METHOD FOR THE DETECTION OF ALLERGENS IN DOMESTIC DUST

Abstract: 1. A process for detecting the incidence of domestic dust containing allergens, as it occurs when domestic dust mites are or were present, characterized in that samples of dust, present in buildings, are completely suspended in an aqueous alcohol solution of alkali metal hydroxide and in that a colour-differing reaction is carried out with the resultant extract, by means of an aromatic diazo compound, and the colour reaction, if it occurs, being taken as evidence that the dust contains residue of domestic dust mites.

Description: Verfahren zum Nachweis von allergenhaltigem Hausstaub Beschreibung Dem Auftreten von Hausstaubmilben (Dermatophagoides pteronyssinus, farinae etc.) wird in neuerer Zeit zunehmend Auf merksamkeit gewidmet (vgl. Zitat 1). Grund dafür ist, dass festgestellt wurde, dass ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung - man rechnet mit etwa 5 * - unter asthmatischen Erscheinungen leidet, die auf Bestandteile des Hausstaubes zurückzuführen sind. Bei diesen Bestandteilen handelt es sich hauptsächlich um den Kot der obengenannten Hausstaubmilben sowie um Bruchstücke abgestorbener Milben Im Darmtrakt der lebenden und abgestorbenen Milben sind die die Gesundheitsstörungen auslösenden Allergene enthalten (vgl. Zitat 2). Eine lebende Milbe selbst enthält nur etwa ein Tausendatel der Allergenmenge, die sie in der Zeit ihres Lebens erzeugt. Der Kot selbst ist vielfach von Pilzen besiedelt, die ihrerseits ebenfalls Allergene hervorbringen können. Die Hauptmenge der Allergene befindet sich in den Staubablagerungen, und zwar auch dann noch, wenn die ursprüngliche Milbenpopulation durch Bekämpfungsmassnahmen abgetötet bzw. reduziert wurde. hufenthaltsorte der Hausstaubmilben sind Polstermöbel, Betten, Fussböden und Wände, insbesondere wenn sie mit textilen Materialien überzogen sind. Flächenmässig gesehen dürften Teppichböden die grösste Rolle spielen. Von den Fussböden und Polstermöbeln wird durch Begehen und Benutzen Feinstataub aufgewirbelt, der sich oft an unzugänglichen Stellen, die weitgehend frei von Luftzug sind, z.B. hinter Schranken, ansammelt. Auch beim Staubsaugen selbst wird dieser Beinststaub zum Teil aufgewirbelt und gelangt so auch an Stellen, die selbst nicht von Milben besiedelt sind. In allen Fällen führt erneutes Aufwirbeln zu erneuten Belästigungen der Bewohner der betreffenden Räume Die Beseitigung der Ursachen für die Hausstaub-Allergie hat zur Voraussetzung, dass die Ursache erkannt wird. Denn es gibt auch-snd-ere Allergien, wie z.B. gegen Pollen (Heuschnupfen3. Die Haussteub-Allergie belastet jedoch die davon betroffenen Menschen das ganze Jahr über, da Milbenkob und Milbenreste praktisch ununterbrochen vorhanaen sind. Arzt und Patient stehen desnalb immer wieder vor der Frage, ob ein MilbenbeCall vorliegt Aufgrund des derzeitigen Standes der Technik gibt es als IVachweismethode nur das mikroskopische Erkennen der Mil- ben selbst. Dieses Verfahren ist jedoch mit so grossen Schwierigkeiten verbunden, dass es nur von wenigen darauf spezialisierten Fachlaboratorien durchgeführt werden kann. Dazu sind die Entnahme der Staubprobe, der Versand derselben unter vorgeschriebenen Bedingungen und dann die Untersuchung im Laboratorium nollfencig Da die Milben neben dein sonstigen Schmutz nicht zu erkennen sind, miis- sen sie von der Staubprobe abgetrennt und dann identifiziert erden. Das bewährteste bekannte Abtrennverfahren besteht in der Flotation, verbunden mit dem manuellen Isolieren der aufschwimmenden Tiere sowie deren Identifikation unter dem Mikroskop (vgl. Zitat 3). Abgesehen von der Tatsache, dass dies nur erfahrene Fachleute durchführen können, ist hervorzuheben, dass ein beträchtlicher Zeitaufwand erforderlich ist, um eine Probe zu bearbeiten; hinzukommen der Versand und das Risiko der Proben-Veränderung während des Transportes. Allen Identifikationsverfahren, die vom Vorhandensein der Milben selbst ausgehen, haftet der Nachteil an, dass Aussagen über die Belastung des Staubes durch Allergene, die die eigentliche Krankheitsursache darstellen, nicht zu erhalten sind. Staubproben, insbesondere solche feinster Struktur, wie sie sich nach dem Aufwirbeln aus der Buft ablagern, können besonders reich an Allergenen sein und wenige oder gar keine Milben enthalten. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher1 ein einfaches und z-lz-erlässiges Nachweisverfahren zur trkeanen 9:on allergenhaltigem Hausstaub zu schaffen. Erfindungsgemäss wurde nun festgestellt, dass ein (wesentlich einfacherer) Nachweis geführt werden kann, der charakteristisch für die Belastung des Hausstaubes mit Ausscheidungsprodukten der Hausstaubmilben ist, unabhängig davon, ob nun lebende bzw. tote Milben im Moment des Nachweises vorhanden sind oder nicht. Der Nachweis knüpft 2n Bestandteile der husscheidungspro- dukte der Nilben an, wie sie sich sowohl im Verdauungstrakt der Milben selbst als auch in deren Exkrementen befinden. Dieser Nachweis ist problemlos sowohl von Fachleuten als auch Laien durchführbar und gibt nicht nur eine Aussage über die Anwesenheit von Exkrementen der Hausstaubmilben im Hausstaub, sondern ermöglicht auch eine Beurteilung des momentanen bzw. früheren Befalles mit Milben. Das erfindungsgemässe Nachweisverfahren zur Feststellung des Vorkommens von allergenhaltigem Hausstaub, wie er sich bei oder nach dem Auftreten von Hausstaubmilben ergibt, besteht nun darin, dass man Proben von vorkommendem Staub, wie er in Gebäuden anfällt, in vJässrig-alkoholischer Alkalimetallhydroxid-Lösung gründlich suspendiert und mit dem entstehenden Extrakt eine Farbreaktion mit Hilfe einer aromatischen Diazoverbindung durchführt, wobei die Farbreaktion hinsichtlich ihres Auftretens als Indiz für die Belastung des Staubes mit Hausstaubmilben Rückständen bewertet wird. In einzelnen ist für die Durchführung des erfindungsge massen Nachweisverf ahrens folgendes zu bemerken. Als Alkohol für die eingesetzte wässrig-alkoholische Lösung verwendet man bevorzugt einen mit Wasser unbegrenzt mischbaren Alkohol, wie z.B. niedere einwertige aliphatische Alkohole. Dabei ist Methanol besonders bevorzugt; aber auch Äthanol kann eingesetzt werden. Das Gewichts- verhältnis von Alkohol zu Wasser in der wassrig-alkoholi- schen Lösung kann variieren und beträgt im allgemeinen (10 bis 95) : (90 bis 5). Besonders bewährt hat sich ein Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser von (50 bis 90) (50 bis 10), speziell von (75 bis 90) : (25 bis 10). Des in der wässrig-alkoholischen Lösung eingesetzte Alkalimetallhydroxid ist bevorzugt Kaliumhydroxid und Natrium- hydroxid. Aber auch Lithiumhydroxid kann eingesetzt werden. Die Menge des Alkalimetallhydroxids in der wässrig-alkoho lischen Lösung kann variieren; im allgemeinen beträgt sie 0,1 bis 50 Gew.-%. Vorteilhaft ist ein Alkalimetallhydroxidgehalt von 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 10 Gew.-%* Ganz speziell bevorzugt beträgt der Alkalimetallhydroxidgehalt in der wässrig-alkoholischen Lösung etwa 4 bis 5 Gew.-%. Für die Farbreaktion eignen sich grundsätzlich alle Verbindungen, die zusammen mit dem Milbenrückstände enthaltenden Staub Farbreaktionen ergeben. Die im vorliegenden Fall angewandte Reaktion beruht auf der Fähigkeit der Milbenrückstände (Milbenkotreste und Bruchstücke abgestorbener Milben), mit aromatischen Diazoverbindungen eine Farbreaktion zu ergeben. Als aromatische Diazoverbindung ist daher jede aromatische Diazoverbindung geeignet, die mit der Extrak tionslösung (im Falle des Vorhandenseins von Hausstaubmilbenrückständen) eine Farbreaktion eingeht, deren resultierender Farbstoff in der Extraktionslösung löslich ist. Als aromatische Diazoverbindung besonders bewährt hat sich Diazosulfanilsäure (4-Diazobenzosulfonsäure), die eine ziegelrote Färbung ergibt. Die aromatische Siazoverbindung kann in fester (gegebenenfalls in üblicher Weise stabilisierter) Form oder in Form einerwässrigen, insbesondere gesättigten Lösung eingesetzt werden. Bei dem erfindungsgemässen Nachweisverfahren geht man zweckmässig in der Weise vor, dass man eine gewonnene Staubprobe (nach Entfernung der Grobanteile) mit der asässrig-alkoholi- schen Alkalimetallhydroxid-Lösung durchtränkt. Dabei kann das Volumenverhältnis der Staubprobe zur Extraktionslösung variieren. Im allgemeinen beträgt dieses Volumenverhältnis Åaer Staubprobe zur Extraktionslösung (0,1 bis 2) : (1). Besonders bewährt hat sich ein Volumenverhältnis von 0,5 : 1. Die mit der Extraktionslösung versetzte Staubprobe wird mit einer aromatischen Diazoverbindung, insbesondere Diazosulfanilsäure (4-Diazobenzolsulfonsäure) versetzt. Dies erfolgt z.B. durch Zugabe der aromatischen Diazoverbindung in fester, gegebenenfalls stabilisierter Form. Stattdessen kann die aromatische Diazoverbindung aber auch in gelöster Form, insbesondere als gesättigte wassrige Lösung (einige Tropfen) zudosiert werden. Das Ganze wird sodann durch Schütteln oder Rühren gut vermischt. Die erhaltene Extraktsuspension lässt man stehen, wobei sich der Staub im allgemeinen von der Extraktionslösung absetzt (wenige Minuten). Aufgrund der vorhandenen aromatischen Diazoverbindung, z.B. Diazosulfanilsäure, bildet sich bei Anwesenheit von Milbenexkrementen eine ziegelrote Färbung, die, wie die Anmelderin festgestellt hat, in ihrer Intensität proportional zu der in der Staubprobe vorhandenen Nilbenkotkonzentration ist Zur Verdeutlichung der Farberkennung kann man die (über dem sedimentierten Staub) überstehende Extraktionslösung abtrennen und die Farbintensität in dieser Form beurtei len. Man kann aber auch einen kleinen Streifen weisses Filterpapier von definierter Grösse (z.B. 0,5 cm2) in die Farblösung eintauchen und die auf dem Papier verbleibende Färbung bewerten. Dem erfindungsgemässen Nachweisverfahren selbst liegen einige spezielle und zum Teil überraschende Befunde zugrunde: 1) Um die für den Farbnachweis relevanten Kotbestandteile bei Normaltemperatur mit der wässrig-alkoholischen. Ex- traktionslösung schnell und erschöpfend zu extrahieren, ist eine Alkalimetallhydroxid-Lösung (z.B. von KOH oder von NaOH) in der angegebenen Konzentration nötig (eine entsprechend konzentrierte Sodalösung, wie sie eigentlich gemäss der nachfolgenden Ziffer 2) nötig wäre, führt nicht zum Erfolg). 2) Die Farbreaktion mit der aromatischen Diazoverbindung, insbesondere mit Diazosulf anilsäure, wurde an sich am besten in nur wässriger, sodaalkalischer Lösung verlaufen. (In nur wässriger Alkalimetallhydroxld-Lösung , z.3.von 4-5 Gew.-% KOH oder NaOH, findet die gewünschte Farbreaktion - wie die Anmelderin festgestellt hat - nicht statt.) Ausgehend von dieser besonderen Problematik im Hinblick auf die Gestaltung eines einfachen Nachweisverfahrens, wurde nun aber überrraschend gefunden, dass bei Einsatz einer Ex traktionslösung von Alkalimetallhydroxid in einem Lösungsmittelgemisch von Alkohol und Wasser, insbesondere in einem Gemisch, bei dem das Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser (50 bis 90) : (50 bis 10) beträgt, einerseits die für den Farbnachweis relevanten Kotbestandteile praktisch quantitativ extrahiert werden, und dass andererseits in derselben Extraktionslösung die gewünschte Farbreaktion mit der aromatischen Diazoverbindung, insbesondere Diazosulfanilsäure, stattfindet. Ausserdem verbessert der Alkohol die Benetzung der Staubproben(und bewirkt gleichzeitig eine schnelle und gleichmässige Farbverteilung auf dem gegebenenfalls eingetauchten Filterpapier). Nachstehend werden weitere Einzelheiten des erfindungsgemässen Nachweisverfahrens angegeben. Das gefundene Analysenverfahren auf Befall von Hausstaub mit allergenhaltigen Rückständen von Hausstaubmilben lässt sich mannigfaltig ausgestalten. Dies gilt sowohl für die Probenentnahme des Staubes, als auch für das Zusammenbringen des Staubes mit der Extraktionslösung, als auch für den Ablauf der Farbreaktion. Im Sinne einer besonders effizienten Staubgewinnung kann in die Ansaunröhre eines üblichen Staubsauzers ein Filter (insb.Stoff- oder Papier-Filter)eingelegt werden, z.B.in Formyl eines kleinen Tuches (insbesondere Taschentuches). Es hat den Vorteil, dass der Feinstaub gezielt und konzentriert gesammelt wird. Bei der Probenentnahme selbst ist zu berücksichtigen, dass Bodenflächen, die des öfteren abgesaugt werden, eine für den Nachweis ausreichende Staub menge eventuell nicht mehr enthalten können; in diesem Falle führt man dann zweckmässig das Absaugen an weniger zugänglichen Stellen durch. Besonders vorteilhaft erfolgt die Staubgewinnung durch Absaugen von Polstermöbeln und Betten. Für die Extraktion der Staubproben eignen sich besonders kleine verschliessbare Glas- und Kunststoffbehälter mit einem Fassungsvermögen von einigen Millilitern (z.B. 1 bis 10 Milliliter), die mit Markierungen zur Volumendosierung der Staubprobe und der Extraktionslösung versehen sind. In speziellen Fällen kann die Extraktion der Staubprobe aber auch z.B. auf einem Uhrglas erfolgen. Die Effizienz des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch den folgenden Vergleich illustriert: An 20 Staubproben, die von Ärzten aus verschiedenen Häusern mit Verdacht auf Hausstaub-Allergie eingesandt wurden, erfolgte zunächst eine biologische Beurteilung unter Anwendung des Flotationsverfahrens (gemäss Stand der Technik, ame oben beschrieben). Diese Bewertung der Pro ben ergab einen mittelstarken, schwachen bzw. keinen Befall. Danach werden mit den gleichen Proben erfindungsgemässe Be wertungen durchgeführt, und zwar von einer Person, die keine Kenntnis von der (vorherigen) biologischen Beurteilung hatte. Die erfindungsgemässen Farbreaktionen zeigten mittleren, schwachen und keinen Befall. Beim Vergleich dieser Ergebnisse mit dem Laborjournal, in dem die (vorherigen) biologischen Befunde registriert waren, ergab sich völlige ubereinstimmung. Beispiel 1 Man versieht einen normalen Staubsauger mit einem neuen Staubbeutel und saugt den zu untersuchenden Textilbereich (z.B. Teppiche, Polstermöbel, Deckbetten, Matratzen) gründlich ab. Nach Beendigung des Absaugens entleert man den gesamten Staubbeutelinhalt auf ein Blatt Papier und entfernt durch leichtes Abklopfen und Abheben die Grob anteile. Der auf dem Papier verbleibende Feinstaub wird für den Farbnachweis verwendet. Für den Farbnachweis dosiert man die Feinstaubprobe (ca. 2 ml) in einen Glas- oder Kunststoffzylinder von ca. 8 ml Inhalt (Durchmesser ca. 1,5 cm). Dazu dosiert man ca. 4 ml einer wässrig-methanolischen Extraktionslösung, bei der das Gewichtsverhältnis von Methanol zu Wasser 75 : 25 beträgt und in der 5 Gew.-% KOH gelöst sind. Dazu fügt man die erforderliche Menge Diazosulfanilsäure (1 Mikrospatelspitze; ca. 20 mg/ml Staub) und schüttelt das verschlossene Gefäss ca. 10 Sekunden. Danach öffnet man das Gefäss (Gasentwicklung). Nach etwa 3 Minuten taucht man einen Streifen aus weissem Filterpapier (0,5 cm2) in die abgesetzte Extraktionslösung und beurteilt die bei Milbenbefall auftretende ziegelrote Färbung (diese bleibt bei Abwesenheit von Milbenrückständen aus). Beispiel 2 Die Staubprobenahme erfolgt analog dem Beispiel 1. Man dosiert die Feinstaubprobe (ca. 0,5 ml) auf ein Uhrglas von ca. 6 cm Durchmesser, fügt 10 Tropfen Extraktionslösung (Methanol/Wasser-Gemisch im Gewichtsverhältnis 90 : 10, worin 4 Gew.-% NaOH gelöst sind) und 10 Tropfen gesättigte, wässrige Diazosulfanilsäure-Lösung hinzu. Nach kurzzeitigem Durchmischen drückt man einen Streifen weisses Filterpapier von definierter Grösse (0,5 cm2) einseitig gegen die breiige Masse. Bei Milbenbefall zeigt sich eine ziegelrote Färbung, die man (vorteilhaft) über die unverschmutzte Papierseite beurteilt. Zitat 1 G. Hoffmann in "Luftqualität in Innenräumen" Gustav Fischer Verlag Stuttgart - New York 1982 Seite 385 bis 401 Zitat 2: E. Petri et al in Aliergologie, Jg. 5, Nr. 3/1982 Seite 109 bis 119 Zitat 3: J.E.M.H. van Bronswijk et al in Allergie und Immunol. 24 (1978) Seite 18 bis 28

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Feststellung des Vorkommens von allergenhaltigem Hausstaub, wie er sich bei oder nach Auftreten von Hausstaubmilben ergibt, d ad u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man Proben von in Gebäuden vorkommenden Staub in wässrig-alkoholischer Alkalimetallhydroxid-Lösung gründlich suspendiert und mit dem entstehenden Extrakt eine Farbreaktion mit Hilfe einer aromatischen Diazoverbindung durchführt, wobei die Farbreaktion hinsichtlich ihres Auftretens als Indiz für die Belastung des Staub es nit Hausstaubmilben-Rückständen bewertet wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkalimetallhydroxid-Gehalt in der wäB- rig-alkoholischen Lösung 0,1 bis 50 Gew.-0/0 beträgt. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis von Alkohol zu Wasser in der Extraktionslösung (10 bis 95) : (90 bis 5) beträgt. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumenverhältnis der Staubprobe zur-Extraktionslösung (0,1 bis 2) : 1 beträgt. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine aromatische Diazoverbindung eingesetzt wird, deren resultierender Farbstoff in der Extraktionslösung löslich ist. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine aufgetretene Farbreaktion hinsichtlich der Intensität der Färbung mit einer standardisierten Farbskala verglichen und aufgrund dieses Vergleichs die Konzentration an Milbenrückständen beurteilt wird.

Inventors: BISCHOFF, EDELBERT, DR., SCHIRMACHER, WOLFGANG, DIPL.-CHEM.
Applicants: WERNER & MERTZ GMBH
Application year: 1984
Main classification: G01N31
IPC codes: G01N31, G01N33, G01N21