DNA SEQUENCES, THEIR PREPARATION, PLASMIDS CONTAINING THESE SEQUENCES AND THEIR USE IN THE SYNTHESIS OF EUKARYOTIC GENE PRODUCTS IN PROKARYOTES

Abstract: The present invention relates to the combination of the promoter/operator region of the tryptophan operon of Serratia marcescens with a synthetic ribosome binding sequence, an expression plasmid which contains this sequence and in which the above sequence is followed by the only Hind III cleavage site in the plasmid, into which site the gene to be expressed can be inserted, and to production plasmids for the expression of eukaryotic gene products in prokaryotes, especially for the preparation of leucocyte interferon.

Description: DNA-Sequenzen, deren Herstellung, diese Sequenzen enthaltende Plasmide und deren Verwendung zur Synthese eukaryotischer Genprodukte in Prokaryoten Eine Voraussetzung für die Expression von Genen in Bakterien ist das Vorhandensein eines sogn. Promotors, einer Erkennungssequenz für die Bindung der bakteriellen RNA-Polymerase. Ein Promotor ermöglicht also die Transkription der stromabwärts gelegenen Sequenzen. Gene, deren Produkte jederzeit synthetisiert werden, haben Promotoren, die immer zur Bindung von RNA-Polymerase-Molekülen fähig sind. Andere Gene bzw. Operons der Bakterien sind reguliert, d.h. ihr Promotor kann durch bestimmte Mechanismen zugänglich oder unzugänglich gemacht werden. Eine weitere Voraussetzung für die Synthese der gewünschten Genprodukte ist eine effiziente Translation der RNA-Transkripte an den bakteriellen Ribosomen. So wurde von Shine und Dalgarno (siehe Nature 254, 34-38 (1975)) gezeigt, dass in Bakterien die Nukleotidsequenz am 5'-Ende der mRNA für deren Bindung ans Ribosom verantwortlich ist. Das Ziel der vorliegenden Anmeldung ist es daher mit Hilfe eines bekannten Promotors, welcher über eine neue Ribosomen bindungs-/flinkersequenz mit einem Strukturgen verbunden ist, die gentechnologische Produktion von bakterienfremden Proteinen zu verbessern. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Sequenz der Formel 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG EMI2.1 GC GAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA EMI2.2 Hin dIII ,welche gegebenenfalls anschliessend an die Ribosomenbindungssequenz eine Linkersequenz enthält. Diese Sequenz stellt eine neue Kombination aus einer literaturbekannten Promotorsequenz und einer literaturbekannten Ribosomenbin 'dungssequenz dar. Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ;jedoch die DNA- Sequenz der Formel 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG EMI2.3 GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT CGC CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA EMI2.4 TAAAGATG ATTTCTAC kLinker} sowie die neue Linkersequenz der Formel 5' AGCTTAAAGATG 3' ATTTCTAC. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die diese Sequenzen enthaltenden Expressionsplasmide, in denen anschliessend an die obigen Sequenzen die einzige Hin dIII Spaltstelle der Plasmide folgt, in die zur Herstellung der Produktionsplasmide das jeweilige gewünschte Gen eingesetzt werden kann, und die Verwendung der so hergestellten Produktionsplasmide zur Herstellung eukaryotischer Genprodukte in Prokaryoten, insbesondere zur Herstellung von Leukocyteninterferon. Zur Erreichung des erfindungsgemässen Zieles wird beispielsweise wie folgt verfahren: Auswahl einer geeigneten bakteriellen Promotorsequenz: Hierzu wird vorzugsweise ein Promotor verwendet, der, in Kombination mit einer Operatorsequenz, induzierbar bzw. reprimierbar ist. Ein derartiger Promotor hat den Vorteil, dass die Synthese des gewünschten bakterienfremden Proteins erst in einer späten Phase des bakteriellen Wachstumszyklus angeschaltet werden kann, z.B. im Falle des Tryptophanoperons (siehe Hallewell und Emtage in Gene 9, 27-47 (1980)) durch Entzug von Tryptophan aus dem Kulturmedium und durch Zugabe von Indol-(3)-acrylsäure als Induktor des Tryptophanoperons zum Kulturmedium, und somit die Vermehrung der Bakterien nicht beeinflusst. Zweckmässigerweise wird zur Konstruktion des Expressionsplasmides das sehr starke und regulierbare literaturbekannte Promotor/Operator-System des Tryptophanoperons von Serratia marcescens (siehe Miozzari und Yanofsky in Nature 276, 684-689 (1978)) der Formel 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG EMI4.1 GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGG CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCC EMI4.2 verwendet. Dieses erhält man nach literaturbekannten Verfahren. Konstruktion der Rihosomenbindungssequenz : Hier wird die als besonders wirksam beschriebene Seauenz der Formel S'TAAGGAGGTTTA (siehe von Jay et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 5543-5548 (1981)) verwendet. Die Konstruktion der Ribosomenbindungssequenz der Formel EMI4.3 erfolgt vorzugsweise durch Zusammenbau der 3 synthetischen Oligonucleotiden der Formeln 6mer 5' TCCTTA, 10mer 5. AGCTTAAACC und 12mer 5' TAAGGAGGTTTA nach literaturbekannten Methoden, wobei vorher zweckmässiger weise das 6mer Oligonucleotid radioaktiv markiert wird. Die anschliessende Verknüpfung des Promotor/Operators mit der Ribosomenbindungssequenz erfolgt nach literaturbekannten Verfahren. Konstruktion des Expressionsplasmides: Aus einem Plasmid, z.B. dem Plasmid pBP 101, das einen Teil des Tryptophanoperons von Serratia marcescens enthält, wird die 90 bp lange Promotor-/ Operator-Sequenz mit Hilfe der Restriktionsenzyme Eco RI und Hae III herausgeschnitten. Dieses Fragment wird hierauf mit der synthetisch hergestell ten RBS mit Hilfe des Enzymes DNA-Ligase verknüpft, und das so hergestellte Promotor-/ Operator-RBS-Fragment, das ein Eco RI- Ende vor dem Promotor/Operator und ein Hin dIII Ende nach der RBS enthält, wird in das Plasmid pBR 322 ein gesetzt, anstelle des plasmideigenen 29 bp langen Eco RI Rin dIII-Fragmentes. Die Wirksamkeit des so konstruierten Expressionsplasmides (pER 103) im Hinblick auf Expression von in die Hin .dIII-Spaltstelle eingebauten Genen wird am Beispiel von Leukocyteninterferon, Subtyp A (IFN-&alpha;A) gezeigt. Expression von IFN-&alpha;A in pER 103 : Interferon wird in menschlichen Zellen, wie andere zum Ex port bestimmten Proteine auch, als Präprotein synthetisiert, d.h. als Protein mit einer Leadersequenz. Diese Leaderse quenz wird erst beim Austritt des Proteinmoleküles aus der Zelle von einem darauf spezialisierten Enzym abgespalten, wodurch die reife Form des Proteins erzeugt wird. Eine Mög lichkeit, reifes Interferon von Bakterien synthetisieren zu lassen, ist eine Entfernung der Leadersequenz auf der DNA Ebene, d.h. die Konstruktion eines Gens, das nur für die Se quenzen des reifen Proteins codiert. Konstruktion des Interferonproduktionsplasmides für IFN-aA: Beispielsweise hat Leukocyteninterferon eine Präsequenz von 23 Aminosäuren, darauf folgt ein Cystein, welches, nach Spaltung des Präinterferons, die erste Aminosäure des "reifen" Interferonpolypeptids darstellt. Zur Konstruktion von Plasmiden, die in Bakterien die Synthese von reifem Interferon ermöglichen sollten, ist es notwendig, ein Fragment des Interferongens zu isolieren, das exakt mit dem Codon für dieses Cystein beginnt. Vor dieses Cysteincodon muss dann ein ATG-Methionincodon gesetzt werden, um die Initiation der Proteinsynthese zu ermöglichen. Diese Konstruktion wird dann in geeigneter Weise beispielsweise in das Expressionsplasmid pER 103 eingesetzt, so dass der Abstand zwischen ATG-Initiationscodon und RBS für die Translation optimal ist. Interferon, das mit Hilfe eines solchen Plasmides in Bakterien hergestellt wird, besitzt die Aminosäuresequenz des reifen Polypeptids plus ein zusätzliches Methionin an dessen NH2-terminalen Ende. Das für IFN-aA codierende Interferonproduktionsplasmid pER 33 wird erfindungsgemäss beispielsweise nach diesen Grundsätzen konstruiert- (seine Herstellung ist in Fig. 4 schematisch wiedergegeben): a) Konstruktion des für reifes Interferon codierenden Gens, mit Ausnahme des Codons für das NH 2-terminale Cystein: Als Ausgangsmaterial für die Interferoninformation dient beispielsweise der für IFN-aA codierende cDNA-Klon 1 F7, welcher am 17. Mai 19-82 unter der DNS-Nummer 2362 bei der Hinterlegungsstelle "Deutsche Sammlung von Mikro Organismen, Griesebachstrasse 8, D 3400 Göttingen (Bun desrepublik Deutschland)" hinterlegt wurde (siehe auch Deutsche Patentanmeldung P 32 20 116.8 vom 28.05. 1982). Er enthält das Interferongen insertiert in die Pst I Spaltstelle von pBR 322. IFN-aA (wie auch andere Leuko cyteninterferon-Subtypen) weist eine Spaltstelle für Sau 3A gleich nach dem für das NH2-terminale Cystein codie renden TGT auf. Die Exstenz dieser Spaltstelle bildet die Grundlage für die verwendete Methode zur Konstruk tion eines "reifen" Interferongens aus geeigneten Re striktionsfragmenten, z.B. aus dem interferonspezi fischen 646 bp Ava II-Fragment und dem 34bp-Sau 3A-Ava 11-Fragment des Plasmides 1 F7. Herstellung des Oligonukleotid-Komplexes: Zu dem so konstruierten Gen muss nun am 5'-Ende das feh lende Cysteincodon und, davoir, ein ATG-Methionincodon hinzugefügt werden; weiters ist ein Verbindungsstück notwendig, das die Ligierung dieser Konstruktion in die Hin dIII-Spaltstelle des Expressionsplasmids pER 103 er möglicht. Zu diesem Zweck werden 4 Oligonukleotide syn thetisiert: ein 14mer 5' TGTGATCTGCCTCA, ein 12mer 1 5' AGCTTAAAGATG, ein 9mer 5' CAGATCACA und ein 8mer 5' CATCTTTA. Diese Oligonukleotide sollen, nach Ligierung und einem Sau 3A-Nachschnitt, das gewünschte Frag ment darstellen, das den Interferongen-Teil (Sau 3A-Ende) mit pER 103 (Hin dIII-EndeJ verbinden kann: EMI7.1 Erfindungsgemäss werden die Oligonukleotide so konstruiert, dass sich der Initiations-Codon ATG und der Cystein-Codon TGT ans separaten fragmenten befinden. Dieses ermöglicht eine gemerelle Verweadung von 12mer (und 8mer) bei der insertion wsm. Genen in pER 103. Das Oligonukleotid mit dem Cystein Co@@@ muss daher mindestens 9 Nukleotide lang sein. Bei sp@elsweise kömen folgende Nukleotide verwendet werden : 5'TGTGATCTG, 5'TGTGATCTGC, 5'TGTGATCTGCC, 5'TGTGATCTGCCT oder 5 TGTGATCTGCCTC. o wird beispielsweise das mit dem 14mer erhaltene ligierte @ligonukle@tid mit Sau 3A verdaut, um das ins Interferongen @au @A-Ende zu erzeugen. Die ensahliessenle Verknüpfung von Interferongen und Oligo muklectid-Kompl@x, die Ligierung in ein Plasmid und dessen Tramsformation in einen bakteriellen Wirt, z.B. wie Escheri chi@ coli HB LoL, erfolgt nach literaturbekannten Verfahren. Zur @rzielung einer weiteren Ausbeutesteigerung bei der Herstbellung eaker@@tischer Genprodukte kann es ferner von Vor Teil sein, wenn das diesbezügliche Produktionsplasmid die -e Empression erforderlichen DNA-Sequenzen mehrfach, z.@. doppelt, eathält, beispielsweise zwei-komplette Gene @@@ reifes 5nterferon oA inklusive der bakteriellen, regula @@rischen Sequenzen. Hierzu wird das mit einem bakteriellen @rmmotor, einer prokaryotischen, ribosomalen bindungsstelle und eine ATG-@@itiationscodon versehene Gen für reifes Imterferon aux einem erfindungsgemäss hergestellten Produktionsplasmid, z.B. aus pER 33, isoliert und nach Veränderung eimes der beiden Enden dieses DNA-Stückes in ein mit einem @escr@ktionsenzym, z.B. EcoRI, erfindungsgemäss hergestellten lime@@@ten, vollständigen gleichen Plasmid eingefügt. Ferner ist es von Vorteil, wenn ein so erfindungsgemäss her gestelltes Tryptophanoperon tragendes Plasmid wie z.B. das Plasmid pER 33 einen par-Lokus enthält, das heisst eine DNA Sequenz, welche bei Abwesenheit eines Selektionsdruckes, z.B. durch ein Antibioticum wie Ampicillin, während des Bakterienwachstums für die gleicnmäige Weitergabe von Pias miden in Tochterzellen verantwortlich ist (siehe P.M. Meacock, S.N. Cohen in Cell 20, 529-542 (1980)). Hierzu wurde der par-Lokus zunächst aus dem Plasmid pPM 31, welches in der vorstehend genannten Literaturstelle beschrieben wird, isoliert und in ein erfindungsgemäss hergestelltes Interferonproduktionsplasmid eingebracht. Durch die vorliegende Erfindung ist es somit gelungen, ein Expressionsplasmid zu konstruieren, das die Promotor-/ Operator-Region des Tryptophan-Operons von Serratia marcescens, sowie eine synthetische RBS enthält. Die Wirk samkeit dieser Konstruktion zur gentechnologischen Produk tion von bakterienfremden Proteinen wurde am Beispiel von Leukocyteninterferon gezeigt. Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher i erläutern: A. Beschreibunq der allgemeinen Methoden: 1. Restriktionsenzymverdauungen Restriktionsendonukleasen, beispielsweise der Firma Bethesda Research Laboratories, wurden unter folgen den Bedingungen verwendet: Eco RI-, Hin dIII-, Pst I- und Ava II-Verdauungen wurden in TA-Puffer durchgeführt (33 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 66 mM K-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 100 pg/ml BSA); Hae III-Verdauungen wurden in TM-Puffer durchgeführt (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgC12); Sau 3A-Verdauungen wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgC12, 75 mM NaCl durchgeführt. 2. Plasmidpräparatian, Gelelektrophorese Plasmide wurden von 1,5 ml - oder von 100-300 ml Übernacht-Kulturen in L-Broth + 25 pg/ml Tetracyclin oder + 100 Rg/ml Ampicillin nach der Vorschrift von Birnboim und Doly (siehe Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)) präpariert. Weitere Reinigung der Plasmide erfolgte durch Isopropanolfällungen (siehe unten) und (bei grossen Ansätzen) durch Chromatogra phie an Sepharose 4B der Firma Pharmacia. Grössere Mengen Plasmide (von 1-6 Liter Kultur) wurden nach der "cleared lysate"-Methode von Clewell und Helsinki (siehe Biochemistry 9, 4428-4440 (1970)) aufgearbeitet, wobei anschliessend daran eine Ethidiumbromid- CsCl-Gradientenzentrifugation durchgeführt wurde. Elektrophorese von Plasmiden bzw. deren Restriktions verdauungsprodukten erfolgte in 0,8 - 1,4 z Agarose gelen oder in 6 % Polyacryamidgelen, in 40 mM Tris Acetat, pH 7,8, 20 mM Na-Acetat, 2 mM EDTA. Präpara tion von Restriktionsfragmenten erfolgte durch Aus schneiden des das gewünschte Fragment beinhaltenden Gelstückches und elektrophoretTsche Elution der DNA aus dem Gel in einen Dialysenschlauch. 3. Kinase und Phosphatasereaktionen, Ligasereaktionen 5 ' -Phosphorylierungsreak tionen (Endmarkierungen) wur- - den in TM-Puffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2) + 5 mM DTT + 0,2-0,5 mM ATP (10-20 pCi 32p-ATP) mit 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase, erhältlich von-der Firma Bethesda Research Laborato ries, 60 Minuten bei 370C durchgeführt. Hierauf wurde 10 Minuten bei 700C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Ligasereaktionen wurden in TM-Puffer + 5 mM DTT + 0,25 mM ATP mit 0,1 Einheiten T4-DNA-Ligase, erhält lich von der Firma Bethesda Research Laboratories (bei "blunt-end"-Ligierungen), bzw. 0,005 Einheiten Ligase (Ligierungen von kohäsiven Enden) über Nacht bei 14 C durchgeführt. Anschliessend wurde das Enzym 10 Minuten bei 700C denaturiert. Aufeinanderfolgende Kinase- und Ligasereaktionen wur den im selben Reaktionsgemisch durchgeführt. Nach Hitzedenaturierung des ersten Enzyms wurden wieder 5 mM DTT und 0,25-0,5 mM ATP zugegeben und die zweite Reaktion angeschlossen. Phosphatasereaktionen wurden im Restriktionsverdau ungspuffer (üblicherweise TA-Puffer) durchgeführt, durch Zugabe von 1 Einheit alkalischer Phosphatase (hergestellt von der Firma Sigma aus Kälberdarm) zu einer Restriktionsverdauung und Inkubation 15 Minuten bei 370C. Daran wurden 1-2 Phenolextraktionen, eine Ätherextraktion und eine Alkoholfällung angeschlos sen. Oft wurden hierauf die DNA-Fragmente noch elek trophoretisch aufgetrennt und geleluiert, bevor wei tere Manipulationen durchgeführt wurden. Um grosse DNA-Fragmente (500 bp und grösser) von klei nen Fragmenten (Linkerfragmenten, die nicht ligiert hatten, oder kleinen Restriktionsverdauungsprodukten) abzutrennen, wurden Isopropanolfällungen durchge führt: Die Reaktion wurde mit 2N NH4-Acetat (End konzentration) versetzt und mit 0,6 Volumen Isopropa nol 10-20 Minuten bei Raumtemperatur gefällt. Nach Zentrifugation 5 Minuten in einer Eppendorfzentrifuge wurde der Überstand entfernt, die Fällung mit kaltem 70% Äthanol gewaschen, nochmals zentrifugiert; das daraus resultierende Pellet wurde getrocknet und war für weitere Manipulationen bereit. B. Herstellung der Oligonukleotide : Legende: DMTr = p,p'-Dimethoxy-triphenylmethyl ibu = Isobutyryl bz = Benzoyl (am Basenstickstoff) = = polymeres Trägermaterial B = Thymin oder Nê-Isobutyrylguanin oder 4 N--Benzoylcytosin oder N6-Benzoyladenin - THF = Tetrahydrofuran Beispiel I Funktionalisierung des polymeren Trägermaterials Die Funktionalisierung des polymeren Trägermaterials erfolg te nach literaturbekannten Verfahren. Als Trägermaterial diente HPLC-Silicagel (Macherey 5 Nagel, Korngrösse 20 m, Porengrösse 200 A). Es wurde derivatisiert wie bei Mateucci und Caruthers beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Succi nylierungsschritt mit Bernsteinsäureanhydrid in wasserfreiem Pyridin durchgeführt wurde (siehe M.D. Matteucci, M.H. Caru thers, Tetrahedron Letters 21, 719 (1981)), J. Am. chem. Soc. 103, 3185 (1981) und auch T. Tanaka, R.L. Letsinger, Nucleic Acids Research 10, 3249 (1982)). Die geschützten Nucleoside wurden so entsprechend folgendem Formelbild kovalent mit dem Silicalgel verknüpft: EMI13.1 Die Belastungsdichte betrug zwischen 68 und 104 Mol Nucleosind pro g Trägermaterial. Beispiel II 5 -Dimethoxytrityl-desoxythymidin-3 -chlormethoxyphosphit Die voll geschützten Nucleosid-3'-chlormethoxyphosphite wur den nach literaturbekannten Verfahren synthetisiert (M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, J. Am. Chem. 103, 3185 (1981) und T. Tanaka, R.L. Letsinger, Nucleic Acids Research 10, 3249 (1982)). 544,6 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxytrityl-thymidin (DMTrdT) wurden in 1,0 ml absolutem THF gelöst und diese Lösung bei -780C innerhalb 15 Minuten unter Argon tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 0,9 mMol Methyl-dichlorphosphit in 0,5 ml absolutem Pyridin und 2,0 ml absolutem THF gegeben. Nach weiteren 10 Minuten wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur erwärmt und zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette in einen trockenen, mit Argon gefüllten Schliffkolben (25 ml) überführt. Bei Raumtemperatur wurde unter Vakuum das Lösungsmittel abgezogen, danach je 0.5 ml Toluol und THF hinzugegeben und erneut eingedampft, wobei als Produkt ein farbloser schaumiger Feststoff zurückbiieb. Dieses Produkt wurde nicht auf seine Reinheit hin analysiert, sondern in 10,0 ml absolutem Pyridin gelöst und diese Lösung unter Argon bei -20 C bis zur weiteren Verwendung, maximal jedoch eine Woche lang, aufbewahrt. Beispiel III -Dimethoxytrityl-N2 5 -isobutyryl-desoxyguanosin-3 -chlor- methoxy-phosphit Analog Beispiel II wurde eine Lösung dieses Nucleosidphosphoro-chloridits in 10,0 ml Pyrdin aus 640,0 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxytrityl-Nê-isobutyl-desoxyguanosin hergestellt. Beispiel IV 5'-Dimethoxytrityl-N6-benzoyl-desoxycytidin-3'chlormethoxy-phosphit Analog Beispiel II wurde eine Lösung dieses Nucleosidphosphoro-chloridits in 10,0 ml Pyridin aus 633,7 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxy-trityl-N4-benzoyl-desoxycytidin hergestellt. Beispiel V 5'-Dimethoxytrityl-N6-benzoyl-desoxyadenosin-3'-chlorme thoxy-phosphit Analog Beispiel II wurde eine Lösung dieses Nucleosidphos phoro-chloridits in 10,0 ml Pyridin aus 657,7 mg (1,0 mMol) 5'-Dimethoxytrityl-N6-benzoyl-desoxyadenosin hergestellt. Beispiel VI Synthese von d-TCCTTA 50 mg (= 5 rMol) des mit DMTrdAbZ beladenen polymeren Trä gers (siehe Beispiel I) wurden in eine Glasfritte gefüllt. Entsprechend der folgenden Auflistung wurden dann verschie dene Lösungsmittel und Reagenzienlösungen hinzugefügt, der Träger darin kurz aufgeschüttelt, und die Lösung nach der gewünschten Umsetzung wieder entfernt, indem sie mit Hilfe eines Argon-Gasstromes von oben durch die Fritte hindurch gepresst wurde. a) Abspaltung der DMTr-Gruppe mit 3 ml einer Lösung aus 70 g Zinkbromid, 500 ml Nitromethan und 5-ml Wasser. Reaktionszeit: 10 Minuten. b) 4 x Waschen mit je 3 ml einer Mischung aus n-Butanol Lutidin-THF (4:1:5). c) 4 x Waschen mit je 4 ml absolutem Pyridin. d) Ankondensation des nächsten Nucleotid-Bausteines: 1 ml der Pyridin-Lösung von 5'-Dimethoxytrityl-desoxy thymidin-3'-chlormethoxyphosphit (Beispiel B) (ca. 100 pMol) wurden unter Argon in die Fritte zu dem poly meren Träger gegeben und dieser in der Lösung aufgeschüt telt. Reaktionszeit: 10 Minuten. e) 3 x Waschen mit je 3 ml absolutem Pyridin. f) Oxidation des Phosphorigsäure-triesters mit 100 mg Jod, - gelöst in 3 ml eines Gemisches aus THF, Lutidin und Wasser (2:2:1). Reaktionszeit: 7 Minuten. g) 3 x Waschen mit je 4 ml THF. h) Acetylierung der nicht umgesetzten 5'-OH-Gruppen mit einer Lösung aus 150 mg 4-Dimethylaminopyridin, 0,3 ml Collidin, 0,25 ml Acetanhydrid und 2,5 ml THF. Reaktionszeit: 5 Minuten. i) 4 x Waschen mit je 3 ml Nitromethan.Dieser Zyklus von a) bis i) wurde nun vier weitere Male wiederholt, wobei bei Schritt d) der für die Sequenz jeweils benötigte Nucleotid-Baustein eingesetzt wurde. Ausbeute-Bestimmung: Nach Ankondensieren des letzten Nucleotid-Bausteines wurde das Trägermaterial im Ölpumpenvakuum getrocknet, eine Probe von ca. 1 mg genau abgewogen und mit 10,0 ml einer 0,1 M Lösung von Toluolsulfonsäure in Acetonitril versetzt. Durch die dabei eintretende Abspaltung des Dimethoxytrityl-Kations erhält man eine orange-rot gefärbte Lösung, deren Absorption bei 498 nm gemessen wurde. Nach der Formel Beladung [ Mol/g] = (Abs. 498). (Verdünnungsfaktor). 14,3 Gewicht des Trägers [mgi lässt sich die Beladung des Träger-Materials mit Dimethoxytrityl-Schutzgruppen berechnen. Man erhielt: 43 pMol/g. Dies entspricht einer durchschnittlichen Ausbeute von 85 % pro Kondensationsschr itt. Abspaltung der Methylreste von den Phosphorsäuretriester Gruppen: Das Trägermaterial wurde 45 Minuten lang in 4 ml einer Lösung von Thiophenol, Triethylamin und Dioxan (1:1:2) geschüttelt, anschliessend mit Methanol, dann mit Ether gewaschen. Abspaltung der Basen-Schutzgruppen und gleichzeitige Abspaltung der Hexanucleotid-Kette vom polymeren Träger: Das Trägermaterial wurde 14 Stunden lang mit 10 ml konz. Ammoniak auf 500C erwärmt, die wässrige Lösung dann abgesaugt und das Filtrat auf ca. 2 ml eingeengt. Reinigung des Produkts: Das so erhaltene Rohprodukt, das am 5'-Ende noch eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe trug, wurde der Reversed-Phase HPLC unterworfen. Säule: y-Bondapak C18 Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 25 % Acetonitril; Fluss 2 ml/min.; Retentionszeit: 14 Minuten. Die gesammelten Elutionsfraktionen wurden auf ca. 1 ml eingeengt, mit 10 ml 80 % Essigsäure versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelasen. Dann wurde bei 500C im Vakuum zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 25 ml Wasser gelöst und das abgespaltene Dimethoxytritanol mit 3 x 15 ml Ether extrahiert. Die wässrige Phase wurde erneut bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 2,5 ml Wasser gelöst, über Biogel P 2 (Säule: 60 x 1,7 cm) entsalzt und lyophilisiert. Analyse des Produkts: Als Reinheitskontrolle diente das analytische HPLC-Diagramm (Säule: 300 x 3,9 mm, -bondapak C18, Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 12 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min.; Retentionszeit: 3,7 Minuten). Beispiel VII Synthese von d-TAAGGAGGTTTA Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 300 mg (30 pMol) DMTrdAbZ HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 3,9 mm, -Bondapak C18, Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 12 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 4,4 Minuten Beispiel VIII Synthese von d-AGCTTAAACC Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 200 mg (16 Mol). DMTrdCbz ## HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 3,9 mm, p-Bondapak C18, Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 12 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 3,4 Minuten. Beispiel IX Synthese von d-CATCTTTA Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 150 mg (1,32 Mol) DMTrdAbz## HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm, p-Bondapak C18, Fa. Waters; Elusans : 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 20 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 7,7 Minuten. Beispiel X Synthese von d-AGCTTAAAGATG Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 200 mg (16,2 Mol) DMTrdGibu## HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm, -bondapak C18, Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 26 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 5,2 Minuten. Beispiel XI Synthese von d-TGTGATCTGCCTCA Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 250 mg (22 Mol) DMTrdAbz## HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm; -Bondapak C18; Fa. Waters; Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 25 % Acetonitril; Fluss: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 6,1 Minuten. Beispiel XII Svnthese von d-CAGATCACA Hergestellt analog Beispiel VI ausgehend von 150 mg (13,2 uMol) HPLC-Diagramm des Produkts: Säule: 300 x 7,8 mm; u-Bondapak C18; Fa. Waters; 7Eluans: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7 mit 20 % Acetonitril; Fluss: 0,2 ml/min; Retentionszeit: 5,2 Minuten. Analyse der Oligodeoxynucleotide Die Sequenzanalyse der synthetisch hergestellten Oligodeoxy nucleotide wurde durchgeführt, nachdem diese in das Interfe ronproduktionsplasmid pER 33 eingebaut worden waren (siehe Beispiel 2: Sequenzanalyse des Interferonplasmids pER 33). Mit dieser Analyse wird gleichzeitig die Richtigkeit der Basenabfolge in den Oligooxynucleotiden belegt (siehe Fig. 5). Beispiel 1 Konstruktion des Expressionsplasmides pER 103 Die Konstruktion des Expressionsplasmides pER 103 ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. a) Isolierung des Promotor/Operator-Fragmentes Das Plasmid pBR 101, das etwa 1000 bp des Tryptophan Operons von Serratia marcescens enthält, stellte das Ausgangsmaterial für die Isolierung der Promotor/Opera tor-Region dar. Diese regulatorische Region liegt inner halb eines 90 bp langen Eco RI - Hae III-Fragmentes, in dem der Promotor in der Richtung Eco RI @@@ EMI20.1 Hae III Etwa 25 pg des Plasmides pBP 101 wurden mit dem Restrik tionsenzym Eco RI verdaut, die zwei entstehenden Frag mente wurden durch Gelelektrophorese (1,4 % Agarose) voneinander getrennt und das 200 bp lange Fragment wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. Dieses Fragment wurde dann mit Hae III verdaut, die beiden Verdauungs produkte wurden auf einem 6 % Polyacrylamidgel getrennt und das 90 bp lange Fragment (Promotor/Operator) wurde - wieder aus dem Gel isoliert. b) Konstruktion der Ribosomenbindungssequenz (RBS) Die RBS wurde aus 3 synthetischen Oligonukleotiden zu sammengesetzt: dem 6mer 5'-TCCTTA, dem 10mer 5'-AGCTTAAACC und dem 12mer 5'-TAAGGAGGTTTA. 500 pMole vom 6mer wurden mit Hilfe des Enzyms Polynukleotidkinase phosphoryliert und dabei radioaktiv markiert (siehe Teil A). Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang auf 700C erhitzt, um die Kinase zu inaktivieren, hierauf wurden äquimolare Mengen von (nicht phosphoryliertem) 10mer und 12mer zugesetzt, das Oligonukleotidgemisch wurde auf 950C erhitzt und dann langsam (über etwa 3 Stunden) auf 30-350C abgekühlt, wobei die Oligonukelotide miteinander hybridisierten: EMI21.1 Durch Zusatz von 0,25 mM ATP und 5mM DTT wurden 6mer und 10mer mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase kovalent miteinander verbunden (siehe Teil A). Das Fehlen von Phosphatresten an den 5'-Enden des 12mers und des isomers verhinderte das Ent stehen von multimeren Ligationsprodukten. Nach der Reaktion wurde 10 Minuten auf 700C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren, hierauf wurden nach Zugabe von 0,5 mM ATP und 5 mM DTT in einer weiteren Kinasereaktion (siehe Teil A) auch die 5'-Enden des 12mers und des 10zers kinasiert, wodurch die RBS fertiggestellt war. c) Verknüpfung von Promotor und RBS 12 pMole des 90 bp langen Eco RI-Hae III Promotor-/ Operator-Fragmentes wurden unter Standardbedingungen (siehe Teil A) mit 60 pMolen RBS ligiert. Da nur das durch den Hae III-Schnitt erzeugte stumpfe Ende ("blunt eng11) des 90 bp-Fragmentes mit dem stumpfen Ende der RBS ligieren kann, entstanden nur Moleküle, die die RBS in der richtigen-Orientierung stromabwärts vom Promotor enthielten. Nach der Reaktion wurde die Ligase 10 Mi nuten bei 700C inaktiviert, es wurde auf TA-Puffer Konzentration (siehe Teil A) eingestellt und mit 200 Ein heiten Hin dIII und 10 Einheiten Eco RI nachverdaut. Dieses war vorteilhaft, um die in der Ligasereaktion entstandenen Multimeren (da neben der gewünschten Reak tion sowohl Eco RI-Enden, als auch Hin dIII-Enden mit einander ligieren konnten) wieder in Monomere zu verwan deln. Hierauf wurde die Probe auf einem 6 % Polyacryl amidgel aufgetrennt und das etwa 100 bp lange Promotor/ Operator-RBS-Fragment (das ein Eco RI- und ein Hin dIII-Ende besitzt) aus dem Gel herausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert, um es vom Überschuss der nicht ligierten RBS abzutrennen. Hiermit war der für die Expression verantwortliche Teil des Expressionsplasmides fertiggestellt (siehe Fig. 3) Die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz lässt sich durch literaturbekannte Methoden der Polynukleotid synthese nachvollziehen. d) Insertion des Promotor/Operator-RBS-Fragments in das Plasmid pBR 322 Etwa 2 yg des Plasmides pBR 322 wurden mit den Restrik tionsenzymen Eco RI und Hin dIII geschnitten, wobei zwei Fragmente entstanden: ein grosses mit 4332 bp und ein kleines mit 29 bp. Das grosse Fragment wurde durch Elek trophorese auf einem 0,8 % Agarosegel vom kleinen Frag - ment getrennt, aus dem Gel herausgeschnitten und elu iert. Etwa 0,4 pMole dieses Fragments wurden dann mit etwa 10 pMolen des Promotor/Operator-RBS-Fragmentes ligiert (siehe Teil A). Das pBR 322-Fragment konnte wegen seiner zwei nicht zusammenpassenden überhängenden Enden nicht mit sich selbst ligieren; da das Promotor/ Operator-RBS-Fragment nur in einer Orientierung in das Plasmid ligiert werden konnte, erfolgte Promotion in Richtung Hin dIII-Spaltstelle, zum Tetracyclinresi stenz-Gen von pBR 322. e) Transformation von Escherichia coli mit dem Expressions plasmid pER 103 Escherichia coli HB 101 wurde mit dem Reaktionsgemisch dieser letzten Ligierung auf literaturbekannte Weise transformiert (siehe Dworkin und Dawid, Dev. Biol. 76, 435-448 (1980)) und die Transformanten wurden auf ampicillinhaltigen Agarplatten selektioniert. Hierfür wurden E. coli HB 101 Zellen zu einer'Dichte von ca. 2 x 108 Zellen/ml aufgezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und in 100 mM CaC12-Lösung suspendiert (20 Minuten bei OOC). Danach wurden die Zellen mit dem Reaktionsgemisch der Ligasereaktion 5 Minuten bei 0 - 40C und 5 Minuten bei 370C inkubiert. Nach Zugabe von 0,5 - 1 ml l-Broth wurde 15 - 30 Minuten bei 370C weiterinkubiert.l9 Transformanten wurden ausgewählt und mit Hilfe von Hae III-Restriktionsverdauungen auf ihren möglichen Gehalt des Promotor/Operator-RBS- Fragmentes geprüft. Das 192 bp lange pBR 322/Hae III-Fragment fehlte und war durch ein 264 bp-Fragment ersetzt worden (16 bp von der Hae III-Spaltstelle in pBR 322 *links" von der Eco RI-Spaltstelle + 103 bp Promotor/Operator RBS-Fragment + 145 bp von der Hin dIII-Spaltstelle bis zur nächsten Hae III-Spaltstelle "rechts" davon, in pBR 322). Von den 19 ausgewählten Transformanten zeigten 18 das erwartete Verdauungsmuster (siehe Fig. 2). f) Seauenzanalyse der Promotor/Onerator-RBS-Region des ExDressionsplasmides pER 103 Um die Richtigkeit der konstruierten Expressionsplasmide ohne Zweifel festzustellen, wurde eines dieser Plasmide (pER 103) in der Promotor/Operator-RBS-Region sequen ziert und deren Position in pBR 322 festgestellt. Die Sequenzanalyse wurde nach der literaturbekannten Methode von Maxam und Gilbert (siehe Proc. Nat. Acad. Sci. 74, 560-564 (1977)) durchgeführt und erfolgte von der Eco RI-Spaltstelle in Richtung Hin dIII-Spaltstelle (und darüber hinaus), wie auch von der Hin dIII-Spaltstelle in Richtung Eco RI-Spaltstelle (und darüber hinaus). Es ergab sich die Nukleotid-Sequenz, welche in Fig. 3 dar gestellt ist. pER 103 ist somit ein Expressionsplasmid, das die Promo tor/Operator-Region des Tryptophanoperons von Serratia marcescens in Kombination mit einer synthetischen RBS enthält. Dieses neue Expressionsplasmid promoviert die Transkription von Genen, die in seine Hin dIII-Spalt stelle eingebaut werden, und ermöglicht eine effiziente Translation dieser Transkriptionsprodukte. Dass dieses der Fall ist, wird in Beispiel 2 gezeigt. Beispiel 2 Konstruktion des Interferonproduktionspiasmides pER 33 a. Konstruktion des für reifes Interferon codierenden Gens, mit Ausnahme des Codons für das NHê-terminale Cystein Etwa 1 g des Pst I-Insertes von 1 F7 wurde mit dem Restriktionsenzym Sau 3A verdaut, und das 177 bp lange Fragment, das von der Sau 3A-Spaltstelle nach dem NH2-terminalen Cysteincodon bis zur nächsten Sau 3A Spaltstelle reicht und eine Ava II-Spaltstelle beinhal tet, wurde von einem 6 % Polyacrylamidgel isoliert. Es wurde mit 1 Einheit alkalischer Phosphatase behandelt (siehe Teil A) und nach Entfernung der Phosphatase durch Phenol- und Ätherextraktion mit Äthanol gefällt. Das Fragment wurde anschliessend mit Ava II geschnitten, wodurch das gewünschte 34 bp Sau 3A-Ava II-Fragment und ein 143 bp-Fragment erhalten wurden. Parallel dazu wurde das interferonspezifische 646 bp Ava Fragment, das von der Ava II-Spaltstelle innerhalb des 177 bp Sau 3A-Fragmentes bis hinter das Terminations codon reicht, aus dem Plasmid 1 F7 präpariert. Etwa 0,5 jig dieses 646 bp Ava II-Fragmentes wurden nun zusammen mit der Mischung aus 34 bp und 143 bp Sau 3A-Ava II-Fragmenten mit dem Enzym DNA-Ligase inkubiert (Ligierung von kohäsiven Enden, siehe Teil A). Dadurch entstanden Ava II-Fragmente, die, kovalent verbunden, von Ava II-Sau 3A-Fragmenten flankiert sind. Sobald ein Ava II-Sau 3A-Fragment mit einem Ava II-Fragment ligiert hat, können an dieser Stelle keine weiteren Ligierungen mehr stattfinden, da die Sau 3A-Enden dephosphoryliert worden waren. Nach der Ligasereaktion wurde 10 Minuten auf 700C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren, dann wurden 5 mM DTT und 0,25 mM ATP zugegeben, und die dephosphorylierten Sau 3A-Enden wurden wieder kinasiert (siehe Teil A). Das Reaktionsgemisch wurde auf einem 6 % Polyacrylamidgel aufgetrennt und Moleküle im Bereich von 700-800 bp (ein 646 bp Ava II-Fragment flankiert von zwei Ava II-Sau 3A-Fragmenten) und im Bereich von 1300 1500 bp (zwei miteinander ligiert 646 bp Ava II-Frag- mente flankiert von Ava II-Sau 3A-Fragmenten) wurden eluiert. b. Präparation des Oligonukleotid-Komplexes der Formel EMI26.1 4 synthetische hergestellte Oligonukleotide, nämlich ein 14mer 5' TGTGATCTGCCTCA, ein 12mer 5' AGCTTAAAGATG, ein 9mer 5' CAGATCACA und ein 8mer 5' CATCTTTA, wurden folgendermassen umgesetzt: je 250 pMole 8mer, 9mer und 14mer wurden phosphoryliert (siehe Teil A), nach der Reaktion wurde die Kinase durch Erhitzen auf 950C inaktiviert, es wurden 250 pMole nicht kinasiertes 12mer zugegeben und das Oligonukleotidgemisch langsam (über etwa 3 Stunden) auf 350C abgekühlt, um Hybrisierung der Oligonukleotide zu ermöglichen. Hierauf wurden nach Zugabe von 5 mM DTT und 0,25 mM ATP die Oligonukleotide miteinander ligiert ("blunt-end"-Ligierung, siehe Teil A). Das. Fehlen eines Phosphatrestes am 5'-Ende des 12mers verhinderte die Bildung von Dimeren; das überhängende Ende des 14mers ist nicht selbstkomplementär, es kann nicht zur Dimerisierung führen. Ein Aliquot (25 pMole) des ligierten Oligonukleotidkomplexes wurde mit 80 Einheiten Sau 3A verdaut, um das ins Interferongen passende Sau 3A-Ende zu erzeugen. Hierauf wurde die Probe 10 Minuten auf 750C erhitzt, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt. Hiermit war das Linkerfragment, das das Interferongen mit dem Hin dIII-geschnittenen pER 103 erfindungsgemäss verbindet, fertiggestellt. c. Verknüpfung von Interferongen und Oligonukleotid Komplex, Ligierung in pER 103 Die isolierten Interferonfragmente (siehe Beispiel 2a), die etwa 1 pMol von Molekülen darstellen, wurden mit dem Sau 3A-geschnittenen Oligonukleotidkomplex (etwa 25 pMole) durch Ligierung der kohäsiven Sau 3A Enden (siehe Teil A) verbunden. Wieder verhinderte das Fehlen eines Phosphatrestes am Hin dIII-Ende des Oligonukleotid komplexes (12mer) den Aufbau von Multimeren. Es entstan den Interferongen-Moleküle, die auf beiden Seiten von einem Oligonukleotidkomplex mit einem freien Hin dIII Ende flankiert waren. Nach Hitzedenaturierung der Ligase und Zugabe von 5 mM DTT und 0,25 mM ATP wurden diese Enden Enden phosphoryliert (siehe Teil A), dann wurde eine Isopropanolfällung (siehe Teil A) durchgeführt, um die ebenfalls in der Ligasereaktion entstandenen Oligonukleotidkomplex-Dimeren abzutrennen. Hierauf wurde die Konstruktion mit 0,05 g Hin dIII-geschnittenem, phos phatasebehandeltem pER 103 ligiert (Ligierung von kohä siven Enden, siehe Teil A). Die Phosphatasebehandlung (siehe Teil A) des Hin dIII-geschnittenen Plasmids ver minderte dessen Rezirkularisierung in der Ligasereak tion. Hiermit war ein Gemisch von Plasmide fertigge stellt, das zu 50 % Interferonproduktionsplasmide ent hielt (nämlich diejenigen Plasmide, die ein 34 pb Sau 3A-Ava II-Fragment in der Ligierung mit dem 646 bp Ava II-Fragment am Genbeginn erhalten hatten - siehe Bei spiel 2a). d. Transformation von Escherichia coli HB 101 und Analyse der Transformation im Hinblick auf Interferonproduktion Das gemäss Beispiel 2c hergestellte Plasmidgemisch wurde analog Beispiel le zur Transformation von Escherichia coli HB 101 verwendet (siehe Dworkin und Dawid, Dev. ; Biol. 76, 435-448 (1980)). Etwa 20 * der erhaltenen Transformanten hatten Inserte (der Rest waren rezirku larisierte pER 103-Plasmide), von denen mehrere auf Interferonexpression untersucht wurden. Dazu wurden 100 ml Bakterienkultur in M9 Minimum Medium, dem alle Aminosäuren ausser Trypthophan (20 pg/ml pro Aminosäure), sowie Thiamin (1 pg/ml), Glucose (0,2 %) und der Induk tor des Tryptophanoperons Indol-(3)-acrylsäure (IAA, 20 vg/ml; siehe Hallewell und Emtage in Gene 9, 27-47 (1980)), zugesetzt worden waren, zu einer optischen Dichte von 0,6-0,8 gezüchtet. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation 10 Minuten bei 7000 U/min pelletiert, 1 x in 50 mM TrisHCl, pH 8, 30 mM NaCl gewaschen und schliesslich in 1,5 ml desselben Puffers suspendiert. Nach Inkubation mit 1 mg/ml Lysozym 30 Minuten lang auf Eis wurden die Bakterien 5 x gefroren und getaut und hierauf die Zellbruchstücke durch Zentrifugation eine Stunde bei 40 000 U/min entfernt. Der Überstand wurde steril filtriert und im Plaquereduktionstest mit V3-Zellen und Vesicular Stomatitis Virus auf Inter feronaktivität getestet. Etwa die Hälfte aller Klone (mit Insert) zeigte beträchtliche Interferonexpression: 2 x 108 Einheiten (internationale Referenzeinheiten) pro Liter Kultur. e. Sequenzanalvse des Interferonproduktionsplasmids pER 33 Einer dieser interferonproduzierenden Klone (pER 33) wurde ausgewählt und von der Promotor/Operator-Region weg bis ins Interferongen hinein sequenziert, um die Richtigkeit des konstruierten Plasmides festzustellen. Die Sequenzanalyse wurde wieder nach Maxam und Gilbert (siehe Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)) durchgeführt und erfolgte von der am 3'-Ende radioaktiv markierten Eco RI-Spaltstelle ausgehend in Richtung Interferongen. Es ergab sich die erwartete Sequenz, ein Ausschnitt davon ist in Fig. 5 dargestellt. In diesem Ausschnitt sind alle zur Konstruktion von pER 33 verwen deten Oligonukleotidfragmente zu sehen. Die vorstehend erwähnten Eigenschaften belegen, dass das erfindunggemäss hergestellte Expressionsplasmid pER 103 die Promotor/Operator-Sequenz des Tryptophanoperons von Serratia marcescens in Kombination mit einer synthe tischen Ribosomenbindungssequenz enthält. Am Beispiel von Leukocyteninterferon konnte gezeigt werden, dass in das Expressionsplasmid pER 103 in geeigneter Weise ein gebaute Gene hohe Werte an Expression zeigen. Das Expressionsplasmid pER 103 wurde in Escherichia coli K 12, HB 101 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganis men Grisebachstrasse 8, D 3400 Göttingen, unter der DSM-Nr. 2773 am 27. Oktober 1983 gemäss Budapester Ver trag hinterlegt. Beispiel 3 Konstruktion des Interferonplasmids pER 21/1 Die Konstruktion des Plasmids pER 21/1 ist schematisch in Figur 6 dargestellt. a) Präparation des IFNaA Gens aus pER 33 2 pg pER 33 wurden mit den Restriktionsenzym EcoRI und BamHI geschnitten, wodurch zwei Fragmente der Längen ca. 1300 bp und ca. 4000 bp entstanden. Diese Fragmente wur den auf einem 1,2 % Agarosegel elektrophoretisch aufge trennt. Das kürzere Fragment wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert. Die Enden dieser DNA wurden durch Zugabe von je 1,25 nMol dATP, dGTP, dCTP und dTTP sowie von 2 Einheiten Klenowfragment der DNA-Polymerase I in stumpfe Enden überführt. Die DNA wurde durch Phenolex traktion und Präzipitation aus äthanolischer Lösung ge reinigt und anschliessend in 15 pl H2O aufgenommen. Etwa 15 pMol EcoRI-Linker (New England Biolabs Inc.) 32 wurden durch Zugabe von y- p-ATP und T4-Polynukleotid- kinase in 5 > 1 Reaktionslösung an den 5'Enden phosphory liert. Nach Hitzeinaktivierung der Kinase wurde die DNA, 5 nMol ATP und 0,1 Einheiten T4-Ligase zugesetzt und 16 Stunden bei 140C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde durch Isopropanolfällung von niedermolekularen Substanzen gereinigt. Die DNA wurde abschlief3end mit 20 Einheiten Restriktions enzym EcoRI geschnitten, nochmals durch Isopropanolfäl lung gereinigt und in 10 p1 H2 gelöst. b) Linearisierung des Plasmids pER 33 Ca. 2 pg pER 33 wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt. Anschliessend wurde alkalische Phosphatase zugesetzt, um die 5'Phosphatreste zu entfernen. Die ca. 5300 bp lange, lineare DNA wurde durch Elektrophorese in einem 1,2 % Agarosegel und Elektroelution von restlichem, nicht geschnittenem pER 33 gereinigt. Die DNA wurde mit Phenol und Äther extrahiert, aus äthanolischer Lösung gefällt und in 10 yl H2O gelöst. c) Verknüpfung des linearisierten pER 33 mit dem zusätzlichen Gen für IFNaA 4 yl des mit EcoRI-Linkern versehenen DNA-Stückes, das das IFNaA Gen plus regulatorische Elemente enthält, wurden mit 0,5 jil EcoRI-linearisiertem und dephosphory liertem pER33 in 20 p1 Reaktionslösung mit Hilfe von 0,1 Einheiten T4-Ligase miteinander ligiert. Nach 16 Stunden - Inkubation bei 140C wurde das Enzym durch Erhitzen auf 680C zerstört. d) Transformation von E.coli HB101 und Analyse der Transformation im Hinblick auf Interferonproduktion E.coli HB101 wurde analog Beispiel le mit der DNA aus Beispiel 3c transformiert. Zwei der so hergestellten Klone wurden analog Beispiel 2d auf lnterferonexpression mittels Plaquereduktionstests geprüft. Während der Klon pER 33 bis zu 200 x 106 Einheiten IFN pro 1 1 Kultur aufwies, ergaben sich mit einem der neuen Klone, pER 21/1 bezeichnet, überraschenderweise mehr als 300 x 106 Ein heiten pro Liter Kultur. e) Restriktionsenzymanalyse des pER 21/1 Das Plasmid pER 21/1 wurde in grösserer Menge isoliert und mittels Restriktionsenzymverdauung mit Hin dIII analy siert. Da die in pER33 in die EcoRI Stelle eingebrachte DNA zwei identische EcoRI-Enden aufwies, waren zwei Orientierungen dieser DNA im pER 21/1 möglich. Restrik tionsenzymverdauung mit Hin dill von pER 21/1 mit parallel gerichteten Interferongenen sollte Fragmente der ungefähren Grösse von 4100, 950 (2 Fragmente) und 450 bp zeigen. Wären die beiden Gene jedoch entgegengesetzt orientiert, sind Fragmente der ungefähren Grösse von 4350, 950 (2 Fragmente) und 200 bp zu erwarten. Der Verdauung von ca. 2 pg pER 21/1 mit dem Restriktionsenzym Hin dIII und anschliessende Elektrophorese in einem 1,4 % Agarose gel ergab Fragmente der ungefähren Grösse 4100, 950 und 450 bp. Daher sind die beiden IFNaA Gene parallel zuein ander orientiert (siehe Figur 6). Beispiel 4 Konstruktion des Interferonproduktionsplasmides parpER 33 Die Konstruktion des Plasmides parpER 33 ist schmematisch in Fig. 7 dargestellt. a) Präparation des par-Lokus Etwa 200 pMol EcoRI Linker (New England Biolabs Inc.) wurden in 20 pl Reaktionslösung mit 9 Einheiten T4-Poly nukleotidkinase und 10 nMol ATP an den Enden phorphory liert, und das Enzym anschliessend hitzeinaktiviert. 8 pg des Plasmids pPM 31 wurden mit dem Restriktionsenzym AvaI geschnitten. Die Enden des linearisierten Plasmids wurden durch Zugabe von je 5 nMol dATP, dGTP, dTTP sowie 4 Einheiten des Enzyms Klenowfragment der Polymerase I in stumpfe Enden überführt. Die DNA wurde durch Phenolex traktion und Präzipitation aus äthanolischer Lösung ge reinigt und in 40 p1 H2O aufgenommen. Die EcoRI Linker wurden zusammen mit der linearisierten und stumpfe Enden aufweisenden DNA in 70 jil Reaktionslö sung mit 6 nMol ATP und 1 Einheit T4-Ligase 16 Stunden bei 140C behandelt. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms wurde die Lösung auf 50 mM NaCl und 50 mM Tris-Cl pH=7,6 eingestellt und die DNA mit 300 Einheiten EcoRI behan delt. Nach 2 Stunden Inkubation wurde das Restriktions enzym hitzedenaturiert und die DNA elektrophoretisch in einem 1,4 % Agarosegel aufgetrennt. Das den par-Lokus beinhaltende Stück DNA von ca. 400 bp Länge wurde aus dem Gel elektroeluiert, durch Phenolextraktion und Fällung aus äthanolischer Lösung gereinigt und in 50 p1 H2O gelöst. Dieses Stück DNA weist nun an seinen Enden EcoRI spezifische Überhänge auf. b) Linearisierung des Plasmids pER 33 Etwa 2 pg pER 33 wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt. Anschliessend wurden alkalische Phosphatase ¯ zugesetzt, um die 5'Phosphatreste zu entfernen. Die ca. 5300 bp lange, lineare DNS wurde durch Elektrophorese in einem 1,2 % Agarosegel und Elektroelution von restlichem, nicht geschnittenem pER 33 gereinigt. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol und Äther extrahiert, aus äthanolischer Lösung gefällt und in 50 p1 H2O gelöst. c) Verknüpfung des linearisierten pER 33 mit der par-Lokus DNA 1 ul linearisierte pER 33 DNA wurde mit 1 p1 par-Lokus DNA in 20 ul Reaktionslösung mit Hilfe von 0,1 Einheiten T4-Ligase miteinander ligiert. Nach 16 Stunden Inkbuation bei 140C wurde das Enzym hitzeinaktiviert. d) Transformation von E.coli HB101 und Analyse der Plasmide aus den transformierten Bakterien E.coli HB101 wurde analog zu Beispiel le mit der DNA aus Beispiel 4c transformiert. Es wurden ca. 50 Kolonien erhalten. Aus zehn dieser Kolonien wurde eine geringe Menge Plasmid DNA isoliert (Birnboim und Doly, Nucleic Acid Research 7, 1513-1523 (1979)) und mit dem Restrik tionsenzym PstI geschnitten. Die Analyse durch Agaroseg elektrophorese ergab, dass alle diese Plasmide den ca. 400 bp langen par-Lokus enthielten. Eines dieser Plasmide wurde ausgewählt und mit parpER 33 bezeichnet. e) Analyse des parpER 33 im Hinblick auf Interferonproduktion und Stabilität Analog Beispiel 2d wurden Bakterien, die entweder pER 33 oder parpER 33 enthielten, angezüchtet und anschliessend im Plaquereduktionstest auf Interferongehalt geprüft. Beide Stämme zeigten etwa dasselbe Niveau der Interferon expression. In einem Langzeitversuch, der sich über 120 Bakterien generationen erstreckte, wurde die Stabilität der Plas mide pER 33 und parpER 33 in E.coli HB101 in Abwesenheit des Selektionsdruckes durch das Antibiotikum Ampicillin untersucht. In regelmässigen Abständen wurden der Kultur Proben entnommen, und die Bakterien auf Interferongehalt geprüft. Es stellte sich heraus, dass die pER 33 enthal tenden Bakterien nach ca. 60 Generationen die Interferon produktion einstellten. Bakterien, die parpER 33 enthiel ten, produzierten jedoch auch noch nach 120 Generationen unvermindert Interferon aA. Damit wurde gezeigt, dass das Einbringen des par-Lokus in pER 33 ("parpER 33") die Stabilität des Plasmids in E.coli HB101 erhöht. Verwendete Begriffe und Abkürzungen ATP Adenosintriphosphat Basenpaar: 2 komplementäre Nukleotide, z.B. A-T, G-C blunt end: vollständig basengepaartes Ende eines DNA-Doppelstrangmoleküls, zum Unterschied von überhängen den Einzelstrang-Enden bp: Basenpaare BSA: Bovinserumalbumin cDNA: eine zu mRNA komplementäre DNA codieren: die Information für etwas tra gen; DNA trägt in der Nukleotid sequenz die Information für die Aminosäuresequenz eines Proteins Codon: Gruppe von 3 Nukleotiden, die für eine bestimmte Aminosäure oder aber für den Abbruch der Polypeptidsynthese codiert dephosphorylieren: eine Phosphatgruppe entfernen DNA: Deoxyribonukleinsäure DTT: Dithiothreitol Elektrophorese: Trennung von (DNA-) Molekülen im elektrischen Feld Expression: Umsetzung der Information eines Gens in mRNA durch Transkrip tion und in weiterer Folge in Polypeptid durch Translation Expressionsplasmid: Plasmid, das die Expression von darin insertierten Genen ermöglicht Gen: Abschnitt auf der DNA, der die Information für ein bestimmtes Transkipt (RNA-Molekül) trägt, das in weiterer Folge in ein Protein übersetzt werden kann Genprodukt: RNA (Transkript), Protein (Translationsprodukt) Hybridisierung (von Nukleinsäuren): Ausbildung von stabilen Komplexen zwischen zueinander komplementären DNA-Strängen Hybridplasmid: Plasmid, das einen DNA-Abschnitt fremden Ursprungs enthält IFN-aA: Leukocyteninterferon Subtyp A Initiationscodon: das Codon ATG, das für ethionin codiert und den Start der Translation signalisieren kann Insert: das Stück fremder DNA, das sich in einem Hybridplasmid befindet Kinase: Enzym, das 5' OH-Gruppen an - DNA- und RNA-Molekülen phosphorylieren kann kinasieren: mit 5'-Phosphatgruppen versehen Klon: Bakterienkolonie, von einem einzelnen Bakterium abstammend kohäsive Enden: überhängende Einzelstrangenden eines DNA-Moleküls, die miteinander hybridisieren können komplementär: zueinander passend (Nukleotide in der DNA: A ist komplementär zu T, G ist komplementär zu C) Ligase: Enzym, das verschiedene DNA-Moleküle kovalent mitein ander verbinden kann ligieren: kovalent miteinander verbinden (DNA-Moleküle) mRNA: messenger RNA, ist eine für ein Polypeptid codierende RNA Nukleotid: Baustein einer DNA oder RNA (A= Adenosin, C = Cytidin, G = Guanosin, T = Thymidin, U = Uracil) Nukleotidsequenz: Abfolge der Nukleotide in einem DNA- oder RNA-Molekül Oligonukleotid: wenige miteinander durch Phosphodiesterbindungen verknüpfte Nukleotide (kurzer einzelsträngiger DNA-Abschnitt) Operator: Teil der regulatorischen Region eines Operons, an den der Repressor bindet, wodurch Transkription verhindert wird Operon: Gruppe von (bakteriellen) Genen, die von einer Operator-Region aus reguliert werden Phosphatase: Enzym, das 5'-Phosphatgruppen von DNA-Molekülen entfernen kann Plasmid: ein extrachromosomales, zirkuläre DNA-Molekül Promotor: DNA-Sequenz, die zur Bindung des Enzyms RNA-Polymerase befähigt ist RBS: siehe Ribosomenbindungssequenz Restriktionsendonuklease < Restriktionsenzym) : Enzym, das bei einer bestimmten symmetrischen DNA- Sequenz den DNA-Doppelstrang spalten kann Restriktionsfragmente: Bruchstücke einer DNA, die durch Verdauung mit einer Re striktionsendonuklease entstehen Ribosomenbindungssequenz: Teil der mRNA, der ans Ribosom binden kann RNA: Ribonukleinsäure RNA-Polymerase: Enzym, das einen zu DNA komplementären RNA-Strang synthetisieren kann Sequenz: siehe Nukleotidsequenz Terminationscodon: Codon, das das Ende der Translation signalisiert Transformant: Bakterium, das fremde DNA (ein Plasmid) durch Transformation erhalten hat Transformation: Einschleusen fremder (Plasmid-) DNA in Bakterien Transkription: Synthese von RNA komplementär zu einer DNA-Matrize Translation: Umsetzung der Information von mRNA in ein Polypeptid Tris: Trishydroxymethylaminoethan Kurze Beschreibuno der Illustrationen Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion des Expressionsplasmides pER 103. Die Fragmentgrössen sind nicht massstabgerecht dargestellt. Figur 2 zeigt die Hae III-Verdauungsmuster der Plasmide pBR 322 und pER 103. Das 192 bp-Fragment von pBR 322 ist in pER 103 durch ein Fragment von ca. 270 bp ersetzt. Figur 3 zeigt die Nukleotidsequenz von pER 103 zwischen der Eco RI und der Hin dIII-Spaltstelle. Der Rest des Plasmides entspricht dem grossen Hin dIII-Eco RI-Fragment von pBR 322. Figur 4 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des interferonproduktionsplasmides pER 33. 4 :Pst I-Spaltstelle, : Sau 3A-Spaltstelle,+ : Ava II-Spaltstelle. Mit Ausnahme der Restriktionskarte des 1 F7-Inserts sind die Fragmente nicht massstabgerecht dargestellt. Figur 5 zeigt einen Ausschnitt eines Sequenzgeles, auf dem die Verbindung Promotor-RBS-Interferongen zu sehen ist. Alle in der Konstruktion von pER 33 verwendeten Oligonukleotidfragmente sind vorhanden. Zum besseren Verständnis ist dieselbe Sequenz darunter noch einmal doppelsträngig angegeben; die einzelnen Oligonukleotidbausteine sind eingezeichnet. Figur 6 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Interferonproduktionsplasmids pER 21/1. Die Fragmente bzw. Plasmide sind nicht massstabsgetreu abgebildet. Fiqur 7 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Interferonproduktionsplasmids parpER 33. Die Fragmente und Plasmide sind nicht massstabgetreu wiedergegeben.

Claims: A DNA sequence of formula A DNA sequence according to claim 1, characterized in that, in the ribosome binding sequence, there is a linker sequence and the sequence of a structural gene for any desired polypeptide is added in a form such that this polypeptide is expressed by bacteria and the combination of the DNA sequences is such that the DNA sequence of the structural gene is coupled to the DNA linker sequence by 3',5'-phosphodiester binding. A DNA sequence according to claim 2, characterized in that the structural gene codes for an interferon. A DNA sequence according to claim 2, characterized in that the structural gene is identical to the DNA sequence contained in the PstI insert of clone 1F7 (DMS No. 2362) which codes only for a mature interferon. A DNA sequence according to claim 2, 3 or 4, characterized in that it has the formula ← DNA sequence coding for a mature IFN-α and contained in the PstI insert of the clone 1F7 (DSM No. 2362) → A DNA ribosome binding/linker sequence according to claim 2 of the formula A DNA linker sequence according to claim 2 of the formula A DNA sequence which consists of the linker sequence of claim 7 and the DNA sequence coding for a mature IFN-α and present in the PstI insert of clone 1F7 (DSM No. 2362), without the NH₂-terminal cysteine of this interferon, the two parts being ligated via the Sau3A ends in such a way that the entire mature IFN-α is coded. A plasmid which is replicable in bacteria, containing one or more DNA sequences according to claims 4 to 8. The plasmid pER103, obtainable from the E. coli strain deposited under DSM No. 2773 at the Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen. A plasmid according to claim 9, characterized in that it additionally contains a par-locus. A plasmid according to claim 9 or 11, characterized in that the plasmid pBR322 contains, instead of the 29 bp long EcoRI/HindIII fragment, a DNA sequence of the formula which is followed, after the HindIII cleavage site, by a linker sequence of the formula and a sequence coding for an interferon. The plasmid pER33 as described in Example 2 and containing the DNA sequence according to claim 5. The plasmid pER21/1 as described in Example 3. The plasmid parpER33 as described in Example 4. Process for preparing a DNA sequence according to claim 1, characterized in that a 90 bp long promoter/operator sequence of the tryptophan operon of Serratia marcescens is ligated with a ribosome binding sequence of the formula Process for preparing a DNA sequence according to claims 2 to 5, characterised in that a DNA sequence according to claim 1 is bound to a DNA sequence of the formula Process according to claim 17, characterized in that a gene for interferon, preferably the structural gene according to claim 4, is used as the structural gene. Process for preparing a DNA sequence according to claim 8, characterized in that the 646 bp long AvaII fragment of the PstI insert of clone 1F7 is ligated with a 34 bp long fragment obtained by treating the 177 bp long Sau3A fragment of the PstI insert of clone 1F7 with AvaII, and the resulting fragment is ligated with an oligonucleotide of the formula Process for preparing a plasmid according to claim 9, characterized in that a plasmid is combined with a DNA sequence according to claims 4 to 8. Process for preparing the plasmid pER103 according to claim 10, characterized in that the 29 bp long EcoRI-HindIII fragment native to the plasmid is removed from the plasmid pBR322 by restriction endonuclease cleaving and in its place a DNA sequence according to claim 1 is inserted by ligase reaction. Process for preparing a plasmid according to claim 11, characterized in that a DNA sequence contained in a bacterial plasmid according to claims 4 to 8 and optionally a par-locus isolated from pPM31 is inserted. Process for preparing the plasmid pER33 according to claim 13, characterized in that the DNA sequence according to claim 5 is inserted into the HindIII cleavage site of the plasmid pER103 according to claim 10 by ligase reaction. Process for preparing the plasmid pER21/1 according to claim 14, characterized in that a DNA fragment with a length of about 1300 bp, obtained by treating the plasmid pER33 with the restriction enzymes EcoRI and BamHI, is inserted in the plasmid pER33 according to claim 13, linearised with EcoRI, by means of an EcoRI/BamHI linker. Process for preparing the plasmid parpER33 according to claim 15, characterized in that the par-locus isolated from the plasmid pPM31 is inserted into the plasmid pER33 according to claim 13, which has been linearised by means of the restriction enzyme EcoRI. Microorganism, characterised in that a bacterium is transformed with a plasmid according to claims 9 to 15. Process for preparing a microorganism according to claim 26, characterized in that a plasmid according to claims 9 and 11 to 15 is transformed with a bacterial host. Process for preparing a polypeptide, characterized in that a bacterial host is transformed with a plazmid according to claims 9 to 15 for the regulated production of the polypeptide and the polypeptide thus expressed is isolated. A mature polypeptide with IFN-α activity, characterized in that it can be obtained by growing a bacterium which contains a plasmid containing a DNA sequence according to claims 4, 5 or 8 and by subsequent isolation.

Inventors: ADOLF, GUENTHER, DR., DWORKING, MARC-BRUCE, DR., DWORKIN-RASTL, EVA, DR., HAUEL, NORBERT, DR. DIPL.-CHEM., HAUPTMANN, RUDOLF, DR., MEINDL, PETER, DR., SWETLY, PETER, DR., Adolf, Günther, Dr.
Applicants: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH
Application year: 1983
Main classification: C12N15
IPC codes: C12P21, A61K38, C07K14, C07H21, C12N15, C12P19, C12N1, C12R1