Verlauf einer Fermentation im 10 1 Massstab in einer Nährlösung, enthaltend 30 g Fleischextrakt, 20 g Malzextrakt und 5 g Calciumcarbonat in 1 Liter, ist in Abbildung 11 -dargestellt. Intensives Wachstum verbunden mit der Verwertung der angebotenen C-Quelle unter Säurebildung kann am Abfall des pH-Wertes erkannt werden. Mit Beginn der Alkalisierung kann das Antibiotikum im Kulturfiltrat nachgewiesen werden. Die Produktion erreicht nach 12 bis 18 Stunden ihr Maximum. Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufes wurden zu verschiedenen Zeiten während der Fermentation steril Proben entnommen.Die Proben wurden folgendermassen ausgewertet: a.) pH-Wert: Messung mit einem Labor-pH-Meter (Knick pH-mV-Meter) b) Wachstumsverlauf: Das Wachstum konnte anhand der Zunahme der Lebendkeim zahl verfolgt werden. Hierzu wurden 0,5 ml steril entnommene Kultur in Saline verdünnt und davon 0,1 ml auf Platten (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Dinatriumhydrogenphosphat 2 g, Glucose 10 g auf 1 1.) ausplattiert. Nach 18 Stunden Inkubation bei 370C konnten die Einzelkolonien ausgezählt werden. c.) Antibiotikumkonzentration: Die Proben wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge 3200 2 Minuten abzentrifugiert und 20 p1 des Überstandes im Plattendiffusionstest getestet. Parallel wurde eine Eichkurve mit bekannten Konzentra- tionen erstellt. Nach Erreichen des Produktionsmaximums wurde die Kulturflüssigkeit mittels kontinuierlicher Zentrifugation (Zentrifuge: Typ LA 71b-4, Loher & Söhne, Ruhstorf/Rott) mit 1380 rpm abzentrifugiert. Für eine optimale Abtrennung der Zellen musste die Durchflussrate sehr niedrig gehalten werden. Eine erste Anreicherung der aktiven Komponenten wurde mittels der auf Seite 10 erwähnten Adsorption an Amberlite XAD-8, gemäss nachfolgendem Beispiel 1 erreicht: Beispiel 1 80 Liter Kulturfiltrat wurden über ca. 8 Liter Amberlite XAD-8 gegeben. Im Durchlauf konnte keine Aktivität festgestellt werden. Beim anschliessenden Waschen mit Wasser wurde ebenfalls keine Aktivität eluiert. Anschliessend wurde mit 13 Liter Methanol gewaschen. Im Waschwasser wurde keine Aktivität detektiert. Die Elution erfolgte mit Methanol/Salzssäure 99:1, wobei folgende Fraktionen erhalten wurden: Fraktion 1: 0,8 1 aktiv Fraktion 2: 4,5 1 Hauptaktivität Fraktion 3: 2 1 aktiv Fraktion 4: 2 1 keine Aktivität Fraktion 5: 1 1 keine Aktivität Die Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch auf ihren Gehalt an Epidermin getestet, anschliessend wurden die aktiven Fraktionen vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt (81,2 g). Der Rückstand wurde in Methanol/Essigsäure (95/5) aufgenommen (400 ml), von unlöslichen Bestandteilen abzentrifugiert und in Portionen von je 50 ml an Sephadex LH-20 (Säule 100x5 cm, Fliessmittel Methanol/ Essigsäure 95:5) gelchromatographiert. Positive Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft (14,8 g). Für die multiplikative Verteilung nach Craig kamen Apparaturen der Firma Labortec (Basel) zum Einsatz. Eine erste Trennung wurde mit einer 50 ml-Apparatur im System n-Butanol/Essigester/0,l M Essigsäure (3/1/3) durchgeführt. Die in der Unterphase (100 ml) gelöste Probe (5 g) wurde folgenden Trennbedingungen unterworfen: Stufenzahl: 160 Schüttelbewegungen/Stufe: 70 Schüttelintensität: 45 Trennzeit: 20 min Zur Endreinigung wurde das erhaltene Rohprodukt (4,2 g) in Portionen von je 2 g in der Unterphase des Systems 2-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (50 ml) gelöst und in einer 10 ml-Apparatur mit 440 Elementen aufgereinigt. Stufenzahl: 440 Schüttelbewegungen/Stufe: 50 Schüttelintensität: 50 Trennzeit: 10 min Die Epidermin enthaltenden Elemente wurden vereinigt, eingeengt, mit Wasser aufgenommen und mehrmals am Hochvakuum lyo phylisiert. Das Antibiotikum (2,6 g) erwies sich bei allen vorgenommenen Untersuchungen als einheitlich. Während der Herstellung und Isolierung des Epidermins wurde zur biologischen Charakterisierung der Plattendiffusionstest angewandt; nämlich zur Aufnahme des Wirkungsspektrums sowie zur Kontrolle von Produktion, Aufarbeitung und Anreicherung. Der Test wurde, wie bei Zähner und Maas, Biology of antibiotics (Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1972) beschrieben, in Petrischalen der Firma Greiner, Nürtingen mit Filterrondellen von 6 mm Durchmesser (Macherey & Nagel, Düren) durchgeführt. Die Filterrondellen wurden mit 20 p1 der betreffenden Testflüssigkeit benetzt, bei Raumtemperatur auf einer Glasplatte getrocknet und auf die Testplatten aufgelegt. Die Testplatten wurden bei 370C inkubiert und nach ca. 16 Stunden die Wachstumshemmung ausgewertet. Als Routinetestkeim diente Streptococcus pyogenes ATCC 8668 und, aufgrund seiner problemloseren Handhabung, Micrococcus luteus ATCC 9341. Testplatten mit Streptococcus pyogenes ATCC 8668: Der Testkeim musste vor Herstellung der Testplatten auf Blutplatten mit Mucin [Medium: 500 ml Agar pH 7,4, 160 ml Mucinlösung (10 Gewichtsprozent), 3,5 ml Glucoselösung (50 Gewichtsprozent), 70 ml Hammelblut] frisch überimpft werden. Nach 15-18 Stunden Inkubation bei 370C wurde eine Salinesuspension (E578 0,5) hergestellt und 1 ml dieser Suspension zu 100 ml Nährboden (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Rochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10 g auf 1 1, pH 7,2) pipettiert. Die zu 10 ml Portionen gegossenen Platten waren einige Tage bei 40C haltbar. Testplatten mit Micrococcus luteus ATCC 9341: Eine Übernachtkultur (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10 g auf 1 1, pH 7,2) wurde auf eine Extinktion von 1,0 bei 578 nm ver dünnt. Mit 0,25 ml dieser Suspension wurden 100 ml Agar angeimpft und Platten zu 10 ml gegossen. Die Testplatten konnten mehrere Tage bei 40C aufbewahrt werden. Testpatten für das Wirkungsspektrum: Testplatten mit Bakterien: a.) Aerob lebende Bakterien: Übernachtkulturen wurden in den jeweiligen Testmedien angezogen und die Platten wie bei Micrococcus luteus ATCC 9341 beschrieben hergestellt. B.) Anaerob lebende Bakterien: Die Vorkulturen für Clostridium pasteurianum ATCC 6013 und Propionibacterium acnes DSM 1897 wurden in Reagenz gläsern gezogen, die zur Verdrängung des Sauerstoffes bis zum Wattestopfen mit Nährlösung aufgefüllt wurden. Mit 3 ml Vorkultur wurden 100 ml Agar beimpft und Plat ten in 10 ml Portionen gegossen. Die Inkubation erfolgte im Anaerobier-Topf ?(BBL-Gas Pak 100, Becton, Dickinson GmbH, Heidelberg) bei der je weils optimalen Temperatur. Testplatten mit hefeartig wachsenden Pilzen: In Schüttelkultur wurden die Zellen im jeweiligen Testmedium 18-20 Stunden angezogen. Nach Auszählen in der Thoma-Zähl 6 kammer wurden die Testplatten zu einer Dichte von 10 Or- ganismen/ml Agar angeimpft. Testplatten mit Pilzen und Streptomyceten: Die Testorganismen wurden auf Schrägröhrchen (Medium: Hefeextrakt 4 g, Malzextrakt 10 g, Glucose 4 g auf 1 1) bei den entsprechenden Temperaturen bis zur Sporulation angezogen. Die Sporen wurden mit 3 ml Saline-Tween 80 (1 Tropfen Tween 80 auf 100 ml Saline) abgeschwemmt und in Testplatten eingegossen. Die Substanz Epidermin besitzt eine sehr gute antibakterielle Wirksamkeit; sie wirkt besonders gut gegen eine ganze Reihe grampositiver Bakterien. Die antibakterielle Wirkung von Epidermin wurde vergleichend mit der von Nisin (Nisin vgl. u.a. DE-A-2 000 818 bzw. GB-B-1 182 156) untersucht; bei einigen wichtigen, klinisch relevanten Keimen wurde auch Fusidinsäure in den Vergleich miteinbezogen. Die Wirksamkeit wurde mit Hilfe des Plattendiffusionstests und durch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen ermittelt. a.) Plattendiffusionstest: Im Plattendiffusionstest wurde die Empfindlichkeit verschiedener Mikroorganismen gegen Epidermin und Nisin getestet. Tabelle 2 zeigt, dass beide Antibiotika fast ausschliesslich auf grampositive Bakterien wirken. Verwendet wurde Nisin mit einer Aktivität von 40000 units. Tabelle 2: Empfindlichkeit gegen Epidermin und Nisin Angabe in mm Hemmhof, Konzentrationen 1 mg/ml und 0,5 mg/ml. Mikroorganismen Rulturbed. Epidermin Nisin Temp. Medium 1 0,5 1 0,5 Bakterien Eubacteriales, grampositiv Arthrobacter aurescens 270C 5 8 Sp 9 8 Arthrobacter crystallopoietes 270C 5 16 15 16 15 Arthrobacter globiformis 270C 5 14 12 14 13 Arthrobacter oxydans 27"C 5 12 11 11 10 Arthrobacter pascens 270C 5 13 12 14 13 Bacillus cereus 370C 3 8 Sp - - Bacillus pumilus 37DC 4 14 12 12 10 Bacillus subtilis ATCC 6051 370C 4 12 11 9 8 Bacillus subtilis ATCC 6051 370C 6 17 16 14 12 Bacillus subtilis ATCC 6633 370C 4 14 11 9 8 Bacillus subtilis F 24-2 370C 4 13 11 8 Sp Bacillus subtilis A 14 370C 4 12 10 9 Sp Brevibacterium flavum 370C 4 11 10 8 7 Clostridium pasteurianum 300C 7 17 15 14 13 Clostridium sporogenes 370C 8 10 9 8 Sp Corynebacterium spec. 270C 4 15 13 9 8 Corynebacterium insidiosum 270C 4 19 17 10 8 Corynebacterium rathayi 270C 4 14 12 10 9 Micrococcus luteus ATCC 381 270C 5 10 9 - - Micrococcus luteus ATCC 9341 270C 2 21 20 17 16 Propionibacterium acnes 370C 8 22 19 21 18 Sarcina lutea 370C 5 15 14 15 14 Staphylococcus aureus Tü 202 370C 4 13 10 10 9 Staphylococcus aureus DSM 683 370C 4 11 9 Sp Staphylococcus aureus Pen.res 370C 4 12 11 9 8 Staphylococcus cohnii 370C 2 14 12 9 Streptococcus pyogenes 370C 2 22 20 18 17 Eubacteriales, gramnegativ: Proteus mirabilis 370C 4 11 9 9 7 Proteus vulgaris 370C 5 9 8 8 Sp Actinomycetales: : Streptomyces glaucescens 270C 3 10 8 10 9 Streptomyces violaceoruber 370C 3 9 8 Streptomyces virido- 370C 3 11 10 9 8 chromogenes (-) bedeutet, dass keine Wirkung eintrat; Sp = Spuren b.) Minimale Hemmkonzentration: Die minimale Hemmkonzentration für klinisch relevante Reime, angegeben in pg/ml, wurde in Mikrotiterplatten in folgendem Medium geprüft: 5 ml Na-Lactat, 5 g Na2SO4, 0,5 g KH2PO4, 0,1 g MgCl2, 5 g NH4Cl, 10 g Glucose, 50 ug Calciumpantothenat, 50 g Thiamin, 0,25 iig Folsäure, 50 iig Niacin, 25 g p-Aminobenzoesäure, 50 ug Pyridoxin-Hydrochlorid, 25 g Riboflavin in 1000 ml Aqua dest. In Tabelle 3 sind die minimalen Hemmkonzentrationen ( > g/ml) von Epidermin, Nisin und Fusidinsäure im Vergleich dargestellt. Das hierbei verwendete Nisin besass eine Aktivität von 2500 units. Tabelle 3: Minimale Hemmkonzentration in pg/ml: Epidermin Fusidinsäure Nisin St. epidermidis WG 99 2 4 128 Sc. pyogenes ATCC 8668 0,125 1 4 Sc. pneumoniae ATCC 6302 2 16 32 Mc. luteus ATCC 15957 0,25 0,5 16 Mc. luteus ATCC 9341 X 0,06 0,5 8 Cb. xerosis NCTC 9755 0,125 0,125 16 E. coli ATCC 11775 128 > 128 > 128 E. coli ATCC 9637 128 > 1.28 > 128 Propionib. acnes PC 904 0,06 0,5 32 Propionib. acnes ATCC 25746 0,25 1 64 Die in der Tabelle 2 genannten Medien werden nachfolgend beschrieben. Die Medien wurden nach Einstellen des pH-Wertes 20 Minuten bei 1210C autoklaviert. Die Mengenangaben beziehen sich jeweils auf 1 1 Wasser. Bei chemisch definierten Medien wurde entionisiertes Wasser verwendet. Medium: (2) Glucose-Agar-Medium: Pepton 10 g Fleischextrakt 8 g NaCl 3g Na2HPO4 2g Glucose 10 g (getrennt autoklaviert) Agar 20 g pH 7,2 (3) Hefe-Malz-Medium: Befeextrakt 4 g Malzextrakt 10 g Glucose 4g Agar 20 g pH 7,3 (4) Oxoid-Medium für Bakterien: Fleischextrakt 10 g Pepton 10 g NaCl 5g Agar 20 g pH 7,2 (5) Nutrient broth 8 g (Firma Difco) Agar 20 g pH 7,2 (6) Minimalmedium für Bakterien (HÜTTER et al., 1966): D-Glucose 8 g di-Ammoniumtartrat 4 g NaC1 5 g K2HPO4 2 g MgSO4 x7H2O 1 g CaC12 0,2 g MnSO4 x H20 0,01 g Ferrioxamin B 0,02 g Agar 20 g pH 7,2 (7) Medium für Clostridium pasteurianum: : Fleischextrakt 3 g Hefe Extrakt 3 g Malz Extrakt 3 g Pepton 20 g D-Glucose 5 g Ascorbinsäure 0,2 g Agar 20 g pH 7,0 (8) Brewer Thioglycolatmedium für Propionibacterium acnes: Thioglycolatmedium 40,5 g Agar 20 g pH 7,2 Epidermin ist sehr gut verträglich, bei topischer Anwendung wurden keine toxischen Wirkungen festgestellt. Von sehr grossem Vorteil ist es, dass die resistente Mutante Staphylococcus epidermidis DSM 3095 gegenüber dem von ihm produzierten Epidermin resistent ist. Der Stamm NCIB 11536 besitzt keine derartige Resistenz gegen das von ihm produzierte niedermolekulare Antibiotikum. Der neue Klon DSM 3095 wurde wie folgt gewonnen: Die Adaption wurde in 100 ml Erlenmeyerkölbchen¯mit einem seitlichen Einstich und 10 ml Nährlösung (Brain Heart Infusion) durchgeführt. Die Startkultur wurde mit 0,5 ml einer 12 Stunden alten Kultur angeimpft. Für die Kölbchen, die steigende Epidermin-Konzentrationen enthielten, dienten 0,5 ml der jeweils vorangegangenen, gutgewachsenen Kultur als Impfmaterial. Die Beurteilung des Wachstums erfolgte photometrisch bei 578 nm. Die Kultur, die bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml Epidermin in Flüssigkultur noch gut gewachsen war, wurde in Saline verdünnt und auf einer Platte, in die 0,5 mg/ml Epidermin eingegossen waren, ausplattiert. Als Vergleichswert wurde eine unverdünnte 12 Stunden alte Kultur des literaturbekannten Vergleichsstammes NCIB 11536 ausplattiert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 370C zeigten sich bei der auf.10 -6 verdünnten adaptierten Kultur 94 Einzelkolonien. Der unverdünnt auf 0,15 mg/ml Epidermin enthaltende Platten ausplattierte Vergleichsstamm wuchs auch nach 48 Stunden Inkubation nicht. Die resistenten Kolonien wurden selektioniert und auf Platten Medium 2 im Raster ausgestrichen. Nach einem Vortest auf Produktion durch Ausstechen von Stückchen mit 5 mm Durchmesser und Aktivitätstest auf Micrococcus luteus ATCC 9341 wurden produzierende Klone im Flüssigmedium getestet. Vergleich des resistenten Stammes mit dem literaturbekannten Stamm: a.) Minimale Hemmkonzentration im Plattendiffusionstest: Auf Testplatten mit den beiden Stämmen ergaben sich die in Tabelle 4 aufgeführten minimalen Hemmkonzentrationen. Tabelle 4: Minimale Hemmkonzentrationen von Epidermin im Plattendiffusionstest bei NCIB 11536 und DSM 3095. EMI30.1 Stamm <SEP> pg/ml <SEP> <tb> NCIB <SEP> 11536 <SEP> 10 <tb> DSM <SEP> 3095 <SEP> > <SEP> 1000 <tb> b.) Wachstum und Produktion: Wachstum- und Produktionsverlauf der beiden Stämme wurden in Nährlösung (3% Fleischextrakt, 2% Malzextrakt, 0,37% Ca(OH)2) verglichen. Siehe Abbildung 12. Wachstumsverlauf: Lebendkeimzahlbestimmung Produktionsverlauf: Aktivität gegen Micrococcus luteus ATCC 9341 im Plattendiffusionstest. Beim resistenten Stamm wird eine bessere Produktion beobachtet. c.) Empfindlichkeit gegen Epidermin in verschiedenen Wachstumsphasen: Die Versuche zur Eigenhemmung des Produzentenstammes durch das Antibiotikum und die Untersuchung auf Resistenz der selektionierten Klone wurden im Biophotometer (Eppendorf-Photometer mit Umlaufautomat) durchgeführt. Diese Versuche können z.B. im einzelnen wie folgt durchgeführt werden: Jeweils 0,5 ml einer 12 Stunden Kultur von Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 bzw. des selektionierten resistenten Stammes DMS 3095 wurden auf frisches Medium überimpft. Diese Kulturen liess man bis zu einer Extinktion von 0,043 bei 578 nm hochwachsen (Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm) und verteilte sie dann in Portionen zu 7,5 ml in die Küvetten des Biophotometers (Schichtdicke 2 cm). Die Dichte der Zellsuspension wurde im Biophotometer auf eine Transmission von 90% eingestellt. Die Inkubation erfolgte bei 37"C und maximaler Belüftung. Epidermin wurde als wässrige Lösung in unterschiedlichen Wachstumsphasen zugegeben. Bei beiden Stämmen wurden zu Beginn und in der Mitte der logarithmischen Phase unterschiedliche Epidermin-Konzentrationen zugegeben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 und 14 dargestellt. Mit den bis jetzt getesteten Konzentrationen konnte beim resistenten Stamm keine Lyse beobachtet werden. Das erfindungsgemässe Antibiotikum Epidermin übt, genauso wie die Kulturbrühe, aus der es isoliert wurde, eine bakterizide Wirkung aus, die zur Lysis der Zellen führt. Angesichts der bakteriziden Wirkung und des breiten Wirkungsspektrums gegen grampositive Bakterien ist das erfindungsgemässe Polypeptid-Antibiotikum Epidermin besonders wirksam bei der Behandlung von Infektionen, die durch grampositive Bakterien verursacht wurden. Epidermin ist besonders wertvoll für die Bekämpfung von Hautinfektionen, wie Ekzeme, Impetigo, Cellulitis und insbesonders Akne. Die sehr gute Wirksamkeit gegen einige wichtige Propionibakteriumacnes-Stämme wurde in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Es kann gesagt werden, dass Epidermin, welches normalerweise von Organismen, die die menschliche Haut besiedeln, erzeugt wird, bessere Aktivitäten zum Schutze der Haut ausübt als sonstige übliche Antibiotika. Die eingangs erwähnten pharmazeutischen Zubereitungsformen, die das erfindungsgemässe Antibiotikum zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen und Trägerstoffen enthalten, können der oralen, parenteralen, enteralen oder topischen Applikation dienen. Solche Zubereitungsformen, insbesondere aber topische Zubereitungsformen können als Lösungen, Emulsionen, Gele, Lotionen, Salben, Cremes oder Puder vorliegen. Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung solcher pharmazeutischer Anwendungsformen: Beispiel 2 Tinktur In 100 g Tinktur sind enthalten: Epidermin 1,0 g Ethanol (94,5 Vol.-%) 56,0 g 1,2-Propylenglykol 40,0 g Wasser demineralisiert 3,0 g Herstellung: Epidermin wird in dem Gemisch Ethanol/1,2-Propylenglykol/Wasser gelöst, die Lösung anschliessend sterilfiltriert. Beispiel 3 Lotio In 100 g Lotio sind enthalten: Epidermin 1,00 g 1, 2-Propylenglykol 7,00 g Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (Benzalkon A )) 0,15 g Sorbitanmonopalmitat (Span 40(R)) 0,40 g Sorbimacrogolpalmitat (Tween 40(R)) 1,20 g Ölsäuredecylester (Cetiol V(R)) 2,40 g Gemisch aus Cetyl- und Stearylalkohol (Lanette O(R) 1,60 g Cetylpalmitat 0,80 g demineralisiertes Wasser ad 100 g Herstellung: : Die vorgenannten Mengen an Alkyldimethylbenzylammonium Chlorid, Sorbitanmonopalmitat, Sorbimacrogolpalmitat, Ö1- säuredecylester, Cetyl- und Stearylalkohol und Cetylpalmitat werden in 75 ml Wasser eingerührt, die gefilterte Lösung von Epidermin in 1,2-Propylenglykol und dem restlichen Wasser wird dazugerührt und die Tinktur homogenisiert. Beispiel 4 Gel 100 g Gel enthalten Epidermin 1,0 g Polyethylenglykolether des Laurylalkohols (Brij 35(R) 1,0 g 1,2-Propylenglykol 5,0 g Acrylsäurepolymerisat (Carbopol 934 < R)) 1,2 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester 1,6 g p-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,4 g Parfüm q.s. Natronlauge ad pH 6,5 demineralisiertes Wasser ad 100 g Herstellung: Die vorgegebenen Mengen an Hilfsmitteln werden in 75 ml Wasser eingerührt; das Epidermin wird in dem Gemisch aus 1,2 Propylenglykol und dem restlichen Wasser gelöst und diese Lösung ebenfalls eingerührt; das fertige Gel wird nochmals homogenisiert. Legenden zu den Abbildungen: Abb. 1: Aminosäurenchromatogramm des sauren Totalhydrolysats von Epidermin; Ninhydrin-Färbung, ; = 570 nm. Abb. 2: Gaschromatogramm der N-Pentafluoropropionyl-amino säure-n-propylester des sauren Totalhydrolysats von Epidermin an Chirasil-Val. Temperaturprogramm 3 Min. 850C isotherm, dann 40C/Min. bis 200"C; Trägergas H2 (0,92 bar). Abb. 3: UV-Spektrum von Epidermin in Wasser, pH 3 (C=0,15 mg/ml). Abb. 4: Infrarot-Spektrum von Epidermin in einer Kalium bromidtablette. Abb. 5: 1H-Kernresonanzspektrum von Epidermin (20 mg/0,5 ml D7-Dimethylformamid, 400,16 MHz).. Abb. 6: 13C-Rernresonanzspektrum von Epidermin (40 mg/0,5 ml 12C, 2H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 45360 Pulse). Abb. 7: HPLC-Chromatogramm von Epidermin an p Bondapak C18 (300x3,9 mm). Mobile Phase: A=Acetonitril/ 0,01 M KH2PO4 (10/90), B=Acetonitril/ 0,01 M KH2PO4 (70/30); linearer Gradient von 10% B auf 100% B in 30 Min., Fliessgeschwindigkeit 2 ml/min. Abb. 8: 13C-Kernresonanzspektrum des Fragments P2 (12 mg/0,5 ml 12C, 2H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 38300 Pulse). Abb. 9: Isolierung von Epidermin. Abb. 10: Vergleich der Medien anhand Lebendkeimzahl (durch gezogene Linien) und Aktivität gegen Micrococcus luteus (gestrichelte Linien) Brain Heart Infusion O 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt 0,25% CaCO3 O 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt 0,37% Ca(OH)2 Abb. 11: Verlauf einer Fermentation im 10 l-Massstab o pH-Verlauf A Lebendkeimzahl O Aktivität gegen Streptococcus pyogenes ATCC 8668 Abb. 12: Vergleich von literaturbekanntem Stamm und re sistentem Klon DSM 3095 anhand Lebendkeimzahl (durchgezogene Linien) und Aktivität gegen Micro coccus luteus ATCC 9341 (gestrichelte Linien). O literaturbekannter Stamm K resistenter Klon Abb. 13: Epiderminzugabe in verschiedenen Wachstumsphasen bei Staphylococcus epidermidis NCIB 11536: Kurve 1: normaler Wachstumsverlauf Kurve 2: Zugabe von 10 pg/ml Epidermin zu Beginn der logarithmischen Phase führt zur Lyse. Kurve 3: Zugabe von 10 pg/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen Phase führt ebenfalls zur Lyse. Kurve 4: Zugabe von 2,5 pg/ml Epidermin in der Mit te der logarithmischen Phase führt zur Wachstums verzögerung. Abb. 14: Epiderminzugabe in verschiedenen Wachstumsphasen beim resistenten Klon DSM 3095 Kurve 1: normaler Wachstumsverlauf, identisch mit dem Stamm NCIB 11536. Kurve 2: Zugabe von 120 pg/ml Epidermin zu Beginn der logarithmischen Phase ergibt nur eine geringfü gige Wachstumsverzögerung Kurve 3: Zugabe von 360 pg/ml Epidermin in der Mit te der logarithmischen Phase führt auch hier nur zu einer Wachstumsverzögerung. Abb. 15: Gaschromatogramm des N-Pentafluoropropionyl-amino säure-n-propylester eines Totalhydrolysats von H1 an Chirasil-Val. Temperaturprogramm 3 Min. 800C isotherm, dann 40C/Min. bis 2000C, Trägergas H2.

Claims: Antibiotically active polypeptide known as epidermin, characterised by the following amino acid composition: Asn (1), Pro (1), Gly (2), Ala (2), Ile (2), Phe (2), Lys (2), Lan (2), β-Me-Lan (1), Dhb (1), Tyr (1), S-(2-aminovinyl)-D-cysteine (1) with the following primary structure: whilst the halves of the individual thioetheramino acids closer to the N-terminus are of D configuration. Epidermin as claimed in claim 1, characterised by the following additional parameters: 1. Nature: colourless powder; 2. Solubility: very readily soluble in mixtures of water/glacial acetic acid or methanol/glacial acetic acid, soluble in lower alcohols, insoluble in chloroform, acetone, diethyl ether, petroleum ether; 3. Colour reaction on silica gel plates: Ninhydrin, chlorine/TDM [TDM=4,4'-bis-(dimethylamino)diphenylmethane], orcin/sulphuric acid, anisaldehyde/sulphuric acid. Non-destructive detection in UV light at 254 nm and by spraying with water; 4. Thin layer chromatography: ready-made silica gel plates 60 F₂₅₄ (Merck) were used. System A: chloroform/methanol/17% ammonia (2/2/1), R F = 0.73 System B: chloroform/methanol/17% ammonia (70/35/10) R F = 0.30 System C: n-butanol/glacial acetic acid/water (4/1/1) R F = 0.05 5. HPLC: see Fig. 7. 6. Stability: stable from pH 2 to pH 7, but a sharp drop in activity occurs at higher pH values; 7. Molecular mass: in the region of 2160 (without anions); 8. Ultra-violet absorption spectrum: in aqueous solution, long-wave maximum at 267 nm (Fig. 3); 9. Infra-red absorption spectrum: IR spectrum of a sample in a potassium bromide tablet (Fig. 4); 10. Nuclear magnetic resonance spectra ¹H-NMR spectrum: Fig. 5, ¹³C-NMR spectrum: Fig. 6. Process for preparing, isolating and purifying the antibiotic epidermin, as claimed in claims 1 and 2, characterised in that Staphylococcus epidermidis DSM 3095 is grown aerobically at 34-37°C in a complex nutrient solution consisting of 2-4% of a nitrogen source such as meat extract, 1-3% of a sugar or sugar alcohol as the source of carbon and 0.25 to 1% of a carbonate and/or 0.25 to 0.5% of a hydroxide of an alkaline earth metal, then, after removal of the cells and inorganic salts, in order to isolate the active substance formed, the culture liquor is either extracted with n-butanol at pH 8, the butanol extract is evaporated, the residue is dissolved in methanol and the solution is freed from lipid contaminants by ether precipitation or it is treated with polymers based on acrylate or polystyrene, whilst the adsorbed epidermin is released from the resin with methanol/concentrated hydrochloric acid (99:1), the solution is then neutralised with ammonia and concentrated by evaporation in vacuo , and the isolated material thus obtained is subjected to gel chromatography [Sephadex LH-20 with methanol/acetic acid (95:5)] in order to separate off other low-molecular weight peptides, amino acids and salts, and then subjected to multiplicative countercurrent distribution according to Craig, in which first a liquid-liquid distribution is effected using a system of n-butanol/ethyl acetate/0.1 N acetic acid (3:1:3) in which epidermin is left on the baseline, and subsequently in a second distribution using the neutral system 2-butanol/0.05 N ammonium acetate (1:1), the pure epidermin is isolated as a colourless powder from the eluate by freeze-drying. Process as claimed in claim 3, characterised in that, as nitrogen source, 2-4% by weight of a meat extract, a mixture of all 20 amino acids in amino acid concentrations of 2 g/l, or 2 to 4% by weight of casamino acid in the presence of tryptophan, and as carbon source 1 to 3% by weight of malt extract, maltose, galactose, lactose, mannitol, glucose, glycerol or combinations of lactose with maltose, or galactose with maltose, and 0.25 to 1% by weight of calcium carbonate or 0.25 to 0.5% by weight of calcium hydroxide are introduced into the fermentation medium and, if casamino acid is used, vitamins such as biotin, nicotinic acid, thiamine, pyridoxine.HCl and calcium pantothenate are added, the pH value is adjusted to 6.0 to 7.0 before fermentation and the course of production is monitored by continuous sampling. Epidermin obtained by the process claimed in claim 3. As a new epidermin-producing strain which is resistant to epidermin, Staphylococcus epidermidis DSM 3095. Staphylococcus epidermidis DSM 3095 with the following characteristics: Gram coloration : positive Cell size : 0.5-0.8 µm in diameter Colony size : about 1 mm in diameter Appearance of colonies : smooth, glossy, slightly raised in the centre Colour of colonies : greyish-white Cells in culture : often single cells or groups of two, seldom larger clumps Haemolysis : cultures spread on blood slides showed strong haemolysis Anaerobic growth : the strain grows even under anaerobic conditions Lysozyme sensitivity : the cells are resistant to lysozyme in quantities of up to 2 mg/ml Lysostaphin sensitivity : the cells are sensitive to lysostaphin even in quantities of 20 µg/ml Epidermin resistance : demonstrated up to 1 mg/ml Other resistances : in liquid culture the strain shows a marked resistance to Streptomycin (up to 1 mg/ml) and Spectinomycin (0.5 mg/ml) Increased NaCl content : the strain still grows well with a sodium chloride content of up to 15% by weight, the colonies or the spread-out cultures being adhesive. Antibacterial pharmaceutical preparations, characterised in that they contain epidermin as claimed in claims 1 and 2 together with conventional carriers and/or excipients. Epidermin for use as an antibacterial agent.

Inventors: ALLGAIER, HERMANN, DR. DIPL.-CHEM., JUNG, GUENTHER, PROF. DR., SCHNEIDER, URSULA, WERNER, ROLF-GUENTHER, DR. DIPL.-MIKROB, ZAEHNER, HANS, PROF. DR., Jung, Günther, Prof. Dr., Werner, Rolf-Günther, Dr. Dipl.-Mikrob, Zähner, Hans, Prof. Dr.
Applicants: DR. KARL THOMAE GMBH
Application year: 1985
Main classification: C07K7
IPC codes: A61K35, A61K38, C12P21, C07K14, C12N1, A61K8, C07K7, C12R1, A61Q17, A61P31, A61Q19