WATER SOLUBLE FORMS OF POLYENE ANTIBIOTICS, AND PROCESS FOR PREPARING THEM

Abstract: The polyene antibiotics are in the form of their inclusion complexes formed with gamma -cyclodextrin. The water-soluble derivatives of the polyene antibiotics are prepared by reacting the polyene antibiotics which are insoluble or have limited solubility in water with gamma -cyclodextrin while stirring in the presence of water.

Description: Wasserlösliche Formen von Poylenantibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung Die Erfindung betrifft neue, wasserlösliche und stabile Formen von Polyenentibiotika und ein Verfahren zu ihrer Her- stellung. Dadurch, daB die bakteriellen Infektionen mittels der antibiotika erfolgreich zurückgedrängt werden konnten, stieg die Zahl der pilzlichen Infektionen, und damit stellte sich die Frage nach Präparaten zur wirksamen Bekämpfung fungaler Infektionen. Zum Teil als Folge der verbreiteten Antibiotikumbehandlungen, zum EMI1.1 ännahme oraler Empfängnisverhü tungsmittel verbreiten sich die pilzlichen Infektionen immer stärker. Sie sind vor allem in tropischen und subtropischen Ländern ein Problem der Volksgesunheit, Eine wirksame Bekämpfung der pilzlichen Infektionen wird durch den Umstand erschwert, dass es wesentlich weniger antdiunesl wirksame Stoffe gibt als antibakterielle Stoffe. Die Polyenantibiotika werden wegen ihrer starken antifuslen Wirkung verbreitet gegen systenische und nicht systemische Mykosen eingesetzt. Bis heute sind in der Literatur etwa hundert Polyenantibiotiks beschrieben worden1 praktische Bedeutung haben jedoch nur eine. Für die Struktur der Poylenantibiotike ist charakteristioch, dass ein Teil des Moleküls verhältnismässig hydrophil ist und zahlreiche Hydroxylgruppen enthalt, wahrend die andere Hälfte des Moleküle aus mehrfach ungesättigten hydrophoben Chromophorgruppen besteht. Bezeichnend für Polyanantibiotika ist ihre Empfidlichkeit gegen Wärme, UV-Licht, extreme pH-Werte und insbesondere Sauerstoff. Jede Veranderung der Polyenchromophore ist mit dem Verlust der wirkung verbunden. Mit dem Anstieg der unzahl der Doppelbindungen wird der hydrophobe Charskter stärker, die Löslichkeit sinkt. Die für die Praxis bedeutsamen Poylenantibiotika sie in Wasser praktisch unlöslich. Bei oraler Verabreichung werden sie kaum oder überhaupt nicht resorbiert, deswegen ist ihre Toxizität per cs vernachlässigbar gering. Bei paranteraler, insbesondere intravenöser applikation liegt jedoch ihr LD5O-We-t bei nur wenigen mg/kg Körpergewicht (S.M. Hammond: Biologiacal Activity of Polyene Antibiotica, Progress in Medicinal Chemistry, Vol. 14, North-Holland Bublishtng Company, 1977, S. 105). Polyenantibiotika werden auch zum Fernhalten der Pilze von Gewebekulturen, ferner in der Lebensmittelindustrie und der Landwirtschaft gegen pilzlichs Schäddlinge eingesetzt. Die Anwendung in diesen Richtungen ist jedoch durch die hochgradige Wasserlöslichkeit der Polyenantibiotika beziehungsweise die Instabilität er aus ihnen bereiteten wassrigen dis persen Systeme begrenzt. Die Polyenantibiotika sollten in erster Linie zusammen mit verbreitet angewendeten Pungiziden eingesetzt werden, gegen welche schon in bedeutendem Masse Resistenz entstanden ist. Deshalb muss die für Polyenantibiotika brauchbare Formulierung nicht nur die Wasserlöslichkeit erhöhen und die Stabilität in wässriger Lösung verbessern, sondern auch die Kompatibilität der Polyenantibiotika mit anderen Wirkstoffen gewährleisten. Die Polyensntibiotika sind in polaren Lösungsmitteln (z.B. Dimethylsulfoxyd, Dimehylformamid, Äthanol usw.) löslich. erden diese Lösungen mit Wasser verdünnt, so fällt das Antibiotikum nicht aus, aber es entstehen auch keine echten Lösungen, sondern ein aus nicht dialysierbaren Micellen bestehendes instabiles System (J. Kirschbaum: J. Pharm. Sci. 63, 1974, 1981). In derartigen Micellendispersionen treten die hydrophoben Teile der Moleküle miteinander in Kontakt, was für die Polyenchromophore einen gewissen Schutz bedeutet. Wird die Wasserlöslichkeit erhöht, so sinkt im allgemeinen die chemische Stabilität des Moleküls. Werden zum Peispiel Mnphotericin B und sein Methylester unter identischen Bedingungen trocken gelagert, so ist ihre Stabilität gleich. In wässrigem Medium ist der Methylester des Amphotericins jedoch wesentlich labiler als das Grundmolekül, denn er wird im Wasser besser dispergiert, dadurch ist die Polyenchromophorgruppe weniger geschützt (Bonner: J. Antibiot., 28, 1975, 132). Mit Natriumdesoxycholat oder Natriumlaurylsulfat (Detergentien) beziehungsweise mit Natriumborat wurden Wasser lösliche Komplexe der Polyenantibiotika erhalten; diese ergeben aber in jedem Falle nur kolloidale Dispersionen. Auch durch die Herstellung von Copräzipitaten konnte die Löslichkeit etwas verbessert werden wird zum Beispiel Nistatin zu sammen mit Polyvinylpyrrolidon ausgefällt, eo ist seine Löslichkeit 8-10 mal so gross, die Stabilität sinkt jedoch stark ab (M.B. Dexter: J. Pharm. Pharmacol. 27, 1975, S. 58). Wegen der Wasserunlöslichkeit und der Instabilität in wässrig-dispersen Systemen war bisher an knwendungsarten, bei denen stabile wässrige Lösungen erforderlich sind, nicht zu denken (Injektionslösungen, lokal anwendbare Lösungen wie Augentropfen, Ohrentropfen, oder im Pflanzenschutz versprühbare Lösungen). Bisher sind wässrige Lösungen von Polyenantibiotika noch nicht hergestellt worden, nur wässrige Suspensionen, wie zum Beispiel 10-30 000 E/ml fein pulverisiertes Nistatin enthaltende Augentropfen (Mertindale: The Extra Pharmacopoeia, The Pharmaceutical Press, London, 1977, S. 649). Aus der Literatur ist bekannt, dass bisher jede Erhöhung der Wasserlöslichkeit der Polyenantibiotiks mit einem Verlust an chemischer Stabilität bezahlt wurde. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Löslichkeit der POlyenantibiotika bedeutend (auf das 60-80fache) ansteigt, gleichzeitig ihre chemische und biologische Stabilität jedoch erhalten bleibt, wenn man aus ihnen mit t-Cyclodextrin (im folgenden r-CD) Komplexe bildet. In der Literatur ist besshrieben, dass die Löslichkeit unterschiedlicher Stoffe mit o- und B-Cyclodextrin gesteigert werden kann (J. Szejtlir Cyclodextrins and their inolusion complexes, Akadémia Kiadó, Budapest, 1982), über &gamma;-Cyclo- dextrin sind jedoch nur wenig Angaben zu finden. Eigene Versuche ergaben, dass weder die Löslichkeit noch die Stabilität der Polyenantibiotika mit o- und ss-CD bedeutend erhöht werden können. Von den zahlreichen Poxyen- antibiotika wurden das Flavofungin, das Nistatin und ds3 Amphotericin 3 ausführlicher untersucht. Das Flavofungin wird von Streptomyces flavofungini produziert. Es ist eine lebhaft gelbe, kristalline Substanz, die bie 210 C schmilzt und aus einem 10:1 Gemisch von zwei Komponenten besteht, deren Summenformel C36H58010 beziehungsweise C37H60O10lautet. Flavofungin verfügt über ein sehr breites antifungales Spektrum. Seine biologische und toxikologische Untersuchung wird dadurch erschwert, dass es in Wasser praktisch unlöslich ist und sich beim Stehen an der Luft zersetzt, seine biologische Wirkung veriiert. Steht Flavofungin zur Beispiel bei Raumtemperatur an der Luft, so verliert es innerhalb von zwei Wochen 50 % seiner Aktivität, Unter Stickstofi- oder CO2-Atmospäre ist es unzersetzt lagerbar. Zu einer praktischen Anwendung kam es deshalb bisher nicht (Uri etal., österreichnische Patentanschrift Nr. 215 076). In eigenen Versuchen zur Erhöhung i der Löslichkeit und der Stabilität des Plavofungins wurde mit drei versohiedenen Methoden versucht, seinen ss-CD-Komplex herzustellen. Zuarst wurden 121 mg Flavofungin in 1,5 ml Chloroform gelöst, und die Lösung wurde mit Methanol auf 10 ml aufgefüllt. Dann wurden 1,8 g B-Cyclodextrin (Verlust beim Trocknen 13 %) bei 60 OC in 28 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Stickstoff bei ständigen Rühren tropfenweise die vorher bereitete Flavofunginlösung gegeben. Die Lösung wurde zuerst trübe, klärte sich aber nach etwa 5 Minuten völlig. Die Lösung wurde noch eine halbe Stunde lang gerührt, dann langsam abgekühlt, gefroren und lyophilisiert. In dem Produkt lagen ss-CD und Plavofwigin im Molverhältnis 1:0,53 vor. Im zweiten Versuch wurde ein Produkt mit dem Xolverhältnis 1:0,4 auf die gleiche Weise, aber bei 40 OC hergestellt. Im dritten Versuch wurde das Produkt nicht Iyophilisiert, sondern durch l2stündiges Stehen bei O OC kristallisiert. In diesem Produkt waren 7,9 ffi Plavofungin enthalten. Die an den Lösungen der Produkte aufgenommen UV-Absorptionskurven stimmen mit der des reinen Plavo- fungita überein, Nach einem Monat Lagerung bei Raumtempe rasur und unter Lichtabschluss war eine bedeutende Veränderung des Spektrums zu verzeichnen0 Die Sxtinktion bei 360 nm war abgesunken, die bei 260 nm hingegen angestiegen. Reines Flavofugin beziehungsweise die auf die beschriebene Weise hergestellten ss-CD-Komplexe wurden bei 32 C unter reinem Sauerstoff 250 Stunden lang gelagert. Die Sauerstoffaufnahme des komplex gebundenen Wirkstoffes betrug etwa 30 ffi der Sauerstoffaufnahme des reinen Wirkstoffes0 Das B-CD kann demnach das Flavofungin nur teilweise vor der Oxydation schützen. Auch unter diesen Bedingungen war der Einfluss des Sauerstoffes daran zu sehen, dass das Absorptions- maximum bei 360 nm völlig verschwand und sich das Bild des ganzen Spektrums andere. Der Flavofugin-ss-Cyclodextrin-Komplex erwies sich in mlkrobiologischen Versuchen gegenüber Pilzen als völlig wirkungslos. Es kann demnach festgestellt werden, dass zwischen ss-Cyclodextrin und Flavofungin zwar eine Wechselwirkung eintritt - anders könnte das wasserunlösliche Falvofugin zusummen mit ss-Cyclodextrin keine völlig klare Lösung ergeben der empfindlichste Teil des Moleküls wahrscheinlich aber nicht vom B-Cyclodextrin eingeschlossen wird und sich deshalb ein stabiler, biologisch jedoch aktiver Komplex aus Flavofungin und ss-Cyclodextrin nicht herstellen lässt. Unter dem Aspekt der praktischen Anwendbarkeit konnte zwischen den Polyenantibiotika und &gamma;-Cyclodextrin eine wesentlich vorteilhaftere wechselwirkung beobachtet werden. Der erste Beweis für die Wechselwirkung zwischen Plavo- fungin und &gamma;-Cyclodextrin ist der besträchtliche Anstieg der Löslichkeit des Flavofugins in wässrigen &gamma;-Cyclodextrin- lösungen. Zur Üntersuchung der Löslichkeit wurden wässrige &gamma;-CD-Lösungen unterschiedlicher Konzentration hergestellt: die Lösungen enthielten 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7,5 beziehungsweise 10 % t-CD, Zu Je 1 ml der Lösungen wurden 5 mg festes Flavofungin gegeben. Die Lösungen wurden bei 25 C 3 Stunden lang intensiv geschüttelt. Die Lösungen wurden klarfiltriert, dann wurde spektrophotometrisch die Menge des in Lösung gegangenen Flavofungins ermittelt. Die Messungen zeigten, dass sich das Flavofungin am besten in 4 % &gamma;-CD enthaltenden wässrigen Lösungen löst; unter den Bedingungen der Untersuohung können Konzentrationen von etwa 4 mg/ml erzielt werden. Da die Löslichkeit des Plavofungins in Wasser bei 0,05 mg/ml liegt, entspricht das einem Anstieg der Löslichkeit auf etwa das Achtzigfache. Rine weitere erhöhung der &gamma;-CD-Konzetration steigert die Löslichkeit des Flavofungins nicht weiter. Die Ergebnisse der Löslich keitsuntersuchungen sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Löslichkeit des Flavofungins als Funktion der &gamma;-CD-Konzentra- tion (25 C, 3 Stunden Schütteln) &gamma;-CD-Konz., % Flavofungin-Konz., mg/ml 0 0,05 1 1,0 2 1,8 3 3. 4 4,0-4,2 5 3,8 7,5 3,7 10 3,8 Die aus dem anfänglich linearen Abschnitt der bei 25 C aufgenommen Löslichkeitisisotherme berechnete scheinbare Stabilitätskonstante des Komplexes beträgt etwa 3230. Die maximale Löslichkeit in 4 %iger &gamma;-CD-Lösung wurde auch bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Flavofunginkonzentration betrug bei 10 OC 3,3 mg/ml, bei 30 C 4,1 mg/ml und bei 40 OC 3,8 mg/ml. Das Nistatin wird durch Fermentation von Streptomyces noursei, S. albulus oder S. sureus hergestellt. Es ist das in der grössten Menge erzeugte Polyenmakrolid- antibiotikum. Das im Handel erhältliche Nistatin ist keine einheitliche Substenz, sondern ein Gemisch chemisch nahe verwandter, mit A1, A2 und A3 bezeichneter Komponenten (Sharin at al., Antibiotiki 13, 987 [968]). Eben deshalb sind Isolierung und befriedigende analytische Kennzeichnung der Substanz schwierig; abhängend von Ursprung, Reinheeit und Einheitlichkeit erhält man eine breite Skala physikalischer und chemischer Eigenschaften. Nistatin ist bei Raumtemperatur in Wasser und unpolaren Lösungsmitteln praktisch unlöslich, löst sich jedoch gut in Formamid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Pyridin, Äthy lenglycol und Propylenglyool. Die Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln steigt in Gegenwart von 10-20 % Wasser bedeutend an. Zum Beispiel lösen sich in 75 %-igen wässrigen Äthanol 4 mg/ml (in reines Äthanol 0,55 mg/ml), in 70%igen wässrigem Isopropanol 2,2 mg/ml (in reinem Isopropanol 0,62 mg/ml) (Trakhtonberg et al.: Antibiotiki 5., 9 i1960J; Analytical profiles oi drug substances Vol. 6. Academic Press, New York and London 1977, p. 344). Die maximale Löslichkeit in Metha- nol beträgt 9,2-11,2 mg/ml (Weise et al., Äntibiot. Chemotherapy 7, 374 [1957]). Nistatin wird meistens topisch gegen Monilia-Infektionen der Haut, der Nägel und der Schleimhäute eingesetzt. Zur Heilung der Candidiase des Magen-Darm- -Traktes wird es auch per os appliziert. Gegen systemische Mykosen ist es jedoch wirkungslos, da das per os verabreichte Nistatin nicht resorbiert xird (sein Blutspiegel ist überhaupt nicht messbar). Ähnlich wie im Falle des Plavorungins wurde auch für Nistatin die Löslichkeit in (r &gamma;-CD-Lösungen unterschiedlicher Konzentration ermittelt. Die verwendeten wässrigen &gamma; -CD-Lösungen hatten Konzentrationen von 0, 1, 2,5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 15 %. Pro ml wurden 20 mg Nistalin zugesetzt. Die Lösungen wurden bei 37 C 10 Minuten lang geschüttelt, dann wurde ihr Nistratingehelt spektophotomerisch bestimmt. Ahnlich wie bei Flavofungin wurde gefunden, dass die Löslichkeit des Nistatins in wässrigen &gamma;-CD-Lösungen ansteigt und in 5 %iger -CD-Lösung etwa das 25fache, in 10 einer &gamma; CD-Lösung etwa des 40fache der ursprünglichen Wasserlöslichkeit beträgt. Die Messergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Löslichkeit des Nistatins (biologische Aktivität 5033 E/mg) als Funktion der &gamma;-CD-Konzentration (37 C, 10 min shuttln) #-CD-Konzentration, % Nistrationkonzentration mg/ml 0 0,20 1 1,30 2,5 2,36 4 3,95 5 4,70 6 5,50 7 6,30 8 7,20 9 8,10. 10 8,95 15 8,20 Die aus dem anfänglich linearen Abschnitt der bei 37 C aufgenommenen Löslichkeitisotherme berechnete scheinbare Stabilitätskonstante des Komplexes beträgt etwa 500. Amphotericin B ist ein von Streptomyces nodosus produiertes Polyenantibiothikum. Sein Wikungsspektrum ist breit, ausser auf Hefen und Pilze wirkt es noch gegen Zahlreiche Protozoen. Es wird am verbreitetsten zur Behand luag akuter systemischer Pilzinfektionen angewendet. Es kann oral und als mehrstündige intravenöse Infusion appliziert werden. für letzteren Zweck wird es in Form seines Natriumdesoxycholat-Komplexes verwendet (Markenname: Pungizone). Die intravenöse Applikation von mit den Salzen der Gallensäure gebildeten Komplexen kann jedoch Brechreiz, Anämie und Nierenschäden verursachen, weil diese Komplexe - zwar ist ihre Löslichkeit gut - viel toxischer sind als andere Dsrivate. Die Toxizität des Methylesters von Amphotericin B (i.p. an Mäusen) beträgt zum Beispiel LD50 = 1320 mg/kg, die auf die gleiche Weise gemessene Toxizität des mit Natriumdesoxycholat gebildet Komplexes liegt bei LD50 = 280 mg/kg. Die grössere Toxizität des Desoxycholat-Komplexes wird mit grosser Wahrsoheinlichkeit durch die Gegenwart des Salzes der Gallensäure verursacht (Thomas: The Analyst 101, 321 [1967]). Bei oraler Applikation sind niedrige Blutspiegel mess- bar, d.h. das Antibiotikum ist zur per os erfolgenden Behandlung systemiacher Mykosen geeignet. Die zur parenteralen Anwendung empiohlenen, Amphotericin B enthaltenden Präparate sind jedoch keine echten Lösungen, wie auch die Sonzentrati- onsabhängigkeit des UV-Spektrums zeigt. Das charakteristische UV-Spektrum des Amphotericin B, das der Heptaenschromo- phlor-Gruppe zuzuschreiben ist, ändert sich in wässriger lösung. Das Spektrum zeigt Absorptionsmaxima bei 408, 385, 366 und 347 nm, deren Peakhöhe mit sinkender Wellenlänge abnimmt; das ist cherakteristisch für das Monomer in einer Konzentra- tion von etwa 4 g/ml. Bei höheren Konze.ltrationen verschwin- den die Maxima zwischen 347-408 nm allmähnlich, während bei 325 nm ein neues Absorptionsmaximum erscheint und mit dem Anstieg der Konzentration intensiver wird. Das gleiche spektrale Verhalten kann an Pungizone beobachtet werden, welches ebenfalls ein kolloid-disperses System darstellt. Der Zusatz von Salz zu derartigen Lösungen verringert die Löslichkeit und fördert die Aggragation, weil es die elektrostatische Abstossung zwischen den Molekülen vermindert. Die wäfrige lösung von Amphotericin folgt dem Gesetz von Beer und Lambert nicht, was ebenfalls ein Kennzeichen des Vorhandenseins von Aggregaten in wässriger Lösung ist. In mehr als 50 % Alkohol enthaltenden Lösungen stimmt das Spektrum schon gut mit dem Spektrum des Monomers überein, d.h. die Aggregate zerfallen (Rinnert et al.: Biopolymers, 616, 2419-2477 [1977]). Das UV-Spektrum von Amphotericin B und t-CD enthaltenden wässrigen beziehungsweise mit Phosphatspuffer pH 7,5 bereiteten Lösungen stimmt mit dem in organischen Lösungsmitteln messbaren Spektrum überein, d.h.zeigt die für das Monomer charakteristischen Absorptionsmaxima bei 408, 385, 366 und 347 am und folgt dem gesetz von Beer und Lambert. Dieses Spektralverhalten der mit &gamma; -Cyclodextrin bereiteten Lösungen sind ein Beweis dafür, dass in ihnen das Amphotericin molekular dispers, als echte Lösung vorliegt; das konnte bisher mit keinem Komplex des Amphotericin B erreicht werden, denn diese komplexe, zum Beispiel der mit Borat beziehungsweise mit Natriumdesoxycholat gebildete Komplex, liegen in wässrigem Medium als Micellendispersionen vor. Die Löslichkeit des Amphoterioin B sinkt in physiologischen Salzlösungen in jeden Falle, was der Anwendung als Infusion Grenzen setzt. Zum Beispiel beträgt die Löslichkeit des Boratkomplexes von Amphotericin in Wasser 0,54 mg/ml, aber in isotonischer Kochsalziösung sinkt dieser Wert auf 0,02 mg/ml (Kral ar al., J. of Antibiotics 31(3) 257-259 [1978]). Demgegenüber wird die Löslichkeit des Amphotericin 3 in &gamma;-CD-haltigen Lösungen durch den Zusatz von 0,9 Gew.-% Kochsalz nicht verändert, sondern behält genau den Wert, der in der Tabelle 3 angegeben ist. Das ist ein weiterer Beweis dafür, dass das Amphotericin in den t -CD-haltigen wässrigen Lösungen in molekular disperser Yorm vorliegt. Auoh für Amphotericin B wurde die Löslichkeit als Funktion der &gamma;-CD-Konzentration ermittelt. Zu wässrigen &gamma;-CD-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (0, 2, 4, 5, 6, 8, 10 beziehungsweise 12 %) wurden 5 mg/ml Amphotericin B gegeben, und die bei 37 C thermostatisierten Lösungen wurden 2 Stunden lang intensiv geschüttelt. Die Lösungen wurden klarfiltriert, und die Menge des in Lösung gegangenen Ampho- tericin B wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Die Löslichkeit von Amphotericin B als Punktion der &gamma; -CD Konzentration &gamma;-CD-Konzentration (%) Amphotericin B Konzen tration, mg/ml 0 0,003 2 0,12 4 0,25 5 0,30 6 0,36 8 0,51 10 0,65 12 0,65 Es ist ersichtlich, dass die Löslichkeit von Ampho- tericin 3 in 5 %iger &gamma;-CD-Lösung etwa das Hundertfache, in 10 %iger &gamma;-CD-Lösung ertwa das Zweihundertfache der Löslich keit in Wasser beträgt. Die Assoziationsverhältnisse in wässrigen Lösungen von Amphotericin B können besonders vorteilhaft mit der Methode der Zirkulardikroismus-Spektroskopie untersucht werden, weil das Monomer, das Dimere und die Polymeren höheren Assoziationsgrades gut unterscheidbar. Zirkulardikroismus-Spektren geben. Diese Spektren wurden für den 0,6 % Wirkstoff enthaltenden Komplex aus Amphotericin und &gamma;-CD in wässriger Lsöung, für Amphotericin B in 50 %iger ethanolischer Lösung untersucht. Wie aus der Literatur bekannt, bildet Amphoteiricin B in 50 %igem Athanol eine echte Lösung, in der die monomeren Moleküle getrennt vorliegen (Ernst et al., Biopolymers 20, 1575 [1987]). Durch Messungen konnte bestätigt werden, dass das in Wasser aufgenommene Spektrum des Komplexes dem in 50 %igem Alkohol aufgenommenen Spektrum des Ämphotericins ähnlich ist. Im Spektrum der wässrigen Lösung des Komplexes erscheinen die für monomeres Amphotericin B oharakteristisohlen Banden und zwar eine aus vier Schwingungskomponenten zusammengesetzte positive Bunde zwischen 420 und 340 nm und eine aus drei Komponenten bestehende negative Sande zwischen 290 und 240 zwl. Zwischen 330 und 300 am gibt das Monomer kein Spektrum. Auf die erwähnte Weise konnte festgestellt werden, dass in der wässrigen Lösung des aus Amphotericin B und &gamma;-CD bestehenden Komplexes bei ausreichend grossen Konzentrationen an &gamma;-CD das Amphotericin 3 ebenso in monomerer Form stabilisiert wird wie in 50 %iger hthanolisoher Lösung. In ver dünneren Lösungen dissoziiert der Komplex, doch das freigesetzte Amphotericin wird nur dimerisiert, denn das gegenwärtige t -CD verhindert die Ausbildung Polymere mit höherem Assoziationsgrad. Zum Gegenstand der Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen, uasserlöslichen und stabilen Polyen antibiotikum-Derivate. Diese werden erfindungsgemäss hergestellt, indem man in Wasser beschränkt lösliche beziehungsweise praktisoh unlösliche Polyenantibiotika in Gegenwart von Wasser unter Rühren mit &gamma;-CD umsetzt. Auf 1 mMol Antibiotikum rechnet man 1-40 mMol r-CD und 1-500 ml Wasser. Des Verfahren kann auf zweierlei Weise ausgeführt werden. a) Des Polgenantibiotikum wird auf 1 mMol Antibiotikum bezogen in 20-500 ml Wasser mit 1-40 mMol t-CD unter Rühren bei 25-55 0 umgesetzt, und der erhaltene Antibiotikum &gamma;-Komplex wird gewunschtenfalls isoliert, oder b) das Polwenantibiotikum wird auf 1 mMol Antibiotikum bezogen in -50 ml eines 20-80 vol. %igen, wassermischbaren Lösungsmittels, vorzugsweise Äthanol, unter Rühren beziehungsweise Kneten mit 1-40 mMol &gamma;-CD umgesetzt, und der erhaltene Antibiotikum-&gamma;-CD-Komplex wird durch Lyophilisieren, Zerstäubungstrocknung, Vskuumeindampfen oder Vakuumtrocknung bei niedriger Temperatur isoliert. Die erfindungsgemässen Antibiotikum-&gamma;-CD-Komplexe können zur Herstellung stabiler injizierbarer und lokal an wendbarer Arzneimittelpräparate beziehungsweise zur Herstel lung von Pflanzenschutzmittelkombinationen verwendet werden. Zum Gegenstand der Erfindung gehören ferner Arzneimittelpräparate mit antifungaler Wirkung, vorzugsweise Puder, Augen- und Ohrentropfen, Salben, Tabletten, Scheidenzäpfchen, Injektionslösungen, zum Schutz von Gewebekulturen vor Pilzbefall geeignete Zusatzatofie, die als Wirkstoff Komplexe aus Polyenantibiotika und t-CD sowie die für pharmazeutische Produkte üblichen Streck- und Hilfsstoffe enthalten. Zum Gegenstand der Erfindung gehören auch fungizid wirksame Pflanzenschutzmittel, vorzugsweise Saatgutbeizmittel und Sprühmittel, die als Wirkstoff Polyenantibiotikum-&gamma;-CD-Kom- plexe und die bei der Herstellung von Pflanzenschutzmitteln üblichen Streok-, Träger- und/oder Hilfsstofe enthalten. Aus den erfindungsgemässen Polyenantibiotikum-&gamma; -CD Komplexen können homogen. Lösungen bereitet werden. So kann zum Beispiel das aus der Literatur bekannte Augentropfenpräparat, welches 10-30 000 R/ml Nistatin in Form einer wäss- rigen Suspension enthält, durch Auflösen von 30-70 mg/ml Nistatin-&gamma;-CD-Komplex als homogene Lösung hergestellt werden. Die erhöhte Wasserlöslichkeit ist bei lokal applizierbaren Mitteln wahrscheinlich nit einer erhöhten Wirksamkeit verbunden. Hinsichtlich der Komplexbildung verhalten sich alle Polyenantibiotika gleich. Ausser den beschriebenen Antibio tika können demnach auch zum Beispiel Candidicin, Pimaricin, Cacdidin, Hamycin, Candihexin usw. verwendet werden. Deshalb ist die Erfindung nicht aui die beschriebenen Antibiotika beschränkt. Die Einzelheiten der erfindung werden im folgenden an Uand einiger die Herstellung der antibiotikum-&gamma;-CD-Kom- plexe sowie die Anwendung und Formulierung der Komplexe be treffender Beispiele näher erläutert. Beispie) 1 Herstellung des Flavofugin-&gamma;-Cyclodextrin-Komplexes in homogener Phase 22 g &gamma; &gamma;-Cyclodextrin (Wassergehalt 1,5 %) werden bei 30 0 in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und zu der Lösung 2,5 g festes Plavofungin gegeben. Die Lösung wird 3 Stunden lang intensiv gerührt, dann filtriert und das erhaltende, intensiv gelbe Filtrat lyophilisiert. Man erhält 21 g Produkt, dessen spektrophotometrisoh gemessener Flavofungingehalt 9,3 % beträgt. Das entspricht etwa 80 % der eingesetzten Flavofunginmenge. Der Komplex ist ein lockeres, gelbes Pulver. 100 mg Komplex lösen sich in 2,5 ml destilliertem Wasser bei 50 C innerhalb von Augenblicken zu einer kleren Lösung. Diese Lösung enthält 3,6 mg/ml Plavofungin und erleidet, 6 Tage lang bei Raumtemperatur und gestreutem Licht gelagert, keinerlei auf chemiches oder physikalischem Wege nachweisbare Veränderungen. Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die maximale Löslichkeit bei &gamma;-CD-Gehalten von etwa 4 % auftritt (Plavo funginkonzentration 4 mg/ml), deshalb wird durch Lyophili- zieren dieser Lösung der Komplex mit der vorteilhaftesten Zussamensetzung (9-10 % Wirkstoff) erhalten. Thermogravimetrische Xessungen, Untersuchungen mit dem Differentiel-scanning-Kalotimeter (DSC) und die Thermal Evolution Analyse (TEA) zeigen zwischen Flavofungin, Plavo fungin-&gamma;-CD-Komplex und Gemischen auf Flavofungin und &gamma;-CD einen charakteristischen Unterschied. Das Flavofungin verliert bis 100 C 7 % seiner Kasse (auf Grund der TEA-Kurve treten organische Stoffe aus), beginnt oberhalb von 100 C sich zu zersetzen undbüsst bis 300 C 24 % seiner Masse ein. Die lyophilisierte Probe aus Flavofungin und &gamma;-CD erweist sich einesteile dadurch als Koplex, dass bis 100 C keine organischen Stoffe entweichen, zum anderen, dass in der DSC Kurve zwischen 100 und 200 C die für die Oxydation des Flavofungins charakteristische exotherme Veränderung nicht eintritt, dafür aber bei 263 0 ein für exotherme Prozesse charakteristisches Peak erscheint, das die Oxydation des aus dem Komplex freigesetzten Flavofungins snzeigt. Zur Untersuchung der Wärmestabilität des Flavofungin &gamma; -CD-Komplexes wurden die Substanzen in 1 mm Schichtdicke auf Uhrgläsern susgebreitet und weder vor Lioht noch vor Luft geschützt bei Raumtemperatur beziehungsweise bei 60 oC im Trockenschrank gelagert. Die zu unterschiedlichen Zeitpunkten genommenen Proben wurden spektrophotometrisch analysiert. Auf Grund chemischer messungen wurde gefunden, dass das nicht in einen Komplex eingeschlossene Flavofungin be reits nach 24 Stunden bei 60 C starke Zersetzung erlitt (das wurde auch durch Aufnahme des vollständigen Uv-Spektrums bestätigt). Der Wirkstoffgehelt des Flavofungin-&gamma;-CD-Kom- plexes blieb Jedoch auch nach 50 Tagen zu etwa 75 % erhalten. Ein 10 % Falvofungin enthaltendes, mit Glucose bereitetes physikalisches Gemisch verlor bei 14 tätiger Lagerung bei Raumtemperatur 50 % seines Wirkstoffgehaltes. Der Wirkstoffgehalt des Komplexes war jedoch auch nach 50 Tagen noch zu mehr als 95 % erhalten. Die in einem versohlossenen Gefäss bei +4 0 7 Monate lang gelagerte Probe zeigte keinen Verlust an Wirkstoff. Die Messergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4 Wärmestabilität bei Raumtemperatur und bei 60 C, ausgedrückt in Prozent des ursprünglichen Wirkstoffgehaltes Zeit bei 60 C bei Raumtemperatur (Tage) Flavofungin Flavofungin- Gemisch aus Flavofungin &gamma;-CD-Kompl. Flavofungin &gamma;-Cd-Kompl. und Glucose verbliebener Wirkstoff, % 0 100 100 100 100 1 43,8 2 23 100 90 100 5 99,5 81 99,5 7 99 99 10 98 65 96 15 94 49 94,8 20 85,4 95,0 29 70,5 95,0 35 79,2 94,9 44 78,7 94,8 50 75,0 94,5 Auch die mikrobiologische Wertmessung bestättigte, dass das Flavofungin inForm des &gamma;-CD-Komplexes viel stabiler ist. Flavofungin-&gamma;-CD-Komplex wurde bei Raumtemperatur und bei 60 C gelagert, und danch war die antifungale Wirkung genau so gross wie ursprünglich. (MIC-Wert der unter Stickstoff im Tiefkühlfach gelagertn Flavofunginprobe MIC = 25 g/ml, untersucht an den Testmikroorganismen S. cerevisiae, C. albicans, C. orusei und C. pseudotropicals). Beispiel 2 Herstellung des Flavofungin-&gamma;-CD-Komplexe in heterogener Phase 9 g &gamma;-Cyclodextrin (Wassergehalt 1,5 %) werden in der Reibschale mit 1 g Flavofungin homogenisiert, Des Gemisch wird 1n 5 ml 50 %igem Athanol suspendiert. Die Suspension wird nach einigen Minuten Rühren plötzlich fest. Die pastenartige Substanz wird zu einer dünnen Schicht breitgestriohen und im Vakkumexsikkator einige Stunden lang getrocknet. Dann wird der feste Komplex pulverisiert. 10 g Produkt mit 10 Gew.-% Wirkstoff liegen vor. Auch mit diesem Produkt wird die im Beispiel 1 beschriebene Untersuchung der lärmestabilität vorgenommen. Dabei wurde gefunden, dass der Komplex, ähnlich wie der lyophilisiert. Komplex, eine erhöht Wärmestabilität zeigt und seine antifungale Wirkung nicht geringer wird. Auf den Röntgendiffraktionsaufnahmen des pulverisierten Komplexes erscheinen die charakteristischen Reflexionspeaks bei einem signifikant abweichenden 2 .0 Winkelwert, an anderer Stelle als im Palle eines physikalischen Gemisohes ähnlicher Zusammensetzung. Das läSt auf ein anderes Kristallgitter soblies- sen und stützt damit die Tatsache der Komplexbildung. Die Röntgendiffraktionsaufnahme des lyophilisierten Flavofungin-&gamma;-CD- Komplexes weist auf eine amorphe Struktur hin. Beispiel 3 Herstellung des Bistatin- &gamma;-CD-Komplexes in honogener Phase 10 g &gamma;-CD (Wassergehalt 1,5 %) werden bei 50 OC in 90 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu der Lösung werden 2 g Nistatin (biologische Aktivität 5033 B/mg) gegeben. Die Lösung wird 15 Minuten lang intensiv gerührt. Nach dem Filtrieren wird die, gelbe Lösung lyophilisiert. Man erhält 10 g Produkt, dessen spektrophotometrisoh bestimm- ter Nistatingehalt 8 % beträgt. Biologische Aktivität: 399 E/mg (die 2. internationale Einheit des Nistatin ist 4855 IU/mg, wobei IU der Aktivität von 0,0002059 mg entspricht; Thomas-Dixon: J. Biol.-Stand, 10 (4), 369-377 [1982]). Der Nistatin- t-CD-Komplex ist ein hellgelbes lookeres Pulver, das sich in Wasser bei Raumtemperstur schnell zu einer klaren Lösung löst. In der Lösung ist eine Konzentration von 8-9 mg/ml Nistatin messbar, was etwa 100 mg Komplex/ml Lösung entspricht. Die biologische Wertbestimmung des Komplexes ergab, dass die biologische Aktivität des Ausgangsnistatin erhalten geblieben war. Thermogravimetrische Messungen, Uuntersuchungen mit dem Differential-scanning-Kalorimeter (DSC) und die Thermal Evolution Analyse (TEA) zeigen zwischen Nistatin, Nistatin &gamma;-CDKoplex und Nistatin-&gamma;-CD-Gemisch einen charakteristischen Unterschied. Nistatin enthält 3 % Wasser, welches bis 100 C abgegeben wird (TG-Kurve). Die Zersetzung der Substanz beginnt bei 150 C mit einem stark exothermen Prozess (in der DSC-Kurve Peak bei 165 C +), daran schliesst sich langsame Zersetzung an, und die 350 C ist ein Masserverlust von 54 % messbar. Obwohl die Zersetzung des NIstatins und des &gamma;-CD hinsichtlich der Temperatur zusammenfallen, sind doch in den thermoanalytischen Kurven des Komplexes beziehungsweise des Gemisches einige Abweichungen zu finden, die im Lyophi- lisat das Vorliegen eines Komplexes wahrscheinlich machen. In der TEA-Kurve fehlt der scharfe Peak bei 160 C, der auf Betweichen organischer Substanz hinweist. In der DSC Kurve erscheint der für die Zersetzung des Nistatin charakte riajische exotherme Peak bei 165 OC nioht, exotherme Prozesse +) EMI19.1 8 % Gewichtsverlust (TG-Kurve) des Komplexes setzen erst oberhalb von 200 OC ein. In der TG-Kurve manifestiert sich der Unterschied darin, dass sich die lyophilisierte Probe oberhalb von 250 C schneller zersetzt als das physikalische Gemisch. Die Komplexbildung des Nistatin mit &gamma;-CD wird auch durch 13C-NMR-Untersuchun- gen gestützt. Die Stabilität der aus der lyophilisierten Probe des Nistatin-&gamma;CD-Komplexes bereiteten Lösungen wurde folgendermassen untersucht: aus dem 8 % Wirkstoff enthaltenden Komplex wurde eine wässrige Lösung der Konzentration 5 mg/ml bereitet. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur, nicht vor Licht geschützt gelagert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde der Wirkstoffgehalt der Lösungen spektrophotmetrisch kon trolliert. Tabelle 5 Zeit (Tage) Nistatin-Konzentration (mg/ml) 0 5,0 1 4,8 2 4,75 5 4,70 6 4,6 7 4,55 8 4,5 10 4,5 12 4,5 21 4,1 Die Lösungen begannen am zweiten Tag zu opelisieren. Die Probenahme erfolgte nach dem Aufschütteln der Lösung. Die Probe wurde mit der 400-00fachen Menge AtAyl- alkohols verdünnt und dann photometriert. Die Berechnung erfolgte aus den bei # ax = 3C4+1 erscheinenden Extinttions- werten. Aus der Tabelle 5 ist ersichtlich, dess auch nach 3 Wocnen Lagerung der wassrigen Lösung noch über 80 % des Wirkstoffgehaltes vorhanden sind. Darüber, inwieweit die biologische Aktivität mit den spektrophotometrisch gemessenen zarten in Zusammen- hang steht, sind in der Literatur widersprüchliche Angaben zu finden. Gemäss manchen Autoren verläuft der Verlust der biologischen Aktivität vier- bis achtmal so schnell, als sich aus dem Abnehmen der Extinktion folgern liesse, andere Autoren wiederum sind der Meinung, daS Aktivität und Sx- tinktion parallel absinken (Hamilton-Miller: J. Pharm. Pharmac. 25, 401 [1937]). QemaB eigenen Erfahrungen gehören zu hohen Extinktionswerten hohe Aktivitätswerte. Beispiel 4 Herstellung von Nistatin-&gamma;-Cyclodextrin-Komplex in heterogener Phase 9 g &gamma;- &gamma;-Cyclodextrin (Wassergehalt 1,5 %) und 1 g Nistatin (bilogische Aktivität 5033 L/mg) werden in einer Reibschale miteinander homogenisiert. Das erhaltene Gemisch wird in 6 ml 50 %igem Äthanol suspendiert. Nach einigen Minuten wird die Suspendion plötzlich fest. Die Substanz wird zerkleinert, ausgebreitet und zur Entfernung der Wasserund Lösungsmittelspuran im Exsikkator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Am nächsten Tag wird der feste Komplex pulveri siert. Man erhält 10 g Produkt mit einem Wirkstoffgehalt von 10 Gew.-% (biologische Aktivität: 4=0 E/mg). Der auf die beschriebene Weise hergestellte Komplex zeigte bei den thermoanalytischen TJntersuchungen im Vergleich zum Gemisch die gleichen Abweichungen nie der gemäss Beispiel 3 durch Lyophilisieren hergestellte Komplex. Die Löslichkeit von einer der Wirkstoffmenge von 10 mg/ml entsprechenden Menge Nistratin-&gamma;-CD-Komplex und von Nistatingrundmaterial wurde in 15 ml destilliertem Wasser bei 37 oO untersucht. Die Lösungen wurden mit dem Magnetrührer bei einer Drehzahl von 150 min 1 gerührt. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben genocaen, filtriert und spektrophotometrisch auf ihren Wirkstoffgehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengestellt. Tabelle 6 Zeit (min) Nistatin-&gamma;-CD-Komplex (mg/ml) 2 g,O 5 7 > 2 15 7,8 40 7,4 60 7,2 90 6,0 Das Spektrum der von wässrigen Suspension des Nistatingrundmaterials genommenen Proben war nicht aus wertbar. Das Spektrum der innerhalb der ersten 5 Minuten genommenen Probe war mit dem Spektrum des Nistatin identisch, später war fortschreitende Zersetzung zu beobachten. Zuerst deformierte sich das Maximum um 290 nm und verschwand dann ganz, und im Bereich geringerer Wellenlänge zeigten sich neue Maxima, was auf Schädigung des konjugierten Chromophorsystems schliessen lässt. Beispiel 5 Herstellung von Nistatin-&gamma;-CDKomplex in heterogener Phase durch Iyophilisieren 8 g &gamma;-CD (Wassergehalt 1,5 %) werden bei 40 oO in 80 ml Wasser gelöst und zu der Lösung 2 g Nistatin (biologi sche Aktivität: 5033 E/mg) gegeben. Die Suspension wird bei 40 C 24 Stunden lang gerührt, dann wird das Gemisch durch Laophilisieren wasserfrei gemacht. In Form eines gelben, lockeren Pulvers erhält man 10 g Produkt, dessen spektrophotometrisch gemessener Wirkstoffgehalt 20 ss beträgt. Biologische Aktivität: 950 E/mg. In dem Produkt betragt das Molverhältnis zwischen Nistatin und &gamma;-CD 1:3. Nach rönt3 ondiffsektometris chen Untersuchungen hat der Komplex eine amorphe Struktur. Die auf die gleiche Weise, aber ohne &gamma;-D behandelte Grundsubstanz behält ihren kristallinen Charakter, ihr Röntgen diffraktogramm ist völlig mit dem der Grundsubstanz identisch, ihre biologisohe Aktivität ist jedoch wesentlich schlechter. Wird auf die beschriebene Weise ein Komplex mit höherem Wirkstoifgehalt hergestellt, so zeigt das Röntgendifiraktogramm bereits die für kristallines Nistatin charakterisri- schen Peaks. Zur Untersuchung der Löslichkeit des komplexes werder 500 mg in 10 ml Wasser 5 Minuten lang ei Raumtemperatur gerührt. Im Filtrat ist spektrophotometrisch eine Nistatin- konzentration von 4,5 mg/ml nachweisbar. Beispiel 6 Herstellung des Komplexes aus Amphotericin B und &gamma;-Cd 10 g &gamma;-Cyclodextrin (Wassergehalt: 1,5 %) werden in 90 ml destillierten Wasser bei 37 0 gelöst. Zu der Lösung werden 200 mg Amphotericin B gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden lang intensiv gerührt, dann filtriert und das gelbe Filtrat lyophilisiert. tan erhält 10 g Produkt, dessen spektrophotometrisch gemessener Gehalt an Amphotericin B 0,6-0,8 Gew.-% betragt. Der Komplex ist ein gelbes, lockeres Pulver, das sich in Wasser schnell zu einer klaren Lösung löst. Die erhaltene Lösung hat eine Konzentration von 0,6-0,8 mg/ml Amphotericin B und kann mit Wasser beziehungsweise physiologischer Kochsalzlösung unbegrenzt verdünnt werden, ohne dass Festsubstanz sustiele oder die Lösza4 trXbe würde. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 6 Tage lang gelagert und dann spektrophotometrisch untersucht: ihr Wirkstoffgehalt war unverandert. Beispiel 7 Die s vorhergehenden Beispiele bewei3en, dass die Polyenantibiotika mit &gamma;-Cyclodextrin Einschlusskomplexe bilden und dadurch ihre Stabilität und Wasserlöslichkeit bedeutend steigt. Entscheidend ist jedoch, ob such die antifungale Wirkung geblieben ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde die antifungale Wirkung der auf unterschiedliche Weise hergestellten Komplexe sowohl sofort nach der Herstellung wie auch nach lagerung unter Bedingungen, unter denen der nicht durch Komplexbildung geschützte Wirkstoff bereits betracht- liche Aktivitätseinbussen erleidet, untersucht. a) Flavofugin-&gamma;-Cyclodextrin-Komplex DIe antifugale Wirkung der wässrigen Lösung dieses Komplexes wurde an 6 Spaltpilzen und 13 Padenpilzen untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengefasst. Auf Flavofungin bezogen war die minimale Herkomzentration in jedem Falle 10-25 g/ml, was der Wirksamkeit des nicht komplexgebundenen Wirkstoffes entspricht. Es ist besonders bemerkenswert, dass die Substanz auch gegen phytopathogene Fusarien wirkt, d.h. eine Anwendung gegen pilzliche Pflan- zenschädlinge begründet ist. Der komplexgebundene Wirkstoff wirkt in der gleichen Konzentration wie Flavofugin. Die Untersuchungen wurden mit der Agardiffusionsmethode vorgenommen. Der Komplex hat den Vorteil, dass zum Bereiten der Lösungen keine organischen Lösungsmittel (DMF bzw. DMSO) erforderlich sind. Diese Lösungsmittel wirken nämlich hem niend auf manche Pilze, deshalb muss bei Messungen die Lösungsmittelkonzentration durch Verdünnen mit Wasser auf einen bereits nicht mehr hemmend wirkenden Wert vermindert werden. In der Praxis ist zum Beispiel eine DMS0-Konzentra- tion von unter 1 % zulässig. Manche Polyene neigen jedoch bei derartiger Verdünnung zum Ausfallen, d.h. die Bereitung der zu den Untersuchungen erforderlichen Lösungen stösst oft auf Hindernisse. Empfohlen wird, die Substanz zu pulverisieren und die Bereitung der Lösung sowie deren Verdünnen mit Wasser immer unmittelbar vor der Messung vorzunehmen (J. Ryley, Experimetal Approaches to Antifugal Chemotherapy, in: Advances in Phase. and Chemotherapy, No. 18, Academic Press, London, 1981). Tabelle 7 Minimale Hemmkonzentrationen (MIC) von Plavofungin-&gamma;-CD- Komplex in vitro Testorganismus MIC ( g/ml) 1. Hefen und hefeartlge Pilze Cryptococc. neoform. 78/K-16 5-10 Sacchar. oerevisiae OKI 1282 10 Candida albicans CBS 562 10 Candida tropical CBS 430 25 Candida crusei 79/K 47 10-25 Candida pseud. tr. 5-10 2. Pilze Asperg. niger CBS 12648 25 Asperg. fumigatus CBS 11326 25 Penicillium digitatum CBS 31948 25 Penicilliun chrysogen. 035 19646 25-50 3. Pathogene Pilze Sporotr. Schenkii CBS 34035 25 Trichoph. rubrum CBS 30338 25 Trichoph. mentagroph CBS 50148 25 Trichoph. (Keratomyc sjelloi OOKI) 25 Epiderm. floocosum OKI, IV. 25 Microsp. gypseum CBS 10064 10-25 Microsp. persic. OKI 25 4. Pflanzenpathogen Pilze Fusarium moniliiorm DSM-IMB 11778 10-25 Pusarium oxysporum DSM-IMB 10975 10-25 Die Konzentration des Flavofungins betrug in jedem Falle 10-25/ug/ml. Die bei der Lösungsbereitung aus Flavofungin auftretenden Probleme sind bei Verwendung des Komplexes gegenstanslos. b) Nistatin-&gamma;-CD-Komplex Die biologische Wertmessung wurde mit -der Agardiffu- sionsnethode unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus vorgenommen. Die Komplexe wurden lediglich in Wasser gelöst, das Nistatin hingegen in calciumchlorid- haltigem Methanol > und diese Lösungen wurden dann mit Wasser weiter verdünnt (Ph. Hg. VI, Tomus. II, S. 827). Tabelle 8 Spektrophotometrisch gemessener Wirkstoffgehalt und biologisohe Aktivität einiger Komplexe Komplex Wirkstoffgehalt biol. Aktivität (UV-spektrophotometr.) E/mg 1 7,5 % 351 2 7,6 % 362 3 8,0 % 399 4 8,4 % 450 Die zur Komplexbildung verwendete Kistatingrundsubstanz hatte eine biologische Aktivität von 5033 E/mg. c) Komplex aus Amphotericin B und Die antifugale Wirksamkeit dieses Komplexes wurde mit der Agardiffusionsmethode und Candida albicans als Test- organismus untersucht. Bezogen auf Amphotericin B war die minimale Hemmkonzentration geringer als 5 /ml, das entspricht der Wirksamkeit des nicht komplexgebundenen Wirk stoffes. Beispiel 8 Untersuchung der Resorption von Polyenantibiotikum -Cyclodextrin-Komplexen a) Die Resorption von Nistatin aus par os verabreich- tem Nistatin-&gamma;-CD-Komplex Die Resorption des Wirkstoffes wurde an Mäusen, an einem durch intravenöse Applikation einer Suspension von Candida albicans hervorgerufenen Sepsismodell untersucht. Die Sepsis verursachte innerhalb von 2-3 Tagen 100 %ige Mortalität. Den Versuchstieren wurde per os der gemäss Beispiel 3 hergestellto, 8 % Nistatin enthaltende Komplex verabreicht. In einem Parallelversuch wurde Nistatin intravenös appliziert. Für beide Gruppen wurde die auf die unbehndelte Kontrolle bezogene Verlängerung der Überlebensdauer ermittelt. Tabelle 9 Nistatin Verlänge Nistatin Verlange- resorbiertes i.v. rung der p.o. rung der Nistatin mg/kg Überlebens- mg/kg Überlebens- i.v./p.o. Dosis dauer, % dauer, % x 100 (%) 0,19 30,2 3,12 33,2 6,09 0,39 43,5 6,25 43,5 6,24 0,78 62,7 12,5 63,0 6,24 1,56 34,6 25 38,9 6,24 Wenn man diejenigen in Form des Komplexes per os verabreichten Nistatindosen mit denjenigen i.v. applizierten Nistatindosen vergleicht, die eine etwa gleiche Verlängerung der Uberlebensdauer bewirkten (Tabella 9, letzte Spal+e),so lässt sich errechnen, dass aus dem Komplex durchschnittlich 6,2 ffi des Wirkstoffes in die 3lutbahn gelangten. Bei den höchsten Dosen (i.v. 1,55 mg/kg, , p.o. 25 mg/kg) ist das Zurück- fallen der überlebensdauer bereits auf die schwache Toxizität des Nistatins zurückzuführen. b) Die Resorption von Nistatin aus subcutan applizier tem Nistatin-&gamma;-CD-Komplex Weibliche CFY-Ratten eines durchschnittlichen Gewichtes von 180 g wurden mit Nistatin, sit Nistatin-&gamma;-CD-Komplex (Wirkstoffgehalt9 8 %) beziehungsweise mit t-CD behandelt. Dazu wurde aus den zu untersuchenden Substanzen mit einer Tween 80 enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung eine Suspension bereitet und diese subcutan appliziert. Der Zu sammenhang zwischen den Dosen und der Mortalität ist aus der Tabelle 10 ersichtlich. Während im Falle des Komplexes bei einer Dosis von 20 mg/kg 90 ffi der behandelten Tiere innerhalb von 48 Stunden verendeten, ging von den mit freiem Nistatin behandelten Tieren auch bei einer Dosis von 150 mg/kg innerhalb des Beobachtungszeitraumes von einer Woche kein einziges ein. Zur Kontrolle wurde 10 Tieren subcutan so viel &gamma;-CD appliziert, wie die zu 90 % verendete Gruppe zusammen mit dem Komplex erhielt (302 mg/kg). Innerhalb des einwöchigen Beobachtungszeitraumes verendete kein einziges Tier. Tabelle 10 Nistatin Nistatin-&gamma;-CD-Komplex Dosis Anzahl der Tiere Dosis Anzahl der Tiere mg/kg unter- verendet nach mg/kg unter- verendet nach sucht sucht 24h 48h 7d 24h 48h 7d (1 Woche 10 10 0 0 0 10 10 0 0 0 20 10 0 0 0 20 10 8 1 0 100 5 0 0 0 150 5 0 0 0 Aus der Untersuchung geht eindeutig hervor, dass aus dem Nistatin-&gamma;-Cd-Komplex bei subcutaner Applikation eine toxische Dosis resorbiert wird, während das freie Nistatin bei subcutaner Applikation überhaupt sicht oder nur in ver- nachlässiger geringem Masse resorbiert wird. Qualitativ wurde die Resorption auch durch Messung des Blutspiegels untersucht, weil das resorbierte,in die Blutbahn gelengte Nistatin im Spektrum des Blutscrums nachweisbar ist. Von suboutan appliziertem freiem Nistatin war such im Falle einer Dosis von 200 mg/kg im Blut nichts nachzuweisen, während der Komplex bereits bei einer Dosis von 20 mg/kg einen gut messbaren Blutspiegel ergab: 2-4 Stunden nach der Verabreichung waren im Blut 6-10 g/ml nachweisbar. Beispiel 9 Verringerung der hämolysierenden Wirkung von Polyenantibiotika durch Komplexbildung mit &gamma;-CD a) Nistatin-&gamma;-CD-Komplex Die hämolytische Wirkung von Nistatin, Nistatin-&gamma;-CD- Komplex (Wirkstoffgehalt: Q %) und t-OD wurde an aus menschlichem Blut hergestellten Suspensionen roter Blutkörperchen nach der Methode von T. Irie et al. (J. Pharm. Dyn. 6, 408-414 [1983]) untersuoht. Die Ergebnisse werden in Form der zu 50 %iger Hämolyse gehörenden Konzentrationen (EH50) angegeben. Der für freies Nistatin erhaltene Wert (EH50 = 57 g/ml zeigt eine gute Übereinstimmung mit dem aus der Literatur bekannten Wert von EH50 = 50 g/ml (J. Antibiotios 22, 1080-81 [1979]). Für den Nistatin-&gamma;-CD-Komplex wurde, berechnet als Wirkstoff, ein Wert von EH50 m 115 g/ml gefunden, d.h. im Komplex sinkt die hämolysierende Wirkung des Nistatins auf die Hälfte. Bei einer Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der hämolytischen Wirkung erwies sich, dass der Nistatin-&gamma;-CD-Komplex bis zu einer Konzentration von 70 g/ml Nistatin praktisch nicht hämoly- tisoh wirkt, während freies Nistatin in dieser Konzentration bereits 70 %ige Hämolyse hervorruft. Auch die hämolytische Wirkung einer der im Komplex gebundenen &alpha;-CD-Menge entspre ohenden Menge &gamma;-Cyclodextrin wurde untersucht. Dabei wurde gefunden, dass t-CD in Übereinstimmung mit Angaben aus der Literatur bis zu einer Konzentration von 1600/ug/ml keine Hämolyse verursacht. b) Komplex aus Amphotericin und &gamma;-CD Die hämolytische Wirkung dieses Komplexes (hergestellt gemäss Beispiel 5, Wirkstoffgehalt 0,6 %) wurde auf die unter a) angegebene Weise untersucht. Für freies Amphotericin 3 ergab sich ein Wert von EH50 " 4,8 g/ml, was ebenfalls gut mit den Idoteraturangaben (EH50 = 5 g/ml) übereinstimmt. Der Komplex aus Amphotericin und &gamma;-CD verursachte auch in einer als Wirkstoff berechneten Konzentration von 25 g/ml nur eine 2,6 %ige Hämolyse, während freies Amphotericin in dieser Konzentration bereits 92,4 %ige Hämolgse hervorruft. Herstellung von Polyenantibiotikum- &gamma;-Cyclodextrin- Komplexe enthaltenden Arzneimittelpräparaten und P±lanzen- schutzmitteln Beispiel 10 Puder mit 100 000 IE/g Nistatingehalt 250 mg Nistatin-&gamma;-Cyclodextrin-Komplex werden mit Talkum zu 1 g ergänzt (der Komplex hat eine biologische Aktivität von 400 3/mg). Beispiel 11 Augen- bzw. Ohrentropfen mit 10 000 bzw. 30 000 E/ml Nistatingehalt 30 beziehungsweise 70 mg Nistatin-&gamma;-CD-Komplex, bereitet durch steriles Lyophilisieren eines homogenen Mediums von 400 IE/cg, werden mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Die Lösung wird zweckmässig frisch bereitet. Bei Raumtemperatur gelagert ist sie innerhalb von 10 Tagen verwendbar (mehr als 70 ffi ihrer Aktivität sind auch dann noch erhalten). (Die im Handel erhältlichen ähnlichen Präparate enthalten das Nistatin in mikronisierter Form. Zur Anwendung muss aus diesem Pulver eine Suspension bereitet werden, die vor Licht geschützt im Kühlschrank zu lagern ist. Trotzdem verliert sie den grössten Teil ihrer Aktivität in einer Woche.) Beispiel 12 Nistatinsalbe mit 100 000 IE/g Nistatingehalt 1 g Nistatin-&gamma;-CD-Komplex (Aktivität 400 IE/mg) wird mit 3 g Uuguentum-Simplex-Salbe vermischt. BeisPiel 13 Nistatintabletten mit 200 000 IE/Tablette 500 mg Nistatin-&gamma;-CD-Komplex (400 IE/mg) 145 mg Lactose 30 ag Xartoffelstärke 20 mg Talkum 5 Dg Calciumstearat pro Tablette. Gesamtgewicht einer Tablette: 700 mg Die Tabletten werden in an sich bekannter Weise durch unmittelbares Verpressen hergestellt. Beispiel 14 Scheidenzäpfchen mit 100 000 13/Stück 250 mg Nistatin-&gamma;-CD-Komplex einer durchschnittlichen Aktivität von 400 IE/mg werden mit 2 g deps solidus (festes Fett) oder Massa polyoxyaetheni (Polyäthylenglycol) enthaltender Suppositorienmasse verarbeitet. Beispiel 15 Amphotericin B enthaltende Injektionslösung mit 5 beziehungsweise 10 mg/ml Wirkstofigehalt, zur Anwendung als Infusion 700 bezichungsweise 1400 mg eines C,8 ffi Wirkstoff enthaltenden, unter sterilen Bedingungen lyophilisierten Komplexes aus Amphotericin und &gamma;-CD werden in Pulverampullen gefüllt. Zum Auflösen des Präparates sind 10 beziehungsweise 20 ml steriles destilliertes Wasser notwendig. Zur Verwendung als Infusion kenn die Lösung mit isotonischer Salzlösung oder mit 5 %iger Dextroselösung unbeschränkt verdünnt werden, die Ge- fahr der Niederschlagsbildung besteht nicht. Beispiel 16 Nistatinlösung für Gewebekulturen zum Vermeiden von Pilzbefall (10 000 E/ml) 25 mg lyophilisjerter Nistatin-&gamma;-CD-Komplex der Aktivitat von 400 S/mg werden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Die auf diese Weise bereitete Lösung zeigte nach 10 Tagen Lagerung bei Raumtemperatur, vor Licht nicht geschützt, noch eine Aktivität von 7300 E/ml. In Gewebekulturen wird anhängend von der Art der Kultur im allgemeinen eine Konzentration von 10-500 E/Z1 angewendet. Diese Konzentration wird durch ent sprechendas Verdünnen der Lösung eingestellt. Beispiel 17 Amphotericin B enthaltende Lösung für Gewebekulturen um Vermeiden von Pilzbefall (250 mg/ml) 630 mg eines 0,8 % Wirkstoff enthaltenden Komplexes aus Amphotericin B und t-CD werden vor der Anwendung mit destil liertem Wasser zu 20 cl Lösung gelöst. Abhängend von der Art der Gewebekultur beträgt die angewendete Konzentration 5-50 g/ml und wird durch Verdünnen mit Wasser eingestellt. Beispiel 18 Saatgutbeizmittel Nistatin als Fungizid mit breitem Wirkungsspektrum ergänzt das Wirkungsspektrum von Benomyl und Carbondazin in glücklicher Weise. Die günstige Summenwirkung lieS sich auch durch Freilandversuche bestätigen. Bs wurde Jedoch bis- her wegen seiner hochgradigen Wasserunlöslichkeit und seiner Instabilität in wässrigen Systemen für diesen Zweck nicht eingesetzt. Für Saatgutbeizen empfohlene Zusammensetzung: 25 % Nistatin-&gamma;-CD-Komplex gemäss Beispiel 4 (10 % Wirkstoffgehalt, Aktivität: 450 E/mg) 40 % Benomyl 35 % Träger- und Hilfsstoffe. Dieses Präparat wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Auf 100 g Saatgut rechnet man vorzugsweise etwa 200 g des Präparates.

Claims: Complexes of polyene antibiotics formed with γ-cyclodextrin. Flavofungin-γ-cyclodextrin complex. Nystatin-γ-cyclodextrin complex. Amphotericin B-γ-cyclodextrin complex. Process for the preparation of water-soluble and stable polyene antibiotic derivatives, characterised in that polyene antibiotics which have limited solubility or are virtually insoluble in water are reacted with γ-cyclodextrin with stirring in the presence of water. Process according to Claim 5, characterised in that flavofungin, amphotericin B, nystatin, candicidin or pimaricin is used as the antibiotic. Process according to Claim 5 or 6, characterised in that the polyene antibiotics are reacted with 1-40 mmol of γ-cyclodextrin per mmol of antibiotic in the presence of 1-500 ml, preferably 20-500 ml, of water, preferably at 25-55°C, with stirring, and the antibiotic-γ-cyclodextrin complex obtained is isolated if desired. Process according to one of Claims 5-7, characterised in that the polyene antibiotics are reacted with 1-40 mmol of γ-cyclodextrin per mmol of antibiotic in 1-50 ml of a 20-80% strength by volume, water-miscible solvent, preferably ethanol, with stirring or kneading. Process according to one of Claims 5-8, characterised in that the antibiotic-γ-cyclodextrin complex obtained is isolated by lyophilisation, spray drying, vacuum evaporation or vacuum drying at low temperature. Medicament preparation having antifungal activity, characterised in that it contains 1-80% by weight of polyene antibiotic-γ-cyclodextrin complex. Plant protection agent having antifungal activity, characterised in that it contains 0.25-30% by weight of polyene antibiotic-γ-cyclodextrin complex. Additive having antifungal activity for tissue cultures for avoiding fungal attack, characterised in that it contains 0.02-5 mg/ml of polyene antibiotic-γ-cyclodextrin complex.

Inventors: INCZEFI, ISTVAN, JARAI, MIKLOS, DR., KULCSAR, GABOR, DR., PIUKOVICH, SANDOR, STADLER, AGNES, DR. GEB. SZOEKE, SZEJTLI, JOZSEF, DR., VIKMON, MARIA, DR. GEB. KIRALY, ZLATOS, GABRIELLA, DR., Stadler, Agnes, Dr. geb. Szöke
Applicants: CHINOIN GYOGYSZER ES VEGYESZETI TERMEKEK GYARA RT.
Application year: 1984
Main classification: A61K31
IPC codes: A61K31, C08B37, A61K47, A61K9, C07D313, C07H17