MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR MEMBRANE-ASSOCIATED ANTIGENS

Abstract: Monoclonal antibodies with defined specificity for membrane-associated antigens are prepared as described and can be used as diagnostic aids or carriers for pharmaceutical agents.

Description: Monoklonale Antikörper mit Spezifität für membran-asso zii@rte Antigene Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die an definierte membran-assoziierte Antigene binden. Diese Antikörper können als Diagnostikurn oder als Wirk- stoffträger verwendet werden. Dic Technik der Immunisierung mit definierten, iso lierten Antigenen und der Produktion von Antikörpern gegen solche Antigene ist bekannt Es ist auch bekannt, mit ungereinigtem Antigenmaterial zu immunisieren und diejenigen Antikörper zu selektieren, die eine bestimmte Komponente einer solchen Antigenmischung erkennen. Bei den Versuch, solche Antikörper zu induzieren, ist es gelungen, monoklonale Antikörper zu selektieren, die unter nicht reduzierenden Bedingungen mit folgenden Proteinantigene reagieren: Antigen 1: MW 33 KD + 3, Antigen 2: MW 134 KD + 3, Antigen 3: MW 80 KD + 3, Antigen 4: 55 KD + 3, Antigen 5: 60 KD # 3, Antigen 6: 54 RD + 3, Antigen 7: 260 KD + 3, Antigen 8: nicht bestimmbar, Antigen 9: nicht b stirrnbar, Antigen 10: MW 143 KD # 3, 119 KD # 3, Antigen 11: MW 178 KD * 3, Antigen 12: iViW nicht bestimmbar, Antigen 13 : MW 34 KD # 3, Antigen 14 : MW 195 KD # 3, Antigen 15 : MW 44 KD # 7, Antigen 16 : MW 43 KD # 3, Antioen 17 : MW 130 KD # 3. Die auf den Antigenen 1 - 17 von den AK 1 - 17 erkannten Epitope sind gegen eine Behandlung mit Dithiothreitol (50 mmol/1, 2 Std., 37 C) unterschiedlich empfindlich : Die Epitope von gl, 2 und 15 warden durch obige Behandlung verändert, die von Ag4,10 und 14 bleiben unverändert. Die in vitro Spezifitäten der AR 1 - 17 sind in Tabelle I dargestellt. Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper, die ein Antigen (Agl) erkennen mit einem Molekulargewicht von annähernd 33 KD + 3 oder ein Antigen (Ag2) mit einem Molekulargewicht von annähernd 134 KD # 3 oder ein Antigen (Ag33 mit einem Molekulargewicht von annähernd 80 KD + 3 oder ein Antigen (Ag4) mit einem Molekulargewicht von annähernd 55 KD + 3 oder ein Antigen (Ag5) mit einem Molekulargewicht von annähernd 60 KD + 3 oder ein Antigen (Ag6) mit einem Molekulargewicht von annähernd 54 KD + 3 oder ein Antigen (Ag7) mit einem Molekulargewicht von annähernd 260 KD + 3 oder ein Antigen (Ag8) mit einem nicht bestimmbaren Molekularge weicht oder ein Antigen (Ag9) mit einem nicht bestimmbaren Molekulargewicht oder ein Antigen (Ag10) mit einem Molekulargewicht von annähernd 143 KD + 3, und 119 KD + 3 oder ein Antigen (Agll) mit einem Molekulargewicht von annähernd 178 KD + 3 oder ein Antigen (Agl2) mit einem nicht bestimmbaren Molekularge weicht oder ein Antigen (Agl3) mit einem Molekulargewicht von annähernd 34 KD + 3 oder ein Antigen (Ag14) mit einem Molekulargewicht von annähernd 195 KD + 3 oder ein Antigen (Ag15) mit einem Molekulargewicht von annähernd 44 KD + 7 oder ein ¯ Antigen (AglG) mit einem Molekulargewicht von annähernd 43 RD + 3 o'Jr ein Antigen (Agl7) mit einem <RTI ID=3.8> Molekulargewicht von annähernd 130 KD + 3. Die Antigene 4,8,9,10 sind Mycoplasmenantigene, die auf in der Tabolle beschriebenen Zellinien vorhanden sind. Als Immunogen zur Induktion dieser Antikörper dienen menschliche in vitro-kultivierte Zellinien, Zellextrak- te oder Extrakte aus humanen Geweben. Bevorzugt werden permanente humane Zellinien, in besonderem die CaLu-l, Chago, Oat 75, PaTu II und Bewo-Zellinie. Es kann auch Agl - Ag17 benutzt werden um AK1 - AK17 zu erzeugen. Säugetiere, vorzugsweise lause, werden mit 1 x 106 - 108 Zellen, vorzugsweise aber 107 Zellen einer solchen Zellinie intraperitoneal immunisiert (Tag O - 120, vorzugsweise aber an Tag 0 und 7) und nach 1 - 150 Tagen, vorzugsweise aber an Tag 11, die Milzzellen aus solchen Tieren mit der X63 Ag 8653 Zellinie (The Journal of Immunology 173, 4, 1548-1550, 1979) fusioniert (Nature 256, 495-497, 1975). Die nach 3 Wochen entstehenden flybridome werden getestet, ob sie Antikörper der gewünschten Spezifität enthalten. In diesem Fall wurde eine Palette von 30 in vitro-kultivlerten Zellinien, humane periphere Blutzel- len und menschliches Knochenmark mit hilfe von indirekter Immunfluoreszens (Behring Inst. Mitt. 59, 64-70, 1976) und Zellsorter-Analyse (Acta Cytol. 19, 374-377, 7975),(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77/8, 4914-4917,1980) auf Reaktivität mit den Antikörpern getestet. Überraschenderweise befanden sich unter den ausgetesteten Hybridomüberständen einige, die Antikörper der oben beschriebenen interessanten Spezifitäten enthielten. Die diese Antikörper sezernierenden Hybridome wurden mittels Mikromanipulator kloniert und die von diesen Hybridoma- klonen gewonnenen monoklonalen Antikörper benutzt, um das von ihnen erkannte Antigen immunchemisch zu charakterisieren. Hierzu werden Zellgeister (Hybridoma, 1, 4, 413-421 (1982)), die aus Gewebekulturzellen gewonnen werden, mittels Detergens solubilisiert, ultrazentrifugiert und die so gewonnene Antigenmischung unter nicht reduzierenden Bedingungen im SDS-Polyacrylamidgel (10 g/ 100 ml Acrylamid / 0.026 g/100 ml Bisacrylamid elektrophoretisch aufgetrennt (Nature, 127, 680-685 (1970)). Danach werden alle so getrennten Antigene mittels Elektrobolotting vom SDS-Gel auf Nitrocellulosefilter übertragen. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (1979)). Anschliessend erfolgt die Reaktion der auf dem Nitrocellulosefilter immobilisierten Antigenen mit dem spezifischen Antikörper (Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 363, 1133-1140,(1982))Der Nachweis der Bindung dieses Antikörpers wird durch Reaktion mit 125J-Protein A und Autoradiographie des Filters erbracht. Das Molekulargewicht wird bestimmt im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Markern. Eine präparative Reinigung der entsprechenden Antigene erfolgt affinitätschromatographisch. Nitrocellulosepapier (15 x 15 cm) (floppe-Seylers Z. Phsiol. Chem. 363, 1133-1140, (1982)) wird nach Befeuchten mittels phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS pH 7,2)mit gereinigtem monoklonalem Antikörper-Protein inkubiert (1 Std., 40C, 30 ml, 1-100 g Protein/ml). Danach wird das ungebundene Protein durch Waschen in 500 ml PBS entfernt. Nach Inkubation des Filters für 1 Std. bei 40 C in 3 g/100 ml BSA (Ochsenserumalbumin) 0,05 g/1OO ml Tween 20 in PBS pH 7,2 (Blockierung) wird das Filter nach dreimaligem Waschen mit PBS mit ungereinigten Zelleitrakten, die in 0,5 % Natriumdeoxycholate, 20 mbt Phenylmethylsulfonylfluorid in PBS gelöst sind, für 1 Std. bei 40C inkubiert. Anschliessend wird das nicht gebundene Material mittels 3maligem Waschen mit PBS entfernt. Das spezifisch gebundene Antigen wird durch Inkubation des Filters in 1 9 M NH4SCN bevorzugt 6 M NH4SCN in PBS für 5 bis 30 Minuten bevorzugt 15 Minuten bei 40C abgelöst. Das so gereinigte Antigen kann nach Entfernung des NH4SCN (gelchromatographisch, Dialyse) als Immunogen bzw. für andere Zwecke Verwendung finden. Die aufgrund ihrer Reaktivität mit Agl und Ag2 charakterisierten monoklonalen Antikörper können zur Unterscheidung von aus solidem menschlichem Gewebe abgeleiteten Zellen und von tierischen Zellen als in vitro-Dia gnostikum eingesetzt werden. Weiterhin könnten sie als Positiv-Yontrolle für menschliches Gewebe in der Immunhistologie und zur Unterscheidung von tierischem Gewebe Verwendung finden. AK1 bis AK 17 können weiterhin dazu verwendet werden, verbunden mit Wirkstoffen gezielt zum Wirkort zu bringen, z. B. bei der autologen Knochenmarkstransplan- tation. Die Verwendung dieser Antikörper zum Nachweis der entsprechenden Ag in Körperflüssigkeiten, stellt eine diagnostische Anwendungsmöglichkeit dieser Ak dar. Die Ak können in Konzentrationen von 0.01 pg bis 1 mg/ml verwendet werden Reaktivität von AK 1 - 17 auf in vitro-Zellen Getestete Zellen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Lungentumorzell linien CaLu-l + + + + + + + + + E-14 +--++++++++-----+ B 109/4 + + - + - - A 549 + + + + Oat 75 ++-+-+++-+---++-+ SHP-77 ++-+ +++ -+ Chago + - - + + - - + + - - + Bro-Ca-Hoff # + - - + - # + Pankreastumor zellinien Pa Tu II + + - - - - + - - - - + - - - + + Pa Tu III + - + - - + - + + - - - MIA-Pa-Ca 2 + + - - - + - Panc-l + + - + - + + Gynäkologische Tumorzellinien Bewo +-+++++ - --++-++ - --++-+ HeLa ++ +-++-------++-++------++-+ Pa-1 ++++-+--+--- ++-+--+--- ---+ Melanomzell linien Mel-ULF + + - + - + + - + - + - + - + + Mel-RPMI ++-+-++-+ ---+-+ Mel-51-2 ++-+----# ------+ Mel-21-C-48 + + - + + - + - + + - + # - + + nicht verwandte Tumorzellinien ZR-75-1 + + - - + + - + + MCF-7 ++- +--- - - --- Mamma-Ca-12 + - - + +. .+ Colon-Ca-Ax + - - - - Getestete Zellen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Colon-Wi + + - - - - - - HT-1080 + + - Leiomyosarkom + + Hypernephrom TUW IMR 32 + - - - - - - - Raji + - - - - - - - - - Daudi + - --- - - -- 1788 + - - - - - - 6666/1 + - - - - - - - - Immunozytom + - - + Normale lymphoide Zellen Lymphozyten + + - - - - - - - - + Monozyten + + - - Granulozyten + + - - + Erythrozyten Knochenmark ++--+----- ----+ Normale humane Fibroblasten LL-29 + + - - - Hu-Fi-Br 32 + + + - Hu-Fi-Br 43 + + - - - - Hu-Fi-Br 47 + + - - - - - Hu-Fi-Br 16 + + + - Hu-Fi-Mel-l + + + - Hu-Fi-Mag-13 + + - - Tierische Zellen Vero -+-------- ---+ Greyhound BHK ------+--- ---- Rattenfibroblasten ---------- ---- Mausfibroblasten ---------- ---- + = signifikant positive Reaktion im indirekten Immun fluoreszenztest, im Radioimmunoassay und in der cytofluorometrischen Analyse. + = schwache positiv Reaktion mit einem Teil der ge testeten Population - = keine signifikante Reaktion

Claims: Monoclonal antibodies which recognize an antigen (Ag1) having a molecular weight of approximately 33 KD ± 3, an antigen (Ag2) having a molecular weight of approximately 134 KD ± 3, an antigen (Ag3) having a molecular weight of approximately 80 KD ± 3, an antigen (Ag4) having a molecular weight of approximately 55 KD ± 3, an antigen (Ag5) having a molecular weight of approximately 60 KD ± 3, an antigen (Ag6) having a molecular weight of approximately 54 KD ± 3, an antigen (Ag7) having a molecular weight of approximately 260 KD ± 3, an antigen (Ag8) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag9) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag10) having a molecular weight of approximately 143 KD ± 3 and 119 KD ± 3, an antigen (Ag11) having a molecular weight of approximately 178 KD ± 3, an antigen (Ag12) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag13) having a molecular weight of approximately 34 KD ± 3, an antigen (Ag14) having a molecular weight of approximately 195 KD ± 3, an antigen (Ag15) having a molecular weight of approximately 44 KD ± 7, an antigen (Ag16) having a molecular weight of approximately 43 KD ± 3 or an antigen (Ag17) having a molecular weight of 130 KD ± 3, which have the specific reaction patterns with the cell lines listed in Table I and which are prepared by immunization of mammals with human in vitro cultivated cell lines, cell extracts or extracts from human tissues. An antigen which has a molecular weight of 33 KD ± 3 (Ag1) or 134 KD ± 3 (Ag2), an antigen (Ag3) having a molecular weight of approximately 80 KD ± 3, an antigen (Ag4) having a molecular weight of approximately 55 KD ± 3, an antigen (Ag5) having a molecular weight of approximately 60 KD ± 3, an antigen (Ag6) having a molecular weight of approximately 54 KD ± 3, an antigen (Ag7) having a molecular weight of approximately 260 KD ± 3, an antigen (Ag8) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag9) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag10) having a molecular weight of approximately 143 KD ± 3 and 119 KD ± 3, an antigen (Ag11) having a molecular weight of approximately 178 KD ± 3, an antigen (Ag12) having a non-determinable molecular weight, an antigen (Ag13) having a molecular weight of approximately 34 KD ± 3, an antigen (Ag14) having a molecular weight of approximately 195 KD ± 3, an antigen (Ag15) having a molecular weight of approximately 44 KD ± 7, or an antigen (Ag16) having a molecular weight of approximately 43 KD ± 3, and an antigen (Ag17) having a molecular weight of 130 KD ± 3 and the distribution over human and animal cells indicated in the table. A process for the preparation of a monoclonal antibody as claimed in claim 1, which comprises immunizing mammals with cells of a human cell line cultivated in vitro, a cell extract from a cell line of this type or an extract from a human tissue, removing spleen cells from such an immunized animal, fusing them with the cell line X 63 Ag 8653, selecting the hybridomas, and obtaining the monoclonal antibodies. The process as claimed in claim 3, wherein the human cell line cultivated in vitro is a permanent cell line. The process as claimed in claim 3, wherein the mammals are mice. The use of a monoclonal antibody, as claimed in claim 1, in an in vitro diagnostic aid. The use of a monoclonal antibody, as claimed in claim 1, as carrier for a pharmaceutical active compound.

Inventors: BOSSLET, KLAUS, DR., KANZY, ERNST-JUERGEN, KATOH, TAKAKO, DR., KURRLE, ROLAND, DR., SEDLACEK, HANS-HARALD, DR., Kanzy, Ernst-Jürgen
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: C12P21
IPC codes: C07K14, A61K39, C12N5, C12R1, G01N33, C07K16, C12Q1, C12P21, A61K47, C12N15, A61K38