PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSE OF NUCLEIC ACIDS

Abstract: 1. A process for enzymatic hydrolysis of nucleic acids, wherein high molecular nucleic acids are treated with 5'-phosphodiesterase immobilized by means of a diisocyanate on a macroporous anion exchange resin based on phenol/formaldehyde carrying essentially secondary amino groups.

Description: Immobilisierte 5'-Phosphodiesterase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung Die Immobilisierung von Enzymen ist schon mehrfach beschrieben worden: in der Britischen Patentschrift 1 369 462 ist beschrieben, dass man N-Acyl-D,L-aminossAuren mit Acylasen umsetzen kann, wobei selektiv die L-Aminosäure umgesetzt wird. Es wird erwähnt, dass die Acylase auch auf einem inerten Material wie Cellulose, Sand oder Aluminiumoxid adsorbiert sein kann und mit einem bifunktionalen Reagenz wie Glutardialdehyd vernetzt werden kann. In der Deutschen Offenlegungsschrift 2 732 301 wird die Immobilisierung von Proteinen beschrieben, wobei speziell auf das Enzym Penicillinacylase verwiesen wird. Nach der Deutschen Patentschrift 3 048 612 kann eine derart fixierte Penicillin-G-Aoylase zur Racematspaltung von D,L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure eingesetzt werden. Die Europäische Patentanmeldung A1-43169 betrifft Enzympräparationen mit Inulinase-Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym durch Reaktion mit Glutardialdehyd an ein makroporöses Harz mit Aminound/oder Hydroxygruppen gebunden. Als Beispiel wird ein Phenol-Formaldehyd-Harz mit Hydroxygruppen aufgeführt und erwähnt, dass auch ein Phenol-Formaldehyd-Harz mit Aminogruppen Verwendung finden könne. Weiterhin wird erwähnt, dass zur Bindung des Enzyms an einen Träger als bifunktionale Reagenzien neben Dialdehyden auch Dicarbonsäuren, deren Anhydride oder Diisocyanate in Betracht kommen. In der SP-A1-43169 ist der Phenol-Forinaldehyd-Harz-Träger R mit Aminogruppen durch das Warenzeichen DUOLITE A-7 charakterisiert. Nach der Europäischen Patentanmeldung A2-37667 handelt es sich hierbei um ein makroporöses Anion-Austauscherharz auf Phenol-Formaldehydbasis mit einem Teilchendurchmesser von 250 - 840 um, 31 m2/g spezifischer Oberfläche, 0,52 com3/ Gesamtvolumen der Makronoren. die einen Porendurchmesser von 10 - 200 nm aufweisen. und 7.5 mea/; Anion-Austauscherkanazität aufgrund von primären und sekundären Aminogruppen. Dieses Produkt wird von der Firma Diamond Shamrock vertrieben. Als allgemein geeignet werden granulat- oder perlförmige Anion-Austauscherharze auf Phenol-Formaldehydbasis beschrieben, deren Grösse vorzugsweise im Bereich von 250um bis 1,4 mm liegt. Aus der Europäischen Patentanmeldung A2-75262 ist es bekannt, 5'-Ribonucleotide dadurch herzustellen, dass man die Ribonucleinsäure (RNA) in Rohnucleinsäurelösungen mit einer an einen polymeren Träger immobilisierten 5'-Phosphodiesterase selektiv hvdrolvsiert. wobei also die Desoxvribonucleinsäure (DNA) unverändert bleibt. Bevorzugt wird ein makroporöser Träger mit Kanälen mit einem Durchmesser bis zu 100 nm und einem Porenvolumen von etwa 2 bis 3 ml/g. Die Immobilisierung von 5'-Phosphodiesterase war schon früher beschrieben worden, wobei jedoch nichts Über die Selektivität der Hydrolyse ausgesagt ist (S. Noguchi et al., Journal of Solid-Phase Biochemistry 1, 105 (1976)). Es wurde nun gefunden, dass die Fixierung von 5'-Phosphodiesterase an einen speziellen Träger ein sehr aktives Enzym liefert, das generell Nucleinsäuren zu Nucleotiden sPaltet. also auch hochmolekulare Desoxyribonucleinsäure. Erfindungegemäss wird die 5'-Phosphodiesterase an Anion Austauscherharze auf Phenol-Pormaldehyd-Basis mit vorzugsweise sekundären Aminogruppen mit Hilfe eines Diisocyanats gebunden. Von besonderem Vorteil ist, dass zur Bindung des Enzyms an den Träger kein Katalysator erforderlich ist, wie es beispielsweise bei den in der Europäischen Patentanmeldung EP-Ai-52365 genannten Methoden der Fall ist. Als Diisocyanate kommen aromatische, cycloaliphatische und insbesondere aliphatische Diisocyanate in Betracht, wie sie beisPielsweise in der EP-A1-52565 beschrieben Rind. Bevor.iipt sind hnndrlaiiblinhn hatische Diisocyanate wie das 2,2,4- und 2,4,4-Trimethyl-hexamethylen- 1,6-diisocyanat und insbesondere das Hexamethylen-1,6- diisocyanat. Zur Kopplung des Enzyms an den Ionenaustauscher wird dieser zunächst in die freie Basenform überführt, zweckmässig durch Suspendieren in einer starken wässrigen Base wie Natronlauge. Nach Neutralwaschen und Trocknen wird das wasserfreie Harz in einem aprotischen Lösemittel für das Diisocyanat aufgenommen und das Diisocyanat in Substanz oder in Lösung zugesetzt und gut vermischt. Das Um seteunsprodukt kann nach Abtrennen von der Reaktionslö sung und Waschen mit dem Lösemittel unmittelbar zu der Umsetzung mit dem Enzym verwendet werden. Es kann aber auch isoliert und getrocknet werden und ist unter Feuchtigkeitsausschluss längere Zeit haltbar. Das so vorbehandelte Harz kann unmittelbar mit einer wässrigen Lösung des Enzyms umgesetzt werden, wobei sich die Reaktionsbedingungen nach den Eigenschaften des Enzyms richten. Im allgemeinen wird das vorbehandelte Harz mit der wässrigen Enzymlösung ausreichend lange bei Raumtemperatur verrührt, das Produkt abfiltriert und gewaschen, beispielsweise mit gesättigter oder physiologischer Kochsalzlösung und anschliessend mit Wasser. Das gewaschene Enzymimmobilisat kann unmittelbar eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemässen immobilisierten 5'-Phosphodiesterase zur Spaltung von Nucleinsäuren, insbesondere von hochmolekularer DNA. Als Ausgangsmaterial eignen sich DNA-Lösungen, wie sie nach dem Verfahren der EP A2-75262 erhalten werden. Ein weiteres geeignetes Ausgangsmaterial kann durch Auftrennung von Rohnucleinsäurelösungen in einem Membrantrennverfahren erhalten werden, wobei die DNA als Retentat zurückbleibt und die RNA permeiert. Bevorzugt ist die Ultrafiltration an Hohlfaser-Membranen (Deutsche Offenlerungsschrift 33 08 932). In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist. Beispiel 1 Das hanaelsübliche makroporöse Anionen-Austauscherha,rz auf Basis Phenol-Formaldehyd mit im wesentlichen sekundären Aminogruppen DUOLITE A-7 wird zur Überführung in die freie Basenform in 2N Natronlauge aufgenommen, gerührt und mit entionisiertem Wasser neutral gewaschen. Nach Trocknen im Vakuumschrank (40 C, 50mbar, 24 Stunden) werden 100 R des wasserfreien Harzes in 200 ml wasserfreiem Dichlormethan aufgenommen. mit 10 a Hexamethylen 1.6-diisocyanat versetzt und 2 Stunden unter Feuchti- keitsausschluss bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend filtriert man ab und wäscht das Harz mit Dichlormethan gründlich nach. Das Harz wird unter Feuchtigkeitsausschluss von Dichlormethan befreit und unter Feuchtigkeitsausschluss bis zum Einsatz aufbewahrt. Beispiel 2 5 g 5'-Phosphodiesterase (Nuclease Rp der Fa. Amano) werden in 200 ml 0,1 N wässrigem Acetatpuffer (pH 5,5) -gelöst Zur Lösung gibt man unter Rühren 100 g des nach Beispiel 1 behandelten Harzes und rührt weitere 2 Stun den bei Raumtemperatur. Das Produkt wird abfiltriert und zunächst mit 0,1 N Acetat-Puffer,(pH 5,5), hierauf mit gesättigter Kochsalzlösung und erneut mit dem Acetatpuf fer gewaschen. Das abfiltrierte Produkt wird in eine Säule gefüllt. Zur Messung der Aktivität wird bei 55"C durch das immobi lisierte Enzym eine Substratlösung, bestehend aus 4 % RNA und 0,1 mm Zinksulfat (pH 5,0), mit einer Durchflussge schwindigkeit (SV) von 20 bis 30 h-1 gepumpt. Die Menge der entstehenden Mononucleotide wird photometrisch oder durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermittelt. Beispiel 3 200 g DNA werden in 10 1 Wasser aufgenommen und durch Einstellen des pH-Werts auf 5,0 in Lösung gebracht. Die Lösung wird mit 500 mg Zinksulfat-Heptahydrat versetzt und bei 55"C über eine Säule, gefüllt mit 500 ml einer nach Beispiel 2 immobilisierten 5'-Phosphodiesterase, gegeben. Die Durchflussgeschwindigkeit wird so einge stellt, dass gerade ein 100 zeiger Abbau der DNA zu den 5'-Desoxynucleotiden erfolgt (5 1/Std.). Die Isolierung und Trennung der 4 verschiedenen 5'-Des oxynucleotide kann in bekannter Weise durch Ionenaus tauschchromatographie oder Adsorption erfolgen. Als Ausgangsmaterial eignet sich eine DNA nach Beispiel 2 der EP A2-75262 oder nach Beispiel 1 oder 2 der Deutschen Offenlezungsschrift 35 08 972.

Claims: PATENTANSPRÜCHE: 1. 5'-Phosphodiesterase, immobilisiert an ein makroporö-' ses Niionaustauscherharz auf Basis Phenol-Formaldehyd mit im wesentlichen sekundären Aminogruppen, wobei Enzym und Träger mittels eines Diisocyanats verknüpft sind. 2. 5'-Phosphodiesterase nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, dass das Trägerharz einen Porendurchmesser von 10 bis 200 Nanometer und einen Teilchendurchmesser von 250 bis 84Almaufseist. 3. 5'-Phosphodiesterase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Diisocyanat ein Alkylendiiso cyanat mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylen kette ist. 4. Verfahren zur Herstellung der 5'-Phosphodiesterase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerharz in der freien Basenform mit dem Diisocyanat umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt in wässrigem Medium mit einer Lösung des Enzyms umgesetzt wird. 5. Verwendung der 5'-Phosphodiesterase nach Anspruch 1 bis 3 zur Hydrolyse von Nucleinsäuren. 6. Verwendung der 5'-Phosphodiesterase nach Anspruch 1 bis 3 zur Hydrolyse von DNA. PATENTANSPRÜCHE für Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten 5' Phosphodiesterase, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym mittels eines Diisocyanats an ein makroporöses Anionaustauscherharz auf Basis Phenol-Formaldehyd mit im wesentlichen sekundären Aminogruppen bindet. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerharz einen Porendurchmesser von 10 bis 200 Nanometer und einen Teilchendurchmesser von 250 bis 840 iim aufweist. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass das Diisocyanat ein Alkylendiisocyanat mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen In der Alkylenkette ist. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerharz in der freien Basenform mit dem Diisocyanat umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt in wässrigem medium mit einer Lösung des Enzyms umgesetzt wird. 5. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 4 erhältlichen 5' Phosphodiesterase zur Hydrolyse von Nucleinsäuren. 6. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 4 erhältlichen 5'-Phosphodiesterase zur Hydrolyse von DNA.

Inventors: KELLER, REINHOLD, DR., SCHLINGMANN, MERTEN, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C12N11
IPC codes: C12P19, C12N11