ISOLATION OF ENZYMETICALLY PREPARED CARBOXYLIC ACIDS

Abstract: 1. A process for isolating enzymatically produced carboxylic acids from fermentation broths wherein the fermentation broths are treated with polymers which contain tertiary amino groups and the adsorbed carboxylic acids are desorbed by treatment with a polar solvent from the group of the aliphatic alcohols, aliphatic ketones and aliphatic carboxylic acid esters.

Description: Isolierung von enzymatisch erzeugten Carbonsäuren Die Isolierung von Carbonsäuren, die nicht oder nur schwer durch Destillation abgetrennt werden können, ist recht aufwendig. Enzymatisch, z.B. fermentativ erzeugte Hydroxycarbonsäuren wie Milchsäure und Zitronensäure werden deshalb häufig in Form der Calciumsalze ausgefällt, aus denen dann mit Schwefelsäure die Carbonsäuren wieder freigesetzt werden. Hierbei wird die bis zu 25fache Gewichtsmenge an feuchtem Gips erhalten, der im allgemeinen nicht unter vertretbaren Kosten aufgearbeitet werden kann und deshalb deponiert werden muss. Im folgenden soll unter den Begriffen nFermentation bzw. "fermentativ" jede enzymatische Reaktion verstanden werden, also auch solche mit freien oder gebundenen Enzymen und mit toten Zellen. Es ist bekannt, dass man fermentativ erzeugte Milchsäure mit Hilfe eines Anionenaustauschers isolieren kann, wobei die im Ionenaustauscher gebundene Milchsäure dann mit einer Calciumhydroxidlösung oder mit starker Schwefelsäure isoliert wird. Im ersteren Fall muss die Milchsäure aus dem Calciumlactat wieder freigesetzt werden und im letzteren Fall wird der Austauscher mit Sulfationen beladen, was zu einem Salzanfall führt. Ein Nachteii beim Einsatz von Ionenaustauschern ist auch, dass andere Anionen aus der Fermentationslösung gebunden werden, also auch die der Nährsalze. Hierdurch wird nicht nur die Kapazität des Ionenaustauschers beansprucht und die Aufarbeitung verteuert, sondern auch praktisch verhindert, dass Carbonsäuren kontinuierlich aus Fermentationslösungen abgetrennt werden und die restliche Lösung mit den darin enthaltenen Salzen wieder in die Fermentation zurückgeführt wird. Es wurde nun gefunden, dass enzymatisch erzeugte Carbonsäuren aus den Reaktionslösungen bzw. -suspensionen besonders vorteilhaft abgetrennt werden können, wenn man diese Lösungen bzw. Suspensionen mit Polymerisaten behandelt, die tertiäre Aminogruppen en-thalten, und die adsorbierten Carbonsäuren durch Behandeln mit einem polaren Lösemittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole, aliphatischen Ketone und aliphatischen Carbonsäureester desorbiert. Bevorzugte Ausgestaltungen dieser Erfindung werden im folgenden näher erläutert: Geeignete Polymerisate mit tertiären Aminogruppen, die selektiv Carbonsäuren adsorbieren und deren Desorption mit den genannten polaren Lösemitteln erlauben, sind beispielsweise aus den deutschen Patentschriften 1 274 128 und 3 043 766 bekannt. Besonders vorteilhaft sind die in den deutschen Patentanmeldungen P 33 24 834.6 und P 33 24 835.4 vorgeschlagenen vernetzten Copolymerisate. Aus der deutschen Patentschrift 3 043 766 ist es bekannt, Carbonsäuren aus technischen Lösungen bzw. Abwässern wiederzugewinnen. Es findet sich darin jedoch kein Anhaltspunkt dafür, dass dieses Verfahren auch für die Isolierung aus Fermentationslösungen geeignet ist, da diese Lösungen eine Vielzahl von organischen und anorganischen Komponenten gelöst bzw. suspendiert enthalten. Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung bezieht sich auf eine kontinuierliche Reaktion, wobei die aus dem Reaktor abfliessende Lösung oder Suspension kontinuierlich durch einen von mehreren parallel geschalteten Desorbern läuft, wobei die aus dem Desorber austretende Flüssigkeit - gegebenenfalls nach Aufstärken mit Nährstoffen und/oder Nährsalzen - in den Reaktor zurückgeführt wird. Nach Beladen eines Desorbers wird die Reaktionslösung auf den nächsten Desorber geführt und aus dem beladenen Desorber die Carbonsäure mit Hilfe des polaren Lösemittels eluiert. Bei dieser kontinuierlichen Ausgestaltung der Erfindung kann es vorteilhaft sein, nur einen mehr oder weniger grossen Anteil der enthaltenen Carbonsäure zu adsorbieren und die restlichen Anteile im Kreislauf zurückzuführen. Man kann so beispielsweise ein unerwünscht starkes Konzentrationsgefälle an Produkt zwischen Fermenterein- und -auslauf vermeiden, beispielsweise bei produktkatalysierten Fermentationsreaktionen. Bei Fermentationslösungen bzw. -suspensionen mit einem hohen Anteil an Fremdsubstanzen kann es auch technisch vorteilhaft sein, die Carbonsäuren nur zum Teil zu adsorbieren, um den apparativen Aufwand gering zu halten. Bei einem Kreislaufverfahren spielt dann der im Kreisstrom verbleibende Anteil an Produkt praktisch keine Rolle. Besonders vorteilhaft ist eine Ausgestaltung der Erfindung, bei der die Fermentation mit Hilfe von fixierten Biokatalysatoren erfolgt, wobei es sich bei diesen fixierten Katalysatoren um trägergebundene Enzyme oder fixierte Mikroorganismen handeln kann. Geeignete perlförmige Biokatalysatoren sind beispielsweise in den deutschen Offenlegungsschriften 2 343 633 und 2 805 607 beschrieben sowie in der deutschen Patentanmeldung P 32 37 341.4 vorgeschlagen. Besonders vorteilhaft werden solche fixierten Biokatalysatoren in einem Reaktor nach dem Schlaufenprinzip eingesetzt, wie es in der deutschen Patentanmeldung P 32 47 214.5 vorgeschlagen wurde. Die Behandlung der Fermentationsbrühen mit dem Adsorptionsmittel erfolgt in üblicher Weise. Für kontinuierliche Verfahren kann das Adsorptionsmittel in Fliessbett- oder Festbett-Reaktoren angeordnet sein. Die Desorption der Carbonsäure erfolgt zweckmässig mit leicht-flüchtigen polaren Lösemitteln wie Essigsäuremethyl- oder -ethylester, Azeton oder Methyl-ethyl-keton und insbesondere mit niederen Alkanolen wie Ethanol und besonders vorteilhaft Methanol. Die Desorption der Carbonsäuren aus fest angeordneten Adsorptionsmittel kann im Gleich- oder Gegenstrom, bez. auf die Beladung, erfolgen. Bevorzugt ist das Gegenstromverfahren. Die Abtrennung der Carbonsäure aus dem Eluat erfolgt nach bekannten Methoden. Beim Einsatz leicht flüchtiger Elutionsmittel können diese leicht durch Destillation abgetrennt werden. Je nach der Löslichkeit des Produktes kann es vorteilhaft sein, nur einen Teil des Elutionsmittels abzudestillieren und das Produkt aus der konzentrierten Lösung zu kristallisieren. Es ist selbstverständlich auch möglich, dem Elutionsmittel Basen, wie beispielsweise Ammoniak zuzusetzen, wobei dann jedoch - je nach Basenmenge anteilig - das entsprechende Salz erhalten wird. Wenn dieses Salz leicht zerlegbar, beispielsweise thermolabil, ist, kann auch auf diesem Wege die freie Carbonsäure erhalten werden. Gegebenenfalls kann auf die organische Komponente auch ganz verzichtet werden, wobei dann die wässrige Basenlösung das polare Elutionsmittel darstellt. In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist. Beispiel 1 20 g abzentrifugierte Lactobacillus bulgaricus-Zellen werden nach Beispiel 1 der deutschen Patentanmeldung P 32 37 341.4 immobilisiert und in eine auf 420C thermo statigierte Säule mit 5,0 cm Innendurchmesser gefüllt. Aus einem 3 l-Vorratsgefäss wird eine 10%ige Glucoselösung vom pH 6,5 durch die Säule gepumpt. Die Durchflussgeschwindig keit wird dabei so eingestellt, dass der pH-Wert des Eluats 4,0 nicht unterschreitet. Zur Adsorption der gebildeten D-Milchsäure wird das Eluat über eine zweite Säule gepumpt, welche mit 50 g des nach Beispiel 5 a) der deutschen Patentanmeldung P 33 24 834.6 hergestellten Adsorberharzes gefüllt ist. Die von der D-Milchsäure befreite Substratlösung fliesst in das Vorratsgefäss zurück. Nach Erreichen der Kapazitätsauslastung des Adsorbers (68,0 g Milchsäure/100 g Adsorber) desorbiert man die adsorbierte D-Milchsäure durch Elution mit Methanol. Nach Abdestillieren des Methanols wird D-Milchsäure in einer Reinheit von 99 % in Form eines farblosen Öls gewonnen. Durch Einsatz einer weiteren Adsorbersäule kann über 12 Tage D-Milchsäure kontinuierlich fermentiert und isoliert werden. Beispiel 2 30 g abzentrifugierte Aspergillus niger-Zellenvwérden gemäss Beispiel 1 der deutschen Patentanmeldung P 32 37 341.4 immobilisier-t und in eine auf 300C thermostatisierte Säule mit 5,0 cm Innendurchmesser gefüllt. Aus einem 3 l-Vorratsgefäss wird eine 13%ige Saccharoselösung vom pH 4,0 mit einer Durchflussgeschwindigkeit von einem Säulenvolumen pro Stunde über die Säule gepumpt. Zur Adsorption der gebildeten Zitronensäure wird das Eluat dieser Säule über eine zweite Säule gepumpt, die mit einem Adsorberharz gefüllt ist, das nach Beispiel 6 a der deutschen Patentanmeldung P 33 24 834.6 erhalten wurde. Das von Zitronensäure befreite Eluat fliesst in das Vorratsgefäss zurück. Nach Erreichen der Kapazitätsauslastung des Adsorbers (95 g Zitronensäure/100 g Adsorber) wird die beladene Säule durch eine zweite Adsorbersäule ersetzt. Die Desorption der Zitronensäure erfolgt durch Elution mit Methanol. Nach Aufkonzentrieren der methanolischen Lösung und Abkühlen auf 5 0C erhält man 85 g Zitronensäure in Form farbloser Kristalle. Beispiel 3 20 g abzentrifugierte Lactobacillus delbrueckii-Zellen werden in 20 g 5%iger Natriumalginatlösung suspendiert und bei 200C durch eine Kanüle von 1,0 mm Durchmesser in ein Vernetzerbad, bestehend aus 2 1 einer 0,5 molaren Calciumchloridlösung, getropft und 20 Minuten gerührt. Die entstandenen Kügelchen mit einem mittleren Radius von 2 mm werden abfiltriert und in 2 1 einer Substratlösung, enthaltend 10 Gew.-% Glucose und 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, gegeben. Die Lösung wird auf 42 0C thermostatisiert und gerührt. Durch kontinuierliche Zugabe von 5 N-Natronlauge über ein Autotitratorgerät wird der pH-Wert der Lösung auf 6,2 gehalten. Nach vollständigem Verbrauch der Glucose werdendie Biokatalysator-Kügelchen abfiltriert. Die filtrierte Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,0 gestellt und zur Adsorption der gebildeten D-Milchsäure über eine-Säule gepumpt, die mit300 g dem nach Beispiel 13a der deutschen Patentanmeldung P 33 24 835.4 erhaltenen Harz gefüllt ist. Nach erfolgter Adsorption wird das Adsorberharz mit 2 Bettvolumina entionisiertem Wasser gewaschen und anschliessend durch Elution mit Methanol die D-Milchsäure desorbiert. Nach Abdestillierten des Methanols erhält man 178 g D-Milchsäure in Form eines farblosen Öls. Beispiel 4 2 1 einer autoklavierten Nährlösung, enthaltend pro Liter 140 g Saccharose, 2,23 g Ammoniumnitrat, 1,0 g Dikaliumphosphat und 0,23 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat, werden mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und mit Aspergillus niger angeimpft. Die Kultur wird bei 300C leicht geschüttelt. Nach 5 Tagen beträgt die Zitronensäurekonzentration 27 g/l (enzymatisch ermittelt) Die Kulturlösung wird von der Zellmasse abfiltriert und das Filtrat über eine Säule, gefüllt mit 70 g des nach Beispiel 5a der deutschen Patentanmeldung P 33 24 835.4 erhaltenen Harzes, gepumpt. Danach wird das Adsorberharz mit 2 Bettvolumina entionisiertem Wasser gewaschen und die adsorbierte Zitronensäure mit Methanol eluiert. Das Methanol wird zum grössten Teil abgedampft, wobei 48 g Zitronensäure in Form farbloser Kristalle anfallen. Anhang: Beispiele 5a und 6 a aus der deutschen Patentanmeldung P 33 24 834.6: BeisPiel 5: a) 55g 4-Vinyl-pyridin, 5g 1,7-Bis-(3-hydroxypropyl) 1±1,3,3,5'5,717-octamethyl-tetrasiloxan-bis-acrylat werden zusammen mit 0,22g Dibenzopylperoxid gelöst und unter ständigem Durchleiten von Stickstoff und unter ständigem Rühren in eine Lösung aus 300ml Wasser 37,5g Natriumformiat und 37,5g einer 1%gen wässrigen Hydroxyethylcellulose-Lösung gegeben. Dann wird auf 700C angeheizt und 1 h polymerisiert. Das erhaltene Copolymerisat wird mit Wasser gewaschen, dann anschliessend mit Methanol digeriert und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 48g. BeisPiel 6: a) 55g 4-Vinyl-pyridin, 5g Borsäure-triallylester werden zusammen mit 0,22g Dibenzoyl-peroxid gelöst und unter ständigem Durchleiten von Stickstoff und unter ständigem Rühren in eine Lösung aus 300ml Wasser 37,5g Natriumformiat und 37,5g einer 1%igen wässrigen Hydroxyethylcellulose-Lösung gegeben. Dann wird auf 600C erhitzt und 1 h polymerisiert. Das erhaltene perlförmige Copolymerisat wird abgetrennt mit Methanol gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 52g. Beispiele 5a und 13a aus der deutschen Patentanmeldung P 33 24 835.4: Beispiel 5: a) 120g 1-Vinyl-imidazol, 40g N-Vinylmethylacetamid und 20g N,N1-D4ethylen-bis-acrylamid werden bei Raumtemperatur mit 180mol Wasser und Ig 4,4'-Azocyanopentansäure verrührt. Diese Lösung wird in 1200ml n-Heptan, das 4g lipophiles Schutzkolloid enthält, eingerührt Unter ständigem Rühren und Durchleiten von Stickstoff wird auf 65 bis 700c erwärmt und 2 h copolyraerisiert. Das erhaltene perl förmige Copolymerisat wird abgetrennt, gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 162g. Beispiel 13: a) 40g 1-Vinyl-imidazol, 2, 5g 2,5g N,N' N,N'-Merhylen-bis-acrylamid und 2,5g 1,7-Bis-t2-hydroxypropyl)-1,1,3,3,5,5,7,7-oct < - rnethyl-tetrasiloxan-bisacrylat werden zusammen mit 4,41 Azobiscyanopentansäure und 45ml Wasser gelöst und in 300 ml n-Heptan und 1g lipophilem Schutzkolloid eingerührt. Unter ständigem Rühren und Durchleiten von Stickstoff wird auf 700C geheizt und 1 h copolymerisiert. Das entstandene hochvernetzte, strukturierte perlförmige Copolymerisat wird abgetrennt, mit Aceton gewaschen und ge- trocknet. Die Ausbeute beträgt 42g.

Claims: PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Isolierung von enzymatisch erzeugten Car bonsäuren aus den Reaktionslösungen bzw. -suspensionen, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Lösungen oder Suspensionen mit Polymerisaten behandelt, die tertiäre Aminogruppen enthalten, und die adsorbierten Carbon säuren durch Behandeln mit einem polaren Lösemittel aus der Gruppe der aliphatischen Alkohole, aliphatischen Ketone und aliphatischen Carbonsäureester desorbiert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die aus einer kontinuierlichen Reaktion aus dem Reaktor abfliessende Lösung oder Suspension kontinuierlich durch einen von mehreren parallelgeschalteten Desorbern läuft und die austretende Flüssigkeit in den Reaktor zurückge führt wird. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nur ein Anteil der enthaltenen Carbonsäuren adsorbiert wird. 4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsmittel in einem Festbett-Reaktor angeordnet ist. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption im Gegenstrom zur Beladungsrichtung erfolgt. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Desorptions mittel leicht flüchtig ist. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Desorptionsmittel Essigsäuremethyl- oder -ethyl ester, Azeton, Methyl-ethyl-keton, Ethanol oder Metha nol ist. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich net, dass das Elutionsmittel ganz oder teilweise von der Carbonsäure abdestilliert wird. 9. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polare Lösemittel ganz oder teilweise durch eine Base ersetzt wird. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Base eingesetzt wird, die zu einem leicht zerleg baren Salz führt.

Inventors: ENGELHARDT, FRIEDRICH, DR., GREINER, ULRICH, DR., HESS, GERHARD, KEIL, KARL-HEINZ, DR., KELLER, REINHOLD, DR., KUHLEIN, KLAUS, DR., SCHLINGMANN, MERTEN, DR., Kühlein, Klaus, Dr.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C07C51
IPC codes: C07C67, C12P7, C07C51