HUMAN-PARATHYROID HORMONE (HUMAN-PTH) PRODUCING HYBRID VECTOR

Abstract: The invention relates to hybrid vectors producing human parathyroid hormone and to the human parathyroid hormone gene.

Description: Human-Parathormon produzierende HySridvektoren und Human Parathormongen Human-Parathormon reguliert u.a. den Einbau und Ausbau von Calcium in Knochen. Aufgabe der Erfindung ist es, biologisches Material zur Verfügung zu stellen, mit dem Human-Parathormon technisch hergestellt werden kann. Gemäss einer Ausführungsform wird diese Aufgabe durch einen in prokaryotischen Zellen klonierbaren Hybridvektor gelöst, der Human-Parathormon produziert und durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist: (a) einen Promotor, (b) einen sich an den Promotor anschliessenden DNA-Bereich von 0 bis 1000 und isbesondere 0 bis 200 Basenpaaren, (c) eine sich an den DNA-Bereich gemäss (b) anschliessende ribosomale Bindungsstelle, (d) einen sich an die ribosomale Bindungsstelle anschliessenden DNA-Bereich von 4 bis 15 Basenoaaren, (e) ein sich an den DNA-Bereich gemäss (d) anschliessendes Startcodon und (f) die folgende Human-Parathormon kodierende DNA-Sequenz: : Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His TCT GTG AGT GAA ATA CAG CTT ATG CAT AAC CTG GGA AAA CAT AGA CAC TCA CTT TAT GTC GAA TAC GTA TTG GAC CCT TTT GTA Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu CTG AAC TCG ATG GAG AGA GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG CTG GAC TTG AGC TAC CTC TOT CAT OTT ACC GAC GCA TTC TTC GAC Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC CTT GGA GCT CCT CTA GCT GTC CTA CAC GTG TTA AAA CAA CGG GAA CCT CGA GGA GAT CGA Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp CCC AGA GAT GCT GGT TCC CAG AGG CCC CGA AAA AAG GAA GAC GGG TCT CTA CGA CCA AGG GTC TCC GGG GCT TTT TTC CTT CTG Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala AAT GTC TTG GTT GAG AGC CAT GAA AAA AGT CTT GGA GAG GCA TTA CAG AAC CAA CTC TCG GTA CTT TTT TCA GAA CCT CTC CGT Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln GAC AAA GCT GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG T CTG TTT CGA CTA CAC TTA CAT AAT TGA TTT CGA TTT AGG GTC A Als prokaryotische Zellen kommen alle Zellen in Betracht, in denen sich Hybridvektoren mit den angegebenen Merkmalen in technischem massstab unter Bildung von Human-Parathormon klonieren lassen. Insbesondere kommt Escherichia coli in e- tracht. Beispiele für geeignete Promotoren für E. coli finden sich beispielsweise bei Sengbusch, P. von, Molekular- und Zellbiologie, Springer-Verlag, Heidelberg etc. 1979. Bei E. coli kann die ribosomale Bindungsstelle beispielsweise die folgende DNA-Sequenz aufeisen: AGGA oder GGAG TCCT CCTC Ein 3eispiel für ein bei E. coli verwendbares Startcodon hat die DNA-Sequenz ATG TAC Gemäss einer weiteren Ausführungsform wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch einen in eukaryotischen Zellen klonierbaren und Human-Parathormon produzierenden Hybridvektor gelöst, (A) der dadurch herstellbar ist, dass man (a) aus Schweine-Nebenschilddrusen mRNA isoliert, (b) die isolierte mRNA als ds-cDNA mit Hilfe eines Vektors in E. coli kloniert, (c) aus Pools erhaltener Klone Hybridvektor-DNA isoliert, (d) isolierte Hybridvektor-DNA an einen für jeden Pool. eigenen Träger fixiert, gemäss (a) isolierte mRNA anlagert und wieder entfernt, entfernte mRNA in Schweine-Prä-Pro-Parathormon oder Schweine-Parathormon zu übersetzen versucht, gebildetes Schweine-Prä-Pro-Parathormon oder Schweine-Parathormon durch AntikörDerfällung nachweist und damit geinäss (b) erhal- tent Klone ermittelt, die Schweine-Parathormongen-Sequenzen aufweisen, Hybridvektor-DNA ermittelter und Schweine-Parathormongen-Sequenzen aufweisende Klone sequenziert und den oder die Klone identifiziert, die Hybridvektor-DNA mit Schweine Parathormon kodierender DNA-Sequenz aufweisen, (-e) Hybridvektor-DNA der gemäss (d) identifizierten Klone radioaktiv markiert, (f) mit erhaltener radioaktiv markierter Hybridvektor-DNA eine Human-Genbank screent und (g) das ermittelte Human-Parathormon in einen in eukaryotischen Zellen klonierbaren vybridvektor überführt, (8) und der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine zwischen zwei RI-Schnittstellen liegende DNA-Sequenz, die die folgende DNA-Sequenz umfasst, oder einen Unterbereich der zwischen den RI-Schnittstellen liegenden DNA-Sequenz aufweist: TGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAGCTACTAACATACCTGAACGAAGATCTTGTTCTAAGA ACAGAAATOAAATGAGTCGTAGTCGATGATTGTATGGACTTGCTTOTAGAACAAGATTCT EMI6.1 <tb> CATTGTAT <SEP> Intron <SEP> II <SEP> ca. <SEP> 400 <SEP> bp <tb> <SEP> Net <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Ala <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Met <tb> <SEP> GTG <SEP> AAG <SEP> ATG <SEP> ATA <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> AAA <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GCT <SEP> AAA <SEP> GTT <SEP> ATG <tb> <SEP> CAC <SEP> TTC <SEP> TAC <SEP> TAT <SEP> GGA <SEP> CGT <SEP> TTT <SEP> CTG <SEP> TAC <SEP> CGA <SEP> TTT <SEP> CAA <SEP> TAC <tb> Ile Val Met Leu Ala Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys ATT GTC ATG TTG GCA ATT TGT TTT CTT ACA AAA TCG GAT GGG AAA TAA CAG TAC AAC CGT TAA ACA AAA GAA TGT TTT AGC CTA CCC TTT EMI6.2 <tb> Ser <SEP> Val <SEP> Lys <tb> TCT <SEP> GTT <SEP> AAG <tb> AGA <SEP> CAA <SEP> TTC <tb> <SEP> @@@@ <tb> @@@ <SEP> <SEP> AAG <SEP> AGA <SEP> TOT <SEP> GTG <SEP> AGT <SEP> GAA <SEP> ATA <SEP> CAG <SEP> CTT <SEP> ATG <SEP> CAT <SEP> AAC <tb> ca. <SEP> 80 <SEP> bp <SEP> TTC <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> CAC <SEP> TCA <SEP> CTT <SEP> TAT <SEP> GTC <SEP> GAA <SEP> TAC <SEP> GTA <SEP> TTG <tb> Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg CTG GGA AAA CAT CTG AAC TCG ATG GAG AGA GTA GAA TGG CTG CGT GAC CCT TTT GTA GAC TTG AGC TAC CTC TOT CAT CTT ACC GAC GCA Lys tys Leu Gln Asp Val uis Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro AAG AAG CTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC CTT GGA GCT CCT TTC TTC GAC GTC OTA CAC GTG TTA AAA CAA CGG GAA CCT CGA GGA Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu CTA GCT CCC AGA GAT GCT G5T TCC CAG AGG CCC CGA AAA AAG GAA GAT CGA CCC TCT CTA CGA CCA AGG GTC TCC <RTI ID=6.12> CCC GCT TTT TTC CTT Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu-Ala GAC AAT GTC TTG GTT GAG AGC CAT GAA AAA AGT CTT GGA GAG GCA CTG TTA CAG AAC CAA CTC TCG GTA CTT TTT TCA GAA CCT CTC CGT Asp Lys Pla Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln GAC AAA GCT GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG TGA CTG TTT CGA CTA CAC TTA CAT AAT TCA TTT CGA TTT AGG GTC ACT AAA TGA AAA CAG ATA TTG TCA GAG TTC TGC TCT AGA CAG TGT ACC TTT ACT TTT GTC TAT AAC ACT CTC AAG ACG AGA TOT GTC ACA TCC CCA ACA PTA CAT GCT GCT AAT TCA AAG CTC TAT TAA GAT TTC CAA CGT TOT TAT GTA CGA CGA TTA AGT TTC GAG ATA ATT CTA AAG GTT GTG CCA ATA TTT CTG ATA TAA CAA ACT ACA TGT AAT CCA TCA CTA CAC GGT TAT AAA GAC TAT ATT GTT TGA TGT ACA TTA GGT ACT GAT GCC ATG ATA ACT GCA ATT TTA ATT GAT TAT TCT GAT TCC ACT TTT CGG TAC TAT TGA CGT TAA AAT TAA CTA ATA AGA CTA AGG TGA AAA ATT CAT TTG AGT TAT TTT AAT TAT CTT TTC TAT TGT TTA TTC TTT TAA GTA AAC TCA ATA AAA TTA ATA GAA AAG ATA ACA AAT AAG AAA TTA AAG TAT GTT ATT GCA TAA TTT ATA AAA GAA TAA AAT TCG ACT AAT TTC ATA CAA TAA CGT aTT AAA TAT TTT CTT ATT TTA AGC TGA TTT AAA CCT CTC TTC TAC CTT AAA ATG TAA AAC AAA AAT GTA ATG AAA TTT GGA GAG AAG ATG GAA TTT TAC ATT TTG TTT TTA CAT TAC ATC ATA AGT CTA AAT AAA TGA AGT ATT TCT CAC TCA AA TAG TAT TCA GAT TTA TTT ACT TCA TAA AGA GTG AGT TT ---- PräPro - PTH Beispiele für eukaryotische Zellen, in denen der Hybridvektor klonierbar ist und Human-Parathormon produzieren kann, sind Humanzellen oder Affenzellen, beispielsweise Affennieren zellen. Schliesslich wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch Human-Parathormongen gelöst, (a) das gemäss den vorstehenden Ausführungen und Anspruch 3 (A) herstellbar ist und (b) durch die zwischen z;vei 2I-Schnittstellen liegende DNA Sequenz gemäss den vorstehenden Ausführungen und gemäss Anspruch 3 (B) oder einen Unterbereich davon gekennzeichnet ist. Zur Produktion von Human-Parathormon ist es auch möglich, das erfindungsgemässe Human-Parathormongen direkt in eukaryotische Zellen zu transformieren. Nachstehend wird die Herstellbarkeit der erfindungsgemässen Hybridvektoren und des erfindungsgemässen Human-Parathormongens an einem Beispiel und drei Schemata näher erläutert. Aus frisch geschlachteten Schweinen wurden die Nebenschilddrüsen operiert. Aus diesem Drüsengewebe wurde mRNA isoliert. Die isolierte mRNA wurde als dop-peistrangige komplementäre DNA (ds-cDNA) mit Hilfe eises Plasmids in E. coli kloniert. Aus den erhaltenen Hybridklonen wurde die Hybridplasmid-DNA isoliert. Aus den Nebenschilddrüsen isolierte mRNA wurde in einem In-Vitro-Translationssystem in das Schweine-Prä-Pro Parathormon oder Schweine-Parathormon übersetzt. Das Schweine-Prä-Pro-Parathormon oder Schweine-Parathormon wurde durch Antikörperfällung nachgewiesen. Mit Hilfe einer "Hybrid Arrested-Translation" konnten die Klone aufgefunden werden, die Schweine-Parathormonsequenzen enthielten. Aus den ermit telten Hybridklonen wurde Hybridplasmid-DNA, die das Schweine-Parathormongen (Schema 1) umfasste, radioaktiv markiert (nick-tranalatiert) und zum Screenen von Humangenbänken verwendet. Auf diese Weise ermitteltes Human-Parathormongen wurde durch Subklonieren in einem Plasmid angereichert. Ein auf diese Weise angereichertes Human-Parathormongen wurde sequenziert. Die Sequenz des für die Expression von Human Parathormon relevanten Abschnittes ist dem Schema 2 zu entneh flen. Die ermittelte Sequenz stimmte mit der bekannten cDNA Sequenz und mit der bekannten Aminosäuresequenz des Human Parathormons überein. Im folgenden wird Schema 3 zzläutert (1) In das weitere erfahren wurde die zwischen zwei RI-Schnittstellen liegende DNA-Sequenz eingesetzt, die die DNA-Sequenz des Schemas 2 umfasst. (2) Es wurde nun nit Hilfe der Restriktionsendonuklease Sau3A das Prä-Pro-PTH-Gen (PTH = Parathormon) von Gen des reifen 1-84-PTH getrennt. (3) Durch Auffüllen von dATP und dGTP mit dem "Large Fragment" der E.-coli-DNA-Polymerase-I und (4) anschliessenden Abbau mit S1-Nuklease wurde der verbleibende Einzelstrangrest (GA) der klebrigen Enden (sticky ends) beseitigt, die vom Sau3A-Schnitt herrührten (GATC); ; dadurch wurde das Codon "TCT" für die Aminosäure 1 (Serin) des Human-PTH rekonstituiert. (5) An dieses in der angegebenen Weise behandelte PTH-DNA-Fragment wurde ein DNA-Adaptor ligiert. Dadurch wurde dem Serin ein Methionin Codon "ATG" direkt vorgeschaltet. Dieses Codon ist eines der wichtigen Signale für den Start der Synthese von PTH im 'flikroorganismus. (6-7) Das in der angegebenen Weise konstruierte PTH-Fragment wurde in die ClaI-Spaltstelle von pBR322 subkloniert. Ausgewählt wurde ein Klon. dessen PTH-Gen vor der Hindiii-Spaltstelle des pER322 im Uhrzeigersinnorientiert war. Dieser PTH-Klon wurde mit HindIII gespalten. (8) Die "sticky ends" dieser Spaltstelle liessen Auffüllreaktionen mit vier verschiedenen Nukleotiden zu. In Kombination mit dem Abbau durch S1-Nuklease gelangte man zu Fragmenten mit aufge füllen Enden (flush ends), deren Entfernung vom ATG-Codon 4 bis 10 Basenpaare betrug. (9) Vor diese Variation an Fragmenten wurden zwei synthetische DNA-Adaptoren ligiert, und zwar /TCCCTAGGGA/+/TCCCTAGGGA/. Diese Linker enthielten die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle, ein weiteres wichtiges Signal für die Expression im Mikroorganismus. Dadurch entstand weiter eine BamHI-Spaltstelle. Diese war für die Klonierung hinter verschiedenen Promotoren (wie trp, tacT5) beschriebener Vektoren geeignet. Die E. coli-Zellen wurden im LB-Vollmedium in Gegenwart von Ampicillin (50 Xug/ml) bis zur mittleren logarithmischen Phase angezogen und abzentrifugiert. Das Pellet wurde in einem Suspensionspuffer mit Guanidiniumhydrochlorid (3 ^ 10 suspendiert (ungefähr 10 Zellen/ml); danach wurde mit Ultraschall (Sonifier) bis zu einer ootischen Dichte (OD650) aufgeschlossen, die etwa 1/3 der optischen Dichte zu Beginn entsprach. Dieser Zellaufschluss wurde abzentrifugiert. Der Überstand enthielt PTH. Das Protein wurde mit 5-prozentigem TCA gefällt und in 0,02 n Salzsäure gelöst. TCA-Reste wurden mit Äther ausgewaschen. Das aus Rohextrakt und nach Extraktion gewonne PTH war immunologisch gegen Antikörper 1-34, 28-48 und 48-68 wirksam (RIA) und war im Adenylcyclase-Test biologisch aktiv. Das Human-Parathormongen wurde mit einem Vektor verknüpft (pBR322/SV40-Derivat) und mit Hilfe einer Calciumphosphat Fällung in Affennierenzellen transformiert. Aus 10 Zellen wurde PTH durch Extraktion gewonnen und im RIA getestet. Ausserdem wurde das Human-Parathormongen (lambda-Humanhybrid DNA) mit dem Thymidinkinasegen von Herpes simplex durch Co-Transformation in T3-Zellen transformiert; aus den Tk+-Klonen urde durch DNA-Hybridisieren die Integration des Human PTH-Gens identifiziert. Schema 1 Asp Thr Val Lys Val Met Val Val Met Leu Ala Ile Cys Phe GAC ACA GTT AAA GTA ATG GTT GTC ATG OTT GCA ATT TGT TTT CTG TGT CAA TTT CAT TAC CAA CAG TAC GAA CGT TAA ACA AAA Leu Ala Arg Ser Asp Gly Lys Pro Val Lys Lys Arg Ser Val CTT GCA AGA TCA GAT CCC AAC CCT GTT AAG AAG AGA TCT GTG GAA CGT TCT AGT CTA CCC TTC GGA CAA TTC TTC TCT AGA CAC Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser AGT GAA ATA CAG CTT ATG OAT AAC CTG GGC AAA CAC CTG AGC TCA CTT TAT GTC GAA TAC GTA TTG GAC CCC TTT GTG GAC TCG Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp TCT CTG GAG AGA GTG GAA TGG CTG CGA AAG AAG CTG CAG GAT AGA GAC CTC TOT CAC CTT ACC GAC GCT TTC TTC GAC GTC CTA Val His Asn Phe Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Val His Arg GTG CAC AAC TTT GTT GTT CTC GGA GCT TCT ATA GTT CAC AGA CAC GTG TTC AAA CAA CAA GAG CCT CGA AGA TAT CAA CTG TCT Asp Gly Gly Ser Gln Arg Pro Pro Lys Lys Glu Asp Asn Val GAT GGT GGT TCC CAG AGA CCC CCA AAA AAG GAA GAC AAT GTC CTA CCA CCA AGC GTC TCT CCC GGT TTT TTC CTT CTG TTA CAC Leu Val Glu Ser His Gln Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys CTA GTT GAG AGC CAT CAA AAA A.T CTC GGA GAA GCA GAT AAA GAT CAA CTC TCG GTA GTT TTT TCA GAG CCT CTT CGT CTA TTT Ala Ala Val Gly GCT GCT GTG GGG CGA CGA CAC CCC completed TGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAGCTACTAACATACCTGAACGAAGATCTTGTTCTAAGA ACAGAAATCAAATGAGTCGTAGTCGATGATTGTATGGACTTGCTTCTAGAACAAGATTCT EMI11.1 <tb> CATTGTAT <tb> GTAACATA <SEP> Intron <SEP> II <SEP> ca. <SEP> 400 <SEP> bp <tb> <SEP> Met <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Ala <SEP> ys <SEP> Val <SEP> Met <tb> <SEP> GTG <SEP> AAG <SEP> ATC <SEP> ATA <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> AAA <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GCT <SEP> AAA <SEP> GTT <SEP> ATG <tb> <SEP> CAC <SEP> TTC <SEP> TAC <SEP> TAT <SEP> GGA <SEP> CGT <SEP> TTT <SEP> CTG <SEP> TAC <SEP> CGA <SEP> TTT <SEP> CAA <SEP> TAC <tb> Ile Val Met Leu Ala Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys ATT GTC ATG TTG GCA ATT TGT TTT CTT ACA AAA TCG GAT GGG AAA TAA CAG TAC AAC CGT TAA ACA AAA GAA TGT 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Lys Glu CTA GCT CCC AGA GAT GCT GCT TCC CAG ACC CCC CA AAA AAG GAA GAT CGA GGG TCT CTA CGA CCA ACC GTC TCC GGG GCT TTT TTC CTT Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu.Ala GAC AAT GTC TTC GTT GAG AGC CAT GAA AAA AGT CTT GCA GAG GCA CTG TTA CAG AAC CAA CTC TCG GTA CTT TTT TCA GAA CCT CTC CGT Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln GAC AAA GCT GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAC TGA CTG TTT CCA CTA CAC TTA CAT AAT TGA TTT CCA TTT AGC GTC ACT AAA TGA AAA CAG ATA TTG TCA GAG TTC TGC TCT AGA CAG TGT AGG TTT ACT TTT GTC TAT AAC ACT CTC AAG ACG AGA TCT GTC ACA TCC GCA ACA ATA CAT GCT GCT AAT TCA AAG CTC TAT TAA GAT TTC CAA CGT TrT TAT GTA CGA CGA TTA AGT TTC GAG ATA ATT CTA AAC GTT GTG CCA ATA TTT CTG ATA TAA CAA ACT ACA TGT AAT CCA TCA CTA CAC GGT TAT AAA GAC TAT ATT GTT TGA TGT ACA TTA GGT AGT GAT GCC ATG ATA ACT GCA ATT TTA ATT GAT TAT TCT GAT TCC ACT TTT CGG TAC TAT TGA CGT TAA AAT TAA CTA ATA AGA CTA AGG TGA AAA ATT CAT TTG AGT TAT TTT AAT TAT CTT 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ATA <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> AAA <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GCT <SEP> AAA <SEP> GTT <SEP> ATG <tb> <SEP> CAC <SEP> TTC <SEP> TAC <SEP> TAT <SEP> GGA <SEP> CGT <SEP> TTT <SEP> CTG <SEP> TAC <SEP> CGA <SEP> TTT <SEP> CAA <SEP> TAC <tb> Ile Val Met Leu Ala Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys ATT GTC ATC TTG GCA ATT TGT TTT CTT ACA AAA TCG GAT GGG AAA TAA CAG TAC AAC CGT TAA ACA AAA GAA TGT TTT AGC CTA CCC TTT EMI13.2 <tb> Ser <SEP> Val <SEP> Lys <tb> TCT <SEP> GTT <SEP> AAG <tb> AGA <SEP> CAA <SEP> TTC <tb> <SEP> Intron <SEP> I <SEP> Lys <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Ila <SEP> Gln <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> His <SEP> Asn <tb> AAG <SEP> AGA <SEP> TCT <SEP> GTG <SEP> @GT <SEP> <SEP> GAA <SEP> ATA <SEP> CAG <SEP> CTT <SEP> AT@ <SEP> <SEP> CAT <SEP> AA@ <tb> @@@@@@ <SEP> TTC <SEP> <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> CAC <SEP> TCA <SEP> CTT <SEP> TAT <SEP> GTC <SEP> GAA <SEP> TAC <SEP> GTA <SEP> TTG <tb> Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg CTG CCA AAA CAT CTG AAC TCG ATG GAG AGA GTA GAA TGG CTG OGT GAC CCT TTT GTA GAC TTG AGC TAC CTC TCT CAT CTT ACC GAC GCA Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro AAC AAG CTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT CCC CTT GGA GCT CCT TTC TTC GAC GTC CTA CAC GTG TTA AAA CAA CGG GAA CCT CGA GGA Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu CTA GCT CCC AGA GAT GCT GGT TCC CAG ACC CCC CGA AAA AAG GAA GAT CGA GGG TOT CTA CGA CCA ACC GTC TCC CCC GCT TTT TTC CTT Asp Asn Val.Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala GAC AAT GTC TTG GTT CAG AGC CAT GAA AAA AGT CTT GGA GAG GCA CTG TTA CAG AAC CAA CTC TCG GTA CTT TTT TCA GAA CCT CTC CGT Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln GAC AAA GCT GAT GTC AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG TGA CTG TTT CCA CTA CAC TTA CAT AAT TGA TTT CGA TTT AGG GTC ACT AAA TCA AAA CAC ATA TTG TCA GAG TTC TGC TCT AGA CAC TGT ACC TTT ACT TTT GTC TAT AAC ACT CTC AAG ACG AGA TCT GTC ACA TCC GCA ACA ATA CAT GCT GCT AAT TCA AAG CTC TAT TAA GAT TTC 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DNA-Adaptor EMI14.1 <SEP> Mel <SEP> Ser <SEP> Val <tb> CATCGATG <SEP> TCTGTG..... <tb> GTAGCTAC <SEP> AGACAC..... <tb> 6) erneuter Schnitt (ClaI) Met Ser Val CGATGTCTGTG..... TACAGACAC..... 7) Subklonieren in die ClaI-Spaltstelle von pBR322 und erneuter Schnitt (HindIII) ClaI Met Ser Val AGCTTCATCGATGTCTGTG AGTAGCTACAGACAC 8) verschiedene Auffüllreaktionen Met TCATCGATG...... AGTAGCTAC...... Met TTCATCGATG...... AAGTAGCTAC...... Met CTTCATCGATG...... GAAGTAGCTAC...... Met GCTTCATCGATG...... CGAAGTAGCTAC...... Met AGCTTCATCGATG...... TCGAAGTAGCTAC...... 9) Ligation mit DNA-Adaptoren (2 identischen Linkern) EMI16.1 <tb> <SEP> BamI <SEP> Mel <SEP> Ser <SEP> Val <tb> TCCCTAGGGA <SEP> TCCCTAGGGA <SEP> GCTTCATCGATGTCTGTG..... <tb> AGGGATCCCT <SEP> AGGGATCCCT <SEP> CGAAGTAGCTACAGACAC..... <tb> 10) erneuter Schnitt (BamI) EMI16.2 <tb> <SEP> Stop <SEP> RS <SEP> Met <SEP> Ser <SEP> Val <tb> <SEP> @@@@@@@@@@ <tb> GATCCCT <SEP> AGGGAG <SEP> CT <SEP> T <SEP> CAT <SEP> CGATGT <SEP> CT <SEP> GTG <tb> <SEP> GGATCCCTCGAAGTAGCTACAGACAC..... <tb> 11) Insertion in ein Plasmid nach einem starken Promotor EMI16.3 Änderungen 1. Seite 1 Zeilen 1 bis 2 sollen lauten: "Human-Parathyroidhormon (Human-PTH) produzierende Hybridvektoren, Human Parathyroidhormongen, eukaryotische Zellen mit dem Hybridvektor und deren Verwendung. 2. Seite 1 Zeile 4 und fortlaufend in den Anmeldungsunterlagen: "Human-Parathyroidhormon" statt Human-Parathormon. 3. Seite 1 Zeile 5 soll lauten: "Calcium in Knochen. Die Wirkungen und Funktionen von Human-Parathyroidhormon und seinen Agonisten und Antagonisten werden von Dambacher, Praktische Osteologie, Thieme Verlag Stuttgart / New York 1982; Reeve et al, British Medical J. 1340 (1980) 1 11; und Potts et al, Advances in Protein Chemistry 35 (1982) 323 - 395 beschrieben. 4. Seite 4 Zeile 4 lautet: "klonieren lassen. Einzelheiten zum Klonieren und zur Expression von Genen unter der Steuerung von E.-coli-Promotoren beispielsweise in Streptomyces lassen sich bei Chater, Nature 299 (1982) 10 ff finden. Insbesondere kommt Escherichia coli in Be-". 5. Seite 7 Zeilen 3 bis 4 lauten: "Tierzellen, insbesondere Wirbeltierzellen, beispielsweise Froschzellen (vgl. Wickens et al, Nature 285 (1980) 628 bis 634), Säugetierzellen, Affenzellen, z.B. Affennierenzellen und Humanzellen." 6. Seite 7 Zeile 19 ist der folgende neue Absatz einzusetzen: "Schliesslich betrifft die Erfindung - eukaryotische Zellen, wie Tierzellen, insbesondere Wirbel tierzellen, wie Froschzellen, Säugetierzellen, Affenzellen und Humanzellen, die Human-Parathyroidhormon mit dem Hybridvektor gemäss den Ansprüchen 5, 6, 7 oder 8 produ zieren, und - die Verwendung der vorstehend angeführten Zellen bei Organismen mit mangelhaften Wirkungen und Funktionen des Parathyroidhormons, beispielsweise bei Säugetieren, insbesondere Menschen. Bezüglich der Wirkungen und Funktionen eines spezifischen Parathyroidhormons in Organismen verschiedener Spezieswird auf Goltzman et al, Pept. Chem. Struct. Biol., Proc. Am. Pept. Symp. 4th, 1975, p. 571 - 577, 574, verwiesen. Die im Detail angegebene DNA-Sequenz (Anspruch 1; Anspruch 5 = Schema 2; Schema 1) kann durch DNA-Sequenzen ersetzt werden, deren Einzelstränge sich mit den Einzelsträngen der im Detail angegebenen DNA-Sequenz hybridisieren lassen. Ferner kann jedes Basentriplett durch ein Synonym ersetzt werden." 7. Seite 5 Zeile 12: "Human-Parathyroidhormongen" anstelle von "Human-Parathormon". 8. Seiten 6, 11, 13 und 20: "Intron II ca. 4 000 bp" anstelle von "Intron II ca. 400 bp"; und "Intron I 103 bp" anstelle "Intron I ca. 80 bp". 9. Seite 8 drittletzte Zeile: "entgegengesetzten Uhrzeigersinn" statt "Uhrzeigersinn". 10. Seite 9 Zeile 10: "tac, T5" statt "tac T5". 11. Seite 5 Zeilen 12 bis 13 und Seite 19 Zeilen 28 bis 29: (g) das ermittelte Human-Parathyroidhormongen (die DNA Sequenz zwischen den EcoRI-Schnittstellen gemäss (B)) isoliert und in einen Expressionshybridvektor überführt, der in eukaryotischen Zellen kloniert werden kann," 12. Seite 5 Zeile 15, Seite 7 Zeile 11, Seite 8 Zeile 14 und Seite 19 Zeile 30: "EcoRI-Schnittstellen" statt "RI Schnittstellen". 13. Seite 5 letzte Zeile und Seite 19 Zeilen 32 bis 33: "EcoRI-Schnittstellen liegenden DNA-Sequenz aufweist, insbesondere einen Unterbereich, der Human-Parathyroidhormon oder dessen Agonisten oder Antagonisten exprimiert:" statt "RI-Schnittstellen liegenden DNA-Sequenz /aufweist/:". 14. Seite 1 Zeilen 17 bis 21 und Anspruch 1 Zeilen 10 bis 13 sollen lauten: "(b) gegebenenfalls einen sich an den Promotor anschliessenden DNA-Bereich von 1 bis 1000 oder 1 bis 200 Basenpaaren, (c) eine ribosomale Bindungsstelle, die sich an den DNA-Bereich gemäss (b) oder, sofern (b) fehlt, an den Promotor gemäss (a) anschliesst,". 15. Seite 4 Zeile 32: "hybridisiert" statt "anlagert". 16. Entfällt. 17. Seite 7 Zeilen 28 bis 29 lauten: "Aus den erhaltenen Hybridklonen wurden die Hybrid-Plasmid-DNAs isoliert und in ihrer Einzelstrangform an einen Träger fixiert. Aus den Nebenschilddrüsen isolierte mRNA wurde mit fixierter Einzelstrang-DNA hybridisiert und entfernt und in". 18. Seite 7 Zeile 34: "und DNA-Sequenzanalyse konnten" statt "konnten". 19. Seite 8 Zeile 2: "ne-cDNA-Parathyroidhormongen" statt "ne-Parathormongen". 20. Seite 8 Zeile 17 soll lauten: "klease Sau3A der Prä Pro-Teil des PTH-Gens vom Gen" 21. Seite 8 Zeile 16: "(2)" zu streichen. 22. Seite 8 Zeile 18: "getrennt (2)". statt "getrennt. (3)". 23. Seite 8 Zeile 20: "(3) und" statt "und (4)". 24. Seite 8 Zeilen 24, 29 und 33: ". (5)", ". (6 bis 7)" und ". (8)" werden "(4).", "(5)." bzw. "(7).". 25. Seite 8 Zeile 32: "pBR322 (6 bis 7) gegen den Uhrzeigersinn statt "pBR322 im Uhrzeigersinn". 26. Seite 9 Zeile 4: "(8)." statt ". (9)". 27. Seite 9 Zeile 6: "/TCCCTAGGGA/ (9)." statt "/TCCCTAGGGA/ 28. Seite 9 Zeile 9: "PamHI-Spaltstelle (10)" statt "BamHI- Spaltstelle". 29. Seite 9 Zeile 11: "geeignet (11)" statt "geeignet". 30. Seite 8 Zeile 30: "PTH-Genfragment" statt "PTH-Frag- ment". 31. Seite 9 Zeile 13 : "Die transformierten E." statt "Dis E.". 32. Seite 9 Zeilen 24 bis 25 : "Antikörper (spezifisch zu PTH-Fragmenten A51-34, AS28-48 und AS48-68) wirksam" statt "Antikörper 1-34, 28-48 und 48-68 wirksam". 33. Seite 9 Zeile 31 soll lauten: "wurde PTH durch Extraktion gewonnen; es war im RIA positiv gegen Antikörper (spezifisch zu den PTH-Fragmenten AS28-48 und AS44-68)." 34. Seite 16: "RI" bedeutet "EcoRI", "BamI" bedeutet "BamHI" und "RS" bedeutet "ribosomale Bindungsstelle". 35. Die folgenden Ansprüche 3 bis 4 sind hinzuzufügen: "3. Hybridvektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die spezifische DNA-Sequenz gemäss Anspruch 1 (f) durch eine DNA-Sequenz ersetzt ist, deren Einzelstränge mit den Einzelsträngen der spezifischen DNA-Sequenz hybridisiert werden können, wobei die ersetzende DNA-Sequenz gewünschte Produkte exprimieren kann. 4.-Hybridvektor nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass ein oder mehrere Basentripletts durch Synonyme ersetzt sind." 35. Der bisherige Anspruch 3 wird Anspruch 5. 36. Auf Seite 21 sollen die bisherigen Ansprüche 4 bis 8 durch die folgenden Ansprüche ersetzt werden: "6. Hybridvektor nach Anspruch 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass er in Tierzellen, insbesondere Wirbeltierzellen, Säugetierzellen, Affenzellen, beispielsweise Affennierenzellen und Humanzellen klonierbar ist. 7. Hybridvektor nach Anspruch 5 oder 6, dadurch 9 e k e n n z e i c h n e t , dass die spezifische DNA-Sequenz gemäss Anspruch 5 (B) durch eine DNA-Sequenz ersetzt ist, deren Einzelstränge sich mit den Einzelsträngen der spezifischen DNA-Sequenz hybridisieren lassen, wobei die ersetzende DNA-Sequenz gewünschte Produkte exprimieren kann. 8. Hybridvektor nach Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass ein oder mehrere Basentripletts durch Synonyme ersetzt sind. 9. Human-Parathyroidhormongen: (a) herstellbar gemäss Anspruch 5 (A) und (b) gekennzeichnet durch die zwischen zwei EcoRI-Schnittstellen liegende DNA-Sequenz gemäss Anspruch 5 (B) oder einen Unterbereich davon. 10. Eukaryotische Zellen, insbesondere Tierzellen,- beispielsweise Wirbeltierzellen, Säugetierzellen, Affenzellen und Humanzellen, die Human-Parathyroidhormon mit dem Hybridvektor gemäss Anspruch 5, 6, 7 oder 8 produzieren. 11. Verwendung der Zellen gemäss Anspruch 10 für Organismen (beispielsweise Säugetiere, insbesondere Menschen) mit Parathyroid-Mangelwirkungen oder Parathyroid-Mangelfunktionen."

Claims: Claims for the following Contracting States BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, SE Hybrid vector which can be cloned in prokaryotic cells and which produces human parathyroid hormone, characterized by the following features: (a) a promoter, (b) a DNA region, adjacent to the promoter, of from 0 to 1000 or from 0 to 200 base pairs, (c) a ribosome binding site, adjacent to the DNA region according to (b), (d) a DNA region, adjacent to the ribosome binding site, of from 4 to 15 base pairs, (e) a start codon, adjacent to the DNA region according to (d), and (f) the following DNA sequence encoding human parathyroid hormone: Hybrid vector according to claim 1, characterised in that it can be cloned in E. coli. Hybrid vector according to claim 1 or 2, characterised in that the specific DNA sequence according to claim 1(f) is replaced by a DNA sequence the single strands of which can be hybridised with the single strands of the specific DNA sequence, the replacement DNA sequence being able to express desired products. Hybrid vector according to claim 1, 2 or 3, characterised in that one or more base triplets are replaced by synonyms. Claims for the following Contracting State : AT Process for the preparation of a hybrid vector which can be cloned in prokaryotic cells and which produces human parathyroid hormone, characterised in that a vector is provided with the following features: (a) a promoter, (b) a DNA region, adjacent to the promoter, of from 0 to 1000 or from 0 to 200 base pairs, (c) a ribosome binding site, adjacent to the DNA region according to (b), (d) a DNA region, adjacent to the ribosome binding site, of from 4 to 15 base pairs, (e) a start codon, adjacent to the DNA region according to (d), and (f) the following DNA sequence encoding human parathyroid hormone: Process according to claim 1, characterised in that the hybrid vector can be cloned in E. coli. Process according to claim 1 or 2, characterised in that the specific DNA sequence according to claim 1(f) is replaced by a DNA sequence the single strands of which can be hybridised with the single strands of the specific DNA sequence, the replacement DNA sequence being able to express desired products. Process according to claim 1, 2 or 3, characterised in that one or more base triplets are replaced by synonyms.

Inventors: MAYER, HUBERT, DR.
Applicants: GESELLSCHAFT FUER BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Application year: 1984
Main classification: C12N15
IPC codes: A61K35, C12N15, A61K38, C12N5, C12R1, C07K14