RECONSTITUTABLE DRY REAGENT FOR DIAGNOSTIC PURPOSES AND METHOD OF MANUFACTURE

Abstract: 1. A reconstitutable dry reagent for diagnostic purposes with at least one protein containing component and other components, characterized in that the protein containing component is present as lyophilizate and the other components as granulates.

Description: Rekonstituierbares Trockenreagenz für diagnostische Zwecke und Verfahren zu seiner Herstellung. BESCHREIBUNG Die Erfindung bezieht sich auf ein rekonstituierbares Trockenreagenz für diagnostische Zwecke mit wenigstens einem proteinhaltigen Bestandteil sowie weiteren Bestandteilen. Sie hat auch ein Verfahren zur Herstellung dieses Trockenreagenzes zum Gegenstand. Bei der Lipasebestimmung wird bekanntlich primär die C(-Esterbindung des Triglycerids unter Bildung des Diglycerids und einer freien Fettsäure hydrolisiert. Diese Hydrolyse kann titimetrisch oder turbodimetrisch verfolgt werden. Für die Diagnostik der Pankreaserkrankung besitzt die Bestimmung der Enzyme Lipase und Amylase eine hohe Aussagekraft. Bei akuter Pankreatitis kommt es nämlich zu einem starken Anstieg beider Enzyme im Serum. Die Amylase wird jedoch wegen ihres geringen Molekulargewichts durch die Niere relativ schnell wieder ausgeschieden, während die Lipaseaktivität im Serum 1 längere Zeit erhöht bleibt. Eine sichere Diagnose der Pankreatitis ist durch die Bestimmung beider Enzyme zu erhalten. Damit die Lipase ihre maximale Aktivität entfalten kann, benötigt sie Co-Lipase als Co-Faktor. Da die Co-Lipase jedoch ca. zweimal schneller als Lipase von der Niere aus dem Serum entfernt wird, muss dem lipasehaltigen Serum Co-Lipase bei der Lipasebestimmung zugesetzt werden. Aus der DE-As 29 04 305 ist ein Trockenreagenz zur Lipasebestimmung bekannt, das 0,2 bis 10 Gewichtsprozent Triglycerid, 20 bis 90 Gewichtsprozent Schutzkolloid, 5 bis 60 Gewichtsprozent Gallensäurealkalisalz, 0,001 bis 0,1 Gewichtsprozent- Co-Lipase, 0,1 bis 2,0 Gewichtsprozent Konservierungsmittel, 5 bis 20 Gewichtsprozent Harnstoff, 3 bis 50 Gewichtsprozent Puffersubstanz für pH 6,0 bis 10,5 und 0,5 bis 5 Gewichtsprozent Aktivator enthält. Zur Herstellung dieses Reagenzes wird eine wässrige Emulsion durch Lösen.des Gallensäuresalzes, der Co-Lipase sowie wenigstens eines Teils des Schutzkolloids und des Konservierungsmittels und anschliessendes Einspritzen einer Triglyceridlösung in diese Lösung gebildet. Anschliessend wird die Emulsion lyophilisiert, worauf die restlichen Bestandteile, nämlich die Puffersubstanz, Harnstoff sowie das restliche Schutzkolloid und das restliche Konservie ongsmittel sowie der Aktivator zugegeben werden. Nach dem bekannten Verfahren lässt sich also ein zufriedenstellendes Trockenreaoenz nur durch Lyophilisation der meisten Bestandteile sowie durch Zuoabe von Fremdstoffen, wie Harnstoff, erhalten. Auch ist es bekannt, zur Amylasebestimmung ein rekonstituierbares Reagenz zu verwenden, das aus einem Lyophilisat besteht, das a-Glucosidase und Oligosaccharid enthält. Dieses Reagenz ist mit einem relativ grossen Leerwert behaftet. Aufgabe der Erfindung ist es; ein einwandfreies rekonsti tuierbares Trockenreagenz für diagnostische Zwecke, das wenigstens einen proteinhaltigen Bestandteil sowie weitere, nichtproteinhaltige Bestandteile enthält, anzugeben, dessen Herstellung mit einem relativ geringen Aufwand verbunden ist. Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Reagenz bzw. das im Anspruch 13 gekennzeichnete Verfahren gelöst. Bei dem erfindungsgema.ssen Reagenz wird also ein Lyophilisat, das den proteinhaltigen Bestandteil enthält, mit einem Granulat,das die weiteren Bestandteile enthält, zu einem Monoreagenz, d.h. zu einem durch Wasserzugabe gebrauchsfertigen Reagenz kombiniert. Bei der Bestimmung von Enzymen liegt dabei das Substrat in aller Regel in dem Granulat vor, während in dem Lyophilisat als Proteine insbesondere Indikatorenzyme oder C-Enzyme enthalten sind. Das Granulat, das die nichtproteinhaltigen Bestandteile enthält, kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter schärferen Bestimmungen hergestellt werden. So'wird nicht nur die Lyophilisation als relativ aufwendige Trocknungsmethode umgangen, vielmehr können die nichtproteinhatigen Bestandteile inniger miteinander vermischt und sehr fein zerkleinert werden. Aufgrund der unterschiedlichen Stabilität von Lyophilisat und Granulat ergeben sich auch insofern Produktvorteile, derart, dass das Granulat als der wesentlich stabilere Teil auf Vorrat produziert werden kann und bei der Herstellung einer Reagenziencharge nur das proteinhaltige Lyophilisat frisch zubereitet werden muss. Weiterhin vereinfacht ein solches Vorgehen die Herstellung verschiedenster Abpackungsgrössen der Teste, da hierzu nur die Einwaage an Granulat geändert werden braucht. Beispielsweise ist Co-Lipase wenig thermostabil und durch Scherkra.f" te leicht zerstörbar. Durch die getrennte Zubereitung der weiteren Bestandteile, als des Triglycerids, der Emulgatoren usw. zu einem Granulat, kann also bei der Granulatherstellung eine erheblich höhere Temperatur angewendet werden, als dies bei der Lyophilisation der Fall ist. Ferner können die weiteren Bestandteile innig bei Raumtemperatur miteinander vermischt werden und anschliessend scharf getrocknet werden, was eine sehr feine Zerkleinerung des Granulats möglich macht. Auf diese Weise wird die Bildung einer sehr stabilen Triglycerid-Eulsion guter Reproduzierbarkeit gewährleistet. Wie vorstehend erwähnt, weist ein -Glucosidase sowie Oligomeres enthaltendes Lyophilisat, das als Trockenreagenz zur Amylasebestimmung verwendet wird, einen relativ hohen Leerwert auf. Es hat sich nun gezeigt, dass sich dieser Leerwert drastisch reduzieren lässt, wenn die Glucosidase einer separaten Lyophilisation bei einer maximalen Temperatur von 30 bis 500 C unterworfen wird. Der hohe Leerwert des bekannten Trockenreagenzes ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Glucosidase enzymatische Verunreinigungen aufweist, die auch langkettigere Oligosaccharide spalten. Diese Spaltung vollzieht sich auch, wenn die Glucosidase und die Oligosaccharide vor der gemeinsamen Qyophilisation gelöst werden. Wird hingegen nach einer bevorzugten erfindungsgemässen Ausführungsform eine separate Lyophilisation der Glucosidase bei einer maximalen Temperatur von 30 bis 500 C durchge-führt, so gelingt es, diese enzymatischen Verunreinigungen zu inaktivieren, d.h. eine Glucosidase hoher Spezifität bereitzustellen. Weiterhin weist das Reagenz nach der DE-AS 29 04 305 eine relativ lange Lag-Phase von vier Minuten und mehr auf. Von Bedeutung ist nun, dass sich nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Lag-Phase bei der Lipasebestimmung erheblich dadurch herabsetzen lässt, wenn statt einer Gallensäure ein Gemisch aus 1 bis 40 Gewichtsprozent Taurodesoxycholsäure, 2 bis 20 Gewichtsprozent Cholsäure und 5 bis 50 Gewichtsprozent Desoxycholsäure, jeweils in Form ihrer Alkalisalze, eingesetzt wird. Dadurch kann eine Herabsetzung der Lag-Phase auf zwei Minuten oder weniger erreicht werden. Weiterhin wird durch dieses Gallensäuregemisch eine sichere Hemmwirkung gegenüber Postheparinlipase erzielt. Die Postheparinlipase wird aus dem Gewebe freigesetzt, wenn z.B. bei einer Operation Heparin verabreicht wird. Die Postheparinlipase stammt also nicht vom Pankreas und führt daher zu einer Verfälschung der Werte der Pankreaslipasebestimmung. Als Triglycerid eignen sich für die Lipasebestimmung natürliche wie synthetische Triglyceride mit Fettsäureresten zwischen 4 und 22 C-Atomen. Beispielsweise erweist sich Tributyrin als geeignet. Bevorzugt werden jedoch Triglyeride mit längerkettigen ungesättigten Fettsäureresten, insbesondere Triglyceride, deren Fettsäurereste 8 bis 20 C-Atome-und 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen aufweisen, verwendet. Aufgrund seiner leichten Zugänglichkeit wird Triolein besonders bevorzugt, auch Olivenöl ist sehr gut geeignet. Als Konservierungsmittel werden bei dem Reagenz zur Lipasebestimmung beispielsweise Alkaliazide, insbesondere Natriumazid, verwendet. Als Puffersubstanz eignet sich für das Reagenz für die Lipasebestimmung beispielsweise Diäthanolaminpuffer, Tri äthanolaminpuffer, Trispuffer usw. Ein besonders guter Aktivator ist Calciumchlorid. Bei der Amylasebestimmung liegt in dem Testreagenz beispielsweise Oc-Glucosidase, Hexokinase (HK), Glucose-6 Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) sowie ein Oligomeres mit 4 bis 10 Glucoseeinheiten und Adenosintriphosphat (ATP) vor. Di e -Amylase im Serum hydrolisiert dabei das Oligosaccharid zu Maltose, die durch die A-Glucosidase in zwei Glucosemoleküle gespalten wird. Die freigesetzte Glucose wird beim U/V-Test mit HK und G-6-PDH bestimmt. Die HK bewirkt die Umsetzung der Glucose mit ATP unter Bildung von Adenosindiphosphat (ADP) und die G-6-PDH die Umsetzung \ton Gl ucose-6-Phosphat und NAD zu 6-Phospho- gluconat und NADH, dessen Bildung verfolgt wird. Als Puffer kann bei der Amylasebestimmung z.B. Phosphatpuffer eingesetzt werden. Als Aktivator sind Natriumchlorid und Magnesiu.macetat geeignet. Statt durch den UV-Test kann das erfindungsgemässe Reagenz auch zur Bestimmung der Amylase mittels Farbtest ausgebildet sein. Dazu wird als Oligosaccharid eine chromophore Gruppe aufweisendes Saccharid entsprechend der DE-OS 28 22 364 verwendet. Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Beispiel t In ein Reagenzgefäss (50 ml) werden 0,1 ml einer 0,4 gewichtsprozentigen Co-Lipaselösung lyophilisiert. In 150 ml Wasser werden 34 mg Triolein, 480 mg Tris, 7,5 mg Calciumchlorid und 517 mg eines Gemischs aus 31 Gewichtsprozent Natrium-Taurodesoxicholat, 14 Gewichtsprozent Natrium-Cholat und 55 Gewichtsprozent Natrium-Desoxycholat gemischt. Das Gemisch wird im Rotationsverdampfer bei 700 C zur Trockene eingeengt, zerkleinert und mit einem Sieb mit einer Maschenweite von 0,25 mm gesiebt. Von diesem Granulat werden 53 mg in das ReaktionsgefäB mit dem Lyophilisat eingewogen. Zur Rekonstitution bzw. Herstellung der Testlösung werden dem Reaktionsgefäss 50 ml Aqua dest. gegeben. Zu 2 ml dieser Testlösung werden 0,1 ml unverdünnte Serumprobe gegeben. Die Kalkulation erfolgt über'einen Standard mit definierter Lipaseaktivität nach Rick (Z. klin. Chem. u. klin. Biochem., 1969, Heft 5, Seiten 530 bis 539). Beispiel 2 In einem Reaktionsgefäss (50 ml) werden 0,05 ml einer Ct-Glucosidase-Lösung (280 Kr/1), 0,15 ml Hexokinase-Lösung (830 KU/1) und 0,15 ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (830 Kr/7) lyophilisiert. In 60 ml Wasser werden 3.500 mg Oligosaccharid (4 bis 10 Glucoseeinheiten), 8.520 mg Phosphatpuffer, 2.900 mg Natriumchlorid, 535 mg Magnesiumacetat, 862 mg Adenosin Triphosphat (ATP) und 1.989 mg Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADY gemischt. Das Gemisch wird in einem Rotationsverdampfer bei 700 C unter Vakuum eingedampft. Der trockene Rückstand wird zerkleinert und mit einem Sieb mit einer Maschenweite von 0,25 mm gesiebt. Von diesem Granulat werden 915 mg in das Reagenzgefäss mit dem Lyophilisat eingewogen. Zur Herstellung der Testlösung werden 50 ml Aqua dest. dem Reaktionsgefäss zugegeben. Zu 1 ml dieser Testlösung wird 0,05 ml unverdünnte Serumprobe gegeben. Die Kalkulation erfolgt über den Extinktionskoeffizienten des durch die Nachweisreaktion gebildeten NADH.

Claims: PATENTANSPROCHE 1. Rekonstituierbares Trockenreagenz für diagnostische Zwecke mit wenigstens einem proteinhaltigen Bestandteil sowie weiteren Bestandteilen, dadurch gekennzeichnet, dass der proteinhaltige Bestandteil als Lyophilisat vorliegt und die weiteren Bestandteile als Granulat. 2. Reagenz nach Anspruch 1 zur Lipasebestimmung unter Ver wendung @on 0,001 @ bis 0,2 Gewichtsprozent Co-Lipase und 0,2 bis tO Gewichtsprozent eines emulgierbaren Triglycerids, dadurch gekennzeichnet, dass die Co-Lipase im Lyophilisat vorliegt und das Triglyce-rid im Granulat. 3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Granulat ausserdem 10 bis 60 Gewichtsprozent Puffersubstanz für pH 6,0 bis 10,5, 5 bis 60 Gewichtsprozent Gallensäuren-Alkalisalz, 0,1 bis 2,0 Gewichtsprozent Konservierungsmittel und 0,5 bis 5 Gewichtsprozent Aktivator enthält. 4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Granulat 10 bis 60 Gewichtsprozent Gallensäuren-Alkalisalz vorliegt und das Gallensäuren-Alkalisalz im Granulat durch ein Gemisch aus 1 bis 40 Gewichtsprozent Tauradesoxycholsäure, 2 bis 20 Gewichtsprozent Cholsäure und 10 bis 70 % Desoxycholsäure in Form ihrer Alkalisalze gebildet ist. 5. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivator durch ein Chlorid, vorzugsweise Calciumchlorid gebildet wird. 6. Reagenz nach Anspruch 1 zur Amylasebestimmung unter Verwendung von y-Glucosidase oder CC- und 8-Glucosidase und Oligosacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass die cc - und/oder ss-Glucosidase im Lyophilisat vorliegt und die Oligosaccharide im Granulat. 7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es 50 bis 500 kU/7 - und/oder B-Glucosidase sowie 0,03 bis 7 mmol/l Oligosaccharide, jeweils bezogen auf das rekonstituierte Reagenz enthält. 8. Reagenz nach Anspruch 6 oder 7, dadurch ekennzeichnet, dass das Granulat zusätzlich 3 bis 50 Gewiccsprozent Puffersubstanz für pH 6 bis 10 und 0,5 bis 5 Gewichtsprozent Aktivator enthält. 9. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zur Bestimmung der Amylase mittels UV-Test, dadurch gekennzeichnet, dass im Lyophilisat ausserdem Hexokinase und Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase und im Granulat zusätzlich Adenosin-5'-Triphosphat vorliegt. 10. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zur Bestimmung der Amylase mittels Farbtest, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligosaccharid eine chromophore Gruppe besitzt. 11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligosaccharid aus 4 bis 10 Glucoseeinheiten besteht und als chromophore Gruppe p-Nitrophenol aufweist. 12. Verfahren zur Herstellung eines rekonstituierbaren. Trockenreagenzes nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in ein Reaktionsgefäss der proteinhaltige Bestandteil bzw. die Co-Lipase bzw. die R- und/oder ss-Glucosidase als Lyophilisat und die weiteren, nicht-proteinhaltigen Bestandteile als Granulat eingebracht werden, wobei das Granulat durch Lösen, Suspendieren oder Emulgieren der weiteren Bestandteile und anschliessendes Trocknen nach einem anderen Trocknungsverfahren als der Lyophilisation erhalten wird. 13. Verfahren. nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyophilisat durch Lyophilisieren einer Lösung, Suspension oder Emulsion des proteinhaltigen Bestandteils bzw. der Co-Lipase bzw. der a- und/oder B-Glucosidase in dem Reaktionsgefäss hergestellt und das Granulat zugewogen wird. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Trocknen der weiteren Bestandteile im Vakuum bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur erfolgt. 15. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Reagenz zur Amylasebestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyophilisation der cc und/oder B-Glucosidase bei einer Temperatur durchgeführt wird, die gegen Ende der Lyophilisation 30 bis 500 C beträgt.

Inventors: DANNINGER, JOSEF, LAMPART, ALFRED, DR., SPAETHE, REINER, DR., TENGER, FRANZISKA
Applicants: AMERICAN HOSPITAL SUPPLY CORPORATION
Application year: 1983
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1