PROCESS FOR THE CONTINUOUS ENZYMATIC PRODUCTION OF GLUCONIC ACID OR ITS DERIVATIVES AND SORBITOL AND/OR MANNITOL

Abstract: 1. A method of continuous enzymatic production of gluconic acid and/or derivatives thereof and i. sorbitol or ii. mannitol or iii. sorbitol and mannitol from disaccharides containing glucose and/or fructose, characterised in that the disaccharide starting substrate is split into the corresponding monosaccharides by specific glycosidases in a reaction step occurring simultaneously or before the redox process, and if required the glucose/fructose ratio is adjusted to about 1:1 by enzymatic isomerization (likewise simultaneous or previous) by glucose-converting xylose isomerase or by chemical isomerization, and an aqueous solution of glucose and/or fructose or an aqueous solution of a disaccharide containing glucose and/or fructose is continuously supplied to a reactor containing glucose dehydrogenase and i. sorbitol dehydrogenase or ii. mannitol dehydrogenase or iii. polyol dehydrogenase and, if required, additional dehydrogenases, isomerases or specific glycosidases and an additional redox system, and an aqueous solution containing the products formed is continuously withdrawn from the reactor.

Description: B E S C H R E I B .U N G Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure und/oder ihren Derivaten und Sorbit oder Mannit oder Sorbit und Mannit aus Gemischen, die Glucose und Fructose enthalten oder aus Disacchariden, die Glucose und/oder Fructose enthalten. Gluconsäure wird bisher industriell nur fermentativ hergestellt. Die anfänglich benutzten Drehtrommel- und Submersverfahren sind inzwischen durch ein Verfahren mit Aspergillus niger ersetzt worden, bei dem Gluconsäure, Gluconate und Gluconolacton sowie Glucoseoxidase aus den Mycelien gewonnen werden (vgl. US-Pat. 3.669.840). Bei diesen Verfahren zur Gluconsäuregewinnung stellt Sauerstoff den eigentlich limitierenden Faktor dar. Ausgangssubstrat ist Glucose bzw. Maltose. Versuche mit künstlichen Zellen (Refezellen + Glucoseoxidase in Polyacrylamid) und immobilisierten Enzymen wurden an verschiedenen Stellen durchgeführt, blieben bisher jedoch ohne industrielle Anwendung, nicht zuletzt aufgrund der zu geringen Stabilität und Standzeit der Gesamtsysteme. Die mögliche chemische Synthese der Gluconsäure ist mit hohen Energiekosten verbunden und wie bei den meisten fermentativen Verfahren müssen auch hier die Produkte von grossen Mengen an Begleitstoffen getrennt werden. Gluconsäure findet auf vielen Gebieten Verwendung. Beispielsweise wird sie als milde Säure bei der Herstellung von Wurst- und Fleischwaren, Backpulver und Milchprodukten eingesetzt. Sie findet weiterhin Verwendung als Reinigungsmittel, als Mittel zur Metalloberflächenbehandlung und als Gerbemittel. Auch auf pharmazeutischem Gebiet wird sie eingesetzt. Als Ausgangsverbindung besitzt sie Bedeutung bei der Synthese von Ketogluconsäuren, für Vorstufen der Vitamin-C-Snthese (Ascorbinsäure) und für die Gewinnung von D-Arabinose innerhalb der Synthese von Riboflavin. Ihr Derivat, das Gluconsaure- & lacton findet Verwendung in Reinigungsmitteln zur Verhütung von Milchstein und Bierstein, als Katalysator bei der Herstellung saurer Kolloidharze, zur Herstellung von Wasserfarben und bei der Behandlung von Metalloberflächen. Die Zuckeralkohole Sorbit und Mannit wurden bisher nur durch katalytische Reduktion von Invertzucker unter Verwendung von Nickelkatalysatoren hergestellt. Ihre Synthese ist sehr energieaufwendig und führt zu mehreren Nebenprodukten, so dass die Ausbeuten entsprechend vermindert sind und die Aufarbeitung der Reaktionsprodukte kompliziert abläuft. Gleiches gilt für die von Glucose bzw. Fructose ausgehenden reduktiven Verfahren (Natriumborhydrid, elektrolytisches Verfahren) Beide Zuckeralkohole werden für diätetische Lebensmittel als Zuckeraustauschstoffe mit nur geringer kariogener Wirkung besonders für Diabetiker, als Feuchthaltemittel anstelle von Glycerin, Weichmacher, Kristallisationsverzögerer und zur Verbesserung der Rehydratation von Trockenprodukten, ausserdem als Rohstoff für Lacke, Firnisse, Tenside und Explosivstoffe in der Papier-, Leder- und Textilindustrie und bei der Leim- und Gelatine-Herstellung verwendet. Sorbit ist eine Vorstufe für Sorbose, die ein wesentliches Zwischenprodukt der Vitamin-C-Synthese darstellt. Der Weltjahresbedarf an Sorbit und Mannit beträgt derzeit ca. 400.000 Tonnen. Der Einsatz von Enzymmembranreaktoren stellt ein noch relativ junges Entwicklungsgebiet innerhalb der Enzym technologie dar. Obwohl einige wenige Prozesse wie z. B. die Herstellung von L-Aminosäuren aus °(-Ketocarbonsäuren (DE-OS 29 30 070) bereits technisch durchgeführt werden, sind Reaktionen mit Coenzymregenerationssystemen für industrielle Anwendung bisher noch nicht ausreichend untersucht worden. Verfahren, bei denen sowohl die Oxidationsreaktion als auch die Reduktionsreaktion wirtschaft lich interessante Produkte liefern, sind bisher nicht bekannt geworden. Die Herstellung polymergebundener Coenzyme wird in der DE-OS 28 41 414 beschrieben. Der Einsatz ton Membrantrennverfahren zur Aufarbeitung der Produkte inbiotechnologischen Prozessen steht eben alls erst am Anfang einer aussichtsreichen Entwicklung. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure und/oder ihren Derivaten und Sorbit oder Mannit oder Sorbit und Mannit zur Verfügung zu stellen. Bei dem Verfahren sollen als Ausgangsmaterialien leicht verfügbare Stoffe verwendet werden und das Verfahren soll auf einfache Weise kontinuierlich ablaufen können. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Herstellung von Gluconsäure und/oder ihren Derivaten und i. Sorbit oder ii. Mannit oder iii. Sorbit und Mannit aus Glucose und/oder Fructose oder Glucose und/oder Fructose enthaltenden Disacchariden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einen Reaktor, der Glucose Dehydrogenase und i. Sorbit-Dehydrogenase oder ii. Mannit-Dehydrogenase oder iii. Polyol- Dehydrogenase sowie gegebenenfalls noch weitere Dehy drogenasen, Isomerasen oder spezi fische Glykosidasen und ein zusätzliches Redoxsystem enthält, kontinuierlich eine wässrige Lösung von Glucose und/oder Fructose oder eine wässrige Lösung von einem Glucose und/oder Fructose enthaltenden Disaccharid zuführt und aus dem Reaktor kontinuierlich eine wässrige Lösung mit den gebildeten Produkten abführt. Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es möglich, zwei industriell unterschiedliche Produktgruppen, nämlich die Gluconsäure und ihre Derivate sowie die Zuckeralkohole Mannit und Sorbit zu gewinnen. Damit kann der Zuckerindustrie und der Stärke industrie ein saisonunabhängiges Produktionsverfahren für zusätzliche und alternative Produkte zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere ist das erfindungsgemässe Verfahren für die Verarbeitung der bei der Fructose-Produktion als Nebenprodukt anfallenden Glucose-Fructose-Gemische geeignet. Hierbei sind z. B. Durchsätze von ca. 1 Tonnejstunde bei Feststoffgehalten von 15 - 20% üblich. Mit dem erfindungsgemässen enzymtechnologischen Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure und ihrer Derivate steht eine Alternative zum fermentativen Verfahren zur Verfügung. Das neue Verfahren überwindet gleichzeitig die beiden grundsätzlichen Limitierungen des verschiedentlich erfolglos erprobten enzymatischen Verfahrens mit Glucose Oxidase und Katalase (1. schlechte Löslichkeit des Substrats O2 in Wasser und 2. die Hemmung beider Enzyme durch das Zwischenprodukt H2O2). Ausserdem wird mit dem erfindungsgemässen Verfahren ein enzymtechnologischer Prozess zur Herstellung von Sorbit bzw. Mannit zur Verfügung gestellt, der von der Stärke Industrie sehr gewünscht, bisher jedoch wegen der mit der Coenzymregeneration verbundenen Probleme und Kosten nicht verwirklicht werden konnte. Mit der erfindungsgemässen Einführung des beschriebenen Systems zur Coenzymregeneration wird gleichzeitig ein zweites industriell interessantes Produkt erzeugt. Der Gesamtprozess kann damit ökonomischer gestaltet werden. Es sind Enzyme bekannt, die bevorzugt den Hydrierungsvorgang (Reduktion) katalysieren, also zur Bildung von Polyhydroxyalkoholen (Zuckeralkoholen) aus den entsprechenden Zuckern führen. Diese Reaktionsrichtung wird durch kontinuierliche Abfuhr der gebildeten Zuckeralkohole aus der iXeaktionsmischung mittels des erfindungsgemässen Membranreaktors noch stärker bevorzugt. Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand des folgenden Reaktionsschemas näher erläutert. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann beispielsweise als Ausgangsmaterial ein Gemisch verwendet werden, das Glucose und Fructose enthält. Bei der Herstellung von Fructose aus Saccharose fällt in der Zuckerindustrie als Nebenprodukt ein Fructose-Glucose-Gemisch an. Dieses ist für das erfindungsgemässe Verfahren besonders geeignet. Das Glucose-Fructose-Gemisch kann Glucose und Fructose in beliebigen Anteilen enthalten, da Glucose und Fructose reversibel ineinander durch glucoseumsetzende Xylose Isomerase umwandelbar sind. Bei der Stärkehadrolyse (Amylose) erzeugter > Stärkesirup besteht aus einem Gemisch von Glucose, Maltose und Dextrinen EMI6.1 <tb> Inulin <SEP> 10 <SEP> > <SEP> <SEP> n-Fructose <tb> EMI6.2 <tb> Saccharose <SEP> Maltose <SEP> Cellobiose <SEP> Lactose <tb> <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> I <SEP> 9 <tb> Glucose+Fructose <SEP> 2xGucose <SEP> 2xGlucose <SEP> Glucose+Galactos <tb> 5 <tb> <SEP> Glucose <SEP> Fructose <tb> <SEP> 1 <tb> Glucose <SEP> 1 <SEP> / <SEP> bp <SEP> Gluconsäure <tb> <SEP> NA <SEP> NADH <tb> <SEP> Sorbit <SEP> ----"\ <SEP> 2 <tb> <SEP> Sorbit <SEP> [mose <tb> <SEP> Mannit <SEP> C <tb> <SEP> Sorbit <tb> <SEP> Mannit <tb> <SEP> Mannit <tb> <SEP> ose <tb> 1. Glucose - Dehydrogenase 4. Polyol - Dehydrogenase 2. Sorbit - Dehydrogenase 5. Xylose - Isomerase 3. Mannit - Dehydrogenase 6. ss -rructofuranosidase (Invertas 7. Maltase (Glucoamylase) 8. Cellobiase 9. P -Galactosidase 9. Inulinase Dieses Gemisch kann nach weiterer enzymatischer (Glucoamylase, Glucoseisomerase) oder chemischer Umsetzung ebenfalls als Ausgangs substrat für die kontinuierliche Herstellung von Gluconsäure und Sorbit bzw. Mannit mit dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden. Als Substrate für das erfindungsgemässe Verfahren können ausserdem Disaccharide, die Glucose und/oder Fructose enthalten, eingesetzt werden. Beispiele für solche Disaccharide sind Saccharose, Cellobiose, Maltose oder Lactose. Die Disaccharide werden so ausgewählt, dass sie durch chemische oder enzymatische Spaltung und gegebenenfalls durch eine nachfolgende Isomerisierung leicht in Glucose-Fructose-Gemische überführbar sind. Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens, dass man als Substrat Lactose verwenden kann. Lactose fällt in beachtlichen Mengen in der Milchindustrie (Molke) an und die Beseitigung der Lactose ist derzeit eine grosse Schwierigkeit, da bei der Milchindustrie grosse Abwassermengen anfallen, die Lactose enthalten. Verwendet man bei dem erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial ein Gemisch aus Glucose und Fructose, so enthält dieses die beiden Bestandteile bevorzugt in einem Verhältnis von 1:1. Verwendet man als Ausgangsmaterialien reine Glucose oder Disaccharide, so wird die Spaltung der Disaccharide und die Isomerisierung der Glucose bevorzugt so eingestellt, dass Gemische, die Glucose und Fructose in einem Mengenverhältnis 1:1 enhalten, resultieren. ErfindungsgemäB werden so die eingesetzten Disaccharide durch substatspezifische Glycosidasen in die entsprechenden Monosaccharide gespalten. Saccharose wird durch p Fructofuranosidase (Invertase) (E. C. 3.2.1.26) in Glucose und Fructose, Maltose durch Maltase (E. E. 3.2.1. 20) in Glucose; Cellobiose durch Cellobiase (E. C. 3.2.1. 21) in Glucose und Lactose durch (3-Galactosidase (E. C. 3.2.1.23) in Glucose und Galactose zerlegt. Inulin wird durch Inulinase (E. C. 3.2.1.7) in monomere Fructose gespalten und kann isomerisiert werden. Wie oben beschrieben, wird die so erhaltene Glucose und/ oder Fructose oder direkt zum Einsatz gelangende Monosaccharide werden - falls erforderlich - durch eine glucoseumsetzende Xylose-Isomerase (E. C. 5.3.1.5) in äquimolare Mengen Glucose und Fructose umgewandelt. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Glucose durch Glucose-Dehydrogenase zu Gluconsäure aufoxidiert, wobei gleichzeitig das verwendete Redoxsystem in seine reduzierte Form überführt wird. Gleichzeitig wird die Fructose durch Sorbit-Dehydrogenase, Mannit-Dehydrogenase oder Polyol-Dehydrogenase zu Sorbit und/oder Mannit re duziert. Dabei wird das beteiligte Redoxsystem wieder in die oxidierte Form überführt (vgl. das oben aufgeführte Reaktionsschema). Als mögliche Redoxsysteme werden beispielsweise Cu2+/Cul oder Fe 3+ iFe 2+ in freier oder anorganisch bzw. organisch komplexierter Form verwendet, z.B. als K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 oder Cytochrom c. Andererseits können Vitamine wie K3, K2, K1 und Riboflavin oder Chinon/Hydrochinon-Systeme wie z.B. Benzochinon, - oder o -Naphthochinon, Redoxfarbstoffe wie 2, 6-Dichlorphenol-indophenol, o-Chlorphenolindo-2. 6-di- chlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyltetrazoliumchlorid und Phenazinmethosulfat oder die Coenzymsysteme NAD+/NADH, NADP+/NADPH, Q0, Q2, Q6, Q7, FAD/FADH2 und FMN verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD /NADH) für das beschriebene Verfahren. Das jeweilige zusätzliche Redoxsystem kann entweder in freier gelöster Form eingesetzt werden, bevorzugt ist jedoch bei Verfahren mit Membranreaktoren die Verwendung in polymergebundener gelöster oder enzymgebundener gelöster aber auch in immobilisierter Form. Dadurch wird (ist) sein Molekulargewicht so erhöht, dass es vollständig durch die Membran zurückgehalten wird. Der abfliessende Produktstrom enthält neben Gluconsäure und Sorbit und/oder Mannit je nach Aufbau der Anlage und Aktivität der eingesetzten Enzyme auch nicht umgesetzte Glucose und Fructose. Die Komponenten werden voneinander getrennt durch Adsorptionschromatographie (Aktivkohle- oder Aktivkohle-Celite-Säulen), Verteilungschromatographie (Cellulose- oder Celite-Säulen) oder Ionenaustauschchromatographie. Die im Produktstrom enthaltene Gluconsäure wird in Form von Gluconsäure--lacton, Natriumgluconat oder Calciumgluconat gewonnen. Das Gluconsäure- -lacton wird durch Auskristallisieren aus der konzentrierten Lösung erhalten. Zur Gewinnung von Natriumgluconat wird die Gluconsäurelösung mit einer äquimolaren Menge Natronlauge versetzt und das dabei gebildete Natriumgluconat durch Trocknen erhalten. Analog wird zur Herstellung von Calciumgluconat die Gluconsäurelösung mit Calciumcarbonat versetzt. Dem Reaktorinhalt kann enzymatisch inaktives Protein zugegeben werden, um die beteiligten Enzyme vor Inaktivierung zu schützen. Die Menge an zugesetztem Schutz protein beträgt z.B. im Falle von Albumin das ein- bis das 104-fache der Menge der beteiligten Enzyme. Es sollte nicht mehr als eine 1%ige Schutzproteinlösung resultieren. Aufgrund seines hohen Molekulargewichtes wird auch das Schutzpfoein vollständig durch die Membran zurückgehalten. Die im Reaktor gemeinsam vorliegenden Enzyme haben verschiedene Halbwertszeiten ihrer Inaktivierung. Um über einen längeren Zeitraum hinweg den Reaktor funktionsfähig zu halten, werden die Enzyme dem Reaktor in einem Aktivitätsverhältnis zwischen 10:1 und 1:10 zugefügt, wobei das Enzym mit der schnelleren Inaktivierung anfangs im Überschuss vorliegt. Auch durch Nachdosierung einzelner gelöster Enzyme während des Produktionsprozesses können die Substratumsatzraten je Zeiteinheit von Vorwärts- und Rückwärts reaktion wieder aufeinander abgestimmt werden. Einige der benötigten Enzyme sind wie im Falle der Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium (E. C. 1.1.1.47) und Sorbit-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.14) aus Schafsleber im Handel erhältlich. Ebenso ist Xylose-Isomerase (E. C. 5.3.1.5) kommerziell zugänglich (Lectobacillus brevis). Die weiteren Enzyme lassen sich z.B. aus folgenden Quellen isolieren. -Sorbit-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis (E.C. 1.1.1.14 S.B.Horwitz, Meth. Enzymol. 9, 155-159 (1966) -Mannit-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis (E.C. 1.1.1. 67 - B.L. Horecker, Meth. Enzymol. 9, 143-146 (1966) - Polyol-Dehydrogenase aus Candida utilis oder Leber gewebe. (M. Chakravorty, B.L. Horecker, Meth. Enzymol. 9, 163-166 (1966) Als Enzymreaktor wird bei dem erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt ein Ultrafiltrationshohlfasermodul eingesetzt. Es ist besonders bevorzugt, vom Material her asymmetrische Hohl fasern aus Polyamid oder Polysulfon mit einer Wandstärke zwischen 30 und 100 ss bei einem Innendurchmesser von 100 bis 400 ss zu verwenden. Es kann auch ein Modul, bei welchem die eigentliche Trennmembran mit z.B. 20.000 Dalton aussen sitzt und in dessen Stützmaterial das Enzym Coenzym-System zusammen mit Schutzprotein eingebracht wird, verwendet werden. Durch einen geeigneten Transmembrandruck wird die kontinuierliche Entfernung des Produkt-Substrat-Gemisches erreicht. Erfindungsgemäss können bei Molekulargewichten der Produkte von < 200 D, auch sehr dünne Membranen verwendet werden, wodurch es möglich wird, ohne Druck zu arbeiten. Der bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete Reaktor kann auf einfache Weise ausgewählt werden, wobei der Reaktor folgende Bedingungen erfüllen muss: 1. Vollständige Rückhaltung der Enzyme, der polymerge bundenen Coenzyme (z.B. NAD /NADH) und des evtl. zugesetzten inerten Schutzproteins, 2. nur minimale Protein- und Coenzymablagerungen auf der Membran, um die Filtrationsleistung langfristig aufrechtzuerhalten. 3. Kontinuierliche Produktabführung, insbesondere von Gluconsäure, um die reaktionsbedingte pH-Absenkung so gering wie möglich zu halten. Anhand der beigefügten Zeichnungen wird das erfindungsgemässe Verfahren näher erläutert. Es zeigen Figur 1: Eine schematische Darstellung des Verfahrens mit einem Pnhlçaser -Ultrafiltrationsmodul Figur 2: Eine schematische Darstellung der Aufarbeitung von Gluconsäure und Sorbit Figur 3: Das Prinzip eines Hohlfaser-Ultrafiltrations moduls Figur 4: Den schematischen Aufbau einer für das er findungsgemässe Verfahren verwendeten Hohl faser, wobei sich die selektive Schicht auf der Hohlfaseraussenseite befindet. Figur 5: Eine schematische Darstellung des Verfahrens gemäss Ansprüchen 15, 16 und 17. Als Ausgangsmaterial wird bevorzugt ein Gemisch verwendet, welches Glucose : Fructose im Verhältnis 85:15 enthält. Das sterilfiltrierte Gemisch 1 wird im Reaktor 2 isomerisiert. Das Glucose/Fructose 1:1 enthaltende Gemisch wird nach Einstellung des pH-Wertes in einen UF-Hohlfaserreaktor 3 (UF = Ultrafiltration) geleitet, wo die eigentliche Reaktion stattfindet. In dem Reaktor befindet sich das Coenzymsystem wie oben aufgeführt, und die Substrate werden in Gluconsäure und Sorbit überführt. Das abgezogene Ultrafiltrat enthält ausser den gewünschten Produkten noch Glucose und Fructose. In einer Elektro dialysestllfe 4 erfogt eine Trennung in Gluconsäure und ein Gemisch aus Sorbit sowie restlicher Glucose und Fructose. Das Sorbit wird mit Hilfe eines säulenchromatographischen Verfahrens 5a und 5b, von den nicht umgesetzten Substraten Glucose und Fructose abgetrennt. Stehen mehrere Säulen 5a, 5b zur Verfügung, erfolgt jeweils auf einer Säule die Auftrennung, während die andere(n) gleichzeitig regeneriert wird (werden). Nach der Abtrennung des Sorbits wird das Gemisch aus Glucose und Fructose in den Reaktor 3 zurückgeleitet, wohingegen die Sorbitlösung einer Umkehrosmose 6 unterworfen wird. In der beigefügten Zeichnung 2 werden die weiteren Aufarbeitungsschritte beispielhaft erläutert. Die Gluconsäure wird beispielsweise mit Natriumhydroxid 7 oder Calciumcarbonat 8 in Natriumgluconat oder Calciumgluconat überführt. Das weitere Vorgehen erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Umkehrosmose 9, durch Trocknen auf einem Walzentrockner 10, Kristallisation 11 etc. Der Sorbit wird beispielsweise durch Umkehrosmose 9 und anschliessend ebenfalls durch Trocknen auf einem Walzentrockner 10 und Kristallisation 11 gereinigt. In der beigefügten Figur 3a ist ein Hohlfaser-Ultrafiltrationsmodul 3 im Längsschnitt und in der Figur 3b im Querschnitt dargestellt. Der Ultrafiltrationsreaktor besteht aus einem Gehäuse 11, den Hohlfasern 12, einer Substratzufuhr 13, einem Produktabfluss 14 und einem Substratabfluss 15. In Figur 3b ist der Hohlfaserreaktor im Querschnitt dargestellt. Man erkennt die einzelnen Fasern 12, die einen Innen-aum und eine Wand aufweisen. In der Figur 4 ist der schematische Aufbau einer Hohlfaser gemäss Anspruch 7, bei der sich die selektive Schicht auf der Hohlfaseraussenseite befindet, dargestellt. Es bedeuten: 16 die mikroporöse Wand, 17 die semipermeable Membran, die für die Enzyme und Coenzyme durchlässig ist, 18 eine semipermeable Membran, die für das Substrat, das Produkt, die Enzyme und das an das Polymere gebundene Coenzym durchlässig ist, 19 der Biokatalysator (Enzyme), 20 das Substrat, 21 die Produkte und 22 das polymergebundene Coenzym. Die mikroporöse Wand 16 der Hohlfaser ist auf der Aussenseite und der Innenseite jeweils durch eine semipermeable Membran 17, 18 begrenzt. Dabei wird durch den Herstellungsprozess die äussere semipermeable Membran so eingestellt, dass sie nur für die bei der Reaktion entstehenden Produkte 21 und restliche Substrate 20 durchlässig ist, während die innere Membran sowohl für das Substrat 20, die Enzyme und das polymergebundene Coenzym 22 durchlässig ist. Der Biokatalysator 19 wird in der mikroporösen Schicht zwischen den beiden semipermeablen Membranen adsorptiv immobilisiert. Substrate und Coenzym werden von innen in die Hohlfaser eingeführt. Unter der treibenden Kraft eines Druckes oder Konzentrationsgradienten permeieren Substrat und Coenzym die innere semipermeable Membrane. Sie gelangen in die mikroporöse Wand der Hohlfaser. Dort wird das Substrat mit Hilfe des Biokatalysators in'das Produkt umgewandelt, das dann über die äussere Membran die Hohlfaser verlässt. Um die Hohlfasermembran im technischen Massstab einsetzen zu können, werden sie als Bündel von einigen tausend Fasern 12 wie in der Abbildung 3 dargestellt, in einem Mantelrohr mit einem Giessharz so eingegossen, dass das Substrat und die Coenzyme an der Stirnseite des Mantelrohres in die Fasern eingeführt werden und das Produkt aus seitlicher öffnung 14 abgeführt werden kann. Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch in einem Säulenreaktor mit trägerfixierten Enzymen und Coenzymen durchgeführt werden, wobei die Coenzyme auch am gleichen Träger immobilisiert sein können. Das erfindungsgemässe Verfahren kann weiterhin in einem Wirbelbett durchgeführt werden. In Figur 5 ist die Prozessdurchführung in einem kombinierten Verfahren mit Wirbelbett 23 und Membranmodul 24 schematisch dargestellt. Das Coenzym ist dabei an die Wirbelbettkörper 25 fixiert (adsorptiv oder kovalent) und die Substrate und die Enzyme durchströmen das Wirbelbett 23. Es ist jedoch auch möglich, dass das Enzym oder die Enzyme auf der Oberfläche der Wirbelbettkörper fixiert sind, und dass das Coenzym gelöst, jedoch in polymergebundener Form eingesetzt wird. Das Gemisch aus Restsubstrat, Produkt, Enzym und gegebenenfalls polymergebundenem Coenzym kann dann nach Verlassen des Wirbelbetts durch den Membranmodul 24 geleitet werden, dessen Trennmembran 26 so ausgestattet ist, dass sie nur das Produkt sowie Restsubstrat hindurchlassen, die übrigen Komponenten jedoch aufgrund ihres hohen Molekulargewichts zurückhalten, wobei letztere dem Wirbelbettreaktor über eine Rückführeinrichtung 27 mit Pumpe 28 wieder zugeführt werden. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken. Beispiel 1: Enzymatische Herstellung von Calciumgluconat und Sorbit aus Lösungen, die Glucose und Fructose im Verhältnis 1:1 enthalten: Auf der Membran eines Hohlfaserreaktors mit einer Ausschlussgrenze der Membran von 5 000 D mit 100 cm2 innerer Oberfläche sind je 5 Units der Enzyme Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium und Sorbit-Dehydrogenase aus Schafsleber kovalent immobilisiert. Im Reaktor sind 10 3 mol an Polyethylenglycol 6 000 kcvalent ge- bundenes NAD /NADH eingeschlossen. Der Reaktor wird kontinuierlich von 2,5 ml/h einer wässrigen, auf pH 6,5 gepufferten Lösung durchflossen, die je 0,1 mol Glucose und Fructose pro Liter gelöst enthält. Die aus dem Membranreaktor abfliessende Lösung enthält neben Gluconsäure und Sorbit c.uch nicht umgesetzte Glucose und Fructose. Die Produkte werden durch Adsorptionschromatographie an Aktivkohle-Celite-Säulen aufgetrennt. Sorbit wird kristallisiert. Die erhaltene Gluconsäure wird mit einer äquimolaren Menge Calciumcarbonat versetzt, das gebildete Calciumgluconat abfiltriert und getrocknet. Beispiel 2: Enzymatische Herstellung von Gluconsäure-6-lacton und Mannit aus Lösungen, die Glucose und/oder Fructose in beliebigem Verhältnis enthalten: Zu einem 50 ml fassenden, von einer Ultrafiltrationsmembran mit einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 3 nm verschlossenen Reaktor, der je 500 Units der Enzyme Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium, Mannit Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis und Xylose-Isomerase aus Lactobacillus brevis sowie 1 mmol an wasserlösliches Polyethylenimin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 30 000 und 40 000 Daltons kovalent gebundenes NAD+/NADH enthält, wird eine auf pH 6,5 gepufferte Lösung mit insgesamt 180 g/l 6 1 mol/l Glucose und Fructose (in beliebigem Verhältnis) kontinuierlich zugeführt, so dass ein Durchsatz von 25 ml/h = 25 mmol/h erreicht wird. Ausserdem enthält der Reaktor 0,1 % Rinderserumalbumin. Die abfliessende Lösung enthält neben Gluconsäure und Mannit auch nicht umgesetzte Glucose und Fructose. Die Gluconsäure wird mittels Elektrodialyse bei 0,5 bis 0,8 V über eine Anionenaustauschermembran von den restlichen Substanzen abgetrennt. Die gluconsäurehaltige Lösung wird durch Umkehrosmose konzentriert und das sich bildende Gluconsäure- 6-lacton durch Kristallisation gewonnen. Aus der mannit-, glucose- und fructosehaltigen Lösung wird das Mannit mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie an stark basischen Anionenaustauschern, z.B. Amberlite IRA 400, abgetrennt. Die Fraktionen mit Glucose und Fructose werden in den Prozess zurückgeführt. Beispiel 3: Enzymatische Herstellung von Natriumgluconat, Sorbit und Mannit aus saccharosehaltigen Lösungen: Eine auf pH 6 - 7 gepufferte Lösung, die 360 g/l e 1 mol/l Saccharose enthält, wird mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min über eine Säule von 8 cm Länge und 2 cm innerem Durchmesser geleitet, die 12 000 Units (o 120 & der theoretisch benötigten Menge) kovalent an Glasperlen gebundene 3-Fructofuranosidase (Invertase) enthält. Die abfliessende Lösung wird über eine zweite Säule mit gleichen Dimensionen geführt, die mit Polyacrylamid gefüllt ist, an dem je 12 000 Units (o 120% der theoretisch benötigten Menge) Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium und Polyol Dehydrogenase aus Candida utilis und 16 mmol NAD+ mit einer Restaktivität von mindestens 75% fixiert sind. Die aus der zweiten Säule ausfliessende Lösung enthält Gluconsäure, Mannit und Sorbit, ausserdem noch geringe Mengen Glucose und Fructose. Die Substanzen werden mittels Verteilungschromatographie an Celite-Säulen getrennt und die Glucose und Fructose wieder in die zweite Säule eingespeist. Die gluconsäurehaltige Fraktion wird mit einer äquimolaren Menge Natronlauge versetzt und das gebildete Natriumgluconat getrocknet.

Claims: PATENTANSPRUCHE 1. Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Herstellung von Gluconsäure und/oder ihren Derivaten und l. Sorbit oder ii. Mannit oder iii. Sorbit und Mannit aus Glucose und/oder Fructose oder Glucose- und/oder Fructose enthaltenden Disacchariden, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man in einen Reaktor, der Glucose-Dehydrogenase und i. Sorbit-Dehydrogenase oder ii. Mannit-Dehydrogenase oder iii. Polyol-Dehydrogenase sowie gegebenenfalls noch weitere Dehy drogenasen, Isomerasen oder spezifische Glykosidasen und ein zusätzliches Redoxsystem enthält, kontinuierlich eine wässrige Lösung von Glucose und/oder Fructose oder eine wässrige Lösung von einem Glucose und/oder Fructose enthaltenden Disaccharid zuführt und aus dem Reaktor kontinuierlich eine wässrige Lösung mit den gebildeten Produkten abführt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man Glucose-Dehydrogenase und Sorbit-Dehydrogenase oder Mannit-Dehydrogenase oder Polyol-Dehydrogenase in einem Aktivitätsverhältnis zwischen 10:1 und 1:10 einsetzt. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass bei der Oxidations-Reduktionsreaktion der pH-Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8 gehalten wird. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man als zusätzliches Redoxsystem Cu 2+ /Cu1+ oder Fe 3+ iFe 2+-Komplexe, wie K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6, Cytochrom c, Vitamine wie K3, K2 oder K1, Riboflavin, Benzochinon/Hydrochinon,OC-Naph- thochinon, (3-Naphthochinon1 Redoxfarbstoffe wie 2. 6-Di- chlor-phenol-indophenol, o-Chlorphenolindo-2.6-dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyltetrazoliumchlorid, Phenazinmethosulfat oder Coenzymsysteme wie NAD /NADH, NADP /NADPH, Q0, Q2, Q6, Q7, FAD/FADH, FMN in freier, polymer- oder enzymgebundener Form gelöst oder immobilisiert verwendet, bevorzugt jedoch das Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD /NADH) einsetzt. 5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man das als Ausgangs- substrat vorliegende Disaccharid in einem mit dem Redox Vorgang gleichzeitig ablaufenden oder vorgeschalteten Reaktionsschritt durch spezifische Glykosidasen in die entsprechenden Monosaccharide spaltet und dass man gegebenenfalls ein Glucose-Fructose-Verhältnis von ca. 1:1 durch ebenfalls gleichzeitige oder vorgeschaltete enzymatische Isomerisierung mittels glucoseumsetzender Xylose-Isomerase oder durch chemische Isomerisierung einstellt. 6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Oxidations-Reduktionsreaktionen in einem Reaktor mit Ultrafiltrationsmembran durchführt, ein Coenzymsystem verwendet, das an ein wasserlösliches Polymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 5.000 und 60.000 Dalton gebunden ist, über die Membran eine Druckdifferenz erzeugt und hinter der Membran einen kontinuierlichen Produktstrom abführt. 7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g-e k e n n z e i c h n e t , dass man als Membranen hohle Fasern verwendet, die in ihrer Struktur asymmetrisch aufgebaut sin, wobei die für Enzyme und polymergebundene Coenzyme undurchlässige selektive Schicht der Membran auf der Aussenseite der Hohlfaser liegt, während die Innenseite der Faser Poren enthält, die auh-r die Enzyme und Coenzyme durchlässig sind. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man die Substratlösung auf der Innenseite der Hohlfasermembran einführt, zwischen der Innenwand und der Aussenwand der Fasereine hydrostatische Druckdifferenz erzeugt, so dass die Substratlösung durch die innere Faserwand hindurch geht und dass die enzymatische(n) Reaktion(en) bevorzugt im porösen Stützmaterial zwischen Innenwand und Aussenwand abläuft (ablaufen). 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6, 7 oder 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man den Durchsatz des Substrats durch geeignete Wahl der hydrostatischen Druckdifferenz so einstellt, dass seine Aufenthaltszeit in der Hohlfaserwand ausreicht, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen. 10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die eigentliche für Enzyme und polymergebundene Coenzyme undurchlässige selektive Schicht der Membran auf der Innenseite der Hohlfaser liegt, die enzymatische Reaktion also im Lumen der Hohlfaser stattfindet. 11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man zu der Reaktionslösung ein Schutzprotein in einer Menge, die dem 1- bis 104-fachen der Menge der beteiligten Enzyme entspricht, zusetzt. 12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Enzyme oder Coenzyme kovalent an der Membran des Reaktors immobilisiert sind. 13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurcn g e k e n n z e i c h n e t , dass die Coenzyme an wasserlösliche Polymere gebunden sind. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Oxdations-Reduktions- reaktionen in einem Säulenreaktor mit trägerfixierten Enzymen und Coenzymen durchgeführt werden, wobei die Coenzyme auch am gleichen Träger immobilisiert sein können. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Oxidations Reduktionsreaktionen in einem Wirbelbett durchgeführt werden, wobei das Coenzym auf der Oberfläche der Wirbelbett Körper fixiert ist und das Substrat plus Enzym - das Wirbelbett durchströmt. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym oder die Enzyme auf der Oberfläche der Wirbelbett-Körper fixiert ist oder sind und dass das Coenzym gelöst, jedoch in polymergebundener Form eingesetzt wird. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 15, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Gemisch aus Restsubstrat, Produkt und Enzym oder polymergebundenen Coenzymen nach Verlassen des Wirbelbettes einen Membranmodul durchströmt, dessen Membranporen so ausgestaltet sind, dass sie nur das Produkt sowie Restsubstrat hindurchlassen, die übrigen Komponenten jedoch zurückhalten, wobei letztere dem Wirbelbett-Reaktor wieder zugeführt werden. 18. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man die gebildeten Produkte Gluconsäure oder ihre Derivate und Sorbit oder Mannit oder Sorbit und Mannit durch (1) Elektrodialyse, t2) Ionenaustausch-Trennprozesse, (3) andere Membranverfahren, (4) eine Kombination der o.g. Verfahren in Gruppen gleichen Ladungszustands trennt und dabei teilweise konzentriert. 19. Verfahren nach mindestens einem der vorhergenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Zuckeralkohole Sorbit und/oder Mannit durch (1) Adsorptionschromatographie, (2) Verteilungschromatographie, (3) Ionenaustauschchromatographie, (4) fraktionierte Kristallisation von den Resten an Glucose und Fructose abtrennt und separat weiterarbeitet. 20. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, g e k e n n z e i c h n e t durch zwei hintereinandergeschaltete UF-Hohlfaserreaktoren (2, 3), wobei im ersten die Isomerisierungsreaktion, im zweiten die Redoxreaktionen ablaufen, sowie Trenn- und Reinigungsvorrichtungen (4, 5a, 5b, 6) und übliche Zu- und Ableitungsfilter, Regeleinrichtungen und Probeentnahmeeinrichtungen.

Inventors: CHMIEL, HORST, PROF. DR.-ING., KULBE, KLAUS DIETER, DR. DIPL.-CHEM., SCHWAB, URSULA, STRAHTMANN, HEINRICH, DR.-ING.
Applicants: FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V.
Application year: 1984
Main classification: C12P7
IPC codes: C12P1, C12M1, C12P7, C12P17