METHOD FOR THE PHOTOMETRIC DETERMINATION OF THE ACTIVATED PARTIAL THROMBOPLASTIN TIME, AND REAGENT THEREFOR

Abstract: The method entails the use of a chromogenic substrate.

Description: Verfahren zur fotometrischen Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und Reagenz dazu Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fotometrischen Bestimmung der aktivierten partiellen'Thromboplastinzeit (APTT) sowie ein dazu geeignetes Reagenz. Die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) ist neben der Thromboplastinzeit (Prothrombinzeit, Quick-Wert) der am häufigsten durchgeführte Gerinnungstest. Die APTT erlaubt Aussagen über das Verhalten des endogenen Weges der Gerinnung. Eine weitere wichtige Anwendung dieses Tests liegt in der Kontrolle der Heparintherapie. Die APTT erfasst das hochmolekulare Kininogen, Präkallikrein und die Faktoren XII, X, Ix, VIII, V und I, daneben auch die Inhibitoren der Gerinnung, insbesondere Antithrombin III bei der Heparintherapie und Fibrinogenspaltprodukte (Antithrombin VI), die alle die APTT verlängern. Reagenzien für die Bestimmung der APTT enthalten im wesentlichen Phospholipide und einen geeigneten Aktivator der "Kcntaktphase". Durch die Kontaktaktivierung wird der Faktor XII aktivierte der dann Faktor XI und Präkallikrein aktiviert. Durch die im Reagenz enthaltenen Lipide und Calciumionen kommt es dann zu einer Aktivierung des gesamten endogenen Weges, die in einer Fibringerinnselbildung endet. Die bis zu diesem Zeitpunkt benötigte Zeit ist tlessparameter. Als Aktivatoren der Kontaktphase werden anorganische Materialien, vorzugsweise Celite oder Kaolin eingesetzt. Daneben findet auch Ellagsäure (US-P 3,486,981 und DE-OS 29 15 310) Verwendung. Ellagsäure bietet als optisch klares Reagenz Vorteile bei der Verwendung optischer Messverfahren zur Detektion der Gerinnselbildung. Nach Bock et al., Biochemistry 20, 7258-7266 (1982) soll allerdings die wirksame Spezies ein wasserunlöslicher Kom- plex aus Metallionen und Ellagsäure sein. Ein weiterer Aktivator ist Dextransulfat. Diese Aktivatoren der Kontaktphase sind jedoch unphysiologisch und auch schwierig zu standardisieren. Beispielsweise hängt die Gerinnungszeit einer kaolinakti-. vierten APTT ganz wesentlich von der Partikelgrösse des Aktivators ab. Auch werden einige Gerinnungsfaktoren derartig fest an solche oberflachenaktive Materialien adsorbiert, dass man diese als Adsorbenzien zur Präparation der Kontaktfaktoren benutzt. Daneben ist aber auch die Zusammensetzung des Phospholipids, das ein solches Reagenz enthält, wesentlich für das Ergebnis. Auch die Lange der Vorinkubationszeit, nach der die eigentliche Reaktion, die zur Gerinnselbildung fuhrt, durch 'IRekal- zifizierung" gestartet-wird, spielt eine wichtige Rolle, da aktivierte Gerinnungsfaktoren durch die plasmatischen Inhibitoren, insbesondere Antithrombin III, gehemmt werden. Als physiologische Aktivatoren der Gerinnung gelten Sulfatide (Fujikawa et al., Biochem. 19 (1980), 1322-1330 und Tans und Griffin, Blood, 59 (1982), 69-75. Sulfatide gehören zur Verbindungsklasse der Glycosphingolipide und enthalten am Galaktosering eine Sulfatgruppe. Zu dieser Verbindungsgruppe gehoren unterschiedliche Spezies, die in der Art der Fettsäurekette differieren. Sie sind in allen Geweben in den Membranen nachweisbar, in besonders reichlicher Menge im Gehirns aus dem man es auch in sehr reiner Form gewinnen kann. Sulfatide sind wirksamer als Kaolin bei der Kontaktaktivierung von Plasma. Xonventionelle APTT-Bestimmungen laufen auf die Messung eines Fibringerinsels hinaus. Die Bildung eines solchen Gerinnsels ist messtechnisch nur schwierig zu verfolgen. Eine ganze Reihe von Geräten wurde entwickelt, die unterschiedliche mechanische, elektrische oder optische Verfahren zu benutzen. Seit Einführung chromogener Substrate für Gerinnungsfaktoren wurde auch versucht, diese für die Bestimmung der Gerinnungsenzyme einzusetzen. Der Vorteil chromogener Substrate liegt in der einfachen Standardisierbarkeit der niedermolekularen Substrate im Gegensatz zu den komplexen, hochmolekularen natürlichen Substraten. Es entfällt das Problem, die Bildung eines Gerinnsels zu messen. Auch für die Durchführung von "Globaltests" wurden bereits chromogene Substrate eingesetzt. So beschrieben Yamada und Meguro, Thrombos. Res. 15 (1979), 351-358, eine Methode zur Durchführung der APTT. Diese beruht auf der Aktivierung des endogenen Weges mit Ellagsäure in Gegenwart von Phospholipid, Calcium und dem chromogenen Thrombin-Substrat H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S 2238). Nachteile dieses Verfahrens sind der Einsatz eines unphysiologischen Aktivators, die mangelhafte Spezifität des chromogenen Substrates und die extrem langen Messzeiten (Normalwert um 7,4 Minuten). Uber die Einzelfaktorenempfindlichkeit wurden nur unvollständige Daten publiziert. Eine weitere Methode wird von P. Aiyappa, Ann. New York Acad. Sci. (1981), S. 812-821, beschrieben. In diesem Messsystem wird Plasma durch Ellagsäure in Gegenwart von Phospholipid und Calciumionen 5 Minuten aktiviert und das bis dahin gebildete Thrombin mit einem chromogenen Substrat gemessen. Diese Methode kann zur Bildung von Fibrin führen, das aktives Thrombin einschliesst. Auch kann Thrombin durch Inhibition wieder desaktiviert werden. Andererseits lassen sich pathologische Plasmen innerhalb der gewählten Inkubationszeit möglicherweise gar nicht oder nur unvollständig aktivieren, obwohl sie eigentlich, wenn auch verzögert, dazu in der Lage sind. Das von Aiyappa beschriebene Verfahren erlaubt nicht, in Mangelplasmen eine Gerinnung zu messen. Uberraschend wurde nun gefunden, dass wesentliche Nachteile der beschriebenen APTT-Methoden mit chromogenen Substraten durch den Einsatz eines Sulfatids als physiologischen Aktivator in Verbindung mit einem hochspezifischen Thrombinsubstrat beseitigt werden können. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit mit einem Aktivator, einem gerinnungsaktiven Phospholipid oder Phospholipidgemisch, Calciumionen und einem chromogenen Substrat für Thrombin, dadurch gekennzeich net, dass der Aktivator ein Sulfatid oder Sulfatidgemisch ist. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Reagenz zur Bestimmung der aktivierten partiellen Thrombinzeit, bestehend aus einem Sulfatid,-einem Phospholipid, einem löslichen Calciumsalz und einem chromogenen Substrat in lyophilisierter Form. Brauchbare Sulfatide sind kommerziell erhältlich, bei spielsweise von den Firmen Serva, Sigma oder Supelco. Vorteilhaft werden solche Sulfatide verwendet, die in einer D0nnschlchtchromatographle auf Kieselgel und einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser 65:25:4 als Laufmittel einem RF-Wert von 0,2 - 0,3, bevorzugt 0,25, und mit Chloroform/Stethanol 40:15 einen solchen von 0,25 0,35, bevorzugt 0,31, haben. Solche Sulfatide können aber auch nach beschriebenen Verfahren, beispielsweise nach Hara und Radin, Anal. Biochem. 100, 364-370 (1979) oder aus Hirnacetontrockenpulver, gewonnen werden. Sinnvolle Testkonzentrationen liegen zwischen 0,1 und 50 vg/ ml. Das Sulfatid kann zunächst in einer Konzentration von 0,01 g/l in 50 mol/l HEPES-Puffer, pH 7,6, suspendiert und für die Bereitung des Reagenzes verwendet werden. Als Phospholipid können die in konventionellen Reagenzien eingesetzten tierischen und pflanzlichen Lipide verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von Lipiden aus menschlichen Thrombozyten oder eines Extrakts aus mensclischer Plazenta. Wichtig ist, dass diese Lipide keine thromboplastische Aktivität zeigen, um nicht auch den exogenen Weg zu aktivieren. Das chromogene Substrat für Thrombin muss spezifi-sch sein, um in diesem Test eingesetzt werden zu können, da ja Thrombin selektiv neben den anderen ebenfalls aktivierten Gerinnungsfaktoren gemessen werden soll. Chromo (R) TH (Tos-Gly-Pro-Arg-pRA) und S 2160 (Bz-Phe-Valzym Arg-pNA) sind relativ unspezifisch und zeigen auch andere Gerinnungsfaktoren an wie Kallikrein oder die Faktoren Xa und XIIa. Besser eignet sich S 2238 (HD Phe-Pip-Arg-pNA), obgleich auch hier die Spezifität gegenüber den Kontaktfaktoren nicht sehr hoch ist. Ausser para-Nitroaniliden sind auch Peptide mit anderen Ghromo- phoren geeignet, beispielsweise Cumarinderivate, wobei die Hydrolyse durch Messung der Fluoreszenz verfolgt wird. Die fUr¯einen Globaltest wie der APTT am besten geeigneten chromogenen Peptide sind Trombinsubstrate, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 32 44 030.8 be schrieben sind. Sie enthalten als Chromophor Derivate der 5-Amino-2-nitrobenzoesäure. Bevorzugt wird eine Verbindung der allgemeinen Formel 1 EMI6.1 mit R=C15-Alkyl oder -CHlCH(CH3)2)CoOCH3und X = H-D-Phe-, BOC-Gly- oder Tosyl-Gly- verwendet. Das Substrat wird vorzugsweise in sehr geringer Konzen- tration eingesetzt. Die besten Ergebnisse erzielt man mit 50 Ezol/l bei der Verwendung von H-D-Phe-Pro-hrg- ANBS-isopropylamid. Die Calciumkonzentration sollte zwischen 1 und 10 mMol/l betragen, bevorzugt werden 5 6fol/l. Sulfatid, Phospholipid, chromogenes Substrat und das Calciumsalz, bevorzugt Calciumchlordid, werden in einem Puffer wie HEPES oder TRIS pH 7,2-8,5 gelöst oder suspendiert. Auch Imidazol-, Glycylglycin- oder Triethanol amin-Puffer sind brauchbar. Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässigerweise bei 25-37 C ausgefuhrt, indem eine Plasmaprobe mit dem temperierten Reagenz in einer thermostatisierten Küvette zusammengebracht wird. In einem Photometer wird bei 405-410 nm die Reaktion verfolgt. Bei einem typischen Normalplasma bleibt die Extinktion einige Zeit konstant, um dann innerhalb von wenigen Sekunden stark anzusteigen. Messparameter ist die Zeit > die nötig ist, eine bestimmte Extinktionsdifferenz, beispielsweise 0,1, zu erreichen. Grundsätzlich ist auch eine kinetische Auswertung der exponentiellen Kurve mog- lich. Die Umsetzung einer bestimmten Substratmenge ist analog zu der einer konventionellen APTT, wo das akti vierte Thrombin eine bestimmte Menge Fibrinogen umsetzt und damit das Gerinnsel auslöst. Beispiel 1 zeigt, dass das neue Verfahren in der bevorzugten Form Änderungen der Aktivität jedes einzelnen Faktors des endogenen w,- ges anzeigt. Im Gegensatz zur konventionellen APTT, in der nach einer bestimmten festen Aktivierungszeit die eigentliche, zm Gerinnsel führende Reaktion durch CaC12-Zusatz gestartet wird, kann bei dem neuen Verfahren CaCl2 von Anfang ta zugesetzt werden, so dass man mit einem Pipettierschritt weniger auskommt CMonoreagenz). Prinzipiell ist jedoch auch ein dem bisherigen Verfahren analoges Testsystem mit dem erfindungsgemässen Verfahren möglich. Zu diesem Zweck wird das chromogene Peptid zusammen mit CaCl2 erst nach einer bestimmten Vorinkubationszeit zugesetzt. Es erweist sich dann als günstig, auch während der Elorinku- bationsphase dem Sulfatidreagenz etwas CaCl2 (etwa 1 mMol/l) zuzusetzen und die eigentliche Reaktion durch Zusatz von mehr CaC12-Lösung zu starten. Als Endkonzentration ist auch hier 5 mMol/l CaCl2 optimal. Die Verwendung von Sulfatiden zur Kontaktativierung von Plasma in Kombination mit chromogenen Substraten war bisher nicht bekannt. Reagenzienhersteller empfehlen die Lagerung der Sulfatide unter 0 C. Die Lyophilisation Von Sulfatiden zusammen mit den notwendigen anderen Bestand- teilen des Reagenzes führt zu einem stabilen Produkts Die APTT verlängert sich stets drastisch. Uberraschenderweise gelangt man durch Zusatz von Serum- albumin Gelatine oder einem abgebautem und vernetztem Kollagen zu einem stabilen, wirksamen Reagenz. Eine Kan zentration von lediglich etwa 0,1-1% erlaubt die Herstellung eines Lyophilisates mit guter Aktivität. Wie bei konventionellen Reagenzien ist die Verbindung mit Mangelplasma die Bestimmung der Einzelfaktoren des endogenen Weges möglich. Dazu wird die Plasmaprobe ver dünnt werden, um den Einfluss der anderen Gerinnungsfaktoren auszuschalten oder sie wird im Unterschuss zu dem verwendeten Mangelplasma eingesetzt. Ein Zusatz von Aminosäuren, besonders Glutamin, Asparagin oder Glutaminsäure, erhöht die Heparin-Empfindlichkeit des Reagenzes. Abkürzungen: ANBS 5-Amino-2-nitrobenzoesäure Arg Arginin Gly Glycin HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure Phe Phenylalanin Pip Pipecolinsäure Pro Prolin Tos Toluolsulfonyl TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan Das folgende Beispiele erläutert die Erfindung. Beispiel 1: Faktorenempfindlichkeit des neuen Reagenzes Reagenz: 0,1 ml 3 mMol/l H-D-Phe-Pro-Arg-ANBS-isopropyt amid Chromogenes Substrat (S 82 107) 0,5 ml Fibraccel 1:1000 (gerinnungsaktiver ho mologer Phospholipidkomplex, Behringwer- ke AG) 0,5 ml Sulfatidlösung (Fa. Supelco; RF 0,25 mit CHCl3/MeOH/H2O 65:25:4 auf Kieselgel) 0,01 g/l 5,0 ml Puffer (HEPES, NaCl, Ca2+: 25, 50, 5 mMol/l; pH 7,6, 0,25 % Haemaccels (DE-PS 11 18 792 und 11 53 134) Ansatz: 100 ul Plasma bzw. Mangelplasma (Behringwerke), F VII-Mangelplasma kongenital 1 ml Reagenz 370C,- Messung der Zeit, bis E405 nm = 01- Mangelplasma Sekunden Faktor II 1.200 Faktor V 1.200 Faktor VII 207 Faktor VIII 378 Faktor IX 498 Faktor X 4'48 Faktor XI 396 Faktor XII 336 -HMWK (Hochmolekulares Kininogen) 396 Kallikrein 720 Poolplasma 170

Claims: A method for the determination of the activated partial thromboplastin time (APTT) by means of a chromogenic substrate and activation by sulfatides or mixtures of sulfatides, wherein all the reagents, apart from the sample, necessary for carrying out the test are added in one step. The method as claimed in claim 1, wherein the chromogenic substrate is a compound of the formula I: where R is C₁-₅-alkyl or -CH[CH(CH₃)₂]COOCH₃, and X is H-D-Phe- or tosyl-Gly-. A reagent for the determination of the APTT by means of a method as claimed in claim 1, which contains all the components necessary for carrying out the test (a sulfatide or mixture of sulfatides, phospholipid, calcium ions and a chromogenic thrombin substrate) in one solution. A reagent as claimed in claim 3, which contains a buffer, preferably HEPES, of pH 7.2 - 8.5. A reagent as claimed in claim 3, which additionally contains an amino acid, preferably glutamine, asparagine or glutamic acid. A reagent as claimed in claim 3, which additionally contains serum albumin, gelatin or a degraded and crosslinked collagen. A reagent as claimed in claim 3, which is in freeze-dried form. The method as claimed in claim 1, wherein the sample is diluted with an appropriate deficient plasma for determination of single factors.

Inventors: KOLDE, HANS-JUERGEN, DR., Kolde, Hans-Jürgen, Dr.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C12Q1
IPC codes: G01N33, C12Q1