MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR HUMAN BLOOD GROUP ANTIGEN K (CELLANO), AND HYBRIDOMA CELL LINES PRODUCING THESE MONOCLONAL ANTIBODIES

Abstract: For The Contracting states BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, SE 1. A hybridoma cell line which produces an antibody with specificity against a blood group feature of human erythrocytes, obtained by fusion of an antibody-producing animal cell and a neoplastic cell, characterized in that it produces an antibody with specificity against the blood group feature k of human erytghrocytes. For the Contracting State AT 1. A process for the preparation of a hybridoma cell line which produces an antibody with specificity against the blood group feature k of human erythrocytes, characterized in that an antibody producing animal cell and a neoplastic cell are fused.

Description: Monoklonale Antikörper spezifisch für das humane Blutgruppenantigen k (cellano) una flybridoma-Zell- Linien, die diese monoklonalen Antikörper produziert Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper spezifisch für das menschliche Blutgruppenantigen k (cellano), d.h. Antikörper mit Spezifität gegen das Blutgruppenmerkmal k humaner Erythrozyten sowie Hybridoma-Zell Linien, die diese monoklonalen Antikörper produzieren. Antikörper werden seit langem in der medizinischen Diagnostik verwendet. Ihre Verwendbarkeit ist jedoch etwas begrenzt, da es aufgrund ihrer Komplexizität und Vielseitigkeit schwierig ist, homogene Antikörper zu erzielen. Antikörper sind komplexe Proteinmoleküle bzw. Moleküle auf Proteinbasis, die durch das Immunsystem von Menschen oder Tieren produziert werden, um den Menschen oder das Tier gegen Antigene zu schützen. Antikörper für die medizinische Verwendung werden im allgemeinen dadurch erhalten, dass man einem Tier ein Antigen injiziert, welches das Immunsystem des Tieres stimuliert und eine Antikörperfraktion aus dem peripheren Blutserum oder aus der Ascitesflüssigkeit isoliert. Die Antikörperfraktion enthält Antikörper mit Spezifi- tät gegen das injizierte Antigen sowie zahlreiche andere Antikörper, die vnn dem Tier produziert wurden. Nach bekannten Verfahren kann es möglich sein, im wesentlichen einen Antikörper zu isolieren mit Spezifität gegen das bestimmte Antigen. Jedoch selbst et wenn ein Antikörper für ein bestimmtes Antigen isoliert wird, ist dieser Antikörper meistens ein Gemisch aus verschiedenen Antikörpern, die mit unterschiedlichen antigenen Determinanten des Antigens reagieren können. Der Versuch, Zellen in vitro dazu zu bringen, in grösserer Menae und vor allem über längere Zeit hin spezifische Antikörper zu produzieren, , scheiterte daran, dass die Zellen in vitro schnell inaktiviert werden und ihre AntIk örperproduktion einstellen. In den letzten Jahren wurden Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper entwickelt, die es möglich machen, homogene hochspezifische Antikörper zu erzielen. Im allgemeinen werden solche Antikörper dadurch hergestellt, dass man ein Tier mit einem Antigen immunisiert, Antikörper produzierende Zellen von diesem Tier erhält und die Antikörper produzierenden Zellen mit Tumor Zell-Linien, z.B. Myeloma-Zell-Linien, fusioniert, wobei man Hybridomas erhält, die isoliert werden und die die monoklonalen Antikörper produzieren (Köhler, G. und Milstein, C., Eur.J.Immunol., 6, 511-519 (1976) und Köhler, Grund Milstein, C., Nature, 256, 495 (1975). Die Zellen des Hybridomas haben von dem einen "Elternteil" das Vermögen mitbekommen, einen ganz bestimmten Antikörper zu produzieren. Dem anderen"Elternteil'1, dem Myelom, verdanken sie Ihre Fähigkeit, sich auf lange Zeit hin weiter zu teilen. Diese Hybridomas können entweder in vitro oder aber als Tumoren in einem Wirtstier gezüchtet werden. Da jede Antikörper produzierende Zelle (Klon) nur Antikörper einer einzigen Spezifität bildet, produzieren die monoklonalen Kulturen der Hybridomas, die aus einem solchen Klon mit einer Spezifität gezüchtet wurden, jeweils einen homogenen Antikörper, der entweder aus dem Kulturmedium von Hybridoma-Kulturen in vitro oder aus den Zellen, Ascitesflüssigkeiten oder Serum von tumortragenden Wirtstieren erhalten werden kann. Nicht alle Hybridomaklone, die aus der Fusionierung von neoplastischen Zellen mit Antikörper produzierenden Zellen resultieren, sind spezifisch für cas gewünschte Antigen, da viele Hybridomas Artikörper erzeugen, die das immunisierte Tier gequen andere Antigene prodzient hat. Selbst AntIkörper gegen spezifisches Antigen können von Klon zu Klo unterschiedlich sei, da Antikörper von unterschiedlichen Zellen mit unterschiedlichen anti- genen Determinanten des gleichen Moleküls reagieren können. Deshalb ist es efforderlich, den entstehenden Antikörper oder cas die Antikörper enthaltende Medium, Serum oder Ascitesflüssigkeit auf seine Reaktivität mit cem bestimmten Antigen zu testen und seine Spezifi- tät zu testen, indem man bestimmt, mit welchen anderen Antigenen er reagiert. Aufgrund der Homogenität und hohen Spezifität der auf diese Weise hergestellten monoklonalen Antikörper sind letztere äussert wertvoll für diagnostische Zwecke. Monoklonale Antikörper mit Spezifität gegen Blutgruppenmerkmale A und 3 sind bereits bekannt und lassen sich zur Bestimmung dieser Blutgruppenmerkmale innerhalb der Transfusionsmedizin und für Forensische Untersuchungen verwenden (vgl. VOAK, D., SACKS, S., ALDERSON, T., TAKEI, F., LENNOX, E., JARVIS, J., MILSTEIN, C. und DARNBOROUGH, J. (1980) ; Monoclonal Anti-A from a Hybrid Myelomz: Evaluation as a Blood Grouping Reagent. Vox Sanquinis, 39, 134-140). Es bestand jedoch ein Bedarf, Antikörper mit Spezifität gegen andere Blutgruppenmerkmale humaner Erx- throzyten nerzustellen. Erfindungsgemäss lassen sich nunmehr monoklonale Antikörper mit Spezifität gegen des Blutgruppenmerkmal k (cellane) von Humanerythrczyten herstellen. Bezüglich der Definition von k bzw. cellanc siehe C. Prokop, W. Göhler "Die menschlichen Blutgruppen", Gustav-Fischer Verlag, New York, 1976, Seite 101-104. Um die Produktion von Antikörpern mit Spezifität gegen das Blutgruppenmerkmal k zu induzieren, werden. Tiere mit humanen k-positiven Erythrozyten immunisiert. Die dafür ausgewählte Tierspecies ist nicht kritisch, jedoch sollte der Stamm des Tieres genetisch gut derfiniert sein. Da dies für verschiedene Murinstämme, z.B. Ratten, Mäuse usw., zutrifft und da verschiedene neoplastische Zellen von Murinen ebenfalls als gut charakterisierte Kulturen erhältlich sind, wurden Mäuse für die Herstellung der erfindungsgemässen Antikörper verwendet. Jedoch lassen sich auch andere Tierspezies für diesen Zweck verwenden. BALB/c Mäuse werden immunisiert mit humanen k-positlven Erythrozyten intravenös. Nach der letzten Injektion werden die Mäuse getötet und die Milzzellen für das Fusionsexperiment gewonnen. Danach wird eine Milzzellensuspension hergestellt. Die Milzzellensuspension wird dann gewaschen, zweckmässigerweise durch Zentrifugieren in Hank's Medium. Die so erhaltenen Antikörper produzierenden Zellen werden mit neoplastischen Zellen fusioniert. Einige Tumorzellen, insbesondere Myeloma Zellen, lassen sich vorteilhafterweise mit den Antikörper produzierenden Zellen fiasionieren unc liefern lebensfähige, Antikörper produzierende Kulturen von Hybridomas. Vorzugsweise sollten die Tumorzellen und die Antikörper produzierenden Zellen von der gleicher Spezies stammen, da dabei die Wahrscheinlichkeit, dass die genetischen und biochemischen Eigenschaften der Dlternzellen verträglich sina, grösser wird und dadurch lebensfähige Hybridomas produziert werden. Es gibt eine Vielzahl gut charakterisierter Myeloma Zell-Linien, die sich erfindungsgemäss verwenden lassen. Beispiele her tür sind P3-X63-Ag8, P3-X63-Ag8.653, S 194, Y3, SP2/0, MPC-11 und deren Derivate. Vorzugsweise wird die Linie P3-X63-Ag8.653 (CNCM 1-251) IKearney et al, J. Immunol.123: 1548(1979) verwendet. Vorzugsweise wählt man eine Myeloma-Linie aus, die keinen Antikörper produziert, so dass das dabei entstehende Hybridoma nur Antikörperketten von der Eltern-Milz- oder -Lymphknoten Zelle produziert. Die Myeloma-Zellen werden zweckmässigerweise in RPMI 1640 gehalten, dem 10 % FCS zugesetzt werden. Myeloma-Zellen und Zellen, die von Mäusen erhalten wurden, die mit humanen k-positiven Erythrozyten immunisiert worden waren, werden nach der Methode von Köhler, G. und Milstein, C., Eur.J.Immunol.6, 292 (1976) fusioniert. Die Hybridomas werden durch die Verwendung von Hypoxanthin-Aminopterin-thymidin (HAT) Medium selektiert, wobei jegliches Wachstum in HAT-Medium die erfolgreiche Hybridisierung von Maus-Milz-Zellen und Maus-Myloma Zellen anzeigt. Ihre Produktion von Antikörpern gegen die zur Immunisierung der Maus verwendeten k-positiven Erythrozyten wird mit Hilfe von Haemagglutinationstests festgestellt. Hybridzellen werden mit Hilfe der "limiting dilution method in Mikrotiterplatten kloniert. Klone von Hybridomas können in vitro gezüchtet werden nach den bekannten Gewebekulturmethoden, wie beispielse durch Cotton et al., Eur.J.Immunol. 3, 136 (1973) beschrieben. Wahlweise lassen sich die Hybridomas jedoch auch in vivo als Tumoren in einem histokornpatiblen Tier oder in athyrnischen Nzcktmauser. züchten. Die Antikörper lassen sich aus dem in vitro Kultur meaium oder aus dem Serum oder der Ascitesflüssigkeit des Tieres nch bekannten Methoden gewinnen Die Spezifität des Antikörpers von jedem Klon gegen das Blutgruppenmerkmal k ir. Humanerythrozyten wirc mit Hilfe von Haemagglutinationstests festgestellt, und Klone, die Antikörper produzieren mit Spezifität gegen das Blutgruppenmerkmal k in Humanerythrozytenlwerden selektiert. Beispiel Herstellung von Hybridoma-Zell-Linien BALB/c Mäuse wurden immunisiert mit 5 x 108 humanen k-positiven Erythrozyten intravenös, 2 x wöchentlich mit insgesamt 10 Injektionen. 4 Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und die Milzzellen für das Fusionsexperiment gewonnen. Danach wurde eine Milzellensuspension hergestellt. die Milzzellensuspension wurde 2 x durch Zentrifugieren (800 x g) in Hank's Medium gewaschen. Hybridoma-Zell-Linien wurden erhalten durch Fusion von 108 der auf vorstehende Weise gewonnenen Milzzellen mit 10 Mausmyeloma-Zellen P3-X63-Ag8.653 (CNT-251), die in RPMI 1640 gehalten wurden,dem 10% FCS zugesetzt wurde. Die Zellmischung wurde bei 800 x g 2 x zentrifugiert, resuspendiert zur Fusion in 40 % (v/v)iqer Polvethylen- glykol (PEC) 4000-Lösung in Hank's Medium. Die Hybridomas wurden durch die Verwendung von HAT-Medium auf folgende Weise selektiert und auf Antikörper mit Spezifität gegen das Blutgruppenmerkmal k untersucht. Es wurden 570 Näpfe einer Mikrotiterplatte, gefüllt mit 200 Fl Zellsuspension und einer Zelldichte von 1,3 x 705 Zellen/ml, ausgesät. Nach 12 Tagen Inkubation bei 370C und 5 z CO2 wurden in 224 Näpfen Klone gefunden. Von den 224 Näpfen wurden von 174 Näpfen Uberstände auf Antikörper gegen Blutgruppenantigene untersucht. Die Uberstände wurden im direkten Agglutinationstest mit dem bekannten Röhrchenzentrifugationstest und dem Anti-Human Globulin-Test untersucht. Einer dieser Uberstände zeigte bei Verwendung der Anti-Human Globulin-Tests eine Spezifität für das Blut gruppenantigen k. Dieser Napf wurde nach der "limlting dilution" Methode kloniert. Insgesamt wurden 384 Mikrotiterplattennäpfe ausgesät. 316 davon zeigten Klonwachstum, in 70 davon wuchs nur 1 Klon. Diese 70 Näpfe wurden auf Spezifität getestet: 66 von 70 Näpfen waren positiv für das Merkmal k. Die Tabelle zeigt eine typische Reaktion der erhaltenen Hybridomaüberstände mit verschiedenen Testzellen. Tabelle EMI9.1 Antikörper-Idenufizlerungstabelle <SEP> Stute <SEP> Zusat <SEP> lests <tb> <SEP> I <SEP> II <SEP> III <tb> <SEP> Kell <SEP> Duffy <SEP> Luth- <SEP> Kidd <SEP> MNS <SEP> Lewls <SEP> P <SEP> Xg <SEP> Collon <SEP> Dom- <SEP> Special <SEP> Type <tb> Btutgruppensystem <SEP> RH-br <SEP> eran <SEP> brock <tb> Oonor <SEP> No. <SEP> Rn-Typ <SEP> D <SEP> C <SEP> @ <SEP> c <SEP> e <SEP> Cw <SEP> ? <SEP> ? <SEP> ? <SEP> k <SEP> h <SEP> k@@ <SEP> kp@ <SEP> Fya <SEP> Fyb <SEP> Lun <SEP> Lwh <SEP> Jka <SEP> Jkb <SEP> M <SEP> N <SEP> S <SEP> @ <SEP> L@a <SEP> L@b <SEP> P1 <SEP> X@@ <SEP> Co@ <SEP> Co@ <SEP> Doa <SEP> Dob <tb> <SEP> 107 <SEP> 675 <SEP> R1R1 <SEP> 1 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 87 <SEP> 8@ <SEP> (@ <SEP> +) <tb> <SEP> 319 <SEP> 314 <SEP> R@R2 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <tb> <SEP> 301 <SEP> 148 <SEP> R@R1 <SEP> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 3 <tb> <SEP> 301 <SEP> 159 <SEP> R@r <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <tb> <SEP> 122 <SEP> 600 <SEP> r'r <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> A <SEP> 2@ <SEP> B@ <SEP> (c <SEP> +) <SEP> R@@ <tb> <SEP> 121 <SEP> 943 <SEP> r"r <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 6 <tb> <SEP> 120 <SEP> 325 <SEP> rr <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 7 <tb> <SEP> 320 <SEP> 228 <SEP> rr <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> @ <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 8 <tb> EMI9.2 <RTI ID=9.2> Agglutinationsstärke der positiven Überstände (t = schwach, 4 = stark; - = negativ) Hybridomas, die Antikörper mit dem in der Tabelle ange gebenen Reaktionsmuster zeigten, wurden mit der "Limiting dilution method" kloniert. So erhaltene Hybridoma -Linien wurden etabliert und so wohl in Uberständen als auch in Ascitesflüssigkeiten, die nach Inocculation der Hybridoma-Linien in BALB/c Mäusen gewonnen wurden, auf Spezifität und Avidität m:-'-t Test-Erythrozyten untersucht. Die erhaltene Hybridoma-Linie ist unter der Nr. BS45 (CNCM 1-268) etabliert und hinterlegt. Die Hybridoma-Linie BS45(cNNM I-268) produziert einen Antikörper der Klasse IgG 1. Die Linie B545 (cNCM I-268) produziert diesen Anti körper permanent in Zellsuspensionskulturen in vorzugs weise RPMI 1640-Medium. Die Hybridoma-Linie BS45 (CNCM I-268) wächst auch als intraperitonealer Tumor in BALB/c-Mäusen und produziert unter diesen Bedingungen IgG 1 Antikörper mit der beschriebenen Spezifität, die aus dem Ascites der tumortragenden Tiere gewonnen werden können. Die erfindungsgemässen Antikörper sind wertvolle Hilfs mittel für die Transfusionsmedizin und für Forensische Untersuchungen.

Claims: Patentansprüche 1. Hybridoma-Zell-Linie, die einen Antikörper mit Spezi fität gegen ein Blutgruppenmerkmal von humanen Ery throzyten produziert, erhalten durch Fusion einer Antikörper produzierenden Tierzelle und einer neoplasti schen Zelle, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass sie einen Antikörper mit Spezifität gegen das Blut gruppenmerkmal k humaner Erythrozyten produziert. 2. Zell-Linie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper produzierende Zelle murinen Ursprungs ist. 3. Zell-Linie nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper produ ziehenden Zellen BALB/c Maus-Milzzellen sind. 4. Zell-Linie nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die neoplastische Zelle eine Myeloma-Zelle ist. 5. Zell-Linie nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die neoplastische Zelle die Myeloma-Zell-Linie P3-X63-Ag8.653 (CNCM 1-251) ist, die keine Antikörper produziert. 6. Hybridoma-Zell-Linie BS 45 (CNCM I-268). . Monoklonaler Antikörper, gekennzeichnet durch seine Spezifität gegen das Blutgruppenmerkmal k humaner Erythrozyten # Monoklonaler Antikörper nach Anspruch X, dadurch gekennzeichnet, dass er von einer Hybridoma-Zell Linie gemäss Anspruch 1 bis 6 produziert worden ist. 9. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 7 oder 8 zur Bestimmung des Blutgruppenmerkmals k humaner Erythrozyten.

Inventors: MANN, GISELA, PFEFFER, ALMUT, SCHULTE, GERTRUD, SONNEBORN, H.H., DR.
Applicants: BIOTEST-SERUM-INSTITUT GMBH
Application year: 1983
Main classification: G01N33
IPC codes: C07K14, G01N33, C07K16, C12N5, C12P21, C12N15