PROCESS FOR OBTAINING SOMATIC LUCERN HYBRIDS BY THE FUSION OF PROTOPLASTS

Abstract: 1. A process for the production of somatic hybrids of lucernes, characterised in that : (a) the protoplasts of two genotypes or of two species of lucerne are isolated in a culture medium, (b) the resulting protoplasts are fused in a culture medium containing a calcium salt as fusion agent, (c) after the fusion operation regeneration of the plants is effected.

Description: Procédé d'obtention d'hybrides somatiques de luzernes par fusion de protoplastes. La présente invention concerne la préparation hybrides somatiques de luzernes par fusion de protoplastes de deux espèces de luzernes, notamment de Medicago falcata avec Medicago sativa, la luzerne cultivée. Les produits de fusipn de ces deux espèces permettent dlintroduire une variabilité génétique chez la luzerne conduisant à la sélection de nouvelles variétés industriellevent intéressantes. Ceci est Darticulièrement important car, à la différence du mais par exerle, les hybrides de luzernes commercialement utilisables sont difficiles à obtenir. Les méthodes de sélection de la luzerne sont compliquées du fait des effets da consanguinité, de l'allogamie et de la tétrarloldie. Cette difficulté de la sélection expliaue en partie pourouoi les rende- ment s en mais ont augmenté de 320 % en 45 ans alors que les rendements en luzerne n'augmentaient dans le même temps que de 40 % comme cela est rappelé dans Bioscience, vol. 30, " 1, 1980, 17-21. Par ailleurs, les schémas de sélection classiques utilisent toujours du matériel issu des mêmes populations et il peut sembler utile d'introduire des géniteurs possédant d'autres caractéristiques et qui augmenteraient la variabilité génétique. En effet, la luzerne est une plante relativenent sensible à certaines conditions de milieu à des maladies et à des insectes; l'obtention d'hybrides somatiques peut permettre d'obtenir des luzernes plus résistantes et d'augmenter les rendements. Bien que l'on sache régénérer des plantes à partir de protoplastes de M. sativa, comme cela est décrit par exemple par A.V. Mezentsev, Chem. Abs. vol. 95, 1981, 420, 39193b et vol. 96, 1982, 262, 157258v, et que l'on sacre effectuer des hybridations somati aues avec régénération sur certaines plantes telles que le tabac, comme cela est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique na 4 3ù0 310, il n'existe aucun exemple de régénration aDrès le traitement de fusion sur h. sativa et aucun exemple connu de fusion suivie de régénératior. chez les légumineuses. La présente invention propose un procédé d'obtention d'hybrides somaticues de luzernes, caractérise en ce que a) on isole les @rotoplastes de deux espèces de luzernes, b) on fait fusionner les protoplastes obte rus, c) on effectue une régénération des plantes après l'opération de fusion. Ce procédé peut également s'appliquer à la fusion de protoplastes de deux génotypes de la même espèce. Les protoplastes de chaque génotype ou espèce sont préparés séparément par digestion enzymatique des tissus végétaux dans un milieu de culture dilué par exemple à l'aide de cellulase, hémi-cellulase et pectinase dans un milieu de culture dérivé de celui de Kao. Un élément important de ce procédé est l'uti- lisation d'un sel de calcium, en particulier le chlo rure de calcium comme agent fusionnant. De préférence la solution de fusion est exempte de polyéthylène glycol mais peut contenir par exemple du mannitol dans un tampon tel qu'un tampon glycine. En effet, il semble que les protoplastes de Nedicago supportent mal les traitements de fusion mettant en oeuvre le PEG. Les protoplastes isolés sont mis en suspension dans la solution de fusion puis la suspension est placée à 320C pendant environ 15 minutes. Après centrifugation et lavage, les protoplastes issus de ltopération de fusion sont incubés à l'obscurité pendant une dizaine de jours Les protoplastes sont ensuite cultivés en lumière diffuse sur un milieu de culture dérivé de celui de Kao par apport régulier de milieu frais. Les embryoides obtenus sont alors cultivés sur papier filtre puis repiqués sur milieu solide. On obtient ainsi, après un délai d'environ 6 mois des plantules qui sont soumises à l'étude pour rechercher les caractéristiques les différenciant des parents. EXEMPLE 1 On utilise comme parents deux espèces de luzerne - Medicago sativa. et - Nedicago falcata. Les protoplastes sont obtenus par une incubation lente de 15 à 16 heures à l'obscurité à 260C, dans une solution enzymatique contenant : cellulase, hémi-cellulase et pectinase, diluée avec du milieu de culture, dérivé de celui de Kao (I-iolec. Gen. Genet. 150, 225-230, 1977). NH4NO3 : 600,00 mg/l KNO3 : 1 900,00 CaCl2,2H2O : 600,00 MgSO4,7H2O : 300,00 KH2PO4 : 170,00 KCl : 300,00 KI : 0,75 mg/l H3BO3 : 3,00 MnSO4,H2O : 10,00 ZnSO4,7H2O : 2,00 nA2MoO4,2H2O : 0,25 CuSO4,5H2O : 0,025 CoCl2,6H2O : 0,025 Pour EDTA : 8 ml/l. Inositol : 100,00 mg/l Nicotinamide : 1,00 Pyridoxine HOl : 1,00 Thiamine BCl : 10,00 D-Ca pantothénate : 0,50 acide folique : 0,20 acide p-aninobenzolque : 0,01 Biotine : 0,005 mg/1 Chlorure de choline : G,50 Riboflavine : 0,10 Acide ascorbique : 1,00 Vitamine A :d 0,005 Vitamine D3 : 0,005 Vitamine B12 : 0,01 Glucose : 110 400,00 mg/1 Saccharose : 125,00 Fructose : 125,00 Ribose : 125,00 Xylose : 125,00 Mannose : 125,00 Rhamnose : 125,00 Cellobiose : 125,00 Sorbitol : 125,00 Mannitol : 125,00 Acides organiques (pH = 5,5) Pyruvate de sodium 5 5 mg/l Acide citrique : 10 Acide malique : 10 Acide fumarique : 10 2,4 D : 0,2 mg/l Zéatine : 0,5 A.N.A. : 1,0 N.Z. amine : 125 mg/l Eau distillée : 1000 ml (pH = 5,7 /NaOH filtré). La solution enzymatique est ôtée puis les protoplastes sont lavés une fois avec du milieu de culture et mis en suspension à 250 000 protoplastes/ml. Les suspensions sont alors réparties comne suit 1 tube avec 2 ml de protoplastes de M. sativa 1 tube avec 2 ml de protoplastes de M. falcata (témoins de viabilité des protoplastes) 1 tube avec 4 ml de protoplastes de M. sativa 1 tube avec 4 ml de protoplastes de N. falcata (témoins de viabilité après l'opération de fusion) 4 tubes avec 2 ml de protoplastes de M. sativa + 2 ml de protoplastes de N. falcata (destinés à l'opération d'allofusion). Tous les tubes, sauf les témoins de viabilité des protoplastes, sont centrifugés à 100 g pendant 4 minutes; le surnageant est ôté. Puis, on ajoute dans chaque tube 2 ml de solution de fusion CaCl2 2H20 : 0,74 g Mannitol : 9,5 g dans 100 ml de tampon glycine à 0,375 g de glycine pour 100 ml. Le pH est ajusté à 10,4 et la solution est stérilisée par filtration. Les protoplastes sont remis en suspension dans cette solution à la pipette Pasteur; puis les tubes sont mis dans un bain-marie à 3200 pendant 15 minutes. Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 5 minutes à 60 g. Les protoplastes sont alors lavés une fois avec une solution saline (sels de Frearson, Frearson et al., Dev. Biol. 33, 130-137 (1973) KH2PO4 : 27,2 mg/l KNO3 : 101,0 CaCl2.2H2o : 1 48C,O MgSO4.7H2O : 246,0 KI : 0,16 CuSO4,5H2 : 0,025 et une fois avec du milieu de culture puis mis en suspension à 50 CCO protoplastes/ml à raison de 3,5 ml par boîte, dans des boîtes de Eétri prétraitées (de 5 cm de diamètre) scellées au parafilm. Les protoplastes sont cultivés à 26 C, à l'obscurité pendant 10 jours, puis en lumière diffuse. À 7 jours de culture, on observe des divisions dans toutes les boîtes, on dilue alors de la façon suivante Les 4/5 du contenu de chaque boîte sont transférés dans une boîte neuve, on réajuste alors la quantité de liquide dans les boîtes par adjonction de milieu frais; (ce procédé limite les pertes dues à la production de phénols en cours de culture). Les cultures sont ensuite mises en lumière diffuse et entretenues en ajoutant du milieu frais tous les 7 jours jusqu'à l'obtention de petits embryoldes de 1 mm qui sont alors cultivés sur papier filtre iuscuau repiquage en milieu solide. Le pourcentage de fusion, délicat à observer du fait aue la manipulation s'effectue en tube, peut être estimé entre 5 et 10 %. Les plantes régénérées sont étudiées amour un certain nombre de marqueurs : cytonlasmioues (la stérilité mâle), nucléaires (marqueurs enzymatiaues, biométrie de la plante, coloration des fleurs). Il est ainsi possible de détecter les produits d'allofusion. De cette façon on a pu mettre en évidence différents hybrides. Plusieurs hybrides somatiaues suffisamment développé ont pu être identifiés comme étant des produits de fusion par le zymogramme des peroxydases et des B amylases qui cumulent les bandes des deux génotypes parentaux et par la bigarrure des fleurs qui caractérise les hybridations entre M. sativa et M. falcata. Pour d'autres plantes, on a pu montrer par analyse enzymatique qu'il s'agissait d'hybrides somatiques partiels.

Claims: - REYENDICaDIONS 1 - Procédé d'obtention d'hybrides somatiques de luzernes, caractérisé en ce que a) on isole les protoplastes de deux génotypes ou de deux espèces de luzernes, b) on fait fusionner les protoplastes obtenus, c) on effectue une régénération des plantes après l'opération de fusion. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme agent fusionnant à l'étape b) un sel de calcium. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution de fusion contient du chlorure de calcium mais est exempte de polyéthylène glycol. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les protoplastes sont préparés par digestion enzymatique de fragments de tissus végétaux dans un milieu de culture dilué. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 a 4, caractérisé en ce que la fusion est effectuée par mise en suspension des Drotop'astes issus de l'étape a) dans une solution de fusion contenant du chlorure de calcium et du mannitol. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la régénération est effectuée par mise en suspension des protoplastes fusionnés de l'étape b) dans un milieu de culture. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de culture est le milieu de Kao ou un milieu qui en dérive. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les deux espèces de luzernes parentes sont Nedicago sativa et Nedicago falcata.

Inventors: DATTEE, YVETTE, TEOULE, EVELYNE
Applicants: ACVF ASS CREAT VARIET FOURRAGE, UNIV PARIS
Application year: 1984
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N15, C12N5, C12R1, A01H1