CULTURES OF MICROORGANISMS DEGRADING POLYSUBSTITUTED AROMATIC HYDROCARBONS, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE IN BIOLOGICAL PURIFICATION PLANTS

Abstract: 1. Microorganism cultures degrading multiply substituted hydrocarbons carrying non-identical substituents, consisting of microorganisms adhering to carrier materials which carry positive charges, which microorganisms can be propagated with multiply-substituted aromatic hydrocarbons as the only source of hydrocarbons.

Description: Mehrfach substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen-Kulturen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in biologischen Kläranlagen Bei den bekannten. Verfahren der biologischen Abwasserreinigung werden durch den Stoffwechsel von Mikroorga- nismen die als biologisch leicht abbaubar geltenden Abwasserinhaltstoffe eliminiert. Biologisch als schwer abbaubar geltende, im Abwasser gelöste organische Substanzen werden dabei im allgemeinen, wenn überhaupt, nur in geringem Masse, vor allem durch Fällung und Adsorption, aus dem Abwasser entfernt. Auch durch eine mehrstufige biologische Reinigung wird keine wesentliche Verbesserung für die Elimination biologisch schwer abbaubarer Abwasserinhaltstoffe erreicht. In Einzelfällen sind spezielle Mikroorganismen bekannt geworden, die schwer abbaubare Stoffe in ihrem Stoffwechselprozess abbauen können. So sind z.B. Organismen bekannt, die einfache Naphthalinsulfonsäuren oder Chloraromaten abzubauen vermögen. Jedoch kommen solche speziellen Mikroorganismen in den üblichen Klär anlagen nicht vor Dies ist einerseits bedingt durch die geringe Vermehrungsrate dieser Organismen, die bei Anwesenheit von biologisch gut abbaubaren Substanzen von den anderen anwesenden Mikroorganismen überwachsen werden und darüber hinaus eine Abbaurepression bei den speziellen Organismen für die Elimination der schwer abbaubaren Verbindungen durch leicht abbaubare erfolgt. Andererseits können diese speziellen Organismen wegen ihrer schlechten Flockbarkeit bzw. ihrer schlechten Aufwachseigenschaft kaum im System zurückgehalten werden. Sie schwemmen aus. Es wurde daher bereits vorgeschlagen, solche Mikroorganismen auf geeigneten Substraten zu fixieren, so dass sie im System erhalten bleiben. Wegen der hohen Eigentoxizität, der geringen Abbauleistung der Mikroorganismen und der Entstehung toxischer Abbauprodukte ist der Abbau solcher schwer abbaubaren Stoffe im allgemeinen nicht über das Laborstadium hinausgekommen. Eine Ausnahme bilden hier Chloraromaten, für die leicht adaptierbare Mikroorganismen in der Natur vorhanden sind. Als besonders problematisch im Hinblick auf den mikrobiologischen Abbau gelten mehrfach substituierte Naphthaline, insbesondere Naphthalinsulfonsäuren, die sogenannten Buchstabensäuren. Wenn in Einzelfällen ihre Entfernung aus Kulturflüssigkeiten mit Mischpopulation gelang, wird dies auf intracelluläre Akkumulation zurückgeführt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es zunächst, Mikroorganismen aufzufinden, die mit Buchstabensäuren als einziger Kohlenwasserstoff-Quelle vermehrt werden können. Dabei wurde ein neuer Konstruktionsweg für Mikroorganismen aufgefunden, mit dem solche Mikroorganismen hergestellt werden können. Jedoch waren die so hergestellten Mikroorganismen noch nicht für den Einsatz in biologischen Kläranlagen geeignet, da der Abbau unter gleichzeitiger Ausscheidung von z.T. toxischen Zwischenprodukten erfolgte. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher weiterhin, die Mikroorganismen so weiterzuentwickeln, dass sie einen Totalabbau der Buchstabensäuren bewirken können. Es wurde gefunden, dass dies durch einen weiteren Adaptionsschritt gelingt, bei dem die Mikroorganismen auf speziell präparierten Festkörperoberflächen fixiert sind. Schliesslich wurde gefunden, daB sich das erfindungsgemässe Konstruktionsprinzip so verallgemeinern lässt, dass für eine Vielzahl schwer abbaubarer, mehrfach verschieden substituierter Kohlenwasserstoffe Mikroorganismen Kulturen hergestellt werden können, die mit diesen mehrfach verschieden substituierten Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenwasserstoff-Quelle unter Totalabbau vermehrt werden können. Es wurde ferner gefunden, dass die erhaltenen Mikroorganismen-Kulturen auch in Mischkulturflüssigkeiten, wie sie z.B. in biologischen Kläranlagen vorliegen, stabil bleiben und ihre Fähigkeit zum Totalabbau behalten. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher mehrfach substituierte Kohlenwasserstoffe mit nicht identischen Substituenten total abbauende Mikroorganismen Kulturen, bestehend aus an positive Ladungen tragenden Festkörperoberflächen anhaftenden Mikroorganismen, wobei die Mikroorganismen mit diesen mehrfach substituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenwasserstoffguelle vermehrt werden können. Als Substituenten im Sinne der vorliegenden Erfindung zählen anorganische Säurereste wie -CN-NO2, -Cl, -SO3 Aminreste, Aliphaten,-wie z.B. Methyl, Ethyl oder substituierte Aliphaten. Ferner können OH-Gruppen oder COOH-Gruppen vorhanden sein. Bei aliphatischen Kohlenwasserstoffen und einfachen Ringsystemen sollen unter "mehrfach substituiert" OH-, COOH- und Alkyl-O-Gruppen nicht mitgezählt werden. In diesem Sinne soll Nitrophenol als einfach substituiert gelten, obwohl eine OH Gruppe als zweiter Substituent. vorhanden ist. Entsprechend gilt Nitrokresol als zweifach substituiert und Chlornitrokresol als dreifach substituiert. Dagegen sollen bei mehrfach cyclischen Systemen wie substituierten Naphthalinen unter "mehrfach substituiert" OH- und COOH Gruppen mitgezählt werden. Zum Beispiel soll Hydroxynaphthalinsulfonsäure als zweifach substituiert gelten. Diese Zählweise der Substituenten hat ihren Grund darin, dass bei den einfacher aufgebauten Verbindungen der mikrobiologische Abbau durch OH- und COOH-Gruppen im allgemeinen nicht erschwert wird. Diese Substituen ten können daher bei der Auswahl spezieller Mikroorganismen ausser Betracht bleiben. Nicht identische Substituenten im Sinne der vorliegenden Erfindung liegen dann vor, wenn unter den "zählende" Substituenten mindestens zwei verschiedene Substituenten vorhanden sind. Zum Beispiel gilt ein Nfach substituierter Kohlenwasserstoff dann als nicht identische Substituenten aufweisend, wenn höchstens N - 1-Substituenten identisch sind. Mehrfach substituierte Kohlenwasserstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind mindestens zweifach, vorzugsweise zwei- bis zehnfach und insbesondere dreifach substituierte Kohlenwasserstoffe im Sinne der o.g. Zählung. Als Kohlenwasserstoffe kommen aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe in Frage, bis hin zu höhermolekularen wasserlöslichen Verbindungen, wie sie bei der Herstellung von Pflanzenschutzmitteln und Farbstoffen. vorkommen. Als zweifach substituierte Benzole bzw. Phenole sind Nitrochlorbenzol, Nitrochlorphenol, Nitrokresol, Nitrotoluol, Nitroanilin, und Aminonitrophenol zu nennen. Als dreifach substituierte Benzole bzw. Phenole sind Chlornitrokresol, Chlornitrotoluol und Chlornitroanilin zu nennen. Als substituierte Mehrfachringsysteme sind vor allem Naphthaline zu nennen, insbesondere Naphthalinsulfon säure, z.B. Hydroxynaphthalinsulfonsäure, Amino-naphthalin-sulfonsäuren, Amino-hydroxy-naphthalin-sulfonsäuren und Amino-naphthalin-disulfonsäuren. Als Trägermaterialien, die Festkörperoberflächen mit positiven Ladungen aufweisen, können Ionenaustauscher, geladene Polyurethane, Polystyrol oder Trägermaterialien mit speziell präparierten Oberflächen wie Polyethylenkugeln, die mit einem positiv geladenen Polyelektrolyten (z.B. Prestamenol) behandelt wurden, eingesetzt werden. Es können aber auch gelartige Trägermaterialien wie z.B. mit Aluminiumverbindungen behandelte SiO2-Gele oder -Sole oder gelartige Polyisocyanate eingesetzt werden. Wesentlich ist, dass oberflächlich positive Ladungen vorhanden sind. Die Auswahl der Trägermaterialien erfolgt in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Einsatz der erfindungsgemässen Mikroorganismen-Kulturen. Zum Beispiel ist es für ein Tropfkörperverfahren zweckmässig, die Mikroorganismen-Rulturen in Form von auf behandelte Polyethylenkugeln aufgebrachten Mikroorganismen einzusetzen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von mindestens N-fach substituierte Kohlenwasserstoffe mit nicht identischen Substituenten abbauenden Mikroorganismen-Kulturen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) zunächst verschiedene, höchstens (N - 1)-fach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikro organismen mit diesen höchstens (N - 1)-fach sub stituierten Kohlenwasserstoffen als Kohlenwasser stoff-Quelle getrennt vermehrt werden, b) wobei die Substituenten der höchstens (N - 1)-fach substituierten Kohlenwasserstoffe gemeinsam min destens alle Substituenten der N-fach substituier ten Kohlenwasserstoffe mindestens einmal aufweisen, c) die verschiedenen, an höchstens (N - 1)-fach sub stituierte Kohlenwasserstoffe adaptierten Kulturen vereinigt werden und durch allmählichen Austausch des Substrates durch den N-fach substituierten Kohlenwasserstoff an diesen adaptiert werden, d) die N-fach substituierte Kohlenwasserstoffe. abbauen den Mikroorganismen auf positive Ladungen tragende Trägermaterialien aufgebracht werden und e) unter Zugabe des N-fach substituierten Kohlenwas serstoffs weiter vermehrt werden. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren handelt es sich demnach um ein Verfahren, das aus drei Adaptionsschritten besteht. Das Verfahren geht aus von Mikroorganismen, die geringer substituierte Kohlenwasserstoffe abzubauen vermögen. In einem ersten Adaptionsschritt (oben genanntes Merkmal a) werden diese Mikroorganismen einem erhöhten Selektionsdruck dadurch ausgesetzt, dass sie mit den geringer substituierten Sohlenwasser- stoffen als Kohlenstoff-Quelle vermehrt werden. Dabei werden mehrere, vorzugsweise mindestens zwei. verschiedene Populationen mit verschieden substituierten Kohlenwasserstoffen getrennt vermehrt. Vorzugsweise soll der Kohlenwasserstoff, an dessen Abbau adaptiert wird, einen merklich, besonders bevorzugt den überwiegenden Teil des Substrates bilden, sodass ein ausreichender Selektionsdurck ausgeübt wird. In einem zweiten Adaptionsschritt (oben genanntes Merkmal c) werden diese verschiedenen Populationen vereinigt und an den höher substituierten Kohlenwas- serstoff adaptiert und vermehrt. Es wird angenommen, dass in diesem Adaptionsschritt zwischen den vorher getrennt vermehrten Mikroorganismen durch Plasmidübertragung Abbaueigenschaften übertragen werden. Selektive Adaption dürfte in diesem Adaptionsschritt höchstens von untergeordneter Bedeutung sein. Es wird eine Mikroorganismen-Population erhalten, die die höher substituierten Kohlenwasserstoffe zwar abbauen kann, jedoch Zwischenprodukte des Abbaus ausscheidet. Im dritten Adaptionsschritt (oben genanntes Merkmal e) werden schliesslich Mikroorganismen-Kulturen erhalten, die den Totalabbau der höher substituierten Kohlenwasserstoffe bewirken. Es ist nicht bekannt, welche Veränderungen die Mikroorganismen-Kultur in diesem dritten Adaptionsschritt erfährt. Jedoch wird vermutet, dass eine Art katalytische Aktivierung der Mikroorganismen erfolgt. Diese katalytische Aktivierung erfolgt offenbar nicht spontan, sondern benötigt eine gewisse Gewöhnungszeit, die zwischen wenigen Tagen und einem Monat betragen kann. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung der höher substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen kann von bekannten, die einzusetzenden niedriger substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen ausgegangen werden, soweit diese zur Verfügung stehen. Stehen die niedriger substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen nicht zur Verfügung, kann a priori begonnen werden. Hierzu werden in bekannter Weise Proben von Oberflächengewässern, aus Kläranlagen oder Waldböden eingesetzt, aus denen durch Vermehrung unter Zugabe von Nährlösungen und Separation Mischpopulationen gezüchtet werden. Aus diesen Mischpopulationen werden in bekannter Weise durch Selektionsverfahren Mikroorganismen gewonnen, die die entsprechenden nicht oder nur einfach substituierten Kohlenwasserstoffe abbauen. Aus den entsprechenden nicht substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen gelingt es im allgemeinen in aufeinanderfolgenden Adaptionsschritten Mikroorganismen zu gewinnen, die zunächst einfach substituierte Kohlenwasserstoffe und danach zweifach substituierte Kohlenwasserstoffe abzubauen vermögen. Liegen bereits verschieden einfach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen vor, können die zweifach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen vorteilhaft nach dem erfindungsgemässen Verfahren gewonnen werden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann demnach mehrfach wiederholt werden, indem zunächst aus einfach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen zweifach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen gewonnen werden, aus diesen zweifach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen durch Wiederholung des erfindungsgemässen Verfahrens dreifach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen gewonnen werden. Allgemein gelingt es, aus (N - fach substituierte Kohlenwasser- stoffe abbauenden Mikroorganismen N-fach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen zu gewinnen. Obwohl es erfindungsgemäss bevorzugt ist, zur Gewinnung von N-fach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen von (N - 1)-fach substituierte Kohlen- wasserstoffe abbauenden Mikroorganismen auszugehen, ist dies jedoch nicht in jedem Fall notwendig. Zum Beispiel gelingt die Herstellung von 3-fach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen in bestimmten Fällen auch dann, wenn von einem zweifach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden und einem einfach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismus ausgegangen wird. Wesentlich ist lediglich, dass alle Substituenten im ersten getrennten Adaptionsschritt vorhanden sind. Obwohl es ferner erfindungsgemäss bevorzugt ist, zur Herstellung mehrfach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauender Mikroorganismen von jeweils geringer substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen auszugehen, wobei die Kohlenwasserstoffe mit Ausnahme der Substituenten identisch sind, ist dies nicht in jedem Fall notwendig und möglich. Wesentlich ist, dass mit dem geringer substituierten Kohlenwasserstoff die Mikroorganismen an einen identischen ersten Abbauschritt adaptiert werden. So kann z.B. zur Herstellung von mehrfach substituierten komplizierteren Ringsystemen abbauenden Mikroorganismen für den ersten Adaptionsschritt auch ein niedriger substituiertes weniger kompliziertes Ringsystem als Substrat vorgesehen werden. Zum Beispiel gelingt es aus an Naphthalinsulfonsäure und an Anilin im ersten Adaptionsschritt getrennt adaptierte Mikroorganismen im zweiten Adaptionsschritt Aminonaphthalinsulfonsäure abbauende Mikroorganismen zu erhalten, die dann im dritten Adaptionsschritt weiter für den Totalabbau adaptiert werden können. Erfindungsgemäss wird im zweiten Adaptionsschritt bevorzugt von zwei getrennt an den Abbau von niedriger substituierten Kohlenwasserstoffen adaptierten Mikroorganismen ausgegangen, wobei die zwei verschieden substituierten Kohlenwasserstoffe bereits alle Substituenten des höher substituierten Kohlenwasserstoffs enthalten. Jedoch ist nicht ausgeschlossen, dass der zweite Adaptionsschritt an z.B. dreifach substituierte Kohlen- wasserstoffe auch dann gelingt, wenn von drei nur ein fach unterschiedlich substituierte Kohlenwasserstoffe abbauenden Mikroorganismen ausgegangen wird. Am einfachsten gelingt der zweite Adaptionsschritt dann, wenn der den Abbau am meisten behindernde Substituent bereits in jedem der Substrate des ersten Adaptionsschrittes vorhanden war. So geht man z.B. vorteilhaft von substituierte Naphthalinsulfonsäuren abbauenden Mikroorganismen aus, wenn man höher substituierte Naphthalinsulfonsäure abbauende Mikroorganismen gewinnen will, da die Sulfonsäuregruppe in dieser Substanzklasse den Abbau am stärksten behindert. Auf die erfindungsgemäss wesentliche Bedeutung des dritten Adaptionsschritts wurde bereits hingewiesen. Wesentlich für den dritten Adaptionsschritt ist, dass die auf das Trägermaterial aufgebrachten Mikroorganismen auf spezifischem Substrat adaptiert werden. Dieser dritte Adaptionsschritt gelingt z.B. nicht, wenn die Mikroorganismen-Kultur, d.h. Mikroorganismen mit Trägersubstanz, in eine biologische Kläranlage eingebracht wird, auch wenn diese die speziellen mehrfach substituierten Kohlenwasserstoffe enthält. Es wurde jedoch gefunden, dass verschiedene, erfindungsgemäss erhaltene, verschiedene mehrfach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauende Mikroorganismen gleichzeitig auf Trägerkörper aufgebracht werden können und gemeinsam dem dritten Adaptionsschritt unterzogen werden können, wenn ein entsprechend abgestimmtes Mischsubstrat als gemeinsame Kohlenwasserstoffquelle für die verschiedenen Mikroorganismen eingesetzt wird. Das Mischsubstrat soll die substituierten Kohlenwasserstoffe enthalten, auf denen die Mikroorganismen im zweiten Adaptionsschritt getrennt gezüchtet wurden. Darüber hinaus ist die Anwesenheit einer gewissen Menge anorganischer Salze vorteilhaft. Ferner können noch substituierte Kohlenwasserstoffe, die in verschiedenen ersten Adaptionsschritten als Substrat eingesetzt waren, in dem Mischsubstrat enthalten sein. Das Mischsubstrat soll jedoch nicht solche Substanzen in merklicher Konzentration, z.B. mehr als 20 %, enthalten, die in üblichen Abwässern zum BOD beitragen. Vorzugsweise hat das Mischsubstrat die Zusammensetzung der biologisch abzubauenden, schwer abbaubaren Substanzen im Abwasser ohne Berücksichtigung der BOD-Substanzen. Die erhaltenen Mikroorganismen-Kulturen, bestehend aus Mikroorganismen und Trägermaterial, sind als solche transport- und lagerfähig. Nach längerer Lagerzeit ist lediglich eine Reaktivierung auf dem entsprechenden Substrat als Nährlösung zweckmässig. Sind die Mikroorganismen-Kulturen einmal vorhanden, so reicht es für ihre Vermehrung, in eine entsprechende Nährlösung als Substrat, in der sich die entsprechenden Mikroorganismen-Kulturen (Trägermaterial plus Mikroorganismen) befinden, zusätzlich Trägermaterialien einzuführen, auf die dann die entsprechenden Mikroorganismen aufwachsen. Die Vermehrung kann demnach in einem kontinuierlichen Reaktor erfolgen, in dem Trägermaterialien und Nährlösung unter Belüftung eingeführt werden und kontinuierlich Mikroorganismen-Kul turen zum Einsatz in biologischen Kläranlagen entnommen werden. Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele weier erläutert: Beispiel 1: Gewinnung von Mikroorganismenkulturen zum Abbau von mehrfach substituierten Naphthalinsulfonsäuren Als Ausgangskultur zur Herstellung einer Mikroorganismenkultur, die mehrfach substituierte Naphthalinsulfonsäuren abbauen kann, dienten zwei Pseudomonas-Stämme A 3 und C 22. (H.J. Knackmuss, Appl. Environ Microbiol., Vol. 42, p 44-55, 1981). Diese zum Abbau von einfach substituierten Naphthalinsulfonsäuren befähigten Stämme (Abbau von Naphthalin-1-Sulfonsäure (NS-1) und Naphthalin-2-Sulfonsäure (NS-2) wurden mit Belebtschlamm einer Kläranlage der chemischen Industrie (Bayer AG, Dormagen/ Bayer AG, Leverkusen) kombiniert und in Erlenmeyerkolben mit je 0,1 % NS-1 und NS-2 angezogen. Der Belebtschlamm war in der Lage, einfach phenolische Aromaten abzubauen. Die Adaption dieses Kulturgemisches an zweifach substituierte Naphthalinsulfonsäuren erfolgte im 10 1 Massstab (Fermenter Fa. Braun-Melsungen). Die Nährlösung enthielt neben je 0,1 % NS-1, NS-2, Naphthalin1,6-disulfonsäure (NS-1,6), Naphtahlin-2,6-disulfonsäure (NS-2,6) und 6-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure (Schäffersäure). Als zusätzliche Wachstumssubstrate dienten je 0,05 % Ethanol und Acetat. Nach dem Anwachsen des Kulturgemisches wurde in kontinuierlicher Kultur die Züchtung für den Abbau von zweifach substituierten Naphthalinsulfonsäuren begonnen. Die Verweilzeit der Nährlösung betrug am Anfang 50 Stunden. Sie wurde über etwa 3 Monate beibehalten und dann innerhalb eines Monats schrittweise auf 20 h verringert. Der Abbau der zweifach substituierten Naphthalinsulfonsäuren betrug dann mehr als 80 %. Die kontinuierliche Fermentation dieser Kulturen mit einer der Nährlösung zugesetzten Amino-Naphthalinsulfonsäure, 7-Amino-4-hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure (I-Säure), brachte lediglich Abbauwerte unter 50 %. Eine Kultur, die Naphthalinsulfonsäure mit zusätzlichem Aminorest abbaut, wurde durch gemeinsame Züchtung mit eier Anilin-abbauenden Kultur gewonnen, wobei die Anilinkultur aus klärschlamm von Kläranlagen der chemischen Industrie durch Adaption an 100 ppm Anilin stammte. Die Napthalinsulfonsäure-Kultur wurde mit der Anilin-abbauenden Kultur gemeinsam in einem 10 1-Permenter gezogen. Die Nährlösung enthielt NS-2 200 ppm NS-1 200 ppm Schäffersäure 200 ppm Anilin 100 ppm Gamma-Säure (6-Amino-4-hydroxi-2 naphthalinsulfonsäure) 50 ppm Nach dem Anwachsen der kombinierten Kultur wurde mit einer Verweilzeit von 20 h die kontinuierliche Züchtung begonnen. Nach 10 Tagen wurden etwa 85-90% der Naptha linsulfonsäuren abgebaut. Dieser Abbauwert blieb über mehrere Monate konstant. Danach wurde 50 ppm I-Säure und nach 7 Tagen 100 ppm I-Säure der Nährlösung zugesetzt. Der Abbau ging auf 70-80% zurück, blieb aber über ein Jahr bei kontinuierlicher Züchtung konstant. Die Verschlechterung des Abbaues um 10-20 % war auf die Bildung und Anhäufung von Zwischenprodukten des Abbaues von Aminonaphthalinsulfonsäuren zurückzuführen. Diese Substanzen führen zu einer intensiven Braunfärbung des Kulturmediums. Die weitere Entwicklung der Kultur erfolgte in 1 1-Erlenmeyerkolben. Diese weitere Entwicklung wird anhand der Figuren 1 und 2 gleichzeitig näher erläutert: Fig. 1 zeigt den Verlauf des Abbaus des organischen Kohlenstoffs (TOC) während der weiteren Entwicklung. Fig. 2 zeigt Chromatogramme eines Abbauproduktes von Clevesäure von bei in Fig. 1 angegebenen Zeitpunkten der Entwicklung entnommenen Proben. Die Nährlösung enthielt: NS-1 250 ppm NS-2 250 ppm Anilin 250 ppm Clevesäure-1,7 250 ppm (8-Amino-2-naph thalinsulfonsäure) Die Kultur wurde zunächst batchweise unter Schütteln angezogen, wobei alle 2-5 Tage die Nährlösung erneuert wurde. Unter diesen Bedingungen wurde 75 Tage kultiviert. Der Abbau der organischen Komponenten lag bei etwa 70 % (Fig 1, Phase 1). Der Rest war ein Abbauprodukt der Clevesäure-1,7, das mittels HPLC-Analytik als neue Substanz erfasst werden konnte. (Fig. 2, Chromatogramm I, Peak A). Nach 75 Tagen Züchtung der kombinierten Anilin Aminonaphthalinsulfonsäure-Rultur wurden zu 100 ml Nährlösung 10 ml mit Clevesäure gesättigter kationischer Ionenaustauscher (Levatit MP 500 A) zugesetzt. Der Abbau steigerte sich nach 40tägiger Inkubation mit t5maligem Überimpfen in frische Nährlösung auf etwa 90% (Fig. 1, Phase 2). Das Zwischenprodukt des Abbaues trat nur noch in geringen Konzentrationen auf (Fig. 2, Chromatogramm III). Die Kultur war nach dieser Züchtungszeit auch in der Lage, I-Säure und Gamma-Säure vollständig abzubauen (Fig. 1, Phase 3). Eine Zugabe von 50 ppm der beiden Säuren veränderte die Abbauwerte nur wenit (Fig. 2, Chromatogramm V). In dieser Phase der Züchtung konnte auf Anilinzusatz zur Nährlösung verzichtet werden. Die verschiedenen Stufen diese Beispiels sind in der nachfolgenden Tabelle 1 noch einmal dargestellt. Tabelle 1 Züchtungsphasen bei der Herstellung von mikrobiellen Kolturen zum Abbau von Naphthalinsuifonsäuren mit 3 Resten Züchtungs- Ausgangs- Adaptierte Adaptions- Abbau- Nährlösungs- Kultivierungs phasen kultur Kultur zum zeit leistung Komponenten art (Nr.d.Kultur) Abbau von z. Anzucht 1 A3,C22 NS-1, NS-2 0 total NS-1, NS-2 batch 2 Klärschlamm Phenole 0 total p-Nitrophenol batch Phenol 3 Kultur 1 NS-1, NS-2,6 NS-1, NS-2, NS-2,6 kontinuierlich + Kultur 2 NS-2, NS-1,6 4 Monate 80 % NS-1,6,Schäffersäure Schäffersäure 4 Klärschlamm Anilin 1 Monat total Anilin batch 5 Kultur 3 I-Säure NS-1, NS-2, NS-2,6 + Kultur 4 Gamma-Säure I-Säure,Anilin kontinuierlich Clevesäure 1 Monat 75 % Gammasäure Ausscheidung v. Produkten des Abbaues 6 Kultur 5 wie 5 1,5 Mon. mehr als 90% Ionenaustauscher MP500A o.Auscheidg. v.NS-1,NS-2,Anilin batch mit zwei Produkten des Clevesäune tägiger Über Abbaues I-Säure impfung Gamma-Säure 7 Kultur 5 wie 5 0 90 % wie 6, aber chne wie 6 Anilin Beispiel 2 Gewinnung von Mikroorganismenkulturen für den Abbau mehrfach substituierter Aromaten Es wurde von Kulturen ausgegangen, die einfach substituierte, aromatische Verbindungen abbauen können. Die Kulturen wurden aus Klärschlämmen von Kläranlagen der chemischen Industrie und Kulturböden mit üblichen Anreicherungstechniken gewonnen. Ausserdem wurden Bakterienstämme aus Kulturensammlungen (DSM), wie Pseudomonas putida. Ps.spec B 13, Acinetobacter, Arthrobacter verwendet. Diese Kulturen bauen einfache, aromatische Verbindungen, wie 4-Nitrophenol, 3-Chlorbenzoat, Anilin und Aminobenzoat ab. Zur Gewinnung von Kulturen, die menrfach substituierte aromatische Verbindungen abbauen können, werden diese Kulturen vereinigt und in zwei verschiedenen Nährlösungen weitergezüchtet, Nähr- lösung t enthielt neben den einfach substituierten Verbindungen noch 1-Chlor-4-nitrobenzol, 2-Nitro-m-xylol und 1,3-Dinitrobenzol. Nährlösung 2 enthält zusätzlich 4-nitrohydroxitoluol und 2,4-Dinitrophenol und Nitroanilin. Die Anzucht erfolgte in 2 1-Fermentern. Nach Stägier batch-Kultur wurde die Züchtung in kontinuierlicher Kultur weitergeführt. Die Konzentrationen der mehrfach substituierten verbindunglen in der Nährlösung wurde von anfangs 20 ppm in Intervallen auf 100 ppm erhöht. Nach etwa viermonatiger kontinuierlicher Kultur wurden die mehrfach substituierten Verbindungen in Konzentration über 100 ppm vollständig abgebaut. Die auf diese Weise gewonnenen Kulturen wurden. vereinigt und zur biologischen Reinigung von Produktionsabwässern der chemischen Industrie eingesetzt. Folgende Abwässer wurden mit den angegebenen Abbauwerten überprüft. Abwasser 1 Nitrobenzol 25 % 2 2 Nitrotoluol 35 % 3 Nitro-o-dichlor benzol kein Abbau n 4 Nitronaphthalin 37 % Die Abbauversuche wurden in batch-Ansätzen durchgeführt. Die Abbauwerte ergaben sich nach zweitägiger Inkubation. Die weitere Züchtung der Kultur erfolgte in batch-Ansätzen unter Zusatz von 10 % kationischem Ionenaustauscher. Nach jeweils zweitätiger Inkubation wurde das Abwasser unter Zurücklassen des Ionenaustauschers ausgetauscht. Die Abbauversuche wurden über mehrere Monate fortgesetzt. Der Abbau der Abwasserinhaltsstoffe lag auch nach vollständiger fluoretischer Beladung des Ionenaustauschers mit Abwasserinhaltsstoffen bei den geprüften Abwässern über 60 %, bei den Abwässern 1, 3 und 4 über 70 %.

Claims: Patentansprüche 1) Mehrfach substituierte Kohlenwasserstoffe mit nicht identischen Substituenten abbauende Mikroorganismen Kulturen, bestehend aus an positive Ladungen tra genden Trägermaterialien anhaftenden Mikroorganismen, wobei die Mikroorganismen mit diesen mehrfach sub stituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenwasserstoffquelle vermehrt werden können. 2) Verfahren zur Herstellung von mindestens N-fach substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe ab bauenden Mikroorganismen-Kulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a) zunächst unterschiedliche, höchstens (N - 1) fach substituierte Kohlenwasserstoffe abbauen de Mikroorganismen mit jeweils diesen (N - 1) fach substituierten Kohlenwasserstoffen als Kohlenwasserstoffquelle getrennt vermehrt werden, b) wobei die Substituenten der höchstens (N - 1)- fach substituierten Kohlenwasserstoffe gemein sam mindestens alle Substituenten der N-fach substituierten Kohlenwasserstoffe mindestens einmal aufweisen, c) die verschiedenen, an mindestens (N - 1)-fach substituierte Kohlenwasserstoffe adaptierten Kulturen vereinigt werden und durch allmäh lichen Austausch des Substrates durch den N-fach substituierten Kohlenwasserstoff adap tiert werden, d) die N-fach substituierte Kohlenwasserstoff ab bauenden Mikroorganismen auf positive Ladungen tragende Trägermaterialien aufgebracht werden und e) unter Zugabe des N-fach substituierten Kohlen wasserstoff als Kohlenwasserstoff-Quelle weiter vermehrt werden. 3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass N-Substituenten der mindestens N-fach substi tuierten Kohlenwasserstoffe anorganische Säurereste, Aminreste und/oder aliphatische Reste mit 1 bis 6 C-Atomen sind. 4) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, da durch gekennzeichnet, dass die N-Substituenten nicht identisch sind. 5) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, da durch gekennzeichnet, dass N = 3 oder 4 ist. 6) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, da durch gekennzeichnet, dass als mindestens N-fach substituierte Kohlenwasserstoffe substituierte Naphthalinsulfonsäuren eingesetzt werden. 7) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, da durch gekennzeichnet, dass die mindestens N-fach, bzw. höchstens (N - 1)-fach substituierten Roh lenwasserstoffe zusätzlich OH-, COOH- oder Aryl Reste als Substituenten aufweisen. 8) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, da durch gekennzeichnet, dass die höchstens (N - 1) der höchstens (N - 1)-fach substituierten Kohlen wasserstoffe identisch sind mit (N - 1) der min destens N-fach substituierten Kohlenwasserstoffe. 9) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, da durch gekennzeichnet, dass als positive Ladungen tragende Trägermaterialien Ionenaustauscherharze eingesetzt werden. 10) Verwendung der Mikroorganismen-Kulturen nach einem der Ansprüche t bis 9 in biologischen Kläranlagen.

Inventors: BAUMGARTEN, JORG, DR., MANN, THEO, DR., SCHMIDT, FRIEDRICH, DR., Baumgarten, Jörg, Dr.
Applicants: BAYER AG
Application year: 1983
Main classification: C12N1
IPC codes: C12N1, C02F3