GENE-TECHNOLOGICAL PROCESS FOR THE PREPARATION OF HUMAN INTERLEUKIN-2, AND DEVICE FOR CARRYING OUT THIS PROCESS

Abstract: A synthetic DNA sequence can be used to obtain human interleukin-2 in a genetic engineering process. The gene is advantageously synthesised in the form of a plurality of fragments which are ligated enzymatically to give larger part-sequences which are incorporated into hybrid plasmids and amplified in host organisms. The part-sequences are reisolated and then combined to give the complete gene and incorporated into a hybrid plasmid, and the latter is expressed in a host organism.

Description: Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Human Interleukin-2 und Mittel zur Durchführung dieses Ver fahrens Die Erfindung betrifft ein Verfahren sur Herstellung von Human-Interleukin-2 und davon abgeleitete Polypeptide mit biologischer und immunologischer Aktivität von Human Interleukin-2, chemisch synthetisierte Gene, die diese Peptide codieren sowie geeignete Vektorkonstruktionen und Wirtsorganismen zur Expression dieser Polypeptide. Human-Interleukin-2, im folgenden t'IL-2", ist ein Polypeptid aus 133 Aminosäuren. Die DNA-Sequenz des menschlichen IL-2 sowie dessen gentechnologische Synthese sind in der Europä eichen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP O 091 539 Al beschrieben (Amino Acid SequencelI der Fig. 2b). Dieser Synthese liegt eine aus Säugetierzellen isolierte mRNA zugrunde, welche in cDNA überführt, in Vek toren eingebaut und in Wirtszellen, darunter auch E.coli, zur Expression gebracht wurde. Bakterien, insbesondere E.coli, sind aus einer Reihe von Gründen bevorzugte Wirtszellen für die gentechnische Produktion von Polypeptiden. Gene eukaryotischer Zellen, die -wie in der genannten Patentanmeldung beschrieben - durch Reverse Transcriptase aus mRNA erhalten wurden, werden häu fig nach Einbau in Plasmide und Transformation in Bakterien nur unbefriedigend exprimiert. Die Erfindung betrifft deshalb eine synthetische DNA-Sequenz, die für IL-2 codiert, welche besonders vorteilhaft in E.coli zur Expression eines Polypeptids mit IL-2-Aktivität führt. Ferner umfasst die Er findung solche DNA-Sequenzen, die gegen die synthetische DNA-Sequenz hybridieren und die sich aus dieser durch ein fache oder multiple Substitionen, Deletionen oder Inser tionen von Basen ableiten. Der Austausch, die Insertion oder die Deletion von Codons oder eine Kombination davon führt zu Peptiden m5t einer oder mehreren ausgetauschten Aminosäure(n) oder zu längeren oder kürzeren IL-2-Derivaten, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind. Diese Polypeptide mit der biologischen oder immunologischen Aktivität des IL-2 können in ihren Eigenschaften derart verändert sein, dass die Stabilitt des Peptids erhöht ist, die Lipophilie des Polypeptids zugunsten einer besseren Löslichkeit verändert ist, die Applikation als Arznelmittel erleichtert ist oder aber die biologische Aktivität erhöht ist. Der genetische Code ist bekanntlich "entartet", d.h. dass nur für zwei Aminosäuren eine einzige Nucleotid-Sequenz codiert, während den restlichen 18 genetisch codierbaren AminosSuren 2 bis 6 Tripletts zuzuordnen sind. Von den hierdurch gegebenen Variationsmöglichkeiten machen Jedoch - die Wirtszellen unterschiedlicher Spezies nicht immer den gleichen Gebrauch. Für die Synthese der Gene besteht somit eine unübersehbare Vielfalt von Codon-Möglichkeiten. Es wurde nun gefunden, dass die DNA-Sequenz I (Anhang) > die für die gesamte Aminosäurensequenz 1-133 von IL-2 codiert, sowie die zur Synthese der Sequenz I benutzten DNA Teilsequenzen (Sequenz II, Anhang, mit den Teilsequenzen IIa (IL 2-I) bis II d (IL 2-IV) besonders vorteilhaft für die gentechnoiogische Synthese von IL-2 sind. Am 5'-Ende des codierenden Stranges der DNA-Sequenz I befindet sich eine 'tüberhEngende" DNA-Sequenz, beispielsweise entsprechend der Restriktionsendonuclease Eco RI, am 3'-Ende des codierenden Stranges dagegen eine andere einzelsträngige, überhängende Sequenz, beispielsweise entsprechend dem Restriktionsenzym Sal I. Diese beiden unterschiedlichen Erkennungssequenzen gewährleisten die Insertion der DNA in Plasmide in der ge wünschten Orientierung. Selbstverständlich können auch andere überstehende Sequenzen gewählt werden, die Schnittstellen im vorgesehenen Vektor entsprechen. Diese Erkennungssequenzen erlauben nicht nur die Reisolierung der DNA aus einem Vektor durch Schneiden mit den entsprechenden Enzymen, beispielsweise Eco RI und SalI, sondern auch zahlreiche Modifikationen der DNA wie Entfernung der einzelsträngigen Bereiche, beispielsweise mit Mung Bean Nuclease, völliges oder teilweises Auffüllen des kürzeren Endes, beispielsweise mit Kleenow-Polymerase, oder die Addition geeigneter Adapter oder Linker. Die überlappenden Enden sind daher ausserordentlich vorteilhaft für den Einbau der erfindungsgemässen DNA in Expressionsvektoren. Zwischen diesen Erkennungssequenzen und den Codons für die Aminosäurefolge befindet sich am 5'-Ende des codierenden Stranges das Codon für die Aminosäure Methionin (das in der DNA-Sequenz 1 mit 0 beziffert ist). Alternativ hierzu kann eine Praesequenz (auch Signal- oder leader-Sequenz genannt), eines bakteriellen oder sonstigen wirtseigenen Proteins stehen (Ubersichtsartikel: Perlman und Halvorson; J. Mol. Biol. 167 (1983), 391), welche die Sekretion des gewünschten Polypeptids aus dem Cytoplasma bewirkt und bei diesem Exkretionsprozess von einer in der Wirtszelle natürlich vorkommenden Signal-Peptidase abgespalten wird. Am Ende des codierenden Stranges folgt bzw. folgen dann auf das für Threonin codierende Triplett 133 ein bzw. vorzugsweise zwei Stop-Triplett(s). Im Anhang ist die DNA-Sequenz I, welche die Nucleotide 9 bis 407 (Aminosäuren 1-133) umfasst, im Zusammenhang mit der Nucleotidsequenz 1 bis 8 (überstehende Sequenz gemäss Eco RI und Met-Codon) und zwei Stop-Codons (Nucleotide 408 bis 413) sowie der überstehenden Sequenz gemäss Sall dargestellt. Die zwei Stop-Codons stellen eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Sie gewähr leisten, dass selbst bei hoher Proteinsyntheserate die Moleküle am gewünschten Ende "abgeschnitten" werden und keine "Fusionsproteine" gebildet werden. Drei interne singuläre Schnittstellen für die Restriktionsenzyr Pst I, Xba I und Sac I (Nucleotide 69-74, 182-187 und 291-296 des codierenden Stranges der DNA-Sequenz I) ermöglichen die Subklonierung von vier Genfragmenten IL 2-1 bis IL 2-IV, die in gut untersuchten Klonierungsvektoren, wie etwa pUC 12, eingebaut werden können. Zusätzlich wurden innerhalb des Strukturgens eine Reihe von weiteren singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme eingebaut, die einer seits einen Zugang zu Teilsequenzen des IL-2 schaffen und andererseits die Durchführung von Variationen erlauben: Restriktionsenzym Erkennungs- Position des ersten sequenz Nukleotids der Er kennungssequenz (codierender Strang) 5t 3, Aha II GGCGCC 8 Ava II GGACC 65 Ban I GGGGCC 8 Ban II GAGCTC 291 Bbv I GCTGC 59 Bst NI CCTGG 221 Dde I CTCAG 226 Fnu 4HI GCTGC 59 Hae II GQOGCC 8 Hha I GCGC 9 Hinf I GACTC 35 Hph I TCACC 373 Mlu 1 ACGCGT 117 Nar 1 GGCGCC 8 Pvu 1 GGATCG 346 Sau 96 1 GGACC 65 Scr FI CCTGG 221 Die DNA-Sequenz I 1äAt sich aus 38 Oligonucleotiden unterschiedlicher Länge aufbauen (siehe DNA-Sequenz II),indem diese zunächst chemisch synthetisiert und dann über sticky ends" von 4 bis 9 Nucleotiden enzymatisch verknüpft werden. Bei der DNA-Sequenz I wurde weiterhin berücksichtigt, dass bei denjenigen Aminosäuren, denen mehrere Codons zuzuordnen sind, diese nicht gleichwertig sind, sondern vielmehr in der jeweiligen Wirtszelle wie E. coli unterschiedliche Präferenzen zeigen. Weiterhin wurden palindromische Sequenzen auf ein Mindestmass reduziert. Die Genstruktur der DNA-Sequenz I ist somit leicht aus relativ kleinen Bausteinen zugänglich, ermöglicht die Subklonierung von vier Genf ragmenten in gut bekannte Vektoren und erlaubt deren Kombina-tion zum Gesamtgen. Die singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme erleichtern ausserordentlich die Bildung von Verlängerungen, Veränderungen und Verkürzungen des Proteinmoleküls. Verlängerungen werden nach Umsetzung mit dem jeweiligen Restriktionsenzym durch Addition geeigneter, chemisch synthetisierter DNA-Moleküle erhalten. Veränderungen werden durch Herausschneiden einzelner Abschnitte der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Ersetzen durch andere, chemisch gewonnene DNA-Sequenzen erhalten. Verkürzungen können nach Spaltung mit dem jeweiligen Restriktionsenzym durch Umsetzung mit Nucleasen erhalten werden. Die biologische Aktivität der verlängerten, veränderten oder verkürzten Moleküle kann in einem biologischen Testsystem geprüft werden, beispielsweise durch Induktion des Zellwachstums einer T-Zell-Population, die von der Anwesenheit des IL-2 im Medium für die Vermehrung streng abhängig ist. Der Einbau der synthetischen Gene bzw. Genfragmente in Klonierungsvektoren, beispielsweise in handelsübliche Plasmide wie pUC.12 bzw. andere allgemein zugängliche Plasmide wie ptac 11, ptrp H1 und pKK 177.3, erfolgt in an sich bekannter Weise. Auch können die chemisch synthetisierten Gene zuvor mit geeigneten chemisch synthetisierten Kontrollregionen versehen werden, die eine Expression der Proteine ermöglichen. Hierzu kann auf das Lehrbuch von Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982) verwiesen werden. Die Transformation der so erhaltenen Hybridplasmide in geeignete Wirtsorganismen, vorteilhaft E. coli, ist ebenfalls an sich bekannt und in dem vorstehend genannten Lehrbuch eingehend beschrieben. Die erfindungsgemäss erhaltenen Genfragmente IL 2-I bis IL 2-IV, die damit erhaltenen Hybridplasmide und die transformierten Wirtsorganismen sind ebenfalls neu und Gegenstand der Erfindung. Dasselbe gilt für aus der DNA-Sequenz I abgewandelte neue DNA-Sequenzen. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen niedergelegt. In den folgenden Beispielen werden noch einige Ausgestaltungen der Erfindung im einzelnen erläutert, woraus sich die Vielzahl der möglichen Abwandlungen und Kombinationen für den Fachmann ergeben. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist. Beispiele 1. Chemische Synthese eines einzelsträngigen Oligonucleotids Am Beispiel des Genbausteins Ia, der die Nucleotide 1-17 des codierenden Strangs umfasst, wird die Synthese der Genbausteine erläutert. Nach bekannten Methoden (M.J. Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096)) wird das am 3'-Ende stehende Nucleosid, im vorliegenden Falle also Cytidin (Nucleotid Nr. 17), an Kieselgel ((R)FRACTOSIL, Firma Merck) über die 3'-Hydroxyfunktion covalent gebunden. Hierzu wird zunächst das Kieselgel unter Abspaltung von Ethanol mit 3-(Triethoxysilyl) propylamin umgesetzt, wobei eine Si-O-Si-Bindung ent steht. Das Cytidin wird als N4-Benzoyl-3'-0-succinoyl 5'-dimethoxytritylether in Gegenwart von Paranitro phenol und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid mit dem modifizierten Träger umgesetzt, wobei die freie Carboxy gruppe der Succinoylgruppe den Aminorest der Propylamino gruppe acyliert. In den folgenden Syntheseschritten wird die Basenkompo nente als 5'-0-Dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorig- säuremonomethylester-dialkylamid oder -chlorid einge setzt, wobei das Adenin als N6-Benzoyl-Verbindung, das Cytosin als N4-Benzoyl-Verbindung, das Guanin als N2-Isobutyryl-Verbindung und das keine Aminogruppe ent haltende Thymin ohne Schutzgruppe vorliegen. 50 mg des polymeren Trägers, der 2 iimol Cytosin gebunden enthält, werden nacheinander mit den folgenden Agentien behandelt: a) Nitromethan, b) gesättigte Zinkbromidlösung in Nitromethan mit 1 % Wasser, c) Methanol, d) Tetrahydrofuran, e) Acetonitrfll, f) 40 timol des entsprechenden Nucleosidphosphits und 200 iimol Tetrazol in 0,5 ml wasserfreiem Acetonitril (5 Minuten), g) 20 % Acetanhydrid in Tetrahydrofuran mit 40 % Lutidin und 10 % Dimethylaminopyridin (2 Minuten) h) Tetrahydrofuran, i) Tetrahydrofuran mit 20 % Wasser und 40 % Lutidin, J) 3 % Jod in Kollidin/Wasser/Tetrahydrofuran im Volu menverhältnis 5:4:1, k) Tetrahydrofuran und l) Methanol. Unter¯trPhosphit" wird hierbei der Desoxyribose-3'-mono phosphorigsäure-monomethylester verstanden, wobei die dritte Valenz durch Chlor oder eine tertiäre Aminogruppe, beispielsweise einen Morpholinorest, abgesättigt ist. Die Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte können jeweils nach der Detritylierungsreaktion b) spektrophotometrisch durch Messung der Absorption des Dimethoxytritylkations bei einer Wellenlänge von 496 nm bestimmt werden. Nach abgeschlossener Synthese des Oligonucleotids werden die Methylphosphatschutzgruppen des Oligomers mit Hilfe von p-Thiokresol und Triethylamin abgespalten. Anschliessend wird durch 3-stündige Behandlung mit Ammoniak das Oligonucleotid vom festen Träger abgetrennt. Eine 2- bis 3-tägige Behandlung der Oligomeren mit konzentriertem Ammoniak spaltet die Aminoschutzgruppen der Basen quantitativ ab. Das so erhaltene Roh produkt wird durch Hochdruckfllissigkeitschromatographie (HPLC) oder durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gerei nigt. Ganz entsprechend werden auch die übrigen Genbausteine Ib-IVj synthetisiert, deren Nucleotidfolge aus der DNA Sequenz II hervorgeht. 2. Enzymatische Verknüpfung der einzelsträngigen Oligo nucleotide zu den Genfragmenten IL 2-I bis IL 2-IV. Zur Phosphorylierung der Oligonucleotide am 5'-Terminus wurde Je 1 nmol der Oligonucleotide Ia und Ib mit 5 nmol Adenosintriphosphat mit vier Einheiten T4-Polynucleotid Kinase in 20 tjl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Dithiothreitol (DTT) 30 Minu- ten bei 370C behandelt (C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acids Res. 2 (1972) 825). Das Enzym wird durch fünfminütiges Erhitzen auf 95 C desaktiviert. Anschliessend werden die Oligonucleotide Ia und Ib gigen- einander hybridisiert, indem man sie in wässriger Lösung 2 Minuten auf 950C erhitzt und dann langsam auf 50C abkühlt. Analog werden die Oligonucleotide Ic und Id sowie le und If phosphoryliert und paarweise hybridisiert. Für das Subfragment IL 2-11 werden die Oligonucleotide IIaXmit IIb usw. bis IIi mit IIj, für das Subfragment IL 2-III die Oligomeren IIIa mit IIIb usw. bis IIIk mit IIII und für das Subfragment IL 2-IV die Oligomeren IVa mit IVbvusw. bis IVi mit IVJ phosphoryliert und paarweise hybridi siert. Die so erhaltenen drei Oligonucleotidpaare für das Genfragment IL 2-1, die fünf Oligonucleotidpaare für die Genfragmente IL 2-1I und IL 2-IV sowie die sechs Oligonucleotidpaare für das Genfragment IL 2-III werden Jeweils wie folgt ligiert: Die doppelsträngigen Nucleotide werden vereinigt und in Jeweils 40 jil 50 mM Tris-HCl-PuRfer, 20 mM Magnesium chlorid und 10 mM DTT mit Hilfe von 100 Einheiten T4-DNA-tigase bei 150C im Laufe von 16 Stunden ligiert. Die Reinigung der Genfragmente IL 2-I bis IL 2-IV erfolgt durch Gelelektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamid gel (ohne Harnstoffzusatz, 20 . 40 cm, 1 mm Dicke) > wo bei als Markersubstanz X 174 DNA (Fa. BRL), geschnitten mit Hinf I, oder pBR 322, geschnitten mit Hae III, diente. 3. Herstellung von Hybridplasmiden, die die Genfragmente IL 2-1 bis IL 2-IV enthalten a) Einbau des Genfragmentes IL-2-I in pUC 12 Das Plasmid pUC 12 entspricht dem Plasmid pUC 8 (Vieira et al., Gene 19 (1982) 259-268; Messing et al., ibid. 269-276), enthält allerdings einen etwas vergrösserten Polylinker mit den zusätzlichen Restrik tionsstellen für die Enzyme XbaI und SacI (Norrander et al., Gene 26 (1983) 101-106). Das Plasmid wird mit den Enzymen EcoRI und PstI inkubiert. Hierdurch wird ein etwa 40 Basenpaare grosses Polynucleotid aus dem Plasmid herausgeschnitten- Die Abtrennung dieses Prag- ments vom geöffneten Plasmid gelingt entweder durch Chromatographie an (R)SEPHADEX G50 oder durch Elek trophorese an 1,5 zeiger Agarose in bekannter Weise (Maniatis). Auf eine Abtrennung des Fragments kann auch verzichtet werden, da Plasmide mit der Insertion von lt 2-I leicht durch Ausplattieren erkannt werden können (wie im folgenden ausgeführt wird): In das geöffnete Plasmid wird das Fragment IL 2-1 wie folgt enzymatisch eingesetzt, wobei das Plasmid p 145/3 (Figur 1) gebildet wird: Die DNA wird in einer Mischung aus 50 mM Tris (pH 7,6), 5 mM ATP, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 5mM MgC12 und ca. 100 Einheiten T4 DNA-Ligase 16 Stunden bei 120C ligiert. Anschliessend wird das Plasmid in E.coli K 12 (JM 103), kompetent gemacht mit 70 mM Ca12, transformiert. Bakterien, die das Plasmid p 145/3 enthalten, können auf Agar-Platten mit 50 tig/ml Ampicillin, 1 mM Isopropyl-Thiogalactosid (IPTG) und 2 % 5-Brom-4 chlor-3-indolyl-ss-D-galactosid (X-Gal) als "weisse" Kolonie entdeckt werden. Eventuell noch unverändertes oder nicht vollständig geschnittenes Plasmid pUC 12 verursacht blaue Bakterienkolonien. Etwa fünf der weissen Bakterienklone werden kultiviert und die enthaltenen Plasmide in bekannter Weise (Maniatis) isoliert. Die Grösse der Insertion wird durch Inkubation mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI und anschliessende Elektrophorese auf 10einem Polyacrylamidgelen überprüft. Hierauf erfolgt eine Sequenzierung der Insertion nach Maxam und Gilbert (Methods Enzymol. 65 (1980) 499) oder Sanger und Coulson (J. Mol. Biol. 94 (1975) 441). b) Einbau des Genfragments IL 2-II in pUC 12 Analog zu a) wird das Plasmid pUC 12 mit den Restrik tionsenzymen Pst I und Xba I umgesetzt und, ggf. nach Abtrennung des entstandenen Oligonucleotids, das Fragment IL 2-11 enzymatisch eingebaut. Es entsteht das Plasmid p 147/1 (Figur 2). c) Einbau des Genfragments IL 2-III in pUC 12 Analog zu a) wird das Plasmid pUC 12 mit den Restriktionsenzymen Xba I und Sac I umgesetzt und das Fragment IL 2-III enzymatisch eingebaut. Es ent steht das Plasmid p 138/25 (Figur 3). d) Einbau des Genfragments IL 2-IV in pUC 12 Analog zu a) wird das Plasmid pUC 12 mit den Restrik tionsenzymen Sac I und Sal 1 geschnitten und das Fragment IL 2-IV enzymatisch eingebaute Es entsteht das Plasmid p 143/1 (Figur 4). 4. Verknüpfung der Genf ragmente Nach Vermehrung der Plasmide p 145/3, p 147/1, p 138/25 und p 143/1 und Bestätigung der Sequenz werden die Sub fragmente IL 2-I bis IL 2-IV erneut mit den entsprechen den Restriktionsenzymen herausgeschnitten und durch Elektrophorese auf Polyacrylamid abgetrennt. Nach Ein tauchen der Gele in eine wässrige Lösung von Ethidium bromid werden die Banden unter UV-Licht identifiziert, herausgeschnitten und die DNA in bekannter Weise eluiert (Maniatis). Die Subfragmente IL 2-1 bis IL 2-IV werden wie unter 3 a) beschrieben enzymatisch verknüpft und in das durch Um setzen mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I geöffnete Plasmid pUC 12 eingebaut. Man erhält das Hybridplasmid p 159/6 (Figur 5), dessen Sequenz nochmals durch Analyse bestätigt wird. 5. Konstruktion von Hybridplasmiden für die Expression der DNA-Sequenz I a) Einbau in pKK 177.3 Das Expressionsplasmid pKK 177.3 (Plasmid ptac 11, Amman et al., Gene 25 (1983) 167, bei dem in die Eco RI-Erkennungsstelle synthetisch eine Sequenz einge baut wurde, die eine SalI-Schnittstelle enthält) wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I geöffnet. Aus dem Plasmid p 159/6 (Figur 5) wird die DNA-Sequenz I mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I herausgeschnitten und auf Polyacrylamid oder 2%ige niedrig-schmelzende (low melting) Agarose ge geben, von der Plasmid-DNA abgetrennt und die Inser tion wiedergewonnen (Maniatis). Durch Ligation des aufgeschnittenen Plasmids pKK 177.3 mit der DNA Sequenz I wird ein Hybridplasmid geschaffen, bei dem der Insertion eine Expressions- bzw. Regulations region vorgeschaltet ist. Nach Zugabe eines geeigneten Induktors wie IPTG wird eine mRNA gebildet, die zur Expression des Polypeptids entsprechend der DNA Sequenz I führt. b) Einbau in p trp H1 Das Expressionsplasmid p trp H1 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167-178) enthält die Kontrollelemente des Trp-Operons (Promotor, Operator), gefolgt von einer Hind III-Restriktionsstelle (Fig. 6). Nach Isolieren der DNA- Sequenz I aus p 159/6 werden die überstehenden Enden mit Mung Bean Nuclease nach Angaben des Herstellers (PL Biochemicals) abgebaut. p trp H1 wird mit Hind III geöffnet und die tberste- henden Enden ebenfalls mit Mung Bean Nuclease entfernt. Die DNA-Sequenz I wird dann stumpfendig mit T 4 DNA-Ligase in das geöffnete Plasmid eingebaut (Fig. 6). Durch das Triplett ATG für Methionin in Position 0 wird der Start für die Proteinsynthese festgelegt. Die Expression wird durch Abwesenheit von Tryptophan undZoder Anwesenheit von Indolylacrylessigsäure indu ziert. 6. Darstellung von Modifikationen a) Verkürzungen am C-terminalen Ende des Proteins Zur Darstellung von verkürzten Proteinmolekülen mit biologischer Aktivität des IL-2 wurde das Plasmid p 159/6 mit dem Restriktonsenzym Sal I umgesetzt und anschliessend in an sich bekannter Weise mit Exonuc l-ease III und S l-Nuclease inkubiert. Nach Umsetzung mit Eco RI wurden nun Teilsequenzen des IL-2 erhal ten, die an einem Ende die überlappenden Sequenzen für Eco RI tragen und am anderen Ende stumpfendig sind. Nach Addition einer chemisch synthetisierten DNA, die an einem Ende stumpfendig ist und hier als erstes Co don ein Stop-Codon aufweist, am anderen Ende dagegen den Überhang einer Sal Sequenz trägt, kann diese verkürzte DNA-Sequenz in die gleichen Expressions vektoren eingebaut werden. b) Verkürzungen am N-terminalen Ende des Proteins. Zur Konstruktion eines Hybridplasmids, das die DNA Sequenz für die Expression von Des-[Ala1]-It-2 ent hält, wird aus dem Plasmid p 159/6 nach an sich bekannten Methoden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Hind III die DNA- Sequenz I inklusive Polylinker teil des Plasmids herausgeschnitten, elektrophore tisch vom Restplasmid abgetrennt und mit dem Restriktionsenzym Aha II nachgeschnitten. Das iso lierte Aha II-Kind III-Fragment wird wie in Beispiel 5 b) beschrieben stumpfendig gemacht und dann mit Sal I nachgeschnitten. Mit Hilfe des folgenden Adap tors 5 AA TTC ATG 3' 3' G TAC 5' erhält man nach Ligation mit dem mit Eco RI und Sal I geöffneten Plasmid pKK 177.3 ein neues Hybridplasmid, das das Gen zur Herstellung von Des-tAlal]-IL-2 ent hält. 7. Transformation der Hybridplasmide. Kompetente E. coli-Zellen werden mit 0,1 bis 1 iig der Hybridplasmide, die die Sequenz I oder Derivate davon enthalten, transformiert und auf Ampicillin enthaltende Agarplatten plattiert. Anschliessend lassen sich Klone, die die korrekt integrierte IL-2-Gensequenz oder Derivate davon in den entsprechenden Plasmiden enthalten, durch DNA-Schnellaufarbeitung identifizieren (Maniatis a.a.O.). 8. Expression der IL-2-AktivitEt aufweisenden Polypeptide Nach Transformation der Hybridplasmide mit der DNA Sequenz I oder Derivaten davon in E. coli wird ein Poly peptid exprimiert, das ausser der It-2-Aminosäuresequenz bzw. abgewandelte Sequenzen am Aminoterminus noch eine zusätzliche Methionylgruppe trägt, 9. Aufarbeitung und Reinigung Die zur gewünschten optischen Dichte kultivierten Bakterienstämme werden mit einem geeigneten Induktor, beispielsweise IPTG, hinreichend lange, beispielsweise 2-4 Stunden, inkubiert. Anschliessend werden die Zellen mit 0,1 g Kresol und 0,1 mM Benzylsulfonylfluorid abgetötet. Auf einem SDS-PAA-Gel ist nach der Induktion eine Protelnbande mit einem Molgewicht von etwa 15 000 Dalton festzustellen. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren wird die Zellmasse in einer Pufferlösung (50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH X,5) aufgenommen und mechanisch aufgeschlossen, beispielsweise mit einer French-Presse bzw. (R)DYNO- Mühle (Fa. Willy Bachofer, Basel), worauf die unlös lichen Bestandteile abzentrifugiert werden. Ein Teil des IL-2-Proteins verbleibt nach dem Zellaufschluss im Rückstand und kann mit 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinium-Hydrochlorid, Pufferlösungen mit Detergentien ionischer oder nicht-ionischer Art und ähn lichen Lösemitteln solubilisiert werden. Aus diesen Lö sungen wird das die IL-2-AktivitEt enthaltende Protein nach üblichen Verfahren gereinigt* Geeignet sind Ionenaustauscher-, Adsorptions-, Gelfiltrationssäulen oder Affinitätschromatographie an Antikörpersäulen. Durch Natriumdodecylsulfat-Acrylamidgel- oder HPLC Analytik werden Anreicherung und Reinheit des Produktes kontrolliert. Zur biologischen Charakterisierung des IL-2-Proteins werden T-Zellen verwendet, die strikt abhängig von der Anwesenheit von IL-2 im Medium sind. Die Zellteilungsrate solcher Zell-Linien ist in gewissen Grenzen proportional zur IL-2-Konzentration des Mediums, die daher über die Aufnahme von 3H-Thymidin aus dem Medium festgestellt werden kann. DNA-Sequenz Triplett Nr. 0 1 2 Aminosäure Met Ala Pro Nucleotid Nr. 1 10 Cod. Strang 5' AA TTC ATG GCG CCG nicht cod. Strang 3' G TAC CGC GGC 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 30 40 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTG TGA GTT GAC 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 50 - 60 70 CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG OTT GAC CTT GTG GAC GAC GAG CTG GAC GTC 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100 ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAG AAA TAC TAG GAG TTG GCA TAG TTG TTG ATG TTT 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130 AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAG TGG AAG 43 44 45 46 47 48 <RTI ID=19.1> 49 50 51 52 Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160 AAA TTC TAC ATG GGG AAA AAA GCT ACC GAA TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 200 210 220 CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAG TTG GAC 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250 GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280 CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310 GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340 TTC ATG TGG GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG AAG TAC ACG GTT ATG CGG CTG CTT TGA GGG 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 350 360 370 ACG ATC GTT GAA TTT GTG AAC CGT TGG ATG TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400 ACC TTG TGC CAG TCG ATC ATC TGT ACC CTG TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC 133 134 135 Thr 410 ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGG T 5' DNA-Sequenz II Sequenz II (IL 2-I) EMI21.1 <tb> <SEP> <SEP> Ia- <SEP> - <tb> Nucleotid <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> 10 <tb> Cod. <SEP> Strang <SEP> 5' <SEP> AA <SEP> TTC <SEP> ATG <SEP> GCG <SEP> GCG <tb> nicht <SEP> cod. <SEP> Strang <SEP> 3' <SEP> G <SEP> TAC <SEP> GGG <SEP> GGC <tb> <SEP> Eco <SEP> RI <SEP> ¯ <SEP> Ib <tb> <SEP> ---L <SEP> 6-------- <SEP> I-C <tb> <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 40 <tb> ACC <SEP> 1 <SEP> TCT <SEP> TCT <SEP> TCT <SEP> ACC <SEP> AAA <SEP> AAG <SEP> ACT <SEP> CAA <SEP> CI <SEP> a <tb> TGG <SEP> AGA <SEP> AGA <SEP> | <SEP> AGA <SEP> TGG <SEP> TTT <SEP> TTC <SEP> TGA <SEP> GTT <SEP> GAG <tb> <SEP> Id <tb> <SEP> le <tb> <SEP> 50 <SEP> 60 <SEP> 70 <tb> CAA <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> GAC <SEP> CTG <SEP> CA <tb> GTT <SEP> GA <SEP> C <SEP> CTT <SEP> GTG <SEP> GAC <SEP> GAC <SEP> GAC <SEP> CTG <SEP> G <SEP> PstI <tb> GTT <SEP> G <tb> <SEP> DNA-Sequenz <SEP> lib <SEP> (IL <SEP> 2-lI) <tb> <SEP> IIa- <SEP> - <SEP> w <SEP> ¯ <tb> <SEP> 80 <SEP> 90 <SEP> 100 <tb> PstI <SEP> G <SEP> ATG <SEP> ATC <SEP> CTG <SEP> AAC <SEP> GGT <SEP> ATC <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> TAC <SEP> AAA <tb> AC <SEP> GTC <SEP> TAC <SEP> TAG <SEP> GAC <SEP> TTG <SEP> CCA <SEP> TAG <SEP> TTG <SEP> TTG <SEP> ATG <SEP> TTT <tb> iL-- <SEP> IIb <SEP> - <SEP> W <SEP> } <SEP> IId <tb> <SEP> IIc <SEP> ccclIe <tb> <SEP> 110 <SEP> 120 <SEP> ¯I <SEP> 130 <tb> AAC <SEP> GOG <SEP> AAA <SEP> CTG <SEP> ¯ <SEP> ACG <SEP> CGT <SEP> ATG <SEP> CTG <SEP> ACC <SEP> TTC <tb> TTG <SEP> GGC <SEP> TTT <SEP> GAG <SEP> TGC <SEP> GCA <SEP> TAC <SEP> GAC <SEP> TGG <SEP> AAG <tb> lid <SEP> --IId <SEP> 4 <SEP> IIr <tb> EMI22.1 <tb> Ile <SEP> * <SEP> <SEP> IIg <tb> <SEP> 140 <SEP> 150 <SEP> 160 <tb> AAA <SEP> TTC <SEP> TAC <SEP> ATG <SEP> GCG <SEP> AAA <SEP> AAA <SEP> GCT <SEP> 3 <SEP> ACC <SEP> GAA <tb> TTT <SEP> AAG <SEP> ATG <SEP> TAC <SEP> nur <SEP> TTT <SEP> TTT <SEP> CGA <SEP> TGG <SEP> CTT <tb> <SEP> b <SEP> 4 <SEP> IIh- <SEP> F <tb> <SEP> 71Ii <tb> <SEP> 170 <SEP> 180 <tb> CTG <SEP> AAA <SEP> CAC <SEP> CTC <SEP> CAG <SEP> TGT <SEP> Xbal <SEP> <tb> GAG <SEP> TTT <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> GTC <SEP> ACA <SEP> GAT <SEP> C <tb> 4 <SEP> IIJ <SEP> > <tb> DNA-Sequenz <SEP> IIc <SEP> (IL <SEP> 2= <SEP> IIIa <tb> <SEP> 190 <tb> <SEP> CTA <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> GAG <tb> <SEP> TT <SEP> CTT <SEP> CTG <tb> <SEP> Xba <SEP> I <SEP> Ilib <tb> IIIc <SEP> ' <SEP> II <SEP> t <SEP> <SEP> lIle <tb> <SEP> 200 <SEP> 210 <SEP> 220 <tb> CTG <SEP> AAA <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> GTT <SEP> CTG <SEP> AAC <SEP> CTG <tb> GAG <SEP> TTT <SEP> GGC <SEP> GAG <SEP> | <SEP> CTC <SEP> CTT <SEP> OAA <SEP> GAG <SEP> TTG <SEP> GAC <tb> IIIb <SEP> ç <SEP> Ilib <SEP> C <SEP> lIId <tb> <SEP> IlIg <SEP> <tb> <SEP> 230 <SEP> TT <SEP> L <SEP> 240 <SEP> ¯AAT <SEP> 250 <SEP> CCG <tb> GGT <SEP> GAG <SEP> TCT <SEP> AAA <SEP> AAT <SEP> TTC <SEP> GAG <SEP> GTG <SEP> GGT <tb> CGA <SEP> GTC <SEP> AGA <SEP> TTT <SEP> TTA <SEP> AAG <SEP> | <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> GCA <SEP> GGC <tb> Ilif <SEP> Ilih <tb> <SEP> lIli <SEP> b <SEP> 4 <SEP> IIIk <tb> <SEP> 260 <SEP> 270 <SEP> 280 <tb> CGT <SEP> GAC <SEP> GTG <SEP> ATC <SEP> TCT <SEP> AAC <SEP> C <SEP> rc <SEP> AAC <SEP> GTT <SEP> ATC <tb> GCA <SEP> CTG <SEP> | <SEP> GAG <SEP> TAG <SEP> AGA <SEP> TTG <SEP> TAG <SEP> TTG <SEP> GAA <SEP> | <SEP> TAG <tb> <SEP> lIli <tb> EMI23.1 <tb> <SEP> 111k <tb> <SEP> 290 <tb> <SEP> GTT <SEP> CTG <SEP> GAG <SEP> CT <tb> <SEP> CAA <SEP> GAC <SEP> C <SEP> Sac <SEP> I <tb> <SEP> III1 <SEP> <tb> <SEP> DNA- <SEP> Sequenz <SEP> II <SEP> d <SEP> (IL <SEP> 2-IV) <tb> <SEP> IVa <tb> <SEP> 300 <SEP> 310 <tb> <SEP> Sac <SEP> I <SEP> C <SEP> AAA <SEP> GGT <SEP> TCT <SEP> GAA <SEP> ACC <SEP> ACG <tb> <SEP> TC <SEP> GAG <SEP> TTT <SEP> GCA <SEP> AGA <SEP> CTT <SEP> TGG <SEP> TGC <tb> <SEP> IV <SEP> b <tb> <SEP> 4--- <SEP> ----- <SEP> - <SEP> -------- <SEP> IVC <SEP> - <SEP> b <SEP> <tb> <SEP> 320 <SEP> 330 <SEP> 3401 <tb> TTCATG <SEP> TGC <SEP> GAA <SEP> TAC <SEP> GCG <SEP> GAC <SEP> GAA <SEP> A <SEP> GOG <tb> <SEP> AAG <SEP> TAC <SEP> ACG <SEP> CTT <SEP> ATG <SEP> CGG <SEP> CTG <SEP> CTT <SEP> TGA <SEP> CGC <tb> <SEP> IVd <tb> <SEP> IVe <SEP> 4W <SEP> a----------- <SEP> IVg <tb> <SEP> 350 <SEP> 360 <SEP> 370 <tb> <SEP> ACG <SEP> ATC <SEP> GTT <SEP> GAA <SEP> TTT <SEP> CTG <SEP> AAC <SEP> CGT <SEP> TGG <SEP> ATC <tb> <SEP> - <SEP> V <SEP> TAG <SEP> CAA <SEP> CTT <SEP> AAA <SEP> qGAC <SEP> TTG <SEP> GCA <SEP> ACC <SEP> TAG <tb> ¯1- <SEP> Ivr <SEP> F <SEP> zf <tb> <SEP> IVg <SEP> <SEP> zu <SEP> IVi <tb> <SEP> 380 <SEP> 390 <SEP> 400 <tb> <SEP> ACC <SEP> TTC <SEP> TGC <SEP> CAG <SEP> TCG <SEP> - <SEP> ATC <SEP> ATC <SEP> TCT <SEP> ACC <SEP> CTG <tb> <SEP> TGG <SEP> AAG <SEP> ACG <SEP> GTC <SEP> AGC <SEP> TAG <SEP> I <SEP> TAG <SEP> AGA <SEP> TGG <SEP> GAC <tb> <SEP> IVh <SEP> - <SEP> S <SEP> zu <SEP> I <SEP> <SEP> IVj <tb> <SEP> IVi <tb> <SEP> 410 <tb> <SEP> ACC <SEP> TGA <SEP> TAG <SEP> Sal <SEP> I <SEP> 3' <tb> <SEP> TGG <SEP> ACT <SEP> ATC <SEP> AGC <SEP> T <SEP> 5 <tb> <SEP> IVj <tb>

Claims: Claims for the following Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL and SE DNA sequence I with the nucleotides 9 to 407 (amino acids 1 to 133) shown in Table 1, coding for a protein with the biological activity of human interleukin-2 (IL-2). DNA sequence I with the nucleotides 6 to 407 (amino acids 0 to 133), shown in Table 1, followed by one or two stop codon(s), coding for a protein with the biological activity of human interleukin-2 (IL-2). DNA sequences IIa (IL 2-I), IIb (IL 2 2-II), IIc (IL 2-III) and IId (IL 2-IV) shown in Table 2. DNA oligonucleotides Ia to IVj shown in Table 2. Hybrid plasmids which contain between an EcoRI and a PstI cleavage site the DNA sequence IIa (IL 2-I) or between a PstI and an XbaI cleavage site the DNA sequence IIb (IL 2-II) or between an XbaI and a SacI cleavage site the DNA sequence IIc (IL 2-III) or between a SacI cleavage site and a SalI cleavage site the DNA sequence IId (IL 2-IV) shown in Table 2. Hybrid plasmids which contain between an EcoRI and a SalI cleavage site the DNA sequence I shown in Table 1. Hybrid plasmids which contain the DNA sequence I (nucleotides 6-413) shown in Table 1. Host cells, in particular E. coli, which contain hybrid plasmids as claimed in claim 5 to 7. A genetic engineering process for the preparation of IL-2, which comprises employing a synthetic gene which contains the DNA sequence I (nucleotides 9 to 407 corresponding to amino acids 1 to 133) shown in Table 1. The use of the DNA sequences shown in Tables 1 and 2 for preparing modified DNA sequences. Claims for the following Contracting State : AT A genetic engineering process for the preparation of IL-2, which comprises employing a synthetic gene which contains the DNA sequence I (nucleotides 9 to 407 corresponding to amino acids 1 to 133) shown in Table 1. The process as claimed in claim 1, wherein the gene contains the DNA sequence I (nucleotides 6 to 407 corresponding to amino acids 0 to 133), shown in Table 1, followed by one or two stop codon(s). The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the gene has, upstream of the triplet for the first amino acid, the codon ATG and, downstream of the last amino acid, two stop codons. The process as claimed in claim 1 to 3, wherein E. coli is used as host organism. The use of the DNA sequences shown in Tables 1 and 2 for preparing modified DNA sequences.

Inventors: ENGELS, JOACHIM, DR., MERTZ, RONALD, DR., MUELLNER, HUBERT, DR., OKAZAKI, HIROSHI, DR., UHLMANN, EUGEN, DR., WENGENMAYER, FRIEDRICH, DR., WINNACKER, ERNST-LUDWIG, PROF. DR., Müllner, Hubert, Dr.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C12N15
IPC codes: C07K14, C07H21, A61K38, C12P21, C12R1, C12N15, C12N1