STABILIZED SUSPENDED BIOCHEMICAL PREPARATIONS

Abstract: 1. Stabilized suspended biochemical preparations which contain, suspended in an aqueous medium, particles of a carrier having functional groups to which biochemical materials are covalently bound, characterized in that they contain, as a carrier, particles of a silicic acid heteropolycondensate produced by hydrolytic polycondensation of a) at least one completely hydrolyzable silane of the general formula I SiX4 wherein X is hydrogen, halogen, hydroxy, alkoxy, acyloxy or -NR2 (R = hydrogen and/or alkyl), with the proviso that not all of radicals X are hydrogen, and b) at least one organo-functional silane of the general formula II R'a (R"Y)b SiX(4-a-b) wherein X is as defined above, R' is alkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, arylalkenyl or alkenylaryl, R" is alkylene, phenylene, alkylenephenylene or alkenylene, said radicals being optionally interrupted by oxygen or sulphur atoms or -NH-groups, Y is halogen or an optionally substituted amino, optionally substituted anilino, amide, polyamide, aldehyde, keto, carboxy, hydroxy, polyol, mercapto, cyano, diazo, carboxylic acid alkyl ester, sulphonic acid, phosphoric acid, acryloxy, methacryloxy, epoxy, vinyl, N-maleinimido or N-(5-iminofuran-2-one) group, a is 0, 1 or 2 and b is 1, 2 or 3, (a + b) having a value of 1, 2 or 3, as well as, optionally, the following components c) and/or d) : c) at least one organo-silane of the general formula III R'b SiX(4-b) wherein X, R' and b are defined above ; d) at least one substantially involatile oxide of an element of the main groups la to Va or the secondary groups IVb or Vb or the periodic table, which is soluble in the reaction medium, or at least one compound which is soluble in the reaction medium and is capable of forming such a substantially involatile oxide, in an organic solvent, optionally, in the presence of a condensation catalyst, said silicic acid heteropolycondensate containing 40 to 95 percent by weight of component a), 5 to 50 percent by weight of component b), 0 to 40 percent by weight of component c) and 0 to 30 percent by weight of component d), each based on the siloxane or oxide units of the polycondensate.

Description: Stabilisierte biochemische Suspensionspräparate Die Erfindung betrifft stabilisierte biochemische Suspensionspräparate, die sich insbesondere für immunchemi- sche Verfahe, z.B. Radio-, Enzym- oder Fluoreszenzimmunoassays, aber auch als Bioreaktoren eignen. Der Einsatz von an Festkörpern fixierten biochemischen Materialien, z.3. Antigenen, Antikörpern, Hormonen, Aminosäuren, Haptenen, Proteinen oaer Enzymen, in lmmunchemischen Verfah en ist bekannt. ür Immunoassays hat stich hierbei insbesondere die Verwendung von Teströhrchen bewährt, deren Innenoberfläche mit dem biochemischen Material beschichtet ist (Coated Tubes) ; siehe z.B. Catt et al, Science 158 (1967) S. 1570/1571 und die US-PS 3 652 761. Coated-Tube-Systeme haben jedoch den Nachteil, dass ihre Bindungskapazität zum Ankoppeln der biochemischen Ma- terialien beschränkt ist bzw. entsprechend grosse Oberflächen notwendig sind. Ferner ist die Kinetik der Coated-Tube-Systeme diffusionsbestimmt, d.h. die Messungen werden von der Diffusionsgeschwindigkeit des biochemischen Substrats zur beschichteten Röhrchenoberfläche be einfluss und dadurch zeitaufwendig und ungenau. Ziel der Erfindung ist es daher, stabilisierte biochemische Materialien bereitzustellen, die beim Einsatz in biologischen oder biochemischen Verfahren eine beliebig hoch dosierbare kopplungsfähige Oberfläche zur Verfügung stellen können und eine Kinetik entsprechend einem homo genen System, d.h. ohne Diffusionsprobleme, ermöglichen. Diese Aufgabe wird mit einem stabilisierten biochemischen Suspensionspräparat gemäss Hauptanspruch gelöst. Die erfindungsgemässen Suspensionspräparate haben den Vorteil, dass sie die Eigenschaften von an Festkörpern fixierten biochemischen Materialien, d.h. insbesondere die Stabilisierung der biochemischen Substanzen, und die Egen- schaften einer Flüssigkeit, z.B. genaue und einfache Dosierbarkeit, in sich vereinigen. Die Suspensionen sind über längere Zeit stabil und können als Quasi-Flüssigkeiten leicht mit einer Pipette dosiert werden. Gegebenenfalls wird vor dem Gebrauch aufgeschütteli. Nach Durchführung der Tests oder Ansätze lassen sich die Suspensionsteilohen andererseits wieder leicht abtrennen, z.B. durch Zentr- fugieren oder Filtrieren. Die eridungsgemässen Suspensionspräparate haben eine ausserordentlich hohe und beliebig steuerbare spezifisrhe Oberfläche, die für die Ankopplung der biochemischen Materialien zur Verfügung steht. Aufgrund ihrer Eigenschaft als Quasi-Flüssigkeiten spielen auch Diffusionsvorgänge im Gegensatz zu herkömmlichen Coated-Tube-Systemen keine Rolle, sondern es liegt eine homogene Kinetik vor, die eine schnelle und genaue Messung ermöglicht. Die erfindungsgemässen Suspensionspräparate enthalten Teilchen eines funktionelle Gruppen aufweisenden Kiesel säure- heteropolykondensats, an dessen funktionelle Gruppen biochemische Materialien kovalent gebunden sind, in einem wässrigen Medium suspendiert. Gewöhnlich beträgt der Gehalt an Kieselsäureheteropolykondensat-Teilchen 0,1 bis 50, vorzugsweise 0,5 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Suspension, jedoch sind für spezielle Anwendungen auch Konzentrationen ausserhalb dieser Bereicne anwendbar. Die durchschnittlIche Grösse der Kieselsäureheteropolykondensat-Teilchen beträgt gewöhnlich 0,1 bis 10 m, vorzugsweise 0,1 bis 5 m und insbesondere 0,1 bis 1 m, jedoch sind für spezielle Anwendungen auch Teilchengrössen ausser- halb dieser Bereiche anwendbar. Als wässriges Medium können Wasser oder wässrige Lösungen, z.B. Pufferlösungen, verwendet werden. Gegebenenfalls und je nach dem Verwendungszweck enthalten die Suspensionspräparate noch weitere Zusätze, z.B. Suspensionshilfsmittel, wie Polyalkylenglykole, Sucrose oder Triethanolamin; Puffer, wie Phosphat-, Barbital-oder Trispuffer ; Konservierungsmittel, wie Natriumazid, Merthiolat, Benzoesäurederivate oder quaternäre Ammoniumverbindungen ; oaer sonstige übliche Additive, z.B. Zusätze, die die biochemische Akti- vität stabilisieren, wie Polyvinylalkohol oder Proteine. Die Kieselsäureheteropolykondensat-Teilchen werfen vorzuc3- weise hergestellt durch hydrolytische Polykondensation von einem oder mehreren Silanen oder Polysiloxanen, wobei min- destens ein Silan oder Polysiloxan eine mit biochemscnen Materialien reaktive funktionelle Gruppe aufweist, in einem organischen Lösungsmittel gegebenenfalls in Gegenwart eines Kondensaticnskatalysators, Zerkleinern des erhalten Kieselsäureheteropolykondensats und Ankoppeln des bioche- mischen Materials nach üblichen Methoden der organischen Chemie. Besonders bevorzugte Kieselsäureheteropolykondensate werden hergestellt durch hydrolytische Polykondensation von a) mindestens einem vollständig hydrolysierbaren Silan der allgemeinen Formel I SiX4 (1) in der X Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Acyloxy oder -NR2 ( R = Wasserstoff und/oder Alkyl) bedeutet, jedoch nicht alle Reste X Wasser stoff sind, und b) mindestens einem organofunktionellen Silan der all gemeinen Formel II a(R"Y)bSiX(4-a-b) (II) in der X die vorstehende Bedeutung hat, R' Alkyl, Alkenyl, Aryi, Arylalkyl, Alkylaryl, Arylalkenyl oder Alkenylaryl bedeutet, R" Alkylen, Phenylen, Alkylenphenylen oder Alkenylen darstelit, wobei diese Reste durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder -NH-Gruppen unterbrochen sein können, Y Halo gen oder eine gegebenenfalls substituierte Amino-, gegebenenfalls substituierte Anilino-, Amid-, Polyamid-, Aldehyd-, Keto-, Carboxy-, Hydroxy-, Polyol-, Mercapto-, Cyano-, Diazo-, Carbonsäure alkylester-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Acryl oxy-, Methacryloxy-, Epoxid-, Viny1-, N-Malein imido- oder N-(5-Iminofuran-2-on)-Gruppe ist, a den Wert 0, 1 oder 2 und b den Wert 1, 2 oder 3 haben, wobei (a + b) den Wert 1, 2 oder 3 hat, sowie gegebenenfalls den folgenden Komponenten c) und/oder d): c) mindestens einem Organosilan der allgemeinen Formel III Rb'SiX (4-b) (III) in der X, R' und b die vorstehende Bedeutung ha ben; d) mindestens einem im Reaktionsmedium löslichen schwer-flüchtigen Oxid oder mindestens einer im Reaktionsmedium löslichen, ein schwerflüchtiges Oxid bildenden Verbindung eines Elements der Hauptgruppen Ia bis Va oder der Nebengruppen IVb oder Vb des Periodensystems. Das Kieselsäureheteropolykondensat enthält hierbei gewöhnlich 40 bis 95 Gewichtsprozent der Komponente a), 5 bis 50 Gewichtsprozent der Komponente b), 0 bis 40 Ge- wichtsprozent der Komponente c) und 0 bis 30 Gewichtsprozent der Komponente d), jeweils bezogen auf Siloxanoder Oxideinheiten im fertigen Kondensat. Die Komponente a) wird vorzugsweise in einer Menge von mindestens 50, ins.o-o- sondere 70 Gewichtsprozent und höchstens 90, insbesonoere 80 Gewichtsprozent verwendet. Die Komponente b) wird vorzugsweise in einer Menge von mindestens 10, insbesondere 20 Gewichtsprozent, und höchstens 40, insbesondere 30 C-e- wichtsprozent verwendet. Wenn die Komponenten c) und/oder d) verwendet werden, beträgt ihr Mindestgehalt vorzugsweise 1 , insbesondere 5 Gewichtsprozent, und ihr Höchstgehalt vorzugsweise 20, insbesondere 10 Gewichtsprozent. In den vorstehenden Formeln (I), (II) und (III) können mehrmals vorhandene Reste R, R', R", X bzw. Y bei einer Verbindung jeweils die gleiche oder unterschiedliche Bedeutung haben. Die Alkylreste bedeuten z.B. geradkettige, verzweigte oder cyclische Reste mit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlen- stoffatomen und insbesondere niedere Alkylreste mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Spezielle Beispiele sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, n-Xexyl und Cyclohexyl. Die Arylreste enthalten z.B. 6 bis 25, vorzugsweiSe 6 bis 14 und insbesondere 6 bis 10 Kohlenstoffatome. Spezielle Beispiele sind Phenyl und Naphthyl, wobei Phenol bevorzugt ist. Die Alkenvlreste sind z.B. geradkettige, verzweigte oder cyclische Reste mit 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und insbesondere niedere Alkenylreste, wie Vinyl, Allyl und 2-Butenyl. Die Alkoxy-, Acyloxy-, Alkylamino-, Arylalkyl-, Alkylaryl-, Arylalkenyl-, Alkenylaryl-, Alkylen, Alkylenphenylen-, Keto-, Carbonsäurealkylester- und substituierten kzinoreste leiten sich z.B. von den vorstehend genannten Alkyl-, Alkenyl- und Arylresten ab Spezielle Beispiele sind Methoxy, Ethoxy, n- und i-Propoxy, n-, sek-, und tert.-Butoxy, Acetyloxy, Propionyloxy, Monomethylamio, Monoethylamino, Dimethylamico, Diethylamino, Monomethylanilino, Benzyl, Tolyl, Methylen, Ethylen, Dimethylen, Toluylen und Styryl. Die genannten Reste können gegebenenfalls übliche Substituenten tragen, z.B. Halogenatome, niedere Alkylreste, Hydroxy-, Nitro- oder Aminogruppen. Unter den Halogenen sind Fluor, Chlor und Brom bevorzugt und Chlor besonders bevorzugt. Bei den organofunktionellen Silanen (b) und den Organosilanen (c) haben vorzugsweise den Wert 0 und b vorzugsweise den Wert 2. Spezielle Beispiele für hydrolysierbare Silane (a) sind SiCI4, HSiC13, Si(OCH3)4, Si(OC2H5)4 und Si(OOCH3)4. Bei den organofunktionellen Silanen (b) kann die Brückengruppe R" gegebenenfalls durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder -NH-Gruppen unterbrochen sein. Vorzugsweise entstehen auf diese Art 2 bis 10 sich wiederholende Struktureinheiten. Spezielle Beispiele für organofunktionelle Silane (b) sind: (C2H5O)3-Si-(CH2)3-OH, (C2H5O)3-Si-CH2-NH2, (CH3O)3-Si-(CH2)3-NH-(CH2)2-NH2, (C2H5O)3-Si-p-C6H4-NH2, (C2H5O)3-Si-(CH2)3-OH, (CH3O)3-Si-(CH2)4-SH, CH3(CH3O)2-Si-CH2-CH(CH3)-CH2-NH-(CH2)2-NH2, CH3(C2H5O)2-Si-(CH2)4-NH2, (CH3)2C2H5O-Si-CH2-NH2, CH3(C2H5O)2-Si-CH2-OH, (C3H7)3-Si-(CH2)3-CN, EMI7.1 (CH3O)3-Si-(CH2)3-S-(CH2)2-CHO. Spezielle Beispiele für Organosilane (c) sind: (CH3)2-Si-Cl2, (CH3)2-Si-(OCH3)3, (CH3)2-Si-(OC2H5)2, (C6H5)2-Si-Cl2, (C6H5)2-Si-(OC2H5)2, CH2=CH-Si-Cl3, CH2=CH-CH2-Si-(OC2H5)3, CH2=CH-CH2-Si-(CH3COO)3, (i-C3H7)3-Si-OH und (CH3)2-Si-(OH)2. Diese Silane sind zum Teil Handelsprodukte oder sie lassen sich nach bekannten Methoden herstellen; vgl. w. Noll, "Chemie und Technologie der Silicone Weinheim/Bergstrasse (1968). Anstelle der monomeren Ausgangssilane (a) bis (c) können gegebenenfalls auch vorkondensierte, im Reaktionsmedium lösliche Oligomere dieser Silane eingesetzt werden; d.h. geradkettige oder cyclische, niedermolekulare Teilkoncen- sate (Polyorganosiloxane) mit einem Xondensationsgrad von z.B. etwa 2 bis 6. Als Komponente (d) werden im Reaktionsmedium lösliche, schwerflüchtige Oxide oder derartige schwer-flüchtige Oxide bildende Verbindungen von Elementen der Hauptgruppen Ia bis Va oder der Nebengruppen IVb oder Vb des Periodensystems eingesetzt. Vorzugsweise leitet sich die Komponen- te (d) von folgenden Elementen ab: Na, K, Mg, Ca, B, Ti, Zr, Al, Si, Pb, P, As und/oder V, wobei Na, Ca, Mg, B, Al, Ti und P besonders bevorzugt sind. Unter den schwerflüchtigen Oxiden sind Na20, K2O, CaO,TiO2, As 203 und P2O5 und B203 besonders bevorzugt. Im Reaktionsmedium lösliche, schwerflüchtige Oxide bildende Verbindungen sind z.B. anorganische Säuren, wie Phosphorsäure und Borsäure, sowie deren Ester, Halogenide und Salze. Ferner eignen sich z.B. Hydroxide, wie NaOH, KOH oder Ca(OH)2 und Alkoxide, wie NaOR, KOR, Ca(OR)2, Al(OR)3 oder Ti(OR)4, wobei sich R von niederen Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, ableitet. Weitere verwendbare Ausgangsverbindungen sind entsprechen- de Salze mit flüchtigen Säuren, z.B. Acetate, basische Acetate, wie basisches Bleiacetat, Formiate, Nitrate und Halogenide. Die hydrolytische Polykondensation der Ausgangskomponenten erfolgt z.B. in einem organischen Lösungsmittel in Gegen- wart einer zur Kondensation ausreichenden Wassermenge, vorzugsweise 50 bis 150 % und insbesondere 100 % der zur Hydrolyse der vorhandenen hydrolysierbaren Gruppen stöchiometrisch erforderlichen Wassermenge. Beispiele tür geeignete organische Lösungsmittel sind Alkohole, vorzugsweise niedere Alkohole, wie Methanol und Ethanol Ketone, vorzugsweise niedere Dialkylketone, wie Aceton und Methylisobutylketon, Ether, vorzugsweise niedere Dialkylether, wie Diethylether, Amide, wie Dimethylformamid, und deren Gemische. Gegebenenfalls wird dem PeaRtionssystem ein Kondensationskatalysator zugesetzt, z.B. eine Protcnen oder Hydroxylionen abspaltende Verbindung oder ein Amin. Bei- spiele für geeignete Katalysatoren sind organische oder anorganische Säuren, wie Salzsäure, Salpetersäure, Schwefel- säure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder Benzoesäure, sowie organische oder anorganische Basen, wie Ammoniak, Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, z.B. Natrium-, Kalium- oder Calciumhydroxid, und wasserlösliche Amine, wie Triethylamin. Hierbei sind flüchtige Säuren und Basen, insbesondere Salzsäure und Ammoniak, besonders bevorzugt. 1 N Mineralsäuren sind besonders bevorzugt. -2 Die Katalysatorkonzentration beträgt vorzugsweise 5 x 10 bis bis 5 x 10 4, insbesondere 10 2 bis 10 3 Mol H bzw. OH pro 1 Liter Reaktionsgemisch. Die Polykondensation wird üblicherweise bei -20 bis +150 C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, bei erhöhtem oder verringertem Druck, vorzugsweise jedoch bei Atmosphärendruck, an der Luft durchgeführt. Gegebenenfalls kann auch unter Inertgasschutz gearbeitet werden. Nach beendeter Kondensaticn trennt man das organische Lösungsmittel ab und wäscht das Produkt mit Wasser bei Raum- temperatur oder erhöhter Temperatur frei von Lösungsmittel und Katalysator. Anschliessend kann gegebenenfalls getrocknet werden, z.B. unter vermindertem Druck bei 40 bis 60 C. Die mechanische Zerkleinerung des Produkts wird in üblichen Mühlen, z.B. Scheibenschwingmühlen oder Kugelmühlen, gegebenenfalls in einem organischen Medium, wie Ethanol, durch- geführt. Aus dem erhaltenen Granulat können dann stabile Suspensionen auf verschiedene weise hergestellt werden. Ein einfaches Verfahren ist das Mahlen und Sieben auf die gewünschte Korngrösse und anscbliessende Suspendieren in einem wässrigen Medium. Ein bevorzugtes Verfahren besteht jedoch darin, dass man das Granulat in Wasser aufschlä:Tt, gegebenenfalls Peptisierungsmittel, wie Triethanolamin, Natriumcarbonat oder Ammoniumoxalat, zugibt und die Aufschlämmung z.B. 5 Minuten bis 24 Stunden mechanisch rührt. Anschliessend lässt man z.B. 1 bis 10 Minuten absetzen und dekantiert die Suspension von der sesimentierten Grobfraktion ab. Die erhaltene Suspension kann dann zu einem Pulver gefriergetrocknet oder als solches weiter verarnei- tet werden. Ein alternatives Verfahren besteht darin, das zerkleinerte Granulat in organischen Medien von unterschiedlicher Dichte zu sedimentieren, um auf diese Weise die gewünschte Frak tionierung zu erzielen. Hierbei werden z.B. für die Feinstteilchen Ether, für die Mittelfraktion Ethanol und für die Grobfraktion Chloroform oder Kohlenstofftetrachlorid oder entsprechende Lösungsmittelgemische verwendet. Nach dem Abtrennen der gewünschten Korngrössenfraktion wird das Lösungsmittel z.B. in einem Rotationsverdampfer abgedampft und man erhält das gewünschte pulverförmige Produkt. Die Ankopplung der biochemischen Materialien, z.B. Antigene, Antikörper, Hormone, Aminosäuren, Haptene, Proteine oder Enzyme, an di e die Kieselsäureheteropolykondensat-Teilchen er- folgt nach üblichen Methoden der organischen und Biochemie. Geeignete Verfahren sind in der einschlägigen Fachliteratur und z.B. der US-PS 3 652 761 beschrieben. Je nach der Reaktivität der funktionellen Gruppen der anzukoppelnden biocher'.ischen Materialien bzw. des Kieselsäureheteropolykondensats müssen die funktionellen Gruppen des Kieselsäureheteropolykondensats gegebenenfalls nach den Methoden der Organischen Chemie weiter modifiziert werden. Hierbei kann es erforderlich sein, zunächst daä Kieselsäureheteropolykondensat zu derivatisieren und anschliessend das gewünschte Material ankoppeln. Als Derizatisierungs- mittel kommen z.B. Amine, Carbonsäuren, Säurechloride, Thiocarbamate, Thiocarbaminsäurechlorid, Diazoverbindungen, Ester oder Sulfide in Betracht. Die Wahl der Modifizierung hängt dabei von den notwendigen Bedingungen der nachfolgenden Kopplungsreaktion ab, da hierbei in Temperatur-, pH-Bereichen und Medien gearbeitet werden muss, bei denen eine irreversible Denaturierung oder ein Aktivitätsverlust der biochemischen Materialien weitgehend ausgeschlossen ist bzw. bei denen die charakteristischen Eigenschaften dieser Materialien nicht wesentlich verändert werden. Vorzugsweise werden die biochemischen Materialien deshalb bei Raumtemperatur in einem wässrigen Medium bei pH 2 bis 11 angekoppelt. Andererseits ist darauf zu achten, dass die Kopplungsreaktion mit genügender Geschwindigkeit abläuft, um die biochemischen Materialien nicht zu lange nicnt-physiologischen Bedingungen auszusetzen. Unter Beachtung dieser GesIchtspunkte lassen sich Kiesel säureheteropolykondensate herstellen bzw. modifizieren, die nach Ankopplung des biochemischen Materials optimale Resultate liefern. Eine Modifizierung eines }*-Aminopropylgruppen enthaltenden Kondensats kann z.B. dadurch erfolgen, dass man das Kondensat 30 bis 60 Minuten mit einer wässrigen, etwa 2,5prozentigen Glutaraluehyalosung behandelt. Das Diazoderivat des genannten Kondensates kann z.B. durch Umsetzen mit p-Nitrobenzoylchlorid, Reduzieren der Nitrogruppe zur Aminogruppe und Diazotieren > *it Salpetriger Säure hergestellt werden. Wenn das Kieselsäureheteropolykondensat aufgrund der Verwendung geeigneter funktioneller Silane als Ausgangsverbindungen bereits Anilinogruppen enthält, kann sofort mit Salpetriger Säure diazotiert werden. Durch Umsetzen von Aminogruppen des Kondensats mit Thiophosgen gelangt man zum Isothiocyanoderivat. Andererseits ist bei Verwendung von z.B. Aldehydgruppen oder Maleinimidogruppen enthaltenden Ausgangssilanen keine weitere Modifizierung des Kieselsäureheteropolykondensats erfor derlich und die biochemischen Materialien können direkt angekoppelt werden. Bei Carboxylgruppen aufweisenden Kondensaten empfiehlt es sich, die Kopplungsreaktion in Gegenwart von Carbodiimid durchzuführen. Die gegebenenfalls derivatisierten Kieselsäureheteropolykondensate werden zur Ankopplung in einem geeigneten Puffer system, z.B. Citrat (pH 2 bis 3), Acetat (pH 4,0), Phosphat (pH 7,0), Bicarbonat (pH 9,5) oder Borat (pH 8,0) mit dem biochemischen Material inkubiert. Hierbei werden zwischen dem Kieselsäureheteropolykondensat und den biochemischen Materialien kovalente Bindungen geknüpft. Die Inkubationszeit beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden bei Raumtemperatur. Zum Entfernen des Überschusses von biochemischem Material werden die Kieselsäure- heteropolykondensat-Teilchen dann abfiltriert oder abzentrifugiert und mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen und können dann in einem gewünschten wässrigen Medium zu den erfindungsgemässen Suspensionspräparaten suspendiert werden. Die Suspensionspräparate werden in geeignete Behälter abgefüllt und können an der Luft oder unter Inertgas gelagert werden. Sie können für die verschiedensten Anwendungszwecke eingesetzt werden, z.X. als ¯-e.mmittel in irztunchemischen Verfahren, wie Radio-, Enzym- oder Fluoreszenzimmunoassays, zur Affinitätschromatographie oder in anderen biologischen Verfahren, z.B. als Bioreaktoren in der Enzymtechnik oder Mikrobiologie. Für die Fixierung und Stabilisierung mercaptogruppen- haltiger biologischer und biochemischer Materialien haben sich neuartige Imino- und Imidosilane der allgemeinen Formel IV Y'(CH2)cSiX'3 (Iv) in der Y eine N-Maleinimido- oder M-(5-Iminofuran-2-on) Gruppe ist, X' Alkoxy mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen bedeutet und c eine ganze Zahl von 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6 ist, sowie deren Homopolykondensate und Copolykondensate mit einer oder mehreren der vorstehend genannten anderen Komponenten a) bis d) als besonders wirksam erwiesen. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch diese neuen Silane (IV) und ihre Homo- und Copolykondensate. Zur Fixierung und Stabilisierung Mercaptogruppen enthaltender biochemischer Materialien können die monomeren Silane iIM7) oder ihre Homo- oder Copolykondensate auf übliche Träer aufgebracht werden1 z.B. auf Glas, Keramikstorfe, Kunststoffe, Metalle, Metalloxide oder Papiere, die vorzugsweise vorher gereinigt wurden. Alternativ kann man die Homound Copolykondensate auch als erfindungsgemässe Suspensionspräparate einsetzen, nachdem auf die vorstehend beschriebene Weise die biochemischen Materialien kovalent angekoppelt wuraen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1 Herstelluna von .idehvdg anulat 160 g Tetramethoxysilan und 4C g 3-Oxopropyl-3'-trimeth- oxysilylpropylthioether, 300 ml Methanol und 42 g Wasser sowe 9,3 g : N HCl werden in dieser Reihenfolge in einem offenen Becherglas vorgelegt und 17 Stunden kondensiert. Man erhält ein hartes, glasartiges Granulat, das mit 700C heissem Wasser bis zur pH-Konstanz (pH 6) ausgewaschen wird. Anschliessend wird im Trockenschrank bei 500C vorgetrocknet und im Mipumpenvakuum nachgetrocknet. Zum Zerkleinern werden 20 g Granulat 20 Minuten in einer Scheibenschwingmühle und anschliessend 3 Stunden in einer Kugelmühle mit Ethanol gemahlen. Das Lösungsmittel wird in einem Rotationsverdampfer abgezogen, wobei ein pulverförmiges Produkt zurückbleibt. Beispiel 2 Herstellung von Maleinimidogranulat Nach dem Verfahren von Beispiel 1 werden 1,01 Mol Tetramethoxysilan, 0,076 Mol 3-Hydroxypropyl-3'-trimethoxysilyl- propylthioether, 0,074 Mol &gamma;-Maleinimidopropyltriethoxy- silan, 372 ml Methanol und 40,1 ml Wasser in ein Becherglas gegeben und 17 Stunden stehengelassen. Man erhält ein testes körniges Produkt, das gemäss Beispiel 1 weiter verarbeitet wird. Beispiel 3 Herstellung eines Anilinogranulats Nach dem Verfahren von Beispiel 1 werden 0,53 Mol Tetramethoxysilan und 0,06 Mol N-p-Aminobenzoyl-3-aminopropyl- triethoxysilan, 150 ml Methanol und 21 ml Wasser sowie 4,65 ml 1 N HCl zusammengegeben und über Nacht stehengelas- sen. Das erhaltene körnige Produkt wird neutral gewaschen und gemäss Beispiel 1 zerkleinert. Beispiel 4 Herstellung eines mminoaranulats Nach dem Verfahren von Beispiel 1 werden 0,53 Mol Tetramethoxysilan und je 0,04 Mol g-Aminopropyltriethoxysilan bzw. 3-Hydroxypropyl-3'-trimethoxysilylpropylthioether, 150 ml Methanol und 21 ml Wasser in einem offenen Becherglas zusammengegeben und 17 Stunden kondensiert. Das anfallende Kondensat wird neutral gewaschen und gemäss Beispiel 1 weiter verarbeitet. Beispiel 5 Herstellung stabiler Suspensionen 1 g der zerkleinerten Granulate wird in 100 ml Wasser aufse- schlämmt, in einen Erlenmayer-Kolben gegeben und mit einem Quirl 10 Minuten gerührt. Anschliessend werden die Bestandteile, die sic innerhalb von 5 Minuten absetzen, abgetrennt und die verbleibende Suspension gefriergetrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Pulver kann in wässrigen Lösungen zu stabilen Suspensionen dispergiert werden. B e i s p i e l 6 Kopplung eines T4-Antikörpers an Anilinogranulat Zur Diazotierung werden 100 ml 4N HCl und 1 g Natriumn rit 4 S Anilinogranulat 10 Minuten bei 4 C gerührt unc dann solange mit jeweils 100 ml 0,1 m Bicarbonatpuffer von pH 8,4 gespült, bis der pH-Wert 8,4 beträgt. Das gewaschene Granulat wird in 30 ml-Fläschchen gefüllt und mit 20 ml 0,1 m Bicarbonatpuffer (pH 8,4) und 150 l nativem T4-Antiserum versetzt. Hierauf rollt man 90 Minuten auf dem Rollblock, zentrifugiert, giesst den Überstand ab und wäscht mit 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,4, bis der pH-Wert 7,4 erreicht ist. Dann wird wieder zentrifugiert und der Über- stand abgegossen, worauf man das gewaschene Granulat in 60 ml-Fläschchen einfällt und mit 0,01 m Phosphatpuffer von pH 7,4 aufschlämmt. Zur Ermittlung der Standardkurven werden jeweils S, 10, 25, 50 bzw. 100 Al mit T4-Antikörper gekoppeltes Granulat zu 1 ml T4-Tracer gegeben und die Standardkurven gemessen. Beispiel 7 T3-Assay 1 g Aldehydgranulat mit einer Korngrösse von 0,050 bis 0,0O3 mm wird mit 20 ml T3-Antiserum (Verdünnung 1 : 150 000) in 0,1 ol/l Citratpuffer (pH 3) 30 Minuten unter Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Kopplungslösung wird zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschliessend wird das Antikörper-Granulat (AK-Granulat) in 2 ml 0,05 Mol/l Trispuffer (pH 8,9) aufgeschlämmt und in einem T3 PsIA eingesetzt. 125 Dazu werden 100 l T3-Standard, 500 l 1-i3-Lösung und 100 l Granulat in ein Teströhrchen pipettiert, mit einer Vlbrationsr,ischer vermischt und 2,5 h bei 37 C/Was- serbad inkubiert. Anschliessend wird 15 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert, der Überstand mit einer Pasteurpipette entfernt un aer Rückstand im Gammazähler gemessen. Es wird eine Bindekapazität von 19 % erhalten; die Diskriminierung zwischen erstem und letztem Standardpunkt beträgt 56,5 %. Beispiel 8 FT4-Assav 1,5 g Aldehydgranulat mit einer Korngrösse von 0,050 bis 0,063 mm werden mit 25 ml 10 % BSA in 0,1 Mol/l Citratpuffer (pH 3) unter Rotation 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der BSA-Lösung wird zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und in 6 ml 0,01 Mol/l Phosphatpuffer pH 7,4 aufgeschlämmt. Für den Assay werden verwendet: FT4-Standards enthaltend 60, 125, 250, 500, 1000, 2000 pg/ml T4 in 0,01 Mol/l Phosphatpuffer (pH 7,4) 125I-Tr-Lösung (ca. 120 000 IpM/ml) T4-Antiserum (RIA-mat T4) 2. AK/PEG-Lösung (Verdünnung 1:500) Assay-Fliessschema EMI18.1 <tb> 200 <SEP> rl <SEP> Standard/Patientenserum <tb> <SEP> + <tb> 200 <SEP> al <SEP> Granulat <SEP> (50 <SEP> mg) <tb> mischen, <SEP> 2 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C/Wasserbad <SEP> inkubieren <tb> 1 <SEP> 5 <SEP> Minuten <SEP> zentrIfugieren <tb> überstand <SEP> ent-eflen <tb> mit <SEP> 500 <SEP> l <SEP> -hoschatnuffer <SEP> (37"C) <SEP> waschen <tb> <SEP> ' <tb> 15 <SEP> nu <SEP> 5 <SEP> Minuten <SEP> zenLriCugieren <tb> überstand <SEP> entfernen <tb> 1 <SEP> 2R <SEP> | <tb> 50O <SEP> ulToscn4 <SEP> + <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> To-Antiserum <tb> <SEP> -1 <tb> mischen, <SEP> 25 <SEP> Minuten <SEP> bei <SEP> RT <SEP> inkubieren <tb> <SEP> $ <tb> 500 <SEP> ssl <SEP> 2.AK/PEG-Lösung <tb> mischen, <SEP> 15 <SEP> Minuten <SEP> bei <SEP> RT <SEP> inkubieren <tb> 30 <SEP> Minuten <SEP> zentrifugieren <tb> Uberstand <SEP> entfernen <tb> Rückstand <SEP> messen <tb> Es wird eine Bindungskapazität von 50,6 % erhalten, die Diskriminierung zwischen erstem und letztem Standard- punkt beträgt ca. 11 000 IpM. Beispiel 9 Herstellung von #-Maleinimidopropyltrimethoxysilan In einen Dreihalskolben mit Rückflusskühler und zwei Tropftrichtern werden unter Schutzgas und magnetischem Rühren 675 ml Methanol und 26,2 g (0,27 Mol) Maleinsäure- imid gegeben. In den Tropftrichtern werden 50 ml Methanol und 49,6 ml (0,27 Mol) 30prozentige Natriummethylatlösung bzw. 400 ml Methanol und 63,2 g (0,26 Mol) t-Brompropyl- trimethoxysilan vorgelegt. Die Maleinimidlösung wird zum Rückfluss erhitzt. In der Siedehitze wird die Methylatlösung während 1 h zugetropft. Dann tropft man unter Rückfluss während 3 h die Silanlösung zu. Nach 17stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im ölpumpen vakuum am Rotationsverdampfer abgezogen und der zähflüs- sige, rote Rückstand in 1 1 Ether aufgenommen, wobei ein feinkristalliner Niederschlag entsteht. Man filtriert mit einer Umkehrfritte unter Schutzgas. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man eine rotgefärbte Flüssigkeit, aus der die gewünschte Verbindung isoliert wird (Ausbeute 20 %), IR (Film) : 2844 (OCH3), 1715 (C=O), 1085 (Si-O), 820 (Si-OC) cm GC-MS: 15O C, 4 Peaks, Peak 1: J' -Brompropyltrimethoxysilan Peak 2: g -Maleinimidopropyltrimethoxysilan MS: m/z = 259 (M+; 20 %) ber. (C1oH17NO5Si) 259,08771, gef. 259,08911, Peak 3: höhermolekulares, bromhaltiges, nicht identi fiziertes Produkt, Peak 4: höhermolekulares, nicht identifiziertes Produkt. B e i s p i e l 10 Herstellung von 5-(3'-Triethoxysilylpropyl)-iminofuran-2-on In einen 1 1 Dreihalskolben mit Rückflusskühler werden unter Schutzgas und magnetischem Rühren nacneinanaer 500 ml Ether, 41 S (0,2 Mol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 20 5 (0,2 Mol) Maleinsäureanhydrid und 47 g (0,2 Mol) &gamma;-Amino- propyltriethoxysilan gegeben. Es wird weitere 17 h bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene N,N'-Dicyclohex harnstoff wird in einer Umkehrfritte unter Schutz gas ab iltriert und die klare, gelbegefärbte Lösung am Rotationsverdampfer am Ölpumpenvakuum abgezogen. Das erhaltene Produkt wird fraktioniert destilliert. Man erhält 50 g eines konstant siedenden Produktes. Sdp.: 111-113 C bei 0,12 - 0,2 mbar. IR (Film) : 3100 (=C-H), 1800 (C=O), 1692 (C=N), 1581 (C=C) 1080 (Si-O), 790 (Si-OC) cm-1. MS: m/z = 30' (M+, 2%) ber. (C13H23NO5Si) 301, 13469, gef. 301,13325. 90 MHZ-1H-NMR (CDCl3) : # = 7,34 (JAB = 5,5 Hz), 3,83 (q,3J = 7,2 Hz, 6 H), 3,71-3,49 (m, 2H), 2,02-1,55 (m, 2H), 1,21 (t, 3J = 7,2 Hz, 9 H) 0,82-0,57 ppm (m, 2 H).

Claims: P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Stabilisierte biochemische Suspensionspräparate, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass sie Teilchen eines funktionelle Gruppen aufweisenden Kieselsäureheteropolykondensats, an dessen funktionel le Gruppen biochemische Materialien kcvalent gebunden sind, in einem wässrigen Medium suspendiert enthalten. 2. Präparate nach Anspruch 1, dadurcn gekennzeichnet, dass sie 0,1 bis 50 Gewichtsprozent Kieselsäurehetero pclykondensat-Teilchen, bezogen auf das Gewicht der Suspension, enthalten. 3. Präparate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeicn net, dass das Kieselsäurehetercpolykondensat eine Teil chengrösse von 0,1 bis 10 llm hat. 4. Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Susensionshilfs- mittel, Puffer, Konservierungsmittel und/oder andere übliche Additive enthalten. 5. Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselsäureheteropolykor.den- sat-Teilchen hergestellt worden sind durch hydroly tische Polykondensation von einem oder mehreren Sila nen oder Polysiloxanen, wobei mindestens ein Silan oder Polysiloxan eine mit biochemischen Materialien reaktive funktionelle Gruppe aufweist, in einem orga nischen Lösungsmittel gegebenenfalls in Gegenwart eines Kondensationskatalysators, Zerkleinern des er haltenen Kieselsäureheteropolykondensats und An- koppeln des biochemischen Materials nacn üblichen Me- thoden der organischen Chemie. 6. Präparate nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kieselsäureheteropolykondensat hergestellt worden ist durch hydrolytische Polykondensation von a) mindestens einem vollständig hydrolysierbaren Silan der allgemeinen Formel I SiX4 (I) in der X Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Acyloxy oaer 2 ( R = Wasserstoff und/ozer Alkyl) bedeutet, jedoch nicht alle Reste X Wasser stoff sind, und b) mindestens einem organofunktionelien Silan der all gemeinen Formel II R'a (R"Y)bSiX(4-a-b) (II) in der X die vorstehende Bedeutung hat, R' Alkyl, Alkenyl, Aryl, Arylalkyl, Alkylaryl, Arylalkenyl oder Alkenylaryl bedeutet, R" Alkylen, Phenylen, Alkylenphenylen oder Alkenylen darstellt, weise diese Reste durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder -NH-Gruppen unterbrochen sein können, Y Halo gen oder eine gegebenenfalls substituierte Amino-, gegebenenfalls substituierte Anilino-, Amid-, Polyamid-, Aldehyd-, Keto-, Carboxy-, Hydroxy-, Polyol-, Mercapto-, Cyano-, Diazo-, Carbonsäure alkylester-, Sulfonsäure-, Phosphorsäure-, Acryl- oxy-, Methacryloxy-, Epoxid-, Vinul-, N-Malein- imido- oder N-(5-Iminofuran-2-on)-Gruppe ist, a den Wert 0, 1 oder 2 und b den Wert 1, 2 oder 3 haben, wobei (a + b) den Wert 1, 2 oder 3 hat, sowie gegebenenfalls den folgenden Komponenten c) und/oder d): : c) mindestens einem Organosilan der allgemeinen Formel III R'bSiX(4-b) (III) in der X, R' und b die vorstehende Bedeutung ha ben; d) mindestens einem in Reaktionsmedium löslichen schwer-flüchtigen Oxid oder mindestens einer im Reaktionsmedium löslichen, ein schwerflüchtiges Oxid bildenden Verbindung eines Elements der Hauptgruppen Ia bis Va oder der Nebengruppen IVb oder Vb des Periodensystems. 7. Präparate nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Kieselsäureheteropolykondensat 40 bis 95 Gewichtsprozent der Komponente a}-, 5 bis 50 Ge wichtsprozent der Komponente b), 0 bis 40 Gewichts prozent der Komponente c) und 0 bis 30 Gewichtspro zent der Komponente d) enthält, jeweils bezogen auf Siloxan- bzw. Oxideinheiten des Polykondensats. 8. Präparate nach einem der Ansprüche 5 bis 7, da durch gekennzeichnet, dass das Kieselsäurehetero- polykondensat unter Verwendung eines sauren oder ba sischen Kondensationskatalysators in einer Menge ent sprechend 5 x 10 2 bis 5 x 10 4 Mol H bzw. OH bezogen auf 1 Liter Polykondensationsgemisch, herge stellt worden ist. 9. Imino- und Imidosilane der allgemeinen Formel IV Y'(CH2)cSiX'3 (IV) in der Y' eine N-Maleinimido- oder N-(5-Iminofuran 2-on)-Gruppe ist, X' Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoff atomen bedeutet und c eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist. 10. Verwendung der Silane nach Anspruch 9 zur Fixierung und Stabilisierung von Mercaptogruppen enthaltenden biochemischen Materialien. 11. Verwendung der Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in immunchemischen Verfahren, wie z.B. Radio-, Er.zym- oder Fluoreszenzimmunoassays oder der Affinitätschromatographle.

Inventors: PATZELT, HELMUT, DR., SCHMIDT, HELMUT, DR., VON STETTEN, OTTO, DR.
Applicants: FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V., VON STETTEN, OTTO
Application year: 1983
Main classification: C12N11
IPC codes: C08G77, C12N11, G01N33, C07F7