TEST STRIP FOR THE DETECTION OF LEUCOCYTES IN URINE

Abstract: 1. Use of a compound of the chemical formula see diagramm : EP0120396,P6,F1 wherein R1 and R2 are the same or different and represent hydrogen, halogen, a low alkyl or alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a (C1 -C4 )-dialkylamino group, an acetylamino group, a nitro group, or an optionally substituted or anelated aromatic, n is an integer number from 1 to 4, preferably 1 to 2, and m is an integer number from 1 to 4, preferably 1 to 2, too, and R3 represents hydrogen, a low alkyl group having 1 to 4, preferably the acetyl residue, or a cyanoalkyl residue, preferably the cyanoethyl residue, or a salt of this compound for the detection of leukocytes and other esterolytically and/or proteolytically effective substances in body liquids and exudations, particularly on an absorbable carrier together with an enzyme-specific substrate and/or chromogen, as well as further auxiliaries, such as buffer systems, optionally thickening agents, surface-active agents, oxidants, and/or stabilizers.

Description: TESTSTREIFEN ZUM NACHt;IElS VON LEUXOZYTE,N Iti HARd Die Erfindung betrifft die Verwendung von Benzimidazolderivaten zum nachweis von Leukozyten in Körperflüssig keiten und Ausscheidungsprodukten, insbesondere als Diagnostikum in Form eines Testpapiers. Zur frühzeitigen Erkennung der akuten und chronischen Pyelonephritis, vieler entzündlicher Erkrankungen der ableitenden Harnweqe wie Urethritis, Cystitis sowie Infektionen durch Trichomonaden, Gonokokken, Mycoplasmen, Viren und nahezu allen Arten von Harntransportstörungen wird der Leukozyturie grosse Bedeutung beigemessen. Als besonders geeignet für einen Screening-Test haben sich Testpapiere erwiesen, die zur Reaktion die esterolyti sche bzw. proteolytische Aktivität der in Leukozyten vorhandenen Esterasen bzw. Proteasen ausnutzen. Mit einem solchen Test werden neben intakten Leukozyten auch lysierte Zellen nachgewiesen, die durch mikrosko pisches Auszählen der Leukozyten im nicht zentrifugierten Harn bzw. Harnsediment nicht erfasst wurden und ins besondere bei längeren Harnstandzeiten durch eine Lyse der Leukozyten falsch negative Befunde zur Folge hat ten. Als Chromogene für einen solchen Test finden farblose oder schwach gefarbte Ester Verwendung, bei denen durch die enzymatische Spaltung eine Alkohol- bzw. Phenolkom ponente freigesetzt wird, die selbst gefärbt ist oder in einer Folgereaktion farbige Derivate bildet. Solche Esterasesubstrate sind aus der Histochemie schon lange bekannt und werden z.8. beschrieben bei: M..Nachlas, A.M.Seligman, J.Nat.Cancer Inst. 9, 415 (1949) R.J.Barnett, A.M.Seligman, Science 114, 579 (1951) T.K.Shnitka, A.M.Seligman, J.Histochem. 9, 504 (1961) F.Schmalzl, H.Braunsteiner, Klin.Wschr. 46, 642 (1968) L.T.Yam, C.Y.Li, W.H.Crosby, Am.J.Clin.Pathol. 55, 283 (1971) M.3.Castillo. K.Nakagima, M.Zimmerman, 3.C.Powers, Anal.Biochem. 99, 53 (1979) Weitere Bestandteile eines Testpapiers für Leukozyten sind neben dem Chromogen ein Puffersystem, ggfs. ein oberflächenaktives Mittel, ein Oxidationsmittel sowie Hilfsmittel mit verschiedenen Funktionen. In den DE-OS 28 26 965, 28 36 644 und 38 54 987 werden Teststreifen beschrieben, die zum Nachweis einer erhöhten Leukozyturie geeignet sein sollen. Die danach hergestellten Teststreifen waren jedoch entweder zu unempfindlich oder erforderten sehr lange Reaktionszeiten (15 min und mehr). Es ist auch bereits bekannt, die Reaktionszeit durch Kupplung der durch Esteraseabspaltung gebildeten Alkohol- bzw. Phenolkomponente mit einem Diazoniumsalz gemäss DE-OS 30 17 721 zu verkürzen. Auch kann die Reaktionszeit durch den Einsatz zusätzlicher Reaktionverstärker gemäss DE-OS 29 05 531 verkürzt werden; als Reaktionsverstärker werden in der DE-OS 29 05 531 Pyridinderivate eingesetzt. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass als Aktivator ausser diesen bekannten Verbindungen Benzimidazolderivate besonders gut geeignet sind. Bestimmte Benzimidazolderivate führen neben einer Erhöhung der Stabilität auch zu einer entschiedenden Verkürzung der Reaktionszeit. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung einer Verbindung der chemischen Formel EMI3.1 worin R1 und R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Halogen, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine (C1-C4)-Dialkylamino-, eine Acetylaminogruppe, eine Nitrogruppe oder einen gege benenfalls substituierten oder annellierten Aromaten bedeuten, n eine ganze Zahl von 1 bis 4, bevorzugt 1 bis 2, und m ebenfalls eine ganze Zahl von 1 bis 4, bevorzugt 1 bis 2 ist, und R3 für Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4, bevorzugt den Acetylrest, oder einen Cyanoalkyl rest, bevorzugt den Cyanoethylrest, steht oder eines Salzes dieser Verbindung in einem Mittel, insbeson dere zum Nachweis von Leukozyten und anderen estero lytisch und/oder proteolytisch wirksamen Substanzen in Körperflüssigkeiten und Ausscheidungen, insbeson dere auf einem saugfahigen Trager zusammen mit einem enzymspezifischen Substrat und/oder Chromogen. sowie weiteren Hilfsmitteln wie einem Puffersystem, ggfs Verdickungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Oxi dationsmitteln und/oder Stabilisatoren. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Diagnostikum, insbesondere Schnelldlagnostikum in Form eines Teststreifens, bestehend aus einem Träger, einem enzymspezifischen Substrat und/oder ±hromogen, einem Aktivator sowie weiteren Hilfsmitteln wie einem Puffersystem, ggfs. Verdickungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Oxidationsmitteln und/oder weiteren Stabilisatoren, das dadurch qekennzeichnet ist, dass der Aktivator eine Verbindung nach Anspruch 1 ist. Die 2-(2-Pyridyl)-benzimidazole der allgemeinen Formel sind bekannte Verbindungen. Ihre Herstellung wird z.B. beschrieben in den folgenden Literaturstellen: V.J.Cohen, J.Heterocycl.Chem. 16, 13 (1979) A.Bistrzycki, A.Lecco, Helv.chim.Acta 4, 425 (1921) D.Jerchel, H.Fischer, M.Kracht, Liebigs Ann. 575 162 (1952) J.Hall, D.R.Kamm, J.Org.Chem. 30 (6), 2092 (1965) F.H.Case, J.Heterocycl.Chem. 4, 157 (1967) M.Ichikawa et al., Chem.Pharm.Bull. 25 (2), 358 (1977) CA 87, 23155 q M.Ichikawa, Org.Prep.Proced.Int.-10(5), 205 (1978) CA 89, 179 920 n R.D.Haugewitz et al., J.Med.Chem. 22, 1113 (1979) CA 91, 117 155 z ,8.Ichikawa, Chem.Pharm.Bull. 27(5), 1255 (1979) CA 91, 211 323 z Als Chromogene kommen Enzymsubstrate oder andere zum Nachweis esterolytisch bzw. proteolytisch wirksamer Enzyme geeignete Substrate infrage, z.B. Sulfonphthaleinsäureester gemäss DE-OS 28 26 965, Azofarbstoffester gemäss DE-OS 28 36 644 sowie Indoxyl- und/oder Thioindoxylaminosäureester und/oder -peptidester gemäss DE-OS 28 54 987. Die Chromogene werden üblicherweise in Konzentrationen von 10-4 bis 10-1 ol/l Imprägnierlösung eingesetzt. Als Puffer kommen alle Systeme infrage, die nach dem Eintauchen in die zu untersuchende Flüssigkeit einen pH-Wert von 6 bis 10, vorzugsweise 7 bis 9, ergeben. Beispiele für geeignete bekannte Puffersysteme sind Phosphat-, Barbiturat-, Borat-, Tris-(Hydroxymethyl) Aminomethan(Tris)-, und Aminosäurepuffer. Vorteilhaft werden erfindungsgemäss zusätzlich oberflächenaktive Mittel mit verwendet. Geeignet hierfür sind alle bei der Herstellung von Teststreifen üblicherweise eingesetzten Tenside oder Netzmittel, z.B. kationaktive Netzmittel wie quaternäre Ammoniumsalze, anionaktive Netzmittel wie Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsul fosuccinat oder nicht-ionogene Netzmittel wie z.B. Brij 35, Triton X 100 usw. Als Oxidationsmittel können erfindungsgemäss u.a. Kaliumbromat, Kaliumjodat, Kaliumchromat, Kaliumhexacyanoferrat-(III), Phenazinmethosulfat und/oder Tetrazoliumsalze eingesetzt werden. Als weitere Hilfsmittel können Verdickungsmittel wie Gelatine, Gummi arabicum oder auch Polyvinylpyrrolidon eingesetzt werden. Weiter seien als Hilfsstoffe noch Stabilisatoren wie z.B. Phosphor- bzw. Phosphonsäureamide und als Komplexbildner Metallsalze z.B. der Elemente Eisen, Kupfer, Zink usw. genannt. Das Diagnostikum wird hergestellt, indem üblicherweise ein saugfähiger Träger wie ein Filtrierpapier, ein Cellulosevlies oder ein Vlies aus Synthesefaser mit einer einzigen Lösung der Komponenten oder mit mindestens zwei Lösungen getränkt und anschliessend getrocknet wird, wobei bei mehrstufiger Imprägnierung jeweils vor der nachfolgenden Imprägnierung getrocknet wird. Die Erfindung wird durch die folgend Beispiele veranschaulicht: Beispiel 1: Es wird eine Lösung aus folgenden Bestandteilen hergestellt: Lösung 1 6 g Natriumdihydrogenphosphat-2-nydrat 60 ml dest. Wasser (mit 32 NaOH auf pH 8 einstellen und mit dest Wasser auf 100 ml auffüllen). Filtrierpapier MN 215 wird mit vorstehender Lösung imprägniert und bei ca, 700C getrocknet. Das so erhaltene Papier wird anschliessend mit folgender Lösung nachimprägniert: Lösung 2 1 g Phosphorsäuretrimorpholid 0,25 g 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumfluoroborat 0,04 g 3-[N-(Toluolsulfonyl)-L-alanyloxy]-1-methoxy naphathalin 0,25 g 2-(2-Pyridyl)-benzimidazol 100 ml Aceton Das so erhaltene Testpapier wird zur Herstellung des Prüfmittels in 5 x 6 mm grosse Testzonen mit Hilfe geeigneter Kleber auf einen Polyesterstreifen befestigt. Die Test ozone verfärbt sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine rötlich bis rot. Beispiel 2: Filtrierpapier MN 215 wird gemäss Beispiel 1 mit nachfolgenden lösungen nacheinander imprägniert und getrocknet. Lösung 1 33 mg Kaliumhexacyanoferrat-(III) 40 ml Methanol 60 ml Phosphatpuffer (s.Beispiel 1) Lösung 2 1 g Phosphorsäuretrimorpholid 0,25 g 2-(2-Pyridyl)-benzimidazol 0,04 g 3-[N-( Toluol-4-sulfonyl)-L-alanylox 7-indol 100 ml Aceton Die so erhaltenen Testpapiere färben sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine blau. Beispiel 3: Filtrierpapier MN 215 wird gemäss Beispiel 1 mit nachfolgenden Lösungen imprägniert und getrocknet: Phosphatpuffer siehe Beispiel 1 Lösung 2 1 g Phosphorsäuretrimorpholid 0,25 g 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumfluorborat 0,04 g 3-[N-(Toluolsulfonyl)-L-alanyloxy]-1- methoxy-naphthalin 0,25 g 5-(6)-Methyl-2-(2-pyridyl)-benzimidazol 100 ml Aceton Das so erhaltene Test papier färbt sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine rötlich bis rot In analoger Weise lassen sich anstelle des 5-(6) Methyl-2-(2-pyridyl)-benzimidazols auch die folgenden funktionellen Derivate einsetzen: 4,5-Dimethyl-2-(2-pyridyl)-benzimidazol 5-(6)-Nitro-2-(2-pyridyl)-benzimidazol Beispiel 4: Filtrierpapier MN 215 wird gemäss Beispiel 1 mit nachfolgenden Lösungen nacheinander imprägniert und getrocknet: : Lösung 1 0,25 g 2-(2-Pyridyl)-benzimidazol 40 ml Methanol 60 ml Phosphatpuffer pH 8 (s.Beispiel 1). Lösung 2 1 g Phosphorsauretrimorpholid 1 g Oleylalkohol 0,25 g 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumfluoroborat 0,04 g 3-N-(Toluolsulfonyl)-L-alanyloxy3-1- methoxy-naphthalin 100 ml Aceton Das so erhaltene Testpapier färbt sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine rötlich bis rot. Beispiel 5: Filtrierpapier MN 215 wird gemäss Beispiel 1 mit nachfolgeden Lösungen nacheinander imprägniert und getrocknet: Lösung 1 Phosphat puffer gemäss Beispiel 1 Lösung 2 1 g Phosphorsäuretrimorphoiid 0,25 g 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumfluoroborat 0,04 g 3rN-(Toluolsulfonyl)-L-alanyloxy7- methoxy-naphthalin 0,25 g 2-(4-Methylpyridyl-2)-benzimidazol 100 ml Aceton Das so erhaltene Testpapier färbt sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine rötlich bis rot. In analoger Weise lassen sich anstelle des 2-(4-Methylpyridyl-2)-benzimidazols auch die folgenden Derivate einsetzen: 2-(4-Phenylpyridyl-2)-benzimidazol 1-Methyl-2-(2-pyridyl)-benzimidazol 5-Phenyl-2-)2-pyridyl)benzimidazol Beispiel 6 Fitrierpapier MN 215 wird gemäss Beispiel 1 mit nachfolgenden Lösungen imprägniert und getrocknet: Lösung 1 Phosphat puffer gemäss 8eispiel 1 Lösung 2 1 g Phosphorsäuretrimorpholid 0,25 9 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumfluoroborat 0,04 g 3-LN-( Toluol-4-sulfonyl)-L-alanylox -indol 0,25 g 5-Methoxy-2-(2-pyridyl)benzimidazol 100 ml Aceton Das so erhaltene Testpapier färbt sich beim Eintauchen in leukozytenhaltige Urine rötlichbraun. In analoger Weise lasse sich auch 5-Chlor-2-(pyridyl)benzimidazol als Aktivator einsetzen.

Claims: PATENTANSPRUCHE 1. Verwendung einer Verbindung der chemischen Formel EMI11.1 worin R1 und R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Halogen, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine (C1-C4)-Dialkylamino-, eine Acetylaminogruppe, eine Nitrogruppe oder einen gege benenfalls substituierten oder annelierten Aromaten bedeuten, n eine ganze Zahl von 1 bis 4, bevorzugt 1 bis 2, und m ebenfalls eine ganze Zahl von 1 bis 4, bevorzugt 1 bis 2 ist, und R3 für Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4, bevorzugt den Acetylrest, oder einen Cyanoalkyl rest, bevorzugt den Cyanoethylrest, steht oder eines Salzes dieser Verbindung in einem Mittel, insbeson dere zum Nachweis von Leukozyten und anderen estero lytisch und/oder proteolytisch wirksamen Substanzen in Körperflüssigkeiten und Ausscheidungen, insbesondere auf einem saugfähigen Träger zusammen mit einem enzymspezifischen Substrat und/oder Chromogen sowie weiteren Hilfsmitteln wie einem Puffersystem, ggfs. Verdickungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Oxidationsmitteln und/oder Stabilisatoren. 2. Diagnostikum, insbesondere Schnelldiagnostikum in Form eines Teststreifens, bestehend aus einem Träger, einem enzymspezifischen Substrat und/oder Chromogen, einem Aktivator sowie weiteren Hilfsmitteln wie einem Puffersystem, ggfs. Verdickungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, Oxidationsmitteln und/oder weiteren Stabilisatoren, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator eine Verbindung nach Anspruch 1 ist.

Inventors: FLEGLER, KARL-HEINZ, DR.
Applicants: MACHEREY-NAGEL & CO, CHEMIKALIENHANDEL
Application year: 1984
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1, G01N33