PROCESS FOR THE EXTRACTION OF LEAFY PROTEINS FROM A VEGETABLE MATERIAL, PARTICULARLY FROM A VEGETABLE OF THE GENUS NICOTIANA

Abstract: 1. A method of extracting proteins from the leaves of plants, more particularly of the genus Nicotiana in which : a) the leaves are reduced to pulp in the presence of 0 to 2.5 times the weight of green material of water and 0.5 to 2 parts of an anti-oxydant for 100 parts of plant material, b) the liquid, or green juice, containing the major part of the insoluble proteins in suspension and the soluble proteins is immediately extracted from the mixture obtained, c) the insoluble proteins are precipitated, d) the precipitate is separated from the liquid for clarifying this liquid containing a protein fraction I and a protein fraction II, e) the protein fraction I of the clarified liquid resulting from the preceding step is precipitated, and f) the protein fraction I thus obtained is extracted, which method is characterized by the fact that, for precipitating the protein fraction I, carbon anhydride in the gaseous state (CO) is diffused in the clarified liquid at least until saturation of the liquid with CO2 .

Description: Procédé d'extraction des protéines foliaires a partir d'une matière végétale et plus particulièrement d'une plante genre Nicotiana. La présente invention concerne un procédé d'extraction des protéines foliaires d'une matière végétale et plus particulièrement d'une plante genre Nicotiana. Selon un aspect de l'invention, elle a trait à un procédé d'extraction de la fraction I protéique hydrosoluble de la plante. Différents procédés ont été publiés. Ils sont basés sur les observations très anciennes de H.M. ROUELLE qui, dès 1773, met en évidence, par pressurage et chauffage des jus, la présence de "matière glutineuses ou végéto-animales" dans les parties vertes des végétaux. La fraction I protéique a été identifiée pour la première fois en 1947. I1 est admis par lthomme de l'Art que les protéines foliaires peuvent etre réparties en deux groupes principaux en fonction de leur solubilité dans l'eau - les protéines membranaires, insolubles dans l'eau, liées en particulier aux pigments chlorophylliens, qui correspondent pour l'essentiel aux protéines vertes décrites dans les différents procédés d'extraction connus. - les protéines hydrosolubles. Ces protéines appelées également protéines blanches après extraction, sont constituées pour moitié environ par la Ribulose 1-5 diphosphate carboxylase oxygénase (EC, 4.1.1.39) ou fraction I protéique, d'origine chloroplastique et pour moitié par la fraction II protéique, mélange des autres enzymes d'origine essentiellement cytoplasmique. Ces protéines jusqu'à présent, malgré leur abondance dans le règne végétal et leur valeur nutritive pour l'homme et l'animal, n'ont pas fait l'objet d'une exploitation intensive car les procédés connus ne sont pas utilisables industriellement. La protéine de la fraction I est celle qui potentiellement est la plus intéressante car a l'étant pur elle est inodore, insipide et incolore. La plante de tabac, genre Nicotiana, est le seul végétal actuellement connu qui permet d'obtenir une quantité importante de ladite protéine sous forme cristallisée ou pré-cristallisée, donc très purs. De plus, elle est remarquablement équilibrée en acides aminés essentiels, ce qui permet d'envisager son utilisation dans certains régimes alimentaires pour malades souffrant de troubles du métabolismes (maladie rénale, Les procédés connus pour isoler les protéines débutent par la réduction en pulpe des feuilles ou bien des feuiles et des tiges de la plante par broyage. Ce broyage est suivi d'un pressurage qui permet de séparer de la masse fibreuse le jus vert contenant une grande partie des protéines insolubles et des protéines solubles dans l'eau. La séparation des protéines insolubles de ce jus se fait jusqu'à present après avoir provoqué leur coagulation par chauffage du jus à 500C + 20C pendant 10 à 30 min suivi d'un refroidissement rapide à la température ambiante voisine de 20 C. Après cette étape, deux techniques courantes peuvent etre mises en oeuvre. La centrifugation ou la filtration sous vide. Cette dernière technique, qui requiert l'emploi d'additifs de filtration du type "perlite" pour atteindre son maximum d'efficacité, est parfaitement adpatée au traitement industriel. Le jus clarifié de couleur brune, qui contient en mélange les fractions protéiques I et II est, de manière connue, traité suivant divers procédés abondamment décrits dans la littérature et plus particulièrement dans la demande de brevet français n 81 09 950. Il est évident pour l'homme de l'Art que ces procédés sont coûteux. Parfois longs, voire inefficaces, dans la mesure où, si aucun additif n'est apporté au jus, la précipitation de la fraction I sera inexistante dans les cas où la plante utilisée sera en fin de période végétative, par exemple. L'acidification réalisée par addition d'acides minéraux ou organiques demande un ajustement d'une extrême précision pour éviter que la fraction I protéique ne précipite sous forme amorphe et cet ajustement est d'autant plus délicat qu'il varie en fonction d'un grand nombre de facteurs tels que l'état physiologique du végétal, la variété, la température du jus. l'invention vise un procédé d'extraction des protéines des feuilles de plantes genre Nicotiana comprenant les étapes consistant a) à réduire les feuilles en pulpe par exemple en présence de o à 2,5 fois le poids de matières vertes d'eau et de 0,5 à 2 parties d'un agent anti-oxydant pour 100 parties de matière végétale. b) à extraire immédiatement du mélange obtenu le jus vert contenant une partie des protéines insolubles en suspension et des protéines solubles. c) à faire précipiter les protéines insolubles. d) à séparer le précipité du liquide. e) à faire précipiter la fraction I protéique du liquide clarifié résultant de l'étape précédente. f) à extraire la fraction I protéique ainsi obtenue dans laquelle pour faire précipiter les protéines, on diffuse de l'anhydride carbonique à l'état gazeux dans le jus. Toutes les espèces, genre Nicotiana, mais plus particulièrement Nicotiana tabacum L se prêtent à ce procédé d'extractioo La fraction I protéique (FIp) est localisée essentiellement au niveau des feuilles, mais la présence des tiges peut favoriser l'extraction. Les feuilles seules ou conjointement avec les tiges sont utilisées. Elles peuvent être issues de plantes sénescentes ou de repousses tardives (3ème ou 4ème coupe). Le procédé suivant l'invention permet ltextraction de FIp encore importante avec ce type de plants, ce qui n' est pas le cas des procédés connus jusqu'à présent. Lesdites parties de la plante sont broyées et réduites en pulpe en présence d'une quantité d'eau comprise entre 0 et 2,5 fois le poids de matière végétale traitée. Afin d'éviter les réactions parasites (oxydations, formations de complexes qui réduiraient les rendements), on ajoute un anti-oxydant, de préférence le métabisulfite de sodium par pulvérisation au cours du broyage, ou par trempage juste avant broyage à raison de 0,5 à 2 parties d'anti-oxydant pour 100 parties de matière végétale. On presse immédiatement la masse broyée pour en extraire la portion liquide ou jus vert contenant la majeure partie des protéines du végétal. L'un des buts de l'invention est d'obtenir un procédé per fectionné de séparation des protéines du jus de pressurage. Un autre but de l'invention est d'obtenir la précipitation des protéines insolubles du jus de pressurage de manière rapide et sans dépense énergétique importante. Un autre but de l'invention est d'obtenir la protéine de la fraction I par un procédé simple et rapide sans contamination; Un autre but de l'invention est d'extraire des protéines de plantes en fin de saison végétative (3ème ou 4ème coupe). La manière dont ces objectifs, ainsi que d'autres, sont atteints conformément à la présente invention ressort de la description détaillée qui suit. A cet effet l'invention prévoit, pour séparer les protéines insolubles du jus vert, de diffuser du C02 gazeux pendant un temps suffisant pour obtenir la coagulation des protéines insolubles sans faire précipiter les protéines de la fraction Ip. Ce résultat est obtenu de manière variable suivant le produit traité mais de préférence de débit de C02 sous pression atmosphérique doit être compris entre 10 à 100 ml/min et litre de jus traité et la durée du traitement est inférieure à une heure, de préférence comprise entre 5 et 15 minutes. Ce traitement provoque la précipitation rapide des protéines insolubles sans qu'il soit nécessaire de chauffer le jus. La séparation est alors effectuée de manière connue, par exemple par centrifugation ou filtration sous vide. Le jus clarifié obtenu par ce procédé ou d'autres procédés par ailleurs connus contient les fractions protéiques I et Il. L'invention prévoit encore d'assurer la précipitation de la fraction I en diffusant du C02 gazeux à travers la masse de jus à traiter au moins jusqu'à saturation du jus. Ce traitement conduit de préférence à température ambiante voisine de 200C provoque en quelques minutes, une précipitation sélective de la FIp sous forme cristallisée ou précristallisée. Selon une modalité de l'invention, la réaction est conduite dans l'obscurité. Le précipité est récupéré par soutirage ou par centrifugation, le liquide contient encore la fraction IIp qui peut être récupérée à son tour selon un procédé connu, par exemple soit par acidification, soit par traitement thermique. Le rendement d'extraction par le procédé selon l'invention est majoré de 10 à 30% par rapport à ceux des procédés connus. La fraction I protéique obtenue se présente sous une structure pré-cristalline nettement différentiée et le traitement par CO2 ne contamine pas le produit. Le jus traité s'ajuste de lui-même au pH optimum par saturation de la solution en C02. D'autres avantages et détails de l'invention sont illustrés par les exemples suivants EXEMPLE Matériel végétal Nicotiana tabacum variété PB (tabac noir) variété BB 16 (tabac type Burley) variété BB 16 sénescente (45 jours après 3 coupe) cultivé à à 250 000 plants/ha, récolté en plantes entières (tiges + feuilles). Broyage Un lot de 20 kg de tabac est broyé dans un appareil de type LAW (hélice bi-pales + trémie de 2 mm). Au cours de cette opération, une solution de métabisulfite de sodium à 10 g/l est pulvérisée sur le tabac a raison de 0,5 1 par kg de tabac. Pressurage : La "bouillie" obtenue est immédiatement transférée dans une presse à plateaux et soumise à une pression de 10 kg/cmê (une presse à bande ou à vis pourrait egalement être utilisée). Les caractéristiques du tabac avant broyage du "jus vert" et du "tourteau" sont rassemblées dans le tableau ci-après. (Voir tableau page 11). Traitement du jus vert La coagulation thermique des "protéines vertes" est réalisée à t = 500C + 20C par passage du "jus vert" dans un serpentin immergé dans un bain-marie à 75 C. Grâce à ce procédé, la température s'élève rapidement (en i min environ) à 500C; elle est ensuite maintenue à ce niveau, pendant 10 min, à l'aide d'un deuxième bain-marie stabilisé à 50 C. Le jus est alors refroidi rapidement (1 min) jusqu'à 200C par passage dans un serpentin plongé dans une cuve à eau réfrigérée. La clarification du jus ainsi traité est réalisée par filtration sous vide à l'aide de fioles à vide de 5 1 équipées de filtres de type Büchner. Les filtres Büchner ( = 24 cm) sont garnis au préalable d'une feuille de papier filtre (PRAT et DUMAS), réf. 202 IFS) sur laquelle est déposée une couche d'environ 0,5 cm de perlite ou dicalite (adjuvant de filtration). La clarification ainsi obtenue ne peut être parfaite que dans la mesure où de la perlite (ou dicalite) est mélangée, avant filtration au jus à clarifier (10 g/l). Si un tel montage convient bien pour le traitement de quelques dizaines de litres de jus, il doit cependant être remplacé par un filtre rotatif à tambour, sous vide, dans le cas où des quantités plus importantes de jus sont à traiter. La clarification du jus peut également être obtenue par centrifugation à haute vitesse (#10 000 g), difficile à réaliser sur de grandes quantités. Traitement du jus clarifié Le jus clarifié est divisé en 3 fractions aliquotes de 5 1 chacune. La première fraction (A) est conservée telle quelle a 25 C, à l'obscurité. La seconde fraction (B) est traitée par le C02 gazeux pendant 15 min (débit du CO2:50 ml/min), à l'aide d'un diffuseur placé dans le fond d'un récipient et relié à une bouteille de gaz C02 (38 kg) par l'intermédiaire d'un détendeur. La troisième fraction (C) est acidifiée avec HCI (2N) jusqu'à obtenir le pH atteint dans la fraction (B) après traitement par le CO2. Après précipitation de la FIp (quasi immédiate dans le cas des fractions (B) et (C), les dépôts cristallins sont récupérés par soutirage et/ou centrifugation à 2000 g puis lyophilisés. Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-après. Voir tableau page 12). Cet exemple démontre la supériorité du traitement par le gaz C02 sur les traitements témoins (A) et (C) (très forte augmentation des rendements d'extraction, rapidité de la cristallisation) et sur les traitements par acidification (simplicité de mise en oeuvre, pureté de la fraction I protéique précipitée(. EXEMPLE Il A partir de plants de tabac juvéniles (variété BB 16), le protocole expérimental de l'exemple 1 a été conservé jusqu'au traitement du jus clarifié par le gaz C02. La variante apportée dans cet exemple est la durée du traitement par le C02 : le jus clarifié a en effet été divisé en 5 parties égales et "gazéifié" pendant 15 min, 1 h, 2 h ou 4 h. Les rendements en FIp correspondants sont reportés dans le tableau ci-après EMI9.1 <tb> Durée <SEP> du <SEP> traitement <SEP> pH <SEP> FIp <SEP> cristallisée <tb> <SEP> au <SEP> CO2 <SEP> (g/kg <SEP> tabac <SEP> frais) <tb> Témoin <SEP> (non <SEP> traité) <SEP> 6,0 <SEP> 1,66 <tb> <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 5,70 <SEP> 3,21 <tb> <SEP> 1 <SEP> h. <SEP> 5,60 <SEP> 3,66 <tb> <SEP> 2 <SEP> h. <SEP> 5,60 <SEP> 3,57 <tb> <SEP> 4 <SEP> h. <SEP> 5,60 <SEP> 3,61 <tb> Une durée de traitement supérieure à 15 min augmente relativement peu le rendement d'extraction, elle peut néanmoins se justifier pour certains tabacs qui se prêtent mal à l'extraction de la FIp (tabacs sénescents, certaines variétés ....). EXEMPLE III Des plants de tabac de la variété BB 16, récoltés au stade juvénile (35 jours), sont traités selon le protocole de l'exemple 1 jusu'à l'obtention du "jus vert". Les protéines vertes sont alors précipitées non pas par la chaleur, comme dans l'exemple 1, mais par "gazéification" du "jus vert" par le C02. La floculation des protéines vertes est obtenue après 15 min de traitement à température ambiante (débit de C02 : 25 ml/min/1 jus). La récupération des protéines solubles (FIp + FIIp) est effectuée de la même manière que dans l'exemple 1 (filtration sous vide ou centrifugation). La cristallisation de la FIp peut alors être réalisée soit en laissant décanter le jus clarifié tel quel, soit en traitant à nouveau le jus par le C02 selon une des modalités des exemples 1 et 2. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ciaprès. (Voir tableau page 13). Cet exemple souligne }'intérêt d'un traitement au C02 sur "jus vert". En effet, la phase de chauffage à 500C est dans ce cas "court-circuitée" ce qui entraîne une simplification supplémentaire de la technique d'extraction et surtout une économie d'énergie non négligeable. Ce procédé comporte toutefois le risque de précipiter une partie des protéines solubles avec les protéines vertes si la durée du traitement par C02 est mal contrôlée. Ces exemples illustrent de manière non limitative l'objet de l'invention et on peut y apporter des modifications sans sortir de son cadre. EMI11.1 <SEP> Azote <SEP> total <SEP> FTp-FIIp <tb> <SEP> Volume <SEP> poids <SEP> pH <SEP> (%n.s.tabac <SEP> (%n.s.tabac <tb> <SEP> (1) <SEP> (kg) <SEP> avant <SEP> broya- <SEP> avant <SEP> broya <SEP> ge) <SEP> ge) <tb> <SEP> - <SEP> Variété <SEP> PB <SEP> - <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 3,9 <SEP> 8.7 <tb> TABAC <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 4,9 <SEP> 10.2 <tb> AVANT <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 4,4 <SEP> 6,7 <tb> BROYAGE <SEP> sénescente <tb> <SEP> -Variété <SEP> PB <SEP> 21,0 <SEP> 21,5 <SEP> 5,9 <SEP> 2,4 <SEP> 6,3 <tb> "JVS <SEP> VERT" <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> 21,5 <SEP> 22,0 <SEP> 6,0 <SEP> 3,0 <SEP> 8,0 <tb> <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> 20,5 <SEP> 21,5 <SEP> 6,1 <SEP> 2,7 <SEP> 5,3 <tb> <SEP> sénescente <tb> <SEP> -Variété <SEP> PB <SEP> - <SEP> 8,5 <SEP> - <SEP> 1,5 <SEP> 2,4 <tb> "TOURTEAU <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 8,0 <SEP> - <SEP> 1,9 <SEP> 2,2 <tb> <SEP> - <SEP> " <SEP> BB <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 8,5 <SEP> - <SEP> 1,7 <SEP> 1,4 <tb> <SEP> sénescente <tb> EMI12.1 <SEP> pH <SEP> JUS <SEP> CLARIFIE <tb> <SEP> Durée <SEP> de <SEP> la <SEP> FIp <SEP> cristal- <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> % <tb> <SEP> avant <SEP> après <SEP> cristalli- <SEP> lisée <SEP> de <SEP> la <SEP> FIp <tb> <SEP> traite- <SEP> traite- <SEP> sation <SEP> (g/kg <SEP> tabac <SEP> précipitée <tb> <SEP> ment <SEP> ment <SEP> vert) <SEP> (% <SEP> n.s.) <tb> <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> 5,9 <SEP> 5,9 <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 1,5 <SEP> 15,1 <tb> Variété <SEP> " <SEP> B <SEP> 5,9 <SEP> 5,5 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 3,2 <SEP> 15,2 <tb> PB <SEP> " <SEP> C <SEP> 5,9 <SEP> 5,5 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 2,9 <SEP> 14,8 <tb> <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> 5,8 <SEP> 5,8 <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 2,0 <SEP> 15,8 <tb> Variété <SEP> " <SEP> B <SEP> 5,8 <SEP> 5,4 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 4,1 <SEP> 15,7 <tb> BB <SEP> 16 <SEP> " <SEP> C <SEP> 5,8 <SEP> 5,4 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 3,7 <SEP> 14,2 <tb> <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> 6,2 <SEP> 6,2 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> Variété <SEP> " <SEP> B <SEP> 6,2 <SEP> 5,7 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 1,8 <SEP> 15,9 <tb> BB <SEP> 16 <SEP> " <SEP> C <SEP> 6,2 <SEP> 5,7 <SEP> qq <SEP> min <SEP> 1,5 <SEP> 14,3 <tb> sénescente <tb> EMI13.1 Traitement <SEP> du <SEP> "jue <SEP> vert" <SEP> Traitement <SEP> du <SEP> pH <SEP> après <SEP> PIp <SEP> cristallisée <tb> <SEP> "jus <SEP> olarifié" <SEP> traitement <SEP> (g/kg <SEP> tabac <SEP> frais) <tb> chauffage <SEP> à <SEP> 50 C <SEP> (10 <SEP> min) <SEP> témoin <SEP> 6,1 <SEP> 1,90 <tb> <SEP> CO2 <SEP> (15 <SEP> min) <SEP> 5,6 <SEP> 3,95 <tb> diffusion <SEP> CO2 <SEP> (15 <SEP> min) <SEP> témoin <SEP> 5,9 <SEP> 1,50 <tb> <SEP> CO2 <SEP> (15 <SEP> min) <SEP> 5,5 <SEP> 2,75 <tb>

Claims: Revendications 1. Procédé d'extraction des protéines des feuilles de plantes, plus particulièrement du genre Nicotiana selon lequel a) on réduit les feuilles en pulpe par exemple en présence de O à 2,5 fois le poids de matières vertes d'eau et de 0,5 à 2 parties d'un agent anti-oxydant pour 100 parties de matière végétale, b) on extrait immédiatement du mélange obtenu le liquide, ou jus vert, contenant la majeure partie des protéines insolubles en suspension et des protéines solubles, c) on fait précipiter les protéines insolubles, d) on sépare le précipité du liquide pour clarifier ce liquide contenant une fraction I et une fraction II protéiques, e) on fait précipiter la fraction I protéique du liquide clarifié résultant de l'étape précédente, et f) on extrait la fraction I protéique ainsi obtenue, procédé caractérisé par le fait que, pour faire précipiter la fraction I protéique, on diffuse de l'anhydride carbonique (COz) à l'état gazeux dans le liquide clarifié au moins jusqu'à saturation du liquide en C02 - 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la précipitation des protéines insolubles est obtenue par chauffage du liquide à 50 C + 20C pendant 10 à 30 min et refroidissement à 200C. 3.- Procédé selon la revencication 1 ou 2, dans lequel la plante est du genre Nicotiana tabacum L. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel à ltétape c), on précipite les protéines insolubles par diffusion d'anhydride carbonique (C02) à l'état gazeux dans le liquide pendant un temps suffisant sans entraîner la précipitation de la fraction I protéique. 5.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la température du liquide clarifié est voisine de 200C. 6.- Procédé selon l'une des revendications i à 5, dans lequel l'étape d) est réalisée dans l'obscurité. 7.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les feuilles et les tiges des plantes sont réduites en pulpe. 8.- Procédé selon l'une des revendications i à 7, dans lequel l'agent anti-oxydant est du métabisulfite de sodium.

Inventors: DUMERY, BERNARD
Applicants: TABACS & ALLUMETTES IND
Application year: 1984
Main classification: A23J1
IPC codes: A23J1