PROCESS FOR ANTIGEN DETERMINATION

Abstract: 1. A method for determination of the antigen content of a sample by the antigen-antibody reaction, comprising diluting at least one of the two reaction components with a physiological saline solution, which contains polyethyleneglycol and a buffer substance, thereafter combining both reaction components and determining the antigen-antibody-reaction photometrically, characterized in that the buffer substance is a glycine, glycyl-glycine, acetate, citrate, N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-glycine, histidine/HCl, 2-amino-2-(hydroxymethyl)- 1,3-propanol or 5,5-dialkyl-barbituric acid buffer.

Description: Verfahren zur Antigen-Bestimmung BESCHREIBUNG Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des Antigen-Gehalts einer Probe durch die Antigen Antikörper-Reaktion nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie hat auch ein Verdünnungsmittel für die Antigen- bzw. Antikörper-Reaktionskomponente zur Durchführung dieses Verfahrens zum Gegenstand. Die Bestimmung von diagnostisch relevanten Parametern mittels Antigenen in Proben, wie Serum, Plasma oder Liqour, durch die immunologische oder Antigen-Antikörper-Reaktion, die fotometrisch beispielsweise durch Nephelometrie oder Turbidimetrie ausgewertet wird, bedingt oftmals eine spezielle Vorbereitung der beiden Reaktionskomponenten. Oblicherweise wird dabei die eine Reaktionskomponente, die die Probe enthält, deren Antigen-Gehalt bestimmt werden soll, und die andere Komponente, die den Antikörper enthält, also in der Regel durch das entsprechende Antiserum gebildet wird, mit physiologischer Kochsalzlösung oder mit einer physiologischen Kochsalziösung, die zusätzlich 4 % Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 6000) enthält, verdünnt. Der Gehalt an Polyäthylenglykol dient hauptsächlich dazu, die bei der Reaktion entstehenden Antigen-Antikörper-Komplexe an einer Ausflockung, d.h. an der Bildung eines Niederschlags in der durch die Vereinigung der beiden Reaktionskomponenten gebildeten Testlösung während der Antigen Bestimmung, also des Messvorgangs zu verhindern. Diese Eigenschaft des Polyäthylenglykols ist seit längerer Zeit bekannt und stellt für diese Messungen eine Grundanforderung dar, da sonst nicht alle gebildeten Antigen-Antikörper Komplexe während der Messung erfasst werden können. Bei der Bestimmung von Immunglobulinen durch Laserturbidimetrie nach "Arbeitsanleitung für das Lasermed-Turbidometer (pm 4) zur Bestimmung der Immunglobuline IgA, IgG, IgM mit ATAB-Antiseren, Firma AHS Deutschland GmbH, Bereich Merz und Dade, München," 1982, wurde festgestellt, dass verschiedene physiologische Kochsalzlösungen mit 4 Gew.-% Polyäthylenglykol, obwohl sie jeweils nach derselben Rezeptur, mit denselben Chemikalien und von der gleichen Person hergestellt worden waren, unterschiedliche Messsignale am Laserturbidometer während der Analyse ergaben. Es konnten also keine hinreichend reproduzierbaren Ergebnisse erhalten werden. Besonders gestört wurde dabei die sogenannten Kinetik-Methode nach der erwähnten Arbeitsanleitung, bei der nach einer Vorreaktion von beispielsweise 10 Sekunden die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion gemessen und dann der Antigen-Gehalt bestimmt wird. Im Gegensatz zur sogenannten "Fix point-Methode" nach der erwähnten Arbeitsanleitung, d.h. der Endpunktmessung nach einer Reaktionsdauer von beispnelsweise 30 Minuten, braucht man bei der erwähnten Kinetik-Methode also nicht den gesamten Verlauf der Antigen-Antikörper-Reaktion bis zu Ende abzuwarten. Die Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, löst die Aufgabe, ein Verfahren bzw. ein Verdünnungs mittel bereitzustellen, mit dem der Antigen-Gehalt einer Probe selbst mit der Kinetik-Methode reproduzierbar und exakt bestimmbar ist. Das Antikörpermolekül besitzt eine polyvalente und deshalb stark strukturierte Form, während Polyäthylenglykol unpolar und deshalb unstrukturiert ist. Beim Zusammengeben der beiden Reaktionskomponenten kommt es deshalb erst nach geraumer Zeit zu einer gewissen homogenen Verteilung, welche einigermassen reproduzierbare Analysenergebnisse liefert. Das erfindungsgemässe Verfahren beruht nun darauf, eine rasche und homogene Verteilung der beiden Reaktionskomponenten dadurch zu erzielen, dass die polyäthylenglykolhaltige, physiologische Kochsalzlösung zusätzlich mit einer Puffersubstanz versetzt wird, die die strukturierte Form des Antikörpermoleküls durch Ladungsausgleich weitgehend aufhebt. Oberraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion insbesondere von der chemischen Zusammensetzung der Puffersubstanz abhängig ist, und zwar weit mehr als von der Konzentration der Puffersubstanz oder dem pH-Wert. Von besonderer Bedeutung bei der Erfindung ist weiter, dass nicht solche Puffersubstanzen gewählt werden, die eine schnellst mögliche Reaktionsgeschwindigkeit zulassen, sondern vorzugsweise solche Puffersubstanzen, die zu einer sich über einen längeren Zeitraum erstreckenden konstanten Anfangsreaktionsgeschwindigkeit führen. Durch diese Eigenschaft der erfindungsgemäss einsetzbaren Puffersubstanzen wird nämlich die Reaktion gewissermassen gestreckt, so dass sich ein linearer Verlauf über einen relativ langen Zeitraum ergibt. Dadurch wird die Genauigkeit der Ergebnisse der Kinetik Methode beträchtlich verbessert. Werden beispielsweise 20 mmol/l 5.5-Diäthylbarbitursäure, pH 7,5, als Puffer zu der physiologischen, 4 Gew.-t polyäthylenglykol-haltigen Kochsalzlösung zugesetzt, so wird nach der Vereinigung der beiden Reaktionskomponenten eine Vorreaktionszeit von beispielsweise 10 Sekunden abgewartet, an die sich eine Messzeit von beispielsweise 30 Sekunden anschliesst. Der Zeitraum von 30 Sekunden stellt dann eine auch für sehr präzise Messergebnisse ausreichende Messgrundlage für die Antigen Bestimmung dar.

Claims: PATENTANSPROCHE 1. Verfahren zur Bestimmung des Antigen-Gehalts einer Probe durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei zumindest eine der beiden Reaktionskomponenten mit einer physiologischen Kochsalzlösung, die Polyäthylenglykol enthält, verdünnt wird, dann die beiden Reaktionskomponenten vereinigt werden und die Antigen-Antikörper-Reaktion fotometrisch bestimmt wird, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die polyäthylenglykol-haltige physiologische Kochsalziösu eine Puffersubstanz enthält. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz ein Glycin-, Glycylglycin-, Acetat-, Zitrat-, Bicine-, Histidin/HCl-, Tris-, oder 5.5-Dialkylbarbitursäure-Puffer ist. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Barbitursäure 5.5-Diäthylbarbitursäure ist. 4. Verfahren nach einem der AnsprUche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Puffersubstanz in der Kochsalzlösung 5 bis 200.mmol/l, vorzugsweise 20 bis 50 mmol/l beträgt. 5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyäthylenglykols in der Kochsalzlösung 2 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise etwa 4 Gew.-% und das mittlere Molekulargewicht des Poly äthylenglykols 4000 bis 12.000, vorzugsweise etwa 6000 beträgt. 6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der die Puffersubstanz enthaltenden, polyäthylenglykolhaltigen physiologischen Kochsalzlösung 4,0 bis 9,0 und vorzugsweise 6,5 bis 8 beträgt. 7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine fotometrische Bestimmung des kinetischen Verlaufs der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt wird. 8. Polyäthyl englykol-haltige, physiologische Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel wenigstens einer der beiden Reaktionskomponenten der Antigen-Antikörper-Reaktion zur fotometrischen Bestimmung des Antigen-Gehalts, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Puffersubstanz.

Inventors: DANNINGER, JOSEF, SPAETHE, REINER, DR. MED.
Applicants: AMERICAN HOSPITAL SUPPLY CORPORATION
Application year: 1983
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33, A61K39