PROCESS FOR THE SEQUENCE ANALYSIS BY MASS SPECTROSCOPY OF A, IF NECESSARY MODIFIED OLIGORIBONUCLEOTIDE OR OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDE

Abstract: 1. Method for the mass spectrometric sequence analysis of an oligoribonucleotide or oligodeoxyribonucleotide, characterized in that (a) the unprotected nucleotide is subjected to mass spectrometry (b) the negative ions are recorded, and (c1) the difference in mass between successive 5'-P ions by weight and/or (c2) the difference in mass between successive 3'-P ions by weight is determined, and (d) the successive mass differences that have been determined are assigned to the bases.

Description: Verfahren zur Sequenzanalyse eines gegebenenfalls modifizierten Oligoribonukleotids oder Oligodesoxyribonukleotids Synthetische Oligonukleotide werden für die modernen Biowissenschaften immer wichtiger. Insbesondere hat die chemische Synthese von vorgegebenen Nukleotidsequenzen die Entwicklung der Gentechnologie gefördert und beschleunigt. Dadurch wurde die Entwicklung neuer und schnellerer Synthesemethoden angeregt, beispielsweise die Entwicklung von besseren Kupplungsmethoden (1, 2), von hochselektiven und milden Entschützungsmitteln (3, 4) und die Verwendung von geeigneten festen Trägern (5, 6, 7). Derartige Synthesen lassen sich heute in einigen Tagen durchführen; demgemäss ist die grössere Arbeit bei der sorgfältigen Analyse der entschützten Oligonukleotide zu leisten. Sequenzanalysen werden üblicherweise durch chemische Abbaumethoden (8) oder "Wandering Spot"-Methoden (9) nach radioaktiver Markierung durchgeführt. Für vollgeschützte Oligonukleotide wurde ein relativ kom plexes Fragmentierungsverhalten auf Basis einer Negativio 252 nen-252Cf-Plasmadesorptionsmassenspektrometrie beschrieben (12). McNeal et al. geben ferner an, dass Oligonukleotide mit den natürlich auftretenden Phosphodiester-Internukleotidbindungen ein noch komolexeres Fragmentierungsverhalten zeigen und dass die Ausbeute an Molekülionen stark beeinträchtigt wird (12). Entsprechend diesem Stand der Technik muss es überraschen, dass es erfindungsgemäss möglich ist, eine Sequenzanalyse von gegebenenfalls modifizierten Oligoribonukleotiden. oder Oligodesoxyribonukleotiden durch Massenspektrometrie auf einfache Weise durchzuführen. Dazu wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Sequenzanalyse eines gegebenenfalls modifizierten Oligöribonukleotids oder Oligodesoxyribonukleotids vorgeschlagen, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass man (a) das gegebenenfalls modifizierte Nukleotid einer Massenspektrometrie unterwirft, wobei es sich bei dem modifizierten Nukleotid um ein Nukleotid mit mindestens einem ionischen Phosphatrest (Phosphatladung) oder um ein unter Messbedingungen einen derartigen Phosphatrest lieferndes Nukleotid handelt, (b) die Negativionen registriert und (cl) die Massendifferenz zwischen gewichtsmässig aufeinanderfolgenden 5'-P-Ionen und/oder (c2) die Massendifferenz zwischen gewichtsmässig aufeinanderfolgenden 3'-P-Ionen ermittelt und (d) die ermittelten aufeinanderfolgenden Massendifferenzen den Basen zuordnet. Beispiel für anwendbare massenspektrometrische Methoden sind die FAB-Massenspektrometrie und die SIMS-Massenspektrometrie oder Kombinationen dieser Methoden. Hinsichtlich der FAB-Massenspektrometrie sei beispielsweise auf Barber et al. (10) und Morris et al. (13) hingewiesen. Ein wesentliches Merkmal der FAB-Massenspektrometrie besteht darin, dass das in Form einer Monolayer auf einer Matrix vorliegende zu untersuchende Material mit neutralen, ungeladenen Teilchen bombardiert wird, beispielsweise mit einem Edelgas in einem Feld von beispielsweise 5 kV oder mehr. Das erfindungsgemässe Verfahren wird also auf ungeschützte bzw. entschützte Oligoribonukleotide oder Oligodesoxyribonukleotide angewandt. Die Obergrenze der Basenanzahl von nach dem erfindungsgemässen Verfahren zu analysierenden Nukleotiden ist nicht durch das Verfahrensprinzip begrenzt, in der Praxis kann jedoch eine Grenze durch das Auflösungsvermögen des verwendeten Massenspektrographen gesetzt werden. Richtwerte für die Homogenität des zu sequenzierenden Materials sind 95, insbesondere 97 und vorzugsweise 99 %. Es muss jedoch dem Fachmann überlassen bleiben und kann ihm zugemutet werden, den geeigneten Homogenitätsgrad zu ermitteln. Es kann sich erweisen, dass von Fall zu Fall ein anderer Homogenitätsgrad wünschenswert ist, da manche Verunreinigungen überproportional im Spektrum vertreten sein können, wie nukleotidisches Material mit lipophilen Gruppen z.B. mit der Tritylgruppe. Nachstehend wird die Erfindung anhand von Figuren näher erläutert. Es zeigen: Fig. la ein Negativionen-FAB-Massenspektrum des Oligodesoxyribonukleotids a, nämlich d(A-C-T-C-G-A-T-G) (d = desoxy), Fig. lb ein Negativionen-FAB-Massenspektrum des Oligodesoxyribonukleotids b, nämlich d(G-C-G-A-T-C-G-C), Fig. lc ein Negativionen-FAB-Massenspektrum des Oligodesoxyribonukleotids c, nämlich d(G-A-A-G-A-T-C-T-T-C), Fig. 2a ein vereinfachtes Strukturschema des Oligodesoxyribonukleotids a, Fig. 2b ein vereinfachtes Strukturschema des Oligodesoxyribonukleotids b, Fig. 2c ein vereinfachtes Strukturschema des Oligodesoxyribonukleotids c, Fig. 3 ein vereinfachtes Strukturschema des Oligoribonukleotids d (G-A-U) sowie dessen Negativionen-FAB-Massenspektrum, Fig. 4 ein vereinfachtes Strukturschema des Oligoribonukleotids d (A-A-A-A-A-A) sowie dessen Negativionen-FAB-Massen Spektrum, Fig. 5 ein vereinfachtes Strukturschema des Oligoribonukleotids d (A-A-A-A-A-A-A-A) sowie dessen Negativionen-FAB-Massenspektrum und Fig. 6 ein vereinfachtes Strukturschema des Oligodesoxyribonukleotids d (G-A-T) sowie dessen Negativionen-FAB-Massenspektrum, wobei bei den vereinfachten Strukturschemen der Figuren 2a bis 2c diejenigen Bindungen durch gestrichelte Linien markiert sind, deren Bruch zu den wesentlichen Fragment ionen führt; dabei wurde an den Bruchstellen jeweils die Masse dieser Fragmentionen angeführt, wobei die oben an einer gestrichelten Linie angegebene Masse dem 5'-P-Sequenzion und die unten an einer gestrichelten Linie angegebene Masse dem 3'-P-Sequenzion entspricht. Wenn man reine Oligonukleotide in das erfindungsgemässe Verfahren einsetzt, erhält man praktisch nur spezifische 5'-P Sequenzionen und 3'-P-Sequenzionen (vgl. Fig. 1a bis lc). Diese ausschliessliche Bildung spezifischer Sequenzionen ermöglicht eine rasche Sequenzanalyse allein dadurch, dass man die Massendifferenzen zwischen aufeinanderfolgenden Sequenz ionen des gleichen Typs ermittelt. Eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Typen von Sequenzionen ist möglich, da Ionen unterschiedlichen Typs, jedoch mit der gleichen Anzahl von Nukleotideinheiten regelmässig durch ihre Peakintensität zu unterscheiden sind. Da die Bindung mit dem 3'-0 Atom, das mit einem sekundären Kohlenstoffatom des Zuckeranteils verbunden ist, labiler ist als die Bindung mit dem 5'-O-Atom, das mit einem primären Kohlenstoffatom des Zuckeranteils verbunden ist, treten die 5'-P-Sequenzionen ohne Ausnahme intensiver als die entsprechenden 3'-P-Sequenzionen auf. Zur Ermittlung der Nukleotidsequenz geht man folgendermassen vor. Beginnend vom (M-H)--Peak ((M-H)-= Molekül minus Proton) klassifiziert man alle Sequenz ionen entsprechend ihrer Intensität entweder als 5'-P-Ionen oder als 3'-P-Ionen. Für die Figuren la und 2a erhält man dabei folgendes Ergebnis: Tabelle 1 5'-P-Sequenzionen 3'-P-Sequenzionen 2407 /(M-H)--Ion/ 2174 2158 1885 1854 1581 1541 1292 1212 963 923 650 619 346 330 Danach ermittelt man die genaue Massendifferenz zwischen benachbarten Peaks desselben Sequenzionentyps. Mit der folgenden Tabelle kann man den ermittelten Massendifferenzen das Jeweilige Nukleotid zuordnen. Tabelle 2 Massendifferenz Massendifferenz Nukleotid mittelständig endständig (mit PO4H) (ohne PO4H) (mit PO4H + OH) A 313 233 330 C 289 209 306 G 329 249 346 T 304 224 321 Den Figuren 2a bis 2c kann man entnehmen, dass man hinsichtlich der 5'-P-Sequenzionen und der 3'-P-Sequenzionen zwischen einem 5'-Ende (links in den Figuren) und einem 3'-Ende (rechts in den Figuren) unterscheiden kann, die den entgegengesetzten Enden des Jeweiligen Oligodesoxyribonukleotids zugeordnet sind. Dementsprechend kann man die vollständige Basensequenz eines dem erfindungsgemässen Verfahren unterworfenen Oligonukleotids zweimal ablesen, indem man entweder am 5'-Ende oder am 3'-Ende beginnt. Diese Möglichkeit, die Basensequenz eines Oligonukleotids in zwei verschiedenen Richtungen abzulesen, bietet die Möglichkeit, dass man die Basensequenz nicht unbedingt in jeder Leserichtung vollständig ablesen muss, sondern nur bis zu bzw. ab einem Überlappungsbereich. Dieses Vorgehen kann dann vorteilhaft sein, wenn sich (beispielsweise infolge von Verunreinigungen des zu untersuchenden Oligonukleotids) die Massen der Sequenzionen mit zunehmender Massenzahl weniger genau ermitteln lassen. In diesem Fall kann man eine vollständige Sequenzanalyse durch Zusammensetzen der in beiden Leserichtungen nur bis zum bzw. ab Überlappungsbereich für die kleineren Massenzahlen gewonnenen Ergebnisse ermitteln. Es ist klar, dass alle Fragmente derselben Zusammensetzung dieselbe Masse unabhängig davon besitzen, ob es sich um 5'-P-Sequenzionen oder um 3'-P-Sequenzionen handelt. So zeigt das Spektrum der Sequenz b (Fig. 1b) nur einen Peak für beide endständigen Dinukleotidionen. Trotz dieses Umstands bietet die Ermittlung der Sequenz keinerlei Probleme. Aus dem Gesamtspektrum ist klar zu entnehmen, dass in einem weiten Massenbereich nur ein einziger Peak auftritt. Die Massen und die Peakintensitäten der höheren Oligonukleotidionen bestätigen klar, dass (gelesen vom 5'-Ende) die zweite Position C und die siebente Position G und der einzelne Peak der Masse 635 beide Dinukleotidionen repräsentiert. Synthese der experimentell untersuchten Oligodesoxyribonukleotide Im wesentlichen arbeitete man nach den bewährten Phosphotriestermethoden. Es wurden Benzoyl-, Anisoyl- und Isobutyryl Gruppen zum Schutz der heterozyklischen Basen, 4-Methoxytrityl-Gruppen zum Schutz von 5'-OH und 2-Chlorphenyl- und 2,2,2-Tribromäthyl-Gruppen zum Schutz der Phosphatfunktionen verwendet. Die Kondensationsreaktionen wurden in Lösung mit 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazolid als Kondensationsmittel durchgeführt. Schliesslich bildete man die ungeschützten Oligomeren durch Behandeln mit Pyridin (10 %) in konzentriertem Ammoniak und danach durch Behandeln mit Essigsäure (80 %). Homogenitäten von mehr als 99 % wurden routinemässig nach Ionenaustauschchromatographie (Sephadex A-25 in Gegenwart von 7 m Harnstoff) und nachfolgendes Entsalzen erhalten. Die Homogenität wurde sorgfältig durch Umkehrphasen-HPLC (Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie), Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Kettenlängen-Markierungen t11) und zweidimensionale Fingerprint-Methode überprüft. Statt einer Ionenaustauschchromatographie in Gegenwart von Harnstoff oder Formamid kann man auch eine mehrfache Umkehrphasenchromatographie, eine Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen oder eine der vielen möglichen Kombinationen dieser Verfahren anwenden. Herstellung der Massenspektrogramme der Fig. la bis Ic Die Figuren la bis 1c zeigen die relevanten Regionen der Negativ ionen eines unter Beschuss mit schnellen Atomen durchgeführten Massenspektrogramms (FAB) von a = d(A-C-T-C-G-A T-G), b = d d(G-C-G-A-T-C-G-C) und c = d d(G-A-A-G-A-T-C-T-T-C) unter Ausschluss der Glycerinmatrix. Die Massendifferenz zwischen zwei Marken ist ein Indiz für das jeweilige Nukleotid. Die Massendifferenzen oberhalb der Spektren betreffen Fragmentionen mit 5'-Phosphatenden (5'-Phosphatsequenzionen bzw. 5'-P-Sequenzionen) und die Massendifferenzen unterhalb der Spektren betreffen Fragmentionen mit 3'-Phosphatenden < 3'-Phosphatsequenzionen bzw. 3'-P-Sequenzionen). Die höchste Masse liefert das (M-H)--Ion. Das entsprechende doppelt geladene Ion wurde bei der halben Masse gefunden. Die Spektren wurden mit einem Kratos MS 50 S mit einem Hochfeldmagneten (Massenbereich etwa 3000 bei 8 kV) und einer Kratos-FAB Quelle aufgenommen. Die Atomkanone verwendete Xenon und lieferte einen Strahl neutraler Atome bei 8 bis 9 keV. Es wurde eine Lösung des Triäthylammoniumsalzes jedes Oligodesoxyribonukleotids (4 bis 5 ul mit einem Gehalt entsprechend 1 bis 1,5 oD 260; etwa 10 nmol) in die Glycerinmatrix (etwa 2 ,ul) auf einem FAB-Kupferprobenträger injiziert. Das Wasser wurde über eine Schleuse (direct insertion lock) entfernt und die Spektren wurden bei einer Magnetauflösungsrate von 300 s/Dekade aufgezeichnet. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Sequenzanalyse von Oligoribonukleotiden ist in Tab. 3 und den Fig. 3 bis 5 erläutert. 1. Die Triethylammoniumsalze von Oligoribonukleotiden geben die zu den entsprechenden Oligodesoxyribonukleotiden analogen Massenpeaks (Beispiel: rA6, ru8). 2. Die Analyse von gemischt-basigen Ribo-Tri- und Tetrameren zeigt, dass auch bei Oligoribonukleotiden die Ionen unterschiedlichen Typs jedoch mit der gleichen Anzahl von Nukleotideinheiten regelmässig durch ihre Peakintensität zu unterscheiden sind (Beispiel: d(G-A-T) und r(G-A-U), wobei zu beachten ist, dass Oligoribonukleotide üblicherweise das Nukleotid Uridin (U) statt Thymidin (T) enthalten (vgl. Fig. 3 und 6). Das Verfahren ist analog auch auf chemisch modifizierte Oligomere anwendbar, wobei entweder im zu untersuchenden Material mindestens eine Phosphatladung vorhanden sein muss (vgl. Tab. 4 und 5), oder eine solche unter den Messbedingungen erzeugt werden kann. Letzteres ist der Fall bei Phosphatschutzgruppen, die reduktiv abspaltbar sind (Beispiel: Tribromethyl- oder Cyanoethyl-Schutzgruppe). Eine besondere Bedeutung dieser Variante des erfindungsgemässen Verfahrens liegt in der Möglichkeit, Zwischenstufen für die Oligonukleotidsynthese auf ihre Identität zu untersuchen. Es werden heutzutage meist teilgeschützte Monound Dinukleotide für die Synthese verwendet. Letztere entzogen sich bislang einer massenspektrometrischen Sequenzanalyse. Die Ergebnisse des erfindungsgemässen Verfahrens sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die charakteristischen Sets von Peaks ermöglichen eine eindeutige Sequenzaussage für Dinukleotide. Tab, 3: Sequenz-Ionen von Oligoribonukleotiden EMI10.1 Nucleosid <SEP> C <SEP> U <SEP> A <SEP> G <tb> erstes <SEP> Fragment <SEP> 322 <SEP> 323 <SEP> 346 <SEP> 362 <tb> (Nukleosid <SEP> + <SEP> PO3) <tb> Folgefragmente <SEP> 305 <SEP> 396 <SEP> 329 <SEP> 345 <tb> (Nukleosid <SEP> + <SEP> PO2-H) <tb> letztes <SEP> Fragment <SEP> 225 <SEP> 226 <SEP> 249 <SEP> 265 <tb> (Nukleosid <SEP> - <SEP> OH) <tb> Tab. 4: Geschützter Dideoxyribonukleotid-Typ: DMTr - dX - Pocp - dY - Pocp - O @ DMTr = Dimethoxytrityl ocp = o-Chlorphenyl X : Abz, Cbz, Gib. T X, Y = Nukleosid bz = Benzoyl Y : Abz, Cbz, Gib, T ib = i-Butyryl p = Phosphatrest EMI11.1 X/Y <SEP> A <SEP> C <SEP> G <SEP> T <tb> <SEP> M <SEP> 1373 <SEP> M <SEP> 1349 <SEP> M <SEP> 1355 <SEP> M <SEP> 1260 <tb> <SEP> pAp <SEP> 734 <SEP> pCp <SEP> 710 <SEP> pGp <SEP> 716 <SEP> pTp <SEP> 621 <tb> A <SEP> Ap <SEP> 544 <SEP> Cp <SEP> 520 <SEP> Gp <SEP> 526 <SEP> Tp <SEP> 431 <tb> <SEP> DMTrAp <SEP> 846 <SEP> DMTrAp <SEP> 846 <SEP> DMTrAp <SEP> 846 <SEP> DMTrAp <SEP> 846 <tb> <SEP> M <SEP> 1349 <SEP> M <SEP> 1325 <SEP> M <SEP> 1331 <SEP> M <SEP> 1236 <tb> <SEP> pAp <SEP> 734 <SEP> pCp <SEP> 710 <SEP> pGp <SEP> 716 <SEP> pTp <SEP> 621 <tb> C <SEP> Ap <SEP> 544 <SEP> Cp <SEP> 520 <SEP> Gp <SEP> 526 <SEP> Tp <SEP> 431 <tb> <SEP> DMTrCp <SEP> 822 <SEP> DMTrCp <SEP> 822 <SEP> DMTrCp <SEP> 822 <SEP> DMTrCp <SEP> 822 <tb> <SEP> M <SEP> 1355 <SEP> M <SEP> 1331 <SEP> M <SEP> 1337 <SEP> M <SEP> 1242 <tb> <SEP> pAp <SEP> 734 <SEP> pCp <SEP> 710 <SEP> pGp <SEP> 716 <SEP> pTp <SEP> 621 <tb> G <SEP> Ap <SEP> 544 <SEP> Cp <SEP> 520 <SEP> Gp <SEP> 526 <SEP> Tp <SEP> 431 <tb> <SEP> DMTrGp <SEP> 828 <SEP> DMTrGp <SEP> 828 <SEP> DMTrGp <SEP> 828 <SEP> DMTrGp <SEP> 828 <tb> <SEP> M <SEP> 1260 <SEP> M <SEP> 1236 <SEP> M <SEP> 1242 <SEP> M <SEP> 1147 <tb> <SEP> pAp <SEP> 734 <SEP> pCp <SEP> 710 <SEP> pGp <SEP> 716 <SEP> pTp <SEP> 621 <tb> T <SEP> Ap <SEP> 544 <SEP> Cp <SEP> 520 <SEP> Gp <SEP> 526 <SEP> Tp <SEP> 431 <tb> <SEP> DMTrTp <SEP> 733 <SEP> DMTrTp <SEP> 733 <SEP> DMTrTp <SEP> 733 <SEP> DMTrTp <SEP> 733 <tb> Tab. 5: Sequenz-Ionen von 5'-(MMTR)-Oligodeoxyribonucleotiden; MMTR = Monomethoxytrityl EMI12.1 Nucleosid <SEP> C <SEP> T <SEP> A <SEP> G <tb> erstes <SEP> Fragment <SEP> 3'-P <SEP> 578 <SEP> 593 <SEP> 602 <SEP> 618 <tb> erstes <SEP> Fragment <SEP> 5'-P <SEP> 306 <SEP> 321 <SEP> 330 <SEP> 346 <tb> Folgefragmente <SEP> 289 <SEP> 304 <SEP> 313 <SEP> 329 <tb> letztes <SEP> Fragment <SEP> 3'-P <SEP> 209 <SEP> 224 <SEP> 233 <SEP> 249 <tb> letztes <SEP> Fragment <SEP> 5'-P <SEP> 481 <SEP> 496 <SEP> 505 <SEP> 521 <tb>

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Sequenzanalyse eines gegebenenfalls modifizierten Oligoribonukleotids oder Oligodesoxyribonukleotids, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man (a) das gegebenenfalls modifizierte Nukleotid einer Massenspektrometrie unterwirft, wobei es sich bei dem modifizierten Nukleotid um ein Nukleotid mit mindestens einem ionischen Phosphatrest (Phosphatladung) oder um ein unter Messbedingungen einen derartigen Phosphatrest lieferndes Nukleotid handelt, (b) die Negativionen registriert und (cl) die Massendifferenz zwischen gewichtsmässig aufeinanderfolgenden 5'-P-Ionen und/oder (c2) die Massendifferenz zwischen gewichtsmässig aufeinanderfolgenden 3'-P-Ionen ermittelt und (d) die ermittelten aufeinanderfolgenden Massendifferenzen den Basen zuordnet. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man das Nukleotid einer FAB-Massenspektrometrie unterwirft. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man ein Nukleotid mit einer Homogenität von 95, insbesondere 97 und vorzugsweise 99 % verwendet.

Inventors: BLOCKER, HELMUT, DR., FRANK, RONALD, DR., GROTJAHN, LUTZ, DR., Blöcker, Helmut, Dr.
Applicants: GESELLSCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Application year: 1983
Main classification: C12Q1
IPC codes: H01J49, C12Q1