AGENT FOR THE TREATMENT OF OSTEOPOROSE

Abstract: 1. Claims for the Contracting States : BE, CH, LI, DE, FR, GB, IT, NL, SE A (1-38) parathyroid hormone fragment for the application as a therapeutically active ingredient. 1. Claims for the Contracting State : AT A process for the production of a human (1-38) parathyroid hormone fragment, characterized by synthesizing the peptide sequence 1-38 of said human parathyroid hormone in a stepwise manner on a chloromethylated resin, subsequently cleaving it from the carrier resin and from the concomitant protective groups by means of anhydrous HF in the presence of anisole, and purifying it by extraction and chromatography.

Description: Gegenstand der vorliegenden Erfinduna ist ein Mittel zur Behandluna der Osteoporose. Die Osteoporose ist die am häufigsten vorkommende Erkrankung des Skeletts und des Halteapparates des Menschen. Die Osteoporose ist keine einheitliche Erkrankung, sondern eine monoforme Reaktion des Skeletts auf eine Vielzahl von möglichen Ursachen. Sie resultiert aus einem Missverhältnis des Knochenumbaus, bei dem entweder der Knochenanbau vermindert ist bei konstantem Knochenabbau, der Knochenanbau gleichbleibend ist bei vermehrtem Knochenabbau oder der Knochenanbau weniger gesteigert ist als der Knochenabbau. Die häufigste Form der Osteoporose äussert sich darin, dass die den Knochenumbau betreffenden Prozesse darniederliegen, die sog. "low-turnover-Osteoporose". Die Entstehung und Verhinderung dieser Form ist unter den Experten besonders strittig, da ihr wahrscheinlich primäre Störungen zugrunde liegen, die schon über Jahre unbemerkt wirksam gewesen sind. Grundeinheit des Knochenstoffwechsels ist die BMU (basic multicellular unit)nach Frost - Treatment of osteoporosis by manipulation of coherent bone cell populations Clin. Orthop. and Relat. Res. 143 (1979), S. 227 . Normalerweise erfolgt dort eine geordnete celluläre Tätigkeit von Osteoblasten und Osteoklasten, wahrscheinlich in direkter Informationskopplung zu den tiefer liegenden Osteozyten. Diese Zellen sind in einem gekoppelten Stoffwechsel beider Zellpopulationen zum Knochen anbau und Knochenabbau verbunden. Durch das externe Milieu in der BMU wird deren Stoffwechsel sowie deren Regeneration geregelt. Wesentlicher Regulator des BMU ist das Parathormon; vergl. Parsons, Handbuch der Inneren Medizin, Band 4, Klinische Osteologie, Springer Verlag, Berlin, 1980, S. 135. Dosisabhängig kommt es hierbei zu einer prädominanten Stimulation von Osteoblasten und/oder gekoppelt Osteoklasten. Es ist noch nicht geklärt, ob Parathormon dabei über eine zunächst osteodestruktiv noch nicht wirksame Stimulation der Osteoklasten, die Osteoblasten stimulieren kann oder direkt an den Osteoblasten wirken kann. Die Bedeutung der anderen am Knochenstoffwechsel beteiligten Hormone ist zwar anerkannt, die re gulatorische Interaktion dieser Hormone mit den Zellen unter den physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist aber noch nicht erfasst. Alle bisherigen Versuche, einen darniederliegenden Knochenstoffwechsel, unabhängig von der Drimä- ren Ursache hierfür, wieder in Gang zu setzen, sind bisher entmutigend verlaufen. Es ist bereits versucht worden, mit synthetischen humanen (1-34) Parathormon-Fragment den BMU zu stimulieren. Es wurden hierbei täglich subcutane Injektionen von 450 - 750 Einheiten (1-34) Parathormon-Fragment kontinuierlich appliziert, und zwar über eine Dauer von 6 bis 24 Monaten. Dabei wurden aber nicht nur der Knochenanbau, sondern auch der Knochenabbau in unvorhersehbarer Weise stimuliert, wobei das Ungleichgewicht bei den einzelnen Patienten nicht vorhergesagt werden konnte. Ausser dem (1-34) Parathormon-Fragment sind auch kürzere sowie modifizierte Parathormonanaloge sowie längere Parathormonpeptide biologisch wirksam. Die Hauptproblematik besteht darin, den für den jeweiligen Zweck geeigneten Bioassay zu finden, da in vivo- und in vitro Studien Speziesunterschiede und unterschiedliche Target-Antworten nicht berücksichtigen. Die Literatur ist daher voll von verwirrenden und abweichenden Resultaten über die biologische Aktivität unterschiedlicher Parat hormonpeptide; verb. Rosenblatt, Parathyroid hormone, Chemistry and structure-activity relations, Pathobio loy Annual 11 (1981), S. 53. Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein Mittel zur Behandlunq der Osteoporose zu entwickeln, welches in kontrollierbarer und vorhersehbarer Weise den Knochenaufbau stimuliert und den Knochenabbau resultiert. Diese Aufaabe kann überraschenderweise gelöst werden durch synthetiscbes humanes (1-38) Parat hormon-Fraqment. Dieses wird vorzugsweise injiziert, und zwar vorzugsweise subcutan. Das synthetische humane (1-38) Parathormon-Fragment wird in Mengen von 300 bis 600 Einheiten pro Taq appliziert. Zur Unterstützung der Therapie ist es möglich, phasen verschoben das den Knochenbau regulierende EHDP ( Ethulenhydroxiddinhos.Dhonat) einzusetzen. Es empfiehlt sich, nach zwei Wochen Therapie mit dem synthetischen humanen (1-38) Parathormon-Fragment nach ca. 1 Woche eine dreiwöchige Behandlung mit 2-4, vorzugsweise 2,5 mg/kg EHDP folgen zu lassen. Danach sollten ca. 3 Wochen keine Behandlunger. ertol- qen und erst dann der nächste Therapie-Schub zur Anwendung kommen. Synthetisches humanes (1-38) Parathormon wurde in der japanischen Patentanmeldung 80/158566 beschrieben. In dieser Patentanmelduna wird weiterhin beschrieben, dass man dieses Parathormon Fragment dazu verwenden kann, Antikörper herzustellen, die eine immunologische Kreuzaktivität gegen Parathormon besitzen. Als Verwendung der neuen Substanz wird daher ausschliesslich angegeben, dass es zur Herstellung von Antikörpern zu diagnostischen Zwecken verwendbar ist. Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, dass das synthetische humane (1-38) Parathormon-Fragment im Gegensatz zum synthetischen humanen (1-34) Parathormon-Fragment ausgezeichnet geeignet ist, Osteoporose zu behandeln. Das erfindungsgemäss verwendete synthetische humane (1-38) Parathormon-Fragment wird in an sich bekannter Weise hergestellt, indem man in einem Peptidsyntheseautomaten schrittweise auf einem chlormethylierten Harz die Peptidsequenz 1-38 des humanenParathormons aufbaut, anschliessend mit wasserfreier HF in Gegen wart von Anisol vom Trägerharz sowie den mitgeführten Schutzgruppen abspaltet und durch Extraktion und Chromatographie reinigt. Die Koppelung der Peptidbausteine wird vorzugsweise mit folgenden Reagenzien und Reaktionsschritten durchgeführt: 1. CH2Cl2 waschen (2 mal) 2. MeOH waschen (2 mal) 3. CH2C12 waschen (3 mal) 4. 50 % TFA + 5 % 1,2 Ethandithiol in CH2C12 5. CH2C12 waschen (2 mal) 6. MeOH waschen (1 mal) 7. Et3N 10 % in CH2C12 + 5 % DMF 8. MeOH waschen (1 mal) 9. Et3N 10 % in CH2C12 + 5 % DMF 10. MeOH waschen (1 mal) 11. CH2C12 waschen (2 mal) 12. Benzyloxycarbonyl-Aminosäure (2 = mmol) in 40 ml CH2C12 + DCCI (20 mmol) (1 mal). Zur Ankopplung des jeweils nächsten Peptidbausteins wird diese Reaktionsfolge wiederholt. Bei dem Verfahren werden die t-Ami- nogruppen von Lysine mit der 2-Chlorobenzyloxycarbonyl- gruppe, von Asparagin und Glutamin mit der Xanthyl gruppe schützt. Die Guanidingruppe von Arginin und und die Imidazolgrune von Histidin wird mit der Tosylgrupoe geschützt, und die ss-Carboxylgruppe von Aspartinsäure, die t-Carboxylgrupoe von Glutaminsäure sowie die Hvdroxylgruppe von Serin wird mit der Benzylgruppe geschützt. Die Extraktion erfolgt durch wässrige Essigsäure, dann Filtrieren über Sephadex G-25 mit 1 molarer Essigsäure, Lyophilisieren und Chromatographieren mit Ammoniumacetat-Acetonitril als Elutionssmittel unter Hochdruck. Das reine Material wird über Sephadex G-10 mit 1 molarer Essiqsäure entsalzt, das so erhaltene Produkt durch Dünnschicht-Chromatographie in verschiedenen Puffersystemen untersucht und als homogen befunden. Die Aminosäurenanalyse und Sequenz Analyse zeit das richtige Aminosäureverhältnis. Durch Umkehrphasen HPLC wird gefunden, dass das so erhaltene Produkt zu 98 % rein ist. Das so erhaltene Produkt wird steril in Ampullen gefüllt und auf Pyrogenität getestet. Die Stabilität und biologische Aktivität werden in einem Bioassay an humanen Nierenmembranen gemessen gegen den humanen MRC Standard (London) 79/500 und gegen die bovinen Standard des MRC (London) 67/342, und zwar in gleicher Weise 6000 bis 7000 E/mg bei zwei Auflösungen. Das Material ist am Knochenzell-Assay ebenso wirksam wie das (1-34) Parathormon-Fragment. Bezüglich der Osteoklasten-Stimulation ist das Material äqui potenz mit (1-84) extraktivem bovinem Parathormon. Während, unter und nach der Therapie sollen alle Parameter des tarathormonabhängigen Calciumstoffwechsels des Knochens, des Darmes und der Niere inklusive der 1.25- (OH) 2-Vitamin D-Synthese sorgfältig überwacht werden, um festzustellen, ob die Therapie bei dem jeweiligen Patienten anschlägt und zu keinen Entgleisungen des Stoffwechsels führt.

Claims: Patentansprüche 1. Mittel zur Behandlung der Osteoporose enthaltend synthetisches humanes (1-38) Parathormon-Fragment in injizierbarer Form. 2. Mittel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Ethylenhydroxiddiphosphonat enthält. 3. Verwendung von synthetischen humanen (1-38) Parat hormon-Fragment zur Behandlung von Osteoporose. 4. Verwendung von synthetischen humanen (1-38) Parat hormon-Fragment gemäss Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, dass man es einsetzt zusammen mit EHDP (Ethylenhydroxiddiphosphonat).

Inventors: HESCH, ROLF DIETER, PROF. DR.
Applicants: HESCH, ROLF DIETER, PROF. DR.
Application year: 1983
Main classification: A61K37
IPC codes: A61K38, C07K14