PHOTOMETRIC METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF A SUBSTANCE UNDERGOING A REACTION, WHEREIN SCATTERING CENTRES ARE FORMED OR USED

Abstract: 1. A method for the photometric determination of the concentration of a reactant in a reaction in which scattering centers are formed or consumed in the sens of a transition from Rayleigh to Mie scattering where the peak rate of reaction Vmax and the time from the start of the reaction to the appearance of the peak rate of reaction tmax are determined and to obtain a single value for the concentration the functional relationship between concentration, Vmax and tmax is found empirically using a standard preparation, and Vmax and tmax are measured on the sample, which comprises choosing between the two possible concentration values on the basis of the 2nd reaction parameter, namely Vmax or tmax .

Description: Photometrisches Verfahren zur Konzentrationsbestimmung bei Reaktionen, die unter Bildung oder Verbrauch von Streuzentren verlaufen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Partners einer Reaktion mittels einer Lichtstreuungsmessung. Das Phänomen der Lichtstreuung an Teilchen, die sich in einem homogenen Medium befinden, wird sowohl über die Messung der Streulichtintensität (Nephelometrie) als auch über die Messung des Intensitätsverlustes des durch das Medium tretenden Lichtstrahls (Turbidimetrie) zur Konzentrationsbestimmung genutzt. Viele chemische Reaktionen führen in mehreren Schritte zu Molekülaggregaten oder Makromolekülen, die sich in ihrem Streulichtverhalten sehr stark von den Ausgangsstoffen unterscheiden und deren Konzentration über diese Eigenschaft bestimmt werden kann. Zum Beispiel treten bei Überschreitung des Löslichkeits- produktes sehr viele Ionen zu Kristallen zusammen die zunächst als Trübung erscheinen und schliesslich so gross werden, dass sie aus der flüssigen Phase sedimentieren. Ein anderes Beispiel ist die immunchemische Reaktion zwischen einem löslichen Antigen und einem bivalenten Antikörper, die zu grossen und stark lichtstreuenden Molekülaggregaten führen kann. Der zeitliche Verlauf solcher Reaktionen entspricht sehr häufig dem allgemeinen kinetischen Verlauf aufeinanderfolgender Reaktionen 1. Ordnung, das heisst die Konzentrationskurve für die Bildung des Endproduktes zeigt einen Wendepunkt und somit tritt die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erst im Laufe der Reaktion auf. Am Beispiel einer immunchemischen Reaktion ist dieser Verlauf für zwei Antigenkonzentrationen in Fig. 1 dargestellt. Aus den Signal-Zeit-Rurven in Fig. 1 kann auf verschiedene Weise ein konzentrationsabhängiges Messsignal gewonnen werden (Tab. 1). Tab. 1 Zeitliche Randbedingungen bei der Gewinnung von konzentrationsabhängigen Messsignalen (S=Signal, t=Zeit) Name Prinzip 1) Endpunkt- Das Messsignal wird zu einem so verfahren späten Zeitpunkt ermittelt, bei dem es sich erfahrungsgemäss nicht mehr verändert, aber noch keine Präzipi tat ion stattfindet. 2) Kinetisches Das eigentliche Messsignal ist die Verfahren Differenz zweier Signale, die zu "fixed-time verschiedenen, aber fest vorgegebe Kinetik" nen Zeitpunkten ermittelt werden. 3) Kinetisches Die maximale Reaktionsgeschwindig Verfahren keit, d.h. die maximale Änderung des grate deter- Signals pro Zeiteinheit, wird ermit mination" telt: "peak rate a) durch Messung von delta S in hin method" reichend kurzen Intervallen von delta t und Bestimmung des gröss ten Quotienten delta S/delta t. b) elektronische Differenzierung dS /dt und Bestimmung des Maximums c) Konstruktion der Tangente an die Signal/Zeit-Kurve und Bestimmung der maximalen Steigung. Eine grosse Zahl von Analyten kann heute nach den in Tab. 1 aufgeführten Verfahren mit direkter oder indirekter Streulichtmessung quantifiziert werden. Betrachtet man die Abhängigkeit eines geeigneten Messsignals (Tab. 1) von der Konzentration eines Reaktionspartners, z. B. des Antigens, während der andere Reaktionspartner mit konstanter Konzentration eingesetzt wird, so kann man zum Beispiel bei immunchemischen Reaktionen, den in Abb. 2 dargestellten Zusammenhang beobachten. Die überraschende Tatsache, dass das gleiche Messsignal sowohl auf eine niedrige als auch auf eine hohe Konzentration des Analyten zurückgeführt werden kann, führt zu einer Zweideutigkeit der Signal-Konzen- tration-Beziehung, die dem Fachmann als Antigenüberschuss -Phänomen oder Heidelbergerkurve bekannt ist. Diese Zweideutigkeit ist prinzipiell überall dort beobachtbar, wo Komplexe unterschiedlicher Stöchiometrie möglich sind, je nach Überschuss des einen oder anderen Reaktionspartners, und sich diese Komplexe in ihrer Signaleigenschaft, zum Beispiel Streulicht, nicht unterscheiden. zum Beispiel: MonxCoMonx+m und Monx+mCoMonx wobei Mon = Monomer CoMon = Co-Monomer Ag2 Ak und AgAk2 wobei Ag = Antigen Ak = homologer Antikörper Lec2 GP und Lec GP2 wobei Lec= Lectin GP = Glykoprotein tAgxclxl) und (Ag,+lClx)+ wobei Ag = Silberion Cl = Chloridion Führt man solche Reaktionen zum Zwecke der Konzentrationsbestimmung durch, so definiert und optimiert man das Verfahren für eine bestimmte Überschuss-Situation. In der Praxis führt dies dort zu Schwierigkeiten, wo der Analyt in einem sehr grossen Konzentrationsbereich vorliegen kann und der Konzentrationsüberschuss eines Reaktionsteilnehmers nicht sichergestellt werden kann. Diese Situation spielt besonders eine Rolle bei der immunchemischen Bestimmung der Immunglobuline, deren Konzentration um den Faktor 1000 schwanken kann. Die Testbedingungen und die ökonomisch optimale Antikörperkonzentration zur Bestimmung der normalen und subnormalen Konzentration erlauben nicht die Erfassung einer um den Faktor 1000 erhöhten Konzentration. Das folgende bezieht sich deshalb nur auf immunchemische Reaktionen, obwohl das Verfahren prinzipiell auf alle Reaktionen anwendbar ist, welche die oben erörterten Eigenschaften aufweisen und ein analoges kinetisches Verhalten zeigen. In Bezug auf immunchemische Reaktionen sind eine Fülle von Verfahren und Ausführungsformen bisher vorgeschlagen worden, um zu erkennen, auf welchem Teil der Heidel bergerkurve man sich mit einem gegebenen Analysenansatz befindet. Im folgenden seien einige Beispiele genannt: 1. Das älteste und sicherste Verfahren zur Erkennung eines Antigenüberschusses ist die Durchführung einer Doppelbestimmung mit zwei verschiedenen probenver- dünnungen. Beim Vorliegen eines Antigenüberschusses erhält man bei der grösseren Verdünnung ein höheres Signal und findet scheinbar einen höheren Proteinge halt als bei der konzentrierteren Probe. (H. E. Schultze u. G. Schwick; Prot. Biol. Fluids 5, 15-25 (1958)). Verbesserte Ausführungsformen dieses Verfahrens sehen den weiteren Zusatz von Antikörpern in den Testansatz vor, nachdem die Reaktion ein gewisses Gleichgewicht erreicht hat. Beim Vorliegen eines Antigenüberschusses tritt dann eine Signalerhöhung ein (T. O. Tiffany et al., Clin. Chem. 20, 1055 - 1061 (1974)). Ebenso lässt sich ein Antigenüberschuss durch Nachdosieren mit An tigenmaterial bekannter Konzentration erkennen (J. C. Sternberg; Clin. Chem. 23, 1456 - 1464 (1977)). 2. Im speziellen Fall der continous-flow-Technik wird das Vorliegen eines Antigenüberschusses durch Auftre ten eines Doppelpeaks bemerkt (R. F. Ritchie; Pro tides Biol. Fluids 21, 569 (1974)). 3. Durch Betrachtung der Reaktionskinetik nach graphischer Auf zeichung des Reaktionsverlaufes kann man bei turbidimetrischer Messung zwischen Antikör perüberschuss und milder" Antigenüberschuss unter scheiden (I. Deverill; Protides Biol. Fluids 26, 697 (1979)) (P. J. J. Van Munster et al., Clin. Chim. Acta 76, 377 - 388 (1077)). 4. Durch Bestimmung der Reaktionsdauer bis zum Auftreten der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei nephelo metrischer Messung kann eine Grösse berechnet werden, die eine Diskriminierung zwischen Antigen-und Anti körperüberschuss erlaubt (DE-A-27 24 722 C2). Die unter den Punkten 2 und 4 genannten Verfahren unterscheiden sich vorteilhaft von den anderen Techniken dadurch, dass nicht alle Proben auf das Vorliegen eines Antigenüberschusses überprüft werden müssen, sondern dass während des Messvorganges eine Information darüber erhalten wird, ob eine Prüfung auf Antigenüberschuss durchgeführt werden muss. Verfahren 2 ist an eine bestimmte Technik gebunden und nicht allgemein für nephelometrische oder turbidimetrische Proteinbestimmungen anwendbar. DE-A-27 24 722 C2 als Stand der Technik geht davon aus, dass eine Funktion der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit existiert, die es erlaubt, mit Hilfe eines Schwellenwertes dieser Funktion zwischen Antigenüberschuss und Anti körperüberschuss zu diskriminieren (Anspruch 1). In Spalte 12, Zeile 8 - 21 dieser Patentschrift wird ausgeführt, dass als Diskriminatorfunktion die Zeit (T) dienen kann, die von der Reaktionsauslösung bis zum Auftreten des Maximalwertes (H) der Reaktionsgeschwindigkeit verstreicht. Diese Ausführungen werden jedoch in Spalte 21, Zeilen 55 - 68, stark eingeschränkt, dort heisst es, dass kein einzelner Zeitwert existiert, bei dem der Antikörperüberschuss-Kurventeil auf der einen Seite dieses Wertes und der Antigenüberschuss-Kurventeil auf der anderen- Seite läge. Die Erfindung löst das Problem durch Koordinatentransformation und die Einführung neuer Variablen. Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass bei Feststellung eines Antigenüberschuss-Zustandes die Messung nach entsprechender Verdünnung der Probe zur Erzielung eines Antikörperüberschuss-Zustandes wiederholt wird. Diese zusätzliche Messung einer Probe, die im Antigenüberschuss-Zustand gefunden wird, ist material-und zeitaufwendig. Der Erfindung liegt deshalb als Aufgabe die Schaffung eines Verfahrens zugrunde, welches es erlaubt, ohne zusätzliche Messung den Gehalt einer Probe an einem Antigen oder Antikörper zu bestimmen, auch wenn sich diese im Antigenüberschuss-Zustand des jeweiligen Testansatzes befindet. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch Messung der Zeit, die von der Reaktionsauslösung bis zum Auftreten des Maximalwertes der Reaktionsgeschwindigkeit verstreicht, bei einem kinetischen Verfahren, d.h. bei Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Konzentration, auf beiden Seiten der Heidelbergerkurve quantitativ gemessen werden kann. Eine Unterscheidung zwischen Antikörperüberschuss und Antigen überschuss ist nicht mehr notwendig. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Konzentration eines Reaktanden einer Reaktion, die unter Bildung oder Verbrauch von Streuzentren im Sinne eines Übergangs von der Rayleigh- zur Mie-Streuung verläuft, bei welchem die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) und die Zeit vom Reaktionsbeginn bis zum Auftreten der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (man) bestimmt werden, dadurch gekennzeichnet, dass zur eindeutigen Bestimmung der Konzentration der funktionelle Zusammenhang zwischen Konzentration, Vmax und tmax mit einem Standardpräparat empirisch ermittelt, Vmax und tmax an der Probe gemessen und mittels der am Standardpräparat ermittelten Beziehung zwischen der Konzentration der Reaktanden und Vmax und tmax die Konzentration des Reaktanden bestimmt wird. Die Beziehung zwischen Konzentration und Vmax und tmax kann beispielsweise in einer Tabelle, einer Matrix oder einer oder mehreren mathematischen Funktionen wiedergegeben sein. Es ist bekannt, dass Reaktionsgeschwindigkeit und Signalintensität von Antigen-Antikörper-Reaktionen nach Ionenstärke, Ionenart und Polymerzusatz des Reaktionsmediums in einem weiten Bereich beeinflusst werden können. Die folgenden Ausführungen beschränken sich deshalb nicht auf die in den Beispielen aufgeführten Bedingungen sondern gelten für Präzipitatsreaktionen, die sich im oben genannten Sinne beeinflussen lassen. Bestimmt man die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (man) in Abhängigkeit von der Konzentration, so erhält man den in Fig. 2 dargestellten Zusammenhang. Bestimmt man gleichzeitig mit Vmax die Zeit, die von Beginn der Reaktion bis zum Erreichen von Vmax verstreicht (tmax), so ergibt sich der in Fig. 3 dargestellte Zusammenhang. Jede der beiden Signal-Konzentrationskurven zeigt das Antigenüberschuss-Phänomen; bestimmten Signalen können zwei Konzentrationen zugeordnet werden. Projeziert man die beiden Funktionen in eine Abbildung (Fig. 4 > , so erkennt man, dass kein Wertepaar (Vmax, tmax) existiert, das zwei verschiedenen Konzentrationen zugeordnet werden kann. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) und die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (man) sind offensichtlich voneinander unabhängige Variable der Konzentration, und die Heidelbergerkurve ist eine dreidimensionale Kurve (Fig. 5), die bei geeigneter Reaktionsführung keine Doppeldeutigkeit im Hinblick auf die Konzentration zeigt. Messverfahren, bei denen nur mit einer zweidimensionalen Projektion dieser Kurve gearbeitet wird, z. B. Messung von Vmax als Funktion der Konzentration (Fig. 6), zeigen immer eine Doppeldeutigkeit im Hinblick auf die Konzentration. Bei der praktischen Auswertung der gefundenen Zusammenhänge ist zu beachten, dass in der Nähe des Minimums oder des Maximums einer Signal-Konzentrations-Kurve die Konzentration nur mit einer verminderten Präzision bestimmt werden kann, da relativ geringe Signaldifferenzen einer grossen Konzentrationsdifferenz entsprechen. Bei dem neuen Verfahren der Bestimmung zweier unabhängiger Messsignale wird die Präzision besonders dann verbessert, wenn das Minimum der Funktion Konz. = f (man) möglichst weit von dem Maximum der Funktion Konz. = f (Vmax) entfernt ist. Arbeitsweise und Reaktionsbedingungen des neuen Verfahrens sollen in den folgenden Beispielen gezeigt werden. Beispiel 1: Bestimmung des Maximum-Bereiches einer Kali- brationskurve für IgG Photometer: DU-8 mit Zusatzteil für nephelometrische Messungen (Beckman Instruments) Reaktionsmedium: 0.02 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7.3 mit 40 g/l Polyäthylenglycol 6000 (Serva), Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland und 64 g/l Natriumbromid Probenverdünnungsmedium: Physiologische NaCl-Lösung Antiserum: LN-Antiserum gegen Human IgG/kappa-Kette (vom Kaninchen) (Behringwerke AG, OSAS 14), 1:31 mit Reaktionsmedium verdünnt Standard: T-Protein-Standard-Serum (human), (Behring werke AG, OSKT 06) Testansatz: 20 p1 Proben-/Standardverdünnung werden mit 500 jil Antiserumverdünnung versetzt und so fort im Photometer unter Verwendung des Ki netik II-Programmes maximal 3 min. bei einer Wellenlänge von 334 nm gemessen a) Turbidimetrische Messung Konzentration der Maximale Reak- Zeit von Reak Standardverdünnung tionsgeschwin- tionsbeginn bis in mg/dl IgG digkeit zum Auftreten (Vmax in mE/min) des Maximums (tmax in sec.) 110.4 425 38 92 466 30 78.9 542 24 73.6 569 20 69 583 18 64.9 576 16 61.3 567 16 55.2 548 14 22.1 219 20 11.0 75 30 b) Nephelometrische Messung Konzentration der Maximale Reak- Zeit vom Reak Standardverdünnung tionsgeschwin- tionsbeginn bis in mg/dl IgG digkeit zum Auftreten (Vmax in mE/min) des Maximums (-max in sec.) 110.4 1410 36 92 1490 30 78.9 1710 22 73.6 1730 22 69 1780 20 64.9 1800 20 61.3 1810 20 55.2 1720 18 22.1 706 24 11.0 325 42 Beispiel 1 zeigt, dass sowohl bei turbidimetrischer als auch bei nephelometrischer Messung Konzentrationen im und zu beiden Seiten des Maximums der Heidelbergerkurve eindeutig bestimmt werden können. Zur Ermittlung einer unbekannten Probenkonzentration wird nach Messung von Vmax und tmax zwischen den tabellierten Werten des Standards interpoliert. Der Messbereich wird durch geeignete Verdünnung der Proben festgelegt, in Beispiel 1 bei 1:51 Verdünnung der Probe von 560 bis 5600 mg/dl IgG, und kann so gewählt werden, dass der Teilbereich mit der geringeren Präzision nicht in den klinisch relevanten Entscheidungsbereich des entsprechenden Parameters fällt. Beispiel 2: Aufnahme einer Kalibrationskurve für IgM (turbidimetrischi Photometer: DU-8 (Beckman Instruments) Reaktionsmedium: 0.15 m NaCl-Phosphatpuffer pH 7.2 mit 39 g/l PEG 6000 (Serva) und 8 g/l NaCl Probenverdünnungsmedium: Physiologische NaCl-Lösung Antiserum: LN-Antiserum gegen man IgM,p-Kette (vom Kaninchen) (Behringwerke AG, OSAT 14), 1:11 mit Reaktionsmedium verdünnt Standard: T-Protein-Standard-Serum (human), (Behring werke AG, OSKT 06) Testansatz: 200 p1 Proben-/Standardverdünnung werden mit 500 p1 Antiserumverdünnung versetzt und so fort im Photometer unter Verwendung des Ki netik IT-Programnie maximal 3 min. bei einer Wellenlänge von 312 nm gemessen Konz.Stand. Konz.Probe Max.Reakt. Zeit v.Reakt. verdünnung l:21-Verdünn. geschwind. beginn bis mg/dl IgM in mg/dl IgM (Vmax in mE Maximum /min) (tax in sec.) 110 2310 371 34 74 1540 508 28 55 1155 591 18 44 924 639 14 37 770 639 12 31 660 620 12 28 578 611 10 24 513 598 10 22 462 556 10 20 420 508 10 18 385 488 10 17 355 467 10 16 330 460 10 15 308 419 10 14 290 405 10 13 272 378 10 12 257 368 10 11 231 330 10 5.5 116 158 10 2.8 58 69 10 1.4 29 27 12 Aus Beispiel 2 lässt sich entnehmen, dass bei der geähl- ten Probenverdünnung eine Konzentration zwischen 30 und 600 mg/dl IgM mit einer besseren Präzision gemessen werden kann als zwischen 600 und 900 mg/dl. Bei einem Normalbereich zwischen 70 und 300 mg/dl IgM im Serum legen jedoch Werte oberhalb von 600 mg/dl stets den Verdacht auf eine monoklonale Gammopathie nahe und erfordern, unabhängig von der Präzision des Wertes, weitere Untersuchungen.

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Konzen tration eines Reaktanden einer Reaktion, die unter Bildung oder Verbrauch von Streuzentren im Sinne eines Übergangs von der Rayleigh- zur Mie-Streuung verläuft, bei welchem die maximale Reaktionsgeschwin digkeit (Vmax) und die Zeit vom Reaktionsbeginn bis zum Auftreten der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (man) bestimmt werden, dadurch gekennzeichnet, dass zur eindeutigen Bestimmung der Konzentration der funktionelle Zusammenhang zwischen Konzentration, Vmax und tmax mit einem Standardpräparat empirisch ermittelt, Vmax und tmax an der Probe gemessen und mittels der am Standardpräparat ermittelten Beziehung zwischen der Konzentration des Reaktanden und Vmax und tmax die Konzentration des Reaktanden bestimmt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine immunchemische Reaktion ist. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Bestimmung mittels einer Durchlicht-Messung (turbidimetrisches Verfahren) aus geführt wird. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Bestimmung mit Strahlung einer Wellenlänge von 240 bis 700 nm, vorzugsweise jedoch von 300 bis 380 nm, ausgeführt wird. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Bestimmung mittels einer Streulicht-Messung (nephelometrisches Verfahren) aus geführt wird.

Inventors: METZMANN, ERWIN, DR.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: G01N21
IPC codes: G01N33, G01N21, G01N15