PROCESS FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE MUTAGENICITY OF CHEMICAL AGENTS USING PHAGES IN AN IN VITRO TEST

Abstract: 1. A process for the quantitative determination of the mutagenic effect of chemical substances on phages by a test carried out in vitro, characterized in that for the statistic evaluation of the phages to a suspension of the phages having a concentration of 10**6 to 10**8 phages/ml prepared with a buffer solution having a pH of 6,0 to 8,0 a known amount of a chemical substance to be tested and being soluble in or mixable with water, utmost 20 % by volume, aqueous methanol or ethanol solution or utmost 38 %, by volume, aqueous dimethyl sulfoxid solution is added, as phages those are being used which comprise no lysogenic gene containing doublestranded DNS, then after the addition of the chemical substance immediately a sample is taken from the suspension and the starting phages concentration of the sample is determined by breeding and cultivation, respectively in a manner known per se on a corresponding host cell, and the phages suspension containing the chemical substance is maintained at a temperature of 20 to 37,5 degrees C, a sample is taken from the suspension form time to time and the concentration of the surviving phages is determined at the point of sampling by breeding and cultivation, respectively in a manner known per se on a corresponding host cell, and on the basis of the obtained data the numeric value being characteristic for the mutagenic effect is calculated.

Description: Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Bestlmmung der mutagenen Wirkung von chemischen Stoffen auf Phagen durch eine in vitro durchgeführte Unter suchung. Zur Klärung der schädlichen (in erster Linie mutagenen und karzinogenen beziehungsweise Krebs erzeugenden) Wirkung der chemischen Stoffe wäre nach dem gegenwärtigen Standpunkt das zweekmässige Verfahren eine aus 3 Schritten bestehende Reihenuntersuchung (Bridges: Mutat. Res. 26 (1974), 335 bis 340), das sich auf 3 unterschiedliche Organisationsstufen bezieht. In der Praxis erfolgt die Untersuchung jedoch auf 1, eventuell 2, der 3 Stufen. Die erste Stufe stellen die in vitro durchgeführten Reihenuntersuchungen, bei denen mehr oder minder zuverlässige annähernde Informationen über die mutagene Wirkung der untersuchten chemischen Stoffe erhalten werden, dar. Zur Klärung der kareinogenen (und teratogenen beziehungsweise Missbildungen verursachenden) Wirkung der chemischen Stoffe ist diese Untersuchungsstufe nicht geeignet, da die verwendeten Untersuchungsorganismen (Mikroorganismen) von zu niederer Ordnung sind; auf Grund der allgemeinen biologischen Kenntnisse ist es jedoch sehr wahrscheinlich, dass die unter Bedingungen in vitro eine mutagene Wirkung aufweisenden Stoffe in Organismen von höherer Ordnung karzinogen (oder teratogen) wirken werden. Daher werden die chemischen Stoffe, welche sich bei in vitro erfolgenden Untersuchungen als mutagen erwiesen, gewöhnlich nicht noch in vivo durchgeführten Reihenuntersuchungen unterworfen, sondern eindeutig als schädlich eingestuft. Die Aufgabe der die zweite Stufe darstellenden in vivo durchgeführten Reihenuntersuchungen besteht darin, dass vom Gesichtspunkt der karzinogenen Wirkung die etwaige aktivierende Wirkung des tierischen Stoffwechsels auf die Chemikalien, welche sich bei in vitro durchgeführten Untersuchungen als inaktiv (unschädlich) erwiesen, untersucht wird. Obwohl es auch vorkommen kann, dass die Chemikalien, welche sich bei in vitro durchgeführten Untersuchungen als mutagen erwiesen, gerade durch die im tierischen Organismus ablaufenden Stoffwechselvorgänge (zum Beispiel Abbau) ihre schädliche Wirkung verlieren, werden diese Chemikalien wie bereits erwähnt im allgemeinen nicht mehr unter Bedingungen in vivo untersucht. Die in vivo erfolgenden Untersuchungen erfordern Organismen höherer Ordnung (für Laborato riumszwecke geeignete gleintiere) und gewöhnlich langwierige Versuche und sind mit wesentlich höherem Aufwand verbunden als die in vitro durchgeführten Untersuchungsverfahren. Die dritte Stufe der Reihenuntersuchungen bilden die Humanuntersuchungen. Diese Untersuchungen erfolgen dann, wenn das Ausmass des durch die Verwendung des chemischen Stoffes verursachten Risikos in Fällen, in welchen sich der chemische Stoff in den 2 vorherigen Reihenuntersuchun- gen als unschädlich oder aber in 1 der 2 Reihenuntersuchungen zwar als schädlich erwies, seine Verwendung jedoch unumgänglich ist, bestimmt werden soll. Diese Untersuchungen müssen gewöhnlich an menschlichen Gewebekulturen durchgeführt werden, so dass es klar ist, dass siemit recht hohem Aufwand verbunden sind. Wie aus dem Obigen hervorgeht, sind die in'vitro durchgeführten Untersuchungen von grundlegender Bedeutung für die Bestimmung der Verwendbarkeit der chemischen Stoffe. Wenn diese Untersuchungen keine zuverlässigen Ergebnisse liefern oder aber zur entsprechenden Charakterisierung des untersuchten chemischen Stoffes nicht geeignet sind, kann es vorkommen, dass von der weiteren Untersuchung wertvoller Stoffe oder ihrer Verwendung Abstand genommen wird beziehungsweise die schädliche Wirkung, welche schon auch in den in vitro durchgeführten Untersuchungen hätte auftreten müssen, nur durch komplizierte und mit hohem Aufwand verbundene weitere Untersuchungen nachgewiesen werden kann. Neben der Zuverlässigkeit und ausreichenden Aus- wertbarkeit besteht eine weitere Anforderung an die in vitro durchgeführten Untersuchungen darin, dass sie einfach, schnell und mit geringem Aufwand durchführbar sein sollen; heutzutage wäre es wünschenswert, dass sich diese Untersu chung nicht nur auf Medikamente, sondern auch auf die Untersuchung aller, beispielsweise in der Industrie, Landwirtschaft und in den Haushalten vorkommenden, chemischen Stoffe erstreckt. Bei den bekannten in vitro durchgeführten Untersuchungsverfahren wird im allgemeinen die Mutation von Mikroorga nismen (gewöhnlich Bakterien) untersucht. Von diesen Verfahren wird der sogenannte Ames-Test (Ames und Mitarbeiter: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70 (1973), 2 281) verhältnis massig oft angewandt, wobei die auxotrophen Mutanten von Salmonella typhimurium mit dem zu untersuchenden chemischen Stoff behandelt werden und die vom letzteren hervorgerufene Reversion untersucht wird. Auch die von anderen Verfassern an anderen Objekten, zum Beispiel Mutanten von E. coli und S. cerevisiae ausgearbeiteten Verfahren (Pueyo : Mutat. Res. 54 [1978], 311 ; Glatt und Mitarbeiter : Mutant. Res, 66 (1979], 307; Glatt und Mitarbeiter: Mutät. Res. 66 (1979), 329) beruhen auf einem ähnlichen Prinzip. Der gemeinsame Nachteil dieser Verfahren besteht darin, dass die Untersuchungen über die mutagene Wirkung des Stoffes meistens nur eine bejahende oder verneinende Antwort geben, die Wirkungsstärke aber quantitativ nicht charakterisieren, also nicht entsprechend ausgewertet werden können. Ein weiterer Nachteil ist, dass das Erhalten der entsprechenden auxotrophen Mutantenbakteriens tämme eine mit verhältnismässig hohem Aufwand verbundene und arbeitsintensive Aufgabe, welche auch viel Sachkenntnis erfordert, ist. Diese Verfahren zur Bestimmung der mutagenen Wirkung nutzen gewöhnlich nur das Endergebnis des Vorganges, mit der Kinetik, das heisst dem zeitlichen Ablauf, der mutagenen Wirkung des untersuchten chemischen Stoffes sind sie jedoch nicht befasst. Die quantitative Bestimmung beziehungsweise Charakterisierung der unter Bedingungen in vitro auftretenden mutagenen Wirkungen befindet sich im Versuchsstadium. Von Glatt und Mitarbeitern (Mutat. Res. 66 E1979], 307) wurde ein willkiirlicher Mutagenitätsindex, bei dessen Berechnung die an den von den 4 Salmonella-Mutanten (TA 1535, TA 1537 TA 98 und TA 100) für empfindlich befundenen 3 Stammen (TA 100, TA 98, TA 1537) gemessene mutagene Wirkung, das heisst die durch 1 nMol chemischen Stoff hervorgerufene revertante Xoloniezahlzunahme im Vergleich zur spontan revertierten Koloniezahl, mit unterschiedlichen Faktoren multipliziert wird und die erhaltenen Produkte summiert werden, eingeführt. Dieses Verfahren weicht also im wesentlichen nur insofern von den vorher beschriebenen qualitativen Charakterisierungsverfahren ab, als die zur qualitativen Wertung der mutagenen Wirkung des chemischen Stoffes geeigneten Daten willkürlich umgeformt und dadurch besser benutzbar gemacht werden, diese Umgestaltung hat jedoch keinerlei prinzipielle Grundlage, sie ist völlig formal. Es liegt auf der Hand, dass dieses vor allem auf qualitativen Daten beruhende Verfahren keine zuverlässigen quantitativen Werte zur Charakterisierung der mutagenen Wirkung zu liefern vermag. Es wurden auch schon und werden zur Zeit Bakteriophagen zum Studium des Wirkungsmechanismus Jeweils eines chemischen Stoffes oder einer Gruppe von chemischen Stoffen eingesetzt. Zum Nachweis wird die mutagene Wirkung des chemischen Stoffes genutzt, das heisst es wird untersucht, welche Veränderung an den Phagen durch den chemischen Stoff verursacht wird (Spezifitschnosti chimitscheskowo mutagenesa, Nauka, Moskau, 196\ 76 bis 80 und 80 bis 84; Biochim. Biophys. Hung. 10 [1975], 115 bis 120; J. Virol. 19 [1976], 318 bis 324 und 24 [1977], 716 bis 719; Biochem. Biophys. Acta 546 [1979] 495 bis 506). Diese Arbeiten waren nicht darauf gerichtet und auch die Ergebnisse trugen nicht dazu bei, mit ihrer Hilfe Mutagenitätsprüfverfahren zu erarbeiten. Im Fachschrifttum wird ein ausgesprochen auf der Phagenmutagenität beruhendes Prüfverfahren in Bezug auf geradzahlige T-Phagen (T2, T4) empfohlen. Von Japanischen Verfassern (Ikeda, IsJima: J. Gen. Appl. Microbiol. 11 [1965], 129 bis 135) wurden T2-Phagen verwendet. In diesem Verfahren wird die spezifische Mutation (±2h) der wilden T2-Phage (T2h+) auf die Wirtszelle E. coli B/2 zur Untersuchung der mutagenen Aktivität der Chemikalien zunutze gemacht. In der Praxis fand dieses Verfahren in den letzten 15 Jahren keine Verbreitung. Das hat folgende prinzipielle beziehungsweise praktische Gründe: a) Die Nucleinsäure der T2-Phage hat grössenordnungs mässig ein Molekulargewicht von 108. Von¯dieser grossen Nucleinsäure nimmt an der Mutation h+ EMI5.1 h offensichtlich nur ein sehr kleiner Teil teil, das heisst es beteiligen sich an ihr nur einige Gene. Es ist also wenig wahrscheinlich, dass vom T2-Pha- gengenom nur das beziehungsweise die die für den Prf- versuch ausgewählte Mutation verursachende(n) Gen(e) mit dem chemischen Stoff und nur sie in Wechselwirkung treten. Dieser Umstand senkt die Empfindlichkeit des Verfahrens stark. b) Mit diesem Umstand hängt auch die Tatsache zusam men, dass die Wahrscheinlichkeit der letalen be ziehungsweise tödlichen Mutation, das heisst der Phageninaktivierung, wesentlich höher als die Wahr scheinlichkeit der für den Prüfversuch verwendeten Mutation ist. So kann die auf die Wirkung des che mischen Stoffes zustandekommende Phagenvernichtung auch das Entstehen der ausgewahlten Mutante ver decken. Diese Erscheinung kann bei besonders hohen mutagenen Stoffkonzentrationen auftreten. c) Bei der praktischen Durchführung des genannten be kannten Verfahrens besteht ein Nachteil auch darin, dass der mutagene chemische Stoff direkt dem Kom- plex von Phagen und Bakterien zugesetzt wird, wes halb seine bakterizide Wirkung zur Geltung kommen und das Wachsen der Wirtsbakterien verhindert wer den kann, was eventuell auch das Auswerten vereiteln kann. Das auf der A-Phageninduktion beruhende im Fachschrifttum Indukttest genannte Verfahren bezieht sich auch auf Phagen (J. Gen. Appl. Microbiol. 11 [1965, 129 bis 135; Proc. Natl, Acad. Sci. 73 [1976), 3 700 bis 3 704). Dieses Verfahren unterscheidet sich jedoch schon prinzipiell von den vorherigen darin, dass der mutagene chemische Stoff mit dem ganzen (lysogenisierten) Bakteriumchromosom in Wechselwirkung tritt. Die vom mutagenen chemischen Stoff hervorgerufene DNS-Schädigung führt zu einer Stoffwechseländerung, die wiederum die Induktion der A-Prophage verursacht. Im Indukttest ist das Erscheinen von Phagen also nur ein Indikator des Auftretens der Mutation, die mutagene Wirkung ist Jedoch nicht direkt auf die Phagen gerichtet. Das mit dem Grundverfahren zusammenhängende Problem besteht darin, dass das Verfahren wenig empfindlich ist, das heisst, dass eine hohe mutagene Konzentration des chemischen Stoffes zum Auslösen der Induktion notwendig ist (J. Gen. Appl. Microbiol. 11 t1965], 129 bis 135). Wie in jedem bekannten Verfahren zur Untersuchung einer nicht-letalen Mutation kann der zu untersuchende chemische Stoff auch in diesem Fall neben der Prophageninduktion schädliche Wirkungen ausüben. Diese Wirkung kann einerseits direkt auf die Phage, andererseits auf die lysogenisierte Wirtsbakterie gerichtet sein. Im ersten Fall wird die Phage inaktiviert, während sich im zweiten Fall die Phagenerzeugungsfähigkeit der Zelle verringert. Beide erwähnten Wirkungen sind vorwiegend bei hohen mutagenen Konzentrationen des chemischen Stoffes zu erwarten und können die Prophageninduktion verdecken. Dadurch kann der Prufversuch ein falsch negatives Ergebnis liefern. Der gemeinsame Mangel der angegebenen Verfahren besteht darin, dass für die quantitative Wertung der mutagenen Wirkung nur eine sehr primitive und willkürliche Verfahrensweise gewählt wird. Auf Grund der Charakterisierung kann nur eine positive (leicht oder stark) beziehungsweise negative Entscheidung getroffen werden. Eine solche im wesentlichen aus 2 Stufen bestehende Skala kann überhaupt nicht die Er fahrung widerspiegeln, dass die Stärkeskala der mutage nen/karzinogenen Wirkung der chemischen Stoffe 6 bis 7 Grössenordnungen umfasst (J. Toxicol. Environm. Health 6 [1980], 1 133 bis 1 177). Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile der bekannten Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der mutagenen Wirkung von chemischen Stoffen, welches zuverlässig und empfindlich ist, einfach, mit geringem Aufwand und schnell sowie mit gut zu erhaltenden und zu handhabenden Untersuchungsstoffen durchgeführt werden kann sowie eine quantitative Aussage über die mutagene Wirkung und ihre Kinetik bei guter Auswertbarkeit gibt, zu schaffen. Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht. Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, dass bestimmte Phagen als Untersuchungsstoffe zur quantitativen Bestimmung der mutagenen Wirkung von chemischen Stoffen bei Erreichung des Obigen eingesetzt werden können. Solche sind Phagen, die eine kein lysogenes Gen enthaltende doppelsträngige DNS haben. In diesen Phagen führt nach eigenen Untersuchungen die Dimerisation einer einzigen Pyrimidinbase schon zum Zugrundegehen der ganzen Rhage. In den Bakterien müssen dagegen demgegenüber zur Auslösung der Reversion der Mutante eventuell mehrere oder umfangreichere, genau nicht bekannte chemische Veränderungen innerhalb eines einzigen Objektes erfolgen. Demzufolge können die teilweise veränderten Bakterien bei der Auswertung der Untersuchung als intakt erscheinen. Die Phagen zeigen also im Gegensatz zu den Bakterien schon die erste Schädigung zuverlässig an. Diese Phagen üben ähnlich wie die übrigen Phagen in Abwesenheit von Wirtszellen keine Lebensfunktionen aus, weswegen auch nicht mit der Gefahr gerechnet werden muss, dass sich das Untersuchungsobjekt nach Ablauf der schädlichen chemischen Reaktion durch biologische Reaktio- nen regeneriert und sich bei der endgültigen Auswertung als heil zeigt und dadurch ein falsches Ergebnis angibt. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der Phagen besteht darin, dass sie in Pufferlösungen-(pH-Wert von 6,0 bis 8,0, wie etwa 7,0) im Kühlschrank ohne besondere Behandlung, zum Beispiel Lüften, Zusatz von Nihrböden oder Umimpfen, praktisch unbegrenzt gelagert werden können, weswegen ihr Erhalten und ihre Nutzung wesentlich einfacher ist und mit einem wesentlich geringeren Aufwand verbunden ist als die von Mikroorganismen. Frühere eigene Untersuchungen (Studia Biophys. 33 i1972), 121 waren nur mit der durch ultraviolettes Licht verursachten Inaktivierung der T7-Phagen befasst. Im Laufe der nunmehrigen Versuche wurde der zeitliche Ablauf der auf die Wirkung von chemischen Stoffen hin erfolgenden Inaktivierung der obigen Phagen untersucht und festgestellt, dass die Zeit, in welcher ein gegebener chemischer Stoff in der untersuchten Konzentration die gleiche Phagenver nichtung verursacht wie das ultraviolette Licht, das in der Phagenbevölkerung durchschnittlich 1 Pyrimidindimer hervor ruft, angegeben werden kann. Der Erfindung liegt die Fest stellung zugrunde, dass das Produkt der Konzentration des chemischen Stoffes und der Zeit der die erwähnte Phagen vernichtung verursachenden Wirkung eine Konstante ist und die mutagene Wirkung des gegebenen chemischen Stoffes quan titativ charakterisiert. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der mutagenen Wirkung von chemi schen Stoffen auf Phagen durch eine in vitro durchgeführte Untersuchung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zur statistischen Auswertung der Phagen einer mit einer Puffer- lösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 bereiteten Sus pension der Phagen von einer Konzentration von 106.bis 108 Phagen/ml eine bekannte Menge eines in Wasser, in einer höchstens 20 vol.- h-igen wässrigen Methanol- oder Äthanollösung oder in einer höchstens 38 vol.-%-igen wäB- rigen Dimethylsulfoxydlösung löslichen oder sich mit diesen Lösungsmitteln vermischenden zu untersuchenden chemischen Stoffes zugesetzt wird, wobei als Phagen solche, welche eine kein lysogenes Gen enthaltende doppelsträngige DNS aufweisen, eingesetzt werden, dann der Suspension nach der Zugabe des chemischen Stoffes sofort eine Probe entnommen wird und die Ausgangsphagenkonzentration der Probe (N(0)] durch in an sich bekannter Weise auf einer entsprechenden Wirtszelle durchgeführte Züchtung beziehungsweise Kultivierung bestimmt wird und die den chemischen Stoff enthaltende Phagensuspension auf einer Temperatur von 20 bis 37,5 C, insbesonder 37 C, gehalten wird, der Suspension von Zeit zu Zeit eine Probe entnommen wird und die Konzentration der überlebenden Phagen durch in an sich bekannter Weise auf einer entsprechenden Wirtszelle durchgeführte Züchtung beziehungsweise Kultivierung zum Zeitpunkt der Probenahme [N(t)3 bestimmt wird sowie auf Grund der erhaltenen Angaben der für die mutagene Wirkung charakteristische Zahlenwert errechnet wird. Das Berechnen des für die mutagene Wirkung charakte risttrschen konstanten Zahlenwertes kann wie folgt vorgenommen werden. Es werden die zu den einzelnen Zeitpunkten gehörenden Quotienten ln |N(t)/N(o)| berechnet, durch Berechnung oder auf graphischem Wege die dem Wert ln N(tf X -1 zugehörige Zeit bestimmt und dieser Wert mit der Eonzentra- tion des zu untersuchenden chemischen Stoffes multipliziert. Der als Endergebnis der beschriebenen Bestimmung und Berechnung erhaltene Wert wird im folgenden "pyrimidindi- meräquivalente Dosis" genannt. Die pyrimidindimeräquivalente Dosis ist für jede einzelne Verbindung ein konstanter Wert und charakterisiert die mutagene Wirkung der Verbindung quantitativ. Die pyrimidindimeräquivalente Dosis und die mutagene Wirkung ändern sich in einander entgegengesetztem Sinne, das heisst, dass Je höher die pyrimidindimer äquivalente Dosis einer gegebenen Verbindung ist, um so geringer die mutagene Wirkung der Verbindung ist. Zur Veranschaulichung ist es in der Praxis zweckmässig, zur Charakterisierung der mutagenen Wirkung den Kehrwert dieses Wertes, der sich in gleichem Sinne wie die mutagene Wirkung ändert, statt der pyrimidindimeräquivalenten Dosis zu verwenden. Wenn die reziproke Skala zur Charakterisierung der mutagenen Wirkung verwendet wird und die Zeit bei der Berechnung in Minuten und die Konzentration des zu untersuchenden chemischen Stoffes in Mol/l angegeben werden, dann haben die nicht beziehungsweise weniger gefährlichen Stoffe Werte von 0 bis 1 und die stark imita- genen Stoffe Werte über 1. Im Hinblick darauf, dass für die zur Inaktivierung der Phagen führenden chemischen Reaktionen die Gesetze der grossen Zahlen gültig sind, kann die pyrimidindimeräquivalente Dosis mit zuverlässiger Genauigkeit nur dann bestimmt werden, wenn sehr viele Untersuchungsobjekte (Phagen) in den Versuch einbezogen werden. Daher müssen die Phagen in ausreichend hoher Konzentration eingesetzt werden, wie es oben festgelegt ist. Vorzugsweise wird die Phagenkonzen- tration zu 8 x 106 bis 108 Phagen/ml, insbesondere 8 x 106 bis 5 x 107 Phagen/ml, ganz besonders 107 bis 5 x 10? Phagen/ml, beispielsweise 107 Phagen/ml, gewählt. Vorzugsweise werden als Phagen die 7Phagen eingesetzt. Da die Phagen am vorteilhaftesten in Wasser erhalten werden können, ist das erfindungsgemässe Verfahren besonders vorteilhaft zur Durchführung der Bestimmung der imita- genen Wirkung von wasserlöslichen oder sich mit Wasser vermischenden chemischen Stoffen anwendbar. Unter Berücksichtigung der pH-Empfindlichkeit der Phagen können die Bestimmungen mit solchen chemischen Stoffen, welche den pH-Wert der Puffer unter 6,0 senken, nicht durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, als Phagensuspension eine solche, welche mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bereitet worden ist, einzusetzen. Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1 Bestimmung der mutagene Wirkung von Vitamin B1 Es wurde zu 2 ml einer mit einem Phosphatpuffer aus 0,13 g Magnesiumsulfat (Mg504), 1 g Ammoniumchlorid (NR401), 3 g Kaliumdihydrogenphosphat (EH2P04) und 6 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) in 1 1 Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 bereiteten X7-Phagensuspension mit einer Konzentration von 1 x 107 bis 5 x 107 Phagen/ml die identische Menge von im auf 370C erwärmten Phosphatpuffer derselben Zusammensetzung in einer Konzentration von 0,2 Mol/l (27,8 g/l) gelöstem Vitamin B1 zugegeben. Der Suspension wurde sofort eine Probe entnommen und nach der unten beschriebenen Verfahrensweise wurde die Ausgangsphagenkonzentration (N(0)] bestimmt. Die Suspension wurde in einen auf 370C geheizten Thermostaten eingebracht und zur Bestimmung der Konzentration FN(t)3 der die Wirkung von Vitamin B1 nach dem Ablauf der Jeweiligen Zeit (t) überlebenden Phagen wurde der Suspension 45, 90 135, 180, 300 und 360 Minuten nach dem Beginn der Bebrütung beziehungsweise Inkubation Je 1 Probe mit einem Volumen von 0,05 ml entnommen. Als Blindversuchs- beziehungsweise Kontrollprobe wurde eine X7-Phagensuspension, welche abgesehen vom Zusatz von Vitamin B1 in allem gleich behandelt wurde, verwendet. Der Blindversuchs- beziehungsweise Kontrollsuspension wurde zu gleichen Zeitpunkten wie der mit Vitamin B1 bebrüteten beziehungsweise inkubierten Suspension eine Probe entnommen. Nach insgesamt 6 Probenahmen wurde der Versuch abgebrochen. Die Phagenkonzentration wurde mittels der von der Anmelderin geänderten (Karczag: Dissertation, 1976; Earozag, Fidy, Aczel: Studia Biophys. 30 [1972); Ront6: Disseration, 1979) Titration nach Gratia (Adams: Bacteriophages, Intersci. New York t1959]) wie folgt bestimmt: Die entnommenen Proben wurden im ersten Schritt mit dem Phosphatpuffer der oben angegebenen Zusammensetzung auf 5 ml und dann der ersten Verdünnung entnommene 0,05 ml Proben jeweils erneut auf 5 ml verdünnt. Der zweiten Verdünnung entnommene 0,1 ml Proben wurden mit 1,5 ml dünnem Agar und 0,5 ml E. coli B/r Wirtszellensuspension (Suspendiermedinm: NBhr- bouillon, Konzentration: 108/ml) verrührt und das Gemisch wurde in eine Petri-Schale gefüllt. Die Verdünnung war für die biologische Titration geeignet, wenn in Je 1 Petri-Schale 50 bis 300 aktive Phagen gelangten. Die biologische Titration wurde zweckmässig 4 bis 5-mal wiederholt. Nach dem Erstarren des Oberflächenagars wurden die Petri-Schalen 2 bis 3 Stunden lang in einem Thermostaten bei 37 0C bebrütet beziehungsweise inkubiert. Nach dem Ende der Bebrütung beziehungsweise Inkubation zeigte Je 1 Plaque die Stelle der keine letalen Mutation erleidenden Phagen in den einzelnen Petri-Schalen an; die Zahl der Leerflecke gibt also bei der Probenahme die Zahl der in die Petri -Schale gelangten aktiven Phagen an. Es wurde der Durchschnitt der bei den von gleichen Probenahmen durchgeführten Titrationen erhaltenen Plaques gebildet und aus den Verdünnungsverhältnissen wurde berechnet, wie viele heile Phagen die entnommene Probe ursprünglich enthielt. Aus der ins Verhältnis zum Volumen der Suspension gesetzten Menge der Probe wurde die Menge der überlebenden Phagen [N(t)] bestimmt. Für den Zeitpunkt Jeder einzelnen Probeentnahme wurde der Brudh ln {%\NNOt] errechnet und dieser Wert in Abhängigkeit von der Zeit graphisch (zweckmässig in einem halblogarithmischen Koordinatensystem) dargestellt. Der Anfangsabschnitt der Kurve der so erhaltenen Dosiswirkung wurde durch eine Gerade angenähert und so graphisch der Wert der ln [N(t)] I -1 zugehörigen Bebrütungs- beziehungsweise Inkubationszeit (in Minuten ausgedrückt) bestimmt. Durch die Multiplikation dieser Bebrütungs- beziehungsweise Inkubationszeit (291 Minuten) mit der in Mol/l ausgedrückten Kon- zentration von Vitamin B1 (0,1 Mol/l) wurde die pyrimidin Dosis, deren Wert 29 Mol. Minute betrug, I 1 erhalten. Der Kehrwert der pyrimidindimeräquivalenten Dosis betrug t ) Mol . Minute Beispiel 2 Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise wurden auch die pyrimidindimeräquivalenten Dosen bezie hungsweise deren Kehrwerte von anderen Verbindungen, welchletztere in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind, bestimmt. Tabelle EMI15.1 <tb> <SEP> Kehrwert <SEP> der <SEP> pyrimidin <tb> <SEP> Untersuchte <SEP> dimeräquivalenten <SEP> Dosis <tb> <SEP> Verbindung <SEP> in <tb> <SEP> Mol <SEP> . <SEP> Minute <tb> Nitrosomethylharnstoff <SEP> 0,76 <tb> Äthylenimin <SEP> 6,7 <tb> 4-Desoxy-4-amino-10-methylfolsäure <tb> {4-Amino-N10-methyl-pteroyl-glu <tb> <SEP> taminsäure} <SEP> 11 <tb> <SEP> [Methotrexat] <tb> N-(Acetyl)-äthylenimin <SEP> 33 <tb> {2-(Chlor)-äthyl}-{2-(hydroxy)- <SEP> 38 <tb> <SEP> -äthyl}-sulfid <tb> <SEP> [monofunktioneller <SEP> Schwefelsenf] <tb> 1,4-Di-{2'-(methylsulfonyl)-oxy <tb> äthylamino}-1,4-di-{desoxy}-ery <tb> thrit-dimethylsulfat <SEP> 111 <tb> <SEP> (Lycurim] <tb> Di-{2-(chlor)-äthyl}-sulfid <SEP> 1 <SEP> 000 <tb> <SEP> [bifunktioneller <SEP> Schwefelsenf] <SEP> 1 <SEP> 000 <tb> Die in der obigen Tabelle zusammengestellten Daten stimmen mit der Erfahrung, dass die schädliche Wirkung der untersuchten chemischen Stoffe tatsächlich in der angegebenen Reihenfolge zunimmt, völlig überein und das Verhältnis ihrer in Tierversuchen bestimmten letalen Dosen entspricht den aus den obigen Werten berechenbaren Quotienten. Nach den Untersuchungen betrug die Fehlergrenze bei den Versuchen weniger als 10%. Patentansprüche

Claims: Patentansprüche 1.) Verfahren zur quantitativen Bestimmung der mutage nen Wirkung von chemischen Stoffen auf Phagen durch eine in vitro durchgeführte Untersuchung, dadurch gekennzeichnet, dass man zur statistischen Auswertung der Phagen einer mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 bereiteten Suspension der Phagen von einer Konzentration von 106 bis 108 Pha gen/ml eine bekannte Menge eines in Wasser, in einer höchstens 20 vol.- /-igen wässrigen Methanol- oder Äthanollösung oder in einer höchstens 38 vol.-%-igen wässrigen Dimethylsulfozydlösung löslichen oder sich mit diesen Lösungsmitteln vermischenden zu untersu chenden chemischen Stoffes zusetzt wobei man als Phagen solche, welche eine kein lysogenes Gen ent haltende doppelsträngige DNS aufweisen, einsetzt, dann der Suspension nach der Zugabe des chemischen Stoffes sofort eine Probe entnimmt und die Ausgangs- phagenkonzentration der Probe durch in an sich be kannter Weise auf einer entsprechenden Wirtszelle durchgeführte Züchtung beziehungsweise Kultivierung bestimmt und die den chemischen Stoff enthaltende Phagensuspension auf einer Temperatur von 20 bis 37,4ob hält, der Suspension von Zeit zu Zeit eine Probe entnimmt und die Konzentration der überleben den Phagen durch in an sich bekannter Weise auf einer entsprechenden Wirtszelle durchgeführte Züch tung beziehungsweise Kultivierung zum Zeitpunkt der Probenahme bestimmt sowie auf Grund der erhaltenen Angaben den für die mutagene Wirkung charakteri stischen Zahlenwert errechnet. 2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phagen die T7-Phagen einsetzt. 3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man die Phagenkonzentration zu 8 x 106 bis 108 Phagen/ml, insbesondere 8 x 106 bis 5 x 10 Phagen/ml, wählt. 4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, dass man als Phagensuspension eine solche, welche mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bereitet worden ist, einsetzt. Zusammenfassung

Inventors: GYORGYI, RONTO, DR., IMRE, TARJAN, DR., ISTVAN, SUGAR, DR., SZOMBATHELYI, AGNES, DR., Györgyi, Rontó, Dr., Imre, Tarján, Dr., István, Sugár, Dr.
Applicants: RADELKIS ELEKTROKEMIAI MUSZERGYARTO SZOVETKEZET
Application year: 1983
Main classification: C12Q1
IPC codes: G01N33, C12Q1