ADHESIVE WOUND COVERING MATERIAL COMPRISING COLLAGEN

Abstract: 1. Dry, Fleecy or spongy tissue-adherent flat collagenous dressing made of collagen and fibrinogen, characterized in that the dressing is made in layers by freeze-drying a collagen/fibrinogen combination and contains a collagen layer which is 0.3 to 2 cm thick, and which has on at least one surface a fibrinogen layer which is 0.2 to 2 mm thick with a fibrinogen content of from 0.5 to 10 mg/cm**2 and is anchored in the collagen.

Description: Gewebeverklebbare kollagene Wundauflage Kollagen wird seit geraumer Zeit in der Chirurgie verwendet. Es kann in Form von Schwämmen oder Fasern zur Blutstillung verwendet werden und ist auch nach entsprechender Modifizierung zur Beschleunigung der Wundheilung geeignet. Bei Patienten mit defekter Blutgerinnung oder bei grossflächigen Blutungen genügen übliche kollagene Wundauflagen nicht. Man hat daher bereits versucht, Kolagenmaterial mit dem Gewebe zu verkleben, wobei man Kleber auf Basis Resorcin-Formaldehyd, Kollagen oder Gelatine verwendete. Solche Kleber sind zwar hämostyptisch, jedoch wegen ihrer Toxizität für die Praxis ungeeignet. Dies gilt auch für Acrylatkleber und die Kombination mit kollagenen Wundauf lagen. Es ist bekannt, dass Kollagen kovalente Vernetzungen mit Bindegewebebestandteilen eingehen kann. Dabei finden Vernetzungen vom Kollagen über Schiff-Basen sowie Aldolkondensation statt. Bekannt ist auch, dass bei Basalmembranen die Gewebefestigkeit zusätzlich durch S-S Brücken des Basalmembrankollagens erreicht wird. Bekannt ist weiterhin, Proteine, wie Albumin mit intermolekularen S-S Bindungen nach milder Reduktion und nachfolgender Oxidation über S-S Brücken zu vernetzen. Bei Verletzungen bildet sich durch die Blutgerinnung ein primärer Wundverschluss. Hierfür sind aggregierte Thrombozyten und ein Fibrinnetzwerk verantwortlich. Es ist bekannt, dass einzelne Fibrinmoleküle durch Transglutaminasen (wie Faktor XIII) vernetzt werden. Hierbei bilden sich neue Peptidbindungen zwischen Glutaminsäure und Lysin benachbarter Ketten. Mit der Technik der Fibrinklebung, also durch Verwendung von Fibrinogen und Thrombin, wird die Endphase der plasmatischen Blutgerinnung nachgeahmt. Die Fibrinklebung allein ist nicht in der Lage, grossflächige Blutungen zu stillen. Dies gelingt erst durch eine kombinierte Anwendung der Fibrinklebung mit einer resorbierbaren kollagenen Wundauflage. Jedoch muss man dabei drei Komponenten bereithalten, nämlich die kollagene Wundauflage, Thrombinlösung mit Antifibrinolytika und eine tiefgefrorene hochkonzentrierte Fibrinogenlösung. Da-Blutungen häufig plötzlich und unprogrammiert auftreten, stehen diese drei Komponenten im entscheidenden Augenblick häufig nicht anwendungsbereit zur Verfügung, denn zumindest die tiefgefrorene Fibrinogenlösung muss zuvor aufgetaut werden. Auch das Mischen vor der Applikation ist verhältnismässig kompliziert. In der "Wiener medizinische Wochenschrift Nr. 7 (1976)" wird auf den Seiten 86 bis 89 über die lokale Anwendung von Fibrinogen und Kollagen zur Blutstillung in der Herzchirurgie berichtet. Bei der Technik der dort beschriebenen Klebung verwendet man humanes Fibrinogen Kryopräzipitat, Thrombin, ein Faktor XIII Konzentrat sowie ein Kollagenvlies, Das Fibrinogen wird auf die gewünschte Stelle aufgebracht und dort durch den Zusatz der Thrombinlösung und von Faktor XIII zur Gerinnung gebracht. Bei stärkeren Blutungen wendet man das Kollagenvlies als vollständig resorbierbare Trägersubstanz an, wobei man auf das Kollagenvlies die Lösungen aufträgt und anschliessend das Kollagen mit der mit Fibrinogen beschichteten Seite auf die blutende Stelle aufpresst. Dadurch soll eine vollständige Auspolymerisierung des Fibrins und Haftung der Fibrinfasern im Gewebe erfolgen. Bei dieser Klebetechnik erfolgt die Beschichtung des Kollagens mit Fibrinogen erst unmittelbar vor der Anwendung, um ein Kollabieren des Kollagenschwammes weitgehend zu vermeiden. Aufgabe der Erfindung ist es, dem Chirurgen eine kollagene Wundauflage zur Verfügung zu stellen, die in vorbereiteter Form direkt während der Operation angewendet werden kann un? wobei die vorendhntenAchteile der Fibrinklebung in Kombination mit resorbierbarem Kollagen nicht auftreten. Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, eine lagerfähige Kollagenzubereitung zur Verfügung zu stellen, die die für die Einleitung der lokalen Hämostase erforderlichen Komponenten enthält. Diese Aufgabe wird durch eine gewebeverklebbare, kollagene Wundauflage gemäss dem Anspruch 1 gelöst. Die erfindungsgemässe Wundauflage hat einen schichtweisen Aufbau. Die Hauptschicht besteht hierbei aus dem Kollagen und zwar hat diese Schicht eine Dicke zwischen etva 0,3 und 2 cm, vorzugsweise 0,7 bis 1 cm. Einseitig oder beidseitig auf dieserRollagenschicht befindet sich eine Fibrinogenschicht. Diese Fibrinogenschicht hat eine Dicke von etwa 0,2 bis 2 mm und wird auf die Kollagenoberfläche aufgebracht, wobei eine Verankerung der t Fibrinogenmoleküle mit den Kollagenmolekülen im Grenzgebiet der Schichten vorliegt. Wesentlich ist, dass die Fibrinogenschicht, Fibrinogen in einer Menge von 0,5 bis 10 mg, vorzugsweise 4 mg/cm2 enthält. Es ist häufig vorteilhaft, wenn das Fibrinogen das einseitig oder beidseitig auf das Kollagen als Schicht aufgebracht wird, freie SH-Gruppen enthält. Diese freien SH-Gruppen können zuvor in dem Fibrinogen durch reduktive Spaltung der Disulfidbrücken ausgebildet sein, oder indem man Fibrinogen mit SH-Gruppen haltigen Fibrinogen abmischt. Weiterhin ist es auch möglich die in Fibrinogen enthaltenen Disulfidbrücken unverändert zu lassen und zusätzlich SH-Gruppen einzubauen, z.B. nach der Methode von Benesch & Benesch in "Proceedings of the National Academy of the USA, Washington", Band 44, 1958, S. 848 bis 853 oder Biochem.Journ. 1966 101, Seiten 717 bis 720 (Stephen und Mitarbeiter). Es kann vorteilha;ft sein,wenn neben dem Fibrinogen wenigstens eine der Schichten noch Antifibrinolytika und/oder polyvalente Proteinaseninhibitoren enthält, wobei ausserdem noch Thrombin vorhanden sein kann, mit dem Proviso, dass das Thrombin sich nicht in der gleichen Schicht oder in unmittelbarem Kontakt mit Fibrinogen befindet. Die Herstellung der erfindungsgemässen kollagenen Wundauflage kann in folgender Weise erfolgen: Zunächst wird Kollagen in sich bekannter Weise präpariert. Das Kollagen soll dabei vorzugsweise einen Reinheitsgrad, ausgedrückt durch das Gewichts verhältnis von Stickstoff zu Hydroxyprolin < 4, ins- besondere < 3 aufweisen. Faktor N/Hyp = mg N mg 4-Hyp J. Mol.Bio.44 1969,Seite 161. Eine 1,5 %-ige Kollagenlösung in 0,05 %-iger Essigsäure wird in bekannter Weise zu einem 0,5 cm dicken Kollagenschwamm gefriergetrocknet. Erwünschtenfalls kann man bei dieser Gefriertrocknung auch eine Lösung einsetzen, welcher man zuvor Antifibrinolytika (Tranexamsäure) und/oder poyvalente Proteinaseninhibitoren (Aprotinin) zugegeben hat, wobei diese in solchen engen zugegeben werden, dass im fertigen olla- genschwamn pro cm' eine Konzentration von 0,2 bis 10 mg bzw. 4-bis :1000 KIE vorliegt. Getrennt von der'Herstellung des Kollagenschwamms wird eine Fibrinogenlösung wie folgt hergestellt: Fibrinogen für Infusionszwecke wird in isof. NaCl bis zu einer Konzentration von 30 mg Fibrinogen pro ml gelöst. Diese Lösung wird dann mit einer üblichen Sprühvorrichtung auf den zuvor hergestelltenKollagenschwamm unter sterilen KauteLen in einer Dicke von 0,2 bis 2 mm aufgesprüht, die eine Menge von 0,5 bis 10 mg/cm2 ergibt, sofort gefriergetrocknet, wobei die dadurch ausgebildete Schichtdicke in der Regel 2 mm Schichthöhe nicht übersteigen darf, weil sonst die Haftung dieser Schicht schlecht ist. Mit dieser Technik wird eine ausreichende Verankerung in der Kollagenmatrix sichergestellt. Gewünschtenfalls können auch in die Fibrinogenschicht Antifibrinolytika und/oder polyvalente Proteinaseninhibitoren eingearbeitet werden. Es ist bekannt, Kollagen als Träger für Antibiotika, wie Gentamycin zu verwenden. Auch die erfindungsgemässen Wundauf lagen können Wirkstoffe enthalten, beispielsweise Gentamycin 1 Tetracyclin oder andere Antibiotika oder Chemoterapeutika. Herstellung von Kollagen: Von allen Pigmentschichten und Muskelresten befreite frische Rindersehnen wurden homogenisiert und eine Menge, die 100 g Trockengewicht entspricht, in 3 1 0,05 m Zitratpuffer (pH 3,7) 24 Stunden lang extrahiert und anschliessend gegen 1 % Essigsäure 12 Stunden dialysiert. Das in 3 1 1 % Essigsäure suspendierte Gewebe wird 48 Stunden bei 100C unter ständigem Rühren mit Pepsin im Verhältnis Kollagen : Pepsin = 50 : 1 inkubiert. Der Ansatz wird mit 1 % Essigsäure auf 5 1 verdünnt und durch Zentrifugation von den ungelösten Sehnenfragmenten befreit. Die viskose Kollagenlösung wird gegen alkalisiertes Leitungswasser (pH 8,0) dialysiert und dann scharf zentrifugiert. Der Rückstand wird erneut in 5 1 1 % Essigsäure gelöst und dialysiert. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis der Faktor Stickstoff:4-Hydroxy prolin < 3 ist. Nach dem letzten Dialysieren wird mit 0,05 % Essigsäure eine 1,5 %-ige Kollagenlösung hergestellt, die für die nachfolgenden Versuche verwendet wird. Zur Herstellung einer Antifibrinolytika'und/oder Proteinaseninhibitor-haltigen Kollagenschwammes von 10 x 10 x 0,5 cm werden 50 ml der Kollagenlösung mit 0,2 g Tranexamsäure und/oder 40.000 KIE Aprotinin versetzt und gefriergetrocknet. Zur Herstellung eines Kollagen-Gentamycin-Schwamms von 10 x 10 x 0,5 cm werden 50 ml der Kollagenlösung auf pH 1 bis 2 eingestellt, mit 100 mg Gentamycinsulfat versetzt und gefriergetrocknet. Herstellung von Fibrinogenlösung: Im Handel befindliches steriles Fibrinogen wird in steriler isotoner Na HC1 gelöst, so dass eine Lösung von 30 mg Fibrinogen/ml Lösung vorliegt, die für die nachfolgenden Versuche verwendet wird. Um ein SH-Gruppen-modifiziertes Fibrinogen zu erhalten, arbeitet man wie folgt: Fibrinogen wird in isotoner Kochsalzlösung bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. 10 ml dieser Fibrinogenlösung werden mit 1 ml einer N-Acetylhomocystein thio S tonlösung (60 mg/ml Aqua dest) und 10 ml eines Carbonatpuffers (pH 10,6) versetzt und bei OOC 35 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 40 ml eines Phosphatpuffers pH 7,0 i 0,4 gestoppt. Anschliessend wird mit der Technik der Membranfiltration unter Verwendung eines Filters (Ausschlussgrenze Molekulargewicht 5.000) die Lösung entsalzt und gleichzeitig eingeengt. Herstellung von Wundauf lagen, die Kollagen und Fibrinogen enthalten: Es wird zunächst 100 ml einer 1 %-igen Kollagenlösung in eine Metaliform von 10 x 10 cm gegeben, nach üblicher Technik gefriergetrocknet und der resultierende Schwamm dann sterilisiert. Unter aseptischen Bedingungen wird nun dieser sterilisierte Kollagenschwamm mit einer Fibrinogenlösung besprüht, wobei pro Quadratzentimeter Kollagenoberfläche 5 mg Fibrinogen aufgetragen werden. Anschliessend erfolgt eine erneute Gefriertrocknung und Verpackung unter sterilen Kautelen. Die Kollagenschicht hat eine Dicke von 10 mm und die darauf befindliche Fibrinogenschicht eine Dicke von ca. 0,3 mm. Resultate der in vitro und in vivo Versuche mit Kolla-' gen-Fibrinogen-- sowie Gentamycin-Kollagen-Fibrinogen- Schwämmen. In vitro: Die so hergestellten Wundauflagen wurden mit einer Reissfestigkeitsrnaschine getestet, bestehend aus einem Kraftaufnehmer, verbunden mit einem Schreiber. Die Eichung erfolgte im Bereich von 100 bis 1000 Pond. Die Kollagen-Fibrinogenschämme wurden mit der Kollagenseite auf eine Plastikscheibe (D=1 cm) mittels eines technischen Klebers geklebt. Die fibrinogenbeschichtete Seite wurde dann mit 0,1 ml Thrombinlösung (1000 NIH/ml) befeuchtet und nach 20 Minuten in der Testmaschine die Reissfestigkeit bestimmt. Es resultierten Werte von 730 Pond/cm' (Mittelwert aus 7 Messungen). In vivo: In einer Studie an 400 Ratten wurden die (Gentamycin) Kollagen-Fibrinogen-Wundauflagen(als Fibrocoll bezeichnet) zur Anastomosensicherung am Colon mit der herkömmlichen Gewebeklebung mit Plasmafraktionen (Fibrinklebesystem = FK) untersucht. a) Kontrollgruppe (Enterotomien mit 7 invertierenden Einzelknopfnähten nach Lembert. b) zusätzliche Applikation von FK c) FK mit Kollagenvlies (fibrinogen-,gentamycin-frei) d) Nahtsicherung mit Fibrocoll e) Fibrocoll mit Gentamycin ( 1 mg/cm2) In derlnitialphase der Wundheilung zeigten die mit verschiedenen Klebesystemen behandelten Tiere bis zum 3. postoperativen Tage im Nahtbereich eine deutlich höhere Wundfestigkeit. Gegenüber der herkömmlichen Fibrinklebetechnik waren bei Verwendung von Fibrocoll Adhäsionen im Wundbereich vermindert. Durch die Applikation der Gentamycin-Kollagen-Fibrinogen Wundauflagen wurde eine kontrollierte Freigabe des Antibiotikums beobachtet, die Serumkonzentrationen lagen weit unter der toxischen Grenze. In einer weiteren Versuchsserie wurden Hemihepatektomien in "finger fracture technignettbei 5 Schweinen durchgeführt und nach Ligatur der fassbaren Arterien und Venen die blutenden Parenchymdefekte mit Kollagen-Fibrinogen Wundauflagen versorgt. Im folgenden postoperativem Verlauf wurden Nachblutungen nie beobachtet, die Resorption der Materialien war nach 12 Wochen abgeschlossen. Mit den (Gentamycin) Kollagen-Fibrinogen-Wundauflagen steht ein Material zur Verfügung das bei einfacher, rascher, sicherer Handhabung ausgezeichnet zur Blutstillung eingesetzt werden kann. Weiter wird eine Verbesserung der Wundheilung bei gleichzeitigem Antibiotikaschutz beobachtet.

Claims: Patentansprüche: 1. Trockene, vlies- oder schwammförmige,gewebeverkleb bare, flächenförmige, kollagene Wundauflage aus Kollagen und Fibrinogen, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass sie schichtweise durch Gefriertrocknung einer Kollagen/Fibrinogen-Kom bination aufgebaut ist und eine 0,3 bis 2 cm dicke Kollagenschicht enthält, die wenigstens an einer Oberfläche eine 0,2 bis 2 mm dicke Fibri nogenschicht mit einer Fibrinogenmenge von 0,5 bis 10 mg/cm2 aufweist und in dem Kollagen ver ankert ist. 2. Wundauflage gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Fibrinogen SH-Gruppen enthält. 3. Wundauflage gemäss Anspruch 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daB das Fibrinogen SH-Gruppen enthält, die entweder durch nachträg liche Sulfhydrierung in das Fibrinogenmole'l eingebracht oder durch Reduktion der Disulfidbrücken im Fibrinogen molekül gebildet wurden. 4. Wundauflage gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass sie zusätzlich einen Arzneimittelwirkstoff enthält. 5. Wundauflage gemäss Anspruch 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass sie in wenigstens einer der Schichten Antifibrinolytika und/oder polyvalente Proteinaseninhibitoren und oder Thrombin enthält, wobei jedoch die Kombination Thrombin-Fibrinogen in einer Schicht ausgeschlossen ist. 6. Wundauflage gemäss Anspruch 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der Arzneimittel wirkstoff ein Antibiotikum ist. 7. Wundauflage gemäss Anspruch 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Antibiotikum Gentamycin ist. 8. Wundauflage gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass das Kollagen einen Reinheitsgrad, ausgedrückt durch das Ge wichtsverhältnis von Stickstoff zu 4-Hydroxyprolin von C4, vorzugsweise < 3 hat.

Inventors: STEMBERGER, AXEL, DR.-RER.NAT.
Applicants: DR. RUHLAND NACHF. GMBH
Application year: 1983
Main classification: A61L15
IPC codes: A61F13, A61L15, A61L27, A61K38