PROCESS FOR THE PREPARATION OF 3-OXO-DELTA-1,4 STEROIDS

Abstract: 1. A process for the preparation of 3-oxo-delta **1.4 -steroids of the general formula I : see diagramm : EP0126876,P7,F4 wherein X is a hydrogen atom, a or a methyl group, see diagramm : EP0126876,P7,F5 represents the groupings see diagramm : EP0126876,P7,F6 see diagramm : EP0126876,P7,F7 or see diagramm : EP0126876,P7,F8 see diagramm : EP0126876,P8,F1 represents the groupings see diagramm : EP0126876,P8,F2 see diagramm : EP0126876,P8,F3 see diagramm : EP0126876,P8,F4 see diagramm : EP0126876,P8,F5 see diagramm : EP0126876,P8,F6 or see diagramm : EP0126876,P8,F7 wherein Z represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a fluorine atom or a chlorine atom, R1 represents a hydrogen atom or an alicyclic hydrocarbon radical having from 1 to 4 carbon atoms, R2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkanoyloxy group having from 1 to 6 carbon atoms, or a benzoyloxy group, R3 represents a hydrogen atom, a hydroxy group or a methyl group, and R4 and R5 each represents an alkyl group having from 1 to 4 carbon atoms, from 3-oxo-delta **4 -steroids of the general formula II : see diagramm : EP0126876,P8,F8 wherein X, see diagramm : EP0126876,P8,F9 and see diagramm : EP0126876,P8,F10 have the meanings given above, or their 21-esters of alkanecarboxylic acids having from 1 to 6 carbon atoms, by fermentation with a biocatalyst in which microorganisms of the species Arthrobacter simplex or Bacillus sphaericus are immobilised in cross-linked polyvinyl alcohol partially esterified with acrylic acid, characterised in that the biocatalyst is added to an aqueous suspension of the micronised 3-oxo-delta **4 -steroid, the reaction mixture is incubated at a temperature of from 20 to 40 degrees C until the steroid has reacted, and then the biocatalyst is mechanically removed from the aqueous suspension of the 3-oxo-delta **1.4 -steroid formed.

Description: Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekennzeichnete Verfahren. Bekanntlich werden Mikroorganismen-Kulturen der Species Arthrobacter simplex (wie z.B. ATCC 6946,13260 und 1F0 3530) oder Bacillus sphaericus (wie z.B. ATCC 7054,7055,12488 und 13805) zur Al-Dehydrierung von 3-Keto-A4-steroiden verwendet. Es ist vorbekannt, dass Mikroorganismen der Species Arthrobacter simplex, die in vernetztem, partiell mit Acrylsäure veresterten Polyvinylalkohol immobilisiert sind, ebenfalls die Fähigkeit besitzen 3-Keto-A4-steroide zu 3-Keto-1,4- steroiden zu dehydrieren (I. Chibata S. Fukui and L.B. Wingard: Enzyme Engeneering Plenum Press, New York, Volume 6, 181-189). Auch aus Mikroorganismen der Species Bacillus sphaericus lassen sich in gleicher Weise Biokatalysatoren herstellen. Diese für die Herstellung des Biokatalysators benötigten Mikroorganismen werden in üblicher Weise angezüchtet und nach erfolgter Anzucht abfiltriert oder abzentrifugiert, mit Wasser oder verdünnter Pufferlösung gewaschen und nochmals filtriert oder zentrifugiert. Die so erhaltene feuchte Biomasse kann ohne weitere Aufarbeitung zur Herstellung des Biokatalysators verwendet werden, wobei man etwa die 2 bis 30-fache vorzugsweise 10 bis 15-fache Menge feuchte Biomasse bezogen auf den vernetzten partiell mit Acrylsäure veresterten Polyvinylalkohol (Trockenmasse) verwendet. Andererseits kann aber diese Biomasse auch durch Sprühtrocknung getrocknet werden und man setzt dann 1 bis 10 mal vorzugsweise 5 bis 8 mal so viel Trockenpulver wie Polymerisat (Trockenmasse) ein. Zur Herstellung des partiell mit Acrylsäure veresterten Polyvinylalkohols verwendet man vorzugsweise Polyvinylalko hol, welcher ein Molekulargewicht von 20 000 bis 200 000 hat. Die Veresterung des Polyvinylalkohols mit Acrylsäure kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, welche man üblicherweise zur Veresterung von primären oder sekundären Alkoholen mit sterisch ungehinderten Carbonsäuren anwendet. Eine wenig aufwendige Veresterungsmethode ist ein Verfahren, bei dem der Polyvinylalkohol und Acrylsäure im molaren Verhältnis von etwa 1:1 bis 1:4 bezogen auf die Hydroxygruppen des Polyvinylalkohols in wässriger Lösung in Gegenwart starker Säuren - wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure- oder stark saure Ionenaustauscher - wie zum Beispiel Amberlite IR-120- erhitzt. Nach erfolgter Umsetzung wird die Säure - beispielsweise durch Neutralisation und anschliessende Dialyse oder durch Kationenaustauscher, wie Amberlite(R) IR-4B, entfernt - beziehungsweise den stark sauren Ionenaustauscher abfiltriert. Das erhaltene Produkt kann als Lösung oder nach Einengen im Vakuum oder Gefriertrocknen als Feststoff weiter umgesetzt werden. Der Feststoff pro g sollte etwa 0,4 bis 1,5 milliäquivalente Vinylgruppen enthalten (Die Bestimmung kann nach der in Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl-Müller Aufl. 4 Band II, Seite 33 beschriebenen Methode) erfolgen. Die zum Zweck der Immobilisierung der Mikroorganismen folgende Vernetzung des mit Acrylsäure partiell veresterten Polyvinylalkohols erfolgt beispielsweise in Gegenwart eines Fotosensibilisators (wie z.B. Riboflavin-5'-monophosphat oder Natriumbenzoat) durch Bestrahlen mit sichtbarem oder UV-Licht. Vorzugsweise wird der Mikroorganismus in einer eventuell gepufferten 1 bis 20 %igen wässrigen Lösung des partiell mit Acrylsäure veresterten Polyvinylalkohols suspendiert, mit einem Fotosensibilisator versetzt, zu einer dünnen Schicht ausgebreitet und bestrahlt. Nach erfolgter Vernetzung wird der Biokatalysator gewaschen, gewünschtenfalls gefriergetrocknet und als Folie oder in zerkleinerter Form verwendet. Wird der Biokatalysator in zerkleinerter Form verwendet, so ist es zweckmässig ihn nach der Zerkleinerung nass zu sieben und die Siebfraktionen von 0,02 bis 2 mm, vorzugsweise solche von 0,05 bis 1,5 mm Korngrösse zur Umsetzung von Steroiden zu verwenden. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden pro 100 ml einer 0,1 bis 5 gewichtsprozentigen Suspension des Biokatalysators in Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung 0,03 bis 2 g des mikronisierten Steroids (die maximale Substratkonzentration ist abhängig von der Struktur des umzusetzenden Steroids) zugesetzt und man inkubiert die Reaktionsmischung bis zur Beendigung der Umsetzung. Oft ist es zweckmässig das mikronisierte Steroid (Korngrösse vorzugsweise 0,1 bis 50 zusätzlich noch zu emulgieren. Das kann geschehen, indem man es unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxyaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin(R), Tagat(R), TWeen(R) und 5pan(R) beispielsmässig genannt. Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Art der angewendeten Reaktionsbedingungen abhängig. Diese Grössen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden. Nach erfolgter Fermentation wird der Biokatalysator mechanisch wie zum Beispiel mittels eines Siebes abgetrennt, gewaschen und kann dann erneut zur Fermentation eingesetzt werden. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens. Beispiel 1 a) Zwei 2 1 Erlenmeyerkolben, von denen jeder 500 ml einer sterilisierten Nährlösung aus 0,5 Ó Corn steep, 0,1 m Hefeextrakt und 0,05 m Stärkezucker, eingestellt auf pH 7,0 enthält, wird mit einer Lyophilkultur von Arthro bacter simplex (ATCC 6946) beimpft und 48 Stunden bei 300 C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Diese Vorkultur dient zur Beimpfung eines 50 1 Glasfermenters, der mit 30 1 eines sterilisierten Mediums aus 0,5 S Corn steep, 0,1 S Hefeextrakt und 0,05 S Stärkezucker, einge stellt auf pH 7,0, gefüllt ist. Nach der Beimpfung wird bei 290 C unter Belüftung (10 Liter/Min.), 0,7 atü Druck und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) 24 Stunden germi niert. Mit dieser Vorfermenter-Kultur wird nun ein Stahl fermenter beimpft, der 500 1 eines bei 1210 C und 1,1 atü sterilisierten Mediums aus 0,5 Dó Corn steep, 0,1 % Hefe extrakt und 0,05 OD Stärkezucker, eingestellt auf pH 7,0, enthält und unter den Bedingungen des Vorfermenters eben falls 24 Stunden bis zur optimalen Zelldichte germiniert. Anschliessend wird die Kultur in einem Labor Separator LG 205 [Firma Westfalia Separator AG/Oelde (Westf.)J bei 10 000 Umdrehungen/Min. separiert. Die abgeschleuderte Zellmasse wird zur Entfernung anhaftender Bestandteile des Nährmediums mit destillierten Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise dargestellte feuchte Bakterienpaste (2,85 kg) wird in 2,85 1 eines 0,05 molaren Tris-(hy droxymethyl)-methylamin-Puffers von pH 7,6 aufgeschlemmt, zur Zerteilung von Zellklumpen durch ein Metallgazefilter gedrückt und in einem Universal-Labor-Zerstäubungstrock- ner Firma Zahn & Co., Hameln, Deutschlandj bei einer Verdampfungstemperatur von 800 C versprüht, wobei 600 ml Zellsuspension pro Stunde eingespeist werden. Man erhält so 513 g Arthrobacter simplex Trockenpulver. b) 22 g Polyvinylalkohol (Molgewicht ca. 72 000 Hersteller firma nerck AG) wird in 250 ml In wässriger Salzsäure bei 800 C gelöst. Dann setzt man unter Stickstoff 72 g redestillierte Acrylsäure zu, erhitzt noch 3 Stunden lang bei 900 C unter Rühren und rührt weitere 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Dann neutralisiert man die Reaktionsmischung mit ver dünnter Natronlauge dialysiert sie zwei Tage lang gegen Wasser und lyophilisiert sie. (Der Vinylgruppengehalt des Polymeren liegt bei 0,80 m Äquiv./g.) c) 10 ml einer 8 Gewichtprozentigen Lösung des gemäss b) hergestellten Polymeren in Phosphatpuffer (25 m mol Di natriumhydrogenphosphat und 25 m mol Kaliumdihydrogen phosphat pro Liter) werden mit einer Suspension von 6,00 g Arthrobacter simplex Trockenpulver in 25 ml des gleichen Phosphatpuffers und 80 mg Riboflavin-5'-monophosphat Natriumsalz versetzt, verrührt und auf einer 600 cm2 grossen Glasplatte gleichmässig ausgestrichen. Man bestrahlt die Mischung 3 Stunden lang aus 20 cm Abstand mit einer 250 Watt starken Lampe mit sichtbarem Licht wobei die Temperatur im Strahlengang mittels eines Gebläses auf maximal 25 C begrenzt wird. Der als Folie anfallende Biokatalysator wird 24 Stunden lang in Phosphatpuffer bei 300 C geschüttelt und dann lyophylisiert. Dann wird er zermahlen und die Teilchen mit einer Korngrösse von 0,5 bis 1 mm ausgesiebt. Der so erhaltene Biokatalysator kann monatelang gelagert werden, ohne dass er in seiner Aktivität nachlässt. d) Hydrocortison wird in einer Turbulenzmühle mikronisiert bis seine Teilchengrösse überwiegend 1 bis 20 F beträgt. e) 36,2 mg mikronisiertes Hydrocortison werden in 50 ml Phosphat-Puffer (25 m mol Dinatriumhydrogenphosphat und 25 m mol Kaliumdihydrogenphosphat pro Liter) mit 100 mg lyophilisiertem Biokatalysator versetzt und bei 300 C mit 160 Umdrehungen pro Minute geschüttelt, bis zur voll ständigen Umsetzung des Substrats (Dauer ca. 24 Stunden). Nach beendeter Umsetzung wird der Biokatalysator von der Prednisolon-Suspension durch Sieben abgetrennt In der gleichen Weise kann der Biokatalysator abermals mit mikronisierter Hydrocortison-Suspension umgesetzt werden. Selbst nach dreissigmaliger Wiederholung hat der Biokata lysator noch seine volle Aktivität beibehalten. Beispiel 2 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 können folgende Steroide in der Al-Position dehydriert werden: 4-Östren-3,17-dion (hier entsteht durch Doppelbindungsisomerisierung tistron), 4-Androsten-3,17-dion, 17ss-Hydroxy-4-androsten-3-on, 4-Pregnen-3,20-dion, 17a-Hexanoyloxy-4-pregnen-3,20-dion, llss,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion, l7o, 21-Dihydroxy-4-pregnen-3, 11, 20-trion, llss,21-Dihydroxy-6 -methyl-17a-propionyloxy-4-pregnen-3,20-dion, 6 -Fluor-llss,21-dihydroxy-16 -methyl-4-pregnen-3,20-dion, 21-Hydroxy-16 ,17 -isopropylidendioxy-4,11-pregnadien-3,20- dion 21-Hydroxy-17 -propionyloxy-16ss-methyl-4,11-pregnadien-3,20- dion und 9ss , llss-Epoxy-21-hydroxy-16ss-methyl-4-pregnen-3 20-dion. Beispiel 3 a) 22 g Polyvinylalkohol (Molgewicht ca. 72 000 Hersteller firma Merck AG) wird in 250 ml ln wässriger Salzsäure bei 800 C gelöst. Dann setzt man unter Stickstoff 36 g redestillierte Acrylsäure zu, erhitzt noch 3 Stunden lang bei 900 C unter Rühren und rührt weitere 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Dann neutralisiert man die Reaktionsmischung mit ver dünnter Natronlauge dialysiert sie zwei Tage lang gegen Wasser und lyophilisiert sie. (Der Vinylgruppengehalt des Polymeren liegt bei 0,40 m Xquiv./g.) b) 10 ml einer 8 Gewichtprozentigen Lösung des gemäss b) hergestellten Polymeren in Phosphatpuffer (25 m mol Di natriumhydrogenphosphat und 25 m mol Kaliumdihydrogen phosphat pro Liter) werden mit einer Suspension von 6,00 g Arthrobacter simplex - hergestellt nach Beispiel 1 a) Trockenpulver in 25 ml des gleichen Phosphatpuffers und 80 mg Riboflavin-5'-monophosphat-Natriumsalz versetzt* verrührt und auf einer 600 cm2 grossen Glasplatte gleichmässig ausgestrichen. Man bestrahlt die Mischung 1 Stunde lang aus 40 cm Abstand mit einer 300 Watt starken UV-Fotolampe wobei die Temperatur im Strahlengang mittels eines Ge bläses auf maximal 250 C begrenzt wird. Der als Folie anfallende Biokatalysator wird 24 Stunden lang in Phosphatpuffer bei 300 C gewaschen. c) Hydrocortison wird in einer Turbulenzmühle mikronisiert bis seine Teilchengrösse überwiegend 1 bis 20 W beträgt. d) 36,2 mg mikronisiertes Hydrocortison werden in 50 ml Phosphat-Puffer (25 m mol Dinatriumhydrogenphosphat und 25 m mol Kaliumdihydrogenphosphat pro Liter) mit 400 mg der feuchten Biokatalysatorfolie versetzt und bei 30 C mit 160 Umdrehungen pro Minute geschüttelt, bis das Sub strat völlig umgesetzt ist (Dauer ca. 30 Stunden). Nach beendeter Umsetzung wird der Biokatalysator aus der Prednisolon-Suspension herausgenommen. In der gleichen Weise kann der Biokatalysator abermals mit mikronisierter Hydrocortison-Suspension umgesetzt werden. Selbst nach dreissigmaliger Wiederholung hat der Biokatalysator noch seine volle Aktivität beibehalten. Beispiel 4 362 mg mikronisiertes Hydrocortison werden in 200 ml Phosphat Puffer (25 m mol Dinatriumhydrogenphosphat und 25 m mol Ka liumdihydrogenphosphat pro Liter) suspendiert, mit 0,5 g lyophilisierter Biokatalysator - hergestellt nach Beispiel 1versetzt und bei 30" C mit 160 Umdrehungen pro Minute bis zur völligen Umsetzung (ca. 48 Stunden lang) geschüttelt. Dann wird der Biokatalysator durch Sieben abgetrennt, mit Phosphatpuffer vom Sieb gespült, mit einer Suspension von 362 mg mikronisiertem Hydrocortison versetzt, das Gemisch mit Phosphatpuffer auf 200 ml aufgefüllt und wiederum bis zur völligen Umsetzung des Substrats bei 300 C mit 160 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Man wiederholt diese Umsetzung noch 9 mal mit dem gleichen Biokatalysator - wobei der Biokatalysator nach den einzelnen Umsetzungen wochenlang in Phosphatpuffer bei +40 C aufbewahrt werden kann, ehe er zur nächsten Umsetzung verwendet wird. Die erhaltenen Prednisolon-Suspensionen werden jeweils mit Chloroform extrahiert und die organischen Phasen im Vakuum eingeengt. Die vereinigten Prednisolon-Rohprodukte werden aus Aceton umkristallisiert. Man erhält 3,42 g Prednisolon (= 95 S der Theorie) vom Schmelzpunkt 237-240 C.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von 3-Oxo-A1'4-steroiden aus in der 1,2-Position gesättigten 3-0xo- -steroiden durch Fermentation mit einem Biokatalysator in welchem Mikro orgnismen der Spezies Arthrobacter simplex oder Bacillus sphaericus in vernetztem partiell mit Acrylsäure ver esterten Polyvinylalkohol immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass man den Biokatalysator einer wässrigen Suspension des mikronisierten 3-Oxo-A4-steroids zusetzt, die Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 20 bis 400 C bis zur Umsetzung des Steroids inkubiert und danach den Biokatalysator mechnisch von der wässrigen Suspension des gebildeten 3-Oxo-h '4-steroids abtrennt. 2. Verfahren zur Herstellung von 3-0xo-Al'4-steroiden der allgemeinen Formel 1 EMI11.1 worin X ein Wasserstoffatom, ein Chloratom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe bedeutet, EMI11.2 die Gruppierungen EMI12.1 mit Y in der Bedeutung von Wasserstoff, Fluor oder Chlor und EMI12.2 die Gruppierungen EMI12.3 mit Z in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms, einer Hydroxy gruppe eines Fluoratoms oder eines Chloratoms, R1 in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms oder eines ali cyclischen Kohlenwasserstoffrests mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen, R2 in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms, einer Hydroxy gruppe, einer gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom unterbrochenen Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer Alkanoyloxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einer Benzoyloxygruppe R3 in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms, einer Hydroxygruppe oder einer Methylgruppe und R4 und R5 in der Bedeutung einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, darstellen, gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 3-Oxo-A4-steroid der allgemeinen Formel II EMI13.1 worin xs EMI13.2 die obengenannte Bedeutung besitzen, oder deren 21-Ester von Alkancarbonsäuren mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen fermentiert.

Inventors: BEIER, WILFRIED, DIPL.-CHEM., MANECKE, GEORG, PROF. DR.
Applicants: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT BERLIN UND BERGKAMEN
Application year: 1984
Main classification: C12P33
IPC codes: C12P33, C07J5