DIAGNOSTIC TEST SYSTEM

Abstract: 1. A diagnostic-test system consisting of a solid phase of a polystyrene that has the capacity to bind protein or of a sheet of polyester film at least one side of which has a uniform pigment-lacquer dulling layer that has the capacity to adhere to specific reagents, the reagents are dried on said phase in spatially separated compartments or fields characterized in that monoclonal antibodies that are specific to certain antigens, especially blood-type antigens, are employed.

Description: Diagnostisches Testsystem Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Testsystem bestehend aus einer festen Phase aus einem proteinbindungsfähigen Polystyrol oder einer Polyesterfolie, die mindestens auf einer Seite mit einer gleichmässigen gegenüber bestimmten reagentien haftfähigen Pigmentlackmattierungsschicht versehen ist, auf die in räumlich voneinander getrennten KompartDnenten oder Feldern Reagentien aufgetrocknet sind. Unter diagnostischem Testsystem versteht man beispielsweise Blutgruppenidentitätskarten, die insbesondere ihre Anwendung im Bed side-Test finden oder Mikro titerplatten zur Blutgruppendiagnostik, die ihre Anwendung in der Blutgruppenserologieo in Blutbanken, Krankenhäusern und bei Vaterschaftsbestimmungen finden. Aus dem DE-GM 80 29 569 ist eine Blutgruppenidentitätskarte aus einer mit Pigmentlackmattierungsschicht versehenen Polyesterfolie bekannt, die auf ihrer Oberfläche auf räumlich voneinander getrennten Feldern festhaftende trockne Schichten aus im wesentlichen reinen Antiseren aufweist. Gegenüber früheren Blutgruppenidentitätskarten mit angetrockneten Antiseren, die als Haftvermittler Dextran verwendeten, wobei das Dextran-AntiSerum-Gemisch nicht direkt mit dem zu testenden Blut vermischt werden konnte, sondern erst mit Wasser aufgelöst werden musste, hat die in der DE-GM 80 29 569 beschriebene Karte den Vorteil, dass auf der mit Pigmentlackmattierung beschichteten Polyesterfolie, wie sie als Zeichenfolie auf dem Markt ist, Antiseren ohne jegliche haftvermittelnden Zusätze ausgeze ichnet haften. Dadurch entfällt ein Haftmittel, wie es bei früheren Karten erforderlich war, und zugegebenes Blut löst beim Verrühren die angetrockneten Antiseren auf, so dass auf das Auflösen mit Wasser verzichtet werden kann und der Test sehr leicht und schnell durchführbar ist. Aus dem DE-GM 81 37 962 ist eine Mikrotiterplatte zur Blutgruppendiagnostik bekannt, die mit einer Vielzahl von Näpfchen aus einem proteinbindungsfähigen Kunststoff ausgestattet ist und deren Näpfchenböden festhaftende trockne Schichten aus im wesentlichen reinen Antiseren aufweisen. Gegenüber früheren Mikrotiterplatten, in die flüssige Antiseren entweder unmittelbar vor der Untersuchung in die Näpfchen eingefüllt oder auf Vorrat eingefüllt und eingefroren wurden, hat die in der DE-GM 81 37 962 beschriebene Mikrotiterplatte den Vorteil, dass auf dem starren, Aransparenten, proteinbindunas- trocene fähigen KunststofftAntiseren ohne jegliche haftvermittelnden Zusätze ausgezeichnet haften, Antiseren, die in die Näpfchen eingebracht werden, eine festhaftende Schicht auf den Böden der Näpfchen bilden und beim Transport kein Ablösen der Schicht erfolgt. Das Einfüllen flüssiger Antiseren entfällt und vor der Anwendung erübrigt sich somit ein Rehydratisieren. Es wird lediglich ein Tropfen Kochsalzaufschwemmung der zu untersuchenden Blute zugegeben, wobei sich durch leichtes Schütteln die Antiseren lösen. Nach kurzem Zentrifugieren (z.B. 2 Minuten bei 1000 U/Min.) - ohne vorausgehende Inkubation - wird aufgeschüttelt und ausgewertet. Neben all den Vorteilen, die diese vorstehend beschriebenen diagnostischen Testsysteme gegenüber früheren Systemen aufweisen, besitzen sie jedoch den Nachteil, dass ihre Lagerfähigkeit bei höheren Temperaturen oder bei der sogenannten Wechsellagerung, d.h. Wechsel zwischen höheren und niedrigeren Temperaturen begrenzt ist. Die auf den festen Phasen angetrockneten, im wesentlichen reinen Antiseren werden z.B. aus Citratplasmen durch Rekalzifizierung gewonnen. Der Rekalzifizierungsvorgang ist ein Gleichgewichtsprozess, der nicht zur völligen Ausfällung aller am Gerinnungsvorgang beteiligter Proteine führt. Um Denaturierung der Proteine zu verhindern, muss eine gewisse Restfeuchte im Produkt vorhanden sein. Bei Lagerung bei höheren Temperaturen finden in Gegenwart der Restfeuchte Wechselwirkungen der Proteine untereinander statt, die zu Gelbildung führen. Die Vielfalt der Proteine und ihre Wechselwirkungen untereinander machen es unmöglich, genaue Angaben über schwerlösliche oder zur Gelbildung führende Proteine zu machen. Als störende Faktoren kommen vor allem Denaturierungs- und Abbauprodukte der am Gerinnungsablauf beteiligten Proteine in Betracht. Der Faktor XIII, ein fibrinstabilisierender Gerinnungsfaktor, kann zu Quervernetzungen führen, und es ist mit Fibronectin, dem CIG (cold insoluble globulin), einem Fibrinabbauprodukt, zu rechnen, das bei Zimmertemperatur nicht in Lösung geht. Bei Zugabe von Blut oder einer Erythrozytensuspension zu den angetrockneten Antiseren kann eine solche Gelbildung ein vollständiges Auflösen verhindern, was zu falsch positiven Resultaten führt, da die Gelbildung wie eine Agglutination aussieht. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Lagerfähigkeit diagnostischer Testysteme, bei denen auf eine feste Phase Reagentien, wie Antiseren, aufgetrocknet sind, zu verbessern. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass in einem gattungsgemässen diagnostischen Testystem als auf getrocknete Reagentien anstelle herkömmlicher Antiseren oder deren Immunglobulin-Fraktionen, monoklonale Antikörper mit Spezifität gegen bestimmte Antigene, insbesondere Blutgruppenantigene, verwendet werden Man fand, dass aufgrund der Reinheit der monoklonalen Antikörper - sie sind praktisch frei von Fremdproteinen - keine Nachgerinnung oder störende Gelbildung bei Lagerung bei höheren Temperaturen oder Raumtemperatur stattfindet. Gegen die Verwendung von monoklonalen Antikörpern für den erfindungsgemässen Zweck bestand jedoch ein Vorurteil. Es zwar zu erwarten, dass aufgrund der hohen Verdünnung, in der monoklonale Antikörper vorliegen, und der Abwesenheit von Schutzkolloiden, wie z.B. Albumin, keine lange Haltbarkeit besonders bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur vorhanden sein würde, da bekanntlich hochverdünnte Proteinlösungen, in denen durch die Verdünnung auch der kolloidale Schutzfaktor verringert wird, äusserst instabil sind. Uberraschenderweise zeigte sich jedoch, dass bei der erfindungsgemässen Verwendung monoklonale Antikörper aussergewöhnlich stabil und lange reaktionsfähig sind. Monoklonale Antikörper sind hochspezifische Antikörper, die sich dadurch herstellen lassen, dass man ein Tier mit einem Antigen immunisiert, Antikörper produzierende Zellen von diesem Tier erhält und die Antikörper produzierenden Zellen mit Tumor-Zell Linien; z.B. Myeloma-Zell-Linien, fusioniert, wobei man Hybridomas erhält, die isoliert werden und die die monoklonalen Antikörper produzieren (Köhler, G. und Milstein, C., Eur.J.Immunol., 6, 511-519 (1976) und Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 256, 495 (1975) Monoklonale Antikörper funktionieren wie Antiseren, obgleich sie nicht Bestandteil eines Serums, sondern aus dem Serum "herausgepickte" Antikörper sind. Die aus dem Kulturmedium von Hybridoma-Kulturen in vitro oder aus den Ascitesflüssigkeiten von tumortragenden Wirtstieren gewonnenen monoklonalen Antikörper reagieren angetrocknet auf festen Phasen als agglutinierende Antikörper in gleicher Weise wie Antiseren oder Immunglobulin-Fraktionen. Sie haften auf den erfindungsgemäss zu verwendeten festen Phasen ohne jegliche haftvermittelnden Zusätze in genauso ausgezeichneter Weise wie Antiseren. Ein für die feste Phase besonders geeignetes Folienmaterial ist eine Polyesterfolie, die im Extrudierverfahren hergestellt und durch biaxiale Streckung und Hitzestabilisierung dimensionsstabil gemacht wurde und auf beiden Seiten mit einer gleichmässigen Pigmentlackmattierung beschichtet ist. Eine besonders zweckmässige Folie besitzt folgende mechanische und physikalische Eigenschaften: Zugfestigkeit 1 800 kg/cm2, Streckgrenze 980 kg/cm2, thermische Ausdehnung 0,027 mm/m/ C, Feuchtigkeitsausdehnung 0,01 mm/m/% RF, Wärmefestigkeit 150 0C Eine derart besonders zweckmässige Folie ist unter der Bezeichnung Zeichenfolie Safir PL Opak-weiss im Handel erhältlich. Als besonders gut geeignete Mikrotiterplatten erwiesen sich Flachbodenplatten mit zylindrischen Näpfchen aus strahlensterilisiertem Polystyrol, wie sie für die Verwendung für Zellkulturen im Co star (R) Kat.Nr. 3596 beschrieben werden. Diese Platten weisen eine hohe Proteinbindungsfähigkeit auf. Die Näpfchen bö den können zylindrisch, U-förmig oder V-förmig ausgebildet sein. Beispiel 1 Es wurden vergleichende Lagerungsversuche zwischen Blutgruppenidentitätskarten aus einer Polyesterfolie, wie sie vorstehend als besonders zweckmässige Folie beschrieben wurde1 durchgeführt, auf die einerseits Anti-A und Anti-B Antiseren und andererseits Anti-A und Anti-B monoklonale Antikörper auf getrocknet worden waren. Bei einer Wechsellagerung zwischen 370C und 2-80C war bei den mitkatix=en beschichteten Karten bereits nach 3 Wochen Gelbildung zu beobachten, während bei den mit monoklonalen Antikörpern beschichteten Karten nach 14 Wochen keine Gelbildung erfolgt war und die Antikörper völlig intakt bzw. reaktiv waren ohne störende Effekte. Beispiel 2 Man verfuhr nach Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, dass man die Karten bei Raumtemperatur lagerte. Bei den mit Antiseren beschichteten Karten war bereits nach 6 Wochen Gelbildung zu beobachten, während bei den mit monoklonalen Antikörpern beschichteten Karten nach 2 7 Wochen keine Gelbildung erfolgt war und die Antikörper völlig intakt bzw. reaktiv waren ohne störende Effekte. Ausser zur Blutgruppenbestimmung lassen sich mit dem erfindungsgemässen Testsystem auch andere serologische und mikrobiologische Tests durchführen.

Claims: P a t e n t a n s p r u c h Diagnostisches Testsystem bestehend aus einer festen Phase aus einem proteinbindungsfähigen Polystyrol oder einer Polyesterfolie, die mindestens auf einer Seite mit einer gleichmässigen gegenüber be stimmten Reagentien haftfähigen Pigmentlackmattierungs schicht versehen ist, auf die in räumlich von einander getrennten Kompartirflenten oder Feldern Reagentien auf getrocknet sind, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass als Reagentien monoklonale Antikörper mit Spezifität gegen be stimmte Antigene, insbesondere Blutgruppenantigene verwendet werden.

Inventors: UTHEMANN, HORST, DR. DIPL.-CHEM.
Applicants: BIOTEST-SERUM-INSTITUT GMBH
Application year: 1984
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33