PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A HERPES ANTIGEN, APPROPRIATE MEANS THEREFOR AND A PROCESS FOR ITS PRODUCTION, AND THE USE OF THIS ANTIGEN

Abstract: 1. A process for the preparation of glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) or immunogenic components thereof, which comprises introducing the HindIII L fragment of HSV-1 or part fragments which encode these immunogenic components into vectors, and transforming pro- or eukaryotic cells with these vectors and causing them to be expressed in the transformants.

Description: Verfahren zur Herstellung eines Herpes-Antigensj dazu geeignetes Mittel sowie Verfahren zu seiner Herstellung und die Verwendung dieses Antigens Die Erfindung betrifft eine rekombinante Desoxyribonucleinsäure (DNA?, die den genetischen Code fur ein antigenes Protein aus Herpes-Viren enthält, eine Zelle, die jene rekombinante Desoxyribonucleinsäure enthält und dieses antigene Protein produziert, die Verwendung jener rekombinanten Desoxyribonucleinsäure oder dieser Zelle zur Herstellung dieses Proteins sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung dieses antigenen Proteins. Ein Protein, das die Bildung von Antikörpern gegen Herpes-Viren bewirkt, ist von grossem Interesse für die Herstellung von Impfstoffen zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen, die durch diese Viren verursacht werden. Untersuchungen in den letzten Jahren lassen vermuten, dass bestimmte Tumorarten durch Herpesviren (HV) hervorgerufen werden können. Deshalb ist an einen lmpfstoff, beispielsweise gegen Herpes simplex Virus Typ l (HSV-1) oder Typ 11 (HSV-2) die Forderung zu stellen, dass dieser absolut frei sein muss von HSV-DNA (Desoxyribonucleinsäure) oder daB die virale DNA inaktiviert sein muss, um mögliche Transformationen auszuschliessen. Die konventionelle Herstellung eines diesen Forde;ungen entsprechenden Impfstoffes würde aufwendige Relnigungs- schritte verlangen. Als antigene Komponenten von HSV wurden bisher einige Glycoproteine beschrieben, die in der Hülle des Virus integriert sind (sogenannte HüllproteIne) und denen Genorte auf der HSV-DNA zugeordnet werden konnten. Es bestand also die Aufgabe, ein Herpes-Antigen herzustellen, das frei von Nucleinsäure von Herpesviren ist und zur Herstellung eines lmpfstoffes gegen Erkrankungen geeignet ist, die von Herpesviren verursacht werden. Die Aufgabe wurde nun dadurch gelöst, dass ein Genomabschnitt (DNA) aus einem Herpes simplex-Virus isoliert und in einen Mikroorganismus transferiert wird, in dem diese DNA repliziert und exprimiert wird. Im folgenden wird die Kloni-erung des Gen abschnittes, der für das Glycoprotein C (gC) codiert, beschrieben. Analog durchführbar ist das Verfahren auch für die anderen bereits beschriebenen Hüllproteine gA, gB, gD und gE sowie für jedes andere virale Protein. In der Europäischen Patentanmeldung 0 013 828 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit antigenen Eigenschaften des Hepatitis B-Virus beschrieben, in welchem aus der DNA des Virus eine DNA-Sequenz, die für eine antigene Determinante des Virus codiert, mit DNA eines sogenannten "cloning vehicle1' oder "Vektor" verbunden und diese kombinierte Desoxyribonucleinsäure in eine Wirtszelle eingeschleust wird, so dass diese das Polypeptid mit den antigenen Eigenschaften des Hepatitis B-Virus produziert. im folgenden wird ein zur Lösung der gest-ellten Aufgabe geeignetes Verfahren beschrieben. Es sind jedoch auch Varianten dieses Verfahrens für den erfin'dungsgemässen Zweck verwendbar, beispielsweise solche mit anderen Vetor-Wirtszellen-Kombinationen. 1. Gewinnung Virus-spezifischer Nucleinsäure 1.1 Wahl des HSV-Stammes )nfektionen mit hohen Infektionsdosen führen in vielen Virussstemen zur Bildung von defekten Virusgenomen. Deshalb wurde zur Vermeidung solcher Artefakte ein klo nierter Virusstamm verwendet, mit dem in geringer Multi plizität (o,l PFU/2elle) Wirtszellen, beispielsweise Verozellen, infiziert wurden. Wir verwendeten HSV-1 Stamm F. Bei Arbeiten mit anderen Stämmen (mit z.B. cos oder tflclntyre) wäre ebenso zu verfahren. 1.2 isolierung der HSV-DNA Zur Vermeidung von Verlusten, die bei einer Virusreini gung entstehen, wurde die virale DNA direkt aus dem Zell-Lysat oewonnen. Hierfür wurde die Zentrifugation im hoch auflösenden Dichtegradienten (KJ, NaJ) verwendet, die eine weitgehende Abtrennung der in der Schwimmdichte signifikant verschiedenen Zell-DNA von der viralen DNA ermöglichte. Die Zugabe von interkal ierenden Farbstoffen, - beispielsweise Ethidiumbromid, machte eine direkte Sichtkontrolle des Trennungsergebnisses und der Gewin nung der viralen DNA möglich (Walbromers and Scheggat, Virology (1976) 74, 256-258?. 2. isolierung eines Genomabschnittes, der für ein anti genes Protein aus der Virushülle codiert HSV1-DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen hydroly siert und die DRA-Fragmente in einem Agarosege# elektro phoretisch getrennt. Hierzu eignet sich die Nuclease Hindil] da nach Verdauung der DNA mit die sen Enzymen die vollständige Information für gC auf ei nem spezifischen Fragment lokalisiert ist (HindIII-K Fragment). Das HindIII-K-Fragment (DNA-Abschnitt : 0,592 - 0.647, ca. 8200 bp, siehe auch Figur 1) wurde aus dem Agarosegel extrahiert (J. Langridge et al., Analyt. Biochem. 103, 264-271 (1980). Ebenso lässt sich die DNA mit Methoden isolieren, wie sie H.O.Smith beschreibt (Meth. Enzymol. 65@-371-380 (1980??. 3. Herstellung eines Plasmids, das den HSV-DNA- HindIII-K-Abschnitt besitzt und Transformation von Eakterien mit diesem rekombinanten Plasmid Das HindIII-K-Fragment wurde in das Tetracyclingen (Tet-Gen) des Plasmids pBR 322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)) ligiert (F. Bolivar and K. Backman, Meth Enzymol. 65, 245 (1980) (Abb. 1)) und in Escherichia coli Stamm HB 101 transformiert. Ausser dem Plasmid pBR322 können auch andere geeignete Vektoren verwendet werden wie zum Beispiel pBR327, pSR328 ocer pBR329 (-L. Covarrubias and F. Bolivar, Gene 17, 79 - 89 (1982) oder pUC7, pUC8 oder pUC9 (J. Messing, Recombinant DNA, A.G. Walton, ed. 143-153 (1981), Elsevier Scientific Publishing Comp., Amsterdam) oder das Plasmid pUR 222 (U. Rüther et al., Nucl. Acids Res. 9, 4087 - 4098 (1981)). Neben dem Stamm HB 101 sind andere Stämme von E.coli wie C600 (B.Bachmann, Bacteriol. Rev. 36, 525-557 (1972)), RR1, SF8 oder SK1592 mit ähnlichen Methoden wie der von uns verwendeten transformierbar (S.L Peacock et al., Biochim. Biophys. Acta 635, 243-250, (1981); M.G.M. Brown et al., FEMS Microbiol. Lett. 5, 219-222 (1979)). fiei Transformationen von eukaryontischen Zellen könnte man als Vektoren zum Reispiel verwenden: Bovine Papilloma-Virus-DNA (N. Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1, 486 bis 496 (1981); SV40 (a.T. Elder et al., Ann. Rev. Genetics 15, 295 - 340 (1981) oder chimäre Plasmide Wie pSG (R.M. Sendai-Goldin et al., Mol. Cell. Biol. 1, 743-752 (1981)). 4. Selektionierung geeigneter Klone Die mit rekombinanten Plasmiden transformierten Zellen wurden auf Petrischalen mit L-Broth als Nährquelle unter Zusatz von Na-Ampicillin (50 mg/l) ausgespatelt und 1 Tag bei 370C inkubiert. Klone, die sich als Ampicillin resistent und Tetracyclin sensitiv erwiesen, wurden gegen radioaktives HSV-1-Hind III-L-Fragment hybridisiert (E. Southern, Meth. Enzymol. 65, 152-176 (1980)). Positive klone wurden in je 5,0 ml Flüssigkultur angezüchtet und die DNA isoliert (H.M. Goodman and R.J. MacDonald, Meth. Enzymol. 65, 75-90 (1980); D.S. Holmers and M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)). Durch Verdauung der rekoSbinierten Plasmide mit den Endonucleasen Hind III, Bam HI, Sal I, Pvu I, Pvu II und Mst II und Verlgeich mit der Restriktionskarte von HSV-1-Stamm COS, wurden Klone eindeutig identifiziert, die das Hind III-L-Fragment in die Hind 111-Stelle des pBR 322 integriert hatten. Die Orientierung des L-Fragmentes und der gC-mRNTA in pED HSV 9 ist in Figur 1 dargestellt. 5. Verkürzung des Hind III-L-Fragmentes und Umklonierung des Fragments Das gC ist ein spätes (&gamma;) Protein, dessen mRNA auf dem rechten Teil des Hind III-L-Fragmentes lokalisiert ist (Fink-et al., J. Virol. in press, 1983). Da die gC-mRNA, die den Peptidanteil des gC codiert, vermutlich nicht gesplissen wid, kann die genomische Information in Prokaryonten exprimiert werden. Erstrebenswert ist es dabei, nicht benötigte DNA-Anteile des Hind III-L-Fragmentes zur Synthese des'gC zu entfernen. Dies kann unter anderem durch Verdauung der DNA mit geeigneten Endonucleasen erreicht werden. Durch Verdauung des Hind III-L-Fragmentes 5'endig vom Translationsstart mit der E > .onuklease Bal 3 bis zum Translationsstart und Ligierung des verkürzten L-Frag- mentes hinter einen effizienten Promotor (wie z.B. Trp-, Lacoder Tac-Promotor) kann in prokaryontischen Systemen eine hohe Syntheserate des gC-Polypeptids erreicht werden (Figur 2). Um eine Antikörperproduktion veranlassen zu können, wird eventuell nicht das Gesamtprotein gC benötigt, sondern nur ein Tei des Proteins, das antigene Determinanten trägt. Zur ProduXtion solcher Poleptide können klonierte DNA-Fragmente verwendet werden, bei denen mit Exonucleasen wie Bal31 in den codierten Bereich des gC hinein abgebaut worden ist oder Subfragmente des Hind III L-Fragmentes, wie beispielsweise das Eco/Hind IL-Fragment. Die Linierung des Eco/Hind-IL-Fragments in die Eco RI-Stelle hinter den lac UV 5 promotor in pUC 8 ermöglicht die Synthese eines Fusion sprot eins mit den ersten NH2-terminalen Aminosäure der B-Galactosidase und dem gröBten Teil des gC-Polypeptids (Figur 3). Eine Klonierung und Exprcssion anderer antigene Glycoproteine von HSV als des gC kann analog den hier aufgeführten Vorgängen erfolgen. Wenn ein Spleissen der entsprechenden mRNAs erfolgt kann die komplementäre DNA (cDNA) zur Expression der Glycoproteine verwendet werden, wobei kleine klonierte DNA-Fragmente wie das Eco/Hind-IL- Fragment, an das nur die gCmRNA von HSV-l bindet, zur Selektionierung der entsprechenden mRNAs aus einem Lysat von mit HSV infizierten Zellen dienen können. Aber auch eine Klonierung der genomischen DNA ist in solchen Fällen denkbar, da auch das entsprechende, in Prokaryonten gebildete Genprodukt, trotz der hier nicht vorhandenen Splicing-Mechanismen ein Protein darstellen kann; das einige oder alle antigene Determinanten trägt. Sogar eine Verknüpfung von DNA Fraomenten verschiedener Gene aus nur einem oder aus zwei unterschiedlichen Typen von Herpesviren und eine Expression solch eines Hybridproteins ist möglich. Weiterhin ist eine Expression in eukaryontischen Zellen (Hefe, tierische Zellkulturen) möglich, vor allem dann, wenn eine Glycosilierung des Proteins wünschenswert ist. Wegen seiner antigenen Eigenschaften ist ein solches Protein geeignet 2ur Gewinnung von Antiseren und/oder Impfstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Adjuvantien und ueblichen Hilfsstoffen. Es kann auch für diagnostische Zwecke verwendet werden, beispielsweise zum Nachweis von Antikörpern gegen Herpes- Viren. Antiseren gegen ein solches Protein können zum Nachweis von Herpes-Viren selbst dienen.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer antigenen Determinante des Herpes simplex Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der 9esoxyribo- nucleinsäure dieses Virus einen Genomabschnitt iso- liert, der für ein solches Polypeptid kodiert, den Genomabschnitt enzymatisch an die Desoxyribonucleir.- säure eines Vektors bindet, diese kombinierte Des oxyribonucleinsäure in eine Zelle einbrinot, in welcher die kombinierte Desoxyribonucleinsäure die Produktion dieses Polypeptids bewirkt, und dieses Polypeptid gewinnt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Genomabschnitt das' HindIII-L-Fragment der Herpes simpiex-Desoxyribonucleinsäure (Genomabschnitt 0.592 bis 0.647) ist. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Genomabschnitt ein Teil des Hindlil-L-Frao- mentes der Herpes simplex-Desoxyribonucleinsäure ist. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor das Plasmid pBR322 ist. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kombinierte Desoxyribonucleinsäure aus dem Genomabschnitt 0.592 bis 0.647 und dem Abschnitt - der Desoxyribonucleinsäure des Plasmids pBR322 be steht. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kombinierte Desoxyribonuclelnsäure ein Teil des Genomabschnittes 0.592 bis 0.647 und eines Ab schnitts der Desoxyribonucleinsäure eines Vektors ist. 7. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die Zelle ein Bacillus, ein Actinomycet, eine Hefe oder eine tierische Zelle ist. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle Escherichia coli ist. 9. Polypeptid erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 8. 10. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 9 zur Gewinnung eines Antiserums und/oder zur Herstellung eines Impfstoffs oder eines diagnostischen Mittels.

Inventors: BROKER, MICHAEL, DR., WINNACKER, ERNST-LUDWIG, PROF. DR., WOLF, HANS, PROF. DR., Bröker, Michael, Dr.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1983
Main classification: C12N15
IPC codes: C07K14, C12P21, C12N15, G01N33, A61K39