PROCESS FOR THE BIOLOGICAL PREPARATION OF GLUTATHIONE

Abstract: 1. A process for biological production of glutathione by fermenting yeast (Sacch. cerev.) with L-cystein, L-glutamic acid and glycine as precursors, comprising - granulating the yeast by one of the known procedures, and - fluidizing the yeast by air within a fluidized bed reactor, and - spraying the fluidized yeast with an aqueous solution of the precursors, and - further fluidizing the yeast by air at a temperature from 20 to 45 degrees C over an average particle residence time in the reactor from 30 min to 5 h.

Description: Verfahren zur biologischen Herstellung von mikrobiellen metaboliten und Enzymen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen erstellung von mikrobiellen Metaboliten durch fermentative Umsetzung von Präkursor-Verbindungen und zur Herstellung von enzymen durch Zusatz von Effektor Verbindungen mittels Biomasse aus lebenden Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen oder mycelbildenden Pilzen. Die Erfindung bezweckt die Ausbeute an den gewünschten Substanzen zu erhöhen und diese Substanzen in einer Form zu erzeugen, in der sie direkt weiterverwendet werden können oder aus der sie in vergleichsweise einfachen Verfahren abgetrennt und gereinigt werden können. Die Umsetzung von Präkursor-Verbindungen zu halbsynthetischen Produkten mittels Mikroorganismen ist bekannt. Dabei werden unter Präkursoren solche Verbindungen verstanden, die von geeigneten Mikroorganismen in wenigen enzymatischen Umwandlungsschritten zu Folgeprodukten umgesetzt werden. Die Folgeprodukte sind vorzugsweise pharmazeutisch einsetzbare wertvolle Substanzen, die durch chemisch-synthetische Methoden nur schwer oder bisher gar nicht zugänglich sind. Nach DS-PS 548 459 kann beispielsweise Benzaldehyd zu Phenylacetylcarbinol fermentativ umgesetzt werden, woraus man mittels weiterer chemischer Umwandlungen das pharinazeu- tisch wertvolle Ephedrin erhält. Nach US-3 281 407 kann man durch fermentative Verknüpfung von Cystein, Glutaminsäure und Glycin das pharmazeutisch wichtige Peptid Glutathion herstellen. Nach JP-50 031 546 kann man mittels Hefe aus 5'-Cytidylsäure und Cholin das Pharmazeutikum Cytidindiphosphorcholin herstellen. Versetzt man die Biomasse mit geeigneten Effektor-Verbindungen, so kann man die Reaktionsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion erhöhen und dadurch grössere Kon zentriationen der gewünschten Verbindungen in der Biomasse erreichen. Die obengenannten und andere entsprechende Umsetzungen werden üblicherweise in verdünnter.wässriger Phase als submerse Fermentation durchgeführt. In der Stoffwechselphysiologie der Mikroorganismen ist die Brzeugungsrate von Metaboliten und Enzymen im allgemeinen stark von der onzentration der anwesenden Präkursoren oder Effektoren abhängig, und zwar nimmt in den meisten Fällen die Erzeugungsrate mit der Konzentration zu. Bei der submersen Fermentation besteht der Reaktions ansatz meist zu mehr als 90 * aus Wasser. Deshalb müssen hierbei die Präkursoren oder Effektoren in relativ grosser 'enge eingesetzt werden, um eine hinreichend-grosse Konzentration der Präkursoren oder Effektoren - bezogen auf die Biomasse - und dadurch eine annehmbare Ausbeute an gewünschten Metaboliten oder Enzymen zu erhalten. Damit stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zur biologischen Herstellung von Metaboliten und Enzymen zu finden, bei dem die Mikroorganismen in grösserer Konzentration vorliegen als bei der submersen Fermentation, wobei jedoch die Bedingungen, unter denen sich die Mikroorganis men befinden, auf deren Anforderungen abgestimmt werden können, damit die Stoffwechselvorgänge in der gewünschten Richtung ablaufen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren, bei dem die lebende Biomasse in Form wirbelfähiger Partikel mit dem Präkursor oder dem Effektor zusam mengebracht wird und in einem Wirbelbettreaktor inkubiert wird. Die Biomasse kann aus Bakterien, Hefen oder mycel bildenden Pilzen - Jeweils in granulierter Form - bestehen, die in einem Gasstrom bei einer Temperatur von 5 OC bis 80 OC bewegt wird. Der Präkursor oder der Effektor kann in die Biomasse vor dem Granulieren eingearbeitet werden, oder er wird als Suspension oder Lösung auf die im Wirbelbett befindlichen Partikel aufgesprüht, oder er wird dem Gasstrom zugegeben, sofern diese Stoffe gasförmig sind. Die Verweilzeit der wirbelfähigen Partikel im-Sirbelbettreaktor beträgt von 10 Mi- nuten bis 10 Stunden. Nach beendeter Umsetzung kann die Biomasse entweder in Form der granulierten Partikel ohne weitere Aufarbeitung unmittelbar verwendet werden, oder sie kann durch Zusatz von Konservierungsmitteln im feuchten Zustand lagerfähig gemacht werden, oder sie kann durch anschliessende Trocknung im Wirbelbett lagerfähig gemacht werden, oder sie kann nach bekannten Verfahren aufgearbeitet werden, um die erzeugten Metaboliten oder'Enzyme von der Biomasse zu trennen und gegebenenfalls in reiner Form zu gewinnen. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren ist die Menge des Wassers, das die Mikroorganismen umgibt, wesentlich kleiner als bei der submersen Fermentation. Setzt man beispielsweise granulierte Hefe mit 35 a Trockenmasse ein, ist ausserhalb der Hefezellen kaum noch wasser vorhanden Dadurch lässt sich eine relativ grosse Konzentration des Präkursors oder des Effektors auf der Biomasse erreichen, wodurch viele fermentative Umsetzungen beschleunigt oder erst ermöglicht werden. Zur Herstellung der wirbelfähigen Partikel aus lebender Biomasse werden Mikroorganismen verwendet, die nach bekannten Submers-Verfahren gezüchtet, aus der Kulturbrühe abgetrennt und anschliessend nach einem ebenfalls bekannten Verfahren, wie es beispielsweise in DE-OS 28 13 077 angegeben ist, zu wirbelfähigen Partikeln umgearbeitet werden. Hierbei können Zusatzstoffe oder Trägerstoffe zugegeben werden, die die Granulierung erleichtern oder ermöglichen. Der Präkursor oder der Effektor kann hierbei in gelöster, suspendierter oder fester Form in die Biomasse eingearbeitet werden. Die wirbelfähigen Partikel werden im Wirbelbettreaktor durch einen Gasstrom und gegebenenfalls mittels mechanischer Bewegung fluidisiert. Sollen anaerobe Bedingungen eingehalten werden, wird das lirbelbett mit Stickstoff, Xohlendioxid oder einem anderen Inertgas betrieben. Werden aerobe Bedingungen verlangt, wird das tairbel- bett mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas, beispielsweise Luft, betrieben. Damit der Stoffwechsel in der lebenden Biomasse nicht behindert wird, darf der zur Fbiidisierung benutzte Gasstrom die Biomasse nicht aus trocknen. Deshalb wird der Gasstrom zweckmässigerweise mit Wasserdampf gesättigt, und man sprüht gegebenenfalls zusätzlich etwas wasser auf die im Wirbelbett befindlichen Partikel. Mit diesem Sprühwasser kann man gleichzeitig den Präkursor oder den Effektor auf die Partikel bringen. Gegebenenfalls kann dein Sprühwasser noch eine begrenzte Menge an Währstoff- komponenten zugesetzt werden, die den Mikroorganisnlen bei energieverbrauchenden Umsetzungen die notwendige Energie nachliefern. Die bei diesen erfindungsgemässen fermentativen Umsetzung gen gegebenenfalls freiwerdende 1tärmemenge ist gering, weil keine Wachstu;nsvorgänge ablaufen und praktisch keine neue Biomasse erzeugt wird. Die gewünschte Temperatur im Wirbelbettreaktor kann in jedem Falle durch Wahl einer geeigneten Temperatur des zur Fluidisierung benutzten Gases eingehalten werden. Das erfindungsgemässe Verfahren hat folgende Vorteile: - Die hergestellten Metabolite und Enzyme können in ein ner Form anfallen, in der sie für die pharmazeutische Applikation unmittelbar geeignet sind. - In keinem Falle werden chemische Katalysatoren verwen det, die - sofern sie -toxisch oder physiologisch un verträglich sind - von den erzeugten Metaboliten oder Enzymen abgetrennt werden müssen. - Der Biomasse in wirbelfähiger Form können auch Stoffe zugesetzt werden, die die Aktivität der Biomasse nicht verändern, obwohl sie die Permeabilität der Zellwände normalerweise stark erhöhen. Bei submerser Fermentation würden derartige Stoffe die Mikroorganismen irreversi bel schädigen, da der Zellinhalt in das umgebende wässrige Medium ausfliessen würde. - Der Präkursor wird in einigen Fällen besser umgesetzt als bei der submersen Fermentation. - Verfahren ist besonders wirtschaftlich, weil man die benötigten Mikroorganismen unabhängig vom erfin dungsgemässen Verfahren ohnehin für andere Zwecke unter optimalen Wachstumsbedingungen in technischem Massstab züchtet.und hieraus die benötigten Mengen zwecks Umar beitung zu wirbelfähigen Partikeln abzweigt. Die Metaboliten und Enzyme werden in bereits vorhande ner Biomasse erzeugt. Für die dazu notwendigen Stoff wechselvorgänge können optimale Bedingungen gewählt werden, die unabhängig von den Bachstumsbedingungen bei der Züchtung der Biomasse sind. Das Verfahren gestattet, auch Metabolite und Enzyme in annehmbarer Ausbeute herzustellen, die auf rein chemi- schem ziege bisher nicht zugänglich sind. Stach dem erfindungsgemässen Verfahren werden auch Reak tionen zugänglich, die bei der submersen Fermentation nur in völlig untergeordnetem Umfang ablaufen. Das Verfahren benötigt nur einen mässig grossen Aufwand an Apparaten. und Energie. Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die folgenden Beispiele erläutert, ohne hierauf beschränkt zu sein. Beispiel 1: Anreicherung von Glutathion in Hefe Das Tripeptid Glutathion wird unter anderem in pharmazeutischen Präparaten verwendet. Es wird in Hefe ange reichert, wenn man der Hefe die Präkursor-Verbindungen L-Cystein, Glycin, L-Glutaminsäure sowie L-Ammoniumlaktat zusetzt. Handelsübliche Backhefe (Sacch. cerevisiae) mit 33% Trockensubstanz wurde mit 2 hydrophobiertem Kieselgel vermischt und durch ein Drahtgewebe mit 0,5 mm Maschen- weite gedrückt. Das Granulat wurde in einen Wirbelbettreaktor gefüllt und mittels eines Stromes feuchter Luft (Geschwindigkeit 0,8 m/s; Temperatur 25 ?c) bewegt. Auf die fbiidisierten Partikel wurde innerhalb einer Stunde in mehreren Abschnitten die Präkursor-Lösung in einer Gesamtmenge von 0,2 Liter Lösung pro Kilogramm (feuchter) Hefe aufgesprüht. Die wässrige Lösung enthielt 10 g/l L-Cystein.HCl 10 g/l Glycin 10 g/l L-Glutaminsäure 30 g/l Ammoniumlaktat Anschliessend wurde während einer weiteren Stunde im Luftstrom bei 25 OC inkubiert. Während dieser Zeit wurde insgesamt etwa 0,2 Liter Wasser¯pro Kilogramm (feuchter) Hefe auf die fluidisierten Partikel aufgesprüht. Nach einer Verweilzeit von insgesamt 2 Stunden im 1iirbel- bettreaktor stieg der Anteil der Trockensubstanz der Hefe von 33 % auf 45,5 %. Zur Analyse wurde die Hefe extrahiert. Dazu wurde 1 g Hefe in wenig einprozentiger Phosphorsäure suspendiert und anschliessend auf 10 ml aufgefüllt. Die Suspension sorde im Wasserbad -5 min lang auf 60 OC erhitzt, und die Hefezellen wurden abzentrifugiert. In dem klaren Überstand wurde der Glutathion-Gehalt enzymatisch mittels Glyoxalase nach Lernt und Bergmeyer bestimmt < H. U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim; 3. Auflage (1974), Seiten 1687 - 1692). Der Gehalt an Glutathion in der Hefe war von 0,45 % auf 2,4 % % gestiegen, jeweils bezogen auf die Trockensubstanz der Hefe, d. h. auf etwa das Fünffache des normalen Gehalts. Beispiel 2: Bildung von Acetoin mittels Hefe Der Aromastoff Acetoin wird in Hefe aus der Präkursor Verbindung Acetaldehyd gebildet Die granulierte Hefe wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und mittels fe-acll- ter Luft fluidisiert (Geschwindigkeit n, m/s; Temperatur 25 C). Auf die fluidisierten Partikel wurde innerhalb einer Stunde in mehreren Abschnitten die Präkursor-Lösung in einer Gesamtmenge von 0,2 Liter Lösung pro Kilogramm (feuchter) Hefe aufgesprüht. Die wässrige Lösung enthielt 100 g/l Acetaldehyd 300 g/l Glucose (als Nährstofkomponeute) Anschliessend wurde während einer weiteren Stunde im Luftstrom bei 25 OC inkubiert; während dieser Zeit wurde insgesamt etwa 0,2 Liter Wasser pro Kilogramm (feuchter) Hefe aufgesprüht. Nach einer Verweilzeit von insgesamt 2 Stunden im Birbel- bettreaktor stieg der Anteil der Trockensubstanz der Hefe von 33 % auf 38 %. Zur Analyse wurde die Hefe wie in Beispiel 1 extrahiert. In dem klaren überstand wurde der Acetoin-Gehalt nach hesterfield bestimmt (Journal of Biological Chemistry 1G1 (1945), Seite 495). Der Gehalt an Acetoin in der Hefe war. von einem Wert unterhalb der Nachweisgrenze ( < 10 ppm) auf 130 ppm gestiegen, jeweils bezogen auf die Trockensubstanz der Hefe. Beispiel 3: Reduktion von Methylethylketon durch Hefe Die Hefe (Sacch. cerevisiae) ist in der Lage, Ketone zu Alkoholen zu reduzieren. Die granulierte Hefe wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und mittels feuchtem Stickstoff bei 25 C fluidisiert. Auf die fluidisierten Partikel wurde innerhalb eier Stunde in mehreren Abschnitten die Präkursor-Fmulsion iii einer Gesamtmenge von 0,2 Liter Rmulsion pro Kilogramm (feuchter) Hefe aufgesprüht. Die wässrige Emulsion enthielt 150 g/l Dutanon-(2) 1 g/l Emulgator (Brij 35) Nach einer Verweilzeit von insgesamt einer Stunde im Wirbelbettreaktor war der Anteil der Trockensubstanz der Hefe von 33 % auf 37 % gestiegen. Zur Analyse wurde ein Teil der Hefe wie in Beispiel 1 extrahiert. Der klare Überstand wurde mittels der Gas Flüssig-Chromatographie untersucht. In der Hefe, die vor der Behandlung weder Butanon-(2) noch Butanol-(2) enthielt, wurden nach der Behandlung 1,1 % Butanon-(2) und 1,2 % Butanol-(2) nachgewiesen, jeweils bezogen auf die Trockensubstanz der Hefe. Der überwiegende Teil des Ketons ist also zu dem entsprechenden Alkohol reduziert worden. Beipiel 4: Herstellung von Selen-haltigen Aminosäuren Selen ist ein essentielles Spurenelement, das in organisch gebundener Form (Selen-haltige Aminosäuren im Protein) pharmazeutisch besonders günstig wirkt. Hefe ist in der Lage, solche Aminosäuren zu bilden, wenn anorganisch gebundenes Selen vorliegt. Vor der Herstellung des Hefegranulats nach Beispiel 1 würde die Hefe mit 0,02 ss Selendioxid tS 2) 0,2 C/o primärem Ammoniumphosphat (WH4)H2P04 (bezogen auf die Masse der feuchten Hefe) verknetet und durch ein Sieb gedrückt. Die granulierte Hefe wurde in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und mittels feuchter Luft bei 25 C fluidisiert. Auf die fluidisierten Partikel wurde innerhalb von 2 Stunden in mehreren Abschnitten eine wässrige Lösung von 10 50 Glucose (als Nährstoffkomponente) in einer Gesamtmenge von etwa 0,5 Liter Lösung pro Kilogramm (feuchter) Hefe auf- gesprüht. Nach einer Verweilzeit von insgesamt .2 Stunden im Wirbelbettreaktor war der Anteil der Trockensubstanz von 33 % auf 39 50 gestiegen. Zur Analyse wurden 10 g Hefe in 30 ml einprozentiger Phosphorsäure suspendiert, 5 min auf 60 OC erhitzt und zentrifugiert. Der klare Überstand wurde abgegossen, der Rückstand wurde noch zweimal mit einprozentiger Phosphorsäure verrührt und zentrifugiert. In den vereinigten klaren Uberständen wurde das mit Phosphorsäure extrahierte anorganisch vorhandene Selendioxid colorimetrisch bestimmt (H. Ariyoshi et al, Talanta 5; Pergamon Press (1960), Seite 112) bzw. es wurde nach Aufschluss das in nicht-extrahierbarer Form vorliegende organisch gebundene Selen bestimmt. Vor der Behandlung im Wirbelbettreaktor enthielt das Hefegranulat - bezogen auf die Trockensubstanz - < 0,002 % organisch gebundenes Selen (als SeO2 berechnet). Nach der Behandlung wurde gefunden: 0,0098 % anorganisch vorhandenes Selen (als SeO2 berechnet) 0,0512 % organisch gebundenes Selen (als SeO2 berechnet) Das eingesetzte Selen lag also überwiegend in organisch gebundener Form vor. Beispiel 5: Herstellung von S-Adenosyl-L-Methionin mittels Hefe Der Präkursor L-Nethionin wird nach Adenosylierung durch die Hefe in Form von intrazellulärem S-Adenosyl-L-.'iethionin gespeichert. Vor der Herstellung des Hefegranulats nach Beispiel 1 wor- de die Hefe zunächst mit 1 * L-Methionin und 2 % hydrophobiertem Kieselgel (bezogen auf die Masse der feuchten Hefe) verknetet. Die granulierte Hefe wurde in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und 2 Stunden bei 25 C mittels feuchter Luft fluidisiert. Während dieser Zeit wurden die fluidisierten Partikel mit etwa 0,5 Liter Wasser pro Kilogramm (feuchter) Hefe besprüht. Nach einer Verweilzeit von insgesamt 2 Stunden im Birbel- bettreaktor war der Anteil der Trockensubstanz von 33 % auf 39,5 % gestiegen. Zur Analyse wurde die Hefe wie in Beispiel 1 extrahiert. S-Adenosyl-L-Methionin wurde im Extrakt durch Absorption an einem Anionenaustauscher, Waschen und anschliessnde - Elution und Photometrie bei 260 nm bestimmt (F. Schlank in Fortschr. d. Chemie org. Naturstoffe, Band 23; Springer-Verlag, Berlin, New York (1965), Seite 7). Durch die erfindungsgemässe Behandlung ist der Gehalt der Hefe an S-Adenosyl-L-Methionin von 60 ppm auf 360 ppm gestiegen (bezogen auf die Trockensubstanz). Beispiel 6: Anreicherung von NAD in Hefe Nicotinsäureamid-adenin-dinuclootid (NAD) ist ein wichti- ges Reagenz in der biochemischen Analytik und wird übli cherweise aus efe isoliert. Vor der Herstellung des Hefegranulats nach Beispiel 1 wurde die Hefe zunächst mit 0,5 % Adenin 1 % Nicotinsäureamid 0,5 % primärem Kaliumphosphat KH2PO4 2 6 hydrophobiertem Kieselgel (bezogen auf die Masse der feuchten Hefe) verknetet. Die granulierte Hefe wurde in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und 4 Stunden bei 25 C mittels feuchter Luft fluidisiert. Während dieser Zeit wurden die fluidisicrten Partikel mit etwa 0,6 Liter Wasser pro Kilogramm (feuchter) Hefe besprüht. Nach einer Verweilzeit von insgesamt 4 Stunden im wirbel- bettreaktor war der Anteil der Trockensubstanz von 33 % auf 41 % gestiegen. Zur Analyse wurde die Hefe in Wasser suspendiert, 5 min auf 85 OC erhitzt und extrahiert. In dem klaren Überstand wurde NAD durch enzymatische Reduktion nach Klingenberg bestimmt (in: d. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim (1974), 3. Auflage, Band 2, Seite 2094). Nach der Behandlung ist der Gehalt der Hefe an NAD von 0,049 % auf 0,196 50 gestiegen (bezogen auf die Trocken- substanz), also auf etwa das Vierfache des Ausgangswertes. Beispiel 7: Anreicherung von Invertase in Hefe Inw-ertase ist ein vorwiegend intracellulär in Hefe und anderen Mikroorganismen vorkommendes Enzym, das Saccharose zu Glucose und Fructose hydrolysiert. Die meuge des in handelsüblicher liefe vorhandenen Enzyms kann durch Behand- lung der Hefe mit der ffektorverbindung Saccharose erhöht werden. Die granulierte Hefe (Sacch. cerevisiae) korde wie in Bei spiel 1 hergestellt, in einen Wirbelbettreaktor eingefüllt und mittels feuchter Luft bei 25 OC fluidisiert. Auf die fluidisierten Partikel wurde innerhalb von 2 Stunden die Effektor-Lösung in einer Gesamtmenge von 0,5 Li ter Lösung pro Kilogramm (feuchter) Hefe aufgesprüht. Die wässrige Lösung enthielt 20 g/l Saccharose Nach der Verweilzeit von 2 Stunden im Wirbelbettreaktor war der Anteil der Trockensubstanz der Hefe von 33 auf 36 % gestiegen. Zur Analyse des Invertase-Gehaltes wurde 10 g Hefegranulat mit 10 g Seesand zerrieben, in 20 ml 0,01 m-Natrinm- acetatpuffer (pH 4,5) aufgenommen und 20 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert. In dem klaren Zell extrakt wurde der Proteingehalt nach der Methode von Lowry et al (O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Randall in J. Biol. Chem. 193 (1951), Seite 265) bestimmt sowie die Invertase-Aktivität nach Somogyi-Nelson (M. Somogyi in J. Biol. Chem. 195 (1952), Seite 19). Eine Invertase Einheit ist definiert als diejenige Enzym-Menge, die 1 Mikromol Saccharose in 1 Minute bei 30 OC hydrolysiert. Durch die Behandlung der Hefe im Wirbelbettreaktor stieg der Gehalt an Invertase-Enzym von 3,6 auf 6,6 Einheiten pro lilligramm Protein, also auf fast den doppelter. Wert. Beispiel 8: Anreicherung von Prease-in Bakterien Irease ist das in vielen Organismen vorhandene Enzym zur Hydrolyse von Harnstoff. Die Menge des Enzyms .n der Zelle wird bei einigen Organismen durch die verfügbare Menge assimilierbarer Stickstoff-Verbindungen reguliert. Während des logarithmisch verlaufenden Teils der Wachstums- kurve von Bakterien des Stammes Pseudomonas fluorescenz in einer Nährlösung aus 3 g/l Fleischextrakt und 5 g/l Pepton wurde ein Teil der Bakterienmasse geerntet. Diese Menge wurde gewaschen und mit der doppelten Menge nativer an gefeuchteter Maisstärke gemischt und durch ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite granuliert. Das Granulat (mit 60 s Trockensubstanz) wurde in einen wirbelbettreaktor gefüllt und bei 30 C mit feuchter Luft fluidisiert. Zur mechanischen Verfestigung des Granulats urden 20 ml einer fünfprozentigen Polyethylenimin-Lösung pro Kilogramm feuchten Granulats sowie anschliessend 20 ml einer einprozentigen Glutardialdehyd-Lösung pro Kilogramm feuchten Granulats aufgesprüht. Anschliessend wurde das Granulat 2 Stunden im Luftstrom fluidisiert; während dieser Zeit wurden o,6 1 Wasser pro Kilogramm feuchten Granulats aufgesprüht. Zur Bestimmung der Urease-Aktivität wurde ein Teil des Granulats aus dem Wirbelbettreaktor in Wasser suspendiert und durch Ultraschall homogenisiert. Nach dem Abzentrifugieren der Zellen wurde die Urease-Aktivität im klaren UTberstand nach der Methode von Gutmann und Bergmeyer bestimmt (II. U. Bergmeyer: Hethoden der enzymatischen Analyse,.Verlag Chemie, Weinheim; Band 2, 3. Auflage (1974), Seiten 1842 bis 1844). Eine Urease-Einheit ist definiert als diejenige Urease-Menge, die bei 30 OC 1 Mikromol NR4 + freisetzt. Durch die Behandlung der Bakterien im Wirbelbettreaktor stieg die Menge des gebildeten Urease-Enzyms in deii Zellen von 0,8 auf 11 Einheiten pro Minute und Gramm Protein, also auf etwa das Dreizehnfache des Ausgangswertes.

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zur biologischen Herstellung von mikro biellen Metaboliten und Enzymen in lebender Biomasse aus Bakterien, Hefen oder mycelbildenden Pilzen unter Verwendung anorganischer und/oder organischer Prä kursor- oder Effektor-Verbindungen, gekennzeichnet durch - Zusammenbringen der Biomasse mit dem Präkursor oder Effektor und - Fluidisieren der wirbelfähigen Biomasse in einem Gasstrom bei einer Temperatur von 5 C bis 80 OC und einer Verweilzeit von 10 Minuten bis 10 Stunden im Wirbelbettreaktor. 2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeiclInet durch - Besprühen der fluidisierten Biomasse im Wirbelbett reaktor mit einer Suspension oder Lösung des Präkursors oder tffektors. 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch - tinarbeiten des Prakursors oder çffeNtors in die biomasse vor dem Granulieren. 4. Verfahren iiach Anspruch 1, gekennzeichnet durch - Fluidisieren der wirbelfähigen Biomasse in einem Gasstrom, der den gasförmigen Präkursor oder Effektor enthält oder aus diesem besteht. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch - Verwenden der behandelten Biomasse nach beendeter Umsetzung ohne weitere Aufarbeitung, oder - Konservieren der Biomasse in feuchtem Zustand durch Zugeben von Konservierungsmitteln, oder - Konservieren der Biomasse durch Trocknen, oder - Extrahieren der Metaboliten oder Enzyme aus der Biomasse. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Glutathion mittels Hefe (Sacch. cerevisiae) unter Verwendung von L-Cystein, L-Glutaminsäure und Glycin als Präkursoren, gekennzeichnet durch - Granulieren der Hefe, - Fluidisieren der Hefe mittels Luft bei einer Tempe ratur von 20 0C bis 45 C und einer Verweilzeit von 30 Minuten bis 5 Stunden im Wirbelbettreaktor, - Besprühen der fluidisierten Hefe mit einer wärigen Lösung der Präkursoren. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Selen-haltigen- organischen Verbindungen mittels Hefe (Sacch. cerevisiae), gekennzeichnet durch - Verkneten der Hefe mit einer anorganischen Selen verbindung - Granulieren der Hefe, - Fluidisieren der Hefe mittels Luft bei einer Tempe ratur von 20 OC bis 45 OC und einer Verweilzeit von 30 Minuten bis 5 Stunden im lsirbelbettreaktor. s Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von S-Adenosyl-L-Methionin mittels Hefe (Sacch. cerevisiae) unter Verwendung von L-Methion als Prä kursor, gekennzeichnet durch - Verkneten der Hefe mit L-Methionin, - Granulieren der Hefe, - Fluidisieren der Hefe mittels Luft bei einer Tempe ratur von 20 OC bis 45 OC und einer Verweilzeit von 30 Minuten bis 5 Stunden im Wirbelbettreaktor. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Anreiche rung von Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid in Hefe (Sacch. cerevisiae) unter Verwendung von Adenin und Nicotin als Präkursoren, gekennzeichnet durch - Verkneten der Hefe mit Adenin und 'icotinsäurealnid, - Granulieren der Hefe, - Fluidisieren der liefe mittels Luft bei einer Tempe ratur von 20 OC bis 45 C und einer Verweilzeit von 30 Minuten bis 5 Stunden im Itirbelbettreaktor. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Anreicile- rung von Invertase in Hefe (Sacch. cerevisiae) unter Verwendung von Saccharose als Effektor, gekennzeichnet durch - Granulieren der Hefe, - Fluidisieren der Hefe mittels Luft bei einer Tempe ratur von 20 OC bis 45 OC und einer Verweilzeit von 30 Minuten bis 5 Stunden im Wirbelbettreaktor, - Besprühen der fluidisierten Hefe mit einer wässrigen Lösung des Effektors.

Inventors: HILL, FRANK F., DR., KIRK, HANS-GEORG, DR., THOMMEL, JURGEN, DR., Thommel, Jürgen, Dr.
Applicants: HUELS CHEMISCHE WERKE AG
Application year: 1983
Main classification: C12P21
IPC codes: C12P19, C12P1, C12N9, C12P21, C12P7, C12P13, C12N1