VECTOR MODIFIED BY AT LEAST A PART IF NOT THE WHOLE OF GENE LAM B AND MICROORGANISMS TRANSFORMED WITH THIS VECTOR AND MADE CAPABLE OF SYNTHESIZING A DETERMINED EXTERNAL MEMBRANE PROTEIN, ENCODED BY AN INSERT ALSO INCLUDED IN SAID VECTOR

Abstract: 1. Vector modified by a nucleotide sequence containing a predetermined nucleotide insert coding for a predetermined amino acid, said nucleotide sequence being placed under the control of a sufficiently strong promoter to permit the transcription and translation essentially of the whole of said nucleotide sequence in a strain of _E_._ _c_o_l_i previously transformed by said modified vector, said vector being characterized in that the proximal part of said nucleotide sequence, with respect to said promoter and upstream of said predetermined nucleotide insert, contains the front part of the _l_a_m B gene coding for at least the 180 first amino acids of the N-terminal part of the corresponding protein, and wherein the distal part of said nucleotide sequence, also situated downstream of said predetermined insert, comprises the rear part of the _l_a_m B gene, coding for at least the 20 last amino acids of the C-terminal part of the corresponding protein, said front and rear parts of the _l_a_m B gene as well as the abovesaid nucleotide fragment being respectively in phase with the promoter, wherein the hybrid protein resulting from the translation of said sequence under the control of said promoter contains, on the one hand, respectively at least the 180 first and at least the 20 last amino acids of the protein coded by the _l_a_m B gene and, on the other hand, the abovesaid predetermined amino acid sequence.

Description: Vecteur modifié par une partie au moins, sinon la totalité, du gène lam B et micro-organismes transformés par ce vecteur, et rendus aptes à synthétiser une protéine de membrane externe déterminée , codée par un inséra t également contenu dans ledit vecteur. L'invention est relative à des vecteurs perfectionnés modifiés par au moins une partie du gène lam B, sinon la totalité de celui-ci, ce vecteur pouvant à son tour être modifié par un insérat constitué par un fragment déterminé de nucleotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides. L'invention est encore relative à des souches de micro-organismes, plus particulièrement de E. coli, transformées par un tel vecteur et rendues aptes à synthétiser une protéine hybride contenant ladite séquence déterminée d'aminoacides et à la transporter à la surface externe de leurs membranes. Des vecteurs appartenant à ce domaine technique ont déjà été décrits dans des publications et brevets antérieurs. On rappellera en particulier que l'on avait déjà décrit dans le brevet francais nO 82 07201 déposé le 26 avril 1982 un vecteur porteur du promoteur de l'opéron lactose et d'au moins un fragment du gène Z de ce même opéron, caractérisé par le fait qu'au moins une séquence, plus particulièrement une séquence comportant la partie proximale du gène lam B se trouve insérée dans ce vecteur, plus particulièrement dans le susdit fragment de gène Z ou immédiatement en aval de celuici. La longueur de cette séquence du gène lam B devait être suffisante pour permettre la production par le micro-organisme transformé, notamment E. coli, sous le contrôle du promoteur de l'opéron lactose d'une pro téine hybride transportée dans la membrane externe de ces cellules et contenant des séquences d'acides aminés contenues dans le récepteur du phage X et la B-galactosidase et respectivement codées par lam B et le gène S. Dans certaines cas, la protéine hybride peut être excrétée, dans le milieu de culture dudit micro-organisme transformé. Il a cependant été constaté que la production de la protéine hybride de membrane externe n'allait pas sans difficultés, que la réalisation de la culture des micro-organismes, transformés dans des conditions permettant d'assurer la transcription et la traduction de la séquence correspondante de nucléotides, pouvait s'accompagner soit d'un certain niveau d'instabilité, soit d'une certaine toxicité de la protéine hybride synthétisée, pouvant entraîner la lyse d'une proportion importante des cultures cellulaires, soit des deux à la fois. La présente invention a pour but de remédier au moins en partie à ces difficultés, notamment de fournir des vecteurs du type sus-indiqué, contenant également un insérat formé d'une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés déterminée, dont on désire induire la synthèse dans un micro-organisme approprié, plus particulièrement E. coli, dans des conditions telles que la protéine exprimée correspondante présente une stabilité plus satisfaisante et que les colonies bactériennes transformées puissent se développer et fournir des générations successives de micro-organismes transformés et producteurs de ladite protéine hybride à la surface externe de leurs cellules, tout en contrôlant l'éventuelle lyse d'une partie des cellules, dans des proportions compatibles avec la production de colonies suffisamment importantes de cellules transformées. L'invention résulte de la découverte que des cellules modifiées, comportant sur leurs membranes externes, des protéines hybrides contenant elles-mêmes une séquence d'acides aminés déterminée, répondant aux conditions sus-indiquées, peuvent être obtenues par transformation préalable de ces cellules avec un vecteur modifié, dans lequel le fragment nucléotidique codant pour la séquence déterminée d'aminoacides est lui-même inséré dans le gène lam B placé sous le contrôle d'un promoteur suffisamment fort pour permettre la transcription et la traduction de la totalité de la séquence définie par les éléments correspondants du gène lam B (ou de la partie de gène lam B) et du fragment déterminé de nucléotides, lorsque les conditions suivantes sont respectées. Le vecteur modifié selon l'invention est modifié par une séquence nucléotidique contenant un insérat déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides, cette séquence nucléotidique étant placée sous le contrôle d'un promoteur suffisamment fort pour permettre la transcription et la traduction essentiellement de la totalité de ladite séquence nucléotidique dans une souche de E. coli préalablement transformée par ledit vecteur modifié. Le vecteur modifié selon l'invention est caractérisé en ce que la partie proximale de ladite séquence nucléotidique, vis-à-vis dudit promoteur et en amont dudit insérat déterminé de nucléotides, contient la partie antérieure du gène lam B codant pour au moins les 180 premiers aminoacides de la partie N-terminale de la protéine correspondante, et en ce que la partie distale de ladite séquence nucléotidique, aussi située en aval dudit insérat déterminé, comporte la partie postérieure du gène lam B, codant pour au moins les 20 derniers aminoacides de la partie C-terminale de la protéine correspondante, lesdites parties antérieure et postérieure du gène lam B ainsi que le susdit fragment de nucléotides étant respectivement en phase avec le promoteur, afin que la protéine hybride résultant de la traduction de ladite séquence sous le contrôle dudit promoteur contienne, d'une part, respectivement au moins les 180 premiers et au moins les 20 derniers aminoacides de la protéine codée par le gène lam B et, d'autre part, la susdite séquence déterminée d'aminoacides. Il stest en effet avéré que la présence, en aval du fragment déterminé du nucléotide codant pour la séquence d'acides aminés recherchés, de la partie postérieure du gène lam B codant pour au moins les 20 derniers aminoacides de la partie C-terminale de la protéine correspondante (ou comme on le dira dans ce qui suit, pour la simplicité du langage, de la partie C-terminale du gène lam B), était une condition essentielle à l'obtention de bonnes conditions de transformation. L'absence de ltextrémité Cterminale du gène lam B, voire son altération, se manifeste en effet par un considérable accroissement de la toxicité de la protéine codée par le vecteur ainsi modifié à ltégard du micro-organisme. La réalisation d'un vecteur contenant cette partie C-terminale du gène lam B, dans les conditions qui ont été énoncées, va à l'encontre de nombreuses tentatives décrites dans. la littérature, pour produire des vecteurs mettant en jeu des fusions de séquences constituées à partir de fragments de gène lam B et de l'insérat codant pour la séquence d'acides aminés dont la transcription et la traduction sont recherchées, dans lesquelles les fragments de gène lam B sont en général toujours placés en amont seulement de 1 'insérat et sont le plus souvent une partie N-terminale du gène lam B présumées contenir la séquence signal et les informations néc-essaires au transport de la protéine hybride à travers la membrane externe des cellules. La condition relative à la longueur minimum de la partie inférieure du gène lam B, en aval de l'insérat, est importante également. On constate en effet que la condition exprimée plus haut, que cette partie antérieure, codant pour au 'moins les 180 premiers aminoacides de la partie N-terminale de la protéine correspondante (ou encore la partie N-terminale du gène lam B), est importante aussi du point de vue de la stabilité de la protéine synthétisée. La protéine hybride dont la synthèse est induite par des------------------------------------ vecteurs, dans lesquelles la partie N-termina le du gène B serait plus courte en amont de l'insérat, conduirait à des protéines hautement instables, comme cela peut être détecté par des essais de caractérisation des proté ines, induites en présence d'un marqueur radioactif. De préférences, les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble un nombre total suffisant de nucléotides pour que de telles parties, lorsqu'elles sont placées en phase sous le contrôle d'un promoteur tac à l'intérieur d'un plasmide le contenant, soient aptes à permettre l'obtention dans une souche de E. coli préalablement transformée par ce plasmide, d'une protéine stable et non léthale pour E. coli, sur la membrane externe du micro-organisme. Dans le cas de vecteurs mettant en jeu un promoteur tac (par exemple tel que décrit dans l'article de H.A. DE BOER et Coll. paru dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 21-25, janvier 1983), la toxicité ou la léthalité de la protéine hybride synthétisée par le micro-organisme transformé peut être appréciée dans les conditions. suivantes. Avantageusement, le microorganisme utilisé consiste en un mutant de E. coli, initialement résistant au phage A et/ou initialement incapable de croître spontanément dans un milieu contenant une maltodextrine. On sait en effet que le gène lam B code pour le récepteur du phage A Le récepteur du phage X se comporte également comme le feraient des pores dans la membrane cellulaire à l'égard des maltodextrines. La transformation de tels micro-organismes avec le vecteur selon l'invention (ou un vecteur contenant le gène lam B entier (sauvage)) restitue à ces mutants la sensibilité au phage A et/ou la capacité de croître sur des malto dextrines, notamment en présence d'un inducteur constitué par l'isopropylthiogalactoside (IPTG). Dans les essais qui ont été réalisés dans le cadre. de la présente invention, le mutant de E. coli utilisé était constitué de la souche BB = thr leu tonB thi lacis ¯¯¯ ¯¯¯ laci Qi recA dex5 metA supE, F' lacIQ1 Z+Y+proAB+. Cette souche est dérivée de la souche pop 6510 et contient un épisome F' comportant lui-même une mutation lacis . Cette souche, transformée en outre par le plasmide p BBO, a été déposée à la C.N.C.M. de l'INSTITUT PASTEUR de Paris le 6 septembre 1983 sous le n I-239. Des vecteurs préférés sont déri v és du plasmide pBBO obtenu par 1 insertion d'un promoteur tacl2 de DE BOER et Coll., inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pHSF1 décrit par J.M. CLEMENT, D. PERRIN et J. HEDGPETH. 1982. Mol. Cen. G. 185, 302-310 , juste avant la séquence de SHINE et DALCARNO du gène lam B. La transformation de la susdite souche mutante par pBBO et la culture du micro-organisme transformé en présence d'IPTG 10 3M sur le milieu de culture solide de Luria, conduit à une surproduction de la protéine codée par lam B. Les bactéries transformées forment des colonies translucides qui se développent régulièrement jusqu'à confluence, en l'absence sensible de lyse cellulaire. La léthalité de certains vecteurs, par exemple ceux dans lesquels les 10 derniers triplets de l'extrémité C-terminale de lam B ont été modifiés, se manifeste par une sensibilité excessive à 1'IPTG, pouvant entralner la lyse de toutes les cellules après une seule génération. A l'inverse, le défaut de stabilité des protéines synthétisées par un vecteur non conforme à l'invention peut être apprécié après immunoprécipitation de la totalité des extrait-s cellulaires des cellules transformées recueillies après lyse ou rupture des parois cellulaires et marquées avec un acide aminé radioactif, par exemple la 35S-methionine, selon la méthode décrite par ITO et Coll. (K. ITO, P.J. BASSFORD et J.R. BECKWITH, 1981, Cell 24, 707-717). La stabilité des protéines formées, notamment lorsque la traduction est interrompue de façon prématurée, se manifeste par une dégradation des protéines formées, de sorte que celles-ci ne peuvent rapidement plus être détectées par autoradiographie, dans des essais de fractionnement sur gel d'acrylamide - modifié par du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 %. Cette instabilité s'observe notamment lorsque la partie proximale du gène lam B dans le vecteur selon 1 'invention est trop courte ou encore lorsque l'insérat, même introduit dans un site adéquat de lam B, entraine un décalage de la phase de lecture de la partie C-terminale de la partie postérieure du gène lam B. On appréciera donc que les tests qui viennent d'être décritstsont à l'origine de la détermination des conditions auxquelles doivent répondre les vecteurs selon l'invention, pour permettre la synthèse,dans des conditions optimales, de la protéine hybride de membrane externe. L'insertion d'un fragment déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides dans le gène lam B, dans les conditions qui ont été définies plus haut, conduit à des vecteurs aptes à rendre les cellules qu'ils transforment capables de se développer en présence d'IPTC, en formant des colonies qui ne lysent pas. En outre, les protéines immunoprécipitables persistent dans le temps, donc sont stables. Les constatations qui ont été faites plus haut en ce qui concerne la capacité de la souche mutante transformée par pBBO de synthétiser des protéines hybrides se retrouvant dans les membranes externes des cellules lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu approprié en présence d'IPTG, se manifeste encore dans des cultures de cellules sem blables modifiées par un vecteur dérivé de pBBO, par insertion dans celui-ci d'un insérat déterminé dans les conditions qui ont été définies en ce qui concerne l'invention. Là encore, on obtient des colonies translucides ou, le cas échéant, des colonies de moindre importance, cependant non lysées, et portant à l'extérieur de leurs membranes des protéines hybrides contenant le produit d'expression de -l 'insérat. Le fait même que ces colonies se soient développées dans les conditions. sus-indi- quées atteste d'ailleurs que le clonage et l'expression de l'insérat ont été réalisés. On peut également transformer des E. coli ne présentant pas les mutations susindiquées, étant alors entendu que la détection de la protéine hybride devrait alors mettre en jeu d'autres modes de détection, par exemple des anticorps préalablement formés contre la séquence d'acides aminés pour laquelle code 1 'insérat, ou contre une protéine contenant cette séquence d'acides aminés. L'expérience montre que les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B totalisent ensemble au moins 350 triplets de nucléotides sur les 420 triplets de ce gène, dont la séquence a été entièrement réalisée (fig.1). Il est encore davantage préféré que les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble substantiellement la totalité des nucléotides du gène lam B. Les délétions réduites qui peuvent être envisagées, voire les modifications de certaines séquences des deux parties du gène lam B, doivent être telles qu'elles ne modifient pas sensiblement les propriétés globales de ce vecteur. La description des tests qui précèdent fournit à l'homme du métier les éléments qui lui permettront, en toutes circonstances, de tester celles des délétions ou modifications qui peuvent être réalisées, sans modifier l'ensemble des propriétés du vecteur selon l'invention. Il en sera encore de même en ce qui concerne la vérification de l'impact sur la bactérie ultérieurement transformée du choix du site d'insertion de 1 'insérat dé terminé dans le vecteur et des longueurs relatives des parties antérieure et postérieure du gène lam B. D'une façon générale, notamment lorsque les parties antérieure et postérieure du gène lam B comprennent la quasi-totalité des nucléotides du gène intact, cette insertion pourra être effectuée entre le site 180 et le site 350 (la numé rotation s'effectuant à partir du triplet codant pour le premier acide aminé du récepteur du phage X). En ce qui concerne le promoteur, on peut avoir re cours à tout autre promoteur assez fort pour permettre la transcription et la traduction dans E. coli de la sé quence totale, telle qu'elle a été définie plus haut. Bien que les promoteurs tac soient préférés, les promoteurs lac et trp peuvent également être utilisés utilement. Conformément aux constructions préférées de 1 'inven- tion, les premiers triplets de nucléotides tra duits sous le contrôle du promoteur choisi sont constitués par les premiers triplets de la partie antérieure du gène lam B et, de préférence encore, le codon d'arrêt de la tra ction se trouve placé immédiatement après le dernier acide né du récepteur du phage A (trp en position 421). Le ve + eut être constitué par tout acide nucléique apte à trans er un E. coli. De préférence, il s'agit d'un plasmide tel ue pBR322, le cas échéant d'un phage. L'insertion de L'insérant au sein de la séquence du vecteur contenant le gène lam B, soit entier, soit délé té des parties de moindre importance (par exemple. la sé quence 350-400) peut être réalisée par toute technique en soi connue. Dans le cas où le vecteur consiste dans un plasmide, on peut avoir recours à la linéarisation du du plasmide en utilisatn des enzymes de restriction, la fixation de courtes séquences de nucléotides ("linkers"), de préférence après bicateinarisation des extrémités de restriction à l'aide des nucléotides appropriés et en pré- sence de la polymérase de Klenow, les "linkers" contenant le site de restriction correspondant aux extrémités cohésives de l'insérat que l'on veut introduire dans le site correspondant de lam B, le traitement dans les condi tion.s rlliillc-- is ' t'j9 du plasmide linéarisé ainsi modifié et de la séquence de nucléotides contenant l'insé- rat avec l'enzyme de restriction en question et la ligation, notamment en présence d'une T4 ADN-ligase, des fragments entre eux pour reconstituer le plasmide contenant l'insérat dans la position ainsi choisie. L'invention concerne encore les micro-organismes transformés comportant des protéines hybrides exposées à leur surface et contenant la séquence déterminée d'aminoacides codée par le susdit insérat. L'invention concerne enfin un procédé de fabrication de telles souches transformées, caractérisé par la transformation d'un microorganisme appartenant à la catégorie de ceux qui portent des récepteurs du phage A, notamment E. coli, avec le vecteur tel qu'il a été défini plus haut, la sélection des souches transformées et la culture des souches transformées productrices de ladite protéine hybride sur les membranes externes de leurs cellules dans un milieu de culture approprié. De préférence, la souche mise en oeuvre est un mutant initialement résistant au phage X et/ou initialement incapable de croitre spontanément dans un milieu contenant une maltodextrine. Les souches transformées sont alors sélectionnées selon qu'elles sont devenues non résistantes au phage A et/ou devenues capables de croître dans un milieu contenant de la maltodextrine. Le cas échéant, la protéine hybride peut être récupérée à partir de ces micro-organismes, notamment après rupture ou lyse des parois, notamment en ayant recours à des fractionnements sur gel et, le cas échéant, en mettant en oeuvre des tests immunologiques de reconnaissance des protéines hybrides. Par exemple, on met en oeuvre des anticorps préalablement formés contre la séquence d'acides aminés ou la protéine qui la contient. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaltront encore au cours de la description qui suit d'un principe préféré de fabrication des vecteurs conformes à l'invention. 10) Fabrication d'un plasmide conforme à l'invention con tenant un inséra t formé par une séquence de nucléotides extraite du gène S du génome de l'hépatite virale B (délimitée par des extrémités de restriction BstNI). Le site nucléo tidique reconnu par 1 'enzyme de restriction SmaI (position 183) dans le gène lam B contenu dans pBBO) a été choisi pour y insérer le susdit fragment d'ADN codant pour une partie de liantigène HBs. Ce fragment de 44 nucléotides a été obtenu par digestion du gène S du génome du virus de l'hépatite virale B par l'enzyme de restriction BstNI, aux positions nucléotidiques 111 et 155 vis-à-vis de la position O du site EcoRI dudit génome (DNA-HBV). Les extrémités de ce fragment ont ensuite été traitées par la polymérase de Klenow pour bicaténariser les extrémités monocaténaires des fragments ainsi obtenus. Aux extrémités des fragments ainsi obtenus ont été accolés, en présence d'une enzyme ligase du phage T4, deux oligo-nucléotides obtenus par synthèse chimique, dont les séquences primaires avaient été programmées pour être reconnues par Bam HI. Les fragments ainsi modifiés ont été soumis à l'action de BamHI pour reformer des extrémités cohésives BamHI. Les fragments finalement obtenus ont été à nouveau traités par un ADN-ligase du phage T4. Le plasmide reconstitué et contenant l'insérat issu du gène S de DNA-HBV, placé entre une partie proximale comportant de l'ordre de 183 triplets nucléotidiques issus de lam B et la partie distale constituée par une séquence de lam B, comportant essentiellement les triplets codant pour les 238 acides aminés suivants, a été utilisé pour transformer la souche BB1, dans les conditions qui ont déjà été indiquées, La protéine hybride formée sur une membrane externe des cultures de E. coli transformées et induites en présence d'IPTG peut ensuite être étudiée sur le plan de ses propriétés iùimu- nologiques, pour ce qui est de sa capacité à réagir, notamment dans un test ELISA,avec un sérum anti-HBs ou dans un test tel que décrit par ITO et ses Collaborateurs, pour reconnaître des fragments du gène lam B. Il va de soi que l'on peut remplacer la séquence d'ADN extraite du gène S de l'hépatite virale B par toute autre séquence de nucléotides dont 1 'expression pourrait être recherchée dans des conditions semblables. Par exemple, on peut avoir recours à un insérat extrait du génome d'un tout autre virus, par exemple à un insérat codant pour un peptide immunogène du virus de la poliomyélite ou de la fièvre aphteuse et pour un fragment d'une toxine ou toute autre protéine douée de propriétés particulières. D'une façon générale, le vecteur selon l'invention se prête à l'expression et au transport,à travers des membranes cellulaires de souches de micro-organismes ainsi transformées, de toute séquence peptidique d'origine procaryote ou eucaryote. L'invention fournit par conséquent des moyens d'étude particulièrement intéressants des comportements réciproques des micro-organismes transformés de la séquence peptidique susceptible d'être transportée à travers la membrane externe du micro-organisme. L'invention permet en outre, grâce à l'exposition à la surface de micro-organismes de protéines de constitution déterminée, l'étude de principes vaccinants mettant en jeu par exemple une protéine virale vaccinante, fixée sur la bactérie hôte (lorsque celle-ci est inoffensive), de sorte que celle-ci puisse être directement utilisée comme véhicule porteur des antigènes vaccinants que constituent ces protéines virales. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes ; en particulier dans ce qui précède, il a surtout été fait état du gène lam B ou de parties de celui-ci. Il va de soi que doivent également être considérées comme des équivalents entrant dans le champ de protection des revendications toutes autres formes d 'ADN ou de fragments d'ADN capables de coder pour des polypeptides identiques ou ayant des propriétés semblables. On mentionnera à titre d'exemples, les séquences de cADN susceptibles d'être obtenues par recopie enzymatique de L'ART messager correspondant au récepteur du phage A, le cas échéant à son précurseur. Il va de soi qu'un tel cADN ou les parties antérieure et postérieure correspondantes pourraient,comme il a été décrit plus haut en ce qui concerne les fragments de lam B, être mis sous le contrôle du promoteur en mettant en oeuvre des méthodes de recombinaison génétique bien connues des spécialistes. L'invention n'est pas davantage limitée aux microorganismes constitués par E. coli. On remarque que des techniques semblables peuvent être appliquées à des espèces différentes de micro-organismes, tels que les shighellae, lesquels sont également susceptibles de synthétiser dans les conditions qui ont été évoquées plus haut, une protéine hybride de membrane externe. D'une façon plus générale encore l'invention s'étend à toutes espèces de micro-organismes, dès lors qu'ils sont transformables par le plasmide vecteur choisi, lequel aura au préalable été inséré dans la séquence devant être exprimée et contenant l'insérat susdit entouré par les parties antérieure N-terminale et postérieure C-terminale de lam B. Enfin, on remarquera que les techniques de clonage décrites par MANIATIS, FRITSCH et SAMBROOK dans l'ouvrage intitulé "Molecular cloning" ont été appliquées dans les exemples indiqués plus haut. On peut avoir naturellement recours à toute autre technique classique. Par exemple, on mentionnera encore les techniques décrites dans la publication déjà mentionnée de H.A. DE BOER et Coll.

Claims: REVENDICATIONS 1 - Vecteur modifié par une séquence nucléotidique contenant un insérat déterminé de nucléotides codant pour une séquence déterminée d'aminoacides, cette séquence nucléotidique étant placée sous le contrôle d'un promoteur suffisamment fort pour permettre la transcription et la traduction essentiellement de la totalité de ladite séquence nucléotidique dans une souche de E. coli préalablement transformée par ledit vecteur modifié, ledit vecteur étant caractérisé en ce que la partie proximale de ladite séquence nucléotidique,vis-à-vis dudit promoteur et en amont dudit insérat déterminé de nucléotides, contient la partie antérieure du gène lam B codant pour au moins les 180 premiers aminoacides de la partie N-terminale de la protéine correspondante, et en ce que la partie distale de ladite séquence nucléotidique, aussi située en aval dudit insérat déterminé, comporte la partie postérieure du gène lam B, codant pour au moins les 20 derniers aminoacides de la partie C-terminale de la protéine correspondante, lesdites parties antérieures et postérieures du gène lam B ainsi que le susdit fragment de nucléotides étant respectivement en phase avec le promoteur, afin que la protéine hybride résultant de la traduction de ladite séquence sous le contrôle dudit promoteur contienne, d'une part, respectivement au moins les 180 premiers et au moins les 20 derniers aminoacides de la protéine codée par le gène lam B et, d'autre part, la susdite séquence déterminée d'aminoacides. 2 - Vecteur selon la revendication.1, caractérisé en ce que les susdites partie antérieure et partie postérieure du gène lam B contiennent ensemble un nombre total suffisant de nucléotides pour que de telles parties, lorsqutelles sont placées en phase sous le contrôle d'un promoteur tac à l'intérieur d'un plasmide le contenant, soient aptes à permettre l'obtention dans une souche de E. coli préalablement transformée par ce plasmide, d'une protéine stable et non léthale pour E. coli, sur la membrane externe du micro-organisme. 3 - Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam 5 totalisent ensemble au moins 350 triplets de nucléotides. 4 - Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que les susdites parties antérieure et postérieure du gène lam B contiennent ensemble substantiellement la totalité des nucléotides du gène lam B. 5 - Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les premiers triplets de nucléotides,transcrits et traduits sous le contrôle du susdit promoteur, appartiennent à la partie antérieure du gène lam B. 6 - Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le promoteur susdit est un promoteur tac. 7 - Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide, notamment dérivé de pBR 322. 8 - Micro-organisme, notamment du type E. coli transformé par un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7 et capable d'exprimer la susdite séquence déterminée de nucléotides sous la forme d'une protéine externe sur ia membrane dudit micro-organisme. 9 - Micro-organisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il porte sur sa membrane externe des protéines contenant la susdite séquence déterminée d 'amino- acides. 10 - Procédé de fabrication d'une souche de E. coli comportant des protéines hybrides exposées à l'ex- térieur de la membrane externe des cellules, et contenant elles-mêmes une séquence déterminée d'aminoacides, caractérisé par la transformation d'un mutant de E. coli, de préférence initialement résistant au phage et/ou initialement incapable de croître spontanément dans un milieu contenant une maltodextrine, avec un vecteur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7, la sélection des souches transformées devenues non résistantes au phage À et/ou devenues capables de contre dans un milieu contenant de la maltodextrine et la culture des souches transformées productrice de ladite protéine hybride sur leur membrane externe dans un milieu de culture approprié.

Inventors: BOUGES-BOCQUET, BERNADETTE, GUESDON, JEAN-LUC, HOFNUNG, MAURICE
Applicants: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS), INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM), INSTITUT PASTEUR
Application year: 1984
Main classification: C12N15
IPC codes: C12R1, C12N1, C07K14, C12N15