PURIFICATION OF RECOMBINANT INTERLEUKIN-2

Abstract: Homogeneous recombinant human interleukin-2 is prepared by extraction of IL-2 from the cell membrane components of transformed microorganisms after lysis and purification of the extract by chromatography. <IMAGE>

Description: Reinigung von rekombinanten Interleukin-2 Human-Interleukin-2 (IL-2), in der Vergangenheit als T-Zellen Wachstumsfaktor beschrieben, ist ein lösliches Protein, welches von Lektin- oder Antigen-aktivierten T-Zellen synthetisiert werden kann und das in der Lage ist die Lymphozyten-Reaktivität zu modulieren und die Langzeit-in vitro-Kultur Antigen-spezifischer T-Effektor-Lymphozyten zu fördern. IL-2 verstärkt nachgewiesenermassen auch die Thymo zyten-Mitogenese und induziert cytotoxische T-Lymphozyten -Reaktivität. Somit ist diese Lymphozyten-regulierende Substanz für die Steigerung der humoralen und zellgebundenen Immunantwort und zur Wiederherstellung einer normalen humoralen und zellgebundenen Immunität nützlich. Diese nachgewiesenen immunologischen Aktivitäten zeigen, dass IL-2 zur medizinischen Immuntherapie von Krankheiten des Immunsystems einschliesslich neoplastischer Krankheiten, bakterieller und viraler Infektionen, Immunmangelkrankheiten, Autoimmunkrankheiten usw. eingesetzt werden kann (Papermaster, B. et al., Adv. Immunopharm., 507, (19801). Ein kürzlich erschienener Uebersichtsartikel im Journal of The American Medical Association, Vol. 249. No. 2 (14. Januar 1983) bespricht auf den Seiten 166-171 die klinische Applikation verschiedener Lym phokine unter besonderer Berücksichtigung des Human-IL-2. Die Reinigung von homogenem Human-IL-2 aus induzierten menschlichen malignen Zellen bis zur Homogenität wurde vor kurzem durch ein mehrstufiges hochauflösendes Flüssigkeitschromatographie-Verfahren (HPLC) erreicht. Das resultierende homogene Human-IL-2 war gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität von etwa 1.4 x 109 E/mg (siehe z.B. Europäische Patentanmeldung Nr. 83.109202.8, Publikationsnummer 106 179) Taniguchi et al. berichteten über die Klonierung und Sequenzierung des IL-2 Gens und die Expression von unreifen Human-IL-2 auf dem gThird Annual Recombinant DNA Congress" in Philadelphia, Pennsylvania, am 9. Februar 1983 (Nature, 302, 305-310 (1983j). Die cDNA, von der sich die Aminosäure- sequenz des IL-2 Proteins ableitet. wurde aus mRNA von Jurkat Zellen. die mit Concanavalin A angeregt worden waren, isoliert. Der cDNA Klon mit voller Länge ist 800 Basenpaare lang und codiert für ein Protein mit 153 Aminosäuren. Siehe auch Europaische Patentanmeldung Publikations-Nr. 91539. Auch von anderen Arbeitsgruppen wurde die Klonierung und Sequenzierung des IL-2 Gens beschrieben. Siehe Devos et al., HMolecular Cloning of Human Interleukin-Z cDNA and Its Expression in E coli", Nucleic Acids Research, 11, 4307 -4323 (1983). Siehe auch Europäische Patentanmeldung Publikations-Nr. 118 977. Obwohl die Expression von IL-2 in transformierten Wirtszellen, hauptsächlich in E. coli, in verschiedenen Literaturstellen beschrieben ist, werden keine Reinigungsverfahren offenbart, die es dem Fachmann erlauben werden, reifes rekombinantes Human IL-2 in homogener oder im wesentlichen reiner Form zu erhalten. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem, insbesondere reifem Human-IL-2. Sie beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem reifem Human-IL-2 bis zur Homogenität, das über die Methoden des Standes der Technik hinausgeht un das dadurch gekennzeichnet, dass man (a) einen transformierten Organismus, der eine DNA-Sequenz enthält, die reifes Human-IL-2 codiert, kultiviert; (b) diese Kultur des transformierten Organismus zur Expression und Akkumulation von reifem Human-IL-2 veranlasst; (c) die Zellkultur lysiert; (d) die im Zellysat enthaltenen Zellmembranbestandteile abtrennt: (e) aus den isolierten Zellmembranbestandteilen IL-2 mittels einer Waschlösung extrahiert; und (f) die Waschlösung chromatographisch reinigt. Kurze Beschreibung der Figuren Figur 1 gibt die DNA Nukleotidsequenz von pIL-2-2B und die entsprechende Aminosäuresequenz von reifem Human-IL-2 wieder. Das aminoterminale Ende von reifem IL-2 ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Figur 2 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pRC2, ausgehend von pBR 322. Figur 3 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pRC23 mit einem PL Promotor. Figur 4 beschreibt die Konstruktion des IL-2 Strukturgens, das Ser-IL-2 exprimiert. Figur 5 zeigt schematisch die Konstruktion eines Expressionsvektors ohne ein Promotor-System (pRC 201/IL-2), der reifes IL-2 exprimiert. Figur 6 zeigt schematisch die Konstruktion eines Expressionsvektors mit einem PL Promotor-System, der zur Expression von reifem IL-2 verwendet wurde. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stützt sich auf den überraschenden Befund, dass von einer Mikrobe expremiertes IL-2 dazu neigt, mit der Membranfraktion der Wirts mikrobe, in der Hauptsache mit der inneren Membran der Mikrobe (das ist diejenige Membran deren Lipid-Doppelschicht häufig mit hydrophoben Proteinen assoziert ist), zu assozieren, Die Abtrennung der Membranen während des Aufreinigungsverfahrens für IL-2 aus transformierten Mikroorganismen führt demzufolge zu hohen Ausbeuten und einem Endprodukt von hoher Reinheit. Obwohl verschiedene Verfahren zur Zellyse, z.B. enzymatische oder chemische Lyse, im Zusammenhang mit vorliegender Erfindung angewandet werden können, ist die Lyse durch Beschallung das bevorzugte Verfahren. Die inneren und aussehen Membranen werden dann von den restlichen Zellbestandteilen durch bekannte Verfahren, wie z.B. Zentrifugation, abgetrennt. Nach der Abtrennung der Zellmembranen aus dem Zellysat, werden diese mit Extraktionslösungen, vorzugsweise Salz- und Detergenzlösungen, gewaschen um eine Lösung zu gewinnen, die wenigstens 50% IL-2 enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellmembranen in 4 getrennten Schritten mit Salz- und Detergenzlösungen gewaschen. Der erste Schritt ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellmembranen vorzugsweise mit einer Salzlösung, insbesondere mit 1M NaCl, wäscht. Im zweiten Schritt werden die Zellmembranen mit einer Detergenzlösung, vorzugsweise 1% Triton X-l00, gewaschen. Im dritten Schritt werden die Zellmembranen mit einer weiteren Salzlösung, vorzugsweise 1.75-2 M Guanidin-HCl, gewaschen. Die abschliessende Waschung erfolgt mit einer weiteren Salzlösung, vorzugsweise etwa 4-7 M Guanidin-HCL. Die Waschlösung nach der 4. und letzten Waschung enthält dann ungefähr 50% IL-2. Die letzte Waschlösung wird schliesslich vorzugsweise mit Hilfe der hochauflösenden Flüsssigkeitschromatographie (HPLC) an Umkehrphasen chromatographisch gereinigt. Dieser HPLC-Reinigungsschritt führt zu aktivem, in fast 100% reiner oder homogener Form vorliegendem IL-2. Es ist auch denkbar, dass Antikörper-Affinitätschromatographie-Säulen, mit poly- oder monoclonalen Antikörpern gegen IL-2, anstelle von HPLC benutzt werden können. Andere chromatographische Reinigungsverfahren wie Farbstoff-Affinitätschromatographie (z.B. mit Procion Rot Agarose, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83103582.9, veröffentlicht am 26. Oktober 1983 unter Publikations-Nr. 92163, beschrieben) oder Sephacryl S200 Säulen können ebenfalls benutzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Chromatographie mehrstufig durchgeführt, d.h. auf HPLC-Chromatographie folgt anschliessend Farbstoff-Affinitätschromatographie. Das gemäss vorliegender Erfindung gereinigte IL-2 kann in gleicher Weise wie die anderen bekannten Substanzen mit immunmodulierender Aktivität verwendet werden, z.B. als Mittel zur Behandlung von immunsuppressiven Zuständen. Es kann in Form pharmazeutischer Präparate oral. durch Injektion oder lokal verabreicht werden, Dosis und Dosierfrequenz können entsprechend der Erfahrung bei der klinischen Applikation von bekannten immunmodulierenden Substanzen, tb- licherweise 1-200 x 106 Einheiten täglich, festgesetzt werden. Die aus dieser Erfindung resultierenden Arzneimittel enthalten besagtes IL-2 zusammen mit physiologisch verträglichem Trägermaterial. Alle üblichen Trägermaterialien können verwendet werden. Das Trägermaterial kann ein inertes, organisches oder anorganisches Material sein, welches sich zur enteralen, perkutanen oder parenteralen Darreichung eignet. Als Träger eignen sich Wasser, Gelatine, Gummi ara bicum, Lactose, Maisstärke, Stearinsäure, Talk, vegetabile Oele, Polyalkylenglykole, insbesondere Polyäthylenglykole, natürliche Vaseline und dergleichen. Des weiteren können die pharmazeutischen Präparate weitere pharmazeutisch aktive Wirkstoffe enthalten. Zusätzliche Additive wie Aromatisierungsmittel, Ueberzugsmittel, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel, Puffer und dergleichen können mittels üblicher galenischer Verfahren zugefügt werden. Die pharmazeutischen Präparate können in jeder Darreichungsform hergestellt werden, d.h. a) in fester Form, z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, Pudern, Granulaten und dergleichen zur oralen Verabreichung; b) in flüssiger Form, z.B. in Form von Lösungen, Sirups, Suspensionen, Elixieren und dergleichen zur oralen Verabreichung; c) als Präparate zur parenteralen Verabreichung, z.B. als sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen; und d) als Präparate zur lokalen Anwendung in Form von Lösungen, Suspensionen, Salben, Cremes, Gelbes. mikronisierten Pudern, Aerosolen und dergleichen. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert werden und/oder können Hilfsmittel wie z.B. Ueberzugsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel. Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes und/oder Puffer enthalten. Als parenterale Verabreichungsformen kommen Infusions- oder Injektionslösungen, die intravenös oder intramuskulär injiziert werden können, in Frage. Die Konstruktion von IL-2 Expressionsvektoren und Transformanden, die in der Lage sind, IL-2 zu exprimieren wird im Detail hiernach beschrieben. Die Aminosäure-Sequenz von reifem IL-2 Protein ist in Figur 1 gezeigt. Das Protein kann in seiner reifen Form mit Methionin als aminoterminaler Aminosäure exprimiert werden unter der Voraussetzung. dass das Initiationscodon am Genan fang ATG ist. Das Methionin wird u.U. von der Wirtszelle nach der IL-2 Expression abgespalten. Die bei dieser Erfindung benutzten Expressionsvektoren sind pBR322 Derivate, die den PL-Promotor, der aus Bakteriophagen-Lambda-DNA isoliert wurde, enthalten. Pt ist der Promotor der Wahl, da er ein sehr starker Promotor ist, der wirksam vom Lambda-cI-Repressor kontrolliert wird, dessen Gen entweder auf dem Chromosom des Mikroorganismus, dem Vektor, der den PL Promotor enthält oder einem anderen kompatiblen Vektor lokalisiert ist. Das Gen, das für den Repressor codiert, trägt eine cIts Mutation, die einen temperatursensitiven Repressor zur Folge hat. Solch ein Vektor, der bei dieser Erfindung benutzt werden kann und der die cI Mutation trägt, ist der Vektor pRK 248 cIts, der in der Forschung bekannt und von Kahn et al., Methods in Enzymology, 68, 268 (1979), beschrieben wurde. Bei einer Temperatur von 300C funktioniert der Repressor normal, jedoch bei Temperaturen von etwa 370-420C wird er inaktiviert. Der Pt Promotor wird also bei 300C repremiert (abgedreht) und bei 370-420C derepremiert (angedreht). Diese Art der PL Promotor-Kontrolle erlaubt es, die Kultur bei etwa 300C-360C ohne Expression des gewünschten Genprodukts wachsen zulassen, um dann zu einem optimalen Zeitpunkt die Temperatur auf etwa 420C zu erhöhen, bei der das gewünschte reife Human-IL-2 Produkt exprimiert wird. Der bei dieser Erfindung bevorzugt benutzte Vektor besitzt eine zusätzliche EcoR1 Schnittstelle distal zur SD Sequenz (stromabwärts in 3' Richtung). Die folgende Beschreibung dient zur Illustration der Konstruktion eines bevorzugten Vektors, des Vektors pRC23, in den das IL-2 Gen eingeführt wird. Andere Vektoren können jedoch auch benutzt werden. Gemäss dem in den Figuren 2 und 3 beschriebenen Verfahren wurden 20 Mikrogramm pBR322 DNA mit EcoRl verdaut und anschliessend in zwei verschiedenen Reaktionen eingesetzt: 1. zur Behandlung mit S1 Nuklease, um die 5'- überhängenden Enden zu entfernen, und 2. zur Behandlung mit DNA Polymerase I Klenow Fragment, um die kohäsiven Enden aufzufüllen. Beide Reaktionen wurden durch Phenol- und anschliessende Aethanolextraktion gestoppt. Die DNA aus jedem der Reaktionsansätze wurde mit synthetischen Bgl II Verbindungssequenzen kombiniert, mit Bgl II und Pst I verdaut und danach an 1% Agarose elektrophoretisch aufgetrennt. Die 3600 BP (Basenpaare) und 760 BP-enthaltenden Fragmente aus beiden Reaktionsansatzen wurden aus dem Gel isoliert. Zur Konstruktion von pRC2, wurde das 3600 BP-enthaltende Fragment aus der Klenow Reaktion mit dem 760 BP-enthaltenden Fragment, der S1 Reaktion kombiniert. Der E. coli Stamm RR1 wurde mit dieser DNA-Kombination transformiert und Transformanden wurden in einem Medium mit 50 Bg/ml Ampicillin selektioniert. Transforman- den mit der erwarteten Plasmid-Kombination, d.h. einem Plasmid mit einer Bgl II-Schnittstelle in unmittelbarer Nahe der EcoR1-Schnittstelle, wurden durch Restriktionsanalyse der isolierten Plasmid-DNAs identifiziert. Das Plasmid pRC 23 wurde durch die Kombination eines synthetischen Oligonukleotids, welches für eine *consensus" RBS (vom Computer entwickelte Ribosomen-Bindungsstelle) codiert (Scherer et al. Nucleic Acids Research, 8, 3895 (1980)j, mit einem 250 BP -enthaltenden Bgl II-Hae III Fragment, welches den Lambda PL Promotor enthält, und dem Plasmid pRC2 konstruiert. Um das 250 BP-enthaltende DNA-Fragment zu isolieren, welches den Lambda PL Promotor enthält, wurde 1 Mikrogramm 450 BP-enthaltendes Bgl II-HpaI DNA Fragment (von BP # 35260 bis 35710 der Lambda Phagen DNA-Sequenz) mit Hae III verdaut und die resultierenden Produkte wurden mit Hilfe praparativer Gelelektrophorese an 5% Polyacrylamid isoliert. Ungefähr 200 ng des 250 Bp-enthaltenden Bgl II-Hae III Fragments wurden mit je 60 pM der in Figur 3 gezeigten synthetischen Oligonukleotide kombiniert, welche für den grössten Teil einer Wconsensusn RBS-Sequenz codieren, deren Sequenz, wie von Scherer et al. beschrieben, mittels Computer-Analyse entwickelt wurde. Die resultierenden Moleküle wurden dann mit Bgl II und EcoRl behandelt (um Oligomere auszuschliessen), gelelektrophoretisch gereinigt und mit pRC2 DNA, die ebenfalls mit Bgl II und EcoR1 behandelt wurde, kombiniert. Die Transformation von E. coli RR1 (pRK 248 cIts) mit dieser DNA-Kombination wurde nach Standardverfahren durchgeführt und die Transformanden wurden in einem Medium mit 50 ug/ml Ampicillin bei 300C selektioniert. 50 Transformanden wurden erhalten, von denen 8 für die weitere Analyse ausgewählt wurden. Die Plasmid DNAs dieser 8 Transformanden wurde isoliert und mittels Hinc II-Spaltung analysiert. 6 dieser 8 Plasmid DNAs zeigten das erwartete Restriktionsmuster und auch die Nukleotidsequenz-Analyse nach Maxam-Gilbert von einer dieser 6 bestätigt die erwartete Konstruktion (bezeichnet als pRC 23). Konstruktion eines Expressionsvektors. der für reifes Human -IL-2 codierende DNA enthält (1) Isolierung von Human-IL-2 codierender mRNA mRNA wurde aus H33HJ-JAI Zellen (ATCC Nr. CRL-8163, hinterlegt am 26. August 1982), einem Klon der Jurkat Zellinie FHCRC, nach Induktion mit PHA und PMA isoliert. 12000 ml *33HJ-JAI-Klon Zellkulturen 6 Zellen/ml) wurden in RPMI 1640 Gewebekultur-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 50 E/ml Penicillin, 50 Bg/ml Streptomycin, 50 g/ml Gentamycin und 300 g/ml frischem L-Glutamin, wachsen gelassen. Diese Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 6 1 des zuvor ausführlich beschriebenen Mediums, ohne Serum, jedoch ergänzt mit 18 PHA und 10 ug/ml PMA, resuspen diert. Jeweils 6 1 resuspendierte Zellen wurden auf sterile Glaswalzenflaschen verteilt und auf ein Walzwerk gelegt (10 U/min. bei 370C). 8 Stunden später, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und die mRNA wurde durch ein Phenol-Chloroform -Standardverfahren extrahiert. Danach wurde die Aetha nol-gefällte RNA durch Hochgeschwindigkeitszentrifuga tion sedimentiert und in einer 0,5 M Salzlösung aufge nommen. Oligo-(dT)-Cellulose-Chromatographie wurde be nutzt um die mRNA mit poly(A)-Ende von der Gesamt-ENA abzutrennen. Die Aethanol-gefällte mRNA wurde in Hasser in einer Konzentration von 500 g/ml auf genommen. 30 ng RNA wurden dann in Xenopus Oozyten mikroinjiziert. Nach 24 Stunden Inkubation in steriler Barth's Lösung, wurden 4 Eier in sterile 1.5 ml Eppendorf-Hütchen über führt und mit 500-1500 ul frischer, steriler Barth's Lösung gefüttert. Nach 48 Stunden wurden 200 > 1 Inku bationsmedium geerntet und mit einem Standard CTLL-Zell -3H-Tdr-Einbautest (Gillis et al., J. Immunol. 120, 2027 ±1978)) auf IL-2 Aktivität getestet. mRNA Proben, die nach der Translation im Oozytentest eine deutliche IL-2 Aktivität zeigten, wurden gesammelt, nach ihrer Grösse durch Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugation auf getrennt und nach Aethanol-Fällung zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek verwendet. (2) cDNA-Synthese 3,5 Bg gereinigte mRNA (mit einem Sedimentations -Koeffizient von 10S im Sucrosegradienten) wurden zur Herstellung doppel.strängiger komplementaerer DNA (ds cDNA) nach der folgenden Methode (Gubler and Hoffmann, Gene 25, 263-269 ±1983)) verwendet. (a) Erststrang cDNA Synthese: Die mRNA wurde in 17,5 > 1 Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM Mg12. 10 mM DTT, 4 mM Na-Pyrophosphat, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dGTP, 1,25 mMdTTP, 0,5 mM dCTP, 100 BgXml Oligo (dT)12 18 und 10 Ci 32P-dCTP (Amersham 3000 Ci/mMol) inkubiert. Nach 5 Minuten Inkubation bei 430C wurden 3000 Einheiten AMV reverse Transcriptase/ml zur Inkubationsmischung gegeben und diese für weitere 30 Minuten bei 43"C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu 20 mM gestoppt, das cDNA-mRNA Hybrid mit Phenol -Kresol extrahiert und durch Aethanol-Fällung kon zentriert. Die Ausbeute der Erststrang Synthese betrug 58,6 ng (1,7%) gemessen durch TCA-unlösliche Radioaktivität. (b) Zweitstrana cDNA Synthese: Das cDNA-mRNA Hybrid wurde in 5,8 > 1 H2O aufge nommen. Zu dieser Lösung wurden 7,7 ul Zweit strang-Synthesemix gegeben um eine Lösung mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM Mg12, 10 mM (NHss)2S04, 100 mM KC1, 0,15 mM beta-NAD, 50 iig/ml BSA, 40 mM dNTPs, 8,5 Einheiten/ml E. coli RNase H (Bethesda Research Labs), 230 Einhei ten/ml DNA Polymerase I, 10 Einheiten/ml E. coli DNA Ligase zu erhalten. Die Mischung wurde zuerst für 60 Minuten bei 12"C und dann für 60 Minuten bei 220C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu 20 mM gestoppt und die ds cDNA mit Phenol -Kresol extrahiert. Eine mit Sephadex G-50 fein gefüllte, mit 10 mM TEAB äquilibrierte Säule wurde benutzt, um die ds cDNA von den freien Nukleotiden abzutrennen. Die Ausbeute dieser Reaktion betrug 107 ng ds cDNA (91%). (c) VerknüPfunq und Transformation 64 ng ds cDNA wurden mit Deoxyguanosin (dG)-Resten nach Standardmethoden verlängert. Der Vektor, pBR322, wurde zuerst mit EcoRV verdaut und an schliessend mit Deoxycytidin (dC)-Resten ver längert. 100 ng verlängerte pBR 322 DNA und 1,25 ng verlängerte cDNA-Fragmente (Verhältnis 80:1) wurden in 250 iil 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl für 90 Minuten bei 580C verbunden und zur Transformation mit kompetenten E. coli RR1 Zellen verwendet. Die transformierten Zellen wurden auf LB Platten mit 100 ug/ml Ampicillin ausplattiert und für 12 Stunden bei 370C inkubiert. Es wurden 3200 Kolonien für die IL-2 cDNA-Bibliothek erhalten. (3) Sichten der cDNA-Bibliothek nach IL-2 Gensequenzen Zum Auffinden von cDNA-Kopien mit vollständigen IL-2 Gensequenzen wurde eine synthetische Deoxynukleotidsonde benutzt, die den von Taniguchi et al. (Nature 302, 305- -310 (19833) veröffentlichten Nukleotiden 45-65 der Human-IL-2 cDNA-Sequenz entspricht. Diese Sonde (ACAATGTACAGGATGCAACTC) wurde nach der Festphasen-Phos phordiestermethode chemisch synthetisiert, mit HPLC gereinigt und mit 32P-ATP (ICN Pharmaceuticals, 7000 CiSmM) und Polynukleotidkinase markiert. Kolonien der cDNA-Bibliothek wurden nach der Methode von Grun stein und Hogness (Methods in Enzymology 68, 379 ±19793) auf Nitrocellulose-Filter übertragen. Nach Hybridisie rung bei 30"C für 16 Stunden, wurden die Filter in 4 x SSC Puffer bei 450C für 45 Minuten gewaschen, ge trocknet und für die Autoradiographie verwendet. Eine einzige positive Kolonie wurde erhalten. welche die vollstandige IL-2 Gensequenz enthielt. Von dieser Kolonie. pIL-2-2B bezeichnet. wurde Plasmid DNA herge stett und für die Nukleotidsequenz-Analyse und die Expression in E. coli verwendet. Die Nukleotidseguenz war bis auf zwei Veränderungen mit der von Taniguchi et al. veroffentlichten Sequenz identisch. Diese Verande rungen sind: ein Insert, welches bei Nukleotid 17 der Taniguchi Sequenz beginnt und ein Austausch von G in Position 503. (4) Herstellung eines E. coli Plasmidvektors, der für Ser-IL-2 codierende DNA enthält Ein E. coli Expressionsvektor, der Ser-IL-2 codierende DNA enthält, wurde durch Kombination dreier Segmente hergestellt (siehe Figur 4):(1) dem Vektor pRC23 mit dem Lambda PL Promotor, (2) einem synthetischen Verbin dungsstück und (3) einem aus IL-2 cDNA isolierten HgiAI -Aha III Fragment. pRC23 Vektor DNA (50 ng) wurde mit EcoR1 und EcoRV verdaut, mit Phenol extrahiert und dann mit Aethanol präzipitiert. Das synthetische Adapterstück wurde durch Hybridisierung zweier komplementärer synthetischer Deoxynukleotid-Sequenzen, A und B hergestellt: : (A) 5'AATTCAATTATGAGTGCA 3' (B) 3' GTTAATACTC 5' Dieses doppelsträngige Verbindungsstück kann an seinem 5'Ende mit einer EcoRl-Schnittstelle und an seinem 3' Ende mit einer HgiAl-Schnittstelle verbunden werden. Das 1 Kb grosse IL-2 cDNA-Insert wurde aus pIL-2-2B DNA nach Behandlung mit dem Restriktionsenzym Bam H1 durch Gelreinigung isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit HgiAI und Aha III nachbehandelt, mit Phenol extrahiert und mit Aethanol präzipitiert. HgiAI schneidet zwischen dem Alanin und dem Prolin Codon am Anfang der für reifes IL-2 codierenden Sequenz. Bei der Klonierung zur Expression des entsprechenden IL-2 Gens wird die dem PL Promotor benachbarte EcoRl-Schnittstelle des Vektors pRC23 benutzt. Das synthetische Verbindungsstück kann diese EcoRl-Schnittstelle mit der HgiAI Schnittstelle am Anfang des IL-2 cDNA-Fragments verbinden. Durch die Verknüpfung des Verbindungsstückes mit der cDNA werden gleichzeitig das für den Translationsstart notwendige Methionin-Codon und die Codons für Serin und Alanin, die ersten Aminosäuren des reifen IL-2 Proteins, erzeugt. Die cDNA wird mit dem stumpfen Aha III Ende über das stumpfe EcoRV Ende mit der pRC23 Vektor DNA verbunden. Die Kombination der drei DNA-Segmente wurde in 10 ijl Reaktionsmischung, enthaltend 65 mM Tris, pH 7,6, 10 mM Mg1,. 0,5 mM ATP, 15 mM beta-Mercaptoäthanol und je 2 0,05 pM DNA des Vektors, des synthetischen Verbindungsstückes und des cDNA-Inserts, durchgeführt. Das Kombinationsgemisch wurde zuerst für 5 Minuten auf 650C erhitzt, dann auf 40C abgekühlt und nach Zugabe von 200 Einheiten T4 DNA Ligase für 16 Stunden bei 40C inku biert. Die T4 DNA Ligase wurde durch Erhitzen der Reak- tionsmischung auf 650C für 5 Minuten inaktiviert. An schliessend wurden die verbundenen DNA-Fragmente mit EcoRV behandelt, um nichtverdaute Vektor-DNA zu besei tigen. Die Mischung wurde dann zur Transformation mit E. coli RR1 (pRK 248 cIts) verwendet. Diese Zellen wurden bei 300C für 15 Stunden wachsen gelassen. Die Kolonien wurden, wie zuvor beschrieben, auf Nitro cellulosefilter übertragen, getrocknet und mit der 32P-markierten synthetischen Deoxynukleotidsequenz A hybridisiert. Eine positive Kolonie, pRC 23/IL-2 # 4-1 bezeichnet, wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Dieser Klon synthetisierte mehr als 200 000 Einheiten/ml IL-2, nachdem der PL Promotor durch die Temperaturer höhung auf 420C induziert worden war. Die IL-2 Aktivität wurde mittels biologischem Test auf CTLL Zellen, eine Indikator-Zellinie für IL-2 (beschrieben von Gillis et al. J. Immunol. 120, 2027 (1978)), nachgewiesen. (5) Herstellung eines E. coli Exnressionsvektors, der reif es IL-2 synthetisiert (mit Alanin am aminoterminalen Ende). Zur Expression von reifem IL-2 in E. coli, wurde der folgende Weg gewählt. Wie in Figur 5 gezeigt, befindet sich an der Ser-Ala Peptidbindung, die gleichzeitig die Schnittstelle zum Entfernen des Signalpeptids darstellt (Robb et al., PNAS, 80, 5990-5994 (1983)), eine HgiAI -Schnittstelle. Nach Behandlung mit HgiAI wurde das kohäsive Ende durch Behandlung mit T4 DNA Polymerase in ein stumpfes Ende umgewandelt. Das resultierende Frag ment wurde dann über sein stumpfes Ende mit einem aus dem Phagen Lambda isolierten 108 BP BglII-Hae III-Frag ment verbunden, danach mit Bgl II und Xba I behandelt und zwischen die Restriktionsschnittstellen Bgl II und Xba I des Vektors pRC23/IL-2, &num; 4-1. gehängt. Dieser Klonierungszwischenschritt wurde gemacht um sicher zu gehen, dass die T4-DNA Polymerase-Behandlung wie erwartet funktioniert hat, was durch die Schaffung einer neuen Stu I-Schnittstelle durch Verbindung des Hae III Endesemit dem stumpfen HgiAI-Ende bestätigt wurde. Nachbehandlung mit Stu 1 stellt das mit dem Prolin-Codon CCT beginnende stumpfe Ende an dieser Stelle wieder her. Diese Plasmid-Zwischenkonstruktion wurde pRC 201/IL-2 bezeichnet. Es wurden 2 synthetische Deoxyoligonucleotide geschaffen, die ein ATG-Translations-Startcodon enthalten, das Codon für die Aminosäure Alanin wiederherstellen und ein EcoRl Ende erzeugen. Diese Oligomere wurden über die EcoRl Enden mit dem Expressionsvektor pRC23 verbunden. Das so erhaltene Produkt wurde mit Pst I nachbehandelt. so dass ein 1025 BP-enthaltendes Fragment entstand, welches mittels Gelelektrophorcse isoliert wurde. Das 1025 BP-enthaltende Fragment (mit einem Pst I und einem stumpfen Ende) wurde zwischen die Pst I - und die neu geschaffene Stu I-Restriktionsstellen des Plasmids pRC201/IL-2 eingefügt. Zur Identifizierung von Transformanden mit gewünschter Konstruktion wurden die Plasmid DNAs isoliert und durch Restriktionsenzymanalysen überprüft. Die bestätigte Plasmid -Konstruktion wurde pRC233/IL-2 bezeichnet (siehe Figur 6). Bevorzugte Wirtsorganismen zur Transformation mit einem Vektor, der das IL-2 Gen entält, sind erfindungsgemäss Bakterien, wie z.B. E. coli; Bacillaceae, wie z.B. Bacillus subtilis und dergleichen. Hefen bilden eine weitere Gruppe bevorzugter Mikroorganismen zur Transformation. Ein besonders bevorzugter Mikroorganismus, der als Rezipient bei den Transformationen verwendet wird, ist E. coli K-12 Stamm 294, wie in der britischen Patentanmeldung Nr. 20 55 382 A beschrieben. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection am 28. Oktober 1978 unter der ATCC Nr. 31 446 deponiert. Ausserdem können auch andere E. coli Stämme, wie z.B. E. coli RRl, ATCC Accession Nr. 31 343, oder andere Mikroorganismen, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind, als Wirtsorganismen benutzt werden. Bei der Umsetzung dieser Erfindung in die Praxis werden Uebernachtkulturen der transformierten E. coli Zellen in LB-Medium bei 300C wachsen gelassen. Ein Liter der Uebernachtkulturen wird vorzugsweise mit M-9 Minimalmedium, ergänzt mit Casaminosäuren, auf 10 Liter verdünnt. Nach dem Eintritt in die logarithmi sche Wachstumsphase wird die Wachstumstemperatur der Kultur zur Induktion der IL-2 Produktion von 300C auf 42"C erhöht. Nach 2-3-stündiger Inkubation be2 420C werden die Bakterien mittels Zentrifugation gesammelt. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt. Die Reinigungsschritte sind im Detail in den folgenden Bei spielen beschrieben. BeisPiel 1 1 g transformierter E. coli Zellen, die IL-2 (mit Serin am aminoterminalen Ende des Proteins) herstellen, wurden in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsul fonylfluorid resuspendiert und durch Beschallen lysiert. Das Lysat wurde bei 14000 x g 15 Minuten zentrifugiert. Die Membranbestandteile des zentrifugierten Lysats wurden von den anderen Lysat-Bestandteilen abgetrennt. Die Membranbestandteile wurden dann 4 Wasch- oder IL-2-Extraktionsschrit- ten unterworfen. deren Ergebnisse in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Für jede Waschung wurden 5 ml Waschlösung pro Gramm Zellen verwendet. Wie in Tabelle 1 im Detail zusammengefasst, wurde der Hauptteil der IL-2-AkLivität bei der letzten Waschung extrahiert. Diese Waschlösung, die den Hauptteil der IL-2-Aktivität und wenigstens 50% reines IL-2. gemessen mit Hilfe von SDS-PAGE, enthielt, wurde direkt der Umkehrphasen-HPLC (RP-C8) unterworfen. Die Ausbeute betrug 40-60% fast 100% reines IL-2 (mit Serin am aminoterminalen Ende des Proteins). Die Ausbeute an biologischer IL-2-Akti vität lag bei 1 x 108 Einheiten/mg. vität lag bei 1 x Einheiten/mg. Tabelle 1 Extraktion von IL-2 aus E. coli Membranen Gesamt- Gesamt IL-2 Spezifische Protein Aktivität Aktivität Extraktion (mg (Einheiten) (E/mq) Waschung mit 1 M NaCl 0,4 mg 0,03 x 106 0,1 x 106 Waschung mit 1% Triton 2 mg 0,75 x 106 0,4 x 106 Waschung mit 1,75 M Guanidin-HCl 1 mg 1,5 x 106 1,5 x 106 Waschung mit 7 M Guanidin-HCl 4,7 mg 250 x 106 53 x 106 (99%) 252,3 x 106 BeisPiel 2 Dieses Beispiel dient zur Darstellung der Neigung von IL-2, sich an die Zellmembranbestandteile der transformierten E. coli Wirtszellen zu assoziieren. Um dies zu zeigen, wurden 1 g transformierter E. coli Zellen, die IL-2 mit Serin am aminoterminalen Ende herstellen1 in 10 ml 20%-prozentiger Sucrose, 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 aufgenommen und mit Lysozym-EDTA lysiert um die im periplasmatischen Raum lokalisierten Proteine abzutrennen. Der Rest des Lysats wurde anschliessend beschallt. Die Membranen (innere und äussere Membran) wurden durch Sucrosegradient-Zentrifugation von den anderen zellulären Komponenten ab- und in innere und äussere Membranen aufgetrennt. Tabelle 2 zeigt, dass die Hauptmenge der biologischen IL-2-Aktivität bei der inneren Zellmembran zu finden ist. Tabelle 2 Lokalisierung von IL-2 in E. coli Zellen Gesamt- Gesamt IL-2 Ausbeute an Protein Aktivität IL-2 Fraktionen (mg) (Einheiten) Lösliche Fraktion 37 mg 2 x 106 0,3 Per iplasmische Fraktion 2 mg 10 x 106 1,5 Aeussere Membran 6 mg 8 x 106 1,2 Innere Membran 15 mg 6,6 x 108 97 BeisPiel 3 1 g transformierter E. coli Zellen, die reifes IL-2 herstellen, wurden in 30 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert und durch Beschallen lysiert. Das Lysat wurde bei 14000 x g 15 Minuten zentrifugiert. Die Membranbestandteile des zentrifugierten Lysats wurden von den anderen Lysatbestandteilen abgetrennt. Die Membranbestandteile wurden dann 4 Wasch- oder IL-2 -Extraktionsschritten unterworfen, deren Ergebnisse in Tabelle 3 zusammengefasst sind. Für jede Waschung wurden 5 ml Waschlösung pro Gramm Zellen verwendet. Wie in Tabelle 3 im Detail zusammengefasst, wurde der Hauptteil der IL-2 Aktivität bei der letzten Waschung extrahiert. Diese Waschlösung, die den Hauptteil der IL-2 Aktivität und wenigstens 50rb reines IL-2, gemessen mit Hilfe von SDS-PAGE, enthielt, wurde direkt der Umkehrphasen-HPLC (RP-C8) unterworfen. Die Ausbeute betrug ungefähr 60% fast 100% reines IL-2 Protein. Die Ausbeute an biologischer IL-2-Aktivität lag bei 4 x 108 Einheiten/mg. Tabelle 3 Extraktion von reifem IL-2 aus E. coli Membranen Gesamt- Gesamt IL-2 Spezifische Protein Aktivität Aktivität Extraktion (mg) (Einheiten) tE/ma) Waschung mit 1 M NaCl 0,5 0,3 x 106 0,6 1 106 Waschung mit 1% Triton 3,3 5,5 x 106 1,7 x 106 Waschung mit 1,75 M Guanidin-HCl 2,5 10,0 xl06 4,0 x 10 Waschung mit 7 M Guanidin-HCl 10,1 779 x 106 77,1 x 106 (98) 794,8 xl06 BeisPiel 4 Das folgende Beispiel beschreibt die Reinigung von reifem IL-2 aus einer Paste transformierter E. coli Zellen durch Procion-Rot Agarose-Chromatographie und HPLC. Zellmembranextraktion Gefrorene E. coli Zellen (enthaltend ein für Human IL-2 codierendes Plasmid) werden aufgetaut und 1 g dieser Zellen wird in 5 ml Puffer A (0,03 M Tris-HCL, pH 8,0, 0,005 M EDTA) aufgenommen. Die resultierende Zellsuspension wird dann 15 Minuten gerührt und danach werden die Zellen durch Zentrifugation in einem Sorvall SS-34 Rotor (10000 U/min. während 10 Minuten) gesammelt. Der Ueberstand wird verworfen und die Zellen werden in 5 ml Puffer A resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden mit einem Ultraschallgerät aufgebrochen (6 x 30 Sekunden). Die aufgebrochenen Zellen werden abzentrifugiert (10000 U/min. während 10 Minuten) und der Ueberstand mit den löslichen Proteinen wird verworfen. Der Rückstand wird einmal mit 5 ml Puffer A gewaschen und abzentrifugiert (10000 U/min. während 10 Minuten). Der Rück- stand, welcher der Membranfraktion entspricht, wird in Puffer B (1 M NaCl, 0,03 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 M EDTA) mit einem Gewebehomogenisator aufgelöst und 10 Minuten gerührt. Die Membranfraktion wird durch Zentrifugation in einem Sorvall SS-34 Rotor (15000 U/min. während 10 Minuten) abzentrifugiert. Der Rückstand wird in 5 ml Puffer C (1% Triton X-100, 0,03 M Tris-HCl, pH 8,0) gelöst, homogenisiert, gerührt und erneut abzentrifugiert (15000 U/min. während 10 Minuten). Der Rückstand wird in 5 ml 1,75 M Guanidin-HCl gelöst, homogenisiert, gerührt und abzentrifugiert (15000 U/min. während 10 Minuten). Der resultierende Rückstand wird einmal mit 5 ml Puffer A gewaschen und abzentrifugiert. Die Membranfraktion (Rückstand) wird mit 5 ml 7 M Guanidin-HCl extrahiert. Nach der Zentrifugation wird der IL-2 enthaltende Extrakt aufbewahrt und der Rückstand ein zweites Mal mit 5 ml 7 M Guanidin-HCl extrahiert. Dieser Extrakt wird ebenfalls aufbewahrt. Procion-Rot Avarose-Chromatoqraphie Die Säule wird bei Raumtemperatur gefüllt, mit zwei Säulenvolumen 7 M Guanidin-HCl gewaschen und dann bei 4"C mit Aequilibrierungspuffer (0.01 M Tris-HCl, pH 7.9, 0,035 M NaCl) äquilibriert. Mindestens 1 ml Procion Rot Agarose sollte pro 100 pg erwartetes IL-2 Protein verwendet werden. Die Durchflussrate beträgt 2 Bettvolumina pro Stunde. Der IL-2 enthaltende 7 M Guanidin-HCl Extrakt wird 40-fach mit Aequilibrierungspuffer verdünnt und das Präzipitat durch Zentrifugation entfernt. Mit dem resultierenden Ueberstand wird die Säule beladen. Die Säule wird mit zwei Säulenvolumina Aequilibrierungspuffer gewaschen. IL-2 erscheint in einem Gipfel nach 1,5-2 Volumina Elutionspuffer (0,01 M Tris-HCl, pH 7,9, 1,035 M NaCl). Nach der Elution des IL-2, wird die Säule durch Waschen mit 6 M Guanidin-HCl von Fresd- material gesäubert. HPLC (C-18)-Chromatoqraphie Der pH des Procion-Rot-Eluats wird durch langsame Zugabe von 1,0 M Essigsäure auf 7 eingestellt. Proben von jeweils 0,1 ml werden zur Bestimmung der Aktivität vor und nach der pH-Einstellung entnommen. Das neutralisierte Eluat (60 ml) wird mit einer Durchflussrate von 1 ml/Minute auf eine 0,31 x 25 cm RP-18 Säule gepumpt und mit einem Puffergemisch, bestehend aus 5% HPLC-Puffer II und 95% HPLC-Puffer I äquilibriert. Der Säulendurchfluss wird gesammelt und bezüglich seines Proteingehalts und seiner biologischen IL-2 Aktivität untersucht. Die Säule wird bei Raumtemperatur nach dem in Tabelle 4 beschriebenen Gradientenprofil eluiert. Der Durchfluss wird bei 220 nm Wellenlänge gemessen und 1,5 ml Fraktionen werden gesammelt. Ihr Proteingehalt und ihre biologische IL-2 Aktivität werden bestimmt. Der Peak mit maximaler IL-2 Aktivität eluiert bei ca. 74% HPLC-Puffer II (59% Acetonitril). Die Fraktionen werden bei 4-80C aufbewahrt und gemäss ihrer spezifischen Aktivität vereint. Tabelle 4 Durchführungsbedingungen für die HPLC (RP-18-Säule) eines typischen Procion-Rot Eluats. Probenmenge: 60 ml Sulenabmessungen 0,41 x 25 cm HPLC-Puffer I: 0,01 M Phosphorsäure, 0,05 M Lithiumchlorid HPLC-Puffer II: 0,01 M Phosphorsäure, 0,05 M Lithiumchlorid, 80% Acetonitril Durchflussrate: 1 ml/min % HPLC-Puffer II Dauer (Min) Aequilibrierung 5 20 Probenmenge - 60 Waschen 5 15 Schritt 1, Gradient 5-35 15 Schritt 2, Gradient 35-85 50 Schritt 3, konstant 85 5 Schritt 4, konstant 5 5 Alle Chromatographieschritte werden bei Raumtemperaturen durchgeführt.

Claims: A process for the production of homogeneous mature recombinant human interleukin-2 (IL-2), characterized by a) cultivating microorganisms transformed with a DNA sequence which codes for mature human IL-2; b) causing the transformed microorganisms to express and accumulate mature human IL-2; c) lysing the microorganisms to give a cell lysate; d) separating the cell membrane components present in the cell lysate; e) extracting IL-2 from the isolated cell membrane components using a wash solution which contains about 4 to 7M guanidine HCl; and f) chromatographically purifying the IL-2 from the wash solution. A process according to claim 1, characterized in that the transformed microorganisms are lysed by sonification. A process according to claim 1 or 2, characterized in that the cell membrane components are separated from the cell lysate by centrifugation. A process according to any one of claims 1-3, characterized in that the isolated cell membrane components are washed with salt and detergent solutions prior to the extraction of the IL-2 with a wash solution containing about 4 to 7M guanidine HCl. A process according to claim 4, characterized in that the washings with the salt and detergent solutions are carried out in 3 sequential, separate process steps. A process according to claim 5, characterized in that the cell membrane components are washed in the first process step with a NaCl solution, in the second process step with a detergent solution and in the third process step with a guanidine HCl solution having a molarity of approximately 1.75 to 2.0. A process according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the extraction of the IL-2 from the isolated cell membrane components is carried out using a wash solution which contains approximately 7M guanidine HCl. A process according to claim 1, characterized in that the chromatographic purification is carried out by high performance liquid chromatography (HPLC). A process according to claim 1, characterized in that the chromatographic purification is carried out by affinity chromatography. A process according to claim 9, characterized in that the affinity chromatography is dye affinity chromatography. A process according to claim 1, characterized in that the chromatographic purification is a multiple step procedure in which high performance liquid chromatography and affinity chromatography are used. A pharmaceutical preparation containing as active ingredient homogeneous, mature, recombinant human interleukin 2 (IL-2) having a specific activity of at least 53 x 10⁶ U/mg, obtainable in accordance with the process according to any one of claims 1 to 11, and a physiologically compatible carrier material.

Inventors: KUNG, HSIANG-FU, YAMAZAKI, SHIGEKO
Applicants: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
Application year: 1984
Main classification: C12P21
IPC codes: C12N15, A61K38, A61K35, G01N33, C12P21, C12R1, C07K14, C07K1