CULTURE MEDIUM AND PROCESS FOR THE MULTIPLICATION OF VIRUSES IN A SUSPENSION CULTURE

Abstract: 1. Culture medium consisting substantially of inorganic salts, amino acids, sugar, antibiotics, vitamins and additives, wherein among these additives there is or are one or more substances selected from the group of insulin in a concentration of at least 1 mg/l, transferrin in a concentration of at least 2 mg/l, biotin in a concentration of at least 0,5 mg/l, peptic peptone in a concentration of at least 0,5 g/l and/or casein peptone in a concentration of at least 0.5 g/l.

Description: Kulturmedium und Verfahren zur Virusvermehrung in Suspensionskultur Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium und ein Verfahren zur Vermehrung von Viren in einer Suspension von Zellen. Die vermehrten Viren dienen der Gewinnung von Antigen, die in Diagnostika und gegebenenfalls in Impfstoffen verwendet werden können. Viren können oft nur in EinschichtC'Monolayer")-Zellkul- turen vermehrt werden, das heisst, die Zellen und Viren vermehren sich nur an der Grenzfläche des Nährmediums. Dies bedeutet niedrige Raum-Zeit-Ausbeuten, grossen Arbeitsaufwand, hohe Mediumkosten sowie erhöhtes Kontaminationsrisiko, da in vielen Gefässen gearbeitet werden muss. Das Auffinden von Bedingungen unter denen ein Virus in einer Suspension von Zellen vermehrt wird, wobei der gesamte mit Nährlösung gefüllte Raum genutzt wird, bedeutet einen erheblichen Vorteil gegenüber einer Grenz flächenkul tur. Monolayer-Zcllkulturen sind für viele Viren bekannt. Für das Rinder-Leukose-Virus (BLV = bovines Leukosevirus) wurde ein solches Verfahren in J. Nat. Cancer Inst., Band 52, 491-497 (1974) beschrieben. Dieses Virus verursacht die enzootische Leukose, die eine Erkrankung des hämatopoetischen, lymphatischen Systems in Rindern ist und erhebliche Verluste mit sich bringt. Zur Erkennung der infizierten Tiere kann man ein in Gewebekultur hergestelltes Antigen verwenden. Es wurde überraschend ein Media gefunden, in welchem Zellen und Viren in Suspcnsion vermehrt werden können. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Nährmedium und seine Verwendung in einem Verfahren zur Vermehrung von Viren in einer Suspension von Zellen. Das Medium enthält anorganische Salze, Aminosäuren, Zucker, Antibiotika und Vitamine sowie einen oder mehrere der Stoffe Insulin, Transferrin, Biotin, peptisches Pepton und Casein-Pepton. Gegebenenfalls sind diese Stoffe in folgenden Mengen im Medium enthalten: Insulin 1.0 - 10.0 mg/l Transferrin 2.0 - 20.0 mg/l Biotin 0.5 - 10.0 mg/l peptisches Pepton 0.5 - 10.0 g/l Casein-Pepton 0.5 - 10.0 gjl Gegebenenfalls werden dem Medium 0 bis 5 Volumprozent Serum zugegeben. Für die Zellkulturen geeignete Zellen sind besonders foetale Lämmer-Nieren-Zellen (FLK), die permanente humane Zellinie Hep-2 oder Baby-Hamster Kidney-Zellen (BHK-Zellen, Monolayertyp). Die Zellkulturen können nach bekannten Verfahren in Suspension angelegt werden. Jn einer solchen Supensionskultur können Reoviren, MKS Viren, die Erreger der infektiösen bovinen Rhinotracheitis (1BR) oder der infektiösen pustulösen Vulvovaginitis oder Herpes simplex-Viren, besonders jedoch das Rinder Leukose-Virus (BLV), das Para-Influenza 3-Virus oder Herpesvirus suis,vermehrt werden. Die Viren können in bekannter Weise aufgearbeitet werden, um für diagnostische oder lmpfzwecke geeignete Antigene zu erhalten. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Aus einem 20 Liter-Fermenter der Zel lstammhaltung mit FLK-Zellen, die mit BLV infiziert sind, wurden 6 Liter Zellsuspension entnommen, in einen 50 Liter-Fermenter überführt und mit 19 Liter neuem KPL-2-Medium + 5 t Kälberserum (KS) verdünnt. Zusammensetzung des KBL-2-Mediums Grundmedium: Na C1 7,2 g/l K C1 0,4 g/l Mg O4 x 7H2O 0,2 g/l Fe(NO3)3 x 9H2O 0,0001 g/l Na H2 PO4 x 2H2O 0,07 g/l K H2 PO4 0,03 g/l Na2 H P04 x 2H2O 0,037 g/l Ca Cl 2 X 2 H2O 0,225 g/l Neomycin (reine Base) 0,1 g/l Phenol rot 0,02 9/1 Glucose 3,5 9/1 Na HCO 1,55 g/l Vitamine: 100-fach nach Eagles 1959 doppelt Aminosäuren: L-Cystin 1,6 g/l L-Tryptophan 0,8 g/l L-Glutamin 30,0 g/l Zusätze: Insulin 2,5 mg/l Transferrin 5,0 mg/l Blotin 2,0 mg/l peptisches Pepton 1,25 g/l (Oxoid,L49) Casein-Pepton 1,25 g/l (Serva,C/TLG). Die Suspensionskultur wurde unter Rühren bei 370C bebrütet. Von der vierundzwanzigsten Stunde nach Ansatz ab wurde die Kultur mit 1 Liter Luft/l Kultur/Stunde durchgast. 5 Tage nach Kulturansatz wurde die Kultur geerntet, die Zellen abzentrifuglert und der überstand In bekannter Weise zum BLV-Antigen aufgearbeitet, (van Maaten und Miller, Bibl. Haematol. (1976) 43, 360-362). Aus diesen 25 Liter Kulturflüssigkeit wurden durch Konzentrieren 250 ml einer Lösung von Leukose-Antigen gewonnen, die in der Agargelpräzipitation (AGP) einen Titer von 1 : 32 aufwies. Beispiel 2 Aus einem 20 Liter-Fermenter mit FLK-Zellen, die mit BLV infiziert waren, wurden 5 Liter Zellsuspension entnommen, in einen 50 Liter-Fermenter überführt und mit 30 Liter neuem KPL-2-Medium + 2,5 t KS verdünnt. Die Suspensionskultur wurde unter Rühren bei 36 C bebrütet. 30 Stunden nach Ansatz wurde die Kultur mit 0,5 Liter Luft/Liter Kultur/Stunde durchgast. 5 Tage nach Kulturansatz wurde die Kultur geerntet, die Zellen abzentrifugiert und der Oberstand in bekannter Weise zum BLV-Antigen aufgearbeitet. Aus den 35 Litern Kulturüberstand wurden durch Konzentrieren 350 ml einer Lösung von Leukose-Antigen gewonnen, die in der AGP einen Titer von 1 : 32 aufwies. Beispiel 3 Von einer Rouxschale wurden HEP 2-Zellen in bekannter Weise btrypsiniert und in 1 Liter KPL-2-tiedium aufgenom men, in einen 2 Liter-Fermenter überführt und bei 37OC in Suspension gehalten. Nach 4 Tagen hatten sich die Zellen von 200 000 Zellen/ml auf 2 000 000 Zellen/ml vermehrt. Diese Zellsuspension wurde nun 1:3 mit neuem KPL2-Medium verdünnt und mit Parainfluenza 3-Virus infiziert. Nach 48 Stunden wurde die Kultur geerntet. Der KBR-Titer der Virusernte betrug 1:16. Beispiel 4 Von einer Rouxschale wurden HEP-2-Zellen in bekannter Weise abtrypsinlert und in 1 Liter RPMl 1640-Medium, das 2,5 mg Insulin, 5 mg Transferrin und 2 mg Biotin enthielt, aufgenommen, in einen 2 Liter-Fermenter überführt und bei 37 C in Suspension gehalten. Nach 4 Tagen hatten sich die Zellen von 170 000 Zellen/ml auf 2 000 000 Zellen/ml vermehrt. Diese Zellsuspension wurde nun 1:3 mit neuem RPMI 1640 + Insulin, Transferrin und Biotin verdünnt und mit PI -Virus infiziert. Nach 3 48 Stunden wurde die Kultur geerntet. Der KBR-Titer betrug 1:20. Beispiel 5 1 Liter Zellsuspension HEP-2-Zellen der 5. Suspensionspassage mit 2 200 000 Zellen/ml wurden mit 9 Liter RPMI 1640 + 2,5 mg Insulin, 5 mg Transferrin und 2 mg Biotin verdünnt und In einen 20 Liter-Fermenter überführt. Die Kultur wurde bei 37 0C In Suspension gehalten. Nach 4 Tagen hatten sich die Zellen erneut auf 2 000 000 Zellen/ml vermehrt. Die Zellen wurden 1:3 mit frischem RPMI 1640 Medium + Insulin, Transferrin und Biotin verdünnt und mit Pl 3-Virus infiziert. 48 Stunden nach der Infektion erfolgte die Virusernte, die einen KBR-Titer von 1:20 aufwies. Beispiel 6 Von einer Rouxschale wurden BHK-Monolayerzellen abtrypsl- niert, in 1 Liter KPL-2-Medium aufgenommen, in einem 2 Liter-Fermenter überführt und bei 37 C in Suspension gehalten. Nach 48 Stunden hatten sich die Zellen von 180 000 Zellen/ml auf 2 400 000 Zellen/ml vermehrt. Die Kultur wurde 1:3 mit frischem KPL-2-Medium verdünnt und mit Herpesvirus suis infiziert. 24 Stunden später wurde die Kultur geerntet. Im Festphasen-Immunadsorbens-Test wurde ein Titer von 1:30 gefunden.

Claims: Patentansprüche: 1. Kulturmedium bestehend auo anorganischen Salzen, Aminosäuren, Zucker, Antibiotika, Vitaminen und Zusätzen, dadurch gekennzeichnet, dass unter diesen Zusätzen einer oder mehrere der Stoffe Insulin, Transferrin, Biotin, pept isches Pepton und/oder Casein-Pepton ist beziehungsweise sind. 2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es 1 bis 10 mg/l Insulin, 2 bis 20 mg/l Trans ferrin, 0,5 bis 10 mg/l Biotin, 0,5 bis 10 g/l peptisches Pepton und/oder 0,5 bis 10 g/l Casein Pepton enthält. 3. Verfahren zur Vermehrung von Viren in einer Suspen sion von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass in ei nem Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2 vermehrt wird. 4. Diagnostikum, das nach Anspruch 3 vermehrte Viren enthält. 5. Impfstoff, der nach Anspruch 3 vermehrte Viren ent hält.

Inventors: BEHRENS, FRITZ, DR., BERNHARDT, DIETER, DR., BLESER, KLAUS, KRAJCZEWSKI, BRUNO
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1983
Main classification: C12N5
IPC codes: C12N7, A61K39