SURFACE-GRAFTED PARTICULATE SUPPORT, ITS PREPARATION AND ADSORBENTS FOR AFFINITY-CHROMATOGRAPHY COMPRISING THIS SUPPORT, AND ITS USE, ESPECIALLY IN BIOLOGY

Abstract: 1. A particulate support for the manufacture, by covalently bonding of a ligand, of adsorbents for affinity chromatography on a column, said support being essentially constituted by particles of a base polymeric material adapted for use in column chromatography and on which are grafted molecules of at least one unsaturated monomer capable of forming a copolymer with the base material and bearing at least one chemical function capable of forming, subsequently, under non-denaturing conditions, a covalent bond with the ligand used in the envisaged adsorption, characterized in that the molecules of unsaturated monomer are grafted essentially at the surface of the particules of the base polymeric material, the amount of grafted monomer possessing an accessible chemical function per unit of surface area (estimable monomer per unit of surface area) being from 10 to 500 mu g per cm**2 of surface area of the support, and the ratio of the amount of grafted monomer possessing an accessible chemical function to the total amount of grafted monomer (estimable monomer/fixed monomer) being from 0.05 to 0.5.

Description: Support particulaire greffé en surface, son procédé de préparation et adsorbants pour chromatographie d'affinité incorporant ce support, ainsiXque leur utilisation, notamment en biologie. L'invention concerne un support pour adsorbants utilisables en chromatographie d'affinité, notamment dans le domaine de la bioloqie. Plus précisément, l'invention a pour objet un support particulaire, obtenu a partir de particules d'une matière polymère inerte, qui présente en surface des fonctions chimiques aptes à former des liaisons covalentes avec des ligands utilisables en chromatographie d'affinité, notamment pour la séparation ou l'élimination de substances biologiques. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ce support. L'invention a en outre pour objet les adsorbants pour chromatographie d'affinité obtenus par fixation covalente d'un ligand approprié sur ce support. Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation de tels adsorbants, notamment pour la récupération ou l'élimination de substances biologiques, en particulier à partir du sang. L'utilisation de supports inertes porteurs d'éléments biofonctionnels fixés par des liaisons covalentes s'est généralisée et étendue à un grand nombre d'applications biologiques et biomédicales. En particulier, on a déjà proposé d'utiliser, en chromatographie d'affinité, en tant qu'adsorbants des supports inertes porteurs de ligandsap- propriés pour la purification de substrats biologiques ou l'extraction de substances biologiques intéressantes à partir de substrats biologiques tels que notamment le sang. Le pouvoir séparateur de l'adsorbant dépend de la spécificité du ligand fixé sur le support vis-à-vis de la substance à éliminer ou à extraire. Il est à ce propos essentiel que les propriétés physico#-chiniques et chimiques du support n'aient pas d'effet défavorable sur l'intéraction entre le ligand et la molécule a fixer. Compte tenu de ces considérations, on a déjà cherché à exploiter de très nombreux supports présentant des pro priétés variées. Ainsi, il existe actuellement un grand nombre de sup ports utilisés en chromatographie d'affinité. La plupart se présentent sous forme de gels qui diffèrent suivant la dimension des mailles et la composition chimique des chai nes macromoléculaires qui les constituent (cellulose, dex tran, agarose, polyacrylamide, polystyrène, divinyl benzène...). Par ailleurs, certains supports solides tels que bil les de verre, céramique, etc., retenant un ligand spécifique, sont utilisés dans le même but en exploitant le phénomène d'absorption. Toutefois, aucun des supports proposés jusqu'S pré sent ne s'est révélé :satisfaisant, en particulier pour former des adsorbants utilisables en chromatographie d'affini té sur colonne. On a pu établir que les différents inconvénients prEsends en chomatographie d'affinité sur oolonne par les supports de l'art antérieur pouvaient être élimnés en ayant recours à un support particulaire (se présentant sous forme de poudre ou de billes selon la taille des particules), présentant une bonne stabilité dimensionnelle tout en possédant une bonne réactivité chimique, pratiquement limitée à sa surface, vis-à-vis du ligand spécifique de la substance, notamment biologique, à récupérer ou éliminer. On c o n n a I t certes déjà de nombreux supports qui, sous forme particulaire, présentent les propriétés méca niques requises. Cependant on n'avait pas jusqu'à pré sent résolu de façon satisfaisante le problème de la fixa tion du ligand choisi sur un tel support. L'invention apporte une solution satisfaisante à ce problème en fournissant un support particulaire modifié, qui après fixation covalente d'un ligand approprié, conduit à l'obtention d'un adsorbant efficace et stable pour chromatographie d'affinité sur colonne. Ce résultat est obtenu grâce à la structure particulière de ce support dans, lequel les "greffons" sont répartis en surface et présentent une longueur déterminée, de telle sorte qu'il peut fixer des molécules, notamment biologiques, par covalence, tout en conservant leur structure sinon native, du moins encore fonctionnelle, avec une accessibilité de leurs fonctions chimiques réactives suffisante pour réagir efficacement avec le composé à séparer par chromatographie d'affinité sur colonne. Plus précisément, l'invention a pour objet un support particulaire pour la fabrication d'adsorbants pour chromatographie d'affinité sur colonne, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de particules d'une matière polymère de base aptes à être utilisées en chromatographie sur colonne et sur lesquelles sont greffées, essentiellement en surface, des molécules d'au moins un monomère insaturé capable de former un copolymère avec la matière de base et porteur d'au moins une fonction chimique capable de former, ultérieurement, dans des conditions non dénaturantes, une liaison covalente avec le ligand utilisé dans l'adsorption envisagée, la quantité de monomère greffé possédant une fonction chimique accessible par unité de surface (mono-. 2 mère dosé par unité de surface) étant de 10 à 500 iig par cm de sur- face du support et le rapport de la quantité de monomère greffé possédant une fonction chimique accessible à la quantité totale de monomère greffé (monomère dosél monomère pesé) étant de 0,05 à 0,5. De préférence, la quantité de monomère dosé par unité 2 de surface est de 30 à 350 tig par cm et le rapport mono- mère dosé/monomère pesé est de 0,05 à 0,3. On entend ici par "particules d'une matière polymère de base aptes a être utilisées en chromatographie sur co lonne" des particules d'une matière présentant notamment et simultanément, à l'état de particules, les qualités suivantes: - tenue dimensionnelle sous pression, - résistance à l'écrasement, - densité supérieure à l'unité, - inerties chimique et physico-chimique suffisantes dans les conditions d'utilisation, - insolubilité dans la plupart des solvants, notam ment dans l'eau et les solutions aqueuses, - taux de gonflement faible dans l'eau et les solutions aqueuses Parmi les matières qui, à l'état particulaire, répondent à cette définition on peut citer notamment : le chlorure de polyvinyle, le polystyrène, le poly-chloro-trifluoroéthylène, des polyamides et le polyéthylène, et leurs copolymères présentant les caractéristiques sus indiquées. Suivant la taille de ces particules on parlera de "poudres ou microbilles" (taille inférieure à 1 mm) ou de "billes" (particules pratiquement sphériques ayant des diamètres supérieurs à 1 mm). Le "greffage en surface" du monomère insaturé conduit à "l'encapsulation" plus ou moins importante de la particule dans une couche de copolymère de la matière de base et du ou des monomère(s) insaturé(s) greffé(s) , appelés ciaprès, pour simplifier, "le monomère". Le monomère greffé doit présenter outre une insaturation, par exemple une double liaison carbone-carbone, capable de former, par greffage, un copolymère avec la matière de base, au moins une fonction chimique capable de former ultérieurement une liaison covalente avec le ligand dont l'utilisation est envisagée, et ceci dans des conditions non dénaturantes pour le ligand, c'est-a-dire des conditions qui ne modifient pas de façon importante l'aptitude du ligand une fois fixé à réagir de façon sélective avec la substance à adsorber. Le monomère greffé comporte, en tant que fonction chimique répondant à cette définition, par exemple et de façon préférée, au moins une fonction chimique choisie parmi - les fonctions acide carboxylique activables par les carbodiimides, - les fonctions amide activables par le glutaraldéhyde, - les fonctions amine activables par le glutaraldéhyde, - les fonctions aldéhyde qu'il n'est pas nécessaire d'activer, et - les fonctions hydroxyle activables par le bromure de cyanogène. En tant que monomères insaturés répondant à la définition donnée ci dessus on peut citer - l'acide acrylique, - l'acrylamide, - l'allylamine, - l'acroléine, - l'acrylate d'éthylène-glycol et - le méthacrylate de diméthylaminoéthyle. Les fonctions chimiques accessibles pour des réactions covalentes ultérieures du monomère greffé peuvent être dosées chimiquement selon des méthodes connues de l'homme du métier, éventuellement après modification (hydrolyse des fonctions amide en fonctions acide par exemple). Le nombre de fonctions chimiques accessibles ainsi déterminé par dosage permet aisément de calculer, à partir du poids moléculaire du monomère greffé, et connaissant la surface de la matière polymère de base, le poids de monomère greffé possédant une fonction chimique ¯assib1e (monomère dosé) par unité desurface du support avant greffage. La quantité totale de monomère fixé (monomère pesé) est la différence entre le poids P1 du support après greffage et le poids PO de la matière polymère de base. L'invention a également pour objet un procédé pour la préparation du support particulaire selon l'invention. Ce procédé utilise, comme source d'énergie, des rayonnements ionisants, en l'absence de tout catalyseur chimique. Plus précisément, le procédé selon l'invention pour la préparation d'un support particulaire greffé, défini précédemment, est caracte risé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer le greffage radiochimique, sur des particules d'une matière polymère de base choisie, du ou des monomère(s) insaturé(s) choisi(s), en solution dans un solvant non agressif vis à vis des réactifs ou en l'absence de sol vant Selon ce procédé, on a essentiellement recours à trois types de techniques de greffage radiochimiques connus, à savoir - le greffage après préirradiation en pr#sence d'oxyg;-ne, - le greffage après préirradiation en absence d'oxy gène, - le.greffage direct sous rayonnements. On rappellera brièvement ci-après le principe de chacune de ces trois techniques. 1) Greffage après préirradiation en présence d'oxygène (greffage sur polymères peroxydés) Cette méthode consiste à peroxyder le polymère de base en l'irradiant en présence d'oxygène puis à effectuer le greffage dans une seconde étape au cours de laquelle on décompose, notamment par la chaleur, les peroxydes macromoléculaires formés, en présence du monomère à greffer. 2) Greffage après préirradiation en absence d'oxygène: Cette méthode consiste à irradier, dans une première étape, un polymere a tat vitreux ou cristallisé. Les macroradicaux formés ont une mobilité très réduite et certains d'entre eux restent "pièges1, sans se recombiner. Dans une seconde étape, on laisse diffuser le monomère à greffer dans le polymère ainsi traité ; les macroradicaux formés précédemment amorcent la polymérisation et on obtient un copolymère greffé. 3) Greffage direct sous rayonnements Cette méthode consiste à utiliser directement les macroradicaux formés lors de la radiolyse du polymère de base pour amorcer la polymérisation du polymère à greffer présent dans le milieu au moment de l'irradiation. Dans tous les cas, les rayonnements ionisants proviennent avantageusement d'accélérateurs d'électrons ou de sources de cobalt 60. Selon l'invention, on a établi que des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus lorsque le greffage est effectué - sur des particules de polymère de base dont la taille est située dans la gamme d'environ 10 à environ 5 000 p; - dans un solvant tel que l'eau, l'acétone ou l'éthanol, purs ou en mélange - à une concentration du monomère dans le solvant de 10 à 80 % en poids - pendant une durée de 1 à 6,5 heures - à une température située dans la gamme allant de la température ambiante à la température d'ébullition du solvant utilisé ; et - avec une dose d'irradiation comprise dans la gamme de 0,3 à 10 Mrad. Selon un mode préféré de réalisation, le procédé seion l'invention pour la préparation du support particulaire greffé, défini précédemment, est donc caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer le greffage radiochimique, sur des particules d'une matière polymère de base choisie dont la taille est située dans la gamme d'environ 10 à environ 5 000 , du monomère insaturé choisi, en solution à une concentration de 10 à 80 % en poids, dans liteau, l'acétone ou l'éthanoi, purs ou en mélange, pendant une durée de 1 à 6,5 heures, à une température située dans la gamme allant de la température ambiante à la température d'ébullition du solvant utilisé, avec une dose d'irradiation comprise dans la gamme de 0,3 à 10 Mrad. Le support particulaire greffé en surface selon l'invention, obtenu comme il vient d'être décrit; ou selon tout autre procédé, est stable et peut être conservé tel quel. Ce support particulaire greffé est avantageusement utilisé pour préparer des adsorbants pour chromatographie, notamment dans le domaine de la biologie. Dans ce domaine, depuis déjà un certain nombre d'années, on effectue des recherches intensives en vue de mettre au point des dispositifs permettant d'extraire ou d'éliminer, de manière sûre et efficace, différentes substances à partir de matières biologiques, en particulier à partir du sang. Pour ce faire, un des moyens les plus efficaces envisages jusqu'à ce jour consiste à adsorber la substance à extraire ou à éliminer-sur un adsorbant muni d'une substance apte à réagir de façon spécifique avec ladite substance à extraire ou à éliminer. Ainsi, on peut par exemple éliminer du sang, in vitro ou par circulation extracorporelle ex vivo, un anticorps, un antigène ou un substrat d'enzyme en faisant passer le sang à purifier sur un adsorbant muni respectivement de l'antigène, anticorps ou enzyme correspondant. Cette méthode peut également être utilisée, notamment in vitro, pour récupérer à partir du sang des constituants biologiques recherchés, notamment en thérapeutique, tels qu'antigènes ou anticorps. Le support particulaire greffé en surface selon l'invention convient particulièrement bien à la préparation de tels adsorbants. En effet, un tel support présente à sa surface un grand nombre de sites réactifs vis-à-vis notamment des ligands de substance biologiques. Comme on peut, en fai sant varier notamment la taille des particules, la nature du monomère greffé et la longueur des greffons grâce à un choix approprié des conditions de greffage, régler sur ce support la distance, la densité et la répartition des sites réactifs, il est possible d'y fixer par covalence un très grand nombre de ligands, en particulier des ligands spécifiques de substances biologiques. La fixation covalente du ligand sur le support particulaire a lieu selon des méthodes connues, telles que décrites par exemple caris inTn.unochemistry 1, 213-229, (1964), J. of Imnunologîcal Methocls 11, 129-133 (1976) et Sciwlce 195, 302 (1977), après activation des sites réactifs du support. Il est rappelé à ce propos que l'activation des fonctions acide peut se faire au moyen de carbodiimides et celle des fonctions amide et amine au moyen de glutaraldéhyde. On a en outre établi selon l'invention que les sites réactifs sont rendus plus accessibles pour la fixation covalente du ligand lorsqu'on effectue une hydratation du support, préalable à l'activation. Donc, selon l'invention, ou hydrate de préférence le support avant de procéder à son activation, puis à la fixation covalente du ligand. La durée de l'hydratation dépend essentiellement de la structure et de la composition du support particulaire greffé. Cette durée peut être déterminée aisément par l'homme du métier, pour chaque type de support. Par exemple, dans le cas d'un support particulaire greffé à l'acide acrylique, ou à l'acrylamide après hydrolyse des fonctions amide en fonctions acide, on peut déterminer la duree d'hydratation optimum (au bout de laquelle le maximum de fonctions acide sont rendues accessibles) en suivant les variations de pH d'une solution de soude dans laquelle un échantilion du support greffé est mis en suspension. En tout état de cause, on a pu établir que selon l'invention une durée d'hydratation préalable de 24 heures suffit à rendre accessibles toutes les fonctions utilisables. A ce stade le taux de gonflement, en volume, du support est au maximum de 30 %, le plus souvent de l'ordre de 10 %et le support conserve toutes ses caractéristiques mécaniques désirées pour la chromatographie d'adsorption sur colonne. L'invention a donc en outre pour objet un adsorbant pour chromatographie d'affinité, caractérisé en ce qu'il résulte de la fixation covalente du ligand spécifique de la substance à adsorber, sur le suppoFt particulaire selon l'invention. L'invention a de plus pour objet un procédé pour la préparation. de cet adsorbant pour chromatographie d'affinité, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à fixer par covalence le ligand spécifique de la substance à adsorber, sur le support après activation de celui-ci, précédée de préférence d'une hydratation. Enfin l'invention a pour objet l'utilisation d'un tel adsorbant, en particulier dans le domaine de la biologie, et notamment pour extraire ou éliminer une substance biologique du sang, in vitro ou par circulation extracorporelle ex vivo. A titre d'exemples, on indiquera à ce propos que - pour extraire ou éliminer un antigène du sang ,on utilisera avantageusement un adsorbant selon l'invention dans lequel le ligand est l'anticorps, par exemple monoclonal, correspondant - pour extraire ou éliminer un anticorps du sang, on utilisera avantageusement un adsorbant selon l'invention dans lequel le ligand est l'antigène correspondant ; et - pour éliminer un substrat d'enzyme du sang, on utilisera avantageusement un adsorbant selon Invention dans lequel le ligand est l'enzyme correspondante. Il va de soi que pour traiter des milieux complexes tels que le sang, l'homme du métier devra choisir, sur la base de ses connaissances générales en la matière, parmi les nombreux supports particulaires selon l'invention, ceux qui sont compatibles non seulement avec le ligand à fixer, mais encore avec le milieu complexe à traiter avec lequel ils ne devront pas donner de réactions secondaires gênantes, en particulier dans le cas de l'épuration du sang par circulation extracorporelle ex vivo L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent. I Exemples de préparation de supports. Exemple 1 Poudre de chlorure de polyvinyle greffée par de l'a crylamide, après irradiation en l'absence d'oxygène. Le support de base est une poudre de chlorure de poly vinyle (commercialisée sous la dénomination PVC Lycovyl GB 1220) dont la granulométrie est comprise entre 100 et 200 microns. Le greffage d'acrylamide est effectué en ab sence d'oxygène. La poudre est d'abord irradiée en atmosphère d'azote sous rsonnement y. Une dose de 0,57 Mrad est ap pliquée avec un débit de 0,19 Mrad/heure. La poudre est ensuite mise au contact du monomère en solution dans un mélange eau-acétone (3:5) contenant 15 % d'acrylamide pendant lh30 à température ambiante, toujours à l'abri de l'oxygène et sous agitation. La poudre greffée est alors lavée dans un mélange eau acétone (3:5) et séchée. Le greffage pondéral qui est défini comme étant égal EMI12.1 (P1 étant le poids final et P0 le poids initial) est de 12,7 %. L'hydrolyse des fonctions amide accessibles réalisée dans une solution d'acide chlorydrique 3N pendant 3 heures à reflux permet ensuite d'évaluer les fonctions acide carboxylique obtenues et de les doser par la soude. De cette manière le dosage conduit à une évaluation de 2,35 % (en poids) de chaînes dérivées de l'acrylamide présentant un site actif. Exemple 2 Poudre de chlorure de polyvinyle greffée par de l'a crylamide, après irradiation en l'absence d'oxygène. Le support de base est le même que dans l'exemple 1. Le greffage d'acrylamide est effectué suivant le même procédé et dans les mêmes conditions d'irradiation que dans l'exemple 1. La solution de greffage contient 20 % d'acrylamide et le greffage à la température ambiante dure 1 heure. La poudre lavée et séchée est ainsi greffée à 24 % en poids et 5 % de polyacrylamide actif peuvent être dosés. Exemple 3 Poudre de chlorure de polyvinyle greffée par de l'acide acrylique, après irradiation en l'absence d'oxygène. Le support de base est le même que dans l'exemple 1. Le greffage d'acide acrylique est effectué en atmosphère d'azote. L'irradiation est faite dans un premier temps, une dose de 0,6 Mrad étant appliquée sous électrons. Le greffage est ensuite réalisé par agitation de la poudre, toujours en atmosphère d'azote, en suspension dans une solution contenant 10 % d'acide acrylique dans l'eau en présence de 0,15 % d'inhibiteur (sel de Mohr) pendant 1 heure à 85 T 20C. Le greffage est évalué à 3,5 % par dosage des fonctions acide carboxylique par la soude. Exemple 4 Poudre de chlorure de polyvinyle greffée par de l'allylamine, acrès irradiation en l'absence d'oxygène. Le support de base est le même que dans l'exemple 1. L'irradiation et le greffage d'allylamine sont effectués en absence d'oxygène, sous vide. La poudre est préirradiée sous électrons ayant une énergie de 3 MeV. La dose appliquée est de 5 Mrad. Le greffage est réalisé en laissant la poudre au contact d'une solution d'allylamine à une concentration de 50 % dans l'éthanol, sous agitation, pendant lh à 40 + 20C. Les lavages sont réalisés dans l'éthanol. Le greffage pondéral mesuré est de 6 %. Exemple 5 Billes de polystyrène greffées par de l'acide acrylique, après irradiation en présence d'oxygène. Le support, sous forme de billes de diamètre 3,2 mm, est constitué de polystyrène. Il est peroxydé par irradiation à l'air, sous rayonnements y. Une dose de 7,5 Mrad est appliquée à un débit de 0,44 Mrad/heure. Le support est ensuite agité dans une solution contenant en poids 79,6 % d'acide acrylique, 20 % d'eau, 0,4 % de sel de Mohr, pendant 6h30, à 87 f 20C, sous atmosphère d'azote. Le taux de greffage pondéral est de 2,8 % ; il est évalué, par dosage, à 0,29 %. Exemple 6 Billes de polystyrène greffées par de l'acrylamide, après irradiation en présence d'oXygène. Des billes de polystyrène de 3,2mm de diamètre sont greffées par de l'acrylamide dans les conditions suivantes: La peroxydation du support est réalisée par irradiation, à l'air, sous électrons (3 MeV) avec une dose de 7,5 Mrad. Après 24 heures, les billes sont plongées dans une solution contenant en poids 59,4 % d'acrylamide, 40 % d'eau, et 0,6 % de sel de Mohr, dans laquelle barbote de l'azote. La tem pérature de la solution est de 92 f 20C, la durée de gref fage est de 6h30. Le taux de greffage pondéral est de 0,45 %. Exemple 7 Billes de polystvrène greffées par de l'acrylate de butyle et de 11 acide acrylique, après irradiation en présence d'oxygène. Des billes de polystyrène de 3,2 mm de diamètre sont greffées simultanément, dans les mêmes conditionis d'irradiation que celles décrites dans l'exemple 6,par de l'acide acrylique et de l'acrylate de butyle pour augmenter la balance hydrophile/ hydrophobe. Le greffage est effectué dans#une solution contenant, en poids, 5 % d'acrylate de butyle, 74,6 % d'acide##rylique, 20 % d'eau et 0,4 % de sel de Mohr, à 87 + 20C pendant lh45. Le taux de greffage pondéral est de 2,4 %. Exemple 8 Billes de polystyrène greffées par de l'acide acrylique, après irradiation en présence d'oxygène. Des billes de polystyrène de 3,2 mm de diamètre sont greffées par de l'acide acrylique. La méthode utilisée est la peroxydation, l'irradiation du support étant effec tuée sous faisceau d'électrons (3 MeV), a l'air, avec une dose de 7,5 Mrad. Après 24 heures, les billes, plongées dans une solu tion contenant en poids 79,6 % d'acide acrylique, 20 % d'eau et 0,4 t de sel de Mohr, sont agitées pendant 4 heures à 87 + 20C, en maintenant dans la solution, un barbotage d'azote. Le greffage pondéral est de 2;6 % et legreffageit#sur# par dosage desfonctions acide est de 0,12 %. Exemple 9 Poudre de copolymère chlorure de polyvinyle-acétate de vinyle greffée par de l'acide acrylique, après irradia tion en présence d'oxygène. Le support de base est un copolymère, sous forme de mi- microbilles, de chlorure de polyvinyle contenant 10 %#c'acétate de vinez (camercialisé sous la dénomination Lucovyl SA 6001), dont la granulométrie est comprise entre 100 et 200 microns. Le greffage de l'acide acrylique est effectué après irradiation, a l'air, de la poudre, sous rayonnements y, à une dose de 0,3 Mrad dispensée en 1 heure. La solution de greffage, hors de laquelle l'oxygène est chassé par barbo targe d'azote, contient, en poids, 9,95 % d'acide acrylique dans 90 % d'eau, en présence de 0,05 % de sel de Mohr. Elle est chauffée à .80 t 20C durant le temps de greffage de 1 heure. Le taux de greffage pondéral, mesuré par différence de poids, après lavage et séchage est de 3,6 %. Le dosage des fonctions acide. carboxylique correspond à 1,5 % de greffage. Exemple 10 Poudre de copolymère de chlorotrifluoroéthylène et de fluorure de vinylidène greffée par l'acide acrylique, après irradiation en l'absence d'oxygène. Un support de base constitué de copolymère de chlorotrifluoréthylène et de fluorure de vinylidène tommercialisé sous la dénaunation Kel-F) de granulométrie comprise entre 80 et 160 microns, est greffé par de l'acide acrylique dans les conditions suivantes : une préirradiation du support est réalisée en absence d ' oxy- gène, sous vide, sous électrons (3 MeV) avec une dose de 0,87 Mrad. Le greffage est ensuite effectué, sous vide, à 90 - 20C pendant 1h10 au contact d'une solution de 20 t d'acide acrylique dans l'eau en présence de 0,2 % de sel de Mohr. Les fonctions acide dosées correspondent s un taux de greffage dosable de 8,9 %. Exemple 11 Poudre de copolymère de chlorure de polyvinyle et d'acétate de vinyle greffée sous vide par de l'acroléine, après irradiation par un faisceau d'électrons. Le support de base est une poudre de copolymère de chlorure de polyvinyle - acétate de vinyle contenant 10 % d'acétate de vinyle dont la granulométrie est comprise entre 100 et 200 p. Le greffage d'acroléine est effectué sous vide, après un double dégazage. La poudre est irradiée par un passage sous faisceau d'électrons (énergie : 3 MeV intensité : 400 pA) à une dose de 2,05 Mrad. Elle est ensuite mise au contact d'une solution d'acroléine se composant de 50 % d'acroléine 25 % d'éthanol 25 % d'eau pendant 17 heures à la température ambiante. La poudre greffée est lavée à l'éthanol. Le greffage est évalué par pesée à 5,3 % et par dosage des fonctions aldéhyde à 1,5 %. Exemple 12 Poudre de polyamide greffée par de l'acrylate d'éthylène-glycol, après irradiation sous vide par un faisceau d'électrons. Le support de base est un polyamide 11 de granulométrie comprise entre 10 et 100 p. Le monomère greffé est l'acrylate d'éthylène-glycol. Le greffage est effectué sur la poudre préirradiée sous faisceau d'électrons (E = 3 MeV, I = 400 pA) en absence d'oxygène sous vide, à une dose de 9 Mrad, en mettant 10 g de poudre en suspension pendant 15 minutes à 750C dans 100 ml d'une solution contenant 50 % d'acrylate d'éthylèneglycol dans l'eau, en présence de 0,5 % de sel de Mohr. La poudre est lavée à l'eau et séchée. Le taux de greffage pondéral est de 186 %. Exemple 13 Poudre de polyéthylène greffée par de l'acrylate d'éthylène-glycol, après irradiation sous vide par un faisceau d'électrons. Le support de base est un polyéthylène (très haut poids moléculaire) de granulométrie comprise entre 10 et 100 p. Le monomère greffé est l'acrylate d'éthylène-glycol. Le greffage est effectué par une méthode de préirradiation en absence d'oxygène, sous vide. La poudre de polyéthylène est irradiée sous faisceau d'électrons (E = 3 Mev, I = 400 pA) à une dose de 9 Mrad. Elle est mise ensuite au contact1 toujours sous vide, d'une solution de 49,5 % d'acrylate d'éthylène-glycol et de 0,5 % de sel de Mohr dans l'eau, à 750C pendant 90 minutes, à raison de 10 ml de solution par gramme de poudre. La poudre greffée est ensuite lavée à l'eau et séchée. Le taux de greffage pondéral est de 110 %. Exemple 14 Poudre de copolymère de chlorure de polyvinyle et de polyacétate de vinyle greffée par le méthacrylate de diméthylamino-éthyle, après préirradiation en l'absence d'oxygène, par des rayons z. Le support de base est une poudre de copolymère de chlorure de polyvinyle et de polyacétate de vinyle à 10 % de polyacétate de vinyle (commercialisée sous la dénomination : Lucovyl SA 6001) dont la granulométrie est comprise entre 100 et 200 p. Le greffage du monomère, à savoir le méthacrylate de diméthylaminoéthyle (MADAME) de formule EMI17.1 est effectué selon une méthode de préirradiation en absence d'oxygène. La poudre est irradiée en atmosphère d'azote sous rayonnement X à une dose de 1,5 Mrad avec un débit de 0,3 Mrad/h, elle est ensuite mise au contact du monomère en solution contenant 4Q % de MADAME, 59,6 % d'eau et 0,4 % dhydroquinone jouant le rôle d'inhibiteur, à raison de 5 ml de solution par gramme de support. La réaction s'effectue à 300C pendant une heure, en atmosphère d'azote. La poudre est ensuite lavée dans des solutions d'eau éthanol et séchée à 50 C. Le taux de greffage pondéral obtenu est de 8,6 %. Il Exemples de preparation d'adsorbants. Exemple 15 Fixation d'acides aminés sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 1. Après hydratation du support, les fonctions amide sont activées par incubation du support greffé pendant 17h à 370C dans une solution contenant 6 % de glutaraldéhyde en tampon MES (0,1 M) a pH 7,4, à raison de 25 ml de solution pour un gramme de support greffé. Le support est mis en suspension à raison de 1 g/10 ml et agité dans une solution d'acide amine (50 g/l) e n tampon MEQ (0,1 M) maintenue à une température de 50C pendant 5 heures. Les manipulations sont effectuées à différents pH 6,5 ; 7,5 ; 8,5, avec deux acides aminés différents : la lysine et l'acide glutamique. Les taux de couplage sont évalués par dosage des fonctions acide carboxylique par la soude 0,1 N. La validité de ce test est prouvée en confirmant sur témoin l'absence de toute hydrolyse des fonctions amide sur le même support n'ayant pas subi l'activation et le couplage. Les résultats obtenus sont les suivants EMI18.1 <tb> <SEP> pH <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> moles <SEP> Rendement <SEP> par <tb> <SEP> fixées <SEP> par <SEP> <SEP> gramme <SEP> rapport <SEP> au <SEP> greffage <tb> <SEP> 6,5 <SEP> <SEP> 2.55.10-4 <SEP> 77% <tb> Lysine <SEP> 7,5 <SEP> 1,34.10-4 <SEP> 40,5 <SEP> % <SEP> <tb> <SEP> 8,5 <SEP> 2,2 <SEP> .10 <SEP> 66,7 <SEP> 66,7 <SEP> % <tb> <SEP> 26,5 <SEP> 0,88.10-4 <SEP> 26,5 <SEP> % <tb> Acide <SEP> 7,5 <SEP> 1,08.10 <SEP> 4 <SEP> 33 <tb> glutamique <SEP> 8,5 <SEP> 1,03.10-4 <SEP> <SEP> 31,1 <SEP> % <tb> Exemple 16 Fixation d'une enzyme (chymotrypsine) sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 1. Après hydratation du support, l'activation est effectuée dans des conditions identiques à celles décrites à l'exemple 15. Le couplage de la chymotrypsine est réalisé au pH optimum de 7 dans des conditions équivalentes à celles décrites pour le couplage des acides aminés. La concentration de la solution de chymotrypsine n'est que de 2 g/litre; Le support subit ensuite 4 lavages : ler lavage : 17h en tampon MES (0,1 M) 2eme lavage : 7h en tampon MES (0,1 M) NaCl(lM) à FH 7. 3eme lavage : 41h dans une solution de Cl(10 3M) NaCl(lM) à pH 3. 4eme lavage : 7h en tampon TRIS (O,OlM)CaC12(0,05 M) à pH 8. Les résultats sont évalués en - poids de chymotrypsine par gramme de support, déduits des mesures de densité optique sur le milieu réactionnel ; et - activités enzymatiques mesurées sur les diffé rentes solutions et sur la poudre. L'activité enzymatique est exprimée en Unités Internationales (UI) ton rappelle qu'une Unité Internationale représente le nombre de micromoles de soude ajoutées, nécessaires pour neutraliser les fonctions acide carboxylique libérées par l'hydrolyse de l'ester éthylique de l'acétyltyrosine (ATEE) sous l'action de la chymotrypsinej Dans la solution de couplage la concentration en chymotrypsine chute de 1,93 g/l à 1,815 g/l; une quantité de 1,15 mg est donc fixée par gramme support. Parallèlement l'activité enzymatique de la solution chute de 259 UI à 7,68 Ul. L'activité enzymatique finale mesurée par gramme de support est de 25,8 Ul. Exemple 17 Fixation de y-globulines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 2. Après hydratation du support, les fonctions amide sont activées en agitant la poudre en suspension dans une solution à 2,5 % de glutaraldéhyde en tampon phosphate à pH 7,2, pendant 1 heure à 40C. Après rinçage de la poudre, on couple des y-globulines G humaines marquées à l'i o de 1 2 5 , p a r agitation d e 1 a poudre en suspension dans une solution de 1 mg/ml de y-globulines (yg) en tampon phosphate à 40C, pendant une nuit. Des lavages intenses en tampon phosphate sont répétés afin d'éliminer les protéines adsorbées. Dans ces conditions, la fixation de yg est évaluée à 0,6 mg par gramme de support. Exemple 18 Fixation de y-globulines sur un support. On u#tilise le support obtenu à l'exemple 3. L'activation des fonctions acide carboxylique, après hydratation, est réalisée en présence de l-cyclohexyl-3 (2-morpholino-éthyl)carbodiimide dans une solution tampon MES acide 2-N(morpholino)éthane.sulfonique (0,1 M), à pli 4,75, pendant 1 heure à 200C. Le support rincé est mis en suspension dans une solution de y-globulines G humaines (1 mg/ml) et agité une nuit à 40C. Les lavages sont effectués en tampon MES. La fixation atteint 7 mg de y-globulines G humaines par gramme de support. Exemple 19 Fixation de y-globulines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 4. La fixation de y-globulines G humaines marquées à 1' iode 125, après hydratation et activation par le glutaraldéhyde conduit, dans les conditions habituelles, à la fixation de 0,7 mg de yg par gramme de support. Exemple 20 Fixation de y-globulines sur un Support. On utilise le support obtenu à l'exemple 5. Les y-globulines G humaines fixées sur ce support dans des conditions équivalentes à celles décrites dans l'exemple 18 sont de 25 à 35 ijg par cm2 de surface du support. Exemple 21 Fixation de y-globulines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 6. La fixation de y-globulines G humaines dans des conditions équivalentes à celles décrites dans l'exemple 17 atteint 20 à 30 pg par cmê de surface du support. Exemple 22 Fixation de y-globulines sur un support. On utilise le support obtenu a l'exemple 7. La fixation de y-globulines G humaines dans les conditions habituellement employées pour les fonctions acide carboxylique (exemple 18) est de 45 #g/cm2 de surface du support. Exemple 23 Fixation de y-globulines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 8. Le support permet dans les conditions habituelles (exemple 18) la fixation de 80 à 130 pg de y-globulines 2 G humaines par cm de sa surface. Exemple 24 Fixation d'hématies humaines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 9. La fixation irréversible d'hématies humaines sur ce support est réalisée après hydratation et traitement intermédiaire du support par l'éthylène-imine fixée par le carbodiimide. Les conditions opératoires sont les suivantes Les microbilles greffées sont plongées dans une solution d'éthylène-imine de poids moléculaire 30 000 à 40 000 dans un tampon MES, sous agitation rotative, à raison de 50 mg d'éthylène-imine par gramme de microbilles. Ce traitement dure 90 minutes à température ambiante. Les microbilles sont ensuite transférées dans une solution contenant, en concentrations finales, les éléments suivants, pour 0,25 gramme de microbilles/ml de solution - polyéthylène-imine : 12,5 mg/ml - l-cyclohexyl-3 (2-morpholinoéthyl) carbodiimide : 50 mg/ml L'ensemble est maintenu 48h à température ambiante, sous agitation rotative. Les microbilles sont rincées à l'eau et traitées à nouveau 4h à température ambiante dans une solution contenant le carbodiimide (50 mg/ml) et du chlorure d'ammonium (1M). Après de nombreux rinçages, elles sont stockées en tampon TRIS (10 mM) à pH 7,4 en présence de NaN3 (0,2 %). Avant de permettre l'adsorption des hématies sur les microbilles, les 2 éléments sont lavés séparément dans un tampon sucrose-acétate (7/3) à 310 mOSM à pH 5 (il est rappelé que 1 OSM est la pression osmotique exercée par une solution aqueuse contenant 1 mole-de soluté (molécule ou ion) par litre, séparée de l'eau pure par une membrane imper méable à ce soluté). Une suspension 50/50 en volume de microbilles est ajoutée goutte à goutte dans une suspension 50/50 en volume de globules rouges, dans les mêmes proportions . Une agitation rotative très légère est appliquée pendant 10 minutes. Un rinçage est ensuite effectué avec le même tampon à pH 7,4. On prépare une solution de glutaraldéhyde (310 mOSM - 1 %) dans un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline : solution isotonique tamponnée). Les microbilles sont mises en suspension à raison de 10 % de microbilles dans une solution contenant 0,5 % de glutaraldéhyde. La réaction dure 1 heure à température ambiante. Différents rinçages sont effectués à 40C - glycine (0,1 M) - tampon PBS suivis d'une incubation d'une heure en solutiqn de glycine. Le rinçage final est effectué en tampon PBS. Les amaties du milieu réactionnel sont comptées sur cellule de Malassez (lame qui permet de dénombrer les cellules) et évaluéesenoutreaprès hémolyse en milieu ammoniacal. On peut ainsi estimer qu'il y a de 8 à 9.108-hématies fixées par gramme de support. Exemple 25 Fixation d'hématies humaines sur support. On utilise le support obtenu à l'exemple 4 sur lequel on adsorbe des hématies humaines puis on les fixe au glu taraldéhyde. Les conditions opératoires décrites dans l'exemple 24 sont reprises, en évitant le traitement à l'éthylène-imine. La fixation d'hématies est estimée du même ordre de grandeur, soit 8 à 9.108 hématies par gramme de support. Exemple 26 Fixation d'acide glutamique sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 10. L'activation des fonctions acide carboxylique et la fixation d'acide glutamique sont réalisées en un seul temps. La poudre est mise en suspension pendant 17h à 40C dans une solution contenant l'acide glutamique (50 g/I) et du 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoéthyl) carbodi- imide (10 %) en tampon MES (0,lM) à pH 4,75. Pour 1 gramme de support 10 ml de solution sont nécessaires. Le dosage des fonctions acide carboxylique sur le support couple permet, par rapport au témoin non couplé1 d'évaluer un taux de 14 % en poids d'acide glutamique fixé par liaison irréversible. Exemple 27 Fixation de chymotrypsine sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 11. Le couplage de la chymotrypsine est réalisé en agitant 1 gramme de support greffé pendant 20h à 200C dans 10 ml d'une solution tampon phosphate de potassium (0,05 M à pH 7) contenant 20 mg de chymotrypsine. La poudre est ensuite lavée abondamment en milieu tampon phosphate (pH 7), puis en milieu tampon phosphate N l (1M) puis dans une solution de Ho1(10-3 M)-Nacl(lM) à pH 3, et enfin en tampon TRIS (0,01 M) -CaC12 (0,05 M) à pH 8. L'activité enzymatique de la poudre ainsi obtenue est de 22 UI/gramme de support (I'activité initiale de la chymotrypsine en solution est de 13 UI/mg). Exemple 28 Fixation de B-galactosidase sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 12. Les fonctions hydroxyle sont activées par le bromure de cyanogène dans les conditions suivantes : 1 g de support est mis en suspension à température ambiante pendant 15 minutes dans une solution de carbonate de sodium (0,02 M) dont le pH est ajusté à ll par la soude et contenant 10 X de bromure de cyanogène, à.raison de 30 millimoles de bromure de cyanogène pour 1 g de support. Après rinçage dans une solution de bicarbonate de sodium (0,1 M), la poudre est mise en suspension dans 10 ml d'une solution de B-galactosidase à 2 g/l dans un tampon bicarbonate pH 9,3, pendant 24 heures à 4 C. La poudre est ensuite lavée abondamment et successivement dans 4 solutions: - NaHCO3 (0,1 M) - HC1 (10 J M) - NaCI (0,5 M) - eau distillée. L'activité enzymatique de la B-galactosidase fixée est mesurée après incubation de la poudre à 370C pendant 20 minutes en présence d'orthonitrophénol-D-galactopyranoside (ONPG), substrat dont l'orthonitrophénol (ONP) est libéré par hydrolyse, proportionnellement à la quantité d'enzyme présente. L'activité ainsi mesurée est de 0,84 micromole d'ONP libérée par gramme de support. Exemple 29 Fixation de 6-galactosidase sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 13. L'activation des fonctions hydroxyle par le bromure de cyanogène ainsi que le couplage de la 6-galactosidase sont réalisés dans les conditions décrites dans l'exemple 28. De même l'activité enzymatique de l'enzyme fixée est mesurée par l'action hydrolytique de l'enzyme sur le substrat : ONPG. L'activité mesurée est de 0,45 micromole d'ONP libérée par gramme de support. Exemple 30 Fixation d'hématies humaines sur un support. On utilise le support obtenu à l'exemple 14. L'adsorptionet la fixation des globules rouges sont réalisées directement sur le support, après avoir lavé séparément les billes et les globules rouges en tampon sucrose-acétate (7/3),à pH 5. Une suspension 50/50 en volume de microbilles est ajoutée goutte à goutte dans une suspension 50/50 en globules rouges, dans les mêmes proportions. Une agitation rotative très légère est appliquée pendant 10 minutes. Un rinçage est ensuite effectué avec le même tampon à pH 7,4. On prépare une solution de glutaraldéhyde : 1 % dans le tampon PBS (solution isotonique tamponnée). Les microbilles sont mises en suspension à raison de 10 % de microbilles dans une solution contenant 0,5 % de glutaraldéhyde. La réaction dure 1 heure à température ambiante. Différents rinçages sont effectués à 40C - glycine (0,1 M) - tampon PBS suivis d'une incubation d'une heure en solution glycine. Le rinçage final est effectué en tampon PBS. Le nombre d'hématies fixées est évalué à 8 à 9.108 par gramme de support (1,8 à 2.106 hématies/cm2). III Utilisation des adsorbants selon l'invention : application à l'épuration immunologique. L'épuration immunologique est une application particulière du principe de la chromatographie d'affinité. L'élimination du milieu plasmatique des éléments indésirables (ex. anticorps, antigènes, complexes immunes) est réalisée par mise e n contact avec un support qui possède à sa surface les éléments actifs réagissant spécifiquement avec l'élément à éliminer. Les techniques d'épuration plasmatique les plus cou ramnent employées sont actuellement les plasmaphérèses. Les éliminations sont dans ce cas non spécifiques avec perte importante de plasma, coûteuses et on observe un certain nombre d'accidents. La fabrication d'adsorbants obtenus à partir de supports polymères greffés, possédant des caractéristiques mécaniques variées et ayant fixe irréversiblement différentes biomolécules, ouvre une large voie d'application dans ce domaine. Quelques uns des adsorbants décrits dans la deuxième partie ont été utilisés pour mettre en évidence leur ca pacité d'épuration. A.Epuration "in vitro" Exemple 31 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 18. Des lapins (blancs de Bouscat) sont immunisés par injection intradermique de y-globulines G humaines (de la société Sigma : fraction Il de Cohn). Des prélèvements réguliers sont effectués pour le dosage des anticorps et la constitution de "pools d'anticorps" utilisés lors des "épurations in vitro". Le dosage quantitatif des anticorps est effectué par une méthode radioimmunologique du type sandwich utilisant des y-globulines G humaines (yGH) radioiodées (1125). Selon cette méthode, des yGH fixées sur des particules de cellulose sont mises en contact simultanément avec l'anti sérum et le traceur 125I yGH en excès. Les yGH fixées sur cellulose sont en excès pour piéger tous les anticorps. L'excès de traceur est éliminé par lavage. La quantité de traceur fixée au support par l'intermédiaire des anticorps et'des yGH est proportionnelle à la quantité d'anticorps présente dans l'antisérum. Les résultats comparés à un standard sont exprimés en #g/ml. Le pool d'anticorps prélevé sur lapin est dilué avec du sérum de lapin normal. A l'aide d'une pompe péristaltique Ee type Mastuflex) la solution est perfusée dans l'épurateur ; le système fonctionne en circuit fermé ; des prélèvements successifs sont effectués pour le dosage des anticorps anti yGH et des protéines totales. Les conditions opératoires de deux essais et les résultats d'épuration "in vitro" sont indiqués dans le tableau suivant. EMI27.1 <tb> <SEP> Essai <SEP> n0 <SEP> <SEP> 1 <SEP> 2 <tb> - <SEP> Surface <SEP> totale <SEP> du <SEP> 4.200 <SEP> 4.200 <tb> <SEP> support <SEP> (cm2) <tb> - <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> anti- <SEP> 19,7 <SEP> 43 <tb> <SEP> corps <SEP> (g/ml) <SEP> <tb> - <SEP> Volume <SEP> de <SEP> plasma <SEP> (ml) <SEP> 30 <SEP> 50 <tb> - <SEP> Quantité <SEP> d'anticorps <SEP> 591 <SEP> 2.150 <tb> <SEP> (mg) <tb> - <SEP> Débit <SEP> (mlXmn) <SEP> <SEP> 5 <SEP> 5 <tb> - <SEP> Temps <SEP> (mn) <SEP> 60 <SEP> 60 <tb> - <SEP> % <SEP> d'épuration <SEP> 97 <SEP> 75 <tb> - <SEP> Anticorps <SEP> épurés <SEP> <SEP> 573 <SEP> 1.612 <tb> <SEP> (Ug) <SEP> <tb> Exemple 32 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 20 pour réaliser des essais d'épuration de sérum renfermant des anticorps anti-y-globulines G humaines, dans des condi tions analogues à celles de l'exemple 31. Les conditions opératoires de deux essais d'épuration "in vitro" et les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant. EMI28.1 <tb> <SEP> Essai <SEP> n0 <SEP> <SEP> 1 <SEP> 2 <tb> <SEP> - <SEP> Surface <SEP> totale <SEP> du <SEP> support <SEP> (cmê) <SEP> <SEP> 210 <SEP> 420 <tb> <SEP> - <SEP> Conc. <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> (ug/ml) <SEP> <SEP> 4,7 <SEP> 4,7 <tb> <SEP> - <SEP> Volume <SEP> de <SEP> plasma <SEP> (ml) <SEP> 30 <SEP> 30 <tb> <SEP> - <SEP> Quantité <SEP> d'anticorps <SEP> (ug) <SEP> <SEP> 141 <SEP> 141 <tb> <SEP> - <SEP> Débit <SEP> (ml/mn) <SEP> 15 <SEP> 15 <tb> - <SEP> <SEP> Temps <SEP> (mn) <SEP> 60 <SEP> 60 <tb> <SEP> - <SEP> % <SEP> <SEP> d'épuration <SEP> 10 <SEP> 40 <tb> <SEP> - <SEP> Anticorps <SEP> "épurés# <SEP> <SEP> (ug) <SEP> <SEP> 14 <SEP> 56,4 <tb> Exemple 33 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 22 pour réaliser un essai d'épuration de sérum renfermant des anticorps anti-y- globulines G humaines, dans des conditions analogues à celles de l'exemple 31. Surface totale du support (cm 2 630 Conc. en anticorps (g/ml) 11 Volume de plasma (ml) ....................30 Quantité d'anticorps ( g).................. ( g) 330 Débit (ml/mn)..................... (ml/mn) 20 Temps (mn)* 60 % d'épuration 33 Anticorps épurés ( g),..................... (g) 109 Exemple 34 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 23 pour réaliser un essai d'épuration de sérum renfermant des anticorps anti-y-globulines G humaines, dans des conditions analogues à celles de l'exemple 31. Surface totale du support (cm2) .............. 210 Concentration en anticorps (#g/ml) 16 Volume de plasma (ml)........................ (ml) 30 Quantité d'anticorps ( g)........................ (g) 480 Débit (ml/mm) ¯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..¯... 5 Temps (mn)................................ (mn) 60 % d'épuration 9 Anticorps "épurés" ( g) ............... . . . . . . . . g) 48 Exemple 35 On utilise l'adsorbant obtenu a l'exemple 24. La capacité d'adsorption spécifique de l'antigène A porté par les hématies fixées sur le support a été vérifiée par rapport à l'activité non spécifique vi-à-vis d'un anticorps B. Pour cela les taux d'anticorps anti A et anti B contenus dans un sérum ont été mesurés avant et après incubation d'une heure à 370C du support dans ce sérum. On élimine les anticorps anti A présents dans un sang frais humain. Les activités sont mesurées suivant la méthode décrite par C. ROPARS, A. MULLER, C. HUREL et J. LEBLANC dans .Bl. Transf. and Imm., tome XXIV, n0 1L1981). Le sérum de départ est titré au 256e. Les conditions de deux essais réalisés et leurs ré- sultats sont indiqués dans le tableau suivant EMI29.1 <tb> <SEP> Essai <SEP> n0 <SEP> <SEP> 1 <SEP> 2 <tb> - <SEP> Poids <SEP> de <SEP> support <SEP> sec <SEP> (mg) <SEP> 320 <SEP> 630 <tb> - <SEP> Dilution <SEP> du <SEP> sérum <SEP> 1/4 <SEP> 1/2 <tb> - <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> sérum <SEP> (ml) <SEP> 2 <SEP> 2 <tb> - <SEP> Epuration <SEP> : <SEP> anti <SEP> A <SEP> 93 <SEP> % <SEP> 87,6 <SEP> % <tb> - <SEP> Epuration <SEP> : <SEP> anti <SEP> B <SEP> z <SEP> 0 <SEP> o <SEP> #L <SEP> O <tb> Le taux de protéines total est. resté pratiquement constant. Exemple 36 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 30. L'épuration in vitro effectuée sur 2 ml de sérum avec 320 mg de support sec, selon la technique décrite dans l'exemple 35, conduit à une épuration spécifique anti A, de 85 % et une épuration non spécifique anti B, de 5 %. B*Epuration "-ex vivo" Exemple 37 On utilise l'adsorbant obtenu à l'exemple 18. Un shunt artério-veineux (jugulaire-carotide) est préalablement posé sur un lapin immunisé par injection intradermique de y-globulines G humaines et anesthésié au Nembutal. Le sang est perfusé directement sur une colonne contenant 25 à 30 g de l'adsorbant. Le débit est de 10 à 15 ml/mn. L'animal est hépariné au préalable et par perfusion au cours de l'opération. La circulation sanguine extracorporelle dure 1h30. Le taux d'anticorps est de 22,2 pg/ml au départ et de 2,21 #g/ml après épuration. Les protéines totales chutent de 56 mg/ml à 44,8 mg/ml. L'invention ne se limite auc-uement à ceux de ses modes de réa lisation et d'application envisagés ou décrits dans les exemples. En particulier, on obtint des résultats satisfaisants en effectuant le greffage direct du monomère sur le support particulaire de base, ne tamment dans les conditions préférées qui ont été définies précéâetr'cent.

Claims: REVENDICATIONS 1. Support particulaire pour la fabrication d'adsorbants pour chromatographie d'affinité sur colonne, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de particules d'un matière polymère de base aptes à être utilisées en chromatographie sur colonne et sur lesquelles sont greffées, essentiellement en surface, des molécules d'au moins un monomère insaturé capable de former un copolymère avec la matière de base et porteur d'au moins une fonction chimique capable de former, ultérieurement, dans des conditions non dénaturantes, une liaison covalente avec le ligand utilisé dans l'adsorption envisagée, la quantité de monomère greffé possédant une fonction chimique accessible par unité de surface. (monomère dosé par unité de surface) étant de 10 à 500 pg par cm de surface du support et le rapport de la quantité de monomère greffé possédant une fonction chimique accessible à la quantité totale de monomère greffé (monomère dos/ monomère pesé) étant de 0,05 à 0,5. 2. Support particulaire selon la revendication li caractérisé en ce que la quantité de monomère dosé par unité de surface est de 30 à 350 tig par cm2 et le rapport monomère dosé/monomère pesé est de 0,05 à 0,3. 3. Support particulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la matière de base est choisie parmi le chlorure de polyvinyle, le polystyrène, le poly chîorotrifluoroéthylène, les polyamides et le polyéthylene et leurs copolymères aptes à être utilisés, à l'état de particules, en chromatographie sur colonne. 4. Support particulaire selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le monomère porte au moins une fonction acide carboxylique, une fonction amide, une fonction amine, une fonction aldéhyde ou une fonction hydroxyle. 5. Support particulaire selon la revendication 4, caractérisé en ce que le monomère est choisi parmi l'acide acrylique, l'acryîamide, lallylamine, 1'acroléine, l'acre late d'éthylène-glycol et l'#. méthacrylate de diméthylaminc éthyle. 6. Procédé pour la préparation du support particulaire greffé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer le greffage radiochimique, sur des particules d'une matière polymère de base choisie, du monomère insaturé choisi, en solution dans un solvant non agressif vis-à-vis des réactifs ou en l'absence de solvant. 7. Procédé pour la préparation du support particulaire greffé selon l'une des revendicationsl à 5, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer le greffage radiochimique, sur des particules d'une matière polymère de base choisie dont la taille est située dans la gamme d'environ 10 à environ 5 000 p, du monomère insaturé choisi, en solution à une concentration de 10 à 80 % en poids, dans l'eau, l'acétone ou l'éthanol purs ou en mélange, pendant une durée de 1 à 6,5 heures, à une température située dans la gamme allant de la température ambiante à la température d'ébullition du solvant utilisé, avec une dose d'irradiation comprise dans la gamme de 0,3 à 10 Mrad. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le greffage a lieu après préirradiation par des rayonnements ionisants provenant d'accélérateurs d'électrons ou de sources de cobalt 60, en présence d'oxygène. 9. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le greffage a lieu après préirradiation par des rayonnements ionisants provenant d'accélérateurs d'électrons ou de sources de cobalt 60, en l'absence d'oxygène. 10. Adsorbant pour chromatographie d'affinité, caractérisé en ce qu'il résulte de la fixation covalente du ligand spécifique de la substance à adsorber, sur le support particulaire selon l'une des revendications 1 à 5. 11. Procédé pour la préparation de l'adsorbant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste à fixer par covalence le ligand spécifique de la substance à adsorber, sur le support après activation de celui-ci, précédée de préférence d'une hydratation. 12. Utilisation de l'adsorbant selon la revendication 10, en particulier dans le domaine de la biologie, et notamment pour extraire ou éliminer une substance biologique du sang, "in vitro" ou par circulation extracorporelle "ex vivo".

Inventors: COLLIN, CLAUDE, DUMONT, CHRISTOPHE, DUVAL, DOMINIQUE, GAUSSENS, GILBERT, KIRZENBAUM, MARECK, MORILLON, CECILE, NICAISE, MARYVONNE, Morillon, Cécile
Applicants: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ETABLISSEMENT DE CARACTERE SCIENTIFIQUE TECHNIQUE ET INDUSTRIEL
Application year: 1983
Main classification: B01J20
IPC codes: C12N11, C07K1, G01N30, B01J20, B01D15, C07K17, C07K16