TEST DEVICE AND PROCESS FOR THE DETECTION OF THIOLS

Abstract: In a simple and speedy manner the presence of thiols, such as sodium 2-mercaptoethanesulphonate, in body fluids such as urine may be determined by contacting a sample of the fluid with a device comprising an absorbent substrate having absorbed therein a reagent which is capable of acting as an indicator for thiols, such as 5',5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), a buffer and a non-thiol group containing anti-oxidant, such as quinol.

Description: Die vorliegende Erfindung betrifft eine Testvorrichtung, insbesondere eine Vorrichtung zum Nachweis von Thiolen in einer Körperflüssigkeit. Während Vorrichtungen zum Nachweis oder zur Konzentrationsbestimmung verschiedener Substanzen in Körperflüssigkeiten bekannt sind, z. B. Tauchpapierstreifen zum Nachweis von Zucker im Urin, sind keine Vorrichtungen erhältlich, die Thiole, wie z. B. Natrium-2-mercaptoethansulfonat (im folgenden MESNA genannt), Penicillamine, Cystin u. ä. nachweisen können. MESNA wird bei der Krebstherapie mit Oxazaphosphorinen als Harnorgane schützendes Reagenz eingesetzt. Die Oxazaphosphorine (Cyclophosphamid, Ifosfamid und Trophosphamid) sind alkylierende Reagenzien, die vielfach bei der cytostatischen Therapie verwendet werden. Urotoxische Nebenwirkungen können ihre Anwendung einschränlien. In der Blase können diese Nebenwirkungen von der erhöhten Miktionsfrequenz und Dysurie bis zur schweren hämorrhagischen Zystitis reichen und zu Fibrose, reduzierter Kapazität und sogar zu Blasentumoren führen. Forcierte Diurese und Blasenspülungen werden routinemässig durchgeführt um solche Komplikationen zu vermeiden.Das erfordert jedoch stationäre Behandlung und ist nicht nur zeitraubend, sondern unbequem und möglicherweise für den Patienten gefährlich. MESNA, eine Sulfhydryl-Verbindung, kann die mit diesen Medikamenten einhergehende Urotoxizität verhindern. Es beeinträchtigt nicht den alkylierenden oder cytotoxischen Effekt der Oxazaphosphorine und reagiert auch nicht mit anderen cytotoxischen Verbindungen, wie BCNU, Doxorubicirf,t:5FU, MTX, VCR oder Cisplatinum. MESNA wird in vivo schnell zum biologisch inaktiven Disulfid DIMESNA oxidiert, das in der Niere wieder zur freien Thiolverbindung reduziert-wird. MESNA reagiert im Urin mit Acrolein,. das als Hauptmetabolit der Oxazaphosphorine für deren Urotoxizität verantwortlich ist,und bildet einen nichttoxischen, stabilen Thioether, der dann unver ändert ausgeschieden wird. Ebenso führt spontane Zersetzung des o-Hydroxyoxazaphosphorins in der Blase zu Acrolein. MESNA vermindert die Zersetzungs-Rate der 4-Hydroxy-Metabolite der Oxazaphosphorine im Urin durch die Bildung eines relativ stabilen, nichturotoxischen Kondensationsproduktes und vermindert so die Rate freiwerdenden Acroleins. Da die Halbwertszeiten der Metaboliten innerhalb des Organismus wesentlich grösser sind als die von MESNA, und der Grad des Schutzes von der Konzentration an freiem Thiol im Urin abhängt, ist es von ausserordentlicher Bedi- tung, die Blasen-MESNA-Konzentration zu jeder Zeit auf einem, die Harnorgane schützenden Spiegel (veranschlagt auf einen Überschuss von annähernd 300 pg/ml) zu halten. Obwohl jedoch für normale Patienten solche MESNA-Dosen verabreicht werden, dass eine Konzentration von ca. 900 Mg/ml Urin in der Blase erreicht wird, gibt es eine bedeutende Anzahl von Patienten, die bei normalen MESNA Gaben geringere Konzentrationen in der Blase aufweisen und somit von den Metaboliten der alkylierenden Reagenzien gefährdet werden, wenn nicht der MESNA-Spiegel in der Blase beobachtet und erhöht wird. Mögliche Gründe für die niedrigen MESNA-Spiegel in der Blase sind erhöhte Flussigkeitsaufnahme, was zum Ausspülen von MESNA aus der Blase führt,. und Nierenversagen. Wenn geringe MESNA-Werte festgestellt werden, kann die MESNA-Dosierung so lange erhöht werden, bis ein,die Harnorgane schützender Spiegel erreicht ist. Da jedoch grosse Überschüsse an MESNA möglicherweise zu unerwarteten Nebenwirkungen, wie Übelkeit führen, ist die Erhöhung der Dosierung nur dort angezeigt, wo normale Dosierungen sich als ungenügend herausgestellt haben. Die Thiole, wie HESNA, in einer Urinprobe sind oxidationsempfindlich und wenn der Thiolgehalt der Probe nicht innerhalb 1/2 h nach der Sammlung festgestellt wird, erhält man ungenaue Ergebnisse. Um die vorhandenen Labormethoden für die Thiolbestimmung nutzen zu können, muss die Oxidation chemisch unterbunden werden bevor die Proben zur Analyse gegeben werden. Die Thiol-Bestimmung wird dann im Labor durch Zugabe von Ellman's Reagenz, eine Lösung, in der die aktive Substanz 5',5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (im folgenden "5,5-DNB" genannt) ist, und durch Messung der Absorptionsänderung der Proben durchgeführt. In Gegenwart von Thiolen zeigt das Ellman's Reagenz eine tiefgelbe Farbe. Die beschriebene Labormethode zur Bestimmung der Thiole im Urin erfordert hochentwickelte Laboreinrichtungen, ist zeitraubend und führt möglicherweise zu einer Verzögerung im Bereich von Stunden zwischen der Abgabe des Urins und der nötigen Änderung der Thioldosierung, die erfolgen muss, wenn ungenügende Thiolkonzentrationen festgestellt werden. Während dieser Verzögerung können die oben beschriebenen, durch die Metaboliten der alkylierenden Reagenzien in der Blase hervorgerufenen gefährlichen und schmerzhaften Wirkungen eintreten. Um den MESNA-Spiegel der Blase überwachen und wenn nötig, anheben zu können, um diese Nebenwirkungen zu vermeiden, besteht ein Bedarf an einer neuen Methode zur Bestimmung von Thiolen in Körperflüssigkeiten wie Urin, die für eine schnelle Überwachung der Thiolspiegel geeignet ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Methode und eine Vorrichtung zum Nachweis von Thiolen in Körperflüssigkeiten zu entwickeln, die schnell und ohne Labor oder geschultes Laborpersonal eingesetzt werden kann. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Thiolen in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Absorptionsmaterial enthält, in dem ein Reagenz, das bei Gegenwart von Thiolen eine sichtbare Farbver änderung zeigt, ein Puffer und ein Anti-Oxidans, das keine Thiolgruppen enthält, absorbiert ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zum Nachweis von Thiolen in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe einer Körperflüssigkeit genommen wird, innerhalb einer halben Stunde nach der Entnahme mit einer Vorrichtung in Kontakt gebracht wird, die ein Absorptionsmaterial enthält, in dem ein Reagenz, das bei Gegenwart von Thiolen eine sichtbare Farbveränderung zeigt, ein Puffer und ein Anti Oxidans, das keine Thiolgruppen enthält, absorbiert ist, und visuell festgestellt wird, im allgemeinen 5 bis 10 Sekunden nach dem Kontakt der Vorrichtung mit der Probe, ob eine Farbveränderung eingetreten ist oder nicht. Die erfindungsgemässe Vorrichtung enthält ein Anti-Oxidans, da bei dessen Abwesenheit festgestellt wurde, dass sich das Absorptionsmittel, das üblicherweise Papier, wie z.B. Filterpapier ist, verfärbt und dadurch den Nachweis der Farbveränderung ungenau werden lässt. Das Anti Oxidans darf keine Thiolgruppen enthalten. Geeignete Substanzen sind Flavonoide und Katechine, Ascorbinsäure, Chinole und Chinolderivate. Besonders bevorzugt ist Chinol, da es seine antioxidative Wirkung ohne Beeinträchtigung des farbver ändernden Reagenzes zeigt. Geeignete Chinol-Konzentrationen im Absorptionsmittel, angenommen es ist Filterpapier, erhält man durch Eintauchen des Substrates in eine Lösung, die wenigstens 3,5 g/ 1, vorzugsweise wenigstens 4 g/l Chinol enthält. Als ein Reagenz, das in Gegenwart von Thiolen, wie MESNA, Penicillamin, Cystin o.ä. Farbveränderung zeigt, eignet sich die aktive Komponente aus dem Ellman's Reagenz. Bei Verwendung dieses Reagenzes 5,5DNB verändert sich die Farbe des Absorptionsmittels unmittelbar nach Kontakt mit einer Urin-Probe, die genügende Konzentrationen an Thiol aufweist,nach leuchtendgelb. Durch Veränderung der Reagenzkonze+r?tion im Absorptlons- mittel kann die Empfindlichkeit der Vorrichtung ebenso variiert werden, um sicherzustellen, dass der Farbwechsel für das spezielle Thiol,z.B. MESNA, erst oberhalb einer bestimmten akzeptablen Minimalkonzentration beobachtet wird. So kann, wenn beispielsweise das Absorptionsmaterial Whatman No. 1 Filterpapier in eine Lösung, die unter anderem 2 g/l 5,5-D,B enthält, eingetaucht und getrocknet wird, der Farbwechsel zum tiefgelbe hin bei einer Urinprobe, die ungefähr 400 pg/ml oder mehr MESNA enthält, eintreten. Dadurch kann der normale Thiolspiegel im Urin eines Patienten, der keine Thiolbehandlung erhält und kleiner ist als ca. 50 pg/ml, mit der erfindungsgemässen Vorrichtung kein positives Ergebnis bewirken. Das Absorptionsmittel der erfindungsgemässen Vorrichtung enthält einen Puffer, der sicherstellt, dass der pH für die Thiol/Reagenz¯Reaktion den für den Farbwechsel optimalen Wert besitzt. Der Puffer-pH hängt ab von der Wahl des Reagenzes; für 5,5-D-NX ist ein schwach alkalischer pH, üblicherweise ca. 7.4, angebracht. Nach einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung hat die Vorrichtung die Form eines Kunststoffstreifens, dessen eines Ende das Absorptionsmittel trägt. Bei dieser Ausführungsform kommen die Finger des Ausführenden nicht mit der Probe oder dem Absorptionsmittel in Kontakt. Elution kann dazu führen, dass die Farbe auf dem Absorptionsmittel über die Oberfläche wandert. Zur Minimierung dieses Effektes kann das Absorptionsmittel, das vorzugsweise die Form einer Scheibe, eines Streifens oder eines Blattes bis zu einer Dicke von ca. 0.5 mm besitzt, an seinen grossen Flächen von einem Plastikfilm überzogen werden, der nur die Ränder freilässt. Testvorrichtungen dieser Art können auf übliche Weise verpackt werden, z.B. in Flaschen über Silica Gel, das das Absorptionsmittel davor bewahrt, feucht zu werden. Die erfindungsgemässe Vorrichtung und Methode ist schnell, nicht-invasiv und kann von Schwestern, dem Patienten oder Verwandten bei stationärer oder ambulanter Behandlung eingesetzt werden. Es ist eine einfache Möglichkeit, um den Thiolspiegel des Urins zu beobachten,und die es erlaubt, die MESNA-Dosierung unverzüglich anzupassen, um dadurch die urotoxischen Auswirkungen der Zeiten mit geringem MESNA-Spiegel im Urin zu verhindern. MESNA besitzt einen breiten therapeutischen Index und kann intravenös oder oral gegeben werden. Die Anwendung des erfindungsgemässen Teststreifens erlaubt die Anpassung der MESNA-Dosierung und sorgt dadurch für den Schutz gegen Urothel-Toxizität der Oxazaphosphorine. Bei ambulanter Oxazaphosphorin-Behandlung kann MESNA erfolgreich oral verabreicht werden. Veränderung der freien Thiolkonzentration im Urin kann mittels erfindungsgemässem Teststreifen beobachtet werden, wodurch jede notwendige Modifikation der MESNA-Dosierung möglich wird. Daher hat die Teststreifenmethode klinische Bedeutung für die stationäre und ambulante cytotoxische Oxazaphosphorin-Therapie. Dadurch, dass sie eine Anpassung der MESNA-Dosierung ermöglicht, wird nicht nur die Therapie effektiver, sondern genauso nachhaltig wird die Lebensqualität des Patienten verbessert. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Testvorrichtung soll nun durch Beispiele unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben werden: Figur 1 ist eine perspektivische Ansicht der bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. In Figur 1 besteht die Testvorrichtung aus einem dünnen Kunststoffstreifen (1), an dessen einem Ende ein Blatt Filterpapier (2) befestigt ist, das ein Reagenz, das in der Lage ist, einen sichtbaren Farbwechsel in Gegenwart von Thiolen zu zeigen, einen Puffer und ein Anti-Oxidans ohne Thiol-Gruppe, absorbiert enthält. Bei Benutzung wird der Streifen (1) an dem, dem Blatt (2) entgegengesetzten Ende gehalten, das Blatt in eine Körperflüssigkeit wie Urin eingetaucht, herausgezogen und visuell geprüft, ob ein Farbwechsel des Reagenzes eingetreten ist oder nicht. Die Herstellung, der Gebrauch, die Sensitivität und die Stabilität der erfindungsgemässen Testvorrichtung wird anhand der folgenden Beispiele beschrieben. Beispiel 1 Herstellung Eine Reagenzlösung mit folgenden Konzentrationen wurde hergestellt: 5',5'-Dithiobis -(2-nitrobenzoesäure) 0,05 g Trikaliumcitrat 2,5 g Chinol 0,1 g Phosphat Puffer (0,25 M, pH 7,4) ad 25 ml In diese Lösung wurde Whatman No. 1 Filterpapier eingetaucht, das anschliessend über Nacht langsam bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Beispiel 2 Verwendung des Teststreifens Urinproben können entweder unmittelbar nach ihrer Abgabe oder später, dann jedoch unter Zugabe von soviel EDTA, dass die Konzentration im Urin annähernd 1 mg/ml beträgt, getestet werden. Diese Massnahme ist nötig, um die spon tane Bildung von MESNA-Disulfid, das nicht detektierbar ist, zu reduzieren. In den folgenden Beispielen wurden schmale Streifen des nach Beispiel 1 imprägnierten Filterpapiers in Urinproben getaucht. Eine leuchtendgelbe Farbe, die innerhalb weniger als 30 Sekunden erschien, wurde als Hinweis auf MESNA-haltige Urin-Proben genommen. Zur Kontrolle wurden 8 Urinproben von 4 Männern und 4 Frauen , die kein MESNA oder keine anderen Thiole, ausser den normalen, aus Speisen stammenden,erhalten hatten, durch Eintauchen der imprägnierten Testpapiere getestet. Alle zeigten keine Reaktion. Eine Reihe mit abnehmenden MESNA Konzentrationen wurde mit den nach Beispiel 1 hergestellten Testpapieren überprüft. Die Nachweisgrenze für MESNA lag bei ungefähr 0.015 mg/ml. Die Obergrenze, über der keine weitere Farbveränderung mehr beobachtet werden konnte, lag annähernd bei 2 mg/ml. Der visuell beobachtbare Farbwechsel für das imprägnierte Papier variierte von leicht blassgelb für Konzentrationen von 0,015 bis 0,062 mg/ml über gelb für Konzentrationen von 0,025 bis 0,08 mg/ml zu orange für Konzentrationen von 0,07 - 0,6 mg/ml und höher. Die Überlappungen dieser semiouantitativen Kategorien kommen durch unterschiedliche Interpretation der Farbe durch verschiedene Personen zustande. Eine Blindprobe vor der Applikation von MESNA ist daher zu empfehlen! Beispiel 3 Stabilität der Teststreifen Nach Beispiel 1 hergestellte imprägnierte Papiere wurden der normalen Laboratmosphäre im Licht für einen Monat ausgesetzt. Während dieser Zeit trat eine leichte Bräunung ein, die wahrscheinlich das Resultat der Chinol-Oxidation ist. Dieser Effekt beeinflusste jedoch nicht den Nachweis der Thiole in den Urinproben oder die Sensitivität der Technik. Nichtsdestoweniger kann die Lagerung in dunklen Behältern über Silica Gel die Verfärbungen des Papiers reduzieren.

Claims: Patentansprüche 1) Vorrichtung zum Nachweis von Thiolen in Körper flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Absorptionsmaterial enthält, in dem ein Indi kator für Thiole, ein Puffer und ein Anti-Oxidans ohne Thiolgruppen absorbiert ist. 2) Vorrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Form eines Streifens, an dessen einem Ende das Absorptionsmaterial in Form einer Scheibe, eines Streifens oder eines Blattes bis zu einer Stärke von 0,5 mm gemäss Anspruch 1 befestigt ist, besitzt. 3) Vorrichtung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Absorptionsmaterial Filterpapier ist. 4) Vorrichtung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator 5',5' Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) ist. 5) Vorrichtung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti-Oxidans Flavonoide, Katechine, Ascorbinsäure, Chinole oder Chinolderivate verwendet werden. 6) Vorrichtung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-Oxidans Chinol oder dessen Derivate ist. 7) Vorrichtung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, da-ss sie aus einem dünnen Kunst stoffstreifen besteht, an dessen einem Ende ein Blatt Filterpapier, das als Indikator 5',5'-Dithiobis-(2-nitro benzoesäure) einen Puffer und als Anti-Oxidans Chinol absorbiert enthält, befestigt ist. 8) Verfahren zum Nachweis von Thiolen in Körperflüssig keiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung gemäss Anspruch 1 bis 7 in die zu testende Körper flüssigkeit eingetaucht wird und der Grad einer auf tretenden Farbveränderung als semiquantitatives Mass für die Anwesenheit von Thiolen genommen wird. 9) Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Körperflüssigkeitsprobe nach der Entnahme ein Stabilisator zugegeben wird. 10) Verfahren gemäss Anspruch 8 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, dass der Stabilisator EDTA ist, und die Konzen tration des Stabilisators in der Probe ca. 1 mg/ml beträgt.

Inventors: FRANCIS DALTON, JOAN ISOBEL, SHAW, IAN CHARLES
Applicants: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL G.M.B.H
Application year: 1983
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33