PROCESS FOR THE PREPARATION OF ISOMALTULOSE (6-0-ALPHA-D-GLUCOPYRANOSIDO-D-FRUCTOSE) USING IMMOBILIZED BACTERIAL CELLS

Abstract: 1. In a process for preparing isomaltulose (6-0-alpha-D-glucopyranosido-D-fructose) wherein sucrose solution is treated with or brought into contact with dead immobilized cells of a microorganism and the formed isomaltulose is obtained by crystallizing characterized in passing one part of the sucrose solution having a concentration of 40% by weight to 75% by weight, preferably 45% by weight to 60% by weight via a reactor, which is filled with immobilized dead cells at 25 degrees C to 40 degrees, preferably 30 degrees C to 40 degrees C so that 80% to 90% of the sucrose is converted, in passing the first mother liquor obtained after having crystallized the formed isomaltulose with a further part of the sacrose solution via a second reactor, which is also filled with immobilized, dead cells at 25 degrees C to 40 degrees C, preferrably 30 degrees C to 40 degrees C so that the sucrose is almost completely converted, and by obtaining the isomaltulose resulting from the second part of the solution in crystalline form by methods known per se, in dissolving and crystallizing the crystals in the converted first part of the solution and in separating the resultant isomaltulose crystals.

Description: Verfahren zur Herstellung von IsomaltuZose (6-0-°-D-Glucopyranosido-D-fructose) mit Hilfe von immobilisierten BakterienzelGen In der älteren Patentanmeldung P 30 38 219.5-41 ist vorgeschlagen, Isomaltulose mit Hilfe von t5ikroorganis- men durch enzymatische Umwandlung der Saccharose herzustellen, in dem man reine Saccharoselösungen mit toten, immobilisierten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen behandelt bzw. in Kontakt bringt. Dabei werden Saccharoselösungen im onzentra- tionsbereich von 45 Gew.-% bis 75 Gew.-%, vorzugsweise 65 Gew.-E bis 75 Gew-%, bei einer Temperatur von 40 C bis 650Ckontinuierlich durch einen mit den immobilisierten Zellen gefüllten Reaktor geleitet. Die dabei entstandene Isomaltulose wird durch an sich bekannte Methoden kristallin gewonnen. Bei den verwendeten Mikroorganismen handelt es sich um Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285) und Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512 F (ATCC lo830a)), vorzugsweise um Protaminobacter rubrum (CBS 574.77). Bei der Durchführung dieses vorgeschlagenen Verfahrens hat sich gezeigt, dass häufig ein hoher Anteil (bis zu rund einem Drittel) der eingesetzten Saccharose nicht in die gewünschte Verbindung (Isomaltulose) sondern in Nebenprodukte umgewandelt wird und/oder unumgesetzt in der Reaktionslösung verbleibt. Da diese Nebenprodukte auch die Kristallisation der entstandenen Isomaltulose hemmen und somit die ristallausbeute noch weiter herabsetzen, ist es von grossem wirtschaftlichen Interesse, ein Verfahren zu haben, das die Bi3dung von unerwünschten und störenden Nebenprodukten ganz oder wenigstens teilweise verhindert. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es möglich ist, Isomaltulose in hoher Reinheit und Ausbeute aus Saccharose dadurch zu gewinnen, dass man Saccharoselösungen mit einer Konzentration von 40 Gew.-% bis 75 Gew.-t, vorzugsweise 45 Gew.-% bis 60 Gew.-t, mit der Mutterlauge einer vorangegangenen Isomaltulose Kristallisation vermischt, diese Lösung mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen bei einer Temperatur von 25"C bis 40 C, vorzugsweise 30 C bis 4o0C, behandelt bzw. in Kontakt bringt und die entstandene Isomaltulose mit an sich bekannten Methoden kristallin gewinnt. Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens besteht darin, dass man die Saccharoselösung mit einer Ronzentration von 40 Gew.-E bis 75 Gew.-E, vorzugsweise 45 Gew.-% bis 60 Gew.-%, in zwei Teile teilt, den ersten Teil über einen mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen gefüllten Reaktor bei 25"C bis 4o0C, vorzugsweise 30 C bis 40 C, so leitet, dass 80 - 9o % der Saccharose umgesetzt werden, den zweiten Teil der Saccharoselösung mit der Mutterlauge aus einer vorangegangenen Isomaltu lose-Rristallisation mischt, diese Lösung über einen zweiten mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Miroorganismen gefüllten Reaktor bie 25"C bis 40 C, vorzugsweise 30 C bis 4oCC, leitet, so dass die Saccharose nahezu vollständig umgesetzt wird, die entstandene Isomaltulose aus dieser Lösung durch an sich bekannte Methoden kristallin ge winnt, die kristalle in dem umgesetzten ersten Teil der Reaktionslösung auflöst und zur Kristallisation bringt, die entstandenen Isomaltu]ose-Sristalle abtrennt und die J'utter)auge zum Zumischen zu dem zweiten Teil der Saccharose] ösung verwendet. Die einzuhaltende mittlere Ve-rweilzeit der Saccharoselösung im Reaktor richtet sich nach der jeweils vorhandenen spezifischen Aktivität der immobilisierten Zellen. Die spezifische Aktivität wird als mol umge- setzte Saccharose pro g inmobilisierte Zellen (trocken) pro Minute definiert. Beispielsweise enthält ein Reaktor mit 100 mm Durchmesser und 450 mm Betthöhe 950 g immobilisierte Zellen (trocken) mit einer spezifischen Aktivität von 60 Einheiten/g. Dieser Reaktor muss mit 1900 ml Saccharoselösung 650 Gew.-%) pro Stunde durchströmt werden um 90S der eingebrachten Saccharose umzusetzen. Da die Aktivität über die Betriebszeit kontinuierlich abnimmt, muss die Strömungsgeschwindig keit ständig nachreguliert werden, um ein Produkt mit konstanter Zusammensetzung zu erhalten. Die besonderen Vorteile des anmeldungsgemässen Verfahrens werden anhand von folgenden Beispielen näher erläutert. Dabei stellt Beispiel 1 Arbeitsweise und Ergebnisse des bekannten Verfahrens der deutschen Patentanmeldung P 30 38 219.5-41 dar. Beispiel 1 a) Von einer Abimpfung des Stamr,es Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) werden Zellen mit 1o ml eines sterilen Nährsubstrates, bestehend aus 8 kg Dick saft aus einer Zuckerfabrik (Trockensubstanzgehalt = 65%), 2 kg Maisquellzwasser o,1 kg(NH4) 2HP04 und 89,9 kg dest 1'asser (bei Bedarf auf pH 7,2 einge stellt) abgeschwemmt. Diese Suspension dient als Impigut für die Schüttelmaschinen-Vorkultur in 1-l-Kolben mit 200 ml Nährlösung obiger ZusarnJr'en- setzung. Nach einer 3o-stindigen Bebrütungszeit bei 29 C werden 16 1 Nährlösung obiger Zusammensetzung mit 20 Kolben (Gesarntinhalt 4 1) in einem 3o-l-Klein- fermenter beimpft und bei derselben Temperatur bei einer Belüftungsrate von 20 1 Luft pro minute und einer Rührgeschwindigkeit von 35oUpN fermentiert. Die anwachsende Keimzahl wird mikroskopisch bestimmt. 9 Erreichen von 5.109 Keimen/ml wird der Fermen terinhalt in ein anderes Gefäss transferiert, dort mit einem kationenaktiven Flockungsinittel (wie z. B. PRIt'SFLOC C7 von Rohm & Haas, Philadelphia/USA) versetzt. Die ausgeflockten Zellen werden absetzen gelassen, abdekantiert, mit o,1 M Phosphatpuffer (pH 7,o) gewaschen und an der Zentrifuge entwässert. Die Masse wird dann zu Strängen extrudiert, an der Luft getrocknet und gemahlen. b) Die Siebfraktion o,3 bis o,8 mm aus dem oben ge wonnenen Präparat wird in einer o,1%-igen Glut araldehydlösung 10 Minuten gerührt, mit Phosphat puffer (o,1M, pH 7,o) gewaschen und unter Wasser in eine temperierbare Säule gefüllt. Die Säule wird dann auf 50 C erwärmt und mit einer 70 gew.-%-igen Saccharoselösung kontinuierlich durchströmt. Die Strömungsgeschwindigkeit wird dabei so eingestellt, dass am Ende der Säule keine Saccharose mehr nachweis bar ist. Die so gewonnene Isomaltuloselösung hat folgende durchschnittliche Zusammensetzung (HPLC = Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie): Fructose 7,4 g/1oo g TS Glucose o,3 g/loo g TS Saccharose o,1 g/loo g TS Isomaltulose 62,6 g/loo g TS 1-0- < -D-Glucopyrano- sido-D-Fructose 16,6 g/loo g TS Oligosaccharide 13,o g/100 g TS Diese Lösung wird einem Kühlungskristallisator zu geführt, auf 20 C gekühlt und die auskristallisierte Isomaltulose an Siebkorbzentrifugen von der Mutter- lauge abgetrennt. Die Mutterlauge wird auf 78 - 82 t TS-Gehalt eingedampft, einer 2. Kühlungskristalli sation bis auf 20 C unterworfen und die auskristalli sierte 2. Xsomaltulosemenge an Siebkorbzentrifugen von der l;utterEauge abgetrennt. Ausbeute: 100 kg einer Saccharoselösung mit 70 kg Saccharose enthalten nach der Umsetzung 43,8 kg Isomaltulose (62,6 % v. TS-Gehalt). Daraus werden bei der 1. Kristallisation 15,9 kg reine Isomaltulose und bei der 2. Kristallisation 13,4 kg Isomaltulose mit 98 % Reinheit gewonnen. Das entspricht einer Gesamtaus beute von 29 kg reiner Isomaltulose aus 70 kg Saccharose oder 41,4 % vom Rohstoff. (In diesem Beispiel und in den nachfolgenden wird mit wasser freier Isomaltulose gerechnet.) Beispiel 2 Die Siebfraktion o,3 bis o,8 mm aus dem nach Beispiel 1 a) hergestellten Präparat wird in einer o,1 %-igen Glutaraldehydlösung 10 Minuten gerührt, mit Phosphatpuffer (o,1M, pH 7,o) gewaschen und unter wasser in eine temperierbare Säule gefüllt. Die Säule wird dann auf 30 C erwärmt und mit einer 50 gew.-t-igen Saccharose lösung kontinuierlich durchströmt. Die Strömungsgeschwindigkeit wird dabei so eingestellt, dass am Ende der Säule keine Saccharose mehr nachweisbar ist. Die so gewonnene Isomaltuloselösung hat folgende durchschnittliche Zusammensetzung (HPLC): Fructose 3,6 g/loo g TS Glucose 1,8 g/loo g TS Saccharose O Isomaltulose 78,4 g/loo g TS 1 -O-a-D-Gll3copyrano- sido-D-fructose 12,6 g/loo g TS Oligosaccharide .3,6 g/loo g TS Diese Lösung wird auf 78 - 82 E TS-Gehalt eingedampft, einem Kühlungskristallisator-zugeführt, auf 20 C gekühlt und die auskristallisierte Isomaltulose an Siebkorbzentrifugen von der Mutterlauge abgetrennt. Die Mutterlauge wird wiederum auf 78 - 82 g TS-Gehalt eingedampft, einer 2. Kühlungskristallisation bis auf 20tC unterworfen und die auskristallisierte 2. Isomaltulosemenge an Siebkorbzentrifugen von der Mutterlauge abgetrennt. Ausbeute: 100 kg einer Säccharoselösung mit 50 kg Saccharose enthalten nach der Umsetzung 39,2 kg Isomaltulose (78,4 z v. TS-Gehalt). Daraus werden bei der 1. Kristallisation 25,o kg reine Isomaltulose und bei der 2. Xristallisation 9,6 kg Isomaltulose mit 98 t Reinheit gewonnen. Das entspricht einer Gesamtausbeute von 34,4 kg reiner Isomaltulose aus 50 kg Saccharose oder 68,8 t vom Rohstoff. Beispiel 3 Die Siebfraktion o,3 bis o,8 mm aus dem nach Beispiel 1 a) hergestellten Präparat wird in einer o,1 e-igen G]utaraldehydlösung lo Minuten gerührt, mit Phosphatpuffer (o,1Yi, pH 7, o) gewaschen und unter Wasser in zwei auf 30oC temperierten Säulen gefüllt. Die Arbeitsweise wird anhand des Schemas (Fig. 1) beispielhaft erläutert. Eine der Säulen (1) wird mit einer 50 gew.-k-igen Saccharoselösung kontinuierlich durchströmt. Die Strömungsgeschwindigkeit wird dabei so eingestellt, dass beim Durchströmen der Säule nur etwa 9o ? der Saccharose umgesetzt werden. Die so erhaltene Peaktionslösung hat folgende beispielhafte Zusariirensetzung (HPLC): Fructose 2,9 g/loo g TS Glucose 1,6 g/loo g TS Saccharose 10,8 g/100 g TS Isomaltulose 75,2 g/100 g TS l-O-4-D-Glucopyrano- sido-D-fructose 6,4 g/loo g TS Oligosaccharide 3,1 g/100 g TS Parallel zu der ersten Säule wird die zweite Säule (2) mit einem Substrat beschickt, das aus einem Gemisch aus Saccharose und ?w5utterlauge einer vorangegangenen Isomaltulose-Kristallisation besteht. Eine beispielhafte Zusammensetzung (HPLC) dieses Substrates ist: TS-Gehalt 50 Gew.-E Fructose 2,o g/loo g TS Glucose 1,o g/100 g TS Saccharose 76,2 g/100 g TS Xsomaltu]ose 10,8 g/loo g TS 1-0-t-D-Glucopyrano- sido-D-fructose 8,2 g/loo g TS Oligosaccharide 1,8 g/loo g TS Die Fliessgeschwindigkeit durch diese Säule wird so eingestellt, dass die Lösung am Ende der Säule höchstens 1 g Saccharose pro loo g Trocken substanz enthält. Die so erhaltene Reaktionslösung hat folgende beispielhafte Zusammensetzung (HPLC): Fructose 5,4 g/100 g TS Glucose 2,2 g/loo g TS Saccharose 1,o g/loo g TS Isomaltulose 72,3 g/loo g TS 1-0-u-D-Glucopyrano- - sido-D-fructose 16,6 g/loo g TS Oligosaccharide 2,5 g/100 g TS Diese Lösung wird auf 78 - 82 % TS-Gehalt eingedampft, einer Kühlungskristallisation bis auf 20 C unterworfen und die auskristallisierte Isomaltulose an Siebkorb zentrifugen von dieser 2. Mutterlauge abgetrennt. Die an dieser Stelle erhaltene Isomaltulose wird in der von der ersten Säule erhaltenen Reaktionslösung gelöst, auf 78 - 82 8 TS-Gehalt eingedampft, in einen Sühlungs- kristallisator auf 20 C gekühlt und die auskristalli sierte reine Isomaltulose an Siebkorbzentrifugen von der Mutterlauge abgetrennt. Die an dieser Stelle an fallende Mutterlauge wird für die Substratherstellung für die zweite Säule verwendet. Die 2. Mutterlauge, die auch als Melasse bezeichnet werden kann, enthält ca. 30 - 40 z a. TS an 1-0-d-Gluco- pyranosido-D-fructose und kann als Rohstoff für die Ge winnung von diesem Zucker eingesetzt werden. Die Gewinnung dieses Zuckers kann zum Beispiel durch chramato- graphische Trennung an lonenaustauscher oder anderen geeigneten Trennmaterialien, nach einer Voranreicherung durch Auskristallisieren eines weiteren Teiles der Isomaltulose aus ethanol und Entfernen der durch Hefe vergärbaren Zucker durch Behandlung mit freier oder immobilisierter Hefe, durchgeführt werden. Ausbeute: Bei der in diesem Beispiel geschilderten Arbeitsweise gewinnt man pro 100 kg Saccharose 80,0 kg reine Iso ma ltulose.

Claims: PATEIQTANSPRUCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose (6-0-°-D-Glucopyranosido-D-fructose) durch enzymatische Umwandlung aus Saccharose mit Hilfe von Isomaltulose aus Saccharose bildenden tdikroorganismen, bei dem man reine Saccharoselösungen mit toten, immobilisierten Zellen solcher ikroorganismen behandelt bzw. in Kontakt bringt, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Saccharoselösung mit der 1ç5utterlauge einer vorangegangenen Isomaltulose-Kristallisation mischt, diese Lösung mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen bei einer Temperatur von 250C bis 40 C, vorzugsweise 30 C bis 40 C, behandelt bzw. in Kontakt bringt und die entstandene Isomaltulose mit an sich bekannten Methoden kristallin gewinnt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Saccharoselösung mit einer Kon- zentration von 40 Gew -% bis 75 Gew.-%, vorzugsweise 45 Gew.-% bis 60 Gew.-%, in zwei Teile teilt, wobei man den einen Teil über einen mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikro- organismen gefüllten Reaktor bei 25"C bis 4o0C, vorzugsweise 30 C bis 40 C, leitet, so dass 80 - 9o t der Saccharose umgesetzt werden, den zweiten Teil der Saccharoselösung mit der Mutler- lauge aus einer vorangegangenen lsomaltulose-Kristalli- sation mischt, diese Lösung über einen zweiten mit immobilisierten, toten Zellen von Isomaltulose aus Saccharose bildenden Mikroorganismen gefüllten Reaktor bei 25"C bis 40 C, vorzugsweise 30 C bis 40 C leitet, so daB die Saccharose nahezu vollständig umgesetzt wird, die aus diesem zweiten Teil der Lösung entstandene Isomaltulose durch an sich bekannte Methoden kristallin gewinnt, die Kristalle in den umgesetzten ersten Teil der Lösung auflöst, zur Kristallisation bringt und die entstandenen Isomaltulose-Kristalle abtrennt und die Mutterlauge des ersten Teiles der umgesetzten Lösung - als Mutterlauge aus einer vorangegangenen Isomaltulose Kristallisation - zum Zumischen zu dem zweiten Teil der Saccharoselösung verwendet. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den verwendeten Mikroorganismen um Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285) und Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512 F (ATCC 10830a)), vorzugsweise um Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), handelt. 4. Verfahren zur Gewinnung von 1-O- < -Glucopyrano- sido-D-fructose, insbesondere nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einer Mutterlauge der Isomaltulose-Gewinnung nach Voranreicherung durch Auskristallisieren eines weiteren Teiles der Isomaltulose aus Methanol und Entfernen der durch Hefe vergärbaren Zucker durch Behandlung mit freier oder immobilisierter Hefe die 1-0- < -Glucopyranosido-D-fructose durch chromatographische Trennung an Ionenaustauschern oder anderen geeigneten Trennrnaterialien zunächst als wässrige Lösung gewinnt und dann durch an sich bekannte Methoden in trockene Form überführt.

Inventors: MUNIR, MOHAMMAD, DR.
Applicants: SUDDEUTSCHE ZUCKER-AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1983
Main classification: C12P19
IPC codes: C12N11, C12P19