PROCESS FOR OBTAINING CELL CULTURES

Abstract: The cell cultures are obtained from the kidneys of pig carcasses by digestion with a proteinase. Cell cultures of this type can be used advantageously for growing viruses.

Description: Verfahren zur Gewinnung von Zellkulturen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Zellkulturen. Herstellungsverfahren für Zellkulturen und auch für solche aus Schweinenieren zur Gewinnung von Virussuspen- sionen als Vaccineantiqene sind bekannt. Sie basieren zum Beispiel auf der Verwendunq von Schweineembryonieren, Ferkelnieren, Dermanenten Schweinenierenzellstartimen oder Schlachtschweinnieren. Nachteile der Verfahren des Standes der Technik für die industrielle Produktion sind: Schweineembryonieren sind für industrielle Produktionsmassstäbe nicht in genügender Menge und zu den gewünschten Zeiten erhaltlich. Ferkelnieren sind relativ klein, das heisst sie erbringen bei zwar gutem Zellwachstum nur eine geringe Zellausbeute. Ausserdem ist der zugehörige TierkörDer nach der Nierenentnahme als Nahrungsmittel in der Reqel unbrauchbar. Permanente Schweinenierenzellstämme wie PK 15, IB S 2, STA oder SK 6 sind zwar in grossen Mengen vermehrbar, sind aber häufiq mit Fremdagenzien wie Mycoplasmen oder Viren kontaminiert, so dass ihre industrielle Nutzung für die Herstellung von immunbioloqischen Produkten ein erhöhtes Risiko beinhaltet. Auch ist der mit der Zell stammhaltung verbundene Aufwand einschliesslich der laufenden qualitativen Überprüfungen beträchtlich. Hinzu kommt noch, dass sich viele Viren auf oermanenten Zellstämmen wegen deren genetischer Veränderungen nicht oder im Vergleich zu primären Zellkulturen aus Organzellen nur schlecht vermehren. Schlachtschweinnieren sind eine kostengünstiqe Zellbasis. Nieren ausgewachsener Schlachtschweine erbringen jedoch im Vergleich zu embryonalen oder Ferkelnieren nur relativ wenige Zellen mit Zellteilungsaktivitat. Wenn nun Schlachtschweinnieren noch auf herkömmliche Weise mit dem zellschadigenden Verdauungsferment Trypsin aufgeschlossen werden, so reduziert sich die Anzahl vitaler Zellen in einer so angelegten Zellkultur nochmals drastisch. Dadurch wird verstandlich, dass auf herkömmliche Weise fermentativ aufgeschlossene Suspensionen aus Nierenzellen von Schlacht schweinen nur mit erheblichem Aufwand wie durch Mediumwechsel, erhöhten Serumzusatz zum Kulturmedium oder spezielle Kultivierungsmedien und nach langer Kultivierungsdauer zu meist nur partiell qeschlossenen Zellrasen führen. Zellkulturen aus Schlachtschweinnieren, hergestellt durch den üblichen TryPsinaufschluss der Organe, sind also problematisch im Hinblick auf ihre Wuchsfreudiqkeit. Insbesondere treten diese Wachstumsschwieriqkeiten dann hervor, wenn die Kulturgefässe mit den tryptisch aufgeschlossenen Schlachtschweinnierenzellen zur oPti- malen Ausnutzung der Rultivierungsfläche gerollt werden. Es bestand deshalb weiterhin ein Bedarf an einem auch technisch befriedigenden Verfahren zur Gewinnung von Zellkulturen-aus Nierenzellen von Schweinen. Es wurde nun überraschenderweise ein Verfahren gefunden, das es gestattet, Nierenzellen von Schlachtschweinen ohne besondere Mediumzusätze und ohne Mediumwechsel in 5 bis 8 Tagen in stationaren oder ollkulturen zu dichten Zellrasen auswachsen zu lassen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufschluss der Nieren zu Einzelzellen Collagenaselösung benutzt wird. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Gewinnung einer Zellkultur durch Aufschluss von Nieren von Schlachtschweinen mittels eines Enzyms, dadurch qekennzeichnet, dass das Enzym Collagenase ist. Eine verwendbare Collagenase kann beispielsweise gewonnen werden aus Clostridium histolyticum und wird in einer Konzentration von 10-15, vorzugsweise 12,5 mq (entsprechend 6.250 Mandl-Einheiten) pro 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, cH-Wert 7,0 bis 7,5) eingesetzt. Von besonderer Bedeutung für die Gewinnung grosser Mengen an vitalen, mitoseaktiven Einzelzellen ist eine unter Rühren 12- bis 24-stündige Einwirkungsdauer der Collagenaselösung bei 16 bis 22"C auf die zerkleinerten Nieren. Die so gewonnenen Einzelzellen werden dann in bekannter Weise durch Zentrifugation bei etwa 800 x g und Waschen mit PBS gereinigt. Das zentrifugierte Zellsediment wird danach im Verhältnis von vorzugsweise 1:250 bis 1:350 in bekannten Kultivierungsmedien wie Eagles minimal essential medium (Eagles MEM) oder in TCM 199 mit Zusatz von 100 ml/l Rälberserum resuspendiert, in Kulturgefässe portioniert, die bei 37"C stationär gehalten oder gerollt werden. Innerhalb von 8 bis 16 Stunden beginnen zahlreiche der an der Glasfläche sedimentierten Nierenzellen sich zu teilen. Dieser Vorgang kann mikroskopisch beobachtet werden und zeigt, dass ein signifikanter Unterschied in der Anzahl der teilungsfahigen Nierenzellen und in der Schnelligkeit der Zellteilungsfolgen im Vergleich zu Zellansätzen nach herkömmlichen Kultivierungsverfahren besteht. Die Mitoseaktivität der mit Collagenase behandelten Nierenzellen von Schweinen führt zu schnellem Dichtwachsen des Zeilrasens ohne irgendwelche weiteren Hilfsmassnahmen für die Zellkultur. Hierdurch können - wie nachstehende Beispiele erläutern - in rascher Folge grosse Mengen an Zellkulturen für die industrielle Virus züchtung vorteilhaft hergestellt werden. Beispiel 1 Schlachtschweinnieren wurden nach den herkömmlichen Verfahren mit 2 g/l Trypsinlösung zu Einzelzellen aufqeschlossen, nach Zentrifugation bei etwa 800 q mit PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Zellsediment wurde im Verhältnis 1:300 in Eagles MEM suspendiert, dem 2,5 g/l Laktalbuminhydrolysat (LAH) und 100 ml/l Ka1- berserum zugesetzt worden waren. Diese Suspension wurde in Hengen von 600 ml in sterile 5 l-Glaskolben gefüllt. Die Kulturen wurden unter Rollen bei 370C bebrütet. Innerhalb von 10 bis 14 Tagen hatten sich nur partiell qeschlossene Zellrasen gebildet. Nach Wechseln des achstumsmeaium auf serumfreies Medium (Eagles MEM mit 2,5 g/ 1 LAH) wurden die Kulturen mit Reovirus der Serotyten 1 bzw. 3 infiziert und bis zur Erntereife der Kultur 3 bis 5 Tage bei 370C gehalten. Der Virusgehalt der Kulturabgüsse wurde nach Entfernung der Zellreste mittels Zentrifugation und anschliessender Filtration in üblicher Weise durch Verimpfung von Verdünnungsstufen auf Zellkulturen geprüft. Zum Vergleich wurden steril zerkleinerte Schlachtschweinnieren mit Collagenaselösung, die 12,5 mg Collagenase pro 1 enthielt (entsPrechend 6.250 Mandl-Einheiten/100 ml), behandelt. Wach 18-stündiger Einwirkunqsdauer bei 18"C wurden die zu Einzelzellen aufgeschlossenen Nierenzellen in gleicher Weise wie oben weiterverarbeitet. Die Kulturntedien, die Kulturgefasse, die abgefüllten Zell suspensionsmengen und die Bebrütung waren gleich. Im Gegensatz zu den Zellkulturen nach dem herkömmlichen Verfahren waren bei den nach dem erfindungsgemässen Verfahren aufgeschlossenen Nierenzellen bereits nach wenigen Stunden Mitosen mikroskopisch erkennbar. Auch lagen die einzelnen mitoseaktiven Zellen sehr eng beieinander, da die Anzahl der geschädigten und deshalb amitotischen Zellen gegenüber dem herkömmlichen Aufschlussverfahren stark reduziert war. Aufgrund der sehr früh beginnenden und sehr zahlreichen Mitosevorgänge waren 5 bis längstens 8 Tage nach Zellkulturansatz dicht geschlossene infektionsfähige Gewebekulturen vorhanden. Die Infektion der Gewebekulturen sowie die Virusernte und -prüfung er folgten in analoger Weise wie bei den nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellten Kulturen. Nach den beiden.beschriebenen Verfahren wurden je 5 Kulturansätze im technischen Massstab hergestellt, auf denen jeweils 150 bis 300 1 Reovirus der Serotypen 1 und 3 gezüchtet wurden. Die Virusgehalte der Vergleichsansätze wurden auf permanenten Affennierenzellen (Verozellen) bestimmt. Für Reovirus des Serotyps 3 wurden bis 14,5fach und für den Serotyp 1 wurden 5,6- bis 6,3-fach höhere Titer gefunden, wenn mit dem erfindungsgemässen Verfahren anstelle des Verfahrens nach dem Stand der Technik gearbeitet wurde. Beispiel 2 Für die Herstellung von 40 1 einer Suspension von Rhinopneumonitis -Virus (Erreger des Stutenabortes) auf Ferkelnierenzellen wurden 20 junge Ferkel benötigt, während nach dem erfindungsgemässen Verfahren des Beispiels 1 nur 2 Nierenpaare von Schlachtschweinen gebraucht werden. Ein qualitativer Nachteil des Virus, hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren, wurde nicht beobachtet. Beispiel 3 Das Aujeszky-Virus ist als Herpesvirus ein schlechtes Antigen, deshalb kommt einem hohen Virusgehalt in der Vaccine eine grosse Bedeutung zu. Es wurden vergleichend Aujeszky-Viruszüchtungen auf Nierenkulturen von Schlachtschweinen durchgeführt, die einmal nach dem herkömmli- chen Verfahren mit trypsinaufgeschlossenen Nierenzellen und zum anderen nach dem erfindungsgemässen Verfahren (Beispiel 1) hergestellt worden waren. Während der virustiter/ml von den nach dem herkömnlichen Verfahren hergestellten Kulturen bei 10-7t5 laq, betrug er bei den nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Kulturen im Mittel 10-8t5, das heisst es wurde von den jüngeren (5-8 Tage alten) und dichten Gewebekulturen etwa zehnmal mehr Virus synthetisiert als von den älteren (10-14 Tage alten) und in der Regel nicht dichten Kulturen des Standes der Technik. Beispiel 4 Schweineparvovirus (PPV) gilt als Erreger des SMEDI Syndroms bei Zuchtsauen, das durch Aborte, Totgeburten, Geburt lebens schwacher Ferkel und Sterilitat bei Sauen charakterisiert ist. Das PPV vermehrt sich nur in jungen, noch wachsenden Gewebekulturen von Schweinen, vorzugsweise in Schweinenierenkulturen. Versuche zur Züchtung von PPV in Gewebekulturen von Schlachtschweinen, hergestellt nach dem erfindungsge massen Verfahren, haben ergeben, dass solche Zellkulturen besonders gut für die Vermehrung von diesem Virus geeiqnet sind. Es wurden Haemagglutinationstiter von 1:2048 bis 1:16.384 gefunden, während Virustiter von 1:1024 für nach dem Stand der Technik in embryonalen Schweinenie ren zellkulturen oder permanenten Schweinenierenzellstam- men vermehrtes PPV schon als gut gelten.

Claims: A process for obtaining a cell culture by disintegration of the kidneys of slaughtered pigs using an enzyme, which comprises exposing the comminuted kidneys to a stirred collagenase solution with a concentration of 100-150 mg/l for 12 to 24 hours at 16 to 22°C and allowing the pig kidney cells obtained in this way to grow to cell cultures in a known manner.

Inventors: BENGELSDORFF, HANS-JOACHIM, DR., KOSCHEL, ECKHARD
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1985
Main classification: C12N5
IPC codes: C12N5, C12N7