Method for the preparation of tuberculin-L antigen

Abstract: 1. Process for the preparation of tuberculin L antigen from a culture of BCG or tuberculous bacilli, characterized in that a fraction rich in antigen L, called TP-G-DEAE fraction, of which the titer is higher than 100 000 U/mg, in guinea pigs sensitized with living BCG, from an inactivated BCG culture filtrate subjected to a preparatory fractionation which comprises a step of precipitation of said filtrate with trichloracetic acid at 2% final concentration, a step of precipitation of the collected supernatant, with trichloracetic acid at 10% final concentration, reprecipitation of the precipitate so obtained, previously dissolved in a small volume of water, with trichloracetic acid at 10% final concentration, to obtain a fraction called TP-G-TCA 10 which, after dissolving in a small volume of acetic acid and removal of the slight precipitate formed, is fractionated on a weakly acid resin ion exchange column, to collect the fraction corresponding to the peak most active on guinea pigs sensitized with living BCG, passing into the end of the dead space, called fraction TP-G-CM, which fraction itself is subjected to fractionation on a basic resin ion exchange column, to collect the fraction corresponding to the peak most active on guinea pig sensitized with living BCG, passing into the end of the dead space, called fraction TP-G-DEAE, whose titer is higher than 100 000 U/mg.

Description: La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de l'Antigène tuberculinique L. La tuberculine est, comme on le sait, un agent de diagnostic permettant de déceler la sensibilisation d'un sujet aux bacilles tuberculeux, qu'il s'agisse de bacilles de Koch virulents ou du vaccin BCG. La sensibilité à la tuberculine se manifeste par un phénomène allergique qui se traduit par une réaction oedémo-érythémateuse consécutive à une application cutanée (par cuti-réaction ou injection intradermique) de tuberculine ; cette réaction se manifeste par l'apparition d'un érythème ou d'une papule de forme sensiblement circulaire dont le diamètre est lié à la dose injectée et à la sensibilité du sujet. Depuis les filtrats concentrés de cultures de bacilles tuberculeux préparés par KOCH, on a cherché à purifier la tuberculine de façon de plus en plus poussée, pour en améliorer l'activité et la spécificité soit vis-à-vis de l'espèce bacillaire, et de son état (vivant ou inactivé), soit visà-vis de la mesure du degré de résistance du sujet. Formulant l'hypothèse que la partie active de la tuberculine est constituée par des substances protidiques, les Chercheurs ont, conformément à l'Art antérieur, essentiellement visé à isoler ces substances protidiques sous la forme la plus pure possible, dans le but d'obtenir un produit hautement actif et éviter les réactions non spécifiques de la tuberculine. C'est ainsi que les travaux de LONG et SEIBERT ÛCf. ANN. REV. OF TUBER., 59, 1949, p. 862 ont permis d'isoler un produit de haute activité connu sous le nom de tuberculine PPD (purified protein derivative), qui constitue en outre, un étalon de référer ce. Toutefois, comme le procédé d'isolement des protéines proposé par LONG et SEI.BERT présentait l'inconvénient de donner des produits présentant des caractères chimiques et une activité biologique variables, J. BRETEY et A. LAMENSANS f. C.R. ACAD. SC. PARIS, Ifi, Mai 1951, p. 1880-1882¯7 propo sèrent un autre procédé qui permettait d'extraire des cultures de bacilles tuberculeux, pratiquement la totalité des substances protidiques douées de propriétés tuberculiniques. Cependant, F. ROMAIN, S. AUGIER-GIBORY, E. VERS MISSE et J. AUGIER ont observé récemment ±Cf. C.R. ACAD. SC. PARIS, 293, 23 Novembre 1981, p. 631-6337 que certaines tuberculines présentent une activité 5 à 10 fois plus forte que d'autres, selon la méthode de sensibilisation des animaux utilisés pour le titrage. L'évaluation de l'activité d'une tuberculine est habituellement réalisée par la mesure du diamètre de la réaction oedémo-érythémateuse provoquée par son injection intradermique chez le cobaye sensibilisé, comparativement à la mesure du diamètre de la réaction obtenue par l'injection d'une tuberculine standard servant de référence. Or, au cours de leurs travaux, F. ROMAIN et Al., ont constaté que certaines 'tuberculines ont une activité beaucoup plus grande - exprimée par son titre en unités TU/mg - en hypersensibilité retardée chez les cobayes sensibilisés avec des bacilles vivants tels que le bacille BCG, que chez les cobayes sensibilisés par des bacilles inactivés et que l'activité de ces tuberculines peut etre 5 à 6 fois supérieure dans le premier cas que ce qu'elle est dans le second cas. Ils ont pu attribuer cette différence d'activité à la présence d'un antigène, dénommé Antigène L, qu'ils ont isolé à partir de tubercuGine IP 48 purifiée selon le procédé de J. BRETEY et A. LAMENSANS mentionné plus haut, par chromatographie sur DEAE-Cellulose et traitement de la fraction passant avec le volume mort de la colonne, par concentration, précipitation par l'acétone, dissolution dans l'eau, précipitation par l'acide trichloracétique, séparation du surnageant qui est précipité par l'acétone, puis à nouveau précipité par l'acide trichloracétique, le surnageant obtenu étant précipité par l'acétone pour donner une traction Aac II contenant l'Antigène La dont L'activité est 5,57 fois supérieure à celle de la fraction B qui est passée entre 0,005 M et 0,1 M dans la colonne de DEAE-Cellulose et a été concentrée et extraite par entraînement par un précipité d'acide benzoïque. Le titre de la fraction Aac Il est de 82 500 TU/mg, et celui de la fraction B est de 14 800 TU/mg ; cependant, le rendement en fraction Aac Il n'est que de 8 % environ. Ce faible rendement, ajouté à la complexité du procédé, a amené les Inventeurs à rechercher un nouveau procédé d'isolement de l'Antigène L qui permette de réaliser une purification plus poussée encore de la tuberculine de départ et d'obtenir une fraction pratiquement uniquement constituée par de l'Antigène L, présentant un titre plus élevé que précédemment, qui permette d'obtenir des rendements plus élevés en fraction riche en Antigène L et qui soit d'une mise en oeuvre relativement simple et rapide. La présente invention a pour objet un procédé de 'préparation d'antigène tuberculinique L à partir d'une culture de bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'on isole une fraction riche en Antigène L, dénommée fraction TP-G-DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant, à partir d'un filtrat de culture de BCG non inactivé soumis à un fractionnement préparatif qui comprend une étape de précipitation dudit filtrat par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale, une étape de précipitation du surnageant recueilli, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, reprécipitation du précipité ainsi obtenu, préalablement dissous dans un faible volume d'eau, par de l'acide trichloracétique à 10 8 concentration finale, pour obtenir une fraction dite TP-G-TCA 10 qui, après dissolution dans un faible volume d'acide acétique et élimination du léger précipité formé, est fractionnée sur une colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dénommée fraction TP-G-CM, laquelle fraction est elle-même soumise à un fractionnement sur une colonne de résine échangeuse d'ions basique, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dite fraction TP-G-DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg. Selon un mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, les étapes du fractionnement préparatif auquel est soumis le filtrat de culture de BCG non inactivé utilisé comme matière première, pour en isoler la fraction TP-G-DEAE riche en Antigène L, sont réalisées en présence de butanol à 3,8-4,2 % concentration finale. Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé objet de la présente invention, la fraction TP-G-DEAE est elle-même soumise à une chromatographie de gel-filtration, par tri moléculaire, pour recueillir la fraction qui 'passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion, laquelle fraction est soumise à un dessalage par chromatographie sur tamis moléculaire, pour obtenir une fraction, dénommée TP-G-GF05, dont le titre est supérieur à 600 000 U/mg. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet de la présente invention, la colonne de résine échangeuse dtions faiblement acide utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-CM, est équilibrée par une solution d'acide acétique 50 mM, pH 3. Selon un autre mode de mise en oeuvre préférée du procédé objet de la présente invention, la colonne de résine échangeuse d d'ions basique utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-DEAE, est équilibrée par du tampon TRIS-HCl 50 mM, pH 7. Les Inventeurs ont pu mettre en évidence que le butanol ajouté à toutes les solutions mises en oeuvre dans le procédé d'obtention de la fraction riche en Antigène L, améliore d'une façon déterminante les précipitations, tout en jouant par ailleurs son rôle connu d'antiseptique. Par unité "U", on entend le 1/40 000 de mg de la fraction BR6 décrite sous le nom de "B" dans le C.R. Acad. Sci. 1981, 293, 631-633. La fraction BR6 a elle-même été titrée en fonction de l'étalon international de PPD humain (PPDM de Copenhague Staten Serum Institute). Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, on opère avantageusement comme décrit ciaprès PREPARATION DE L'ANTIGENE L Le procédé de préparation de l'Antigène L conforme à l'invention, combine un processus de purification par précipitation par l'acide trichloracétique, avec un processus de fractionnement sur colonnes de chromatographie. 1") On part d'un filtrat d'une culture de 12 semaines de BCG non inactivé auquel on ajoute du butanol 4 % con 'centration finale, que l'on précipite par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale ; le précipité est écarté et on recueille le surnageant, que l'on précipite par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale. Le précipité obtenu est redissous dans un petit volume d'eau additionnée de butanol 4 % concentration finale et à nouveau précipité par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale. Le précipité obtenu est désigné comme étant la fraction "TP-G-TCA 10". 2") On dissout la fraction TP-G-TCA 10 dans une faible quantité d'acide acétique contenant du butanol 4 8 concentration finale, de préférence 50 mM, pH 3, on élimine par centrifugation le léger précipité qui se forme et on fait passer le surnageant sur une colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide telle que CM-Trisacryl-M, équilibrée par une solution d'acide acétique contenant du butanol 4 % concentration finale, à pH 3, de préférence identique à celle qui a servi à dissoudre la fraction TP-G-TCA 10. Le pic passant en fin de volume mort, désigné comme étant la fraction TP-G-CM, est la fraction la plus active sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 3") On dissout alors cette fraction TP-G-CM dans une faible quantité de tampon TRIS-HCl contenant du butanol 4 % concentration finale 50 mM, pH 7 et on fait passer la 60lution obtenue sur une colonne de résine échangeuse d'ions basique telle que DEAE-Trisacryl-M, équilibrée par le même tampon pH 7. Le pic passant en fin de volume mort, désigné comme étant la fraction TP-G-DEAE, est la fraction la plus active sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant. Le procédé combiné d'isolement par précipitation et par fractionnement sur colonne permet d'obtenir la fraction TP-G-DEAE avec un rendement qui est d'au moins 20 % par rapport à la fraction TP-G-TCA 10. 4) Le fractionnement est poursuivi en chromatographiant la fraction TP-G-DEAE sur une colonne de tri moléculaire par gel-filtration, telle qu'une colonne d'agarose (type "SEPHADEX") ou d'acrylamide-agarose (type AULTROGEL"). La fraction qui passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion et qui contient l'antigène L, est recueillie et dessalée par chromatographie sur tamis moléculaire (par exemple sur "TRISACRYL" GF05). La fraction TP-G-GFE5 obtenue présente une activité très élevée, très supérieure à celle de la fraction TP-G-DEAE, sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant et le rendement en fraction TP-G-GF05 est d'au moins 10 % par rapport au TP-G-TCA 10 mis en oeuvre en tant que matière première. PREPARATION DE LA SUBSTANCE DE REFERENCE POUR LE TITRAGE DE L'ACTIVITE DE L'ANTIGENE L On a recherché, parmi les très nombreuses fractions qui avaient été isolées au cours de recherches antérieures sur la purification des PPD, une substance de référence qui soit à peu près indépendante du mode de sensibilisation, que les cobayes soient sensibilisés par des bacilles vivants ou non. Dans ce but, on a comparé pour ces diverses fractions, les diamètres des réactions d'hypersensibilité retardée (HSR) obtenues sur cobayes sensibilisés depuis environ 3 mois, par du BCG vivant ou inactivé. La substance retenue donne, pour une même dose injectée sensiblement (N t 0,5 mm) les mêmes diamètres pour les deux modes de sensibilisation. Il s'agit d'une fraction obtenue par fractionnement sur DEAE-Cellulose, d'une tuberculine humaine purifiée par fractionnement alcoolique d'une solution phénolique de tuberculine In48, lequel fractionnement donne deux fractions, à savoir . une fraction qui traverse la colonne avec le volume mort, dénommée AR6, . une autre fraction qui est retenue sur la colonne, dont elle est éluable par un tampon phosphate 0,2 M, pH 7, et qui est dénommée BR6. La fraction AR6 donne des réactions beaucoup plus importantes 'avec les cobayes sensibilisés par du BCG vivant, tandis que la fraction BR6 donne sensiblement les mêmes diamètres pour les deux modes de sensibilisation (vivant et inactivé). C'est la raison pour laquelle cette fraction BR6 a été choisie comme substance de référence. MESURE DE L'ACTIVITE DES FRACTIONS ISOLEES L'évaluation de l'activité des fractions isolées, et notamment des fractions TP-G-DEAE et TP-G-GFO5, a été mesurée par la détermination du titre de ces fractions par la méthode mise au point par J. AUGIER, G. GAYOT, G. GRANGE, C. DENISE, S. AUGIER-GIBORY et C. POUJEOL, décrite dans DEVELOP. BIOL. STAND., 29, 1975, page 331. Les titres des fractions ont été mesurés par rapport au titre de la fraction BR6, respectivement sur des cobayes sensibilisés par du bacille BCG vivant et sur des cobayes sensibilisés par du bacille BCG inactivé. Les résultats obtenus sont réunis dans le Tableau qui va suivre : TABLEAU EMI8.1 <tb> <SEP> TITRE <SEP> en <SEP> HSR <SEP> TITRE <SEP> en <SEP> HSR <SEP> RYE <SEP> TIREZ <tb> <SEP> FRACTION <SEP> avec <SEP> BCG <SEP> avec <SEP> BCG <SEP> VrSSTw <tb> <SEP> vivant <SEP> inactivé <tb> Filtrat <SEP> de <SEP> cul <tb> ture <SEP> (de <SEP> départ) <SEP> 15 <SEP> 800 <SEP> U/ml <SEP> 7 <SEP> 100 <SEP> U/ml <SEP> 2,2 <tb> TP-G-TCA <SEP> 10 <SEP> 176 <SEP> 000 <SEP> U/mg <SEP> 21 <SEP> 900 <SEP> U/mg <SEP> 8 <tb> TP-G-CM <SEP> 192 <SEP> 000 <SEP> U/mg <SEP> 11 <SEP> 850 <SEP> U/mg <SEP> 16,2 <tb> TP-G-DEAE <SEP> 378 <SEP> 000 <SEP> U/mg <SEP> 10 <SEP> 430 <SEP> U/mg <SEP> 36 <tb> TP-G-GF05 <SEP> 630 <SEP> 000 <SEP> U/mg <SEP> 19 <SEP> 000 <SEP> U/mg <SEP> 33 <tb> Les fractions TP-G-DEAE et TP-G-GF05 sont celles qui ont le meilleur rapport d'activité, puisqu'elles sont plus de 30 fois plus actives en HSR sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant que sur ceux sensibilisés par du BCG inactivé. Ces fractions TP-G-DEAE et TP-G-GF05 sont donc très riches en Antigène L, la fraction la plus active étant la fraction TP-G-GF05. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 18 litres de milieu de Sauton neutralisés par NH40H (pH = 6,9) sont répartis dans 45 boîtes de Roux à raison de 0,4 litre chacune. Ces boîtes de Roux sont ensemencées par des fragments de voile de cultures de BCG de 7 à 8 jours cultivées en ballon. Après 12 semaines de culture à 36-37"C, on mesure le pH de toutes les fioles, et sont retenues celles dont le pH est voisin de 5 4 0,5. On filtre les bacilles sur papier et on obtient 13 litres de filtrat. Les résidus bacillaires sont éliminés par filtration sur SAM 20. On peut également filtrer sur membrane d'ultra-filtration calibrée à 106 Daltons. Le filtrat est concentré 5 fois par évaporation sous vide et on obtient 2,6 litres auxquels on ajoute du butanol (4 % concentration finale). On ajoute ensuite 2 % TCA (concentration finale). L'on centrifuge ensuite 1 heure à 15 000 g. Le surnageant recueilli est refroidi à 4"C, on ajoute du TCA de manière que la concentration finale soit 10 % compte-tenu des 2 8 antérieurs. Le précipité est recueilli par ultra-filtration et centrifugation, repris dans 15 ml d'H20 distillée, amené à pH 7 par NaOH, clarifié par centrifugation, puis précipité par TCA 10 % concentration finale. Le culot est lavé 2 fois par au moins 10 fois le volume du culot, de TCA 10 % concentration finale. Il est lavé 3 fois par de l'acétone et est séché sous vide : poids obtenu : 330 mg ; il s'agit de la fraction TP-G-TCA 10. 100 mg de ce produit sont dissous dans 4 ml de CH3COOH 50 mM pH 3 contenant éventuellement 4 % d'alcool butylique, ou butanol, (concentration finale). On élimine l'insoluble par centrifugation. On dépose le surnageant sur une colonne de CM-Trisacryl-M de 12 cm X 1,6 cm, après équilibrage par la même solution de CH3COOH. Le débit est de 5 ml/ heure. On recueille le premier pic qui s'élue à la fin du volume mort et le produit est obtenu à l'état sec par lyophilisation (62 mg) ; il s'agit de la fraction TP-G-CM. 40 mg de ce produit sont dissous dans 3 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7 contenant éventuellement 4 % (concen tration finale) d'alcool butylique (utilisé ici pour ses propriétés antiseptiques) et introduits sur une colonne de DEAE Trisacryl-M de atêiffte dimension que la précédente et au mXme débit ; on recueille galesent le premier pic qui passe avec le volume mort ; le produit est lavé 3 fois par ultrafiltration sur membrane UM2 de porosité 1 000 Daltons, puis recueilli par lyophilisation. On obtient 21 mg du produit recherché, qui est très riche en Antigène L (fraction TP-G-DEAE). Rendement : 33 % par rapport à la fraction TP-G-TCA 10. Titrage Sur cobayes sensibilisés par des bacilles vivants 378 000 U/mg, et sur cobayes sensibilisés par des bacilles tués et injectés dans de l'antigène de Freund incomplet : 10 430 U/mg. Le rapport vivants/inactivés est de 36. Analyse chimique teneur en protéines titrées par la méthode du microbiuret 95 % . teneur en polyosides libres titrés par la réaction à l'anthrone (Morris) : inférieure à 1 % . teneur en ADN titrés par la méthode de Burton : 0 . teneur en ARN titrés par la méthode à l'orcinol : inférieu re à 1 % . poids moléculaire mesuré en gel de polyacrylamide en pré sence de SDS : au maximum 15 000 Daltons . point isoélectrique mesuré en gel de polyacrylamide en pré sence de Servalyt 2-11 : s'échelonnant de 4 à 6. EXEMPLE 2 Le processus de fractionnement sur colonnes de chromatographie est poursuivi en soumettant la fraction TP-G-DEAE obtenue à l'Exemple 1 à une chromatographie sur une colonne de tri moléculaire par gel-filtration, par exemple sur une colonne d'"ULTROGEL" AcA 202 (IBF) de 95 cm de hauteur et de 16 mm de diamètre, avec un débit de 3,55 ml/heure/ cm2. La fraction qui passe à la fin du volume mort (55 ml) à partir du tube 181 jusqu'au tube 214, c'est-à-dire jusqu'au début de l'inclusion, est recueillie et contient l'antigène L (13,3 ml). La fraction fortement incluse (tubes 215-244 ; 12,2 ml) est peu active et est éliminée. La fraction recueillie est dessalée d'une manière connue en elle-même, par chromatographie sur tamis moléculaire, par exemple sur "TRISACRYL" GF05, dont le poids d'exclusion est de 3 000, sur une colonne de 1 mètre de hauteur et de 16 mm de diamètre. La fraction TP-G-GFO5 obtenue (40 mg) est lyophilisée. Le rendement en fraction TP-G-GFO5 par rapport au TP-G-TCA 10 utilisé comme matière première à l'Exemple 1, est de 15 %. Titrage : sur cobayes sensibilisés par des bacilles vivants : 630 000 U/mg sur cobayes sensibilisés par des bacilles tués et ' injectés dans de l'antigène de Freund incomplet : 19 000 U/mg Rapport vivants/inactivés : 33 Caractérisation de la fraction TP-G-GF05 riche en antigène L Elle est très soluble, que ce soit dans l'eau, les milieux basiques ou les milieux acides Son poids moléculaire, mesuré sur gel de polyacrylamide à 18 %, contenant 0,1 % de SDS, est de 15 000 Daltons au ma ximum Elle est essentiellement constituée par des protéines : 98% par la méthode du biuret Elle ne contient pratiquement pas d'acides aminés aromati ques, comme le montre son spectre d'absorption en U.V. une très faible absorption à 280 nm ; Elle ne se fixe pratiquement pas sur les résines échangeu ses d'ions faiblement acides et basiques, ce qui permet de la séparer par simple filtration ; . Elle migre par électrophorèse Son point isoélectrique, mesuré sur gel de polyacrylamide en présence de SERVALYT 2-lt : fait apparaître plusieurs bandes 8 s'échelonnant entre 4 et 6 ; Sa chromatographie HPLC montre qu'elle se compose de plu sieurs substances actives. La fraction TP-G-DEAE présente un titre qui est de très loin supérieur aux titres indiqués dans la littérature pour les fractions actives de la tuberculine et notamment pour les fractions riches en Antigène L, dont le titre est au maximum de 82 500 U/mg, alors que celui de la fraction TP-G DEAE est supérieur à 100 000 et peut être aussi élevé que 378 000. La fraction TP-G-GF05 présente, cependant, un titre encore plus élevé que la fraction TP-G-DEAE, puisqu'il peut etre environ 1,6 fois supérieur au titre de la fraction TP-G DEAE, pour un rapport vivantsJinactivés sensiblement du même ordre. Ceci permet d'envisager son utilisation en tant qu'agent de diagnostic à des doses très inférieures à celles utilisées actuellement dans le cas de la tuberculine, tout en obtenant une activité et une spécificité très supérieures à celles de la tuberculine.

Claims: REVENDICATIONS 1g) Procédé de préparation d'antigène tuberculinique L à partir d'une culture de bacilles BCG ou tuberculeux, caractérisé en ce qu'on isole une fraction riche en Antigène L, dénommée fraction TP-G-DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg, sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant, à partir d'un filtrat de culture de BCG non inactivé soumis à un fractionnement préparatif qui comprend une étape de précipitation dudit filtrat par de l'acide trichloracétique à 2 % concentration finale, une étape de précipitation du surnageant recueilli, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, reprécipitation du précipité ainsi obtenu, préalablement dissous dans un faible volume d'eau, par de l'acide trichloracétique à 10 % concentration finale, pour obtenir une fraction dite TP-G-TCA 10 qui, après dissolution dans un faible volume d'acide acétique et élimination du léger précipité formé, est fractionnée sur une colonne de rési- ne échangeuse d'ions faiblement acide, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dénommée fraction TP-G-CM, laquelle fraction est elle-meme soumise à un fractionnement sur une colonne de résine échangeuse d'ions basique, pour recueillir la fraction correspondant au pic le plus actif sur cobayes sensibilisés par du BCG vivant, passant en fin de volume mort, dite fraction TP-G DEAE, dont le titre est supérieur à 100 000 U/mg. 2°) ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes du fractionnement préparatif auquel est soumis le filtrat de culture de BCG non inactivé utilisé comme matière première, pour en isoler la fraction TP-G-DEAE riche en Antigène L, sont réalisées en présence de butanol à 3,8-4,2 % (concentration finale). 3 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la fraction TP-G-DEAE obtenue en mettant en oeuvre ledit procédé selon la revendica tion 1, est elle-même soumise à une chromatographie de gelfiltration, par tri moléculaire, pour recueillir la fraction qui passe à la fin du volume mort jusqu'au début de l'inclusion, laquelle fraction est soumise à un dessalage par chromatographie sur tamis moléculaire, pour obtenir une fraction, dénommée TP-G-GF05, dont le titre est supérieur à 600 000 U/mg. 4µ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la colonne de résine échangeuse d'ions faiblement acide utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-CM, est équilibrée par une solution d'acide acétique 50 mM, pH 3. 5µ} Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la colonne de résine échangeuse d'ions basique utilisée pour l'obtention de la fraction TP-G-DEAE, est équilibrée par du tampon TRIS-HCl 50 mM, pH 7. 6B) Fraction isolée de filtrat de culture de BCG non inactivé, par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dénommée fraction TP-G-DEAE, caractérisée en ce qu'elle est riche en Antigène tuberculinique L, en ce que son poids moléculaire est de 15 000 Daltons au maximum, en ce que son point isoélectrique est de 4 à 6 et en ce que son titre d'activité est supérieur à 100 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 7") Fraction isolée à partir de la fraction TP-G DEAE selon la revendication 6, par le procédé selon la revendication 3, dénommée fraction TP-G-GF05, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par de l'Antigène tuberculinique L, en ce que son poids moléculaire est de 15 000 Daltons au maximum, en ce que son point isoélectrique s'échelonne de 4 à 6, en ce qu'elle se compose essentiellement de protéines et présente une faible teneur en acides aminés aromatiques et en ce que son titre d'activité est supérieur à 600 000 U/mg sur des cobayes sensibilisés par du BCG vivant. 8i} Agent de. diagnostic de la sensibilisation d'un sujet aux bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'il comprend en tant que constituant actif, la fraction selon la revendication 6. 9") Agent de diagnostic de la sensibilisation d'un sujet aux bacilles tuberculeux, caractérisé en ce qu'il comprend en tant que constituant actif, la fraction selon la revendication 7.

Inventors: AUGIER JACQUES, ROMAIN FELIX, AUGIER, JACQUES, ROMAIN, FELIX, Romain, Félix
Applicants: PASTEUR INSTITUT, INSTITUT PASTEUR
Application year: 1984
Main classification: A61K49
IPC codes: A61K49, A61K39