EXPRESSION AND EXCRETION OF POLYPEPTIDES IN EUCARYOTES UNDER THE CONTROL OF AN ADENOVIRUS PROMOTER

Abstract: Recombinant DNA modified by a nucleotide sequence coding for a specific polypeptide sequence whose expression is sought, this recombinant DNA being suitable for the transformation of eukaryot, especially human or animal, cell lines whose endogenic polymerases are capable of recognising adenovirus promoters. The DNA according to the invention is more particularly characterised in that the said nucleotide insertion sequence is placed under the direct control of the early promoter of the E1A region of the adenovirus genome.

Description: ADN recombinant comportant une séquence nucléotidique Cg- dant Pour un polvpeptide déterminé sous le contrôle d'un Promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet ADN recombinant, cellules eucaryotes transformées par cet ADN recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment à la constltution de vaccins. L'invention concerne un ADN recombinant comportant une séquence nucleotidique codant pour un polypeptade détermine sous le contrôle d'un promoteur d'adenovirus, ces vecteurs contenant cet ADN recombinant et des cellules eucaryotes transformees par cet ADN recombinant, les produits d'excretion de ces cellules transformées et leurs applications, notamment à la constitution de vaccins. Les adénovirus humains possédent un long génome 'environ 36.000 pb) linéaire et double brin qui code pour au moins 30 protéines. Le cycle viral, au cours de l'in ection de cellules permissives, est divise en deux pha es, precoce et tardive. Il est connu que les quatre régions du aenome viral exprimée en phase précoce sont appelees regions ti, E2, E3 et E4, dont les positions respectives dans le genome viral entier sont schematiquement representées dans la fig. 1. La région s1, située a l'extrémité gauche du génome, est elle-meme divisee en deux renions E1A et E1P. Le passage de la phase précoce à la phase tardive, marque par la replication du DNA viral, est caractérisé par un changement brutal du programme génétique du virus. L'expression de certains gènes précoces est reprimee alors que la transcription des genes tardifs s'effectue principalement a partir d'un seul promoteur, le promoteur mateur tardif (fig. 1). De plus, on observe un forte répression de 'a synthèse des pro téines de la cellule hote (1). L'organisation génétique des adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad2, Ad5) est suffisamment connue pour que 1'on puisse manipuler leur génome in vitro et son utilisation comme vecteur d'expression d'un gène étranger dans une cellule animale en culture a déjà été envisagée. Il est en effet connu que la région E3, qui représente 6 % du génome, n'est pas essentielle ±fl vitro et peut donc être substituée dans sa totalité (2). La taille du tragment de DNA etranger qu'il est possible d'insérer dans le genome de ces virus est grande. En effet, le virus peut encapsider un genome dont la longueur excède de 5 ei celle du genome sauvage. Différents vecteurs dérivés des adénovirus de type 2 ou 5 ont donc été construits. Dans ces recombinants, le gene etranger etait exprimé sous le contrôle du promoteur majeur tardif. Ceci a permis d'obtenir dans certains cas une synthèse de la protéine codée par un gène étranger à un niveau comparable à celui des proteines virales tardives (4, 5, 6, 7). Ceci étant, il résulte de ce qui precede, que l'expression du gene étranger sous le contrôle du promoteur tardif ne peut se manifester que dans la phase tardive du cycle viral. L'invention decoule de la constatation que le promoteur de la région précoce ElA du génome d'un adenovirus (ci-apres desicne simplement par "promoteur E1A") pouvait contrôler de façon particulièrement efficace l'expression d'un gène htrologue (c'est-à-dire étranger vis-a-vis des aenes qui lui sont normalement associes dans 3 'adénovirus) ou plus genéralement d'une séquence nucléotidique Plétéro- logue codant pour une sequence polypeptidique dont l'expression est recherchee. En d'autres termes, le promoteur E1A se comporte comme un promoteur fort, et ce plus particulièrement lorsque l'ensemble promoteur ElA-séquence codante héterologue est inséré dans un vecteur viral. L'invention concerne donc de façon générale un ADN recombinant pour la transformation de lignées cellulaires eucaryotes, notamment humaines ou animales , choisies parmi celles qui sont infectables par des adénovirus ou dont les polymérases endogènes sont susceptibles de reconnaitre les promoteurs des adénovirus, cet ADN recombinant étant en outre modifié par un acide nucléique d'insertion contenant une séquence nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique dont J 'expression dans lesdites lignées cellu Paires est recherchee. Cet ADN recombinant est plus parti- culièrement caractérisé par le fait que ladite séquence d'insertion est placée sous le contrôle direct du promoteur précoce de la region E1A du génome d'un adenovirus. De preference, cet ADN recombinant est incorporé dans un vecteur réplicable dans lesdites lignees cellulaires ou associé par recombinaison génétique avec un tel vecteur. S'agissant d'un vecteur virai, notamment de celui derivé d'un adénovirus, on peut alors également bénéficier de l'avantage s'attachant à la région E1A des adénovirus, a savoir que son expression est constitutive et permanente tout au long du cycle viral (8, 9). tUne forme particuliere préférée de J'kDN recombinant selon l'invention est caracterisée par le, fait qu'elle comporte, en aval de l'acide nucléique d'insertion, dans le sens de la transcription, un genome défectif d'adénovirus comprenant néanmoins l'ensemble de celles des sequences essentielles nécessaires à la réplication de l'adenovirus correspondant, qui sont normalement situées en aval des genes normalement sous le contrôle direct du promoteur précoce ElA dans ledit génome. Xvanta-cusement, le génome défectit d'adénovirus avec lequel l4ADN recombinant conforme à l'invention est associé, est constitué par un génome complet d'adénovirus, cependant dépourvu de la partie antérieure de la région ElA du génome viral, notamment de son fragment 0-2,6 a"" (pourcentage exprimé par rapport à la taille totale du génome de l'adénovirus). Les ADNs recombinants de l'invention, associés avec des éléments de vecteurs tels que ceux qui ont été mentionnés ci-dessus, constituent en fait des vecteurs contenant lesdits ADNs recombinants. Il sera encore en ce qui les concerne fait référence à des "virus recombinants défectlfs", lorsque les éléments de vecteurs associes à I 'AtN-recombinant selon l'invention seront derivés d'une genome défectif d'adenovirus. Ces virus recombinants défectifs sont avantageusement utilisés pour la transformation dc lignées cellu'aires transformables d'eucaryotes superieurs (notamment d'origine humaine ou animale) comportant elles-mémes une sequence distincte de nucléotides apte à complémenter la partie du génome de l'adénovirus dont le susdit vecteur est dépourvu, ladite sequence distincte entant de préférence incorporée au genome des cellules de ladite lignée cellulaire. A titre d'exemple préféré de telles lignees cellupaires, on mentionnera la lignée 293, lignée de rein embryonnaire humain qui contient, intégrés dans son génome, les onze premiers pourcents de l'extrémité gauche au gnome d'un Ad5. Ceux-ci permettent de complémenter des virus recombinants defectifs qui portent des délétions de cette reaion (10). L'utilisation de ces systemes vecteur virus défectif recombinant - cellules contenant une séquence capable de complementer les virus recombinants defectifs, est d'un intérêt tout particuller, lorsque la séquence nucléoti- dique contenue dans l'acide nucléique d'insertion de l'ADN recombinant code pour une protéine qui, lorsqu'elle est exprimée dans un hôte cellulaire naturel sous le contrôle de son promoteur naturel, est excrétée dans le milieu d'une culture de cet hôte cellulaire naturel. Le gène S du génome du virus de l'hépatite B constitue a cet égard une séquence nucléotidique d'un intérêt particulier, et ce pour plusieurs raisons. D'une part1 le produit d'expression du gène S dans les cellules qui l'ex- priment, l'HBsAg (11, 12), est secrété dans le surnageant cellulaire sous forme de particules faciles à détecter et à quantifier par dosage radioimmunologique, ce qui permet une évaluation précise de la capacité d'expression du vecteur viral. D'autre part, l'invention fournit un vecteur viral recombinant permettant l'étude de l'expression des génes de l'HBV tant au niveau de la transcription que de la traduction, ce qui est d'autant plus interessant qu'il n'existait pas 3usqu'â ce jour de système de culture cellulaire capable de propager le virus de l'hépatite B (HBV). Enfin, l'infection cellulaire par le virus recombinant adénovirus-HBV illustre de façon particulièrement avantageuse la base méthodologique d'un procédé de fabrication d'un vaccin contre un agent pathogène détermine (en l'occurrence le virus de l'hépatite B dans l'exemple con sidére). Une autre séquence nucléotidique du génome du virus de l'hepatite B d'un intérêt particulier est le cene E muni de sa région pré-S2 qui code pour l'antigène HBs et pour un recepteur de la sérumalbumine humaine polymerisée (pHSA)(25),(26). Il va de soi que l'on peut substituer dans l'ÂDN recombinant le gene S par toute autre séquence nucleotidique codant pour un antigène protecteur distinct contre un autre agent pathogene déterminé, surtout lorsque cet antigène protecteur distinct est lui-même normalement susceptible d'être secrété par les cellules transformées par l'ADN recombinant. Il va de soi également que l'on peut substituer dans l'ADN recombinant le gène S et la région pré-S2 par toute autre séquence nucléotidique codant pour un antigene protecteur distinct contre un autre agent pathogene déterminé, surtout lorsque cet antigène protecteur distinct est lui-même normalement susceptible d'être sécrété par les cellules transformées par 1'ADN recombinant. La séquence nucléotidique codant pcur cet antigène protecteur distinct peut d'ailleurs éventuellement être insérée dans l'ADN recombinant en phase avec un autre gène, par exemple l'antigène HBsAg, dès lors que cet autre gène peut être utilisé comme "lo comotive" pour promouvoir 3'excrétion également de cet antigène distinct, notamment sous forme de protéine hy' bride. Au titre des antigenes distincts susceptibles d être ainsi produits (le cas échéant sous forme de protéine hybride), on mentionne par exemple des glyco- protéines de structure du virus d'Epsteim-Barr. Les premiers nucleotides de la séquence nucléo tidique codant pour un polypeptide déterminé (protéine "simple" ou hybride) sont placés, notamment par construc tion aussi près que possible de ce promoteur, notamment de la "boite TATA" (TATA box), caractéristique du promoteur, étant cependant entendu que la séquence nucléotidique entre le promoteur et l'ATG initiateur de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide déterminé devra en general contenir les triplets codant pour l'extrémité 5 non traduite de lARN messager correspondant normalement a la séquence codante et contenant les séquences d'appariement aux ribosomes nécessaires à une traduction efficace. Cette extrémité 5' non traduite de l'ARN messager peut d'ailleurs être remplacee par l'extrémité 5' non traduite d'un ARN messager distinct de celui norma liement associé a une séquence codante déterminée. Par exemple, on peut, dans le cas du gène S, remplacer l'ex tSémlté 5' non traduite contenant le gène pré-S ou joux tcnt celui-ci par l'extrémité 5' non traduite de l'ARN messager de l'antigène T de SV40. Mais on a aussi remarqué que lorsqu'on utilise une séquence d'ADN contenant lés régions S et pré-S2 du génome du virus de l'hépatite B sous le contrôle du promoteur fort E7A, il est possible d'obtenir les expressions à la fois de la région pré-S2 et de la région S. Toute autre extrémité 5' non traduite d'ARN messager peut être utilisée, dès lors qu'elle est compatible avec l'autre extrémité similaire choisie. Il est avantageux que la distance entre la boite TATA du promoteur et le site d'initiation de l'ARN mes sager soit d'environ 30 nucléotides. Le promoteur E1A de l'ADN recombinant selon l'in- vention et encore plus généralement le vecteur selon l'invention mettant en oeuvre des parties plus importantes du génome d'un adénovirus sont de préférence issus d'un adénovirus appartenant à la catégorie C, telle qu'elle a été definie par TOOZE. Ces adénovirus ont la propriété connue de 'étire pas oncogènes. Les sous-types Ad2 ou Ad5 de cette categorie d'adénovirus se caractérisent par un pouvoir transformant important. L'utilisation de ce dernier type d'ADN recombinant est donc particulièrement recommandée, lorsque le produit d'expression recherché est destiné a la production d'antigènes protecteurs, notamment de principes actifs de vaccins. Cela sera encore d'autant plus vrai dans le cas où des adenovirus entiers, et méme infectieux, seront utilisés comme principes actifs de vaccins vivants, notamment dans les conditions qui seront encore explicitées plus loin. L'invention concerne naturellement également les lignees cellulaires, notamment d'origine humaine ou animale, qui sont transformées par des ADN recombinants tels que définis ci-dessus et qui ont été rendues capables de synthétiser un polypeptide codé par la séquence nucléotidique (ou lesdites séquences nucléotidiques) contenues dans ces ADNs recombinants et placées sous le contrôle direct dudit promoteur. L'invention concerne plus particulièrement encore les lignées cellulaires transformées avec un ADN recombinant conforme à l'invention et en outre caractérisées en ce que les cellules de ces lignées cellulaires contiennent elles-me mes une séquence distincte de nuclëotides alites à complémenter la partie du génome de l'adénovirus dont le susdit vecteur est dépourvu, ladite séquence distincte étant de préférence incorporée au génome des cellules de ladite )ignée cellulaire. A ce titre, la lignée 293 déjà mentionnée plus haut, après avoir été transformée par les ADNs recombinants, constitue une culture cellulaire préférée selon l'invention. Grâce à la sequence de complémentation que contiennent les cellulles de cette lignée, on observe une multiplication virale importante à l'intérieur de ces cellules et, par voie de conséquence, une expression également multipliee de la séquence codante pour le polypeptide prédéterminé. Dans le premier cas ou cette sequence codante est le gène S, on obtient une production importante d'antigènes HBsAg excrétés dans le milieu de culture de ces cellules. Dans le second cas où les se- quences codantes sont constituées par le gène S et la region pré-52 du virus de l'hépatite B, l'adénovirus recombinant dirige in vitro la synthèse des particules HBsAg possédant une activité de récepteur pour la pHSA. Injecté à des lapins, ce virus recombinant produit des anticorps anti-HBsAg et anti-pHSA. Ceci montre la possibilité d'utiliser' un adénovirus recombinant pour exprimer un gène à la fois in vitro et in vivo. Les mêmes vecteurs peuvent être utilisés pour la transformation de cellules Vero dans des conditions analogues. Les vecteurs contenant l'ADN recombinant selon l'invention peuvent également etre utilisés pour la transformation de cellules ne possédant pas elle-meme la séquence de complémentation dans les conditions qui ont été indiquées ci-dessus. Il pourra alors être nécessaire de procéder a une co-transformation de ces derniers types de cellules, d'une part, avec un vecteur contenant 1'ADN recombinant selon l'invention, d'autre part, avec un adénovirus non défectif ou un ADN recombinant distinct contenant les séquences d'adénovirus dont est dépourvu le vecteur recombinant conforme à l'invention. Il pourra certes être observé dans ce dernier cas une production simultanée d'antigènes HBsAg (lorsque la séquence codante conrlcnt le gene S) et de l'adénovirus repliqué et libère par les cellules ainsi transformées. L'antigène protecteur formé peut cependant, le cas échéant, être séparé de la suspension virale, par exemple par mise en contact du ;lieu de culture avec des anticorps anti-adénovirus, de préférence immobilisés sur un support solide, tel que l'agarose réticulée, commercialisée sous la désignation eLPHAROSo. De toute façon, la présence de quantités résiduelles de virus dans la préparation vaccinante n'est que d'une importance relativement mineure. En effet l'adénovirus n'a qu'un pouvoir pathogène faible chez l'homme. Il n'entraîne que des infections respiratoires benignes. La faible importance du pouvoir pathogène des adenovirus, plus particulièrement de ceux qui appartienent au groupe C des acénovirus humains, permet d'envisager la constitution de "vaccins vivants". Ceux-ci peuvent être constitués par des adénovirus infectieux modifiés au niveau de la région E3 par l'insertion de l'ADN recombinant selon l'invention dans la partie non essentielle de l'adenovirus. A cet égard, il faut souligner le fait que les adenovirus humains du groupe C ne se sont jamais révélés tumorigènes chez l'animal (3). Ces vecteurs ou virus seront d'un intérêt tout particulier pour la transforma tion de cellules Vero, dont le caractère non tumorigéne est maintenant solidement établi. De ce fait elles constituent une lignée d'origine animale particulièrement favorable à la production de produits à usage humain. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de constructions préférées de vecteurs contenant l'ADN recombinant selon l'invention et des conditions dans lesquelles ces vecteurs sont utilisables. Il sera fait référence à cette occasion aux dessins dans lesquels - la-f-ig. 1 représente schématiqVement les positions relà- tives des différentes régions du génome d'un adénovirus du sous-type Ad5, d'une part, et à échelle agrandie, de la région E1A de ce génome - la fig. 2 est un schéma désormais classique du génome du virus de l'hépatite B - les fig. 3 a 6 montrent les constructions successives qui ont conduit à la réalisation d'un plasmide contenant un premier ADN recombinant conforme à l'invention (fig. 61 et - la fig. 7 représente schématiquement )a construction d'un "virus recombinant ,défectif" à partir du plasmide modifié de la fig. 5 et de génomes défectifs de Ad5. On fera d'abord les observations suivantes à propos des figures, avant de décrire la réalisation de constructions d'ADNs recombinants selon l'invention. Dans les iig. 3 à 6, les parties en trait fin correspondent à des séquences du plasmide pML2. Les nombres apparaissant dans les fig. 1 à 5 in diquent les positions des sites de restriction dans les séquences virales Ad5, SV40 et HBV. Les numérotations des positions des sites de restriction de Ad5 et du SV450 sont celles de J. TOOZE (1), celles de l'HBV sont celles de P. TIOLLAIS et al. (11 > . Les raturations des désignations de sites dans les dessins témoignent de la présence antérieure des memes sites dans les parties correspondantes des ADNs qui seront décrits ci-après. Ces sites ont cependant été délétés, supprimés par réparation dts extrémités cohésives des fragments ouverts ou fragmentés à l'aide des enzymes de restriction correspondasntes, ou par tout autre moyen tel qu'envisagé dans la description qui suit des constructions qui ont été faites. 1. RaPpel des principaux éléments de la structure et de l'organisation du génome de l'adénovirus Ad5 (ci-après souvent simplement désigné par la désignation Ad5) Ils résultent des parties lA et 1B de la fig. 1. iA : Le génome est une molécule de DNA linéaire double brin longue d'environ 36.000 pb. Les flèches in diquent la position et le sens des transcriptions des régions précoces Ela, Elb, E2, E3 et E4. Le promoteur majeur tardif PMt et l'unité de transcription qui lui est associée sont également montrés. Les numérotations de 10 en 10, de O à 100, correspondent à des tailles exprimées en % de la taille du génome total. n a La région ElA. Les transcripts de cette région ont tous des extrémites 5'P (position 499) et 3'OH (posi tion 1632) identiques. Le premier T de l'élément TATA du promoteur est situé à la position 468. Les sites de restriction utilisés dans les constrructions des plasmides sont indiqués. Les tailles sont exprimées par des nombres de paires de bases. 2. Orlaine des fragments contenant le aène S ou le sente S et la région pré-S2 utilisés dans les constructions sui suivent. 1 cas : Fragment du génome du virus de l'hépatite B contenant le gene S. Il est issu du génome du virus de l'hépatite B cfig. 2). Il est rappelé que le génome du virus de l'hépatite B est une molécule de DNA circulaire partiellement simple brin. Sa longueur est d'environ 3.200 pb. Il est constitué par l'appariement de deux brins de longueur inégale appelés brins L(-) et S(+). Le gène S représente la séquence codante du polypeptide majeur de l'enveloppe virale qui porte 1'HBsAg. Le fragment d'ADN utilisé dans les constructions ci-apres est le fragment Xh01127-Bg1111984. Le site de polyadénylation du messager de l'HBsAg a été localisé à la position 1916. cas Fragment du génome du virus de l'hépatite B contenant le. gène S et la région pré-S2., Le fragment d'ADN utilisé est le fragment Mst113161-Bg 1111982 qui code à la fois pour l'antigène HBs et pour un récepteur de la sérumalbumine humaine polymérisée (pHSA). Le site MstII précède le codon d'initiation de la région pré-52 de 9 nucléotides. Le site BglII est situé à 64 nucléotides en aval du signal de poly A addition du géne S (de l'anglais "poly A addition signal"). Il est question dans ce qui suit de la construction et de la propagation d'un adénovirus recombinant comportant le gene S. Le mode opératoire est identique. pour obtenir un adénovirus recombinant, conforme à l'invention, possédant le gène S et la région pré-52, étant entendu que, dans ce second cas, c'est le fragment d'ADN MstII-BglII qui est inséré entre les sites de restriction HindIII et BamHI du plasmide pK4, à la place du fragment d'ADN XhoI-BglII dont il est question ciaprès. On désignera dans ce qui suit par Ad5(X-B) l'adenovirus recombinant possédant le gène S et par Ad5(M-B) l'adénovirus recombinant possédant le gène.S et la région pré-S2. 3. Construction du Plasmide pE1A(TaqI) (fiq 3). Le plasmide pE1A(TaqI) contient les 632 premiers nucléotides de l'extrémité gauche du génome de 1'Ad5. Ce fragment a été obtenu par coupure du fragment de restriction purifié SacI E (O - 5,0 ') de l'Ad5 par TaqI (fig. 1). Ce fragment a été inséré entre les sites de restriction EcoRI et ClaI du plasmide pML2 (fig. 3) Le plasmide pML2 a été ouvert par EcoRI et ClaI. Le fragment de Ad5 a été lié au plasmide linéarisé au niveau de l'extrémité Taxi. La jonction des extrémités Taqi-Clal recrée un site de restriction ClaI. L'extrémité EcoRI du recombinant a été réparée avec la DNA-polymérase I de E. coli (fragment de Klenow) et le plasmide recircularisé au moyen de la ligase T4. Le site EcoRI a donc été reconstitué. 4. Fabrication du plasmide pAB1 (fig 4) Le plasmode pAB1 a été construit à partir du plas mide pEIA(TaqI), de façon à éliminer la partie codante de la région E1A. Ceci a été effectué par isolement du frag- ment PvuII-PvuII (positions 452-623), coupure de ce rag- ment par l'enzyme HaeIII (position 495), reinsertion du fragment PvuII452-HaeIII495 au niveau du site PvuII623 du plasmide pE1A(TaqI). En d'autres termes, le fragment HaeIII495-Pvu623 a eté délété. Le plasmide pAB1 contient un site HindIII proche du site d'initiation de transcription de la region E1A et un site BamEI (de pML2) situé a distance. Ce deux sites de restriction peuvent cotre utilises pour cloner des genes étrangers sans qu'il y alt fusion génétique. 5. Production du plasmide pKr (fig 5). pAb1 a été coupé par HindIII et BamHI et le frag- ment contenant le promoteur de E1A, issu de pAB1, a été lié, au niveau de son extremite BamHI au fragment BglI-BamHI (positions 5235-2533 du genome du virus SV40) ci-après dénommé A(SV40) contenant le gène codant pour les antigènes T et t du virus SV40. Après réparation des extrémités BglI et HindIII du reconstituant par le fragment de Kleenow, le plasmide est recircularisé au moyen de la ligase T4. La construction présente dans le plasmide pK4 a été testée en mettant en jeu l'expression transitoire du gene T. Introduit dans des cellules HeLa par transfection selon la technique au phosphate de calcium (19), le plasmide pK4 dirige la synthèse de l'antigène T de SV4O qui a été détectée par immunofluorescence. Environ 1 t. des cellules transfectées présentaient une fluorescence nette. L'absence de fluorescence après transfection cellulaire par un plasmide covenant le fur agent de SV4O inséré dans la mauvaise orientation montre que le gène des antigènes T et t est bien placé sous le contrôle du promoteur E1A de l'Ad5. C'est le site HindIII, à la position 5171 du fragment A(SV40) qui est ensuite utilisé pour substituer le susdit fragment contenant le gène S à la majeure partie de ASSV40). 6. Production du Plasmide PK4S (X-B)(fiq. 6). Le plasmide pK4 a été digéré par HindIII et BamHI. Le fragment XhoI-BgilI (positions 125 à 1982) du génome du virus de l'hépatite B (HBV) (fig. 2) a été inséré, en lieu et place de la majeure partie de A(SV40) entre les sites de restriction HindIII et BamHI du plasmide pK4, après ri- paration de leurs extrémités respectives par la DNA polymérase I d'E. coli (fragment de Kleenow) (fig. 3). Les sites de restriction XhoI, HindIII, BamHI et BglII sont perdus après ligature. Le site HindI,I était situé à 8 nucléotides en amont de l'ATG initiateur des antigènes T et t. L'insertion du gène S dans ce site permet donc de conserver l'extrémité 5 du mRNA précoce de SV40 contenant le site de lapping et les séquences d'appariement du messager aux ribosomes. Le fragment de DNA HBV contient la séquence codante ou gène S (position 155 à 833) du polypeptide majeur de l'enveloppe virale porteur de l'HBsAg ainsi que la séquence située en 3' du gène S et qui inclut le site de polyadénylation de l'ARN messager de l'HBsAg à la position 1916 (20, 21, 22). Deux plasmides pK4S+ et pK4S porteurs du fragment HBV inséré daneules deux sens ont été isolés. Des cellules 293 ont été transfectées par ces deux plasmides et la synthèse d'HBsAg a été recherchée dans le surnageant cellulaire 3 jours après la transfection. Seul + le plasmide pi'4S qui possède le promoteur ElA Åa l'extré- mité 5' du gene S est capable de diriger la synthèse d'HBsAg. Ceci montre que l'expression du gène S est bien sous le contrôle du promoteur E1A de l'Ad5. Finalement, un site de estriction ClaI non méthylé dans E. coli a été introduit dans le plasmide pK4S+ (X-B) au niveau du site NruI de la séquence pML2. Le site est nécessaire à la construction du virus recombinant. C'est finalement le fragment délimité par des ex trémités PstI et ClaI, et obtenu à partir de p4S+ (X-B), qui a été utilisé pour la fabrication d'un "virus recombinant défectif" conforme à l'invention. 7. Construction du virus recombinant défectif (fig 7) 3 microgrammes du fragment de restriction Pstl-ClaI purifié à partir du plasmide pK4S+ (X-B) ont été ligaturés à 20 microgrammes du fragment de restriction Clal (2,6 's - 100 %) de l'Ad5 purifié par ultracentrifugation en gradient de saccharose pour fournir le "virus défectif recombinant" Ad5. 8. Propagation du virus recombinant. Les cellules 293 ont été cultivées dans des boîtes de 6 cm de diamètre. 4 heures avant la transfection le surnageant de culture a été remplacé par du milieu. 5 boites de cellules 293 à 70 % de confluence ont alors été transfectées avec le mélange de ligation selon la technique au phosphate de calcium puis incubées pendant-4 heures à 37'C. Après adsorption, les cellules contenues dans chaque boite ont été lavées avec 2 ml de tampon TS (NaCl 8000,0 mg/l, KCl 380,0 mg/l, Na2 HPO4 100,0 mg/l, CaCl2 100,0 mg/l, MgCl2, 6H20 100,0 mg/l, Tris 3000,0 mg/l pH 7,4), traitées avec 400 microlitres d'une solution TS contenant 20 -0 de glycérol pendant 1 minute à température ordinaire, lavées deux fois avec 2 ml de tampon TS, puis recouverte avec 4 ml de milieu MEM contenant 1 \ d'agar noble, 1 . de sérum de veau foetal. Aux jours 4 et 7, les cellules ont été recouvertes avec 4 ml du mélange nutritif. Auiour 10, les cellules ont été colorées avec 4 ml du milieu nutritif supplémenté avec 0,01 t de rouge neutre. Les plages ont été observées au jour Il. Les virus ont été resuspendus dans 1 ml de TS et amplifié sur cellules 293. La présence de HBsAG dans le milieu de culture a été testée par RIA (Austria II, laboratoire ABBOTT). Après amplification, la presence de séquences HBV dans le recombinant a été testée par hybridation. Cinq plages ont été analysees. Une seule contrenait un virus recombinant HBsAg . Ce clone Ad5(X-B) ainsi qu'un autre clone étaient positifs pour la détection de séquences HBV. La taille du génome viral recombinant excède celle du virus sauvage de 2100 pb. Aucune délétion n'a pu être détectée par analyse de fragments de restriction du génome recombinant. Par ailleurs, cette analyse a montré que les séquences du pML2 situées entre le site de restriction PstI et la séquence d'Ad5 ont été correctement excisées au cours de la propagation du génome recombinant dans la lignée 293. 9. La synthèse d'HBsAq dirigée par le vecteur Ad5(X-B). Des cellules 293 et des cellules Vero ont été infectées par le virus Ad5(X-B). Les niveaux d'expression de HBsAg synthétisé sont montrés dans le tableau 1. Des échantillons du surnageant cellulaire ont été prélevés 3 jours après l'infection et l'HBsAg a été recherché par essai radioimmunologique ("radio-immunoassay : RIA). Les résultats montrent que le vecteur Ad5(X-B) est capable de diriger la synthèse d'HBsAg dans ces deux lignées cellulaires, et l'excrétion d'HBsAg par les lignées cellulaires dans'leurs milieux de culture respectifs. L'HBsAg synthétisé a été purifié par ultracentrifugation en CsCl, Il a une densité de 1,20. Des particules typiques de 22 nm ont été observées par microscopie électronique. 10. Synthèse d'HBsAs dirigée Par les vecteurs Ad5(M-B). Les niveaux d'expression de l'HBsAg synthétisé après l'infection de cellules 293 et de cellules Vero par Ad5(M-B) sont montrés dans le tableau I. La cinétique de la distribution extra- et intracellulaire de HBsAg à partir de cellules Vero infectées par Ad5(M-B) a indiqué que la synthèse d'HBsAg a commencé 3 heures après l'infection et a pu être détectée dans le milieu après 8 heures. L'infection par le virus recombinant Ad5(M-B) a conduit à une accumulation de HBsAg de OTS à 1 pu/106 cellules dans le milieu après 120 heures. Des expériences répétées ont montré que le virus recombinant contenant la région pré-S2 synthétise de plus grandes quantités de HBsAg que le virus recombinant ne contenant que le gène S. L'HBsAg purifiée à partir du milieu de culture de cellules infectées par l'adénovirus recombinant Ad5(M-B) a consisté en une population homogène de particules ayant un diamètre moyen de 22 nm. La densité après centr;fugation en CsCl a été de 1,21. 11. Activité de récepteur pour la PHSA des particules HBsAg issues de cellules Vero. Les particules HBsAg produites dans les cellules Vero ont été testées par la technique d'hémagglutination de globules rouges de moutons recouverts de pHSA et par essai radioimmunologique (RIA) pour déceler la présence d'une activité de récepteur pour la pHSA. Une activité de fixation pour la pHSA a été détectée, mais pas pour l'albumine bovine polymérisée (tableau II). Une telle activité n'a pas été décelée avec les cellules Vero infectées par l'adénoviMus recombinant Ad5(X-B) contenant seulement le gène S. 12. Activité in vivo du virus recombinant. Des lapins ont été inoculés intraveineusement avec des préparations hautement purifiées de l'adénovirus recombinant AdS(M-B) et de l'adénovirus sauvage. Bien que l'antigène HBsAg n'ait pu être détecté dans leur sérum, 5 lapins sur 8, inoculés avec le virus recombinant, ont montré l'apparition d'un titre anti-HBs variant de 20 à 270 mIU/ml après 15 jours (tableau III). Aucun anticorps anti-HBs n'a été détecté dans les lapins auxquels on a injecté le type sauvage d'adénovirus. Après une seconde inoculation intraveineuse réalisée 4 semaines après la premlère, un second pic a été observé dans la réponse anti-HBs atteignant 440 mIU/ml pour l'un des animaux. 4 semaines après la seconde injection, des titres d'anti-HBs variant de 6 mIU/ml à 360 mIU/ml étaient relevés. Des études antérieures ont indiqué que le niveau minimum d'anti-HBs encore protecteur contre l'HBV est de 10 mIU/ml pour l'homme. Les anticorps anti-pHSA ont été recherchés chez les lapins inoculés dans le but de déterminer leur rapport avec la neutralisation de l'HBV. Ces anticorps, detectés par l'inhibition de l'hémagglutination, ont été trouvés dans 5 animaux sur 5 ayant une réponse anti-HBs positive (tableau IV). L'adénovirus recombinant Ad5(M-B) dirige donc in vivo la synthèse de particules HBsAg ayant un caractère récepteur pour la sérumalbumlne humaine polymérisée. L'invention fournit donc une base méthodologique pour la fabrication d'un vaccin contre l'hépatite B (ou contre d'autres types d'affections) dans des cultures cellulaires. L'intérêt de l'utilisation de l'adénovirus de type 5 comme vecteur est double. D'une part, ce virus est un virus dont le pouvoir pathogène chez l'homme est faible. Il n'entraine que des infections respiratoires bénignes. D'autre part, ce sérotype qui appartient au groupe-l des adénovirus humains n'est pas tumorigène chez l'animal. D'autre part, le taux de production d'HBsAg obtenu sur cellules Vero (environ 1 microgramme/106/par cycle inrectieux) est a priori suffisant pour une exploitation industrielle. Or cette lignée cellulaire est non tumorigène et pour cette raison, elle constitue la lignée d'origine animale a priori la plus favorable à la production d'un produit à usage humain. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes ; parmi ces variantes, il y a lieu de mentionner les autres formes de vecteurs contenant l'ADN recombinant selon l'invention, notamment des plasmides. Ceux-ci peuvent être, soit utilisés pour fabriquer des vecteurs viraux du genre de ceux qui ont été decrits, soit être utilisés eux-mêmes en tant que véhicules d'incorporation de l'ADN recombinant dans le génome des cellules d'eucaryotes supérieurs, notamment des cultures de cellules humaines ou de primates. Il va également de soi que peuvent être substitués aux cellules 293 qui ont été mentionnées plus haut toutes autres cellules d'eucaryotes supérieurs infectables par des adénovirus ou susceptibles de reconnaitre le promoteur E7A des adénovirus, ces cellules ayant été modifiées, par incorporation au préalable dans leurs propres génomes, d'une séquence contenant les parties manquantes au virus recombinant défectif selon l'invention du génome d'un adénovirus, notamment sous le contrôle d'un promoteur fort reconnu par ces cellules, par exemple d'un promoteur de la thymidine kinase ou d'un promoteur de virus SV40. La séquence originaire de l'adénovirus, alors intégrée dans le génome de ces cellules d' eucaryotes supérieurs, poudra donc complémenter les virus défectifs conformes à l'invention, dans des conditions analogues à celles permises par les cellules 293. Ces méthodes sont applicables avef un avantage particulier à des cellules Vero. L'adénovirus Ad5 mis en oeuvre a été déposé le 3 août 1984 sous le n I-322 à la C.N.C.M. ("Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris. La lignée 293 a été déposée à la C. .C.M. le 3 août 1984 sous le n 1-323. TABLEAU I Production de HBsA9 extracellulaire en fonction du temps Ad5(X-B) Ad5(X-B) Ad5(M-B) Ad5(M-B) Cellules Cellules Cellules Cellules Vero 293 Vero 293 Jour infectées infectées infectées infectées 1 13 15 106 35 2 17 90 N.D. N.D. 3 45 110 349 56 4 110 100 668 60 5 320 130 1 057 63 6 470 120 1 153 N.D. 7 550 120 900 N.D. Les quantités cumulatives de HBsAg (en ng) produites après infection de cellules 293 et de cellules Vero, soit par Ad5(X-B), soit par AdS(M-B) sont indiquées. TABLEAU Il Activité de récepteur pour la PHSA des Particules HBsAq à Partir de cellules Vero. Surnageant de culture de Sérum humain cellules AdS(X-B) Ad5(M-B) Témoin HBsAg+ Témoin non HBeAg+ sain infecté RIA HA RIA HA RIA HA RIA HA RIA HA pHSA 143 - 7 512 64 119 - 10 472 128 65 pBSA 58 ND 85 ND 77 ND 145 ND 81 ND Les résultats sont exprimes en cpm pour l'essai radioimmunologique en phase solide et en titre d'hémagglutination (HA). ND, non determiné. pHSA : sérumalbumine humaine polymérisée. pHSA sérumaîbumine bovine polymérisée. cpm : (counts per minute). TABLEAU III Réponse anti-HBs (mIU ml-1) chez les laPins inoculés. Semai- L a p i n s nes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O O O O O O O O O O O 1 0 O 2 0 0 30 8 6 12 20 2 2 0 2 0 2 15 20 270 70 85 3 0 2 O 0 5 18 13 48 15 11 4 1 0 O 0 2 21 15 27 17 7 5 0 o 2 0 2 99 52 440 146 136 6 0 0 O O 0 78 26 401 151 148 7 0 0 0 0 0 20 27 325 58 42 8 O O O O 0 20 40 367 35 6 On a fait une injection intraveineuse de 109 pfu de l'adénovirus Ad5 sauvage purifié à des lapins (lapins 1 et 2) et 10 pfu d'adénovirus recombinant AdS(M-B) pu rosie à des lapins (lapins 3 à 10) immédiatement après le prélèvement du sang à la semaine O et à la semaine 4. La quantité d'anticorps anti-HBs a été mesurée en utili sar le système RIA AUSAB de Abbott et exprimée en unités internationales (3,5 RIA équivalant à 1 mIU). (pfu = plage formant unité). TABLEAU IV Réponse immunoqène du recePteur anti-PHSA (réciproque du titre). Lapins Semai- 6 7 8 9 10 nes O O O O O O 1 16 2 2 2 2 4 16 16 16 16 3 4 4 16 8 8 4 2 2 4 4 4 5 16 32 32 32 32 t. t6 32 32 16 32 7 8 8 32 8 16 8 4 4 8 4 8 On a infecté, d'une manière intraveineuse, des lapins avec 10 pfu d'adénovirus recombinant Ad5(M-P) purifiés aux semaines O et 4. Les animaux ont été identifiés par les memes numéros que dans le tableau III. L'activité de recepteur anti-pHSA a été exprimée comme la réciproque du titre de serum le plus élevé capable de fournir une inhibition à 100 et de l'hémagglutination. Les particules d'HBsAg possédant un titre d'hémagglutination récepteur pour la pHSA de 1:128 ont été mélangées avec un volume égal de dilutions en séries de sérums inhibiteurs. REFERENCES (1) Edited by Tooze, DNA Tumor Viruses (part II), Cold Spring Harbor Laboratory, 1980. (2) Berkner, K. and Sharp, P. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 6003-6020. (3) Jones, N. and Shenk, T. (1978) Cell 13, 181-188. 74) Solnick, D. (1983) The Embo Journal 2, 845-851. 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Claims: Recombinant vector containing the early promoter of the E1A region of the genome of an adenovirus for the transformation of eucaryotic, particularly human or animal cell lines, selected among those which are infectable by adenoviruses or whose endogenous polymerases are liable of recognizing the promoters of adenoviruses, said vector being further modified by a nucleic acid insertion containing a nucleotide sequence coding for a polypeptide sequence whose expression in said eucaryotic cell lines is sought, characterized in that said insertion sequence is substituted for the E1A genes normally placed under the direct control of said early promoter of the E1A region, said insertion sequence being itself placed under the direct control of said promoter, and in that it comprises, downstream of said nucleic acid insertion, all of the essential sequences of an adenovirus genome which are necessary for the replication of the corresponding adenovirus and which are normally located downstream of the genes normally under the direct control of the E1A early promoter in said genome, and in that said nucleotide sequence coding for the polypeptide sequence whose expression is sought is heterologous with respect to the genes of said adenovirus. Recombinant vector according to claim 1, characterized in that the genome of the adenovirus with which it is associated is defective, in that it is deprived of the anterior part of the E1A region of the viral genome, particularly of its 0-2,6 % fragment. Recombinant vector according to claim 1, characterized in that the recombinant DNA formed by said early promoter of the E1A region and the insertion nucleic sequence is incorporated in the non-essential region of an adenovirus, particularly in the non-essential part of the E3 region of said adenovirus. Recombinant vector according to claim 1, characterized in that it consists of an infectious adenovirus comprising the recombinant DNA formed by the early promoter of the E1A region and the nucleic sequence insertion, incorporated in one of its non-essential regions, particularly in the non-essential part of the E3 region. Recombinant vector according to any one of claims 1 to 4, characterized in that its promoter originates from an adenovirus of category C, belonging to sub-type Ad2 or Ad5. Recombinant vector according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the nucleotide sequence contained in the aforesaid nucleic acid insertion codes for a protein which, when it is expressed in a natural cellular host under the control of its natural promoter, is excreted into the culture medium of this natural cellular host. Recombinant vector according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the aforesaid nucleotide sequence codes for a protective antigen against a given pathogenic agent, particularly for the HBsAg antigen. Recombinant vector according to claim 7, characterized in that said nucleic acid sequence comprises the S gene and the pre-S2 region of the genome of hepatitis B. A cell line of human or animal origin, characterized in that it is transformed by a recombinant vector according to any one of claims 1 to 8, and in that it synthesizes the polypeptide coded by the aforesaid nucleotide sequence. The cell line according to claim 9 considered in combination with claim 1 or claim 2 or both at once, and, as the case may be, with any one of claims 5 to 8, characterized in that it itself contains a distinct sequence of nucleotides able to complement the part of the genome of the adenovirus which the aforesaid vector is deprived of, the said distinct sequence preferably being incorporated into the genome of the cells of said cell line. A process of production of a determined polypeptide including the transformation by a recombinant vector containing a nucleotide sequence coding for said polypeptide of the cells of a eucaryotic, particularly animal of human cell line, chosen among those which are infectable by the adenoviruses or whose endogenous polymerases are able to recognize the promoters of the adenoviruses, characterized by the fact that the transforming DNA is in accordance with any one of claims 1 to 8 and in that the expression products, including said specified polypeptide of these cells are recovered. The process according to claim 11, characterized in that the recombinant vector is in accordance with any one of claims 5 to 8. The process according to claim 11, characterized by the fact that the aforesaid transformed eucaryotic cells are in accordance with claim 10. The process according to claim 11, characterized by the fact that the aforesaid transformed eucaryotic cells are simultaneously transformed with the corresponding infectious adenovirus. The process according to any one of claims 11 to 14, characterized in that the specific nucleotide sequence is in accordance with that defined in claim 7. A process of production of a polypeptide possessing the immunogenic properties characteristic of the virus of hepatitis B including the transformation of a line of eucaryotic, particularly animal or human cells, chosen from among those which are infectable by adenoviruses of whose endogenous polymerases are able to recognize the adenovirus promoters, by a recombinant vector containing an insert itself containing a nucleotide sequence coding for an immunogenic polypeptide characteristic of the virus of hepatitis B, characterized in that the aforesaid nucleotide sequence is substituted for the E1A genes normally placed under the direct control of the early promoter of the E1A region of the genome of an adenovirus, said insertion sequence being itself placed under the direct control of said promoter and said recombinant vector further containing, downstream of said nucleic acid insertion, all of the sequences of an adenovirus genome which are essential and necessary for the replication of the corresponding adenovirus and which are normally located downstream of the genes normally under the direct control of the early E1A promoter in said genome. The process according to claim 16, characterized in that the recombinant vector consists of a defective andenovirus which can be replicated in said cell lines, said adenovirus being deprived of the anterior part of the E1A region of the viral genome, particularly of its 0-2,6 % fragment, and in that one recovers in the culture medium the expression products of the eucaryotic cell lines transformed by the recombinant DNA, including the polypeptide coded by the aforesaid nucleotide sequence and synthesized by said cell lines. The process according to claims 16 to 17, characterized in that the promoter of the recombinant DNA originates from an adenovirus of category C, belonging to sub-type Ad2 or Ad5. The process according to any one of claims 16 to 18, characterized in that the recombinant DNA formed by said early promoter and said insertion sequence is incorporated into a non-essential region of the adenovirus, particularly into the non-essential part of the E3 region of this adenovirus. The process according to any one of claims 16 to 19, characterized in that the eucaryotic cell line itself contains a distinct sequence of nucleotides able to complement the part of the genome of the adenovirus of which the aforesaid vector is deprived, the said sequence preferably being incorporated into the genome of the cells of said cell line. The process according to any one of claims 16 to 20, characterized in that the recombinant DNA includes a nucleotide sequence corresponding to the S gene of the genome of the virus of hepatitis B. The process according to any one of claims 16 to 20, characterized in that the recombinant DNA includes the sequence corresponding to the S gene and the pre-S2 region of the genome of the virus of hepatitis B. Vaccine whose active principle consists of an adenovirus which is infectious and can be replicated and which comprises, incorporated into one of its non-essential regions, particularly the non-essential part of its E3 region, a DNA recombinant formed between the early promoter of the E1A region and a nucleic sequence insertion coding for a protective antigen against the pathogenic agent selected, and particularly against the hepatitis B virus, said nucleic sequence insertion being substituted for the E1A genes normally under the control of said promoter.

Inventors: BALLAY, ANNICK, LEVRERO, MASSIMO, PERRICAUDET, MICHEL, TIOLLAIS, PIERRE
Applicants: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS), INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM), INSTITUT PASTEUR
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N15, A61K39, C12P21, C07K14, C12N5, C12R1, C07H21