PROCESS FOR PREPARING AN ANTIHAEMOPHILIC FACTOR CONCENTRATE

Abstract: 1. Process for preparing an antihaemophilic factor concentrate (AHF concentrate) with a concentration of at least 25 U of AHF/ml and a specific activity of at least 1.5 U of AHF/mg of protein from human blood plasma by a combination of measures such as by cryoprecipitation, précipitation, purification with protein precipitants, centrifugation and lyophilisation, characterized in that a) the cryoprecipitate is dissolved in a buffer of low ionic strength, the solution is adjusted to a pH of 6 to 6.8 and to a temperature of 5 degrees C to 15 degrees C, and the precipitate resulting thereby is separated from the supernatant, and then b) the supernatant, which has been pre-purified in this way and enriched in AHF in relation to the concomitant proteins, is neutralised, and is subjected to a purifying precipitation by successive addition of sodium chloride up to concentration of about 15 % by weight and of glycine up to an amount of about 10 % by weight, whereupon the precipitate containing the AHF concentrate is separated off, redissolved in a physiological buffer, where appropiate with the addition of stabilisers, and converted by deep-freezing and lyophilisation into a form which can be stored.

Description: Verfahren zur Herstellung eines Antlhämophillefaktor-Konzentrats Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines gereinigten Antihämophiliefaktor (AHF,Faktor VfflKonzentrats, insbesondere ein Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute an gereinigtem AHF aus menschlichem Plasma gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Zu den wichtigsten physiologischen Eigenschaften des Blutes zähit dessen Gerinnungsfähigkeit, die gewährleistet, dass Blut bei Verletzungen mit offenen Wunden oder bei internen Blutungen gestillt wird. Am Gerinnungsvorgang, der enzymatisch kontrolliert wird und der über mehrere Reaktionsschritte abläuft, können bis zu zwölf plasmatische Faktoren und zusätzliche Thrombozyten-oder Zellelemente beteiligt sein. Unter den Gerinnungsfaktoren nimmt der AHF einen besonderen Rang ein. Im Humanplasma ist der AHF in der Regel in einer sehr geringen Konzentration von etwa 10 mg/l Plasma vorhanden. Fehlen und Mangel dieses Faktors sind vererblich und bilden die Ursache der häufigsten angeborenen Bluterkrankung, der Hämophills A, die nur durch Substitution des fehlenden Plasmafaktors VIII behandelt werden kann. Die Isolierung und Reinigung des AHF ist daher für die Bereitstellung von Präparaten zur Behandlung von Hämophille-Patienten von allergrosster Bedeutung. Der AHF ist ein hochmolekulares Protein, dessen Reindarstellung wegen der ausgeprägten chemischen Labilität bisher nicht gelungen ist. Es sind aber bereits verschiedene Verfahren für die Herstellung von therapeutisch wirksa men AHF-Konzontraten beschrieben worden. Bekannte Präparate mit niedriger Konzentration an Faktor VIII bezogen auf das Gesamtprotein sind InO die Kpyoprëzipitate, die mittels eines Ausfrierverfahrens gewonnen werden, welches auf der abgestuften Löslichkeit der Plasmaproteine nach dem Eln frleren und Wlederauftsuen beruht. Bei diesem Verfahren wird tlefgefrorenes Plasma in einem niedrigen Temperaturbereich von etwa Ooc bis 10 C langsam aufgetaut, das entstandene Kryopräripitat dadurch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und ohne weitere Reinigungsoperationen gegebenenfalls durch Wiederaufldsen und Gefriertrocknen in eine haltbare Form gebracht (vg dazu 3. Pool et al., Nature 203, 1964,5 312 ff.). Diese Krynpräzipitate enthalten neben dem AHF noch andere Plasmaproteine in grösseren Mengen, beispielsweise Fibrinogen, Plasminogen und Plasmin. Insbesondere der hohe Fibrinogengehalt bewirkt bei diesen Praparaten eine geringe Löslichkeit, die zur Folge hat, dass fUr die Verabreichung einer gewöhnllchen Einzeldosis an AHF von beispielsweise 500 E (Einheiten) bis zu 100 ml Flflssigkeit erforderlich sind. Grosse Flössigkeltsmengen stellen einerseits eine Belastung für Herz und Kreislauf dar und machen andererseits die Hämophllle-Petienten, die auf die ständige Substitution des fehlenden Blutfaktors angewiesen sind, von Infusionen und arztlicher Hilfe abhängig Es ist daher vorteilhaft Konzentrate zu verabreichen, deren Volumen 20 bis 30 ml Flüsalg- kalt nicht übersteigt und die sich der Patient ohne ärztliche Hilfe selbst injizieren kann. Zu diesem Zweck war es notwendig, AHF-Injektlonslösungen mit höherem ReinheItsgrad und besserer Lösüchkelt zu finden, die in einem Volumen von etwa 20 bis 30 ml Flüssigkelt etwa 500 E AHF enthalten. In der DE-OS-2,516.186 ist ein Reinigungs- und Anreicherungsverfahren be- schrieben, dessen wesentliche Merkmale darin bestehen, dass das gesammelte Rohkryopraz"ipitat mit einem Citratpuffer extrahlert wird und aus diesem Pufferextrakt ein Grosstell des Fibrinogen und anderer Begleltproteine durch Einstellen eines pH-Wertes von 6.0 bis 6.8 und einer Temperatur von OOC bis 20 c ohne Zugabe eines Fällungsmittels ausgefällt wird. Aus dem neutrallsie- rten überstand kann dann durch Sterüfiltrieren und Lyophilisieren ein AHF Praparat geworfen werden, welches zwar wesentlich besser losllch Ist als das unbehandelte Kryopräzipitat, aber noch Verunreinigungen und Begleitproteine, beispielsweise im Verlaufe der Fällung denaturierten AHF, enthält und eine spezifische Aktivität von weniger als 1 E pro mg Protein aufwelst. In einer Weiterentwicklung ist In der US-PS-4,294.826 ein zweistufiges Reinigungs-und Anreicherungsverfahren aus dem Kryopräzipitat beschrieben, bei dem in der ersten Stufe eine Pufferlösung des Kryopräzipitats einer Flbrino- genfällung unter den in der DE-OS-2,516.186 angegebenen Bedingungen unter zogen wird, worauf die so vorgereinigte und an AHF angereicherte Lösung in einer zweiten Stufe durch eine neuerliche pH-Fällung bei pH 5.0 bis 6.0 bei einer Temperatur von Oo bis 140C und Abtrennen der unter diesen Bedingungen ausgefällten Begleitpröteine weitergereinigt wird. Nach der Rückstellung des pH-Wertes im Uberstand in den Neutralitätsbereich wird entweder die Lösung selbst oder ein Lyophilisat davon zum fertigen AHF-Präparat verarbeitet. Mit diesem Verfahren wird zwar der Reinigungseffekt verbessert und ein Produkt erhalten, welches eine spezifische Aktivität von mindestens 1 E pro mg Protein aufweist, aber neben dem Umstand, dass in der US-PS-4,294.826 keine Angaben über die Ausbeute enthalten sind, hat das Verfahren den Nachteil, dass sämtliche Lösungsmittel, welche im Verlaufe des Verfahrens von der Auflösung des Kryopräzipitats bis zur abschliessenden Neutralisation zugegeben werden, zur Herstellung eines Lyophilisats oder einer konzentrierten AHF-Lösung ganz oder teilweise durch Gefriertrocknung wieder entfernt werden wüssen. Die Entfernung von grösseren Losungsmittelvolumina durch Lyophilisation ist aber zeitraubend und kostspielig. Desgleichen bleiben sämtliche Verunreinigungen organischer und anorganischer Natur, die nicht bei der zweifachen Fällung ausfallen und abgetrennt werden, beispielsweise sämtliche'Puffer- und Neutra lisationsselze, in der fertigen AHF-Lösung oder im Lyophilisat zurück. Andererseits ist in der Arbeit von N. Heimburger et al. in der Zeitschrift Arzneimittelforschung 31 (1) Nr. 4 (1981), 5.619 - 623 ein Verfahren zur Herstellung eines hochgereinigten AHF-Präparats beschrieben, bei dem das Fibrinogen aus einer Lösung des Kryopräzipitats durch fraktionierte Fällung mit Glycin entfernt und der AHF über eine nachfolgende Natriumchlorid- Fällung aus dem Glycinüberstand ausgefällt wird. Bei diesem Verfahren erhält man zwar hochgereinigte Präparate, muss Jedoch den Nachteil von Ausbeuteverlusten In Kauf nehmen, da bei der fraktionierten Glycinfällung der AHF tallweise mltgefäült wird. Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, welches unter Vermeidung der den bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile eine wirtschaftlich Herstellung eines weitgehend reinen AHF-Präparats mit einer hohen Faktor VIII-Konzentratlon In guter Ausbeute aus Humanplasma ermöglicht. Diese Aufgabe wird beim erfindungsgemässen Verfahren dadurch gelost, dass der grösste Teil des Fibrinogen und anderer Begleitprotelne durch eine pH- Fallung entfemt und in der letzten Reinigungsstufe der AHF durch selektive Rainigungsfällung mittels Proteinfällungsmittel sus der vorgereinigten Lösung Isoliert wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines AHF-Konzentrats mit einer Konzentration von mindestens 25 E pro ml und einer spezifischen Aktivität von mindestens 1.5 E AHF pro mg Protein aus menschlichem Blutplasma durch eine Kombination von Massnahmen wie durch Kryopräzipitieren, Fallen, Reinigen mit irrotelnfallungsmitteln, Zentrifugieren und Lyophilisieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) das Kryoprazipitat in einem Puffer geringer lonenstärke auflöst, in der Lösung einen pH-Wert von 6.0 bis 6.8 sowie eine Temperatur von 5 bis 1500 einstellt und die dabei entstandene Fällung vom überstand abtremt, sodann b) den 80 vorgereinigten und an AHF in Bezug auf die Begleitproteine angereicherten tierstand neutralisiert, durch aufeinanderfolgende Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von etwa 15 Gew. % und von Glycin bis zu einer Menge von etwa 10 Gew.% einer Reinigungsfällung unterzieht, worauf der das AHF-Konzentrat enthaltende Niederschlag abgetrennt, gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren In einem physiologischen Puffer wiedergelöst und durch Tieffrieren und Lyophill- sieren in haltbare Form gebracht wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner die nach diesem Verfahren hergestellten AHF onzentrate, sowie die Präparate, die die genannten AHF Konzentrate enthalten. Zur Auflösung des Kryopräzipitats eignen sich Pufferlösungen mit geringer Ionenstärke und Konzentration, beispielsweise Citratpuffer mit einer Konzen traktion von 0.05 bis 0.5 Gew.% Tri-Natrlumcitrat, vorzugsweise kann eine 0.1 Gew.%ige Tri-Natriumcitratpufferlösung verwendet werden. Das Auflösen kann bei Raumtemperatur geschehen, jedoch kann bei grösseren Kryoprä.zipi tatmengen gelindes Erwärmen auf 30 bis 400C zur Beschleunigung des Lö sungsvorgangs zweckmässig sein. Die Lösung des Kryopräzipitats wird zur Ausfällung des grössten Teils an Fibrinogen durch Zugabe von verdünnten anorganischen oder organischen Säuren, beispielsweise verdünnter Salzsäure, Essigsäure oder Citronensäure auf eine pH-Wert von etwa 6.0 bis 6.8 eingestellt und rasch auf Temperaturen von 5 bis 15 C abgekühlt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Fibrinogenfällung durch Ansäuern der Kryopr zipitatlösung mit etwa 0.1 n Salzsäure oder etwa 1 Gew.%iger Citronensäure unter Rühren auf einen pH-Wert von 6.2 bis 6.4, wobei wiederum ein pH-Wert von 6.30 besonders bevorzugt ist, bei einer Temperatur von 100 bis 150C durchgeführt werden. Nach längerem Stehen, fällt ein faseriger Niederschlag aus, der auf übliche Weise durch Filtrieren, Dekantieren oder bevorzugt durch Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Unter den angegebenen Bedingungen fallen Begleitproteine des AHF, vor allem der grösste Teil des Fibrinogen, aber auch CIP (Cold-insoluble proteins), Plasminogen und Plasmin aus, während der AHF nicht mitgefällt wird und im klaren Überstand bzw. Filtrat zurückbleibt. Der pH-Wert des überstandes bzw. des Filtrats wird sodann vorzugsweise mit einer verdünnten Base, zweckmässig mit etwa 1 n Natronlauge auf einen pH Wert von & bis 7.5, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die Reinigungsfällung des AHF wird erfindungsgemäss durch abgestufte Zugabe von Proteinfällungamitteln durchgeführt, Indem der neutrallserte Überstand bzw. das Filtrat der Fibrinogenfällung mit Natriumchlorid unter Rohren bis zu einer Konzentration von etwa 15 Gew.% versetzt wird und asschliessend durch langsame Zugabe von Glycin bis zu einer Konzentration von etwa 10 Gew.%, die AHF-Fällung vervolstandigt wird Zweckmassig wird während der Glycin - fällung durch Zugabe verdünnter Basen, beispielsweise von 0.1 n NaOH, der pH-Wert im NEutralitätsbereich, vorzugsweise im Bereich von & bis 7.5, ganz bevorzugt im Bereich von 6.8 bis 7.2, gehalten und durch Kehlung von aussen oder von innen eine Temperatur von 00 bis iooc, vorzugsweise von 50 bis 80C eingestellt. Die Zugabe von Natriumchlorid und Glycin nacheinander kann in beliebiger Form geschehen, doch hat es sich als zweckmässig erwiesen, beide Proteinfällungsmittel in fester Form zuzugeben, um das Volumen der Lösung möglichst gering zu halten. Nach längerem Stehen, das je nach Grosse des Ansatzes zwischen einer und mehreren Stunden betragen kann, wird der entstandene Niederschlag auf übliche Weise, bevorzugt durch Zentrifugieren, abgetrennt, wiedergelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht. Zweckmässig löst man dazu den das AHF-Konzentrat enthaltenden Niederschlag in der etwa fünt- bis sechsfachen Menge eines physiologischen Puffers, beispielsweise eines 0.1 Gew.%igen Tri-Natriumcitratpuffers, bei neutralem pH-Wert, wobei gelindes Erwärmen auf 30 bis 40 C, bevorzugt auf 35 bis 37 C , zur Beschleunigung des Lösungsvorgangs vorteilhaft sein kann. Diese Losung kann zweckmassig zur Entfernung allenfalls vorhandener niedermoleku- larer Anteile fDr mehrere Stunden gegen einen Puffer gleicher Konzentration und lonenstärke wie der Lösungspuffer dialysiert werden. Die das AHF Konzentrat enthaltende Lösung oder das Dialysat werden gegebenenfalls mit den für Faktor VIII Ueblichen Stabilisierungsmitteln, einzeln oder in Kombina- tion, beispielsweise mit Natriumchlorid, Glycin, Tri-Natriumcitrat, Kohlenhydraten wie Glucose, oder Heparin versetzt, sterilfiltriert, abgefüllt und lyophiiisiert. Das erffndungsgemesse Verfahren Ist spezifisch geeignet zur grosstechnischen Herstellung eines gereinigten Faktor Vm-Konzentrats, welches allen Anforderungen in der modernen Therapie entsprlcht. Das mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte, lyophllisierte AHF Konzentrat hat eine spezifische Aktivität von mindestens 1,5 E pro mg Protein und list sich In Wasser rückstandsfrei zu einer injizierbaren Lösung mit mindestens 25 E AHFiml Lösungsmittel. Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung ist die überraschend hohe Ausbeute, mit der das über zwei Stufen gereinigte AHF-Konzentrat erhalten wird und die etwa 20 bis 30 % der theoretischen Plasmamenge beträgt. Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung. Beispiel: 6 kg Kryopräzipitat aus 596 1 Plasma werden bei 350C in 301 0.1 Gew.56iger Tri-Natriumcitratpufferlösung gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf 21 C wird mit 0.1 N HCl ein pH-Wert von 6.30 eingestellt. Anschlisssend wird auf 150C gekühlt, 30 min sedimentiert, der entstandene Niederschlag abzentrifugiert und der Oberstand mit 0.1 N NaOH auf pH 6.95 eingestellt. Zum überstand werden bei 200C langsam portionsweise 5.5 kg Kochsalz zugegeben. Anschliessend werden langsam portionsweise 3.5 kg Glycin zugegeben und während der Zugabe wird der pH-Wert kontrolliert und durch Zusatz von 0.1 N Natronlauge im Bereich von 6.9 bis 7.2 gehalten. Die Mischung wire auf 8 C abgekühlt und 2 Stunden lang gerührt. Anschllessend wird der Niederschlag (607 g) durch Zentrifugieren abgetrennt und in ca. 3.2 1 0.1 Gew.%igem Trl-Natrlumcitratpuffer gelöst. Diese Lösung wird 3 Stunden lang gegen 80 1 0.1 Gew.%igen Tri-Natriumcitratpuffer bei pH 7 dialysiert. Nach der Dialyse erhält man 4.2 1 AHF-Lösung, die klärfiltriert wird. Anschliessend wird Natrlumchlorid, Glycin und Trl-Natriumcitrat zugegeben und in Flaschen zu je 20 ml abgefüllt. Die einzelnen Gefässe werden durch Lyophilisation vom Lösungsmittel befreit. Man erhält ca. 266 Flaschen, die Je Flasche MO E. Iyophilisieetes AHf Konzentrat mit einer spez. Aktivität von mindestens 1,3 E FVE/mg Protein enthalten, welches sich in Wasser zu einer klaren AHF-Lösung von mindestens 25 E AHF/ml rückstendsfrel löst.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines Antihämopblliefaktor-Konzentrats (AHF Konzentrats) mit einer Konzentration von mindestens 25 E AHFlml und einer spezifischen Aktivität von mindestens 1,5 E AHF/mg Protein aus menschlichem Blutplasma durch eine Kombination von Massnahmen wie durch Kryopräzipitleren, Fällen, Reinigen mit Protelnfällungsmitteln, Zentrifugieren und Lyophilisieren, dadurch gekennzeichnet, dass man a) das Kryopräzipitat in einem Puffer geringer Ionenstärke auflöst, in der Lösung einen pH-Wert von 6.0 bis 6.8 sowie eine Temperatur von 50C bis 150C einstellt und die dabei entstandene Fällung vom Uberstand abtrennt, sodann b) den so vorgereinigten und an AHF in Bezug auf die Begleitproteine angereicherten Überstand neutralisiert, durch aufeinanderfolgende Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von etwa 15 Gew.% und von Glycin bis zu einer Menge von etwa 10 Gew.% einer Reinigungsfällung unterzieht, worauf der das AHF-Konzentrat enthaltende Niederschlag abgetrennt, gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren in einem phy siologischen Puffer wiedergelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fällung in Stufe a) bei einem pH-Wert von 6.50 und einer Temperatur von 10 C bis 15 C durchführt. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Glycinfällung in Stufe b) einen pH-Wert von 6.8 bis 7.2 einhält und eine Temperatur von 5 C bis 80C einstellt. 4. Verfahren nach den AnsprUchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die physlologsche Pufferlösung des AHF-Konzentrats in Stufe b) vor dem Lyophilisieren gegen einen Puffer gleicher Konzentration und Ionenatärke wie der Lösungspuffer dialysiert. 5. AHF-Konzentrat mit einer Konzentration von mindestens 25 E AHF/ml und einer spezifischen Aktivität von mindestens 1.5 E FVIII/mg Protein, hergestellt nach dem Verfahren der Anspruchs 1 bis 4. 6. AHF-Prapara'te,enthaltend ein AHF-Konzentrat gemass Anspruch 5. Patentansprüche für den Vertragsstaat AT 1. Verfahren zur Herstellung eines Antihämophiilefaktor-Konzentrats (AHF Konzentrats) mit einer Konzentration von mindestens 25 E AHF/ml und einer spezifischen Aktivität von mindestens 1,5 E AHF/mg Protein aus menschlichem Blutplasma durch eine Kombination von Massnahmen wie durch Kryopräzipitieren, Fällen, Reinigen mit Proteinfällungsmi tteln, Zentrifugieren und Lyophilisieren, dadurch gekennzeichnet, dass man a) das Kryopräzipitat in einem Puffer geringer Ionenstärke auflöst, in der Lösung einen pH-Wert von 6.0 bis 6.8 sowle eine Temperatur von 50C bis 15 C einstellt und die dabei entstandene Fällung vom Überstand abtrennt, sodann b) den so vorgereinigten und an AHF in Bezug auf die Begleitproteine angereicherten Oberstand neutralisiert, durch aufeinanderfolgende Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von etwa 15 Gew.% und von Glycin bis zu einer Menge von etwa 10 Gew.% einer Reinigungsfällung unterzieht, worauf der das AHF-Konzentrat enthaltende Niederschlag abgetrennt, gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren in einem phy siologischen Puffer wiedergelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fällung in Stufe a) bei einem pH-Wert von 6.30 und einer Temperatur von 10 c bis 15 C durchführt. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Glycinfällung in Stufe b) einen pH-Wert von 6.8 bis 7.2 einhält und eine Temperatur von 50C bis 80C einstellt. 4. Verfahren nach den Amsprüchen 1 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die physlologische Pufferlösung des AHF-Konzentrats in Stufe b) vor dem Lyophillsleren gegen einen Puffer gleicher Konzentration und Ionenstärke wie der Lösungspuffer dlalysiert.

Inventors: FROLIK, MANFRED, KALTSCHMID, HELMUT, DR.
Applicants: LENTIA GESELLSCHAFT MIT BESCHRANKTER HAFTUNG, SCHWAB & CO. GES.M.B.H.
Application year: 1984
Main classification: C07K3
IPC codes: C07K14