PROCESS FOR THE PREPARATION OF OBLIGATE METHYLOTROPHIC, FOREIGN DNA EXPRESSING BACTERIA, AND APPROPRIATE PLASMIDS AND HOST ORGANISMS THEREFOR

Abstract: 1. Claims for the Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE A hybrid plasmid with a plasmid replicon inherent to an obligate methylotrophic bacterium. 1. Claims for the Contracting State AT A process for the preparation of obligate methylotrophic bacteria, which express contained foreign DNA, which comprises a) isolating a plasmid from an obligate methylotrophic bacterium, b) preparing from this and from a plasmid with selection markers a hybrid plasmid with a replicon inherent to the obligate methylotrophic bacterium, c) introducing this hybrid plasmid by transformation into a host organism and amplifying it there, d) after selection, treating the clones with a suitable conjugative plasmid and abolishing the mobilizability defect, e) conjugating the clones thus obtained with, preferably plasmid-free, obligate methylotrophic bacteria as recipient and f) selecting the desired clones.

Description: Verfahren zur Herstellung von.obligat methylotrophen, Fremd-DNA exprimierenden Bakterien und dafür geeignete Plasmide und Wirtsorqanisrnen ¯¯¯¯¯ Die Erfindung betrifft die genetische Manipulation von methylotrophen Mikroorganismen, insbesondere Verfahren zur Herstellung von obligat methylotrophen Bakterien, die enthaltene Fremd-DNA exprimieren, Plasmide zur Einführung der Fremd-DNA und Wirtsorganismen. Eines der erfindungsgemassen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein aus einem obligat methylotrophen Bakterium stammen des Plasmid isoliert, b) hieraus und aus einem Plasmid mit Selektionsmarkern ein Hybridplasmid mit einem dem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon herstellt, c) dieses Hybridplasmid durch Transformation in einen Wirtsorganismus einbringt und dort amplifiziert, d) nach Selektion die Klone mit einem geeigneten konju gativen Plasmid behandelt und den Mobilisierbarkeits defekt des Hybridplasmids behebt, e) die so erhaltenen Klone mit obligat methylotrophen Bakterien als Rezipient konjugiert und f) die gewünschten Klone selektioniert. Das im Verfahrensschritt a) eingesetzte Plasmid wird vorzugsweise aus einem Bakterium der Gattung Methylomonas, insbesondere der Art Methylomonas clara isoliert. Besonders bevorzugt ist das Plasmid pBE 3 aus dem Methylomonas clara-Stamm, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2397 hinterlegt ist, sowie entsprechende Plasmide mit demselben Replicon. Das im Verfahrensschritt b) eingesetzte Plasmid mit Selektionsmarkern kann das Plasmid pBR 322 sein, das in Gene 2 (1977) 95 - 113 beschrieben ist. Die so erhaltenen Hybridplasmide werden im folgenden als pRMX bezeichnet. Als Plasmid mit Selektionsmarkern, das im Verfahrensschritt b) eingesetzt werden kann, eignet sich auch ein Hybridplasmid, das die genetische Information für die Expression von Insulin enthält, wie es in der europäischen Patentanmeldung 0 032 675 beschrieben ist. Das nach Verfahrensschritt b) erhaltene Hybridplasmid wird dann durch Transformation in einen geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft Escherichia coli, eingebracht und dort amplifiziert. Im Verfahrensschritt d) wird in diesen Wirtsorganismus, der das Hybridplasmid enthält, ein geeignetes konjugatives Plasmid, vorteilhaft RP 4, eingebracht. Zusätzlich wird durch Einführen geeigneter Plasmide wie Col K und Col V der Mobilisierbarkeitsdefekt komplementiert. Der so vorbereitete Wirtsorganismus kann dann im Verfahrensschritt e) das im Verfahrensschritt c) eingebrachte Hybridplasmid durch Konjugation auf ein vorzugsweise plasmidfreies obligat methylotrophes Bakterium als Rezipient übertragen. Als Rezipient bevorzugt sind Bakterien der Gattung Methylomonas, insbesondere von der Art Methylomonas clara, vor allem vom Stamm ATCC 31 226. Dieser Stamm ist beispielsweise in der Deutschen Patentschrift 26 33 451 und in der US-Patentschrift 4 166 004 beschrieben. Abschliessend werden im Verfahrensschritt f) die gewünschten Klone durch Anzucht in einem Medium, das Methanol als Kohlenstoffquelle enthält, sowie auf Grund der übertragenen Resistenz bzw. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika selektioniert. Die so erhaltenen obligat methylotrophen Bakterien sind in der Lage, die enthaltene Fremd-DNA zu exprimieren, also beispielsweise Insulin zu produzieren. Einzelheiten dieser Verfahrensschritte werden im Rahmen der Beispiele näher ausgeführt. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Variante des vorstehend genannten Verfahrens, bei dem die Verfahrensschritte d) und e) wie folgt vereinfacht werden: Im Schritt d) wird nach Selektion das Hybridplasmid isoliert und im Schritt e) das isolierte Plasmid durch Transformation im Sphäroplasten des obligat methylotrophen Bakteriums eingebracht. Die Erfindung betrifft somit auch Sphäroplasten aus methylotrophen Bakterien, vor allem aus obligat methylotrophen Bakterien, insbesondere aus Bakterien der Gattung Methylomonas, vorzugsweise der Art Methylomonas clara. Besonders bevorzugt ist der Stamm Methylomonas clara ATCC 31226. Die erfindungsgemässen Sphäroplasten kann man dadurch herstellen, dass man die Bakterien in einem glycinreichen Medium, das einen osmotischen Stabilisator enthält, züchtet. Vorzugsweise ist dieses Medium schwach hypotonisch. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen dieses Herstellungsverfahrens werden im folgenden näher erläutert. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der neuen Sphäroplasten zum Einbringen von externer DNA in diese Bakterien. Diese externe DNA wird in erster Linie in Form eines Plasmids eingebracht. Als Plasmide kommen die obengenannten Hybridplasmide in Betracht. Zur Bildung der Sphäroplasten werden die methylotrophen Bakterien in einem geeigneten Medium, vorteilhaft in einem Minimalmedium, bis zu einer geeigneten Zelldichte angezüchtet. Geeignete Zelldichten liegen in einem Bereich der OD 600 von vorzugsweise 0,5 bis 1,8, insbesondere 0,9 bis 1,11. Ein definiertes Volumen dieser Kulturen wird dann in die etwa 5-fache Menge des genannten Mediums eingebracht, das ausserdem reich an Glycin ist und einen osmotischen Stabilsator enthält. Der Gehalt an Glycin kann bis zur Sättigungskonzentration gehen, bevorzugt ist ein Gehalt von 2 bis 4 Gew.-k. Als osmotische Stabilisatoren kommen Zucker wie Saccharose, Zuckeralkohole wie Sorbit und Polyglykole wie Polyethylenglykol 6000 in Betracht. Das Medium ist vorzugsweise schwach hypotonisch, was durch geeignete Konzentrationen an osmotischem Stabilisator eingestellt wird. Geeignet ist beispielsweise eine Saccharosekonzentration von 10 Gew.-% oder einmolares Sorbit. In diesem Medium werden die Bakterien solange geschüttelt, bis unter dem Phasen-Kontrastmikroskop im wesentlichen keine täbchenförmigen methylotrophen Bakterien erkennbar sind. Im allgemeinen können nach etwa einer Stunde Schütteln (100 bis 180 Upm) bei etwa 370C die Bildung der Sphäroplasten als unbewegliche, kugelige Strukturen beobachtet werden. Dieser Prozess ist im allgemeinen nach etwa 4 Stunden abgeschlossen. Die gebildeten Sphäroplasten werden vorsichtig abzentrifugiert, beispielsweise bei 40" 10 Minuten bei 2600 g, und in geeigneten Medien resuspendiert. Zur.Stabilisierung der Sphäroplasten enthält dieses Resuspendierungsmedium ebenfalls einen osmotischen Stabilisator in geeigneter Konzentration, beispielsweise 15 Gew.-% Polyethylenglykol vom Molgewicht 6000. Diese Suspension wird in einem ungefähren Volumenverhältnis von 5 : 1 mit einer Mischung versetzt, die zu gleichen Teilen aus dem zur Resuspension der Sphäroplasten benutzten Medium und dem Träger der einzubringenden DNA in einem geeigneten Puffer besteht. Als DNA-Träger kommt - wie vorstehend ausgeführt - in erster Linie ein Hybridplasmid in Betracht. Ein geeigneter Puffer hierfür besteht aus einer wässrigen Lösung, die pro Liter 10 mmol TRIS (Tris (hydroxymethyl)-aminomethan) und 1 mmol Natrium-Ethylendiamin tetraacetat (TE-Puffer, pH 8,0) enthält. Zu dieser Mischung wird ein osmotischer Stabilisator gegeben (beispielsweise das dreifache Volumen der Sphäroplasten-Suspension an 4 Gew.-iger Polyethylenglykol 6000-Lösung) und vorsichtig durchmischt. Nach kurzem Stehen bei Raumtemperatur wird etwa das 10-fache Volumen der Sphäroplasten-Suspension an Resuspensionsmedium zugegeben und die Mischung vorsichtig zentrifugiert (3600 g). Der Niederschlag wird dann in dem doppelten Volumen der Sphäroplasten-Suspension an Resuspensionsmedium aufgenommen und zur Uberprüfung, ob die Transformation stattgefunden hat, auf Agarplatten ausgestrichen. Diese Agarplatten entsprechen in ihrer Zusammensetzung dem Resuspensionsmedium und enthalten neben 1,5 Gew.-% Bacto-Agar noch ein zur Selektion geeignetes Antibiotikum, beispielsweise 50 /ug/ml Ampicillin oder 10 ug/ml Tetracyclin, falls die eingesetzten Hybridplasmide die entsprechenden Resistenzgene enthielten. Die Platten werden dann bei 370C für 1 bis 3 Tage bebrütet und resistente Kolonien nach Anzucht in dem genannten Flüssigmedium, das ein geeignetes Antibiotikum enthält, auf das Vorhandensein von Plasmid-DNA untersucht (Humphreys et al., BAA 383 (1975) 457-463). Hierbei können die zur Transformation eingesetzten Plasmide aus den methylotrophen Bakterien isoliert werden. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Plasmide aus dem Methylomonas clara-Stamm DSM 2397 sowie die Hybridplasmide mit einem einem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon, also Plasmide, die in den Bakterien der Gattung Methylomonas, vorzugsweise der Art Methylomonas clara, insbesondere dem Stamm.kTCC 31226 repliziert werden, in denen prokaryotische oder eukaryotische DNA integriert ist, insbesondere diejenige für die Expression von Insulin. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Wirtsorganismen, die die genannten Plasmide enthalten, sowie die Wirtsorganismen, die zusätzlich das konjugative Plasmid und weiterhin solche, die zusätzlich Plasmide zur Aufhebung des Mobilisi erungsdefekts enthalten. Bevorzugte Wirtsorganismen enthalten als konjugatives Plasmid RP 4 und als Plasmide zur Aufhebung des Mobilisierungsdefekts Col K oder Col V. Der Vorteil der Erfindung liegt darin, dass von einem Replicon eines Plasmids aus einem obligat methylotrophen Bakterium, also mit sehr engem Wirtsbereich, Gebrauch gemacht wird. Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich somit durch hohe Sicherheit aus, so dass es auf rekombinante DNA, die risikoreiche Informationen enthält, anwendbar ist. In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist. In den Beispielen wurden die folgenden Abkürzungen verwendet: ATP = Adenosintriphosphat EDTA = Ethylendiamin-tetraessigsäure bzw. -acetat (Na) OD600 = Optische Dichte (optical density) bei 600 nm TE-Puffer = wässrige Lösung, enthaltend pro Liter 10 m Mol Tris-HCl, auf pH 8 eingestellt, und 1 m Mol EDTA, ebenfalls auf pH 8.0 eingestellt Tris (-HCl) = Tris-hydroxymethyl-aminomethan (-Hydrochlorid) Beispj ele 1. Plasmid-Isolierung aus 14. clara DSM 2397 Die Plasmid-Isolierung erfolgte im wesentlichen nach der Methode von Humphreys et al. (BBA 383 (1975) 457 - 063). Hierzu wurden die Bakterien aus 1 1 Kulturmedium bei einer OD600 von etwa 1,0 abzentrifugiert und der Bakteriennieder- schlag in 5 ml Sucroselösung (25 % Sucrose in 50 mMol/l Tris-HCl Lösung vom pH 8,0) resuspendiert. Unter Eiskühlung wurden 1 ml Lysozymlösung (5 mg/inl Lysozym in 250 mMol/l Tris-HCl Lösung, pH 8,0) sowie 2 ml 0,2 molare EDTA-Lösung vom pH 8,0 zugegeben. Unter gelegentlichem Umschwenken wurde die Mischung 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Dann wurde die Lysis durch Zugabe von 8 ml einer Mischung, bestehend aus 50 mMol/l Tris-HCl, 75,5 mMol/l EDTA und 0,2 % eines nichtionischen Tensids ((R)Triton X-100) voin pH 8,0, herbeigeführt. Die hochviskose Mischung wurde 30 Minuten bei 48 000 g zentrifugiert, wobei als Uberstand ein klares Lysat erhalten wurde. Pro 10 ml Uberstand wurden 1,1 ml 5-molare Kochsalzlösung sowie 1,1 g Polyethylenglycol vom mittleren Molgewicht 6 000 zugegeben. Die Mischung wurde bei 4 C über Nacht inkubiert. Der flockige Niederschlag wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 1 500 g gesammelt und in 3,5 ml Pufferlösung (50 mMol/l Tris-HOl, 5 mMol/l EDTA, 50 mMol/l NaCl, pH 8,0) gelöst und das Volumen der Lösung gemessen. Nach Zugabe von 1 g CsClEpro ml Lösung sowie von 1/15 ml einer 1 %igen wässrigen Ethidiumbromid-Lösung wurde 10 Minuten bei 16 000 g zentrifugiert. Der Uberstand dieser Zentrifugation wurde ins Gleichgewicht zentrifugiert (20 Stunden bei 117 000 Umdrehungen pro Minute, 18 C, im Vertikalrotor) und wies auch ohne Bestrahlung mit UV-Licht zwei deutlich sichtbare, etwa einen Zentimeter auseinanderliegende Banden auf. Durch Einstrahlen von UV-Licht der Wellenlänge 366 nm wurden die fluoreszierenden Banden hervorgehoben und die untere Plasmid-Bande durch seitliches Anstechen des Gradienten mit einer Nadel und anschliessendcs Aufziehen der Bande in einer Spritze geerntet. Das Ethidiumbromid wurde durch wiederholtes Ausschütteln mit an.CsCl gesättigtem Isopiopanol entfernt. Nach 3maliger Dialyse gegen 2 1 TE-Puffer für jeweils mindestens 2 Stunden wurde die Plasmid-DNA in einer Reinheit erhalten, die den Einsatz in den folgenden Verfahrensschritten erlaubte. Zeigten sich in der DNA-Lösung noch Verunreinigungen, so wurde diese zweimal mit gleichen Volumina an mit 0,1 molarer Tris-HCl Lösung vom pH 8,0 gesättigtem Phenol und dann 3mal mit absolutem Ether extrahiert. Der überschüssige Ether wurde abgeblasen, die Lösung mit 1/9 des Volumens an dreimolarer Natriumacetatlösung versetzt und die DNA durch Zugabe des gleichen Volumens an Isopropanol gefällt. Nach Stehen über Nacht wurde die Mischung 30 Minuten lang bei 12 000 g zentrifugiert und der DNA-Niederschlag mit 90 %igem Ethanol gewaschen. Danach wurde die DNA lyophilisiert und mit TE-Puffer aufgenommen. 2. DNA-Isolierung aus Agarose Im folgenden Verfahren fand die von Langridge et al. (Analytical iochemistry 103 (1980) 264 - 271) beschriebene Methode Anwendung. Die DNA wurde auf ein horizontales 0,5 kiges Agarose-Gel aufgetragen (niedrig schmelzende Agarose, Typ VII, No. A-4018, Sigma). Nach der Elektrophorese wurden die Banden durch Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht und aus dem Gel ausgeschnitten. Das die DNA enthaltende Agarosescheibchen wurde bei 700C in einem Glasröhrchen geschmolzen, das Volumen gemessen und auf 37 C abgekühlt. Hierzu wurden gleiche Volumenmengen der nachstehend beschriebenen Butanolund Wasserphasen zugegeben. 150 ml n-Butanol wurden mit 150 ml Wasser im Scheidetrichter geschüttelt und nach Trennung der Phasen in 100 ml der wassergesättigten Butanolphase 1 g Hexadecyl-trimethylammoniumbromid gelöst. Diese Lösung wurde mit 100 ml der Wasserphase ausgeschüttelt, wobei ein Entschäumer zugegeben werden kann (50 ul Antifoam A, Sigma). Nach Trennung der Phasen über Nacht wurden diese getrennt aufgefangen. Die nach Zugabe dieser Butanol- und Wasserphasen erhaltene Mischung wurde durch vorsichtiges Drehen des Röhrchens gründlich durchmischt und die Trennung der Phasen bei 370C abgewartet. Die obere, die DNA enthaltende Butanolphase wurde abgetrennt und die verbleibende wässrige Phase noch zweimal in der beschriebenen Weise mit Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolphasen wurden mit 1/4 des Volumens an 0,2 molarer NaCl-Lösung versetzt und wieder gründlich .t durchgemischt. Nach Abtrennung der wässrigen Phase erfolgte eine erneute Salzextraktion und die vereinigten wässrigen Phasen wurden tropfenweise mit dem gleichen Volumen an Chloroform versetzt (das über eine Aluminiumoxidsäule gereinigt worden war). Nach halbstündigem Stehen auf Eis wurde die untere Chloroformphase verworfen und verbliebenes Chloroform mit Luft ausgeblasen. Die DNA wurde mit Isopropanol gefällt und nach Abtrennung in TE-Puffer resuspendiert. 3. Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel Zur Sichtbarmachung und Charakterisierung von DNA-Fragmenten unter 0,3 MD fanden 8 - 15 %ige Polyacrylamid-(PAA)-Gele Anwendung. Die Gele waren 1 mm dick, 30 cm lang und 14 cm breit. Als Puffer diente eine Mischung, die pro Liter 89 mMol Borsäure, 89 mMol Tris-HCl und 2,5 mMol EDTA enthielt und den pH 8,2 aufwies. Zur Herstellung eines 8 frigen PAA-Gels wurden 33 ml einer 24 zeigen PAA-Stocklösung (23,22 g Acrylamid und 0,78 g N,N'-Methylenbisacrylamid in 100 g wässriger Lösung), 10 ml des genannten Elektrophoresepuffers, der jedoch alle Komponenten in 10-facher Konzentration enthielt, 6,25 ml einer 6,4 frigen 3-Ethylamino-propionitril-Lösung und 50,75 ml Wasser zusammengegeben. Die Mischung wurde an der Wasserstrahlpumpe entgast und die Polymerisation mit festem Ammoniumperoxodisulfat gestartet. Sofort anschliessend wurde das Gel gegossen und bis zum Beginn der Elektrophorese mindestens 2 Stunden gewartet. Vor dem Auftragen der Proben wurde an das Gel zur Entfernung von restlichem Ammoniumperoxodisulfat etwa eine Stunde lang eine Spannung von 100 V angelegt. Die Elektrophoresen wurden bei 100 V und einem Stromfluss von 12 mA durchgeführt. 4. Charakterisierung des Plasmids pBE 3 aus dem Methylomonas clara-Stamm DSM 2397 Das Plasmid pBE 3 wurde mit den in der Tabelle 1 genannten Restriktionsendonukleasen verdaut und die entstandenen Fragmente gelelektrophoretisch aufgetrennt. Durch Doppelverdauungen und durch Charakterisierung einzelner, in pBR 322 klonierter Fragmente - wie nachstehend beschrieben wurden die in Tabelle 2 und Figur 1 niedergelegten Ergebnisse erhalten. Das Plasmid pBE 3 ist eine Deletionsmutante aus einem grösseren Plasmid. Daneben existieren noch kleinere Plasmide. Alle diese Plasmide sind im Sinne dieser Erfindung äquivalent, sofern sie das methylomonas-eigene Replicon enthalten. Tabelle 1: Übersicht der zur Charakterisierung von pBE 3 verwendeten Enzyme: Enzym Zahl der Fragmente Acc I 1 Xor II 1 Eco RI 5 Hinc II 5 Ava I 12 Bal I mind. 19 Keine Spaltung mit Bam HI Dgl II Bst EII Eco RV Hind III Hpa I Kpn I Nru I Pst I Pvu II Sal I Sma I Sph I Sst I Sst II Stu I Xba I Xho I Xmn I Tabelle 2: Grösse der Fragmente (in MD), die durch Spaltung von pBE 3 mit Restriktionsnucleasen erhalten wurden: EcoR I: Hinc II: Ava I: F1 : 4,14 H1 : 6,8 Al : 210 F2 : 3,09 H2 : 1,42 A2 : 1,72 F3 : 1,27 H3 : 0,87 A3 : 1,26 F4 : 0,91 H4 : 0,31 A4a : 1,03 F5 : 0,63 H5 : 0,28 A4 : 1,03 A5 : 0,85 A6 : 0,66 A7 : 0,55 A8 : 0,50 A9 : 0,13 A10: 0,08 All: 0,07 EcoR I + EcoR I + Ava I : Hinc II: D1 : 1,35 El : 2,29 D2 : 1,22 E2 : 1,83 D3a: 1,03 E3 : 1,112 D3 : 1,03 E4 : 1,27 D4 : 0,85 E5 : 0,91 D5 : 0,70 E6 : 0,63 D6 : 0,63 E7 : 0,46 D7 : 0,55 E8 : 0,40 D8 : 0,54 E9 : 0,31 D9 : 0,53 E10: 0,28 D10: 0,50 D11 : 0,40 D12: 0,111 D13: 0,12 D14 : < 0,1 D15 : < 0,1 D16: < 0,1 5. Restriktionsverdauungen Einzelverdauungen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 bis 100ul mit den von den Herstellern empfohlenen Puffern durchgeführt. Um eine vollständige Verdauung der DNA zu gewährleisten, wurden die Proben über Nacht inkubiert. Bei Doppel- und Mehrfachverdauungen wurden die entsprechenden Enzyme meist gleichzeitig zur DNA zugesetzt. Der Puffer bestand in diesen Fällen aus einer Lösung, die pro Liter 50 mMol Kochsalz, 5 mMol Tris-HCl (auf pH 7,5 eingestellt), 6 mMol Magnesiumchlorid, 6 mMol 2-Mercaptoethanol und 100 mg Rinderserumalbumin enthielt. Kontrollversuche zeigten, dass die Enzyme in diesem Puffer die gleichen Ergebnisse liefern wie in den von den Herstellern empfohlenen. Ausnahmen bildeten Enzyme, die einen überdurchschnittlich hohen Salzbedarf haben. In diesen Fällen wurde zunächst bei geringer Salzkonzentration mit dem einen Enzym verdaut und erst nach Erhöhung der Salzkonzentration das zweite Enzym zugegeben. 6. Partielle Verdauungen mit Eco R I 2 g Plasmid-DNA wurden mit 1 U des Restriktionsenzyms in einem Gesamtvolumen von 50 l bei 37 C inkubiert. Gleiche Ansätze wurden unterschiedlich lang inkubiert und die Reaktion zu den verschiedenen Zeiten durch zehnminütiges Erhitzen des Ansatzes auf 700C abgestoppt. Eine gelelektrophoretische Analyse des jeweiligen Bandenmusters zeigte, wie weit die Verdauung nach den definierten Zeiten fortgeschritten war. 7. Wachstumsbedingungen Alle verwendteten Escherichia coli-Stämme wurden in L-Broth (10 g Bactro Trypton, 5 g Hefe-Extrakt und 5 g Kochsalz pro 1 Liter Wasser) gezüchtet. Die Methylomonas clara-Stämme wurden in einem der beiden folgenden Minimal-Medien gezüch- tet: M 36 : 1,5 % Methanol 0,1 % H3P04 0,083 % K2S04 0,018 % Na2SO4 x 10 H20 0,036 % MgSO4 x 7 H20 0,004 % CaCO3 0,015 % Citronensäure 0,005 % (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H20 80 l/1 Spurenelementelösung V 135 L: 1,5 % Methanol 0,16 % K2S04 0,06 % MgS04 x 7 H20 0,025 % Na2S04 0,014 % CaCO3 0,01 % Fe2(SO4)3 0,2 % H3PO4 0,28 % NH3 (25 %) 0,3 % KNO 0,3 % NaHCO3 1 ml/l Spurenelementelösung Spurenelmentelösung: 0,05 g/l H3B03 0,01 g/l KJ 0,04 g/l MnSO4 x 4 H2O 0,04 g/l ZnSO4 x 7 H20 0,02 g/l (NH4)6Mo7O24 8. Konstruktion der Hybridvektoren Das Plasmid pBE 3 wurde mit dem Restriktionsenzym Eco R I partiell verdaut, so dass der Hauptteil des Plasmids nur einmal geschnitten wurde und in der linearisierten Form vorlag. pBR 322-DNA wurde mit Eco R I total verdaut und anschliessend einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase unterzogen. Die so vorbereiteten DNAs wurden zusammengegeben und mit T4-DNA-Ligase bei 14 C über Nacht inkubiert. 50 dieser ligierten Mischung dienten sodann zur Transforma tion in den durch CaCl2-Behandlung kompetent gemachten E. coli-Stamm HB 101. Die Bakterien wurden auf L-Broth-Platten mit 20 1ug/ml Tetra cyclin ausgestrichen und über Nacht bebrütet. Resistente Kolonien wurden auf frische Platten überimpft und gut ausgewachsene Klone durch single colony lysis auf das Vorhandensein von Plasmid-DNA mit höherem Molekulargewicht als pBR 322 untersucht. Klone, die eine solche Plasmid-DNA enthielten, wurden schliesslich in 100 ml L-Broth mit oder ohne Tetracyclin angezüchtet und nach Chloramphenicol Stimulierung der Bakterien die Plasmid-DNA gewonnen. Restriktionsverdauungen mit den Enzymen Eco R I und Ava I zeigten, dass das in der Figur 2 gezeigte Hybridplasmid pRM 21 und das in der Figur 3 gezeigte Hybridplasmid pRM 54 erhalten worden waren. Daneben können Hybridplasmide identifiziert werden, die Fraktionen von pBE 3 enthalten. 9. Ligase-Reaktion Ligase-Reaktionen wurden in 50 1ul Volumen bei einer Gesamt DNA-Konzentration von 20 /ug/ml ausgeführt. Der Puffer ent hielt pro Liter 30 mMol Tris-HCl (auf pH 7,5 eingestellt), 4 mMol Magnesiumchlorid, 10 mMol Dithioerythrit und 0,2 mMol ATP. Zu diesen Ansätzen wurde 1 ,ul T4-Ligase entsprechend 400 U zugegeben (1 U entspricht hier der Menge Enzym, die nötig ist, um 50 % einer Hind III-verdauten lambda-DNA in 30 Minuten bei -160C in einem Volumen von 20 ,ul zu ligieren. Die Konzentration der DNA in diesem Ansatz beträgt dabei etwa 330 /ug/ml). Das für ein bestimmtes Ligase-Experiment optimale Verhältnis der beiden DNAs zueinander wurde nach den Verfahren von Dugaiczyk et al., JMB 96 (1975) 171 errechnet. Inkubiert wurde bei 140C für mindestens 16 Stunden. 10. Konjugation Rezipient und Donor wurden über Nacht bis zu einer OD600 von 1,0 - 1,2 (Rezipient) bzw. 1,4 - 1,6 (Donor) angezüchtet und gleiche Volumina von Rezipient und Donor so zusammen gegeben, dass der Mischung eine grosse Oberfläche zur Verfügung stand. Die Mischung wurde 2 Stunden lang ohne zu Schütteln bei 37 0C inkubiert und anschliessend 200 ,ul davon auf Agarplatten ausgestrichen, deren Zusammensetzung eine Selektion gegen den Donor und für den mit einer neuen, durch das zu übertragende Plasmid vermittelten, Eigenschaft ausgestatteten Rezeptor erlaubte. Bei der Konjugation zwischen E. coli HB 101 und M. clara DSM 2397 waren dies Methanol Minimalmedium-Flatten mit Zusatz eines (durch die Art des zu übertragenden Plasmids bestimmten) Antibiotikums. In anderen Experimenten wurden Rezipient und Donor wie oben beschrieben inkubiert und 200 ul dieser Mischung auf Methanol-Minimalmedium-Platten ohne Antibiotikum ausgestrichen. Diese Platten wurden über Nacht bei 37 C bebrütet und der entstandene Bakterienrasen mit 2 ml Methanol-Minimalmedium abgeschwemmt. 200 ul dieser Suspension kamen dann wieder zum Ausstrich auf Methanol-Minimalmedium-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum. Klone zeigten sich nach 118 72stündigem Bebrüten der Platten bei 37 C. 11. Expression eukaryotischer DNA in M. clara a) Das Plasmid pBE 3 wurde nach den beschriebenen Verfahren in Derivaten von pBR 322 kloniert bzw. umkloniert, die als c-DNA-Sequenz eines eukaryotischen Gens die des Affen Insulins enthielten. Affeninsulin-c-DNA ist in die Pst I-Schnittstelle von pBR 322 derart eingebaut worden, dass diese fremde Information unter der Kontrolle des B-Lactamase-Promotors in E. coli exprimiert wurde. Dabei entstand ein Fusionsprotein, das mit Antiinsulin-Antikörpern nachgewiesen werden konnte (Europäische Patentanmeldung 0 032 675). Die Affeninsulin-c-DNA enthält zwei interne Pst I-Schnitt stellen. Die kodierende Information kann daher durch Pst I-Verdauung nicht in intakter Form aus dem Plasmid entfernt werden. Um eine Replikation dieses Plasmids in M. clara zu ermöglichen, wurde daher so vorgegangen, dass DNA-Sequenzen aus dem M. clara-Plasmid pBE 3 in dieses Insulininformation exprimierende pBR 322-Derivat eingebaut wurde. Die experimentelle Durchführung erfolgte wie vor stehend beschrieben. Hierbei konnte eine Reihe von hybriden Plasmiden erhalten werden, die sich in ihrer Struktur nur durch die in den pBR 322-Anteil eingebaute Affeninsulin-c-DNA von den zuvor beschriebenen Hybridvek toren unterscheiden. Die Anordnung des Insulingens im pBR 322-Anteil dieser Vektoren bleibt dabei unverändert in Phase, so dass auch diese Klone Insulin-antigene Determi nanten in E. coli exprimieren. Einer dieser Klone, der die gesamte pBE 3-Sequenz enthält, erhielt die Bezeich nung pInMc 68. b) Der festgestellte Mobilisierbarkeitsdefekt von pBR 322 kann durch Plasmide wie Col K und Col V komplementiert werden (Young und Poulis, Gene 4 (1978) 175 - 179). Daher wurde in die oben beschriebenen, durch Calciumchlorid-Behandlung kompetent gemachten Donorstämme mit dem konjugativen Plas mid RP 4 und den Hybridvektoren der pRM-Reihe noch zusätz lich das Plasmid Col K durch Transformation eingeführt. Als Indikatorstamm zum Nachweis des Plasmids Col K wurde der Colicin-empfindliches Stamm AB 1157 verwendet (Warren et al., MGG 170 (1979) 103 - 107). Um in Konjugationsexperi menten zwischen den E. coli-Donorstämmen HB 101 (RP 4, Col K, pRM 54) bzw. HB 101 (RP 4, Col K, pRM 21) und dem Rezipienten M. clara ATCC 31226 auf Klone zu selektio nieren, die den Hybridvektor enthielten, wurde in Gegen wart hoher Dosen Tetracyclin (50 Xug/ml) auf Methanol Minimalmedium (M 36) selektioniert. Eine Analyse zahlreicher M. clara-Klone ergab, dass in ca.- 10 % der Fälle Klone erhalten worden waren, die nur den Hybridvektor enthielten. In einem Konjugationsexperiment zwischen dem E. coli-Donorstamm HB 101 (RP 4, Col K, pInMc 68) und dem M. clara-Rezipienten ATCC 31226 konnten in gleicher Weise M. clara-Klone erhalten werden, die nur das Plasmid pInMc 68 enthielten. c) Die erhaltenen M. clara-Klone mit dem Plasmid pInMc 68 wurden in der Folge gezüchtet und über einen Radioimmun assay bzw. einen Fettzellassay auf ihren Insulingehalt überprüft. Entspechend dem in der Europäischen Patentan meldung 0 032 675 mit E. coli gemachten Beobachtungen konnten auch im Falle von M. clara ATCC 31226 Insulin werte zwischen 1 und 5 IE pro Liter gemessen werden. Somit wird also die im pBR 322-Anteil des Hybridvektors pInMc 68 enthaltene Insulininformation auch in M. clara korrekt und effizient exprimiert. 12. Der Stamm Methylomonas clara ATCC 31226 wird in dem Mini mal-Medium M 36 bis zu einer OD600 von 0,9 bis 1,4 angezüchtet. 20 ml dieser Kulturen werden in 100 ml M 36-Medium eingebracht, das ausserdem 4 % Glycin und 10 % Saccharose enthält. In diesem Medium werden die Bakterien 4 Stunden bei 370C und 100 bis 180 Upm geschüttelt. Unter dem Phasenkontrastmikroskop sind dann keine läng lichen, beweglichen Bakterien mehr zu erkennen. Die gebildeten Sphäroplasten werden bei 4OC 10 Minuten bei 2600 g abzentrifugiert und in 1 ml M 36-Medium resus pendiert, das zusätzlich 10 % Saccharose enthält. Die genannten Medien können anstelle der 10 % Saccharose auch 1 Mol pro Liter Sorbit oder 15 % Polyethylenglykol vom mittleren Molgewicht 6000 enthalten. Die Abtrennung der Sphäroplasten kann auch durch 10-minü tiges Zentrifugieren bei 4 C und 3600 g erfolgen. 13. 0,5 ml der nach Beispiel 12 erhaltenen Suspension werden mit 0,1 ml einer Mischung versetzt, die zu gleichen Teilen aus Resuspensionsmedium und TE-Puffer besteht, in dem das Plasmid pRM 21 enthalten ist. Zu dieser Mischung gibt man 1,5 ml 4 %ige Polyethylenglykol-6000-Lösung und durch mischt vorsichtig. Diese Mischung lässt man 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen, gibt 5 ml Resuspensionsmedium zu und zentrifugiert bei 3600 g. Der Niederschlag wird in 1 ml Resuspensionsmedium aufge nommen und auf Agarplatten ausgestrichen, die in ihrer Zusammensetzung dem Resuspensionsmedium entsprechen und zusätzlich 1,5 % Bakto-Agar und 50 /ug/ml Ampicillin enthalten. Die Platten werden bei 370C 3 Tage bebrütet und die Kolonien in M 36-Medium, das 50 ,ug/ml Ampicil lin enthält, gezüchtet. Aus den so erhaltenen Bakterien konnte das zur Transformation eingesetzte Plasmid pRM 21 isoliert werden. Anstelle von Ampicillin kann bei diesem Verfahren auch jeweils Tetracyclin in einer Konzentration von 10 /ug/ml eingesetzt werden. Das gleiche Ergebnis erhält man auch, wenn man anstelle des genannten Plasmids das Plasmid pRM 54 einsetzt. 111. Arbeitet man nach Beispiel 13, setzt jedoch als Plasmid pINMc 68 ein, und selektioniert mit 10 /ug/ml Tetracyclin, so erhält man Methylomonas clara-Klone mit diesem Plasmid, die Insulin produzieren.

Claims: Patentansprüche: 1. Hybridplasmide mit einem einem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon. 2. Plasmid nach Anspruch 1, das in einem Bakterium der Gattung Methylomonas, vorzugsweise der Art Methylomonas clara, insbesondere vom Stamm ATCC 31226 repliziert wird. 3. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2 mit integrierter euka ryotischer DNA, insbesondere für die Expression von Insulin. 4. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2 mit integrierter pro karyotischer DNA. 5. Verfahren zur Herstellung von obligat methylotrophen Bakterien, die enthaltene Fremd-DNA exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus einem obligat methylotrophen Bakterium ein Plas mid isoliert, b) hieraus und aus einem Plasmid mit Selektionsmarkern ein Hybridplasmid mit einem dem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon herstellt, c) dieses Hybridplasmid durch Transformation in einen Wirtsorganismus einbringt und dort amplifiziert, d) nach Selektion die Klone mit einem geeigneten konju gativen Plasmid behandelt und den Mobilisierbarkeits defekt behebt, e) die so erhaltenen Klone mit vorzugsweise plasmidfreien obligat methylotrophen Bakterien als Rezipient konju giert und f) die gewünschten Klone selektioniert. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das obligat methylotrophe Bakterium eines der Gattung Methylomonas, vorzugsweise von der Art Methylomonas clara, insbesondere von Stamm ATCC 31 226 ist. 7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium, aus dem das Plasmid isoliert wird, vom Stamm DSM 2397 ist. 8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid mit Selektions markern pBR 322 ist und/oder die genetische Information für die Expression von Insulin enthält. 9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus Escheri chia coli ist, das konjugative Plasmid RP 4 ist und der Mobilisierbarkeitsdefekt durch Einführung des Plasmids Col K oder Col V behoben wird. 10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man anstelle der Verfahrens schritte d) und e) das als Rezipient dienende obligat methylotrophe Bakterium in die Sphäroplasten überführt und das Hybridplasmid durch Transformation einbringt. 11. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 10 genannten Sphäroplasten aus methylotrophen Bakterien, dadurch ge kennzeichnet, dass man die Bakterien in einem glycinrei chen Medium, das einen osmotischen Stabilisator enthält, gezüchtet, wobei das Medium vorzugsweise schwach hypo tonisch ist und 2 bis 4 Gew.-% Glycin enthält. 12. Plasmide aus DSM 2397. 13. Wirtsorganismus, enthaltend ein Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, sowie gegebenenfalls ein konjugatives Plasmid und gegebenenfalls ein den Mobili sierbarkeitsdefekt behebendes Plasmid. 14. Organismus nach Anspruch 13, der als konjugatives Plasmid RP 4 sowie gegebenenfalls das Plasmid Col K oder Col V enthält. 15. Sphäroplasten aus methylotrophen, vorzugsweise obligat methylotrophen Bakterien, insbesondere der Gattung Methylomonas, vor allem der Art Methylomonas clara, speziell vom Stamm Methylomonas clara ATCC 31226. Patentansprüche für Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung von obligat methylotrophen Bakterien, die enthaltene Fremd-DNA exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus einem obligat methylotrophen Bakterium ein Plas mid isoliert, b) hieraus und aus einem Plasmid mit Selektionsmarkern ein Hybridplasmid mit einem dem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon herstellt, c) dieses Hybridplasmid durch Transformation in einen Wirtsorganismus einbringt und dort amplifiziert, d) nach Selektion die Klone mit einem geeigneten konju gativen Plasmid behandelt und den Mobilisierbarkeits defekt behebt, e) die so erhaltenen Klone mit vorzugsweise plasmidfreien obligat methylotrophen Bakterien als Rezipient konju giert und f) die gewünschten Klone selektioniert. 2. Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 1 genannten Hybridplasmids, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem obligat methylotrophen Bakterium ein Plasmid isoliert und hieraus und aus einem Flasmid mit Selektionsmarkern ein Hybridplasmid mit einem dem obligat methylotrophen Bakterium eigenen Replicon herstellt. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das obligat methylotrophe Bakterium eines der Gattung Methylomonas, vorzugsweise von der Art Methylomonas clara, insbesondere von Stamm ATCC 31 226 ist. 11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium, aus dem das Plasmid isoliert wird, vom Stamm DSM 2397 ist. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1, 3 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid mit Selektionsmarkern pBR 322 ist und/oder die genetische Information für die Expression von Insulin enthält. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus Escherichia coli ist, das konjugative Plasmit RP 4 ist und der Mobilisierbarkeitsdefekt durch Einführung des Plasmids Col K oder Col V behoben wird. 7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man anstelle der Verfahrensschritte d) und e) das als Rezipient dienende obligat methylotrophe Bakterium in die Sphäroplasten überführt und das Hybridplasmid durch Transformation einbringt. 8. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 7 genannten Sphäroplasten aus methylotrophen Bakterien1 dadurch ge kennzeichnet, dass man die Bakterien in einem glycinrei chen Medium, das einen osmotischen Stabilisator enthält, züchtet, wobei das Medium vorzugsweise schwach hypo tonisch ist und 2 bis 4 Gew.-% Glycin enthält.

Inventors: ESSER, KARL, PROF. DR., MARQUARDT, RUDIGER, DR., PRAVE, PAUL, PROF, DR., STAHL, ULF, DR., WINNACKER, ERNST LUDWIG, PROF. DR., WOHNER, GERHARD, DR., Marquardt, Rüdiger, Dr., Präve, Paul, Prof, Dr., Wöhner, Gerhard, Dr.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1983
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N1, C12P21, C12N15