Amino acid preparations containing glutaminic residues

Abstract: 1. Claims for the Contracting States CH, DE, GB, LI, SE Amino acid preparations containing glutamine for oral or intravenous application, characterized in that they contain the glutamine as an alpha-aminoacylated derivative in the form of the water-soluble dipeptides or tripeptides. 1. Claims for the Contracting State AT Process for the production of amino acid preparations containing glutamine for oral or intravenous application, characterized in that the glutamine is used as an alpha-aminoacylated derivative in the form of the water-soluble dipeptides or tripeptides.

Description: Beschreibung Glutaminhaltige Aminosäure-Zubereitungen In vielen Fällen schwerer Erkrankung ist die Ernährung auf oralem Wege nicht oder nur schwer möglich. Insbesondere bei postoperativen und posttraumatischen Zuständen und in schweren Fällen von Karzinomen, Verbrennungen, Infektionen, akutem und chronischen Nieren-Versagen, Leberinsuffizienz sowie langanhaltender Bewusstlosigkeit oder schweren Stoff wecrsalslDrungen müssen die Patienten dann parenteral mit Infusionslösungen ernährt werden, wobei zur Aufrechterhaltung der Ernährung dem Organismus neben Kohlenhydraten und Fett insbesondere Aminosäuren parenteral zugeführt werden müssen. Wegen der negativen Stickstoffbilanz, besonders bei postoperativer und posttraumatischer Stoffwechsellage, ist die Versorgung mit Aminosäuren von besonderer Bedeutung, wobei das Angebot nicht nur die essentiellen Aminosäuren umfassen soll, die der Organismus nicht selbst synthetisieren kann, sondern auch die anderen Aminosäuren, damit der Verlust an körpereigenen Proteinen möglichst schnell durch erneuten Aufbau dieser Proteine wieder ausgeglichen werden kann Zu den wichtigen Aminosäuren, die hierbei dem Organismus zur Verfügung gestellt werden müssen, gehört u.a. auch das Glutamin, messen Konzentration im intrazellulären Aminosäuremuster ai der erwähnten Stoffwechsellage häufig einen besonders stärken Abfall - bis zu 50% - zeigt (J Askanazi et al, Ann. Surg., Bd. 191, S. 465-472 (1980) und Ann. Surg., Bd. 192, 5. 78-85 (1980)). Ein besonderes Problem bei der parenteralen Zufuhr von Glutamin mittels aminosäurehaltigen Infusionslösungen liegt aber darin, dass diese Aminosäure ein toxisches Cyclisie rungsprodukt bildet und daher zur intravenösen Anwendung nicht geeignet ist. Diese Umwandlung des Glutamins kann z.B. schon beim Hitzesterilisieren einer wässrigen Lösung eintreten, oder auch im Organismus, wenn es als solches appliziert wird. Es wurde nun erkannt, dass das Glutamin als an der OL-Amino- gruppe durch o & Aminoacylreste substituiertes Derivat, d.h. in Form der Tri- oder Dipeptide des Glutamins dem Organismus, insbesondere durch Infusionslösungen, zugeführt werden kann, ohne Gefahr der Bildung des toxischen Cyclisierungsprodukts. Diese Di- und Tripeptide des Glutamins mit anderen Amino säuren, wie Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin oder Valin, sind sehr leicht wasserlöslich, so dass sie gegebenenfalls in relativ hoher Konzentration in den Infusionslösungen an gewendet werden können, wobei gleichzeitig dem Organismus auch andere Aminosäuren zugeführt werden, ohne dass dadurch osmotische Problem auftreten. Die Löslichkeit beispiels weise des Gly-Ala-Gln beträgt 680 g/L H2O, während die freien Aminosäuren eine geringere Löslichkeit besitzen Glycin: 225 g/L H2O; Alanin: 158g/L H2O und Glutamin: 325 giL H2O. Nach der Infusion werden im Organismus diese Di- oder Tri peptide durch körpereigene Aminopeptidasen, z.B. durch die in Säugetiergeweben vorhandenen Peptidhydrolasen, aufgespalten und dadurch dann das Glutamin langsam freigelegt, zur unmittel baren Verwertung beim Aufbau der körpereigenen Proteine. Die endständige Aminogruppe des Glutamins wird nämlich u.a. durch die Glutamin-Aminotransferase auf -Ketocarbonsäuren ber- tragen, weshalb für die körpereigene Synthese von Aminosäuren das Glutamin von grosser Bedeutung ist. Durch die Aminoacylierung des Glutamins wird auch eine Stabilisierung der endständigen Amidgruppe erreicht, und zwar sowohl gegen übliche Hydrolyse bei der Sterilisierung der Lösungen als auch gegen die Clutaminase-Enzymreaktion im Organismus. Erfindungsgemäss wird das Glutamin als CC-aminoacyliertes Derivat, d.h. also in Form der Di- oder Tripeptide'verwendet, wobei diese zusammen mit anderen Aminosäuren in den oralen Aminosäurepräparaten oder -infusionslösungen vorhanden sind. Hierdurch gelingt es, auch grössere Mengen an Glutamin dem Organismus zuzuführen, ohne dass es zu toxischen Erscheinungen kommen kann. Vorzugsweise enthalten die Präparate, insbesondere die Infusionslösungen zur parenteralen Ernährung, als Dipeptid das Alanyl-L-Glutamin oder als Tripeptid das Glycyl-L-alanyl L-glutamin. Die Infusionslösungen sollen die Di- oder Tripeptide des Glutamins in Mengen von 1 - 50 g/L enthalten und können gegebenenfalls weitere niedere Peptide enthalten sowie andere Nahrungsstoffe, wie Kohlenhydrate, z.B. Glucose, oder auch emulgierte Fette und Öle sowie Vitamine und Mineralsalze, wie sie üblicherweise in den Infusionslösungen zur parenteralen Ernährung vorhanden sind. Wenn auch das erfindungsgemäss anstelle des freien Glutamins zu verwendende gut wasserlösliche O(-aminoacylierte Glutamin vorzugsweise dem Organismus zusammen mit anderen Aminosäuren als Infusionslösung zugeführt werden soll, so eignen sich diese Glutaminderivate auch für die Applikation in oralen Aminosäure Präparaten, die als Granulate oder in Dragee-Form eingenommen werden. Die erfindungsgemäss zu verwendenden Di- oder Tripeptide des Glutamins, wie das L-Alanyl-L-glutamin oder das Glycyl-L-alanyl L-glutamin können leicht durch die N-Carboxy-Anhydrid-Methode hergestellt werden. Die Peptide werden hierbei vom Carboxyl Ende her aufgebaut, wobei die freie Aminogruppe der vorgelegten Aminosäure mit dem jeweiligen N-Carboxy-Anhydrid der anzuhängenden Aminosäure reagiert. Diese Methode ist durch R. Hirschmann et al in J.Org.Chem., Bd. 32, 3415-3425 (1967) und in J.Am.Chem.Soc., Bd. 93, 2746-2754 (1971) beschrieben worden. Sie wurde auch zur Herstellung von Alanyl-glutamin und anderen Peptiden angewendet, Biopolymers, Bd. 11, 2493-2503 (1972). Diese Methode lässt sich in automatischen Vorrichtungen durchführen, siehe P. Pfaender et al, Hoppe-Seyler's Z. Physiol-Chem., Bd. 354, S. 267-285 (1973) und DE-OS 24 16 941 sowie US-PS 3 951 741. Bei der bekannten Synthesemethode unter Verwendung der N Carboxy-Anhydrid-Aminosäureverbindungen wird in Gegenwart eines Boratpuffers gearbeitet. Da die für therapeutische Zwecke notwendige Abtrennung des erhaltenen Tripeptids von dem Boratpuffer Schwierigkeiten bereitet, empfiehlt es sich, die Synthese in Aqua dest. durchzuführen, was überraschenderweise mit guten Ausbeuten gelingt. Um die Di- oder Tripeptide von Nebenprodukten, d.h. eventuell entstandenen höheren Peptiden abzutrennen, lässt sich z.B. das Alanyl-Glutamin-Dipeptid oder das Glycyl-Alanyl-Glutamin-Tripeptid leicht chromatographisch reinigen, z.B. unter Verwendung von Sephadex-Säulen. Durch Auflösen der gereinigten Peptide und der gewünschten Aminosäuren in Aqua dest. werden Infusionslösungen erhalten, die gegebenenfalls noch Mineralsalze und andere Stoffe enthalten können und sich leicht isotonisch einstellen lassen. Die Lösungen können in üblicher Weise hitzesterilisiert werden, (z.B. 0,5 h, 1200C, pH=5,5 - 7,5) ohne Gefahr einer Veränderung des Tripeptids oder Dipeptids. Im Falle der Verwendung zusammen mit Glucose oder anderen Kohlenhydraten in Infusions lösungen für parenterale Ernährung sind diese jedoch erst nach der Sterilisierung oder kurz vor der Verwendung beim Patienten zuzufügen, um Nebenreaktionen der freien Aminogruppe des Peptids mit der Glucose bei der Hitzesterilisierung auszuschliessen. Nachfolgend sei die Herstellung des Ala-Gln-Dipeptids und des Gly-Ala-Gln-Tripeptids unter Anwendung der N-Carboxy-Anhydrid Methode beschrieben. Diese Verbindungen können dann erfindungsgemäss für Infusionslösungen verwendet werden. Herstellung von L-Alanin-L-Glutamin (Ala-Gln) a) Herstellung von Alanin-N-Carboxy-Anhydrid (Ala-NCA) In einem 2-L-Dreihals-Kolben wurden 30 g Alanin (L-Form) ( 3.4 x 10 Mol) in 1200 mL getrocknetem Tetrahydrofuran suspendiert. Unter Rühren wurde bei 300C bis 400C ein trockener Phosgen-Strom mit etwa 2 Blasen/sec eingeleitet. Nach 1 - 1,5 h war die Aminosäure bis auf einen kleinen Rest gelöst, worauf das Einleiten von Phosgen abgebrochen wurde, um eine Überphosgenierung zu vermeiden. Zur Vertreibung überschüssigen Phosgens wurde mit trockenem Stickstoff begast und anschliessend das ungelöste Alanin abdekantiert und das Tetrahydrofuran am Rotationsverdampfer abgezogen. Der feste Rückstand wurde in 40 mL Aceton aufgenommen und mit einem ther- schuss Petrolether gefällt. Es wurde unter N2-Atmosphäre ab-P- nutscht und das gereinigte Alanin-NCA im Exsikkator über P 205 und NaOH-Plätzchen getrocknet. Es wurden Ausbeuten von ca. 85 - 89% erhalten. b) Umsetzung von Ala-NCA mit Glutamin 5 g feinst gepulvertes Glutamin (- 0.034 Mol) wurden in 300 mL H20 bidest. gelöst. Nach dem Kühlen der Lösung auf OOC und Einstellung der Lösung mit ca. 50% NaOH auf pH 10,2 wurden 4,26 g Ala-NCA (- 0,037 Mol) innerhalb von 10 Min in kleinen Anteilen zugegeben, um die pH-Schwankungen möglichst gering zu halten. Danach wurde mit ca. 50% H2SO4 auf pH 3,5 titriert, um das Peptidcarbaminat zu decarboxylieren. Anschliessend wurde die Lösung neutralisiert und lyophilisiert. Die Rohausbeute betrug 14,0 g. Das Lyophilisat des Rohansatzes (14,0 g) wurde auf 3 Sephadex G-10-Läufe (jeweils ca. 4,7 g) aufgeteilt, um die Kapazität der Säule nicht zu überschreiten. Bereits beim 1. Lauf wurde eine reine Dipeptidfraktion erhalten. Die unreinen Fraktionen wurden erneut auf die Sephadex-Säule gegeben und so weiteres reines Dipeptid erhalten, dessen Reinheit dünnschichtchromatographisch an Kieselgelplatten mit Butanol-Eisessig Wasser (4 : 1 : 1) als Laufmittel und mit Ninhydrin als Entwicklungsreagens kontrolliert wurde. Das erhaltene Ala-Gln kann den Aminosäurelösungen in gewünschter Menge zugesetzt werden. Herstellung von Glycin-L-Alanin-L-Glutamin (Gly-Ala-Gln) a) Herstellung von Glycin-N-Carboxy-Anhydrid (Gly-NCA) In entsprechender Weise, wie bei der Herstellung von Ala-NCA beschrieben, wurde auch das Glycin-N-Carboxy-Anhydrid hergestellt,wobei aber die Ausbeuten, bezogen auf das eingesetzte Glycin, geringer waren. b) Umsetzung des Ala-Gln mit Gly-NCA 4,34 g t- 0,02 Mol) des Ala-Gln-Dipeptids wurden in 300 mL H20 bidest. mit 2,22 g (- 0,022 Mol) NCA-Gly unter Verwendung der in der DE-OS 24 16 941 und US-PS 3 951 741 beschriebenen Vorrichtung umgesetzt. Das durch Lyophilisation erhaltene rohe Gly-Ala-Gln wurde auf der Sephadex-G-10-Säule gereinigt, wobei die Fraktionen wieder dünnschicht-chromatographisch kontrolliert wurden. Das erhaltene Gly-Ala-Gln eignet sich für die Verwendung in Infusionslösungen. Die erfindungsgemässe Verwendung der Di- und Tripeptide des Glutamins als Glutaminquelle in Aminosäure-Infusionslösungen wird im folgenden anhand einiger Beispiele gezeigt. Die dabei zusätzlich zu den üblichen Aminosäuren verwendeten Tripeptide des Cystins bzw. Tyrosins zeichnen sich durch gute Wasserlöslichkeit aus und können nach der N-Carboxy-Anhydrid Methode hergestellt werden, was in einer gleichzeitig eingereichten Anmeldung näher erläutert wird. Beispiel 1 Gly-Ala-Gln und die anderen Substanzen wurden in den angegebenen Mengen in Aqua dest. gelöst, die Lösung in Infusionsflaschen abgefüllt und dann sterilisiert. Die Lösung kann in einer Menge von 10 - 30 mL je kg Körpergewicht und Tag infundiert werden. Peptide und Aminosäuren g/1000 mL Gly-Ala-Gln 22,5 L-Isoleucin 2,1 L-Leucin 2,9 L-Lysin-acetat 4,37 L-Methionin 1,80 L-Phenylalanin 1 , 25 L-Threonin 2,70 L-Tryptophan 1,00 L-Valin 2,30 L-Arginin 7,00 L-Histidin 1,75 L-Alanin 0,7 L-Glutaminsäure 5,00 Glycin 0,8 L-Prolin 7,0 L-Serin 6,2 CyS-Lys(CyS)1) 1) 2,0 Tyr-Lys(Tyr) ) 2,0 Kaliumhydroxid 1,96 Natriumchlorid 2,57 Calciumglycero-phosphat-2-hydrat 0,49 Magnesiumchlorid 0,61 Natriumglycerophosphat 5,51 Kaliunchlorid 0,37 1) N'-Cystinyl-N6-cystinyl-lysin 6 2) N -Tyrosinyl-N -tyrosinyl-lysin Die beiden Tripeptide enthalten L-Cystin bzw. T,-Tyrosin in leicht löslicher Form. Beispiel 2 Die Substanzen wurden wie in Beispiel 1 beschreiben in Aqua dest. gelöst und in Infusionsflaschen abgefüllt und sterilisiert. Peptide und Aminosäuren g/1000 mL Gly-Ala-Gln 1,9 L-Isoleucin 7,60 L-Leucin 8,50 L-Lysin-Honomalat 7,67 L-Methionin 0,25 L-Phenylalanin 0,10 -Threonin 1,20 L-Tryptophan 0,10 L-Valin 6,40 t-Arginin 4,90 Is-Histidin 0,60 L-Ornithin-L-asportat 8,03 L-Alanin 1,50 L-Glutaminsäure 1,00 Glycin 0,20 L-Prolin 1,20 L-Serin 1,75 CyS-Lys(CyS) 0,30 Tyr-Lys (Tyr) 0,20 Natriumglycerophosphat-5-hydrat 4,52 Magnesiumchlorid 1,02 Kaliumchlorid 1,34 Beispiel 3 Die Substanzen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in Aqua dest. gelöst und in Infusionsflaschen abgefüllt und sterilisiert. Peptide und Aminosäuren g/1000 mL Gly-Ala-Gln 11,3 L-Isoleucin 2,51 L-Leucin 2,79 L-Lysin 1,45 L-Methionin 0,80 L-Phenylalanin 1,40 L-Threonin 1,74 L-Tryptophan 0,56 L-Valin 2,09 L-Arginin 3,49 L-Histidin 0,70 L-Alanin 0,50 L-Asparaginsäure 4,00 L-Glutaminsäure 3,20 Glycin 0,50 L-Prolin 3,80 CyS -Lys ( cyS) 2,00 Tyr-Lys( Tyr) 2,00 Nikotinamid 0,06 pvridoxinhydrochlorid 0,04 Riboflavin-5-phosphat-Na-salz 0,0025 Kalimhydroxid 1 , 40 Natriumhydroxid 1,20 Calciumchlorid 0,735 Magnesiumacetat 0,536

Claims: Use of glutamine as an α-aminoacylated derivative in the form of the water-soluble dipeptides or tripeptides, to produce aqueous, glutamine containing amino acid preparations for the oral or parenteral feeding for the elaboration or conservation of body protein. Use of the dipeptides or tripeptides according to claim 1 in a proportion of 1 to 50 g per litre of aqueous preparation. Use of the dipeptide L-alanyl-L-glutamine or of the tripeptide glycyl-L-alanyl-L-glutamine according to claim 1 or 2.

Inventors: FEKL WERNER DR, FUERST PETER PROF DR, PFAENDER PETER PROF DR, FEKL, WERNER, DR., FUERST, PETER, PROF. DR., PFAENDER, PETER, PROF. DR., Fürst, Peter, Prof. Dr.
Applicants: KABI PHARMACIA GMBH
Application year: 1983
Main classification: C07K5
IPC codes: C07K5