PROCESS FOR OBTAINING VIRUSES OR VIRUSANTIGENS AND USE THEREOF IN DIAGNOSIS AND THERAPY (VACCINE)

Abstract: The invention relates to a process for obtaining a virus, respectively a virus antigen from biological material, particularly from body liquids, whereby fibronectine to which the virus is bound is extracted; to this effect, as a starting material will be used either a body liquid containing already fibronectine or a biological starting material to which fibronectine has been previously added; after isolating the fibronectine to which the virus is bound, the virus, respectively the viral antigen is obtained in a free state by breakage of the bond with the fibronectine; this release of the virus may be carried out according to a known process, particularly by specific enzyme action and/or surfactant action or by elimination reactions or simply by heating; as a result, a suspension is obtained from which the virus respectively the viral antigen may be isolated; the latter may be further purified in a manner known per se. The virus, respectively the viral antigen thus obtained, - and this concerns particularly the virus of hepatitis non A-non B -, is one aspect of the invention; however, the field of the invention extends also to the utilisation of the viral antigen obtained for the preparation of corresponding antibodies, to the field of immunologic diagnostic of hepatitis non A-non B and to the field of the preparation of vaccines. Furthermore, the invention also relates to a diagnostic kit enabling to diagnose the virus, respectively the viral antigenic material masked by the presence of unbroken or broken up fibronectine.

Description: Die diagnostishen Schwierigkeiten beim Nachweis einer Virämie, d.h. der Nachweis freier Viren im zftkulierenden Blut sind bekannt. Mit Ausnahme weniger Virusinfektionen, wie z.B. der Hepatitis B, gelingt der Nachweis freier Viren im Blut in der Regel nicht, Viele Erregerviren von Viruskrankheiten sind bekannt und Diagnose und zum Teil Behandlung sind über die gebildeten Antikörper möglich. Dagegen besteht immer noch Unklarheit, ob bei der sogenannten Non A-Non B-Hepatitis überhaupt ein Virus als Erreger anzunehmen ist, da ein solches Virus bisher nie zweifelsfrei identifiziert werderi konnte. Demgemäss war es auch bis jetzt nicht möglich, gezielt Antikörper für die Diagnostik oder gar Impfserum zu gewinnen. Non A-Non B-Hepatitiserkrankungen sind in der Literatur ausführlich und zahlreich beschrieben. Sieb z.B. Gerety R.J. Non A-Non B-Hepatitis, Academic Press, New York, 1981. Ausgehend von der Feststellung, dass z.B. die Non A-Non B-Hepatitis hauptsächlich durch Blutderivate mit honem Fibronectingehalt übertragen wird, wurde gefunden, dass Virus antigene bzw. Viren an Fibronectin gebunden und dadurch maskiert werden, was eine Erklärung für die diagnostischen Schwierigkeiten, freie Antigene bzw. Viren im Blut nachzuweisen, bietet. Es wurde weiterhin gefunden, dass die Anreicherung oder Isolierung von Fibronectin und seinen Spaltprodukten aus dem zirkulierenden Blut und aus Körperflüssigkeiten zur Gewinnung von Fibronectin-gebundenen Antigenen bzw. Viren und damit zur Gewinnung solcher Antigene bzw. Viren und zur Diagnostik der Viruserkrankung eingesetzt werden kann. Fibronectin ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 440.000 Dalton. Es wird in fast allen Körpe- zellen produziert und insbesondere von Endothelzellen und anderen Hohlräume auskleidenden Zellen,sowie von Zellen des Bindegewebsuystems an den Zelloberflächen abgelagert. Das Zelloberflächenglycoprotein unterscheidet sich geringfügig von dem Fibronectin, das im Blut des Menschen zu finden ist. Synonyma für Fibronectin sind: kälteunlösliches Globulin, opsonierendes Glycoprotein, Zelladhäsionsfaktor, Zelloberflächenprotein, Antigelatine-Faktor. Es ist heute bekannt, dass Fibronectin als Ankerprotein für Kollagene und weitere Bestandteile des Bindegewebes dient. Das Ausmass der Konzentration an der Zelloberfläche spielt eine Rolle für die Ausbreitung von Tumorzellen. Für klinisch-praktische Belange wichtig, hat sich gezeigt, dass Fibronectin im Blut als ein Hauptprotein der Opsonine die Phagozytose durch die Zellen des retikuloentothelialen Systems von Leber, Milz, Lunge und Knochennark unterstützt. Die Bindung von Einzelstrang- und Doppelstrang-DNS, Heparin, Kollagen, Fibrin und dessen Spaltprodukten,Proteoglykanen, Zellen und Zelldetritus, sowie Staphylokokken an Fibronectin wurde beschrieben: H. G. Klingemann: Fibronectin Die gelben Hefte (Behring XXII, 1982) S. 1-54 - 161 G. Pott, P. Zündorf, U. Gerlach, B. Voss, J. Rautenberg: Die Bedeutung struktureller Glykoproteine, dargestellt am Beispiel der Fibronectine - biochemische Grundlagen und klinische Auswertung, Z. Gastroenterologie 20 (1982) S. 649-658. Die Bestimmung von Fibronectin im Blut zur Disgnostik e- verminderten Funktion des retikuloendothelialen Systems und der therapeutische Einsatz von Fibronectin bei Sepsis und verzögerter Wundheilung finden zur Zeit Eingang in Sie Therapie. Bei Untersuchungen über die Fähigkeit von Fibronectin, andere Substanzen zu binden, hat sich,wie erwähnt, über- raschenderweise gezeigt, dass Fibronectin an bestimmten Stellen des Moleküls auch verschiedene Virusantigene bzw. Viren bindet, z.B. Antigene der Hepatitisviren A und B. Durch Spaltung des Proteins in Bruchstücke und Analyse über Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie konnten solche Peptide, nämlicn Kollagen nicht bindende Bruchstücke des Fibronectins mit erhöhter Bindungsfähgikeit für verschiedene Antigene bzw. Viren,gefunden werden. Gereinigtes Fibronectin und seine Bruchstücke wurden mi. gegebenenfalls radioaktiv markierter Viussuspension inkubiert und in der Kälte mittels Zentrifugation sedimentiert. Überstand und Sediment wurden auf Radioaktivität oder, beim Einsatz nicht markierter Viren die einzelnen Fraktionen mittels radioimmunologischer Nachweismethoden auf die Anwesenheit aer eingesetzten Viren untersucht. Die Verdrängungsreaktion der an Fibronectin gebundenen Viren von ihrer Bindungsstelle war mi; anderen Viren, z. B. Hepatitisvirus A, möglich. Diese Versuche zeigten, dass verschiedene Viren, insbe- sondere Hepatitisviren, an Fibronectin bzw. an Spaltpro- dukte von Fibronectin gebunden werden. Gleichzeitig ergab sich, dass ein Teil der Viren durch die Fibronectin- bindung derart maskiert wurde, dass sie immunologisch nicht mehr (z. B. durch die üblichen Antigen-Antikörper- Reaktionen) nachweisbar waren. Die Freisetzung und Gewinnung von derart maskierten Antigenen bzw. Viren, insbesondere des Non A-Non B Hepatitisvirus oder jedenfalls des Antigens, bietet die Möglichkeit der Isolierung der Antigene bzw. Viren, der gezielten Züchtung von Viren und Antikörper, damit der Gewinnung von Impfstoff einerseits und der Anwendung in der Diagnostik andererseits. Die Gewinnung und Freisetzung des Virus erfolgt aus Fibronectin von Virusträgern. Diese Methode kann aber nicht nur dazu benutzt werden, an Fibronectin gebundene Viren zu gewinnen, sondern Fibronectin das nicht von Viren besetzt ist kann auch benutzt werden, um zum Beispiel aus dem Stuhl von Virus trägern Viren zu binden und somit abzutrennen und dann zu gewinnen. Dies ist mit dem Prinzip der Affininitätschromatographie zu vergleichen. Die Zerstörung des Bindungsmechanismus erfolgt in an sich bekannter Weise, insbesondere durch spezielle Enzyme unotoder Detergentien oder durch Verdrängungsreaktionen oder Erhitzen. Als Beispiel für solche an sich bekannte Massnahmen sei auf Zerstörung der Antigen/Anti- körperbindung (J.A. durch pH-Erniedrigung) oder einer Substrat/Rezeptorbindung verwiesen. Die grundsätzlichen Verfahrensschritte sind wie folgt : la ) Anreicherung von Fibronectin aus Körperflüssigkeit, insbesondere Blutplasma, durch Kryopräzipitation, z.B. Zentrifugation von Plasma bei 0 - 4 "C ib ) Reindarstellung von Fibronectin aus dein dabei er haltenen Sediment Das Reinigungsverfahren und die Anreicherung von Fibronectin durch Kryopräzipitation sind bekannt. 1c ) Gegebenenfalls Herstellung von Spaltprodukten aus Fibronectin (durch Proteasebehandlung, z. B. mit Subtilisin) und Ermittlung derjenigen Spaltproduk- te, die Bindungsstellen für das gewünschte Virus enthalten. ;;ie erwähnt lässt sich das Verfahren auch zur Isolierung von Viren aus biologischem Material, wie z. 3. aus Stuhl anwenden, wobei dann folgende grundsätzliche Verfahrens- schritte angewandt werden: A) Herstellung einer Kochsalzaufschwennung von Stuhl bzw. eines Gewebehomogenats und Abzentrifugieren der groben Bestandteile (8000 g) B) Zugabe von Fibronectin bzw. eines geeigneten -ibro- nectinburchstückes zum Uberstand und Bindung von im überstand befindlichen Viren und/oder Virus antigenen, C) Abtrennung des Fibronectins bzw der Fibronectin- bruckstücke zusammen mit den hieran gebundenen Vi ren und/oder Virus antigenen. Dieses Fibronectin bzw. die Bruchstücke werden wie unter la ) und ib ) erwähnt angereichert und gereinigt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie unter 2 bis S angerührt. Die Gewinnung der Viren aus Fibronectin bzw. dessen Bruchstücken gestaltet sich dann wie folgt. 2a ) Zerstörung der Bindung zwischen Fibronectin bzw. Fibronectinbruchstück und Virus durch Zugabe spe zieller Enzyme und/oder Detergentien insbesondere rezeptorzerstörender Enzyme wie Neuraminidase oder Chymotrypsin oder gegebenenfalls durch Erhit- zen. 2b ) Alternativ zu 2a ) Verdrängung der gebuncenen V ren mittels anderer Viren, z. B. Hepatitis A-Vi- rus und/oder Substanzen, die um dieselbe Fibro nectinbindungsstelle konkurrieren. Daran kann sich eine weitere Virusisolierung durch Ent- fernung der bei den Schritten 2a ) oder 2b ) verwendeten Hilfsstoffe mittels Adsorptionsverfahren oder mittels Trennverfahren nach Dichte, Molekulargewicht und Ladung der verschiedenen Substanzen und Viren anschliessen, wie dies an sich bekannt ist. Aus der in den Verfahrensschritten 2a ) und 2b ) erhaltenen Virussuspension oder der gegebenenfalls gereinigten Suspension lässt sich das Virus nachweisen, und zwar 3a ) bevorzugt durch Virusantigen-Antikörper-Bindungs- reaktion oder 3b ) alternativ durch Hämagglutinationsreaktionen. Das gereinigte Virus und/oder die Virus antigene können zum Nachweis von Antikörpern eingesetzt werden, also z. B. zur Diagnose einer Virusinfektion. 4.1.a) Bevorzugt mittels Antigen-Antikörper-Bindungs reaktionen, 4.1.b) alternativ dazu mittels Neutralisationsverfahren. Der Nachweis von Antikörper gegen Virus antigene erfolgt 5.1 .a) bevorzugt durch Virusantigen-Antikörper-3in- dungsreaktionen oder 5.1.b) alternativ dazu durch Neutralisationsverfaren, d. h. die Aufhebung der Agglutination antigen beladener Partikel oder eines cytopathogenen Effe? tes durch spezifische Antikörper. Das Virus und/oder die Virus antigene können dann 5.2.a) zur Erzeugung von Antikörpern mittels aktiver Immunisierung von Laboratoriumstieren, eingesetzt werden, also zur Gewinnung spezifischer .Antikör- per für diagnostische Zwecke. s.2.b) Weiterhin ist der Einsatz des abgetöteten Virus und/oder der Virus antigene zur Erzeugung spezi fischer Antikörper beim Menschen zur Impf@ möglich. Die Freisetzung und die Gewinnunc es Vi- rus ermöglicht folglich auch die Herstellung einer Vaczine. 5.3 Die Spaltung der Fibronectin-Virusbindung ermög licht ein Diagnosekit zum Nachweis von maskierten Viren. Ein zum Nachweis von an Fibronectin gebundenen maskierten Viren geeigneter Diagnosekit enthält zum Unterschied zu üblichen Diagnosekits die (je nach Aufbau des Diagnosekmts) prinzipiell nur markierte oder nicht markierte Antigene sowie markierte oder nicht markierte Antikörper gegen diese Antigene (Viren) enthalten, zusätzlich Reagentien, welche die Freisetzung der gebundenen Viren aus -ibvo- nectin ermöglichen, so dass sie erfasst werden können. Die Gewinnung von Antigen durch Virus isolierung gemäss den oben beschriebenen Verfahrensschritten und nachfolgende Virus - züchtung folgen dann in an sich für die Vac=ineherstellung bekannter Weise. Wie erwähnt ist das Reinigungsverfahren und die Anreiche- rung von Fibronectin durch Rryopräzipitation bekannt. Nicht bekannt war die Bindung von Viren bzw. Antigene an Fibronectin durch Virusbindungsstellen im Fibronectinmolekül und seinen Spaltprodukten, die Maskierung von Vi- ren bzw. Antigenen durch Bindung an Fibronectin und an Spaltprodukte von Fibronectin, so dass sie nicht mehr immunologisch nachweisbar sind sowie die Möglichkeit, gebundene Viren aus der Bindung freizusetzen un scit der Einsatz des bekannten Reinigungsverfahrens und zur Anrei cherung von Fibronectin durch Kryopräzipitation in hombl- nation mit einer Verdrängungsreaktion oder einer enzyma- tischen oder thermischen Abspaltung zur Isolierung von Viren bzw. Virusantigenen, die Möglichkeit zur Isolierung von Viren bzw. Virsanti- genen aus virusantigenhaltigen Suspensionen durch Zugabe von Fibronectin bzw. Fibronectinspaltprodukten und insbesondere, da nicht bekannt war, dass Non A-Non B-HeDatitis-Virus durch BIndung an Fibronectin und seine Spaltprodukte maskiert wird, die Gewinnung von Non A-Non B-Hepatitis-Virus Suspensionen, also des bis jetzt nicht bekannten Virus und somit des Antikörpers. Die immunologischen Testverfahren und Diagnosekits sind grunasätzlich bekannt. Ein Testverfahren zur Diagnose von Non A-Non B-Hepatitis war bisher nicht bekannt, da der dazu erforderliche Virus (= Antigen und somit auch der Antikörper) fehlte. Diese Diagnoseverfahren und ein Testkit dazu sind nun möglich. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfinaung. Beispiel 1 Übersicht über den Verfahrensablauf Es sind die einzelnen Schritte am Beispiel der Gewinnung von Fibronectin und Virus ozw. Antigen aus Blut aufeinanderfolgend dargestellt: 1. Blut wird mit 0,11 molarem Natrium-Citrat im Ver hältnis 10:1 (Volumen zu Volumen) versetzt. 2. Das Plasma wird durch Zentrifugation (1000 g) ab getrennt. 3. Es folgt die Kryopräzipitation von Fibronectin aus Blutplasma durch 7entrifugation mit 2000 g bei OOC. 3a. Der uberstand wird dekantiert. 3b. Das Sediment enthält angereichertes Fibronection. Es wird bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dabei geht das ausgefallene Kryopräzipitat wieder in Lö sung. 4. Es folgt die Reinigung von Fibronectin und die Her stellung von Fibronectinspaltprodukten, falls dies gewünscht ist. 4a. Das Kryopräzipitat wird auf einer das 20-facne Üs- gangsvolumen des Plasma enthaltenden Säule Ampholine (pH-Gradient 3 bis 9) aufgetragen und 90 Minuten bei 1500 V, 30 W elektrofokussiert. Die bei pH 4,9 konzentrierten Proteine werden gesammelt und 48 Stunden gegen 0,1 X NaCl dialysiert. Die Nonzentra- tion des Fibronectins in diesen raktionen wiro it bekannten Methoden (Lasernephelometrie, Mancini- Technik) bestimmt. 4b. Die im Punkt 4.a) erhaltene vorgereinigte Fibro nectinfraktion wird auf eine, das 4-fache Ausgangs volumen an Plasma enthaltende Säule aufgetragen, die mit der Bromcyan-Methode gekoppelte Typ I Nollagen- Sepharose enthält. Diese Sepharose-Säule wurde zu vor mit 0,05 M Tris-HCl, 0,1 d NaCl, 0,4 M Epsilon Aminocapronsäure, pH 7,6, äquilibriert Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt mit 1 M Kalium-Bromid, 0,05 M Tris-HCl, 0,025 M Epsilon Aminocapronsäure , pH 5,3. Die eluierten Proteine werden mittel Druckfiltra tion eingeengt, der Fibronectingehalt mittels Laser nephelometrie oder Mancini-Technik gemessen, die Reinheit mittels SDS Polyacrylamid-Elektrophorese nach bekannten Verfahren überprüft. ;die erwähnt, ist diese Arbeitsweise bekannt. 4c. Zur Herstellung von Fibronectin-Spaltprodukten wird Fibronectin mit 1/100 des Gewichtsanteils Sub tilisin (Carlsberg Typ VIII) in 0,01 71 Tris-Puffer, pH 8,0, in Anwesenheit von 2 Trasylol, 0,02 'l CaCl bei 37"C 60 linuten verdaut. Nach Tieffrieren zur Beendigung der Enzymreaktion wird eine Menge von 20 mg Fibronectin auf der unter 4.b) beschriebenen Kollagen-Sepharose getrennt, die nicht-kollagen bindenden Bruchstücke aus dem Durchlauf werden nach Konzentrierung durch Druckfiltration au einer 68 x 15 cm messende Säule Sephacryl 300 getrennt. Die Äquilibrierung der Säule erfolgt mit 0,05 1 Tris-HCl, pH 7,6. Die fibronectinbruchstücaltigen Fraktionen werden gesammelt und in üblicher :ieise konzentriert. Die Proteinbestimmung erfolgt nach Lowry. Die Bruchstücke werden für'die VirusDin- zungen eingesetzt. Freisetzung und Gewinnung der gebundenen Viren: Die Lösung, die entweder angereichertes Fibronectin, gereinigtes Fibronectin oder Fibronectin-Spaltpro- dukte enthält, wird 5.a mit speziellen Enzymen, insbesondere Neuraminidase oder Chymotrypsin und/oder Detergentien, z. B. SDS versetzt oder auf S0 C (10 min) erhitzt und solcher massen der Bindungsmechanismus zwischen Fibronectin und Virus zerstört. 5.b Alternativ dazu können angereichertes vibronectin, gereinigtes Fibronectin oder Fibronectin-Spalt produkte enthaltende Lösungen mit Substanzen oder Viren, z. B. Hepatitis A-Virus, versetzt werden, die um die gleiche Virusbindungsstelle am Fibronec- tin konkurrieren. Dies führt zu einer kompetitiven Verdrängung und damit Freisetzung von an Fibronectin- Bindungsstellen gebundenen Viren. 6. Gewünschtenfalls erfolgt die weitere Reinigung sol cherart aus Fibronectin oder aus Fibronectin-Spalt- produkten freigesetzter Viren und die Entfernung der zur Freisetzung eingesetzten Hilfsstoffe, wie Enzy me, Detergentien oder Viren, mittels Dichtegradien ten-Zentrifugation in einem Cäsium-Chlorid-Gradient nach bekannten Verfahren. 7. Die einzelnen Fraktionen des Gradienten werden a) eluiert, b) deren Dichte bestimmt und c) gegen 0,15 molares NaCl dialysiert. 3. Der Nachweis der entsprechend ihrer DIchte in den einzelnen Fraktionen enthaltenen Viren erfolgt mittels Antigen-Antikörper-Bindungsreaktionen. Die weiteren Beispiele erläutern Grundlagen der Gewinnung und Einzelschritte. Beispiel 2 Nachweis der Virusbindung an Fibronectin-antikörcerreak- tion durch Fibronectin und seine Stalttrodukte Mit Hep2titis-A-Virus-Antikönxrn beschichtete Polystyrol-Kugeln wurden in eine Hepatitis-A-Virus-Suspension eingebracht und die Bindung des Hepatitis-A-Virus in bekannter Weise durch Zugabe von mit 125J-markiertem Hepatitis-A-nti- körper nachgewiesen. Dieser radioimmunologische Nachweis von Hepatitis-A-Virus gelingt nicht mehr, wenn zur Virus suspension Fibronectin oder spezielle, nämlich Kollagen nicht bindende Bruchstücke des Fibronectins zugegeben wuraen. Hingegen gelingt der radioimmunologische Nachweis, wenn das Fibronectin bzw. die genannten Bruchstücke nach bzw. vor der Antigen-Antikörper-Bindung it aem Antikör- per in Kontakt gebracht werden. Das Fibronectin bzw. seine Bruchstücke beeinträchtigen also nicht die Bindungsfähigkeit des Anti:- pers,sie maskieren jedoch das Antigen, so dass dieses n: t mehr vom Antikörper gebunden werden und demnach auc sicht mehr radioimmunologisch nachgewiesen werden kann. Es wurde noch ein weiteres Virusantigen - Rötelnantlgen (der Firma Organon) auf Bindung und maskierung im Hämag- glutinations-Hemmtest geprüft. Dieser in der Virologie übliche Hämagglutinations-Hemmtest wird nach bekannten Verfahren durchgeführt. Besonders vorbehandelte Schaf- serythrozyten werden durch Zugabe von Virusantigen, in diesem Fall Rötelnantigen, agglutiniert. Diese Agglutina- tion kann verhindert werden, indem antikörperhaltige Seren vor Zugabe der Schafserythrozyten mit dem Virus- antigen (Rötelnagglutinin) zusammengebracht werden. Die Bindung dieses Antigens an die Antikörper verhindert draufhin die Agglutinierung der Erythrozyten. Um unspezifische Hemmstoffe zu entfernen, werden die Seren zuerst an Caolin und Schafserythrozyten adsorbiert. Die Zugabe von gleicherart adsorbiertem Fibronectin sowie auch von nicht-adsorbiertem Fibronetin oder dessen Spalt produkten zu Röteln-Agglutinin oder zu nicht-antikörperhaltigen Seren verhindert die rötelnantigenspezifische Agglutination der Indikator-Erythrozyten. Entsprechende Kontrollen, die den Ausschluss von Antikörpern und unspezifischen Inhibitoren gewährten, wurden durchgeführt. Unspezifischer Nachweis der Hepatitis-A- und Hepatitis-B Virusantigene mittels ihrer Bindung an Fibronectin Polystyrolkugeln 6,5 mm im Duchmesser wurden in eie Fibronectinlösung (30 g Fibronectin/ml, 0,1 M Carbonalpuffer pH 9,2) eingebracht und 16 Stunden bei Zi mer- temperatur inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die fibronectinbeladenen Kugeln mit 200 ul Hepatitis-A Virus-Suspension inkubiert. Die Hepatitis-A-Virus Suspension wurde im Radioimmunoassay auf die Anwesenheit von Hepatitis-A-Viren überprüft und zur Reinigung von Hepatitis-A-Viren nach bekannten Verfahren (Siegel, G. und Frösner, G., J. Virology 1978, 26, 40-47) eingesetzt. Nach Inkubation über Nach bei Zimmertemperatur wurde die Hepatitis-A-Virus enthaltende Stuhlsuspension mit phosphat- gepufferter physiologischer Kochsalzlösunc (versetzt mit 0,05% Tween 20) ausgiebig gewaschen. Danach wurden 200 l Tracer (radioaktiv J125-markierte Antikörper gegen Hecatitis-A-Virus) zugegeben und weitere drei bis vier Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubations- zeit wurde der Tracer durch ausgiebiges Waschen mit des tilliertem Wasser entfernt und die auf den Kuceln gebundene -dic- aktivität in einen Gamma-Zähler gemessen. Als Kontrollen dienten unbesc;-ichte- te Kugeln und gleicherart hergestellte StuhlsusDensionen von Patienten, die keine Hesatitis-A-Viren im Stuhl au=- wiesen. Der gleiche Ansatz erfolgte zum Nachweis der unspezifischen Bindung von Hepatitis-B-Viren bzw. Hepatitis-B-Virusoberflächenantigen. Anstelle der A-Virus-Suspension wurden 200 ul gereinigtes Hepatitis-B-Surface-Antigen (kommerziell erhältlicher gereinigter Impfstoff der Firma LABAZ) oder bekannte Hepatitis-B-Virus haltige Seren eingesetzt. Beispiel 3 Gewinnung virusbindender Fibronectinbruchstücke Fibronectin kann enzymatisch mit Subtilisin in mehrere Bruchstücke gespalten werden. Bruchstücke, die BInsuncs- stellen für Kollagen enthalten, erwiesen sic als ungeeignet für die Bindung von Hepatitisvirusantigenen. Die für die Virusbindung ungeeigneten, d. h. die kollagenbindenden Bruchstücke, lassen sich in einfacher Weise durch Adsorption an Kollagen-Sepharose abtrennen. Die virusbindenden Bruchstücke werden in bekannter Weise durch chromatographische Methoden nach Molekulargewichten getrennt. Die hierbei gewonnenen Bruchstücke weisen Moieku- largewichte zwischen 10.000 und 100.000 auf. Beispiel 4 Freisetzung von an Fibronectin gebundenen Viren Die Freisetzung von an Fibronectin gebundenem Hepatitis- virusantigen konnte durch Zugabe von rezeptorzerstören- den Enzymen (Neuraminidase, Chymotrypsin) durch Verdrän- gungsreaktionen oder durch Erhitzen erreicht werden. Speziell beim gesuchten Non-A-Non-B-Virusantigen (bzw. der mit Non-A-Non-B-Hepatitis assoziierten Substanz) konnte eine besonders effektive Freisetzung durch Zugabe von Neuraminidase (das sogen. receptor destroying enz.me) sowie durch einfaches Erhitzen auf 80 C (10 min) erreicht werden. Für das Hepatitis-A-Virus ist die Freisetzung durch Erhitzen nicht geeignet, da die Antigenität dieses Virus bei diesen relativ hohen Temperaturen zerstört wird; gleichermassen ist auch beim Hepatitis-A-Virus Chymotrypsin nicht für die Freisetzung geeignet, da dieses -nz':m die Antigeneigenschaften des Hepatitis-A-Virus zerstört. Bedingt geeignet für die Freisetzung des He?ati.is-e-Virus- Antigen ist Neuraminidase. Zusammenfassend kann man festhalten, dass die jeweils geeignete Freisetzungsmetnoae nach spezifischen Viruseigenschaften (Hitzestabilität, Säurestabilität, Grösse, Hülle, Stabilität gegenüber Enzymen und Detergentien) ausgewählt werden muss. Beispiel 5 Reinigung der Virussuspension Die nach der Freisetzung der Virusantigene vorliegende Suspension enthält im allgemeinen neben den Antigenen Fibronectin oder Fibronectinbruchstücke oder denaturiertes Fibronectin sowie die zur Freisetzung benutzte Substanz (z. B. Neuraminidase). Eine Isolierung des Virusantigens aus dieser Suspension oder eine Abtrennung störender Substanzen ist nur dann erforderlich, wenn solche Sub stanzen bei Nachfolgereaktionen (z. B. Antigen-Antikörper- reaktionen) stören. Eine solche Reinigung erfolgt nach bekannten Methoden. Beispielsweise kann denaturiertes Fibronectin durch Zentrifugieren aus der Virussuspension entfernt werden. Eine weitergehende Reinigung.kann durch chromatographische Trennung oder durch Gradientenzentrifugation erfolgen. Beispiel 6 Maskierung von Virusantigen.durch Fibronectin Soweit festgestellt werden konnte, werden nicht alle gebundenen Virusantigene maskiert. Dies gilt insbesondere für das Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das sich im Gegensatz zum (maskierten) Hepatitis-A-Antigen im fibronectin- haltigen Serum nachweisen lässt. Wie das Hepatitis-A-Virus- antigen wird auch das Non-A-Non-B-Virusantigen (bzw. das mit Non-A-Non-B-Hepatitis assoziierte Partikel) durch Fibronectin maskiert. Die Maskierung von Hepatitis-A-Viren verhindert nicht, dass sie als Antigene wirksam werden, wie aus der Bildung spezifischer Antikörper gegen Hepatitis-A- Virusantigene folgt. Beispiel 7 Beweis für die Freisetzung von Non-A-Non-B-Hepatitis-Virus- antigenen aus Fibronectin Ein direkter Beweis für die Freisetzung des Non-A-Non-B Virusantigens aus Fibronectin könnten nur durch eine Infi- zierung geeigneter Tiere mittels der freigesetzten Substanz bzw. durch die Erzeugung von einer Non-A-Non-B-Hepatitis- Infektion verhindernden Antikörpern erbracht werden. Die Diagnose der Infektion von Tieren durch Non-A-Non-B- Hepatitis-Virus erfolgt durch den morphologischen Nach- weis von Leberzellnekrosen und entzündlichen Infiltraten (histologischer Nachweis), den klinisch chemischen Nacnweis anhand des Anstieges leberspezifischer Enzyme im Serum sowie den gleichzeitigen Ausschluss anderer Lebererkrankungen, insbesondere den Ausschluss von Hepatitis A und Hepatitis B. Ein indirekter Beweis für die Freisetzung des Non-A-Non-B Hepatitis-Virus wurde bei den Untersuchungen in folgender Weise erbracht: Ausgehend von den überlegungen, dass Non-A-Non-3-Viren im Blut in freier Form mittels den üblichen Testmethoden mit Radioimmunoassay bisher nicht nachgewiesen werden konnten und dass die Häufigkeit der Infektion bei Gaben von Plasmaderivaten in direkter Korrelation mit dem Fibronectingehalt der verwandten Plasmaderivate bei parenteral übertragener Non-A-Non-B-Hepatitis stand, wurden fibronectinfreie biologische Flüssigkeiten auf die Anwesenheit von Substanzen untersucht, die mit einer Non-A-Non-B-Hepatitis einhergingen. Die Ausscheidung von Viren in verschiedene Körperflüs- sigkeiten, Sekrete und Exkrete ist bekannt und wird in der Virologie zum Nachweis von Viren eingesetzt (Virusnachweis im Speichel, Stuhl usw.). Anhand von über 3000 Untersuchungen an Patienten mit sporadischer und parenteral erworbener Non-A-Non-B-h.epatitis sowie an gesunden Kontrollpersonen und Patienten, die an anderen Virushepatitiden und Leberkrankheiten anderer Genese litten, konnte gezeigt werden, dass im Verlaufe der Non A-Non-B-Hepatitis eine spezielle Substanz im fibronectinfreien Stuhlfiltrat nachzuweisen ist. Der Nachweis dieser Substanz korreliert mit der klinischen Diagnose Non-A-Non B-Hepatitis. Dieses mit Non-A-Non-B-Hepatitis assoziierte Partikel wurde hinsichtlich seiner chemischen und physikalischen Eigenschaften untersucht. Dazu wurden Stabilität gegen organische Lösungsmittel, Hitzeinaktivierung, Sta bilität gegenüber verschiedenen Detergentien, Dichteg-a- dientenzentrifugation im Cäsiumchloridgradienten und Saccharosegradienten durchgeführt. Dieses Partikel lässt sich in gleicher Art wie das Hepatitis-A-Virus durch Fibro- nectin maskieren und kann auch durch Zugabe von Hepatitis- A-Viren aus seiner Bindung vom Fibronectin verdrängt werden. Entsprechend ist sein Verhalten gegenüber eiweissab- bauenden Enzymen und organischen Lösungsmitteln. Entspre- chend seinem Sedimentationsverhalten handelt es sich um stabiles partlkuläres Material ähnlich einem Virus, das zudem mit einer jahreszeitlichen Häufung in den Winter- monaten und Frühjahrsmonaten ausgeschieden wird. Methodik: 1:10 (G/V) verdünnte Stuhlsuspension von Patienten mit NANB-Hepatitis wurden nach zweimaliger Fällung mit 10% PEG-6000 und Freun-Extraktion mit DNase, RNase und Sarcosyl (1%ig) inkubiert. Das Sediment wurde auf einem Cäsium- chloridgradienten mit einer Dichte von 1,2 bis 1,4 (g/ml) aufgetragen und 6,24 und 42 h zentrifugiert (30.000 RP.M). Die positiven Fraktionen wurden im Saccharose-Gradienten von (5-30%) weiter gereinigt (40.000 RPM) und mittels SDS-PAGv analysiert. Die Stabilität gegenüber Enzymen und Detergenzien wurde mit Chymotrypsin, Trypsin, Elastase, Papain, Pepsin, Pronase, DNase, RNase, Neuaminidase und SDS untersucht. Die Hitzestabilität wurde über einen Bereich von 37 C bis 1000C geprüft. Je 50 g Protein pro ml der Substanz wurden zusammen mit kompletten Frend'schen Adjuvanz zum Immunisierung von Kaninchen einoesetzt. Die Überprüfung der Bindungsaffinität der Substanz erfolgte nach 125 J-Markierung und Inkubation mit normalem mensch lichten Serum und anschliessender chromatoaraphischer Trennung (Biogel Ac 34). Ergebnisse: Ein Hauptpeak der Substanz fand sich konstant bei einer Dichte von 1,25 bis 1,26 (g/ml). In der SDS PAGE stellten sich zwei Polypeptide mit einem Molekular 125 gewicht bei 40.000 D dar. Die -J-markierte Substanz zeigte eine starke Affinität gegen alle chromatogra- phisch trennbaren Serumfraktionen. Pronase-, Papain- und Pepsinbehandlung sowie Zusatz von 0,1% SDS zerstörte die Bindungsaffinität des gereinigten Materials, das sich gegenüber den anderen Enzymen sowie gegenüber einer Erhitzung auf 700C über 45 Min. als stabil erwies. Die mit der Substanz immunisierten Kaninchen bildeten spezifische Antikörper. Bei prospektiver Untersuchung zur Frage einer posttransusionären Hepatitis unter Einschluss einer Untersuchung des Stuhls au das Vorhandensein einer der Hepatitis NANB assoziierte Substanz wurde bei einer Reihenuntersuchung festgestellt, dass 21% der Patienten im Stuhl positiven Befund zeigten, von denen 63% manifest an einer Hepatitis erkrankten. Weitere 25% entwickelten bis zum Stichtag einen Anstieg der Gamma-GT. Nur bei 5,5% liessen sich keine Veränderungen feststellen. Somit ist aus der Sicht eines positiven Tests eine der Hepatits N 3 assozierten Substanz im Stuhl zu 97,5% der Fälle mit einer vermutlich infektionsbedingten Leberschädigung zu rechnen, falls eine Transfusion vorausgeht. Die Gesamtzahl n der Patienten, bei denen eine genügend lange Dauer nach der Transfusion vorlag, demgemäss eine dem Studienziel entsprechende Diagnose gestellt werden konnte, betrug 38. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens der Erfindung besteht in einer Abänderung wobei das Fibronectin aus dem Blutplasma vor Freisetzung des Virus bzw. Antigens entfernt und so ein virusfreies Blutplasma erhalten wird. Diese Modifikation ist noch wichtiger bei der Herstellung von Blutplasmafraktionen, z.B. Gammaglobulin oder Faktor 8. Bei der üblichen Herstellung solcher Slutplasmafraktionen findet eine gewisse Anreicherung von Fibronectin statt und die Entfernung des Fibronectins entfernt gleichzeitig alle Viren bzw. bindungsfähige Antigene, so dass virenfreie Plasmafraktionen erhalten werden. Der Ausdruck "Fibronectin", wie er hier verwendet wird, bezieht sicn insbesondere auf menschliches Fibronectin und auf das Fibronectin von Primaten allgemein. Da Fibronectin artspezirisch ist, können Unterschiede be stimmter aktiver Gruppen der Fibronectinstruktur auf treten die die Bindungsfähgikeit für Viren, insbesondere Non-A-,Non-B-Virus bzw. die entsprechenden Antigene, nicht auftreten lassen. Im Lichte der obigen Beschreibung kann dies jedoch von Fall zu Fall bestimmt werden, wenn mit einem anderen Fibronectin als dem von Primaten ge arbeitet werden soll.

Claims: Patentansprüc:ze 1. Verfahren zur Gewinnung von Viren bzw. Virusantigen aus biologischem Material, insbesondere Körperflüssig- keiten, d a d u r c h gekennzeichnet, dass man als Aus gangsmaterial eine fibronectinhaltige Körperflüssigkeit oder ein mit Fibronectin versetztes biologisches ;ate- rial verwendet und das Virus bzw. das Vlrusantlgen durch an sich bekannte Zerstörung des Bindungsmechanismus, insbesondere durch spezielle Enzyme und/oder Detergenzien oder durch Ver drängungsreaktionen oder Erhitzen freisetzt und gegebenen falls aus der erhaltenen Suspension die Viren bzw. das Virenantigen isoliert und gewünschtenfalls in an sich bekannter Weise weiter reinigt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h gekenn zeichnet, dass man statt Fibronectin Fibronectinbruch stücke, die zur Bindung von bestimmten Viren bzw. Viren antigen befähigt. sind, einsetzt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h ge kennzeichnet, dass man Non A-Non B-Hepatitisvirus bzw. -virus antigen aus Fibronectin oder dessen Bruchstücken gewinnt. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h gekennzeichnet, dass man als Körperflüs sigkeit Blut oder als biologisches Material ein Stuhl homogenisat verwendet. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h gekennzeichnet, dass man die Freisetzung des Virus bzw. des Virusantigens mit Neuraminidase oder Chymotrypsin durchführt. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Freisetzung des Virus bzw. Virusantigens durch Erhitzen durch führt. 7. Non A-Non B-Hepatitisvirus bzw. Virusantigen.in Suspen sion, wie sie bei der Gewinnung aus Fibronectin oder dessen Bruchstücken anfällt oder in isoliertem Zustand, gegebenenfalls nach Reinigun. 8. Anwendung des Non A-Non B-Xepatitisvirus bzw. des -virusantigens nach Anspruch 7 zur Herstellung von Antikörpern und zur immunologischen (Labor) Diagnose von Non A-Non B-Hepatitis sowie zur Herstellung von Impfstoff. 9. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, insbesondere Anspruch 4 für Screening-Tests, insbe sonaere zur Früherkennung von Vireninfektionen lurch Stuhluntersuchung, insbesondere für Posttrans=usions- Hepatitis. 10. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Gewinnung von virus- bzw. antigenfreien Blutplasmafraktionen durch Entfernen des Fibronectins mit dem daran gebundenen Virus oder Antigen aus dem Plasma vor der Freisetzung des Virus bzw. Virusantigens. 1 1. Diagnosekit zur Diagnose von durch Fibronektin oder dessen BruchshiRen maskierten Viren bzw. Virenan tigenen, enthaltend neben markierten Antigenen sowie markierten und nicht markierten spezi fischen Antikörpern gegen diese Antigene zusätzlich Reagenzien, welche die Freisetzung der gebundenen Viren bzw. Virenantigene aus Fibronektin oder dessen Bruch stücken ermöglichen. 12. Diagnosekit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Freisetzung von gebundenem Virus bzw. Antigen Neuraminidase oder Chymotrypsin und gegebenenfalls Kollagen-Sepharosefilter enthalten sind.

Inventors: SEELIG, RENATE, DR., LIEHR, HEINRICH, PROF. DR., POTT, GERHARD, DR., SEELIG, HANS PETER, PROF. DR.
Applicants: LIEHR, HEINRICH, PROF. DR., POTT, GERHARD, DR., SEELIG, HANS PETER, PROF. DR., SEELIG, RENATE, DR.
Application year: 1984
Main classification: C12N7
IPC codes: C12N7, C12Q1, G01N33, A61K35, C12R1, A61K39