PROCESS FOR THE PREPARATION OF 3,11-ALPHA DIHYDROXY-1,3,5(10) ESTRATRIENE DERIVATIVES

Abstract: 1. Process for the preparation of 3,11 alpha-dihydroxy-1,3,5(10)-oestratiene derivatives of the general formula I see diagramm : EP0114984,P4,F1 in which R represents an alkyl radical having a maximum of 4 carbon atoms, characterized in that a 3-oxo-4-oestrene derivative of the general formula II see diagramm : EP0114984,P4,F2 in which R has the meaning mentioned above and X and Y together represent an oxo group or X represents a hydroxy group and Y represents a hydrogen atom, is fermented with a culture of Aspergillus ochraceus and, when hydroxylation is complete, with a culture of Arthrobacter simplex or Bacillus sphaericus.

Description: Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekenn zeichnete Verfahren und die Verwendung der dabei erhaltenen Verfahrensprodukte. 3,11a-Dihydroxy-1,3,5(10)-östratrien-Derivate der allgemeinen Formel I gemäss Anspruch 1 sind Wichtige Zwischenprodukte zur Partialsynthese pharmakologisch wirksamer Steroide. Es ist bekannt, dass Steroide mit aromatischem A-Ring als Substrate für mikrobiologische Umsetzungen wenig geeignet sind (K.Kieslich, Steroid Conversions, in R.H. Rose Microbiol. Bioconversions, Academic Press 1981, 425). Die an 3-Oxo-#4- oder 3-Hydroxy-E -steroiden in hohen Ausbeuten durchführbare lla-Hydroxylierung (W. Carney and H.L. Herzog, Microbial Transformations of Steroids, Academic Press 1967) ist auf Östron und Östradiol nicht übertragbar. Überraschen- derweise erhält man mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens in hohen Ausbeuten die lla-Hydroxyverbindungen des Ö^stradiols und seiner 18-Alkylhomologen. Der erste Reaktionsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicher reise bei der mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden mit-Pilzkulturen anwendet. So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Fermentationsbedingungen, wie zum Beispiel Auswahl des günstigsten Nährmediums, des geeigneten Substratlösungs- oder Suspensionsmittels, der Substratkonzentration, der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung, pH-Wert und der optimalen Zeiten für Germination, Substratzugabe und Substratkontakt am Enzym des Mikroorganismus analytisch, insbesondere dünnschichtchromatographisch, ermittelt. Dabei hat sich gezeigt, dass es Zweckmässig ist, Konzentrationen von etwa 100 - 2 000 mg Substrat pro Liter Nährmedium einzusetzen. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 5 - 7 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20 - 40 C, vorzugsweise von 25 350 C. Zur Belüftung werden vorzugsweise 0,5 bis 5 Liter Luft pro Minute pro Liter Kulturbrühe zugeführt. Die Umwandlung des Substrates wird zweckmässigerweise durch dünnschichtchromatographische Analyse von Probeextrakten verfolgt. Die Fermentationsdauer beträgt etwa 20 bis 80 Stunden. Die für diesen ersten Reaktionsschritt benötigten Aspergillus ochraceus Stämme stehen der Fachwelt bei anerkannten Mikro organismen-Sammlungen frei zur Verfügung. Geeignete Stämme sind beispielsweise: Aspergillus ochraceus CBS 13 252, ATCC 1008, ATCC 12 337, ATCC 18 500 oder NRRL 405. Nach beendeter Hydroxylierung wird die erhaltene Hydroxyverbindung zweckmässigerweise nicht isoliert, sondern der Fermentationsansatz mit einer 6 bis 24 Stunde alten Kultur von Arthrobacter simplex oder Bacillus sphaericus versetzt, welche unter den Bedingungen hergestellt wurde, die man üblicherweise zur Anzucht von Bakterienkulturen verwendete Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20 - 400 C, vorzugsweise von 25 - 350 C. Zur Belüftung werden vorzugsweise 0,5 bis 5 Liter Luft pro Minute pro Liter Kulturbrühe-zugeführt. Die für diesen zweiten Reaktionsschritt Arthrobacter simplex oder Bacillus sphaericus Stämme stehen ebenfalls bei anerkannten Mikroorganismen-Sammlungen frei zur Verfügung. Geeignete Stämme sind beispielsweise: Arthrobacter simplex IFO (3530), ATCC 13 260 und AtCC 6 946 oder Bacillus sphaericus ATCC 7 054, ATCC 7 055, ATCC 12 488 oder ATCC 13 805. Der Verlauf des zweiten Reaktionschritts wird ebenfalls analytisch, beispielsweise dünnschichtchromatographisch, verfolgt. Die Fermentationsdauer dieses Schrittes beträgt etwa 40 bis 80 Stunden. Nach erfolgter Fermentation werden die Fermentationsprodukte in an sich bekannter Weise isoliert. Die Isolierung kann zum Beispiel in der Weise erfolgen, dass man die Fermentationsansätze mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert, die Extrakte einengt und die so erhaltenen Rohprodukte gegebenenfalls durch Chromatographie und/oder Kristallisation reinigt. Bevorzugte Ausgangsverbindungen des erfindungsgemässen Verfahrens sind solche der allgemeinen Formel II, welche als Sustituenten R eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe tragen. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens. Diese Beispiele erläutern darüberhinaus die Verwendung der Verbindung der Formel I mit R in der Bedeutung einer Methylgruppe zur Synthese von pharmakologisch wirksamen Substanzen der Formel III gemäss Patentanspruch 2. In der gleichen Weise können die übrigen Verbindungen der Formel I in pharmakologisch wirksame Substanzen der Formel III überführt werden. Beispiel 1 EMI4.1 Ein 2 Liter-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 1200C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 1 % Corn steep liquor, 1,25 1 Sojabohnenmehlund 0,005 X Sojaöl enthält, wird mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus ochraceus (ATCC 1008) beimpft und 21/2 Tage auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur wird ein 20 Liter-Vorfermenter beimpft, der mit 15 1 eines 60 Minuten bei 1210C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Mediums, bestehend aus 1 X Corn steep liquor, 1 X Sojabohnenmehl und 0,005 X Sojaöl, eingestellt auf pH 6,2, gefüllt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 290C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 1/Min.) und Rühren (220 UJMin.) 24 Stunden germiniert. Danach werden 0,9 Liter dieser Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und damit ein 50 Liter-Hauptfermenter beimpft, der mit 15 Liter sterilisiertem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie die Vorfermenterkultur beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden unter Vorfermenterbedingungen wird eine sterilfiltrierte Lösung von 10,5 g 19-Nortestosteron in 150 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben kontrolliert, die mittels Methylisobutylketon extrahiert und dunnschicht- chromatographisch analysiert werden. Nach einer Kontaktzeit von ca. 60 Stunden ist die Hydroxylierung vollständig. Parallel zur Hydroxylierung werden in einem zweiten Fermenter 15 1 flüssiges Nährmedium, bestehend aus 1 Z Hefeextrakt, 0,5 % Corn steep liquor und 0,05 I Stärkezucker sterilisiert, mit 250 ml einer 2-tägigen Arthrobacter simplex - Kultur (ATCC 6946) beimpft und unter Belüftung (15 1/Min.) und Rühren (220 U/Min.) bei 30"C germiniert. Der Zeitpunkt der Beimpfung ist dabei so zu wählen, dass die Kultur bei Beendigung der Hydroxylierung eine Anwachsphase von ca. 18-24 Stunden hinter sich hat. Sodann wird die gesamte Bakterien-Kultur in den halbgefüllten Substratfermenter überführt und mit der A. ochraceus - Kultur vereinigt. Die Bebrütung wird unter den oben genannten Bedingungen fortgesetzt und die nun einsetzende Aromatisierung weiterhin dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach weiteren 60-70 Stunden Kontaktzeit ist'auch die Aromatisierung beendet. Die Kulturbrühe wird nun mit der Hälfte ihres Volumens und anschliessend noch zweimal mit 1/3 des Volumens an Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Den Rückstand rührt man-zur Entfernung des Antischaummittels 2 Stunden mit Hexan, wobei das Hexan mehrmals ersetzt wird und kristallisiert schliesslich aus Aceton um. Man erhält 8,2 g 3,lla-Dihydroxy-l,3'5(lO)-östratrien- -17-on vom Schmelzpunkt 267-2690C. Verwendung des Verfahrensprodukts: a. 3-Benzyloxy-lla-hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on Zu einer Suspension aus 4 g 3,lla-Dihydroxy-1,3,5(10)- -östratrien-17-on und 19,2 g Kaliumcarbonat in 230 ml Aceton tropft man bei Raumtemperatur 3,2 ml Benzyl bromid in 30 ml Aceton und rührt anschliessend 5 Stun den bei 600C. Nach dem Abkühlen giesst man in ca. 2 1 Wasser und extrahiert mit Methylenchlorid. Kristalli sation des Rohprodukts aus Methanol ergibt 5,19 g der Titelverbindung vom Schmp. 154-156 C [&alpha;] 20 = (CHC13, c = 0,5). b. 3-Benzyloxy-17,17-ethylidendioxy-1,3,5(10)-östra- trien-l la-ol Man erhitzt 5,19 g des unter a. erhaltenen Benzyläthers, 5,33 ml Ethylenglykol und 126 mg p-Toluolsulfonsäure in 200 ml Benzol 2 Stunden am Wasserabscheider. Nach dem Abkühlen wäscht man mit gesätt. NaHCO3-Lösung und gesamt. Kochsalzlösung und engt ein. Man erhält 5,6 g des Ketals als farbloses Öl, [&alpha;]D20 = -63,7 (CHCl3, c = 0,5). 0 c. 3-Benzyloxy-lla-ethoxy-1,3,5(10)-ostratrien-17-on Zu einer auf 0 C gekühlten Suspension von 642 mg Natriumhydrid in 30 ml Dimethylformamid tropft man eine Lösung von 900 mg des unter b. erhaltenen Ketals in 15 ml DMF und rührt 15 Min. nach. Anschliessend fügt man 2,27 ml Bromethan hinzu und rührt 16 Stunden bei 25 C. Darauf giesst man in Eiswasser und extrahiert mit Methylenchlorid. Nach dem Einengen erhält man 906 mg eines Rohprodukts, das ohne weitere Reinigung in 20 ml Dioxan gelöst und nach Zusatz von 4 ml 4N-HC1 90 Min. - bei 50 C gerührt wird. Anschliessend giesst man in Wasser, extrahiert mit Methylenchlorid und engt ein. Nach Kristallisation aus Methanol erhält man 780 mg der Titel 20 verbindung vom Schmp. 132-135 C, [&alpha;]D20 =-23 (CHCl3, c =0,5). 3-Benzyloxy-lla-methoxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on Analog erhält man aus 1,2 9 Ketal bei Ersatz von Ethyl bromid durch Jodmethan (1,6 ml) 930 mg der lla-Meth oxy-Verbindung vom Schmp. 148-1500C (Diisopropylether). 3-Benzyloxy-lla-propoxy-l,S,5(10)-dstratrien-17-on Bei Verwendung von l-Brompropan (1,9 ml) erhält man aus 1,1 g des Ketals 710 mg der lla-Propoxy-Verbindung vom Schmp. 1030C (Hexan). r,720 = 2,10 (CHC13, c=0,5). d. 11&alpha;-Ethoxy-3-hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on Eine Lösung von 650 mg 3-Benzyloxy-11&alpha;-ethoxy-1,3,5(10)- -östratrien-17-on in 35 ml Ethanol und 35 ml Essigester wir & nach Zusatz von 650 mg Palladiumkohle (10% Pd) bei Raumtemp. und Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme von 35 ml H2 (1,5 h) wird vom Katalysator abtiltriert und eingeengt. Kristallisation des Rohprodukts aus Hexan ergibt 503 mg der Titelverbindung vom Schmp. 174-1760C, 20 [&alpha;]D20 = -30,6 (CHCl3, c = 0,5). Analog erhält man: 3-Hydroxy-lla-methoxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on 5 vom Schmp. 208-210 C und 3-Hydroxy-ll -propoxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on 20 vom Schmp. 182-183 C (Hexan), (al =-31,2 (CHCl3, c = 0,5). e. 17 -Ethinyle -ethoxy-1,3,5(10)-östratrien-3,17B-diol Die Ethinylierung der unter d. erhaltenen 17-Ketone er folgt nach dem in DOS 22 27 492 beschriebenen Verfanren. Auf diese Weise erhält man: 17&alpha;-Ethinyl-11&alpha;-ethoxy-1,3,5(10)-östratrien-3,17ss-diol vom Schmp. 213-2170C (Diisopropylether), Ausbeute 90X, 20 = -140 (CHC13, = (CHCl3' 17a-Ethinyl-llc-methoxy-1,3,5(10)-östratrien-3,17ss-diol, Schmp. 279-281 C, [&alpha;]20 = -147 (CHC13, c=0,5). D = 17a-Ethinyl-lla-propoxy-1,3,5(10)-östratrien-3,17B-diol, 20 [&alpha;]D = -131 (CHCl3, c = 0,5). Beispiel 2 EMI8.1 Unter den Bedingungen des Beispiels la werden zu einem 50 Liter-Fermenter, der 15 Liter einer Aspergillus ochraceus Kultur enthält, 15 g 18-Methyl-19-nor-4-ostren-3,17-dion, gelöst in 200 ml DMF, zugegeben und 36 Stunden incubiert. Anschliessend wird der Ansatz mit 15 1 einer 24 Stunden vorkultivierten Arthrobacter simplex - Kultur vereinigt und weitere 63 Stunden aerob fermentiert. Zur Isolierung des Umwandlungsprodukts extrahiert man die Kulturbrühe mit Methylisobutylketon, dampft den Extrakt zur Trockne ein, entfernt das Antischaummittel durch Waschen mit Hexan und chromatographiert das Rohprodukt über eine kiesegelsäule (Elution mittels Dichlormethan + 12X Aceton). Nach Kristallisation aus Methanol/Hexan erhält man 6,3 g 3,11a-Dihydroxy-18-methyl-1,3,5(10)-östratrien-17-on vom Schmelzpunkt 263-2640C.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von 3,lla-Dihydroxy-1,3,5(10)- östratrien-Derivaten der allgemeinen Formel I EMI10.1 worin R einen Alkylrest mit maximal 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 3-Oxo-4-östren-Derivat der allgemeinen Formel II EMI10.2 worin R die obengenannte Bedeutung besitzt und X und Y gemeinsam eine Oxogruppe darstellen oder X eine Hydroxygruppe und Y ein Wasserstoffatom darstellen, mit einer Kultur von Aspergillus ochraceus und nach -. erfolgter Hydroxylierung mit einer Kultur von Arthrobacter simplex oder Bacillus sphaericus fermentiert. 2. Verwendung von 3,11&alpha;-Dihydroxy-1,3,5(10)-östratrien Derivaten der allgemeinen Formel I gemäss Anspruch 1 zur Herstellung von Steroiden der allgemeinen Formel III EMI11.1 worin R und R' einen Alkylrest mit maximal 4 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Inventors: EDER, ULRICH, DR., NEEF, GUNTER, DR., PETZOLDT, KARL, DR., Neef, Günter, Dr.
Applicants: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT BERLIN UND BERGKAMEN
Application year: 1983
Main classification: C12P33
IPC codes: C07J21, C07J1, C12P33