PROCESS FOR THE BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF L-MALIC ACID

Abstract: 1. A process for producing the pure L-isomer of malic acid from neutralized fumaric acid under bioconversion conditions by free movable microorganisms in an aqueous solution of fumarate characterized in that said microorganisms are fungi, that the initial concentration of fumarate is 11 to 15 % by weight and that the concentration of L-malic acid at the time of harvesting is 100 to 170 g per liter of fermentation broth.

Description: Verfahren zur biotechnoloRischen Herstelluna von L-XPf elsäure Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des reinen L-Isomeren der Äpfelsäure aus neutralisierter Fumarsäure durch mikrobielle Fermentation mittels frei beweglicher Mikroorganismen in wässriger Phase und einer Konzentration der L-Äpfelsäure zum Zeitpunkt der Ernte von 100 bis 170 g pro Liter der Kulturlösung. L-Äpfelsäure wird in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie als Puffersubstanz, Komplexbildner, Acidulans und Feuchthaltemittel eingesetzt. L-Äpfelsäure ist als Naturstoff für diese Anwendungsgebiete geeigneter als das chemisch, z. B. durch Wasseranlagerung an Maleinsäureanhydrid, zugängliche D,L-Isomerengemisch der Äpfelsäure. Das D-Isomer der Äpfelsäure kommt in der Natur nicht vor, weshalb die Anwendung der chemisch synthetisierten D,L-Äpfelsäure im Lebensmittel- und Pharmabereich nicht unbedenklich ist. Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der biotechnologischen Herstellung von L-Äpfelsäure in reiner Form. Zur biotechnologischen Herstellung von L-Äpfelsäure sind mehrere Verfahren bekannt. Ein Teil dieser Verfahren ar beitet'mit speziellen Bakterien, die Fumarsäure durch Anlagerung von Wasser in L-Äpfelsäure überführen. In US-3.922.195 wird vorgeschlagen, die Bakterienzellen zu immobilisieren. Nach DE-AS 23 .63 285 wird mit freien Bakterienzellen oder mit dem aus Bakterienzellen isoliertem Enzym Fumarase gearbeitet. Weiter ist die Umsetzung von Glucose in L-Äpfelsäure durch Vergesellschaftung eines Pilzes mit einem Bakterium beschrieben worden (J. Ferment. Technol., Vol. 54, Nu 4, (1976), Seiten 197 bis 204). Hierbei bildet der Pilz aus Glucose Fumarsäure, die dann von dem Bakterium in L-Äpfelsäure überführt wird. Das die Umsetzung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure bewirkende Enzym, die Fumarase, kann aus biologischem Material, wie der Zellmasse von Bakterien oder Pilzen, in speziellen Verfahren isoliert und dann - in freier oder immobilisierter Form - zur Gewinnung von L-Äpfelsäure aus Fumarsäure eingesetzt werden (DE-AS 24 15 310; CS-171.990). Bei einigen Verfahren wird dem Fermentationsansatz eine grosse Menge einer Kalzium-Verbindung zugegeben, wodurch die gebildete L-Äpfelsäure bereits während der Fermentation als Ca-Malat ausfällt (DE-OS 14 17 033). Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von L-Äpfelsäure mit Hilfe von Pilzen sind ebenfalls bekannt. Bei diesen Verfahren wird die L-Äpfelsäure im wesentlichen durch biochemischen Ab- bzw. Umbau der an den betreffenden Pilz verfütterten Kohlenstoffquelle (z.B. Melasse, Zucker, Ethanol, Essigsäure) erhalten (J. Ferment. Technol. Vol. 55, No. 2 (1977), Seiten 196 bis 199). Diese Verfahren gehen nicht direkt von Fumarsäure aus. Bei dem in US-3.Q63.910 beschriebenen Verfahren kann der Fermentationsansatz neben 10 bis 15 % eines Zuckers noch 1 bis 10 ffi einer organischen Säure, wie z. B. Brenztraubensäure oder Fumarsäure, enthalten. Jedoch dient bei diesem Pilz-Verfahren die zugesetzte organische Säure nicht als Substrat für die Synthese von L-ÄpfelsäureSsondern als Reaktionsbeschleuniger des biochemischen Ab- bzw. Umbaues des angebotenen Zuckers in L-Äpfelsäure. Weiter ist die fermentative Überführung von n-Paraffin in L-Äpfelsäure durch Vergesellschaftung von zwei Hefearten möglich, wobei die eine Hefeart Paraffin in Fumarsäure überführt und die zweite Hefeart die entstandene Fu marsäure in L-Äpfelsäure umwandelt (Agr. Biol. Chem. Vol. 34 (1970), Seiten 1833 bis 1838). Die bekannten Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von L-Äpfelsäure haben u. a. die nachstehend aufgeführten Eigenarten: - Bei der Verwendung von Bakterien sind biotechnologische Verfahren schwieriger zu handhaben als bei Verwendung von Pilzen. Aus der geringen Grösse der Bakterien können beispielsweise Abtrennprobleme entstehen. Bakterien neigen ferner dazu, Nebenprodukte, darunter auch toxi sche Nebenprodukte, zu bilden. Besonders störend für eine Anwendung der L-Äpfelsäure im Pharmabereich ist das von Bakterien gebildete LPS-Toxin (Lipopolysaccharid Toxin), das pyrogen wirkt, und von dem die L-Äpfelsäure nur durch aufwendige Verfahrensschritte, wie z. B. durch Ultrafiltration, zu reinigen ist. Bei dem in US-3.922.195 be schriebenen Bakterien-Verfahren tritt als Nebenprodukt in ge ringer Menge Bernsteinsäure auf, die von Äpfelsäure nur mit Schwierigkeiten abzutrennen ist. - Beim Einsatz des Enzyms Fumarase kommt als Fumarase Quelle in erster Linie mikrobielle Zellmasse in Frage. Vor Beginn der Herstellung von L-Äpfelsäure muss mikro bielle Zellmasse gezüchtet und mit erheblichem Aufwand zu Fumarase aufgearbeitet werden. - Die Immobilisierung von lebenden Zellen oder des aus Zellen isolierten Enzyms Fumarase ist ein zusätzlicher, sehr aufwendiger Verfahrensschritt. - Bei der Fermentation in Gegenwart von- Ca-Ionen in grosser Konzentration wird die gebildete L-Äpfelsäure bereits während der Fermentation als Ca-Malat gefällt; das führt zu Problemen beim Rühren und Belüften des Fermen tationsansatzes. - Die erzielbare Konzentration der L-Äpfelsäure ist im allgemeinen vergleichsweise gering und liegt deutlich unter 100 g pro Liter Kulturlösung, wenn man von den in US-3.922.195 (immobilisierte Bakterien) und in DE-OS 14 17 033 (hohe Kalziumkonzentration) beschrie benen Umsetzungen absieht. Die Fermentation dauert länger als drei Tage. Die wegen dieser geringen Pro duktivität erforderliche grosse Kapazität der Bio-Reak toren verursacht einen grossen apparativen Aufwand, zumal es sich um aufwendig gebaute Reaktoren handelt, die eine kontaminationsfreie Prozessführung ermöglichen. Damit stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren der obengenannten Art zu entwickeln, bei dem L-Äpfelsäure mit grosser Produktivität in Bio-Reaktoren einfacher Bauart in einer der Aufarbeitung zu reiner L-Äpfelsäure entgegenkommenden Form auf möglichst wirtschaftliche Weise hergestellt wird. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren, das durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist: - Verwenden von Pilzen als Mikroorganismen, - eine Konzentration der vorgelegten Fumarsäure von 11 bis 15 Gew.-ffi. Die Fumarsäure kann in h hrstoff-haltiger oder Nährstofffreier Lösung zu L-Äpfelsäure fermentiert werden. Es kann zweckmässig sein, die Fumarsäure nur in Nährstoff-freier Lösung zu fermentieren und die dazu benötigte Zellmasse in einer Fumarsäure-freien oder Fumarsäure-haltigen Nährlösung zu züchten. Die dazu geeignete Nährlösung kann wesentlich weniger als 11 % Fumarsäure enthalten, da in diesem Fall der Pilz lediglich an Fumarsäure adaptiert werden soll. Obwohl der Begriff "Fermentation" in der Fachliteratur bisher einen relativ grossen Bedeutungsumfang hat, wird in diesem Zusammenhang unter 11Fermentation11 die biochemische Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure unter Einwirkung der Fumarase verstanden. Mit "Züchtung" wird die Vermehrung der Biomasse aus dem Inoculum unter Verbrauch von Nährstoffen bezeichnet. In Nährstoff-haltiger Fumarsäure Lösung laufen beide Vorgänge (Züchtung und Fermentation) neben- bzw. hintereinander ab. Für die Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure Lösung werden der Lösung mit neutralisierter Fumarsäure die für das Wachsen des Pilzes nötigen Nähr- und Wirkstoffe zugesetzt. Nach ihrer Sterilisation wird diese Lösung mit 1 bis 20 % Inoculum eines Pilzes geimpft und während 1 bis 3 Tagen bei 20 bis 50 OC fermentiert. Anschliessend wird die Kulturlsung in Zellmasse und Kulturfiltrat getrennt, und aus dem Kulturfiltrat wird nach den bekannten Verfahren die L-Äpfelsäure isoliert. Die abgetrennte Zellmasse kann für mehrere - etwa für drei weitere - Fermentationen in jeweils neu angesetzter Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung verwendet werden. Dabei kann das Volumen der Fumarsäure-Lösung das einfache bis zehnfache des Volumens der vorhergehenden Fermentation in Nährstoffhaltiger Lösung oder des Volumens der Züchtung in Fumarsäure-freier oder Fumarsäure-haltiger Nährlösung ausmachen, wenn die gesamte aus der Nährstoff-haltigen Lösung resultierende Zellmasse verwendet wird. In Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung wird 12 bis 24 Stunden lang bei 25 bis 60 C fermentiert. Die aerobe fermentative Umsetzung - in Nährstoff-haltiger Lösung - von Fumarsäure in L-Äpfelsäure erfolgt unter Belüften in einer einfach zusammengesetzten anorganischen Nährsalzlösung, die als Kohlenstoffquelle für den Energie- und Betriebsstoffwechsel des Pilzes Maismehl, einen Zucker oder eine andere Kohlenstoffverbindung (z. B. Ethanol) und als Substrat für die L-Äpfelsäure-Produktion 11 bis 15 Gew.-% Fumarsäure in Form eines Salzes enthält. Bei dem verwendeten Pilz handelt es sich vorzugsweise um einen Pilz, der zwar Fumarsäure in L-Äpfelsäure überführen kann, der ab*r weder Fumarsäure noch L-Äpfelsäure in einem nl!nnenswerten Ausmass für seinen Energie- und. Betriebsstoffwechsel nutzt. Dazu gehören Pilze, die bevorzugt aut den Ordnungen Aspergillus, Peniciliium, Paecilomyces, Trichosporon, Taphrina, Helminthosporium und Pythium stammen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist jedoch nicht auS Pilze aus diesen Ordnungen beschränkt. Wegen der grossen Produktivität kann die Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung nach spätestens drei Tagen abgebrochen werden. Die Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lö sung kann bereits nach 12 bis 24 Stunden abgebrochen werden. Die Konzentration der L-Äpfelsäure in der Suspension beträgt zum Zeitpunkt der Ernte in jedem Fall mehr als 100 g pro Liter. Die L-Äpfelsäure wird weitgehend - oder ausschliesslich in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung hergestellt. Pilz Zellmasse aus einer vorhergehenden Fermentation oder Züchtung wird hierzu nach ihrer erfolgten (Fermentation) bzw. erfolgten oder nicht erfolgten (Züchtung) Abtrennung vom Kulturfiltrat in eine Lösung, die lediglich Fumarsäure (11 bis 15 Gew.-*) in Form eines Salzes enthält, überführt und unter leichtem Rühren und Belüften erneut inkubiert. Nach 12 bis 24 Stunden liefert diese Fermentation L-Äpfelsäure in einer Konzentration von mehr als 100 g pro Liter. Mit der aus einer Fermentation oder Züchtung in Nährstoff-haltiger Lösung resultierenden Pilz-Zellmasse können mehrere - etwa bis zu drei Fermentationen in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung nacheinander durchgeführt werden, wobei das Flüssigkeitsvolumen jeder einzelnen dieser Fermentationen das einfache bis zehnfache - vorzugsweise das einfache bis dreifache - des Volumens der vorhergehenden Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung (oder der Züchtung in Fumarsäure-freier oder Fumarsäure-haltiger STährstoff-Lösung) beträgt. Die Bio-Reaktoren für die Fermentation in Nährstofffreier Fumarsäure-Lösung sind wesentlich einfacher gebaut als übliche Bio-Reaktoren. Sie benötigen beispielsweise - da in ihnen der Pilz nicht mehr wächst - kein leistungsfähiges Rühr- und Belüftungssystem zur Erzielung einer grossen Sauerstoff-Transfer-Rate. Eine Vorrichtung zur Sterilisation ist ebenfalls nicht erforderlich, da diese Fermentationen mit 12 bis 24 Stunden Dauer vergleichsweise kurz sind und Infektionskeime - die wegen des Fehlens einer leicht metabolisierbaren Kohlenstoffverbindung und aufgrund des grossen osmotischen Druckes der Lösung ohnehin ungünstige Wachstumsbedingungen haben sich in dieser kurzen Zeit nicht nennenswert entwickeln können. Die Nährstoff-freie Lösung enthält als einzige Komponente Fumarsäure in Form eines Salzes und gegebenenfalls Aktivatoren für die fermentative Umsetzung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure. In dieser Lösung ist der Stoffwechsel des Pilzes reduziert auf die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure, die somit frei von den üblicherweise in einer Kulturlösung enthaltenen Komponenten - wie z. B. den für das Wachstum zugesetzten Nährstoffen und den als Nebenprodukte der Wachstumsvorgänge entstehenden organischen Verbindungen - anfällt. Die Fumarsäure ist ein in Nahrungsmittelqualität grosstechnisch hergestelltes Massenprodukt, das für das erfindungsgemässe Verfahren .unittelbar eingesetzt werden kann. Bei der Fermentation ir Nährstoff-haltiger Fumarsäure Lösung geht man folgenc rmassen vor. Fumarsäure wird in eine Konzentration von 11 bis 15 *, vorzugsweise von 12 bis 13 , in Wasser vorgelegt und mit Lauge, vorzugsweise Nattonlauge neutralisiert. Die Lösung wird mit den für das Wa:isen des Pilzes notwendigen an organischen Nährstoffen versetzt, beispielsweise pro Liter Lösung mit 1 ml konzentrierter Phosphorsäure (H3P04) 1,4 ml konzentrierter Ammoniumhydroxid-Lösung (NH40H) 0,9 g Magnesiumsulfat (MgS04 7 7 H20) 30 mg Eisenchlorid (FeC1 6 6 H20) 3 2 2 g Kaliumchlorid (XCl) Der Zusatz von KOl ist erforderlich, wenn nicht zumindest ein Teil der Fumarsäure mittels Kaliumhydroxid neutralisiert wurde. Für Ansätze mit Pilzen, die zum Wachsen bestimmte Wirkstoffe (z. B. Vitamine) benötigen, wird die Lösung noch mit diesen Wirkstoffen versetzt. Die Nährstoff-haltige Lösung wird auf einen pH-Wert von 3 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, eingestellt und anschliessend - vorzugsweise thermisch - sterilisiert. Die zum Wachsen des Pilzes erforderlichen Kohlenstoffverbindungen werden entweder zusammen mit den anorganischen Nährstoffen sterilisiert oder - z. B. zur Vermeidung von Karamelisierungserscheinungen bei Zuckern - separat davon. Geeignete Kohlenstoffverbindungen für das Pilz Wachstum sind Maismehl, Saccharose, Glucose, Glycerin, Ethanol und andere kohlenstoffhaltige Verbindungen. Nach der Sterilisation wird der Fermenter mit Inoculum eines für die Umsetzung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure geeigneten Pilzes in einer Menge von 1 bis 20 , vorzugsweise in einer Menge von 3 bis 10 *, des Fermentationsansatzes angeimpft und unter kontrollierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Belüftung und pH-Wert für 1 bis 3 Tage betrieben. Während dieser Zeit baut der eingeimpfte Pilz zunächst unter Verbrauch der zugesetzten Kohlenstoffverbindung seine Zellmasse auf, die dann den weitaus grössten Teil der vorgelegten Fumarsäure in L-Äpfelsäure überführt, so dass nach spätestens drei Tagen eine L-Äpfelsäure-Konzentration von mehr als 100 g pro Liter Kulturlösung erhalten wird. Die Fermentationstemperatur liegt bei 20 bis 50 C, vorzugsweise bei 25 bis 35 C. Sie kann, wenn das Wachsen des Pilzes weitge- hend beendet ist (beispielsweise nach 1,5 Tagen Fermentation), auf 25 bis 60 OC, vorzugsweise äuf 30 bis 45 OC erhöht werden Aus dieser Temperaturerhöhung nach Beendigung des Pilz-Wachstums resultiert eine Erhöhung der Umsatzgeschwindigkeit von Fumarsäure in L-Äpfelsäure, denn überraschenderweise liegt die optimale Temperatur für die Umsetzung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure über der für das Wachsen des Pilzes optimalen Temperatur. Der pH-Wert während der Fermentation wird durch Einspeisen des entsprechenden Neutralisationsmittels zwischen 3 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, gehalten. Rührerdrehzahl und Belüftung sind auf ausreichende Versorgung des Pilzes mit Sauerstoff einzustellen. Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturlösung durch Filtrieren oder eine andere Flüssigkeit/Feststoff Trennoperation in Kulturfiltrat und Pilz-Zellmasse getrennt. Das Filtrat steht zur Isolierung der in ihm enthaltenen L-Äpfelsäure nach bekannten Verfahren, beispielsweise durch Fällung als Ca-lat, zur Verfügung. Die Pilz-Zellmasse kann zur anschliessenden Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung eingesetzt werden. Bei der Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure Lösung geht man folgendermassen vor. Die aus einer vorhergehenden Fermentation in Nährstofffreier oder Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung oder aus einer Züchtung in Fumarsäure-freier oder Fumarsäurehaltiger Nährstoff-Lösung resultierende Zellmasse wird in eine Lösung, die lediglich 11 bis 15 ffi (vorzugsweise 12 bis 13 *) Fumarsäure in Form eines Salzes enthält, überführt; die Suspension wird in einem Bio-Reaktor unter schwachem Rühren und Belüften für 12 bis 24 Stunden inkubiert. Die Konzentration an L-Äpfelsäure liegt dann - wie am Ende der Fermentation in Nährstoffhaltiger Fumarsäure-Lösung - bei mehr als 100 g pro Liter Suspension. Die Temperatur während der Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung liegt bei 25 bis 60 C, vorzugsweise bei 30 bis 45 C. Die Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung kann in einem Bio-Reaktor von sehr einfacher Bauart durchgeführt werden; dieser Reaktor benötigt keine Vorrichtungen zur Erzielung einer hohen Sauerstoff-Transfer-Rate und zur Sterilisation. Es genügt ein einfach zu reinigender thermostatisierbarer Behälter mit Vorrichtungen zum Rühren und Belüften. Ein schwaches Rühren ist erforderlich, um die Sedimentation der Pilz-Zellmasse zu verhindern; ein schwaches Belüften ist notwendig, um die Zellen mit der für die Erhaltungsatmung nötigen Sauerstoffmenge zu versorgen. Die einfache Bauart des Bio-Reaktors für die Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung wirkt sich wirtschaftlich günstig aus, vor allem dann, wenn die L-Äpfelsäure überwiegend oder ausschliesslich durch Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung hergestellt wird. Das Flüssigkeitsvolumen kann dabei das einfache bis zehnfache, vorzugsweise das zweifache bis fünffache des Volumens bei der Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung oder bei der Züchtung in Fumarsäure-freier oder Fumarsäure-haltiger Nährstoff-Lösung betragen. Das ermöglicht hinsichtlich der Volumina der beiden Arten der Bio-Reaktoren ein Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 10. Mit der aus einer Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung oder aus einer Züchtung in Fumarsäurefreier oder Fumarsäure-haltiger Nährstoff-Lösung resultierenden Zellmasse können mehrere, etwa bis zu drei (vorzugsweise zwei) Fermentationen in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung hintereinander durchgeführt werden. Wird die Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure Lösung mehrfach wiederholt, empfiehlt es sich zur Inaktivierung von dann eventuell auftretenden Kontaminationskeimen, die Pilz-Zellmasse vor jedem erneuten Einsatz für 10 bis 60 Minuten in einer Lösung mit einem tiefen pH-Wert, beispielsweise einem pH-Wert von 2 bis 3, eventuell unter Zusatz eines Bakterizids, zu inkubieren. Derartige Verfahren zur Bekämpfung von Kontaminationskeimen sind bereits von anderen biotechnologischen Verfahren (z. B. der Backhefe-Herstellung) bekannt. Die Erfindung hat folgende Vorteile: - Es werden frei bewegliche Pilze und keine Bakterien (in freier oder imniobilisierter Form) sowie kein erst aus Zellmasse zu isolierendes Enzym verwendet. - Der Fermentationsansatz enthält Kalzium lediglich als Spurenelement (z. B. aus dem Trinkwasser). - Die Fermentationszeit ist kurz, die Produktivität ist gross. - Die Fumarsäure wird überwiegend oder ausschliesslich in Nährstoff-freier Lösung unter optimalen Fermenta tionsbedingungen umgesetzt; die optimalen Wachstums bedingungen des Pilzes brauchen dabei nicht beachtet zu werden. - Die abgetrennte Pilz-Zellmasse kann mehrfach verwendet werden. Während der Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure Lösung können sich Xontaminationskeime nicht nennens wert entwickeln. - Die L-Äpfelsäure fällt nach Fermentation in (Nährstoff haltiger oder Nährstoff-freier) Fumarsäure-Lösung in einer-onzentration von 100 bis 170 g pro Liter an. Die Ausbeute beträgt mehr als 0,9 g L-Äpfelsäure pro Gramm Fumarsäure, also mehr als 77 o/o der theoretischen Aus beute. - L-Äpfelsäure wird in einer Lösung erhalten, die deren Aufarbeitung zu einer für Nahrungsmittel und Pharma zeutika geeigneten Qualität sehr nahe kommt, z.B. hin sichtlich der Abwesenheit von LPS-Toxinen und Bern steinsäure. - Es entsteht keine D-Äpfelsäure. - Das Verfahren ist sehr wirtschaftlich, da überwiegend Bio-Reaktoren einfacher Bauart verwendet werden. Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Fermentation in Nährstoff-haltiger Fumarsäure-Lösung verläuft beispielsweise wie folgt: Beispiel 1 In 1 Liter Trinkwasser werden 125 g Fumarsäure vorgelegt und mit einer Mischung aus NaOH und KOH (9 Teile NaOH und 1 Teil KOH) neutralisiert. Folgende Nährstoffe werden zugegeben: 10 g Saccharose 1 ml konzentrierte Phosphorsäure (H3P04) 1,4 ml konzentrierte Ammoniumhydroxid-Lösung (NH4OH) 0,9 g Magnesiumsulfat (MgS04 7 H20) 30 mg Eisenchlorid (FeC1 6 H20) 3 Ein Fermenter mit 8 Liter Arbeitsvolumen wird mit dieser Nährstoff-haltigen Fumarsäure-Lösung beschickt, thermisch sterilisiert und mit 0,25 Liter Inoculum des Pilzes Aspergillus wentii geimpft. Die Fermentationsbedingungen sind: Belüftung: 0,5 Liter Luft pro Liter Reaktorvolumen und Minute (0,5 vvm) Rührerdrehzahl: 500 Umdrehungen pro Minute (Blattrührer in Kombination mit einem Leitrohr) Temperatur: 30 0 pH-Wert: 7,0 (wird durch Einspeisen von NH40H Lösung mittels Steuerlrng über pH-Elektrode konstant gehalten) Fermentationszeit: 72 Stunden Am Ende der Fermentationszeit sind 132 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 2 Die Fermentation nach Beispiel 1 wird unter Erhöhung der Inoculum-Menge auf 0,8 Liter wiederholt. Nach 48 Stunden Fermentation sind 118 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 3 Die Fermentation nach Beispiel 1 wird unter Einsatz ton 0,8 Liter Inoculum des Pilzes Helminthosporium sativum wiederholt. Nach 72 Stunden Fermentation sind 108 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 4 Die Fermentation nach Beispiel 1 wird unter Einsatz von 0,d Liter Inoculum des Pilzes Penicillium nalgiovensis wiederholt. Nach 72 Stunden Fermentation sind 105 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 5 Die Fermentation nach Beispiel 1 wird mit einer Nähr lqsung, die anstelle von Saccharose 10 g Maismehl pro Liter Lösung enthält, wiederholt. Nach 72 Stunden Fermentation sind 123 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 6 Die Fermentation nach Beispiel 1 wird nach Erhöhung der Saccharose-Menge auf 30 g pro Liter wiederholt. Nach 72 Stunden Fermentation sind 128 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Zur Isolierung der während der Fermentation gebildeten L-Äpfelsäure wird das Pilzmyzel durch Filtrieren vom Kulturfiltrat getrennt und das Kulturfiltrat mit der stöchiometrischen Menge Salzsäure (bezogen auf die eingesetzte Fumarsäure) versetzt. Aus der salzsauren Lösung fällt die geringe Menge nicht umgesetzter Fumarsäure aus und wird abfiltriert. Das Filtrat wird nach Erwärmung auf ca. 60 OC mit der stöchiometrischen Menge Kalziumhydroxid (bezogen auf die gebildete L-Äpfelsäure) versetzt und 60 Minuten bei ca. 90 C gerührt. Anschliessend wird heiss abfiltriert und das Ca-Malat schonend getrocknet. Man erhält aus 8 Liter Kulturfiltrat 1.237 g Ca-Malat. Die Fermentation in Nährstoff-freier Fumarsäure-Lösung verläuft beispielsweise folgendermassen: Beispiel 7 Das durch Filtrieren der 8 Liter Kulturfiltrat des Beispiels 6 erhaltene Pilzmyzel wird in 16 Liter einer 12,5 zeigen Fumarsäure-Lösung (neutralisiert mit STROH und KOH im Verhältnis 9 : 7) suspendiert und in einem schwach gerührten und belüfteten Behälter bei 35 OC inkubiert. Nach 20 Stunden Fermentation sind 111 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 8 Die Fermentation nach Beispiel 7 wird unter Zusatz von 1 g eines oberflächenaktiven Mittels, z. B. eines Emulgators, und 1 g Ammoniumsulfat (1KH4)2SO4 pro Liter Lösung wiederholt. Nach 16 Stunden Fermentation sind 115 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 9 Die Fermentation nach Beispiel 7 wird mit 16 Liter einer 14,0 zeigen (mit WaOH und KOH - im Verhältnis 9 : 1 neutralisierten) Fumarsäure-Lösung wiederholt. Nach 20 Stunden Fermentation sind 142 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstariden. Beispiel 10 Das aus der Fermentation nach Beispiel 7 abgetrennte Pilzmyzel wird in 16 Liter einer 12,5 zeigen Fumarsäure Lösung (neutralisiert mit NaOH und KOH im Verhältnis 9 : 1) suspendiert. Nach 20 Stunden Fermentation sind 113 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Beispiel 11 Das aus der Fermentation nach Beispiel 10 abgetrennte Pilzmyzel wird für eine weitere Fermentation analog zu Beispiel 10 eingesetzt. Nach 24 Stunden Fermentation sind 108 g L-Äpfelsäure pro Liter Kulturlösung entstanden. Bei allen Beispielen wird die Kulturlösung analog zu Beispiel 6 aufgearbeitet.

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung des reinen L-Isomeren der Äpfel säure aus neutralisierter Fumarsäure durch mikroblelle Fermentation mittels frei beweglicher Mikroorganismen in wässriger Phase und einer Kon zentration der L-Äpfelsäure zum Zeitpunkt der Ernte von 100 bis 170 g pro Liter der Kulturlösung, gekennzeichnet durch - Verwenden von Pilzen als Mikroorganismen, - eine Konzentration der vorgelegten Fumarsäure von 11 bis 15 Gew.-%. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch - Herstellen einer wässrigen Lösung der neutralisier ten Fumarsäure, die zusätzlich die für das Wachsen des Pilzes nötigen Nährstoffe enthält, - Impfen der Lösung mit 1 bis 20 * Inoculum des Pilzes, - Fermentieren bei 20 bis 50 0 während 1 bis 3 Tagen, - Abtrennen der Zellmasse und der L-Äpfelsäure aus der Kulturlösung. 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch - Herstellen einer wässrigen Lösung der neutralisierten Fumarsäure ohne Nährstoffe für den Pilz, Zugeben der aus einer Züchtung in Fumarsäure freier oder Fumarsäure-haltiger Nährlösung oder aus einer Fermentation in Nährstoff-haltiger Fu marsäure-Lösung resultierenden Zellmasse zu der Nährstoff-freien Fumarsäure-Lösung, deren Volumen das einfache bis zehnfache des Flüssigkeitsvolu mens der vorangegangenen Züchtung in Fumarsäure freier oder Fumarsäure-haltiger Nährlösung oder der vorangegangenen Fermentation in Nährstoff haltiger Fumarsäure-Lösung ausmacht, wenn die gesamte Zellmasse der vorausgegangenen Züchtung oder Permentation eingesetzt wird, - Fermentieren während 12 bis 24 Stunden bei 25 bis 60 C, - Abtrennen der Zellmasse und der L-Äpfelsäure aus der Kulturlösung. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet durch - mehrfaches Verwenden der abgetrennten Zellmasse in einer jeweils neu angesetzten Nährstoff-freien Fumarsäure-Lö sung. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch - Verwenden von Pilzen aus einer der Ordnungen Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Trichosporon, Taphrina, Helminthosporium, Pythium. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch - Verwenden des Pilzes Aspergillus wentii.

Inventors: SCHINDLER, FRITZ, DR.
Applicants: HULS AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C12P7
IPC codes: C12P7