PROCESS FOR THE PREPARATION OF THE OPTIC ANTIPODES OF TERTIARY LEUCINE

Abstract: 1. A process for the preparation of L-tert.-Leucine from N-acyl-D,L-tert.-Leucine, wherein the racemate is resolved in an aqueous medium with an immobilized acylase and the unreacted N-acyl-D-tert.-Leucine and the liberated carboxylic acid are separated off.

Description: Verfahren zur Herstellung der optischen Antipoden von tert .-Leucin Optisch aktives tert.-Leucin, das aus dem chiralen Pool der natur nicht zugänglich ist, besitzt als chirales HilRsreagenz in der asymmetrischen organischen Synthese ausserordentliches Interesse. Durch klassische Methoden der Racematspaltung ist es nur. schwer in grösseren Mengen zugänglich. Aus der britischen Patentschrift 1 369 462 ist zwar ein Verfahren bekannt, bei dem ein Racemat der Formel EMI1.1 in der R eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryloder Aralkylgruppe und R1 eine Acylgruppe ist, für die es eine spezfische Deacylase gibt, im wässrigen Medium mit einer Deacylase behandelt wird, die bekanntermassen die N-Acylseitenkette eines Penicillins unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure entfernt, wobei die freie L Aminosäure entsteht, die von der N-Acyl-D-amsinosäure abgetrennt wird. Andererseits ist es aber aus A. Plaskie et al., The Journal of Antibiotics, XXXI (1978) 783 788, insbesondere S. 786, Tabelle 2, bekannt, dass die Natur der Aminosäure einen deutlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit dieser Reaktion hat: Wenn in der vorstehend genannten Formel R1 Phenylacetyl ist, verringert sich die Geschwindigkeit der Deacylierung für R= Methyl, Ethyl und Isopropyl wie 1 : 0,4 : 0,04. Erwartungsgemäss erfolgt mit R= tert.-Butyl unter den dort genannten Be dingungen.überhaupt keine Reaktion mehr. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass racemisches N-Acyl-tert.-Leucin dann enzymatisch leicht gespalten wird, wenn die Acylase trägergebunden vorliegt. Die Tatsache, dass das Enzym an ein inertes Material gebunden sein kann, ist bereits in der britischen Patentschrift erwähnt. Es war jedoch nicht zu erwarten, dass eine solche Fixierung die sterische Hinderung der Reaktion derartig zurückdrängt, zumal mit der Fixierung eines Enzyms generell eine Verringerung der Aktivität verbunden ist. Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von L-tert.-Leucin durch enzymatische Spaltung von racemischem N-Acyl-tert.-Leucin im wässrigen Medium mit Hilfe einer trägergebundenen Acylase. Das nicht gespaltene N-Acyl-D-tert.-Leucin kann in an sich bekannnter Weise durch chemische Deacylierung, beispielsweise durch saure Hydrolyse, in das freie D-tert.-Leucin übergeführt werden oder aber nach Racemisierung wieder in den Prozess zurückgeführt werden. Als N-Acylrest kommen alle Acylgruppen in Betracht, die bekanntermassen durch Acylasen abgespalten werden, wie beispielsweise Alkanoylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Aralkanoylgruppen, vorzugsweise Phenylacetyl, und Aroylgruppen wie Benzoyl, die jeweils durch Halogen, Hydroxy, niederes Alkyl oder niederes Alkoxy substituiert sein können. Geeignete Acylreste sind literaturbekannt, beispielsweise aus der genannten britischen Patentschrift und den deutschen Offenlegungsschriften 2 352 579, 2 446 320, 2 939 269 und 3 048 612. Die entsprechenden kcylasen sind ebenfalls in diesen Druckschriften erwähnt. Wenn zur Acylierung eine schwerflüchtige Carbonsäure verwendet wird, kann das nach Abtrennung des L-tert. Leucins und Entfernung des Wassers zurückbleibende Gemisch aus der N-Acyl-D-Verbindung und der schwerflüchtigen Carbonsäure unmittelbar durch Erhitzen wieder racemisiert werden (Patentanmeldung ....... vom gleichen Anmeldetag, entsprechend der deutschen Patentanmeldung P 33 34 849.9). Die Fixierung des Enzyms an einen Träger ist - wie vorstehend angegeben - bereits aus der britischen Patentschrift 1 369 462 bekannt, wobei als inertes Material - Cellulose, Sand oder Aluminiumoxid und als Vernetzungsmittel ein bifunktionelles Reagenz wie Glutaraldehyd erwähnt sind. Verwiesen werden kann auch auf die deutsche Offenlegungsschrift 27 32 301, die speziell die Fixierung von Penicillinacylase betrifft. Ein so hergestelltes Penicillin-G-Amidase-Präparat zeigt gegenüber N-Phenacetyl-L-tert.-Leucin eine relative Aktivität von 10 bis 15 % (Penicillin-G = 100 k). Besonders vorteilhafte Träger für die Amidase sind Phenol-Formaldehyd-Harze mit freien N-H-Gruppen, wie sie als schwach basische Ionenaustauscher handelsüblich sind. An diese Träger wird das Enzym mit Hilfe eines bifunktionellen Isocyanats wie Hexamethylen-1 ,6-diiso- cyanat gebunden. Besonders vorteilhaft sind macroporöse Harze mit einem mittleren Porendurchmesser von 80 bis 100 nm. Ein unter der Handelsbezeichnung #Duolite A7 vertriebener schwach basischer Ionenaustauscher der genannten Porengrösse ergibt nach Bindung mit Hexamethylen- 1,6-diisocyanat ein Penicillin-G-Amidase-Präparat mit einer relativen Aktivität von über 90 % (Penicillin-G = 100 %). Derart immobilisierte Acylasen, ihre Herstellung und Verwendung sind Gegenstand der Patentanmeldung ...... vom gleichen Anmeldetag (entsprechend der deutschen Patentanmeldung P 33 34 846.4). Der Nachteil der gegenüber dem freien Enzym verringerten Aktivität wird bei den immobilisierten Enzymen durch eine erhöhte Standzeit mehr als aufgehoben. So konnte eine Lebensdauer von über einem Jahr und eine Halbwertszeit von mehr als 8 Monaten beobachtet werden. Je nach Löslichkeit des Ausgangsmaterials kann die Substratkonzentration bei 0,1 bis 30, vorzugsweise 4' bis 10, Gew.-% liegen. Die Temperatur und der pH-Wert richten sich nach dem jeweiligen Enzym. Im allgemeinen liegt die Umsetzungstemperatur bei 10 bis 60'C, vorzugsweise bei 20 bis 40"C, und der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8. Die Reaktion kann in einem gepufferten System oder ohne Pufferzusatz ablaufen. Die Umsetsungsdauer ist neben der Temperatur und dem Enzymimmobilisat abhängig vom Enzym-Substrat-Verhältnis, das grundsätzlich in weiten Grenzen schwanken kann. Für kurze Reaktionszeiten von etwa 0,5 bis 5 Stunden wählt man zweckmässig ein Gewichtsverhältnis von Enzym zu Substrat von 1 : 4 bis 4 : 1. Die Reaktion kann absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Im letzteren Fall wird das immobilisierte Enzym in einem Fliessbett- oder Festbett-Reaktor angeordnet. So kann das Enzymimmobilisat beispielsweise in Säulen gepackt oder in einem Schlaufenreaktor eingesetzt werden. Verlauf und Ende der Reaktion können mit polarimetrischen oder titrimetrischen Methoden verfolgt werden. Die entstehende freie Aminosäure kann ausserdem quantitativ mittels der Ninhydrin-Reaktion bestimmt werden. Die Aufarbeitung erfolgt in an sich bekannter Weise: Das freie Etert.-Leucin kann von der nicht angegriffenen N-Acyl-D-Verbindung und der freigesetzten Säure durch die unterschiedliche Löslichkeit, beispielsweise durch Extraktion, oder auf Grund des unterschiedlichen pK -Wertes durch Adsorption, beispielsweise an Ionenaustauschern, aufgetrennt werden. Flüchtige freigesetzte Carbonsäuren können auch durch Destillation abgetrennt werden. Besonders bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist. Beispiel l 300 g des handelsüblichen schwach basischen Ionenaustauschers Duolite A7 (Phenol-Formaldehyd-Harz mit freien N-H-Gruppen der Firma Diamond Shamrock, vgl. EP-A2-37 667, Beispiel 1) werden durch lO-minUtiges Rühren in 500 ml 2 N Natronlauge und anschlieSendes Neutralwaschen mit entionisiertem Wasser in die freie Basenform Uberführt. Nach 24 Stunden Trocknen bei 400C und 50 mbar werden 100 g trockenes Harz in 200 ml wasserfreiem Dichlormethan aufgenommen, mit 10 g Hexamethylen-l,6-diiso- cyanat versetzt und 2 Stunden unter Luftausschluss gerührt. Man filtriert das Harz ab und wäscht es mit Dichlormethan gründlich nach. Nach Trocknen im Exsiccator wird das aktivierte Harz in 200 ml einer wässrigen Lösung von 10 g Penicillin-G Acylase gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird abriltriert und mit gesättigter Kochsalzlösung und anschliessend mit entionisiertem Wasser gewaschen. Beispiel 2 100 g (0,4 Mol) N-Phenacetyl-D,L-tert.-Leucin werden in 400 ml 1 N Natronlauge gelöst und auf einen pH-Wert von 7,8 und ein Gesamtvolumen von 1000 ml eingestellt. Diese Reaktionslösung wird auf 370C thermostatisiert und unter Rühren mit 100 g nach Beispiel 1 lmmobilisler- ter Penicillin-G-Amidase versetzt. Durch Titrieren mit 0,05 N Natronlauge wird der pH-Wert während der Hydrolysereaktion konstant gehalten und gleichzeitig der Umsetzungsverlauf registriert. Nach 3 bis 4 Stunden wird keine Natronlauge mehr verbraucht. Nach Abfiltrieren des Enzymmaterials und Ansäuern mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 3 kristallisieren Phenylessigsäure und N Phenacetyl-D-tert.-Leucin aus. .Die Phenylessigsäure kann durch Extraktion mit Essigsäureethylester-Hexan aus dem Kristallisat abgetrennt werden, worauf 45 g (0,18 Mol= 90 % d. Th.) N-Phenacetyl-D-tert.-Leucin vom Schmelzpunkt 163 bis 164 C, [a]20 14,20 (c= 1, in Methanol) zu rückbleiben. Aus der eingeengten Mutterlauge werden durch Extraktion mit Ethanol-Wasser 23 g (0,18 Mol= 90 d. Th.) L-tert. Leucin vom Schmelzpunkt über 2500C, [a]20 -9,4 (c= 1, in Wasser) isoliert. Beispiel 3 Aus 50 g (0,2 Mol) N-Phenacetyl-D,L-tert.-Leucin wird entsprechend Beispiel 2 eine 10 %ige Substratlösung hergestellt und kontinuierlich bei 370C durch eine Säule gepumpt, die mit 100 g Enzymimmobilisat entsprechend Beispiel 1 gefüllt ist. Im Vorratsgefäss wird der pH-Wert bei 7,8 durch Zugabe von 0,05 N Natronlauge gehalten. Nach etwa 2 Stunden ist die Hydrolyse beendet. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 2. Beispiel 4 Man verfährt gemäss Beispiel 3, trennt jedoch die freigesetzte Aminosäure wie folgt ab; Man gibt die Reaktionslösung über einen stark sauren Kationenaustauscher in der H+-Form ( SDowex 50 Wx2) und desorbiert mit 5 %iger wässriger Ammoniaklösung. Aus dem Desorbat erhält man durch Vakuumtrocknung bei 80 bis 1000C 12,4 g (0,095 Mol = 95 % d. Th.) L-tert.-Leucin, Schmelzpunkt über 250 C, [&alpha;]D20 -9,44 (c= 1, in Wasser). Aus dem Eluat des Ionenaustauschers isoliert man die Phenylessigsäure und das N-Phenacetyl-D-tert.-Leucin gemäss Beispiel 2. Beispiel 5 Aus dem gemäss Beispiel 2 bis 4 erhaltenen N-Phenacetyl-Dtert.-Leucin isoliert man das D-tert.-Leucin durch saure Hydrolyse mit Salzsäure: [a]20 +9,0 (c= 1, in Wasser).

Claims: PatontansprUcho: 1. Verfahren zur Herstellung von L-tert.-Leucin aus N Acyl-D,L-tert.-LeucinJ dadurch gekennzeichnet, dass man das Racemat im wässrigen Medium mit einer immo bilisierten Acylase spaltet und das nicht umgesetzte N-Acyl-D-tert.-Leucin und die freigesetzte Carbon säure abtrennt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem N-Acyl-D-tert.-Leucin durch saure Hydrolyse das D-tert.-Leucin freisetzt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man als Acylverbindung die Phenacetyl verbindung einsetzt. h. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden AnsprUche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acyla se Penicillin-G-Amidase einsetzt. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichent, dass man die Acyla se -mit Hilfe eines Alkyiendiisocyanats an ein Phenol Formaldehyd-Harz mit freien N-H-Gruppen fixiert.

Inventors: GRABLEY, SUSANNE, DR., SCHLINGMANN, MERTEN, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C07C101
IPC codes: C12P41, C12P13