DETERMINATION OF FIBRIN WITH FIBRIN-SPECIFIC ANTIBODIES

Abstract: 1. A highly specific antibody against fibrin, obtainable by immunization using a peptide which contains an amino acid sequence of fibrin which is exposed by splitting off fibrinopeptide A from the fibrin molecule.

Description: Bestimmung von Fibrin mit Fibrin-spezifischen Antikörpern Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bestimmung von Fibrin im Plasma oder im Gewebe mit hochspezIfischen Antikörpern die hierfür benötigten Anti- körper ein Verfahren zu deren Herstellung und die hierfür eingesetzten Immunogene. Es ist bekannt, dass bei Patienten mit disseminierter in travasaler Gerinnung (Verbrauchslcaoagulopathie) lösliches Fibrin im zirkulierenden Blut auftritt. Dieses Fibrin ist durch die Einwirkung proteolytischer Enzyme aus dem lös- licn Plasmaprotein Fibrinogen entstanden. Lösliches Fibrin kann sich in Kapillaren und kleinen Blutgefässen zu Fibrinsträngen zusamenlagern, die licht- und elektronenmikroskopisch nachweisbar sind (Übersicht bei: Müller-Berghaus, G., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 3: 209 - 246, 1977). Auch bei entzündlichen Erkran- kunden kann im Gewebe intra- oder extravaskulär ein D4a- terial nachgewiesen werden, das sich von Fibrinogen ableitet. Es bestand deshalb die Aurgabe, ein Reagenz bzw ein Verfahren zu entwicklen, um Fibrin von Fibrinogen unterscheiden zu können und Fibrin spezifisch und quantitativ zu bestimmen Es ist bekannt, dass proteolytische Enzyme, wie z.B. Thrombin, vom Fibrinogenmolekül sowie intra- als auch extravasal Peptide abspalten, so dass Firbrinmonomer entsteht. Mehrer Fibrinmonomere können sich zu einem Fibrinpolymer, einem Fibringerinnsel, zusammenlagern, das dann für den Organismus, wenn dies sich intranasal ereignet, zu deletären Folgen führt. Es ist demnach erstrebenswert, sehr Frühzeitig bei eie krankhaften Geschehen Fibrin nachzuweisen. Bisher gibt es nur qualitative Methoden zum Nachweis von Fibrin, da sich Fibrin vom Fibrinogen nur durch die Abspaltung der Fibrinopeptide unterscheidet. Die qualitativen bzw. semiquantitativen Methoden beruhen z.B. auf einer Fällung nach Zugabe von Ethanol (Godal, H.C., Abildgaard, U., Scand. J. Haematol. 3: 342 - 350, 1966), Protaminsulfat (Niewiarowski, S., Gurewich, V., J. Lab. Clin. ed. 77: 665-676, 1971) oder Agglutination von beschichteten Erythrozyten oder Latexpartikeln (Largo, R., Heller, V., Straub, P.W., Blood 47: 991-1002, 1976). Diese zitierten Methoden erlauben nicht zwischen Fibrin und Fibrinogen zu unterscheiden. Andere Methoden ver- suchen Fibrin vom Fibrinogen durch Chromatographie zu trennen (Alikjaersig, N., Fletcher, A., Burstein, R., Am. J. Obstet. Gynecol. 122: 199 - 209, 1975; ileene, D.L., Matthias, F.R., Thromb. Res. 2: 137 - 154, 1973). Auch dlese Methoden sind nicht spezifisch, da Fibrin sich nicht völlig von Fibrinogen abtrennen lässt. Fibrinogen ist notwendig, um Fibrin in Lösung zu halten (Krell, W., Mahn, I., Müller-Berghaus, G., Thromb. Res. 14: 299 - 310, 19799. Eine mögliche Methode, im gereinigten System Fibrin von Fibrinogen zu unterscheiden, ist die Bestimmung des Nr- terminalen Glycins (Kierulf, P., Godal, H.C., Scand. J. Haematol. 9: 370 - 372, 1972). Diese Methode ist jedoch kompliziert und benötigt grosse Mengen an Ausgangsmaterial, weswegen sie sich nicht als Test durchgesetzt nach. In einer kleinen Plasma- oder Gewebeprobe kann somit bisher Fibrin nicht von Fibrinogen unterschieden werden. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass Fibrin mit Hilfe hochspezifischer Antikörper bestimmt wird. Diese Bestimmung kann auch in Anwesenheit vergleichs- weise hoher Konzentrationen von Fibrinogen nicht nur qualitativ, sondern sogar quantitativ erfolgen. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungs- gemässen Antikörper gebildet werden, wenn man als Antigene Peptide einsetzt, die die Aminosäuresequenz bestimmter Molekülbaschnitte des Fibrinmoleküls nachahmen. Dies war um so überraschender, als frühere Immunisierungsversuche gegen das komplette Fibrinmolekül zu keinen Fibrin-spezifischen Antikörpern führten. Antiseren, die die erfindungsgemässen Antikörper enthalten, werden erhalten indem man in den Organismus von Versuchstieren als Antigen Peptide mit einer Teilaminosäuresequnez des Fibrins einbringt. Bevorzugt sind Peptide, die eine Aminosäuresequenz von 3 bis 12 Aminosäuren enthalten, die nach Abspaltung des Fibrinopeptids A vom N-terminalen Ende des Fibrinogenmoleküls freigelegt wird. Als vorteilhaft hat sich das Hexapeptid der Formel Giy-Pro-Arg-Val-Val-Glu erwiesen. Dieses wird in üblicher Weise, zweckmässig unter Einschaltung einer "spacer" Gruppierung, an hierfür geeignete Trägerpeptide gebunden. Die Oligopeptide, die die Aminosäuresequenz des Fibrins, insbesondere der terminalen Gruppen, die durch Abspaltung der Fibrinopeptide freigesetzt werden, nachahmen, werden in bekannter leise synthetisiert. Geeignete Ver faiiren sind beispielsweise in E. Wünsch in Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie11, Band XV/1 und 2; The Peptides, Vol. 1, "Major Methode of Peptide Bond Formation", Academic Press (1979), oder "Perspectives in Peptide Chemistry's, A. Eberle, R. Geiger and T. Wieland (Editors), S. Karger, Basel (1981), beschrieben. Dabei werden Aminosäuren oder Peptidfragrrente, deren funktionelle Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen sollen, in geeigneter Weise geschützt sind, zur Reaktion gebracht. Die freien Carboxygruppen von Aminosäurederivaten oder Peptidfragmenten werden in geeigneter Weise aktiviert und mit der Aminogruppe von Aminosäurederivaten oder teilgeschützten Peptidfragmenten umgesetzt. Die Aktivierung kann mit DCCI, DCCI/HOBt, DCCI/Hydroxy- succinimid, POCl3, Chlorameisensäureestern oder der Azid Methode erfolgen. Bevorzugt verwendet man die DCCI/HOBt Methode nach Chem. Ber. 103, 788 (1970). Der Aufbau der teilgeschützten Oligopeptide Boc-Gly-Prc Arg-Val-Val-Glu-#-Capr-OH und Fmoc-Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu HMDA-H kann stufenweise vom C-terminalen Ende her oder auch durch Fragmentkupplungen erfolgen. Ausserdem kommt stufenweiser Aufbau an einem löslichen oder unlöslichen polymeren Träger, wie beispielsweise Polyoxyethylen oder vernetztes Polystyrol, in Frage. Als Schutzgruppe für die alpha-Aminofunktion der Aminosäuren oder Peptidfragmente kommen Boc, Fmoc, Z, a,a-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxy carbonyl, 2-(Biphenyl)-(4))-propyl-(2)-oxycarbonyl und Trityl in Frage. Bevorzugt verwendet man Boc, Fmoc und Z. Als Schutz für die alpha-Carboxygruppe von Aminosäuren und Peptidfragmenten verwendet man die Veresterung-mit Alkanolen oder araliphatischen Alkoholen. Bevorzugt sind die Methyl-, Benzyl- und tert. Butylester. Die Seitenkettenfunktionen der teilges chützten Oligopep- tide sind eine Carboxygruppe sowIe ein Guanidinofuktion. Diese können entsprechend ihrer Reaktivität mit in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen substituiert sein. Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxygruppe in Glu die Veresterung mit aliphatischen oder aralipha- tischen Alkoholen wie beispielsweise Methanol, tert. Butanol oder Benzylalkohol. Zum Schutz der Guanicino- funktion des Arginifis kann sie protoniert sein oder durch NG-Tosyl, NG-Nitro, NG-Adamantyloxycarbonyl und NG-Benzyloxycarbonyl substituiert sein. Die Protonierung wird bevorzugt. Der N-Terminus der verwendeten Oligopeptide m zur ein deutigen Reaktionsführung bei der Kopplung an das Trägerprotein so geschützt sein, dass eine Abspaltung der Schutz gruppe am Peptid-Protein-Konjugat ohne Schädigung des Proteins erfolgen kann. Dazu eignen sich die Fmoc-Schutzgruppe, die unter alkalischen Bedingungen sowie die 2 (Bipehnyl-(4))-propyl-(2)-oxycarbonyl-, &alpha;,&alpha;-Dimethyl- 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-, Boc- und Tritylgruppe, die er realtiv milden sauren Bedingungen abgespalten werden können. Als "spacer"-Gruppierung kommen die in der Peptidchemie üblicherweise verwendeten Brückenglieder in Betracht, wie sie beispielsweise auch bei der humobilisierung von Enzymen verwendet werden. Die entsprechenden Reagenzien enthalten zwei gleiche oder verschiedene V reaktive Gruppen an den Enden einer Alkylengruppe mit beispielsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, wobei als reaktive Gruppen solche @ in Betracht kommen, die mit den funktionellen Gruppen der Aminosäuren eine kovalente Bindung eingehen könnten. Geeignet sind beispielsweise Dialdehyde wie Glutaraldehyd, Diisocyanate wie 1,6-Hexamethylendiisocyanat, Diamine wie 1,6-Hexarne thylendiarnin oder #-Aminocarbonsäure wie #-Aminocapronsäure. Diese bifunktionellen Reagenzien werden - gegebenenfalls nach Aktivierung - in bekannter Weise einerseits mit dem Oligopeptid und andererseits mit dem Träger verknüpft. Die Umsetzung der teilgeschützten Oligopeptide mit de Trägerprotein, erfolgt irq Falle von Boc-Gly-Pro-Arg-Val- Val-Glu-#-Capr-OH über eine Aktivierung der Carboxygruppe mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimids wie beispielsweise N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbo dlimid oder mit DCCI/Hydroxysuccinimid. Fmoc-Gly-Pro- Arg-Val-Val-Glu-HMDA-H wird mit Hilfe eines bifunktio nellen Reagenzes, wie beispielsweise MBS, über die freie Aminogruppe gebunden. Die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe am Peptid-Protein-Konjugat mit 1,2 N HCl./liAc ist nur bei RSt LQ\glich. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit 0,2 N NaOH gelingt bei vielen Trägerproteinen, wie beispielsweise RSA oder KLH. Als Träger kommen grundsätzlich beliebige Proteine in Betracht. Zweckmässig werden solche Trägerproteine ausgewählt, die keine reuzreaktion'verursachen. Geeignet sind beispielsweise Albumine wie Rinderserum-Albumin oder Haemocyanine wie Keyhole limpet hemocyanine. Mit den so erhaltenen Antigenen werden Versuchstiere wie Mäuse, Ratten, Kaninchen oder Ziegen in bekannter Weise immunisiert und so Antiseren mit polyklonalen Antikörpern erhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden in entsprechen- der Weise monoklonale Antikörper nach der Methode von G. Köhler und G. Milstein, Nature 256, 495 - 497 (1975) erzeugt. Hierzu können die bekannten Mausmyelomazellinien eingesetzt werden. Als besonders günstig hat es sich erwiesen, eine Zellinie zu benutzen, die selbst kein Immunglobulin produziert. Die efindungsgemässen polyklonalen und monoklonalen Antikörper reagieren nicht mit Fibrinogen, wohl aber mit des A-Fibrin (Fibrin Typ I), des-AB-Fibrin (Fibrin Typ II), dem Peptidkonjugat und dem synthetischen Peptid. Diese Bin- - dung erfolgt mit einer so grossen Empfindlichkeit und Spezifität, dass Nanogramm-Mengen an monoklonalen Antikörpern Nanogramm-Mengen an Antigenen (des-A-Fibrin und/oder des AB-Fibrin) selbst In Gegenwart von Fibrinogen in phosiolo- gischer Konzentration (3 mg/ml) spezifisch erkennen können. Vorstehend und in den folgenden Beispielen wurden die nachstehendenAbkürzungen verwendet: Arg L-Arginin Boc t-Butyloxycarbonyl c-Capr #-Aminocapronsäure (bzw. davon -abge- leiteter Rest) DCCO Dicyclohexylcarboddimid DCH Dicyclohexylharnstoff des-AA-Fibrin Typ I des-AABB-Fibrin Typ II DF Dimethylformamid ELISA Enzymimmunoassay (enzyme linked immunosorbent assay) Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl Glu L-Glutaminsäure Gly Glycin HAc Essigsäure HMDA 1,6-Hexamethylendiamin (bzw. davon ab geleiteter Rest) HOBt 1-Hydroxy-1H-benzotriazol Ig Immunglobulin i.p. intraperitoneal i.v. intravenös KLH Koyhole limpet hemocyanine (Haemocyanin einer marinen Napfschnecke) MBS m-Maleinimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid Ester OBzl Benzylester OtBu t-Butylester PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline) Pro L-Prolin RSA Rinderserum--Albumin s.c. subcutan TFA Trifluoressigsäure Val L-Valin Z Benzyloxycarbonyl Herstellunf oder synthetischen Peptide Die Peptide der Beispiele 1 und 2 werden durch Elementar- analyse, Aminosäureanalyse und Dünnschichtchromatographie charakterisiert. Die chemische Reinheit wird durch Dünnschichtchromatographie in verschiedenen Lösungsmittelgemischen festgelsttel. Die Racemisierung wird gaschromatographichen auf einer mit RCHIRASIL-Val belgten Glaskapil larsäule nach J. Chromat. Sci. 15, 174 (1977) überprüft und liegt für jede Aminosäure unter 2 Prozent. Beispiel 1 Unter Einbeziehung von #-Aminocapronsäure als Spacer wird das teilgeschützte Peptid Boc-G1y-Pro-Arg-Val-Val- Glu-#-Capr-OH nach dem Syntheseschema I synthetisiert. Beispiel 2 Unter Einbeziehung von Hexanethylendiamin als Space wird das teilgeschützte Peptid Fmoc-Gly-Pro-Arg-Val- Val-Glu-HMDA-H nach den Syntheseschema II synthetisiert. Beispiel 3 20 mg Boc-Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-#-Capr-OH (Beispiel 1) erden in 0,4 ml Ethanol gelöst und 4 mg DCCI sowie 2,5 mg Hydroxysuccinimid zugegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird der Peptid-Hydroxysuccinimidester langsam zu einer Lösung von 760 mg RSA (reinst) in 7 ml Puffer (0,25 m HEPES, 0,2 m CaCl2m pH 7,5) zugetropft. Nach 20 Stunden bei Raumtemperatur wird von DCH abfil- triert, gegen destillierstes Wasser dialysiert und lyophilisiert. 300 mg des so erhaltenen Peptid-RSA-Kunjugats werden in 1 ml 1,2 N HCl/HAc gelöst und 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wird im Vakuum abdestil- liert, der Rückstand in Wasser gelöst und lyophilisiert. Beispiel 4 20 mg KLH werden in 1 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer (pH 6) gelöst. Dann werden 3 m MBS, gelöst in 0,2 ml D;IF, zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Niedermolekulare Bestandteile werden durch Gelfiltration auf RSEPHADEX G 25 entfernt. Die Proteinfraktionen werden vereinigt und durch Ultrafiltration auf 4 ml konzentriert. Nach Zugabe von 10 ml Natriumboratpuffer (pH 9) werden 5 mg Fmoc-Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-HMDA-H (Beispiel 2), gelöst in 0,5 ml DMF, zugetropft und die Lösung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Abspaltung der Schutzgruppe werden 15 ml 0,2 N NaOH zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt ach Neutralisation wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Herstellung heterologer Antikörper Beispiel 5 Ein an ein Trägerprotein (RSA,KLH) uni-direktional gekoppeltes Peptid wird in PBS gelöst und zu gleichen Teilen mit Freund-Adjuvans gemischt. Jeweils 200 g dieses Gemisches werden in 6 - 8 Wochen alte Balb/c Mäuse ip. und s. c injiziert. Diese Injektionen werden zwei- mal im Abstand von 3 - 4 Wochen wiederholt. Antiseren der Mehrzahl so behandelter Tiere zeigen im ELISA-Test eine positive Reaktion gegen Fibrinmonomere und das unkonjugierte Peptid, aber keine Immunantwort gegen Fibrinogen Des-AA- und des-AABB-Fibrinmonomere werden durch Behandlung einer Fibrinogenlösung mit Batroxobin (2,5 U/mg Fibrinogen) bzw. Thrombin (5 U/mg Fibrinogen) hergestellt. Die entstandenen Gerinnsel werden isoliert und in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4) mit 3-molarem Harnstoffzusatz gelöst. Eine Repolymerisation erfolgt dadurch, dass der Harnstoff durch Dialyse entfernt wird. Das Gerinnsel wird wieder in dem zuvor beschriebenen Tris-Harnstoff-Puffer aufgelöst Die Gegenwart von Antikörpern im Mausserum gegen bestimmte Antigene (Fibrinogen, des-A-Fibrin (Fibrin Typ I); des-AB-Fibrin (Fibrin Typ II), unkonjugiertes Peptid) wird mittels ELISA bestimmt. Das Prinzip beruht darauf, dass eine Serumverdünnung mit den an einen Trager immobilisierten Antigen inkubiert wird. Nach einem Wasch schritt und anschliessendem Zusatz einer mit einem Enzym wie Phosphatase oder Peroxydase markierten anti-Maus-Ig- Lösung wird durch Zugabe eines Substrates eine Änderung der optischen Dichte in nur den Reaktionsgefässen gemessen, in denen die Serumantikörper mit den entsprechenden Antigen reagiert haben. Unter Anwendung eines ELISA konnten folgende optische Dichten mit Antiseren von Mäusen, die gegen ein synthetisches Hexapeptid immunisiert worden waren, gemessen werden: V e r w e n d e t e A n t i g e n e Maus Fibrinogen des-AA-Fibrin des AABB-Fibrin unkonjugiertes Hexapeptid 1 0 1,45 1,45 0,691 2 0,046 1,35 1,08 0,51 3 0,017 1,64 1,25 o,49 4 0,03 2,0 1,55 . 0,51 Dieses Ergebnis zeigt, dass heterologe Antikörper in Seren von Mäusen, die gegen konjugiertes Peptid immunisiert werden waren, eingedutig Fibrinogen und Fibrin unterscheiden können. Herstellung monoklonaler Antikörper Beispiel 6 Nach obengenanntem Schema mit konjugiertem Peptid (RSA, KLH) immunisierte Mäuse erhalten 3 Tage vor Entnahme der Milz eine i.v. Injektion von 100 mg konjugiertem peptid, welches in PBS gelöst wird Etwa 108 Zellen von der Milz einer immunisierten Maus werden mit 5 < 107 Myelomazellen (x63-Sp8-653, eine Linie, die kein Immunglobulin synthetisiert; zu beziehen bei The Sallc Institute, Cell Distribution Center, San Diego CA 92112, USA) in Gegenwart von Polyethylenglykol (MG 3400) fusioniert. Fusionierte Zellen worden auf 4 latte, die jeweils 24 Vertiefungen enthalten, ausgesät. Jede dieser Vertiefungen enthält 5 . 107 Milzzellen unimmunisierter syngener Mäuse in Nährmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält. Die Antikörper enthaltenden Überstände dieser fusionierten Zellen (Hybridoma) werden 10 - 14 Tage später mittels des oben beschriebenen ELISA-Tests bezüglich ihrer Spe zifität gegen folgende Antigene getestet: Fibrinogen, des-AA-Fibrin, des-AABF-Fibrin und unkonjugiertes Peptid. Um monoklonalen Antikörper zu erhalten, die nur gegen Fibrinmonomer und gegen das syntetische Peptid gerich tet sind, werden Hybridomazellen, deren Überstände keine gegen Fibrinogen gerichteten Antikörper enthalten, zweimal kloniert. Syntheseschema I EMI12.1 Syntheseschema II EMI13.1

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimung von Fibrin, dadurch gekenn zeichnet, dass gegen Fibrin hochspezifische Antikörper eingesetzt werden. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass monoklonale Antikörper eingesetzt werden. 3. Gegen Fibrin hochspezifische Antikörper, erhältlich durch Immunisieren mit Hilfe eines Peptids, das eine Aminosäuresequenz des Fibrins enhält, die durch Ab spaltung von Fibrinopeptid vom Fibrinmolekül frei gelegt wird. 4. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunogen eine Aminosäuresequenz enthält. die durch Abspaltung von Fibrinopeptid A freigelegt wird. 5. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekenn zeichnet, dass die Aminosäuresequenz 3 bis 12 Amlno säure enthält. 6. Antikörper nach Anspruch 3 bis 5 > dadurch gekennzeich- net, dass das Immunogen die Sequenz Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu enthält. 7. Antikörper nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, dass däs Immunogen die Aminosäuresequenz über eine Spacer-Gruppierung an ein Trägerpeptid ge hunden enthält. 8. Antikörper nach Anspruch 3 bis 7, dadurch gekenil- zeichnet, dass sie monoklonal sind.

Inventors: EBERLE, REINHARD. DR., FUHGE, PETER, DR., HEIMBURGER, NORBERT. PROF.DR., MULLER-BERGHAUS, GERT, PROF. DR., SCHEEFERS-BORCHEL, URSULA DR., Müller-Berghaus, Gert, Prof.Dr.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
Application year: 1984
Main classification: G01N33
IPC codes: C07K7, G01N33, C12P21, C07K16, C12Q1, C12N15