METHOD FOR THE PASTEURIZATION OF PLASMA OR CONCENTRATES OF BLOOD COAGULATING FACTORS II,VII, IX AN X

Abstract: 1. A process for the preparation of a virtually virus-free and hepatitis-safe product of blood coagulation factors II, VII, IX and X by heating an aqueous liquid containing these factors, if appropriate in the presence of an aminoacid and/or a saccharide or sugar-alcohol, which comprises heating the solution in the presence of calcium ions and a chelating agent and, if appropriate, antithrombin III and/or heparin.

Description: Verfahren zur Pasteurisierung von Plasma oder von Konzentraten der Blutqerinnunqsfaktoren II, VII, IX und X Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer von aktiven Viren praktisch freien Plasma-Präpara- tion oder eines von solchen Viren praktisch freien Kon- zentrates der Blutgerinnungsfaktoren II, VII, IX und X durch Erwärmen in Gegenwart von Stabilisatoren sowie eine danach hergestellte Präparation dieser FaJtoren. Solche Präparationen können zur Behandlung von BluGge- rinnungsstörungen verwendet werden. Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in Stufen ablaufen- der Vorgang, der durch verschied.ene physiologische wie pathologische Ursachen ausgelöst wird, und dessen Ablauf von etwa 20 fördernden oder hemmenden Faktoren abhängt. Durch Verminderung oder Vermehrung dieser Blutgerinnungs- faktoren treten Störungen der Blutgerinnung auf, die sich teilweise als Krankheiten manifestieren. Konzentrate der Faktoren II, VIX, IX und x sind für die Behandlung verschiedener angeborener oder erworbenen Störungen der Synthese dieser Faktoren geeignet. Die be- handlung von Patienten mit Konzentraten dieser Faktoren war bisher mit dem Risiko eier Virus übertragung und speziell einer Hepatitis verbunden. Albumin gilt als hepatitissicher, wenn es in wässriger Lösung und in Gegenwart von Stabilisatoren auf 60 C erhitzt wird (Gellis, S. S. et a1., J. Clin. Invest. (148) 27, 2393. Es ist deshalb anzunehmen, dass ein in Gegenwart geeigneter Stabilisatoren erhitztes Konzentrat der Faktoren II, VII, IX und X ebenfalls hepatitissicher ist. In der deutschen Offenlegungsschrift 29 16 711 ist ein Verfahren zur Stabilisierung anderer Gerinnungsfaktoren in wässriger Lösung gegen Wärme durch Zusatz einer Aminosäure und eines ono-oder Oligosaccharids oder Zuckeralkohols beschrieben. Doch kann auf diese Weise nicht verhindert werden, dass die Faktoren II, VII, IX und X beim Erwärmen zum grossen Teil inaktiviert werden. Daher war die Beobachtung ein Fortschritt, dass die Faktoren II und VII durch Chelat Bildner (DE 30 43 857 Al) und die Faktoren IX und X durch Calcium (DE 30 AS 153 Al) vor einer thermischen Inaktivierung in wässriger Lösung geschützt werden. Beide Verfahren erlaubten jedoch nicht die Herstellung einer Präparation aller vier Faktoren in einem Arbeitsprozess, wie sie wünschenswert ist, da alle vier Faktoren bei Vitamin K-Mangel oder unter der Therapie mit oralen Anitkoagulantien vermindert sind und daher gleichzeitig substituiert werden müssen. Es bestand demnach die Aufgabe, ein Verfahren zur Stabilisierung einer die Faktoren II, VII, IX und X enthaltenden wässrigen Lösung gegen thermische Inaktivierung zu finden. Uberraschend wurde nun gefunden, dass eine alle vier Faktoren II, VII, IX und X enthaltende wässrige Lösung durch Zusatz von Calciumionen und eines Chelat-Bildners gegen die nachteiligen Folgen einer Wärmebehandlung geschützt werden kann. Gegebenenfalls können Antithrombin III (AT) und Heparin zugesetzt werden, um eine Aktivierung der Faktoren II und VII zu verhindern. Damit waren die Voraussetzungen geschaffen, diese vier Faktoren frei von akti.ven Viren in einem Arbeitsgang mit hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen. Der Chelat-Bildner wird zusätzlich zu dem bereits vorhandenen Citrat zugesetzt. Es überrascht, dass eine Mischung von Calciumionen und Chelat-Eildner den angestrebten Schutz aller Faktoren II, VII, IX und X gegen einen Aktivitätsverlust durch Erwärmen bewirkt, obwohl nach DE 30 43 857 ein Chelat Bildner für den Schutz der Faktoren II und VII zweckmässig ist, während zum gleichen Zweck für die Faktoren IX und X Calciumionen gebraucht werden (DE 30 45 153), und Chelat-Bildner auch mit Calcimionen Komplexe bilden. Je nachdem, ob der Chelat-Bildner oder die Calciumionen im ueberschuss vorliegen, sollten deshalb jeweils nur die beiden entsprechenden Faktoren gegen einen Wärmeabbau geschützt sein und nicht alle vier. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer praktisch virusfreien und hepatitissicheren Präparation der Blutgerinnungsfaktoren II, VII, IX und X durch Erwärmen einer wässrigen Lösung, gegebenenfalls in Gegenwart einer Aminosäure und/oder eines Saccharids oder Zuckeralkohols, dadurch gekennzeichnet, dass in Gegenwart von Calciumionen und einem Chelat Bildner und gegebenenfalls von Antithrombin III und/oder Heparin erwärmt wird. Eine solcne Lösung kann eine diese Faktoren enthaltende Lösung oder ein diese enthaltendes Konzentrat, aber auch Plasma oder eine Plasma-oder Placentafraktion sein. Die optimale Konzentration von Calciumionen liegt im Bereich von 1 - 50 mmol/l, vorzugsweise 25 - 50 r,mol/l. Geeignete Calciumionen liefernde Salze sind beispie weise das Chlorid, Acetat oder Nitrat sowie alle wasserlöslichen Calcium-Salze von Zuckersäuren wie Gluconsäure oder Lactonsaure. Bevorzugt werden das Chlorid und das Acetat verwendet. Geeignete Chelat-Bildner sind beispielsweise: Ethylen- diamino-tetraessigsäure (EDTA), Ethylenglycol-bis- (2- aminoethylether)-tetraessigsäure (EGTA), Diaminocyclohexan-tetraessigsäure (CDTA), Diaminopropan-tetraessig- säure oder Nitrilotriessigsäure und besonders deren lösliche Alkali-Salze. Bevorzugt werden aliphatische Aza-tri-oder-tetra-Carbon- säuren mit 6-20 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Stick- stoffatomen und deren lösliche Alkali salze und besonders die Natriumsalze von Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) oder Ethylenglycol-bis-(2-amino-ethylether)tetraessigsäure CEGTA) verwendet. Die optimale Kon- zentration der Chelat-Bildner ist 1 bis 20 mmol/l und vorzugsweise 5 mmol/l Als besonders geeignet haben sich Mischungen von 25 mmol/l Calcium mit 5 mmol/l EDTA erwiesen. Antithrombin III wird in einer Konzentration von 0,05 2 E/ml, bezogen auf die Aktivität von 1 ml Citratmisch- plasma (1 E), eingesetzt und zusammen mit Heparin in Konzentrationen von 0,5 - 20 USP-E/inl, bevorzugt 0,2 B Antithrombin III mit 2 USP-E Heparin. In Anwesenheit einer Mischung von Calciumionen und einem Chelat-Bildner und gegebenenfalls des Antithrombin III Heparin-Komplexes kann die wässrige Lösung der Gerinnungsfaktoren so lange erhitzt werden, dass eine Übertragung von Viren und speziell Hepatitis-Erregern nach dem Stand des heutigen Wissens praktisch auszuschliessen ist. Dies gilt vor allem, wenn die Pasteurisierung mit Adsorptions-und Fällungsverfahren kombiniert wird, bei denen der Wirkstoff im Uberstand bleibt und die Hepatitisviren zusammen mit dem unlöslichen Nieder- schlag abgetrennt werden können. Eine Präparation, die mindestens 10 Stunden bei etwa 60"C in wässriger Lösung gehalten wurde, gilt heute als praktisch hepatitissicher insbesondere wenn von humaner Gebeflüssigkeit ausgegangen wird, in der nach einem Test der dritten Gnnera- tion Hepatitisviren nicht nachgewiesen werden können. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine alle vier Faktoren enthaltende Lösung, vorzugsweise Plasma oder eine Plasma-oder Plazentafraktion, mit 0,2 - 2 E/ml Anti- thrombin III, 2 - 20 USP-E/ml Heparin, 25 - 50 mslol/l Calciumionen und 1 - 20 mmol/l EDTA, 1 - 3 mol/l mindestens einer der Aminosäuren Glycin; ; alpha-ode beta Alanin, Lysin, Leucin, Valin, Asparagin, Serin, Hydroxy- prolin, Prolin, Glutamin, alpha-, beta- oder gamma Aminobuttersäure, vorzugsweise aber Glycin und 20 bis 60 g/l00 g Lösung eines Mono-oder Oligosaccharids oder Zuckeralkohols, vorzugsweise 1 bis 3 mol/l Glycin und 20 bis 60 g/ 100 g Lösung Saccharose, versetzt, auf eine Temperatur von 300C bis 100 C, vorzugsweise 600C bis 1000C, erhitzt und 1 Minute bis 48 Stunden, vorzugsweise 8 - 12 Stunden, bei dieser Temperatur gehalten wird, wobei die kürzeste Zeit der höchsten Temperatur zuzuordnen ist und umgekehrt. Es wird ein pH-Wert von 6 bis 8 eingehalten. Auf diese Weise wird eine praktisch virusfreie Präparation der Faktoren II, VII, IX und X erhalten. Abhängig von der Löslichkeit des Calciumsalzes, der Ami- nosäure oder des Kohlenhydrates können die entsprechenden Konzentrationen von 0,3 und 3,0 mol/l und 60 g/1O0 g zu höheren Konzentrationen erweitert werden, wenn das Calciumsalz, die Aminosäure oder das Kohlenhydrat bei der gewünschten Temperatur eine entsprechend höhere Löslichkeit aufweisen. Die Temperaturbehandlung kann auch in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten durchjeführt werden. Mit der bevorzugt verwendeten Kombination von Antithrombin III, Heparin, Calciumchlorid und EDTA mit Glycin und Saccharose wird durch Erhitzen ein hepatitissicheres Präparat erzielt. Um zu einem Virus-freien Plasma zu kommn, das die Faktoren II, VII, IX und X in nativer und aktiver Form enthält, wird das Plasma mit der Mischung eines Chelatbildners, vorzugsweise EDTA und Calciumionen, vorzugsweise in solchen Mengen, dass diese in den Konzentra- tionen von 5 mmol/l EDTA und 25 mmol/l Calciumchlorid vorliegen, versetzt und in einer Saccharose (60 g/100 g) -Glycin (2 mol/l)-Mischung auf 60 C erwärmt und 10 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Um zu einem nativen und aktiven Konzentrat der Faktoren II, VII, IX und X zu kommen, wird die Plasma- oder Placentafraktion, zweckmässigerweise eine Fraktion, in der die zu stabilisierenden Faktoren angereichert sind, mit einer Mischung eines Chelatbildners, vorzugsweise EDTA und Calciumionen, vorzugsweise in den Konzentrationsverhältnissen von 5 mmol/l EDTA und 25 mmol/l Calciumchlorid, versetzt. Nach Zugabe von Antithrombin III, vorzugsweise 0,2 E/ml und Heparin1 vorzugsweise 2 USP/ml, wird in einer Saccharose (60 g/100 g)-Glycin (2 mol/l) Mischung auf GO8C erwärmt und 10 H bei dieser Temperatur gehalten. Eine solche Fraktion erhält man beispielsweise nach dem Verfahren von Sou].ier et al., Thrombosis Diath. Haemorrh. Suppl. 35, 61 (1969). Dazu adsorbiert man Plaslna, das als einem mit 0,(1 mo]/l EDTA anticoaguliertem Blut gewonnen wurde, an Calciumphosphat und zentrifugiert ab. Dabei werden die Faktoren quantitativ an das Adsorbens gebunden und können durch mehrfaches Eluieren mit 0,2 mol/l Tri-Natriumcitrat gewonnen werden. Die vereinigten Eluate werden durch kombinierte Alkohol-und Essigsäure- fällungen bei Temperaturen von -8 C bis +4 C weiter gereinigt. Dabei werden die Faktoren gleichzeitig konzentriert. man nimmt das Konzentrat in einem geeigneten Puffer, vorteilhaft Kochsalz/Natriumcitrat mit 0,06 bzw. 0,02 mol/l und pH 1,5 auf. Die Rückgewinnung un Reinigung der Gerinnungsfaktoren aus der erhitzten Lösung kann durch Fällen mit Ammonium sulfat bei 30-45 % Sättigung, Adsorbieren des Über- standes an 0, bis 1 g/100 ml Calciumphosphat und vlu- ieren erreicht werden. Die Rontrolle der Massnahmen zur Anreicherung und Reinigung der Faktoren II, VII, IX und X sind dem Fachmann durch die Kenntnis von Bestinunungsmethoden für die be treffenden Substanzen gelaufig. Unter Verwendung dieser Kontrollli,ethoden können die Verfahrensbedingungen unter dem Gesichtspunkt einer befriedigenden Ausbeute und einer befriedigenden Reinheit des Produktes gelenkt werden. Der Faktor II kann zum Beispiel nach der Methode von Koller, F. et al., Dtsch. med. Wschr 81, 516 (1956), bestimmt werden. Dazu werden ein Teil, beispielsweise 0,1 ml Faktor II-Mangelplasma, und ein Teil ver dünntes Normalplasma vermischt. Dicse Mischung wird 30 Sekunden bei +37 C gehalten. Danach setzt man zwei Teile calciumhaltiges Thromboplastin, beispielsweise hergestellt nach der deutschen Patentschrift 23 56 493, zu und bestimmt die Zeit, die bis zum Auftreten eines Ge rinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor II enthaltenden Lösung sich ergebende Ge rinnungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normal plasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. Eine Einheit Faktor II entspricht der Faktor II-Aktivi- tät von 1 ml Normalplasma. Der Faktor VII kann zum Beispiel nach der Methode von Voller, F. et al., Acta haemat. 6, 1 (1951), bestimmt werden. Dazu werden ein Teil, beispielsweise 0,1 ml Faktor VII-Mangelplasma und ein Teil verdünntes Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 30 Sekunden bei +37 C gehalten. Danach setzt man zwei Teile calciumhal- tiges Thromboplastin, beispielsweise hergestellt nach der deutschen Patentschrift 23 56 493, zu und bestimmt die Zeit, di.e bis zum Auftreten eines Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor VII enthaltenden Lösung sich ergebende Gerin- nungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. Eine Einheit Faktor VII entspricht der Faktor VII-Aktivität von 1 m Normalplasma. Die Bestimmung des Faktors IX erfolgt beispielsweise nach folgendem Verfahren: 1 Teil, beispielsweise 0,1 ml partielles Thromboplastin, zum Beispiel hergestelZt nach der DE-AS 23 16 430, wird mit einem Teil Faktor IX-Mangelplasma und einem Teil verdünntem Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 6 Minuten bei 37 C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37 C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchlo- rid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Calcitmchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor IX enthaltenden Lösung sich ergebende Gerinnungs- zeit unter Bezugnahme auf eine mit einer liormalplasma- Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. 1 Internationale Einheit (= 1 IE) Faktor IX entspricht der Faktor IX-Aktivität von 1 ml Normalplasma. Der Faktor X kann beispielsweise nach der Methode von Duckert et al., Blood Coagulation, Hemorrbage and rShrom- bosis, Ed. Tocantins, L. J. and Kazal, L. A. (1964), bestimmt werden. Dazu werden ein Teil, zum Beispiel 0,1 ml Faktor X-Mangelplasma und 1 Teil verdünntes Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 30 Sekunden bei +37 C gehalten. Danach setzt man zwei Teile calciumhaltiges Thromboplastin, beispielsweise hergestellt nach der L9E- PS 23 56 493, zu und bestimmt die Zeit, die bis zum Auftreten eines Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor X enthaltenden Lösung sich ergebende Gerinnungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. Eine Einheit Faktor X entspricht der Faktor X-Aktivität von 1 ml Normalplasma. Zur Abtötung der Hepatitisviren werden der Lösung Calciumionen, EDTA, Glycin und Saccharose und gegebenenfalls Antithrombin III und Heparin zugesetzt und er hitzt. Nach Pasteurisierung (10 Stunden, 600C) von flumanplasma nach Zusatz von Saccharose (60 g/100 g) und Glycin (2 mol/l) und in Gegenwart von 25 mmol/l Calciumchlorid sowie 5 mmol/l EDTA wurden folgende Aktivitäten, bezogen auf das eingesetzte Plasma, gefunden: F II 90 , F VII 85 %, F IX 83 %, F X 80 e. Der Einfluss der verschiedenen Stabilisatoren auf die Erhaltung der Aktivität der einzelnen Prothrombinfak- toren in einer Plasma-oder Placentafraktion beim Erhitzen ist der Tabelle I zu entnehmen. Die Pasteurisierung mit Saccharose und Glycin allein ergibt eine schlechte F IY.-Ausheute. Das ist jedoch sehr nachteilig, da das Prothrombin-Konzentrat vorwiegend für die Therapie der Hämophilie B eingesetzt wird. Die zusätzliche Verwendung von Calciumionen ohne Chelatbildner in der Konzentration von 6,25 mmol/l führt zu einer Aktivierung von F VII und F IX und vermindert auch die Ausbeuten an F II und F X. Eine solche Präparation wäre wegen eines möglichen Thromboserisikos für die Anwendung am Menschen nicht geeignet. Bei der Verwendung von EDTA ohne Calciumionen in der Konzentration von 5 mmol/l neben Saccharose und Glycin werden bei guten F II und F VII Ausbeuten schlechte F IX und F X Ausbeuten erzielt. Allein mit Antithrombin III, Heparin, Saccharose und Glycin lassen sich die Prothrombinfaktoren nicht stabilisieren. Das beste Ergebnis ergibt die Kombination von Calciumionen mit EDTA bei Zusatz von Antithrombin III und e- parin mit Saccharose und Glycin. Unter diesen Bedingungen liegen die Ausbeuten fü alle vier Faktoren in der Grössenordnung von etwa 80 % und die Präparation ist auch frei von aktivierten Faktoren und Thrombin. Die Konzentrationen an Gerinnungsfaktoren in einer wäss- rissen Lösung, mit der das beschriebene Verfahren ausge- führt werden kann, liegen besonders in den folgenden Bereichen: Faktor II 0.3 bis 50 E/ml; Faktor VII 0.3 bis 30 E/ml; Faktor IX 0.5 bis 60 E/ml; Faktor X 0.4 bis 60 E/ml. Besonders bevorzugt sid die Bereiche 0.5 bis 25, 0.5 bis 15, 0.7 bis 30 und 0.6 bis 30 für die Faktoren II, VII, IX beziehungsweise X. Als Konzentrat wird üblicherweise eine Lösung bezeichnet, die Wirkstoffe - also im vorliegenden Fall Gerin nungsfaktoren - in höherer Konzentration enthält als die natürlichen Ausgangsmaterialien. Tabelle I Zusätze Gerinnungsaktivität nach Erhitzen (10 h, 60 C) in % bezogen auf das Ausgangsmaterial Saccharose Glycin Ca-Ionen EDTA AT III Heparin F II F VII F IX F X g/100 g mol/l mmol/l mmol/l E/ml USP-E/ml 60 2 - - - - 83 58 25 43 60 2 6,25 - - - 47 akt.* akt.* 40 60 2 - 5 - - 73 61 41 50 60 2 25 5 0,2 2 72 83 83 87 60 2 - - 0,2 2 72 55 48 33 * akt. = aktiviert Für die Weiterreinigung kann die erhitzte Lösung gegeben nenfalls zentrifugiert werden. Verunreinigungen können durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat und 30 - 45 t Sätti- gung entfernt werden. Der Überstand kann dann an 0,04 bis 1,0 g Calclumphos- phat pro 100 m Lösung adsorbiert, das beladene Adsorbens gewaschen, mit Citratpuffer eluiert und das Eluat dialysiert werden. Für die Anwendung am Menschen kann das Produkt einer Sterilfi.ltration unterworfen werden. Eine nach diesem Verfahren erhältliche, von aktiven Viren freie Faktor II, VII, IX und X-Präparation stellt im besonderen den Gegenstand der Erfindung dar. Zur Erhöhung der Lagerstabilität ist es zweckmässig, der Präparation Protein -stabilisierende Substanzen, beispielsweise Proteine, Aminosäuren oder Kohlenhydrate, zuzusetzen. Schliesslich kann das dieser Behandlung unterzogene Präparat in gefriergetrockneter Form zur Verfügung gestellt wurden, wobei der Zusatz von Antikc-- agulantien wie beispielsweise Heparin, vorteilhaft sein kann. Das erfindungsgemässe Produkt, speziell in Form eines Konzentrates, ist, in einer für die pharmazeutische Verabreichung geeignc;ten Lösung, ein Arzneimittel für die Behandlung von Koagulopathien und kann intravenös, vor- teilhaft als Infusion, zur Therapie und Prophylaxe von durch Faktoren-Mangel bedingten Blutungen eingesetzt werden. In Form eines lyophilisierten, gerinnungsaktiven Plasmas deckt das pasteurisierte Produkt die Indikationen von fresh-frozen-plasma ab, z. B. beim Auffüllen des Blutvolumens, Aufrechterhaltung des onkotischen Drucks, Blutverlust nach grossen Operationen und Unfällen sowie die Behandlung der verschiedenen Formen des Schocks und die Erstversorgung von Polytraumatisierten. Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen er läutern werden. Beispiel 1 1000 ml Human-Citratplasma wurden unter Rühren auf 25 30 C erwärmt und mit 20 ml einer Lösung, die l,6 g EDTA enthielt und mit 2 n NaOH auf pH 7,8 eingestellt worden war, versetzt. 10 min später wurden in die auf 30 C erwärmte Lösung 1000 g Saccharose langsam eingerührt. Nach Losen der Saccharose wurden 150 g kristallines Glycin langsam und unter Rühren zugegeben; nachdem stich das vollstandig gelöst hatte, wurden 25 ml 1 molarer CaCl2 Lösung zugegeben und die Lösung mit 2 N NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Die durch die Stabilisatoren auf 1,7 1 ver mehrte Lösung wurde im Wasserbad 10 Stunden auf 60 C erhitzt und war auch nach dem Erhitzen klar. Entfernung der Stabilisatoren: Nach dem Erkalten der pasteurisierten Lösung wurde dies über einen 3,0 und 1,2 Sartorius-Membran-Filter klärfiltriert; dann wurde die Lösung mit einem Citrat-NaCl Puffer (0,01 mol/l Tri-NaCitrat pH 7,5; 0,06 mol/l NaCl) auf 5 1 verdünnt-und auf einem Ultrafilter unter gleichzeitigem Konzentrieren 3mal gegen 5 1 eines Puffers der glcichen Zusammensetzung dialysiert und auf 1000 ml konzentriert. Nach Erreichen des Plasma-Ausgangsvolumens von 1000 ml wurde die klare Lösung über Sartorius-Membran-Filter klär- und sterilfiltriert, in 50 ml-Volumina abgefüllt und lyophilisiert. In dem mit 50 ml destilliertem Wasser rekonstituierten Trockengut wurden folgende Aktivitäten, bezogen auL ein Standard-Human-Plasma, gefunden: F II 87 %, F VII 81 9 r F IX 83 8, F X 80 %. Beispiel 2 1. Gewinnung der Prothrombin-Faktoren durch Adsorption an DEAE-Sephadexund Elution 550 1 Citratplasma wurden mit DEAE-Sephadex Zu 50 (0,6 g/l) versetzt, das in physiologischer Nochsalz- lösung 5 mmol/l EDTA enthielt, und pH 6 äquilibriert worden war. Die Suspension wurde zur Adsorption 60 min bei 15 C gerührt. Nach Sedimentation des Adsor bens wurde der Uberstand abgehebert und das DEAE Sephadex mit den adsorbierten Faktoren mit 50 1 physiologischer Kochsalzlösung, die 5 mmol/l EDTA enthielt, solange gewaschen, bis es frei von verun- reinigenden Proteinen war. Dann wurde das Adsorbens mit 7 1 1 mol/l NaCl, pH 8, enthaltend 5 mmol/l EDTA, gerührt, das Adsorbens durch Zentrifugation abge trennt und verworfen. 2. Pasteurisierung Zu dem überstand wurden 0,2 E AT III/ml und 2 E/ml Heparin gegeben. Dann wurden 1 050 g festes Glycin zugesetzt und, nachdem sich dieses gelöst hatte, 25,7 g CaCl2 . 2H2O entsprechend einer Endkonzentration von 25 mmol/l. Nach Erreichen eines konstanten pH Wertes von 7,2 wurde die Lösung auf 30 bis 375C er hitzt und 10,5 kg Saccharose zugesetzt (Endkonzentra tion etwa 60 g/100 g Lösung). Nachdem der pH-Wert dieser hochviskosen Lösung noch einmal auf 7,2 einge stellt worden war, wurde die Lösung im Wasserbad 10 Stunden auf 60 C erhitzt. 3. Abtrennung unerwtinschter Proteine durch Fällung mit Anmoniumsulfat Die pasteurisierte Lösung, etwa 14 1, wurde auf Raum temperatur abgekühlt und zu 31,5 1 destilliertem Wasser gegeben, die 334 g CaCl2 . 2H2O, entsprechend einer Endkonzentration von 50 mmol/l, enthielten. In diese Lösung der Prothrombin-Faktoren wurden bei pH 7,5 24,5 1 gesättigte Anmeniumsulfatlösung einge bracht, die Fällung abzentrifugiert und verworfen. 4. Hochreiniguny der Prothrombinfaktoren durch Adsorp tion an Calciumphosphat Der überstand, die Prothrombinfaktoren enthaltend, wurde mit 700 g festem Ca3(PO)2 bei pH 7,6 versetzt und 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Calciumphosphat wurde durch Zentrifugation ge wonnen und dreimal mit 20 1 einer Lösung von 0,5 mol/l NaCl und 1 g/100 ml Glycin, pH 7,6 gewaschen. Die Elution der Prothrombinfaktoren vom Adsorbens er folgte mit 750 ml eines Puffers, der 0,2 mol/l. Tri natriumcitrat, 0,15 mol/l NaCl, 1 g/100 ml Glycin, 0,6 E/ml AT III und 28 E/ml Heparin enthielt (pH etwa 7,5), und Rühren (20 Minuten) bei Raumtemperatur. Das Eluat wurde durch Zentrifugation bei 3 000 g von gro ben Partikeln befreit. 5. Konfektionierung Der Uberstand wurde mit 0,15 g/100 ml Aerosil ver setzt und durch Ultrazentrifugation bei 30 000 g von Feststoffen befreit. Zum klaren überstand wurden etwa 0,6 g Humanalbumin auf 100 ml Flüssi nkeit gegeben, auf pH 6,8 eingestellt und 3 Stunden gegen 50 1 phy siologische Kochsalzlösung dialysiert. Die Lösung auf etwa 60 E F IX, 60 E F II, 50 E F X und 25 E F VII eingestellt, sterilfiltriert, in 5 ml-Volumen abge- füllt und lyophilisiert.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung einer praktisch virusfreien und hepatitissicheren Präparation der Blutgerinnungs- faktoren II, VII, IX und X durch Erwärmen eine diese Faktoren enthaltende wässrige Flüssigkeit, gegebenen falls in Gegenwart einer Aminosäure und/oder eines Saccharids oder Zuckeralkohols, dadurch gekennzeich net, dass in Gegenwart von Calciumionen und einem Chelat-Bildner und gegebenenfalls von Antithrombin III und/oder Heparin erwärmt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Calciumionen 1 - 50 inmol/1, vorzugsweise 25 - 50 mmol/l, ist. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelat-Bildner eine aliphatische Aza-tri-oder -tetra-Carbonsäure mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Stickstoffatomen oder ihr lösliches Alkali- salz ist. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration das Chelat-Bildners 1 bis 20, vorzugsweise 5 iQ.ol/l ist. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnctr dass in Gegenwart von 0,2 - 2 E/ml Antithrombin III, 2 - 20 USP-E/ml Heparin, 25 - 50 mmol/l Calciumionen, 1 - 20 mmol/l EDTA, 1 - 3 tnol/l mindestens einer der Aminosäuren Glycin, alpha-oder beta-Alanin, Lysin, Leucin, Valin, Asparagin, Serin, Hydroxyprolin, Pro lin, Glutamin, alpha-, beta-oder gamma-Aminobutter- säure, vorzugsweise Glycin, und 20 bis 60 g/100 g Lösung eines Mono-cder Oligosaccharids oder Zucker alkohols, vorzugsweise 1 bis 3 mol/l Glycin und 20 bis 60 g/100 g Lösung Saccharose, auf eine Temperatur zwischen 30 C und 100 C, vorzugsweise 60 C bis 100 C, 1 Minute bis 48 Stunden, vorzugsweise 8 - 12 Stunden, erwärmt wir. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige @lüssigkeit Citratplasma oder eine Plasma- oder Placenta-Fraktion ist. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige rlüssigkeit ein Konzentrat der Fak- toren II, VII, IX und X ist.

Inventors: HEIMBURGER, NORBERT, PROF. DR., KUMPE, GERHARDT, PREIS, HANS MARTIN, WORMSBACHER, WILFRIED, Wormsbächer, Wilfried
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1984
Main classification: A61L2
IPC codes: A61L2